(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
i)二官能性試薬の溶液の存在下、多孔質セルロース高分子膜に塩基を添加して、その中でセルロース高分子を架橋する；
ii)前記膜と配位子を導入する試薬とを反応させる、前記配位子は正または負に帯電した基を含む、
各段階を含むプロセスにより製造した多孔質架橋帯電セルロース高分子膜であって、得られる多孔質架橋帯電セルロース高分子膜は水溶液中で40〜250容積％膨潤し、前記ｉ）において二官能性試薬の溶液中の濃度は0.25−2容積％であり、そして、二官能性試薬はエピクロロヒドリンであることを特徴とする、前記高分子膜。
【請求項２】
請求項１に記載の膜の使用を含む、第一成分と第二成分の結合または吸着の差をベースとして溶液または懸濁液中で第一成分を第二成分から分離する方法。
【請求項３】
請求項１に記載の膜の使用を含む、溶液中の他成分から標的分子を分離する方法であって、前記方法はクロマトグラフィー法である、前記方法。
【請求項４】
前記標的分子は、膜中に存在するクロマトグラフィー配位子と結合する結合部分を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記標的分子はタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記標的分子はポリヌクレオチドである、請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
前記標的分子はウイルスである、請求項３または４に記載の方法。
【請求項８】
前記溶液は細胞抽出物、細胞溶解物または細胞培養物である、請求項２〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記配位子及び前記結合部分は特異的結合対の一部である、請求項３または４のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記配位子及び前記結合部分は、ビオチン/ストレプトアビジン(steptavidin)、ビオチン/アビジン、ビオチン/ニュートラアビジン、ビオチン/カプタビジン(captavidin)、エピトープ/抗体、プロテインA/免疫グロブリン、プロテインG/免疫グロブリン、プロテインL/免疫グロブリン、GST/グルタチオン、His-tag/ニッケル、抗原/抗体、FLAG/M１抗体、マルトース結合タンパク質/マルトース、キチン結合タンパク質/キチン、及びカルモジュリン結合タンパク質/カルモジュリンからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結合配位子で置換したときに、標的分子、特に生体分子の吸着能力を高めるためのセルロース高分子膜の架橋プロセスに関する。本発明はまた、本発明のプロセスにより製造した膜を使用して溶液から標的分子を分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的分子のクロマトグラフィー分離は、新規生物学的製剤及び診断試薬の大規模製造などの化学及びバイオテクノロジー分野では商業的関心が強い。さらに、ヒトゲノムにより発現されたタンパク質の機能が研究されるプロテオミクス分野での進歩により、近年、タンパク質精製は非常に重要になってきた。タンパク質の他に、プラスミドDNAなどの核酸及びウイルス粒子などの粒子もワクチン製造及び遺伝子治療目的のためクロマトグラフィー手段により精製する必要がある。
【０００３】
通常、タンパク質は細胞培養によって産生され、タンパク質は細胞内にあるか、または周囲培地に分泌される。使用される細胞株は有機体であるので、これらは糖、アミノ酸、成長因子などの複雑な成長培地で培養しなければならない。栄養物及び細胞副生成物の複雑な混合物から治療に利用するのに十分なレベルまで所望のタンパク質を分離且つ精製するのは難題である。
【０００４】
多孔質ポリスルホン及びセルロース膜は、化学的及び生物学的混合物を濾過及び分離するのに広く使用されている(たとえば欧州特許第0483143号：特許文献１)。これらの膜としては限外濾過及び精密濾過膜が挙げられ、濾過プロセスは静水圧差(hydrostatic  pressure  differential)をベースとする。限外濾過膜は、500〜1,000,000ダルトンの範囲の分子量をもつ高分子を保持できる孔径を特徴とする。
【０００５】
