(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アゴニスト複合体IL-6/sIL-6Rの活性を阻害する能力があり、２つの単量体を含むポリペプチド二量体であって、該単量体のそれぞれは、IgG1タンパク質のFcドメインに融合したgp130分子の細胞外部分を含み、少なくともFcドメインのヒンジ領域のアミノ酸残基Leu235が少なくとも１つの親水性アミノ酸残基で置換されており、前記親水性アミノ酸残基がGluまたはAspである、上記ポリペプチド二量体。
【請求項２】
更にヒンジ領域のアミノ酸残基Leu234がPheまたはAlaで置換されている、請求項１記載のポリペプチド二量体。
【請求項３】
ヒンジ領域のアミノ酸残基Leu234および／またはGly237がアミノ酸残基Alaで置換されている、請求項２記載のポリペプチド二量体。
【請求項４】
ヒンジ領域がLeu234-Leu235-Gly236-Gly237の代わりにAla234-Glu235-Gly236-Ala237のアミノ酸配列モチーフを含有する、請求項１から３のいずれかに記載のポリペプチド二量体。
【請求項５】
ヒンジ領域がアミノ酸配列Asp221-Lys222-Thr223-His224-Thr225-Cys226-Pro227-Pro228-Cys229-Pro230-Ala231-Pro232-Glu233-Ala234-Glu235-Gly236-Ala237-Pro238-Ser239-Val240を含有する、請求項４記載のポリペプチド二量体。
【請求項６】
可溶性gp130分子が、IgG1タンパク質のFcドメインのヒンジ領域に、直接またはフレキシブルなポリペプチド・リンカーを介して融合している、請求項１から５のいずれかに記載のポリペプチド二量体。
【請求項７】
リンカーがグリシン、セリン、アスパラギン、トレオニン、およびアラニンから成る群から独立して選択される２から５０個のアミノ酸残基を含むリンカーである、請求項６記載のポリペプチド二量体。
【請求項８】
１つまたはそれ以上のN-グリコシル化部位が、可溶性gp130分子とFcドメインとの間に挿入されている、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド二量体。
【請求項９】
単量体が、単純な共有結合、フレキシブルなペプチド・リンカー、または１つもしくはそれ以上のジスルフィド架橋を介して互いに結合されている、請求項１から８のいずれかに記載のポリペプチド二量体。
【請求項１０】
該二量体の少なくとも１つの単量体がPEG化されている、請求項１から９のいずれかに記載のポリペプチド二量体。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれかに記載のポリペプチド二量体の単量体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２記載の発現ベクターを含有するホスト細胞。
【請求項１４】
請求項１から９のいずれかに記載のポリペプチド二量体を生成する方法であって、請求項１３記載のホスト細胞を培養し、そして該ホスト細胞または培養液からの単量体または二量体を回収することを含む上記方法。
【請求項１５】
請求項１から１０のいずれかに記載のポリペプチド二量体を含有する医薬組成物。
【請求項１６】
アゴニスト複合体IL-6/sIL-6Rの阻害が有益な効果をもたらす疾患または傷害の治療および／または予防のための医薬組成物を調製するための、請求項１から１０のいずれかに記載のポリペプチド二量体の使用。
【請求項１７】
該疾患が、骨吸収、高カルシウム血症、悪液質、腫瘍または他のタイプの癌、自己免疫疾患、炎症性またはアトピー性疾患、感染症、内分泌障害、または代謝性もしくは異化性疾患である、請求項１６記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２つの可溶性gp130分子を含有し、それぞれの分子がIgG1タンパク質のFcドメインに融合しているポリペプチド二量体に関し、ここで、Fcドメインのヒンジ領域は二量体に好適な特性がもたらされるように修飾されている。本発明はまた、該二量体を含有する医薬組成物および種々の医学的用途にも関する。
【背景技術】
【０００２】
多機能性サイトカイン、インターロイキン-6（IL-6）は広範な生体機能を示し、中でもB細胞の刺激および肝臓における急性期タンパク質合成の誘導は最も注目されているものである。IL-6は、IL-6特異的表面受容体（IL-6R）への結合を介して標的細胞にその活性を及ぼす。この受容体／リガンド複合体はIL-6受容体複合体の第2のサブユニットであるgp130のホモ二量体化を促進する。gp130の二量体化によってIL-6シグナルの伝達が起こる。2つの機構（選択的スプライシングおよび切断）によって生成される可溶型IL-6R（sIL-6R）も、IL-6と複合体を形成してgp130二量体化およびシグナリングを誘発する能力を有する。
【０００３】
IL-6Rの細胞質部分はシグナル伝達に関与しないため、gp130ホモ二量体によるシグナリングは膜結合型または可溶性IL-6Rと複合体を形成したIL-6によって誘導できる。しかしながら、sIL-6Rの存在によってIL-6応答性細胞のリガンドに対する感作が起こる。更に、IL-6に完全に依存するハイブリドーマ細胞は、培養液中に存在するsIL-6Rを継続的に除去すると、ごく少量のIL-6に応答して増殖しない。
【０００４】
