(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６からなる群から選択される少なくとも一つのＮＫ受容体に特異的に結合し、ヒトＮＫ細胞上の前記少なくとも一つのＮＫ受容体に結合する場合、前記ＮＫ細胞を涸渇させる、抗体または抗体フラグメントを含み、ここに、前記抗体または抗体フラグメントはＣＤ１６  Ｆｃ受容体に結合するヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ３アイソタイプのＦｃ領域を含むものである、免疫増殖性障害の処置のための医薬組成物。
【請求項２】
患者内のＴ細胞またはＮＫ細胞によって顕著に発現される少なくとも一つのＮＫ受容体に特異的に結合し、結合した前記Ｔ細胞またはＮＫ細胞を涸渇させる、抗体または抗体フラグメントを含み、ここに、前記抗体または抗体フラグメントはＣＤ１６  Ｆｃ受容体に結合するヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ３アイソタイプのＦｃ領域を含むものである、患者における免疫増殖性障害の処置のための医薬組成物。
【請求項３】
前記少なくとも一つのＮＫ受容体が、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６からなる群から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記少なくとも一つのＮＫ受容体が、前記ＮＫ細胞の少なくとも５０％に検出可能に存在する、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記免疫増殖性障害が、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、結節性多発動脈炎、全身性エリテマトーデス、ウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、クローン病、原発性胆汁性肝硬変、強皮症、大腸炎、シェーグレン症候群、１型糖尿病、ぶどう膜炎、グレーブス病、甲状腺炎、１型糖尿病、心筋炎、リウマチ熱、強皮症、強直性脊椎炎、関節リウマチ、糸球体腎炎、サルコイドーシス、皮膚筋炎、重症筋無力症、多発性筋炎、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症、円形脱毛症、天疱瘡／類天疱瘡、乾癬、および白斑から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記抗体または抗体フラグメントがヒト、ヒト化またはキメラ抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記抗体または抗体フラグメントが複数のＫＩＲ受容体に結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記抗体または抗体フラグメントがＮＫｐ４６に特異的に結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記抗体または抗体フラグメントがＮＫＧ２Ｃに特異的に結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ａ．ヒトＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２E、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６からなる群から選択される少なくとも一つのＮＫ細胞受容体に特異的に結合し、
ｂ．ＣＤ１６  Ｆｃ受容体に結合し、
ｃ．ヒトＮＫ細胞上の前記少なくとも一つのＮＫ細胞受容体に結合する場合、前記ＮＫ細胞を涸渇させ、
ここに、ＣＤ１６に結合するヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ３アイソタイプのＦｃ領域を含むものである、
モノクローナル抗体または抗体フラグメント。
【請求項１１】
前記抗体または抗体フラグメントがヒト、ヒト化またはキメラ抗体である、請求項１０に記載のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
【請求項１２】
前記抗体または抗体フラグメントがＮＫｐ４６に特異的に結合する、請求項１０に記載のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
【請求項１３】
前記抗体または抗体フラグメントがＮＫＧ２Ｃに特異的に結合する、請求項１０に記載のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
【請求項１４】
前記抗体または抗体フラグメントがＮＫＧ２ＣおよびＮＫＧ２Ｅに特異的に結合する、請求項１０に記載のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
【請求項１５】
免疫増殖性障害の処置における使用に適切な抗体または抗体フラグメントを産生させる方法であって、
ｉ．ＮＫ細胞の表面上に存在する１つ以上の受容体に特異的に結合する複数の抗体を提供する工程、
ｉｉ．免疫増殖性障害を伴う１人以上の患者から採取されたＮＫ細胞に結合する前記抗
体の能力を試験する工程、
ｉｉｉ．前記複数の抗体から、１人以上の前記患者から採取されたＮＫ細胞の少なくとも５０％に結合する抗体を選択する工程、
ｉｖ．前記抗体をヒトへの投与に適切ならしめる工程
を含み、
ここに、前記抗体または抗体フラグメントはＣＤ１６  Ｆｃ受容体に結合するヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ３アイソタイプのＦｃ領域を含むものである、
方法。
【請求項１６】
前記抗体または抗体フラグメントが、それが結合する前記ＮＫ細胞を涸渇させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体または抗体フラグメントが、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６から選択される単一の受容体に結合する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体または抗体フラグメントが、それをヒト化またはキメラ化することによってヒトへの投与に適切にされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法を使用して産生される抗体または抗体フラグメントを含む組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の組成物または請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメント、および医薬的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物。
【請求項２１】
前記免疫増殖性障害が、アレルギー、喘息、関節炎、および脱髄性症状から選択される自己免疫障害である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記免疫増殖性障害が、皮膚アレルギー、血管浮腫、骨関節炎、脊椎関節症、胃腸炎、および神経炎症性障害から選択される炎症性疾患である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記免疫増殖性障害が、組織損傷または傷害および／あるいは少なくとも３箇月継続する疾患によって特徴付けられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記抗体または抗体フラグメントが、放射性同位元素、毒性ペプチド、および毒性小分子から選択される細胞毒性剤に結合することによってヒトへの投与に適切にされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体または抗体フラグメントが、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２およびＫＩＲ２ＤＬ３に結合する、請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増殖性障害、特に、ＮＫ型ＬＤＧＬのような免疫増殖性障害を処置する方法、ならびにそのような障害を処置するための治療ストラテジーにおける使用のための抗体を産生させる方法に関する。一般的に、本方法は、障害の基礎となる増殖細胞の表面上に存在する受容体に特異的に結合する抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、従来にない免疫に関与するリンパ球のサブ集団である。ＮＫ細胞の特徴および生物学的特性として、ＣＤ１６、ＣＤ５６、および／またはＣＤ５７のような表面抗原の発現、細胞表面において発現されるα／βまたはγ／δＴＣＲ複合体の不在、特定の細胞溶解性酵素の活性化により、「自己の」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞に結合し、死滅させる能力、腫瘍細胞またはＮＫ活性化受容体−リガンドを発現する他の罹患した細胞を死滅させる能力、および免疫応答を刺激または阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力が挙げられる。
【０００３】
ＮＫ細胞活性は、活性化および抑制シグナルの両方に関与する複雑な機構によって調節される。ＮＫ細胞仲介認識およびＨＬＡクラスＩ欠損標的細胞の死滅に重要な役割を果たすいくらかの異なるクラスのＮＫ特異的受容体が同定されている。１つのそのようなクラスの受容体、ＮＣＲ（自然細胞障害性受容体（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ））は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４、Ｉｇスーパーファミリーのすべてのメンバーを含む。特異的なｍＡｂによって誘導されるそれらの架橋は、ＮＫ細胞を強度に活性化して、細胞内Ｃａ＋＋レベルの増加、細胞障害性の誘発およびリンフォカイン放出を生じる。
【０００４】
２つのＮＫ細胞受容体のさらなるファミリーは、ＫＩＲ受容体（キラー細胞免疫グロブリン様受容体）およびＣＤ９４／ＮＫＧ２である。これらのファミリーのそれぞれは、活性化および抑制性受容体の両方を含有する。ＫＩＲ遺伝子は、ＮＫ細胞上において発現されるＩｇスーパーファミリーメンバーの多様な多型性のグループを現し、２つまたは３つの細胞外Ｉｇ様ドメインのいずれかを有する。ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、およびＫＩＲ３ＤＬ３を含むファミリーの抑制性メンバーの細胞質ドメインは、荷電した残基を含有するＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、およびＫＩＲ３ＤＳ１のような活性性メンバーの細胞質ドメインとは対照的に、ＩＴＩＭ配列を含有する。ＫＩＲファミリーの抑制性メンバーは、抑制性効果ＨＬＡクラスＩ分子を仲介する。ＫＩＲ受容体ファミリー内に認められる多型は、個体間の遺伝子バリエーションならびにインビボでの特定のＮＫ細胞のクローンの拡大の結果である。レビューについては、例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５を参照のこと。
【０００５】
ＣＤ９４およびＮＫＧ２タンパク質は、Ｃ−型レクチンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ９４は、ＮＫ細胞上で好適に発現され、すべてのＮＫ細胞のうち少なくとも５０％においてそれ自体が発現されるＮＫＧ２ＡのようなＮＫＧ２スーパーファミリーメンバーとヘテロ二量体を形成する。ＮＫＧ２Ａは、２つのＩＴＩＭドメインを含有し、ＣＤ９４と共に、非古典的ＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ｅ（ヒトにおいて、マウスではＱａ−１ｂ）に結合するヘテロ二量体抑制性受容体を形成する（例えば、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０を参照のこと）。
【０００６】
ＮＫ−ＬＤＧＬ（ＮＫ型顆粒リンパ球増多症、あるいはＮＫ−ＬＧＬと呼ばれる）は、ＮＫ細胞またはＮＫ様細胞、即ち、表面抗原発現（例えば、ＣＤ３−、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋など、例えば、非特許文献１１を参照のこと）の特徴的組み合わせを示す大顆粒リンパ球のクローン発現によって引き起こされる増殖性障害のクラスを指す。これらの障害の基礎となる細胞増殖は、いくつかの患者において見られる軽度の症状からＮＫ−ＬＤＧＬ白血病と呼ばれる急速進行性の、しばしば致死性の形態の疾患までの範囲に及ぶ多様な影響を及ぼし得る。このクラスの障害の症状として、発熱、軽度の好中球減少、血小板減少、貧血、リンパ球増加、脾腫、肝腫、リンパ節症、骨髄浸潤などを挙げることができる（例えば、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４を参照のこと）。ＮＫ−ＬＤＧＬ白血病の処置は、しばしば、集中的であって、化学療法に関与し、疾患は、しばしば、致死的であって、凝固障害および多臓器不全に関連し、多数の臓器のＬＧＬ浸潤に関与する。自己免疫障害はまた、ＬＤＧＬにおいて顕著であり、何よりもまず関節リウマチを含む多数の障害が観察され、関節リウマチ患者の血液または関節液においてＬＤＧＬ白血病表現型を伴う細胞の数の増加が見出されている。これらの拡大された細胞のいくつかは、ＬＧＬの機能的および表現型特徴を有するＣＤ２８陰性Ｔ細胞である。また、ＬＤＧＬ患者では、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）および再生不良性貧血が観察される。従って、ＮＫ−ＬＤＧＬおよびＬＤＧＬの処置に有用な療法は、一般的に、免疫増殖性および自己免疫病態、特に、ＮＫ細胞が関与する障害の処置においても用途を有することが予想される。
【０００７】
一般的に、確立された免疫障害の処置に有効である有効な療法はほとんど認められていない。例えば、関節リウマチの場合、一旦誘発されると、免疫応答は滑膜の炎症を引き起こす。炎症の早期および中期分子メディエーターとして、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキンＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＬ−１５、トランスフォーミング増殖因子β、線維芽細胞増殖因子および血小板由来増殖因子が挙げられる。ＲＡの現代の薬理学的処置は、これらのメディエーターを標的化するが、しかし、関与する細胞がＮＫ細胞である場合、基礎をなす細胞を取り出さない。一旦、炎症反応が確立されると、滑膜は肥厚し、軟骨および基礎をなす骨は、崩壊し始め、関節破壊の徴候が生じる。免疫増殖性障害の有効な処置が相対的に欠乏していることから考えると、これらの障害の基礎をなす免疫細胞活性化および／または増殖を制限ならびに反転するための新規かつ革新的なストラテジーが、当該技術分野において大いに必要とされることは明らかである。本発明は、これらのおよび他の必要性に取り組む。
【非特許文献１】トラウスダレ（Ｔｒｏｗｓｄａｌｅ）およびパーハム（Ｐａｒｈａｍ）（２００４年）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３４（１）：７−１７
【非特許文献２】ヤワタ（Ｙａｗａｔａ）ら（２００２年）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ２２（５−６）：４６３−８２
【非特許文献３】シュー（Ｈｓｕ）ら（２００２年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １９０：４０−５２
【非特許文献４】ミドルトン（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ）ら（２００２年）Ｔｒａｎｓｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１０（２−３）：１４７−６４
【非特許文献５】ビルチェス（Ｖｉｌｃｈｅｓ）ら（２００２年）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ２０：２１７−５１
【非特許文献６】ＯＭＩＭ６０２８９４
【非特許文献７】ブラウド（Ｂｒａｕｄ）ら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ３９１：７９５−７９９
【非特許文献８】チャン（Ｃｈａｎｇ）ら（１９９５年）Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ２５：２４３３−２４３７
【非特許文献９】ラゼティック（Ｌａｚｅｔｉｃ）ら（１９９６年）Ｉｍｍｕｎ１５７：４７４１−４７４５
【非特許文献１０】ロドリゲス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）ら（１９９８年）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４７：３０５−３０９
【非特許文献１１】ラフラン（Ｌｏｕｇｈｒａｎ）（１９９３年）Ｂｌｏｏｄ  ８２：１
【非特許文献１２】ザンベロ（Ｚａｍｂｅｌｌｏ）ら（２００３年）Ｂｌｏｏｄ１０２：１７９７
【非特許文献１３】ラフラン（Ｌｏｕｇｈｒａｎ）（１９９３年）Ｂｌｏｏｄ８２：１
【非特許文献１４】エプリング−バーネッテ（Ｅｐｌｉｎｇ−Ｂｕｒｎｅｔｔｅ）ら（２００４年）Ｂｌｏｏｄ−２００３−０２−４００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在までのところ、ＮＫ細胞上で発現され、ＮＫ細胞活性をダウンレギュレートすることが意図される受容体に特異的な抗体は、一般的に、受容体機能または受容体発現をモジュレートしている。即ち、抗体は、活性受容体の機能化を阻止するか、またはＮＫ細胞上の抑制性受容体を活性化している。他の抗体は、活性受容体をダウンレギュレートするように指向された。ＮＫ細胞上で発現される受容体に指向された抗体を使用して、目的の受容体受容体を発現するＮＫ細胞を涸渇（死滅）させることができることを実証した。さらに、このＮＫ細胞涸渇は、毒性部分で機能化されていない「裸の」抗体によって仲介され得る。Ｆｃ受容体、特に、ＣＤ１６に結合するエフェクター領域を有する抗体が、特に好適である。
【０００９】
本発明者らはまた、これらの涸渇抗体が、試験したすべての器官および骨髄において、インビボで細胞を排除することができることを実証した。それは、抗体を使用して、器官内に局在するＮＫ細胞（循環ＮＫ細胞だけではない）に関与する免疫増殖性障害を処置することができることを示すため、およびそれは、涸渇抗体を使用して、例えば、自己反応性ＮＫ細胞が既に出現し、病理に関与している確立された免疫増殖条件を処置することができることを示すため、これは、重要な特徴である。一旦それらが良好に確立されると、免疫増殖性障害がしばしば診断されるため、ＮＫ細胞を涸渇することは、それらの活性を阻害することまたはさらなる増殖を防止することよりも重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、増殖性障害、特に、ＮＫ型ＬＤＧＬおよびＮＫ細胞に関与すると考えられる他の障害のような免疫増殖性障害の処置に有用な抗体ならびにこの抗体を産生させるための方法を提供する。ＮＫ細胞は、例えば、関節リウマチおよび糖尿病のような免疫増殖性障害に関与することが報告されている。それゆえ、本発明の抗体は、例えば、喘息、骨関節炎、関節リウマチ、および脊椎関節症を含む関節炎、胃腸炎、クローン病および大腸炎、神経炎症性障害、ならびにＩ型糖尿病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、乾癬、シェーグレン症候群、エリテマトーデス、脱髄性症状、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、多発性筋炎、ギラン・バレー症候群、ウェゲナー肉芽腫症（ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｕｓ）、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎、ベーチェット（Ｂｅｃｈｅｔ’ｓ）病、チャーグ・ストラウス症候群、高安動脈炎などのような自己免疫障害の処置において有用であることが予想される。１つの実施態様においては、免疫増殖性障害は、特に、ＮＫ型ＬＤＧＬおよびＴ−ＬＤＧＬを含まない。本方法を使用して産生される抗体は、ＮＫ型ＬＤＧＬにおいて拡大されるＮＫ細胞または免疫増殖性障害ならびに特に、関節リウマチおよびＩ型糖尿病のような自己免疫障害において拡大されるＴもしくはＮＫ細胞のような障害を基礎とする拡大される細胞を特異的に標的化することを可能にする。抗体は、例えば、免疫系による破壊のためにそれらを標的化することによって、またはそれらを、放射性同位元素、毒素、もしくは薬物のような細胞障害性薬剤と直接接触させることにより細胞を死滅させることによって、細胞増殖の病理学的影響を制限することができる。本明細書に記載の抗体ならびにそれらの使用のための指示書を含むキットのような、多くの増殖性障害のいずれかの処置のために抗体を使用する方法もまた提供される。
【００１１】
従って、本発明は、ＮＫ細胞に関与する免疫増殖性障害を伴う患者を処置する方法を提供し、本方法は、ＮＫ受容体に特異的に結合する抗体を患者に投与する工程を含む。また、個体において炎症を減少する方法、あるいは個体においてＮＫもしくはＴ細胞を排除、死滅または涸渇する方法も包含される。
【００１２】
別の実施態様では、本発明は、ＮＫ受容体に特異的に結合し、ヒトＮＫ細胞上の前記ＮＫ受容体に結合する場合、前記ＮＫ細胞を涸渇させる抗体を含む組成物の、免疫増殖性障害の処置のための医薬品の製造のための使用を提供する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、ＮＫ細胞を排除する方法、活性化されたＮＫ細胞を排除するための方法、炎症を減少するための方法、または個体もしくは生物学的サンプルにおいて前炎症性サイトカインを減少するための方法を提供し、本方法は、前記ＮＫ細胞と、ＮＫ受容体に特異的に結合する抗体を含む組成物とを接触させる工程を含む。
【００１４】
別の態様では、本発明は、哺乳動物においてＮＫおよび／またはＴ細胞を涸渇するための方法を提供し、本方法は、ＮＫ受容体に特異的に結合する抗体を含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含む。
【００１５】
別の態様では、本発明は、炎症を減少するか、活性化されたＮＫ細胞の数を減少するか、または哺乳動物もしくは生物学的サンプルにおける前炎症性サイトカインを減少するための方法を提供し、本方法は、ＮＫＧ２Ａを発現するＮＫ細胞および／またはＮＫＧ２Ｃを発現する細胞を排除する工程を含む方法を含む。好ましくは、ＮＫＧ２Ａを発現するＮＫ細胞およびＮＫＧ２Ｃを発現する細胞が排除される。好ましくは、ＮＫまたはＴ細胞を排除する工程は、前記ＮＫ細胞を、ＮＫＧ２Ａおよび／またはＮＫＧ２Ｃに特異的に結合する抗体を含む組成物に接触させる工程を含む。１つの例では、前記接触工程は、細胞エフェクターを含む細胞培養培地において行われ、場合により、前記培養培地は、ＰＢＭＣまたは全末梢血リンパ球を含む。別の態様では、前記接触工程は、哺乳動物においてインビボで行われる。