精密濾過膜は、泡立ち点試験により測定されるように、0.01〜10ミクロン(μｍ)の直径の選択透過性細孔を示す。標的種と結合させるために膜を配位子で置換する吸着分離に関しては、通常、精密濾過膜が使用される。細孔濾過(pore  filtration)作用を避けるために、＞0.1μｍ、さらには＞0.5μｍの孔径、即ち目的とする最大標的種サイズを十分に超え、且つ早い流速を与えるのに十分に高い膜を使用するのが好ましい。より大きな孔径では流速はより早くなるが、慣用の膜を使用すると、利用可能な表面積が少ないため、吸着能は低すぎるだろう。
【０００６】
広範に使用されているにもかかわらず、セルロース膜には、強酸及び強塩基、並びにセルラーゼ酵素による攻撃に対する感受性などの多くの不都合な点がある。塩基に対する感受性は、初期は収縮及び膨潤を特徴とし、最終的には膜の分解につながる。高温は化学的崩壊及び収縮を促進する一方で、特に相当濃度のアルカリと結びつくと、低温は膨潤及び破裂を促進する。膜の細孔構造は容易に破壊されることがあるので、膜を通る流速は大きく低下する。
【０００７】
繊維工業の経験から、架橋によってセルロース繊維により優れた特徴を付与し得ることは昔から公知であった(Kirk-Othmer’s  Encyclopedia  of  Chemical  Technology，第22巻，770〜790頁、第三版、1983年：非特許文献１)。そのような架橋は、セルロース膜の物理的強度及び耐薬品性を改善するために特に望ましい。さらに膜の化学的誘導体化が望ましい場合に、たとえばセルロースポリマーのヒドロキシル基にタンパク質結合配位子を結合させるには、塩基に対する感受性が特に重要である。
【０００８】
従って、本発明の目的は、帯電配位子で置換したときに、タンパク質、核酸及びウイルスなどの標的分子に対して高い吸着能力をもつ多孔質架橋帯電セルロース高分子膜(porous  cross-linked  charged  cellulosic  polymeric  membrane)を提供することである。本発明のさらなる目的は、その高い流量/流速にも、その最小タンパク質吸着能及び柔軟性にも悪影響を与えないプロセスで架橋セルロース高分子膜を提供し、且つさらに化学的変性させるために高い耐塩基性を膜に付与することである。本発明のさらなる目的は、上記プロセスによって製造した膜を提供することである。本発明のさらなる目的は、標的分子の結合親和性をベースとして前記膜を使用して溶液中の他の成分から標的分子を分離する方法を提供することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】欧州特許第0483143号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Kirk-Othmer’s  Encyclopedia  of  Chemical  Technology，第22巻，770〜790頁、第三版、1983年
【発明の概要】
【００１１】
本発明の第一の側面に従って、
i)二官能性試薬の溶液の存在下、多孔質セルロース高分子膜に塩基を添加し、その中でセルロース高分子を架橋する；
ii)前記膜と配位子を導入する試薬とを反応させる、前記配位子は正または負に帯電した基を含む、
各段階を含む多孔質架橋帯電セルロース高分子膜の製造プロセスであって、得られる多孔質架橋帯電セルロース高分子膜は水溶液中で40〜250容積％膨潤することを特徴とする、前記製造プロセスを提供する。
【００１２】
段階i)及びii)は、連続してまたは同時に実施できることは理解されよう。
好ましくは、得られる膜は水溶液中で50〜250容積％、より好ましくは100〜250容積％、最も好ましくは125〜250容積％まで膨潤する。
【００１３】
好適には、前記塩基は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、水酸化テトラアルキルアンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシウム、三リン酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、炭酸カリウム、ケイ酸カリウム、三リン酸カリウム及び炭酸水素ナトリウムからなる群から選択される。
【００１４】
好適には、前記セルロース高分子膜は、セルロースエステル、セルロースエーテル、セルロース水和物、カルバミン酸セルロース、キサントゲン酸セルロース、セルローススルホンまたはその任意の混合物を含む。
【００１５】
好適には、前記セルロースエステルは、酢酸セルロース、硝酸セルロース、キサントゲン酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロース、安息香酸セルロース及びその混合物からなる群から選択されるエステルである。
【００１６】