gp130は、最初にインターロイキン-6シグナル伝達体として記述されたが、これは多くのサイトカイン（例えばIL-6、IL-11、白血病阻害因子（LIF）、オンコスタチンM（OSM）、および毛様体神経栄養因子（CNTF））に共通する伝達鎖である。これらのサイトカインは全て二または三者間受容体複合体を介して作用し、シグナリングはホモ二量体化（IL-6の場合）またはgp130とLIF-R（LIF、CT-1、OSM、CLC、およびCNTFの場合）もしくはOSM-R（OSMの場合）とのヘテロ二量体化によって誘発される。このように、これらのサイトカインは種々の組織において類似の生体活性に介在する。
【０００５】
gp130はほとんど全ての細胞型に見られるのに対し、IL-6Rはかなり制限された発現を示す。1つの細胞型によってsIL-6Rが放出されることによって、gp130しか発現しない他の細胞がIL-6に応答するようになる。このシナリオはトランスシグナリングと呼ばれる。事実、いくつかの細胞活性について、sIL-6RとIL-6の複合体が必要とされ、IL-6単独では観察されないことが報告されている。可溶性gp130タンパク質はヒト血漿中に高濃度で見られる。最近、デザイナー・サイトカイン、ハイパーIL-6（H-IL-6）（sIL-6RのC末端がフレキシブル・ペプチドリンカーによって成熟IL-6のN末端に共有結合している）が報告された。IL-6／sIL-6R複合体と同様、H-IL-6もgp130しか発現しない細胞に作用する。個別成分としてのIL-6およびsIL-6Rに比較し、この融合分子ではそれに匹敵する生体シグナルを誘導するのに100から1000倍低い濃度で十分である。
【０００６】
種々の疾患または障害の治療には、可溶性IL-6Rに依存するIL-6応答の特異的阻害が望ましいかもしれない。それらの疾患には以下がある：骨吸収、高カルシウム血症、悪液質、腫瘍または他のタイプの癌（例えば結腸癌、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病、ホジキン病）、自己免疫疾患（例えば多発性硬化症（MS）または1型糖尿病）、炎症性またはアトピー性疾患（例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、喘息、乾癬、サルコイドーシス、紅斑性狼瘡、またはブドウ膜炎）、感染症（例えば細菌、ウィルス、カビ、または他の病原体による）、並びに内分泌障害および代謝性または異化性疾患（例えば２型糖尿病、肥満、高血糖症、または高コレステロール血症）。例えばsgp130二量体またはsgp130Fc二量体は治療への適用に有用であることが見出されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の根底にある技術的な課題は、改善されたsgp130Fc二量体を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かかる技術的課題は、特許請求の範囲に明記する態様を提供することによって解決される。本発明に至る実験の際に、sgp130Fc融合タンパク質の生体活性、精製能、および安定性は、sgp130とFc部分の間のヒンジ領域のアミノ酸組成に依存することが発見された。このモチーフへのFc受容体の結合を低下させるために、ヒトIgG1-Fcのアミノ酸234、235、および237（EUナンバリングに基づく）が変異された（Duncanら, Nature（1988）,332:563-564；CanfieldおよびMorrison,J. Exp.Med.（1991）,173：1483-1491；Winesら,J.Immunol.（2000）,164：5313-5318；Sondermannら,Nature（2000）,406：267）。意外なことに、野生型配列Leu234-Leu235-Gly236-Gly237のLeu235をグルタミン酸（Glu、E）またはアスパラギン酸（Asp、D）で置換し、強い親水性を有する（帯電した）アミノ酸で疎水性モチーフを破壊することによって、sgp130Fc融合タンパク質の生体活性および安定性を向上させることができた。234および237位の変異により、この効果は増大される。最も有効な変異体はAla234-Glu235-Gly236-Ala237の配列を特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】sgp130Fcのヒンジ領域変異タンパク質  ヒトIgG1-Fcのヒンジ領域下流に部位特異的変異を導入した。実験によって確認された理想的配列は"AEGA"である（化合物CR5/18に導入）。略号および記号：aa＝アミノ酸（単数または複数）；C（下線付き）＝Fc融合タンパク質の二量体化に必要な２つのジスルフィド架橋を形成するシステイン；X＝アラニン（Ala、A）またはフェニルアラニン（Phe、F）；Z＝グルタミン酸（Glu、E）またはアスパラギン酸（Asp、D）。
【図２】野生型sgp130FcおよびCR5/18のサイズ排除クロマトグラフィー溶出曲線  CR5/18は野生型sgp130Fcに比較して凝集体（副産物）の量が有意に低く、従って、混入物のない生成物の収量がより高いことを示している。
【図３】MTS細胞生存率アッセイで測定したCR5/18または野生型sgp130FcによるBAF3/gp130細胞のIL-6/sIL-6R誘導型増殖阻害  100ng/mLのIL-6および50ng/mLのsIL-6Rによって誘発した増殖の阻害において、CR5/18は野生型（wt）sgp130Fcより生体活性が有意に高い。これはCR5/18のIC50（1）に反映されており、sgp130FcのIC50（2）の約半分である。略号および記号：IC50＝50％の阻害効果が得られる濃度；IL-6＝インターロイキン-6；I/R＝IL-6＋sIL-6R；MTS＝代謝的に活性な細胞によって490nmに吸収を有する可溶性ホルマザン産物に変換される基質；OD＝490nmにおける光学密度；sIL-6R＝可溶性インターロイキン-6受容体。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
