(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一定の割合の光合成細菌、バキッルス、酵母菌、乳酸桿菌、放線菌で構成され、
前記光合成細菌はロドシュードモナス・パルストリスであり、前記バキッルスは枯草菌であり、前記酵母菌はビール酵母であり、前記乳酸桿菌は好酸性乳酸桿菌であり、前記放線菌はストレプトマイセス・▲けい▼陽であり、
全体積に対する各組成成分の含有量は、それぞれ光合成細菌６〜１３％、バキッルス１１〜１７％、酵母菌２５〜３４％、乳酸桿菌３３〜４４％、放線菌４〜９％であることを特徴とする糖尿病治療用複合微生物製剤。
【請求項２】
請求項１記載の糖尿病治療用複合微生物製剤を製造する方法であって、
光合成細菌、バキッルス、酵母菌、乳酸桿菌と放線菌が一次複合発酵工程と、二次複合発酵工程とを行う工程を含み、
前記一次複合発酵工程は、前記光合成細菌、バキッルス、酵母菌、乳酸菌、放線菌をそれぞれに一次培地に接種して一次培養を行い、各組成成分の一次菌を得る工程（１）と、
前記各組成成分の一次菌をそれぞれ二次培地に接種して、前記光合成細菌は間欠的な通気培養を行い、前記バキッルスは通気培養を行い、前記酵母菌は通気培養を行い、前記乳酸菌は嫌気培養を行い、前記放線菌は通気培養を行い、各組成成分の発酵菌液を得る工程（２）と、
前記各組成成分の発酵菌液を複合し、一次複合菌を得る工程（３）とを含み、
前記二次複合発酵工程は、前記一次複合菌に無菌水を入れて２〜４倍に希釈し、そして、全体積に対して、植物性乳酸桿菌１０〜２０％、好酸性乳酸桿菌１０〜２０％、ビール酵母１０〜２０％、黒砂糖５〜１５％を更に追加して均一に混合して、発酵装置中で複合し、無菌・気密状態で発酵させ、培養ｐＨ５〜８、培養温度２５℃〜３５℃で２〜３日間培養し、二次複合菌を得る工程であることを
特徴とする糖尿病治療用複合微生物製剤の製造方法。
【請求項３】
糖尿病治療用薬物製造における、請求項１記載の糖尿病治療用複合微生物製剤又は請求項２記載の製造方法により得られた糖尿病治療用複合微生物製剤の利用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物技術分野に関し、特に、糖尿病治療用複合微生物製剤及びその製造方法、並びに糖尿病治療用薬物の製造における利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病とは、ヒトのインスリンの分泌や利用の異常などの原因で、血液中のブドウ糖（単糖の一種）の濃度が高い状態が長く続く病気であり、多発且つ生涯に渡る疾患である。世界保健機関（ＷＨＯ）の調査によれば、現在世界中の糖尿病患者が約１.６億人であるが、そのうち、中国の患者数は６０００万人あまりで、世界の糖尿病患者の１/３を占める。統計によると、糖尿病による失明の可能性は普通人の１０〜２３倍、壊疽と四肢切断の可能性は普通人の２０倍、腎不全の可能性は普通人の１７倍、冠動脈疾患と脳卒中の可能性は普通人の２〜３倍、急死の可能性は普通人の３〜８倍であるので、世界保健機関は、できるだけ早めに糖尿病を治療し、糖尿病合併症の減少に力を入れるというように呼びかけた。
【０００３】
糖尿病の薬物療法としては、インスリン注射、経口血糖降下薬と漢方薬療法が挙げられるが、現在、生物学的治療法までに発展している。中国特許９９１０５６２１の「糖尿病治療用薬物」は、単種の微生物菌株の代謝物からの抽出液で糖尿病治療用薬物を製造することを開示したものである。中国特許００８０４９９９の「糖尿病治療用薬物」は、生理学的に許容可能な微生物や動物由来の酵素混合物に関する。中国特許０１１３０４５０の「生物学的血糖降下製剤」は、放線菌、乳酸菌と酵母菌の三種微生物から構成され、従来の活性化、拡大培養、発酵、濾過、除渣、除菌、冷凍乾燥などの方法を利用して製成したものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、上記のような治療法には、依然として様々な問題点が存在している。西洋薬で糖尿病を治療することは、高価である一方、副作用もあるし、且つ対症療法のみで、根治療法にならない。逆に、漢方の場合は、血糖降下までに時間がかかり、短時間で効果が見えない。しかし、生物学的技術の利用により前記両者の不足を克服できる。中国特許９９１０５６２１の「生物的な血糖降下製剤」は単一菌種であるので、治療効果も単一である。また、中国特許００８０４９９９に記載された薬物は糖尿病補助治療に用いられる酵素製剤である。中国特許０１１３０４５０に記載された生物的な血糖降下製剤は、放線菌、乳酸菌と酵母菌の三種微生物から構成されたものであるが、簡単な混合物に過ぎなく、それぞれ細菌の配合比も明示されていないし、且つ一定の臨床検証もないため、製剤の臨床効果はまだ評価できない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、光合成細菌、バキッルス、酵母菌、乳酸桿菌、放線菌を含む多様なプロバイオティクス成分から構成される糖尿病治療用複合微生物製剤を提供することを目的とする。
【０００６】
そのうち、各組成成分が全体積に対して、それぞれの含有量は、光合成細菌６〜１３％、バキッルス１１〜１７％、酵母菌２５〜３４％、乳酸桿菌３３〜４４％、放線菌４〜９％である。
【０００７】
前記光合成細菌はロドシュードモナス・パルストリス(ＲＨｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ)であり、前記バキッルスは枯草菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ)であり、前記酵母菌はビール酵母(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)であり、前記乳酸桿菌は好酸性乳酸桿菌(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ)であり、前記放線菌はストレプトマイセス・▲けい▼陽(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｊｉｎｇｙａｎｇｅｓｉｓ)である。
