(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＫＫ１ポリペプチド（配列番号１）およびＤＫＫ４ポリペプチド（配列番号１２４）のエピトープと特異的に結合する抗原結合領域を有する抗体またはその機能的フラグメントを含む組成物であって、ここで、この抗原結合領域はＤＫＫ１とＤＫＫ４の双方の少なくとも１つのエピトープと結合する抗体またはその機能的フラグメントの抗原結合領域であり、該抗体またはその機能的フラグメントが、
ａ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列の３つの相補決定領域（ＣＤＲｓ）を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
ｂ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲｓを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、組成物。
【請求項２】
ＤＫＫ１またはＤＫＫ４との結合が、Ｗｎｔによりシグナル伝達される転写の拮抗作用；電気化学発光に基づく結合分析；酵素結合免疫吸着アッセイ結合；ＦＭＡＴ；ＳＥＴ；ＳＰＲ；オステオカルシン（ＯＣＮ）血清濃度；オステオプロテグリン（ＯＰＧ）血清濃度；１型プロコラーゲン−Ｎ−プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）血清濃度；ＡＬＰ生産；ＴｏｐＦｌａｓｈまたは骨溶解の改善から選択される少なくとも１つのアッセイで決定される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
配列番号１１に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲｓが、表１１ＡのＭＯＲ０４９１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３で示される配列である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
配列番号３０に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲｓが、表１１ＢのＭＯＲ０４９１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３で示される配列である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
配列番号１１に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲｓが、表１１ＡのＭＯＲ０４９１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３で示される配列であり；および
配列番号３０に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲｓが、表１１ＢのＭＯＲ０４９１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３で示される配列である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
少なくとも１つのＣＤＲが、表１１Ａで示されるＭＯＲ０４９１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３または表１１Ｂで示されるＭＲＯ０４９１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３の配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項３〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
ＤＫＫ１ポリペプチド（配列番号１）およびＤＫＫ４ポリペプチド（配列番号１２４）のエピトープと特異的に結合する、単離された抗体または機能的フラグメントであって、
ａ）配列番号９７に記載のヌクレオチド配列にコードされたアミノ酸配列、そのアミノ酸配列の保存的変異体を有する抗原結合軽鎖、ここで、該保存的変異体は表１１ＢのＭＯＲ０４９１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３で示される配列を含む；および
ｂ）配列番号１０１に記載のヌクレオチド配列にコードされたアミノ酸配列、そのアミノ酸配列の保存的変異体を有する抗原結合重鎖、ここで、該保存的変異体は表１１ＡのＭＯＲ０４９１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３で示される配列を含む
を含む、抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項８】
ヌクレオチド配列が発現のために、および／または臨床使用のためにさらに至適化されたものである、請求項７に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項９】
ＤＫＫ１ポリペプチド（配列番号１）およびＤＫＫ４ポリペプチド（配列番号１２４）のエピトープと特異的に結合する、単離された抗体または機能的フラグメントであって、
ａ）配列番号１０４に記載のヌクレオチド配列にコードされたアミノ酸配列、そのアミノ酸配列の保存的変異体を有する抗原結合軽鎖、ここで、該保存的変異体は表１１ＢのＭＯＲ０４９１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３で示される配列を含む；および
ｂ）配列番号１０８に記載のヌクレオチド配列にコードされたアミノ酸配列、そのアミノ酸配列の保存的変異体を有する抗原結合重鎖、ここで、該保存的変異体は表１１ＡのＭＯＲ０４９１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３で示される配列を含む
を含む、抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項１０】
ヌクレオチド配列が発現のために、および／または臨床使用のためにさらに至適化されたものである、請求項９に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項１１】
ＤＫＫ１ポリペプチド（配列番号１）およびＤＫＫ４ポリペプチド（配列番号１２４）のエピトープと特異的に結合する、単離された抗体またはその機能的フラグメントであって、
ａ）配列番号１１１に記載のアミノ酸配列、そのアミノ酸配列の保存的変異体を有する抗原結合軽鎖、ここで、該保存的変異体は表１１ＢのＭＯＲ０４９１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３で示される配列を含む；および
ｂ）配列番号１１５に記載のアミノ酸配列、そのアミノ酸配列の保存的変異体を有する抗原結合重鎖、ここで、該保存的変異体は表１１ＡのＭＯＲ０４９１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３で示される配列を含む
を含む、抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項１２】
ＤＫＫ１ポリペプチド（配列番号１）およびＤＫＫ４ポリペプチド（配列番号１２４）のエピトープと特異的に結合する、単離された抗体またはその機能的フラグメントであって、
ａ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ；および
ｂ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ
を含む、抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項１３】
ＤＫＫ１ポリペプチド（配列番号１）およびＤＫＫ４ポリペプチド（配列番号１２４）のエピトープと特異的に結合する、単離された抗体またはその機能的フラグメントであって、
ａ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲｓを含むＶＨ；および
ｂ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲｓを含むＶＬ
を含む、抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項１４】
配列番号１１に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲｓが、表１１ＡのＭＯＲ０４９１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３で示される配列である、請求項１３に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項１５】
配列番号３０に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲｓが、表１１ＢのＭＯＲ０４９１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３で示される配列である、請求項１３に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項１６】
配列番号１１に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲｓが、表１１ＡのＭＯＲ０４９１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３で示される配列であり；および
配列番号３０に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲｓが、表１１ＢのＭＯＲ０４９１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３で示される配列である、請求項１３に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項１７】
少なくとも１つのＣＤＲのアミノ酸配列が、表１１Ａで示されるＭＯＲ０４９１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３または表１１Ｂで示されるＭＯＲ０４９１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項１８】
抗体またはその機能的フラグメントがＩｇＭおよびＩｇＧ（このＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３またはＩｇＧ４から選択される）から選択されるスキャフォールドを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
ＩｇＭまたはＩｇＧがポリクローナルまたはモノクローナルから選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
単離された抗体またはその機能的フラグメントが、標的ＤＫＫ１とＤＫＫ４の双方のエピトープに特異的な抗原結合領域を含み、ここで、この抗原結合領域はＤＫＫ１とＤＫＫ４の双方の少なくとも１つのエピトープと結合する抗体またはその機能的フラグメントの抗原結合領域であり、前記エピトープが標的ＤＫＫ１またはＤＫＫ４のＣＹＳ２ドメインの少なくとも６以上のアミノ酸残基を含む、請求項７〜１７のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項２１】
完全な免疫グロブリンまたはそのＦａｂフラグメントもしくはｓｃＦｖ抗体フラグメント、重鎖抗体および非免疫グロブリンスキャフォールド上のその抗原結合領域から選択される、請求項２０に記載の単離された抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項２２】
抗体またはその機能的フラグメントがＩｇＭおよびＩｇＧ（このＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３またはＩｇＧ４から選択される）から選択されるスキャフォールドを含む、請求項７〜１７、２０および２１のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項２３】
前記エピトープがコンフォメーショナルエピトープである、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項２４】
請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗体または機能的フラグメントとそのための薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的フラグメントをコードする遺伝子を担持する非ヒト・トランスジェニック動物。
【請求項２６】
ＤＫＫ１またはＤＫＫ４の存在に関連する障害または状態を処置する方法に使用するための請求項２４に記載の医薬組成物であって、該方法がそれを必要とする対象に有効量の当該医薬組成物を投与する工程を含むものである、医薬組成物。
【請求項２７】
前記障害または状態が骨溶解病変、骨髄腫もしくは多発性骨髄腫に関連する骨溶解性病変、骨、乳房、結腸、メラニン細胞、肝細胞、上皮、食道、脳、肺、前立腺もしくは膵臓の癌またはその転移に関連する骨溶解病変；移植に関連する骨欠損から選択されるか、または骨肉腫、前立腺癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、多発性骨髄腫を含む骨髄腫、糖尿病、肥満、筋肉消耗、アルツハイマー病、骨粗鬆症、オステオペニア、リウマチ、大腸炎および／または望ましくない脱毛である、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
該方法が第二の治療薬を投与することをさらに含む、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記第二の化学療法薬がゾメタ（登録商標）である、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
第二の治療薬が抗癌薬；代謝アンタゴニスト、抗糖尿病薬、抗骨粗鬆症薬；抗生物質；抗炎症薬；増殖因子；およびサイトカインからなる群から選択される、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
請求項７〜１７および２０〜２３のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメントである第一の成分を含む免疫複合体。
【請求項３２】
請求項７〜１７および２０〜２３のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメントを含むキット。
【請求項３３】
薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
抗体が単位用量で存在する、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項３５】
対象に投与する上での使用説明書をさらに含む、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３６】
抗体が中和抗ＤＫＫ１／４抗体である、請求項１〜６および１８〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
抗体が１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１．０ｎＭ、５００ｐＭまたは１００ｐＭ未満のＫｏｎでＤＫＫ１と結合し、ＤＫＫ１の解離速度が１０−２／秒、１０−３／秒、１０−４／秒または１０−５／秒未満である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
抗体がＤＫＫ２またはＤＫＫ３に比べてＤＫＫ１またはＤＫＫ４に対し１０２〜１０６高い親和性を有する請求項３６または３７に記載の組成物。
【請求項３９】
抗体がＤＫＫ１またはＤＫＫ４との結合をめぐって中和抗ＤＫＫ１／４と競合する、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
哺乳類における増殖性障害または疾患を予防または処置するための医薬組成物であって、
（ａ）請求項３６に記載の中和抗ＤＫＫ１／４組成物と
（ｂ）１以上の薬学的に活性な薬剤
を含む医薬剤の組合せを含む、医薬組成物。
【請求項４１】
薬学的に活性な薬剤が中和抗ＤＫＫ１／４組成物またはその誘導体以外の特に任意の薬学的に活性な薬剤を意味し、その薬剤が、
ｉ．アロマターゼ阻害剤；
ｉｉ．抗エストロゲン作用薬、抗アンドロゲン作用薬またはゴナドレリン作用薬；
ｉｉｉ．トポイソメラーゼＩ阻害剤またはトポイソメラーゼＩＩ阻害剤；
ｉｖ．微小管活性剤、アルキル化剤、抗新生物剤、代謝拮抗剤またはプラチン化合物；
ｖ．タンパク質もしくは脂質キナーゼ活性またはタンパク質もしくは脂質ホスファターゼ活性を標的化／低減する化合物、さらなる抗脈管形成化合物または細胞分化プロセスを誘導する化合物；
ｖｉ．モノクローナル抗体；
ｖｉｉ．シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ビスホスホネート、ヘパラナーゼ阻害剤、生物反応修飾物質；
ｖｉｉｉ．Ｒａｓ発癌性イソ型の阻害剤；
ｉｘ．テロメラーゼ阻害剤；
ｘ．プロテアーゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤またはプロテアソーム阻害剤；
ｘｉ．血液性悪性疾患の処置に用いられる薬剤またはＦｌｔ−３の活性を標的化、低減もしくは阻害する化合物；
ｘｉｉ．ＨＳＰ９０阻害剤；
ｘｉｉｉ．抗増殖性の抗体；
ｘｉｖ．ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤；
ｘｖ．セリン／トレオニンｍＴＯＲキナーゼの活性／機能を標的化、低減または阻害する化合物；
ｘｖｉ．ソマトスタチン受容体アンタゴニスト；
ｘｖｉｉ．抗白血病化合物；
ｘｖｉｉｉ．腫瘍細胞傷害アプローチ；
ｘｉｘ．ＥＤＧ結合剤；
ｘｘ．リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤；
ｘｘｉ．Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ阻害剤；
ｘｘｉｉ．ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲのモノクローナル抗体；
ｘｘｉｉｉ．光線力学療法；
ｘｘｉｖ．脈管形成抑制ステロイド；
ｘｘｖ．コルチコステロイド含有インプラント；
ｘｘｖｉ．ＡＴ１受容体アンタゴニスト；および
ｘｘｖｉｉ．ＡＣＥ阻害剤
から選択される、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
（ａ）請求項３６に記載の中和抗ＤＫＫ１／４組成物；
（ｂ）薬学的に活性な薬剤；および
（ｃ）薬学的に許容される担体
を含む医薬組成物。
【請求項４３】
（ａ）請求項３６に記載の中和抗ＤＫＫ１／４組成物の医薬製剤；および
（ｂ）同時使用、並行使用、個別使用または逐次使用のための薬学的に活性な薬剤の医薬製剤
を含む市販のパッケージまたは製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１(「ＤＫＫ１」)、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−４(「ＤＫＫ４」)または双方の抗体の組成物および使用方法、骨密度、代謝、糖尿病、癌などのＤＫＫ関連の異常の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｗｎｔシグナル伝達経路は胚発生および新生物プロセスの制御に関与している。細胞外Ｗｎｔタンパク質は、特に骨芽細胞、破骨細胞および脂肪細胞の増殖、分化および調節を含む多くの細胞種の増殖および分化を担っている。
【０００３】
多くの癌が骨組織に関連しており、前立腺癌で見られるもののような骨芽細胞病変、または肺癌、乳癌および多発性骨髄腫で見られるもののような骨溶解病変を生じ得る(例えば、Tian et al., 2003 New England J. Med. 349:2483-2494)。
【０００４】
Ｗｎｔ遺伝子ファミリーのメンバーは種々の発生プロセスに必要な分泌型糖タンパク質をコードしている(Fedi et al., 1999 J. Bio. Chem. 274:19465-19472)。Ｗｎｔファミリーメンバーのタンパク質は骨の沈着を生じる骨芽細胞の増殖および分化に重要なシグナル伝達経路を誘導する。骨形成の他、骨吸収も破骨細胞として知られる細胞により行われる進行中の正常なプロセスである。これに対し、核因子κＢリガンド(ＲＡＮＫＬ)の受容体アクチベーターは破骨細胞の骨吸収の最後のメディエーターであり、それは閉経後骨粗鬆症の病態に、ならびに関節リウマチ、転移癌、多発性骨髄腫、アロマターゼ阻害療法およびアンドロゲン枯渇療法に関連する骨欠損に主要な役割を果たす(例えば、Lewiecki (2006) Expert Opin Biol Ther. 6: 1041-50参照)。骨芽細胞により発現されるオステオプロテグリン(ＯＰＧ)はＲＡＮＫＬを阻害し、それにより破骨細胞の活性および形成を低下する。同化的骨形成と分解的骨吸収の間のバランスは正常な骨密度を調節し、一方または他方の増加はそれぞれ骨密度の増加または骨欠損の増加をもたらす。
【０００５】
Ｗｎｔは他の細胞表面タンパク質と結合し、それを介して機能し、Ｗｎｔシグナル伝達は新生物プロセスに寄与し得る。さらに、遺伝子変異が、タンパク質β−カテニンを含む腺腫様多発結腸ポリープとして知られている細胞タンパク質複合体に影響を及ぼすことがあり、これらの複合体はヒト結腸癌、黒色腫および肝細胞癌などの疾病を有する患者の細胞で見られているが、このことはＷｎｔシグナル伝達経路の異常がこれらの、またおそらくは他のヒト癌の発症に関連していることを示唆する(Fedi et al., 1999 J. Bio. Chem. 274:19465-19472)。
【０００６】
Ｗｎｔシグナル伝達を阻害するタンパク質には少なくとも２つのファミリーがあり、すなわち分泌型frizzled関連ファミリーおよびＤｉｃｋｋｏｐｆ(ＤＫＫ)ファミリーである。ＤＫＫファミリーは現在のところ４つのファミリーメンバー、すなわちＤＫＫ１(ヒトＤＮＡ受託番号ＮＭ＿０１２２４２；ＰＲＴ受託番号Ｏ９４９０７)、ＤＫＫ２(ヒト受託番号ＮＭ＿０１４４２１；ＰＲＴ受託番号ＮＰ＿０５５２３６)、ＤＫＫ３(ヒト受託番号ＮＭ＿０１５８８１；ＰＲＴ受託番号ＡＡＱ８８７４４)およびＤＫＫ４(ヒト受託番号ＮＭ＿０１４４２０；ＰＲＴ受託番号ＮＰ＿０５５２３５)を含む。
【０００７】
Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１(ＤＫＫ１)はＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の分泌型阻害剤である。例えば、Niehrsの米国特許出願２００５−００７９１７３；McCarthyの米国特許出願２００４−０２３４５１５参照。ＤＫＫ１はＷｎｔに誘導される軸の複製を阻害する能力を有し、遺伝子分析では、ＤＫＫ１が上流でＷｎｔシグナル伝達を阻害する働きをすることが示唆される。ＤＫＫ１はまた、高レベルＤＫＫ１に曝露した後のニワトリおよびマウス胚における骨構造の欠損に対する作用により示されるように、骨格の発達にも重要である(Tian et al., 2003 New England J. Med. 349:2483-2494)。高いＤＫＫ１血清レベルは前立腺癌と関連付けられており、多発性骨髄腫患者の骨髄血漿および末梢血における高いＤＫＫ１およびＲＡＮＫＬレベルは局部的骨病変の存在の存在に関連している。例えば、Tian 2003,ＯＭＩＭ受託番号６０５１８９参照。ＤＫＫ１はまた、脂肪形成、軟骨形成、消化管上皮の増殖、リウマチに関連する骨欠損および毛包原基形成の誘導にも役割を果たす。ＯＭＩＭ受託番号６０５１８９。
【０００８】
Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−４(ＤＫＫ４)はあまり十分な特徴付けはされていないが、同様にＷｎｔ経路の分泌型阻害剤である。ＤＫＫ４はアルツハイマー病患者の病巣に沈着していることが示されており、筋肉で発現する。Ｗｎｔは筋肉の発達には既知の役割を持たないことから、本明細書では、ＤＫＫ４は筋肉の発達に阻害的役割を有すると仮定する。
【０００９】
ＤＫＫ１および／またはＤＫＫ４により媒介されるＷｎｔシグナル伝達の拮抗作用を妨げるまたは打ち消す薬剤を含む、癌および骨密度異常を処置するための組成物および方法の必要がある。
【発明の開示】
【００１０】
(発明の概要)
本明細書の一態様は、ＤＫＫ１および／またはＤＫＫ４ポリペプチドまたはそのフラグメントと選択的に結合し、それを中和する抗体またはその抗原結合部分を提供する。好ましい態様では、抗体はＤＫＫ１／４中和抗体である。種々の態様では、ＤＫＫ１／４中和抗体の抗原結合部分はＤＫＫ２またはＤＫＫ３と結合しない。
【００１１】
一態様では、抗体またはその抗原結合部分は、例えば、ヒト、ヒト化、ヒューマニアード(humaneered)、サメまたはラクダスキャフォールドから選択されるフレームワークなどの免疫グロブリン様スキャフォールド内に配置され、かつ／またはさらに組換え抗体、キメラ抗体またはＣＤＲグラフト抗体であってもよい。例えば、ヒト抗マウス抗体応答を最小化するように設計された技術(Ｋａｌｏｂｉｏｓのヒューマニアリング技術またはＰＤＬのヒト化技術)が本発明の範囲内で考えられる。さらに、ＤＫＫ１またはＤＫＫ４に特異的な抗原結合部分もまた、例えば、アドネクチン、フィブリノゲン、アンキリン由来リピートなどのタイプのフレームワーク内に配列されたものを含み、非免疫グロブリン様スキャフォールド内にあってもよい。
【００１２】
特定の態様では、Ｄｋｋ１抗体は標的タンパク質ＤＫＫ１に特異的な抗原結合領域を有すると特徴付けられ、この抗体または機能的フラグメントはＤＫＫ１またはそのフラグメントと結合する。関連の態様では、ＤＫＫ４抗体は標的タンパク質ＤＫＫ４に特異的な抗原結合領域を有すると特徴付けられ、この抗体または機能的フラグメントはＤＫＫ４またはそのフラグメントと結合する。関連の態様では、Ｄｋｋ４抗体は標的タンパク質ＤＫＫ４に特異的な抗原結合領域を有すると特徴付けられ、この抗体または機能的フラグメントはＤＫＫ４またはそのフラグメントと結合する。好ましい態様では、抗体またはその抗原結合部分はＤＫＫ１およびＤＫＫ４ポリペプチドと結合するが、ＤＫＫ２またはＤＫＫ３ポリペプチドと結合しない。
【００１３】
別の態様では、抗体またはその抗原結合部分はモノクローナルである。別の態様では、抗原結合部分はポリクローナルである。種々の態様では、ＤＫＫ１抗体またはその抗原結合部分はＤＫＫ１またはＤＫＫ４ポリペプチドの３０の連続するアミノ酸からなるペプチドと結合する。
【００１４】
関連の態様では、このＤＫＫ１またはＤＫＫ４との結合は、以下のアッセイ：Ｗｎｔによりシグナル伝達される転写のＤＫＫ１またはＤＫＫ４拮抗作用の阻害；表面プラズモン共鳴親和性測定、酵素結合免疫吸着アッセイ結合；電気化学発光に基づく結合分析；ＦＭＡＴ、ＳＥＴ、ＳＰＲ、ＡＬＰ、ＴｏｐＦｌａｓｈ、オステオカルシン(ＯＣＮ)、１型プロコラーゲン−Ｎ−プロペプチド(Ｐ１ＮＰ)およびオステオプロテグリン(ＯＰＧ)などのバイオマーカーの血清濃度、ならびにＦｒｉｚｚｌｅｄ(Ｆｚ)、ＬＲＰ(ＬＲＰ５／６)またはＫｒｅｍｅｎ(Ｋｒｍ)などの細胞表面受容体に対する結合の少なくとも１つにより測定される。ある特定の態様では、Ｄｋｋ１抗体または抗原結合部分は以下の特性：ＤＫＫ１に対する選択性がヒトＤＫＫ２またはＤＫＫ３に対するよりも少なくとも１０３倍、１０４倍または１０５倍高いこと；ＤＫＫ１またはＤＫＫ４と１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１.０ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは１０ｐＭ未満のＫｏｎで結合すること；およびＤＫＫ１に対する解離速度が１０−２／秒、１０−３／秒、１０−４／秒または１０−５／秒であることの少なくとも１つを有する。
【００１５】
関連の態様では、本発明の抗体はＬＲＰ５／６との結合をめぐってＤＫＫ１および／またはＤＫＫ４と競合する。関連の態様では、本発明の抗体はＫｒｍとの結合をめぐってＤＫＫ１および／またはＤＫＫ４と競合する。
【００１６】
さらに別の態様では、本発明は、上記抗体またはこれらの抗体の機能的フラグメントのいずれかの単離された抗原結合領域、およびこれらのアミノ酸配列を提供する。よって、ある特定の態様では、本発明は、配列番号２〜２０および配列番号４０〜７２、ならびにこれらの配列の保存的またはヒューマニアード変異体の群から選択される単離されたアミノ酸配列を提供する。
【００１７】
さらに、ある特定のさらなる態様では、本発明は、アミノ酸配列である配列番号２〜２０、６５−７２およびこれらの配列の保存的またはヒューマニアード変異体を提供し、それらは、各々Ｈ−ＣＤＲ−３である単離された抗原結合領域を提供する。
【００１８】
関連の態様では、この単離された抗原結合領域は、配列番号２〜２０、５７〜６４およびこれらの保存的またはヒト化変異体から選択されるアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ２領域である。さらに別の関連の態様では、この単離された抗原結合領域は、アミノ酸配列ＧＩＳＧＳＧＳＹＴＹＹＡＤＳＶＫＦを有する配列番号４０、アミノ酸配列ＧＩＳＹＹＧＧＮＴＹＹＡＤＳＶＫＦを有する配列番号４１およびアミノ酸配列ＧＩＳＹＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＦを有する配列番号４２、ならびにこれらの配列のアミノ酸残基の保存的またはヒューマニアード変異体の群から選択される配列で表されるコンセンサスＨ−ＣＤＲ２領域である。
【００１９】
ある特定の態様では、提供される新規な配列は配列番号２〜５、８〜１１、２０、４９〜５６およびこれらの保存的またはヒューマニアード変異体であり、これらはＨ−ＣＤＲ１領域である単離された抗原結合領域を提供する。
【００２０】
関連の態様では、この単離された抗原結合領域は、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＴ(配列番号４３)、ＧＦＴＦＮＳＹＧＭＴ(配列番号４４)、ＧＦＴＦＳＮＹＧＭＴ(配列番号４５)、ＧＦＴＦＳＳＹＷＭＴ(配列番号４６)、ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＴ(配列番号４７)、ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＳ(配列番号４８)およびこれらの配列のいずれかの保存的またはヒューマニアード変異体から選択されるアミノ酸配列(１文字アミノ酸コードを使用)を有するコンセンサスＨ−ＣＤＲ１領域である。
【００２１】
別の態様では、本発明は、配列番号２１〜３９、８９〜９６およびこれらの配列の保存的またはヒューマニアード変異体から選択されるアミノ酸配列などのＬ−ＣＤＲ３領域を有する単離された抗原結合領域であるアミノ酸配列を提供する。さらに別の関連の態様では、この単離された抗原結合領域は、配列番号２１〜３９、７３〜８０およびこれらの配列の保存的またはヒューマニアード変異体から選択されるアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ１領域である。さらに別の関連の態様では、この単離された抗原結合領域は、配列番号２１〜３９、８１〜８８およびこれらの配列の保存的またはヒューマニアード変異体から選択されるアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ２領域である。
【００２２】
ある特定の態様では、この単離された抗原結合領域は、配列番号２１〜３９およびこれらの配列の保存的またはヒューマニアード変異体から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変鎖である。
【００２３】
別の態様では、本発明は、配列番号９７〜１０３の群から選択されるヌクレオチド配列を提供する。関連の態様では、これらの各ヌクレオチド配列はアミノ酸配列をコードし、これらのコードされているアミノ酸配列の保存的またはヒューマニアード変異体も本発明の範囲内にある。別の関連の態様では、配列番号９７〜１００の各々のヌクレオチド配列は抗原結合軽鎖をコードする。さらなる関連の態様では、配列番号１０１〜１０３の各々のヌクレオチド配列は抗原結合重鎖をコードする。さらに別の関連の態様では、これらの各ヌクレオチド配列は細胞での発現のためにさらに至適化される。好ましい細胞としては、限定されるものではないが、例えば、チャイニーズハムスター(例えばＣＨＯ)細胞、バキュロウイルス、酵母、細菌、骨髄腫細胞および／またはヒト(H. sapiens)が含まれる。
【００２４】
好ましくは、配列は発現のために、また生産および臨床使用のために至適化される。臨床使用のために至適化される特徴としては、限定されるものではないが、例えば、半減期、薬物動態(ＰＫ)、抗原性、エフェクター機能、ＦｃＲｎクリアランス、および抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)活性または補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)活性を含む患者の応答が含まれる。
【００２５】
さらなる態様では、本発明は、配列番号１０１〜１０３の群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる重鎖を有する単離された抗原結合領域を提供する。関連の態様では、本発明は、配列番号９７〜１００の群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖を有する単離された抗原結合領域を提供する。さらに別の関連の態様では、本発明は、配列番号９７〜１００の群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖と配列番号１０１〜１０３の群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる重鎖を有する単離された抗原結合領域を提供する。
【００２６】
ある特定の態様では、本発明は、配列番号１０４〜１１０の群から選択されるヌクレオチド配列を提供する。関連の態様では、これらの各ヌクレオチド配列はアミノ酸配列をコードし、これらのアミノ酸配列の保存的またはヒューマニアード変異体も本発明の範囲内にある。別の関連の態様では、配列番号１０４〜１０７の各ヌクレオチド配列は抗原結合軽鎖をコードする。さらなる関連の態様では、配列番号１０８〜１１０の各ヌクレオチド配列は抗原結合重鎖をコードする。さらに別の関連の態様では、これらの各ヌクレオチド配列は発現および／または臨床使用のために至適化される。
【００２７】
さらなる態様では、本発明は、配列番号１０８〜１１０の群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる重鎖を有する単離された抗原結合領域を提供する。別の関連の態様では、本発明は、配列番号１０４〜１０７の群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖を有する単離された抗原結合領域を提供する。さらに別の関連の態様では、本発明は、配列番号１０４〜１０７の群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖と配列番号１０８〜１１０の群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる重鎖を有する単離された抗原結合領域を提供する。
【００２８】
他の態様では、本発明は、配列番号１１１〜１１７の群から選択されるアミノ酸配列を提供し、また、これらの配列の保存的変異体を提供する。関連の態様では、配列番号１１１〜１１４の各々は抗原結合軽鎖を表す。別の態様では、配列番号１１５〜１１７の各々は抗原結合重鎖を表す。さらに別の関連の態様では、このアミノ酸配列は発現および／または臨床使用のために至適化される。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、配列番号１１５〜１１７の群から選択されるアミノ酸配列で表される重鎖を有する単離された抗原結合領域を提供し、また、これらの配列の保存的変異体を提供する。関連の態様では、本発明は、配列番号１１１〜１１４の群から選択されるアミノ酸配列で表される軽鎖を有する単離された抗原結合領域を提供し、また、これらの配列の保存的変異体を提供する。さらに別の関連の態様では、本発明は、配列番号１１５〜１１７の群から選択されるアミノ酸配列で表される重鎖を有する単離された抗原結合領域を提供し、また、これらの配列の保存的変異体を提供し、配列番号１１１〜１１４の群から選択されるアミノ酸配列で表される軽鎖を提供し、これらの配列の保存的変異体を提供する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、配列番号１２０〜１２１の群から選択されるヌクレオチド配列および／または個々のヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖もしくは重鎖の可変領域を有する単離された抗原結合領域を提供する。関連の態様では、これらの各ヌクレオチド配列はアミノ酸配列をコードし、これらのアミノ酸配列の保存的またはヒューマニアード変異体も本発明の範囲内にある。別の関連の態様では、配列番号１２０のヌクレオチド配列は抗原結合軽鎖をコードする。さらなる関連の態様では、配列番号１２１のヌクレオチド配列は抗原結合重鎖をコードする。さらに別の関連の態様では、これらの各ヌクレオチド配列は発現および／または臨床使用のためにさらに至適化される。
【００３１】
ある特定の態様では、本発明は、１１８〜１１９の群から選択されるアミノ酸配列およびこれらの配列の保存的またはヒューマニアード変異体を提供する。関連の態様では、配列番号１１８は軽鎖の抗原結合可変領域を表す。別の関連の態様では、配列番号１１９は重鎖の抗原結合可変領域を表す。さらに別の関連の態様では、このアミノ酸配列は発現および／または臨床使用のために至適化される。
【００３２】
他の態様では、本発明は、配列番号２〜３９で表されるＣＤＲ領域と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を提供する。関連の態様では、本発明は、配列番号１１１〜１２０で表される配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を提供する。さらに別の関連の態様では、本発明は、配列番号９７〜１１０および１２０〜１２１で表される配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を提供する。
【００３３】
ある特定の態様では、上記の単離された抗体はいずれもＩｇＧである。関連の態様では、上記の単離された抗体はいずれもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。別の態様では、この抗体はＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＡである。関連の態様では、本発明は、モノクローナル抗体組成物またはポリクローナル抗体組成物から選択される。さらなる態様では、この抗体はキメラ、ヒト化、ヒューマニアード、組換え抗体などである。さらに別の態様では、本発明は、ＤＫＫ１のエピトープに特異的な抗原結合領域を有する単離されたヒトもしくはヒト化抗体またはその機能的フラグメントを提供し、この抗体または機能的フラグメントはＤＫＫ１もしくはＤＫＫ４と結合するか、またはそうでなければＤＫＫ１もしくはＤＫＫ４と細胞表面受容体(例えば、ＬＲＰ５／６、Ｋｒｅｍｅｎ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄなどの受容体)の結合を遮断する。ある特定の態様では、抗体またはそのフラグメントは骨溶解病変の発症を予防、処置または改善する。他の態様では、本発明の抗ＤＫＫ組成物はＤＫＫ１関連またはＤＫＫ４関連の癌または疾病を予防、処置または改善する。
【００３４】
関連の態様では、本発明は、標的ＤＫＫ１またはＤＫＫ４のエピトープに特異的な抗原結合領域を有する単離されたヒトまたはヒト化抗体または機能的フラグメントを提供し、このエピトープはＤＫＫ１および／またはＤＫＫ４のＣＹＳ１−リンカー−ＣＹＳ２ドメインを含むポリペプチドフラグメントに由来する６個以上のアミノ酸残基を含む。関連の態様では、このエピトープはコンフォメーショナルエピトープである。好ましい態様では、このエピトープはＣＹＳ２ドメイン内にある。特定の態様では、このエピトープは修飾アミノ酸残基を含む。関連の態様では、このエピトープは少なくとも１つのグリコシル化アミノ酸残基を含む。
【００３５】
機能的フラグメントはＦｖフラグメントおよびＦａｂフラグメント(ｓｃＦｖなどの短鎖型を含む)、ならびに非免疫グロブリンスキャフォールドおよびラクダ抗体やサメ抗体などの重鎖抗体およびナノボディーに結合されたものを含む抗体の他の抗原結合領域を含む。関連の態様では、上記の単離された抗体はＩｇＧである。別の関連の態様では、上記の単離された抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。別の態様では、この抗体はＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＡである。関連の態様では、本発明はポリクローナル抗体組成物である。
【００３６】
別の態様では、本発明は、上記抗体または機能的フラグメントまたは保存的変異体のいずれか少なくとも１つとその薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００３７】
さらに別の態様では、本発明は、上記抗体またはそれらの機能的フラグメントのいずれかをコードする遺伝子を担持するトランスジェニック動物を提供する。
【００３８】
ある特定の態様では、本発明は、ＤＫＫ１またはＤＫＫ４発現に関連する障害または状態を処置するための方法を提供する。本明細書において「ＤＫＫ１関連疾患」または「ＤＫＫ４関連疾患」は、限定されるものではないが、骨溶解病変、特に、骨髄腫、特に多発性骨髄腫、骨、乳房、結腸、メラニン細胞、肝細胞、上皮、食道、脳、肺、前立腺もしくは膵臓の癌またはその転移に関連する骨溶解病変；移植に関連する骨欠損を含む。さらなる疾病または障害は、限定されるものではないが、例えば、骨肉腫、前立腺癌、肝細胞癌(ＨＣＣ)、多発性骨髄腫を含む骨髄腫、糖尿病、肥満、筋肉消耗、アルツハイマー病、骨粗鬆症、オステオペニア、リウマチ、大腸炎および／または望ましくない脱毛を含む。この方法はそれを必要とする対象に有効量の上記医薬組成物のいずれかを投与することを含む。
【００３９】
関連の態様では、処置される障害または状態は骨密度異常である。別の関連の態様では、この処置される骨密度異常は対象における骨溶解病変の存在である。
【００４０】
別の態様では、処置される障害または状態は癌に関連する骨溶解病変などの骨粗鬆性状態である。関連の態様では、処置される癌は多発性骨髄腫などの骨髄腫、あるいは骨、乳房、結腸、メラニン細胞、肝細胞、上皮、食道、脳、肺、前立腺もしくは膵臓の癌またはその転移である。他の態様では、骨粗鬆性状態は骨粗鬆症またはオステオペニアまたは骨肉腫である。
【００４１】
ある特定の態様では、上記の方法はいずれも、化学療法薬を投与することをさらに含む。関連の態様では、この化学療法薬は抗癌薬である。別の関連の態様では、この化学療法薬は抗骨粗鬆症薬である。
【００４２】
さらに別の態様では、本発明は標的細胞を処置する方法を提供し、その方法はＤＫＫ１またはＤＫＫ４と細胞の相互作用を上記抗体またはその機能的フラグメントのいずれかで遮断することを含む。一般に、標的細胞はＤＫＫ１またはＤＫＫ４と結合する受容体を有する。一態様では、この標的細胞は骨芽細胞であり、この場合、本発明の中和抗ＤＫＫ１／４組成物による処置は増殖を促進し、骨形成を刺激する。一態様では、この標的細胞は筋肉細胞であり、この場合、処置は筋肉消耗を打ち消す。
【００４３】
関連の態様では、その方法は標的細胞を有する患者を化学療法薬または放射線療法で処置することをさらに含む。関連の態様では、投与または接触の後、上記の方法はいずれも骨溶解病変の発症の改善または遅延を観察することをさらに含む。
【００４４】
さらに別の態様では、本発明は、血清においてＤＫＫ１またはＤＫＫ４を同定する方法を提供する。この方法は、検出可能な標識をさらに含む上記抗体または抗体フラグメントのいずれかでＤＫＫ１またはＤＫＫ４を検出することを含む。この標識は放射性、蛍光性、磁性、常磁性、または化学発光性である。
【００４５】
別の態様では、上記ヒトまたはヒト化抗体または抗体フラグメントはいずれも合成品である。
【００４６】
別の態様では、本発明は、上記抗体またはこれらの抗体の機能的フラグメントのいずれかおよび付加的治療薬の医薬組成物を提供する。付加的治療薬は抗癌薬；抗骨粗鬆症薬；抗生物質；代謝アンタゴニスト；抗糖尿病薬；抗炎症薬；抗脈管形成薬；増殖因子；およびサイトカインからなる群から選択される。
【００４７】
本発明はさらに、哺乳類、特にヒトにおいて癌などの増殖性疾患または疾病を、
(ａ)本発明の中和抗ＤＫＫ１／４組成物と
(ｂ)１以上の薬学的に活性な薬剤
を含む医薬剤の組合せで予防または処置する方法に関し、ここで、少なくとも１つの薬学的に活性な薬剤は抗癌治療薬である。
【００４８】
本発明はさらに、
(ａ)ＤＫＫ１／４中和抗体と、
(ｂ)薬学的に活性な薬剤と、
(ｃ)薬学的に許容される担体
を含む医薬組成物に関し、ここで、少なくとも１つの薬学的に活性な薬剤は抗癌治療薬である。
【００４９】
本発明はさらに、
