(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）または（２）を有効成分として含有することを特徴とする腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進剤：
（１）ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ GｒｏｗｔｈFａｃｔｏｒ）蛋白質、
（２）下記（２−ａ）または（２−ｂ）を含むＤＮＡ、
（２−ａ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ、
（２−ｂ）前記（２−ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項２】
有効成分が、ＨＧＦ蛋白質であることを特徴とする請求項１に記載の再生促進剤。
【請求項３】
ＨＧＦ蛋白質が、下記（１−ｄ）または（１−ｅ）であることを特徴とする請求項１に記載の再生促進剤：
（１−ｄ）配列番号３または４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（１−ｅ）配列番号３または４で表されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する蛋白質。
【請求項４】
有効成分が、下記（２−ａ）または（２−ｂ）を含むＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の再生促進剤：
（２−ａ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ、
（２−ｂ）前記（２−ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡが、下記（２−ｄ）または（２−ｅ）であることを特徴とする請求項１に記載の再生促進剤：
（２−ｄ）配列番号１または２で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（２−ｅ）配列番号１または２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
ＤＮＡが、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクター、センダイウイルス・エンベロープ（ＨＶＪ−Ｅ）ベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターに組み込まれていることを特徴とする請求項１に記載の再生促進剤。
【請求項７】
局所適用形態を有する請求項１に記載の再生促進剤。
【請求項８】
腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進剤の製造の為の、下記（１）または（２）の使用：
（１）ＨＧＦ蛋白質、
（２）下記（２−ａ）または（２−ｂ）を含むＤＮＡ、
（２−ａ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ、
（２−ｂ）前記（２−ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、スポーツ外傷や交通事故等による腱や靭帯の断裂等の損傷が増加している。靭帯のなかでも、膝前十字靱帯（anterior cruciate ligament；ＡＣＬ）や膝後十字靭帯（posterior cruciate ligament；ＰＣＬ）は、膝関節で大腿骨と脛骨をつなぐ組織であるので、ＡＣＬやＰＣＬが断裂すると、膝関節の安定性が維持できなくなる。靭帯は、断裂すると縫い合わせることは出来ないので、損傷した靭帯を修復または置換するため、多くの場合、靭帯再建術が試みられている。例えば、損傷したＡＣＬを靭帯移植片で置換することによって再建するＡＣＬ再建術において、移植する移植片としては、従来、骨ブロックが取り付いた状態の膝蓋腱が使用されてきた。このようなＡＣＬ再建術では、骨同士がくっつくと、靭帯として機能するので、リハビリが早くできるという利点があるが、術後の疼痛や筋力が低下することが問題となっている。【０００３】
近年、膝を曲げる筋肉の腱の一部であるハムストリングス（膝屈筋腱、半腱様筋腱、薄筋腱）等の腱を移植腱として用いるＡＣＬ再建術が報告されている（例えば、非特許文献１等参照。）。より詳細には、その手術手技は、脛骨の上端および大腿骨の下端に骨トンネル（貫通孔）が形成され、移植腱の一方の端部を大腿骨の骨トンネル内に配置し、移植腱のもう一方の端部を脛骨の骨トンネル内に配置するというものである。移植腱はこうして大腿骨と脛骨の間を延在し、それによって移植腱が働いて、本来のＡＣＬと実質的に同じ機能を有して膝関節の正常な機能が回復されるようになる。しかし、ＡＣＬ再建術の目標は，正常のＡＣＬ機能と膝関節のキネマティクスの再構築であるので、骨トンネル内の骨表面と移植腱とが接触する部分において、腱骨移行部組織が十分な強度をもって再生される必要がある。このため、移植腱が靭帯として機能するまでに時間がかかるという問題がある。腱骨移行部組織の再生を促進する薬剤としては、例えば、ＢＭＰ−２（Bone Morphogenetic Protein-2：非特許文献２）や、ＴＧＦ−β１（Transforming Growth Factor-β1：非特許文献３）等が知られているが、腱骨移行部組織の再生を促進する薬剤としてまだ実用化されていない。【０００４】
一方、肝細胞増殖因子（Hepatocyte Growth Factor：ＨＧＦ、以下「ＨＧＦ蛋白質」という）は、最初に成熟肝細胞に対する強力なマイトゲンとして同定され、１９８９年にその遺伝子クローニングがなされた（非特許文献４及び５）。その後、様々な組織において、血管新生や細胞の分化、増殖、抗アポトーシス等の様々な作用をもつことが報告されている。腱組織における作用については、ラットの膝蓋腱の中央部に創を作成し、その創部にＨＧＦ遺伝子プラスミドＤＮＡを注入すると、創部のコラーゲン線維の配列を改善したと報告されている(非特許文献６）。しかし、腱骨移行部組織は、腱そのものの構造と異なり、組織学的にも全く異なる骨と腱とを付着（または固着、癒合）させる複雑な組織である。非特許文献６には、そのような複雑な腱骨移行部組織の再生については記載も示唆もされていない。また、ＨＧＦ蛋白質は、前述の腱骨移行部組織の再生を促進する薬剤として知られているＴＧＦ−β１の発現を抑制することが報告されている（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】S.A. Rodeoら，ザ・ジャーナル・オブ・ボーン・アンド・ジョイント・サージェリー（The Journal of Bone and Joint Surgery; JBJS），1993年，第75-A巻（No.12），p.1795-1803.
【非特許文献２】S.A. Rodeoら，ザ・アメリカン・ジャーナル・オブ・スポーツ・メディシン（The American Journal of Sports Medicine），1999年，第27巻，p.476-488
【非特許文献３】Shuji Yamazakiら，ザ・ジャーナル・オブ・アルスロスコピック・アンド・リレイテッド・サージェリー（The Journal of Arthroscopic and Related Surgery; JBJS），2005年，第21（No.9），p.1034-1041
【非特許文献４】中村敏一ら，バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・アンド・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.），1984年，第122巻，p.1450-1459
【非特許文献５】中村敏一ら，ネイチャー（Nature），1989年，第342巻，p.440-443
【非特許文献６】夏梅隆至ら，日整会誌（J. Jpn. Orthop. Assoc.），1998年，第72巻（8号），S1254
【非特許文献７】Kunio Matsumoto and Toshikazu Nakamura，バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical and Biophysical Research Communications），1997年，第239巻，p.639-644
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生を促進する薬剤を提供することを目的とするものである。とりわけ、本発明は、例えばＡＣＬ等の靭帯再建術後の移植腱または靭帯片と骨との接触部位または移植腱もしくは靭帯片と骨との間隙において腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生を促進する薬剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ＨＧＦ蛋白質が腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進剤に関する。【０００９】
［１］下記（１）または（２）を有効成分として含有することを特徴とする腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進剤：
（１）下記（１−ａ）もしくは（１−ｂ）または（１−ｃ）、
（１−ａ）ＨＧＦ（Hepatocyte Growth Factor）蛋白質、
（１−ｂ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチド、
（１−ｃ）（１−ａ）または（１−ｂ）の塩、
（２）下記（２−ａ）もしくは（２−ｂ）または（２−ｃ）を含むＤＮＡ、
（２−ａ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ、
（２−ｂ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチドをコードするＤＮＡ、
（２−ｃ）前記（２−ａ）または（２−ｂ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ。【００１０】
［２］有効成分が、下記（１−ａ）もしくは（１−ｂ）または（１−ｃ）であることを特徴とする前記［１］に記載の再生促進剤：
（１−ａ）ＨＧＦ蛋白質、
（１−ｂ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチド、
（１−ｃ）（１−ａ）または（１−ｂ）の塩。【００１１】
［３］ＨＧＦ蛋白質が、下記（１−ｄ）または（１−ｅ）であることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の再生促進剤：
（１−ｄ）配列番号３または４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（１−ｅ）配列番号３または４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であって、腱骨移行組織または靭帯骨移行組織の再生促進作用を有する蛋白質。【００１２】
なお、ここで（１−ｅ）の蛋白質としては「配列番号３または４で表されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する蛋白質」を挙げることができる。【００１３】
［４］有効成分が、下記（２−ａ）もしくは（２−ｂ）または（２−ｃ）を含むＤＮＡであることを特徴とする前記［１］に記載の再生促進剤：
（２−ａ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ、
（２−ｂ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチドをコードするＤＮＡ、
