(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラノーマの治療薬の製造における治療上有効量のデキサナビノールまたはその塩の使用。
【請求項２】
前記メラノーマの癌細胞が前癌性、悪性、転移性、または多剤耐性である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記メラノーマの治療薬がメラノーマ癌細胞においてＮＦκＢ活性を別々に、同時に、または経時的に抑制するための薬である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記メラノーマの治療薬がメラノーマ癌細胞の腫瘍形成の抑制するための薬である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記腫瘍形成の抑制が前記メラノーマ癌細胞において細胞毒性およびアポトーシスの両方を誘発することを含む、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記メラノーマの治療薬は、化学療法薬、免疫療法薬、遺伝子治療薬、または放射線治療薬を含む治療薬のうちの一つ以上と別々に、同時に、または、経時的に併用して投与される薬である、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記メラノーマの治療薬は、経口でもしくは静脈内に投与される薬である、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
メラノーマの治療のための医薬組成物であって、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、またはキャリアとの混合体でデキサナビノールまたはその塩と、化学療法薬、免疫療法薬、遺伝子治療薬、もしくは放射線治療薬を含む治療薬のうちの一つ以上の治療薬とを含む、医薬組成物。
【請求項９】
局所投与または静脈内投与に順応した、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
デキサナビノールまたはその塩を含む、メラノーマの治療のための局所投与のための医薬組成物。
【請求項１１】
クリーム剤、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、ジェル剤、ローション剤、軟膏剤（ｕｎｇｕｅｎｔ）、皮膚軟化薬、コロイド分散剤、懸濁剤、乳剤、油剤、スプレー剤、フォーム剤、またはムース剤の形態である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノーマの治療のための薬物および方法を提供する。より具体的には、本発明はメラノーマの治療のためのデキサナビノールまたはその誘導体を提供する。
【背景技術】
【０００２】
メラノーマ症例の発生率は、１９４０年代から年々倍増している。メラノーマは、現在男性では６番目に最も多い癌であり、および女性では７番目に最も多い癌である。その発生率は、全世界で増加している（Ｐａｒｋｅｒ，  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７）。メラノーマの５年生存率は３０〜４０％であり、悪性メラノーマでは転移による最も高い死亡率のリスクを伴う（Ｊｅｍａｌ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１）。この疾患が遠隔臓器（例えば肝臓、骨、および脳）に拡散すると、５年生存率は１２％未満に低下する。現在のところ、転移性（ステージＩＶ）メラノーマの患者に対する効果的な長期治療法はない。標準的化学療法レジメンは、これらの患者において著しい長期延命効果を呈さず、および化学療法は、毒性のために罹患の程度と関連することもある。癌の進行を阻止することおよび進行した疾患を治療することの両目的で、メラノーマに対する新規の標的療法を開発することが明らかに必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
