(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＩ型糖尿病の治療用の化合物を識別する方法であって、
（ａ）膵β細胞を、１または複数の試験化合物と接触させること、および
（ｂ）前記膵β細胞における、イノシトールヘキサリン酸キナーゼ１（ＩＰ６Ｋ１）の発現レベルおよび５−ジホスホイノシトールペンタキスリン酸（ＩｎｓＰ７）のレベルのうちの少なくとも一方を決定すること、からなり、
対照に対する、前記ＩＰ６Ｋ１の発現レベルの増加および前記ＩｎｓＰ７のレベルの増加のうちの少なくとも一方が、該試験化合物がＩＩ型糖尿病を治療するのに適していることを示す方法。
【請求項２】
前記接触させることが、基本グルコース条件下で起こる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記膵β細胞は、膵組織、膵臓の単離されたランゲルハンス膵島、単離された膵β膵島細胞、およびインスリン分泌細胞株から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記膵β細胞は、膵臓の単離されたランゲルハンス膵島である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
膵β細胞で前記試験化合物により誘発されるインスリン放出を測定すること、および該測定値を対照と比較することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試験化合物により誘発される膵β細胞キャパシタンスを測定すること、および該測定値を対照と比較することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記決定することは、膵β細胞におけるイノシトールヘキサリン酸キナーゼ１（ＩＰ６Ｋ１）の発現レベルを決定することからなる請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記決定することは、膵β細胞における５−ジホスホイノシトールペンタキスリン酸（ＩｎｓＰ７）のレベルを決定することからなる請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
患者におけるＩＩ型糖尿病を治療するための医薬組成物であって、
有効量のイノシトールヘキサリン酸キナーゼ１（ＩＰ６Ｋ１）の発現を増加させることが可能な治療薬
を含み、該治療薬が、前記ＩＰ６Ｋ１を含む遺伝子治療ベクター、もしくは前記ＩＰ６Ｋ１である、医薬組成物。
【請求項１０】
患者におけるＩＩ型糖尿病を治療するための医薬組成物であって、
有効量の５−ジホスホイノシトールペンタキスリン酸（ＩｎｓＰ７）の生産を増加させることが可能な治療薬
を含み、該治療薬が、イノシトールヘキサリン酸キナーゼ１（ＩＰ６Ｋ１）を含む遺伝子治療ベクター、前記ＩＰ６Ｋ１、または前記ＩｎｓＰ７である、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はII型糖尿病の治療のための試薬および方法と、II型糖尿病の治療のための化合物の識別方法とに関する。
（相互参照）
本願は、２００７年８月３１日に出願された米国仮特許出願出願番号第６０／９６９，４４３号の優先権を主張し、該出願全体を援用する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホイノシチドは、その水溶性型と脂質型の両方で、細胞シグナル伝達事象において大きな役割を有している。重要な事象は、イノシトール１，４，５−トリリン酸（Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ３）の生成およびそれによる細胞内Ｃａ2+ホメオスタシス（１）ならびにホスファチジルイノシトール（ＰＩ３キナーゼ）の３−リン酸化イノシトール脂質産物（２）の調節であり、有糸分裂誘発、アポトーシス、および小胞輸送において多様な役割を果たしている。ホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸（Ｐｔｄｌｎｓ（４，５）Ｐ２）は、上記２つのシグナル伝達系の主な源であるが、上記シグナル伝達経路に関する単なる前駆物質ではなく、それ自体、小胞輸送、エキソサイトーシス、細胞骨格転位、およびイオンチャンネルの調節（３）において重要な役割を果たしている。最近の十年間で、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ３セカンドメッセンジャーの遠い誘導体である高度にリン酸化したイノシトールポリリン酸が、シグナル伝達および細胞調節において役割を果たしていることもよく認識されるようになってきた（４−６）。恐らく、最も心躍る新しい展望が、イノシトールペンタキスリン酸およびイノシトールヘキサキスリン酸の両方のジエステル誘導体の役割に関する（ＩｎｓＰ５およびＩｎｓＰ６）。ＩｎｓＰ６ジホスホイノシトールペンタキスリン酸のピロリン酸誘導体とビス−（ジホスホ）イノシトールテトラキスリン酸は、一般に「ＩｎｓＰ７」および「ＩｎｓＰ８」と呼ばれている。これらのイノシトールピロリン酸誘導体は急速にターンオーバーし、ＡＴＰと同様な加水分解の自由エネルギーを有すると推測される（４）。この高エネルギーリン酸グループの著しい結果、ＩｎｓＰ7はＡＴＰ独立的かつ酵素独立的な態様でタンパク質の部分を直接リン酸化す
ることができる（７）。細胞応答の種類は、見たところかかる分子によって制御されるが（４，８）、かかる分子を作るキナーゼの細胞内分布の差により促進され得る（９）。イノシトールピロリン酸の濃度は、重要な細胞事象の最中に動的に制御され、その細胞機能に対する重要を強調している。例えば、ＩｎｓＰ７レベルは細胞周期の進行中に変化する（１０）。また、ＩｎｓＰ７はサイクリン／ＣＤＫ複合体を調節するが（１１）、ＩｎｓＰ８は細胞ストレスに応じて急増する（８）。しかしながら、最近の研究によって、ＩｎｓＰ６の酵素の補因子としての役割等も類推により分かってきており、非刺激条件下でさえＩｎｓＰ７が重要な制御分子である可能性がある。
【０００３】
ホスホイノシチドは、インシュリンを分泌する膵臓のβ細胞の重要な調節因子でもある（１２）。膵β細胞は血糖ホメオスタシスに重要な役割を果たしており、カップリングによりグルコースおよび他の循環調節因子または神経由来調節因子の濃度を増大させるよう作用し、インシュリンのエキソサイトーシスに至る。高度リン酸化ＩｎｓＰ６は、それが電圧依存性Ｌ型Ｃａ2+チャンネル（７３）、エキソサイトーシス（１４,１５）およびダ
イナミン媒介性エンドサイトーシス（７６）を活性化することが示されているが、これらはインシュリン分泌のすべてのキープロセスであるため特に興味深い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
β細胞におけるＩｎｓＰ７の役割はいまだ決定されていない。しかしながら、小胞輸送