好適には、前記セルロースエーテルは、メチルセルロース、エチルセルロース、プロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びカルボキシメチルセルロースからなる群から選択されるエーテルである。
【００１７】
好適には、前記二官能性試薬は、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジイソシアネート、ジメチル尿素、ジメチルエチレン尿素、ジメチルクロロシラン、ビス(2-ヒドロキシエチルスルホン)、グリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ジビニルスルホン、アルキレンジハロゲン及びヒドロキシアルキレンジハロゲンからなる群から選択される。
【００１８】
好適には、前記グリシジルエーテルは、ブタンジオールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル及びポリエチレングリコールジグリシジルエーテルからなる群から選択される。
【００１９】
好ましくは、前記二官能性試薬はエピクロロヒドリンである。
好適には、二官能性試薬の混合物を使用する。
好適には、前記試薬は、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド(GMAC)、ジエチルアミノエチルクロリド、アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド(GMAC)、アクリロニトリル、エピクロロヒドリン、トリメチルアミン、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、臭化アリル、重亜硫酸塩、アリルグリシジルエーテル/ビサルファイト、ビニルスルホン酸ナトリウム、スチレンスルホネート、アクリル酸、アクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、臭化シアノゲン、クロロトリアジン、ジグリシジルエーテル、N-ヒドロキシスクシンイミド、塩化トシル、塩化トレシル及びジイソシアナートからなる群から選択される。
【００２０】
前記配位子は、正または負に帯電した基を含む；そのような基の例としては、四級アンモニウムイオン、アミン、アミジン、ピリジン、ピリジニウムイオン、イミダゾール、イミダゾリニウムイオン、ホスホニウムイオン、スルホニウムイオン、スルホネート、サルフェート、ホスフェート、ホスホネート、フェノール及びカルボキシレート並びにその任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
好適には本プロセスは、無機塩の存在下で実施する。好ましくは、塩は硫酸ナトリウムである。
好適には膜は、0.1〜10μｍ、好ましくは0.5〜10μｍ、最も好ましくは0.8〜5.0μｍの孔径の細孔を含む。
【００２２】
好適には、膜は複数の酢酸セルロース基を含む。
好適には、前記膜は複数の酢酸セルロース基を含み、前記塩基は水酸化ナトリウムであり、前記二官能性試薬はエピクロロヒドリンであり、前記試薬はグリシジルトリメチルアンモニウムクロリド(GMAC)であり、且つ前記塩は硫酸ナトリウムである。
【００２３】
好適には、架橋プロセスは20℃〜60℃で少なくとも１時間の間実施し、好ましくは45℃〜55℃で少なくとも1時間の間実施し、より好ましくは45℃〜55℃で６〜８時間実施し、最も好ましくは47℃の温度で18時間実施する。
【００２４】
本発明の第二の側面において、
i)二官能性試薬の溶液の存在下、多孔質セルロース高分子膜に塩基を添加して、その中でセルロース高分子を架橋する；
ii)前記膜と配位子を導入する試薬とを反応させる、前記配位子は正または負に帯電した基を含む、
各段階を含むプロセスにより製造した多孔質架橋帯電セルロース高分子膜であって、得られる多孔質架橋帯電セルロース高分子膜は水溶液中で40〜250容積％膨潤することを特徴とする、前記高分子膜を提供する。
【００２５】
本発明の第三の側面に従って、上記膜の使用を含む、第一成分と第二成分の結合または吸着の差をベースとして溶液または懸濁液中で第一成分を第二成分から分離する方法を提供する。
【００２６】
本発明の第四の側面に従って、前記膜の使用を含む、溶液中の他成分から標的分子を分離する方法であって、前記方法はクロマトグラフィー法である、前記方法を提供する。
