(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
調節性白血球細胞を刺激するに有効な量の非変性マイコバクテリア・ボビスBCG及び1.5％未満の残存水分からなり、前記細菌が凍結乾燥により死滅されている細菌調製物。
【請求項２】
(i)生存マイコバクテリア・ボビスBCG細胞の培養物を回収し、
(ii)水中でマイコバクテリア・ボビスBCG細胞を洗浄し、
(iii)水中でマイコバクテリア・ボビスBCG細胞を凍結し、
(iv)凍結乾燥機中で、凍結マイコバクテリア・ボビスBCG細胞を少なくとも34時間乾燥して少なくとも98.5％の水分を除去することによりそれらを死滅させ、
(v)凍結乾燥死滅マイコバクテリア・ボビスBCG細胞を回収する
ことからなる凍結乾燥法により製造される、請求項１に記載の細菌調製物。
【請求項３】
生存細菌細胞の培養物を回収し、水中で該細菌細胞を凍結し、凍結乾燥機中で少なくとも98.5％の水分を除去するのに充分な時間、凍結細菌細胞を乾燥することによりそれらを死滅させ、そして凍結乾燥死滅細菌細胞を回収することを含む凍結乾燥法により製造される、請求項１に記載の細菌調製物。
【請求項４】
乾燥による凍結細菌細胞の死滅が0.02 mBar〜0.2 mBarの乾燥チャンバー圧力で実施される、請求項２又は３に記載の細胞調製物。
【請求項５】
(１)0.5％未満の残存水分を有する請求項１に記載の細菌調製物の有効量、及び(２)医薬上許容される担体、添加物、免疫増強剤、アジュバントおよび請求項１に記載の細菌調製物とは異なる免疫調節物質の１又はそれより多くを含み、生存マイコバクテリア・ボビスBCGを含まない医薬組成物と、該医薬組成物の投与用デバイスとを少なくとも含むキット。
【請求項６】
残存水分の量が１％未満である請求項１〜４のいずれか１項に記載の細菌調製物。
【請求項７】
残存水分の量が0.5％未満である請求項１〜４のいずれか１項に記載の細菌調製物。
【請求項８】
長期凍結乾燥により死滅させた非変性マイコバクテリア・ボビスBCG及び0.5％未満の残存水分を含み、生存マイコバクテリア・ボビスBCG細胞の培養物を回収し、水又は塩の水溶液中で該マイコバクテリア・ボビスBCG細胞を凍結し、凍結乾燥機中で、凍結マイコバクテリア・ボビスBCG細胞を少なくとも34時間乾燥して少なくとも99.5％の水分を除去することによりそれらを死滅させ、凍結乾燥死滅マイコバクテリア・ボビスBCG細胞を回収することからなる凍結乾燥法により製造され、生存マイコバクテリア・ボビスBCGを含まない細菌調製物。
【請求項９】
(１)0.5％未満の残存水分を有する請求項８に記載の細菌調製物の有効量、及び(２)医薬上許容される担体、添加物、免疫増強剤、アジュバントおよび請求項８に記載の細菌調製物とは異なる免疫調節物質の１又はそれより多くを含み、生存マイコバクテリア・ボビスBCGを含まない医薬組成物と、該医薬組成物の投与用デバイスとを少なくとも含むキット。
【請求項１０】
長期凍結乾燥により死滅させた非変性マイコバクテリア・ボビスBCG及び0.5％未満の残存水分を含み、生存マイコバクテリア・ボビスBCG細胞の培養物を回収し、水又は塩の水溶液中でマイコバクテリア・ボビスBCG細胞を洗浄し、水又は塩の水溶液中でマイコバクテリア・ボビスBCG細胞を凍結し、凍結乾燥機中で、凍結マイコバクテリア・ボビスBCG細胞を少なくとも34時間乾燥して少なくとも99.5％の水分を除去することによりそれらを死滅させ、凍結乾燥死滅マイコバクテリア・ボビスBCG細胞を回収することからなる凍結乾燥法により製造され、生存マイコバクテリア・ボビスBCGを含まない細菌調製物。
【請求項１１】
(１)0.5％未満の残存水分を有する請求項１０に記載の細菌調製物の有効量、及び(２)医薬上許容される担体、添加物、免疫増強剤、アジュバントおよび請求項１０に記載の細菌調製物とは異なる免疫調節物質の１又はそれより多くを含み、生存マイコバクテリア・ボビスBCGを含まない医薬組成物と、該医薬組成物の投与用デバイスとを少なくとも含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトおよび動物において、免疫調節不全を含む疾患の治療のための、グラム陽性通性細胞内細菌、例えばマイコバクテリアのようなグラム陽性細菌から製造される成分を含む組成物に関する。本発明は、該成分および組成物の製造にも関する。
【背景技術】
【０００２】
Th1-Th2平衡異常のような免疫調節不全を含む疾患は、種々の癌や、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、クローン病および真性糖尿病のような自己免疫疾患、ならびに喘息、アレルギー性鼻炎、結膜炎(conjonctivis)およびアトピー性皮膚炎のようなアレルギー疾患を含む。
【０００３】
例えば：
アレルギー性喘息は、気道アレルゲン誘発性炎症を含む、一般的な疾患である；気道において吸入されたアレルゲンと反応するTリンパ球の存在および活性化の結果として、炎症性白血球、好酸球、および時として好中球が気道に漸加される。CD4+ Tリンパ球は、気道への好酸球の漸加、およびおそらくその後のそれらの活性化を引き起こすTh2タイプのサイトカインの産生を介して、アレルギー性の気道炎症を開始するのに主要な役割を担っている。Th2およびTh1エフェクターの間の平衡異常が、喘息の発病を推進すると考えられている。
【０００４】
よって、例えばIFN-γの噴霧によるか、またはマイコバクテリアのワクチンの投与により、肺においてTh1免疫応答を賦活化することが提案されている；このような賦活化は、マウスにおいて二次アレルギープロセスの発現を阻害するようである。
【０００５】
より具体的には、外因性喘息またはアトピー性喘息(例えば職業性、および薬物性)は、特異的免疫グロブリンE (IgE)の産生、通常の空気中のアレルゲンへの陽性の皮膚試験、および／またはアトピー性の症状を伴うTh2タイプの免疫応答の増強に関連する。外因性喘息における気流閉塞は、気道の炎症により引き起こされる非特異的な気管支反応亢進(BHR)に関与する。この炎症は、肥満細胞、好酸球およびリンパ球を含む種々の炎症性細胞により放出される化学物質により媒介される。これらの媒介物質の作用は、血管透過性、粘液分泌および気管支平滑筋収縮となる。アトピー性喘息においては、気道炎症を起こす免疫応答は、IL-4およびIL-5を分泌するT細胞のTh2クラスにより引き起こされる。内因性または特発性の喘息は、上気道感染の後に発現すると報告されているが、外因性喘息よりも治療するのが難しいとされる中年またはより高齢の人に新規に発生することもあり得る。
【０００６】
したがって、アレルギー性疾患は、Tヘルパー2 (Th2)サイトカインである、IL-4、IL-5およびIL-13を分泌するTリンパ球により媒介され、高レベルの血清IgE、および好酸球の漸加となる。しかしながら、Th1細胞もこれらの病理に関わるであろう；例えば、慢性アトピー性皮膚病変においてTh1細胞が同定されている。このようなTh1-Th2平衡異常は、ある種の癌、特に膀胱癌のようなその他の疾患、または自己免疫疾患において見出されている。
【０００７】
例えばShirakawaら(Science、1997、275、3)により行われたもののような疫学的研究は、ツベルクリン反応とアトピー性疾患との間の逆の関連を実証した。このような結果は、グラム陽性通性細胞内細菌、例えばエム・ツベルクローシス(M. tuberculosis)、エム・ボビス(M. bovis)またはBCGのようなマイコバクテリアのような生存グラム陽性細菌に対する従来の免疫化が、アトピー性疾患に対して防御し得ることを示す。
【０００８】
治療方策の一つは、関連するアレルゲンまたは抗原へのTヘルパー1 (Th1)応答を誘導することによりTh2成分をダウンレギュレーションすることである。なぜなら、Th1およびTh2サイトカインは、互いに拮抗性であると考えられているからである。
【０００９】
異なる群からの実験結果は、強いTh1免疫応答を誘導することが知られているマイコバクテリアおよびリステリアを含む細胞内細菌を用いた成体のマウスの免疫化が、アレルゲンまたは抗原誘導Th2応答を均衡し得ることを示している；アレルギーにおいては、これは好酸球増加症および関連するBHRを減少させるであろう。
【００１０】
これが、ある種のマイコバクテリアがアレルギー性疾患、およびより具体的には喘息の治療のために提案されている理由である。
【００１１】
この観点で、マイコバクテリアを含有する種々の組成物が試験されている：
−生BCGワクチンは、実験的喘息またはその等価物において、特に鼻腔内に与えられた場合に、潜在的な効果を有すると考えられている(KJ. Erbら、J. Exp. Med、1998、187、561〜569；MA. Nahoriら、Vaccine、2001、19、1484〜1495)。しかしながら、それらの結核予防に対する有用性にも関わらず(JB Milsteinら、WHO Bull. OMS、1990、68、93〜108)、生BCGワクチンは、いくつかの欠点を示す；第一に、それらの残存病原性のために、免疫無防備状態の対象に与えることができない；第二に、全細菌量に比例し、かつ局部潰瘍形成に、または偶発的な皮下注射の場合により深刻な反応(膿瘍)に導き得る皮内のBCGワクチン化への局所反応がある。したがって、特にそれが鼻腔内またはエアロゾル経路により与えられた場合、このようなワクチンは、気道のアレルギー性疾患、またはTh1-Th2平衡異常に関与するその他の疾患の免疫治療のための、かなりの期間にわたる繰り返しの投与に適合されない。鼻腔内またはエアロゾルによる投与は、肺において生BCGワクチンの容認し難い有害作用に導き得る；
【００１２】
−マイコバクテリアの熱死滅調製物：
BCGまたはマイコバクテリウム・ツベルクローシスの熱死滅調製物は、ワクチンに用いられた場合に、系統的な防御特性を有していない(R. Janssenら、Immunol.、2001、102、4、441〜449；MA Skinnerら、Immunol.、2001、102、2、225〜233；GA Rookら、Novartis Found Symposium、1998、217、73〜87および87〜98)。さらに、該調製物は、結核の診断を妨害するBCG精製蛋白誘導体(PPD)に対する遅延型過敏を誘導する。しかしながら、ある著者は、新生児の期間における、熱死滅エム・ボビス単独またはエム・バッカエ(M. vaccae)に追加しての予めの免疫化(pre-immunization)は、IgE応答をダウンレギュレーションするのに役立つ可能性があると考えていることを記載しなければならない(F. Tukenmezら、Pediatr. Allergy Immunol.、1999、10、2、107〜111；F. Tukenmezら、J. Asthma、2000、37、4、329〜334；Nahoriら、前記)；
【００１３】
マイコバクテリウム・バッカエの熱死滅調製物(CC Wangら、Immunol. 1998、93、3、307〜313；WO 00/74715)は、アレルギーの免疫治療において臨床的に用いられる。いくつかの結果は、熱死滅マイコバクテリアのTh1アジュバントとしての有効性を実証し、そして抗原特異的免疫調節における組換えマイコバクテリアの使用の可能性を示す(R. Janssenら、Immunol.、2001、102、4、441〜449；MA Skinnerら、Immunol.、2001、102、2、225〜233；CC Wangら、Immunol. 1998、93、3、307〜313；WO 00/74715)。上記の調製物は免疫治療において有効であるけれども、これらは、BCGまたはマイコバクテリウム・ツベルクローシスの熱死滅調製物と共有するいくつかの欠点を示し、これが免疫治療におけるそれらの使用を排除する。
【００１４】
実際に、マイコバクテリアの全ての熱死滅調製物は：