でのイノシトールピロリン酸の関与の示唆（４）、インシュリンエキソサイトーシスのプロセスに対するかかる輸送事象の重要性、およびＩｎｓＰ７の直近の前駆物質であるＩｎｓＰ６がβ細胞で高濃度であること（７３）に鑑みると、イノシトールピロリン酸はβ細胞において重要な役割を果たしていると本願発明者らは仮定する。本願発明者らは本願において、インシュリンエキソサイトーシスの調節におけるＩｎｓＰ７の新規な役割について実証する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１態様では、本発明は、II型糖尿病の治療方法であって、有効量のＩＰ６Ｋ１キナーゼの発現を増加させることが可能な治療薬を、II型糖尿病の患者に投与することからなる方法を提供する。
【０００６】
別の態様では、本発明は、膵β細胞からのインシュリンエキソサイトーシスを刺激する方法であって、有効量の発現ＩＰ６ＫＩキナーゼを増加させることが可能な治療薬を、膵β細胞からのインシュリンエキソサイトーシスの刺激が必要な患者に投与することからなる方法を提供する。
【０００７】
別の態様では、本発明は、II型糖尿病を治療する方法であって、有効量のＩｎｓＰ７の生産を増加させることが可能な治療薬を、II型糖尿病の患者に投与することからなる方法。
【０００８】
さらなる態様では、本発明は、II型糖尿病の治療用の化合物を識別する方法であって、
（ａ）膵β細胞を、１または複数の試験化合物と接触させること、および
（ｂ）ＩＰ６Ｋ１キナーゼの発現レベルおよびＩｎｓＰ７のレベルのうちの少なくとも一方を決定すること、からなり、
前記ＩＰ６Ｋ１キナーゼの発現の増加およびＩｎｓＰ７の増加のうちの少なくとも一方が、該試験化合物がII型糖尿病を治療するのに適していることを示す方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】高い基本レベルのＩｎｓＰ７が膵β細胞中に存在し、ＩＰ６Ｋが膵β細胞中で発現している。（Ａ）初代膵島またはインシュリン分泌ＭＩＮ６ｍ９細胞での［３Ｈ］標識ＩｎｓＰ６の百分率としての［３Ｈ］標識ＩｎｓＰ７の比較。データは３つの別個の実験から得たものである。（Ｂ）（Ａ）の膵島データを正常島（６０％）対ｏｂ／ｏｂ（９０％）の種々のβ細胞組成を考慮するために変換した。（Ｃ）全体ＲＮＡを島およびＭＩＮ６ｍ９細胞から抽出し、逆転写した。伝令ＲＮＡの相対発現を、適切なプライマーおよびプローブを使用して定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。１８ＳリボソームＲＮＡ（ＴａｑＭａｎ（商標）リボソームＲＮＡコントロール試薬、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を内在性対照として使用した。
【図２】ＩＰ６Ｋの発現は、膵β細胞におけるエキソサイトーシスを促進する。ＩＰ６Ｋ１はＣａ2+依存性エキソサイトーシスを刺激する。（Ａ）個々のマウスβ細胞をＥＧＦＰ（ｍｏｃｋ）で、またはＥＧＦＰと野生型（ＩＰ６Ｋ１）またはＩＰ６Ｋのキナーゼ不活性（ＩＰ６Ｋ１−Ｋ／Ａ）変異型のいずれかとの組み合わせでトランスフェクトし、穿孔パッチ構成を用いて一連の４回の５００ミリ秒の脱分極を受けた。細胞キャパシタンス（ΔＣｍ）の増大が細胞外培地中の３ｍＭグルコースで測定した。（Ｂ）個々の脱分極に対してプロットした細胞やパシタンスの平均増大およびｍｏｃｋ（偽の）トランスフェクトをしたか野生型（ＩＰ６Ｋ１）またはキナーゼ不活性（ＩＰ６Ｋ１−Ｋ／Ａ）ＩＰ６Ｋのいずれかを過剰発現している細胞での一連の脱分極の最後における細胞キャパシタンスの増大の合計を表すヒストグラム（Ｃ）ｍｏｃｋトランスフェクトしたか野生型またはＩＰ６Ｋ１−Ｋ／Ａ）のいずれかを過剰発現している細胞における個々の脱分極に対してプロットした統合Ｃａ2+電流（ＱＣａ）を示すヒストグラム。値は８−１２回の実験から得たものである。＊Ｐ＜０．０５。（Ｄ）ｍｏｃｋトランスフェクト細胞または野生型（ＩＰ６Ｋｎ）またはキナーゼ不活性（ＩＰ６Ｋ１−Ｋ／Ａ）１，２，および３型キナーゼのいずれかを過剰発現している細胞における一連の脱分極の最後における細胞キャパシタンスの平均合計増大を表すヒストグラム。値は７−１２回の実験から得たものである。＊Ｐ＜０．０５。（Ｅ）ＩＮＳ−１Ｅ細胞を、ｐＣＭＶ５−ｈＧＨおよび空のベクター（ｐｃＤＮＡ３）（ｍｏｃｋ）と平行して同時トランスフェクトするか、ｐＣＭＶ５−ｈＧＨと野生型（ＩＰ６Ｋｎ）またはキナーゼ不活性（ＩＰ６Ｋ１−Ｋ／Ａ）１，２および３型キナーゼとで同時トランスフェクトした。ｈＧＨ分泌を３ｍＭグルコースのＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ重炭酸塩ＨＥＰＥＳ緩衝液で比較した。ｈＧＨ放出は、分泌されたｈＧＨとして合計ｈＧＨの百分率で示している。値は３つの実験（各々三連とする）から得たものである。＊Ｐ＜０．０５。
【図３】ＩｎｓＰ７は、用量依存的にＣａ2+依存性エキソサイトーシスを促進する個々のマウスβ細胞を、標準の全細胞のパッチ構成を使用して、一連４回、５００ミリ秒で脱分極させた。（Ａ）エキソサイトーシスは、対照条件下でおよびピペット充填溶液中の３μＭ  ５−ＩｎｓＰ７の存在下で観察された。５−ＩｎｓＰ７を２分間細胞へ拡散させてから、実験を開始した。（Ｂ）３μＭ  ５−ＩｎｓＰ７  ピペット充填溶液の不在下または存在下での個々の脱分極に対してプロットした細胞キャパシタンスの平均増加と、一連の脱分極の最後における細胞キャパシタンスの合計増加とを表すヒストグラム。（Ｃ）３μＭ  ＩｎｓＰ７  ピペット充填溶液の不在下または存在下での個々の脱分極に対してプロットした統合Ｃａ2+流れ（ＱＣａ）を示すヒストグラム。（Ｄ）−７０ｍＶから０までの一回の膜脱分極により引き起こされるエキソサイトーシスに対する５−ＩｎｓＰ７の刺激作用の濃度依存性。曲線はヒル方程式に対する平均データポイントの最小二乗法を表わす。値は５−７回の実験から得たものである。＊Ｐ＜０．０５。（Ｅ）上記の（Ａ）と同じプロトコルを使用したエキソサイトーシスに対する１０μＭ濃度のＩｎｓＰ７のいくつかの異性体の比較。
【図４】ＩＰ６Ｋ２ではなくＩＰ６Ｋ１のＲＮＡサイレンシングは、ＲＲＰからの顆粒の放出を阻害する。（Ａ）  個々のマウスβ−細胞を、２５ｎＭのＩＰ６Ｋ１（番号１）に対するｓｉＲＮＡでトランスフェクトするかまたは同じ濃度の陰性対照でトランスフェクトし、穿孔パッチ構成を使用して一連で４回、５００ミリ秒で脱分極させた。細胞キャパシタンス（ΔＣｍ）の増加を、細胞外培地中の３ｍＭグルコースで測定した。（Ｂ）ｍｏｃｋトランスフェクトさせるかＩＰ６Ｋ１に対するｓｉＲＮＡまたは陰性対照のいずれかを過剰発現した細胞における、個々の脱分極に対してプロットした細胞キャパシタンスの平均増大および一連の脱分極の最後における細胞キャパシタンスの合計増大を示すヒストグラム。（Ｃ）ＩＰ６Ｋ１とＩＰ６Ｋ２のＲＮＡサイレンシング後のキャパシタンス増加の合計に対する影響。（Ｄ）対照条件下およびＩＰ６Ｋ１の発現レベルが低減された細胞でのエキソサイトーシスに対する５−ＩｎｓＰ７の影響。
【図５】エキソサイトーシスに対する５−ＩｎｓＰ７の影響はＩｎｓＰ６とは異なる。個々のマウスβ細胞を、標準の全細胞のパッチ構成を使用して、一連４回、５００ミリ秒で脱分極させた。エキソサイトーシスは、対照条件下でおよびピペット充填溶液中の３μＭ  ５−ＩｎｓＰ７または１０μＭ  ＩｎｓＰの存在下で観察された。リン酸イノシトールを、２分間細胞へ拡散させてから、実験を開始した。