メラノーマに対する新規の効果的な治療法を見つけることは、極めて難しいと分っている。従来の化学療法薬および放射線に対する高い耐性は、メラノーマの顕著な特徴の一つである。（Ｓｍａｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｅｉｓｅｎ，  ２００３；  Ｓｔｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。さらに特異的な標的療法が開発され得ることを期待して、研究は現在、メラノーマ遺伝子突然変異およびシグナル伝達経路に関連する混乱を同定することに移行してきている。細胞増殖、アポトーシス、および耐性または転移にとって重要ないくつかの細胞経路は、メラノーマで活性化されることが示されている。メラノーマは、調節機能の喪失または坑アポトーシス機能もしくは増殖機能の獲得を含む複数の欠陥をおそらく発生させる。従って、いくつかのシグナル伝達経路を同時に抑制し得る治療薬が極めて望ましい。さらに、化学療法耐性が抑制される場合は、標準的化学療法を新規の薬剤と併用して投与することで、従来の化学療法をメラノーマに対してさらに有効に活用することが可能になる。課題は現在、これらの異常な経路を標的とする選択的な薬剤を開発することである。
【０００４】
核因子κＢ（ＮＦκＢ）経路の異常な活性化は、メラノーマ成長、転移、およびアポトーシスからの回避と関連していた。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、正常なメラニン細胞と比較して、ヒトメラノーマ培養物中で構成的に増加したＮＦκＢの結合を示している（Ｄｈａｗａｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４，  ＭｃＮｕｌｔｙ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４）。ＮＦκＢのサブユニットであるＲｅｌＡの発現も、正常な皮膚と比べて、ヒト母斑およびメラノーマにおいて著しく増加することが示されている。ＮＦκＢ経路は従って、メラノーマを治療するための標的候補である。ＮＦκＢの構成的活性化は、いくつかの効果がある。以前の研究は、ＮＦκＢの持続的活性化がケモカイン（例えばＣＸＣＬ８およびＣＸＣＬ１）の産生を増大させることになり、それによって血管新生を刺激し、従ってメラノーマにおける腫瘍形成を促進させることを示した。さらに、活性化ＮＦκＢは、坑アポトーシスおよび増殖に関与するいくつかの遺伝子の重要な中心的調節因子である（Ｍａｙｏ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７）。その坑アポトーシスの役割に加えて、ＮＦκＢはメラノーマでの化学療法耐性の発現において決定的役割も有する可能性がある（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  １９９９）。
【０００５】
メラノーマにおけるＮＦκＢの活性化は、ＮＦκＢ経路の主要な調節因子であるＩＫＫの構成的活性化に起因することが示されている（Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，  ２００１）。ＮＦκＢ経路インヒビター、および特にＩＫＫインヒビターは、アポトーシスに向かって腫瘍細胞を標的にすることでそれら細胞を死滅させ非常に効果的な手段を提供し得る。
【０００６】
正常な細胞でＮＦκＢの機能に影響されずに、メラノーマでのＮＦκＢの活性化を選択的に標的にする小分子は、従って単一薬剤として、または現存する化学療法と併用して、重要な治療可能性を有する。
【０００７】
目的の一つの特定の化合物は、米国特許第４，８７６，２７６号に開示されている、１，１  ジメチルヘプチル−（３Ｓ，４Ｓ）−７−ヒドロキシ−Δ6−テトラヒドロカンナビノール（デキサナビノール）である。非競合的なＮＭＤＡ受容体遮断薬であることに加えて、デキサナビノールはＮＦκＢを抑制することが示されている（Ｊｕｔｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４）。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は現在、１，１  ジメチルヘプチル−（３Ｓ，４Ｓ）−７−ヒドロキシ−Δ6−テトラヒドロカンナビノール（ＩＮＮ  デキサナビノール）またはその誘導体とメラノーマ細胞を接触させることを含む、メラノーマ細胞を急速に死滅させる方法を見出している。本発明は、前癌性、悪性、転移性、または多剤耐性であるメラノーマ癌細胞を考える。
