(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質に対する関心対象の化合物の結合定数を求めるための方法であって、以下の工程を含む方法:
a)高親和性化合物を、関心対象の化合物を透過させる半透膜によって2つのチャンバーが分けられている2チャンバーシステムに添加して、
分配平衡に達した後に、一方のチャンバーの中にある関心対象の高親和性化合物の量を求める工程、
b)シンク化合物を、シンク化合物が半透膜を透過できない一方のチャンバーに添加して、
分配平衡に達した後に、シンク化合物に対する関心対象の化合物の分配係数を求める工程であって、
前記シンク化合物が、非特異的タンパク質に対する関心対象の化合物の親和性を有意に下げる物質であり、かつ前記非特異的タンパク質が、広範囲の化合物に非選択的に結合するタンパク質である、前記工程、
c)非特異的タンパク質を、非特異的タンパク質が半透膜を透過できない他方のチャンバーに添加して、
分配平衡に達した後に、シンク化合物の存在下での非特異的タンパク質に対する関心対象の化合物の分配係数を求める工程、ならびに
d)工程b)およびc)の分配係数を用いて関心対象の化合物の結合定数を求める工程。
【請求項２】
半透膜が、サイズ選択性の膜である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
シンク化合物がPVPまたはシクロデキストリンである、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
シンク化合物がPVP25である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
タンパク質が血漿タンパク質である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
血漿タンパク質が血清アルブミンである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
工程a)、b)、およびc)が並行して行われる、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
薬物としての化合物の成功はその効力だけでなく、薬物強度、薬物相互作用、安全性、薬物動態、および製造コストとの最適なバランスにも左右される。
【０００２】
化合物が受容体において有効になる前に、化合物の放出、吸収、および分布は少なからぬ影響を及ぼす。遊離した(結合していない)薬物だけが受容体において有効である。薬物のタンパク質に対する結合が強すぎる場合、薬物の薬理学的応答の強度は低下し、薬物の分布容積、代謝、および排泄にも影響を及ぼすことがある。
【０００３】
最良の物理化学的特性を有する物質を発見するためのフィードバックを化学者が入手し、化学構造と物理化学パラメータとの関係を理解するためには、ハイスループット-ADMEスクリーニング(A=吸収、D=分布、M=代謝、E=排泄)によって決められるインビトロデータの作成を最大限にすることが必須である。
【０００４】
タンパク質結合を確かめる公知の方法は、例えば、平衡透析である。この方法の出発点は、試料チャンバーおよびタンパク質チャンバーの2つのチャンバーであり、これらは半透膜によって分けられている。膜のMWCOは、試験物質は膜を透過できるが、高分子(例えば、タンパク質)は保持されるように選択される。既知の濃度および体積の試験物質が試料チャンバーの中に入れられる。次いで、試料チャンバーの中にある物質の1つと同じ体積の、既知の濃度のタンパク質がタンパク質チャンバーの中に入れられる。試験物質が膜を通って拡散するにつれて、一部はタンパク質に結合し、一部は溶解状態で遊離のままになる。相互作用の親和性が低いほど、いかなる時点においても、結合していない試験物質の濃度は高くなる。膜を通る試験物質の拡散および試験物質の結合は、平衡に達するまで続く。平衡状態では、溶解状態で遊離している試験化合物の濃度は両チャンバーの中で等しい。しかしながら、タンパク質チャンバーの中では、結合している試験物質があるために、試験物質の全体の濃度は高い(試験化合物がタンパク質に結合する場合)。次いで、試料チャンバーの中にある遊離試験物質の濃度を用いて、試験化合物の結合特性を求めることができる。
【０００５】
別の方法はBIAcore技術の使用である。BIAcore技術では一方の結合パートナーがセンサーチップ上に固定化されている。他方の結合パートナーは、マイクロセルの中に入れられたチップを通過する。結合検出は、チップ表面にタンパク質または他の分子が結合した時に起こる、金属チップからの単色光反射のわずかな変化である、「表面プラズモン共鳴(SPR)」という現象に依存している。
【０００６】