【図６】ＭＩＮ６ｍ９細胞でのｓｉＲＮＡのスクリーニング。各ＩＰ６Ｋに対して６つのｓｉＲＮＡを、１００ｍＮでＭＩＮ６ｍ９細胞をサイレンシングするその能力についてスクリーニングした。そして、ＩＰ６Ｋ１またはＩＰ６Ｋ２をサイレンシングするために、各ケースで２つ、ＩＰ６Ｋ１（１と４）およびＩＰ６Ｋ２（３と５）を個別にまたは組み合わせて用いた。これを２つの陰性対照と比較した。ｍＲＮＡを抽出し、遺伝子の発現量をＴａｑｍａｎ（商標）ＲＴ−ＰＣＲで測定した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。
【図７】ＩＰ６Ｋ１またはＩＰ６Ｋ２のＲＮＡサイレンシングは細胞ＩｎｓＰ７レベルを低下させる。ＭＩＮ６ｍ９細胞を、陰性対照かＩＰ６Ｋ１および2のいずれかに対して選択したｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＩＰ６Ｋ１（１と４）に対するｓｉＲＮＡを、２５ｎＭで各々加えた。ＩＰ６Ｋ２（３と５）に対するｓｉＲＮＡを同様の濃度で加えた。これを５０ｎＭの陰性対照の添加により対照比較した。４つのｓｉＲＮＡはすべて同時に適用し、１００ｎＭ陰性対照ｓｉＲＮＡにより対照比較した。ｓｉＲＮＡでのトランスフェクトの２時間後、培地を５０μＣｉ／ｍｌ［３Ｈ］イノシトール含有培地に変更し、細胞を４８時間から７２時間培養した。細胞を抽出し、ＨＰＬＣにかけた。データはイノシトール脂質の合計に対して表され、３つの個別の実験からの平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。
【図８】ＭＩＮ６ｍ９細胞における単一Ｌ型Ｃａ2+チャンネル活性に対するＩＰ６Ｋ１−ｓｉＲＮＡの効果。ＭＩＮ６ｍ９細胞を、５０ｎＭの陰性対照に対して選択されたｓｉＲＮＡで、またはＩＰ６Ｋ１に対するｓｉＲＮＡ（１および４）それぞれ２５ｎＭでトランスフェクトした。（Ａ）対照細胞（陰性対照ｓｉＲＮＡトランスフェクション、左）およびＩＰ６Ｋ１−ｓｉＲＮＡを受けた細胞（右）に対する細胞に取り付けたパッチから記録された単一Ｃａ2+チャンネル電流の例。いずれのパッチも１つのＬ型Ｃａ2+チャンネルを含んでいる。（Ｂ）対照ＭＩＮ６ｍ９細胞（ｎ＝３０）およびＩＰ６Ｋ１−ｓｉＲＮＡを受けた細胞（ｎ＝３０）における単一Ｌ型Ｃａ2+チャンネルの電流パラメータ。対照ＭＩＮ６ｍ９細胞とＩＰ６Ｋ１−ｓｉＲＮＡを受けた細胞との間で、１つのパッチ当たりのチャンネル数、開確率、平均閉時間、平均開時間に有意差はない（Ｐ＞０．０５）。データは平均±ＳＥＭとして示す。統計学的有意差は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ試験またはｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ試験のいずれかにより評価した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本願では、特段の定めがない限り、使用した技術は、以下のようないくつかの周知文献に見出されるものである：Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, placeCitySan Diego, StateCA), "Guide to Protein Purification" in Methods in Enzymology (M. P. Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, placeCitySan Diego, StateCA), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed. (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY), Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N. J.), およびthe Ambion 1998 Catalog (Ambion, Austin, TX)。
【００１１】
１態様では、本発明は、II型糖尿病の治療方法であって、II型糖尿病の患者に、II型糖尿病を治療するのに有効な量の患者の膵β細胞におけるＩｎｓＰ７を増加させることが可能な治療薬を投与することからなる方法を提供する。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、II型糖尿病の治療方法であって、II型糖尿病の患者に、II型糖尿病治療するのに有効な量の患者の膵β細胞におけるＩＰ６Ｋ１キナーゼの発現を増加させることが可能な治療薬を投与することからなる方法を提供する。
【００１３】
本願発明者らが添付書類で実証したように、膵β細胞は高レベルのＩｎｓＰ７を維持している。その後、このピロリン酸塩は、インシュリンを含有する顆粒の容易に放出されるプールを制御し、それによりβ細胞の即時のエキソサイトーシス能を維持することにより、インスリン分泌プロセスにおける重要な責任分子としての役割を果たす。本発明者らはさらに、ＩＰ６Ｋ１により生成された内在性ＩｎｓＰ７が膵β細胞のエキソサイトーシス能の増強の原因であることをさらに示した。したがって、ＩＰ６Ｋ１キナーゼの発現を増加させることが可能な治療薬を、ＩｎｓＰ７の生成し、その結果膵β細胞のエキソサイトーシス能を増大させることにより、II型糖尿病を治療するために使用することが可能であ
る。
【００１４】
１実施形態では、治療薬は、ＩＰ６Ｋ１またはその活性断片の発現を指向する遺伝子治療ベクターを含む。（タンパク質アクセッション情報：Ｑ９２５５１（配列番号１）；ｃＤＮＡアクセッション情報（オールタナティブスプライス変異型）１．ＮＭ＿１５３２７３．３（配列番号３）、２．ＮＭ＿００１００６１１５（配列番号２）遺伝子治療ベクターは、ＩＰ６Ｋ１またはその活性断片の発現を指向する遺伝子治療ベクターを含む。遺伝子治療方法は、ＩＰ６Ｋ１またはその活性断片を発現可能な核酸構築物を患者に、好ましくは患者の膵β細胞に投与することを含む。１例では、ｃＤＮＡ配列がインシュリンプロモーターと作用的に結合される（Leibiger, MoI. Cell. 1:933-938 (1998)）。そのよう
な遺伝子治療および送達方法は例えば本願に援用するWO90/11092またはM. I. Phillips (Ed.): Gene Therapy Methods. Methods in Enzymology, Vol. 346, Academic Press, placeCitySan Diego 2002に記載されているように当該技術分野で周知である。したがって、例えば、患者由来の細胞を、導入される分子に対応する核酸と作用的に結合されたプロモータを含む核酸構築物でエキソビボにより組み換え、次に、かかる組換え細胞を治療される患者に与えてもよい。かかる方法は当該技術分野では周知である。例えば、本願に援用するBelidegrun, A., et al., J. Natl. Cancer Inst. 85: 207-216 (1993); Ferrantini, M. et al., Cancer Research 53: 1107-1112 (1993); Ferrantini, M. et al., J. Immunology 153: 4604-4615 (1994); Kaido, T., et al., Int. J. Cancer 60: 221-229 (1995); Ogura, H., et al., Cancer Research 50: 5102-5106 (1990); Santodonato, L., et al., Human Gene Therapy 7:1-10 (1996); Santodonato, L., et al., Gene Th erapy 4:1246-1255 (1997); および Zhang, J.-F. et al., Cancer Gene Therapy 3: 31-38 (1996))を参照されたい。組換えられる細胞は、例えば膵β細胞であってよい。
