(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2をコードする核酸分子を標的とする13〜40核酸塩基長の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなる、ヒトにおける肝臓脂肪症またはコレステロール血症を治療するための医薬組成物であって、該オリゴヌクレオチドは、配列番号：18と100％相補的であり、ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2の発現を少なくとも40％阻害する、医薬組成物。
【請求項２】
該オリゴヌクレオチドが、配列番号：18のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2をコードする核酸分子のイントロンに対して100％相補的である、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項３】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドが15〜30核酸塩基長である、請求項1または2記載の医薬組成物。
【請求項４】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドである、請求項1または2記載の医薬組成物。
【請求項５】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの、修飾されたヌクレオシド間結合、糖部分または核酸塩基を含む、請求項1〜4いずれか記載の医薬組成物。
【請求項６】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの2'-O-メトキシエチル糖部分を含む、請求項5記載の医薬組成物。
【請求項７】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項5記載の医薬組成物。
【請求項８】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの5-メチルシトシンを含む、請求項5記載の医薬組成物。
【請求項９】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、10個の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央ギャップ領域、およびその両側に隣接する2'-O-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドから構成される5個のヌクレオチドのウイングから構成される20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチドであり、ヌクレオシド間結合はオリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエートであり、全てのシチジン残基が5-メチルシチジンである、請求項1〜4いずれか記載の医薬組成物。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の発現を調節するための組成物および方法を提供する。詳細には、本発明は、アンチセンス化合物、特に、好ましい態様において、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2をコードする核酸分子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド化合物に関する。本明細書中では、このような化合物が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２発現を調節することを示す。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
トリグリセリドは、真核生物における主要なエネルギー貯蔵分子の1つである。トリグリセリド（トリアシルグリセロールとも呼ばれる）の食物からの吸収は、食物のトリアシルグリセロールが消化管中で加水分解され、次いで腸細胞中で再合成される一連の工程により起こる非常に効率的なプロセスである。トリアシルグリセロールの再合成は、モノアシルグリセロールおよび脂質アシル-CoAからのジアシルグリセロールの合成を触媒するモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（MGAT）により開始するモノアシルグリセロール経路を介して起こり得る。ジアシルグリセロールの別の合成は、2分子の脂質アシル-CoAのグリセロール-3-リン酸へのカップリングを明らかにするグリセロール-リン酸経路により提供される。いずれの場合も、ジアシルグリセロールは、次いで、2つのジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ酵素のうちの1つによって触媒される反応において、脂質アシル-CoAの別の分子でアシル化されてトリグリセリドを形成する（非特許文献１）。
【０００３】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼによって触媒される反応は、トリグリセリド合成における最終的かつ唯一の確証された工程である。このように、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼは、消化管の脂質吸収、リポタンパク質の集合、血漿トリグリセリド濃度の調節および脂肪細胞における脂質貯蔵に関与する。最初のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼであるジアシルグリセロールトランスフェラーゼ１は、1960年に同定され、このタンパク質をコードするヒト遺伝子およびマウス遺伝子は、1998年に単離された（非特許文献２;非特許文献３）。ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１が欠損したマウスは生存可能であり、かつ他の生物学的経路によってなおトリグリセリドの合成が可能であるが、このことは、トリグリセリド合成のための複数のメカニズムが存在することを示唆する（非特許文献４）。
【０００４】
第二のジアシルグリセロールトランスフェラーゼであるジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２（DGAT2、ジアシルグリセロール0-トランスフェラーゼ２、アシル-CoA：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２としても知られている）が、Mortierella菌、ヒトおよびマウスにおいて次々に同定された（非特許文献５;非特許文献６）。酵素アッセイは、この最近同定されたタンパク質が、まさに、広範囲の長鎖脂質アシル-CoA基質を利用するジアシルグリセロールトランスフェラーゼ活性を有することを示す（非特許文献５）。
【０００５】
ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２は、その配列がジアシルグリセロールトランスフェラーゼ１とは無関係である遺伝子のファミリーのメンバーである。ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ１と比べて配列が異なることに加えて、インビトロアッセイにより、ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２が、より低濃度の塩化マグネシウムおよびオレオイル-CoAでより高い活性を有することが示される（非特許文献５）。ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２の予測されるタンパク質配列は、少なくとも1つの推定上の膜貫通ドメイン、3つの潜在的N-結合グリコシル化部位、6つの潜在的タンパク質キナーゼCリン酸化コンセンサス部位に加えて、アシルトランスフェラーゼ酵素上で見出される推定上のグリセロールリン酸化部位と共通の配列を含む（非特許文献５）。International Radiation Hybrid Mapping Consortiumは、ヒトジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２を染色体11q13.3にマッピングした。
【０００６】
ヒト組織において、最も高レベルのジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２は、肝臓および白色脂肪組織で検出され、乳腺、精巣および末梢血白血球ではより低レベルで検出される（非特許文献５）。2.4および1.8キロベースの2つのmRNA種は、ヒト組織で検出され、一方、マウス組織における主要なジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２mRNA種は、2.4キロベースである。ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２は、肝臓および白色脂肪組織に加えて、マウス小腸の全てのセグメントで発現するが、近位消化管ではより高く発現し、遠位消化管ではより低く発現する（非特許文献５）。
【０００７】
ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ活性は、ラット肝臓の出生後の生育中に明確なパターンを示す。mRNA発現と活性パターンとの間には相関性はないので、翻訳後修飾は、ラットの生育の間におけるジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２活性の調節に関与し得る（非特許文献７）。
【０００８】
培養マウス脂肪細胞の膜画分由来のジアシルグリセロール活性を測定するインビトロアッセイにより示されるように、ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２mRNAは、インスリン処理により優先的にアップレギュレートされる（非特許文献８）。絶食マウスにおいて、ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２発現は大幅に減少し、再度給餌すると顕著に増加する。脂肪酸合成、アセチル-CoAカルボキシラーゼおよび脂肪酸合成酵素に関与する2つの酵素の発現パターンは、同様の様式で、絶食および再給餌に応答する。これらの結果は、ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２が肝臓で豊富に発現されるという観察と組み合わせると、ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２が内因性脂肪酸合成経路に深く結びついていることを示唆する（非特許文献８）。
【０００９】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１遺伝子中に破壊を有するマウスの研究は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２がトリグリセリド合成に寄与することの証拠を提供する。ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２mRNAの発現レベルは、野生型マウスおよびジアシルグリセロールトランスフェラーゼ１欠損マウスの両方からの消化管セグメントにおいて同様である（非特許文献９）。Buhmanらは、ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ１および２の活性を識別するために塩化マグネシウムを用いて、ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ１欠損マウスにおいては、ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ活性が近位消化管で50％に、遠位消化管で10〜15％に減少していることを観察した（非特許文献９）。
【００１０】
さらに、ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２mRNAレベルは、数週間の高脂質の食餌後であっても、ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ１欠損マウスの肝臓または脂肪組織でアップレギュレートされない（非特許文献５;非特許文献１０）。しかしながら、肥満をもたらすレプチン遺伝子に変異を有するob／obマウスでは、ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２が野生型マウスに比べて高度に発現するが、このことは、ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２が、これらのマウスにおいて観察される高度に蓄積された脂質塊の一因となっていることを示す。さらに、レプチンおよびジアシルグリセロールトランスフェラーゼ１における組み合わさった変異により、ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ１欠損マウス由来の白色脂肪組織におけるジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２発現のレベルと比べて、白色脂肪組織におけるジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２発現のレベルが3倍に上昇する（非特許文献１０）。ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２mRNAはまた、これらのマウスの皮膚内でアップレギュレートされる（非特許文献１１）。これらのデータは、レプチンが、通常はジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２発現をダウンレギュレートし、また、これらのマウスの白色脂肪組織におけるジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２のアップレギュレーションによって、レプチン欠損／ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ１欠損マウスにおいてもなお起こるトリグリセリド合成のための代替の経路が提供され得ることを示唆する（非特許文献１０）。
【００１１】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１ノックアウトマウスは、痩せており、食餌誘発性肥満に耐性を有し、組織のトリグリセリドレベルが減少しており、かつ、インスリンおよびレプチンへの感度が増加しているという興味深い表現型を示す（非特許文献１０;非特許文献４）。ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２はまた、トリグリセリド合成にも関与するので、ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２での阻害は同様に体脂肪含有率の減少をもたらし得る。
【００１２】
特許文献１および特許文献２は、ヒトジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２αをコードする核酸分子、および前記ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２αの活性を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を主張および開示する（Casesら, 2003）。
【００１３】
特許文献３は、「タンパク質クラスターV」と呼ばれる遺伝子の群のメンバーである核酸配列、および該タンパク質クラスターV群中の核酸分子を調節し得る剤の同定方法に言及している。この出願はまた、タンパク質クラスターV遺伝子ファミリーのメンバーの機能を破壊するためにRNA干渉または二本鎖RNAを使用することに言及している（Attersand, 2003）。
【００１４】
特許文献４は、ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ活性を修飾することに言及しており、アンチセンス、RNA干渉およびジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２アンチセンスプラスミド構築物（Smithら, 2003）を含む種々の方法によりジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２を修飾することを含む。
【００１５】
特許文献５は、植物細胞中でトリアシルグリセロール組成物を修飾する方法に言及しており、該方法は、ジアシルグリセロールおよび脂質アシル基質からのトリアシルグリセロール形成において活性な酵素をコードする核酸構築物（アンチセンス方向における核酸構築物を含む）で植物細胞を形質転換することを含む。被検体に治療有効量のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼアゴニストを投与することにより、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性の変化に関連する疾患または症状を改善するための方法も言及している。この出願は、このようなアンタゴニストがアンチセンス分子を含み得ることを示す（Lardizabalら, 2003）。
【００１６】
特許文献６は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸配列を含む群から選択される、単離された核酸分子に言及する。この公報はまた、標的核酸配列に結合しているセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、開示および特許請求された核酸分子の転写または翻訳を阻害し得ることをコメントしている（Bakerら, 2000）。
【００１７】
特許文献７は、ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む配列の群から選択されるポリヌクレオチドに言及している。前記ポリヌクレオチドの発現を変化させるためのスクリーニング方法および前記ポリヌクレオチド配列に特異的に結合する分子のライブラリのスクリーニング方法が議論されている（Shiffmanら, 2001）。
【００１８】
特許文献８は、分泌された膜貫通ポリペプチドをコードする核酸分子に言及しており、該分子には、ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２核酸分子およびこれらの配列のいずれかから誘導されたオリゴヌクレオチドプローブが挙げられる（Bakerら, 2001）。
【００１９】
特許文献９は、ポリヌクレオチド配列の群に言及しており、該群は、ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2をコードする核酸分子、およびこのポリヌクレオチド配列の群に対するアンチセンスポリヌクレオチドを含む（Isogaiら,2003）。
【００２０】
特許文献１０は、ヒトジアシルグリセロールトランスフェラーゼ２ヌクレオチド配列と相同である単離された精製ポリヌクレオチド配列に言及している。この出願はまた、ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２に相同である配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列のセンスまたはアンチセンス配列の少なくとも8つの連続したヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドについても言及している（Botsteinら, 2002）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】米国特許出願公開第20030124126号
【特許文献２】米国特許出願公開第20020119138号
【特許文献３】米国特許出願公開第20030104414号
【特許文献４】米国特許出願公開第20030100480号
【特許文献５】米国特許出願公開第20030028923号
【特許文献６】PCT公開公報第WO 00／78961号
【特許文献７】PCT公開公報第WO 01／77389号
【特許文献８】PCT公開公報第WO 01／68848号
【特許文献９】欧州特許出願第EP 1308459号
【特許文献１０】PCT公開公報第WO 02／08260号
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Fareseら, Curr. Opin. Lipidol., 2000, 11, 229-234
【非特許文献２】Casesら, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1998, 95, 13018-13023
【非特許文献３】Oelkersら, J. Biol. Chem., 1998, 273, 26765-26771
【非特許文献４】Smithら, Nat. Genet., 2000, 25, 87-90
【非特許文献５】Casesら, J. Biol. Chem., 2001, 276, 38870-38876
【非特許文献６】Lardizabalら, J. Biol. Chem., 2001, 276, 38862-38869
【非特許文献７】Watermanら, J. Lipid. Res., 2002, 43, 1555-1562
【非特許文献８】Meegallaら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, 298, 317-323
【非特許文献９】Buhmanら, J. Biol. Chem., 2002, 277, 25474-25479
【非特許文献１０】Chenら, J. Clin. Invest., 2002, 109, 1049-1055
【非特許文献１１】Chenら, J. Clin. Invest., 2002, 109, 175-181
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
現在のところ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の合成を効果的に阻害する公知の治療剤は存在しない。従って、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の機能を効果的に阻害し得るさらなる剤がなお必要とされている。
【００２４】
本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２発現を調節するための組成物および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸分子を標的とする13〜40核酸塩基長のアンチセンス化合物であって、ここで前記化合物が、前記ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸分子に対して少なくとも70％相補的であり、かつここで前記化合物がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２mRNAの発現を少なくとも10％阻害する、アンチセンス化合物、
〔２〕前記化合物が配列番号：２１、２４、２５、２６、２８、２９、３５、３６、４７、４９、５７、６２、６５、６６、７１、７３、７７、８１、８２、９０、９２および９４からなる群より選択される配列を含む、〔１〕記載のアンチセンス化合物、
〔３〕１５〜３０核酸塩基長を含む、〔２〕記載のアンチセンス化合物、
〔４〕オリゴヌクレオチドを含む、〔１〕記載のアンチセンス化合物、
〔５〕DNAオリゴヌクレオチド、RNAオリゴヌクレオチド、またはキメラオリゴヌクレオチドを含む、〔４〕記載のアンチセンス化合物、
〔６〕前記化合物の少なくとも一部がRNAとハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド-RNA二本鎖を形成する、〔４〕記載のアンチセンス化合物、
〔７〕前記ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸分子と少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％の相補性を有する、〔１〕記載のアンチセンス化合物、
〔８〕少なくとも1つの、修飾されたヌクレオシド間結合、糖部分または核酸塩基を有する、〔１〕記載のアンチセンス化合物、
〔９〕少なくとも1つの2'-O-メトキシエチル糖部分、少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合、または少なくとも1つの5-メチルシトシンを有する、〔１〕記載のアンチセンス化合物、
〔１０〕ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の発現が阻害されるように細胞または組織を接触させることを含む、細胞または組織においてジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の発現を阻害する方法のための、〔１〕記載のアンチセンス化合物、
〔１１〕ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸分子の好ましい標的セグメントを、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の1つ以上の候補調節剤と接触させる工程、および
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の発現を調節するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２発現の1つ以上の調節剤を同定する工程
を含む、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の調節剤をスクリーニングする方法、
〔１２〕ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２発現の調節剤が、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、DNAオリゴヌクレオチド、RNAオリゴヌクレオチド、RNAとハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド−RNA二本鎖を形成することができる、前記RNAオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を有するRNAオリゴヌクレオチド、またはキメラオリゴヌクレオチドを含む、〔１１〕記載の方法、
〔１３〕試料中の、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸の存在を確認することを含む、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２発現と関連のある罹患状態を確認する、診断方法において使用するための少なくとも1つの、配列番号：６もしくは７を含むプライマー、または配列番号：８を含むプローブ、
〔１４〕〔１〕の化合物を含む、キットまたは分析装置、
〔１５〕動物において、状態の重症度を改善または軽減する方法のための〔１〕記載のアンチセンス化合物であって、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の発現が阻害されるように、かつ前記状態の1つ以上の物理的特徴の測定値が前記状態の重症度の軽減を示すように前記動物と接触させることを含む化合物、
〔１６〕該状態が心臓血管障害、肥満、糖尿病、コレステロール血症、および肝臓脂肪症からなる群より選択される、〔１５〕記載のアンチセンス化合物、
〔１７〕肥満が食餌誘導性である、〔１６〕記載のアンチセンス化合物、
〔１８〕肥満の物理的特徴が、増大した脂肪である、〔１７〕記載のアンチセンス化合物、
〔１９〕該動物が哺乳動物である、〔１６〕記載のアンチセンス化合物、
〔２０〕動物における血清遊離脂肪酸を低下させる方法のための〔４〕記載のアンチセンス化合物、
〔２１〕動物における血清トリグリセリド、HDLコレステロール、総血清コレステロール、血漿もしくは血清インスリン、または肝臓トリグリセリドを低下させる方法のための〔４〕記載のアンチセンス化合物、
〔２２〕前記血漿インスリンレベルが前記接触の二週間後に低下する、〔２１〕記載のアンチセンス化合物、
〔２３〕前記血漿インスリンレベルが前記接触の四週間後に低下する、〔２１〕記載のアンチセンス化合物、
〔２４〕前記化合物が、配列番号：２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５６、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７５、７６、７７、７８、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９４、９５、９６、９７、１０１、１０９、１１４、１１５、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２７、１２８、１３０、１３３、１３６および１４２からなる群より選択される配列を含む、〔１〕記載の化合物、