（２−ｃ）前記（２−ａ）または（２−ｂ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡ。【００１４】
［５］ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡが、下記（２−ｄ）または（２−ｅ）であることを特徴とする前記［１］または［４］に記載の再生促進剤：
（２−ｄ）配列番号１または２で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（２−ｅ）配列番号１または２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。【００１５】
［６］ＤＮＡが、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクター、センダイウイルス・エンベロープ（ＨＶＪ−Ｅ）ベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターに組み込まれていることを特徴とする前記［１］、［４］または［５］のいずれかに記載の再生促進剤。【００１６】
［７］局所適用形態を有する前記［１］〜［６］のいずれかに記載の再生促進剤。【００１７】
また、本発明はＨＧＦ蛋白質またはそれをコードするＤＮＡの用途に関する。【００１８】
［８］腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進剤の製造の為の、下記（１）または（２）の使用：
（１）下記（１−ａ）もしくは（１−ｂ）または（１−ｃ）、
（１−ａ）ＨＧＦ蛋白質、
（１−ｂ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチド、
（１−ｃ）（１−ａ）または（１−ｂ）の塩、
（２）下記（２−ａ）もしくは（２−ｂ）または（２−ｃ）を含むＤＮＡ、
（２−ａ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ、
（２−ｂ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチドをコードするＤＮＡ、
（２−ｃ）前記（２−ａ）または（２−ｂ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ。【００１９】
［９］腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生を促進する方法に使用される、下記（１）または（２）：
（１）下記（１−ａ）もしくは（１−ｂ）または（１−ｃ）、
（１−ａ）ＨＧＦ蛋白質、
（１−ｂ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチド、
（１−ｃ）（１−ａ）または（１−ｂ）の塩、
（２）下記（２−ａ）もしくは（２−ｂ）または（２−ｃ）を含むＤＮＡ、
（２−ａ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ、
（２−ｂ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチドをコードするＤＮＡ、
（２−ｃ）前記（２−ａ）または（２−ｂ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ。【００２０】
［１０］腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織損傷患者に、下記（１）または（２）を投与することを特徴とする腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進方法：
（１）下記（１−ａ）もしくは（１−ｂ）または（１−ｃ）、
（１−ａ）ＨＧＦ蛋白質、
（１−ｂ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチド、
（１−ｃ）（１−ａ）または（１−ｂ）の塩、
（２）下記（２−ａ）もしくは（２−ｂ）または（２−ｃ）を含むＤＮＡ、
（２−ａ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ、
（２−ｂ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチドをコードするＤＮＡ、
（２−ｃ）前記（２−ａ）または（２−ｂ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進剤は、骨から分離した移植腱あるいは靭帯片と骨とが接触する面、または移植腱もしくは靭帯片と骨との間隙において、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生を促進することができる。このため、損傷や断裂等により、骨から分離した腱と骨または靭帯と骨との付着（固着、癒合）を促進することができる。また四肢関節（例えば、膝、足、肘、肩等）の靭帯再建術［例えば、ＡＣＬ再建術、ＰＣＬ再建術、側副靭帯再建術、ＭＰＦＬ（medial patelofemoral ligament：内側大腿膝蓋靭帯）再建術、足関節外側靭帯再建術、尺側靭帯再建術または腱板修復術等］において、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織が再生されるのを促進できるので、移植腱と骨または移植靭帯と骨との付着（または固着、癒合）を促進できる。このため、例えば靭帯断裂等により関節等が不安定になりスポーツ活動や日常生活に支障をきたした故障者の靭帯再建術後における復帰を早めることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
ＨＧＦ蛋白質
「ＨＧＦ蛋白質」は、前述するように、成熟肝細胞に対する強力なマイトゲン（mytogen）として同定された蛋白質であり、肝細胞増殖因子（Hepatocyte Growth Factor）と称されているものである（非特許文献４、５など参照）。その名称はＨＧＦ以外にＳＦ（scatter factor）、ＴＣＦ（Tumor Cytotoxic Factor）等が使用されている。
【００２３】
本発明で使用される「ＨＧＦ蛋白質」は公知物質であり、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。
【００２４】
ＨＧＦ蛋白質は、例えばＨＧＦ蛋白質を産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、その培養上清等から分離、精製することにより得ることができる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦ蛋白質をコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清液から目的とする組換えＨＧＦ蛋白質を分離すること等により得ることもできる（例えば、特開平5-111382号公報、Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989年、第163巻，p.967等を参照）。前記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母または動物細胞等を用いることができる。
【００２５】
本発明において、ＨＧＦ蛋白質として好ましくは、ヒト由来のＨＧＦ（ｈＨＧＦ）をコードする遺伝子から産生される蛋白質を挙げることができる。かかるｈＨＧＦをコードする遺伝子として、好ましくは配列番号１または２に示される塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。
【００２６】
かかるＨＧＦ蛋白質として、具体的には、組換えＤＮＡ技術により、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡを導入した細胞によって生産される配列番号３または５のＨＧＦ蛋白質を、また配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡを導入した細胞によって生産される配列番号４または６のＨＧＦ蛋白質を挙げることができる。
【００２７】
配列番号３〜６で示されるＨＧＦ蛋白質は、いずれもヒト由来の天然ＨＧＦ蛋白質であって、ＨＧＦとしてのマイトゲン活性およびモートゲン活性を有している。かかるＨＧＦ蛋白質は、ＮＣＢＩのデータベース（NCBI-GenBank Flat File Release 164.0）等に、例えばAccession No. P14210（配列番号３）またはAccession No. NP_001010932（配列番号４）として登録されている。なお、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するＨＧＦ蛋白質は、配列番号３で示されるアミノ酸配列の第１６１〜１６５番目に位置する５個のアミノ酸残基が欠失している５アミノ酸欠損型ＨＧＦ蛋白質である。ちなみに、上記天然ＨＧＦ蛋白質は、糖蛋白質であり、例えば、Accession No. NP_001010932（配列番号４）で示されるＨＧＦ蛋白質は、２８９位のＡｓｎ、３９７位のＡｓｎ、４７１位のＴｈｒ、５６１位のＡｓｎおよび６４８位のＡｓｎに糖鎖が付加されている。
【００２８】
配列番号５および６に示すアミノ酸配列は、配列番号３および４において、Ｎ末端から３１番目のアミノ酸領域（シグナル配列）が切断されてなる成熟蛋白質のアミノ酸配列である。
【００２９】
本発明が対象とするＨＧＦ蛋白質は、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する限り、上記配列番号３または４に示されるアミノ酸配列において１もしくは複数個（複数個とは例えば、２〜３５個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個；以下同様である。）のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されていてもよく、また同様に糖鎖が欠失、置換、挿入もしくは付加されていてもよい。かかるＨＧＦ蛋白質は、遺伝子工学的手法、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的手段により製造することができる。挿入されるアミノ酸、置換されるアミノ酸、さらに付加されるアミノ酸は、２０種類の天然アミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基を有する限りどのような化合物でもよいが、例えばγ−アミノ酪酸等が挙げられる。なお、配列番号４に示されるアミノ酸配列は、前述するように、配列番号３に示されるアミノ酸配列において５つのアミノ酸残基が欠失してなる５アミノ酸欠損型ＨＧＦ蛋白質である。
【００３０】
さらに、本発明で対象とするＨＧＦ蛋白質は、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する限り、上記配列番号３または４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するものであってもよい。好ましくは配列番号３または４に示されるアミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有する蛋白質である。なお、前述する配列番号５に示すアミノ酸配列は、配列番号３または４に示すアミノ酸配列とそれぞれ９５．７％および９６．４％の同一性を有し、また配列番号６に示すアミノ酸配列は、配列番号３または４に示すアミノ酸配列とそれぞれ９５．１％および９５.７％の同一性を有している。ここで、「同一性」とは、蛋白質の一次構造（アミノ酸配列）を比較し、配列間において各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度を意味する。
