(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
無菌処理の効果をモニタリングするための生物学的インジケータであって、
表面に官能末端基を有する基質であって、前記官能基はケイ素結合原子を１０％未満有する前記基質と、
内生胞子、菌類、マイコバクテリア、植物性バクテリア、もしくは原生動物を有する複数の微生物指標と、
一方の端部が共有結合により表面の前記官能末端基と結合し、他方の端部が前記微生物指標と共有結合により結合しているヘテロ二官能性架橋試薬を含んでなる前記生物学的インジケータ。
【請求項２】
前記表面層官能基は、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、カルボニル、炭素数が２〜２０であるアルケン、またはハロゲン化物、またはこれらの組み合わせを含んでなり、
前記内生胞子は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、セレウス菌、またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、またはこれらの組み合わせを含んでなり、
前記菌類は、アスペルギルス・ニガー、カンジダ菌、毛瘡白癬菌、またはＷａｇｉｅｌｌａ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ、またはこれらの組み合わせを含んでなり、
前記マイコバクテリアは、  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｅｒｒａｅ、またはこれらの組み合わせを含んでなり、
前記植物性バクテリアは、アエロモナス細菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｅｃｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ、大腸菌、クレブシエラ菌（肺炎菌）、レジオネラ菌、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、緑膿菌、サルモネラ菌、ヘリコバクター・ピロリ菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、またはＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、またはこれらの組み合わせを含んでなり、そして前記原生動物は、ジアルディア・ランブリア、またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、またはこれらの組み合わせを含んでなる、請求項１に記載の生物学的インジケータ。
【請求項３】
前記ケイ素結合原子の量は、前記基質の表面にある官能基の総量に対して５％未満であり、
前記ヘテロ二官能性架橋試薬は、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スルホスクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）、スクシンイミジルアセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、スクシンイミジルｔ−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジルｔ−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチラート（ＳＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチラート（スルホ−ＳＭＰＢ）、Ｎ−（ａ−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−ｋ−マレイミドウンデカン酸（ＫＭＵＡ）、スクシンイミジル３−［ブロモアセトアミド］プロピオネート（ＳＢＡＰ）、Ｎ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）、３−［２−アミノエチルジチオ］プロピオン酸ＨＣｌ（ＡＥＤＰ）（ホモ二官能性架橋試薬でもよい）、メチルＮ−スクシンイミジルアジペート（ＭＳＡ）、Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸（ＢＭＰＡ）、Ｎ−［ｋ−マレイミドウンデカン酸］−ヒドラジン（ＫＭＵＨ）、およびＮ−［β−マレイミドフェニルプロピオン酸］ヒドラジドＴＦＡ（ＢＭＰＨ）、Ｎ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアネート（ＰＭＰＩ）、またはこれらの組み合わせを含んでなる、請求項２に記載の生物学的インジケータ。
【請求項４】
前記官能末端基は、アミンまたはヒドロキシルであり、
前記微生物指標は、硫黄末端基を有しかつＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓであり、前記官能末端基は、ケイ素結合原子を２％以下含み、
前記ヘテロ二官能性架橋試薬は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートであり、
前記微生物は、１０４〜１０７ｃｆｕ／生物学的インジケータの濃度で存在し、そして前記基質上の前記微生物は、均一に分布され、前記分布は、前記基質のある領域と前記基質上の別の領域と比較して、２５％以下の標準偏差を有する、請求項３に記載の生物学的インジケータ。
【請求項５】
表面に官能末端基を有する基質であって、前記官能基はケイ素結合原子を１０％未満有する前記基質と、前記官能末端基とヘテロ二官能性架橋試薬によって共有結合している複数の微生物指標とを含んでなる生物学的インジケータであって、前記微生物は、内生胞子、菌類、マイコバクテリア、植物性バクテリア、原生動物、またはこれらの組み合わせを含んでなる生物学的インジケータ。
【請求項６】
前記官能末端基は、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、カルボニル、炭素数が２〜２０であるアルケン、またはハロゲン化物、またはこれらの組み合わせを含んでなる、請求項５に記載の生物学的インジケータ。
【請求項７】
前記内生胞子は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、セレウス菌、またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、またはこれらの組み合わせを含んでなり、前記菌類は、アスペルギルス・ニガー、カンジダ菌、毛瘡白癬菌、またはＷａｎｇｉｅｌｌａ  ｄｅｒ
ｍａｔｉｔｉｓ、またはこれらの組み合わせを含んでなり、
前記マイコバクテリアは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｅｒｒａｅ、またはこれらの組み合わせを含んでなり、および前記植物性バクテリアは、アエロモナス細菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｉｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ、大腸菌、クレブシエラ菌（肺炎菌）、レジオネラ菌、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、緑膿菌、サルモネラ菌、ヘリコバクター・ピロリ菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、またはＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、またはこれらの組み合わせを含んでなり、および
