(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト多能性幹細胞のクローン培養物を生成する方法であって:
培養容器内の塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）含有限定培養培地中の培養物内のヒト多能性幹細胞の培養物を準備する工程;
培養内幹細胞から単個のヒト多能性幹細胞を選ぶ工程;
単個のヒト多能性幹細胞を用いて、培養容器内でヒト多能性幹細胞の新規培養を開始する工程であって、
培養容器が、該容器内の表面を被覆するマトリックス、及び、bFGF含有限定培養培地を含み、
bFGF含有限定培養培地が薬剤を含み、
薬剤は、該薬剤を含まないbFGF含有限定培養培地と比較して、ヒト多能性幹細胞培養のクローニング効率を増加させるために選ばれ、かつ、下記：
【化１−１】
0005419279.tif 000015
【化１−２】
0005419279.tif 000016
からなる群より選ばれる式で表される小分子である、前記工程；及び
単個のヒト多能性幹細胞を培養して、ヒト多能性幹細胞のクローン培養物を生成する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
薬剤が、キナーゼ阻害剤である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
薬剤が、Rho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
ヒト多能性幹細胞が、ヒト胚幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
bFGF含有限定培養培地が、フィーダー細胞又は血清のない未分化の多能性幹細胞の増殖と維持を支持する、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
ヒト多能性幹細胞のクローン培養物を生成する方法であって:
培養容器内にbFGF含有限定培養培地中の培養内ヒト多能性幹細胞の培養物を準備する工程;
培養内幹細胞から単個のヒト多能性幹細胞を選ぶ工程;
単個のヒト多能性幹細胞を用いて、培養容器内でヒト多能性幹細胞の新規培養を開始する工程であって、
培養容器が、bFGF含有限定培養培地を含み、
bFGF含有限定培養培地が薬剤を含み、
薬剤は、該薬剤を含まない多能性幹細胞培養培地と比較して、ヒト多能性幹細胞培養のクローニング効率を増加させるために選ばれ、かつ、下記：
【化２−１】
0005419279.tif 000017
【化２−２】
0005419279.tif 000018
【化２−３】
0005419279.tif 000019
からなる群より選ばれる式で表される、前記工程；及び
単個のヒト多能性幹細胞を培養して、ヒト多能性幹細胞のクローン培養物を生成する工程
を含む、前記方法。
【請求項７】
多能性幹細胞が、胚幹細胞又は誘導多能性幹細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
培養容器;
容器内に含有する、bFGF含有限定培養培地;
bFGF含有限定培養培地中で増殖するヒト多能性幹細胞; 及び
薬剤を含有するbFGF含有限定培養培地であって、
薬剤は、該薬剤を含まないbFGF含有限定培養培地と比較して、ヒト多能性幹細胞培養のクローニング効率を増加させるために選ばれ、
薬剤が、下記：
【化３−１】
0005419279.tif 000020
【化３−２】
0005419279.tif 000021
からなる群より選ばれる式で表される、キナーゼ阻害剤である、前記培養培地
を含む、ヒト多能性幹細胞培養物。
【請求項９】
幹細胞が、胚幹細胞又は誘導多能性幹細胞である、請求項８に記載のヒト多能性幹細胞培養物。
【請求項１０】
ヒト多能性幹細胞を培養するための限定培地であって、ヒト多能性幹細胞培養のクローニング効率を増加させるために選ばれる薬剤を含み、薬剤が、下記：
【化４−１】
0005419279.tif 000022
【化４−２】
0005419279.tif 000023
【化４−３】
0005419279.tif 000024