しかしながら、これらの方法は全て、高い物質処理量で99％結合と99.99％結合を区別できないので、ハイスループットアッセイにおいて高親和性物質のタンパク質結合能力を確かめるのに適していない。これは、最後に分析される遊離試験物質の濃度が低すぎて定量できないためである。
【０００７】
高親和性薬物を用いると、結合物質の量のわずかな変化は、体内の遊離画分に大きな影響を及ぼし(以下の表を参照されたい)、それによって、作用および副作用に影響を及ぼすことがある。従って、まさにこの範囲の中で測定を行うことが非常に重要である。
【０００８】
差が4％の例:
0005637608.tif 000002
【発明の概要】
【０００９】
従って、本発明は、タンパク質に対する関心対象の高親和性化合物の結合定数を求める方法であって、以下の工程を含む方法を提供する:
a)高親和性化合物を、関心対象の化合物を透過させる膜によって2つのチャンバーが分けられている2チャンバーシステムに添加して、
分配平衡に達した後に、一方のチャンバーの中にある関心対象の高親和性化合物の量を求める工程、
b)シンク化合物を、シンク化合物が膜を透過できない一方のチャンバー(シンクチャンバー)に添加して、
分配平衡に達した後に、シンク化合物に対する関心対象の化合物の分配係数を求める工程、
c)非特異的タンパク質を、非特異的タンパク質が膜を透過できない他方のチャンバー(タンパク質チャンバー)に添加して、
分配平衡に達した後に、シンク化合物の存在下での非特異的タンパク質に対する関心対象の化合物の分配係数を求める工程、ならびに
d)工程b)およびc)の分配係数を用いて試験化合物の結合定数を求める工程。
【００１０】
工程a)、b)、および工程c)は連続して行われてもよく、並行して行われてもよい(図3を参照されたい)。
【００１１】
従って、本発明はまた、タンパク質に対する関心対象の高親和性化合物の結合定数を求める方法であって、工程a)、b)、およびc)が並行して行われる、以下の工程を含む方法を提供する:
a) 各システムの2つのチャンバーが、関心対象の化合物を透過させる膜によって分けられている、並行して遂行するための2チャンバーシステムを準備し、高親和性化合物を2チャンバーシステムに添加して、
分配平衡に達した後に、一方のチャンバーの中にある関心対象の高親和性化合物の量を求める工程、
b)高親和性化合物およびシンク化合物を、シンク化合物が膜を透過できない、第2のチャンバーシステムの一方のチャンバー(シンクチャンバー)に添加して、
分配平衡に達した後に、シンク化合物に対する関心対象の化合物の分配係数を求める工程、
c)高親和性化合物およびシンク化合物を、第3のチャンバーシステムの一方のチャンバー(シンクチャンバー)に添加し、かつ非特異的タンパク質を、非特異的タンパク質が膜を透過できない他方のチャンバー(タンパク質チャンバー)に添加して、
分配平衡に達した後に、シンク化合物の存在下での非特異的タンパク質に対する関心対象の化合物の分配係数を求める工程、ならびに
d)工程b)およびc)の分配係数を用いて試験化合物の結合定数を求める工程。
【００１２】
さらに、本願は、高親和性試験化合物の結合定数を求めるためのシンク化合物の使用を提供する。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
タンパク質に対する関心対象の化合物の結合定数を求めるための方法であって、以下の工程を含む方法:
a)高親和性化合物を、関心対象の化合物を透過させる半透膜によって2つのチャンバーが分けられている2チャンバーシステムに添加して、
分配平衡に達した後に、一方のチャンバーの中にある関心対象の高親和性化合物の量を求める工程、
b)シンク化合物を、シンク化合物が膜を透過できない一方のチャンバーに添加して、
分配平衡に達した後に、シンク化合物に対する関心対象の化合物の分配係数を求める工程、
c)非特異的タンパク質を、非特異的タンパク質が膜を透過できない他方のチャンバーに添加して、
分配平衡に達した後に、シンク化合物の存在下での非特異的タンパク質に対する関心対象の化合物の分配係数を求める工程、ならびに
d)工程b)およびc)の分配係数を用いて試験化合物の結合定数を求める工程。
［２］
フィルターが、サイズ選択性の膜である、［1］記載の方法。
［３］
シンク化合物がPVPまたはシクロデキストリンである、［1］または［2］記載の方法。
［４］
シンク化合物がPVP25である、［1］〜［3］のいずれか一項記載の方法。
［５］
タンパク質が血漿タンパク質である、［1］〜［4］のいずれか一項記載の方法。
［６］
血漿タンパク質が血清アルブミンである、［5］記載の方法。
［７］
工程a)、b)、およびc)が並行して行われる、［1］〜［6］のいずれか一項記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