前記原生動物は、ジアルディア・ランブリア、またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  
ｐａｒｖｕｍ、またはこれらの組み合わせを含んでなり、
前記ヘテロ二官能性架橋試薬は、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スルホスクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）、スクシンイミジルアセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、スクシンイミジルｔ−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジルｔ−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチラート（ＳＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチラート（スルホ−ＳＭＰＢ）、Ｎ−（ａ−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−ｋ−マレイミドウンデカン酸（ＫＭＵＡ）、スクシンイミジル３−［ブロモアセトアミド］プロピオネート（ＳＢＡＰ）、Ｎ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）、３−［２−アミノエチルジチオ］プロピオン酸ＨＣｌ（ＡＥＤＰ）、メチルＮ−スクシンイミジルアジペート（ＭＳＡ）、Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸（ＢＭＰＡ）、Ｎ−［ｋ−マレイミドウンデカン酸］−ヒドラジン（ＫＭＵＨ）、およびＮ−［β−マレイミドフェニルプロピオン酸］ヒドラジドＴＦＡ（ＢＭＰＨ）、またはＮ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアネート（ＰＭＰＩ）を含んでなる、請求項６に記載の生物学的インジケータ。
【請求項８】
前記官能末端基は、アミンまたはヒドロキシルであり、
前記微生物指標は、硫黄末端基を有しかつＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓであり、
前記ヘテロ二官能性架橋試薬は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートであり、
前記微生物は、１０４〜１０７ｃｆｕ／生物学的インジケータの濃度で存在し、そして前記基質上の前記微生物は、均一に分布され、前記分布は、前記基質のある領域と前記基質上の別の領域と比較して、２５％以下の標準偏差を有する、請求項７に記載の生物学的インジケータ。
【請求項９】
表面に官能末端基を有する基質であって、前記官能基はケイ素結合原子を１０％未満有する前記基質と、前記基質上に存在し、且つ官能末端基を有する独立した表面層と、バイオテロ剤、臨床的に適切な生物、耐性菌、または細胞成分、またはこれらの組み合わせを含んでなる病原因子と、前記表面層官能基と共有結合しており、かつ、前記病原因子と共有結合しているヘテロ二官能性架橋試薬とを含んでなる無菌性をモニタリングするための生物学的インジケータ。
【請求項１０】
前記官能基は、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、カルボニル、炭素数が２〜２０であるアルケン、ハロゲン化物、またはこれらの組み合わせを含んでなり、そして前記病原因子は、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｅｌｏｎｉ、ウイルス、タンパク性プリオン、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ボツリヌス菌（ボツリヌス
菌毒素）、ブルセラ菌（ブルセラ症）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ（鼻疽）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ（類鼻疽）、オウム病クラミジア（オウム病）、コレラ（コレラ菌）、ウェルシュ菌（イプシロン毒素）、コクシエラバーネッティ（Ｑ熱）、ニパウイルスおよびハンタウイルスのごとき新興感染症、Ｏ１５７（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、食品の安全性を脅かす生物（例えば、サルモネラ菌）、野兎病菌（野兎病）、鼻疽（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）、疫病（ペスト菌）、トウゴマ（トウゴマの実）からのリシン毒素、発疹チフスリケッチア（チフス熱）、チフス菌（腸チフス）、赤痢菌（細菌性赤痢）、天然痘（大痘瘡）、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、コレラ菌（コレラ）、ウイルス性脳炎（アルファウィルス［例えば、ベネズエラウマ脳炎、東部ウマ脳炎、西部ウマ脳炎］）、ウイルス性出血熱（フィロウィルス［例えば、エボラ、マールブルグ］およびアレナウイルス［例えば、ラッサ熱ウイルス、マチュポウ
イルス］）、水の安全性を脅かす生物（例えば、クリプトスポリジウムパルゥム）、またはペスト菌（疫病）、またはこれらの組み合わせを含んでなる、請求項９に記載の生物学的インジケータ。
【請求項１１】
前記ヘテロ二官能性架橋試薬は、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スルホスクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）、スクシンイミジルアセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、スクシンイミジルｔ−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジルｔ−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチラート（ＳＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチラート（スルホ−ＳＭＰＢ）、Ｎ−（ａ−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−ｋ−マレイミドウンデカン酸（ＫＭＵＡ）、スクシンイミジル３−［ブロモアセトアミド］プロピオネート（ＳＢＡＰ）、Ｎ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）、３−［２−アミノエチルジチオ］プロピオン酸ＨＣｌ（ＡＥＤＰ）、メチルＮ−スクシンイミジルアジペート（ＭＳＡ）、Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸（ＢＭＰＡ）、Ｎ−［ｋ−マレイミドウンデカン酸］−ヒドラジン（ＫＭＵＨ）、およびＮ−［β−マレイミドフェニルプロピオン酸］ヒドラジドＴＦＡ（ＢＭＰＨ）、またはＮ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアネート（ＰＭＰＩ）、またはこれらの組み合わせを含んでなる、請求項１０に記載の生物学的インジケータ。
【請求項１２】
前記病原因子の濃度は、約１０４〜約１０７ｃｆｕ／生物学的インジケータである、請求項１１に記載の生物学的インジケータ。
【請求項１３】
