(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉ
【化１】
0005647109.tif 000012
で表されるスフィンゴ脂質の生体触媒的調製方法であって、
一般式ＩＩ
【化２】
0005647109.tif 000013
で表されるリゾスフィンゴ脂質と、一般式ＩＩＩ
【化３】
0005647109.tif 000014
で表されるカルボキシルエステル
［式中、Ｒ１は、アルキル基、ヒドロキシ基、ケト基またはアミン基から選択される少なくとも１つのさらなる基で置換されているか非置換である、２〜５５個の炭素原子を有する直鎖または分岐したアルキル鎖を表し、
Ｒ２は、Ｈ、ホスホコリン、エタノールアミン、セリンまたは糖を表し、
Ｘは、ＣＨ＝ＣＨ、ＣＨ２−ＣＨ２またはＣＨ２−ＨＣＯＨを表し、
Ｒ３は、少なくとも１つの基−ＯＲ４（式中、Ｒ４は、独立して、
Ｈ
および
−Ｃ（Ｏ）Ｒ１（式中、Ｒ１は上記定義の通りである）
からなる群から選択される、同一または非同一の基である）で置換されていてもよい、１〜１２個の炭素原子を有する直鎖または分岐したアルキル基を表す。］
とを、反応させることによる生体触媒的調製方法であり、使用する生体触媒が、カンジダ・アンタークチカ由来のリパーゼＢを含むことを特徴とする、生体触媒的調製方法。
【請求項２】
Ｒ３が、１〜４個の炭素原子を有する非置換アルキル基であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一般式ＩＩＩのカルボキシルエステルが、ポリオールと少なくとも１つの酸Ｒ１ＣＯＯＨとの完全または部分エステルであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記リゾスフィンゴ脂質が、前記酵素反応の前に、前記リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物の脱プロトン化によって調製されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物の脱プロトン化と、生体触媒的調製との間に濾過ステップが行われることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記リゾスフィンゴ脂質が、生体触媒作用中に、前記リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物の脱プロトン化によって調製されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記リゾスフィンゴ脂質の、カルボン酸カルボキシレート、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、炭酸塩、水酸化物またはハロゲン化物が、前記リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物として使用されることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
有機塩基または無機塩基が前記脱プロトン化に使用されることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
プロトン化後に水を少しも遊離しない塩基が使用されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アルカリ金属アルコラートが塩基として使用されることを特徴とする、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物と塩基との間のモル比が、１０：１〜０.０５：１の範囲内であることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体触媒の量が、前駆体の全質量を基準にして、１％（ｗ／ｗ）〜１００％（ｗ／ｗ）の範囲内で使用されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記生体触媒が回収されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素反応の開始時に、リゾスフィンゴ脂質とカルボキシルエステルとのモル比１：１０〜１０：１で反応物質が存在することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記反応が、有機溶剤中で実施されることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
カールフィッシャー法で検出される水含量０.１Ｍ以下として定義された無水条件下で前記反応が実施されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記反応開始時の前記反応物質濃度が、各反応物質について、０.０１Ｍ〜３Ｍの範囲内であることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記反応温度が、２０℃〜１３０℃の範囲内であることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記反応が、１ｂａｒ未満の圧力下で実施されることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
式Ｉの標的化合物に関連した変換が、理論的に予想される変換の８０％超であることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
式Ｉおよび０.００１〜１９質量％の対応するＮ,Ｏ−ジアセチル化生成物を含む組成物が得られることを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴ脂質の酵素的合成ならびに、リゾスフィンゴ脂質とカルボキシルエステル由来のスフィンゴ脂質を含む組成物に関し、また、こうしたスフィンゴ脂質または組成物を含む化粧製剤、皮膚用製剤または医薬製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、一般式Ｉ
【化１】
0005647109.tif 000002
で表されるスフィンゴ脂質の生体触媒的調製方法であって、
一般式ＩＩ
【化２】
0005647109.tif 000003
で表されるリゾスフィンゴ脂質を、一般式ＩＩＩ
【化３】
0005647109.tif 000004
（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＸは以下に定義の通りである）
で表されるカルボキシルエステルと反応させることによる調製方法に関する。
【０００３】
本スフィンゴ脂質は、化粧用および／または皮膚用有効成分として使用される。
【０００４】
Ｒ２＝Ｈである一般式Ｉのスフィンゴ脂質は、セラミドと言われ、皮膚（角質層）内に天然に存在する極性脂質である。外側の角質細胞では、セラミドは、細胞膜の主成分（脂質含量の４０〜６５％）に相当し、たとえば、透水性を調節することにより、その保護機能において中心的役割を果たす。加齢とともに、ケラチノサイトは、セラミド合成能の大部分を失い、それ故皮膚はその保護作用の一部を失い、たとえば、もはや表皮の水分喪失を完全に抑制することはできない。これは、セラミドの局所適用によって、少なくとも部分的に補うことができる（たとえば、Farwick, M. et al., Int. J. Cosm. Sci., 2007, 29(4), 319-329またはKlee, S.K. et al. Basic Clinic. Dermatol., 2007, 40, 155-165）。
【０００５】
加えて、アトピー性皮膚炎の治療における、セラミドの好ましい作用が報告されている（Kerscher, M. et al., Eur. J. Dermatol., 1991, 1, 39-43; Imokawa, G. et al., J. Soc. Cosmet. Chem. 1989, 40, 500-507）。
【０００６】
多くの先進工業諸国、特にドイツにおける人口統計推移を考慮すると、セラミドの需要はさらに増大すると予想される。
【０００７】
先行技術では、セラミドは、活性化カルボン酸誘導体を使用して、Ｒ２＝Ｈである一般式ＩＩのリゾスフィンゴ脂質、たとえば、フィトスフィンゴシン（Ｒ２＝ＨかつＸ＝ＣＨ２−ＨＣＯＨである、一般式ＩＩ）等の、ショッテン・バウマン（Schotten Baumann）類似Ｎ−アシル化によって調製される。