【０００９】
それ故、第一の態様に従って、本発明はメラノーマの治療のためのデキサナビノールまたはその誘導体を提供する。
【００１０】
本発明に係るメラノーマの治療は、デキサナビノールまたはその誘導体をメラノーマ癌細胞に与えることによってメラノーマ癌細胞におけるＮＦκＢの活性を抑制することを含み得る。
【００１１】
あるいは、メラノーマの治療は、有効量のデキサナビノールまたはその誘導体とメラノーマ癌細胞を接触させることによるメラノーマ癌細胞の腫瘍形成の抑制を含み得る。腫瘍形成の抑制は、癌細胞において細胞毒性およびアポトーシスの両方を誘発することを含む。
【００１２】
さらに、本発明に係るメラノーマの治療は、ＮＦκＢ活性とメラノーマ癌細胞の腫瘍形成とを別々に、同時に、または経時的に抑制することを含み得る。
【００１３】
デキサナビノールまたはその誘導体は、メラノーマの治療の場合有利である。なぜならば、現在用いられている化学療法薬と比べて、とりわけ毒性の減少、副作用の減少、および／または耐性の減少を示すからである。
【００１４】
メラノーマの治療および／または防止のために、デキサナビノールまたはその誘導体と併用して、第２の治療薬がメラノーマ癌細胞に与えられ得ることが、さらに考えられる。第２の薬剤は、化学療法薬、免疫療法薬、遺伝子治療薬、または放射線治療薬を含み得る。第２の治療薬は、デキサナビノールまたはその誘導体と共に別々に、同時に、または経時的に投与されてもよい。
【００１５】
本明細書において「誘導体」という用語は、従来から知られているデキサナビノールの任意の誘導体（とりわけ溶媒和化合物）を含むものとする。本明細書で説明する化合物の対応する溶媒和化合物を調製、精製、および／または処理することが簡便でありまたは望ましくもある。それを、説明する複数の用途／方法のうちのいずれか一つで用いてもよい。本明細書において「溶媒和化合物」という用語は、溶質（例えば化合物またはその化合物の塩）および溶媒の複合体を言及する。溶媒が水の場合、溶媒和化合物は、水和物（例えば、基質の分子あたり存在する水分子の数に応じて、一水和物、二水和物、三水和物等）と称されることもある。「誘導体」という用語は、特に塩を含むものとする。デキサナビノールの適合性塩は公知であり、先行技術に説明されている。薬学的に許容される塩を作製するのに用いることの可能な有機酸塩および無機酸塩ならびに有機塩基塩および無機塩基塩。そのような酸としては、フッ化水素酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、クエン酸、コハク酸、マレイン酸、およびパルミチン酸が挙げられるがこれらに限定されない。塩基としては、水酸化ナトリウムおよび水酸化アンモニウム等の化合物が挙げられる。当業者は、デキサナビノールの薬学的に許容される四級アンモニウム誘導体を作製するのに用いることが可能な薬剤を四級化することを熟知している。これらは、ヨウ化メチルおよびヨウ化エチルならびに硫酸メチルおよび硫酸エチルが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１６】
本発明のさらなる態様により、本発明者は、治療上有効量のデキサナビノールまたはその誘導体とメラノーマ細胞を接触させることを含むメラノーマの治療法または軽減方法を提供する。
【００１７】
従って、一実施形態において、本発明は、メラノーマの治療のための薬物の製造においてデキサナビノールまたはその誘導体の用途を提供する。
【００１８】
本発明者は特に、メラノーマの治療のために局所的に投与可能な薬物（例えばメラノーマの治療のための局所的に投与可能な薬物）の製造において、デキサナビノールまたはその誘導体の用途を提供する。
【００１９】
さらに、第ニ態様において、本発明はメラノーマの治療方法を提供する。該方法は、治療上有効量のデキサナビノールおよびその誘導体ならびに／またはそれらを組み合わせで投与することを含む。