【０００８】
本発明の第２の目的は光合成細菌、バキッルス、酵母菌、乳酸桿菌と放線菌の一次複合発酵工程と二次複合発酵工程を含む糖尿病治療用複合微生物製剤の製造方法を提供することにある。
【０００９】
前記一次複合発酵工程は、
光合成細菌、バキッルス、酵母菌、乳酸菌、放線菌の母種を各々に一次培地に接種して一次培養を行い、一次菌種を得る工程（1）と、
光合成細菌、バキッルス、酵母菌、乳酸菌、放線菌の一次菌種をそれぞれに二次培地に接種して二次培養を行い、発酵菌液を得る工程（２）と、
各発酵菌液を所定の割合で均一的に混合して、一次複合菌を得る工程（３）とを含む。
【００１０】
そのうち、前記工程（１）において、光合成細菌の場合は、一次培養の際に接種量を０.５〜１％、好ましくは０.５％にし、培養ｐＨ６〜１０、培養温度２８℃〜３６℃、照度３０００〜４０００ルクスで７〜１０日間培養する。また、バキッルスの場合は、一次培養の際に接種量を０.５〜１％、好ましくは０.５％にし、培養ｐＨ６〜８、培養温度２８℃〜３４℃で２〜３日間培養する。酵母菌の場合は、一次培養工程の際に接種量を０.５〜１％、好ましくは０.５％にし、培養ｐＨ４〜７、培養温度２５℃〜３０℃で１〜２日間培養する。乳酸菌の場合は、一次培養の際に接種量を０.５〜１％、好ましくは０.５％にし、培養ｐＨ６〜８、培養温度２８℃〜３４℃で２〜５日間培養する。放線菌の場合は、一次培養の際に接種量を０.５〜１％、好ましくは０.５％にし、培養ｐＨ６〜８、培養温度２７℃〜３２℃で５〜７日間培養する。
【００１１】
前記工程（２）において、光合成細菌の場合は、二次培養の際に間欠的な通気培養を実施し、接種量を５〜１５％、好ましくは１０％にし、培養ｐＨ６〜１０、培養温度２８℃〜３６℃、照度３０００〜４０００ルクスで７〜１０日間培養する。また、バキッルスの場合は、二次培養の際に通気培養を実施し、接種量を５〜１５％、好ましくは１０％にし、培養ｐＨ６〜８、培養温度２８℃〜３２℃で２〜５日間培養する。酵母菌の場合は、二次培養の際に通気培養を実施し、接種量を５〜１５％、好ましくは１０％にし、培養ｐＨ４〜７、培養温度２５℃〜３０℃で１〜２日間培養する。乳酸菌の場合は、二次培養の際に嫌気培養を実施し、接種量を５〜１５％、好ましくは１０％にし、培養ｐＨ６〜８、培養温度２８℃〜３４℃で２〜５日間培養する。放線菌の場合は、二次培養の際に通気培養を実施し、接種量を５〜１５％、好ましくは１０％にし、培養ｐＨ６〜８、培養温度２７℃〜３２℃で５〜７日間培養する。
【００１２】
また、前記二次複合発酵の工程は、以下のように、二次複合菌を得る工程と、二次複合菌液の検査工程とを含む。
二次複合菌を得る工程において、まず、前記一次複合菌に無菌水を入れて２〜４倍に希釈し、そして、全体積に対して、植物性乳酸桿菌１０〜２０％、好酸性乳酸桿菌１０〜２０％、ビール酵母１０〜２０％、黒砂糖５〜１５％を添加して均一的に混合し、発酵装置中で複合して、無菌・気密状態で発酵を行い、培養温度２５℃〜３５℃、培養ｐＨ５〜８で２〜３日間培養し、二次複合菌を得る。
また、二次複合菌液の検査工程において、二次複合菌液の試料に対して検査を行う。液体状態、均一の色沢、また特別な微生物発酵においの有無に対して簡単に評価し、続いて、ｐＨ計でｐＨを測定し、ｐＨ５〜８の範囲内であれば正常値である。そして、平板計数法を用いて生菌数と雑菌数を測定するが、生菌総数が５×１０８ｃｆｕ/ｇより大きい、また雑菌率が≦５％であれば、前記二次複合菌液は合格品である。
【００１３】
本発明の第３の目的は、糖尿病治療用薬物製造における前記糖尿病治療用複合微生物製剤の利用を提供することにある。糖尿病患者に本発明の糖尿病治療用複合微生物製剤を服用させ、一日三回、一回２０ｍｌ、１５日の一連の治療３回を行うことにより、服用後の有効率は８０％以上になり、血糖値は正常に戻る。
【００１４】
本発明の要点は以下通りである。
１．本発明に係る糖尿病治療用複合微生物製剤の組成成分において、光合成細菌とバキッルスは微生物生態バランスを調整する機能を持ち、酵母菌は多様な蛋白質、ビタミンＢ類、核酸とミネラルを含有するため、人体の代謝機能をコントロールでき、乳酸桿菌は動物体内で血清コレステロールの低下、内毒素のコントロール、腸管内の腐敗菌抑制、機体免疫力の向上などの多くの生理学的機能を発揮でき、放線菌は抗生物質を生成できる。
２．光合成細菌、バキッルス、酵母菌、乳酸桿菌、放線菌などの多様なプロバイオティクスを所定の割合で配合し、二回の複合発酵によって、本発明の糖尿病治療用複合微生物製剤を製造する。
３．発酵により生成された多様な有益な生物調節因子、アミノ酸、抗生物質及び各複合微生物の活性タンパクと活性酵素製剤の協同作用を利用することで、本発明の糖尿病治療用複合微生物製剤を糖尿病治療用薬物の製造に用いる。本発明の糖尿病治療用複合微生物製剤はヒトの代謝機能を迅速に調節し、ランゲルハンス島細胞群を修復・再結合し、血液中の過剰な糖質を転換し、損傷されたランゲルハンス島β細胞への負担を軽減し、損傷されたランゲルハンス島の機能を徐々に回復でき、また、微小循環灌流を改善し、安定な体内環境を維持し、生体のバランスを保ち、代謝紊乱と崩れたバランスを整え、根元より糖尿病及びその合併症を治すことができる。これにより、糖尿病患者の生活品質が高められ、長期的に西洋薬の服用、過酷な食事制限という臨床弊害を解消できる。また、本発明の糖尿病治療用複合微生物製剤は、コストが低い、効果が早い、口当たりが良い、利用する際の食事制限不要などのメリットがあり、病気を徹底的に治療できる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の糖尿病治療用複合微生物製剤の主な効果は以下通りである。
１．ランゲルハンス島細胞集団の修復・再結合、血液中の過剰な糖質の転換、損傷されたランゲルハンス島β細胞への負担軽減、修復因子の活性化、損傷されたランゲルハンス島機能の回復、合併症の抑制、自身免疫力の向上、微生物生態循環の促進などの効果があり、最終的にランゲルハンス島機能の完全回復により徹底的に健康に戻って、病気を完治できる。