【０００８】
フィトスフィンゴシンは、一般に発酵起源である。
【０００９】
活性化カルボン酸は一般に、それ自体として使用されるか、またはカルボン酸からイン・シチュで調製されるかのいずれかである、塩化カルボニルである。米国特許第６４２０６０４号（Cosmoferm, NL）は、スフィンゴシン塩基を好適なカルボニルハロゲン化物と反応させることによる、幾つかのセラミドの合成について記述している。この方法の際立った不都合は、有毒な有機塩素化合物を使用する必要性がある一方で、結果として生じる最終生成物が高塩負荷であることである。さらに、極めて反応しやすいカルボニルハロゲン化物を使用する際には、かなりの量の不要な副産物の生成を予想しなければならないことは、当業者に明白である。
【００１０】
代替合成経路は、無水物によって進行する。したがって、たとえば、国際公開第９３／２００３８号パンフレット（Gist-Brocades, NL）は、フィトスフィンゴシンのＮ−アシル化用の反応性カルボン酸誘導体を得るために、カルボン酸とアルキルフェニルスルホニルクロリドから、混合無水物を塩基触媒合成することを教示している。
【００１１】
これらの経路全部に共通しているのは、反応性カルボン酸誘導体の使用に依存していることである。これに関連した不都合は、こうした物質の高い腐蝕性およびそれらの健康に対する危険性の両者であり、これにより特別の反応器システムおよび注意が必要となり、したがって、調製の複雑さが増大する。加えて、本生成物を局所適用できるためには、反応しやすく有毒な前駆体および副産物が本生成物から除去されていることが保証されなければならない。高塩負荷、ならびにそれに関連した生成物精製および廃棄物処理のための付加的な複雑さもさらに予想される。先行技術の方法のさらなる不都合は、低い前駆体濃度および生成物濃度しか得られないことであり；たとえば、国際公開第９３／２００３８号パンフレット（Gist-Brocades, NL）は、反応性かつ有毒な共試薬である、塩化ｐ−トルエンスルホニルおよびトリエチルアミンの同時使用と共に、有毒な溶剤塩化メチレン中の最大１５％（ｗ／ｖ）の前駆体溶液を記している。加えて、本生成物の純度または収量（いずれの場合にも、８０％）はいずれも満足のいくものではない。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、無害かつ産業上利用することができる様式で、先行技術の不都合の少なくとも１つを克服することができる、セラミドを得る代替方法を提供することである。
【００１３】
生体触媒的に、すなわち、酵素を触媒として使用して、アミド化反応を得ることもできる。酵素の産業上の利用の概説は、たとえばLieseら（Industrial Biotransformations; Second, Completely Revised Edition, Wiley-VCH, Weinheim, 2006）に見られる。カルボン酸誘導体を合成するのに好ましい生体触媒は、加水分解酵素（E.C. 3.1.x.x）、特にリパーゼ（トリアシルグリセロール加水分解酵素、E.C. 3.1.1.3）およびエステラーゼ（E.C. 3.1.1.1）である。
【００１４】
リパーゼは、細胞の代謝における自然機能に従って、エステルの加水開裂を優先的に触媒する。しかし、エステルの縮合的生成も、文献に多数記述されている。それらの代表例は、Drauz and Waldmann (Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, A Comprehensive Handbook; Second, Completely Revised and Enlarged Edition, Vol. II, Wiley-VCH, Weinheim, 2002)、Aehle (Enzymes in Industry, Production and Applications; Second, Completely Revised Edition, Wiley-VCH, Weinheim, 2004)またはBornscheuer (Enzymes in Lipid Modification, Wiley-VCH, Weinheim, 2000)に見られる。
【００１５】
リパーゼ−触媒縮合反応における求核剤としてのアミンの使用例も、文献にある。
【００１６】
Y.-M. Xia et al., J Mol Catal B, 2004, 31,111-115は、たとえば、カンジダ・アンタークティカ（Candida antarctica (CALB)）由来のリパーゼにより触媒される反応性一級アミンを用いたラウリン酸メチルのアミド化によるＮ−ラウロイル−β−アミノプロプリオニトリルの合成について記述している。記載の方法の不都合は、基質溶液の希釈（５０ｍＭ未満）の制限に加え、僅か９４.３％までの変換という、比較的低い変換である。さらに、示された反応には、位置選択性または化学選択性は全く必要ない。
【００１７】
しかし、前駆体分子、たとえば、フィトスフィンゴシン等は、複数の反応性官能基を有する可能性があるため、本発明による反応には、このような選択性が絶対的に必要であろう。この選択性の問題は、たとえばP.Tufvesson et al.: Biotechnol.Bioeng., 2007, 97(3), 447-453により示され：エタノールアミンとカルボン酸とを用いたＣＡＬＢ−触媒による反応において、酵素触媒によるエステル化を回避する単純な選択的アミド化は不可能であった。前駆体の多回添加および蒸留による反応水の除去によってのみ、所望のアミドの濃縮を達成することが可能であった。
【００１８】
酵素的アミド化のさらなる例で、M.Nechab et al.: JOC, 2007, 72, 6918-6923は、ＣＡＬＢを使用した、（Ｒ）立体配置二級アミンの立体選択的反応について記述している。生成物の高い光学純度（＞９９％  ee）が確認されたことから、ＣＡＬＢの（Ｒ）立体配置アミンに対する強い優先傾向が示唆され、したがって、たとえばフィトスフィンゴシンは、Ｓ−立体配置であるため、この触媒で、アミン炭素原子に反応するかどうか疑わしい。加えて、やはり、非常に希釈された基質溶液（１００ｍＭ）が、高濃度（２７％ｗ（ＣＡＬＢ）／ｗ（基質））の生体触媒と同時に使用され、記載の方法の産業上の魅力を著しく制限している。
【００１９】
国際公開第９４／２６９１９号パンフレット（Gist-Brocades, NL）は、細菌リパーゼまたは哺乳リパーゼの使用とともに、カルボキシルエステルを使用するフィトスフィンゴシンの酵素的Ｎ−アシル化について記述している。細菌リパーゼおよび哺乳リパーゼ、特に、シュードモナス・アルカリゲネス（Pseudomonas alcaligenes）由来のリパーゼは、記載の方法で好ましく使用される。この方法の不都合は、特に、中程度の変換（最高７８％）を達成するだけのために、大量の生体触媒（３０〜９５％ｗ／ｗ）を必要とすることである。加えて、かなりの量の不要なＮ,Ｏ−ジアシル化生成物（最高１７％）が確認された。さらに、基質の希釈溶液のみが使用され（５９〜９３ｍＭ）、その結果として空時収量が低くなる。さらなる不都合は、基質としてフィトスフィンゴシン塩基に制限されることであり、フィトスフィンゴシンの酸付加生成物、たとえばフィトスフィンゴシンサルフェートの使用と比較して、基質価格の激増を伴う。さらに、酵母および真菌に由来するリパーゼは、触媒として不安定であることが明確に指摘されている。したがって、国際公開第９４／２６９１９号パンフレットに記述されている方法は、既存の化学的方法に代わる経済的に価値ある代替法としては除外される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
このように、従来実現できなかった、アルキルカルボキシレートからのスフィンゴ脂質の生体触媒的合成の実施を可能にするために、先行技術の不都合を克服する、リゾスフィンゴ脂質を酵素的にアミド化する方法が引き続き必要である。
【００２１】
したがって、本発明の目的は、先行技術の方法の不都合の１つまたは複数がない方法を提供することであった。特に、その意図は、容易に入手できるリゾスフィンゴ脂質を前駆体として、さらには高濃度で、使用することができる方法を開発することであった。
【００２２】
明確に言及されていないさらなる目的は、以下の説明、実施例および特許請求の範囲の文脈から明白である。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