すなわち、本発明はアゴニスト複合体IL-6/sIL-6Rの活性を阻害する能力があり、２つの単量体を含むポリペプチド二量体に関し、ここで各単量体はIgGタンパク質のFcドメインに融合した可溶性gp130分子またはその変異体もしくはフラグメントを含み、少なくともFcドメインのヒンジ領域のアミノ酸残基Leu235は少なくとも１つの親水性アミノ酸残基で置換されている。好ましい親水性アミノ酸残基はGluおよびAspである。
【００１１】
本明細書で使用する"可溶性"という用語は細胞内ドメイン（好ましくは膜貫通ドメ
イン）が欠失したgp130分子をいう。
【００１２】
本発明の二量体は、既知の方法で遺伝子操作することができる。使用するドメインはgp130の細胞外ドメイン全体から成っていてもよく、またはアゴニスト複合体IL-6/sIL-6Rの活性を阻害する能力を保持するその変異体もしくはフラグメントから成っていてもよい。好ましいフラグメントは少なくとも細胞外ドメインD1からD3から成るフラグメントである。
【００１３】
"IgGタンパク質のFcドメインに融合する"という表現は、好ましくは、二量体の融合パートナーが単にIgG1タンパク質のFcドメインから構成されることを意味する。しかしながら、Fc部分は１つより多いIgGアイソタイプ由来の配列を含んでいてもよく、所望のエフェクター機能を最適化するための特定の配列モチーフの選択は当該分野の通常の技術範囲内である。
【００１４】
本発明のポリペプチド二量体の好ましい態様では、ヒンジ領域のアミノ酸残基Leu234がPheまたはAlaで置換されている。
【００１５】
本発明のポリペプチド二量体の更に好ましい態様では、ヒンジ領域のアミノ酸残基Leu234および／またはGly237がアミノ酸残基Alaで置換されている。
【００１６】
本発明のポリペプチド二量体の更に好ましい態様では、ヒンジ領域がアミノ酸配列モチーフLeu234-Leu235-Gly236-Gly237の代わりにAla234-Glu235-Gly236-Ala237を含有する。
【００１７】
特に好ましいものは、ヒンジ領域がアミノ酸配列Asp221-Lys222-Thr223-His224-Thr225-Cys226-Pro227-Pro228-Cys229-Pro230-Ala231-Pro232-Glu233-Ala234-Glu235-Gly236-Ala237-Pro238-Ser239-Val240を含有するポリペプチド二量体である。
【００１８】
好ましくはC末端での、gp130細胞外ドメイン（sgp130）またはその変異体もしくはフラグメントのFc部分ヒンジ領域への融合は、直接であってもよく、あるいは種々の長さおよびアミノ酸の組み合わせを持ったフレキシブルなポリペプチドリンカーを用いてもよい。これらのリンカーは、全体が人工的なもの（例えばグリシン、セリン、アスパラギン、トレオニン、およびアラニンから成る群から独立して選択される2-50個のアミノ酸残基を含む）であってもよいし、または、天然に存在するタンパク質から導入されたものであってもよい。それらのリンカーによって二量体のフレキシビリティーおよび結合特性を向上できる。
【００１９】
更に、本発明のsgp130Fc融合タンパク質は、例えば以下のようなタグに更に融合させてもよい：ポリ（His）、Myc、Strep、ポリアルギニン、Flag、緑色蛍光タンパク質（GFP）、TAP、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、HA、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、マルトース結合タンパク質（MBP）、V5、HSV、S、水泡性口内炎ウィルス（VSV）、プロテインC、ルシフェラーゼ、Glu-Glu、E、ベータ-GAL、T7、または、抗体もしくは他の結合分子によって迅速な精製、ウェスタン・ブロットもしくはELISAでの検出、免疫沈降、もしくはバイオアッセイにおける活性低下／阻害を行うことができるような他のエピトープ。
【００２０】
本発明のポリペプチド二量体の更なる好ましい態様では、1つまたはそれ以上のN-グリコシル化部位を可溶性gp130分子またはその変異体もしくはフラグメントとFcドメインとの間に挿入する。コア配列Asn-X-SerまたはAsn-X-Thrを有するN-グリコシル化部位のアミノ酸モチーフはタンパク質中のモチーフの状態に依存し、当業者は、例えばNetNGlyc（Center for Biological Sequence Analysis、Technical University of Denmark）のような無料ソフトウェアを用いてこれを予測および設計できる。本発明のsgp130Fc二量体の好ましいN-グリコシル化リンカー要素はHis-Asn-Leu-Ser-Val-Ileである。
【００２１】
本発明の別の目的は、PEG化または他の化学的修飾を施与した二量体である。sgp130分子のPEG化は、例えばヒトIFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-15、またはIL-2に関して報告されている方法（Youngsterら,Curr Pharm Des（2002）、8:2139；Graceら,J Interferon Cytokine Res（2001）、21:1103；Pepinskyら,J Pharmacol Exp Ther（2001）,297:1059；Pettitら,J Biol Chem（1997）,272:2312；Goodsonら,Biotechnology NY（1990）,8:343；Katre；J Immunol（1990）,144:209）に従って、実施することができる。