(ａ)ＤＫＫ１／４中和抗体の医薬製剤と、
(ｂ)薬学的に活性な薬剤と、
(ｃ)薬学的に許容される担体
を含む医薬組成物に関し、ここで、少なくとも１つの薬学的に活性な薬剤は抗癌治療薬である。
【００５０】
本発明はさらに、
(ａ)ＤＫＫ１／４中和抗体の医薬製剤と、
(ｂ)同時使用、並行使用、個別使用または逐次使用のための薬学的に活性な薬剤の医薬製剤
を含む、市販のパッケージまたは製品に関し、ここで、少なくとも１つの薬学的に活性な薬剤は抗癌治療薬である。
【００５１】
ある特定の態様では、本発明は、配列番号２〜２０および配列番号２〜２０を有するＣＤＲ領域とＣＤＲ領域において少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８または９９の配列同一性を有する配列から選択される重鎖である第一のアミノ酸配列と、配列番号２１〜３９および配列番号２１〜３９で示されるＣＤＲ領域とＣＤＲ領域において少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有する配列から選択される軽鎖である第二のアミノ酸配列とを有する抗体を提供する。
【００５２】
さらに別の態様では、本発明は、上記のような抗体またはフラグメントである第一の成分と第二のアミノ酸配列を有する第二の成分からなる免疫複合体を提供する。例えば、この免疫複合体は細胞毒素であるか、またはこの免疫複合体はＤＫＫ１またはＤＫＫ４とは異なる標的に対して結合特異性を有する結合タンパク質または抗体である。例えば、このＤＫＫ１またはＤＫＫ４とは異なる結合特異性の標的は癌細胞表面の腫瘍抗原または腫瘍関連タンパク質である。
【００５３】
ある特定の態様では、本発明は、二重特異性抗体である上記抗体のいずれかを提供する。
【００５４】
別の態様では、本発明は、上記抗体または抗体フラグメントを有するキットを提供する。いくつかの態様では、このキットはさらにその薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。関連の他の態様では、このキット中の上記抗体はいずれも単位用量で存在する。さらに別の態様では、このキットはＥＬＩＳＡ診断キットである。関連の態様では、このキットは対象に上記抗体のいずれかを投与する上での使用説明書を含む。
【００５５】
図面の簡単な説明
図１は非洗浄ビーズを種々のＨｕＣＡＬ(登録商標)ストリンジェンシーで洗浄したビーズと比較した場合に、Ｓｔｒｅｐ−ＴａｃｔｉｎコーティングビーズからのＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１の有意な損失はないことを示すグラフである。
図２は実施例３に示される１００μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬を用いたＷｎｔ活性アッセイの結果を示す棒グラフである。
図３は酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)のグラフである。
図４は実施例６に示される標準的なＷｎｔ３ａ依存性ＴＣＦ／ＬＥＦ  ｌｕｃリポーターアッセイを示すグラフである。
図５はＫｒｅｍｅｎ共受容体タンパク質の同時発現により媒介されるＤＫＫ１に対して極めて高い感受性を示す修飾型のＴＣＦ／ＬＥＦ  ｌｕｃリポーターアッセイを示すグラフである。
図６ＡはＤＫＫ１と結合する抗ＤＫＫ１／４抗体の表面プラスミン共鳴(surface plasmin resonance)のグラフ表示である。図６Ｂは算出された結合親和性と動態値の表である。
図７Ａはエピトープマッピングの用いるための全長および末端切断型ＤＫＫ１の模式図である。
図７Ｂは本発明の抗体と図７ＡのＤＫＫ１タンパク質およびフラグメントとの結合を示す。
図８は競合的ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＤＫＫ１／４抗体結合アッセイのグラフ表示である。
図９は下流のＷｎｔ関連遺伝子転写の、ＤＫＫ１／４抗体関連の再活性化のグラフ表示である。
図１０はＡＬＰ分泌のＤＫＫ１／４抗体逆転ＤＫＫ１阻害のグラフ表示である。
図１１はin vivo異種移植に対するＤＫＫ１／４抗体作用のグラフ表示である。
図１２はin vivoにおけるＤＫＫ１／４抗体に関連する骨密度の上昇のグラフ表示である。
図１３はゾメタの抗骨溶解効力ＤＫＫ１／４抗体と比較したグラフ表示である。
図１４は同化骨に対するＤＫＫ１／４抗体の用量依存的効力のグラフ表示である。
【００５６】
(発明の詳細な説明)
本発明は、ＤＫＫ１またはＤＫＫ４と特異的に結合し、ＤＫＫ１またはＤＫＫ４の機能的特性を阻害する、単離されたＤＫＫ１／４抗体、特にヒト抗体に関する。好ましい態様では、ＤＫＫ１／４抗体はＤＫＫ２またはＤＫＫ３と特異的には結合しない。ある特定の態様では、本発明の抗体は特定の重鎖および軽鎖配列に由来し、かつ／または特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域などの特定の構造的特徴を含む。本発明は、単離された抗体、このような抗体を作製する方法、このような抗体を含む免疫複合体および二重特異性分子、ならびに本発明の抗体、免疫複合体または二重特異性分子を含有する医薬組成物を提供する。本発明はまた、これらの抗体を用いてＤＫＫ１またはＤＫＫ４に関連する障害または状態を阻害する方法を提供する。意図される疾病および障害は、限定されるものではないが、骨溶解病変、特に骨髄腫、特に多発性骨髄腫に関連する、あるいは骨、乳房、結腸、メラニン細胞、肝細胞、上皮、食道、脳、肺、前立腺もしくは膵臓の癌またはその転移に関連する骨溶解病変；移植に関連する骨欠損を含む。さらなる疾病または障害は、限定されるものではないが、例えば骨肉腫、前立腺癌、肝細胞癌(ＨＣＣ)、多発性骨髄腫を含む骨髄腫、糖尿病、肥満、筋肉消耗、アルツハイマー病、骨粗鬆症、オステオペニア、リウマチ、大腸炎および／または望ましくない脱毛を含む。
【００５７】
本発明がより容易に理解されるように、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は詳細な説明を通じて示される。
【００５８】
「免疫応答」とは、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または自己免疫性炎症もしくは病的炎症の場合には正常なヒト細胞または組織への選択的傷害、破壊またはヒト身体からの排除をもたらす、例えばリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球および上記の細胞または肝臓により産生される可溶性高分子(抗体、サイトカインおよび補体を含む)の作用を指す。
【００５９】
「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へシグナルを伝達する役割を果たす様々なシグナル伝達分子の間の生化学的な関係を指す。本明細書において「細胞表面受容体」とは、例えば、シグナルを受容することができ、かつ、細胞の原形質膜を経てこのようなシグナルを伝達することができる分子および分子の複合体を含む。本発明の「細胞表面受容体」の一例として、ＤＫＫ１またはＤＫＫ４タンパク質分子が結合する受容体がある。このような細胞表面受容体は、限定されるものではないが、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ(Ｆｚ)、ＬＲＰ(ＬＲＰ５およびＬＲＰ６)、ならびにＫｒｅｍｅｎ(Ｋｒｍ)を含む。
【００６０】
本明細書において「抗体」とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、およびＦａｂ、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖなどのそのフラグメント、ならびに親抗体の抗原結合機能を保持する他のフラグメントを指す。抗体はそれ自体、免疫グロブリンもしくは糖タンパク質、またはそのフラグメントもしくは一部、または修飾免疫グロブリン様フレームワーク内に含まれる抗原結合部分を含む構築物、または非免疫グロブリン様フレームワークまたはスキャフォールドを含む構築物内に含まれる抗原結合部分を指し得る。
【００６１】
本明細書において「モノクローナル抗体」とは、均質な抗体集団を有する抗体組成物を指す。この用語は抗体の種または供給源に関して制限されず、それが作製される方法によっても制限されるものではない。この用語は完全免疫グロブリンならびにＦａｂ、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖ、およびその抗体の抗原結合機能を保持する他のものなどのフラグメントを包含する。全ての哺乳類種のモノクローナル抗体は本発明に使用可能である。しかしながら、特にこれらの抗体は一般にラットまたはマウス起源のものであり、これはモノクローナル抗体を生産するために必要なハイブリッド細胞系統またはハイブリドーマの作製用におけるラットまたはマウス細胞系統の入手可能性のためである。
【００６２】
本明細書において「ポリクローナル抗体」とは、ヘテロな抗体集団を有する抗体組成物を指す。ポリクローナル抗体は免疫動物または選択されたヒトからの血清をプールしたものに由来する場合が多い。
【００６３】
本明細書において「単鎖抗体」とは、結合抗体の結合ドメイン(重鎖および軽鎖の双方)を同定し、その結合機能の保存を可能とする連結部分を提供することにより作製される抗体を指す。これは本質的に、抗原との結合に必要な可変ドメインの部分だけを有する徹底的に省略された抗体を形成する。単鎖抗体の同定および構築は、Ladnerらの米国特許第４,９４６,７７８号に記載されている。
【００６４】
「天然抗体」とは、ジスルフィド結合により内部連結された少なくとも２つの重(Ｈ)鎖と２つの軽(Ｌ)鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は重鎖可変領域(本明細書ではＶＨと略)と重鎖定常領域からなる。この重鎖定常領域は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域(本明細書ではＶＬと略)と軽鎖定常領域からなる。この軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬからなる。これらのＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる保存性の高い領域が散在している相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができる。アミノ末端からカルボキシ末端へと次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並ぶ３つのＣＤＲと４つのＦＲからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第一の成分(Ｃｌｑ)を含む宿主の組織または因子との結合を媒介し得る。
【００６５】
本明細書において抗体の「抗原結合部分」(または簡単には「抗原部分」)とは、標的、例えば１以上のＣＤＲと結合するタンパク質配列を指す。それは例えば、抗原(例えば、ＤＫＫ１)と特異的に結合する能力を保持する全長抗体、抗体の１以上のフラグメントおよび／または非免疫グロブリン関連スキャフォールド上のＣＤＲを含む。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントにより遂行され得る。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に含まれる結合フラグメントの例は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；ヒンジ領域においてジスルフィド橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ(ａｂ)２フラグメント；ＶＨドメインとＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単腕のＶＬドメインとＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント(Ward et al., 1989 Nature 341:544-546)；および単離された相補性決定領域(ＣＤＲ)を含む。
【００６６】
本明細書において「抗原」または「エピトープ」は互換的に、抗体、抗体フラグメントまたはそれらの等価物の抗原結合部分により特に認識される標的タンパク質上のポリペプチド配列を指す。抗原またはエピトープは標的配列内で連続していてもよいし、あるいは不連続であってもよい少なくとも６個のアミノ酸を含む。コンフォメーショナルエピトープは不連続残基を含んでもよく、場合により天然修飾アミノ酸残基または合成修飾アミノ酸残基を含んでもよい。残基に対する修飾は、限定されるものではないが、リン酸化、グリコシル化、ペグ化、ユビキチン化、フラニル化などを含む。
【００６７】
さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬとＶＨは独立した遺伝子によりコードされているが、それらは組換え法を用い、ＶＬ領域とＶＨ領域が対となって一価分子を形成している１本のタンパク質鎖として作製可能とする合成リンカーにより連結することができる(単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として知られている；例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426;およびHuston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883参照)。このような単鎖抗体も抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に含むものとする。これらの抗体フラグメントは当業者に公知の常法を用いて得られ、これらのフラグメントは完全抗体と同様にして有用性に関してスクリーニングされる。
【００６８】
本明細書に記載されるように、保存的変異体は、タンパク質工学の技術分野の熟練者によく知られている、特定されたアミノ酸配列のいずれかにおけるアミノ酸残基、特に保存的変異物を含む。
【００６９】
本明細書において「単離された抗体」とは、抗原特異性の異なる他の抗体を実質的に含まない抗体を指す(例えば、ＤＫＫ１と特異的に結合する単離された抗体は、ＤＫＫ１以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかしながら、ＤＫＫ１と特異的に結合する単離された抗体は、他種由来のＤＫＫ１分子またはＤＫＫ４などの他のファミリーメンバーもしくはパラログなどの他の抗原に対して交差反応性を持ち得る。さらに、単離された抗体は他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まない。
【００７０】
本明細書において「ヒト抗体」とは、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の双方がヒト起源の配列に由来している可変領域を有する抗体を含むものとする。さらに、抗体が定常領域を含む場合、この定常領域も、例えば、ヒト生殖細胞系配列または突然変異型ヒト生殖細胞系配列などのヒト配列に由来する。本発明のヒト抗体はヒト配列によってはコードされていないアミノ酸残基(例えば、in vitroランダムもしくは部位特異的突然変異誘発により、またはin vivo体細胞突然変異により導入された突然変異)を含み得る。しかしながら、本明細書において「ヒト抗体」は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含まないものとする。
【００７１】
「ヒトモノクローナル抗体」とは、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の双方がヒト配列に由来している可変領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を指す。一態様では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合させた、ヒト重鎖導入遺伝子と軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生される。
【００７２】
本明細書において「ヒト化抗体」とは、免疫グロブリンのフレームワーク領域の少なくとも一部がヒト免疫グロブリン配列の由来することを意味する。ヒトフレームワーク配列にグラフトされている別の種、特に哺乳類種、例えばマウスの生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列を有する抗体などの「ヒト化」抗体。技術例は、ＰＤＬのヒト化技術を含む。
【００７３】
本明細書において「ヒューマニアード抗体」とは、同じエピトープと結合するが、配列が異なる抗体を意味する。技術例はKalobiosのヒューマニアリング技術により生産されたヒューマニアード抗体を含み、この場合、抗原結合領域の配列は保存的アミノ酸置換によるよりむしろ例えば突然変異により誘導される。
【００７４】
本明細書において「組換えヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリン遺伝子が遺伝子導入または染色体導入された動物(例えばマウス)またはそれから作製されたハイブリドーマから単離された抗体、ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞(例えば、トランスフェクトーマ)から単離された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体などの組換え手段により作製、発現、作出または単離されたあらゆるヒト抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全部または一部の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む他のいずれかの手段により作製、発現、作出または単離された抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、そのフレームワーク領域とＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来している可変領域を有する。しかしながら、ある特定の態様では、このような組換えヒト抗体はin vitro突然変異誘発(またはヒトＩｇ配列が遺伝子導入された動物を用いる場合には、in vivo体細胞突然変異誘発)を受けてもよく、従って、組換え抗体のＶＨ領域とＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、それに関連するが、自然界でin vivoにおけるヒト抗体生殖細胞系レパートリー内には存在しない配列である。
【００７５】
本明細書において「イソ型」とは、重鎖定常領域遺伝子により提供される抗体クラス(例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４などのようなＩｇＧ)を指す。
【００７６】
「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」とは、本明細書では、「抗原と特異的に結合する抗体」という用語と互換的に用いられる。本明細書において「ヒトＤＫＫ１と特異的に結合する」とは、ヒトＤＫＫ１とＫＤ  ５×１０−９Ｍ以下、２×１０−９Ｍ以下または１×１０−１０Ｍ以下で結合する抗体を指すものとする。「ヒトＤＫＫ１以外の抗原と相互作用する」抗体は、その抗原とＫＤ  ０.５×１０−８Ｍ以下、５×１０−９Ｍ以下または２×１０−９Ｍ以下で結合する抗体を指すものとする。「特定の抗原と交差反応しない」抗体とは、その抗原とＫＤ  １.５×１０−８Ｍ以上、またはＫＤ  ５〜１０×１０−８Ｍまたは１×１０−７Ｍ以上で結合する抗体を指すものとする。ある特定の態様では、抗原と交差反応しないこのような抗体は、標準的な結合アッセイにおいてこれらのタンパク質に対して本質的に検出可能な結合を示さない。
【００７７】
本明細書において、ＬＲＰ、ＦｚまたはＫｒｍなど、「ＤＫＫ１と細胞表面受容体との結合を阻害する」抗体とは、ＤＫＫ１と受容体の結合をＫ  １ｎＭ以下、０.７５ｎＭ以下、０.５ｎＭ以下または０.２５ｎＭ以下で阻害する抗体を指す。
【００７８】
本明細書において「骨溶解」とは骨密度の低下を指し、これは例えば骨芽細胞活性の低下、破骨細胞活性の増大を含む種々の作用機序によるものであり得る。よって、骨溶解は一般に骨の無機質密度に影響を及ぼす機構を包含する。本明細書において「骨溶解活性を阻害する」とは、骨形成の増強か骨吸収の遮断かのいずれかにより骨密度の低下を阻害する抗体を指すものとする。
【００７９】
本明細書において「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」は特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指すものとし、本明細書において「Ｋｄｉｓ」または「ＫＤ」は特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すものとする。本明細書において「ＫＤ」は解離定数を指すものとし、Ｋａに対するＫｄの比(すなわち、Ｋｄ／Ｋａ)から得られ、モル濃度(Ｍ)として表される。抗体のＫＤ値は当技術分野で十分に確立されている方法を用いて決定することができる。抗体のＫＤを決定する方法は表面プラズモン共鳴の使用、ＦＭＡＴまたはBiacore(登録商標)システムなどのバイオセンサーシステムの使用による。
【００８０】
本明細書において「親和性」とは、単一の抗原部位における抗体と抗原の間の相互作用の強度を指す。各抗原部位内で、抗体の「腕」の可変領域は多数の部位において抗原と弱い非共有結合力で相互作用し、相互作用が強くなるほど親和性が強くなる。
【００８１】
本明細書において「アビジティー」とは、抗体−抗原複合体の全体的な安定性または強度の情報が得られる指標を指す。これは抗体エピトープの親和性；抗原および抗体双方の価数；および相互作用部分の構造的配置の３つの主要な因子によって制御される。最終的に、これらの因子は抗体の特異性、すなわち、特定の抗体が正確な抗原エピトープと結合している可能性を定義する。
【００８２】
よりアビジティーの高いプローブを得るために、二量体コンジュゲート(ＦＡＣＳマーカーと結合した２分子のＪＷＪ−１)を構築することができ、このようにして親和性の低い相互作用(例えば、生殖細胞系とのもの)がＦＡＣＳによりより容易に検出できるようになる。さらに、抗原結合のアビジティーを増強する別の手段はＤＫＫ１またはＤＫＫ４抗体の、本明細書に記載のフィブロネクチン構築物のいずれかの二量体または多量体を作製することを含む。このような多量体は、例えば、天然Ｃ−Ｎ末端結合を模倣することにより、またはそれらの定常領域によりともに保持される抗体二量体を模倣することにより、個々のモジュール間の共有結合により形成可能である。Ｆｃ／Ｆｃ境界部に対して操作される結合は共有結合であっても非共有結合であってもよい。さらに、Ｆｃ以外の二量体形成相手または多量体形成相手をＤＫＫ１またはＤＫＫ４ハイブリッドに用いてこのようなより高次の構造物を作出することができる。
【００８３】
本明細書において「交差反応性」とは、他の抗原上のエピトープと結合する抗体または抗体集団を指す。これは抗体のアビジティーまたは特異性が低いことによるか、同一もしくは極めて類似したエピトープを有する複数の異なる抗原によるかのいずれかにより起こり得る。交差反応性は関連のある抗体群との全般的結合を求める場合、または抗原エピトープ配列が、進化上保存性が高くない際に交差種標識を試みる場合に望ましいことがある。
【００８４】
本明細書においてＩｇＧ抗体に関して「高親和性」または「抗特異性」とは、標的抗原に対するＫＤが１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下または１０−１０Ｍ以下である抗体を指す。しかしながら、「高親和性」結合は他のイソ型抗体では異なり得る。例えば、ＩｇＭイソ型に対する「高親和性」結合とは、ＫＤが１０−７Ｍ以下または１０−８Ｍ以下である抗体を指す。
【００８５】
本明細書において「対象」とは、ヒトまたは非ヒト動物を含む。
「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば哺乳類および非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
【００８６】
本明細書において「至適化される」とは、ヌクレオチド配列が、産生細胞または生物体に好ましいコドンを用いてアミノ酸配列をコードするように変更されており、かつ／またはそのヌクレオチド配列が、潜伏性のスプライス供与部位またはスプライス受容部位を除くように変更されていることを意味する。至適化されたコドン表は当技術分野で広範な種に関してよく知られている。スプライス供与部位および受容部位の配列も当技術分野で知られており、潜伏性のスプライス部位は、例えば転写物または発現データの分析により特定可能である。産生細胞は、限定されるものではないが、例えばバキュロウイルスまたは細菌(大腸菌(E. coli))などの原核細胞、または例えば酵母(例えば、ピキア(Pichia))、チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)、骨髄腫細胞もしくはヒト細胞などの真核細胞を含む。至適化ヌクレオチド配列は、「親」配列としても知られる最初のヌクレオチド配列により元々コードされているアミノ酸配列および残基数を完全にまたはできる限り保持するように操作される。本明細書において至適化配列は産生細胞において好ましいコドンを有するように操作されているが、本明細書では他の真核細胞および原核細胞でのこれらの配列の至適化発現も意図される。至適化されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列も場合により至適化されているという。
【００８７】
関連の態様では、本発明の中和抗ＤＫＫ１／４組成物のポリペプチド配列およびそれらをコードするヌクレオチドは好ましくは生産および臨床使用のために至適化されるのが好ましい。臨床使用のための至適化され得る特徴は、限定されるものではないが、例えば半減期、薬物動態(ＰＫ)、抗原性、エフェクター機能、ＦｃＲｎクリアランス、および抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)活性または補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)活性を含む患者応答を含む。
【００８８】
本明細書において「ＤＫＫ１関連疾患」または「ＤＫＫ４関連疾患」としては、限定されるものではないが、骨溶解病変、特に骨髄腫、特に多発性骨髄腫に関連する、または骨、乳房、結腸、メラニン細胞、肝細胞、上皮、食道、脳、肺、前立腺もしくは膵臓の癌またはその転移に関連する骨溶解病変；移植に関連する骨欠損が挙げられる。さらなる疾患または障害は、限定されるものではないが、例えば、骨肉腫、前立腺癌、肝細胞癌(ＨＣＣ)、多発性骨髄腫を含む骨髄腫、糖尿病、肥満、筋肉消耗、アルツハイマー病、骨粗鬆症、オステオペニア、リウマチ、大腸炎および／または望ましくない脱毛を含む。
【００８９】
本明細書において「処置」とは、障害の発症の予防またはその病状の変更を意図して行われる介入である。よって、「処置」とは、治療的処置および予防的手段の双方を指す。処置を必要とするものとしては、すでに障害を有しているものならびに障害を予防しようとするものを含む。腫瘍(例えば癌)処置では、治療薬は腫瘍細胞の病状を直接軽減するか、または腫瘍細胞を他の治療薬、例えば放射線療法および／または化学療法による処置に対してより感受性とすることができる。癌の「病状」としては、患者の安寧を損なう全ての現象を含む。これには限定されるものではないが、異常なまたは制御されない細胞増殖、転移、隣接細胞の正常な機能の妨害、サイトカインまたは他の分泌産物の異常なレベルでの放出、炎症性応答または免疫応答の抑制または悪化などが含まれる。
【００９０】
骨溶解などの疾病の臨床徴候、生化学的徴候、放射線学的徴候または主観的徴候に苦しむ患者の処置はこのような徴候のいくつかまたは全てを緩和すること、または疾病の疾病素因を低減することを含み得る。
【００９１】
一般に、本発明の中和抗ＤＫＫ１／４組成物はＤＫＫ１またはＤＫＫ４またはその双方に関連するＷｎｔ関連疾患を予防、処置または改善するが、ＤＫＫ２、ＤＫＫ３またはＷｎｔ経路の他のモジュレーターに関連する疾患は予防、処置または改善しない。
本発明の種々の局面を以下のサブセクションでさらに詳しく記載する。
【００９２】
Ｗｎｔ経路は間充識幹細胞(ＭＳＣ)の骨芽細胞への分化の主要なレギュレーターである。それはまた、活発な骨芽細胞のための重要な生存因子でもある。Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１(ＤＫＫ１)は主として成体の脳で発現されるＷｎｔ経路アンタゴニストであり、骨溶解病変を有する骨髄腫患者では調節を受けない。中和抗ＤＫＫ１／４抗体は、骨芽細胞活性を高めると同時に破骨細胞活性を低下させることで働く真の蛋白同化剤である。これに対して、蛋白同化剤として市販されているＰＴＨなどの現行薬は、実際には、骨芽細胞および骨芽細胞双方に関連するマーカーを増加させる。
【００９３】
本発明では、ＤＫＫ１との結合のために選択されたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が提供される。好ましい抗体はヒトＤＫＫ１に対して１０ｐＭ未満の親和性を有する。いくつかの態様では、この抗ＤＫＫ１抗体はＤＫＫ４(Ｋｄ〜３００ｐＭ)とは交差反応するが、ＤＫＫ２(親和性分析中)とは交差反応しない。
【００９４】
抗ＤＫＫ１抗体または抗ＤＫＫ４抗体の好ましいエピトープはＣｙｓ−２ドメイン(ＡＡ１８９〜２６３)にマッピングされ、ＬＲＰ６およびＫｒｅｍｅｎ双方の結合を担っていることが知られている。一態様では、このエピトープはＤＫＫ１またはＤＫＫ４ポリペプチドのＣｙｓ−２ドメインに由来するアミノ酸残基を少なくとも６個、ほとんどの場合では３０個含む。ある特定の態様では、このエピトープは少なくとも６個の連続するアミノ酸のストレッチを含む。別の態様では、好ましい結合部位は非直線的であり、すなわち、不連続アミノ酸残基を含む。いくつかの態様では、結合はＮ−グリコシル化に依存する。Ｃｙｓ−２ドメインの２５６番残基に１つのＮ−グリコシル化部位しか予測されていない。
【００９５】
本発明では、中和抗ＤＫＫ１抗体は、ＥＬＩＳＡおよび細胞表面結合アッセイの双方において、ＤＫＫ１とＬＲＰ６の相互作用を遮断する。予測されたように、これはin vitroにおいて１ｎＭ以下のＥＣ５０でＤＫＫ１のＷｎｔ抑制活性を効果的に打ち消す。
【００９６】
in vitro骨芽細胞分化モデルでは、マウス１０Ｔ１／２細胞をＷｎｔ３Ａで処置して、骨芽細胞活性のマーカーであるアルカリホスファターゼ(ＡＰ)の分泌を刺激する。ＤＫＫ１はこのモデルでＡＰの産生を遮断し、本発明の抗体はこの阻害を完全に逆転させる。
【００９７】
ある特定の態様では、本発明の抗体はマウスにおいて用量直線的薬物動態(ＡＵＣ)を示し、マウスにおける用量２０〜２００μｇ／マウスでの用量依存性最終半減期は３５〜９６時間である。
【００９８】
骨溶解性前立腺腫瘍転移の脛骨内モデルを用い、本発明の抗体は腫瘍により誘発される皮層の骨損傷を抑制する。このモデルにおいて、小柱骨に対する作用が、腫瘍移植片および擬似移植片の双方が骨に対する機械的損傷を引き起こし、その結果、後に再構成される網状骨の初期増加をもたらし、それにより見掛けの骨量増加が見られるという所見により混乱をきたした。ある特定の態様では、本発明の抗体は腫瘍移植脛骨および擬似移植脛骨の双方で網状骨の生産を高め、リモデリングを伴う骨量の低下を抑制する。
【００９９】
関連の態様では、骨マーカー(オステオカルシン、ｓＲＡＮＫＬ、ＯＰＧ、ＡＰ、ＴＲＡＰ)の変化を用いて、骨関連疾患に対する本発明の抗体の臨床効果を示し、本明細書で提供される中和抗ＤＫＫ１抗体の薬学上有効なレベルでの処置の臨床成績を予測する。ＫｒｍはＬＲＰとほぼ同じ領域においてＤＫＫと結合する。Ｋｒｍは、ＤＫＫとＬＲＰの相互作用を介したＷｎｔシグナル阻害に必要であった。Ｗｎｔ経路の不活性化のためにインターナライズさせるため、Ｋｒｍ−ＤＫＫ−ＬＲＰの複合体を形成した。
【０１００】
本発明の中和抗ＤＫＫ１／４組成物は好ましくはＤＫＫ１またはＤＫＫ４と結合し、それらのＬＲＰおよび／またはＫｒｍとの相互作用を遮断し、それによりＷｎｔシグナル伝達経路に対するＤＫＫ１またはＤＫＫ４の作用を中和する。Ｗｎｔ経路の再活性化はＤＫＫ１および／またはＤＫＫ４に限りがある場合にのみ起こる。
【０１０１】
種々の種のＤＫＫ１に対する抗体の結合能を評価するための標準的アッセイは当技術分野で公知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットおよびＲＩＡを含む。好適なアッセイは実施例に詳細に記載する。これらの抗体の結合動態(例えば結合親和性)はまた、Biacore分析、ＢｉｏＶｅｒｉｓ  ＳＥＴアッセイ、ＦＭＡＴ、化学発光および／またはＳＰＲアッセイ(シグナル阻害または放出アッセイ)によるなど、当技術分野で公知の標準的アッセイにより評価することができる。ＤＫＫ１の機能的特性に対するこれらの抗体の作用を評価するアッセイは実施例にさらに詳細に記載する。
【０１０２】
よって、当技術分野で公知であり、本明細書に記載される方法論に従って決定されるこれらのＤＫＫ１機能的特性(例えば、生化学活性、免疫化学活性、細胞活性、生理活性または他の生物活性など)の１以上を「阻害する」抗体は、抗体の不在下(例えば、または無関連の特異性の対照抗体が存在する場合)で見られるものに比べた、特定の活性において統計学的に有意な低下に関連すると理解される。ＤＫＫ１活性を阻害する抗体は、測定パラメーターの少なくとも１０％、少なくとも５０％、８０％または９０％といった統計学的に有意な低下を果たし、ある特定の態様では、本発明の抗体はＤＫＫ１機能活性を９５％、９８％または９９％を超えて阻害し得る。
【０１０３】
Ｄｉｃｋｋｏｐｆファミリーメンバー
適当な骨代謝は、骨芽細胞、破骨細胞および周囲の間質の間の複雑な調節経路網の相互連絡を含む。これらの調節機構の不均衡が骨粗鬆症などの骨溶解状態、腫瘍誘発性の骨溶解病変、腎臓移植および肝臓移植誘発性の骨欠損、および抗ホルモン化学療法誘導性の骨欠損に関与している。これらの状態は骨痛、骨折、脊椎圧迫および運動低下をはじめとする重篤な症候を持ち得る。認可されている、または現在臨床評価中のほとんどの処置は主として破骨細胞機能を阻害することにより作用するものである。例えば、ゾレンドロン酸(ゾメタ)などのビスホスホネートは現行の医療標準であり、破骨細胞の機能と生存を阻害することにより作用する。ビスホスホネートは全般的に有効であるが、患者によっては確実な応答を示さず、腎臓毒性または骨の壊死のために使用が継続できない[Markowitz 2003][Ruggiero 2004]。さらに、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦ中和抗体など、破骨細胞の発達を標的とする、またはカテプシンＫ阻害剤など、破骨細胞機能を標的とする、複数の治験薬がある。
【０１０４】
骨芽細胞活性の刺激は骨溶解疾患を処置する新規な機構を提供する。Ｗｎｔ経路は骨芽細胞の分化および活性に主要な役割を果たし、特にＤｉｃｋｋｏｐｆ(ＤＫＫ)ファミリーのアンタゴニストはin vitroにおいてこの方法の鍵となるレギュレーターであることが確認されている(総説としては[Krishnan 2006]を参照)。in vitroにおいて、Ｗｎｔは本質的な骨芽細胞生存および分化因子である。Ｗｎｔ経路の役割に関する臨床学的検証はＷｎｔ共受容体ＬＲＰ５における突然変異により得られる。ＬＲＰ５の不活性化突然変異は骨粗鬆症−偽神経膠腫症候群(ＯＰＰＧ)をもたらし[Ai 2005]、活性化突然変異は高い骨量をもたらす[Boyden 2002]。これらの活性化突然変異は細胞外ドメインに見られ、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ(ＤＫＫ)ファミリーのＷｎｔアンタゴニストとの結合を損なうことが示された。
【０１０５】
ＤＫＫ１は骨病変を有する患者の骨髄腫細胞で過剰発現されるが、正常な血漿細胞または骨病変のない患者の血漿細胞には存在しないことが報告されている[Tian 2004][Politou 2006]。骨髄腫細胞によるこのようなＤＫＫ１の過剰発現は、骨芽細胞の分化を遮断し、従って骨吸収を促進することにより骨芽細胞と破骨細胞の正常なバランスを損なう。さらに、デキサメタゾンなどの骨髄腫に使用される抗腫瘍処置薬のいくつかはＤＫＫ１をアップレギュレートすることが報告されている[Ohnaka 2004]。よって、抗ＤＫＫ１中和抗体は骨溶解病変におけるＷｎｔ経路の再活性化を可能とすべきであり、ＤＫＫ１レベルが比較的低いか、または他のアンタゴニストが優勢である他の組織におけるＷｎｔシグナル伝達に影響を及ぼさない。成体では、ＤＫＫ１は骨でのみ高い発現を示すことが報告されており[Li 2006]、これは成体において骨代謝を調節する上でのＤＫＫ１の前進性の役割を示唆する。
【０１０６】
乳房組織においてＷｎｔ１を過剰発現するトランスジェニックマウスは乳癌を発症し[Tsukamoto 1988]、約９０％のヒト結腸直腸癌は、Ｗｎｔ経路の２つの細胞質成分であるＡＰＣかβ−カテニンのいずれかに突然変異を有する[Morin 1997][Rowan 2000]。この種の証拠は、Ｗｎｔ経路の活性化は腫瘍の発生または進行を高めるリスクであるかもしれないという懸念を浮上させる。さらに、ＤＫＫは結腸直腸腫瘍および黒色腫ではダウンレギュレートされており、このことは腫瘍抑制の役割の可能性を示唆する。
【０１０７】
本発明のＤＫＫポリペプチドはＤＫＫ１(配列番号１)およびＤＫＫ４(配列番号１２４)、ならびにＤＫＫ２(配列番号１２２)およびＤＫＫ３(配列番号１２３)を含む。ＤＫＫファミリーメンバーは表Ａ  ＤＫＫ１ファミリーメンバーPileUpに示されているように２つのＣＹＳドメイン(ＣＹＳ１およびＣＹＳ２)を有する。ＤＫＫタンパク質は酸性のＮ末端シグナルペプチド、離散したリンカー領域により隔てられたシステイン残基のクラスターを含む２つのＣＹＳドメイン、および可能性としてのＣ末端Ｎ−グリコシル化部位を含む。ＤＫＫ４のＣＹＳ２ドメインは原形質膜においてＷＮＴ／ＤＫＫ相互作用を促進し得る脂質結合機能を有する。ＯＭＩＭ受託番号６０５４１７。
【０１０８】
【表１】
0005552233.tif 000002
【０１０９】
ＤＫＫ１およびＤＫＫ４に対する抗体
好ましい態様では、本発明の抗体はヒトＤＫＫタンパク質に特異的である。より好ましい態様では、本発明の抗体。
【０１１０】
ＤＫＫ１またはＤＫＫ４中和抗体は腫瘍誘発に関連付けられているＷｎｔ経路の修飾とは異なる。Ｗｎｔ経路は複雑な細胞外リガンド網によって調節され、ＤＫＫ１の受容体およびアンタゴニストは１つだけである。成体におけるＤＫＫ１の限られた発現および他のＷｎｔアンタゴニストとのその機能重複のため、中和ＤＫＫ１抗体はＷｎｔシグナル伝達、または従って腫瘍形成の広範な活性化を生じるとは考えにくい。これはさらに、１つには、ＬＲＰ５突然変異の活性化(ＤＫＫ結合の阻害)が高い骨量表現型をもたらすが、見かけ上、癌リスクの上昇はないということ[Moon 2004]、また、ＤＫＫ１異系接合性ヌルまたはDoubleridgeマウスが低いＤＫＫ１レベル、高い骨量表現型を有するが、腫瘍形成率の上昇は報告されていない[MacDonald 2004]という２つの知見によりさらに裏付けられる。
【０１１１】
抗ＤＫＫ１抗体は、de novo腫瘍形成のリスクを上昇させずに、骨髄腫誘発性の骨溶解に良い影響を及ぼすべきである。このような抗体は抗腫瘍化学療法と、また可能性として、破骨細胞機能を阻害する抗骨吸収薬と併用されると予測される。
【０１１２】
ポリクローナル抗体
本発明の抗体はポリクローナル抗体、特にヒトポリクローナル抗体であり得る。ポリクローナルは免疫動物または選択されたヒトの血清をプールしたものに由来する。
【０１１３】
モノクローナル抗体
本発明の抗体は好ましくは、例えば実施例１〜８において単離され、構造的に特性決定されたものなどのヒトモノクローナル抗体である。これらの抗体の特異的ＶＨアミノ酸配列が例えば配列番号２〜２０に示されている。これらの抗体の特異的ＶＬアミノ酸配列は例えば配列番号２１〜３９に示されている。
【０１１４】
抗体のＶＨアミノ酸配列は、例えば配列番号１１９で示される配列など、哺乳類細胞での発現のために至適化してもよい。抗体のＶＬアミノ酸配列は、例えば配列番号１１８で示される配列など、哺乳類細胞での発現のために至適化してもよい。同様に、配列は、どの発現系が至適化される特徴に好ましいかにより、例えば、酵母、細菌、ハムスターおよび他の細胞における発現のために至適化することができる。本発明の他の抗体としては、変異してもなお、上記の配列で示されるＣＤＲ領域とＣＤＲ領域において少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸を含む。
【０１１５】
さらに、全長軽鎖親ヌクレオチド配列は配列番号９７〜１００で示される。全長重鎖親ヌクレオチド配列は配列番号１０１〜１０３で示される。哺乳類細胞での発現のために至適化された全長軽鎖ヌクレオチド配列は配列番号１０４〜１０７で示される。哺乳類細胞での発現のために至適化された全長重鎖ヌクレオチド配列は配列番号１０８〜１１０で示される。至適化された軽鎖ヌクレオチド配列によりコードされる全長軽鎖アミノ酸配列は配列番号１１１〜１１４で示される。至適化された重鎖ヌクレオチド配列によりコードされる全長重鎖アミノ酸配列は配列番号１１５〜１１７で示される。本発明の他の抗体としては、変異してもなお、上記配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸または核酸を含む。
【０１１６】
これらの各抗体はＤＫＫ１と結合することができるので、ＶＨ、ＶＬ、全長軽鎖および全長重鎖配列(ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列)は、本発明の他の抗ＤＫＫ１結合分子を作出すべく「混合および適合化」可能である。ＤＫＫ１とこのような「混合および適合化」抗体の結合は上記および実施例で記載される結合アッセイ(例えばＥＬＩＳＡ)を用いて試験することができる。これらの鎖が混合および適合化される場合、特定のＶＨ／ＶＬ対のＶＨ配列は構造的に類似するＶＨ配列と置換すべきである。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖対の全長重鎖配列は構造的に類似する全長重鎖配列と置換すべきである。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対のＶＬ配列は構造的に類似するＶＬ配列と置換すべきである。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖対の全長軽鎖配列は構造的に類似する全長軽鎖配列と置換すべきである。本発明の抗体のＶＨ、ＶＬ、全長軽鎖および全長重鎖配列は、同じ生殖細胞系配列に由来するＶＨ、ＶＬ、全長軽鎖および全長重鎖配列を用いており、従って、構造的類似性を示すことから、特に混合および適合化に従う。
【０１１７】
よって、一局面において、本発明は、配列番号２〜２０および１１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号２１〜３９および１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域を有する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、この抗体はＤＫＫ１と特異的に結合する。
【０１１８】
重鎖と軽鎖の組合せの例は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；または配列番号３を含むＶＨ領域と配列番号２２を含むＶＬ領域；または配列番号４を含むＶＨ領域と配列番号２３を含むＶＬ領域；または配列番号５を含むＶＨ領域と配列番号２４を含むＶＬ領域；または配列番号６を含むＶＨ領域と配列番号２５を含むＶＬ領域；または配列番号７を含むＶＨ領域と配列番号２８を含むＶＬ領域；または配列番号８を含むＶＨ領域と配列番号２９を含むＶＬ領域；または配列番号９を含むＶＨ領域と配列番号３０を含むＶＬ領域；または配列番号１０を含むＶＨ領域と配列番号３１を含むＶＬ領域；または配列番号１１を含むＶＨ領域と配列番号３２を含むＶＬ領域；または配列番号１２を含むＶＨ領域と配列番号３３を含むＶＬ領域；または配列番号１１９を含むＶＨ領域と配列番号１１８を含むＶＬ領域を含む。
【０１１９】
別の局面において、本発明は、配列番号１１５〜１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む全長重鎖と、配列番号１１１〜１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む全長軽鎖を有する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１２０】
よって、全長重鎖と全長軽鎖の組合せの例はそれぞれ、配列番号１１５と配列番号１１１；または配列番号１１６と配列番号１１２；または配列番号１１７と配列番号１１３；または配列番号１１７と配列番号１１４を含む。
【０１２１】
別の局面において、本発明は、配列番号１０１〜１０３からなる群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる全長重鎖と、配列番号９７〜１００からなる群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる全長軽鎖を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１２２】
よって、全長重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチドの例はそれぞれ、配列番号１０１と９７；または配列番号１０２と９８；または配列番号１０３と９９；または配列番号１０３と１００を含む。