表面に官能基を有する基質であって、前記官能基はケイ素結合原子を１０％未満有する前記基質と、
バイオテロ剤、臨床的に適切な生物、耐性菌、または細胞成分、またはこれらの組み合わせを含んでなる病原因子と、
前記基質官能基と共有結合しており、かつ、前記病原因子と共有結合しているヘテロ二官能性架橋試薬と、を含んでなる無菌性をモニタリングするための生物学的インジケータ。
【請求項１４】
表面に官能基を有する基質と、
前記官能基は、アミンまたはヒドロキシルであり、
前記ヘテロ二官能性架橋試薬は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートであり、そして
前記基質上の前記病原因子は、均一に分布され、前記分布は、前記基質のある領域と前記基質上の別の領域と比較して、２５％以下の標準偏差を有する、請求項１３に記載の生物学的インジケータ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、架橋試薬を介して１種以上の微生物と共有結合する官能基を含有する担体表面を有する、滅菌、消毒などを観測するための生物学的滅菌インジケータに関する。前記インジケータは、医療機器および付属品、器具、溶液、表面、布などの各種滅菌処理を評価する際に用いられ、再利用されるかまたは最終滅菌される品物についての滅菌の程度または成功を示すことができる均一で一貫性のある微生物群を含有することが望ましい。
【背景技術】
【０００２】
生物学的インジケータは、滅菌処理の効果を検査および／または測定するのに用いられる。代表的な生物学的インジケータは、調査中の滅菌処理に対する耐性が高い、個体数が調整された微生物を含有する。滅菌処理への暴露後、生物学的インジケータを培地で培養して、残りの生菌の増殖を促す。自己充足型生物学的インジケータは、一般に脆弱な小瓶内で、培地を内部に備えている。胞子片生物学的インジケータは、観測された滅菌処理後に、別の容器の培地と混ぜ合わされる。成長培地の変色または濁りによって示される微生物増殖は、滅菌処理は効果が無かったことを示している。
【０００３】
一般に、細菌胞子は生物学的インジケータに好ましい。その理由は、細菌胞子は、大半の他の種類の微生物よりも滅菌処理に対する耐性が高いと認識されているからである。従って、細菌胞子を死滅させる滅菌処理は、あらゆる他の汚染微生物も死滅させると考えられる。
【０００４】
細菌胞子の選択は、滅菌方法、滅菌の種類および評価される方法によって決まる。例えば、ゲオバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）胞子は、湿熱、過酢酸、過酸化水素、および液状およびガス状の他のペルオキシ化合物を用いる滅菌システムを観測するのに利用される。その理由は、これらの指標胞子は、酸化化学反応に対する耐性が高いからである。同様に、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）胞子は、エチレンオキシド滅菌システムおよび乾熱滅菌システムを観測するのに利用される。
【０００５】
前記微生物は、通常、ストリップやディスクのごとき担体または基質に担持される。前記基質は、滅菌処理に適合する材料から形成され、滅菌評価に影響を及ぼす可能性がある添加剤を含有しない。ろ紙、クロマトグラフィー紙、吸い取り紙、ガラス繊維、ポリマープラスチック、セラミック、ステンレス鋼、および金属酸化物品のごとき材料が、基質または担体として用いられることが多い。
【０００６】
前記微生物を基質上に分散させるには、水またはアルコール中の微生物の懸濁液を、紙または他の基質材料の網の上に吊るされた針に従来方式で送り込む。前記紙を、前記針の下を一定の速度で移動させることによって、前記紙が前記針の下を通過する際に前記紙の上に懸濁液の跡が形成される。あるいは、マイクロピペットを用いて、前記懸濁液を手作業で前記基質に移す。その後、含浸紙の網を適当な大きさに切断し、通常は試験紙片または試験ディスクとして、前記インジケータとして使用する。
【０００７】
基質表面に対して微生物の量が制御可能であることの必要性に加えて、前記微生物が前記基質の表面にしっかりと固定されることが重要である。疎水性相互作用および静電相互作用、イオン交換およびファンデルワールス力などの、前記基質に対する前記微生物の各種結合が提案されている。特許文献１は、非官能性タンパク質の表面への吸着および官能性タンパク質を吸着した非官能性タンパク質と共有結合させるための架橋剤の使用に関する。しかしながら、そのような固定化技術は、特に水性環境において、決して望ましくはない結合をもたらすことが多い。特許文献２は、ヒドロキシル基を有する基質に共有結合的に固定されたタンパク質のごとき活性剤に関する。シランは、１つの官能基で前記基質およびヘテロ二官能性架橋剤と結合するため、この基とは異なるもう１つの官能基が空いており、この官能基に、高いタンパク質の機能性を維持したまま、タンパク質が結合する。前記シランは、前記基質のヒドロキシル基と反応する官能基と、前記活性剤のアミノ基と反応するスクシンイミド基を含有するヘテロ二官能性架橋剤の官能基と反応するチオール末端基とを有する。
【特許文献１】米国特許第４，４７８，９４６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，０７７，２１０号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
滅菌、消毒、または他のそのような滅菌処理が複合有機生物（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｌｉｖｉｎｇ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）に対して効果的であったかどうかを判断するための生物学的インジケータは、官能基を本質的に含有するかあるいは付加されているまたは官能基含有単分子層のごとき自己組織化表面層（ＳＡＭ）を有する基質を含んでなる。前記官能基としては、ヒドロキシル基、ハロゲン化物基、アミン基などが挙げられ、チオ基は除外されることが望ましい。好ましい実施態様では、胞子、植物性生物または病原因子のごとき微生物指標の共有結合を官能化基質表面に付与するヘテロ二官能性化合物のごとき架橋剤が用いられる。そのような実施態様において、前記微生物指標は、表面層または好ましくは表面層の無い基質としっかりと結合し、洗浄、流体乱流などによって取り除くことは非常に困難である。
【０００９】
他の実施態様では、ガラスのごとき基質の固有の官能ヒドロキシル基を用いることができる。この実施態様において、微生物指標すなわち病原因子は、例えば物理的または電子的手段（これらに限定されない）によって、または、共有結合によってではなく水素結合によってヒドロキシル官能表面と結合する。
【００１０】
あまり望ましくない実施態様では、有機シランカップリング剤を使用して官能基を基質表面に付加するが、この場合、２つの異なる官能基が一般に用いられる。この実施態様において、微生物指標は、共有結合によってではなく例えば物理的または電子的手段によって前記シランカップリング剤と結合する。
【００１１】
どちらの実施態様においても、官能剤は均一かつ一貫した形で塗布され、これにより、その上の微生物群も確実に均一で一貫性のある状態となる。
【００１２】
生物学的インジケータは、一般に、手術器具のごとき各種物品の滅菌、消毒または他のそのような生物破壊処理が、前記物品が再利用できるぐらい効果的であったかどうかを示すのに用いられる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
無菌性をモニタリングするための生物学的インジケータであって、
基質と、
前記基質上に存在する官能末端基を含有しかつケイ素結合原子を実質的に全く含有していない表面層と、
