(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）またはＢ−ＣＬＬを発症するリスクを検出する方法であって、該対象由来の試験試料における少なくともｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂ遺伝子産物のレベルを測定することを含み、ここで試験試料のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを対照試料の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比較した減少が、対象におけるＢ−ＣＬＬまたはＢ−ＣＬＬを発症するリスクのいずれかを表す、前記方法。
【請求項２】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルがノーザンブロット解析を使用して測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象における２つ以上の予後マーカーに関連したＢ−ＣＬＬを検出する方法であって、対象に由来するＢ−ＣＬＬ試料における少なくともｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂ遺伝子産物のレベルを測定することを含み、試験試料のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを対照試料の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比較した変化が、対象における２つ以上の予後マーカーに関連したＢ−ＣＬＬを表す、前記方法。
【請求項４】
対象におけるＢ−ＣＬＬまたはＢ−ＣＬＬを発症するリスクを検出する方法であって、以下：
（１）対象から得られた試験試料からＲＮＡを逆転写して、１組の標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供すること；
（２）ｍｉＲＮＡ−特有プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに標的オリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズし、試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを提供すること；および
（３）試験試料ハイブリダイゼーションプロファイルと対照試料から生み出されたハイブリダイゼーションプロファイルを比較すること；
を含み、
ここで、少なくともｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂのシグナルのダウンレギュレーションが、対象におけるＢ−ＣＬＬまたはＢ−ＣＬＬを発症するリスクを表す、前記方法。
【請求項５】
対象における２つ以上の有害な予後マーカーに関連するＢ−ＣＬＬまたは２つ以上の有害な予後マーカーに関連するＢ−ＣＬＬを発症するリスクを検出する方法であって、以下：
（１）対象から得られた試験試料からＲＮＡを逆転写して、１組の標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供すること；
（２）ｍｉＲＮＡ−特有プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに標的オリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズし、試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを提供すること；および
（３）試験試料ハイブリダイゼーションプロファイルと対照試料から生み出されたハイブリダイゼーションプロファイルを比較すること；
を含み、
ここで、少なくともｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂのシグナルのダウンレギュレーションが対象が癌または癌を発症するリスクのいずれかを表す、前記方法。
【請求項６】
Ｂ−ＣＬＬを治療するための医薬組成物であって、少なくともｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂ遺伝子産物および薬剤的に受容できるキャリアを含む、前記医薬組成物。
【請求項７】
少なくとも２つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物が、適切な対照細胞に比較してＢ−ＣＬＬ細胞においてダウンレギュレーションされているｍｉＲ遺伝子産物に対応する、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
抗−Ｂ−ＣＬＬ剤を同定する方法であって、細胞に試験薬剤を提供すること、およびＢ−ＣＬＬ細胞における減少した発現レベルに関連した少なくともｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂ遺伝子産物のレベルを測定することを含み、ここで適切な対照細胞に比較した該細胞におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルの増加が、試験薬剤が抗‐Ｂ−ＣＬＬ剤であることを表す、前記方法。
【請求項９】
対象における侵襲性慢性リンパ球性白血病または侵襲性慢性リンパ球性白血病を発症するリスクを検出する方法であって：
ヒト対象由来の試験試料におけるＴ−細胞白血病／リンパ腫１（Ｔｃｌ−１）癌遺伝子発現のレベルを測定すること、および
該対象由来の試験試料におけるｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂ遺伝子産物のレベルを測定すること、
を含み、ここで、対照試料のいずれかのＴｃｌ−１癌遺伝子発現のレベルと比較した、試験試料のＴｃｌ−１癌遺伝子発現のレベルの増加、および対照試料の対応するｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂ遺伝子産物のレベルと比較した、試験試料のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの減少は、該対象が侵襲性慢性リンパ球性白血病に罹患しているかまたは侵襲性慢性リンパ球性白血病を発症するリスクがあるかのいずれかを示す、前記方法。
【請求項１０】
ヒト対象が緩徐進行性（indolent）慢性リンパ球性白血病またはそれを発症するリスクを有するかを検出し、そして侵襲性第１１染色体正常白血病から緩徐進行性慢性リンパ球性白血病を識別するための指標を提供する方法であって、以下：
緩徐進行性慢性リンパ球性白血病を有するか、発症しつつあることが疑われる患者由来の試験試料中のｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂ遺伝子産物レベルを測定し、そして
当該試験試料におけるｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂ遺伝子産物レベルを、侵襲性第１１染色体正常白血病の対照試料におけるｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂ遺伝子産物レベルと比較する、
ことを含み、ここで当該対照試料と比較した当該試験試料における増加したｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂ遺伝子産物レベルは、当該ヒト対象が緩徐進行性慢性リンパ球性白血病またはそれを発症するリスクを有することを示すまたは識別する指標を提供する、前記方法。
【請求項１１】
ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂ遺伝子産物レベルがノーザンブロット解析を使用して測定される、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願に対する相互参照
該当無し（Ｎ／Ａ）。
政府援助
本発明はＮＩＨ  Ｇｒａｎｔ／Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＰＯ１  ＣＡ８１５３４から得た補助金によって、すべてまたは一部が援助された。政府は本発明にある程度の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）は、米国において毎年およそ１０，０００の新規な症例の原因となる、世界で最も一般的なヒト白血病である１。ＴＣＬ１（Ｔ−細胞白血病／リンパ腫１）癌遺伝子は、成熟Ｔ−細胞白血病において１４ｑ３１．２で頻発する染色体再配列の標的として発見された２。以前に、Ｂ−細胞においてＴＣＬ１を発現するトランスジェニックマウスはＢ−ＣＬＬを発症することが報告された３。本発明者はＴＣＬ１がＢ−およびＴ−細胞における抗アポトーシスシグナルの伝達において重要な分子であるＡｋｔ腫瘍性タンパク質のコアクチベーターであることも現在示している４ため、本発明者はＴＣＬ１の脱制御がＢ−ＣＬＬの病因における原因となる事象であると現在考えている。
【０００３】
最近の報告は、ヒトＣＬＬにおける高度なＴＣＬ１発現が突然変異していないＶＨ状態およびＺＡＰ７０陽性率と相関することを示唆し、ＴＣＬ１が引き起こすＣＬＬがＢ−ＣＬＬの悪性度の高い形状であることを示唆する５。ヒトＢ−ＣＬＬの予後不良に関連する最も重要な遺伝因子の１つは、染色体１１ｑ欠失である６。
【０００４】
マイクロＲＮＡは一時的で、組織特有の遺伝子制御に関与すると考えられている高度に保存された非コーディング遺伝子の大きなファミリーである７。我々は最近、マイクロＲＮＡ発現プロファイルを使用して正常なＢ細胞を悪性Ｂ−ＣＬＬ細胞と識別しうること、およびマイクロＲＮＡシグネチャーが慢性リンパ球性白血病の予後および進行に関連することを証明した８、９。
【０００５】
現在、Ｂ−ＣＬＬの治療または予防のための一般的な首尾よい方法は入手できない。治療の方針は、特有の腫瘍マーカーの解析を含む、多様な予後パラメーターを基礎にしてしばしば選択される。
【０００６】
相当な量のＢ−ＣＬＬに対する療法の研究にもかかわらず、ＣＬＬを診断し、効果的に治療することは難しいままであり、患者において観察された死亡率は、該疾患の診断、治療および予防に改善が必要であることを示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、一部、正常な対照細胞に比較して乳癌細胞において異なって発現される、慢性リンパ球性白血病ｍｉＲＮＡの癌特異的シグネチャー確認を基礎にする。
【０００８】
従って、本発明は対象由来の試験試料における少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む、対象が慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）に罹患しているか、またはそれを発症するリスクがあるかどうかを診断する方法を包含し、ここで試験試料のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを対照試料の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比較した変化は、対象がＢ−ＣＬＬに罹患しているか、またはそれを発症するリスクがあるかのいずれかであることを表す。
【０００９】
ある態様では、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−１８１である。ある態様では、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２９ｂおよび／またはｍｉＲ−１８１ｂである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、当業者に周知である多様な技術を使用して測定することができる。一態様では、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルはノーザンブロット解析を使用して測定される。別の態様では、試験試料の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは対照試料の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルより少ない。また、別の態様では、試験試料の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは対照試料の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルより多くなりうる。
【００１１】
本発明はまた、対象のＢ−ＣＬＬ試料における少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む、対象における１つ以上の予後マーカーに関連したＢ−ＣＬＬを診断する方法を提供し、ここで試験試料の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを対照試料の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比較した変化は、対象が１つ以上の予後マーカーに関連したＢ−ＣＬＬに罹患していることを表す。一態様では、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対象から得られた試験試料からＲＮＡを逆転写して、１組の標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供すること；ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに標的オリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズし、試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを提供すること；および試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルと対照試料から生み出されたハイブリダイゼーションプロファイルを比較することによって測定される。少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルの変化は、対象がＢ−ＣＬＬに罹患しているか、またはそれを発症するリスクがあるかのいずれかであることを表す。
