(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液浸対物レンズと、
標本と前記標本を保持する保持部材とを含む標本ユニットに前記液浸対物レンズを合焦する合焦手段と、
前記合焦手段により合焦された前記液浸対物レンズの、前記標本に対する光軸方向の相対的な座標である、合焦座標を検出する合焦座標検出手段と、
前記合焦座標検出手段により検出された合焦座標を記録する記録手段と、
前記記録手段に記録された合焦座標に基づいて、前記保持部材と前記液浸対物レンズの間が液浸媒体で満たされているか否かを判定する判定手段と、を含む
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項２】
請求項１に記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、
前記判定手段による判定に用いられる閾値を設定する閾値設定手段を含み、
前記判定手段は、
現在の合焦座標と前記記録手段に記録された合焦座標との差が前記閾値未満であるときに、前記保持部材と前記液浸対物レンズの間が前記液浸媒体で満たされていると判定し、
現在の合焦座標と前記記録手段に記録された合焦座標との差異が前記閾値以上であるときに、前記保持部材と前記液浸対物レンズの間が前記液浸媒体で満たされていないと判定する
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項３】
請求項２に記載の顕微鏡システムにおいて、
前記記録手段に記録された合焦座標は、現在の合焦座標が記録される直前に記録された前回の合焦座標である
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項４】
請求項２または請求項３に記載の顕微鏡システムにおいて、
前記閾値は、前記保持部材の光軸方向の厚さを用いて算出される値である
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項５】
請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、
ユーザに前記液浸媒体の不足を通知する通知手段を含み、
前記通知手段は、前記判定手段により前記保持部材と前記液浸対物レンズの間が前記液浸媒体で満たされていないと判定されたときに、ユーザに前記液浸媒体の不足を通知する
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項６】
請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、
前記液浸媒体を供給する供給手段を含み、
前記供給手段は、前記判定手段により前記保持部材と前記液浸対物レンズの間が前記液浸媒体で満たされていないと判定されたときに、前記液浸媒体を供給する
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項７】
請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、
前記標本の撮影を行う撮影手段を含み、
前記判定手段は、前記撮影手段により前記標本の撮影が行われる前に、前記保持部材と前記液浸対物レンズの間が前記液浸媒体で満たされているか否かを判定する
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡システムに関し、特に、液浸対物レンズを含む顕微鏡システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
標本を保持するカバーガラスやガラスボトムディッシュなどの保持部材と対物レンズとの間を水や油などの液体（以降、液浸媒体と記す）で満すことで、光学系の開口数を高め、分解能と輝度の向上を実現する技術が知られている。このような液浸技術を利用した液浸対物レンズは、現在、広く普及しており、例えば、タイムラプス観察などでも利用されている。
【０００３】
しかしながら、長時間にわたって生細胞等の標本を観察するタイムラプス観察に液浸対物レンズを用いる場合、観察期間中に液浸媒体が蒸発することにより、保持部材と液浸対物レンズの間に液浸媒体で満たされていない空間（以降、ギャップと記す）が生じることがある。
【０００４】
また、標本中の複数の部位を観察する多点タイムラプス観察などでは、液浸対物レンズに対して標本の相対的な移動が発生するが、倒立顕微鏡の場合には、保持部材の下面に液浸媒体の一部が残ってしまう。このため、移動後の液浸対物レンズ上の液浸媒体が不足し、保持部材と液浸対物レンズの間にギャップが生じることがある。
【０００５】
このようなギャップが生じると、液浸対物レンズの光学性能は著しく低下してしまう。このような技術的な課題を踏まえ、例えば、特許文献１では、液浸媒体を自動的に供給する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００４−５３１７６５公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１で開示される技術では、液浸媒体を自動的に供給することが可能である。しかしながら、保持部材と液浸対物レンズの間のギャップを検出することはできず、液浸媒体が不足していることを検出することはできない。
【０００８】
従って、液浸媒体の不足による光学性能の低下を防止するためには、液浸媒体が不足しているか否かに関わらず、撮影毎に常に液浸媒体を供給しなおす必要がある。
【０００９】
以上のような実情を踏まえ、本発明では、液浸媒体の不足を検出する技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様は、液浸対物レンズと、標本と標本を保持する保持部材とを含む標本ユニットに液浸対物レンズを合焦する合焦手段と、合焦手段により合焦された液浸対物レンズの、標本に対する光軸方向の相対的な座標である、合焦座標を検出する合焦座標検出手段と、合焦座標検出手段により検出された合焦座標を記録する記録手段と、記録手段に記録された合焦座標に基づいて、保持部材と液浸対物レンズの間が液浸媒体で満たされているか否かを判定する判定手段と、を含む顕微鏡システムを提供する。