【００１６】
２．新陳代謝の調節により総合的に血糖を調節し、全体的に患者の生体機能を調整する。一方、患者自身機能を引き出すことにより、血糖値を正常値に戻すように調節し、人体自身の血糖調節機能を回復する。
【００１７】
３．微小循環灌流を改善して細胞の酸素・血液供給を促進し、また、血液灌流を促進して組織の血流量を増加することにより、糖尿病微小血管合併症の治療と予防ができ、糖尿病の致命的なリスクを減少できる。
【００１８】
４．神経伝導速度を向上して肢端の温度を高めることにより、糖尿病患者の肢端の痒みと痛みを改善し、壊疽と四肢切断の発生を予防することができる。
【００１９】
５．糖尿病性神経障害患者の睡眠を改善し、頑固な不眠及び脱力、精力不振などの症状を改善することができる。
【００２０】
６．糖尿病性胃腸神経機能の紊乱による下痢、便秘などの病症、及び糖尿病による高血圧を改善することができる。
【００２１】
７．人体の安定な内環境を維持し、生体のバランスを保ち、代謝の紊乱と崩れたバランスを整えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】一次複合発酵のフローチャートである。
【図２】二次複合発酵のフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明を限定するものではない。
【００２４】
〈各菌種の培地〉
ロドシュードモナス・パルストリスの一次培地は以下通りに作成する。ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １．０ｇ、ＮａＨＣＯ３  ５．０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．５ｇ、ＮａＣｌ  ０．２ｇ、ペプトン１．５ｇを４００ｍｌの蒸留水に溶かして、Ｈ３ＰＯ４とＮａ２ＣＯ３を用いてｐＨ  ７．１に調整し、そして、１０００ｍｌまで蒸留水を加え、１１５℃で１０分間滅菌することにより、一次培地を作成する。また、ロドシュードモナス・パルストリスの二次培地は以下の通りに作成する。Ｎａ２ＣＯ３  ３ｇ、ＮａＣｌ  ０．１ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．３ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ３  ０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ３  ０．３ｇ、クエン酸アンモニウム鉄７ｍｌ、ペプトン１．２ｇを配合して、蒸留水を用いて１０００ｍｌにメスアップし、更にＨ３ＰＯ４とＮａ２ＣＯ３を用いてｐＨ  ７．２に調整することにより、二次培地を作成する。
【００２５】
枯草菌の一次培地は、牛肉エキス  ３ｇ、ペプトン  １０ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇの配合物に蒸留水を加えて１０００ｍｌにメスアップし、且、ｐＨ  ７．０に調整することにより作成される。二次培地は、牛肉エキス  １０ｇ、ペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇの配合物に蒸留水を加えて１０００ｍｌにメスアップし、且、ｐＨ  ７．０に調整することにより作成される。
【００２６】
ビール酵母の一次培地は、じゃがいも汁  ８００ｍｌ、ブドウ糖  ２０ｇ、寒天  ２０ｇの配合物に蒸留水を用いて１０００ｍｌにメスアップし、且、ｐＨ  ６．０に調整することにより作成される。二次培地は、酵母エキス  １０ｇ、ペプトン  ２０ｇ、ブドウ糖２０ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．６ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ２．５ｇの配合物に水で１０００ｍｌにメスアップし、且、ｐＨ  ６．０に調整することにより作成される。
【００２７】
好酸性乳酸桿菌の一次培地は、ＫＮＯ３  １ｇ，可溶性澱粉  １０ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４  ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．５ｇ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４  ０．０１ｇ、寒天  ２０ｇの配合物に蒸留水を用いて１０００ｍｌにメスアップし、且、ｐＨ  ７．２に調整することにより作成される。二次培地は、ＫＮＯ３  ０．８ｇ、可溶性澱粉  ８ｇ、ブドウ糖  ５ｇ、酵母液  ５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．３ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．２ｇ、ＮａＣｌ  ０．４ｇ、ＦｅＳＯ４  ０．０５ｇの配合物に蒸留水を用いて１０００ｍｌにメスアップし、且、ｐＨ  ７．２に調整することにより作成される。
【００２８】
ストレプトマイセス・▲けい▼陽の一次培地はＫＮＯ３  １ｇ、可溶性澱粉  ２０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．５ｇ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４  ０．０１ｇ、寒天  ２０ｇの配合物に蒸留水を用いて１０００ｍｌにメスアップし、且、ｐＨ７．２に調整することにより作成される。二次培地は、ＫＮＯ３  ０．８ｇ、可溶性澱粉  ８ｇ、ブドウ糖  ５ｇ、酵母液５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．３ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．２ｇ、ＮａＣｌ  ０．４ｇ、ＦｅＳＯ４  ０．０５ｇの配合物に蒸留水を用いて１０００ｍｌにメスアップし、且、ｐＨ  ７．２に調整することにより作成される。
