(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラニン細胞からケラチン形成細胞へのメラニンの移動を調節する物質の能力を評価する方法であって、
ａ）試験物質を提供し、
ｂ）Ｍｙｏ−Ｘを発現する細胞を提供し、
ｃ）ミオシン−Ｘ（Ｍｙｏ−Ｘ）の発現または活性化を調節する試験物質の能力を測定する
段階を含んでなる、方法。
【請求項２】
Ｍｙｏ−Ｘを発現する細胞がメラニン細胞またはケラチン形成細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試験物質で処理した細胞でのＭｙｏ−Ｘの発現または活性化を対照細胞でのＭｙｏ−Ｘの発現または活性化と比較することを含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｍｙｏ−Ｘの発現または活性を調節する試験物質の能力を測定する段階が、
細胞中または細胞上のＭｙｏ−Ｘタンパク質の量を測定し、
Ｍｙｏ−Ｘタンパク質の合成における前駆体の量を測定し、または
細胞中のメラノソーム移動レベルを測定する
ことを包含する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法の段階ａ）〜ｃ）によりメラニンの移動を調節する前記物質の能力を評価し、
Ｍｙｏ−Ｘの発現または活性化を増加させることができる物質を選択する
ことを含んでなる、皮膚または毛髪の色素沈着を高めることができる活性物質を選択する方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法の段階ａ）〜ｃ）によりメラニンの移動を調節する前記物質の能力を評価し、
Ｍｙｏ−Ｘの発現または活性化を減少させることができる物質を選択する
ことを含んでなる、皮膚または毛髪の色素沈着を減少させることができる物質を選択する方法。
【請求項７】
評価される物質が植物抽出物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚または毛髪の色素沈着の検討または調節に有用な方法、組成物を調製するための皮膚または毛髪のメラニン色素沈着を調節する活性剤としての植物抽出物の使用、および化粧的ケアの方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトでは、色素沈着は、皮膚、毛包または眼におけるメラニン色素の合成および分布によって生じる。色素沈着は、一般的には予め定義されているが、多数の内部または外部要因によって調節されている。メラニン細胞およびさらに多数のメラニン細胞によって産生されるメラニン、それらのチロシナーゼ活性およびメラニンをケラチン形成細胞へ輸送するそれらの能力、およびメラニン顆粒を含むメラノソームの大きさが、ヒトの皮膚の色を左右する。それぞれの個人について、皮膚の色は、主として皮膚が紫外線（ＵＶ）から受ける放射線被曝の多少によって変化する。換言すれば、それぞれの個人について、彼または彼女の最も薄い皮膚の色に対応して、前記個人が最も弱いＵＶ放射線被曝を受けたとき基礎皮膚色素沈着が起こり、彼または彼女がより強いＵＶ放射線被曝を受けると、強いＵＶ放射線被曝に持続的に暴露されたときの彼または彼女の最も濃い皮膚の色に対応する最大の色素沈着までの範囲の一層強い皮膚色素沈着が起こる。
【０００３】
さらに、周知のように、世界的規模の母集団には、皮膚色素沈着に関してきわめて大きな遺伝的多様性が存在する。従って、母集団によれば、上記で定義した基礎色素沈着に対応する皮膚の色は、２つの両極端な色調である非常に薄いおよび非常に濃いものの間にある濃いめまたは薄めの色調を有する。また、母集団によれば、基礎色素沈着と最大色素沈着との間の皮膚色調の差は、おおよそ大きい。従って、薄い色の皮膚（基礎色素沈着）を有するある母集団に属する個人は、ＵＶ放射線の作用に速やかにおよび／または著しく反応し、従ってこれらの個人が意図的に自らを日光に長期間暴露しなかったときであっても、容易に濃い色調の皮膚を見せることができる。
【０００４】
その上、個人では、皮膚、特に顔または手に一層濃いおよび/または一層着色の強い部分および/またはスポットの出現を経験し、皮膚の色を不均一にする。これらのスポットは、メラニン細胞における激化したメラニン形成活性から生じる表皮のケラチン形成細胞のメラニンが高濃度であることによる。
【０００５】
皮膚色素沈着の形成機構は、メラニンの合成を伴っている。この機構は、とりわけ複雑であり、図式的には下記の主要段階を含む：
チロシン→ドーパ→ドーパキノン→ドーパクロム→メラニン。
【０００６】
チロシナーゼおよびチロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）は、このシリーズの反応に包含される本質的な酵素である。それらは、特にチロシンのドーパ（ジヒドロキシフェニルアラニン）への転換のための反応およびドーパのドーパキノンへの転換のための反応を触媒し、メラニン色素を形成する。
【０００７】
分子は、それが表皮メラニン細胞の活性を阻害することによってこれらの細胞に直接作用しおよび／またはそれがメラニン生合成の段階の１つを遮断しあるいはそれが形成されたメラニンを分解するときには、色素脱失分子であると認められる。これは、特にこの分子がメラニン産生に関わる酵素の１つを阻害しまたはそれがメラニン合成鎖の化合物と反応する場合である。
【０００８】
既知の色素脱失物質は、特にヒドロキノンおよびその誘導体、コウジ酸、アルブチン、イミノフェノール、カルニチンとキノンの組合せ、アミノフェノールアミド誘導体、およびベンゾチアゾール誘導体である。これらの物質は、いくつかの欠点を有する可能性がある。それらは不安定である可能性があり、高濃度での使用が必要とされることがあり、それらの作用法に関して特異性を欠くことがあり、または細胞毒性または刺激性を有することがある。
【０００９】
一方、分子は、皮膚または毛包に存在するメラニン細胞におけるメラニン産生に対するその刺激活性によって、かつこのように皮膚または毛髪の色素沈着を促進し、皮膚および毛髪の色素沈着の異常を治療することができるようにすることによって、さらに詳細にはメラニンの生合成を促進することによって、色素沈着分子であると認められる。
【００１０】
既知の色素沈着物質は、詳細にはフォルスコリン（Coleus forskholii抽出物）またはＴｅｐｈｒｏｓｉａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ抽出物のようなアデニレートシクラーゼ活性剤である。
【００１１】
メラニン細胞は、表皮および毛球の基底層に沿って分布している神経堤由来の細胞である。これらの細胞は、メラノソームと呼ばれる独特なメラニン細胞に特異的な細胞小器官中でメラニン産生と呼ばれる過程によりメラニン色素を合成する。皮膚および毛髪に色素沈着させるには、このメラニンを、メラニン細胞から隣接するケラチン形成細胞へ移動しなければならない。哺乳類の皮膚、眼、および毛髪/毛/毛皮の色は、一連の様々な分子および化合物によって多数の制御点で調節される多数の段階を含む工程におけるメラニンの量および性質(褐色/黒色のユーメラニンまたは赤色/黄色のフェオメラニン)によって決定される。最近の二十年ほどの間に、メラニン合成およびメラノソーム生物発生/成熟の分子制御の理解において大きな進歩が見られている。
【００１２】
しかしながら、メラニン移動を制御する方法に関する知識は、この過程が皮膚表面および毛髪繊維に沿って考えられる色素沈着のレベルを究極的に制御するので、主として臨床/美容上の関心を有していた。
【００１３】
発明者らは、ミオシンＸ（Ｍｙｏ−Ｘ）の作用を含むヒトの皮膚のメラニン細胞からヒトの皮膚のケラチン形成細胞へのメラニン移動を制御し、メラニン細胞からケラチン形成細胞へのメラニンの移動を調節する機構を示している。
【００１４】
メラニン細胞の生物学（例えば、メラニン移動）におけるＭｙｏ−Ｘの関与は、これまでは報告されていない。メラニン細胞でのメラニン産生（すなわち、メラニン合成）の調節については多くのことが知られているが、メラニン細胞からケラチン形成細胞へのメラノソーム移動方法についての知識は未だに極めて限定されている。細胞捕食についての役割に加えて、ケラチン形成細胞膜と相互作用することができる糸状仮足を介するメラノソーム移動を支持する証拠が増えている（Scott et al, 2002, Singh et al, 2008)。重要なことには、メラニン細胞樹状突起の側部および先端から生じ、かつそれらの管腔中にメラノソームを含む糸状仮足と一致する構造は、インサイチュー（in situ）ならびにインビトロ（in vitro）でもヒトの皮膚で既に報告されている(Scott et al., 2002)。
【発明の概要】
【００１５】
メラニン移動の生物学に関する検討中に、本発明者らは、この過程におけるＭｙｏ−Ｘの潜在的役割を検討した。本出願明細書では、ヒトの皮膚のメラニン細胞からヒトの皮膚のケラチン形成細胞へのメラニン移動を制御する新規な機構を説明する。
【００１６】
この機構は、Ｍｙｏ−Ｘの作用を含んでいる。Ｍｙｏ−Ｘは、メラニン細胞上のナノチューブ（糸状仮足と呼ばれる）の産生を調節し、メラニン移動の細胞内導管として働く。Ｍｙｏ−Ｘがメラニン移動を調節することを明らかにするため、本発明者らは、遺伝子サイレンシング法を用いてメラニン細胞におけるその発現をノックダウンした。Ｍｙｏ−Ｘを欠くことにより、メラニン細胞糸状仮足が失われ、同時にメラノソームのケラチン形成細胞への移動が抑制された。
【００１７】
本発明者らは、糸状仮足産生がどのように調節されるかを検討し、ミオシンスーパーファミリーのアクチン性モータータンパク質が関係している可能性があることを観察した。具体的には、Ｍｙｏｓｉｎ−Ｘ（Ｍｙｏ−Ｘ；２４０ＫＤａの脊椎動物に特異的なＭｙＴＨ４−ＦＥＲＭミオシン）は、糸状仮足形成にきわめて重要である(Sousa and Cheney 2005)。それは、糸状仮足先端複合体（filopodial tip complex）の一部分としておよび／または糸状仮足形成に必要な分子を輸送することによって機能する(Bohil et al, 2006)。
【００１８】
本出願明細書では、Ｍｙｏ−Ｘがヒトのメラニン細胞とヒトのケラチン形成細胞との間のメラニン移動を制御することができることを、初めて報告する。Ｍｙｏ−Ｘとその構造および作用に基づく分子は、哺乳類の皮膚および毛髪での色素沈着の新規な調節として用いることができる。
【００１９】
第一の態様によれば、本発明は、メラニン細胞からケラチン形成細胞へのメラニンの移動を調節する物質の能力を評価する方法であって、
ａ）  試験物質を提供し、
ｂ）  Ｍｙｏ−Ｘを発現する細胞を提供し、
ｃ）  ミオシン−Ｘ（Ｍｙｏ−Ｘ）の発現または活性化を調節する試験物質の能力を測定する
段階を含んでなる、方法を提供する。
【００２０】
「調節する」とは、活性剤がヒトにおける、Ｍｙｏ−Ｘの発現または活性を増加させることができる、またはＭｙｏ−Ｘの発現または活性を減少させることができるいずれかのことを意味し、この活性剤は、直接的にＭｙｏ−Ｘに、または間接的に、すなわち、Ｍｙｏ−Ｘ代謝経路における上流ターゲットに作用する。
【００２１】
好ましくは、Ｍｙｏ−Ｘを発現する細胞は、メラニン細胞またはケラチン形成細胞であり、さらに好ましくは、メラニン細胞である。