【００１１】
本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、判定手段による判定に用いられる閾値を設定する閾値設定手段を含み、判定手段は、現在の合焦座標と記録手段に記録された合焦座標との差が閾値未満であるときに、保持部材と液浸対物レンズの間が液浸媒体で満たされていると判定し、現在の合焦座標と記録手段に記録された合焦座標との差異が閾値以上であるときに、保持部材と液浸対物レンズの間が液浸媒体で満たされていないと判定する顕微鏡システムを提供する。
【００１２】
本発明の第３の態様は、第２の態様に記載の顕微鏡システムにおいて、記録手段に記録された合焦座標は、現在の合焦座標が記録される直前に記録された前回の合焦座標である顕微鏡システムを提供する。
【００１３】
本発明の第４の態様は、第２の態様または第３の態様に記載の顕微鏡システムにおいて、閾値は、保持部材の光軸方向の厚さを用いて算出される値である顕微鏡システムを提供する。
【００１４】
本発明の第５の態様は、第１の態様乃至第４の態様のいずれか１つに記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、ユーザに液浸媒体の不足を通知する通知手段を含み、通知手段は、判定手段により保持部材と液浸対物レンズの間が液浸媒体で満たされていないと判定されたときに、ユーザに液浸媒体の不足を通知する顕微鏡システムを提供する。
【００１５】
本発明の第６の態様は、第１の態様乃至第４の態様のいずれか１つに記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、液浸媒体を供給する供給手段を含み、供給手段は、判定手段により保持部材と液浸対物レンズの間が液浸媒体で満たされていないと判定されたときに、液浸媒体を供給する顕微鏡システムを提供する。
【００１６】
本発明の第７の態様は、第１の態様乃至第６の態様のいずれか１つに記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、標本の撮影を行う撮影手段を含み、判定手段は、撮影手段により標本の撮影が行われる前に、保持部材と液浸対物レンズの間が液浸媒体で満たされているか否かを判定する顕微鏡システムを提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、液浸媒体の不足を検出する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。
【図２】集光位置と反射位置とが一致しているときに、図１に例示される顕微鏡システムに含まれる受光センサに入射するレーザー光を例示した図である。
【図３】集光位置と反射位置とが一致していないときに、図１に例示される顕微鏡システムに含まれる受光センサに入射するレーザー光を例示した図である。
【図４】集光位置と反射位置とが一致していないときに、図１に例示される顕微鏡システムに含まれる受光センサに入射するレーザー光を例示した図である。
【図５】対物レンズの各座標における受光センサの各受光領域で検出されるレーザー光の強度の総和を示すグラフを例示した図である。
【図６】図１に例示される顕微鏡システムで行われる合焦判定に用いられるグラフを例示した図である。
【図７】図１に例示される顕微鏡システムで行われる合焦判定に用いられる他のグラフを例示した図である。
【図８】図１に例示される顕微鏡システムに含まれる乾燥系対物レンズの合焦状態を例示した図である。
【図９】図１に例示される顕微鏡システムに含まれる液浸対物レンズの合焦状態を例示した図である。
【図１０】液浸媒体の不足による、図１に例示される顕微鏡システムに含まれる液浸対物レンズの合焦状態の変化を例示した図である。
【図１１】図１に例示される顕微鏡システムに含まれるオフセット補正レンズ群により、レーザー光の集光位置と励起光の集光位置とをずらした液浸対物レンズの合焦状態を例示した図である。
【図１２Ａ】図１に例示される顕微鏡システムによるタイムラプス観察の準備作業のフローを例示したフローチャートである。
【図１２Ｂ】図１に例示される顕微鏡システムによるタイムラプス観察の処理フローを例示したフローチャートである。
【図１３】図１に例示される顕微鏡システムによるタイムラプス観察時の時間と合焦状態の座標を例示した図である。
【図１４】実施例２に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。
【図１５】図１４に例示される顕微鏡システムに含まれる電動ステージの観察ポジションを例示した図である。
【図１６】図１４に例示される顕微鏡システムに含まれる電動ステージの供給ポジションを例示した図である。
【図１７】図１４に例示される顕微鏡システムによるタイムラプス観察の処理フローを例示したフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００１９】
図１は、本実施例に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。なお、本実施例では、図１の紙面に直交する方向をＹ方向として、各レンズの光軸方向をＺ方向として、図１の紙面に平行で且つ光軸と直交する方向をＸ方向として、定義する。
【００２０】
図１に例示される顕微鏡システム１は、ガラスディッシュ３に保持された標本Ｓを観察する倒立型の蛍光顕微鏡システムであり、対物レンズ１０とガラスディッシュ３との間に液浸媒体が満たされている否かを判定して、液浸媒体の不足を検出することができる顕微鏡システムである。
【００２１】
顕微鏡システム１は、電動レボルバ１９に装着された複数の対物レンズ１０（乾燥系対物レンズ１０ａ、液浸対物レンズ１０ｂ）と、培養液２に浸された標本Ｓと標本Ｓを保持するガラスディッシュ３とを含む標本ユニットＳＵが固定された電動ステージ４と、標本Ｓを蛍光観察するための蛍光観察手段と、標本ユニットＳＵに対物レンズ１０を合焦する合焦手段と、顕微鏡システム１全体を制御するコントロール部１８と、ユーザからの指示の入力に用いられる操作部４０と、を含んでいる。
