(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血前駆細胞に抗ＡＣＡ抗体を提供する工程、ここで、造血前駆細胞と抗ＡＣＡ抗体の架橋が、造血幹細胞の生成、維持および増殖を生じる、
を含む、未分化状態の造血幹細胞を取得し、維持し、かつ増殖する方法。
【請求項２】
該抗ＡＣＡ抗体がモノクローナル抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該抗ＡＣＡ抗体がポリクローナル抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該細胞が、骨髄、末梢血、臍帯血、脂肪組織、肝臓、筋肉、骨格筋芽細胞、心筋芽細胞、内皮または上皮に由来する、請求項１または２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性非胚性幹細胞を取得するため、または非胚性幹細胞の多能性表現型を維持するための、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカー型糖タンパク質ACAまたはACAの活性化因子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹（ES）細胞は、原型的な幹細胞であり、分化して、成体の生物に見られるありとあらゆる細胞型を形成することができる。かかる幹細胞は、多くの細胞型に分化することができるので、多能性細胞として記載されている。ES細胞はヒト胚組織から単離されているが、研究ならびに治療学におけるそれらの使用は、倫理的考慮により妨げられている。幹細胞はまた、造血、神経、胃腸、表皮、肝性および間葉系幹細胞を含む殆どの組織に存在する。しかしながら、これらの幹細胞は、自己再生能がより低く、分化の能力がより制限されており、すなわち、それらは多能性でない。
【０００３】
最近まで、組織特異的幹細胞は起源の組織の細胞にしか分化できないと考えられていた。しかしながら、最近の研究により、組織特異的幹細胞が、起源の組織以外の系統に分化し得ることが示唆された。骨髄または濃縮された造血幹細胞の移植の後に、ドナー起源の骨格筋芽細胞、心筋芽細胞、内皮、肝管および胆管上皮、肺、腸および皮膚上皮、ならびに神経外胚葉細胞が検出されている。いくつかの研究により、神経幹細胞ならびに筋肉細胞が造血細胞に分化し得ることが証明された。胚盤胞に注入された場合、神経幹細胞は、キメラマウス胚の多数の組織に寄与する。しかしながら、これまでに行われた研究は、組織特異的幹細胞が複数の組織の機能的細胞に分化し得ること、すなわち多能性にされ得ることを、決定的には証明し得なかった。要約すると、非胚性（ヒト）多能性幹細胞（成体幹細胞）を取得する差し迫った必要性が展開されてきたが、これまで、多能性の欠如の問題を含む、かかる幹細胞の増殖のための安定した長期培養に関連した問題は、解決されていない。
【０００４】
したがって、本発明の基礎となる技術的問題は、多能性である非胚性幹細胞の取得／維持を可能にする手段を提供することである。
【０００５】
上述の技術的問題の解決は、請求項に特徴付けられる態様を提供することによって達成された。驚くべきことに、ヒトGPIアンカー型表面糖タンパク質であるACAの活性化は、ヒト造血幹細胞の多能性表現型を維持するのに十分であることが発見された。ACAは、以前にヒト赤血球から単離された、脂質アンカーの、独特のホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC（PI-PLC）感受性ジアシルグリセロール構造を有する、65 kDの膜糖タンパク質である（Becker-KojicおよびTerness、J. Biol. Chem. 2002; 277: 40472-40478；EP-A1 1 391 463）。本発明をもたらす研究において、精製タンパク質に対するウサギポリクローナル抗体ならびにマウスモノクローナル抗体を生成し、使用して、一色および二色のフローサイトメトリーによって、ヒト末梢血液細胞に関して、ACAタンパク質の発現を解析した。結果から、このタンパク質は、全ての、顆粒球、単球およびBリンパ球に統計的に単峰形で存在するが、T細胞には存在しないことが示された。最も重要なことに、骨髄中のCD34+/CD38-幹／前駆細胞のサブセットもまた、ACAを含む。増殖している細胞、特に悪性の由来のものにおいて、ACAが細胞増殖に必要な強いシグナルを誘導することは明らかである。