【００２２】
PEG-ポリペプチド二量体がsIL-6R依存的にIL-6応答を阻害する能力を有し、それを当該分野で公知の方法でアッセイすることができる限り、いずれの種類のポリエチレングリコールも本発明に好適である。好ましくは、本発明のポリペプチド二量体のポリエチレングリコールはPEG1000、2000、3000、5000、10000、15000、20000、または40000であり、PEG 20000または40000が特に好ましい。
【００２３】
二量体を形成するために、２つの可溶性gp130分子を、単純な共有結合、フレキシブルなペプチドリンカー、または、好ましくは１つもしくはそれ以上のジスルフィド架橋を介して互いに結合させる。ペプチドリンカーは全体が人工的なもの（例えばグリシン、セリン、アスパラギン、トレオニン、およびアラニンから成る群から独立して選択される２から20アミノ酸残基を含む）であってもよいし、または、天然に存在するタンパク質から導入されたものであってもよい。ジスルフィド架橋の形成は、例えば組換え発現によって行うことができ、ここでsgp130Fc単量体をコードする核酸配列は、好ましくはFcドメインのヒンジ領域に、システインをコードするコドンを１つまたはそれ以上含む。
【００２４】
本発明の二量体は、好ましくは同二量体の単量体をコードするポリヌクレオチドおよびベクター（好ましくは該ポリヌクレオチドを含有する発現ベクター）を使用し、遺伝子組換えによって生成する。本発明の二量体の生成のためには、ポリヌクレオチドは既存のクローンから得る、すなわち、好ましくはポリヌクレオチドは天然に存在するポリペプチドまたはその一部をコードする（ヒトgp130/IL6STの場合：GenBank配列NM 002184およびsupporting clones；ヒトIgG1/IGHG1の定常領域の場合：例えばGenBank配列AK057754）。高ストリンジェントまたは中ストリンジェント条件下（定義についてはSambrook,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）N.Y.参照）で天然のDNAまたはRNAの相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドも、そのポリペプチドが天然配列の生体活性を保持している限り、本発明の二量体の生成に有用である。
【００２５】
組換えベクターは当業者に知られる方法に従って構築できる；例えばSambrook,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）N.Y.参照。種々の発現ベクター／ホスト系を、本発明の二量体をコードする配列を含有および発現させるために利用することができる。これらには、限定されるわけではないが以下がある：微生物、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド、もしくはコスミドDNA発現ベクターをトランスフォームした細菌；酵母発現ベクターをトランスフォームした酵母；ウィルス発現ベクター（例えばバキュロ・ウィルス）に感染させた昆虫細胞系；ウィルス発現ベクター（例えばカリフラワー・モザイク・ウィルス、CaMV；タバコ・モザイク・ウィルス、TMV）もしくは細菌発現ベクター（例えばTiまたはpBR322プラスミド）をトランスフォームした植物細胞系；または動物細胞系。
【００２６】
細菌系では、本発明のポリペプチド二量体に企図される使用に基づいて、多様な発現ベクターを選択することができる。本発明への使用に好適なベクターには、それに限定されるわけではないが、細菌における発現のためのpSKK発現ベクターがある。
【００２７】
野生型または改変型（例えば糖鎖改変型）の酵母種、例えばサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、チゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、またはピキア・パストリス（Pichia pastoris）において、構成的または誘導性プロモーターまたはプロモーター系、例えばアルファ因子、アルコールオキシダーゼ、PGH、テトラサイクリン、グルコース（tetracycline glucose）などを含む多様なベクターを使用することができる；Grantら（1987）Methods Enzymol.153:516-544；Siamら（2004）Methods 33:189-198；Macauley-Patrickら（2005）Yeast 22:249-270；Gellissenら（2005）FEMS Yeast Res.5:1079-1096；WildtおよびGerngross（2005）Nat.Rev.Microbiol.3:119-128参照。
【００２８】