【００２２】
電動レボルバ１９は、コントロール部１８からの制御信号により、任意の対物レンズ１０を光路上に挿入することができる。図１では、液浸対物レンズ１０ｂが、光路上に挿入されて、標本ユニットＳＵに対向して配置されている。また、電動レボルバ１９は、モータ２２ａを備えた架台２３に固定されている。コントロール部１８からの制御信号によりモータ制御部２４ａがモータ２２ａを駆動させることで、架台２３は光路上に挿入された対物レンズ１０の光軸方向（Ｚ方向）に移動する。この架台２３の移動により、対物レンズ１０も移動するため、標本Ｓに対する対物レンズ１０の光軸方向の相対的な座標（以降、単に対物レンズの座標と記す）を変化させることができる。また、対物レンズ１０の座標は、モータ２２ａに取り付けられたエンコーダ２１からの出力信号が入力される座標検出部２５により検出することができる。
【００２３】
ガラスディッシュ３が固定された電動ステージ４は、対物レンズ１０の光軸に直交するＸ方向及びＹ方向に移動可能であり、ステージ制御部５は、コントロール部１８からの制御信号により、電動ステージ４の移動を制御する。
【００２４】
蛍光観察手段は、標本Ｓを励起する励起光を射出する光源６と、コレクタレンズ７と、標本Ｓの励起に適した波長の光を透過する励起フィルタ８と、励起光を反射し蛍光を透過するダイクロイックミラー９と、観察に不要な波長の光を分離する吸収フィルタ１１と、標本Ｓから生じた蛍光の進行方向を切り換える光路切換え部１２と、ミラーＭと、接眼レンズ１３と、光源６から射出される励起光を遮断する電動シャッタ１７を含んでいる。電動シャッタ１７は、コントロール部１８からの制御信号により、励起光を遮断するＯＮ状態と励起光を遮断しないＯＦＦ状態とのいずれかの状態に制御される。
【００２５】
光源６から射出される励起光は、コレクタレンズ７及び励起フィルタ８を介して入射したダイクロイックミラー９を反射して対物レンズ１０に入射する。対物レンズ１０は、励起光を標本Ｓに照射することで、標本Ｓを励起光で照明する。励起光の照射により励起された標本Ｓから生じた蛍光は、対物レンズ１０を介してダイクロイックミラー９に入射する。さらに、蛍光は、ダイクロイックミラー９を通過し、吸収フィルタ１１、光路切換え部１２、ミラーＭを介して、接眼レンズ１３に入射する。従って、顕微鏡システム１では、蛍光観察手段を用いることで、標本Ｓを目視観察することができる。
【００２６】
また、顕微鏡システム１は、顕微鏡システム１の外部に設けられた、ＣＣＤカメラユニット１４とビデオキャプチャボード１５とホストＰＣ１６に接続することができる。さらに、顕微鏡システム１は、光路切換え部１２により蛍光をＣＣＤカメラユニット１４に導くことで、ＣＣＤカメラユニット１４により標本Ｓを撮像し、さらに、撮像された標本Ｓの画像を、ビデオキャプチャボード１５を介して、ホストＰＣ１６に保存することができる。即ち、顕微鏡システム１は、蛍光観察手段による目視観察のみではなく、標本Ｓの撮影を行うこともできる。
【００２７】
図１では、ＣＣＤカメラユニット１４、ビデオキャプチャボード１５、及び、ホストＰＣ１６は、顕微鏡システム１の外部に設けられているが、特にこれに限られない。顕微鏡システム１が、ＣＣＤカメラユニット１４、ビデオキャプチャボード１５、及び、ホストＰＣ１６を含んでもよい。即ち、顕微鏡システム１は、蛍光観察手段と、ＣＣＤカメラユニット１４と、ビデオキャプチャボード１５と、ホストＰＣ１６とからなる撮影手段を含んでもよい。
【００２８】
合焦手段は、標本ユニットＳＵに対物レンズ１０を自動的に合焦する、いわゆるオートフォーカス機能を実現する手段である。合焦手段は、可視外領域の赤外光であるレーザー光を発光する赤外光半導体レーザー２６と、コントロール部１８からの制御信号により赤外光半導体レーザー２６の発光を制御するレーザー駆動部２７と、赤外光半導体レーザー２６から発光されたレーザー光を略平行光に変換するコリメートレンズ２８と、レーザー光の光束の一部を遮断する投光側ストッパ２９と、Ｐ偏光を反射しＳ偏光を透過するＰＢＳ３０と、集光レンズ群３１と、オフセット補正レンズ群３２と、λ／４板３３と、赤外光を反射するダイクロイックミラー３４と、集光レンズ群３５と、受光センサ３６と、標本ユニットＳＵに対物レンズ１０が合焦されているか否かについての判定（以降、合焦判定と記す）を行う合焦判別部３７と、を含んでいる。なお、受光センサ３６は、それぞれ独立に入射光を検出する受光領域Ａと受光領域Ｂを有する２分割フォトダイオードであり、光軸を中心に設置されている。
【００２９】
合焦手段は、さらに、架台２３を移動させるモータ２２ａと、モータ２２ａの駆動を制御するモータ制御部２４ａと、オフセット補正レンズ群３２を移動させるモータ２２ｂと、モータ２２ｂの駆動を制御するモータ制御部２４ｂを含んでいる。
【００３０】
赤外光半導体レーザー２６から照明光として発光されたレーザー光は、コリメートレンズ２８により略平行光に変換されて、投光側ストッパ２９に入射する。レーザー光の光束の半分は投光側ストッパ２９により遮断されて、レーザー光の残りの半分はＰＢＳ３０に入射する。その後、レーザー光のＰ偏光成分のみがＰＢＳ３０を反射して、集光レンズ群３１により集光され、オフセット補正レンズ群３２を通過する。なお、オフセット補正レンズ群３２の機能については、後に詳述する。
【００３１】
オフセット補正レンズ群３２を通過したレーザー光はλ／４板３３に入射する。λ／４板３３は、レーザー光の偏光方向を４５度回転させて、Ｐ偏光であるレーザー光を円偏光に変換する。その後、レーザー光は、赤外光を反射するダイクロイックミラー３４を反射し、対物レンズ１０により集光して、標本ユニットＳＵに照射される。
【００３２】
