(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
連結核酸分子の調製方法であって、
ａ）ポリＡ以外の一本鎖ＲＮＡを供給し、
ｂ）二本鎖領域と一本鎖３′末端領域とを有するＤＮＡからなる１以上の核酸を供給し、
ｃ）ＲＮＡに核酸配列の一本鎖３′端末領域をハイブリダイズさせ、ＲＮＡの３′末端に対して核酸の二本鎖領域の５′末端を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ及び大腸菌ＤＮＡリガーゼからなる群から選択されるＤＮＡリガーゼによってライゲーションする
ことを含んでなる方法。
【請求項２】
前記核酸が
１）後段でＲＮＡ合成のプロモータ配列として使用できるヌクレオチド配列、及び
２）核酸の標識又は核酸の操作に使用できるタグ、
からなる群から選択される１以上の特徴を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記リガーゼがＴ４  ＤＮＡリガーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
１）のヌクレオチド配列及び２）のタグを用いて得られた生成物をＲＮＡポリメラーゼで転写して５′末端配列にタグを付与したｃＲＮＡを調製することをさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項５】
５′末端配列にタグを付与したｃＲＮＡ分子を、二本鎖領域と一本鎖領域とを含む第２の二本鎖ＤＮＡ配列とライゲーションする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ライゲーションしたＲＮＡ−ＤＮＡ分子生成物をＲＮＡポリメラーゼによってさらに転写し、ＲＮＡ分子の５′末端及び３′末端にタグを含むＲＮＡを複数コピーする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
５′末端及び３′末端にタグを付与したＲＮＡ配列を、
ａ）ＲＮＡの３′末端の配列タグと相補的なＤＮＡプライマーと混合してハイブリダイズし、
ｂ）逆転写酵素及びｄＮＴＰｓでインキュベートして一本鎖ｃＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二本鎖を調製し、
ｃ）工程ｂ）の生成物をＲＮａｓｅとインキュベートし、
ｄ）工程ｃ）の生成物を、一本鎖ｃＤＮＡの３′末端のタグ配列に相補的な配列を含む第２の一本鎖プライマー及びＤＮＡポリメラーゼとインキュベートし、両末端にタグを付与した二本鎖ｃＤＮＡの配列を調製する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
標的ＲＮＡ配列の増幅方法であって、
ａ）一本鎖の形態のＲＮＡを供給し、
ｂ）ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列を含む二本鎖領域と、標的ＲＮＡにハイブリダイズする一本鎖領域とを含むＤＮＡ配列を添加し、
ｃ）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ及び大腸菌ＤＮＡリガーゼからなる群から選択されるＤＮＡリガーゼによってＲＮＡの３′末端にＤＮＡ配列をライゲーションしてＤＮＡ−ＲＮＡを調製し、
ｄ）ＲＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ−ＲＮＡを転写してアンチセンス相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を調製する
ことを含んでなる増幅方法。
【請求項９】
ｅ）ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列を含む二本鎖領域と、ｃＲＮＡにハイブリダイズする一本鎖領域とを含むＤＮＡ配列を添加し、
ｆ）酵素的手段によってｃＲＮＡとＤＮＡ配列をライゲーションし、
ｇ）ＲＮＡポリメラーゼによって工程ｆ）の生成物の転写を行って標的ＲＮＡと同じセンスＲＮＡの複数のコピーを調製する
ことをさらに含む、請求項８記載の増幅方法。
【請求項１０】
前記二本鎖ＤＮＡ配列の少なくとも１つがタグ配列を含む、請求項９記載の増幅方法。
【請求項１１】
前記両方の二本鎖ＤＮＡ配列がタグ配列を含む、請求項９記載の増幅方法。
【請求項１２】
前記リガーゼがＴ４  ＤＮＡリガーゼである、請求項８記載の増幅方法。
【請求項１３】
前記タグ配列が異なる、請求項１１記載の増幅方法。
【請求項１４】
工程ｂ）及びｅ）で用いる二本鎖ＤＮＡ配列が異なるＲＮＡポリメラーゼのプロモータを含む、請求項９記載の増幅方法。
【請求項１５】
工程ｄ）が１以上のヌクレオチドアナログを含む反応で実施される、請求項８又は請求項９記載の増幅方法。
【請求項１６】
前記核酸がアフィニティータグをさらに含んでなり、アフィニティータグが連結核酸分子の精製に使用できる、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な核酸の増幅法、精製法及び検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中の核酸、特に特定の配列の核酸の量を増幅する能力は多くの分子生物学技術及びアッセイにおいて重要な問題である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４６８３１９５号及び米国特許第４６８３２０２号）は特異的な核酸配列の増幅のために広く用いられている。この方法では、核酸配列の混合物は増幅される特定の配列を特定する２つの短いオリゴデオキシヌクレオチドプライマと混合する。
【０００３】
従前の方法の多くはＤＮＡの増幅に関連するものである。しかし標的ＲＮＡ分子を増幅する試みが増加している。ＲＮＡの増幅は例えば発現分析やウィルス検出の分野において重要である。ＲＮＡの増幅に関係する１つの技術はＲＴ−ＰＣＲと呼ばれている。この技術ではＲＮＡ分子は逆転写酵素の作用によって相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列に複製される。そのｃＤＮＡは次に適切なプライマーとの組み合わせでＤＮＡポリメラーゼによって増幅される。
【０００４】
異なる方法論がＶａｎ  Ｇｅｌｄｅｒ他によって米国特許第５５４５５２２号、米国特許第５７１６７８５号及び米国特許第５８９１６３６号で論じられている。ここでＲＮＡターゲット分子はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列が連結されたプライマーとの組み合わせで、逆転写酵素によってｃＤＮＡに逆転写する。二本鎖ｃＤＮＡを生じさせた後、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを添加し、転写によって相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の多数のコピーを生成する。
【０００５】
Ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒ他によって記載された方法はｃＤＮＡ合成を必要とし、逆転写酵素ＲＮａｓｅポリメラーゼ及びリガーゼを必要とする多段階工程であり、そのプロトコルの途中で精製工程も必要である。これらの工程が追加されることにより煩雑さ、さらにはｃＲＮＡ合成のコストが増加する。
【０００６】
近年、転写されるＲＮＡ分子が二本鎖ＤＮＡプロモータに付着する場合、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼ）が転写によって短いＲＮＡフラグメントを複製できることが証明されている。二本鎖ＤＮＡ領域上でのＲＮＡポリメラーゼによる転写開始の後、転写がそのＲＮＡ−ＤＮＡ接合部で行われ、そのＲＮＡ領域において速度又は処理性に顕著な損失がない。さらに転写されるその鋳型ＲＮＡは一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二本鎖であってもよい。このプロセスの唯一の要件はＲＮＡポリメラーゼが二本鎖ＤＮＡセグメント上で転写を開始しなければならないことである（Ａｒｎａｕｄ−Ｂａｒｂｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６  ３５５０−３５５４（１９９８））。
【０００７】
ＤＮＡリガーゼは互いにＤＮＡ鎖を結合する反応を触媒する一方、ＲＮＡリガーゼは互いにＲＮＡ鎖を結合する反応を触媒する。ＤＮＡリガーゼはＲＮＡ鎖へのＤＮＡのライゲーションを行う効率が非常に悪いと言われるが、それは誤解である。ＤＮＡリガーゼがそのＤＮＡ骨格において、５′−リン酸末端を有するＤＮＡと３′−ＯＨ末端を有するＲＮＡを結合する反応を効率的に触媒することが証明されている（Ａｒｎａｕｄ−Ｂａｒｂｅ，ｅｔ  ａｌ，１９９８）。ＤＮＡリガーゼは５′−リン酸末端を有するＲＮＡと３′−ＯＨ末端を有するＤＮＡを効果的に結合することがほとんどできず（ＲＮＡプライマー除去前の岡崎フラグメント成熟時に存在するニックと同様）、また２つのＲＮＡ鎖間のホスホジエステル結合の形成活性が極めて弱い（Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｓｈｕｍａｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３６：９０７３−９０７９（１９９７））。
【０００８】
Ｎａｔｈ及びＨｕｒｗｉｔｚの文献（ＪＢＣ２４９  ３６８０−３６８８（１９７４））では、大腸菌のＤＮＡリガーゼ又はＴ４  ＤＮＡリガーゼを用い、ポリｄＴ配列存在下で、ポリｄＡの５′−リン酸とポリＡの３′−ＯＨの共有結合によるライゲーションを行い、ハイブリダイゼーションを行うことに関して論じられている。同様の知見がＦａｒｅｅｄ他によって報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６  ９２５（１９７１））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の少なくとも１つの例示的な実施形態では、従来の増幅方法に存在する幾つかの工程を省略する。また上記のポリアデニリル化（ポリ（Ａ））ｍＲＮＡを精製する従来の方法ではオリゴ（ｄＴ）配列が共有結合によってＲＮＡに結合せず、それらによる塩基対形成（水素結合（共有結合でない））を用いるだけであるため、穏やかな緩衝液の条件を必要とする。ＲＮＡの末端に配列をライゲーションした場合、非常に安定な共有結合が形成され、よりストリンジェントな緩衝液条件を採用できる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の方法は核酸構造体の産生、並びにその後の核酸の精製及び増幅に関係する使用に関する。該方法は二本鎖領域と一本鎖領域とを含むＤＮＡ配列を必要とする。一本鎖領域は標的ＲＮＡ配列と相補的である。ＲＮＡ配列をさらにそのＤＮＡ配列のその一本鎖領域にハイブリダイズさせ、さらにその２つの配列を新規な方法によりライゲーションし、ＲＮＡ−ＤＮＡ分子を調製する。そのＤＮＡ配列は調製後のＲＮＡ−ＤＮＡ分子の使用に応じて付加的な特徴も含む。