−毒性で、壊死性の物質としてふるまう、肺胞のマクロファージによるTNF-αの産生を誘導し、これがこのような熱死滅調製物の免疫治療における使用を排除し、そして
−ヒトでの臨床実験において観察される掻痒疱疹、硬結および持続する傷を伴う壊死のような、局部の副作用を誘導する(PM Shirtcliffeら、Am. J. Respir. Crit. Care Med.、2001、163、1410〜1414)。
【００１５】
したがって、Th1-Th2平衡異常、例えばアレルギー性疾患のような免疫調節不全を含む疾患の治療のために、グラム陽性通性細胞内細菌、例えばマイコバクテリアのようなグラム陽性細菌に由来し、良好な耐容性を示し、かつ上記に示す欠点を有さない効果的な組成物への要望がある。
【００１６】
さらに、このような組成物は、調製物中に存在する活性成分の同定を許容しなければならない。10〜30分間の120℃における加熱を含む熱死滅調製物は、熱不安定性の成分の同定を決して許容しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
よって、本発明の一つの目的は、深刻な有害反応なしに、Th1-Th2平衡異常のような免疫調節不全、例えば癌、自己免疫疾患およびアレルギー性疾患を含む疾患の治療に有用な、死滅グラム陽性通性細胞内細菌調製物、例えばマイコバクテリア調製物のような、新規な死滅グラム陽性細菌調製物、およびそれを含有する組成物を提供することである。
【００１８】
本発明のその他の目的は、免疫調節不全を含む疾患の治療へのその能力の他に、これらの細菌細胞からの活性分子の同定を許容するために細菌細胞からの分子の構造を保存している該死滅グラム陽性細菌調製物を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
驚くべきことに、本発明者らは、細菌細胞からの分子を変性させない「ソフト法(soft methods)」により死滅させたグラム陽性通性細胞内細菌、例えばマイコバクテリアのようなグラム陽性細菌が、喘息またはその他の免疫調節不全を患っている対象に投与された場合に、インビボで白血球調節細胞(CD4+ CD25+ T細胞および／またはB細胞および／または樹状細胞)を賦活化できることを示している。これらの調節細胞の賦活化は、喘息の患者の免疫応答性をつくりなおし、これは長期間(数週間)にわたって局所的および系統的な効果を有する；結果として、これらの死滅グラム陽性細胞内細菌調製物を用いて処理されたアレルギー患者は、長期間にわたって喘息から防御される。
【００２０】
本発明者らは、細菌細胞からの分子の構造が保存されているこれらの死滅細菌調製物が、炎症、貧血、血小板減少、およびTNF-α産生の誘導のような有害作用を誘導しないことも示している。
【００２１】
本発明は：
−細菌細胞からの分子の構造を変性させない方法により得ることができる、死滅グラム陽性細菌を含み、かつ
−インビボにおいて、抗原に対する免疫応答の調節を誘導し得る(免疫調節調製物)
ことを特徴とする、細菌調製物に関する。
【００２２】
免疫調節調製物とは、いずれの抗原(自己抗原または外来抗原)に対する免疫応答の誘導の前または後に、免疫調節細胞および免疫ヘルパー細胞の間の比を変更し得る調製物を意味する。免疫調節細胞は、CD4+ CD25+ T細胞および／またはB細胞および／または樹状細胞のような白血球調節細胞を含む。例えば、CD4+ CD25+ T細胞は、Schevachら、Nat. Rev. Immunol.、2002、2、389〜400に記載されている。
【００２３】
上記の細菌調製物の有利な実施形態によると、それは死滅グラム陽性通性細胞内細菌を含有する。
グラム陽性通性細胞内細菌とは、インビトロで合成培地において成育する能力と同時に、哺乳動物または非哺乳動物宿主からの真核細胞にインビボで感染し、かつこれらの細胞、例えばマクロファージにおいて増殖する能力をもつグラム陽性細菌を意味する。
【００２４】
上記の細菌調製物の有利な実施形態によると、それは、リステリア種(Listeria sp.)、コリネバクテリウム種(Corynobacterium sp.)、ならびにマイコバクテリア種(Mycobacteria sp.)、ノカルディア種(Nocardia sp.)およびロドコッカス種(Rhodococcus sp.)を含む放線菌からなる群より選択される死滅グラム陽性通性細胞内細菌を含む。
好ましくは、該細菌調製物はマイコバクテリア・ボビス、より好ましくはマイコバクテリア・ボビスBCGを含む。
【００２５】
細菌細胞からの分子の構造を変性させない方法とは、分子の空間的立体配置の甚大な変性とならない方法を意味する；好ましくは、該方法は、タンパク質、多糖類および脂質のような、細菌細胞からの巨大分子の3次元構造を保存する。
「ソフト法」と呼ばれるこれらの方法は、限定されないが、その巨大分子成分の構造を保存しながら細菌の細胞膜を破壊する物理的手段の使用を含む。これらの方法は、限定されないが：長期凍結乾燥、シリカまたはジルコニウムビーズの存在下での粉砕、いわゆる「フレンチプレス」の使用、超音波破砕およびガンマ線照射を含む。上記で定義したような死滅細菌調製物を得るために用いられ得るその他の方法は、当業者に知られている。
【００２６】
−例えば、長期凍結乾燥死滅細菌調製物は、該調製物から実質的に全ての水分が除去されていることを意味する；よって、長期凍結乾燥死滅細菌調製物は、1.5％未満、好ましくは1％未満、より好ましくは0.5％未満の残存水分を含有する。しかしながら、最適化されていない凍結乾燥の条件では、凍結乾燥細菌の調製物がより多く(約10％)の残存水分を含有する、すなわち全ての細菌が死滅していない場合、残りの生存細菌の死滅は、代わりに、該調製物を空気(大気圧)と接触させることにより得られる；このような調製物は、上記の長期凍結乾燥死滅細菌調製物と同じ特性および活性を有する。長期凍結乾燥死滅細菌調製物中の残存水分は、例えばカール・フィッシャーの比色分析法により測定される。
【００２７】
本発明の死滅グラム陽性細菌調製物からの分子の変性がないことは、当該技術において周知のいずれの方法により確かめられる。例えば、タンパク質の構造は、生存細菌から得られたタンパク質抽出物との比較により、Laemmli、Nature、1970、277、680〜に従って、変性および非変性条件で、死滅グラム陽性細菌調製物の抽出物のゲル電気泳動により確かめられる；タンパク質は、直接、適切な染料を用いるゲルの染色、またはメンブレンへのタンパク質の移動後に、グラム陽性細菌のタンパク質に対する適切な抗体を用いる染色のいずれかにより視覚化される。ゲルろ過または質量分析法のようなその他の方法も、本発明の死滅グラム陽性細菌調製物から精製される分子の構造を確かめるのに用いることができる。
【００２８】
上記の細菌調製物のその他の有利な実施形態によると、それは、長期凍結乾燥法により得ることができる長期凍結乾燥死滅細菌を含有する。
好ましくは、該長期凍結乾燥死滅細菌調製物は：
(i) 生存細菌細胞の培養物を回収し、
(ii) 水またはホウ酸塩のような塩の水溶液中で細菌細胞を洗浄し、
(iii) 水またはホウ酸塩のような塩の水溶液中で細菌細胞を凍結し、
(iv) 少なくとも98.5％の水分、好ましくは少なくとも99％の水分、より好ましくは少なくとも99.5％の水分を除去するのに充分な時間、凍結乾燥機中で、凍結した細菌細胞を乾燥することによりそれらを死滅させ、そして
(v) 長期凍結乾燥死滅細菌細胞を回収する
ことにより製造される。
【００２９】
代わりに、該長期凍結乾燥死滅細菌調製物は、(ii)の細菌細胞の洗浄を省略すること以外は上記で定義したのと同じ方法により製造される。
【００３０】
好ましくは、工程(iv)は、約0.02 mBar〜0.2 mBar；より好ましくは0.06 mBar〜0.1 mBarの乾燥チャンバー圧力で、少なくとも10〜12時間、より好ましくは数日にわたって、少ない熱の供給および低い冷却蒸気トラップの温度で、乾燥の間じゅう乾燥死滅細菌調製物が低温である(細菌細胞分子の変性がない)ことを確実にして行う。
【００３１】
凍結乾燥法において、長期凍結乾燥状態は、凍結乾燥機における空気の漏れがない場合に、氷冷却器および真空ポンプを真空チャンバーから数秒間分離しても真空チャンバーの圧力がもはや変動を示さない時に達成される；これは、凍結乾燥細菌からもはや水分が除去され得ないことを意味する(＝定常水蒸気圧力)。例えば、冷却トラップが-52℃である場合、長期凍結乾燥死滅細菌を効率的に得るためには、乾燥チャンバー中の圧力は、0.06〜0.120 mBar、通常は約0.09 mBarの範囲内であることが可能である。
【００３２】
本発明は：
−リン脂質を除去する、該死滅細菌調製物の有機溶媒抽出物からなる画分A、
−ペプチドグリカンのような糖由来成分を除去する、死滅細菌調製物のグリコシダーゼ処理抽出物からなる画分B、
−核酸を除去する、死滅細菌調製物のDNアーゼおよび／またはRNアーゼ消化抽出物からなる画分C、
−タンパク質を除去する、死滅細菌調製物のプロテアーゼ処理抽出物からなる画分D、
−有機溶媒、グリコシダーゼ、DNアーゼおよび／またはRNアーゼ、および最後にプロテアーゼにより連続的に処理された死滅細菌調製物の抽出物からなる画分E
からなる群より選択される、本発明の死滅細菌調製物の異なる画分にも関する。
【００３３】
好ましくは：
−画分Aが、メタノール／クロロホルム混液を用いる抽出により得られる。
−画分Bが、リゾチームを用いる消化により得られる。
−画分Cが、DNアーゼIおよび／またはRNアーゼAを用いる消化により得られる。
−画分Dが、ズブチリシンを用いる消化により得られる。
【００３４】
上記の画分の有利な実施形態によると、これらは上記で定義したような、長期凍結乾燥細菌調製物から単離される。
上記の画分の有利な実施形態によると、これらはマイコバクテリア画分、好ましくはマイコバクテリア・ボビス画分、より好ましくはマイコバクテリア・ボビスBCG画分からなる。
【００３５】
本発明は、死滅細菌調製物、および／または上記で定義したような少なくとも1つのそれらの画分の有効量、医薬上許容される担体および／または添加物、および／またはアジュバント、および／または免疫増強剤、および／または本発明のの細菌調製物とは異なる免疫調節物質を含む、Th1-Th2平衡異常のような免疫調節不全を含む疾患の予防または治療のための医薬組成物にも関する。
【００３６】
アジュバントとは、抗原と組み合わせて投与された場合に、該抗原への特異的免疫応答(抗体産生、BおよびT細胞活性化)を可能にする天然または合成の物質を意味する。
【００３７】
免疫増強剤とは、抗原と共同して投与された場合に、非特異的免疫応答(例えば抗原の食作用の増大)を誘導する天然または合成の物質を意味する。
【００３８】
本発明によると、上記の組成物は、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、クローン病および真性糖尿病のような自己免疫疾患、喘息、アレルギー性鼻炎およびアトピー性皮膚炎のようなアレルギー疾患、ならびに癌の治療に有利に用いることができる。
【００３９】
該組成物の有利な実施形態によると、それは、マイコバクテリア、好ましくはマイコバクテリア・ボビス、より好ましくはマイコバクテリア・ボビスBCGからなる。
【００４０】
該組成物のその他の有利な実施形態によると、それは、上記で定義したような長期凍結乾燥法により得ることができる長期凍結乾燥死滅細菌からなる；好ましくは、該長期凍結乾燥死滅細菌は、上記で定義したような凍結乾燥法により得られる。
【００４１】
該組成物のさらに他の有利な実施形態によると、それは鼻腔内経路により投与されるのに適した形態にある。
該組成物のさらに他の有利な実施形態によると、それは経口または舌下経路により投与されるのに適した形態にある。
【００４２】
一般に、本組成物は、非経口注射(例えば皮内、筋肉内、静脈内または皮下)、鼻腔内(例えば吸引または噴霧)、経口、舌下、または皮膚を介するか、もしくは直腸を介しての局所により投与され得る。