従って本発明の膜は、標的分子または化合物の単離、特に生体分子の単離に使用することができる。そのような生体分子としては、タンパク質(たとえばモノクローナル若しくはポリクローナル抗体、抗体フラグメント、宿主タンパク質、膜タンパク質、プリオン)、ペプチド(たとえばジペプチド若しくはオリゴペプチド)、核酸(たとえばDNA、プラスミドDNA、RNA)、ペプチド核酸、エンドトキシン、ウイルス、細胞(たとえば細菌性細胞、哺乳類細胞)、細胞小器官及び細胞片が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは膜は代謝産物及び薬剤候補などの有機分子を単離するのに有用である。別の態様では、本発明の膜は、診断目的のためなどの上記分子または化合物のいずれか一つを同定するのに有用である。かくして、本発明の膜を使用して精製した製品は薬剤または薬剤標的；治療で使用するためのベクター、たとえば遺伝子治療で使用するためのプラスミド若しくはウイルス；機能化食品などの補充食；及びin-vitro及びin-vivo診断薬であってもよい。本発明に従って精製した生体分子の具体的な用途は、オーダーメード医療用薬剤である。本発明に従った膜は、上記のような不都合な標的化合物から所望の液体を精製するのにも有用である。
【００２７】
好適には標的分子は、膜に存在する配位子と結合する結合部分(binding  moiety)を含む。標的分子は任意の有機または無機分子であってもよいが、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはポリヌクレオチドなどの生体分子であるのが好ましい。場合により、標的分子はウイルスまたはウイルスの化学成分である。
【００２８】
好適には、前記溶液は溶媒抽出物、細胞溶解物または細胞培養物である。
好適には、前記配位子及び結合部分は特異的結合対の一部である。好ましくは、配位子及び前記結合部分は、ビオチン/ストレプトアビジン(steptavidin)、ビオチン/アビジン、ビオチン/ニュートラアビジン、ビオチン/カプタビジン(captavidin)、エピトープ/抗体、プロテインA/免疫グロブリン、プロテインG/免疫グロブリン、プロテインL/免疫グロブリン、GST/グルタチオン、His-tag/ニッケル、抗原/抗体、FLAG/M１抗体、マルトース結合タンパク質/マルトース、キチン結合タンパク質/キチン、カルモジュリン結合タンパク質/カルモジュリン(Terpe，2003，Appl  Microbiol  Biotechnol，60，523-533)及びLumio(商標)試薬/Lumio(商標)認識配列からなる群から選択される。umio(商標)試薬及び認識配列は、Invitrogen  Life  Corporation，Carlsbad，CA、アメリカより市販されている。
【００２９】
配位子/結合部分の他の例は、酵素阻害剤/酵素(たとえばベンズアミジンまたはアルギニン及びセリンプロテアーゼ、たとえばカタラーゼ)、ヘパリン/凝固因子、リジン/プラスミノーゲンまたはリボソームRNA、Procion  Red/NADP+依存性酵素、チバクロン青(Cibacron  Blue)/血清アルブミン、コンカナバリンA/グルコピラノシル及びマンノピラノシル基、並びにプロテインAまたはプロテインC/IgGのFc領域がある。
【００３０】
定義
本発明の状況で適用される「架橋した(cross-linked)」なる用語は、高分子の剛性及び／または安定性を高める高分子(即ちセルロース高分子)の様々な鎖または一本の鎖の部分の間に側部結合があることを意味する。架橋度とは、単位体積当たりのそのような側部結合数を意味する。ゴム弾性理論から、架橋度が増加するにつれて高分子溶液中の平衡膨潤は増加することが公知である。
【００３１】
本明細書において、「膜」なる用語は、通常、柔軟な薄シートまたは層を意味し、これは一つ以上の細孔を含み、通常、一表面上及びその反対面上の溶液との間でフィルターとして機能する。誤解を避けるために「多孔質(porous)」なる用語は、その物品が一つ以上の細孔(pore)を含むことを示すために膜またはフィルターに関して本明細書中で使用する。
【００３２】
「塩基」なる用語は、プロトンを得る傾向がある物質を意味する慣用の化学的意義をもつ。たとえば、塩基は水溶液中で酸と反応して、塩と水だけを形成する物質であるので、ヒドロキシルイオンを提供する物質である。
【００３３】
本明細書中で使用される「二官能性試薬(bifunctional  reagent)」なる用語は、一分子中の二つの基、または二つの異なる分子それぞれの中の一つの基と相互作用し得る二つの反応性官能基をもつ化合物を意味する。
【００３４】
「配位子(ligand)」なる用語は、標的分子と結合し得る任意の化学部分(chemical  moiety)を意味する。配位子は一つ以上の帯電基を含み、数個の原子を含む小分子フラグメントから大きく構造的に複雑なタンパク質まで変動する、任意のサイズ及び複雑性であってもよい。
【００３５】