【００１５】
核酸分子は裸の核酸分子として送達されてもよい。用語「裸の」核酸分子とは、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチンまたは沈降剤等を含む細胞への進入を支援、増進、または促進するよう作用する任意の送達手段を含まない配列を指す。しかしながら、遺伝子治療に使用される核酸分子は、当業者に周知の方法により調製可能なリポソーム製剤およびリポフェクチン製剤等によっても送達される。そのような方法は例えば本願に援用する米国特許第５，５９３，９７２号、第５，５８９，４６６号および第５，５８０，８５９号に記載されている。
【００１６】
裸の核酸分子は、送達部位での直接の針による注射、静脈注射、局所投与、カテーテル注入およびいわゆる「遺伝子銃」を含むがこれらに限定されない当該技術分野で周知の任意の方法により送達される。これらの送達方法は当該技術分野で周知である。構築物は、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチン等の伝達手段で送達されてもよい。
【００１７】
別の実施形態では、治療薬は、ＩＰ６Ｋ１またはその活性断片を含む。ポリペプチドは、活性領域を細胞膜を横切って搬送可能な１または複数のアミノ酸配列または他の分子である伝達領域（transduction domain）を備えた結合体としての送達を含むがこれに限定
されない任意の適切な技術により投与することができる。そのような領域は、結合されたポリペプチドの細胞膜を横切る直接移動を行うよう、他のポリペプチドに結合可能である（例えばCell 55: 1179-1188, 1988; Cell 55: 1189-1193, 1988; Proc Natl Acad Sci U
S A 9V. 664- 668, 1994; Science 285: 1569-1572, 1999; J Biol Chem 276: 3254-3261 , 2001 ; and Cancer Res 61 : 474-477, 2001参照）。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、II型糖尿病の治療用の化合物を識別する方法であって、
（ａ）膵β細胞を、１または複数の試験化合物と接触させること、および
（ｂ）ＩＰ６Ｋ１キナーゼの発現レベルおよびＩｎｓＰ７のレベルのうちの少なくとも
一方を決定すること、からなり、
前記ＩＰ６Ｋ１キナーゼの発現の増加およびＩｎｓＰ７の増加のうちの少なくとも一方が、該試験化合物がII型糖尿病を治療するのに適していることを示す方法を提供する。
【００１９】
上述したように、ＩＰ６Ｋ１キナーゼの発現を増加させることが可能な治療薬を使用してＩｎｓＰ７を生成し、それにより膵β細胞のエキソサイトーシス能を増大させることにより、II型糖尿病を治療することが可能である。したがって、膵β細胞のＩＰ６Ｋ１キナーゼおよびＩｎｓＰ７のうちの少なくとも一報の発現を増加させるために使用することが可能な化合物をII型糖尿病の治療のために使用することができる。
【００２０】
膵β細胞のＩＰ６Ｋ１キナーゼの発現レベルおよびＩｎｓＰ７の増加のうちの少なくとも一方の決定は、以下の例に開示されるがそれらに限定されない当該技術分野の任意の技術を用いて行うことが可能である。
【００２１】
本明細書に使用する場合、「基本グルコース条件」とは、１〜６ｍＭグルコースの間のグルコース濃度を意味し、１実施形態では、３ｍＭグルコースが使用される。当業者には理解されるように、基本グルコース濃度は種によって変わり得る。基本グルコース濃度は、細胞質の遊離Ｃａ2+濃度またはインシュリン放出等の変化を引き起こさない条件により、任意の特定の細胞または組織の種類に対して決定することが可能である。
【００２２】
本明細書に使用する場合、「膵β細胞」とは、膵臓のβ膵島細胞を含む任意の細胞集団である。細胞は任意の哺乳動物から得手もよいし、またはアッセイがインビボで行われる場合には哺乳動物種内に存在していてもよい。そのような膵臓のβ膵島細胞集団は、膵臓の単離されたランゲルハンス膵島（「膵島」）、単離された膵β膵島細胞、およびインスリン分泌細胞株を含む。膵臓の単離方法は当該技術分野で周知であり、膵島を分離する方法は例えばCejvan et al., Diabetes 52:1176-1181 (2003); Zambre et al., Biochem. Pharmacol. 57:1159-1164 (1999), およびFagan et al., Surgery 124:254-259 (1998)な
らびにそれらの文献に引用されている文献に見出すことができる。インスリン分泌細胞株は米国培養寄託機関（「ＡＴＣＣ」）（メリーランド州ロックヴィル所在）から利用可能である。膵β細胞が使用されるさらなる実施形態では、それらは膵島に９５％を超えるβ細胞を含むｏｂ／ｏｂマウスから得られる。
【００２３】
膵β細胞でのＩＰ６Ｋ１キナーゼの発現を増加および／またはＩｎｓＰ７を増加させる１または複数の試験化合物の能力についての最適な情報を得るためには、対照細胞のレベルと、実験細胞でのＩＰ６Ｋ１キナーゼおよび／またはＩｎｓＰ７レベルを比較することが好ましい。そのような対照細胞は、下記の１つ以上を含み得る。
【００２４】
１．１または複数の試験化合物と接触させない以外は、同じ方法で処理される同じ宿主細胞、
２．（時間依存的効果の分析のため）異なる時点で前記１または複数の試験化合物と接触させる以外は、同じ方法で処理される同じ宿主細胞、および
３．（濃度依存的効果の分析のため）異なる濃度で前記１または複数の試験化合物と接触させる以外は、同じ方法で処理される同じ宿主細胞。
【００２５】
試験化合物がポリペプチド配列を含む場合、そのようなポリペプチドは化学合成されてもよいし、組み換えで発現されてもよい。組換え発現は、上記に開示したような当該技術分野の標準的方法を使用して行うことができる。そのような発現ベクターはバクテリア発現ベクターまたはウイルス発現ベクターを含んでよく、そのような宿主細胞は原核生物であってもよいし、真核生物であってもよい。固相法、液相法またはペプチド縮合法、またはそれらの任意の組み合わせを含む周知の技術を用いて調製された合成ポリペプチドは、