【００２２】
本発明によるメラニンの移動を調節する物質の能力を評価する方法は、試験物質で処理した細胞でのＭｙｏ−Ｘの発現または活性化をコントロール細胞でのＭｙｏ−Ｘの発現または活性化と比較することを含んでなる。
【００２３】
前記の能力の測定は、
細胞中または細胞上のＭｙｏ−Ｘタンパク質の量を測定し、
Ｍｙｏ−Ｘタンパク質の合成における前駆体の量を測定し、または
細胞中のメラノソーム移動レベルを測定する
ことを包含する。
【００２４】
Ｍｙｏ−Ｘの発現を測定する方法は、細胞中または細胞上のＭｙｏ−Ｘタンパク質の量を測定し、またはＭｙｏ−Ｘタンパク質の合成における前駆体、例えば、Ｍｙｏ−ＸをコードするｍＲＮＡの量を測定することを包含する。Ｍｙｏ−Ｘタンパク質またはＭｙｏ−Ｘ  ｍＲＮＡレベルの発現レベルの測定に要する手法は、当業者には明らかであろう。タンパク質レベルを測定するための手法は、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、二次元電気泳動または質量分析法を包含してもよい。ｍＲＮＡレベルを測定する手法は、ノーザンブロット法、逆転写酵素ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、マイクロアレイまたはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）チップを包含することがある。
【００２５】
Ｍｙｏ−Ｘの発現または活性化のレベルは、当業者に明らかな多数の方法によって測定してもよい。本発明の態様において、発現は、免疫蛍光、ウェスタンブロット法を用いて、またはＭｙｏ−Ｘ  ｍＲＮＡのレベルを測定することによって測定してもよい。上記のように、他の適当な方法は、当業者には明らかであろう。
【００２６】
Ｍｙｏ−Ｘの活性の測定方法は、細胞におけるメラノソーム移動レベルの測定が挙げられる。前記レベルを測定するのに要する手法は、ケラチン形成細胞へのメラニン移動の定量分析を包含してもよく、当業者には明らかであろう。
【００２７】
メラニン移動レベルを測定する手法は、Singh SK et al., Exp. Dermatol. 17, 5, 418-426によって記載されているようなｇｐ１００の分子トラッカーとしての使用、または当業者に明らかな任意の適当な方法を包含してもよい。
【００２８】
他の態様によれば、本発明は、
請求項１に記載の方法の段階ａ）〜ｃ）によりメラニンの移動を調節する前記物質の能力を評価し、
Ｍｙｏ−Ｘの発現または活性化を増加させることができる物質を選択する
ことを含んでなる、皮膚または毛髪の色素沈着を高めることができる活性物質を選択する方法、および
請求項１に記載の方法の段階ａ）〜ｃ）によりメラニンの移動を調節する前記物質の能力を評価し、
Ｍｙｏ−Ｘの発現または活性化を減少させることができる物質を選択する
ことを含んでなる、皮膚または毛髪の色素沈着を減少させることができる物質を選択する方法を提供する。
【００２９】
本発明の意味では、「皮膚または毛髪の色素沈着」は、「ヒトにおける皮膚または毛髪の色素沈着」と理解すべきである。
【００３０】
本発明によれば、評価されるまたは試験物質は、植物抽出物である。Ｍｙｏ−Ｘの発現または活性化を増加させることができるものとして本発明の方法によって選択された植物抽出物は、大豆の抽出物、好ましくは、大豆種子抽出物、さらに好ましくは、大豆種皮抽出物からなる群から選択され、Ｍｙｏ−Ｘの発現または活性化を減少させることができるものとして本発明の方法によって選択される植物抽出物は、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ属植物の抽出物、好ましくはＡｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｓ抽出物、さらに好ましくはＡｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｓ種子抽出物、Ｃｙａｔｈｅａ属植物の抽出物、好ましくはＣｙａｔｈｅａ  ｃｕｍｉｎｇｉｉ抽出物、さらに好ましくはＣｙａｔｈｅａ  ｃｕｍｉｎｇｉｉ葉抽出物、Ｓｅｃａｌｅ属植物の抽出物、好ましくはＳｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ抽出物、さらに好ましくはＳｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ種子抽出物、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ属植物の抽出物、好ましくはＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの分泌物、およびＢｕｄｄｌｅｊａ属植物の抽出物、好ましくはＢｕｄｄｌｅｊａ  ａｘｉｌｌａｒｉｓ抽出物、さらに好ましくはＢｕｄｄｌｅｊａ  ａｘｉｌｌａｒｉｓ葉抽出物からなる群から選択される。
【００３１】
もう一つの態様によれば、本発明は、上記植物抽出物の少なくとも１種類の化粧用組成物、またはＭｙｏ−Ｘの発現または活性を調節する活性剤としての化粧用組成物の調製における使用を提供し、前記組成物は皮膚または毛髪の色素沈着の調節を目的とするものである。
【００３２】
本発明によれば、植物抽出物は、当業者に知られている様々な抽出方法によって調製することができる。
【００３３】
抽出は、好ましくは選択された植物材料を極性溶媒または極性溶媒の混合物と接触させることによって行われる。本発明によれば、「極性溶媒」という用語は、その溶媒が４の値以上の極性指数値を有することを意味する。極性指数は、分子の多少極性であることを示す（溶解度および状態変化の）熱力学的量に基づいて計算される量である。
【００３４】
溶媒の極性指数については、L.R. SNYDERの論文「通常の液体の溶媒特性の分類(Classification of the solvent properties of common liquids)」Journal of Chromatography, 92 (1974), 223-230を参照することができ、この論文は、本出願明細書に参照することにより包含されている。
【００３５】
極性溶媒は、好都合には水、エタノール、グリコール、エチレングリコール、グリセロール、ブチレングリコールおよびプロピレングリコールのようなＣ１−Ｃ４アルコール、およびそれらの混合物から選択される。
【００３６】
好ましくは、抽出は、水−アルコール混合物、特に水−エタノール混合物、および好ましくは水−エタノール混合物であって、好都合には５０／５０（ｖ／ｖ）の比であるものを用いることによって行われる。
【００３７】
本発明によれば、Ｍｙｏ−Ｘの発現または活性を調節することができる少なくとも植物抽出物は、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ属植物の抽出物、好ましくはＡｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｓ抽出物、さらに好ましくはＡｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｓ種子抽出物、Ｃｙａｔｈｅａ属植物の抽出物、好ましくはＣｙａｔｈｅａ  ｃｕｍｉｎｇｉｉ抽出物、さらに好ましくはＣｙａｔｈｅａ  ｃｕｍｉｎｇｉｉ葉抽出物、Ｓｅｃａｌｅ属植物の抽出物、好ましくはＳｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ抽出物、さらに好ましくはＳｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ種子抽出物、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ属植物の抽出物、好ましくはＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの分泌物、大豆属植物の抽出物、好ましくは大豆種子抽出物、さらに好ましくは大豆種皮抽出物、Ｂｕｄｄｌｅｊａ属植物の抽出物、好ましくはＢｕｄｄｌｅｊａ  ａｘｉｌｌａｒｉｓ抽出物、さらに好ましくはＢｕｄｄｌｅｊａ  ａｘｉｌｌａｒｉｓ葉抽出物からなる群から選択される。
【００３８】
詳細には、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ属植物の抽出物、好ましくはＡｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｓ抽出物、さらに好ましくはＡｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｓ種子抽出物、Ｃｙａｔｈｅａ属植物の抽出物、好ましくはＣｙａｔｈｅａ  ｃｕｍｉｎｇｉｉ抽出物、さらに好ましくはＣｙａｔｈｅａ  ｃｕｍｉｎｇｉｉ葉抽出物、Ｓｅｃａｌｅ属植物の抽出物、好ましくはＳｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ抽出物、さらに好ましくはＳｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ種子抽出物、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ属植物の抽出物、好ましくはＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの分泌物、Ｂｕｄｄｌｅｊａ属植物の抽出物、好ましくはＢｕｄｄｌｅｊａ  ａｘｉｌｌａｒｉｓ抽出物、さらに好ましくはＢｕｄｄｌｅｊａ  ａｘｉｌｌａｒｉｓ葉抽出物は、Ｍｙｏ−Ｘの発現または活性を減少させる活性剤であり、大豆の抽出物、好ましくは大豆種子抽出物、さらに好ましくは大豆種皮抽出物は、Ｍｙｏ−Ｘの発現または活性を増加させる活性剤である。
【００３９】
本発明のもう一つの目的は、皮膚または毛髪の色素沈着を調節する活性剤としての化粧用組成物または化粧用組成物の調製での使用のための、Ｃｙａｔｈｅａ属植物の抽出物、好ましくは、Ｃｙａｔｈｅａ  ｃｕｍｉｎｇｉｉ抽出物、さらに好ましくはＣｙａｔｈｅａ  ｃｕｍｉｎｇｉｉ葉抽出物、Ｓｅｃａｌｅ属植物の抽出物、好ましくはＳｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ抽出物、さらに好ましくはＳｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ種子抽出物、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ属植物の抽出物、好ましくはＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの分泌物、大豆の抽出物、好ましくは大豆種子抽出物、さらに好ましくは大豆種皮抽出物からなる群から選択される少なくとも１種類の植物抽出物を提供することであり、詳細には、Ｃｙａｔｈｅａ属植物の抽出物、好ましくはＣｙａｔｈｅａ  ｃｕｍｉｎｇｉｉ抽出物、さらに好ましくはＣｙａｔｈｅａ  ｃｕｍｉｎｇｉｉ葉抽出物、Ｓｅｃａｌｅ属植物の抽出物、好ましくはＳｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ抽出物、さらに好ましくはＳｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ種子抽出物、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ属植物の抽出物、好ましくはＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの分泌物は、皮膚または毛髪の色素沈着を減少させるために使用される活性剤であり、かつ大豆の抽出物、好ましくは大豆種子抽出物、さらに好ましくは大豆種皮抽出物は、皮膚または毛髪の色素沈着を高めるために使用される活性剤である。