【００４３】
明示したように、ある実施形態においては、本発明の組成物は、気管支肺の粘膜表面への送達に適した形態にある。例えば、該組成物は、喘息の治療に現在用いられているものに類似のエアロゾルの形態または噴霧器により、患者への送達のための液体製剤に懸濁され得る。
【００４４】
明示したように、その他の実施形態においては、本発明の組成物は経口投与に適した形態にある。例えば、該組成物は、経口投与のための錠剤、通常のカプセル、ゼラチンカプセルまたはシロップの形態であり得る。これらのゼラチンカプセル、通常のカプセルおよび錠剤の形態は、スターチ、ガムおよびゼラチンのようなアジュバントまたは結合剤、リン酸カルシウムのようなアジュバント、コーンスターチまたはアルギン酸のような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、甘味剤または呈味剤のような、医薬製剤に通常用いられる医薬品添加剤を含有し得る。溶液または懸濁液は、薬理学的に影響のない溶媒の添加により、水性または非水性媒質中に製造し得る。これらは、グリコール、ポリグリコール、プロピレングリコール、ポリグリコールエーテル、DMSOおよびエタノールを含む。
【００４５】
本組成物は、本発明の細菌細胞またはその画分を含有するリポソームのように、医薬上許容される担体および／または添加物および／または免疫増強剤および／またはアジュバントを付加的に含むことができる；医薬組成物の製造に用いられる上記の1以上の添加物は、抗凝集剤、抗酸化剤、色素、呈味剤、または滑沢、結着もしくは分離剤、ならびに一般に、製薬業において通常用いられるいずれの医薬品添加物の中から選択され得る。
【００４６】
当業者に周知のいずれの適切な担体を本発明の医薬組成物に用い得るが、担体の種類は、投与の形態に応じて多様である。皮下注射のような非経口投与については、担体は、水、食塩緩衝液、ラクトース、グルタメート、油脂またはワックスを含むのが好ましい。経口投与については、上記の担体のいずれか、またはマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロースおよび炭酸マグネシウムのような固体担体を用いることができる。生分解性のマイクロスフェア(例えばポリラクティックガラクチド)も、本発明の医薬組成物の担体として用いることができる。適切な生分解性マイクロスフェアは、例えば米国特許4,897,268および5,075,109号に開示されている。
【００４７】
いずれの種類のアジュバントを本発明の組成物に用いて、免疫応答を増強することができる。ほとんどのアジュバントが、水酸化アルミニウムまたはミネラルオイルのような、迅速な代謝から抗原を守るか、または制御された炎症反応を創るように設計された物質、およびリピドA、ボルデテラ・ペルツシス(Bordetella pertussis)トキシンのような、免疫応答の非特異的促進物質を含む。適切なアジュバントは、例えば、ヒトへの注射に用いることができないフロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバントのように、市場で入手可能である。ヒトに用いることができるその他の適切なアジュバントは、水酸化アルミニウム、生分解性マイクロスフェア、モノホスホリルAおよびQuil Aを含む。
【００４８】
好ましい投与の頻度および有効な投与量は、種によって、そして対象によって多様である。例えば、長期凍結乾燥マイコバクテリア調製物またはその画分の量は、マウスにおいて約1μg〜10 000μg (約106〜1010 CFU)；好ましくは10μg〜約1 000μg；より好ましくは約10μg〜100μgの物質に等しい投与量範囲である。該投与量は、種または対象の体表面積、および投与の頻度に依存してより高いか、またはより低いことが可能である。例えば、2ヶ月に1度の1または2投与量の投与は、喘息の治療においてより効果的であろう。
【００４９】
本発明は、免疫調節不全を含む疾患の予防および／または治療における同時の、別々のもしくは逐次の使用のための組み合わせ製剤としての、本発明の細菌調製物またはそれらの画分、ならびに抗癌剤、抗糖尿病薬および免疫調節剤から選択される剤を含有する物質にも関する。
好ましくは、該剤は抗ヒスタミン剤および抗炎症剤から選択される。
【００５０】
本発明は、アレルゲン暴露の通常の期間の少なくとも2週間前に開始して、2ヶ月間隔で、マウスにおいて1μg〜10 000μg、好ましくは10μg〜1 000μg、最も好ましくは10μg〜100μgに等しい投与量範囲で、経口、舌下、非経口または鼻腔内の経路により投与される、喘息の治療用の医薬品の製造のための、本発明の細菌調製物またはそれらの画分の使用にも関する。
【００５１】
本発明は、マウスにおいて1μg〜10 000μg、好ましくは10μg〜1 000μg、最も好ましくは10μg〜100μgに等しい投与量範囲で、経口、舌下、非経口または鼻腔内の経路により投与される、ヒトの乳児の喘息の予防用の医薬品の製造のための、本発明の細菌調製物またはそれらの画分の使用にも関する。
【００５２】
本発明は、少なくとも：
(i) 生存細菌細胞の培養物を回収し、
(ii) 水またはホウ酸塩のような塩の水溶液中で細菌細胞を洗浄し、
(iii) 水またはホウ酸塩のような塩の水溶液中の細菌細胞を凍結し、
(iv) 少なくとも98.5％の水分、好ましくは少なくとも99％の水分、より好ましくは少なくとも99.5％の水分を除去するのに充分な時間、凍結乾燥機中で、凍結した細菌細胞を乾燥することによりそれらを死滅させ、そして
(v) 長期凍結乾燥死滅細菌細胞を回収する
工程を含むことを特徴とする、上記の長期凍結乾燥死滅細菌調製物の製造方法にも関する。
【００５３】
上記の長期凍結乾燥死滅細菌調製物の製造の代替方法は、工程(i)、(iii)、(iv)および(v)を含み；工程(ii)の細菌細胞の洗浄が省略される。
【００５４】
好ましくは、工程(iv)は、少なくとも98.5％の水分を除去するために、約0.02 mBar〜0.2 mBar；より好ましくは0.06 mBar〜0.1 mBarの乾燥チャンバー圧力で、少なくとも10〜12時間、凍結細菌の融解を防止し、そして乾燥死滅細菌を細菌細胞分子変性温度より低く保ちながら行うことにより調製される。
該方法の有利な実施形態によると、これは長期凍結乾燥死滅マイコバクテリアの調製物からなる。
【００５５】
本発明は、Th1-Th2平衡異常、例えば多発性硬化症、真性糖尿病およびクローン病のような自己免疫疾患、喘息、アレルギー性鼻炎またはアトピー性皮膚炎のようなアレルギー疾患、癌のような免疫調節不全を含む疾患の予防および／または治療のための医薬品の製造のための、上記の細菌調製物またはそれらの画分の使用にも関する。
【００５６】
上記の使用によると、上記の死滅細菌調製物またはそれらの画分は、上記で定義したような医薬上許容される担体、および／または免疫増強剤、および／またはアジュバント、および／または上記で定義したようないずれの通常の添加剤と関連させる。
本発明の有利な実施形態によると、マイコバクテリア、好ましくはマイコバクテリア・ボビス、より好ましくはマイコバクテリア・ボビスBCGを用いる。
【００５７】
本発明のその他の有利な実施形態によると、長期凍結乾燥法により得ることができる長期凍結乾燥死滅細菌を用いる。
【００５８】
本発明の死滅細菌調製物は、次の利点を有する：
−これらは、対象をTh1-Th2平衡異常のような免疫調節不全、例えば喘息を含む疾患から防御する、
−これらは、感染性ではなく、免疫不全の対象に投与し得る、
−これらは、炎症性の有害作用に導かず、これはおそらく、特にこれらが毒性および壊死活性に導き得るTNFαの産生を導かないという事実による。加えて、これらは貧血および血小板減少を含む他の副作用を導かない、
【００５９】
−これらは、BCG精製蛋白誘導体(PPD)に対する遅延型過敏を誘導することなく用いることができるので、結核の診断に干渉しない、
−そして、これらは、細菌細胞からの分子の構造を保存する(分子の甚大な変性がない)方法により製造されるので、上記死滅細菌調整物からの免疫調節分子の同定を許容する。
【００６０】
本発明は、少なくとも本発明の医薬組成物、該医薬組成物の投与の手段、および／または処方された治療へのコンプライアンスを確実にする手段を含むことを特徴とする、免疫調節不全を含む疾患の治療のためのキットにも関する。
【００６１】
本発明は、次に続く付加的な記載および図によりさらに説明され、これは、マウスにおける喘息への長期凍結乾燥死滅BCGの防御的効果、長期凍結乾燥死滅BCG、熱死滅BCGおよび生存BCGにより誘導される免疫応答、または長期凍結乾燥死滅BCGおよびそれらの画分の製造の分析を例証する実施例に言及する。しかしながら、これらの実施例は、本発明の例証のためにのみ示され、その限定をいずれにしても構成するものではないことが理解されるべきである。
【００６２】
−図1は、凍結乾燥生存BCGワクチンの製造の標準的な方法(A)を、本発明による、長期凍結乾燥死滅BCGの製造方法(B)との比較により説明する：ミリバール(mBar)での圧力(-△-)、および℃でのサンプル(-○-)またはトレー(-●-)の温度は、時間(hours)の期間に対して示す。
【００６３】
−図2は、呼吸の減少により分析された、特にストリンジェントな(高度にTh2)喘息のBP2マウスモデルでの気管支肺反応亢進に対する、長期凍結乾燥死滅BCG (凍結乾燥死滅BCG)の防御的効果を説明する。マウスのBP2株は、Th2/喘息軸(Th2/asthma axis)に高度に感受性である。マウスは、Th2促進剤として知られるミョウバンと組み合わせたオボアルブミン(OVA)でも感作される。比較すると、このストリンジェントなマウスモデルにおいて、生存BCGまたは熱死滅BCGで処理された群では、有意な効果は観察されない。カーブの下の面積(cm2)を示す：個体(-○-)、マウスの群当たりの平均±SEM (-●-)。
【００６４】
−図3は、気管支肺の抵抗性により分析された、アレルゲンとしてOVAを用いた、喘息のBP2マウスモデルでの気管支肺反応亢進に対する、長期凍結乾燥死滅BCG (凍結乾燥死滅BCG)の防御的効果を説明する。比較すると、生存BCGまたは熱死滅BCGで処理された群では、有意な効果は観察されない。1分間の間隔で測定された増強された休止期(Penh)を示す：個々のデータ(-○-)、マウスの群当たりの平均±SEM (-●-)。
***長期凍結乾燥死滅BCGで処理した群における、気管支肺反応亢進に対する統計的に有意(p＜0.001)な防御的効果。
【００６５】
−図4は、気管支肺胞洗浄(BAL)の細胞計数により分析された、喘息のBP2マウスモデルの肺での好酸球の増加に対する、長期凍結乾燥死滅BCG (凍結乾燥死滅BCG)の防御的効果を説明する。比較すると、生存BCGまたは熱死滅BCGで処理された群では、有意な効果は観察されない。個々のデータ(-○-)、マウスの群当たりの平均±SEM (-●-)を示す。
【００６６】
−図5は、気管支肺胞洗浄の細胞計数により分析された、喘息のBP2マウスモデルの肺での好中球の増加に対する、長期凍結乾燥死滅BCG (凍結乾燥死滅BCG)の防御的効果を説明する。比較すると、生存BCGまたは熱死滅BCGで処理されたマウスでは、有意な効果は観察されない。個々のデータ(-○-)、マウスの群当たりの平均±SEM (-●-)を示す。**長期凍結乾燥死滅BCGで処理した群における、好中球の数の統計的に有意な(p＜0.01)減少。
【００６７】
−図6は、気管支肺胞洗浄中の非常に低いレベルのフィブロネクチンにより分析された、喘息のBP2マウスモデルにおける長期凍結乾燥死滅BCG (凍結乾燥死滅BCG)での肺の炎症または組織損傷の有利な非存在を説明する。比較すると、生存BCGまたは熱死滅BCGで処理された群では、BAL中のかなり高いレベルのフィブロネクチンが観察される。データは、IU/mlで表される；個々のデータ(-○-)、マウスの群当たりの平均±SEM (-●-)。***長期凍結乾燥死滅BCGで処理した群における、フィブロネクチンのレベルの統計的に有意な(p＜0.001)減少。