この機能的特性は、細胞膜にACAを挿入するアンカーの生化学的構造と一致している。内因性ホスホリパーゼCまたはDでの加水分解から生じる、イノシトールグリカン、ジアシルグリセロールおよびホスファチジン酸等のACAのグリセロ脂質誘導体は、膜シグナリングの発生における周知の中間体であり、細胞内セカンドメッセンジャーのカスケードを活性化する。生細胞の膜中の、GPI連結型タンパク質、チロシンキナーゼおよび脂質を含む脂質ベースの組織的な基盤である脂質ラフトが、多くの細胞の過程において主要な役割を果たしているという強力な証拠が、ここ数年で提供されている。いくつかのGPI連結型タンパク質の架橋によって、細胞表面タンパク質に関連する活性化のアップレギュレーションおよび増殖促進サイトカインの産生が誘導される。
【０００６】
以下に説明される実験は、ヒト造血幹細胞の自己再生能の維持に関係する推定上の新規のACA特異的シグナルトランスダクション経路（1つまたは複数）を解明する。造血幹細胞（＝HSC）は、自己再生する、および複数の血液細胞の前駆体に分化する、二重の能力によって特徴付けられる。これらの2つの特徴は、そのHSCが非対称な分裂を経て、一方で長い造血を維持する細胞、ならびに他方では種々の子孫細胞および異なる血液系統を、生じることを必要とする。非対称に分裂するCD34+/CD38-細胞は、対称な分裂を示す（CD34+/CD38+）よりも多くの芽細胞のコロニーを生じた。注目すべきことに、抗体に誘導された細胞膜上のACAのライゲーションに続いて、前駆細胞集団（CD34+/CD38+）は、非対称に分裂した細胞になり、明らかに、ACAタンパク質のシグナリングコンピテンスを示している。ACA抗体のライゲーションの後に臍帯血から単離された単核細胞は、数倍も高い濃度の造血幹細胞を生じ、そのため、これが臨床上の習慣に有用な幹細胞集団を得るために新規な方法であり得ることを示す。
【０００７】
このように、本発明は、多能性非胚性幹細胞を取得するため、非胚性幹細胞の多能性表現型を維持するため、または、該幹細胞の分化が最小限にされるか、もしくは防がれるように、多能性非胚性幹細胞をエクスビボで拡大培養するための、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカー型糖タンパク質ACAまたはACAの活性化因子の使用に関する。
【０００８】
本明細書中で使用される場合、用語「非胚性幹細胞」は、任意の非胚性幹細胞、例えば、造血幹細胞、表皮幹細胞、間葉系幹細胞または神経幹細胞等の、性腺幹細胞または体性幹／前駆細胞を含み、造血系由来の幹細胞が好ましい。多能性バージョンの該幹細胞の取得および／または増殖させるための源は、例えば、骨髄、末梢血、臍帯血、脂肪組織、肝臓、筋肉、骨格筋芽細胞、心筋芽細胞、内皮および上皮である。
【０００９】
本明細書中で使用される場合、用語「グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカー型糖タンパク質ACA」は、Becker-KojicおよびTerness、2002およびEP-A1 1 391 463に記載されている天然のタンパク質、ならびに、例えばアミノ酸の（1つまたは複数の）欠失、（1つまたは複数の）置換および／または（1つまたは複数の）付加によって野生型配列とは異なるアミノ酸配列を有するがそれでも生物学的活性を示すタンパク質をいう。
【００１０】
本明細書中で使用される場合、用語「ACAの活性化因子」は、タンパク質自身の活性化因子または発現の活性化因子をいう。
【００１１】
本明細書中で使用される場合、用語「該幹細胞の分化が最小限にされるか、もしくは防がれる」は、幹細胞が増殖の前に有していた潜在能の状態を実質的に維持する培養条件をいう。
【００１２】
幹細胞は、いくつかの方法、例えば（ａ）該タンパク質もしくは活性化因子を含有する培地中で細胞を培養すること、（ｂ）分泌可能な形態で該タンパク質もしくは活性化因子を細胞内で発現するベクターで細胞をトランスフェクトすること、または（ｃ）細胞を、該融合タンパク質を分泌可能な形態で発現する生成細胞と共培養することによって、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカー型糖タンパク質ACAまたはACAの活性化因子と接触させられ得る。当業者は、トランスフェクションの適切な方法および適切なベクターを知っている；例えば、DE 196 08 813 C2を参照のこと。当業者は、どのアプローチが最も適切なものであるかを決定し得る。
