(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドを発現し、分泌する組換え型リステリアワクチン株の作成方法であって、
その染色体においてＤ−アラニンラセマーゼ遺伝子及びＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ遺伝子に変異を含む栄養要求性リステリア株を準備するステップと、
前記栄養要求性リステリア株を、異種抗原を含む前記ポリペプチドをエンコードする第１の核酸配列と、Ｄ−アラニンラセマーゼ酵素及び／またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である代謝酵素をエンコードする第２の核酸配列とを有し、当該組換え型リステリアワクチン株に抗生物質耐性を付与しないプラスミドに接触させるステップとを含み、
前記栄養要求性リステリア株が前記プラスミドを取り込み、前記代謝酵素が、前記栄養要求性リステリア株の染色体における前記Ｄ−アラニンラセマーゼ遺伝子及び前記Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ遺伝子の変異による前記栄養要求性リステリア株の代謝欠陥を補完し、
このことによって前記組換え型リステリアワクチン株を作成することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記代謝酵素をエンコードする第２の核酸配列は、前記栄養要求性リステリア株の染色体において欠失していることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
前記ポリペプチドは、前記異種抗原及びさらなるポリペプチドを含んでいる融合タンパク質であり、
前記さらなるポリペプチドは、ＬＬＯタンパクの非溶血性断片、ＰＥＳＴ様アミノ酸配列、又はＡｃｔＡタンパクであることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
前記第１の核酸配列は、プロモータ／制御配列に作用可能に連結されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、
前記代謝酵素は、Ｄ−アラニンラセマーゼ酵素であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
前記代謝酵素は、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、
前記第２の核酸配列は、プロモータ／制御配列に作用可能に連結されることを特徴とする方法。
【請求項８】
ポリペプチドを発現し、分泌する組換え型リステリアワクチン株であって、
前記組換え型リステリアワクチン株の材料である栄養要求性リステリア株は、その染色体においてＤ−アラニンラセマーゼ遺伝子及びＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ遺伝子に変異を含み、
タンパク抗原を含む前記ポリペプチドをエンコードする第１の核酸配列と、Ｄ−アラニンラセマーゼ酵素及び／またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である代謝酵素をエンコードする第２の核酸配列とを有し、当該組換え型リステリアワクチン株に抗生物質耐性を付与しないプラスミドを含んでおり、
前記代謝酵素が、前記栄養要求性リステリア株の染色体における前記Ｄ−アラニン遺伝子及び前記Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ遺伝子の変異による前記栄養要求性リステリア株の代謝欠陥を補完することを特徴とするワクチン株。
【請求項９】
請求項８に記載の組換え型リステリアワクチン株であって、
前記プラスミドは、転写因子の発現を促進する遺伝子をさらに含むことを特徴とするワクチン株。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換え型リステリアワクチン株であって、
前記転写因子は、前記ワクチン株の染色体において欠失していることを特徴とするワクチン株。
【請求項１１】
請求項８に記載の組換え型リステリアワクチン株であって、
前記ポリペプチドは、前記異種抗原及びさらなるポリペプチドを含んでいる融合タンパク質であり、
前記さらなるポリペプチドは、ＬＬＯタンパクの非溶血性断片、ＰＥＳＴ様アミノ酸配列、又はＡｃｔＡタンパクであることを特徴とするワクチン株。
【請求項１２】
請求項８に記載の組換え型リステリアワクチン株であって、
前記第１の核酸配列は、プロモータ／制御配列に作用可能に連結されることを特徴とするワクチン株。
【請求項１３】
請求項８に記載の組換え型リステリアワクチン株であって、
前記代謝酵素は、Ｄ−アラニンラセマーゼ酵素であることを特徴とするワクチン株。
【請求項１４】
請求項８に記載の組換え型リステリアワクチン株であって、
前記代謝酵素は、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素であることを特徴とするワクチン株。
【請求項１５】
請求項８に記載の組換え型リステリアワクチン株であって、
前記第２の核酸配列は、プロモータ／制御配列に作用可能に連結されることを特徴とするワクチン株。
【請求項１６】
異種抗原を発現する組換え型リステリア株を遺伝子工学的に作成する方法であって、
その染色体においてＤ−アラニンラセマーゼ遺伝子及びＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ遺伝子に変異を含む栄養要求性リステリア株を準備するステップと、
前記栄養要求性リステリア株を、異種抗原を含むポリペプチドをエンコードする第１の核酸配列と、Ｄ−アラニンラセマーゼ酵素及び／またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である代謝酵素をエンコードする第２の核酸配列とを有するプラスミドに接触させるステップとを含み、
前記核酸構造体が前記栄養要求性リステリア株のゲノムに組込まれ、前記代謝酵素が、前記栄養要求性リステリア株の染色体における前記Ｄ−アラニンラセマーゼ遺伝子及び前記Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ遺伝子の変異による前記栄養要求性リステリア株の代謝欠陥を補完し、
このことによって、抗抗原免疫応答の誘導を助ける前記組換え型リステリア株を作成し、
前記免疫応答は腫瘍浸潤性Ｔ細胞による抗腫瘍免疫応答を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６のいずれかに記載の方法であって、
前記代謝酵素は、Ｄ−アラニンラセマーゼ酵素であることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、
前記代謝酵素は、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素であることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法であって、
前記核酸構造体は、前記栄養要求性リステリア株内で作用する複製領域を含まないことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１６に記載の方法であって、
前記核酸構造体を組込むステップは、前記栄養要求性リステリア株のプロファージ組込部位を使用することを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１６、１９、及び２０のいずれかの方法によって作成されたリステリアワクチン株。
【請求項２２】
前記組換え型リステリアワクチン株は、抗抗原免疫応答の誘導を助け、前記免疫応答が、インビボ腫瘍浸潤性の抗原特異性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）免疫応答であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記組換え型リステリアワクチン株は、抗抗原免疫応答の誘導を助け、前記免疫応答が、インビボ腫瘍浸潤性の抗原特異性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）免疫応答であることを特徴とする請求項８に記載のワクチン株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異種抗原及び代謝酵素を発現するリステリア・ワクチン株、並びにその作成方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは、現在のところ知られている、最も有益かつコスト効率の良い公衆衛生手段である。しかしながら、腫瘍症及び感染症に関する理解が進むにつれて、従来のワクチン戦略が完全に効果的であるとは言えないことが明らかになってきた。従来のワクチンは、動物の免疫力を引き出すために、不活化又は弱毒化された有機体又は抗原のサブユニットを使用している。しかし、この手法、特に不活化ワクチン又はサブユニットワクチンには、自然での免疫応答は主として体液性であるため、細胞性免疫を必要とする細胞内生物又は腫瘍を死滅させるのには効果的ではないという問題点があった。また、弱毒化又は不活化された細菌は、多くの場合、免疫を短い間引き起こすだけであり、その免疫は体液性に限定されるという問題点もある。さらに、従来の弱毒化又は不活化された細菌ワクチンは、腫瘍細胞、及び細胞内病原体に感染した細胞の溶解に必要な、細胞傷害性Ｔリンパ球（cytotoxic T-lymphocyte：ＣＴＬ）による免疫応答を引き起こさないという問題点もある。
【０００３】
ウイルス性ワクチンは、多くの場合、ワクチン内でＣＴＬ応答を誘発するために使用される。ウイルス性ワクチンは、通常、細胞の連続継代培養によって弱毒化された病原性ウイルス、又は熱若しくは化学不活性化によって不活性化されたウイルスである。不活性化されたウイルスは、細胞に感染することができないので、サブユニットワクチンのように、体液性免疫応答のみを誘発する。一方、弱毒化されたウイルスは、細胞に感染することができ、固体内でＣＴＬ反応を誘発することができる。しかし、弱毒化されたウイルス性ウイルスにも短所はある。第１に、ウイルスの弱毒化は、多くの場合、試行錯誤のプロセスである。第２に、弱毒化されたウイルスの使用は、特に子供、高齢者及び免疫不全者への使用は、深刻な安全性の問題を含んでいる。この従来の細菌及びウイルスワクチンの問題に対する解決策は、例えばリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes：ＬＭ）などの細菌ワクチンベクターに存在する。ＬＭは、ベータ溶血性でグラム陽性の通性細胞内微生物である。
【０００４】
リステリア・モノサイトゲネス内に異種抗原を発現させるための方法としては、現在、３つの方法が使用されている。それらの方法としては、プラスミドベースの発現系や、染色体ベースの発現系などがある。染色体ベースの方法の１つは、「Frankel et al., 1995, J.Immunol. 155:4775-4782」及び「Mata et al., 2001, Vaccine 19:1435-1445」に開示されている。簡単に説明すると、関心のある抗原をエンコードする遺伝子は、適切なプロモータ及びシグナル配列と共に、リステリア染色体の領域と相同な２つのＤＮＡ領域間に挿入される。この相同的組換えは、リステリア染色体で抗原が特異的に組込まれることを可能にする。前記抗原及び前記相同性ＤＮＡを含んでいるカセットは、４０℃以上の温度では複製することができない温度感受性プラスミドに結合される。このプラスミドは、選択及びプラスミド維持のための薬剤耐性マーカーをさらに含む。このプラスミドの操作及び複製は、通常、大腸菌内で行われる。その理由は、大腸菌は、リステリアと比べると、複製が高速であり転写が容易であるからである。リステリアはグラム陽性細菌であり、大腸菌はグラム陰性細菌であるため、前記薬剤耐性遺伝子は、有機体の各種類に特異的であり得る。または、両方の種類の細菌に効果的な、同一薬剤耐性遺伝子の２つの複製が存在し得るが、異なるグラム陽性及びグラム陰性プロモータの制御下にある。構築後、前記プラスミドは、前記プラスミドを含む大腸菌との直接的な接合によって、又は前記大腸菌からの前記プラスミドの溶解及び単離によってＬＭに形質転換され、その後、コンピテントＬＭのエレクトロポレーションが行われる。
【０００５】
プラスミドのリステリア染色体の所望する領域への組込みは、「Camilli et al., 1992, Mol.Microbiol. 8:143-157」に開示されている二段階の対立遺伝子変換法によって行われる。簡単に説明すると、リステリアは、プラスミド複製を防止するために、４０℃以上で継代培養される。プラスミドのリステリア染色体への組込みは、選択薬剤（クロラムフェニコール）の存在下における４０℃での成長で選択される。形質転換細胞の選択後、細菌は３０℃で継代培養され、外来ベクター配列が切除されたリステリアをスクリーニングするために、薬剤感受性に選択される。この方法の欠点は、二重対立遺伝子変換法は時間がかかること、及び、適切なワクチン株に至るまでに多数のクローンの選択を必要とすることである。