人工植物発現系を使用する場合（例えばStogerら（2005）Curr.Opin.Biotechnol.16:167-173；Gomordら（2005）Trends Biotechnol. 23:559-565参照）、本発明の二量体（またはその単量体）をコードする配列の発現は、多様なプロモーターのいずれによって行ってもよい。例えばウィルスプロモーター、例えばCaMVの35Sおよび19Sプロモーターを単独で、またはTMV由来のオメガ・リーダー配列と併せて使用してもよい（Takamatsu（1987）EMBO J.6:307-311）。あるいはまた、植物プロモーター、例えばRUBISCOの小サブユニットまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい（Coruzziら.(1984) EMBO J. 3:1671-1680；Broglieら.(1984) Science 224:838-843；およびWinterら(1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105）。これらの構築物は直接的なDNA形質転換または病原体を介するトランスフェクションによって植物細胞に導入できる。それらの技術は一般に入手できる多くの総説に報告されている（例えばHobbs and Murry in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.；pp.191-196参照）。
【００２９】
昆虫系を本発明の二量体（またはその単量体）に使用してもよい。例えばその系の一つとして、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウィルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus；AcNPV）をベクターとして使用し、ツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）細胞またはトリコプルシア（Trichoplusia）幼虫において外来遺伝子を発現させる。配列をウィルスの非本質的領域（例えばポリへドリン遺伝子）に導入し、ポリへドリン・プロモーターの制御下に配してもよい。sgp130Fc単量体またはそのフラグメントもしくは変異体をコードするDNA配列を好適に挿入できれば、ポリへドリン遺伝子は不活性となり、コートタンパク質を持たない組換えウィルスが生成される。次いで、組換えウィルスを用いて、例えばツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）細胞またはトリコプルシア（Trichoplusia）幼虫を感染させ、本発明のsgp130Fcを発現させてもよい（Engelhardら,(1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227）。
【００３０】
哺乳動物ホスト細胞では、例えば細胞の脂質系トランスフェクションまたはウィルス形質導入に基づく様々な発現系を使用することができる。アデノウィルスを発現ベクターとして使用する場合、本発明のポリペプチド（単数または複数）をコードする配列を、後期プロモーターおよび三部分を持つ（tripartite）リーダー配列から成るアデノウィルス転写／翻訳複合体にライゲートさせてもよい。ウィルスゲノムの非本質的E1またはE3領域への挿入を用いて、感染ホスト細胞において本発明のポリペプチドを発現させることのできる生存ウィルスを得てもよい（Logan, J.およびShenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659）。更に、転写エンハンサー、例えばラウス肉腫ウィルス（RSV）エンハンサーを使用して哺乳動物ホスト細胞における発現を向上させてもよい。
【００３１】
組換えベクター（単数または複数）の導入後、ホスト細胞を、ベクターを含有する細胞の増殖を選択するための選択培地中で増殖させる。形質転換した細胞系は、任意の数の選択系を使用して回収することができる。これらには、それに限定されるわけではないが、単純ヘルペスウィルス・チミジンキナーゼ（Wigler, M.ら(1977) Cell 11:223-32）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy, I.ら(1980) Cell 22:817-23）遺伝子があり、それらはそれぞれtk.sup.細胞またはaprt.sup.細胞に使用できる。また、代謝拮抗物質耐性、抗生物質耐性、または除草剤耐性を選択基準として使用することもできる；例えばdhfr（メトトレキサートに対する耐性を与える。Wigler, M.ら.(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70）；npt（アミノグリコシド・ネオマイシンおよびG-418に対する耐性を与える。Colbere-Garapin, F.ら(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14）；およびalsまたはpat（それぞれ、クロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与える）。更なる選択可能な遺伝子、例えばtrpB（細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにする）またはhisD（細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにする）が報告されている（Hartman, S. C.およびR. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51）。可視マーカーはアントシアニン、β-グルクロニダーゼとその基質（GUS）、およびルシフェラーゼとその基質（ルシフェリン）などのマーカーによって頻用されるようになり、形質転換体の同定だけでなく、特定のベクター系に起因する一過性または安定タンパク質発現の定量にも広く使用されている（Rhodes, C. A.ら(1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131）。
【００３２】