【実施例１】
【００２９】
［複合微生物製剤の製造方法］
〈一次複合発酵〉
（一）  一次培地での培養
ナス形フラスコに入れた３００ｍｌのロドシュードモナス・パルストリスを、６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種し、培養ｐＨ６、培養温度２８℃、照度３０００ルクスで１０日間培養し、ロドシュードモナス・パルストリスの一次菌（一次接種菌）が得られた。
【００３０】
ナス形フラスコに入れた３００ｍｌの枯草菌を、６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種し、培養ｐＨ６、培養温度２８℃で３日間培養し、枯草菌の一次菌が得られた。
【００３１】
ナス形フラスコに入れた３００ｍｌのビール酵母を、６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種し、培養ｐＨ４、培養温度２５℃で２日間培養し、ビール酵母の一次菌が得られた。
【００３２】
ナス形フラスコに入れた３００ｍｌの好酸性乳酸桿菌を、６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種し、培養ｐＨ６、培養温度２８℃で５日間培養し、好酸性乳酸桿菌の一次菌が得られた。
【００３３】
ナス形フラスコに入れた３００ｍｌのストレプトマイセス・▲けい▼陽を、６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種して、培養ｐＨ６、培養温度２７℃で７日間培養し、ストレプトマイセス・▲けい▼陽の一次菌が得られた。
【００３４】
（二）  二次培地での培養
ロドシュードモナス・パルストリスの一次菌６０Ｌを、６００Ｌの当該菌種の二次培地に接種し、間欠的に通気培養を行い、培養ｐＨ６、培養温度２８℃、照度３０００ルクスで１０日間培養し、ロドシュードモナス・パルストリスの発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、ロドシュードモナス・パルストリス菌の生菌数が５×１０８〜１０×１０８個であることが分かった。
【００３５】
枯草菌の一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌の二次培地に接種し、通気培養を行い、培養ｐＨ６、培養温度２８℃で３日間培養し、枯草菌の発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、枯草菌の生菌数が３０×１０８〜５０×１０８個であることが分かった。
【００３６】
ビール酵母の一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌の二次培地に接種し、通気培養を行い、培養ｐＨ４、培養温度２５℃で２日間培養することにより、ビール酵母の発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、ビール酵母の生菌数が５×１０８〜１０×１０８個であることが分かった。
【００３７】
好酸性乳酸桿菌の一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌の二次培地に接種し、静置状態で嫌気培養を行い、培養ｐＨ６、培養温度２８℃で５日間培養し、好酸性乳酸桿菌の発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、好酸性乳酸桿菌の生菌数が２０×１０８〜３０×１０８個であることが分かった。
【００３８】
ストレプトマイセス・▲けい▼陽の一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌の二次培地に接種し、通気培養を行い、培養ｐＨ６、培養温度２７℃で７日間培養し、ストレプトマイセス・▲けい▼陽の発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、ストレプトマイセス・▲けい▼陽の生菌数が３０×１０８〜５０×１０８個であることが分かった。
【００３９】
（三）  混合複合
各組成成分の発酵菌液を、全体積に対して、ロドシュードモナス・パルストリス  １０％、枯草菌  １０％、ビール酵母  ３０％、好酸性乳酸桿菌  ４５％、ストレプトマイセス・▲けい▼陽  ５％の割合で、１０００Ｌの発酵装置中で均一に混合して複合を行い、一次複合菌１０００Ｌが得られた。
【００４０】
〈二次複合発酵〉
一次複合菌１０００Ｌに無菌水２４５０Ｌを入れて希釈し、そして、植物性乳酸桿菌１５０Ｌ、好酸性乳酸桿菌１５０Ｌ、ビール酵母１５０Ｌ、黒砂糖１００Ｌを更に追加して均一に混合し、発酵装置中で複合して、無菌・気密状態で発酵を行って、培養ｐＨ７、培養温度３０℃で３日間培養し、二次複合菌４０００Ｌが得られた。
【００４１】
検査を行った結果、得られた複合菌において、生菌総数が２０×１０８〜３０×１０８個であることが分かった。そのうち、ロドシュードモナス・パルストリスは総数の８%、枯草菌は１２%、ビール酵母は３２%、好酸性乳酸桿菌は４４%、ストレプトマイセス・▲けい▼陽は４%をそれぞれ占める。
【実施例２】
【００４２】
［複合微生物製剤の製造方法］
〈一次複合発酵〉
（一）  一次培地での培養
ナス形フラスコに入れた５００ｍｌのロドシュードモナス・パルストリスを６０Ｌの当該菌の一次培地に接種し、培養ｐＨ８、培養温度３２℃、照度３５００ルクスで８日間培養することにより、ロドシュードモナス・パルストリスの一次菌が得られた。
【００４３】
ナス形フラスコに入れた５００ｍｌの枯草菌を６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種し、培養ｐＨ７、培養温度３２℃で２日間培養し、枯草菌の一次菌が得られた。
【００４４】
