(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度を判定する方法であって、以下：
（ａ）サンプルの１つ以上のアリコートを提供する工程であって、ここで各アリコートが、アリコートあたり１ゲノムより少ない量で核酸を含有する工程；
（ｂ）第１の増幅反応において、各アリコート中の１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する工程；
（ｃ）１つまたはそれ以上の増幅産物をレプリカアリコートに再分し、かつ各アリコート中の２つまたはそれ以上の核酸配列について第２の増幅反応を行うこと、ここで前記核酸配列の少なくとも１つはテストマーカーであり、前記核酸配列の少なくとも１つは参照マーカーである工程；および
（ｄ）テストマーカーの増幅産物の数を、参照マーカーの増幅産物の数と比較することによって、テストマーカーのコピー数を計算する工程、
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、第１の増幅反応における各アリコートが、増幅反応あたり０．１〜０．９ゲノムのＤＮＡを含む、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記テストマーカーのコピー数を、テストマーカーおよび参照マーカーの増幅産物の数を手作業で算出することによって計算する、方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法であって、前記テストマーカーのコピー数を、等式：
Ｎｐ＝Ｎ（１−ｅ−Ｚ）
を用いて計算し、
ここでＮはアリコートの数であり；Ｚはアリコートあたりの増幅産物の平均数であり；そしてＮｐはポアソン分布によって少なくとも１分子の核酸を含むことが期待されるアリコートの数である、方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法であって、テストマーカーのコピー数を、等式：
Ｚ＝−ｌｎ（１−Ｎｐ／Ｎ）
を用いて計算し、
ここでＮは所与の配列に関して試験した核酸のアリコートの数であり；Ｎｐは該核酸に関して陽性であったアリコートの数である（すなわち、少なくとも１コピーの核酸配列が増幅される）、方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法であって、増幅反応を、ＰＣＲを用いて行う、方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法であって、第１の増幅反応を、フォワードプライマーおよびリバースプライマーペアを用いて行う、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法であって、２番目の増幅反応を、フォワード内部プライマーおよびリバースプライマーを用いて行う、方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法であって、サンプルを、第１染色体、第２染色体、第３染色体、第４染色体、第５染色体、第６染色体、第７染色体、第８染色体、第９染色体、第１０染色体、第１１染色体、第１２染色体、第１３染色体、第１４染色体、第１５染色体、第１６染色体、第１７染色体、第１８染色体、第１９染色体、第２０染色体、第２１染色体、第２２染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体からなるグループから得る、または得ることができる、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法であって、アリコートにする前のサンプルにおける核酸の濃度を、ＵＶ分光測定によって決定する、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法であって、アリコートにする前のサンプルにおけ
る核酸の濃度を、一倍体ゲノムあたり１つのコピーしか存在しないと考えられる１つまた
はそれ以上の核酸を、２つまたはそれ以上の異なる希釈において増幅することによって決
定し、ここで１つまたはそれ以上の核酸に関して陽性であることが見出された各希釈にお
けるサンプルの割合を使用して、ＤＮＡ濃度の推定を正確にし、そして従って続く分析に
必要な希釈を決定するために使用する、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、４つの核酸を増幅し、そして６つの希釈を調製する、
方法。
【請求項１３】
核酸のサンプルにおける１つまたはそれ以上の変化を同定する方法であって、以下：
（ａ）請求項１〜１２のいずれかに記載の方法によって、１番目および２番目のサンプル中の１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度を判定する工程；
（ｂ）任意でそれぞれのサンプルに関して、徐々により高い分解能で、該方法を反復して繰り返す工程；および
（ｃ）１番目および２番目のサンプルにおける、１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度の１つまたはそれ以上の違いを同定する工程、
を含み、前記変化が転座、増幅、重複または欠失である、前記方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記サンプルが、疾患を持つ被験体および疾患を持たない被験体であるか、または疾患を持つ被験体および疾患を持たない被験体に由来する、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記疾患が癌である、方法。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法であって、さらなる研究のために１つの領域に焦点を合わせる前に、染色体全体が最初にスキャンされる、方法。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法であって、該方法を最初は２Ｍｂの分解能で行い、徐々に１００塩基対またはそれ以下に下げる、方法。
【請求項１８】
サンプルが疾患に罹患している被験体からのものであるか否かを決定する、疾患診断を補助するための方法であって、以下：
（ａ）請求項１〜１２のいずれかに記載の方法によって、サンプル中の１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度を判定する工程；および
（ｂ）１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数を、１つまたはそれ以上の核酸配列の正常なコピー数と比較する工程；
を含み、ここでサンプル中の１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数と、１つまたはそれ以上の核酸配列の正常なコピー数との間の違いは、該サンプルが疾患に罹患している被験体からのものであることを示す、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、被験体由来の核酸のサンプル中の１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数が、正常コピー数より多い場合、転座、増幅または重複を示す、方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法であって、被験体由来の核酸のサンプル中の１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数が、正常コピー数より少ない場合、欠失を示す、方法。
【請求項２１】
請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法であって、ここで前記疾患が癌である、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、ここで前記癌が腎臓癌である、方法。
【請求項２３】
請求項１８〜２２のいずれかに記載の方法であって、ここで前記被験体が、以下：（ｉ）疾患に罹患した、または罹患していることが疑われる被験体；（ｉｉ）疾患の素因があることが既知の被験体；（ｉｉｉ）疾患を引き起こすことが既知である、または疑われる、１つまたはそれ以上の因子または状況に曝露された被験体；および（ｉｖ）疾患を発症する過程にある、またはその過程にあることが疑われる被験体、からなる群より選択される、方法。
【請求項２４】
核酸のサンプル中の１つまたはそれ以上の変化をクローニングする方法であって、以下：
（ａ）請求項１３〜１７のいずれかに記載の方法によって、核酸のサンプル中の１つまたはそれ以上の変化を同定する工程；および
（ｂ）１つまたはそれ以上の変化をクローニングする工程、
を含み、前記変化が転座、増幅、重複または欠失である、前記方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、前記変化がインバースＰＣＲクローニングを用いて、クローニングされる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ゲノムＤＮＡのような、核酸配列のコピー数の変化を検出する方法、およびこの方法の様々な適用に関連する。例として、本方法を、ゲノムの変化の検出および癌のような疾患の診断のために使用し得る。さらに、本発明の方法によって同定された非相互的ｔ（３；５）転座も記載される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
染色体の変化（例えば異常）は多くの場合、遺伝的異常、変性性疾患、および癌と関連する。染色体全体のコピーの欠失または増殖、および染色体の区域または特定の領域の欠失または増幅は、癌のような疾患においてよく起こる（非特許文献１；非特許文献２）。実際、ＤＮＡ配列の増幅および欠失は、疾患の原因であり得る。例えば、原癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子はそれぞれ、多くの場合腫瘍形成に特徴的である（非特許文献３）。明らかに、疾患に関連する特定のゲノム領域の同定およびクローニングは、疾患の研究および診断および予後のより良い手段の開発の両方において重要である。
【０００３】
従って、個人化した、予防的、および予測的医学の目的を実行するために、ゲノム配列決定後の時代において、個々のゲノムの状態を決定する方法が必要である。疾患の（例えば癌）ゲノムは、多くの異常を示すが、遺伝性の染色体異常は、多くの複雑な症候群および疾患素因と関連している。実際、癌ゲノム全体のある範囲の提案された配列決定は、そのような変化に関してゲノムをスキャンする方法を用いて、異常が位置する領域によりよく焦点を合わせ得る。新生物は多くの場合、欠失、増幅および転座を含む、複雑な細胞遺伝学的異常を有する。白血病および肉腫は、典型的に相互染色体転座（２）を示すが、上皮の腫瘍（それはヒト癌の９０％以上を含む）は、はるかにより不均一である（１）。上皮腫瘍では、染色体の獲得または喪失および不均衡な転座が主に起こる。これに加えて、小さな細胞遺伝学的に目に見えない異常、例えば染色体の転座に伴って時々見出されるものが腫瘍に存在する（３）。特によく特徴付けられた、非相互的染色体転座は、腎細胞癌における不均衡なｄｅｒ３ｔ（３；５）である（４、５）。これらの異常は、非乳頭状腎細胞癌と特異的に関連し、ここでそれは少なくとも１５％の頻度で起こる（６）。これらの転座のｄｅｒ（３）ｔ（３；５）の限界点の解明は、それらが非相互的であるので妨げられてきた。
【０００４】
この問題へのアプローチは、非相互的転座は、ゲノム配列のコピー数の変化を引き起こすという事実に基づき得る。多くのハイブリダイゼーションに基づく技術が、ゲノム内のコピー数をスキャンするために利用可能である。これらの方法は、ゲノムＤＮＡ（７）を、ＢＡＣＳまたはＰＡＣＳ（８、９）またはヒト参照配列を示すオリゴヌクレオチド（１０、１１）のアレイのためのプローブとして使用する、または代表的なゲノムプローブ（ＲＯＭＡ）（１２−１４）またはＳＮＰアレイ（１５）を使用する。しかし、アレイに基づく方法は、調査する標的の各セットのために新しいアレイを作成しなければならないので、柔軟性を欠く。さらに、ハイブリダイゼーションシグナルは、プローブに対応するゲノムの特定の領域のコピー数を反映するので、これらのアプローチは、常に定量的であるわけではない。定量的ＰＣＲに基づく他のアプローチは、評価する各遺伝子座に関して最適化を必要とする。
【０００５】
本発明は、１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数の変化の検出における改善に関連する。
【非特許文献１】Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１８：Ｓｕｐｐｌ．１：５−１４
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０７２：３３−５０
【非特許文献３】Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．４９：２０３−２１７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の概要）
本明細書中で記載される方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ、またはＭＣＣと呼ばれる）は、限界ＤＮＡ希釈において、ゲノムマーカーのような核酸配列の増幅が起こる頻度を分析することによって、コピー数の頻度を判定する。
【０００７】
その方法は、腎細胞癌におけるヒト第３染色体の短腕をコピー数スキャニングして、非相互的転座の限界点の位置を３００ｂｐ以内に決めて、それをクローニングすることを可能にすることによって実証された。これは初めて腎細胞癌における新生非相互的転座の限界点をクローニングした。
【０００８】
（本発明の概要局面）
最初の局面において、以下の工程を含む、サンプル中の１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度を判定する方法を提供する：（ａ）サンプルの１つまたはそれ以上（例えば複数）のアリコートを提供すること、ここで各アリコートはアリコートあたり１ゲノムより少ない量で核酸を含む；（ｂ）第１の増幅反応において、アリコートそれぞれの１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する；（ｃ）２回目の増幅反応において、工程（ｂ）から得た、または得られるアリコートそれぞれの１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する、ここで少なくとも１つの核酸配列はテストマーカーである；および（ｄ）テストマーカーの増幅産物の数を、参照マーカーと比較することによって、テストマーカーのコピー数を計算する。
【０００９】
２番目の局面において、以下の工程を含む、核酸のサンプル中の１つまたはそれ以上の変化を同定する方法を提供する；（ａ）本発明の最初の局面の方法によって、１番目および２番目のサンプル中の１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度を判定する；（ｂ）任意でそれぞれのサンプルに関して、徐々により高い分解能で、その方法を反復する；および（ｃ）第１および２番目のサンプルにおける、１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度の１つまたはそれ以上の違いを同定する。
【００１０】
３番目の局面において、以下の工程を含む、被験体において疾患を診断する方法を提供する；（ａ）本発明の最初の局面の方法によって、サンプル中の１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度を判定する；および（ｂ）１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数を、１つまたはそれ以上の核酸配列の正常なコピー数と比較する；ここでサンプル中の１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数および１つまたはそれ以上の核酸配列の正常コピー数の間の違いは、その被験体がその疾患に罹患していることを示す。
【００１１】
本発明の４番目の局面において、以下の工程を含む、核酸のサンプル中の１つまたはそれ以上の変化をクローニングする方法を提供する：（ａ）本発明の２番目の局面によって、核酸のサンプル中の１つまたはそれ以上の変化を同定する；および（ｂ）その１つまたはそれ以上の変化をクローニングする。
【００１２】
本発明の５番目の局面は、非相互的ｔ（３；５）転座をコードする単離された核酸に関連し、ここで座標１０５３８６４４３ｂｐまでの染色体５ｑ２１．３が、座標７４１１１８９３ｂｐからの染色体３ｐ１３と融合しており、そしてここで接合部のアデニン残基はいずれかの染色体由来である。
【００１３】
６番目の局面は、請求２４−２７のいずれかによって、非相互的ｔ（３；５）転座の存在を決定する工程を含む、被験体において癌を診断する方法に関連し、ここで転座の存在は、その被験体が癌を有することを示す。
【００１４】
（好ましい実施態様）
好ましくは、第１の増幅反応における各アリコートは、増幅反応あたり約０．１−０．９ゲノムのＤＮＡを含む。
【００１５】
好ましくは、テストマーカーのコピー数を、テストマーカーおよび参照マーカーの増幅産物の数を手作業で算出することによって計算する。
【００１６】
好ましくは、テストマーカーのコピー数を、等式：Ｎｐ＝Ｎ（１−ｅ−Ｚ）を用いて計算し、ここでＮはアリコートの数である；Ｚはアリコートあたりの増幅産物の平均数である；そしてＮｐは、ポアソン分布によって少なくとも１分子の核酸を含むことが期待されるアリコートの数である。
【００１７】
好ましくは、テストマーカーのコピー数を、等式：Ｚ＝−ｌｎ（１−Ｎｐ／Ｎ）を用いて計算し、ここでＮは所与配列に関して試験した核酸のアリコートの数である；Ｎｐはその核酸に関して陽性であったアリコートの数である。
【００１８】
好ましくは、増幅反応を、ＰＣＲを用いて行う。
【００１９】
好ましくは、第１の増幅反応を、フォワードプライマーおよびリバースプライマーペアを用いて行う。
【００２０】
好ましくは２番目の増幅反応を、フォワード内部プライマーおよびリバースプライマーペアを用いて行う。
【００２１】
好ましくは、サンプルを、第１染色体、第２染色体、第３染色体、第４染色体、第５染色体、第６染色体、第７染色体、第８染色体、第９染色体、第１０染色体、第１１染色体、第１２染色体、第１３染色体、第１４染色体、第１５染色体、第１６染色体、第１７染色体、第１８染色体、第１９染色体、第２０染色体、第２１染色体、第２２染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体からなるグループから得る、または得ることができる。
【００２２】
好ましくは、アリコートにする前のサンプルにおける核酸の濃度を、ＵＶ分光測定によって決定する。
【００２３】