からなる群より選ばれる式で表される、前記培地。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2007年1月17日に米国仮特許出願第60/880,747号の利益を主張し、この明細書の記載は本願明細書に全体で示されるように含まれるものとする。
【０００２】
胚幹(ES)細胞は、特性が多能性である、細胞培養の増殖と種々の系列限定細胞集団に対する分化の双方が可能な多能性細胞である(Odorico et al., Stem Cells 19:193-204 (2001))。これらの特性のために、ヒトES細胞を含むES細胞は、種々の機能を行う非常に特異的な細胞型になり得る。
一般に、ヒトES細胞は、高度に均一であり、自己複製能を有し、且つ体のいかなる機能細胞にも分化する能力を有する。自己複製は、適切な条件下、細胞培養内無制限増大の可能性による長期増殖能力につながる。更に、ヒトES細胞が部位特異的でないように分化する場合には、複数の異なる組織型のマーカーを発現する細胞の不均一な集団が得られる(WO 01/51616; Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:113 (2001))。これらの特徴は、ヒトES細胞を治療的有用性を有する細胞の産生のためのユニークな均一性出発集団にする。
ヒトES細胞は、科学的且つ商業的研究利用目的の種々の分化した細胞型にするために使用し得る。現在、多くの種類の分化したヒト細胞は、容易に利用可能でなく、試験管内培養内で著しい数に増大することができない。しかしながら、ヒトES細胞は、培養内で無制限に増大することができ、全部ではないが多くの人体の分化した細胞型に分化することができる。このように、ヒトES細胞を誘導して人体の多くの特定の細胞型に分化するために培養技術が開発されている。ヒトES細胞の利用可能性によって、多くの分化したヒト細胞が科学的且つ商業的研究用に著しい数で利用可能になるという可能性が開けてきた。
ヒトES細胞を用いて作業するに当たっての一つの難しさは、バッチ間で異なる傾向がある、動物製品又は血清のような製品を用いずにヒトES細胞の標準培養の条件を開発することである。このように、当該技術は、ヒトES細胞培養の培養条件ができる限り限定されるものであることが必要である。
この要求を解決するために、限定条件（defined condition）で未分化のヒトES細胞の長期培養を可能にした一組の培養条件が最近記載された。Ludwig et al., Nat. Methods 3:637-646 (2006)の記載は本願明細書に全体として示されるように含まれるものとする。Ludwigらは、その中でTeSRTM培地と呼ばれる、培地の各成分が完全に開示され確認されたヒトES細胞の培養のための培地を記載した。それ故、TeSRTMは、ヒトES細胞培養に完全に限定され且つ充分な培地である。TeSRTMは、未分化のヒトES細胞の培養より更に困難な制限である、新規ヒトES細胞系の誘導に用いるのに有効であることもわかった。
細胞が他の細胞と或いは環境における物理的構造と直接接触している環境で増殖する場合、ヒトES細胞は優先的に未分化のままである。他の細胞環境において、ヒトES細胞は、分化をし始めるとともに無限増殖ができなくなる。
このことは、ES細胞培養をクローン化する方法において重要である。本明細書に用いられる“クローニング”は、出発培養物から、理想的には、単個ES細胞から或いは少なくとも極めて少ないES細胞からES細胞培養を開始する方法を意味する。未分化のES細胞のクローン培養を可能にする培養条件は、正常なES細胞の培養と増殖に必要とされるすべての最も厳しい条件になり得る。
【０００３】
第一態様において、本発明は、多能性幹細胞培養物をクローン化する方法であって、培養容器内の限定培養培地中の培養物内の多能性幹細胞の培養物を準備する工程; 培養物中の幹細胞から単個細胞を選ぶ工程; 及び単個細胞を有する培養容器内で培養培地中の幹細胞の新規培養を開始する工程を含み、培養培地が幹細胞培養のクローニング効率を増加させるために選ばれる薬剤を含み、薬剤が幹細胞培養のクローニング効率を増加させる小分子である、前記方法としてまとめられる。“限定培養培地（defined culture meidum）”又は“限定培地（defined medium）”とは、培地がすべての成分の量が既知であることを意味する。典型的には、細胞培養のための培養培地に通常添加される血清は、例えば、既知の量の血清成分、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、おそらく特定の増殖因子(即ち、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子又は血小板由来増殖因子)で置き換えられる。