驚くべきことに、先行技術とは対照的に、真菌リパーゼがカルボキシルエステルとリゾスフィンゴ脂質を選択的に反応させ、高純度のスフィンゴ脂質を形成可能なことが見出された。さらに、この反応は、経済的に理にかなった様式で実施可能なことが見出された。
【００２４】
本発明による方法および／または本発明で使用される生体触媒は、比較的低い酵素濃度、たとえば使用する前駆体を基準にして１０重量％未満を実施に使用する必要とするため、および／または当該生体触媒を何度も、たとえば少なくとも１０回、再使用できるため、経済的に価値のある方法でアミド化反応を実施できるという利点を有する。したがって、本発明による方法のさらなる利点は、クロマトグラフィまたは分別結晶等の精巧な完成反応なしで、高純度、たとえば、有効含量＞９０％およびＮ,Ｏ−ジアシル化生成物の比率５％未満の生成物を調製することができることである。本発明の方法の特有の利点は、カルボン酸成分として、容易に入手可能なアルキルカルボキシレート（例えば、メチルエステル）であって任意の望ましくない二次反応を引き起こさないものを使用することを含む。
【００２５】
以下の図面は実施例の一部である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】フィトスフィンゴシンと３.４倍過剰のアシルドナーとの酵素反応の経過。
【図２】フィトスフィンゴシンとステアリン酸メチルとの酵素反応の経過の比較。三角：Ｎ−ステアロイルフィトスフィンゴシン追加あり、四角：Ｎ−ステアロイルフィトスフィンゴシン追加なし。
【図３】生体触媒のリサイクル：関連サイクルの初期活性は黒色で再現され、２４時間後の収率は斜線で再現されている。
【図４】様々な溶剤中での、フィトスフィンゴシンとステアリン酸メチルとの酵素反応の時間変換曲線。
【図５】トリステアリンをアシルドナーとして使用する、酵素的セラミドＩＩＩ合成の経過。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明はしたがって、一般式Ｉ
【化４】
0005647109.tif 000005
で示されるスフィンゴ脂質の生体触媒的調製方法であって、
一般式ＩＩ
【化５】
0005647109.tif 000006
で表されるリゾスフィンゴ脂質と、
一般式ＩＩＩ
【化６】
0005647109.tif 000007
で表されるカルボキシルエステル
［式中、Ｒ１は、場合により１つもしくは複数の多重結合および／または芳香環もしくは芳香族複素環を含んでもよく、場合により酸素原子またはエステル官能基もしくはアミド官能基が割り込んでいてもよく、また場合によりアルキル基、ヒドロキシ基、ケト基またはアミン基から選択される少なくとも１つのさらなる基で置換されていてもよい、２〜５５個の炭素原子を有する直鎖または分岐したアルキル鎖を表し、好ましくは、場合により１つもしくは複数の多重結合および／または芳香環もしくは芳香族複素環を含んでもよく、場合により酸素原子またはエステル官能基もしくはアミド官能基が割り込んでいてもよく、また場合によりアルキル基、ヒドロキシ基、ケト基またはアミン基から選択される少なくとも１つのさらなる基で置換されていてもよい−ＣＨ２−Ｙ−ＣＨ３（式中、Ｙは炭素−炭素結合、あるいは、１〜５３個の炭素原子を有する直鎖または分岐したアルキレン鎖である）を表し、
Ｒ２は、Ｈ、ホスホコリン、セリン、エタノールアミンまたは糖を表し、好ましくは糖またはＨを表し、最も好ましくはＨを表し、
Ｘは、ＣＨ＝ＣＨ、ＣＨ２−ＣＨ２またはＣＨ２−ＨＣＯＨを表し、好ましくはＣＨ２−ＨＣＯＨを表し、
Ｒ３は、少なくとも１つの基−ＯＲ４（式中、Ｒ４は、独立して、
Ｈ
および
−Ｃ（Ｏ）Ｒ１
からなる群から選択される、同一または非同一の基である）で置換されていてもよい、１〜１２個の炭素原子を有する直鎖または分岐したアルキル基を表す。］
を反応させることによる生体触媒的調製方法に関し、使用される生体触媒が以下の：
菌界の生物から単離することができる酵素クラスＥ.Ｃ.３.１.１のカルボキシルエステル加水分解酵素、および
菌界の生物から単離することができる酵素クラスＥ.Ｃ.３.１.１のカルボキシルエステル加水分解酵素と、アミノ酸レベルで少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、９８％または９９％相同である、酵素クラスＥ.Ｃ.３.１.１のカルボキシルエステル加水分解酵素
を含む群から選択される酵素クラスＥ.Ｃ.３.１.１のカルボキシルエステル加水分解酵素を少なくとも１つ含むことを特徴とする。
【００２８】
「アミノ酸レベルでの相同性」は、本発明の文脈で、以下、既知の方法を用いて決定することができる「アミノ酸同一性」を意味する。一般に、特定の要求を考慮に入れたアルゴリズムを用いた特別のコンピュータープログラムを使用する。同一性を決定する好ましい方法は、まず第一に比較すべき配列間の最大一致を生じさせる。同一性を決定するためのコンピュータープログラムとしては、
−GAP (Deveroy, J. et al., Nucleic Acid Research 12 (1984), page 387, Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (WI)、および
−BLASTP、BLASTNおよびFASTA (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), pages 403-410を含むＧＣＧプログラムパッケージなどがあるが、この限りではない。このＢＬＡＳＴプログラムは、National Centre For Biotechnology Information(ＮＣＢＩ)およびさらなるソース（BLAST handbook, Altschul S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894; Altschul S. et al.、上記）から入手できる。
【００２９】
当業者は、２つのヌクレオチド間またはアミノ酸配列間の類似性または同一性を計算するために、様々なコンピュータープログラムを利用できることを承知している。したがって、２つのアミノ酸配列間のパーセンテージ同一性は、たとえばＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comを介して得られる）のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch （J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)）アルゴリズムによって、具体的には、ブロッサム（Blossom）６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６、または４および長さウェイト１、２、３、４、５、または６を使用して、決定することができる。異なるパラメータの使用は、僅かに異なる結果につながるであろうが、２つのアミノ酸配列間のパーセンテージ同一性は、全体として著しく異ならないであろうことを、当業者は理解するであろう。通常は、プリセット（ギャップウェイト：１２、長さウェイト：１）を適用し、ブロッサム６２マトリックスが使用される。
【００３０】
上述のアルゴリズムによる６０％の同一性は、本発明との関連で、６０％相同性を意味する。同じことが、より高い同一性にも当てはまる。
【００３１】
本発明による方法において、一般式ＩＩＩのカルボキシルエステルは、特に好ましくは、カルボン酸と、アルコールＲ３ＯＨの−Ｒ３基とのエステルであり、ここで、カルボン酸は、６〜３０個の炭素原子、特に８〜２２個の炭素原子を有する、天然の植物油または動物油をベースとする天然の脂肪酸の群から選択される。天然の脂肪酸は、分岐しておらず、また偶数の炭素原子から成る。どの二重結合も、シス立体配置である。例は：カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、イソステアリン酸、ステアリン酸、１２−ヒドロキシステアリン酸、ジヒドロキシステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ペトロセリン酸、エライジン酸、アラキン酸、ベヘン酸、エルカ酸、ガドレイン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、アラキドン酸であり、これらのエステル生成物が最も特に好ましい。
【００３２】