【００３１】
また、配列番号３または４に示されるアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列からなるＨＧＦ蛋白質としては、他にＮＣＢＩのデータベースに登録されている、Accession No.  BAA14348またはAccession No. AAC71655等のヒト由来ＨＧＦを挙げることができる。
【００３２】
また、本発明で対象とするＨＧＦ蛋白質は、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する限り、配列番号３および４に示すそれぞれのアミノ酸配列において、１〜３１番目のアミノ酸領域からなるシグナル配列に代えて、他の蛋白質のシグナル配列を有するものであってもよい。かかるシグナル配列としては、ヒト血清アルブミン、インターフェロン、ヒトアミラーゼなどのシグナル配列を挙げることができる。
【００３３】
また、本発明で対象とするＨＧＦ蛋白質は、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する限り、上記配列番号１または２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを有する細胞から生産される蛋白質であってもよい。
【００３４】
ここでストリンジェントな条件としては、約０．７〜１Ｍの塩化ナトリウム存在下、約６５℃でハイブリダイゼーションした後、約０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウムよりなる）を用いて、約６５℃の条件で洗浄する条件を挙げることができる。
【００３５】
ＨＧＦ蛋白質をコードする遺伝子、具体的には、配列番号１若しくは２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、または当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを有する細胞を用いて本発明のＨＧＦ蛋白質を生産する方法としては、例えばこれらのＤＮＡを有する初代培養細胞や株化細胞を培養し、得られた培養上清などから目的のＨＧＦ蛋白質を分離、精製する方法を挙げることができる。また、遺伝子工学的手法により、上記ＤＮＡを適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清などから目的とするＨＧＦ蛋白質（組換え蛋白質）を分離することなどにより得ることもできる（例えば、特開平5-111382号公報、特開平11-1499号公報、Biochem. Biophys. Res. Commun.1989年、第163巻，p.967など参照）。
【００３６】
前記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母または動物細胞等を用いることができる。天然のＨＧＦ蛋白質は糖蛋白質であるので、これと同様に糖蛋白質を産生する場合は、宿主細胞として動物細胞を用いることが好ましい。動物細胞としては、例えばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、マウスＦＭ３Ａ２細胞等が挙げられる。発現ベクターの動物細胞への移入はトランスフェクション法、マイクロインジェクション法等により行われるが、その中では、リン酸カルシウム法が最も一般的である。移入により形質転換された動物細胞の培養は、常法により浮遊培養または付着培養で行うことができる。培地としては、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０などが一般的である。
【００３７】
ＨＧＦ蛋白質が、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するかどうかについては、以下のように評価することはできる。例えば、少なくとも骨と、骨から分離させた腱または靭帯とを靭帯固定具等で固定する。これに、後述の実施例等に記載の方法に従い、対象のＨＧＦ蛋白質を作用させる。その結果、例えば何も作用させない場合（コントロール）と比較して、ＨＧＦ蛋白質を作用させた場合においてより効果的な腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生が観察されれば、該ＨＧＦ蛋白質は、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有していると判断される。  
【００３８】
本発明が対象とするＨＧＦ蛋白質は、骨延長促進作用を有する限り、糖鎖付加の有無ならび糖鎖付加の数は特に制限されない。すなわち、天然に生じうる程度の数（１〜複数個）が、欠失、置換、挿入もしくは付加等されているＨＧＦ蛋白質であってもよい。糖鎖が欠失、置換、挿入もしくは付加したＨＧＦ蛋白質としては、例えば天然のＨＧＦ蛋白質に付加している糖鎖を酵素等で処理し糖鎖を欠損させたもの、また糖鎖が付加しない様に糖鎖付加部位のアミノ酸配列に変異が施されたもの、あるいは天然の糖鎖付加部位とは異なる部位に糖鎖が付加するようアミノ酸配列に変異が施されたもの等が挙げられる。このようなＨＧＦ蛋白質としては、具体的には、例えばＮＣＢＩのデータベース（NCBI-GenBank Flat File Release 164.0；以下において同様である。）に登録されているAccession No. NP_001010932のヒトＨＧＦに対し、糖鎖付加部位の２８９位ＡｓｎをＧｌｎに、３９７位ＡｓｎをＧｌｎに、４７１位ＴｈｒをＧｌｙに、５６１位ＡｓｎをＧｌｎに、６４８位ＡｓｎをＧｌｎにそれぞれ置換することによって糖鎖が付加しないようにしたＨＧＦ蛋白質［Fukuta K et al., Biochemical Journal, 388，555-562（2005）］等を挙げることができる。
【００３９】
本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシラート［−ＣＯＯＭ（Ｍは金属を示す）］、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチル等のＣ１−６アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ３−８シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチル等のＣ６−１２アリール基；例えば、ベンジル、フェネチル等のフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチル等のα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基等のＣ７−１４アラルキル基、並びにアセチルオキシメチル、ピバロイルオキシメチル等のＣ２−６アルカノイルメチル基等が用いられる。
【００４０】
本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質が、Ｃ末端以外にカルボキシル基またはカルボキシラートを有している場合、カルボキシル基またはカルボキシラートがアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば前述のＣ末端のエステル等が挙げられる。
【００４１】
さらに、本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質には、前記蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の反応性基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾリル基、インドリル基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質等の複合蛋白質等も含まれる。
【００４２】
なお、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質は、ヒトに適用する場合は前記したヒト由来のものが好適に用いられるが、ヒト以外の哺乳動物（例えばサル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、モルモット、チンパンジー等）に由来するＨＧＦ蛋白質であってもよい。
【００４３】
このようなＨＧＦ蛋白質としては、例えばＮＣＢＩのデータベース等に登録されているマウス由来ＨＧＦ蛋白質（例えばAccession No. AAB31855、NP_034557、BAA01065、BAA01064等）、ラット由来ＨＧＦ蛋白質（例えばAccession No. NP_058713等）、ウシ由来ＨＧＦ蛋白質（例えばAccession No. NP_001026921、BAD02475等）、ネコ由来ＨＧＦ蛋白質（例えばAccession No. NP_001009830、BAC10545、BAB21499等）、イヌ由来ＨＧＦ蛋白質（例えばAccession No.  NP_001002964、BAC57560等）またはチンパンジー由来ＨＧＦ蛋白質（例えばAccession No. XP 519174等）等が例示されるが、これらに限定されない。
【００４４】
これらのＨＧＦ蛋白質は、本発明の再生促進剤の有効成分として使用する場合、医薬として使用できる程度に精製されたものであればよく、その限りにおいて、種々の方法で調製されたものを用いることができる。なお、精製方法としては、制限されないが、例えばヘパリン・セファローズやハイドロキシアパタイト等を用いたカラムクロマトグラフィーを挙げることができる。
【００４５】
また、本発明の再生促進剤において、ＨＧＦ蛋白質は単独で使用してもよいし、また腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を損なわない限り、種々の蛋白質との混合蛋白質として使用することができる。
【００４６】
ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチド
本発明で用いる、ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチド（以下、ＨＧＦ部分ペプチドと略記する場合がある）としては、前記ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって、前記ＨＧＦ蛋白質と同様に腱骨または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を少なくとも有するものであればいずれのものであってもよい。本発明において、ＨＧＦ部分ペプチドのアミノ酸の数は、前記のＨＧＦ蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも約２０個以上、好ましくは約５０個以上、より好ましくは約１００個以上のアミノ酸配列を含有するペプチド等が好ましい。具体的には、例えば、このようなＨＧＦ部分ペプチドとしては、配列番号３で表されるヒトＨＧＦアミノ酸配列のＮ末端側から３２番目のアミノ酸から２１０番目のアミノ酸までのアミノ酸配列（ＨＧＦのＮ末端ヘアピンループから第１クリングルドメインまでの配列）で示されるペプチドや、配列番号３で表されるヒトＨＧＦアミノ酸配列のＮ末端側から３２番目のアミノ酸から２８８番目のアミノ酸までのアミノ酸配列（ＨＧＦのＮ末端ヘアピンループから第２クリングルドメインまでの配列）で示されるペプチド等が好ましく挙げられる。
【００４７】