【００１３】
当業者はまた、幹細胞の培養に適切な方法および適切な培地を知っている。本発明のタンパク質を含有する基礎培地は、哺乳動物（ヒト）細胞の培養に一般に用いられる任意の培地であり得る；例えば、DE 196 08 813 C2、EP-B1 0 695 351を参照のこと。好ましい態様において、基礎培地は、IMEM（Life Technologies, Karlsruhe, Germany）またはCellgro（Cellgenix, Freiburg, Germany）である。当業者は、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカー型糖タンパク質ACAまたは活性化因子の最適な濃度を、単純な実験によって決定し得る；DE 196 08 813 C2をまた参照のこと。好ましくは、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカー型糖タンパク質ACAまたは活性化因子の濃度は、5〜100 ng/ml培地の範囲内である。
【００１４】
培地への添加物として用いられる本発明のタンパク質は、標準的な方法に従って調製され得る。好ましくは、このタンパク質は、例えばBecker-KojicおよびTerness、2002に記載されるように、組み換えによって生成されるか、または天然の源から精製される。当業者は、周知の方法に従って、ACA/ACA発現の活性化因子を調製し得る。好ましい活性化因子は、ACAを刺激することが証明されている抗ACA抗体である。用語「抗体」は、好ましくは、異なるエピトープ特異性を有する、プールされたモノクローナル抗体から本質的になる抗体、ならびに別個のモノクローナル抗体調製物に関する。モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法によって、ACAの断片を含む抗原から生成される（例えば、Kohlerら、Nature 256 (1975), 495参照）。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」（Ab）または「モノクローナル抗体」（Mab）は、ACAに特異的に結合できる、インタクトな分子ならびに（例えば、FabおよびF(ab')2断片等の）抗体断片を含むよう意図される。FabおよびF(ab')2断片はインタクトな抗体のFc断片を欠き、循環からより迅速になくなり、インタクトな抗体よりも少ない非特異的組織結合を有し得る。（Wahlら、J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)。）このように、これらの断片、ならびにFABまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物が好ましい。さらに、抗ACA抗体としては、キメラ、単鎖およびヒト化抗体が挙げられる。
【００１５】
このタンパク質は、直接、すなわち培地への添加物として、使用され得るだけでなく、細胞内発現およびそれに続く分泌によって、幹細胞に供給されることもできる。細胞内発現のために、哺乳動物細胞で複製することができる任意のベクター、好ましくは発現ベクターを使用し得る。好ましくは、ACAまたは活性化因子をコードするDNA配列が、適切なプロモーターに、動作可能に連結される。適切な（発現）ベクターは、当業者に公知である。好ましい組み換えベクターは、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または、より好ましくは、レトロウイルス等のRNAウイルスである。さらにより好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリレトロウイルスの誘導体である。本発明において使用され得るかかるレトロウイルスベクターの例は：モロニーマウス白血病ウイルス（MoMuLV）、ハーヴィーマウス肉腫ウイルス（HaMuSV）、マウス乳房腫瘍ウイルス（MuMTV）およびラウス肉腫ウイルス（RSV）である。さらに、HIVまたはSIV等のレンチウイルスもまた好ましい。
【００１６】