好ましくは、アリコートにする前のサンプルにおける核酸の濃度を、一倍体ゲノムあたり１つのコピーしか存在しないと考えられる１つまたはそれ以上の核酸を、２つまたはそれ以上の異なる希釈において増幅することによって決定し、ここで１つまたはそれ以上の核酸に関して陽性であることが見出された各希釈におけるサンプルの割合を、ＤＮＡ濃度の推定を正確にし、そして従って続く分析に必要な希釈を決定するために使用する。
【００２４】
好ましくは、４つの核酸を増幅し、そして６つの希釈を調製する。
【００２５】
好ましくは、サンプルは疾患を持つ被験体、または疾患を持たない被験体またはそれ由来である。
【００２６】
好ましくは、さらなる研究のために１つの領域に焦点を合わせる前に、染色体全体を最初にスキャンする。
【００２７】
好ましくは、本方法を最初は約２Ｍｂの分解能で行い、徐々に約１００塩基対またはそれ以下に下げる。
【００２８】
好ましくは、その変化は転座、増幅、重複または欠失である。
【００２９】
好ましくは、もし被験体由来の核酸のサンプル中の１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数が、正常コピー数より多いなら、転座、増幅または重複を示す。
【００３０】
好ましくは、もし被験体由来の核酸のサンプル中の１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数が、正常コピー数より少ないなら、欠失を示す。
【００３１】
好ましくは、その疾患は癌である。
【００３２】
好ましくは、その癌は腎臓癌である。
【００３３】
好ましくは、その被験体を、以下のものからなるグループから選択する：（ｉ）疾患に罹患した、または罹患していることが疑われる被験体；（ｉｉ）疾患の素因があることが公知の被験体；（ｉｉｉ）疾患を引き起こすことが公知である、または疑われる、１つまたはそれ以上の因子または状況に接触した被験体；および（ｉｖ）疾患を発症する過程にある、またはその過程にあることが疑われる被験体。
【００３４】
好ましくは、インバースＰＣＲ法を用いて、その変化をクローニングする。
【００３５】
好ましくは、染色体５ｑ２１．３は、配列ＴＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＧＧＡＴＡＴＡＴＧＴＡＴＡＡＡＡＴＣを含む。
【００３６】
好ましくは、染色体３ｐ１３は、配列ＴＡＧＧＧＡＧＴＧＡＡＧＴＡＧＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＴＧＣＣＡＧを含む。
【００３７】
好ましくは、非相互的ｔ（３；５）転座は、配列ＴＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＧＧＡＴＡＴＡＴＧＴＡＴＡＡＡＡＴＣＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＡＡＧＴＡＧＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＴＧＣＣＡＧを含む。
【００３８】
好ましくは、その癌は、腎細胞癌である。
【００３９】
利点
本発明は、多くの利点を有する。これらの利点は、以下の説明において明らかとなる。
【００４０】
例として、その方法は、配列を数百塩基対までの間隔で調査し得るので、有効に無制限の分解能を提供し、そして増幅した領域の特徴付けに同様に適用可能であるので、本発明は有利である。
【００４１】
さらなる例として、それは染色体の領域または完全なゲノムの迅速なスキャニングを可能にするために、その操作のためのゲノムデータベースおよびＰＣＲプライマーのライブラリーしか必要としないので、本発明は有利である。
【００４２】
さらなる例として、選択したマーカーの密度に依存して、あらゆるレベルの分解能を達成し得るので、本発明は有利である。従って、研究の領域を容易に制御し得る。
【００４３】
さらなる例として、他のＤＮＡ計測技術と異なり、本明細書中で記載される方法は、ゲノム全体の増幅またはいかなるハイブリダイゼーション工程も必要としないので、本発明は有利である。これは、領域特異的ゲノム増幅、プローブ内の反復配列の不完全な抑制から起こり得るあらゆる問題を回避し、そして短いオリゴアレイまたはアレイＣＧＨのためのＥ．ｃｏｌｉＤＮＡが混入したＢＡＣ／ＰＡＣの増幅において起こり得るような、交差ハイブリダイゼーションのリスクを除去する（９）。
【００４４】
さらなる例として、その方法は実質的にデジタル（分子コピー数を算出する）であり、それは結果の解釈を簡単にするが、一方マイクロアレイアプローチは、解釈のために計算アルゴリズムを必要とし得るので、本発明は有利である（２３）。
【００４５】
さらなる例として、その方法は自動化に向いており、そしてハイスループットに基づいて分析できるが、それはまた手作業での操作にも容易に適用可能であり、そして従って、アレイヤーのような機械の必須の必要性はないので、本発明は有利である。
【００４６】
さらなる例として、その方法は、きわめて少ない量のゲノムＤＮＡを必要とし、数十から数百と少ない細胞からのＤＮＡに適用可能であり、そしてＤＮＡは高分子量である必要はないので、本発明は有利である。その方法は、被験体からの前新生物生検材料の詳細な分析、保管された腫瘍サンプルのレトロスペクティブな分析、または腫瘍の異なる小さい領域間のゲノム変動性の調査のような、今まで実行不能だった研究を可能にする。
【００４７】
さらなる例として、本明細書中で記載された方法はまた、疾患に関係するか、またはヒトの変動の正常な範囲の一部を形成するかに関わらず、コピー数に影響を与える遺伝性染色体異常の分析を簡単にするので、本発明は有利である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
変化
本明細書中で使用する場合、「変化」という用語は、遺伝物質の喪失または獲得を含む、公知のまたは隠された変化のような、変化を指す。
【００４９】
適切に、変化は、２倍体状態からのコピー数の変化のような、コピー数の変化であり、それを本明細書中で記載された方法を用いて、ＤＮＡ反復頻度を判定することによって決定し得る。
【００５０】
１つの実施態様において、その変化は、染色体異常のような異常である。
【００５１】
１つの実施態様において、その変化は、転座（例えば不均衡な転座または非相互的転座）、増幅、複製、または欠失から成るグループから選択される。
【００５２】
特に好ましい実施態様において、その変化は、癌または腫瘍細胞由来の、またはそれから得られる核酸において検出される非相互的転座のような、非相互的転座である。
【００５３】
コピー数
「コピー数」という用語は、ヒトのような特定の有機体のゲノムにおける、特定の核酸配列（例えば遺伝子座）のコピー数を意味する。
【００５４】
テストマーカー
本明細書中で使用される場合、「テストマーカー」という用語は、核酸配列を指し、そのコピー数は本発明の方法によって決定される。
【００５５】
参照マーカー
本明細書中で使用される場合、「参照マーカー」という用語は、核酸配列を指し、そのコピー数は既知である、またはテストマーカーのコピー数を計算するために決定される。本明細書中で記載されるように、テストマーカーのコピー数は、テストマーカーの増幅産物の数を、参照マーカーのものと比較することによって計算する。
【００５６】
参照マーカーのコピー数を、本明細書中で記載された方法、または比較ゲノムハイブリダイゼーションまたはアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション等のような、核酸のコピー数を決定するために使用し得るあらゆる他の方法を用いて決定し得る。もちろん、そのコピー数は以前に記載されたかもしれないので、参照マーカーのコピー数を、文献を参照することによっても決定し得る。
【００５７】
本発明の１つの実施態様において、テストマーカーおよび／または参照マーカーを増幅する。
【００５８】
サンプル
本明細書中で使用される「サンプル」という用語は、本明細書中で記載されたような増幅による検出に適当な形式で、核酸、典型的にはＤＮＡ（好ましくはゲノムＤＮＡ）を含む、またはそれから成るサンプルを指す。本方法において使用されるサンプルは、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウマ、およびウシを含むがこれに限らない、あらゆる真核生物のような、実質的にあらゆる有機体由来であり得る。
【００５９】
好ましくは、そのサンプルはヒトである、またはヒト由来である。
【００６０】
そのサンプルは、個体または個体のグループから得られた、組織および／または液体のサンプルのような、有機体と関連する実質的にあらゆる供給源由来であり得る。説明的な例は、皮膚、血漿、血清、血液、尿、涙、臓器、脊髄液、リンパ液および腫瘍を含む。そのサンプルを、増殖培地、組み換え細胞、および細胞構成成分を含む、インビトロの細胞培養物から得ることさえできる。
【００６１】
サンプルを腫瘍の診断または研究のために取る場合、そのサンプルを、典型的には腫瘍組織または腫瘍形成の初期であることが疑われる組織から取る。濃縮技術によって、腫瘍の存在の評価のために必要なサンプルを、例えば血漿から腫瘍細胞またはＤＮＡを濃縮することによって得ることができる。
【００６２】
従って、多くの場合、そのサンプルは組織、または細胞サンプルであり、ここで核酸が単離および／またはクローニングおよび／または増幅される。それは例えば特定の染色体由来のゲノムＤＮＡ、または単位複製配列または欠失のような、特定の変化内の選択された配列（例えば特定のプロモーター、遺伝子、増幅または制限断片）であり得る。
【００６３】
細胞および組織サンプルを単離する方法は、当業者に周知であり、そして吸引、組織切片、針生検等を含むがこれに限らない。多くの場合、そのサンプルは「医学的サンプル」であり、それは組織学的目的のために取られた、凍結切片またはパラフィン切片のような組織の切片を含む、被験体由来のサンプルである。そのサンプルはまた、染色体の異常を検出する、および／またはコピー数を決定することが望ましくあり得る、細胞培養物からの上清（細胞の）または細胞自体、組織培養物および他の媒体からの細胞由来であり得る。
【００６４】
当該分野において公知の標準的な手順を用いて、必要な核酸をサンプルから単離し得る。
【００６５】
本明細書中で記載された方法の特定の適用は、例えば腫瘍および胎児組織を含む医学的標本由来の、対象の細胞または細胞集団からのＤＮＡ配列を分析するためである。
【００６６】
しかし、もし核酸、例えばＤＮＡを少数の細胞から（例えば特定の腫瘍小領域から）、または単一の細胞から抽出するなら、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順によって、または非ポリメラーゼ連鎖反応（非ＰＣＲ）手順によって、その核酸を増幅することが必要であり得る場合もある。ＰＣＲおよび好ましいＰＣＲ手順を、本明細書中で記載する。代表的な非ＰＣＲ手順は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および本明細書中で記載されたような適当なプライマーおよびその伸長（ランダムプライミング）を用いることによる直線状の増幅を含む。
【００６７】
好都合なことに、保存された組織標本、例えばパラフィン包埋またはホルマリン固定病理学標本由来の核酸を、本明細書中で記載された方法によって試験し得る。そのような標本由来の核酸を、Ａｎａｔｏｍｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ９５（２）：１１７−１２４（１９９１）およびＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４６：２９６４−２９６９（１９８６）において記載されたもののような、公知の技術によって抽出し得、そしてもし必要なら、試験のために増幅し得る。そのような核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順を用いることによって増幅し得、ここで例えばパラフィン包埋組織由来のＤＮＡをＰＣＲによって増幅する。
【００６８】
そのような保存された核酸を試験することに特に価値があるのは、そのような標本は通常、その標本が取られた被験体の医学的記録を伴うということである。従って、被験体の核酸材料の明らかになった状態および治療の医学的履歴およびそれらの被験体の予後の間に、貴重な診断的／予後的関連付けがなされ得る。例えば、本明細書中で記載された方法によって集められた情報を、その予後が公知である被験体の同様のパターンとの関連にマッチする増幅および／または欠失パターンに基づいて、腫瘍の浸潤性を予測するために使用し得る。
【００６９】
同様に、天然の固定過程によって保存された考古学的材料のような、他の方法によって固定された他の核酸も研究し得る。種間のコピー数の差異は、研究している種の類似性および相違の程度についての情報を提供する。従って、本明細書中で記載された方法を用いることによって、実存のまたは絶滅した種の間またはその中での進化的に重要な連結および分離をなし得る。
【００７０】
本明細書中で記載されたように、一旦サンプルが調製されたら、それを１つまたはそれ以上のアリコート（例えば複数のアリコート）に分け得る。アリコートの数の関係において、「複数」という用語は、２またはそれ以上、好ましくは１０またはそれ以上、好ましくは２０またはそれ以上、好ましくは３０またはそれ以上、好ましくは４０またはそれ以上、好ましくは６０またはそれ以上、好ましくは８０またはそれ以上、好ましくは９０またはそれ以上、またはさらに好ましくは１００、２００、３００、４００、６００、８００またはさらに１０００またはそれ以上を意味する。
【００７１】
特に好ましい実施態様において、本発明の方法を、複数のウェルを含む１つまたはそれ以上のプレートで行う。好ましくは、そのプレートは９６穴または３８４穴を含む。他の適当なサイズのプレートも使用し得る。よって、サンプルのアリコートの数は、典型的にはプレートのウェルの数に関係する。しかし、そのようなプレートを使用する場合、１つまたはそれ以上のウェルをコントロールとして使用し得るので、サンプルは必ずしもそれぞれおよび全てのウェルにアリコートに分ける必要はない。例として、もし実験を１つまたはそれ以上の９６穴プレートで行うなら、各プレートの約８またはそれくらいのウェルを、ネガティブコントロールとして使用し得、それはサンプルのアリコートと接触しない。言い換えると、ネガティブコントロールは、サンプルである、またはサンプル由来の、ゲノムＤＮＡのような核酸を欠く
本発明によって使用されるサンプルの各アリコートは、ＨＡＰＰＹマッピングに関して記載されたように、増幅反応あたり１ゲノム未満を含む（２２）。好ましくは、本発明によって使用されるサンプルの各アリコートは、増幅反応あたり約０．９、約０．８、約０．７、約０．６、約０．５、約０．４、約０．３、約０．２または約０．１ゲノムまたはそれより少ない量を含む。より好ましくは、本発明によって使用されるサンプルの各アリコートは、増幅反応あたり約０．１−０．９ゲノムまたは増幅反応あたり約０．３−０．５ゲノムのような、増幅反応あたりあらゆる適当な開始または終了点からなる範囲の数のゲノムを含む。最も好ましくは、本発明によって使用されるサンプルの各アリコートは、増幅反応あたり約０．３ゲノムを含む。
【００７２】
アリコートに分ける前にサンプル中の正確なＤＮＡ濃度を決定するために、サンプルあたり０．２５および８ゲノムの間のＤＮＡを与えることが予測される（ＵＶ分光光度法によって決定されたＤＮＡ濃度に基づいて）範囲のＤＮＡ希釈を用いて、最初の試験を行い得る。核酸サンプルあたり約４つの核酸配列を、１倍体ゲノムあたり１コピーしか存在しないと考えられる、異なる核酸配列に関して、６つの希釈のような、異なる希釈において分析し得る。これらのマーカーに関して陽性であることが見出された各希釈におけるサンプルの割合を使用して、核酸濃度の推定を正確にし、そして従って続く分析に必要な希釈を決定する。
【００７３】
増幅
本明細書中で使用される場合、「増幅」は、インビトロで、ゲノムＤＮＡのような核酸の鎖を増加させるあらゆる過程を指す。
【００７４】
好ましくはその過程は酵素的であり、そして特徴において線形または指数関数的である。
【００７５】
増幅技術は、サーマルサイクリング増幅法および等温増幅法として広く分類される方法を含むがこれに限らない。適当なサーマルサイクリング法は、例えばリガーゼ連鎖反応を含む（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０（１９８９）；およびＳｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７（１９８８））。リガーゼ連鎖反応は、ＤＮＡリガーゼ、および標的鎖あたり２つの、４つのオリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドは増幅される核酸の隣接する配列にハイブリダイズし、そしてリガーゼによって連結される。反応は熱変性され、そしてサイクルを反復する。本発明において有用な等温増幅法は、例えば鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３９２−３９６（１９９２））、Ｑ−ベータ−レプリカーゼ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７−１２０２（１９８８））；核酸に基づく配列増幅（ＮＡＳＢＡ）（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３−５６５（１９９５））；および自家持続配列複製法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８（１９９０））を含む。
【００７６】
特に好ましい増幅法はＰＣＲである。当業者に周知であるように、これは実質的にあらゆる核酸配列を、選択的に増幅し得る方法である。その方法は、ＤＮＡの反対の鎖にハイブリダイズし、そして増幅する配列の限界を規定する、前もって決定した配列の、対になったオリゴヌクレオチドのセットを使用することを含む。そのオリゴヌクレオチドは、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼによって触媒される、連続する複数回のＤＮＡ合成を開始する。合成の各回を、典型的には溶解および再アニーリング工程によって分け、当該ＤＮＡ配列を１時間以内で数百倍に増幅することを可能にする（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７、１９８８）。本明細書中で記載されるように、１つ以上の核酸を、複数の対になったプライマーを採用する多重ＰＣＲによって、同時に増幅し得る。
【００７７】
核酸を、増幅の間またはその後に、１つまたはそれ以上のヌクレオチドにおいて標識し得る。
【００７８】
本明細書中で記載されるように、その方法を、２相増幅反応を用いて行う。
【００７９】
第１の増幅反応