【００２０】
デキサナビノールおよびその誘導体ならびに／またはそれらの組み合わせは、それ自体は知られており、および当業者にとって既知の方法を用いて調製可能であり、または商業的に入手可能である。特に、デキサナビノールおよびその調製方法は、米国特許第４，８７６，２７６号に開示されている。
【００２１】
有利なことに、本発明の用途および／または方法において、本発明の化合物およびその誘導体ならびに／またはそれらの組み合わせは、経口で、もしくは静脈内に投与され得る。
【００２２】
従って、用途において、本発明の化合物の方法および／または組成物は、錠剤、カプセル剤、糖衣錠、坐薬、懸濁剤、溶液剤、注射剤（例えば静脈内、筋肉内、または腹腔内注射用）、植込錠、局所用製剤（例えば、ジェル剤、クリーム剤、軟膏剤、エアゾール剤、もしくはポリマー系剤等の経皮製剤）、または吸入型（例えばエアゾール剤もしくは粉末製剤）として提供され得る。
【００２３】
経口投与に適した組成物としては、錠剤、カプセル剤、糖衣錠、液剤、懸濁剤、溶液剤、およびシロップ剤が挙げられる。皮膚への局所投与に適した組成物としては、クリーム剤、例えば水中油型乳剤、油中水型乳剤、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、ジェル剤、ローション剤、軟膏剤（ｕｎｇｕｅｎｔ）、皮膚軟化薬、コロイド分散剤、懸濁剤、乳剤、油剤、スプレー剤、フォーム剤、ムース剤等が挙げられる。局所塗布に適した組成物としては、例えば脂質もしくは特殊な界面活性剤で構成されたリポソームキャリアも挙げられる。
【００２４】
他のアジュバント、希釈剤、またはキャリアの例は、以下の通りである：
錠剤および糖衣錠の場合−賦形剤（例えば乳糖、デンプン、結晶セルロース、タルク、およびステアリン酸；潤滑剤／流動促進剤（例えばステアリン酸マグネシウムおよびコロイド二酸化ケイ素；崩壊剤（例えばデンプングリコール酸ナトリウムおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム）；
カプセル剤の場合−アルファル化デンプンまたは乳糖；
経口溶液剤または注射剤またはかん腸剤の場合−水、グリコール、アルコール、グリセリン、植物油
坐薬の場合−天然油もしくは硬化油またはワックス。
【００２５】
上述のように化合物もしくはその誘導体および／またはそれらの組み合わせまたは任意の併用レジメでも、例えば経皮送達装置もしくは適切な媒体を介して、または例えば軟膏基剤（制御送達用のパッチに組み入れることが可能である）で経皮的に投与することも可能である。そのような装置は、例えば経口薬または静脈内投薬に関連する長期治療を可能にし得るので、有利である。
【００２６】
経皮送達装置の例としては、例えば患者の皮膚を介して化合物または物質を放出するように順応するパッチ、包帯材、絆創膏、または硬膏剤が挙げられ得る。当業者は、化合物または物質を経皮的に送達するのに用いられ得る材料および技法を熟知しているであろう。また模範的な経皮送達装置は、英国特許第２１８５１８７号、米国特許第３２４９１０９号、米国特許第３５９８１２２号、米国特許第４１４４３１７号、米国特許第４２６２００３号、および米国特許第４３０７７１７号で提供されている。
【００２７】
メラノーマの治療のために、本発明は特に、皮膚上でもしくは注射（例えば皮下に）によってまたは両方で、組成物を局所的に投与することを可能にする。さらに、デキサナビノールまたはその誘導体は、皮膚腫瘍の成長を軽減させるために、注入法によってかつ局所的に、同時にもしくは経時的に送達され得る。
【００２８】
局所的に投与される組成物が特に好ましい。
【００２９】
ここで、ほんの一例として本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】メラノーマＡ３７５細胞におけるシスプラチン（Ａ）およびデキサナビノール（Ｂ）のアポトーシスおよび増殖への効果を示す図。
【図２】メラノーマＧ３６１細胞におけるシスプラチン（Ａ）およびデキサナビノール（Ｂ）のアポトーシスおよび増殖への効果を示す図。
【図３】メラノーマＷＭ３６６−４細胞におけるシスプラチン（Ａ）およびデキサナビノール（Ｂ）のアポトーシスおよび増殖への効果を示す図。