【００１１】
ＲＮＡの３′末端がプロモータ配列を含んでいる二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドに最初にライゲーションされるような方法も実施形態に含まれる。この二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは二本鎖領域中にＲＮＡポリメラーゼのプロモータを含んでなり、それに続く一本鎖ＤＮＡ部分が３′突出部を形成する。３′突出部がチミジン残基の鎖を含むとき、二本鎖ＤＮＡの一本鎖部分がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３′末端ポリ（Ａ）テール部とハイブリダイズする。リガーゼの添加後、この二本鎖ＤＮＡ配列のうち１つの鎖がｍＲＮＡの３′末端とライゲーションする。ＲＮＡポリメラーゼを添加すると、これらのハイブリッド分子は能率的に転写され、ｃＲＮＡが合成される。通常ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写反応により各鋳型が何倍にも転写されるため、この方法によりＲＮＡ増幅が効果的に行える。
【００１２】
上記と同様の他の方法は、ＲＮＡに対するＤＮＡオリゴヌクレオチドの上記と同様のライゲーションを含む。しかしそのＤＮＡオリゴヌクレオチドは固相担体に付着するか、又はアフィニティタグを含む。これによりＲＮＡ分子の非常に効果的な共有結合及び／又は捕捉が可能となり、様々な目的に適宜使用できる。
【００１３】
さらに他の方法ではライゲーション及びその後の転写を利用し、ｃＲＮＡの５′末端においてユーザの指定する配列を含む相補ＲＮＡを調製する。この配列「タグ」はＲＮＡポリメラーゼプロモータとライゲーションしたＲＮＡ分子の３′末端との間に位置する。ユーザ指定の配列はこのｃＲＮＡを精製、識別し、又は他の配列特異的な操作に使用できる。このｃＲＮＡ生成物をその後ライゲーションし、上記の方法で再度増幅した場合、得られる二重増幅産物はその最初のセンス鋳型に対して「センス」であり、この新たな生成物は異なる２種類のユーザ指定の配列をその５′末端に有してもよい。これらの配列はｃＤＮＡの合成に使用でき、全長合成及び方向性クローニングが可能となる。当業者はユーザ指定配列の有無にかかわらず、この二重増幅方法はＲＮＡ量の顕著な増加を与えることができ、従来分析できなかった極微量の試料の分析が可能になることを理解するであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
ａ）概略
本発明の方法は新規な核酸構造体の産生、並びにその後の核酸の精製及び増幅での使用に関する。該方法は二本鎖領域と一本鎖領域とを含むＤＮＡ配列を必要とする。２つのＤＮＡオリゴを一緒に混合すること、又はヘアピンループを形成できる１つのオリゴを用いることによりこのコンホメーションが形成されうることが特記すべき点である。一本鎖領域は目的のＲＮＡ配列と相補的であり、以下を含んでもよい。
１）例えば５′−ｄ［…（Ｔ）ｘ］−３′などのポリ（ｄＴ）配列
（Ｘがあらゆる整数であり、「…」がその前の二本鎖領域の１つの鎖を表す）、又は
２）例えば５′−ｄ［…ＴＴＴ（Ｖ）ｘ（Ｎ）ｘ］−３′などの可変ヌクレオチド配列を有する３′末端のポリ（ｄＴ）配列（ＶがＡ、Ｃ又はＧであってよく、Ｎが４つの全ヌクレオチドのいずれでもよく、Ｘがいかなる整数でもあってもよく、「…」がその前の二本鎖領域の１つの鎖を表す）。ＲＮＡを次にＤＮＡ配列の一本鎖領域にハイブリダイズさせ、その２つの配列を新規な方法によりライゲーションさせ、ＲＮＡ−ＤＮＡ分子を調製する。当業者であればポリ（ｄＴ）部を除去して一本鎖の構成を５′−ｄ−［…（Ｖ）ｘ（Ｎ）ｘ］３′、ｄ−［…（Ｖ）ｘ］３′又はｄ［…（Ｎ）ｘ］−３′としてもよいことを認識するであろう。
【００１５】
ｂ）核酸
上記方法は特にＲＮＡの増幅及び精製に適用される。様々な供給源に由来するＲＮＡでもよいが、該方法では特にポリＡテール部を含む真核生物ｍＲＮＡが好適である。例えばＲＮＡをヒト又は他の動物などの供給源を由来としてもよく、健常者の集団と疾病／感染の集団との間、又は治療を受けた試料と対照試料の間における、ＲＮＡ試料の比較試験の一部とすることもでき、ＲＮＡを用いて疾患か健康か、癌か癌でないか、治療したか治療しないかに関する試験、薬物スクリーニング、感染性物質スクリーニングを個々人にて評価し、診断に利用することも含まれうる。ＲＮＡは通常試料ごとに異なるＲＮＡ配列の混合物であって、４つの天然の塩基Ａ，Ｃ，Ｇ及びＵを有するＲＮＡ配列を含む。非天然の又は修飾されたその他の塩基が存在してもよい。ＲＮＡ（特に標識ＲＮＡ）の多数のコピーの生成は多くの用途にとって重要である。すなわち試料が胎児由来、老人由来、単一の細胞又は限られた細胞による限定的な分析、患者の生検標本、ハイスループット試験用である場合、稀な現象のスクリーニングなどの希薄な試料（混合試料中の細胞、例えば癌の転移の際又は転移前の血液中の癌細胞のスクリーニング）である場合、環境試料（細菌戦における検出、水の純度、食品試験）である場合、などの状況が挙げられる。
【００１６】
ｃ）最初のハイブリダイゼーション及びライゲーション
ＲＮＡ試料を、二本鎖領域と一本鎖領域とを含む１以上の核酸配列と混合する。核酸配列中の一本鎖領域がそのＲＮＡにハイブリダイズする。ＲＮＡの３′末端に対する、核酸の二本鎖領域中の５′末端のライゲーションは酵素的手段によってなす。用いる核酸配列はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの組合せ、又はＰＮＡなどの核酸アナログであってもよい。核酸配列は異なる長さの２つの異なる鎖を含んでもよく、又は二本鎖領域と一本鎖領域を形成できるヘアピン構造を含む一本鎖でもよい。
【００１７】
簡略化のため、詳細な説明では核酸配列がＤＮＡを含む態様を示す。図１に示すように、本発明の１つの例示的な実施形態の第一工程では、ｍＲＮＡ配列の３′末端にＤＮＡ配列をライゲーションさせる。このＤＮＡ配列は二本鎖領域と一本鎖領域とを含む。一本鎖領域はｍＲＮＡの３′末端とハイブリダイズさせ、ＲＮＡ配列に隣接するように二本鎖領域を配置させるために用いる。図示のとおり、一本鎖ＤＮＡ（部分／領域）はさらにｍＲＮＡのポリＡテール部にハイブリダイズする幾つかのＴ残基（ポリｄＴ）を含んでもよい。ポリｄＴ配列は１〜１００の鎖長（より好ましくは３〜２５鎖長）とすることができる。
【００１８】
ｍＲＮＡの３′末端に対するＤＮＡ配列のライゲーションは多くの異なるＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼを用いて実施できることを見出した。特にＴ４  ＤＮＡリガーゼが好適であることが示された。ＤＮＡ中の陥凹５′末端は良好なライゲーションのためリン酸基を必要とする。
【００１９】
後で調製するＲＮＡ−ＤＮＡ分子の使用目的に依存し、分子の二本鎖ＤＮＡ部分／領域は以下の特徴の少なくとも１つを含む。第一の例ではアフィニティータグが挙げられ、それによりＲＮＡ−ＤＮＡ分子の分離及び精製が可能となり、簡便なＲＮＡ精製法を提供する。アフィニティータグの例としては、アビジン又はストレプトアビジンでコートされた担体に結合できるビオチン、又はＨｉｓタグ若しくは当業者に周知の抗体及び他のシステムなどの他のタグ／結合パートナーが挙げられる。アフィニティータグはライゲーションしたＤＮＡの３′末端に存在させてもよい。
【００２０】
第二に、ＲＮＡポリメラーゼ活性に必要なプロモータ配列は二本鎖ＤＮＡ配列中に組み込むことができる。これらは周知であり、最も好ましい配列はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼに必要なものであるが、ＳＰ６又はＴ３  ＲＮＡポリメラーゼに必要な配列も使用できる。実際、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであって、ＲＮＡ合成認識の開始に必要な二本鎖プロモータ配列を必要とするいかなるものも、この系において機能すると考えられる。ＲＮＡポリメラーゼプロモータは理想的にはオリゴヌクレオチドの５′末端から１〜４０塩基対の位置に存在する。
【００２１】
さらに、そのＲＮＡ−ＤＮＡ間の作用の前にタグ領域（図１でＴａｇ＃１と記載）を転写部位の下流の二本鎖ＤＮＡ領域に導入できる。この領域の存在によりライゲーション又は増幅前のライゲーションによって生成する核酸構造体に対する次の操作が可能となる。タグ領域の一例は制限酵素により切断されるヌクレオチド配列である。タグ領域の他の例としては、他のタンパク質分子が結合するヌクレオチド配列が挙げられる。
【００２２】
ＲＮＡに対する二本鎖ＤＮＡ配列のハイブリダイゼーション／アニーリングは、ライゲーション位置に隣接し、核酸配列の協働的な結合に関係するヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡ配列によっても促進できる。
【００２３】
さらにタグの別の例は色素又は放射性物質であってもよい。
【００２４】
ｄ）精製
好適なアフィニティータグを核酸配列中に、好ましくは核酸配列の３′末端に含め、その配列をＲＮＡ配列にライゲーションする場合、連結ＲＮＡ−核酸分子の精製が可能となる。若干の実施形態では、核酸配列はＤＮＡ（好ましくは二本鎖ＤＮＡ）を含む。好ましくはアフィニティータグがＤＮＡ配列の二本鎖ＤＮＡ領域に含まれ、それによりＲＮＡに対するハイブリダイゼーションへの干渉のおそれが最小化される。ＲＮＡが核酸配列にライゲーションし、アフィニティータグに間接的にライゲーションするため、ＲＮＡの塩基対合（水素結合）に依存する他の方法よりもさらにストリンジェントな精製条件を用いることができる。これを図１の最初の部分において模式的に示す。意図する使用が精製のみである場合、二本鎖ＤＮＡ領域にＲＮＡポリメラーゼプロモータ領域を含める必要はない。アフィニティータグとしては、例えばビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、Ｈｉｓタグ及びその他多くの従来技術において周知の多くのものが挙げられる。
【００２５】
ｅ）増幅
