(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネコ科動物の大腸生検組織から単離されることによって得られたビフィズス菌ＮＣＩＭＢ  ４１６７５の単離株。
【請求項２】
生存細胞形態である、請求項１に記載のビフィズス菌株。
【請求項３】
非生存細胞形態である、請求項１に記載のビフィズス菌株。
【請求項４】
前記菌株が、経口摂取後に著しく免疫調節性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のビフィズス菌株。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のビフィズス菌株を含む、製剤。
【請求項６】
プロバイオティク材料を更に含む、請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
プレバイオティク材料を更に含む、請求項５又は６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項８】
摂取可能な担体を更に含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項９】
前記摂取可能な担体が、カプセル、錠剤、又は粉末のような薬学的に許容可能な担体である、請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
前記摂取可能な担体が、油懸濁液、乳ベース懸濁液、チーズ、カカオバターベース組成物、グレービー及び／又はヨーグルトベース組成物のような食料製品である、請求項８に記載の製剤。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のビフィズス菌株又は請求項５〜１０のいずれか一項に記載の製剤を含む、食品。
【請求項１２】
前記食品が乾燥食品である、請求項１１に記載の食品。
【請求項１３】
前記食品が湿潤食品である、請求項１１に記載の食品。
【請求項１４】
プロバイオティク材料を更に含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の食品。
【請求項１５】
プレバイオティク材料を更に含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の食品。
【請求項１６】
前記食品がコンパニオンアニマル食品である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の食品。
【請求項１７】
薬剤として使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のビフィズス菌株、又は請求項５〜１０のいずれか一項に記載の製剤、又は請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項１８】
望ましくない炎症活性の予防及び／又は治療に使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のビフィズス菌株、又は請求項５〜１０のいずれか一項に記載の製剤、又は請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項１９】
望ましくない胃腸管炎症活性の予防及び／又は治療に使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のビフィズス菌株、又は請求項５〜１０のいずれか一項に記載の製剤、又は請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項２０】
望ましくない炎症活性による自己免疫不全の予防及び／又は治療に使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のビフィズス菌株、又は請求項５〜１０のいずれか一項に記載の製剤、又は請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項２１】
望ましくない炎症活性による下痢疾患の予防及び／又は治療に使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のビフィズス菌株、又は請求項５〜１０のいずれか一項に記載の製剤、又は請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項２２】
コンパニオンアニマルの免疫系の調節又は改善に使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のビフィズス菌株、又は請求項５〜１０のいずれか一項に記載の製剤、又は請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項２３】
コンパニオンアニマルの自己免疫疾患の予防及び／又は治療に使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のビフィズス菌株、又は請求項５〜１０のいずれか一項に記載の製剤、又は請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項２４】
コンパニオンアニマルの炎症の予防及び／又は治療に使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のビフィズス菌株、又は請求項５〜１０のいずれか一項に記載の製剤、又は請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビフィズス菌株、及びとりわけ免疫調節性生物学的薬剤としてのプロバイオティク細菌としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸内細菌によるコロニー形成からヒト胃腸管を保護する防御機構は非常に複雑であり、免疫学的観点及び非免疫学的観点の両方に関与する（１）。生来の防御機構は、胃の低ｐＨ、胆汁塩、蠕動、ムチン層、及びリゾチームのような抗菌化合物を含む（２）。免疫機構は、小腸及び結腸全体に分布するパイエル板と呼ばれる、特殊なリンパ会合体、潜在的Ｍ細胞を含む（３）。これらの部位にある内腔抗原は、サイトカインネットワークの確立及び胃腸管への抗体の分泌を伴う適切なＴ及びＢ細胞サブセットの刺激をもたらす（４）。加えて、抗原提示は、上皮細胞を介して上皮内リンパ球及び潜在的固有層免疫細胞に対して生じ得る（５）。したがって、宿主は実質的に胃腸管の免疫防御に投じる。しかし、胃腸管粘膜は宿主が外部環境と相互作用する最大の表面であるので、平均寿命にかけて胃腸管が処理する１００トンもの食物に対する免疫応答性を調節するためには、特定の制御機構を有する必要がある。更に、消化管では、胃腸内に５００種を超える１０１１〜１０１２／ｇもの数の細菌がコロニー形成される。したがって、これらの制御機構は、非病原性の付着細菌を、宿主に相当な損傷を引き起こすであろう侵襲的病原から区別する能力を有する必要がある。事実、腸内フローラは、新たに摂取された潜在的病原性微生物に立ち向かうことによって宿主の防御に寄与する。
【０００３】
プロバイオティク細菌は、治療が意図される種、又はそれに近い種に由来する場合、より有効であると一部で考えられている。したがって、ヒトに由来するものとは異なる、コンパニオンアニマルのために使用されるべきコンパニオンアニマル由来のプロバイオティク菌株が必要とされている。
【０００４】
ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ  ０１／９０３１１は、プロバイオティク活性を有する、ネコから得られた糞便試料から単離されたプロバイオティク微生物を開示している。しかし、これらの細菌は、糞便試料から得られたものであり、ＧＩ管の上部に存在する自然の腸内マイクロフローラの一部を形成しない可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ  ０１／９０３１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、プロバイオティク特性及び加工に対する生存能力で選択された、特にネコに適合する、ＧＩ管の上部に存在する自然の腸内マイクロフローラから単離することにより得られる細菌株を提供すること、並びにこれらの菌株を、使用に好適な組成物に組み込むことが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明により、ビフィズス菌ＮＣＩＭＢ  ４１６７５の単離株が提供される。
【０００８】
このビフィズス菌株は、生存細胞形態であってもよいし、非生存細胞形態であってもよい。
【０００９】
このビフィズス菌株は、ネコ科動物被検体からの大腸生検組織から単離されることができる。
【００１０】
このビフィズス菌株は、経口摂取後に著しく免疫調節性であり得る。
【００１１】
本発明は、本明細書に記載されているようなビフィズス菌株を含む製剤も提供する。
【００１２】
この製剤は、プロバイオティク材料を更に含んでもよい。この製剤は、プレバイオティク材料を更に含んでもよい。この製剤は、摂取可能な担体を更に含んでもよい。この摂取可能な担体は、カプセル、錠剤、又は粉末のような薬学的に許容可能な担体であってもよい。この摂取可能な担体は、油懸濁液、乳ベース懸濁液、チーズ、カカオバターベース組成物、グレービー及び／又はヨーグルトベース組成物のような食料製品であってもよい。
【００１３】
本発明は、本明細書に記載されるようなビフィズス菌株又は製剤を含む食品を更に提供する。
【００１４】
この食品は乾燥食品であってもよい。この食品は湿潤食品であってもよい。この食品は、プロバイオティク材料を更に含んでもよい。この食品は、プレバイオティク材料を更に含んでもよい。この食品はコンパニオンアニマル食品であってもよい。
【００１５】
本発明は、薬剤として使用するための、本発明に記載のビフィズス菌株、又は製剤、又は食品も提供する。
【００１６】
本発明は、望ましくない炎症活性の予防及び／又は治療に使用するための、本明細書に記載のビフィズス菌株、又は製剤、又は食品も提供する。
【００１７】
本発明は、望ましくない胃腸管炎症活性の予防及び／又は治療に使用するための、本明細書に記載のビフィズス菌株、又は製剤、又は食品も提供する。
【００１８】
本発明は、望ましくない炎症活性による自己免疫疾患の予防及び／又は治療に使用するための、本明細書に記載のビフィズス菌株、又は製剤、又は食品も提供する。
【００１９】
本発明は、望ましくない炎症活性による下痢疾患の予防及び／又は治療に使用するための、本明細書に記載のビフィズス菌株、又は製剤、又は食品も提供する。
【００２０】
本発明は、コンパニオンアニマルの免疫系の調節又は改善に使用するための、本明細書に記載のビフィズス菌株、又は製剤、又は食品も提供する。
【００２１】
本発明は、コンパニオンアニマルの自己免疫疾患の予防及び／又は治療に使用するための、本明細書に記載のビフィズス菌株、又は製剤、又は食品も提供する。
【００２２】
本発明は、コンパニオンアニマルの炎症の予防及び／又は治療に使用するための、本明細書に記載のビフィズス菌株、又は製剤、又は食品も提供する。
【００２３】
我々は、ビフィズス菌株ＡＨ１２１Ａ（ＮＣＩＭＢ  ４１６７５）又はその変種若しくは変異型について説明する。
【００２４】
株は、切除及び洗浄したネコ科動物の胃腸管からの単離によって得られる。
【００２５】
変種は、遺伝組み換えされた変種であってもよい。変異型は、天然に発生するビフィズス菌の変異型であってもよい。
【００２６】
株はプロバイオティクであってもよい。株は生物学的に純粋な培養物の形態であってもよい。
【００２７】
また、ビフィズス菌ＮＣＩＭＢ  ４１６７５の単離株についても説明する。
【００２８】
ビフィズス菌株は生存細胞形態であってもよい。あるいは、ビフィズス菌株は非生存細胞形態であってもよい。
【００２９】
プロバイオティク菌は、生存細胞形態で一般に使用され得る。しかし、プロバイオティク菌により発現される有益な因子を含有する、死滅した培養物又は組成物のような非生存細胞にも及ぶことができる。これには、熱で死滅した微生物、あるいはｐＨ変化に曝されることにより又は圧力を受けることにより死滅した微生物が含まれ得る。非生存細胞製品の調製はより単純であり得るので、細胞を容易に医薬品に組み込むことができ、生存細胞に比べ保管要件の制限ははるかに少ない。米国特許第４３４７２４０号に記載のように、乳酸カセイ菌ＹＩＴ  ９０１８は、腫瘍の成長の治療及び／又は予防のための方法として、熱によって死滅した細胞の有効な使用の例を提供する。
【００３０】
我々は、コンパニオンアニマルの健康を維持及び改善するための、切除及び洗浄されたネコ科動物の胃腸管から単離することによって得られる細菌の使用、並びにこの乳酸菌を含む組成物についても説明する。
【００３１】
我々は、本明細書に記載のビフィズス菌株を含む製剤について説明する。この製剤は別のプロバイオティク材料を含んでもよく、この製剤はプレバイオティク材料を含んでもよい。
【００３２】