組換えポリペプチドの精製は、この目的のための任意の公知の方法、すなわち抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動などを伴う慣例的な方法によって実施する。更なる使用可能な精製法はアフィニティー・クロマトグラフィーである。これには例えば、標的ポリペプチドと結合するプロテインA、プロテインG、またはモノクローナル抗体が用いられ、これらを作製してカラム内に含まれるゲル・マトリクスに固定化する。不純物を含む組換えポリペプチド含有標品をカラムに通過させる。ポリペプチドはアフィニティー・ゲル・マトリクスとの特異的相互作用によってカラムに結合するが、不純物は通過する。洗浄後、pHまたはイオン強度の変化によってポリペプチドをカラムから溶出し、次に、単量体として生成される場合は二量体化を行い、必要によりPEG化する。
【００３３】
従って、本発明は本発明のポリペプチド二量体の生成法にも関し、この方法は、該ポリペプチドの単量体をコードするDNA配列を用いて形質転換したホスト細胞を培養し、そして該ホスト細胞または培養液からポリペプチド単量体または二量体を回収することを含む。
【００３４】
本発明のポリペプチド二量体は、アゴニスト複合体IL-6/sIL-6Rの活性阻害が必要とされる全ての病態の治療および／または予防に有用である。
【００３５】
従って、本発明は有効量の本発明のポリペプチド二量体を、好ましくは医薬的に許容されるキャリアーと共に含有する医薬組成物にも関する。"医薬的に許容される"とは
、活性成分の生体活性の有効性に干渉せず、投与するホストに対して毒性を示さない任意のキャリアーを含むことを意味する。好適な医薬キャリアーの例は当該分野で知られており、リン酸緩衝液、水、エマルジョン（例えば水中油型エマルジョン）、種々の湿潤剤、無菌溶液などがある。それらのキャリアーは慣例的な方法で調剤し、有効投与量で被験体に投与できる。
【００３６】
"有効量"とは、疾患の経過および重篤度に影響を与え、それらの病態の低減または
寛解をもたらすのに十分な活性成分の量をいう。
【００３７】
これらの疾患または傷害を治療および／または予防するのに有用な"有効投与量"は
,当業者に知られる方法で決定することができる（例えばFinglら, The Pharmocological Basis of Therapeutics, GoodmanおよびGilman編, Macmillan Publishing社, New York, pp. 1-46 (1975)参照）。
【００３８】
組成物の投与は、種々の方法、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、または皮内投与で行うことができる。投与計画は担当医および他の臨床的因子によって決定される。医学の技術分野でよく知られるように、個々の患者の投与量は多くの因子、例えば患者のサイズ、体表面積、年齢、性別、投与すべき特定の化合物、投与の時間および経路、治療の種類、全身状態、および同時に投与する他の薬剤に依存する。
【００３９】
本発明はまた、アゴニスト複合体IL-6/sIL-6Rの阻害が有益な効果をもたらす疾患または傷害の治療および／または予防のための医薬組成物を調製するのための上記のようなポリペプチド二量体の使用にも関する。本発明のポリペプチド二量体の好ましい医学的使用は、以下の治療／予防である：骨吸収、高カルシウム血症、悪液質、腫瘍または他のタイプの癌（例えば結腸癌、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病、またはホジキン病）、自己免疫疾患（例えば多発性硬化症または1型糖尿病）、炎症性またはアトピー性疾患（例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、喘息、乾癬、サルコイドーシス、紅斑性狼瘡、またはブドウ膜炎）、感染症（例えば細菌、ウィルス、カビ、または他の病原体による）、並びに内分泌障害および代謝性または異化性疾患（例えば２型糖尿病、肥満、高血糖症、または高コレステロール血症。
【実施例】
【００４０】
以下の実施例で本発明についてより詳細に記載する。
【００４１】
実施例１  sgp130Fc変異タンパク質CR5/18の構築および生成
（A）材料
Gatewayクローニングシステムの要素（AccuPrime Pfx DNAポリメラーゼ、ドナー・ベクターpDONR221、CMVプロモーターで制御される発現ベクターpcDNA-DEST40、インサートの転移のためのBPおよびLRリコンビナーゼ、およびコンピテントE.coli細胞）は、Invitrogen社（Karlsruhe,ドイツ）から購入した。QuikChange II部位特異的変異導入キットはStratagene社（Amsterdam,オランダ）から得た。PAGE精製した変異導入プライマーはMicrosynth社（Balgach、スイス）から得た。CHO-K1細胞はGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures（Braunschweig、ドイツ）から得た。培養液成分は以下から購入した：Ham's F12培養液、低IgG FBS、およびPBS（PAA Laboratories社； Colbe、ドイツ）、FBS（Biochrom社；Berlin、ドイツ）、トリプシン／EDTA溶液（Invitrogen社）、およびG418溶液（Sigma-Aldrich社； Taufkirchen、ドイツ）。トランスフェクション試薬Lipofectamine 2000はInvitrogen社から得た。免疫沈降のためのProtein A/G Plus AgaroseはSanta Cruz社（Heidelberg、ドイツ）から得た。