(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つのエチレン性二重結合、及びアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、一つのエチレン性二重結合、及び生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）、並びに、一つのエチレン性二重結合、及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）を共重合して得られ、
前記モノマー（ｃ）が下記の一般式［３］で表されるアルコキシシリルを有するモノマーであることを特徴とする医療材料用高分子化合物。
【化１】
0005552474.tif 000014
（式中Ｒ４は水素原子またはメチル基を示し、Ｚは炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は加水分解可能なアルコキシ基であり、その他はアルキル基を示す。）
【請求項２】
前記一つのエチレン性二重結合、及びアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、前記一つのエチレン性二重結合、及び生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）、前記一つのエチレン性二重結合、及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）、並びに、一つのエチレン性二重結合、及びアルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｄ）を共重合して得られることを特徴とする請求項１に記載の医療材料用高分子化合物。
【請求項３】
前記一つのエチレン性二重結合、及びアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）が下記の一般式［１］で表されるモノマーである請求項１または２に記載の医療材料用高分子化合物。
【化２】
0005552474.tif 000015
（式中Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ２は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上の整数の場合、繰り返されるＸは、同一であっても、または異なっていてもよい。）
【請求項４】
前記一つのエチレン性二重結合、及びアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）がメトキシポリエチレングリコールアクリレート又はメトキシポリエチレングリコールメタクリレートである請求項１または２に記載の医療材料用高分子化合物。
【請求項５】
前記メトキシポリエチレングリコールアクリレート及び／又はメトキシポリエチレングリコールメタクリレートのエチレングリコール残基の平均繰り返し数が３〜１００である請求項４に記載の医療材料用高分子化合物。
【請求項６】
前記一つのエチレン性二重結合、及び生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）の官能基がアルデヒド基、活性エステル、エポキシ基、ビニルスルホン基、ビオチンから選ばれる少なくとも一つの官能基である請求項１〜５のいずれか一項に記載の医療材料用高分子化合物。
【請求項７】
前記一つのエチレン性二重結合、及び生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）が下記の一般式［２］で表される活性エステルを有するモノマーである請求項１〜５のいずれか一項に記載の医療材料用高分子化合物。
【化３】
0005552474.tif 000016
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｙはアルキル基または炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示す。Ｗは活性エステル基を示す。ｑは１〜２０の整数を示す。ｑが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＹは、同一であっても、または異なっていてもよい。）
【請求項８】
前記活性エステルがｐ−ニトロフェニルエステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである請求項６または７に記載の医療材料用高分子化合物。
【請求項９】
前記一つのエチレン性二重結合、及びアルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｄ）がｎ−ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、及びシクロヘキシルメタクリレートから選ばれる少なくとも一つのモノマーである請求項２〜８のいずれか一項に記載の医療材料用高分子化合物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の医療材料用高分子化合物を含む医療材料用表面コーティング材料。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の医療材料用高分子化合物を含む層を基板表面に形成したバイオチップ用基板。
【請求項１２】
前記基板がプラスチック製である請求項１１に記載のバイオチップ用基板。
【請求項１３】
前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである請求項１２に記載のバイオチップ用基板。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の医療材料用高分子化合物を含む溶液を基板表面に塗布した後、該高分子化合物を架橋させることを特徴とするバイオチップ用基板の製造方法。
【請求項１５】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のバイオチップ用基板に生理活性物質を固定化したバイオチップ。
【請求項１６】
前記生理活性物質が核酸、アプタマー、蛋白質、オリゴペプチド、糖鎖、及び糖蛋白質から選ばれる少なくとも一つの物質である請求項１５に記載のバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質を固定化する機能を有する医療材料用高分子化合物に関する。さらに、本発明は、該高分子材料を含む表面コーティング材料、該高分子化合物を用いたバイオチップ基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子活性の評価や疾患プロセス、薬物効果の生物学的プロセスを含む生物学的プロセスを解読するための試みは、伝統的に、ゲノミクスに焦点が当てられてきたが、プロテオミクスは、細胞の生物学的機能についてより詳細な情報を提供する。プロテオミクスは、遺伝子レベルというよりもむしろ、蛋白質レベルでの発現を検出し、定量することによる、遺伝子活性の定性的かつ定量的な測定を含む。また、蛋白質の翻訳後修飾、蛋白質間の相互作用など遺伝子にコードされない事象の研究を含む。
【０００３】