ビフィズス菌は共生微生物である。ビフィズス菌は、ヒトの胃腸管内の微生物フローラから単離されてきた。胃腸管内の免疫系がこのフローラの員に対して顕著な反応を有することができないのは、その結果生じる炎症活性のために宿主細胞及び組織機能もまた破壊されることになるからである。このため、免疫系が胃腸管フローラの共生非病原性員を病原性微生物と異なるものとして認識することを可能にするいくつかの作用が存在する。これによって、確実に宿主組織への損傷が制限され、防御バリアがなお維持される。
【００３３】
本明細書全体を通して、用語「変種」、「変異型」、及び「遺伝子組み換えされた変種」は、親株と比べて遺伝的特性及び／又は表現型特性が変更されたビフィズス菌株を含む。ビフィズス菌ロンガムの自然発生変異型は、選択的に単離された標的特性の自発的変化を含む。親株特性の意図的変更は、遺伝子破壊、接合伝達などのような従来的（インビトロ）遺伝子操作技術によって実現される。遺伝子組み換えは、ビフィズス菌株のゲノムへの外因性及び／又は内因性のＤＮＡ配列の導入を含み、例えば、プラスミドＤＮＡ又はバクテリオファージなどのベクターによるこの細菌株のゲノムへの挿入による。
【００３４】
自然変異又は誘導変異は、削除、挿入、トランスバージョン、又は他のＤＮＡ組み換えのような、ＤＮＡ配列によってエンコードされるアミノ酸配列の変化を結果としてもたらし得る少なくとも１つの塩基の変化を含む。
【００３５】
変種、変異型、及び遺伝子組み換えされた変種という用語は、また、自然において全ての微生物に関して一貫している速度でゲノムに蓄積する遺伝子変化、及び／又は自然突然変異によって生じる遺伝子変化、及び／又は遺伝子の獲得、及び／又はゲノムの意図的（インビトロ）操作によってではなく変異型の自然選択によって達成される遺伝子損失を経たビフィズス菌株、並びに／あるいは抗生物質のような環境的圧力に曝されたときに細菌の生存を支持する選択的利点を提供する変異型もまた含む。３０変異型は、その生物の生化学的機能性を本質的に変えないが、例えば抗生物質耐性など、細菌の識別又は選択のためにそれらの生成物を使用することができる、ゲノムへの特定の遺伝子の意図的（インビトロ）挿入によって作り出すことができる。
【００３６】
当業者は、親株を使ったＤＮＡ配列相同性分析によってビフィズス菌の変種株又は変異株を識別できることを理解するであろう。親株と近い配列同一性を有するビフィズス菌株は、変種株又は変異株とみなされる。親株ＤＮＡ配列と９７％以上、９８％以上、又は９９％以上など９６％以上の配列同一性（相同性）を有するビフィズス菌株は、変種又は変異型であるとみなされ得る。配列相同性は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ，ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で公的に入手可能なオンライン相同性アルゴリズム「ＢＬＡＳＴ」プログラムを使用して決定することができる。
【００３７】
親株の変種は、親株の１６ｓ〜２３ｓ遺伝子間スペーサポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％の配列相同性又は少なくとも９５％の配列相同性など少なくとも８５％の配列相同性を有する、誘導されたビフィズス菌株も含む。これらの変種は、その細菌ゲノムの他のＤＮＡ配列におけるＤＮＡ変異も更に含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
本発明は、添付の図を参照してあくまで例として与えられる以下の説明によって、より明瞭に理解されるであろう。
【図１】コンゴレッド寒天平板上で増殖したビフィズス菌ロンガムＡＨ１２１Ａの写真。
【図２】ビフィズス菌ロンガム１２１Ａ（ビフィズス菌１２１Ａ）で刺激されたＰＢＭＣでのＩＬ−１０：ＩＬ−１２ｐ７０の比率を図示する棒グラフ。
【図３】低ｐＨ環境での株１２１Ａの生存を図示するプロット。ｐＨ２．５の環境には、株を６時間被曝させ、生菌数を用いて生存率を評価した。
【図４】インビトロ培養末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのサイトカイン分泌のプロット。
【図５】インビトロ培養末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのサイトカイン分泌のプロット。
【図６】インビトロ培養末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのサイトカイン分泌のプロット。
【図７】Ａ〜Ｅは、１２１Ａ及びＢｉｆ  ３５６２４の濃度の増加によるインビトロ刺激後のＰＢＭＣにおけるＩＬ−１０の誘導プロファイルを示す線グラフ。
【図８】Ａ〜Ｄは、１２１Ａ及びＢｉｆ  ３５６２４の濃度の増加によるインビトロ刺激後のＰＢＭＣにおけるＩＬ−Ｉβの誘導プロファイルを示す線グラフ。
【図９】Ａ〜Ｄは、１２１Ａ及びＢｉｆ  ３５６２４の濃度の増加によるインビトロ刺激後のＰＢＭＣにおけるＩＬ−６の誘導プロファイルを示す線グラフ。
【図１０】Ａ〜Ｄは、１２１Ａ及びＢｉｆ  ３５６２４の濃度の増加によるインビトロ刺激後のＰＢＭＣにおけるＩＬ−８の誘導プロファイルを示す線グラフ。
【図１１】Ａ〜Ｄは、１２１Ａ及びＢｉｆ  ３５６２４の濃度の増加によるインビトロ刺激後のＰＢＭＣにおけるＩＬ−１２  ｐ７０の誘導プロファイルを示す線グラフ。
【図１２】Ａ〜Ｅは、１２１Ａ及びＢｉｆ  ３５６２４の濃度の増加によるインビトロ刺激後のＰＭＢＣにおけるＴＮＦ−αの誘導プロファイルを示す線グラフ。
【図１３】Ａ〜Ｃは、１２１Ａ及びＢｉｆ  ３５６２４の濃度の増加によるインビトロ刺激後のＰＭＢＣにおけるＩＦＮ−γの誘導プロファイルを示す線グラフ。
【図１４】Ａ〜Ｄは、１２１Ａ及びＢｉｆ  ３５６２４の濃度の増加によるインビトロ刺激後のＰＢＭＣにおけるＧ−ＣＳＦの誘導プロファイルを示す線グラフ。
【図１５】ヒト骨髄型樹枝状細胞によるＩＬ−１０及びＩＬ−１２  ｐ７０の分泌への１２１Ａの影響を示す棒グラフ。
【図１６】ヒト未感作ＣＤ４＋  Ｔ細胞への１２１Ａの影響を示す棒グラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
ビフィズス菌ロンガム株ＡＨ１２１Ａの堆積物は、２００９年１１月５日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＮＣＩＭＢ）Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１  ９ＹＡ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫで作製され、受け入れ番号ＮＣＩＭＢ  ４１６７５を与えられた。
【００４０】
ビフィズス菌ロンガム株ＵＣＣ  ３５６２４の堆積物は、１９９９年１月１３日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＮＣＩＭＢ）Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１  ９ＹＡ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫで作製され、受け入れ番号ＮＣＩＭＢ  ４１００３を与えられた。
【００４１】
ビフィズス菌ロンガムは遺伝子が組み換えられた変種でもよく、自然発生するその変異型でもよい。
【００４２】
ビフィズス菌ロンガムは生存細胞形態であることが好ましい。
【００４３】
あるいは、ビフィズス菌ロンガムは非生存細胞形態であってもよい。
【００４４】
本明細書で使用する時、「コンパニオンアニマル」とは家畜を意味する。好ましくは、「コンパニオンアニマル」は、家庭で飼われるネコ科動物（ネコ）、イヌ科動物（イヌ）、ウサギ、白イタチ、ウマ、ウシなどを意味する。より好ましくは、「コンパニオンアニマル」は、家庭で飼われるネコ科動物を意味する。
【００４５】
乳酸ビフィズス菌株
本発明の第一の態様は、動物内でプロバイオティク活性を有する切除及び洗浄されたネコ科動物の胃腸管から単離することにより得られる、ビフィズス菌属の乳酸菌株を含む。プロバイオティクは、生存微生物又は死滅微生物、微生物の加工組成物、タンパク質又は炭水化物のようなそれらの構成成分、あるいは宿主に有益な作用を及ぼす細菌発酵の精製画分である。プロバイオティク菌は、生存細胞形態で一般に使用される。しかし、プロバイオティク菌により発現される有益な因子を含有する、死滅した培養物又は組成物のような非生存細胞にも及ぶことができる。これには、熱で死滅した微生物、あるいは、ｐＨ変化に曝されることにより又は圧力を受けることにより死滅した微生物が含まれ得る。本発明の目的では、「プロバイオティク」は、特に指定がない限り、本発明の微生物によって発酵中に産生される代謝産物を更に含むことが意図される。これらの代謝産物は、発酵の媒質に放出されてもよいし、微生物内に蓄えられてもよい。本明細書で使用する時、「プロバイオティク」は、また、治療的用量で与えられた場合に宿主動物に有益な機能を果たす、細菌、細菌性ホモジネート、細菌性タンパク質、細菌抽出物、細菌発酵上清、及びこれらの混合物も含む。
【００４６】
切除及び洗浄された哺乳類のＧＩ管から直接単離することにより得られるビフィズス菌属の乳酸菌は、生菌細胞の摂食後にＧＩ管に付着すること、並びに生存可能な形態、非生存可能な形態、又は分画された形態で動物に与えると、著しく免疫調節性でもあることが分かっている。理論に束縛されるものではないが、切除及び洗浄されたＧＩ管から単離することにより得られるビフィズス菌は、胃腸粘膜組織と密接に関連していると考えられている。更に理論に束縛されるものではないが、このことは、プロバイオティク作用をもたらす代替的な宿主反応を生み出す本発明のプロバイオティクビフィズス菌をもたらすと考えられている。切除及び洗浄されたＧＩ管からの単離によって得られるプロバイオティク細菌は、粘膜上皮及び宿主の免疫細胞との直接相互作用を介して宿主の免疫系を調節できることが判明している。この免疫調節は、プロバイオティク菌に関連した従来の作用機序、すなわち、閉鎖（occlusion）による胃腸への病原体付着の予防、及び栄養競合と相まって、本発明のビフィズス菌をプロバイオティク生物としてきわめて有効なものにする。
【００４７】
切除及び洗浄されたネコ科動物のＧＩ管から単離することによって得られる本発明のビフィズス菌は、多数の病原菌株／種に対してインビトロ抗菌活性を有する。理論に束縛されるものではないが、このインビトロ抗菌活性は、動物、好ましくはネコ科動物などのコンパニオンアニマルの生体内で潜在的プロバイオティク活性を示すと考えられている。本発明の乳酸菌は、好ましくは、サルモネラティフィムリウム、リステリアモノサイトゲネス、リステリアイノキュア、又は大腸菌、より好ましくはこれらの株の組み合わせ、更になお好ましくはこれらの株全てに対して、インビトロ抗菌活性を有する。
【００４８】
理論に束縛されるものではないが、本発明の乳酸菌の抗菌活性は、本明細書中の乳酸菌による多数の異なる作用の結果である可能性があると考えられる。これまで、当該技術分野では、糞便試料から単離された幾つかの細菌株が、経口摂取後に、閉鎖（occlusion）によって胃腸粘膜への病原生物の付着を予防することにより、ＧＩ管においてそのプロバイオティク効果を及ぼすことが示唆されてきた。これには、胃腸内に細菌のコロニーを形成させるために、「生きている」すなわち生菌細胞の経口摂取が必要である。しかし、切除及び洗浄されたネコ科動物のＧＩ管から単離することにより得られる本発明のビフィズス菌は、生存可能形態で与えられれば閉鎖（occlusion）による何らかのプロバイオティク効果を及ぼすが、インビトロでの発酵時に、病原微生物の増殖を阻害する、若しくは病原微生物を死滅させる、及び／又は宿主動物の免疫能力を変化させる物質（単数又は複数）を産生するので、生存可能形態でも非生存可能形態でもかなりのプロバイオティク効果をもたらす可能性があると考えられている。この形態のプロバイオティク活性は、本発明の細菌を生存可能又は非生存可能な培養物あるいは精製発酵産物として与えてもなお宿主動物に有益な治療効果をもたらすので、望ましい。
【００４９】
本発明の乳酸菌は、ＧＩ管内を通過した後に生存能力を維持できることが好ましい。このことは、生きた菌の培養物を経口摂取し、食道及び胃を通過後に小腸及び大腸内でコロニー形成を生じさせるために望ましい。本発明の乳酸菌による小腸及び大腸でのコロニー形成は、宿主に長期にわたるプロバイオティク効果をもたらすのに望ましい。非生存細胞又はその精製単離物の経口服用は、一時的な効果をもたらすが、細菌は生存可能ではないので、増殖してその場で継続的にプロバイオティク効果をもたらすことができない。結果として、これには、健康上の利益を維持するために宿主に定期的に服用させることが必要になる場合がある。これに対し、生存可能な形態で胃を通過して生き残ることができ、その後胃腸粘膜に付着し腸粘膜上で増殖することによってコロニーを形成する生存細胞は、その場で継続的にプロバイオティク効果をもたらすことが可能である。したがって、本発明の乳酸菌は、ｐＨ  ２．５の培地に１時間懸濁させた後で生存能力を維持することが好ましい。本明細書で使用するとき、「生存能力を維持する」とは、当業者に既知の平板計数法を使用して、初めに試験培地に懸濁させた細菌の少なくとも２５％が生存可能であることを意味する。好ましくは、「生存能力を維持する」とは、初めに懸濁させた細菌の少なくとも５０％が生存可能であることを意味する。本発明の乳酸菌は、低いｐＨに曝された後で生存能力を維持することが望ましいが、これは、動物において、経口摂取後に生体内の胃及び腸上部で胃液に曝される状況を模しているからである。