【０００６】
異種抗原を含むリステリア株を作成するための第２の染色体ベース方法は、「Lauer et al., 2002, J.Bacteriol. 184:4177-4186」に開示されている。この方法は、対立遺伝子変換を必要としないが、その代わりに２つのファージベースの組込みベクターを必要とする。この方法は、１つ又は２つの薬剤耐性遺伝子を使用し、１つ又は複数の薬剤に対する耐性を有するリステリア有機体を作成する。この方法の欠点は、薬剤耐性遺伝子が存在することである。薬剤耐性遺伝子は、それまで抗生物質治療による対処が可能であった細菌の間で抗生物質耐性が広がる可能性があるため、安全とは考えられない。そのため、ワクチンベクターにおける抗生物質耐性遺伝子の存在は、安全の点ではマイナスであると考えられている。
【０００７】
異種抗原をリステリア内で発現させる第３の方法は、抗原をプラスミドからエピソーム的に発現させることである。この方法は、「Ikonomidis et al., 1994, J. Exp. Med. 180:2209-2218」及び「Gunn et al., 2001, J Immunol 167:6471-6479」に開示されている。この方法は、遺伝子を染色体に組込む必要が無く、複数のコピーで発現することができるので、免疫原性を亢進し得るという利点を有する。しかしがら、プラスミド形質転換細胞を選択するため、及び、増殖中のインビトロにおけるプラスミドの維持を確実にするためには、プラスミド内に２つの薬剤耐性遺伝子（大腸菌内でプラスミドを作成するための薬剤耐性遺伝子と、リステリア・モノサイトゲネスの増殖のための薬剤耐性遺伝子）を含むことが必要である。
【０００８】
したがって、リステリアをワクチンベクターとして使用することを鑑みると、抗生物質耐性を有さないが、強力な免疫応答を誘発するリステリア・ワクチンベクターを作成する方法が当該技術分野では求められている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、異種抗原（heterologous antigen）及び代謝酵素を発現するリステリア・ワクチン株（Listeria vaccine strain）、並びにその作成方法を提供する。
【００１０】
ある実施形態では、本発明は、異種抗原を発現するリステリア・ワクチン株を遺伝子工学的に作成する方法であって、栄養要求性リステリア株を、異種抗原を含むポリペプチドをエンコードする第１の核酸配列と代謝酵素をエンコードする第２の核酸配列とを有するプラスミドに接触させるステップを含み、前記栄養要求性リステリア株が前記プラスミドを取り込み、前記代謝酵素が前記栄養要求性リステリア株の代謝欠陥（metabolic deficiency）を補完（complement）することによって、異種抗原を発現する組換え型細菌ワクチン株を作成する方法を提供する。
【００１１】
他の実施形態では、本発明は、リステリア・ワクチン株であって、タンパク抗原を含むポリペプチドをエンコードする第１の核酸配列と代謝酵素をエンコードする第２の核酸配列とを有するポリペプチドを含んでおり、前記代謝酵素がリステリア・ワクチン株の染色体において欠失している内因性代謝遺伝子を補完することによって、前記プラスミドが前記組換え型細菌ワクチン株内で抗生物質選択性を持たない状態で安定維持されるリステリア・ワクチン株を提供する。
【００１２】
他の実施形態では、本発明は、異種抗原を発現するリステリア・ワクチン株を遺伝子工学的に作成する方法であって、栄養要求性リステリア株を、異種抗原を含むポリペプチドをエンコードする第１の核酸配列と代謝酵素をエンコードする第２の核酸配列とを有する核酸構造体（nucleic acid construct）に接触させるステップを含み、前記核酸構造体が前記栄養要求性細菌株のゲノムに組込まれ、前記代謝酵素が前記栄養要求性リステリア株の代謝欠陥を補完することによって、異種抗原を発現するワクチン株を作成する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、異種抗原及び代謝酵素を発現するリステリア・ワクチン株、並びにその作成方法を提供する。
【００１４】
ある実施形態では、本発明は、異種抗原を発現するリステリア・ワクチン株を遺伝子工学的に作成する方法であって、栄養要求性リステリア株を、異種抗原を含むポリペプチドをエンコードする第１の核酸配列と代謝酵素をエンコードする第２の核酸配列とを有するプラスミドに接触させるステップを含み、前記栄養要求性リステリア株が前記プラスミドを取り込み、前記代謝酵素が前記栄養要求性リステリア株の代謝欠陥を補完することによって、異種抗原を発現する組換え型細菌ワクチン株を作成する方法を提供する。
【００１５】
他の実施形態では、本発明は、リステリア・ワクチン株であって、タンパク抗原を含むポリペプチドをエンコードする第１の核酸配列と代謝酵素をエンコードする第２の核酸配列とを有するポリペプチドを含んでおり、前記代謝酵素が前記リステリア・ワクチン株の染色体において欠失している内因性代謝遺伝子を補完することによって、前記プラスミドが前記組換え型細菌ワクチン株内で抗生物質選択性を持たない状態で安定維持されるリステリア・ワクチン株を提供する。
【００１６】
「形質転換（transforming）」は、ある実施形態では、「形質移入（transfecting）」と同じ意味で使用されており、プラスミド又は他の非相同ＤＮＡ分子を取り込むように、細菌細胞を遺伝子工学的に操作することを意味する。他の実施形態では、「形質転換」は、プラスミド又は他の非相同ＤＮＡ分子の遺伝子を発現するように、細菌性細を遺伝子工学的に操作することを意味する。
【００１７】
本明細書中で示すデータによって実証されるように、細菌ワクチンベクターが含んでいるプラスミドは、細菌染色体から発現した抗原を含んでいる融合タンパク質よりも強力な免疫応答を誘発する抗原を発現する。したがって、本発明は、タンパク抗原を発現する、かつ抗生物質抵抗性遺伝子が欠失した細菌ワクチンベクターを、新規に開示する。
【００１８】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物におけるプラスミドは、転写因子をさらに含む。他の実施形態では、前記転写因子は、前記栄養要求性リステリア株において、又は本発明に係るリステリア株の細菌染色体において欠失している。ある実施形態では、前記転写因子は、ｐｒｆＡ（本明細書に例示されている）である。他の実施形態では、前記転写因子は、当該技術分野では周知の他の転写因子である。
【００１９】
ある実施形態では、代謝遺伝子、転写因子などは、細菌株の１つの染色体において欠失している。他の実施形態では、代謝遺伝子、転写因子などは、細菌株の全ての染色体において欠失している。他の実施形態では、代謝遺伝子、転写因子などは、細菌細胞のゲノムにおいて欠失している。
【００２０】
ある実施形態では、転写因子は、染色体において変異する。他の実施形態では、転写因子は、染色体から削除される。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００２１】
ある実施形態では、本発明に係る方法及び組成物におけるプラスミドは、リステリア・ワクチン株に抗生物質耐性を付与しない。他の実施形態では、前記プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子を含まない。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００２２】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、核酸配列によってエンコードされたポリペプチドは、異種抗原及びさらなるポリペプチドを含んでいる融合タンパク質である。ある実施形態では、前記さらなるポリペプチドは、ＬＬＯタンパクの非溶血性断片である（本明細書に例示されている）。他の実施形態では、前記さらなるポリペプチドは、ＰＥＳＴ酸配である。他の実施形態では、前記さらなるポリペプチドは、ＡｃｔＡタンパク又はその断片である。ＡｃｔＡタンパク及びその断片は、ＬＬＯと同様に、抗原提示及び免疫力を増大させる。
【００２３】
ある実施形態では、本発明に係る方法及び組成物における第１の核酸配列は、プロモータ／制御配列に作用可能に連結される。他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物における第２の核酸配列は、プロモータ／制御配列に作用可能に連結される。別の実施形態では、前記第１及び第２の核酸配列のそれぞれは、プロモータ／制御配列に作用可能に連結される。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００２４】
他の実施形態では、第２の核酸配列のプロモータ／制御配列が大腸菌内で作用することによって、大腸菌株内でのプラスミドの安定維持を可能にする。他の実施形態では、大腸菌株にプラスミドが形質移入されて、大腸菌株内で第２の核酸配列が発現することによって、大腸菌株内でのプラスミドの安定維持を可能にする。
【００２５】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、核酸配列によってエンコードされた代謝酵素は、アミノ酸代謝酵素である。他の実施形態では、前記代謝酵素は、アラニンラセマーゼ酵素（ｄａｌ）である。他の実施形態では、前記代謝酵素は、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素（ｄａｔ）である。ＬＭｄａｌ及びｄａｔ遺伝子は、「Thompson et al., Infec Immun 66:3552-3561, 1998」に記載されているように、ＬＭからクローニング及び単離される。
【００２６】
他の実施形態では、本発明で使用されるｄａｌ遺伝子は、遺伝子銀行のアクセス番号ＡＦ０３８４３８に登録されている配列を有する。他の実施形態では、前記ｄａｌ遺伝子は、当該技術分野では周知の他のｄａｌ遺伝子である。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００２７】
他の実施形態では、本発明で使用されるｄａｔ遺伝子は、遺伝子銀行のアクセス番号ＡＦ０３８４３９に登録されている配列を有する。他の実施形態では、前記ｄａｔ遺伝子は、当該技術分野では周知の他のｄａｔ遺伝子である。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００２８】
Ｄ−アラニン合成のための栄養要求性を有する細菌は、当該技術分野では公知であり、例えば、大腸菌（Strych et al., 2002, J. Bacteriol 184:4321-4325）、コリネバクテリア・グルタミカム（Tauch et al., 2002, J. Biotechnol 99:79-91）、リステリア・モノサイトゲネス（Franker et al., 米国特許第6,099,848号）、ラクトコッカス種及びラクトバシラス種（Bron et al., 2002, Appl Environ Microbiol, 68:5663-70）がある。
【００２９】
他の実施形態では、本発明は、リステリア・ワクチン株であって、タンパク抗原を含むポリペプチドをエンコードする第１の核酸配列と、代謝酵素をエンコードする第２の核酸配列とを有するプラスミドを含んでおり、前記代謝酵素がリステリア・ワクチン株の染色体において欠失している内因性代謝遺伝子を補完することによって、前記プラスミドが前記組換え型細菌ワクチン株内で抗生物質選択性を持たない状態で安定維持されるリステリア・ワクチン株を提供する。
【００３０】
ある実施形態では、前記内因性代謝遺伝子は、前記染色体内で変異する。他の実施形態では、前記内因性代謝遺伝子は、前記染色体から削除される。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００３１】
ある実施形態では、本発明は、異種抗原を発現するリステリア・ワクチン株を遺伝子工学的に作成する方法であって、栄養要求性リステリア株を、異種抗原を含むポリペプチドをエンコードする第１の核酸配列と代謝酵素をエンコードする第２の核酸配列とを有する核酸構造体に接触させるステップを含み、前記核酸構造体が前記栄養要求性細菌株のゲノムに組込まれ、前記代謝酵素が前記栄養要求性リステリア株の代謝欠陥を補完することによって、異種抗原を発現するワクチン株を作成する方法を提供する。
【００３２】
ある実施形態では、前記核酸構造体は、リステリアの複製領域を含まない。したがって、ゲノムに組込まれた複製を含むリステリアのみが、ＬＢ培地で成長したものから選択される。他の実施形態では、前記核酸構造体は、リステリアの複製領域を含む。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００３３】
ある実施形態では、前記核酸構造体は、組込部位を有する。ある実施形態では、前記組込部位は、ＰＳＡ ａｔｔＰＰ´組込部位である。他の実施形態では、前記組込部位は、当該技術分野では周知の他の組込部位である。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００３４】