標本ユニットＳＵを反射したレーザー光は、対物レンズ１０、ダイクロイックミラー３４を介して、λ／４板３３に入射する。λ／４板３３は、レーザー光の偏光方向を４５度回転させて、円偏光であるレーザー光をＳ偏光に変換する。Ｓ偏光であるレーザー光は、オフセット補正レンズ群３２及び集光レンズ群３１を通過して、ＰＢＳ３０に入射する。ＰＢＳ３０はＳ偏光を透過するため、レーザー光はＰＢＳ３０を通過して、集光レンズ群３５に入射し、受光センサ３６に照射される。受光センサ３６は、レーザー光を光電変換によりセンサ信号に変換して、合焦判別部３７へ出力する。
【００３３】
合焦判別部３７は、受光センサ３６から出力されたセンサ信号を受信し、受光領域Ａからのセンサ信号（以降、センサ信号ＳＡと記す）と受光領域Ｂからのセンサ信号（以降、センサ信号ＳＢと記す）とを識別する。さらに、合焦判別部３７は、受光領域Ａへ入射したレーザー光の強度の総和（以降、強度ＩＡ）をセンサ信号ＳＡから算出し、受光領域Ｂへ入射したレーザー光の強度の総和（以降、強度ＩＢ）をセンサ信号ＳＢから算出する。その上で、合焦判別部３７は、強度ＩＡ及び強度ＩＢに基づいて、合焦判定を行う。対物レンズ１０が合焦されていないと合焦判別部３７が判定した場合には、コントロール部１８からの制御信号によりモータ制御部２４ａがモータ２２ａを駆動させて、対物レンズ１０の座標を変化させる。
【００３４】
合焦手段は、合焦判別部３７により対物レンズ１０が合焦されていると判定されるまで、対物レンズ１０の移動と合焦判別部３７による合焦判定を繰り返すことで、対物レンズ１０を標本ユニットＳＵに合焦することができる。
【００３５】
合焦判定では、対物レンズ１０によりレーザー光が集光する集光位置（以降、単に集光位置と記す）とレーザー光が標本ユニットＳＵを反射する反射位置（以降、単に反射位置と記す）との位置関係によって、受光センサ３６の受光領域Ａ及び受光領域Ｂに入射するレーザー光の強度のバランスが変化することを利用する。なお、顕微鏡システム１では、受光センサ３６は、集光位置とおよそ光学的に共役な位置に配置されている。
【００３６】
図２は、集光位置と反射位置とが一致しているときに受光センサに入射するレーザー光を例示した図である。図２（ａ）は、受光センサ３６に入射するレーザー光をＹ方向から見た図を示し、図２（ｂ）は、受光センサ３６に入射するレーザー光をＸ方向から見た図を示している。図３及び図４は、集光位置と反射位置とが一致していないときに受光センサに入射するレーザー光を例示した図である。図３（ａ）及び図４（ａ）は、受光センサ３６に入射するレーザー光をＹ方向から見た図を示し、図３（ｂ）及び図４（ｂ）は、受光センサ３６に入射するレーザー光をＸ方向から見た図を示している。
【００３７】
また、図５は、対物レンズの各座標における受光センサの各受光領域で検出されるレーザー光の強度の総和を示すグラフを例示した図である。なお、図５で例示されるグラフの縦軸は、受光センサ３６の受光領域Ａ及び受光領域Ｂの各々で検出されるレーザー光の強度の総和（強度ＩＡ及び強度ＩＢ）を示している。横軸は、対物レンズの座標を示している。ここでは、集光位置と反射位置とが一致する合焦状態での対物レンズ１０の座標（以降、合焦座標と記す）を０としている。
【００３８】
集光位置と反射位置とが一致している場合、即ち、対物レンズ１０が標本ユニットＳＵに合焦している合焦状態にある場合には、図２に例示されるように、標本ユニットＳＵを反射したレーザー光は、光軸を中心とした受光センサ３６上の極狭い領域に集光する。従って、図５に例示されるように、合焦座標では、強度ＩＡと強度ＩＢは略等しい値を示す。
【００３９】
これに対して、集光位置と反射位置とが一致していない場合、即ち、非合焦点状態にある場合には、図３及び図４に例示されるように、標本ユニットＳＵを反射したレーザー光は、光軸に対して偏った状態で受光センサ３６に照射される。
【００４０】
具体的には、合焦状態から対物レンズ１０が標本ユニットＳＵ側（以降、標本側と記す。）に移動して集光位置が反射位置によりも標本側に位置する場合、即ち、前ピン状態にある場合、図３に例示されるように、標本ユニットＳＵを反射したレーザー光は、受光領域Ａに偏って入射する。従って、図５に例示されるように、対物レンズ１０が合焦座標より標本側に位置する場合には、強度ＩＡが強度ＩＢより大きな値を示す。
【００４１】
また、合焦状態から対物レンズ１０が電動レボルバ１９側（以降、像側と記す。）に移動して集光位置が反射位置より像側に位置する場合、即ち、後ピン状態にある場合、図４に例示されるように、標本ユニットＳＵを反射したレーザー光は、受光領域Ｂに偏って入射する。従って、図５に例示されるように、対物レンズ１０が合焦座標より像側に位置する場合には、強度ＩＢが強度ＩＡより大きな値を示す。
【００４２】
図６及び図７は、合焦判定に用いられるグラフを例示した図である。図６は、対物レンズの各座標における強度ＩＡと強度ＩＢの和（＝ＩＡ＋ＩＢ、以降、第１の評価値と記す）を示す関数（以降、第１の評価関数と記す）のグラフである。図７は、対物レンズの各座標における強度ＩＡと強度ＩＢの和に対する強度ＩＡと強度ＩＢの差の比率（＝（ＩＡ−ＩＢ）／（ＩＡ＋ＩＢ）、以降、第２の評価値と記す）を示す関数（以降、第２の評価関数と記す）のグラフである。
【００４３】
なお、図５に例示される強度ＩＡが示す形状と強度ＩＢが示す形状は合焦座標に対して互いに対称であるため、図６に例示される第１の評価関数は、合焦座標（縦軸）に対して軸対称な形状を有する。また、同様の理由から、図７に例示される第２の評価関数は、合焦座標（原点）に対して点対称な形状を示す。
【００４４】
図６に例示されるように、合焦状態で第１の評価関数は最大となるため、合焦判別部３７は第１の評価値が最大値を示しているか否かによって合焦状態を判定する。従って、第１の評価値を用いて合焦判定を実施する場合、合焦手段は、合焦判別部３７により第１の評価値が最大値を示していると判定される位置に対物レンズ１０を移動させることで、対物レンズ１０を標本ユニットＳＵに合焦する。
【００４５】
図７に例示されるように、合焦状態で第２の評価関数は０となるため、合焦判別部３７は第２の評価値が０か否かによって合焦状態を判定する。従って、第２の評価関数を用いて合焦判定を実施する場合、合焦手段は、合焦判別部３７により第２の評価値が０であると判定される位置に対物レンズ１０を移動させることで、対物レンズ１０を標本ユニットＳＵに合焦する。