（図１）10本のTeflon(商標)バーからなる透析チャンバーシステムを示す。Teflon(商標)バーのうち8本には両側に12個のドリル穴があり、2本には片側に12個のドリル穴がある(図1A)。2本のバーが一緒になって横列12個の円筒形ウェル(横列A〜I)を形成するように、前記のドリル穴は半円筒の形をしている(図1Bを参照されたい)。それぞれの円筒形ウェルが2つ半分の円筒形チャンバーに分けられるように、Teflon(商標)バーの間に半透膜(M)が挿入される。ステンレス鋼の2本の連結棒(R)を用いて、膜と共に10本のTeflon(商標)バーが組み立てられる。
（図２）アッセイの間の透析チャンバーシステムを示す。チャンバーは、膜Mによって分けられた2つのチャンバー(チャンバー1、チャンバー2)を備える。サイズ選択性の膜Mは2つのチャンバーを分け、試験化合物を透過させるが、シンク化合物も非特異的タンパク質も透過させない。
0005637608.tif 000003
丸で囲んだチャンバーの番号は、測定のために試料が採取されるチャンバーを示す。図2A)は、参照条件下でのチャンバーシステムにおける状況の模式図を示す。ここでは、試験化合物はチャンバーシステムの中で均一に分布している。図2B)は、試験化合物およびシンク化合物のあるチャンバーシステムにおける状況の模式図を示す。試験化合物およびシンク化合物はチャンバー1に添加され、結合しなかった試験化合物だけが膜を通過できるので、試験化合物の分布に影響を及ぼす。図2C)は、試験化合物、シンク化合物、および非特異的タンパク質のあるチャンバーシステムにおける状況の模式図を示す。試験化合物およびシンク化合物はチャンバー1に添加され、非特異的タンパク質はチャンバー2に添加される。シンク化合物は、非特異的タンパク質が利用できる結合していない試験化合物の量を減らす。図2D)は、先行技術アッセイを用いたチャンバーシステムにおける状況の模式図を示す。高い割合の試験化合物が非特異的タンパク質に結合する。
（図３）3つの2チャンバーシステムにおいて並行して行われた本願の方法の模式図を示す。
（図４）β-ヒドロキシプロピル-シクロデキストリン(A)およびポリビニルピロリドン単量体(B)の化学構造を示す。
（図５）試験化合物(ワーファリン、ジクロフェナク)とシンク化合物PVP25の占有率と、試験化合物とシンク化合物(β-ヒドロキシプロピル-シクロデキストリン、PVP25)の組み合わせの占有率との比較を示す。X軸:平衡状態にある、結合していない試験化合物の濃度[mM]。y軸:結合した試験化合物の濃度。
0005637608.tif 000004
（図６）カルデビロール(cardevilol)とシンク化合物(β-ヒドロキシプロピル-シクロデキストリン、PVP25)の組み合わせの占有率のグラフ表示を示す。X軸:平衡状態にある、結合していないカルデビロールの濃度[mM]。y軸:結合した試験化合物の濃度。◆カルベジロールPVP25とβ-ヒドロキシプロピルシクロデキストリン。
（図７）試験化合物(ジクロフェナク、ワーファリン、カルベジロール、ナプロキセン、プロキシカム、およびグリベンクラミド)とシンク化合物PVP25の占有率のグラフ表示を示す。x軸:カルデビロールの総濃度[mM]。y軸:カルデビロールの占有率[％(シンク化合物に結合した試験化合物の量)]。
0005637608.tif 000005
（図８）ヒト血清アルブミン(HSA)の存在下での試験化合物(ジクロフェナク、ワーファリン、カルベジロール、ナプロキセン、プロキシカム、およびグリベンクラミド)とシンク化合物PVP25の占有率のグラフ表示を示す。x軸:カルデビロールの総濃度[mM]。y軸:カルデビロールの占有率[％(シンク化合物に結合している試験化合物の量)]。
0005637608.tif 000006
（図９Ａ）PVP25の存在下での、HSAに対するクロルプロマジンの分配(■)、およびPVP25に対するクロルプロマジンの分配(▲)のグラフ表示を示す。
（図９Ｂ）PVP25の存在下での、HSAに対するジクロフェナクの分配(■)、およびPVP25に対するジクロフェナクの分配(▲)のグラフ表示を示す。
（図９Ｃ）PVP25の存在下での、HSAに対するピロキシカム(Piroxicame)の分配(■)、およびPVP25に対するピロキシカムの分配(▲)のグラフ表示を示す。
（図９Ｄ）PVP25の存在下での、HSAに対するナプロキセンの分配(■)、およびPVP25に対するナプロキセンの分配(▲)のグラフ表示を示す。
（図９Ｅ）PVP25の存在下での、HSAに対するワーファリンの分配(■)、およびPVP25に対するワーファリンの分配(▲)のグラフ表示を示す。