図１に示すように、ライゲーションしたＤＮＡ―ＲＮＡ分子は、ライゲーションした二本鎖ＤＮＡ分子に含まれるプロモータ配列を用いることで、ＲＮＡ合成の鋳型として機能できる。様々なＲＮＡポリメラーゼを用いてもよいが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが好適である。ライゲーションしたＤＮＡ−ＲＮＡ分子が転写されると、元の開始ｍＲＮＡ配列と相補的なＲＮＡの多数のコピー（すなわちアンチセンスｃＲＮＡ鎖）が生じる。Ｔａｇ＃１として示すタグ領域をｃＲＮＡの５′領域にも導入できる。
【００２６】
ｆ）次のハイブリダイゼーション及びライゲーション
図２に示すように、図１の反応によって得られた５′タグ付ｃＲＮＡ（アンチセンス鎖）を、別のＤＮＡ配列にハイブリダイズし、ライゲーションすることができる。このＤＮＡ配列は図１に示すＤＮＡ構造と全体として同じであるが、図２に示すように一本鎖領域はポリｄＴでなく、代わりにアンチセンス鎖の３′末端とハイブリダイズするランダムな塩基配列をからなる。さらに、特異的なＲＮＡが増幅されるようにその一本鎖ＤＮＡ領域に特異的な既知の配列を含めてもよい。
【００２７】
二本鎖領域はタグ２と記載する異なるタグ領域を含んでもよいが、そのタグは以前用いたタグ１と同様でもよい。当然ながらいかなるタグを用いずに増幅にそれらの方法を用いることも可能である。プロモータ配列は以前用いた配列と同様でもよく、好ましくは同じものであるが、異なるプロモータ配列を用いてもよい。ハイブリダイゼーション後、混合物をＴ４  ＤＮＡリガーゼによってライゲーションし、連結ｃＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを得る。連結ｃＲＮＡ−ＤＮＡはさらに適切なＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡの多数のコピーの転写に用いることができる。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼはこの工程に適しているが、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ及び大腸菌ＲＮＡポリメラーゼを用いてもよい。この反応で得られるＲＮＡは図示する開始ＲＮＡと同じくセンスであるが、多数のコピーとして存在し、図２に示すように２つの異なるタグ領域を有しうる。
【００２８】
ｇ）ｃＤＮＡ合成
図２又はさらにいずれかの図にて説明したように生産されるＲＮＡは、図３に示すようにｃＤＮＡの調製に用いることができる。ＲＮＡはそのＴａｇ＃１と相補的な配列を含む一本鎖ＤＮＡプライマーとハイブリダイズする。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは、さらに逆転写酵素及びｄＮＴＰを用いて第１のｃＤＮＡ鎖の合成に用いる。第１のｃＤＮＡ鎖合成の完了後、ＲＮＡｓｅを用いてそのヘテロ二本鎖中のＲＮＡを除去する。Ｔａｇ＃２プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰｓを用いて第２の鎖合成をを行って両端にタグ配列を有する全長ｃＤＮＡを得る。ｃＤＮＡにはタンパク質発現、ＲＮＡスプライス部位の分析及び遺伝子発見など、多数の用途が存在する。
【００２９】
ｈ）核酸配列の除去
多くの用途において、使用しない核酸配列を除去するのが好適である。例えば、ＲＮＡにライゲーションしなかったＤＮＡ配列は適切なエキソヌクレアーゼ（例えばλエキソヌクレアーゼ又はＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼ）により、適切な段階で反応生成物を処理して除去できる。
【００３０】
ｉ）ヌクレオチドに関して
上記の多数の用途において、例えばｒＮＴＰ（ＵＴＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ及びＣＴＰ）又はｄＮＴＰ（ＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ）など、標準的なヌクレオチドを用いてもよい。しかし、メチル化ヌクレオチドのようなヌクレオチドアナログ、又はｒＮＴＰαＳ又はｄＮＴＰαＳなどのヌクレオチドの添加が、若干の用途にとって好適であることもある。標準的なヌクレオチドとヌクレオチドアナログとの混合物が適切でありうる。
【００３１】
ｊ）他の考慮すべき点
熟練した当業者であれば構成成分及び方法にさらに変形を与えることが可能であると理解する。
【００３２】
二本鎖及び一本鎖領域を含むＤＮＡ配列をさらに修飾してヌクレオチドアナログを含ませ、エキソヌクレアーゼ分解に対する抵抗性を与えてもよい。この状況では、ＤＮＡ鎖中に修飾したヌクレオチドアナログを含ませ、標的ＲＮＡにライゲーションしないようにするのが好適である。
【００３３】
若干の方法では、さらにエキソヌクレアーゼ処理の前又は後に、相補的なトップのオリゴヌクレオチド鎖を添加することも可能である。
【００３４】
転写反応に追加的なオリゴヌクレオチドを添加することも可能もある。追加的なオリゴヌクレオチドは他の配列も可能であるがポリＡ又はポリｄＡでもよい。
【００３５】
上記の方法によって調製されるライゲーションしたＤＮＡ−ｃＲＮＡ分子を転写前に逆転写酵素で処理してもよい。
【００３６】
上記の方法のいずれかで得られるＲＮＡ（ｃＲＮＡ又は増幅された標的ＲＮＡ）は様々な目的に使用でき、例えばＲＮＡ分析、特にマイクロアレイフォーマットの目的における固定化核酸の使用が挙げられる。
【００３７】
添加するＲＮＡはオリゴヌクレオチド存在下でＲＮａｓｅで処理でき、かかるＲＮＡにはそのオリゴヌクレオチドによって規定される特異的な部位でニッキングする。オリゴヌクレオチドは標準的なヌクレオチドに加えてメチル化ヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドはランダムな配列塩基又は指定された特定の配列を含んでもよい。この方法は実施例１１において開示する。その方法は、ＲＮＡ配列に天然及び修飾ヌクレオチドを含むオリゴデオキシリボヌクレオチドをハイブリダイズさせ、ＲＮＡ鎖に特異的にニックを入れる物質に得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを接触させ、トリミングされたＲＮＡの３′テール部にＤＮＡ配列をライゲーションさせることを含む。オリゴデオキシヌクレオチドは理想的には８ヌクレオチド長より長くなければならず、修飾ヌクレオチドは２′−ＯＨ基のメチル化によって修飾できる。ＲＮＡ鎖にのみニックを入れるのに用いる物質は好適にはＲＮＡｓｅＨである。この実施形態によって得られるニック入りＲＮＡをさらに上記の実施形態においてＲＮＡを多量に増幅させる目的で使用でき、それは上記のように概略した適切な方法によって標識できる。
【実施例】
【００３８】
本実施例は説明のためにのみ開示し、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきでない。以下の、及び本願明細書の他の箇所に挙げるすべての参考文献は援用により本明細書の一部をなす。
【００３９】
材料
水
これらの実施形態で用いる、電気泳動用緩衝液の調製に用いる水を含むすべての水を、混入するいかなるＲＮＡヌクレアーゼも除去するため、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理し、オートクレーブした。ライゲーション又は転写反応液の調製に用いる水はＤＥＰＣ処理されており、Ａｍｂｉｏｎ社から購入した。
【００４０】
ＰＴ７ＩＶＳ５（Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｐｅｒｏｎ社）
【００４１】
【化１】
0005420174.tif 000002
デオキシリボオリゴヌクレオチド（オリゴ）は以下の３つの部分からなる。
１）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列を太字で示す（Ｌｏｐｅｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６９：４１−５１（１９９７）。
２）５塩基の介在配列（ＩＶＳ）又はそのポリ（ｄＴ）配列が開始する転写開始位置に相補的な配列をイタリックで示す。
３）２４塩基のポリ（ｄＴ）配列（Ｔ２４）又はｍＲＮＡの３′側のポリ（ｒＡ）テール部の「捕捉」に用いる配列を下線で示す。
【００４２】
ｃＰＴ７ＩＶＳ５（Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｐｅｒｏｎ社）
【００４３】
【化２】
0005420174.tif 000003
オリゴは以下の４つの部分からなり、ＲＮＡ合成の鋳型となる。
１）５′リン酸基はｍＲＮＡの３′水酸基との共有結合の形成に関与する。
２）イタリックの列の４つのｄＡ残基はｍＲＮＡのその３′ポリ（ｒＡ）テール部の相補的結合を促進する。
３）ＲＮＡポリメラーゼによって転写される第１の塩基を下線付きのＣで示す。ｃＰＴ７ＩＶＳ５  オリゴのその５′末端に向かって、結合するｍＲＮＡ配列中で合成が行われる。
４）プロモータ配列に相補的な配列を太字で示す。
【００４４】
ＰＴ７ＩＶＳ１５（Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｐｅｒｏｎ社）
【００４５】
【化３】
0005420174.tif 000004
オリゴは以下の３つの部分からなる。
１）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列を太字で示す。
２）１５塩基のＩＶＳ又はそのポリ（ｄＴ）配列が開始する転写開始部位に相補的な配列をイタリック体で示す。
３）２４塩基のポリ（ｄＴ）配列（Ｔ２４）又はｍＲＮＡの３′側ポリ（ｒＡ）テール部の「捕捉」に用いる配列を下線で示す。
【００４６】
ｃＰＴ７ＩＶＳ１５（Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｐｅｒｏｎ社）
【００４７】
【化４】
0005420174.tif 000005
オリゴは以下の４つの部分からなり、ＲＮＡ合成の鋳型となる。
１）５′リン酸基はｍＲＮＡの３′水酸基との共有結合の形成に関与する。
２）イタリック列の４つのｄＡ残基はｍＲＮＡの３′ポリ（ｒＡ）テール部の相補的な結合を促進する。
３）ＲＮＡポリメラーゼによって転写される第１の塩基を下線付きのＣで示す。ｃＰＴ７ＩＶＳ５オリゴのその５′末端に向かって、ＩＶＳを通って、結合しているｍＲＮＡ配列中で合成が行われる。
４）プロモータ配列に相補的な配列を太字で示す。
【００４８】
ＲＮＡ３５（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）
【００４９】
【化５】