膨大なゲノム情報の入手が可能となった今日、ますます迅速高効率（ハイスループット）化が求められている。この目的の分子アレイとしてＤＮＡチップが実用化されてきた。一方、生体機能において最も複雑で多様性の高い蛋白質の検出に関しては、プロテインチップが提唱され、最近研究が進められている。プロテインチップとは、蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ（微小な基板や粒子）表面に固定化したデバイスを総称する。
【０００４】
しかし、現状のプロテインチップは一般にＤＮＡチップの延長線上に位置付けられて開発がなされている為、ガラス基板や粒子において蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ表面に固定化する検討がなされている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
プロテインチップのシグナル検出において、信号対雑音比を低下させる原因として検出対象物質の基板への非特異的な吸着（たとえば、非特許文献１参照）が挙げられる。
【０００６】
固定化する方法としては２通りの方法が実施されている。その一つは蛋白質の物理的吸着による固定化の方法である。この方法では、蛋白質を固定化した後に２次抗体の非特異的吸着を防止するため、吸着防止剤のコーティングが行われているが、これら吸着防止剤の非特異的吸着防止能は十分でない。また１次抗体を固定化した後に吸着防止剤をコーティングするため、固定化した蛋白質の上にコーティングされてしまい、バイオチップと２次抗体とが反応できないという問題があった。このため、１次抗体の固定化後、吸着防止剤をコーティングすることなく、生理活性物質の非特異的吸着量の少ないバイオチップが求められている。
【０００７】
これを解決するため、生理活性物質の非特異的吸着量の少ないバイオチップが求められているが、このようなバイオチップを用いた場合、蛋白質を捕捉させた後の洗浄工程において基板に固定化した蛋白質またはそれを捕捉する分子が流出し、信号が低下するという問題があった。この問題に対する１つのアプローチとして、官能基、スペーサー基、および結合基を含む活性成分、架橋用成分、マトリックス形成成分を支持体上に被覆し、硬化させることで、支持体上に強固に結合した機能性表面を形成する方法が開示されている（たとえば、特許文献２）。しかしながら、この開示された方法では支持体上で低分子成分の硬化が進行するため、支持体がプラスチック基板の場合には反りや変形が起きる恐れがあった。また、網の目状に絡み合ったマトリックスが形成されるため、生理活性物質を固定化するための官能基の反応が抑制されたり、固定化した生理活性物質の機能発現の再現性が悪いなどの問題があった。また、マトリックス内部に入り込んだタンパク質が洗浄し難い為に非特異吸着を十分に抑制できないことがあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−１１６７５０号公報
【特許文献２】特表２００４−５３１３９０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」、林崎良英、岡崎康司編、羊土社、２０００年、ｐ．５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、生理活性物質の固定化能力に優れ、タンパク質に対して非特異吸着が少なく、洗浄工程においても溶解したり劣化したりしない化学的・物理的安定性を有し、プラスチック基材表面へも好適にコーティング可能な医療用高分子化合物を提供すること、該高分子化合物を用いてＳＮ比の高いバイオチップ用基板を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、生理活性物質の固定化能力に優れ、タンパク質に対して非特異吸着が少ない医療材料用高分子化合物の開発を目指して鋭意検討を行った。その結果、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）を共重合して得られる医療材料用高分子化合物が、生理活性物質の固定化能力に優れ、非特異吸着が少なく、プラスチック基板上にも均一にかつ反りやうねりなどの問題が生じることなくコーティングでき、バイオチップに好適に用いられることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、
（１）一つのエチレン性二重結合、及びアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、一つのエチレン性二重結合、及び生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）、並びに、一つのエチレン性二重結合、及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）を共重合して得られ、
前記モノマー（ｃ）が下記の一般式［３］で表されるアルコキシシリルを有するモノマーであることを特徴とする医療材料用高分子化合物、
【００１３】
【化１】
0005552474.tif 000002
【００１４】
（式中Ｒ４は水素原子またはメチル基を示し、Ｚは炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は加水分解可能なアルコキシ基であり、その他はアルキル基を示す。）
【００１５】
（２）前記一つのエチレン性二重結合、及びアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、前記一つのエチレン性二重結合、及び生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）、前記一つのエチレン性二重結合、及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）、並びに、一つのエチレン性二重結合、及びアルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｄ）を共重合して得られることを特徴とする（１）に記載の医療材料用高分子化合物、
（３）前記一つのエチレン性二重結合、及びアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）が下記の一般式［１］で表されるモノマーである（１）または（２）に記載の医療材料用高分子化合物、
【００１６】
【化２】
0005552474.tif 000003
【００１７】
（式中Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ２は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上の整数の場合、繰り返されるＸは、同一であっても、または異なっていてもよい。）
【００１８】
（４）前記一つのエチレン性二重結合、及びアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）がメトキシポリエチレングリコールアクリレート又はメトキシポリエチレングリコールメタクリレートである（１）または（２）に記載の医療材料用高分子化合物、
（５）前記メトキシポリエチレングリコールアクリレート及び／又はメトキシポリエチレングリコールメタクリレートのエチレングリコール残基の平均繰り返し数が３〜１００である（４）に記載の医療材料用高分子化合物、
（６）前記一つのエチレン性二重結合、及び生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）の官能基がアルデヒド基、活性エステル、エポキシ基、ビニルスルホン基、ビオチンから選ばれる少なくとも一つの官能基である（１）〜（５）のいずれか一項に記載の医療材料用高分子化合物、