また、本発明のＨＧＦ部分ペプチドには、前述のＨＧＦ部分ペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上の相同性を有する部分ペプチド、好ましくは約９０％以上の相同性を有する部分ペプチド、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する部分ペプチドであって、かつ少なくとも前述のＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の腱骨または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する部分ペプチドも含まれる。
【００４８】
本発明のＨＧＦ部分ペプチドにおいては、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシラート［−ＣＯＯＭ（Ｍは前記と同意義）］、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ；Ｒは前記と同意義）のいずれであってもよい。さらに、ＨＧＦ部分ペプチドには、前記ＨＧＦ蛋白質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチド等の複合ペプチド等も含まれる。
【００４９】
なお、ＨＧＦ部分ペプチドについても、「腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する」とは、前述と同様に評価することができる。
【００５０】
本発明のＨＧＦ部分ペプチドは、公知のペプチドの合成法に従って、あるいはＨＧＦ蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれでも良い。すなわち、ＨＧＦ蛋白質を構成し得る保護基を有していてもよい部分ペプチドまたはアミノ酸と、保護基を有していてもよい残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は、保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、M. BodanszkyおよびM. A. Ondetti、ペプチド・シンセシス（Peptide Synthesis），Interscience Publishers, New York（1966年）、SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド（The Peptide），Academic Press, New York（1965年）等に記載された方法等が挙げられる。反応後は通常の精製方法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、結晶化または再結晶等を組み合わせてＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドを精製単離することができる。
【００５１】
ＨＧＦ蛋白質またはその部分ペプチドの塩
本発明のＨＧＦ蛋白質またはその部分ペプチドはフリー（遊離体）の状態であっても、また塩の形態を有していてもよい。本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等）との塩等が挙げられる。
【００５２】
製造において本発明のＨＧＦ蛋白質またはＨＧＦ部分ペプチドが遊離体の形態で得られる場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られる場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００５３】
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ
本発明において「ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ」とは、前述のＨＧＦ蛋白質を発現し得るＤＮＡをいう。ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡとしては、例えば、Nature，342，440（1989）；特許第2777678号公報；Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989年，第163巻，p.967-973；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,1991年，第88巻（16号），p.7001-7005等に記載され、例えば、GenBank／EMBL／DDBJにAccession No. M69718、M73240、AC004960、AY246560、M29145またはM73240等として登録されているヒト由来のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ等が好ましく挙げられる。
【００５４】
また、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡは、ヒトに適用する場合は前記したヒト由来のものが好適に用いられるが、ヒト以外の哺乳動物（例えばサル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、モルモット、チンパンジー等）に由来するＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００５５】
このようなＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えばＮＣＢＩのデータベース等に登録されている例えば、マウス由来ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ（例えばAccession No. S71816、NM_010427、D10213、D10212等）、ラット由来ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ（例えばAccession No. NM_017017等）、ウシ由来ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ（例えばAccession No. NM_001031751、AB110822等）、ネコ由来ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ（例えばAccession No. NM_001009830、AB080187、AB046610等）、イヌ由来ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ（例えばAccession No. NM_001002964、AB090353等）またはチンパンジー由来ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ（例えばAccession No. XM_519174等）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
さらに、ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡの具体例としては、例えば、配列番号１または２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡが好ましく挙げられる。ここで、配列番号１で表される塩基配列は、Accession No. M60718の塩基配列の第７３〜２２５９に位置する塩基配列に相当し、当該塩基配列からなるＤＮＡは配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡに相当する。また、ＤＮＡ組換え技術において、細胞内で発現および産生されたＨＧＦ蛋白質（配列番号３）は、細胞外に分泌されるときにシグナル配列が切断されて、配列番号５で示すアミノ酸配列からなる成熟ＨＧＦ蛋白質となる。従って、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡは、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＨＧＦ蛋白質をコード（産生）するＤＮＡにも相当する。配列番号２で表される塩基配列は、Accession No. M73240の塩基配列の第６６〜２２３７に位置する塩基配列に相当し、当該塩基配列からなるＤＮＡは配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡに相当する。かかるＨＧＦ蛋白質（配列番号４）も、ＤＮＡ組換え技術において、細胞外に分泌されるときにシグナル配列が切断されて、配列番号６で示すアミノ酸配列からなる成熟ＨＧＦ蛋白質となる。従って、配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡは、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＨＧＦ蛋白質をコード（産生）するＤＮＡに相当する。
【００５７】
さらに、ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡは、前述のものに限定されず、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡである限り、本発明のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡとして使用できる。ここでも、「腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する」とは、前述と同様の方法で評価することができる。
【００５８】
このようなＤＮＡとしては限定されないが、前記ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡと約８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を有し、かつ腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等が例示される。
【００５９】
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡは、当該ＤＮＡを有するｃＤＮＡライブラリーを用いて、例えば通常のハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等により容易に得ることができ、該ＤＮＡの取得は具体的には例えばモレキュラー・クローニング（Molecular Cloning，A Laboratory Manual, Third Edition（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001：以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す。））等の基本書等を参考にして行うことができる。
【００６０】
ここでＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを有するｃＤＮＡライブラリーとしては、例えばヒト由来の肝臓ｃＤＮＡライブラリー、脾臓ｃＤＮＡライブラリー、胎盤ｃＤＮＡライブラリー等を挙げることができる。これらのライブラリーはクローンテック社などから商業的に入手することができる。その他 ＨＧＦ蛋白質を発現している細胞株、及び組織材料から常法に従って 作成したｃＤＮＡライブラリーを用いることもできる。このようなｃＤＮＡが組み込まれたλファージを、「モレキュラー・クローニング第３版」に記載された方法に従って大腸菌に感染させ培養し、形成されたプラークをＨＧＦ蛋白質の一部のアミノ酸配列から推定される塩基配列から作成したオリゴヌクレオチドをプローブとしてプラークハイブリダイゼーション法を行うか、またはＰＣＲ法を行うことで、目的とするＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。