0005420174.tif 000006
ライゲーション及び転写反応の試験の目的で、合成ＲＮＡを設計した。この分子の３′−水酸基はリガーゼの酵素作用によりｃＰＴ７オリゴ（ＩＶＳ５又はＩＶＳ１５）の５′−リン酸基と結合する。
【００５０】
ＲＮＡ６５（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）
【００５１】
【化６】
0005420174.tif 000007
ライゲーション及び転写反応の試験の目的で、合成ＲＮＡを設計した。この分子の３′−水酸基はリガーゼの酵素作用によりｃＰＴ７オリゴ（ＩＶＳ５又はＩＶＳ１５）の５′−リン酸基と結合する。
【００５２】
ＰＴ３ｗ／Ｔ２４（Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｐｅｒｏｎ社）
【００５３】
【化７】
0005420174.tif 000008
オリゴは以下の３つの部分からなる。
１）Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼのそのプロモータ配列を太字で示す（Ｌｉｎｇ  Ｍ−Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １７：１６０５−１６１８（１９８９）。
２）１５塩基のＩＶＳ又はそのポリ（ｄＴ）配列が開始する転写開始部位に相補的な配列をイタリック体で示す。
３）２４塩基のポリ（ｄＴ）配列（Ｔ２４）又はｍＲＮＡの３′側ポリ（ｒＡ）テール部の「捕捉」に用いる配列を下線で示す。
【００５４】
ｃＰＴ３（Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｐｅｒｏｎ社）
【００５５】
【化８】
0005420174.tif 000009
オリゴは以下の４つの部分からなり、ＲＮＡ合成の鋳型となる。
１）５′リン酸基はｍＲＮＡの３′水酸基との共有結合の形成に関与する。
２）イタリック列の４つのｄＡ残基はｍＲＮＡの３′ポリ（ｒＡ）テール部の相補的な結合を促進する。
３）ＲＮＡポリメラーゼによって転写される第１の塩基を下線付きのＣで示す。ｃＰＴ７ＩＶＳ５オリゴのその５′末端に向かって、ＩＶＳを通って、結合しているｍＲＮＡ配列中で合成が行われる。
４）プロモータ配列に相補的な配列を太字で示す。
【００５６】
ポリｄＡ２０（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＩＤＴ）
【００５７】
【化９】
0005420174.tif 000010
ビオチン−ｃＰＴ７ＩＶＳ１５（Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｐｅｒｏｎ社）
【００５８】
【化１０】
0005420174.tif 000011
オリゴは以下の５つの部分からなり、ＲＮＡ合成の鋳型となる。
１）５′リン酸基はｍＲＮＡの３′水酸基との共有結合の形成に関与する。
２）イタリック列の４つのｄＡ残基はｍＲＮＡの３′ポリ（ｒＡ）テール部の相補的な結合を促進する。
３）ＲＮＡポリメラーゼによって転写される第１の塩基を下線付きのＣで示す。ビオチン−ｃＰＴ７ＩＶＳ５オリゴのその５′末端に向かって、ＩＶＳを通って、結合しているｍＲＮＡ配列中で合成が行われる。
４）プロモータ配列に相補的な配列を太字で示す。
５）ビオチン基を最後の３′側のＴ残基の塩基の５位に結合させた。
【００５９】
ＯＨＴｈｉｏＰＴ７ＩＶＳ２５（Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｐｅｒｏｎ社）
【００６０】
【化１１】
0005420174.tif 000012
オリゴは以下の４つの部分からなる。
１）２つの突出Ａ残基はホスホロチオネート結合（＊）で連結している。
２）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列を太字で示す。
３）２５塩基のＩＶＳ又はそのポリ（ｄＴ）配列が開始する転写開始部位に相補的な配列をイタリック体で示す。
４）２４塩基のポリ（ｄＴ）配列（Ｔ２４）又はｍＲＮＡの３′側ポリ（ｒＡ）テール部の「捕捉」に用いる配列を下線で示す。
【００６１】
ＨＴ−ＩＩＩ  １０ｃ
【００６２】
【化１２】
0005420174.tif 000013
オリゴは以下の４つの部分からなる。
１）３つの２′−Ｏ−メチルウリジンモノリン酸残基及び５つのデオキシチミジンモノリン酸残基はｍＲＮＡのポリＡテール部にオリゴを向けさせる。
２）ｄＶ及びｍＮは変性塩基であり、ｄＶはＡ、Ｃ、又はＧのみであり、ｍＮは２′−Ｏ−メチル化された４種全ての塩基であり、それはｍＲＮＡメッセージのポリ（Ａ）のすぐ５′側の最後の２つの塩基にオリゴを固定する。
３）メチル化された残基はＲＮａｓｅＨがｄＴ領域の外側でｍＲＮＡにニックを入れるのを防止する。
４）５つのｄＴ残基によってＲＮａｓｅＨが結合して、ｍＲＮＡ中この領域への標的ニッキングが可能となる。
【００６３】
ＨＴ−ＩＩＩ  １０ｄ
【００６４】
【化１３】
0005420174.tif 000014
オリゴは以下の４つの部分からなる。
１）３つの２′−Ｏ−メチルウリジンモノリン酸残基及び５つのデオキシチミジンモノリン酸残基はｍＲＮＡのポリＡテール部にオリゴを向けさせる。
２）ｄＶ及びｍＮは変性塩基であり、ｄＶはＡ、Ｃ、又はＧのみであり、ｍＮは２′−Ｏ−メチル化された４種全ての塩基であり、それはｍＲＮＡメッセージのポリ（Ａ）のすぐ５′側の最後の２つの塩基にオリゴを固定する。
３）メチル化された残基はＲＮａｓｅＨがｄＴ領域の外側でｍＲＮＡにニックを入れるのを防止する。
４）５つのｄＴ残基によってＲＮａｓｅＨが結合して、ｍＲＮＡ中この領域への標的ニッキングが可能となる。
【００６５】
ＨＴ−ＩＩＩ  １０ｇ
【００６６】
【化１４】
0005420174.tif 000015
オリゴは以下の４つの部分からなる。
１）４つの２′−Ｏ−メチルウリジンモノリン酸残基及び５つのデオキシチミジンモノリン酸残基はｍＲＮＡのポリＡテール部にオリゴを向けさせる。
２）ｄＶ及びｍＮは変性塩基であり、ｄＶはＡ、Ｃ、又はＧのみであり、ｍＮは２′−Ｏ−メチル化された４種全ての塩基であり、それはｍＲＮＡメッセージのポリ（Ａ）のすぐ５′側の最後の２つの塩基にオリゴを固定する。
３）メチル化された残基はＲＮａｓｅＨがｄＴ領域の外側でｍＲＮＡにニックを入れるのを防止する。
４）５つのｄＴ残基によってＲＮａｓｅＨが結合して、ｍＲＮＡ中この領域への標的ニッキングが可能となる。
【００６７】
ＨＴ−ＩＩＩ  Ｂ５
【００６８】
【化１５】
0005420174.tif 000016
オリゴは以下の４つの部分からなる。
１）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列を太字で示す。
２）１５塩基のＩＶＳ又はそのポリ（ｄＴ）配列が開始する転写開始部位に相補的な配列をイタリック体で示す。
３）３塩基のポリ（ｄＴ）配列又はｍＲＮＡの３′側ポリ（ｒＡ）テール部の「捕捉」に用いる配列の一部を下線で示す。
４）Ｖ及びＮは変性塩基であり、ＶはＡ、Ｃ、又はＧのみであり、Ｎは４種全ての塩基であり、それはｍＲＮＡメッセージのポリ（Ａ）のすぐ５′側の最後の２つの塩基にオリゴを固定する。
【００６９】
ｃｐＴ７′−ＩＲ１５−（ＮｏＡ）５′Ｐ
【００７０】
【化１６】
0005420174.tif 000017
オリゴは以下の４つの部分からなり、ＲＮＡ合成の鋳型となる。
１）５′リン酸基はｍＲＮＡの３′水酸基との共有結合の形成に関与する。
２）ＲＮＡポリメラーゼによって転写される第１の塩基を下線付きのＣで示す。ｃＰＴ７ＩＶＳ５オリゴのその５′末端に向かって、ＩＶＳを通って、結合しているｍＲＮＡ配列中で合成が行われる。
３）プロモータ配列に相補的な配列を太字で示す。
４）１５塩基のＩＶＳをイタリックで示す。
【００７１】
ＨＴ−１１１  １０ｆ
【００７２】
【化１７】
0005420174.tif 000018
オリゴは以下の４つの部分からなる。１）５つの２′−Ｏ−メチルウリジンモノリン酸残基及び４つのデオキシチミジンモノリン酸残基はｍＲＮＡのポリＡテール部にオリゴを向けさせる。２）ｄＶ及びｍＮは変性塩基であり、ｄＶはＡ、Ｃ、又はＧのみであり、ｍＮは２′−Ｏ−メチル化された４種全ての塩基であり、それはｍＲＮＡメッセージのポリ（Ａ）のすぐ５′側の最後の２つの塩基にオリゴを固定する。３）メチル化された残基はＲＮａｓｅＨがｄＴ領域の外側でｍＲＮＡにニックを入れるのを防止する。４）５つのｄＴ残基によってＲＮａｓｅＨが結合して、ｍＲＮＡ中この領域への標的ニッキングが可能となる。
【００７３】
リガーゼ
分子内又は分子間での、核酸上の５′−リン酸基と核酸上の３′−水酸基との間の共有結合を形成できるあらゆる酵素を指す。その例としてはＴ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ及び大腸菌ＤＮＡリガーゼが挙げられる。
【００７４】
実施例１
合成ＲＮＡへの二本鎖ＤＮＡのライゲーション
大腸菌ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、１０ユニット／μＬ）以外のすべてのライゲーション反応の構成要素を、表１に示すように混合した。反応液を５分間の６０℃で加熱し、さらに室温に冷却した。大腸菌ＤＮＡリガーゼを適切な試験管に添加し、反応液を３０℃で２時間インキュベートした。各反応液をＲＮａｓｅフリーの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）の１μＬの添加によって停止させた。
【００７５】
【表１】
0005420174.tif 000019
全反応液の５μＬの試料をゲルローディング緩衝液ＩＩ（Ａｍｂｉｏｎ社）５μＬと混合し、９５℃で２分間熱変性させた。各試料の全量を１５％  アクリルアミド、７Ｍ  尿素、ＴＢＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の各ウェルにロードし、室温で、製造業者の指示に従い電気泳動を行った。分散するＤＮＡ分子量マーカーと共に、試料を左から右にそれぞれ番号順にロードした。ローディングダイであるブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）がそのゲルの底部に達したときに電気泳動を停止した。各ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ  Ｄｙｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を１：２００に水で希釈した溶液に１０分間浸漬して染色した。染色後ゲルを蒸留水でリンスし、ＤＮＡのバンドをＴｙｐｈｏｏｎ（商標）８６００  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｔｙｐｈｏｏｎ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でスキャンして観察した。