【００４６】
第１の評価関数、第２の評価関数のいずれを用いても対物レンズ１０を標本ユニットＳＵに合焦することができるが、合焦するために対物レンズ１０を移動すべき方向を容易に認識できる点で、第２の評価関数を用いることがより望ましい。
【００４７】
図７に例示されるように、合焦座標に対して対物レンズ１０が標本側にある場合、即ち、前ピン状態では、第２の評価値は正の値を示し、合焦座標に対して対物レンズ１０が像側にある場合、即ち、後ピン状態では、第２の評価値は負の値を示す。従って、第２の評価値の正負により対物レンズ１０の移動すべき方向が特定できる。具体的には、第２の評価値が正の値であれば、矢印１で示されるように対物レンズ１０を像側に、第２の評価値が負の値であれば、矢印２で示されるように対物レンズ１０を標本側に移動させればよい。
【００４８】
次に、本実施例に係る顕微鏡システム１による液浸媒体の不足の検出方法について説明する。
図８は、乾燥系対物レンズの合焦状態を例示した図である。図９は、液浸対物レンズの合焦状態を例示した図である。ここで、図８に例示される乾燥系対物レンズ１０ａと図９に例示される液浸対物レンズ１０ｂは、焦点距離が等しいものとする。
【００４９】
乾燥系対物レンズ１０ａを使用する場合、図８に例示されるように、ガラスディッシュ３の底面（以降、界面ＩＦ１と記す）は、屈折率の異なる空気と接しているため、乾燥系対物レンズ１０ａから射出されたレーザー光は、界面ＩＦ１で反射する。従って、像側から標本ユニットＳＵに乾燥系対物レンズ１０ａを合焦する場合、集光位置が界面ＩＦ１に一致したときに、乾燥系対物レンズ１０ａは合焦される。
【００５０】
一方、液浸対物レンズ１０ｂを使用する場合、通常、液浸対物レンズ１０ｂと標本ユニットＳＵの間は液浸媒体ＷＴで満たされているため、図９に例示されるように、ガラスディッシュ３の底面は、液浸媒体ＷＴと接している。液浸媒体ＷＴとして例えばオイルを用いている場合、ガラスディッシュ３と液浸媒体ＷＴの屈折率は略等しいため、対物レンズ１０から射出されたレーザー光は、界面ＩＦ１で反射せず、ガラスディッシュ３と培養液２（または標本Ｓ）の界面（以降、界面ＩＦ２と記す）で反射する。従って、像側から標本ユニットＳＵに液浸対物レンズ１０ｂを合焦する場合、集光位置が界面ＩＦ２に一致したときに、液浸対物レンズ１０ｂは合焦される。
【００５１】
図８及び図９に例示されるように、乾燥系対物レンズ１０ａと液浸対物レンズ１０ｂでは、合焦位置が光軸方向にガラスディッシュ３の厚さｔだけ異なるため、乾燥系対物レンズ１０ａと液浸対物レンズ１０ｂを切り換えると、合焦座標は厚さｔだけ変化する。
【００５２】
図１０は、液浸媒体の不足による液浸対物レンズの合焦状態の変化を例示した図である。図１０は、液浸対物レンズ１０ｂと標本ユニットＳＵの間に液浸媒体で満たされている状態を点線で、液浸対物レンズ１０ｂと標本ユニットＳＵの間に液浸媒体で満たされていない状態を実線で示している。
【００５３】
図１０に例示されるように、液浸媒体が不足すると、界面ＩＦ１をまたがって屈折率の差異が生じることになるため、液浸対物レンズ１０ｂから射出されたレーザー光は、界面ＩＦ１で反射する。従って、像側から標本ユニットＳＵに液浸対物レンズ１０ｂを合焦する場合、乾燥系対物レンズ１０ａと同様に、集光位置が界面ＩＦ１に一致したときに、液浸対物レンズ１０ｂは合焦される。
【００５４】
このように、液浸対物レンズ１０ｂと標本ユニットＳＵの間が液浸媒体で満たされている場合と満たされていない場合では、液浸対物レンズ１０ｂと乾燥系対物レンズ１０ａとを切り換えた場合と同様に、合焦座標が厚さｔだけ変化することになる。従って、合焦座標の変化を検出することで、液浸媒体の不足を検出することができる。
【００５５】
図１に例示されるように、本実施例に係る顕微鏡システム１は、合焦座標を検出する合焦座標検出手段であるエンコーダ２１及び座標検出部２５と、合焦座標検出手段により検出された合焦座標を記録する記録手段である合焦座標記録部４１と、合焦座標記録部４１に記録された合焦座標に基づいて標本ユニットＳＵと液浸対物レンズ１０ｂの間が液浸媒体で満たされているか否かを判定する判定手段である液浸媒体充填判定部４２と、を含んでいる。顕微鏡システム１は、さらに、液浸媒体充填判定部４２による判定に用いられる閾値を設定する閾値設定手段である閾値設定部４３と、ユーザに液浸媒体の不足を通知する通知手段である液浸媒体不足通知部４４と、を含んでいる。
【００５６】
顕微鏡システム１は、撮影手段により標本Ｓの撮影が行われる前に、撮影毎に、合焦手段により液浸対物レンズ１０ｂを合焦し、液浸媒体充填判定部４２により充填判定を行う。なお、撮影とは、標本Ｓの１枚の画像を取得するために行われる一連の動作をいうが、合焦動作やステージの移動などは含まないものとする。また、充填判定とは、標本ユニットＳＵと液浸対物レンズ１０ｂの間が液浸媒体で満たされているか否かの判定をいう。
【００５７】
エンコーダ２１は、液浸対物レンズ１０ｂが移動すると移動量に応じた電気信号を座標検出部２５へ出力する。座標検出部２５は、合焦手段により液浸対物レンズ１０ｂが標本ユニットＳＵに合焦されると、エンコーダ２１から出力された電気信号に基づいて、液浸対物レンズ１０ｂの標本Ｓに対する光軸方向の相対的な座標を算出し、それを合焦座標として検出する。座標検出部２５は、合焦座標をコントロール部１８へ出力し、合焦座標記録部４１は、コントロール部１８から入力される合焦座標を記録する。
【００５８】
液浸媒体充填判定部４２は、座標検出部２５で検出された現在の合焦座標Ｚｎと前回の撮影時に合焦座標記録部４１に記録された合焦座標Ｚｎ−１との差を算出し、その差が閾値設定部４３に設定されている閾値ＴＡを上回るか否かを判定する。
【００５９】
閾値ＴＡは、ガラスディッシュ３の厚さｔを基準に閾値設定部４３に算出されるもので値であり、予めユーザがガラスディッシュ３の厚さｔを入力することにより自動的に設定される。例えば、閾値ＴＡは、ガラスディッシュ３の厚さｔと係数ｋの積であり、ここでは、ｋ＝０．８として算出されている。