微生物指標と、
前記表面層官能基と共有結合しておりかつ前記微生物指標と共有結合している架橋試薬とを含んでなる生物学的インジケータ。
【００１４】
基質と、任意に、前記基質上に存在する表面層と、
前記基質または前記任意の表面層が官能基を有しており、
バイオテロ剤、臨床的に適切な生物、耐性菌、または細胞成分、またはこれらの組み合わせを含んでなる病原因子と、
前記基質官能基または前記任意の表面層官能基と共有結合しておりかつ前記病原因子と共有結合している架橋剤とを含んでなる生物学的インジケータ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
滅菌、消毒および失活処理に対する耐性が一般に高い微生物、プリオン、病原因子等の滅菌、消毒または失活処理の滅菌効果をモニタリングおよび／または測定するのに好適な生物学的インジケータを説明する。胞子、例えば内生胞子は、数多くの滅菌処理に対する耐性が一般に高いという理由から、好ましい検査微生物であるが、他の微生物、例えば菌類、マイコバクテリア、植物性バクテリアおよび原生動物を、胞子の代わりに用いることもできる。好ましくは、前記微生物は硫黄末端基を有し、もしそうでなければ、チオール化して硫黄末端基を含有させることができる。内生胞子の例としては、ゲオバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、セレウス菌、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓが挙げられる。菌類の例としては、アスペルギルス・ニガー、カンジダ菌、毛瘡白癬菌、およびＷａｎｇｉｅｌｌａ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓが挙げられる。本発明で用いることができるマイコバクテリアの例としては、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｅｒｒａｅが挙げられる。
【００１６】
植物性バクテリアの例としては、アエロモナス細菌、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・フェリカス（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンラロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ、大腸菌、クレブシエラ菌（肺炎菌）、レジオネラ菌、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、緑膿菌、サルモネラ菌、ヘリコバクター・ピロリ菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、またはＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａが挙げられる。植物性バクテリアに関して、栄養細胞および／またはそれらの構成成分を、同じメカニズムによって固体支持マトリクスに付加し、１種以上の各種賦形剤の存在下における沈着によって乾燥および貯蔵を免れることができる。賦形剤は、不安定要素を安定させるのに用いられる幅広い種類の一般に不活性な化合物である。賦形剤の例としては、炭水化物、とりわけオリゴ糖および高分子サッカリドが挙げられる。そのような化合物の一例としては、二糖類トレハロースが挙げられる。特定の生物の組織内のトレハロースの濃度が高いと、前記組織は水分欠乏状態を凌ぐことができ、また、脱水後に機能的な細胞成分が再生できることも明らかになっている。事実、トレハロースは、厳しい環境条件（すなわち凍結乾燥）下における細胞の生存に必要不可欠である粘膜および他の巨大分子構造に安定性を与えることが知られている。他の安定化賦形剤化合物としては、（これらに限定されるわけではないが）単糖、例えばスクロース、グルコース、マルトース、長鎖ポリマー、例えばデキストラン、スターチ、アガロースおよびセルロースが挙げられる。他の非炭水化物ベースの賦形剤としては、タンパク質、ホスホン酸塩、緩衝剤、ワックス、脂質、油、および他の炭化水素ベースの材料を挙げることができる。
【００１７】
原生動物の例としては、ジアルディア・ランブリアおよびクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が挙げられる。
【００１８】
胞子は、滅菌等の処理に対する耐性が高いため、本発明において好ましい。
【００１９】
内生胞子、菌類等の滅菌等に関する各種処理または工程の効果をモニタリングおよび／または測定することに加えて、本発明のインジケータは、滅菌または消毒処理または工程の効果を測定するのに用いることもできる。
【００２０】
病原因子および他の非模倣剤
病原因子としては、バイオテロ剤、臨床的に適切な剤、細胞成分、および新興耐性菌株が挙げられる。「最も耐性がある」という性質を示すとの認識に基づいて選択される模倣生物（例えばゲオバシラス・ステアロサーモフィラス）および上記他の微生物に加えて、臨床的な意義に基づいてまたはバイオテロ剤として使用できるという理由から、非自己複製剤および亜細胞構成要素または細胞生産物を選択することができる。これらの生物は、自然的または人為的な変異に因って今日では一般的な抗生物質による治療手段あるいは化学的消毒法に対する耐性を有している可能性がある菌株から成ることが多い。前者の例としては、ＶＲＥ’ｓ（バンコマイシン耐性腸球菌）、ＭＳＲＡｓ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｅｌｏｎｉが最低限挙げられる。これらの臨床的意義のある生物は、非常に興味深い。その理由は、ＶＲＥ’ｓおよびＭＳＲＡｓは、それらの代表的な治療手段に対する耐性（抗生物質耐性）を発現した生物を表し、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎｉは、一部のこれまで効果的であった消毒法に対する耐性（グルタルアルデヒド耐性）を発現した生物を表すからである。また、似ている代替物がまだ無い可能性があり、かつ、治療措置または消毒に対する特別な危険性または挑戦を示す可能性がある重要な新興病原因子も数多く存在する。プリオンはその一例である。プリオンはそれ自体は生物ではないが、その病原体としての機能はその構造に関係しており、この構造／機能関係を用いてプリオンの相対感染力を求めることができる。他の非自律エージェント（例えばウィルス）並びに亜細胞成分およびタンパク性プリオンも本発明において考慮される。
【００２１】
バイオテロ剤または病原体として用いることができる病原因子としては、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ボツリヌス菌（ボツリヌス菌毒素）、ブルセラ菌（ブルセラ症）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ（鼻疽）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ（類鼻疽）、オウム病クラミジア（オウム病）、コレラ（コレラ菌）、ウェルシュ菌（イプシロン毒素）、コクシエラバーネッティ（Ｑ熱）、ニパウイルスおよびハンタウイルスのごとき新興感染症、Ｏ１５７：（大腸菌）、食品の安全性を脅かす生物（例えば、サルモネラ菌）、野兎病菌（野兎病）、疫病（ペスト菌）、ヒマ（トウゴマの実）からのリシン毒素、発疹チフスリケッチア（チフス熱）、チフス菌（腸チフス）、赤痢菌（細菌性赤痢）、天然痘（大痘瘡）、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、コレラ菌（コレラ）、ウイルス性脳炎（アルファウィルス［例えば、ベネズエラウマ脳炎、東部ウマ脳炎、西部ウマ脳炎］）、ウイルス性出血熱（フィロウィルス［例えば、エボラ、マールブルグ］およびアレナウイルス［例えば、ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス］）、水の安全性を脅かす生物（例えば、クリプトスポリジウムパルブム）、およびペスト菌（疫病）、またはこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２２】