【００６１】
また、本発明ではＨＧＦ蛋白質をコードするＲＮＡも、逆転写酵素により前述のＨＧＦ蛋白質を発現することができるものであれば、本発明に用いることができる。該ＲＮＡとしては、例えば細胞または組織よりｍＲＮＡ画分を調製して、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅したＲＮＡ等が挙げられ、本発明の範囲内である。また該ＲＮＡも公知の手段により得ることができる。
【００６２】
なお、後述するように、ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡは、当該ＤＮＡが組み込まれた組換え発現ベクターの形態で患者に投与される。かかる発現ベクターとしては、nakedプラスミド、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（Ｉ型単純ヘルペスウイルス等）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０または免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルス等が挙げられる。中でも、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクター、センダイウイルス・エンベロープ（ＨＶＪ−Ｅ）ベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター等が好ましい。
【００６３】
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
本発明の腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進剤には、前記ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記ＨＧＦ蛋白質と同様に、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等が包含されていてもよい。このようなＤＮＡとしては、配列番号１または２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等が好ましく挙げられる。
【００６４】
なお、ここでも、「腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する」とは、前述と同様の方法で評価することができる。
【００６５】
前記ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、または配列番号１もしくは２で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば前記ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号１もしくは２で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡの部分配列をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７〜１Ｍの塩化ナトリウム存在下、約６５℃で、このようなプローブを利用してハイブリダイゼーションを行った後、約０．１〜２倍の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムよりなる）を用い、約６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。ストリンジェントな条件は、以下において同様である。
【００６６】
このようなストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとして具体的には、前述のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡと約８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡ等が挙げられる。より詳細には、例えば、前記の配列番号１または２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとして、配列番号１または２で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡ等が挙げられる。
【００６７】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法、例えば、前記のモレキュラー・クローニング第３版に記載の方法等に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００６８】
ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチドをコードするＤＮＡ
本発明の腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進剤には、前記ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって前記ＨＧＦ蛋白質と同様に腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチドをコードするＤＮＡが包含されていてもよい。ここでも、「腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する」とは、前述と同様に評価することができる。
【００６９】
このようなＤＮＡとしては、前述の部分ペプチドをコードする塩基配列を有し、かつ腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチドをコードするＤＮＡであればいかなるものであってもよい。このようなＤＮＡとしては、具体的には、例えば、配列番号１または２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡであって、かつ前記ＨＧＦ蛋白質と同様に、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチドをコードするＤＮＡ等が挙げられる。
【００７０】
このようなＤＮＡとしては、より具体的には、例えば、配列番号１で表されるヒトＨＧＦの塩基配列の第９４番目から第６３０番目までの塩基配列（ＨＧＦのＮ末端ヘアピンループから第１クリングルドメインまでのペプチドをコードするＤＮＡ）を有するＤＮＡや、配列番号１で表されるヒトＨＧＦの塩基配列の第９４番目から第８６４番目までの塩基配列（ＨＧＦのＮ末端ヘアピンループから第２クリングルドメインまでのペプチドをコードするＤＮＡ）を有するＤＮＡ等が好ましく挙げられる。
【００７１】
また、このようなＤＮＡは前述のものに限定されず、前述のＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチドをコードするＤＮＡと約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を有し、かつ少なくとも腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチドをコードするＤＮＡ等が挙げられる。
【００７２】
当該ＤＮＡは、例えば通常のハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等により容易に得ることができ、該ＤＮＡの取得は具体的には例えば前記モレキュラー・クローニング第３版等の基本書等を参考にして行うことができる。
【００７３】
また、前記ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、細胞もしくは組織由来のｃＤＮＡ、細胞もしくは組織由来のｃＤＮＡライブラリーまたは合成ＤＮＡ等が好ましく挙げられる。前記ライブラリーにゲノムＤＮＡ断片がクローニングされるベクターとしては、バクテリオファージ、プラスミド、コスミドまたはファージミド等が挙げられる。
【００７４】
また、本発明では前記ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチドをコードするＲＮＡも、逆転写酵素によりＨＧＦ蛋白質を発現することができるものであれば、本発明に用いることができる。該ＲＮＡとしては、例えば細胞または組織よりｍＲＮＡ画分を調製して、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅したＲＮＡ等が挙げられ、本発明の範囲内である。また該ＲＮＡも公知の手段により得ることができる。
【００７５】
ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチドをコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチドをコードするＤＮＡ
本発明の腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進剤には、前述のＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチドをコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチドをコードするＤＮＡ等が包含されていてもよい。
【００７６】
このようなＤＮＡとしては、前述のＨＧＦ部分ペプチドをコードするＤＮＡと約８０％以上、好ましくは約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列し、かつ腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチドをコードするＤＮＡを有するＤＮＡ等が挙げられる。
【００７７】
また、このようなＤＮＡとしては、例えば配列番号１または２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチドをコードするＤＮＡが例示される。さらに詳細には、このようなＤＮＡとしては、配列番号１または２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列をコードするＤＮＡと約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列し、かつ腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有するペプチドをコードするＤＮＡを有するＤＮＡ等が挙げられる。
【００７８】
なお、ここでも、「腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用を有する」とは、前述と同様に評価される。また、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイズも、前述と同様に定義される。
【００７９】
腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生
「腱」は、通常、骨格筋と骨とを仲介する組織として説明でき、また「靭帯」は、通常、骨と骨とを仲介する組織として説明できる。但し、本発明において「腱」は、骨と骨とを仲介する靭帯を包含して称する場合もある。また、本発明における腱は、移植片の腱（以下、「移植腱」という場合もある）を含み、本発明における靭帯は、移植片の靭帯（以下、「移植靭帯」という場合もある）を含む。
【００８０】