【００１６】
別の態様では、本発明は、以下の工程：ａ）免疫増殖性障害の存在（例えば、症状ならびに／あるいはＮＫ細胞および／またはＮＫ細胞受容体を発現する細胞の存在）を診断する工程と、ｂ）本発明の抗体で処置する工程とを含む個体を処置するための方法を提供する。１つの態様では、診断工程は、確立された炎症性または自己免疫障害を含み、場合により、ここで、確立された障害は、組織傷害もしくは損傷またはその症状および／または３、６、９、１２、２４もしくは３６箇月間を超えて持続する障害によって特徴付けられる。
【００１７】
本発明はまた、免疫増殖性障害を伴う患者を処置する方法を提供し、本方法は、ａ）患者内のＮＫ細胞のＮＫ受容体状態を決定する工程と、ｂ）ＮＫ細胞において顕著に発現されるＮＫ受容体に特異的に結合する抗体を患者に投与する工程とを含む。
【００１８】
本発明の方法の１つの実施態様では、ＮＫ受容体は活性化受容体である。別の実施態様では、受容体は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＣＤ９４、およびＮＫＧ２Ａからなる群から選択される。別の実施態様では、受容体は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６のようなＮＣＲである。別の実施態様では、抗体は、単一のＮＫ受容体に特異的に結合する。別の実施態様では、ＮＫ受容体状態は、免疫学的アッセイを使用して決定される。別の実施態様では、ＮＫ受容体状態は、ＮＫ細胞上に存在するＮＫ受容体の活性を決定するための機能アッセイを使用して、決定される。別の実施態様では、ＮＫ受容体状態は、遺伝子型判定アッセイを使用して決定される。別の実施態様では、ＮＫ受容体状態は、細胞においてＮＫ受容体をコードするｍＲＮＡを検出するためのアッセイを使用して決定される。別の実施態様では、受容体は、ＮＫ細胞の少なくとも５０％に検出可能に存在する。
【００１９】
別の実施態様では、抗体は細胞障害性抗体である。別の態様では、抗体は、例えば、細胞に対してＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害）あるいはＣＤＣ（補体依存性細胞障害）を仲介することによって、受容体を発現する細胞を死滅させる（例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３型の抗体）。
【００２０】
好適な実施態様では、抗体は、細胞エフェクターをリクルートすることが可能な「裸の」抗体である。本発明のモノクローナルの裸の抗体およびそのフラグメントの機能は、一般的に、Ｆｃ受容体に結合するそれらの能力に依存する。Ｆｃγ受容体のようなＦｃ受容体は、白血球の表面上において発現される。これらの受容体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ部分に結合し、例えば、Ｆｃγ受容体はＩｇＧのＦｃ部分に結合する。この結合は、抗体による抗原の認識と細胞に基づくエフェクター機構とを結び付けることによって免疫機能に寄与することに役立つ。異なる免疫グロブリンクラスは、免疫グロブリンＦｃ領域と免疫細胞上の特異的Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）との特異な相互作用を介して、異なるエフェクター機構を誘発する。活性化Ｆｃγ受容体には、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ、およびＦｃγＲＩＩＩＡが含まれる。ＦｃγＲＩＩＢは、抑制性Ｆｃγ受容体と考えられる。（レビューのために、例えば、ウフ（Ｗｏｏｆ）ら（２００４年）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４（２）：８９−９９、バウマン（Ｂａｕｍａｎｎ）ら（２００３年）Ａｒｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｅｘｐ  （Ｗａｒｓｚ）５１（６）：３９９−４０６、パン（Ｐａｎ）ら（２００３年）Ｃｈｉｎ  Ｍｅｄ  Ｊ（Ｅｎｇｌ）１１６（４）：４８７−９４、タカイ（Ｔａｋａｉ）ら（１９９４年）Ｃｅｌｌ７６：５１９−５２９、ラヴェチ（Ｒａｖｅｔｃｈ）ら（２００１年）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１９：２７５−２９０（そのそれぞれの開示内容全体は参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。理論にとらわれずに述べれば、本発明者らは、本発明の抗体におけるＦｃ受容体結合領域の存在は、本発明の抗体が結合する細胞の涸渇をもたらすと考えている。好適な態様では、抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３型のヒトＦｃ領域を含み、毒性または放射性部分を含有しない。別の実施態様では、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ受容体に結合するヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、場合により、ヒトＦｃ受容体への結合を付与または増加するように改変される。
【００２１】
別の実施態様では、細胞障害性抗体は、放射性同位元素、毒性ペプチド、および毒性小分子からなる群から選択されるエレメントを含む。別の実施態様では、抗体は抗体フラグメントである。別の実施態様では、抗体はヒト化またはキメラ抗体である。別の実施態様では、放射性同位元素、毒性ペプチド、または毒性小分子は、抗体に直接付着される。別の実施態様では、抗体は、前記ＮＫ受容体のマウスまたは霊長類ホモログに結合する。別の実施態様では、抗体は、複数のＫＩＲ受容体に結合する。別の実施態様では、細胞障害性抗体は、免疫学的アッセイにおいて前記ＮＫ受容体状態を決定するために使用されるのと同じ抗体から誘導される。
【００２２】
別の態様では、本発明は、免疫増殖性障害の処置における使用に適切な抗体を産生する方法を提供し、前記方法は次の工程：ｉ）１つ以上のＮＫ細胞受容体に特異的に結合する複数の抗体を提供する工程、ｉｉ）免疫増殖性障害を伴う１人以上の患者から採取されるＮＫ細胞に結合するそれぞれの抗体の能力を試験する工程、ｉｉｉ）複数の抗体から１人以上の患者から採取されるＮＫ細胞の少なくとも５０％に結合する抗体を選択する工程、ｉｖ）抗体をヒトへの投与に適切ならしめる工程を含む。
【００２３】
１つの実施態様では、抗体は、活性化ＮＫ細胞受容体に特異的に結合する。別の実施態様では、抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫＧ２ＣおよびＮＫＧ２Ａからなる群から選択される受容体に結合する。別の実施態様では、抗体は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６のようなＮＣＲに特異的に結合する。別の実施態様では、抗体は、それをヒト化またはキメラ化することによってヒトへの投与に適切にされる。
【００２４】
別の実施態様では、方法は、細胞障害性薬剤を抗体に連結する工程をさらに含む。別の実施態様では、細胞障害性薬剤は、放射性同位元素、毒性ポリペプチド、または毒性小分子である。別の実施態様では、細胞障害性薬剤は、抗体に直接連結される。別の実施態様では、抗体は抗体フラグメントである。別の実施態様では、抗体は、１人以上の患者から採取されるＮＫ細胞の少なくとも６０％に結合する。別の実施態様では、抗体は、１人以上の患者から採取されるＮＫ細胞の少なくとも７０％に結合する。別の実施態様では、抗体は、１人以上の患者から採取されるＮＫ細胞の少なくとも８０％に結合する。
【００２５】
別の態様では、本発明は、免疫増殖性障害を伴う患者を処置する方法を提供し、方法は、ａ）前記患者内のＴ細胞またはＮＫ細胞のＮＫ細胞受容体状態を決定する工程と、ｂ）前記Ｔ細胞またはＮＫ細胞によって顕著に発現されるＮＫ細胞受容体に特異的に結合する抗体を前記患者に投与する工程とを含み、ここで、前記受容体は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６からなる群から選択される。本発明はまた、免疫増殖性障害を伴う患者を処置する方法を提供し、本方法は、ａ）前記患者内のＴ細胞またはＮＫ細胞のＮＫ受容体を決定する工程と、ｂ）患者由来のＮＫまたはＴ細胞を、前記Ｔ細胞またはＮＫ細胞によって顕著に発現されるＮＫ受容体に特異的に結合する前記患者への抗体を含む組成物に接触させることによって、患者からＮＫまたはＴ細胞を排除する工程とを含み、ここで、抗体は、それが結合する前記ＴまたはＮＫ細胞を涸渇させる。
【００２６】
別の態様では、本発明は、免疫増殖性障害を有する患者を処置する方法、または個体において炎症を減少する方法、あるいは個体においてＮＫもしくはＴ細胞を排除、死滅または涸渇する方法を提供し、本方法は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６からなる群から選択されるＮＫ細胞受容体に特異的に結合する抗体を患者に投与することを含む。
【００２７】
本発明の方法の１つの実施態様では、ＮＫ受容体は活性化受容体である。別の実施態様では、受容体は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、およびＣＤ９４からなる群から選択される。別の実施態様では、受容体は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６のようなＮＣＲである。別の実施態様では、受容体は、抑制性受容体、好ましくは、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫＧ２ＣおよびＮＫＧ２ＡのようなＮＫＧ２タンパク質である。別の実施態様では、抗体は、単一のＮＫ細胞受容体に特異的に結合する。別の実施態様では、ＮＫ受容体状態は、免疫学的アッセイを使用して決定される。別の実施態様では、ＮＫ受容体状態は、ＴまたはＮＫ（もしくは他の）細胞上に存在するＮＫ受容体の活性を決定するための機能アッセイを使用して、決定される。別の実施態様では、ＮＫ受容体状態は、遺伝子型判定アッセイを使用して決定される。別の実施態様では、ＮＫ受容体状態は、細胞においてＮＫ受容体をコードするｍＲＮＡを検出するためのアッセイを使用して決定される。別の実施態様では、受容体は、Ｔ細胞またはＮＫ（もしくは他の）細胞の特定の組の少なくとも５０％に検出可能に存在する。
【００２８】
別の実施態様では、抗体は抗体フラグメントである。好ましくは、抗体は細胞障害性抗体であり、抗体は、例えば、細胞に対してＡＤＣＣを仲介することによって、受容体を発現する細胞の死滅をもたらす（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３型の抗体）。別の実施態様では、細胞障害性抗体は、放射性同位元素、毒性ペプチド、および毒性小分子からなる群から選択されるエレメントを含む。１つの態様では、抗体は、さらに、リガンド結合もしくはシグナル伝達のような受容体機能を阻止し、および／または受容体内在化を引き起こす。別の実施態様では、抗体はヒト化またはキメラ抗体である。別の実施態様では、放射性同位元素、毒性ペプチド、または毒性小分子は、抗体に直接付着される。別の実施態様では、抗体は、前記ＴまたはＮＫ受容体のマウスもしくは霊長類ホモログに結合する。別の実施態様では、抗体は、複数のＫＩＲ受容体に結合する。別の実施態様では、細胞障害性抗体は、免疫学的アッセイにおいて前記ＴまたはＮＫ受容体状態を決定するために使用されるのと同じ抗体から誘導される。
【００２９】
別の態様では、本発明は、免疫増殖性障害の処置における使用に適切な抗体を産生する方法を提供し、前記方法は次の工程：ｉ）１つ以上のＮＫ受容体に特異的に結合する複数の抗体を提供する工程、ｉｉ）免疫増殖性障害を伴う１人以上の患者から採取されるＮＫまたはＴ細胞に結合するそれぞれの抗体の能力を試験する工程、ｉｉｉ）複数の抗体から１人以上の患者から採取されるＮＫまたはＴ細胞の少なくとも５０％に結合する抗体を選択する工程、ｉｖ）抗体をヒトへの投与に適切ならしめる工程を含む。
【００３０】
１つの実施態様では、抗体は、活性化受容体に特異的に結合する。別の実施態様では、抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫＧ２ＣおよびＮＫＧ２Ａからなる群から選択される受容体に結合する。別の実施態様では、抗体は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、もしくはＮＫｐ４６のようなＮＣＲ、ＮＫＧ２ＣまたはＮＫＧ２Ｄに特異的に結合する。別の実施態様では、抗体は、それをヒト化またはキメラ化することによってヒトへの投与に適切にされる。別の実施態様では、方法は、細胞障害性薬剤を抗体に連結する工程をさらに含む。別の実施態様では、細胞障害性薬剤は、放射性同位元素、毒性ポリペプチド、または毒性小分子である。別の実施態様では、細胞障害性薬剤は、抗体に直接連結される。別の実施態様では、抗体は抗体フラグメントである。別の実施態様では、抗体は、１人以上の患者から採取されるＮＫまたはＴ細胞の少なくとも６０％に結合する。別の実施態様では、抗体は、１人以上の患者から採取されるＮＫまたはＴ細胞の少なくとも７０％に結合する。別の実施態様では、抗体は、１人以上の患者から採取されるＮＫまたはＴ細胞の少なくとも８０％に結合する。
【００３１】
別の態様では、本発明のモノクローナル抗体は、以下のこと：
ヒトＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６からなる群から選択されるＮＫ細胞受容体に特異的に結合すること、
Ｆｃ受容体に結合すること、
ヒトＮＫ細胞上の前記ＮＫ細胞受容体に結合する場合、前記ＮＫ細胞を涸渇させること
によって特徴付けられる。好ましくは、前記抗体はヒト化またはキメラ抗体である。
【００３２】
好ましくは、前記抗体は、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２ＡまたはＮＫＧ２Ｃに特異的に結合する。場合により、前記抗体は、ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｃに特異的に結合するか、または場合により、前記抗体は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧＣおよびＮＫＧ２Ｅに特異的に結合する。１つの例では、前記抗体は、ＮＫＧ２Ａへの結合についてＺ１９９またはＺ２７０と競合し、および／またはＮＫＧ２Ａ由来の相補性決定領域を含む。好ましくは、前記抗体は、Ｇ１またはＧ３アイソタイプのＦｃ領域を含む。
【００３３】
本明細書に記載の実施態様のいずれかの所定の態様では、免疫増殖性障害は、アレルギー、喘息、骨関節炎、関節リウマチ、および脊椎関節症を含む関節炎、胃腸炎、クローン病および大腸炎、神経炎症性障害、橋本病、悪性貧血、アジソン病、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、乾癬、シェーグレン症候群、エリテマトーデス、脱髄性症状、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、多発性筋炎、ギラン・バレー症候群、ウェゲナー肉芽腫症（ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｕｓ）、セリアック病、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎、ベーチェット（Ｂｅｃｈｅｔ’ｓ）病、チャーグ・ストラウス症候群ならびに高安動脈炎からなる群から選択される自己免疫障害である。好ましくは、免疫増殖性障害は、ＮＫ−ＬＤＧＬもしくはＴ−ＬＤＧＬ、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病または：ＩＴＰ、多発性硬化症、ウェゲナー肉芽腫症、およびシェーグレン症候群からなる群から選択される障害である。免疫増殖性障害を処置するための方法の所定の態様では、前記細胞はＴ細胞である。１つの実施態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ３＋、場合により、ＣＤ４＋ＣＤ２８−またはＣＤ８＋であり、これらの細胞はまた、ＮＫ細胞受容体を発現することが報告されている。例示的態様では、抗体は、ＮＫＧ２Ａに結合し、実質的に、Ｚ１９９およびＺ２７０からなる群から選択される抗体と同じエピトープに結合する。別の例示的態様では、抗体は、ＮＫｐ４６に結合し、実質的に、ＢＡＴ２８１からなる群から選択される抗体と同じエピトープに結合する。別の例示的態様では、抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２および／またはＫＩＲ２ＤＬ３に結合し、実質的に、ＰＣＴ特許国際公開第２００５／００３１７２号パンフレットおよび国際公開第０６／００３１７９号パンフレット（それらの開示内容は本明細書において参照により援用される）に記載の抗体ＤＦ２００、ＮＫＶＳＦまたは１−７Ｆ９と同じエピトープに結合し、実質的に、Ｚ１９９およびＺ２７０からなる群から選択される抗体と同じエピトープに結合する。例示的態様では、抗体は、ＮＫＧ２Ｄに結合し、実質的に、ＢＡＴ２２１、ＥＣＭ２１７、およびＯＮ７２からなる群から選択される抗体と同じエピトープに結合する。
【００３４】
本明細書に記載の実施態様のいずれかの別の態様では、炎症性または自己免疫障害を含む免疫増殖性疾患が、確立された疾患である。好ましくは、疾患は、医学的基準（例えば、ＡＣＲ）に従い、免疫細胞によって仲介される物理的症状（例えば、組織損傷、破壊、浮腫など）によって特徴付けられ、および／または規定された期間（例えば、３、６、９、１２、２４、もしくは３６箇月）の間、軽減しない。
【００３５】
本明細書に記載の実施態様のいずれかの他の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して産生される抗体を提供する。本発明はまた、実質的に同じ抗原特異性および活性を有する（例えば、親抗体と同じ抗原に結合することができる）抗体のフラグメントおよび誘導体を包含する。そのようなフラグメントとして、制限はないが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’２フラグメント、ＣＤＲおよびＳｃＦｖが挙げられる。
【００３６】
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体のいずれか１つ以上を含むキットを提供する。１つの実施態様においては、キットは、少なくとも１つの診断用抗体および少なくとも１つの治療用（例えば、細胞障害性）抗体を含む。別の実施態様では、診断用抗体および治療用抗体は、同じＮＫ細胞受容体に特異的に結合する。別の実施態様では、キットはまた、本発明の方法に従う抗体を使用するための指示書を含む。
【００３７】
本発明はまた、１つ以上の本発明の抗体、またはそのフラグメントもしくは誘導体、および薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含む薬学的組成物を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
緒論
本発明は、増殖性障害、特に、ＮＫ型顆粒リンパ球増多症（ＮＫ−ＬＤＧＬ）のような免疫増殖性障害の処置に適切な抗体を産生および使用するための新規の方法を提供する。抗体を使用して患者を処置する方法である本発明に記載の方法を使用して産生される抗体、抗体誘導体、または抗体フラグメントも包含される。特に、本方法は、１つ以上のどのＮＫ細胞受容体が増殖細胞上に顕著に提示されるかを決定するために、これらの疾患の基礎をなす増殖しているＮＫまたはＮＫ様細胞をタイプ分類すること、および次いで、同じ受容体に特異的に結合する抗体を使用して、患者を処置することに関与する。
【００３９】
ＮＫ−ＬＤＧＬおよび他の免疫増殖性障害は、しばしば、１つもしくは少数のＮＫまたはＮＫ様細胞のクローン拡大によって特徴付けられる。従って、個々のＮＫ細胞は、一般的に、ＮＫ細胞受容体のサブセットのみを発現するため、これらの障害の基礎をなす過剰増殖細胞の実質的な部分は、しばしば、少数のＮＫ細胞受容体を発現する。従って、本発明は、所定の患者の増殖細胞において発現される特定の受容体を同定することによって、これらの障害を処置し、次いで、細胞障害性抗体を使用して、受容体を発現するこの細胞を特異的に標的かする方法を提供する。この方法では、過剰増殖細胞の数が特異的に減少する一方、他の免疫および非免疫細胞は温存される。
【００４０】
一般的に、本方法は、ＫＩＲ受容体のような１つもしくは少数のＮＫ細胞受容体、ＣＤ９４、ＮＫＧ２受容体の１つ、またはＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６のようなＮＣＲにそれぞれ特異的であるモノクローナル抗体のパネルの使用に関与する。しばしば、２つの組の抗体が使用される。直接的または間接的に標識された抗体を含む１つの組は、本質的に診断用であり、所定の患者由来のＮＫ細胞において、特定のどのＮＫ細胞受容体が発現されるかを決定するために使用される。処置のために使用される第２の組は、非ヒト動物（但し、ヒトにおける使用に適切であるようになされており、例えば、ヒト化またはキメラ化される）において一般に惹起されるモノクローナル抗体に対応する。１つの態様では、抗体は、リガンド結合もしくはシグナル伝達のような受容体機能を阻止し、および／または受容体内在化を引き起こす。別の態様では、抗体は、例えば、細胞に対してＡＤＣＣを仲介することによって、受容体を発現する細胞を死滅させる（例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３型の抗体）。所定の実施態様では、抗体は、それらが受容体を発現する細胞を死滅させるように、細胞障害性薬剤で、直接的または間接的にさらに誘導される。例えば、抗体は、放射性同位元素、細胞障害性ポリペプチド、または細胞障害性小分子に連結することができる。
【００４１】
定義
本明細書において使用される以下の用語は、他で指定しない限り、それらに帰属する意味を有する。
【００４２】
明細書において使用する「ＮＫ」細胞は、従来にない免疫に関与するリンパ球のサブ集団を指す。ＮＫ細胞は、ＣＤ１６、ＣＤ５６、および／またはＣＤ５７を含む特異的表面抗原の発現、細胞表面におけるα／βまたはγ／δＴＣＲ複合体の不在、特定の細胞溶解性酵素の活性化により、「自己の」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞に結合して死滅させる能力、腫瘍細胞またはＮＫ活性化受容体に対するリガンドを発現する他の罹患した細胞を死滅させる能力、ならびに免疫応答を刺激または阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力のような所定の特徴ならびに生物学的特性によって同定することができる。当該技術分野において周知の方法を使用してＮＫ細胞を同定するために、これらの特徴および活性のいずれかを使用することができる。