【００７６】
ゲルをグリーン（５３２）レーザー及びフルオレセイン５２６  ＳＰ発光フィルターを用いてスキャンした。
【００７７】
ＤＮＡ分子量マーカーは１００塩基対ラダー（０．５μｇ）、Ｈｏｍｏ−Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃｐｄ（Ａ）４０−６０（１．２５×１０−３  Ａ２６０ユニット）及びＯｌｉｇｏ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｍａｒｋｅｒｓ（８〜３２塩基、０．７５μＬ、すべてＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の混合物とした。ライゲーション反応で３つの異なる核酸成分がセルフライゲーションによる生成物を形成しないことが示された。また、反応完了時の適切なサイズ（７５塩基）のバンドが予想されるｃＰＴ７ＩＶＳ１５及びＲＮＡ３５のライゲーション産物（ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド）であることも示された。
【００７８】
実施例２
３つの異なるリガーゼによる二本鎖ＤＮＡとＲＮＡとのライゲーション
リガーゼ以外のすべてのライゲーション反応の構成成分を、表２に示すように混合した。反応液を５分間の６０℃で加熱し、さらに室温に冷却した。異なるリガーゼを適切な試験管に添加し、反応液を３０℃で２時間インキュベートした。各反応液をＲＮａｓｅフリーの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を１μＬ添加して停止させた。
【００７９】
【表２】
0005420174.tif 000020
全反応液の試料５μＬをゲルローディング緩衝液ＩＩ（Ａｍｂｉｏｎ社）５μＬと混合し、９５℃で２分間熱変性させた。各試料の全量を１５％  アクリルアミド、７Ｍ  尿素、ＴＢＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の各ウェルにロードし、室温で、製造業者の指示に従い電気泳動を行った。分散するＤＮＡ分子量マーカーと共に、試料を左から右にそれぞれ番号順にロードした。ローディングダイであるブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）がそのゲルの底部に達したときに電気泳動を停止した。各ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ  Ｄｙｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を１：２００に水で希釈した溶液に１０分間浸漬して染色した。染色後ゲルを蒸留水でリンスし、ＤＮＡのバンドをＴｙｐｈｏｏｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でスキャンして観察した。ゲルを実施例１と同様のパラメータを用いてスキャンした。
【００８０】
ライゲーション産物が生じたことを示し、それは３つの全リガーゼがＲＮＡの３′−水酸基にＤＮＡの５′−リン酸塩基をライゲーションさせるように機能する結果が示された。ＰＴ７ＩＶＳ１５  オリゴを含まない反応ではライゲーション産物は観察されなかった。
【００８１】
実施例３
ライゲーション後のＲＮＡの転写可能性
大腸菌ＤＮＡリガーゼ以外のすべてのライゲーション反応液の構成成分を、表３に示すように混合した。反応液を５分間の６０℃で加熱し、さらに室温に冷却した。大腸菌ＤＮＡリガーゼを適切な試験管に添加し、反応液を１６℃で２時間インキュベートした。各反応液をＲＮａｓｅフリーの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）の１μＬの添加によって停止させた。
【００８２】
【表３】
0005420174.tif 000021
全反応液の５μＬの試料をゲルローディング緩衝液ＩＩ（Ａｍｂｉｏｎ社）５μＬと混合し、９５℃で２分間熱変性させた。各試料の全量を１５％  アクリルアミド、７Ｍ  尿素、ＴＢＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の各ウェルにロードし、室温で、製造業者の指示に従い電気泳動を行った。分散するＤＮＡ分子量マーカーと共に、試料を左から右にそれぞれ番号順にロードした。ローディングダイであるブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）がそのゲルの底部に達したときに電気泳動を停止した。各ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ  Ｄｙｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を１：２００に水で希釈した溶液に１０分間浸漬して染色した。染色後ゲルを蒸留水でリンスし、ＤＮＡのバンドをＴｙｐｈｏｏｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でスキャンして観察した。
【００８３】
ゲルを実施例１と同様のパラメータを用いてスキャンした。予想されるライゲーション産物はそれぞれ反応２及び４において観察された。反応２と４の一部及びＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）  Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、表４で概説するように増幅を行った。すべての構成成分を一緒に混合し、３７℃で１時間インキュベートした。
【００８４】
【表４】
0005420174.tif 000022
インキュベート後、反応２及び４を同様に分割した。各反応液の一部に０．５Ｍ  ＥＤＴＡを０．５μＬ添加し、ゲル分析を行うまで氷中に保存した。残った一部を７０℃で５分間加熱し、ＳＵＰＥＲａｓｅ  Ｉｎを失活させた。各加熱済の一部にＲＮａｓｅＡ（４４ユニット、ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社）を１μＬ添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。その各々のＲＮａｓｅによる消化を、０．５Ｍ  ＥＤＴＡを０．５μＬ添加して停止させた。全反応液の５μＬの試料をゲルローディング緩衝液ＩＩ（Ａｍｂｉｏｎ社）５μＬと混合し、９５℃で２分間熱変性させた。各試料の全量を１５％  アクリルアミド、７Ｍ  尿素、ＴＢＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の各ウェルにロードし、室温で、製造業者の指示に従い電気泳動を行った。ローディングダイであるＢＰＢがそのゲルの底部から２ｃｍの位置に達したときに電気泳動を停止した。各ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ  Ｄｙｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を１：２００に水で希釈した溶液に１０分間浸漬して染色した。染色後ゲルを蒸留水でリンスし、ＤＮＡのバンドをＴｙｐｈｏｏｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でスキャンして観察した。ゲルを実施例１と同様のパラメータを用いてスキャンした。
【００８５】
反応２及び５からの転写反応産物はそれぞれ一般にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）反応に典型的である。予想される９ヌクレオチド（ｎｔ）長のランオフ転写物がＢＰＢ色素より上に存在するのを観察した。この短いランオフ転写物はライゲーション反応から持ち越された、ライゲーション反応しなかったＰＴ７ＩＶＳ５及びｃＰＴ７ＩＶＳ５オリゴによるものである。Ｔ７  ＲＮＡＰはランオフ反応で鋳型非依存的に１ヌクレオチドの添加を触媒することが公知であり（Ａｒｎａｕｄ−Ｂａｒｂｅ，ｅｔ  ａｌ．１９９８）、その９ｎｔ産物のすぐ上にて観察される。さらに、二本鎖ＤＮＡプロモータへの結合の後、ポリメラーゼがプロモータを通過する十分長い初期転写物を合成するまで、ＲＮＡＰが不稔転写に回ることも公知である（Ｌｏｐｅｚ，ｅｔ  ａｌ．１９９７）。不稔転写産物は若干の反応で９ｎｔ以下の産物に観察された。驚くべきことに、この反応では４４ｎｔの予想される分子量にランオフ転写物が含まれなかった。その代わり、ＲＮＡスミアーがゲルの上部に観察され、それは産物のサイズが多分散の混合物（非特異産物）であることを示唆する。ＲＮＡスミアーはＲＮａｓｅＡ処理により消失したが、ＤＮＡバンドは残った。このスミアーはＴ７  ＲＮＡＰのもう一つの特徴であり（Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３２：１０３０−１０４７（１９９３））、ホモポリマーの鋳型に沿って重合の間前方及び後方に酵素がスリッピングすることより生じる。
【００８６】
ＰＴ７ＩＶＳ１５及びｃＰＴ７ＩＶＳ１５オリゴ（レーン６）を含む転写においても同じタイプの反応生成物が観察された。ライゲーション反応からの、ライゲーションしなかったオリゴの持ち越しから予想される１９ｎｔのランオフ転写物は、より小さい不稔転写物と同様に観察された（矢印）。しかし、鋳型非依存的な核酸の付加は、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分に入ったときのポリメラーゼのつっかえのような現象によって明瞭ではなかった。また、予想される７５ｎｔサイズの転写物は観察されず、むしろＲＮａｓｅＡ処理によって消失するＲＮＡスミアーが観察された。ＲＮＡスミアーは若干の反応で濃くなり、それはより長いＩＶＳによってＲＮＡＰがより効率的にＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分に入れるようにになることを示唆する。
【００８７】
実施例４
ｍＲＮＡに対する二本鎖ＤＮＡ
すべての成分を表５に示すように混合し、３０℃で１５分間インキュベートした。本実施例ではアニーリング工程を含めなかった。ＲＮＡ３５に対するｃＰＴ７ＩＶＳ１５のライゲーションの他に、骨格筋ポリＡ  ＲＮＡ（ｓｍＲＮＡ；Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒ）も、この系のライゲーション標的として用いた。ＲＮａｓｅフリーの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を１μＬ添加し、各反応を停止した。