さらに、本発明による方法において、一般式ＩＩＩのカルボキシルエステルは、好ましくは、カルボン酸と、アルコールＲ３ＯＨの−Ｒ３基とのエステルであり、ここで、カルボン酸は、多価不飽和脂肪酸のヒドロキシル化誘導体の群から選択される。そのような脂肪酸は、例えば、９−または１３−ヒドロキシオクタデカジエン酸、１５−ヒドロキシエイコサテトラエン酸および一連のいわゆるα−ヒドロキシ酸である。同様にこの関連で、カルボン酸は、特に好ましくは、ヒドロキシ−官能化酸の重縮合生成物（たとえばポリ−１２−ヒドロキシステアリン酸またはポリリシノール酸）である。
【００３３】
同様にこの関連で、カルボン酸は、特に好ましくは、芳香族置換基を含む、合成または天然に存在するカルボン酸であり、たとえば、安息香酸、桂皮酸、フェルラ酸、プロトカテク酸、没食子酸、バニリン酸、シリンガ酸、イソフェルラ酸、シナピン酸、カフェイン酸、ゲニチン酸（genitic acid）、サリチル酸、サリチル酸（salicyuric acid）またはニコチン酸である。
【００３４】
本発明による方法において、Ｒ３は、好ましくは、１〜４個の炭素原子を有する非置換アルキル基であり、好ましくは、Ｒ３は、メチル、エチル、ビニル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチル基を含む群から選択される。
【００３５】
本発明による方法のさらなる態様において、一般式ＩＩＩのカルボキシルエステルは、ポリオールと、少なくとも１つの酸Ｒ１ＣＯＯＨとの完全または部分エステルである。ポリオールの完全または部分エステルとしての使用に好ましいものは、グリコール、グリセリル、１，２−ペンタンジイル、１，３−ペンタンジイル、１，２−ブタジイル、１，３−ブタジイル、１，４−ブタジイルエステルならびにそれらの異性体および不飽和類似体である。
【００３６】
Ｒ１ＣＯＯＨのエステル化を介してＲ３基を決定する上述の出発物質は、純物質としてまたは混合物で存在することができ、したがって、一般式ＩＩＩの構造は、場合によっては混合物を示すことがある。
【００３７】
本発明の方法は、異なるＲ１を有する一般式ＩＩＩの混合物の使用によって、一般式Ｉのスフィンゴ脂質の混合物の生体触媒的調製に使用することができる。
【００３８】
同様に、本発明の方法は、異なるＲ３を有する一般式ＩＩＩのカルボキシルエステルの混合物を使用することができる。
【００３９】
本発明によれば、たとえばP. Lersch, U. Schick, Spec. Chem. Mag., 2003, 23(6), 30-31に記載の既報のフィトスフィンゴシンの場合に確立された発酵方法の結果として得られるもののような、リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物（酸付加塩ともよばれる）を使用することも可能である。好ましく使用されるリゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物は、カルボン酸カルボキシレート、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、炭酸塩、水酸化物またはハロゲン化物、特に好ましくは、リゾスフィンゴ脂質の塩化物および硫酸塩である。
【００４０】
本発明による方法でリゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物を使用するとき、リゾスフィンゴ脂質は、酵素反応の前に、リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物の脱プロトン化によって調製されることが好ましい。
【００４１】
こうして得られるリゾスフィンゴ脂質を、本明細書において以降、リゾスフィンゴ脂質塩基とも呼ぶ。
【００４２】
脱プロトン処理は、従来の有機溶剤中、リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物の溶液または懸濁液で行うことができる。使用できる溶剤の例は：パラフィン、一価または多価アルコール（たとえば：メタノール、エタノール、イソプロパノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノール、メチルシクロヘキサノール、２−ブチル−１−オクタノールおよびそれらの異性体、エチレングリコール、グリセロール、ジアセトンアルコール、イソブタノール、等々）、エーテル（ジエチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ポリエトキシレート、ポリプロポキシレートおよびコポリマー等々）、ケトン（アセトン、メチルイソブチルケトン、メチルエチルケトン、等々）、エステル（クエン酸トリエチル、クエン酸トリブチル、イソ酪酸イソブチル、酢酸イソブチル、イソノナン酸イソノニル、酢酸２−エチルヘキシル、酢酸シクロヘキシル、酢酸４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシル）である。メチルイソブチルケトンまたは２−メチル−２−ブタノール等の、毒物学的に許容できる溶剤が好ましい。
【００４３】
脱プロトン化ステップは、溶剤が液体状態である反応温度で実施することができる。好ましくは、−８０℃〜＋１５０℃の間、特に好ましくは０℃〜１２０℃、極めて特に好ましくは＋２５℃〜１００℃の間の反応温度で実施される。
【００４４】
このようにして得られるリゾスフィンゴ脂質塩基の溶液は、それ自身、酵素反応に使用することもでき、予め濾過することもできる。
【００４５】
本発明のさらなる実施態様では、当業者によく知られている方法（たとえば蒸留、またはリゾスフィンゴ脂質塩基の沈殿／結晶化とその後の濾過による除去）で、脱プロトン化ステップの溶剤を除去することができる。このリゾスフィンゴ脂質塩基は場合により、たとえば沈殿または結晶化により、あるいは蒸留で溶剤を除去することにより、酵素反応の前に、単離してもよい。脱プロトン処理につながる塩が除去される濾過ステップは、リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物の脱プロトン化と生体触媒的調製との間に行われることが好ましい。
【００４６】
代替法として、生体触媒作用中に、リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物の脱プロトン化によって、リゾスフィンゴ脂質塩基を調製することができる。
【００４７】
活性化と関連した脱プロトン化は、塩基を使用することにより、好ましくは有機塩基または無機塩基を用いて、行うことができる。無機塩基として好ましく使用されるものは、水酸化物、炭酸塩、金属水素化物（たとえば：水素化リチウムアルミニウム、水素化カルシウム、水素化ナトリウム等々）、イオン交換体（たとえば、陽イオン交換体または陰イオン交換体等）であり、有機塩基としては、金属オルガニル（たとえば、ブチルリチウム等）、アルコラート、アミドおよびそれらの金属塩、たとえば、リチウムジイソプロピルアミド等である。
【００４８】
驚くべきことに、酵素反応で特に容易に反応させることができる特に高品質のリゾスフィンゴ脂質塩基は、特に、酸付加塩との反応で正式に水を少しも生成しない塩基によって提供されることが分かった。したがって、特に好ましい塩基は、その反応で、水を全く遊離しないものである。それらは、プロトン化後に水を少しも遊離しないものである。アルカリ金属アルコラートは、好ましくは塩基として使用される。これは、たとえばアルコール性溶液中に存在してもよい。ナトリウムメトキシドおよびカリウムメトキシドは特に好ましい。これらは同様に、有機溶剤中の溶液として使用することができる。
【００４９】
反応水を回避するための、したがって同様に本発明による方法で好ましい、さらなる代替法は、アルカリ金属水酸化物および／またはアルカリ土金属水酸化物を塩基として使用する際に、その反応で生成される水を結合するために、水結合性の塩、好ましくは水結合性無機塩、たとえば、Ｎａ２ＳＯ４等を使用することである。好ましくは、Ｎａ２ＳＯ４が使用される。
【００５０】
本発明によれば、本方法におけるリゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物と塩基との間のモル比は、１０：１〜０．０５：１、好ましくは３：１〜０.２：１、特に好ましくは１.４：１〜０.６：１の範囲内であり、極めて特に好ましくは、リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物と塩基との間のモル比は、等モルである。
【００５１】
