(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋したジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーを含む、ポリマーネットワーク。
【請求項２】
前記ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーが、前記ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーのアミン基および前記アルデヒド誘導体化デキストランポリマーのアルデヒド基を介して前記アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋される、請求項１に記載のポリマーネットワーク。
【請求項３】
ハイドロゲルの形態である、請求項１または請求項２に記載のポリマーネットワーク。
【請求項４】
２％から１０％ｗ／ｖのジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーと２％から１０％ｗ／ｖのアルデヒド誘導体化デキストランポリマーとを含む、請求項３に記載のポリマーネットワーク。
【請求項５】
前記ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーが、Ｎ−スクシニルキトサンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリマーネットワーク。
【請求項６】
血漿タンパク質、ホルモン、酵素、抗生物質、防腐剤、抗悪性腫瘍薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗炎症薬、成長因子、ステロイド、細胞懸濁液、細胞毒、および細胞増殖阻害剤から選択される１種以上の生物学的活性剤をさらに含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載のポリマーネットワーク。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか一項に記載のポリマーネットワークの製造方法であって、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーの水溶液とアルデヒド誘導体化デキストランポリマーの水溶液とを混合することを含む方法。
【請求項８】
癒着形成の影響を受けやすい組織の癒着を予防または低減するため、創傷治癒を加速または促進するため、あるいは創傷の出血を止めるための組成物であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリマーネットワークを含む組成物。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリマーネットワークを含む、耳、鼻および喉の外科手術用組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリマーネットワークを製造するためのキットであって、
（ａ）ジカルボキシル誘導体化キトサンポリマーと、
（ｂ）アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと、
（ｃ）前記キットを、癒着形成の影響を受けやすい組織の癒着を予防または低減するため、創傷治癒を加速または促進するため、あるいは創傷の出血を止めるために用いるための使用説明書
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
癒着の形成は、多くの外科手術で頻繁に生じる不快な結果である。癒着とは、通常は離れている創傷表面同士をつなぐ線維帯である。癒着は特に、ヘルニア修復、婦人科手術、結腸直腸手術などの腹部手術や骨盤手術後に普通にみられる。
【０００２】
外科手術時の処置と乾燥によって組織に外傷が生じると、線維性の滲出液が放出される。この滲出液は、吸収または溶解されなければ腹膜腔または骨盤腔に貯留し、そこで癒着に変化する場合がある。滲出液は線維芽細胞とともに内殖し、コラーゲンが堆積して血管が形成されはじめ、癒着の組織化が起こり得る状態になる。
【０００３】
癒着が形成されると、小腸閉塞、女性の不妊症、慢性疼痛などの重篤な合併症につながる可能性がある。患者はさらに外科手術を受けて癒着を切開しなければならないこともあるが、その場合も新たな癒着が形成されない保証はどこにもない。
【０００４】
癒着形成を抑えるための技術として、腹膜腔の洗浄、薬理作用物質の投与、組織の機械的な分離がある。出血を止める生理的プロセスである術後止血によって、癒着形成の危険性が低下すると同時に他の利点も得られる可能性がある。
【０００５】
残念なことに、癒着を低減および／または止血を達成するための現行の手順は、とりたてて有効ではなく、患者にとって嫌なこともある。また、状況によっては止血を目的とした処置によって、癒着形成の危険性が増すこともある。
【０００６】
たとえば、慢性副鼻腔炎の治療に用いられている内視鏡的副鼻腔手術（ＥＳＳ）の後、出血を抑えるために患者は不快な鼻タンポンの挿入を我慢しなければならない。しかしながら、鼻タンポンを取り除くと粘膜が傷付くことがあり、これによって癒着が形成される尤度が高くなる。トロンビン、フィブリン、フィブリノゲン、コラーゲンなどの周知の局所用止血薬を取り入れたドレッシングですら、癒着の形成を有意に増加させる可能性がある（たとえば、Chandra R. K., Kern R. C., Advantages and disadvantages of topical packing in endoscopic sinus surgery, Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg 2004, 12, 21-26を参照のこと）。さらに外科手術を必要とする癒着形成は、ＥＳＳを受けた患者の１０〜３０％に発生する。
【０００７】
従来、ポリマー溶液およびゲルを標的部分に適用して癒着を抑えている。たとえば、ゲルを用いて外科的に露出した組織を覆った上で、手術部位を閉じるようにしている。ポリマーを溶液中にてｉｎ  ｓｉｔｕで患者に付けた後、化学反応させてポリマーネットワークが形成されるよう共有結合による架橋形成を可能にしている手法もある。たとえば、SprayGel（商標）は、組織に適用すると組織の癒着バリアを形成するＰＥＧベースの材料である。
【０００８】
キトサンなどの多糖ポリマーもゲル形成薬剤として周知である。キトサンは、創傷治癒特性を有することが認められている。たとえば、米国特許第５，８３６，９７０号には、繊維、粉末、フィルム、フォームまたは水膨潤性ハイドロコロイドとして調製できるキトサンおよびアルギン酸塩の創傷被覆材が開示されている。米国特許第５，５９９，９１６号には創傷被覆材で使用可能な水膨潤性・水不溶性キトサン塩が開示されており、米国特許第６，４４４，７９７号には創傷被覆材またはスキンコーティングとして使用可能なキトサンのマイクロフレークが開示されている。
【０００９】
また、キトサンには、ラットで腹膜癒着の予防効果があることが分かっている（Preventive effects of chitosan on peritoneal adhesion in rats, Zhang, Zhi-Liang et al., World J Gastroenterol, 2006, 12(28) 4572-4577。
【００１０】
キトサンの誘導体についても、創傷治癒と癒着予防に対する効果の調査がなされている。たとえば、ＰＣＴ国際公開第９６／３５４３３号パンフレットには、外科癒着の予防にＮ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンを用いることが記載されている。Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンは、以下の文献にも記載されている。
（ｉ）Kennedy R et al., Prevention of experimental postoperative adhesions by N,O-carboxymethyl chitosan, Surgery, 1996, 120, 866-70；
（ｉｉ）Costain DJ et al., Prevention of postsurgical adhesions with N,O-carboxymethylchitosan: Examination of the most efficacious preparation and the effect of N,O-carboxymethyl chitosan on postsurgical healing, Surgery, 1997; 121, 314-9；
（ｉｉｉ）Krause TJ et al., Prevention of pericardial adhesions with N,O-carboxymethylchitosan in the Rat Model, Journal of Investigative Surgery, 2001 ,14,93-97；
（ｉｖ）Diamond, Michael P. et al., Reduction of postoperative adhesions by N,O-carboxymethylchitosan: a pilot study, Fertil Steril 2003, 80, 631-636；
（ｖ）Diamond Michael P et al., Reduction of post operative adhesions by N,O-carboxymethylchitosan: A Pilot Study, The Journal of the American Association of Gynecologic Laparoscopists, 2004, 11(1), 127；
（ｖｉｉ）Lee, Timothy D. G et al., Reduction in postoperative adhesion formation and re-formation after an abdominal operation with the use of N,O-carboxymethyl chitosan, Surgery, 2004, 135, 307-312。
【００１１】
ＰＣＴ国際公開第９８／２２１１４号パンフレットには、硫酸化単糖、二糖またはオリゴ糖とキトサンとを併用して、コラーゲン含有組織での創傷治癒性を高めることが論じられている。ＰＣＴ国際公開第９６／０２２６０号パンフレットには、ヘパリン、ヘパリン硫酸またはデキストラン硫酸との併用でのキトサンが記載されている。この組み合わせは、皮膚の創傷治癒を促進すると言われている。
【００１２】
ＰＣＴ国際公開第０４／００６９６１号パンフレットには、中性のキトサンと二価多価アルデヒドまたはアルデヒド処理ヒドロキシル含有ポリマーとの架橋によって形成された細胞を固定化して封入するためのゲルが記載されている。
【００１３】
こうして尽力されているにもかかわらず、癒着形成は多くの外科手術分野で依然としてごく普通に発生する。このため、外科手術の成果を改善するのに用いることが可能な、止血と癒着予防に医学的な効力のある新たなポリマー材料に依然として大きな需要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、本発明の目的は、創傷に適用して創傷治癒を助ける、あるいは人々に有用な選択肢を与えることが可能なハイドロゲルを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の開示
本発明は、術創および他の創傷に適用可能なハイドロゲルに関する。このハイドロゲルは、混合時に架橋してポリマーネットワークを形成する２種類のポリマーの水溶液を組み合わせることで製造可能である。架橋が生じたら、得られるポリマーネットワークが水溶液にてハイドロゲルを生じる。このハイドロゲルは、たとえば、ポリマー溶液を標的部分に噴霧する、吹き掛ける、あるいは注ぐことによって、ｉｎ  ｓｉｔｕで形成可能である。あるいは、このハイドロゲルを事前に形成した上で標的部分に適用しても構わない。別の実施形態では、ポリマー成分を取り入れた創傷被覆材が湿っているときに、ハイドロゲルを形成できる。
【００１６】
本発明のハイドロゲルは創傷治癒を助け、癒着が形成されやすい状態の損傷を受けた隣接組織間に生じる癒着の予防を助けることもある。また、本発明のハイドロゲルは、創傷の出血を抑えるまたは止めることで、止血に影響することもある。このハイドロゲルは外科手術条件下で生分解性であり、数日または数週間の時間をかけて徐々に分解される。
【００１７】
一態様では、本発明は、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋したジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーを含む、ポリマーネットワークを提供するものである。
【００１８】
別の態様では、本発明は、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋したジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーからなるポリマーネットワークを提供するものである。
【００１９】
上記の態様の一実施形態では、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーが、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーのアミン基およびアルデヒド誘導体化デキストランポリマーのアルデヒド基を介してアルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋される。
【００２０】
上記の態様の一実施形態では、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーが、Ｎ−スクシニルキトサンポリマーである。
【００２１】
別の態様では、本発明は、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋したＮ−スクシニルキトサンを含む、ポリマーネットワークを提供するものである。