【００６８】
−図7は、生存BCG、熱死滅BCG、長期凍結乾燥死滅BCG(凍結乾燥死滅BCG)で処理されたか、または未処理のマウスの群からの気管支肺胞洗浄中のIL-5レベルを説明する。データは、pg/mlで表される；個々のデータ(-○-)、マウスの群当たりの平均±SEM (-●-)。
−図8は、生存BCG、熱死滅BCG、長期凍結乾燥死滅BCG(凍結乾燥死滅BCG)で処理されたか、または未処理のマウスの群からの血清中のIL-5レベルを説明する。データは、pg/mlで表される；個々のデータ(-○-)、マウスの群当たりの平均±SEM (-●-)。
【００６９】
−図9は、生存BCG、熱死滅BCG、長期凍結乾燥死滅BCG(凍結乾燥死滅BCG)で処理されたか、または未処理のマウスの群からの肺培養物中のIFN-γ(pg/ml)のレベルを説明する；培養物は、インビトロで、精製BCG分泌タンパク質(A)または抗-CD3抗体(B)で賦活化される。個々のデータ(-○-)、マウスの群当たりの平均±SEM (-●-)を示す。
【００７０】
−図10は、治療的プロトコルにおいて生存BCG、熱死滅BCG、長期凍結乾燥死滅BCG(凍結乾燥死滅BCG)で処理されたか、または未処理のマウスの血清中のOVA特異的IgEのレベルを説明する。個々のデータ(-○-)、マウスの群当たりの平均±SEM (-●-)を示す。
【００７１】
−図11Aおよび12Aは、熱死滅BCG(加熱) (-◆-)、または長期凍結乾燥死滅BCG (凍結乾燥)(…■…)のいずれかによりインビトロで賦活化された、それぞれ、BP2およびOVAで免疫化されたBALB/cマウスからの肺胞のマクロファージによるIL-12 (p70およびp40)の産生を説明する。データは、100000細胞当たりのpg/mlで示す。
【００７２】
−図11B (BP2)および12B (BALB/c)は、熱死滅BCG (加熱)により賦活化されたマウスからのマクロファージ中のTNFαのかなりのレベルに比較した、長期凍結乾燥死滅(凍結乾燥)により刺激されたマウスからのマクロファージ中のTNFαの産生の欠如を説明する。データは、100000細胞当たりのng/mlで示す。
【００７３】
−図13は、長期凍結乾燥死滅BCG(凍結乾燥死滅BCG)で処理されたマウスでのBCG精製蛋白誘導体(PPD)に対する遅延型感覚過敏(DTH)の欠如を説明する。比較すると、生存BCGまたは熱死滅BCGのいずれかで処理されたマウスでは、DTHが観察される。個々のデータ(-○-)、マウスの群当たりの平均±SEM (-●-)を示す。***長期凍結乾燥死滅BCG処理された群における、足踵部(footpad)膨張の統計的に有意な欠如(p＜0.001)。
【００７４】
−図14は、喘息のモルモットにおける、ヒスタミンへの気管支肺反応亢進についての長期凍結乾燥死滅BCG (EFD-BCG)の防御的効果を説明する。OVA免疫化動物の群を、長期凍結乾燥死滅BCGの10μg (図14B)もしくは100μg (図14C)で処理するか、または処理しない(図14A)。各動物について、OVAのエアロゾル投与の前(黒い印)および後(白い印)で、気管支収縮を創生し得るヒスタミンの濃度を示す。***長期凍結乾燥死滅BCG 10μg (p＜0.01)または100μg (p＜0.001)で処理した群における、統計的に有意な防御的効果(Kruskal-Wallisの非パラメータ試験)。
【００７５】
−図15Aは、気管支肺胞洗浄の細胞計数により評価される、喘息のBP2マウスモデルでの、肺における好酸球の増加に対する長期凍結乾燥死滅BCG (EFD1)の防御的効果を説明する。比較すると、生存BCGまたは熱死滅BCGで処理した群では、有意な効果は観察されない。データは、マウスの群当たりの平均±SEMで表され；各群についてn = 7である。*長期凍結乾燥死滅BCG処理群における、好酸球の数の統計学的に有意な減少(p＜0.05)。
【００７６】
−図15Bは、生存BCG、熱死滅BCG、長期凍結乾燥死滅BCG(EFD1)で処理されたか、または未処理のマウスの群からの気管支肺胞洗浄中のIL-5のレベルを説明する。データは、マウスの群当たりの平均±SEMで表され；各群についてn = 7である。
【００７７】
−図16は、SDS-PAGEおよび
(A) PVDFメンブレン上に移した後の、抗マイコバクテリア抗体での染色、または
(B) アウロダイ(Aurodye)での染色
により評価される、長期凍結乾燥死滅BCG調製物中のタンパク質の構造の保存を説明する。タンパク質は、スメアしていない分離したバンドとして現れる。
【００７８】
−図17は、気管支肺反応亢進により分析される、水溶性レイグラス(ray-grass)花粉抽出物をアレルゲンとして用いる、喘息のBP2マウスモデルにおける気管支肺反応亢進への長期凍結乾燥死滅BCG (EFD1)の防御的効果を説明する。メタコリン投与後3〜8分の間に測定される増強された休止期(Penh)を示す：データは、マウスの群当たりの平均±SEMで表され；各群についてn = 8である。**長期凍結乾燥死滅BCG処理群における、気管支肺反応亢進に対する統計的に有意(p＜0.01)な防御的効果。
【００７９】
−図18AおよびBは、気管支肺胞洗浄(BAL)の細胞計数により分析された、喘息のBP2マウスモデルの肺での多形核および好酸球の増加に対する、長期凍結乾燥死滅BCG (EFD1)の防御的効果を説明する。データは、マウスの群当たりの平均±SEMで表される。長期凍結乾燥死滅BCG 1 mgおよび10 mgで処理した群における、多形核数の統計的に有意(**p＜0.01)な減少；好酸球数の統計的に有意な減少： 100μg、1 mgおよび10 mgの長期凍結乾燥死滅BCGで処理した群において、それぞれ**p＜0.01、*p＜0.05および*p＜0.05。
【００８０】
−図18Cは、気管支肺胞洗浄中の細胞およびサイトカイン分析により評価された、長期凍結乾燥BCG (EFD1)処理群(10μg、100μg、1 mgおよび10 mg)での、多形核および好酸球の数の減少と、IL-4産生の減少との間の関係を説明する。データは、マウスの群当たりの平均±SEMで表される。10μg、100μg、1 mgおよび10 mgの長期凍結乾燥死滅BCGで処理した群における、IL-4のレベルの統計的に有意な減少(**p＜0.01)。
【００８１】
−図19は、肺細胞浸潤計数により分析された、喘息のBP2マウスモデルでの長期凍結乾燥死滅BCG (EFD1)処理群における肺の白血球浸潤の予防を説明する。データは、マウスの群当たりの平均±SEMで表され；各群についてn = 5である。長期凍結乾燥死滅BCG 10μgで処理した群における、細胞数の統計的に有意な減少(**p＜0.001)。
【００８２】
−図20は、マクロファージ(CD11b+)、多形核細胞(Gr1+)および樹状細胞(CD11c+)のフローサイトメトリー分析により分析された、喘息のBP2マウスモデルでの長期凍結乾燥死滅BCG(EFD1)処理群における肺の白血球浸潤の予防を説明する。データは、マウスの群当たりの平均±SEMで表され；各群についてn = 5である。(i) 長期凍結乾燥死滅 BCG (10μg、100μg、1 mgおよび10 mg)で処理した全ての群における、マクロファージおよび樹状細胞、ならびに(ii) 長期凍結乾燥死滅BCG 100μg、1 mgおよび10 mgで処理した群だけでの多形核の数の統計的に有意な減少。
【００８３】
−図21は、生存BCG、熱死滅BCG、長期凍結乾燥死滅BCG(EFD1)で処理されたか、または未処理であり、かつOVAで攻撃(challenge)されたか、またはされなかったマウスの群からの肺培養物中のIFN-γおよびIL-10 (pg/肺)のレベルを説明する；培養物は、インビトロにて精製BCG分泌タンパク質で賦活化される。データは、マウスの群当たりの平均±SEMで表され；各群についてn = 4である。長期凍結乾燥死滅BCGで処理した群だけでのIL-10産生の統計的に有意な増加(***p＜0.001)。
【００８４】
−図22は、長期凍結乾燥死滅BCG (EFD-BCG)の静脈内投与後の、同じ経路での生存BCGおよび熱死滅BCGの投与に比較した、貧血(A)および血小板減少(B)の欠如を説明する。
【００８５】
−図23は、注射後10週間にわたって毎週測定した足踵部の増大により評価された、長期凍結乾燥死滅BCG (EFD1)の皮下注射後の、生存BCGおよび熱死滅BCGとの比較による、注射部位での最小限の炎症反応を説明する。矢印は、注射の日を示す；EFDおよび熱死滅BCGについてD0およびD36、生存BCGについてD0のみ。
【００８６】
−図24は、長期凍結乾燥死滅BCG (EFD1)の静脈内注射後18日での、同じ経路での生存BCGおよび熱死滅BCGの注射に比較した、肺外植片のLPS刺激後の減少したTNF-αの産生を説明する。未処理群に比べて、長期凍結乾燥死滅BCG群におけるTNF-αの有意な産生はない(***p＜0.001)。比較すると、生存BCGおよび熱死滅BCG処理群において、TNF-αの有意な産生が観察される。
【００８７】
−図25は、90日前にオボアルブミンで免疫化し、45および65日に長期凍結乾燥死滅BCG (EFD1)で処理したかまたは処理せず、そしてオボアルブミンで攻撃したかまたはしなかったBALB/cマウスからの脾臓におけるCD11c+ Gr1+ B220+形質細胞様樹状細胞の増加を説明する。処理群においてCD11c+ Gr1+ B220+細胞数の統計学的に有意な増加(p＜0.001)、処理群においてCD11c+ CD8α+細胞数の増加なし。
【００８８】
−図26は、90日前にオボアルブミンで免疫化し、45日および65日に長期凍結乾燥死滅BCG (EFD1)で処理したかまたは処理せず、そしてオボアルブミンで攻撃したかまたはしなかったBALB/cマウスからの脾臓におけるCD4+ CD25+ IL-10+細胞数の増加を説明する；脾臓細胞は、白血球集団(population)の分析前に、インビトロでOVAまたはBCG培養上清で賦活化するか、または賦活化しない。処理群においてCD4+ CD25+ IL-10+細胞数の統計学的に有意な増加(p＜0.001)。
【００８９】
−図27は、肺細胞浸潤計数により評価された、喘息のマウスモデルにおける、経口経路により与えられた長期凍結乾燥死滅BCG (EFD1)の防御的効果を説明する。***処理群における、肺細胞数の統計的に有意な減少(p＜0.001)。
【００９０】
−図28は、喘息のBALB/cモデルでの気管支肺反応亢進の予防により評価された、皮下経路により注射された長期凍結乾燥死滅BCG (EFD)のある投与量の防御的効果を説明する。
【００９１】
−図29は、喘息のBP2モデルでの気管支肺反応亢進の予防により評価された、皮下経路により注射された長期凍結乾燥死滅BCG (EFD)の作用の遅延を説明する。気管支肺反応亢進の予防は、長期凍結乾燥死滅BCGの投与および攻撃の間に2〜3週間の遅延が存在する場合にのみ起こる。
【００９２】
−図30は、喘息のBP2モデルでの気管支肺反応亢進の予防により評価された、皮下経路により注射された長期凍結乾燥死滅BCG (EFD)の作用の持続期間を説明する；長期凍結乾燥死滅BCGの防御的効果は、少なくとも2ヶ月にわたって持続する。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図1は、凍結乾燥生存BCGワクチンの製造の標準的な方法(A)を、本発明による、長期凍結乾燥死滅BCGの製造方法(B)との比較により説明する。
【図２】図2は、呼吸の減少により分析された、特にストリンジェントな(高度にTh2)喘息のBP2マウスモデルでの気管支肺反応亢進に対する、長期凍結乾燥死滅BCG (凍結乾燥死滅BCG)の防御的効果を説明する。