【００５０】
切除及び洗浄されたネコ科動物の胃腸管から単離することによって得られるビフィズス菌属の乳酸菌株は、動物、好ましくはコンパニオンアニマル又はヒトにおける経口摂取後にプロバイオティク効果を供給するのに用いることができる。このプロバイオティク効果は、一般に、動物の全般的な健康を維持及び改善する。治療的な症状緩和若しくは予防による疾患予防のいずれかにおいて利益を受ける、動物の健康的及び生理学的非限定的要素としては、炎症性疾患、免疫不全、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、癌（特に胃腸管及び免疫系の癌）、下痢性疾患、抗生物質起因性の下痢、虫垂炎、自己免疫疾患、多発性硬化症、アルツハイマー病、アミロイド症、リウマチ様関節炎、関節炎、間接可動性、真性糖尿病、インスリン耐性、細菌性感染症、ウイルス性感染症、真菌性感染症、歯周病、泌尿生殖器疾患、外科手術による外傷、外科手術による転移性疾患、敗血症、体重喪失、体重増加、過剰な脂肪組織蓄積、拒食症、体熱制御、悪液質、創傷治癒、潰瘍、内臓障壁感染症、アレルギー、喘息、呼吸器系疾患、循環系疾患、冠状動脈性心疾患、貧血、凝血系統疾患、腎疾患、中枢神経系疾患、肝臓病、虚血、栄養疾患、骨粗鬆症、内分泌腺疾患、及び表皮疾患が挙げられる。好ましいのは、下痢の治療又は予防を含む胃腸管の治療、好ましくは自己免疫疾患及び炎症の治療又は予防を含む免疫系調節、好ましくは皮膚のアトピー疾患の治療又は予防である皮膚及び／又はコート系の健康の維持又は改善、精神的意識及び活動レベルを含む加齢の影響の緩和又は軽減、視床下部−下垂体−アドレナリン軸に関連する疾患の予防、及び関節の健康の改善による可動性の改善である。
【００５１】
以上で開示した疾患の処置は、当業者に既知の技術を使用して測定され得る。例えば、自己免疫疾患及び炎症などの炎症性疾患は、リンパ球幼若化現象、ナチュラルキラー細胞活性、ワクチンに対する抗体反応、遅延型過敏症、及びこれらの組み合わせのようなインビボ免疫機能試験を使用して検出及び監視され得る。本明細書でこのような方法について簡単に説明するが、これらは当業者には周知である。
【００５２】
１．リンパ球幼若化現象：このアッセイは、様々なマイトジェンに対する試験動物及び対照動物の新鮮な全血から単離されたリンパ球のインビトロ増殖反応を測定する、総合的なＴ細胞及びＢ細胞の機能の指標である。簡潔に言えば、当業者に既知のフィコールハイパーク密度遠心分離法によって、全血から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離する。単離したＰＢＭＣを、ＨＥＰＥＳ、Ｌ−グルタミン、及びペニシリン／ストレプトマイシンを追加したＲＰＭＩ  １６４０細胞培地で２回洗浄する。洗浄した細胞を、ＲＰＭＩ  １６４０中に再懸濁させ、計数し、細胞密度を適切に調節する。２×１０５個の細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）を用い、３７℃及び５％  ＣＯ２で７２時間にわたって、３回、一連の濃度（０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ）の様々なマイトジェンに曝す。そのいくつかの例としては、ポークウィードマイトジェン（Ｇｉｂｃｏ）、フィトヘマグルチニン（Ｇｉｂｃｏ）、及びコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ）が挙げられる。５４時間経過後に、細胞を１μＣｉ  Ｈ−チミジンでパルスし、細胞を採集し、７２時間後にＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴでシンチレーションカウントを読み取る。
【００５３】
２．ナチュラルキラー細胞活性：米国特許第６，３１０，０９０号に記載されているように、このアッセイは、試験動物及び対照動物の新鮮な全血から単離されたナチュラルキラー細胞のインビトロエフェクター活性を測定する。ナチュラルキラー細胞は、哺乳類の先天性免疫機能の構成成分である。ＮＫ細胞の細胞毒性活性を評価する際の標的細胞として、ネコ科動物の甲状腺癌細胞を使用した。この細胞株は、既に、ネコ科動物のＮＫ細胞によって死滅しやすいことが示されていた。標的細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを足した２０ｎｉＬ最小必須培地（ＭＥＭ；ミズーリ州Ｓｔ．ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）とともにＴ７５フラスコにて培養した。コンフルエントになった場合、標的細胞をトリプシン処理し、３回洗浄し、完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％  ＦＣＳ＋１００Ｕ／ｍＬのペニシリン＋１００  １０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）中に細胞数５×１０５個／ｍＬに再懸濁させた。標的細胞の３つの１００μＬアリコートを９６ウェルＵ底プレート（マサチューセッツ州ＣａｍｂｒｉｄｇｅのＣｏｓｔａｒ）内にピペットで入れ、８時間インキュベートして、細胞を付着させた。次いで、フィコールハイパーク分離（前述）によって単離されたリンパ球（エフェクター細胞；１００μＬ）を標的細胞に加えて、エフェクター／標的細胞（Ｅ：Ｔ）比を１０：１にした。３７℃で１０時間インキュベートした後、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を５μｇ含有する２０μＬの基質を加えた。この混合物を３７℃で４時間インキュベートし、その後、未代謝のＭＴＴを吸引によって除去した。２００μＬの９５％エタノールを加えることによってホルマザン結晶を溶解させた。マイクロプレートリーダーを使用して５７０ｎｍで光学密度を測定した。ＮＫ細胞特有溶菌の百分率は次のように計算した。特異的細胞毒性（％）＝１００×｛１−［（標的細胞及びエフェクター細胞のＯＤ−エフェクター細胞のＯＤ）／（標的細胞のＯＤ）］｝
【００５４】
３．ワクチンに対する抗体反応：少なくとも１２週間プロバイオティク餌又は対照餌を与えた後、被験体にワクチンのアレイ（最大５まで）を与える。ワクチンは、新規ワクチンと余剰ワクチンとの混合物であってよい。使用してよいワクチンアレイの非限定例としては、Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈによって調製されたワクチンの混合物が挙げられる。本明細書に用いるのに好適なワクチンの非限定例としては、ネコ科動物ジステンパー、アデノウイルス、コロナウイルス、パラインフルエンザ、及びパルボウイルスが挙げられる。被験体のワクチン歴が、使用すべきワクチンを決定するであろう。所与のワクチンに対する特異的抗体を、血液中で３週間にわたって測定し、対照餌群及びプロバイオティク餌群における反応の長さ及び強度を比較する。４．遅延型過敏症：免疫系の状態を評価するインビトロの非侵襲的方法。この試験は、多クローン性マイトジェンであるフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）と、ヒツジ赤血球、多価ワクチン、ヒスタミン（１００μＬの０．０２７５ｇ／Ｌリン酸ヒスタミン；Ｇｒｅｅｒ（ノースカロライナ州Ｌｅｎｏｉｒ））、又はＰＢＳ（１００μＬの８．５ｇ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水；Ｓｉｇｍａ）とを組み合わせた、皮内注射を含む。注射後０、２４、４８、及び７２時間の時間間隔でキャリパーを使用した皮下脂肪の厚さとして、抗原に対する免疫反応を記録する。皮下脂肪の厚さの増加は、本発明の細菌による処置によって減少するはずの過敏性反応がより大きいことを示す。
【００５５】
本発明のビフィズス菌の効果を判定するための更なる方法は、米国特許第６，１３３，３２３号及び米国特許第６，３１０，０９０号に記載されている。
【００５６】
更に、体脂肪量、除脂肪量、及び骨塩量などの身体組成を測定するためのデュアルＸ線吸収法又はＣＴスキャンを使用して、老化の影響の改善を判定することができる。同様に、この方法を使用して、感染後の被験体における体重減少又は骨密度のような解剖学的変化を判定することができる。
【００５７】
また、本発明のビフィズス菌は、コンパニオンアニマルにおけるストレスレベルを低下させるための方法においても使用することができる。エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、コルチゾール、Ｃ反応性タンパク質、及びその他の急性期タンパク質などの血中ストレスホルモンの濃度を測定して、ストレスレベル及びそれらの低下又は維持を判定してもよい。これらのホルモンは、ストレスのバイオマーカーとして認識されており、当業者に既知の技術を使用して容易に測定することができる。更に、ＣＴ撮像により、視床下部−下垂体−副腎軸線の活性のインビボマーカーとしての副腎サイズを直接測定してもよい。
【００５８】
更に、訓練を受けた２人によって行われる皮膚及び毛皮評価を用いて、アトピー性皮膚疾患を含むコンパニオンアニマルの皮膚及び／又は毛皮系の健康の維持又は改善を測定してもよい。そのような評価中に検査された基準の例には、以下が挙げられる。ａ）脱毛指数：脱毛指数は、標準化されたブラッシングセッション中に得られた毛髪を収集することによって各被験体に割り当てられる。それらの毛髪を保持及び重量測定し、対照と被験体を比較する。ｂ）主観的な皮膚／毛皮評価：脱毛、ふけ、つや、均質性、柔らかさ、及び密度を評価することによって、訓練を受けた評価者が皮膚及び毛皮の状態を主観的に評価する。ｃ）皮膚機能試験：アセトン含浸ガーゼで皮膚表面を拭き取ることによって皮膚バリア機能を評価することができる。この手法は、単一の細胞層及び関連した角質層の脂質画分を除去することによって皮膚バリアを効果的に破壊する。当業者に既知の方法を使用して、経表皮水分損失（ＴＥＷＬ）の増加及び被術部位の赤色度を測定することによって、バリアの破壊を定量化する。前述のカメラ及び照明システムを使用して、発赤（紅斑）スコアを得る。破壊の直前及び直後、並びに５時間及び２４時間エンドポイントにおいて、ＴＥＷＬの読み値及び発赤スコアを得て、皮膚の保護及び治癒特性を評価する。
【００５９】
更に、コンパニオンアニマルにおける胃腸感染症の処置は、コンパニオンアニマルの微生物生態系の改善を含み得る。コンパニオンアニマルの微生物生態系の改善は、コンパニオンアニマルの糞便中の病原菌の量の低減を含むことが好ましい。コンパニオンアニマルの糞便中に存在する病原菌の量は、当業者に既知の標準的な平板計数法を使用して数えることができる。より好ましくは、病原菌は、クロストリジウム、エシェリキア、サルモネラ、バクテロイデス、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。好適な病原菌株の非限定例としては、ウェルシュ菌、クロストリジウムディフィシレ、大腸菌、サルモネラチフィムリウム、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６０】
また、本発明の細菌の使用方法には、哺乳類、好ましくはコンパニオンアニマルの尿路の予防的又は治療的処置も含み得る。尿路の処置の非限定例としては、尿路感染症の治療又は予防、尿路結石を含む腎疾患の治療又は予防、膀胱感染症の治療又は予防等が挙げられる。理論に束縛されるものではないが、本発明のビフィズス菌は、インビトロにて立証されるように、そのシュウ酸分解能の結果としてこれらの疾患の予防に有用であると考えられる。シュウ酸は、腎臓、膀胱、及び他の尿路感染症を引き起こす不溶性沈殿物を形成できる、泌尿器代謝の副産物である。シュウ酸を分解し、その結果尿路でのシュウ酸の沈殿及び蓄積を潜在的に予防することによって、本発明の細菌は、尿路の感染症及びその他の疾患を治療及び予防し得る。シュウ酸の分解は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｒｎ／Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍから市販されているシュウ酸試験キットカタログ番号７５５６９９を使用して、インビトロにて測定できる。
【００６１】
本発明のビフィズス菌は、繊維消化の改善を含む、コンパニオンアニマルの健康を改善又は維持するための方法において使用されることができる。繊維消化の改善は、前記プロバイオティク細菌及び有益な内因性微生物相の増殖を促進し、それがある程度の潜在的な病原菌の抑制に役立つので、望ましい。更に、ヒトにおける腸内発酵に起因した毒性代謝産物及び有害酵素の量の減少が記録されている（６）。各実験において、希釈された糞便の試料を使用する代わりに、対象の細菌株の純粋培養物を使用して植菌したこと以外は、Ｖｉｃｋｅｒｓら（７）に記載された方法を使用して、繊維消化を判定してもよい。