【００２２】
別の態様では、本発明は、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋したＮ−スクシニルキトサンからなるポリマーネットワークを提供するものである。
【００２３】
上記の態様の一実施形態では、Ｎ−スクシニルキトサンが、Ｎ−スクシニルキトサンのアミン基およびアルデヒド誘導体化デキストランポリマーのアルデヒド基によってアルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋される。
【００２４】
別の態様では、本発明は、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋したジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーを含むポリマーネットワークであって、ポリマーネットワークが、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーとアルデヒド誘導体化デキストランポリマーとを水溶液で混合して約１秒から約５分以内にハイドロゲルを形成する、ポリマーネットワーク提供するものである。
【００２５】
別の態様では、本発明は、ポリマーネットワークが、Ｎ−スクシニルキトサンとアルデヒド誘導体化デキストランポリマーとを水溶液で混合して約１秒から約５分以内にハイドロゲルを形成する、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋したＮ−スクシニルキトサンを含むポリマーネットワークを提供するものである。
【００２６】
一実施形態では、ハイドロゲルが約１秒から約３０秒以内、好ましくは約１秒から約２０秒以内、一層好ましくは約１秒から約１０秒以内に生じる。別の実施形態では、ハイドロゲルが、約３０秒から約５分以内に生じる。別の実施形態では、ハイドロゲルが約５秒から約１分以内に生じる。
【００２７】
別の態様では、本発明は、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋したジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーを含むポリマーネットワークであって、ポリマーネットワークが、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーとアルデヒド誘導体化デキストランポリマーとを水溶液中で混合して約５分から約２０分以内にハイドロゲルを形成する、ポリマーネットワークを提供するものである。
【００２８】
別の態様では、本発明は、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋したＮ−スクシニルキトサンを含むポリマーネットワークであって、ポリマーネットワークが、Ｎ−スクシニルキトサンとアルデヒド誘導体化デキストランポリマーとを水溶液中で混合して約５分から約２０分以内にハイドロゲルを形成する、ポリマーネットワークを提供するものである。
【００２９】
一実施形態では、ハイドロゲルが、約５分から約１０分以内に生じる。
【００３０】
別の実施形態では、ハイドロゲルが、約１０分から約２０分以内に生じる。
【００３１】
別の態様では、本発明は、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋したジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーを含むポリマーネットワークであって、ポリマーネットワークが、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーとアルデヒド誘導体化デキストランポリマーとを水溶液中で混合して約２０分から約２時間以内にハイドロゲルを形成する、ポリマーネットワークを提供するものである。
【００３２】
別の態様では、本発明は、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋したＮ−スクシニルキトサンを含むポリマーネットワークであって、ポリマーネットワークが、Ｎ−スクシニルキトサンとアルデヒド誘導体化デキストランポリマーとを水溶液中で混合して約２０分から約２時間以内にハイドロゲルを形成する、ポリマーネットワークを提供するものである。
【００３３】
一実施形態では、ハイドロゲルが、約２０分から約２時間以内、好ましくは約３０分から約１時間以内に生じる。
【００３４】
一態様では、本発明は、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーとアルデヒド誘導体化デキストランポリマーとを水溶液中に含む、創傷治癒組成物を提供するものである。
【００３５】
一実施形態では、ジカルボキシ誘導体がＮ−スクシニルキトサンである。
【００３６】
一実施形態では、組成物が約２％から１０％ｗ／ｖのジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーを含む。一実施形態では、組成物が約２％から１０％ｗ／ｖのアルデヒド誘導体化デキストランポリマーを含む。
【００３７】
別の態様では、本発明は、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋したジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーを水溶液中に含む、ハイドロゲルを提供するものである。
【００３８】
一実施形態では、ハイドロゲルが約２％から１０％ｗ／ｖのジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーを含む。一実施形態では、ハイドロゲルが約２％から１０％ｗ／ｖのアルデヒド誘導体化デキストランポリマーを含む。
【００３９】
好ましくは、ハイドロゲルが、約２％から約８％ｗ／ｖ、一層好ましくは約２％から約６％ｗ／ｖのジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーを含む。最も好ましくは、ハイドロゲルが約５％ｗ／ｖのジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーを含む。
【００４０】
好ましくは、ハイドロゲルが、約２％から約８％ｗ／ｖ、一層好ましくは約２％から約６％ｗ／ｖのアルデヒド誘導体化デキストランポリマーを含む。最も好ましくは、ハイドロゲルが約５％ｗ／ｖのアルデヒド誘導体化デキストランポリマーを含む。
【００４１】
一実施形態では、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーが、Ｎ−スクシニルキトサンである。
【００４２】
一実施形態では、水溶液が、水、生理食塩水、緩衝液、これらの混合物からなる群から選択される。好ましくは、水溶液が約０．９％ｗ／ｖの生理食塩溶液である。
【００４３】
別の態様では、本発明は、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋したジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーを含むポリマーネットワークの製造方法であって、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーの水溶液とアルデヒド誘導体化デキストランポリマーの水溶液とを混合することを含む方法を提供するものである。
【００４４】
一実施形態では、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーの水溶液が約２％から約１０％ｗ／ｖのジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーを含む。好ましくは、水溶液が、約２％から約８％ｗ／ｖ、一層好ましくは約５％ｗ／ｖのジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーを含む。
【００４５】
一実施形態では、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーの水溶液のｐＨが約６から８である。好ましくは、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーの水溶液のｐＨが約６．５から７．５である。
【００４６】
一実施形態では、ジカルボキシ誘導体化キトサンがＮ−スクシニルキトサンである。
【００４７】
一実施形態では、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーの水溶液が、約２％から約１０％ｗ／ｖのアルデヒド誘導体化デキストランポリマーを含む。好ましくは、水溶液が、約２％から約８％ｗ／ｖ、一層好ましくは約５％ｗ／ｖのアルデヒド誘導体化デキストランポリマーを含む。
【００４８】
一実施形態では、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーの水溶液のｐＨが約６から８である。好ましくは、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーの水溶液のｐＨが約６．５から７．５である。
【００４９】
一実施形態では、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーが、５０〜１００％アルデヒド誘導体化、好ましくは７０〜１００％アルデヒド誘導体化、一層好ましくは８０〜１００％アルデヒド誘導体化されている。
【００５０】
一実施形態では、この方法が、等容量の（ａ）ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーの水溶液と（ｂ）アルデヒド誘導体化デキストランポリマーの水溶液とを混合することを含む。
【００５１】
一実施形態では、ポリマーネットワークおよび水溶液が一緒にハイドロゲルを含む。
【００５２】
一実施形態では、溶液同士を一緒に攪拌してポリマーの水溶液を混合する。別の実施形態では、溶液を標的部分に同時に噴霧する、吹き掛ける、あるいは注ぐなどして、標的部分に適用する際に、ポリマーの水溶液を混合する。
【００５３】
一実施形態では、水溶液が、水、生理食塩水、緩衝液、これらの混合物からなる群から選択される。好ましくは、水溶液が約０．９％ｗ／ｖ生理食塩溶液である。
【００５４】
一実施形態では、ポリマーの水溶液が、１種以上の薬学的に許容される賦形剤を含有するものであってもよい。
【００５５】
一態様では、本発明は、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋したジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーを含むハイドロゲルであって、１種以上の生物学的活性剤を含む、ハイドロゲルを提供するものである。
【００５６】
一実施形態では、１種以上の生物学的活性剤が、血漿タンパク質、ホルモン、酵素、抗生物質、防腐剤、抗悪性腫瘍薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗炎症薬、局所麻酔薬、成長因子、ステロイド、細胞懸濁液、細胞毒、細胞増殖阻害剤からなる群から選択される。
【００５７】
一態様では、本発明は、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋したジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーを含むハイドロゲルであって、１種以上の非生物学的活性剤（non-biologically active agent)を含む、ハイドロゲルを提供するものである。
【００５８】
一実施形態では、１種以上の非生物学的活性剤が、増粘剤および染料からなる群から選択される。
【００５９】
一態様では、本発明は、癒着形成しやすい組織の癒着を予防または低減する方法であって、組織を本発明のハイドロゲルで治療することを含む方法を提供するものである。
【００６０】
一実施形態では、癒着が手術後の癒着である。
【００６１】
一実施形態では、この方法は、組織に本発明のハイドロゲルを適用することを含む。好ましくは、ハイドロゲルの層を組織表面に塗り広げる。
【００６２】
一実施形態では、この方法は、（ａ）および（ｂ）の組み合わせで創傷表面にハイドロゲルが形成されるように、（ａ）ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーの水溶液と、（ｂ）アルデヒド誘導体化デキストランポリマーの水溶液とを組織に適用することを含む。
【００６３】
一実施形態では、（ａ）と（ｂ）とを組織に同時に適用する。
【００６４】
一実施形態では、（ａ）と（ｂ）とを組織に同時に噴霧する。一実施形態では、（ａ）と（ｂ）とを組織に同時に吹き掛ける。別の実施形態では、（ａ）と（ｂ）とを組織に同時に注ぐ。
【００６５】
別の態様では、本発明は、組織を本発明のハイドロゲルで治療することを含む、癒着形成しやすい組織の手術後の癒着を予防または低減する方法であって、（ａ）および（ｂ）の組み合わせで組織表面にハイドロゲルが形成されるように、（ａ）ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーの水溶液と、（ｂ）アルデヒド誘導体化デキストランポリマーの水溶液とを組織に適用することを含む方法を提供するものである。
【００６６】
別の態様では、本発明は、創傷を本発明のハイドロゲルで治療することを含む、創傷治癒を加速または促進する方法を提供するものである。
【００６７】
一実施形態では、この方法は、創傷に本発明のハイドロゲルを適用することを含む。好ましくは、ハイドロゲルの層を創傷表面に塗り広げる。
【００６８】
一実施形態では、この方法は、（ａ）および（ｂ）の組み合わせでハイドロゲルが形成されるように、（ａ）ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーの水溶液と、（ｂ）アルデヒド誘導体化デキストランポリマーの水溶液とを創傷に適用することを含む。
【００６９】
一実施形態では、（ａ）と（ｂ）とを創傷に同時に適用する。
【００７０】