第二態様において、本発明は、培養容器を含む多能性幹細胞培養; 容器内に含有される限定培養培地; 培養培地中で増殖する幹細胞; 及び幹細胞培養のクローニング効率を増加させるために選ばれる培養培地中の薬剤を含む多能性幹細胞培養としてまとめられる。
いずれの態様の一部の実施態様においても、薬剤は、キナーゼ阻害剤である。いずれの態様の他の実施態様においても、薬剤は、プロテインキナーゼA阻害剤、プロテインキナーゼC阻害剤、プロテインキナーゼG阻害剤又はRho関連キナーゼ阻害剤である。いずれの態様の更に他の実施態様においても、薬剤は、H-7、イソH-7、H-8、H-9、H-89、HA-100、HA-1004、HA-1077、H-1152又はY-27632より選ばれる。
【０００４】
本発明の目的は、培養条件のクローニング効率を増加させることを含む、多能性幹細胞の培養のための技術を改良することである。多能性幹細胞とは、ES細胞又は誘導した多能性幹(iPS)細胞を意味する。iPS細胞は、分化した体細胞の由来に関して変化していてもよく、効力決定因子の特定の一組に関して変化していてもよく、且つ単離するために用いられる培養条件に関して変化していてもよい再プログラムされた分化した体細胞であるが、それにもかかわらず、それぞれの分化した体細胞の由来と実質的に遺伝的に同一であり且つより高い効力の細胞、例えば、ES細胞と同様の特性を示す。
【０００５】
本発明の利点は、幹細胞培養に小分子の一群の一つの添加よって幹細胞培養条件のクローニング効率を改良することができ、小分子が経済的且つ効果的であることである。
本発明のこれらの及び他の特徴、態様及び利点は、以下の説明からよりよく理解される。好ましい実施態様の説明は、本発明を限定するためのものではなく、すべての変更、等価物及び代替物を包含する。それ故、本発明の範囲を解釈するためには本明細書の特許請求の範囲を参照すべきである。
【０００６】
上記のように、培養内でES細胞のような多能性細胞を増殖させる問題点は、クローニング効率が低いことである。本明細書に用いられる“クローニング効率”は、新規なES細胞コロニーを培養皿のウェルに塗布された個々の細胞の数で割ったトリプシンで個別化した細胞の数を意味する。マトリックス(例えば、Matrigel(登録商標))上に限定された動物性材料を含まない条件でヒトES細胞を増殖させる我々の以前の経験において、クローニング効率は非常に低いものであった(即ち、0.1%未満)。このことは、線維芽細胞にさらすことにより調整された培地に基づく培養系を用いた以前の経験と対照的であり、クローニング効率は低い(即ち、2%未満)ままであったが、ES細胞クローンコロニーを開始するのに充分高いものであった。本明細書に開示されるように、ヒトES細胞が増殖する培養培地に小分子を添加すると、ES細胞培養が小分子を添加しない非常に難しい方法でクローン的に培養させることが可能である。いくつかの小分子は、このために本明細書に例示される。
明確にする点として、ヒトES細胞を“継代すること”とクローンコロニーを開始することの間に差がある。ES細胞培養の典型的な実験において、培養容器が最大である場合、コロニーは、凝集体に分割され、次に新規培養容器に入れられる。これらの凝集体は、典型的には100〜1,000細胞を含有し、培養内増殖を容易に開始する。対照的に、クローンコロニーを開始することは、個々の単個ES細胞からのヒトES細胞コロニーを増殖することを必要とする。
ES細胞のクローニング効率を増加させる薬剤として作用する本明細書において同定される小分子は、このための小分子のスクリーンによって同定した。これらの小分子がヒトES細胞の培養のクローニング効率を増強した機序は、不明である。おそらく、小分子がシグナリングキナーゼと相互作用して、細胞におけるシグナリング経路を変化させるが、相互作用と経路の同一性は、現在知られていない。作用機序に関係なく、小分子はES細胞培養のクローニング効率を効果的に増加させ、培養条件が異なる際でさえ明らかであった。