（図９Ｆ）PVP25の存在下での、HSAに対するグリベンクラミドの分配(■)、およびPVP25に対するグリベンクラミドの分配(▲)のグラフ表示を示す。
（図１０）文献値と比較した、本発明の方法を用いて求められた結合定数のグラフ表示を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
シンク化合物は、非特異的タンパク質に対する高親和性試験物質の親和性を有意に下げる物質である。親和性を有意に下げるとは、シンク化合物の存在下で非特異的タンパク質に結合した試験物質の量と、シンク化合物の非存在下で非特異的タンパク質に結合した試験物質の量の差が統計学的に関連することを意味する(p<0.05、好ましくは、p<0.01)。シンク化合物は膜を通過しないが、試験化合物は膜を通過するようにするために、シンク化合物のサイズは、好ましくは、試験化合物のサイズの2倍である。好ましくは、シンク化合物は複合体を形成している作用物質である。より好ましくは、シンク化合物はポリビニルピロリドン(PVP)であり、最も好ましくは、シンク化合物はポリビニルピロリドンK-25(PVP25、PVP K-25)である。前述の方法のために、シンク化合物の組み合わせ、例えば、PVPおよびシクロデキストリンを使用することができる。
【００１５】
本明細書で使用する「高親和性化合物」という用語は、生理学的条件下および過剰な血漿タンパク質(例えば、アルブミン)の存在下で、総量のうち少なくとも95％が前記血漿タンパク質と結合する(=前記化合物の総量のうち最大5％が遊離型である)化合物を指す。好ましくは、少なくとも97％が結合し、より好ましくは少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％が結合型で存在する。生理学的条件はpH7.0および37℃と定義される。本発明によれば、高親和性化合物または試験化合物は、好ましくは、薬物である。
【００１６】
本明細書で使用する「試験物質」または「試験化合物」という用語は、高親和性化合物を指す。
【００１７】
「結合定数」という用語は、平衡状態にある2つの分子間の結合親和性を表す定数を指す。「結合定数」は、遊離している試験物質と結合している試験物質との平衡状態を表す。
【００１８】
本明細書で使用する「結合した物質」または「結合した化合物」という用語は、タンパク質(特に、非特異的タンパク質)またはシンク化合物に結合している物質または化合物を指す。「占有率(fractional occupation)」という用語は、結合している試験化合物の割合を指す。言い換えると、占有率は、シンク化合物と平衡状態にある結合した試験化合物の量(c結合した試験物質)と、試験化合物の総量(c全体の試験物質)との比である。
0005637608.tif 000007
【００１９】
非特異的タンパク質は、特異的タンパク質とは対照的に広範囲の化合物に結合する(非選択的結合)。非特異的タンパク質は、特に、例えば、血清アルブミンおよびα1酸性糖タンパク質などの血漿タンパク質である。好ましくは、非特異的タンパク質はヒト血清アルブミン(HSA)である。
【００２０】
本発明の方法において用いられる膜は半透膜である。半透膜は、選択された分子種が拡散によって通り抜けることができる膜である。前述のアッセイのための半透膜を、高親和性化合物(および緩衝液)は通り抜けることができるが、シンク化合物または非特異的タンパク質は通り抜けることができない。好ましくは、半透膜は、サイズ選択性の膜である。
【００２１】
半透膜は分子量カットオフ(MWCO)によって特徴付けることができる。好ましくは、MWCOはシンク化合物または非特異的タンパク質の分子量の約半分であり、どちらよりも小さい。試験物質の分子量はシンク化合物または非特異的タンパク質の分子量との比が22〜27であることも好ましく、どちらよりも小さい。より好ましくは、比は約25である。本発明の方法に適した膜は市販されており、例えば、透析膜である。
【００２２】
好ましくは、このアッセイにおいて用いられる非特異的タンパク質の濃度は、インビボでのタンパク質の濃度に相当する。HSAの場合、生理学的濃度は約60mMである。
【００２３】
本発明の方法を最適に実施するためのシンク化合物の濃度は、異なる濃度のシンク化合物(すなわち、段階希釈液)を用いて本発明の方法を行うことによって求めることができる。
【００２４】
アッセイは、2つのチャンバーが半透膜によって分けられた2チャンバーシステムの中で行われる。膜の透過性は、試験物質が膜を透過できるが、シンク化合物も非特異的タンパク質も透過できないように選択される。
【００２５】