一実施形態では、（ａ）と（ｂ）とを創傷に同時に噴霧する。一実施形態では、（ａ）と（ｂ）とを創傷に同時に吹き掛ける。別の実施形態では、（ａ）と（ｂ）とを創傷に同時に注ぐ。
【００７１】
別の態様では、本発明は、創傷を本発明のハイドロゲルで治療することを含む、創傷治癒を加速または促進する方法であって、（ａ）および（ｂ）の組み合わせで創傷表面にハイドロゲルが形成されるように、（ａ）ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーの水溶液と、（ｂ）アルデヒド誘導体化デキストランポリマーの水溶液とを創傷に適用することを含む方法を提供するものである。
【００７２】
別の態様では、本発明は、創傷を本発明のハイドロゲルで治療することを含む、創傷の出血を抑えるまたは止める方法を提供するものである。
【００７３】
一実施形態では、この方法は、創傷に本発明のハイドロゲルを適用することを含む。好ましくは、ハイドロゲルの層を創傷表面に塗り広げる。
【００７４】
一実施形態では、この方法は、（ａ）および（ｂ）の組み合わせでハイドロゲルが形成されるように、（ａ）ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーの水溶液と、（ｂ）アルデヒド誘導体化デキストランポリマーの水溶液とを創傷に適用することを含む。
【００７５】
一実施形態では、（ａ）と（ｂ）とを創傷に同時に適用する。
【００７６】
一実施形態では、（ａ）と（ｂ）とを創傷に同時に噴霧する。一実施形態では、（ａ）と（ｂ）とを創傷に同時に吹き掛ける。別の実施形態では、（ａ）と（ｂ）とを創傷に同時に注ぐ。
【００７７】
別の態様では、本発明は、創傷を本発明のハイドロゲルで治療することを含む、創傷の出血を抑えるまたは止める方法であって、（ａ）および（ｂ）の組み合わせで創傷表面にハイドロゲルが形成されるように、（ａ）ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーの水溶液と、（ｂ）アルデヒド誘導体化デキストランポリマーの水溶液とを創傷に適用することを含む方法を提供するものである。
【００７８】
別の態様では、本発明は、組織を本発明のハイドロゲルで治療することを含む、組織に１種以上の生物学的活性剤を送達する方法であって、ハイドロゲルが、１種以上の生物学的活性剤を含む方法を提供するものである。
【００７９】
一実施形態では、この方法は、組織に本発明のハイドロゲルを適用することを含み、ハイドロゲルが、１種以上の生物学的活性剤を含む。好ましくは、ハイドロゲルの層を組織表面に塗り広げる。
【００８０】
一実施形態では、この方法は、（ａ）および（ｂ）の組み合わせで組織表面にハイドロゲルが形成されるように、（ａ）ジカルボキシ誘導体化（dicarboxy-derivatised)キトサンポリマーの水溶液と、（ｂ）アルデヒド誘導体化デキストランポリマーの水溶液とを組織に適用することを含み、（ａ）および（ｂ）の一方または両方が１種以上の生物学的活性剤を含む。
【００８１】
一態様では、本発明は、癒着形成しやすい組織の手術後の癒着を予防または低減するための薬物の製造における本発明のハイドロゲルの使用法を提供するものである。
【００８２】
別の態様では、本発明は、（ａ）ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーの水溶液と、（ｂ）アルデヒド誘導体化デキストランポリマーの水溶液とを、癒着形成しやすい組織の癒着を予防または低減するための薬物の製造に用いる使用法であって、（ａ）および（ｂ）の組み合わせで本発明のハイドロゲルを形成する使用法を提供するものである。
【００８３】
別の態様では、本発明は、創傷治癒を加速または促進するための薬物の製造における本発明のハイドロゲルの使用法を提供するものである。
【００８４】
別の態様では、本発明は、（ａ）ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーの水溶液と、（ｂ）アルデヒド誘導体化デキストランポリマーの水溶液とを、創傷治癒を加速または促進するための薬物の製造に用いる使用法であって、（ａ）および（ｂ）の組み合わせで本発明のハイドロゲルを形成する使用法を提供するものである。
【００８５】
別の態様では、本発明は、創傷の出血を抑えるまたは止めるための薬物の製造における本発明のハイドロゲルの使用法を提供するものである。
【００８６】
別の態様では、本発明は、（ａ）ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーの水溶液と、（ｂ）アルデヒド誘導体化デキストランポリマーの水溶液とを、創傷の出血を抑えるまたは止めるための薬物の製造に用いる使用法であって、（ａ）および（ｂ）の組み合わせで本発明のハイドロゲルを形成する使用法を提供するものである。
【００８７】
別の態様では、本発明は、１種以上の生物学的活性剤を組織に送達するための薬物の製造における本発明のハイドロゲルの使用法であって、薬物が、１種以上の生物学的活性剤を含む、使用法を提供するものである。
【００８８】
別の態様では、本発明は、（ａ）ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーの水溶液と、（ｂ）アルデヒド誘導体化デキストランポリマーの水溶液とを、１種以上の生物学的活性剤を組織に送達するための薬物の製造に用いる使用法であって、（ａ）および（ｂ）の組み合わせで本発明のハイドロゲルを形成し、（ａ）および（ｂ）の一方または両方が１種以上の生物学的活性剤を含む、使用法を提供するものである。
【００８９】
上述した本発明の方法および使用法において:
一実施形態では、ハイドロゲルが、（ａ）と（ｂ）とを組み合わせて約１秒から約５分以内に生じて薬物を生成する。
【００９０】
一実施形態では、ハイドロゲルが、約１秒から約３０秒以内、好ましくは約１秒から約２０秒以内、一層好ましくは約１秒から約１０秒以内に生じる。別の実施形態では、ハイドロゲルが約３０秒から約５分以内に生じる。別の実施形態では、ハイドロゲルが約５秒から約１分以内に生じる。
【００９１】
一実施形態では、ハイドロゲルが、（ａ）と（ｂ）とを組み合わせて約５分から約２０分以内に生じて薬物を生成する。
【００９２】
一実施形態では、ハイドロゲルが、約５分から約１０分以内に生じる。別の実施形態では、ハイドロゲルが、約１０分から約２０分以内に生じる。
【００９３】
一実施形態では、ハイドロゲルが、（ａ）と（ｂ）とを組み合わせて約２０分から約２時間以内に生じて薬物を生成する。
【００９４】
一実施形態では、ハイドロゲルが、約３０分から約２時間以内、好ましくは約３０分から約１時間以内に生じる。
【００９５】
一実施形態では、（ａ）が、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーを約２％から１０％ｗ／ｖ、好ましくは約２％から約８％ｗ／ｖ、一層好ましくは約５％ｗ／ｖ含む。一実施形態では、（ｂ）が、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーを約２％から１０％ｗ／ｖ、好ましくは約２％から約８％ｗ／ｖ、一層好ましくは約５％ｗ／ｖ含む。
【００９６】
一実施形態では、（ａ）のｐＨが約６から８、好ましくは約６．５から７．５である。
【００９７】
一実施形態では、（ｂ）のｐＨが約６から８、好ましくは約６．５から７．５である。
【００９８】
一実施形態では、ジカルボキシ誘導体化キトサンがＮ−スクシニルキトサンである。
【００９９】
別の態様では、本発明は、湿っているときに本発明のハイドロゲルを放出できる創傷被覆材を提供するものである。
【０１００】
一実施形態では、創傷被覆材が、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーと、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーとを含む。一実施形態では、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーが、Ｎ−スクシニルキトサンである。
【０１０１】
一実施形態では、創傷被覆材が、絆創膏、ストリップ、パッド、ガーゼ、フィルム、ストッキング、テープからなる群から選択される。
【０１０２】
別の態様では、本発明は、本発明の方法で用いられるキットであって、
（ａ）ジカルボキシル誘導体化キトサンポリマーと、
（ｂ）アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと、を含む、キットを提供するものである。
【０１０３】
一実施形態では、キットが、（ａ）および（ｂ）を溶解させて、架橋を起こさせることが可能である水溶液も含む。別の実施形態では、キットが、（ａ）および（ｂ）のいずれか一方または両方の水溶液を含む。
【０１０４】
別の態様では、本発明は、本発明の方法に用いられるキットであって、
（ａ）ジカルボキシル誘導体化キトサンポリマーと、
（ｂ）アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと、を別々の容器に含む、キットを提供するものである。
【０１０５】
一実施形態では、キットが、（ａ）および（ｂ）を溶解させて、架橋を起こさせることが可能である水溶液も含む。別の実施形態では、キットが、（ａ）および（ｂ）のいずれか一方または両方の水溶液を含む。
【０１０６】
上述した本発明のキットにおいて:
一実施形態では、本発明のキットは、癒着形成しやすい組織の手術後の癒着を予防または低減する方法における使用説明書も含む。
【０１０７】
一実施形態では、本発明のキットは、創傷治癒を加速または促進する方法における使用説明書も含む。
【０１０８】
一実施形態では、本発明のキットは、創傷の出血を抑えるまたは止める方法における使用説明書も含む。
【０１０９】
一実施形態では、本発明のキットにて提供されるジカルボキシル誘導体化キトサンポリマーおよびアルデヒド誘導体化デキストランポリマーが、凍結乾燥されたものである。一実施形態では、このキットは、ジカルボキシル誘導体化キトサンポリマーとアルデヒド誘導体化デキストランポリマーとを溶解させるための水溶液も含む。
【０１１０】
一実施形態では、ジカルボキシル誘導体化キトサンポリマーおよびアルデヒド誘導体化デキストランポリマーの少なくとも一方、好ましくは両方が別々に、水溶液に提供される。一実施形態では、水溶液が冷凍されている。
【０１１１】
一実施形態では、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーの水溶液が、約２％から約１０％ｗ／ｖのジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーを含む。好ましくは、水溶液が、約２％から約８％ｗ／ｖ、一層好ましくは約５％ｗ／ｖのジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーを含む。
【０１１２】
一実施形態では、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーの水溶液のｐＨが約６から８である。好ましくは、ジカルボキシ誘導体化ポリマーの水溶液のｐＨが約６．５から７．５である。
【０１１３】
一実施形態では、ジカルボキシ誘導体化キトサンがＮ−スクシニルキトサンである。
【０１１４】
一実施形態では、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーの水溶液が、約２％から約１０％ｗ／ｖのアルデヒド誘導体化デキストランポリマーを含む。好ましくは、水溶液が、約２％から約８％ｗ／ｖ、一層好ましくは約５％ｗ／ｖのアルデヒド誘導体化デキストランポリマーを含む。
【０１１５】
一実施形態では、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーの水溶液のｐＨが約６から８である。好ましくは、アルデヒド誘導体化デキストランの水溶液のｐＨが約６．５から７．５である。
【０１１６】
任意に、水溶液のいずれか一方または両方が、１種以上の薬学的に許容される賦形剤を含むものであってもよい。
【０１１７】
一実施形態では、水溶液が、水、生理食塩水、緩衝液、これらの混合物からなる群から選択される。好ましくは、水溶液が約０．９％ｗ／ｖの生理食塩溶液である。
【０１１８】
一実施形態では、水溶液のいずれか一方または両方が、１種以上の生物学的活性剤および／または１種以上の非生物学的活性剤を含むものであってもよい。
【０１１９】
一実施形態では、（ａ）および（ｂ）のうちの１つ以上で、１種以上の生理学的活性剤も取り入れている。
【０１２０】
本明細書に開示の一定範囲の数字（たとえば１から１０）を参照する場合、その範囲内のすべての有理数（たとえば、１、１．１、２、３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９、１０）ならびに、その範囲内の一定範囲の有理数（たとえば、２から８、１．５から５．５、３．１から４．７）も援用し、よって、本明細書に明示的に開示する全範囲のすべての部分範囲を明示的に開示したものと同等の内容を意図している。これらは、具体的に何を意図しているかを示す単なる例にすぎず、列挙した最小値から最大値までの考えられるかぎりの数値の組み合わせも、同様にして本出願に明示的に言及されたものとみなされる。
【０１２１】
特許明細書、他の外部文書または他の情報源を参照する本明細書では、これは主に本発明の特徴について説明するための文脈を提供することを目的とするものである。特に明記しないかぎり、このような外部文書の引用は、いかなる司法権においても、当該文書または当該情報源が従来技術であると認めたこととはみなされず、従来技術における一般的な常識の一部をなすものでもない。
【０１２２】
また、本発明は広義には、本出願の本明細書で個々にまたは総称として参照または言及している部分、要素、特徴の２つ以上の任意の組み合わせで前記部分、要素または特徴からなるとも言ってもよく、本発明が関連する技術分野において周知の等価物である具体的な整数を本明細書で言及している場合、このような周知の等価物もそれを個々に説明したのと同等に本明細書に援用されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】処置後に鼻の外壁に癒着のある、実施例６で説明する治験各群のヒツジの比率を示すグラフである。