【０００７】
スクリーンは、高スループット蛍光分析を用いて行い、小分子についてクローニング効率を増強する能力をスクリーニングした。非蛍光可溶性基質(6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルホスフェート、DiFMUP)は、アルカリホスファターゼ(ALP)と呼ばれる未分化のヒトES細胞に特異的な酵素よって蛍光生成物に変換した。
2,000細胞を超えるコロニーを有し、且つ96ウェルプレートにおいて500の個別化ヒトES細胞を播種した12日後に形成したウェルにおいて、ALPよって加水分解されるDiFMUPからの蛍光増加は、コロニー形成を可能にする化合物を含有するいかなるウェルも示した。増殖した細胞は、分化の際にALP活性を失い、蛍光増加にならなかった。このように、この分析は、クローン増殖と未分化状態維持の双方を試験した。
本明細書に記載される方法を用いて、ES細胞クローニング効率を増加させる一組の小分子を同定した。一つの好ましい小分子は、(S)-(+)-2-メチル-1-[(4-メチル-5-イソキノリニル)スルホニル]ホモピペラジン二塩酸塩(非公式名: H-1152)である。他の好ましい小分子は、1-(5-イソキノリンスルホニル)ピペラジン塩酸塩(非公式名:HA-100)である。いずれもクローン増殖を容易にするのに等しく効果的であると思われるが、H-1152は、HA-100より10倍低い作業濃度で使用し得る。効果的である他の関連小分子としては、以下のものが含まれた: 1-(5-イソキノリンスルホニル)-2-メチルピペラジン(非公式名: H-7)、1-(5-イソキノリンスルホニル)-3-メチルピペラジン(非公式名: イソH-7)、N-2-(メチルアミノ)エチル-5-イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩(非公式名: H-8)、N-(2-アミノエチル)-5-イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩(非公式名: H-9)、N-[2-p-ブロモシンナミルアミノ)エチル]-5-イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩(非公式名: H-89)、N-(2-グアニジノエチル)-5-イソキノリンスルホンアミド塩酸塩(非公式名: HA-1004)、1-(5-イソキノリンスルホニル)ホモピペラジン二塩酸塩(非公式名: HA-1077)、(S)-(+)-2-メチル-4-グリシル-1-(4-メチルイソキノリニル-5-スルホニル)ホモピペリジン二塩酸塩(非公式名:グリシルH-1152)、(+)-(R)-トランス-4-(1-アミノエチル)-N-(4-ピリジル)シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩(非公式名: Y-27632)。各小分子は、Matrigel(登録商標)被覆培養皿上の限定培地、例えば、TeSRTM1培地においてクローニング効率>1%を支持した。TeSRTM1培地の全成分と使用方法は、上記、Ludwig et al. Ludwig et al.に記載されている。
【０００８】
これらの小分子により調整される作用は、TeSRTM1培地の使用に制限されなかった。これらの小分子は、また、線維芽細胞にさらされた培地である調整培地上で増殖されるES細胞培養のクローニング効率を増加させた。従って、これらの小分子は、ES細胞が効果的に増殖され得るいかなるES細胞培養培地のクローニング効率をも増加させると考えられる。
ES細胞培養培地のクローニング効率を増加させるのに効果的な小分子の一種は、プロテインキナーゼA(PKA)、プロテインキナーゼC(PKC)、プロテインキナーゼG(PKG)、Rho関連キナーゼ(ROCK)を含む、キナーゼ酵素の阻害剤である。