【０１２３】
さらに別の局面では、本発明は、配列番号１０８〜１１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む全長重鎖と、配列番号１０４〜１０７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む全長軽鎖を有し、細胞での発現のために至適化された単離されたモノクローナル抗体または抗原結合部分を提供する。
【０１２４】
さらに別の局面では、本発明は、抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはその組合せを含む抗体を提供する。これらの抗体のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号２〜５、８〜１１、２０および４９〜５６で示される。これらの抗体のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２〜２０および５７〜６４で示される。これらの抗体のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２〜２０および６５〜７２で示される。これらの抗体のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号２１〜３９および７３〜８０で示される。これらの抗体のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２１〜３９および８１〜８８で示される。これらの抗体のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２１〜３９および８９〜９６で示される。これらのＣＤＲ領域はKabatシステムを用いて表される(Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91〜3242)。
【０１２５】
これらの抗体が各々ＤＫＫ１と結合すること、および抗原−結合特異性が主としてＣＤＲ１、２および３領域により提供されることを考えれば、ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列は「混合および適合化」することができる(すなわち、異なる抗体由来のＣＤＲを混合および適合化することができる)が、本発明の他の抗ＤＫＫ１結合分子を作出するためには、各抗体はＶＨ  ＣＤＲ１、２および３ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３を含まなければならない。このような「混合および適合化」抗体のＤＫＫ１結合は上記および実施例に記載の結合アッセイ(例えばＥＬＩＳＡ)を用いて試験することができる。ＶＨ  ＣＤＲ配列が混合および適合化される場合、特定のＶＨ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は構造的に類似するＣＤＲ配列と置換すべきである。同様に、ＶＬ  ＣＤＲ配列が混合および適合化される場合、特定のＶＬ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は構造的に類似するＣＤＲ配列と置換すべきである。さらに、特定のＶＨまたはＶＬ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、親和性または結合特性に関して試験可能な抗体が作出されるよう特異的に、または無作為に突然変異させることができる。新規なＶＨおよびＶＬ配列は１以上のＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ領域配列を、本発明のモノクローナル抗体に関して本明細書に示されるＣＤＲ配列由来の構造的に類似する配列で置換することにより作出できることは当業者には容易に明らかとなる。
【０１２６】
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２〜５、８〜１１、２０および４９〜５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域ＣＤＲ１；配列番号２〜２０および５７〜６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域ＣＤＲ２；配列番号２〜２０および６５〜７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域ＣＤＲ３；配列番号２１〜３９および７３〜８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域ＣＤＲ１；配列番号２１〜３９および８１〜８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域ＣＤＲ２；ならびに配列番号２１〜３９および８９〜９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域ＣＤＲ３を有し、この抗体はＤＫＫ１と特異的に結合する。
【０１２７】
ある特定の態様では、この抗体は、配列番号２を含むＶＨ領域ＣＤＲ１；配列番号６を含むＶＨ領域ＣＤＲ２；配列番号７を含むＶＨ領域ＣＤＲ３；配列番号２１を含むＶＬ領域ＣＤＲ１；配列番号２２を含むＶＬ領域ＣＤＲ２；および配列番号２３を含むＶＬ領域ＣＤＲ３からなる。
【０１２８】
別の態様では、この抗体は、配列番号３を含むＶＨ領域ＣＤＲ１；配列番号１２を含むＶＨ領域ＣＤＲ２；配列番号１３を含むＶＨ領域ＣＤＲ３；配列番号２４を含むＶＬ領域ＣＤＲ１；配列番号２５を含むＶＬ領域ＣＤＲ２；ならびに配列番号２６を含むＶＬ領域ＣＤＲ３からなる。
【０１２９】
さらに別の態様では、この抗体は、配列番号４を含むＶＨ領域ＣＤＲ１；配列番号１４を含むＶＨ領域ＣＤＲ２；配列番号１５を含むＶＨ領域ＣＤＲ３；配列番号２７を含むＶＬ領域ＣＤＲ１；配列番号２８を含むＶＬ領域ＣＤＲ２；および配列番号２９を含むＶＬ領域ＣＤＲ３からなる。
【０１３０】
別の態様では、この抗体は、配列番号５を含むＶＨ領域ＣＤＲ１；配列番号１６を含むＶＨ領域ＣＤＲ２；配列番号１７を含むＶＨ領域ＣＤＲ３；配列番号３０を含むＶＬ領域ＣＤＲ１；配列番号３１を含むＶＬ領域ＣＤＲ２；および配列番号３２を含むＶＬ領域ＣＤＲ３からなる。
【０１３１】
ある特定の態様では、この抗体は、配列番号８を含むＶＨ領域ＣＤＲ１；配列番号１８を含むＶＨ領域ＣＤＲ２；配列番号１９を含むＶＨ領域ＣＤＲ３；配列番号３３を含むＶＬ領域ＣＤＲ１；配列番号３４を含むＶＬ領域ＣＤＲ２；および配列番号３５を含むＶＬ領域ＣＤＲ３からなる。
【０１３２】
別の態様では、この抗体は、配列番号９を含むＶＨ領域ＣＤＲ１；配列番号１０を含むＶＨ領域ＣＤＲ２；配列番号１１を含むＶＨ領域ＣＤＲ３；配列番号３６を含むＶＬ領域ＣＤＲ１；配列番号３７を含むＶＬ領域ＣＤＲ２；および配列番号３８を含むＶＬ領域ＣＤＲ３からなる。
【０１３３】
本明細書において、ヒト抗体は、抗体の可変領域または全長鎖がヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子を用いる系から得られる場合、特定の生殖細胞系配列の「産物」である、またはそれに「由来」する重鎖もしくはＶＬ領域または全長重鎖もしくは軽鎖を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスを対象とする抗原で免疫化すること、またはファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを対象とする抗原でスクリーニングすることを含む。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列の「産物」である、またはそれに「由来」するヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列とヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を比較し、ヒト抗体の配列と最も配列の近い(すなわち％の同一性が最高の)ヒト生殖細胞系免疫グロブリンを選択することによりそれ自体同定することができる。特定のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列の「産物」である、またはそれに「由来」するヒト抗体は、例えば自然に起こる体細胞突然変異または部位指定突然変異の意図的な導入のために、生殖細胞系配列に比べた場合にアミノ酸変化を含み得る。しかしながら、選択されるヒト抗体は一般に、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、他種の(例えばマウス生殖細胞系配列)の生殖細胞系免疫グロブリンアミノ酸配列と比較した場合にそのヒト抗体をヒトとして同定するアミノ酸残基を含む。ある特定の場合、ヒト抗体は生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または少なくとも  ９５％またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。一般に、特定のヒト生殖細胞系配列に由来するヒト抗体はヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は１０個のアミノ酸だけ違いを示す。ある特定の場合、ヒト抗体は生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と５個、またはさらに４個、３個、２個または１個のアミノ酸だけ違いを示し得る。
【０１３４】
相同抗体
さらに別の態様では、本発明の抗体は、全長重鎖および軽鎖アミノ酸配列；本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列と相同な全長重鎖および軽鎖ヌクレオチド配列、可変領域重鎖および軽鎖ヌクレオチド配列、または可変領域重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有し、この場合、この抗体は本発明の中和抗ＤＫＫ１／４組成物の所望の機能特性を保持している。
【０１３５】
例えば、本発明は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は配列番号２〜２０および１１９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域は配列番号２１〜３９および１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、この抗体はＤＫＫ１および／またはＤＫＫ４と特異的に結合し、かつ、この抗体は次の機能的特性：抗体がＤＫＫ１タンパク質とＬＲＰ６、Ｆｚおよび／またはＫｒｍの結合を打ち消すか、または抗体がＤＫＫ４タンパク質とＬＲＰ、Ｐｚおよび／またはＫｒｍの結合を打ち消すかの少なくとも１つを示す。
【０１３６】
さらなる例では、本発明は、全長重鎖と全長軽鎖を含み、全長重鎖は配列番号１１５〜１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含み、全長軽鎖は配列番号１１１〜１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、この抗体はＤＫＫ１と特異的に結合し、かつ、この抗体は次の機能的特性：抗体がＤＫＫ１タンパク質とＤＫＫ１受容体の結合を打ち消すか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解を予防もしくは改善するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解病変を予防もしくは改善するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して癌を予防もしくは改善するかの少なくとも１つを示す。
【０１３７】
別の例では、本発明は、全長重鎖と全長軽鎖を含み、全長重鎖は配列番号１０１〜１０３からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同なヌクレオチド配列を含み、全長軽鎖は配列番号９７〜１００からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同なヌクレオチド配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、この抗体はＤＫＫ１と特異的に結合し、かつ、この抗体は次の機能的特性：抗体がＤＫＫ１タンパク質とＤＫＫ１受容体の結合を阻害するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解を予防もしくは改善するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解病変を予防もしくは改善するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して癌を予防もしくは改善するかの少なくとも１つを示す。
【０１３８】
別の例では、本発明は、全長重鎖と全長軽鎖を含み、全長重鎖は配列番号１０８〜１１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同なヌクレオチド配列を含み、全長軽鎖は配列番号１０４〜１０７からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同なヌクレオチド配列を含む、細胞における発現のために至適化された単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、この抗体はＤＫＫ１と特異的に結合し、かつ、この抗体は次の機能的特性：抗体がＤＫＫ１タンパク質とＤＫＫ１受容体の結合を阻害するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解を予防もしくは改善するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解病変を予防もしくは改善するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して癌を予防もしくは改善するかの少なくとも１つを示す。
【０１３９】
別の例では、本発明は、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、全長重鎖は配列番号１２１からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同なヌクレオチド配列を含み、全長軽鎖は配列番号１２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同なヌクレオチド配列を含む、細胞における発現のために至適化された、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、この抗体はＤＫＫ１と特異的に結合し、かつ、この抗体は次の機能的特性：抗体がＤＫＫ１タンパク質とＤＫＫ１受容体の結合を阻害するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解を予防もしくは改善するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解病変を予防もしくは改善するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して癌を予防もしくは改善するかの少なくとも１つを示す。
【０１４０】
種々の態様では、この抗体は上述の機能的特性の１以上、２以上または３つを示し得る。この抗体は例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
【０１４１】
本明細書において、２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列間の相同性％はその２配列間の同一性％に等しい。２配列間の同一性％はそれらの配列が共通に持つ同一の位置の数の関数であり(すなわち相同性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００)、２配列の最適なアライメントのために導入する必要のあるギャップ数および各ギャップの長さを考慮している。２配列間の配列比較および同一性％の決定は以下の非限定的例に記載されているような数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。
【０１４２】
２つのアミノ酸配列間の同一性％は、ＡＬＩＧＮプログラム(バージョン２.０)に組み込まれているE. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988)のアルゴリズムを用い、PAM120 Weight residue table、ギャップレングスペナルティー１２およびギャップペナルティー４を用いて決定することができる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性％は、ＧＣＧソフトウエアパッケージのＧＡＰプログラム(http://www.gcg.comで入手可能)のに組み込まれているNeedleman and Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970)のアルゴリズムを用い、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックス、ならびにギャップ・ウェイト１６、１４、１２、１０、８、６または４、およびレングス・ウェイト１、２、３、４、５または６を用いて決定することができる。
【０１４３】
それに加え、またはその代わりに、本発明のタンパク質配列はさらに、例えば関連配列を同定すべく公開データベースの検索を行うための「検索配列」として使用することもできる。このような検索はAltschul, et al., 1990 J.Mol. Biol. 215:403-10のＸＢＬＡＳＴプログラム(バージョン２.０)を用いて行うことができる。本発明の抗体分子に相同なアミノ酸配列を得るためには、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３を用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を行うことができる。比較のためのギャップ挿入アライメントを得るためには、Altschul et al., 1997 Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されているようにギャップＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、個々のプログラムのデフォルトパラメーター(例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ)が使用可能である。http:www.ncbi.nhn.nih.gov.参照。
【０１４４】
保存的修飾を有する抗体
ある特定の態様では、本発明の抗体はＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列からなるＶＨ領域とＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列からなるＶＬ領域を有し、これらのＣＤＲ配列の１以上は本明細書に記載の抗体に基づく特定のアミノ酸配列またはその保存的修飾を有し、この抗体は本発明の中和抗ＤＫＫ１／４組成物の所望の機能的特性を保持する。よって、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列からなるＶＨ領域とＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列からなるＶＬ領域からなり、ＣＤＲ１のＶＨ領域は配列番号２〜５、８〜１１、２０、４９〜５６のアミノ酸配列およびその保存的修飾物からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる配列であり、ＣＤＲ２のＶＨ領域は配列番号２〜２０、５７〜６４のアミノ酸配列およびその保存的修飾物からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる配列であり、ＣＤＲ３のＶＨ領域は配列番号２〜２０、６５〜７２のアミノ酸配列およびその保存的修飾物からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる配列であり、ＣＤＲ１のＶＬ領域は配列番号２１〜３９、７３〜８０のアミノ酸配列およびその保存的修飾物からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる配列であり、ＣＤＲ２のＶＬ領域は配列番号２１〜３９、８１〜８８のアミノ酸配列およびその保存的修飾物からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる配列であり、ＣＤＲ３のＶＬ領域は配列番号２１〜３９、８９〜９６のアミノ酸配列およびその保存的修飾物からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる配列である、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、この抗体はＤＫＫ１と特異的に結合し、かつ、この抗体は次の機能的特性：抗体がＤＫＫ１タンパク質とＤＫＫ１受容体の結合を阻害するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解を予防もしくは改善するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解病変を予防もしくは改善するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して癌を予防もしくは改善するかの少なくとも１つを示す。
【０１４５】
種々の態様では、この抗体は上記に挙げた１以上、２以上または３以上の機能的特性を示し得る。このような抗体は例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
【０１４６】
他の態様では、本発明の抗体は全長重鎖配列と全長軽鎖配列を有し、これらの配列の１以上は本明細書に記載の抗体に基づく特定のアミノ酸配列またはその保存的修飾を有し、この抗体は本発明の中和抗ＤＫＫ１／４組成物の所望の機能的特性を保持する。よって、本発明は、全長重鎖と全長軽鎖からなり、全長重鎖は配列番号１１５〜１１７およびその保存的修飾物の群から選択されるアミノ酸配列を有し、全長軽鎖は配列番号１１１〜１１４およびその保存的修飾物の群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、この抗体はＤＫＫ１と特異的に結合し、かつ、この抗体は次の機能的特性：抗体がＤＫＫ１タンパク質とＤＫＫ１受容体の結合を阻害するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解を予防もしくは改善するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解病変を予防もしくは改善するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して癌を予防もしくは改善するかの少なくとも１つを示す。
【０１４７】
種々の態様では、この抗体は上記に挙げた１以上、２以上または３以上の機能的特性を示し得る。このような抗体は例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
【０１４８】
他の態様では、細胞における発現のために至適化された本発明の抗体はＶＨ領域配列とＶＬ領域配列を有し、これらの配列の１以上は本明細書に記載の抗体に基づく特定のアミノ酸配列またはその保存的修飾を有し、この抗体は本発明の中和抗ＤＫＫ１／４組成物の所望の機能的特性を保持する。よって、本発明は、ＶＨ領域とＶＬ領域からなり、ＶＨ領域は配列番号１１９およびその保存的修飾物の群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＶＬ領域は配列番号１１８およびその保存的修飾物の群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、この抗体はＤＫＫ１と特異的に結合し、かつ、この抗体は次の機能的特性：抗体がＤＫＫ１タンパク質とＤＫＫ１受容体の結合を阻害するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解を予防もしくは改善するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解病変を予防もしくは改善するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して癌を予防もしくは改善するかの少なくとも１つを示す。
【０１４９】
種々の態様では、この抗体は上記に挙げた１以上、２以上または３以上の機能的特性を示し得る。このような抗体は例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
【０１５０】
本明細書において「保存的配列修飾」とは、そのアミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響を及ぼさない、または変更しないアミノ酸修飾を指すものとする。このような保存的修飾はアミノ酸の置換、付加および欠失を含む。修飾は部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発など、当技術分野で公知の標準的技術により本発明の抗体に導入することができる。
【０１５１】
保存的アミノ酸置換は、そのアミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、β分枝側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。よって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１以上のアミノ酸残基は同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置換可能であり、変更された抗体は本明細書に記載の機能的アッセイを用いて、保持されている機能に関して試験することができる。
【０１５２】
本発明の中和抗ＤＫＫ１／４組成物と同じエピトープと結合する抗体
別の態様では、本発明は、本明細書で提供される本発明の種々の中和抗ＤＫＫ１／４組成物と同じエピトープと結合する抗体を提供する。このようなさらなる抗体は、標準的なＤＫＫ１結合アッセイを用い、本発明の他の抗体と交差競合する(例えば、統計学的に有意な様式でその結合を競合的に阻害する)それらの能力に基づいて同定することができる。試験抗体が本発明の抗体とヒトＤＫＫ１との結合を阻害することができることが、試験抗体がヒトＤＫＫ１との結合をめぐってその抗体と競合することができることを示し、このような抗体は、非限定的仮説によれば、それが競合する抗体と同じまたは関連の(例えば、構造的に類似のまたは空間的に近接した)ヒトＤＫＫ１上のエピトープと結合し得る。ある特定の態様では、本発明の抗体と同じヒトＤＫＫ１上のエピトープと結合する抗体はヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は実施例に記載のように作製および単離することができる。
【０１５３】
ラクダおよび他の重鎖抗体
ラマ種(Lama paccos、Lama glamaおよびLama vicugna)などの新世界メンバーを含むラクダおよびヒトコブラクダ(Camelus bactrianusおよびCalelus dromaderius)科のメンバーから得られた抗体タンパク質は大きさ、構造的複雑性およびヒト対象に対する抗原性に関して特性決定されている。自然界に見られるこの科の哺乳類に由来する特定のＩｇＧ抗体は軽鎖を欠き、よって、他の動物に由来する抗体に関する、２つの重鎖と２つの軽鎖を有する典型的な４鎖の四分構造とは構造的に異なる。ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４(１９９４年３月３日公開のＷＯ９４／０４６７８)参照。
【０１５４】
ＶＨＨと同定されている小さな１本の可変ドメインであるラクダ抗体の領域は、標的に対して高い親和性を有する小タンパク質を得るための遺伝子工学により得ることができ、この結果、「ラクダナノボディー」として知られる低分子量抗体由来タンパク質が得られる。１９９８年６月２日発行の米国特許第５,７５９,８０８号参照、また、Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62;およびLauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520も参照。ラクダ抗体および抗体フラグメントの操作したライブラリーは例えばAblynx、Ghent、Belgiumから市販されている。非ヒト起源の他の抗体に関して、ラクダ抗体のアミノ酸配列は、ヒト配列をより密接に真似る配列を得るために組換え的に変化させることができる(すなわち、このナノボディーは「ヒト化」することができる)。よって、ヒトに対するラクダ抗体の本来の低い抗原性をさらに低減することができる。
【０１５５】
このラクダナノボディーはヒトＩｇＧ分子のおよそ１０分の１の分子量を有し、このタンパク質の物理的直径は数ナノメーターでしかない。この小ささの１つの結果は、ラクダナノボディーの大きな抗体タンパク質で機能的に不可視の抗原部位に結合する能力であり、すなわち、ラクダナノボディーは従来の免疫技術を用いた場合に、他の方法では隠れている抗原を検出する試薬として、また、可能性としては治療薬として有用である。よって、さらにもう１つの小ささの結果、ラクダナノボディーは、標的タンパク質の溝または狭い割れ目中の特定の部位と結合する結果として阻害可能であり、ゆえに、従来の抗体よりも、従来の低分子量薬剤の機能をより密接に真似る性能で働き得る。
【０１５６】
さらにこの低分子量およびコンパクトなサイズの結果、ラクダナノボディーは極めて熱安定性があり、極端なｐＨやタンパク質分解消化に対しても安定であり、抗原性が低い。もう１つの結果として、ラクダナノボディーは循環系から組織へ、血液脳関門を介する場合でも容易に移動し、神経組織を侵す障害を処置することができる。ナノボディーはさらに血液脳関門を経る薬剤輸送をさらに助長することができる。２００４年８月１９日公開の米国特許出願第２００４０１６１７３８号参照。これらの特徴はヒトに対する抗原性の低さと相まって大きな治療的可能性を示す。さらに、これらの分子は大腸菌などの原核細胞で全面的に発現することができ、バクテリオファージとの融合タンパク質として発現され、機能的である。
【０１５７】
よって、本発明の特徴はＤＫＫ１に対して高い親和性を有するラクダ抗体またはナノボディーである。本明細書におけるある特定の態様では、このラクダ抗体またはナノボディーはラクダ科の動物で本来産生され、すなわち、他の抗体に関して本明細書に記載されている技術を用い、ＤＫＫ１またはそのペプチドフラグメントで免疫化した後、ラクダにより産生される。あるいは、中和抗ＤＫＫ１／４ラクダナノボディーは、例えば適宜突然変異誘発されたラクダナノボディータンパク質を提示するファージのライブラリーから、本明細書の例に記載されるように標的としてＤＫＫ１および／またはＤＫＫ４を用いたパンニング法を用いての選択により操作、すなわち作出される。操作されたナノボディーはさらに、レシピエント対象において４５分〜２週間の半減期を有するように遺伝子工学により調整することができる。
【０１５８】
ラクダ抗体の他、重鎖抗体は、限定されるものではないが、例えば、ある種のサメおよびフグを含む他の動物でも天然に見られる(例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０１４１６１号参照)。本発明においてはこのような重鎖抗体に由来する可変ドメインが使用可能であるが、ラクダ由来重鎖抗体および／またはその可変ドメイン配列の使用が至適化、ヒト化、ヒューマニアリングなどに、および／またはヒトにおける臨床使用に好ましい。
【０１５９】
操作および修飾された抗体
本発明の抗体はさらに、修飾抗体を操作するための出発材料として本明細書に示される１以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列を有する抗体を用いて作製することができ、この修飾抗体は出発抗体とは異なる特性を有し得る。抗体は一方または双方の可変領域(すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ)内の、例えば、１以上のＣＤＲ領域内および／または１以上のフレームワーク領域内の１以上の残基を修飾することにより操作することができる。それに加え、またはその代わりに、抗体を、例えば抗体のエフェクター機能を変更するために定常領域内の残基を修飾することにより操作することもできる。
【０１６０】
行い得る可変領域操作の一種としてＣＤＲグラフト法がある。抗体は、主として、６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)内に存在するアミノ酸残基を通じて標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のこれらのアミノ酸配列はＣＤＲ外の配列よりも個々の抗体間で多様性が大きい。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体−抗原相互作用を担っているので、特性の異なる、異なる抗体に由来するフレームワーク配列にグラフトされた特定の天然抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である(例えば、Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033；winterの米国特許第５,２２５,５３９号ならびにQueen et al.の米国特許第５,５３０,１０１号；同第５,５８５,０８９号；同第５,６９３,７６２号および同第６,１８０,３７０号参照)。
【０１６１】
よって、本発明のもう１つの態様は、配列番号２〜５、８〜１１、２０、４９〜５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列と、配列番号２〜２０および５７〜６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列と、配列番号２〜２０および６５〜７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列をそれぞれ含む；ならびに配列番号２１〜３９および７３〜８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列と、配列番号２１〜３９および８１〜８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列と、配列番号２１〜３９および８９〜９６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３配列をそれぞれ有するＶＬ領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。よって、このような抗体はモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲ配列を含んでなお、これらの抗体とは異なるフレームワーク配列を含み得る。
【０１６２】
このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは刊行されている参照文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖およびＶＬ領域遺伝子の生殖細胞系ＤＮＡ配列は「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系配列データベース(インターネットwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで利用可能)ならびにKabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson、I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798;およびCox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836に見出すことができ、これら各々の開示内容は出典明示により本明細書の一部とされる。
【０１６３】
本発明の抗体に用いるためのフレームワーク配列の例は、本発明の選択抗体により用いられるフレームワーク配列と構造的に類似するもの、例えば、本発明のモノクローナル抗体により用いられるコンセンサス配列および／またはフレームワーク配列を含む。ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３配列、ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列を、フレームワーク領域が由来する生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子に見られるものと同じ配列を有するフレームワーク配列にグラフトすることもできるし、あるいはこれらのＣＤＲ配列を、細胞系配列と比べた際に１以上の突然変異を含むフレームワーク領域にグラフトすることもできる。例えば、ある場合には、抗体の抗原結合力を維持または増強するためにフレームワーク領域内の残基を変異させるのが有益であることが分かっている(例えば、Queen et alの米国特許第５,５３０,１０１号；同第５,５８５,０８９号；同第５,６９３,７６２号および同第６,１８０,３７０号参照)。
【０１６４】
別種の可変領域修飾としては、ＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させることで、「親和性成熟」として知られる、対象抗体の１以上の結合特性(例えば親和性)を改良するというものがある。「部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発」を行って突然変異を導入することができ、抗体結合または対象とする他の機能的特性に対する作用を、本明細書に記載され、実施例に示されているようなin vitroまたはin vivoアッセイで評価することができる。保存的修飾(上述)も導入することができる。これらの突然変異はアミノ酸の置換、付加または欠失であり得る。さらに、一般に、ＣＤＲ領域内の１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの残基だけが変更される。
【０１６５】
よって、別の態様では、本発明は、配列番号２〜５、８〜１１、２０、４９〜５６を有する群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２〜５、８〜１１、２０、４９〜５６と比較して１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１領域；配列番号２〜２０および５７〜６４からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２〜２０および５７〜６４と比較して１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２領域；配列番号２〜２０および６５〜７２からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２〜２０および６５〜７２と比較して１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３領域を有するＶＨ領域；配列番号２１〜３９および７３〜８０からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２１〜３９および７３〜８０と比較して１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１領域；配列番号２１〜３９および８１〜８８からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２１〜３９および８１〜８８と比較して１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２領域；ならびに配列番号２１〜３９および８９〜９６からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２１〜３９および８９〜９６と比較して１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３領域からなる、単離された中和抗ＤＫＫ１／４組成物または抗原結合部分を提供する。
【０１６６】
本発明の操作した抗体は、例えば抗体の特性を改良するためにＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾が施されているものを含む。一般に、このようなフレームワーク修飾は抗体の免疫原性を軽減するために行われる。例えば、１つのアプローチとして、１以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系配列へと「復帰突然変異」させるというものがある。より具体的には、体細胞突然変異を受けた抗体は、その抗体が由来する生殖細胞系配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体のフレームワーク配列とその抗体が由来する生殖細胞系配列とを比較することにより同定することができる。フレームワーク領域配列をそれらの生殖細胞系の構成へ戻すためには、これらの体細胞突然変異を、例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発により生殖細胞系配列へと「復帰突然変異」させることができる。このような「復帰突然変異」抗体もまた本発明に包含されるものとする。
【０１６７】
別種のフレームワーク修飾としては、Ｔ細胞−エピトープを除去することで抗体の潜在的免疫原性を軽減するためにフレームワーク領域内の、さらには１以上のＣＤＲ領域内の１以上の残基を変異させることを含む。このアプローチは「脱免疫化」とも呼ばれ、Carrらにより米国特許公報第２００３０１５３０４３号にさらに詳しく記載されている。
【０１６８】
フレームワーク領域またはＣＤＲ領域内で施される修飾に加え、またはその代わりに、本発明の抗体は、一般に、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞傷害性など、抗体の１以上の機能的特性を変更するためにＦｃ領域内に修飾を含むように操作することができる。さらに、本発明の抗体は化学的に修飾することもできるし(例えば、１以上の化学部分を抗体に結合させることができる)、またはこの場合も抗体の１以上の機能的特性を変更するためにそのグリコシル化を変更する修飾を行うこともできる。これらの態様は各々、以下にさらに詳しく記載される。Ｆｃ領域の残基の符番はKabatのＥＵインデックスのものである。
【０１６９】
一態様では、ＣＨ１のヒンジ領域が、ヒンジ領域のシステイン残基の数が変更、例えば、増加または減少させるように修飾される。このアプローチはBodmerらによる米国特許第５,６７７,４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域のシステイン残基数は、例えば、軽鎖および重鎖の組立を補助するため、または抗体の安定性を増強もしくは低下させるために変更される。
【０１７０】
別の態様では、抗体のＦｃヒンジ領域は抗体の生体半減期を短縮するために変異させる。より具体的には、抗体が天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合に比べて損なわれたブドウ球菌タンパク質Ａ(ＳｐＡ)結合を有するように、Ｆｃ−ヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域に１以上のアミノ酸突然変異が導入される。このアプローチはWardらにより米国特許第６,１６５,７４５号に記載されている。
【０１７１】
別の態様では、この抗体はその生体半減期を延長するように修飾される。例えば、Wardの米国特許第６,２７７,３７５号に記載されているように、次の突然変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆの１以上を導入することができる。あるいは、生体半減期を高めるため、Prestaらにより米国特許第５,８６９,０４６号および同第６,１２１,０２２号に記載されているように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取ったサルベージ受容体結合エピトープを含むように、抗体をＣＨ１またはＣＬ領域内で変更することができる。
【０１７２】
さらに他の態様では、抗体のエフェクター機能が変更されるように、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することにより、Ｆｃ領域が変更される。例えば、抗体のエフェクターリガンドに対する親和性が変更され、親抗体の抗原結合力を保持するように、１以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置換することができる。親和性が変更されているエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、双方ともWinterらにより米国特許第５,６２４,８２１号および同第５,６４８,２６０号にさらに詳しく記載されている。