【００６２】
本発明のネコ科動物プロバイオティク菌株は、臭いを引き起こす糞便及び尿中の化合物の生成を低減することによって、糞便及び尿の臭い、並びに付随して砂箱トイレ内の臭いを低減するのに使用され得る。臭気を引き起こす化合物の非限定例としては、アンモニア、インドール、フェノール、アミン、分枝鎖脂肪酸、及び揮発性硫黄含有化合物が挙げられる。理論に束縛されるものではないが、コンパニオンアニマルの糞便又は尿中のこれら化合物の量を低減することが、糞便又は尿に関連する臭いを低減すると考えられている。更に、砂箱トイレを使用するコンパニオンアニマルにとっては、砂箱トイレの臭いにおいて付随した減少がある。
【００６３】
本発明の乳酸菌の使用方法は、典型的に、動物による経口摂取を伴う。経口摂取は、通常の食餌摂取の一部として、又はそのサプリメントとして行われてもよい。経口摂取は、典型的に、少なくとも月に１回、好ましくは少なくとも週に１回、より好ましくは少なくとも１日に１回行われる。本発明の乳酸菌は、コンパニオンアニマルに治療的に有効な量で与えられて、動物、好ましくはコンパニオンアニマルの健康を維持又は改善することができる。本明細書で使用する場合、乳酸菌に関する用語「治療的に有効な量」とは、処置が必要な宿主動物に所望の効果又は利益をもたらすのに十分であるが、毒性、刺激、又はアレルギー反応のような悪影響を回避するために十分に少ない、本発明の方式で使用した場合に適当な利益／危険比に相応する量を意味する。具体的な「治療的に有効な量」は、処置されている特定の状態、ユーザーの身体的状態、処置期間、併用療法（もしあれば）の性質、使用される具体的な剤形、採用される担体、剤形の溶解度、及び特定の服用レジメンのような因子によって変わるであろう。
【００６４】
乳酸菌は、好ましくは１．０Ｅ＋０４〜１．０Ｅ＋１４ＣＦＵ／日、より好ましくは１．０Ｅ＋０６〜１．０Ｅ＋１２ＣＦＵ／日の１回量でコンパニオンアニマルに与えられる。好ましくは組成物は、切除及び洗浄されたネコ科動物のＧＩ管から単離することにより得られる１．０Ｅ＋０４〜１．０Ｅ＋１２ＣＦＵ／ｇのビフィズス菌属の乳酸菌を、少なくとも０．００１％含有してもよい。乳酸菌は、生存可能な形態で、あるいは死滅細胞、又は留出物、単離物若しくは本発明の乳酸菌の発酵産物の他の画分、あるいはこれらの組み合わせとして、動物に与えることができる。
【００６５】
乳酸菌、あるいはその精製又は単離された画分を用いて、動物の健康の維持又は改善用組成物を調製することが好ましい。前述のように、組成物は、通常の食餌摂取の一部であってもよく、又はサプリメントであってもよい。組成物が通常の食餌摂取の一部を構成する場合、組成物は、ビスケット又はキブルのような乾燥アニマルフード、加工されたグレイン餌、湿潤アニマルフード、ヨーグルト、グレービー、噛み物、トリーツ等の形態であってよい。
【００６６】
このような組成物は、更なる構成成分を含んでもよい。その他の構成成分は、本明細書で使用される組成物に含めるのに有益であるが、本発明の目的には任意である。例えば、フード組成物は、栄養的にバランスが取れていることが好ましい。一実施形態では、フード組成物は、乾燥物質基準で、該フード組成物の約２０重量％〜約５０重量％の粗タンパク質、好ましくは約２２重量％〜約４０重量％の粗タンパク質を含んでよい。粗タンパク質材料は、少なくとも約１５重量％のタンパク質含有量を有するいずれの材料を含んでもよく、その非限定例としては、大豆、綿実、及び落花生のような植物性タンパク質、並びにカゼイン、アルブミン、及び肉組織のような動物性タンパク質が挙げられる。本明細書で有用な肉組織の非限定例としては、新鮮な肉、及び魚粉、家禽粉、肉粉、骨粉等の乾燥又は精製粉が挙げられる。他の種類の好適な粗タンパク質源としては、小麦グルテン又はトウモロコシグルテン、及び酵母などの微生物源から抽出されたタンパク質が挙げられる。
【００６７】
更に、フード組成物は、乾燥物質基準で、該フード組成物の約５重量％〜約３５重量％の脂肪、好ましくは約１０重量％〜約３０重量％の脂肪を含んでもよい。その上更に、本発明の乳酸菌を含むフード組成物は、食物繊維を合計で約４重量％〜約２５重量％含んでもよい。また組成物は、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９９／５１１０８に記載の複数のデンプン源も含んでよい。
【００６８】
本発明の組成物は、更に炭水化物供給源を含んでよい。米、トウモロコシ、ミロ、サトウモロコシ、大麦、アルファルファ、小麦等のグレイン又は穀物が、供給源の例である。加えて、組成物は、乾燥乳清及びその他の酪農副産物のような他の材料を含有していてもよい。
【００６９】
また本発明の細菌を含む組成物は、プレバイオティクも含んでもよい。「プレバイオティク」は、コンパニオンアニマルの腸内細菌相によって発酵され、その結果、病原菌を使ってコンパニオンアニマルの胃腸管内で乳酸菌の増殖及び発達を促進する、物質又は化合物を含む。この発酵の結果、大腸で脂肪酸、特に短鎖脂肪酸が放出される。これは、大腸におけるｐＨ値を低下させる効果を有する。好適なプレバイオティクの非限定例としては、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、又はデンプンのオリゴ誘導体として一般に知られている、イヌリン及びその加水分解生成物のようなオリゴ糖が挙げられる。プレバイオティクは、任意の好適な形態で提供することができる。例えば、プレバイオティクは、繊維を含有する植物材料の形態で提供されてもよい。好適な植物材料としては、アスパラガス、アーティチョーク、玉ねぎ、小麦若しくはチコリー、又はこれらの植物材料の残渣が挙げられる。あるいは、プレバイオティク繊維は、イヌリン抽出物として提供されてもよく、例えば、チコリーからの抽出物が好適である。好適なイヌリン抽出物は、ベルギー、Ｔｉｒｌｅｍｏｎｔ  ３３００のＯｒａｆｔｉ  ＳＡより「Ｒａｆｔｉｌｉｎｅ」の商標名で入手することができる。例えば、イヌリンは、約９０〜約９４重量％のイヌリン、最大で約４重量％のグルコース及びフルクトース、並びに約４〜９重量％のスクロースを含有する白色微粉末であるＲａｆｔｉｌｉｎｅ（ｇ）ＳＴの形態で提供されることができる。あるいは、繊維は、ベルギー、Ｔｉｒｌｅｍｏｎｔ  ３３００のＯｒａｆｔｉ  ＳＡより「Ｒａｆｔｉｌｏｓｅ」の商標名で入手されるようなフラクトオリゴ糖の形態であってもよい。例えば、イヌリンは、Ｒａｆｔｉｌｏｓｅ（ｇ）Ｐ９５の形態で提供され得る。あるいは、フラクトオリゴ糖は、イヌリンの加水分解、酵素的方法、又は微生物の使用により得ることもできる。
【００７０】
乾燥コンパニオンアニマルフードの場合、好適なプロセスは押出調理であるが、ベーキング及びその他の好適なプロセスを使用してもよい。押出調理される場合には、乾燥コンパニオンアニマルフードは、通常、キブルの形態で提供される。プレバイオティクが使用される場合、プレバイオティクは、加工処理前に乾燥コンパニオンアニマルフードのその他の成分と混合されてよい。好適なプロセスは、欧州特許出願第０８５０５６９号に記載されている。プロバイオティク微生物が使用される場合、該微生物を乾燥コンパニオンアニマルフード上にコーティングする、又は乾燥コンパニオンアニマルフードに詰め込むことが最善である。好適なプロセスは、欧州特許公開第０  ８６２  ８６３号に記載されている。
【００７１】
湿潤フードの場合、米国特許第４，７８１，９３９号及び同第５，１３２，１３７号に記載されているプロセスを使用して、擬似肉製品を製造してもよい。例えばスチームオーブンでの調理など、チャンク型製品を製造するためのその他の方法の使用も可能である。あるいは、好適な肉材料を乳化させて肉エマルションを製造し、好適なゲル化剤を添加し、該肉エマルションを加熱してから缶又はその他の容器に詰めることによって、ローフ型の製品を製造してもよい。典型的な湿潤フード組成物は、約５％〜約１５％のタンパク質、約１％〜約１０％の脂肪、及び約１％〜約７％の繊維を含み得る。湿潤フード組成物において使用できる非限定的な成分としては、鶏肉、シチメンチョウ肉、牛肉、白身魚、鶏肉ブロス、シチメンチョウ肉ブロス、牛肉ブロス、鶏の肝臓、発酵用米、コーングリッツ、魚粉、卵、ビートパルプ、塩化物、亜麻粉、子羊肉、牛肉副産物、鶏肉副産物、及びこれらの混合物が挙げられる。別の実施形態では、ビスケット、噛み物及びその他のトリーツ等のサプリメント組成物は、乾燥物質基準で、サプリメント組成物の約２０重量％〜約６０重量％のタンパク質、又は約２２重量％〜約４０重量％のタンパク質を含んでもよい。別の例として、サプリメント組成物は、乾燥物質基準で、該サプリメント組成物の約５重量％〜約３５重量％の脂肪、又は約１０重量％〜約３０重量％の脂肪を含んでもよい。ネコ科動物用に使用されることを意図するフード及びサプリメント組成物は、当該技術分野において一般的に知られている。
【００７２】
コンパニオンアニマルフードは、長鎖脂肪酸及び亜鉛のようなその他の活性剤を含有してもよい。好適な長鎖脂肪酸としては、α−リノール酸、γ−リノレン酸、リノール酸、エイコサペンタン酸、及びドコサヘキサン酸が挙げられる。魚油は、好適なエイコサペンタン酸及びドコサヘキサン酸の供給源である。
【００７３】
ルリチシャ油、ブラックカレント種子油、及びマツヨイグサ油は、好適なγ−リノレン酸源である。ベニバナ油、ヒマワリ油、トウモロコシ油、及び大豆油は、好適なリノール酸源である。また、これらの油を、上で言及したコーティング基材で使用してもよい。亜鉛は、様々な好適な形態で、例えば、硫酸亜鉛又は酸化亜鉛として提供されてもよい。更に、コンパニオンアニマルフードにおいて一般に使用される多くの成分は、脂肪酸及び亜鉛の供給源である。プレバイオティク源としてのチコリーと、大豆油のようなリノール酸の豊富な油とを組み合わせると、相乗効果を示唆する予期せぬ利益がもたらされることが観察されている。
【００７４】
組成物がグレービーの形態の場合、該組成物は、少なくとも１０％のブロス又はストックを含むことが好ましく、その非限定例としては、野菜、ビーフ、チキン、又はハムのストックが挙げられる。典型的なグレービー組成物は、約０．５％〜約５％の粗タンパク質、約２％〜約５％の粗脂肪、及び約１％〜約５％の繊維を含んでよい。
【００７５】
本明細書で使用するのに適したサプリメントの更なる非限定例としては、粉末、油懸濁液、乳ベース懸濁液、チーズ、カカオバターベース組成物、及び丸薬又はカプセルが挙げられる。組成物が丸薬の形態の場合、丸薬を固体の圧縮形態に維持するために、好適な結合剤が必要である。好適な結合剤の非限定例としては、キサンタンガム、ペクチン、レシチン、アルギネート、及び当業者に既知のその他のもののような天然ガムが挙げられる。組成物がカプセルの形態の場合、該組成物は、当業者に既知の技術を使用してカプセル封入されることが好ましい。好適なカプセル封入材料の非限定例としては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、アルギネート、及びゼラチンが挙げられる。ヨーグルトベース組成物は、約１％〜約５％のタンパク質、約１０％〜約２０％の炭水化物、約１％〜約５％の繊維、約１％〜約５％の脂肪及び約５０％〜約９０％のミルクのような液体担体を含んでよい。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるものであり、いかなる方法でも本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【００７７】
実施例１−ビフィズス菌ロンガムＡＨ１２１Ａの単離
ビフィズス菌ロンガム菌株ＡＨ１２１ａは、ネコ科動物の腸組織から単離した。
【００７８】
飼い主主導による承認済みの安楽死のために地元の獣医のところにいる健康なネコから、ネコ科動物の腸試料を得た。全ての動物が健康で無病であった。各ネコの結腸、中間結腸、盲腸、及び回腸を切開して粘膜を露出させた。
【００７９】
粘膜組織を攪拌し（１分間ボルテックス処理）、組織を機械的に均質化した後、上清を除去した。各上清をｄｅ  Ｍａｎｎ  Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）寒天培地に蒔いた。これらを、Ａｎｅｒｏｃｕｌｔ  ＧａｓＰａｋシステムを用いて、３７℃で４８時間嫌気的にインキュベートした。平板からの単離したコロニーをＭＲＳ上に再びストリーキングし、再び同じ条件下で嫌気的に増殖させた。単離したコロニーを更に４回、再びストリーキングして、単一の菌株を精製した。コロニーの形態及び顕微鏡像を評価した。好適な単離物を、グラム反応及びカタラーゼ活性について試験した。ＡＰＩ試験（ＡＰＩ  ５  ＯＣＨＬ、ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を使用して、グラム陽性カタラーゼ陰性桿菌の同定を実施した。採集した細胞を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ６．５）及びシステイン−ＨＣｌ（５００ｍｇ／Ｌ）で２回洗浄した後、音波処理を実施した。遠心分離で細胞破片を除去した。上清をＮａＦ（６ｍｇ／ｍＬ）及びヨード酢酸Ｎａ（１０ｍｇ／ｍＬ）で３７℃で３０分間インキュベートした。室温で１０分間にわたって塩酸ヒドロキシルアミン（ｐＨ  ６．５）でインキュベートすることによって、反応を停止させた。ＨＣｌ（４Ｍ）、ＦｅＣｌ３．６Ｈ２Ｏ（０．１ＭのＨＣｌ中５％（Ｗ／Ｖ））及びフルクトース−６−ホスフェート（Ｎａ塩）を添加した後、発色を監視した。フルクトース−６−ホスフェートからのアセチルリン酸の形成が、そのヒドロキシメートの第二鉄キレートによって形成される赤みを帯びた色によって証明された。