【００６０】
なお、係数ｋは、ガラスディッシュ３の厚さｔの熱ドリフトを考慮して設定されるものであり、測定間隔、設定温度によって１未満の異なる値に設定され得る。
液浸媒体充填判定部４２は、｜Ｚｎ−１−Ｚｎ｜≦ＴＡであれば、合焦座標の変化は小さいため、液浸対物レンズ１０ｂと標本ユニットＳＵの間は液浸媒体で満たされていると判定する。この場合、顕微鏡システム１は、液浸媒体充填判定部４２の判定結果を受けて、撮影動作を開始し、標本Ｓの画像を取得する。
【００６１】
一方、液浸媒体充填判定部４２は、｜Ｚｎ−１−Ｚｎ｜＞ＴＡであれば、合焦座標の変化が大きいため、液浸対物レンズ１０ｂと標本ユニットＳＵの間は液浸媒体で満たされておらず液浸媒体が不足していると判定する。この場合、液浸媒体充填判定部４２は、液浸媒体不足通知部４４へ液浸媒体の不足を示す信号を送信し、液浸媒体不足通知部４４は、ユーザに液浸媒体の不足を通知する。具体的には、液浸媒体不足通知部４４は例えばＬＥＤであり、ＬＥＤの点灯により液浸媒体の不足をユーザに通知してもよい。
【００６２】
さらに、顕微鏡システム１では、オフセット補正レンズ群３２を用いて、合焦状態におけるレーザー光の集光位置と励起光の集光位置とをずらすことができる。図１１は、オフセット補正レンズ群によりレーザー光の集光位置と励起光の集光位置とをずらした液浸対物レンズの合焦状態を例示した図である。
【００６３】
図１に例示されるオフセット補正レンズ群３２は、オフセット補正レンズ群３２から射出されるレーザー光の状態を、収束状態や発散状態に調整するためのレンズ群であり、オフセット補正レンズ群３２の光軸方向に移動可能に配置されている。コントロール部１８からの制御信号によりモータ制御部２４ｂがモータ２２ｂを駆動させることで、オフセット補正レンズ群３２が光軸方向に移動し、オフセット補正レンズ群３２から射出されるレーザー光の状態が調整される。これにより、対物レンズ１０へ入射するレーザー光の状態が変化してレーザー光の集光位置が変化する。一方で、オフセット補正レンズ群３２の移動により、光源６から射出される励起光の集光位置は変化しない。
【００６４】
このため、オフセット補正レンズ群３２によりレーザー光の集光位置と励起光の集光位置をずらすことで、合焦状態で標本Ｓを観察する観察面（励起光の集光位置）を界面ＩＦ２からずらすことができる。図１１では、オフセット補正レンズ群３２により、観察面ＶＰが界面ＩＦ２からＺＳだけずれている状態が例示されている。従って、合焦状態で標本の内部を観察することができる。
【００６５】
次に、本実施例に係る顕微鏡システム１によるタイムラプス観察の処理フローについて説明する。図１２Ａは、本実施例に係る顕微鏡システム１によるタイムラプス観察の準備作業のフローを例示したフローチャートである。図１２Ｂは、本実施例に係る顕微鏡システム１によるタイムラプス観察の処理フローを例示したフローチャートである。また、図１３は、図１に例示される顕微鏡システムによるタイムラプス観察時の時間と合焦状態の座標を例示した図である。縦軸は合焦座標を、横軸は撮影時の時間を示している。
図１３は、撮影時間ｔｓ６と撮影時間ｔｓ７の間で、合焦座標がＺ６からＺ７へ閾値ＴＡ以上に変化してオイル（液浸媒体）切れが発生した例を示している。
【００６６】
図１２Ａに例示されるように、顕微鏡システム１では、タイムラプス観察の開始前に、閾値設定部４３に閾値が設定される。まず、操作部４０を介してユーザから観察に使用するガラスディッシュ３の厚さｔが入力される（ステップＳ１００）。次に、閾値設定部４３は、入力された厚さｔと係数ｋを掛けて閾値ＴＡを算出し（ステップＳ１０１）、算出された閾値ＴＡを記録する（ステップＳ１０２）。これにより、閾値設定部４３に閾値ＴＡが設定される。
【００６７】
図１２Ｂに例示されるように、顕微鏡システム１では、タイムラプス観察が開始されると、まず、操作部４０を介してユーザから撮影間隔時間、撮影枚数、撮影オフセット値が入力される（ステップＳ２００）。撮影間隔時間、撮影枚数、撮影オフセット値は、それぞれ、例えば、１時間、８枚、１０μｍである。次に、ステップＳ２００で設定された撮影オフセット値に基づいてオフセット補正レンズ群３２を駆動することで、観察面が調整される（ステップＳ２０１）。
【００６８】
その後、ステップＳ２０２からステップＳ２１１で示されるタイムラプスサイクルが開始される。タイムラプスサイクルの各サイクルでは、まず、合焦手段により標本ユニットＳＵに対物レンズ１０を合焦する（ステップＳ２０２）。次に、合焦座標検出手段であるエンコーダ２１及び座標検出部２５により合焦座標Ｚｎを検出して、合焦座標記録部４１に記録する（ステップＳ２０３）。さらに、前回のタイムラプスサイクルで取得され合焦座標記録部４１に記録されている合焦座標Ｚｎ−１を読み出し（ステップＳ２０４）後、液浸媒体充填判定部４２により充填判定が行われる（ステップＳ２０５）。具体的には、現在の合焦座標Ｚｎと前回のタイムラプスサイクルで取得され合焦座標記録部４１に記録されている合焦座標Ｚｎ−１との差が閾値設定部４３に設定されている閾値ＴＡを上回るか否かが判定される。
【００６９】
液浸媒体充填判定部４２が差は閾値ＴＡ以下であると判定すると、顕微鏡システム１は、標本ユニットＳＵと液浸対物レンズ１０ｂの間は液浸媒体で満たされていると判断して、撮影動作を開始し、撮影手段により標本Ｓを撮影する（ステップＳ２０６）。
【００７０】
一方、液浸媒体充填判定部４２が差は閾値ＴＡを上回っていると判定すると、撮影動作は開始されず、液浸媒体不足通知部４４によりユーザに液浸媒体の不足が通知される（ステップＳ２０７）。ユーザは、液浸媒体不足通知部４４からの通知を確認し、標本ＳＵと液浸対物レンズ１０ｂの間にオイル等の液浸媒体を供給し、標本ＳＵと液浸対物レンズ１０ｂの間を液浸媒体で満たす（ステップＳ２０８）。
【００７１】