〔２５〕前記化合物が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の5’-非翻訳領域（5’UTR）、開始領域、コード領域、終止領域、3’-非翻訳領域、エキソン：イントロン領域、またはイントロン：エキソン領域と特異的にハイブリダイズできるアンチセンス核酸分子を含む、〔１〕記載の化合物、
〔２６〕動物の細胞または組織におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の発現を阻害する方法のための〔１〕記載の化合物、
〔２７〕前記組織が白色脂肪組織、または褐色脂肪組織である、〔２６〕記載の化合物、
〔２８〕動物における脂肪酸合成、脂質生成、または糖新生を調節する方法のための〔４〕記載の化合物、
〔２９〕動物の肝重量を減少させる方法のための〔４〕記載の化合物、
〔３０〕該動物が肥満、または糖尿病である、〔２９〕記載の化合物、。
〔３１〕脂質生成の調節が、脂質生成遺伝子をコードする核酸のmRNAレベルの変化によって測定され、前記脂質生成遺伝子がグリセロールキナーゼ、ATP−クエン酸リアーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ１、アセチルCoAカルボキシラーゼ２、脂肪酸シンターゼ、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼI、ステアロイルCoAデサチュラーゼ、HMG-CoA還元酵素、リポタンパク質リパーゼおよびステロール調節結合因子タンパク質１からなる群より選択される、〔２８〕記載の化合物、
〔３２〕部分的に二本鎖の化合物または完全に二本鎖の化合物を含む、〔１〕記載のアンチセンス化合物、
〔３３〕該二本鎖化合物がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸分子を標的とする19〜23核酸塩基長のsiRNAであり、かつ1つ以上の突出ヌクレオシドを一方または両方の末端に含む、〔３２〕記載のアンチセンス化合物、
〔３４〕該突出ヌクレオシドがデオキシチミジン（dT）である、〔３３〕記載のアンチセンス化合物、
〔３５〕突出ヌクレオシドの数が１〜６個、１〜４個、または１〜２個である、〔３３〕記載のアンチセンス化合物、
〔３６〕該二本鎖化合物がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸分子を標的とする19〜23核酸塩基長のsiRNAであり、かつ平滑末端を含む、〔３３〕記載のアンチセンス化合物、
〔３７〕前記化合物が、配列番号：２３８、２４１、２４２、２４３、２５１および２５２からなる群より選択される配列を含む、〔３６〕記載のアンチセンス化合物、
〔３８〕心臓血管障害、肥満、糖尿病、コレステロール血症および肝臓脂肪症からなる群より選択される状態の重症度を改善または軽減させるために、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の発現が阻害されるように、かつ前記状態の1つ以上の物理的特徴の測定値が前記状態の重症度の軽減を示すように、動物へ投与するための医薬の調製における、〔１〕記載の化合物の使用、
〔３９〕動物において血清遊離脂肪酸、血清トリグリセリド、HDLコレステロール、総血清コレステロール、血漿もしくは血清インスリン、または肝臓トリグリセリドを低下させるための医薬の調製における、〔４〕記載の化合物の使用、
〔４０〕ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の発現が阻害されるように動物の細胞または組織におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の発現を阻害するための動物への投与のための医薬の調製における、〔１〕記載の化合物の使用、
〔４１〕動物における脂肪酸合成、脂質生成または糖新生を調節するための、動物への投与のための医薬の調製における、〔４〕記載の化合物の使用、
〔４２〕動物の肝重量を減少させるための、動物への投与のための医薬の調製における、〔４〕記載の化合物の使用
に関する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の機能を効果的に阻害し得るさらなる剤が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の要旨
本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸を標的とし、かつ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２発現を調節する化合物、特に、核酸および核酸様オリゴマーに関する。本発明の化合物を含む医薬および他の組成物もまた提供される。さらに、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の調節剤のスクリーニング方法、および細胞、組織または動物においてジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２発現を調節する方法であって、前記細胞、組織または動物を、1つ以上の本発明の化合物または組成物と接触させることを含む方法も提供される。
【００２８】
アンチセンス技術は、特異的遺伝子産物の発現を減少し得る効果的な手段であるので、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２発現の調節のための多くの治療的、診断的および研究的用途において比類なく有用であることが明らかになり得る。
【００２９】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２発現に関連する疾患または症状を有する疑いがあるか、または罹患し易い動物、特にヒトの治療方法もまた本明細書中に記載する。当該方法は、治療的または予防的有効量の1つ以上の本発明の化合物または組成物を、治療を必要とするヒトに投与することを含む。
【００３０】
1つの局面では、本発明は、本明細書中で開示したありとあらゆる症状の治療のための医薬の製造における、本発明の化合物または組成物の使用を提供する。
【００３１】
発明の詳細な説明
A.発明の概要
本発明は、アンチセンス化合物、好ましくは、オリゴヌクレオチド、およびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸分子の機能または作用を調節するのに用いるための同様の種を用いる。これは、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする１つ以上の核酸分子と、特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することにより達成される。本明細書中で用いる用語「標的核酸」および「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸分子」は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードするDNA、当該DNAから複写されたRNA（プレmRNAおよびmRNAまたはその部分を含む）、および当該RNAから誘導されたcDNAを含めて簡便に用いられる。本発明の化合物のその標的核酸でのハイブリダイゼーションは、一般的に「アンチセンス」と呼ばれる。結果として、いくつかの本発明の好ましい態様の実施に含まれると考えられる好ましいメカニズムを、本明細書中で「アンチセンス阻害」という。このようなアンチセンス阻害は、代表的には、オリゴヌクレオチド鎖またはセグメントの水素結合に基づくハイブリダイゼーションに基づき、その結果、少なくとも1つの鎖またはセグメントは、切断されるか、分解されるか、または作動不可能になる。これに関し、現在のところは、このようなアンチセンス阻害のための特異的核酸分子およびその機能を標的にすることが好ましい。
【００３２】
妨害すべきDNAの機能には、複製および転写を挙げることができる。複製および転写は、例えば、内因性細胞テンプレート、ベクター、プラスミド構築物またはその他に由来し得る。妨害すべきRNAの機能には、タンパク質翻訳の部位へのRNAの転座、細胞内のRNA合成部位から離れた部位へのRNAの転座、RNA由来のタンパク質の翻訳、RNAをスプライシングして1つ以上のRNA種を得ること、およびRNAに関与し得るかまたはRNAにより促進され得るRNAに関する触媒活性または複合体形成のような機能が挙げられる。標的核酸機能のこのような妨害の1つの好ましい結果は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２発現の調節である。本発明の文脈において、「調節」および「発現の調節」は、遺伝子をコードする核酸分子（例えば、DNAまたはRNA）の量またはレベルの増加（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。阻害は、しばしば、発現の調節の好ましい形態であり、mRNAは、しばしば、好ましい標的核酸である。
【００３３】
本発明の文脈において、「ハイブリダイゼーション」は、オリゴマー化合物の相補鎖の対形成を意味する。本発明において、対形成の好ましいメカニズムには、水素結合が挙げられ、これはオリゴマー化合物の鎖の相補ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基（核酸塩基）の間のWatson-Crick、Hoogsteenまたは逆Hoogsteen水素結合であり得る。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成により対を形成する相補的核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは、種々の環境下で起こり得る。
【００３４】
アンチセンス化合物は、化合物の標的核酸への結合が、標的核酸の正常な機能を妨害して活性の損失を引き起こし、かつ、特異的結合が望まれる条件（例えば、インビボアッセイまたは治療的処理における生理学的条件、およびインビトロアッセイでアッセイが行われる条件）下でアンチセンス化合物の非標的核酸配列への非特異的結合を避けるのに十分な程度の相補性が存在する場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００３５】
本発明において、語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」は、本発明の化合物がその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列へのハイブリダイズは最小数となるような条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる環境下で異なり、また、本発明の文脈において、オリゴマー化合物が標的配列にハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」は、オリゴマー化合物の性質および組成、ならびに研究されているアッセイによって決定される。
【００３６】
本明細書中で用いる「相補的」は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の水素結合が相補的位置であると考えられる能力を意味する。オリゴヌクレオチド、およびさらなるDNA、RNAまたはオリゴヌクレオチド分子は、各分子中で、十分な数の相補的位置が、互いに水素結合し得る核酸塩基に占有される場合、互いに相補的である。従って、「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補的」は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間で安定かつ特異的な結合が起こるように、十分な数の核酸塩基に対して十分な程度の正確な対および相補性があることを示すのに用いられる用語である。
【００３７】
アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能となるその標的核酸の配列に100％相補的であり得るが、必ずしもそうである必要はないことが当該分野で理解されている。さらに、オリゴヌクレオチドは、1つ以上のセグメントにハイブリダイズし得、その結果、介在または隣接するセグメントは、ハイブリダイゼーション事象に関与しない（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）。本発明のアンチセンス化合物は、標的核酸内の標的領域に対して少なくとも70％、または少なくとも75％、または少なくとも80％、または少なくとも85％の配列相補性を含むことが好ましい。さらに、それらは、標的とされる標的核酸配列内の標的領域に少なくとも90％の配列相補性、少なくとも95％の配列相補性または少なくとも99％の配列相補性を含み得る。例えば、アンチセンス化合物の20核酸塩基のうち18が標的領域に相補的であり、それ故特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物は、90％の相補性を示すであろう。この例では、残りの非相補的核酸塩基は、クラスター化され得るかまたは相補的核酸塩基と共に散在し得、互いにまたは相補的核酸塩基に対して接触している必要はない。従って、標的核酸と完全に相補的な2つの領域と隣接している、4つの非相補的核酸塩基を有する18核酸塩基長のアンチセンス化合物は、標的核酸と77.8％の全相補性を有するので、本発明の範囲内に入るであろう。標的核酸の領域を有するアンチセンス化合物の相補性百分率は、当該分野で公知のBLAST（basic local alignment search tools）プログラムおよびPowerBLASTプログラムを用いて常套的に決定することができる（Altschulら, J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhangおよび Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656）。
【００３８】
相同性百分率、配列同一性または相補性は、例えば、Gapプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison WI）により、SmithおよびWatermanのアルゴリズム（Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489）を用いる初期設定を用いて、決定することができる。いくつかの好ましい態様では、オリゴマー化合物と標的との間の相同性、配列同一性または相補性は、約50％〜約60％である。いくつかの態様では、相同性、配列同一性または相補性は、約60％〜約70％である。いくつかの態様では、相同性、配列同一性または相補性は、約70％〜約80％である。さらなる態様では、相同性、配列同一性または相補性は、約80％〜約90％である。いくつかの態様では、相同性、配列同一性または相補性は、約90％、約92％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％または約100％である。
【００３９】
B.本発明の化合物
本発明によれば、アンチセンス化合物には、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、外部ガイド配列（EGS）オリゴヌクレオチド、代替のスプライサー、および標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズする他のオリゴマー化合物が挙げられる。従って、これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、環状またはヘアピンオリゴマー化合物の形態で導入され得、かつ、内部または末端突出物またはループのような構造的要素を含み得る。本発明の化合物は、一旦システム内に導入されると、1つ以上の酵素または構成タンパク質の作用を惹起して、標的核酸の修飾を起こし得る。
【００４０】
このような酵素の非限定的な1つの例は、RNアーゼHであり、これは、RNA:DNA二重らせんのRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。「DNA様」の一本鎖アンチセンス化合物がRNアーゼHを惹起することは、当該分野で公知である。それ故に、RNアーゼHの活性化は、RNA標的の切断をもたらし、それによって、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド媒介阻害効率を非常に高める。同様の役割は、酵素のRNアーゼIIIおよびリボヌクレアーゼLファミリーにおけるリボヌクレアーゼのような他のリボヌクレアーゼにおいても仮定されている。
【００４１】
アンチセンス化合物の1つの形態は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであるが、多くの種では、二本鎖RNA（dsRNA）分子のような二本鎖構造の導入は、遺伝子またはその関連遺伝子産物の機能の強力かつ特異的なアンチセンス媒介的減少を引き起こすことが示されている。この現象は、植物および動物の両方で起こり、ウイルス防御およびトランスポゾン停止に進化的な関係を有すると考えられている。
【００４２】
動物においてdsRNAが遺伝子サイレンシングをもたらし得たことの第1の証拠は、1995年に、線虫（Caenorhabditis elegans）の研究から得られた（GuoおよびKempheus, Cell, 1995, 81, 611-620）。dsRNAの主な阻害効果は、転写後である（Montgomeryら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 15502-15507）。二本鎖RNA（dsRNA）への曝露により得られた、線虫において定義された転写後アンチセンスメカニズムは、当時からRNA干渉（RNAi）を示してきた。この用語は、内因性標的mRNAレベルの配列特異的減少をもたらすdsRNAの導入に関与するアンチセンス媒介遺伝子サイレンシングを意味するのに一般化されてきた（Fireら, Nature, 1998, 391, 806-811）。最近、dsRNAのアンチセンス極性の一本鎖RNAオリゴマーは、RNAiの強力な導入因子であることが報告されている（Tijstermanら, Science, 2002, 295, 694-697）。
【００４３】
本発明のアンチセンス化合物はまた、異なる塩基が化合物中の1つ以上のヌクレオチド位置に存在する修飾化合物も含む。例えば、第1のヌクレオチドがアデノシンである場合、チミジン、グアノシンまたはシチジンをこの位置に含む修飾化合物が調製され得る。これは、アンチセンス化合物の任意の位置でも起こり得る。次いで、化合物は、本明細書中に記載の方法で試験され、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２のmRNAの発現を阻害する能力を測定する。
【００４４】
本発明の文脈において、用語「オリゴマー化合物」は、複数のモノマー単位を含むポリマーまたはオリゴマーを意味する。本発明の文脈において、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（RNA）もしくはデオキシリボ核酸（DNA）またはそれらの模倣剤（mimetics）、キメラ、アナログおよびホモログのオリゴマーもしくはポリマーを意味する。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖および共有ヌクレオシド（主鎖）間結合から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾または置換オリゴヌクレオチドは、ネイティブ型に対してしばしば好ましい。なぜなら、例えば、細胞取り込みの増強、標的核酸への親和性の増強およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増加のような望ましい特性を有するからである。
【００４５】
オリゴヌクレオチドは、本発明のアンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明は、アンチセンス化合物の他のファミリー、ならびに本明細書中に記載のオリゴヌクレオチドアナログおよび模倣剤（しかし、これらに限定されない）を含む。
【００４６】
本発明に従うアンチセンス化合物は、好ましくは、約8〜約80核酸塩基（すなわち、約8〜約80の結合ヌクレオシド）を含む。当業者は、本発明が、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79または80核酸塩基長の化合物を包含することを理解するであろう。
【００４７】
1つの態様では、本発明のアンチセンス化合物は、12〜50核酸塩基長である。当業者は、本発明が、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50核酸塩基長の化合物を包含することを理解するであろう。
【００４８】
1つの態様では、本発明のアンチセンス化合物は、13〜40核酸塩基長である。当業者は、本発明が、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39または40核酸塩基長の化合物を包含することを理解するであろう。
【００４９】
別の態様では、本発明のアンチセンス化合物は、15〜30核酸塩基長である。当業者は、本発明が、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30核酸塩基長の化合物を包含することを理解するであろう。
【００５０】
さらなる態様では、本発明のアンチセンス化合物は、約12〜約50核酸塩基であるか、または約13〜約40核酸塩基であるか、または約15〜約30核酸塩基である。
【００５１】
別の態様では、アンチセンス化合物は、本明細書中に開示されたアンチセンス化合物の少なくとも8個の連続した核酸塩基を含む。
【００５２】
例示したアンチセンス化合物の範囲内から選ばれる、少なくとも8個の連続した核酸塩基のストレッチを含む8〜80核酸塩基長のアンチセンス化合物もまた、同様に適したアンチセンス化合物であると考えられる。
【００５３】
さらなるアンチセンス化合物は、例示した好ましいアンチセンス化合物の1つの5'末端から連続する少なくとも8個の核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド配列（残りの核酸塩基は、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物の5'末端のすぐ上流から開始し、オリゴヌクレオチドが約8〜約80核酸塩基を含むまで連続する、同じオリゴヌクレオチドの連続するストレッチである）を含む。同様に、アンチセンス化合物は、例示した好ましいアンチセンス化合物の1つの3'末端から連続する少なくとも8個の核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド配列により表される（残りの核酸塩基は、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物の3'末端のすぐ下流から開始し、オリゴヌクレオチドが約8〜約80核酸塩基を含むまで連続する、同じオリゴヌクレオチドの連続するストレッチである）で表される。アンチセンス化合物は、例示した好ましいアンチセンス化合物の配列の内部からの少なくとも8個の連続する核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド配列により表され得、かつオリゴヌクレオチドが約8〜約80核酸塩基を含むまで、いずれかまたは両方の方向に延長され得ることもまた理解される。
【００５４】
1つの態様では、アンチセンス化合物は、配列番号：20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、60、61、62、63、64、65、66、68、69、70、71、72、73、75、76、77、78、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、94、95、96、97、101、109、114、115、120、121、122、123、124、127、128、130、133、136または142を含む。さらに別の態様では、アンチセンス化合物は、1つ以上の配列番号：277〜411である。
【００５５】
別の態様では、アンチセンス化合物は、配列番号：21、24、25、26、28、29、35、36、47、49、57、62、65、66、71、73、77、81、82、90、92または94を含む。
【００５６】
本明細書中で例示された好ましいアンチセンス化合物の経験を積んだ当業者は、過度の実験を行うことなく、さらに好ましいアンチセンス化合物を同定することができるであろう。
【００５７】
C. 本発明の標的
アンチセンス化合物の特定の核酸分子に対する「標的化」は、本発明の文脈において、複数工程のプロセスであり得る。該プロセスは、通常、機能を調節すべき標的核酸を同定することから始まる。この標的核酸は、例えば、その発現が特定の疾患または疾患状態に関連する細胞遺伝子（または遺伝子から転写されたmRNA）、あるいは感染性因子由来の核酸分子であり得る。本発明において、標的核酸は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2をコードする。
【００５８】
また、この標的化プロセスは、通常、所望の効果（例えば、発現の調節）が生じるように、アンチセンス相互作用を起こすための標的核酸内の標的領域、セグメントまたは部位のうち少なくとも1つを決定することを含む。本発明の文脈において、用語「領域」とは、同定可能な構造、機能または特性の少なくとも1つを有する標的核酸の部分であると定義される。標的核酸の領域内は、セグメントである。「セグメント」とは、標的核酸内の領域のより小さなまたは下位の部分であると定義される。本発明で用いられる「部位」は、標的核酸内の位置であると定義される。
【００５９】
当該分野で公知のように、翻訳開始コドンは、代表的には5'-AUG （転写mRNA分子内;対応するDNA分子内の5'-ATG）であるので、翻訳開始コドンはまた「AUGコドン」、「開始コドン」または「AUG開始コドン」とも呼ばれる。RNA配列5'-GUG、5'-UUGまたは5'-CUG、ならびに5'-AUA、5'-ACGおよび5'-CUGを有する翻訳開始コドンを有する遺伝子のうち少数は、インビボで機能することが示されている。従って、用語「翻訳開始コドン」および「開始コドン」は、それぞれの場合における開始アミノ酸が代表的にメチオニン（真核生物において）またはホルミルメチオニン（原核生物において）である場合でさえも、多くのコドン配列を包含することができる。真核生物遺伝子および原核生物遺伝子が2つ以上の代替の開始コドンを有し得、そのいずれか1つが、特定の細胞型または組織で、あるいは特定の一連の条件下で、翻訳開始のために優先的に用いられ得ることもまた当該分野で公知である。本発明の文脈において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする遺伝子から転写されたmRNAの翻訳を開始するためにインビボで用いられるコドン（単数または複数）を意味し、当該コドンの配列にはかかわらない。遺伝子の翻訳終止コドン（または「停止コドン」）は、3つの配列、すなわち5'-UAA、5'-UAGおよび5'-UGA（対応するDNA配列は、それぞれ5'-TAA、5'-TAGおよび5'-TGAである）のうちの1つを有し得ることもまた当該分野で公知である。
【００６０】
用語「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」は、約25〜約50の連続するヌクレオチドを、翻訳開始コドンの部分からのいずれかの方向（すなわち、5'または3'）に含む、mRNAまたは遺伝子の翻訳開始コドンの部分を意味する。同様に、用語「停止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」は、約25〜約50の連続するヌクレオチドを、翻訳終止コドンの部分からのいずれかの方向（すなわち、5'または3'）に含む、mRNAまたは遺伝子の翻訳終止コドンの部分を意味する。結果として、「開始コドン領域」（または「翻訳開始コドン領域」）および「停止コドン領域」（または「翻訳終止コドン領域」）は、本発明のアンチセンス化合物で効果的に標的化され得る全ての領域である。
【００６１】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を意味することが当該分野で公知であるオープンリーディングフレーム（ORF）または「コード領域」もまた、効果的に標的化され得る領域である。本発明の文脈において、好ましい領域は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）の翻訳開始コドンまたは終止コドンを包含する遺伝子間領域である。
【００６２】