ナス形フラスコに入れた５００ｍｌのビール酵母を６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種し、培養ｐＨ５、培養温度２８℃で１日間培養し、ビール酵母の一次菌が得られた。
【００４５】
ナス形フラスコに入れた５００ｍｌの好酸性乳酸桿菌を６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種し、培養ｐＨ７、培養温度３２℃で３日間培養し、好酸性乳酸桿菌の一次菌が得られた。
【００４６】
ナス形フラスコに入れた５００ｍｌのストレプトマイセス・▲けい▼陽を６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種し、培養ｐＨ７、培養温度３０℃で６日間培養し、ストレプトマイセス・▲けい▼陽の一次菌が得られた。
【００４７】
（二）  二次培地での培養
ロドシュードモナス・パルストリスの一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌種の二次培地に接種し、間欠的に通気培養を行い、培養ｐＨ８、培養温度３２℃、照度３５００ルクスで８日間培養し、ロドシュードモナス・パルストリスの発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、ロドシュードモナス・パルストリスの生菌数が５×１０８〜１０×１０８個であることが分かった。
【００４８】
枯草菌の一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌の二次培地に接種し、通気培養を行い、培養ｐＨ７、培養温度３２℃で２日間培養することにより、枯草菌の発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、枯草菌の生菌数は３０×１０８〜５０×１０８個であることが分かった。
【００４９】
ビール酵母の一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌種の二次培地に接種し、通気培養を行い、培養ｐＨ５、培養温度２８℃で１日間培養し、ビール酵母の発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、ビール酵母の生菌数が５×１０８〜１０×１０８個であることが分かった。
【００５０】
好酸性乳酸桿菌の一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌二次培地に接種し、静置状態で嫌気培養を行い、培養ｐＨ７、培養温度３２℃で３日間培養することにより、好酸性乳酸桿菌の発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、好酸性乳酸桿菌の生菌数が２０×１０８〜３０×１０８個であることが分かった。
【００５１】
ストレプトマイセス・▲けい▼陽の一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌の二次培地に接種し、通気培養を行い、培養ｐＨ７、培養温度３０℃で６日間培養し、ストレプトマイセス・▲けい▼陽の発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、ストレプトマイセス・▲けい▼陽の生菌数が３０×１０８〜５０×１０８個であることが分かった。
【００５２】
（三）  混合複合
各組成成分の発酵菌液を全体積に対して、ロドシュードモナス・パルストリス  ５%、枯草菌  １４%、ビール酵母  ３２%、好酸性乳酸桿菌  ４１%、ストレプトマイセス・▲けい▼陽  ８%の割合で、１０００Ｌの発酵装置中で均一に混合して複合を行い、一次複合菌が１０００Ｌ得られた。
〈二次複合発酵〉
【００５３】
一次複合菌１０００Ｌに無菌水２４５０Ｌを入れて希釈し、そして、植物性乳酸桿菌１００Ｌ、好酸性乳酸桿菌１００Ｌ、ビール酵母１００Ｌ、黒砂糖５０Ｌを更に追加して均一的に混合し、発酵装置中で複合して、無菌・気密状態で発酵を行って、培養ｐＨ７、培養温度２５℃で２日間培養し、二次複合菌が３５００Ｌ得られた。
【００５４】
検査を行った結果、得られた複合菌において、生菌総数が２０×１０８〜３０×１０８個であることが分かった。そのうち、ロドシュードモナス・パルストリスは総数の６%、枯草菌は１５%、ビール酵母は３３%、好酸性乳酸桿菌は４２%、ストレプトマイセス・▲けい▼陽は４%をそれぞれ占める。
【実施例３】
【００５５】
［複合微生物製剤の製法］
〈一次複合発酵〉
（一）  一次培地での培養
ナス形フラスコに入れた６００ｍｌのロドシュードモナス・パルストリスを６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種して、培養ｐＨ１０、培養温度３６℃、照度４０００ルクスで７日間培養し、ロドシュードモナス・パルストリスの一次菌が得られた。
【００５６】
ナス形フラスコに入れた６００ｍｌの枯草菌を６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種し、培養ｐＨ８、培養温度３４℃で２日間培養し、枯草菌の一次菌が得られた。
【００５７】
ナス形フラスコに入れた６００ｍｌのビール酵母を６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種し、培養ｐＨ７、培養温度３０℃１日間培養し、ビール酵母の一次菌が得られた。
【００５８】
ナス形フラスコに入れた６００ｍｌの好酸性乳酸桿菌を６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種し、培養ｐＨ８、培養温度３４℃で２日間培養し、好酸性乳酸桿菌の一次菌が得られた。
【００５９】
ナス形フラスコに入れた６００ｍｌのストレプトマイセス・▲けい▼陽を６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種し、培養ｐＨ８、培養温度３２℃で５日間培養し、ストレプトマイセス・▲けい▼陽の一次菌が得られた。
【００６０】
（二）  二次培地での培養