ROCKは、本明細書において特に興味深い。ROCKは、Rhoの標的タンパク質として役に立つセリン/トレオニンキナーゼである(三つのイソ型が存在する-- RhoA、RhoB及びRhoC)。これらのキナーゼは、最初は、RhoA誘発されたストレスファイバーの形成と焦点接着の化学伝達物質として確認された。二つのROCKイソ型--ROCK1(p160ROCK、ROKβとも呼ばれる)及びROCK2(ROKα)--は、Ｎ末端キナーゼドメイン、続いてRho-結合ドメイン及びプレクストリン-相同ドメイン(pH)を含有するコイルドコイルドメインから構成される。いずれのROCKも、ストレスファイバー形成、平滑筋収縮、細胞接着、膜ラフリング及び細胞運動に対するRhoA作用を仲介する、細胞骨格レギュレータである。ROCKは、下流分子、例えば、ミオシン軽鎖(MLC)、MLCホスファターゼ(MLCP)、ホスファターゼ及びテンシン同族体(PTEN)を標的にすることによって生物活性を示す。
例示的ROCK阻害剤は、Y-27632であり、選択的にROCK1を標的とする(ROCK2も阻害する)とともにTNF-α及びIL-1βを阻害する。これは、細胞透過性であり、ATPと競合することよってROCK1/ROCK2(IC50 = 800nM)を阻害する。Ishizaki T, et al., Mol. Pharmacol. 57:976-983 (2000)の記載は、本願明細書に全体として示されるように含まれるものとする。他のROCK阻害剤としては、例えば、H-1152、Y-30141、Wf-536、HA-1077、ヒドロキシルHA-1077、GSK269962A及びSB-772077-Bが挙げられる。Doe C, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 32:89-98 (2007); 上記Ishizaki et al.; Nakajima M, et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 52:319-324 (2003); Sasaki Y, et al., Pharmacol. Ther. 93:225-232 (2002)の記載は、各々本願明細書に全体として示されるように含まれるものとする。
本明細書に同定される小分子は、共通の構造元素として少なくともピリジンを有する。このように、本明細書において有効な他の小分子としては、例えば、N-(4-ピリジル)-N′-(2,4,6-トリクロロフェニル)尿素、3-(4-ピリジル)-1H-インドール、(R)-(+)-トランス-N-(4-ピリジル)-4-(1-アミノエチル)-シクロヘキサンカルボキサミドが挙げられる。
以下に示され上述したデータは、小分子の一種が一般にヒトES細胞培養培地のクローニング効率を増加させることを証明した。一般に、効果的小分子の一種は、以下のようにまとめられる:
【０００９】
【化１】
0005419279.tif 000002
【００１０】
(式中、R1及びR2は、芳香族基を介して結合することができ、R1は、水素又はアルキルであり、R2は、水素又はアルキルであり、R1とR2が環状芳香族の一部でない限り、R1はR2と同じでなく、R3及びR4はイソキノリンのいかなる原子にも結合され、水素又はアルキルである)。
【００１１】
実施例1: ES細胞クローニング効率を増加させる小分子の同定
方法及び材料
限定培地におけるES細胞コロニーのクローニングを可能にするのに効果的な小分子について、クローニングを可能にする所望の活性を小分子スクリーンにおいて同定した。
スクリーンは、Sigma-Aldrich(セントルイス、ミズーリ州)から購入した既知の生物活性により確認された化合物から構成されている小分子ライブラリーを用いた。ライブラリーの種類をDMSOに溶解して1mMの濃度にした。特に示されない限り、用いられる他のすべての薬品はSigmaから購入した。H1ヒトES細胞(WiCell Research Institute; マディソン、ウィスコンシン州)を、上記、Ludwig et al.に記載されるように調製した限定TeSRTM1培地において増殖した。
分析は、Keck-UWCCC小分子スクリーニング施設(ウィスコンシン大学-マディソン、マディソン、ウィスコンシン州)でBeckman Biomek(登録商標) FXラボラトリワークステーションとPerkin Elmer VictorIII(登録商標)プレートリーダーを用いて96ウェルマイクロプレート(Nunclon/Nunc; ロスキルド、デンマーク)において行った。マイクロプレートを、Matrigel(登録商標)(#354230、減少した成長因子; BD Bioscience、サンノゼ、カリフォルニア州)でDMEM/F12(Invitrogen; カールズバッド、カリフォルニア州)中0.3mg/mlにおいて室温で1時間被覆した。