【００４３】
用語「ＮＫ細胞受容体」は、ＮＫ細胞のすべてまたは画分において一貫して見出される任意の細胞表面分子を指す。好ましくは、ＮＫ細胞受容体は、ＮＫ細胞（休止または活性型）において排他的に発現されるが、この用語はまた、他の細胞型においても発現される受容体を包含する。ＮＫ細胞受容体の例として、ＫＩＲ受容体ファミリーのメンバー、ＣＤ９４、ＮＫＧ２受容体、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６のようなＮＣＲ受容体、ＬＩＲ−１などが挙げられる（例えば、トラウスダレ（Ｔｒｏｗｓｄａｌｅ）およびパーハム（Ｐａｒｈａｍ）（２００４年）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ３４（１）：７−１７、ヤワタ（Ｙａｗａｔａ）ら（２００２年）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ２２（５−６）：４６３−８２、シュー（Ｈｓｕ）ら（２００２年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ１９０：４０−５２、ミドルトン（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ）ら（２００２年）Ｔｒａｎｓｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１０（２−３）：１４７−６４、ビルチェス（Ｖｉｌｃｈｅｓ）ら（２００２年）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ２０：２１７−５１、ＯＭＩＭ６０２８９４、ブラウド（Ｂｒａｕｄ）ら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ３９１：７９５−７９９、チャン（Ｃｈａｎｇ）ら（１９９５年）Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ２５：２４３３−２４３７、ラゼティック（Ｌａｚｅｔｉｃ）ら（１９９６年）Ｉｍｍｕｎ１５７：４７４１−４７４５、ロドリゲス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）ら（１９９８年）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ４７：３０５−３０９、ＯＭＩＭ１６１５５５、ホーチンス（Ｈｏｕｃｈｉｎｓ）ら（１９９１年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１０１７−１０２０、アダムキーウィクス（Ａｄａｍｋｉｅｗｉｃｚ）ら（１９９４年）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３９：２１８、レネド（Ｒｅｎｅｄｏ）ら（１９９７年）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ４６：３０７−３１１、ラヴェティヒ（Ｒａｖｅｔｃｈ）ら（２０００年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９０：８４−８９、国際公開第０１／３６６３０号パンフレット、バイタレ（Ｖｉｔａｌｅ）ら（１９９８年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２０６５−２０７２、シボリ（Ｓｉｖｏｒｉ）ら（１９９７年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１２９−１１３６、ペッシノ（Ｐｅｓｓｉｎｏ）ら（１９９８年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：９５３−９６０を参照のこと、そのそれぞれの開示内容は参照により本明細書に援用される）。
【００４４】
本明細書において使用する「ＮＫ受容体状態」は、個体、例えば、免疫増殖性障害を有する患者から採取されるＮＫまたは他の細胞において発現される多様なＮＫ細胞受容体の同一性および重要性を指す。例えば、患者から採取されるＮＫ細胞の試験により、特定のＮＫ細胞受容体、例えば、ＫＩＲ２ＤＳ２が７０％の細胞において発現されること、別の受容体、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１が４０％の細胞において発現されること、別の受容体、例えば、ＣＤ９４が８０％の細胞において発現されることなどが見出され得る。そのような情報は、本方法において使用するための細胞障害性抗体を決定するのに有用である。複数のＮＫ細胞受容体に関する発現情報を有することが明らかに有用である一方、ＮＫ受容体状態はまた、単一の受容体、例えば、ＫＩＲ２ＤＳ２、または少量の受容体、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ２／３およびＫＩＲ２ＤＳ２の発現レベルもしくは重要性を指すことができることが理解されよう。
【００４５】
「ＬＧＬ」、または「大顆粒リンパ球」は、リンパ系細胞の形態学的に異なる集団を指す。末梢血単核細胞の１０〜１５％を構成するＬＧＬ。ＬＧＬは、所定のマーカー、例えば、ＣＤ３発現（ここで、ＮＫ細胞はＣＤ３−であり、Ｔ細胞はＣＤ３＋である）によって識別することができるＮＫ細胞およびＴ細胞の両方（例えば、ラフラン（Ｌｏｕｇｈｒａｎ）（１９９３年）Ｂｌｏｏｄ８２：１−１４を参照のこと）を含むことができる。好ましくは、本発明の目的のために、ＬＧＬ細胞はＣＤ３−である。しかし、本発明の所定の実施態様では、ＰＢＬは、患者から採取され、任意の細胞タイプ、好ましくは、ＬＧＬ、最も好ましくは、ＣＤ３−ＬＧＬが拡大されるかどうかを見るために調べられる。一般に、任意の拡大された細胞タイプは、特定のＮＫ細胞受容体がそれらの表面において顕著に発現されるかどうかについて決定するために試験することができる。
【００４６】
「顕著に発現される」は、所定の患者から採取される指定されたタイプ（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞）の実質的な数の細胞において発現されるＮＫ細胞受容体を指す。用語「顕著に発現される」の規定は正確な百分率値には結びつかない一方、ほとんどの場合、「顕著に発現される」といわれる受容体は、患者から採取される少なくとも３０％、４０％、好ましくは、５０％、６０％、７０％、８０％もしくはそれ以上のＮＫ細胞、Ｔ細胞または他の過剰増殖細胞において存在する。
【００４７】
本明細書において使用する用語「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を指す。重鎖の定常ドメインのタイプに依存して、抗体は、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つに割り当てられる。これらのうちのいくらかは、さらに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのようなサブクラスまたはイソタイプに分けられる。例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一な対からなり、各対は、１本の「軽」（約２５ｋＤａ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０もしくはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれ、これらの軽および重鎖を指す。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ「α」、「δ」、「ε」、「γ」および「μ」と呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元構造が周知である。ＩｇＧおよび／またはＩｇＭは生理学的状況において最も一般的な抗体であるため、およびそれらは実験施設において最も容易に作製されるため、それらは本発明において用いられる好適なクラスの抗体であり、ＩｇＧが特に好適である。好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。ヒト化、キメラ、ヒト、またはそれ以外のヒトに適切な抗体が特に好適である。「抗体」はまた、本明細書に記載の抗体のいずれかの任意のフラグメントまたは誘導体を含む。
【００４８】
用語「特異的に結合する」は、抗体が、好ましくは、競合結合アッセイにおいて、結合パートナー、例えば、活性化ＫＩＲ受容体のようなＮＫ細胞受容体に結合することができることを意味し、組換え形態のタンパク質、その中のエピトープ、または単離されたＮＫもしくは関連の標的細胞の表面上に存在する生来のタンパク質のいずれか一方を使用して評価される。競合結合アッセイおよび特異的結合を決定するための他の方法については、以下においてさらに説明するものとし、当該技術分野において周知である。
【００４９】
ＮＫ細胞受容体（例えば、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ４６）を認識する抗体の効果に関して、用語「涸渇する」または「涸渇すること」は、ＮＫ受容体発現細胞（例えば、ＮＫＧ２ＡもしくはＮＫｐ４６を発現する細胞）の減少または排除を指す。
【００５０】
「ヒトに適切な」抗体は、例えば、本明細書に記載の治療的方法において、ヒトにおいて安全に使用することができる任意の抗体、誘導体化された抗体、または抗体フラグメントを指す。ヒトに適切な抗体は、ヒト化、キメラ、または完全なヒト抗体、あるいは抗体の少なくとも一部が、ヒトから誘導されるか、もしくはそうでなければ、生来の非ヒト抗体が使用される場合に一般に惹起される免疫応答を回避するように改変される任意の抗体のすべてのタイプを含む。
【００５１】
「毒性」もしくは「細胞障害性」ペプチドまたは小分子は、細胞の増殖を遅らせるか、停止するか、または反転するか、任意の検出可能な方法でそれらの活性（例えば、ＮＫ細胞の細胞溶解活性）を減少するか、あるいは直接的もしくは間接的にそれらを死滅させることができる任意の化合物を包含する。好ましくは、毒性または細胞障害性化合物は、直接的に細胞を死滅するか、アポトーシスを惹起するかもしくはその他によって作用する。本明細書において使用されるように、毒性「ペプチド」は、任意のペプチド、ポリペプチド、または非天然アミノ酸または改変された連結を伴うペプチドまたはポリペプチド誘導体を含むそれらの誘導体を含むことができる。毒性「小分子」は、好ましくは、１０ｋＤ、５ｋＤ、１ｋＤ、７５０Ｄ、６００Ｄ、５００Ｄ、４００Ｄ、３００Ｄ、もしくはそれ以下より小さいサイズを伴う任意の毒性化合物またはエレメントを含むことができる。
【００５２】
「免疫原性フラグメント」とは、本明細書において、（ｉ）前記フラグメントに結合し、ならびに／または膜結合受容体およびそれらから誘導される変異体を含む前記フラグメントを含む任意の形態の分子に結合する抗体の作製、（ｉｉ）任意のＭＨＣ分子および前記フラグメントから誘導されるペプチドを含む二分子複合体に反応するＴ細胞に関与するＴ細胞応答の刺激、（ｉｉｉ）哺乳動物免疫グロブリンをコードする遺伝子を発現するバクテリオファージもしくは細菌のようなトランスフェクトされたビヒクルの結合のような免疫応答を誘発することが可能である任意のポリペプチドまたはペプチドフラグメントを意味する。あるいは、免疫原性フラグメントはまた、共有結合によりキャリアタンパク質にコンジュゲートされたペプチドフラグメント、そのアミノ酸配列において前記ペプチドフラグメントを含むキメラ組換えポリペプチド構築物のような免疫応答を誘発することが可能な任意の構築を指し、特に、配列が前記フラグメントをコードする部分を含むｃＤＮＡでトランスフェクトされる細胞を含む。
【００５３】
本発明の目的のために、「ヒト化」抗体は、１つ以上のヒト免疫グロブリンの定常および可変フレームワークが、結合領域、例えば、動物免疫グロブリンのＣＤＲと融合される抗体を指す。そのようなヒト化抗体は、結合領域が、非ヒト抗体に対する免疫反応を回避するように誘導される非ヒト抗体の結合特異性を維持するように設計される。
【００５４】
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が異なるもしくは改変されたクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域、または新たな特性をキメラ抗体に付与する全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物などに連結されるように、定常領域、またはその部分が改変、置き換え、または交換されるか、あるいは（ｂ）可変領域、またはその部分が、異なるもしくは改変された抗原特異性を有する可変領域で改変、置き換え、または交換される抗体分子である。
【００５５】
「ヒト」抗体は、抗原チャレンジに応答して特異的ヒト抗体を産生するように「操作」されているトランスジェニックマウスまたは他の動物から得られる抗体である（例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ７：１３、ロンベルグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ３６８：８５６、テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら（１９９４年）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎ６：５７９（これらの教示内容全体は参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。十分なヒト抗体はまた、遺伝子または染色体トランスフェクション方法、ならびにファージディスプレイ技術（これらのすべては当該技術分野において公知である）によっても構築することができる（例えば、マキャフェルティー（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら（１９９０年）Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５３を参照のこと）。ヒト抗体はまた、インビトロ活性化Ｂ細胞（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号明細書および同第５，２２９，２７５号明細書（それらの全体が参照により援用される）を参照のこと）によって作製することができる。
【００５６】
本発明では、「活性な」または「活性化された」ＮＫ細胞は、生物学的に活性なＮＫ細胞、より詳細には、標的細胞を溶解する能力を有するＮＫ細胞を表す。例えば、「活性な」ＮＫ細胞は、ＮＫ活性化受容体−リガンドを発現し、「自己の」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原（ＫＩＲ不適合細胞）を発現することができない細胞を死滅させることが可能である。再指向性（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）死滅アッセイにおける使用に適切な標的細胞の例としてＰ８１５およびＫ５６２細胞が挙げられるが、しかし、任意の多くの細胞型を使用することができ、当該技術分野において周知である（例えば、シボリ（Ｓｉｖｏｒｉ）ら（１９９７年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１２９−１１３６、バイタレ（Ｖｉｔａｌｅ）ら（１９９８年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２０６５−２０７２、ペッシノ（Ｐｅｓｓｉｎｏ）ら（１９９８年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：９５３−９６０、ネリ（Ｎｅｒｉ）ら（２００１年）Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎ．８：１１３１−１１３５を参照のこと）。「活性な」または「活性化された」細胞はまた、遊離の細胞内カルシウムレベルの増加のサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）産生のようなＮＫ活性に関連する分野において公知の他の任意の特性もしくは活性によっても同定することができる。
【００５７】
本明細書において使用する用語ＮＫ−ＬＤＧＬは、ＮＫ細胞またはＮＫ様細胞、例えば、表面抗原（例えば、ＣＤ３−、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋）の特徴的組を伴う大顆粒リンパ球のクローン拡大（例えば、ザンベロ（Ｚａｍｂｅｌｌｏ）ら（２００３年）Ｂｌｏｏｄ１０２：１７９７、ラフラン（Ｌｏｕｇｈｒａｎ）（１９９３年）Ｂｌｏｏｄ８２：１、エプリング−バーネッテ（Ｅｐｌｉｎｇ−Ｂｕｒｎｅｔｔｅ）ら（２００４年）Ｂｌｏｏｄ−２００３−０２−４００を参照のこと）、または本明細書に記載の任意のＮＫ細胞受容体を発現することによって特徴付けられる任意の増殖性障害を指す。ＮＫ−ＬＤＧＬの障害の症状として、特に、発熱、軽度の好中球減少、血小板減少、貧血、リンパ球増加、脾腫、肝腫、リンパ節症、および骨髄浸潤を挙げることができる（例えば、ザンベロ（Ｚａｍｂｅｌｌｏ）ら（２００３年）Ｂｌｏｏｄ１０２：１７９７、ラフラン（Ｌｏｕｇｈｒａｎ）（１９９３年）Ｂｌｏｏｄ８２：１、エプリング−バーネッテ（Ｅｐｌｉｎｇ−Ｂｕｒｎｅｔｔｅ）ら（２００４年）Ｂｌｏｏｄ−２００３−０２−４００を参照のこと）。
【００５８】
用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」は、その生来の状態において見出されるように、通常、材料に伴う成分を実質的または本質的に含まない材料を指す。純度および均質度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーのような分析化学技術を使用して、典型的に決定される。調製物に存在する優勢な種であるタンパク質が実質的に精製される。
【００５９】
本明細書において使用する用語「生物学的サンプル」として、生物学的液体（例えば、血清、リンパ、血液）、細胞サンプルまたは組織サンプル（例えば、骨髄）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は同義的に使用され、アミノ酸残基の高分子を指す。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学類似物であるアミノ酸高分子、ならびに天然に存在するアミノ酸高分子および天然に存在しないアミノ酸高分子に当てはまる。
【００６１】
例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合の用語「組換え」は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入または生来の核酸またはタンパク質の改変によって改変されていること、あるいは、細胞が、そのようにして改変された細胞から誘導されることを示す。従って、例えば、組換え細胞は、この細胞の生来の（非組換え）形態内において見出されない遺伝子を発現するか、または他の点で異常に発現されるか、不十分に発現されるか、もしくは全く発現されない生来の遺伝子を発現する。
【００６２】
ＮＫ細胞受容体に特異的なモノクローナル抗体の産生
本発明は、ヒトにおける使用に適切であり、かつ１つもしくは少数のＮＫ細胞受容体を標的化する抗体、抗体フラグメント、または抗体誘導体の産生および使用に関与する。本発明の抗体は、様々な当該技術分野において公知の技術のいずれかによって産生させることができる。典型的に、それらは、ＮＫ細胞の表面に存在する受容体を含む免疫原による非ヒト動物、好ましくは、マウスの免疫化によって産生される。受容体は、ＮＫ細胞全体または細胞膜、ＮＫ細胞受容体の全長配列、または任意のＮＫ細胞受容体のフラグメントもしくは誘導体、典型的に免疫原性フラグメント、即ち、受容体を発現する細胞の表面上に暴露されるエピトープを含むポリペプチドの一部を含み得る。そのようなフラグメントは、典型的に、成熟ポリペプチド配列の少なくとも７連続アミノ酸、さらにより好ましくは、その少なくとも１０連続アミノ酸を含有する。それらは、本質的に、受容体の細胞外ドメインから誘導される。いくつかあるいはすべての患者におけるＮＫ細胞のすべてまたは画分の表面上に時々もしくは常に存在する任意の受容体任意の他の受容体は、抗体の作製のために使用することができることが理解されよう。好適な実施態様では、抗体を作製するために使用される活性化ＮＫ細胞受容体は、ヒト受容体である。
【００６３】
最も好適な実施態様では、免疫原は、脂質膜、典型的に細胞表面のヒト野生型ＮＫ受容体ポリペプチドを含む。特定の実施態様では、免疫原は、無傷（ｉｎｔａｃｔ）なＮＫ細胞、特に、無傷なヒトＮＫ細胞、場合により処置または溶解された細胞を含む。抗体は、ＮＫ細胞の表面上に存在する任意のタンパク質もしくは分子、好ましくは、ＮＫ細胞受容体、より好ましくは、ＫＩＲ受容体、ＬＩＲ−１のようなＬＩＲ受容体、Ｌｙ４９、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６のようなＮＣＲからなる群から選択されるＮＫ細胞受容体、ならびに最も好ましくは、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、およびＫＩＲ３ＤＳ１のような活性化ＮＫ細胞受容体（例えば、トラウスダレ（Ｔｒｏｗｓｄａｌｅ）およびパーハム（Ｐａｒｈａｍ）（２００４年）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ３４（１）：７−１７、ヤワタ（Ｙａｗａｔａ）ら（２００２年）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ２２（５−６）：４６３−８２、シュー（Ｈｓｕ）ら（２００２年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ１９０：４０−５２、ミドルトン（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ）ら（２００２年）Ｔｒａｎｓｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１０（２−３）：１４７−６４、ビルチェス（Ｖｉｌｃｈｅｓ）ら（２００２年）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ２０：２１７−５１を参照のこと、そのそれぞれの開示内容全体は参照により本明細書に援用される）、またはＮＫＧ２Ｄ、多数のタイプの免疫細胞、特に、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、いくつかのＣＤ４＋Ｔ細胞、およびγ／δＴ細胞のすべてもしくは画分に一貫して見出される活性化細胞表面分子に対して調製することができる。ＮＫＧ２Ｄはまた、キラー細胞レクチン様受容体、サブファミリーＣ、メンバー４、またはＫＬＲＣ４と称される（例えば、ＯＭＩＭ６０２８９３（その開示内容全体は、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。本明細書において使用するＮＫＧ２Ｄは、任意のＮＫＧ２Ｄアイソフォーム、例えば、ディーフェンバハ（Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ）ら（２００２年）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３（１２）：１１４２−９）に記載のアイソフォームを指す。ＮＫおよびＴ細胞では、ＮＫＧ２Ｄは、ＤＡＰ１０（例えば、ＯＭＩＭ６０４０８９を参照のこと）またはＤＡＰ１２（例えば、ＯＭＩＭ６０４１４２を参照のこと）のようなタンパク質とヘテロ二量体を形成することができる。本明細書においてＮＫＧ２Ｄに帰属する任意の活性、例えば、細胞活性化、抗体による認識などはまた、ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０またはＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１２ヘテロ二量体のようなＮＫＧ２Ｄを含む複合体を指すことができることが理解されよう。