顕微鏡システム１は、その後、改めて合焦手段により標本ユニットＳＵに対物レンズ１０を合焦し（ステップＳ２０９）、合焦座標検出手段であるエンコーダ２１及び座標検出部２５により合焦座標Ｚｎを検出して、合焦座標記録部４１に記録する（ステップＳ２１０）。その後、顕微鏡システム１は、液浸媒体充填判定部４２による充填判定を行うことなく、撮影動作を開始し、撮影手段により標本Ｓを撮影する（ステップＳ２０６）。なお、撮影動作を開始する前に、再度、液浸媒体充填判定部４２により充填判定が行われてもよい。
【００７２】
撮影後、顕微鏡システム１は、ステップＳ２００で設定された撮影枚数だけ標本Ｓを撮影したか否かを判定し（ステップＳ２１１）、設定された撮影枚数だけ撮影が行われていれば、タイムラプス観察を終了する。
【００７３】
撮影枚数に達していない場合には、ステップＳ２００で設定された撮影間隔時間だけ待機（ステップＳ２１２）後に、ステップＳ２０２へ制御が遷移し、新たなタイムラプスサイクルが開始される。そして、設定された撮影枚数だけ標本Ｓを撮影するまでタイムラプスサイクルを繰り返して、タイムラプス観察を終了する。
【００７４】
以上、本実施例に係る顕微鏡システム１によれば、液浸対物レンズ１０ｂと標本ユニットＳＵの間は液浸媒体で満たされて否かを判定することで、液浸媒体の不足を検出することができる。このため、顕微鏡システム１は、観察期間中に液浸媒体が蒸発するなどとして、液浸媒体が不足することがある長期間にわたるタイムラプス観察などに、特に有効である。なお、図１２Ｂでは、標本Ｓ中の一箇所のみを観察するタイムラプス観察を例示したが、特にこれに限られない。顕微鏡システム１は、標本Ｓ中の複数箇所を観察する多点タイムラプス観察にも好適である。
【００７５】
また、顕微鏡システム１によれば、撮影動作を開始する前に液浸媒体の不足を検出することができるため、液浸媒体が不足した状態での標本Ｓの撮影を防止することが可能であり、撮影画像の画質の劣化を防止することができる。
【００７６】
また、顕微鏡システム１によれば、液浸媒体不足通知部４４を通じてユーザに液浸媒体の不足を通知することができるため、ユーザが適宜液浸媒体を供給し直すことで、常に液浸媒体が満たされた状態で標本Ｓを撮影することが可能となり、液浸媒体の不足に起因する光学性能の低下を防止し、常に良好な画像を撮影することができる。
【００７７】
なお、本実施例では、合焦手段として、赤外光半導体レーザー２６と２分割フォトダイオードである受光センサ３６を含む構成を例示し、これらを用いた合焦方法を例示したが、合焦手段や合焦方法は、特にこれに限られない。合焦手段は、例えば、赤外光半導体レーザー２６の代わりにＬＥＤ光源を含んでもよく、例えば、２分割フォトダイオードの代わりに４分割フォトダイオード、ラインセンサ、またはＣＣＤ等を含んでもよい。また、合焦方法も既知の他の方法を利用しても良い。
【００７８】
また、本実施例では、合焦手段が、対物レンズ１０を光軸方向へ移動させることにより、対物レンズ１０を標本ユニットＳＵに合焦する例を示したが、特にこれに限られない。合焦手段は、電動ステージ４を光軸方向へ移動させることにより、対物レンズ１０を標本ユニットＳＵに合焦してもよい。なお、その場合、合焦座標検出手段は、電動ステージ４に備えられたエンコーダと座標検出部から構成されてもよい。
【００７９】
また、本実施例では、液浸媒体充填判定部４２が、判定式として、｜Ｚｎ−１−Ｚｎ｜＞ＴＡを用いて、液浸対物レンズ１０ｂと標本ユニットＳＵの間が液浸媒体で満たされているか否かを判定する例を示したが、判定式は特にこれに限られない。観察中にガラスディッシュ３に熱が加わることでガラスディッシュ３の厚さが変化する現象である熱ドリフトを考慮した判定式を用いても良い。
【００８０】
例えば、判定式として、｜｜Ｚｎ−１−Ｚｎ｜−｜Ｚｎ−２−Ｚｎ−１｜｜≦ＴＡを用いても良い。なお、ここで、ＴＡは閾値を、Ｚｎは現在の合焦座標、Ｚｎ−１は前回の撮影時の合焦座標、Ｚｎ−２は前々回の撮影時の合焦座標である。これにより、撮影間に生じる熱ドリフトによる合焦座標の変化を相殺することができるため、より高い精度の充填判定を行うことができる。
【００８１】
また、本実施例では、液浸媒体不足通知部４４としてＬＥＤを例示したが、特にこれに限られない。ホストＰＣ１６が液浸媒体不足通知部４４として機能してもよく、その場合、ホストＰＣ１６の画面上に液浸媒体の不足を示すメッセージ等を表示してもよい。また、液浸媒体不足通知部４４として警告音を発する装置を用いても良い。また、液浸媒体不足通知部４４は、タイムラプス観察中に合焦が不可能となった場合にも、ユーザに液浸媒体の不足を通知しても良い。
【００８２】
また、本実施例では、顕微鏡システム１として、倒立顕微鏡を含むシステムを例示したが特にこれに限られない。顕微鏡システム１は、正立顕微鏡を含むシステムや、顕微鏡を含むインキュベータ装置などであってもよい。
【００８３】
また、本実施例では、標本保持部材として、ガラスディッシュ３を例示したが特にこれに限られない。例えば、カバーガラスなどであってもよい。また、標本保持部材の材料もガラス材料に限られない。標本保持部材の材料は、液浸媒体の屈折率に近い屈折率を有する材料であればよい。
【００８４】
また、本実施例では、液浸媒体として、オイルを例示したが特にこれに限られない。液浸媒体は、液浸媒体は、標本保持部材の屈性率に近い屈折率を有する媒体であればよい。
【実施例２】
【００８５】
図１４は、本実施例に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。図１４に例示される顕微鏡システム４５は、液浸媒体不足通知部４４の代わりに、液浸媒体を供給する供給手段であるオイル供給制御部４６及びオイル供給部４７を含む点が、図１に例示される顕微鏡システム１と異なっている。その他の構成は顕微鏡システム１と同様であるため、同一の構成要素には同一の符号を付して説明を省略する。なお、オイル供給部４７は、内部に液浸媒体であるオイルを保持している。また、オイル供給部４７は、電動ステージ４に搭載されていて、電動ステージ４の移動によりオイル供給部４７も移動するように構成されている。
【００８６】