「帯電基(charged  group)」なる用語は、特定のpH値でまたは全pH範囲にわたって電気的に帯電している少なくとも一つの官能基を含む基を意味する。
「標的分子」なる用語は、本発明の方法により吸着用に標的とされる任意の化合物または構成要素(entity)を包含するものと理解されよう。
【００３６】
「クロマトグラフィー」なる用語は、密接に関連した分離法の一群を包含する。そのような方法は、一つの相が固定相で他方が移動相である、二つの相互に非混和性相を接触させる機構に全て基づいている。本発明において、膜は固定相を構築し、溶液は移動相を構築する。クロマトグラフィーは、汚染化合物から液体を精製するため、あるいは液体から一種以上の具体的な化合物を回収するために使用できる。
【００３７】
通常、細胞及び／または細胞破片は濾過により除去してきた。たとえば重要なタンパク質を含む浄化溶液が得られたら、溶液の他成分からの分離は通常、種々のクロマトグラフィー法を組み合わせて実施する。これらの手法はその帯電、疎水性度、親和性、サイズなどをベースとしてタンパク質の混合物を分離する。これらの手法のそれぞれに関して幾つかの異なるクロマトグラフィー充填材が利用可能であり、含まれる特定のタンパク質に合わせて精製スキームを調整できる。本発明において、タンパク質は主に帯電及び／または親和性/吸着性をベースとして分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、体積に対して増大した膜面積をプロットしたものである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
発明の詳細な説明
DNA及びタンパク質などの分離に好適な膜吸着材を探すために実験を行った。酢酸セルロース膜を少量の架橋材で架橋すると、同型の高度に架橋した膜よりもはるかにDNA及びタンパク質を吸着するゲル様構造が作られることがデータから示されている。
【００４０】
酢酸セルロース膜は、繊維支持または繊維で支持せずに製造することができる。これらの実施例で使用される繊維支持膜(fiber  supported  membrane)はGE  Water＆Process  Technologies製であり、孔径５μｍである。(不織支持体上にコーティングされた酢酸セルロースを有する)これらの膜に関しては、膜の外側寸法は支持体材料の寸法により決定され、膨潤は(細孔を固定している)膜内部でのみ起きるか、または厚みが増すことによって起きる。使用される(Whatman製、孔径0.8μｍ)非支持膜は全方向で自由に膨潤し得るので、面積の増加によって膨潤を測定する機会を与える。
【００４１】
材料
表１は実験で使用した薬品及び膜を列記する。この表は、本文の薬品で使用した略号も列記する。
【００４２】
酢酸セルロース膜の架橋の例
架橋は、マグネチックスターラーを備えた100mlビーカーで実施した。三つの丸い膜(直径47mm)を水で濡らし、ビーカー内に膜を固定したままにするためにプラスチック製支持網の間に配置した。
【００４３】
硫酸ナトリウムを水に溶解し、溶液を47℃に加熱してから、エピクロロヒドリン(ECH)を添加した。溶液を激しく約５分間攪拌して、確実にECHを溶解させた。膜はビーカー内に、プラスチック製網でビーカー壁に固定して設置した。50％水酸化ナトリウムを６×0.175ml、次いで３×0.350mlで少しずつ、それぞれの添加の間に20分間とって添加した。架橋は７〜18時間継続し、その後、膜を水洗した。
【００４４】
表２は、膜の実験的架橋処方を示す。
Q-官能基化(Q-functionalisation)の例
GMAC  45mlと2M水酸化ナトリウム溶液５mlを50ml遠心分離管中で混合した。プラスチック製網の間に巻いた円形架橋膜１枚をバイアル中に配置した。バイアルは室温(19〜24℃)で18時間循環させた。Q-膜を繰り返し水洗した。
【００４５】
表２は、膜の実験架橋処方及びQ官能基化処方を示す。
方法
膨潤面積
円形膜の寸法は、架橋後とQ-官能基化後に測定した。元のWhatman製ST  68円形膜は直径47mmであった。
【００４６】
ST  68  Q-膜の膨潤面積(area  swelling)は、等式１に従って計算する。
等式１：
面積膨潤(％)＝(((d2)2/(d1)2)-1)*100
d1＝元の直径(47mm)
d2＝Q-結合(Q-coupling)後の直径
膨潤体積
φ2.5cmの円を膜からサンプリングし、レンズクリーニングティッシュ(Linsenpapier)上に置いて過剰量の水に浸した。次いで膜サンプルを乾燥秤量計(HG63，Mettler  Toledo)に置き、120℃に50分(または重量が一定になるまで10分間)加熱した。サンプル重量は２分毎に測定した。乾燥重量が安定したら、少量の水を膜に加えて膜を再び濡らした。