他の標的領域は、翻訳開始コドンからの5'方向のmRNAの部分を意味することが当該分野で公知であり、従って、mRNAの5'キャップ部位と翻訳開始コドンとの間にヌクレオチド（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む5'未翻訳領域（5'UTR）を含み；かつ、翻訳終止コドンからの3'方向のmRNAの部分を意味することが当該分野で公知であり、従って、mRNAの3'末端部位と翻訳終止コドンとの間にヌクレオチド（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む3'未翻訳領域（3'UTR）を含む。mRNAの5'キャップ部位は、5'-5'三リン酸結合を介してmRNAの5'最末端残基に結合したN7-メチル化グアノシン残基を含む。mRNAの5'キャップ領域は、5'キャップ構造それ自体およびキャップ部位に隣接する始めの50ヌクレオチドを含むと考えられている。5'キャップ領域を標的化することもまた好ましい。
【００６３】
従って、本発明は、配列番号：４に記載のヌクレオチド1-2439の部分を標的化するアンチセンス化合物である。別の態様では、アンチセンス化合物は、配列番号：４に記載の5'UTRを含むヌクレオチド1-230の少なくとも8核酸塩基の部分を標的化する。別の態様では、アンチセンス化合物は、配列番号：４に記載の3'UTRを含むヌクレオチド1395-2439の少なくとも8核酸塩基の部分を標的化する。別の態様では、アンチセンス化合物は、配列番号：４に記載のコード領域を含むヌクレオチド231-1394の少なくとも8核酸塩基の部分を標的化する。さらに別の態様では、アンチセンス化合物は、表3または以下の実施例中の追加の表に記載の「好ましい標的セグメント」（本明細書中で定義する）の少なくとも8核酸塩基の部分を標的化する。
【００６４】
いくつかの真核生物mRNA転写は、直接翻訳されるが、多くのものは、翻訳される前に転写物から切除される「イントロン」として知られる1つ以上の領域を含む。残りの（すなわち、翻訳された）領域は、「エキソン」として知られ、共にスプライスされて連続的mRNA配列を形成し、エキソンが接合する部位にエキソン-エキソン接合を生じる。標的エキソン-エキソン接合は、正常なスプライス産物の過産生が疾患に関連する状況で、または異常なスプライス産物の過産生が疾患に関連する状況で、有用であり得る。標的スプライス部位、すなわち、イントロン-エキソン接合またはエキソン-イントロン接合はまた、異常なスプライシングが疾患に関連する状況で、または特定のスプライス産物の過産生が疾患に関連する状況でも有用であり得る。転移または欠失による異常な融合接合もまた好ましい標的部位である。異なる遺伝子源からの2つの（またはそれ以上の）mRNAのスプライシングのプロセスを介して生じたmRNA転写物は、「融合転写物」と呼ばれ、これもまた適切な標的部位である。イントロンは、例えば、DNAまたはプレ-mRNAを標的としたアンチセンス化合物を用いて効果的に標的化され得ることもまた知られている。
【００６５】
代替のRNA転写物が、DNAの同じゲノム領域から生じ得ることもまた当該分野で公知である。これらの代替の転写物は、一般的に「変異体」として知られる。より詳細には、「プレ-mRNA変異体」は、その開始または停止位置において、同じゲノムDNAから生じた他の転写物とは異なる同じゲノムDNAから生じ、イントロンおよびエキソン配列の両方を含む転写物である。
【００６６】
1つ以上のエキソンまたはイントロン領域あるいはスプライシングの間のその部分の切除の際に、プレ-mRNA変異体は、より小さい「mRNA変異体」を産生する。結果として、mRNA変異体は、加工されたプレ-mRNA変異体であり、スプライシングの結果、各独自のプレ-mRNA変異体は、常に、独自のmRNA変異体を生じるはずである。これらのmRNA変異体はまた、「代替スプライス変異体」としても知られる。プレ-mRNA変異体のスプライシングが起こらない場合、プレ-mRNA変異体は、mRNA変異体と同一である。
【００６７】
変異体は、転写を開始または停止するための代替シグナルの使用により産生することができ、また、プレ-mRNAおよびmRNAは、1つ以上の開始コドンまたは停止コドンを有し得ることが当該分野で公知である。代替の開始コドンを用いる、プレ-mRNAまたはmRNAを起源とする変異体は、当該プレ-mRNAまたはmRNAの「代替の開始変異体」として公知である。代替停止コドンを用いるこれらの転写は、当該プレ-mRNAまたはmRNAの「代替停止変異体」として公知である。代替停止変異体の1つの特異的な型は、転写機構による「ポリA停止シグナル」の1つの代替の選択の結果から、複数の転写が生じ、それによって独自のポリA部位で終止する転写を生じる「ポリA変異体」である。本発明の文脈の範囲内で、本明細書中に記載の変異体の型もまた好ましい標的核酸である。
【００６８】
好ましいアンチセンス化合物がハイブリダイズする標的核酸上の位置は、本明細書中の以下で「好ましい標的セグメント」と呼ぶ。本明細書中で用いる用語「好ましい標的セグメント」は、活性なアンチセンス化合物が標的化される標的領域の少なくとも8核酸塩基部分であると定義される。理論に束縛されることは望まないが、現在、これらの標的セグメントは、ハイブリダイゼーションのためにアクセス可能な標的核酸の部分を表すと考えられている。
【００６９】
特定の好ましい標的セグメントの特異的配列が本明細書中に記載されているが、当業者は、これらは本発明の範囲内の特定の態様を例示および記載する働きをすることを理解するであろう。さらなる好ましい標的セグメントは、当業者により同定され得る。
【００７０】
例示した好ましい標的セグメントの範囲から選択される少なくとも8個の連続する核酸塩基のストレッチを含む8〜80核酸塩基長の標的セグメントもまた同様に、標的化に適切であると考えられる。
【００７１】
標的セグメントは、例示した好ましい標的セグメントの1つの5'末端から連続する少なくとも8個の核酸塩基を含むDNAまたはRNA配列（残りの核酸塩基は、標的セグメントの5'末端のすぐ上流から開始し、かつDNAまたはRNAが約8〜約80核酸塩基を含むまで連続する、同じDNAまたはRNAの連続するストレッチである）を含むことができる。同様に、好ましい標的セグメントは、例示した好ましい標的セグメントの1つの3'末端から連続する少なくとも8個の核酸塩基を含むDNAまたはRNA配列（残りの核酸塩基は、標的セグメントの5'末端のすぐ上流から開始し、かつDNAまたはRNAが約8〜約80核酸塩基を含むまで連続する、同じDNAまたはRNAの連続するストレッチである）で表される。好ましいアンチセンス標的セグメントは、例示した好ましい標的セグメントの配列の内部からの少なくとも8の連続する核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド配列により表され、オリゴヌクレオチドが約8〜約80核酸塩基を含むまで、いずれかまたは両方の方向に延長され得ることもまた理解される。本明細書中で例示された好ましい標的セグメントの経験を積んだ当業者は、過度の実験を行うことなく、さらに好ましい標的セグメントを同定できるであろう。
【００７２】
一旦、1つ以上の標的領域、セグメントまたは部位が同定されると、アンチセンス化合物は、標的に対して十分に相補的であるように（すなわち、十分な特異性で十分に良くハイブリダイズし、所望の効果を与えるように）選択される。
【００７３】
オリゴマーアンチセンス化合物もまた、本明細書中（例えば、実施例13で）で開示されるような標的核酸塩基配列の領域に対して標的化することができる。オリゴマーアンチセンス化合物が標的化され得る、領域が8核酸塩基以上80核酸塩基以下である核酸塩基配列の全ての領域は、以下のように説明される：
R （n、n＋m-1）を、標的核酸塩基配列由来の領域とする。ここで、「n」は当該領域の5'最末端核酸塩基の位置であり、「n＋m-1」は当該領域の3'最末端核酸塩基の位置であり、「m」は当該領域の長さである。長さ「m」の領域の集合「S（m）」は、nが1〜L-m＋1の範囲内の領域であると定義され、ここで、Lは標的核酸塩基配列の長さであり、L>mである。全領域の集合「A」は、mが8以上80以下である場合の各長さの領域の和集合となるように構築することができる。
【００７４】
この領域の集合は、以下の数学的表記法を用いて表すことができる：
【００７５】
【数１】
0005420334.tif 000002
【００７６】
式中、数学的演算子｜は「その結果」を示し、
式中、数学的演算子∈は「集合の一員」を示し（例えば、y∈Zは、要素yが集合Zの一員であることを示す）、
式中、xは変数であり、
式中、Nは、正の整数であると定義される全ての自然数を示し、
かつ、式中、数学的演算子
0005420334.tif 000003
は「和集合」を示す。
【００７７】
例えば、mが8、20および80に等しい領域の集合は、以下の様式で構築することができる。標的核酸塩基配列の位置1（n＝1）から開始する、100核酸塩基長（L＝100）の標的核酸塩基配列におけるそれぞれ8核酸塩基長の領域の集合、S（m＝8）は、次の式：
Ｓ(8)={Ｒ1,8|ｎ∈{1,2,3,...,93}
を用いて求めることができ、これは、核酸塩基1-8、2-9、3-10、4-11、5-12、6-13、7-14、8-15、9-16、10-17、11-18、12-19、13-20、14-21、15-22、16-23、17-24、18-25、19-26、20-27、21-28、22-29、23-30、24-31、25-32、26-33、27-34、28-35、29-36、30-37、31-38、32-39、33-40、34-41、35-42、36-43、37- 44、38-45、39-46、40-47、41-48、42-49、43-50、44-51、45-52、46-53、47-54、48-55、49-56、50-57、51-58、52-59、53-60、54-61、55-62、56-63、57-64、58-65、59-66、60-67、61-68、62-69、63-70、64-71、65-72、66-73、67-74、68-75、69-76、70-77、71-78、72-79、73-80、74-81、75-82、76-83、77-84、78-85、79-86、80-87、81-88、82-89、83-90、84-91、85-92、86-93、87-94、88-95、89-96、90-97、91-98、92-99、93-100を含む領域の集合を表す。
【００７８】
標的核酸塩基配列の位置1から開始する、100核酸塩基長の標的配列における20核酸塩基長の領域についての追加の集合は、次の式:
Ｓ(20)={Ｒ1,20|ｎ∈{1,2,3,...,81}
を用いて求めることができ、これは、核酸塩基1-20、2-21、3-22、4-23、5-24、6-25、7-26、8-27、9-28、10-29、11-30、12-31、13-32、14-33、15-34、16-35、17-36、18-37、19-38、20-39、21-40、22-41、23-42、24-43、25-44、26-45、27-46、28-47、29-48、30-49、31-50、32-51、33-52、34-53、35-54、36-55、37-56、38-57、39-58、40-59、41-60、42-61、43-62、44-63、45-64、46-65、47-66、48-67、49-68、50-69、51-70、52-71、53-72、54-73、55-74、56-75、57-76、58-77、59-78、60-79、61-80、62-81、63-82、64-83、65-84、66-85、67-86、68-87、69-88、70-89、71-90、72-91、73-92、74-93、75-94、76-95、77-96、78-97、79-98、80-99、81-100を含む領域の集合を表す。
【００７９】
標的核酸塩基配列の位置1から開始する、100核酸塩基長の標的配列における80核酸塩基長の領域についての追加の集合は、次の式：
Ｓ(80)={Ｒ1,80|ｎ∈{1,2,3,...,21}
を用いて求めることができ、これは、核酸塩基1-80、2-81、3-82、4-83、5-84、6-85、7-86、8-87、9-88、10-89、11-90、12-91、13-92、14-93、15-94、16-95、17-96、18-97、19-98、20-99、21-100を含む領域の集合を表す。
【００８０】
従って、この例では、Aは、領域1-8、2-9、3-10...93-100、1-20、2-21、3-22... 81-100、1-80、2-81、3-82... 21-100を含むであろう。
【００８１】
これらの上述の例示の和集合および10〜19および21〜79の長さについての他の和集合は、以下の数式を用いて表すことができる：
【００８２】
【数２】
0005420334.tif 000004
【００８３】
式中、
0005420334.tif 000005
は、全ての集合の全ての構成員を組み合わせて得られる和集合を表す。
【００８４】
本明細書中に記載の数式は、任意の長さLの標的核酸塩基配列中の全ての可能な標的領域を定義し、式中、領域は長さがmであり、mは8以上80以下の核酸塩基であり、mはLより小さく、かつnはL-m＋1より小さい。
【００８５】
D.スクリーニングおよび標的の検証
さらなる態様では、本明細書中で同定される「好ましい標的セグメント」は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２発現を調節するさらなる化合物のスクリーニングにおいて用いられ得る。「調節剤」は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸分子の発現を減少または増加し、好ましい標的セグメントに相補的な少なくとも8核酸塩基部分を含む化合物である。スクリーニング方法は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸分子の好ましい標的セグメントを、1つ以上の候補調節剤と接触させる工程、およびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸分子の発現を減少または増加する1つ以上の候補の調節剤を選択する工程を含む。一旦、候補の調節剤または調節剤がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸分子の発現を調節（例えば、減少するかまたは増加するかのいずれか）可能であることが示されると、調節剤は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の機能のさらなる調査的研究に、あるいは本発明に従って研究薬、診断薬または治療剤に用いられ得る。
【００８６】
本発明の好ましい標的セグメントはまた、各々の本発明の相補的アンチセンス化合物と組み合わされて、安定な（二本鎖）二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し得る。
【００８７】
このような二本鎖オリゴヌクレオチド部位は、アンチセンスメカニズムによって、標的の発現を調節し、かつ翻訳およびRNAプロセシングを調節することが当該分野で示されている。さらに、二本鎖部位は化学修飾に供してもよい（Fireら, Nature, 1998, 391, 806-811; TimmonsおよびFire, Nature 1998, 395, 854; Timmonsら, Gene, 2001, 263, 103-112; Tabaraら, Science, 1998, 282, 430-431; Montgomeryら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 15502-15507; Tuschlら, Genes Dev., 1999, 13, 3191-3197; Elbashirら, Nature, 2001, 411, 494-498; Elbashirら, Gene Dev. 2001, 15, 188-200）。例えば、このような二本鎖部位は、標的に対する二本鎖アンチセンス鎖の標準的なハイブリダイゼーションにより、標的を阻害し、それによって標的の酵素分解を引き起こすことが示される （Tijstermanら, Science, 2002, 295, 694-697）。
【００８８】
本発明の化合物はまた、薬物の発見および標的の評価の分野に応用され得る。本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２と、疾患状態、表現型または症状との間に存在する関係を解明するために薬物を発見する試みにおいて、本明細書中で同定された化合物および好ましい標的セグメントを使用することを包含する。これらの方法は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2を検出または調節することを含み、試料、組織、細胞または生体を、本発明の化合物と接触させること、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の核酸またはタンパク質のレベルおよび／または処理後所定時間経過後の関連形質または化学的終点を測定すること、および、必要に応じて、測定した値を、非処理試料または追加の本発明の化合物で処理した試料と比較することを含む。これらの方法はまた、他の実験と並行してまたは組み合わせて行うことにより、標的の妥当性評価のプロセスのための未知の遺伝子の機能を決定するか、または特定の疾患、症状または表現型の治療または予防のための標的としての特定の遺伝子産物の妥当性を決定することができる。
【００８９】
E．キット、研究試薬、診断学、及び治療学
本発明のアンチセンス化合物は、診断学、治療学、及び予防のために、ならびに研究試薬、及びキットとして利用される。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、優れた特異性で、遺伝子発現を阻害することができるが、特定の遺伝子の機能を解明するために、または生物学的経路の種々の要素の機能を識別するために、当業者にしばしば用いられる。
【００９０】
キット及び診断に係る使用においては、本発明の化合物は、単独で、または他の化合物、もしくは治療と組み合わせて、細胞及び組織内で発現された遺伝子の一部または全部の相補体の発現パターンを解明するための識別解析及び／または組合せ解析におけるツールとして用いられる。
【００９１】
一つの制限のない例として、一つ以上のアンチセンス化合物で処理された細胞または組織内の発現パターンは、アンチセンス化合物で処理されていない対照細胞または組織と比較され、生成されたパターンは、例えば、検査された遺伝子の、疾患との係り、シグナル経路、細胞局在、発現レベル、大きさ、構造または機能と関連するので、遺伝子発現の識別レベルについて、解析される。かかる解析は、刺激された、または刺激されていない細胞について、及び発現パターンに影響を及ぼす他の化合物の存在または不在のもとで、なされ得る。
【００９２】
当該分野で公知の遺伝子発現解析方法の例としては、DNAアレイまたはマイクロアレイ（Brazma及びVilo, FEBS Lett., 2000, 480, 17-24; Celisら, FEBS Lett., 2000, 480, 2-16）、SAGE（遺伝子発現の連続解析）（Maddenら, Drug Discov. Today, 2000, 5, 415-425）、READS（消化cDNAの制限酵素増幅）（Prashar及びWeissman, Methods Enzymol., 1999, 303, 258-72）、TOGA（総合的遺伝子発現解析）（Sutcliffeら, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 1976-81）、プロテインアレイ及びプロテオミクス（Celisら, FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Jungblutら, Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10）、発現配列タグ（EST）塩基配列決定法（Celisら, FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larssonら, J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57）、サブトラクティブRNAフィンガープリント（SuRF）（Fuchsら, Anal. Biochem., 2000, 286, 91-98; Larsonら, Cytometry, 2000, 41, 203-208）、サブトラクティブクローニング、ディファレンシャルディスプレイ（DD）（Jurecic及びBelmont, Curr. Opin. Microbiol., 2000, 3, 316-21）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（Carulliら, J. Cell Biochem. Suppl., 1998, 31, 286-96）、FTSH（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）法（Going及びGustersonら, Eur. J. Cancer, 1999, 35, 1895-904）ならびに質量分析法（To, Comb. Chem. High Throughput Screen, 2000, 3, 235-41）が挙げられる。
【００９３】
本発明のアンチセンス化合物は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸にハイブリダイズするため、研究及び診断学に有用である。本明細書中に開示されるプライマー及びプローブは、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸分子の特異的検出を要する方法において、及びジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２のさらなる研究において検出するための、または使用するための、該核酸分子の増幅において、有用である。プライマー及びプローブとジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸とのハイブリダイゼーションは、当該分野で公知の手段によって、検出され得る。かかる手段としては、酵素とプライマーもしくはプローブとの結合、または任意の他の適当な検出手段が挙げられ得る。試料中のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２のレベルを検出するためのかかる検出手段を用いたキットもまた、調製され得る。
【００９４】
本発明は、さらに、本明細書中に開示される、あらゆるすべての状態の治療のための医薬の製造における、本発明の化合物または組成物の使用を提供する。
【００９５】
アンチセンスの特異性及び感受性はまた、治療上の使用のために当業者により利用されている。アンチセンス化合物は、ヒトを含め、動物の疾患状態の治療において、治療法の一部として用いられてきた。アンチセンスオリゴヌクレオチド薬は、リボザイムを含め、安全に及び有効に、ヒトに投与されており、多数の臨床試験が進行中である。したがって、アンチセンス化合物は、細胞、組織、及び動物、特にヒトの治療のための治療養生において有用であるよう設計され得る有用な治療様式になり得ることが確立されている。
【００９６】
治療学のために、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の発現を調節することにより治療され得る疾患または障害を有する疑いのある動物、好ましくはヒトが、本発明に従って、アンチセンス化合物を投与することにより、治療されている。例えば、ある制限のない態様では、該方法は、治療が必要な動物に、治療上有効な量のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２阻害剤を投与することを含む。本発明のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２阻害剤は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２タンパク質の活性を有効に阻害するか、またはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２タンパク質の発現を阻害する。ある態様では、動物におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の活性または発現は、約10％阻害される。好ましくは、動物におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の活性または発現は、約30％阻害される。より好ましくは、動物におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の活性または発現は、50％以上阻害される。したがって、アンチセンス化合物は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２mRNAの発現を少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％調節する。
【００９７】
例えば、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の発現の減少は、動物の、血清、脂肪組織、肝臓または任意の他の体液、組織または器官の中で、測定され得る。好ましくは、分析される該体液、組織または器官の中に含まれる細胞は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２タンパク質をコードする核酸分子、及び／またはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２タンパク質自体を含む。
【００９８】
本発明のアンチセンス化合物は、適当な、薬学的に許容され得る希釈剤または担体に、有効な量の化合物を添加することにより、医薬組成物において、利用され得る。本発明の化合物及び方法はまた、予防上有用であり得る。
【００９９】
本発明のアンチセンス化合物はまた、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の発現と関連する疾患状態の識別に有用である。該方法は、配列番号:６もしくは７を含むプライマー、または配列番号:８を含むプローブの少なくとも一つを用いて試料中のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸の存在を識別することを含む。
【０１００】
アンチセンス化合物はさらに、種々の状態を治療するのに、または予防するのに有用である。典型的には、本発明の化合物は、動物における状態の重症度を改善するか、または減少させるために利用される。かかる状態としては、数ある中で、心臓血管障害、食餌誘発性肥満などの肥満、糖尿病、コレステロール血症、及び肝臓脂肪症が挙げられ得る。肥満の身体的兆候には、いくつかあり、数ある中で、増大した脂肪が挙げられる。本発明の化合物を用いた、状態の治療または予防としては、動物を有効量の本発明の化合物と接触させることが挙げられ得る。好ましくは、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の発現が阻害され、該状態の一つ以上の身体的兆候の測定は、該状態の重症度が減少したことを示唆する。典型的には、該動物は肥満である。
【０１０１】
アンチセンス化合物はさらに、動物の血液のある成分を減少させるために利用される。典型的には、本発明の化合物は、動物における、血清の遊離脂肪酸，血清のトリグリセリドを減少させること、HDLコレステロールを減少させること、総血清コレステロール、血漿もしくは血清のインスリン、または肝臓のトリグリセリドを減少させることに有用である。典型的には、該動物は有効量の本発明の化合物に接触させられる。好ましくは、血漿インスリンのレベルは、該動物を本発明の化合物と接触させた後、約2または4週間で下がる。
【０１０２】
本発明の化合物はまた、動物の細胞または組織におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の発現を阻害することに有用である。該方法は、該細胞または組織を本発明の化合物と接触させることを含む。好ましくは、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の発現は、本方法において阻害される。典型的には、該動物の組織は、白色脂肪組織か、または褐色脂肪組織である。
【０１０３】
本発明の化合物はさらに、動物における、数ある中の、脂肪酸合成、脂質生成、または糖新生を調節する方法において有用である。典型的には、該動物は、本発明の化合物と接触させられる。脂質生成の調節は、脂質生成遺伝子をコードする核酸のmRNAレベルにおける変化によって決定され得る。該脂質生成遺伝子は、グリセロールキナーゼ、ATPクエン酸リアーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ１、アセチルCoAカルボキシラーゼ２、脂肪酸シンターゼ、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ、ステアリルCoAデサチュラーゼ、HMG-CoA還元酵素、リポプロテインリパーゼ及びステロール調節結合因子タンパク質１の中から選ばれる。
【０１０４】
本発明の化合物はさらに、動物の肝臓重量を減少させるのに有用である。かかる使用のために、該動物は、本発明の化合物と接触させられる。典型的には、該動物は肥満であるか、または糖尿病である。
【０１０５】
F．修飾