本発明の方法の測定(工程(a)、(b)、および工程(c))は並行して行われてもよく(図3を参照されたい)、連続して行われてもよい。好ましくは、測定は並行して行われる。以下において好ましい態様が説明される。参照実験(前記方法の工程(a))のために、関心対象の化合物が一方のチャンバーに添加され(図2Bを参照されたい)、分配平衡に達した後に、このシステムにおける化合物の分布が確かめられる。これによって、分配平衡に達した後に、チャンバーの少なくとも1つにおいて化合物の質量が求められる。
【００２６】
結合実験1(前記方法の工程(b))のために、関心対象の化合物およびシンク化合物が、参照実験を実施するのに用いられたものと異なる2チャンバーシステムの中のチャンバーに添加される(図2Bも参照されたい)。結合システムの平衡に達した後に、シンク化合物の無いチャンバー(タンパク質チャンバー)の中にある高親和性化合物の量が測定され、シンク化合物に対する関心対象の化合物の分配係数が求められる。
【００２７】
結合実験2(前記方法の工程(d))のために、関心対象の化合物およびシンク化合物が、参照実験または結合実験を実施するのに用いられたものと異なる2チャンバーシステムの中のチャンバー(シンクチャンバー)に添加され(図2Cを参照されたい)、非特異的タンパク質がシンク化合物の無いチャンバー(タンパク質チャンバー)に添加される。平衡に達した後に、シンクチャンバーの中にある遊離試験物質(シンク化合物に結合していない)の量が測定され、シンク化合物の存在下での非特異的タンパク質に対する関心対象の化合物の分配係数が求められる。
【００２８】
高親和性化合物の結合定数は以下の通りに求められる。
【００２９】
試験化合物と非特異的タンパク質との結合は、以下の平衡によって表すことができる可逆プロセスである(Lindup, W.E., Plasma protein binding of drugs-some basic and clinical aspects, in Progress in Drug Metabolism, L.F.C. J.W. Bridges, G.G. Gibson, Editor. 1987. p. 141-185)。
0005637608.tif 000008
[P]=非特異的タンパク質の濃度
[Tu]=非特異的タンパク質に結合していない試験化合物の濃度
Kp=非特異的タンパク質に対する試験化合物の結合定数
[T・P]=平衡に達した時の、非特異的タンパク質に結合した試験化合物の濃度
【００３０】
結合定数Kpは、質量の法則から得られた以下の式を用いて、非結合率fuに変換することができる。
0005637608.tif 000009
fb=非特異的タンパク質に結合した試験化合物の割合
【００３１】
非特異的タンパク質に対する結合定数(Kp)(2)は、シンク化合物に対する分配係数(DCsink)(3)と、シンク化合物の存在下での非特異的タンパク質に対する分配係数(DCp')(3)の組み合わせから計算することができる。
Kp=DCシンク*DCp'  (2)
【００３２】
結合研究I(シンク化合物を使用する。図2B)から：
0005637608.tif 000010
mT(参照) =シンク化合物および非特異的タンパク質の非存在下で平衡状態にある試験化合物の質量(一方のチャンバーにおいて測定される)
mTu(シンク) =シンク化合物の存在下で平衡状態にある、結合していない試験化合物の質量
【００３３】
結合研究II(シンク化合物および高親和性化合物を用いたシステム。図2C)から：
0005637608.tif 000011
[T-P']=シンク化合物の存在下で非特異的タンパク質に結合した試験化合物の濃度
[T-シンク]=シンク化合物に結合した試験化合物の濃度
mTb(P') =シンク化合物および非特異的タンパク質を含むシステムの中にある、平衡状態にある非特異的タンパク質に結合した試験化合物の質量
mTu(P') =シンク化合物および非特異的タンパク質を含むシステムの中にある、平衡状態にある非特異的タンパク質に結合していない試験化合物の質量
V全体は、透析チャンバーの中にある総体積(例えば、200μl)である。
Vpは、非特異的タンパク質の体積である。
Vシンクは、シンク化合物の体積である。
体積は、適用された材料の密度および質量から計算することができる。
V=質量/密度(例えば、ヒト血清アルブミンの密度:ρHSA=1.4g/cm3、PVP25の密度:ρPVP=1.2g/cm3)
【００３４】
遊離した試験物質および/または結合した試験物質の量は、分光測定によって分光光度計において直接、またはHPLCシステムにおける分離後に求めることができる。
【００３５】
全ての参照実験および結合実験のために、チャンバーシステムは、好ましくは、室温および正常圧力(例えば、一晩(約12時間))の下でインキュベートされる。平衡の実現を加速するために、チャンバーを振盪してもよい(好ましくは、約1〜3時間、より好ましくは、1〜2時間、最も好ましくは、約1時間)。
【００３６】