組み換えベクターの構築は、従来の方法に従って行われ得る（Sambrookら、1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA参照）。これらのベクターは、好ましくは、少なくとも1つの選択可能なマーカーを含む。かかるマーカーとしては、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素、G418、またはネオマイシン耐性ならびに大腸菌および他の細菌における培養のためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性の遺伝子が挙げられる。該ベクターの増幅に適切な宿主の代表的な例としては、大腸菌、ストレプトミセスおよびサルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）細胞等の細菌細胞、酵母細胞等の真菌細胞、キイロショウジョウバエS2およびヨトウSf9細胞等の昆虫細胞、動物細胞、ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
幹細胞への上述のベクターの導入は、周知の方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、形質導入、感染、または他の方法によって遂げられ得る。かかる方法は、多くの標準的な研究室マニュアルに記載されている。
【００１８】
本発明の好ましい幹細胞は、性腺幹細胞または体性幹／前駆細胞、好ましくは表皮幹細胞または神経幹細胞である。
【００１９】
造血幹細胞（HSC）は、制限のない自己再生の能力ならびに全ての成熟血液細胞系の前駆体への多系統の分化の能力を有する細胞として定義されている。この発見は、今日の幹細胞研究の始まりを記録した。幹細胞の顕著な特徴は、非対称に分裂して母細胞と同一の娘細胞または分化に深く関与する別の細胞を生じる能力であり得ることが示唆されてきた（YerおよびLily, 1998, Nature 392: 775）。これらの2つの特徴は、HCSが複数回の非対称な分裂を経て異なる血液系統の成熟細胞を生じること、ならびに、細胞が長期の造血を維持することを必要とする。発生生物学における中心となる問題は、造血幹細胞が、どのようにして、自己再生する非対称な様式で分裂し得るのかということ、および単一の細胞がどのようにして分裂して異なる運命を採用する2つの娘細胞を生じ得るのかということである。HSC由来の2つの娘細胞は、最初同等であり得るが、それに続く細胞分裂は、子孫細胞の異なる運命をもたらすに違いないということが可能である。娘細胞は、それに続く環境シグナルへの曝露の際に、すなわち外因性の要因のために、異なるようになり得る。下記の実験において、造血幹細胞の自己再生能のための増殖能が、1つの娘細胞への接触を有する母細胞由来のACAタンパク質からの転移を介して分配され得ることがわかっている。
【００２０】
したがって、ACAまたはACAの活性化因子のさらに好ましい使用において、幹細胞は、HSC、好ましくはヒトHSCである。
【００２１】
以下の実施例によって、本発明を説明する。
【００２２】
実施例１：種々の細胞株におけるACA発現の解析
（A)序文
脂質ドメインは、膜タンパク質および脂質の分類ならびに特定の細胞内部位へのそれらの送達において、独特な機能を有する。低温非イオン性界面活性剤抽出とそれに続くショ糖密度グラジエント浮選を含む生化学的研究によって、キナーゼおよび多くの他のシグナリングタンパク質が、糖脂質およびコレステロールに富んだ低密度界面活性剤不溶性膜画分に濃縮されることが証明される。これらの構造は、界面活性剤抵抗性膜（DRM）、界面活性剤不溶性糖脂質濃縮ドメイン（DIG）を含む、多くの名前で呼ばれてきている。これらは、原形質膜中の脂質ラフト（いわゆる液体秩序相を形成する大部分の膜よりも流動性の低いコレステロールおよびスフィンゴ脂質に富んだドメイン）に由来すると考えられている（SimonsおよびIkonen, 1996, Nature 387: 569-572）。
【００２３】