第１の増幅反応は、典型的には、１つまたはそれ以上、好ましくは２つまたはそれ以上（例えば複数）の核酸配列を増幅するために、複数の外側プライマーによる増幅工程である。大きな遺伝子および転写物、または規定されていない遺伝子を分析する場合、変化を同定するために、多くの場合複数の個々の増幅反応が必要である。従って、大きく複雑な遺伝子の分析を能率的にするために、単一の増幅反応において、異なる核酸配列を同時に増幅するための多重プライマーを利用し得る。多重プライマーの調製方法は、例えば米国特許第６，２０７，３７２号において報告されるように、当該分野で公知である。
【００８０】
１つの実施態様において、１つまたはそれ以上のマーカーを増幅する（例えばテストマーカーおよび／または参照マーカー）。
【００８１】
別の実施態様において、２つまたはそれ以上のマーカーを増幅する（例えばテストマーカーおよび／または参照マーカー）。
【００８２】
別の実施態様において、全てのマーカーを増幅する。
【００８３】
別の実施態様において、１つまたはそれ以上の配列またはマーカーの全てのコピーを増幅する。
【００８４】
別の実施態様において、関心のある染色体またはゲノム領域または遺伝子座における、１つまたはそれ以上のマーカー、２つまたはそれ以上のマーカー、または全てのマーカーを増幅する。
【００８５】
第１の反応に関して、核酸を調製し、そしてアリコートあたり約１ゲノム未満に希釈する。選択した増幅方法がＰＣＲなら、Ｇｏｌｄ  ＰＣＲ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）のようなＰＣＲ緩衝液、約２ｍＭのＭｇＣｌ２のようなＭｇＣｌ２、約２００μＭの各ｄＮＴＰのようなｄＮＴＰ、および約０．１Ｕ／μｌのＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）のようなＴａｑＤＮＡポリメラーゼ−中に、増幅する全ての配列のプライマーを含む、マスターミックスを調製し得る。
【００８６】
適切に、核酸を複数のアリコートに分ける。
【００８７】
適切に、核酸を、複数の同一のまたは実質的に同一のアリコートに分ける。
【００８８】
適切に、調製したアリコートのそれぞれを、ウェルまたは容器に入れる。よって、本発明の１つの実施態様において、増幅反応を、例えば９６穴プレートを用いて、並行して行う。従って、マスターミックスのアリコートを、９６穴プレートの８ウェルに分配し（ネガティブコントロール）、そして続いて約０．０３ゲノム／μｌのゲノムＤＮＡを分析のためにマスターミックスに加える。このミックスのアリコート（それぞれ約０．３ゲノムのＤＮＡを含む）を、残りのウェルのそれぞれにアリコートに分けて、そしてコントロールウェルにゲノムＤＮＡを欠く等価な混合物を加える（ネガティブコントロール）。全てのサンプルを、鉱油（約２０μｌ）で覆う。
【００８９】
アリコートのそれぞれにおいて１つまたはそれ以上のマーカーを増幅するために、第１の増幅反応を行い得る。好ましくは、アリコートのそれぞれにおける全てのマーカーを増幅する。サーモサイクリングを、典型的には約９３℃で約９分間のホットスタート、続いて約９４℃で約２０秒間、約５２℃で約３０秒間、および約７２℃で１分間の約２５サイクルによって行う。当業者は、このサーモサイクリング反応を変化させ得ることを認識する。
【００９０】
増幅産物のそれぞれを、そこに含まれる核酸を増幅するための、２番目の増幅反応に十分な量まで希釈する。
【００９１】
本発明の１つの実施態様において、第１の増幅反応を自動化することが望ましい。
【００９２】
２番目の増幅反応
適切に、第１の増幅反応からの１つまたはそれ以上（例えばそれぞれの）増幅産物を、１つまたはそれ以上のレプリカサンプルまたはレプリカアリコートに再分する、または分ける。
【００９３】
適切に、第１の増幅反応からの１つまたはそれ以上（例えばそれぞれの）増幅産物を、１つまたはそれ以上のレプリカウェルまたはレプリカ容器に再分する、分ける、または分配する。
【００９４】
よって、２番目の増幅反応の前に、第１の増幅反応からの増幅産物の、１つまたはそれ以上のレプリカセットを調製する。適切に、増幅産物のレプリカセットは、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の、第１の増幅反応からのそれぞれの増幅産物を含む。好ましくは、増幅産物のレプリカセットは、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の、第１の増幅反応からのそれぞれの増幅産物を含む。
【００９５】
典型的には、第１の増幅反応からの、１つまたはそれ以上の（例えばそれぞれの）アリコートを、増幅されるマーカーの数と関連する、多くのレプリカサンプル、アリコート、ウェル、または容器に再分する、または分ける、または分配する。適切に、１つのマーカーをレプリカサンプル、アリコート、ウェルまたは容器のそれぞれにおいて増幅する。従って、例として、４つのマーカーを増幅するなら、第１の増幅反応からの各アリコートを、４つのレプリカサンプル、アリコート、ウェルまたは容器に、再分する、分ける、または分配する。最初のマーカーを最初のレプリカサンプル、アリコート、ウェルまたは容器で増幅し、２番目のマーカーを２番目のレプリカサンプル、アリコート、ウェルまたは容器で増幅する等である。
【００９６】
本発明の１つの実施態様において、第１の増幅反応から得た、または得ることができる、１つまたはそれ以上の増幅産物を増幅する。
【００９７】
典型的には、２番目の増幅反応を、セミネステッド増幅反応を用いて行い、ここで第１の増幅反応で使用したのと同じリバースプライマーを、増幅する各マーカーのためのフォワード内部プライマーと組み合わせて使用する。
【００９８】
もし２番目の増幅反応を、ＰＣＲを用いて行うなら、典型的には、セミネステッドＰＣＲは、約１．５ｍＭのＭｇＣｌ２のようなＭｇＣｌ２、および約１μＭの関連するフォワード内部プライマーおよびリバースプライマーを利用する。他の濃度は、前のような、第１の増幅反応で使用したものとほぼ同じである。
【００９９】
１つの実施態様において、サーモサイクリングを、約９３℃で約９分間、続いて約９４℃で２０秒間、約５２℃で約３０秒間、および約７２℃で約１分間の約３３サイクルで行う。当業者は、このサーモサイクリング反応が変化し得ることを認識する。
【０１００】
好都合なことに、２番目の段階の増幅反応を、複数の３８４穴マイクロタイタープレートで機械的に設定し、９６個の第１の増幅反応のそれぞれを、異なるマーカーのそれぞれに関してスクリーニングし得る。従って、例として、４つの核酸配列を２番目の増幅でスクリーニングするなら、３８４穴プレートを使用して、それによって４つの核酸配列それぞれに関して９６穴を提供し得る。あるいは、もし機械化システムではなく、マルチチャンネルピペットを移動のために使用するなら、２番目のセミネステッド増幅段階を、２番目の９６穴プレートで行い得る。
【０１０１】
本発明の１つの実施態様において、２番目の増幅を自動化することが好ましい。
【０１０２】
本発明の１つの実施態様において、第１および２番目の増幅を自動化することが好ましい。
【０１０３】
好都合なことに、本明細書中で記載した方法を、他の増幅反応と組み合わせて使用し得る。例として、本明細書中で記載した方法を、相互的転座のような遺伝的異常を検出する、１つまたはそれ以上のＰＣＲ反応と組み合わせて使用し得る。
【０１０４】
さらなる局面において、以下の工程を含む、サンプル中で１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度を判定する方法を提供する：（ａ）サンプルの複数のアリコートを提供する、ここで各アリコートは、アリコートあたり１ゲノムより少ない量で核酸を含む；（ｂ）第１の増幅反応において、複数のアリコートのそれぞれからの、１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する；（ｃ）２番目の増幅反応において、工程（ｂ）によって調製した複数のアリコートのそれぞれからの、１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する、ここで少なくとも１つの核酸配列はテストマーカーである；および（ｄ）テストマーカーの増幅産物の数と、参照マーカーのものを比較することによって、テストマーカーのコピー数を計算する。
【０１０５】
さらなる局面において、以下の工程を含む、サンプル中で１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度を判定する方法を提供する：（ａ）サンプルの複数のアリコートを提供する、ここで各アリコートは、アリコートあたり１ゲノムより少ない量で核酸を含む；（ｂ）第１の増幅反応において、複数のアリコートのそれぞれからの、１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する；（ｃ）２番目の増幅反応において、工程（ｂ）によって調製した複数のアリコートのそれぞれからの、２つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する、ここで少なくとも１つの核酸配列はテストマーカーであり、そして少なくとも１つの核酸配列は参照マーカーである；および（ｄ）テストマーカーの増幅産物の数と、参照マーカーのものを比較することによって、テストマーカーのコピー数を計算する。
【０１０６】
さらなる局面において、以下の工程を含む、サンプル中で１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度を判定する方法を提供する：（ａ）サンプルの１つまたはそれ以上の（例えば複数の）アリコートを提供する、ここで各アリコートは、アリコートあたり１ゲノムより少ない量で核酸を含む；（ｂ）第１の増幅反応において、各アリコートからの、１つまたはそれ以上の（好ましくは全ての）マーカーを増幅する；（ｃ）第１の増幅反応からの増幅産物をそれぞれ、レプリカサンプルに分配する；（ｄ）２番目の増幅反応において、工程（ｃ）によって調製されたレプリカサンプルにおける各アリコートから１つまたはそれ以上のマーカーを増幅する、ここで少なくとも１つの核酸配列はテストマーカーである；および（ｅ）テストマーカーの増幅産物の数と、参照マーカーのものを比較することによって、テストマーカーのコピー数を計算する。
【０１０７】
さらなる局面において、以下の工程を含む、サンプル中で１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度を判定する方法を提供する：（ａ）サンプルの１つまたはそれ以上の（例えば複数の）アリコートを提供する、ここで各アリコートは、アリコートあたり１ゲノムより少ない量で核酸を含む；（ｂ）第１の増幅反応において、各アリコートからの、１つまたはそれ以上の（好ましくは全ての）マーカーを増幅する；（ｃ）第１の増幅反応からの増幅産物をそれぞれ、レプリカサンプルに分配する；（ｄ）２番目の増幅反応において、工程（ｃ）によって調製されたレプリカサンプルにおける、各アリコートから２つまたはそれ以上のマーカーを増幅する、ここで少なくとも１つの核酸配列はテストマーカーであり、そして少なくとも１つの核酸配列は参照マーカーである；および（ｅ）テストマーカーの増幅産物の数と、参照マーカーのものを比較することによって、テストマーカーのコピー数を計算する。
【０１０８】
プライマー
増幅において使用するプライマーを、増幅する核酸配列（例えば遺伝子座）の隣接領域の配列にハイブリダイズし得るように選択する。プライマーを、増幅する核酸の異なる鎖と、少なくとも実質的な相補性を有するよう選択する。
【０１０９】
プライマーは、重合のための薬剤の存在下で、伸長産物の合成を開始し得るように十分な長さを有していなければならない。プライマーの長さおよび組成は、例えばアニーリング反応を行う温度、プライマーの濃度、およびプライマーの特定の核酸組成を含む、多くのパラメーターに依存する。典型的には、プライマーは１５−３０ヌクレオチド、好ましくは１８−２０ｂｐを含む。本発明のいくつかの実施態様に関して、プライマーが約５２−６０℃の間のＴｍを有することが好ましい（計算Ｔｍ＝２×（Ａ＋Ｔ）＋４×（Ｇ＋Ｃ））に基づく）。好ましくは、そのデザインは、３’末端に少なくとも２つのＧまたはＣ塩基、および５’末端に少なくとも１つを含む。典型的には、４塩基より長い単一塩基の一続きを有するプライマーは使用しない。内側アンプライマーの長さを、約８０−１５０ｂｐの間であるようデザインし、そして外側プライマーの位置はフォワード内側プライマーの約１５０ｂｐより上流ではない。
【０１１０】
プライマーの長さは、当業者に公知のものに加えて、プライマー結合部位の複雑性および上記で列挙した因子に多少は依存し得る。
【０１１１】
典型的には、プライマーは特定のヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする。本明細書中で使用される場合「特異的にハイブリダイズする」という用語は、ストリンジェントな条件下で、特定のヌクレオチド配列に選択的な核酸の結合、２本鎖形成、またはハイブリダイズを指す。「ストリンジェントな条件」という用語は、プライマーがその標的サブ配列に選択的にハイブリダイズし、そして他の配列により少ない程度ハイブリダイズする、または全くハイブリダイズしない条件を指す。
【０１１２】
プライマーを、当該分野において周知の方法によって合成し得る。
【０１１３】
プライマーの選択を、例えば、Ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ．ｏｒｇ）を用いてゲノム配列（Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＮＣＢＩ  ３５、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）から反復要素をマスキングした後、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒを含む、当該分野で公知の様々な方法を用いて行い得る（例えばＰＣＲの従来の使用のためのデザインと同様）。
【０１１４】
上記で記載したような第１の増幅反応において、典型的には、増幅する各核酸配列に関してフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、プライマーを使用する。第１の増幅反応において、全てのマーカーのような複数の核酸配列を増幅するように、複数のプライマーペアを単一の多重反応において組み合わせ得る。
【０１１５】
上記で記載されたような２番目の増幅反応において、セミネステッド増幅反応を、典型的には増幅する特定の核酸配列それぞれに関して行う。使用するプライマーは、フォワード内部プライマーと組み合わせた、第１の増幅反応で使用したような適当なリバースプライマーである。本発明のいくつかの実施態様に関して、使用するプライマーはフォワードプライマーおよびリバース内部プライマーであることが好ましい。本発明のいくつかの実施態様に関して、使用するプライマーが、第１の増幅反応で使用したものと同じまたは実質的に同じであることが好ましい。典型的には、約０．１５μＭの各プライマーを、第１の増幅反応で使用する。典型的には、約１μＭの関連するフォワード内部プライマーおよびリバースプライマーを、２番目の増幅反応に使用する。
【０１１６】
本発明の１つの実施態様において、単一の反応において、それぞれ特定の染色体再編成に関するいくつかのプライマーペアを使用する。プライマーの各ペアは、異なる長さの増幅産物を生じ、そしてそのために増幅産物を区別し得る。
【０１１７】
本発明のさらなる実施態様において、標識したプライマーを使用し、ここで各プライマーペアを異なる標識で標識し、そしてそのために増幅産物を区別し得る。
【０１１８】
従って、好都合なことに、複数の染色体再編成を分析し得る。
【０１１９】
コピー数の決定
２番目の増幅反応の後、増幅産物を様々な方法で分析して、増幅した配列のコピー数を決定し得る。
【０１２０】
例として、サンプルの各アリコートにおける増幅産物の存在または欠如を評価するために、電気泳動を用いて増幅産物を分離することによって、増幅産物を分析し得る。
【０１２１】
さらなる例として、その結果を、融解曲線分析によって評価し得る。
【０１２２】
その結果を、陽性ウェルの数の視覚的評価によって評価し得る。例として、もし２つの核酸マーカー（ＡおよびＢ）を８８アリコートの同じセットにおいて評価するなら、そしてもし各マーカーに関して陽性と評価されるアリコートの数がそれぞれ３４および５６であるなら、２つの配列の平均濃度は、それぞれアリコートあたり０．４９および１．０コピーと計算し得る。従って、もし配列Ａが、ゲノムあたりＮコピー存在することが公知であるなら、配列Ｂはゲノムあたり２Ｎコピー存在することを推測し得る。
【０１２３】
核酸分子がＮ個のアリコートの中で無作為に分布して、アリコートあたり平均Ｚ分子を与えるなら、ポアソン分布によって、少なくとも１分子の核酸を含むことが予測されるアリコートの数Ｎｐは、以下の等式によって与えられる：
Ｎｐ＝Ｎ（１−ｅ−Ｚ）  （ｉ）
逆に、もし核酸のＮ個のゲノム以下の（ｓｕｂ−ｇｅｎｏｍｉｃ）アリコートのパネルを、所定の配列の存在に関して試験するなら、そしてもしこれらのアリコートのＮｐ個がその配列に関して陽性と評価されるなら（すなわち少なくとも１コピーのその配列を含むなら）、アリコートあたりのその配列の平均分子数は、以下のように計算し得る：
Ｚ＝−ｌｎ（１−Ｎｐ／Ｎ）  （ｉｉ）
従って、あらゆる所定の配列に関して陽性と評価されるアリコートの数から、その配列の濃度（アリコートあたりのコピー数で表される）を決定し得る。もし核酸のアリコートの同じセット（または同様のセット）について、２つまたはそれ以上の配列をこの方法で分析するなら、その相対的な濃度、および従ってその相対的な量を計算し得る。
【０１２４】
変化の同定
本発明のさらなる局面において、以下の工程を含む、核酸のサンプルにおいて１つまたはそれ以上の変化を同定する方法を提供する：（ａ）本発明の最初の局面の方法によって、核酸のサンプルにおいて１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数を決定する；および（ｂ）徐々により高い分解能で、その方法を反復する。
【０１２５】
よって、本発明の最初の局面の方法を、徐々により小さい間隔をあけた核酸配列を増幅することによって反復する。典型的には、ゲノム変化の粗い画像を、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）のような、当該分野で既知の方法を用いて得ることができる。そのような方法は、例えば限界点のような、ゲノム変化の付近の特定の染色体における配列のコピー数の推定を提供するために有用であり得る。しかし、関心のあるゲノム変化をさらに規定するために、本発明の方法を、徐々により高い分解能で反復することによって、有利に使用し得る。従って、例えば１回目において、ゲノム変化が起こることが以前に見出された染色体の領域における、約３．８Ｍｂにわたる約０．２−０．５Ｍｂの間隔をあけたマーカーを使用し得る。推定のゲノム変化を約４０ｋｂ以内にさらに精密にするために、約５０ｋｂの間隔のマーカーを使用して、続く回を行い得る。ゲノム変化の位置を、約１−４ｋｂおよび次いで５００ｂｐ以下に決定するために、またさらなる回を行い得る。そのような高い分解能において、その方法をさらに、転座のセントロメア側の欠失のような、他のゲノム変化を同定するために使用し得る。
【０１２６】
疾患