【００６４】
１つの実施態様では、抗体は、１つ以上のＮＫ細胞受容体を認識する１つ以上の既存のモノクローナル抗体から誘導される。適切な抗体の例として、以下のものが挙げられる。
【００６５】
第１の好適な例は、３Ｓ９、２０ｄ５、Ｚ２７０もしくはＺ１９９と称される抗体のようなＮＫＧ２Ａを認識する抗体、またはその誘導体である。３Ｓ９については、米国特許出願公開第２００３／００９５９６５号明細書（その開示内容は参照により本明細書に援用される）に記載されている。３Ｓ９は、ＮＫＧ２ＣおよびＮＫＧ２Ｅ、ならびにＮＫＧ２Ａに結合する。２０ｄ５は市販の抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５０５１８、米国）である。２０ｄ５はマウスＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２ＥおよびＮＫＧ２Ｃに結合する。Ｚ１９９は、市販の抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、製品番号ＩＭ２７５０、米国）である。Ｚ２７０については、同時係属中のＰＣＴ特許国際公開第０６／０７０２８６号パンフレット（その開示内容は、その全体が本明細書において参照により援用される）に記載されている。Ｚ２７０は、２００５年１２月２２日付、受託番号Ｉ−３５４９で、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ），Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｐａｓｔｅｕｒ，２５，Ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２５  Ｐａｒｉｓ、仏国に寄託した。Ｚ２７０はヒトＮＫＧ２Ａに特異的に結合するが、ヒトＮＫＧ２ＣまたはＮＫＧ２Ｅには結合しない。他の実施態様においては、本発明の抗体は、特に、Ｚ２７０を含まない。
【００６６】
他の好適な例として、ＥＢ６ｂ（ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１を認識する）、ＧＬ１８３（ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＳ２）、ＦＥＳ１７２（ＫＩＲ２ＤＳ４）、Ｚ２７（ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＳ１）、Ｑ６６（ＫＩＲ３ＤＬ２）、ＸＡ１８５（ＣＤ９４）、Ｚ１９９（ＮＫＧ２Ａ）、Ｆ２７８（ＬＩＲ−１））、ＢＡＢ２８１（ＮＫｐ４６）、ＣＮＣＭ登録番号Ｉ−２５７６（ＮＫｐ３０）として寄託されたＡＺ２０、Ｚ２３１（ＮＫｐ４４）または１Ｄ１１、ＢＡＴ２２１、ＥＣＭ２１７、およびＯＮ７２（ＮＫＧ２Ｄ）が挙げられる。例えば、ザンベロ（Ｚａｍｂｅｌｌｏ）ら（２００３年）Ｂｌｏｏｄ１０２：１７９７−１８０５、グロウ（Ｇｒｏｈ）ら（２００３年）ＰＮＡＳ１００：９４５２−５７、アンドレ（Ａｎｄｒｅ）ら（２００４年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：１−１１（上記の３つの参考文献の開示内容の全体が参照により援用される）。そのような抗体は、患者のＮＫ受容体状態を決定するための本明細書に記載のタイプ分類工程のための診断用抗体としての使用のために、直接的または間接的に標識する（即ち、標識された第二抗体と共に使用される）ことができる。さらに、抗体は、ヒトへの投与に適切であるようにする、場合により、本治療方法において細胞障害性抗体としての使用ために、本発明に記載のように毒性にすることができる。
【００６７】
本診断用または治療用（例えば、細胞障害性）抗体は、完全長の抗体または抗体フラグメントもしくは誘導体であり得る。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント、二重特異性抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、ただ１つの軽鎖可変ドメイン、または関連重鎖部分を伴わずに軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有するそのフラグメントを含有する一本鎖ポリペプチド、ただ１つの重鎖可変領域、または関連軽鎖部分を伴わずに重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するそのフラグメントを含有する一本鎖ポリペプチド、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。そのようなフラグメントおよび誘導体ならびにそれらを調製する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、ペプシンを使用して、ヒンジ領域のジスルフィド結合より下流の抗体を消化して、Ｆ（ａｂ）’２（それ自体がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に結合される軽鎖であるＦａｂの二量体である）を生成させることができる。Ｆ（ａｂ）’２を、穏やかな条件下で還元して、ヒンジ領域のジスルフィド結合を切断し、それによって、Ｆ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に変換してもよい。Ｆａｂ’単量体は、本質的に、ヒンジ領域の部分を伴うＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ポール（Ｐａｕｌ）編、第３版、１９９３年）を参照のこと）。多様な抗体フラグメントが無傷（ｉｎｔａｃｔ）な抗体の消化によって規定される一方、当業者は、そのようなフラグメントを、化学的かまたは組換えＤＮＡ方法論を使用するかのいずれかによって、デノボで合成することができることを理解している。
【００６８】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の調製については当該技術分野において周知であり、多数の利用可能な技術のいずれかを使用することができる（例えば、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７（１９７５年）、コズボール（Ｋｏｚｂｏｒ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ４：７２（１９８３年）、コール（Ｃｏｌｅ）ら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９８５）の７７−９６頁を参照のこと）。一本鎖抗体の産生のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号明細書）を適応して、所望されるポリペプチド、例えば、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、およびＫＩＲ３ＤＳ１のようなＮＫ細胞受容体に対する抗体を産生させることができる。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物のような他の生物体を使用して、ヒト化、キメラ、または同様に修飾された抗体を発現させてもよい。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用して、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロメリックなＦａｂフラグメントを同定することができる（例えば、マキャフェルティー（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５４（１９９０年）、マークス（Ｍａｒｋｓ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９−７８３（１９９２年）を参照のこと）。１つの実施態様では、方法は、ライブラリーまたはレパートリーから、少なくとも１つのＮＫ受容体と交差反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体を洗濯することを含む。例えば、レパートリーは、場合により、任意の適切な構造（例えば、ファージ、細菌、合成複合体など）によってディスプレイされる抗体またはそのフラグメントの任意の（組換え）レパートリーであってもよい。
【００６９】
分野において周知の任意の様式で、非ヒト哺乳動物を抗原で免疫する工程を行うことができる（例えば、Ｅ．ハーロー（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ）およびＤ．レーン（Ｄ．Ｌａｎｅ）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州（１９８８年）を参照のこと）。一般に、免疫原は、場合により完全フロイントアジュバントのようなアジュバントと共に、緩衝液に懸濁または溶解される。免疫原の量、緩衝液のタイプおよびアジュバントの量を決定するための方法は当該技術分野において周知であり、本発明に対する任意の方法において限定されない。
【００７０】
同様に、抗体の産生を刺激するのに十分な免疫の場所および回数もまた、当該技術分野において周知である。典型的な免疫プロトコルでは、１日目に非ヒト動物に免疫原が腹腔内に注入され、約１週間後に再度注入される。これに続いて、場合により、不完全フロイントアジュバントなどのアジュバントを伴って、約２０日目に抗原が再注入される。再注入は静脈内で実施され、数日間連続で反復され得る。これに続いて、静脈内または腹腔内のいずれかで、典型的にアジュバントを伴わずに、４０日目に追加注入が行われる。このプロトコルにより、約４０日後に、抗原特異的抗体産生Ｂ細胞が生じる。他のプロトコルもまた、それらが、免疫に使用される抗原に対する抗体を発現するＢ細胞の産生を生じる限り、利用することができる。
【００７１】
別の実施態様では、非免疫非ヒト哺乳動物由来のリンパ球が単離され、インビトロで増殖され、次いで、細胞培養において免疫原に暴露される。次いで、リンパ球を回収し、下記の融合工程を行う。
【００７２】
本発明の目的に好適であるモノクローナル抗体では、次の工程は、細胞、例えば、免疫された非ヒト哺乳動物由来のリンパ球、脾細胞、またはＢ細胞の単離、および抗体産生ハイブリドーマを形成するための脾細胞、またはＢ細胞、またはリンパ球と不死化細胞との以後の融合である。従って、本明細書において使用される用語「免疫動物から抗体を調製すること」は、免疫動物からＢ細胞／脾細胞／リンパ球を入手すること、およびそれらの細胞を使用して、抗体を発現するハイブリドーマを産生させること、ならびに免疫動物の血清から直接抗体を入手することを含む。例えば、非ヒト哺乳動物からの脾臓細胞の単離は当該技術分野において周知であり、例えば、麻酔した非ヒト哺乳動物から脾臓を取り出し、それを小片に切断し、単一の細胞懸濁液が生成されるように、セルストレーナーのナイロンメッシュを介して、適切な緩衝液に脾包（ｓｐｌｅｎｉｃ  ｃａｐｓｕｌｅ）から脾臓細胞を圧搾することに関与する。細胞を洗浄し、遠心分離し、任意の赤血細胞を溶解する緩衝液に再懸濁する。溶液を再度遠心分離し、ペレット内に残留するリンパ球を最終的に新鮮緩衝液に再懸濁する。
【００７３】
一旦、単離され、単一細胞懸濁液中に存在すると、抗体産生細胞を不死細胞株に融合させることができる。これは、典型的にはマウス骨髄腫細胞系統であるが、ハイブリドーマを作製するのに有用な他の多くの不死細胞系統が当該技術分野において公知である。好適なマウス骨髄腫系統として、サルク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ）、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、米国より市販されているＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州、米国より市販されているＸ６３  Ａｇ８６５３およびＳＰ−２細胞が挙げられるが、これらに限定されない。融合は、ポリエチレングリコールなどを使用して行う。次いで、得られるハイブリドーマを、非融合親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する選択培地で増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む（ＨＡＴ培地）（この物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨害する）。
【００７４】
ハイブリドーマは、マクロファージのフィーダー層上で増殖され得る。マクロファージは、脾臓細胞を単離するために使用される非ヒト哺乳動物の同腹仔由来であることが好ましく、典型的に、ハイブリドーマプレート化の数日前に、不完全フロイントアジュバントなどで刺激する。融合方法は、例えば、ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）に記載されており、この開示内容は、本明細書において参照により援用される。
【００７５】
コロニー形成および抗体産生に十分な時間、細胞を増殖させる。これは、通常、７〜１４日間の間である。次いで、ハイブリドーマコロニーを、所望される基質、例えば、ＫＩＲ２ＤＳ２のようなＮＫ細胞受容体を特異的に認識する抗体の産生についてアッセイする。アッセイは、典型的に発色ＥＬＩＳＡ型アッセイであるが、ハイブリドーマが増殖するウェルに適応することができるいずれのアッセイを用いてもよい。他のアッセイとしては、免疫沈降およびラジオイムノアッセイが挙げられる。所望の抗体産生に陽性のウェルを試験して、１つ以上の異なるコロニーが存在するかどうかを決定する。１を超えるコロニーが存在する場合、細胞を再クローニングして、増殖させ、ただ単一の細胞が所望の抗体を産生するコロニーを生じていることを確実にする。明らかに単一のコロニーを伴う陽性ウェルを、典型的に再クローニングし、再アッセイし、ただ１つのモノクローナル抗体が検出され、産生されていることを確実にする。
【００７６】
次いで、本発明のモノクローナル抗体を産生することが確認されるハイブリドーマを、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０のような適切な培地において、より多量に培養する。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【００７７】
所望されるモノクローナル抗体を産生させるのに十分な増殖後、モノクローナル抗体（または腹水液）を含有する増殖培地を細胞から分別し、そこに存在するモノクローナル抗体を精製する。精製は、ゲル電気泳動、透析、タンパク質Ａもしくはタンパク質Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、またはアガロースもしくはＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズのような固相支持体に連結された抗マウスＩｇを使用するクロマトグラフィーによって、典型的に達成される（すべて、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、出版番号１８−１０３７−４６、ＡＣ版（その開示内容は参照により本明細書に援用される）に記載されている）。結合型抗体は、低ｐＨ緩衝液（グリシンまたはｐＨ３．０以下の酢酸緩衝液）を使用し、抗体を含有する画分を直ちに中和することによって、タンパク質Ａ／タンパク質Ｇカラムから典型的に溶出される。これらの画分をプールし、透析し、必要に応じて濃縮する。
【００７８】
好適な実施態様では、ＮＫ細胞受容体上に存在する決定基に結合する抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマから単離し、適切な宿主へのトランスフェクションのために適切な発現ベクターに配置する。次いで、宿主を、抗体の抗原認識部分を含む抗体、その変異体、その活性なフラグメント、またはヒト化もしくはキメラ抗体の組換え産生のために使用する。好ましくは、この実施態様において使用されるＤＮＡは、１つ以上のヒトＮＫ受容体、特に、ＮＫ−ＬＤＧＬを伴う患者の有意な画分由来のＬＧＬ細胞において顕著に提示されるＮＫ受容体上に存在する決定基を認識する抗体をコードする。
【００７９】
本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、（例えば、マウス抗体の重および軽鎖をコードする遺伝に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドを使用することによって）従来の手順を使用して、容易に単離され、配列決定され得る。一旦単離されたら、ＤＮＡを発現ベクターに配置することができ、次いで、それは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サル（ｓｉｍｉａｎ）ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他では免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成が得られる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現は当該技術分野において周知である（例えば、スケラ（Ｓｋｅｒｒａ）ら、（１９９３年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２５６、およびプリュックサン（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ）、（１９９２年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．、１３０：１５１を参照のこと）。抗体はまた、例えば、ウォード（Ｗａｒｄ）ら、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４に開示されているような免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選択によって、産生させてもよい。
【００８０】
特定の実施態様では、抗体は、モノクローナル抗体ＥＢ６ｂ、ＧＬ１８３、ＦＥＳ１７２、Ｚ２７、Ｑ６６、ＸＡ１８５、Ｚ２７０（ＣＮＣＭ参照番号３５４９）、Ｚ１９９（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＡＺ２０（ＣＮＣＭ参照番号Ｉ−２５７６）、Ｂａｂ２８１、ＫＬ２４７もしくは製品参照番号１９５３１４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）またはＦ２７８（例えば、ザンベロ（Ｚａｍｂｅｌｌｏ）ら（２００３年）Ｂｌｏｏｄ１０２：１７９７を参照のこと）の１つ、あるいはモノクローナル抗体１Ｄ１１、ＢＡＴ２２１、ＥＣＭ２１７、およびＯＮ７２（例えば、グロウ（Ｇｒｏｈ）ら（２００３年）ＰＮＡＳ１００：９４５２−５７、アンドレ（Ａｎｄｒｅ）ら（２００４年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：１−１１（上記３つの参考文献の開示内容全体が本明細書に援用される）を参照のこと）の１つと同じエピトープまたは抗原決定基に本質的に結合する。モノクローナル抗体と「実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する」という用語は、抗体がｘ（ここで、ｘはＥＢ６ｂなどである）と「競合する」ことを意味する。問題のモノクローナル抗体と実質的に同じエピトープに結合する１つ以上の抗体の同定は、抗体の競合を評価することができる様々な免疫学的スクリーニングアッセイを使用して、容易に決定することができる。そのようなアッセイは当該技術分野において日常的である（例えば、米国特許第５，６６０，８２７号明細書（参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。抗体が結合するエピトープを実際に決定するのに、いずれの方法においても、問題のモノクローナル抗体と同じかまたは実質的に同じエピトープに結合する抗体を同定する必要はないことが理解されよう。
【００８１】
例えば、調べようとする試験抗体が異なる供給源動物から得られるか、または異なるＩｇアイソタイプである場合、コントロール（例えば、ＧＬ１８３）および試験抗体とを混合（または予め吸着）し、エピトープ含有タンパク質、例えば、ＧＬ１８３の場合、ＫＩＲ２ＤＳ２を含有するサンプルに適用する単一の競合アッセイを用いることができる。ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロッティングに基づくプロトコルおよび（例えば、実施例のセクションに記載のような）ＢＩＡＣＯＲＥの使用は、そのような簡単な競合研究における使用に適切であり、当該技術分野において周知である。
【００８２】
所定の実施態様では、抗原（例えば、ＫＩＲ２ＤＳ２エピトープ）を含有するサンプルに適用する前のある期間にコントロール抗体（例えば、ＧＬ１８３）と様々な量の試験抗体（例えば、１：１０または１：１００）とを予め混合し得る。他の実施態様では、コントロールおよび様々な量の試験抗体を、抗原サンプルへの暴露中に簡単に混合することができる。（例えば、非結合型抗体を排除するための分離または洗浄技術を使用することによって）結合型と遊離型の抗体および（例えば、種特異的もしくはアイソタイプ特異的第二抗体を使用することによって、または検出可能な標識でコントロール抗体を特異的に標識することによって）コントロール抗体と試験抗体とを識別することができる限り、試験抗体がコントロール抗体の抗原への結合を減少するかどうかを決定し、試験抗体がコントロールと実質的に同じエピトープを認識することを示すことが可能である。完全に関連のない抗体の非存在下での（標識された）コントロール抗体の結合は、コントロールの高値である。コントロール低値は、標識されたコントロール抗体（例えば、ＧＬ１８３）を正確に同じタイプ（例えば、ＧＬ１８３）の非標識抗体と共にインキュベートすることによって得られ、ここで、競合が生じ、標識された抗体の結合を減少する。試験アッセイでは、試験抗体の存在下における標識された抗体反応性の有意な抑制は、同じエピトープ（即ち、標識されたコントロール抗体と「交差反応する」もの）を認識する試験抗体を示す。約１：１０〜約１：１００の間のコントロール：試験抗体の任意の割合で、標識されたコントロールのそれぞれの抗原への結合を、少なくとも５０％またはより好ましくは７０％だけ減少する任意の試験抗体は、コントロールと実質的に同じエピトープまたは抗原決定基に結合する抗体とみなされる。好ましくは、そのような試験抗体は、コントロールの抗原への結合を少なくとも９０％だけ減少する。