当該分野で公知であるように、ヌクレオシドは塩基と糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常は、時々「核酸塩基」または単に「塩基」と呼ばれるヘテロ環塩基である。かかるヘテロ環塩基の2つの最も一般的な種類は、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノース糖を含むかかるヌクレオシドは、リン酸基が、該糖の2’、3’、または5’ヒドロキシル部に結合し得る。オリゴヌクレオチドの形成においては、該リン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合させ、線状高分子化合物を形成する。次に、かかる線状高分子化合物の各末端がさらに結合し、環状化合物を形成し得るが、線状化合物が一般に好ましい。さらに、線状化合物は、内部核酸塩基相補性を有し得るため、完全に、または部分的に、二本鎖化合物を生じるように、折りたたまれ得る。オリゴヌクレオチド内において、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間主鎖を形成するものと一般に称されている。RNA及びDNAの通常の結合または主鎖は、3’から5’へのリン酸ジエステル結合である。
【０１０６】
修飾されたヌクレオシド間結合（主鎖）
本発明において有用なアンチセンス化合物としては、修飾された主鎖または非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書中に使用される場合、「オリゴヌクレオチド模倣剤」または「模倣剤」は、天然に存在するRNAまたはDNA核酸から修飾された本発明の任意の化合物のことを言う。本明細書中に定義される場合、修飾された主鎖を有するオリゴヌクレオチドとしては、主鎖中にリン原子を保持するもの、及び主鎖中にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的のために、かつ当該分野で時々引用されるように、該ヌクレオシド間主鎖にリン原子を有さない修飾されたオリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであるとみなされ得る。
【０１０７】
リン原子をその中に含む、好ましい、修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖としては、例えば、通常の3’-5’結合を有する、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3’-アルキレンホスホネート、5’-アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3’-アミノホスホラミデート及びアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート及びボラノホスフェート、これらの2’-5’結合された類似体、ならびにその中の一つ以上のヌクレオチド間結合が3’から3’、5’から5’、または2’から2’への結合である、逆の極性を有するもの、が挙げられる。逆の極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、3’末端ヌクレオチド間結合において、単一の、3’から3’への結合、すなわち、無塩基であり得る単一の逆のヌクレオシド残基（核酸塩基が、欠失しているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）を含む。種々の塩、混合塩、及び遊離酸の形もまた、含まれる。
【０１０８】
上記リン含有結合の調製法を教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第：3,687,808号;
4,469,863号; 4,476,301号; 5,023,243号; 5,177,196号; 5,188,897号;
5,264,423号; 5,276,019号; 5,278,302号; 5,286,717号; 5,321,131号;
5,399,676号; 5,405,939号; 5,453,496号; 5,455,233号; 5,466,677号;
5,476,925号; 5,519,126号; 5,536,821号; 5,541,306号; 5,550,111号;
5,563,253号; 5,571,799号; 5,587,361号; 5,194,599号; 5,565,555号;
5,527,899号; 5,721,218号; 5,672,697号及び5,625,050号が挙げられ、その各々は、本明細書中に参照によって援用されている。
【０１０９】
リン原子をその中に含有しない、好ましい、修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルが混合されたヌクレオシド間結合、または一つ以上の、短鎖ヘテロ原子の、もしくはヘテロ環式の、ヌクレオシド間結合により形成される主鎖を有する。これらとしては、（一部はヌクレオシドの糖部分から形成された）モルホリノ結合を有するもの、シロキサン主鎖、スルフィド、スルホキシド、及びスルホン主鎖、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖、リボアセチル（riboacetyl）主鎖、アルケン含有主鎖、スルファメート主鎖、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖、スルホネート及びスルホンアミド主鎖、アミド主鎖、ならびに混合されたN、O、S、及びCH2成分部分を有する他のものが挙げられる。
【０１１０】
上記オリゴヌクレオシドの調製法を教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第：5,034,506号; 5,166,315号;
5,185,444号; 5,214,134号; 5,216,141号; 5,235,033号; 5,264,562号;
5,264,564号; 5,405,938号; 5,434,257号; 5,466,677号; 5,470,967号;
5,489,677号; 5,541,307号; 5,561,225号; 5,596,086号; 5,602,240号;
5,610,289号; 5,602,240号; 5,608,046号; 5,610,289号; 5,618,704号;
5,623,070号; 5,663,312号; 5,633,360号; 5,677,437号; 5,792,608号;
5,646,269号及び5,677,439号が挙げられ、その各々は、本明細書中に参照によって援用されている。
【０１１１】
修飾された糖及びヌクレオシド間結合−模倣剤
他の好ましいアンチセンス化合物、例えばオリゴヌクレオチド模倣剤においては、該ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合の両方（すなわち主鎖）が、新規な基により置換される。該核酸塩基単位は、適当な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されてきた、ある、かかるオリゴヌクレオチド模倣剤は、ペプチド核酸（PNA）と称される。PNA化合物においては、オリゴヌクレオチドの糖主鎖は、主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖を含有するアミドで置換される。該核酸塩基は、保持され、該主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に、直接、または間接的に、結合する。PNA化合物の調製法を教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第：5,539,082号; 5,714,331号及び5,719,262号が挙げられ、その各々は、本明細書中に参照によって援用されている。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsenら, Science, 1991, 254, 1497-1500に見出し得る。
【０１１２】
本発明のある態様には、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチド、及びヘテロ原子主鎖を有するオリゴヌクレオシド、ならびに特に、上記引用された米国特許第5,489,677号の、-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-（メチレン（メチルイミノ）またはMMI主鎖として公知の）、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-、及び-O-N(CH3)-CH2-CH2-（ここで、天然のホスホジエステル主鎖は-O-P-O-CH2-と表される）、ならびに上記引用された米国特許第5,602,240号のアミド主鎖がある。上記引用された米国特許第5,034,506号のモルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドもまた、挙げられる。
【０１１３】
修飾された糖
オリゴヌクレオチド模倣剤はまた、一つ以上の置換された糖部分を含有し得る。したがって、これらは、2’位で、次のもの：OH、F、O-、S-、もしくはN-アルキル、O-、S-、もしくはN-アルケニル、O-、S-もしくはN-アルキニル、またはO-アルキル-O-アルキルの一つを含み得、ここでアルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換された、または置換されていないC1からC10のアルキル、またはC2からC10のアルケニル及びアルキニルであり得る。特に好ましいのは、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、及びO(CH2)nON[(CH2)nCH3]2であり、ここで、n及びmは、1から約10である。他のオリゴヌクレオチド模倣剤は、2’位に次のもの：C1からC10の低級アルキル、置換された低級の、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリル、もしくはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を向上するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を向上するための基、及び類似の性質を有する他の置換基、の一つを含み得る。ある修飾としては、2’-メトキシエトキシ（2’-O-（2-メトキシエチル）または2’-O-メトキシエチルまたは2’-MOEとしてもまた公知の2’-O-CH2CH2OCH3）（Martinら, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504）すなわち、アルコキシアルコキシ基、が挙げられる。さらなる修飾としては、本明細書中以下の実施例に記載されるように、2’-DMAOEとしてもまた公知の2’-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、O(CH2)2ON(CH3)2基、及びまた本明細書中以下の実施例に記載されるように、（当該分野でまた2’-O-ジメチル-アミノ-エトキシ-エチルまたは2’-DMAEOEとして公知の）2’-ジメチルアミノエトキシエトキシ、すなわち、2’-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2が挙げられる。
【０１１４】
他の修飾としては、2’-メトキシ（2’-O-CH3）、2’-アミノ（2’-NH2）2’-アミノプロポキシ（2’-OCH2CH2CH2NH2）、2’-アリル（2’-CH2-CH=CH2）、2’-O-アリル（2’-O-CH2-CH=CH2）及び2’-フルオロ（2’-F）が挙げられる。該2’-修飾は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位に存在し得る。ある2’-アラビノ修飾は、2’-Fである。類似の修飾もまた、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に、3’末端ヌクレオチドまたは2’-5’結合オリゴヌクレオチドにおける糖の3’位、及び5’末端ヌクレオチドの5’位になされ得る。ペントフラノース糖の代わりにシクロブチル部分などの糖を含むオリゴヌクレオチド模倣剤もまた、本発明の範囲内である。かかる修飾された糖構造の調製法を教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第：4,981,957号; 5,118,800号;
5,319,080号; 5,359,044号; 5,393,878号; 5,446,137号; 5,466,786号;
5,514,785号; 5,519,134号; 5,567,811号; 5,576,427号; 5,591,722号;
5,597,909号; 5,610,300号; 5,627,053号; 5,639,873号; 5,646,265号;
5,658,873号; 5,670,633号; 5,792,747号及び5,700,920号が挙げられ、その各々は、本明細書中に参照によって全体が援用されている。
【０１１５】
該糖のさらなる修飾としては、その2’-ヒドロキシル基が、糖の環の3’または4’炭素原子に結合し、それにより、二環式糖部分を形成するロックト核酸（LNA）が挙げられる。該結合は、好ましくは、2’酸素原子及び該4’炭素原子を架橋する、nが1または2であるメチレン（-CH2-）n基である。しかし、本発明は、エチレン結合も包含する。LNA及びその調製法は、国際特許公開第WO 98/39352号、及びWO 99/14226号に記載されている。
【０１１６】
天然の、及び修飾された核酸塩基
オリゴヌクレオチド模倣剤はまた、核酸塩基（当該分野でヘテロ環式塩基、または単に「塩基」としばしば称される）修飾または置換を含む。本明細書中で使用される場合、「非修飾」または「天然」核酸塩基としては、プリン塩基であるアデニン（A）及びグアニン（G）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（T）、シトシン（C）及びウラシル（U）が挙げられる。修飾された核酸塩基としては、5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6-メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2-プロピル及び他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン及び2-チオシトシン、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピニル（-C≡C-CH3）ウラシル及びシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6-アゾウラシル、シトシン及びチミン、5-ウラシル（偽ウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル、及び他の8-置換アデニン及びグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチル、及び他の5-置換ウラシル及びシトシン、7-メチルグアニン、及び7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニン、及び8-アザアデニン、7-デアザグアニン、及び7-デアザアデニン、及び3-デアザグアニン、及び3-デアザアデニンなどの他の合成、及び天然核酸塩基が挙げられる。さらなる修飾された核酸塩基としては、フェノキサジンシチジン（1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾキサジン-2(3H)-オン）、フェノチアジンシチジン（1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾチアジン-2(3H)-オン）、置換されたフェノキサジンシチジン（例えば、9-(2-アミノエトキシ)-H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾキサジン-2(3H)-オン）などのGクランプ、カルバゾールシチジン（2H-ピリミド[4,5-b]インドール-2-オン）、ピリドインドールシチジン（H-ピリド[3’,2’:4,5]ピロロ[2,3-d]ピリミジン-2-オン）などの三環式ピリミジンが挙げられる。修飾された核酸塩基としてはまた、該プリンまたはピリミジン塩基が、他のヘテロ環、例えば7-デアザ-アデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジン、及び2-ピリドンで置換されたものが挙げられ得る。さらなる核酸塩基としては、米国特許第3,687,808号に開示されたもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 858-859ページ, Kroschwitz, J.I., 編John Wiley & Sons, 1990に開示されたもの、Englischら, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613により開示されたもの、及びSanghvi, Y.S., 15章, Antisense Research and Applications, 289-302ページ, Crooke, S.T.及びLebleu, B., 編, CRC Press, 1993により開示されたものが挙げられる。かかる核酸塩基のいくつかは、本発明の化合物の結合親和性を増大させるのに、特に有用である。これらとしては、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、及び5-プロピニルシトシンを含む5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、ならびにN-2、N-6、及びO-6置換プリンが挙げられる。5-メチルシトシン置換は、核酸二本鎖安定性を0.6〜1.2℃増大させることが示され、現在好ましい塩基置換、より詳しくは2’-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合である。
【０１１７】
上記修飾された核酸塩基のいくつかならびに他の修飾された核酸塩基の調製法も教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、上記米国第3,687,808号ならびに
米国特許第：4,845,205号; 5,130,302号; 5,134,066号;
5,175,273号; 5,367,066号; 5,432,272号; 5,457,187号; 5,459,255号;
5,484,908号; 5,502,177号; 5,525,711号; 5,552,540号; 5,587,469号;
5,594,121号, 5,596,091号; 5,614,617号; 5,645,985号; 5,830,653号;
5,763,588号; 6,005,096号; 5,681,941号及び5,570,692号が挙げられ、その各々は、本明細書中に参照によって援用されている。
【０１１８】
結合体
本発明のアンチセンス化合物の別の修飾としては、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを高める一つ以上の部分または結合体をアンチセンス化合物に化学的に連結することが挙げられる。かかる部分または結合体としては、第一級または二級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合した結合体群が挙げられ得る。本発明の結合体群としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的性質を高める群、及びオリゴマーの薬物動態学的性質を高める群が挙げられる。典型的な結合体群としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び染料が挙げられる。薬力学的性質を高める群としては、本発明の関係においては、取り込みを向上させ、分解耐性を高め、及び／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する群が挙げられる。薬物動態学的性質を高める群としては、本発明の関係においては、本発明の化合物の取り込み、分布、代謝、または排出を向上させる群が挙げられる。代表的な結合体群は、1992年10月23日に出願された国際特許出願第PCT/US92/09196号、及び米国特許第6,287,860号に開示されており、その記載全体は、本明細書中に参照によって援用されている。結合体部分としては、限定されないが、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル-S-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール、もしくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロール、もしくはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート、ポリアミン、もしくはポリエチレングリコール鎖、または、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、または、オクタデシルアミン、もしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分などの脂質部分が挙げられる。
【０１１９】
本発明のアンチセンス化合物はまた、製剤原料、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(S)-(+)-プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、2,3,5-トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、ホリニン酸、ベンゾサイアジアザイド、クロロサイアザイド、ジアゼピン、インドメチシン（indomethicin）、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌物質、または抗生物質に結合し得る。オリゴヌクレオチド−薬物結合体及びその調製法は、本明細書中に参照によって全体が援用されている米国特許第6,656,730号に記載されている。
【０１２０】
かかるオリゴヌクレオチド結合体の調製法を教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第：4,828,979号; 4,948,882号;
5,218,105号; 5,525,465号; 5,541,313号; 5,545,730号; 5,552,538号;
5,578,717号, 5,580,731号; 5,580,731号; 5,591,584号; 5,109,124号;
5,118,802号; 5,138,045号; 5,414,077号; 5,486,603号; 5,512,439号;
5,578,718号; 5,608,046号; 4,587,044号; 4,605,735号; 4,667,025号;
4,762,779号; 4,789,737号; 4,824,941号; 4,835,263号; 4,876,335号;
4,904,582号; 4,958,013号; 5,082,830号; 5,112,963号; 5,214,136号;
5,082,830号; 5,112,963号; 5,214,136号; 5,245,022号; 5,254,469号;
5,258,506号; 5,262,536号; 5,272,250号; 5,292,873号; 5,317,098号;
5,371,241号, 5,391,723号; 5,416,203号, 5,451,463号; 5,510,475号;
5,512,667号; 5,514,785号; 5,565,552号; 5,567,810号; 5,574,142号;
5,585,481号; 5,587,371号; 5,595,726号; 5,597,696号; 5,599,923号;
5,599,928号及び5,688,941号が挙げられ、その各々は、本明細書中に参照によって援用されている。
【０１２１】
本発明の組成物において使用されるオリゴマー化合物もまた、オリゴマー化合物の一方または両方の末端に一般に結合した一つ以上の安定化基を有するように修飾されて、例えばヌクレアーゼ安定性などの性質を高め得る。安定化基として挙げられるのは、キャップ構造である。「キャップ構造、または末端キャップ部分」によって意味されるのは、化学修飾であり、これはオリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれてきた（例えば本明細書中に参照によって援用されるWincottら及び国際特許公開第WO 97/26270号を参照）。かかる末端修飾は、末端核酸分子を有するオリゴマー化合物をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内での送達及び／または局在化において、役立ち得る。キャップは、5’末端（5’キャップ）もしくは3’末端（3’キャップ）、または両末端に存在し得る。制限のない例では、5’キャップとしては、逆方向無塩基残基（部分）、4’,5’-メチレンヌクレオチド、1-(β-D-エリトロフラノシル)ヌクレオチド、4’-チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、1,5-アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、L-ヌクレオチド、α-ヌクレオチド、修飾された塩基のヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、スレオ-ペントフラノシルヌクレオチド、非環式3’,4’-セコヌクレオチド、非環式3,4-ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式3,5-ジヒドロキシペンチルリボヌクレオチド、3’-3’-逆方向ヌクレオチド部分、3’-3’-逆方向無塩基部分、3’-2’-逆方向ヌクレオチド部分、3’-2’-逆方向無塩基部分、1,4-ブタンジオールホスフェート、3’-ホスホラミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、3’-ホスフェート、3’-ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または架橋もしくは非架橋メチルホスホネート部分が挙げられる（さらなる詳細は、本明細書中に参照によって援用されるWincottら, 国際特許公開第WO 97/26270号を参照）。
【０１２２】
本発明の特に好ましい3’-キャップ構造としては、例えば4’,5’-メチレンヌクレオチド、1-(β-D-エリトロフラノシル)ヌクレオチド、4’-チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、5’-アミノ-アルキルホスフェート、1,3-ジアミノ-2-プロピルホスフェート、3-アミノプロピルホスフェート、6-アミノヘキシルホスフェート、1,2-アミノドデシルホスフェート、ヒドロキシプロピルホスフェート、1,5-アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、L-ヌクレオチド、α-ヌクレオチド、修飾された塩基のヌクレオチド、ホスホロジチオエート、スレオ-ペントフラノシルヌクレオチド、非環式3’,4’-セコヌクレオチド、3,4-ジヒドロキシブチルヌクレオチド、3,5-ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、5’-5’-逆方向ヌクレオチド部分、5’-5’-逆方向無塩基部分、5’-ホスホラミデート、5’-ホスホロチオエート、1,4-ブタンジオールホスフェート、5’-アミノ、架橋及び／または非架橋5’-ホスホラミデート、ホスホロチオエート及び／またはホスホロジチオエート、架橋または非架橋メチルホスホネート、及び5’-メルカプト部分が挙げられる（さらなる詳細は、本明細書中に参照によって援用されるBeaucage及びTyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925を参照）。
【０１２３】
ヌクレアーゼ安定性を付与するためにオリゴマー化合物の一方または両方の末端をキャップするために用いられ得るさらなる3’及び5’-安定化基としては、2003年1月16日に公開された国際特許公開第WO 03/004602号に開示されたものが挙げられる。
【０１２４】
キメラ化合物
所定の化合物またはオリゴヌクレオチド模倣剤のすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際には前記修飾の一つ以上が、単一の化合物に、またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにさえ、組み込まれ得る。
【０１２５】
本発明はまた、キメラ化合物であるアンチセンス化合物または模倣剤を含む。「キメラ」アンチセンス化合物、または「キメラ」は、本発明の関係においては、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドであり、これは、各々少なくとも一つのモノマー単位からなる、少なくとも二つの化学的に異なる領域、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合におけるヌクレオチド、を含有する。
キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、従って、アンチセンス化合物の形態である。かかるオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解への増大した耐性、増大した細胞取り込み、増大した安定性、及び／または標的核酸に対する増大した結合親和性をオリゴヌクレオチドに付与するようにオリゴヌクレオチドが修飾された、少なくとも一つの化学的に異なる領域を典型的には含有する。オリゴヌクレオチドのさらなる化学的に異なる領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを切断し得る酵素の基質としてはたらき得る。例として、RNアーゼ Hは、RNA:DNA二本鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。RNアーゼ Hを活性化し、補充し、または誘発して、RNA標的の切断を生じる修飾は、その結果オリゴヌクレオチドに媒介された遺伝子発現の阻害の有効性を大いに高める。RNA:RNAハイブリッドの切断は、同様に、細胞及びウイルスのRNAの両方を切断するRNアーゼLなどのエンドリボヌクレアーゼの作用を通じて達成され得る。RNA標的の切断は、通常通り、ゲル電気泳動、及び必要に応じて、当該分野で公知の、関連する核酸ハイブリダイゼーション法によって、検出され得る。
【０１２６】
好ましいキメラオリゴヌクレオチドは、本明細書中の実施例に開示されたものである。特に好ましいキメラオリゴヌクレオチドは、配列番号：65, 26, 29, 及び35と呼ばれるもの、ならびに、表2, 3, 14及び15に示された、ならびに以下の実施例で特定されたキメラオリゴヌクレオチドである。好ましいsiRNAは、配列番号：238, 242, 243, 251及び252と呼ばれるもの、ならびに表11に示された、及び以下の実施例で特定されたものである。
【０１２７】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、二つ以上の、上記のようなオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、及び／またはオリゴヌクレオチド模倣剤の複合構造として形成され得る。キメラアンチセンス化合物は、いくつかの異なる型であり得る。これらとしては、連結されたヌクレオシドの「ギャップ」セグメントが、連結されたヌクレオシドの5’と3’「ウイング」セグメントとの間に位置する第一の型、ならびに「ギャップ」セグメントがキメラアンチセンス化合物の3’または5’末端のいずれかに位置する第二の「開放末端」型が挙げられる。第一の型の化合物はまた、当該分野で「ギャップマー」、またはギャップトオリゴヌクレオチドとして公知である。第二の型の化合物はまた、当該分野で「ヘミマー」または「ウイングマー」として公知である。かかる化合物はまた、当該分野でハイブリッドと呼ばれてきた。20ヌクレオチド長のギャップマーにおいては、ギャップまたはウイングは1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17及び18ヌクレオチド長であり得る。ある態様では、20ヌクレオチドのギャップマーは、6ヌクレオチド長のウイングが5’及び3’側の両方に配置された、8ヌクレオチド長のギャップからなる。別の態様では、20ヌクレオチドのギャップマーは、5ヌクレオチド長のウイングが5’及び3’側の両方に配置された、10ヌクレオチド長のギャップからなる。別の態様では、20ヌクレオチドのギャップマーは、4ヌクレオチド長のウイングが5’及び3’側の両方に配置された、12ヌクレオチド長のギャップからなる。さらなる態様では、20ヌクレオチドのギャップマーは、3ヌクレオチド長のウイングが5’及び3’側の両方に配置された、14ヌクレオチド長のギャップからなる。別の態様では、20ヌクレオチドのギャップマーは、2ヌクレオチド長のウイングが5’及び3’側の両方に配置された、16ヌクレオチド長のギャップからなる。さらなる態様では、20ヌクレオチドのギャップマーは、1ヌクレオチド長のウイングが5’及び3’末端の両方に配置された、18ヌクレオチド長のギャップからなる。あるいは、ウイングは種々の鎖長であり、例えば20ヌクレオチドのギャップマーは、6ヌクレオチドのウイングが一方の側（5’または3’）に、4ヌクレオチドのウイングが他方の側（5’または3’）に配置された、10ヌクレオチド長のギャップからなり得る。
【０１２８】
二つの化学的に異なる領域を有する「開放末端」キメラアンチセンス化合物であるヘミマーでは、20ヌクレオチド長の化合物内の第一の化学的に異なる領域、すなわちギャップ部分は、オリゴマー化合物の5’または3’末端のいずれかに位置し得、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18または19ヌクレオチド長であり得る。20ヌクレオチド長の化合物内の第二の化学的に異なる領域は、該化合物の3’末端に位置し得、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18または19ヌクレオチド長であり得る。例えば、20ヌクレオチドのヘミマーは、5’末端に10ヌクレオチドの第一の化学的に異なる領域、すなわちギャップ部分を、及び3’末端に10ヌクレオチドの第二の部分を有し得る。
【０１２９】
かかるハイブリッド構造の調製法を教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第：5,013,830号; 5,149,797号; 5,220,007号;
5,256,775号; 5,366,878号; 5,403,711号; 5,491,133号; 5,565,350号;
5,623,065号; 5,652,355号; 5,652,356号、及び5,700,922号が挙げられ、その各々は、本明細書中に参照によって全体が援用されている。
【０１３０】
G．製剤
本発明の化合物はまた、取り込み、分布及び／または吸収を助けるために、混合され、カプセルに入れられ、例えばリポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所、もしくは他の製剤などの他の分子、分子構造もしくは化合物の混合物と結合され、または他の場合には会合され得る。かかる取り込み、分布及び／または吸収を助ける製剤の調製法を教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第：5,108,921号;
5,354,844号; 5,416,016号; 5,459,127号; 5,521,291号; 5,543,158号;
5,547,932号; 5,583,020号; 5,591,721号; 4,426,330号; 4,534,899号;
5,013,556号; 5,108,921号; 5,213,804号; 5,227,170号; 5,264,221号;
5,356,633号; 5,395,619号; 5,416,016号; 5,417,978号; 5,462,854号;
5,469,854号; 5,512,295号; 5,527,528号; 5,534,259号; 5,543,152号;
5,556,948号; 5,580,575号及び5,595,756号が挙げられ、その各々は、本明細書中に参照によって援用されている。
【０１３１】
本発明のアンチセンス化合物は、任意の薬学的に許容され得る、塩、エステル、もしくはかかるエステルの塩、またはヒトを含む動物に投与すると、その生物学的に活性のある代謝産物もしくは残留物を（直接もしくは間接的に）提供し得る任意の他の化合物を含む。従って、例えば該記載はまた、本発明の化合物のプロドラッグ及び薬学的に許容され得る塩、かかるプロドラッグの薬学的に許容され得る塩、ならびに他の生物学的同等物に伸長される。
【０１３２】
用語「プロドラッグ」は、内因性酵素もしくは他の化学物質及び／または状態の作用により、身体もしくはその細胞内で活性のある形態（すなわち薬物）に変換される不活性な形態で調製される治療剤を示す。特に本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ型は、1993年12月9日に公開されたGosselinらの国際特許公開第WO 93/24510号、またはImbachらの国際特許公開第WO 94/26764号及び米国特許第5,770,713号に開示された方法に従って、SATE[(S-アセチル-2-チオエチル)ホスフェート]誘導体として調製される。
【０１３３】
用語「薬学的に許容され得る塩」は、本発明の化合物の生理学的に及び薬学的に許容され得る塩、すなわち親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望まれない毒物学的効果をそれに付与しない塩のことを言う。オリゴヌクレオチドについての、薬学的に許容され得る塩及びその使用の好ましい例は、さらに米国特許第6,287,860号に記載されており、これは本明細書中に全体が援用されている。
【０１３４】
薬学的に許容され得る塩基付加塩は、アルカリ及びアルカリ土類金属または有機アミンなどの金属またはアミンで形成される。陽イオンとして用いられる金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。適当なアミンの例は、N,N’-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、N-メチルグルカミン、及びプロカイン（例えばBergeら, 「Pharmaceutical Salts」, J. of Pharma Sci., 1977, 66, 1-19を参照）である。該酸性化合物の塩基付加塩は、通常の方法で、遊離酸の形態を十分な量の所望の塩基と接触させ、塩を生成させることにより、調製される。遊離酸の形態は、通常の方法で、塩の形態を酸と接触させ、遊離酸を単離することにより、再生され得る。遊離酸の形態は、極性溶媒への溶解度などのある物理的性質において、そのそれぞれの塩の形態とやや異なるが、他の点では塩は本発明の目的について、そのそれぞれの遊離酸と同等である。本明細書中に用いられる場合、「薬学的付加塩」は、本発明の組成物の成分の一つの酸の形態の、薬学的に許容され得る塩を含む。これらとしては、該アミンの有機または無機酸塩が挙げられる。好ましい酸性塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩、及びリン酸塩である。他の適当な薬学的に許容され得る塩は、当業者に周知であり、例えば、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、もしくはリン酸などの無機酸との、有機カルボン、スルホン、硫黄もしくは燐酸、またはN-置換スルファミン酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、2-フェノキシ安息香酸、2-アセトキシ安息香酸、エンボン酸、ニコチン酸、もしくはイソニコチン酸との、及びタンパク質の合成に必要とされる20のα-アミノ酸などの天然のアミノ酸、例えばグルタミン酸もしくはアスパラギン酸との、ならびにまたフェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン-1,2-ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4-メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ナフタレン-1,5-ジスルホン酸、2-もしくは3-ホスホグリセリン酸、グルコース-6-リン酸、N-シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成を伴う）との、またはアスコルビン酸などの他の酸有機化合物との、などの種々の無機及び有機酸の塩基性塩が挙げられる。化合物の薬学的に許容され得る塩はまた、薬学的に許容され得る陽イオンを用いて調製され得る。適当な薬学的に許容され得る陽イオンは、当業者に周知であり、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウム及び第四級アンモニウム陽イオンが挙げられる。炭酸塩または炭酸水素塩もまた可能である。
【０１３５】
オリゴヌクレオチドに関して、薬学的に許容され得る塩の好ましい例としては、限定されないが、（a）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミン及びスペルミジンなどのポリアミン、などの陽イオンで形成された塩、（b）無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などで形成された酸付加塩、（c）例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アルコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などの有機酸で形成された塩、ならびに（d）塩素、臭素、及びヨウ素などの元素の陰イオンから形成された塩が挙げられる。
【０１３６】
本発明はまた、本発明のアンチセンス化合物を含有する医薬組成物及び製剤を含む。本発明の医薬組成物は、局所または全身治療が望まれるかどうか、及び治療される部分により、いくつかの方法で投与され得る。投与は、局所的（眼、ならびに膣及び直腸送達を含む粘膜へを含む）、例えば噴霧器によることを含む粉末もしくはエアロゾルの吸入もしくは通気により肺に、気管内、鼻腔内、表皮に、ならびに経皮的）、経口または非経口であり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射もしくは点滴、または頭蓋内、例えば髄腔内もしくは脳室内投与が挙げられる。少なくとも一つの2’-O-メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、特に経口投与に有用であると考えられている。
【０１３７】
局所投与用医薬組成物及び製剤としては、経皮貼付剤、軟膏、ローション剤、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、噴霧剤、液体、及び粉末が挙げられ得る。従来の医薬担体、水性の、粉末または油性の基剤、増粘剤などが必要であり得るかまたは望まれ得る。コーティングされたコンドーム、手袋などもまた有用であり得る。
【０１３８】
好ましい局所製剤としては、本発明のオリゴヌクレオチドが脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、及び界面活性剤などの局所送達剤と混合されているものが挙げられる。好ましい脂質及びリポソームとしては、中性のもの（例えばジオレオイルホスファチジルDOPEエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPC、ジステアロイルホスファチジル（distearolyphosphatidyl）コリン）、負電荷のもの（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロールDMPG）、及び正電荷のもの（例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピルDOTAP及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOTMA）が挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドは、リポソーム内に封入され得るか、または特に正電荷のリポソームへ、それへの複合体を形成し得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、脂質に、特に正電荷の脂質に複合体化し得る。好ましい脂肪酸及びエステルとしては、限定されないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプラート、トリカプラート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル1-モノカプラート、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、もしくはC1-10のアルキルエステル（例えばイソプロピルミリステートであるIPM）、モノグリセリド、ジグリセリド、またはその薬学的に許容され得る塩が挙げられる。局所製剤は、米国特許第6,747,014号に詳細に記載されており、これは本明細書中に参照によって全体が援用されている。
【０１３９】
いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは経口投与により被験体に投与され得る。本発明の被験体は、動物を含む。動物の被験体は、マウス、ラット、イヌ、モルモット、ヒト、ヒト以外の霊長類、ネコ、またはブタなどの哺乳動物であり得る。ヒト以外の霊長類としては、サル、及びチンパンジーが挙げられる。適当な動物の被験体は、マウス、ラット、イヌ、ヒト以外の霊長類、ネコ、またはブタなどの実験動物であり得る。
【０１４０】
いくつかの態様では、被験体はヒトであり得る。ある態様では、本明細書中でより詳細に論じたように、被験体はヒトの患者であり得る。ある態様では、ヒトの患者の一つ以上の遺伝子の発現を調節することが必要であり得る。いくつかの特定の態様では、ヒトの患者の一つ以上の遺伝子の発現を阻害することが必要であり得る。特定の態様では、本明細書中に論じた治療の成果を得るために、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２を調節する、すなわち阻害するかまたは促進することが必要であり得る。
【０１４１】
いくつかの態様では、本発明による、非経口的ではない（例えば経口の）オリゴヌクレオチド製剤は、結果的にオリゴヌクレオチドの増大した生物学的利用能を生じる。かかる関係においては、用語「生物学的利用能」は、投与の特定の様式が薬物の送達に用いられた場合に、循環系（例えば血液、特に血漿）に到達する、投与された薬物の該部分の測定値のことを言う。増大した生物学的利用能は、投与の別の様式に比して、オリゴヌクレオチドを被験体の末梢血漿に送達する投与能力の特定の様式のことを言う。例えば、投与の非経口的ではない様式（例えば経口様式）が、薬物を被験体に導入するために用いられる場合、投与のかかる様式についての生物学的利用能は、投与の異なる様式、例えば静脈内投与様式と比較され得る。いくつかの態様では、非経口的ではない投与の後の、化合物の血漿濃度曲線下面積（AUC0）は、静脈内（i.v.）投与後の薬物の血漿濃度曲線下面積（AUCiv）で除され得、静脈内経路に対する、非経口的ではない経路により吸収された化合物の比を表す無次元の指数（相対的生物学的利用能であるRB）を与える。組成物の生物学的利用能は、他の組成物の生物学的利用能と比較して、最初の組成物の相対的生物学的利用能（RB1）が二番目の組成物の相対的生物学的利用能（RB2）より大きい場合、高いと言われる。
【０１４２】
一般に、薬物の最終作用位置が細胞内であっても、化合物の治療効果が、到達された血中濃度に関係する場合、生物学的利用能は治療効果と関係する（van Berge-Henegouwenら, Gastroenterol., 1977, 73, 300）。生物学的利用能の研究は、経口による服用の後、薬物の末梢血レベルの変化を測定することにより、薬物の腸管吸収の程度を測定するために用いられてきた（DiSanto, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第18版, Gennaro, 編, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990の76章, 1451-1458ページ）。
【０１４３】
一般に、（オリゴヌクレオチドを含有する）経口組成物の生物学的利用能は、その相対的生物学的利用能が、純粋なオリゴヌクレオチド、すなわち透過促進剤不在のオリゴヌクレオチドから実質上なる組成物の生物学的利用能より大きいとき、「増大」したと言われる。
【０１４４】
器官の生物学的利用能は、器官における化合物の濃度のことを言う。器官の生物学的利用能は、被験体において、全身X線撮影法によるなど、いくつかの手段により、測定され得る。器官の生物学的利用能は、本明細書中でより詳細に論じたように、オリゴヌクレオチドへの一つ以上の修飾により、一つ以上の担体化合物または賦形剤などの使用により、改変、例えば増大され得る。一般に、生物学的利用能の増大の結果、器官の生物学的利用能が増大する。
【０１４５】
本発明による経口オリゴヌクレオチド組成物は、「吸収促進剤」または単に「透過促進剤」としても公知の一つ以上の「粘膜透過促進剤」を含有し得る。したがって、本発明のいくつかの態様は、少なくとも一つの透過促進剤と組み合わせた、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを含む。一般に、透過促進剤は、所望の投与様式と関係する粘膜、例えば腸上皮膜を横切る薬物の輸送を促進する物質である。したがって、オリゴヌクレオチドの活性を妨害することなく、かつオリゴヌクレオチドが毒性、過敏、またはアレルギー反応などの許容され得ない程度の副作用なしに動物の体内に導入され得るようにオリゴヌクレオチドの取り込みを促進する、一つ以上の透過促進剤を選択することが望ましい。
【０１４６】
本発明の態様は、一つ以上の薬学的に許容され得る透過促進剤を含有する組成物及びかかる組成物の使用方法を提供し、結果として投与の非経口的ではない様式により投与されるオリゴヌクレオチドの生物学的利用能が向上する。これまで、ある透過促進剤が、ある薬物の生物学的利用能を向上させるために用いられてきた。Muranishi, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1及びLeeら, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems, 1991, 8, 91を参照。オリゴヌクレオチドの取り込み及び送達は、透過促進剤のいくつかの異なる種類の使用によって、非経口的ではない手段により投与される場合でさえ、大きく改善され得ることが見出されてきた。
【０１４７】
いくつかの態様では、非経口的ではない投与のための組成物は、天然のオリゴヌクレオチド（すなわち完全なホスホジエステルデオキシリボシルまたは完全なホスホジエステルリボシルオリゴヌクレオチド）への一つ以上の修飾を含む。かかる修飾は、結合親和性、ヌクレアーゼ安定性、細胞もしくは組織透過性、組織分布、または他の生物学的もしくは薬物動態学的性質を増大し得る。本明細書中でオリゴヌクレオチドの化学的性質に関してより詳細に論じたように、一般に修飾は、塩基、リンカー、または糖になされ得る。本発明のいくつかの態様では、被験体への投与のための組成物、及び特に動物の（ヒトまたは非ヒト）被験体への投与のための経口組成物は、親和性、安定性、組織分布、または他の生物学的性質を高めるための一つ以上の修飾を有する修飾されたオリゴヌクレオチドを含有する。
【０１４８】
適当な修飾されたリンカーとしては、ホスホロチオエートリンカーが挙げられる。本発明によるいくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つのホスホロチオエートリンカーを有する。ホスホロチオエートリンカーは、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ安定性、ならびに血漿タンパク質結合特性を与える。ヌクレアーゼ安定性は、オリゴヌクレオチドのインビボの寿命を増大するのに有用であり、一方血漿タンパク質の結合は腎排泄によるオリゴヌクレオチドの初回通過クリアランスの速度を減少させる。本発明によるいくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは少なくとも二つのホスホロチオエートリンカーを有する。オリゴヌクレオチドが正確にn個のヌクレオシドを有するいくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは1〜n-1個のホスホロチオエート結合を有する。オリゴヌクレオチドが正確にn個のヌクレオシドを有するいくつかの態様では、オリゴヌクレオチドはn-1個のホスホロチオエート結合を有する。オリゴヌクレオチドが正確にn個のヌクレオシドを有しnが偶数である他の態様では、オリゴヌクレオチドは1からn/2個のホスホロチオエート結合、またはnが奇数の場合、1から(n-1)/2個のホスホロチオエート結合を有する。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは交互のホスホジエステル（PO）及びホスホロチオエート（PS）結合を有する。他の態様では、オリゴヌクレオチドは、二つ以上の連続したPO結合の少なくとも一つの一続き、及び二つ以上のPS結合の少なくとも一つの一続きを有する。他の態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つのPS結合に分断された、PO結合の少なくとも二つの一続きを有する。
【０１４９】
いくつかの態様では、ヌクレオシドの少なくとも一つが、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性、またはいくつかの他の有益な生物学的性質を糖に付与する修飾により、リボシル糖単位で修飾される。いくつかの場合には、糖修飾は2’修飾を含み、例えばリボシル糖の2’-OHが交換されるかまたは置換される。2’-OHの適当な交換としては、2’-F及び2’-アラビノ-Fが挙げられる。OHの適当な置換としては、2’-O-アルキル、例えば2-O-メチル、及び2’-O-置換アルキル、例えば2’-O-メトキシエチル、2’-NH2、2’-O-アミノプロピルなどが挙げられる。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つの2’修飾を含む。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも二つの2’修飾を含む。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、各末端に少なくとも一つの2’修飾を有する（すなわち3’及び5’末端のヌクレオシド各々が同一のまたは異なる2’修飾を有する）。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの各末端に少なくとも二つの連続した2’修飾を有する。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つのデオキシヌクレオシドをさらに含有する。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズし得るRNAのRNアーゼ（例えばRNアーゼ H）切断を活性化し得るような、一続きのデオキシヌクレオシドを含有する。いくつかの態様では、RNアーゼに媒介されたRNAの切断を活性化し得る一続きのデオキシヌクレオシドは、約6〜約16個、例えば約8〜約16個の連続したデオキシヌクレオシドを含有する。さらなる態様では、オリゴヌクレオチドは、RNA:RNAハイブリッドに作用するdsRNアーゼ酵素による切断を誘発し得る。
【０１５０】
本発明のオリゴヌクレオチド組成物は、限定されないが、錠剤、カプセル、液体シロップ剤、ソフトゲル、坐剤、及び浣腸剤などの種々の投薬形態で製剤され得る。用語「食事性送達」は、例えば経口、直腸、内視鏡的、及び舌下／口腔内投与を含む。かかる投与様式に共通する必要条件は、消化管の一部またはすべてにわたる吸収、及びかかる投与がなされたオリゴヌクレオチドまたはその模倣剤の効率的な粘膜透過を要することである。
【０１５１】
口腔粘膜を経た薬物の送達は、口腔内及び舌下投与の場合のように、いくつかの望ましい特徴を有し、多くの場合において、薬物の血漿濃度のより急速な増大を含む（Harvey, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第18版, Gennaro, 編, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990の35章, 711ページ）。
【０１５２】
内視鏡検査法は消化管の内部へ直接的に薬物を送達するために用いられ得る。例えば内視鏡的逆行性膀胱膵管造影（endoscopic retrograde cystopancreatography）（ERCP）は、拡張された胃内視鏡検査を利用し、胆道及び膵管への選択的接近を可能にする（Hirahataら, Gan To Kagaku Ryoho, 1992, 19(増刊号10), 1591）。リポソーム製剤を含む医薬組成物は、内視鏡的手段により例えば十二指腸（Somogyiら, Pharm. Res., 1995, 12, 149）または胃粘膜下組織（Akamoら, Japanese J. Cancer Res., 1994, 85, 652）などの消化管の部分に直接的に送達され得る。胃洗浄装置（Inoueら, Artif. Organs, 1997, 21, 28）及び経皮内視鏡的栄養補給装置（Penningtonら, Ailment Pharmacol. Ther., 1995, 9, 471）もまた、医薬組成物の直接的食事性送達のために用いられ得る。