【００８８】
【表５】
0005420174.tif 000023
すべての反応液の試料５μＬをゲルローディング緩衝液ＩＩ（Ａｍｂｉｏｎ社）５μＬと混合し、９５℃で２分間熱変性させた。各試料の全量を１５％のアクリルアミド、７Ｍ尿素、ＴＢＥのゲル（インビトロゲン者）の各ウェルにロードし、室温で、製造業者の指示に従い電気泳動した。ローディングダイであるＢＰＢがそのゲルの底部から２ｃｍの位置に達したときに電気泳動を停止した。各ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ  Ｄｙｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を１：２００に水で希釈した溶液に１０分間浸漬して染色した。染色後ゲルを蒸留水でリンスし、ＤＮＡのバンドをＴｙｐｈｏｏｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でスキャンして観察した。ゲルを実施例１と同様のパラメータを用いてスキャンした。
【００８９】
ＲＮＡ３５と共に、予想されるオリゴのライゲーション産物を観察した。
【００９０】
反応１及び３のアリコート並びにＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、表６で概説するように増幅を実施した。すべての成分を１度に混合し、３７℃で１時間インキュベートした。
【００９１】
【表６】
0005420174.tif 000024
０．５Ｍ  ＥＤＴＡを１μＬ添加し、各反応を停止した。すべての反応液の試料５μＬをゲルローディング緩衝液ＩＩ（Ａｍｂｉｏｎ）５μＬと混合し、９５℃で２分間熱変性させた。各試料の全量を１５％のアクリルアミド、７Ｍ尿素、ＴＢＥのゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の各ウェルにロードし、室温で、製造業者の指示に従い電気泳動した。ローディングダイであるＢＰＢがそのゲルの底部から２ｃｍの位置に達したときに電気泳動を停止した。各ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ  Ｄｙｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を１：２００に水で希釈した溶液に１０分間浸漬して染色した。染色後ゲルを蒸留水でリンスし、ＤＮＡのバンドをＴｙｐｈｏｏｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でスキャンして観察した。ゲルを実施例１と同様のパラメータを用いてスキャンした。
【００９２】
その結果、実施例３で観察されたのと同様に、流出及び不稔転写、並びに鋳型非依存的な１塩基のヌクレオチド添加のいずれも示した。レーン１と比較してランオフ転写物の強度の減少並びに若干の反応におけるゲル上部のＲＮＡスミアーは、このシステムが二本鎖ＤＮＡのＲＮＡＰプロモータをアニールさせ、ライゲーションさせ、ＤＮＡ：ｍＲＮＡハイブリッドから相補ＲＮＡを転写する能力のいずれをも有することを示唆する。
【００９３】
実施例５
迅速なライゲーションキネティクス
表７で概説するようなライゲーション反応液を調製した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを除いてすべての成分を含むバルクの反応混合液を調製し、７つの試験管に各々１９μＬずつ分注した。０時点で水１μＬを添加し、０．５Ｍ  ＥＤＴＡを１μＬ添加し、ゲル分析まで氷上で保存した。残りのすべての反応液にＴ４  ＤＮＡリガーゼ（３５０ユニット、タカラ製）１μＬを添加し、室温で３０秒間、及び８分インキュベートした。指定された時間に０．５Ｍ  ＥＤＴＡ１μＬを適時に試験管に添加し、ゲル分析まで氷上に静置した。
【００９４】
【表７】
0005420174.tif 000025
すべての反応液の試料５μＬをＧｅｌ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（Ａｍｂｉｏｎ）５μＬと混合し、９５℃で２分間熱変性させた。各試料の全量を１５％のアクリルアミド、７Ｍ尿素、ＴＢＥのゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の各ウェルにロードし、室温で、製造業者の指示に従い電気泳動した。ローディングダイであるＢＰＢがそのゲルの底部から２ｃｍの位置に達したときに電気泳動を停止した。各ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ  Ｄｙｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を１：２００に水で希釈した溶液に１０分間浸漬して染色した。染色後ゲルを蒸留水でリンスし、ＤＮＡのバンドをＴｙｐｈｏｏｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でスキャンして観察した。ゲルを実施例１と同様のパラメータを用いてスキャンした。
【００９５】
わずか３０秒後におけるｃＰＴ７ＩＶＳ１５  ＲＮＡ３５ライゲーション産物の出現、及びこのライゲーション産物が時間経過とともに強度の増加が観察されなかった事実は非常に急速な反応キネティクスを示唆するものである。
【００９６】
実施例６
ＥＤＴＡ又はクエン酸の添加による増幅収量の向上
まず本実施例のライゲーションで用いるオリゴを表８で概説するように混合した。表９で概説するようにライゲーション反応液をさらに調製した。ライゲーション液を混合し、３０℃で１５分間インキュベートした。ライゲーション番号１では０．５Ｍ  ＥＤＴＡを１μＬ添加し、一方ライゲーション番号２〜４では各々０．５Ｍ  ＥＤＴＡを２μＬ添加した。ライゲーション番号２〜４は一緒にプールし、十分混合した。
【００９７】
【表８】
0005420174.tif 000026
【００９８】
【表９】
0005420174.tif 000027
表１０で概説するように、ライゲーション反応液のアリコート及びＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて増幅を行った。すべての成分を混合し、３７℃で１時間インキュベートした。０．５Ｍ  ＥＤＴＡを２μＬ添加し、各反応を停止させた。
【００９９】
【表１０】
0005420174.tif 000028
７Ｍ  尿素、ＴＢＥの６％ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、実施例５で概説するようにゲル分析を行った。ＢＰＢ色素がゲルの底部に達するまで行った。図８はＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．２ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社））を用いて体積密度分析を測定し、四角形で表したゲルの蛍光を示す。ゲルを実施例１と同じそのパラメータを用いてスキャンした。結果を図４に示す。
【０１００】
驚くべきことに、鋳型ＲＮＡを用いた体積密度の増加によって証明されるようにクエン酸塩及びＥＤＴＡが増幅反応の収率を増加させることが観察された。結果より、ＤＮＡ鋳型の増幅反応の収率増加が観察された他の化合物はＲＮＡ鋳型の場合でも機能することが示唆される。これらの化合物としては、ポリアミン（米国特許出願公開第２００３／００７３２０２号）及びニトリロ三酢酸、ウラニル二酢酸、トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン−五酢酸、エチレングリコールビス（２−アミノエチル）エーテルジアミン四酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸及びそれらの塩（米国特許第６２６１７７３号）が挙げられる。さらに、適切な濃度で使えば、例えばイソクエン酸塩トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸及び（エチレン−ジオキシ）ジエチレンジニトリロ四酢酸などの金属イオンをキレート化する能力を有する他の化合物は増幅反応の収率を増加させると考えられる。
【０１０１】
実施例７
ＥＤＴＡ存在下での複製キネティクス
ＥＤＴＡの有無による増幅反応のキネティクスの検討を行った。さらに、すべての反応液中にビオチン−１１−ＵＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を添加した。表１１のＡからＣで概説するように、ライゲーション及び複製の反応溶液を調製した。ライゲーション液を混合し、３０℃で１５分インキュベートし、さらに６０℃で１０分間加熱し、リガーゼを失活させた。バルクの複製反応溶液を、ＥＤＴＡを含むものと含まないものとに調製した。各バルク混合液を２０μＬずつのアリコートとして、インキュベーション用の試験管に分注した。０時点では直接０．５Ｍ  ＥＤＴＡを各々１μＬずつ添加し、−８０℃で保存した。残りの試験管を３７℃で１、２、４、８又は１６時間インキュベートした。
０．５Ｍ  ＥＤＴＡを１μＬ添加して各反応を停止させ、ゲル分析（データ示さず）及び精製を行うまで−８０℃で保存した。各反応液をＭｉｃｒｏｃｏｎ（商標）ＹＭ−３０フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて製造業者の指示従い精製した。精製後、各反応液の一部の吸光度を２６０ｎｍで測定した。ＲＮＡ収率は吸光度測定値×希釈倍率×４０μｇ／ｍｌで算出した。
【０１０２】
【表１１】
0005420174.tif 000029
結果より、ＲＮＡ収率が数時間にわたって増加し、さらにＲＮＡ収率がＥＤＴＡ存在下で８、１６時間の時点で増加することが示された。
【０１０３】
実施例８
複製産物のＨＰＬＣ分析