【００１２】
本発明はまた、対象においてＣＬＬを治療する方法を包含し、ここでは少なくとも１つのｍｉＲＮＡシグナルは対照試料から生み出されたシグナルに比較して脱制御（たとえば、ダウンレギュレーション、またはアップレギュレーション）されている。
【００１３】
ある態様では、マイクロアレイはｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−１８１およびその組み合わせからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含む。
【００１４】
本発明はまた、対象から得られた試験試料からＲＮＡを逆転写して、１組の標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供すること；ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに標的オリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズし、試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを提供すること；および試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルと対照試料から生み出されたハイブリダイゼーションプロファイルを比較することによって、対象が対象における１つ以上の有害な予後マーカーに関連したＢ−ＣＬＬに罹患しているか、またはそれを発症するリスクがあるかどうかを診断する方法を包含する。シグナルにおける変化は対象が癌に罹患しているか、またはそれを発症するリスクがあるかのいずれかであることを表す。
【００１５】
本発明はまた、Ｂ−ＣＬＬに罹患している対象のＢ−ＣＬＬを治療する方法を包含し、ここでは、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が対照細胞に比較して対象の癌細胞におい
て、ダウンレギュレーションされているか、またはアップレギュレーションされている。少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が癌細胞においてダウンレギュレーションされている場合、方法は有効量の少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物を対象に投与して、対象における癌細胞の増殖を阻害することを含む。少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が癌細胞においてアップレギュレーションされている場合、方法は少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害するための有効量の少なくとも１つの化合物を対象に投与して、対象における癌細胞の増殖を阻害することを含む。ある態様では、少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−１８１、およびその組み合わせから選択される。
【００１６】
関連する態様では、本発明は対象においてＢ−ＣＬＬを治療する方法を提供し、該方法は対照細胞に比較して、Ｂ−ＣＬＬ細胞内の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物の量を確定すること；および癌細胞内で発現されたｍｉＲ遺伝子産物の量が対照細胞内で発現されたｍｉＲ遺伝子産物の量より少ない場合、有効量の少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物を対象に投与すること；または癌細胞内で発現されたｍｉＲ遺伝子産物の量が対照細胞内で発現されたｍｉＲ遺伝子産物の量より多い場合、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害するための有効量の少なくとも１つの化合物を対象に投与して、対象における癌細胞の増殖を阻害することによってＢ−ＣＬＬ細胞内に発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量を変化させることを含む。ある態様では、少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−１８１、およびその組み合わせからなる群から選択される。
【００１７】
本発明はさらに、少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物および薬剤的に受容できるキャリアを含む、Ｂ−ＣＬＬを治療するための医薬組成物を提供する。特定の態様では、医薬組成物は、適切な対照細胞に比較して、Ｂ−ＣＬＬ細胞においてダウンレギュレーションされているｍｉＲ遺伝子産物に対応する少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物を含む。特定の態様では、医薬組成物はｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−１８１、およびその組み合わせからなる群から選択される。別の特定の態様では、医薬組成物は少なくとも１つのｍｉＲ発現阻害化合物および薬剤的に受容できるキャリアを含む。さらに、特定の態様では、医薬組成物は適切な対照細胞に比較して、Ｂ−ＣＬＬ細胞においてアップレギュレーションされているｍｉＲ遺伝子産物に対して特異的な少なくとも１つのｍｉＲ発現阻害化合物を含む。
【００１８】
他の態様では、本発明は細胞に試験薬剤を提供すること、およびＢ−ＣＬＬ細胞において減少した発現レベルに関連した少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む、抗Ｂ−ＣＬＬ剤を同定する方法を提供し、ここで適切な対照細胞に比較した該細胞におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルの増加は、試験薬剤が抗Ｂ−ＣＬＬ剤であることを表す。ある態様では、ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−１８１、およびその組み合わせからなる群から選択される。
【００１９】
本発明はまた、細胞に試験薬剤を提供すること、およびＢ−ＣＬＬ細胞において増加した発現レベルに関連した少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む、抗Ｂ−ＣＬＬ剤を同定する方法を提供し、ここで適切な対照細胞に比較した該細胞におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルの減少は、試験薬剤が抗Ｂ−ＣＬＬ剤であることを表す。ある態様では、ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−１８１、およびその組み合わせからなる群から選択される。
【００２０】
本発明の種々の目的および利点は、添付の図面の観点から読む場合、以下の好ましい態様の詳細な説明から当業者には明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１−１】図１ａ〜図１ｆ−ＴＣＬ１発現はｍｉＲ２９およびｍｉＲ１８によって制御される。図１ａ−ＣＬＬにおけるＴＣＬ１発現。レーン１〜８：ＣＬＬ試料。レーン２および６：ＴＣＬ１発現は低いと評価された。他のレーンのＴＣＬ１発現はすべて、高い〜非常に高いと評価された。図１ｂ−３つのＢ−ＣＬＬ群におけるＴＣＬ１発現。縦棒は示されたＢ−ＣＬＬ試料の相対数を表す。図１ｃ−ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂならびにＴＣＬ１の３’ＵＴＲの配列アラインメント。
【図１−２】図１ｄ−ルシフェラーゼアッセイにおけるｍｉＲ−２９およびｍｉＲ−１８１標的ＴＣＬ１発現。ｍｉＲ−２９ルシフェラーゼアッセイの場合、ｍｉＲ−２９に相補的な領域を含むＴＣＬ１  ｃＤＮＡのフラグメント（Ｔｃｌ１）を、ルシフェラーゼの終止コドンからすぐ下流のＸｂａＩ部位を使用して、示したような＊＊を含むｐＧＬ３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）コンストラクトまたはｐＧＬ３ベクター単独に挿入した。ｍｉＲ−１８１アッセイの場合、センス（Ｔｃｌ１ＦＬ）またはアンチセンス（Ｔｃｌ１ＦＬＡＳ）オリエンテーションにおいて、全長ＴＣＬ１  ｃＤＮＡをｐＧＬ３ベクターに挿入した。２９３細胞は、示したようなｍｉＲ−２９ｂまたはスクランブル陰性対照、および示したようなｍｉＲ−２９に相同な領域（Ｔｃｌ１）を含むＴＣＬ１ｃＤＮＡの一部を含むｐＧＬ３コンストラクトまたはｐＧＬ３ベクター単独でコトランスフェクションした。ｍｉＲ−１８１アッセイの場合、ＴＣＬ１ＦＬまたはＴＣＬ１ＦＬＡＳはｍｉＲ−１８１によりコトランスフェクションした。ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性は二重ルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりアッセイされ、製造業者の勧めに従ってホタルルシフェラーゼ活性はウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して標準化した。すべての実験はトリプリケートで実行した。図１ｅ−ＴＣＬ１タンパク質発現に対するｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂの効果。２９３細胞はｐｃＤＮＡ３ＴＣＬ１ｆｌ（全長ＴＣＬ１ｃＤＮＡを含む哺乳動物発現ベクター）単独でトランスフェクションする（レーン１）か、またはｐｃＤＮＡ３ＴＣＬ１ｆｌとｍｉＲ−２９ｂ（レーン２）、プレ‐ｍｉＲ陰性対照（レーン３）またはｍｉＲ−１８１ｂ（レーン４）でコトランスフェクションした。ＴＣＬ１発現は抗ＴＣＬ１抗体を使用してウェスタンブロットにより検出した。図１ｆ−マイクロアレイによる、ＴＣＬ１タンパク質発現とｍｉＲ−１８１ｂおよびｍｉＲ−２９ｂとの相関。値はマイクロＲＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーションシグナルを表す。
【図２】図２ａ及び２ｂ−代表的なＣＬＬ試料のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析。ｍｉＲ−１８１とｍｉＲ−２９両方の発現が高い３つの試料（２５、３７および４１）と発現が低い４つの試料（５５、５６、７２および８１）を選択した。製造業者のプロトコルに従って、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−２９ｃに対してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析（ＡＢＩ）を実行した。すべての実験はトリプリケートで実行した。
【図３】図３は、ＣＬＬサブタイプを識別する統計的に有意なマイクロＲＮＡを示す表１を含む。
【図４−１】図４ａ〜４ｄはＣＬＬ試料情報を含む：図４ａはＣＬＬ試料情報を含み；図４ｂは侵襲性ＣＬＬ情報を含む。
【図４−２】図４ｃは緩徐進行性（indolent）ＣＬＬ情報を含む。
【図４−３】図４ｄは１１ｑが欠失した侵襲性ＣＬＬを含む。発現されたＩｇＶＨ遺伝子の突然変異状態の測定およびＺＡＰ−７０のイムノフェノタイピングは先に記載のように実施した（Ｒａｓｓｅｎｔｉ  ＬＺ，Ｈｕｙｎｈ  Ｌ，Ｔｏｙ  ＴＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００４；３５１：８９３−９０１）。ＦＩＳＨはＣＬＬパネルのための慣用のＶｙｓｉｓプローブを使用して実施した。これらのＦＩＳＨアッセイは以下の染色体異常（プローブのセット）を検出することができる：１１ｑ−および１７ｐ−（１１ｑ２３におけるＡＴＭおよび１７ｐ１３．１におけるＰ５３）、１３ｑ−およびトリソミー１２（１３ｑ１４におけるＤ１３Ｓ３１９、１３ｑ３４におけるＬＡＭＰ１およびセントロメア１２におけるＤ１２Ｚ３）。
【図５−１】図５は３種の型のＢ−ＣＬＬにおけるマイクロＲＮＡ発現の対比較を示す表２を含む。
【図５−２】表２の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、動物モデルを使用することによって実証されたように、ＴＣＬ１癌遺伝子の脱制御がこの疾患の侵襲性の形状の病因において原因となる事象であることを証明する。ＣＬＬにおけるＴＣＬ１制御の機序を研究するために、３種のＣＬＬ：緩徐進行性ＣＬＬ、侵襲性ＣＬＬおよび１１ｑ欠失を示す侵襲性ＣＬＬのマイクロＲＮＡ発現プロファイリングが実行された。それぞれのＣＬＬ群に対応する別個のマイクロＲＮＡシグネチャーが確認された。ＴＣＬ１発現は、ＣＬＬにおいて異なって発現される２つのマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−２９およびｍｉＲ−１８１によって制御されることがさらに確定された。一般に、ｍｉＲ−２９およびｍｉＲ−１８１の発現レベルは、検討されたＣＬＬ試料におけるＴＣＬ１発現と逆相関した。本明細書では、ＣＬＬにおけるＴＣＬ１発現は、少なくとも一部はｍｉＲ−２９およびｍｉＲ−１８１によって制御されること、およびこれらのｍｉＲＮＡはＴＣＬ１を過剰発現するＣＬＬにおける治療薬の候補であってもよいことが示される。
【００２３】