移植腱は自己移植腱または同種移植腱であってもよい。用いられる自己移植腱は典型的には、ハムストリングス、膝蓋腱または大腿屈筋腱等から採取されてよい。通常用いられる同種移植腱は死体の供給源から採取され、ハムストリングス、膝蓋腱、大腿屈筋腱、アキレス腱、または脛や肘の腱等であってよい。また、合成（または人工）移植腱または異種移植腱が用いられてもよく、前記自己移植腱（または同種移植腱）と合成移植腱等とのハイブリット移植腱であってもよい。移植腱は、多重に折って使用することもできる。
【００８１】
移植靭帯も、自己移植靭帯または同種移植靭帯であってもよい。用いられる自己移植靭帯は典型的には、腸脛靭帯等から採取されてよい。通常用いられる同種移植靭帯は死体の供給源から採取され、腸脛靭帯、内側側副靭帯（ＭＣＬ）、外側側副靭帯（ＬＣＬ）、前十字靭帯（ＡＣＬ）、後十字靭帯（ＰＣＬ）、外側靭帯、三角靭帯、脛腓靭帯、烏口鎖骨靭帯、または大腿骨頭靭帯等であってよい。また、合成（または人工）移植靭帯または異種移植靭帯が用いられてもよく、前記自己移植靭帯（または同種移植靭帯）と合成移植靭帯等とのハイブリット移植靭帯であってもよい。移植靭帯は、多重に折って使用することもできる。
【００８２】
また、「腱骨移行部」または「靭帯骨移行部」は、腱または靭帯と骨とが付着（または固着、あるいは癒合）する部位であれば、特に限定されず、例えば靭帯再建術において、移植腱を固定するために開けられる骨トンネル（貫通孔）の内側面と移植腱とが付着する部位も含まれる。前記骨トンネルは、例えば、ドリルガイドおよびドリル等を用いて穿孔される。前記靭帯再建術としては、膝関節、足関節、肘関節、手関節または肩関節等における靭帯再建術など挙げられ、より具体的には、例えば、膝関節におけるＡＣＬ再建術、ＰＣＬ再建術、側副靭帯再建術もしくは反復性膝蓋骨脱臼に対するＭＰＦＬ再建術、足関節外側靭帯再建術、肘関節の尺側靭帯再建術または肩関節の腱板修復術等が挙げられる。
【００８３】
例えば移植腱を使用したＡＣＬ再建術の場合、脛骨の上端（近位部）と大腿骨の下端に骨トンネルが穿孔される。骨トンネルが穿孔されると、移植腱が骨トンネルに通され、脛骨と大腿骨との間を本来のＡＣＬと実質的に同じ機能を有して延在するように固定される。固定された移植腱と骨トンネルの内側面とが接触するところまたは移植腱と骨トンネルとで形成される間隙に、腱骨移行部組織が再生されることにより、該移植腱が靭帯としての役割を果たすようになり、膝関節の正常な機能が回復され得る。これにより、脛骨と大腿骨間に靭帯が再形成され得る。
【００８４】
前記固定は、例えば、骨ねじ（締まり嵌めねじ）もしくは同様の締結具や、靭帯固定具または縫合糸（例えば、ナイロン糸、絹糸等）等を用いて行うことができる。締結具、靭帯固定具または縫合糸は単独または組み合わせて用いることができる。靭帯固定具としては、例えばステンレス製ワッシャー（ジンマー株式会社製）やエンド・ボタン（スミス・アンド・ネファーエンドスコピー株式会社製）等が挙げられる。
【００８５】
腱骨移行部または靭帯骨移行部は、複雑な解剖学的特徴を有し、例えば、貫通繊維を含むコラーゲン線維層等が含まれる。
【００８６】
「再生」は「再建」と表現することもでき、腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織が再び作り出されることをいうが、例えば靭帯再建術等においては、移植された腱（または移植された靭帯）が充分な強度をもって骨に付着（固着、癒合）し、生体内で生理的に機能できるようになるすべての状態を含む。腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生は、通常、以下の（１）乃至（５）の過程；
（１）移植腱または移植靭帯と骨との間に方向性のない肉芽組織が形成される過程、
（２）移植腱または移植靭帯と骨との間にコラーゲン線維が形成される過程、
（３）コラーゲン線維が骨方向に方向性を有するようになる過程、
（４）移植腱または移植靭帯から骨組織のなかに入り込む貫通線維（sharpey like fiber）が出現する過程、
（５）貫通線維が成熟する過程、
を含む。靭帯再建術以外における再生についても同様に説明される。
【００８７】
腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進剤
本発明の腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進剤は、下記に示すように有効成分の種類によって、（ａ）ＨＧＦ蛋白質／部分ペプチドを有効成分とする再生促進剤と、（ｂ）ＨＧＦ遺伝子を有効成分とする再生促進剤に分類することができる。
【００８８】
（ａ）ＨＧＦ蛋白質／部分ペプチドを有効成分とする再生促進剤
上記（２）で説明するＨＧＦ蛋白質、（３）で説明するＨＧＦ蛋白質の部分ペプチド（ＨＧＦ部分ペプチド）、またはこれらの少なくとも一方の塩（これらを以下、「ＨＧＦ蛋白質／部分ペプチド」と称する場合がある）を有効成分として含有する再生促進剤。
【００８９】
（ｂ）ＨＧＦ遺伝子を有効成分とする再生促進剤
上記(４)で説明するＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ、（５）当該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、（６）で説明するＨＧＦ部分ペプチドをコードするＤＮＡ、（７）当該ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ（以下、これらを「ＨＧＦ遺伝子」と総称する）を有効成分として含有する再生促進剤。
【００９０】
本発明の腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進剤を患者に投与する場合、その投与形態、投与方法、投与量等は、有効成分が前述の「ＨＧＦ蛋白質／部分ペプチド」である場合と、前述の「ＨＧＦ遺伝子」の場合とで異なってもよい。
【００９１】
本発明の再生促進剤の投与形態、投与方法及び投与量等は、上記有効成分の種類に応じて適宜設計し、また変更することができる。
【００９２】
（ａ）ＨＧＦ蛋白質／部分ペプチドを有効成分とする再生促進剤
当該（ａ）の再生促進剤は、例えば液剤や固形剤等の種々の製剤形態をとりうるが、一般的にはＨＧＦ蛋白質、ＨＧＦ部分ペプチド、またはそれらの塩を慣用の担体と共に注射剤、噴射剤、徐放性製剤（例えば、デポ剤）等の形態に製剤化されるのが好ましい。ここで注射剤や噴射剤は、水性製剤または油性製剤のいずれでもよい。
【００９３】
水性注射剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒（注射用水、精製水等）に、医薬上許容される添加剤、例えば等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等）、保存剤（パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等）、増粘剤（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等）、安定化剤（ショ糖、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）またはｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等）等を適宜添加した溶液に、ＨＧＦ蛋白質を溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。
【００９４】
また適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）または非イオン界面活性剤（ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０等）等をさらに配合してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油または大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコール等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルまたはバイアル等に充填される。注射剤中のＨＧＦ蛋白質含量は制限されないが、注射液全体に対して、通常約０．０００２〜０．５ｗ／ｖ％、好ましくは約０．００１〜０．２ｗ／ｖ％に調整され得る。なお、注射剤等の液状製剤は、凍結保存または凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
【００９５】
噴霧剤も製剤上の常套手段によって調製することができる。噴霧剤として製造する場合、その噴霧剤に配合される添加剤としては、一般に吸入用製剤に使用される添加剤であればいずれのものであってもよく、例えば、噴射剤の他、前記の溶剤、保存剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤等を配合し得る。噴射剤としては、液化ガス噴射剤または圧縮ガス等が挙げられる。液化ガス噴射剤としては、例えば、フッ化炭化水素（ＨＣＦＣ２２、ＨＣＦＣ−１２３、ＨＣＦＣ−１３４ａ、ＨＣＦＣ１４２等の代替フロン類等）、液化石油、ジメチルエーテル等が挙げられる。圧縮ガスとしては、例えば、可溶性ガス（炭酸ガス、亜酸化窒素ガス等）または不溶性ガス（窒素ガス等）等が挙げられる。噴霧剤中のＨＧＦ蛋白質含量は、噴霧剤全体に対して、通常約０．０００２〜５ｗ／ｖ％、好ましくは約０．００１〜２ｗ／ｖ％に調整され得る。
【００９６】
また、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質／部分ペプチドは、生体分解性高分子と共に、徐放性製剤（例えばデポ剤）とすることもできる。ＨＧＦ蛋白質／部分ペプチドは特にデポ剤とすることにより、投薬回数の低減、作用の持続性および副作用の軽減等の効果が期待できる。該徐放性製剤は公知の方法に従って製造することができる。本徐放性製剤に使用される生体内分解性高分子は、公知の生体内分解性高分子のなかから適宜選択できるが、例えばデンプン、デキストランまたはキトサン等の多糖類；コラーゲンまたはゼラチン等の蛋白質；ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリロイシン、ポリアラニンまたはポリメチオニン等のポリアミノ酸；ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリ酸無水物またはフマル酸・ポリエチレングリコール・ビニルピロリドン共重合体等のポリエステル；ポリオルソエステル；ポリメチル−α−シアノアクリル酸等のポリアルキルシアノアクリル酸；ポリエチレンカーボネートまたはポリプロピレンカーボネート等のポリカーボネート等が挙げられる。好ましくはポリエステル、ポリ乳酸または乳酸−グリコール酸共重合体であり、更に好ましくはポリ乳酸または乳酸−グリコール酸共重合体である。乳酸−グリコール酸共重合体を使用する場合、その組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）は徐放期間によって異なるが、例えば徐放期間が約２週間ないし３カ月、好ましくは約２週間ないし１カ月の場合には、約１００／０乃至５０／５０が好ましい。該ポリ乳酸または乳酸−グリコール酸共重合体の重量平均分子量は、一般的には約５，０００乃至２０，０００が好ましい。ポリ乳酸または乳酸−グリコール酸共重合体は、公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の製造法に従って製造できる。生体分解性高分子とＨＧＦ蛋白質の配合比率は特に限定はないが、例えば生体分解性高分子に対して、ＨＧＦ蛋白質が通常約０．００１〜５０ｗ／ｗ％、約０．０１〜３０ｗ／ｗ％が好ましい。
【００９７】