【０１５３】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド製剤は肛門から直腸または下部腸へと投与され得る。直腸坐薬、鬱滞浣腸または直腸カテーテルはこの目的のために使用され得、かつ別の方法で患者のコンプライアンス達成が難しい場合に好まれ得る（例えば小児および老人への適用、または患者が嘔吐もしくは意識不明である場合）。直腸投与は口腔経路と比較してより迅速かつ高い血液レベルを生じ得る（Harvey, Remington’s Pharmaceutical Sciencesの35章, 第18版, Gennaro,編, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, 711ページ）。直腸から吸収される薬物の約50％は肝臓を恐らく迂回するので、この経路による投与は初期通過代謝の可能性をかなり低くする（Benetら, Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics第1章, 第9版,Hardman ら, 編, McGraw-Hill, New York, NY, 1996）。
【０１５４】
いくつかの態様は、粘膜および上皮膜を横切るオリゴヌクレオチドおよび他の核酸の輸送をもたらすために、様々な浸透促進剤を使用する。浸透促進剤は５つの大きいカテゴリー、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤および非キレート非界面活性剤、の1つに属するものとして分類され得る（Leeら, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 92ページ）。よっていくつかの態様は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤および非キレート界面活性剤からなる群の少なくとも１つのメンバーを含有する経口オリゴヌクレオチド組成物を含む。さらなる態様は、少なくとも1つの脂肪酸、例えばカプリン酸もしくはラウリン酸、またはそれらの化合物もしくは塩、を含有する経口オリゴヌクレオチド組成物を含む。他の態様は、オリゴヌクレオチドの経口生物学的利用能を増大させる方法を含み、該方法はオリゴヌクレオチドおよび少なくとも1つの浸透促進剤の同時投与を含む。
【０１５５】
経口オリゴヌクレオチド組成物に添加され得る他の賦形剤としては、界面活性剤（または「表面活性剤」）が挙げられる。これらは、水溶液中に溶けている場合、溶液の表面張力または水溶液と別の溶液との間の界面張力を低くし、消化器粘膜および他の上皮膜を通じてのオリゴヌクレオチドの吸収促進を生じさせる化学物質である。胆汁酸塩および脂肪酸に加えて界面活性剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−20−セチルエーテル（Lee ら, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 92ページ）;ならびにFC-43（Takahashiら, J. Pharm. Phamacol., 1988, 40, 252）等の水素をフッ素で置換した乳状液が挙げられる。
【０１５６】
浸透促進剤として作用し、かつ本発明の組成物として使用され得る脂肪酸および脂肪酸誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（n-デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸塩、トリカプリン酸塩、モノオレイン（1-モノオレイル-ラセミ-グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、1-モノカプリン酸グリセリン、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリンならびにそれらのモノおよびジグリセリドおよび/またはそれらの生理学的に許容され得る塩（すなわち、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノール酸塩など）が挙げられる（Leeら, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 92ページ; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990,7,1; El-haririら, J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651）。
【０１５７】
様々な胆汁酸塩はまた、薬物の取り込みおよび生物学的利用能を促進する浸透促進剤としての機能を果たす。胆汁の生理学上の役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げられる（Brunton, Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics第38章, 第9版, Hardman ら, 編, McGraw-Hill, New York, NY, 1996, 934-935ページ）。種々の天然胆汁酸塩およびそれらの合成誘導体は浸透促進剤として作用する。したがって用語「胆汁酸塩」としては、胆汁の任意の天然成分ならびにその任意の合成誘導体が挙げられる。本発明の胆汁酸塩としては、例えば、コール酸（またはその薬学的に許容され得るナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（CDCA, ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（UDCA）、タウロ-24,25-ジヒドロフシジン酸ナトリウム（STDHF）、グリコジヒドロフジシン酸ナトリウムならびにポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル（POE）が挙げられる（Leeら, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 92ページ; Swinyard, Remington’s Pharmaceutical Sciences第39章, 第18版, Gennaro,編, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, 782-783ページ; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990,7,1; Yamamotoら, J. Pharm. Exp.Ther., 1992, 263, 25; Yamashitaら, J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579）。
【０１５８】
いくつかの態様において、本発明の浸透促進剤は、浸透促進化合物の混合物である。かかる浸透混合物の1つは、カプリンおよび/もしくはラウリン酸またはその塩、例えばナトリウム、を有するUDCA（および/またはCDCA）である。かかる混合物は、特に腸粘膜において、粘膜を横切る生物学的に活性のある物質の送達を増大させるのに有用である。他の浸透促進剤混合物は、5〜95％のカプリンおよび/もしくはラウリン酸とともに、約5〜95％の胆汁酸塩もしくは塩UDCAおよび/またはCDCAを含む。特定の浸透促進剤は、各々の比率が約1:2:2となるUDCAのナトリウム塩、カプリン酸およびラウリン酸の混合物である。別のかかる浸透促進剤は、比率0.01:1から1:0.01（モル基準）のカプリン酸およびラウリン酸（またはそれらの塩）の混合物である。特定の態様において、カプリン酸およびラウリン酸は、例えば約0.1:1から約1:0.1、特に約0.5:1から約1:0.5のモル比率で存在する。
【０１５９】
他の賦形剤としてはキレート剤、すなわち、金属イオンと複合体を形成することにより溶液から金属イオンを除去し、消化器粘膜および他の粘膜を通じてのオリゴヌクレオチドの吸収促進を生じさせる化合物が挙げられる。本発明のDNA様オリゴヌクレオチドを含有する組成物における浸透促進剤としてのそれらの使用に関して、最も特徴付けられたDNAヌクレアーゼは触媒作用に二価金属イオンを必要とし、そのためキレート剤によって阻害されるので、キレート剤はまたデオキシリボヌクレアーゼ阻害剤として役立つさらなる有利な点を含む（Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315）。本発明のキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(EDTA)、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、5-メトキシサリチル酸ナトリウムおよびホモバニリン酸ナトリウム）、コラーゲンのN-アシル誘導体、ラウリン-9ならびにベータジケトン（エナミン）のN-アミノアシル誘導体が挙げられるが、これらに限定されない（Leeら, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 92ページ; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990,7,1;  Buurら., J.Control Rel., 1990, 14, 43）。
【０１６０】
本明細書で用いられる場合、非キレート非界面活性剤の浸透促進剤は、キレート剤または界面活性剤としての微々たる活性を表すが、しかしそれにもかかわらず、消化器のおよび他の粘膜を通じてのオリゴヌクレオチドの吸収を促進させる化合物として定義され得る（Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990,7,1）。この種類の浸透促進剤としては、不飽和環状尿素、1-アルキル-および1-アルケニルアザシクロ-アルカノン誘導体（Leeら, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 92ページ）；ならびにジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾン等の非ステロイド性抗炎症性剤（Yamashitaら, J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１６１】
いくつかの態様において、経口送達のためのオリゴヌクレオチド組成物は、少なくとも2つの別々の相を含み、その相は粒子、カプセル、ゲルカプセル、ミクロスフィア等を含み得る。各相は1つ以上のオリゴヌクレオチド、浸透促進剤、界面活性剤、生体接着剤、発泡剤、または他の補助剤、賦形剤もしくは希釈剤を含み得る。いくつかの態様において、ある相は、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドおよび少なくとも1つの浸透促進剤を含む。いくつかの態様において、第1の相は少なくとも1つのオリゴヌクレオチドおよび少なくとも1つの浸透促進剤を含み、一方第2の相は少なくとも1つの浸透促進剤を含む。いくつかの態様において、第1の相は少なくとも1つのオリゴヌクレオチドおよび少なくとも1つの浸透促進剤を含み、一方第2の相は少なくとも1つの浸透促進剤を含むが実質的にはオリゴヌクレオチドを含まない。いくつかの態様において、少なくとも1つの相は、剤皮もしくはマトリックス等、その相の内容物の放出を遅延させる少なくとも1つの分解遅延剤と混合される。いくつかの態様において、第1の相は少なくとも1つのオリゴヌクレオチドおよび少なくとも1つの浸透促進剤を含み、一方第2の相は少なくとも1つの浸透促進剤および1つの放出遅延剤を含む。特定の態様において、経口オリゴヌクレオチド組成物は、オリゴヌクレオチドおよび浸透促進剤を含有する粒子を含んでいる第1の相、ならびに放出遅延剤で覆われかつ浸透促進剤を含有する粒子を含んでいる第2の相を含む。
【０１６２】
細胞レベルでのオリゴヌクレオチドの取り込み促進剤はまた、本発明の医薬組成物、治療組成物および他の組成物に添加され得る。例えば、LIPOFECTINTM試薬（Junichiら,米国特許第5,705,188号）等のカチオン脂質、カチオングリセロール誘導体、およびポリリシン（Lolloら,国際特許公開WO 97/30731号）等のポリカチオン分子が使用され得る。
【０１６３】
1種以上の核酸を動物に送達するために、「薬学的担体」または「賦形剤」は薬学的に許容され得る溶媒、懸濁剤または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルであり得る。賦形剤は液体もしくは固体であり得、オリゴヌクレオチドおよび所定の医薬組成物のもう一方の構成要素と組み合わせる場合、所望の量、粘度等を供給するために、投与の計画的方法を考慮に入れて選択される。典型的な薬学的担体としては、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース等）；充填剤（例えば、乳糖および他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリル酸塩またはリン酸水素カルシウム等）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、EXPLOTABTM）；ならびに湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６４】
経口オリゴヌクレオチド組成物は、その分野で確立された使用レベルで、医薬組成物中に従来見出される他の補助成分をさらに含み得る。したがって、例えば、該組成物は、かゆみ止め、収斂剤、局所麻酔薬もしくは抗炎症剤等の、さらなる、適合性があり、薬学的に活性のある物質を含み得るか、または、染料、矯味矯臭剤、防腐剤、抗酸化剤、混濁剤、増粘剤および安定剤等の、本発明の組成物の様々な投薬形態の物理的な製剤化において有用なさらなる物質を含み得る。しかしながら、かかる物質は添加された場合、本発明の組成物の構成要素の生物学的活性を過度に干渉してはならない。
【０１６５】
非経口、髄膜下もしくは心室内投与のための組成物および製剤としては、緩衝剤、希釈剤ならびに浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容され得る担体もしくは賦形剤等で、しかしこれらに限定されない他の適切な添加剤をまた含み得る滅菌水溶液が挙げられ得る。
【０１６６】
本発明の医薬製剤は、従来単位投薬形態でもたらされ得るが、製薬産業で周知の従来技術にしたがって調製され得る。かかる技術としては、活性成分を薬学的担体または賦形剤と関連させる工程が挙げられる。一般的に製剤は、活性成分を液体担体もしくは微粉化した固体担体または両方と一様にかつ緻密に関連させ、次いで必要に応じて生成物を形作ることで調製される。
【０１６７】
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ剤、ソフトゲル、坐薬および浣腸等の、しかしこれらに限定されない任意の可能性のある多くの投薬形態へと製剤化され得る。本発明の組成物はまた、水性媒体、非水性媒体または混合媒体における懸濁液として製剤化され得る。水性懸濁液はさらに、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランを含む懸濁液の粘性を増大させる物質を含み得る。懸濁液はまた安定剤を含み得る。
【０１６８】
本発明の医薬組成物としては、泡、溶液、乳状液およびリポソーム含有製剤が挙げられるが、これらに限定されない。これらの組成物は、前もって形成された液体、自己乳化する固体および自己乳化する半固体を含むが、これらに限定されない様々な構成要素から生成され得る。本発明の医薬組成物および製剤は、1つ以上の浸透促進剤、担体、賦形剤、または他の活性もしくは不活性成分を含み得る。
【０１６９】
本発明のある態様において、医薬組成物は泡として製剤化されかつ使用され得る。薬学的泡としては、乳状液、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリーおよびリポソーム等の製剤が挙げられるが、これらに限定されない。基本的に性質が似ているが、これらの製剤は最終生成物の構成要素および粘度が異なる。かかる組成物および製剤の調製法は、一般的に薬学および製剤の分野における当業者に公知であり、本発明の組成物の製剤に適用され得る。
【０１７０】
本発明の化合物は、乳状液として調製および製剤化され得る。乳状液は、通常直径0.1μmを超える小滴の形で別の液体の中に分散しているある液体の一般的に不均一な系である（Idson, Pharmaceutical Dosage Forms中, Lieberman, RiegerおよびBanker(編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1巻, 199ページ; Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms中, Lieberman, RiegerおよびBanker(編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1巻, 245ページ; Pharmaceutical Dosage Forms中のBlock, Lieberman, RiegerおよびBanker(編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第2巻, 335ページ; Higuchiら, Remington’s Pharmaceutical Sciences中, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, 301ページ）。乳状液は大抵、緊密に混合しかつ各々が分散している2つの不混和性混合液相を含む二相の系である。一般的に乳状液は、油中水滴型（w/o）または水中油滴型（o/w）のいずれかの種類であり得る。水相が微粉化されて微小な小滴として油性相の塊に分散している場合、結果として生じる組成物は油中水滴型（w/o）乳状液と呼ばれる。あるいは、油性相が微粉化されて微小な小滴として水相の塊に分散している場合、結果として生じる組成物は水中油滴型（o/w）乳状液と呼ばれる。水相、油性相もしくは分離相それ自体のいずれかの溶液として存在し得る分散相および活性薬物に加え、乳状液はさらなる構成要素を含み得る。乳化剤、安定剤、染料および抗酸化剤等の薬学的賦形剤はまた、必要に応じて乳状液中に存在し得る。薬学的乳状液はまた、例えば、油中水中油滴型(o/w/o)および水中油中水滴型(w/o/w)乳状液の場合等の、2つより多い相を含む複合的乳状液であり得る。かかる複合製剤は大抵、単純な二成分の乳状液では提供しない確かな利点を提供する。o/w乳状液の個々の油滴が小水滴を閉じ込める複合的乳状液は、w/o/w乳状液を構成する。同様に、油性連続相の中で安定した水の小球内に閉じ込められる油滴の系は、o/w/o乳状液を提供する。
【０１７１】
大抵、乳状液の分散相または不連続相は、外相または連続相の中に十分分散し、乳化剤または製剤の粘性によってこの形で維持される。乳状液様式の軟膏基剤およびクリームの場合のように、乳状液のいずれの相も半固体または固体であり得る。乳状液を安定化させる他の手段は、乳状液のいずれの相にも組み込まれ得る乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は4つのカテゴリー、合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微細分散した固体に大きく分類され得る（Idson, Pharmaceutical Dosage Forms中, Lieberman, RiegerおよびBanker(編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1巻, 199ページ）。
【０１７２】
合成界面活性剤は、表面活性剤としても公知であるが、乳状液の製剤化において広範囲な適用可能性を提供しており、かつ文献においても検討されている（Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms中, Lieberman, RiegerおよびBanker(編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1巻, 285ページ; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms中, Lieberman, RiegerおよびBanker(編), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, 第1巻, 199ページ）。界面活性剤は一般的に両親媒性であり、親水性部分および疎水性部分を含む。界面活性剤の親水性の疎水性に対する比率は、親水性/親油性バランス（HLB）と称されており、製剤の調製において界面活性剤の分類および選択での貴重なツールである。界面活性剤は、親水基の性質：非イオン、陰イオン、陽イオンおよび両性、に基づいた異なる種類に分類され得る（Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms中, Lieberman, RiegerおよびBanker(編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1巻, 285ページ）。
【０１７３】
乳状液製剤に用いられる天然乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、リン脂質、レシチンおよびアカシアが挙げられる。吸収基剤は、無水ラノリンおよび親水性ワセリン等のように、水を吸収してw/o乳状液を形成し得るが、それでも半固体の状態を依然として維持するような親水性性質を有する。微粉化された固体はまた、特に界面活性剤との組み合わせにおいておよび粘性のある調製物において優良な乳化剤として使用されてきた。これらには重金属水酸化物等の極性無機固体、ベントナイト、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸マグネシウムアルミニウム等の非膨潤粘土、色素ならびに炭素もしくはトリステアリン酸グリセリル等の非極性固体が含まれる。
【０１７４】
幅広い種類の非乳化剤物質はまた乳状液製剤にも含まれ、乳状液の性質の一因となる。これらには脂肪、油、蝋、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水性コロイド、防腐剤および抗酸化剤が含まれる（Block, Pharmaceutical Dosage Forms中, Lieberman, RiegerおよびBanker(編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1巻, 335ページ; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms中, Lieberman, RiegerおよびBanker(編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1巻, 199ページ）。
【０１７５】
親水性コロイドまたは親水コロイドとしては、多糖（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーガム、カラヤガムおよびトラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテルおよびカルボキシビニルポリマー）等の天然ゴムおよび合成ポリマーが挙げられる。これらは、水中で分散または膨潤して、分散相小滴を取り囲む頑丈な界面薄膜を形成することおよび外相の粘性を増大させることで乳状液を安定化させるコロイド溶液を形成する。
【０１７６】
乳状液は大抵、微生物の成長を容易に支え得る炭水化物、タンパク質、ステロールおよびリン脂質等の多数の成分を含むので、これらの製剤は大抵防腐剤を混合する。乳状液製剤に含まれる、一般に使用される防腐剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、p-ヒドロキシ安息香酸エステル、およびホウ酸が挙げられる。酸化防止剤もまた一般的に製剤の劣化防止のため乳状液製剤へ添加される。使用される酸化防止剤は、トコフェロール、アルキル没食子酸塩、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン等のフリーラジカルスカベンジャー、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウム等の還元剤、ならびにクエン酸、酒石酸およびレシチン等の酸化防止共力剤であり得る。
【０１７７】
皮膚経路、経口経路および非経口経路を介しての乳状液製剤の適用ならびにそれらの製造方法は、文献において検討されている（Idson, Pharmaceutical Dosage Forms中, Lieberman, RiegerおよびBanker(編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1巻, 199ページ）。経口送達のための乳状液製剤は、製剤化の容易さ、吸収および生物学的利用能の見地からの効力という理由のために非常に広範囲で使用されてきた（Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms中, Lieberman, RiegerおよびBanker(編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1巻, 245ページ; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms中, Lieberman, RiegerおよびBanker(編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1巻, 199ページ）。鉱油ベースの緩下薬、油溶性ビタミンおよび高脂肪栄養調製物は、o/w乳状液として一般的に経口より投与されてきた物質の一つである。本発明のある態様において、オリゴヌクレオチドの組成物はマイクロエマルジョンとして製剤化される。マイクロエマルジョンは、単一の光学的に等方性でありかつ熱力学的に安定な溶液である水、油および両親媒性の化合物の系として定義され得る（Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms中, Lieberman, RiegerおよびBanker(編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1巻, 245ページ）。一般的にマイクロエマルジョンは、まず水性界面活性剤溶液中に油を分散させ、次に十分な量の第4の構成要素、一般的に中間鎖長アルコール、を添加して透明な系を形成することによって調製される系である。したがって、マイクロエマルジョンもまた、熱力学的に安定し、表面活性分子の界面薄膜により安定化される2つの不混和性液の等方的に透明な分散として記載されている（LeungおよびShah, Controlled Release of Drugs中: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M.,編, 1989, VCH Publishers, New York, 185〜215ページ）。マイクロエマルジョンは一般に、油、水、界面活性剤、副界面活性剤および電解液を含む3つ〜5つの構成要素の組み合わせを介して調製される。マイクロエマルジョンが油中水滴（w/o）型であるか水中油滴（o/w）型であるかは、使用される油および界面活性剤の性質ならびに界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的パッキングに依存する（Schott, Remington’s Pharmaceutical Sciences中, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, 271ページ）。
【０１７８】
状態図を利用する現象学的アプローチは、広範囲で研究されており、マイクロエマルジョンの製剤化方法の幅広い知識を当業者にもたらしている（Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms中, Lieberman, RiegerおよびBanker(編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1巻, 245ページ； Block, Pharmaceutical Dosage Forms中, Lieberman, RiegerおよびBanker(編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1巻, 335ページ）。従来の乳状液と比較して、マイクロエマルジョンは、自然に形成される熱力学的に安定な小滴の製剤において、水不溶性の薬物を可溶化する利点を提供する。
【０１７９】