疾患細胞において、多くの染色体領域または特定の遺伝子が、変化したコピー数で存在すると同定された。あらゆる特定の核酸配列のコピー数は、典型的には、２倍体の個体においては２であり、各染色体上の、１コピーの核酸配列の存在を反映する。コピー数の変化は、これらの領域によってコードされるタンパク質の異常なレベル、または活性を引き起こし、そして最終的には疾患の表現型を引き起こすことが、広く受け入れられている。
【０１２７】
１つの局面において、以下の工程を含む、核酸のサンプルにおいて１つまたはそれ以上の変化を同定する方法が提供される：（ａ）本発明の最初の局面の方法によって、第１のサンプルおよび２番目のサンプル中の、１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度を判定する；（ｂ）各サンプルに関して、徐々により高い分解能でその方法を反復する；および（ｃ）第１および２番目のサンプルにおいて、１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度の、１つまたはそれ以上の差異を同定する。
【０１２８】
好ましい実施態様において、そのサンプルは、疾患を持つ被験体、または疾患を持たない被験体であるか、またはそれ由来である。特に好ましい実施態様において、疾患の核酸は、癌に罹患した被験体または被験体由来である。よって、その方法を、癌ゲノムおよび正常ゲノムの間の、１つまたはそれ以上の変化を同定するために使用し得る。
【０１２９】
本発明はまた、核酸のコピー数の変化を検出することに基づく、疾患に罹患した、または罹患したことが疑われる被験体において、疾患を診断する方法も提供する。試験する被験体は、疾患の症状または疾患と関連し得る症状を示し得る。その被験体は、いかなる症状も示さない可能性があるが、その代わり家族歴または例えば本明細書中の下記で記載したような遺伝的試験（例えば遺伝的フィンガープリンティング）によって、疾患にかかりやすい、または素因を有することが疑われ得る。その被験体は、疾患を引き起こすことが公知である、または疑われる、１つまたはそれ以上の因子または状態に接触した被験体であり得る。その被験体はさらに、疾患を発症する過程である、またはその過程であることが疑われる被験体でもあり得る。１つの局面において、以下の工程を含む、疾患に罹患している、または罹患していると疑われる被験体において、疾患を診断する方法を提供する：（ａ）本発明の最初の局面の方法によって、サンプル中の１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度を判定する；および（ｂ）１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数を、１つまたはそれ以上の核酸配列の正常な（例えば疾患でない）コピー数と比較する；ここでコピー数の間の差異は、その被験体がその疾患に罹患していることを示す。
【０１３０】
典型的には、正常なコピー数を、試験するその疾患に罹患していない被験体または複数の被験体からのサンプルを分析することによって決定する。
【０１３１】
試験する被験体における１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数および正常コピー数の間の差異は、変化が存在すること、およびその被験体がその疾患に罹患していることを示す。
【０１３２】
共通の疾患を有することが公知である、多くの異なる個体からのサンプルも使用し得る。変化したコピー数を有する核酸配列を同定するために、疾患の個人のそれぞれに関して、多くの異なる核酸配列のコピー数頻度を決定するためのスクリーニングテストを行い得る。例えば腫瘍を有する個人に関して、サンプルを各個人に関して腫瘍領域から取り得、そして変化したコピー数を有するゲノムの領域を同定するためにスクリーニングを行う。そのような情報によって、変化したコピー数を有する核酸配列および特定の疾患の間の関連付けを行い得る。従って、本発明の方法を、特定の疾患と関連している、核酸配列の変化を同定するために使用し得る。
【０１３３】
従って、さらなる局面において、以下の工程を含む、疾患に罹患している、または罹患していることが疑われる、疾患の素因を有することが公知である（例えば家族歴または遺伝的フィンガープリンティングのような遺伝的試験によって）、疾患を引き起こすことが公知である、または疑われる、１つまたはそれ以上の因子または状態に接触した、または疾患を発症する過程にある、またはその過程にあることが疑われる被験体において、疾患を診断する方法を提供する：（ａ）疾患の原因である、または疾患に関連していることが公知である、サンプル中の１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度を判定する；および（ｂ）サンプル中の１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数を、疾患の原因である、または疾患に関連していることが公知であるサンプル中の１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度と比較する；ここでコピー数の間の関連は、その被験体がその疾患に罹患していることを示す。
【０１３４】
１つの実施態様において、その疾患は、腎臓癌のような癌であり得る。
【０１３５】
本発明はさらに、腫瘍細胞である、または腫瘍細胞由来であるサンプルのような、１つまたはそれ以上のサンプルにおいて、増幅および／または欠失のような、１つまたはそれ以上の変化を検出する方法を提供する。得られる結果を使用して、続くサンプルの性質を決定し得る。サンプル中の変化のパターンを、そのサンプルの性質と関連付けることによって、決定し得る。例えば診療記録と関連した保存サンプル由来のＤＮＡを試験することによって、または新規のサンプルを本明細書中で記載された方法によって試験し、そして被験体をフォローする場合に、そのような関連付けを行い得る。
【０１３６】
本発明の別の局面は、好ましくは発症の早い段階で、異常が疑われる細胞または組織由来の細胞を分析する方法を提供することである。本明細書中で記載された方法の利点は、分析のために少量のゲノム核酸しか必要としないことである。そのような細胞または組織における、増幅および／または欠失のような変化の早期検出は、遺伝的再編成に合わせて作り得る、早期の治療的介入を可能にする。さらに、そのような早期検出は、細胞または組織の進行を、本発明の方法によって検出される遺伝的再編成と関連付ける手段を提供する。
【０１３７】
これらの方法を用いて、スクリーニングを、迅速におよび安価に行い得る。従って、その方法は、分子病理学プロファイルの発達に適切であり得、それは医師がより多くの情報に基づいて患者の予後を診断し、そして異なる治療に対する患者の反応をよりよく予測することを可能にして、従って臨床結果を改善する。
【０１３８】
疾患の症状を有する被験体に関して、本明細書中で記載された方法をまた使用して、その被験体が有する症状と関連している疾患と関連していることが公知であるコピー数の変化を、その被験体が有するかどうかを決定し得る。例えば、腫瘍を有する被験体に関して、医師は腫瘍のサンプルを得る。特定の腫瘍型に関連することが公知である核酸配列にコピー数の変化が存在するかどうかを同定するための、腫瘍サンプルのスクリーニングを、本明細書中で記載された方法を用いて迅速に達成し得る。コピー数の変化に関する特定の情報、および特定の変化に関する、疾患の予後および異なる治療戦略の効果の間の関連についての知識によって、医師は、患者の予後および最も効果的な治療選択肢に関して、情報に基づく決定をし得る。例えば、その方法が、特定の核酸配列が増幅していること、およびその遺伝子座の増幅は、低い回復率と関連していることを示すなら、医師は、攻撃的治療の選択肢の可能性のある有効性、および特に疾患がかなり進行しているなら、そのような治療をただ見合わせるという選択肢に関して、依頼人に助言し得る。他方、高い回復率と関連する遺伝子座でコピー数が変化しているなら、医師は、ただ疾患をモニターして病状が悪化するかどうか見ることから、または疾患が悪化する前に攻撃することを保証するためのより攻撃的な処置まで、様々な範囲の治療選択肢を説明し得る。
【０１３９】
従って、さらなる局面において、その被験体が罹患していることが疑われる疾患と関連していることが公知である、１つまたはそれ以上の核酸配列において、本発明の最初の局面による方法を用いて、コピー数の変化が存在するかどうかを同定する工程を含む、被験体が、疾患と関連していることが公知である、１つまたはそれ以上のコピー数の変化を有するかどうかを決定するための方法を提供し、ここで被験体におけるコピー数の変化および疾患におけるコピー数の変化の間の関連は、その被験体がその疾患に罹患していることを示す。
【０１４０】
癌
「腫瘍」または「癌」という用語は、制御不能の増殖、不死、転移可能性、速い成長および増殖速度、およびある特徴的な形態学的特徴のような、癌を引き起こす細胞に典型的な特徴を有する細胞の存在を指す。
【０１４１】
多くの場合、癌細胞は腫瘍の形式であるが、そのような細胞は単独で動物内に存在し得る、または白血病細胞のような、非腫瘍原性癌細胞であり得る。
【０１４２】
癌は、黒色腫、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系の癌、末梢神経系の癌、食道癌、子宮頸癌、子宮または子宮内膜癌、口腔または咽頭癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆管癌、小腸または盲腸癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉種、軟骨肉腫等を含むがこれに限らない。
【０１４３】
腫瘍は、核型が不均一であり得、それぞれ異なる型の遺伝的再編成を有する、様々な細胞の集団を含む。腫瘍細胞は培養するのが困難であり、そして培養細胞が、もとの腫瘍細胞集団を代表するかどうかは明らかでない。本発明は、少量の核酸しか必要としないため、培養の障害を回避する手段を提供し、そして従って腫瘍細胞、および従って腫瘍の不均一性の遺伝的特徴付けを可能にする。
【０１４４】
多くの腫瘍細胞からの大規模な核酸の抽出も、腫瘍内の一致する変化に関して試験するために使用し得る。
【０１４５】
本発明のさらなる局面において、被験体において本明細書中で記載されたように、非相互的ｔ（３；５）転座の存在を決定する工程を含む、被験体の癌に対する罹患率を検出する、診断する、または決定する方法も提供し、ここで転座の存在は、その被験体が癌を有する、発症しそうである、またはその素因を有することを示す。好ましくは、その癌は腎細胞癌である。
【０１４６】
さらなる適用
好都合なことに、本明細書中で記載された方法は、１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度を決定するための、迅速、正確、および安価な方法を提供する。これは、その方法を、多くの疾患の分子分析、および例えば健康を脅かす症候群と関連する染色体の不均衡の評価に理想的にする。
【０１４７】
予後
本明細書中で記載された方法を用いて、ある疾患の表現型および被験体の予後の間の関連を発達させ得る。例えば、その方法を用いて、異常なコピー数を有する核酸を同定するために、同じみかけの疾患の症状を有する、様々な異なる被験体からの、多数の核酸をスクリーニングし得る。この場合、疾患の組織からサンプルを得る。変化したコピー数を有する核酸および疾患の予後の間に関連をつけるために、試験した個人それぞれの健康歴を維持し得る。この方法において、コピー数の変化および被験体の予後の間を関連付け得る。
【０１４８】
よって、さらなる局面において、以下の工程を含む、被験体の予後を決定する方法も提供する：（ａ）本発明の最初の局面による方法を用いる被験体と、同じ見かけの疾患症状を有する、１人またはそれ以上の被験体から、１つまたはそれ以上の核酸のコピー数頻度を決定する；（ｂ）異常なコピー数を有する核酸を同定する；（ｃ）変化したコピー数を有する核酸と、疾患の予後を関連付ける；および（ｄ）被験体において疾患の予後を予測する。
【０１４９】
最適な治療戦略
薬剤を初めて被験体に投与する前に、本明細書中で記載された方法を日常的に適用し得る。もしその被験体が、特定の薬物の解毒に必要な酵素を発現する遺伝子の両方のコピーを欠くことが見出されたら、一般的に被験体にその薬剤を投与すべきでない、または正常レベルの酵素を有する被験体と比較してより低い投与量でその薬剤を投与すべきである。代替治療が利用可能でないなら、後者の過程が必要であり得る。もしその被験体が、特定の薬物の活性化に必要な酵素を発現する遺伝子のコピーを両方とも欠くことが見出されたなら、その薬剤はその被験体に対して有利な効果を有さず、そして投与すべきでない。遺伝子の１つの野生型コピー、および遺伝子の１つの変異コピーを有し、そして低レベルの酵素を有するリスクのある被験体に、再び代替が利用可能かどうかに依存して、注意した場合にのみ、その酵素によって代謝される薬物を投与すべきである。もしその薬剤が問題の酵素によって解毒されるなら、一般的にその被験体により低投与量の薬剤を投与すべきである。もしその薬剤が酵素によって活性化されるなら、ヘテロ接合体の被験体に、より高い投与量の薬物を投与すべきである。特定の生体内変換遺伝子のさらなるコピーを有し、高いレベルの酵素を有するリスクのある被験体に関して、逆があてはまる。スクリーニングの利点によってなされ得る、治療薬のより合理的な選択は、代謝の低い被験体において、より少ない副作用およびより高い薬剤の有効性を引き起こす。
【０１５０】
その方法はまた、新規薬剤の臨床試験に使用する被験体の集団をスクリーニングするために有用であり得る。そのスクリーニングは被験体のプールを同定し、そのそれぞれは野生型レベルの、生体内変換酵素の完全な全量を有する。被験体のプールを次いで薬剤の安全性および有効性を決定するために使用する。そのような試験によって有効であることが示された薬剤を、滅菌蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス液のような、薬剤学的な担体と共に、治療的使用のために処方する。
【０１５１】
疾患に対する感受性
本明細書中で記載された方法をまた、疾患に罹患しやすいことが公知である個人をスクリーニングするために使用し得る。このシナリオにおいて、例えば、個人は、彼または彼女が特定の疾患に罹患しやすいかどうかを、疾患マーカーの存在を示す試験結果または家族歴から知る。サンプルを、被験体が罹患しやすい疾患が関連している組織からから除去する。単なる例として、もし被験体が皮膚癌の既往歴を有する家族出身であるなら、医師は皮膚の生検を行ってサンプルを得る。次いでその被験体が罹患しやすい特定の疾患と関連する遺伝子座または複数の遺伝子座のコピー数頻度値を、本明細書中で記載された方法を用いて決定し得る。もしその決定が異常なコピー数を示すなら、次いでその被験体は、その被験体が疾患にかかり始める可能性、および異なる治療選択肢に関する賛否について相談し得る。被験体がまだ疾患の症状を示していないこの例において、最も適切な行動は、単に被験体をしっかりモニターすることであり得る。しかし、適切な相談の後に、被験体が、後日の問題を避けるために、積極的な予防措置を取ることを選択し得る。
【０１５２】
疾患の症状なし、および疾患に対する感受性が未知である
本明細書中で記載された方法はまた、疾患の症状を有さない、または疾患に対する感受性が未知である個人のスクリーニングにも有用であり得る。このカテゴリーの個人は一般的に、疾患の症状を有さず、疾患の家族歴を有さず、そして彼または彼女が疾患に関連するマーカーを有するかどうか知らない。そのような場合には、その方法を、予防的スクリーニングツールとして使用し得る。これに関して、ある疾患に関連していることが公知である、多くの選択された遺伝子座を調査して、異常なコピー数を有する遺伝子座を同定し得る。この場合、サンプルを、試験する疾患によって影響を受ける異なる組織または液体から得る。もし変化したコピー数を有する遺伝子座または複数の遺伝子座を同定したなら、被験体に、疾患が発症する可能性および、利用可能な治療選択肢の範囲について助言する。
【０１５３】
出生前診断
記載した方法の別の使用法は、出生前診断の領域において、特に胚または胎児においてコピー数の異常を同定する方法としてである。女性が、子供を持つことを人生のより遅くまで待つことは、増加している共通の傾向である。この遅延と関連して、子供が先天性の欠損を持って生まれる危険性が増加する。
【０１５４】
胚（すなわち受精から発生の８週までの発達中の赤ん坊）または胎児（すなわち発生の９週から出産までの発達中の赤ん坊）細胞から核酸を得る方法は、当該分野で周知である。例は、母体の生検（例えば子宮頸部のサンプリング、羊水穿刺サンプリング；血液サンプリング）、胎児の生検（例えば肝臓生検）、および絨毛膜絨網サンプリング（米国特許第６，３３１，３９５号）を含むがこれに限らない。
【０１５５】
発達中の赤ん坊に危険性を与えない非侵襲的な手順であるので、好ましくは、母体血液からの胎児核酸の分離を、本発明のこの局面によって使用する（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９８）６２（４）：７６８−７５）。細胞を含まない胎児核酸を、母体の循環から採取し、そして上記で記載したように分析し得る（Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．（２００２）１８６：１１７−２０）。典型的には、胎児核酸の相対的な量を増加し、そして従って分析を可能にするために、ＰＣＲ技術を、これらの方法と組み合わせて使用する。
【０１５６】
核酸
本明細書中で使用される「核酸」という用語は、１本鎖または２本鎖の形式のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。その用語は、同様の、または改善した結合性質を有する、天然ヌクレオチドの公知のアナログを含む、核酸、すなわちオリゴヌクレオチドを含む。その用語はまた、合成バックボーンを有する核酸様構造も含む。ＤＮＡバックボーンアナログは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファミン酸、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カルバメート、モルホリノカルバメート、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第６００巻、ＢａｓｅｒｇａおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編（ＮＹＡＳ  １９９２）；Ｍｉｌｌｉｇａｎ（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１９２３−１９３７；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと。ＰＮＡは、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンユニットのような、非イオン性バックボーンを含む。ホスホロチオエート結合は、ＷＯ９７／０３２１１；ＷＯ９６／３９１５４；Ｍａｔａ（１９９７）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４４：１８９−１９７において記載されている。その用語によって含まれる他の合成バックボーンは、メチルホスホネート結合、または交互のメチルホスホネートおよびホスホジエステル結合（Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：８６９２−８６９８）、およびベンジルホスホネート結合（Ｓａｍｓｔａｇ（１９９６）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  ６：１５３−１５６）を含む。