【図４】５日間の曝露後の３種類のメラノーマ細胞株におけるデキサナビノールの増殖抑制への効果を示す図。
【図５】Ａ３７５メラノーマ細胞における細胞死滅へのデキサナビノールの経時的効果を示す図。
【図６】腫瘍増殖の経時変化を示す図。
【図７】腫瘍が処置当日の腫瘍体積の４倍に達する時間（腫瘍体積相対値４までの時間）のサマリーグラフを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
［実施例］
（実施例１）
ヒトメラノーマ細胞系においてデキサナビノールによるアポトーシスの誘発
方法
【００３２】
３種類のヒトメラノーマ細胞株（Ａ３７５、Ｇ−３６１、ＷＭ２６６−４）を、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ，  ＵＫ）および２ｍＭのＬグルタミン酸塩を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ，  ＵＫ）中で、３７℃で、５％加湿ＣＯ2中で維持した。細胞を収集して洗浄し、成長培地に再懸濁させて、カウントした（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｖｉ−ＣＥＬＬ  ＸＲ）。細胞を、１２．５μｌ／ウェルアリコート中に１．６×１０5〜２．４×１０5細胞／ｍｌで、３８４ウェルの組織培養プレートの中程の２４０ウェルの上で平板培養した。５０μｌの成長培地を外側のウェルに等分した。細胞株あたり２プレートを調製した。プレートを５％加湿ＣＯ2中で、３７℃で一晩インキュベートした。
【００３３】
デキサナビノールを成長培地で、２×最終アッセイ濃度（１２５、３１．３、７．８１、２．００、０．４９、０．１２、０．０３１、および０．００８μＭ）で調製した（ＤＭＳＯ濃度を希釈範囲にわたり０．５％で一定に保った）。
【００３４】
シスプラチンを陽性対照として使用した。最終アッセイ濃度は、１０、２．５、０．６３、０．１５６、０．０３９、０．０１０、０．００２、および０．０００６μｇ／ｍｌであった。６複製中に、１２．５μｌ／ウェルのデキサナビノールまたはシスプラチンの希釈をプレートに加えた。１２．５μｌの成長培地を培地対照ウェルに加えた。プレートを５％加湿ＣＯ2中で、３７℃で２４時間インキュベートした。
【００３５】
カスパーゼ３／７のレベルをＡｐｏ−ＯＮＥ（Ｃ）Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｃａｓｐａｓｅ−３／７アッセイ・キットで評価した。カスパーゼ基質を添加してから１、２、３、および４時間後、蛍光をＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（Ｃ）ＩＩ384プレートリーダーを用いて測定した。４時間後の測定値を分析で用いた。
【００３６】
細胞生存アッセイをＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（Ｃ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬を用いて、それぞれの細胞株に対して同じプレート上で平行して行った。簡潔に言うと、２５μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（Ｃ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬をそれぞれのウェルに加えた。プレートを５００ｒｐｍで１分間振盪し、次いで５％ＣＯ2中で、３７℃で４時間インキュベートした。蛍光をＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（Ｃ）ＩＩ384プレートリーダー（５７０ｎｍ励起波長、６００ｎｍ発光波長、５９０ｎｍカットオフ）を用いて測定した。デキサナビノールおよびシスプラチンの細胞毒性効果を示すプロットを同じグラフ上でオーバーレイとして示す。
【００３７】
結果