ウェスタンブロットの免疫沈降および１次検出には、いずれもマウス抗ヒトIgG（Fc）モノクローナル抗体を使用した（CBL102； Chemicon社；Hofheim、ドイツ）。ウェスタンブロットの２次検出は抗マウスIgG HRP-結合抗体、ECL-Plusウェスタンブロッティング基質、およびHyperfilm ECL（全て GE Healthcare社；Munich、ドイツ）を使用して行った。ローラーボトル（2.1L、2,5X surface）はGreiner Bio-One社（Frickenhausen、ドイツ）から購入した。吸引ろ過ユニット用の酢酸セルロース・フィルター（0.45μm）はSartorius社（Gottingen、ドイツ）から購入した。アフィニティー・クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）のための物質は全てGE Healthcare社（Munich、ドイツ）から得た；XK16/20カラム中のMabSelect担体（製品コード：17-5199-01）、PD-10脱塩カラム、およびSECのHiLoad 26/60 Superdex 200 pgカラム。Amicon Ultra-15 50 kDa Ultracel-PLメンブレン濃縮ユニットはMillipore社（Eschborn、ドイツ）から購入した。調製済PAGE用アクリルアミド-ビス溶液（19:1、30%）はBio-Rad（Munich、ドイツ）から得た。
【００４２】
（B）CR5/18の構築
gp130の全細胞外ドメインおよび野生型ヒトIgG1 Fcを含む完全長sgp130FcのcDNA（供与源；ヒトgp130/IL6ST：GenBank配列NM 002184およびsupporting clones；ヒトIgG1/IGHG1の定常領域：例えばGenBank配列AK057754）を、CHO-K1細胞での発現に合わせてコドンを最適化し、Gatewayプライマー、AccuPrime Pfx DNAポリメラーゼ、およびBPリコンビナーゼを用いて、標準的なGatewayクローニング法でpDONR221にサブクローニングした。250-300bp毎の積み重ねられたフォワードおよびリバース・シークエンス用プライマーを用いて、サブクローニングしたインサートの全配列を確認した。QuikChange IIキットによる部位特異的変異導入では、IgG1-Fcの下流ヒンジ領域（EUナンバリングでアミノ酸234、235、および237）を野生型配列の"LLGG"から"AEGA"に変異させた。変異させたクローンは、上記のように全配列シーケンシングによって確認した。次いで、Gateway LR組換えによってインサートを発現ベクターpcDNA-DEST40に転移させた。インサートはFc部分の後に２つの停止コドンをコードするため、pcDNA-DEST40（V5および6xHisエピトープ）にコードされるタグはCR5/18中には存在しない。AlwNI制限酵素消化によってポジティブなクローンを同定し、再び配列を確認した。
【００４３】
（C）細胞の培養およびトランスフェクション
CHO-K1細胞を、10% FBS含有Ham's F12培養液中、37℃、5％ CO2、水飽和雰囲気中で培養した。3-4日毎に継代培養を行い、20継代までのみ使用した。Invitrogen社のLipofectamine 2000およびCHO-K1の標準的な条件を用いて、発現コンストラクトpcDNA-DEST40＿CR5/18を細胞にトランスフェクトした。最初の一過性発現試験では、6-ウェルプレート中でCHO-K1細胞をトランスフェクトし、トランスフェクションの24時間後に細胞および上清の両方を回収した。Protein A/G Plus Agaroseおよび抗ヒトIgG（Fc）抗体を使用し、製造者の取扱説明書に従って、上清からCR5/18を免疫沈降させた。全細胞タンパク質を抽出し、Waetzigら, J. Immunol. 168: 5342 (2002)に記載されるように、抗ヒトIgG（Fc）抗体を用いて細胞溶解物および免疫沈降物のウェスタンブロットを行った。
【００４４】
（D）CHO-K1細胞におけるCR5/18の生成
好適な一過性発現の後、CHO-K1細胞をトランスフェクトし、10cmプレート中、400μg/mlのG418を用いて陽性クローンを選択した。生成物の質および特性を確認するために、予め選択したポリクローナルCHO-K1プールをローラーボトルに移し、低IgG FBSで培養した。コンフルエント細胞の上清を毎週、2-3回回収し、3,500xg、4℃、15分間の遠心分離を2回行って細胞デブリを除去し、直ちに処理するか、または-80℃で凍結した。これと平行して、限界希釈法を用いて予め選択したプールから安定な細胞クローンを選択し、上記のようにウェスタンブロット発現分析による特性決定を行った。最も高度かつ安定に発現したクローンをローラーボトルに移し、恒久的生成に使用した。
【００４５】
（E）アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによる精製