投与方法としては、注射剤もしくは噴霧剤を移植腱もしくは靭帯片と骨とが接触する部位（インターフェース：interface）や移植腱もしくは靭帯片と骨との間隙またはその周辺部位に局所適用（直接注射もしくは噴霧）するか、あるいは徐放性製剤（デポ剤）をインターフェースまたはその周辺部位に局所適用する（埋め込む）のが好ましい。また、投与量は、剤形、疾患の程度または年齢等に応じて適宜選択されるが、通常、１回当たり、本発明の腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進剤に含有されるＨＧＦ蛋白質量は０．１μｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１μｇ〜５０ｍｇ、さらに好ましくは１０μｇ〜２５ｍｇである。また、投与回数も剤形、疾患の程度または年齢等に応じて適宜選択され、１回投与とするか、ある間隔をおいて持続投与とすることもできる。持続投与の場合、投与間隔は１日１回から数ヶ月に１回でよく、例えば、徐放性製剤（デポ剤）による投与や徐放性ポンプによる持続投与の場合は、数ヶ月に１回でもよい。
【００９８】
（ｂ）ＨＧＦ遺伝子を有効成分とする再生促進剤
ＨＧＦ遺伝子を患者に投与する場合には、常法、例えば別冊実験医学，遺伝子治療の基礎技術，羊土社，１９９６、別冊実験医学，遺伝子導入＆発現解析実験法，羊土社，１９９７、日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス，１９９９等に記載の方法に従って、行うことが好ましい。
【００９９】
具体的な投与方法としては、例えば、ＨＧＦ遺伝子が組み込まれた組換え発現ベクター等をインターフェースまたはその周辺の組織（例えば骨、筋肉等）へ局所適用（局所注射）する方法等が挙げられる。
【０１００】
発現ベクターとしては、ｎａｋｅｄプラスミド、または無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（Ｉ型単純ヘルペスウイルス等）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０もしくは免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルス等が挙げられるが、これらに限定されない。中でも、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクター、センダイウイルス・エンベロープ（ＨＶＪ−Ｅ）ベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター等が好ましい。
【０１０１】
ＨＳＶ−１ベクターとしては、ウイルス複製のためのＩＣＲ４，ＩＣＰ３４．５およびＶＰ１６（ｖｍｗ６５）をエンコードする３つの遺伝子の欠失により、重篤な障害状態にある複製能力のないＨＳＶ−１（ＨＳＶ１７６４／４−／ｐＲ１９）ベクター（Coffin RS, et al., J. Gen. Virol. 1998年，第79巻，p.3019-3026；Palmer JA，et al., J. Virol., 2000年，第74巻，p.5604-5618；Lilley CE, et al., J. Virol., 2001年，第75巻，p.4343-4356）等が挙げられる。ＨＶＪ−Ｅベクターは、例えばUSP6,913,923に記載の方法で製造できる。ＨＶＪ−Ｅベクターとしては、例えばGenomONE-Neo EX HVJ Envelope Transfection Kit（コスモ・バイオ株式会社製）等を好ましく使用できる。また、ＡＡＶベクターは、非病原性ウイルスに属し、安全性が高く、細胞に効率よく遺伝子導入できるベクターである。ＡＡＶベクターとしては、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５等が挙げられる。これらＨＳＶ−１ベクターやＨＶＪ−ＥベクターまたはＡＡＶベクターは目的遺伝子を安全に長期間発現させ得る。本発明に使用されるベクターとしては、安全でかつ長期発現を可能とするＨＳＶ−１ベクター、ＨＶＪ−ＥベクターまたはＡＡＶベクターがとりわけ好ましい。
【０１０２】
ＨＧＦ遺伝子を患者に投与する場合の製剤形態としては、前記の各投与形態に合った種々の公知の製剤形態、例えば、注射剤、噴霧剤、徐放性製剤（デポ剤）、マイクロカプセル剤等をとり得ることができる。注射剤、噴霧剤、徐放性製剤（デポ剤）は、前述のＨＧＦ蛋白質の場合と同様にして調製できる。ＨＧＦ遺伝子導入ベクターの種類により異なり、また制限されないが、例えば注射剤の場合、遺伝子導入ベクターは通常約１×１０5〜１×１０12ｐｆｕ／ｍＬ、好ましくは約１×１０6〜１×１０11ｐｆｕ／ｍＬに調整され得る。
【０１０３】
マイクロカプセル剤を製造する場合、例えばＨＧＦ遺伝子を含む発現プラスミドを導入した宿主細胞等を芯物質としてこれを公知の方法（例えばコアセルベーション法、界面重合法または二重ノズル法等）に従って被膜物質で覆うことにより直径約１〜５００、好ましくは約１００〜４００μｍの微粒子として、マイクロカプセル剤を製造することができる。被膜物質としては、膜形成性高分子等が挙げられる。該膜形成性高分子としては、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、エチルセルロース、アルギン酸またはその塩、ゼラチン、ゼラチン・アラビアゴム、ニトロセルロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体、キトサン−アルギン酸塩、硫酸セルロース−ポリ（ジメチルジアリル）アンモニウムクロライド、ヒドロキシエチルメタクリレート−メチルメタクリレート、キトサン−カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩−ポリリジン−アルギン酸塩等が挙げられる。
【０１０４】
これらの製剤中のＨＧＦ遺伝子の含量や投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができる。また投与量は、ＨＧＦ遺伝子導入ベクターの種類により異なるが、ＨＧＦ遺伝子導入ベクターに換算して、通常１×１０6ｐｆｕ〜１×１０12ｐｆｕ、好ましくは１×１０7ｐｆｕ〜２×１０11ｐｆｕ、さらに好ましくは１．５×１０7ｐｆｕ〜１．５×１０11ｐｆｕを数日ないし数ヶ月に１回投与するのが好ましい。
【０１０５】
本発明の再生促進剤は、ヒトのほか、ヒト以外の哺乳動物（例えば、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、モルモット、チンパンジー等）にも適用できる。
【０１０６】
本発明の再生促進剤は、前述したように、好ましくは靭帯再建術等が適応される場合に、術後の移植腱と骨とが、または移植靭帯と骨とが接触する部位（インターフェース）またはその周辺部に用いることができる。そして、本発明の腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進剤は、インターフェースまたは移植腱あるいは移植靭帯と骨との間隙に腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織を再生させることができる。
【実施例】
【０１０７】
以下に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【０１０８】
〔実施例１〕
ウサギ自家移植腱モデルにおける腱骨移行部組織再生に対するＨＧＦ蛋白質の効果
方法：日本白色家兎（２．５〜３．０ｋｇ）にミタゾラム（ドルミカム：アステラス株式会社製）３ｍｇと塩酸メデトミジン（ドミトール：日本全薬株式会社製）１ｍｇを筋注後に、ペントバルビタールナトリウム（ソムノペンチル：共立製薬株式会社製）約２６０ｍｇ／時間を持続静脈内投与することにより麻酔を施した。後肢を除毛、消毒し、清潔操作下に両後肢各々において次の手術を行った。まず、後肢前面の皮膚を約５ｃｍ切開し、大腿骨外顆に付着する長趾伸筋（extension digitorum longus；以下、ＥＤＬと略記する。）腱を大腿骨起始（付着）部で切離した。次いで、脛骨の外側面を展開し、直径２．５mmのドリルを用いて、脛骨近位部外側面から内側面に向けて貫通孔（以下、これを「骨トンネル」という）を作製した。先に切離したＥＤＬ腱（移植腱）の遊離端を、図１に示すように、脛骨外側面から骨トンネル内に引き込み、脛骨内側面に引き抜き、ステンレス製ワッシャー（ジンマー株式会社製）と３−０ナイロン糸（株式会社ベアーメディック社製）を用いて固定した。固定時の肢位は足関節中間位とした。移植腱を引き込んだ骨トンネル内を充分に生理食塩液（大塚製薬株式会社製）で洗浄した。次いで、右後肢の移植腱と骨トンネルとの接触面及び間隙に、ＨＧＦ蛋白質１０μｇを１０μＬの生理食塩水に溶解したもの１０μＬを含ませた海綿骨を移植した（ＨＧＦ投与群）。なお、ここでＨＧＦ蛋白質として、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＨＧＦ蛋白質を用いた。左後肢の移植腱と骨トンネルとの接触面及び間隙に、生理食塩水１０μＬを含ませた海綿骨を移植した（コントロール群）。海綿骨は骨トンネル作製時に、採取したものを用いた（０．０５ｇ）。海綿骨を移植後、創を縫合し、閉鎖した。術後、ウサギをケージに戻し、四肢の拘束や固定等せずに自由に運動させた。【０１０９】
術後、２、４、６、８、１２週に、ウサギを各９羽屠殺し、脛骨及びＥＤＬを含む移植腱を一塊の組織として摘出した。摘出した組織における、脛骨近位部の貫通孔（骨トンネル）の入口（外側面）から出口（内側面）までの距離を、キャリバーを用いて計測した。それぞれ４羽を組織学的検討に、５羽を生体力学的検討に用いた。【０１１０】
（１）組織学的検討
摘出した組織を、１０％（ｖ／ｖ）ホルマリン液で２日間保存後に生理食塩水で洗浄し、８０％（ｖ／ｖ）メチルアルコールに２日間浸漬した。次いで、ブランクリュクロ液を用いて、７日間かけて脱灰を行った。脱灰後、脛骨の骨トンネル長軸に沿って切片を作成した。作成した切片を、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色及びマッソントリクローム染色を実施した。染色された切片を光学顕微鏡で観察し、以下の基準でスコア化した。【０１１１】
スコア基準
−：インターフェース（移植腱と骨トンネルとの接触面及び間隙）に、新しい組織の形成が認められない。【０１１２】
＋：インターフェースに、方向性のない肉芽組織の形成が認められる
＋＋：インターフェースに、骨方向に向かって方向性を持つコラーゲン線維が現れる
＋＋＋：インターフェースの方向性を持つコラーゲン線維の間に貫通線維が現れる
＋＋＋＋：貫通線維が太く成熟する。【０１１３】
結果：図２に、術後８週の光学顕微鏡写真を示した。ＨＧＦ投与群（右図Ａ）は、コントロール群（左図Ｂ）に比較して、インターフェースに、骨方向に向かって方向性を持つコラーゲン線維および貫通線維が出現していることが明確に分かる。また、該貫通線維は太く成熟している。【０１１４】
また、インターフェースの組織スコアを表１に示す。表１から明らかなようにＨＧＦ投与群は、術後早期の段階で、インターフェースにおいて腱骨移行部組織の形成（再生）が促進されることが判明した。【０１１５】
【表１】
0005637854.tif 000002
【０１１６】
（２）生体力学的検討
生体力学的検討は、移植腱が骨トンネルに付着して形成された腱骨移行部組織の破断強度を比較することにより実施した。破断強度は、骨トンネルから移植腱が引き抜かれるときの最大荷重（ニュートン；Ｎ）を測定し、骨トンネル長１ｍｍに対する最大荷重として、以下の式から算出した。【０１１７】
破断強度（Ｎ／ｍｍ）＝最大荷重／骨トンネル長
最大荷重は、引張試験機（インストロン社製、モデル４４８２）を用いて、摘出した組織の脛骨を引張試験機に固定した後、ＥＤＬを把持して骨トンネル長軸方向に引張り、骨トンネルから移植腱が引き抜かれるときの荷重とした。なお、移植腱が骨トンネルから引き抜かれる前に断裂したものは、除外した。【０１１８】