【００４０】
本発明のもう一つの態様によれば、皮膚または毛髪の色素沈着を減少させまたは高めるために、Ｃｙａｔｈｅａ属植物の抽出物、好ましくはＣｙａｔｈｅａ  ｃｕｍｉｎｇｉｉ抽出物、さらに好ましくはＣｙａｔｈｅａ  ｃｕｍｉｎｇｉｉ葉抽出物、Ｓｅｃａｌｅ属植物の抽出物、好ましくはＳｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ抽出物、さらに好ましくはＳｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ種子抽出物、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ属植物の抽出物、好ましくはＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの分泌物、大豆の抽出物、好ましくは大豆種子抽出物、さらに好ましくは大豆種皮抽出物からなる群から選択される少なくとも１種類の植物抽出物を含んでなる化粧用組成物の局所的な使用を含んでなる化粧的ケアの方法が提供される。
【００４１】
本発明のさらなる態様によれば、皮膚または毛髪の色素沈着を減少させまたは高めるため、Ｍｙｏ−Ｘの発現または活性を調節する活性剤として本発明の方法によって得られうる少なくとも１種類の植物抽出物を含んでなる化粧用組成物の局所的な使用を含んでなる化粧的ケアの方法が提供される。
【００４２】
詳細には、Ｃｙａｔｈｅａ属植物の抽出物、好ましくはＣｙａｔｈｅａ  ｃｕｍｉｎｇｉｉ抽出物、さらに好ましくはＣｙａｔｈｅａ  ｃｕｍｉｎｇｉｉ葉抽出物、Ｓｅｃａｌｅ属植物の抽出物、好ましくはＳｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ抽出物、さらに好ましくはＳｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ種子抽出物、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ属植物の抽出物、好ましくはＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの分泌物は、皮膚の色素沈着を減少させる活性剤であり、大豆の抽出物、好ましくは大豆種子抽出物、さらに好ましくは大豆種皮抽出物は、皮膚または毛髪の色素沈着を高める活性剤である。
【００４３】
本発明によれば、少なくとも上記の植物抽出物は、化粧用組成物の調製に用いられ、または皮膚または毛髪の色素沈着を薄くするまたは濃くする化粧用組成物の調製での皮膚または毛髪の色素沈着を調節する活性剤として用いられる。
【００４４】
本発明によれば、上記植物抽出物は、本発明の組成物の重量で０．０００１％〜１０％、好ましくは０．０１％〜２％の乾燥重量で表した濃度範囲で用いられる。
【００４５】
もう一つの態様によれば、本発明は、Ｍｙｏ−Ｘの発現または活性を調節する活性物質を含んでなる化粧用組成物を局所的に用いて、皮膚または毛髪の色素沈着を減少させまたは高める化粧的ケアの方法を提供する。
【００４６】
好ましい態様では、前記活性物質は、核酸であり、さらに好ましくはＭｙｏ−Ｘまたはその機能性部分をコードするＤＮＡまたはＲＮＡとの相互作用を介してＭｙｏ−Ｘの発現を調節することができるＲＮＡ分子である。
【００４７】
詳細には、前記ＲＮＡ分子は、Ｍｙｏ−ＸをコードするｍＲＮＡに対してアンチセンス相互作用またはＲＮＡ干渉をターゲッティングすることができる。
【００４８】
一態様では、前記ＲＮＡ分子は、配列５’−ＣＡＧＣＧＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＡＡＴＣＡＡ−３’（配列番号ｌ）を有するＲＮＡｉを介してＭｙｏ−Ｘ  ｍＲＮＡをターゲッティングするためのｍＲＮＡ分子である。
【００４９】
Ｍｙｏ−Ｘ  ｍＲＮＡに対するＲＮＡｉを示すであろう他の適当な配列を決定することは、当業者の技術の範囲内にある。
【００５０】
化粧用または医薬組成物、特に本発明による皮膚科用組成物は、従って、色素沈着を減少させたい場合のみならず色素沈着を増加させたい場合にも化粧品学または皮膚科学において様々な用途を有する。
【００５１】
例えば、これらの色素脱失組成物を用いて、ヒトの皮膚を明るくする効果を得ることができたりまたは均質な皮膚の色を得ることができる。それらは、皮膚、特に顔や手の上に一層濃いおよび/または一層着色した部分および/またはスポットが出現して、皮膚の色を不均一にする場合に用いることもできる。これらのスポットは、メラニン細胞におけるメラニン形成活性の激化によって生じる表皮のケラチン形成細胞における高濃度のメラニンによるものである。前記組成物は、特に特発性黒色腫のようなメラニン細胞機能亢進による局所的色素沈着過剰、日光性ほくろまたは老人性ほくろと呼ばれる色素斑のようなメラニン細胞の機能亢進による限局性色素沈着過剰、光感作または損傷後瘢痕形成のような偶発的色素沈着過剰、およびさらに白斑(vitiligo)のようなある形態の白斑(leucoderma)の治療に用いられる。後者の場合には、皮膚を再着色することはできないので、色素脱失領域の周辺の色素沈着を減少して、一層均一な色の皮膚にする。
【００５２】
本発明の好ましい態様では、少なくとも皮膚または毛髪の色素沈着を減少させることができる植物抽出物（Ｃｙａｔｈｅａ属植物の抽出物、好ましくはＣｙａｔｈｅａ  ｃｕｍｉｎｇｉｉ抽出物、さらに好ましくはＣｙａｔｈｅａ  ｃｕｍｉｎｇｉｉ葉抽出物、Ｓｅｃａｌｅ属植物の抽出物、好ましくはＳｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ抽出物、さらに好ましくはＳｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ種子抽出物、およびＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ属植物の抽出物、好ましくはＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの分泌物からなる群から選択される）を含んでなる化粧用組成物は、特発性黒色腫、ほくろのような疾患と関連した色素沈着過剰を含む皮膚または毛髪の色素沈着過剰の化粧治療のための化粧的ケアの方法に用いられる。前記組成物は、白斑の場合のように色素脱失部分が正常またはそれ以上に色素沈着した皮膚によって取り囲まれている結果としての色素沈着のコントラストを化粧により減少させるための化粧的ケア治療にも用いられる。
【００５３】
本発明による色素脱失組成物は、ある種の個人、特にＵＶ放射線に極めて反応性が高いヒトでは、特に顔および手の着色を薄くして、皮膚の着色をできる限り少なくまたは最小限に維持し、ＵＶ光線の色素沈着効果を減少させる目的で、皮膚漂白剤としても用いられる。
【００５４】
一方、本発明による色素沈着組成物は、求められることが多い美的利点に加えて、表皮におけるメラニンの割合を増加することによって紫外線に対する天然防御ができる日焼けを促進しまたは強化する日焼け製品(sun products)として用いることができる。これらの組成物は、例えば、クリームの形態で用いて、皮膚に一層日焼けした外観を与え、あるいはローションの形態で用いて白髪の出現を防止かつ治療することもできる。
【００５５】
本発明の好ましい態様では、少なくとも皮膚または毛髪の色素沈着を高めることができる植物抽出物（大豆の抽出物、好ましくは大豆種子抽出物、さらに好ましくは大豆種皮抽出物からなる群から選択される）を含んでなる化粧用組成物は、癜風、白色粃糠疹、エリテマトーデス、菌状息肉腫、サルコイドーシス、ハンセン病、梅毒および脱色素性母斑のような疾患と関連した色素脱失を含む皮膚または毛髪の色素脱失の化粧治療を目的とする化粧的ケアの方法に用いられる。
【００５６】
さらに、本発明による化粧用組成物は、少なくとも植物抽出物の他に、日焼け止め剤のような皮膚または毛髪の色素沈着を調節するまたはしない任意の他の活性剤を包含してもよく、ポリマー、界面活性剤、流動調整剤、芳香剤、電解質、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、防腐剤、染料、真珠母貝、色素、およびそれらの混合物から選択することができる少なくとも１種類の化粧上許容可能な賦形剤も包含してもよい。
【００５７】
本発明で引用される化粧用組成物は、局所的な使用を目的とするものである。これらの組成物は、例えば、美容液(serum)、ローション、スプレー、フォーム、溶液、粉末、ポマード、ミルク、エマルション、薄付きクリームまたはハイドロゲルであることができ、スティック、パッチまたはマスクの形態をとることができる。
【００５８】
さらに、局所的な投与を目的とする本発明による化粧用組成物は、化粧品学および皮膚薬学の分野で普通に用いられる薬剤、例えばグリセロール、プロピレングリコール、オレイン酸または精油、特にメントールおよびユーカリプトールのような当該皮膚構造への浸透および拡散を促進するための少なくとも１種類の薬剤を含むことができる。
【００５９】
本発明の態様を、添付の図面を参照して単なる例として説明することにする。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、正常な色素沈着したヒトメラニン細胞におけるメラニン産生に対する活性な本発明の植物抽出物の効果を示す。
【図２】図２は、中程度に色素沈着したＦＭ５５黒色腫におけるメラニン産生に対する本発明の植物抽出物の効果を示す。
【図３】図３ＡおよびＢは、色素沈着した正常なヒトメラニン細胞におけるチロシナーゼ活性に対する本発明の植物抽出物の効果を示す。
【図４】図４ＡおよびＢは、中程度に色素沈着したＦＭ５５黒色腫におけるチロシナーゼ活性に対する本発明の植物抽出物の効果を示す。
【図５】図５ＡおよびＢは、正常なヒトメラニン細胞とケラチン形成細胞の共培養におけるチロシナーゼ活性に対する本発明の植物抽出物、ＩＢＭＸおよびナイアシンアミドの効果を示す。
【図６】図６は、本発明の植物抽出物と共にインキュベーションした後のメラノソーム移動の定量分析の結果を示す。
【図７】図７ＡおよびＢは、正常なヒトメラニン細胞におけるウェスタンブロット法によるＭｙｏ−Ｘタンパク質発現に対する本発明の植物抽出物の効果を示す。
【図８】図８は、表皮メラニン細胞−ケラチン形成細胞の共培養における表皮メラニン細胞のＭｙｏ−Ｘ発現のノックダウン後のメラノソーム移動の定量分析の結果を示す。
【発明の具体的説明】
【００６１】
背景