【図３】図3は、気管支肺の抵抗性により分析された、アレルゲンとしてOVAを用いた、喘息のBP2マウスモデルでの気管支肺反応亢進に対する、長期凍結乾燥死滅BCG (凍結乾燥死滅BCG)の防御的効果を説明する。
【図４】図4は、気管支肺胞洗浄(BAL)の細胞計数により分析された、喘息のBP2マウスモデルの肺での好酸球の増加に対する、長期凍結乾燥死滅BCG (凍結乾燥死滅BCG)の防御的効果を説明する。
【図５】図5は、気管支肺胞洗浄の細胞計数により分析された、喘息のBP2マウスモデルの肺での好中球の増加に対する、長期凍結乾燥死滅BCG (凍結乾燥死滅BCG)の防御的効果を説明する。
【図６】図6は、気管支肺胞洗浄中の非常に低いレベルのフィブロネクチンにより分析される、喘息のBP2マウスモデルにおける長期凍結乾燥死滅BCG (凍結乾燥死滅BCG)での肺の炎症または組織損傷の有利な非存在を説明する。
【図７】図7は、生存BCG、熱死滅BCG、長期凍結乾燥死滅BCG(凍結乾燥死滅BCG)で処理されたか、または未処理のマウスの群からの気管支肺胞洗浄中のIL-5レベルを説明する。
【図８】図8は、生存BCG、熱死滅BCG、長期凍結乾燥死滅BCG(凍結乾燥死滅BCG)で処理されたか、または未処理のマウスの群からの血清中のIL-5レベルを説明する。
【図９】図9は、生存BCG、熱死滅BCG、長期凍結乾燥死滅BCG(凍結乾燥死滅BCG)で処理されたか、または未処理のマウスの群からの肺培養物中のIFN-γ(pg/ml)のレベルを説明する。
【図１０】図10は、治療的プロトコルにおいて生存BCG、熱死滅BCG、長期凍結乾燥死滅BCG(凍結乾燥死滅BCG)で処理されたか、または未処理のマウスの血清中のOVA特異的IgEのレベルを説明する。
【図１１Ａ】図11Aは、熱死滅BCG(加熱) (-◆-)、または長期凍結乾燥死滅BCG (凍結乾燥) (…■…)のいずれかによりインビトロで賦活化された、それぞれ、BP2およびOVAで免疫化されたBALB/cマウスからの肺胞のマクロファージによるIL-12 (p70およびp40)の産生を説明する。
【図１１Ｂ】図11B (BP2)は、熱死滅BCG (加熱)により賦活化されたマウスからのマクロファージ中のTNFαのかなりのレベルに比較した、長期凍結乾燥死滅(凍結乾燥)により刺激されたマウスからのマクロファージ中のTNFαの産生の欠如を説明する。
【図１２Ａ】図12Aは、熱死滅BCG(加熱) (-◆-)、または長期凍結乾燥死滅BCG (凍結乾燥) (…■…)のいずれかによりインビトロで賦活化された、それぞれ、BP2およびOVAで免疫化されたBALB/cマウスからの肺胞のマクロファージによるIL-12 (p70およびp40)の産生を説明する。
【図１２Ｂ】図12B (BALB/c)は、熱死滅BCG (加熱)により賦活化されたマウスからのマクロファージ中のTNFαのかなりのレベルに比較した、長期凍結乾燥死滅(凍結乾燥)により刺激されたマウスからのマクロファージ中のTNFαの産生の欠如を説明する。
【図１３】図13は、長期凍結乾燥死滅BCG(凍結乾燥死滅BCG)で処理されたマウスでのBCG精製蛋白誘導体(PPD)に対する遅延型感覚過敏(DTH)の欠如を説明する。
【図１４】図14は、喘息のモルモットにおける、ヒスタミンへの気管支肺反応亢進についての長期凍結乾燥死滅BCG (EFD-BCG)の防御的効果を説明する。
【図１５Ａ】図15Aは、気管支肺胞洗浄の細胞計数により評価された、喘息のBP2マウスモデルでの、肺における好酸球の増加に対する長期凍結乾燥死滅BCG (EFD1)の防御的効果を説明する。
【図１５Ｂ】図15Bは、生存BCG、熱死滅BCG、長期凍結乾燥死滅BCG(EFD1)で処理されたか、または未処理のマウスの群からの気管支肺胞洗浄中のIL-5のレベルを説明する。
【図１６】図16は、SDS-PAGEおよび(A) PVDFメンブレン上に移した後の、抗マイコバクテリア抗体での染色、または(B) アウロダイでの染色により評価された、長期凍結乾燥死滅BCG調製物中のタンパク質の構造の保存を説明する。
【図１７】図17は、気管支肺反応亢進により分析される、水溶性レイグラス花粉抽出物をアレルゲンとして用いる、喘息のBP2マウスモデルにおける気管支肺反応亢進への長期凍結乾燥死滅BCG (EFD1)の防御的効果を説明する。
【図１８Ａ】図18Aは、気管支肺胞洗浄(BAL)の細胞計数により分析された、喘息のBP2マウスモデルの肺での多形核および好酸球の増加に対する、長期凍結乾燥死滅BCG (EFD1)の防御的効果を説明する。
【図１８Ｂ】図18Bは、気管支肺胞洗浄(BAL)の細胞計数により分析された、喘息のBP2マウスモデルの肺での多形核および好酸球の増加に対する、長期凍結乾燥死滅BCG (EFD1)の防御的効果を説明する。
【図１８Ｃ】図18Cは、気管支肺胞洗浄中の細胞およびサイトカイン分析により評価された、長期凍結乾燥BCG (EFD1)処理群(10μg、100μg、1 mgおよび10 mg)での、多形核および好酸球の数の減少と、IL-4産生の減少との間の関係を説明する。
【図１９】図19は、肺細胞浸潤計数により分析された、喘息のBP2マウスモデルでの長期凍結乾燥死滅BCG (EFD1)処理群における肺の白血球浸潤の予防を説明する。
【図２０】図20は、マクロファージ(CD11b+)、多形核細胞(Gr1+)および樹状細胞(CD11c+)のフローサイトメトリー分析により分析された、喘息のBP2マウスモデルでの長期凍結乾燥死滅BCG (EFD1)処理群における肺の白血球浸潤の予防を説明する。
【図２１】図21は、生存BCG、熱死滅BCG、長期凍結乾燥死滅BCG(EFD1)で処理されたか、または未処理であり、かつOVAで攻撃(challenge)されたか、またはされなかったマウスの群からの肺培養物中のIFN-γおよびIL-10 (pg/肺)のレベルを説明する。
【図２２】図22は、長期凍結乾燥死滅BCG (EFD-BCG)の静脈内投与後の、同じ経路での生存BCGおよび熱死滅BCGの投与に比較した、貧血(A)および血小板減少(B)の欠如を説明する。
【図２３】図23は、注射後10週間にわたって毎週測定した足踵部の増大により評価された、長期凍結乾燥死滅BCG (EFD1)の皮下注射後の、生存BCGおよび熱死滅BCGとの比較による、注射部位での最小限の炎症反応を説明する。
【図２４】図24は、長期凍結乾燥死滅BCG (EFD1)の静脈内注射後18日での、同じ経路での生存BCGおよび熱死滅BCGの注射に比較した、肺外植片のLPS刺激後の減少したTNF-αの産生を説明する。
【図２５】図25は、90日前にオボアルブミンで免疫化し、45および65日に長期凍結乾燥死滅BCG (EFD1)で処理したかまたは処理せず、そしてオボアルブミンで攻撃したかまたはしなかったBALB/cマウスからの脾臓におけるCD11c+ Gr1+ B220+形質細胞様樹状細胞の増加を説明する。
【図２６】図26は、90日前にオボアルブミンで免疫化し、45日および65日に長期凍結乾燥死滅BCG (EFD1)で処理したかまたは処理せず、そしてオボアルブミンで攻撃したかまたはしなかったBALB/cマウスからの脾臓におけるCD4+ CD25+ IL-10+細胞数の増加を説明する。
【図２７】図27は、肺細胞浸潤計数により評価された、喘息のマウスモデルにおける、経口経路により与えられた長期凍結乾燥死滅BCG (EFD1)の防御的効果を説明する。
【図２８】図28は、喘息のBALB/cモデルでの気管支肺反応亢進の予防により評価された、皮下経路により注射された長期凍結乾燥死滅BCG (EFD)のある投与量の防御的効果を説明する。
【図２９】図29は、喘息のBP2モデルでの気管支肺反応亢進の予防により評価された、皮下経路により注射された長期凍結乾燥死滅BCG (EFD)の作用の遅延を説明する。
【図３０】図30は、喘息のBP2モデルでの気管支肺反応亢進の予防により評価された、皮下経路により注射された長期凍結乾燥死滅BCG (EFD)の作用の持続期間を説明する。
【実施例】
【００９４】
実施例1：長期凍結乾燥死滅マイコバクテリアの製造
1) 材料と方法
マイコバクテリウム・ボビスBCG細胞(BCGパスツールワクチン株1173P2、番号I-059のもとに、the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes、25 rue du Docteur Roux、75724 PARIS Cedex 15 (France)に1978年4月24日に寄託(M. Gheorghiuら、1983、Bull. Inst. Pasteur、 81、281〜288))を、滅菌ソートン(Sauton)培地(HOOCCH(NH2O)CH2CONH2H2O (アスパラギン)、4 g/l；C6H8O7；H2O (クエン酸)、2 g/l；K2HPO4 (リン酸水素二カリウム)、0.5 g/l；MgSO4-H2O (硫酸マグネシウム)、0.50 g/l；クエン酸第二鉄、0.05 g/l；グリセロール、60 ml；硫酸亜鉛溶液(パイロジェンフリーの水10 ml 中に硫酸亜鉛0.155 g)、240μl/l、pH 7)中で培養する。より正確には、1173 P2株を、滅菌ソートン培地130 ml を含む250 mlの球形培養フラスコ中で、37℃で14日間培養し、これは培養がその対数期で終わる時間に相当する。
【００９５】
次いで、培養物を2000×gで10分間、4℃で遠心分離して、BCG細胞をペレット化する。細胞培養物上清を捨て、ペレットを蒸留水中に充分に(3回)洗浄する；各洗浄は、上記細胞を蒸留水(細胞ペレット1容積当たり20容積)中に再懸濁し、細胞を2000×gで10分間、4℃で遠心分離する。
【００９６】
最後の洗浄後、ペレットをペレットの容積と等しいか、または2倍の容積の蒸留水に再懸濁する。水50 ml中の細菌20 gを、厚さ約1 cmの層を形成するために、瓶の壁の上に層状にして凍結する。混合物を-60℃で凍結させる。
【００９７】
次いで、水中の細胞の凍結懸濁物を、図1Bに記載の長期凍結乾燥プロトコルの条件下で長期凍結乾燥し、実質的に全ての水分を除去する(残存水分＜1.5%)。簡単に、氷冷却器の温度が約-50℃〜-54℃で圧力を迅速に0.150 mBarに減少させ、凍結乾燥プロセスが開始される。サンプルは凍結したままであり、温度は正確にはモニターしていない。次いで、実質的に全ての水分を除去する(残存水分＜1.5%)ために、圧力を0.1 mBarで34時間維持する。室温(約20℃)までの連続的な増加がある。乾燥の最後に、室温(約20℃)にて空気で大気圧までゆっくりと圧力を戻し、長期凍結乾燥死滅BCG細胞(約2 g)を回収して室温、大気圧下で保存する。
【００９８】
長期凍結乾燥死滅BCG調製物中に存在する残存水分は、カール・フィッシャーの比色分析法、および製造業者の使用説明書に基づき756 KF比色計(METHROM)を用いて測定する。
【００９９】
長期凍結乾燥死滅調製物中の生菌の存在は：
−ml あたりのコロニー形成単位(CFU)の数の測定；長期凍結乾燥死滅調製物の懸濁物 0.2ml (1 mg、例えば水中に約109の長期凍結乾燥死滅BCG細胞)をミドルブルック(Middlebrook) 7H10寒天培地 (DIFCO)上に播種し、プレートを37℃で1ヶ月インキュベートするか、および／または
【０１００】
−生菌のみを染色する蛍光色素CFDA-SE (カルボキシフルオレセイン  ジアセテート−サクシミジル  エステル；MOLECULAR PROBES 参照番号C-1157)での染色；長期凍結乾燥死滅調製物の懸濁物1 ml (水中に約108の長期凍結乾燥死滅BCG細胞)を、CFDA試薬(ストック溶液：DMSO 中に1mg/ml)のPBS中の1/100希釈 100μlと混合する。混合物は、室温で暗所にて60分間インキュベートする。標識された細菌を3000 rpmで15分間遠心分離し、PBS中に2回洗浄し、同緩衝液に再懸濁する。次いで、生存細胞の存在を、蛍光顕微鏡により調べたことにより確かめられる。