結果：術後２週及び６週の破断強度を表２に示した。いずれの時点においても、ＨＧＦ投与群の破断強度はコントロール群に比して大きかった。【０１１９】
【表２】
0005637854.tif 000003
【０１２０】
以上の結果は、ＨＧＦ蛋白質の投与が、腱骨移行部組織を早く、かつ強度をもって再生させることを示すものである。【０１２１】
〔実施例２〕
ウサギ自家移植腱モデルにおける腱骨移行部組織再生に対するＨＧＦ蛋白質の効果
上記で使用したＨＧＦ蛋白質に代えて、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＨＧＦ蛋白質を用いて、上記実施例１と同様に実験を行った。その結果、実施例１と同様に、ＨＧＦ蛋白質に腱骨移行部組織または靭帯骨移行部組織の再生促進作用が認められた。【０１２２】
以下、本発明の再生促進剤の製剤例を記載する。当該製剤例において、ＨＧＦ蛋白質として、配列番号３〜６に示すアミノ酸配列からなるＨＧＦ蛋白質をいずれも使用することができる。【０１２３】
［製剤例１］
生理食塩水１００ｍＬ中に、ＨＧＦ蛋白質ｌｍｇ、マンニトール１ｇ及びポリソルベー卜８０を１０ｍｇ含む溶液を無菌的に調製し、これを１ｍＬずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封することにより、凍結乾燥製剤の形態を有する再生促進剤を得た。【０１２４】
［製剤例２］
０．０２Ｍリン酸緩衝液（0.15Ｍ NaCl及び0.01％ポリソルベート80含有、pH7.4）１００ｍＬ中に、ＨＧＦ蛋白質（配列番号６）１ｍｇ及びヒト血清アルブミン１００ｍｇを含む水溶液を無菌的に調製し、これを１ｍＬずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封することにより、凍結乾燥製剤の形態を有する再生促進剤を得た。【０１２５】
［製剤例３］
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸/グリコール酸＝50/50，重量平均分子量＝10,000；和光純薬工業株式会社製）１．９ｇをジクロロメタン３．０ｍＬに溶解する。この有機溶媒液に、ＨＧＦ蛋白質の凍結乾燥粉末１００ｍｇを添加し、ミキサーミル（株式会社レッチェ）を用いて微粒化し、ＨＧＦ分散液を調製する。この分散液を０．１ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール水溶液８００ｍＬに添加し、ホモミキサーを用いて撹拌・乳化する。室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させた後、遠心分離（約２，０００ｒｐｍ）することによりマイクロカプセルを分取する。次いで蒸留水４００ｍＬを用いて２回洗浄後、Ｄ−マンニトール０．２ｇを添加し凍結乾燥する。凍結乾燥後、更に残留溶媒を除去するため、４０℃下で３日間真空乾燥してＨＧＦ蛋白質を含有する徐放性マイクロカプセルを得る（生体内分解性高分子に対するＨＧＦの配合比率：５．３ｗ／ｗ％）。【０１２６】
［製剤例４］
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸/グリコール酸＝50/50，重量平均分子量＝10,000；和光純薬工業株式会社製）１．８９ｇと酸化亜鉛１０ｍｇとをジクロロメタン３．０ｍＬに溶解する。この有機溶媒液に、ＨＧＦ蛋白質の凍結乾燥粉末１００ｍｇを添加し、ミキサーミル（株式会社レッチェ）を用いて微粒化し、ＨＧＦ分散液を調製する。この分散液を０．１ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール水溶液８００ｍＬに添加し、ホモミキサーを用いて撹拌・乳化する。室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させた後、遠心分離（約２，０００ｒｐｍ）することによりマイクロカプセルを分取する。次いで蒸留水４００ｍＬを用いて２回洗浄後、Ｄ−マンニトール０．２ｇを添加し凍結乾燥する。凍結乾燥後、更に残留溶媒を除去するため、４０℃で３日間真空乾燥してＨＧＦ蛋白質を含有する徐放性マイクロカプセルを得る（生体内分解性高分子に対するＨＧＦの配合比率：５．３ｗ／ｗ％）。【０１２７】
［製剤例５］
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸/グリコール酸＝75/25，重量平均分子量＝15,000；和光純薬工業株式会社製）１．７ｇをジクロロメタン２．７ｍＬに溶解する。この有機溶媒液に、ＨＧＦ蛋白質の凍結乾燥粉末３００ｍｇを添加し、ミキサーミル（株式会社レッチェ）を用いて微粒化し、ＨＧＦ分散液を調製する。この分散液を０．１ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール水溶液８００ｍＬに添加し、ホモミキサーを用いて撹拌・乳化する。室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させた後、遠心分離（約２，０００ｒｐｍ）することによりマイクロカプセルを分取する。次いで蒸留水４００ｍＬを用いて２回洗浄後、Ｄ−マンニトール０．２ｇを添加し凍結乾燥する。凍結乾燥後、更に残留溶媒を除去するため、４０℃で３日間真空乾燥して、ＨＧＦ蛋白質を含有する徐放性マイクロカプセルを得る（生体内分解性高分子に対するＨＧＦの配合比率：１７．６ｗ／ｗ％）。【０１２８】
［製剤例６］
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸/グリコール酸＝75/25，重量平均分子量=15,000；和光純薬工業株式会社製）１．６９ｇと酸化亜鉛１０ｍｇとをジクロロメタン２．７ｍＬに溶解する。この有機溶媒液に、ＨＧＦ蛋白質の凍結乾燥粉末３００ｍｇを添加し、ミキサーミル（株式会社レッチェ）を用いて微粒化し、ＨＧＦ分散液を調製する。この分散液を０．１ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール水溶液８００ｍＬに添加し、ホモミキサーを用いて撹拌・乳化する。室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させた後、遠心分離（約２，０００ｒｐｍ）することによりマイクロカプセルを分取する。次いで蒸留水４００ｍＬを用いて２回洗浄後、Ｄ−マンニトール０．２ｇを添加し凍結乾燥する。凍結乾燥後、更に残留溶媒を除去するため、４０℃で３日間真空乾燥して、ＨＧＦ蛋白質を含有する徐放性マイクロカプセルを得る（生体内分解性高分子に対するＨＧＦの配合比率：１７．８ｗ／ｗ％）。【０１２９】
［製剤例７］
ＤＬ−乳酸重合体（乳酸／グリコール酸＝１００／０，重量平均分子量＝５，０００；和光純薬工業株式会社製）５ｇを塩化メチレン５０ｍＬに溶解し、１０ｗ／ｖ％の溶液を調製する。次いで、この溶液にＨＧＦ蛋白質の凍結乾燥粉末２．５ｍｇを添加する。これを別に４０℃に加温しておいた０．５ｗ／ｖ％キトサン水溶液に加え、ホモミキサーを用いて１０００ｒｐｍの撹拌速度で撹拌し乳化する。得られる乳化液を室温で更に３時間撹拌して塩化メチレンを蒸散させ、次いで、遠心分離（約２，０００ｒｐｍ）して生成したマイクロスフィアを集め、これを予め４０℃に加温しておいた蒸留水を用いて５回洗浄し、次いで室温で減圧乾燥し、ＨＧＦを含有するマイクロスフィアを得る（生体内分解性高分子に対するＨＧＦの配合比率：０．０５ｗ／ｗ％）。【０１３０】
［製剤例８］
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸/グリコール酸＝75/25，重量平均分子量＝5,000；和光純薬工業株式会社製）１０ｇを塩化メチレン：エタノール（４：１）２００ｍＬに溶解し、５ｗ／ｖ％の溶液を調製する。次いで、この溶液にＨＧＦ蛋白質の凍結乾燥粉末２．５ｍｇを添加する。これを、別に４０℃に加温しておいた１ｗ／ｖ％ゼラチン水溶液の中に、５００ｒｐｍの速度でホモミキサーを用いて攪拌しながら、少量ずつ加え乳化する。得られる乳化液を室温で更に３時間撹拌して塩化メチレンとエタノールを蒸散させ、次いで、遠心分離（約２，０００ｒｐｍ）して生成したマイクロスフィアを集める。回収したマイクロスフィアを、予め４０℃に加温しておいた蒸留水を用いて５回洗浄し、室温で減圧乾燥し、ＨＧＦ蛋白質を含有するマイクロスフィアを得る（生体内分解性高分子に対するＨＧＦの配合比率：０．０２５ｗ／ｗ％）。【０１３１】
［製剤例９］
２ｗ／ｖ％ＨＧＦ含有水溶液０．２ｍＬと２ｗ／ｖ％アテロコラーゲンのリン酸緩衝液溶液２ｍＬを混合した後、凍結乾燥を行う。なお、ここでＨＧＦ含有水溶液は、実験例１に記載する方法で調製することができる。得られた凍結乾燥品は、液体窒素を用いて低温で粉砕した後、金型にいれて圧縮成型し、円柱状のＨＧＦ含有徐放性製剤を得る（生体内分解性高分子に対するＨＧＦの配合比率：１０ｗ／ｗ％）。【０１３２】
［製剤例１０］
０．０１ｗ／ｖ％ＨＧＦ含有水溶液１００ｍＬと２ｗ／ｖ％コラーゲン水溶液５０ｇを均一に混合攪拌し、凍結乾燥する。その後、液体窒素を用いて低温粉砕する。これを棒状に圧縮成型し、ＨＧＦ蛋白質を含有する徐放性製剤を得る（生体内分解性高分子に対するＨＧＦの配合比率：１ｗ／ｗ％）。【０１３３】
［製剤例１１］
ＨＧＦ蛋白質１ｍｇを、２ｗ／ｖ％アテロコラーゲン溶液２ｍＬに溶解した後、凍結乾燥を行う。得られた凍結乾燥物を粉砕した後、円柱状に圧縮成型し、ＨＧＦ蛋白質を含有する徐放性製剤を得る（生体内分解性高分子に対するＨＧＦの配合比率：２．５質量％）。【０１３４】
［製剤例１２］
ヒアルロナンのナトリウム塩（極限粘度数45000cc/g）０．５８ｇを２０ｍＬの水と混合し、膨潤させる。次にこの混合物に、２Ｎ水酸化ナトリウム２ｍＬを加え、撹拌して均一な溶液とする。これに、２．４ｍＬの水に０．１０ｇのジビニルスルホンを加えて撹拌して調製した溶液を加え混合物とし、その混合物を７０分放置し、得られるゲルをバイオトリス緩衝液（リン酸塩緩衝の０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ約７．２）の２２３ｍＬ中に入れ、３時間膨潤させる。次に膨潤させたゲルに１ｍＬの２Ｎ  ＨＣｌを加える。１時間後に、０．６ｍＬの２Ｎ  ＨＣｌを加え、１６時間放置した。０．３５ｍＬの２Ｎ  ＨＣｌを加え、膨潤ゲルを緩衝液中３日間ゆっくり撹拌する。均一な粘弾性の柔らかなゲルが得られ、これを０．１５Ｍ  ＮａＣｌで５日間透析する。このゲルを、緩衝食塩水中の１ｗ／ｖ％ＨＧＦと混合して、ＨＧＦ蛋白質の最終濃度を０．２５ｗ／ｖ％とし、ＨＧＦ含有製剤を得る（生体内分解性高分子に対するＨＧＦの配合比率：約２５ｗ／ｖ％）。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明の腱骨または靭帯骨移行部組織の再生促進剤は、腱骨または靭帯骨移行部組織の再生を促進する医療用薬剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】図１は、実施例１におけるウサギ肢関節におけるＥＤＬ腱（左図）とそのＥＤＬ腱が骨に移植された状態（右図）を示す図である。
【図２】図２は、実施例１におけるＥＤＬ腱移植後８週における、腱骨移行部組織の光学顕微鏡写真像を示す図である。図中、ＡはＨＧＦ投与群のＨＥ染色像を、Ｂはコントロール群のＨＥ染色像を示す。
【符号の説明】
【０１３７】
１   長趾伸筋腱（ＥＤＬ腱）
５   骨トンネル
１０ ステンレス製ワッシャー
１２ 長趾伸筋（ＥＤＬ）
１４ 脛骨外側面
１６ 脛骨内側面
１８ 脛骨近位部
２０ 脛骨
２２ 大腿骨外顆
２４ 腓骨
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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