【００４７】
水分損失量：膜中の水分量(膨潤した膜の総重量から引いた乾燥重量)
水吸収量：膜を再膨潤させるために乾燥膜に添加した水量。
水分量：水分損失量及び水分吸収量は等しくなければならない。というのも、これは二つの異なる方法で測定した膜の水分量だからである。この二つの値が等しければ、乾燥後も膜はその元の形状を取り戻すことができると示唆される。
【００４８】
体積膨潤：Q-膜の水分量と架橋及びQ-結合前の膜の含水量とを比較する。
Q-官能基化前の膨潤試験
帯電基で官能基化する前、膜は水中で全く膨潤しない。その理由は、水は非置換セルロースの溶媒ではないためである。しかしながら、膜をセルロースの良溶媒中に浸漬すれば、膜は架橋度により決定される程度まで膨潤する。セルロースの溶媒の典型例としては、N-メチルモルホリンN-オキシド(NMMO)、ジアルキルイミダゾリウム塩、塩化リチウム-ジメチルアセトアミド、塩化亜鉛水溶液(aqueous  zinc  chloride)、銅アンモニア錯体及びカドミウムアンモニア錯体がある。
【００４９】
架橋膜(Q-官能基化前)の膨潤試験ではNMMOを使用する。97％NMMO粉末15gを小さな結晶化瓶中で50％NMMO水溶液10gと混合する。95℃の通風オーブンに入れ、粒子を溶解/融解させる。結晶が溶液中に残っている場合には、水を数滴加える。濾紙小片を加えて、NMMO濃度が十分に高いかどうかを確認する。紙が溶解すれば、濃度は十分である。紙が溶解しなければ、水を少々蒸発させて、再び試験する。
【００５０】
約25mmの膜片を溶液に入れ、15分間静置する。定規で瓶の底から膨潤したストリップ長を測定する。100×(A−B)/Bとして長さ-スケール膨潤比(式中、Bは膨潤前の長さであり、Aは膨潤後の長さである)を計算する。
【００５１】
DNA、BSA及びメタニル結合アッセイ
次いでQ-官能基化膜の結合能力を、メタニル・イエロー(Metanil  Yellow)(Aldrich製、カタログ番号20,202-9)、BSA及びDNA結合アッセイを使用して測定した。
【００５２】
メンタニル・イエロー法は、染料25ppm溶液から着色材を除去するための膜の能力をベースとして開発された。この方法は、AKTAexplorer  100クロマトグラフィー装置(GE  Healthcare)に接続したHR16/10カラム(GE  Healthcare)の二つのカラムアダプター間に膜の円形パネルを挿入することを含んでいた。動的能力(dynamic  capacity)は、10％貫流(breakthrough)(Qb10)が得られるまで、膜に１ml/分でメタニル・イエローの25ppm溶液を送出することにより測定した。
【００５３】
検出は414nmでUV-センサで実施する。
能力は以下のものに従って計算した：
分析した面積：1.5cm2(直径：1.4cm)。
【００５４】
メタニルの分子量：375.4g/mol。
溶液濃度：25ppm。
【００５５】
【数１】
0005420424.tif 000002
【００５６】
DNA結合アッセイは、DNAに関して50％貫流(Qb50)で動的能力を測定するように設計した。DNAアッセイは膜上で装填し、膜は流速0.5mL/分でAKTAexplorer  10（GE  Healthcare）に接続したHR  16/10カラム(GE  Healthcare)中の二つの調節可能なアダプター間に挿入した。DNA溶液は0.1DMA/mL濃度であった。このDNA溶液を50％貫流容量になるまで、第一緩衝液(緩衝液A：25mM  Tris-6M  HClを添加してpH8.0に調節)中の膜に適用し、第二の緩衝液(緩衝液B：25mM  Tris及び1M  HCl-6M  HClを添加してpH8.0に調節)で溶出した。
【００５７】
検出は280nmでUV-センサで実施する。
能力は以下に従って計算した：
分析した面積：1.5cm2(直径：1.4cm)。
【００５８】
溶液濃度：0.1mg/mL。
【００５９】
【数２】
0005420424.tif 000003
【００６０】
能力はQb50(mg/cm2)を膜厚で割ることにより単位体積当たりでも計算する。
ST68膜は110μｍ厚であり、GE  Water  CA  ５μｍ膜は80μｍである。
BSA結合アッセイは膜上で装填したBSAのQb50を測定するように設計し、膜は流速0.5mL/分でAKTAexplorer  10（GE  Healthcare）装置に接続したHR  16/10カラム(GE  Healthcare)中の二つの調節可能なアダプター間に挿入した。BSA溶液は0.1mgBSA/mL濃度であった。このBSA溶液を、第一緩衝液(緩衝液A：25mM  Tris-6M  HClを添加してpH8.0に調節)中の膜に適用し、第二の緩衝液(緩衝液B：25mM  Tris及び1M  HCl-6M  HClを添加してpH8.0に調節)で溶出した。