【図２】鼻の外壁での癒着の平均グレード（実施例６）を示すグラフである。
【図３】篩骨癒着のある各群におけるヒツジの比率（実施例６）を示すグラフである。
【図４】マッチド対照群と比較した全処置での平均篩骨癒着グレード（実施例６）を示すグラフである。
【図５】上皮の高さを経時的に光学顕微鏡法で比較した結果（実施例６）を示すグラフである。
【図６】再上皮化の比率を光学顕微鏡法で比較した結果（実施例６）を示すグラフである。
【図７】再線毛化した表面積の比率を走査型電子顕微鏡法で比較した結果（実施例６）を示すグラフである。
【図８】線毛グレードを走査型電子顕微鏡法で比較した結果（実施例６）を示すグラフである。
【図９】各群の平均線毛運動周波数（ＣＢＦ）（実施例６）を示すグラフである。
【図１０】Boezaart評価尺度を用いる活性ｖｓ偽薬の術野グレードスコア（実施例７）を示すグラフである。
【図１１】Wormald評価尺度を用いる活性ｖｓ偽薬の術野評価尺度（実施例７）を示すグラフである。
【図１２】Wormald評価尺度を用いる活性ｖｓ対照群の術野の評価スコア（実施例８）を示すグラフである。
【図１３】活性ｖｓ対照群の完全な止血までの時間（実施例８）を示すグラフである。
【図１４】活性ｖｓ対照群での経時的な痂皮スコアを比較した（実施例８）グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１２４】
発明の詳細な説明
１．  定義
本明細書で使用する場合、「キトサン」という用語は、ランダムに分散されたβ−（１，４）結合したＤ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンからなる直鎖型の多糖を意味する。キトサンはキチンを脱アセチル化して生成可能なものである。α−キトサンとβ−キトサンのどちらも本発明で使用するのに適している。脱アセチル化度（％ＤＡ）はキトサンの溶解性や他の特性に影響する。市販のキトサンは一般に、脱アセチル化度が約５０から１００％である。完全に脱アセチル化したキトサンのモノマー単位を以下の式Ｉに示す。
【化１】
0005489999.tif 000002
【０１２５】
本明細書で使用する場合、「ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマー」という用語は、環状無水物とキトサンポリマーのＤ−グルコサミン残基のアミン基との反応によって誘導体化されたキトサンポリマーを意味する。ジカルボキシ基の例としては、Ｎ−スクシニル、Ｎ−マロイル、Ｎ−フタロイルがあげられる。Ｎ−スクシニルが好ましい。
【０１２６】
「ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマー」は、他の官能基で部分的に誘導体化されたものであってもよい。この二次誘導体化は、ジカルボキシ基で誘導体化されなかったアミン位置あるいは、Ｄ−グルコサミン残基のヒドロキシ基のいずれかで起こり得る。たとえば、環状無水物とキトサンのＯＨ基とが反応すると、アミド置換基の代わりに、あるいはアミド置換基に加えてエステル基を含有するモノマーが得られることがある。
【０１２７】
二次誘導体化がジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーのアミン位置に存在する場合、ポリマーは、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーとの架橋を形成できるだけの十分な遊離アミン基を保持しなければならない。好ましくは、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーは、環状無水物とＤ−グルコサミン残基のアミン基との反応によってのみ誘導体化される。
【０１２８】
本明細書で使用する場合、「Ｎ−スクシニルキトサンポリマー」という用語は、キトサンポリマーのＤ−グルコサミン残基のアミン基にＮ−スクシニル基を加えることで誘導体化されたキトサンを意味する。Ｎ−スクシニルキトサンポリマーのモノマー単位を以下の式ＩＩに示す。
【化２】
0005489999.tif 000003
【０１２９】
スクシニル化度は可変である。一般に、約３０から７０％であるが、Ｎ−スクシニルキトサンポリマーは、アルデヒド誘導体化デキストランとの架橋を形成できるだけの十分な遊離アミン基を保持しなければならない。Ｎ−スクシニルキトサンポリマーは、「ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマー」（上記）で述べたような二次誘導体化を含むものであってもよい。
【０１３０】
「Ｎ−スクシニルキトサン」という用語は、本明細書で使用する場合、アミン位置でＮ−スクシニル基によってのみ誘導体化され、他の官能基との二次誘導体化を含まない、Ｎ−スクシニルキトサンポリマーを意味する。
【０１３１】
本明細書で使用する場合、「デキストラン」という用語は、短いα−（１，３）側鎖を有するα−（１，６）グリコシド結合で構成されるグルコース多糖を意味する。デキストランのモノマー単位を以下の式ＩＩＩに示す。
【化３】
0005489999.tif 000004
【０１３２】
デキストランは、スクロース含有媒質をロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）  B512Fで発酵させて得られるものである。分子量１ＫＤａから２０００ＫＤａのデキストランが市販されている。
【０１３３】
本明細書で使用する場合、「アルデヒド誘導体化デキストランポリマー」という用語は、隣接する第２級アルコール基が酸化されて反応性ビスアルデヒド官能基となったデキストランポリマーを意味する。アルデヒド誘導体化デキストランポリマーは、他の位置で他の官能基によって誘導体化されていてもよい。好ましくは、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーは、隣接する第２級アルコール基でのみ誘導体化される。アルデヒド誘導体化デキストランポリマーの代表的なモノマー単位を以下の式ＩＶにあげておく。
【化４】
0005489999.tif 000005
【０１３４】
本明細書で使用する場合、「徐放」という用語は、生物学的活性剤の徐放との関連で、拡散のみに基づいて想定される送達と比較して、生物学的活性剤の想定される送達よりも長いことを意味する。
【０１３５】
本明細書で使用する場合、「ハイドロゲル」という用語は、巨大分子間の隙間を埋めるポリマー鎖および水の三次元ネットワークからなる二成分系または多成分系である。
【０１３６】
本明細書で使用する場合、「組織」という用語は、形態学的に類似の細胞が関連の細胞間物質と一緒に凝集したもの（これらが一緒になってヒトを含む生命体の体で１つ以上の特定の機能を果たすよう作用する）を意味する。組織の例として、筋肉、上皮、神経、結合組織があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１３７】
また、「組織」という用語は、大動脈、心臓、胸膜腔、気管、肺、心膜、囲心腔などの胸部組織；胃、小腸および大腸、肝臓、膵臓、胆嚢、腎臓、副腎などの腹部および後腹膜組織；男性および女性の生殖器および泌尿器の組織をはじめとする骨盤腔組織；脊柱および神経、硬膜および末梢神経などの中枢神経系および末梢神経系の組織；骨格筋、腱、骨、軟骨などの筋骨格系組織；眼、耳、首、喉頭、鼻、副鼻腔などの頭部および頸部組織などであるが、これに限定されるものではない、１つ以上の組織型を含む臓器も包含する。
【０１３８】
本明細書で使用する場合、「癒着」という用語は、外科手術などの炎症性刺激の後に生じる、組織間または臓器間あるいは、組織とインプラントとの間の異常な結合を意味する。
【０１３９】
癒着形成しやすい組織は、炎症性刺激に曝露された組織である。たとえば、内視鏡的副鼻腔手術、腹部手術、婦人科手術、筋骨格手術、眼手術、整形外科手術、心血管手術などであるが、これに限定されるものではない、外科的処置に関与した組織。組織は、機械的損傷、骨盤の炎症性疾患などの疾患、放射線治療、外科用インプラントなどの異物の存在といった他のイベントの後にも癒着形成しやすいことがある。
【０１４０】
本明細書で使用する場合、「創傷」という用語は、ヒト生物体をはじめとする生きた生物体での組織の傷害を意味する。組織は、内臓などの内部組織であってもよいし、皮膚などの外部組織であってもよい。傷害は、外科的切開によることもあれば、組織に意図しない力が加わることによることもある。創傷には、擦過創、挫創、刺創などの機械的損傷によって生じる傷害ならびに、火傷や化学的損傷によって生じる傷害を含む。また、傷害は、潰瘍、病変、腫物または感染において生じるものなど、徐々に発生することもある。創傷の例としては、挫傷創、切創、貫通創、穿孔創、穿刺創、皮下創があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１４１】
本明細書で使用する場合、「含む(comprising)」という用語は、「少なくとも一部をなす」ことを意味する。「含む」という用語を含む本明細書の各文を解釈すると、この用語で示した以外の特徴が存在してもよい。「含む(comprise)」及び「含む(comprises)」などの関連の用語も同様に解釈される。
【０１４２】
２．  ポリマーネットワーク
本発明は、２種類の周知のポリマーであるキトサンとデキストランの誘導体化および架橋によって形成される新規なポリマーネットワークに関する。このポリマーは、水溶液中でハイドロゲルを生成しながらすみやかに三次元ポリマーネットワークを形成する。ハイドロゲルの特性については、２種類のポリマー成分の誘導体化と架橋を変更することで、特定の用途に合わせて微調整が可能である。
【０１４３】
もっとも広義の態様では、本発明は、アルデヒド誘導体化デキストランと架橋したジカルボキシ誘導体化キトサンを含むポリマーネットワークを提供するものである。
【０１４４】
２．１  キトサン成分
キトサンは広く利用でき、Sigma-Aldrich（www.sigma-aldrich.com）などのさまざまな提供元から業務入手可能である。
【０１４５】
あるいは、キチンを脱アセチル化してキトサンを調製することも可能である。多くの脱アセチル化方法が従来技術において周知であり、たとえば、加熱しながら濃水酸化ナトリウム溶液中でキチンを加水分解した後、濾過によりキトサンを回収して水で洗浄する。キチンは、グルコサミン単位間の結合がαであるかβであるかによって、α−キチンまたはβ−キチンのいずれかで存在する。キチンは、甲殻類、昆虫、菌類、藻類、酵母に見られ、α−キチンがロブスターやカニ、エビなどの甲殻類の殻から多く得られるのに対し、β−キチンはイカの甲から誘導される。どちらのタイプのキチンも、本発明で使用するジカルボキシ誘導体化キトサンの調製に使用可能である。
【０１４６】
通常、市販のキトサンの平均分子量（ＭＷａｖ）は約１から１０００ｋＤａである。低分子量のキトサンは、ＭＷａｖが約１から５０ｋＤａである。高分子量のキトサンは、ＭＷａｖが約２５０から８００ｋＤａである。どのようなＭＷａｖのキトサンでも本発明で使用可能である。
【０１４７】
キチンの脱アセチル化は、得られるキトサンが遊離第１級アミン基の大部分をそのポリマー骨格とともに有することを意味する。キトサンの脱アシル化度は、本発明のポリマーネットワークの特性に影響することがある。誘導体化または架橋に利用できるのは、脱アセチル化されたグルコサミン単位のみであることがその理由である。また、キトサンの溶解性も脱アシル化度に左右される。
【０１４８】
本発明で使用するのに最も適したキトサンポリマーは、脱アセチル化度が約４０％から１００％である。好ましくは、脱アシル化度が約６０％から９５％、一層好ましくは約７０％から９５％である。
【０１４９】
本発明で使用するキトサンは、キチンの脱アセチル化によって遊離状態にされたアミンでジカルボキシ誘導体化されている。ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーについては、キトサンと環状酸無水物とを反応させることで生成可能である。本発明で使用するのに適した環状酸無水物としては、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸、グルタル酸無水物、シトラコン酸無水物、メチルグルタコン酸無水物、メチルコハク酸無水物などがあげられる。
【０１５０】
好ましくは、無水スクシニル、無水フタル酸またはグルタル酸無水物のうちの１つ以上とキトサンとの反応によってジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーを生成する。一層好ましくは、キトサンと無水スクシニルとの反応によってジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーを生成する。
【０１５１】
誘導体化を達成するには、従来技術において周知のどのような方法を使用してもよい。たとえば、環状無水物をＤＭＦに入れた溶液中で固体キトサンを加熱するか、固体キトサンをメタノール／水混合物に可溶化した後に無水物と反応させることが可能である。この誘導体化プロセスで使用するのに適した他の溶媒としては、ジメチルアセトアミドがあげられる。乳酸、ＨＣｌまたは酢酸などの酸を加えれば、キトサンの溶解性を改善することが可能である。ＮａＯＨなどの塩基は一般に、アセチル化アミンの一部を脱アセチル化する目的で添加される。
【０１５２】
一般的な方法を実施例１にあげておく。使用する方法は、使用する環状無水物および／またはキトサンの平均分子量に応じて選択可能である。キトサンと環状無水物のどちらも、使用する溶媒に対して十分に溶解または使用する溶媒中で十分に膨潤できるものとする。
【０１５３】
好ましい実施形態では、ジカルボキシ誘導体化キトサンがＮ−スクシニルキトサンである。Ｎ−スクシニルキトサンを調製する方法については、従来技術において周知である。たとえば、“Preparation of N-succinyl chitosan and their physical-chemical properties”, J Pharm Pharmacol. 2006, 58, 1177-1181を参照のこと。
【０１５４】