下記に報告される結果に対して、本発明によって用いられる植物抽出物を、それぞれ独自のコード名によって下記の対応で同定する。
Ｌ−１８：Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｓ種子抽出物、
Ｌ−１９：Ｃｙａｔｈｅａ  ｃｕｍｉｎｇｉｉ葉抽出物（極性溶媒抽出）、
Ｌ−２０：Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ種子抽出物（極性溶媒、特に水で抽出後、酵素加水分解）、
Ｌ−２１：Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの分泌物（海水中培養により入手）、
Ｌ−２２：大豆種皮抽出物（水に懸濁後、酵素加水分解）、
Ｌ−２３：Ｂｕｄｄｌｅｊａ  ａｘｉｌｌａｒｉｓ葉抽出物（抽出／濃縮後、凍結乾燥／滅菌）。
【００６２】
この報告は、表皮のケラチン形成細胞と完全に適合させるための正常なヒト表皮メラニン細胞におけるメラノソーム移動に対する様々なＬ−１８〜２３の効果についてのデータを提供している。
【００６３】
最適用量を、表皮メラニン細胞およびケラチン形成細胞に対してそれぞれの活性植物抽出物について個別に標準化している。ａ）メラニン合成およびｂ）チロシナーゼ活性に対するすべてのＬ−１８〜２３の効果を、単独で培養したメラニン細胞および適合したケラチン形成細胞と共に培養したメラニン細胞（すなわち、ＥＭ−ＫＣ共培養）を用いて評価している。ＥＭ：ＫＣ共培養におけるメラノソーム移動に対する活性植物抽出物の効果を、ｇｐ００免疫標識を用いて評価している。
【００６４】
正のメラニン細胞モジュレーター（ＩＢＭＸ）およびメラノソーム移動阻害剤（ナイアシンアミド）の両方を、この検討のコントロールとして用いた。
【００６５】
一般的には、Ｌ−１８、１９、２０、２１、２３は、メラニン合成、チロシナーゼのドーパ−オキシダーゼ活性、メラノソーム移動およびＭｙｏ−Ｘ発現を下方制御した。実際には、Ｌ−１８およびＬ−２３は色素脱失剤として知られていたが、これらのパラメーターに対するそれらの作用はこれまでには示されなかった。対照的に、Ｌ−２２は、前記パラメーターを上方制御することが見出された。
【００６６】
材料および方法
本発明の植物抽出物を用いたメラニン細胞および黒色腫細胞の刺激
細胞培養：
下記の報告において、用いた出発材料は、
Ｌ−１８については、粉末（水性母溶液に加えた後、指示濃度に調整した）であり、
Ｌ−１９については、乾燥抽出物３０％での水／グリセロール混合物の溶液であり、
Ｌ−２０については、乾燥抽出物５、６％での水溶液であり、
Ｌ−２１については、乾燥抽出物６％での水溶液であり、
Ｌ−２２については、乾燥抽出物１５％での水溶液であり、
Ｌ−２３については、粉末（水性母溶液に加えた後、指示濃度に調整）である。
【００６７】
用量の評価：完全に適合した表皮メラニン細胞ＥＭおよび表皮ケラチン形成細胞（ＥＫ）を、血清を補足したフルＭＥＭメラニン細胞およびＫ−ＳＦＭケラチン形成細胞培地の６ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。細胞を、Ｌ−１８（０．００１〜０．００５％）、Ｌ−１９（０．５〜１．０％）、Ｌ−２０（０．１〜０．５％）、Ｌ−２１（１０μｇ／ｍｌ）、Ｌ−２２（０．１〜１．０％）およびＬ−２３（０．０１〜０．０５μｇ／ｍｌ）を補足した無血清培地（いわゆる、飢餓状態）に移し、１２および７２時間培養した。コントロールは、ＩＢＭＸ（１００μＭ）およびナイアシンアミド（１０μＭ）を包含していた。細胞毒性を、細胞死および形態の細胞病理学的変化によって評価した。
【００６８】
約１ｘ１０４個のＥＭおよび２ｘ１０３個のＦＭ５５黒色腫細胞をＬａｂ−ｔｅｋ（登録商標）８ウェルのチャンバースライドのそれぞれのウェルに播種し、２４時間接着させた。次いで、細胞を滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、新鮮な無血清ＲＰＭＩ培地（黒色腫細胞）または飢餓無血清および無ＢＰＥメラニン細胞培地（ＥＭ）のいずれかを３５０μｌ補足し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションした。次いで、細胞を滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、１ｘ１０−４ＭＩＢＭＸを用いて３７℃および５％ＣＯ２で１２、２４および７２時間インキュベーションした。次いで、細胞を滅菌ＰＢＳで緩やかに３回洗浄し、氷冷メタノール中で−２０℃で１０分間固定した。スライドは、免疫細胞化学を行うまで−２０℃で保管した。
【００６９】
メラニン分析：合成メラニン（Ｓｉｇｍａ，英国）５００μｇ／ｍｌを１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（ＢＯＨ  Ｌｔｄ，英国）中で調製し、音波処理水槽にて２０分間溶解した。この保存溶液から、様々なメラニン標準物を１ＭＮａＯＨ中で５０μｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌまで調製した。メラニン標準物を９６ウェルプレートに分注し、試験試料中のメラニン含量を評価するために検量線を作成した。１ＭＮａＯＨ４００μｌをそれぞれの細胞ペレットに加え、ヒートブロック（１００℃）上で１５分間溶解した。ペレットを激しく攪拌し、可溶化したペレットを同じ９６ウェルプレートに分注した。試料の光学密度を、ＤＹＮＥＸ  ＲＥＶＥＬＡＴＩＯＮ  ４．０２プログラム上で４９５ｎｍで読み取った。それぞれの試験試料のメラニン含量を検量線から読み取った。
【００７０】
チロシナーゼ活性の評価のための非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いるＤＯＰＡオキシダーゼ検出：約５ｘ１０５個のＥＭｃおよびＦＭ５５黒色腫細胞を、３つのＴ７５フラスコに播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベーションした。細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥのために調製し、ＰＶＤＦ膜にトランスブロットした。煮沸をしていない未還元タンパク質抽出物７０μｇを、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの適当なウェルに分注した。分離したタンパク質を含むＰＶＤＦ膜を１ｘＰＢＳで１回洗浄した後、５ｍＭＬ−ＤＯＰＡ／０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で室温にて３時間Ｌ−ＤＯＰＡを３回交換しながらインキュベーションした。Ｌ−ＤＯＰＡ反応を、膜を蒸留水中で洗浄することによって停止し、膜をスキャンした。
【００７１】
ウェスタンブロット方法：コンフルエントなＴ２２５フラスコ中のＥＭｃをトリプシン処理し、フル培地（full medium）を含むＴ２５フラスコに播種し、一晩接着させた。処理の２４時間前に、培地を飢餓培地に換えて、２４時間培養した。細胞を滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、飢餓培地のみまたはＬ−１８（０．００１％）、Ｌ−１９（１％）、Ｌ−２０（０．５％）、Ｌ−２１（１０μｇ／ｍｌ）、Ｌ−２２（１％）およびＬ−２３（０．０５μｇ／ｍｌ）で、１２および７２時間インキュベーションした。コントロールは、ＩＢＭＸ（１００μＭ）およびナイアシンアミド（１０μＭ）を包含していた。
【００７２】
それぞれの細胞抽出物からの総タンパク質４０μｇを還元性ＳＤＳ−８％−ＰＡＧＥで電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ベッドフォード，マサチューセッツ）にブロットした。膜を５％ミルクＰＢＳ／０．０７５％Ｔｗｅｅｎ２０で室温にて２時間ブロックした後、一次抗体を用いて４℃にて一晩プローブした。分子量ラダー（Ｍａｇｉｋ  Ｍａｒｋｅｒ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５％ミルクＰＢＳ／０．０７５％Ｔｗｅｅｎ２０中でインキュベーションし、膜ストリップを５％ミルクＰＢＳ／０．０７５％Ｔｗｅｅｎ２０（ネガティブコントロール）１ｍｌ中、または５％ミルクＰＢＳ／０．０７５％Ｔｗｅｅｎ２０中ウサギ抗−Ｍｙｏ−Ｘポリクローナル抗体（１：２００）１ｍｌ、５％ミルクＰＢＳ／０．０７５％Ｔｗｅｅｎ２０中ウサギ抗−ファスシン（１：５００）ポリクローナル抗体１ｍｌ、および５％ミルクＰＢＳ／０．０７５％Ｔｗｅｅｎ２０中ヤギ抗−アクチン（１：１０００）ポリクローナル抗体１ｍｌのいずれかを用いて、ロッキングプラットフォーム上で４℃で一晩インキュベーションした。
【００７３】
徹底的に洗浄した後、ブロットを西洋ワサビペルオキシダーゼ接合二次抗体と２時間インキュベーションした。次いで、分子量ラダーを５％ミルクＰＢＳ／０．０７５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈したＨＲＰ−ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｚｙｍｅｄ，米国）（１：５００）１ｍｌとインキュベーションし、膜ストリップを抗−ウサギＩｇＧ１ｍｌ、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した全抗体（ＨＲＰ）二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，英国）（１：７００、５％ミルクＰＢＳ／０．０７５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈）中にて、ロッキングプラットフォーム上で室温で２時間インキュベーションした。洗浄処理を繰り返し、膜ストリップをＬｕｍｉＧＬＯ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅ（ＢｉｏＬａｂ  Ｌｔｄ，英国）中で室温にて２分間インキュベーションした。化学発光シグナルは、ブロットストリップをＫｏｄａｋ  ＸＲＡ  Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ，英国）に様々な露出時間で暴露した後、バンドが現れるまで現像溶液（Ｋｏｄａｋ，英国）中で現像し、水道水ですすぎ、フィルムが青色に変化するまで定着液（Ｋｏｄａｋ，英国）中で定着した後、水道水ですすぎ、乾燥させることによって検出した。次いで、膜を標識し、スキャンし、ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｔｏｔａｌ  ｌａｂ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１１）を用いてデンシトメトリー分析をした。
【００７４】