本明細書で交換可能に使用される、「ｍｉＲ遺伝子産物」、「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲ」、または「ｍｉＲＮＡ」は、ｍｉＲ遺伝子に由来する、プロセッシングさていれない、またはプロセッシングされたＲＮＡ転写物を表す。ｍｉＲ遺伝子産物はタンパク質に翻訳されないため、「ｍｉＲ遺伝子産物」という用語はタンパク質を含まない。プロセッシングされていないｍｉＲ遺伝子転写物は「ｍｉＲ前駆体」とも呼ばれ、典型的には長さ約７０〜１００ヌクレオチドのＲＮＡ転写物を含む。ｍｉＲ前駆体はＲＮアーゼ（たとえば、ダイサー、アルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔ）、または大腸菌ＲＮアーゼＩＩＩのようなＲＮアーゼＩＩＩ）による消化によって活性な１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子にプロセッシングされうる。この活性な１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子は、「プロセッシングされた」ｍｉＲ遺伝子転写物または「成熟した」ｍｉＲＮＡとも呼ばれる。
【００２４】
活性な１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子は天然のプロセッシング経路により（たとえば、無傷細胞または細胞溶解物を使用して）、または合成プロセッシング経路により（たとえば単離されたダイサー、アルゴノート、またはＲＮアーゼＩＩＩのような単離されたプロセッシング酵素を使用して）ｍｉＲ前駆体から得ることができる。活性な１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子はまた、ｍｉＲ前駆体からプロセッシングされることなく、生物学的または化学的合成によって直接生産することもできると理解される。
【００２５】
本発明は、対象由来の試験試料における少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定すること、および試験試料のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを対照試料の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比較することを含む、対象がＣＬＬに罹患しているか、またはそれを発症するリスクがあるかを診断する方法を包含する。本明細書で使用する「対象」は、乳癌に罹患しているか、または罹患していると疑われるいずれかの哺乳動物でありうる。特定の態様では、対象はＣＬＬに罹患しているか、または罹患していると疑われるヒトである。
【００２６】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対象から得られた生物学的試料中の細胞において測定することができる。たとえば、組織試料は慣用の生検技術によってＣＬＬに罹患していると疑われる対象から取り出すことができる。別の例では、血液試料は対象から取り出すことができ、白血球は標準技術によりＤＮＡ抽出のために単離できる。血液または組織試料は、好ましくは放射線療法、化学療法または他の治療的処置の開始前に対象から得られる。対応する対照組織または血液試料は、対象の冒されていない組織から、正常なヒト個体もしくは正常な個体の集団から、または対象の試料中の大部分の細胞に対応する培養した細胞から得ることができる。対照組織または血液試料は次に対象由来の試料と一緒にプロセッシングされて、その結果対象の試料由来の細胞における特定のｍｉＲ遺伝子から生産されたｍｉＲ遺伝子産物のレベルを、対照試料の細胞由来の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較することができる。
【００２７】
対象から得られた試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較した変化（すなわち、増加または減少）は、対象におけるＣＬＬの存在を表す。一態様では、試験試料中の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルより大きい（すなわち、ｍｉＲ遺伝子産物の発現が「アップレギュレーション」されている）。対象由来の細胞または組織試料中のｍｉＲ遺伝子産物の量が対照細胞または組織試料中の同じ遺伝子産物の量より多い場合、本明細書で使用するように、ｍｉＲ遺伝子産物の発現は「アップレギュレーション」されている。別の態様では、試験試料中の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルより少ない（すなわち、ｍｉＲ遺伝子産物の発現が「ダウンレギュレーション」されている）。対象由来の細胞または組織試料中のｍｉＲ遺伝子から生産されたｍｉＲ遺伝子産物の量が対照細胞または組織試料中の同じ遺伝子から生産された量より少ない場合、本明細書で使用するように、ｍｉＲ遺伝子の発現は「ダウンレギュレーション」されている。対照および正常試料中の相対的なｍｉＲ遺伝子発現は１以上のＲＮＡ発現標準物に関して確定することができる。標準物は、たとえばゼロｍｉＲ遺伝子発現レベル、標準細胞株におけるｍｉＲ遺伝子発現レベルまたは正常ヒト対照の集団に対して以前に得られたｍｉＲ遺伝子発現の平均レベルを含むことができる。
【００２８】
試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、生物学的試料中のＲＮＡ発現レベルを検出するために適したいずれかの技術を使用して測定することができる。生物学的試料に由来する細胞中のＲＮＡ発現レベルを確定するために適切な技術（たとえば、ノーザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）は当業者に周知である。特定の態様では、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルはノーザンブロット解析を使用して検出される。たとえば、全細胞ＲＮＡは核酸抽出バッファーの存在下でホモジェナイズし、その後遠心分離することにより細胞から精製することができる。核酸は沈殿し、ＤＮＡはＤＮアーゼおよび沈殿による処理により取り出される。次に、ＲＮＡ分子は標準技術に従ってアガロースゲル上のゲル電気泳動によって分離され、ニトロセルロースフィルターに移される。その後、ＲＮＡは加熱によりフィルター上に固定化される。特定のＲＮＡの検出および定量は、当該ＲＮＡに相補的な、適切に標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを使用して達成される。たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，編，２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，７章を参照されたい。その全開示は参照として援用される、
一定のｍｉＲ遺伝子産物のノーザンブロットハイブリダイゼーションに適切なプローブは当該一定のｍｉＲの核酸配列から生産することができる。標識されたＤＮＡおよびＲＮＡプローブの作製方法、および標的核酸配列に対するそのハイブリダイゼーションの条件は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，編，２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，１０および１１章に記載され、その開示は参照として本明細書に援用される。
【００２９】
たとえば、核酸プローブは、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、または３５Ｓのような放射性核種；重金属；または、標識されたリガンドに対する特異的結合メンバーとして機能しうるリガンド（たとえば、ビオチン、アビジンまたは抗体）、蛍光分子、化学発光分子、酵素などにより標識されうる。
【００３０】
プローブは、Ｒｉｇｂｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１３：２３７−２５１のニックトランスレーション法、またはＦｉｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：６−１３のランダムプライミング法のずれかにより高い比活性に標識することが可能であり、それらの全開示は参照として本明細書に援用される。後者は１本鎖ＤＮＡから、またはＲＮＡ鋳型から高い比活性の３２Ｐ−標識プローブを合成するための一般に好まれる方法である。たとえば、ニックトランスレーション法に従って、以前から存在するヌクレオチドを高放射性ヌクレオチドで置換することにより、１０８ｃｐｍ／マイクログラムを十分に上回る比活性の３２Ｐ−標識核酸プローブを作製することが可能である。ハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィーによる検出は、ハイブリダイズしたフィルターを写真フィルムに曝すことにより実施することができる。ハイブリダイズしたフィルターに曝された写真フィルムのデンシトメトリーによるスキャニングはｍｉＲ遺伝子転写物レベルの正確な測定を提供する。別の研究方法を使用して、ｍｉＲ遺伝子転写物レベルは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能なＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ４００−Ｂ  ２Ｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒのようなコンピュータ化されたイメージングシステムにより定量することができる。
【００３１】
ＤＮＡまたはＲＮＡプローブの放射性核種標識が有用でない場合、ランダムプライマー法を使用して、類似体、たとえばｄＴＴＰ類似体５−（Ｎ−（Ｎ−ビオチニル−エプシロン−アミノカプロイル）−３−アミノアリル）デオキシウリジン三リン酸をプローブ分子に取り込むことができる。このビオチニル化プローブオリゴヌクレオチドは、蛍光色素または呈色反応を引き起こす酵素に結合したアビジン、ストレプトアビジンおよび抗体（例えば抗−ビオチン抗体）等のビオチン−結合タンパク質との反応により検出することができる。
【００３２】
ノーザンおよび他のＲＮＡハイブリダイゼーション技術に加えて、ＲＮＡ転写物のレベルを検出することは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術を使用して成し遂げることができる。この技術はノーザンブロット技術より必要とする細胞が少なく、顕微鏡カバーガラス上に細胞全体を置くこと、および放射性または別のやり方で標識した核酸（たとえば、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ）プローブを含む溶液で細胞の核酸含量を精査することを含む。この技術は対象由来の組織生検試料を分析することにとりわけよく適合する。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術の実際は、米国特許第５，４２７，９１６号により詳細に記載され、その全開示は参照として本明細書に援用される。一定のｍｉＲ遺伝子産物のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための適切なプローブは核酸配列から生産することができる。
【００３３】
細胞中のｍｉＲ遺伝子転写物の相対数はまた、ｍｉＲ遺伝子転写物の逆転写、その後、この逆転写された転写産物の増幅をポリメラーゼ連鎖反応によって行う（ＲＴ−ＰＣＲ）ことにより測定することができる。ｍｉＲ遺伝子転写物のレベルは内部標準、たとえば同じ試料中に存在する「ハウスキーピング」遺伝子に由来するｍＲＮＡのレベルと比較して定量化することができる。内部標準としての使用のための適切な「ハウスキーピング」遺伝子には、たとえばミオシンまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）が挙げられる。定量的ＲＴ−ＰＣＲの方法およびその変法は当該技術分野の技術の範囲内である。
【００３４】
場合によっては、試料中の複数の異なるｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを同時に確定することが望ましくてもよい。別の場合には、癌に関連したすべての公知のｍｉＲ遺伝子転写物の発現レベルを確定することが好ましくてもよい。何百ものｍｉＲ遺伝子の癌に特有の発現レベルを査定することは時間の浪費であり、多量の全ＲＮＡ（それぞれのノーザンブロットに対して少なくとも２０μｇ）と放射性同位体を必要とするオートラジオグラフィー技術が必要である。
【００３５】
これらの制限を克服するために、１組のｍｉＲ遺伝子に特有の１組のプローブオリゴデオキシヌクレオチドを含む、マイクロチップフォーマット（すなわち、マイクロアレイ）中のオリゴライブラリーが構築されてもよい。そのようなマイクロアレイを使用することにより、生物学的試料における複数のマイクロＲＮＡの発現レベルは、ＲＮＡを逆転写して１組の標的オリゴデオキシヌクレオチドを生み出し、それらをマイクロアレイ上のプローブオリゴデオキシヌクレオチドにハイブリダイズして、ハイブリダイゼーションまたは発現プロファイルを生み出すことによって確定されうる。次に試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料のそれと比較し、どのマイクロＲＮＡがＣＬＬにおける変化した発現レベルを有するかを確定することができる。本明細書で使用する「プローブオリゴヌクレオチド」または「プローブオリゴデオキシヌクレオチド」は、標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを表す。「標的オリゴヌクレオチド」または「標的オリゴデオキシヌクレオチド」は（たとえばハイブリダイゼーションによって）検出されることになる分子を表す。「ｍｉＲ特異的プローブオリゴヌクレオチド」または「ｍｉＲに特異的なプローブオリゴヌクレオチド」は、特定のｍｉＲ遺伝子産物に、またはその特定のｍｉＲ遺伝子産物の逆転写物にハイブリダイズするために選択された配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを意味する。