検査微生物は、単一種でも複数種の組み合わせでもよい。典型的な医療機器の滅菌処理に複数種の組み合わせが用いられる場合、好ましい生物は、ゲオバシラス・ステアロサーモフィラスとバシラス・サチリスとの組み合わせであることが最も多い。
【００２３】
胞子キャリア材料として固体基質が用いられることが好ましい。前記基質は、任意の無機材料、例えば、結晶シリコンなどのシリコン；シート、繊維、ビーズ、微小ガラス球のごとき任意の形状または形態を有するソーダ石灰、ホウケイ酸ガラス、リン酸ガラス、ホウリン酸ガラス、ホウアルミノケイ酸ガラスなど各種ガラス；タイルおよびテラコッタ、各種磁器、ほうろうなどの構造粘土製品のごとき、ケイ素およびその酸化物およびケイ酸塩として知られる錯化合物が主要部分を占め、かつ、高温まで加熱された土原材料と定義することができる各種セラミック；パラジウム、白金、鉄、銅、金のごとき金属；前記金属、または酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化鉄、酸化銅、酸化アルミニウムなどの周期表の４〜１４群の各種金属酸化物のごとき金属化表面を有する各種無機基質、石英のごときシリカ、サファイアなどでもよい。
【００２４】
用いることができる別の基質群とは、紙、ろ紙、ボール紙などのごとき様々な形態のセルロースなどの各種有機化合物である。各種ポリマーとしては、アクリル酸ポリマーおよびアクリレートポリマーなどのアクリルポリマー、ポリエチレンおよびポリプロピレンのごとき各種ポリオレフィン、ポリビニルアルコールポリマー、ポリスチレンなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。また、前記基質は、前記化合物の混合物でもよい。
【００２５】
前記基質は、プラズマ、電子ビーム、ガンマ線、光活性化などによって電子的および／または物理的に改質してもよい。そのような処理は、既存の官能基を使用したり、官能基を付加したり、あるいはヒドロキシル基のごとき基質表面上の固有の基（すなわち、活性基）にアクセスしやすくすることができる。通常、前記基質の露出面の少なくとも１部は平面となり、曲面は本発明に従って処理することができる。例えば、試験管の内面あるいは外面、マルチウェルプレート、またはビーズあるいは容器の外側に前記基質表面を形成することができる。前記基質は中実であることが好ましいが、部分的または全体的に多孔質であってもよい。
【００２６】
前記基質は、露出面を提供する限り、多種多様な形態で存在することができる。好適な形態の例としては、繊維、ワイヤー、ウエハー、ディスク、シート、顕微鏡用スライド、結晶皿、密閉吸収セル、ガラス製メディアアンプルなどが挙げられる。好ましい基質としては、紙、ガラス繊維、アルカリ土類アルミノホウケイ酸ガラス、ポリスチレンなどのごとき様々な形態のセルロースが挙げられる。
【００２７】
本発明の基質は、自然にまたは本質的に、官能基を含有していてもよい。例えば、各種ガラスは、ヒドロキシル基またはアミン基を含有していることが多い。あるいは、官能基を含有する独立した表面層が、ＳＡＭ（自己組織化単分子層法）のごとき単分子層の形態で基質上に存在してもよい。ＳＡＭは、当該技術分野および文献において周知である。前記固有のまたは付加的な官能基層は、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、カルボニル、塩素または臭素のごとき各種ハロゲン化物、および総炭素数が約２〜少なくとも約２０である各種アルケンを含んでなる。チオ基は通常避けられる。
【００２８】
様々な異なる種類の架橋剤を用いて微生物指標を基質と共有結合させることは、本発明の重要な態様の１つである。前記架橋剤は、同じかまたは異なる官能基を有していてもよい。様々な官能基が存在しており、例えば、第１級、第２級および第３級アミンなどの各種アミン化合物、各種イミン、アニリン、カルボン酸のイミジルエステルなどの各種イミド、ヒドロキシル、カルボン酸、炭素数が２〜少なくとも約２０であるアルケニル基、塩素または臭素のごときハロゲン化物、ニトロアリールハロゲン化物、総炭素数が１〜少なくとも約２０であるアルコキシ基、無水物、アルデヒド、シアノ、チオ、ジスルフィドまたはジチオのごとき各種硫黄含有基といった複数の種類に分類される。前記架橋剤の好ましい反応性末端基としては、一般に、各種アミン、なかでも第１級アミン、チオまたは他の硫黄含有基、カルボキシルおよびヒドロキシルが挙げられる。一般的なアミン含有化合物としては、スクシンイミジルエステル、マレイミド、アジドおよびヨードアセトアミドが挙げられる。
【００２９】
好適な架橋試薬としては、ホモ二官能性架橋試薬、ヘテロ二官能性架橋試薬、三官能性架橋試薬、零長架橋試薬および光反応性架橋試薬が挙げられる。ヘテロ二官能性架橋試薬が好ましい。
【００３０】
ホモ二官能性架橋試薬の例としては、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート（ＢＳ３）および３−［２−アミノエチルジチオ］プロピオン酸ＨＣｌ（ＡＥＤＰ）が挙げられる。
【００３１】
ヘテロ二官能性架橋試薬の例としては、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジルアセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、Ｎ−スクシンイミジルｔ−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジルｔ−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチラート（ＳＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチラート（スルホ−ＳＭＰＢ）、Ｎ−（ａ−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−ｋ−マレイミドウンデカン酸（ＫＭＵＡ）およびスクシンイミジル３−［ブロモアセトアミド］プロピオネート（ＳＢＡＰ）が挙げられる。他の架橋剤としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）、３−［２−アミノエチルジチオ］プロピオン酸ＨＣｌ（ＡＥＤＰ）（ホモ二官能性架橋試薬でもよい）、メチルＮ−スクシンイミジルアジペート（ＭＳＡ）、Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸（ＢＭＰＡ）、Ｎ−［ｋ−マレイミドウンデカン酸］−ヒドラジン（ＫＭＵＨ）、Ｎ−［β−マレイミドフェニルプロピオン酸］ヒドラジドＴＦＡ（ＢＭＰＨ）、およびＮ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアネート（ＰＭＰＩ）が挙げられる。
【００３２】
三官能性架橋試薬の例としては、トリススクシンイミジルアミノトリアセテート（ＴＳＡＴ）が挙げられる。
【００３３】
零長架橋試薬の例としては、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）が挙げられる。
【００３４】