免疫蛍光染色：ＥＭ：ＫＣ共培養の検討のため、完全に適合したメラニン細胞（ｐ４）およびケラチン形成細胞（ｐ２）を８ウェルのＬａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）チャンバースライドに１ｘ１０４細胞／ウェルの細胞密度および１メラニン細胞対１０ケラチン形成細胞の比率で播種した。共培養をフルＫ−ＳＦＭおよびＭＥＭ（共培養培地）の混合物中に一晩（１６時間）保持して、細胞接着させた後、培地をさらに２４時間補充した。次いで、細胞を−２０℃の氷冷メタノール中で１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄した後、１０％ロバ血清でブロックして、糸状仮足におけるタンパク質発現を検出した。
【００７５】
二重標識実験のため、第一の一次抗体であるＭｙｏ−Ｘ（１：１００）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）を４℃で一晩加えた後、ＦＩＴＣ接合二次抗体（１：１００）を用いて室温にて１時間インキュベーションした。第二の一次抗体であるサイトケラチン（１：１００）（Ａｂｅａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，英国）またはβ−アクチン（１：１００）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，米国）またはファシン（１：１００）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，米国）またはＮＫｉ／ｂｅｔｅｂ（１：３０）（Ｍｏｎｏｓａｎ）を室温で１時間加えた後、ＴＲＩＴＣ接合二次抗体（１：１００）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，米国）を加えた。ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，カリフォルニア）を用いて、核を染色した。画像を冷却したＨａｍａｍａｔｓｕデジタルカメラで１００ｘの対物レンズを用いて記録し、Ｐａｉｎｔ  Ｓｈｏｐ  Ｐｒｏ（Ｊａｓｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒ．７．カリフォルニア，米国）を用いて後処理した。ネガティブコントロールでは、一次抗体を省き、二次抗体宿主由来の非免疫血清で置換し、二次抗体を包含した。
【００７６】
メラノソーム移動の定量分析：４名の正常な個人（すなわち、Ｆ３９、Ｆ６７、Ｆ５４、Ｆ５２）由来の完全に適合した表皮メラニン細胞（ｐ４）および表皮ケラチン形成細胞（ｐ２）を、８ウェルＬａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）チャンバースライドで２ｘ１０４細胞／ウェルの総細胞密度および１メラニン細胞対１０ケラチン形成細胞の比率に保持した。共培養をさらに２４時間保持した後、滅菌ＰＢＳで３回洗浄した後、飢餓培地のみ、またはＬ−１８（０．００１％）、Ｌ−１９（１％）、Ｌ−２０（０．５％）、Ｌ−２１（１０μｇ／ｍｌ）、Ｌ−２２（１％）およびＬ−２３（０．０５μｇ／ｍｌ）を用いて、１２および７２時間インキュベーションした。コントロールはＩＢＭＸ（１００μＭ）およびナイアシンアミド（１０μＭ）を包含した。次いで、細胞をｇｐ１００による免疫蛍光染色のために処理し、ケラチン形成細胞へのメラノソーム移動を評価した。
【００７７】
メラノソーム移動は、３回の独立した実験において１００ｘの倍率（油浸）で、１つのウェルごとに５つのランダムな顕微鏡視野における受容体ケラチン形成細胞内の蛍光ｇｐ１００ポジティブスポットを数えることによって評価した。メラニン細胞となお関連している可能性があるメラニン顆粒の計数を回避するため、メラニン細胞と直接接触していないケラチン形成細胞内のｇｐ１００ポジティブスポットのみを数えた。
【００７８】
ｓｉＲＮＡを用いるＭｙｏ−Ｘのノックダウン：ヒトＭｙｏ−Ｘをターゲッティングする合成ｓｉＲＮＡ（５’−ＣＡＧＣＧＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＡＡＴＣＡＡ−３’）（配列番号１）および哺乳類遺伝子と既知の相同性を有さないｓｉＲＮＡからなるノンサイレンシングコントロール（５’−ＡＡＴＴＣＴＣＣＧＡＡＣＧＴＧＴＣＡＣＧＴ−３’）（配列番号２）を、Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，カリフォルニアから入手した。ｓｉＲＮＡ処理の前日に、５ｘ１０５個の表皮メラニン細胞／ウェルを、６ウェルプレート上で５０〜６０％のコンフルエントで培養し、３７℃で１２時間インキュベーションした。次いで、細胞をＨｉＰｅｒＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，カリフォルニア）を製造業者の説明書に従って用いることによって、２５ｎＭｓｉＲＮＡの最終濃度で１２時間処理した。蛍光顕微鏡法を用いて、約１００％の細胞がｓｉＲＮＡを吸収したことを確認した（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識で標識したノンサイレンシングコントロールを使用）。１２時間後に、それぞれのウェルの細胞を８ウェルのＬａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）チャンバースライドに移した。共培養の検討のため、ｓｉＲＮＡ処理したメラニン細胞を正常なケラチン形成細胞（２代）と共に８ウェルのＬａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）チャンバースライドに２ｘ１０４細胞／ウェルの細胞密度および１ｓｉＲＮＡで処理したメラニン細胞対１０正常なケラチン形成細胞の比率で播種した。２４時間後に、共培養を、ｇｐ１００およびサイトケラチンまたはＭｙｏ−Ｘを用いる二重免疫蛍光染色処理し、メラノソーム移動に対する遺伝子ノックダウンの影響を検討し、平行試料を免疫蛍光染色およびウェスタンブロット解析によって分析し、遺伝子ノックダウンを確認した。別の実験のため、これらの共培養を、Ｌ−１８〜２３を用いてまたは無しで２４時間処理した。
【００７９】
結果／考察：
植物抽出物Ｌ−１８〜２３の用量選択：
細胞を、植物抽出物および色素沈着モジュレーター（ＩＢＭＸおよびナイアシンアミド）をある範囲の濃度で用いてインキュベーションした。幾つかの用量では、細胞死または細胞形態の異常変化（例えば、空胞形成）を生じた。本発明者は、最適なＬ−１８〜２３活性用量は、変更された細胞増殖または形態と関連しないことを示した。従って、これらの用量を用いて、残りの検討を行った。
【００８０】
正常なヒト表皮のケラチン形成細胞培養物（女性−６７；ｐ２）を、Ｌ−１８（０．００１％）、Ｌ−１９（１％）、Ｌ−２０（０．５％）、Ｌ−２１（１０μｇ／ｍｌ）、Ｌ−２２（１％）およびＬＶＭＨ−２３（０．０５μｇ／ｍｌ）で７２時間処理した。コントロール：メラニン細胞モジュレーター：ＩＢＭＸ（１００μＭ）およびナイアシンアミド（１０μＭ）。
【００８１】
正常なヒト表皮メラニン細胞培養物（女性−６７；ｐ４）を、Ｌ−１８（０．００１％）、Ｌ−１９（１％）、Ｌ−２０（０．５％）、Ｌ−２１（１０μｇ／ｍｌ）、Ｌ−２２（１％）およびＬ−２３（０．０５μｇ／ｍｌ）で７２時間処理した。コントロール：メラニン細胞モジュレーター：ＩＢＭＸ（１００μＭ）およびナイアシンアミド（１０μＭ）。
【００８２】
実験デザインのための用量選択
【表１】
0005420669.tif 000002
【００８３】
メラニン産生に対する植物抽出物Ｌ−１８〜２３の効果：
正常なヒト表皮メラニン細胞（Ｆ５２；ｐ５）およびヒト黒色腫（ＦＭ５５）を、Ｌ−１８（０．００１％）、Ｌ−１９（１％）、Ｌ−２０（０．５％）、Ｌ−２１（１０μｇ／ｍｌ）、ＬＶＭＨ−２２（１％）およびＬ−２３（０．０５μｇ／ｍｌ）で７２時間処理した。さらに、ＩＢＭＸおよびＮＨ４Ｃ１（ポジティブメラニン細胞モジュレーター）およびナイアシンアミド（ネガティブモジュレーター）を、コントロールとして用いた。目視変化は、正常なメラニン細胞では、それらの基底メラニンレベルが既に高いため特に明確ではなかった（図１）。対照的に、黒色腫細胞では、基底メラニンレベルが低いため、目視変化は明らかであった（図２）。Ｌ−１９、Ｌ−２０、Ｌ−２１およびＬ−２３では、正常なメラニン細胞およびＦＭ５５黒色腫細胞の両方における基底レベルと比較してメラニン含量が有意に減少した。しかしながら、Ｌ−２２は、基底レベルと比較してメラニン含量の増加と関連していた。Ｌ−１８は、これらの細胞では有意な変化を誘発しなかった。結果は、表１および図１および２にまとめてある。
【００８４】
図１：正常な色素沈着したヒトメラニン細胞におけるメラニン産生に対する植物抽出物Ｌ−１８〜２３活性の効果
正常なヒト表皮メラニン細胞（女性−５２；ｐ５）を、Ｌ−１８（０．００１％）、Ｌ−１９（１％）、Ｌ−２０（０．５％）、Ｌ−２１（１０μｇ／ｍｌ）、Ｌ−２２（１％）およびＬ−２３（０．０５μｇ／ｍｌ）で７２時間処理した。コントロール：メラニン細胞モジュレーター：ＩＢＭＸ（１００μＭ）、ＮＨ４Ｃ１（１００μＭ）およびナイアシンアミド（１０μＭ）。
（Ａ）メラニン含量は、水酸化ナトリウムで可溶化した後に分光光度法（４７５ｎｍ）によって測定した。
（Ｂ）目視変化は、これらの細胞では、これらの基底メラニンレベルが既に高いため特に明確ではなかった。結果は、未刺激コントロールレベルと比較したメラニン含量の変化（ｐｇ／ｃｅｌｌ）として表した。平均値は、３回の独立した実験の±ＳＥＭ（標準誤差）である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＮＳ：有意性なし。
【００８５】
図２：中程度に色素沈着したＦＭ５５黒色腫におけるメラニン産生に対する植物抽出物Ｌ−１８〜２３の効果
ＦＭ５５細胞を、Ｌ−１８（０．００１％）、Ｌ−１９（１％）、Ｌ−２０（０．５％）、ＬＶＭＨ−２１（１０μｇ／ｍｌ）、Ｌ−２２（１％）およびＬ−２３（０．０５μｇ／ｍｌ）で７２時間処理した。コントロール：メラニン細胞モジュレーター：ＩＢＭＸ（１００μＭ）、ＮＨ４Ｃ１（１００μＭ）、およびナイアシンアミド（１０μＭ）。
（Ａ）メラニン含量は、水酸化ナトリウムで可溶化した後に分光光度法（４７５ｎｍ）によって測定した。基底メラニンレベルが低い細胞は、ＩＢＭＸおよびＮＨ４Ｃ１で刺激した後には明らかなメラニン産生の増加を示した。
（Ｂ）結果は、未刺激コントロールレベルと比較したメラニン含量の変化（ｐｇ／細胞）として表した。平均値は、３回の独立した実験の±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＮＳ：有意性なし。
【００８６】
【表２】
0005420669.tif 000003
【００８７】
チロシナーゼ活性に対する植物抽出物Ｌ−１８〜２３の効果： 
正常なヒト表皮メラニン細胞（Ｆ５２；ｐ５）およびヒト黒色腫（ＦＭ５５）を、Ｌ−１８（０．００１％）、Ｌ−１９（１％）、Ｌ−２０（０．５％）、Ｌ−２１（１０μｇ／ｍｌ）、Ｌ−２２（１％）およびＬ−２３（０．０５μｇ／ｍｌ）で７２時間処理した。さらに、ＩＢＭＸおよびＮＨ４Ｃ１（ポジティブメラニン細胞モジュレーター）およびナイアシンアミド（ネガティブモジュレーター）を、コントロールとして用いた。ＩＢＭＸおよびＮＨ４Ｃ１は、ＥＭおよびＦＭ５５細胞の両方においてチロシナーゼのドーパオキシダーゼ活性の劇的な増加と関連していた（図３および４）。Ｌ−１８〜２３の中、Ｌ−１９、Ｌ−２０、Ｌ−２１およびＬ−２３では、基底レベルと比較して正常なメラニン細胞およびＦＭ５５黒色腫細胞の両方においてチロシナーゼ活性が有意に減少した（図３および４）。対照的に、Ｌ−２２は、基底レベルと比較してチロシナーゼ活性の有意な増加と関連していたが、Ｌ−１８はいずれも有意に変化しなかった。これらの結果は、表２にまとめてある。