好ましい態様において、本発明の方法は、複数の2チャンバーシステムを備えるプレートにおいて並行して行われる。これらの並行して行われるアッセイは同一でもよく、異なってもよく、例えば、高親和性化合物の同一性または濃度が異なってもよい。
【００３７】
本発明を大まかに説明したが、特定の実施例を参照することによってさらに良く理解されるであろう。以下の図と共に、実施例は例示のためだけに本明細書に収められ、特に定めのない限り限定を目的としない。
【実施例】
【００３８】
実施例において言及される市販の試薬は、特に定めのない限り、製造業者の説明書に従って用いられる。
【００３９】
実施例1:材料および方法
1.1 透析チャンバー
以下の実験のために、再利用可能な96ウェルMicro-Equilibrium dialysis Device HTD 96チャンバーを使用した。チャンバーシステムは10本のTeflon(商標)バーからなり、2本のTeflon(商標)バーそれぞれの間に半透膜(1.2 膜を参照されたい)が配置されて、各ウェルの2つの区画を形成する。
【００４０】
組み立てられたTeflon(商標)ブロックをスチールフレームの中に挿入した。個々のウェル間の封止を確実にするために、これらのバーをスチールプレートを用いて密着させた。このスチールプレートは、8個の円盤ばねによりTeflon(商標)バーに反対圧力を加えた。
【００４１】
各実験の前に、Teflon(商標)バーをエタノールで4回リンスすることによって、きれいにした。
【００４２】
1.2 膜
・MWCO
添加物に応じて以下のMWCOを試験した。
0005637608.tif 000012
【００４３】
・膜材料
A)MWCO 6〜8kDaのHTD 96透析膜細片(再生セルロース)(HTDialysis, LLC、カタログNr1103)およびMWCO 12〜14kDaのHTD 96透析膜細片(再生セルロース)(HTDialysis, LLC、カタログNr1101)
上記の膜を脱イオン水で60分間水和した。その後に、膜を20％エタノールで20分間処理し、次いで、脱イオン水で2回リンスした。
【００４４】
B)MWCO 1kDaのSpektra/Por6(再生セルロース)(Spectrum Laboratories、カタログ番号:132640、フラット幅45mm/長さ10m)およびMWCO 3.5kDaのSpektra/Por6(再生セルロース)(Spectrum Laboratories、カタログ番号: 132592、フラット幅45mm/長さ10m)
重金属の除去:
EDTAを含む重金属洗浄液(Spektrum, カタログ:132908);1部の洗浄溶液+9部のH2O蒸留水
1h洗浄し、次いで、H2O蒸留水で5分間洗浄した。
【００４５】
スルフィド0.1％の除去:
硫黄洗浄液A(=亜硫酸ナトリウム)およびB(=0.4％硫酸)(Spektrum, カタログ:132 906)
80℃で、2部のH2O蒸留水+1部の溶液Aを含む溶液を用いて、膜を洗浄した。次いで、膜を、60℃の熱いH2Oで2分間、洗浄した。次いで、膜を、100部の水および4部の溶液Bを含む溶液で洗浄し、次いで、数分間、蒸留水で洗浄した。
【００４６】
あるいは、予め洗浄された膜を使用した。
【００４７】
C)Spektra/Por7(再生セルロース)MWCO 3.5kDa(Spectrum Laboratories、カタログ番号:132111、フラット幅45mm、長さ15m
膜を蒸留水で洗浄した。
【００４８】
1.3シンク化合物
A)シクロデキストリン(図3)
シンク化合物がシンクチャンバーから確実に分離されるようにするために、シクロデキストリンの分子量が、使用した膜のMWCOより大きいことが、シクロデキストリンを使用する条件である。
【００４９】
以下のシクロデキストリンを使用した。
・β-ヒドロキシプロプキシル-シクロデキストリン
・γ-シクロデキストリン
【００５０】
B)ポリビニルピロリドンPVP(図4)
PVP(ポリビドン(Polyvidon)、ポビドン(Povidon)、ポビドナム(Povidonum))、N-ビニルピロリドン(Vinylpyrrolidon)のホモポリマー
通常、分子量はK値で表される。分子量は重合度に依存する(約2500〜3,000,000ダルトン)。
【００５１】
分子量(Mr)約24.000のPVP25(PVP K-25)および分子量(Mr)約10.000のPVP15(PVP K-15)を用いて、実験を行った。
【００５２】
1.4試験化合物
■ワーファリン((RS)-4-ヒドロキシ-3-(3-オキソ-1-フェニルブチル)-2H-クロメン-2-オン)
■フロセミド(4-クロロ-2-(フラン-2-イルメチルアミノ)-5-スルファモイル安息香酸)
■ジクロフェナク(2-(2-(2,6-ジクロロフェニルアミノ)フェニル)酢酸)