【０１０１】
2) 結果
BCG細胞を、材料および方法に記載の長期凍結乾燥プロトコルに従って長期凍結乾燥して死滅させ、図1Bにまとめた。比較すると、BCG細胞を、生BCGワクチンの製造の標準的な方法に従って凍結乾燥させた：BCG細胞(1173P2株)を、37℃でソートン培地中に培養し、対数期の最後に遠心分離により回収し、BCG細胞ペレットを、BCG 4 mg/ml の濃度でグルタミン酸ナトリウム (1.5 g/100 ml H2O)中に再懸濁した。BCG懸濁物をバイアル中に分配し(0.25 ml/バイアル)、図1Aに説明されるプロトコルに従って凍結乾燥させ、1.5 ± 0.5% H2Oを含む各バイアルを、真空下に(0.06 mBar)室温で保存した。
【０１０２】
種々の調製物でのBCG細胞の生存度を、材料および方法に記載のようにして分析した。
次の結果が、カール・フィッシャーの比色分析法、培養分析およびCFDA-SE染色試験により観察された：
−長期凍結乾燥死滅BCG調製物200 mgは、代表的な測定において1.073 mgの水分を含んでおり、これは残存水分0.5 %未満と等しい、
−本発明の方法により製造された長期凍結乾燥死滅BCGサンプルには、生存細菌は検出されなかった、
−標準のBCGワクチン製造方法による凍結乾燥死滅BCG調製物には、50%〜60%の生存細菌が検出された。
【０１０３】
実施例2：長期凍結乾燥死滅マイコバクテリア画分の製造
1) 脱脂画分 (画分A)
ホウ酸塩緩衝液(蒸留水中にNa2B4O7 10H2O 0.363%；H3BO3 0.525%；NaCl 0.619%およびTween 20 0.0005%、pH 8)に懸濁した約1010の長期凍結乾燥死滅BCG 10 mg/mlを12 000×gで10分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットをクロロホルム/メタノール(9/1) 1 mlに室温で24時間再懸濁して脂質を抽出した。クロロホルム/メタノールを10分当たり12 000×gでの遠心分離により除去する。クロロホルム/メタノール抽出物からの脱脂されたペレットを真空乾燥した。
【０１０４】
2) 脱グリコシル画分 (画分B)
ホウ酸塩緩衝液(蒸留水中にNa2B4O7 10H2O 0.363%；H3BO3 0.525%；NaCl 0.619%およびTween 20 0.0005%、pH 8)に懸濁した約1010の長期凍結乾燥死滅BCG 10 mg/mlを12 000×gで10分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを、リゾチーム1 mgを含む0.1 M 酢酸ナトリウム1 mlに37℃で24時間再懸濁して、ペプチドグリカンを除去した。消化産物を96℃で2分間加熱し、12 000×gで1時間の遠心分離により、ペレットを回収した。
【０１０５】
3) DNアーゼおよびRNアーゼ処理画分(画分C)
ホウ酸塩緩衝液に懸濁した約1010の長期凍結乾燥死滅BCG 10 mg/mlを12 000×gで10分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを、DNアーゼ1 mgおよびRNアーゼ1 mgおよび5 mM MgCl2を含む40 mM Tris-HCl緩衝液1 mlに37℃で24時間再懸濁し、核酸を除去した。消化産物を96℃で2分間加熱し、12 000×gで1時間の遠心分離により、ペレットを回収した。
【０１０６】
4) プロテアーゼ処理画分(画分D)
ホウ酸塩緩衝液に懸濁した約1010の長期凍結乾燥死滅BCG 10 mg/mlを12 000×gで10分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを、0.1 mg ズブチリシンを含む0.1 M 酢酸アンモニウム緩衝液1 mlに37℃で23時間再懸濁した。タンパク質を完全に除去するために、次に反応混合物にズブチリシン0.1 mgを添加して37℃で7時間インキュベートした。消化産物を96℃で2分間加熱し、12 000×gで1時間の遠心分離により、ペレットを回収した。
【０１０７】
5) 連続的な処理(画分E)
約1010の長期凍結乾燥死滅BCG 10 mg/mlを12 000×gで10分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを、ホウ酸塩緩衝液に再懸濁し、上記のようにして、クロロホルム/メタノール(9/1)、リゾチーム、DNアーゼ-RNアーゼ混合物およびズブチリシンで、連続的に処理した。消化産物を96℃で2分間加熱し、12 000×gで1時間の遠心分離により、ペレットを回収した。
【０１０８】
6) 長期凍結乾燥死滅BCG調製物のタンパク質および多糖類の含量の特性決定
a) 材料および方法
長期凍結乾燥死滅BCG調製物(10 mg)の調製物を水中の4%ブタノール1 mlに懸濁し、ジルコニア/シリカビーズ(0.1mm) (BIOSPEC PRODUCTS, INC.) 1 gを含む2つのエッペンドルフチューブ(チューブ当たり500μl)に分配した。次いで、チューブをミキサーミルズ (MM301、RESCH)に、周波数25で、5、15、30、60、120、180、240、300または470分間入れた。次いで、チューブを10000 rpmで30分間遠心分離した；上清を回収し、ろ過(0.22μmのフィルター、MILLIPORE)し、タンパク質、アミノ酸および多糖類の濃度を次のようにして測定した：
【０１０９】
−全タンパク質濃度は、マイクロBCAプロテインリエージェントキット(PIERCE)を用いて測定した、
−アミノ酸濃度測定および分析は、質量分析により行った、
−全多糖類濃度は、S. Melvin、Anal. Biochem. 1953、25、1656〜によるアンスロン(anthrone)法を用いて測定した。
【０１１０】
5、60または300分で回収した細菌抽出物のアリコート(タンパク質5μg)をSDS-PAGEにより分離し、タンパク質をPVDFメンブレン上に移し、アウロダイ(Aurodye(登録商標)) (ファルマシア)またはマイコバクテリアのタンパク質に対するポリクローナル抗体のいずれかで染色した。
【０１１１】
b) 結果
5、60または300分後に回収した細菌抽出物は、それぞれタンパク質280、500および1258μg；アミノ酸190、420および880μg、ならびに多糖類697、1267および1765μgを含む。
図16に示す結果は、スメアしないで分離されたタンパク質のバンドの存在により示されるように、長期凍結乾燥法が、死滅BCG調製物中に存在するタンパク質の構造を保存することを示す；長期凍結乾燥死滅BCG調製物の抽出物で観察されるタンパク質プロフィールは、生存BCG調製物で観察されるものに匹敵する。
【０１１２】
実施例3：マウスモデルにおける喘息への長期凍結乾燥死滅マイコバクテリアの防御的効果
1) 材料および方法
a) 動物
雄の成体の(6〜7週齢) BP2 (H-2q)マウスは、Centre d'elevage R. Janvier (Le Genest、Saint Isle、France)から得て、特定の病原菌のいない状態で、動物施設にて維持した。
【０１１３】
b) 喘息様アレルゲン特異的疾患のマウスモデル
雄の成体のBP2マウスを、食塩水(0.4 mlの最終容量)中のオボアルブミン(OVA；ICN Laboratories) 1μg および水酸化アルミニウムアジュバント1.6 mgで、第0日(D0)および7日(D7)に、皮下経路(首の背面部分に)により免疫化した。アレルギー性応答は、食塩水50μl中のOVA 10μgで、第96〜98日に鼻腔内での攻撃により誘発する。代わりに、10μgを免疫化に用いる以外は、OVAと同じ条件において、水溶性レイグラス花粉抽出物をアレルゲンとして用いる。
【０１１４】
c) マイコバクテリアの免疫調節性組成物の製造
実施例1のようにして製造した長期凍結乾燥死滅BCGを、次のBCG調製物との比較により、BP2マウスにおける喘息ワクチンとして試験した：
- 生存BCG 
マイコバクテリウム・ボビスBCGパスツールワクチン1173P2株を、0.05% トリトンWR 1339 (SIGMA)および6%グルコースを補ったベック-プロスカウアー(Beck-Proskauer)培地(Gheorghiuら、1988、J. Biol. Standard.、16、15〜26)で、分散桿菌として培養した。細菌を対数期(5〜7日)に回収し、0.05% トリトンおよび6%グリセロールを補ったベック-プロスカウアー培地中に-70℃で保存した。ml当たりのコロニー形成単位(CFU)は、リン酸緩衝食塩水(PBS)中の適切な希釈をミドルブルック7H10寒天培地(DIFCO)上に播種することにより決定した。懸濁物は、PBS中の108、109または1010 CFU/mlの濃度で、その注射の直前に希釈した(100μl)。
【０１１５】
熱死滅BCG 
上記に記載したようにして製造された生存BCGを、3000 rpmで15分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを食塩水、例えばホウ酸塩を含有する緩衝液(蒸留水中にNa2B4O7 10H2O 0.363%；H3BO3 0.525%；NaCl 0.619%およびTween 20 0.0005%、pH 8)に再懸濁し、懸濁物を115℃で15分間オートクレーブした。
【０１１６】
d) 喘息のマウスモデルでの長期凍結乾燥死滅マイコバクテリアの投与の治療的プロトコル
雄の成体BP2マウスを、上述したようにしてOVAで免疫化する。25匹のマウスの群に、上述のようにして調製したBCG組成物100μlを注射した。
皮下経路(尾の根元)により、OVAでの最初の免疫化後D42〜45およびD65〜70に、
- 生存BCGワクチン株1173P2 (107 CFU)
- 熱死滅BCG (107CFU に等しい108の細菌の死骸)、
- 長期凍結乾燥死滅BCG (10μg〜10 mg；10μgは、107CFUに等しい)、および
- PBS。
アレルギー性応答は、食塩水50μl中のOVA 100μgでの、第96〜98日の鼻腔内での攻撃により誘発する；比較のために、PBS単独を鼻腔内に投与する。
【０１１７】
e) 気管支-肺(BHR)分析
麻酔をかけられていない動物のBHR研究を許容する気圧体積変動記録用装置(barometric plethysmographic equipment) (BUXCO)を用いた。OVAで免疫化し、種々のBCG調製物で処理したか、または未処理の動物を、OVAまたは水溶性レイグラス花粉抽出物での攻撃後24時間で試験した。動物を、体積変動記録用チャンバー内に置いた。これらの基礎のベンチレーションパラメータを記録し、20秒または1分間の間に、それらは、標準の噴霧器を用いて、H2O中に100 mMのメタコリン(ALDRICH)の吸入を受け、それらのベンチレーションパラメータを、メタコリンエアロゾル投与後10分間記録した。その期間中のベンチレーションの減少が報告され(カーブの下の領域)、そして気管支肺抵抗は：製造業者の使用説明書によると(呼気時間(tE)/緩和時間(trel)の40% -1)×ピーク呼気流量(PEF)/ピーク吸気流量(PIF)×0.67のようにして算出される、増強された休止期(Penh)として表される。Penhの平均値を毎分記録した。グラフ図としては、各値を毎分について示した。
【０１１８】
f) 気管支肺胞洗浄(BAL)
マウスに、致死量のウレタン(1.5 g/kg；SIGMA)を用いて腹腔内経路により麻酔をかけた。循環血液を腹部大動脈から除去し、シリンジに接続されたカニューレを気管内に置き、肺をPBS 0.7 mlで3回洗浄して、洗浄をチューブに回収し、氷上に保持した。