メラノーマ細胞株Ａ３７５、Ｇ−３６１、およびＷＭ２６６−４において、シスプラチンまたはデキサナビノールのいずれかを用いての２４時間にわたるインキュベーション後のアポトーシスの誘発は、それぞれ図１〜３に示し、表１に要約する。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅ（登録商標）アッセイで測定したように、細胞毒性を表す細胞生存の評価も示す。
【００３８】
シスプラチンを陽性対照として使用し、３種類のすべてのメラノーマ細胞株において、ＩＣ50値およそ２０〜６０μＭで細胞毒性反応を観察した。アポトーシスの誘発は、用量反応曲線（Ｇ−３６１、ＷＭ２６６−４）が不十分なために容易には定量化されなかった。
【００３９】
デキサナビノールは、３種類のメラノーマ細胞株において１０〜２１μＭの範囲のＩＣ50値で細胞毒性反応を誘発した。アポトーシスの誘発は、用量反応曲線が不十分なために、Ｇ−６３１およびＡ３７５では定量化されなかった。アポトーシスのピーク反応は、２．５μＭで起こり、細胞溶解および細胞喪失のためと思われるが１０μＭの最高濃度で低下した。
【００４０】
表１：３種類のヒトメラノーマ細胞株におけるデキサナビノールのアポトーシスの誘発および細胞増殖への効果
【００４１】
【表１】
0005440985.tif 000002
ＮＤ−用量反応曲線が不十分なためにＥＣ／ＩＣ50は不同定
ランク＊弱いアポトーシス誘発および増殖の減少（＜３５％）
＊＊中程度のアポトーシス誘発および増殖の減少（３５〜７０％）
＊＊＊良好なアポトーシス誘発および増殖の減少（＞７０％）
【００４２】
これらの結果を図１〜３に示す。ここで、
図１は、メラノーマＡ３７５細胞におけるシスプラチン（Ａ）およびデキサナビノール（Ｂ）のアポトーシスおよび増殖への効果を示す；
図２は、メラノーマＧ３６１細胞におけるシスプラチン（Ａ）およびデキサナビノール（Ｂ）のアポトーシスおよび増殖への効果を示す；および
図３は、メラノーマＷＭ３６６−４細胞におけるシスプラチン（Ａ）およびデキサナビノール（Ｂ）のアポトーシスおよび増殖への効果を示す。
【００４３】
（実施例２）
デキサナビノールによるメラノーマ細胞増殖の抑制
方法
【００４４】
メラノーマ細胞増殖を抑制するデキサナビノールの能力も、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイを用いて、３種類のメラノーマ細胞株（Ａ３７５、ＵＡＣＣ６２、Ｍａｌｍｅ−３Ｍ）において研究した。
【００４５】
最終濃度のデキサナビノールの無菌溶液（０．５％ＤＭＳＯに０．００１μＭ〜１００μＭ）を調製した。
【００４６】
細胞を、０．５％ＤＭＳＯでの薬物濃度（ウェルあたり総量１００ｕｌ）で、５％ＣＯ2中、３７℃で５日間インキュベートした。対照ウェルには、細胞と、０．５％ＤＭＳＯと、培地とを含有させた。
【００４７】
ＳＲＢ増殖抑制アッセイを２４時間および５日間の曝露期間で実施した。曝露後、細胞を固定し、ＳＲＢで染色して、ＳｐｅｃｔｏｒＭａｘ（登録商標）２５０マイクロプレート分光光度計装置のプレートリーダー上に読み込んだ。
【００４８】
結果
５日間の曝露後の３種類のメラノーマ細胞株におけるデキサナビノールの増殖抑制への効果を、図４に示す。増殖抑制も、２４時間の曝露後に測定した。両曝露時間のＧＩ50値を表２に要約する。
【００４９】
表２：メラノーマ細胞増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで抑制するデキサナビノールの能力への曝露時間の効果。
【００５０】
【表２】
0005440985.tif 000003
aＳＲＢ増殖抑制アッセイによる測定。
【００５１】
（実施例３）
細胞増殖へのデキサナビノールの経時的効果
方法
【００５２】
１種類のメラノーマ細胞株（Ａ３７５）における細胞増殖へのデキサナビノールの経時的効果を、クローン原生アッセイ法を用いて試験した。
【００５３】
Ａ３７５細胞を、増殖する細胞培養物から収集して、カウントした。細胞を１．０×１０5／ｍｌまで希釈し、次いで２ｍｌ／ウェルを６ウェルプレートに播種した。
【００５４】
細胞を、３７℃で加湿インキュベーター（９５％空気＋５％ＣＯ2）内で一晩インキュベートした。
【００５５】
細胞を、３曝露期間（１時間、６時間、および２４時間）で２０μＭまでの４回量のデキサナビノールで処理した。
【００５６】