ロドシュードモナス・パルストリスの一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌種の二次培地に接種し、間欠的に通気培養を行い、培養ｐＨ１０、培養温度３６℃、照度４０００ルクスで７日間培養し、ロドシュードモナス・パルストリスの発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、ロドシュードモナス・パルストリスの生菌数が５×１０８〜１０×１０８個であることが分かった。
【００６１】
枯草菌の一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌種の二次培地に接種し、通気培養を行い、培養ｐＨ８、培養温度３４℃で２日間培養し、枯草菌の発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、枯草菌の生菌数が３０×１０８〜５０×１０８個であることが分かった。
【００６２】
ビール酵母の一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌種の二次培地に接種し、通気培養を行い、培養ｐＨ７、培養温度３０℃で１日間培養し、ビール酵母の発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、ビール酵母の生菌数が５×１０８〜１０×１０８個であることが分かった。
【００６３】
好酸性乳酸桿菌の一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌種の二次培地に接種し、静置状態で嫌気培養を行い、培養ｐＨ８、培養温度３４℃で２日間培養し、好酸性乳酸桿菌の発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、好酸性乳酸桿菌の生菌数が２０×１０８〜３０×１０８個であることが分かった。
【００６４】
ストレプトマイセス・▲けい▼陽の一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌二次培地に接種し、通気培養を行って、培養ｐＨ８、培養温度３２℃で５日間培養することにより、ストレプトマイセス・▲けい▼陽の発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、ストレプトマイセス・▲けい▼陽の生菌数が３０×１０８〜５０×１０８個であることが分かった。
【００６５】
（三）  混合複合
各組成成分の発酵菌液を、全体積に対して、ロドシュードモナス・パルストリス  ８%、枯草菌  １２%、ビール酵母  ３５%、好酸性乳酸桿菌  ４２%、ストレプトマイセス・▲けい▼陽  ３%の割合で、１０００Ｌの発酵装置中で均一に混入して複合を行い、一次複合菌が１０００Ｌ得られた。
【００６６】
〈二次複合発酵〉
一次複合菌１０００Ｌに無菌水３２５０Ｌを入れて希釈し、そして、植物性乳酸桿菌２００Ｌ、好酸性乳酸桿菌２００Ｌ、ビール酵母２００Ｌ、黒砂糖１５０Ｌを更に追加して均一に混合し、発酵装置中で複合した。無菌・気密状態で発酵させ、温度３５℃、好ましい培養ｐＨ８で３日間培養し、二次複合菌が５０００Ｌ得られた。
【００６７】
検査を行った結果、得られた複合菌において、生菌総数が２０×１０８〜３０×１０８個であることが分かった。そのうち、ロドシュードモナス・パルストリスが総数の７%、枯草菌が１１%、ビール酵母が３４%、好酸性乳酸桿菌が４３%、ストレプトマイセス・▲けい▼陽が５%をそれぞれ占める。
【実施例４】
【００６８】
［複合微生物製剤の製造方法］
〈一次複合発酵〉
（一）  一次培地での培養
ナス形フラスコに入れた６００ｍｌのロドシュードモナス・パルストリスを６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種し、培養ｐＨ１０、培養温度３６℃で、照度４０００ルクスで７日間培養し、ロドシュードモナス・パルストリスの一次菌が得られた。
【００６９】
ナス形フラスコに入れた６００ｍｌの枯草菌を６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種し、培養ｐＨ８、培養温度３４℃で２日間培養し、枯草菌の一次菌が得られた。
【００７０】
ナス形フラスコに入れられた６００ｍｌのビール酵母を６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種し、培養ｐＨ７、培養温度３０℃で１日間培養し、ビール酵母の一次菌が得られた。
【００７１】
ナス形フラスコに入れられた６００ｍｌの好酸性乳酸桿菌を６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種し、培養ｐＨ８、培養温度３４℃で２日間培養し、好酸性乳酸桿菌の一次菌が得られた。
【００７２】
ナス形フラスコに入れられた６００ｍｌのストレプトマイセス・▲けい▼陽を６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種し、培養ｐＨ８、培養温度３２℃で５日間培養し、ストレプトマイセス・▲けい▼陽の一次菌が得られた。
【００７３】
（二）  二次培地での培養
ロドシュードモナス・パルストリスの一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌種の二次培地に接種し、間欠的に通気培養を行い、培養ｐＨ１０、培養温度３６℃で、照度４０００ルクスで７日間培養し、ロドシュードモナス・パルストリスの発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、ロドシュードモナス・パルストリスの生菌数が５×１０８〜１０×１０８個であることが分かった。
【００７４】
枯草菌の一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌種の二次培地に接種し、通気培養を行い、培養ｐＨ８、培養温度３４℃で２日間培養し、枯草菌の発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、枯草菌の生菌数が３０×１０８〜５０×１０８個であることが分かった。