P-1蠕動ポンプおよびAKTA Purifier 100 System（いずれもGE Healthcare社; Munich,ドイツ）を用い、ローラーボトル培養液からCR5/18を含有する上清を4℃で精製した。プロトコールはモノクローナル抗体の精製に関する製造者の推奨に基づく。遠心分離後、新鮮なまたは（氷上で）解凍した上清のpHを6.7-7.0に調整した。真空ろ過（0.45nm）を2ラウンド行った後、上清を脱気し、必要に応じて、pH値を6.7-7.0に再調整した。次に、2-4Lの上清を、PBSで平衡化したアフィニティー・クロマトグラフィー・カラム（6-25ml MabSelectをXK16/20カラムに充填）にP-1ポンプを用いて3-10ml/分の流速で負荷した。PBSで洗浄した後、カラムをAKTA Purifierに移し、未結合のタンパク質が定量的に除去された後、A280が安定するまでPBSで洗浄した。溶出後、AKTAシステムに２つの50mMクエン酸ナトリウムバッファー（それぞれpH3.25およびpH5.5。これらを混合して所望のpH条件を得る）を装着した。pH5.1で１回洗浄した後、pH3.7で溶出した。2mlの1M Tris-HCl（pH11）を含有する15mlの試験管に画分10mlを回収した。ピーク画分をプールし、pHを測定し、必要に応じて7.5に調整した。プールのタンパク質濃度をA280で測定し、Amicon Ultra-15 50 kDa Ultracel-PLメンブレン濃縮ユニットを用いてプールを最高1.5mg/mlまで注意深く濃縮した。PBSで平衡化したPD-10脱塩カラムを用いてクエン酸バッファーをPBSで置換した後、再び280nmでタンパク質濃度を測定した。
【００４６】
サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）では、PBS中、最大1.2mg/mlのタンパク質濃度が好ましい。SECはAKTAシステムにより、PBSで平衡化したHiLoad 26/60 Superdex 200 pgカラムを用いて流速0.8ml/分で行った。野生型sgp130Fcとは対照的に、CR5/18は、高分子量の凝集物の低いピークの後、シングル・ピークとして溶出した（図２）。最初の分析では、PAGE分析のために全ての画分のサンプルを回収した。ピーク画分をプールし、タンパク質濃度を測定してPBSで400-500μg/mlに調整し、１回の分析量ずつのアリコートとして-80℃で凍結し、長期間保存用とした。画分およびプール・サンプルの非変性PAGE分析（7.5%）を行った後、銀およびクマシーで染色した。
【００４７】
図２に示すように、CR5/18の副産物（凝集物）の量は、平行して行った実験で精製した親化合物sgp130Fcに比較して有意に低かった。更に、所望の生成物（CR5/18二量体）の溶出は不純物画分（凝集物）と明らかに分離可能であるが、野生型sgp130Fcではそうではない。従って、CR5/18標品の収量（所望の生成物の比率が高いことによる）および品質のいずれも、従来のsgp130Fcのものより優れており、これによって工業生産コストがより低くなる。これらの結果はCR5/18が親sgp130Fc分子より明らかに改善されていることを示している。
【００４８】
実施例２  標準化細胞増殖アッセイにおけるCR5/18の生体活性
（A）材料
安定にトランスフェクトされたB細胞前駆細胞系BAF3/gp130およびデザイナー・サイトカイン、ハイパーIL-6を使用した。以下のように培養液成分を購入した：DMEMおよびPBS（PAA Laboratories社；Colbe、ドイツ）、FBS（Biochrom社；Berlin、ドイツ）およびトリプシン/EDTA溶液（Invitrogen社; Karlsruhe、ドイツ)。インターロイキン-6（IL-6）および可溶性インターロイキン-6受容体（sIL-6R）は、それぞれBioSource社（Solingen、ドイツ）およびR&D Systems社（Wiesbaden、ドイツ）から購入した。Cell Titer 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay（MTS）をPromega社（Mannheim、ドイツ）から得た。
【００４９】
（B）sgp130FcまたはCR5/18によるIL-6/sIL-6R誘導型BAF3/gp130細胞増殖阻害
BAF3/gp130細胞の増殖および生存能力は、培養液中のIL-6/sIL-6R複合体の存在に依存する。維持のために、BAF3/gp130細胞を10％ FBSおよび10ng/mLハイパーIL-6（共有結合したIL-6およびsIL-6Rから成るデザイナー・サイトカイン；Fischerら, 1997, Nat. Biotechnol. 15: 142-145）を含有するDMEM中、5x105細胞/mL未満の密度で培養した。10ng/mLハイパーIL-6は100ng/mLのIL-6および50ng/mLのsIL-6Rで代替できる。細胞は週２回継代した。アッセイのために、ハイパーIL-6 (またはIL-6/sIL-6R)を含有しない培養液で細胞を２回洗浄した後、96ウェルプレートに5,000細胞／ウェルで播種した。CR5/18または親化合物sgp130Fcを20μg/mLから78ng/mLの範囲の種々の濃度で添加した（1:4希釈シリーズ；図３）。次に、細胞を100ng/mL IL-6および50ng/mL sIL-6Rの存在下で３日間インキュベートした。コントロールはCR5/18またはsgp130Fc未含有の、および最大濃度のCR5/18またはsgp130Fc含有の未刺激細胞、および刺激物質IL-6およびsIL-6Rのみと共にインキュベートした細胞を含んでいる（図３）。
【００５０】
（C）結果
細胞培養液中でのCR5/18または野生型sgp130Fcの生体活性を、３日後の生存BAF3/gp130細胞数（MTS基質変換として測定）の低下によって測定した。CR5/18は野生型sgp130Fcより生体活性が高く、約400ng/mLの濃度でそのIC50に達したが、sgp130Fc（IC50=約800ng/mL）は有意な効果を示さなかった（図３）。これは、CR5/18が野生型化合物の約半分の治療濃度で使用できることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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