【０１７３】
別の態様では、抗体のＣ１ｑ結合が変更され、かつ／または補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)が軽減もしくは排除されるように、アミノ酸残基から選択される１以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置換することができる。このアプローチはIdusogieらにより米国特許第６,１９４,５５１号にさらに詳しく記載されている。
【０１７４】
別の態様では、１以上のアミノ酸残基が変更され、それにより抗体の補体結合能が変更される。このアプローチはBodmerらによりＰＣＴ公報ＷＯ９４／２９３５１にさらに詳しく記載されている。
【０１７５】
さらに別の態様では、抗体の抗体依存性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)を媒介する能力を高めるよう、かつ／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を高めるように、１以上のアミノ酸を修飾することによりＦｃ領域が修飾される。このアプローチは、PrestaによりＰＣＴ公報ＷＯ００／４２０７２にさらに記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上の、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対する結合部位がマッピングされており、結合が改良された変異体が記載されている(Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604参照)。
【０１７６】
さらに別の態様では、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化抗体(aglycoslated antibody)を作製することができる(すなわち、この抗体はグリコシル化を欠いている)。グリコシル化は例えば、「抗原」に対する抗体の親和性を高めるように変更することができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１以上の部位を変更することにより達成することができる。例えば、１以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらし、それによりその部位におけるグリコシル化を排除する１以上のアミノ酸置換を行うことができる。このような非グリコシル化は抗原に対する抗体の親和性を高め得る。このようなアプローチはCoらにより米国特許第５,７１４,３５０号および同第６,３５０,８６１号にさらに詳しく記載されている。
【０１７７】
それに加え、またはその代わりに、フコシル残基量が少ない低フコシル化抗体またはバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体のような改変されたタイプのグリコシル化を有する抗体を作製することもできる。このような改変グリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を高めることが示されている。このような炭水化物修飾は、例えば、改変グリコシル化機構を有する宿主細胞中で抗体を発現させることにより達成することができる。改変グリコシル化機構を有する細胞は先行技術で説明されており、本発明の組換え抗体を発現させる宿主細胞として使用し、それにより改変グリコシル化を有する抗体を産生させることができる。例えば、HangらによるＥＰ１,１７６,１９５は、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊されている細胞系統を記載し、その結果、このような細胞系統で発現した抗体は低フコシル化を示す。PrestaによるＰＣＴ公報ＷＯ０３／０３５８３５には、フコースをＡｓｎ(２９７)結合炭水化物に結合させる能力が低下しており、その結果、この場合にもその宿主細胞で発現した抗体の低フコシル化をもたらす変異型ＣＨＯ細胞系統であるＬｅｃ１３細胞を記載している(Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照)。UmanaらによるＰＣＴ公報ＷＯ９９／５４３４２は、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、β(１,４)−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ(ＧｎＴＩＩＩ)を発現するように操作された細胞系統を記載しており、この操作された細胞系統で発現した抗体はバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造の増加を示し、その結果、抗体のＡＤＣＣ活性の増強をもたらす(Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180も参照)。
【０１７８】
本発明により意図される本明細書の抗体の別の修飾としてＰＥＧ化がある。抗体は例えば抗体の生体(例えば血清)半減期を延長するためにＰＥＧ化することができる。抗体をＰＥＧ化するためには、抗体またはそのフラグメントを一般に、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのＰＥＧと、１以上のＰＥＧ基が抗体または抗体フラグメントに結合するようになる条件化で反応させる。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子(または類似の反応性水溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応により行うことができる。本明細書において「ポリエチレングリコール」とは、モノ(Ｃ１−Ｃ１０)アルコキシ−またはアリルオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するために用いられているいずれの形態のＰＥＧも含むものとする。ある特定の態様では、ＰＥＧ化される抗体は非グリコシル化抗体である。タンパク質をＰＥＧ化する方法は当技術分野で公知であり、本発明の抗体にも適用可能である。例えば、NishimuraらによるＥＰ０１５４３１６およびIshikawaらによるＥＰ０４０１３８４参照。
【０１７９】
非免疫グロブリンスキャフォールド
得られるポリペプチドが標的タンパク質に特異的な少なくとも１つの結合領域を含む限り、多種の抗体／免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドが使用可能である。このようなフレームワークまたはスキャフォールドは、５つの主要イディオタイプのヒト免疫グロブリンまたはそのフラグメントを含み(例えば、本明細書の他所に開示されているもの)、さらに、好ましくはヒト化側面を有する他の動物種の免疫グロブリンを含む。この点でラクダおよび／またはサメで同定されている単鎖重鎖抗体は特に着目されるものである。当業者による新規なフレームワーク、スキャフォールドおよびフラグメントの発見および開発が続いている。
【０１８０】
一局面において、本発明は、本発明のＣＤＲをグラフトすることができる非免疫グロブリンスキャフォールドを用いた非免疫グロブリンに基づく抗体の作製に関する。配列番号１または配列番号１２２の標的タンパク質に特異的な結合領域を含んでいる限り、既知のまたは将来的な非免疫グロブリンフレームワークおよびスキャフォールドが使用可能である。このような化合物は本明細書では「標的特異的結合領域を含むポリペプチド」として知られる。既知の非免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドは、限定されるものではないが、アドネクチン(Adnectins)(フィブロネクチン)(Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA)、アンキリン(Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis, Ltd (Cambridge, MA)およびAblynx nv (Zwijnaarde, Belgium))、リポカリン(lipocalin)(Anticalin)(Pieris Proteolab AG, Freising, Germany)、スモール・モジュラー・イムノファルマシューティカル(small modular immuno-pharmaceuticals)(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA)、マキシボディー(maxybodies)(Avidia, Inc. (Mountain View, CA))、プロテインＡ(Affebody AG, Sweden)およびアフィリン(affilin)(γクリスタリンまたはユビキチン)(Scil Protains GmbH, Halle, Germany)を含む。
【０１８１】
(ｉ)アドネクチン−Compound Therapeutics
アドネクチンスキャフォールドは、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン(例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチンの１０番目のモジュール(１０Ｆｎ３ドメイン)に基づくものである。このＩＩＩ型フィブロネクチンドメインは２つのβシートの間に分布する７または８βストランドを有し、それら自体は互いに対して稠密となりタンパク質核を形成し、さらに互いにβストランドを接続し、溶媒に曝されるループ(ＣＤＲに類似)を含む。βシートサンドイッチの各端にはこのようなループが少なくとも３つあり、この端部はβストランドの方向と垂直にタンパク質の境界となっている(米国特許第６,８１８,４１８号)。
【０１８２】
これらのフィブロネクチンに基づくスキャフォールドは免疫グロブリンではないが、全体的な折り畳みは最小機能抗体フラグメントである重鎖可変領域のものに密接に関係しており、ラクダおよびラマＩｇＧにおける全抗原認ユニットを含む。この構造のため、非免疫グロブリン抗体は、自然界で類似の抗原結合特性および抗体に対する親和性を模倣する。これらのスキャフォールドは、in vivoにおける抗体の親和性成熟の過程に類似する、in vitroにおけるループの無作為化およびシャッフリング戦略に使用可能である。これらのフィブロネクチンに基づく分子は、標準的なクローニングを用いてその分子のループ領域を本発明のＣＤＲで置換することができるスキャフォールドとして使用可能である。
【０１８３】
(ｉｉ)アンキリン−Molecular Partners
この技術は、種々の標的との結合に使用可能な可変領域を保持するためのスキャフォールドとしてアンキリン誘導化リピートモジュールを有するタンパク質の使用に基づくものである。このアンキリンリピートモジュールは２つの逆平行αヘリックスとβターンからなる３３個のアミノ酸のポリペプチドである。これらの可変領域の結合はリボソームディスプレーを用いてほぼ至適化される。
【０１８４】
(ｉｉｉ)マキシボディー／アビマー−Avidia
アビマーはＬＲＰ−１などのタンパク質を含む天然Ａドメインに由来する。これらのドメインはタンパク質−タンパク質相互作用により用いられ、ヒトでは２５０を超えるタンパク質が構造的にＡドメインに基づいている。アビマーはアミノ酸リンカーを介して結合したいくつかの異なる「Ａドメイン」モノマー(２〜１０)からなる。アビマーは、例えば２００４０１７５７５６；２００５００５３９７３；２００５００４８５１２；および２００６０００８８４４に記載されている方法論を用いて標的抗原と結合できるものを作出することができる。
【０１８５】
(ｖｉ)プロテインＡ−アフィボディ
アフィボディ(登録商標)親和性リガンドは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの１つのスキャフォールドに基づく３本のヘリックス束からなる、小さな単純なタンパク質である。プロテインＡは黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来の表面タンパク質である。このスキャフォールドドメインは５８のアミノ酸からなり、そのうち１３は多数のリガンド変異体を有するアフィボディ(登録商標)ライブラリーを作出するために無作為化されている(例えば、米国特許第５,８３１,０１２号参照)。アフィボディ(登録商標)分子は抗体を模倣し、抗体の分子量が１５０ｋＤａであるのに対して、その分子量は６ｋＤａである。その小さなサイズにもかかわらず、アフィボディ(登録商標)分子の結合部位は抗体のものと同等である。
【０１８６】
(ｖ)アンチカリン−Pieris
アンチカリン(登録商標)は、Pieris ProteoLab AG社が開発した製品である。それらは化学的に感受性があるか、または不溶性の化合物の生理学的輸送または貯蔵に通常含まれる、小型かつ頑丈な広範なタンパク質群であるリポカリン類に由来する。数種の天然リポカリンはヒト組織または体液に見られる。
【０１８７】
このタンパク質構造は、強固なフレームワーク上に超可変ループを有する免疫グロブリンを暗示する。しかしながら、抗体またはそれらの組換えフラグメントとは対照的に、リポカリン類は１６０〜１８０のアミノ酸残基を有する１本のポリペプチド鎖からなり、１本の免疫グロブリンドメインよりも端部がやや大きい。
【０１８８】
結合ポケットを形成する４つのループのセットは、著しい構造的可塑性を示し、かつ、種々の側鎖を許容する。よって、この結合部位は、高い親和性と特異性を有する異なる形状の、指定された標的分子を認識するために、特許プロセスで再成形することができる。
【０１８９】
リポカリンファミリーの１つのタンパク質であるPieris Brassicaeのビリン(bilin)結合タンパク質(ＢＢＰ)は、この４つのループセットを突然変異誘発することによりアンチカリン類(anticalins)を開発するために用いられている。「アンチカリン類」を記載している特許出願の一例はＰＣＴ  ＷＯ１９９９１６８７３である。
【０１９０】
(ｖｉ)アフィリン−Scil Protains
アフィリン(商標)分子は、タンパク質および小分子に対して特異的親和性を持つようにデザインされた小型の非免疫グロブリンタンパク質である。新しいアフィリン(商標)分子は、各々異なるヒト由来スキャフォールドタンパク質に基づく２つのライブラリーから極めて迅速に選択することができる。
【０１９１】
アフィリン(商標)分子は免疫グロブリンタンパク質に構造的相同性を示さない。Scil Protainsは２つのアフィリン(商標)スキャフォールドを用い、その一方はヒト眼のレンズの構造タンパク質であるγクリスタリンであり、他方は「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。両ヒトスキャフォールドとも極めて小さく、高温安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤にほぼ耐性がある。この高い安定性は主としてこれらのタンパク質の拡張βシート構造によるものである。γクリスタリン由来タンパク質の例はＷＯ２００１０４１４４に記載されており、「ユビキチン様」タンパク質の例はＷＯ２００４１０６３６８に記載されている。
【０１９２】
抗体操作法
上述のように、本明細書に示すＶＨおよびＶＬ配列または全長重鎖および軽鎖を有する抗ＤＫＫ１抗体を用いて、全長重鎖および／または軽鎖配列、ＶＨおよび／またはＶＬ配列、またはそれに結合した定常領域を修飾することにより、新しい抗ＤＫＫ１／４抗体を作出することができる。よって、本発明の別の局面では、本発明の抗ＤＫＫ１抗体の構造的特徴を用いて、ヒトＤＫＫ１もしくはＤＫＫ４またはその双方との結合、また、ＤＫＫ１もしくはＤＫＫ４またはその双方の１以上の機能的特性の阻害など、本発明の抗体の少なくとも１つの機能的特性を保持する、構造的に関連のある抗ＤＫＫ１／４抗体を作出することができる。
【０１９３】
例えば、本発明抗体またはその突然変異体の１以上のＣＤＲ領域を公知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組換えにより組み合わせ、上述のように、組換え操作された本発明の付加的な抗ＤＫＫ１抗体を作出することができる。他のタイプの修飾は、前節に記載したものを含む。この操作法の出発材料は、本明細書で提供されるＶＨおよび／またはＶＬ配列の１以上またはその１以上のＣＤＲ領域である。操作抗体を作出するためには、本明細書で提供されるＶＨおよび／またはＶＬ配列の１以上またはその１以上のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に作製(すなわち、タンパク質として発現させる)する必要はない。そうではなく、その配列に含まれる情報を出発材料として用い、元の配列に由来する「第二世代」配列を作出した後、この「第二世代」配列をタンパク質として作製および発現させる。
【０１９４】
よって、別の態様では、本発明は、配列番号２〜５、８〜１１、２０、４９〜５６からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２〜２０および５７〜６４からなる群から選択されるＣＤＲ２配列および／または配列番号２〜２０および６５〜７２からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有するＶＨ領域抗体配列と、配列番号２１〜３９および７３〜８０からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２１〜３９および８１〜８８からなる群から選択されるＣＤＲ２配列および／または配列番号２１〜３９および８９〜９６からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有するＶＬ領域抗体配列からなる抗ＤＫＫ１抗体を作製し、このＶＨ領域抗体配列および／またはＶＬ領域抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して少なくとも１つの改変型抗体配列を作出し、その改変型抗体配列をタンパク質として発現させる方法を提供する。
【０１９５】
よって、別の態様では、本発明は、配列番号１１５〜１１７の群から選択される全長重鎖抗体配列と、配列番号１１１〜１１４の群から選択される配列を有する全長軽鎖抗体配列をからなる抗ＤＫＫ１抗体を作製し、その全長重鎖抗体配列および／または全長軽鎖抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して少なくとも１つの改変型抗体配列を作出し、その改変型抗体配列をタンパク質として発現させる方法を提供する。
【０１９６】
別の態様では、本発明は、配列番号１１９の群から選択される配列を有するＶＨ領域抗体配列と、配列番号１１８の群から選択される配列を有するＶＬ領域抗体配列からなる、哺乳類発現のために至適化された中和抗ＤＫＫ１／４組成物を作製し、このＶＨ領域抗体配列および／またはＶＬ領域抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して少なくとも１つの改変型抗体配列を作出し、その改変型抗体配列をタンパク質として発現させる方法を提供する。
【０１９７】
改変型抗体配列を作製および発現させるためには、標準的な分子生物学的技術を使用することができる。改変型抗体配列によりコードされる抗体は、本明細書に記載の中和抗ＤＫＫ１／４組成物の機能的特性の１つ、一部または前部を保持するものであり、その機能的特性としては、限定されるものではないが、ヒトＤＫＫ１との特異的結合であり、この抗体は次の機能的特性：抗体がＤＫＫ１タンパク質とＤＫＫ１受容体の結合を阻害するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解を予防もしくは改善するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して、それにより骨溶解病変を予防もしくは改善するか、または抗体がＤＫＫ１受容体の結合を阻害して癌を予防もしくは改善するかの少なくとも１つを示す。
【０１９８】
この改変型抗体は上述の機能的特性の１以上、２以上または３以上を示し得る。
これらの改変型抗体の機能的特性は、実施例で示されるものなど(例えばＥＬＩＳＡ)、当技術分野で利用可能であり、かつ／または本明細書に記載される標準的アッセイを用いて評価することができる。
【０１９９】
本発明の抗体操作法の特定の態様では、抗ＤＫＫ１抗体コード配列の全体または一部に無作為または選択的に導入することができ、得られた修飾抗ＤＫＫ１抗体は結合活性および／または上記のような他の機能的特性に関してスクリーニングすることができる。突然変異法は当技術分野ですでに記載されている。例えば、ShortによるＰＣＴ公報ＷＯ０２／０９２７８０では、飽和突然変異誘発、合成連結アセンブリまたはその組合せを用い、抗体突然変異を作出およびスクリーニングする方法が記載されている。あるいは、LazarらによるＰＣＴ公報ＷＯ０３／０７４６７９では、抗体の物理化学的特性を至適化するためにコンピューター利用スクリーニング法を使用する方法が記載されている。
【０２００】
抗体のＦｃ定常領域は血清半減期およびエフェクター機能、すなわち、抗体依存性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)活性または補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)活性を決定するために重要である。エフェクター機能および／または血清半減期を変更すべく、このＦｃフラグメントの特定の変異株を工学的に作製することができる(例えば、Xencor technology、また例えばＷＯ２００４０２９２０７も参照)。
【０２０１】
抗体のエフェクター機能および血清半減期を変更する１つの方法として、抗体フラグメントの可変領域に、適当なエフェクター機能を有するＦｃフラグメントをグラフトするものがある。細胞死滅活性のためにはＩｇＧ１またはＩｇＧ４イソ型を選択することができ、サイレント抗体または中和抗体(細胞死滅活性を持たない)のためにはＩｇＧ２イソ型を使用することができる。
【０２０２】
血清半減期の長いサイレント抗体は、抗体の可変領域と、ＨＳＡなどの血清タンパク質またはＨＳＡ結合タンパク質などの、このような血清タンパク質と結合するタンパク質とのキメラ融合物を作製することによって得ることができる。
【０２０３】
エフェクター機能または、抗体のグリコシル化パターンを調節することによっても改変することができる。Glycart(例えば米国特許第６,６０２,６８４号)、Biowa(例えば米国特許第６,９４６,２９２号)およびGenentech(例えばＷＯ０３／０３５８３５)は、哺乳類細胞系統を操作して、エフェクター機能が上昇または低下した抗体を作出している。特に、非フコシル化抗体は高いＡＤＣＣ活性を有する。また、Glycofiは、抗体の特定のグリコフォームを産生することができる酵母細胞系統を開発した。
【０２０４】
本発明の抗体をコードする核酸分子
本発明の別の局面は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。全長軽鎖親ヌクレオチド配列の例は配列番号９７〜１００に示される。全長重鎖親ヌクレオチド配列の例は配列番号１０１〜１０３で示される。細胞での発現のために至適化された全長軽鎖ヌクレオチド配列の例は配列番号１０４〜１０７で示される。細胞での発現のために至適化された全長重鎖ヌクレオチド配列の例は配列番号１０８〜１１０で示される。
【０２０５】
核酸は、細胞溶解物として細胞全体に存在してもよいし、または部分精製された、もしくは実質的に純粋な形態であってもよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌ結合、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動およびその他当該技術の周知の方法を含む標準的技術によって、例えば、他の細胞性核酸またはタンパク質のような他の細胞成分または他の夾雑物から精製して取り出す際に「単離される」または「実質的に純粋にされる」。F. Ausubel, et al. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York参照。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、イントロン配列を含んでいても含まなくてもよい。一態様では、この核酸はｃＤＮＡ分子である。この核酸はファージディスプレーベクターベクターなどのベクター中に存在してもよいし、または組換えプラスミドベクター中に存在してもよい。
【０２０６】
本発明の核酸は、標準的な分子生物技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ(例えば、以下にさらに記載されるようにヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製したハイブリドーマ)により発現される抗体に関して、ハイブリドーマにより産生された抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られた(例えば、ファージディスプレー技術を使用)抗体に関して、この抗体をコードする核酸はライブラリーのメンバーである種々のファージクローンから回収することができる。
【０２０７】
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたら、これらのＤＮＡフラグメントは、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するための標準的な組換えＤＮＡ技術によりさらに操作することができる。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨコードＤＮＡフラグメントを別のＤＮＡ分子と、または抗体定常領域もしくはフレキシブルリンカーなどの別のタンパク質をコードするフラグメントに作動可能なように連結させる。この文脈において用いる場合の「作動可能なように連結される」とは、２つのＤＮＡフラグメントが、例えばその２つのＤＮＡフラグメントによりコードされるアミノ酸配列がフレーム内に留まるように、またはそのタンパク質が所望のタンパク質の制御下で発現されるように機能する様式で連結されることを意味する。
【０２０８】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、そのＶＨコードＤＮＡを重鎖定常領域(ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３)をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能なように連結することにより、全長重鎖遺伝子へと変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で公知であり(例えば、Kabat, E. A., el al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。この重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であり得る。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子では、ＶＨコードＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能なように連結することができる。
【０２０９】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、そのＶＬコードＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能なように連結することにより、全長軽鎖遺伝子(ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子)へと変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で公知であり(例えば、Kabat, E. A., el al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。この軽鎖定常領域はκまたはλ定常領域であり得る。
【０２１０】
ｓｃＦｖ遺伝子を作出するために、ＶＨおよびＶＬコードＤＮＡフラグメントを、ＶＨおよびＶＬ配列が連続する単鎖タンパク質として発現することができるように、例えばアミノ酸配列(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)３をコードするフレキシブルリンカーをコードする別のフラグメントと作動可能なように連結させる(例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426; Huston et at., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990 Nature 348:552-554参照)。
【０２１１】
本発明のモノクローナル抗体の生産
モノクローナル抗体(ｍＡｂ)は、例えば、Kohler and Milstein, 1975 Nature 256:495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術のような従来のモノクローナル抗体方法を含む様々な技術により作製することができる。例えば、Ｂリンパ細胞のウイルス性または癌性形質転換など、モノクローナル抗体生産のための多くの技術を使用することができる。
【０２１２】
ハイブリドーマの作製のための動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、よく確立された手順である。免疫化プロトコールおよび免疫した融合用脾細胞の単離のための技術は当該技術で公知である。融合パートナー(例えば、マウス骨髄腫細胞)および融合手順も公知である。
【０２１３】
本発明のキメラまたはヒト化抗体は、上記のように作製したマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて作製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、標準的な分子生物学的技術を用いて、対象とするマウスハイブリドーマから得ることができ、非マウス(例えば、ヒト)免疫グロブリン配列を含むように操作することができる。例えば、キメラ抗体を作製するためには、マウス可変領域を、当技術分野で公知の方法を用い、ヒト定常領域に連結することができる(例えば、Cabillyらの米国特許第４,８１６,５６７号参照)。ヒト化抗体を作製するためには、マウスＣＤＲ領域を、当技術分野で公知の方法を用い、ヒトフレームワークに挿入することができる(例えば、Winterの米国特許第５２２５５３９号、ならびにQueenらの米国特許第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号、同第５６９３７６２号および同第６１８０３７０号参照)。
【０２１４】
ある特定の態様では、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ＤＫＫ１に対するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりもむしろヒト免疫系部分を含むトランスジェニックマウスまたは染色体導入マウスを用いて生成させることができる。これらのトランスジェニックマウスおよび染色体導入マウスには、本明細書でそれぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウス(商標)と呼ばれる、また、本明細書で「ヒトＩｇマウス」と総称されるマウスを含む。
【０２１５】
ＨｕＭＡｂマウス(登録商標)(Medarex, Inc.)は、内因性μおよびκ鎖座を不活性化する標的突然変異とともに、非再配置ヒト重鎖(μおよびγ)およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座(miniloci)を含む(例えば、Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474):856-859参照)。よって、当該マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現低下を示し、免疫化に応答して、導入したヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子がクラス切り換えと体細胞突然変異を受け、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを生成する(Lonberg, N. et al., 1994 前掲;総説としては、Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93、およびHarding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546)。ＨｕＭａｂマウスの作出とその使用、およびこのようなマウスが有するゲノム修飾は、さらにTaylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591;およびFishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851に記載されている(これら全ての開示内容は出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる)。さらに、米国特許第５,５４５,８０６号、同第５,５６９,８２５号、同第５,６２５,１２６号、同第５,６３３,４２５号、同第５,７８９,６５０号、同第５,８７７,３９７号、同第５,６６１,０１６号、同第５,８１４,３１８号、同第５,８７４,２９９号および同第５,７７０,４２９号(全てLonberg and Kayのもの)；Suraniらの米国特許第５,５４５,８０７号、ＰＣＴ公報ＷＯ９２１０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７１１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２(全てLonberg and Kayのもの)；ならびにKormanらのＰＣＴ公報ＷＯ０１／１４４２４も参照。
【０２１６】
別の態様では、本発明のヒト抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子とヒト軽鎖導入染色体を有するマウスのような導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を有するマウスを用いて作製することができる。本発明ではこのようなマウスを「ＫＭマウス」と呼び、IshidaらのＰＣＴ公報ＷＯ０２／４３４７８に詳細に記載されている。
【０２１７】
さらに、当技術分野ではヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスジェニック動物系も利用可能であり、本発明の抗ＤＫＫ１抗体を作製するために使用可能である。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ(Abgenix, Inc.) と呼ばれる別のトランスジェニック系も使用可能である。このようなマウスは、例えば、Kucherlapatiらの米国特許第５,９３９,５９８号、同第６,０７５,１８１号、同第６,１１４,５９８号、同第６,１５０,５８４号および同第６,１６２,９６３号に記載されている。
【０２１８】
さらに、当技術分野ではヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別の染色体導入動物系も利用可能であり、本発明の抗ＤＫＫ１抗体を作製するために使用可能である。例えば、「ＴＣマウス」と呼ばれるヒト重鎖導入染色体とヒト軽鎖導入染色体の双方を有するマウスが使用可能であり、このようなマウスはTomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されている。さらに、当技術分野ではヒト重鎖および軽鎖導入染色体を有するウシも記載されており(Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894)、本発明の抗ＤＫＫ１抗体の作製に使用可能である。
【０２１９】
また、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーのスクリーニングのためのファージディスプレー法を用いて作製することもできる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレー法は、当技術分野において確立されている。例えば、Ladnerらの米国特許第５,２２３,４０９号、同第５,４０３,４８４号および同第５,５７１,６９８号、Dowerらの米国特許第５,４２７,９０８号および同第５,５８０,７１７号、McCaffertyらの米国特許第５,９６９,１０８号および同第６,１７２,１９７号、ならびにGriffithsらの米国特許第５,８８５,７９３号、同第６,５２１,４０４号、同第６,５４４,７３１号、同第６,５５５,３１３号、同第６,５８２,９１５号および同第６,５９３,０８１号参照。
【０２２０】
また、本発明のヒトモノクローナル抗体は、感作の際にヒト抗体応答が起こり得るように、ヒト免疫細胞を再構築したＳＣＩＤマウスを用いて作製することもできる。このようなマウスは、例えば、Wilsonらの米国特許第５,４７６,９９６号および同第５,６９８,７６７号に記載されている。
【０２２１】
本発明の抗体を同定するには、ヒト抗体ライブラリースクリーンを使用すればよい。スクリーニング技術の選択肢は、限定されるものではないが、例えば、ファージディスプレー(Morphosys)、ライブラリーの種類(例えば、MorphosysからのＨｕＣａｌライブラリー)、親和性成熟技術およびさらなるコドン至適化配列を含む。
【０２２２】
ＤＫＫ１に対するヒトモノクローナル抗体の作製
大腸菌(E.coli)、バキュロウイルスまたはＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞に由来する精製組換えヒトＤＫＫ１またはキーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)とコンジュゲートした精製組換えヒトＤＫＫ１を抗原として用いる。
【０２２３】
ＤＫＫ１に対する完全ヒトモノクローナル抗体は、ＨｕＭａｂトランスジェニックマウスのＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＨＣｏ１７系統、ならびにトランスジェニック染色体導入マウスのＫＭ系統(各々、ヒト抗体遺伝子を発現する)を用いて作製される。これらのマウス系統の各々において、内因性のマウスκ軽鎖遺伝子はChen et al., 1993 EMBO J.12:811-820に記載されているように同形接合的に分断することができ、内因性のマウス重鎖遺伝子はＰＣＴ公報ＷＯ０１１０９１８７の実施例１に記載されているように同形接合的に分断することができる。これらのマウス系統は各々、Fishwild et al., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851に記載されているように、ヒトκ軽鎖導入遺伝子、ＫＣｏ５を有する。ＨＣｏ７系統は、米国特許第５,５４５,８０６号、同第５,６２５,８２５号および同第５,５４５,８０７号に記載されているように、ＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子を有する。ＨＣｏ１２系統は、ＰＣＴ公報ＷＯ０１／０９１８７の実施例２に記載されているように、ＨＣｏ１２ヒト重鎖導入遺伝子を有する。ＨＣｏ１７系統は、ＨＣｏ１７ヒト重鎖導入遺伝子を有する。ＫＮＭ系統は、ＰＣＴ公報ＷＯ０２／４３４７８に記載されているように、ＳＣ２０導入染色体を有する。
【０２２４】
ＤＫＫ１に対する完全ヒトモノクローナル抗体を作製するためには、ＨｕＭａｂマウスおよびＫＭマウスを、大腸菌由来の精製組換えＤＫＫ１またはＤＫＫ１−ＫＬＨコンジュゲートを抗原として免疫化する。ＨｕＭａｂマウスの一般的な免疫スキームはLonberg, N. et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851およびＰＣＴ公報ＷＯ９８／２４８８４に記載されている。抗原の初回注入時においてマウスは６〜１６週齢である。ＤＫＫ１抗原の精製組換え調製物(５〜５０μｇ)(例えば、ＤＫＫ１を発現するトランスフェクト大腸菌細胞から精製)を用い、腹腔内注射、皮下注射(Ｓｃ)または足蹠注射によりＨｕＭａｂマウスおよびＫＭマウスを免疫化する。
【０２２５】
トランスジェニックマウスを完全フロイントアジュバントまたはＲｉｂｉアジュバント中の抗原を、腹腔内(ＩＰ)、皮下(Ｓｃ)または足蹠(ＦＰ)のいずれかにより２回感作させた後、３〜２１日後にフロイントの不完全アジュバントまたはＲｉｂｉアジュバント中の抗原をＩＰ、ＳｃまたはＦＰ感作させる(合計最大１１回の感作)。免疫応答を眼窩後方採血によりモニタリングする。血漿をＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、十分な力価の抗ＤＫＫ１ヒト免疫グロブリン(immunogolobulin)を有するマウスを融合に用いる。屠殺３日前と２日前にマウス静脈に抗原を追加投与し、脾臓を摘出する。一般に、各抗原につき１０〜３５回の融合を行う。数ダースのマウスに各抗原を感作させる。ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ１７およびＫＭのマウス系統の全部で８２個体にＤＫＫ１を感作させる。
【０２２６】
ＤＫＫ１と結合した、抗体を産生するＨｕＭａｂマウスまたはＫＭマウスを選択するために、免疫マウスの血清をFishwild, D. et al., 1996に記載されているようにＥＬＩＳＡで試験する。要するに、マイクロタイタープレートを大腸菌から精製した、ＰＢＳ中１〜２μｇ／ｍｌの組換えＤＫＫ１でコーティングし、５０μｌ／ウェルを４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ(０.０５％)中５％ニワトリ血清２００μｌ／ウェルでブロッキングする。ＤＫＫ１免疫マウスからの血漿希釈液を各ウェルに加え、周囲温度で１〜２時間インキュベートする。これらのプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)をコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃポリクローナル抗体とともに室温で１時間インキュベートする。洗浄後、これらのプレートをＡＢＴＳ基質(Sigma、Ａ−１８８８、０.２２ｍｇ／ｍｌ)で現像し、分光光度計によりＯＤ４１５〜４９５で分析する。抗ＤＫＫ１抗体の最高力価を示したマウスを融合に用いる。融合を行い、ハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡにより抗ＤＫＫ１活性に関して試験する。
【０２２７】
ＨｕＭａｂマウスおよびＫＭマウスから単離されたマウス脾細胞を、標準的なプロトコールに基づき、ＰＥＧを用いてマウス骨髄腫細胞系統と融合させる。得られたハイブリドーマをその後、抗原特異的抗体の産生に関してスクリーニングする。免疫マウスからの脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、５０％ＰＥＧ(Sigma)を用い、４分の１の数のＳＰ２／０非分泌マウス骨髄腫細胞(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  １５８１)と融合させる。細胞を平底マイクロタイタープレート中、およそ１×１０５／ウェルで播種した後、約２週間、ＤＭＥＭ(Mediatech、ＣＲＬ  １００１３、高グルコース、Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを含む)および５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０.０５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０ｍｌｇｌｎｎｉ  ゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ(Sigma、ＣＲＬ  Ｐ−７１８５)中に、１０％ウシ胎児血清、１０％Ｐ３８８Ｄ  １(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  ＴＩＢ−６３)細胞馴化培地、３〜５％オリゲン(ＩＧＥＮ)を含有する選択培地中でインキュベートする。１〜２週間後、細胞を、ＨＡＴをＨＴに置き換えた培地で培養する。次に、個々のウェルをヒト抗ＤＫＫ１モノクローナルＩｇＧ抗体に関してＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。ひと度広範なハイブリドーマ増殖が見られれば、通常、１０〜１４日後に培地をモニタリングする。抗体を分泌するハイブリドーマを再播種し、再びスクリーニングし、なおヒトＩｇＧ陽性であれば、その抗ＤＫＫ１モノクローナル抗体を制限希釈により少なくとも２回サブクローニングする。その後、安定なサブクローンをin vitroで培養し、さらなる特性決定のため、組織培養培地中で少量の抗体を生成させる。
【０２２８】
ヒトＩｇマウスの免疫化
ヒトＩｇマウスを用いて本発明のヒト抗体を作製する場合、Lonberg, N. et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851ならびにＰＣＴ公報ＷＯ９８１２４８８４およびＷＯ０１／１４４２４に記載されているように、精製または富化されたＤＫＫ１抗原および／または組換えＤＫＫ１またはＤＫＫ１融合タンパク質でこのようなマウスを免疫化することができる。初回注入時においてマウスは６〜１６週齢であり得る。例えば、ＤＫＫ１抗原の精製または組換え調製物(５〜５０μｇ)を用い、ヒトＩｇマウスに腹膜内感作できる。