光反応性架橋試薬（すなわち、紫外線照射時に特に求核試薬と反応する）の例としては、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸、スクシンイミジルエステル（ＡＴＦＢ、ＳＥ）、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸ＳＴＰエステル、ナトリウム塩（ＡＴＦＢ、ＳＴＰエステル）、ベンゾフェノン−４−イソチオシアネート、４−ベンゾイル安息香酸、スクシンイミジルエステル、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ−ＮＯＳ）、スルホスクシンイミジル２−［ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド］エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ＳＡＮＤ）、Ｎ−スクシンイミジル−６−［４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ］ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）、スルホスクシンイミジル−６−［４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ］ヘキサノエート（スルホ−ＳＡＮＰＡＨ）およびスクシンイミジル−［４−（ソラレン−８−ヨロキシ）］ブチラート（ＳＰＢ）が挙げられ、反応性チオールとしては、Ｎ−（［２−ピリジルジチオ］エチル）−４−アジドサリチルアミドおよびベンゾフェノン−４−マレイミドが挙げられ、反応性カルボニルとしては、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロベンジルアミンハイドロクロライドが挙げられる。
さらに他の架橋試薬としては、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、下記式
【００３５】
【化１】
0005530098.tif 000002
【００３６】
を有する１，３−ビスマレイミドプロパン、
Ｎ−（４）−カルボキシシクロヘキシルメチル−マレイミドのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、および下記式
【００３７】
【化２】
0005530098.tif 000003
【００３８】
を有する３（２−ピリジル−ジチオ）プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが挙げられる。
【００３９】
このように、前記様々なホモ二官能性、ヘテロ二官能性、三官能性、零長および光反応性架橋試薬は、１種の末端基を介して、基質または分離表面層官能性化合物と反応して共有結合を形成するのに対し、残りの１種以上の官能末端基は、微生物指標または病原因子と反応し、それと共有結合を形成する。前記架橋剤は、まず前記表面または表面層の官能基と反応させた後、前記微生物と反応させてもよいし、あるいは、初めに前記微生物と反応させた後、前記表面または表面層の官能基と反応させてもよいので、反応の順番は重要ではない。
前記微生物指標を、１モル当たり少なくとも約１０、望ましくは約１０〜約１５０、好ましくは約２５〜約１２５キロカロリーの強い共有結合を介して前記基質と結合させることは、本発明の重要な態様の１つである。前記基質に対する微生物指標または病原因子のそのような強い結合または固定は、洗浄滅菌機に関連する悪条件または乱流条件および／または液体薬品滅菌処理に強い。換言すれば、本発明の生物学的インジケータは、例えばジェット噴射衝突、乱流静水圧力などによって基質から洗い流されたり、分離されたりすることが極めて生じにくい。
【００４０】
本発明の生物学的インジケータは、架橋試薬の層を、基質または官能基を含有する基質と独立した層積層物に塗布することによって調製される。前記官能基は、ケイ素結合原子が実質的に無いあるいは前記原子を全く含有していないことが好ましい。ケイ素結合原子は、官能化シランカップリング剤が使用される場合に生じる。「実質的に無い」とは、一般に約１０％未満、望ましくは約５％未満、好ましくは約２または３％未満、または０の官能基が、中間にあるケイ素原子を介して、基質と結合することを意味する。また、前記基質には、タンパク質、部分加水分解タンパク質およびペプチドも実質的に無い。そのようなタンパク質などが存在する場合、その量は、例えば前記基質と結合する官能基の一般に約１０％未満、望ましくは約５％未満、好ましくは約２または３％未満といったように少量である。前記基質または表面層上に含有される前記官能基の種類に応じて、前記官能基と容易に反応して共有結合を形成する少なくとも１種の末端能基を有する架橋試薬が用いられる。例えば、基質表面がアミン官能基を有する場合、ヘテロ二官能性試薬のごとき架橋試薬の官能基の１つは、アルデヒド、イミド、カルボキシル基、カルボン酸のアミジルエステル、無水物などのごとき官能基と容易に反応する。そのような方法の１つは、比較的中性な条件、例えば約６〜約８のｐＨにおいて、架橋試薬をリン酸緩衝液のごとき緩衝液中で好適な時間使用することによって、前記基質の官能基と共有結合を形成させることに関する。余分な架橋試薬は、洗浄などの任意の慣用の方法で取り除くことができる。
架橋試薬の残りの１種以上の末端基は、前記微生物指標または病原因子と容易に反応して共有結合を形成する官能基である。従って、前記微生物指標、病原因子、病原体、刺激物などは、架橋試薬を介して、基質の官能基と共有結合する。前記微生物と反応する前述のような官能基としては、ハロゲン、メラミン誘導体、チオ基、マレイミド、マラミドなどが挙げられる。前記架橋試薬の残りの官能基がピリジン基などで封止される場合、同基を、一般的な還元剤を用いて取り除くことができる。好適な還元剤の例としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウムなどが挙げられる。本発明の好ましい実施態様において、ヘテロ二官能性剤はＳＰＤＰである。ＳＰＤＰは、前記化合物の還元時にピリジン基を取り除き、硫化水素基を残す。前記硫化水素基は、胞子のチオ基中に存在する硫黄と容易に反応して共有結合し、これにより前記胞子が基質表面に固定される。
【００４１】
本発明の好ましい微生物は細菌胞子であり、また、前記胞子は一般に硫黄末端基を含有するため、それは、本発明の望ましい実施態様の良い例となる。胞子または微生物が硫黄末端基を含有しない場合、架橋剤との反応の前にチオール化することができる。微生物のチオール化は、当該技術分野および文献において周知である。
前記１種以上の各種架橋剤は、様々な方法、例えば室温、高温において、紫外線などのごとき放射線によって反応させることができる。
【００４２】
本発明の重要な態様の１つは、基質上の別の領域と比較して、例えば１ｃｍ２のある領域に基づいて、例えば一般に約５０％以下、望ましくは約２５％以下、好ましくは約１０％以下の低い標準偏差が得られるような均一および／または一貫性のある微生物指標または病原因子またはそれらの組み合わせの集団である。微生物指標または病原因子の均一分布は、選択された胞子微生物を、例えば水溶液、一般に水または溶媒中に浮遊させることによって達成される。溶媒としては、エタノール、メタノールおよび他の溶媒が挙げられるが、エタノールが好ましい。しかしながら、胞子の生存能力および耐性が損なわれない限り、胞子を様々な溶液中に浮遊させることができることは理解されるべきである。
【００４３】
あるいは、前記架橋試薬を、まず１種以上の微生物指標または病原因子などと反応させた後、水溶液または溶媒中で官能基含有基質に塗布することによって、前記架橋剤を前記基質と共有結合させてもよい。