他の実施形態では、前記核酸構造体は、インテグラーゼ遺伝子を含む。他の実施形態では、前記インテグラーゼ遺伝子は、ＰＳＡインテグラーゼ遺伝子である。他の実施形態では、前記インテグラーゼ遺伝子は、当該技術分野では周知の他のインテグラーゼ遺伝子である。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００３５】
他の実施形態では、前記インテグラーゼ遺伝子は、リステリアｐ６０プロモータの制御下で発現する。他の実施形態では、前記インテグラーゼ遺伝子は、リステリアに作用する他のプロモータの制御下で発現する。
【００３６】
ある実施形態では、前記核酸構造体は、プラスミドである。他の実施形態では、前記核酸構造体は、シャトルプラスミドである。他の実施形態では、前記核酸構造体は、当該技術分野では周知の他の核酸構造体である。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００３７】
他の実施形態では、前記核酸構造体を栄養要求性リステリア株のゲノムに組込むステップは、二段階の対立遺伝子変換を使用する。他の実施形態では、前記組込みステップは、ファージベースの組込みベクターを使用する。他の実施形態では、前記組込みステップは、当該技術分野では周知の他の組込み方法を使用する。
【００３８】
他の実施形態では、前記核酸構造体を組込むステップは、栄養要求性リステリア株のプロファージ組込部位を使用する。他の実施形態では、前記組込みステップは、当該技術分野では周知の他の組込み方法を使用する。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００３９】
他の実施形態では、本発明は、インビトロ及びインビボの両方において、代謝遺伝子が欠失した変異株の補完によって維持される、リステリア・モノサイトゲネス−大腸菌のシャトルプラスミドを提供する。他の実施形態では、前記代謝遺伝子は、Ｄ−アラニンラセマーゼ遺伝子である。他の実施形態では、前記代謝遺伝子は、当該技術分野では周知の他の代謝遺伝子である。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００４０】
他の実施形態では、本発明は、細菌ワクチン株を弱毒化する方法であって、代謝酵素をエンコードする遺伝子の変異株を前記細菌ワクチン株に導入するステップと、前記代謝酵素をエンコードする核酸配列を含むプラスミドによって前記細菌ワクチン株を形質転換するステップとを含む方法を提供する。
【００４１】
他の実施形態では、本発明は、リステリア・ワクチン株を弱毒化する方法であって、代謝酵素をエンコードする遺伝子の変異株を前記細菌ワクチン株に導入するステップと、前記代謝酵素をエンコードする核酸配列を含むプラスミドによって前記細菌ワクチン株を形質転換するステップとを含む方法を提供する。
【００４２】
ある実施形態では、本発明に係る方法及び組成物における代謝遺伝子は、誘発プロモータの存在下で発現する。他の実施形態では、前記プロモータは、構成的プロモータである。他の実施形態では、前記プロモータは、当該技術分野では周知の他のプロモータである。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００４３】
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る方法によって作成される細菌ワクチン株を提供する。
【００４４】
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る方法によって作成されるリステリア・ワクチン株を提供する。
【００４５】
さまざまな実施形態では、本発明に係る方法及び組成物における抗原としては、これらに限定されるものではないが、例えば次の感染症由来の抗原がある。はしか、おたふく風邪、風疹、急性灰白髄炎、Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｅ０２７０７），Ｃ型肝炎（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｅ０６８９０）並びに他の肝炎ウイルス、インフルエンザ、アデノウイルス（例えば、４型及び７型）、狂犬病（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｍ３４６７８）、黄熱病、日本脳炎（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｅ０７８８３）、デング熱（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｍ２４４４４）、ハンタウイルス、及びＡＩＤＳ（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｕ１８５５２）。
【００４６】
細菌性及び寄生虫抗原は、これらに限定されるものではないが、例えば次の病気の原因となる公知の病原因子に由来する。ジフテリア、百日咳（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｍ３５２７４）、破傷風（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｍ６４３５３）、結核、細菌性及び真菌性肺炎（例えば、ヘモフィルス属インフルエンザ、ニューモシスティス・カリニなど）、コレラ、腸チフス、疫病、細菌性赤痢、サルモネラ中毒（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｌ０３８３３）、レジオネラ症（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｕ５９４８７）、マラリア、鉤虫症、オンコセルカ症（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｍ２７８０７）、住血吸虫症（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｌ０８１９８）、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、ランブル鞭毛虫症（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｍ３３６４１）、アメーバ症、フィラリア症（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｊ０３２６６）、ボレリア症、及び旋毛虫病。
【００４７】
他の実施形態では、前記抗原は、次に挙げる腫瘍抗原の内の１つである。ＭＡＧＥ１（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｍ７７４８１）、ＭＡＧＥ２（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｕ０３７３５）、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４などを含む様々なＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原）のいずれか、様々なチロシナーゼのいずれか、ｒａｓ変異体、ｐ５３変異体（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｘ５４１５６及びＡＡ４９４３１１）、及びｐ９７メラノーマ抗原（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｍ１２１５４）。
【００４８】
他の腫瘍特異性抗原としては、例えば次のものがある。進行癌に関連するＲａｓペプチド及びｐ５３ペプチド、子宮頸癌に関連するＨＰＶ １６／１８及びＥ６／Ｅ７抗原、乳癌に関連するＭＵＣＩ−ＫＬＨ抗原（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｊ０３６５１）、結腸直腸癌に関連する癌胎児性抗原（carcinoembryonic antigen：ＣＥＡ）（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｘ９８３１１）、黒色腫に関連するｇｐ１００（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｓ７３００３）又はＭＡＲＴ１抗原、及び前立腺癌に関連するＰＳＡ抗原（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｘ１４８１０）。ｐ５３遺伝子配列は公知であり（例えば、Harris et al., 1986, Mol. Cell. Biol., 6:4650-4656）、遺伝子銀行にアクセス番号Ｍ１４６９４として登録されている。
【００４９】
本発明に包含される腫瘍抗原は、これらに限定されるものではないが、次のものをさらに含む。Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｍ１６７８９．１，Ｍ１６７９０．１，Ｍ１６７９１．１，Ｍ１６７９２．１）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｕ８７４５９）、ｈＴＥＲＴ（別名テロメラーゼ）（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号ＮＭ００３２１９（１型），ＮＭ１９８２５５（２型），ＮＭ１９８２５３（３型），及びＮＭ１９８２５４（４型））、プロテイナーゼ３（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号Ｍ２９１４２，Ｍ７５１５４，Ｍ９６８３９，Ｘ５５６６８，ＮＭ００２７７，Ｍ９６６２８、及びＸ５６６０６）、ＨＰＶ Ｅ６及びＥ７（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号ＮＣ００１５２６）及びＷＴ−１（例えば、遺伝子銀行のアクセス番号ＮＭ０００３７８（Ａ型），ＮＭ０２４４２４（Ｂ型），ＮＭ０２４４２５（Ｃ型），及びＮＭ０２４４２６（Ｄ型））。
【００５０】
したがって、本発明は、これらに限定されるものではないが、癌（子宮癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肺癌など）及び黒色腫の免疫療法に使用することができる。
【００５１】
上記の各抗原は、本発明の異なる実施形態を表す。
【００５２】
ある実施形態では、本発明に係るベクターは、細菌性生物における抗生物質耐性が増加するというリスクを冒すことなく、リステリア・ワクチンベクターの利点を提供する。
【００５３】
他の実施形態では、本発明に係るワクチン株の利点は、当該ワクチン株に含まれる組換え型プラスミドが、腸内で他の細菌へ移動した際に、維持されそうにないことである。他の実施形態では、前記利点は、プラスミドが正常細胞に対して進化的利点を付与しないことである。他の実施形態では、前記利点は、プラスミドが、仕切り配列などの活性保存システムを含まないことである。したがって、欠失ホスト細胞の外側では、プラスミドは、おそらくは、母集団から薄められ、最終的には自然に取り除かれるであろう。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００５４】
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る抗生物質耐性欠失細菌株（antibiotic resistance free bacterial strain）、薬学的に許容される担体、アプリケータ（applicator）、及びそれらを使用するための使用説明書を含んでいるキットを提供する。
【００５５】
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る抗生物質耐性欠失リステリア株、アプリケータ（applicator）、及びそれらを使用するための使用説明書を含んでいるキットを提供する。
【００５６】
「アラニンラセマーゼ」は、ある実施形態では、アミノ酸アラニンのＬ−異性体をＤ−異性体に変換する酵素を意味する。他の実施形態では、そのような酵素は、ＥＣ番号５．１．１．１．として知られている。
【００５７】
「アミノ酸代謝酵素」は、ある実施形態では、これらに限定されるものではないが、例えば、アミノ酸原子の空間的配置の変更、アミノ酸の加水分解、アミノ酸への基の付加、アミノ酸の分裂などの、アミノ酸をある形態から他の形態へ変換する機能的役割を有するペプチド又はタンパク質を意味する。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００５８】
「栄養要求性細菌」は、ある実施形態では、そのような成長又は複製を可能にする因子の補充がなければ、成長又は複製することができない細菌性株を意味する。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００５９】