【００８３】
１つの実施態様では、競合を、フローサイトメトリー試験によって評価することができる。所定の活性化受容体を有する細胞を、まず、受容体（例えば、ＫＩＲ２ＤＬ２、およびＧＬ１８３抗体を発現するＮＫ細胞）に特異的に結合することが公知であるコントロール抗体と共に、および次いで、例えば、蛍光色素またはビオチンで標識されている試験抗体と共に、インキュベートする。飽和量のコントロール抗体とのプレインキュベーションで得られる結合がコントロールとのプレインキュベーションを伴わない抗体によって得られる結合（蛍光の平均）の８０％、好ましくは、５０、４０もしくはそれ以下である場合、試験抗体はコントロールと競合すると呼ばれる。あるいは、飽和量の試験抗体と共にプレインキュベートした細胞上の（蛍光色素またはビオチンにより）標識されたコントロールにより得られる結合が、抗体とのプレインキュベーションを伴わずに得られる結合の８０％、好ましくは５０％、４０％、もしくはそれ以下である場合、試験抗体はコントロールと競合すると言う。
【００８４】
１つの好適な例では、試験抗体が予め吸着され、抗体結合のための基質、例えば、ＫＩＲ２ＤＳ２タンパク質、またはＧＬ１８３によって結合されることが公知であるそのエピトープ含有部分が固定化される表面に、飽和濃度で、適用される簡単な競合アッセイを用いることができる。表面は、好ましくは、ＢＩＡＣＯＲＥチップである。次いで、コントロール抗体（例えば、ＧＬ１８３）を、基質飽和濃度で表面と接触させ、コントロール抗体の基質表面結合を測定する。コントロール抗体のこの結合を、試験抗体非存在下でのコントロール抗体の基質含有表面への結合と比較する。試験アッセイでは、試験抗体の存在下における基質含有表面の結合の有意な減少は、試験抗体が同じエピトープ（即ち、コントロール抗体と「交差反応する」もの）を認識することを示す。コントロール抗体の抗原含有基質への結合を、少なくとも３０％またはより好ましくは４０％だけ減少する任意の試験抗体は、コントロール抗体と実質的に同じエピトープまたは抗原決定基に結合する抗体とみなされる。好ましくは、そのような試験抗体は、コントロール抗体の基質への結合を少なくとも５０％だけ減少する。コントロールおよび試験抗体の順序は、反転させることができ、即ち、コントロール抗体をまず表面に結合させ、その後に、試験抗体を表面に接触させることが理解されよう。予想されるとおり、第二抗体について認められる結合の減少（抗体が交差反応しているものとみなす）は、より大きな大きさになるため、好ましくは、まず、基質抗原に対してより高い親和性を有する抗体を、基質含有表面に結合させる。そのようなアッセイのさらなる例は、実施例およびサウナル（Ｓａｕｎａｌ）ら、（１９９５年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ１８３：３３−４１（その開示内容は本明細書において参照により援用される）において提供される。
【００８５】
１つの実施態様では、特に、抗体が他の関連しないタンパク質との過剰な交差反応性を示さないことが確実である場合、ＮＫ細胞表面上の複数の受容体、例えば、ＫＩＲ受容体（ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＳ１、もしくはＫＩＲ３ＤＬ２、またはこれらの受容体の１つ以上に関与する任意の組み合わせ）あるいはＮＫＧ２受容体（ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、またはこれらの受容体の１つ以上に関与する任意の組み合わせ）およびさらなる任意のＮＫ細胞受容体のような２つ以上のＮＫ細胞受容体の任意の組み合わせと相互作用することが可能な抗体を得ることができる。好ましくは、ＮＫ細胞受容体由来のエピトープ、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ２エピトープを認識するモノクローナル抗体は、特に、患者由来の実質的な百分率のＮＫ細胞上に存在するエピトープと相互作用するが、しかし、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ２０＋Ｂ細胞、または他の免疫もしくは非免疫細胞とは有意には反応しない。好適な実施態様では、抗体はまた、単球、顆粒球、血小板、および赤血球細胞と非反応性である。好適な実施態様では、抗体は、単一のＮＫ細胞受容体のみを認識し、従って、そのような疾患の根底にある過剰増殖性細胞に対する治療用（例えば、細胞障害性）抗体の効果をできるだけ多く制限する。
【００８６】
一旦、ＮＫ細胞、好ましくは、ヒトＮＫ細胞上の１つ、またはおそらく少数の受容体を特異的に認識する抗体が同定されると、それは、免疫増殖性障害を伴う患者から採取される免疫細胞（好ましくは、ＮＫ）細胞に結合するその能力について試験することができる。
【００８７】
典型的に、抗体は、免疫増殖性障害を伴う患者から採取されるＮＫ細胞に結合するその能力を試験するためのイムノアッセイにおいてバリデートされる。例えば、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が複数の患者から採取され、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６のようなＮＫ細胞上に存在する受容体に対する抗体を使用して、ＰＢＬから富化される（例えば、ザンベロ（Ｚａｍｂｅｌｌｏ）ら（２００３年）Ｂｌｏｏｄ１０２：１７９７を参照のこと）。次いで、当業者に周知の標準的な方法を使用して、ＮＫ細胞に結合する所定の抗体の能力を評価する。１つの実施態様では、細胞のそれぞれのサンプルを、特定のＮＫ細胞受容体にそれぞれに特異的である多様な抗体と共に、個々にインキュベートする。有意な百分率の患者（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％もしくはそれ以上）由来の実質的な割合のＮＫ細胞（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくはそれ以上）に結合することが見出される抗体は、本発明における使用に、本明細書に記載のＮＫ受容体状態タイプ分類工程中の診断目的に、または本明細書に記載の治療方法における使用に、例えば、ヒトに適切な細胞障害性抗体からの誘導体化に適切である。抗体の細胞への結合を評価するために、抗体は、直接的または間接的のいずれかで標識することができる。間接的に標識する場合、第二の標識抗体が、典型的に添加される。次いで、例えば、細胞蛍光分析（例えば、ＦＡＣＳｃａｎ）を使用して、抗体の細胞への結合を検出することができる。例えば、ザンベロ（Ｚａｍｂｅｌｌｏ）ら（２００３年）Ｂｌｏｏｄ１０２：１７９７または他の任意の標準的方法を参照のこと。手順は、Ｔ細胞およびＴ細胞受容体に類似して行うことができることが理解されよう、これは、免疫増殖性障害を伴う患者由来のＴ細胞（例えば、Ｔ細胞ＬＤＧＬ、関節リウマチなど）を使用して行うことができ、Ｔ細胞は、ＣＤ３＋、場合により、ＣＤ４＋ＣＤ２８−またはＣＤ８＋であってもよい。
【００８８】
少数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０）の抗体は、ＮＫ−ＬＤＧＬ、自己免疫または炎症性障害のような障害を伴うほとんどの患者において、過剰増殖（例えば、ＮＫ）細胞のほとんどを検出および標的化するのに十分であることが予想される。従って、本方法を使用して、（単一または小さな組み合わせのいずれかの抗体を使用して）事実上すべての患者をタイプ分類および処置するのに一般的に十分である診断用（直接的もしくは間接的に標識された）および治療用（ヒトに適切な、場合により、毒性の）抗体の小さなパネルを評価することが可能である。そのようなパネルは、究極的に、キットとして利用可能にすることができ、好ましくは、抗体を使用するための指示書を伴って完成する。
【００８９】
従って、本発明に従って産生される抗体のパネルは、１つまたは少数のＮＫ受容体タイプに特異的であるそれらを含む。さらに、いくつかの実施態様では、複数の抗体は、すべての患者におけるインビボでの受容体発現細胞の最大限の標的化を確実にするために、およびまた、多型性受容体が最大数の患者において効果的に標的化されることを確実にするために、所定の受容体に対して調製される。
【００９０】
他の実施態様では、本発明の診断用（直接的または間接的に標識された）および治療用（ヒトに適切な、場合により、毒性の）実施態様における使用のための抗体は、複数のＮＫ受容体（例えば、２、３、４もしくはそれ以上のＮＫ受容体を認識し得ることが理解されよう。例えば、抗体は、複数のＮＣＲ、もしくはＫＩＲ（例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３など）、または複数もしくはＫＩＲ活性受容体もしくはＫＩＲ抑制性受容体を認識することができる。さらに加えて、複数の抗体（例えば、少なくとも２、３、４など）を使用することが可能であり、少なくとも１つは複数のＮＫ受容体を認識する。複数のＮＫ受容体を認識する抗体の例は、ＰＣＴ国際公開第２００５／００３１１７２号パンフレット（Ｉｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａ）（その開示内容は、その全体が本明細書において参照により援用される）において提供される。
【００９１】
ヒトにおける使用に適切な抗体の産生
一般に、非ヒト動物において、ＮＫ−ＬＤＧＬ患者のＬＧＬ（例えば、ＮＫ）細胞上に一般に存在する１つ以上のＮＫ受容体に特異的に結合することができるモノクローナル抗体が産生される場合、抗体は、一般に、それらをヒトにおける治療用途に適切ならしめるように修飾される。例えば、それらを、ヒト化するか、キメラ化するか、または当該技術分野において周知の方法を使用して、ヒト抗体のライブラリーから選択してもよい。そのようなヒトに適切な抗体は、本治療方法において直接使用することができるか、または方法における使用のために、下記のような細胞障害性抗体にさらに誘導体化することができる。
【００９２】
１つの好適な実施態様では、本発明の抗体、例えば、ＧＬ１８３様抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡは、発現ベクターへの挿入前に、例えば、相同非ヒト配列の代わりにヒト重および軽鎖定常ドメインのコーディング配列を置換することによって（例えば、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、（１９８４年）ＰＮＡＳ８１：６８５１）、または免疫グロブリンコーディング配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコーディング配列のすべてもしくは一部を共有結合させることによって、修飾することができる。この様式では、本来の抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。典型的に、そのような非免疫グロブリンポリペプチドが、本発明の抗体の定常ドメインに対して置換される。
【００９３】
１つの特に好適な実施態様では、本発明の抗体はヒト化される。本発明の抗体の「ヒト化」形態は、マウスあるいは他の非ヒト免疫グロブリンから誘導される最小配列を含有する特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖または（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくは抗体の他の抗原結合配列のような）それらのフラグメントである。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、本来の抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置換される一方、本来の抗体の所望される特異性、親和性、および能力は維持される。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を、対応する非ヒト残基によって置換してもよい。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはインポートされたＣＤＲまたはフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改質し、最適化するために作製される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および典型的に２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが本来の抗体の領域に対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域である。より詳細については、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１、５２２（１９８６年）、ライヒマン（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ）ら、（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３、フェルホエン（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ）ら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４（１９８８年）、プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）（１９９２年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２、５９３（それぞれはその全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【００９４】
ヒト化抗体を作製するのに使用すべきヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖の両方）の選択は、抗原性を減少させるのに極めて重要である。いわゆる「ベストフィット」方法に従えば、本発明の抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次いで、マウスの配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として許容される（シムズ（Ｓｉｍｓ）ら、（１９９３年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１５１：２２９６、チョチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）およびレスク（Ｌｅｓｋ）（１９８７年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１））。別の方法は、軽または重鎖の特定の亜群のすべてのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくらかの異なるヒト化抗体に使用することができる（カーター（Ｃａｒｔｅｒ）ら、（１９９２年）ＰＮＡＳ８９：４２８５、プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）ら、（１９９３年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１：１９９３））。
【００９５】
１つ以上のＮＫ細胞受容体、好ましくは、ヒト受容体、および他の好適な生物学的特性に対するそれらの高い親和性を保持しながら、抗体をヒト化することはさらに重要である。この目的を達成するために、好適な方法に従い、親配列の解析のプロセスならびに親およびヒト化配列の３次元モデルを使用する多様な概念上のヒト化産物によって、ヒト化抗体が調製される。３次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者に熟知されている。選択された候補免疫グロブリン配列の見込まれる３次元コンフォメーション構造を例示および示すコンピュータプログラムが利用可能である。これらの標示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能性における残基の可能な役割の解析、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の解析を可能にする。この方法では、ＦＲ残基が選択され、標的抗原の増加した親和性などの所望される抗体の特徴が達成されるように、コンセンサスおよびインポート配列から合わせられる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に、直接的および最も実質的に関与する。
【００９６】
ヒト抗体はまた、免疫化のために、ヒト抗体レパートリーを発現するように操作されている他のトランスジェニック動物を使用することのような他の多様な技術に従って、産生させてもよい。この技術では、ヒト重および軽鎖遺伝子座のエレメントが、内因性重および軽鎖遺伝子座の標的化された崩壊を伴うマウスまたは他の動物に導入される（例えば、ジャコボビッツ（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚ）ら（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ３６２：２５５、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３、ロンベルク（Ｌｏｎｂｅｒｇ）ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ３６８：８５６、テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら（１９９４年）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（それらの開示内容全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。あるいは、遺伝子または染色体トランスフェクション方法によって、またはファージディスプレイ方法を使用する抗体レパートリーの選択を介して、ヒト抗体を構築することができる。この技術では、抗体可変ドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージの大または小コートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上の機能的抗体フラグメントとしてディスプレイされる。糸状粒子は、一本鎖ＤＮＡコピーのファージゲノムを含有するため、抗体の機能的特性に基づく選択はまた、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択を生じる。この方法では、ファージは、Ｂ細胞のいくつかの特性を模倣する（例えば、ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら（１９９３年）Ｃｕｒｒ  Ｏｐ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ３：５５６４−５７１、マキャフェルティー（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら（１９９０年）Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５３（開示内容の全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。ヒト抗体はまた、インビトロ活性化Ｂ細胞（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号明細書および同第５，２２９，２７５号明細書（それらの開示内容は、それらの全体が参照により援用される）を参照のこと）によって作製することができる。
【００９７】
１つの実施態様では、免疫化のために、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ、カリフォルニア州）のような動物を使用して、「ヒト化」モノクローナル抗体が作製される。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子によって置き換えられるその免疫グロブリン遺伝子を有したマウス宿主である。従って、このマウスによりまたはこのマウスのＢ細胞から作製されたハイブリドーマにおいて産生される抗体は、すでにヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、米国特許第６，１６２，９６３号明細書において説明されており、この文献は本明細書においてその全体が参照により援用される。ＨｕＭＡｂ−ＭｏｕｓｅＴＭ（Ｍｅｄａｒｅｘ）を使用して、類似の方法を達成することができる。
【００９８】
本発明の抗体はまた、それらが所望される生物学的活性を示す限り、重および／または軽鎖の部分が本来の抗体における対応する配列と同一かあるいは相同である一方、鎖の残りの部分は別の種から誘導されるかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列に同一かあるいは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにそのような抗体のフラグメントに誘導体化され得る（例えば、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、（１９８４年）ＰＮＡＳ８１：６８５１、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照のこと）。
【００９９】
特にＩｇＧ１またはＩｇＧ３タイプの誘導体化されていない（例えば、「裸の」抗体）または改変されていない形態の抗体は、過剰増殖ＮＫ細胞の増殖を阻害するか、あるいはＮＫ−ＬＤＧＬもしくは関節リウマチ患者由来の細胞のような過剰増殖または所望されないＮＫ細胞に対して細胞障害性であることが予想される一方、それらを細胞障害性にするように誘導体化された抗体を調製することもまた可能である。１つの実施態様では、一旦、ＮＫ細胞受容体特異的抗体が単離され、ヒトにおける使用に適するようにされると、それらは、細胞に対して毒性となるように誘導体化される。この方法では、抗体の患者への投与は、抗体の過剰増殖ＮＫ細胞への比較的特異的な結合をもたらし、従って、疾患の根底にある細胞を直接死滅させるかまたは阻害する。処置の特異性のため、他のほとんどのＮＫ細胞を含む身体の他の非過剰増殖細胞、ならびに免疫系の他の細胞は、処置によって最小限の影響しか受けない。
【０１００】