【００６１】
検出は280nmでUV-センサで実施する。
能力は以下に従って計算した：
分析した面積：1.5cm2(直径：1.4cm)。
【００６２】
溶液濃度：0.1mg/mL。
【００６３】
【数３】
0005420424.tif 000004
【００６４】
能力はQb50(mg/cm2)を膜厚で割ることにより単位体積当たりでも計算する。
ST68膜は110μｍ厚であり、GE  Water  CA  ５μｍ膜は80μｍである。
表３は、ST68  0.8μｍQ-膜の増加面積測定(area  increase  measurement)結果を示す。表３からわかるように、Q-結合後の膨潤度は架橋の間に添加したECHと硫酸ナトリウム量に依存する。いずれのパラメーターも膨潤度に対して負の効果をもつ(いずれのパラメーターも低く保持されるときに膨潤最大となる)。架橋後に膜は元のサイズから(47mmから45mmに)収縮するが、この収縮は架橋処方とは無関係に全ての架橋膜に対して同じである。架橋度が低すぎると、膜はQ-結合反応の間に溶解する。この現象はプロトタイプP14に関して発生し、粘液性ゲルとなった。
【００６５】
表４は、ST  68  Q-膜の水分量を示す。
表５は、CA  ５μｍQ-膜の水分量を示す。
乾燥重量スケールで測定した水分量は、膨潤を測定するのに優れた方法であることが判明した。乾燥後の水分吸収は水分損失とよく相関する。この相関は、繊維支持膜(CA５μｍ)に関するものよりもST68膜に関して良好である。これらの膜はサンプルカップ(乾燥重量スケールで使用した金属プレート)に粘着する傾向があり、その元の構造を回復する能力を制限するのかもしれない。これらの膜は繊維で支持されているので、膨潤面積は観察できなかった。
【００６６】
ST68膜の膨潤面積と膨潤体積との比較を表６に示し、図１は増加水分量に対して増加面積をプロットしている。膨潤に対する架橋度を測定するこの二つの方法はよく相関しているように見える。
【００６７】
表７は、Q-結合前後での膜膨潤の比較を示す。このデータは、Q-結合後の同一膜からのデータとよく相関していることがわかる。
表８は、膨潤、能力及び架橋条件に関して種々の膜から得られたデータをまとめる。
【００６８】
観察結果
膨潤は架橋度と関係している。架橋反応の効果は、架橋剤、塩及びアルカリの濃度並びに反応温度などの反応パラメーターに依存する。
【００６９】
最高の動的結合能力を達成するために、架橋度は最小に保持すべきである。架橋の間に存在する硫酸ナトリウム量とエピクロロヒドリン量はいずれも、得られる架橋度に影響する。ゆるく架橋した膜は、硫酸塩とエピクロロヒドリンの量を低く保持することによって製造する。
【００７０】
繊維支持膜(CA  ５μｍ)は、非支持(ST68)膜よりも水分量が少ないことが判明した。繊維支持膜で優れた能力を達成するには、体積膨潤は＞40％であるべきであり、好ましくは＞50％である。しかしながら非支持(ST68)膜でより高い結合が達成された。表８から見られるように、体積膨潤が＞100％、好ましくは＞125％であるとき、非支持(ST68)膜で高い能力が得られた。
【００７１】
【表１】
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【００７２】
【表２】
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【００７３】
【表３】
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【００７４】
【表４】
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【００７５】
【表５】
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【００７６】
【表６】
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【００７７】
【表７】
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【００７８】
【表８】
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【図１】
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