「融合タンパク質」は、ある実施形態では、互いに連結された２つ又はそれ以上のタンパク質を含むタンパク質を意味する。ある実施形態では、前記２つ以上のタンパク質は、ペプチド結合によって連結される。他の実施形態では、前記２つ以上のタンパク質は、他の化学結合によって連結される。他の実施形態では、前記２つ以上のタンパク質は、前記２つ以上のタンパク質の間にある、スペーサと呼ばれる１つ又は複数のアミノ酸によって連結される。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００６０】
「相同性（homologous）」は、ある実施形態では、２つの高分子間（例えば、２つの核酸分子、２つのＤＮＡ分子若しくは２つのＲＮＡ分子の間、又は、２つのポリペプチド分子の間）で類似するサブユニット配列を意味する。前記２つの分子の各サブユニット位置が、同一の単量体サブユニットによって塞がれる場合（例えば、前記２つの分子の各サブユニット位置が、アデニンによって占められる場合）は、それらは、その位置において相同である。他の実施形態では、２つの配列間での相同は、一致数又は相似位置と直接に相関する。例えば、２つの化合物配列における前記位置の半分が相似である場合（例えば、長さ方向に１０個のサブユニットを有するポリマーにおける５つの位置）、前記２つの配列は５０％相同である。また、前記位置の９０％（例えば、１０の内の９）が一致する又は相同である場合は、前記２つの配列は９０％の相同性を共有する。一例としては、ＤＮＡ配列３´ＡＴＴＧＣＣ５´及び３´ＴＡＴＧＧＣは、５０％の相同性を有する。他の実施形態では、「相同性（homologous）」は、「同一性（identity）」と同義に使用される。他の実施形態では、「相同性」又は「同一性」という用語が、核酸及びタンパク質について使用される場合は、核酸及びアミノ酸配列レベルでの「相同性」又は「同一性」の両方に適用されると解釈されるべきである。
【００６１】
他の実施形態では、「遺伝子」及び「組換え遺伝子」は、本発明に係るポリペプチドをエンコードするオープン・リーディング・フレームを含んでいる核酸分子を意味する。そのような自然的な対立遺伝子変異は、所定の遺伝子のヌクレオチド配列において、一般的に１〜５％の変異を生じさせることができる。代替対立遺伝子（alternative allele）は、様々な異なる人間又は生物の関心のある遺伝子を配列決定することにより、同定することができる。前記同定は、様々な人間又は生物における同一の遺伝子座を同定する交配プローブを使用することによって、容易に行うことができる。そのようなヌクレオチド変異のいずれか又は全て、及び、結果として生じるアミノ酸の多型又は変異体（これらは自然的な対立遺伝子変異の結果として生じ、機能活性は変化しない）は、本発明の範囲内である。
【００６２】
２つのポリヌクレオチドが「作用可能に連結される」という記載は、ある実施形態では、一本鎖又は二本鎖核酸部分に、２つのポリヌクレオチドが、当該２つのポリヌクレオチドの少なくとも１つのポリヌクレオチドが他方に対して特異的な生理学的効果を発揮できるように配列されることを意味する。一例としては、遺伝子のコード領域に作用可能に連結されるプロモータは、前記コード領域の転写を促進することができる。
【００６３】
「プロモータ／制御配列」は、ある実施形態では、プロモータ／制御配列に作用可能に連結される遺伝子産物を発現に必要な又は前記発現を促進する核酸配列を意味する。他の実施形態では、前記配列は、コアプロモーター配列である。他の実施形態では、前記配列は、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサ配列及び他の調整要素である。
【００６４】
［リステリア・ワクチン株］
【００６５】
使用される特定のリステリア株は、当業者には明らかであろう。本発明で使用可能なリステリア株の例としては、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes：ＬＭ）（ＡＴＣＣ番号１５３１３）がある。他の実施形態では、例えば、ＬＭデルタａｃｔＡ変異体（Brundage et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:11890-11894）、又はＬＭデルタ−ｐｌｃＡ（Camilli et al., 1991, J. Exp. Med., 173:751-754）などの弱毒化されたリステリア株が本発明で使用される。他の実施形態では、当業者には明らかなように、１つ又は複数の弱毒化された変異株を導入することによって、新規な弱毒化されたリステリア株が作成される。このような株の例としては、芳香族アミノ酸に対して栄養要求性を有するリステリア株（Alexander et al., 1993, Infection and Immunity 61:2245-2248）や、リポタイコ酸を作成するための変異体（Abachin et al, 2002, Mol. Microbiol. 43:1-14）などがある（ただし、これらに限定されるものではない）。
【００６６】
本発明に係る方法及び組成物において、異なる転写プロモータ、ターミネータ、担体ベクター、又は特定の遺伝子配列（例えば、市販されているクローニングベクター）を使用できることは当業者には明らかであろう。本発明で意図しているように、これらの機能性は、例えば、ｐＵＣシリーズとして知られている市販のベクターによって提供される。他の実施形態では、不必要なＤＮＡ配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）が取り除かれている。
【００６７】
他の実施形態では、市販のプラスミドが本発明に使用される。そのような市販プラスミドは、例えば、Invitrogen（La Jolla, CA）、Stratagene（La Jolla, CA）、Clontech（Palo Alto, CA）などの、様々な提供源から入手することができる。あるいは、そのようなプラスミドは、当該技術分野では公知の方法を用いて作成することができる。他の実施形態では、ｐＣＲ２．１（Invitrogen, La Jolla, CA）などのプラスミドが本発明に使用される。ｐＣＲ２．１は、原核生物内における発現を促進するための、原核生物由来複製起点及びプロモータ／制御要素を有する真核細胞発現ベクターである。他の実施形態では、プラスミドのサイズを減少させ、外来性ヌクレオチド配列の中に挿入されるカセットのサイズを増大させるために、前記外来性ヌクレオチド配列が除去される。
【００６８】
そのような方法は、当該技術分野では公知であり、例えば、「Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York」及び「Ausubei et al., 1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, New York」に開示されている。
【００６９】
抗生物質耐性遺伝子は、分子生物学及びワクチン製剤において一般的に使用される従来の選択及びクローニングのプロセスで使用される。本発明で意図している抗生物質耐性遺伝子としては、これらに限定されるものではないが、例えば次のものがある。アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（chloramphenicol：ＣＡＴ）、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ゲンタマイシン、及び当該技術分野では公知の他の抗生物質に対して耐性を付与する遺伝子産物。各遺伝子は、本発明の異なる実施形態である。
【００７０】
細菌を形質転換する方法は、当該技術分野では公知であり、例えば、塩化カルシウム・コンピテント細胞に基づく方法、エレクトロポレーション法、バクテリオファージ媒介形質導入、化学的及び物理的形質転換技術などがある（de Boer et al., 1989, Cell 56:641-649; Miller et al., 199S, FASEB J., 9:190-199; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Ausubel et al., 1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, Gerhardt et al., ds., 1994, Methods for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, DC; Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）。他の実施形態では、本発明に係るリステリア・ワクチン株は、エレクトロポレーション法を用いて形質転換される。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００７１】
本発明で有用なプラスミド及び他の発現ベクター（本明細書の他の部分で説明している）は、プロモータ／制御配列、グラム陰性及び陽性細菌の複製基点、融合タンパク質をエンコードする単離核酸、及びアミノ酸代謝遺伝子をエンコードする単離核酸としての機能を含み得る。さらに、融合タンパク質及びアミノ酸代謝遺伝子をエンコードする単離核酸は、当該単離核酸の発現を促進するのに好適なプロモータを有し得る。細菌系で発現を促進するのに有用なプロモータは、当該技術分野では公知であり、例えば次のものがある。バクテリオファージ・ラムダ、ｐＢＲ３２２のベータ・ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモータ、及びｐＢＲ３２５のクロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモータ。原核生物プロモータのさらなる例としては、例えば次のものがある。バクテリオファージ・ラムダの主要な左プロモータ及び右プロモータ（ＰＬ及びＰＲ）、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｄ及びｇａｌプロモータ、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）のアルファ・アミラーゼ（Ulmanen et al., 1985. J. Bacteriol. 162:176-182）及びＳ２８−特異的プロモータ（Gilman et al., 1984 Gene 32:11-20）、バチルスのバクテリオファージのプロモータ（Gryczan, 1982, In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., New York）、及びストレプトミセス・プロモータ（Ward et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 203:468-478）がある。本発明で意図されている原核生物プロモータのさらなるものは、例えば、「Glick, 1987, J. Ind. Microbiol. 1:277-282」、「Cenatiernpo, 1986, Biochimie, 68:505-516」、及び「Gottesman, 1984, Ann. Rev. Genet. 18:415-442」に開示されている。本発明で意図されているプロモータ／制御要素としては、これらに限定されるものではないが、例えば、リステリアｐｒｆＡプロモータ、リステリアｈｌｙプロモータ、リステリアｐ６０プロモータ、及びリステリアＡｃｔＡプロモータ（遺伝子銀行のアクセス番号ＮＣ００３２１０）又はそれらの断片などがある。
【００７２】
本発明に係るプラスミドで発現する遺伝子としては、ある実施形態では、栄養要求性変異株を補完するタンパク質をエンコードする単離核酸がある。他の実施形態では、栄養要求性細菌が細菌増殖に必要なビタミン合成遺伝子（例えば、パントテン酸）をエンコードする遺伝子を欠失している場合は、前記プラスミドＤＮＡはパントテン酸を合成するためのタンパク質をエンコードする遺伝子を含む。したがって、プラスミドで前記遺伝子を発現しない栄養要求性細菌はパントテン酸を欠いた状態で増殖することができないが、プラスミドで前記遺伝子を発現する栄養要求性細菌はパントテン酸を欠いた状態でも増殖することができる。
【００７３】
他の実施形態では、前記プラスミドは、アミノ酸代謝酵素をエンコードする遺伝子を含む。アミノ酸代謝酵素は、アミノ酸を細菌増殖及び複製プロセス（例えば、細胞壁合成、タンパク質合成、脂肪酸代謝など）に使用できるようにするために、アミノ酸を代謝する。他の実施形態では、栄養要求性細菌は、細胞壁構成要素であるＤ−グルタミン酸のためのアミノ酸代謝酵素を欠失している。Ｄ−グルタミン酸合成は、Ｄ−ｇｌｕ＋ｐｙｒからアルファ・ケトグルタル酸＋Ｄ−ａｌａへの変換、及びその逆反応に関与するｄａｔ遺伝子によって制御される。Ｄ−グルタミン酸合成は、ｄｇａ遺伝子によっても制御される。また、Ｄ−グルタミン酸合成のための栄養要求性変異株は、Ｄ−グルタミン酸が存在しない状態では増殖しない（Pucci et al, 1995, J Bacteriol. 177:336-342）。さらなる例は、ジアミノピメリン酸合成に関与する遺伝子を含む。そのような合成遺伝子は、ベータ・セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼをエンコードしており、不活性された場合はそれの合成経路のための変異株栄養要求性を与える（Sizemore et al., 1995, Science 270:299-302）。