天然または非天然のアミノ酸を含んでもよい。ペプチド合成に使用されるアミノ酸は、標準的な脱保護、中和、カップリングおよび洗浄プロトコルによる標準Ｂｏｃ（Ｎαアミノ保護Ｎα−ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ酸樹脂であるか、または標準のベースが不安定なＮα−アミノ保護９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸であってよい。ＦｍｏｃおよびＢｏｃ  Ｎα−保護アミノ酸のいずれもＳｉｇｍａ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社、または当業者によく知られている他の化学会社から得ることができる。さらにポリペプチドは、当業者に周知の他のＮα保護基を用いても合成することができる。固相ペプチド合成は、当業者に周知の方法により遂行され、例えば自動合成装置の使用により与えられる。
【００２６】
試験化合物が抗体を含む場合、そのような抗体はポリクローナルであってもよいしモノクローナルであってもよい。抗体は、抗体のヒト化型、完全ヒト型、またはマウス型のいずれであってもよい。かかる抗体はHarlow and Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)等の周知の方法
により製造可能である。
【００２７】
試験化合物が核酸配列を含む場合、そのような核酸は化学合成されてもよいし、組み換え発現されてもよい。組換え発現技術は周知である（例えば前掲のSambrook, et al., 1989参照）。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであってもよいし、一本鎖または二本鎖であってもよい。同様に、かかる核酸は、当該技術分野の標準的技術を用いて手動または自動の反応により化学的にまたは酵素的に合成してもよい。化学的にまたはインビトロで酵素的合成により合成される場合、核酸は細胞への導入前に精製されてもよい。例えば、溶媒または樹脂、沈降、電気泳動、クロマトグラフィまたはそれらの組み合わせによる抽出により、混合物から核酸を除去することが可能である。代わりに、核酸はサンプル処理による損失を回避するために精製を全く行わないか最低限行って使用されてもよい。
【００２８】
試験化合物が、ポリペプチド、抗体または核酸以外の化合物を含む場合、かかる化合物は有機化学合成を行うための当該技術分野の任意の種々の方法により製造可能である。
膵β細胞でのＩＰ６Ｋ１キナーゼの発現を増加および／またはＩｎｓＰ７を増加させるとして識別された試験化合物は、任意のさらなる手法を用いて、II型糖尿病を治療するための候補化合物として使用されるか否かをさらに評価してもよい。かかる手法とは、限定ではないが、試験化合物を膵β細胞と接触させて試験化合物により誘発されるインスリン放出を測定したり、および／または試験化合物により誘発される膵β細胞キャパシタンスを測定したりすることを含み、インスリン放出および／またはキャパシティ（これは以下に説明するようにインシュリンエキソサイトーシスの指標である）を増大させる化合物は、対照と比較して、II型糖尿病の治療のための候補化合物として特に価値を有し得る。さらなる実施形態では、以下に記述されるようにキャパシタンスの測定が行なわれ、最初の脱分極でエキソサイトーシス反応を誘発する試験化合物はII型糖尿病の治療のための良い候補化合物と考えられる。
【００２９】
実施例
材料および方法
試薬および構築物。
【００３０】
以前に記載されたように（２５）、５−ジホスホイノイトールペンタキスリン酸（ＩｎｓＰ７）を合成した。ＩＰ６Ｋ１、ＩＰ６Ｋ２およびＩＰ６Ｋ３のＯＲＦを、Ｓａｌｌ−Ｎｏｔｌ  ｐＣＭＶ−ＩＰ６Ｋ１およびｐＣＭＶ−ＩＰ６Ｋ２（２６）を用いた消化により、およびＳａｌｌ  ｐＧＳＴ−ＩＰ６Ｋ３（２７）を用いた消化により得た。精製ＯＲＦを、真核生物発現ベクターｐＣＭＶ−Ｍｙｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）でサブクローニングした。キナーゼ不活性型を以下のように調製した。以前の研究では、触媒活性にとって
重要なＩｎｓＰ３ＫＡ中のリジンが識別されていた（２８）。マウスＩＰ６Ｋ１、ヒトＩＰ６Ｋ２およびヒトＩＰ６Ｋ３では、このリジンがそれぞれ２２６、２２２および２１７位置で生じている。ＩＰ６Ｋ１については、本願発明者らが、以下のオリゴヌクレオチドを使用してリジン２２６をアラニンへ変化させた：Ｋ２６Ａ、５’−ＧＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＴＧＧＣＣＡＴＧＧＧＴＡＣＣＣＧ−３’（配列番号４）およびその相補配列。ＩＰ６Ｋ２については、本願発明者らが、以下のオリゴヌクレオチドを使用してリジン２２２をアラニンへ変化させた：Ｋ２２２Ａ、５’−ＧＴＣＣＴＴＧＡＣＣＴＣＧＣＧＡＴＧＧＧＣＡＣＡＣＧＡ−３’（配列番号５）およびその相補配列。ＩＰ６Ｋ３については、本願発明者らが、以下のオリゴヌクレオチドを使用してリジン２１７をアラニンへ変化させた：Ｋ２１７Ａ、５’−ＣＣＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＣＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＧＧＣＡＧＣＡＣ−３’（配列番号６）およびその相補配列。構築物を、その効能を確立するためにＩＮＳ−１Ｅ細胞で試験した。ＩＰ６Ｋ１〜３およびそれぞれの触媒不活性型をＩＮＳ−１Ｅ細胞へトランスフェクトした（プロトコルは以下）。すべての構築物は、ウェスタンブロッティングで判断されるように同様のレベルで発現されていた。さらに、ＩＰ６Ｋ１〜３野生型では細胞ＩｎｓＰ７レベルが６倍まで増大したが、それらの触媒不活型（Ｋ／Ａ）では増大しなかった。
【００３１】
ＲＮＡｉはＡｍｂｉｏｎ  ｌｎｃ社（テキサス州オースチン）から得、ＩＰ６Ｋのサイレンシングには以下のＲＮＡｉ  ＩＤを使用した。ＩＰ６Ｋ１に対するＲＮＡｉ（１、ｓｉＲＮＡｉ  ＩＤ＝１８８５６０）および（４、ｓｉＲＮＡｉ  ＩＤ＝７１７５８）。ＩＰ６Ｋ２に対するＲＮＡｉ（３、ｓｉＲＮＡ  ＩＤ＝２８７７０２）および（５、ｓｉＲＮＡ  ＩＤ＝２９２２１１）。非標的対照（１、ｓｉＲＮＡ  ＩＤ  ）４６１１および（２およびｓｉＲＮＡ  ＩＤ＝４６１３）を陰性対照として使用した。これらのｓｉＲＮＡはＣｙ３蛍光タグと共にＡｍｂｉｏｎにより供給され、初代マウスβ細胞実験に使用した。
【００３２】
ＲＮＡ摘出およびリアルタイム−ＰＣＲ。