【００４４】
固有の官能基または架橋試薬と共有結合する自己組織化単分子層（ＳＡＭ）によって提供される官能基を有する調製された基質に、所定の特定の濃度で、胞子懸濁液のごとき微生物を植菌する。前記胞子懸濁液の濃度は、塗布要件および基質への望ましい塗布速度によって異なるが、一般には約１０４〜約１０９ｃｆｕ／ｍｌである。前記担体への胞子溶液の植菌は、その表面を前記胞子溶液に浸漬する、かまたは、一定量の懸濁液を前記基質にピペットで移す、噴霧するまたは印刷することによって達成される。前記生物学的インジケータ上に被着したまたは存在する微生物の実際の量は、生物学的インジケータ当たり約１０４〜約１０７ｃｆｕである。基質が密閉吸着セルや顕微鏡用スライドのように一般に平坦である場合、前記担体の全表面を被覆する。基質がガラス製メディアアンプルのように一般に曲面である場合、端部のみまたは全表面を被覆する。
【００４５】
次に、植菌された基質を、約１７〜約２５℃の周囲温度で約１〜約３０分間以上、あるいは乾燥時間を短縮するために高温で乾燥させた。前記担体の植菌後、前記担体を水または溶媒で洗浄して、表面にしっかりと結合していない胞子を取り除いた。その後、光プローブ顕微鏡または走査プローブ顕微鏡のごとき光オプトメトリック機器を用いて前記基質を目視検査し、担体表面上の微生物指標群の均一性を測定した。また、浸軟あるいは超音波分解したサンプルを滴定することによって、または、当業者らに周知の他の手段によって、担体表面の個体群を数え上げることもできる。
【００４６】
胞子のごとき微生物指標の代わりに、各種病原因子を同様の方法で前記基質に塗布し、前記表面上で望ましい濃度を得ることができる。
【００４７】
基質または表面層は、架橋試薬を介して微生物または病原因子と共有結合する官能基を均一で一貫性のある濃度で有することができるという事実から、それらは、乱流および／または化学滅菌処理または工程に起因する損失がほとんど無く、基質にしっかりと付着している。従って、胞子や病原因子のごとき微生物は、各種品物の滅菌の効果に関して、非常に効果的な生物学的インジケータとなる。例えば、本発明の生物学的インジケータは、液体薬品滅菌処理において最も有用であるが、下記の様々な品物を滅菌するための、蒸気、化学薬品、放射線、蒸気相などのごとき滅菌処理に用いることもできる。滅菌処理の完了後、１種以上の前記生物学的インジケータを、当該技術分野および文献において周知である方法で植菌する。前記微生物、例えば胞子や病原因子が滅菌処理をに耐えた場合、それらは、当業者らに周知の適切な培養条件下における培養において増殖する。増殖の存在は、滅菌サイクルが成功していなかったかもしれないことを示す。従って、前記生物学的インジケータの培養後、消毒または滅菌の程度を慣用の方法で測定する。最終結果は、滅菌された品物の性質によって決定されることが多く、ログリダクションは、少なくとも約４〜約１２、好ましくは少なくとも約５または約６〜約８または約９である。ログリダクションが６であるということは、滅菌処理に付された後、１，０００，０００個体当たり１個体以下の微生物が残存することを意味する。
【００４８】
前記生物学的インジケータに用いられる微生物または胞子または病原因子の種類は、死滅させることが求められる特定の生物と同じであることが多い。例えば、細菌戦争の病原体に関して、ある組成物または容器に炭疽菌が入っていると考えられる場合、滅菌処理の完了時に炭疽菌の胞子を用いることによって、前記処理が炭疽菌指標を死滅させるのに効果的であったかどうかを判断することができる。
【００４９】
本発明の生物学的インジケータを用いた滅菌に付すことができる物品は数多く存在し、手術器具などの器具、医療化合物および医薬化合物を輸送するためのチューブなどの機器、各種粉末、混合物、溶液、布のごとき組成物、および滅菌または消毒処理の印が求められる場合を含んでなる。
【００５０】
本発明の実施態様の作用および利点は、下記実施例からさらによく理解することができる。下記実例は、本発明の利点を説明することが目的であり、本発明の全容を例証するものではない。
【実施例】
【００５１】
実施例１Ａ
ガラスまたはポリスチレン基質のごとき官能基を以って製造されたか、または所望の末端基を備えた自己組織化単分子層を用いて改質されたか、または官能基を放出するあるいは官能基をアクセスし易くする任意の物理的または化学的手段によって処理された、アミン終端表面を有する基質を用いた。ヘテロ二官能性架橋試薬であるＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を、リン酸緩衝生理食塩水中において、好ましくは１７〜４０℃の温度で、３０〜６０分間（２０ｍＭＳＰＤＰ原液をＤＭＳＯまたはＥｔＯＨで調製した）前記アミン終端表面と反応させた。余分なＳＰＤＰを、リン酸緩衝液中で洗浄することによって、すべて取り除いた。その後、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いて、前記表面を約３０分間還元した。その後、ゲオバシラス・ステアロサーモフィラス胞子を、約１秒間〜約１８時間、前記還元された表面と反応させた。さらに、胞子を架橋剤と共有結合させ、その架橋剤を基質上のアミン官能基と共有結合させた。
【００５２】
実施例１Ｂ
胞子のチオール化
ＰＢＳ溶液を用いて、１０６〜１０９ｃｆｕ／ｍＬの胞子溶液を調製した。０．５ｍＬの前記胞子懸濁液に、１２０μＬアリコートの２０ｍＭＳＰＤＰを添加した（前記溶液は、必要に応じて増量してもよい。）。そして、前記ＳＰＤＰを、１秒間〜約２時間、好ましくは１秒間〜３０分間、前記胞子と反応させた。前記ＳＰＤＰ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）のアミン反応基は、胞子殻のタンパク質中のアミンと反応した。その後、未反応のＳＰＤＰを、透析、ろ過またはその両方のごとき標準的な方法、あるいは当業者らに周知の他の手段を用いて、取り除いた。前記未反応ＳＰＤＰの分離に続いて、新たにチオール化された胞子を、（他の実施例で使用されたのと同じ方法に従って）ＳＰＤＰで予め改質された表面に接触させ、その後、還元した。そして、前記胞子は、結合ジスルフィドを介して共有結合を形成する表面と反応した。
【００５３】
実施例２
（還元剤を不使用）
天然ヒドロキシル官能基（すなわち、気体プラズマで処理されて表面にヒドロキシル官能基が形成された高分子表面）を有する基質を用いて、ヘテロ二官能性試薬であるＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）を、ｐＨがアルカリ性である非ヒドロキシル緩衝液中において３０分間、ヒドロキシル基を含有する前記表面と反応させた（ＰＭＰＩ原液を、前記表面に存在するヒドロキシル基の濃度の約１０倍過剰モルのＤＭＳＯまたはＤＭＦで調製した）。そして、前記ＰＭＰＩのイソシアネート末端基が、前記基質の表面上のヒドロキシル分子と反応し、ウレタン結合を形成した。その後、ゲオバシラス・ステアロサーモフィラス胞子上に存在するスルフヒドリル基が、中性ｐＨおよび室温において２時間、前記架橋剤のマレイミド末端官能基と反応した。前記ヘテロ二官能性架橋試薬は、前記胞子および前記基質のヒドロキシル基と共有結合した。
【００５４】
実施例３
（還元剤を不使用）