【０１５７】
その核酸は、ゲノム、合成または組み換え起源のＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばｃＤＮＡであり得る。その核酸は、センスまたはアンチセンス鎖またはその組み合わせのいずれかを示す、２本鎖または１本鎖であり得る。
【０１５８】
好ましくは、その核酸はＤＮＡ、より好ましくはゲノムＤＮＡである。
【０１５９】
その核酸を、組み換えＤＮＡ技術の使用によって調製し得る（例えば組み換えＤＮＡ）。
【０１６０】
本発明の１つの局面において、非相互的ｔ（３；５）転座をコードする単離された核酸を提供し、ここで座標１０５３８６４４３ｂｐまでの染色体５ｑ２１．３が、座標７４１１１８９３ｂｐからの染色体３ｐ１３に融合しており、そしてここで接合部のアデニン残基は、どちらかの染色体由来である。
【０１６１】
好ましくは、染色体５ｑ２１．３は、配列ＴＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＧＧＡＴＡＴＡＴＧＴＡＴＡＡＡＡＴＣまたはその変異体、ホモログ派生物（ｄｅｖｉａｔｅ）、または断片を含む。
【０１６２】
好ましくは、染色体３ｑ１３は、配列ＴＡＧＧＧＡＧＴＧＡＡＧＴＡＧＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＴＧＣＣＡＧまたはその変異体、ホモログ派生物、または断片を含む。
【０１６３】
好ましくは、非相互的ｔ（３；５）転座は、配列ＴＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＧＧＡＴＡＴＡＴＧＴＡＴＡＡＡＡＴＣＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＡＡＧＴＡＧＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＴＧＣＣＡＧまたはその変異体、ホモログ派生物、または断片を含む。
【０１６４】
構築物
本発明の方法によって同定された変化に対応する核酸を、構築物にクローニングおよびライゲーションし得る。
【０１６５】
「結合物」、「カセット」、および「ハイブリッド」のような用語と同義語である「構築物」という用語は、プロモーターに直接または間接的に結合したヌクレオチド配列を含む。
【０１６６】
その構築物は、マーカーを含むまたは発現し得、それは細菌、植物、または哺乳類細胞のような細胞において、ヌクレオチド配列構築物の選択を可能にする。使用し得る様々なマーカー、例えばマンノース−６−リン酸イソメラーゼをコードするもの（特に植物のために）、または抗生物質耐性、例えばＧ４１８、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシンおよびゲンタマイシンに対する耐性を提供するマーカーが存在する。
【０１６７】
ベクター
本発明の方法によって同定された変化に対応する核酸を、ベクターにクローニングおよびライゲーションし得る。
【０１６８】
「ベクター」という用語は、発現ベクター、形質転換ベクターおよびシャトルベクターを含む。
【０１６９】
「形質転換ベクター」という用語は、１つの存在から、その種であり得る、または異なる種であり得る、別の存在へ移動し得る構築物を意味する。その構築物が１つの種から別の種へ、例えばＥ．ｃｏｌｉプラスミドからＢａｃｉｌｌｕｓ属のようなバクテリアへ移動し得るなら、その形質転換ベクターは「シャトルベクター」と呼ばれることがある。それはＥ．ｃｏｌｉからアグロバクテリウムへ、植物へ移動し得る構築物でもあり得る。
【０１７０】
そのベクターを、下記で記載するような適当な宿主細胞へ形質転換して、ポリペプチドの発現を提供し得る。
【０１７１】
そのベクターは、例えば、複製の起点、任意で当該ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター、および任意でプロモーターの制御因子と共に提供された、プラスミド、ウイルスまたはファージベクターであり得る。
【０１７２】
そのベクターは、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカーヌクレオチド配列を含み得る。産業的微生物の最も適当な選択システムは、宿主生物の変異を必要としない選択マーカーのグループによって形成されるものである。真菌選択マーカーの例は、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、ＡＴＰシンセターゼ、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、オロチジン−５’−リン酸脱炭酸酵素（ｐｖｒＡ）、フレオマイシンおよびベノミル耐性（ｂｅｎＡ）のヌクレオチド配列である。非真菌選択マーカーの例は、細菌Ｇ４１８耐性ヌクレオチド配列（これは酵母においても使用し得るが、糸状菌においては使用しない）、アンピシリン耐性ヌクレオチド配列（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ネオマイシン耐性ヌクレオチド配列（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするＥ．ｃｏｌｉ  ｕｉｄＡヌクレオチド配列である。
【０１７３】
ベクターをインビトロで、例えばＲＮＡの産生のために使用し得る、または宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換するために使用し得る。
【０１７４】
従って、ポリヌクレオチドを組み換えベクター（典型的には複製可能なベクター）、例えばクローニングまたは発現ベクターに組み込み得る。そのベクターを使用して、適合性の宿主細胞中で核酸を複製し得る。
【０１７５】
変異体／ホモログ／誘導体／断片
本発明は、その変異体、ホモログ、誘導体および断片の使用を含む。
【０１７６】
「変異体」という用語は、野生型配列と異なる、天然に存在するポリペプチドまたはヌクレオチド配列を意味するよう使用する。
【０１７７】
「断片」という用語は、野生型配列の部分を含む、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列を示す。それは１つまたはそれ以上の大きな連続的な配列の部分、または複数の小さな部分を含み得る。その配列はまた、配列の他の要素を含み得る、例えばそれは別のタンパク質との融合タンパク質であり得る。好ましくは、その配列は少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の野生型配列を含む。
【０１７８】
好ましくは、その断片は５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、または最も好ましくは９９％の、野生型ポリペプチドまたはヌクレオチド配列の活性を保持する。
【０１７９】
その断片は、機能的断片であり得る。
【０１８０】
分子の「機能的断片」によって、そのままの分子と実質的に同じ生物学的活性を保持するまたは有する断片と理解される。全ての場合において、分子の機能的断片は、そのままの分子の生物学的活性の、少なくとも１０％、および少なくとも約２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を保持する。
【０１８１】
「ホモログ」という用語は、問題のアミノ酸配列および問題のヌクレオチド配列とある相同性を有する存在を意味する。ここで、「相同性」という用語は、「同一性」と同等と考え得る。
【０１８２】
本関係において、相同的な配列は、問題の配列と少なくとも７５、８５、または９０％同一、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得るアミノ酸配列を含むよう解釈される。相同性はまた類似性（すなわち、類似の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）の点から考え得るが、本発明の関係においては、配列同一性の点から相同性を表すことが好ましい。
【０１８３】
本関係において、相同的な配列は、問題の配列と少なくとも７５、８５、または９０％同一、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得るヌクレオチド配列を含むよう解釈される。相同性はまた類似性（すなわち、類似の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）の点から考え得るが、本発明の関係においては、配列同一性の点から相同性を表すことが好ましい。
【０１８４】
相同性の比較を、目によって、またはより通常には、容易に入手可能な配列比較プログラムの助けにより行い得る。これらの市販で入手可能なコンピュータープログラムは、２つまたはそれ以上の配列間の相同性％を計算し得る。
【０１８５】
連続的な配列で相同性％を計算し得る、すなわち、１つの配列を他の配列と整列させ、そして１つの配列における各アミノ酸を、他の配列の対応するアミノ酸と、１度に１残基ずつ、直接比較する。これは「ギャップなしの」アラインメントと呼ばれる。典型的には、そのようなギャップなしのアラインメントを、比較的短い数の残基に対してのみ行う。
【０１８６】
これは非常に単純および一貫した方法であるが、例えば他は同一の配列のペアにおいて、１つの挿入または欠失が続くアミノ酸残基をアラインメントからはずし、従って全体のアラインメントを行ったときに相同性％が大きく減少する可能性があることを考慮できない。従って、ほとんどの配列比較法は、全体の相同性スコアを過度に不利にすることなく、可能性のある挿入および欠失を考慮する、最適なアラインメントを生ずるようデザインされる。これは、局所的な相同性を最大にしようとするために、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【０１８７】
しかし、これらのより複雑な方法は、アラインメントに生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」を与え、同じ数の同一アミノ酸に関しては、可能な限り少ないギャップを有する配列アラインメント−２つの比較配列間のより高い関連性を反映する−が、多くのギャップを有するものよりも高いスコアを達成する。「アフィンギャップコスト」が、典型的には使用され、それはギャップの存在に関して比較的高いコストを課し、そしてギャップ内の続く残基それぞれに関してはより少ないペナルティーを課す。これが、最もよく使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、もちろんより少ないギャップを有する最適化されたアラインメントを生じる。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーを修飾することが可能である。しかし、配列比較のためにそのようなソフトウェアを使用する場合には、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティーは、ギャップに関しては−１２、そして各伸長部分に関して−４である。
【０１８８】
従って、最大相同性％の計算は、まずギャップペナルティーを考慮した最適なアラインメントの産生を必要とする。そのようなアラインメントを実施するための適当なコンピュータープログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージである（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７）。配列比較を行い得る他のソフトウェアの例は、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９同書−第１８章を参照のこと）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）、比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳソフトウェアおよびＣＬＵＳＴＡＬを含むがこれに限らない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡはどちらも、オフラインおよびオンライン探索に利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９同書、７−５８から７−６０頁を参照のこと）。しかし、いくつかの適用に関しては、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新しいツールも、タンパク質およびヌクレオチド配列を比較するために利用可能である（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７７（１）：１８７−８を参照のこと）。
【０１８９】
最終的な相同性％を同一性の点から判定し得るが、アラインメント手順そのものは、典型的には全か無かのペア比較に基づくものではない。その代わり、一般的には一定の割合の類似性スコアマトリックスを使用し、それは化学的類似性または進化的距離に基づいて対になった比較それぞれにスコアを割り当てる。よく使用されるそのようなマトリックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス−ＢＬＡＳＴソフトウェアプログラムのデフォルトマトリックスである。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般的に公開されたデフォルト値またはもし供給されるならカスタムシンボル比較表のいずれかを使用する（さらなる詳細に関してはユーザーマニュアルを参照のこと）。いくつかの適用に関しては、ＧＣＧパッケージのために公開デフォルト値を、または他のソフトウェアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ６２のようなデフォルトマトリックスを使用することが好ましい。
【０１９０】
ソフトウェアが最適なアラインメントを産生したら、相同性％、好ましくは配列同一性％を計算することが可能である。そのソフトウェアは、典型的には、配列比較の一部としてこれを行い、そして数字の結果を生じる。
【０１９１】
配列同一性を決定する場合にギャップペナルティーを使用するなら、好ましくは以下のパラメーターを使用する：
【０１９２】
【化１】
0005491171.tif 000002
ポリペプチド配列の比較に関しては、以下の設定を使用し得る：３．０のギャップ生成ペナルティーおよび０．１のギャップ延長ペナルティー。適切に、アミノ酸配列に関する同一性の程度を、少なくとも５個の連続するアミノ酸に対して決定する、少なくとも１０個の連続するアミノ酸、少なくとも１５個の連続するアミノ酸、少なくとも２０個の連続するアミノ酸、少なくとも３０個の連続するアミノ酸、少なくとも４０個の連続するアミノ酸、少なくとも５０個の連続するアミノ酸、または少なくとも６０個の連続するアミノ酸に対して決定する。
【０１９３】
その配列はまた、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有し得、それはサイレントな変化を引き起こし、そして機能的に等価の物質を生ずる。その物質の２次結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて、計画的にアミノ酸置換をし得る。例えば、陰性に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む；陽性に荷電したアミノ酸は、リシンおよびアルギニンを含む；そして同様の親水性値を有する、無電荷の極性頭部グループを有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンを含む。
【０１９４】
例えば、以下の表によって、保存的置換をし得る。２番目の列の同じブロックにある、および好ましくは３番目の列の同じ行にあるアミノ酸は、相互に置換し得る：
【０１９５】
【化２】
0005491171.tif 000003
本発明はまた、相同的置換（置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）および置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）はどちらも、本明細書中で、存在するアミノ酸残基の、代わりの残基との交換を意味して使用される）を含み、すなわち塩基性と塩基性、酸性と酸性、極性と極性等のような、似たものと似たものの置換が起こり得る。すなわち１つのクラスの残基から別のクラスへの、またはオルニチン（下でＺと呼ばれる）、ジアミノ酪酸オルニチン（下でＢと呼ばれる）、ノルロイシンオルニチン（下でＯと呼ばれる）、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンのような、非天然アミノ酸の含有を代わりに含む、非相同性置換も起こり得る。
【０１９６】
アルファ＊およびアルファ−二置換＊アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、トリフルオロチロシン＊、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン＊のような、天然アミノ酸のハロゲン化物誘導体、Ｌ−アリル−グリシン＊、β−アラニン＊、Ｌ−α−アミノ酪酸＊、Ｌ−γ−アミノ酪酸＊、Ｌ−α−アミノイソ酪酸＊、Ｌ−ε−アミノカプロン酸＃、７−アミノヘプタン酸＊、Ｌ−メチオニンスルホン＃＊、Ｌ−ノルロイシン＊、Ｌ−ノルバリン＊、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン＊、Ｌ−ヒドロキシプロリン＃、Ｌ−チオプロリン＊、４−メチル−Ｐｈｅ＊、ペンタメチル−Ｐｈｅ＊のようなフェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）＃、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）＊、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸）＊、Ｌ−ジアミノプロピオン酸＃およびＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）＊を含む非天然アミノ酸によっても置換し得る。＊の表示は、上記の議論（相同的または非相同的置換に関連する）の目的のために使用して誘導体の疎水性の性質を示し、一方＃は誘導体の親水性の性質を示すために使用し、＃＊は両親媒性の特徴を示す。