（７）前記一つのエチレン性二重結合、及び生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）が下記の一般式［２］で表される活性エステルを有するモノマーである（１）〜（５）のいずれか一項に記載の医療材料用高分子化合物、
【００１９】
【化３】
0005552474.tif 000004
【００２０】
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｙはアルキル基または炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示す。Ｗは活性エステル基を示す。ｑは１〜２０の整数を示す。ｑが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても、または異なっていてもよい。）
【００２１】
（８）前記活性エステルがｐ−ニトロフェニルエステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである（６）または（７）に記載の医療材料用高分子化合物。
（９）前記一つのエチレン性二重結合、及びアルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｄ）がｎ−ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、及びシクロヘキシルメタクリレートから選ばれる少なくとも一つのモノマーである（２）〜（８）のいずれか一項に記載の医療材料用高分子化合物、
（１０）（１）〜（９）のいずれか一項に記載の医療材料用高分子化合物を含む医療材料用表面コーティング材料、
（１１）（１）〜（９）のいずれか一項に記載の医療材料用高分子化合物を含む層を基板表面に形成したバイオチップ用基板、
（１２）前記基板がプラスチック製である（１１）に記載のバイオチップ用基板。
（１３）前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである（１２）に記載のバイオチップ用基板、
（１４）（１）〜（９）のいずれか一項に記載の高分子化合物を含む溶液を基板表面に塗布した後、該高分子化合物を架橋させることを特徴とするバイオチップ用基板の製造方法、
（１５）（１１）〜（１３）のいずれか一項に記載のバイオチップ用基板に生理活性物質を固定化したバイオチップ、
（１６）前記生理活性物質が核酸、アプタマー、蛋白質、オリゴペプチド、糖鎖、及び糖蛋白質から選ばれる少なくとも一つの物質である（１５）に記載のバイオチップ、
である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、生理活性物質の固定化能力に優れ、タンパク質に対して非特異吸着が少なく、洗浄工程においても溶解したり劣化したりしない化学的・物理的安定性を有し、プラスチック基材表面へも好適にコーティング可能な医療用高分子化合物を提供でき、更に該高分子化合物を用いてＳＮ比の高いバイオチップ用基板を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の高分子化合物は、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）を共重合して得られることを特徴とする。この高分子化合物は、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質、生理活性物質を固定化する性質および高分子主鎖同士を架橋させる性質を併せ持つポリマーで、アルキレングリコール残基が生理活性物質の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、生理活性物質を固定化する官能基が生理活性物質を固定化する役割を果たす。
【００２４】
本発明に使用するアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）は、特に構造を限定しないが、一般式［１］で表される（メタ）アクリル基と炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｘの連鎖からなる化合物であることが好ましい。本発明において、「アルキレングリコール残基」とは、アルキレングリコール（ＨＯ−Ｒ−ＯＨ、ここでＲはアルキレン基）の片側端末又は両端末の水酸基が他の化合物と縮合反応した後に残る「アルキレンオキシ基」（−Ｒ−Ｏ−、ここでＲアルキレン基）を意味する。例えば、メチレングリコール（ＨＯ−ＣＨ２−ＯＨ）の「アルキレングリコール残基」はメチレンオキシ基（−ＣＨ２−Ｏ−）であり、エチレングリコール（ＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ）の「アルキレングリコール残基」はエチレンオキシ基（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）である。
【００２５】
【化４】
0005552474.tif 000005
【００２６】
一般式［１］において、アルキレングリコール残基Ｘの炭素数は１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、更に好ましくは２〜４であり、より更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基の繰り返し数ｐは、１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは２０〜９０の整数である。繰り返し数２以上１００以下の場合は、鎖中で繰り返されるアルキレングリコール残基Ｘの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。
【００２７】
アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）としては、例えばメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート；２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート等の水酸基の一置換エステルの（メタ）アクリレート類；グリセロールモノ（メタ）アクリレート；ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート；２−メトキシエチル（メタ）アクリレート；２−エトキシエチル（メタ）アクリレート；メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート；エトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート；エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。「（メタ）アクリレート」とは、メタクリレート又はアクリレートを意味する。
【００２８】