H1ヒトES細胞を、5日目に6ウェルNunclon(登録商標)皿で増殖し、次に、1%ニワトリ血清を含有する1mlのトリプシン/EDTA(Invitrogen)で37°Cにおいて5分間処理した。トリプシンをDMEM/F12中の20%ウシ胎児血清で急冷し、200RCFで1.5分間遠心分離よって細胞を集めた。培地を吸引した後、細胞を5,000細胞/mlの密度までTeSRTM1培地に再懸濁した。この細胞懸濁液の100μLを各ウェルに分配し、1μLの10mM 阻害剤DMSO溶液を添加し、ピペット操作によって混合し、10μMの最終阻害剤濃度を得た。プレートを37°Cで2日間5% CO2でインキューベートした。次に、培地をクローニング分子がないTeSRTM1培地と交換した。プレートを更に8日間培養し、一日おきに培地を変えた。
コロニー形成を検出するために、我々は、蛍光分析によるALP分析(EnzChek(登録商標); Invitrogen)を用いた。この分析において、可溶性非蛍光基質(DiFMUP)は、ALPよって蛍光生成物に変換される。プレートを50mM TrisHCl(pH 7.5)で洗浄し、100μLの38μM DiFMUP溶液で1時間処理した。コロニーを有するウェルにおいて、蛍光の増加は、コロニー形成につながる化合物を含有するいかなるウェルでも示した。増殖したが、分化もした細胞は、これらの細胞がALP活性を欠いているので、蛍光増加を生じなかった。プレートを、マルチプレートリーダーよって読み出した(0.1ms発光間隔で、励起355nm、発光455nm)。
スクリーンにおいて活性を示した化合物を、1% DMSO中種々の濃度で6ウェルプレートにおいて試験した。これらの分析については、10,000細胞/ウェルをMatrigel(登録商標)被覆プレートに塗布し、次に合計4日間一日おきに上記小分子で処理した。クローニング効率に対して試験した小分子の効果を評価するために、我々は10日後に手でコロニーを計数した。
我々は、これらの小分子について他の培地上のヒトES細胞クローニングに対する効果も試験した。我々は、調整培地(CM)に対する効果をTeSRTM1培地をCMや同一処理で置き換えて試験した。培地のクローニング効率は、HA-100の添加よって増加した。更に、我々は、100ng/μlのbFGFを添加した無調整培地により同様の試験を行った。更にまた、HA-100を添加すると、HA-100を欠く同様の対照培養に比べてクローニング効率が増加した。
【００１２】
結果
小分子スクリーンの結果は、相対蛍光単位とした。蛍光分析の典型的な性能によって平均値17,868、標準偏差5,104及び標準誤差197が得られた。典型的な成功(コロニーが増殖したことを意味する)によって200,000を超える記録が得られた。すべての潜在的な成功は、充分な試料の視覚による検査によって確認した。約1mm直径の明らかなコロニーを、ウェルにおいて真陽性（true positive）で観察した。我々は、4,500の個々の試料から4つの成功を得た。成功は、HA-100、ラトステロール(コレステロール前駆物質)、オバクノール(リモノイド)及びキパジン ジマレエート(セロトニン2A作動薬)であった。これらの四つの化合物から、HA-100だけが6ウェル分析において培養したヒトES細胞のクローニング効率を増加させるのに活性として確認することができた。
我々は、クローニング効率(CE; 塗布した単個細胞の数当たりのコロニー形成単位(CFU)の数、トリプシン/EDTA処理した)を求めた。HA-100は小分子スクリーンにおいて同定された第一分子であり、その後、他の構造的に同様の小分子についてもクローニング効率を試験した。下記の化合物は、ある濃度範囲内で同様の活性を示し、小分子による三つのキナーゼ(例えば、PKA、PKC、PKG)のIC50値を、以下の表1に示す:
下記の構造を有するHA-100(Sigma):
【００１３】
【化２】
0005419279.tif 000003
【００１４】
下記の構造を有するH-7(Sigma):
【００１５】
【化３】
0005419279.tif 000004
【００１６】
下記の構造を有するイソH-7(Sigma):
【００１７】
【化４】