環状無水物とキトサンとの反応によって、遊離アミン位置の一部がジカルボキシ基でアシル化される。たとえば、使用する環状無水物が無水コハク酸の場合、アミン基の一部がＮ−スクシニル化される。Ｎ−スクシニル化後にＮａＯＨ処理することで、アシル基の一部がキトサンのアミン基から除去される。ＮａＯＨ処理の温度を高めると、実施例４で示すように、存在する遊離アミン基の比率が高くなる。
【０１５５】
アシル化度については、生成物におけるＣ：Ｎの比で示される。また、アシル化度を‘H nmrで判断することも可能である。Ｎ−スクシニルキトサンポリマーを以下に示す。式Ｖは、ポリマー中に存在する３つのタイプのＤ−グルコサミン単位すなわち、Ｎ−スクシニル化−Ｄ−グルコサミン、遊離Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを示す。
【化５】
0005489999.tif 000006
【０１５６】
一実施形態では、ｘが約６０から８０％であり、ｙが約１から１５％、ｚが約１０から２５％である。
【０１５７】
別の実施形態では、ｘが約６０から８０％、ｙが約１から３０％、ｚが約２から２５％である。
【０１５８】
無水物置換の度合いが高ければジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーの溶解性は高まるが、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーとの架橋の妨げになる場合がある。
【０１５９】
一実施形態では、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーが、約２０％から８０％ジカルボキシ誘導体化されている。好ましくは、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーが、約３０％から６０％ジカルボキシ誘導体化されている。一層好ましくは、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーが、約４５％から５０％ジカルボキシ誘導体化されている。
【０１６０】
一実施形態では、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーが、約５０％から９０％ジカルボキシ誘導体化されている。好ましくは、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーが、約６０％から８０％ジカルボキシ誘導体化されている。
【０１６１】
２．２  デキストラン成分
デキストランは、主にα−１，６リンケージで結合されたＤ−グルコース単位で構成される多糖である。ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroies）をスクロースで成長させて、高分子量の粗デキストランを業務入手する。得られる多糖を加水分解して、低分子量のデキストランを得る。
【０１６２】
デキストランをジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーに架橋可能にする前に、これを活性化しなければならない。デキストランで隣接する第２級アルコール基から酸化によって反応性のビスアルデヒド官能基を生成可能である。一般的な方法を実施例２にあげておく。次に、得られたアルデヒド誘導体化デキストランポリマーをジカルボキシ誘導体化キトサンの第１級アミン基に還元的にカップリングし、本発明の架橋ポリマーネットワークを形成することが可能である。
【０１６３】
一実施形態では、酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウムである。他の好適な酸化剤に、過ヨウ素酸カリウムなどがある。
【０１６４】
酸化生成物であるアルデヒド誘導体化デキストランポリマーは実際に、少量の遊離アルデヒド基を含有するのみである。アルデヒド基の大半はアセタールおよびヘミアセタールとしてマスクされ、デキストランの遊離アルデヒド形態と平衡状態にある。遊離アルデヒド基の一部が反応することで、アセタールおよびヘミアセタール形態から遊離したアルデヒド基のより多い形態に平衡がシフトする。
【０１６５】
酸化度は、使用する酸化剤のモル比に影響されることがある。酸化度が高くなればなるほど、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーの多くの部位を架橋に利用できるようになる。しかしながら、酸化度が低めのほうがアルデヒド誘導体化デキストランポリマーの可溶性が高くなる。過ヨウ素酸反応でもデキストランポリマーの分子量が劇的に低下する。
【０１６６】
一実施形態では、酸化度が、約３０％から約１００％、一層好ましくは約５０％から約１００％である。最も好ましくは、酸化度が約８０から約１００％である。
【０１６７】
実施例５では、アルデヒド誘導体化（または酸化）度の異なるアルデヒド誘導体化デキストランポリマーを用いて調製した本発明のポリマーネットワークのゲル化時間を比較する。溶液中でＮ−スクシニルキトサンの溶液と組み合わせると、高度にアルデヒド誘導体化したデキストランポリマーほど分子量が小さく、短時間でゲルを形成する。
【０１６８】
誘導体化度は、ヒドロキシルアミン塩酸塩と拡大反応を実施した後、遊離プロトンを滴定して測定可能である（Zhao, Huiru, Heindel, Ned D, “Determination of degree of substitution of formyl groups in polyaldehyde dextran by the hydroxylamine hydrochloride method,” Pharmaceutical Research (1991), 8, page 400-401）。
【０１６９】
２．３  デキストラン成分によるキトサン成分の架橋
本発明は、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋したジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーを含む、ポリマーネットワークを提供するものである。一実施形態では、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーがＮ−スクシニルキトサンポリマーである。一実施形態では、Ｎ−スクシニルキトサンポリマーが、Ｎ−スクシニルキトサンポリマーのアミン基およびアルデヒド誘導体化デキストランポリマーのアルデヒド基によってアルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋している。好ましくは、Ｎ−スクシニルキトサンポリマーが、Ｎ−スクシニルキトサンである。
【０１７０】
また、本発明は、上述したようなポリマーネットワークを生成する方法も提供するものである。
【０１７１】
本発明のポリマーネットワークを製造するには、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーをアルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋させる。これは、２種類のポリマーの水溶液を混合することで達成可能である。たとえば、実施例３を参照のこと。
【０１７２】
一度生成してしまえば、各ポリマー成分の水溶液は、溶液状のまま保っても構わないし、凍結乾燥などによって乾燥させて固体生成物とすることも可能である。この場合は、一緒に混合して本発明のハイドロゲルを形成する前に、固体のポリマー成分を水溶液に再溶解させればよい。
【０１７３】
一実施形態では、ポリマーマトリクス形態のｐＨが約６から８、好ましくは約６．５から７．５の水溶液が望ましい。これは、２種類の溶液を混合する前に、ポリマー成分ごとの水溶液のｐＨを上記の範囲内に調整して達成可能である。あるいは、個々のポリマー成分の水溶液のｐＨを、透析後かつ凍結乾燥前に調整することも可能である。ｐＨについては、好適な塩基または酸を用いて調整可能である。通常、ｐＨの調整にはＮａＯＨを使用する。
【０１７４】
一実施形態では、水溶液のいずれか一方または両方が独立に、１種以上の薬学的に許容される賦形剤を含有してもよい。一実施形態では、水溶液が独立にＮａＣｌを含有してもよい。好ましくは、ＮａＣｌの濃度が約０．５から５％ｗ／ｖである。一層好ましくは、ＮａＣｌの濃度が約０．５％から２％ｗ／ｖであり、最も好ましくは約０．９％ｗ／ｖである。
【０１７５】
一実施形態では、水溶液は、Ｎａ２ＨＰＯ４などのリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、乳酸緩衝液、クエン酸緩衝液、重炭酸緩衝液などであるが、これに限定されるものではない、１種以上の緩衝液を独立に含有するものであってもよい。
【０１７６】
２．４  本発明のハイドロゲル
ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーは、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと反応し、三次元架橋ポリマーネットワークを生成する。このポリマーネットワークは、これが形成される水溶液との間でハイドロゲルを形成する。本発明のハイドロゲルは、自らを医療用途で、特に創傷治癒、手術による癒着の予防、出血の低減（止血）で使用するのに適したものとする特性を有する。
【０１７７】
理論に拘泥することなく、本発明のハイドロゲルを創傷表面に適用すると、この隙間内でのフィブリンおよび血塊の形成が防止され、それによって以後の癒着の形成が防止されると思われる。
【０１７８】
ハイドロゲルの特性については、２種類のポリマーの誘導体化と架橋を変更することで、特定の用途に合わせて微調整が可能である。
【０１７９】
本発明のポリマーネットワークでは、キトサンのＤ−グルコサミン残基のアミン基が、
（ａ）アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋されてもよいし、
（ｂ）ジカルボキシ基との間でアシル化されてもよく、あるいは、
（ｃ）アセチル化（元のキチン材料から）されてもよい。
【０１８０】
アセチル化度および／またはジカルボキシアシル化度が高いと、アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋する遊離アミン基があまり残らない。結果として、２種類のポリマーの水溶液を混合すると、生じる重合量がジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーのアシル化およびアセチル化のパターンに影響されることになる。これは、仮にそうであれば、いかに短時間でハイドロゲルが形成されるかに影響する。ポリマーの希溶液中で極めてわずかな重合が生じる場合、ハイドロゲルは形成されない。
【０１８１】
ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーおよびアルデヒド誘導体化デキストランポリマーの水溶液は、各成分を約２％から約１０％ｗ／ｖずつ含む。
【０１８２】
通常、２種類のポリマーの水溶液を等濃度で混合して、本発明のハイドロゲルを形成する。しかしながら、２種類のポリマーの特性が、混合時に架橋して本発明のハイドロゲルを形成するようなものになるのであれば、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーとアルデヒド誘導体化デキストランポリマーとに異なる比を用いることも可能である。
【０１８３】
当業者であれば、混合時に成分のポリマー溶液がすみやかに架橋してハイドロゲルを形成するように、
（ａ）キトサンの脱アセチル化度、
（ｂ）キトサンのジカルボキシ誘導体化度、
（ｃ）アルデヒド誘導体化デキストランの酸化度、
（ｄ）水溶液中の濃度
のパラメータを操作することが可能である。
【０１８４】
あるいは、当業者であれば、これらのパラメータを必要に応じて操作して、ゆっくりとまたは特定の時間内にハイドロゲルが生じるようにすることができる。
【０１８５】
ポリマーの二次誘導体化、水溶液の性質、生物学的に活性なまたは非生物学的活性剤の添加などの要因も考慮すべきである。たとえば、混合ポリマー成分を含む水溶液のｐＨが約６から８の場合、本発明のハイドロゲルをさらに短時間で形成できることがある。
【０１８６】
上述したパラメータを操作することで、本明細書に記載の方法を使用して、本発明者らは混合して数秒程度もすれば生じる本発明のハイドロゲルを生成した。本発明の他のハイドロゲルは、２種類の溶液を混合してから、数分から数時間かけて生じる。
【０１８７】
ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマー溶液およびアルデヒド誘導体化デキストランポリマー溶液を使用前に滅菌して、組織への適用で組織に微生物が導入されないようにしてもよい。あるいは、凍結乾燥させた固体のジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーおよびアルデヒド誘導体化デキストランポリマーを滅菌した上で、滅菌水溶液に溶解することも可能である。
【０１８８】
溶液を滅菌するには、従来技術において周知のどのような技術を用いてもよい。たとえば、放射性同位元素源（通常はコバルト−６０）からのγ線または電子ビームあるいはｘ線の照射を用いる放射線滅菌による。
【０１８９】
放射線への曝露によって、ジカルボキシ誘導体化キトサンおよびアルデヒド誘導体化デキストランポリマーの機能性に影響しかねない化学変化が生じることがある。たとえば、遊離アミン基が酸化された場合、ポリマー成分間の架橋にあまり利用できなくなり、ゲルが形成されるまでの時間が長くなることもある。また、放射線を用いるとポリマー成分の分子量が低下する場合がある。溶液中で一緒に混合したときに特定の時間枠でハイドロゲルを生じることを意図したジカルボキシ誘導体化キトサン成分とアルデヒド誘導体化デキストラン成分を調製する際には、これらの要因について考慮すべきである。
【０１９０】
また、本発明のハイドロゲルは、１種以上の生物学的活性剤および／または１種以上の非生物学的活性剤を含有することが可能である。
【０１９１】
一実施形態では、１種以上の生物学的活性剤が、血漿タンパク質、ホルモン、酵素、抗生物質、防腐剤、抗悪性腫瘍薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗炎症薬、成長因子、ステロイド、細胞懸濁液、細胞毒、細胞増殖阻害剤からなる群から選択される。