本発明に用いる生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）の官能基としては、化学的に活性な基、受容体基、リガンド基などがあるが、これらに限定されない。具体的な例としては、アルデヒド基、活性エステル、エポキシ基、ビニルスルホン基、ビオチン、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、ヒドロキシル基、アクリレート基、マレイミド基、ヒドラジド基、アジド基、アミド基、スルホネート基、ストレプトアビジン、金属キレートなどがあるがこれらに限定されない。これらの中でも生理活性物質に多く含まれるアミノ基との反応性の点からアルデヒド基、活性エステル、エポキシ基、ビニルスルホン基が好ましく、また生理活性物質と結合定数が高いビオチンが好ましい。中でもモノマーの保存安定性の点から活性エステルが最も好ましい。
【００２９】
本発明に使用する生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）は、特に構造を限定しないが、下記の一般式［２］で表される（メタ）アクリル基と活性エステル基がアルキル基または炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基の連鎖を介して結合した化合物であることが好ましい。
【００３０】
【化５】
0005552474.tif 000006
【００３１】
一般式［２］において、アルキレングリコール残基Ｙの炭素数は１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、更に好ましくは２〜４であり、より更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｙの繰り返し数ｑは１〜２０の整数であり、より好ましくは２〜１８の整数であり、更に好ましくは３〜１６の整数であり、最も好ましくは４〜１４の整数である。繰り返し数２以上２０以下の場合は、鎖中繰り返されるアルキレングリコール残基の炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。
【００３２】
本発明に使用する「活性エステル基」は、エステル基の片方の置換基に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
【００３３】
このような活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、コハク酸イミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられるが、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。
【００３４】
本発明に使用する生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）の望ましい組成比は１〜５０ｍｏｌ％であり、好ましくは１〜３０ｍｏｌ％、最も好ましくは１〜２０ｍｏｌ％である。
【００３５】
本発明に使用する架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）は、架橋可能な官能基の反応が高分子化合物合成中に進行しないものであれば特に制限されるものではない。
【００３６】
架橋可能な官能基としては、例えば加水分解によりシラノール基を生成する官能基やエポキシ基、（メタ）アクリル基、グリシジル基などが用いられるが、架橋処理が容易なことから加水分解によりシラノール基を生成する官能基やエポキシ基、グリシジル基が好ましく、より低温で架橋できることから加水分解によりシラノール基を生成する官能基が好ましい。
【００３７】
加水分解によりシラノール基を生成する官能基とは、水と接触すると容易に加水分解を受けシラノール基を生成する基であり、例えば、ハロゲン化シリル基、アルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基等を挙げることができる。中でも、ハロゲンを含まないことからアルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基が好ましく、中でもシラノール基を生成し易い点からアルコキシシリル基が最も好ましい。
【００３８】
加水分解によりシラノール基を生成する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、（メタ）アクリル基とアルコキシシリル基が直接または炭素数１〜２０のアルキル鎖を介して結合した一般式［３］で表されるエチレン系不飽和重合性モノマーであることが好ましい。
【００３９】
【化６】
0005552474.tif 000007
【００４０】
アルコキシシリル基を含有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、例えば、３−（メタ）アクリロキシプロペニルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルビス（トリメチルシロキシ）メチルシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリス（メトキシエトキシ）シラン、８−（メタ）アクリロキシオクタニルトリメトキシシラン、１１−（メタ）アクリロキシウンデニルトリメトキシシラン等の（メタ）アクリロキシアルキルシラン化合物等を挙げることができる。中でも３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシランがアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとの共重合性が優れている点、入手が容易である点等から好ましい。これらのアルコキシシリル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。
【００４１】
本発明に使用する架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）の望ましい組成比は１〜２０ｍｏｌ％であり、好ましくは２〜１５ｍｏｌ％、最も好ましくは２〜１０ｍｏｌ％である。
【００４２】
本発明に使用する高分子化合物は、上述したアルキレングリコール残基、生理活性物質を固定化する官能基および架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー以外に他の基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含んでもよい。例えば、アルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｄ）を共重合させてもよく、アルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｄ）としてはｎ―ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート又はｎ−オクチルメタクリレートが好ましい。
【００４３】
本発明の高分子化合物の合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、少なくともアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）および架橋可能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）を含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。
【００４４】