【００７４】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物におけるプラスミドは、融合タンパク質をエンコードする遺伝子を含む。抗原を含む融合タンパク質は、例えば、適切な配列のクローニング及び制限処理、又は後述する直接的な化学合成などの、任意の適切な方法を用いて作成することができる。或いは、部分配列をクローニングし、適切な部分配列を適切な制限酵素を使用して切断し、その断片を連結することによって、所望するＤＮＡ配列を作成することもできる。他の実施形態では、抗原をエンコードするＤＮＡは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction：ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を用いて作成される。まず、天然ＤＮＡ断片の両側の新しい末端を、別々に増幅させる。一方の増幅された配列の５´末端はペプチドリンカーをエンコードし、他方の増幅された配列の３´末端はペプチドリンカーをエンコードする。第１の断片の５´末端は、第２の断片の３´末端を補完するので、これらの２つの断片（ＬＭＰアガロース等での部分精製後）は、第３のＰＣＲ反応において重複テンプレートとして使用される。増幅された配列は、コドン、開始部位（アミノ配列を作成しようとする）のカルボキシ側における断片、リンカー、及び開始部位（カルボキシル基配列を作成しようとする）のアミノ側における配列を含み得る。前記抗原は、プラスミドに連結される。各方法は、本発明の異なる実施形態である。
【００７５】
他の実施形態では、本発明は、臨床に適用される、ファージベースの染色体組込み系をさらに含む。必須酵素に対して栄養要求性を有するホスト株は、これらに限定されるものではないが、例えば、Ｄ−アラニンラセマーゼ（例えば、Ｌｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−））が使用される。「ファージ硬化段階」を防止するために、ＰＳＡに基づくファージ組込み系を使用することができる（Lauer, et al., 2002 J Bacteriol, 184:4177-4186）。これは、他の実施形態では、組込み遺伝子を維持するために、抗生物質による持続的な選択を必要とする。したがって、他の実施形態では、本発明は、抗生物質による選択を必要としない、ファージベースの染色体組込み系の作成を可能にする。代わりに、栄養要求性ホスト株は、補完され得る。
【００７６】
本発明に係る組換えタンパクは、他の実施形態では、組換えＤＮＡ技術を用いて合成される。この技術は、ある実施形態では、融合タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列を作成するステップと、そのＤＮＡを特定のプロモータ／制御要素の制御下で発現カセット（例えば本発明に係るプラスミドなど）に挿入するステップと、前記タンパク質を発現させるステップとを含む。本発明に係る融合タンパク質（例えば、非溶血性ＬＬＯ／抗原）をエンコードするＤＮＡは、例えば、「Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90-99」のホスホトリエステル法、「Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151」のホスホジエステル法、「Beaucage et al., 1981, Tetra. Lett. 22:1859-1862」のジエチルホスホラミダイト法、及び米国特許第４，４５８，０６６号の固相支持法（solid support method）などの、適切な配列のクローニング及び制限処理、又は直接的な化学合成などの、任意の適切な方法を用いて作成することができる。
【００７７】
他の実施形態では、化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを作成するのに使用される。この一本鎖オリゴヌクレオチドは、様々な実施形態では、相補配列とのハイブリッド形成によって、又は前記一本鎖オリゴヌクレオチドをテンプレートとして使用したＤＮＡポリメラーゼとの重合によって、二本鎖ＤＮＡに変換される。ＤＮＡの化学合成は約１００の塩基の配列に限定されるため、長い配列は短い配列の連結によって得られることは当業者には明らかであろう。他の実施形態では、部分配列をクローニングし、適切な部分配列を適切な制限酵素を使用して切断し、その断片を連結することによって、所望するＤＮＡ配列を作成することができる。
【００７８】
他の実施形態では、本発明に係る融合タンパク質又は組換えタンパクをエンコードするＤＮＡは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction：ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を用いてクローニングされる。したがって、非溶血性ＬＬＯの遺伝子は、適切な制限酵素認識部位と他の制限部位（例えば、クローニングを促進するための同一でない制限酵素認識部位）とを含んでいるセンスプライマを使用してＰＣＲ増幅される。抗原をエンコードする単離核酸についても、同じことが繰り返される。非溶血性ＬＬＯと抗原配列との連結、及びプラスミド又はベクターへの挿入により、抗原の末端に結合した非溶血性ＬＬＯをエンコードするベクターが作成される。２つの分子は、直接的に、又は制限酵素認識部位によって導入される短いスペーサを介して結合される。
【００７９】
他の実施形態では、前記２つの分子は、１つ又は複数のアミノ酸から成るペプチド・スペーサによって隔てられる。一般的に、前記スペーサは、タンパク質と結合することや、前記分子間において所定の最小距離或いは空間的関係を維持すること以外は、特定の生物活性は持たない。しかし、前記スペーサの構成アミノ酸は、分子の所定の性質（例えば、折り畳み、正味荷電、又は疎水性）に影響を与えるように選択される場合もある。他の実施形態では、融合タンパク質又は組換えタンパクをエンコードする前記核酸配列は、様々なにホスト細胞に形質転換される。前記ホスト細胞としては、例えば、大腸菌や、他の細菌性ホスト（例えば、リステリア、酵母、及び様々な高等真核細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ及びＨｅＬａ細胞株、並びに骨髄腫細胞株））がある。組換え型融合タンパク質遺伝子は、各ホストに対する適切な発現制御配列に、作用可能に連結される。プロモータ／制御配列については、本明細書の他の部分で説明している。他の実施形態では、前記プラスミドは、さらなるプロモータ／制御要素、並びリボソーム結合部位及び転写終結シグナルをさらに含む。真核細胞については、前記制御配列は、例えば、免疫グロブリン遺伝、ＳＶ４０、サイトメガロウイルスなどに由来するプロモータ及びエンハンサー、並びにポリアデニル化配列を含み得る。また、スプライスドナー、及びアクセプタ配列も含み得る。
【００８０】
他の実施形態では、本発明に係る融合タンパク質は、とりわけ、ＬＭ非溶血性ＬＬＯタンパクを含む。前記ＬＭ非溶血性ＬＬＯタンパクは、ある実施形態では、全長ＬＬＯタンパク（５２９アミノ酸）の最初から約４００〜４４１のアミノ酸を含み、前記配列は例えば「Mengaud et al., 1988, Infect. Immun. 56:766-772（遺伝子銀行のアクセス番号Ｐ１３１２８）」に開示されている。抗原と非溶血性ＬＬＯタンパクとを含む融合タンパク質の作成については、本明細書中の他の部分及び例えば「Gunn et al., 2001, J. Immunology 167:6471-6479」に記載されている。
【００８１】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物における融合タンパク質は、ＬＬＯタンパク又は他の生物（例えば、原核生物）に由来するＰＥＳＴ配列を含む。
【００８２】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物における融合タンパク質は、リステリア有機体に由来するＡｃｔＡ配列を含む。ＰＥＳＴ配列又はＡｃｔＡ配列を含んでいる融合タンパク質の作成及び使用については、基本的には、米国特許第６，７６７，５４２号、国際公開番号ＷＯ ０１／７２３２９、及び米国出願番号第１０／８３５，６６２号（Paterson et al.）に記載されているようにして実施することができる。
【００８３】
これらの及び他の疾病の抗原は当該技術分野では公知であり、当業者であれば、本発明で使用する非溶血性ＬＬＯタンパク及び抗原を含んでいる融合タンパク質を容易に作成することができるであろう。他の実施形態では、前記プラスミドを含んでいる栄養要求性細菌を選択するために、形質転換された栄養要求性細菌が、アミノ酸代謝遺伝子の発現を選択することができる培地上で培養される。例えば、ある実施形態では、Ｄ−グルタミン酸合成のための栄養要求性を有する細菌は、Ｄ−グルタミン酸合成をするための遺伝子を含んでいるプラスミドによって形質転換される。しかし、前記プラスミドによって形質転換されていない栄養要求性細菌、又はＤ−グルタミン酸合成のためのタンパク質をエンコードするプラスミドが発現しない栄養要求性細菌は成長しない。他の実施形態では、Ｄ−グルタミン酸合成のための栄養要求性を有する細菌は、前記プラスミドがＤ−アラニン合成のためのアミノ酸代謝酵素をエンコードする単離核酸を含む場合は、本発明に係るプラスミドによって形質転換され発現した際、Ｄ−グルタミン酸が存在しない状態で成長する。必要とされる成長因子、栄養、アミノ酸、ビタミン、抗生物質などを含んでいる又は欠失している適切な培地を作成するための方法は当該技術分野では公知であり、そのような培地はBecton-Dickinson（Franklin Lakes, NJ）から市販されている。各方法は、本発明の異なる実施形態である。
【００８４】
他の実施形態では、本発明に係るプラスミドを含んでいる栄養要求性細菌が適切な培地で選択されると、前記細菌は選択圧下で増殖する。このような増殖は、栄養要求性因子を有していない培地での前記細胞の増殖を含む。栄養要求性細菌株でアミノ酸代謝酵素を発現するプラスミドの存在により、前記プラスミドを細菌と共に複製することができる。したがって、プラスミドを有する細菌を持続的に選択することができる。前記プラスミドを含んでいる栄養要求性細菌が培養される培地の量を調節することにより、リステリア・ワクチンベクターの作成を容易にスケールアップできることは当業者には明らかであろう。
【実施例】
【００８５】
実施例１：エピソーム性抗体をエンコードする構造体を担持する細菌ベクターによる免疫応答の誘発
【００８６】
［材料及び実験方法］
【００８７】
（形質転換及び選択）
【００８８】
大腸菌ＭＢ２１５９は、標準的な手順に従って、形質転換に使用される。細菌細胞は、、エレクトロポレーションのために、Ｈ２Ｏで洗浄することによって作成される。
【００８９】
（細菌培養及びリステリアのインビボ継代培養）
【００９０】
大腸菌は、下記の標準的な方法を用いて培養される。リステリアは、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが添加されたＬＢ培地（Difco, Detroit, MI）で３７℃、２５０ｒｐｍで攪拌されながら培養され、指数増殖期間中に収集される。Ｌｍ−ＬＬＯＥ７の場合は、培地に、３７μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが添加される。成長速度を分析するために、細菌は、抗生物質を含んだ１０ｍｌのＬＢ培地で、１６時間培養された。ＯＤ６００ｎｍが測定し、株間の培養密度が正規化される。前記培養物は、適切な抗生物質及びＤ−アラニン（該当する場合）を含んだＬＢ培地で、１：５０に希釈される。
【００９１】
（マウスにおけるＬＭの継代培養）
【００９２】
１ｘ１０８ＣＦＵを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに腹腔内注射する。３日目に、脾臓を摘出し、ＰＢＳ内で均質化する。規定どおりに抗生物質を有するＬＢプレート上に、脾臓の懸濁液のアリコートを蒔く。いくつかのコロニーを増殖及び混合させて、注射ストックを作る。
【００９３】
（プラスミドｐＧＧ５５の生成）
【００９４】