多数の毒性部分またはストラテジーのうちのいずれかを使用して、そのような抗体を産生させることができる。所定の好適な実施態様では、抗体は、放射性同位元素または他の毒性化合物で直接誘導体化される。そのような場合、標識された単一特異性抗体を、患者に注入することができ、ここで、ついで、それは、標的抗原を発現する細胞に結合し、死滅させることができ、非結合型抗体は、簡単に身体から浄化される。「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ」（ＡＥＳ）のような間接的ストラテジーを使用することもできる（例えば、米国特許第５，２５６，３９５号明細書、バーベット（Ｂａｒｂｅｔ）ら（１９９９年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ１４：１５３−１６６を参照のこと、それらの開示内容全体が参照により本明細書に援用される）。この特定のアプローチは、放射性標識ハプテンならびにＮＫ細胞受容体および放射性ハプテンの両方を認識する抗体の使用に関与する。この場合、抗体は、まず、患者に注入され、標的細胞に結合され、次いで、一旦、非結合型抗体が血流から浄化され、放射性標識ハプテンが投与される。ハプテンは過剰増殖または所望されない細胞（例えば、ＮＫもしくはＴ）細胞上の抗体−抗原複合体に結合し、それによって、それらを死滅させ、非結合型ハプテンは、身体から浄化される。
【０１０１】
細胞障害性または細胞抑制効果を伴う部分の任意のタイプは、特異的ＮＫ受容体発現細胞を阻害または死滅させるために本抗体と共同で使用することができ、放射性同位元素、毒性タンパク質、毒性小分子、例えば、薬物、毒素、免疫調節物質、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、酵素インヒビター、治療用放射性核種、血管新生インヒビター、化学療法薬、ビンカアルカロイド類、アントラサイクリン系薬剤、エピドフィルロトキシン類（ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎｓ）、タキサン系薬剤、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、ＣＯＸ−２インヒビター、ＳＮ−３８、有糸分裂阻害剤、抗血管新生およびアポトーシス薬剤、特に、ドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、ＣＰＴ−１１、カンプトテシン類（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａｎｓ）、ナイトロジェンマスタード、ゲムシタビン、アルキルスルホン酸、ニトロソ尿素類、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位錯体、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、リシン、アブリン、５−フルオロウリジン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシン−Ａ、ヨウシュヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉｎ）毒素、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）内毒素などを含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９５年）、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  （ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，２００１年）、パスタン（Ｐａｓｔａｎ）ら（１９８６年）Ｃｅｌｌ４７：６４１、ゴールデンベルグ（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ）（１９９４年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  ４４：４３、米国特許第６，０７７，４９９号明細書を参照のこと、それらの開示内容全体が参照により本明細書に援用される）。毒素は、動物、植物、真菌、または微生物由来であり得るか、または化学合成によりデノボで作製され得ることが理解されよう。
【０１０２】
毒素または他の化合物は、任意の多くの利用可能な方法を使用して、直接的もしくは間接的に抗体に連結することができる。例えば、薬剤を、Ｎ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のような架橋剤を使用するジスルフィド結合形成を介するか、または抗体のＦｃ領域における炭水化物部分を介して、還元型抗体成分のヒンジ領域に付着させることができる（例えば、ウー（Ｙｕ）ら（１９９４年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ５６：２４４、ウォン（Ｗｏｎｇ）、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ１９９１年）、ウペスラシス（Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ）ら、「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、バーチ（Ｂｉｒｃｈ）ら（編）、１８７−２３０頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５年）、プライス（Ｐｒｉｃｅ）、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、リッター（Ｒｉｔｔｅｒ）ら（編）、６０−８４頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ１９９５年）、カテル（Ｃａｔｔｅｌ）ら（１９８９年）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｔｏｄａｙ７：５１−５８、デルプリノ（Ｄｅｌｐｒｉｎｏ）ら（１９９３年）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ８２：６９９−７０４、アルピッコ（Ａｒｐｉｃｃｏ）ら（１９９７年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｒｎｉｓｔｒｙ８：３、ライスフィールド（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ）ら（１９８９年）Ａｎｔｉｈｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｒｎ．２：２１７を参照のこと、それらのそれぞれの開示内容全体が参照により本明細書に援用される）。
【０１０３】
１つの好適な実施態様では、抗体は、Ｉ−１３１のような放射性同位元素で誘導体化される。多くの適切な放射性同位元素のいずれかを使用することができ、インジウム−１１１、ルテチウム−１７１、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、アスタチン−２１１、銅−６２、銅−６４、銅−６７、イットリウム−９０、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、リン−３２、リン−３３、スカンジウム−４７、銀−１１１、ガリウム−６７、プラセオジム−１４２、サマリウム−１５３、テルビウム−１６１、ジスプロシウム−１６６、ホルミウム−１６６、レニウム−１８６、レニウム−１８８、レニウム−１８９、鉛−２１２、ラジウム−２２３、アクチニウム−２２５、鉄−５９、セレン−７５、ヒ素−７７、ストロンチウム−８９、モリブデン−９９、ロジウム−１０５、パラジウム−１０９、プラセオジム−１４３、プロメチウム−１４９、エルビウム−１６９、イリジウム−１９４、金−１９８、金−１９９、および鉛−２１１を含むがこれらに限定されない。一般に、放射性核種は、好ましくは、オージェ放射体については、２０〜６，０００ｋｅＶの範囲、好ましくは、６０〜２００ｋｅＶの範囲で、β放射体については１００〜２，５００ｋｅＶ、およびα放射体については４，０００〜６，０００ｋｅＶの崩壊エネルギーを有する。α粒子の発生に伴って実質的に崩壊する放射性核種もまた好適である。
【０１０４】
本方法に含まれる細胞障害性部分を選択する際に、この部分は、ヒト身体における心臓、腎臓、脳、肝臓、骨髄、直腸、乳、前立腺、甲状腺、胆嚢、肺、副腎、筋肉、神経線維、膵臓、皮膚、あるいは他の生命を維持する器官または組織から選択される１つ以上の組織のような生命を維持する正常な組織に対して有意なインビボでの副作用を発揮しないことを確実にすることが所望される。本明細書で使用する用語「有意な副作用」は、インビボで投与する場合、化学療法中に通常遭遇するような極僅かなもしくは臨床的に管理可能な副作用しか生じない抗体、リガンドまたは抗体コンジュゲートを指す。
【０１０５】
結合および細胞障害性活性に対する細胞障害性抗体の試験
一旦、免疫増殖性障害を伴う患者由来の細胞上のＮＫ細胞受容体に特異的に結合することが公知であり、ヒトにおける使用に適切にされ、場合により、毒性部分を含むように誘導体化されている抗体が得られると、それらは、一般に、標的細胞の活性を妨害する、影響を及ぼす、および／またはこの細胞を死滅させるそれらの能力について評価される。一般に、競合に基づくアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロッティング、ＢＩＡＣＯＲＥに基づくアッセイ、およびフローサイトメトリーアッセイを含むＮＫ細胞またはＮＫ細胞受容体に結合する抗体を検出するための上記のアッセイは、ヒト化、キメラ、または細胞障害性抗体のような他のヒトに適切なＮＫ細胞抗体とそれらの標的細胞との相互作用を検出するために、同等に適用することができる。典型的に、標的細胞は、免疫増殖性障害を伴う患者から採取されるＮＫ細胞である。
【０１０６】
本アッセイでは、ヒト化またはヒトに適切な治療用（例えば、細胞障害性）抗体が標的細胞またはヒトＮＫ細胞受容体に結合する能力が、コントロールタンパク質、例えば、構造的に関連しない抗原に対して惹起された抗体、または非Ｉｇペプチドもしくはタンパク質が同じ標的に結合する能力と比較される。任意の適切なアッセイを使用して、コントロールタンパク質に対して２５％、５０％、１００％、２００％、１０００％もしくはそれ以上増加した親和性を伴って標的細胞またはＮＫ細胞受容体に結合する抗体あるいはフラグメントは、標的を「特異的に結合する」または「特異的に相互作用する」と言い、下記の治療方法における使用に好適である。
【０１０７】
結合に加えて、抗体が増殖を阻害する、または好ましくは、標的細胞を死滅させる能力を評価することができる。１つの実施態様では、１つ以上の関連受容体を発現するヒトＮＫ細胞、例えば、ＮＫ−ＬＤＧＬ患者から採取されるＬＧＬまたはＮＫ細胞を、プレート、例えば、９６ウェルプレートに導入し、多様な量の関連抗体に暴露させる。バイタル染料、即ち、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、カリフォルニア州）のような無傷（ｉｎｔａｃｔ）な細胞によって取り込まれる色素を添加し、洗浄して、過剰な染料を除去することにより、光学密度（抗体によって死滅した細胞が多いほど、光学密度が低い）によって、生存可能な細胞の数を測定することができる。（例えば、コノリー（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）ら（２００１年）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ２９８：２５−３３（その開示内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。他の任意の適切なインビトロ細胞障害性アッセイ、細胞増殖もしくは生存を測定するためのアッセイ、またはＮＫ細胞活性を検出するためのアッセイを、同等に使用することができ、同じく、例えば、抗体を動物モデル、例えば、関連受容体を発現するヒトＮＫ細胞を含有するマウスに投与し、ヒトＮＫ細胞の生存または活性に対する抗体投与の影響を経時的に検出するインビボアッセイも使用することができる。また、抗体が非ヒト受容体、例えば、霊長類ＮＫ細胞受容体と交差反応する場合、治療用抗体を、インビトロまたはインビボで使用して、関連受容体を発現する動物由来のＮＫ細胞に結合するおよび／または死滅させる抗体の能力を評価することができる。
【０１０８】
過剰増殖ＮＫ細胞の増殖をインビトロもしくはインビボで、検出可能な程度で遅らせるか、停止するか、または反転させることができる任意の抗体、好ましくは、ヒトに適切な抗体、例えば、細胞障害性抗体を、本方法において使用することができる。好ましくは、抗体は、増殖を停止する（例えば、標的化されたＮＫ細胞受容体を発現するＮＫ細胞の数の増加をインビトロもしくはインビボで防止する）ことが可能であり、最も好ましくは、抗体は、増殖を反転させることができ、そのような細胞の総数の減少をもたらす。所定の実施態様では、抗体は、標的化された受容体を発現するＮＫ細胞の数の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の減少を生じることが可能である。
【０１０９】
従って、１つの好適な実施態様では、本発明は、免疫増殖性障害の処置における使用に適切な抗体を産生させるための方法を提供し、本方法は、次の工程：ａ）ＮＫ細胞の表面上に存在する受容体に特異的に結合する複数の抗体を提供する工程と、ｂ）免疫増殖性障害を伴う１人以上の患者から採取されるＮＫ細胞に結合する抗体の能力を試験する工程と、ｃ）前記複数の抗体から、１人以上の前記患者から採取される実質的な数のＮＫ細胞に結合する抗体を選択する工程と、ｄ）前記抗体をヒトへの投与に適切ならしめる工程とを含む。１つの実施態様では、方法は、細胞障害性薬剤が前記抗体に連結される工程をさらに含む。そのような方法では、「実質的な数」は、例えば、３０％、４０％、５０％、好ましくは、６０％、７０％、８０％、９０％もしくはそれ以上の百分率の細胞を意味し得る。
【０１１０】
本発明はまた、以下の工程：ａ）ＮＫ−ＬＤＧＬを伴う１人以上の患者から採取されるＮＫ細胞に特異的に結合する抗体を提供する工程と、ｂ）ＮＫ−ＬＤＧＬを伴う１人以上の患者から採取されるＮＫ細胞に結合する抗体の能力を試験する工程と、ｃ）抗体が、１人以上の患者から採取される実質的な数のＮＫ細胞に結合する場合、抗体をヒトへの投与に適切ならしめる工程とを含む関連する方法を提供する。１つの実施態様では、方法は、細胞障害性薬剤が抗体に連結される工程をさらに含む。そのような方法、ならびに先の段落を含む本明細書の他の箇所に記載の方法は、ＮＫ細胞以外の細胞、例えば、Ｔ細胞、ＬＧＬ細胞を使用して、ＮＫ−ＬＤＧＬ以外の障害、例えば、Ｔ細胞ＬＤＧＬまたは他の免疫増殖性障害の処置のために同等に実施することができることが理解されよう。
【０１１１】
等価な方法を使用して、動物を処置するか、または動物モデルにおいて試験するのに適切な抗体を産生させることができることが理解されよう。その場合、抗体は、関連動物由来であり、およびＮＫまたは他の細胞のクローン拡大に関与する動物疾患において優勢であるＮＫ細胞受容体を特異的に認識することが可能であることが確実にされる。同様に、抗体は、特定の動物への投与に適切であるように改変される。
【０１１２】
炎症をインビボで試験するためのモデル
インビボで炎症に対してＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣ発現細胞を涸渇することの抗炎症効果を、マウスモデルで評価することができる。マウスＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、−Ｃおよび−Ｅ標的化ラットｍＡｂ２０Ｄ５のようなＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／または−Ｃに対する涸渇抗体は、マウス、例えば、慢性炎症のためのマウスモデルにおいて特定のリンパ球集団を涸渇するために使用される。そのようなモデルの例として、関節リウマチ、またはヒト多発性硬化症のマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を研究するためのインビボモデルであるコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルが挙げられる。そのようなモデルでは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび−Ｃ細胞を涸渇するｍＡｂは、炎症の発症前、中または後のいずれかに注入され得、炎症の減少は、これらのモデルにおける炎症の強度を測定するための当該技術分野における公知の技術によって、（例えば、生理学的または免疫組織化学によって）評価され得る。
【０１１３】
処置方法のための抗体の投与
本方法を使用して産生される抗体は、増殖性障害、特に、免疫増殖性障害を処置するのに特に有効である。一般に、本方法を使用して、１つもしくは少数のＮＫ細胞受容体を発現する任意の細胞の存在または過剰によって生じる任意の障害を処置することができ、この障害は、従って、特定のＮＫ細胞受容体を発現する細胞を選択的に死滅または阻害することによって有効に処置され得る。他の適切な疾患として、Ｔ細胞型ＬＤＧＬ、自己免疫障害、およびＣＤ３＋および場合により、ＣＤ４＋ＣＤ２８−もしくはＣＤ８＋であるＴ細胞を含むＮＫまたは関連する細胞に関与する他の任意の免疫増殖性あるいは悪性の障害が挙げられる。「免疫増殖性疾患」は、過剰または制御されていない炎症、もしくは発赤、浮腫、発熱などの炎症の任意の態様によって特徴付けられるかまたは発症する任意の障害、病体、あるいは疾患を指し、具体的には、炎症性疾患および自己免疫障害を含む。炎症性疾患には、アレルギー性鼻炎／副鼻腔炎、蕁麻疹／発疹のような皮膚アレルギー、血管浮腫、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、薬物アレルギー、昆虫アレルギー、および肥満細胞症喘息（ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓａｓｔｈｍａ）のようなアレルギー障害を含むアレルギー、喘息、骨関節炎、関節リウマチ、および脊椎関節症を含む関節炎、胃腸炎、クローン病および大腸炎、神経炎症性障害、ならびに自己免疫障害が含まれる。
【０１１４】
「自己免疫」障害は、自己と非自己もしくは他のものとを識別する能力の破壊のため、免疫系が自己の細胞または組織に対する反応を展開する任意の障害、病態、あるいは疾患を含む。自己免疫障害の例として、橋本病、悪性貧血、アジソン病、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、乾癬、シェーグレン症候群、エリテマトーデス、脱髄性症状、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、多発性筋炎、ギラン・バレー、ウェゲナー肉芽腫症（Ｗｅｇｅｎｅｒ’ｓ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｕｓ）、セリアック病、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎、ベーチェット病（Ｂｅｃｈｅｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、チャーグ・ストラウス症候群、高安動脈炎などが挙げられる。自己免疫障害は、免疫系の任意の成分に関与し得、身体の任意の細胞または組織型を標的化し得る。
【０１１５】
本明細書において使用する関節リウマチという用語は、関節の炎症に関与し、関節びらん、リンパ球浸潤、滑膜過形成（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、線維芽細胞様滑膜細胞およびマクロファージの進行性の増殖ならびに／あるいはＴもしくはＮＫ細胞（例えば、ＣＤ５６＋であるＮＫ細胞、ＣＤ３＋、および場合により、ＣＤ４＋ＣＤ２８−もしくはＣＤ８＋であるＴ細胞）、およびまた、ＫＩＲ２ＤＬ１＋、ＫＩＲ２ＤＬ２＋、ＫＩＲ２ＤＬ３＋、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ＋、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ＋、ＫＩＲ３ＤＬ１＋、ＫＩＲ３ＤＬ２＋、ＫＩＲ３ＤＬ３＋、ＫＩＲ２ＤＳ１＋、ＫＩＲ２ＤＳ２＋、ＫＩＲ２ＤＳ３＋、ＫＩＲ２ＤＳ４＋、ＫＩＲ２ＤＳ５＋、ＫＩＲ３ＤＳ１＋、ＣＤ９４＋、ＮＫＧ２Ａ＋、ＮＫＧ２Ｃ＋、ＮＫＧ２Ｄ＋、ＮＫＧ２Ｅ＋、ＮＫＧ２Ｆ＋、ＮＫＧ２Ｇ＋、ＮＫｐ３０＋、ＮＫｐ４４＋、ＮＫｐ４６＋のいずれか１つ以上であるこの細胞の存在のような特徴を含む任意の障害を指す。特に、存在する細胞タイプがＴ細胞である場合、本発明の抗体によって標的化されるＴまたはＮＫ細胞受容体は、ＮＫＧ２タンパク質、好ましくは、ＮＫＧ２Ｄである。一般的に、確立された関節リウマチにおいて、滑膜は肥厚し、軟骨および基礎をなす骨は、崩壊し始め、関節破壊の徴候が生じる。
【０１１６】
１つの実施態様では、本発明に従って処置される疾患は、確立された免疫増殖性障害であって、一般的に、組織損傷または傷害および／あるいは少なくとも３、６、９、１２、２４もしくは３６箇月継続する疾患（例えば、炎症、症状または組織損傷）によって特徴付けられる。
【０１１７】
１つの実施態様では、本治療方法の成分は、患者において拡大されたＮＫまたは他の細胞上の優勢な受容体が同定されるタイプ分類工程である。一般的に、この工程では、ＮＫ細胞または他の（例えば、Ｔ細胞、ＬＧＬ細胞）のサンプルが患者から採取され、例えば、イムノアッセイを使用して、細胞上の多様なＮＫ細胞受容体の相対的重要性を決定するために試験される。ＮＫ細胞がこの方法に好適である場合、ＮＫ細胞受容体を発現する任意の細胞タイプ（例えば、ＣＤ３＋、場合により、ＣＤ４＋ＣＤ２８−またはＣＤ８＋であるＴ細胞）を使用することができることが理解されよう。理想的には、この工程は、免疫増殖性障害の増殖ＮＫ細胞において最も一般に見出される多様なＮＫ細胞受容体を共に認識する抗体（直接的または間接的のいずれかで標識された）のパネルを含有するキットを使用して実施される。しばしば、１つもしくは少量の受容体が、細胞の実質的な数、例えば、３０％、４０％、５０％、好ましくは、６０％、７０％、８０％、９０％もしくはそれ以上に存在することが見出される。その場合、次いで、単一もしくは少数の治療用（例えば、細胞障害性）抗体、検出される受容体に対して特異的に指向されたこの抗体を投与することができる。本方法で、過剰増殖または所望されない細胞が特異的に標的化される。
【０１１８】
上記の免疫学的アッセイに加えて、患者から採取される多様なＮＫ細胞受容体またはＮＫ細胞の同一性および相対的発現レベルを決定するための他の方法を使用することもできる。例えば、ＲＮＡに基づく方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロッティングを使用して、患者から採取される細胞における多様なＮＫ細胞受容体の相対的転写レベルを調べることができる。多くの場合、単一または少数の受容体特異的転写物が優位であり、転写物によってコードされる特定の受容体に特異的な細胞障害性抗体を使用する患者の処置を可能にする。