溶媒としてはそれぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。プラスチック基材に該高分子化合物を塗布する場合は、エタノール、メタノールが基材を変性させないため好ましい。
【００４５】
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。
【００４６】
本発明の高分子化合物の化学構造は、少なくともアルキレングリコール残基、生理活性物質を固定化する官能基及び架橋可能な官能基を有する各エチレン系不飽和重合性モノマーが共重合されたものであれば、その結合方式がランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態をなしていてもかまわない。
【００４７】
本発明の高分子化合物の分子量は、高分子化合物と未反応のエチレン系不飽和重合性モノマーとの分離精製が容易になることから、数平均分子量は５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。
【００４８】
本発明の高分子化合物は、基材表面を該高分子化合物で被覆することにより、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質、特定の生理活性物質を固定化する性質を容易に付与することが可能である。さらに、高分子主鎖同士を架橋させる性質を併せ持つことから、基材表面を被覆した後に、架橋させることが可能である。これにより、基材上の高分子に不溶性を付与することができ、基材洗浄による信号低下を低減することができる。
【００４９】
基材表面への高分子化合物の被覆は、例えば、（ｉ）有機溶剤に高分子化合物を０．０５〜１０重量％濃度になるように溶解した高分子溶液を調製し、（ｉｉ）該高分子溶液を浸漬、吹きつけ等の公知の方法で基材表面に塗布した後、（ｉｉｉ）塗布した溶液を室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。その後、架橋可能な官能基に応じた任意の方法で高分子の主鎖同士を架橋させる。架橋可能な官能基が加水分解によりシラノール基を生成する官能基の場合の高分子化合物の被覆については、有機溶剤中に水を含有させた混合溶液を用いてもよい。含有される水により加水分解が生じ、該合成高分子中にシラノール基が生成し、さらに合成した高分子を加熱することにより主鎖同士が結合され、高分子化合物が不溶になる。溶液の調製の容易さを考えると、含水量が約０．０１〜１５重量％程度のものが好ましい。
【００５０】
有機溶剤としてはエタノール、メタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン等の単独溶媒またはこれらの混合溶剤が使用される。中でも、エタノール、メタノールがプラスチック基材を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。また、エタノール、メタノールは、溶液中で高分子化合物を加水分解させる場合にも、水と任意の割合で混ざるので好ましい。
【００５１】
本発明の高分子化合物を溶解した溶液を基材表面に塗布した後、乾燥させる工程において、高分子化合物中のシラノール基は、他の高分子化合物中のシラノール基、水酸基、アミノ基等と脱水縮合して架橋を形成する。さらに基材表面に水酸基、カルボニル基、アミノ基などがある場合も同様に脱水縮合し、基材表面と化学的に結合することができる。シラノール基の脱水縮合により形成される共有結合は加水分解されにくい性質があるので、基材表面に被覆された高分子化合物は容易に溶解したり、基材から脱離してしまうことはない。シラノール基の脱水縮合は加熱処理により促進される。高分子化合物が熱により変成されない温度範囲内、例えば、６０〜１２０℃で５分間〜２４時間加熱処理するのが好ましい。
【００５２】
本発明に使用するバイオチップ用基板の素材は、ガラス、プラスチック、金属その他を用いることができるが、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックが好ましく、熱可塑性樹脂がより好ましい。
【００５３】
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、たとえばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；環状ポリオレフィン；含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。
【００５４】
基材表面と表面に被覆される高分子化合物との密着性を高めるために、基材表面を活性化することが好ましい。活性化する手段としては酸素雰囲気下、アルゴン雰囲気下、窒素雰囲気下、空気雰囲気下などの条件下でプラズマ処理する方法、ＡｒＦ、ＫｒＦなどのエキシマレーザーで処理する方法があるが、酸素雰囲気下でプラズマ処理する方法が好ましい。
【００５５】
本発明の高分子化合物を基材に塗布することで容易に生理活性物質の非特異的吸着を抑制されたバイオチップ基板を作製できる。さらに該高分子化合物を架橋することで、基材上の高分子化合物に不溶性を付与することができる。これらのことより、該高分子化合物を塗布した基材はバイオチップに好適に用いることができる。
【００５６】
本発明のバイオチップ基板を使用して各種の生理活性物質を固定化することができる。固定化する生理活性物質は核酸、アプタマー、蛋白質、オリゴペプチド、糖鎖、糖蛋白質などがある。例えば核酸を固定化する場合は、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基を導入することが好ましい。アミノ基の導入位置は分子鎖末端あるいは側鎖（「ブランチ」ともいう）であってもよいが、分子鎖末端にアミノ基が導入されていることが好ましい。
【００５７】
本発明において生理活性物質をバイオチップ基板上に固定化する際には、生理活性物質を溶解又は分散した液体を点着する方法が好ましい。
【００５８】
点着後、静置することにより、生理活性物質が表面に固定化される。例えばアミノ化された核酸を用いた場合は、室温から８０℃において１時間静置することにより、アミノ化された核酸の固定化が可能である。処理温度は高いほうが好ましい。生理活性物質を溶解または分散させる液体としてはアルカリ性であることが好ましい。
【００５９】
洗浄後は生理活性物質を固定化した部分以外の基板表面の部分の官能基を不活性化処理する。活性エステルやアルデヒド基の場合はアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行うことが好ましい。
【００６０】
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを好ましく用いることができる。
【００６１】
一級アミノ基を有する化合物としては、メチルアミン、エチルアミン、ブチルアミン、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５−アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを好ましく用いることができ、アミノエタノール、グリシンが最も好ましい。
【００６２】
このように生理活性物質を固定化することによって得られたバイオチップは免疫診断システム、遺伝子マイクロアレイシステム、タンパク質マイクロアレイシステム、マイクロフルイディスクデバイスを含めた多くの分析システムにおいて使用することができる。
【実施例】
【００６３】