【０１９７】
変異アミノ酸配列は、グリシンまたはβ−アラニン残基のようなアミノ酸スペーサーに加えて、メチル、エチル、またはプロピル基のようなアルキル基を含む、その配列のあらゆる２つのアミノ酸残基の間に挿入し得る、適当なスペーサーグループを含み得る。変異のさらなる形式は、当業者によってよく理解される、ペプトイド形式の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の存在を含む。疑いを避けるために、「ペプトイド形式」は、α−炭素置換基が、α炭素ではなく残基の窒素原子にある変異アミノ酸残基を指して使用される。ペプトイド形式のペプチドを調製する手順は、当該分野で公知である、例えばＳｉｍｏｎ  ＲＪら、ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０）、９３６７−９３７１およびＨｏｒｗｅｌｌ  ＤＣ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４）、１３２−１３４。
【０１９８】
本発明で使用するためのヌクレオチド配列は、それらの中に合成または修飾ヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドに対する多くの異なる型の修飾が、当該分野で公知である。これらは、メチルホスホネートおよびホスホロチオエートバックボーンおよび／または分子の３’および／または５’末端におけるアクリジンまたはポリリシン鎖の付加を含む。本発明の目的のために、そのヌクレオチド配列を、当該分野で利用可能なあらゆる方法によって修飾し得ることが理解される。そのような修飾を、本発明で有用なヌクレオチド配列のインビボ活性または寿命を増強するために行い得る。
【０１９９】
キット
本発明の方法で使用するための材料は、理想的にはキットの調製に適当である。
【０２００】
そのようなキットは、本明細書中で記載した、本発明の方法で利用する１つまたはそれ以上の様々な試薬（典型的には濃縮した形式で）をそれぞれ含む容器を含み得、例えば緩衝液および適当なヌクレオチド３リン酸（例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ；またはｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、およびＵＴＰ）を含み、本発明において使用するためのＤＮＡポリメラーゼおよび１つまたはそれ以上のプライマーも含み得る。
【０２０１】
容器中のオリゴヌクレオチドは、あらゆる形式、例えば凍結乾燥、または溶液中（例えば蒸留水または緩衝化溶液）等であり得る。同じ増幅反応で使用するために用意したオリゴヌクレオチドは、単一の容器中で組み合わせ得る、または別々の容器中であり得る。
【０２０２】
そのキットは、任意でさらにコントロール核酸を含む。
【０２０３】
典型的には説明書のセットも含まれる。
【０２０４】
さらなる局面
さらなる局面において、以下の工程を含む、サンプル中の１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度を判定する方法が提供される：（ａ）サンプルの１つまたはそれ以上のアリコートを提供する、ここで各アリコートは、アリコートあたり１ゲノムより少ない量で核酸を含む；（ｂ）第１の増幅反応において、アリコート中の１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する；（ｃ）２番目の増幅反応において、工程（ｂ）によって調製したアリコートから、２つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する、ここで少なくとも１つの核酸配列は、テストマーカーであり、そして少なくとも１つの核酸配列は参照マーカーである；および（ｄ）テストマーカーの増幅産物の数と、参照マーカーのものを比較することによって、テストマーカーのコピー数を計算する。
【０２０５】
さらなる局面において、以下の工程を含む、サンプル中の１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度を判定する方法が提供される：（ａ）サンプルの１つまたはそれ以上のアリコートを提供する、ここで各アリコートは、アリコートあたり１ゲノムより少ない量で核酸を含む；（ｂ）第１の増幅反応において、各アリコート中のテストマーカーを増幅する；（ｃ）第１の増幅反応からの増幅産物のそれぞれを、少なくとも２つのレプリカアリコートに分ける；（ｄ）２番目の増幅反応において、工程（ｃ）によって調製した、少なくとも１つのレプリカアリコート中のテストマーカーを増幅する；および（ｅ）テストマーカーの２番目の増幅反応からの増幅産物の数と、参照マーカーのものを比較することによって、コピー数を計算する。
【０２０６】
さらなる局面において、以下の工程を含む、サンプル中の１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度を判定する方法が提供される：（ａ）サンプルの１つまたはそれ以上のアリコートを提供する、ここで各アリコートは、アリコートあたり１ゲノムより少ない量で核酸を含む；（ｂ）第１の増幅反応において、各アリコートからテストマーカーおよび参照マーカーを増幅する；（ｃ）第１の増幅反応からの増幅産物をそれぞれ、少なくとも２つのレプリカアリコートに分ける；（ｄ）２番目の増幅反応において、第１のレプリカアリコートからのテストマーカーおよび工程（ｃ）によって調製された、２番目のレプリカアリコートからの参照マーカーを増幅する；および（ｅ）テストマーカーおよび参照マーカーの増幅産物の数を比較することによって、コピー数を計算する。
【０２０７】
さらなる局面において、以下の工程を含む、サンプル中の１つまたはそれ以上の核酸配列のコピー数頻度を判定する方法が提供される：（ａ）サンプルの１つまたはそれ以上のアリコートを提供する、ここで各アリコートは、アリコートあたり１ゲノムより少ない量で核酸を含む；（ｂ）第１の増幅反応において、各アリコートから１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する、ここで少なくとも１つの核酸配列はテストマーカーであり、そして少なくとも１つの核酸配列は参照マーカーである；（ｃ）第１の増幅反応からの増幅産物をそれぞれ、少なくとも２つのレプリカアリコートに分ける；（ｄ）２番目の増幅反応において、第１のレプリカアリコートからのテストマーカーおよび工程（ｃ）において調製された、２番目のレプリカアリコートからの参照マーカーを増幅する；および（ｅ）テストマーカーの増幅産物の数と、参照マーカーのものを比較することによって、テストマーカーのコピー数を計算する。
【０２０８】
一般的な組み換えＤＮＡ法の技術
本発明は、他に示さなければ、分子生物学、微生物学、および組み換えＤＮＡ技術の従来の技術を採用し、それは当業者の能力の範囲内である。そのような技術は、文献において説明される。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、１−３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９５および定期的な増補；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第９、１３、および１６章、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ、Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ、およびＡ．Ｋａｈｎ、１９９６、ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編）、１９８４、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ；およびＤ．Ｍ．Ｊ．ＬｉｌｌｅｙおよびＪ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ、１９９２、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：  ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。これらの一般的なテキストはそれぞれ、本明細書中で参考文献に組み込まれる。
【０２０９】
本発明を今、実施例によってさらに説明し、それは本発明の実施において当業者を助けるために役立つことを意味し、そしていかなる方法においても、本発明の範囲を制限することを意図しない。さらに、上で詳細に描写したような、および下記の請求部分において請求されるような、様々な本発明の実施態様および局面のそれぞれは、以下の実施例において実験的な支持を見出す。
【実施例】
【０２１０】
実施例１
材料および方法
分子コピー数算出（ＭＣＣ）
ＳＫ−ＲＣ−９およびＳＫ−ＲＣ−１２細胞系統２０を、ＤＭＥＭプラス１０％の胎児ウシ血清中で培養した。ＳＫ−ＲＣ−９およびＳＫ−ＲＣ−１２細胞からのゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｌｔｄ．ＵＫ）を用いて調製した。ＤＮＡを、蒸留水で約１０ゲノム／μｌ（約３０ｐｇ／μｌ）に希釈し、そしてアリコートにおいて−７０℃で保存した。
【０２１１】
概略において、ＭＣＣにおいて、複数の配列に関するゲノムサンプルのアッセイを、図１で図式的に示すように、２段階ＰＣＲ増幅を用いて行う。３つのＰＣＲプライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー、およびネステッドフォワード内部プライマー）を、アッセイする各遺伝子座（すなわちゲノムマーカー）に関して使用する。最初の段階において、複数のＰＣＲプライマーペア（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）を、単一の多重反応において組み合わせる。この反応の産物を、２番目の段階のＰＣＲ反応の鋳型として使用し、それはそれぞれ単一の配列に関するフォワード内部プライマーおよびリバースプライマーを使用する。Ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ．ｏｒｇ）を用いて、ゲノム配列から反復要素をマスキングした後（Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＮＣＢＩ  ３５、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）、プライマーの選択を、単純な基準を用いて行った（従来のＰＣＲの使用のためのデザインと類似している）。典型的には、プライマーの長さは１８−２０ｂｐであり、５２−６０℃の間のＴｍを有する（Ｔｍ＝２×（Ａ＋Ｔ）＋４×（Ｇ＋Ｃ）の計算に基づく）。デザインは、３’末端において少なくとも２つ、そして５’末端において少なくとも１つのＧまたはＣ塩基を必要とする。４塩基より長いいかなる単一の塩基の一続きも許されない。内部アンプライマーの長さが８０−１５０ｂｐの間であり、そして外部プライマーの位置がフォワード内部プライマーの上流１５０ｂｐ以下であるようにデザインする。
【０２１２】
ＤＮＡ濃度は、ＭＣＣ分析において重要であるが、アリコートあたり〜０２−０６一倍体ゲノムの平均ＤＮＡ含量で正確さを得るので、非常に正確である必要はない。ゲノムＤＮＡ調製物の開始濃度を、紫外線分光測定を用いて決定し、そしてこれに基づいて、サンプルあたり０．２５および８ゲノムの間のＤＮＡを与えることが予測される、一連の希釈（簡便には６）を作成した。１倍体ゲノムあたり１コピー存在すると考えられるＤＮＡ部分に対応する、４つのマーカーそれぞれに関して、各希釈の１６個のアリコートをアッセイした（上記で記載したように、９６穴プレートでＭＣＣを用いて）。陽性と評価された（４つのマーカー全てにわたって平均した）アリコート（ウェル）の割合を使用して、各希釈における実際のＤＮＡ濃度を計算した。これらのデータを、今度はＭＣＣ分析のために必要な希釈の正確な程度を決定するために使用した。有効なＭＣＣの濃度が決定された場合、そのＤＮＡ希釈を全てのＭＣＣ工程に関して使用し得る。ＤＮＡの新規調製物はそれぞれ、独立した用量設定を必要とする。
【０２１３】
ＭＣＣに関して、アッセイする全ての配列に関するフォワードプライマーおよびリバースＰＣＲプライマー（０．１５μＭの各オリゴ）、１×Ｇｏｌｄ  ＰＣＲ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、および０．１ｕ／μｌのＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）および約０．０３ゲノム／μｌ（０．０９ｐｇ／μｌ）のゲノムＤＮＡを含む、マスターミックスを調製した。１０μｌのこのミックスを、９６穴プレートの８８個のウェルそれぞれに分配し、そして残りの８個のウェル（ネガティブコントロール）に１０μｌの、似ているがＤＮＡを欠くミックスを入れた。全てのサンプルを、２０μｌの鉱油で覆った。サーモサイクリングを、９３℃で９分間のホットスタート、続いて９４℃で２０秒間、５２℃で３０秒間、および７２℃で１分間の２５サイクルで行った。各ＰＣＲ反応を、水で５００μｌに希釈し、そして５μｌのサンプルを、２番目の段階の（マーカー特異的）セミネステッドＰＣＲのそれぞれにおいて鋳型として使用した（１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１μＭの関連するフォワード内部プライマーおよびリバースプライマー、他の濃度は前と同様、９３℃で９分間、続いて９４℃で２０秒間、５２℃で３０秒間、そして７２℃で１分間の３３サイクルのサーモサイクリング）。セミネステッドＰＣＲの後、８μｌの２×添加緩衝液（１５％ｗ／ｖ  Ｆｉｃｏｌｌ  ４００、０．１ｍｇ／ｍｌのブロモフェノールブルー、４×Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ、１×ＴＢＥ）を各ウェルに加え、そして増幅産物を、成形済み１０８ウェル水平６％ポリアクリルアミドゲル（ＭＩＲＡＧＥゲル；Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）において１０Ｖ／ｃｍで１０分間電気泳動することによって分析し、各サンプルにおけるＰＣＲ産物の存在または欠如を評価した。後者の実験において、結果を、製造者のＳＤＳソフトウェアによるＡＢＩ７９００ＨＴを用いて、融解曲線分析によって評価した。
【０２１４】
これらの場合において、第２段階のＰＣＲのＰＣＲ混合物を、４ｍＭのＭｇＣｌ２および０．５×ＳｙＢｒ  ＧｒｅｅｎＩ（Ｃａｍｂｒｅｘ、ＵＫ）を含むよう修飾した。全ての第２段階ＰＣＲ反応を、複数の３８４穴マイクロタイタープレート（各プレートは、４つのマーカーそれぞれに関して９６個の反応を含む）において自動的に設定した。（注：２番目の、セミネステッドＰＣＲ段階を、自動化システムではなく、移動のためにマルチチャンネルピペットを用いて、２番目の９６穴プレートにおいて行い得る。）
ＭＣＣデータの統計学的分析
ＤＮＡ分子が、一連のアリコートの中で無作為に分布しているなら、あらゆる所定の配列に関して陽性と評価されたアリコートの数から、その配列の濃度（アリコートあたりのコピー数で表される）を、ポアソン方程式から決定し得る（補足の情報を参照のこと）。ゲノムＤＮＡのアリコートの同じセットで、この方法で２つまたはそれ以上の配列を分析するなら、その相対的濃度、および従ってゲノムＤＮＡにおけるその相対的な量を計算し得る。
【０２１５】
例えば、もし２つのＤＮＡマーカー（ＡおよびＢ）を、８８個のアリコートの同じセットで評価するなら、そしてもし各マーカーに関して陽性と評価されたアリコートの数がそれぞれ３４および５６であるなら、２つの配列の平均濃度を、それぞれアリコートあたり０．４９および１．０コピーと計算し得る（方程式ｉｉより、補足情報パートＡオンライン）。従って、もし配列Ａが、ゲノムあたりｎコピー存在することが公知であるなら、配列Ｂは、ゲノムあたり２ｎコピー存在することを推測し得る。
【０２１６】
蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
ＦＩＳＨ分析を、製造会社の指示によって、標準的なプロトコールに従って、染色体全体のペイント（Ｖｙｓｉｓ）またはＤＩＧ検出のために、ＤＩＧ−ｎｉｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎおよび蛍光抗体エンハンサーキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ、ＵＫ）によって蛍光にした、ＢＡＣ  ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｔｄ．からのＢＡＣクローン）を用いて行った。ＳＫ−ＲＣ−９のこの研究において使用したＢＡＣクローンは、第３染色体短腕のＲＰ１１−２４Ｅ１、ＲＰ１１−７８１Ｅ１９、ＲＰ１１−４１３Ｅ６、および第５染色体長腕のＣＴＤ−２１９３Ｇ５、ＣＴＤ−２１９７Ｉ１１であった。ＳＫ−ＲＣ−１２のこの研究において使用したＢＡＣクローンは、ＲＰ１１−３２８Ｎ１２、ＲＰ１１−２４Ｅ１、ＲＰ１１−４１３Ｅ６、ＲＰ１１−５２８Ｅ１４、ＲＰ１１−４２４Ｃ９であった。ＢＡＣクローンの位置は、Ｅｎｓｅｍｂｌ  ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｒｖｅｒ、Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＮＣＢＩ３５由来である。
【０２１７】
フィルターハイブリダイゼーション分析
ゲノムＤＮＡを制限酵素によって完全に消化し、０．８％アガロースゲルで分画し、そしてＨｙｂｏｎｄＮ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）膜に移した。サザンフィルターハイブリダイゼーションを、プラスミドベクター２４から単離され、記載されたような無作為オリゴヌクレオチドプライミング反応によって放射性標識された断片を用いて行った２５。
【０２１８】
ＳＫ−ＲＣ−９ＤＮＡにおける５ｑおよび３ｐの分析のためのゲノムプローブを、ＰＣＲによってヒトＤＮＡから増幅し、そしてＴＯＰＯクローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて産物をクローニングし、そして配列を検証した。第３染色体プローブ３ｐＡのプライマー配列は、ＡＡＧＣＡＧＧＴＴＡＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣ（ゲノム位置７４１１２７２５から７４１１２７４８ｂｐ）およびＣＴＣＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＴＡＴＴＴＡＡＡＧ（ゲノム位置７４１１３１４６から７４１１３１６７ｂｐ）であり、第３染色体プローブ３ｐＢのプライマー配列は、ＣＣＣＡＴＴＧＣＴＣＣＣＣＡＧＣＣ（ゲノム位置７４１１４１１４から７４１１４１３７ｂｐ）およびＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＧＡＴＧＡＧＡＧＧ（ゲノム位置７４１１４２３９から７４１１４２５７ｂｐ）、および染色体５ｑプローブのプライマー配列は、ＣＴＧＴＴＣＡＴＴＣＣＴＴＣＡＡＣＴＴＣＣＴＡ（ゲノム位置１０５３８６０１３から１０５３８６０３５ｂｐ）およびＧＣＴＧＡＴＴＴＴＡＴＡＣＡＴＡＴＡＴＣＴＧＴＡＴＧ（ゲノム位置１０５３８６４１２から１０５３８６４３７ｂｐ）であった。