【００３６】
特定の試料の「発現プロファイル」または「ハイブリダイゼーションプロファイル」は本質的に試料の状態のフィンガープリントであり；２つの状態が同じように発現されたどんな特定の遺伝子を有していてもよいが、いくつもの遺伝子の同時評価は、細胞の状態に独特の遺伝子発現プロファイルの生成を可能にする。すなわち、正常な細胞がＣＬＬ細胞から識別されてもよく、そしてＣＬＬ細胞内で、異なる予後状態（たとえば、長期生存の見込みが良好または不良）が確定されてもよい。異なる状態におけるＣＬＬ細胞の発現プロファイルを比較することにより、これらの状態のそれぞれにおいて（遺伝子のアップレギュレーション−およびダウン−レギュレーションの両方を含む）どの遺伝子が重要であるかに関する情報が得られる。ＣＬＬ細胞または正常細胞において異なって発現される配列の確認、および異なる予後の成り行きを生じる異なる発現は、多くの様式におけるこの情報の使用を可能にする。たとえば、特定の治療計画（たとえば、特定の患者における長期の予後を改善するために化学療法剤が役立つかどうかを確定すること）が評価されてもよい。同じように、公知の発現プロファイルと患者試料を比較することによって診断が行われるか、または確証されてもよい。さらに、これらの遺伝子発現プロファイル（または個々の遺伝子）は、ＣＬＬ発現プロファイルを抑制するか、または不良な予後プロファイルをより良好な予後プロファイルに変換する薬物候補のスクリーニングを可能にする。
【００３７】
従って、本発明は対象から得られた試験試料からＲＮＡを逆転写し、１組の標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供すること、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに標的オリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズし、試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを提供すること、および試験試料ハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生み出されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することを含む、対象がＣＬＬに罹患しているか、またはそれを発症するリスクを持つかどうかを診断する方法を提供し、ここで少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルの変化は対象がＣＬＬに罹患しているか、またはそれを発症するリスクがあるかを表す。
【００３８】
一態様では、マイクロアレイはヒトｍｉＲＮオームの実質的な部分に対するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含む。特定の態様では、マイクロアレイはｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−１８１およびその組み合わせからなる群から選択される１以上のｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含む。
【００３９】
マイクロアレイは公知のｍｉＲＮＡ配列から生み出された遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブから作製することができる。アレイはそれぞれのｍｉＲＮＡに対して２種の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含んでいてもよく、その１つは活性な、成熟配列を含み、そして他の１つはｍｉＲＮＡの前駆体に特異的である。アレイはまた、ヒトオルソログとわずか数塩基だけ異なる１以上のマウス配列のような対照を含んでいてもよく、それらはハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件のための対照として役割を果たすことができる。両方の種に由来するｔＲＮＡはまた、マイクロチップ上にプリントされ、特異的ハイブリダイゼーションのための内部の相対的に安定な陽性対照を提供してもよい。非特異的ハイブリダイゼーションのための１以上の適切な対照が同じようにマイクロチップ上に含まれていてもよい。この目的のために、配列はいずれか公知のｍｉＲＮＡとの相同性がないことに基づいて選択される。
【００４０】
マイクロアレイは当該技術分野で公知の技術を使用して作られてもよい。たとえば、適切な長さ、たとえば４０ヌクレオチドのプローブオリゴヌクレオチドはＣ６位で５’−アミン修飾され、市販のマイクロアレイシステム、たとえばＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅ  ＯｍｎｉＧｒｉｄ（登録商標）１００  ＭｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒおよびＡｍｅｒｓｈａｍ  ＣｏｄｅＬｉｎｋ（登録商標）活性化スライドを使用してプリントされる。標的ＲＮＡに対応する標識されたｃＤＮＡオリゴマーは、標識されたプライマーにより標的ＲＮＡを逆転写することにより作製される。第１鎖合成後、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは変性し、ＲＮＡ鋳型に分解する。そうして作製された標識された標的ｃＤＮＡを、次にたとえば６Ｘ  ＳＳＰＥ／３０％  ホルムアミド、２５℃、１８時間のハイブリダイゼーション条件下、マイクロアレイチップにハイブリダイズさせ、続いて０．７５Ｘ  ＴＮＴ中、３７℃、４０分間洗浄する。固定化されたプローブＤＮＡが試料中の相補的な標的ｃＤＮＡを認識するアレイ上の位置でハイブリダイゼーションが起こる。標識された標的ｃＤＮＡは結合が起こるアレイ上の正確な位置の印となり、自動的な検出および定量を可能にする。アウトプットはハイブリダイゼーション事象リストからなり、前記患者試料中の特定のｃＤＮＡ配列の相対存在量、従って対応する相補的ｍｉＲの相対存在量を示す。一態様に従って、標識されたｃＤＮＡオリゴマーはビオチン−標識プライマーから作製されたビオチン−標識ｃＤＮＡである。次に、マイクロアレイはたとえばストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲートを使用してビオチン−含有転写物の直接検出によりプロセッシングされ、慣用のスキャニング法を利用してスキャンされる。アレイ上のそれぞれのスポットの画像強度は患者試料中の対応するｍｉＲの存在量に比例する。
【００４１】
アレイの使用はｍｉＲＮＡ発現の検出にとっていくつかの利点を有する。第１に、一次点における同一試料中で数百もの遺伝子の包括的な発現を確認することができる。第２に、オリゴヌクレオチドプローブの注意深い設計によって、成熟および前駆体分子両方の発現を確認することができる。第３に、ノーザンブロット解析と比較してチップは少量のＲＮＡしか必要とせず、２．５μｇの全ＲＮＡを使用することにより再現性のある結果を提供する。相対的に限定された数のｍｉＲＮＡ（種毎に数百）は、それぞれに対して別個のオリゴヌクレオチドプローブを持つ、いくつかの種に共通のマイクロアレイの構築を可能にする。そのようなツールは、種々の条件下で公知の各ｍｉＲの種を越えたの解析を可能にする。
【００４２】
特有のｍｉＲの定量的な発現レベルアッセイの使用に加えて、ｍｉＲＮｏｍｅの実質的な部分、好ましくはｍｉＲＮｏｍｅ全体に対応するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロチップを利用して、ｍｉＲ発現パターンの解析のためのｍｉＲ遺伝子発現プロファイリングが実行されてもよい。異なるｍｉＲＮＡシグネチャーは、確立された疾患マーカーに、または直接的に疾患状態に関連させることができる。
【００４３】
本明細書に記載された発現プロファイリング法に従って、癌（たとえばＣＬＬ）に罹患していると推測される対象に由来する試料の全ＲＮＡは定量的に逆転写され、試料中のＲＮＡに相補的な１組の標識された標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供する。次に標的オリゴデオキシヌクレオチドはｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズされ、試料のハイブリダイゼーションプロファイルを提供する。結果は試料のハイブリダイゼーションプロファイルであり、試料中のｍｉＲＮＡの発現パターンを表す。ハイブリダイゼーションプロファイルは、マイクロアレイ中のｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドへの試料に由来する標的オリゴデオキシヌクレオチドの結合に由来するシグナルを含む。プロファイルは結合の存在または不在（シグナル対ゼロシグナル）として記録されてもよい。より好ましくは、記録されたプロファイルはそれぞれのハイブリダイゼーションに由来するシグナルの強度を含む。プロファイルは、正常、すなわち癌でない対照試料から生み出されたハイブリダイゼーションプロファイルに比較される。シグナルの変化は対象における癌の存在を表す。
【００４４】
ｍｉＲ遺伝子発現を測定するための他の技術はまた、当該技術分野の技術の範囲内であり、ＲＮＡ転写および分解の速度を測定するための種々の技術を含む。
【００４５】
本発明はまた、対象に由来するＣＬＬ試験試料中の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定すること、およびＣＬＬ試験試料中の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比較することを含む、１つ以上の予後マーカーに関連するＣＬＬを診断する方法を提供する。対照試料に比較した試験試料中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルにおける変化（たとえば、増加、減少）は、対象が１つ以上の予後マーカーに関連するＣＬＬに罹患しているか、またはそれを発症するリスクがあるかのいずれかであることを表す。
【００４６】
ＣＬＬは不都合な（すなわち悲観的）予後に関連したマーカー、または良好な（すなわち楽観的）予後に関連したマーカーを含む、１つ以上の予後マーカーまたは特徴に関連しうる。ある態様では、本明細書に記載された方法を使用して診断されるＣＬＬは１つ以上の不都合な予後の特徴に関連する。
【００４７】
本明細書では、これらの予後マーカーのそれぞれに関連する、ＣＬＬ細胞において発現が変化する特定のマイクロＲＮＡが記載される。一態様では、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは対象から得られた試験試料からＲＮＡを逆転写し、１組の標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供すること、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに標的オリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズし、試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを提供すること、および試験試料ハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生み出されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することによって測定される。
【００４８】
いずれか１つの理論に束縛されることを望まないが、細胞における１つ以上のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化が、これらのｍｉＲの１つ以上の意図した標的の脱制御を忌避起こす可能性があり、そのことがＣＬＬの形成を導きうる、と考えられている。従って、ｍｉＲ遺伝子産物のレベルを変化させることにより（たとえば、ＣＬＬ細胞においてアップレギュレーションされているｍｉＲのレベルを減少させることにより、癌細胞においてアップレギュレーションされているｍｉＲのレベルを増すことにより）、首尾よくＣＬＬを治療してもよい。ＣＬＬ細胞において脱制御されるｍｉＲＮＡの遺伝子標的と推定されるものの例は本明細書に記載される。
【００４９】
従って、本発明は対象のＣＬＬを治療する方法を包含し、ここでは少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物は対象の癌細胞において脱制御（たとえばダウンレギュレーション、アップレギュレーション）されている。少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物がＣＬＬ細胞においてダウンレギュレーションされている場合、該方法は、有効量の少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物を投与することを含み、その結果対象における癌細胞の増殖が阻害される。少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物が癌細胞においてアップレギュレーションされている場合、該方法は、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子の発現を阻害する、ｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物として本明細書で表される有効量の少なくとも１つの化合物を対象に投与することを含み、その結果ＣＬＬ細胞の増殖が阻害される。
【００５０】