BAL中に存在する細胞の数を、COULTERにより提供される自動計数装置(ZBI)で測定した。種々の細胞タイプ(好酸球、好中球、マクロファージ)のパーセンテージを測定するために、スライドグラス上でサイトスピンしたBAL細胞をDIFF QUICK (BAXTER)で染色した。
【０１１９】
g) フィブロネクチンアッセイ
BALを、1000 rpmで10分間、4℃にて遠心分離し、上清中に存在するフィブロネクチンを、標準の方法(Rennardら、Anal. Biochem.、1980、205〜214)に従って、競合酵素免疫分析法(EIA)により分析した。
【０１２０】
h) 肺の外植片の調製および分析
肺を、3 mm あたり約1 mmの小片に切断した。各肺からの4または5つの断片を、AIM V培地(Life Technologies) 1 mlを含む組織培養プレートのウェルに入れた。肺の外植片を、基礎のレベルの測定のために培地のみの中で培養した；代わりに、BCG培養物ろ液(10μg/ml)を培養物に添加してマイコバクテリアの特異的細胞を明らかにするか、または抗-CD3モノクローナル抗体を培養物に添加してTリンパ球の反応性を明らかにした。24時間後に、製造業者の使用説明書にしたがって、市販のキットを用いてELISAにより、種々のリンフォカイン(IFN-γ、TNF-α、IL-10・・・)の存在を分析した。
肺全体(気管以外)をコラゲナーゼおよびDNアーゼ媒質中に解離させ、異なる蛍光色素で標識された種々のモノクローナル抗体を用いてフローサイトメーターで浸潤細胞を数えた。
【０１２１】
i) 肺の組織病理学的分析
肺全体を、緩衝ホルムアルデヒド中に固定し、組織病理学的分析のために処理した。シッフ染色を用いて、粘液および粘液含有細胞を染色した。対比染色として、ヘマトキシエオシン染色(hematoxy-eosin stain)を用いた。スライドを検査し、細胞浸潤および粘液含量の評価を、サンプルの起源についての知識なしにスライドを評点する一人の観察者により行った(ブラインドアッセイ)。
【０１２２】
j) サイトカインアッセイ
免疫化されたマウスの群からの血清およびBALサンプル中に存在するか、またはこれらのマウスからの肺外植片培養物により分泌されたかのいずれかのサイトカインを、次のようにして分析した：IFN-γ、IL-10およびIL-12を、ELISAにより試験した；TNF-αおよびIL-5を、EIA (酵素免疫分析法)により試験した。
【０１２３】
k) OVA特異的IgEアッセイ
血清中に存在するOVA特異的IgEのレベルを、標準の方法(Hansenら、J. Immunol.、2000、223〜230)に従って、ELISAにより分析した。
【０１２４】
l) 統計学的分析
群当たりの動物の数(n)は、4 ＜ n ＜ 8であった。独立事象について、スチューデントの両側(t)検定を行った。
【０１２５】
2) 結果
a) 気管支肺(BHR)分析
OVAまたは水溶性レイグラス花粉抽出物で免疫化され、種々のBCG調製物で処理されかまたは未処理の動物を、OVAまたはレイグラス花粉で攻撃後24時間で試験した。
フロイント不完全アジュバントよりもアレルギー反応の効力が高いアジュバントである水酸化アルミニウムと結合したオボアルブミンで免疫化された、Th2バックグラウンドのBP2を用いる、これらの研究において選択されるモデルは、したがって前記のCC Wand らにより用いられたフロイント不完全アジュバント中のオボアルブミンで免疫化されたBALB/cマウスのモデルよりも、ストリンジェントである。
【０１２６】
図2および3に示すデータは、この喘息のストリンジェントなモデルにおいて、未処理のコントロールに比べてメタコリンに対するより低い反応性により示されるように、長期凍結乾燥死滅BCG (10μg)は、気管支肺について統計的に有意な(p ＜ 0.001)防御的効果を有する。対照的に、この喘息のストリンジェントなモデルにおいて、生BCG (107 CFU)または熱死滅BCG (108の細菌の死骸)で処理された動物において、有意な防御的効果は観察されなかった。喘息について、長期凍結乾燥死滅BCG (EFD)調製物では、水溶性レイグラス花粉抽出物をアレルゲンとして用いた場合に(図17)、同様の統計的な防御効果(p ＜ 0.01)が観察される。
【０１２７】
b) 気管支肺胞洗浄(BAL)
長期凍結乾燥死滅BCG 10μg、100μg、1 mgまたは10 mgで処理したマウスの群において(図4、5、15A、18Aおよび18B)、好酸球(p<0.05)および好中球(p<0.05)の数の減少が観察される。
炎症性応答を反映する、気道滲出液中に存在するフィブロネクチンのレベルは、長期凍結乾燥死滅BCG (10μg、図6)で処理した群において、非常に有意な減少(p＜0.001)を示す。
アレルギー性応答の間に好酸球数の増加に影響を与えるリンフォカインであるIL-5についてのアッセイは、長期凍結乾燥死滅BCG で処理した群において(図7、8および15)、BALおよび血液中の両方の減少を示す。
【０１２８】
Th2サイトカインであるIL-4についてのアッセイは、長期凍結乾燥死滅BCG 10μg、100μg、1 mgまたは10 mgで処理したマウスの群からのBALで、統計的に有意な減少を示す(図18C)。
比較すると、生存BCG (107 CFU)または熱死滅BCG (108の細菌の死骸)で処理されたマウスでは、有意な効果は観察されなかった。
【０１２９】
これらの結果は、肺の炎症性応答(好酸球および好中球の産生、フィブロネクチンの滲出)の減少により実証されるように、長期凍結乾燥死滅BCGが喘息の症状を治療し得る免疫応答を誘導することができることを示す。Th2バックグラウンドの、この喘息のストリンジェントなモデル(BP2マウス)において、生存BCGまたは熱死滅BCG処理群のいずれにおいても防御は観察されなかった。
【０１３０】
c) 肺の組織病理学および浸潤細胞の分析
肺の組織病理学的分析は、長期凍結乾燥死滅BCG (EFD)での処理が、肺の白血球の浸潤および気管支上皮の粘膜異形成を防止することを示す。
これらの結果は、肺の組織中に存在する細胞のフローサイトメトリー分析により確実にされ、これは長期凍結乾燥死滅BCGでの処理は、肺において、白血球浸潤の統計的に有意な減少(p ＜ 0.001)を誘導する(図19)；異なる白血球の集団の分析(図20)は、長期凍結乾燥死滅BCG 処理群の肺における、マクロファージ(CD11b+)、多核白血球(Gr1+)、および樹状細胞(CD11c+)の数の減少を示す。
【０１３１】
d) サイトカイン分析
種々のBCG調製物で処理されたマウスの群からの肺の生検を、BCGまたは抗-CD3 mAbにより分泌される未精製のタンパク質の存在下、または非存在下に培養し、上清中のIFN-γおよびIL-10の産生を分析した。
図9および21に示す結果は、IFN-γの産生は、BCGでの免疫化を必要とする(図9 A)ことを示す。長期凍結乾燥死滅BCG群(図9A)で観察された、より低いレベルのIFN-γは、他のBCG免疫化群で観察されるレベルから統計的に有意ではない。抗-CD3抗体でのTリンパ球の非特異的促進は、種々の群(BCGで処理したか、または未処理)でのIFN-γのよく似たレベルを示し、BCGでの免疫化が肺に存在するTリンパ球の数を変更しないことを示唆する(図9B)。
【０１３２】
図21に示す結果も、生存BCGおよび熱死滅BCG処理群に比べて、長期凍結乾燥死滅BCG処理群において、統計的に有意な(p ＜ 0.001)より高いIL-10のレベルを示す。
長期凍結乾燥死滅BCG処理群と、その他のBCG調製物で処理された群との間の、肺におけるサイトカインの発現プロフィールの差異は、長期凍結乾燥死滅BCGの活性が、アレルゲン送達後の肺組織に存在する白血球の集団での修飾に関係することを示す。肺の外植片により放出される多量のIL-10および少量のIFN-γは、アレルゲン送達後に、長期凍結乾燥死滅BCG群の肺組織中に調節細胞が存在することを明らかにし得る。
【０１３３】
e) 抗-OVA特異的IgEのレベル
種々のBCG調製物で処理する前にOVAでの免疫化を実現した(治療的プロトコル)が、抗-OVA IgEのレベルは全ての群で同じであり(図10)、長期凍結乾燥死滅BCGで観察される防御的効果は、IgE濃度への直接の影響を含まないことを示唆する。
【０１３４】
実施例4：熱死滅または長期凍結乾燥死滅BCGにより賦活化された肺胞のマクロファージにより産生されるサイトカインの分析
1) 材料および方法
実施例3に記載のようにして獲得し、維持されたBP2およびBALB/c (H-2d)マウスを、実施例3bに記載のようにしてOVAで免疫化した。OVAの最後の注射後1週間で、ウレタンの致死量(1.5 g/kg；SIGMA)を用いて腹腔内経路によりマウスに麻酔をかけた。循環血液を腹部大動脈から除去し、シリンジに接続されたカニューレを気管内に置き、肺を2%の胎児ウシ血清を含むHBSS培地(Life Technologies) 0.5 mlで2回、および1 mlで5回洗浄した。BAL中に存在するマクロファージの数を、COULTERにより提供される自動計数装置(ZBI)で測定した。マクロファージを1000 rpmで20分間、室温にて遠心分離し、その濃度を3 %胎児ウシ血清、2 mMグルタミン、100 UI/mlペニシリンおよび10μg/mlストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地中に340. 103細胞/mlに調整した。次いで、マクロファージを組織培養のための96ウェルプレート中に分配(100 000細胞/ウェル)し、5% CO2の存在下で37℃において少なくとも2時間インキュベートした。RPMI培地での数回の洗浄により、非接着細胞を除去した後、マクロファージを熱死滅BCGまたは長期凍結乾燥死滅BCG (マクロファージ当たり5等量CFU、例えば両方のBCG調製物について1.6 106 CFU/ml)の存在下で培養した；イー・コリリポ多糖類(LPS；1μl/ml)およびOVA (10μg/ml)を、コントロールとして用いた。細胞培養上清を、種々の調製物の添加後2、4、6、8、12、24、48、72および96時間で回収し、すぐに-20℃で凍結した。
【０１３５】
2) 結果
図11および12に示す結果は：
1) Th1細胞の成熟および抗アレルギー性サイトカイン(IFN-γ)の産生に関与するIL-12が、長期凍結乾燥死滅および熱死滅BCG調製物により賦活化されたBALB/cおよびBP2マウスの肺胞マクロファージにより産生され、
2) 重要な炎症性副作用(壊死、潰瘍・・・)と関連し得るサイトカインであるTNF-αが、熱死滅BCG調製物により賦活化されたBALB/cおよびBP2マウスの肺胞マクロファージによってのみ産生される；本実験で用いた濃度での長期凍結乾燥死滅BCG調製物により賦活化された肺胞マクロファージでは、TNF-αは産生されない
ことを示す。
これらの結果は、熱死滅および生存BCGの注射後に観察される副作用とは反対に、長期凍結乾燥BCGの注射後に観察される最小限の有害反応を支持する。
【０１３６】
実施例5：長期凍結乾燥死滅BCGの投与は、BCG精製蛋白誘導体(PPD)に対する遅延型過敏(DTH)を誘導しない。
1) 材料および方法
実施例3d に記載のようにして、マウスをOVAで免疫化し、種々のBCGの調製物で処理するか、または処理しなかった。種々のBCG調製物での最初の皮下注射後100日で、ヒトでの結核の診断に用いられる、BCG精製蛋白誘導体(PPD)に対する遅延型過敏(DTH)を、マウスの種々の群について行った。より精密には、食塩水中のPPD 50μl (4μg)を、マウスの足踵部に注射し、24時間後に足踵部の膨張を測定した。
【０１３７】
2) 結果