【００８０】
種の同定
１６ｓ遺伝子間スペーサ（ＩＧＳ）シークエンシングを行って、単離されたビフィズス菌の種を同定した。簡潔に、１００μＬの抽出液及び２５μＬの組織調製液（Ｓｉｇｍａ、ＸＮＡＴ２  Ｋｉｔ）を用いて、ＤＮＡをＡＨ１２１Ａから単離した。試料を室温で５分間インキュベートした後、９５℃で２時間インキュベートし、次いで、１００μＬの中和溶液（ＸＮＡＴ２キット）を添加した。ナノドロップ分光分析装置を使用してゲノムＤＮＡ溶液を定量化し、４℃で保存した。ＰＣＲは、ＩＧＳプライマー、ＩＧＳ  Ｌ：５’−ＧＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３）を用いて行った結果、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１が同定され、ＩＧＳ  Ｒ：５’−ＣＴＧＧＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＴＣＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４）ではＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２が同定された。サイクル条件は、９４℃で３分間（１サイクル）、９４℃で３０秒間、５３℃で３０秒間、７２℃で３０秒間（２８サイクル）であった。ＰＣＲ反応は、４μＬ（５０ｎｇ）のＤＮＡ、ＰＣＲミックス（ＸＮＡＴ２キット）、０．４μＭのＩＧＳ  Ｌ及びＲプライマー（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を含有していた。ＰＣＲ反応は、エッペンドルフ熱サイクラー（Eppendorf thermocycler）にて行われた。ＰＣＲ産物（１０μＬ）を、ＴＡＥ中２％アガロースＥｔＢｒ染色ゲル上で分子量マーカー（１００ｂｐ  Ｌａｄｄｅｒ、Ｒｏｃｈｅ）と並べて分析して、ＩＧＳプロファイルを決定した。ビフィズス菌のＰＣＲ製品（単一バンド）を、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ  ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。遺伝子間スペーサ−領域に関して、精製されたＰＣＲ製品をプライマー配列（上記）を使用して、配列した。次いで、ヌクレオチド相同性により、菌株の同一性を決定するために、配列データを、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースに対して検索した。得られたＤＮＡ配列データを、ＮＣＢＩ標準ヌクレオチド−ヌクレオチド相同性ＢＬＡＳＴ検索エンジン（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）にかけた。この配列に最も近い配列を同定し、次いでＤＮＡＳＴＡＲ  ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェアを用いてそれらの配列を整列させて比較した。得られた配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１［ＩＧＳ正順］及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２［ＩＧＳ逆順］）は配列一覧で見ることができる。ＮＣＩＭＢデータベースの検索は、ＡＨ１２１Ａがビフィズス菌ロンガムに最も近い配列相同性を伴う特有のＩＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１［正順］及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２［逆順］）配列を有することを明らかにした。
【００８１】
実施例２−コンゴレッド寒天スクリーン
コンゴレッド寒天スクリーンを使用して、ＥＰＳ発現菌株を表現型的にスクリーニングした。つまり、１０ｍＬの変性Ｒｏｇｏｓａブロス培養基（＋０．０５％システイン）を、新しく増殖させた菌株のコロニーとともに無菌で植菌し、濁るまで３７℃で嫌気的にインキュベートした（約１６〜約２４時間）。ブロス培養物をコンゴレッド寒天平板上に無菌でストリーキングし、３７℃で４８時間、嫌気的にインキュベートした。増殖の副生成物として生成されたＥＰＳ及び／又は特定の株の代謝が、コンゴレッド染料の摂取を防いだ結果としてクリーム／白色コロニー形態をもたらすと考えられる。より少ないＥＰＳを生成する株（Stains）は容易にコンゴレッド染料を摂取し、ピンク／赤色コロニー形態をもたらす。赤色ＥＰＳを生成しない株は赤色に染色し、赤色寒天を背景にほとんど透明に見える。
【００８２】
図１を参照すると、ビフィズス菌ロンガムＡＨ１２１Ａのコロニー形態は凸状かつムコイド状の明るい白色コロニーである。
【００８３】
実施例３
様々な濃度のブタ胆汁に対するネコ科動物細菌の単離物ＡＨＦ１２１Ａの耐性を判定し、ｐＨ  ２．５でのネコ科動物細菌の単離物ＡＨＦ１２１Ａの生存を６時間及び様々な濃度の胆汁を用いたそれに続く胆汁耐性を評価する。
【００８４】
実験計画：
試験株はＡＨＦ１２１Ａビフィズス菌ロンガムである。胆汁耐性は、ブタの胆汁を補ったＭＲＳ／ＲＣＡ寒天平板（０．３、０．５、１．０、２．０、５．０、７．５、及び１０％）を用いて検査する。ｐＨ  ２．５での株の生存を、平板計数法を用いて−５、５、３０、６０、１２０、１８０、及び３６０分間隔で監視する。ｐＨ  ２．５で６時間、株に課された後、胆汁耐性を検査する。
【００８５】
方法：
ネコ科胆汁耐性の判定手順の概略を以下に記す。
【００８６】
０．３％〜１０％の範囲の様々な濃度のネコ科動物胆汁の存在下での、凍結乾燥された細菌の生存率を評価した。
【００８７】
４５％合成胆汁原液を作製し、この胆汁原液を８０℃で１０分間熱処理して栄養細胞を全て殺し、様々な濃度の合成ネコ科動物胆汁平板を調製した。
【００８８】
２％（６．６７ｍＬ胆汁原液＋１４３．３３の適切な寒天）、
１％（３．３３ｍＬ胆汁原液＋１４６．６７ｍＬの寒天）、
０．５％（１．６７ｍＬ胆汁原液＋１４８．３３ｍＬの寒天）の様々な胆汁濃度を使用した。
【００８９】
各希釈に対して、オートクレーブ法の後、溶融した不要な寒天を取り除き、適切な体積の胆汁原液と置換した。
【００９０】
胆汁平板は毎日新しくしたが、最長１週間は保存することができる。
【００９１】
スプレッドプレート法によって、凍結乾燥された各試験株のＣＦＵ／ｇを定量化した。
【００９２】
１０９ＣＦＵ／ｍＬの凍結乾燥した株を１０ｍＬの滅菌ＰＢＳ中に再懸濁することによって試験株をブタ胆汁平板に染み付け、ブタ胆汁平板を４等分し、各平板に４株（１０μＬ）を染み付けた。
【００９３】
平板を作業台で３０分間（又は染みが乾燥して寒天になるまで）乾燥させ、適切な条件下でインキュベートした。
【００９４】
低ｐＨ環境（ｐＨ  ２．５）で菌株の生存率を評価する手順の概略を以下に記す。
【００９５】
凍結乾燥粉末の計数は、スプレッドプレート法を用いて行った。１００ｍＬのブロスに６Ｍ  ＨＣｌを添加してｐＨ  ２．５に調節することによって培養基を酸性にした。調整のために必要な体積を記録し、滅菌法を用い、同体積の酸を用いて、４×１００ｍＬ  ＭＲＳのブロス（残りのブロス）のｐＨを調節した。スプレッドプレート法によって、凍結乾燥された各試験株のＣＦＵ／ｇを定量化した。
【００９６】
１０９ＣＦＵ／ｍＬの凍結乾燥した細菌を酸性培養基中に再懸濁し、適切な嫌気条件でインキュベートした。５、３０、６０．１２０、１８０、２４０、３６０分にアリコートを取り除き、スプレッドプレート法を用いてそのＣＦＵ／ｍＬを決定することによって生存率を測定した。
【００９７】
結果：
【表１】
0005600179.tif 000002
＋＋＋＝非常に良好な増殖〜１００％
＋＋＝良好な増殖〜６６％
【００９８】
結論：
○  表１は、ネコ科動物の胆汁が菌株の増殖に与える影響を示す。ネコ科動物の菌株は≦２％の濃度のネコ科動物胆汁に耐性があった。
○  図３は、ｐＨ  ２．５での酸への耐性を示す。
【００９９】
実施例４−１２１ＡがＩＬ−１０：ＩＬ−１２比に与える影響
ＢＤバキュテイナーＣＰＴ管（ＢＤカタログ番号３６２７６１）を製造業者の指示にしたがって用い、健康なヒト末梢血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＰＢＭＣを洗浄し、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ−Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）（Ｇｌｕｔａｍａｘ（グルタミン代用品）＋ピルビン酸＋ブドウ糖４．５ｇ／Ｌ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１０５６９−０１０）、１０％のウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｆ４１３５）、及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ０７８１）に再懸濁した。ＰＢＭＣを平底９６ウェルプレートでインキュベートし（各ウェルに２×１０５細胞）、２０μＬの細菌懸濁液（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬの濃度）を添加した。ＰＢＭＣをインキュベータ内で３７℃／５％  ＣＯ２にて細菌と４８時間共インキュベートした。２日のインキュベーション期間の後、３００×ｇでプレートを遠心分離し、上清を取り除き、−８０℃で冷凍保存してから分析した。Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ（カタログ番号Ｋ１５００８Ｂ−１））の９６ウェルアッセイキットを用いて、培養上清におけるインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）及びインターロイキン−１２ｐ７０（ＩＬ−１２ｐ７０）の濃度を定量化した。
【０１００】
２つの形式で共培養実験用に細菌を調製した。（ａ）Ｄｉｆｃｏ  ＭＲＳ培養基で新しい増殖細菌を増殖し、固定相に入った直後に採集した。全ての細胞は嫌気性条件で３７℃で増殖した。（ｂ）Ｄｉｆｃｏ  ＭＲＳ培養基にて３７℃で嫌気性条件下で細菌を増殖し、固定相に入った直後に採集した。これらの細菌のそれぞれの凍結乾燥粉末を生成し、予めアリコートした１００ｍｇバイアル瓶にて−８０℃で保存した。使用の直前にそれぞれの菌株のアリコートを冷凍庫から１つ取り出し、室温に戻した。各菌株を１０ｍＬのリンガーで３回洗浄し、遠心分離した。その都度、新しいバイアル瓶を使用した。各増殖条件に対して増殖曲線（ＯＤ対生存細胞数）を作成し、洗浄した細胞を細胞数で正規化してからＰＢＭＣに添加した。全ての実験に、無細菌の対照も含めた。全てのアッセイを３回行った。
【０１０１】
図２は、菌株１２１ＡがＩＬ−１０：ＩＬ−１２の誘導に与える影響を示す。新しく増殖した凍結乾燥培養物は両方とも同様の効果を呈した。
【０１０２】
実施例５−１２１ＡがＩＬ−１０の分泌に与える影響
宿主の総合的な健康の重要な決定因子における、微生物に対する適切な免疫応答。過剰な応答は炎症性疾患（例えば大腸炎）につながる可能性があり、一方、不十分な応答は病原体の持続及び播種につながる。本明細書に記載の免疫アッセイは、特定の微生物に対する応答としての宿主の免疫活性の決定のための有用な方法として本文献に十分に説明されている。
【０１０３】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ（単細胞、樹枝状細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞を含む））は健康ドナーから入手し、各菌株を用いてインビトロで刺激した。次いで、培養物上清を取り除き、サイトカイン濃度を定量化した。
【０１０４】
ＩＬ−１０は、異常な炎症性免疫応答を制御するための非常に重要なサイトカインである。ＩＬ−１０ノックアウトアニマルでは大腸炎及び胃腸管腫瘍が発生し、一方、免疫系の調節性細胞はＩＬ−１０を分泌及び活用して、損傷を与える可能性のある免疫応答を制御する。したがって、このサイトカインの分泌の増強は、不適切な炎症活性及び病原体に対する過度の免疫応答に対する保護となるであろう。
【０１０５】
インビトロ培養した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ１０分泌は、各菌株での共インキュベーションの４８時間後に判定した。それらの菌株はＡＨＦ１２１Ａ及び３５６２４で記録されたのと同様のＩＬ−１０レベルのＩＬ１０分泌を誘導した（図４〜６）。