本明細書で使用する、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、疾患症状の開始を予防するか、または遅延させること、および／または疾患または状態の症状の重症度または頻度を軽減することを含む、疾患または状態、たとえばＣＬＬに関連した症状を改善することを表す。「対象」および「個体」という用語は、本明細書では動物、たとえば霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のウシ科、ヒツジ科、ウマ科、イヌ科、ネコ科、齧歯類、もしくはネズミ科の種を含むがそれらに限定されない哺乳動物等の動物を含むと定義される。好ましい態様では、動物はヒトである。
【００５１】
本明細書で使用する、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の「有効量」は、ＣＬＬを患う対象において癌細胞の増殖を阻害するのに十分な量である。当業者は、対象のサイズおよび体重；疾患の浸透の程度；対象の年齢、健康状態および性別；投与経路；ならびに投与が局所的であるか、または全身的であるか、等を考慮にいれることによって、一定の対象に投与されることになるｍｉＲ遺伝子産物の有効量を容易に確定することができる。
【００５２】
たとえば、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、治療されることになる対象のおおよその、または推定された体重を基礎にすることができる。好ましくは、そのような有効量は本明細書に記載のように、非経口的に、または腸管内に投与される。たとえば、対象に投与されることになる単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、約５〜３０００マイクログラム／ｋｇ体重、約７００〜１０００マイクログラム／ｋｇ体重、または約１０００マイクログラム／ｋｇ体重より多い範囲であり得る。
【００５３】
当業者はまた、一定の対象への単離されたｍｉＲ遺伝子産物投与のための適切な投与計画を容易に確定することができる。たとえば、ｍｉＲ遺伝子産物は対象に（たとえば、単回注射またはデポジション（deposition）として）１回投与することができる。あるいは、ｍｉＲ遺伝子産物は対象に約３〜約２８日、いっそうとりわけ、約７〜約１０日の期間、１日に１回または２回投与することができる。特定の投与計画では、ｍｉＲ遺伝子産物は１日１回、７日間投与される。投与計画が複数の投与を含む場合、対象に投与されるｍｉＲ遺伝子産物の有効量は投与計画全体で投与される遺伝子産物の全量を含むことができると理解される。
【００５４】
本明細書で使用する「単離された」ｍｉＲ遺伝子産物とは合成されるか、またはヒトの介在により自然状態から変更されるか、または取り出されるものである。たとえば、合成ｍｉＲ遺伝子産物、またはその自然状態の中の共存物質から部分的に、または完全に分離されたｍｉＲ遺伝子産物は、「単離された」と見なされる。単離されたｍｉＲ遺伝子産物は実質的に精製された形状で存在可能であり、またはｍｉＲ遺伝子産物が送達されている細胞中に存在可能である。従って、細胞に計画的に送達されるか、または細胞内で計画的に発現されるｍｉＲ遺伝子産物は「単離された」ｍｉＲ遺伝子産物であるとみなされる。ｍｉＲ前駆体分子から細胞内で生産されたｍｉＲ遺伝子産物も「単離された」分子であると見なされる。
【００５５】
単離されたｍｉＲ遺伝子産物はいくつかの標準技術を使用して得ることができる。たとえば、ｍｉＲ遺伝子産物は当該技術分野で公知の方法を使用して化学的に合成されるか、または組換えにより生産することができる。一態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は適切に保護されたリボヌクレオシドホスホロアミダイトおよび慣用のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを使用して化学的に合成される。合成ＲＮＡ分子または合成試薬の製造業者としては、たとえばＰｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ，ＵＳＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅの一部，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ，ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）およびＣｒｕａｃｈｅｎ（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）が挙げられる。
【００５６】
あるいは、ｍｉＲ遺伝子産物は、いずれか適切なプロモーターを使用して組換え環状または線状ＤＮＡプラスミドから発現されうる。プラスミドからＲＮＡを発現するための適切なプロモーターには、たとえばＵ６もしくはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列、またはサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。他の適切なプロモーターの選択は当該技術分野の技術の範囲内である。本発明の組換えプラスミドはまた、癌細胞におけるｍｉＲ遺伝子産物発現のための誘導性または調節性プロモーターを含むことができる。
【００５７】
組換えプラスミドから発現されるｍｉＲ遺伝子産物は、標準技術によって培養細胞発現系から単離することができる。組換えプラスミドから発現されるｍｉＲ遺伝子産物はまた、癌細胞に送達されるか、または該細胞中で直接発現されうる。癌細胞にｍｉＲ遺伝子産物を送達するための組換えプラスミドの使用は以下でより詳細に論じられる。
【００５８】
ｍｉＲ遺伝子産物は別個の組換えプラスミドから発現されうるか、またはそれらは同じ組換えプラスミドから発現されうる。一態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は単一プラスミドからＲＮＡ前駆体分子として発現され、そして前駆体分子は、癌細胞内に残存するプロセッシング系を含むがそれらに限定されない、適切なプロセッシング系によって機能的なｍｉＲ遺伝子産物にプロセッシングされる。他の適切なプロセッシング系には、たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏショウジョウバエ細胞溶解産物系（たとえば、Ｔｕｓｃｈｌらの米国公開特許出願第２００２／００８６３５６号に記載され、その全開示は参照として本明細書に援用される）、および大腸菌ＲＮアーゼＩＩＩ系（たとえば、Ｙａｎｇらの米国公開特許出願第２００４／００１４１１３号に記載され、その全開示は参照として本明細書に援用される）が挙げられる。
【００５９】
ｍｉＲ遺伝子産物を発現するために適したプラスミドの選択、遺伝子産物を発現するためのプラスミドへの核酸配列の挿入の方法、および関心のある細胞への組換えプラスミド送達の方法は当該技術分野の技術の範囲内である。たとえば、Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ９：１３２７−１３３３；Ｔｕｓｃｈｌ（２００２）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：４４６−４４８；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５５３；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：４９７−５００；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：５００−５０５およびＰａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５−５０８を参照されたい。それらの全開示は参照として本明細書に援用される。
【００６０】
一態様では、ｍｉＲ遺伝子産物を発現するプラスミドはＣＭＶ中間−初期プロモーターの制御下でｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする配列を含む。本明細書で使用するプロモーターの「制御下」とは、ｍｉＲ遺伝子産物をコードする核酸配列がプロモーターの３’に位置し、その結果プロモーターがｍｉＲ遺伝子産物コーディング配列の転写を開始できることを意味する。
【００６１】
ｍｉＲ遺伝子産物はまた、組換えウイルスベクターから発現されうる。ｍｉＲ遺伝子産物は２つの別個の組換えウイルスベクターから、または同じウイルスベクターから発現されうることが企図される。組換えウイルスベクターから発現されるＲＮＡは標準技術により、培養細胞発現系から単離されうるか、または癌細胞において直接発現されうる。癌細胞にｍｉＲ遺伝子産物を送達するための組換えウイルスベクターの使用は、以下でいっそう詳細に論じられる。
【００６２】
本発明の組換えウイルスベクターは、ｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列およびＲＮＡ配列を発現するためのいずれか適切なプロモーターを含む。適切なプロモーターには、たとえば、Ｕ６もしくはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列、またはサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。他の適切なプロモーターの選択は当該技術分野の技術の範囲内である。本発明の組換えウイルスベクターはまた、癌細胞におけるｍｉＲ遺伝子産物発現のための誘導性または調節性プロモーターを含むことができる。
【００６３】
ｍｉＲ遺伝子産物のコーディング配列を受容できるいかなるウイルスベクターをも使用することができる：たとえば、アデノウイルス（ＡＶ）に由来するベクター；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（たとえば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、ネズミ白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス；等に由来するベクター。ウイルスベクターの親和性は、他のウイルス由来のエンベロープタンパク質または他の表面抗原によりベクターをシュードタイプ化することにより、あるいは異なるウイルスキャプシドタンパク質を置換することにより適宜改変されうる。
【００６４】
たとえば、本発明のレンチウイルスベクターは水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなどに由来する表面タンパク質によりシュードタイプ化されうる。本発明のＡＡＶベクターは、ベクターを工学的に操作して異なるキャプシドタンパク質血清型を発現させることにより異なる細胞を標的にすることができる。たとえば、血清型２型ゲノム上の血清型２型キャプシドを発現するＡＡＶベクターはＡＡＶ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ２／２ベクター中のこの血清型２型キャプシド遺伝子は血清型５型キャプシド遺伝子によって置換され、ＡＡＶ２／５ベクターを生産しうる。異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための技術は当該技術分野の技術の範囲内であり；たとえば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７９１−８０１を参照されたい；その全開示は参照として本明細書に援用される。
【００６５】
本発明の使用に適した組換えウイルスベクターの選択、ＲＮＡを発現するための核酸配列をベクターに挿入する方法、ウイルスベクターを関心のある細胞に送達する方法、および発現されたＲＮＡ産物の回収は当該技術分野の技術の範囲内である；たとえば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ（１９９５），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１−３１０；Ｅｇｌｉｔｉｓ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６０８−６１４；Ｍｉｌｌｅｒ（１９９０），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．１：５−１４；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２５−３０を参照されたい。それらの全開示は参照として本明細書に援用される。
【００６６】
とりわけ適切なウイルスベクターはＡＶおよびＡＡＶに由来するものである。ｍｉＲ遺伝子産物を発現するための適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載され、その全開示は参照として本明細書に援用される。ｍｉＲ遺伝子産物を発現するための適切なＡＡＶベクター、組換えＡＡＶベクターを構築するための方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５２０−５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号；米国特許第５，１３９，９４１号；国際特許出願第ＷＯ９４／１３７８８号；および国際特許出願第ＷＯ９３／２４６４１号に記載され、それらの全開示は参照として本明細書に援用される。一態様では、ｍｉＲ遺伝子産物はＣＭＶ中間初期プロモーターを含む単一の組換えＡＡＶベクターから発現される。
【００６７】
ある態様では、本発明の組換えＡＡＶウイルスベクターは、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモーターの制御下でポリＴ終止配列との作動可能に連結されたｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする核酸配列を含む。本明細書で使用する「ポリＴ終止配列との作動可能に連結された」とは、センスまたはアンチセンス鎖をコードする核酸配列が５’方向においてポリＴ終止シグナルに直接隣接していることを意味する。ベクターに由来するｍｉＲ配列の転写中に、ポリＴ終止シグナルは転写を終止する役割を果たす。