＜ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）の合成＞
０．０１ｍｏｌのポリエチレングリコールモノメタクリレート（Ｂｌｅｎｍｅｒ  ＰＥ−２００（ｎ＝４）、日本油脂（株）製）を２０ｍＬのクロロホルムに溶解させた後、−３０℃まで冷却した。−３０℃に保ちながらこの溶液に、予め作成しておいた０．０１ｍｏｌのｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート（Ａｌｄｒｉｃｈ製）と０．０１ｍｏｌのトリエチルアミン（和光純薬（株）製）及びクロロホルム２０ｍＬの均一溶液をゆっくりと滴下した。−３０℃にて１ｈ反応させた後、さらに２時間溶液を攪拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）を得た。得られたモノマーを重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、エチレングリコール残基が４．５単位含まれていることを確認した。
【００６４】
（高分子化合物の合成例１）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（ＰＥＧＭＡ、数平均分子量Ｍｎ＝約１８８、Ａｌｄｒｉｃｈ製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（ＭＰＤＥＳ、ＧＥＬＥＳＴ，ＩＮＣ．製）をそれぞれ順に０．９０ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ、になるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに０．００２ｍｏｌ／Ｌの２，２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、和光純薬（株）製）を添加し、均一になるまで該モノマー混合溶液を撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で４時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．１３ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、３．４ｐｐｍ付近に現れるＰＥＧＭＡの末端メトキシ基に帰属されるピーク、７．４ｐｐｍおよび８．２９ｐｐｍ付近に現れるＭＥＯＮＰのベンゼン環に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。
【００６５】
（高分子化合物の合成例２）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（ＰＥＧＭＡ、数平均分子量Ｍｎ＝約３００、Ａｌｄｒｉｃｈ製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（ＭＰＤＥＳ、ＧＥＬＥＳＴ，ＩＮＣ．製）をそれぞれ順に０．９０ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ、になるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに０．０１ｍｏｌ／Ｌの２，２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、和光純薬（株）製）を添加し、均一になるまで該モノマー混合溶液を撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で２時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．１３ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、３．３８ｐｐｍ付近に現れるＰＥＧＭＡの末端メトキシ基に帰属されるピーク、７．４ｐｐｍおよび８．３ｐｐｍ付近に現れるＭＥＯＮＰのベンゼン環に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。
【００６６】
（高分子化合物の合成例３）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（ＰＥＧＭＡ、数平均分子量＝約４７５、Ａｌｄｒｉｃｈ製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（ＭＰＤＥＳ、ＧＥＬＥＳＴ，ＩＮＣ．製）をそれぞれ順に０．９０ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ、になるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに０．００２ｍｏｌ／Ｌの２，２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、和光純薬（株）製）を添加し、均一になるまで該モノマー混合溶液を撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で１．５時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重エタノール溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．１５ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、３．３５ｐｐｍ付近に現れるＰＥＧＭＡの末端メトキシ基に帰属されるピーク、７．６ｐｐｍおよび８．４ｐｐｍ付近に現れるＭＥＯＮＰのベンゼン環に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。
【００６７】
（高分子化合物の合成例４）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（ＰＥＧＭＡ、数平均分子量＝約１１００、Ａｌｄｒｉｃｈ製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（ＭＰＤＥＳ、ＧＥＬＥＳＴ，ＩＮＣ．製）をそれぞれ順に０．４５ｍｏｌ／Ｌ、０．０２５ｍｏｌ／Ｌ、０．０２５ｍｏｌ／Ｌ、になるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに０．００２ｍｏｌ／Ｌの２，２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、和光純薬（株）製）を添加し、均一になるまで該モノマー混合溶液を撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で１時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重エタノール溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．１６ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、３．３５ｐｐｍ付近に現れるＰＥＧＭＡの末端メトキシ基に帰属されるピーク、７．６ｐｐｍおよび８．４ｐｐｍ付近に現れるＭＥＯＮＰのベンゼン環に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。
【００６８】
【表１】