【０２２９】
ＤＫＫ１に対する全長ヒトモノクローナル抗体を作製するための詳細な手順は上記されている。種々の抗原による累積的な経験により、まず、フロイントの完全アジュバント中の抗原で腹腔内(ＩＰ)免疫し、次に２週おきにフロイントの不完全アジュバント中の抗原でＩＰ免疫(合計最大６回)した際、トランスジェニックマウスが応答することが示されている。しかし、フロイント以外のアジュバントも有効であることが分かっている。さらに、完全な細胞はアジュバントの不在下でも極めて免疫原性が高いことが分かっている。この免疫応答を、眼窩後方採血により得られた血漿サンプルによる免疫化プロトコール過程でモニタリングすることができる。血漿はＥＬＩＳＡによりスクリーニングすることができ、十分な力価の抗ＤＫＫ１ヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合に使用することができる。屠殺３日前にマウス静脈に抗原を追加投与し、脾臓を摘出する。各免疫化について２〜３回融合を行う必要があると思われる。一般に、各抗原について６〜２４個体のマウスを免疫する。通常、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２系統の双方を使用する。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２導入遺伝子の双方を、２つの異なるヒト重鎖導入遺伝子(ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２)を有する１個体のマウスに一緒に育成することができる。
【０２３０】
ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫マウス由来の脾臓および／またはリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞系統などの適当な不死化細胞系統と融合させることができる。得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生に関してスクリーニングすることができる。例えば、免疫マウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁物を、５０％ＰＥＧを用い、６分の１数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８.６５３非分泌マウス骨髄腫細胞(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０)と融合させることができる。細胞を、約２×１４５で平底マイクロタイタープレートに播種した後、２０％胎児クローン血清、１８％「６５３」細胞馴化培地、５％オリゲン(ＩＧＥＮ)、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０.０５５ｍＭ  ２−メルカプトメタノール、５０単位／ｍＬペニシリン、５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび１ｘＨＡＴ(Sigma；ＨＡＴは融合２４時間後に添加する)を含有する選択培地中で２週間インキュベートする。約２週後、細胞を、ＨＡＴをＨＴに置き換えた培地中で培養することができる。次に、個々のウェルをＥＬＩＳＡによりヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体に関してスクリーニングすることができる。ひと度広範なハイブリドーマ増殖が見られれば、通常、１０〜１４日後に培地を観察することができる。抗体を分泌するハイブリドーマを再播種し、再びスクリーニングし、なおヒトＩｇＧ陽性であれば、そのモノクローナル抗体を制限希釈により少なくとも２回サブクローニングすることができる。その後、安定なサブクローンをin vitroで培養し、特性決定のため、組織培養培地中で少量の抗体を生成させる。
【０２３１】
ヒトモノクローナル抗体を精製するために、選択したハイブリドーマを、モノクローナル抗体を精製用の２リットルのスピナーフラスコ中で増殖させることができる。上清を濾過し、濃縮した後、プロテインＡ−セファロース(Pharmacia, Piscataway, N.J.)によるアフィニティクロマトグラフィーを行うことができる。溶出したＩｇＧをゲル電気泳動と高速液体クロマトグラフィーで調べ、純度を確認することができる。緩衝液をＰＢＳに交換し、濃度を、吸光係数１.４３を用いてＯＤ２８０にて測定することができる。モノクローナル抗体はアリコートに分け、−８０℃で保存することができる。
【０２３２】
モノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
また、本発明の抗体は、例えば、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術と遺伝子トランスフェクション法の組合せを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマ中で産生させることができる(例えば、Morrison, S.(1985)Science 229:1202)。
【０２３３】
例えば、抗体またはその抗体フラグメントを発現させるために、部分的または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、標準的な分子生物学的技術(例えば、ＰＣＲ増幅または対象抗体を発現するハイブリドーマを用いたｃＤＮＡクローニング)により得ることができ、このＤＮＡを、それらの遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能なように連結されるように、発現ベクター中に挿入することができる。これに関して「作動可能なように連結される」とは、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというそれらの意図される機能を果たすようにベクターに連結されることを意味するものとする。この発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞に適合するように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は個別のベクターに挿入することができ、さらに一般には、両遺伝子を同じ発現ベクターに挿入することもできる。抗体遺伝子は、標準的方法(例えば、抗体遺伝子フラグメント上の相補性制限部位とベクターとの連結、または制限部位が全く存在しない場合には、平滑末端連結)によって発現ベクター中に挿入される。本明細書に記載の抗体の軽鎖およびＶＨ領域を用い、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントと作動可能なように連結され、ＶＬセグメントはベクター内のＣＬセグメントと作動可能なように連結されるように、それらを所望のイソ型の重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードしている発現ベクターに挿入することにより、いずれの抗体のイソ型の全長抗体遺伝子も作出することができる。それに加え、またはその代わりに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。当該抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドがインフレームで抗体鎖遺伝子のアミノ末端に連結されるようにベクター中にクローニングすることができる。当該シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド(すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド)であってもよい。
【０２３４】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有している。「調節配列」とは、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むものとする。このような調節配列は、例えば、Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990))に記載されている。当業者ならば、調節配列の選択を含む発現ベクターのデザインが被形質転換宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存することが分かるであろう。哺乳類宿主細胞発現のための調節配列は、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、シミアンウイルス４０(ＳＶ４０)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(ＡｄＭＬＰ))およびパピローマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳類細胞における高レベルタンパク質発現を指示するウイルスエレメントを含む。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはＰ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列も使用可能である。さらに、調節エレメントは、ＳＲａプロモーター系などの異なる起源由来の配列で構成され、それらはＳＶ４０初期プロモーターおよびヒト１型Ｔ細胞白血病ウイルスの長い末端反復配列に由来する配列を含む(Takebe, Y. et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。
【０２３５】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中のベクターの複製を調節する配列(例えば、複製開始点)および選択マーカー遺伝子などの付加的配列を有してもよい。この選択マーカー遺伝子は、ベクターを導入した宿主細胞の選択を容易にする(例えば、全てAxelらの米国特許４,３９９,２１６号、同第４,６３４,６６５号および同第５,１７９,０１７号参照)。例えば、一般に、選択マーカー遺伝子は、ベクターを導入した宿主細胞上でＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)遺伝子(メトトレキサート選択／増幅とともにｄｈｆｒ−宿主細胞中で使用するため)およびｎｅｏ遺伝子(Ｇ４１８選択用)を含む。
【０２３６】
軽鎖および重鎖の発現のためには、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを、標準的技術により宿主細胞にトランスフェクトする。「トランスフェクション」という用語の種々の形態は、外来ＤＮＡを原核生物または真核生物宿主細胞に導入するために一般に用いられる広範な技術を包含するものとし、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどがある。本発明の抗体を原核生物または真核生物宿主細胞のいずれで発現させることも理論上可能である。このような真核細胞、特に、哺乳類細胞は原核細胞に比べて、適切に折りたたまれた抗原結合抗体を構築および分泌しやすいので、真核細胞、特に哺乳類宿主細胞での抗体発現が述べられる。抗体遺伝子の原核生物発現は、高収率の活性抗体産生には無効であることが報告されている(Boss, M. A. and Wood, C. R., 1985 Immunology Today 6:12-13)。
【０２３７】
本発明の組換え抗体を発現させるための哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ細胞)(例えば、R.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621に記載されているようなＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用される、Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む)、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞とともに使用する場合には、別の好適な発現系として、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８,８４１に示されているＧＳ遺伝子発現系がある。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞中に導入する場合、宿主細胞中で抗体を発現させるのに、または宿主細胞を増殖させる培養培地中に抗体を分泌させるのに十分な時間、宿主細胞を培養することにより抗体が産生される。抗体は標準的なタンパク質精製法を用いて培養培地から回収することができる。
【０２３８】
医薬組成物
別の局面において、本発明は、組成物、例えば、本発明の中和抗ＤＫＫ１／４組成物またはその抗原結合部分の１つまたは組合せを含有する、薬学的に許容される担体とともに製剤された医薬組成物を提供する。このような組成物は、本発明の(例えば、２種以上の異なる)抗体、または免疫複合体または二重特異性分子の１つまたは組合せを含み得る。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するかまたは相補的活性を有する抗体(または免疫複合体または二重特異性抗体)の組合せを含み得る。
【０２３９】
本発明の医薬組成物は、また、併用療法、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。
【０２４０】
例えば、併用療法は、本発明の抗ＤＫＫ１抗体を少なくとも１種類の他の抗炎症薬または抗骨粗鬆症薬と組み合わせて含み得る。併用療法で使用可能な治療薬の例は、以下の本発明の抗体の使用についての節でより詳しく記載される。
【０２４１】
本明細書において「薬学的に許容される担体」には、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれ、それらは生理的に適合する。当該担体は、(例えば、注射または注入による)静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与に適しているべきである。投与経路に応じて、有効化合物、すなわち、抗体、免疫複合体または二重特異性分子は、化合物を不活性化し得る酸や他の天然条件の作用から化合物を保護する物質で被覆することもできる。
【０２４２】
本発明の医薬組成物は、１種以上の薬学的に許容される塩を含み得る。「薬学的に許容される塩」は、所望の親化合物の生物活性を保持するが、望ましくない毒性作用を付与しない塩を指す(例えば、Berges, S.M., et al., 1977 J. Pharma. Sci. 66:1-19参照)。このような塩の例として、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩としては、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸などの無毒性の無機酸に由来するもの、ならびに脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの無毒性の有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土金属に由来するもの、ならびにＮ,Ｎ’−ジベンチルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒性の有機アミンに由来するものが含まれる。
【０２４３】
また、本発明の薬剤組成物は薬学的に許容される抗酸化剤を含んでもよい。薬学的に許容される抗酸化剤の例は、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(ＢＨＡ)、ブチル化ヒドロキシトルエン(ＢＨＴ)、レシチン、プロピルガレート、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；およびクエン酸、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤を含む。
【０２４４】
本発明の薬剤組成物に使用することができる好適な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、およびその好適な混合物、オリーブオイルなどの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルを含む。適切な流動性は、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散物の場合には、必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０２４５】
また、これらの組成物は保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含んでもよい。微生物存在の防止は、殺菌手順(同上)ならびに例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの様々な抗菌剤および抗真菌剤の包含により確保することができる。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤を当該組成物に包含させることが望ましい場合がある。さらに、注射剤形の吸収の延長は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる物質を包含させることにより実現することができる。
【０２４６】
薬学的に許容される担体としては、無菌注射溶液または分散液を即時調製するための無菌水溶液または分散液および無菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および物質は当技術分野で公知である。ただし、これまで従来の媒体または薬剤が当該有効化合物と適合しなかったので、本発明の薬剤組成物においてその使用が意図される。補助的な有効化合物もまた、当該組成物中に配合することができる。
【０２４７】
治療用組成物は、一般に、製造および保存条件下で無菌かつ安定でなければならない。当該組成物は、溶液、ミクロエマルション、リポソームまたはその他高濃度の薬物に適した調整構造物として調剤することができる。当該担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、およびその好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散物の場合には、必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、例えば、糖、ポリアルコール(マンニトール、ソルビトールなど)または塩化ナトリウムのような等張化剤を当該組成物に含有させることができる。注射組成物の吸収の延長は、モノステアリン酸アルミニウム塩およびゼラチンなどの吸収を遅らせる物質を組成物に包含させることにより実現することができる。
【０２４８】
無菌注射溶液は、必要量の有効化合物を、必要に応じて上記に述べた成分の１つまたはそれらの組合せとともに適当な溶媒中に配合した後、無菌的精密濾過を行うことにより調製することができる。一般に、分散物は、基本的分散媒と上記に述べたものの中から必要な他の成分を含む無菌ビヒクル中に有効化合物を配合することによって調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、この調製方法は真空乾燥および凍結乾燥(リオフィライゼーション)であり、これにより、有効成分に、事前に無菌濾過した溶液からのあらゆる所望の付加的成分を加えた粉末が得られる。
【０２４９】
単位投与形を作製するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、治療すべき対象と特定の投与様式によって異なる。単位投与形を作製するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に、治療効果をもたらす組成物の量である。一般的に、この量は、１００％のうち、薬学的に許容される担体との組合せ中、有効成分が約０.０１％〜約９９％、約０.１％〜約７０％、または約１％〜約３０％の範囲である。
【０２５０】
投与計画は、所望の最適応答(例えば、治療応答)をもたらすように調整される。例えば、単回のボーラスを投与してもよいし、または経時的に数回の分割量で投与してもよいし、または治療状況の緊急性により指示される場合には、用量を増減してもよい。特に、投与の容易性および投与量の均一性のため、非経口組成物を単位投与形として調剤するのが有利である。本明細書において、単位投与形とは、処置対象に対する単位用量として適した物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と会合させて所望の治療効果をもたらすよう計算された所定量の有効化合物を含む。本発明の単位投与形の仕様は、有効化合物の独自の特徴と達成すべき特定の治療効果、および各個体における治療感受性に関して、このような有効化合物を調剤する技術に固有の限界により規定され、かつ直接的に依存する。
【０２５１】
抗体投与のため、用量は約０.０００１〜２００ｍｇ／ｋｇ、通常には０.０１〜５０ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。例えば、用量は０.３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重であるか、または１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲である。例としての処置計画には、週１回投与、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、月１回、３ヶ月に１回または３〜６ヶ月に１回の投与を伴う。本発明の抗ＤＫＫ１抗体のための投与計画は、静脈投与による１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重を含み、当該抗体は下記の投与スケジュール：４週間おきに６回の後に３か月おき；３週間おき；３ｍｇ／ｋｇ体重を１回の後、３週間おきに１ｍｇ／ｋｇ体重、の１つを用いて与える。
【０２５２】
ある方法では、結合特異性の異なる２種類以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合、投与した各抗体の用量は示した範囲内にある。抗体は通常、複数回投与する。各投与間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３カ月おきまたは１年おきであり得る。患者の標的抗原に対する抗体またはＯＣＮ、ＯＰＧもしくはＰ１ＮＰなどのいくつかの生物マーカーの血中レベルを測定することによって示されるように、間隔は不定期であってもよい。血漿抗体濃度が約１〜１０００μｇ／ｍＬとなるよう用量を調整する方法や約２５〜３００μｇ／ｍＬとなるように調整する方法もある。
【０２５３】
あるいは、抗体は、徐放性製剤として投与することもでき、この場合、投与頻度は少なくてよい。用量と頻度は、患者における抗体の半減期によって異なる。一般に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、次に、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。用量と投与頻度は、その処置が予防なのか治療なのかによって異なり得る。予防的適用では、比較的低用量が比較的低頻度で、長期間投与される。残りの生涯にわたって治療を受け続ける患者もいる。治療的適用では、疾患進行を遅らせるかもしくは停止させるまで、または患者が疾患症状の部分的改善または完全改善を示すまで、比較的高用量を比較的短間隔で必要とする場合がある。その後、患者は、予防計画で投与を受ける。
【０２５４】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の用量レベルは、特定の患者、組成物、および投与様式に対して、患者への毒性なく、所望の治療応答を達成するのに有効な有効成分の量が得られるように変更することができる。選択される用量レベルは、使用する本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用する特定の化合物の排泄速度、処置期間、使用する特定の組成物と併用される他の薬剤、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、健康状態および既往歴を含む様々な薬物動態因子によって異なる。
【０２５５】
本発明の抗ＤＫＫ１抗体の「治療有効量」は、疾患症状の重篤度の低下、疾病の無症候期間の頻度と期間の増加、または疾患に罹患したことによる不全または障害の予防をもたらし得るものである。
【０２５６】
本発明の組成物は、当技術分野で公知の様々な方法の１以上を用い、１以上の投与経路で投与することもできる。当業者には明らかであろうが、投与経路および／または投与様式は、目的とする結果によって異なる。本発明の抗体のための投与経路は、例えば、注射または注入によって、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路を含む。本明細書において「非経口投与」とは、腸および局所投与以外の、通常には注入による投与様式を意味し、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管的、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入が含まれる。
【０２５７】
あるいは、本発明の抗体は、局所、上皮などの非経口経路で、または、例えば、鼻腔内、口腔内、膣内、直腸内、舌下または局所で粘膜投与経路により投与することができる。
【０２５８】
活性化合物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系などの徐放性製剤のような、当該化合物を急速に放出しないよう保護する担体とともに調製することができる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの、生分解性、生体適合性ポリマーも使用可能である。このような製剤の多くの調製方法が特許を得ており、すなわち、当業者に一般に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978参照。
【０２５９】
治療用組成物は、当該技術において公知の医療ディバイスにより投与することができる。例えば、一態様において、本発明の治療用組成物は、米国特許第５,３９９,１６３号、同第５,３８３,８５１号、同第５,３１２,３３５号、同第５,０６４,４１３号、同第４,９４１,８８０号、同第４,７９０,８２４号または同第４,５９６,５５６号に示されているディバイスなどの無針皮下注射ディバイスにより投与することができる。本発明で有用な公知のインプラントおよびモジュールの例は、制御された速度で医薬を分配するためのインプラント可能な微小注入ポンプを示す米国特許第４,４８７,６０３号；皮膚から医薬を投与するための治療ディバイスを示す米国特許第４,４８６,１９４号；精密な注入速度で医薬を送達するための医薬注入ポンプを示す米国特許第４,４４７,２３３号；連続的薬物送達のための流量可変のインプラント可能な注入装置を示す米国特許第４,４４７,２２４号；複数チャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達系を示す米国特許第４,４３９,１９６号；および浸透圧薬物送達系を示す米国特許第４,４７５,１９６号を含む。これらの特許は出典明示により本明細書の一部とされる。他のこのような多くのインプラント、送達系およびモジュールが当業者に公知である。
【０２６０】
ある特定の態様では、in vivoにおいて適切な分布を確保するために本発明のヒトモノクローナル抗体を調剤する。例えば、血液脳関門(ＢＢＢ)は多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢを確実に通過できるようにするためには(所望の場合)、それらを例えばリポソーム中に調剤することができる。リポソームの製造方法については、例えば、米国特許第４,５２２,８１１号、同第５,３７４,５４８号および同第５,３９９,３３１号を参照。当該リポソームは、特定の細胞または器官に選択的に輸送される１以上の部分を含むことができ、それによって標的薬物送達を増進する(例えば、V.V. Ranade, 1989, J. Clin. Pharmacol. 29:685参照)。標的化部分の例は、葉酸またはビオチン(例えば、Lowらの米国特許第５,４１６,０１６号参照)、マンノシド(Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038)、抗体(P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140; M.Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)、界面活性剤プロテインＡ受容体(Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol. 1233:134)、ｐ１２０(Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090)を含む(また、K. Keinanenn; M.L. Laukkanen, 1994 FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Immunomethods 4:273も参照)。
【０２６１】
組合せ
本発明はさらに、哺乳類、特にヒトにおける癌などの増殖性障害または疾患を、
(ａ)中和抗ＤＫＫ１／４組成物と
(ｂ)１以上の薬学的に活性な薬剤
を含む医薬剤の組合せで予防または処置する方法に関する。
【０２６２】
本発明はさらに、
(ａ)中和抗ＤＫＫ１／４組成物と、
(ｂ)薬学的に活性な薬剤と、
(ｃ)薬学的に許容される担体
を含む医薬組成物に関する。
【０２６３】
本発明はさらに、
(ａ)中和抗ＤＫＫ１／４組成物の医薬製剤と、
(ｂ)同時使用、並行使用、個別使用または逐次使用のための薬学的に活性な薬剤の医薬製剤
を含む、市販のパッケージまたは製品に関する。
【０２６４】
薬学的に活性な薬剤
「薬学的に活性な薬剤」とは、作用機序の異なる多くの薬学的に活性な薬剤を包含する幅広い用語である。これらのいくつかとＤＫＫ１／４中和抗体／組成物の組合せは癌療法に改善をもたらし得る。一般に、薬学的に活性な薬剤は作用機序に従って分類される。利用可能な薬剤の多くは種々の腫瘍の発達経路の代謝拮抗剤であるか、または腫瘍細胞のＤＮＡと反応する。トポイソメラーゼＩおよびトポイソメラーゼＩＩなどの酵素を阻害する薬剤、または抗有糸分裂薬もある。
【０２６５】
「薬学的に活性な薬剤」とは、中和抗ＤＫＫ１／４組成物またはその誘導体以外の特に薬学的に活性ないずれの薬剤も意味する。これには限定されるものではないが、
ｉ.アロマターゼ阻害剤；
ｉｉ.抗エストロゲン作用薬、抗アンドロゲン作用薬またはゴナドレリン作用薬；
ｉｉｉ.トポイソメラーゼＩ阻害剤またはトポイソメラーゼＩＩ阻害剤；
ｉｖ.微小管活性剤、アルキル化剤、抗新生物剤、代謝拮抗剤またはプラチン化合物；
ｖ.タンパク質もしくは脂質キナーゼ活性またはタンパク質もしくは脂質ホスファターゼ活性を標的化／低減する化合物、さらなる抗脈管形成化合物または細胞分化プロセスを誘導する化合物；
ｖｉ.モノクローナル抗体；
ｖｉｉ.シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ビスホスホネート、ヘパラナーゼ阻害剤、生物反応修飾物質；
ｖｉｉｉ.Ｒａｓ発癌性イソ型の阻害剤；
ｉｘ.テロメラーゼ阻害剤；
ｘ.プロテアーゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤またはプロテアソーム阻害剤；
ｘｉ.血液性悪性疾患の処置に用いられる薬剤またはＦｌｔ−３の活性を標的化、低減もしくは阻害する化合物；
ｘｉｉ.ＨＳＰ９０阻害剤；
ｘｉｉｉ.抗増殖性の抗体；
ｘｉｖ.ヒストンデアセチラーゼ(ＨＤＡＣ)阻害剤；
ｘｖ.セリン／トレオニンｍＴＯＲキナーゼの活性／機能を標的化、低減または阻害する化合物；
ｘｖｉ.ソマトスタチン受容体アンタゴニスト；
ｘｖｉｉ.抗白血病化合物；
ｘｖｉｉｉ.腫瘍細胞傷害アプローチ；
ｘｉｘ.ＥＤＧ結合剤；
ｘｘ.リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤；
ｘｘｉ.Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ阻害剤；
ｘｘｉｉ.ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲのモノクローナル抗体；
ｘｘｉｉｉ.光線力学療法；
ｘｘｉｖ.脈管形成抑制ステロイド；
ｘｘｖ.コルチコステロイド含有インプラント；
ｘｘｖｉ.ＡＴ１受容体アンタゴニスト；および
ｘｘｖｉｉ.ＡＣＥ阻害剤
が含まれる。
【０２６６】
本明細書において「アロマターゼ阻害剤」は、エストロゲンの産生、すなわち、アンドロステンジオンおよびテストステロンからそれぞれエストロンおよびエストラジオールへの変換を阻害する化合物に関する。この用語には、限定されるものではないが、ステロイド類、特に、アタメスタン、エキセメスタンおよびフォルメスタン；ならびに特に非ステロイド類、特に、アミノグルテチミド、ログレチミド、ピリドグルテチミド、トリロスタン、テストラクトン、ケトコナゾール、ボロゾール、ファドロゾール、アナストロゾールおよびレトロゾールが含まれる。エキセメスタンはＡＲＯＭＡＳＩＮとして；フォルメスタンはＬＥＮＴＡＲＯＮとして；ファドロゾールはＡＦＥＭＡとして；アナストロゾールはＡＲＩＭＩＤＥＸとして；レトロゾールはＦＥＭＡＲＡまたはＦＥＭＡＲとして；また、アミノグルテチミドはＯＲＩＭＥＴＥＮとして市販されている。アロマターゼ阻害剤である薬学的に活性な薬剤を含む本発明の組合せは、例えば乳癌などのホルモン受容体陽性腫瘍の処置に特に有用である。
【０２６７】
本明細書において「抗エストロゲン作用薬」は、そのエストロゲン受容体レベルにおいてエストロゲンの作用に拮抗する化合物に関する。この用語には、限定されるものではないが、タモキシフェン、フルベストラント、ラロキシフェンおよび塩酸ラロキシフェンが含まれる。タモキシフェンは、例えばＮＯＬＶＡＤＥＸなどの市販されている形態で投与することができ、塩酸ラロキシフェンはＥＶＩＳＴＡとして市販されている。フルベストラントは米国特許第４,６５９,５１６号に開示されているように調剤することができ、ＦＡＳＬＯＤＥＸとして市販されている。抗エストロゲン作用薬である薬学的に活性な薬剤を含む本発明の組合せは、例えば乳癌などのエストロゲン受容体陽性腫瘍の処置に特に有用である。
【０２６８】
本明細書において「抗アンドロゲン作用薬」としては、アンドロゲン性ホルモンの生物作用を阻害し得るいずれの物質にも関し、限定されるものではないが、例えば米国特許第４,６３６,５０５号に開示されているように調剤可能なビカルタミド(ＣＡＳＯＤＥＸ)が含まれる。
【０２６９】
本明細書において「ゴナドレリン作用薬」としては、限定されるものではないが、アバレリスク、ゴセレリンおよび酢酸ゴセレリンが含まれる。ゴセレリンは米国特許第４,１００,２７４号に開示されており、ＺＯＬＡＤＥＸとして市販されている。アブレリスクは例えば米国特許第５,８４３,９０１号に開示されているように調剤することができる。
【０２７０】
本明細書において「トポイソメラーゼＩ阻害剤」には、限定されるものではないが、トポテカン、ギマテカン、イリノテカン、カンプトテシアン(camptothecian)およびその類似体、９−ニトロカンプトテシンおよび高分子カンプトテシンコンジュゲートＰＮＵ−１６６１４８(ＷＯ９９／１７８０４の化合物Ａ１)が含まれる。イリノテカンは、例えば商標ＣＡＭＰＴＯＳＡＲとして市販されているような形態で投与することができる。トポテカンは、例えば商標ＨＹＣＡＭＴＩＮとして市販されているような形態で投与することができる。
【０２７１】
本明細書において「トポイソメラーゼＩＩ阻害剤」としては、限定されるものではないが、ドキソルビシン(例えばＣＡＥＬＹＸなどのリポソーム製剤を含む)、ダウノルビシン(例えばＤＡＵＮＯＳＯＭＥなどのリポソーム製剤を含む)、エピルビシン、イダルビシンおよびネモルビシンなどのアントラサイクリン類；ミトキサントロンおよびロソキサントロンなどのアントラキノン類；ならびにエトポシドおよびテニポシドなどのポドフィロトキシン類が含まれる。エトポシドはＥＴＯＰＯＰＨＯＳとして；テニポシドはＶＭ２６−ＢＲＩＳＴＯＬとして；ドキソルビシンはＡＤＲＩＢＬＡＳＴＩＮまたはアドリアマイシンとして；エピルビシンはＦＡＲＭＯＲＵＢＩＣＩＮとして；イダルビシンはＺＡＶＥＤＯＳとして；またミトキサントロンはＮＯＶＡＮＴＲＯＮとして市販されている。
【０２７２】
本明細書において「微小管活性剤」は、微小管安定剤、微小管脱安定剤およびミクロチューブリン重合阻害剤に関し、限定されるものではないが、タキサン類、例えば、パシルタキセル(paciltaxel)およびドセタキセル；ビンカアルカロイド類、例えば、ビンブラスチン、特に硫酸ビンブラスチン；ビンクリスチン、特に硫酸ビンクリスチンおよびビノレルビン；ディスコデルモリド類；コチシン(cochicine)およびそのエポチロンサンド誘導体、例えば、エポチロンＢまたはその誘導体が含まれる。パクリタキセルはタキソールとして；ドセタキセルはタキソテールとして；硫酸ビンブラスチンをＶＩＮＢＬＡＳＴＩＮ  Ｒ.Ｐとして；また、硫酸ビンクリスチンはＦＡＲＭＩＳＴＩＮとして市販されている。また、パクリタキセルのジェネリック型ならびにパクリタキセルの種々の投与形も含まれる。パクリタキセルのジェネリック型としては、限定されるものではないが、塩酸ベタキソロールが含まれる。パクリタキセルの種々の投与形は、限定されるものではないが、ＡＢＲＡＸＡＮＥとして市販されているアルブミンナノ粒子パクリタキセルを含み；ＯＮＸＯＬ、ＣＹＴＯＴＡＸディスコデルモリドは例えば米国特許第５,０１０,０９９号に開示されているようにして得ることができる。また、米国特許第６,１９４,１８１号、ＷＯ９８／１０１２１、ＷＯ９８／２５９２９、ＷＯ９８／０８８４９、ＷＯ９９／４３６５３、ＷＯ９８／２２４６１およびＷＯ００／３１２４７に開示されているエポトリン誘導体も含まれる。特に好ましいのはエポトリンＡおよび／またはＢである。
【０２７３】
本明細書において「アルキル化剤」としては、限定されるものではないが、シクロホスファミド、イフォスファミド、メルファランまたはニトロソ尿素(ＢＣＮＵまたはＧｌｉａｄｅｌ)、またはテモゾールアミド(ＴＥＭＯＤＡＲ)が含まれる。シクロホスファミドは、例えば商標ＣＹＣＬＯＳＴＩＮとして市販されているような形態で、また、イフォスファミドはＨＯＬＯＸＡＮとして市販されているような形態で投与することができる。
【０２７４】
「抗新生物代謝拮抗剤」としては、限定されるものではないが、５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)；カペシタビン；ゲムシタビン；５−アザシチジンおよびデシタビンなどのＤＮＡ脱メチル化剤；メトトレキサート；エダトレキサート；ならびに限定されるものではないが、ペメトレキセドなどの葉酸アンタゴニストが含まれる。カペシタビンは、例えば商標ゼローダとして市販されているような形態で、また、ゲムシタビンはＧＥＭＺＡＲとして市販されているような形態で投与することができる。
【０２７５】
本明細書において「プラチン化合物」としては、限定されるものではないが、カルボプラチン、シスプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、およびＺＤ０４７３などの白金剤が含まれる。カルボプラチンは、例えばＣＡＲＢＯＰＬＡＴとして市販されているような形態で、また、オキサリプラチンはＥＬＯＸＡＴＩＮとして市販されているような形態で投与することができる。
【０２７６】
本明細書において「タンパク質または脂質キナーゼ活性またはタンパク質または脂質ホスファターゼ活性を標的化／低減する化合物、またはさらなる抗脈管形成化合物」としては、限定されるものではないが、タンパク質チロシンキナーゼおよび／またはセリンおよび／またはセロインキナーゼ阻害剤(theroine kinase inhibitor)または脂質キナーゼ阻害剤が含まれ、例えば以下のものがある。
ｉ)血管内皮増殖因子受容体(ＶＥＧＦ)の活性を標的化、低減または阻害する化合物、例えば、ＶＥＧＦの活性を標的化、低減または阻害する化合物、特に、ＶＥＧＦ受容体を阻害する化合物、例えば、限定されるものではないが、７Ｈ−ピロロ[２,３−ｄ]ピリミジン誘導体(ＡＥＥ７８８)；ＢＡＹ４３−９００６；(４−ｔｅｒｔ−ブチル−フェニル)−９４−ピリジン−４−イルメチル−イソキノリン−１−イル)−アミン(ＡＡＬ８８１)などのＷＯ００／０９４９５に開示されているイソルコリン(solcholine)化合物。
ｉｉ)血小板由来増殖因子受容体(ＰＤＧＦＲ)の活性を標的化、低減または阻害する化合物、例えば、ＰＤＧＦＲの活性を標的化、低減または阻害する化合物、特に、ＰＤＧＦ受容体を阻害する化合物、例えば、Ｎ−フェニル−２−ピリミジン−アミン誘導体、例えば、イマチニブ、ＳＵ１０１、ＳＵ６６６８およびＧＦＢ−１１１。
ｉｉｉ)繊維芽細胞増殖因子受容体(ＦＧＦＲ)の活性を標的化、低減または阻害する化合物。
ｉｖ)インスリン様増殖因子受容体１(ＩＧＦ−１Ｒ)の活性を標的化、低減または阻害する化合物、例えば、ＩＧＦ−ＩＲの活性を標的化、低減または阻害する化合物、特に、ＩＧＦ−１Ｒ受容体を阻害する化合物。化合物としては、限定されるものではないが、ＷＯ０２／０９２５９９に開示されている化合物およびその誘導体である４−アミノ−５−フェニル−７−シクロブチル−ピロロ[２,３−ｄ]ピリミジン誘導体(ＡＥＷ５４１)が含まれる。
ｖ)Ｔｒｋ受容体チロシンキナーゼファミリーの活性を標的化、低減または阻害する化合物。
ｖｉ)Ａｘｌ受容体チロシンキナーゼファミリーの活性を標的化、低減または阻害する化合物。
ｖｉｉ)ｃ−Ｍｅｔ受容体の活性を標的化、低減または阻害する化合物。
ｖｉｉｉ)Ｒｅｔ受容体チロシンキナーゼの活性を標的化、低減または阻害する化合物。
ｉｘ)Ｋｉｔ／ＳＣＦＲ受容体チロシンキナーゼの活性を標的化、低減または阻害する化合物。
ｘ)Ｃ−ｋｉｔ受容体チロシンキナーゼ(ＰＤＧＦＲファミリーの一部)の活性を標的化、低減または阻害する化合物、例えば、ｃ−Ｋｉｔ受容体チロシンキナーゼファミリーの活性を標的化、低減または阻害する化合物、特に、ｃ−Ｋｉｔ受容体を阻害する化合物、例えば、イマチニブ。
【０２７７】
ｘｉ)ｃ−Ａｂｌファミリーのメンバーおよびそれらの遺伝子融合産物の活性、例えば、ＢＣＲ−Ａｂｌキナーゼを標的化、低減または阻害する化合物、例えば、ｃ−ＡｂＩファミリーメンバーおよびそれらの遺伝子融合産物の活性を標的化、低減または阻害する化合物、例えば、Ｎ−フェニル−２−ピリミジン−アミン誘導体、例えば、ＰａｒｋｅＤａｖｉｓからのイマチニブ、ＰＤ１８０９７０、ＡＧ９５７、ＮＳＣ６８０４１０またはＰＤ１７３９５５；ＢＭＳ３５４８２５。
ｘｉｉ)タンパク質キナーゼＣ(ＰＫＣ)およびセリン／トレオニンキナーゼのＲａｆファミリーのメンバー、ＭＥＫ、ＳＲＣ、ＪＡＫ、ＦＡＫ、ＰＤＫおよびＲａｓ／ＭＡＰＫファミリーのメンバー、またはＰＩ(３)キナーゼファミリーのメンバー、またはＰＩ(３)−キナーゼ関連キナーゼファミリーのメンバー、および／またはサイクリン依存性キナーゼファミリー(ＣＤＫ)のメンバーの活性を標的化、低減または阻害する化合物、特に、米国特許第５,０９３,３３０号に開示されているスタウロスポリン誘導体、例えば、ミドスタウリン(midostaurin)。さらなる化合物の例としては、例えば、ＵＣＮ−０１；サフィンゴール(safingol)；ＢＡＹ４３−９００６；ブリオスタチン１(Bryostatin 1)；ペリフォシン(Perifosine)；イルモホシン(Ilmofosine)；ＲＯ３１８２２０およびＲＯ３２０４３２；ＧＯ６９７６；Ｉｓｉｓ３５２１；ＬＹ３３３５３１／ＬＹ３７９１９６；イソチノリン(isochinoline)化合物、例えば、ＷＯ００／０９４９５に開示されているもの；ＦＴＩｓ；ＰＤ１８４３５２またはＱＡＮ６９７、Ｐ１３Ｋ阻害剤が含まれる。
ｘｉｉｉ)タンパク質チロシンキナーゼの活性を標的化、低減または阻害する化合物、例えば、メシル酸イマチニブ(ＧＬＥＥＶＥＣ)；チルホスチン(tyrphostin)またはピリミジルアミノベンズアミドおよびその誘導体(ＡＭＮ１０７)。チルホスチンは好ましくは、低分子量(Ｍｒ＜１５００)化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、ベンジリデンマロニトリル種またはＳアリールベンゼンマロニトリルまたは二基質性キノリン種の化合物から選択される化合物、さらに特には、チルホスチンＡ２３／ＲＧ−５０８１０、ＡＧ９９、チルホスチンＡＧ２１３、チルホスチンＡＧ１７４８、チルホスチンＡＧ４９０、チルホスチンＢ４４、チルホスチンＢ４４(＋)鏡像異性体、チルホスチンＡＧ５５５、ＡＧ４９４、チルホスチンＡＧ５５６；ＡＧ９５７およびアダホスチン(adaphostin)(４−｛[(２,５−ジヒドロキシフェニル)メチル]アミノ｝−安息香酸アダマンチルエステル、ＮＳＣ６８０４１０、アダホスチン)からなる群から選択されるいずれかの化合物である。