【０１９２】
ハイドロゲルマトリクスに取り込まれる生物学的活性剤は、ハイドロゲルが崩壊する際に放出される。このようにして、本発明のハイドロゲルを用いて生物学的活性剤を標的部分に送達することが可能である。
【０１９３】
また、非生物学的活性剤をハイドロゲルマトリクスに取り込むことも可能である。たとえば、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グアーガム、ローカストビーンガム、キサンタンガムなどの多糖類増粘剤、ポリアクリル酸などのポリマー増粘剤ならびにコポリマー、ポリアクリルアミド、コポリマー、アルコール、無水マレイン酸コポリマーなどを加えて、さらに剛性の高いハイドロゲルを生成することが可能である。
【０１９４】
また、ポリマー成分の水溶液に多糖類増粘剤を加えて、溶液が適用するのに好適な粘度になるようにしてもよい。たとえば、ハイドロゲルをｉｎ  ｓｉｔｕで創傷または組織などの標的部分に形成する場合、ポリマー成分の水溶液は、架橋が起こり得る前に流れ落ちてしまわないように十分に粘性のものとする。したがって、使用する特定のジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーおよび／またはアルデヒド誘導体化デキストランポリマーが、極めて非粘性の水溶液を形成する場合、増粘剤を用いて粘度を高めてもよい。他の実施形態では、増粘剤を添加しなくてもポリマー成分の水溶液が十分に粘性のものとなる。
【０１９５】
同様に、適用するハイドロゲルの正確な場所と量を確定できるように、フルオレセインおよびメチレンブルーなどの染料をハイドロゲルマトリクスに取り込むことも可能である。
【０１９６】
これらの別の作用剤（agent）は、従来技術において周知のどのような方法でハイドロゲルに取り込んでもよい。たとえば、作用剤が固体物質の場合、一方の乾燥ポリマー成分とブレンドすることが可能である。こうして組み合わせた乾燥材料を水溶液に溶解し、これを第２のポリマー成分の水溶液と混合する。
【０１９７】
取り込む作用剤が液体の場合、水性ポリマー溶液の一方と直接に組み合わせ、保管用に凍結乾燥させることが可能である。あるいは、溶液を混合して本発明のハイドロゲルを形成する前に、水性ポリマー溶液の混合物に直接に加えることも可能である。
【０１９８】
また、作用剤を共有結合的にポリマー成分のひとつと反応させることも可能である。大量の作用剤が存在し、作用剤がＮ−スクシニルキトサンの遊離アミン基と反応する場合、得られるハイドロゲルは形成に時間がかかる場合がある。しかしながら、作用剤とポリマー成分との共有結合反応は、ハイドロゲルが生じ得ないほどの架橋を防ぐものでなければならない。
【０１９９】
ハイドロゲルが分解すると、ポリマーから作用剤が加水分解される。
【０２００】
３  本発明のハイドロゲルの使用
一態様では、本発明は、組織を本発明のハイドロゲルで治療することを含む、癒着形成しやすい組織の癒着を予防または低減する方法を提供するものである。
【０２０１】
一実施形態では、癒着が手術後の癒着である。
【０２０２】
別の態様では、本発明は、創傷を本発明のハイドロゲルで治療することを含む、創傷の出血を抑えるまたは止める方法を提供するものである。
【０２０３】
一態様では、本発明は、創傷を本発明のハイドロゲルで治療することを含む、創傷治癒を加速または促進する方法を提供するものである。
【０２０４】
上述した本発明の方法で：
一実施形態では、本発明のハイドロゲルをｉｎ  ｓｉｔｕで生成する。たとえば、溶液を標的部分に噴霧する、吹き掛ける、あるいは注ぐことによって、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーおよびアルデヒド誘導体化デキストランポリマーの水溶液を同時に適用することが可能である。標的部分は、創傷（特に術創）であってもよいし、組織であってもよい。
【０２０５】
２種類の成分が出会って、空気中あるいは創傷表面または組織で混ざり、反応して架橋ポリマーネットワークが生成される。水溶液中でのポリマーネットワークの形成によって、ハイドロゲルが得られる。
【０２０６】
溶液については、従来技術において周知のどのような手段を用いてでも、標的部分に噴霧する、吹き掛ける、あるいは注ぐことが可能である。噴霧する場合、別々の容器から水溶液を同時に分散液滴の塊の形で放出する。容器を加圧してもよい。たとえば、ＰＣＴ国際公開第００／０９１９９号パンフレットには、２種類の重合可能な流体の噴霧を可能にする装置について記載されている。この装置は、流体が噴霧時にのみ混ざるように、別々のチャンバに保存された流体を噴霧する。
【０２０７】
吹き掛ける場合、液体流の状態でポリマー含有水溶液を別々の容器から同時に押し出す。たとえば、別々の注射器と、溶液を標的部分に適用する際に、これをその先端で混合できるようにするアプリケータとを用いて、水溶液を標的部分に吹き掛けることが可能である。あるいは、溶液を単に標的部分に注ぐことも可能である。
【０２０８】
２つのポリマー溶液を同時に適用すべきであるが、ハイドロゲルを形成できるだけの十分な架橋が生じるのであれば、各々が標的部分に厳密に同じ量かつ厳密に同時に到達する必要はない。
【０２０９】
他の接着剤またはシーラント系用に開発されたｉｎ  ｓｉｔｕゲル化のためのさまざまな方法論および装置を用いて、ポリマーの水溶液を適用して本発明のハイドロゲルを形成すればよい。
【０２１０】
別の実施形態では、まずはジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーをアルデヒド誘導体化デキストランポリマーと混合して水溶液中でポリマーネットワークを形成した後、生じるハイドロゲルを治療対象部分に適用して、本発明のハイドロゲルを用いる。ポリマーの混合とハイドロゲルの適用との間の時間は、ゲルの形成速度に左右される。従来技術において周知のどのような方法を用いて、ハイドロゲルを標的部分に適用してもよい。たとえば、広口径注射器を用いてハイドロゲルを適用することが可能である。
【０２１１】
一実施形態では、ハイドロゲルの使用量を、（ａ）治療部分での癒着数の低減または最小化、（ｂ）これを適用する創傷の治癒の加速または促進、あるいは、（ｃ）これを適用する創傷の出血の低減または停止のために十分なものとすべきである。
【０２１２】
本発明のハイドロゲルを使用すれば、癒着形成イベントによって引き起こされる組織の癒着を低減または最小化できるが、これらのハイドロゲルは、手術後の癒着を予防または低減するのに特に有用である。
【０２１３】
本発明の方法は、どのような生物体の治療にも適用可能である。一実施形態では、この方法をヒトに適用する。
【０２１４】
ハイドロゲルが出血と癒着の両方を低減する機能によって、これらのハイドロゲルが事実上どのような外科的処置でも価値のあるツールになる。本発明のハイドロゲルを使用可能な外科的処置の例として、腸の外科手術などの腹部の処置、胸部の処置、頭蓋間および脊髄外科手術をはじめとする神経外科的処置、神経放出処置および脳の表層での処置、卵巣嚢腫摘出および子宮摘出などの骨盤処置、洞手術、眼処置、耳鼻科の処置、声帯および索の処置などの頸部および咽頭部の処置、屈筋腱および伸筋腱の癒着の分離などの整形外科処置、火傷の処置があげられるが、これに限定されるものではない。
【０２１５】
本発明のハイドロゲルは、耳、鼻、喉の外科手術で使用するのに特に適している。洞でのゲル形成が弱いのは、粘液線毛クリアランスがゆっくりとゲルを洞表面から取り除くような場合である。鼻粘膜粘液線毛輸送系の線毛拍動は、鼻粘膜上皮を覆う粘液層を鼻咽頭まで運ぶよう機能する。それをするにあたって、洞表面に適用されるどのような物質も同様に放出される。本発明のハイドロゲルは、適用後すぐに極めてしっかりとしたものとなるため、鼻粘膜粘液線毛輸送系によって取り除かれることはない。
【０２１６】
一旦適用すると、本発明のハイドロゲルは、内部組織間の物理的なバリアを維持し、癒着を予防する。組織表面が治癒するにつれて、ハイドロゲルが分解してその部位から取り除かれる。
【０２１７】
また、本発明のハイドロゲルを、直接に、あるいはハイドロゲルを取り入れた創傷被覆材を用いて、皮膚科学的創傷および皮膚創傷に適用することも可能である。
【０２１８】
３．１  本発明のハイドロゲルを用いる生物学的活性剤の送達
本発明のハイドロゲルを、生物学的活性剤の部位特異的徐放キャリアとして用いることが可能である。したがって、一態様本発明は、組織を本発明のハイドロゲルで治療することを含む、１種以上の生物学的活性剤を組織まで送達する方法であって、ハイドロゲルが１種以上の生物学的活性剤を含有する方法を提供するものである。
【０２１９】
生物学的活性剤の部位特異的送達によって、従来の全身投与に関連した副作用を低減でき、治療有効量の生物学的活性剤を確実に患部まで到達される。たとえば、本発明のポリマーネットワークを用いて、慢性の静脈不全および脚部の潰瘍を治療することが可能である。ポリマーネットワークに取り込まれる血管新生促進因子および上皮成長因子が、潰瘍の治癒を助けることができる。本発明のポリマーネットワークは、ゲルとして創傷に対して直接に適用してもよいし、創傷に適用される創傷治癒被覆材に取り込んでもよい。
【０２２０】
本発明のポリマーネットワークに取り入れることが可能な生物学的活性剤としては、血漿タンパク質、ホルモン、酵素、抗生物質、防腐剤、抗悪性腫瘍薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗炎症薬、成長因子、麻酔、ステロイド、細胞懸濁液、細胞毒、細胞増殖阻害剤があげられるが、これに限定されるものではない。
【０２２１】
生物学的活性剤は、本発明のポリマーと併せて創傷治癒の一助となるよう作用することがある。たとえば、テトラサイクリン、シプロフロキサシンなどの抗生物質；線維芽細胞成長因子をはじめとするヘパリン結合成長因子などの成長因子；血小板由来の成長因子、インスリン結合成長因子−１、インスリン結合成長因子−２、上皮成長因子、形質転換成長因子−α、形質転換成長因子−β、血小板因子４、ヘパリン結合因子１および２はいずれも、本発明のポリマーネットワークに取り入れることが可能である。
【０２２２】
使用可能な他の生物学的活性剤としては、ナイスタチン、ジフルカン、ケトコナゾールなどの抗真菌薬；ガングシクロビル、ジドブジン、アマンチジン、ビダラビン、リバラビン、トリフルリジン、アシクロビル、ジデオキシウリジンなどの抗ウイルス薬；α１抗トリプシン、α１抗キモトリプシンなどの抗炎症薬；５−フルオロウラシル、タキソール、タキソテール、アクチノマイシンＤ、アンドリアマイシン、アザリビン、ブレオマイシン、ブスルファン、酪酸、カルムスチン、クロランブシル、ｃｉｓ−プラチン、シタラビン、シタラビン、ダカルバジン、エストロゲン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、プレドニシロン、プレドニゾン、プロカルバジン、ストレプトゾトシン、チオグアニン、チオテパ、トリブチリン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ゲンタマイシン、カルボプラチン、シクロホスファミド、イホスファミド、マホスファミド、レチノイン酸、リシン、ジフテリア毒素、毒液などの細胞毒または細胞増殖阻害剤；エストロゲン、テストステロン、インスリンなどのホルモン；ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタソン、フルチカゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、メメタソン（memetasone）、プレドニゾン／プレドニゾロン、トリアムシノロンなどのステロイド；アルブミンなどの血漿タンパク質；免疫グロブリンＡ、ＭおよびＧをはじめとする免疫グロブリン；フィブリノゲン；因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩＩＩをはじめとする凝固因子；プラスミノーゲン；タンパク質Ｃ；タンパク質Ｓ；抗トロンビンＩＩＩ、α１抗トリプシン、α２マクログロブリン、Ｃ１エステラーゼ阻害剤をはじめとする血漿プロテイナーゼ阻害剤；α１酸糖タンパク質；セルロプラスミン；ハプトグロビン；トランシフェリング；相補成分Ｃ１〜Ｃ９ｌ  Ｃ４ｂ結合タンパク質；インターαトリプシン阻害剤；Ａ−１、Ａ−１１、Ｂ、Ｃ、Ｅをはじめとするアポリポタンパク質；フィブロネクチンおよびアンジオスタチンがあげられるが、これに限定されるものではない。
【０２２３】
また、本発明のハイドロゲルは、ペプチド、タンパク質、単炭水化物、複合炭水化物、脂質、糖脂質、糖タンパク質、ビタミン、ミネラルなどの栄養補助剤を含むものであってもよい。
【０２２４】
生物学的活性剤をハイドロゲルに取り込むと、作用剤の部位特異的送達が可能になる。また、ハイドロゲルの分解速度を微調整して放出速度を制御することが可能である。
【０２２５】
本発明のハイドロゲルに生物学的活性剤を加えるには、従来技術において周知のどのような手段を用いてもよい。たとえば、作用剤を混合前に一方のポリマー成分溶液に加え、溶液同士を一緒にしてもよい。取り込み手段は生物学的活性剤の性質に左右される。
【０２２６】
添加対象となる生物学的活性剤の濃度は、作用剤の性質、これを適用する部位、ハイドロゲルの物理的な特徴によって左右されることになる。濃度は、治療有効量の生物学的活性剤が標的部位に送達されるような十分なものとする。一実施形態では、生物学的活性剤の濃度が、ハイドロゲル約１ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌである。好ましくは、生物学的活性剤の濃度が、ハイドロゲル約１ｕｇ／ｍｌから約１００ｕｇ／ｍｌである。添加対象となる生物学的活性剤の適切な量については、当業者であれば、さまざまな濃度の生物学的活性剤を含有するハイドロゲルを試験して、特定の目的に最も有効なハイドロゲルを選択することで、計算で求めることが可能である。
【０２２７】
本発明のハイドロゲルの物性によって、これが適用された場所と実質的に同じ場所に保持され、体液によってすぐに流されてしまったり、重力によって沈んでしまったりすることもない。ハイドロゲルは、それ自体が適用する組織に密着し、組織の表面全体と接触するようになっている。
【０２２８】
４．  キット
別の態様では、本発明は、
（ａ）ジカルボキシル誘導体化キトサンポリマーと、