マイクロエマルジョンの調製に使用される界面活性剤としては、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Brij96、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、モノラウリン酸テトラグリセリン（ML310）、モノオレイン酸テトラグリセリン（MO310）、モノオレイン酸ヘキサグリセリン（PO310）、ペンタオレイン酸ヘキサグリセリン（PO500）、モノカプリン酸デカグリセリン（MCA750）、モノオレイン酸デカグリセリン（MO750）、セキオレイン酸デカグリセリン（SO750）、デカオレイン酸デカグリセリン（DAO750）が、単独でまたは副界面活性剤との組み合わせで挙げられるがこれらに限定されない。副界面活性剤は、一般的にエタノール、1-プロパノール、および1-ブタノール等の短鎖アルコールであるが、界面活性剤薄膜への浸透によっておよびその結果としての界面活性剤分子間に発生する空間が原因の不規則な薄膜の形成によって、界面流動性を増大させる役割を果たす。しかしながらマイクロエマルジョンは、副界面活性剤を使用せずに調製され得、アルコール不含自己乳化マイクロエマルジョン系は、当該分野で公知である。水相は、一般的に、水、薬物の水溶液、グリセリン、PEG300、PEG400、ポリグリセリン、プロピレングリコールおよびエチレングリコールの誘導体であり得るが、これらに限定されない。油相としては、Captex300、Captex355、Capmul MCM、脂肪酸エステル、中間鎖（C8〜C12）モノ、ジ、およびトリグリセリド、ポリオキシエチレン化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化C8-C10グリセリド、植物油およびシリコーン油等の物質が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１８０】
マイクロエマルジョンは特に、薬物可溶化の見地および薬物の吸収促進から重要である。脂質ベースのマイクロエマルジョン（o/wおよびw/oの両方）は、ペプチドを含む薬物の経口生物学的利用能を増大させるために提案されている（Constantinidesら, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385〜1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205）。マイクロエマルジョンは、向上した薬物可溶化、酵素加水分解からの薬物の保護、膜流動および浸透性の、界面活性剤に誘導される変化のための薬物吸収の可能な促進、調製の容易さ、固体投薬形態にまさる経口投与の容易さ、向上した臨床的効力および減少した毒性の利点を提供する（Constantinidesら, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385； Hoら, J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138〜143）。大抵マイクロエマルジョンは、その構成要素が周囲温度で合わせられる場合、自然に形成し得る。これは特に、熱不安定性の薬物、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドの製剤化の場合、有利であり得る。マイクロエマルジョンはまた、美容的および薬学的の両方の適用において、活性成分の経皮送達にも効果的である。本発明のマイクロエマルジョン組成物および製剤は、胃腸管からのオリゴヌクレオチドの全身性の吸収の増大を促進し、ならびに胃腸管、膣、口腔前庭および他の投与域内でのオリゴヌクレオチドの局所細胞取り込みを向上させるであろうと期待される。
【０１８１】
本発明のマイクロエマルジョンはまた、製剤の性質を向上させるために、ならびに本発明のオリゴヌクレオチドおよび核酸の吸収を促進するために、モノステアリン酸ソルビタン（Grill 3）、ラブラソールおよび浸透促進剤等の、さらなる成分および添加剤を含み得る。本発明のマイクロエマルジョンに使用される浸透促進剤は、本明細書中に記載される5つの大きなカテゴリーの1つに属するものとして分類され得る。
【０１８２】
薬物の製剤化において研究されかつ使用されているマイクロエマルジョンの他にも多数の組織化された界面活性剤構造が存在する。該構造としては、単分子層、ミセル、二分子層および小胞が挙げられる。リポソーム等の小胞には、薬物送達の見地からそれらが提供するその特異性および作用の持続時間のために、大きな関心が引き付けられている。
【０１８３】
本発明の製剤としては、リポソーム製剤が挙げられる。本発明で使用する場合、用語「リポソーム」は、球状の二分子層または複数の二分子層に配置された両親媒性脂質から構成される小胞を意味する。リポソームは、脂肪親和物質から形成される膜および送達される組成物を含有する水性の内部を有する単層状または多層状の小胞である。
【０１８４】
無傷な哺乳類の皮膚を横切るために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下において、各々が50nm未満の直径を有する一連の微細孔を通過しなければならない。したがって、高度に変形可能でかつかかる微細孔の通過が可能なリポソームを使用することが望ましい。
【０１８５】
リポソームのさらなる利点としては：天然のリン脂質から得られるリポソームは生体適合性がありかつ生分解性である；リポソームは広範囲な水および脂質可溶性薬物を取り込み得る；およびリポソームは、その内部区画に封入された薬物を代謝および分解から保護し得る、が挙げられる（Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms中, Lieberman, RiegerおよびBanker(編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1巻, 245ページ）。リポソーム製剤の調製化において考慮すべき重要なことは、脂質表面電荷、小胞の大きさおよびリポソームの水性の体積である。
【０１８６】
リポソームは、活性成分の作用部位への移動および送達に有用である。リポソームの膜は構造的に生体膜と類似しているので、リポソームが組織に適用される場合、リポソームは細胞膜と融合し始める。リポソームおよび細胞の融合が進むとき、リポソームの内容物は、活性剤が作用し得る細胞内に移される。
【０１８７】
リポソーム製剤は、多数の薬物の送達様式として広範囲な研究の焦点となっている。局所投与のために、リポソームは他の製剤にまさっていくつかの利点を提供する証拠が増大している。かかる利点としては、投与された薬物の高度な全身性吸収に関係のある副作用の減少、所望の標的での、投与された薬物の蓄積の増大、ならびに親水性および疎水性両方の、広範囲な種類の薬物を皮膚へ投与する能力が挙げられる。
【０１８８】
いくつかの報告は、リポソームの、高分子量DNAを含む薬剤を皮膚へ送達する能力を詳述している。鎮痛薬、抗体、ホルモンおよび高分子量DNAを含む化合物が皮膚へ投与されている。適用の大部分は、表皮上層の標的化を生じた。
【０１８９】
リポソームは2つの広範囲な種類、陽イオンおよび非陽イオン、に分類され、両方ともDNA、RNAまたは任意の核酸ベースの構築物を細胞に送達するのに有用である。陽イオン性リポソームは、負電荷を有するDNA分子と相互作用して安定した複合体を形成する、正電荷を有するリポソームである。正電荷を有するDNA/リポソーム複合体は、負電荷を有する細胞表面と結合し、エンドソームに取り入れられる。エンドソーム内部の酸性pHのために、リポソームはその内容物を細胞質に放出しながら破裂する（Wangら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980〜985）。
【０１９０】
pH感受性または負電荷を有し、非陽イオン性リポソームとしても公知のリポソームは、DNAと複合体を形成するよりもDNAを取り込む。DNAおよび脂質の両方とも同様に帯電しているので、複合体形成よりも反発が生じる。それにもかかわらず、いくらかのDNAはこれらリポソームの水性内部に取り込まれる。pH感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするDNAを培養物中の細胞単層へ送達するのに使用されている。外因性遺伝子の発現が標的の細胞内で検出された（Zhouら, Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269〜274）。
【０１９１】
リポソーム組成物のある主な型としては、他の天然由来のホスファチジルコリン以外にリン脂質が挙げられる。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）から形成され得る。陰イオン性リポソーム組成物は、一般的にジミリストイルホスファチジルグリセリンから形成され、一方陰イオン性紡錘生成リポソームは主としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）から形成される。リポソーム組成物の別の型は、例えば、ダイズPCおよび卵PC等のホスファチジルコリン（PC）から形成される。別の型は、リン脂質および/またはホスファチジルコリンおよび/またはコレステロールの混合物から形成される。いくつかの研究は、リポソーム薬物製剤の皮膚への局所送達を評価している。インターフェロンを含むリポソームのモルモット皮膚への適用は、皮膚ヘルペス創傷の減少を生じたが、他の手段（例えば、溶液としてまたは乳状液として）を介してのインターフェロンの送達は無効だった（Weinerら, Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405〜410）。さらに、追加の研究は、水系を使用するインターフェロンの投与に対し、リポソーム製剤の一部として投与されるインターフェロンの効力を検査し、リポソーム製剤は水性投与よりも優れていると結論付けた（du Plessisら, Antiviral Research, 1992, 18, 259〜265）。
【０１９２】
非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系はまた、薬物の皮膚への送達におけるそれらの有用性を確定するために研究されている。NovasomeTMI（ジラウリン酸グリセリン/コレステロール/ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテル）およびNovasomeTMII（ジステアリン酸グリセリン/コレステロール/ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテル）試薬を含有する非イオン性リポソーム製剤は、シクロスポリン-Aをマウス皮膚の真皮に送達するために使用された。結果、かかる非イオン性リポソーム系は、シクロスポリン-Aの皮膚の異なる層への沈着促進に効果的であると示された（Huら, S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466）。
【０１９３】
本明細書中で用いられる場合、リポソームはまた、リポソームに取り込まれる場合に特殊化した脂質を欠くリポソームに関連して増大した循環寿命を生じる一つ以上の特殊化した脂質を含むリポソームを指す用語「立体的に安定した」を含む。立体的に安定したリポソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が（A）モノシアロガングリオシドGM1等の1つ以上の糖脂質を含有するもの、または（B）ポリエチレングリコール（PEG）部分等の1つ以上の親水性ポリマーで誘導されているものである。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、当該分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリンまたはPEG誘導脂質を含有する立体的に安定したリポソームのために、これら立体的に安定したリポソームの増大した循環半減期は、網内系（RES）の細胞内への減少した取り込みから導かれると考えられている（Allenら, FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wuら, Cancer Research, 1993, 53, 3765）。リポソームおよびそれらの使用はさらに米国特許第6,287,860号に記載されており、その全体は本明細書中に援用されている。
【０１９４】
1つ以上の糖脂質を含有する様々なリポソームは当該分野において公知である。Papahadjopoulosら（Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64）は、リポソームの血中半減期を向上させる、モノシアロガングリオシドGM1、硫酸ガラクトセレブロシドおよびフォスファチジルイノシトールの能力を報告した。これら知見は、Gabizonらによって記載された（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949）。ともにAllenらに対する米国特許第4,837,028号およびWO 88/04924は、（1）スフィンゴミエリンおよび（2）ガングリオシドGM1または硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含有するリポソームを開示している。米国特許第5,543,152号（Webbら）は、スフィンゴミエリンを含有するリポソームを開示している。1,2-sn-ジミリストイルホスファチジルコリンを含有するリポソームは、WO 97/13499（Limら）で開示されている。
【０１９５】
1つ以上の親水性ポリマーで誘導される脂質を含有する多数のリポソームおよびその調製方法は、当該分野において公知である。Sunamotoら（Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778）は、PEG部分を含む非イオン洗剤、2C1215G、を含有するリポソームを記載した。Illumら（FEBS Lett., 1984, 167, 79）は、ポリスチレン粒子の重合体グリコールによる親水性被覆が、有意に促進した血中半減期を生じると示した。ポリアルキレングリコール（例えばPEG）のカルボキシル基群の結合によって修飾された合成リン脂質は、Searsにより記載されている（米国特許第4,426,330号および第4,534,899号）。Klibanovら（FEBS Lett., 1990, 268, 235）は、PEGまたはステアリン酸PEGで誘導されるホスファチジルエタノールアミン（PE）を含有するリポソームが、血中循環半減期において有意に増加することを証明する実験を記載した。Blumeら（Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91）は、かかる観察をジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（DSPE）およびPEGの組合せから形成される他のPEG誘導リン脂質、例えばDSPE-PEG、に広げた。外面において共有結合したPEG部分を有するリポソームが、Fisherに対する欧州特許第EP 0 445 131 B1号およびWO 90/04384に記載されている。PEGで誘導された1〜20モル％のPEを含むリポソーム組成物およびその使用方法は、Woodleら（米国特許第5,013,556号および第5,356,633号）およびMartinら（米国特許第5,213,804号および欧州特許第EP 0 496 813 B1号）により記載されている。他の多数の脂質ポリマー結合体を含有するリポソームは、WO 91/05545および米国特許第5,225,212号（両方ともMartinらに対する）ならびにWO 94/20073（Zalipskyら）において開示されている。PEGで修飾されたセラミド脂質を含有するリポソームは、WO 96/10391（Choiら）に記載されている。米国特許第5,540,935号（Miyazakiら）および第5,556,948号（Tagawaら）には、表面上にて官能基でさらに誘導され得るPEG含有リポソームが記載されている。
【０１９６】
Thierryらに対する国際特許公開第WO 96/40062号は、リポソーム中に高分子量核酸を封入する方法に言及している。Tagawaらに対する米国特許第5,264,221号はタンパク質結合リポソームについて言及し、かかるリポソームの内容物としてアンチセンスRNAが挙げられ得ることを主張している。Rahmanらに対する米国特許第5,665,710号は、リポソーム中にオリゴデオキシヌクレオチドを封入するある方法を言及している。Loveらに対する国際特許公開第WO 97/04787号は、raf遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するリポソームについて言及している。
【０１９７】
トランスファーソーム（Transfersome）はリポソームのさらに別の型であり、薬物送達ビヒクルの魅力的な候補である、高度に変形し得る脂質集合体である。トランスファーソームは、小滴よりも小さい孔を通して容易に浸透し得るほど高度に変形し得る脂質小滴として説明され得る。トランスファーソームは使用される環境に対して適応性があり、例えば、自己最適化し（皮膚の孔の形状に適応できる）、自己修復し、しばしば細分化無しで標的に到達し、大抵自己充填する。トランスファーソームを生成するために、表面エッジ活性剤、通常は界面活性剤、を標準的なリポソーム組成物に添加することが可能である。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚へ送達するために使用されている。血清アルブミンのトランスファーソームを介した送達は、血清アルブミンを含む溶液の皮下注射と同程度効果的であることが示されている。
【０１９８】
界面活性剤は、乳状液（マイクロエマルジョンを含む）およびリポソーム等の製剤において幅広い適用性を有する。天然および合成の両方の、多数の異なる型の界面活性剤の性質を分類しおよび順位付ける最も一般的な方法は、親水性/親油性バランス（HLB）の使用である。親水基（「頭部」としても公知）の性質は、製剤に使用される異なる界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供する（Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms中, Marcel Dekker, Inc, New York, NY, 1988, 285ページ）。
【０１９９】
界面活性剤分子がイオン化していない場合、該界面活性剤は非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品または化粧品において幅広い適用性を有し、広い範囲のpH値にわたって使用できる。一般的にそれらのHLB値は、その構造によって2〜約18の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステル、およびエトキシル化エステル等の非イオン性エステルが挙げられる。エトキシル酸脂肪アルコール、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化/プロポキシル化ブロックポリマー等の非イオン性アルカノールアミドおよび非イオン性エーテルもまた、この種類に含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は最も普及している非イオン性界面活性剤類のメンバーである。
【０２００】
界面活性剤分子が水に溶解または分散する場合に負電荷を有するとき、該界面活性剤は陰イオン性として分類される。陰イオン性界面活性剤としては、石鹸、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド等のカルボン酸塩、硫酸アルキルおよびエトキシル化硫酸アルキル等の硫酸エステル、スルホン酸アルキルベンゼン、アシルイセチオネート、アシルタウレートおよびスルホコハク酸塩等のスルホン酸塩ならびにリン酸塩が挙げられる。陰イオン性界面活性剤類の最も重要なメンバーは、硫酸アルキルおよび石鹸である。
【０２０１】
界面活性剤分子が水に溶解または分散する場合に正電荷を有するとき、該界面活性剤は陽イオン性として分類される。陽イオン性界面活性剤としては、第四アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。第四アンモニウム塩は、この種類の中で最も使用されるメンバーである。
【０２０２】
界面活性剤分子が正電荷または負電荷のいずれかを帯びる能力を有する場合、該界面活性剤は両性として分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、N-アルキルベタインおよびリン脂質が挙げられる。
【０２０３】
薬物製品、製剤および乳状液における界面活性剤の使用が検討されている（Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms中, Marcel Dekker, Inc, New York, NY, 1988, 285ページ）。
【０２０４】
ある態様において、本発明は核酸、特にオリゴヌクレオチドの、動物の皮膚への効率的な送達を実施するために、様々な浸透促進剤を使用する。大抵の薬物は、溶液中でイオン化および非イオン化の両方の形態で存在する。しかしながら、一般的に脂溶性薬物または脂肪親和性薬物のみが容易に細胞膜を横切る。横切られる膜が浸透促進剤で処理される場合、非脂肪親和性薬物でさえ細胞膜を横切り得ることが発見されている。非脂肪親和性薬物の細胞膜を横切る拡散を促進するのに加え、浸透促進剤はまた、脂肪親和性薬物の浸透性を高める。
【０２０５】
他の薬剤は、投与されるエチレングリコールおよびプロピレングリコール等のグリコールを含む核酸、2-ピロール等のピロール、アゾン、ならびにリモネンおよびメントン等のテルペンの浸透を促進するために利用され得る。
【０２０６】
本発明の医薬製剤および医薬組成物はまた界面活性剤を含有し得る。薬物製品、製剤および乳状液中の界面活性剤の使用は、当該分野において周知である。界面活性剤およびそれらの使用は、米国特許第6,287,860号にさらに記載されており、その全体は本明細書中に援用されている。
【０２０７】
当業者は、製剤がそれらの意図された使用、すなわち、投与の経路に応じて決まりきった手順で設計されることを認めるだろう。
【０２０８】
局所投与のための好ましい製剤としては、本発明のオリゴヌクレオチドが脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤等の局所送達薬剤と混合されているものが挙げられる。好ましい脂質およびリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルDOPEエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPC、ジステアロイルホスファチジルコリン）陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセリンDMPG）および陽イオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルDOTAPおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOTMA）が挙げられる。局所または他の投与のために、本発明のオリゴヌクレオチドはリポソーム内に封入され得るか、またはそれとの複合体、特に陽イオン性リポソームとの複合体を形成し得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは脂質、特に陽イオン性脂質と錯体を形成し得る。好ましい脂肪酸およびエステル、薬学的に許容され得るそれらの塩、ならびにそれらの使用は米国特許第6,287,860号にさらに記載されており、その全体は本明細書中に援用されている。局所製剤は米国特許第6,747,014号に詳細に記載されており、その全体は参照として本明細書中に援用されている。
【０２０９】
経口投与のための組成物および製剤としては、散剤または顆粒剤、ミクロ微粒子、ナノ微粒子、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サシェ、錠剤または小型錠剤が挙げられる。増粘剤、矯味矯臭剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または接合剤が望ましくあり得る。好ましい経口製剤としては、本発明のオリゴヌクレオチドが1つ以上の浸透促進剤、界面活性剤およびキレート剤とともに投与されるものが挙げられる。好ましい界面活性剤としては、脂肪酸および/もしくはエステルまたはその塩、胆汁酸および/またはその塩が挙げられる。好ましい胆汁酸/塩および脂肪酸ならびにそれらの使用は、米国特許第6,287,860号にさらに記載されており、その全体は本明細書中に援用されている。浸透促進剤の組み合わせ、例えば胆汁酸/塩と組み合わせた脂肪酸/塩もまた好ましい。特に好ましい組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸およびUDCAのナトリウム塩である。さらに浸透促進剤としては、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン-20-セチルエーテルが挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドは、噴霧乾燥粒子を含む顆粒状形態またはマイクロもしくはナノ粒子を形成する錯体形態で、経口的に送達され得る。オリゴヌクレオチド錯化剤およびそれらの使用は、米国特許第6,287,860号にさらに記載されており、その全体は本明細書中に援用されている。オリゴヌクレオチドの経口製剤およびそれらの調製は、米国特許第6,747,014号；米国特許公開第2003/0027780号（2003年2月6日）およびその親出願；ならびに米国特許出願第09/082,624号（1998年5月21日出願）に詳細に記載されており、各々の全体は参照として本明細書中に援用されている。
【０２１０】
非経口、髄膜下または心室内投与のための組成物および製剤としては、緩衝剤、希釈剤ならびに浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容され得る担体または賦形剤等で、しかしこれらに限定されない他の適切な添加剤をまた含み得る滅菌水溶液が挙げられ得る。
【０２１１】
オリゴヌクレオチドは、インビボの送達のために許容され得る投薬形態、例えば、非経口または非経口でない製剤として製剤化され得る。非経口製剤としては、静脈内（IV）、皮下（SC）、腹膜内（IP）、硝子体内および筋肉内（IM）製剤、ならびに肺吸入、鼻腔内投与、局所投与等を介する送達のための製剤が挙げられる。非経口でない製剤としては、消化官を介した送達のための製剤、例えば経口投与、直腸投与、空腸内点滴注入等が挙げられる。直腸投与としては、浣腸または坐薬としての投与が挙げられる。経口投与としては、カプセル、ゲルカプセル、ピル、エリキシル等としての投与が挙げられる。
【０２１２】
本発明の化合物はまた、拍動性送達によって投与され得る。「拍動性送達」は、浸透促進剤と組み合わされた薬物（例えばアンチセンス化合物）の第1のパルスおよび浸透促進剤の第1のパルスによる放出の際に吸収されない薬物の吸収を増進させる浸透促進剤の第2のパルスを送達する医薬製剤をいう。
【０２１３】
本発明のある態様は、腸の薬物吸収を促進するための遅延放出経口製剤であり、
（a）該薬物および浸透促進剤を含有する担体粒子の第1の集団、ここで該薬物および該浸透促進剤は、腸内の第1の場所にて放出される；ならびに
（b）浸透促進剤および遅延放出被覆剤またはマトリックスを含有する担体粒子の第2集団、ここで浸透促進剤は該第1の場所から下流の腸における第2の場所にて放出され、それによって、薬物が第2の場所に到達するとき、薬物の吸収が増大する
ことを含む。
【０２１４】
あるいは、（a）および（b）における浸透促進剤は異なる。この増強は、少なくとも2つの担体粒子の集団を封入することで得られる。担体粒子の第1の集団は、生物学的に活性のある物質および浸透促進剤を含有し、担体粒子の第2の（および任意に追加の）集団は、浸透促進剤および遅延放出被覆剤またはマトリックスを含有する。
【０２１５】
経口投与される薬物に適用される用語「初回通過効果」は、胃酸および様々な消化酵素の作用による分解である。初回通過クリアランス効果を改善するある手段とは、投与する薬物の量を増大し、その結果、初回通過クリアランスで失った薬物の割合が補償される。これは、例えば、単純に動物へより多くの薬物を提供することにより、i.v.投与で容易に達成し得る。しかしながら、他の要因は、非経口でない手段を介して投与される薬物の生物学的利用能に影響を及ぼす。例えば薬物は、消化官もしくは血流中で酵素的にもしくは化学的に分解され得、かつ/または様々な粘膜に対して不透性もしくは半透性であり得る。
【０２１６】
これらの医薬組成物は、直腸経路、膣経路、鼻腔経路または肺経路を介して投与される場合、生物学的に活性のある物質の吸収を増大し得る。生物学的に活性のある物質の放出は、胃腸管の任意の部分において達成され得る。
【０２１７】
オリゴヌクレオチドの液体医薬組成物は、オリゴヌクレオチドを適切なビヒクル、例えば滅菌された、発熱物質を含まない水、または食塩水と組み合わせることによって調製され得る。他の治療化合物は任意に含められ得る。
【０２１８】
本発明はまた、固体微粒子組成物の使用も意図する。かかる組成物は、呼吸に適する大きさのオリゴヌクレオチドの粒子を含むのが好ましい。かかる粒子は、例えば従来の手段によって、例として乳鉢および乳棒を用いて乾燥オリゴヌクレオチドを粉砕し、次に得られた粉末組成物を、大型粒子および塊の分離のために400メッシュのふるいを通過させることによって調製され得る。活性オリゴヌクレオチドを含有する固体微粒子組成物は、任意的にエーロゾルの形成を促進するように働く分散剤、例えばラクトースを含み得る。
【０２１９】