【００７５】
ビール酵母の一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌種の二次培地に接種し、通気培養を行い、培養ｐＨ７、培養温度３０℃で１日間培養し、ビール酵母の発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、ビール酵母の生菌数が５×１０８〜１０×１０８個であることが分かった。
【００７６】
好酸性乳酸桿菌の一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌種の二次培地に接種し、静置状態で嫌気培養を行い、培養ｐＨ８、培養温度３４℃で２日間培養し、好酸性乳酸桿菌の発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、好酸性乳酸桿菌の生菌数が２０×１０８〜３０×１０８個であることが分かった。
【００７７】
ストレプトマイセス・▲けい▼陽の一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌種の二次培地に接種し、通気培養を行い、培養ｐＨ８、培養温度３２℃で５日間培養し、ストレプトマイセス・▲けい▼陽の発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、ストレプトマイセス・▲けい▼陽の生菌数が３０×１０８〜５０×１０８個であることが検査により分かった。
【００７８】
（三）  混合複合
各組成成分の発酵菌液を全体積に対して、ロドシュードモナス・パルストリス１５%、枯草菌２０%、ビール酵母２０%、好酸性乳酸桿菌３５%、ストレプトマイセス・▲けい▼陽１０%の割合で、１０００Ｌの発酵装置中で均一に混入して複合を行い、一次複合菌が１０００Ｌ得られた。
【００７９】
〈二次複合発酵〉
一次複合菌１０００Ｌに無菌水３２５０Ｌを入れて希釈し、そして、植物性乳酸桿菌２００Ｌ、好酸性乳酸桿菌２００Ｌ、ビール酵母２００Ｌ、黒砂糖１５０Ｌを更に追加して均一に混合し、発酵装置中で複合した。無菌・気密状態で発酵させ、培養温度３５℃、好ましい培養ｐＨ８で３日間培養し、二次複合菌が５０００Ｌ得られた。
【００８０】
検査を行った結果、得られた複合菌において、生菌総数が２０×１０８〜３０×１０８個であることが分かった。そのうち、ロドシュードモナス・パルストリスが総数の１２%、枯草菌が１７%、ビール酵母が２５%、好酸性乳酸桿菌が３８%、ストレプトマイセス・▲けい▼陽が８%をそれぞれ占める。
【実施例５】
【００８１】
［複合微生物製剤の製法］
〈一次複合発酵〉
（一）  一次培地での培養
ナス形フラスコに入れた３００ｍｌのロドシュードモナス・パルストリスを６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種して、培養ｐＨ６、培養温度２８℃、照度３０００ルクスで１０日間培養し、ロドシュードモナス・パルストリスの一次菌が得られた。
【００８２】
ナス形フラスコに入れた３００ｍｌの枯草菌を６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種して、培養ｐＨ６、培養温度２８℃で３日間培養し、枯草菌の一次菌が得られた。
【００８３】
ナス形フラスコに入れられた３００ｍｌのビール酵母を６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種し、培養ｐＨ４、培養温度２５℃で２日間培養し、ビール酵母の一次菌が得られた。
【００８４】
ナス形フラスコに入れられた３００ｍｌの好酸性乳酸桿菌を６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種し、培養ｐＨ６、培養温度２８℃で５日間培養し、好酸性乳酸桿菌の一次菌が得られた。
【００８５】
ナス形フラスコに入れられた３００ｍｌのストレプトマイセス・▲けい▼陽を６０Ｌの当該菌種の一次培地に接種し、培養ｐＨ６、培養温度２７℃で７日間培養し、ストレプトマイセス・▲けい▼陽の一次菌が得られた。
【００８６】
（二）  二次培地での培養
ロドシュードモナス・パルストリスの一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌種の二次培地に接種し、間欠的に通気培養を行い、培養ｐＨ６、培養温度２８℃、照度３０００ルクスで１０日間培養し、ロドシュードモナス・パルストリスの発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、ロドシュードモナス・パルストリス菌の生菌数が５×１０８〜１０×１０８個であることが分かった。
【００８７】
枯草菌の一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌種の二次培地に接種し、通気培養を行い、培養ｐＨ６、培養温度２８℃で３日間培養し、枯草菌の発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、枯草菌の生菌数が３０×１０８〜５０×１０８個であることが分かった。
【００８８】
ビール酵母の一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌種の二次培地に接種し、通気培養を行い、培養ｐＨ４、培養温度２５℃で２日間培養し、ビール酵母の発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、ビール酵母の生菌数が５×１０８〜１０×１０８個であることが検査により分かった。
【００８９】
好酸性乳酸桿菌の一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌種の二次培地に接種し、静置状態で嫌気培養を行い、培養ｐＨ６、培養温度２８℃で５日間培養し、好酸性乳酸桿菌の発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、好酸性乳酸桿菌の生菌数が２０×１０８〜３０×１０８個であることが分かった。