【０１０６】
実施例６：Ｂｉｆ．ＡＨ１２１ａは、ヒト免疫系細胞とインビトロで共インキュベートされたとき、Ｂｉｆ．ＡＨ３５６２４と異なる免疫調節活性を有する。
【０１０７】
材料及び方法
ＰＢＭＣサイトカイン誘導アッセイにより、ビフィズス菌ロンガムインファンティス菌株ＵＣＣ３５６２４（Ｂ６２４）及びビフィズス菌ロンガム菌株１２１ａのアッセイを行った。細菌は、以下の形式で共培養実験用に調製した。Ｄｉｆｃｏ  ＭＲＳ培養基にて３７℃で嫌気性条件下で細菌を増殖し、固定相に入った直後に採集する。これらの細菌のそれぞれの凍結乾燥粉末を生成し、予めアリコートした１００ｍｇバイアル瓶にて−８０℃で保存する。使用の直前に各菌株のアリコートを冷凍庫から１つ取り出し、室温に戻す。各菌株を１０ｍＬのリンガーで３回洗浄し、遠心分離する。その都度、新しいバイアル瓶を使用する。
【０１０８】
Ｐｅｔｒｏｆｆ−Ｈａｕｓｓｅｒ計数チャンバを製造業者の指示に従って用いて直接顕微鏡計数を行い、洗浄した細胞を細胞数によって正規化してからＰＢＭＣアッセイに加えた。ＰＢＭＣの各ウェルに細菌（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に２０μＬ）を加えて、各実験に示されている細菌合計数にする。
【０１０９】
ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）サイトカイン誘導アッセイ
ＢＤバキュテイナーＣＰＴ管（ＢＤカタログ番号３６２７６１）を製造業者の指示に従って用い、健康なヒト末梢血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離する。ＰＢＭＣを洗浄し、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ−Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）（Ｇｌｕｔａｍａｘ（グルタミン代用品）＋ピルビン酸＋ブドウ糖４．５ｇ／Ｌ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１０５６９−０１０）、１０％のウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｆ４１３５）、及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ０７８１）に再懸濁する。ＰＢＭＣを平底９６ウェルプレートでインキュベートし（各ウェルに２×１０５細胞）、２０μＬの細菌懸濁液（１×１０６〜８ＣＦＵ／ｍＬの濃度範囲）を添加する。最高６つの異なる量の細菌（２．５Ｅ＋０８、１．０Ｅ＋０８、５．０Ｅ＋０７、２．５Ｅ＋０７、１．０Ｅ＋０７、及び１．０Ｅ＋０６）を検査する。無細菌の対照も検査する。全てのアッセイを３回行う。２日のインキュベーション期間の後、３００×ｇでプレートを回転させ、上清を取り除き、−８０℃で冷凍保存してから分析する。ＰＢＭＣをインキュベータ内で３７℃／５％  ＣＯ２にて細菌と４８時間共インキュベートする。Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、カタログ番号Ｋ１５００８Ｂ−１）の９６ウェルアッセイキットを用いて、培養上清のサイトカインのアッセイを行う。ヒトインターロイキン１β（Ｉｌ−１β）、ヒトインターロイキン６（Ｉｌ−β）、ヒトインターロイキン８（Ｉｌ−８）、ヒトインターロイキン１０（Ｉｌ−１０）、ヒトインターロイキン１２ｐ７０（Ｉｌ１２ｐ７０）、ヒトインターロイキンガンマ（ＩＦＮ−γ）、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、及びヒトＧ−ＣＳＦを定量化し、ミリリットル当たりのピコグラム（ｐｇ／ｍＬ）として報告する。各試料のアッセイを３回〜５回行う（Ａ  ｔｏ  Ｅ）。
【０１１０】
結果
ビフィズス菌ロンガムインファンティス菌株ＵＣＣ３５６２４（Ｂ６２４）及びビフィズス菌ロンガム菌株１２１ａは、免疫調節のためにＰＢＭＣサイトカイン誘導アッセイを用いてアッセイされて、検査された最高６つの異なる量の細菌（２．５Ｅ＋０８、１．０Ｅ＋０８、５．０Ｅ＋０７、２．５Ｅ＋０、１．０Ｅ＋０７、１．０Ｅ＋０６）での拡張用量応答曲線を生成する。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、及びＧ−ＣＳＦを含むサイトカインの範囲に関して、上清をアッセイする。最高５人のドナー（Ａ〜Ｅ）からのサイトカインの測定値を平均（＋／−ＳＥＭ）として表す。
【０１１１】
３５６２４と比較し、菌株１２１ａはＩＬ−１０を含むほとんどのサイトカインの誘導に対して非常に類似したパターンを呈したが、ＩＬ−６及びＩＬ−８の生成は増加し、かなり異なるパターンを呈した。
【０１１２】
ＩＬ−１０：１２１ａでのインキュベーションは、インビトロ刺激後のＰＢＭＣにおける抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の用量応答性の増加を誘導する（図７）。ＩＬ−１０の誘導は、定性的にも定量的にも３５６２４でのインキュベーションと類似している。ＩＬ−１０の最大誘導は、ウェル当たり最高１．０×１０９の細菌には満たないようである。
【０１１３】
ＩＬ−１β：１２１ａでのインキュベーションは、インビトロ刺激後のＰＢＭＣにおける炎症性サイトカインＩＬ−１βの用量応答性の増加を誘導する（図８）。ＩＬ−１βの誘導は、定性的にも定量的にも３５６２４でのインキュベーションと類似している。ＩＬ−１βの最大誘導は、ウェル当たり最高１．０×１０９の細菌には満たないようである。
【０１１４】
ＩＬ−６：１２１ａでのインキュベーションは、インビトロ刺激後のＰＢＭＣにおけるサイトカインＩＬ−６の用量応答性の増加を誘導する（図９）。定量的には、３５６２４と比較して１２１ａではパターンが異なり、１２１ａではより高レベルのＩＬ−６が測定され、ウェル当たりの細菌用量が低いほどそうであった。
【０１１５】
ＩＬ−８：１２１ａでのインキュベーションは、インビトロ刺激後のＰＢＭＣにおけるサイトカインＩＬ−８の用量応答性の増加を誘導する（図１０）。定量的には、３５６２４と比較して１２１ａではパターンが異なり、ウェル当たりの全ての細菌用量で１２１ａではより高レベルのＩＬ−８が測定された。
【０１１６】
ＩＬ−１２：１２１ａでのインキュベーションは、インビトロ刺激後のＰＢＭＣにおける炎症性サイトカインＩＬ−１２の用量応答性の増加を誘導する（図１１）。１２１ａ及び３５６２４でのＩＬ−１２の調節のパターンは釣鐘型であり、ピークレベルに上昇してから、細菌濃度が高くなるにつれて下降する。定量的には、そのパターンはＩＬ−１２ではやや可変であるが、どちらかといえば、３５６２４と比較して１２１ａでも類似している。
【０１１７】
ＴＮＦ−α：１２１ａでのインキュベーションは、インビトロ刺激後のＰＢＭＣにおける炎症性サイトカインＴＮＦ−αの用量応答性の増加を誘導する（図１２）。ＴＮＦ−αの誘導は、５回のうち３回は定性的に定量的にも３５６２４でのインキュベーションと類似であり、２回はより高いレベルのＴＮＦ−αが見られた（Ｃ  ＆  Ｅを参照）。ＩＬ−１０の最大誘導は、ウェル当たり最高１．０×１０８の細菌になるようである。
【０１１８】
ＩＮＦ−γ：１２１ａでのインキュベーションは、インビトロ刺激後のＰＢＭＣにおける炎症性サイトカインＩＮＦ−γの用量応答性の増加を誘導する（図１３）。定量的には、そのパターンはＩＮＦ−γではやや可変であるが、どちらかといえば、３５６２４と比較して１２１ａと類似している。
【０１１９】
Ｇ−ＣＳＦ：１２１ａでのインキュベーションは、インビトロ刺激後のＰＢＭＣにおけるサイトカインＧ−ＣＳＦの用量応答性の増加を誘導する（図１４）。Ｇ−ＣＳＦの誘導は、定性的にも定量的にも３５６２４でのインキュベーションと類似している。
【０１２０】
実施例７−１２１Ａが樹枝状細胞によるサイトカイン生成に与える影響
概要
免疫応答は非常によく調節されたプロセスであり、通常、感染からの保護及び無害な環境抗原の寛容をもたらす。しかし、炎症性疾患では、活性化された免疫応答は、元来の免疫応答の活性化及び有極Ｔ細胞サブセットの拡張を特徴とする慢性的炎症性状態をもたらす。炎症性疾患の現在の治療は、主要な炎症メディエータ又は炎症細胞集団の抑制に焦点を当てている。しかし、これらのアプローチは疾患症状の一時的な抑制しか与えない。長期的治療又は予防の成功は、害を与える炎症性応答から守る細胞調節プロセスの強化によってのみ可能である。ビフィズス菌ＡＨＦ１２１Ａは、元来の免疫系（すなわち樹枝状細胞）からのＩＬ−１０の分泌を選択的に刺激するプロバイオティク微生物であり、インビトロでＦｏｘｐ−３陽性調節性Ｔ細胞の極性化を誘導する。生体内では、ＩＬ−１０分泌及び調節性Ｔ細胞は異常な炎症性応答の強力な抑制剤である。
【０１２１】
Ｔｒｅｇ細胞
免疫寛容の維持における調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の基本的役割は広範な動物モデルで実証されており、アレルゲン、自己抗原、又は同種抗原に対する免疫寛容を回復することによって、アレルギー、喘息性肺炎、自己免疫疾患、及び同種移植片拒絶を含む、Ｔ細胞メディエーションによるいくつかの疾患を予防又は治癒するＴｒｅｇ細胞の養子免疫伝達又は意図的な拡張が示された［８］。Ｔｒｅｇメディエーションによる免疫抑制のための複数の分子機構では、ＩＬ−１０の分泌が特に重要であると説明されてきた［９］。Ｔｒｅｇ細胞の欠如又は機能不良は、ヒトにおけるＩｇＥ過多症候群、過好酸球増加症、及び自己免疫とも相関されており、一方、それらの存在は免疫寛容と関連づけられている［１０］。非病原性の環境抗原に対する免疫応答がアレルギー又は非有害性免疫のいずれかにつながる機構に関する研究は、アレルゲン特有のＩＬ−１０生成Ｔｒｅｇｓ（ＴＲ１細胞）が健康な個体における支配的なＴ細胞サブセットであることを実証している［１１，１２］。アレルギー性でない健康な養蜂家を養蜂シーズン中に蜂毒抗原に繰り返し曝露させることは、毒抗原に対する免疫寛容の機構を確認するために有用な代表的なインビボモデルである［１３］。蜂に複数回刺された後、毒抗原特有のＴＨ１及びＴＨ２細胞はＩＬ−１０−分泌性ＴＲ１細胞に切り替わる。これと並行して、アレルゲンに対する皮膚の後期応答の抑制並びにアレルゲン特有のＴＨ１及びＴＨ２細胞の阻害が生じる。この応答は、毒への曝露が続く限り観察され、養蜂シーズンの終わりから２〜３ヶ月内に初期レベルに戻る。
【０１２２】
生体内のＴｒｅｇ機能を強化するように設計された様々な戦略が現在研究されている。これらには、誘導性又は構造性のＴｒｅｇ細胞の養子免疫伝達、及び特定のアジュバント又は免疫調節剤によるそれらの誘導が含まれる。Ｔｒｅｇ細胞の抗原特有の抑制能力は全身性免疫抑制をもたらさず、生体内で長期持続する抗原特有の調節を実際にもたらす可能性があるので、従来の治療に比べ、これらのアプローチは魅力的である。更に、制限された副作用で個々の患者特有の治療が可能である。開発済み又は開発中の多くの免疫調節剤（例えばラパマイシン、ＣＤ８０／ＣＤ８６：ＣＤ２８共刺激遮断剤アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ））、非細胞分裂性抗ＣＤ３モノクローナル抗体、Ｔ細胞欠乏及び抗腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）ｍＡｂｓ）は、Ｔｒｅｇ細胞に対して、機能を強化又は抑制し得る直接又は間接の影響を示す［１４〜１８］。マウスモデルにおける炎症器官において発現したアレルゲン又は自己抗原の認識によってその器官（又はその器官の流入領域リンパ節）を標的とすることができるＴｒｅｇ細胞集団を拡張することには、選択的利点がある［１９］。したがって、器官特有のＴｒｅｇ細胞の伝達は、進行中疾患の抑制に有効である可能性があるが、それらのＴｒｅｇ細胞は必ずしも全く同一の自己抗原を自己攻撃性エフェクターＴ細胞として認識する必要はない［２０］。これは、アレルゲン、自己抗原、又は移植物抗原に対する免疫寛容のＴｒｅｇ細胞アームを標的とすることを目的とする治療戦略としての意味を有する。Ｔｒｅｇ細胞又はＴｒｅｇ細胞を組織内に誘導する小分子化合物の養子免疫伝達の可能性は研究されているが［１９］、これまでのところ、二重盲検プラセボ対照治験は報告されていない。これまでのところ、ヒトにおけるＴｒｅｇ細胞生成及び活性化を誘導する抗原特有のアプローチはアレルゲン−ＳＩＴだけである。アレルゲン−ＳＩＴはＴｒｅｇ細胞及びＩＬ−１０分泌性ＴＲ１様細胞を誘導し、グルココルチコイド及びβ２アドレナリンアゴニストでの治療はこれらの細胞の数及び活性を促進するようである［２１〜２３］。Ｆｏｘｐ３プロモータの発現を調節する必須転写要素が最近報告されており、これらは、新規治療の開発のための新しい標的を提供するであろう［２４、２５］。
【０１２３】
新規治療選択肢としての微生物