ｐＧＧ５５をサブクローニングするための開始点は、プラスミドｐＤＰ１６５９である。ｐＤＰ１６５９は、上流制御配列及びプロモータと共に、ＬＬＯの最初の４２０のアミノ酸をエンコードするゲノムＤＮＡ断片であるＬＭゲノムＤＮＡをＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）で増幅させ、その断片をｐＵＣ１９に連結することで作成される。ＮＰ抗原をエンコードするＤＮＡ断片は、Dr. Peter Paleseから提供されるプラスミドｐＡＰＲ５０１をテンプレートとしての使用してＰＣＲ増幅され、インフレーム翻訳融合として、ｐＵＣ１９のＬＬＯ断片下流に連結される。前記融合タンパク質は、その後、グラム陰性及びグラム陽性細菌の両方に複製することができるシャトルベクターであるｐＡＭ４０１にサブクローニングされる（Wirth R. An FY, Clewell DB. Highly efficient protoplast transformation system for Streptococcus faecalis and a new Escherichia coli-S. faecalis shuttle vector. J Bacteriol 165(3):831-6, 1986）。ｈｌｙプロモータ及び遺伝子断片は、５´−ＧＧＧＧＧＣＴＡＧＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣ−３´（SEQ ID NO:3）及び５´−ＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＡＣＴＴＣＡＴＣ−３´（SEQ ID NO:4）プライマを使用して作成される。
【００９５】
次に、ｐｒｆＡ遺伝子をｐＤＰ１６５９のＳａｌＩ部位にクローニングすることによって、ｐＤＰ２０２８プラスミドを作成する。ｐｒｆＡ遺伝子は、次のプライマを使用して増幅される。
【００９６】
５´−ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＴＧＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴ−３´（SEQ ID NO:5）、及び
【００９７】
５´−ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧ−３´（SEQ ID NO:6）。
【００９８】
次に、ｐＤＰ２０２８及びｐＧＧ４９からｐＧＧ３４を作成する。ｐＧＧ４９は、ｈｌｙプロモータ、ＨＩＶｇｐ７０と融合したＬＬＯ断片のＮ末端をエンコードする遺伝子、及びリステリアｐｒｆＡ遺伝子から成る挿入断片を含んでいる。ｐＧＧ４９は、ｐＧＧ３４を生成すべくｐＤＰ２０２８で切断されるＸｂａＩ及びＳａｌＩに結合された前記挿入断片を除去するために、ＮｈｅＩ及びＳａｌＩで切断される。
【００９９】
その後、次のようにして、ｐＧＧ３４からｐＧＧ５５を作成する。ヒト乳頭腫ウイルスＥ７遺伝子は、５´−ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣ−３´（SEQ ID NO:1）及び５´−ＧＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３´（SEQ ID NO:2）プライマを使用してＰＣＲ増幅され、ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩ（New England Biolabs, Beverly, MA）で切断され、同様に切断されたｐＧＧ３４に連結される。その結果、Ｅ７遺伝子は、ＸｈｏＩの上流に位置するｈｌｙ遺伝子と融合する。結果として生じるプラスミドｐＧＧ５５は、ｈｌｙ、Ｅ７抗原及びｐｒｆＡの多遺伝子カセットを含む。ｈｌｙプロモータは、Ｅ７遺伝子のＸｈｏＩ部位と結合したｈｌｙ遺伝子産物であるＬＬＯにおける最初の４４１のアミノ酸の発現を促進する。ＬＬＯの溶血性Ｃ末端を除去することにより、融合タンパク質の溶血作用は中和される。多能性転写因子であるｐｒｆＡもまた、ｐＧＧ−５５に含まれている。ｐｒｆＡの発現は、自身の天然プロモータによって引き起こされる。
【０１００】
（ＧＧ−Ｌ７４の作成）
【０１０１】
ＧＧ−Ｌ７４は、「Gunn et al., 2001, J.Immunology 167: 6471-6479」で開示されているように、温度感受性シャトルプラスミドを使用した、ｏｒｆＺ領域での二重対立遺伝子交換（double allelic exchange）によって、リステリア株１０４０３Ｓから作成される。ＧＧ−Ｌ７４は、ｌｙ−Ｅ７融合遺伝子を含んでいる発現カセットを、リステリア・モノサイトゲネスゲノムのｏｒｆＺ領域に導入することによって作成される。ｈｌｙプロモータは、Ｅ７遺伝子のＸｈｏＩ部位と結合したｈｌｙ遺伝子産物であるＬＬＯにおける最初の４４１のアミノ酸の発現を促進する。その結果、ＬＬＯ−Ｅ７のように転写及び分泌される、ｈｌｙ−Ｅ７融合タンパク質が生成される。ｈｌｙ−Ｅ７遺伝子は、ｈｌｙ遺伝子への組込みを防止するために、ｐＫＳＶ７シャトルベクターに逆方向に連結される。結果として生じるプラスミドＧＧ−Ｌ７４は、モノサイトゲネスゲノムのｏｒｆＸ，Ｙ，Ｚ領域に対応する１．６Ｋｂ配列の真ん中に挿入される上述した発現カセットを含む発現系である。Ｌ．モノサイトゲネスゲノム１０４０３Ｓは、ｐＧＧ−７４によって形質転換される。相同領域は、「Gunn et al., 2001, J.Immunology 167: 6471-6479」に開示されているように、相同的組換えによって、ＬＬＯ−Ｅ７遺伝子カセットのｏｒｆＺ領域への挿入を可能にする。クローンは、ＬＬＯ−Ｅ７遺伝子カセットのｏｒｆＺ領域への組込みについて検査される。
【０１０２】
（実験的設計）
【０１０３】
マウス（ｎ＝８）の皮下に、２ｘ１０５ＴＣ−ｌ（ATCC, Manassas, VA）が埋め込まれ、腫瘍が明白となった後、約７日間培養される。ＴＣ１は、ＨＰＶ Ｅ６及びＥ７により不死化され、活性化ｒａｓによって形質転換されたＣ５７ＢＬ／６上皮細胞株であり、皮下埋め込みにより腫瘍を形成する。マウスは、適切なリステリア株によって、腫瘍細胞の埋め込み後の７日目及び１４日目に免疫される。免疫されない対照ブループ（天然）も含まれる。腫瘍の成長は、電子キャリパによって測定される。
【０１０４】
［結果］
【０１０５】
各々、エピソーム性構成体（ＧＧ−Ｌ５５）又はリステリア染色体（ＧＧ−Ｌ７４）由来のヒト乳頭腫ウイルスのＥ７抗原への非溶血性ＬＬＯ断片の融合を発現する２つのリステリア・ワクチンベクターは、動物における、腫瘍に対する免疫力を生じさせる能力、腫瘍形成を防止する能力、及び腫瘍成長を抑制する能力について評価される。マウスにおけるＧＧ−Ｌ５５及びＧＧ−Ｌ７４のＬＤ５０は、それぞれ、１０９及び１０６ＣＦＵであった。ＴＣ−１細胞は、マウスの皮下に埋め込まれ、腫瘍が明らかになるまで（約５ｍｍの大きさになるまで）成長されられる。マウスは、その後、ＬＤ５０が０．１のＧＧ−Ｌ５５，ＧＧ−Ｌ７４、又は、ＬＤ５０が０．００１のＧＧ−Ｌ５５よって免疫される（免疫負荷の効果を調べるために）。
【０１０６】
ＴＣ−１腫瘍細胞を注入した２８日後に、ＧＧ−Ｌ５５が投与された８匹の動物の内の５匹には腫瘍が見られず、実験が終わるまでそのままであった。何も投与されなかった動物、及びＧＧ−Ｌ７４によって免疫された動物の全てでは、腫瘍が大きく成長した。少量のＧＧ−Ｌ５５が投与された動物でも腫瘍は成長したが、腫瘍はＧＧ−Ｌ７４で免疫されたグループよりも著しく小さかった（図１）。
【０１０７】
したがって、プラスミドから発現した抗原構成体は、リステリア染色体から発現した抗原構成体よりも、強力で保護力のある免疫応答を付与する。
【０１０８】
実施例２：抗生物質耐性遺伝子の代わりにアミノ酸代謝酵素を含んでいるプラスミドは、インビトロ及びインビボの両方で、大腸菌及びＬＭにおいて維持される。
【０１０９】
［材料及び実験方法］
【０１１０】
＜抗生物質耐性因子欠失プラスミドｐＴＶ３の作成＞
【０１１１】
（ｐ６０−ｄａｌカセットの作成）
【０１１２】
抗生物質耐性因子欠失ベクター（antibiotic resistance gene-free vector）を作成する第１のステップは、切断されたｐ６０プロモータをｄａｌ遺伝子に融合させることである。ＬＭアラニンラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子（順方向プライマ：５´−ＣＣＡ ＴＧＧ ＴＧＡ ＣＡＧ ＧＣＴ ＧＧＣ ＡＴＣ−３´； SEQ ID NO:8）（逆方向プライマ：５´−ＧＣＴ ＡＧＣ ＣＴＡ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＴＡ ＴＴＴ ＴＣＴ ＡＧＧ−３´； SEQ ID NO:9）、及び最小量のｐ６０プロモータ配列（順方向プライマ：５´−ＴＴＡ ＡＴＴ ＡＡＣ ＡＡＡ ＴＡＧ ＴＴＧ ＧＴＡ ＴＡＧ ＴＣＣ−３´； SEQ ID NO:22）（逆方向プライマ：５´−ＧＡＣ ＧＡＴ ＧＣＣ ＡＧＣ ＣＴＧ ＴＣＡ ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＡＡ ＡＣＴ ＣＣＴ ＣＴＣ−３´； SEQ ID NO:23）は、ＬＭ株１０４０３のゲノムからＰＣＲ増幅法によって単離される。前記プライマは、その後のＳＯＥ（splice overlap extension）-ＰＣＲ法によるｐ６０及びｄａｌの融合のために、ｐ６０配列の上流のＰａｃＩ部位、ｄａｌ配列の下流のＮｈｅＩ部位（太字の制限酵素認識部位）、及びｐ６０プロモータの下流の重複ｄａｌ配列（第１の１８ｂｐ）に導入される。切断されたｐ６０プロモータの配列は、ＣＡＡＡＴＡＧＴＴＧＧＴＡＴＡＧＴＣＣＴＣＴＴＴＡＧＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＡＴＴＡＴＣＴＣＡＴＣＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＴＧＧＧＴＡＡＡＣＴＴＡＧＴＡＴＴＡＴＣＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＴＡＣＴＴＡＡＴＴＡＣＧＴＡＣＴＧＧＧＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＣＣ（SEQ ID NO:7,Kohler et al., J Bacteriol 173:4668-74,1991）である。ＳＯＥ−ＰＣＲ法を用いて、ｐ６０及びｄａｌ ＰＣＲ産物は融合され、クローニングベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen, La Jolla, CA）内にクローニングされる。
【０１１３】
（ｐＧＧ５５からの抗生物質耐性遺伝子の除去）
【０１１４】
ｐＧＧ５５からのクロラムフェニコール・アセチル転移酵素（chloramphenicol acetyltransferase：ＣＡＴ）遺伝子の除去、及びｐ６０−ｄａｌカセットを導入するための次のクローニング計画により、グラム陽性複製領域は断続的に除去される（oriRep; Brantl et al., Nucleic Acid Res 18:4783-479O, 1990）。グラム陽性ｏｒｉＲｅｐを再導入するために、ｏｒｉＲｅｐは、配列（ＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＣＧ，SEQ ID NO:11）の下流のＮａｒＩ／ＥｈｅＩ部位に付加された５´プライマを使用して、ｐＧＧ５５からＰＣＲ増幅される。ＰＣＲ生成物は、クローニングベクターｐＣＲ２．１内にクローニングされ、その配列は確認された。
【０１１５】
ｐ６０−ｄａｌ配列を、ｐＧＧ５５ベクター内に組み込むために、ｐ６０−ｄａｌ発現カセットは、ＰａｃＩ／ＮｈｅＩの二重切断によって、ｐＣＲ−ｐ６０ｄａｌから切除される。ＥｈｅＩ及びＮｈｅＩのためのさらなる制限酵素認識部位を導入するために、ｐＧＧ５５におけるグラム陽性細菌の複製領域は、ＰＣＲ（プライマ１，５´−ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＧＴ ＣＡＣ ＣＧＧ ＣＧＣ ＣＡＣＴＡＡ ＣＴＣ ＡＡＣ ＧＣＴ ＡＧＴ ＡＧ−３´； SEQ ID NO:21），（プライマ２，５´−ＴＴＡ ＡＴＴ ＡＡＧ ＣＴＡ ＧＣＣ ＡＧＣ ＡＡＡ ＧＡＡ ＡＡＡ ＣＡＡ ＡＣＡ ＣＧ−３´，SEQ ID No:21）によって、ｐＣＲ−ｏｒｉＲｅｐから増幅される。そのＰＣＲ産物は、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogen, Carlsbad, Calif.）に結合され、その配列は確認された。その複製領域は、ＥｈｅＩ／ＮｈｅＩ切断によって連結され、ベクターｐＧＧ５５はＥｈｅＩ及びＮｈｅＩで二重切断され、前記プラスミドから両方のＣＡＴ遺伝子が同時に除去される。２つの挿入断片、ｐ６０−ｄａｌ及びｏｒｉＲｅｐ、並びにｐＧＧ５５断片は、互いに連結され、ｐＴＶ３を生成する。
【０１１６】
（リアルタイムＰＣＲのためのＤＮＡの作成）
【０１１７】
全てのリステリアＤＮＡは、Masterpure Total DNAキット（Epicentre, Madison, WI）を使用して作成される。簡単に説明すると、リステリアは、２５ｍｌのルリアー・ベルターニ（Luria-Bertani：ＬＢ）培地内で、３７℃、２５０ｒｐｍで２４時間、攪拌されながら培養される。細菌細胞は、ＤＮＡを単離した後、遠心分離によって沈殿させされ、５ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含んだＰＢＳに再懸濁され、３７℃で２０分間培養される。