【００９０】
ストレプトマイセス・▲けい▼陽の一次菌６０Ｌを６００Ｌの当該菌種の二次培地に接種し、通気培養を行い、培養ｐＨ６、培養温度２７℃で７日間培養し、ストレプトマイセス・▲けい▼陽の発酵菌液が得られた。前記発酵菌液を検査した結果、ストレプトマイセス・▲けい▼陽の生菌数が３０×１０８〜５０×１０８個であることが分かった。
【００９１】
（三）  混合複合
各組成成分の発酵菌液を全体積に対して、ロドシュードモナス・パルストリス１５%、枯草菌２０%、ビール酵母２５%、好酸性乳酸桿菌３０%、ストレプトマイセス・▲けい▼陽１０%の割合で、１０００Ｌの発酵装置中で均一に混合して複合を行い、一次複合菌が１０００Ｌ得られた。
【００９２】
〈二次複合発酵〉
一次複合菌１０００Ｌに無菌水２４５０Ｌを入れて希釈し、そして、植物性乳酸桿菌１５０Ｌ、好酸性乳酸桿菌１５０Ｌ、ビール酵母１５０Ｌ、黒砂糖１００Ｌを更に追加して均一に混合し、発酵装置中で複合した。無菌・気密状態で発酵させ、培養温度３０℃、培養ｐＨ７で３日間培養し、二次複合菌が４０００Ｌ得られた。
【００９３】
検査を行った結果、得られた複合菌において、生菌総数が２０×１０８〜３０×１０８個であることが分かった。そのうち、ロドシュードモナス・パルストリスが１３%、枯草菌が１６%、ビール酵母が２９%、好酸性乳酸桿菌が３３%、ストレプトマイセス・▲けい▼陽が９%をそれぞれ占める。
【００９４】
［実験例１］
糖尿病治療用薬物の製造における本発明の複合微生物製剤の利用
１．一般資料
患者が１０３人であって、そのうち、男性が８１人、女性が２２人であり、年齢範囲が４０〜７０歳である。
【００９５】
２．診断基準
世界保健機関に規定された糖尿病診断基準に基づいて、多数の患者が中長期罹病の糖尿病患者であることを診断した。
【００９６】
３．治療方法：本発明実施例１に係る複合微生物製剤を、一日三回、毎回２０ｍｌの用量で、食事後の十分間に経口服用する。一連の治療を１段階１５日にし、６段階の一連治療を渡って服用する。
【００９７】
注意事項：
１）服用前に、まず薬瓶の底を上に向け、均一になるように振ること。
２）服用後の一時間以内に、水を飲まないこと。
３）食事制限が不要であること。
４）インスリンを使用している患者は、７日間内に徐々にインスリンの用量を減少し、血糖値が正常値に戻ると使用停止。
５）他の糖尿病治療用薬物は１５日間内に徐々に用量を減少し、血糖値が正常値に戻ると使用停止。
６）直射日光を避けて常温で保存すること。
【００９８】
４．治療効果の判定基準
治療効果は、以下のように確かな効果、好転、無効という三つの評価基準がある。
確かな効果とは、空腹際の血糖値及び食事後の二時間の血糖値を正常値範囲までに下げ、又は空腹際の血糖値及び食事後の二時間の血糖値の減少が治療前の４０%を超えることと、グリコヘモグロビンを正常値までに下げ又はグリコヘモグロビンの減少が治療前の３０%を超えることを示す。
好転とは、空腹際の血糖値及び食事後の二時間の血糖値の減少が治療前の２０%を超えるが、確かな効果の基準までに達しないことと、グリコヘモグロビンゲインの減少が治療前の１０%を超えるが、確かな効果の基準までに達しないことを示す。
無効とは、空腹際の血糖値及び食事後の二時間の血糖値が下がらない、又は好転の基準までに達成しないことと、グリコヘモグロビンが下がらない、又は好転の基準までに達しないことを示す。
【００９９】
治療結果（表１を参照）
【０１００】
【表１】
0005525622.tif 000002
【０１０１】
典型的な臨床例
毛さん、男性、６１歳、糖尿病罹病１８年、インスリン注射９年、本発明の複合微生物製剤を服用する前に、食事制限を行い、虚弱体質である。最高血糖値が１８.５ｍｍｏｌ／Ｌ、トリグリセリドが７.６ｍｍｏｌ／Ｌ、総コレステロールが９.４ｍｍｏｌ／Ｌである。本発明の複合微生物製剤を服用した１５日後、インスリン注射をやめ、他の糖尿病治療用薬物の使用も使用量を５０％減少させ、食事制限をせず、血糖値やトリグリセリド、コレステロールなどの数値が明らかに下がった。また、４５日間後に検査すると、血糖値が５.７ｍｍｏｌ／Ｌ、トリグリセリドが２.３ｍｍｏｌ／Ｌ、総コレステロールが４.５ｍｍｏｌ／Ｌであり、体質と食事は全体に正常に回復した。
【０１０２】
劉さん：男性、５７歳、糖尿病罹病１７年、インスリン注射６年、本発明の複合微生物製剤を服用する前に、食事制限を行い、虚弱体質である。最高血糖値が１６.９ｍｍｏｌ／Ｌ、トリグリセリドが６.９ｍｍｏｌ／Ｌ、総コレステロールが８.２ｍｍｏｌ／Ｌである。本発明の複合微生物製剤を服用した１３日後、インスリン注射をやめ、他の糖尿病治療用薬物も使用量を５０％減少させ、食事制限をせず、血糖値やトリグリセリド、コレステロールなどの数値が明らかに下がった。また、４５日間後に検査すると、血糖値が４.６ｍｍｏｌ／Ｌ、トリグリセリドが２.８ｍｍｏｌ／Ｌ、総コレステロールが５.３ｍｍｏｌ／Ｌ、体質と食事は全体に正常に回復した。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明に係る複合微生物製剤によって、ヒトの代謝機能を迅速に調整し、ランゲルハンス島細胞集団を修復・再結合し、血液中の過剰な糖質を転換して、損傷されたランゲルハンス島β細胞への負担を減らし、損傷されたランゲルハンス島機能を徐々に回復させ、微小循環灌流を改善し、神経伝導速度を向上し、肢端の温度を高めて、糖尿病性神経障害患者の睡眠を改善し、安定な内環境を維持し、生体のバランスを保ち、代謝の紊乱と崩れたバランスを整えることができる。当該複合微生物製剤は、糖尿病及びその合併症の治療に用いられ、糖尿病患者の生活品質を高めることができる。
【図１】
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【図２】
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