ｘｉｖ)上皮細胞増殖因子ファミリーの受容体チロシンキナーゼ(ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ホモ二量体またはヘテロ二量体として)の活性を標的化、低減または阻害する化合物、例えば、上皮細胞増殖因子受容体ファミリーの活性を標的化、低減または阻害する化合物、特に、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えば、ＥＧＦ受容体、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４を阻害するか、またはＥＧＦもしくはＥＧＦ関連リガンドと結合する化合物、タンパク質または抗体、特に、全般的かつ具体的にＷＯ９７／０２２６６(例えば実施例３９)、またはＥＰ０５６４４０９、ＷＯ９９／０３８５４、ＥＰ０５２０７２２、ＥＰ０５６６２２６、ＥＰ０７８７７２２、ＥＰ０８３７０６３、米国特許第５,７４７,４９８号、ＷＯ９８／１０７６７、ＷＯ９７／３００３４、ＷＯ９７／４９６８８、ＷＯ９７／３８９８３および特に、ＷＯ９６／３０３４７(例えば、ＣＰ３５８７７４として知られる化合物)、ＷＯ９６／３３９８０(例えば、化合物ＺＤ１８３９)およびＷＯ９５／０３２８３(例えば、化合物ＺＭ１０５１８０、例えば、トラスツズマブ(ヘルセプチン(HERCEPTIN)(登録商標))、セツキシマブ、イレッサ(Iressa)、ＯＳＩ−７７４、ＣＩ  １０３３、ＥＫＢ−５６９、ＧＷ−２０１６、Ｅ１.１、Ｅ２.４、Ｅ２.５、Ｅ６.２、Ｅ６.４、Ｅ２.１１、Ｅ６.３またはＥ７.６.３)に開示されている化合物、タンパク質またはモノクローナル抗体、およびＷＯ０３／０１３５４１に開示されている７Ｈ−ピロロ−[２,３−ｄ]ピリミジン誘導体、エルロチニブ(erlotinib)およびゲフィチニブ(gefitinib)。エルロチニブは例えばＴＡＲＣＥＶＡなどの市販されているような形態で投与することができ、ゲフィチニブは、ＡＢＸ−ＥＧＦＲを含む上皮細胞増殖因子受容体に対するヒトモノクローナル抗体であるイレッサとして投与することができる。
ｘｖ)セリン／セロニンｍＴＯＲキナーゼの活性／機能を標的化、低減または阻害する化合物、特に、ｍＴＯＲキナーゼファミリーのメンバーを標的化／阻害する化合物、タンパク質または抗体、例えば、ＲＡＤ、ＲＡＤ００１、ＣＣＩ−７７９、ＡＢＴ５７８、ＳＡＲ５４３、ラパマイシンおよびその誘導体／類似体、AriadからのＡＰ２３５７３およびＡＰ２３８４１、エベロリムス(everolimus)(ＣＥＲＴＩＣＡＮ)およびシロリムス(sirolimus)。ＣＥＲＴＩＣＡＮ(エベロリムス、ＲＡＤ)は、Ｔ細胞および血管平滑筋細胞の増殖を妨げる研究中の新規な増殖シグナル阻害剤である。
【０２７８】
抗体という場合には、完全なモノクローナル抗体、ナノボディー、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全抗体からなる多重特異性抗体、および所望の生物活性を示す限り抗体フラグメントを含む。
【０２７９】
本明細書において「タンパク質または脂質ホスファターゼの活性を標的化、低減または阻害する化合物」とは、限定されるものではないが、ホスファターゼ１、ホスファターゼ２Ａ、ＰＴＥＮまたはＣＤＣ２５の阻害剤、例えば、オカダ酸またはその誘導体が含まれる。
【０２８０】
本明細書において「モノクローナル抗体」とは、限定されるものではないが、ベバシズマブ(bevacizumab)、セツキシマブ(cetuximab)、トラスツズマブ(trastumab)、イブリツモマブチウキセタン(Ibritumomab tiuxetan)、デノスマブ(denosumab)、抗ＣＤ４０、抗ＧＭ−ＣＳＦ、およびトシツモマブ(tositumomab)およびヨウ素Ｉ１３１が含まれる。ベバシズマブは例えばＡＶＡＳＴＩＮなどの市販されているような形態で投与することができ；セツキシマブはＥＲＢＩＴＵＸとして；トラスツズマブはＨＥＲＣＥＰＴＩＮとして；リツキシマブはＭＡＢＴＨＥＲＡとして；イブリツモマブチウキセタンはＺＥＶＵＬＩＮとして；抗ＲＡＮＫＬはデノスマブ(ＡＭＧ１６２)として；抗ＣＤ４０はＨＣＤ１２２(米国特許出願２００２−０１０６３７１)として；トシツモマブおよびヨウ素Ｉ１３１はＢＥＸＸＡＲとして投与することができる。
【０２８１】
「さらなる抗脈管形成化合物」としては、限定されるものではないが、それらの活性に関して別の機構を有する、例えば、タンパク質または脂質キナーゼ阻害とは無関連の化合物、例えば、サリドマイド(THALOMID)およびＴＮＰ−４７０が含まれる。
【０２８２】
本明細書において「細胞分化プロセスを誘導する化合物」とは、限定されるものではないが、レチノイン酸、α−、γ−もしくはδ−トコフェロール、またはα−、γ−もしくはδ−トコトリエノールが含まれる。
【０２８３】
本明細書において「シクロオキシゲナーゼ阻害剤」としては、限定されるものではないが、例えば、Ｃｏｘ−２阻害剤、５−アルキル置換２−アリールアミノフェニル酢酸および誘導体、例えば、セレコキシブ(celecoxib)(SELEBREX)、ロフェコキシブ(rofecoxib)(VIOXX)、エトリコキシブ(etricoxib)、バルデコキシブ(valdecoxib)または５−アルキル−２−アリールアミノフェニル酢酸、例えば、５−メチル−２−(２’−クロロ−６’−フルオロアニリノ)フェニル酢酸、ルミラコキシブ(lumiracoxib)が含まれる。
【０２８４】
本明細書において「ビスホスホネート」としては、限定されるものではないが、エトリドン酸(etridonic)、クロドロン酸、チルドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、イバンドロン酸、リセドロン酸およびゾレンドロン酸が含まれる。「エトリドン酸(etridonic acid)」は、例えば、DIDRONELなどの市販されているような形態で投与することができ；「クロドロン酸」はBONEFOSとして；「チルドロン酸」はSKELIDとして、「パミドロン酸」はAREDIAとして；「アレンドロン酸」はFOSAMAXとして；「イバンドロン酸」はBONDRANATとして；「リセドロン酸」はACTONELとして；また、「ゾレンドロン酸」はゾメタとして投与することができる。
【０２８５】
本明細書において「ヘパラナーゼ阻害剤」とは、ヘパリン硫酸の分解を標的化、低減または阻害する化合物を指す。この用語には、限定されるものではないが、ＰＩ８８が含まれる。
【０２８６】
本明細書において「生物反応修飾物質」としては、限定されるものではないが、リンホカインまたはインターフェロン、例えば、インターフェロンγが含まれる。
【０２８７】
本明細書において「Ｒａｓ発癌性イソ型の阻害剤」は、限定されるものではないが、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−ＲａｓまたはＮ−Ｒａｓを含み、本明細書においては、Ｒａｓの発癌活性を標的化、低減または阻害する化合物、例えば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤(ＦＴＩ)、例えば、Ｌ−７４４８３２、ＤＫ８Ｇ５５７またはＲ１１５７７７(ZARNESTRA)を指す。
【０２８８】
本明細書において「テロメラーゼ阻害剤」としては、限定されるものではないが、テロメラーゼの活性を標的化、低減または阻害する化合物が含まれる。テロメラーゼの活性を標的化、低減または阻害する化合物は特にテロメラーゼ受容体を阻害する化合物、例えば、テロメスタチン(telomestatin)である。
【０２８９】
本明細書において「マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤」または(ＭＭＰ阻害剤)としては、限定されるものではないが、コラーゲンペプチドミメティックおよび非ペプチドミメティック阻害剤；テトラサイクリン誘導体、例えば、ヒドロキサメートペプチドミメティック阻害剤バチマスタット(batimastat)；およびその経口により生体利用可能な類似体マリマスタット(marimastat)(BB-2516)、プリノマスタット(prinomastat)(AG3340)、メタスタット(metastat)(NSC683551)ＢＭＳ２７９２５１、ＢＡＹ１２−９５６６、ＴＡＡ２１１、ＭＭＩ２７０ＢまたはＡＡＪ９９６が含まれる。
【０２９０】
本明細書において「メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤」としては、限定されるものではないが、メチオニンアミノペプチダーゼ化合物の活性を標的化、低減または阻害する化合物が含まれる。メチオニンアミノペプチダーゼ化合物の活性を標的化、低減または阻害する化合物としては、例えば、ベンガミド(bngamide)またはその誘導体がある。
【０２９１】
本明細書において「プロテアソーム阻害剤」としては、プロテオソームの活性を標的化、低減または阻害する化合物が含まれる。プロテオソームの活性を標的化、低減または阻害する化合物としては、限定されるものではないが、ＰＳ−３４１、ＭＬＮ３４１、ボルテゾミブ(bortezomib)またはベルケード(Velcade)が含まれる。
【０２９２】
本明細書において「血液性悪性疾患の処置に用いられる薬剤」としては、限定されるものではないが、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ受容体(Ｆｌｔ−３Ｒ)の活性を標的化、低減または阻害する化合物；インターフェロン、１−ｂ−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン(ａｒａ−ｃ)およびビスルファン(bisulfan)；およびＡＬＫ阻害剤、例えば、未分化リンパ腫キナーゼを標的化、低減または阻害する化合物が含まれる。
【０２９３】
本明細書において「Ｆｌｔ−３の活性を標的化、低減または阻害する化合物」としては、限定されるものではないが、Ｆｌｔ−３を阻害する化合物、タンパク質または抗体、例えば、Ｎ−ベンゾイル−スタウロスポリン、ミドスタウリン(midostaurin)、スタウロスポリン(staurosporine)誘導体、ＳＵ１１２４８およびＭＬＮ５１８が含まれる。
【０２９４】
本明細書において「ＨＳＰ９０阻害剤」としては、限定されるものではないが、ＨＳＰ９０の内因性アデノシン三リン酸分解酵素活性を標的化、低減または阻害する化合物；ユビキチンプロテオソーム経路を介してＨＳＰ９０クライエントタンパク質を分解、標的化、低減または阻害する化合物が含まれる。ＨＳＰ９０の内因性アデノシン三リン酸分解酵素活性を標的化、低減または阻害する化合物としては、特に、ＨＳＰ９０のアデノシン三リン酸分解酵素活性を阻害する化合物、タンパク質または抗体、例えば、１７−アリルアミノ、１７−デメトキシゲルダナマイシン(１７ＡＡＧ)、ゲルダナマイシン誘導体；他のゲルダナマイシン関連化合物；ラディシコール(radicicol)およびＨＤＡＣ阻害剤がある。
【０２９５】
本明細書において「抗増殖性の抗体」としては、限定されるものではないが、トラスツズマブ(trastuzumab)(ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ)、トラスツズマブ−ＤＭ１、エルロチニブ(erlotinib)(TARCEVA)、ベバシズマブ(bevacizumab)(AVASTIN)、リツキシマブ(rituximab)(RITUXAN)、ＰＲＯ６４５５３(抗ＣＤ４０)および２Ｃ４抗体が含まれる。抗体とは、例えば、完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全抗体からなる多重特異性抗体、および所望の生物活性を示す限り抗体フラグメントを含む。
【０２９６】
本明細書において「ＨＤＡＣ阻害剤」とは、ヒストンデアセチラーゼを阻害し、抗増殖活性を有する化合物に関する。これには限定されるものではないが、ＷＯ０２／２２５７７に開示されている化合物、特に、Ｎ−ヒドロキシ−３−[４−[[(２−ヒドロキシエチル)[２−(１Ｈ−インドール−３−イル)エチル]−アミノ]メチル]フェニル]−２Ｅ−２−プロペンアミド、およびＮ−ヒドロキシ−３−[４−[[[２−(２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル)−エチル]−アミノ]メチル]フェニル]−２Ｅ−２−プロペンアミドおよびその薬学的に許容される塩(ＬＢＨ５８９)が含まれる。さらに特に、スベロイルアニリドヒドロキサム酸(ＳＡＨＡ)；[４−(２−アミノ−フェニルカルバモイル)−ベンジル]−カルバミン酸ピリジン−３−イルメチルエステルおよびその誘導体；酪酸、ピロキシアミド、トリコスタチンＡ(trichostatin A)、オキサムフラチン(Oxamflatin)、アピシジン(apicidin)、デプシペプチド(Depsipeptide)；デプデシン(depudecin)およびトラポキシン(trapoxin)も含まれる。
【０２９７】
本明細書において「セリン／セロニン(theronine)ｍＴＯＲキナーゼの活性／機能を標的化、低減または阻害する化合物」としては、限定されるものではないが、ｍＴＯＲキナーゼファミリーのメンバーを標的化／阻害する化合物、タンパク質または抗体、例えば、ＲＡＤ、ＲＡＤ００１、ＣＣＩ−７７９、ＡＢＴ５７８、ＳＡＲ５４３、ラパマイシンおよびその誘導体／類似体、AriadからのＡＰ２３５７３およびＡＰ２３８４１、エベロリムス(everolimus)(ＣＥＲＴＩＣＡＮ)およびシロリムス(sirolimus)(ＲＡＰＡＭＵＮＥ)、ＣＣＩ−７７９およびＡＢＴ５７８が含まれる。ＣＥＲＴＩＣＡＮ(エベロリムス、ＲＡＤ)は、Ｔ細胞および血管平滑筋細胞の増殖を妨げる研究中の新規な増殖シグナル阻害剤である。
【０２９８】
本明細書において「ソマトスタチン受容体アンタゴニスト」としては、限定されるものではないが、ソマトスタチン受容体を標的化、低減または阻害する薬剤、例えば、オクトレオリド(octreoride)およびＳＯＭ２３０が含まれる。
【０２９９】
本明細書において「抗白血病化合物」としては、限定されるものではないが、デオキシシチジンの２’−α−ヒドロキシリボース(アラビノシド)誘導体であるピリミジン類似体Ａｒａ−Ｃが含まれる。また、ヒポキサンチンのプリン類似体である６−メルカプトプリン(６−ＭＰ)およびリン酸フルダラビンシチジンも含まれる。
【０３００】
「腫瘍細胞傷害アプローチ」とは、電離放射線療法などのアプローチを指す。前記および後記でいう「電離放射線療法」とは、Ｘ線およびγ線などの電磁線か、またはα、βおよびγ粒子などの粒子のいずれかとして生じる電離放射線療法を意味する。電離放射線療法は限定されるものではないが、放射線療法で提供され、当技術分野で公知である。Hellman, Cancer, 4th Edition, Vol. 1, Devita et al., Eds., pp. 248-275 (1993)参照。
【０３０１】
本明細書において「ＥＤＧ結合剤」としては、限定されるものではないが、ＦＴＹ７２０などのリンパ球の再循環を調節する免疫抑制薬の一種が含まれる。
【０３０２】
本明細書において「リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤」としては、限定されるものではないが、ピリミジンまたはプリンヌクレオシド類似体、限定されるものではないが、フルダラビンおよび／またはａｒａ−Ｃなど；６−チオグアニン；５−ＦＵ；クラドリビン(cladribine)；６−メルカプトプリン、特に、ＡＬＬに対するａｒａ−Ｃと組み合わせたもの；および／またはペントスタチンが含まれる。リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤は、特に、ヒドロキシ尿素または２−ヒドロキシ−１Ｈ−イソインドール−１,３−ジオン誘導体、例えば、ＰＬ−１、ＰＬ−２、ＰＬ−３、ＰＬ−４、ＰＬ−５、ＰＬ−６、ＰＬ−７またはＰＬ８である。Nandy et al., Acta Oncologica, Vol. 33, No. 8, pp. 953-961 (1994)参照。
【０３０３】
本明細書において「Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ阻害剤」としては、限定されるものではないが、米国特許第５,４６１,０７６号に開示されている化合物が含まれる。
【０３０４】
本明細書において「ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲのモノクローナル抗体」としては、限定されるものではないが、ＷＯ９８／３５９５８に開示されている化合物、例えば、１−(４−クロロアニリノ)−４−(４−ピリジルメチル)フタラジンまたはその薬学的に許容される塩、例えば、コハク酸塩、またはＷＯ００／０９４９５、ＷＯ００／２７８２０、ＷＯ００／５９５０９、ＷＯ９８／１１２２３、ＷＯ００／２７８１９およびＥＰ０７６９９４７に開示されている化合物；Prewett et al., Cancer Res, Vol. 59, pp. 5209−5218 (1999); Yuan et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 93, pp. 14765-14770 (1996); Zhu et al., Cancer Res, Vol. 58, pp. 3209-3214 (1998);およびMordenti et al., Toxicol Pathol, Vol. 27, No. 1, pp. 14-21 (1999)、ＷＯ００／３７５０２およびＷＯ９４／１０２０２に記載されているもの；O’Reilly et al., Cell, Vol. 79, pp. 315-328 (1994)により記載されているアンギオスタチン(ANGIOSTATIN)；O’Reilly et al., Cell, Vol. 88, pp. 277-285 (1997)により記載されているエンドスタチン；アントラニル酸アミド；ＺＤ４１９０；ＺＤ６４７４；ＳＵ５４１６；ＳＵ６６６８；ベバシズマブ；または抗ＶＥＧＦ抗体または抗ＶＥＧＦ受容体抗体、例えば、ｒｈｕＭＡｂおよびＲＨＵＦａｂ；ＶＥＧＦアプタマー、例えば、Macugon；ＦＬＴ−４阻害剤；ＦＬＴ−３阻害剤；ＶＥＧＦＲ−２  ＩｇＧ１抗体；Angiozyme(RPI 4610)；およびAvastanが含まれる。
【０３０５】
本明細書において「光線力学療法」とは、癌を治療または予防するための光増感剤としても知られるある種の化学物質を使用する療法を指す。光線力学療法の例は、限定されるものではないが、例えば、ＶＩＳＵＤＹＮＥおよびポルフィマーナトリウムなどの薬剤による処置を含む。
【０３０６】
本明細書において「脈管形成抑制ステロイド」としては、限定されるものではないが、脈管形成を遮断または阻害する薬剤、例えば、アネコルタブ(anecortave)、トリアムシノロン(triamcinolone)、ヒドロコルチゾン、１１−α−エピヒドロコルチゾール、コルテキソロン(cortexolone)、１７α−ヒドロキシプロゲステロン、コルチコステロン、デオキシコルチコステロン、テストステロン、エストロンおよびデキサメタゾンが含まれる。
【０３０７】
本明細書において「コルチコステロイド含有インプラント」としては、限定されるものではないが、例えば、フルオシノロン(fluocinolone)およびデキサメタゾン(dexamethasone)などの薬剤が含まれる。
【０３０８】
本明細書において「ＡＴ１受容体アンタゴニスト」としては、限定されるものではないが、ＤＩＯＶＡＮなどの薬剤が含まれる。
【０３０９】
本明細書において「ＡＣＥ阻害剤」としては、限定されるものではないが、ＣＩＢＡＣＥＮ、ベナゼプリル(benazepril)、エナゼプリル(enazepril)(ＬＯＴＥＮＳＩＮ)、カプトプリル(captopril)、エナラプリル(enalapril)、フォシノプリル(fosinopril)、リシノプリル(lisinopril)、モエキシプリル(moexipril)、キナプリル(quinapril)、ラミプリル(ramipril)、ペリノドプリル(perindopril)およびトランドラプリル(trandolapril)が含まれる。
【０３１０】
他の薬学的に活性な薬剤としては、限定されるものではないが、植物アルカロイド、ホルモン剤およびアンタゴニスト、生物反応修飾物質、好ましくは、リンホカインまたはインターフェロン、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体；または種々雑多な薬剤、もしくは他の作用機序または未知の作用機序の薬剤が含まれる。
【０３１１】
特に個々の化合物のクレームおよびその中の実施例の最終生成物に関して、特許出願または化学刊行物の引例が示されている各場合において、主要な最終生成物、医薬製剤およびクレームは出典明示により本明細書の一部とされる。同様に、そこに開示されている、対応する立体異性体ならびに対応する結晶変態、例えば、溶媒和物および多型も含まれる。本明細書に開示される組合せで有効成分として用いられる化合物は、それぞれ引用されている文献に記載されているように調製および投与することができる。
【０３１２】
コード番号、一般名または商標により識別される活性剤の構造は、標準的な大要「The Merck Index」の現行版またはデータベース、例えば、Patents International、例えば、IMS World Publicationsまたは以上および以下に述べられている刊行物から入手することができる。対応するその内容は出典明示により本明細書の一部とされる。
【０３１３】
成分(ａ)および(ｂ)という場合にはそのいずれの有効物質の薬学的に許容される塩も含むことを意味すると理解される。成分(ａ)および／または(ｂ)からなる有効物質が例えば少なくとも１つの塩基中心を有する場合、それらは酸付加塩を形成することができる。また、所望により付加的に存在する塩基中心を有する対応する酸付加塩も形成可能である。酸性基、例えばＣＯＯＨを有する有効物質は塩基を伴って塩を形成することができる。成分(ａ)および／または(ｂ)からなる有効物質またはその薬学的に許容される塩はまた水和物の形態で使用することもでき、あるいは結晶化に用いられる他の溶媒を含むこともできる。
【０３１４】
よって、第１の局面において、本発明は、哺乳類、好ましくはヒト患者における持続的脈管形成により誘発される増殖性疾患または障害の予防処置のための方法に関し、その方法は患者を薬学的に有効な量の、
(ａ)中和抗ＤＫＫ１／４組成物と
(ｂ)薬学的に活性な薬剤
との組合せで同時または逐次処置することを含む。
【０３１５】
好ましい態様において、本発明は、
(ａ)中和抗ＤＫＫ１／４組成物と、
(ｂ)アロマターゼ阻害剤；抗エストロゲン作用薬；抗アンドロゲン作用薬；ゴナドレリン作用薬；トポイソメラーゼＩ阻害剤；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤；微小管活性剤；アルキル化剤；抗新生物性代謝拮抗剤；プラチン化合物；タンパク質もしくは脂質キナーゼ活性またはタンパク質もしくは脂質ホスファターゼ活性を標的化／低減する化合物、抗脈管形成化合物；細胞分化プロセスを誘導する化合物；モノクローナル抗体；シクロオキシゲナーゼ阻害剤；ビスホスホネート；ヘパラナーゼ阻害剤；生物反応修飾物質；Ｒａｓ発癌性イソ型の阻害剤；テロメラーゼ阻害剤；プロテアーゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤；プロテアソーム阻害剤；Ｆｌｔ−３の活性を標的化、低減または阻害する薬剤；ＨＳＰ９０阻害剤；抗増殖性の抗体；ＨＤＡＣ阻害剤；セリン／セロニン(theronine)ｍＴＯＲキナーゼの活性／機能を標的化、低減または阻害する化合物；ソマトスタチン受容体アンタゴニスト；抗白血病化合物；腫瘍細胞傷害アプローチ；ＥＤＧ結合剤；リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤；Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ阻害剤；ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲのモノクローナル抗体；光線力学療法；脈管形成抑制ステロイド；コルチコステロイド含有インプラント；ＡＴ１受容体アンタゴニスト；およびＡＣＥ阻害剤からなる群から選択される１以上の薬学的に活性な薬剤
を含む、医薬製剤を提供する。
【０３１６】
成分(ａ)および(ｂ)の組合せ、これらの２成分を投与することを含む温血動物の処置方法、同時使用、個別使用または逐次使用のためのこれらの２成分を含む医薬組成物、増殖性疾患の進行の遅延もしくは処置のため、またはこれらの目的の医薬製剤の製造のための該組合せの使用、またはこのような成分(ａ)と(ｂ)の組合せを含む市販製品(全て上述または上記で定義される通り)は以下、本発明の組合せとも呼ぶ(従って、この用語は、適当であれば、この用語をそのように置き換えることができるこれらの態様の各々を指す)。
【０３１７】
同時投与は、例えば、２以上の有効成分の１つの定まった組合せの形態で、または独立に調剤された２以上の有効成分を同時に投与することにより行うことができる。逐次使用(投与)は好ましくは、ある時点での組合せの１つ(または１以上)の成分の投与と異なる時点での他の成分の投与、すなわち、長期間の交互投与を意味し、その結果好ましくは、この組合せは単独成分の独立投与よりも高い有効性を示す(特に相乗効果を示す)。個別使用(投与)は好ましくは、異なる時点での組合せ成分の互いに独立の投与を意味し、好ましくは、成分(ａ)と(ｂ)が、両成分の測定可能な血中レベルの重複が、重複する様式では(同時には)存在しないことを意味する。
【０３１８】
また、２以上の逐次、個別および同時投与の組合せも可能であり、好ましくは、その結果、この組合せ成分薬は、その組合せ成分薬が、それらの治療有効性に対して相互作用が見られないほど長い間隔で独立に使用される場合に見られる作用を超える共同治療効果を示す(相乗効果が特に好ましい)。
【０３１９】
本明細書において「進行の遅延」とは、処置される疾病の最初の徴候または再発の前段階または初期段階にある患者、例えば対応する疾病の前形態が診断される患者、または例えば医療処置中の状態もしくは対応する疾病が発症するおそれのある偶発症候の結果起こる状態にある患者に対する組合せの投与を意味する。
【０３２０】
「共同治療活性」または「共同治療効果」は、当該化合物が、それらが好ましくは処置される温血動物、特にヒトにおいてなお(好ましくは相乗的)相互作用(共同治療効果)を示すような時間間隔で個別に(長期交互様式、特に、順序特異的様式で)与え得ることを意味する。これがその場合であるかどうかは、とりわけ血中レベルを追跡することにより決定することができ、両化合物が少なくとも一定期間、処置されるヒトの血中に存在することを示す。
【０３２１】
「薬学的に有効」とは、好ましくは、増殖性疾患の進行に対して治療上、または広義には予防上有効である量に関する。
【０３２２】
本明細書において「市販パッケージ」または「製品」は、特に、上記で定義される成分(ａ)と(ｂ)が独立に、または異なる量の成分(ａ)と(ｂ)を含む種々の一定組合せの使用により、すなわち、同時にまたは異なる時点で投与可能であるという意味において「パーツキット」を定義する。さらに、これらの用語は、成分(ａ)と(ｂ)を有効成分として含む(特に組み合わせた)市販パッケージを、増殖性疾患の進行の遅延におけるその同時使用、逐次使用(好ましくは長期交互の時間指定順序)または(好ましいとは言えないが)個別使用に関する使用説明書とともに含む。よって、当該パーツキットの各パーツは例えば、同時、または長期交互、すなわち、パーツキットの各パーツに関して異なる時点で、等時間間隔または異なる時間間隔で投与することができる。極めて好ましくは、この時間間隔は、各パーツの併用において処置される疾病に対する効果がこれらの組合せ相手(ａ)および(ｂ)のいずれか一方のみの使用により得られる効果よりも大きくなるように(標準的方法に従って判定できる)選択される。組合せ製剤における組合せ相手(ａ)と組合せ相手(ｂ)の投与総量の比は、例えば、処置される患者の部分集団の必要または単独の患者の必要に見合うように変更可能であり、この必要の違いは、特定の疾病、患者の年齢、性別、体重などによるものであり得る。好ましくは、少なくとも１つの有益な作用、例えば、組合せ相手(ａ)と(ｂ)の効果の相互増強、特に、相加的効果よりも高い効果があり、ゆえに、組み合わせずに個々の薬剤だけで処置した場合の許容可能なものよりもそれぞれこれら組合せ薬の各々の低用量で達成され、例えば副作用の低減などのさらなる有利な効果、または組合せ相手(成分)(ａ)と(ｂ)の一方または双方の非有効用量における組合せ治療効果、極めて好ましくは組合せ相手(ａ)と(ｂ)の強力な相乗効果をもたらす。
【０３２３】
成分(ａ)と(ｂ)の組合せの使用および市販パッケージの使用の双方の場合、同時使用、逐次使用および個別使用のいずれの組合せも可能であり、これは成分(ａ)と(ｂ)が一時点で同時に投与した後、後の時点で宿主毒性のより低い一方の成分のみを、例えば１日量を３〜４週間を超えるような長期にわたって投与し、その後、他方の成分を投与するか、またはさらにその後の時点で両成分の組合せを投与する(引き続いて、最適な抗腫瘍作用のための薬物組合せ治療コースを行う)などが可能である。
【０３２４】
本発明の組合せはまた、例えば外科的介入、温熱療法および／または放射線療法などの他の処置との組合せにも適用することができる。
【０３２５】
本発明の医薬組成物は常法によって調製することができ、ヒトを含む哺乳類含むに対する経口または直腸などの腸内投与、および非経口投与に好適なものであり、治療上有効な量のＶＥＧＦ阻害剤と少なくとも１つの薬学的に活性な薬剤単独、または１以上の薬学的に許容される担体との組合せ、特に腸内適用もしくは非経口適用に好適なものを含む。
【０３２６】
医薬組成物は約０.００００２〜約１００％、特に例えば即使用可能な注入希釈液の場合には０.０００１〜０.０２％、または例えば注射もしくは注入用濃縮物または特に非経口製剤の場合には約０.１％〜約９５％、好ましくは約１％〜約９０％、より好ましくは約２０％〜約６０％の有効成分(各場合ｗ／ｗ)を含む。本発明の医薬組成物は例えば、アンプル、バイアル、糖衣錠、錠剤、点滴バッグまたはカプセルの形態などの単位投与形であり得る。
【０３２７】
本発明の処方物に使用される各組合せ相手の有効用量は、使用する特定の化合物または医薬組成物、投与様式、処置される状態および処置される状態の重篤度によって異なり得る。熟練の医師、臨床医または獣医であれば、その状態を予防、治療または進行を抑制するのに必要な各有効成分の有効量を容易に決定することができる。
【０３２８】
チルホスチン、特に、アダホスチンは好ましくは、温血動物、特にヒトに、約１〜６０００ｍｇ／日、より好ましくは２５〜５０００ｍｇ／日、最も好ましくは５０〜４０００ｍｇ／日の範囲の用量で投与される。特に断りのない限り、化合物は好ましくは１日に５回まで、特に１〜４回投与される。
【０３２９】
腸内または非経口投与を目的とする併用療法のための医薬製剤は、例えば、糖衣錠、カプセル剤または坐剤およびさらにはアンプルなどの単位投与形である。特に断りのない限り、これらの処方物は常法、例えば、通常の混合、造粒、糖衣、溶解または凍結乾燥プロセスにより調製される。必要な有効量は複数の用量単位の投与により達成することができるので、各投与形の個々の用量中に含まれる組合せ相手の単位含量はそれ自体で有効量を構成する必要はないと考えられる。当業者であれば、組合せ相手の適当な薬学的有効量を決定することができる。
【０３３０】
好ましくは、当該化合物またはその薬学的に許容される塩は、錠剤、カプセル剤もしくはシロップ剤の形態で経口医薬製剤として、または適当であれば非経口注射剤として投与される。
【０３３１】
経口投与用組成物を調製する場合、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存剤、着色剤などのいずれの薬学的に許容される媒体を用いてもよい。薬学的に許容される担体は、デンプン、糖類、微晶質セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤を含む。
【０３３２】
有効成分の溶液、また、懸濁液、特に、等張水溶液または懸濁液は、有効成分の非経口投与に有用であり、例えば、有効成分単独をまたは例えばマンニトールなどの薬学的に許容される担体とともに含む凍結乾燥組成物の場合、このような溶液または懸濁液は使用前に作製することができる。当該医薬組成物は滅菌可能であり、かつ／または例えば保存剤、安定剤、湿潤剤および／または乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調整するための塩および／またはバッファーなどの賦形剤を含むことができ、例えば通常の溶解または凍結乾燥プロセスなどの、それ自体既知の方法で調製される。これらの溶液または懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンなどの増粘物質を含んでもよい。油中の懸濁液は油成分として注射用に慣例の植物油、合成油または半合成油を含む。
【０３３３】
等張化剤は、例えばマンニトール、デキストロース、グルコースおよび塩化ナトリウムなど、当技術分野で公知のもののいずれから選択してもよい。注入処方物は水性媒体で希釈可能である。希釈剤として使用する水性媒体の量は輸液中の有効成分の所望の濃度に応じて選択する。輸液は抗酸化剤など、静脈投与される処方物中に汎用される他の賦形剤を含んでもよい。
【０３３４】
本発明はさらに、本明細書において、上記に定義された組合せ相手(ａ)と(ｂ)が独立に、または量の異なる組合せ相手(ａ)と(ｂ)を含む種々の一定組合せの使用により、すなわち同時または異なる時点で投与することができるという意味において特に「パーツキット」を定義する「組合せ製剤」に関する。次に、このパーツキットの各パーツは、例えば同時にまたは長期で交互に、すなわち、そのパーツキットも各パーツに関して異なる時点で、等時間間隔または異なる時間間隔で投与することができる。組合せ製剤における組合せ相手(ａ)と組合せ相手(ｂ)の投与総量の比は、例えば、患者が受ける副作用の重篤度に基づき、処置される患者の部分集団の必要または単独の患者の必要に見合うように変更可能である。
【０３３５】
本発明の使用および方法
本発明の抗体(ならびに免疫複合体および二重特異性分子)はin vitroおよびin vivoで診断上および治療上有用である。例えば、これらの分子は、例えばin vitroまたはin vivoにおいて培養細胞に、あるいは例えばin vivoにおいて対象に投与して種々の障害を治療、予防または診断することができる。本明細書において「対象」とは、ヒトおよび非ヒト動物を含むものとする。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類および非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類および爬虫類を含む。当該方法はＤＫＫ１発現に関連する障害を有するヒト患者を処置するのに特に好適である。ＤＫＫ１に対する抗体が別の薬剤とともに投与される場合、この２つは順次または同時のいずれかで投与することができる。
【０３３６】
一態様では、本発明の抗体(ならびに免疫複合体および二重特異性分子)は、ＤＫＫ１のレベルまたはＤＫＫ１を含む細胞のレベルを検出するために使用することができる。これは例えば、サンプル(in vitroサンプルなど)および対照サンプルを抗ＤＫＫ１抗体と、その抗体とＤＫＫ１間の複合体の形成を可能とする条件下で接触させることにより行うことができる。抗体とＤＫＫ１間で形成された複合体を検出し、サンプルと対照で比較する。限定されるものではないが、例えばＥＬＩＳＡ、ＭＡＬＤＩおよびフローサイトメトリーアッセイなどの当技術分野で周知の標準的検出法を、本発明の組成物を用いて行うことができる。
【０３３７】
よって、一局面において、本発明はさらに、サンプル中のＤＫＫ１(例えばヒトＤＫＫ１抗原)の存在を検出するか、またはＤＫＫ１量を測定する方法を提供し、その方法は、サンプルおよび対照サンプルをＤＫＫ１と特異的に結合する本発明の抗体またはその抗原結合部分と、その抗体またはその一部とＤＫＫ１間で複合体の形成を可能とする条件下で接触させることを含む。その後、この複合体の形成を検出し、サンプルと対照サンプルとの複合体の形成の違いがサンプル中のＤＫＫ１存在の指標となる。
【０３３８】
また、本発明の組成物(例えば、抗体、ヒト抗体、免疫複合体および二重特異性分子)と使用説明書からなるキットも本発明の範囲内にある。当該キットはさらに少なくとも１種類の付加的試薬または本発明の１以上の付加的抗体(例えば、第一の抗体とは異なる標的抗原上のエピトープと結合する相補的活性を有する抗体)を含むことができる。キットは一般に、キットの内容の意図した目的を示したラベルを含む。ラベルとは、キット上またはキットとともに供給されるか、他の方法でキットに付随する書類、または記録材料を含む。
【０３３９】
本発明を詳しく述べてきたが、以下の実施例および特許請求の範囲でさらに本発明を説明する。なお、これらは例示であり、さらなる限定を意味するものではない。当業者であれば、慣例の試験のみと本明細書に記載の特定の手順に対する多くの等価なものを用いて確認することを認識するか、または確認することが可能である。このような等価なものは本発明のおよび特許請求の範囲の範囲内にある。本願に引用されている、発行特許および公開特許出願を含む全ての刊行物の内容は出典明示により本明細書の一部とされる。
【実施例】
【０３４０】
実施例１：ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ(登録商標)ライブラリーからのヒトＤＫＫ１特異的抗体の作製
ヒトＤＫＫ１タンパク質に対する治療用抗体は、抗体変異体タンパク質の供給源として市販のファージディスプレーライブラリーであるＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ(登録商標)ライブラリーを用い、６つのＣＤＲの全てが適当な突然変異により多様化され、かつ、高い結合親和性を有するクローンの選択により作製する。ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ(登録商標)は、ファージ表面へのＦａｂフラグメントの結合にＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ(商標)技術を用いた(ＷＯ０１／０５９５０  Ｌｏｈｎｉｎｇ  ２００１)Ｆａｂライブラリーである(Knappik et al., 2000 J.Mol. Biol. 296:57-86; Krebs et al., 2001 J Immunol. Methods 254:67-84; Rauchenberger et al., 2003 J Biol Chem. 278(40):38194-38205)。
【０３４１】
一般法：ファージミドレスキュー、ファージの増幅および精製
このＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ(登録商標)ライブラリーを、標準的な富化細菌培地(２ｘＹＴ)に３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１％グルコースを含有させたもの(２ｘＹＴ−ＣＧ)で増幅させる。細胞をＯＤ６００ｎｍ値０.５にてＶＣＳＭ１３ヘルパーファージに感染させた(細胞とファージの混合物を振盪させずに３７℃で３０分間、その後、２５０ｒｐｍで振盪させつつ３７℃で３０分間インキュベーション)後、細胞を遠心分離し(４１２０ｇ；５分；４℃)、２ｘＹＴ／３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール／５０μｇ／ｍｌカナマイシン／０.２５ｍＭ  ＩＰＴＧに再懸濁させ、２２℃で一晩増殖させる。この終了時に、細胞を遠心分離により除去し、ファージを上清から２回ＰＥＧで沈殿させ、ＰＢＳ／２０％グリセロールに再懸濁させ、−８０℃で保存する。
【０３４２】
２回のパンニング間のファージの増幅は次のようにして行う：対数増殖期中の大腸菌ＴＧ１株の細胞をファージに感染させ、ＤＫＫ１タンパク質で選択した後に溶出し、１％グルコースおよび３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを添加したＬＢ−寒天(ＬＢ−ＣＧプレート)上に播種する。これらのプレートを３０℃で一晩インキュベーションした後、細菌コロニーを寒天表面から掻き取り、これを用いて２ｘＹＴ−ＣＧ培養液にＯＤ６００ｎｍ値０.５となるまで接種した後、上記のように生産的感染が得られるようＶＣＳＭ１３ヘルパーファージに加える。
【０３４３】
Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ磁性ビーズを用いる液相パンニングに関する予備実験
Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩはＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎマトリックスに対して親和性が低いことが報告されており(Voss and Skerra, 1997 Protein Eng. 10:975-982によれば, ＫＤ〜１μＭ)、従って、抗体選択中の抗原の捕捉にＳｔｒｅｐ−ＴａｃｔｉｎコーティングＭａｇＳｔｒｅｐビーズを用いることの適性を評価するため、また、パンニング中の抗原の損失を避けるために予備実験を行う。
【０３４４】
この目的で、８ｍｇのＭａｇＳｔｒｅｐビーズを４６μｇのＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１とともに室温で１時間インキュベートし、このサンプルを、予めブロッキングした４本のエッペンドルフ管に分注する。１本は陽性対照として用い(洗浄無し)、他の３本のサンプルはＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ(登録商標)手動パンニングのセクションに従って種々のストリンジェンシーで洗浄する。Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１とＭａｇＳｔｒｅｐビーズ(IBA, Gottingen, Germanyから入手されるＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎコーティング磁性ビーズ)の結合の検出は、ヤギ抗ＤＫＫ１抗体とルビジウム標識抗ヤギ検出抗体を用いてＢｉｏＶｅｒｉｓにて行う。
【０３４５】
本明細書の図１で示されるように、非洗浄ビーズを種々のＨｕＣＡＬ(登録商標)ストリンジェンシーで洗浄したビーズと比べた場合、Ｓｔｒｅｐ−ＴａｃｔｉｎコーティングビーズからのＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１の有意な損失は検出されない。よって、Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１は、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎコーティング磁性ビーズ(ＭａｇＳｔｒｅｐビーズ)による液相パンニングにおいて使用するのに好適であると思われる。
【０３４６】
ライブラリーからのＤＫＫ１特異的抗体のパンニングによる選択
ヒトＤＫＫ１を認識する抗体を選択するため、２種類のパンニング戦略を適用する。
【０３４７】
要するに、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ(登録商標)ファージ−抗体を、種々の組合せのＶＨマスター遺伝子を含む４つのプールに分割する(プール１はＶＨ１／５λκを含み、プール２はＶＨ３λκを含み、プール３はＶＨ２／４／６λκを含み、プール４はＶＨ１−６λκを含む)。これらのプールに対してそれぞれ、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁性ビーズ(Ｍｅｇａ  Ｓｔｒｅｐビーズ；ＩＢＡ)上に捕捉されたＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１で２回の液相パンニングを行い、３回目の選択だけは、ビオチン化抗ＡＰＰ抗体を用い、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁性ビーズ上に捕捉されたＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１か、またはストレプトアビジンビーズ(Ｄｙｎａｂｅａｄｓ(登録商標)Ｍ−２８０ストレプトアビジン；Ｄｙｎａｌ)により捕捉されたＡＰＰタグ付きヒトＤＫＫ１タンパク質のいずれかで行う。
【０３４８】
詳しくは、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁性ビーズに結合されたＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１を用いる液相パンニングでは以下のプロトコールを適用する：ＰＢＳで１：１希釈した２ｘＣｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲ  １.５ｍｌで４℃にて一晩処理することにより、プレブロッキングビーズを調製する。プレブロッキングビーズは次のような処理により調製する：５８０μｌ(２８ｍｇビーズ)ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁性ビーズを５８０μｌのＰＢＳで１回洗浄し、５８０μｌの１ｘＣｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲ(１容量の１ｘＰＢＳで希釈)に再懸濁させる。これらのビーズのブロッキングは４℃で一晩プレブロッキング管の中で行う。
【０３４９】
各パンニング条件について最終量５００μｌとなるようにＰＢＳで希釈したファージ粒子を５００μｌの２ｘＣｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲ／０.１％Ｔｗｅｅｎと混合し、回転盤上で室温にて１時間維持する。ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎまたはビーズ結合ファージを除去するため、ファージ粒子の予備吸着を２回行う：１６０μｌのブロッキング済みＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁性ビーズ(４ｍｇ)をブロッキング済みファージ粒子に加え、回転盤上で室温にて３０分間インキュベートする。磁気ディバイス(Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣ−Ｅ)によりビーズを分離した後、ファージ上清(〜１.１ｍｌ)を新しいブロッキング済みの反応試験管に移し、１６０μｌのブロッキング済みビーズを用い、３０分間の予備吸着を繰り返す。その後、４００ｎＭまたは１００ｎＭのいずれかのＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１を、新しいブロッキング済み１.５ｍｌの反応試験間中でブロッキング済みファージ粒子に加え、この混合物を回転盤上で室温にて６０分間インキュベートする。