（ｂ）アルデヒド誘導体化デキストランポリマーと、を含む、本発明の方法で用いるキットを提供するものである。
【０２２９】
本発明のキットは、架橋して水溶液中で本発明のハイドロゲルを形成するポリマー成分を適宜提供する。
【０２３０】
一実施形態では、本発明のキットは、ポリマー（ａ）および（ｂ）を溶解させて架橋し、ハイドロゲルを形成可能な水溶液も含む。あるいは、本発明のキットは、（ａ）および／または（ｂ）を、第２のポリマー成分と混合できる状態で水溶液に事前に溶解して提供するものである。この水溶液は、液体状であっても冷凍したものであってもよい。
【０２３１】
一実施形態では、本発明のキットは、ポリマー成分（ａ）および（ｂ）を凍結乾燥粉末として提供するものである。本発明のキットを使用するには、凍結乾燥させたポリマーを好適な水溶液に溶解した後、混合することを含む。あるいは、（ａ）および（ｂ）の両方を好適な水溶液に加え、溶解して架橋するまで混合してもよい。一実施形態では、水溶液が、水、生理食塩水、緩衝液、これらの混合物からなる群から選択される。
【０２３２】
一実施形態では、本発明のキットが、１種以上の生物学的活性剤をさらに含むものであってもよい。たとえば、１種以上の生物学的活性剤を、ポリマー成分（ａ）および（ｂ）のうちの一方または両方に取り入れることが可能である。あるいは、１種以上の生物学的活性剤が水溶液中に存在してもよく、そこに（ａ）および／または（ｂ）を溶解させる。
【０２３３】
５．  創傷被覆材
また、本発明は、湿ると本発明のハイドロゲルを放出できる創傷被覆材も提供するものである。創傷被覆材は、従来技術において周知の好適なドレッシングであればどのようなものであってもよい。一例として、絆創膏、ストリップ、パッド、ガーゼ、フィルム、ストッキング、テープがあげられる。
【０２３４】
一態様では、創傷被覆材が、ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーおよびアルデヒド誘導体化デキストランポリマーを含む。好ましくは、ジカルボキシ誘導体化キトサンがＮ−スクシニルキトサンである。
【０２３５】
本発明の創傷被覆材を調製するために、乾燥固体ジカルボキシ誘導体化キトサンポリマーおよびアルデヒド誘導体化デキストランポリマーをドレッシングの構造にブレンドする。あるいは、創傷被覆材を一方のポリマーの水溶液に含浸させた後に乾燥させ、さらにマットとして第２のポリマーを導入することも可能である。マットは水溶性糊などの第３の成分で一緒に保持することが可能である。別の例として、２種類のポリマーを乾燥させて混合した後、創傷治癒被覆材の構造の一部として極めて多孔性の高い組織からなる２つの小片間に配置することも可能である。
【０２３６】
創傷被覆材が湿ると、２種類のポリマー成分が架橋して、創傷被覆材の水性成分中でハイドロゲルが生じる。創傷被覆材については、体外の流体で湿らせてもよいし、体内の流体で湿らせてもよい。たとえば、創傷の上にのせると、創傷被覆材は、創傷からの血液または創傷滲出液と接触して湿ることがある。創傷が十分に湿っていなければ、水または生理食塩溶液などの生理学的に許容される好適な液体と接触させて創傷被覆材を湿らせることも可能である。
【０２３７】
成分ポリマーを変えることで、ハイドロゲルが生じる速度を変えることが可能である。創傷被覆材の用途が異なれば、必要なハイドロゲル形成の速度も異なることがある。
【０２３８】
創傷被覆材に印加する圧力によってハイドロゲルの形成を助けてもよい。
【０２３９】
創傷被覆材は、消毒薬ならびに、上述したような他の生物学的活性剤などの別の作用剤を含有するものであってもよい。これらの作用剤は、従来技術において周知の標準的な方法を用いてドレッシング材料に取り込むことが可能なものであり、あるいは、ドレッシングの構造とブレンドされるポリマー溶液に取り込んでもよい。
【０２４０】
本発明のさまざまな態様について、以下の実施例を参照して非限定的な方法で示す。
【実施例】
【０２４１】
実施例１
Ｎ−スクシニルキトサンポリマー（ＤＭＦ法）
バッチＡ．無水コハク酸（２．１５ｇ、０．０２１５ｍｏｌ）を１００ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でキトサン（１．５ｇ、０．００７ｍｏｌ）に加えた。この混合物を窒素下で３時間、１５０℃まで加熱した。
【０２４２】
冷却時、混合物から固体を回収し、メタノールで洗浄した後、アセトンで洗浄した。乾燥後の固体を水酸化ナトリウム（４００ｍｌ、２Ｍ）に溶解し、溶液を一晩攪拌した。すべての固体が溶解したわけではなかった。未溶解の固体を濾過し、溶液を蒸発させて約３０〜５０ｍｌにした。
【０２４３】
この溶液を、３Ｌ容のビーカーで透析袋によって水を定期的に交換しながら４８〜６０時間透析した。次に、溶液を濃縮し、凍結乾燥させた。Ｎ−スクシニルキトサン生成物をワタ状の固体として得た。
【０２４４】
バッチＢ．キトサン（イカの甲由来）（３０ｇ）および無水コハク酸（４２ｇ）をＤＭＦ（５００ｍｌ）に入れたものを２０時間で１４０℃まで加熱した。得られたＮ−スクシニルキトサンを濾過により回収し、エタノールで洗浄した後、ジエチルエーテルで洗浄し、ポンプで乾燥させた。乾燥後の固体を水酸化ナトリウム溶液（水８００ｍｌに１０ｇ）に加え、一晩攪拌した。次に、この溶液をセライトで濾過し、１２時間ごとに水を交換しながら３日間透析した。凍結乾燥によって、１４ｇのＮ−スクシニルキトサン（分析Ｃ３９．２％、Ｈ５．９％、Ｎ５．１％）が得られた。
【０２４５】
バッチＣ．キトサン（３０ｇ、実用グレードAldrich、中分子量）および無水コハク酸（４２ｇ）をＤＭＦ（１Ｌ）中にて３時間、１３０℃まで加熱した。キトサンは膨潤したが溶解されなかった。冷却時、キトサンを濾別し、フィルタにてメタノールで洗浄した。次に、ＮａＯＨ溶液（水１．５Ｌに５０ｇ）にキトサンを加え、均質になるまで（通常は３０分間）高速オーバーヘッドスターラーで混合した。ときにはキトサンが全部可溶というわけではなく、そのような場合はセライトで濾過して残りのゲルを除去する。この溶液を１４時間かけて５０℃まで加熱し、蒸留水（５０Ｌを４回交換）でセルロース管材にて３日間透析した。少量の水酸化ナトリウムを用いてｐＨを８．０に調整した。次に、この溶液を回転蒸発器の減圧下にて容量約７００ｍＬまで減らし、極めて濃い溶液を得た。続いて、これを凍結乾燥させて約３５ｇの生成物を得た。
【０２４６】
Ｎ−スクシニルキトサン（メタノール法）
３時間攪拌しながらキトサン（Aldrich、実用グレード）（２０ｇ）を乳酸（２０ｍｌ）および水（６５０ｍｌ）に溶解した。メタノール（６５０ｍｌ）を加え、混合物を３５℃まで温めた。無水コハク酸（２９ｇ）を加え、混合物を３５℃で４時間強く攪拌した。無水コハク酸は溶解するのに数時間を要した。水酸化ナトリウム溶液（水３００ｍｌに３５ｇ）を加え、混合物を１時間強く攪拌した。こうして得られた、部分的にゲル化した曇った混合物を１日間透析してメタノールを除去し、続いて強く攪拌して残っている最終ゲルを破砕し、蒸留水にて（１２時間ごとに水を交換しながら）さらに３日間透析し、濾過した。凍結乾燥によって生成物（１６．５ｇ）を得た。
【０２４７】
実施例２
アルデヒド誘導体化デキストラン
バッチＡ．デキストラン（１ｇ、ＭＷ６０，０００〜９０，０００）を２０ｍｌの蒸留水に溶解した。過ヨウ素酸ナトリウム（２ｇ）を溶液に加え、これを室温にて３時間攪拌した。この溶液を３Ｌ容のビーカーで水を定期的に交換しながら一晩透析した。次に、この溶液を濃縮し、凍結乾燥させて、アルデヒド誘導体化デキストランを白色粉末として得た。
【０２４８】
バッチＢ．デキストラン（２０ｇ、Aldrich、Ｍｎ２１，５００、ＭＷ１４２，０００）を水（２００ｍｌ）に溶解した後、過ヨウ素酸ナトリウム（２００ｍｌ中４０ｇ）の攪拌混合物に加えた。外部冷却によって発熱反応の温度を３５℃未満に保ち、反応を窒素下で実施した。３時間後、溶液を３日間透析（１２時間ごとに水を交換）し、濾過し、凍結乾燥させてアルデヒド誘導体化デキストランを白色粉末として得た（１４．７ｇ、実測Ｃ３９．８％、Ｈ５．９％）。最終分子量はＭｎ２５７０、ＭＷ４７００であった。
【０２４９】
バッチＣ．デキストラン（３６ｇ、Aldrich食品グレード、ｍｗ８０，０００）を水（８００ｍＬ）中にて強く攪拌しながら、固体の過ヨウ素酸ナトリウム（５０ｇ）を加えた。温度が３０℃未満にとどまるように、外部冷却によって発熱反応を制御した。２時間後、溶液を濾過し、セルロース管材にて３日間透析した（蒸留水５０Ｌを４回交換）。少量の水酸化ナトリウムを用いてｐＨを８．０に調整し、この溶液を減圧下にて容量約３００ｍＬまで減らし、凍結乾燥させた。収率は約３０ｇであった。
【０２５０】
実施例３
水溶液中にアルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋したＮ−スクシニルキトサンを含むポリマーネットワーク
実施例１のＮ−スクシニルキトサン（３０ｍｇ）を０．６ｍｌの蒸留水に溶解させ、５％ｗ／ｖの水溶液（溶液Ａ）を生成した。アルデヒド誘導体化デキストランポリマー（３０ｍｇ）を０．６ｍｌの蒸留水に溶解して、５％ｗ／ｖ水溶液（溶液Ｂ）を生成した。
【０２５１】
溶液Ａと溶液Ｂとをハイドロゲルが生じるまで（約２分間）一緒に混合した。ハイドロゲルは、水溶液中でアルデヒド誘導体化デキストランポリマーと架橋したＮ−スクシニルキトサンを含むポリマーネットワークである。
【０２５２】
実施例４
Ｎ−スクシニルキトサンの官能基レベルとハイドロゲルのゲル時間に対する塩基処理の効果
実施例１（ＤＭＦ法−バッチＣ）に基づいてＮ−スクシニルキトサンを調製したが、キトサンとＮａＯＨの溶液については以下の表１に示す温度で１４時間加熱した。表１から、温度が高くなればなるほど脱アシル化度が大きくなり、結果として遊離アミン基の割合も多くなることが分かる。アセチルおよびＮ−スクシニル基に対する遊離アミン基の相対特性を‘Η nmrで求めた。
【０２５３】
実施例３に基づいてＮ−スクシニルキトサンおよびアルデヒド誘導体化デキストランの架橋によって調製したハイドロゲルのほうが、Ｎ−スクシニルキトサンの遊離アミンの割合が多く、短時間で形成された。
【０２５４】
【表１】
0005489999.tif 000007
【０２５５】
実施例５
デキストランのアルデヒド誘導体化とハイドロゲルのゲル形成時間に対するｍｏｌ％過ヨウ素酸塩の効果
実施例２に基づいてアルデヒド誘導体化デキストランを調製したが、ここでは異なるｍｏｌ％の過ヨウ素酸塩を用いた。反応を室温にて２時間実施した。表２に、得られたアルデヒド誘導体化デキストランの分子量、アルデヒド基のｍｏｌ％、アルデヒド誘導体化デキストランの溶液をＮ−スクシニルキトサンの溶液と混合した際にハイドロゲルが形成されるまでの時間を示す。
【０２５６】
【表２】
0005489999.tif 000008
【０２５７】
キトサン残基１つあたりに存在するアルデヒド基の理論最大ｍｏｌ％は２００であり、これは過ヨウ素酸塩の各ｍｏｌが１つのキトサン残基と反応すれば達成される。２００というｍｏｌ％は１００％酸化（または１００％アルデヒド誘導体化）を示す。
【０２５８】
実施例６
ヒツジにおける内視鏡的副鼻腔手術後の癒着に対するハイドロゲルの効果
２０頭のヒツジ（merino cross wethers）で、十分に確立された内視鏡的副鼻腔手術創傷治癒プロトコールを用いて、標準化全層粘膜創傷を得た。各ヒツジの鼻の外壁に２つの傷を作り、それぞれの側に篩骨損傷を１つ作った。損傷を受けた領域を４つの処理群に無作為化し、（ａ）対照、（処理なし）、（ｂ）SprayGel（商標）、（ｃ）組換え組織因子、ｄ）本発明のハイドロゲルのうちの１つで処理した。
【０２５９】
群（ｂ）、（ｃ）、ｄ）では、粘膜噴霧装置を用いて活性剤５ｍｌを創傷表面に噴霧した。SprayGel（商標）および本発明のハイドロゲルについては各々、２つの別々の液体成分として噴霧し、これが噴霧直後に組み合わさって粘膜接着ゲルが形成された。
【０２６０】
２８日目、５６日目、８４日目、１１２日目にヒツジを評価した。検討するごとに、キシラジン４ｍｇを筋肉内注射してヒツジを適度に落ち着かせた。４週ごとの訪問時に毎回、癒着の有無、記録された場所、各癒着のグレードについて、独立した観察者（動物実験技士）が既刊のグレーディングスキームに基づいて（表３）鼻腔を調べた。
【０２６１】
【表３】
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【０２６２】
各ヒツジの４つの領域で、cytobrush plus細胞収集器（MedscandMedical、Sweden）を用いて、局所麻酔はせずに生検試料から遠い部位を内視鏡で目視確認しながら線毛細胞の擦過診を集めた。擦過部位を慎重に順序付け、触れていない部分を試料採取するために１６週間にわたって記録した。
【０２６３】
併用麻酔薬の４つのスプレーと鬱血除去薬のスプレー（co-phenylcaine−ＥＮＴ技術）を、鼻外壁の損傷部位の生検試料前に各鼻腔に適用した。切開を作り、鋭利なFreerエレベーターと、パンチ生検試料鉗子を用いて各損傷部位から得た２つの生検試料標本とで、小さなフラップを隆起させた。触れられていない部分を試料採取するために、４週間おきに生検試料を得て、生検試料部位を慎重に順序付け、１６週間にわたって記録した。最終生検試料後、ペントバルビタールナトリウム（＞１００ｍｇ／ｋｇ）を静脈注射して安楽死させた。
【０２６４】
光学顕微鏡法の標本を４時間ホルマリン固定した後、７０％エタノールに入れて処理した。標本をパラフィンブロックに埋包し、厚さ４μｍに切片化し、６〜８切片を２枚のスライドガラスにのせて各生検試料標本とした。次に、これをヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した。画像捕捉用のソフトウェア（Image Master Pro）を用いて、各標本を光学顕微鏡法で調べた。固有層のある鼻粘膜表面部分の長さと、被蓋上皮のある表面の長さを測定して、再上皮化の比率を求めた。４つの無作為な切片を各生検試料標本ごとに測定した。これらの同じデジタル画像を用いて上皮の高さも測定した。また、基底膜および上皮の頂端膜側をマーカーとして、１切片からの上皮の４つの無作為部分を各標本について測定した。
【０２６５】