【０１１８】
リアルタイムＰＣＲのための基準となる標的ＤＮＡを得るために、ＬＬＯ−Ｅ７は、ｐＧＧ５５（５´−ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴＴＡＣ−３´；SEQ ID NO:12）、５´−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧ−３´；SEQ ID NO:13）からＰＣＲ増幅され、ベクターｐＥＴｂｌｕｅｌ（Novagen, San Diego, CA）にクローニングされる。同様に、ｐｌｃＡアンプリコン（amplicon）は、ｐＣＲ２．１にクローニングされる。大腸菌は、ｐＥＴ−ＬＬＯＥ７及びｐＣＲ−ｐｌｃＡのそれぞれによって形質転換され、リアルタイムＰＣＲに使用するための、精製されたプラスミドＤＮＡが作成される。
【０１１９】
（リアルタイムＰＣＲ）
【０１２０】
Taqman primer-probeセット（Biosystems, Foster City, CA）は、リステリアゲノム標的としての次のプライマ５´−ＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧ−３´（SEQ ID NO:14）；５´ＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ−３´（SEQ ID NO:15）；５´−ＦＡＭ−ＴＧＣＧＴＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＧＴＡＧＡＣＡＴＴＣＧＴＡＣＴＡＭＲＡ−３´（SEQ ID NO:16）及び単一コピー遺伝子ｐｌｃＡ（ＴＧＡＣＡＴＣＧＴＴＴＧＴＧＴＴＴＧＡＧＣＴＡＧ−３´（SEQ ID NO:17）、５´−ＧＣＡＧＣＧＣＴＣＴＣＴＡＴＡＣＣＡＧＧＴＡＣ−３´（SEQ ID NO:18）、５´−ＴＥＴ−ＴＴＡＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＴＡＴＧＴＣＴＣＣＧＴＴＡＴＡＧＣＴＣＡＴＣＧＴＡ−ＴＡＭＲＡ−３´（SEQ ID NO:19）を使用して、プラスミド標的としてのＥ７と共に、ABI PrimerExpressソフトウエア（Biosystems）を使用してデザインされる。
【０１２１】
０．４μＭプライマ及び０．０５ｍＭプローブは、製造業者の提言を受けて、ＰｕＲＥ Ｔａｑ ＲＴＧ ＰＣＲビーズ（Amersham, Piscataway, NJ）と混合される。精製されたプラスミドＤＮＡ、ｐＥＴ−ＬＬＯＥ７及びｐＣＲ−ｐｌｃＡを有する各標的について、標準的な曲線が作成され（内部標準）、未知のサンプルの遺伝子コピー数を計算するのに使用された。Ｅ７コピー／ｐｌｃＡコピーの平均割合は、標準曲線に基づいて計算され、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３及びＬｍ−ＬＬＯＥ７についての結果を、、ゲノムに組込まれたＥ７遺伝子の単一コピーを有するリステリア株であるＬｍ−Ｅ７の結果で割ることによって測定される。全てのサンプルは３通り作成され、ｑＰＣＲ分析を３回繰り返した。サンプル間の変動は、ＫｙＰｌｏｔソフトウエアを使用して、２要因の分散分析（two-way ANOVA）によって分析される。ｐ＜０．０５であれば、結果は、統計的に有意であると見なされる。
【０１２２】
（増殖測定）
【０１２３】
細菌は、＋／−１００マイクログラム（μｇ）／ｍｌ Ｄ−アラニン及び／又は３７μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ培地内で、３７℃、２５０ｒｐｍで攪拌されながら培養される。最初の接種材料は、全ての株に対して同一となるように、ＯＤ６００ｎｍ計測に基づいて調節される。
【０１２４】
［結果］
【０１２５】
Ｄ−アラニンラセマーゼに基づく、栄養要求株補完系は、抗生物質耐性遺伝子を使用することなくＬＭにおけるプラスミド維持を仲介するのに使用される。大腸菌株ＭＢ２１５９は、Ｄ−アラニンラセマーゼを合成することができないａｌｒ（−）／ｄａｄＸ（−）欠損変異体である。同様に、リステリア株Ｌｍ ｄａｌ（−）／ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）も、ｄａｌ及びｄａｔ遺伝子が部分欠失しているため、Ｄ−アラニンラセマーゼを合成することができない。大腸菌−リステリアシャトルベクターｐＡＭ４０１に基づいているプラスミドｐＧＧ５５は、リステリアｐ６０プロモータの制御下で、両方のＣＡＴ遺伝子を除去し、それらをｐ６０−ｄａｌ発現カセットに置き換えることにより調整される（図１参照）。ＤＮＡは、いくつかのコロニーから精製される（図２参照）。
【０１２６】
インビトロにおけるプラスミド安定性を調べるために、ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７及びＬｍｄｄ（ｐＴＶ３）を、選択圧の存在下及び非存在下で、７０代培養した。ＣＦＵは、各培養物の選択性及び非選択性プレートについて毎日測定択される。この系では、プラスミドの欠失は、選択性プレート（Ｌｍｄｄ（ｐＴＶ３）にのみＢＨＩ、ＬＭ−ＬＩＯ−Ｅ７に対してはＢＨＩを含むクロラムフェニコール）と対比して、非選択性プレート（Ｌｍｄｄ（ｐＴＶ３）に対してはＢＨＩを含むＤ−アラニン、ＬＭ−ＬＩＯ−Ｅ７にのみＢＨＩ）で成長する多くのコロニーで生じる。選択性プレートと非選択性プレートとの間では、ＣＦＵの差は検出されなかった（図３Ａ参照）。このことは、実験が終了するまでの少なくとも７０代の培養の間は、プラスミドは安定維持されることを示す。
【０１２７】
さらに、インビボでのプラスミドの安定性を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでテストした。前記テストは、注射後の異なる時点で生菌を単離することによって行った。再び、選択性及び非選択性プレートにおけるＣＦＵを計算し、単離された細菌のプラスミド維持の測定に使用した（図３Ｂ）。選択性及び非選択性プレートに、ＣＦＵの差異は認められなかった。このことは、全ての単離された細菌において、組換えプラスミドの安定性が存在することを示す。Ｌｍｄｄ（ｐＴＶ３）生菌は少なくとも５日目までに単離されるので、インビボにおけるプラスミドの欠損後に注入された細菌の早期の除去は、Ｌｍｄｄ（ｐＴＶ３）細菌に見られる低毒性の原因の可能性からは除外される（実施例３）。
【０１２８】
要約すれば、ｐＴＶ３は、リステリアと同様に、インビトロ及びインビボの両方において、大腸菌内で安定的に維持される。さらなるＤ−アラニンが追加されなかったＬＢ培地における細菌増殖は、ｄａｌ発現カセットがグラム陰性大腸菌においても活動的であることを示す。大腸菌ｐＴＶ３及びＬｍｄｄ−ｐＴＶ３の両方がクロラムフェニコールに対しての感受性を保つことは、プラスミドから両ＣＡＴ遺伝子を成功的に除去できたことを示す。代表的なプレートを図４〜７に示す。
【０１２９】
Ｅ７配列のリアルタイムＰＣＲを用いて、リステリア及び大腸菌の両方における、クロラムフェニコールの存在下のＬｍ−ＬＬＯＥ７とクロラムフェニコールの非存在下のＬｍｄｄ−ＴＶ３との間での、細胞ごとのｐＴＶ３のコピー数を比較した。Ｌｍ−ＬＬＯＥ７は、ｐＧＧ５５からＬＬＯ／Ｅ７融合タンパク質を発現する。Ｌｍｄｄ−ＴＶ３及びＬｍ−ＬＬＯＥ７のプラスミドコピー数に有意差はなかった。このことは、リステリア及び大腸菌の両方において、プラスミドｐＴＶ３が安定維持されることを示す。
【０１３０】
細菌性作用の補完を確認するために、インビトロにおけるＬｍｄｄ、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３及びＬｍｄｄ−ＴＶ３の成長速度を比較した。非補完Ｌｍｄｄは、アラニンフリー培地で成長することができる（図８）。実際は、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３は、外因性Ｄ−アラニンによって補完されたＬｍ−ＬＬＯＥ７及びＬｍｄｄよりも早く対数増殖期に至る。Ｌｍ−ＬＬＯＥ７のこの成長減衰は、特に、ＣＡＴ発現の代謝負担に起因する。しかしながら、クロラムフェニコールが存在しなくても、インビトロにおいて、Ｌｍ−ＬＬＯＥ７はＬｍｄｄ−ＴＶ３よりもゆっくりと増殖する。
【０１３１】
実施例３：代謝酵素を含んでいるプラスミドは、細菌の毒性を増加させない
【０１３２】
［材料及び実験方法］
【０１３３】
（溶血性溶解試験）
【０１３４】
４ｘ１０９ＣＦＵのリステリアは融解され、遠心分離（１分間、１４０００ｒｐｍ）によって沈殿され、ＰＢＳ（１００μｌ、ｐＨ５．５、１Ｍのシステインを含む）内で再懸濁される。細菌は、１：２に連続希釈され、分泌されたＬＬＯを活性化させるために、３７℃で４５分間培養される。ヒツジの脱繊維素全血液（Cedarlane, Hornby, Ontario, Canada）は、５ボリュームのＰＢＳによって５回洗浄され、６ボリュームのＰＢＳシステインによって３〜４回洗浄される。洗浄は、再懸濁が透明になるまで行われる。そして、洗浄ステップ間に、細胞を沈殿させ（３０００×ｇで８分間）、ＰＢＳシステイン内で１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度に再懸濁する。１０％の１００μｌの洗浄された血液細胞は、１００μｌのリステリア再懸濁液と混合され、さらに、３７℃で４５分間培養される。未溶解の血液細胞は、その後、遠心分離（１０分間、１０００×ｇ）によって沈殿させられる。１００μｌの懸濁液は新しいプレートに移され、ＯＤ５３０ｎｍが測定され、サンプル希釈に対してプロットされる。
【０１３５】
［結果］
【０１３６】
毒性はＬＬＯ機能と結びついているため、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３とＬｍ−ＬＬＯＥ７との間の溶血性融解活性が比較される。この分析は、ＬＬＯ機能を、赤血球の溶解によってテストする。この試験は、培養上清、精製されたＬＬＯ又は細菌細胞について実施することができる。Ｌｍｄｄ−ＴＶ３は、Ｌｍ−ＬＬＯＥ７よりも高い溶血性融解を示す。
【０１３７】
インビトロでの毒性も、毒性測定手段でＬＤ５０値を計測することにより調べられる（より直接的なので、より正確である）。Ｌｍｄｄ−ＴＶ３のＬＤ５０（０．７５ｘ１０９）は、Ｌｍ−ＬＬＯＥ７のＬＤ５０（１ｘ１０９）にとても近い。このことは、代謝酵素を含んでいるプラスミドは、細菌の毒性を増加させないことを示す。
【０１３８】
実施例４：代謝酵素を含んでいるプラスミドを担持するワクチン株は、抗原発現を媒介する。
【０１３９】
代謝酵素を含んでいるプラスミドからの抗原発現は、インビトロでウエスタンブロット法によってテストされる。細菌培養上清からの等量の総タンパク量を分析した結果、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３培養物に含まれる抗原の総量はＬｍ−ＬＬＯＥ７の約２倍であった。この差は、Ｌｍ−ＬＬＯＥ７のプラスミドのサイズ（１２．８ｋＢ）が、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３のプラスミドのサイズ（７．６ｋＢ）よりも大きいことにより、Ｌｍ−ＬＬＯＥ７における全代謝負荷が高いためだと思われる。
【０１４０】
したがって、抗生物質耐性遺伝子の代わりに代謝酵素を使用して、栄養要求性細菌におけるプラスミド維持を媒介することができる。さらに、このようなプラスミドは、細菌における異種タンパク質の発現に役立つ。
【０１４１】
実施例５：代謝酵素を含んでいるプラスミドによる抗腫瘍免疫の誘発
【０１４２】
代謝酵素を含んでいるプラスミドの癌ワクチンとしての効果を、実施例１で説明したような腫瘍緩解モデルにおいて調べる。ＨＰＶワクチンの開発用に特性化され、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３又はＬｍ−ＬＬＯＥ７による免疫後に同サイズの生成腫瘍の退行と対照比較することが可能なＴＣ−ｌ細胞株モデルが使用される。２つの別々の実験では、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３及びＬｍ−ＬＬＯＥ７によるマウスの免疫は、同様の腫瘍退行をもたらし（図９）、ワクチン接種されたグループとの間で有意差は無かった（ｐ＜０．０５）。免疫のないマウスは、当該マウスにおける腫瘍の直径が２０ｍｍに達したら屠殺せざるを得なかったのに対して、全ての免疫されたマウスは、６３日後もまだ生存している。治癒されたマウスは、実験が終了するまで、腫瘍が無いままである。
【０１４３】
したがって、代謝酵素を含んでいるプラスミドは、癌治療ワクチンとして有効である。癌治療ワクチンには、癌予防ワクチンよりも強力な免疫応答が必要とされるので、本実施例の結果は、癌予防ワクチンに対して有用であることを実証する。
【０１４４】
実施例６：代謝酵素を含んでいるプラスミドは、抗体特異性の腫瘍浸潤Ｔ細胞を誘発する。
【０１４５】
［材料及び実験方法］
【０１４６】
（Ｔ細胞分析）
【０１４７】