【０２１９】
ＳＫ−ＲＣ１２ＤＮＡのフィルターハイブリダイゼーションのための第３染色体プローブを、プライマーＧＡＡＴＴＣＡＧＣＴＡＴＴＣＡＡＣＧＣ（ゲノム位置８１．９３８．１５１）およびＧＧＡＡＧＴＧＣＴＡＡＡＣＡＣＡＡＴＧＧ（ゲノム位置８１．９３８．３８８）を用いてゲノムＰＣＲ産物をクローニングすることによって作成した。
【０２２０】
インバースＰＣＲクローニング
インバースＰＣＲクローニングを、記載されたように行った２１。ＳＫ−ＲＣ−９ＤＮＡ（５μｇ）を、１００ユニットのＸｂａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で、３７℃で一晩消化した。消化したＤＮＡを、フェノールで抽出し、そしてエタノール沈殿で回収した。消化したＤＮＡを、６００μｌの容量で、１６℃で１６時間、３２００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）でライゲーションすることによって環状化した。ライゲーションしたＤＮＡを、エタノールで沈殿し、そして２５℃の４０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡに溶解した。５μｌ（〜０．６μｇＤＮＡ鋳型）を、５００μＭの各ｄＮＴＰ、１μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、１×緩衝液（Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ２、Ｒｏｃｈｅ）および３．７５ｕのＥｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ酵素（Ｒｏｃｈｅ）を含む、５０μｌのＰＣＲ反応で使用した。ＰＣＲ増幅条件は、９４℃で２分間、続いて９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で１５分間の３５サイクル、そして６８℃で３０分間の最後の伸長工程であった。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルで分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、そしてＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へクローニングした。転座接合部のインバースＰＣＲのプライマー配列は、ＣＴＴＣＣＡＴＡＣＣＡＣＴＴＡＴＧＧＴＧＴＣＴＡリバース（染色体３ｐゲノム位置７４１１２２９６から７４１１２３１９ｂｐ）およびＡＡＴＧＣＡＧＡＣＣＣＴＣＡＡＡＣＴＡＴＡＣＣフォワード（染色体３ｐゲノム位置７４１１２４７２から７４１１２４９４ｂｐ）であった。
【０２２１】
ＳＫ−ＲＣ−１２における第３染色体の欠失融合領域のＰＣＲ増幅のためのプライマー配列は、５’−ＡＡＴＧＴＣＡＴＧＣＡＧＣＡＴＡＴＧＡＣ（ゲノム位置８１．６４８．３８０）およびＴＧＡＴＣＴＴＧＡＴＴＡＣＡＴＡＧＣＡＴＴ（ゲノム位置８１．９３７．９８３）であった。
【０２２２】
実施例２
分子コピー数算出（ＭＣＣ）
正常細胞は、常染色体遺伝子に関して二倍体であるが、癌細胞は、染色体の転座、欠失、増幅、または反転を有し得る。もしこれらの変化が、二倍体状態からのコピー数の変化を含むなら、ＤＮＡ反復の頻度を判定することによって、これを決定することが可能である。ＭＣＣ法は、限界ＤＮＡ希釈（事実上単一のＤＮＡ分子）においてゲノムマーカーのＰＣＲ増幅が起こる頻度を分析することによって、これを達成する。複数のＰＣＲ反応を、９６穴形式で行い、そして相対的なコピー数を、ＰＣＲ産物を有するウェルの数に依存して、隣接したマーカーに関して決定する。
【０２２３】
ＭＣＣ法の本質を、不均衡な転座の見本と共に、図１に示す。腎細胞癌は、多くの場合、染色体３および５（ｐ；ｑ）の間に、非相互的転座を有し４、５、１７、１８、コピー数の不均衡を引き起こす。これを図１Ｃで示し、ここで転座は黒い染色体の遠位部分に関して１ｎのコピー数、および転座の近位で２ｎを生じる。ゲノムＤＮＡは、ＨＡＰＰＹマッピング１９に関して記載されたように高度に希釈され、そして１つの一倍体ゲノムより少ないＤＮＡを含むアリコートを、９６穴マイクロタイタープレートの８８個のウェルに分配し、８個のウェルはネガティブＰＣＲコントロールのために残しておく。ＰＣＲ分析の最初の回は、単一の９６穴プレート（図１Ｄ）の各ウェルに、全てのプールした外側プライマーを有する各アリコートの多重増幅工程であり、あらゆる標的配列の全てのコピーは、ある程度増幅される。２回目のＰＣＲは、鋳型として多重プレートから新しいレプリカプレートに移したＰＣＲ産物を使用する、個々のマーカーそれぞれに関するセミネステッドＰＣＲ工程（すなわち多重ではない）である（図１Ｅ、Ｆ）。これらの２回目のＰＣＲ産物を、ポリアクリルアミドゲルにおいて分離し（図１Ｇ、Ｈ）、そして評価する。あらゆる特定のマーカーに関して陽性であるアリコートの割合は、ゲノムにおけるそのマーカーの相対的コピー数を反映する。ここで示した実験において、陽性ＰＣＲ反応の数を、手作業で算出した。簡便さのために、様々な工程を、ＰＣＲおよびセミネステッドＰＣＲのマイクロタイタープレートの間、および２番目のマイクロタイタープレートからゲルへサンプルを移動するための、自動化移動システムを採用して行う。もし自動化が利用可能でなければ、マルチチャンネルピペットを用いて、これを手作業で容易に行い得る。
【０２２４】
腎細胞癌に適用されたＭＣＣにおける、ＰＣＲ産物のゲル視覚化の例を、非相互的限界点の遠位または近位それぞれのマーカーに関して、図１ＧおよびＨにおいて示す。前者において、２４個のウェルがＰＣＲ産物を示し、一方後者において、４６個のウェルが産物を示し、マーカー間の約２倍のコピー数の差異を示す。（統計学的分析の詳細を、補足情報において見出し得る。）染色体領域の最初のスキャンを行う場合、広い間隔のマーカーを使用し得、そしてそれらの間の距離を、必要に応じて変化させ得る。例えば、もし細胞遺伝学的データが利用可能でなければ（小さい生検サンプルから得られたＤＮＡの場合にそうであり得るように）、より詳細な研究のために１つの領域に焦点を合わせる前に、染色体全体をスキャンすることが有利であり得る。約２Ｍｂの間隔の約７０個のマーカーが、第３染色体全体に関してこの情報を与える。
【０２２５】
実施例３
腎臓癌における非相互的転座の同定およびクローニング
ＭＣＣ法の開発の背後にある動機の１つは、そのクローニングの前置きとして、腎細胞癌における再発する非相互的染色体転座ｔ（３；５）（ｐ；ｑ）の限界点の位置を、正確に特定することであった。これらの重要な染色体転座は、細胞遺伝学によって徹底的に研究され、そして３つの主な限界点領域が、第３染色体の短腕について記載された６。非乳頭状および乳頭状腎細胞癌細胞系統を、一次および転移腫瘍材料から確立した２０。第３および第５染色体ペイントを用いた、転移性腎細胞癌腫ＳＫ−ＲＣ−９細胞系統のＦＩＳＨ分析は、非相互的ｔ（３；５）染色体転座の存在を明らかにした（補足図１オンライン）。ｔ（３；５）染色体転座限界点の位置を、最初に、染色体３ｐの約３Ｍｂ領域（７３．２から７５．８Ｍｂ）からのＢＡＣクローンを用いて、ＦＩＳＨによって調査した（図２）。腎癌腫ｔ（３；５）において相互誘導体染色体は存在しないので、ＢＡＣＳはｄｅｒ（３；５）染色体にハイブリダイズするまたはしないかのいずれかであるので、限界点にまたがるＢＡＣクローンの十分なマッピングを得ることが不可能である。従って、非相互的転座のＢＡＣ−ＦＩＳＨ分析は、限界点の側面に位置するＢＡＣＳの位置を特定することに依存する（図２）。
【０２２６】
このＢＡＣは、正常第３染色体に結合するが、ｔ（３；５）には結合しないので（図２Ａ）、ｔ（３；５）限界点のテロメア側に位置する、最も近位のＢＡＣクローンは、ＲＰ１１−２４Ｅ１（３ｐテロメアから７３２５６３５８−７３４１９６７９ｂｐ）であった。ＢＡＣクローンＲＰ１１−７８１Ｅ１９（３ｐテロメアから７４２１０８８５−７４２３６０８９）は、正常第３およびｔ（３；５）染色体の両方にハイブリダイズするので（図２Ｂ）、限界点のちょうど近位に位置する。これらのデータは、ＳＫ−ＲＣ−９における限界点を、多くても染色体３ｐ１３−ｐ１２．３の１Ｍｂに位置を特定した（図２Ｃ等）。
【０２２７】
我々は、徐々により高い分解能で複数回のＭＣＣを用いて、第３染色体における転座限界点の位置を規定しようとした。ＦＩＳＨデータ（図２）は、限界点のテロメア側にある第３染色体短腕配列は、細胞あたり２コピー存在することが期待され（ＳＫ−ＲＣ−９細胞の倍数性のため）、一方限界点の近位にあるもの、または長腕にあるものは、４コピー存在する（すなわち、２つの正常第３染色体および２つのｄｅｒ３；５染色体を含む）ことが期待されることを示した。我々は、染色体３ｐ１３−ｐ１２．３の領域において、約３．８Ｍｂにわたって、０．２−０．５Ｍｂの間隔をあけた１２個のマーカーのコピー数を調査する、最初の回のＭＣＣを行った。その結果（図３、第１回）は、７３７６０５８３ｂｐおよび７４３３３５５９ｂｐに位置するマーカーの間における、相対的コピー数の２倍のシフトを明らかにし、推定転座限界点を、約５７０ｋｂの領域内に規定した。続く回のＭＣＣを、約５０ｋｂの間隔の１２個のマーカーを用いて行い（図３、第２回）、さらに推定限界点領域を約４０ｋｂの範囲内に規定した。さらなる２回のＭＣＣ（図３、第３および４回）が、さらにコピー数のシフトの位置を、それぞれ約１−４ｋｂおよび次いで３００ｂｐまでに特定した。それに加えて、４回目のＭＣＣは、推定転座のセントロメア側の明らかな欠失を明らかにした（下記で議論する）。
【０２２８】
我々は、フィルターハイブリダイゼーションを用いて、ＭＣＣデータがゲノム変化に対応することを確認した。コピー数シフトに対応する染色体３ｐの領域からプローブを作成し（図４、プローブ３ｐＡ）、そしてＳＫ−ＲＣ−９細胞、およびｔ（３；５）限界点が、ＳＫ−ＲＣ−９のものの近位にある（ＡＤ、ＧＣおよびＴＨＲ、未発表）、異なる腎細胞系統ＳＫ−ＲＣ−１２由来の制限酵素消化ゲノムＤＮＡを有するフィルターにハイブリダイズさせた。ＳＫ−ＲＣ−９の２つの異なる制限酵素消化によって再編成されたバンドが観察され、ＭＣＣ法はこの細胞系統の第３染色体における本物の異常を同定したことを示す。
【０２２９】
実施例４
非相互的ｔ（３；５）転座限界点のクローニング
ＳＫ−ＲＣ−９ＤＮＡの４回目のＭＣＣ分析は、コピー数のシフトを示し、それはそのゲノム位置を考慮すれば、第３および第５染色体の間の非相互的転座の接合部の候補であった。染色体３ｐのこの領域の正常配列は公知であるので、我々はその異常に対応するＤＮＡのインバースＰＣＲクローニングのために、第３染色体プライマーのペアをデザインした。公知のＤＮＡ部分に関連する未知のＤＮＡをクローニングするこの方法は、環状化したＤＮＡ鋳型上を反対方向に伸長し得る（図５Ａで説明する）ＰＣＲプライマーのデザインに依存する２１。よって、ＳＫ−ＲＣ−９ＤＮＡを、ＸｂａＩで消化し、分子内環を産生し、そしてＰＣＲを行って〜１．５ｋｂのバンドを産生した。このＰＣＲ産物の配列は、それはｔ（３；５）非相互的染色体転座の接合部を含むことを示し（図５Ｂ）、ここで染色体５ｑの領域（位置を図５Ｃで示す、座標１０５３８６４４３ｂｐ）が、染色体３ｐの領域（図５Ｄ、座標７４１１１８９３ｂｐ）に融合していた。接合部のアデニン残基は、どちらかの染色体由来であり得る。ＳＫ−ＲＣ−９細胞由来のＤＮＡにおけるこの第５染色体部分の再編成は、フィルターハイブリダイゼーション研究を用いて正式に示された（図３Ｂ、プローブ５ｑ）。
【０２３０】
実施例５
ＭＣＣは、潜在性の染色体変化を検出し得る
ＭＣＣ分析による転座限界点の規定の間に、我々は限界点のすぐセントロメア側約７００ｂｐにわたる領域において、さらなるコピー数の減少を観察した（図３、第４回）。この発見を、ＳＫ−ＲＣ−９ＤＮＡを、異なる３ｐクラスター領域に位置するｔ（３；５）を有する別の腎癌腫（ＳＫ−ＲＣ−１２）と比較する、２回の独立したＭＣＣ分析によって実証した（補足図２）。
【０２３１】
ＳＫ−ＲＣ−９ＤＮＡにおけるこの異常の、可能性のある説明は、転座限界点のすぐセントロメア側の、ｔ（３；５）染色体における小さな欠失であり得る。我々は、その領域の側面に位置するプライマーによるゲノムＰＣＲによって、これを実証しようとした。我々は、正常第３染色体から、期待されるサイズ（９０７ｂｐ）の断片を増幅し得たが、ＤＮＡの欠失した部分を横切って増幅されるはずのより小さい産物の証拠は存在しなかった（データは示していない）。従って、この短い欠失は、別の位置からの配列の挿入を伴っていなければならない。図４のフィルターハイブリダイゼーション分析は、この可能性を確認する。もし転座が単に小さな欠失と関連するだけなら、ＳＫ−ＲＣ−９ＤＮＡをＢｇｌＩＩで消化する場合、我々は５ｑプローブとハイブリダイズした場合約４．３ｋｂのｄｅｒ（３；５）染色体からの再編成された断片を予測する。その代わりに、我々は約５ｋｂの大きな断片を観察した（図４Ｂ）。さらに、３ｐＢプローブを用いて観察されたＮｃｏＩおよびＳａｃＩ断片の大きさは（図４Ｃ）、どちらも単純な欠失に関して予測されるよりも有意に大きかった（それぞれ１１．５ｋｂまたは９．５ｋｂと観察され、そして４．５または４ｋｂと予測された）。３ｐＢプローブは、転座接合部を検出せず、さらなる異常のみを検出するので、ＮｃｏＩハイブリダイゼーションデータは、特に重要である。これらのデータは、欠失と共に挿入を示唆し、そして３ｐのマイクロ欠失を伴う挿入は、７ｋｂより大きいようであることを示唆する。
【０２３２】
実施例６
ＭＣＣによって検出された、腎癌細胞系統における第３染色体の２８９ｋｂの欠失
ＭＣＣの感受性のさらなる具体例は、非相互的ｔ（３ｐ；５ｑ）転座を有する（データは示していない）、明細胞腎癌腫ＳＫ−ＲＣ−１２細胞系統における、潜在性の欠失の特徴付けによって提供された。ＢＡＣクローンＲＰ１１−５２８Ｅ１４（第３染色体７６．７−７６．９Ｍｂ）およびＲＰ１１−４２４Ｃ９（第３染色体８７．７−８８．０Ｍｂ）によるＦＩＳＨ分析は、ｔ（３；５）の限界点領域を、約１０Ｍｂの大きな領域に線引きした。約０．２５Ｍｂの間隔でこの領域に広がるマーカーのパネルを用いて、ＭＣＣ分析を行った（図６Ａ、第１回）。コピー数のシフトがマーカー２２および２３の間に観察された（マーカー２１、２２、２４、および２５のＰＣＲ産物の分析ゲルを、補足図３に示す）。より近い間隔のマーカーによるＭＣＣの続く回（図６Ａ、第２および３回）は、その領域を約２ｋｂまで解明し、そしてＭＣＣの最終回は、コピー数のシフトの位置を４００ｂｐ以内に特定した（図６、第４回）。ゲノム変化の存在を、第３染色体からの２３７ｂｐのプローブを用いたフィルターハイブリダイゼーションによって、およびＳＫ−ＲＣ−１２ＤＮＡの制限断片を、リンパ芽球様細胞系統（ＬＣＬ）のものと比較することによって、確認した。再編成された断片を、ＳＫ−ＲＣ−１２ＤＮＡによる各場合において観察した（補足図４）。
【０２３３】
第４回のコピー数シフトに対応するゲノム領域を、インバースＰＣＲを用いて得た。この接合部領域配列を得るために、ゲノムＤＮＡをＮｃｏＩで消化し、そして自己ライゲーションして環状ＤＮＡ鋳型を形成し、ＭＣＣ第４回で位置を特定した第３染色体配列を用いて増幅した。ＰＣＲ産物をクローニングし、そして配列を得て、コピー数の変化が〜２８９ｋｂの染色体３ｐの単純な欠失から生じたことを明らかにした（図６Ｂ、８１．６４および８１．９４Ｍｂ）。正常第３染色体由来の、欠失点の側面に位置する領域の配列を、ＳＫ−ＲＣ−１２の融合した第３染色体と比較する（図６Ｂ）。これは、欠失部分の両末端における６ｂｐの領域の同一性を開示し（図６Ｂ）、この微小な相同性が、２本鎖の切断を修復するための非相同的末端接合に使用されたかもしれないことを示唆する。
【０２３４】
実施例７
ＭＣＣ結果の統計学的分析
もしＤＮＡ分子がＮ個のアリコート中にランダムに分布して、アリコートあたり平均Ｚ個の分子を与えるなら、ポアソン分布に従って、少なくとも１分子のＤＮＡを含むことが期待されるアリコートの数Ｎｐは、
Ｎｐ＝Ｎ（１−ｅ−Ｚ）  （ｉ）
によって与えられる。
【０２３５】
逆に、もしＮ個のゲノム以下のＤＮＡのアリコートのパネルを、当該配列に関してＰＣＲによって試験するなら、そしてもしこれらのアリコートのＮｐ個がその配列に関して陽性である（すなわち、少なくとも１コピーの配列を含む）なら、アリコートあたりのその配列の平均分子数は、
Ｚ＝−ｌｎ（１−Ｎｐ／Ｎ）  （ｉｉ）
のように計算し得る。
【０２３６】
従って、あらゆる所定の配列に関して陽性であるアリコートの数から、その配列の濃度（アリコートあたりのコピー数で表される）を決定し得る。もし２つまたはそれ以上の配列を、同じセット（または類似のセット）のゲノムＤＮＡのアリコートで、この方法で分析するなら、その相対的濃度、および従ってゲノムＤＮＡにおけるその相対的な量を計算し得る。
【０２３７】
実施例８
ＭＣＣ分析に使用するＢＡＣクローンおよびＰＣＲプライマー
ＢＡＣクローン
ＳＫ−ＲＣ−９細胞においてｔ（３；５）の位置を規定するために使用するＢＡＣクローンを、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／の、Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅデータベース、アセンブリーＮＣＢＩ３５を用いて、第３および５染色体において位置を特定した。
【０２３８】
ＢＡＣクローンのリスト
３ｐにおけるＢＡＣの座標（残基１が染色体３ｐのテロメアに位置する）
ＲＰ１１−２４Ｅ１  ７３２５６３５８−７３４１９６７９ｂｐ
ＲＰ１１−７８１Ｅ１９  ７４２１０８８５−７４２３６０８９ｂｐ
ＲＰ１１−４１３Ｅ６  ７５６９８６３４−７５８８５４０６ｂｐ
５ｑにおけるＢＡＣの座標（残基１が第５染色体のセントロメアに位置する）
ＣＴＤ−２１９３Ｇ５  １０２７１９８１８−１０２９０３６０４ｂｐ
ＣＴＤ−２１９７Ｉ１１  １０８０７８０３１−１０８２５２１６８ｂｐ
ＳＫ−ＲＣ−９のＭＣＣ分析において使用したプライマー
プライマーは、Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｒｖｅｒ、Ｂｕｉｌｄ３５から得、そして与えられた座標はその配列情報を指す。これは継続して改訂中であるので、将来における正確な位置は、ゲノムデータベースのＢＬＡＳＴサーチを用いて決定するべきである。
【０２３９】
ＳＫ−ＲＣ−９の分析に使用したプライマーを、表１に示す
ＳＫ−ＲＣ−１２  ＦＩＳＨに使用したＢＡＣクローンのリスト
３ｐにおけるＢＡＣ座標（残基１は染色体３ｐのテロメアに位置する）
ＲＰ１１−３２８Ｎ１２  第３染色体の７２．５−７２．７Ｍｂ
ＲＰ１１−２４Ｅ１  第３染色体の７３．１−７３．３Ｍｂ
ＲＰ１１−４１３Ｅ６  第３染色体の７５．５−７５．７Ｍｂ
ＲＰ１１−５２８Ｅ１４  第３染色体の７６．７−７６．９Ｍｂ