図13に示す結果は、長期凍結乾燥死滅BCG (107 CFUに等しいか、または10μg)で免疫化されたマウスは、陰性の皮膚試験により示されるように、BCG精製蛋白誘導体に対して遅延型過敏を発生しないことを示す。マウスは、大量の投与量の長期凍結乾燥死滅BCG (1 mgおよび10 mg)を注射した後にのみ、PPDに対する感作を少し発生した。比較すると、生存BCGまたは熱死滅BCGで免疫化されたマウスは、低い投与量(生存BCGの107 CFU、または熱不活性化BCGについては108の細菌の死骸に等しい)であっても、陽性の皮膚試験により示されるように、BCG精製蛋白誘導体に対して遅延型過敏を発生する。これらの結果は、特異的賦活化の下で高いレベルのIFN-γの産生を示す他のBCG調製物処理群とは反対に、長期凍結乾燥死滅BCG処理群で、特異的刺激の下に少量のIFN-γの産生を示す、先行する結果(図9および21)に相関する。同様に、PPDに対するモルモットの反応性は、長期凍結乾燥死滅BCG処理後に下限ぎりぎりである。
【０１３８】
これらの結果は、長期凍結乾燥死滅BCGでの免疫化に続いて、特異的Tリンパ球の特定のサブタイプが選択されるか、または代わりに特異的T細胞がある特定の組織に固定化されることを示す。結果として、生存BCGまたは熱死滅BCGでの免疫化とは反対に、長期凍結乾燥死滅BCGでの免疫化は、DTH皮膚試験による結核の診断を妨げない。
【０１３９】
実施例6：モルモットモデルにおける、喘息に対する長期凍結乾燥(EFD)死滅マイコバクテリアの防御的効果
1) 材料および方法
雄の成体モルモット(350 g)を、食塩水(最終容量0.4 ml)中のオボアルブミン(OVA；ICN Laboratories) 10μgおよびミョウバン1 mgで皮下経路により免疫化した。
3週間後、該モルモット(10動物の群を3つ)に、長期凍結乾燥死滅BCG (107または108 CFU等量、すなわち10μgまたは100μg)、またはPBS (コントロール)のいずれかを皮内に注射した。
【０１４０】
気管支肺の反応性を、マウスに用いたのとは異なる方法で、モルモットについて分析する；各動物の敏感度を、アレルゲン攻撃の24時間前の、エアロゾル投与されたヒスタミンの増加する投与量(20、50、100または400μg)で評価し、上昇したPenh値を与えるヒスタミンの最高濃度を、ヒスタミンへの敏感度の基礎のレベルとみなした。
アレルゲン攻撃の24時間後に、同様の測定を行った；OVA免疫化モルモットは、ヒスタミン形質転換細胞のより高い敏感度を発生し、よって、同じPenh値を得るのに、攻撃の前よりも少ないヒスタミンが必要である。
【０１４１】
より精密には：
各群の6匹のモルモットを、BCGまたはコントロール物質の注射の後7〜10週間(例えばオボアルブミンの免疫化後10〜13週間)で行うヒスタミン試験で、その気管支肺の反応性について試験する。
気圧体積変動記録器を用いて、各モルモットについて明確な気管支収縮を誘発するヒスタミンの投与量を測定する。
基礎の反応性を、試験の第1日目に測定することがわかっているので、各モルモットはそれ自身のコントロールである。
24時間後、オボアルブミンエアロゾルを投与する。第3日にヒスタミン反応性を再び測定する。
オボアルブミンの投与は、ヒスタミンへの気管支肺反応亢進を増大させる。
【０１４２】
2) 結果
図14に示す結果は、それぞれ本発明の長期凍結乾燥死滅BCG 10μg (107 CFU 等量) (図14B)または100μg (108 CFU等量) (図14C)で処理した5/6および6/6のモルモットが、気管支肺反応亢進に対して防御されている(ヒスタミン感作の増加がない)が、コントロール群(図14A) (BCGでの処理なし)では、ヒスタミンへの気管支肺反応亢進がかなり増加している(×4)。
【０１４３】
実施例7：長期凍結乾燥死滅BCGの最小限の副作用
a) 貧血および血小板減少がない
マウスに、長期凍結乾燥死滅BCG (10μg)もしくは実施例3dに記載のような種々のBCG調製物を静脈内に注射するか、または処理しなかった。注射後18日で、血液サンプルからの赤血球および血小板の数を測定した。
図22に示す結果は、生存BCGおよび熱死滅BCG処理群とは反対に、長期凍結乾燥BCG処理群では貧血も血小板減少も観察されなかったことを示す。
【０１４４】
b) 注射部位での最小限の炎症反応
第0日に、実施例3dに記載のような種々のBCG調製物をマウスの群に皮下注射した(足踵部の領域に)。生存BCGは1回のみ注射し、熱死滅および長期凍結乾燥死滅BCGは2回(第0日および第36日)注射した。こうして、足踵部の増大を10週間にわたって毎週測定した。
図23に示す結果は、長期凍結乾燥死滅BCGが、最小限の炎症性副作用を発現することを示す。
【０１４５】
c) LPS 賦活化後の減少されたTNF-αの産生
上述したような種々のBCG調製物で18日前に処理したマウスからの肺の外植片を、インビトロでLPSの存在下または非存在下に維持し、TNF-αの産生を、製造業者の使用説明書に従って市販のキットを用いてELISAにより測定した。図24に示す結果は、生存BCGおよび熱死滅BCG処理とは反対に、長期凍結乾燥死滅BCG処理はマクロファージの産生および／または活性化を誘導しない。
【０１４６】
実施例8：長期凍結乾燥死滅BCGの皮下注射後の、流入領域リンパ節および脾臓での細胞の分析
1) 材料および方法
実施例3dに記載のような種々のBCG調製物で皮下経路により48時間前に処理されたマウスの流入領域リンパ節に存在する細胞を、種々の蛍光色素で標識された、種々の白血球集団の細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体を用いて、フローサイトメトリーにより分析した。
長期凍結乾燥死滅BCGで皮下経路により処理されたマウスの脾臓に存在する細胞を、OVAもしくはBCG培養物上清の存在下でインビトロにて賦活化するか、または賦活化しなかった後に、上記のようにして分析した。
【０１４７】
2) 結果
a) 流入領域リンパ節
流入領域リンパ節に存在する細胞の分析は、生存BCGおよび熱死滅BCG処理群と比較すると、リンパ節に存在する細胞は、長期凍結乾燥死滅BCGの皮下注射の48時間後に、3〜5倍の数であったことを示す。長期凍結乾燥死滅BCGの注射後4日での種々の白血球集団の動力学的分析は、48時間での樹上細胞 (CD11c+)数の一過性の増加とともに、6時間〜96時間でのB220+およびCD4+リンパ球の数の増加を示す。
【０１４８】
b) 脾臓
脾臓に存在する細胞の分析は：
− 長期凍結乾燥処理群における、CD11c+ Gr1+ B220+形質細胞様樹状細胞の数のかなりの増加、同じ群でCD8α+細胞の数の増加は観察されなかった(図25)。
− インビトロでOVAもしくはBCG培養物上清で賦活化するか、または賦活化しなかったいずれの長期凍結乾燥処理群におけるCD4+ CD25+ IL-10+細胞の数のかなりの増加(図26)を示す。
【０１４９】
結果は、喘息のマウスモデルにおいて、長期凍結乾燥死滅BCGは、アレルゲン(OVAまたは水溶性レイグラス花粉)に予め感作されたマウスにおいて、免疫調節細胞(CD11c+ Gr1+ B220+形質細胞様樹状細胞)を誘導するか、またはそれ自身が免疫調節細胞である(CD4+ CD25+ IL-10+細胞)細胞の数のかなりの増加を誘発することができ、これが喘息の症状に対する防御的効果となる。
【０１５０】
実施例9：経口経路による長期凍結乾燥死滅BCGは、活性である
実施例3dに記載のようにして、予めOVAで免疫化されたマウスを、第42、44、46および62、64ならびに66日に長期凍結乾燥1 mgで経口的に処理したか、または処理せずに、次いで第96日にOVAで攻撃したか、またはしなかった。長期凍結乾燥死滅BCGの防御的効果を、実施例3に記載のようにして肺細胞浸潤の計数により評価した。
結果は、未処理の群と比較すると、長期凍結乾燥死滅BCG処理群の肺の全細胞数の有意な減少p＜0.001を示す(図27)。白血球集団の分析は、処理群の肺でのマクロファージ、多核および樹状細胞の数のかなりの減少を示す。
【０１５１】
実施例10：長期凍結乾燥死滅BCGの有効投与量、投与のリズム、作用の持続期間および遅延の測定
長期凍結乾燥死滅BCGを、予め免疫化したマウスに皮下経路により注射し、次いでOVAで攻撃し、そしてその活性を、実施例3に記載のようにして試験した。
【０１５２】
a) 有効投与量および投与回数
成体のマウスをOVAで第0および7日に感作し、第45日に1回、または第45および65日の2回、長期凍結乾燥死滅BCGで皮下経路により注射して、次いで第96日にオボアルブミンで攻撃した。長期凍結乾燥死滅BCGの活性を、実施例3に記載のようにして、喘息のBP2モデルの気管支肺反応亢進の予防により試験した。
最少の投与量(10μg)は活性であり、100μgより多い投与量は、活性を増加させなかった。
防御的効果は、長期凍結乾燥死滅BCGの1回の投与量(10μg)のみで観察された(図28)。
【０１５３】
b) 長期凍結乾燥死滅BCGの作用の遅延
時間列を決定して長期凍結乾燥死滅BCGの効率を得るために、成体のマウス(群当たり6匹)を、第0および7日にOVAで感作し、第14日に長期凍結乾燥死滅BCG 100μgを皮下注射し、次いで第21、28または35日にOVAで攻撃した。長期凍結乾燥死滅BCGの活性を、実施例3に記載のようにして、喘息のBP2モデルの気管支肺反応亢進の予防により試験した。
【０１５４】
気管支肺反応亢進の予防は、長期凍結乾燥死滅BCGの投与と、攻撃との間に2〜3週間の遅延が存在すれば、起こる(図29)；この結果は、長期凍結乾燥死滅BCGが活性になる前に、所定の細胞集団の漸加および増殖が必要であることを示す。この結果は、マウスを喘息から防御するには、長期凍結乾燥死滅BCGの1回の投与量で充分であることも確認する。
【０１５５】
c) 長期凍結乾燥死滅BCGの作用の持続期間
長期凍結乾燥死滅BCGの作用の持続期間の測定のために、成体のマウス(群当たり6匹)を、第0および7日にOVAで感作し、第45および65日に長期凍結乾燥死滅BCG 100μgを皮下注射し、次いで第96または42日にOVAで攻撃した。長期凍結乾燥死滅BCGの活性を、喘息のBP2モデルにおける気管支肺反応亢進への防御的効果、および肺細胞浸潤の計数により、実施例3に記載のようにして評価した。
結果は、長期凍結乾燥死滅BCGの防御的効果が少なくとも2ヶ月持続することを示す(図30)。
【０１５６】
d) 長期凍結乾燥BCGの投与の、防御的プロトコルに対する治療的なプロトコル
上に示すような、これまでの結果は、「治療的プロトコル」(アレルゲン免疫化の後の投与)における長期凍結乾燥死滅BCGの効力を実証している。よって、予防的プロトコルにおける長期凍結乾燥死滅BCGの効力を評価するために、マウスを次のようにして処理した：
【０１５７】
−成体のマウス(6〜7週齢、群当たり6匹のマウス)に、OVA免疫化の前の14、21または28日(第-14、-21および-28日)に長期凍結乾燥死滅BCG (100μg)で皮下注射し、OVAで第0および7日に免疫化し、次いで第14日にOVAで攻撃した。
【０１５８】
−新生児のマウス(7〜8日齢、群当たり6〜8匹のマウス)に、OVA免疫化の前の56日(第-56日)に長期凍結乾燥死滅BCG (100μg)を皮下または鼻腔内に注射し、OVAで第0および7日に免疫化し、次いで第14日にOVAで攻撃した。
【０１５９】
予防的プロトコルにおける長期凍結乾燥死滅BCGの活性を、実施例3に記載のようにして、喘息のBP2モデルにおける気管支肺反応亢進への防御的効果により評価した。
【０１６０】
成体のマウスでの結果は、調製物が感作の数日前(2週間〜3週間)に注射された場合にのみ、予防的プロトコルにおける、長期凍結乾燥BCGの防御的効果を示す。
新生児のマウスでの結果は、皮下投与でのみ、予防的プロトコルにおける、長期凍結乾燥BCGの防御的効果を示す；鼻腔経路は、これらの条件下では活性に乏しい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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