0005552474.tif 000008
【００６９】
（実施例１〜４）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２−ノルボルネンの開環重合体の水素添加物、ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ／１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度：１２３℃）を用い、射出成形により、スライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作成した。酸素雰囲気下のプラズマ処理によって基板表面に酸化処理を施した。この固相基板を高分子化合物の合成例１〜４にてえられた高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液に浸漬、６５℃にて４時間加熱乾燥することにより、基板表面にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、活性エステル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー及び架橋可能な官能基有するエチレン系不飽和重合性モノマーからなる高分子化合物を含む層を導入した。
【００７０】
（比較例１）
（ノンコート基板）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２−ノルボルネンの開環重合体の水素添加物、ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ／１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度：１２３℃）を用い、射出成形により、スライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作成した。酸素雰囲気下のプラズマ処理によって基板表面に酸化処理を施した。
【００７１】
（比較例２）
（アルデヒド基板）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２−ノルボルネンの開環重合体の水素添加物、ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ／１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度：１２３℃）を用い、射出成形により、スライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作成した。酸素雰囲気下のプラズマ処理によって基板表面に酸化処理を施した。この基板を２体積％の３−アミノプロピルトリメトキシシランのエタノール溶液に浸漬した後、純水洗浄し、４５℃にて２時間熱処理することによりアミノ基を導入し、さらに１体積％のグルタルアルデヒド水溶液に浸漬した後、純水洗浄することでアルデヒド基を導入した。
【００７２】
（比較例３）
特許文献２の実施例Ｘに従いアミン反応性スライドガラス基板を作製した。
【００７３】
実施例１〜４の基板および比較例３の基板については下記実験を５回繰り返して再現性を確認した。再現性は抗原であるマウスＩｇＧ２ａを添加しない系で行った。
【００７４】
（実験１）
工程１（１次抗体の固定化）
次に実施例、比較例で得られた基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッターにより炭酸バッファ（和光純薬製、ｐＨ９．５）で３．３μｍｏｌ／リットルに調製された一次抗体である抗マウスＩｇＧ２ａをスポット後、各基盤を室温の環境下に２４時間静置することにより一次抗体を固定化した。
【００７５】
工程２（吸着防止処理）
その後、実施例１〜４の各基板を０．１ｍｏｌ／リットルのエタノールアミン（和光純薬製、鹿特級）と０．１ｍｏｌ／リットルのトリスバッファ（ＳＩＧＭＡ製）とからなる水溶液（ｐＨ９．５）に１時間浸漬することにより残りの活性エステル部を失活させた。
また、比較例１の基板には、希釈剤としてＰＢＳバッファ（日水製薬製、純水１リットル中に９．６ｇの組成培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を溶解したバッファ）を用いて市販の吸着防止剤であるブロックエース（大日本製薬株式会社製）を４倍希釈した溶液に２時間浸漬することにより吸着防止処理を施した。別の比較例１の基板には、吸着防止処理を施さなかった。
比較例２の基板には、希釈剤としてＰＢＳバッファ（日水製薬製、純水１リットル中に９．６ｇの組成培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を溶解したバッファ）を用いて市販の吸着防止剤であるブロックエース（大日本製薬株式会社製）を４倍希釈した溶液に２時間浸漬することにより吸着防止処理を施した。
【００７６】
工程３（抗原抗体反応１）
その後、ＰＢＳバッファ（日水製薬製、９．６ｇの組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を１リットル中に溶解したバッファ）で１０％に希釈したＦＢＳ（子牛血清）溶液を作製した。この溶液中に抗原であるマウスＩｇＧ２ａを添加し２０ｎｍｏｌ／リットルとした溶液を作製した。この溶液をＰＢＳバッファ（日水製薬製、９．６ｇの組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を１リットル中に溶解したバッファ）で１０％に希釈したＦＢＳ（子牛血清）で１倍、２倍、３倍、４倍希釈溶液を作製した。これらの希釈溶液およびマウスＩｇＧ２ａを含まない１０％ＦＢＳ溶液を３７℃にて２時間、各基板と接触させることにより抗原抗体反応を実施した。
抗原抗体反応後、基板を、０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間洗浄した。
【００７７】
工程４（抗原抗体反応２）
洗浄後、二次抗体であるビオチン標識抗マウスＩｇＧ２ａをＰＢＳバッファ（日水製薬製、９．６ｇの組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を１リットル中に溶解したバッファ）に添加することにより２０ｎｍｏｌ／リットルの溶液を作製した。この溶液と基板とを３７℃にて２時間、抗原抗体反応を実施した。
抗原抗体反応後、各基盤を０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間洗浄した。
【００７８】
工程５（標識化）
最後にＣｙ５標識されたストレプトアビジンをＰＢＳバッファ（日水製薬製、９．６ｇの組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を１リットル中に溶解したバッファ）に添加することにより２０ｎｍｏｌ／リットルの溶液を作製した。この溶液と基板とを３７℃にて３０分反応させた後、各基盤を０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間洗浄することにより標識化をした。
【００７９】
各基板について蛍光量測定を行いスポットシグナル強度値とバックグランド値を評価した。バックグランド値の結果を表２に、スポットシグナル強度の結果を表３に、再現性試験結果を表４に示す。
【００８０】