【０３５０】
これらのファージ−抗原複合体を、それぞれ４００ｎＭまたは１００ｎＭファージパンニングに加えた３２０μｌまたは１６０μｌいずれかのブロッキング済みＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁性ビーズを用いて捕捉させた後、回転盤上で室温にて２０分間インキュベートする。ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁性ビーズと結合しているファージ粒子を再び磁気粒子セパレーターで回収する。
【０３５１】
次に、ビーズをＰＢＳ／ ０.０５％Ｔｗｅｅｎ(ＰＢＳＴ)で７回洗浄した後、ＰＢＳのみでさらに３回洗浄する。ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁性ビーズからのファージ粒子の溶出は、各試験管に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０中、２００μｌの２０ｍＭＤＴＴを１０分間加えることにより行う。溶出液を回収し、ビーズを２００μｌのＰＢＳで１回洗浄し、このＰＢＳ溶出液をＤＴＴ溶出液に加える。この溶出液サンプルを用い、ＯＤ６００ｎｍ値０.６〜０.８まで増殖させた大腸菌ＴＧ−１培養物１４ ｍｌに感染させる。
【０３５２】
感染およびその後の５０００ｒｐｍで１０分の遠心分離の後、各細菌ペレットを５００μｌの２ｘＹＴ培地に再懸濁させ、２ｘＹＴ−ＣＧ寒天プレートに播種し、３０℃で一晩インキュベートする。翌朝、得られたコロニーをプレートから掻き取り、上記のようなレスキューと増幅によりファージを調製する。
【０３５３】
Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１での２回目の液相パンニングは、低い抗原量を用いること(５０ｎＭおよび１０ｎＭ)と洗浄手順のストリンジェンシーを適宜変更すること以外は１回目のプロトコールに従って行う。
【０３５４】
３回目の選択には、２種類の異なるパンニング戦略を適用し、２回目のパンニングの増幅ファージ産物を分割し、２種類の異なるパンニング条件に置く。ファージ産物の第一の半分は上記のようにＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎビーズ上に捕捉されたヒトＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１での標準的なパンニング戦略に用いる(抗原量はそれぞれ１０ｎＭまたは１ｎＭ)。
【０３５５】
３回目の選択の第二のパンニングバリエーションはヒトＡＰＰタグ付きＤＫＫ１で行う。ＡＰＰタグ付きＤＫＫ１タンパク質を終濃度５０ｎＭまたは１０ｎＭで、予め明澄化した２回目のファージ粒子１ｍｌと混合し、この混合物を回転盤上で室温にて１時間インキュベートする。並行して、８ｍｇのプレブロッキングＤｙｎａビーズＭ−２８０ストレプトアビジン(Ｄｙｎａｌ)を４０μｇのビオチン化マウス抗ＡＰＰ抗体とともに回転盤上で室温にて３０分間インキュベートした後、ｓｔｅｐをＰＢＳＴで２回洗浄する。ＡＰＰタグ付きＤＫＫ１と結合したファージ−抗体からなる事前に形成させた複合体を室温にて３０分間、抗ＡＰＰコーティングＭ−２８０ストレプトアビジン磁性ビーズにより捕捉させる。ファージの溶出および増幅は上記のように行う。
【０３５６】
可溶性Ｆａｂフラグメントのサブクローニングおよび発現
可溶性Ｆａｂの迅速かつ効率的な発現を助けるため、選択されたＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ(登録商標)ファージミドのＦａｂコードインサートを発現ベクターｐＭＯＲＰＨ(登録商標)Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨにサブクローニングする。このため、選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを制限酵素エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、それによりＦａｂコードインサート(ｏｍｐＡ−ＶＬＣＬおよびｐｈｏＡ−Ｆｄ)を切り出す。次に、このインサートをＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩで消化した発現ベクターｐＭＯＲＰＨ(登録商標)Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨにクローニングする。
【０３５７】
このベクターからＦａｂタンパク質を発現させ、これは結果として検出および精製の双方のための２つのＣ末端タグ(それぞれＦＬＡＧ(商標)および６ｘＨｉｓ)を有する。
【０３５８】
大腸菌におけるＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ(登録商標)Ｆａｂ抗体の微小発現
上記で得られた各クローンによりコードされるタンパク質を十分量得るために、選択されたＦａｂをｐＭＯＲＰＨ(登録商標)Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨ発現ベクターにサブクローニングした後に、クロラムフェニコール耐性単一細菌コロニーを選択する。次に、これらの各コロニーを用い、無菌の９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル(各ウェルはウェル当たり１００μｌの２ｘＹＴ−ＣＧ培地を含む)に接種し、細菌を３７℃で一晩増殖させる。各大腸菌ＴＧ−１培養物サンプル(５μｌ)を、ウェル当たり３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび０.１％グルコースを添加した２ｘＹＴ培地１００μｌで予め満たした、新たな無菌の９６ウェルマイクロタイタープレートに移す。これらのマイクロタイタープレートを、培養物がＯＤ６００ｎｍ値約０.５の若干の濁りが出るまで(〜２〜４時間)、マイクロプレートシェーカー上で４００ｒｐｍにて振盪しながら３０℃でインキュベートする。
【０３５９】
これらのプレート形式における発現のため、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび３ｍＭ  ＩＰＴＧ(イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド)を添加した２０μｌの２ｘＹＴ培地を各ウェルに加え(終濃度０.５ｍＭ  ＩＰＴＧ)、これらのマイクロタイタープレートを通気性テープで封じ、４００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩インキュベートする。
【０３６０】
全細胞溶解液(ＢＥＬ抽出液)の作製
これらの発現プレートの各ウェルに、２.５ｍｇ／ｍｌリゾチームを含有する４０μｌのＢＥＬバッファー(２ｘＢＢＳ／ＥＤＴＡ：２４.７ｇ／ｌホウ酸、１８.７ｇＮａＣｌ／ｌ、１.４９ｇＥＤＴＡ／ｌ、ｐＨ８.０)を加え、プレートをマイクロタイタープレートシェーカー(４００ｒｐｍ)上で２２℃にて１時間インキュベートする。これらのＢＥＬ抽出液をＦＭＡＴによる結合分析に用いる(実施例２参照)。
【０３６１】
大腸菌におけるマイクログラム量のＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ(登録商標)Ｆａｂ抗体の発現および精製
大腸菌ＴＧ１  Ｆ細胞における、ｐＭＯＲＰＨ(登録商標)Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨによりコードされるＦａｂフラグメントの発現は、５０ｍｌのプラスチック試験管内で行う。このために、単一クローンを接種した前培養物を２ｘＹＴ−ＣＧ培地で３０℃にて一晩増殖させる。翌朝、各前培養物５０μｌを用い、無菌の５０ｍｌプラスチック試験管にて、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび０.１％グルコースを添加した２５ｍｌ  ２ｘＹＴ培地に接種し、３０℃で一晩インキュベートする。大腸菌細胞を採取し、細胞ペレットを冷凍し、最後にＢｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ(Novagen)で破壊する。Ｆａｂフラグメントを、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを用いて単離する(Qiagen, Hilden, Germany)。
【０３６２】
大腸菌におけるミリグラム量のＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ(登録商標)Ｆａｂ抗体の発現および精製
ＴＧ１  Ｆ細胞における、ｐＭＯＲＰＨ(登録商標)Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨによりコードされるＦａｂフラグメントの発現は、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを添加した７５０ｍｌの２ｘＹＴを用い、培養にて行う。培養物を３０℃で、ＯＤ６００ｎｍ値が０.５に達するまで振盪させる。０.７５ｍＭ  ＩＰＴＧを加えることで発現を誘導した後、３０℃で２０時間インキュベートする。リゾチームを用いて細胞を破壊し、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー(Qiagen, Hilden, Germany)によりＦａｂフラグメントを単離する。タンパク質濃度はＵＶ分光光度法(Krebs et al., 2001)により測定する。
【０３６３】
実施例２：ＤＫＫ１特異的ＨｕＣＡＬ(登録商標)抗体の同定
上述のパンニング戦略により選択された個々の大腸菌クローンのＢＥＬ抽出液をFluorometric Microvolume Assay Technology(FMAT(商標), 8200 Cellular Detection System analyzer, Applied Biosystems, Foster City, Calif.)により分析し、ＤＫＫ１特異的Ｆａｂをコードするクローンを同定する。FMAT(商標)8100 HTS Systemは、生細胞またはビーズを用いて混合して読み取るだけの非放射性アッセイの検出を自動化した蛍光マクロ共焦ハイスループットスクリーニング装置である(Miraglia, J. Biomol. Screening (1999), 4(4) 193-204)。
【０３６４】
細菌溶解液からＤＫＫ１結合Ｆａｂを検出するための蛍光微量アッセイ技術に基づく結合分析(ＦＭＡＴ)
大腸菌溶解液(ＢＥＬ抽出液)からのＤＫＫ１結合Ｆａｂ抗体の検出のため、ＦＭＡＴ  ８２００細胞検出システム(Applied Biosystems)を用いて結合を分析する。Ｍ−４５０  Ｅｘｐｏｘｙビーズ(Dynal)上にＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１を結合させるために、３００μｌ  Ｍ−４５０Ｅｐｏｘｙビーズ(１.２×１０８ビーズ)のサンプルを反応試験管に移し、磁気粒子セパレーターで捕捉する。上清を除去し、１ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７.４中で４回洗浄する。抗原コーティングのため、６０μｇのＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１を、１５０μｌの１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７.４中のビーズ懸濁液に加える。抗原−ビーズ懸濁液を回転盤上で室温にて１６時間インキュベートする。その後、コーティングビーズをＰＢＳで３回洗浄し、最終量２５０μｌのＰＢＳに再懸濁させる。
【０３６５】
各３８４ウェルプレートについて、３％ＢＳＡ、０.００５％Ｔｗｅｅｎ−２０、４μｌ  ＤＫＫ１コーティングビーズ(１.９×１０６ビーズ)および４μｌ  Ｃｙ５(商標)検出抗体を含有する２０ｍｌ  ＰＢＳの混合物を調製する。この溶液の４５μｌサンプルを３８４ウェルＦＭＡＴ黒／透明底プレート(Applied Biosystems)のウェルに分注する。Ｆａｂ含有ＢＥＬ抽出液(５μｌ)を各ウェルに加える。これらのＦＭＡＴプレートを室温で一晩インキュベートする。翌朝、これらのプレートを８２００細胞検出システム(Applied Biosystems)で分析する。
【０３６６】
陽性クローンが得られ、ＦＭＡＴで陽性の特異的シグナルが得られたクローンの重鎖および軽鎖配列を分析する。５７のユニークな(非冗長)抗ＤＫＫ１クローンが、ヒトＤＫＫ１と十分強い結合を示したことが確認されることが分かる。これらのクローンを発現させ、精製し、親和性に関して、また機能的アッセイで調べる。
【０３６７】
表面プラズモン共鳴を用いるナノモル親和性の検出
これらのクローンを用い、標準的なＥＤＣ−ＮＨＳアミンカップリング化学により、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４.５中、〜４００ＲＵ密度の組換えヒトＤＫＫ１、マウスＤＫＫ１(R&D system)またはカニクイザルＤＫＫ１でコーティングしたＣＭ５チップ(Biacore, Sweden)に対して動態ＳＰＲ分析を行う。匹敵する量のヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)を参照フローセルに固定化する。ＰＢＳ(１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、２.７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１.７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４  ｐＨ７.４)をランニングバッファーとして用いる。Ｆａｂ調製物は、流速２０μｌ／分で、１６〜５００ｎＭの一連の濃度で適用する。結合段階を６０秒に、解離段階を１２０秒に設定する。この方法により決定したヒト、マウスおよびカニクイザルの各ＤＫＫ１に対する親和性(ｎＭ)の概要を表１に示す。
【表２】
0005552233.tif 000003
【０３６８】
実施例３：ＤＫＫ１のＷｎｔ拮抗活性を阻害する抗ヒトＤＫＫ１  Ｆａｂ候補の同定
ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ(登録商標)ライブラリーから選択された結果としての５７の異なるＤＫＫ１特異的抗体を用いて精製抗体を得、これを次にヒトＤＫＫ１のＷｎｔ拮抗活性を阻害する効力に関して調べる。図２および４に示されるように、これらのうち１７の抗体候補が機能的に有効である。
【０３６９】
各ＨｕＣＡＬ(登録商標)Ｆａｂの機能活性を、ルシフェラーゼリポーター遺伝子アッセイを用いて確認する。１２のＴＣＦ／Ｌｅｆ結合部位をルシフェラーゼリポーター遺伝子の上流にクローニングし、ルシフェラーゼ遺伝子をＴＣＦ／Ｌｅｆ応答性とする。カノニカルなＷｎｔタンパク質はβ−カテニンの安定化をもたらし、それによりＴＣＦ／Ｌｅｆの転写を活性化し、ルシフェラーゼタンパク質を産生する。ＤＫＫ１タンパク質を添加するとＷｎｔ活性は遮断され、従って、ルシフェラーゼ遺伝子の転写も遮断される。その結果、個々の細胞により産生されるルシフェラーゼレベルは選択されたＦａｂのＤＫＫ１作用遮断力に比例すると考えられる。
【０３７０】
安定なＴＣＦ／Ｌｅｆ応答性リポーター細胞系統ＨＥＫ２９３Ｔ／１７−１２ｘＳＴＦ
安定なヒト胚腎臓細胞リポーター細胞系統ＨＥＫ２９３Ｔ／１７−１２ｘＳＴＦを用い、バイオアッセイを行う。これらの細胞を、１０％ＦＣＳ(PANまたはBioWhittaker)および１μｇ／ｍｌピューロマイシン(BD Biosciences)を含有するＤＭＥＭ高グルコース培地(Invitrogen)で、集密度９０％に達するまで培養する。その後、これらの細胞をトリプシン処理し、計数し、ピューロマイシン不含培養培地で濃度が４×１０５細胞／ｍｌとなるように希釈する。次に、これらの細胞を白色平底９６ウェルプレート(Corning；１００μｌ細胞懸濁液／ウェル)に播種し、３７℃および５％ＣＯ２下で一晩インキュベートする。翌日、アッセイ培地を調製する：５００ｎｇ／ｍｌ  ＤＫＫ１−ＡＰＰをＷｎｔ３ａ細胞馴化培地(ＣＭ)に加える。抗ＤＫＫ１  ＨｕＣＡＬ(登録商標)Ｆａｂ(終濃度２０μｇ／ｍｌ)および陽性対照として用いるヤギ抗ヒトＤＫＫ１抗体(R&D Systems)(終濃度１.５μｇ／ｍｌ)をＣＭで希釈する。
【０３７１】
付着している細胞を損なわないようにアッセイプレートの各ウェルから６０μｌ量の培地を採取し、ＣＭで希釈した６０μｌの試験抗体または対照に置き換える。これらの細胞をさらに２４時間インキュベートし、各ウェルに１００μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬を加える。５分のインキュベーション後、発光を照度計(GenioPro, Tecan)で読み取る。５７のうち２０のＦａｂで得られた結果を図２に示す。ルシフェラーゼの発現程度は、抗体存在程度の指標となる。
【０３７２】
実施例４：結合親和性の定量分析：ＤＫＫ１のＷｎｔ拮抗活性を阻害する抗ヒトＤＫＫ１  Ｆａｂ候補の同定
親和性の測定
抗ＤＫＫ１抗体のさらなる特性決定を行うため、ヒト、カニクイザルおよびマウスＤＫＫ１に対する親和性を調べる。組換えＤＫＫ１タンパク質をＣＭ５  Biacoreチップ上に固定化し、Ｆａｂを移動相として種々の濃度で適用する。一価親和性の確実な測定のために、サイズ排除クロマトグラフィーで９０％以上の単量体画分を示したＦａｂバッチだけをBiacore測定に用いる。
【０３７３】
ヒト、マウスおよびカニクイザルＤＫＫ１に対する親和性データの要約を表２に示す。試験した１７のＦａｂ全てが、ヒトＤＫＫ１に対して１００ｎＭ未満の親和性を有することが分かる。さらに、９クローンは１０ｎＭ未満の親和性を有する抗体を生成した。試験した全ての場合で、カニクイザルおよびマウスのＤＫＫ１の親和性はヒトＤＫＫ１に対する親和性とほぼ同じである。
【表３】
0005552233.tif 000004
【０３７４】
ＥＣ５０の決定
ＤＫＫ１に対して最大の親和性を有する抗体のクローンに対して５０％阻害の有効濃度を示すデータを表３に示す。これらのデータは有効濃度ＥＣ５０が３９〜９５ｎＭの範囲であり、５８と８３ｎＭの間に中央値があることを示す。
表３.選択されたＦａｂの５０％阻害の有効濃度
【表４】
0005552233.tif 000005
【０３７５】
実施例５：ＬＣＤＲ３カセットおよびＨＣＤＲ２カセットの平行交換による選択された抗ＤＫＫ１  Ｆａｂの親和性成熟
親Ｆａｂフラグメントのプールに関してＤＫＫ１に対する本明細書に記載の抗体の親和性を至適化するために、各親Ｆａｂの軽鎖のＬＣＤＲ３、フレームワーク４および定常領域(４０５ｂｐ)をＢｐｉＩおよびＳｐｈＩを用いて除去し、フレームワーク４および定常ドメインとともに、多様化したＬＣＤＲ３のレパートリーに置き換える。バインダープールベクターの０.５μｌサンプルを、多様化したＬＣＤＲ３を有する３倍モル過剰のインサートフラグメントと連結させる。
【０３７６】
同様のアプローチにおいて、ＸｈｏＩおよびＢｓｓＨＩＩ部位を用いてＨＣＤＲ２を多様化し、接続フレームワーク領域を一定に維持する。クローニング効率を高めるために、親ＨＣＤＲ２を、多様化したＨＣＤＲ２カセットの挿入前に５９０ｂｐのスタッファー(stuffer)配列に置き換える。
【０３７７】
１１の異なるライブラリーのライゲーション混合物を４ｍｌの大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中にエレクトロポレーションすると、２×１０７〜２×１０８の独立したコロニーが得られた。ライブラリーの増幅は従前に記載されたようにして行う(Rauchenberger et al., 2003 J Biol Chem. 278(40):38194-38205)。品質管理のため、ライブラリー当たり数個のコロニーを無作為に採取し、プライマーＣＦＲ８４(ＶＬ)とＯＣＡＬ＿Ｓｅｑ＿Ｈｐ(ＶＨ)を用いて配列決定を行う(SequiServe, Vaterstetten, Germany)。
【０３７８】
親和性成熟のための候補の選択
次の特性を有すると特性決定されたことにより６つの選択成熟候補を選択した：ヒトＤＫＫ１に対する親和性が１０ｎＭ未満であること、カニクイザルおよびマウスＤＫＫ１に対して有意な交差反応性を有すること、ＥＣ５０が１００ｎＭ未満であること、大腸菌におけるＦａｂ発現レベルが良好〜中程度であること、およびＦａｂ精製後に凝集がないこと。
【０３７９】
親和性測定の過程で、ＭＯＲ０４４８０が高い希釈率で極めて不安定であることが明らかになった。このため、全ての供試Ｆａｂで最高の親和性(１ｎＭ)と最良のＥＣ５０(７ｎＭ)を有していたとしても、ＭＯＲ０４４８０を成熟候補のリストから除いた。ＭＯＲ０４４８３はヒトＤＫＫ１に対して５.５ｎＭという高親和性を有していたが、マウスＤＫＫ１と交差反応性を示し、ＭＯＲ０４４５３は精製後に高い割合のＦａｂ凝集を含んでいた。従って、これら２つの抗体も成熟から除外した。
【０３８０】
使用可能なあらゆるデータを慎重に評価した後、６つの成熟候補(ＭＯＲ０４４５４、ＭＯＲ０４４５５、ＭＯＲ０４４５６、ＭＯＲ０４４６１、ＭＯＲ０４４７０およびＭＯＲ０４５１６)を選択した。これらの候補の特性を表４に一覧化する。
【表５】
0005552233.tif 000006
＊  １回の測定
n.d.：測定せず
#  単量体の割合＞９０％
【０３８１】
親和性成熟に関して選択されたＦａｂライブラリーの作製
高い親和性および抗ＤＫＫ１抗体の阻害活性を有するクローンを得るために、従前の実施例で示した選択されたＦａｂクローンＭＯＲ０４４５４、ＭＯＲ０４４５５、ＭＯＲ０４４５６、ＭＯＲ０４４６１、ＭＯＲ０４４７０およびＭＯＲ４５１６に対して、親和性成熟として知られるプロセスであるさらなる多様化と選択を行う。
【０３８２】
このために、３ヌクレオチド突然変異誘発(Virnekas et al., 1994 Nucleic Acids Res. 22:5600-5607; Nagy et al., 2002 Nature Medicine 8:801-807)により事前に構築した対応するＬＣＤＲ３成熟カセットとＨＣＤＲ２成熟カセットを用い、ＣＤＲ領域を多様化する。表５は親クローンＭＯＲ０４４５４、ＭＯＲ０４４５５、ＭＯＲ０４４５６、ＭＯＲ０６１、ＭＯＲ０４４７０およびＭＯＲ４５１６のＬＣＤＲ３配列を示す。
【表６】
0005552233.tif 000007
【０３８３】
表６は親クローンＭＯＲ０４４５４、ＭＯＲ０４４５５、ＭＯＲ０４４５６、ＭＯＲ０６１、ＭＯＲ０４４７０およびＭＯＲ４５１６のＨＣＤＲ２配列を示す。
【表７】
0005552233.tif 000008
【０３８４】
発現ベクターｐＭＯＲＰＨ(登録商標)Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨからのＦａｂフラグメントをファージミドベクターｐＭＯＲＰＨ(登録商標)２５(米国特許第６,７５３,１３６号参照)にサブクローニングする。このベクターは、Ｎ末端がシステイン残基と融合するとともに、Ｃ末端システインがＦｄ抗体鎖と融合したファージタンパク質ｐＩＩＩを提供し、よって、ファージ表面で個々のＦａｂフラグメントのジスルフィド結合したディスプレーが可能となる。親Ｆａｂの親和性と有効性の双方を至適化するために、２つの異なる戦略を並行して適用する。
【０３８５】
５つのファージ抗体Ｆａｂライブラリーが作製され、６つの親クローンのうち５つのＬＣＤＲ３が個々の軽鎖ＣＤＲ３配列のレパートリーにより置換される。ＭＯＲ０４４５４はそのＣＤＲ領域の１つに付加的ＢｐｉＩ制限部位を有し、このＢｐｉＩ制限酵素がライブラリークローニング法に用いられることから、このクローンの成熟は行われない。
【０３８６】
並行して、各親クローンのＨＣＤＲ２領域を個々の重鎖ＣＤＲ２配列のレパートリーで置換する。各親Ｆａｂを切り出し、５９０ｂｐのスタッファーに置換する。このＤＮＡスタッファーは、二重消化ベクターバンドから単独消化を分離する助けをし、成熟パンニング中、高親和性親Ｆａｂのバックグラウンドを引き下げる。その後の工程で、このスタッファーを各親クローンのＦａｂコードプラスミドから切り出し、多様化の高いＨＣＤＲ２成熟カセットに置き換える。
【０３８７】
２×１０７メンバーという大きな親和性成熟ライブラリーを標準的なクローニング手順により作製し、多様化したクローンをエレクトロコンピテント大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’細胞(Invitrogen)に形質転換させる。Ｆａｂ提示ファージを上記の実施例１に記載されているように作製する。
【０３８８】
以降の選択プロセスを容易にするため、４つの成熟プールを構築する：プール１ａはＭＯＲ０４４７０およびＭＯＲ０４５１６  ＬＣＤＲ３ライブラリーからなり、プール１ｂはＭＯＲ０４４７０およびＭＯＲ０４５１６  ＨＣＤＲ２ライブラリーからなり、プール２ａはＭＯＲ０４４５４、ＭＯＲ０４４５５、ＭＯＲ０４４５６およびＭＯＲ０４４６１  ＬＣＤＲ３ライブラリーからなり、プール２ｂはＭＯＲ０４４５４、ＭＯＲ０４４５５、ＭＯＲ０４４５６およびＭＯＲ０４４６１  ＨＣＤＲ２ライブラリーからなる。
【０３８９】
各プールについて、Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１の量を引き下げつつ、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎビーズによるファージ−抗原捕捉を用い、液相にてパンニングを行う。並行して、ビオチン化ＤＫＫ１の量を引き下げつつ(ニュートラビジンコーティングプレートに捕捉される)、各プールをパンニングに適用する。パンニングのストリンジェンシーを高めるため、かつ、解離速度の向上に向けて選択するために、インキュベーション期間を延長して精製親Ｆａｂならびに非標識抗原との競合を行う。
【０３９０】
富化したファージミドプールをパンニングした直後にｐＭＯＲＰＨ(登録商標)Ｘ９＿ＦＨ  発現ベクターにサブクローニングする。約２３００の単一クローンを採取し、ＩＰＴＧでＦａｂを誘導する。
【０３９１】
成熟パンニング戦略
４つの抗体プールを用い、液相にてＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１およびビオチン化Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１でそれぞれ２または３回パンニング手順を行う。各パンニング戦略では、精製親Ｆａｂタンパク質または非標識ＡＰＰタグ付きＤＫＫ１との競合、ならびに低抗原濃度および十分な洗浄を用いてストリンジェンシーを高める。
【０３９２】
非標識Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１に対する液相パンニングは、主として実施例１に記載の標準的プロトコールに従い、２回の選択で行う。ただし、これらの手順は抗原量を引き下げつつ(５ｎＭから１ｎＭへ引き下げ)適用し、競合相手を伴うかまたは伴わずに高ストリンジェンシーの洗浄手順であり、抗体−ファージの抗原を伴うインキュベーション時間が延長されている。
【０３９３】
ビオチン化ＤＫＫ１を用いた１回目の選択では、ニュートラビジンプレートのウェルを３００μｌのＰＢＳで２回洗浄する。これらのウェルをＰＢＳで１：１希釈した２ｘＣｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲ(Chemicon, Temecula, CA)(ブロッキングバッファー)でブロッキングする。選択前に、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ(登録商標)ファージも、０.１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１容量のブロッキングバッファーで、室温で３０分間ブロッキングする。ブロッキングしたファージ調製物の１００μｌアリコートをニュートラビジン−コーティングプレートのウェルに室温にて３０分間移す。この予備吸着ステップを１回繰り返す。ブロッキングし、予め明澄化したファージ調製物を５ｎＭビオチン化ＤＫＫ１とともに、回転盤上で２２℃にて２時間インキュベートする。親Ｆａｂ、ＡＰＰ−ＤＫＫ１を加え、または競合相手を加えずに、サンプルを回転盤上で４℃にて一晩インキュベートする。
【０３９４】
抗原−ファージ複合体を室温で２０分間、ニュートラビジンプレートのウェルに捕捉する。十分な洗浄工程の後、ウェル当たり１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８.０中２０ｍＭのＤＴＴ２００μｌを室温で２０分間加えることで、結合したファージ粒子を溶出させる。溶出液を取り出し、ＯＤ６００ｎｍ値０.６〜０.８まで増殖させた１４ｍｌの大腸菌ＴＧ１細胞に加える。これらのウェルを２００μｌのＰＢＳで１回すすぎ、この溶液をまた大腸菌ＴＧ１細胞に加える。大腸菌を、振盪せずに３７℃で４５分間ファージに感染させる。５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離の後、細菌ペレットを各々５００μｌの２ｘＹＴ培地に再懸濁させ、２ｘＹＴ−ＣＧ寒天プレートに播種し、３０℃で一晩インキュベートする。これらのコロニーをプレートの表面から掻き取ることで採取し、上記のようにファージ粒子をレスキューし、増幅させる。
【０３９５】
２回目および３回目の選択は、洗浄条件のストリンジェンシーが高く、抗原濃度がそれぞれ１および０.１ｎＭであること以外は、１回目の選択に関して上記したように行う。
【０３９６】
電気化学発光(ＢｉｏＶｅｒｉｓ)に基づくＤＫＫ１結合Ｆａｂの結合分析
大腸菌溶解液(ＢＥＬ抽出液)において親和性が向上したＤＫＫ１特異的抗体フラグメントを検出するために、ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｍ−３８４  ＳＥＲＩＥＳ(登録商標)ワークステーション(BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK)を用いる。アッセイは、９６ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートおよびアッセイバッファーとして０.５％ＢＳＡおよび０.０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を添加したＰＢＳで行う。ビオチン化ヒトＤＫＫ１は、供給者の使用説明書に従い、Ｍ−２８０ストレプトアビジン常磁性ビーズ(Dynal)に固定化する。各ウェルにビーズ原液の１：２５希釈液を加える。１００μｌ希釈ＢＥＬ抽出液サンプルとビーズをシェーカー上で室温にて一晩インキュベートする。検出には、供給者(BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK)の使用説明書に従い、ＢＶ−ｔａｇ(商標)で標識した抗ヒト(Ｆａｂ)’２(Dianova)を用いる。
【０３９７】
無作為に採取した約２３００のクローンセットを上記の方法により分析した。最も高い値の得られた１６０クローンのサブセットを溶液平衡滴定においてさらなる分析のために選択した。
【０３９８】
溶液平衡滴定(ＳＥＴ)を用いるピコモル親和性の測定
ＫＤ値の測定には、Ｆａｂの単量体画分(分析的ＳＥＣにより分析して単量体含量少なくとも９０％；Superdex75, Amersham Pharmacia)を用いる。液相での電気化学発光(ＥＣＬ)に基づく親和性測定およびデータ評価は基本的にHaenelら、2005に記載されているように行う。溶液中で一定量のＦａｂを種々の濃度(３ｎ連続希釈系)のヒトＤＫＫ１(開始濃度４ｎＭ)とともに平衡化する。常磁性ビーズ(Ｍ−２８０ストレプトアビジン、Dynal)に結合させたビオチン化ヒトＤＫＫ１とＢＶ−ｔａｇ(商標)(BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK)標識抗ヒト(Ｆａｂ)’２(Dianova)を加え、この混合物を３０分間インキュベートする。次に、非結合Ｆａｂの濃度を、Ｍ−ＳＥＲＩＥＳ(登録商標)３８４アナライザー(BioVeris Europe)を用いたＥＣＬ検出により定量する。
【０３９９】
このために、１６０の単一クローンを選択し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースによりμｇスケールで精製した。予備親和性をＢｉｏＶｅｒｉｓで４点の溶液平衡滴定(ＳＥＴ)により測定する。これらのデータから、親和性を示す２０クローンを選択した。これらのＦａｂをｍｇスケールで精製する。ＭＯＲ０４９５０は、Ｆａｂの部分的凝集のため、親和性測定およびさらなる評価から除外し、サイズ排除クロマトグラフィーで検出した。最終的な親和性は、８点ＳＥＴ測定とヒト、マウスおよびカニクイザルＤＫＫ１を用い、各Ｆａｂクローンの２つの独立したバッチから測定した。
【０４００】
マウスおよびカニクイザルＤＫＫ１に対する親和性の測定は、本質的に上記と同様に、ヒトＤＫＫ１の代わりに溶液中のアナライトとしてマウスＤＫＫ１(R&D Systems)およびカニクイザルＤＫＫ１を用いて行う。遊離Ｆａｂの検出のためには、常磁性ビーズに結合させたビオチン化ヒトＤＫＫ１を用いる。親和性はHaenel et al., 2005 Anal Biochem 339.1:182-184に従って算出する。
【０４０１】
上記のアッセイ条件を用い、親和性至適化抗ＤＫＫ１  Ｆａｂに対する親和性を溶液中で測定した。ＭＯＲ０４９１０およびＭＯＲ０４９４６に対する親和性を測定したところ、ＫＤ値はヒトＤＫＫ１に対して３０ｐＭ以下、マウスおよびカニクイザルＤＫＫ１に対して３６〜４２ｐＭの間であった。さらに７つの抗体が、３つ抗原全てに対して１００ｐＭの親和性を示した。クローンＭＯＲ０４９５０はビオチン化ＤＫＫ１との結合を示さなかった。これらの親和性を表７にまとめる。
【０４０２】
【表８】
0005552233.tif 000009
*: ２つの異なるFabバッチから少なくとも２回の独立した測定を行った
#: １回の測定のみ
【０４０３】
実施例６：親和性至適化抗ヒトＤＫＫ１  Ｆａｂの特性決定
酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)技術
５０％ヒト血清(ＨＳ)の存在下での成熟Ｆａｂの結合特異性を測定する。ＴＢＳ中、ヒト組換えビオチン化ＤＫＫ１の連続希釈系を室温で２時間ニュートラビジンマイクロタイタープレート上に、８ｎｇＤＫＫ１／ウェル〜１２５ｎｇＤＫＫ１／ウェルの濃度でコーティングする。抗原をコーティングした後、ウェルを、室温で１時間、１％ＢＳＡを添加したＴＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ(ＴＢＳ−Ｔ)でブロッキングする。上記の精製Ｆａｂを終濃度１μｇ／ｍｌとなるようにＴＢＳ／４％ＢＳＡまたはＴＢＳ／５０％ＨＳのいずれかで希釈し、コーティングおよびブロッキング済みウェルに加え、これらのプレートを室温で１時間インキュベートする。検出のため、抗ＦＬＡＧアルカリ性ホスファターゼ(ＡＰ)コンジュゲート抗体(ＴＢＳＴ中１：５０００希釈液)および蛍光性基質ＡｔｔｏＰｈｏｓ(Roche)を用いる。各インキュベーションの後、マイクロタイタープレートのウェルをＴＢＳＴで５回洗浄するが、標識二次抗体とともに最終のインキュベーション工程を行った後は、ウェルを３回洗浄する。
【０４０４】
蛍光はＴＥＣＡＮ  Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒプレートリーダーで測定する。結合曲線の例を図３に示す。表８は、５０％ヒト血清の存在下での至適化抗ＤＫＫ１  Ｆａｂの結合活性を、４％ＢＳＡ中の結合活性と比較してまとめる。結合活性は８３％〜１００％の範囲であった。中央値は９３％であることが分かり、よって、抗ＤＫＫ１  Ｆａｂはヒト血清の存在下で標的と完全に結合することが分かる。
【表９】
0005552233.tif 000010
* １回の測定
【０４０５】
Ｕ２ＯＳ細胞系統を用いた、ヒト血清の存在下でのルシフェラーゼリポーター細胞
至適化抗ＤＫＫ１  Ｆａｂの結合特異性のさらなる測定のために、骨肉腫細胞系統Ｕ２ＯＳを用い、１５％ヒト血清の存在下でルシフェラーゼリポーター細胞アッセイを繰り返した。Ｕ２ＯＳ細胞(ＡＴＣＣ  Ｎｏ.ＨＴＢ−９６)は供給者のプロトコール(ATCC, Manassas, VA, USA)に従って増殖させる。これらの細胞をトリプシン処理し、計数し、濃度が２×１０５細胞／ｍｌとなるように培養培地(ＭｃＣｏｙの５ａ／１０％ＦＣＳ)で希釈する。各２×１０４細胞につき、溶液は０.０７５μのｐＴＡ−ＬＵＣ−１２ｘＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈと０.００４μｇのｐｈＲＬ−ＳＶ４０の混合物として調製する。これらを混合し、最終量の９.８μｌ  ＯＰＴＩ−ＭＥＭとする。次に、０.２μｌのＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬(Roche, Mannheim, Germany)を加える。このトランスフェクション混合物を軽くインキュベートした後、事前に調製した細胞と混合する。次に、これらの細胞を白色９６ウェル細胞培養皿に１００μｌ／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩インキュベートする。翌日、アッセイプレートの各ウェルから７５μｌの培地を取り出した後、１０μｌのＨｕＣＡＬ(登録商標)Ｆａｂ抗体希釈液(無血清培養培地で１０〜０.０１μｇ／ｍｌ希釈)、７０％ＦＣＳかヒト血清のいずれか１５μｌ、および５０μｌのＷｎｔ３ａ細胞馴化培地(６００ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１−ＡＰＰを含有)に置き換える。
【０４０６】
陰性対照としては、抗体希釈液の代わりに無血清培地を加える。最大ルシフェラーゼシグナルを得るために、抗体希釈液の代わりに１０μｌの無血清培地とＤＫＫ１−ＡＰＰを含まない５０μｌのＷｎｔ３ａ  ＣＭを含有する対照を加える。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした後、製造業者の使用説明書に従い、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム(Promega, Madison, WI, USA)を用いて発光を測定する。
【０４０７】
表９は、１５％ヒト血清の存在下での至適化抗ＤＫＫ１  Ｆａｂの阻害活性を示す(１５％ＦＣＳにおける阻害活性と比較)。このデータは、血清の存在下で得られた活性は２６％〜９０％の範囲であり、中央値は７０〜７４％であることを示す。これらのデータは、ヒト血清の存在下で機能する抗ＤＫＫ１  Ｆａｂのクローンが得られることを示す。
【表１０】
0005552233.tif 000011
【０４０８】
ルシフェラーゼリポーター細胞アッセイによる親和性至適化抗ＤＫＫ１  ＦａｂのＥＣ５０の測定
ルシフェラーゼ発現阻害を得るために、標準的なＷｎｔ３ａ依存性ＴＣＦ／ＬＥＦ  ｌｕｃリポーターアッセイにおける親和性改良Ｆａｂの試験で１０ｎＭのＤＫＫ１を用いた。アッセイの感受性が低すぎるので、この方法ではＥＣ５０値が得られないと思われる。このことは非常に阻害曲線が極めて急勾配であることで示され、図４に示したように全てのＦａｂについて類似のＥＣ５０値を調べた。
【０４０９】
改良型のＴＣＦ／ＬＥＦ  ｌｕｃリポーターアッセイを開発した。ＤＫＫ１はＫｒｅｍｅｎ−１および−２トランスメンブランタンパク質と結合し、この相互作用はＷｎｔシグナル伝達の強力な相乗的阻害をもたらす(Mao et al. 2002 Nature: 417: 664-67)。従って、Ｋｒｅｍｅｎ  ｃＤＮＡをＴＣＦ／ＬＥＦ  ｌｕｃリポーターアッセイとともに同時トランスフェクトする。この結果としてのＷｎｔ３ａ依存性リポーターアッセイは、Ｋｒｅｍｅｎ共受容体タンパク質の同時発現を媒介とする、ＤＫＫ１感受性に極めて高い向上を示した。このアッセイにおいては、Ｗｎｔシグナル伝達の完全阻害を誘導するのに０.３３ｎＭのＤＫＫ１で十分である。０.３３ｎＭのＤＫＫ１を用いてＦａｂ滴定(１０濃度)を繰り返したところ、Ｓ字阻害曲線(図５)が得られ、そこからＥＣ５０値を算出することができた。
【０４１０】
それにより、上記のようなＥＣ５０に関して、親和性至適化抗ＤＫＫ１  Ｆａｂを分析した。表１０に示すように、この方法によって得られたＥＣ５０値は０.２ｎＭ〜５.６ｎＭの範囲であった。
【０４１１】
【表１１】
0005552233.tif 000012
【０４１２】
親和性至適化Ｆａｂの配列分析
１２のＦａｂ全ての重鎖およびＶＬ領域(ＶＨおよびＶＬ)のヌクレオチド配列を調べた。相補性決定領域(ＣＤＲ)のアミノ酸配列を表１１Ａおよび表１１Ｂに示す。
【０４１３】
【表１２】
0005552233.tif 000013
【表１３】
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【表１４】
0005552233.tif 000015
【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
0005552233.tif 000019
【０４１４】
配列分析は、６つの親(Ｐ)Ｆａｂのうち５つで親和性が向上した成功形態が得られたことを示す。ＭＯＲ０４４６１およびＭＯＲ０４４７０は、ＨＣＤＲ２ならびにＬＣＤＲ３において至適化することができた。ＭＯＲ０４４５４では至適化の成功形態は得られなかった。さらに、表１１Ｂにおいて種々のＣＤＲのコンセンサス１およびコンセンサス２配列に示されるように、異なる親抗体間で高い相同性が見られる。当業者に周知の方法を用い、表１０Ａに示されている親配列に関しても同様のコンセンサス配列を得ることができる。
【０４１５】
さらに、ＭＯＲ０４９２０はＨＣＤＲ２領域に突然変異(Honegger and Pluckthun, 2001 J Mol Biol 309.3:657-670が公開している符番体系によれば、７３番においてＳｅｒ残基からＧｌｙ残基へ)を有するものと判定され、従って、ＨｕＣＡＬ(登録商標)デザインからはずれている。
【０４１６】
ＭＯＲ０４９１３は、κ軽鎖のフレームワーク４に点突然変異(１４８番においてＬｙｓからＡｓｎへの置換)を有することが示された。この位置は抗体の結合特性に影響を及ぼすとは考えられないので、この突然変異はＩｇＧ変換中に生殖細胞系／ＨｕＣＡＬ(登録商標)組成物に復帰させ、抗体ＭＯＲ０５１４５を得た。
【０４１７】
ＭＯＲ０４９４７は、ＬＣＤＲ２に可能性のあるグリコシル化部位を有する。この部位は、ＭＯＲ０４９４７バックアップ候補として選択されたに過ぎないので除去しなかった。
【０４１８】
実施例７：ＨｕＣＡＬ(登録商標)免疫グロブリンの生産
ＩｇＧ形式への変換
全長免疫グロブリン(Ｉｇ)を発現させるために、重鎖(ＶＨ)および軽鎖(ＶＬ)の可変ドメインフラグメントをｐＭＯＲＰＨ(登録商標)Ｘ９＿ＦＨ  Ｆａｂ発現ベクターから、ヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ４用のｐＭＯＲＰＨ(登録商標)＿ｈ＿ＩｇまたはｐＭＯＲＰＨ(登録商標)２＿ｈ＿Ｉｇベクター系のいずれかにサブクローニングする。ヒトＩｇＧ２用の別のベクターを用いてもよい。ＶＨドメインフラグメントのｐＭＯＲＰＨ(登録商標)＿ｈ＿ＩｇＧ１およびｐＭＯＲＰＨ(登録商標)＿ｈ＿ＩｇＧ４へのサブクローニングのためには、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＭｆｅＩおよびＢｌｐＩを用いる。ＶＨドメインフラグメントのｐＭＯＲＰＨ(登録商標)２＿ｈ＿ＩｇＧ１ｆおよびｐＭＯＲＰＨ(登録商標)２＿ｈ＿ＩｇＧ４へのサブクローニングのためには、制限酵素ＭｆｅＩおよびＢｌｐＩを用いる。ＶＬドメインフラグメントのｐＭＯＲＰＨ(登録商標)＿ｈ＿ＩｇκおよびｐＭＯＲＰＨ(登録商標)２＿ｈ＿Ｉｇκへのサブクローニングは、ＥｃｏＲＶおよびＢｓｉＷＩ部位を用いて行い、ｐＭＯＲＰＨ(登録商標)＿ｈ＿ＩｇλおよびｐＭＯＲＰＨ(登録商標)２＿ｈ＿Ｉｇλ２へのサブクローニングはＥｃｏＲＶおよびＨｐａＩを用いて行う。
【０４１９】
ヒトＩｇＧの一時的発現および精製
ＨＥＫ２９３細胞を等量のＩｇＧ重鎖および軽鎖発現ベクターでトランスフェクトする。トランスフェクション４日または５日後に、細胞培養上清を採取する。上清のｐＨを８.０に調整し、濾過除菌を行った後、この溶液に対し、標準的なタンパク質Ａカラムクロマトグラフィー(Poros 20A, PE Biosystems)を行う。
【０４２０】
親ＦａｂのＩｇＧ形式への変換
親和性成熟の開始と並行して、ＭＯＲ０４４５４、ＭＯＲ０４４５６およびＭＯＲ０４４７０をｐＭＯＲＰＨ(登録商標)＿ｈ＿ＩｇＧ１およびｐＭＯＲＰＨ(登録商標)＿ｈ＿ＩｇＧ４発現ベクターにクローニングする。ＩｇＧ２発現ベクターの作出のためには別の構築物が使用可能である。ＨＥＫ２９３細胞の一時的トランスフェクションにより小規模発現を行い、全長免疫グロブリンを細胞培養上清から精製する。
【０４２１】
これらのデータは、サイズ排除クロマトグラフィーにより、これらの抗体が単量体形態であることを示す。Ｗｎｔ３ａ依存性リポーターアッセイでの試験は、これらのタンパク質が機能的であることを明らかにした。
【０４２２】
実施例８：発現に関して至適化された遺伝子のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列