0005419279.tif 000005
【００１８】
下記の構造を有するH-89(Sigma):
【００１９】
【化５】
0005419279.tif 000006
【００２０】
下記の構造を有するHA-1004(Sigma):
【００２１】
【化６】
0005419279.tif 000007
【００２２】
表1
0005419279.tif 000008
【００２３】
更に、すべての小分子を調整培地(CM)において試験し、CM単独と比較して小分子によるCMが30%までのクローニング効率を示した。
我々は、また、Oct4、多能性ES細胞の細胞内マーカーが存在するHA-100処理から得られたコロニーを試験した。免疫蛍光法は、未分化状態を意味する、クローン化コロニーにおいて処理された細胞においてOct4発現の維持の明らかな証拠を示した。このことは、ヒトES細胞がトリプシンよって個別化され且つ多能性を失うことなくHA-100の存在下で培養され得ることを示す。
続いて、他の関連小分子についても、ヒトES細胞のクローニング効率を増加させる能力を試験した。下記の構造を有するHA-1077(Upstate Biotechnologies、レークプラシッド、ニューヨーク州)は、クローニング効率を増加させた:
【００２４】
【化７】
0005419279.tif 000009
【００２５】
二つの他の関連小分子も、同様の効果を示した。第一小分子は、下記の構造を有するH-8(Biomol; プリマスミーティング、ペンシルベニア州)であった:
【００２６】
【化８】
0005419279.tif 000010
【００２７】
第二小分子は、下記の構造を有するH-9(Biomol)であった:
【００２８】
【化９】
0005419279.tif 000011
【００２９】
しかしながら、一つの小分子は、ヒトES細胞のクローニング効率を増加させなかった。この小分子は、下記の構造を有する1-[N,O-ビス-(5-イソキノリンスルホニル)-N-メチル-L-チロシル]-4-フェニルピペラジン(非公式名: KN-62又はKN62)であった:
【００３０】
【化１０】
0005419279.tif 000012
【００３１】
実施例2: ROCK阻害剤はES細胞クローニング効率を増加させる
方法及び材料
実施例1に記載される実験を、H-1152(EMD Chemicals, Inc./Calbiochem; サンディエゴ、カリフォルニア州)及びY-27632(EMD Chemicals, Inc./Calbiochem)で繰り返した。概要としては、H-1152又はY-27632をDMSOに溶解し、20mMの濃度にした。H1ヒトES細胞を、TeSRTM1培地においてマトリゲル(登録商標)被覆プレート上で100,000細胞/mlの密度で増殖した。H-1152及びY-27632を、20μM、15μM、10μM又は5μM/DMSOの最終濃度でそれら自体のプレート上のウェルに添加した。DMSO及びHA-100(10μM)を、それぞれ負と正の対照として用いた。プレートを、合計4日間一日おきに処理した。上記ALP分析においてコロニー形成を検出した。
第二実験において、H-1152及びY-27632を、5μM、500nM、50nM又は5nM/DMSOの最終濃度でそれら自体のプレート上のウェルに添加した。DMSO及びHA-100(10μM)を、それぞれ、負と正の対照として用いた。上記のように、プレートを処理した。
結果
500nM H-1152及び5μM Y-27632は、ALP分析においてほとんどのコロニー形成を示した。プレートを目で調べ、H-1152については500nMを超える濃度の場合に、また、Y-27632については5μMを超える濃度の場合に、HA-100(10μM)と同じか又はより良好であることが見られた。
H-1152の構造は、以下の通りである:
【００３２】
【化１１】
0005419279.tif 000013
【００３３】
Y-27632の構造は、以下の通りである:
【００３４】
【化１２】
0005419279.tif 000014
【００３５】
理解を明瞭にするために説明と実施例によって詳細に上記の発明を記載してきたが、本発明のある種の適応が、当業者にとって通常の最適化の内容であり、本発明の真意、又は添付の特許請求の範囲の範囲から逸脱することなく実施することができることは理解される。