ＲＰ１１−４２４Ｃ９  第３染色体の８７．７−８８．０Ｍｂ
ディスカッション
腎臓癌のｔ（３；５）転座
我々は、コピー数の局所的変異を同定するために染色体またはゲノム領域をスキャンしながら、ＭＣＣが異なる配列のコピー数を直接算出し得ることを示した。この方法の反復は、我々が非相互的染色体転座の限界点の位置を特定およびクローニングすることによって示したように、異常な部分の正確な境界の位置を迅速に特定することを可能にする。我々がクローニングした特定の限界点は、新規の非相互的染色体転座のクローニングの最初の例を示す。腎臓癌は、非常に悪い予後を有し２２、そして近位尿細管に起こる腫瘍（非乳頭状腎臓癌）は、多くの場合非相互的染色体転座ｔ（３；５）を有する。第３染色体の限界点は、短腕の３つの異なる領域に集中しており６、そしてこの論文で我々が記載したものは（ＳＫ−ＲＣ−９細胞において）、最も遠位のクラスター（染色体３ｐ１３）に位置する。ＳＫ−ＲＣ−９における染色体３ｐまたは５ｑいずれかからの限界点ＤＮＡ配列の分析は、特に接合部において物質の喪失または獲得は存在しないことを示し、正確な末端の切断および修復を意味する。それに加えて、その切断は、いかなる公知のまたは推定遺伝子内の切断を含まない（図５を参照のこと）。従って、その転座は融合遺伝子を生じず、そして非相互的転座の主な発癌性の結果に関する異なるメカニズムを示唆する。他の腎癌腫非相互的転座の限界点を分析およびクローニングするためにＭＣＣを使用することは、これにより光を当て、そして異なる転座の間の限界点配列の比較は、転座の配列特異的メカニズムが存在するかどうかを明らかにするのを助けるであろう。
【０２４０】
腎臓癌において、染色体の変化が非相互的転座と同時に存在する
この研究において、新しいＭＣＣ技術を使用して、非相互的転座限界点の位置および第３染色体における２つの潜在性の欠失の存在を決定した。増加する分解能を有するコピー数決定を、繰り返して用いることにおけるその技術の効果を、２つの癌に関連する変化をクローニングおよび配列決定するために適用した。欠失および増幅が染色体転座に伴うという証拠が増加しているが、それが機能的に有意であるかどうかは、機能的テストが不十分であるために決定するのが困難であった。染色体間転座に関わる染色体は、２本鎖の切断時には本質的に不安定であり、さらなる変化の発生は、それほど驚くべきことではないようであり得る。しかし、ＤＮＡ修復メカニズムは、本質的に高い忠実度を有し、変化は機能的に重要であり得るという考えに信憑性を加える。
【０２４１】
ゲノム分析に対するＭＣＣアプローチ
ＭＣＣは、コピー数の変化の位置の特定に関して、他の方法に比べていくつかの利点を有する。その方法は、配列を広い間隔から数百塩基対まで調査し得るので、有効に無制限の分解能を提供する。ＭＣＣはゲノム配列情報を利用するので、それはその操作のためのゲノムデータベース、および一連のＰＣＲプライマーしか必要としない。ＭＣＣで使用するために形式を定めたＰＣＲプライマーのライブラリーを、染色体領域または完全なゲノムの迅速なスキャニングを可能にするために確立し得る。さらに、その方法は、ゲノム増幅の領域、および欠失に適用可能であろう。
【０２４２】
コピー数決定のためのアレイに基づく技術と異なり、ＭＣＣはゲノム全体の増幅、またはいかなるハイブリダイゼーション工程も必要としない。これは短いオリゴアレイを使用する場合、またはＥ．ｃｏｌｉＤＮＡが混入したアレイＣＧＨのためのＢＡＣ／ＰＡＣの増幅によって起こり得るような、偏った増幅、プローブ中のリピート配列の不完全な抑制、または交差ハイブリダイゼーションから生じ得るあらゆる問題を回避する９。ＭＣＣによる正確なコピー数の定量は、アリコートのパネルにおける遺伝子座の全てのコピーの好結果の増幅に依存する。ほとんどのＰＣＲプライマーセットは、よく作用する（ほとんどまたは全てのコピーを検出する）か、または全く作用しない（コピーを検出しない、または全ての場合において非常に少ないＰＣＲ産物しか生じない）かいずれかである。後者は明らかであり、そしてマーカー５および７においてしたように（図３、第１回）、分析から放棄し得る。やはり、明らかに低いコピー数の単一のマーカーは、単にその遺伝子座のコピーのいくつかを検出できなかったことから生じ得るので、注意して見なければならない。実際には、明らかなコピーの喪失は、分析がより高い分解能へ進むにつれて確認される（またはされない）ので、これは不利益ではない。マイクロアレイアプローチは定量的であり、多くの場合解釈のために複雑なアルゴリズムを必要とするが、ＭＣＣは本質的にデジタルアプローチであり、それは結果の解釈を単純にする２３。ＭＣＣは手動の操作に容易に適用可能であるが、それはまた自動化にもふさわしく、そしてハイスループットＰＣＲ分析のための他のプラットフォームにも適応可能であり、時間およびコストの節約の可能性がある。
【０２４３】
ＭＣＣは、きわめて少ない量のゲノムＤＮＡを必要とし、数十から数百の少ない細胞に適用可能であり、そしてＤＮＡは高分子量である必要はない。従って我々は、被験体からの新生物発生前の生検材料の詳細な分析、保管された腫瘍サンプルのレトロスペクティブな分析、または腫瘍の異なる小領域間のゲノム変異性の探究のような、今まで実行不能であった研究を、ＭＣＣが可能にすることを示唆する。ＭＣＣはまた、疾患に関連するか、またはヒト変異の正常なスペクトルの一部を形成するかに関わらず、コピー数に影響を与える遺伝性の染色体異常の分析を簡単にするであろう。我々の現在の仕事におけるＭＣＣの使用は、不均衡が細胞の間で一定である細胞系統を採用する。ＭＣＣの構成的なコピー数の差異（例えば遺伝した症候群）への適用は、ＤＮＡが同一であるので、同様である。これは、サンプリングの「質」が有用性に影響を与え得る（他のコピー数に基づく方法と同様）、疾患に基づく材料の生検の場合には必ずしもあてはまらない。腫瘍サンプルは、切除が癌細胞、間質細胞（おそらく正常な核型）、および炎症性細胞を含むので、特に問題であり得る。それにも関わらず、ＭＣＣに必要な少量の材料およびそのアプローチの感受性は、正常ＤＮＡのいくらかのバックグラウンドに対してさえも、コピー数の異常の検出を可能にするであろう。
【０２４４】
【表１Ａ】
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【０２４５】
【表１Ｂ】
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【０２４６】
【表１Ｃ】
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【０２４７】
【表１Ｄ】
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【０２４８】
【表１Ｅ】
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【０２４９】
【化３】
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【０２５０】
【化４】
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上記の明細書において言及された全ての出版物は、本明細書中で参考文献に組み込まれる。記載された方法および本発明のシステムの様々な修飾および変異が、本発明の範囲および意図から離れることなく、当業者に明らかである。本発明を、特定の好ましい実施態様に関して記載したが、請求される本発明は、そのような特定の実施態様に過度に制限されるべきでないことが理解されるべきである。実際、分子生物学または関連する分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記載された方法の様々な修飾が、以下の請求の範囲内であると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２５１】
【図１】分子コピー数算出方法の概説  分子コピー数算出（ＭＣＣ）は、染色体の部分に沿った染色体マーカーに対応する、ゲノムＤＮＡからのＰＣＲ増幅産物の頻度に依存する。ＭＣＣは２段階の手順である。この図において、（Ａ）細胞は非相互的転座を有し、そして従って１つのマーカー配列（緑で示す）は、転座限界点のテロメア側に存在する２番目のマーカー（赤で示す）の２倍のコピー数で存在する。（Ｂ）ＤＮＡを標的細胞から調製し、そしてアリコートあたり１ゲノムより少なく希釈する。（Ｃ）これらのアリコートを９６穴プレートのウェルに入れる；単純さのために、赤および緑のマーカーのみを図示し、赤および緑のマーカーゲノムＤＮＡを有する、限られた数のウェルを示す。（Ｄ）全てのマーカーを適度な量増幅するために、最初の多重ＰＣＲ増幅を行い、そして赤および緑のマーカーが増幅する仮説のウェルを例示する。（Ｅ、Ｆ）多重反応産物を、レプリカプレートに分割し、そしてさらなるＰＣＲを、各マーカーに関してセミネステッドプライマーを用いて行う（Ｅは赤いマーカー産物の仮定の分布を示す、およびＦは緑のマーカー産物の仮定の分布を示す）。（Ｇ、Ｈ）セミネステッド工程のＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動によって分析する。この例示において、赤いマーカーは２４個のウェルで、そして緑のマーカーは４６個のウェルで見出され、コピー数の２倍の増加に対応する。
【図２】ｔ（３；５）転座限界点の位置を決定するための、ＢＡＣクローンのＳＫ−ＲＣ−９染色体とのインサイツハイブリダイゼーション  第３および第５染色体ペインティング（補足図１オンライン）を用いて、非乳頭状腎細胞癌に典型的なｔ（３；５）非相互的染色体転座の存在が、ＳＫ−ＲＣ−９細胞（不完全な４倍体系統）において見出された。ｔ（３；５）の局所の位置を、第３染色体由来のＢＡＣクローンによるＦＩＳＨを用いて決定した。ヒト第３染色体短腕の約１Ｍｂの領域を規定するＢＡＣクローン（７３２５６３５８−７３４１９６７９ｂｐに位置するクローンＲＰ１１−２４Ｅ１、パネルＡおよび７４２１０８８５−７４２３６０８９ｂｐに位置するクローンＲＰ１１−７８１Ｅ１９、パネルＢ）を、第５染色体全体のペインティング（赤い蛍光）と組み合わせて、ＳＫ−ＲＣ−９染色体からの分裂中期の拡散のＦＩＳＨ分析のために、蛍光的に緑に標識した。ＢＡＣクローンＲＰ１１−２４Ｅ１は、２つの正常な第３染色体の短腕にハイブリダイズするが（パネルＡ、緑の丸）、キメラ転座染色体ｔ（３；５）にはせず（パネルＡ、白い丸）、このＢＡＣは、転座ｔ（３；５）限界点のテロメア側であることを示す。ＢＡＣクローンＲＰ１１−７８１Ｅ１９は、正常第３染色体（パネルＢ、緑の丸）およびキメラ染色体ｔ（３；５）（パネルＢ、白い丸）の両方にハイブリダイズする。従って、このＢＡＣはｔ（３；５）限界点のセントロメア側に位置する。これらのデータは、転座限界点は、これら２つのＢＡＣクローンによって規定される染色体領域の間またはその中にあることを示す。
【０２５２】
Ｃ．ＦＩＳＨによって決定された、推定ｔ（３；５）転座限界点を含む第３染色体の領域を示す、ＳＫ−ＲＣ−９における正常第３染色体およびキメラｔ（３；５）の概略図表示。第３染色体を緑で、および第５染色体を赤で示す。およそ染色体３ｐ１３−ｐ１２．３の領域を含む、限界点を含む領域を白で示し、そして下に拡大する。
【図３】ＭＣＣ法は、第３染色体の３００ｂｐ以内にｔ（３；５）限界点の位置を決定する  各グラフは、染色体３ｐに広がる配列の相対的コピー数（縦軸）を示す（横軸：テロメア−セントロメア方向は左から右である）。
【０２５３】
第１回：３ｐ１３−ｐ１２．３に含まれる、〜３．７Ｍｂに広がる約２００から５００ｋｂの間隔で配列を選択した（正確な染色体位置および距離は、プライマー配列と共に表１で提供する）。プライマーのセット、すなわちセット５および７は、産物を生じなかった（点線で示す）。目で見た調査は、マーカー８および９の間にコピー数の２倍のシフトを示した（四角で囲って示す）。続く第２、３および４回において、徐々により短いマーカー間の距離を有する新規配列を選択した。第４回は、〜３００ｂｐ（５０−３００ｂｐ）離れたマーカーを使用し、そしてｔ（３；５）非相互的転座限界点を示すコピー数のシフト（四角で囲って示す）、および転座接合点のセントロメア側にある、第３染色体の領域における約７００ｂｐの短い欠失（点線の四角で示す）を表す２番目の異常を示した。
【図４】ＳＫ−ＲＣ−９ＤＮＡのフィルターハイブリダイゼーションは、再編成した部分を示し、そしてマイクロ欠失を伴う挿入を明らかにする。
【０２５４】
Ａ−Ｃ．ＳＫ−ＲＣ−９またはＳＫ−ＲＣ−１２（ＳＫ−ＲＣ−９のものより近位のｄｅｒ（３；５）を有する腎癌腫）のゲノムＤＮＡを、示された制限酵素で消化し、分画し、そして染色体３ｐ（３ｐＡまたは３ｐＢ）または５ｑのいずれか由来のクローン化ＰＣＲプローブへハイブリダイゼーションするためにフィルターへ移す。染色体３ｐプローブは、図３のＭＣＣデータから位置を決定し、そしてこの領域由来の反復を含まないゲノム配列を、ヒトゲノム配列データベースを用いて同定した。同様に、染色体５ｑ由来のプローブを、ｔ（３；５）接合部のクローニングおよび配列決定後に、ヒトゲノム配列データベースから決定した。
【０２５５】
Ｄ．ｔ（３；５）限界点の両側のハイブリダイゼーションプローブの位置を示す、染色体５ｑ、ｔ（３；５）および３ｐの関連する領域の部分的制限地図（染色体３ｐには３ｐＡおよび３ｐＢと呼ばれる、２つのプローブが存在した）。小さい欠失を伴う挿入の長さは確実でなく、そして小さい灰色の領域によって示され、それはＢにおいて示されるフィルターハイブリダイゼーションによって示されるようなＢｇｌＩＩ制限酵素部位を含む。
Ｂ＝ＢｇｌＩＩ；Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｎ＝ＮｃｏＩ；ＲＶ＝ＥｃｏＲＶ；Ｓ＝ＳｐｅＩ
Ｃ＝ＳＫ−ＲＣ−１２由来のコントロールゲノムＤＮＡ；Ｒ９＝ＳＫ−ＲＣ−９ゲノムＤＮＡ
【図５】ｔ（３；５）非相互的転座接合部の配列および染色体位置  ＳＫ−ＲＣ−９ゲノム内のｔ（３；５）転座接合部の位置を、ＭＣＣ法によって３００ｂｐ以内に決定した。ヒトゲノム配列データベースが、この推定される転座周囲の制限部位の同定を可能にし、そしてインバースＰＣＲを用いて接合部をクローニングした。ＳＫ−ＲＣ−９のＤＮＡをＸｂａＩで消化し、高希釈で自己ライゲーションして分子内環を得て、そしてＰＣＲ産物を、プライマーＦおよびＲ（パネルＡ）（プライマー配列に関しては方法を参照のこと）で増幅して得た。ＰＣＲ産物の配列は、ｔ（３；５）非相互的転座の接合部がクローニングされ、そして接合部は隣接する５ｑ（パネルＢ、赤で囲った配列）および３ｐ（パネルＢ、緑で囲った配列）配列を含むことを確認した。融合した配列の接合部における単一のさらなるＡ残基（矢印で示す位置）は、いずれかの染色体由来であり得ることに注意する。転座限界点の位置を、ヒトＥｎｓｅｍｂｌデータベース（ＮＣＢＩリリース３５）を用いて、染色体５ｑおよび３ｐで決定し、そしてパネルＣ（５ｑ）およびＤ（３ｐ）において示した。これらのパネルのそれぞれにおいて、上の線は関連する染色体の帯およびＭｂ距離を示し、そして下は様々な公知または推定遺伝子を示す。Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子の位置を、第５染色体（Ｃ）および第３染色体（Ｄ）の両方に関して示す。Ｇｅｎｓｃａｎ予測転写物（ＡＮ０３８２４１）を第５染色体の１０６．５８Ｍｂに示し、２つのｍＲＮＡ、ＢＣ０４０６７２（Ｒｉｋｅｎ  ｃＤＮＡ）およびＨＳＰ９０が、それぞれ第３染色体の７４．１０および７４．２に位置する。ＳＫ−ＲＣ−９のｔ（３；５）転座は、第３染色体または第５染色体のいずれにおいても遺伝子を分割しない。
【図６】ＳＫ−ＲＣ−１２における第３染色体の欠失のＭＣＣマッピングＡ．ＭＣＣ第１回マッピングに関して、３５個のマーカーのパネルを用いて、約０．２５Ｍｂ離れた間隔のマーカーを有するゲノム領域〜９Ｍｂをスクリーニングした。マーカー２２および２３の間でコピー数のシフトが検出された。その結果を、ゲノム／アリコートをｙ軸に、そしてマーカー番号をｘ軸に、マーカーパネルに関して示す。マーカーの間の距離は、ゲノムの距離を反映するのではなく数値のものである。四角で囲った領域は、低コピーから高コピーのシフトを表す。第１回のデータに基づいて、２番目のセットのプライマーを、平均３０ｋｂ離してデザインした；コピー数の変化はマーカー９および１３の間にマッピングされたことを示す。続いて、さらに２回のＭＣＣを、約３Ｋｂ（第３回）および４００ｂｐ（第４回）離れたマーカーを用いて行った。コピー数のシフトが、第４回においてマーカー６および７の間で起こり、シフトの位置を第３染色体の８００ｂｐ以内に規定した。Ｂ．このコピー数のシフトを有するＳＫ−ＲＣ−１２ＤＮＡのゲノム領域を、インバースＰＣＲの後にクローニングし、そしてＳＫ−ＲＣ−１２細胞における第３染色体の潜在性の欠失を明らかにした。上の配列（大文字）は、染色体３ｐの欠失のテロメア末端に広がり、そして下の配列（小文字）は染色体３ｐの欠失のセントロメア末端に広がり、一方中央の配列は、８１．６４および８１．９４Ｍｂに位置する、ＳＫ−ＲＣ−１２ＤＮＡにおける欠失の接合部に見出される融合物である。
【図７】ＳＫ−ＲＣ−９中期染色体のペインティング  第３染色体（赤）および第５染色体（緑）によるハイブリダイゼーションシグナルおよびＳＫ−ＲＣ−９培養物（この系統は不完全な４倍体である）の中期のＤＡＰＩ染色における、融合した画像を示し、非乳頭状腎細胞癌に典型的な非相互的ｔ（３；５）染色体転座の存在を示す。染色体のペインティングを、Ｖｙｓｉｓから得た。
【図８】ＳＫ−ＲＣ−９染色体ｔ（３；５）におけるマイクロ欠失の同定  ２組の実験においてＳＫ−ＲＣ−９を、またはコントロールとしてＳＫ−ＲＣ−１２を用いて、ＭＣＣデータを第４回ＰＣＲ（主文図３におけるように）から得た。転座およびマイクロ欠失領域は、再現性のあるコピー数のシフトを示し、一方コントロールＳＫ−ＲＣ−１２ＤＮＡは、この領域においてコピー数のシフトを有さない水平の曲線を示す。
【図９】ＳＫ−ＲＣ−１２ＤＮＡの第１回ＭＣＣに関するＰＣＲ産物のアガロースゲル分画  ＳＫ−ＲＣ−１２ＤＮＡで、染色体３ｐの約０．２５Ｍｂの領域にわたるマーカーを用いて、第１回ＭＣＣ分析を行い（図６Ａ、第１回を参照のこと）、マーカー２２および２３の間にコピー数のシフトを示した。マーカー２１、２２、２４、および２５のセミネステッドＰＣＲ産物に関する分析ゲルを示す。
【図１０】ＭＣＣによって検出されたゲノムの変化を確認するための、ＳＫ−ＲＣ−１２ＤＮＡのフィルターハイブリダイゼーション  ＳＫ−ＲＣ−１２染色体３ｐＤＮＡのＭＣＣは、コピー数のシフトを４００ｂｐの領域内に同定し（図６Ａ、第４回を参照のこと）、ゲノムの変化を示した。これを、コントロールリンパ芽球様細胞系統（ＬＣＬ）から調製したＤＮＡと比較して、ＳＫ−ＲＣ−１２ゲノムＤＮＡのフィルターハイブリダイゼーションによって確認した。２３７ｂｐのプローブを第３染色体から増幅し、そして示した制限消化物とハイブリダイズした。ＬＣＬと比較して、ＳＫ−ＲＣ−１２ＤＮＡを有する各場合において、再編成された断片を観察した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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