それぞれの曝露期間の後、ＰＢＳで２回洗浄し、次いでシングルストレングスのトリプシンを０．２ｍｌ各ウェルに加えて、細胞が分離するまで３７℃でインキュベートすることで、細胞をウェルから収集した。細胞懸濁液を１／１０希釈でカウントし、次いで１／１０、１／１００、１／１０００に希釈した。
【００５７】
１０ｃｍシャーレ（７ｍｌの新鮮な培地を含有する）にデキサナビノール治療および対照治療のための３種類の異なる細胞密度で播種した。適切な大きさのコロニーが対照シャーレに形成されると、シャーレを固定し、染色してカウントした。
【００５８】
デキサナビノール処置Ａ３７５細胞での生存率を、以下の式を用いて算出した：
クローニング効率％＝カウントしたコロニー数／播種した細胞数×１００
生存率＝薬物で処置した細胞のクローニング効率／対照細胞のクローニング効率×１００
【００５９】
結果
Ａ３７５メラノーマ細胞における細胞死滅へのデキサナビノールの経時的効果を、図５に示す。
【００６０】
（実施例４）
ヒトメラノーマ細胞異種移植の増殖に対するデキサナビノールによる抑制
方法
【００６１】
デキサナビノールがメラノーマ細胞増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで抑制したことを確立して、本発明者は次いでこの化合物がｉｎ  ｖｉｖｏで活性があるかどうかを確立することを追求した。予備薬物動態（ＰＫ）および最大耐用量（ＭＴＤ）試験を実施し、デキサナビノールの治療上有効量レベルが、Ａ３７５腫瘍を有するＣＤ１マウスにおいて達成され得るかどうかを同定した。その結果は、ＭＴＤ（１００ｍｇ／ｋｇ静注の単回投与）で１０μＭの血漿濃度が２時間の間達成可能であることを示した。これに基づいて、単回投与有効性試験を行った。デキサナビノールを、生理食塩水中１０％のクレモフォール／エタノール（１：１  Ｖｖ／ｖ）の媒体で希釈した。対照マウスには、媒体だけを投与した。
【００６２】
１０匹のマウスにデキサナビノールを１００ｍｇ／ｋｇ静注で投与した。１０匹のマウスに媒体（１０ｍｌ／ｋｇ）を投与した。マウスに、５０μｌの培地中の１×１０7のＡ３７５ヒトメラノーマ細胞を側腹部に移植した。一旦、腫瘍が触知できる（およそ５ｍｍ×５ｍｍ）ようになると、２０匹のマウスにデキサナビノールまたは媒体のいずれかで（上記のように）処置した。マウスを、少なくとも毎日観察し、週に３回、体重を量った。処置後、腫瘍の大きさを週に３回測定した。この処置を４週間続けた。
【００６３】
結果
腫瘍増殖の経時変化と、腫瘍が処置当日の腫瘍体積の４倍に達する時間（腫瘍体積相対値４までの時間）のサマリーグラフとを図６および図７に示す。
【００６４】
要約
他の組織での播種性のメラノーマ転移に由来するものを含むいくつかの確立したヒトメラノーマ細胞株に対して、デキサナビノールを試験した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイは、およそ平均１４μＭで分布する濃度で試験したヒトメラノーマ細胞株のすべてに対してデキサナビノールが極めて細胞毒性であることを示した。デキサナビノールは、カスパーゼ３／７依存的な様式でアポトーシス細胞死を誘発した。
【００６５】
この効果は時間非依存であり、２４時間後と同様に１時間後に細胞死滅は著しかった。
【００６６】
デキサナビノールのｉｎ  ｖｉｔｒｏ坑腫瘍効果は、患者において安全かつ臨床的に達成可能であることを示す薬物濃度で観察された（およそ１０〜２０μＭ）。次いでヒトメラノーマ細胞異種移植の増殖へのデキサナビノールの単回投与の効果に、取り組んだ。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイの結果に基づき、最低限必要な血漿濃度（少なくとも２時間保持される１０μＭ）を、ＣＤ１ヌードマウスにＭＴＤ（１００ｍｇ／ｋｇ）でデキサナビノールを単回静注で投与することによって達成した。デキサナビノールの単回投与は、Ａ３７５ヒト腫瘍異種移植を有するＣＤ１ヌードマウスにおいて増殖遅延効果があった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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