【００８８】
図３：色素沈着した正常なヒトメラニン細胞におけるチロシナーゼ活性に対する植物抽出物Ｌ−１８〜２３の効果
正常なヒト表皮メラニン細胞（女性−５２；ｐ５）を、Ｌ−１８（０．００１％）、Ｌ−１９（１％）、Ｌ−２０（０．５％）、Ｌ−２１（１０μｇ／ｍｌ）、ＬＶＭＨ−２２（１％）およびＬ−２３（０．０５μｇ／ｍｌ）で７２時間処理した。コントロール：メラニン細胞モジュレーター：ＩＢＭＸ（１００μＭ）、ＮＨ４Ｃｌ（１００μＭ）およびナイアシンアミド（１０μＭ）。
（Ａ）タンパク質抽出物をエレクトロブロッティングし、膜をＬ−ＤＯＰＡで染色してチロシナーゼ活性を評価した。
（Ｂ）バンド強度および値のデンシトメトリースキャンは、未刺激コントロールレベルと比較した増加倍数（fold increase）として表した。平均値は、３回の独立した実験の±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＮＳ：有意性なし。
【００８９】
図４：中程度に色素沈着したＦＭ５５黒色腫におけるチロシナーゼ活性に対する植物抽出物Ｌ−１８〜２３の効果
ＦＭ５５細胞をＬ−１８（０．００１％）、Ｌ−１９（１％）、Ｌ−２０（０．５％）、Ｌ−２１（１０μｇ／ｍｌ）、Ｌ−２２（１％）およびＬ−２３（０．０５μｇ／ｍｌ）で７２時間処理した。コントロール：メラニン細胞モジュレーター：ＩＢＭＸ（１００μＭ）、ＮＨ４Ｃ１（１００μＭ）およびナイアシンアミド（１０μＭ）。
（Ａ）タンパク質抽出物をエレクトロブロッティングし、膜をＬ−ＤＯＰＡで染色してチロシナーゼ活性を評価した。
（Ｂ）バンド強度および値のデンシトメトリースキャンは、未刺激コントロールレベルと比較した増加倍数として表した。平均値は、３回の独立した実験の±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＮＳ：有意性なし。
【００９０】
【表３】
0005420669.tif 000004
【００９１】
しかしながら、単一培養としてのＥＭの結果は、ケラチン形成細胞由来のパラクリンの影響を完全には反映しないことがあり、従ってＬ−１８〜２３に関連した効果を完全に明らかにすることはできないことがある。従って、チロシナーゼ活性についての上記評価を、２種類の植物抽出物、すなわち変化を全く示さないもの（Ｌ−１８）および有意な減少を示すもの（Ｌ−２３）で、完全に適合したＥＭ：ＫＣ共培養において繰り返した。共培養条件下で、今般、Ｌ−１８はチロシナーゼのドーパオキシダーゼ活性において有意な減少（ＥＭ細胞のみで増殖したときの−３．４６％から適合したＫＣと共に共培養したときの−５７．０２％まで）を示したことは注目すべきことである。Ｌ−２３については、チロシナーゼのドーパオキシダーゼ活性は、共培養のときには（すなわち、単一培養での−４１．１６％から共培養での−７６．１７％まで）さらなる減少が見られた（図５および表３）。同様なポジティブおよびネガティブな傾向は、それぞれＩＢＭＸおよびナイアシンアミドでも見られた。
【００９２】
図５：正常なヒトメラニン細胞およびケラチン形成細胞の共培養におけるチロシナーゼ活性に対する植物抽出物Ｌ−１８およびＬ−２３、ＩＢＭＸおよびナイアシンアミドの効果（注：タンパク質ローディングは、メラニン細胞タンパク質のみについて平均化した）
正常なヒト表皮メラニン細胞培養物（女性−５２；ｐ５）および適合した共培養物Ｆ５２ＭＣ−ＫＣを、Ｌ−１８（０．００１％）、Ｌ−２３（０．０５μｇ／ｍｌ）で７２時間処理した。コントロール：メラニン細胞モジュレーター：ＩＢＭＸ（１００μＭ）、およびナイアシンアミド（１０μＭ）。ネガティブコントロールレーン：ケラチン形成細胞のみ。
（Ａ）タンパク質抽出物をエレクトロブロッティングし、膜をＬ−ＤＯＰＡで染色してチロシナーゼ活性を評価した。
（Ｂ）バンド強度および値のデンシトメトリースキャンは、未刺激コントロールレベルと比較した増加倍数として表した。平均値は、３回の独立した実験の±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００９３】
【表４】
0005420669.tif 000005
【００９４】
植物抽出物Ｌ−１８およびＬ−２３を用いるｇｐ１００ポジティブメラノソーム移動の定量分析：
ｇｐ１００免疫染色は、ケラチン形成細胞へのメラニン移動の包括的評価およびメラニン細胞表現型モジュレーターの評価のための強力な追跡方法を提供する(Singh et al, 2008)。全Ｌ−１８〜２３、ホスホジエステラーゼ阻害剤ＩＢＭＸ（すなわち、ｃＡＭＰインデューサー）およびナイアシンアミドで処理した後のＥＭ：ＫＣ共培養の二重免疫標識（ＮＫｉ／ｂｅｔｅｂおよび抗細胞骨格抗体）では、すべて、ケラチン形成細胞における蛍光緑のｇｐ１００ポジティブメラニン顆粒の数が明らかに変化した（図６）。
【００９５】
この分析法では、基底（すなわち、未刺激）条件下でのメラニン細胞から適合したケラチン形成細胞へのメラノソーム移動は、ケラチン形成細胞当たり平均してｇｐ１００ポジティブスポット２７．３と測定された。しかしながら、これは、ＩＢＭＸでの共培養の２４時間刺激後には、ほぼ４倍のケラチン形成細胞当たりｇｐ１００ポジティブスポット９９．５まで増加した。逆に、ナイアシンアミドはメラノソーム移動を２８％減少した（ケラチン形成細胞当たりｇｐ１００ポジティブスポット１９．６；ｐ＜０．０１；皮膚の色素沈着を薄くするものとしてのその臨床的使用と相関する結果(Hakozaki et al, 2002; Greatens et al., 2005))。
【００９６】
Ｌ−１８、Ｌ−１９、Ｌ−２０、Ｌ−２１およびＬ−２３は、すべて、未刺激コントロールと比較してメラノソーム移動の減少によって明らかなようにメラノソーム移動を有意に減少させた。対照的に、未刺激基底レベルと比較して共培養をＬ−２３で刺激したときには、ケラチン形成細胞へのメラノソーム移動の増加が観察された。
【００９７】
図６：植物抽出物Ｌ−１８〜２３とインキュベーションした後のメラノソーム移動の定量分析（表４）
メラニン細胞−ケラチン形成細胞の適合した共培養物（女性−３９）を、既知のメラニン細胞モジュレーター（ＩＢＭＸ（１００μＭ）およびナイアシンアミド（１０μＭ））と平行してＬ−１８（０．００１％）、Ｌ−１９（１％）、Ｌ−２０（０．５％）、Ｌ−２１（１０μｇ／ｍｌ）、Ｌ−２２（１％）およびＬ−２３（０．０５μｇ／ｍｌ）で２４時間処理した。抗−ｇｐ１００抗体（緑色）および抗−アクチン抗体（赤色）による二重免疫標識では、ケラチン形成細胞へ移動した蛍光スポットの数に明らかな変化が見られた。異なる処理群のそれぞれについて、５つの無作為に選択した顕微鏡視野（視野当たり全部で２０個の細胞）から採取した移動したメラノソームの定量。値は、未刺激コントロールレベルと比較してケラチン形成細胞当たりのｇｐ１００ポジティブスポットの数の増加率として表した。平均値は、４回の独立した実験の±ＳＥＭである。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００９８】
【表５】
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【００９９】
正常なヒトメラニン細胞におけるＭｙｏ−Ｘ発現に対する植物抽出物Ｌ−１８〜２３の効果
Ｍｙｏ−Ｘ（データは示さず）およびｇｐ１００に対する抗体による二重免疫標識では、ＥＭ細胞周辺および樹状突起における顕著なＭｙｏ−Ｘ発現が明らかになった。Ｍｙｏ−Ｘは、ＥＭ糸状仮足でも検出された。本発明者らは、ＩＢＭＸがＭｙｏ−Ｘの発現および（ＥＭ樹状突起を越える黄色スポットの全数によって示唆されるように）糸状仮足の全数を増加させたことを見出した。ＩＢＭＸは、未処理細胞と比較してＥＭ糸状仮足におけるＭｙｏ−Ｘ局在化も増加した。対照的に、Ｍｙｏ−Ｘ発現はＥＭではＬ−１８、Ｌ−１９、Ｌ−２０、Ｌ−２１およびＬ−２３によって有意に下方制御されたが、Ｌ−２２単独によって上方制御された。ＥＭ糸状仮足中のＭｙｏ−Ｘの局在化は、これらの植物抽出物によっても有意に減少した。
【０１００】
ＩＢＭＸ（１００μＭ）によって１２時間刺激されたＥＭ（Ｆ３９）のウェスタンブロット法では、未処理コントロール（図７Ａ、Ｂ）と比較してＭｙｏ−１０発現において３倍増加を示した。対照的に、メラノソーム移動阻害剤ナイアシンアミド（１０μＭ）は、Ｍｙｏ−Ｘ発現を６０％減少させた。すべてのＬ−１８〜２３は、Ｌ−２２を除き、ＥＭ  Ｍｙｏ−Ｘ発現を有意に下方制御した（図７Ａ、Ｂ）。
【０１０１】
図７：正常なヒトメラニン細胞におけるウェスタンブロット法によるＭｙｏ−Ｘタンパク質発現に対する植物抽出物Ｌ−１８〜２３の効果
正常なヒト表皮メラニン細胞培養物（Ｆ３９−ＥＭ）を、Ｌ−１８（０．００１％）、Ｌ−１９（１％）、Ｌ−２０（０．５％）、Ｌ−２１（１０μｇ／ｍｌ）、Ｌ−２２（１％）およびＬ−２３（０．０５μｇ／ｍｌ）で１２時間処理した。コントロール：ＩＢＭＸ（１００μＭ）およびナイアシンアミド（１０μＭ）。
（Ａ）細胞抽出物を、抗−Ｍｙｏ−Ｘおよびローディングコントロールとしての抗−β−アクチンを用いてウェスタンブロット法によって分析した。
（Ｂ）未刺激コントロールと比較した変化率として表されるＭｙｏ−Ｘおよびアクチンバンド強度のデンシトメトリー分析。平均値は、３回の独立した実験の±ＳＥＭである。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０１０２】
表皮メラニン細胞におけるＭｙｏ−Ｘ発現のノックダウンは、表皮のケラチン形成細胞へのメラノソーム移動を阻害する
【０１０３】
メラノソーム移動におけるＭｙｏ−Ｘの役割を、ヒトＭｙｏ−ＸおよびノンサイレンシングコントロールｓｉＲＮＡに対して合成ｓｉＲＮＡを用いて１２時間検討した。メラニン細胞におけるＭｙｏ−Ｘサイレンシングは、ウェスタンブロット法によって分析した。この阻害は、免疫蛍光によっても確かめ、Ｍｙｏ−Ｘの発現はノンサイレンシングコントロールｓｉＲＮＡと比較してほぼ完全に阻害されることも示した。Ｍｙｏ−Ｘサイレンシングしたメラニン細胞の抗−ｇｐ１００抗体による二重免疫標識により、メラニン細胞突起の周囲にｇｐ１００−ポジティブメラノソームを欠いていることにより明らかにされたように糸状仮足の非存在を明らかにした。ノンサイレンシングコントロールｓｉＲＮＡで処理したメラニン細胞は、糸状仮足領域に顕著なＭｙｏ−Ｘおよびｇｐ１００を示した。
【０１０４】
本発明者らは、内因性Ｍｙｏ−Ｘ発現がメラニン細胞における糸状仮足を介するメラノソーム移動の要件であるかどうかを決定しようとした。メラニン移動におけるＭｙｏ−Ｘの関与を試験するため、Ｍｙｏ−Ｘサイレンシングしたメラニン細胞およびノンサイレンシングメラニン細胞を用いて、２４時間ＭＣ−ＫＣ共培養を確立した。この共培養物の抗−ｇｐ１００抗体および抗−Ｍｙｏ−Ｘによる二重免疫標識では、Ｍｙｏ−Ｘサイレンシングしたメラニン細胞で培養したケラチン形成細胞へ移動した蛍光スポットの数の阻害が明らかに示された。抗−ｇｐ１００抗体および抗−サイトケラチンでの二重免疫標識では、ケラチン形成細胞へ移動した蛍光スポット（メラニン顆粒を表す）の数に明らかな変化が見られた。