図１４に例示される顕微鏡システム４５では、液浸媒体充填判定部４２により行われる充填判定の結果、標本ＳＵと液浸対物レンズ１０ｂの間が液浸媒体で満たされていないと判断された場合、コントロール部１８からの制御信号により、オイル供給制御部４６がオイル供給部４７を制御して、自動的に標本ＳＵと液浸対物レンズ１０ｂの間を液浸媒体で満たす。
【００８７】
より具体的には、まず、ステージ駆動部５が、標本ユニットＳＵと液浸対物レンズ１０ｂが対向する図１５に例示される観察ポジションから、オイル供給部４７と液浸対物レンズ１０ｂが対向する図１６に例示される供給ポジションへ、電動ステージ４を移動させる。次に、オイル供給制御部４６がオイル供給部４７に液浸対物レンズ１０ｂ上へ適量のオイルを供給させる。オイル供給部４７は、不図示の小型ポンプを用いることで、内部に保持されているオイルから適量のオイルを液浸対物レンズ１０ｂ上へ供給することができる。最後に、ステージ駆動部５が、電動ステージ４を図１６に例示される供給ポジションから図１５に例示される観察ポジションへ戻す。
【００８８】
図１７は、本実施例に係る顕微鏡システム４５によるタイムラプス観察の処理フローを例示したフローチャートである。図１７に例示されるタイムラプス観察の処理フローは、充填判定の結果、液浸媒体が不足していると判定された場合に行われる処理のみが、図１２Ｂに例示される顕微鏡システム１によるタイムラプス観察の処理フローと異なっている。このため、顕微鏡システム１の処理と同一の処理には同一の符号を付して説明を省略する。なお、顕微鏡システム４５によるタイムラプス観察の準備作業のフローは、図１２Ａに例示される顕微鏡システム１によるタイムラプス観察の準備作業のフローと同様である。
【００８９】
図１７に例示されるように、本実施例に係る顕微鏡システム４５では、ステップＳ２０５の充填判定処理の結果、液浸媒体が不足していると判定されると、図１６に例示される供給ポジションへ電動ステージ４が移動する（ステップＳ３００）。そして、コントロール部１８からの制御信号によりオイル供給制御部４６がオイル供給部４７を制御し、オイル供給部４７が液浸対物レンズ１０ｂ上へ適量のオイルを供給する（ステップＳ３０１）。オイルの供給が終了すると、ステップＳ３００での移動前に位置していた図１５に例示される観察ポジションへ電動ステージ４が復帰する（ステップＳ３０２）。その後の処理は、実施例１に係る顕微鏡システム１の場合と同様である。
【００９０】
以上、本実施例に係る顕微鏡システム４５によれば、実施例１に係る顕微鏡システム１と同様に、液浸媒体の不足を検出することができる。また、実施例１に係る顕微鏡システム１と同様に、撮影動作を開始する前に液浸媒体の不足を検出することができるため、液浸媒体が不足した状態での標本Ｓの撮影を防止することが可能であり、撮影画像の画質の劣化を防止することができる。
【００９１】
さらに、本実施例に係る顕微鏡システム４５によれば、液浸媒体の不足を検出した場合に、自動的に液浸媒体を供給することができる。このため、タイムラプス観察におけるユーザの負担を大幅に削減することができる。
【００９２】
なお、本実施例では、供給手段として、オイル供給制御部４６と電動ステージ４上に配置されたオイル供給部４７とを含む構成を例示したが、特にこれに限られない。供給手段は、液浸媒体の不足を検出した場合に、液浸対物レンズ１０ｂ上に適量の液浸媒体を供給できれば良い。
【００９３】
また、本実施例に係る顕微鏡システム４５も、実施例１に係る顕微鏡システム１と同様に、合焦手段、顕微鏡、標本保持部材、液浸媒体、充填判定の判定式等を適宜変更してもよい。
【符号の説明】
【００９４】
１、４５・・・顕微鏡システム、２・・・培養液、３・・・ガラスディッシュ、４・・・電動ステージ、５・・・ステージ制御部、６・・・光源、７・・・コレクタレンズ、８・・・励起フィルタ、９、３４・・・ダイクロイックミラー、１０・・・対物レンズ、１０ａ・・・乾燥系対物レンズ、１０ｂ・・・液浸対物レンズ、１１・・・吸収フィルタ、１２・・・光路切換え部、１３・・・接眼レンズ、１４・・・ＣＣＤカメラユニット、１５・・・ビデオキャプチャボード、１６・・・ホストＰＣ、１７・・・電動シャッタ、１８・・・コントロール部、１９・・・電動レボルバ、２１・・・エンコーダ、２２ａ、２２ｂ・・・モータ、２３・・・架台、２４ａ、２４ｂ・・・モータ制御部、２５・・・座標検出部、２６・・・赤外光半導体レーザー、２７・・・レーザー駆動部、２８・・・コリメートレンズ、２９・・・投光側ストッパ、３０・・・ＰＢＳ、３１、３５・・・集光レンズ群、３２・・・オフセット補正レンズ群、３３・・・λ／４板、３６・・・受光センサ、３７・・・合焦判別部、４０・・・操作部、４１・・・合焦座標記録部、４２・・・液浸媒体充填判定部、４３・・・閾値設定部、４４・・・液浸媒体不足通知部、４６・・・オイル供給制御部、４７・・・オイル供給部、Ｓ・・・標本、ＳＵ・・・標本ユニット、ＩＦ１、ＩＦ２・・・界面、ＶＰ・・・観察面、Ｍ・・・ミラー
【図１】
0005530330.tif 000002
【図５】
0005530330.tif 000003
【図６】
0005530330.tif 000004
【図７】
0005530330.tif 000005
【図８】
0005530330.tif 000006
【図９】
0005530330.tif 000007
【図１０】
0005530330.tif 000008
【図１１】
0005530330.tif 000009
【図１２Ａ】
0005530330.tif 000010
【図１２Ｂ】
0005530330.tif 000011
【図１４】
0005530330.tif 000012
【図１５】
0005530330.tif 000013
【図１６】
0005530330.tif 000014
【図１７】
0005530330.tif 000015
【図２】
0005530330.tif 000016
【図３】
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【図４】
0005530330.tif 000018
【図１３】
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