【０１１９】
別の実施態様では、遺伝子型判定によって、患者の増殖免疫細胞（例えば、ＮＫ）細胞上において発現されるＮＫ細胞受容体の同一性について洞察することができる。例えば、２０以上の異なるＫＩＲハプロタイプおよび、少なくとも４０の異なる遺伝子型が同定されている（例えば、シュー（Ｈｓｕ）ら（２００２年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．１９０：４０−５２（参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照のこと）。これらのハプロタイプおよび遺伝子型のいくつかは、活性化または抑制性ＫＩＲ受容体発現と関連する。従って、患者が特定のハプロタイプまたは特定の遺伝子型を所有しているという決定は、しばしば、どの受容体が患者のＮＫ細胞において最も発現される可能性が高いかを示すことができる。場合によって、患者における所定のハプロタイプまたは遺伝子型は、特定の発現パターンまたはＮＫ受容体状態と高い信頼度で関連し得、従って、本治療方法における使用のための特定の治療用（例えば、細胞障害性）抗体の選択を可能にする。
【０１２０】
別の実施態様では、患者における免疫増殖性（好ましくは、ＮＫ）細胞の活性を評価するための機能アッセイは、単独で、または他の方法、例えば、免疫学的か、ＲＮＡに基づくか、もしくは遺伝子型判定の方法と共同で使用される。１つ以上の活性化ＮＫ細胞受容体が多くの患者において優位であり得るため、特定の患者から採取される細胞が特に活性である（任意の標準的なアッセイ、例えば、細胞溶解アッセイ、サイトカイン産生、細胞内の遊離のカルシウムなどを使用して決定される）という所見は、どの受容体が増殖細胞において発現され得るかについての重要な情報を提供する。そのような情報は、特に、他の結果と組み合わされる場合、最も特異的な治療ストラテジーを達成するために、どの細胞障害性抗体または抗体を使用すべきかを決定するために使用することができる。例えば、特定のＮＫ−ＬＤＧＬ患者由来のＮＫ細胞の大部分がＧＬ１８３抗体（抑制性ＫＩＲ２ＤＬ２およびＫＩＲ２ＤＬ３受容体ならびに活性化ＫＩＲ２ＤＳ２受容体の両方を認識する）によって特異的に認識されるという所見は、ほとんどのＮＫ細胞もまた活性であるという所見と組み合わせて、理想的な処置がＮＫＲ２ＤＳ２には特異的であるが、ＫＩＲ２ＤＬ２またはＫＩＲ２ＤＬ３にはそうではない単一の細胞障害性抗体に関与すると結論するために使用し得る。理想的には、本処置方法は、最大数の治療用抗体を使用して、過剰増殖ＮＫまたはＮＫ様細胞の最大集団を標的化する。
【０１２１】
理想的には、本抗体、それらを使用するための方法、およびキットを開発する際に、異なるＮＫ細胞受容体に対して指向された多くの異なる抗体で、多くの患者がスクリーニングされる。本方法では、ほとんどの患者において拡大されるＮＫ細胞の大部分を網羅する診断用および治療用（例えば、細胞障害性）抗体のパネルを集成することができる。例えば、ＫＩＲ受容体の１つ（例えば、ＫＩＲ２ＤＳ２）が、ＮＫ−ＬＤＧＬを伴う患者の実質的な百分率（例えば、２５％、５０％、もしくはそれ以上）で拡大された細胞の少なくとも５０％において発現されることが決定される場合、本発明に従って作製されるキットは、一般的に、受容体に対する少なくとも１つの診断用抗体、ならびに受容体に対する１つ以上の治療用抗体を含む。他の細胞タイプにおいても発現される受容体もまた含まれ得るが、受容体がＮＫ細胞に特異的である、即ち、他の任意の細胞タイプでは発現されない場合、このことは特に当てはまる。特に、それが、患者におけるＮＫ細胞の実質的な画分を標的化するための唯一の方法である場合、非ＮＫ細胞特異的である受容体に特異的に結合する治療用抗体を使用してもよい。関与する非ＮＫ細胞タイプのタイプに依存して、ＮＫ細胞とのその相互作用を最大にし、非ＮＫ細胞タイプとのその相互作用を最小にするために、治療用抗体の投与の形態またはタイミングを特異的に調整し得る（例えば、受容体が未熟ＢもしくはＴ細胞においても発現される場合、骨髄または胸腺とのその接触を最小にする方法で抗体を投与する）。
【０１２２】
本発明のキットは、任意の数の診断用および／または治療用抗体、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、もしくは他の任意の数の診断用および／または治療用抗体を含有し得る。そのようなキットでは、診断用抗体は、しばしば、直接的または間接的のいずれか（例えば、第二抗体を使用して）標識される。治療用抗体は、改変されていない形であり得、即ち、例えば、単純に標的細胞に結合し、それによって、それらを不活化するか、細胞死を誘発するかもしくは免疫系による破壊のためにそれらを区分することによって作用する任意の連結された細胞障害性または他の部分を伴う。他の実施態様では、治療用抗体は、１つ以上の細胞障害性部分に連結される。キットの内容物のこのような説明は、いかなる方法においても制限されないことが理解されよう。例えば、治療用抗体では、キットは、改変されていないかまたは細胞障害性抗体の任意の組み合わせを含有することができる。さらに、キットは、化学療法または抗増殖剤のような他のタイプの治療化合物も含有し得る。好ましくは、キットはまた、例えば、患者におけるＮＫ受容体状態をタイプ分類し、従って治療用抗体を投与するための本明細書に記載の方法を詳述する抗体を使用するための指示書を含む。
【０１２３】
治療用抗体の投与は、特に、上掲のタイプ分類工程において決定されるＮＫ受容体状態から考えて適切であるような単一または複数のＮＫ細胞受容体に対して指向される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは任意の数の異なる抗体の投与に関与し得ることもまた、理解されよう。抗体のそのような組み合わせは、共に、または個別に、例えば、それぞれの抗体の相対的毒性、患者のＮＫ受容体状態、もしくは他の要因に依存して、投与することができる。
【０１２４】
さらに、処置は、複数回の治療用（例えば、細胞障害性）抗体の投与に関与し得る。例えば、最初のラウンドの抗体投与後、患者におけるＮＫまたはＬＧＬ細胞の全体数が再測定され、なお上昇しているのであれば、さらなるラウンドのＮＫ受容体状態タイプ分類を実施することができ、続いて、さらなるラウンドの治療用抗体投与が行われる。このさらなるラウンドの投与において投与された細胞障害性抗体は、初期のラウンドにおいて使用されたものと同一である必要はないが、しかし、主に、タイプ分類工程の結果に依存することが理解されよう。この方法では、複数ラウンドのＮＫ受容体状態タイプ分類および治療用抗体投与を、例えば、ＬＧＬまたはＮＫ細胞増殖が抑制されるまで実施することができる。
【０１２５】
本発明はまた、組成物、例えば、任意の適切なビヒクルにおいて、患者において標的化されたＮＫ細胞受容体を発現する細胞の増殖もしくは活性を阻害するか、またはこの細胞を死滅させるのに有効な量で、そのフラグメントおよび誘導体を含む本抗体のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。組成物は、一般に、薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む。抗体および組成物を患者に投与する本方法はまた、動物を試験するか、またはヒト疾患の動物モデルにおける本明細書に記載の方法または組成物のいずれかの有効性を試験するために使用することができることが理解されよう。
【０１２６】
これらの組成物に使用され得る薬学的に許容可能なキャリアとして、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースに基づく物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、蝋、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
本発明の組成物は、経口的、非経口的、吸入スプレーにより、局所的、直腸内、経鼻的、頬側的、膣内にまたはインプラントされたリザーバを介して投与することができる。本明細書で使用する「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内および頭蓋内注入または輸注技術を含む。好ましくは、組成物は、経口的、腹腔内または静脈内に投与される。
【０１２８】
本発明の無菌注入可能な形態は、水性または油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、適切な分散または湿潤剤および懸濁剤を使用して、当該技術分野において公知の技術に従って処方することができる。無菌注入可能な調製物はまた、非毒性の非経口的な許容可能な希釈剤もしくは溶媒における無菌注入可能な溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中溶液として）であってもよい。なかでも、用いられ得る許容可能なビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル溶液および等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来的に用いられる。この目的のために、合成モノ−またはジグリセリドを含む任意の低刺激不揮発性油を用いることができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体のような脂肪酸は、注入可能物の調製に有用であり、それらは、特に、ポリオキシエチレンバージョン（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ）のオリーブ油またはヒマシ油のような天然の薬学的に許容可能な油である。これらの油溶液または懸濁液はまた、エマルジョンおよび懸濁液を含む薬学的許容可能な剤形の処方において一般に使用される長鎖アルコール希釈液または分散剤、例えば、カルボキシメチルセルロースまたは類似の分散剤を含有してもよい。薬学的に許容可能な固体、液体、または他の剤形の製造に一般に使用される他の一般に使用される界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎおよび他の乳化剤またはバイオアベイラビリティの増強剤もまた、処方の目的のために使用することができる。
【０１２９】
本発明の組成物は、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液を含むがこれらに限定されない任意の経口的な許容可能な剤形で経口的に投与することができる。経口使用のための錠剤の場合、一般に使用されるキャリアとして、乳糖およびトウモロコシデンプンが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤もまた、典型的に添加される。カプセル形態の経口投与のための有用な希釈剤として、乳糖および乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。経口用途に水性懸濁液が必要な場合、有効成分は乳化および懸濁剤と組み合わせられる。所望であれば、所定の甘味、風味付け、または着色剤もまた添加することができる。
【０１３０】
あるいは、本発明の組成物は、直腸内投与のための坐剤の形態で投与することもできる。これらは、薬剤と、室温では固体であるが直腸温度では液体であり、従って、直腸内では融解して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤とを混合することによって調製することができる。そのような材料として、ココアバター、蜜蝋およびポリエチレングリコールが挙げられる。本発明の処方物はまた、局所に、眼に、経鼻エアゾルまたは吸入によって投与してもよい。そのような組成物は、薬学的処方の分野において周知の技術に従って調製される。
【０１３１】
１つの実施態様では、本発明の抗体は、単独かまたは患者または動物に対して標的化された送達のための別の物質と共に、リポソーム（「免疫リポソーム」）に組み入れられ得る。そのような他の物質は、遺伝子治療のための遺伝子の送達またはＮＫ細胞における遺伝子を抑制するためのアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉもしくはｓｉＲＮＡの送達のための核酸、あるいは他の手段を介するＮＫ細胞の活性化のための毒素または薬物、あるいはＮＫ細胞の活性化または腫瘍もしくは感染細胞の標的化に有用であり得る本明細書に記載の他の任意の薬剤を含む。
【０１３２】
別の実施態様では、本発明の抗体は、バイオアベイラビリティ、インビボでの半減期などを改善するために改変することができる。例えば、任意の数の形態のポリエチレングリコールおよび当該技術分野において公知の付着の方法（例えば、リー（Ｌｅｅ）ら（２００３年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．１４（３）：５４６−５３、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）ら（２００３年）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２（３）：２１４−２１、デケルト（Ｄｅｃｋｅｒｔ）ら（２０００年）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．８７（３）：３８２−９０を参照のこと）を使用して、抗体をペグ化することができる。
【０１３３】
いくらかのモノクローナル抗体は、Ｒｉｔｕｘａｎ（リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ））、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ））またはＸｏｌａｉｒ（オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ））、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ），Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ、Ｏｎｃｏｌｙｍならびに類似の投与レジメン（即ち、処方および／または用量および／または投与プロトコル）が本発明の抗体と共に使用され得るような臨床的状況において効率的であることが示されている。糖のためのスケジュールおよび用量は、例えば、製造者の指示書を使用して、これらの製品のための既知の方法に従って決定することができる。例えば、モノクローナル抗体は、１００ｍｇ（１０ｍＬ）または５００ｍｇ（５０ｍＬ）の単回使用のバイアルのいずれかにおいて１０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給することができる。生成物は、９．０ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬポリソルベイト（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０）、および注射用滅菌水において、靜注投与のために処方される。ｐＨを６．５に調整する。本発明の抗体のための例示的に適切な用量範囲は、約１０ｍｇ／ｍ２〜５００ｍｇ／ｍ２であり得る。しかし、これらのスケジュールは例示的であること、至適スケジュールおよびレジメンは、臨床治験において決定されなければならない抗体の親和性および忍容性を考慮して適応することができることが理解されよう。２４時間、４８時間、７２時間または１週間もしくは１箇月間、ＮＫ細胞を飽和するＮＫ細胞受容体に対する抗体の注入の量およびスケジュールは、抗体の親和性およびその薬物動態パラメータを考慮して決定される。
【０１３４】
別の実施態様に従えば、本発明の抗体組成物は、抗体が投与されている特定の治療目的に通常利用される薬剤を含む１つ以上のさらなる治療剤をさらに含むことができる。さらなる治療剤は、通常、処置されている特定の疾患または状態のための単剤治療におけるこの薬剤に典型的に使用される量で存在する。そのような治療剤として、癌の処置に使用される治療剤、炎症性または自己免疫障害、感染性疾患を処置するために使用される治療剤、他の免疫療法において使用される治療剤、（ＩＬ−２もしくはＩＬ−１５のような）サイトカイン、他の抗体のおよび他の抗体のフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。特定の治療アプローチが、患者の状態自体に有害であることが知られておらず、ＮＫ細胞受容体抗体に基づく処置を顕著に和らげない限り、その本発明との併用が考慮される。
【０１３５】
化学療法は、しばしば、特定のＮＫ−ＬＤＧＬ白血病におけるＮＫ−ＬＤＧＬのような増殖性障害を処置するために使用されるため、本発明のＮＫ細胞受容体抗体治療用組成物を、他の化学療法またはホルモン療法剤と併用して投与してもよい。様々なホルモン治療および化学療法剤は、本明細書において開示される併用処置方法において使用することができる。例示的に考えられる化学療法剤として、アルキル化剤、代謝拮抗剤、細胞障害性抗生物質、ビンカアルカロイド、例えば、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、カルミノマイシン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、タモキシフェン、タキソール、タキソテール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、エトポシド（ＶＰ−１６）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、チオテパ、メトトレキサート、カンプトテシン、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、アミノプテリン、コンブレタスタチン（系薬剤）、ならびにそれらの誘導体およびプロドラックが挙げられる。ホルモン剤としては、例えば、ＬＨＲＨアゴニスト、例えば、リュープロレリン、ゴセレリン、トリプトレリン、およびブセレリン、抗エストロゲン、例えば、タモキシフェンおよびトレミフェン、抗アンドロゲン例えば、フルタミド、ニルタミド、シプロテロンおよびビカルタミド、アロマターゼ阻害剤例えば、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾールおよびファドロゾール、ならびにプロゲスターゲン例えば、メドロキシ、クロルマジノンおよびメゲストロールが挙げられる。さらに有用な化学療法剤として、ＤＮＡ複製、有糸分裂および染色体分離を妨害する化合物が挙げられ、また、ポリヌクレオチド前駆体の合成および忠実度を破壊する薬剤を使用してもよい。併用治療のための化学療法剤が米国特許第６，５２４，５８３号明細書の表Ｃに列挙されており、薬剤および適応に関する開示内容は、具体的に、本明細書において参照により援用される。列挙されたそれぞれの薬剤は例示的であり、限定的ではない。別の有用な供給源は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、第３３章、特に６２４〜６５２頁である。用量の変動は、治療中の状態に依存して生じる可能性がある。処置を施行する医師は、個々の対象に対する適切な用量を決定することが可能である。
【０１３６】
本発明の別の重要な実施態様に従えば、ＮＫ細胞受容体抗体治療用組成物は、抗体または化合物が投与される特定の治療的炎症もしくは自己免疫適応症に通常利用される１つ以上のさらなる治療用薬剤、例えば、関節リウマチの処置に使用される治療用薬剤、ウェゲナー肉芽腫症の処置に使用される治療用薬剤、シェーグレン症候群の処置に使用される治療用薬剤、インスリン依存性糖尿病の処置に使用される治療用薬剤、ＩＬ−１０のようなサイトカイン、ならびにサイトカインならびに免疫細胞活性化および増殖を駆動する他の分子を中和する化合物、例えば、抗ＴＮＦ−α抗体および他の化合物、ならびに抗ＩＬ−１５抗体および他の化合物との共同で投与してもよい。
【０１３７】
本発明は、手術などの古典的アプローチと組み合わせて使用してもよい。１つ以上の薬剤またはアプローチを本治療と組み合わせて使用する場合、組み合わされた結果が、各処置を個別に行う場合に観察される効果の相加である必要はない。少なくとも相加的効果は一般に所望されるが、ＮＫ細胞数の任意の減少、サイトカイン産生または単回治療の１つを超える他の有益な効果は、有益であり得る。また、組み合わされた処置が相乗効果を示すことを求める特定の要件は存在しないが、このことは間違いなく可能であり、有利である。ＮＫ細胞受容体抗体治療用組成物の処置は、例えば、数分〜数週間および数箇月の範囲の間隔だけ他の処置より先行するか、または後に続き得る。また、ＮＫ細胞受容体抗体治療用組成物または他の薬剤のいずれかの１回を超える投与が利用されることも想定される。薬剤は、数日もしくは数週間おきに交換可能に投与してもよく、またはＮＫ細胞受容体抗体治療用組成物の処置のサイクルを行い、続いて、他の薬剤療法のサイクルを行ってもよい。いずれにせよ、必要なのは、投与回数に関係なく、治療上有益な効果を及ぼすのに有効な組み合わされた量で、両方の薬剤を送達することだけである。
【０１３８】
他の態様では、免疫調節化合物またはレジメンは、本発明との併用で実践され得る。好適な例として、サイトカインによる処置が挙げられる。そのような併用アプローチでは、多様なサイトカインを用いることができる。サイトカインの例として、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、もしくはＩＦＮ−γ、またはこれらのサイトカインのいずれかを阻害する化合物（例えば、サイトカインに結合する抗体もしくは可溶性受容体）が挙げられる。サイトカインまたはそれらの阻害剤は、標準的なレジメンに従い、患者の病態およびサイトカインの相対的毒性のような臨床的適応と一致させて、投与される。
【０１３９】
本方法はまた、補助化合物と組み合わせて使用することができる。補助化合物はとしては、その例として、制吐剤、例えば、セロトニン拮抗薬および治療薬、例えば、フェノチアジン系薬剤、置換ベンズアミド系薬剤、抗ヒスタミン系薬剤、ブチロフェノン系薬剤、副腎皮質ステロイド、ベンゾジアゼピン系薬剤およびカンナビノイド系薬剤、ビスホスホネート系薬剤、例えば、ゾレドロン酸およびパミドロン酸、ならびに造血成長因子、例えば、エリスロポエチンおよびＧ−ＣＳＦ、例えば、フィルグラスチム、レノグラスチムおよびダルベポエチンを挙げることができる。
【０１４０】
本発明のさらなる態様および利点を、以下の実施例のセクションで開示するが、これは例示的であり、本出願の範囲を限定するものではないとみなすべきである。
【実施例】
【０１４１】
実施例１−ＮＫ細胞受容体に特異的なｍＡｂの作製
新規モノクローナル抗体を、例えば、モレッタ（Ｍｏｒｅｔｔａ）ら（１９９０年）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７２（６）：１５８９−９８に記載のように、５週齢のＢａｌｂＣマウスを活性型ポリクローンまたはモノクローンＮＫ細胞系統で免疫することによって、作製する。異なる細胞融合後、ｍＡｂを、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６などのような１つ以上のＮＫ細胞受容体を特異的に認識するそれらの能力について、最初に選択する。ポジティブなモノクローナル抗体を、免疫増殖性障害（例えば、ＮＫ−ＬＤＧＬ、関節リウマチなど）を伴う患者から採取されるＮＫ細胞に特異的に結合するそれらの能力について、さらにスクリーニングする。