本発明の特定の実施態様では、リゾスフィンゴ脂質塩基を調製するために、存在する任意の水が脱プロトン化混合物から除去される。このために使用される除水方法は、たとえば、物理的方法（たとえば蒸留、膜方法、抽出または吸着（たとえば分子篩））あるいは化学的方法（たとえば：金属水素化物および金属酸化物との反応、または、無水物、エステル等の他の反応物質との反応）等である。
【００５２】
冒頭に既述の通り、国際公開第９４／２６９１９号パンフレット（Gist-Brocades）に記載の先行技術を考慮すると、真菌リパーゼを、本発明による方法で効率よい生体触媒として使用できることは、全く驚きである。
【００５３】
本発明による方法における生体触媒としては、とくに、菌界の生物から単離することができる酵素クラスＥ.Ｃ.３.１.１のカルボキシルエステル加水分解酵素、および／またはアミノ酸レベルで、菌界の生物から単離できるものと少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、９８％または９９％相同である、カルボキシルエステル加水分解酵素があり、その生物は、Aspergillus属、Bipolaris属、Candida属、Fusarium属、Geotrichum属、Humicola属、Microsporum属、Mucor属、Pichia属、Thermomyces属、Penicillium属、Rhizopus属、Rhizomucor属、Microsporum属、Mucor属、Saccharomyces属、Thermomyces属、Trichosporon属、Zygosaccharomyces属の群から選択される。
【００５４】
典型的な代表は、たとえば：
Aspergillus caesiellus、A. candidus、A. carbonarius、A. carneus、A. chevalieri、A. clavatus、A. costaricaensis、A. cretensis、A. deflectus、A. flaviceps、A. flavus、A. flocculatosus、A. fumigatus、A. glaucus、A. ibericus、A. lacticoffeatus、A. lentulus、A. neobridgeri、A. nidulans、A. niger、A. niveus、A. ochraceus、A. oryzae、A. parasiticus、A. penicilloides、A. piperis、A. pseudoelegans、A. pseudofisheri、A. restrictus、A. roseoglobulus、A. sclerotioniger、A. sojae、A. steynii、A. sydowi、A. terreus、A. udagawae、A. ustus、A. versicolor、A. westerdijkiae、Bipolaris australiensis、B. hawaiiensis、B. picifera、Candida antarctica、C. cylindracea、C. lipolytica、C. rugosa、C. utilis、C. robusta、C. kefyr、C. albicans、C. glabrata、C. krusei、C. lusitaniae、C. parapsilosis、C. tropicalis、Fusarium chlamydosporum、F. coeruleum、F. dimerum、F. incarnatum、F. moniliforme F. oxysporum、F. proliferatum、F. sacchari、F. semitectum、F. solani、F. sporotrichoides、F. sub glutinans、F. tabacinum、F. verticillioides、Geotrichum candidum、G.klebahnii、Humicola fuscoatra var. Fuscoatra、H.a grisea var. Grisea、H. grisea var. Thermoidea、H. insolens、Microsporum amazonicum、M. audouinii、M. audouinii var. Langeronii、M. audouinii var. Rivalierii、M. boullardii、M. canis、M. canis var. distortum、M. cookei、M. equinum、M. ferrugineum、M. fulvum、M. gallinae、M. gypseum、M. nanum、M. persicolor、M. praecox、M. racemosum、M. vanbreuseghemii Mucor javanicus、M. pusillus、M. plumbeus、M. racemosus、M. hiemalis、Penicillium aurantiogriseum、P. brevicompactum、P. chrysogenum、P. camemberti、P. digitatum、P. citrinum、P. commune、P. corylophilum、P. crustosum、P. cyclopium、P. expansum、P. funiculosum、P. glabrum、P. glaucum、P. griseofulvum、P. italicum、P. marneffei、P. nalgiovense、P. nordicum、P. notatum、P. palitans、P. purpurrescens、P. purpurogenum、P. olsonii、P. oryzae、P. roqueforti、P. variabile、P. viridicatum、P. verrucosum、Pichia acaciae、P. amylophilia、P. ciferrii、P. pastoris、P. alni、P. americana、P. amethionina、P. angophorae、P. angusta、P. anomala、P. antillensis、P. barkeri、P. besseyi、P. bimundalis、P. bispora、P. bovis、P. cactophila、P. canadensis、P. capsulata、P. caribaea、P. castillae、P. chambardii、P. delftensis、P. deserticola、P. dryadoides、P. euphorbiae、P. euphorbiiphila、P. fabianii、P. faecalis、P. farinosa、P. fermentans、P. finlandica、P. fluxuum、P. galaeiformis、P. glucozyma、P. guilliermondii、P. hampshirensis、P. haplophila、P. heedii、P. heimii、P. henricii、P. holstii、P. inositovora、P. jadinii、P. japonica、P. kluyveri、P. kodamae、P. lynferdii、P. maganishii、P. media、P. membranifaciens、P. methanolica、P. methylivoria、P. mexicana、P. meyerae、P. minuta、P. mississippiensis、P. nakasei、P. nakazawae、P. norvegensis、P. oezlemii、P. ofunaensis、P. ohmeri、P. onychis、P. opuntiae、P. petersonii、P. philodendri、P. philogaea、P. pijperi、P. pini、P. populi、P. pseudocactophila、P. quercuum、P. rabaulensis、P. rhodanensis、P. salicaria、P. scolyti、P. segobiensis、P. silvicola、P. spartinae、P. stipitis、P. strasburgensis、P. subpelliculosa、P. sydowiorum、P. tannicola、P. thermotolerans、P. toletana、P. trehalophila、P. triangularis、P. veronae、P. wickerhamii、P. xylosa、Thermomyces lanuginosa、Rhizopus arrhizus、R. delemar、R. niveus、R. oryzae、R. azygosporus、R. microsporus、R. schipperae、R. stolonifer、Rhizomucor miehei、Saccharomyces barnettii、S. bayanus、S. castellii、S. cerevisiae、S. dairenensis、S. exiguus、S. paradoxus、S. pastorianus、S. rosinii、S. servazii、S. spencoerorum、S. transvaalensis、S. unisporus、S. bailii、Trichosporon asahii、T. asteroides、T. beigelii、T. coremiiforme、T. cutaneum、T. faecale、T. gracile、T. inkin、T. mucoides、T. ovoides、T. pullulans、Zygosaccharomyces bisporus、Z. cidri、Z. fermantati、Z. florentinus、Z. mellis、Z. microellipsoides、Z. mrakii、Z. rouxiiである。