脾臓由来のＴ細胞及び腫瘍浸潤Ｔ細胞は、標準的な手順に従って、ＣＤ８及びＣＤ４表面マーカー並びにＥ７特異性について分析される（Gunn et al., 2001, J.Immunol, 167:6471-6479）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、腫瘍がＬｍｄｄ−ＴＶ３又はＬｍ−ＬＬＯＥ７と共に埋め込まれた７日後及び１４日後に、腹膜内に免疫接種される。脾細胞及び腫瘍は、２回目の注射の５日後に採取され、１：２００に希釈された、Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ，SEQ ID NO:26）又は対照ペプチド（ＨＩＶ−Ｇａｇ）がロードされたＨ−２Ｄｂ四量体によって室温で染色される。四量体は、国立アレルギー感染病研究所（米国）の四量体コア施設（Tetramer Core Facility）、及び国立衛生研究所（米国）のエイズ研究部門（AIDS Research and Reference Reagent Program）から提供される。
【０１４８】
ＣＤ８用の三色フローサイトメトリ（５３−６．７、ＰＥ共役）、及びＥ７ Ｈ−２Ｄｂ四量体は、ＦＡＣＳCalibur（Ｒ）フローサイトメトリ及びCellQuest（Ｒ）ソフトウエア（Becton Dickinson, Mountain View, CA）を使用して実施される。細胞内ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）染色は、細胞の第２のサブセットに対して実施される。細胞表面抗原及びＩＦＮ産物を染色する前に、リンパ球は、ゴルジ体に細胞内ＩＦＮ−γを蓄積すべく、モネンシン（BD Biosciences）の存在下で培養することによってインビトロで刺激される。インターロイキン２（５０Ｕ／ｍｌ）及びブレフェルジンＡ（１μｌ／ｍｌ）とが追加されたＲＰ−１０内で５時間培養した後、前記細胞はフィコエリトリン共役抗ＣＤ８（PharMingen）及び抗原提示細胞共役ＭＥＬ−１４（抗ＣＤ６２リガンド）によって、４℃で２０分間、エフェクターマーカーについて表面着色される。細胞は、ＣＤ８＋ ＩＦＮ−＋個体群について試験される前に、活性細胞選択するには低いＣＤ６２リガンドにゲートされる（選択される）。
【０１４９】
［結果］
【０１５０】
ワクチンの抗腫瘍効果は、多くの場合は、前記ワクチンにおける抗原特異性の腫瘍浸潤性リンパ球を誘発する能力と関係している。Ｌｍｄｄ−ＴＶ３効果をさらに特性化するためには、腫瘍浸潤性の細胞傷害性Ｔ細胞（cytotoxic T-cells：ＣＴＬ）のＥ７抗原特異性が分析される。したがって、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３及びＬｍ−ＬＬＯＥ７の両方は、腫瘍の成長を制御する、腫瘍浸潤性の抗原特異性ＣＴＬを誘発する。
（表１）
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【０１５１】
３匹のマウスから成る各グループに、マトリゲル懸濁液内の１ｘ１０５のＴＣ−１腫瘍細胞を注射した（on day）。細胞は、抗ＣＤ８抗体及びＥ７四量体によって染色され、ＦＡＣＳ分析される。ＣＤ８＋／Ｅ７四量体＋／ＣＤ６２−細胞をゲーティング（選択）した後、全生細胞に対するＣＤ８＋／Ｅ７四量体＋／ＣＤ６２−細胞の割合を計算した。
【０１５２】
実施例７：ファージ組込み系に基づく、組換え遺伝子の染色体組込み
【０１５３】
次の（１）〜（４）を含むプラスミドが作成される。（１）大腸菌の複製遺伝子、（２）ＰＳＡ ａｔｔＰＰ´組込部位、（３）その天然プロモータの制御下のリステリアｄａｌ遺伝子、及び（４）リステリアｐ６０プロモータの制御下のＰＳＡインテグラーゼ遺伝子。他のプロモータ又はポリシストロニック発現カセットを使用して、導入遺伝子（特に、ｄａｌ遺伝子及びＰＳＡインテグラーゼ遺伝子）の発現を誘発できることは、当業者には明らかであろう。ｐＰＬ２由来のＰＳＡインテグラーゼ遺伝子及びＰＳＡ ａｔｔＰＰ´組込部位は（Lauer et al., 2002, Bacteriol, 2002. 184:4177-4186）、それらの核酸をシャトルプラスミドｐＴＶ３にクローニングするのに適合する５´末端及び３´末端に制限酵素認識部位を含めるためにＰＣＲによって修飾される。このステップの間に、ｐＴＶ３由来のリステリア複製領域が除去され、プラスミドｐＴＶ６が生じる。このプラスミドは、大腸菌内で増幅するための複製機能（ｄａｌ栄養要求性大腸菌及びリステリアを補完するためのｄａｌ遺伝子）と、プラスミドをリステリアゲノムに組込むための組込機能（ＰＳＡインテグラーゼ、ａｔｔＰＰ´部位）を有する。プラスミドは、ｄａｌ栄養要求性大腸菌ＭＢ２１５９内で増幅され（Strych et al.）、単離され、その後、リステリアに,エレクトロポレーションされる。
【０１５４】
或いは、野生型のＬＭ株１０４０３Ｓの代わりに、ホスト株として、ｄａｌ栄養要求性Ｌｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（前記実施例）が使用される。プラスミドはリステリア複製領域を含まないので、ゲノムに組込まれた複製を含むリステリアのみが、ＬＢ培地で成長したものから選択される。
【０１５５】
要約すると、本発明は、抗生物質の選択と、栄養要求性突然変異株の補完を使用する選択との置き換えを可能にする。本発明に、他の栄養要求性株及び補完系を適用できることは当業者には明らかであろう。
【０１５６】
実施例８：ｐＴＶ３に基づいた一般的なシャトルベクターの作成
【０１５７】
ｐＴＶ３は、ＫａｓＩ又はＥｈｅＩ及びＡａｔＩＩで切断され、ｐｒｆＡ遺伝子、ＬＬＯ−Ｅ７融合タンパク質、及びＬＥＯプロモータの大部分が除去される。ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＸｂａＩ、ＮｏｔＩ、ＳｐｅＩ、ＳｍａＩ、及びＳａｃＩからなる多重クローニング部位は、次の一対のオリゴヌクレオチドをベクターバックボーンに結合させることによって導入される。
【０１５８】
５´−ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＣＴ ＣＡＧ ＡＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＡＣＴＡＣＴ ＣＣＣ ＧＧＧ ＧＡＧ ＣＴＣＧ（SEQ ID No:24）。
【０１５９】
５´−ＴＣＧ ＡＣＧ ＡＧＣ ＴＣＣ ＣＣＧ ＧＧＡＣＴＡ ＧＴＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＴＣ ＴＧＡ ＧＣＴ ＣＧＡ ＧＧＧ ＡＴＣ ＣＧＡ ＣＧＴ（SEQ ID No:25）。末端の突出部分は、ＡａｔＩＩ及びＳａｌＩで制限処理されたベクター部位と適合する。
【０１６０】
関心のある抗原カセットは、その後、多重クローニング部位と結合される。前記プラスミドは、その後、その中にエンコードされている抗原を発現するワクチン株を作成するのに使用される。
【０１６１】
実施例９：発現プラスミドに基づいた一般的なシャトルベクターの作成
【０１６２】
ｐ６０−ｄａｌ発現カセット（実施例２）は、発現カセットに導入される。例えば、市販されておるプラスミド（例えば、ｐＣＲ２．１）を使用することができる。その後、そのプラスミドから抗生物質耐性遺伝子が除去される。前記プラスミドは、その後、その中にエンコードされている抗原を発現するワクチン株を作成するのに使用される。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】大腸菌株−リステリアシャトルプラスミドｐＧＧ５５（左側）とｐＴＶ３（右側）の概略マップである。ＣＡＴ（−）：大腸菌クロラムフェニコール・トランスフェラーゼ酵素、ＣＡＴ（＋）：リステリアクロラムフェニコール・トランスフェラーゼ酵素、Ｏｒｉ Ｌｍ：リステリアの複製基点、Ｏｒｉ Ｅｃ：大腸菌のｐｌ５複製基点、ｐｒｆＡ：リステリア病原因子の制御因子、ＬＬＯ：Ｃ末端切断リステリオリシンＯ及びそのプロモータ、Ｅ７：ＨＰＶ Ｅ７、ｐ６０−ｄａｌ：ｐ６０プロモータの発現カセット及びリステリアｄａｌ遺伝子。選択された制限部位も示されている。
【図２】大腸菌株ＭＢ２１５９からのｐＴＶ３のプラスミド作成。核酸のQiagen（Ｒ）midi作成は、製造者プロトコルに従って行われる。（左から右へ）レーン１及び７：分子量マーカー、１００Ｂｐラダー（Invitrogen）。レーン２：ｐＴＶ３、クローン＃１５。レーン３：ｐＴＶ３、クローン＃１６。レーン４：ｐＴＶ３、クローン＃２２。レーン５：ｐＴＶ３、クローン＃２４。レーン６：ｐＧＧ５５対照。
【図３】インビトロ（Ａ）及びインビボ（Ｂ）におけるプラスミド維持。インビトロでの安定性を測定するために、（ＧＧ５５−Ｃｈｌ）を含む若しくは含まないクロラムフェニコール（ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７）、又はＤ−アラニン［Ｌｍｄｄ（ｐＴＶ３）］を含む若しくは含まない株を培養した。培養物は、毎日、新鮮な培地に１：１０００に希釈された。ＢＨＩ（ＢＨＩ）で、及びＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７のためのクロラムフェニコール（ＢＨＩ−Ｃｈｌ）を有するＢＨＩで、又はＬｍｄｄ（ｐＴＶ３）のためのＤ−アラニン（ＢＨＩ−Ａｌａ）を有するＢＨＩで、培養物のＣＦＵを毎日測定した。全ての液体培地及びプレートは、リステリア・モノサイトゲネス株１０４０３Ｓが天然に耐性のあるストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含んでいる。インビボにおけるプラスミド維持を測定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に、ＬＭ（ＬＤ５０の１／１０）が注入される。脾臓は、注射後の異なる時点で採取され、リン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline ：ＰＢＳ）内で均一化される。ＣＦＵの計算は、Ｌｍｄｄ（ｐＴＶ３）のためのＤ−アラニンの存在下又は非存在下のＢＨＩプレート上で、ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７のためのクロラムフェニコールの存在下又は非存在下のＢＨＩプレート上で、及び野生型のみのＢＨＩプレート上で行われる。
【図４】ＬＢ寒天プレート上での、ｐＴＶ３ベクターによって形質転換された大腸菌株ＭＢ２１５９（アラニンラセマーゼ陰性）の成長を示す。細菌は、異なる培地に蒔かれる。左上：寒天のみ。ＭＢ２１５９−ＴＶ３は成長する。右上：アラニンを含む寒天。ＭＢ２１５９−ＴＶ３は成長する。左下：クロラムフェニコールを含む寒天。ＣＡＴ遺伝子が欠失しているので、ＭＢ２１５９−ＴＶ３は成長しない。右下：クロラムフェニコール及びアラニンを含む寒天。ＣＡＴ遺伝子が欠失しているので、ＭＢ２１５９−ＴＶ３は成長しない。
【図５】ＬＢ−寒天プレート上での、ｐＴＶ３ベクターを含まない大腸菌株ＭＢ２１５９（アラニンラセマーゼ陰性）の成長を示す。寒天プレートは、図５に示すように配置される。左上：ＭＢ２１５９は成長しない。右上：アラニンを含む寒天。ＭＢ２１５９は成長する。左下：クロラムフェニコールを含む寒天。ＭＢ２１５９は成長しない。右下：ＭＢ２１５９は成長しない。
【図６】ＬＢ−寒天プレート上での、ｐＴＶ３ベクターによって形質転換されたＬＭ株Ｌｍｄｄ（−）の成長を示す。細菌は、異なる培地に蒔かれる。上側：ストレプトマイシンを含み、Ｄ−アラニンを含まない寒天。Ｌｍｄｄ−ｐＴＶ３は成長する（ホスト株１０４０３はストレプトマイシン耐性である）。左下（クロラムフェニコールを含む寒天）及び右下（クロラムフェニコール及びＤ−アラニンを含む寒天）：ｐＴＶ３内にＣＡＴ遺伝子が存在しないので、Ｌｍｄｄ−ｐＴＶ３は成長しない。
【図７】ＬＢ−寒天プレート上での、ｐＴＶ３ベクターを含まないＬＭ株Ｌｍｄｄ（−）の成長を示す。左上：ストレプトマイシンを含む寒天。Ｄ−アラニンが存在しないので、Ｌｍｄｄ（−）は成長することができない。右上：アラニンを含む寒天。Ｌｍｄｄ（−）は成長する。左下（クロラムフェニコール及びＤ−アラニンを含む寒天）及び右下（クロラムフェニコールを含む寒天）：Ｌｍｄｄ（−）は、クロラムフェニコールに対して感受性がある、かつ成長しない。
【図８】時間に対してプロットされた光学密度（６００ｎｍ）より判断される、細菌増殖を示している。＋Ａｌａ：Ｄ−アラニンを含む培地。＋Ｃｈｌ：クロラムフェニコールを含む培地。
【図９】ＬＭワクチン株（Ａ）の投与の結果による、腫瘍の緩解を示している。円は、天然マウスを示す。逆三角形は、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３が投与されたマウスを示す。十字は、Ｌｍ−ＬＬＯＥ７が投与されたマウスを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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