■ベラパミル(2-(3,4-ジメトキシフェニル)-5-[2-(3,4-ジメトキシフェニル)エチル-メチル-アミノ]-2-(1-メチルエチル)ペンタンニトリル)
■クロルプロマジン(3-(2-クロロ-10H-フェノチアジン-10-イル)-N,N-ジメチル-プロパン-1-アミン)
■カルベジロール(3-(9H-カルバゾール-4-イルオキシ)-2-ヒドロキシプロピル][2-(2-メトキシフェノキシ)エチル]アミン)
■ナプロキセン((+)-(s)-2-(6-メトキシナフタレン-2-イル)プロパン酸)
■ピロキシカム((8E)-8-[ヒドロキシ-(ピリジン-2-イルアミノ)メチリデン]-9-メチル-10,10-ジオキソ-10λ6-チア-9-アザビシクロ[4.4.0]デカ-1,3,5-トリエン-7-オン)
■グリベンクラミド(5-クロロ-N-(4-[N-(シクロヘキシルカルバモイル)スルファモイル]フェネチル)-2-メトキシベンザミド)
【００５３】
1.5:実験手順
1)膜を調製し(実施例2を参照されたい)、実施例1の透析チャンバーを組み立てる。
2)タンパク質チャンバー(チャンバー2)に、最終体積約100〜150ulまで緩衝液および他の添加剤を満たす。両側の体積が正確に同じになることが重要である。
1チャンバーあたりの体積:
シンク化合物として純粋なシクロデキストリンを用いた場合、各チャンバーの中の体積は147μl(γ-シクロデキストリン2.5％(m/V))であった。
チャンバーの中にシンク化合物としてPVPおよびPVPとシクロデキストリンの組み合わせを用いた場合、体積は100μlであった(PVP15 4％(m/V)、PVP25 4％(m/V)、 PVP25 4％(m/V)+β-ヒドロキシプロピル-シクロデキストリン4％(m/V))。
緩衝液:  50mM TAPSO, pH7.4を、NaClを用いて総濃度154mMまで等張にし、添加剤に応じて異なる添加剤を添加した。
試験化合物の最終濃度:  0.02mM〜0.6mM
HSAの最終濃度:  60mM
DMSOの最終濃度:  6％(V/V)
最後に、DMSO保存液を添加する。なぜなら、時間はかかるが、膜が乾燥する危険性があるために、かなり速くチャンバーを満たさなければならないからである。
3)全てのピペッティング工程を自動化した(Tecan)
4)蒸発を防ぐために、Teflon(商標)アセンブリを接着フィルムで覆った(カタログNr.:1102; HT-Dialysis)。
5)チャンバーシステムを1時間振盪し、次いで、一晩(約12時間)インキュベートした。発生した熱によって多量に蒸発する危険性があるために、長時間の振盪を避けなければならない。
6)平衡に達した後に、シンクチャンバー(参照、シンク化合物およびHSAを用いた結合研究II)からの試料、またはタンパク質チャンバー(参照、シンク化合物のみを用いた結合研究I)からの試料をハーフエリア(half-area)UV-プレートに移し、分光測定によって分析するか(spectra max, 190 Plate Reader;250〜500nm)、HPLCによって分析した。
【００５４】
1.6 測定データの分析
結合研究を用いて、分配係数および結合定数を計算することができる。
【００５５】
薬物とHSAとの結合は、以下の式[4]
[Du]+[HSA].[D・HSA]
によって表すことができる可逆プロセスである。
式中、角括弧は濃度を表すために用いられ、[Du]、[HSA]、および[D・HSA]は、それぞれ、HSAに結合していない薬物、HSA、およびHSAに結合した薬物の濃度である。
【００５６】
結合定数KHSAは、質量の法則から得られた以下の式を用いて、非結合率fuに変換することができる。
0005637608.tif 000013
【００５７】
HSAに対する結合定数(KHSA)(2)は、PVPに対する分配係数(DCPVP)(3)およびPVPの存在下でのHSAに対する分配係数(DCHSA')(3)から計算することができる。
KHSA=DCPVP・DCHSA'                    (2)
【００５８】
結合研究Iから:
0005637608.tif 000014
【００５９】
結合研究IIから:
0005637608.tif 000015
【００６０】
式中、[D-HSA']および[D-PVP]は、それぞれ、PVPの存在下でHSAに結合した薬物およびPVPに結合した薬物である。
【００６１】
V全体は透析チャンバーの中の総体積(200μl)であり、VHSAおよびVPVPはHSAおよびPVP25の体積であり、密度および秤量した試料から計算することができる。
0005637608.tif 000016
【００６２】