【００５５】
本発明による方法で特に好ましく使用されるカルボキシルエステル加水分解酵素は、Thermomyces lanuginosus（受入番号Ｏ５９９５２）由来のリパーゼ、Candida antarctica（受入番号Ｐ４１３６５）由来のリパーゼＡおよびＢならびにMucor miehei（受入番号Ｐ１９５１５）由来のリパーゼ、Rhizomucor javanicus（受入番号Ｓ３２４９２）由来のリパーゼ、Rhizopus oryzae（受入番号Ｐ６１８７２）由来のリパーゼ、Candida rugosa（受入番号Ｐ２０２６１、Ｐ３２９４６、Ｐ３２９４７、Ｐ３２９４およびＰ３２９４９）由来のリパーゼ、Rhizopus niveus（受入番号Ｐ６１８７１）由来のリパーゼ、Penicillium camemberti（受入番号Ｐ２５２３４）由来のリパーゼ、Aspergillus niger（ＡＢＧ７３６１３、ＡＢＧ７３６１４およびＡＢＧ３７９０６）由来のリパーゼおよびPenicillium cyclopium（受入番号Ｐ６１８６９）由来のリパーゼの群から選択される酵素、ならびに、各場合において、アミノ酸レベルで、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、９８％または９９％相同のものである。相同性に関しては、前述の定義を参照することが可能である。
【００５６】
市販例および同様に本発明による方法で好ましく使用されるカルボキシルエステル加水分解酵素は、商品Lipozyme TL IM、Novozym 435、Lipozyme IM 20、Lipase SP382、Lipase SP525、Lipase SP523、(全てNovozymes A/S, Bagsvaerd, Denmarkの商品)、Chirazyme L2、Chirazyme L5、Chirazyme L8、Chirazyme L9(全てRoche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germanyの商品)、およびLipase M “Amano”、Lipase F-AP 15 “Amano”、Lipase AY “Amano”、Lipase N “Amano”、Lipase R “Amano”、Lipase A “Amano”、Lipase D “Amano”、Lipase G “Amano”(全てAmano, Japanの商品)である。
【００５７】
本生体触媒は、無水物または部分的水和物の形で好ましく使用される。本生体触媒は、固定化されるかまたは凍結乾燥物として使用することができる。固定化のために使用することができる担体は、不活性な有機担体または無機担体である。固定化型酵素に好ましく使用されるかまたは存在する不活性な担体は、粒子の少なくとも９０％が１０〜５０００μｍ、好ましくは５０〜２０００μｍの粒径を有する粒径分布を有する粒状担体である。特に使用することができる有機担体は、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリビニルスチレン、スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ＰＴＦＥおよび／または他のポリマーを含むか、またはこれらから成るものである。固定化すべき酵素に応じて、特に酸性イオン交換樹脂または塩基性イオン交換樹脂、たとえばDuolite A568、Duolite XAD 761、Duolite XAD 1180、Duolite XAD 7HP、Amberlite IR 120、Amberlite IR 400、Amberlite CG 50、Amberlyst 15(全てRohm and Haasの製品)またはLewatit CNP 105およびLewatit VP OC 1600(Lanxess, Leverkusen, Germanyの製品)を、担体材料として使用することができる。使用することができる無機担体は、最新技術で周知の酸化物（oxidic）担体および／またはセラミック担体である。特に使用できる無機担体は、たとえばセライト、沸石、シリカ、細孔制御ガラス（ＣＰＧ）またはたとえば、L. Cao, “Carrier-bound Immobilized Enzymes: Principles, Application and Design”, Wiley-VCH: 2005, Weinheim, Germanyに記載されているもののような他の担体である。固定化型酵素に存在する不活性な担体または固定化型酵素の製造に使用される不活性な担体は、特に好ましくはポリビニルスチレン、ポリメタクリレートまたはポリアクリレートから成る。
【００５８】
本発明によれば、共有結合的または非共有結合的に、好ましくは非共有結合的に、粒子上に固定化することが可能である。非共有結合的固定化の場合、たとえば酵素水溶液（たとえば無機塩または洗浄剤等のさらなる成分を含んでもよい）を用いて、担体をインキュベートするかまたは含浸させる。このインキュベーション／含浸は、たとえば０℃〜５０℃、好ましくは０℃〜４０℃の温度で、実施することができる。このインキュベーション／含浸は、数分から数時間までの期間にわたって好ましく行われる。インキュベーションの進行は、従来の蛋白質測定方法で溶液中の酵素濃度を測定することにより追跡することができる。所望の程度の固定化に到達した後、好ましくは担体を水洗し、必要に応じて乾燥させる。
【００５９】
好適な生体触媒を含む全細胞を、静止細胞としてまたは乾燥型としてのいずれかで、好ましくは先行技術の方法で透過処理して、使用することも可能である。
【００６０】
本発明によれば、使用される基質に対して、０.０１〜３００％（ｗ／ｗ）の量比で、生体触媒を使用することができる。それぞれの反応条件で（特に、基質、それらの濃度、溶剤および反応温度に応じて）、好ましい質量比は、生体触媒の比活性から得られる。こうしたパラメータに応じて、生体触媒の好ましい量は、１〜９６時間、好ましくは８〜２４時間の期間内に、反応物質の完全変換を可能にする量である。生体触媒の量は、前駆体の全質量を基準にして、１〜１００％（ｗ／ｗ）および極めて特に好ましくは１〜５０％（ｗ／ｗ）、特に１〜２０％（ｗ／ｗ）の範囲で、好ましく使用される。
【００６１】
ある特定の実施態様では、この生体触媒は回収される(recovered)。
【００６２】
本発明によれば、酵素反応の開始時に、反応物質は、１：１０〜１０：１というリゾスフィンゴ脂質とカルボキシルエステルとのモル比で存在することが可能である。この関連で、用語「モル比」は、リゾスフィンゴ脂質アミンとアシルドナーカルボキシレート基とのモル比に関する。１：３〜３：１の量比が、好ましく使用される。１：１.４〜１.４：１の量比、とりわけ等モル量比が、特に好ましく使用される。
【００６３】