全体ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア）を使用して細胞から抽出した。ＲＮＡを１時間、３７℃でＤＮａｓｅＩにより消化し（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、ドイツセントレオンロット）、次にＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）で再精製した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社のＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅキットを使用して、製造業者の取扱説明書に従って１μｇの精製したＲＮＡを逆転写した。逆転写酵素反応から得られた３．９４μｌの生じたｃＤＮＡｓを１０、０６μｌ滅菌水に希釈し、各サンプルの１．２５μ１アリコートを三連で各異なる定量ＰＣＲ反応ごとに試験した。伝令ＲＮＡの相対発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓの生成物をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍに適用、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシティ）により測定した。分析には、以下のＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した：ＩＰ６Ｋ１に対して：イノシトールヘキサリン酸キナーゼ１、ＩＰ６Ｋ２に対して：イノシトールヘキサリン酸キナーゼ２、およびＩＰ６Ｋ３に対して：イノシトールヘキサリン酸キナーゼ３。１８ＳリボソームＲＮＡに対するプライマーおよびプローブ（ＴａｑＭａｎ（商標）Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を内在性対照として使用した。
【００３３】
細胞培養とトランスフェクション。
ＨＩＴ  Ｔ１５細胞およびマウス膵島を、以前に記載されたように（２９）ＲＰＭＩ−１６４０培地に維持した。特定のＲＰＭＩ−１６４０培地にそれぞれ存在するインスリン分泌ＨＩＴ  Ｔ１５細胞およびマウス膵島に対して、［３Ｈ］ミオイノシトール（ＧＥヘルスケア、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン、ウプサラ）１０または５０μＣｉ／ｍｌで、以前に記載されたように（２９）標識化を行った。細胞を７２時間で標識したが、４８−１６８時間の標識化ではＩｎｓＰ６対ＩｎｓＰ７の比が変化しなかった。実験のため、膵島または細胞を洗浄してＫｒｅｂｓ緩衝液に移し、基本グルコース条件（細胞株は０．１ｍＭおよび膵島は３ｍＭ）下で３０分インキュベートした。ポリリン酸イノシトールを以前に記載されたように（２９）ＨＰＬＣで抽出および分離した。他に記載されたように（３０）ＩＮＳ−１Ｅ細胞を培養した。マウス膵島を雌ＮＭＲＩマウス（Ｂｏｍｈｏｌｔｇａａｒｄ社、デンマーク、ライ）または正常血糖性ｏｂ／ｏｂマウスから、以前に記載されたように（３１，３２）分離した。細胞を１０％（ｖ／ｖ）の熱不活性化ウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）でインキュベートした。単一マウスの膵島細胞を、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（ｍｏｃｋ）またはｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰと対照構築物との組み合わせを２μｇ／ｍｌで上記ＲＰＭＩ  １６４０細胞培養培地にプレーティングした後日、製造業者の取扱説明書に従ってリポフェクトアミン（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて付着させてトランスフェクトした。リポフェクトアミン（商標）をＤＮＡに対して４：１の比で使用した。細胞をトランスフェクションの４８時間後に使用した。ＧＦＰ蛍光に基づくと、マウス膵島細胞中のトランスフェクション効率は８＋／−１％に及んだ（ｎ＝１２４細胞；４つの異なる細胞調製物およびトランスフェクション）。ＳｉＲＮＡをリポフェクトアミン（商標）２０００および最適ＭＥＭ（商標）培地を使用して、ＭＩＮ６ｍ９細胞および初代膵島細胞にトランスフェクトした。翌日培地をＭＩＮ６ｍ９細胞または初代膵島細胞のいずれかの通常の培地に変更し、細胞をさらに４日間培養した。
【００３４】
キャパシタンス測定。
キャパシタンス測定のために、ＥＧＦＰを発現している細胞を選択した。穿孔パッチまたはパッチクランプ技術の標準全細胞構成と、ＥＰＣ９パッチクランプアンプ（Ｈｅｋａ
Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ社、ドイツ、ランブレヒト／プファルツ）とを使用して、エキソサイトーシスを細胞キャパシタンスの変化としてモニタした。穿孔パッチ構成のピペット溶液は、（単位ｍＭで）７６  Ｃｓ２ＳＯ４、１０  ＮａＣＩ、１０  ＫＣｌ、１  ＭｇＣｌ２、５ＨＥＰＥＳ（ＣｓＯＨを使用してｐＨ７．３５）および０．２４ｍｇ／ｍｌアンホテリシンＢから構成された。穿孔には数分間が必要であり、Ｇｓｅｒｉｅｓ（一連のコンダクタンス）が安定し、＞３５ｎＳである場合に電圧クランプは満足であると考えられた。標準的な全細胞記録のために使用されるピペット溶液は、（単位ｍＭで）１２５  Ｃｓグルタミン酸塩、１０  ＣｓＣｌ、１０  ＮａＣｌ、１  ＭｇＣｌ２、５ＨＥＰＥＳ、０．０５  ＥＧＴＡ、０．０１  ＧＴＰ、および３  ＭｇＡＴＰ（ＣｓＯＨを使用してｐＨ７．１５）を含んでいた。ＩｎｓＰ７アイソフォームを、本文書に示した最終濃度になるようにピペット充填溶液に溶解させ、使用まで凍結した。細胞外培地は、（単位ｍＭで）１１８  ＮａＣＩ、２０  テトラエチルアンモニウム−Ｃｌ、５．６  ＫＣｌ、１．２  ＭｇＣｌ２、２．６  ＣａＣｌ２、５ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４０）および３  グルコースから構成した。刺激プロトコルは、１Ｈｚで適用される一連の４回の５００ミリ秒の脱分極から成り、−７０ｍＶから０ｍＶまでに及んだ。キャパシタンス測定は３３°Ｃで行ない、記録チャンバを１．５ｍｌ／分の速度で潅流した。
単一Ｌ型Ｃａ2+チャンネル活性の測定
細胞付着パッチの記録を、以前に記載されたように（３２）対照ＭＩＮ６ｍ９細胞およびＩＰ６Ｋ１−ｓｉＲＮＡを受けたＭＩＮ６ｍ９細胞に対して行なった。簡単に説明すると、一般に電極抵抗は２−４ＭΩとした。細胞付着シングルチャネル記録を、電荷担体としてＢａ2+を用いて行い：（単位はｍＭ）１１０  ＢａＣｌ２、１０  ＴＥＡ−Ｃｌ、５
ＨＥＰＥＳ−Ｂａ（ＯＨ）２およびｐＨ７．４、また、（単位はｍＭ）１２５  ＫＣｌ、３０  ＫＯＨ、１０  ＥＧＴＡ、２  ＣａＣｌ２、１  ＭｇＣｌ２、５  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨおよびｐＨ７．１５を含む脱分極用外部記録溶液を使用して、細胞内電位を約０ｍＶとする。記録はＡｘｏｐａｔｃｈ（商標）２００アンプ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、アメリカ合衆国カリフォルニア州フォスターシティ）で作成した。保持電位の−７０ｍＶから膜電位の０ｍＶに細胞を脱分極させるために、周波数０．５Ｈｚで電圧パルス（２００ミリ秒）を加える。生じた電流を１ｋＨｚでフィルタし、５ｋＨｚでデジタル化し、ソフトウェアプログラムｐＣＬＡＭＰ（商標）６（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、アメリカ合衆国カリフォルニア州フォスターシティ）で分析した。
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）放出分析