スフィンゴ脂質の長い飽和疎水性脂肪酸尾部はコレステロールと会合して詰め込まれる傾向があるので、これらの構造は自然に形成される。飽和アシル鎖を有するリン脂質もまたラフト中に仕切られる傾向があるが、殆どの細胞において、原形質膜リン脂質の大部分は不飽和アシル基を有し、より流動的なバルク相を形成する。これらの構造は、その主要な構造構成要素が脂質であり、二重層中の内因的な高速の側方の移動を有するので、高度に動的である。それらの動的な性質によって、これらが細胞生理機能の変化に迅速に応答するのに理想的に適するようになる。多くの膜貫通タンパク質は脂質ラフトから排除されるが、いくつかはそれらの中に仕切られる；これらの違いの理由は、大部分知られていない。しかしながら、脂質ラフトに最もよく見られるタンパク質は、アシル化またはグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカー等の1つ以上の脂質修飾を有する；飽和アシル基が、液体秩序相への詰め込みに好都合である。これらのタンパク質の多くはシグナリングに関係し、そのため、脂質ラフトは、シグナリングの発生の調整および促進のための超分子基盤台として細胞によって頻繁に用いられる。
【００２４】
シグナルトランスダクション経路は、状況に応じて作用して環境的情報を表現型の応答に変換する、機能的に互いに依存するタンパク質の組の機能単位としての複合物である。グリコシルホスファチジル（GPI）部分を介して膜に固定された多くの表面糖タンパク質は、それらが原形質膜の外葉にしか侵入しないが、それでも抗体誘導ライゲーションに続く細胞内シグナリングの発生を媒介することができるという点で独特である。これらは、細胞の増殖および分化の制御に関与し、細胞活性化およびシグナルトランスダクションの重要な調節因子であるタンパク質チロシンキナーゼに非共有的に結合することが証明されている（Stefanovaら、1991, Science 254: 1016-1019）。したがって、これらのいわゆるIII型膜タンパク質は、それらを細胞質シグナル伝達分子に連結させ得るいかなる細胞内ドメインも欠けている。一部のGPI連結型タンパク質に対する天然のリガンドまたは抗体の結合は、細胞活性化を誘導した。GPI分子の生物学的活性の一部は、タンパク質分解または脂質分解の切断生成物によって制御され得る。これらの代謝産物によって、イノシトールホスホグリカン、イノシトールペプチドグリカンおよびジグリセリドを含む、薬理活性セカンドメッセンジャーの潜在的に豊富な源が提供される。
【００２５】
現在、ヒトHSCおよび前駆体の表現型は、完全には定義されていない。殆どの研究から、ヒトHCSは、表面糖タンパク質CD34を発現する、小型の休止状態の細胞であることが示唆される。多くの研究室および臨床調査からのデータにより、CD34+細胞は、全てのリンパ造血系およびリンパ造血幹細胞の前駆細胞を含むおよそ1％のヒト骨髄（BM）単核細胞を含むが、それらはリンパ造血系の能力の範囲全体を生じ、かつそれらは骨髄性白血病、骨髄形成異常および再生不良性貧血における異常な細胞の正常な相当物であることが示される。幹細胞は重要だがCD34+細胞集団において希少な細胞型であるため、研究者らは、CD34+細胞集団を、さらに豊富な幹細胞に再分した。CD34+/CD38-サブセットは、10％未満のヒトCD34+成人BM細胞（＜0.1％の骨髄単核細胞）を含み、系統関与マーカー（lin）の発現を欠き、インビトロの置換能力のある細胞を含み、幹細胞が高度に豊富であると予想される。免疫磁性ミクロスフェアまたは蛍光活性化細胞分離を用いて骨髄から精製されたこれらの細胞は、ヒツジ胎仔インビトロモデルにおいて、容易に検出可能な、長期で多系統のヒト造血を生じた。対照的に、免疫前ヒツジ胎仔へのCD34+/CD38+細胞の転移は、短期のヒト造血しか生じず、CD34+/CD38+細胞集団は比較的初期の多能性造血前駆細胞を含むが幹細胞を含まないことが示唆される。（Curtら、1996, Blood 88: 4102-4109）。要約すると、CD34+/CD38-細胞集団は長期の多系統造血の移植に対して高い能力を有し、そのため、この細胞集団は幹細胞が高度に豊富であることが予想される。
【００２６】
この実験の目的は、ヒト造血幹細胞におけるヒト糖タンパク質ACAの発現および機能的重要性を解明することであった。
【００２７】
（B）結果
材料および方法
臍帯血および結集された末梢血から単離された単核血液細胞に、免疫磁性ビーズまたは蛍光活性化細胞分離を用いて、CD34+細胞を濃縮し、抗ACA特異的モノクローナル抗体を用いてACA発現を調査した。
【００２８】
（１）ヒト造血幹／前駆細胞でのACA発現のFACS解析
単核細胞を、結集された末梢血細胞から単離し（P. Molleeら、Bone Marrow Transplant 2002; 30 273-278）、CD34 APC標識抗体で染色し、蛍光活性化細胞分離器でCD34+細胞を単離した。濃縮したCD34+細胞を、CD38PEおよびACA特異的抗体ならびに二次抗体としてヤギ抗マウスAlexa Fluor 488（Mo Bi Tec GmbH, Gottingen, Germany）で染色し、蛍光活性化細胞分離器で解析した（図１）。