【００６８】
本発明の治療法の他の態様では、ｍｉＲ発現を阻害する有効量の少なくとも１つの化合物を対象に投与することもできる。本明細書で使用する「ｍｉＲ発現を阻害すること」とは、治療後の活性な成熟型ｍｉＲ遺伝子産物の生産が治療前に生産された量より少ないことを意味する。当業者は、たとえば診断法に関して先に論じたｍｉＲ転写レベルを確定するための技術を使用して、ｍｉＲ発現が癌細胞において阻害されているかどうかを容易に確定することができる。阻害は遺伝子発現レベルで（すなわち、ｍｉＲ遺伝子産物をコードするｍｉＲ遺伝子の転写を阻害することによって）、またはプロセッシングのレベルで（たとえば、ｍｉＲ前駆体から成熟した、活性なｍｉＲへのプロセッシングを阻害することにより）起こりうる。
【００６９】
本明細書で使用するｍｉＲ発現を阻害する化合物の「有効量」とは、癌に関連した染色体の特徴を伴う癌を患う対象において、癌細胞の増殖を阻害するために十分な量である。当業者は、たとえば対象のサイズおよび体重；疾患の浸透の程度；対象の年齢、健康状態および性別；投与経路；ならびに投与が局所的であるか、または全身的であるかを考慮にいれることによって、一定の対象に投与されることになるｍｉＲ発現−阻害化合物の有効量を容易に確定することができる。
【００７０】
たとえば、発現阻害化合物の有効量は、治療されることになる対象のおおよその、または推定された体重を基礎にすることができる。そのような有効量は本明細書に記載のように、とりわけ非経口的に、または腸内に投与される。たとえば、対象に投与される発現−阻害化合物の有効量は、約５〜３０００マイクログラム／ｋｇ体重、約７００〜１０００マイクログラム／ｋｇ体重に及ぶことが可能であり、またはそれは約１０００マイクログラム／ｋｇ体重より多くなりうる。
【００７１】
当業者はまた、一定の対象に対してｍｉＲ発現を阻害する化合物を投与するための適切な投与計画を容易に確定することができる。たとえば、発現−阻害化合物は対象に１回（たとえば単回注射またはデポジションとして）投与することができる。あるいは、発現−阻害化合物は、約３〜約２８日間まで、より好ましくは約７〜約１０日間までの期間、対象に１日に１回または２回投与することができる。特定の投与計画では、発現−阻害化合物は１日１回、７日間投与される。投与計画が複数回投与を含む場合、対象に投与される発現−阻害化合物の有効量は投与計画全体で投与される化合物の総量を含むことができると理解される。
【００７２】
ｍｉＲ遺伝子発現を阻害するための適切な化合物には、２本鎖ＲＮＡ（たとえば、短鎖−もしくは低分子−干渉ＲＮＡまたは「ｓｉＲＮＡ」）、アンチセンス核酸、およびリボザイムのような酵素的ＲＮＡ分子が挙げられる。これらの化合物のそれぞれは一定のｍｉＲ遺伝子産物を標的として、標的ｍｉＲ遺伝子産物を破壊するか、またはその破壊を誘発することができる。
【００７３】
たとえば、一定のｍｉＲ遺伝子の発現は、ｍｉＲ遺伝子産物の少なくとも一部に対して少なくとも９０％、たとえば少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列相同性を有する単離された２本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子によるｍｉＲ遺伝子のＲＮＡ干渉を誘発することによって阻害することができる。特定の態様では、ｄｓＲＮＡ分子は「短鎖もしくは低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」である。
【００７４】
本発明の方法に有用なｓｉＲＮＡは長さが約１７ヌクレオチド〜約２９ヌクレオチド、好ましくは長さが約１９〜約２５ヌクレオチドの短鎖２本鎖ＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡは、標準ワトソン−クリック塩基対相互作用（以後「塩基対形成」）によって一緒にアニーリングしたセンスＲＮＡ鎖および相補的アンチセンスＲＮＡ鎖を含む。センス鎖は標的ｍｉＲ遺伝子産物内に含まれる核酸配列に実質的に同一である核酸配列を含む。
【００７５】
本明細書で使用する、標的ｍＲＮＡ内に含まれる標的配列に「実質的に同一」であるｓｉＲＮＡ中の核酸配列とは、標的配列に同一であるか、または標的配列と１または２ヌクレオチドが異なる核酸配列である。ｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は、２つの相補的な１本鎖ＲＮＡ分子を含むことが可能であるか、または２つの相補的部分が塩基対を形成し、１本鎖「ヘアピン」部分によって共有結合により連結している単一分子を含むことが可能である。
【００７６】
ｓｉＲＮＡはまた、１以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変更によって自然に存在するＲＮＡと異なる、変化したＲＮＡでもありうる。そのような変更には、たとえばｓｉＲＮＡの末端またはｓｉＲＮＡの１以上の内部ヌクレオチドへの非ヌクレオチド物質の付加、またはｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に対し抵抗性にする修飾、またはデオキシリボヌクレオチドによるｓｉＲＮＡ中の１以上のヌクレオチドの置換を挙げることができる。
【００７７】
ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖は３’オーバーハングを含むこともできる。本明細書で使用する「３’オーバーハング」は、２本鎖ＲＮＡの３’末端から伸びた少なくとも１つの対形成をしていないヌクレオチドを表す。従って、ある態様では、ｓｉＲＮＡは、長さが１〜約６ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む）、長さが１〜約５ヌクレオチド、長さが１〜約４ヌクレオチド、または長さが約２〜４ヌクレオチドの少なくとも１つの３’オーバーハングを含む。特定の態様では、３’オーバーハングはｓｉＲＮＡの両方の鎖に存在し、長さが２ヌクレオチドである。たとえば、ｓｉＲＮＡのそれぞれの鎖はジチミジル酸（「ＴＴ」）またはジウリジル酸（「ｕｕ」）の３’オーバーハングを含むことができる。
【００７８】
単離されたｍｉＲ遺伝子産物に関して先に記載のように、ｓｉＲＮＡは化学的に、または生物学的に生産可能であり、または組換えプラスミドもしくはウイルスベクターから発現させることが可能である。ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子を生産し、試験するための代表的な方法は、Ｇｅｗｉｒｔｚの米国公開特許出願第２００２／０１７３４７８号およびＲｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，の米国公開特許出願第２００４／００１８１７６号に記載され、それらの全開示は参照として本明細書に援用される。
【００７９】
一定のｍｉＲ遺伝子の発現はまた、アンチセンス核酸によって阻害することができる。本明細書で使用する「アンチセンス核酸」は、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ペプチド核酸相互作用によって標的ＲＮＡに結合する核酸分子を表し、そしてそれは標的ＲＮＡの活性を変化させる。本発明の方法における使用に適切なアンチセンス核酸は、一般にｍｉＲ遺伝子産物中の連続した核酸配列に相補的な核酸配列を含む１本鎖核酸（たとえばＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ、ＰＮＡ）である。アンチセンス核酸はｍｉＲ遺伝子産物中の連続した核酸配列に５０〜１００％相補的、７５〜１００％相補的、または９５〜１００％相補的である核酸配列を含むことができる。ｍｉＲ遺伝子産物の核酸配列は本明細書に提供される。いずれかの理論に束縛されることを望まないが、アンチセンス核酸はＲＮアーゼＨまたはｍｉＲ遺伝子産物／アンチセンス核酸二本鎖を消化する他の細胞ヌクレアーゼを活性化すると考えられる。
【００８０】
アンチセンス核酸はまた、標的特異性、ヌクレアーゼ抵抗性、送達または分子の効力に関連した他の特性を高めるための核酸バックボーン、または糖および塩基部分（またはそれらの等価物）の修飾を含むことができる。そのような改変は、コレステロール部分、アクリジン等の二本鎖インターカレーター、または１つ以上のヌクレアーゼ耐性基を含む。
【００８１】
アンチセンス核酸は単離されたｍｉＲ遺伝子産物に関して先に記載のように、化学的に、または生物学的に生産可能であり、または組換えプラスミドまたはウイルスベクターから発現することが可能である。生産し、試験するための代表的な方法は、当該技術分野の技術の範囲内であり；たとえばＳｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎｇ（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１００４およびＷｏｏｌｆらの米国特許第５，８４９，９０２号を参照されたい。それらの全開示は参照として本明細書に援用される。
【００８２】
一定のｍｉＲ遺伝子の発現はまた、酵素的核酸によって阻害することができる。本明細書で使用する「酵素的核酸」は、ｍｉＲ遺伝子産物の連続する核酸配列に相補性を有する基質結合領域を含む核酸を表し、そしてそれはｍｉＲ遺伝子産物を特異的に開裂することができる。酵素的核酸の基質結合領域は、たとえば、ｍｉＲ遺伝子産物中の連続した核酸配列に５０〜１００％相補的、７５〜１００％相補的、または９５〜１００％相補的であり得る。酵素的核酸はまた、塩基、糖、および／またはリン酸基における修飾を含むことができる。本発明の方法における使用のための代表的な酵素的核酸はリボザイムである。
【００８３】
酵素核酸は単離されたｍｉＲ遺伝子産物に関して先に記載のように、化学的に、または生物学的に生産可能であり、または組換えプラスミドまたはウイルスベクターから発現することができる。ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子を生産し、試験するための代表的な方法は、Ｗｅｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９９５），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２０９２−９６；Ｈａｍｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９），Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．９：２５−３１；およびＣｅｃｈらの米国特許第４，９８７，０７１号に記載され、それらの全開示は参照として本明細書に援用される。
【００８４】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物、またはｍｉＲ発現を阻害するための少なくとも１つの化合物の投与は、癌に関連した染色体の特徴を伴う癌を患う対象における癌細胞の増殖を阻害することになる。本明細書で使用する「癌細胞の増殖を阻害する」とは、細胞を致死させるか、または細胞の成長を永久にもしくは一時的に、阻止するかもしくは遅らせることを意味する。癌細胞増殖の阻害は、対象におけるそのような細胞の数が、ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物の投与後に一定のままであるか、または減少する場合に推測することができる。癌細胞増殖の阻害はまた、そのような細胞の絶対数は増すが、腫瘍成長速度が減少する場合、推測することができる。
【００８５】
対象の体内における癌細胞の数は、直接測定によって、または原発性もしくは転移性腫瘍塊のサイズからの推測により確定することができる。たとえば、対象における癌細胞の数は免疫組織化学的方法、フローサイトメトリー、または癌細胞の特徴的な表面マーカーを検出するために設計された他の技術によって測定することができる。
【００８６】
ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現−阻害化合物は、対象の癌細胞にこれらの化合物を送達するために適切ないずれかの手段により対象に投与することができる。たとえば、ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ発現阻害化合物は、これらの化合物により、またはこれらの化合物をコードする配列を含む核酸により対象の細胞をトランスフェクトするために適した方法により投与することができる。一態様では、細胞は少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を含むプラスミドまたはウイルスベクターによりトランスフェクトされる。
【００８７】
真核細胞のトランスフェクション法は当該技術分野で周知であり、たとえば細胞の核または前核への核酸の直接注入；エレクトロポレーション；リポソーム導入または親油性物質によって媒介される導入；受容体媒介核酸送達、生物弾丸導入（bioballistic）または粒子加速；リン酸カルシウム沈殿およびウイルスベクターによって媒介されるトランスフェクションが挙げられる。
【００８８】
たとえば、リポソーム導入化合物、たとえばＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチル硫酸、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）またはリポフェクチン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ）のような等価物により細胞はトランスフェクトされうる。使用される核酸の量は本発明の実施にとって重要ではなく；受容できる結果は０．１〜１００マイクログラムの核酸／１０５細胞により達成されてもよい。たとえば、１０５細胞につき３マイクログラムのＤＯＴＡＰ中約０．５マイクログラムのプラスミドベクターの比が使用されうる。
【００８９】
ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物はまた、いずれか適切な腸内または非経口投与経路によって対象に投与することができる。本発明の方法にとって適切な腸内投与経路は、たとえば、経口、直腸内、または鼻腔内送達が挙げられる。適切な非経口投与経路には、たとえば血管内投与（たとえば、静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および血管へのカテーテルによる点滴注入）；組織周辺および組織内注射（たとえば、腫瘍周辺および腫瘍内注射、網膜内注射または網膜下注射）；（たとえば浸透圧ポンプによる）皮下注入を含む皮下注射またはデポジション；たとえばカテーテルまたは他の留置装置（たとえば網膜ペレット、または坐剤または多孔性、非多孔性、もしくはゼリー状物質を含むインプラント）による関心のある組織への直接適用、；および吸入が挙げられる。とりわけ適切な投与経路は患者への注射、注入および静脈内投与である。
【００９０】
本発明の方法では、ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子産物発現阻害化合物は、送達試薬と組み合わせてネイキッド（ｎａｋｅｄ）ＲＮＡとして、またはｍｉＲ遺伝子産物もしくは発現阻害化合物を発現する配列を含む核酸（たとえば組換えプラスミドまたはウイルスベクター）としてのいずれかで対象に投与することができる。適切な送達試薬としては、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ親油性試薬；リポフェクチン；リポフェクタミン；セルフェクチン；ポリカチオン（たとえばポリリシン）、およびリポソームが挙げられる。
【００９１】
ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物を発現する配列を含む組換えプラスミドおよびウイルスベクター、ならびに癌細胞にそのような組換えプラスミドおよびウイルスベクターを送達するための技術は本明細書で論じられる。
【００９２】
特定の態様では、リポソームを使用してｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子−発現阻
害化合物（またはそれらをコードする配列を含む核酸）が対象に送達される。リポソームはまた、遺伝子産物または核酸の血中半減期を増すことができる。本発明に使用のための適切なリポソームは標準的なベシクル形成脂質から形成可能であり、そのような脂質としては一般に中性の、または負に荷電したリン脂質およびステロール（たとえばコレステロール）が挙げられる。脂質の選択は一般に、所望するリポソームサイズおよび血流中のリポソーム半減期のような因子の考慮が指針となる。リポソーム作製のための多様な方法が公知であり、たとえばＳｚｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７；および米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号および第５，０１９，３６９号に記載され、それらの全開示は参照として本明細書に援用される。
【００９３】
本発明の方法において使用するためのリポソームはリポソームを癌細胞に方向付けるリガンド分子を含むことができる。癌細胞において優勢な受容体に結合するリガンド、たとえば腫瘍細胞抗原に結合するモノクローナル抗体が好ましい。
【００９４】
本発明の方法において使用するためのリポソームはまた、修飾されて単核マクロファージ系（「ＭＭＳ」）および細網内皮系（「ＲＥＳ」）によるクリアランスを回避することができる。そのような修飾されたリポソームは表面に、またはリポソーム構造に組み入れられたオプソニン化阻害部分を有する。とりわけ好ましい態様では、本発明のリポソームはオプソニン化阻害部分とリガンドの両方を含むことができる。
【００９５】
本発明のリポソームを作製することにおける使用のためのオプソニン化阻害部分は典型的には、リポソーム膜に結合している大きな親水性ポリマーである。本明細書で使用するオプソニン化阻害部分は、たとえば、膜自体への脂溶性アンカーのインターカレーションにより、または膜脂質の活性基への直接結合により、化学的に、または物理的に膜に結合している場合、そのような部分はリポソーム膜に「結合」している。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、ＭＭＳおよびＲＥＳによるリポソームの取り込みを著しく減少させる保護表面層を形成する；たとえば、米国特許第４，９２０，０１６号に記載され、その全開示は参照として本明細書に援用される。
【００９６】
リポソームを修飾するために適したオプソニン化阻害部分は、好ましくは約５００〜約４０，０００ダルトン、より好ましくは約２，０００〜約２０，０００ダルトンの数−平均分子量を持つ水溶性ポリマーである。そのようなポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；たとえばメトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびＰＥＧまたはＰＰＧステアリン酸；合成ポリマー、たとえばポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドン；線状、分枝、またはデンドリマーポリアミドアミン；ポリアクリル酸；ポリアルコール、たとえばカルボキシル基またはアミノ基が化学的に結合したポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシド、たとえばガングリオシドＧＭ１が挙げられる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、もしくはメトキシＰＰＧのコポリマー、またはその誘導体も適切である。その上、オプソニン化阻害ポリマーはＰＥＧとポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーでありうる。オプソニン化阻害ポリマーはまた、アミノ酸を含む天然多糖類、またはガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン等のカルボン酸を含む天然多糖類、；アミノ化多糖もしくはオリゴ糖（線状または分枝）；または、たとえば炭酸の誘導体と反応し、カルボキシル基の連結を生じたカルボキシル化多糖またはオリゴ糖でありうる。好ましくは、オプソニン化阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体により修飾されたリポソームは時には「ペギル化（PEGylated）リポソーム」と呼ばれる。
【００９７】
オプソニン化阻害部分は非常に多くの周知の技術のいずれか１つによりリポソーム膜に結合することができる。たとえば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルはホスファチジル−エタノールアミン脂溶性アンカーに結合し、その後膜に結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３および溶媒混合物（たとえば、３０：１２の比のテトラヒドロフランと水、６０℃）を使用して、還元的アミノ化によりステアリルアミン脂溶性アンカーにより誘導体化することができる。
【００９８】
オプソニン化阻害部分により修飾されたリポソームは、被修飾のいリポソームよりずっと長く循環中に残存する。この理由のために、そのようなリポソームは時には「ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）」リポソームと呼ばれる。ステルスリポソームは、多孔性または「漏出性（leaky）」微小血管により栄養を与えられる組織中に蓄積することが知られている。従って、そのような微小血管の欠陥によって特徴付けられる組織、たとえば固形腫瘍は効率的にこれらのリポソームを蓄積することになる；Ｇａｂｉｚｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１８：６９４９−５３を参照されたい。その上、ＲＥＳによる取り込みの減少は、肝臓および脾臓におけるリポソームの著しい蓄積を妨げることによってステルスリポソームの毒性を低下させる。従って、オプソニン化阻害部分により修飾されたリポソームは、ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（またはそれらをコードする配列を含む核酸）を腫瘍細胞に送達するためにとりわけ適する。
【００９９】
ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、当該技術分野で公知の技術に従って、対象にそれらを投与する前に、時には「薬剤（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）」と呼ばれる医薬組成物として製剤することができる。従って、本発明はＣＬＬを治療するための医薬組成物を包含する。一態様では、医薬組成物は少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物および薬剤的に受容できるキャリアを含む。特定の態様では、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物は、適切な対照細胞に比較して、ＣＬＬ細胞における発現レベルが減少したｍｉＲ遺伝子産物に対応する。ある態様では、単離されたｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−１８１およびその組み合わせからなる群から選択される。
【０１００】
他の態様では、本発明の医薬組成物は少なくとも１つのｍｉＲ発現阻害化合物を含む。特定の態様では、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、対照細胞よりＣＬＬ細胞に発現が多いｍｉＲ遺伝子に対して特異的である。ある態様ではｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物はｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−１８１およびその組み合わせからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲ遺伝子産物に対して特異的である。
【０１０１】
本発明の医薬組成物は少なくとも無菌および発熱物質フリーであると特徴付けられる。本明細書で使用する「医薬組成物」はヒトおよび動物への使用のための製剤を含む。本発明の医薬組成物を作製するための方法は当該技術分野の技術の範囲内であり、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８５）に記載され、その全開示は参照として本明細書に援用される。
【０１０２】
本発明の医薬製剤は、薬剤的に受容できるキャリアと混合した、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物もしくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（またはそれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）（たとえば重量で０．１〜９０％）、または生理的に受容できるその塩を含む。本発明の医薬製剤はまた、リポソームによって被包された少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（またはそれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）および薬剤的に受容できるキャリアを含むことができる。
【０１０３】
とりわけ適切な薬剤的に受容できるキャリアは水、緩衝水、通常の生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などである。
【０１０４】
特定の態様では、本発明の医薬組成物は、ヌクレアーゼによる分解に耐性を示す、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物もしくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（またはそれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）を含む。当業者は、たとえば２’−位が修飾されている１つ以上のリボヌクレオチドをｍｉＲ遺伝子産物に組み込むことによって、ヌクレアーゼ耐性を示す核酸を容易に合成することができる。適切な２’−修飾リボヌクレオチドには、フルオロ、アミノ、アルキル、アルコキシ、およびＯ−アリルによって２’−位で修飾されたものが挙げられる。
【０１０５】
本発明の医薬組成物はまた、慣用の医薬賦形剤および／または添加剤を含むことができる。適切な医薬賦形剤には、安定化剤、酸化防止剤、浸透圧調節剤、バッファー、およびｐＨ調節剤が挙げられる。適切な添加剤には、たとえば、生理的生体適合性バッファー（たとえば、塩酸トロメタミン）、キレート剤（たとえばＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアミド）もしくはカルシウムキレート剤錯体（たとえばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）の添加、または場合によりカルシウムもしくはナトリウム塩（たとえば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムまたは乳酸カルシウム）の添加が挙げられる。本発明の医薬組成物は液体の形状において使用のために包装することが可能であり、または凍結乾燥することも可能である。
【０１０６】
本発明の固体医薬組成物の場合、慣用の非毒性固体の薬剤的に受容できるキャリア：たとえば、薬剤的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム（ｔａｌｃｕｍ）、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを使用することができる。