【０１０５】
この分析法を用いて、メラニン細胞からケラチン形成細胞へのノンサイレンシングコントロールｓｉＲＮＡ条件でのメラノソーム移動の割合を測定した（図８）。このメラノソーム移動のレベルは、正常なケラチン形成細胞で２４時間培養したＭｙｏ−Ｘサイレンシングしたメラニン細胞では、８０％減少した（図８）。これは、メラニン細胞からケラチン形成細胞へのメラノソームの移動の成功におけるＭｙｏ−Ｘの生理学的役割を初めて立証したものである。
【実施例】
【０１０６】
下記の例において、百分率は、組成物の総重量に対する重量により示される。植物抽出物の量は、乾燥重量として表す。
【０１０７】
例１：
顔の肌色を明るくするための化粧用粉末
Ｃｙａｔｈｅａ  ｃｕｍｉｎｇｉｉ葉抽出物                    ０．５％
マイクロセルロース                                          ２０．０％
ラウリルスルホ酢酸ナトリウム                                １５．０％
芳香剤、染料、防腐剤                                        適量
タルク                                                      適量  １００％
【０１０８】
この粉末は、皮膚を浄化し、また数日間規則的に使用することによって肌色を明るくすることもできる。これは、顔の皮膚に１日１回または２回つけることができる。
【０１０９】
例２：
エマルション−ゲル形態の色素脱失化粧用デイクリーム。
Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ種子抽出物                      ０．１％
グリセロール                                                ５．０％
カプリル酸／カプリン酸／コハク酸トリグリセリド              ５．０％
メトキシ桂皮酸オクチル                                      １．０％
コポリオールジメチコン                                      ０．５％
アクリル酸／Ｃ１０−３０アルキルアクリレートクロスポリマー  ０．５％
中和剤                                                      必要量
防腐剤、着臭剤、着色剤                                      必要量
水                                                          適量  １００％
【０１１０】
昼光または直接日光により多少強い照射を受けている幾人かの個人は、明るい皮膚を保ち、色素沈着スポットの出現を避けたいものである。
【０１１１】
上記で定義したエマルション−ゲルの使用は、この目的を達成する手段を提供する。この組成物は、通常は朝に顔につける。これは、顔の通常のまたは不規則な色素沈着に対する予防および治療作用にも有効である。
【０１１２】
例３：
色素沈着スポットを防止するＳＰＦ３０保護流体
Ｔｈａｓｓｉｏｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ抽出物              ０．０１％
揮発性ペンタシクロメチコン                                  ４９．０％
二酸化チタン                                                １５．０％
メトキシ桂皮酸オクチル                                      ７．５％
グリセリン                                                  ５．０％
フェニルトリメチコン                                        ５．０％
コポリオールジメチコン                                      ３．０％
ポリメチルメタクリレート                                    ２．５％
ブチルメトキシジベンゾイルメタン                            １．０％
中和剤、着臭剤、防腐剤、酸化防止剤                          必要量
水                                                          適量  １００％
【０１１３】
この保護流体は、強い日光照射に曝される前にこの現象を受けるヒトに色素沈着スポットの出現を防止するのに用いられる。日光フィルターに高濃度で存在することにより、メラニン含量の低下による自然な保護の減少が相殺されることに注目すべきである。
【０１１４】
例４：
病的または外傷性起源の皮膚色素沈着過剰の治療用の皮膚科用クリーム
Ｃｙａｔｈｅａ  ｃｕｍｉｎｇｈｉｉ葉抽出物                  ０．３％
ステアリン酸グリセリル＋ＰＥＧ−１００ステアレート          ５．０％
水素化ポリイソブテン                                        ４．０％
アスコルビルリン酸マグネシウム                              ３．０％
グリセリルトリカプリレート／カプレート                      ３．０％
スクアラン                                                  ３．０％
グリセロール                                                ２．０％
蜜蝋                                                        １．５％
セトアリールオクタノエート                                  １．５％
セチルアルコール                                            １．０％
ステアリルアルコール                                        １．０％
ジメチコン                                                  １．０％
キサンタンゴム                                              ０．３％
エチレンジアミン四酢酸                                      ０．２％
クエン酸                                                    ０．１％
クエン酸ナトリウム                                          ０．１％
中和剤、芳香剤、防腐剤                                      適量
水                                                          適量  １００％
【０１１５】
このクリームの使用により、病的または外傷性起源の皮膚色素沈着過剰を減少させることができる。このクリームは、白斑の場合の色素脱失した部分の周辺における色のコントラストを減少させることもできる。
【０１１６】
例５：
肌の色を明るくするための化粧用顔ローション
Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ              ０．０１％
エチルアルコール                                              ３０．０％
ＰＰＧ−３ミリスチルエーテル                                  ５．０％
グリセロール                                                  ２．０％
カルボマー                                                    ０．２％
ポリソルベート２０                                            ０．２％  
中和剤、芳香剤、防腐剤                                        適量
水                                                            適量  １００％
【０１１７】
肌の色を明るくするこのローションは、皮膚から化粧を落として、皮膚を浄化した後に用いられる。
【０１１８】
例６：
化粧用の顔の色を明るくする美容液
Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ（ライ麦）種子抽出物              ０．２  ％
グリセロール                                                  ２％
ＥＤＴＡ四ナトリウム                                        
クエン酸                                                      適量  所望ｐＨ
クエン酸三ナトリウム
キサンタンゴム                                                ０．３  ％
ポリアクリルアミド、Ｃ１３．１４イソパラフィン、ラウレス−７  ０．５  ％
ジメチコンコポリオール                                        ０．３  ％
芳香剤、染料、防腐剤                                          適量
水                                                            適量  １００％
【０１１９】
この濃度が極めて高い美容液組成物の一滴は、一般にフェイスクリームをつける前に顔に塗布する。この美容液は、通常は１〜２週間の治療として、肌の色を明るくしまたは保持するために用いられる。
【０１２０】
例７：
体毛を薄くするための化粧用ローション
Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ抽出物          ０．０１％
パンテニルエチルエーテル                                        ０．５％
ＤＬ−α−トコフェリルアセテート                                ０．２％
ポリソルベート６０                                              １％
芳香剤                                                          ０．２％