【００２９】
（２）CD34+/CD38+細胞（ヒト前駆細胞集団）でのACA発現
単核細胞を臍帯血から単離し、CD34 APC標識抗体と共に、インキュベートし、販売業者（Miltenyi Biotec, Germany）によって記載されたようにMACS抗APCマイクロビーズを用いて磁気的にCD34陽性細胞を分取した。CD38 PE抗体での染色の後、蛍光活性化細胞分離器を用いてCD34+/CD38+細胞を精製した。単離された細胞を、10％FBSを含有するRPMI培養培地と共に培養皿に入れ、ACA特異的抗体（EP 1 391 463 A1）および二次抗体としてヤギ抗マウスAlexa Fluor 488と共にインキュベートし、倒立蛍光顕微鏡を用いて画像を得た（図２Ａ）。有糸分裂の幹／前駆細胞を上述のように24時間培養し、次いで4％パラホルムアルデヒド中で、5分間室温で固定し、洗浄後、ヤギ抗マウスAlexa Fluor 488で標識した抗ACA抗体と共にインキュベートした。倒立蛍光顕微鏡を用いて画像を得た。有糸分裂の幹／前駆細胞は、最も高い程度のACA発現を示す（図２Ｂ）。
【００３０】
（３）CD34+/CD38-細胞（ヒト幹細胞集団）でのACA発現
単核細胞を臍帯血から単離し、上述のようにCD34+細胞を濃縮し、CD38 PEで染色し、次いで蛍光活性化細胞分離器を用いてCD34+/CD38-細胞を精製した。単離された細胞を培養培地に入れ、ACA／ヤギ抗マウスAlexa Fluor 488特異的抗体と共にインキュベートし、倒立蛍光顕微鏡を用いて画像を得た（図３）。
【００３１】
（４）ACA特異的抗体との、CD34+/CD38+細胞の架橋（ライゲーション）
すでに記述したように得られたCD34+/CD38+細胞を、ACA特異的抗体と共にインキュベートし、適切な培養培地と共に培養プレートに入れ、ACA特異的抗体との培養の前および24時間後に、倒立蛍光顕微鏡を用いて画像を得た（図４）
【００３２】
（ｃ）結論
上述の実験から、以下の結論が引き出され得る：
・ACAは、重要な造血幹（CD34+/38-）および前駆（CD34+/38+）細胞集団の両方で発現される。
・CD34+/CD38+細胞は、対称に分裂する細胞および制限された（短期の！）造血の能力を有する前駆細胞集団を表すと考えられる。この集団は、形態学的に終末的に分化し（形態学的にさらなる変化はない！）、細胞表面分子の均一な分布を示す、球形の非極性細胞からなる。興味深いことに、ACAは、これらの細胞で、これらの細胞の膜中の特定のマイクロドメインにおいて発現される。
・CD34+/CD38-細胞は非対称に分裂し、長期の多系統造血の移植に対する高い能力を有し、幹細胞が高度に豊富であると考えられている。ACAは、これらの細胞で排他的に細胞の極の（紡錘！）部分において発現され、幹細胞が互いに接触している場合は膜のマイクロドメインで絶えず発現される。
・ACA特異的抗体とのCD34+/CD38+細胞の架橋（ライゲーション）は、この細胞集団の完全な形質転換をもたらす。球形の非極性細胞は、24時間後に、ACAタンパク質の典型的な「デノボ」発現を有する非対称に分裂する細胞になり、明らかに、ACAタンパク質のシグナリングコンピテンスを示している。ACAの関与によって、シグナリングタンパク質の共存を容易にする脂質ラフトの凝集が促進され、これにより、タンパク質チロシンリン酸化ならびにそれに続くシグナルトランスデューサータンパク質および転写を活性化するタンパク質の活性化が増強される。最も重要なことに、対応する抗体でのACAの直接の刺激は、HSCを分化していない（多能性の）状態で維持し、インビトロでの造血幹細胞の大量な拡大培養をもたらすのに十分である。
【００３３】
ひとまとめにして考えると、これらのデータから、ACAタンパク質は、ヒト造血幹細胞の多能性表現型を維持する最も重要な細胞の過程において重要な分子であり、幹細胞に付随する倫理的な重荷なしに臨床上の習慣に利用され得ることが示唆される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】図１：CD34+/CD38+およびCD34+/CD38-発現に基づいて分離された幹細胞集団での、ACA発現の代表的な解析データ。（A)アイソタイプ対照。