ｐＣＭＶ５−ｈＧＨと、空ベクターｐｃＤＮＡ３または対象プラスミドとによるトランスフェクション後、ＩＮＳ−１Ｅ細胞を４８−マルチウェルプレート（１つのウェル当たりの２×１０5細胞）に播き、４８時間培養した。インキュベーションと分泌実験は以前
に記載されたように（３３）、上述と同じ細胞外培地を使用し、３ｍＭグルコースを補給して行なった。
【００３５】
統計分析。
結果を、示した数の実験に対する平均値±平均値の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として示す。統計学的有意差を、対象に対する複数の比較の場合にはＤｕｎｎｅｔｔ試験で、複数のグループ間の多数の比較が要求される場合にはＴｕｋｅｙ試験を使用して評価した。
【００３６】
結果
［３Ｈ］ミオイノシトール標識プロトコルを使用して、本願発明者らは、インシュリン分泌細胞および膵島をイノシトールピロリン酸種の存在の有無について調べた。ＩｎｓＰ７は、ＩｎｓＰ６キナーゼを用いて生成された正規ＩｎｓＰ７標準との同時溶出により同定された（データは図示しない）。ＩｎｓＰ８はほとんど検知されなかった。図１Ａは、
インシュリン分泌または初代β細胞に対する細胞ＩｎｓＰ６レベルの割合として発現されたＩｎｓＰ７レベルを示す。正常マウスの膵島（６０％がβ細胞）では、ＩｎｓＰ７の相対レベルはＩｎｓＰβレベルの約５％である。対照的に、約９０％を超えるβ細胞を有するｏｂ／ｏｂマウスの膵島のＩｎｓＰ７の割合は約８％である。これは、ＩｎｓＰ７レベルの上昇がβ細胞に限定されることを示唆している。１００％のβ細胞へ初代マウスデータを正規化する（図１Ｂ）と、β細胞はＩｎｓＰ６濃度の約９％でＩｎｓＰ７レベルを維持していることをすること示唆している。インシュリン分泌細胞株のうち、ＨＩＴ−Ｔ１５細胞だけが同様のレベルのＩｎｓＰ７（１０％のＩｎｓＰ６）を有している。成長している培養細胞のみに高い信頼で適用できる平衡標識技術（１３）を用いて、発明者らはＨＩＴ−Ｔ１５細胞におけるＩｎｓＰ７の基本濃度が５．８＋／−０．１４μＭ（±ＳＥＭ、ｎ＝３）であると推測できたが、これは他の哺乳動物細胞または酵母で推算した範囲（１〜５μＭ）（４）の上限の濃度を反映している。ＩｎｓＰ７は他の哺乳動物細胞（４）と共通してβ細胞でも細胞ＩｎｓＰ６プールと迅速に交換する状態にあり（データは図示しない）、β細胞におけるＩｎｓＰ６の細胞濃度も高いため（１３）、高レベルのＩｎｓＰ７がβ細胞に存在するのは驚くべきことではない。
【００３７】
重要な注意は、高いＩｎｓＰ７が、個別の細胞コンパートメントを考慮しない細胞全体の平均であるということである。これは、ＩｎｓＰ６キナーゼの主なアイソフォームの１つであるＩＰ６Ｋ２が核にあり（９）、したがって、それが生産するＩｎｓＰ７が例えば細胞質ゾルおよび原形質膜での事象、例えばそれぞれ小胞輸送およびエキソサイトーシス、等に影響を及ぼさない可能性があることである。したがって、Ｔａｑｍａｎ（商標）に基づく定量的リアルタイムＰＣＲを使用して、本願発明者等は膵島およびβ細胞溶解物を、ＩＰ６Ｋアイソフォームの存在について調べた。図１ＣはＩＰ６Ｋ１およびＩＰ６Ｋ２の発現を証明しているが、ＩＰ６Ｋ３の発現は証明していない。２つのキナーゼ発現レベルは所与の細胞型におけるのと類似していたが、恐らくＩｎｓＰ７代謝が細胞周期を上方調節している（１０，１１）という事実を反映して、細胞株ＭＩＮ６と比較して初代細胞
におけるＩＰ６Ｋ１および２の発現は低かった。したがって、高ＩｎｓＰ７レベルは排他的な核プールを反映せず、細胞の至る所で一貫して高く、よってこれがインシュリン分泌に影響を及ぼし得る可能性がある。
【００３８】
高いＩｎｓＰ７濃度がβ細胞を反応性のある状態に維持するための原因であるかどうかを調べるために、本願発明者らは基本条件下で初代β細胞にて３つの報告されたすべての哺乳動物ＩＰ６Ｋを過剰発現させ、刺激されたエキソサイトーシスが続いて増強されるかどうか調べた。本願発明者らは、エキソサイトーシスの基準として細胞キャパシタンスの増加を使用した。この技術は、インシュリン含有下流が原形質膜（１７）と融合した場合に起こるβ細胞表面積の増大を検出する。代謝上インタクトな細胞での測定を可能にするために穿孔パッチ全細胞技術を使用し、エキソサイトーシスは−７０ｍＶから０ｍＶまでの一連の４回の５００ミリ秒の脱分極化パルスにより誘発した。ｍｏｃｋ（偽の）トランスフェクト細胞では、一連のパルスによって誘発されるキャパシタンスの増大は７９＋／−１１ｆＦ（ｎ＝８；図２Ａ、Ｂ）に達した。ＩＰ６Ｋ１を過剰発現している細胞では、キャパシタンス増加の振幅が１５３％刺激され、平均１９８＋／−１２ｆＦ（Ｐ＜０．０５；ｎ＝１０）だったが、ＩＰ６Ｋ１のキナーゼ不活化型を過剰発現している細胞ではエキソサイトーシスに対する影響は観察されなかった（図２Ａ、Ｂ）。興味深いことに、最初の脱分極により引き起こされるキャパシタンス増大は、野生型ＩＰ６Ｋ１を過剰発現する細胞では２９３％だけ増大した。最初の脱分極中のエキソサイトーシスは、大半が、容易に放出されるプール（ＲＲＰ）の内容を表わすと考えられる（７８）。ＲＲＰ（単位ｆＦ）のサイズは方程式：ＲＲＰ＝Ｓ／（１−Ｒ２）を使用して推定することができ、Ｓは第１（ΔＣ１）パルスと第２（ΔＣ２）パルスに対する応答の合計であり、Ｒｈａ比ΔＣ２／ΔＣ１である（１８）。本願発明者らは、ｍｏｃｋトランスフェクト細胞および野生型ＩＰ６Ｋ１細胞におけるＲＲの平均が９６＋／−９ｆＦ（ｎ＝８）および２２５＋／−２１ｆＦ（ｎ＝１０）であると推算する。したがって、ＩＰ６Ｋ１は、ＲＲＰのサイズを１３４％増加させた。１顆粒当たり３ｆＦの換算係数を使用する（１９）と、ｍｏｃｋトランスフェクト細胞および野生型ＩＰ６Ｋ１細胞におけるＲＲＰはそれぞれ３０および７５の粒子を含むと推算される。ＩＰ６Ｋ１の刺激作用は最初の脱分極に限定され、最後の３回のパルスでは増強はほとんど見られなかった（図２Ｂ）。一連の脱分極におけるエキソサイトーシスのレスポンスの消耗は、Ｃａ2+誘導エキソサイトーシスの抑制を生じさせるＣａ2+電流の不活性化を反映しない（図２Ｃ）。
【００３９】
図２Ｄは、エキソサイトーシスを刺激する野生型のＩＰ６Ｋ１の能力が、ＩＰ６Ｋ２およびＩＰ６Ｋ３によって共有されることを示す。ＩＰ６Ｋ２およびＩＰ６Ｋ３のキナーゼ不活性型の過剰発現は、ｍｏｃｋトランスフェクト細胞（図２Ｄ）と比較してエキソサイトーシス能に影響を及ぼさなかった。エキソサイトーシスの制御におけるＩＰ６Ｋの役割を確認するために、本願発明者らは、ｈＧＨ（ｈＧＨはトランスフェクト細胞由来のエキソサイトーシスのリポーターとしてのみ機能する。）一過性同時トランスフェクション分析を用いてＩＮＳ−１Ｅ細胞でのそれらの過剰発現の効果を調べた。ＩＰ６Ｋ１過剰発現細胞における細胞キャパシタンスの増加の合計は初代マウスβ細胞で観察されたのに匹敵するため、ＩＮＳ−１Ｅ細胞は適切な細胞系を表わす（データは図示しない）。ＩＰ６Ｋ１−３の過剰発現はｈＧＨ分泌を基本を超えて１５０％だけ刺激し（Ｐ＜０．０５；ｎ＝９−１２）、これはキナーゼ不活性変異型によっては共有されない効果である（図２Ｅ）。ＩＰ６Ｋ１および２のみがβ細胞に存在するという事実に基づくと、ＩＰ６Ｋ３ではなくてＩＰ６Ｋ１および２がエキソサイトーシスの適当な調節因子であると考えられる。
【００４０】