哺乳類発現を増強するために、細胞での発現のためのコドン利用を至適化する目的で、Ｆａｂの重鎖および軽鎖へ変異を導入する。いくつかの負のシス作用モチーフが哺乳類における発現を低下させることが知られている。この至適化プロセスは、発現に負の影響を及ぼす負のシス作用部位(スプライス部位またはポリ(Ａ)シグナルなど)を除去する。本明細書の至適化プロセスはさらにＧＣ含量を高めてｍＲＮＡ半減期を延長する。
【０４２３】
軽鎖可変および重鎖領域はＦａｂクローンＭＯＲ０４９４５(全長軽鎖親ヌクレオチド配列は配列番号９８であり、全長重鎖親ヌクレオチド配列は配列番号１０２である)を用いて至適化し、ファージディスプレーを用いた選択により単離する。次に、このクローンおよび他のクローン全長軽鎖および重鎖の各々をコードするヌクレオチド配列を、これらの手順を用いて各々至適化する。
【０４２４】
ＭＯＲ０４９４５のＶＨ鎖およびＶＬ鎖の至適化プロセス
哺乳類細胞での発現に関してＶＬ鎖およびＶＨ鎖の各々のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を至適化するために、コドン利用を哺乳類遺伝子のコドン傾向よりに合わせる。さらに、ＧＣ含量が極めて高い(＞８０％)または極めて低い(＜３０％)領域を可能な限り低減または排除する。あるいは、細菌、酵母またはバキュロウイルスでの発現のための至適化は、それらの個々の遺伝子の傾向としてのコドン利用の採用を伴う。
【０４２５】
哺乳類発現のための至適化プロセス中、次のシス作用配列モチーフを避ける：内部ＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ部位およびリボゾームエントリー部位、ＡＴ豊富またはＧＣ豊富配列ストレッチ、ＲＮＡ不安定モチーフ(ＡＲＥ)配列エレメント、阻害性ＲＮＡ配列エレメント(ＩＮＳ)、ｃＡＭＰ応答(ＣＲＳ)配列エレメント、リピート配列およびＲＮＡ二次構造、隠れた部位(cryptic site)および分岐点を含むスプライス供与部位および受容部位。特に断りのない限り、ＶＬ鎖のヌクレオチド配列を至適化するプロセスではＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の導入を避ける。特に断りのない限り、ＶＨ鎖のヌクレオチド配列を至適化するプロセスではＭｌｙＩおよびＢｓｔＥＩＩ部位の導入を避ける。
【０４２６】
発現に関して至適化されたＭＯＲ０４９４５のＶＨ鎖およびＶＬ鎖のアミノ酸配列
上記のクローンＭＯＲ０４９４５のＶＨ鎖およびＶＬ鎖に関して得られた至適化アミノ酸配列に対して哺乳類細胞での発現率より高くかつより安定にすることができるよう、コドン利用を哺乳類のものに合わせる。実施例５参照。
【０４２７】
下表１２Ａは、発現に関して至適化された可変軽鎖鎖のセンスおよびアンチセンス(ＡＳ)ヌクレオチド配列(配列番号１２０)と結果として得られた軽鎖可変鎖アミノ酸(ＡＡで表す)配列(配列番号１１８)を示す。
【０４２８】
表１２Ａ.発現に関して至適化されたＶＨ鎖のヌクレオチドセンスおよびアンチセンス配列とアミノ酸配列
【表１９】
0005552233.tif 000020
【０４２９】
表１２Ｂは、発現に関して至適化されたセンスおよびアンチセンス可変重鎖ヌクレオチド配列(配列番号１２１)と結果として得られた可変重鎖アミノ酸(ＡＡで表す)配列(配列番号１１９)を示す。
【０４３０】
表１２Ｂ.発現に関して至適化されたＶＨ鎖のヌクレオチドセンスおよびアンチセンス配列とアミノ酸配列
【表２０】
0005552233.tif 000021
【０４３１】
至適化前と後のチャートは、親配列および至適化遺伝子それぞれの配列コドンのパーセンテージを示し、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖をコードする関連ヌクレオチド配列の質的クラスを分析する。本明細書において質的値は、所望の発現系の、あるアミノ酸に用いられている最も多いコドンを１００として、残りのコドンを利用頻度に応じて尺度化されることを意味する(Sharp, P.M., Li, W.H., Nucleic Acids Res. 15 (3), 1987)。
【０４３２】
さらに、コドン・アダプテーション・インデックス(codon adaptation index, CAI)は、そのヌクレオチド配列のコドンが標的生物のコドン利用の偏好にいかに十分見合っているかを表す数値である。ＣＡＩの最大値は１.０とし、従って、ＣＡＩ＞０.９は高い発現が可能であるとみなされる。至適化前のＶＬ鎖のＣＡＩは０.７３であることが分かり、至適化後のＣＡＩは０.９５であると判定された。同様に、至適化前のＶＨ鎖のＣＡＩは０.７４であることが分かり、至適化後、至適化構築物のＣＡＩは０.９８であると判定され、ＶＬ鎖のＧＣ含量はＭＯＲ０４９４５の親配列の５１％からＭＯＲ０４９４５由来の至適化配列の６２％まで上昇した。図９Ａおよび９Ｂに示されているように、ＶＨ鎖のＧＣ含量は、ＭＯＲ０４９４５の親配列の５４％からＭＯＲ０４９４５の至適化誘導体の６４％まで上昇した。
【０４３３】
ＭＯＲ０４９１０、ＭＯＲ０４９４５、ＭＯＲ０４９４６およびＭＯＲ０５１４５の全長軽鎖および重鎖の発現に関する至適化
至適化プロセスを、ＭＯＲ０４９１０(配列番号９７)、ＭＯＲ０４９４５(配列番号９８)、ＭＯＲ０４９４６(配列番号９９)およびＭＯＲ０５１４５(配列番号１００)の親全長ヌクレオチド配列、ならびにＭＯＲ０４９１０(配列番号１０１)、ＭＯＲ０４９４５(配列番号１０２)、ＭＯＲ０４９４６(配列番号１０３)およびＭＯＲ０５１４５(配列番号１０３)の重鎖の親全長ヌクレオチド配列の各々に適用した。
【０４３４】
至適化プロセスを用い、親クローン番号と関連した次の軽鎖ヌクレオチド配列の各々を構築した：クローンＭＯＲ０４９１０ｂに対して、至適化ヌクレオチド配列は配列番号１０４；クローンＭＯＲ０４９４５に対して、至適化ヌクレオチド配列は配列番号１０５；クローンＭＯＲ０４９４６に対して、至適化ヌクレオチド配列は配列番号１０６；クローンＭＯＲ０５１４５に対して、至適化ヌクレオチド配列は配列番号１０７である。さらに、この至適化プロセスを用い、親クローン番号と関連した次の重鎖ヌクレオチド配列も構築した：クローンＭＯＲ０４９１０に対して、至適化ヌクレオチド配列は配列番号１０８；クローンＭＯＲ０４９４５に対して、至適化ヌクレオチド配列は配列番号１０９；クローンＭＯＲ０４９４６に対して、至適化ヌクレオチド配列は配列番号１１０；クローンＭＯＲ０５１４５に対して、至適化ヌクレオチド配列は配列番号１１０である。
【０４３５】
これらの至適化軽鎖ヌクレオチド配列は次の至適化軽鎖アミノ酸配列に関連している：クローンＭＯＲ０４９１０に対して、至適化アミノ酸配列は配列番号１１１；クローンＭＯＲ０４９４５に対して、至適化アミノ酸配列は配列番号１１２；クローンＭＯＲ０４９４６に対して、至適化アミノ酸配列は配列番号１１３；クローンＭＯＲ０５１４５に対して、至適化アミノ酸配列は配列番号１１４である。至適化重鎖ヌクレオチド配列は次の至適化重鎖アミノ酸配列に関連する：クローンＭＯＲ０４９１０に対して、至適化アミノ酸配列は配列番号１１５；クローンＭＯＲ０４９４５に対して、至適化アミノ酸配列は配列番号１１６；クローンＭＯＲ０４９４６に対して、至適化アミノ酸配列は配列番号１１７；クローンＭＯＲ０５１４５に対して、至適化アミノ酸配列は配列番号１１７である。
【０４３６】
意図される全長軽鎖および重鎖配列のヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の一覧を表１３Ａおよび表１３Ｂに示す。表１３Ａは、至適化ヌクレオチド配列とそれらによりコードされるポリペプチドを示す。これらのヌクレオチド配列は、哺乳類発現系で認識される潜伏スプライス部位を除去するよう至適化されている。表１３Ｂは、表１３Ａに挙げられているクローンの親ヌクレオチド配列を示す。
【０４３７】
表１３Ａ：軽鎖(ＬＣ)および重鎖(ＨＣ)配列−至適化
【表２１】
0005552233.tif 000022
【表２２】
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【表２３】
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【０４３８】
表１３Ｂ：軽鎖(ＬＣ)および重鎖(ＨＣ)配列−親
【表２４】
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【表２５】
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【０４３９】
実施例９：生物活性アッセイ
中和抗ＤＫＫ１／４抗体の生物活性は、ＳｕｐｅｒＴｏｐｆｌａｓｈ  Ｋｒｍ１７と呼ばれる遺伝的に改変された細胞系統ＨＥＫ２９３  Ｔ／１７  ＳＴＦ＿７０ＩＲＥＳ＿Ｋｒｍ＿(１７)を用い、リポーター遺伝子アッセイで測定する。この細胞系統はヒト胚腎臓細胞ＨＥＫ２９３に由来し、ｉ)プロモーターＴＣＦがホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に融合されたリポーター構築物、およびｉｉ)この細胞の表面でＫｒｍの過剰発現をもたらす構築物で安定にトランスフェクトされる。この細胞系統では、Ｗｎｔタンパク質曝露が用量依存的にルシフェラーゼの発現を刺激する。Ｗｎｔの存在下、最大より少ない一定用量のＤＫＫ１に段階的量の抗ＤＫＫ１／４抗体を添加すると、１６時間のインキュベーション期間中、ルシフェラーゼ発現の増強が起こる。この期間の終了時に、細胞溶解液中の酵素活性に基づき、ルシフェラーゼ量を定量する。ルシフェラーゼは基質ルシフェリンから化学発光生成物であるオキシルシフェリンへの変換を触媒する。次に、生じた白熱型の発光を適当な照度計で測定する。
【０４４０】
中和抗ＤＫＫ１／４抗体試験サンプルの生物学的効力は、ルシフェラーゼ発現増強力を参照標準の場合と比較することにより測定する。サンプルおよび標準をタンパク質含量に基づいてノーマライズする。次に、相対的効力を、欧州薬局方に従う平行線検定を用いて算出する。最終的な結果は、参照標準に対するサンプルの相対的効力(％)として表す。
【０４４１】
実施例１０：関連の生物標的に対するin vitro活性
低ナノモル範囲での親和性および細胞アッセイでの強力な活性を有する主要なＦＡｂを選択する。ＤＫＫ１の生理学的結合相手はＬＲＰ５／６(Ｋｄ〜３４０ｐＭ)ならびにＫｒｅｍｅｎ１および２(Ｋｄ〜２８０ｐＭ)[Mao 2001][Mao 2002]である。これらの高親和性相互作用を考えれば、生理学的ＤＫＫ１相互作用によりよく匹敵させるために、親和性をさらに改良することが望ましい。選択されたＦＡｂの親和性および生物活性を増強するために、三ヌクレオチド指定突然変異誘発[Virnekas 1994][Knappik 2000][Nagy 2002]を用いたカセット突然変異誘発により、ＣＤＲ−Ｌ３領域とＣＤＲ−Ｈ２領域を並行して至適化する。
【０４４２】
親和性成熟の後、低ピコモルの親和性を有し、ＥＣ５０が１ｎＭ以下の、ＤＫＫ１により阻害されたｗｎｔシグナル伝達を再活性化し、カニクイザル、マウスおよびラットＤＫＫ１と交差反応するＦＡｂを選択する。次に、このＦＡｂの可変領域を２つの異なるヒトＩｇＧ１フレームワークへと操作する。
【０４４３】
抗ＤＫＫ１／４抗体はヒトＤＫＫ１に対して高い親和性(２ｐＭ)を有し、この親和性の抗体に典型的な結合速度を伴う。図６参照。
【０４４４】
図６.方法：主要候補およびｒｈＤＫＫ１(組換えヒトＤＫＫ１)(Batch BTP7757)の結合親和性および結合速度を、ＣＭ５(Ｓ)センサーチップ(Cat#BR-1006-68)を含むBiacore  Ｔ１００(Biacore, Uppsala, Sweden)を備えた表面プラズモン共鳴を用いて測定する。抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ(Jackson Immuno Research. Cat#109-006-098)を各フローセルに固定化した後、主要候補を約１００ＲＵの予測捕捉で捕捉する。最後に、６種類の濃度のＤＫＫ１(０.１９５〜６.２５ｎＭの範囲)を、濃度反復１回で、このチップに流す。フローセルをＤＫＫ１の結合のために２４０秒活性化し、その後、３０分の解離を行う。ノーマライズしたデータ(バックグラウンドを差し引く)を、ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  １.０ソフトウエア中のＫｉｎｅｔｉｃｓ分析を用い、物質移動モデルで１：１結合に当てはめる。この実験を３回行い、示されているデータはこれら３回の実験の平均値と標準偏差である。
【０４４５】
実施例１１：エピトープマッピング
成熟ＤＫＫ１は２つのシステイン豊富領域(Ｃｙｓ−１およびＣｙｓ−２)を有する２６６個のアミノ酸のタンパク質である。Ｃｙｓ−２ドメインはＬＲＰとＫｒｅｍｅｎタンパク質双方との結合を担い、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害の必要十分条件である[Li 2002][Brott 2002]。免疫沈降実験(図７Ａ、７Ｂ)は、抗ＤＫＫ１／４抗体がＣｙｓ−２ドメインと特異的に結合するが、Ｃｙｓ−１ドメインとは特異的に結合しないことを示す。抗ＤＫＫ１／４抗体は変性ＤＫＫ１を用いるウエスタンブロット法において弱い活性しかなく、ペプチドマッピング実験では、そのタンパク質(ＪＴＰ)の長さを包含する重複する１５のアミノ酸ペプチドのいずれとも特異的に結合することは判明せず、このことは抗ＤＫＫ１／４抗体がＣｙｓ−２内の非線状エピトープを認識する可能性を示唆している。
【０４４６】
図７(Ａ)は、全長型および末端切断型のＤＫＫ１の模式図である。全長(ＦＬ、残基１〜２６６を含む)、カルボキシル末端切断型(ΔＣ、残基１〜１８５を含む)およびアミノ末端端切断型(ΔＮ、残基１〜６０および残基１５７〜２６６を含む)をＣ末端においてＨＡエピトープと融合させ、哺乳類発現ベクターのサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターの制御下にクローニングする。図７(Ｂ)は、中和抗ＤＫＫ１／４抗体とＤＫＫ１タンパク質の結合を示す。全長型、アミノ末端切断、カルボキシル末端切断型のＤＫＫ１タンパク質を含んで発現する一時トランスフェクトＨｅｋ２９３細胞由来の細胞馴化培地を抗リゾチームＩｇＧ１対照または抗ＤＫＫ１／４抗体とともに室温で２時間インキュベートし、タンパク質Ｇビーズ上で免疫複合体を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、トランスファーし、抗ＨＡ抗体でブロットする。合計産物の１／１０を対照として加える。
【０４４７】
実施例１１：エピトープマッピング−Ｎ−グリコシル化
Ｗｎｔシグナル伝達経路内のいくつかのタンパク質を、それらの細胞活性を調節する翻訳後酵素により共有結合的に修飾する。ＤＫＫ１を含むＤＫＫファミリーメンバーをＮ−グリコシル化により修飾する[Krupnik 1999]。ＤＫＫ１は、Ｃｙｓ−２ドメイン内の２５６番アミノ酸に理論的Ｎ−結合グリコシル化部位を１つ有する。このＣｙｓ−２ドメインの保存性の高い性質と、ＬＲＰ６に対するＤＫＫ１およびＤＫＫ１に対する抗ＤＫＫ１／４抗体双方の可能性のある結合部位を考え、本発明者らは、抗ＤＫＫ１／４抗体がＮ−グリコシル化型のＤＫＫ１を認識するかどうかを調べようと考えた。ＥＬＩＳＡは、抗ＤＫＫ１／４抗体がＮ−グリコシル化型のｒｈＤＫＫ１を、特異的なＮ−結合脱グリコシル化型のｒｈＤＫＫ１よりもはるかによく認識することを示す(表１４Ａ)。しかも、同タンパク質は、組換えタンパク質の融合エピトープタグ領域に対する二次抗体(抗ＨＩＳ)でも同様によく認識される。この親和性の違いを、表面プラズモン共鳴を用いて定量したところ、抗ＤＫＫ１／４抗体がグリコシル化ｒｈＤＫＫ１より、さらに脱グリコシル化タンパク質より１００倍高いＫＤを有することが分かった(表１４Ｂ参照)。
【表２６】
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【表２７】
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【０４４８】
抗ＤＫＫ１／４抗体と野生型(ＷＴ)ｒｈＤＫＫ１(ＨＥＫ  ＨＩＳエピトープタグ付きバッチ番号ＢＴＰ７７５７)およびＮ−結合脱グリコシル化(Ｎ−ＤＥＧＬＹ、酵素ＰＮＧアーゼＦ(Sigma, Cat# E-DEGLY)でＮ−結合脱グリコシル化した)ｒｈＤＫＫ１との結合をＥＬＩＳＡにより測定する。要するに、高結合ＥＬＩＳＡ(Ｎｕｎｃ＃４４２４０４)プレートを１μｇ／ｍｌのＷＴまたはＮ−ＤＥＧＬＹ  ＤＫＫ１でコーティングする。ＷＴ  ＤＫＫ１に対する抗ＤＫＫ１／４抗体および抗ＨＩＳ抗体の双方の結合を、それら個々のＮ−ＤＥＧＬＹの結合と比較した場合の比を示す。この実験を３種類の異なる濃度で行い(１つの代表的濃度のデータを示す)、全ての濃度で同様の結果であった。ＷＴおよびＮ−ＤＥＧＬＹ  ＤＫＫ１(ＨＥＫ２９３  バッチ番号ＢＴＰ７７５７)の双方に対する抗ＤＫＫ１／４抗体の結合親和性および結合速度を、Biacore  Ｔ１００を用いて測定する。抗ＤＫＫ１／４抗体は一貫してＷＴ  ＤＫＫ１の場合よりもＮ−ＤＥＧＬＹ  ＤＫＫ１に対して１００倍低い親和性を有していた。
【０４４９】
実施例１２：ＤＫＫファミリーメンバーの同一性％
ヒトＤｉｃｋｋｏｐｆファミリーは４つのパラログからなり(表１５参照)、そのうち３つ(ＤＫＫ１、２および４)はＬＲＰ６およびＫｒｅｍｅｎタンパク質と結合し、ＬＲＰ５／６のインターナリゼーションを誘導し、カノニカルなＷｎｔシグナル伝達を阻害する[Mao 2001][Mao 2003]。ＤＫＫ２はまた、ＬＲＰ６の過剰発現と相乗効果を示してＷｎｔシグナル伝達を増強するが、ＬＲＰ６とＫｒｅｍｅｎ２の同時発現がこの経路のＤＫＫ２阻害を回復させる[Mao 2003]。よって、ＤＫＫ２は細胞の状況に応じて作用薬およびアンタゴニストの双方としての働きをすることができる。ＤＫＫ３は、ＬＲＰ５／６とＫｒｅｍｅｎの相互作用を担うＣｙｓ−２ドメイン内を含め、最も保存性が低いファミリーメンバーであり、ＬＲＰまたはＫｒｅｍｅｎとは結合せず、かつ、Ｗｎｔシグナル伝達を遮断しないことから、他のＤＫＫファミリーメンバーと異なる[Mao 2001][Mao 2003]。
表１５  タンパク質全域およびＣｙｓ−２ドメイン内におけるＤＫＫファミリーメンバーの同一性％
【表２８】
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【０４５０】
ＤＫＫファミリーメンバー間の相同性を、アミノ酸一致の割合を比較するペアワイズ配列アラインメントのＡｌｉｇｎＸアルゴリズムを用いて評価する(Vector NTI Advanced 9.1.0)。ギャップオープニングペナルティとギャップエクステンションペナルティはそれぞれ１０と０.１とする。この評価にはタンパク質全域の比較ならびにＣｙｓ−２ドメインのみの比較を含んだ。上記の表に示されているように、ＤＫＫ１、２および４はタンパク質全域に３０〜４０％のアミノ酸配列相同性を有する。Ｃｙｓ−２ドメインのみの比較では、ＤＫＫ１と２はこの領域内に６９％相同性を有し、ＤＫＫ４はＤＫＫ１および２の同じドメインとだいたい５７％の相同性を有する。ＤＫＫ３が示す他のファミリーメンバーとの相同性は最低レベルである。全てのメンバーでＣｙｓ−２ドメイン内の相同性が最大である。
【０４５１】
実施例１３：ヒトＤＫＫファミリーメンバーに対する抗ＤＫＫ１／４抗体の親和性
ＤＫＫ１と結合する他、抗ＤＫＫ１／４抗体はＤＫＫ４とも結合する(表１６参照)。ＤＫＫ４に対する親和性はＤＫＫ１に対する親和性のおよそ１００倍低いが、なおナノモル以下であり、従って、生物学的かつ臨床的に適切である可能性がある。注目すべきことは、ＤＫＫ２もＤＫＫ４も、ＤＫＫ１のＣｙｓ−２ドメインにおいてグリコシル化の標的として推定されるアスパラギン残基を保存していないことである。予備的な免疫沈降実験では、抗ＤＫＫ１／４抗体がＤＫＫ２と特異的には結合しないことが示唆された。ＤＫＫ２と結合する抗ＤＫＫ１／抗体の結合親和性はＤＫＫ２の精製が上手く行った後に判定される。ＤＫＫ３の明らかに異なる機能と結合特性に一致して、抗ＤＫＫ１／４抗体はＤＫＫ３と結合しない。
表１６  ヒトＤＫＫファミリーメンバーに対する抗ＤＫＫ１／４抗体の親和性
【表２９】
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【０４５２】
ヒトＤＫＫファミリーのタンパク質の他のメンバーに対する抗ＤＫＫ１／４抗体の結合親和性および結合速度を、Biacore  Ｔ１００を用いて測定する。前記のように、抗ＤＫＫ１／４抗体と有意な結合を示すタンパク質に関して実験を３回行い、３回の実験の平均と標準偏差として報告する。相同性が最も低いファミリーメンバーであるＤＫＫ３は、バックグラウンドレベルを超える検出可能な結合を示さず、従って、ＮＳＢ(有意でない結合)と見なされる。同様に、最近のデータでは、本発明の抗ＤＫＫ１／４抗体がＤＫＫ２に対しても有意な結合を示さないことが示唆されている。
【０４５３】
実施例１４：抗ＤＫＫ１／４抗体はＤＫＫ１のＬＲＰ６に対する結合を遮断する
ＤＫＫ１は、ＬＲＰ５／６およびＫｒｅｍｅｎとの相互作用を介してそのＷｎｔ拮抗活性を媒介し、インターナリゼーションを誘導し、Ｗｎｔにより誘導されるＬＲＰ５／６とＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の相互作用を遮断する。抗ＤＫＫ１／４抗体は、図８の競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＤＫＫ１のＬＲＰ６に対する結合を競合的に阻害する。
【０４５４】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＤＫＫ１結合の可視化が可能なほど十分なレベルの内因性ＬＲＰ５または６を発現しない。しかしながら、ＬＲＰ６を表面輸送シャペロンタンパク質ＭＥＳＤと同時トランスフェクションすると、細胞表面にＧＦＰタグ付きＤＫＫ１が検出できるようになり、ＤＫＫ１／ＬＲＰ６相互作用の特異的性質を示す。抗ＤＫＫ１／４抗体と同じ可変領域を有するＭＯＲ０４９１０はこの相互作用を特異的に遮断する。
【０４５５】
抗ＤＫＫ１／４抗体の、ＤＫＫ１とＬＲＰ６との直接的結合を阻害する能力はＥＬＩＳＡにより測定する。要するに、非処理プレート(Fisher, Cat#12565501)を１μｇ／ｍｌの組換えＬＲＰ６(R&D Systems Cat#1505-LR)、次いで５００ｎｇ／ｍｌのｒｈＤＫＫ１でコーティングし、抗ＤＫＫ１／４抗体またはｈＩｇＧ１(抗リゾチームＭＯＲ３２０７、ＡＣＥ１０９１５)いずれかの濃度曲線を氷上で３０分間プレインキュベートし、その後、それらをＬＲＰ６コーティングプレートに２時間置く。プレートを洗浄し、ＤＫＫ１結合のレベルを抗ＤＫＫ１抗体(R&D Systems AF1096)で検出する。生のＯＤ値を示す(バックグラウンドを差し引いたもの)。漸増濃度の抗ＤＫＫ１／４抗体は、ＤＫＫ１とＬＲＰ６との結合を用量依存的に阻害するが、漸増濃度のｈＩｇＧ１はＤＫＫ１とＬＲＰ６の結合を遮断しない。
【０４５６】
ＭＯＲ０４９１０の、細胞表面でのＤＫＫ１／ＬＲＰ６結合を阻害する能力は、蛍光顕微鏡により測定する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｍｏｃｋトランスフェクトするか、またはＬＲＰ６およびＭＥＳＤをコードするプラスミドで一時的にトランスフェクトする。細胞を、抗リゾチームＦＡｂまたは抗ＤＫＫ１  ＦＡｂ  ＭＯＲ０４９１０と一緒にＤＫＫ１−ＧＦＰ細胞馴化培地とともに３７℃で１時間インキュベートし、蛍光顕微鏡で調べる。ＧＦＰの蛍光は、ＤＫＫ１−ＧＦＰと、原形質膜上で過剰発現したＬＲＰ６との結合を反映する。抗ＤＫＫ１／４抗体は細胞表面でのＤＫＫ１とＬＲＰ６との相互作用を遮断する。
【０４５７】
実施例１４：リポーターアッセイ−ＤＫＫ１の再活性化はＴＣＦ／ＬＥＦ遺伝子の転写を阻害する
カノニカルなＷｎｔシグナル伝達はβ−カテニンの核への輸送において最高となり、そこでＴＣＦ／ＬＥＦファミリーの転写因子と会合し、Ｗｎｔ応答性遺伝子の転写の増強をもたらす。リポーターアッセイは、ルシフェラーゼ遺伝子の転写を駆動し、Ｗｎｔ経路の調節の検出を容易にするＴＣＦ／ＬＥＦ応答性プロモーターを用いて確立される。このアッセイにおいて、ＤＫＫ１は、Ｗｎｔ３Ａ細胞馴化培地(ＣＭ)により誘導されたルシフェラーゼ活性を効果的に遮断する。抗ＤＫＫ１／４抗体はＤＫＫ１により抑制されたＷｎｔシグナル伝達を再活性化し、見掛けのＥＣ５０は０.１６ｎＭである(図９)。このアッセイは完全な抑制に約１ｎＭのＤＫＫ１を必要とし、抗体の親和性は２ｐＭであることから、このＥＣ５０はアッセイの感受性および抗ＤＫＫ１／４抗体競合の絶対的限界ではなくむしろ各タンパク質の相対量を反映する可能性がある。
【０４５８】
ＳｕｐｅｒＴｏｐｆｌａｓｈリポーターおよびＫｒｅｍｅｎで安定トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＤＫＫ１、５０％のＷｎｔ３ａ細胞馴化培地および種々の量の抗ＤＫＫ１／４抗体で処理する。１８時間後、ルシフェラーゼ活性をＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイキット(Promega)により測定する。
【０４５９】
実施例１５：リポーターアッセイ−前骨芽細胞様細胞におけるＤＫＫ１により阻害されたアルカリ性ホスファターゼ分泌の逆転
抗ＤＫＫ１／４抗体がより生理学的に関連のある状況でＤＫＫ１機能を遮断するかどうかを調べるために、Ｗｎｔにより媒介される、多能性マウス細胞系統Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２(１０Ｔ１／２)の骨芽細胞分化を測定するin vitroアッセイを確立した(図１０参照)。骨芽細胞分化の際、１０Ｔ１／２細胞はアルカリ性ホスファターゼ(ＡＰ)を分泌し、この現象はＤＫＫ１により阻害され得る。抗ＤＫＫ１／４抗体は、Ｗｎｔ３Ａ細胞馴化培地の存在下で１０Ｔ１／２分化のＤＫＫ１抑制を遮断するが、ＩｇＧ対照は遮断しない。
【０４６０】
Ｗｎｔはいくつかの細胞状況で増殖およびアポトーシスを誘導することが報告されており、β−カテニンの安定化または核局在により示されるようなＷｎｔ経路の活性化は多くの場合、腫瘍の進行と関連がある。さらに、数種の癌(例えば、結腸癌および黒色腫)でのＤＫＫ１のダウンレギュレーション[Gonzalez-Sancho 2005] [Kuphal 2006]は研究者に、ＤＫＫ１が数種の癌の腫瘍サプレッサーであり得ることを示唆するに至らせた。ＤＫＫ１が腫瘍増殖または腫瘍生存に作用を有するかどうかを調べるために、腫瘍細胞系統を抗ＤＫＫ１／４抗体で処理し、増殖の変化を分析した。供試した腫瘍細胞系統に、抗ＤＫＫ１／４抗体の添加により有意な影響を受けたことが判明したものはなかった。
【０４６１】
数種の癌細胞系統の生存および増殖に対する抗ＤＫＫ１／４抗体の作用をin vitroで評価する。このアッセイでは、抗ＤＫＫ１／４抗体(１００μｇ／ｍｌ)を腫瘍細胞系統とともにインキュベートし、３日後に、細胞数に対して直線的な関係を有する代謝活性細胞の指標として、細胞数をＡＴＰの定量(Promega, Cell Titer Glo Assay(登録商標))により表した。このアッセイは３種類の異なる血清濃度(無血清、最小増殖および完全増殖)で行う。非処置細胞およびｈＩｇＧ１処置細胞に比べて有意な変化は見られなかった。細胞系統上清をＥＬＩＳＡによりＤＫＫ１の発現に関して分析した。
【０４６２】
実施例１６：ＤＫＫ１の種交差反応および中和
中和抗ＤＫＫ１／４抗体をそのヒトＤＫＫ１に対する高い親和性および中和力だけでなく、有効性および安全性試験に用い得る他種とのその交差反応性に基づいても選択する。抗ＤＫＫ１／４抗体はマウス、ラットおよびカニクイザル(ｃｙｎｏ、Macaca fascicularis)ＤＫＫ１とも、ヒトＤＫＫ１の場合と同様の親和性で交差反応する(表１７参照)。さらに、抗ＤＫＫ１／４抗体は４種のＤＫＫ１全てに媒介されるＷｎｔ抑制活性を中和し(表１７)、このことはこれらの種が安全性および有効性双方のモデルに適切であるはずであることを示唆する。
表１７  ＤＫＫ１の種交差反応および中和
【表３０】
0005552233.tif 000031
【０４６３】
ヒト、カニクイザル、マウスおよびラットＤＫＫ１の親和性測定は、Ｍ−３８４  ＳＥＲＩＥＳ(登録商標)アナライザー(BioVeris, Europe)を用い、溶液平衡滴定(ＳＥＴ)によりアッセイする。溶液平衡滴定(ＳＥＴ)によるＫＤ決定のためには、ＩｇＧタンパク質の単量体画分(単量体含量少なくとも９０％、分析的ＳＥＣにより分析；Superdex75, Amersham Pharmacia)を用いる。液相での電気化学発光(ＥＣＬ)に基づく親和性測定およびデータ評価は基本的に[Haenel et al., 2005]により記載されているようにして行い、[Piehler et al., 1997]に従って改良した結合適合モデルを適用する。溶液中で、一定量のＭＯＲ４９１０  ＩｇＧを種々の濃度(連続３ｎ希釈系)のヒトＤＫＫ１(開始濃度４ｎＭ)で平衡化する。常磁性ビーズ(Ｍ−２８０ストレプトアビジン、Dynal)に結合させたビオチン化ヒトＤＫＫ１およびＢＶ−ｔａｇ(商標)(BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK)標識ヤギ抗ヒト(Ｆａｂ)’２ポリクローナル抗体を加え、３０分間インキュベートする。次に、非結合ＩｇＧの濃度を、Ｍ−３８４  ＳＥＲＩＥＳ(登録商標)アナライザー(BioVeris, Europe)を用い、ＥＣＬ検出により定量する。ラット、マウスおよびカニクイザルＤＫＫ１に対する親和性の測定は、溶液中のアナライトとしてヒトＤＫＫ１の代わりにマウス、ラットおよびカニクイザルＤＫＫ１を用い、本質的に上記の通りに行う。遊離ＩｇＧ分子の検出のため、常磁性ビーズに結合させたビオチン化ヒトＤＫＫ１を用いる。ＭＯＲ４９１０および抗ＤＫＫ１／４抗体は同等のＥＣ５０でヒトＤＫＫ１(Novartis)を中和し、抗ＤＫＫ１／４抗体はまた、サル(Novartis)、マウス(R&D Systems 1765-DK-010)およびラット(Novartis)ＤＫＫ１も中和する。ヒト、ラット、マウスおよびカニクイザルＤＫＫ１に対するＴＯＰＦＬＡＳＨリポーターアッセイは、Ｗｎｔ細胞馴化培地の阻害剤として、ヒトＤＫＫ１の代わりに各種の組換えＤＫＫ１を用い、本質的に上記のように行う(図９)。ラット組換えＤＫＫ１は、ＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイの有意な阻害を達成するためにより高い濃度のタンパク質を必要とした。
【０４６４】
実施例１７：ＰＣ３Ｍ２ＡＣ６異種移植片の脛骨内増殖に対する抗ＤＫＫ１／４抗体の作用
前立腺腫瘍転移は、骨溶解というより圧倒的に骨芽細胞様であるという点で骨転移の中でも特異的である[Keller 2001]。しかしながら、いっそう優勢な骨芽細胞的骨転移は骨溶解の基底領域を有し、特に患者がアンドロゲンアブレーション療法中である場合には、低い骨密度(ＢＭＤ)を有する場合が多い[Saad 2006]。最近、ＤＫＫ１がスイッチとして働き得ることが示され、これにより、ＤＫＫ１の発現は混合型骨芽細胞様／骨溶解性前立腺腫瘍細胞系統(Ｃ４−２Ｂ)の骨溶解特性を増強する。さらに、ＤＫＫ１のｓｈＲＮＡ抑制は、優勢な骨溶解性前立腺腫瘍細胞系統(ＰＣ３)の骨溶解活性を阻害した[Hall 2005][Hall 2006]。ＤＫＫ１のノックダウンもまた、腫瘍異種移植片の脛骨内増殖を阻害し、骨溶解活性が転移ニッチを確立するのに重要である可能性があるが、前立腺転移における続いてのＤＫＫ１の低下は腫瘍を骨芽細胞様の表現型に変換することを筆者らに推測させるに至らせた。
【０４６５】
骨溶解前立腺腫瘍モデルは、[Kim 2003]による方法から採用されている。ルシフェラーゼを安定発現する骨溶解性前立腺腫瘍細胞系統(ＰＣ３Ｍ)の変異体(ＰＣ３Ｍ２ＡＣ６)をマウスの脛骨に注入する。腫瘍の増殖をルシフェラーゼによりモニタリングするとともに、骨の変化をマイクロコンピューター断層撮影法(ｍｉｃｒｏ−ＣＴ)および組織学によりモニタリングする。腫瘍増殖を高めるのではなく、抗ＤＫＫ１／４抗体は腫瘍増殖の阻害に向かう傾向にあった。この阻害はどの研究でも有意ではないが、これまでに行った５つのうち５つの研究で一貫して見られ、腫瘍増殖に対する３用量の抗ＤＫＫ１／４抗体の作用を示す代表的な研究を図１１に示す。皮下ＰＣ３Ｍ２ＡＣ６異種移植片を有する抗ＤＫＫ１／４抗体処置マウスでも同様の有意でない阻害傾向が見られた。
【０４６６】
処置は移植５日後開始する(０.２×１０６細胞／動物)。抗ＤＫＫ１／４抗体を２０、６０および２００μｇ／マウス／日の用量で、１日１回(ｑ.ｄ.)、１週間に３回、２週間、ｉ.ｖ.投与する。対照ＩｇＧは２００μｇ／マウス／日で、１日１回(ｑ.ｄ.)、１週間に３回、２週間、ｉ.ｖ.投与する。ビヒクル対照(ＰＢＳ)は、１日１回(ｑ.ｄ.)、１週間に３回、２週間、ｉ.ｖ.投与する。最終的な有効性データおよび体重変化を処置後に算出する。
【０４６７】
このモデルを用い、本発明者らは、抗ＤＫＫ１／４抗体が腫瘍により誘発される皮層の骨損傷を阻害することが見出した。このモデルにおいて、小柱骨に対する作用が、腫瘍移植片および擬似移植片の双方が骨に対する機械的損傷を引き起こし、その結果、後に再構成される網状骨の初期増加をもたらし、それにより見掛けの骨量増加が見られるという所見により混乱をきたした。従って、全骨容量／小柱容量(ＢＶ／ＴＶ)比に対する新たに形成された網状骨と小柱の相対的作用ははっきりしない。しかしながら、抗ＤＫＫ１／４抗体が腫瘍移植脛骨および擬似移植脛骨の双方において骨の産生を高め、再構成を伴う骨容量の低下を阻害する、または遅延させることは明らかである。同じ腫瘍誘発骨溶解モデルを用い、抗ＤＫＫ１／４抗体は、ゾメタと同等の抗骨溶解活性を示す(図１２参照)。この抗ＤＫＫ１／４抗体の骨代謝作用は、２０〜２００μｇ／マウスの範囲の用量応答性であり、最小有効用量は２０〜６０μｇ／マウスの間である(図１３参照)。これらのデータを合わせると、抗ＤＫＫ１／４抗体は、腫瘍により誘発される骨溶解性疾患に影響を有するはずであるが、骨粗鬆症または骨折の修復の促進などの非腫瘍性疾患にも効果的である可能性が示唆される。
【０４６８】
実施例１８：抗ＤＫＫ１／４抗体は腫瘍移植脛骨および擬似移植脛骨の双方において高い骨密度を維持する
マウスにおける有効性の薬力学的マーカーを評価する努力において、骨代謝の３つの血清マーカー：オステオカルシン(ＯＣ)、オステオプロテジェリン(ＯＰＧ)および核因子κＢリガンドの分泌型受容体アクチベーター(ｓＲＡＮＫＬ)を分析した。予測されるこの抗体の作用機序のために、より典型的な破骨細胞マーカーよりもこれらの骨芽細胞マーカーが用いられる。しかしながら、腫瘍を有する動物とナイーブ動物で、一貫した変化は検出されない。ミクロ−ＣＴまたはＩＨＣにより測定したところ、これらのマーカーはいずれも一貫して見られず、骨損失の相関性は無かった。
【０４６９】
処置マウスの脛骨のミクロＣＴ再構成の代表例を図１２Ａに示す。皮層損傷は０＝損傷無し〜３＝重篤な損傷としてスコアリングする。図１２Ｂ。腫瘍移植脛骨の皮層損傷は、試験群に関して盲検化したミクロＣＴ分析により手動でスコアリングする。擬似移植足には皮層損傷は見られなかった。
【０４７０】
方法：１２週齢の雌ヌードマウスを左脛骨に２×１０５のＰＣ−３Ｍ２ＡＣ６細胞を脛骨内移植し、右脛骨には擬似注入を行う。処置は移植５日後に開始する。ＮＶＰ−抗ＤＫＫ１／４抗体−ＮＸ(抗ＤＫＫ１／４抗体)およびＩｇＧ対照を２００μｇ／マウス／日の用量で、１日１回(ｑ.ｄ.)、１週間に３回、２週間ｉ.ｖ.投与する。ビヒクル(ＰＢＳ)対照も１日１回(ｑ.ｄ.)、１週間に３回、２週間ｉ.ｖ.投与する。μ−ＣＴ  ＶｉｖａＣＴ４０スキャナー(SCANCO, Switzerland)を用い、腫瘍移植７、１４および１８日後に動物をスキャンする。小柱骨密度(ＢＶ／ＴＶ)を方法に記載されているように分析する。アスタリスク(＊)は同時点でのビヒクルおよびＩｇＧ対照(ｎ＝１２)双方との統計学的有意差を示す(ｐ＜０.０５)。
【０４７１】
図１３において、骨量を測定するために、小柱の二次的海綿質をギムザ染色に基づき、Ｚｅｉｓｓ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｚ.１およびＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウエアで画像化する。読み取りは視野全体の石灰化した骨の％に基づく。各列は、示された動物数の平均と標準偏差を表す。ＰＢＳ、ＩｇＧおよび抗ＤＫＫ１／４抗体処置群のうち、腫瘍を有する動物だけを分析する。右足に擬似注入は行われず、左足に腫瘍を有した。統計学：ダネットの多重比較一元配置ＡＮＯＶＡ試験。左足または右足をＰＢＳ群の各足と比較した(Ｐ＜０.０５＊、ｐ＜０.０１＊＊、ｐ＞０.０５ｎ.ｓ.)。
【０４７２】
図１４は、抗ＤＫＫ１／４抗体の同化骨有効性が用量依存的であり、最小有効用量が２０〜６０μｇ／マウス、３回／週であることを示す。１２週齢の雌ヌードマウスは、左脛骨に２×１０５のＰＣ−３Ｍ２ＡＣ６細胞を脛骨内移植し、右脛骨に擬似注入を行う。移植６日後に処置を開始する。ＮＶＰ−抗ＤＫＫ１／４抗体−ＮＸ(抗ＤＫＫ１／４抗体)を、２０、６０および２００μｇ／マウス／日の用量で、１日１回(ｑ.ｄ.)、１週間に３回、２週間、ｉ.ｖ.投与する。対照ＩｇＧは２００μｇ／マウス／日を、１日１回(ｑ.ｄ.)、１週間に３回、２週間、ｉ.ｖ.投与する。ビヒクル対照(ＰＢＳ)は、１日１回(ｑ.ｄ.)、１週間に３回、２週間、ｉ.ｖ.投与する。μ−ＣＴ  ＶｉｖａＣＴ４０スキャナー(SCANCO, Switzerland)を用い、腫瘍移植後７日目および２０日目に動物をスキャンする。小柱骨密度(ＢＶ／ＴＶ)を方法に記載されているように分析する。アスタリスク(＊)は同時点でのビヒクル、ＩｇＧ、ドリルのみおよびナイーブ動物を含む全ての対照との統計学的有意差を示す(ｐ＜０.０５)。
【０４７３】
実施例１８：バイオマーカーの状態
ＤＫＫ１バイオ
ＤＫＫ１のＲＮＡ発現パターンはすでに記載されている。Krupnik (1999)は、ノーザンブロット分析による胎盤での発現を示し、心臓、脳、肺、肝臓、骨格筋または膵臓では発現は検出されなかった。Wirths (2003)は、肝臓、腎臓および乳房でのＲＮＡ発現は無いが、肝芽細胞腫およびビルムス腫瘍の一部にＲＮＡ発現が見られることを示している。ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりＤＫＫ１の消化管発現を調べている研究者らは、正常または悪性にかかわらず、胃および結腸での発現は無いことを示している(Byun 2006)。
【０４７４】
マウスにおけるＲＮＡ発現分析では、ＤＫＫ１の発現レベルは骨で高く、胎児および胎盤では中程度であり、褐色脂肪組織、胸腺および十二指腸では弱いことが明らかになった[Li 2006]。
【０４７５】
ＤＫＫ１タンパク質の発現は、現行の研究で用いられているものと同じヤギ抗体を用い、骨髄腫標本で評価する(Tian, 2003)。この論文では、低悪性度形態の患者の骨髄腫細胞で発現が見られ、５人の対照被験者の骨髄生検標本ではＤＫＫ１タンパク質の発現は検出されない。
【０４７６】
治療用抗体抗ＤＫＫ１／４抗体の組織分布および種交差反応性は、一連の正常ヒトおよびサル組織に対してスクリーニングすることにより調べる。組織全体の切片および組織マイクロアレイの双方を評価する。陽性対照として市販のＤＫＫ１抗体を含め、同じ組織セットで評価する。
【０４７７】
ＤＫＫ１＿１５(ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＤＫＫ１／４抗体)およびＤＫＫ１＿８(ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ＤＫＫ１、R&D Systems、# AF1096、ロットGBL013101およびGBL14111)。
【０４７８】
他のバイオマーカー
ＤＫＫ１の病態生理学的役割についてはほとんど知られていないことから、バイオマーカー試験による抗ＤＫＫ１／４抗体のin vivo作用およびこれをさらなる開発にいかに活用することができるかについての知識基盤を構築する多大な努力が注がれ、また、注がれてきた。着目される重点領域として次のものが含まれる。
１)破骨細胞活性および骨芽細胞活性の循環マーカーの測定による正常な、および転移性の骨代謝における抗ＤＫＫ１／４抗体の作用を理解すること
２)目的適応を確立および拡大するための多発性骨髄腫および他の腫瘍におけるＤＫＫ１の発現レベルの比較
３)β−カテニンの活性化を評価するための、結腸、骨髄、肺、皮膚および乳房などの重要組織の遺伝子発現レベルにおける作用
【０４７９】
予備的な分子疫学的研究では、多発性骨髄腫患者におけるＤＫＫ１血清レベルの上昇が確認され、この適応におけるＰＯＣを助ける。
【０４８０】
既存の知識に基づき、表１８は、抗ＤＫＫ１／４抗体に対して提案される潜在的バイオマーカーを示す。
【表３１】
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【０４８１】
実施例１９：抗ＤＫＫ１抗体の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列
抗ＤＫＫ１抗体の軽鎖および重鎖可変領域の全アミノ酸配列(そのＣＤＲ領域は表５、６、１１Ａおよび１１Ｂに示されている)を表１９に示す。
【０４８２】
【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【０４８３】
表１９の可変領域ＣＤＲおよびＦＲセクションを、重鎖に関しては表２０Ａに(配列番号２〜２０；ＶＨ３は配列番号１２５、ＶＨ５は配列番号１２６)、κ軽鎖に関しては表２０Ｂに９(配列番号２１、２２、２３、２７、２８および２９；ＶＫ１は配列番号１２７、ＶＫ３は配列番号１２８)、λ軽鎖に関しては表２０Ｃにアライメントを示す(配列番号２４、２５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６および３７；ＶＬ２は配列番号１２９、ＶＬ１は配列番号１３０)。 
表２０Ａ  抗ＤＫＫ１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列アライメント(配列番号２〜２０、１２５〜１２６)
【表３５】
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【０４８４】
表２０Ｂ.抗ＤＫＫ１抗体のκ軽鎖可変領域のアミノ酸配列のアライメント(配列番号２４〜２５、３０〜３７、１２９〜１３０)
【表３６】
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【０４８５】
表２０Ｃ.抗ＤＫＫ１抗体のλ軽鎖可変領域のアミノ酸配列のアライメント(配列番号)
【表３７】
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【０４８６】
コンセンサスＣＤＲ配列を少なくとも配列番号４０〜４８および表１１Ｂに示す。さらなるコンセンサスＣＤＲ配列は、当業者であれば、標準的な方法および本明細書に示される方法を用い、表２０Ａ〜２０Ｃのアライメントから決定することができる。
【０４８７】
均等
以上の本発明の特定の態様の詳説から、新規な抗体およびその免疫学的フラグメントが述べられたことは明らかである。本明細書では特定の態様が詳細に開示されているが、これは単に例示のために例として示されたものである。特に、本発明者らは、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の置換、変更および改変が行えることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０４８８】
【図１】非洗浄ビーズを種々のＨｕＣＡＬ(登録商標)ストリンジェンシーで洗浄したビーズと比較した場合に、Ｓｔｒｅｐ−ＴａｃｔｉｎコーティングビーズからのＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１の有意な損失はないことを示すグラフである。
【図２】実施例３に示される１００μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬を用いたＷｎｔ活性アッセイの結果を示す棒グラフである。
【図３】酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)のグラフである。
【図４】実施例６に示される標準的なＷｎｔ３ａ依存性ＴＣＦ／ＬＥＦ  ｌｕｃリポーターアッセイを示すグラフである。
【図５】Ｋｒｅｍｅｎ共受容体タンパク質の同時発現により媒介されるＤＫＫ１に対して極めて高い感受性を示す修飾型のＴＣＦ／ＬＥＦ  ｌｕｃリポーターアッセイを示すグラフである。
【図６Ａ】ＤＫＫ１と結合する抗ＤＫＫ１／４抗体の表面プラスミン共鳴(surface plasmin resonance)のグラフ表示である。
【図６Ｂ】算出された結合親和性と動態値の表である。
【図７Ａ】エピトープマッピングの用いるための全長および末端切断型ＤＫＫ１の模式図である。
【図７Ｂ】本発明の抗体と図７ＡのＤＫＫ１タンパク質およびフラグメントとの結合を示す。
【図８】競合的ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＤＫＫ１／４抗体結合アッセイのグラフ表示である。
【図９】下流のＷｎｔ関連遺伝子転写の、ＤＫＫ１／４抗体関連の再活性化のグラフ表示である。
【図１０】ＡＬＰ分泌のＤＫＫ１／４抗体逆転ＤＫＫ１阻害のグラフ表示である。
【図１１】in vivo異種移植に対するＤＫＫ１／４抗体作用のグラフ表示である。
【図１２】in vivoにおけるＤＫＫ１／４抗体に関連する骨密度の上昇のグラフ表示である。
【図１３】ゾメタの抗骨溶解効力とＤＫＫ１／４抗体と比較したグラフ表示である。
【図１４】同化骨に対するＤＫＫ１／４抗体の用量依存的効力のグラフ表示である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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