【図１Ｂ】図１：CD34+/CD38+およびCD34+/CD38-発現に基づいて分離された幹細胞集団での、ACA発現の代表的な解析データ。（B)CD34+/CD38+およびCD34+/CD38-細胞でのACA発現。
【図２Ａ（ａ）】図２：ヒト糖タンパク質ACAに対するモノクローナル抗体で染色されたCD34+/CD38+細胞の免疫蛍光検査像。
【図２Ａ（ｂ）】図２：ヒト糖タンパク質ACAに対するモノクローナル抗体で染色されたCD34+/CD38+細胞の免疫蛍光検査像。
【図２Ａ（ｃ）】図２：ヒト糖タンパク質ACAに対するモノクローナル抗体で染色されたCD34+/CD38+細胞の免疫蛍光検査像。
【図２Ａ（ｄ）】図２：ヒト糖タンパク質ACAに対するモノクローナル抗体で染色されたCD34+/CD38+細胞の免疫蛍光検査像。
【図２Ａ（ｅ）】図２：ヒト糖タンパク質ACAに対するモノクローナル抗体で染色されたCD34+/CD38+細胞の免疫蛍光検査像。
【図２Ｂ（ａ）】図２：ヒト糖タンパク質ACAに対するモノクローナル抗体で染色されたCD34+/CD38+細胞の免疫蛍光検査像。
【図２Ｂ（ｂ）】図２：ヒト糖タンパク質ACAに対するモノクローナル抗体で染色されたCD34+/CD38+細胞の免疫蛍光検査像。
【図２Ｂ（ｃ）】図２：ヒト糖タンパク質ACAに対するモノクローナル抗体で染色されたCD34+/CD38+細胞の免疫蛍光検査像。
【図２Ｂ（ｄ）】図２：ヒト糖タンパク質ACAに対するモノクローナル抗体で染色されたCD34+/CD38+細胞の免疫蛍光検査像。
【図２Ｂ（ｅ）】図２：ヒト糖タンパク質ACAに対するモノクローナル抗体で染色されたCD34+/CD38+細胞の免疫蛍光検査像。
【図３（ａ）】図３：ACAに対するモノクローナル抗体で染色されたCD34+/CD38-細胞の免疫蛍光検査像。
【図３（ｂ）】図３：ACAに対するモノクローナル抗体で染色されたCD34+/CD38-細胞の免疫蛍光検査像。
【図３（ｃ）】図３：ACAに対するモノクローナル抗体で染色されたCD34+/CD38-細胞の免疫蛍光検査像。
【図３（ｄ）】図３：ACAに対するモノクローナル抗体で染色されたCD34+/CD38-細胞の免疫蛍光検査像。
【図３（ｅ）】図３：ACAに対するモノクローナル抗体で染色されたCD34+/CD38-細胞の免疫蛍光検査像。
【図４（ａ）】図４：抗ACA特異的抗体との架橋の前および24時間後のCD34+/CD38+細胞の免疫蛍光検査像。
【図４（ｂ）】図４：抗ACA特異的抗体との架橋の前および24時間後のCD34+/CD38+細胞の免疫蛍光検査像。
【図４（ｃ）】図４：抗ACA特異的抗体との架橋の前および24時間後のCD34+/CD38+細胞の免疫蛍光検査像。
【図４（ｄ）】図４：抗ACA特異的抗体との架橋の前および24時間後のCD34+/CD38+細胞の免疫蛍光検査像。
【図４（ｅ）】図４：抗ACA特異的抗体との架橋の前および24時間後のCD34+/CD38+細胞の免疫蛍光検査像。
【図１Ａ】
0005426095.tif 000002
【図１Ｂ】
0005426095.tif 000003
【図２Ａ（ａ）】
0005426095.tif 000004
【図２Ａ（ｂ）】
0005426095.tif 000005
【図２Ａ（ｃ）】
0005426095.tif 000006
【図２Ａ（ｄ）】
0005426095.tif 000007
【図２Ａ（ｅ）】
0005426095.tif 000008
【図２Ｂ（ａ）】
0005426095.tif 000009
【図２Ｂ（ｂ）】
0005426095.tif 000010
【図２Ｂ（ｃ）】
0005426095.tif 000011
【図２Ｂ（ｄ）】
0005426095.tif 000012
【図２Ｂ（ｅ）】
0005426095.tif 000013
【図３（ａ）】
0005426095.tif 000014
【図３（ｂ）】
0005426095.tif 000015
【図３（ｃ）】
0005426095.tif 000016
【図３（ｄ）】
0005426095.tif 000017
【図３（ｅ）】
0005426095.tif 000018
【図４（ａ）】
0005426095.tif 000019
【図４（ｂ）】
0005426095.tif 000020
【図４（ｃ）】
0005426095.tif 000021
【図４（ｄ）】
0005426095.tif 000022
【図４（ｅ）】
0005426095.tif 000023