グリセロール                                                    ０．５％  
染料                                                            適量
水                                                              適量  １００％
アルコール                                                      ５０％
【０１２１】
このローションは、明るくしようとする毛髪を有する部分、特に腕に、毛髪がゆるやかに明るくなるのに十分な時間、つける。
【０１２２】
例８：
化粧用手用抗スポットゲルクリーム
カプリル酸／カプリン酸ジグリセリルスクシネート                  ６％
オクチルオクタノエート                                          ２．５％
メトキシ桂皮酸オクチル                                          ６％
Ｃｙａｔｈｅａ  ｃｕｍｉｎｇｉｉ葉抽出物                        ０．３％
フェニルトリメチコン                                            ２．５％
ベンゾフェノン−３                                              ０．５％
ヒアルロン酸ナトリウム                                          ０．１％
キサンタンゴム                                                  ０．２％
アクリル酸／Ｃ１０−３０アルキルアクリレートコポリマー          ０．５％
グリセロール                                                    ２％
ＰＥＧ１５０                                                    ３％
中和剤、染料、芳香剤、防腐剤                                    適量
精製水                                                          適量  １００％
【０１２３】
このクリームは、スポットの着色を減少させるために、手のスポット（日光性および／または老人性ほくろ）に直接つけなければならない。
【０１２４】
例９：
病的色素沈着過剰の治療のための皮膚科用溶液
Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ種子抽出物                            ０．２％
揮発性ペンタシクロメチコン                                        ４９．０％
二酸化チタン                                                      １５．０％
メトキシ桂皮酸オクチル                                            ７．５％
グリセリン                                                        ５．０％
フェニルトリメチコン                                              ５．０％
コポリオールジメチコン                                            ３．０％
ポリメチルメタクリレート                                          ２．５％
ブチルメトキシジベンゾイルメタン                                  １．０％
中和剤、着臭剤、防腐剤、酸化防止剤                                必要量
水                                                                適量１００％
【０１２５】
この美容液を、局所的色素沈着過剰を患うヒトの治療のために毎日皮膚につける。
【０１２６】
例１０：
毛髪の色素脱失用ヘアートニックローション
【０１２７】
【表６】
0005420669.tif 000007
【０１２８】
例１１：
日焼けクリーム
水素化大豆粉（大豆種皮抽出物）                              ０．３％
イソセチルステアレート                                      ８．０％
水素化落花生油                                              １０．０％
ラノリン油                                                  ３．５％
セチルアルコール                                            ５．０％
ステアリルアルコール                                        ２．５％
軽流動パラフィン                                            １０．０％
オキシエチレン化セチルアルコールの
中和したリン酸モノエステル                                  ３．０％
メトキシ桂皮酸オクチル                                      ５．０％
【０１２９】
この相を、
パントテノール                                            ０．１％
防腐剤                                                    ０．２％
を含む適量の水相と乳化して、１００％とする。
【０１３０】
例１２：
自然な日光保護を強化するためのローション
アルコール                                                ４２．５０％
プロピレングリコール                                      ３．００％
メントール                                                ０．０５％
ヒドロキシプロピルメチルセルロース                        １．５％
水素化大豆粉                                              ０．２％
着香した水性賦形剤                                        適量  １００．０％
【０１３１】
このローションを、日光に長時間暴露される前に３〜８日間毎日、好ましくは、１日２回局所的に塗布する。
【０１３２】
毎日の塗布は、暴露の期間中継続することができる。
【０１３３】
例１３：
白髪を染めるためのヘアートニックローション
水素化大豆粉（大豆種皮抽出物）                            ０．１０％
３−メチルキサンチン                                      ０．０３％
アルコール                                                ３０．０％
香料可溶化剤を含む着香した水性賦形剤                      適量  １００．０％
【０１３４】
このローションは、白髪の出現を速やかに減少させる強壮治療を目的として毛髪および頭皮に１日２回塗布することができる。
【０１３５】
例１４：
皮膚の色素沈着の促進を目的とする皮膚科用ゲル
水素化大豆粉                                              ０．１０％
エタノール                                                ０．０３％
蒸留水                                                    ３０．０％
１．２５％  Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９４０（登録商標）ゲルを含むゲル化賦形剤
適量  １００．０％
【０１３６】
文献
Bohil AB, Robertson BW, Cheney RE (2006). 「ミオシン−Ｘは糸状仮足形成において機能する分子モーターである(Myosin-X is a molecular motor that functions in filopodia formation.)」PNAS 103: 12411-12416.
Kawabata M, Imamura T,Miyazono K (1998)「骨形態形成タンパク質によるシグナル導入(Signal transduction by bone morphogenetic proteins)」. Cytokine Growth Factor Rev. 9, 49-61.
Scott G、Leopardi S, Printup S, Madden BC (2002).「糸状仮足はケラチン形成細胞へのメラノソーム移動の導管である(Filopodia are conduits for melanosome transfer to keratinocytes)」. J Cell Sci: 115: 1441-1451.
Singh SK, Nizard C, Kurfurst R, Bonte F, Schnebert S, Tobin DJ (2008).「ヒトメラニン細胞−ケラチン形成細胞共培養におけるメラノソーム移動の分析のための新規なツールとしてのシルバーローカス生成物(Silv/gpl00/Pmel17)(The silver ocus product (Silv/gpl00/Pmel17) as a new tool for the analysis of melanosome transfer in human melanocyte-keratinocyte co-culture)」. Exp Dermatol. 17(5):418-26.
L.R. SNYDER:「通常の液体の溶媒特性の分類(Classification of the solvent properties of common liquids)」; Journal of Chromatography, 92 (1974), 223-230.
Sousa, A. D. & Cheney, R. E. (2005). 「Ｍｙｏｓｉｎ−Ｘ：細胞の指先における分子モーター(Myosin-X: A Molecular Motor at the Cell's Fingertips)」 Trends Cell Biol. 15, 533-539. 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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