【０１０７】
たとえば、経口投与のための固体医薬組成物は、先に挙げたキャリアおよび賦形剤のいずれか、ならびに１０〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（またはそれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）を含むことができる。エアゾール（吸入）投与のための医薬組成物は先に記載のようにリポソームに被包された、重量で０．０１％〜２０％、好ましくは重量で１％〜１０％の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（またはそれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）、および噴射剤を含むことができる。キャリア：たとえば鼻腔内投与のためのレシチンが必要に応じて含まれることも可能である。
【０１０８】
本発明はまた、細胞に試験剤を提供すること、および細胞における少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む、抗−ＣＬＬ剤を同定する方法を包含する。一態様では、該方法は細胞に試験剤を提供すること、およびＣＬＬ細胞における減少した発現レベルに関連した少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む。適切な対照細胞に比較した該細胞におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルの増加は、試験剤が抗−ＣＬＬ剤であることを表す。特定の態様では、ＣＬＬ細胞における減少した発現レベルに関連した少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−１８１およびその組み合わせからなる群から選択される。
【０１０９】
他の態様では、該方法は細胞に試験剤を提供すること、およびＣＬＬ細胞における増加した発現レベルに関連した少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む。適切な対照細胞に比較した該細胞におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルの減少は、試験剤が抗−ＣＬＬ剤であることを表す。特定の態様では、ＣＬＬ細胞における増加した発現レベルに関連した少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−１８１およびその組み合わせからなる群から選択される。
【０１１０】
適切な作用物質には薬物（たとえば、低分子、ペプチド）、および生物学的高分子（たとえば、タンパク質、核酸）が挙げられるが、それらに限定されない。作用物質は組換えにより、合成により生産することが可能であり、またはそれは自然の供給源から単離（すなわち、精製）されてもよい。細胞にそのような作用物質を提供するための種々の方法（たとえば、トランスフェクション）は当該技術分野で周知であり、そのような方法のいくつかは先に記載されている。少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物の発現を検出するための方法（たとえば、ノーザンブロッティング、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、発現プロファイリング）も当該技術分野で周知である。
【０１１１】
本発明はここで以下の限定的でない実施例によって説明される。
【実施例】
【０１１２】
ＣＬＬ試料およびマイクロＲＮＡマイクロチップ実験。
【０１１３】
８０のＣＬＬ試料はＣＬＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓにおいてＣＬＬと診断された患者からインフォームドコンセント後に得られた。手短に述べると、血液をＣＬＬ患者から得て、リンパ球をＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅグラジエント遠心分離（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって単離し、標準Ｔｒｉｚｏｌ法を使用したＲＮＡ抽出のために処理した。タンパク質抽出は先に記載１０のように実行した。マイクロＲＮＡ−マイクロチップ実験は先に記載９のように実施した。それぞれのマイクロＲＮＡマイクロチップには、３２６ヒトおよび２４９マウスマイクロＲＮＡ遺伝子に対応する、デュープリケートプローブが含まれた。統計的解析は先に記載のように実行した１１。統計的に有意に異なって発現されたマイクロＲＮＡを同定するために、ＢＲＢ  ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓを使用してクラス予測解析を実施し。
ＤＮＡ−コンストラクト、トランスフェクション、ウェスタンブロッティングおよびルシフェラーゼアッセイ。
【０１１４】
５’および３’ＵＴＲ  ｃＤＮＡを含む全長ＴＣＬ１  ｃＤＮＡを、ｐＵＳＥａｍｐベクター（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）にクローニングした（図１ｅにおいて使用）。ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂ  ＲＮＡデュープレックスはＡｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）から購入した。トランスフェクションは先に記載１２のように実行した。ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性は二重ルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりアッセイし、ホタルルシフェラーゼ活性はウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して標準化した。細胞溶解産物作製およびウェスタンブロット解析は、先に記載４のように抗−ＴＣＬ１モノクローナル抗体（クローン２７Ｄ６）を使用して実行した。
結果と考察
Ｔｃｌ１の高発現は侵襲性Ｂ−ＣＬＬ表現型に相関する
Ｂ−ＣＬＬ試料におけるＴＣＬ１およびマイクロＲＮＡ発現を評価するために、３群のＢ−ＣＬＬ：２３の緩徐進行性Ｂ−ＣＬＬ試料、２５の侵襲性Ｂ−ＣＬＬ試料および３２の１１ｑ欠失を示す侵襲性Ｂ−ＣＬＬ試料が選択された。試料の詳細な説明は図４ａ〜４ｄに示す。
【０１１５】
マイクロＲＮＡマイクロチップ実験は、３群のＣＬＬがマイクロＲＮＡ発現パターンにおいて著しく特徴的な違いを示すことを明らかにした（図３−表１および図５−表２を参照されたい）。
【０１１６】
３群のＣＬＬにおけるＴＣＬ１タンパク質発現を確定するために、２７Ｄ６  ＴＣＬ１モノクローナル抗体を使用したウェスタンブロット解析を実行した。これらの実験の結果は図１ａ〜ｂに示す。
【０１１７】
ＴＣＬ１発現は、低い、中等度、高いおよび非常に高いとして査定された。我々の実験は緩徐進行性Ｂ−ＣＬＬ  ２３の中の１５（６５％）、侵襲性Ｂ−ＣＬＬ  ２５の中の１１（４４％）および１１ｑ欠失侵襲性Ｂ−ＣＬＬ  ３２の中の１（３％）における低レベルを明らかにし；一方高い、および非常に高いＴＣＬ１発現は、緩徐進行性Ｂ−ＣＬＬ  ２３の中の１（４％）、侵襲性Ｂ−ＣＬＬ  ２５の中の１４（５６％）および１１ｑ欠失侵襲性Ｂ−ＣＬＬ  ３２の中の２４（７５％）において観察された（図１ｂ）。
【０１１８】
本発明者は、ＴＣＬ１過剰発現は侵襲性Ｂ−ＣＬＬ表現型（ｐ＜１０−６）および１１ｑ欠失物（ｐ＜１０−４）に相関すると考えている。結果は、ヒトＣＬＬにおける高いＴＣＬ１発現は突然変異していないＶＨ状態およびＺＡＰ７０陽性率と相関することを明らかにしている最近発表された研究５と一致する。
ｍｉＲ−２９およびｍｉＲ標的Ｔｃｌ１発現
どのｍｉＲＮＡがＴＣＬ１を標的にするかを決定するために、Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｅｒｖｅｒ  ａｎｄ  ｍｉＲＢａｓｅデータベースにより提供されたＲＮＡハイブリッドソフトウェア１３が使用された。ＴＣＬ１を標的にするｍｉＲ−候補の中で、ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂ（図１ｃ、相同性がより低いいくつかの他の部位は示さない）は１１ｑが欠失した侵襲性Ｂ−ＣＬＬにおいてもダウンレギュレーションされていることが見いだされた（図３−表１）。
【０１１９】
これらのｍｉＲの発現は代表的な組の試料におけるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより確認された（図４ａ〜４ｄ）。
【０１２０】
さらに、ｍｉＲ−２９ファミリーメンバーの発現は、予後良好および不良のＣＬＬ試料を識別できることが以前に示された９。次に、先に記載１２のように、ルシフェラーゼＯＲＦの下流に挿入されたＴＣＬ１  ３’ＵＴＲを使用して、これらのｍｉＲが実際にＴＣＬ１発現を標的にするかどうかが確定された。ＨＥＫ２９３細胞は、ｍｉＲ−２９ｂまたは示したようなスクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅ）陰性対照、および示したようなｍｉＲ−２９に相同な領域（Ｔｃｌ１）を含むＴＣＬ１  ｃＤＮＡの一部を含むｐＧＬ３コンストラクトまたはｐＧＬ３ベクター単独でコトランスフェクションした。
【０１２１】
ｍｉＲ−１８１アッセイの場合、全長ＴＣＬ１  ｃＤＮＡがセンス（Ｔｃｌ１ＦＬ）またはアンチセンス（Ｔｃｌ１ＦＬＡＳ）オリエンテーションでｐＧＬ３ベクターに挿入した。図１ｄは、ＴＣＬ１  ｍＲＮＡ発現がｍｉＲ−２９およびｍｉＲ−１８１によって阻害されることを示す。これらの発見を確証するために、５’および３’ＵＴＲを含む全長ＴＣＬ１  ｃＤＮＡをＣＭＶ哺乳動物発現ベクターにクローニングし、ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂがＴＣＬ１タンパク質発現レベルに影響を与えるかどうかを検討した。我々は図１ｅに示すように、このコンストラクトをｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−１８１ｂおよびプレ−ｍｉＲ陰性対照（スクランブル）で２９３細胞にコトランスフェクションした。
【０１２２】
これらの実験は、ＴＣＬ１とｍｉＲ−２９およびｍｉＲ−１８１の同時発現が著しくＴＣＬ１発現を減少させることを明らかにした（図１ｅ、レーン２対レーン１および３）。
【０１２３】
従って、本明細書では、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルでｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂがＴＣＬ１発現を標的にすることを示している。興味深いことに、Ｂ−ＣＬＬ試料においてｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂ発現とＴＣＬ１タンパク質発現との間には逆の相関があり（図１ｆ）：高いｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂ発現を示すすべての試料はまた、低いか、または中等度のＴＣＬ１発現を示し；非常に高いＴＣＬ１発現を示すすべての試料は大部分低いｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−１８１ｂ発現を示す。これらの結果は、ＣＬＬにおけるＴＣＬ１発現は、少なくとも部分的に、ｍｉＲ−２９およびｍｉＲ−１８１によって制御されることを示す。
【０１２４】
本明細書では、ＴＣＬ１発現はｍｉＲ−２９およびｍｉＲ−１８１によって制御され、この制御は研究した３群のＢ−ＣＬＬと関係することが証明される。ＴＣＬ１タンパク質発現とこれらの２つのｍｉＲ間の逆の相関が観察されたが、顕著な割合のＢ−ＣＬＬ試料が低いＴＣＬ１発現および低いｍｉＲ−２９およびｍｉＲ−１８１発現を示す（図１ｆ）。このことは、これらの試料において、ＴＣＬ１発現が転写の段階で、または他のｍｉＲＮＡによりダウンレギュレーションされていることを暗示する。ｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−１８１のいずれも１１ｑに位置しないという事実は、その領域がこれら２つのｍｉＲの発現の重要なレギュレーターを含むことを暗示する。
【０１２５】
興味深いことに、ｍｉＲ−１８１はＢ細胞において異なって発現され、ＴＣＬ１は最もＢ−細胞に特有な遺伝子である１４。理論に束縛されることを望まないが、本発明者は、Ｂ−細胞成熟の異なるステージにおいて、ＴＣＬ１およびｍｉＲ−１８１発現との間に逆の相関があると考える。ｍｉＲ−２９およびｍｉＲ−１８１は自然に存在するＴＣＬ１阻害因子であるため、これらのｍｉＲはＴＣＬ１を過剰発現するＢ−ＣＬＬにおいて治療薬としての有用な候補でありうる。
【０１２６】
特許法の規定に従って、本発明の原理および施行の様式はその好ましい態様において説明され、例示されている。しかし、本発明はその意図または範囲から逸脱せずに、特に説明され、例示されたものと異なって実行されてもよいことは理解されなければならない。参考文献
先に論じた参考文献および以下の参考文献は、それらが代表的な手順、またはその他の詳細の捕捉を提供する程度に、特に参照として本明細書に援用される。
【０１２７】
【表１】
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【０１２８】
【表２】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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