ライゲーションに基づくＲＮＡ増幅反応産物を２つの異なるＲＮＡエキソヌクレアーゼによる同時処理をを行ってＨＰＬＣ分析した。増幅ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）１０μｇを、２μｇのヘビ毒ホスホジエステラーゼ及び０．６ユニットの細菌アルカリホスファターゼ（共にＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用い、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ８及び１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で、３７℃で６時間処理した。さらに対照として各ヌクレオシド三リン酸塩  ４ｍＭ溶液を消化した。消化後、６０μＬの反応液を水で１２０μＬにし、０．２μｍのナイロン製のＡｃｒｏｄｉｓｃ（商標）シリンジフィルター（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて精製し、タンパク質を除去した。各消化物を２０〜４０μＬずつ、ＸＴｅｒｒａ（登録商標）ＭＳ  Ｃ１８  ５μｍ  ４．６×１００ｍｍカラム（水）に接続しているＨＰＬＣに注入し、表１２記載の緩衝液勾配プロフィールとした。緩衝液Ａは０．１％のトリエチルアンモニウム酢酸塩（アプライドバイオシステム社）とし、緩衝液Ｂはアセトニトリル（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）とした。
【０１０４】
【表１２】
0005420174.tif 000030
この溶媒システムを用いた場合、ヌクレオシド溶出の順序は早いものからＣ、Ｕ、Ｇ及びＡであった。最初の消化データは３７℃で１４時間のインキュベーションによる実施例６の反応２で概説するように、ライゲーション及び増幅反応を行うと非特異産物が合成されることを示した。この非特異産物はＤＮＡ鋳型を用いて行う対照の反応と比較してＡ及びＵのヌクレオシド含量が多かった。
【０１０５】
結果は実施例８の消化されたＲＮＡの２分から１２分の間のＨＰＬＣトレースを示す。Ａ．ヌクレオシドのみ（溶出時間における対照として用いる）Ｂ．ＤＮＡ鋳型を用いた対照反応 Ｃ．Ａ及びＵを高含有する非特異産物を示すライゲーションに基づくＲＮＡ増幅物質。
【０１０６】
ライゲーションに基づくＲＮＡ増幅反応にビオチン−１１−ＵＴＰ又はＣｙ５−ＵＴＰのいずれを添加しても、非特異産物の高いＵのピークの減少が観察された。
【０１０７】
ビオチン−１１−ＵＴＰを添加した場合の、ＲＮＡエキソヌクレアーゼで消化されたライゲーションに基づくＲＮＡ増幅反応の高いＵピークの減少。Ａ．Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ及びオリゴＰＴ３ｗ／Ｔ２４及びｃＰＴ３を用いて２５％ビオチン−１１−ＵＴＰのデータを得た。Ｂ．Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて５０％Ｃｙ５−ＵＴＰのデータを得た。
【０１０８】
ＲＮＡエキソヌクレアーゼ消化物において観察されたＡピークの高さを減少させる試みにおいて、多くのＮＴＰアナログをライゲーションに基づくＲＮＡ増幅反応で試験した。アナログは非アナログヌクレオシドの減少を伴いながら１００％〜２０％の間の濃度で置換される。例えばヌクレオチドアナログで２５％の濃度で置換する場合、その対応するヌクレオチドは７５％まで濃度が低下する。試験した様々なアナログ及び濃度（表１３）のうち、２′−アミノ−２′−デオキシアデノシン−５′−三リン酸及び２−アミノアデノシン−５′−三リン酸（ジアミノプリン；ＤＡＰ）のみにおいて非特異産物の高いＡピークの減少を観察した。
【０１０９】
【表１３】
0005420174.tif 000031
Ａ：７５％の２′−アミノ−２′−デオキシアデノシン−５′−三リン酸塩（及び２５％のＡＴＰ）又はＢ：５０％ジアミノプリン（及び５０％のＡＴＰ）の置換を含むライゲーションに基づくＲＮＡ増幅反応物を、ヘビ毒気ホスホジエステラーゼ及び細菌アルカリホスファターゼで消化した際、高いＡピークの減少を観察した ＣはこのＨＰＬＣ溶媒システムでＤＡＰのみが移動したことを示す。
【０１１０】
理論に束縛される訳ではないが、ライゲーションに基づくＲＮＡ増幅反応生成物におけるポリＡポリＵの非特異産物の合成において２つの局面、すなわち１）ｍＲＮＡポリＡテールを転写してポリＵ  ＲＮＡ生成物を生成させるときにＲＮＡポリメラーゼがスリップする局面と、２）ポリＵ  ＲＮＡがポリＡ  ｍＲＮＡテールと共にデュプレックス又はトリプレックスを形成し、ＲＮＡポリメラーゼの鎖をスイッチし、ポリＵ鋳型を転写し、ポリＡ  ＲＮＡの生成を可能にする局面が存在したことが考えられる。ポリｄＡ分子を添加してハイブリダイズさせ、鎖のスイッチング反応からポリＵを除去することによって、非特異的なＡピークが消失すると予測した。
【０１１１】
得られたｃＲＮＡのＲＮＡエキソヌクレアーゼ消化及びＨＰＬＣ分析によって示すように、反応液に６μｇのポリｄＡ２０を添加することで非特異的Ａピークの減少を観察した。ピーク領域をグラフ化前にＣで標準化した。対照：ビオチン−ＵＴＰ又はｄＡ２０を含まない反応＋Ｂ−ＵＴＰ：２５％  ビオチン−ＵＴＰを含む反応＋Ｂ−ＵＴＰ＋ｄＡ２０：２５％  ビオチン−ＵＴＰ及び６μｇのポリｄＡ２０を含む反応
さらに、反応液に低い濃度の変性剤を添加したとき、結果として生じるポリＡの合成の減少と共にポリＵ生成物の鋳型ＲＮＡへのアニーリングが妨害されることも示唆される。ライゲーションに基づくＲＮＡ増幅反応に０．０００５％のＳＤＳを存在させ、ＲＮＡエキソヌクレアーゼ消化を用い、ＨＰＬＣ分析した結果を得た。ＲＮＡエキソヌクレアーゼによるｃＲＮＡ消化及びＨＰＬＣ分析が示すように、反応液に０．０００５％のＳＤＳを添加することで非特異的Ａピークが減少する結果が示された。
【０１１２】
実施例９
転写産物のマイクロアレイ分析
ラットの腎臓及び肝臓由来の全ＲＮＡ（Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒ）を用いて表１４で概説するようにライゲーション液Ａ及びＢを調製した。成分を混合し、室温で２分間インキュベートした。ライゲーション液Ｌ１及びＬ２は各々１μＬのλエキソヌクレアーゼ（２０ユニット／μＬ、５０ユニット／μＬから１×ライゲーション緩衝液（ＮＥＢ）で希釈）を含み、一方ライゲーション液Ｌ３及びＬ４では各々３μＬのλエキソヌクレアーゼを添加（Ｔ７遺伝子６タンパク質もここに添加；データ示さず）した。すべてのライゲーション液をさらに３７℃で３０分間インキュベートした。ライゲーション液Ｌ１及びＬ２各々に０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（Ａｍｂｉｏｎ社）を１．６μＬ添加し、一方ライゲーション液Ｌ３及びＬ４各々に０．５Ｍ  ＥＤＴＡを４．８μＬ添加した。ライゲーション液をさらに６５℃で１５分間インキュベートし、混合液中のすべての酵素を熱で失活させた。これらの操作の後、Ｌ１及びＬ２では全量が各々１６．５μＬ、又はＬ３及びＬ４では各々４９．５μＬであり、ＥＤＴＡ濃度は各々同様に４８．４８ｍＭであった。
【０１１３】
【表１４】
0005420174.tif 000032
表１４において調製するライゲーション材料を用いて、表１５で概説する反応液を調製した。反応液に用いる試薬は１０×緩衝液以外はＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ，Ｍａｎｕａｌ  Ｐｒｅｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）のものを用いた。本実施例で用いる１０×緩衝液の組成は、４００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０（Ａｍｂｉｏｎ社）、３００ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ａｍｂｉｏｎ社）、１００ｍＭ  ジチオスレイトール（ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社）及び２０ｍＭ  スペルミジン（ＳＩＧＭＡ社）である。ＮＴＰｓの８×マスター混合物、ビオチン−１１−ＵＴＰ、１０×緩衝液、ｄＡ２０及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを表１５Ａのマスター混合物の１×組成に基づいて調製した。このマスター混合物をさらに表１５Ｂの反応液で概説するように分割した。各反応液を３７℃で１４時間インキュベートした。
【０１１４】
【表１５】
0005420174.tif 000033
インキュベーション終了後、各反応液を製造業者の指示に従ってＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。各反応のアリコートを１：７．５（Ｌ１及びＬ２）又は１：３０（Ｌ３〜Ｌ６）で水で希釈し、２６０ｎｍ吸収度を測定した。図１６はＡ２６０の１単位のＲＮＡが４０μｇ／ｍＬの物質を含むと仮定したときの、各反応から得たｃＲＮＡ収量を示す。
【０１１５】
結果は実施例９の反応から得られたｃＲＮＡの収率を示す。
【０１１６】
反応液Ｌ３〜Ｌ６から４μｇを、又はＬ１及びＬ２からできるだけ多くのμｇ数をハイブリダイゼーション用に調製し、ＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）ＡＤＭＥ  Ｒａｔ  Ｂｉｏａｒｒａｙ′ｓ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に、「ＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：１６−Ａｓｓａｙ  Ｂｉｏａｒｒａｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」（ｒｅｖ．ＡＡ／２００４−０７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社））中の製造業者の指示に従いハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは２５０ｒｐｍで振動しながら３７℃で１９時間以上インキュベートした。ハイブリダイゼーション終了後、各チャンバーを４６℃の２５０μＬの０．７５×ＴＮＴ緩衝液（１×ＴＮＴ緩衝液は０．１Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）で３回洗浄した。洗浄後、４６℃の２５０μＬの０．７５×ＴＮＴ緩衝液を各チャンバーに添加し、スライドをシールし、１０分間以内の時間で４６℃にてインキュベートした。０．７５×ＴＮＴ緩衝液を除去し、表１６で概説するように調製した各チャンバーをＣｙ５−ストレプトアビジン複合体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を含むＴＮＢ緩衝液２５０μＬで１度洗浄した。ＴＮＢ緩衝液の組成は０．１Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び０．５％  ＮＥＮ  ブロッキング試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）である。洗浄後、Ｃｙ５−ストレプトアビジン複合体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を含むＴＮＢ緩衝液を２５０μＬずつ各チャンバーに添加し、スライドをシールし、室温にて３０分間暗所でインキュベートした。