走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）の標本をリン酸緩衝生理食塩水に入れ、超音波洗浄器を用いて２０分間洗浄して、血塊、粘膜、壊死組織片、生物膜を除去した。次に、４％パラホルムアルデヒド／１．２５％グルタルアルデヒドをリン酸緩衝生理食塩水＋４％スクロースに入れたｐＨ７．２の溶液で標本を固定し、処理するまで４℃で保管した。処理では、四酸化オスミウムを用いて標本を漸進的に脱水した後、さらに高速処理するためのマイクロ波技術（PELCO Bio Wave（登録商標））を用いてエタノールの濃度を高めた（７０％、９０％、９５％、１００％  ＆  １００％）。この後、二酸化炭素臨界点乾燥装置を用いて標本を乾燥させ、続いてＥＭスタブに載せた。最後に、標本に金と炭素をコーティングした。各標本をＳＥＭ（Phillips XL30 Field Emission走査型電子顕微鏡）で調べ、倍率５００×で４つの表面画像を取得した。既刊の評価尺度に基づいて標本をグレード評価した。明確化が必要であれば、標本を２０００×と５０００×のさらに高い倍率で調べた）。各標本について４枚の写真（倍率５００×）を用いて、画像解析ソフトウェアと、すでに検証済みの技術（Macintosh D, Cowin A, Adams D, Wormald PJ, Am. J. Rhinol. 2005, 19(6), 557-81）とを用いて、線毛で覆われている表面積の比率を求めた。
【０２６６】
擦過で得られた細胞を１ｍｌのダルベッコ培養液に懸濁させ、攪拌して細胞を培養液に放出させた。これをＣＢＦ解析実施まで３６．５℃に保った。各標本２０μｌを３６．５℃まで温めた顕微鏡のスライドガラスに載せ、位相差顕微鏡法を用いた。１標本あたり細胞１０個を個々に分析し、これらの平均をＣＢＦとして得た。
【０２６７】
この研究に用いたヒツジの状態（well being）を、ヒツジの扱いに関する経験豊富なアニマルハウスの獣医スタッフが監視した。作用剤の適用後２日間は、体温、心拍数、運動性、経口摂取についてヒツジを１日４回監視した。その後、残りの研究期間では運動性と経口摂取について、ヒツジを毎日２回監視した。
【０２６８】
統計解析
Bonferroni補正した事後試験を用いる二元配置ＡＮＯＶＡを実施して、上皮の高さ、再上皮化、再線毛化、線毛グレードおよび鼻の外壁の癒着の比率とグレードを分析した。ウィルコクソン符号順位検定を用いて、篩骨癒着率のマッチドペアを解析した。統計的有意性についてはｐ＜０．０５に設定した。
【０２６９】
結果を図１〜５にあげておく。
【０２７０】
結果
鼻の外壁に経時的な癒着のある各群におけるヒツジの比率を図１に示す。全層損傷法を使用すると、対照群の癒着率が１５％、組織因子群の癒着率が２５％であったのに対し、SprayGel（商標）群の率は１０％であった。ハイドロゲル群は癒着率が１０％であったが、しかしながらこれは５６日目に５％まで落ち、研究の最後までそのレベルに保たれた。ハイドロゲル群は、５６日目、８４日目、１１２日目に組織因子群よりも癒着の比率が有意に低かった（５％ｖｓ２５％、ｐ＜０．０５）。
【０２７１】
癒着の平均グレードは、SprayGel（商標）群ではそれほど重篤ではない傾向にあり、ハイドロゲル群ではなお一層重篤ではないが、しかしながらこれらの差異は有意ではなかった（図２）。
【０２７２】
各群の経時的な篩骨癒着率を図３に示す。上述した方法を用いると、対照群で篩骨癒着形成率４０％となった。これは組織因子群では５０％まで増加した。SprayGel（商標）群は癒着率が１４％と低かったが、しかしながら、ハイドロゲル群では篩骨癒着がまったく認められなかった。このマッチドペア研究では少数ではあるが、組織因子群よりもハイドロゲル群のほうが癒着は有意に少なかった（０％ｖｓ５０％、ｐ＜０．０５）。図４参照。
【０２７３】
上皮の高さを経時的に光学顕微鏡法で解析したところ、４つの群間で有意な差異は認められなかった（図５）。
【０２７４】
各群での再上皮化した粘膜の比率が図６から明らかである。ハイドロゲル群は、２８日目に組織因子群と比して再上皮化の比率が有意に高かった（７０％ｖｓ３３％、ｐ＜０．００１）。また、SprayGel（商標）群は、８４日目に組織因子群よりも再上皮化の比率が有意に高かった（８９％ｖｓ６１％、ｐ＜０．０５）。
【０２７５】
図７は、４つの群それぞれについて、経時的に再線毛化された表面積の比率（平均±標準偏差）を示す。２８日目に、ハイドロゲル群は、線毛化が対照群（６２％ｖｓ３１％、ｐ＜０．０１）および組織因子（６２％ｖｓ２３％、ｐ＜０．００１）よりも有意に多かったのに対し、SprayGel（商標）群も組織因子より有意に線毛化した面積が多かった（４７％ｖｓ２３％、ｐ＜０．０５）。５６日目に、ハイドロゲル群は組織因子群よりも線毛化が有意に多いままであった（６７％ｖｓ４０％、ｐ＜０．０５）。全体として、ハイドロゲル群の再線毛化が改善される傾向にあったが、これはどの時点でも有意ではなかった。
【０２７６】
それぞれの時点で各群平均１〜２個の標本が使用できず、グレード５となった。以下の表４に、ヒツジ鼻線毛の走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）画像での評価尺度を示す。
【０２７７】
【表４】
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【０２７８】
二元配置ＡＮＯＶＡによって、使用できない標本数には、どの時点でも各群とも有意な差異がないことが明らかになったため、これらを以後の解析から除外した（データ図示せず）。図８に、各群の各時点での平均±ＳＤ線毛グレードを示す。８４日目に、SprayGel（商標）の平均線毛グレードが組織因子よりも有意に良好であり（１．８ｖｓ２．６、ｐ＜０．０５）、１１２日目にハイドロゲルの平均グレードが対照群より有意に良好であった（１．９ｖｓ２．７、ｐ＜０．０５）。
【０２７９】
平均ＣＢＦは、４つの群のいずれにおいても経時的に有意に異なっていなかった（図９）。ハイドロゲル群は、線毛機能がすべての時点で改善される傾向にあったが、しかしながら、これは有意ではなかった。
【０２８０】
重要なことに、どのヒツジにも研究中に有害イベントが起こらなかった。発熱、頻拍症、運動不良または経口摂取不良の報告も研究中をとおしてなかった。
【０２８１】
考察
SprayGel（商標）と本発明のハイドロゲルはいずれも、癒着予防特性を呈した。特に、ハイドロゲルは鼻の外壁と前篩骨の両方で組織因子に比して癒着形成を有意に低下させた。
【０２８２】
創傷治癒に関しては、対照群と比較して、特に組織因子との比較で、再上皮化率、再線毛化率、線毛グレードが改善されたハイドロゲルとSprayGel（商標）の両方で結果が同じパターンをたどった。創傷治癒の最も顕著な特徴は、ハイドロゲル群の上皮における短時間での回復であるが、これは２８日目に再線毛化した表面積の比率と再上皮化率が有意に高いことを反映していた。研究開始から間もない頃、４群すべての線毛グレードは有意に異なっていなかったが、しかしながら、研究の後半では、ハイドロゲル群の線毛グレードが組織因子および対照群に比して有意に改善された。
【０２８３】
実施例７  ヒトでの治験
前向きランダム化比較パイロット試験を実施した。フルハウスの内視鏡的副鼻腔手術を受けた６名の患者に対して無作為にハイドロゲル２０ｍｌを与え、対側には何の処置もほどこさなかった。それぞれの側で手術の終わりに内視鏡下で観察しながら溶液を噴霧して適用した。適用後の出血については、標準的な動画内視鏡法で記録し、事前に検証した２つの尺度で２分ごとに最大１０分まで評価した。
【０２８４】
結果
ハイドロゲルでは、適用後４分、６分、８分、１０分の時点で術野に臨床的に有意な改善が認められた（表５および図１０および図１１を参照のこと）。
【０２８５】
【表５】
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【０２８６】
さらに、本発明のハイドロゲルは、６症例のうち５例で外科医が偽薬よりも有効であるとみなしており、１症例では差異なしとなった。平均動脈圧、心拍数、呼気終末ＣＯ２などの止血に影響することが知られている他のパラメータも、偽薬と活性側とで有意に違わなかった。
【０２８７】
実施例８
ヒツジにおける内視鏡的副鼻腔手術後の止血に対するハイドロゲルの効果
この研究では、ヒツジバエ（Oestrus ovus）を外寄生させた２１頭のヒツジ（merino cross wethers）を用いた。経鼻内視鏡でヒツジバエ感染を目視確認し、リーシュマン染色した鼻用のスワブで好酸球性副鼻腔炎を記録した。頸静脈にチオペントンナトリウムを注射（体重ｋｇあたり１９ｍｇ）して全身麻酔を導入した。次に、１．５〜２．０％ハロタンの吸入により麻酔を維持したまま気管内挿管した。マイクロデブリッダーを用いて前篩骨複合体と鼻腔壁との間に標準的な粘膜損傷を作る前に中鼻甲介を取り除いた（Medtronic ENT、Jacksonville、Florida）。ストップウォッチを用いて両側での損傷実施時間を３０秒間で区切った。粘膜損傷直後に、Boezaart術野評価尺度（Boezaart AP、Van Der Merne J、Coetzee A、Comparison on sodium nitroprusside and esmolol induced controlled hypertension for functional endoscopic sinus surgery. (Can J Anaesth 1995, 42, page 373-376）（表６）を用いて独立した観察者によって基線術野グレードを求めた。
【０２８８】
【表６】
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【０２８９】
各鼻腔をコンピュータで無作為化して、処置なし（対照群）と、術野グレードの計算直後に篩骨領域に本発明のハイドロゲル５ｍｌ適用とに分けた。本発明のハイドロゲルをフルオレセインで染色して可視化を補助した。出血が止まるか最大で１０分間観察するまで、基線評価後の２分ごとに各側について術野グレードを求めた。
【０２９０】
ヒツジから抜管し、個々の小屋に返した。食餌の無処置（intact）、鼻汁、観察温度などの変数について、ヒツジを毎日３回監視した。術後２週間にわたって、出血が止まらず鼻汁に血液が混じっているのを訓練された動物飼育員が記録した。術後毎日、ヒツジを落ち着かせ、動画内視鏡検査を実施して、創傷部位の痂皮／ゲルの有無を記録した。次に、これを３点目盛りスケールで０〜２まで評価した（表７）。術後１４日間にわたって、毎日の観察を継続した。
【０２９１】
【表７】
0005489999.tif 000013
【０２９２】
結果
GraphPad PrismおよびSPSS 11.0を用いて術野グレードスコアを解析した。データが正規分布していないため、ウィルコクソン符号順位検定を用いる非母数データ用の一対比較試験を使用して、それぞれの側での手術グレードの差異を解析した。複数回の試験でのBonferroni補正を手術グレードのすべての解析に適用し、統計的有意性をｐ＜０．０５に設定した。スチューデントのＴ−検定を用いて、完全な止血に至るまでの時間の平均を比較した。
【０２９３】
対照群ｖｓ本発明のハイドロゲルでの経時的な止血の比較
本研究のこの段階では、２１頭のヒツジ（merino cross wethers）を用いた。基線出血時間に対照群ｖｓハイドロゲルで有意な差異は認められなかった（２．４±０．６７ｖｓ２．４±０．７４）。ハイドロゲル側のほうが、適用後２分、４分、６分の時点で有意に止血された。対照群ｖｓハイドロゲルの平均評価スコアと９５％信頼区間は、２分−１．６（±０．９２）ｖｓ０．９（±０．５３）、４分−１．０（±０．６６）ｖｓ０．２４（±０．４３）、６分−０．４（±０．５９）ｖｓ０．０４８（±０．２１）（ｐ＜０．０５）（図１２）であった。
【０２９４】
完全な止血までの時間
ハイドロゲル側はすべて、６分までに完全に止血された。止血までの平均時間は、ハイドロゲル側で４．０９（±１．６１）ｖｓ対照群側で６．５７（±２．２０）（ｐ＝０．０４９）（図１３）と、有意に改善された。対照群側で続いている出血は、８分の時点で３つの側、１０分の時点で１つの側にあった。これに対し、ハイドロゲル側では６分を過ぎてからは出血は認められなかった。
【０２９５】
術後５日目に１頭のヒツジが死んだ。検死の結果、これは胃内容物の誤嚥が原因であることが分かった。このヒツジにも出血の証拠はなかった。残りのヒツジでは、術後１日を過ぎると鼻汁に血液が混じることはなくなり、どのヒツジも介入が必要なほど過剰な出血が続くことはなかった。
【０２９６】
痂皮／ハイドロゲル溶解スコア
本研究のこの段階では、２０頭のヒツジを用いた。術後１日目、３１日目、７１日目、１４１日目に、対照群側の平均痂皮とハイドロゲル溶解スコアに有意な差異は認められなかった。対照群ｖｓハイドロゲルの平均痂皮／ハイドロゲル溶解スコアならびに９５％信頼区間は、１日目−２．０（±０．００）ｖｓ１．９（±０．３１）、３日目−１．６（±０．６０）ｖｓ１．６５（±０．５９）、７日目−０．４７（±０．６１）ｖｓ０．５３（±０．７０）、１４日目−０．００（±０．００）ｖｓ０．０５（±０．２２）（図１４）であった。
【０２９７】
結論
ヒツジの慢性副鼻腔炎モデルでは、本発明のハイドロゲルは、粘膜損傷の２分、４分、６分後に対照群に比して止血を有意に改善する。また、対照群と比較すると、同様の痂皮溶解特性を呈する。有意な止血作用のある創傷治癒に対する周知の好ましい効果と組み合わせて、本発明のハイドロゲルは、ＥＳＳを受けている患者におけるＥＳＳ後の術後創傷被覆材として大きな可能性を秘めている。
【産業上の利用可能性】
【０２９８】
産業上の利用可能性
本発明は、創傷治癒と癒着の予防を助けるために創傷に適用可能な水ベースの生分解性ハイドロゲルを提供するものである。このハイドロゲルは、止血に対しても好ましい効果があり、絆創膏やフィールドドレッシングに適用して、出血性の外傷創傷および術後の出血を止める助けとすることが可能である。
【０２９９】
本発明のハイドロゲルは、外科的処置時の用途に適している。これを用いることで、外科手術を受けている患者の予後を改善可能である。
【０３００】
本発明のハイドロゲルは、医療訓練を受けていない人でも容易に調製可能であり、被害者が医療機関に搬送されるまでの間に被害者の血液が過剰に失われてしまうのを防ぐ目的で、緊急時に使用することも可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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