異常な炎症活性の治療のための、微生物及び微生物代謝物の意図的な投与への関心が高まっている。現在検討されている典型的な微生物としては、ビフィズス菌、乳酸菌、非病原性大腸菌、及びバクテロイデス菌株が挙げられる［２６〜３１］。これらの微生物に伴う保護効果は、おそらく、上皮細胞、樹枝状細胞、及びＴ細胞が関わる複数の機構を媒介としてもたらされるものである。しかし、これらの微生物に共通の特徴であるＴｒｅｇ細胞誘導能力がますます報告されている。例えば、ネズミ科動物の胃腸内の片利共生微生物の混合物（ＶＳＬ＃３プロバイオティクカクテル）との遭遇は、ネズミ科動物モデルの大腸炎における炎症の減衰と関連づけられる粘膜Ｔｒｅｇ細胞の発育を推進することが示されている［３２］。加えて、ビフィズス菌インファンティス菌株の摂取は、Ｔｒｅｇ細胞の転換を促進し、生体内におけるＬＰＳ誘導型ＮＦ−κＢ活性から保護し、一方、ラクトバシラスロイテリは、マウスにおけるアレルギー性気道応答から保護するＴｒｅｇ細胞を誘導する［３３、３４］。Ｔｒｅｇ細胞は胸腺由来であるが、周辺器官（胃腸粘膜を含む）においても誘導され得る［３５、３６］。ＴＧＦ−β及びレチノイン酸依存性プロセスを介するＴｒｅｇ細胞の転換は、主にこの粘膜内のＣＤ１０３＋樹枝状細胞による［３７、３８］。この転換は、多数の片利共生微生物の存在と関連づけられる胃腸管特有の環境因子によって推進される可能性が高い。しかし、生体内のＴｒｅｇ細胞の誘導において全ての片利共生微生物が同等に効果的である可能性は低い。最近の研究は、複数の片利共生微生物（ビフィズス菌ロンガムＡＨ１２０６、ビフィズス菌ブレーＡＨ１２０５、及びラクトバチラスサリバリウスＡＨ１０２）を比較すると、ネズミ科動物モデルにおいてビフィズス菌ロンガムＡＨ１２０６がＴｒｅｇ細胞を誘導したこと、及び肺への好酸球補充から保護し、血清ＩｇＥの誘導を遮断することが可能であったことを示した［３９］。その他の菌株はＴｒｅｇ細胞を効果的に誘導せず、同じモデルにおいてアレルギー性炎症から保護することができなかった。したがって、Ｔｒｅｇ細胞の誘導は、潜在アレルゲンに対する異常な免疫応答性の発症に対する保護という、健康な微生物相の重要な特性であり得る。アレルギーの治療のための生きた微生物の使用に加えて、期待される別の方法は、その有益な効果に関与する微生物因子を特定し、それらの単離された因子を単独で使用することである。例えば、バクテロイデスフラジリス由来の多糖類Ａは、粘膜樹枝状細胞による提示の後に無菌マウスにおける適切なＴＨ１／ＴＨ２バランスを促進し、ＩＬ−１０分泌性ＣＤ４＋  Ｔ細胞を介して動物モデルにおいて大腸炎から保護する［２９，４０］。寛容原生樹枝状細胞及びＴｒｅｇ活性を誘導する新しい微生物化合物の継続的な同定は、臨床試験における評価のための新規な治療用分子を疑いなくもたらすであろう。
【０１２４】
樹枝状細胞の差別化及び熟成
Ｆｉｃｏｌｌ密度遠心分離及び細胞分離の組み合わせを用い、ＣＤ１４−特有抗体でコーティングした磁性マイクロビード（ＭｉｌｔｅｎｔｙｉＢｉｏｔｅｃ）を使用して、ヒト単球を血液から単離した。単離されたＣＤ１４＋細胞分画の純度は、全ての実験で９０％を超えていた。未熟のＤＣ（ｉＤＣ）を生成するために、精製したＣＤ１４＋細胞を５日間、ＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＧＭ−ＣＦＳ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下で培養して、骨髄樹枝状細胞に差別化した。６日目に、細胞を刺激しないまま残す（ｉＤＣ）か、ＬＰＳ（１ｍｇ／ｍＬ）５×１０５で細胞を刺激した。ＭＤＤＣは細菌細胞で２４時間刺激した。ビフィズス菌ロンガムＡＨＦ１２１Ａ菌株（１０：１の細菌対ＤＣ比（５×１０６）、１：１の細菌対ＤＣ比（５×１０５）で２４時間。予測したとおり、抗生物質の適用の結果として、この期間中に細菌増殖は観察されなかった。この時点で上清を単離し、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスプラットホームを用いてＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０のレベルを分析した。
【０１２５】
ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞の単離及びＤＣとの共培養
Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐグラジエントでバフィーコートの遠心分離によりＰＢＭＣを単離した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞は陰性選択アフィニティカラム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の指示どおりに用いて分離した。分離後、Ｔ細胞を洗浄し、加熱不活性化したウシ胎児血清１０％、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び２ｍｍｏｌ／ＬのＬグルタミンを補ったＲＰＭＩ１６４０培養基に再懸濁した。精製したＣＤ４＋  Ｔ細胞（１×１０６／ｍＬ）を、固定化した抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）と可溶性抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍＬ）ｍＡｂｓ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）との組み合わせで刺激した。次いで、精製したＣＤ４＋  Ｔ細胞をＤＣでインキュベートした。４８時間後、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は透過性になり、ＣＤ２５及びＦｏｘｐ−３に対して染色された。フローサイトメトリを使用して細胞を評価した。
【０１２６】
結果は、ＡＨＦ１２１Ａで刺激した樹枝状細胞が、ＣＤ２５及びＦｏｘｐ−３を発現する調節性Ｔ細胞サブセットの極性化及び／又は拡張を推進することを示している。
【０１２７】
プロバイオティクは、ＤＣによるサイトカイン生成を誘導するのに異なる能力を有する。
【０１２８】
放出されるサイトカインのタイプは、Ｔ細胞の極性化に影響する可能性がある。したがって、我々は上述のように細菌で２４時間処置した後のＭｏＤＣによるＩＬ−１２ｐ７０及びＩＬ−１０の生成を分析した。ＬＰＳは試験した全てのサイトカインの強力な誘導剤であり、ＡＨＦ１２１Ａは異なるサイトカイン放出を引き出した（図１５）。ＡＨＦ１２１ＡはＬＰＳと比べて低いレベルのＩＬ−１０を誘導したが、検出可能なレベルのＩＬ−１２ｐ７０は誘導しなかった。このように、ＡＨＦ１２１Ａは、より低い炎症可能性を示していた。
【０１２９】
サイトカインの生成における差は、異なるＴ細胞極性化能力を反映している。
【０１３０】
ＤＣによるサイトカインの放出は、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、又は調節性Ｔ細胞に向けたＴ調節性細胞の極性化を推進することが重要である。サイトカインの生成において観察された差を鑑み、我々は、ＡＨＦ１２１Ａにより生成されたＭＤＤＣがＦｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇを誘導する可能性を有するかどうかを更に試験した。ＤＣは、５日間ＡＨＦ１２１Ａでインキュベートし、次いで、高度に精製された同種異系未感作細胞で共培養した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞次いで、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇ集団をＦＡＣＳにより分析した。結果は、ＡＨＦ１２１Ａで刺激した樹枝状細胞が、ＣＤ２５及びＦｏｘｐ−３を発現する調節性Ｔ細胞サブセットの極性化及び／又は拡張を推進することを示している。（図１６）
【０１３１】
我々は、それを受けて、ＡＨＦ１２１Ａが生成した寛容原性ＤＣがＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇの生成を誘導したと想定する。事実、我々は、ＡＨＦ１２１Ａで培養されたＭＤＤＣがＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞をＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｆｏｘｐ３＋  Ｔ細胞に転換し得ることを実証した。要約すると、ＡＨＦ１２１Ａは、インビトロにおけるＭＤＤＣによるＴｒｅｇの生成を上方調節又は増強することによって、強力な免疫調節効果を及ぼした。結果は、インビトロにおけるＡＨＦ１２１Ａへの応答としてのＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇの生成の証拠、すなわち生体内での炎症性免疫疾患の調節のための治療的に有用であり得る効果を提示している。（図１６）
【０１３２】
これまでに、いくつかのプロバイオティク（すなわちＬ．ｃａｓｅｉ及びｒｅｕｔｅｒｉ）が調節性Ｔ細胞の発育を誘導できることが示されている（３２、４１、４２）。３つの異なる動物モデルにおいてビフィズス菌ＡＨ１２０６が調節性Ｔ細胞の強力な活性化を媒介することが示された。加えて、ビフィズス菌ＡＨ１２０６の摂取は、肺への好酸球補充から保護し、血清ＩｇＥの誘導を遮断した。ここで、調節性Ｔ細胞はアレルゲン特有の炎症性応答の調節において重要な役割を果たしていると仮定される（３９）。動物モデルにおける複数の研究は、ＣＤ４  ＣＤ２５  Ｆｏｘｐ３細胞が肺及び流入領域リンパ節の両方に補充され、アレルゲン誘導性気道好酸球、粘液分泌過多及び気道反応過多を抑制し得ることを示している（４３〜４８）。
【０１３３】
多くのヒト及び動物での研究は、現在、共生細菌に対する寛容の損失によってＩＢＤがもたらされることを示している。Ｒｏｕｎｄ及びＭａｚｍａｎｉａｎの研究（４９）は、実験的大腸炎での保護及び治療中にＰＳＡがＴｒｅｇの発育を指示することを示している。これらの結果は、Ｆｏｘｐ３＋  Ｔ細胞によって誘導可能なＩＬ−１０生成が、粘膜表面で寛容を媒介し、腸炎を予防するために重要であることを示す研究と一致している（４９、５０）。
【０１３４】
実施例８−組成物の例
以下は、本発明のプロバイオティクビフィズス菌を含む乾燥キブル組成物の例である。
【表２】
0005600179.tif 000003
【０１３５】
以下は、本発明のプロバイオティクビフィズス菌ロンガムを含む湿潤コンパニオンアニマルフード組成物の例である。
【表３】
0005600179.tif 000004
【０１３６】
以下は、本発明のプロバイオティクビフィズス菌ロンガムを含むヨーグルトサプリメント組成物の例である。
【表４】
0005600179.tif 000005
【０１３７】
本発明の特定の実施形態が例示され、記載されてきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、他の様々な変更及び修正を実施できることが、当業者には明白であろう。したがって、本発明の範囲内にあるそのような全ての変更及び修正を、添付の「特許請求の範囲」で扱うものとする。
【０１３８】
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３１．Ｇｒａｂｉｇ  Ａ，Ｐａｃｌｉｋ  Ｄ，Ｇｕｚｙ  Ｃ，Ｄａｎｋｏｆ  Ａ，Ｂａｕｍｇａｒｔ  ＤＣ，Ｅｒｃｋｅｎｂｒｅｃｈｔ  Ｊ，Ｒａｕｐａｃｈ  Ｂ，Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ  Ｕ，Ｅｃｋｅｒｔ  Ｊ，Ｓｃｈｕｍａｎｎ  ＲＲ，Ｗｉｅｄｅｎｍａｎｎ  Ｂ，Ｄｉｇｎａｓｓ  ＡＵ，Ｓｔｕｒｍ  Ａ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｖｉａ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２−ａｎｄ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２００６；７４：４０７５〜８２。
３２．Ｄｉ  Ｇｉａｃｉｎｔｏ  Ｃ，Ｍａｒｉｎａｒｏ  Ｍ，Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｍ，Ｓｔｒｏｂｅｒ  Ｗ，Ｂｏｉｒｉｖａｎｔ  Ｍ．Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ  Ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｈ１−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｃｏｌｉｔｉｓ  ｂｙ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ＩＬ−１０  ａｎｄ  ＩＬ−１０−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＴＧＦ−β．Ｂｅａｒｉｎｇ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５；１７４：３２３７〜４６。