表面付近にビニル基のごとき天然二重結合を有するかまたは二重結合が形成されるように処理された表面を有する基質を、ＤＭＳＯまたはＤＭＦ中の１０ｍＭＮ−スクシンイミジル−６−［４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ］ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）の１０％溶液の存在下において、ｐＨが７〜９のリン酸ナトリウム溶液に浸漬した。試料（基質および溶液）を、通常は１分間未満、３００〜４６０ｎｍ（望ましくは３００〜３７０ｎｍ）の波長の紫外線に曝した。ＳＡＮＰＡＨのニトロフェニルアジド基がナイトレン基を形成し、続いて、このナイトレン基が、前記基質の表面上の二重結合と付加反応を始めた。ｐＨが７のリン酸緩衝液中において、ゲオバシラス・ステアロサーモフィラス胞子懸濁液（濃度：１０７ｃｆｕ／ｍｌ）を、室温において６０分間、改質された表面に接触させた。ＮＨＳエステルが第１級アミノ基と反応して、安定したアミド結合が形成された。前記ＳＡＮＰＡＨ架橋剤は、前記胞子および前記基質の表面上に存在するビニル基と共有結合した。
【００５５】
本発明の他の実施態様では、官能化シランカップリング剤を使用して官能基を基質に付加するが、この官能基は、後に、架橋試薬が介在すること無く、微生物指標に直接結合する。従って、基質官能基と胞子のごとき微生物との間に共有結合は形成されないが、むしろ物理的あるいは他の種類の非共有結合が形成される。前記官能化カップリング剤は、ｎが１〜３であり、望ましくは１〜３である式（ＦＲ）ｎＳｉＸ４−ｎを有することができる。Ｒは、炭素数が１〜約２０、望ましくは２〜約１８、好ましくは３〜約１６であるアルキルのごとき有機化合物、または炭素数が６〜約２０、望ましくは６〜約１５である芳香族化合物、または、それらの組み合わせ、例えばアルキルアリール、アリールアルキルなどである。Ｘは、クロロまたはブロモ基のごときハロゲン化物、好ましくは塩素、またはアルコキシ基、Ｒ１が炭素数が１〜約１０、好ましくは１または２であるアルキルであるＯＲ１である。従って、様々なシランカップリング剤を用いることができ、その代表的な例としては、プロピルトリメトキシシラン、ブチルトリメトキシシラン、プロピルトリエトキシシラン、ブチルトリエトキシシラン、プロピルトリクロロシラン、プロピルトリブロモシラン、ブチルトリクロロシラン、ブチルトリブロモシラン、１１−ヘキサデシルトリクロロシラン、１５−ペンタデセニルトリクロロシラン、１１−ブロモウンデシルトリクロロシラン、モノクロロシラン、ジクロロシランなどが挙げられる。前記シランカップリング剤の官能基Ｆは、物理的結合を介して細菌、胞子などと結合することができる化合物である。好適な官能基としては、チオ化合物、アミン化合物、カルボニル含有化合物、臭素化合物、エポキシ化合物、カルボキシル含有化合物、アルケン化合物およびアルキン化合物など、およびそれらの誘導体が挙げられる。官能化シランカップリング剤の例としては、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリクロロシラン、３−メルカプトプロピルトリクロロシランなどが挙げられる。
【００５６】
各種有機シランは、一般に複数の、通常は３種のＸ基を有するため、それらは、ガラスやセルロースのごとき一部の基質に固有のヒドロキシル基と架橋結合して、
【００５７】
【化３】
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【００５８】
基の二次元単分子層状ネットワークを形成することができる。前記基において、酸素原子は、基質表面と結合したヒドロキシル基から誘導される。当然ながら、１種の官能化シランカップリング剤を用いることもできるし、異なる２種以上の官能化シランカップリング剤の混合物を用いることもできる。結果として、基質表面に高密度の微生物指標が固定される。
基質に官能化オルガノシランカップリング剤の層を形成する方法は、シラン化合物を、対応するアルキルシランの沈着の前に約６０〜７５℃にまで加熱された溶媒に添加することを含んでなる。好適な溶媒は、任意の乾燥有機溶媒、例えば、トルエン、ヘキサデカン、ベンゼン、ナフタレン、キシレンのごとき芳香族炭化水素、アセトンなどのごとき乾燥ケトンであるが、ヘキサデカンが好ましい。
胞子のごとき微生物指標は、基質表面上の官能分子と胞子殻内のタンパク質との疎水性相互作用または静電相互作用によって前記表面に物理吸着させることができる。また、前記胞子は、前記タンパク質内に存在するアミン基を用いて前記表面に化学吸着させることもできる。
【００５９】
実施例４
（シラン結合剤）
密閉吸収セルまたは結晶皿を含有する基質材料のサンプルを、硫酸と過酸化水素との溶液で洗浄することによって基質表面上のあらゆる有機不純物を取り除くことによって作製した。その後、前記基質を大量の水で洗浄することによって、残留酸または過酸化物をすべて取り除いた。
【００６０】
その後、前記基質を、６０〜７５℃の水浴において、ヘキサデカン中の１％ヘキサデシルトリクロロシランまたは１１−ブロモウンデシルトリクロロシランまたは１５−ペンタデセニルトリクロロシランからなるシラン溶液に、約３０秒間〜５時間浸した。その後、前記基質を取り出し、非極性溶媒で洗浄することによって残留シラン分子を取り除いた。
【００６１】
生物学的インジケータを調製するために、前記官能化基質を、約５〜１００ｍｌの胞子溶液に、約１秒間〜約１８時間、好ましくは１秒間〜３時間、浸漬した。あるいは、前記官能化基質に、胞子懸濁液を植菌、噴霧または印刷してもよい。胞子溶液に浸漬した後、前記基質を周囲条件（１７〜２５℃および１〜３０分間）で放置して乾燥させた。乾燥後、前記生物学的インジケータ品を滅菌水で洗浄することによって、緩く付着した胞子をすべて取り除いた。この洗浄によって、しっかりと付着した胞子だけが残る。その後、前記生物学的インジケータを周囲条件で再度乾燥させ、検査して、胞子群の数および分布を求めた。
【００６２】
実施例５
（シラン結合剤）
ガラス基質材料のサンプルを、アミン終端表面を有するように改質した。前記ガラスの表面を、３０％の過酸化水素（３５％）と７０％の濃硫酸との溶液を用いて洗浄した。洗浄したガラス表面を、無水溶媒、好ましくはヘキサデカンまたはアセトン中の３−アミノプロピルトリメトキシシランの１％溶液に浸漬することによって、アミン官能表面を調製した。前記アミン官能表面を、ＤＭＳＯまたはＥｔＯＨ中に２０ｍＭＳＰＤＰ原液を含有するリン酸緩衝生理食塩水中に、１７〜２５℃の温度で約３０〜約６０分間、浸漬した。その後、リン酸緩衝液中ですすぐことによって、余分なＳＰＤＰを取り除いた。
【００６３】
その後、２５ｍｇ／ｍｌのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する緩衝酢酸溶液を用いて還元した。前記表面を、１７〜２５℃の温度で３０分間、酢酸／ＤＴＴ溶液に浸漬した。その後、前記表面を大量の緩衝酢酸溶液で洗浄することによってＤＴＴをすべて取り除いた。
【００６４】
生物学的インジケータ品を調製するために、ヘテロ二官能性剤が付着した基質を、約３０秒間〜約２０時間、適量の胞子溶液に浸漬した。前記胞子溶液に浸漬した後、前記基質を周囲条件（１７〜２５℃）で放置して乾燥させた。
【００６５】
実施例６
さらに他の実施態様では、ホウケイ酸ガラスのごときヒドロキシル官能化表面を用いて生物学的インジケータを調製することができる。前記官能化基質を、約５〜１００ｍｌの胞子溶液に、約１秒間〜約２４時間、好ましくは１秒間〜３時間、浸漬した。前記胞子溶液に浸漬した後、前記基質を周囲条件（１７〜２５℃および１〜３０分間）で放置して乾燥させた。乾燥後、前記生物学的インジケータ品を滅菌水で洗浄することによって、緩く付着した胞子をすべて取り除いた。この洗浄によって、しっかりと付着した胞子だけが残る。その後、前記生物学的インジケータを周囲条件で再度乾燥させ、目視検査して、表面上の胞子群の分布および胞子の数を求めた。均一で一貫性のある胞子群が得られ、標準偏差は約２５％以下であった。
【００６６】
特許法に従って、最良の形態および好ましい実施態様を説明してきたが、本発明の範囲はそれらに限定されるものではなく、むしろ添付の請求の範囲によって限定されるものである。