実施例および比較例における蛍光量の測定には、Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＣｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製マイクロアレイスキャナー「ＳｃａｎＡｒｒａｙ」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度５０％、励起波長６４９ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ、解像度５０μｍであった。
【００８１】
実施例１〜４を比較例１（ブロックエース処理なし）と比較することにより、本発明のバイオチップ基板によりバックグランドが低減されたことが確認された。
【００８２】
また、実施例１〜４を比較例２と比較することにより、本発明によるバイオチップ基板は、従来のアルデヒド基板に市販の吸着処理剤で処理する場合よりもバックグランドが低くシグナルが高いバイオチップ基板であることがわかった。
【００８３】
実施例１〜４を比較例３と比較することにより、本発明によるバイオチップ基板は特許文献２に記載の基板よりも、バックグランドが低い、すなわち血清中に含まれる非特異的なタンパクを吸着しにくいことが分かった。また、本発明によるバイオチップ基板は１次抗体スポット部の抗原なしの時のシグナル強度が低い、すなわち基板に１次抗体がその抗体機能を保持した状態で固定化されていることが分かった。更に、本発明によるバイオチップ基板は再現性に関しても優れるバイオチップ基板であることが分かった。
【００８４】
【表２】
0005552474.tif 000009
【００８５】
【表３】
0005552474.tif 000010
【００８６】
【表４】
0005552474.tif 000011
【００８７】
実施例４の基板および比較例３の基板については、更に下記実験２〜６による評価を行った。
【００８８】
（実験２）
工程１（アプタマーの固定化）
次に実施例４及び比較例３で得られた基板上に、０．１Ｍリン酸バッファ（和光純薬製、ｐＨ９．５）に１０μｍｏｌ／リットルになるように調製された各種アプタマー溶液を同じ基板上にスポットした。尚、エンドスタチン、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦを検出するアプタマーを用いた。その後、該基板を６５℃の環境下に１時間静置することによりアプタマーを固定化した。
【００８９】
工程２（吸着防止処理）
その後、基板は０．１ｍｏｌ／リットルのエタノールアミン（和光純薬製、鹿特級）と０．１ｍｏｌ／リットルのトリスバッファ（ＳＩＧＭＡ製Ｔ５９１２）とからなる水溶液（ｐＨ９．５）に１時間浸漬することにより残りの活性エステル部を失活させた。
【００９０】
工程３（アプタマーとたんぱく質の反応）
その後、４０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ（同仁社製ＧＢ６０、ｐＨ７．５）、１１１ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ塩化カルシウムの水溶液で１μｇ／ｍＬに希釈したエンドスタチン（Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＧｍｂＨ社製ＳＰ５２３０ＣＰ）溶液を作製した。この溶液を３７℃にて２時間、基板と接触させることによりアプタマーとたんぱく質の反応を実施した。反応後、基板を、４０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ７．５）、１１１ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ塩化カルシウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの水溶液で３７℃にて３０分間洗浄した。
【００９１】
工程４（染色工程）
洗浄後、基板を、ＮＨＳ−ＡＬＥＸＡ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を０．１Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）溶液中に３ｍｇ／ｍＬの割合になるように調製した溶液と室温で３０分間反応させた。反応後、基板を、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含むＳＳＰＥバッファ（ＳＩＧＭＡ社製Ｓ１０２７、ｐＨ７．５）で室温で５分間洗浄した。
【００９２】
（実験３）
実験２の工程３にてエンドスタチンの替わりにＦＧＦ  ｂａｓｉｃ（Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＧｍｂＨ社製ＰＡ０５５Ｘ）を用いた以外は実験２と同様の実験を行った。
【００９３】
（実験４）
実験２の工程３にてエンドスタチンの替わりにＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．社製２９３−ＶＥ−０１０）を用いた以外は実験２と同様の実験を行った。
【００９４】
（実験５）
実験２の工程３にてエンドスタチン溶液の替わりに、１０％に希釈したヒト血清ＡＢ型（大日本製薬社２９３１９−４９）溶液を用いた以外は実験２と同様の実験を行った。
【００９５】
（実験６）
実験２の工程３にてエンドスタチン溶液の替わりに、１０％に希釈したヒト血清ＡＢ型（大日本製薬社２９３１９−４９）と１０μｇ／ｍＬに希釈したＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．社製２９３−ＶＥ−０１０）とをひとつの溶液として用いた以外は実験２と同様の実験を行った。
【００９６】
各実験ごとに蛍光量測定を行いスポットシグナル強度値とバックグランド値を評価した。
【００９７】
各蛍光量の測定には、Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＣｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製マイクロアレイスキャナー「ＳｃａｎＡｒｒａｙ」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度５０％、励起波長６４９ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ、解像度５０μｍであった。
【００９８】
実施例４の基板を使用した実験２〜６の評価結果を表５に、比較例３の基板を使用した実験２〜６の評価結果を表６に示した。
【００９９】
実施例４の基板では、実験２〜４では固定化したアプタマーと反応させたタンパク質の特異的なシグナルが観察された。実験５では血清中のそれぞれのタンパク質を検出することができ、さらに低いバックグランドを保っている。
比較例３の基板の場合、実験２〜４では固定化したアプタマーと特異的なタンパク質が検出できるがバックグランドが高くなる結果となった。実験５、６では高いシグナル値が得られているが、ＶＥＧＦを加えた効果がシグナルとして現れていない。これはアプタマーが特異的なタンパク質以外に非特異的にタンパク質を認識しているのでシグナルが高くなっていると考察される。また血清の使用によりタンパク質が基板に吸着しバックグランドが高くなっている。
【０１００】
【表５】
0005552474.tif 000012
【０１０１】
【表６】
0005552474.tif 000013