ρHSA=1.4g/cm3およびρPVP=1.2g/cm3。密度を求めるために、PVPを融解しなければならなかった。空気が入るため、ばらつきがある。従って、本当の密度はBASF(製造業者)からの情報に基づいた。
【００６３】
別のシンク化合物と平衡状態にある、結合していない試験化合物/結合した試験化合物の濃度を求める場合、前述の式を同様に適用することができる。
【００６４】
実施例2:β-ヒドロキシプロピル-シクロデキストリンとγ-シクロデキストリンとの比較
0005637608.tif 000017
【００６５】
結果を表1に示した。10％β-ヒドロキシプロピルシクロデキストリン溶液を用いた場合、試験化合物の30％超が結合することができる。γ-シクロデキストリンに対する親和性は、β-ヒドロキシプロピル-シクロデキストリンに対する親和性よりかなり低い(同じ占有率に達するためには、2.5倍の濃度のγ-シクロデキストリンが必要とされる)。
【００６６】
（表１）ワーファリンについて測定された添加剤結合レベル
0005637608.tif 000018
【００６７】
実施例3:シンク化合物としてβ-ヒドロキシプロピル-シクロデキストリンを用いたアッセイ
特に言及しない限り、試験条件は前記の通りである。
0005637608.tif 000019
【００６８】
（表２）試験化合物とβ-ヒドロキシプロピル-シクロデキストリンとの平均結合
0005637608.tif 000020
【００６９】
結論:
試験化合物の分子量が小さいほど、β-ヒドロキシプロピル-シクロデキストリンに対する親和性が大きくなる。
【００７０】
実施例4:PVP15とPVP25との比較
特に言及しない限り、試験条件は前記の通りである。
薬物の濃度:  0.02〜0.6mM
PVP15およびPVP25の量:  それぞれ40g/l
【００７１】
（表３）試験化合物とPVP15およびPVP25との平均結合(n.d.=測定せず)
0005637608.tif 000021
【００７２】
試験物質のPVP25に対する親和性はPVP15に対する親和性より大きい。従って、PVP25を用いて、以下の実施例の実験を行った。
【００７３】
実施例5:シンク化合物としてPVP25およびシクロデキストリンの組み合わせを用いたアッセイ
0005637608.tif 000022
【００７４】
結果を図5および図6に示した。β-ヒドロキシプロピルシクロデキストリンおよびPVP25の使用によって、薬物およびシンク化合物の複合体の方向に平衡が動く量は、PVP25のみの使用より少ない(図6を参照されたい)。
【００７５】
（表４）ワーファリンについて測定された添加剤結合レベルの概要(実施例2および4からの結果を含む)
0005637608.tif 000023
【００７６】
実施例6:PVP25およびヒト血清アルブミン(HSA)を用いたアッセイ
試験化合物カルベジロールを使用した以外は、実施例5に記載のように同じ試験条件を使用した。結果を図8および図9に示した。
0005637608.tif 000024
【００７７】
HPLC条件:
HPLCシステム(Agilent 1100)において分析を行った。RPカラム(Chromolith flash, RP18e, 4.6x25mm)において分離を行った。水と0.05％ギ酸(A)およびアセトニトリル(B)の勾配を用いて、試料を溶出した。勾配条件:初期5％B、0.4分95％B;1分95％B;1.1分5％B。
【００７８】
試験化合物およびPVPを用いた結果を図7に示した。試験化合物、PVP25、およびHSAを用いた結果を図8および図9に示した。
【００７９】
実施例7:文献値との比較
実施例6(「新手法」)において求められた、試験化合物の結合レベルを、従来法を用いて求められた値(文献値)と比較した。結果を表2および図10に示した。
【００８０】
（表５）文献および実施例6に基づく試験化合物の結合レベル
0005637608.tif 000025
【図１】
0005637608.tif 000026
【図２】
0005637608.tif 000027
【図３】
0005637608.tif 000028
【図４】
0005637608.tif 000029
【図５】
0005637608.tif 000030
【図６】
0005637608.tif 000031
【図７】
0005637608.tif 000032
【図８】
0005637608.tif 000033
【図９Ａ】
0005637608.tif 000034
【図９Ｂ】
0005637608.tif 000035
【図９Ｃ】
0005637608.tif 000036
【図９Ｄ】
0005637608.tif 000037
【図９Ｅ】
0005637608.tif 000038
【図９Ｆ】
0005637608.tif 000039
【図１０】
0005637608.tif 000040