【０１１７】
【表１６】
0005420174.tif 000034
Ｃｙ５−ストレプトアビジンのコンジュゲート後、各チャンバーを室温で０．７５×ＴＮＴ緩衝液２５０μＬで３回洗浄した。最後の洗浄後に各チャンバーに室温で０．７５×ＴＮＴ緩衝液を２５０μＬ添加し、スライドをシールし、暗所にて室温で２０分間インキュベートした。最後の洗浄を０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有する０．１×ＳＳＣ緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ社）２５０μＬで行った。この洗浄液を各チャンバーに添加し、直ちに除去した。スライドを乾燥し、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｅｎｅＰｉｘ（商標）４０００Ｂアレイスキャナーを用い、”ＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：１６−Ａｓｓａｙ  Ｂｉｏａｒｒａｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”ｒｅｖ．ＡＡ／２００４−０７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に概説されるようにスキャンした。図１７は実施例９のハイブリダイゼーションの結果を示す。図５は以下を示す。上段：左から右に、腎臓全ＲＮＡ（ライゲーション液にリガーゼ無添加）（Ｔ１）、肝臓全ＲＮＡ（ライゲーション液にリガーゼ無添加）（Ｔ２）。中段：左から右に、リガーゼ添加腎臓全ＲＮＡ（反応液にＳＤＳ無添加）（Ｔ３）、リガーゼ添加腎臓全ＲＮＡ（反応液にＳＤＳ添加）（Ｔ４）。下段：左から右に、リガーゼ添加肝臓全ＲＮＡ（反応液にＳＤＳ無添加、）（Ｔ５）、リガーゼ添加肝臓全ＲＮＡ（反応液にＳＤＳ添加）（Ｔ５）。注意：すべてのバイオアレイデータをこの図に示さない。
【０１１８】
製造業者の指示にしたがい、ＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用い、ＡＤＭＥ  Ｒａｔ  Ｂｉｏａｒｒａｙｓにてシグナル強度を測定した。アレイ間での平均標準化シグナル強度及びそれに由来する比率を用いて発現レベルを比較した。該比率は腎臓及び肝臓の全ＲＮＡ試料間での差分発現レベルの測定にも用いた。これらの比較図を図６に示す。
【０１１９】
実施例１０
ストレプトアビジンビーズを用いたｍＲＮＡ精製
表１７で概説するようにライゲーション液を調製し、混合し、室温で２分間インキュベートした。λエキソヌクレアーゼを４μＬずつ各試験管に添加し、反応液を３７℃で１５分間インキュベートした。各試験管に０．５Ｍ  ＥＤＴＡを６．４μＬ添加し、反応液を６５℃で１５分間インキュベートした。精製するライゲーション液ごとに、１００μＬのＭＰＧストレプトアビジン磁気粒子（ＰｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ  ＬＬＣ社）を、製造業者の指示にしたがい、２Ｍ  ＫＣｌを１００μＬずつ添加して洗浄し、さらに２Ｍ  ＫＣｌを１００μＬ及び水を８２．５μＬずつ添加し再懸濁した。洗浄した磁気ビーズの各１８２．５μＬの調製液に適切なライゲーション液１７．５μＬを添加し、随時穏やかに混合しながら室温で１５分間インキュベートした。磁石を用いてビーズを液相から分離し、各々２００μＬの７０％エタノールで二度洗浄した。各ビーズペレットを水５０μＬに再懸濁し、６５℃で３分間加熱した。磁石を用いてビーズを液相から再び分離し、その液相を次の分析のために保存した。
【０１２０】
【表１７】
0005420174.tif 000035
精製の前後の試料における核酸濃度（ＤＮＡ及びＲＮＡ）を、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）ＲＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）用いて測定した。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎをＴＥ緩衝液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）で１：２００に希釈した。キットのリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）スタンダードを表１８で概説するようにＴＥ緩衝液で１：５０で希釈し、標準曲線を作成した。各々の前後試料１７．５μＬを８２．５μＬのＴＥ緩衝液と混合して希釈した。希釈された各試料１０μＬをさらに９０μＬのＴＥ緩衝液及び１００μＬのＲｉｂｏＧｒｅｅｎと混合した。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ及び標準曲線の希釈試料の吸収度を、製造業者によるフルオレセイン用のデフォルト設定により、ＦＡＲＣｙｔｅ（商標）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて測定した。
【０１２１】
【表１８】
0005420174.tif 000036
実施例１１
ＲＮａｓｅＨによるポリ（Ａ）テールのトリミング
この実験のワークフローは以下の通りである：１）ＲＮａｓｅＨ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社；１０ユニット／μＬ）を用いたｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールの標的トリミング ２）トリミングされたポリ（Ａ）ｍＲＮＡのライゲーションに基づく増幅、及び３）ＲＮＡエキソヌクレアーゼ消化及びＨＰＬＣ分析のための特定の反応液の選択。ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールのトリミングはＲＮａｓｅＨ存在下でｍＲＮＡ又は全ＲＮＡ（Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒ）を、各反応液でオリゴＨＴ−ＩＩＩ  １０ｃ、ＨＴ−ＩＩＩ  １０ｄ、ＨＴ−ＩＩＩ  １０ｆ又はＨＴ−ＩＩＩ１０ｇと混合して行った。ＲＮａｓｅＨ消化のための代表的な組成を表１９に示す。ＲＮａｓｅＨを１×ライゲーション緩衝液で２．５Ｕｎｉｔｓ／μＬに希釈し、３７℃で３０分間消化を実施した。
【０１２２】
【表１９】
0005420174.tif 000037
各ＲＮａｓｅＨ消化物から５μＬを用い、大まかに表２０の反応条件を用い、それぞれ、同様にラベルしたライゲーションに基づくＲＮＡ増幅反応を行った。ライゲーション液を室温で１５分間インキュベートし、さらに各々に１μＬ（５Ｕｎｉｔｓ）のλエキソヌクレアーゼを添加した。３７℃で３０分インキュベートした後、各ライゲーション液に１２９ｍＭ  ＥＤＴＡを１μＬ添加し、６５℃で１５分間さらにインキュベートした。各々２μＬを実施例５のゲル電気泳動で分析するとき、大まかに表２０で概説するように反応液を調製し、３７℃で１６時間インキュベートした。
【０１２３】
【表２０】
0005420174.tif 000038
ゲル電気泳動の結果は、表１９のポリ（Ａ）トリミング反応にＲＮａｓｅＨを添加することにより高分子量の転写生成物の増加を示した。これらの結果より、すべてのオリゴが精製ＲＮＡ及びＲＮＡ混合物においてｍＲＮＡからのポリ（Ａ）テールのトリミングができることが示された。さらに、捕捉オリゴＨＴ−ＩＩＩ  Ｂ５及びｃｐＴ７′−ＩＲ１５−（ＮｏＡ）５′Ｐはハイブリダイズし、ライゲーションし、この修飾ｍＲＮＡを転写できた。
【０１２４】
実施例８で概説するように、代表的な反応からの精製物をＲＮＡエキソヌクレアーゼで消化し、ＨＰＬＣで分析した。これらの消化物に含まれるものには反応に由来する精製物が含まれ、ｍＲＮＡからのポリ（Ａ）テールのトリミングがされていなかった（「対照」とラベルした）。図８はこのＨＰＬＣ分析の結果のグラフである。
【０１２５】
図８の結果からｍＲＮＡからのポリ（Ａ）テールのトリミングが転写の間高分子量のアーティファクトの生成を防止することが証明された。さらに、実施例１１のように調製される材料はマイクロアレイハイブリダイゼーション試験（示されないデータ）において機能的に活性を示した。
【０１２６】
当業者にとって、ｍＲＮＡの（Ａ）ポリテールのサイズが上記の方法で測定できることは自明である。ＲＮａｓｅＨのニッキング活性がｍＲＮＡの５′末端に向けて３塩基移動する場合、ｍＲＮＡにはメッセージ−ポリ（Ａ）テールの接合部でニックが入れられると考えられる。さらにポリ（Ａ）テールの鎖長は高いパーセンテージ（２０〜３０％）のポリアクリルアミドによる変性ゲル電気泳動によって測定できる。
【０１２７】
本明細書に記載したすべての特許、特許公報及び他の公表された参考文献は各々が本明細書において個々に具体的に引用された場合と同様に、全開示内容が援用により本明細書の一部をなす。好ましい本発明の実施例を記載したが、それらは例示のみを目的として示しており、限定的なものではなく、当業者であれば記載されている実施例以外の方法で本発明を実施できると考えられる。本発明は以下によってのみその範囲を限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】最初のライゲーション及びそれに続く転写反応を示す概略図。
【図２】追加のライゲーション及び転写反応を示す概略図。
【図３】ｃＤＮＡの調製方法を示す概略図。
【図４】体積密度測定値の結果。
【図５】様々な組織由来のアレイによるハイブリダイゼーションの結果。
【図６】チャート形式による図５の結果。
【図７】精製前後におけるＤＮＡ及びＲＮＡの結果。
【図８】エキソヌクレアーゼで消化したｃＲＮＡのＨＰＬＣ分析の結果。すべての結果を「Ｃ」で標準化した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0005420174.tif 000044
【図７】
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【図８】
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【配列表】
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