反応物質は、さらなる溶解剤を含まずに溶融状態で存在してもよく、有機溶剤中に溶解または懸濁されていてもよい。反応は、好ましくは有機溶剤中で実施される。特に適した溶剤は、２０〜１３０℃の範囲内の温度で、反応物質を高濃度で溶解することができるものである。特に適していると証明されている例は、たとえば、メチルイソブチルケトンまたはシクロヘキサノン等のケトン、２−ブチル−１−オクタノール、メチルシクロヘキサノール、１−メトキシ−２−プロパノール、２，３−ブタンジオール２−オクタノール、ジアセトンアルコール、２−メチル−２−ブタノール等の立体障害性二級アルコール、酢酸４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシル、酢酸２−エチルヘキシル、酢酸シクロヘキシル等の立体障害性エステルならびに１，４−ジオキサン、テトラヒドロフランおよびVaronic APM（Evonik Goldschmidt GmbH、Essen、Germany）等のエーテルであるが、こうした溶剤に限定されない。不適当であると証明されている溶剤は、とりわけ生体触媒によるかなり大きい活性で変換されるエステルである。フィトスフィンゴシンを前駆体として用いて、酪酸エチルを使用した反応で、たとえば所望の生成物に加えて、かなりの量の、Ｎ−ブチリルフィトスフィンゴシンと使用したアシルドナー（たとえばステアリン酸メチル）とのエステル交換生成物を検出することができた。同じことが、酢酸ブチルの使用にも当てはまる（Ｎ−アセチルフィトスフィンゴシンとアシルドナーブチルエステルの形成）。
【００６４】
本反応は、カールフィッシャー（Karl Fischer）法で検出される含水量が０.１００Ｍ以下、０.０１０Ｍ以下および特に好ましくは最高でも０.００５Ｍとして定義された無水条件で好ましく実施される。
【００６５】
高基質濃度は、反応速度に特に有利である。変換率が高いと、生成物が高濃度になるが、驚くべきことに、変換率が高いとき、酵素活性に対して悪影響はない。酵素反応では生成物阻害が通常観察されるため、このことは当業者には驚くべきことである。加えて、驚くべきことに、非常に高い変換乃至定量的変換を達成するために、反応生成物（セラミドまたはアルコール）の１つを反応混合物から除去することが、絶対的に必要というわけではないことが分かった。当業者によく知られているLe Chatelierの原理に従えば、このことが本平衡反応に関して予想されたであろう。僅か６７〜７８％という先行技術（国際公開第９４／２６９１９号パンフレット、Gist−Brocades）の反応率が、その必要を予想させることになった。しかし、本発明によれば、より低い基質濃度でも、効率よく反応することが可能である。
【００６６】
本発明の文脈で好ましい反応開始時の反応物質濃度は、各反応物質について、０.０１Ｍ〜３Ｍの範囲内、特に０.２Ｍ〜２Ｍの範囲内、特に好ましくは０.５Ｍ〜１.０Ｍの範囲内である。
【００６７】
反応温度に関して、特に適した温度は、基質が溶剤に均質に溶解する温度であることは分かっていた。これに関連して、２０〜１３０℃の範囲内の反応温度が有利であった。とりわけ高温では、変色のため、反応混合物の注意深い脱気が必要である。しかし、驚くべきことに１００℃以下の反応温度では、この種の用心は無用であることが分かった。したがって、反応温度は、好ましくは４０〜９０℃の範囲内であり、極めて特に好ましくは、７０〜８５℃の範囲内である。
【００６８】
反応は好ましくは、１ｂａｒ未満、好ましくは０.５ｂａｒ未満、特に好ましくは０.０５ｂａｒ未満の圧力で実施される。
【００６９】
この反応は、バッチ方法（撹拌容器）で実施することもでき、または固定床反応器で連続的または半連続的に実施することもできる。高速の生体触媒失活は、とりわけバッチ方法で推定されるものであった。撹拌によって生じる機械的ストレスによる生体触媒の機械的破壊、ならびに反応物質および溶剤に起因する失活作用と対をなす生体触媒の熱失活について留意すべきである。このような作用は当業者に周知であり、また好適な救済策が文献に開示されている。したがって、たとえば生体触媒の機械的疲弊が撹拌方法で起きるのであれば、固定床を使用することにより、これを回避することが可能である。さらなる反応器は、当業者に周知であり、同様に、機械的酵素失活を回避するのに好適である。
【００７０】
さらに、エステルをアシルドナーとして使用するとき、遊離したアルコールによって生体触媒が化学的に失活されることが予想される（たとえば：Y. Yoshida et al., J. Biosci. Bioeng., 2006, 102(1), 66-68）。このような失活を回避する方法は当業者に周知であり、たとえば、蒸留による反応混合物からのアルコール除去や膜方法の使用などがある。しかし、驚くべきことに、上述の方法を使用しなくても、活性を著しく損失せずに生体触媒を何度も再使用できることが分かった。
【００７１】
結果として得られる生成物が、スフィンゴ脂質および高比率（全生成物の最高１９％）の対応するＮ，Ｏ−ジアシル化生成物の組成物であることは、先行技術に記載されている全ての方法に共通である。こうした組成物は、たとえば、Ｎ，Ｏ−ジアシル化生成物の比率が５％以上であるため、化粧用組成物に全く使用できない。さらに、本発明による方法では、驚くべきことに、二級アミン官能基のアミド化は、アルコール官能基の１つのエステル化より紛れもなく好ましいことが分かった。反対の挙動、特に、一級、すなわち立体的に容易に近づける、アルコール官能基の選好が予想されたであろう。先行技術（国際公開第９４／２６９１９号パンフレット、Gist−Brocades）は、類似した状況について記している：細菌リパーゼを使用し、アシルドナーがフィトスフィンゴシンより６０％モル過剰であっても、その状況で得られた反応生成物は、かなりの比率のＮ，Ｏ−ジアシル化生成物（モノジアシル化生成物とジアシル化生成物の比率＞１：５）を含んでいた。
【００７２】
それとは反対に、リゾスフィンゴ脂質より３.６倍過剰のアシルドナーを用いても、リゾスフィンゴ脂質が反応混合物中に存在する限り、顕著なジアシル化がないことを、本発明による方法で示すことが可能であった。リゾスフィンゴ脂質が完全にスフィンゴ脂質に変換されていたときに限って、緩徐なエステル化活性を検出することが可能である。リゾスフィンゴ脂質およびアシルドナーを化学量論的に使用したとき、上述の不要な副反応はほとんど認められなかった。
【００７３】
したがって本発明は、酵素反応による粗生成物としてでさえ、特に純粋なＮ−アシルフィトスフィンゴシンが得られる方法に関する。式Ｉで表される標的化合物に関連した変換は、理論的に予想される変換の好ましくは８０％超、特に好ましくは８５％超、および極めて特に好ましくは９０％超である。
【００７４】
本発明による方法はさらに、式Ｉおよび０.００１〜１９質量％、好ましくは０.００５〜１９質量％、特に好ましくは０.０１〜５質量％の、対応するＮ，Ｏ−ジアシル化生成物を含む組成物を調製するのに好適である。
【００７５】
したがって、本発明は同様に、本発明による方法を使用して調製される、式Ｉおよび０.００１〜１９質量％、好ましくは０.００５〜１９質量％、特に好ましくは０.０１〜５質量％の、対応するＮ，Ｏ−ジアシル化生成物を含む組成物に関する。
【００７６】
本発明は同様に、本発明による方法を使用して調製されるスフィンゴ脂質に関する。
【００７７】
本発明はさらに、スフィンゴ脂質を反応混合物から分離する方法に関する。スフィンゴ脂質は好都合な物理的性質を有するため、スフィンゴ脂質は結晶化／沈殿により反応溶液から容易に除去することができ、したがって、既に高い粗生成物の純度を、簡単な方法でさらに高めることができる。
【００７８】
スフィンゴ脂質および本発明による組成物は、化粧用製剤および医薬製剤の製造に特に適する。したがって本発明は同様に、本発明による少なくとも１つのスフィンゴ脂質および／または本発明による１つの組成物を含む、化粧用製剤または医薬製剤に関する。
【００７９】
本発明を、以下に詳述する実施例において例として説明するが、本発明は、実施例で言及されている実施態様に限定されることは意図されず、その適用範囲は完全な記述および特許請求の範囲から明白である。
【実施例】
【００８０】
実施例１：ＰＳサルフェートの脱プロトン化
フィトスフィンゴシンサルフェート（Cosmoferm,Delft,NL）１００ｇを、５５℃のメタノール６００ｇ中に懸濁させ、ナトリウムメトキシド４６ｇと混合し、５５℃で１５０分間撹拌する。次いで、この懸濁液を熱濾過するとき、その濾液は高濃度である。淡いベージュ色の固体（７８ｇ）をさらなる実験に使用する。
【００８１】
実施例２：アミド化反応性に関する、市販のリパーゼのスクリーニング
ジオキサン（１１ｍＬ）中の、フィトスフィンゴシン（実施例１から）およびステアリン酸メチル（各１Ｍ）の等モル溶液に、表１に記載の真菌リパーゼ各０.３５ｇ（５％  ｗ／ｗ）を懸濁させ、８０℃で７２時間、リパーゼで振盪する。次いで、生体触媒を熱濾去し、その濾液をガスクロマトグラフィで分析する。
【００８２】
【表１】
0005647109.tif 000008
【００８３】
カンジダ・アンタークチカ（Candida antarctica）由来のリパーゼＢを、さらなる実験に使用した。