３３．Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ  Ｃ，Ｓｃｕｌｌｙ  Ｐ，Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ  Ｄ，Ｍｕｒｐｈｙ  Ｓ，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  Ｆ，Ｌｙｏｎｓ  Ａ，Ｓｈｅｒｌｏｃｋ  Ｇ，ＭａｃＳｈａｒｒｙ  Ｊ，Ｋｉｅｌｙ  Ｂ，Ｓｈａｎａｈａｎ  Ｆ，Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ  Ｌ．Ｃｏｍｍｅｎｓａｌ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ＮＦ−ｋＢ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ２００８；４：ｅ１０００１１２。
３４．Ｋａｒｉｍｉ  Ｋ，Ｉｎｍａｎ  ＭＤ，Ｂｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋ  Ｊ，Ｆｏｒｓｙｔｈｅ  Ｐ．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｎ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ａｉｒｗａｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２００９；１７９：１８６〜９３。
３５．Ｋａｒｉｍ  Ｍ，Ｋｉｎｇｓｌｅｙ  ＣＩ，Ｂｕｓｈｅｌｌ  ＡＲ，Ｓａｗｉｔｚｋｉ  ＢＳ，Ｗｏｏｄ  ＫＪ．Ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＣＤ２５＋ＣＤ４＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｒｏｍ  ＣＤ２５−ＣＤ４＋  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｉｎ  ａ  ｔｈｙｍｕｓ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４；１７２：９２３〜８。
３６．Ｃｈｅｎ  Ｗ，Ｊｉｎ  Ｗ，Ｈａｒｄｅｇｅｎ  Ｎ，Ｌｅｉ  ＫＪ，Ｌｉ  Ｌ，Ｍａｒｉｎｏｓ  Ｎ，ＭｃＧｒａｄｙ  Ｇ，Ｗａｈｌ  ＳＭ．Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ＣＤ４＋ＣＤ２５−  ｎａｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＴＧＦ−β  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｆｏｘｐ３．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００３；１９８：１８７５〜８６。
３７．Ｃｏｏｍｂｅｓ  ＪＬ，Ｓｉｄｄｉｑｕｉ  ＫＲ，Ａｒａｎｃｉｂｉａ−Ｃａｒｃａｍｏ  ＣＶ，Ｈａｌｌ  Ｊ，Ｓｕｎ  ＣＭ，Ｂｅｌｋａｉｄ  Ｙ，Ｐｏｗｒｉｅ  Ｆ．Ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｃｏｓａｌ  ＣＤ１０３＋  ＤＣｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｆｏｘｐ３＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ａ  ＴＧＦ−β  ａｎｄ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００７；２０４：１７５７〜６４。
３８．Ｓｕｎ  ＣＭ，Ｈａｌｌ  ＪＡ，Ｂｌａｎｋ  ＲＢ，Ｂｏｕｌａｄｏｕｘ  Ｎ，Ｏｕｋｋａ  Ｍ，Ｍｏｒａ  ＪＲ，Ｂｅｌｋａｉｄ  Ｙ．Ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｌａｍｉｎａ  ｐｒｏｐｒｉａ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｘｐ３  Ｔ  ｒｅｇ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００７；２０４：１７７５〜８５。
３９．Ｌｙｏｎｓ  Ａ，Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ  Ｄ，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  Ｆ，ＭａｃＳｈａｒｒｙ  Ｊ，Ｓｈｅｉｌ  Ｂ，Ｃｅｄｄｉａ  Ｍ，Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＷＭ，Ｆｏｒｓｙｔｈｅ  Ｐ，Ｂｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋ  Ｊ，Ｋｉｅｌｙ  Ｂ，Ｓｈａｎａｈａｎ  Ｆ，Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ  Ｌ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｔｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｘｐ３＋  Ｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ａｌｌｅｒｇｙ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ２００９；ｉｎ  ｐｒｅｓｓ。
４０．Ｍａｚｍａｎｉａｎ  ＳＫ，Ｌｉｕ  ＣＨ，Ｔｚｉａｎａｂｏｓ  ＡＯ，Ｋａｓｐｅｒ  ＤＬ．Ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｏｆ  ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ  ２００５；１２２：１０７〜１８。
４１．Ｆｏｌｉｇｎｅ  Ｂ，Ｚｏｕｍｐｏｐｏｕｌｏｕ  Ｇ，Ｄｅｗｕｌｆ  Ｊ，Ｂｅｎ  Ｙｏｕｎｅｓ  Ａ，Ｃｈａｒｅｙｒｅ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａ  ｋｅｙ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２：ｅ３１３。
４２．Ｓｍｉｔｓ  ＨＨ，Ｅｎｇｅｒｉｎｇ  Ａ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｌｅｉｊ  Ｄ，ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ＥＣ，Ｓｃｈｉｐｐｅｒ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎｄｕｃｅ  ＩＬ−１０−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ３−ｇｒａｂｂｉｎｇ  ｎｏｎｉｎｔｅｇｒｉｎ．ＪＡｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１５：１２６０〜１２６７。
４３．Ｚｕａｎｙ−Ａｍｏｒｉｍ  Ｃ，Ｓａｗｉｃｋａ  Ｅ，Ｍａｎｌｉｕｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｉｒｗａｙ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ  ｂｙ  ｋｉｌｌｅｄ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００２；８：６２５〜９。
４４．Ｌｅｅｃｈ  ＭＤ，Ｂｅｎｓｏｎ  ＲＡ，Ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ  Ａ，Ｆｉｔｃｈ  ＰＭ，Ｈｏｗｉｅ  ＳＥ．Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｒ  ｐ１−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ａｉｒｗａｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｆｏｘｐ３＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７；１７９：７０５０〜８。
４５．ＭｃＧｌａｄｅ  ＪＰ，Ｇｏｒｍａｎ  Ｓ，Ｚｏｓｋｙ  ＧＲ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｓｔｈｍａｔｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｂｙ  ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ｂ−ｉｎｄｕｃｅｄ，ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ２００７；３７：１２６７〜７６。
４６．Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ  ＤＨ，Ｓｔｕｍｂｌｅｓ  ＰＡ，Ｚｏｓｋｙ  ＧＲ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ａｉｒｗａｙ  ｈｙｐｅｒｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｉｒｗａｙ  ｍｕｃｏｓａｌ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００６；２０３：２６４９〜６０。
４７．Ｗｕ  Ｋ，Ｂｉ  Ｙ，Ｓｕｎ  Ｋ，Ｘｉａ  Ｊ，Ｗａｎｇ  Ｙ，Ｗａｎｇ  Ｃ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｌｌｅｒｇｅｎ−ＤＮＡ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｘｐ３＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００８；６７：１４０〜５１。
４８．Ｂｏｕｄｏｕｓｑｕｉｅ  Ｃ，Ｐｅｌｌａｔｏｎ  Ｃ，Ｂａｒｂｉｅｒ  Ｎ，Ｓｐｅｒｔｉｎｉ  Ｆ．ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｓｔｈｍａ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ２００９；３９：１４１５〜２６。
４９．Ｒｏｕｎｄ  ＪＬ，Ｍａｚｍａｎｉａｎ  ＳＫ．Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｆｏｘｐ３＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｂｙ  ａ  ｃｏｍｍｅｎｓａｌ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１０  Ｊｕｌ  ６；１０７（２７）：１２２０４〜９。
５０．Ｒｕｂｔｓｏｖ  ＹＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０  ｌｉｍｉｔｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｔ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００８；２８：５４６〜５５８。
【図１】
0005600179.tif 000006
【図２】
0005600179.tif 000007
【図３】
0005600179.tif 000008
【図４】
0005600179.tif 000009
【図５】
0005600179.tif 000010
【図６】
0005600179.tif 000011
【図７】
0005600179.tif 000012
【図８】
0005600179.tif 000013
【図９】
0005600179.tif 000014
【図１０】
0005600179.tif 000015
【図１１】
0005600179.tif 000016
【図１２】
0005600179.tif 000017
【図１３】
0005600179.tif 000018
【図１４】
0005600179.tif 000019
【図１５】
0005600179.tif 000020
【図１６】
0005600179.tif 000021
【配列表】
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