重要なことは、ＩＰ６ＫがＩｎｓＰ５をも基質として利用して、イノシトールピロリン酸（４）の異なる部分を生成し得ることである。したがって、ＩｎｓＰ７がエキソサイトーシスを直接促進できることを確認することが必要であった。哺乳動物のＩｎｓＰ７は５−異性体であり、これを詳細な実験に使用した（図３Ａ−Ｄ）。また、本願発明者らは、
ＩｎｓＰ７の他の理論的異性体も評価した（図３Ｅ）。エキソサイトーシスに対する５−ＩｎｓＰ７の影響を測定するために、本願発明者らは、標準の全細胞実験に一連の脱分極を適用し、ここではβ細胞を３μＭ  ＩｎｓＰ７を含む溶液で透析した。全細胞構成の確立に続いて、細胞に２分間の平衡期間を与えた。その後、エキソサイトーシスを引き起こすために−７０ｍＶから０ｍＶまで４回の５００ｍｓの脱分極を適用した。一連の６つの実験で、細胞キャパシタンスの増加の合計は、それぞれ３μＭ  ＩｎｓＰ７のピペット充填溶液の存在下では２３１＋／−１２ｆＦ（Ｐ＜０．０１）となり、対照条件下では７７＋／−１１ｆＦとなった（図３Ａ）。ＩＰ６Ｋ１−３を過剰発現している細胞の場合、５−ＩｎｓＰ７の存在下で最初の脱分極によって引き起こされるキャパシタンス増加が、続く３回の脱分極に答えたエキソサイトーシスに対する影響はほとんどない状態で、強く刺激された（図３Ｂ）。５−ＩｎｓＰ７がエキソサイトーシスを刺激する能力は、全細胞のＣａ2+電流の変化（図３Ｃ）とは関係していなかった。エキソサイトーシスに対する５−ＩｎｓＰ７の刺激作用は濃度依存的であった（図３Ｄ）。０．１μＭ以下のＩｎｓＰ７ではエキソサイトーシス刺激が観察されなかった。より高い濃度では、５−ＩｎｓＰ７は９０〜４１０％エキソサイトーシスを刺激した。ヒル（Ｈｉｌｌ）方程式への平均データ点の近似により、１．０２μＭの半最大刺激作用および１．５の同時作用因数が算出された。エキソサイトーシスの最大刺激は１０μＭ以上のＩｎｓＰ７の濃度で観察され、３８０％を超える刺激を生じた（図４Ｄ）。したがって、５−ＩｎｓＰ７は用量依存的に、ＩｎｓＰ７濃度（１−１０μＭ）という生理学的範囲内のエキソサイトーシスを増強した。ＩｎｓＰ７の他の異性体も１０μＭでエキソサイトーシスを刺激することができたが、ＣＨ−ＰＰ（シクロヘキサンに基づく単純なピロリン酸塩）は効果がなかった（図４Ｅ）。エキソサイトーシスに対するＩｎｓＰ７の効果を調べるために使用される条件下では、ＩｎｓＰ６の正味の効果はエンドサイトーシスではなくエキソサイトーシスを促進することであった（図５参照）。これは、エキソサイトーシスに対するＩｎｓＰ６の効果が、エンドサイトーシスが阻害された条件下でのみ識別できるからである（１５）。これはＩｎｓＰ７には当てはまらない。さらに、エキソサイトーシスに対するＩｎｓＰ６の効果は、エンドサイトーシスが阻害される場合、ＲＲＰからの分泌を選択的に促進しない（データは図示しない）。本願発明者らのデータは、ＩｎｓＰ７およびＩｎｓＰ６がエキソサイトーシスに別個の効果を有することを示している。これらの実験およびキナーゼの過剰発現に関する実験は、リン酸化ピロリン酸、つまりＩｎｓＰ８の役割を排除しないが、このピロリン酸はβ細胞では低濃度であるかまたは検出されないため（しかしながら）、生理学的役割を果たすことはあり得ない。
【００４１】
この点の本願発明者らのデータはすべて、エキソサイトーシスの制御におけるＩｎｓＰ７のための役割を示しているが、本願発明者らの結果は酵素またはＩｎｓＰ７のいずれかの外因性の添加に基づいている。内因性ＩｎｓＰ７が生理学的に関連した方法でエキソサイトーシスのキャパシティに寄与しているか否かを試験するために、本願発明者らは、ｓｉＲＮＡを用いてβ細胞中のＩＰ６Ｋ１およびＩＰ６Ｋ２をサイレンシングした。マウス特異的ｓｉＲＮＡをマウス細胞株ＭＩＮ６と、Ｔａｑｍａｎ（商標）リアルタイムＰＣＲ遺伝子発現分析とを使用してスクリーニングした（図６参照）。ＩＰ６Ｋ１またはＩＰ６Ｋ２のいずれかを除去すると、細胞内ＩｎｓＰ７レベルが著しく減少した（図７参照）。適切なｓｉＲＮＡ候補を蛍光タグ化し、初代β細胞にトランスフェクトした。上述の穿孔パッチ技術を用いて、蛍光細胞について細胞キャパシタンス測定を行なった。興味深いことに、ＩＰ６Ｋ２ではなくＩＰ６Ｋ１のサイレンシングだけが（図４Ｃ）がエキソサイトーシス能を阻害し、顆粒のＲＲＰの消耗を反映する最初のパルスでサイレンシングの効果がやはり最も顕著だった（図４Ａ、Ｂ）。さらに、ＩＰ６Ｋ１をサイレンシングしたときに全細胞モードに５−ＩｎｓＰ７を添加すると、正常なエキソサイトーシス応答を回復することができた（図４Ｄ）。したがって、ＩＰ６Ｋ２ではなくＩＰ６Ｋ１により生成された内因性ＩｎｓＰ７が、膵臓のβ細胞のエキソサイトーシス能の増大の原因である。本願発明者らの内因性の系と外因性の系との間の矛盾は、インビボで２つのキナーゼが異なる分布をしているか、細胞内結合しているかの反映であり得る。実際、ＩＰ６Ｋ１はエキソサイトーシスに関与するタンパク質と結合してよいが、これはＩＰ６Ｋ２にはできない（２０）。興味深いことに、アポトーシスにおけるＩＰ６Ｋ２の役割を見た他の研究で同様のパターンが示されている（２１）。すなわち、ＩＰ６Ｋ１−３が実質的に過剰発現すると、アポトーシスの増加につながるが、ＩＰ６Ｋ２のサイレンシングのみがこれを防ぐ。いずれの場合も、ＩｎｓＰ７の上方への生理学的増加は、異なるキナーゼにより示されるコンパートメント化の一部を明らかに克服する。
【００４２】
エキソサイトーシスに対する５−ＩｎｓＰ７の効果の考えられる機構の説明の一つは、ＩｎｓＰ６に対して以前に記載されたように（１３）、電位依存性Ｌ型Ｃａ2+チャンネル活性の直接の刺激であり得る。全細胞のＣａ2+チャンネルデータはこれとは異なっているが（図２Ｃおよび３Ｃ）、細胞付着パッチ構成を適用し、ＩＰ６Ｋ１−ｓｉＲＮＡを受けたＭＩＮ６ｍ９細胞でインタクトな細胞内環境を維持し、これにより細胞内ＩｎｓＰ５は有意に減少した（図７）。図に示されるように、ＩＰ６Ｋ１  ｓｉＲＮＡは１つのパッチ当たりのチャンネル数、開確率、平均閉時間、および平均開時間を有意には変更しなかった（Ｐ＞０．０５）。従って、ＩｎｓＰ７はＬ型Ｃａ2+チャンネル活性動に影響せず、このことはＩｎｓＰ６（１３）とは顕著な対照をなす。
【００４３】
まとめると、膵β細胞は高レベルのＩｎｓＰ７を維持している。その後、このピロリン酸塩は、インシュリンを含有する顆粒の容易に放出されるプールを制御し、それによりβ細胞の即時のエキソサイトーシス能を維持することにより、インスリン分泌プロセスにおける重要な責任分子としての役割を果たす。将来の重要な疑問は、ＩｎｓＰ７代謝の破壊が２型糖尿病、すなわち膵臓β細胞の分泌欠陥により特徴づけられる疾病（２２）の病因に役割を果たすか否かということである。この点で、ヒントは、２型糖尿病に係っている日本の家族におけるＩＰ６Ｋ１遺伝子の破壊の推定（２３）およびＩＰ６Ｋ１遺伝子欠損マウスにおける血しょうインシュリンレベルおよびグルコース耐性の両方の減少（２４）によりヒントが与えられる。
参考文献
【００４４】
【表１】
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0005491395.tif 000003
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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