【００８４】
実施例４：陰性対照
フィトスフィンゴシンとアシルドナーとの、可能性のあるあらゆる無触媒反応を除外するために、０.２Ｍ強度、８０℃で、フィトスフィンゴシンをステアリン酸メチルに溶解し、４時間インキュベートした。ガスクロマトグラフィによるその後の分析は、有意な（定量化可能な）変換を示さなかった。
【００８５】
実施例５：フィトスフィンゴシンサルフェートとの反応
フィトスフィンゴシンサルフェートを脱プロトン化する必要性を証明するために、以下の比較実験を実施した：フィトスフィンゴシンサルフェート８.１８ｇおよびステアリン酸メチル６.７２ｇを、８０℃のジオキサン１５ｍＬに懸濁させ、Novozym 435  ０.１６ｇと混合した。撹拌しながら４時間インキュベーションした後、この反応混合物をガスクロマトグラフィで分析した。僅か３１.７ｍＭのＮ−ステアロイルフィトスフィンゴシンが確認されただけであった。炭酸ナトリウム２.４ｇを加えた後であること以外は同一条件での比較実験で、Ｎ−ステアロイルフィトスフィンゴシン３６８ｍＭが確認された。
【００８６】
実施例６：酵素的アシル化の位置選択性
フィトスフィンゴシンに比して超過剰のアシルドナーを得るために、フィトスフィンゴシン４.４３ｇを１２０℃のステアリン酸メチル１５.０９ｇに溶解した。この溶液をNovozym 435  ０.９８ｇに溶解し（５％  ｗ／ｗ）、標準気圧で撹拌した。定期的に試料を採取して、ガスクロマトグラフィで分析した。
【００８７】
反応経過（図１）から分かる通り、不要なＮ，Ｏ−ジステアリルフィトスフィンゴシンの顕著な蓄積は、使用したフィトスフィンゴシンが完全に変換された時にのみ起こる。１時間後、１９ｍＭ（変換＞９９.５％）の残余フィトスフィンゴシン濃度で、Ｎ，Ｏ−ジアシル化生成物はまだ検出されず、Ｎ，Ｏ−ジアシル化生成物の形成は、約５ｍＭ未満のフィトスフィンゴシン濃度でのみ確認される。加えて、二次反応の反応速度は、２５を超える倍数(factor)で所望の反応速度を下回る。
【００８８】
実施例７：生成物阻害に関する実験
あらゆる生成物阻害を除外するために、２つの並行実験を実施した。この目的のため、各ケースにおいて、フィトスフィンゴシン１.５９ｇを、ステアリン酸メチル７.４５ｇと共に、８０℃のジオキサン２５ｍＬに溶解し、さらに、各ケースにおいてNovozyme 435  ０.４９ｇと混合した。２つの反応混合物の１つを、Ｎ−ステアロイルフィトスフィンゴシン（Cosmoferm, Delft, NL）１.３ｇとさらに混合した。２つの時間−変換曲線の比較が示す通り（図２）、その反応軌跡は全く同じであり、したがって任意の顕著な生成物阻害を除外することが可能である。
【００８９】
実施例８：生体触媒の再使用可能性
生体触媒の再使用可能性を評価するために、以下の通りに一連の実験を実施した：フィトスフィンゴシン３.３ｇをステアリン酸メチル１４.９ｇと一緒に、８０℃のジオキサン５０ｍＬ中に溶解し、Novo 435  ０.９８ｇを加えることによって反応を開始した。試料を定期的に採取し、ガスクロマトグラフィで分析し、初期速度および変換率をそれから算出した。２４時間後、その反応バッチを熱濾過し、後に残っている酵素を、毎回、熱い（５０℃）ジオキサン５０ｍｌで３度洗浄する。次いで、このようにしてリサイクルした生体触媒を、上述と同じ条件で再使用する。この手順を全６回繰り返す。
【００９０】
図３から明白なように、観測可能な活性低下なしに少なくとも７度、この生体触媒を反応に使用することができる。
【００９１】
実施例９：生体触媒の速度論的パラメータの測定
酵素的Ｎ−アシル化の速度論的パラメータを、以下の通りに測定した：一方の反応物濃度は変えるが、他方の濃度は一定に保った。反応は、いずれの場合にも同量の酵素を使用して、８０℃のジオキサン中で実施した。試料を定期的に採取してガスクロマトグラフィで分析した；それから、それぞれの初期速度を決定し、Lineweaver-Burkに準拠して解析した。決定された結果は、フィトスフィンゴシンに関してはＫＭ値４００ｍＭであり、またステアリン酸メチルに関してはＫＭ値１９６ｍＭであった。
【００９２】
実施例１０：温度が反応速度に及ぼす影響
酵素反応を様々な温度で実施し、基質は、すべての場合に等モル量で使用した。使用した酵素量は、いずれの場合にも１.４％（ｗ／ｗ）であった。初期速度のガスクロマトグラフ評価の結果および４時間後の変換の結果も、表２に報告する。
【００９３】
【表２】
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【００９４】
実施例１１：様々な溶媒の使用
フィトスフィンゴシンおよびステアリン酸メチルを、８０℃のそれぞれの溶剤中に１Ｍで各々溶解し、５％（ｗ／ｗ）のNovozym 435と混合して撹拌した。定期的に試料を採取してガスクロマトグラフィで分析した。図４から明白なように、変換時間曲線および個々の反応の２４時間後の変換も、ほぼ一致した。
【００９５】
実施例１２：フィトスフィンゴシンと様々な脂肪酸エステルとの酵素反応
フィトスフィンゴシンおよび表３に報告したアシルドナーを、各々１Ｍで８０℃の溶剤に溶解し、５％（ｗ／ｗ）のNovozym 435と混合して撹拌した。定期的に試料を採取して、ガスクロマトグラフィで分析した。
【００９６】
【表３】
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【００９７】
実施例１３：生成物の選択的結晶化
ステアリン酸メチル（７３４ｍＭ）およびフィトスフィンゴシン（１４６ｍＭ）を、８０℃の２−メチル−２−ブタノールに溶解し、５％（ｗ／ｗ）のNovozym 435と混合し、８０℃で２０時間撹拌した。次いで、酵素を熱濾去し、透き通った出発溶液を一晩、４５℃に温度調節した。沈殿した固体を濾去し、濾液および濾過残渣を、ガスクロマトグラフで分析した。表４から明らかなように、基質が超過剰に存在する場合でも、分別沈殿によって、所望の生成物を選択的に濃縮することが可能になる。
【００９８】
【表４】
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【００９９】
実施例１４：アシルドナーとしてのトリステアリン
トリグリセリド（トリステアリン）をアシルドナーとして使用して、酵素反応を実施した。８０℃で、ジオキサン１７ｇ中にフィトスフィンゴシン５.４ｇおよびトリステアリン５ｇを含む溶液に、Novozym 435  ０.５ｇを加え、大気圧下で撹拌した。試料を定期的に採取し、ガスクロマトグラフィで分析した。
【０１００】
図５から明らかなように、アシルドナーの完全変換は可能である。驚くべきことに、中間体部分グリセリド（グリセロールジステアレートまたはグリセロールモノステアレート）はほとんど確認されないことが、ガスクロマトグラフィによる分析から明らかになった。
【０１０１】
実施例１５：フィトスフィンゴシンサルフェートからのＮ−ステアロイルフィトスフィンゴシンのワンポット合成
フィトスフィンゴシンサルフェート（Cosmoferm, Delft,NL）１００ｇを、５５℃のＭＩＢＫ（メチルイソブチルケトン）１００ｍｌに懸濁させ、ナトリウムメトキシド４６ｇと混合し、５５℃で１８０分間、撹拌する。次いで、ステアリン酸メチル７３.３ｇおよびNovo435  ５ｇを加える。このようにして得た懸濁液を、８０℃で３６時間撹拌し、熱濾去する。透き通った濾液を、室温で４時間静置し、沈殿した透き通ったベージュ色の固体（Ｎ−ステアロイルフィトスフィンゴシン１２２.３ｇ、純度＞９７％）を濾去する。
【０１０２】
実施例１６：固定床反応器でのパイロットバッチ
フィトスフィンゴシンサルフェート２０７.８ｇを、ＮａＯＣＨ３溶液（メタノール中２５％濃度）１０８.０４ｇと共に５５℃のＭＩＢＫ  ５００ｍｌに懸濁させ、続いてフィルタープレスを介して固定床反応器に熱いうちに移し、ステアリン酸メチル１４９.３ｇと混合する。この固定床は、Novozyme 435  １７.８ｇを含む。反応器全体を、８０℃に温度調節する。約２５ｍｌ分−１のポンプ流量で反応混合物を固定床に流す。０.８ｂａｒの圧力下、過剰のメタノールを除去する。２４時間後、この反応器に窒素を通気し、反応器を空にして、この反応溶液を室温で一晩静置する。沈殿した固体を濾去する（Ｎ−ステアロイルフィトスフィンゴシン２８７.１ｇ、純度９８.７％）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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