【０１４２】
実施例２−末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の精製およびポリクローンまたはクローンＮＫ細胞集団の作製
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｉｐａｑｕｅ勾配およびプラスチック付着細胞の涸渇により、ＮＫ−ＬＤＧＬ患者もしくは別の免疫増殖性障害を伴う患者、または健康なドナーから誘導する。富化されたＮＫ細胞を得るために、ＰＢＬを抗ＣＤ３（ＪＴ３Ａ）、抗ＣＤ４（ＨＰ２．６）および抗ＨＬＡ−ＤＲ（Ｄ１．１２）ｍＡｂと共にインキュベート（４℃で３０分間）し、続いて、ヤギ抗体マウス被覆Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ、諾国）と共にインキュベート（４℃で３０分間）し、免疫磁気涸渇する（ペンデ（Ｐｅｎｄｅ）ら（１９９８年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２３８４−２３９４、シボリ（Ｓｉｖｏｒ）ら（１９９７年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１２９−１１３６、バイタレ（Ｖｉｔａｌｅ）ら（１９９８年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２０６５−２０７２）。ＣＤ３−４−ＤＲ−細胞は、細胞溶解アッセイにおいて使用するか、またはポリクローンＮＫ細胞集団、または限界希釈後）、ＮＫ細胞クローン（モレッタ（Ｍｏｒｅｔｔａ）（１９８５年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：１４８−１５５）を入手するために、１００Ｕ／ｍｌ  ｒＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、米国）および１．５ｎｇ／ｍｌ  ＰＨＡ（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｔｄ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）の存在下、照射処理されたフィーダー細胞上で培養する。
【０１４３】
実施例３−フロー細胞蛍光（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）分析
ＰＥ−もしくはＦＩＴＣ−コンジュゲートアイソタイプ特異的ヤギ抗マウス第２試薬（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、アラバマ州）で直接標識されるかまたは第２試薬が後で追加されるかのいずれかである多様なＮＫ細胞受容体に特異的なｍＡｂで、患者およびコントロール細胞を染色する。サンプルを、１もしくは２色細胞蛍光分析によって分析する（ＦＡＣＳｃａｎ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州）（例えば、モレッタ（Ｍｏｒｅｔｔａ）ら（１９９０年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：６９５−７１４を参照のこと）。
【０１４４】
実施例４−抗体−基質相互作用のＢｉａｃｏｒｅ分析
組換えタンパク質の産生および精製
組換えタンパク質を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において産生させる。ＮＫ細胞受容体の細胞外ドメイン全体をコードするｃＤＮＡを、標準的な方法を使用するＰＣＲによって増幅する。核酸配列を、ビオチン化シグナルをコードする配列を伴うフレームにおいて、ｐＭＬ１発現ベクターにクローニングする（ソウルクイン（Ｓａｕｌｑｕｉｎ）ら、２００３年）。タンパク質発現を、ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において実施する。トランスフェクト細菌を、ＯＤ６００＝０．６まで、３７℃、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補充した培地中で増殖させ、発現を１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導する。タンパク質を、変性条件（８Ｍ尿素）下の封入体から回収する。組換えタンパク質のリホールディングを、Ｌ−アルギニン（４００ｍＭ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））およびβ−メルカプトエタノール（１ｍＭ）を含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８、ＮａＣｌ１５０ｍＭ緩衝液において、室温で、尿素濃度を６段階の透析（それぞれ、４、３、２、１  ０．５および０Ｍ尿素）で減少することによって、実施する。還元型および酸化型グルタチオン（それぞれ５ｍＭおよび０．５ｍＭ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））を、０．５および０Ｍ尿素の透析工程中に添加する。最後に、タンパク質を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ緩衝液に対して、広範に透析する。可溶性のリホールドしたタンパク質を濃縮し、次いで、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＡＫＴＡ  ｓｙｓｔｅｍ）上で精製する。表面プラズモン共鳴測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ装置（Ｂｉａｃｏｒｅ）上で実施する。すべてのＢｉａｃｏｒｅ実験において、ＨＢＳ緩衝液にランニング緩衝液としての役割を果たす０．０５％界面活性剤Ｐ２０を補充する。
【０１４５】
タンパク質の固定
上記のように産生される組換え基質タンパク質をＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ）上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合で固定化する。センサーチップ表面を、ＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｂｉａｃｏｒｅ）で活性化する。カップリング緩衝液（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ４．５）中タンパク質を注入した。残留する活性型基の失活を、１００ｍＭエタノールアミンｐＨ８（バイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ））を使用して実施した。
【０１４６】
親和性測定
動態測定のため、多様な濃度の可溶性抗体（１×１０―７〜４×１０―１０Ｍ）を固定化された基質サンプル上に適用する。測定は、２０μｌ／分連続流速で実施する。各サイクルについて、センサーチップの表面を、１０ｍＭ  ＮａＯＨ  ｐＨ１１の５μｌ注入によって、再生する。ＢＩＡｌｏｇｕｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラム（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．１，Ｂｉａｃｏｒｅ）を、データ解析のために使用する。可溶性分析物（多様な濃度での４０μｌ）を、２０μｌ／分の流速、ＨＢＳ緩衝液において、例えば、５００反射率単位（ＲＵ）、および１０００ＲＵの基質を含有するデキストラン層上で、注入する。
【０１４７】
実施例５−ヒトＮＫ細胞受容体を発現するマウスＮＫ細胞の涸渇のためのインビボモデル
ＮＫ細胞生物学的機能の解剖は、選択的欠損症モデルがないため、困難になっている。抗体、特に、裸の抗体を使用して、ＮＫ細胞をインビボで涸渇し得るかどうかを調べるために、選択的欠損症のモデルを使用して、抗体がマウスにおいてＮＫ細胞を排除し得る程度について評価した。ＮＫｐ４６は、特異的なＮＫ細胞マーカーであることが示され、この理由のため、ＮＫｐ４６調節配列を使用して、そのようなモデルを作製した。このストラテジーの可能性をバリデートするため、ＮＫＰ４６隣接遺伝子ＦＣＡＲおよびＮＡＬＰ７間に局在する２４ｋｂヒトゲノム領域からなるトランスジェニックベクターを作製した（図１ａ）。トランスジェニック創始動物（ｈｕＮＫｐ４６Ｔｇと称する）から、子孫をメンデル頻度で得、正常に発達させたところ、繁殖性が認められた。マウスＮＫｐ４６と交差反応しないＢＡＢ２８１（抗ヒトＮＫｐ４６）抗体を使用して、これらのマウスにおけるヒトＮＫｐ４６の細胞表面発現を評価した。ヒトＮＫｐ４６は、顆粒球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびＣＤ１ｄ−α−ｇａｌ−ｃｅｒ四量体＋ＮＫＴ細胞上では発現されなかったが、しかし、高いおよび均質なレベルですべてのＮＫ細胞において発現された（図１ｂ）。さらに、ヒトＮＫｐ４６は、骨髄におけるＮＫ細胞発達の未熟段階で発現を開始し（図１ｃ）、試験したすべての器官から単離されたすべてのＮＫ細胞でも同じレベルで実質的に発現を保持する（図１ｄ）。特に、それ故、ｈｕＮＫｐ４６ＴｇマウスにおけるヒトＮＫｐ４６発現のパターンは、親マウスにおける内因性マウスＮＫｐ４６分子のそれに類似した。従って、ヒトＮＫｐ４６の細胞表面発現は、ｈｕＮＫｐ４６ＴｇマウスにおけるＮＫ細胞を規定したが、これは、ヒトＮＫｐ４６調節配列を使用して、ＮＫ特異的遺伝子発現を駆動することができることを実証する。ｈｕＮＫｐ４６ＴｇマウスにおけるＮＫ細胞は、正常な計数、表現型およびエフェクター機能を示した。重要なことに、再指向性（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）溶解がヒトＮＫｐ４６を介して誘導された（図１ｅ）が、これは、ヒトＮＫｐ４６分子がマウスＮＫ細胞において機能的であることを示す。
【０１４８】
実施例６−抗ヒトＮＫｐ４６を使用するマウスＮＫ細胞のインビボでの涸渇
ＨｕＮＫｐ４６Ｔｇマウス：マウスに、ＰＢＳまたはＮＫｐ４６に対する異なる３つの抗体：ＢＡＢ２８１（ＩｇＧ１、１００μｇ）、ＫＬ２４７（ＩｇＭ、１００μｇ）、および１９５３１４（ＩｇＧ２ｂ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、５０μｇ）の混合物を、眼窩後より注入した。抗ヒトＮＫｐ４６抗体の静脈投与は、注入２日後に、血液および試験したすべての器官からのＮＫ細胞のほぼ完全な消失をもたらした（図２）。対照的に、ＮＫＴ細胞およびＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の計数は、有意な影響を受けなかった（図２）ことから、ｈｕＮＫｐ４６を示す。Ｔｇマウスは、ＮＫ細胞選択的涸渇のマウスモデルとして使用することができ、Ｆｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６）結合能を伴うその抗体（例えば、マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂ）は、ＮＫ細胞の涸渇を仲介することができる。従って、ＣＤ１６に結合する対応するヒトエフェクター領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、またはＣＤ１６に結合するように改変されたＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４のような他のＦｃ領域）を使用することは、特にまた、骨髄および器官（所望されないＮＫ細胞が所定の器官または組織に局在し得る免疫増殖性障害の重要な特徴）におけるＮＫ細胞の涸渇に使用することができる。
【０１４９】
実施例７−ＮＫＧ２Ａおよび−Ｃ発現リンパ球のＺ２７０涸渇は、前炎症性サイトカインの分泌を減少する
緒論
ＩＬ−１５は、炎症部位においてアップレギュレートされることが公知であり、ＴおよびＮＫ細胞のようなリンパ球、および単球由来の細胞系統に対して免疫刺激効果を有することが公知である。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび−Ｃは、慢性炎症、例えば、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｈｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）における炎症部位のＴおよびＮＫ細胞上に高い頻度で存在するＨＬＡ−Ｅ特異的受容体である。これらの適応症では、前炎症性サイトカインＴＮＦ−αは、炎症の重要な駆動体であり、ＴＮＦ−α標的化療法（例えば、インフリキシマブまたはフミラ（Ｈｕｍｉｒａ））は炎症を減少することができる。ＴＮＦ−αは、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＴおよびＢ細胞によって産生される。いくらかの実験では、一方のＮＫまたはＴ細胞と他方のマクロファージのような単球由来細胞との間の細胞対細胞接触依存性機構が、ＴＮＦ−αの強力な産生を誘導することが示されている。本発明者らは、本明細書において、モノクローナル抗体でＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび−ＣポジティブＮＫおよびＴ細胞を涸渇することは、抗炎症効果を有し得ることを実証する。これは、インビトロアッセイにおいて例示されており、ここで、本発明者らは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび−Ｃ発現細胞について涸渇されたリンパ球は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび−Ｃ発現細胞が涸渇されていないリンパ球よりも、単球細胞系統によるＴＮＦ−α産生を誘導しないことを示している。
【０１５０】
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび−Ｃ発現リンパ球の涸渇は、単球を活性化するリンパ球の能力を減少する
血液からＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび−Ｃポジティブ細胞を涸渇することの抗炎症効果を、インビトロで実証した。このため、ヘパリン含有ＣＰＴバキュテイナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）チューブ（ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、本質的に製造者のプロトコルに従って、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健康なドナー由来の新鮮血液から単離した。リンパ球を、ペトリ皿において、１０％ＦＣＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補充した１０ｍｌのＧｌｕｔａｍａｘ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（以下培地という）中で１時間、ＰＢＭＣを培養することによって、単球から分離し、単球を皿に付着させた。リンパ球を１回洗浄した。続いて、上清中のリンパ球を、３７℃、５％ＣＯ２で、約２４時間、培地中、６ウェルプレート中ヒトＩＬ−１５（ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、５ｍｌの全容積を使用して、インキュベートした。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび−Ｃポジティブ細胞を、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により、本質的に製造者のプロトコルに従って、取り出した。要約すると、０．５％ＢＳＡを含有する滅菌ＰＢＳ中で、細胞を１回洗浄した。細胞の半分を、抗ＮＫＧ２Ａ（Ｚ１９９）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ）（２μｇ／ｍｌ）および抗ＮＫＧ２Ｃ（クローン１３４５２２）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）（２．５μｇ／ｍｌ）の組み合わせと共に、氷上で３０分間、インキュベートした。続いて、細胞を、滅菌ＰＢＳ／０．５％ＰＢＳ中で２回洗浄し、８０μｌの細胞に対して２０μｌのヤギ抗マウスＩｇＧ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓと共に、氷上で３０分間、インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで洗浄した。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび−Ｃポジティブ細胞を、ＬＤ  ＭＡＣＳカラムを使用して取り出した。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび−Ｃポジティブ細胞の取り出しは、典型的に、＞９５％であり、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳａｒｒａｙ）において抗ＣＤ９４（ＨＰ−３Ｄ９）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）染色細胞を分析することによって評価される（図３を参照のこと）。フロースルーセルを、１０％ＦＣＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＧｌｕｔａｍａｘ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で１回洗浄し、２４ウェルプレート中、ＴＨＰ−１細胞と共に、２４時間、１０：１のリンパ球対ＴＨＰ−１比で、１ｍｌ培地／ウェルの容積を使用して、培養した。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ−および−Ｃ涸渇リンパ球によるＴＨＰ−１細胞の活性化を、ＣＢＡ  Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩキットを使用し、本質的に製造者のプロトコルに従って、組織培養培地におけるＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、−４、−６、および−１０の分泌をＦＡＣＳａｒｒａｙ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で測定することによって、分析した。非涸渇細胞と比較して、ＮＫＧ２Ａおよび−Ｃ涸渇リンパ球を使用した培養では、ＴＮＦ−α産生の顕著な減少が観察された。それ故に、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび−Ｃ発現リンパ球を涸渇することは、リンパ球の前炎症能を減少する。
【０１５１】
本明細書において引用されたすべての刊行物および特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が、あたかも具体的かつ個別に参照により組み入れられて示されているが如く、それらの全体が、参照により、本明細書に援用される。
【０１５２】
上述の発明は、例えば、理解を明確にする目的で、例示および例の方法でいくらか詳細に説明してきたが、当業者であれば、本発明の教示内容に照らし合わせて、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、それに所定の変化および改変を加えられ得ることが、容易に明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】ヒトＮＫＰ４６ゲノム配列を使用して、マウスＮＫ細胞に遺伝子タグを付与することができる：（ａ）遺伝子導入に使用されるヒト遺伝子フラグメントの略図。ＮＫＰ４６エキソンを黒棒として示す。（ｂ）ｈｕＮＫｐ４６トランスジェニックマウスから得られる脾臓細胞懸濁液を、ＮＫ１．１、ヒトＮＫｐ４６および他の細胞表面分子発現について染色した。示される細胞タイプを、実験手順に記載のように同定した。（ｃ）ｈｕＮＫｐ４６トランスジェニックマウス由来の骨髄細胞を、ＣＤ３、ＣＤ１２２、ＤＸ５、ＮＫ１．１およびヒトＮＫｐ４６発現について染色した。ＮＫ前駆体（ＮＫｐ）、未熟および成熟ＮＫ細胞を同定した。（ｄ）ｈｕＮＫｐ４６トランスジェニックマウスから得られるリンパ節（鼠蹊部）、肝臓、肺および末梢血細胞懸濁液を、ＣＤ３、ＮＫ１．１およびヒトＮＫｐ４６発現について染色した。（ｂ〜ｄ）の結果は、示されたサブセットまたはゲートされたＣＤ３−ＮＫ１．１＋細胞（ｃ）におけるヒトＮＫｐ４６（白色のヒストグラム、太線）またはアイソタイプコントロール（灰色ヒストグラム、細線）の発現を示す。（ｅ）示された抗体と共にインキュベートされたＤａｕｄｉ細胞に対するＢ６（Ｃ５７ＢＬ／６）から誘導されるＬＡＫ細胞またはｈｕＮＫｐ４６Ｔｇ（Ｔｇ）脾臓細胞の再指向性（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）溶解アッセイ。Ｂ６およびｈｕＮＫｐ４６Ｔｇマウスから調製されるＬＡＫ細胞の細胞溶解機能は同等であった。図１の結果は３つの実験を表している。
【図２】抗ヒトＮＫｐ４６抗体の注入によって、ｈｕＮＫｐ４６−トランスジェニックマウス由来のＮＫ細胞を特異的に涸渇させることができる。方法において記載のように、ｈｕ−ＮＫｐ４６トランスジェニックマウスのグループに、ＰＢＳ（コントロール）またはヒトＮＫｐ４６に対する３つのｍＡｂの組み合わせを静脈注入した。（ａ）血液中のＮＫ１．１＋ＣＤ３−細胞の百分率を、注入後に経時的に測定した。（ｂ）注入の４８時間後、マウスを屠殺し、脾臓、末梢血液、肝臓ならびに肺におけるＮＫ細胞、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞およびＣＤ１ｄ−制限ＮＫＴ細胞の百分率を測定した。結果を、コントロールマウスと比較した注入時の示された細胞サブセットの百分率として表す。
【図３】ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび−Ｃ発現細胞について涸渇されたリンパ球（白色棒）は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび−Ｃ発現細胞を含有するリンパ球（黒色棒）ほど、ＴＨＰ−１細胞と共にインキュベートされる場合にＴＮＦ−α産生を誘導しない。リンパ球またはＴＨＰ−１細胞を単独で培養した場合、ＴＮＦ−α産生は観察されなかった（説明文を参照のこと）。対照的に、ＩＦＮ−α産生が影響を受けなかったことは、ＴＨＰ−１細胞と同時培養した場合、リンパ球が活性化されたことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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