本発明にしたがってオリゴヌクレオチド組成物はエーロゾル化され得る。液体粒子のエーロゾル化は、噴霧器を用いる等の任意の適切な手段によって生成され得る。例えば米国特許第4,501,729号参照。噴霧器は、圧縮ガス、一般的に空気または酸素の、狭いベンチュリ穴を通した加速か、または超音波振動のどちらかによって液体または懸濁液を治療用エーロゾルミストに変形させる市販の装置である。適切な噴霧器としては、PARI LC PLUS、PARI DURA-NEB 2000、PARI-BABY Size、PARI PRONEB Compressor with LC PLUS、PARI WALKHALER Compressor/Nebulizer System、PARI LC PLUS Reusable Nebulizer、およびPARI LC JET+Nebulizer（登録商標）の名称でBlairex（登録商標）より販売されているものが挙げられる。
【０２２０】
噴霧器における使用のための製剤は、滅菌された、発熱物質を含まない水等の液体中のオリゴヌクレオチドまたは食塩水からなり得、ここで該オリゴヌクレオチドは、製剤の約40％ w/wまでを構成する。好ましくは、オリゴヌクレオチドは20％ w/w未満を構成する。所望により、防腐剤（例えば、ヒドロキシ安息香酸メチル）、抗酸化剤、および矯味矯臭剤等のさらなる添加剤を組成物に添加し得る。
【０２２１】
オリゴヌクレオチドを含有する固体粒子はまた、当該分野で公知の任意の固体微粒子薬物エーロゾル発生器を使用してエーロゾル化し得る。上述のように、かかるエーロゾル発生器は呼吸に適した粒子を生成し、エーロゾル単位体積当たりの再現可能な定量をさらに生じる。適切な固体微粒子エーロゾル発生器としては、注入器および定量吸入器が挙げられる。定量吸入器は当該分野で使用され、本発明において有用である。好ましくは、液体または固体エーロゾルが、1分あたり約10〜150リットル、より好ましくは1分あたり約30〜150リットル、最も好ましいのは1分あたり約60リットルの速度で生成される。
【０２２２】
生物学的に活性のある物質の増大した生物学的利用能はまた、組成物の経口投与および本発明の方法を介して達成される。本発明の組成物はさらに、その分野が確立された使用レベルで、医薬用組成物の中に従来的に見出だされる他の補助成分を含み得る。したがって、例えば該組成物は、例として、かゆみ止め、収斂剤、局所麻酔薬または抗炎症剤等の、さらなる、適合性があり、薬学的に活性のある物質を含み得るか、または染料、矯味矯臭剤、防腐剤、抗酸化剤、懸濁剤、増粘剤および安定剤等の、本発明の組成物の様々な投薬形態の物理的な製剤化において有用なさらなる物質を含み得る。しかしながら、かかる物質は添加される場合、本発明の組成物の構成要素の生物学的活性を過度に干渉してはならない。製剤は殺菌され得、所望により、助剤、例えば潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、着色料、調味料および/または芳香物質、ならびに製剤の核酸と有害に反応しないようなものと混合され得る。
【０２２３】
水性懸濁液は、例としてカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランを含む、懸濁液の粘性を増大させる物質を含み得る。懸濁液はまた安定剤を含み得る。
【０２２４】
本発明のある態様は、1つ以上の低重合体化合物および非アンチテンス機構により機能する1つ以上の他の化学療法薬剤を含む医薬組成物を提供する。かかる化学療法薬剤の例としては、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビスクロロエチルニトロソ尿素、ブスルファン、マイトマイシンC、アクチノマイシンD、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトザントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、4-ヒドロキシペルオキシシクロホスホラミド、5-フルオロウラシル（5-FU）、5-フルオロデオキシウリジン（5-FUdR）、メトトレキサート（MTX）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（VP-16）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（DES）等の癌化学療法薬物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化合物とともに使用される場合、かかる化学療法薬剤は、個々に（例えば、5-FUおよびオリゴヌクレオチド）、連続的に（例えば、5-FUおよびオリゴヌクレオチドのある期間の後にMTXおよびオリゴヌクレオチドが続く）、または1つ以上の他のかかる化学療法薬剤（例えば5-FU、MTXおよびオリゴヌクレオチド、または5-FU、放射線療法およびオリゴヌクレオチド）と組み合わせて使用され得る。非ステロイド性抗炎症薬物およびコルチコステロイドを含むがこれらに限定されない抗炎症薬物、ならびにリビビリン、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルを含むがこれらに限定されない抗ウイルス性薬物はまた、本発明の組成物に組み込まれ得る。アンチセンス化合物および他の非アンチセンス薬物の組み合わせはまた、本発明の範囲内である。2つ以上の結合した化合物は、一緒にまたは連続して使用され得る。
【０２２５】
別の関連ある態様において、本発明の組成物は、第1の核酸を標的にする1つ以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第2の核酸標的を標的にする1つ以上のさらなるアンチセンス化合物を含み得る。あるいは、本発明の組成物は、同じ核酸標的の異なる領域を標的にした2つ以上のアンチセンス化合物を含み得る。アンチセンス化合物の多数の例が当該分野において公知である。2つ以上の結合した化合物が、一緒にまたは連続して使用され得る。
【０２２６】
H.投与
治療用組成物の製剤化およびその引き続く「投与(administration)(投与(dosing))」は、当業者の技術の範囲内であると考えられる。投与は、数日〜数ヶ月続く治療の過程内で、または治癒が達成されたもしくは疾患状態の減少が達成されるまで、治療すべき疾患状態の重篤度および反応性に依存する。最適な投与スケジュールは、患者の身体内での薬物の蓄積を測定することにより計算され得る。当業者は、最適な投薬量、投与方法および頻度を容易に決定し得る。最適な投薬量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対効能に依存して変動し得、一般的には、インビトロおよびインビボ動物モデルにおいて効果的であることが見出されているEC50に基づいて評価され得る。一般的に、投薬量は、体重1kg当たり0.01μg〜100 g、体重1kg当たり0.1μg〜10 g、体重1kg当たり1.0μg〜1 g、体重1kg当たり10.0μg〜100 mg、体重1kg当たり100μg〜10 mg、または体重1kg当たり1 mg〜5 mgであり、1日毎に、1週間毎に、1ヶ月毎にもしくは1年毎に1回以上、または2〜20年毎に1回でも投与され得る。当業者は、投与の頻度を、体液または組織中での測定された薬物の滞留時間および濃度に基づいて容易に評価し得る。首尾良い治療の後、患者に、疾患状態の再発を予防するための維持療法を受けさせることが望ましくあり得るが、この場合、オリゴヌクレオチドを、体重1kg当たり0.01μg〜100 gの範囲内で、1日毎に1回以上〜20年毎に1回、維持投薬量で投与する。
【０２２７】
治療用組成物での治療の効果は、該治療を受けている患者または被験体から組織または体液を回収した後に評価され得る。生検試料は、患者または被験体に有害な効果をもたらすことなく特定の組織から回収され得ることが当該分野で公知である。ある態様において、組織およびその構成細胞には、血液（例えば、ヒト造血前駆細胞、ヒト造血幹細胞、CD34＋細胞、CD4＋細胞等の造血細胞）、リンパ球および他の血液系細胞、骨髄、乳房、子宮頚部、結腸、食道、リンパ節、筋肉、末梢血、口腔粘膜および皮膚が挙げられるが、これらに限定されない。他の態様において、体液およびその構成細胞には、血液、尿、精液、滑液、リンパ液および脳脊髄液が挙げられるが、これらに限定されない。患者から採取した組織または体液は、標的mRNAまたはタンパク質の発現レベルから評価され得る。さらに、特定の疾患状態、状態または表現型と関連することが知られているかまたは疑われている他の遺伝子のmRNAまたはタンパク質の発現レベルを評価し得る。mRNAレベルは、リアルタイムPCR、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーションまたはDNAアレイ分析により測定され得るか、または評価され得る。タンパク質レベルは、ELISA、免疫ブロット、定量タンパク質分析、タンパク質活性分析（例えば、カスパーゼ活性分析）、免疫組織化学または免疫細胞化学を用いて測定され得るか、または評価され得る。さらに、治療の効果は、当該分野で公知の決まりきった手順の臨床的方法により、治療を受ける患者または被験体から回収した前述の組織および体液における疾患または状態に関連するバイオマーカーを測定することにより評価され得る。これらのバイオマーカーには、グルコース、コレステロール、リポタンパク質、トリグリセリド、遊離脂肪酸ならびにグルコースおよび脂質代謝の他のマーカー；リポタンパク質（a）またはLp（a）またはアポリポタンパク質 B；肝臓トランスアミナーゼ、ビリルビン、アルブミン、血中尿素窒素、クレアチンならびに腎機能および肝機能の他のマーカー；インターロイキン、腫瘍壊死因子、細胞内接着分子、C反応性タンパク質および炎症の他のマーカー；テストステロン、エストロゲンおよび他のホルモン；腫瘍マーカー;ビタミン、ミネラルおよび電解質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２８】
本発明を、その好ましいある態様に従って詳細に説明したが、以下の実施例は、本発明を例示するためのみの働きをし、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書中に記載の各参考文献、GENBANK（登録商標）受託番号等は、その全体が参照として本明細書中に援用される。
【実施例】
【０２２９】
実施例
実施例１
ヌクレオシドホスホルアミダイトの合成
アミダイトおよびその中間体を含む以下の化合物は、米国特許第6,426,220号および国際特許出願公開第WO 02／36743号に記載のように調製された; 5-メチル dC アミダイトの5'-O-ジメトキシトリチル-チミジン中間体、5-メチル-dCアミダイトの5'-O-ジメトキシトリチル-2'-デオキシ-5-メチルシチジン中間体、5-メチルdCアミダイトの5'-O-ジメトキシトリチル-2'-デオキシ-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジンの最後から2番目の中間体、［5'-O-（4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル）-2'-デオキシ-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3'-O-イル］-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト（5-メチルdCアミダイト）、2'-フルオロデオキシアデノシン、2'-フルオロデオキシグアノシン、2'-フルオロウリジン、2'-フルオロデオキシシチジン、2'-O-（2-メトキシエチル）修飾アミダイト、2'-O-（2-メトキシエチル）-5-メチルウリジン中間体、5'-O-DMT-2'-O-（2-メトキシエチル）-5-メチルウリジンの最後から2番目の中間体、［5'-O-（4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル）-2'-O-（2-メトキシエチル）-5-メチルウリジン-3'-O-イル］-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト（MOE Tアミダイト）、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-（2-メトキシエチル）-5-メチルシチジン中間体、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-（2-メトキシエチル）-N4-ベンゾイル-5-メチル-シチジンの最後から2番目の中間体、［5'-O-（4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル）-2'-O-（2-メトキシエチル）-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3'-O-イル］-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト（MOE 5-Me-Cアミダイト）、［5'-O-（4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル）-2'-O-（2-メトキシエチル）-N6-ベンゾイルアデノシン-3'-O-イル］-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト（MOE Aアミダイト）、［5'-O-（4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル）-2'-O-（2-メトキシエチル）-N4-イソブチリルグアノシン-3'-O-イル］-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト（MOE Gアミダイト）、2'-O-（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトおよび2'-O-（ジメチルアミノ-オキシエチル）ヌクレオシドアミダイト、2'-（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O2-2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-（2-ヒドロキシエチル）-5-メチルウリジン、2'-O-（［2-フタルイミドキシ］エチル）-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-メチルウリジン、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-［（2-ホルムアドキシイミノオキシ）エチル］-5-メチルウリジン、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-［N,Nジメチルアミノオキシエチル］-5-メチルウリジン、2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン、5'-O-DMT-2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン、5'-O-DMT-2'-O-（2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン-3'-［（2-シアノエチル）-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト］、2'-（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト、N2-イソブチリル-6-O-ジフェニルカルバモイル-2'-O-（2-エチルアセチル）-5'-O-（4,4'-ジメトキシトリチル）グアノシン-3'-［（2-シアノエチル）-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト］、2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ（2'-DMAEOE）ヌクレオシドアミダイト、2'-O-［2（2-N,N-ジメチルアミノエトキシ）エチル］-5-メチルウリジン、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-［2 （2-N,N-ジメチルアミノエトキシ）-エチル）］-5-メチルウリジンおよび5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-［2（2-N,N-ジメチルアミノエトキシ）-エチル）］-5-メチルウリジン-3'-O-（シアノエチル-N,N-ジイソプロピル）ホスホルアミダイト。
【０２３０】
実施例２
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドの合成
本発明に従って用いられるアンチセンス化合物は、固相合成の周知の技術により、簡便かつ決まりきった手順で調製し得る。かかる合成のための装置は、例えば、Applied Biosystems（Foster City, CA）を含むいくつかの販売業社により販売されている。当該分野で公知のかかる合成の任意の他の手段が、さらにまたは代替的に使用され得る。同様の技術を使用して、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体等のオリゴヌクレオチドを調製することが周知である。
【０２３１】
オリゴヌクレオチド：未置換および置換ホスホジエステル（P＝O）オリゴヌクレオチドは、ヨウ素で酸化する標準的なホスホルアミダイト化学を用いる自動化DNA合成機 （Applied Biosystemsモデル394）で合成される。
【０２３２】
ホスホロチオエート（P＝S）は、ホスファイト結合を酸化するための3,H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン 1,1-ジオキシドの10％ w／vアセトニトリル溶液を利用してチオ化を行うこと以外、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドと同様に合成される。チオ化反応工程の時間は、180秒まで延長し、通常のキャッピング工程を先に行った。CPGカラムからの切断および55℃での濃縮水酸化アンモニウム中での脱保護（12〜16時間）の後、オリゴヌクレオチドを、3容積より多いエタノールを用いて、1 M NH4OAc溶液から沈殿させることにより回収した。ホスフィネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参照として援用される米国特許第5,508,270号に記載のように調製される。
【０２３３】
アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参照として援用される米国特許第4,469,863号に記載のように調製される。
【０２３４】
3'-デオキシ-3'-メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参照として援用される米国特許第5,610,289号または同第5,625,050号に記載のように調製される。
【０２３５】
ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参照として援用される米国特許第5,256,775号または同第5,366,878号に記載のように調製される。
【０２３６】
アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参照として援用される国際特許出願第PCT／US94／00902号および同第PCT／US93／06976号（それぞれ国際特許公開第WO 94／17093号および同第WO 94／02499号として公開されている）に記載のように調製される。
【０２３７】
3'-デオキシ-3'-アミノ ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参照として援用される米国特許第5,476,925号に記載のように調製される。
【０２３８】
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参照として援用される米国特許第5,023,243号に記載のように調製される。
【０２３９】
ボラノリン酸オリゴヌクレオチドは、いずれも本明細書中で参照として援用される米国特許第5,130,302号および同第5,177,198号に記載のように調製される。
【０２４０】
オリゴヌクレオシド：MMI結合オリゴヌクレオシドとしても特定されるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド、MDH結合オリゴヌクレオシドとしても特定されるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、およびアミド-3結合オリゴヌクレオシドとしても特定されるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、およびアミド-4結合オリゴヌクレオシドとしても特定されるメチレンアミノカルボニル結合オリゴ-ヌクレオシド、ならびに、例えば、交互にMMIおよびP＝OまたはP＝S結合を有する混合骨格化合物は、いずれも本明細書中で参照として援用される米国特許第5,378,825号、同第5,386,023号、同第5,489,677号、同第5,602,240号および同第5,610,289号に記載のように調製される。
【０２４１】
ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参照として援用される米国特許第5,264,562号および同第5,264,564号に記載のように調製される。
【０２４２】
エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参照として援用される米国特許第5,223,618号に記載のように調製する。
【０２４３】
実施例３
RNA合成
一般的に、RNA合成化学は、戦略的な中間体反応における種々の保護基の選択的組み込みに基づく。当業者は、有機合成における保護基の使用を理解するであろうが、有用な保護基の種類には、シリルエーテルが含まれる。特定のかさ高いシリルエーテルは、2'-ヒドロキシル上の酸に不安定なオルトエステル保護基と組み合わせて、5'-ヒドロキシルを保護するのに用いられる。次いで、この保護基の組は、標準的な固相合成技術により使用される。全ての他の合成工程後、酸に不安定なオルトエステル保護基を最後に除去することが重要である。さらに、必要に応じて、合成の間に早期にシリル保護基を使用することにより、2'-ヒドロキシルの望まない脱保護が起こることなく、容易な除去が確実になる。
【０２４４】
異なるように除去されかつ異なるように化学的に不安定な保護基での2'-ヒドロキシルの保護と組み合わせた5'-ヒドロキシルの連続的保護のためのこの手順に従って、RNAオリゴヌクレオチドを合成した。
【０２４５】
RNAオリゴヌクレオチドは、段階的な様式で合成される。それぞれのヌクレオチドを、（3'-から5'-の方向に）順に、固相支持体に結合させたオリゴヌクレオチドに添加する。鎖の3'末端における第1のヌクレオシドを、固相支持体に共有結合させる。ヌクレオチド前駆体、リボヌクレオシドホスホルアミダイトおよび活性化剤を添加し、第2の塩基を、第1のヌクレオシドの5'末端にカップリングさせる。支持体を洗浄し、任意の未反応の5'-ヒドロキシル基を無水酢酸でキャップして、5'-アセチル部分を得る。次いで、結合を、より安定で、かつ最終的に所望されるP（V）結合に酸化する。ヌクレオチド付加サイクルの最後に、5'-シリル基をフッ化物で切断する。該サイクルを、それぞれの次のヌクレオチドについて繰り返す。
【０２４６】
合成後、リン酸塩上のメチル保護基を、DMF中の1 M ジナトリウム-2-カルバモイル-2-シアノエチレン-1,1-ジチオレート三水和物（S2Na2）を利用して、30分間で切断する。脱保護溶液を、水を使用して、固相支持体に結合したオリゴヌクレオチドから洗い流す。次いで、支持体を、水中の40％メチルアミンで10分間、55℃にて処理する。これによりRNAオリゴヌクレオチドが溶液中に遊離し、環外アミンを脱保護し、かつ2'-基を修飾する。オリゴヌクレオチドを、この段階で、陰イオン交換HPLCにより分析し得る。
【０２４７】
2'-オルトエステル基は、除去すべき最後の保護基である。Dharmacon Research, Inc. （Lafayette, CO）が開発したエチレングリコールモノ酢酸オルトエステル保護基は、有用なオルトエステル保護基の一例であり、以下の重要な特性を有する。これはヌクレオシドホスホルアミダイト合成およびオリゴヌクレオチド合成の条件に安定である。しかしながら、オリゴヌクレオチド合成後、オリゴヌクレオチドはメチルアミンで処理されるが、該メチルアミンはオリゴヌクレオチドを固相支持体から切断するのみならず、オルトエステルからアセチル基を除去する。得られるオルトエステル上の2-エチルヒドロキシル置換基は、アセチル化前駆体よりも電子吸引性が低い。結果として、修飾オルトエステルは、酸触媒加水分解に対してより不安定になる。詳細には、アセチル基が除去された後、切断速度はおよそ10倍速くなる。従って、このオルトエステルは、オリゴヌクレオチド合成に適合するための十分な安定性を有し、さらに引き続いて修飾される場合、最終的なRNAオリゴヌクレオチド産物と適合する比較的穏やかな水性条件下で脱保護を行うことを可能にする。
【０２４８】
さらに、RNA合成の方法は、当該分野で周知である（Scaringe, S. A.博士論文, University of Colorado, 1996; Scaringe, S. A.ら,J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 11820-11821; Matteucci, M. D.およびCaruthers, M. H. J. Am. Chem. Soc., 1981, 103, 3185-3191; Beaucage, S. L.およびCaruthers, M. H. Tetrahedron Lett., 1981, 22, 1859-1862; Dahl, B. J.ら, Acta Chem. Scand,. 1990, 44, 639-641; Reddy, M. P.ら, Tetrahedrom Lett., 1994, 25, 4311-4314; Wincott, F.ら, Nucleic Acids Res., 1995, 23, 2677-2684; Griffin, B. E.ら, Tetrahedron, 1967, 23, 2301-2313; Griffin, B. E.ら, Tetrahedron, 1967, 23, 2315-2331）。
【０２４９】
本発明のRNAアンチセンス化合物（RNAオリゴヌクレオチド）は、本明細書中に記載の方法により合成され得るか、またはDharmacon Research, Inc （Lafayette, CO）から購入し得る。相補的RNAアンチセンス化合物を合成し、次いで、当該分野で公知の方法によりアニーリングして、二重鎖（二本鎖）アンチセンス化合物を形成し得る。例えば、二本鎖は、30μlのRNAオリゴヌクレオチドの各相補的鎖（50 μM RNAオリゴヌクレオチド溶液）および15μlの5Ｘアニーリング緩衝液（100 mMの酢酸カリウム、30 mMのHEPES-KOH（pH 7.4）、2 mMの酢酸マグネシウム）を組み合わせ、次いで、90℃で1分、次いで37℃で1時間加熱することにより、形成され得る。得られる二本鎖アンチセンス化合物は、標的核酸の役割を研究するためのキット、分析、スクリーニングもしくは他の方法に、または診断目的もしくは治療目的のために使用され得る。
【０２５０】
実施例４
キメラ化合物の合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドまたは混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なる型のものであり得る。これらには、結合ヌクレオシドの「ギャップ」部分が結合ヌクレオシドの5'と3'の「ウイング」部分の間に位置する第1の型、および「ギャップ」部分がオリゴマー化合物の3'または5'末端のいずれかに位置する第2の「開放末端」型が挙げられる。第1の型のオリゴヌクレオチドはまた、「ギャップマー（gapmer）」またはギャップトオリゴヌクレオチドとしても当該分野で公知である。第2の型のオリゴヌクレオチドは、「ヘミマー（hemimer）」または「ウイングマー（wingmer）」としても当該分野で公知である。
【０２５１】
［2'-O-Me］--［2'-デオキシ］--［2'-O-Me］ キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
2'-O-アルキルホスホロチオエートおよび2'-デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチド部分を有するキメラオリゴヌクレオチドは、上述のApplied Biosystems自動化DNA合成機モデル394を用いて合成される。オリゴヌクレオチドは、自動化合成機ならびにDNA部分用の2'-デオキシ-5'-ジメトキシトリチル-3'-O-ホスホルアミダイトおよび5'と3'ウイング用の5'-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホルアミダイトを使用して合成される。標準的な合成サイクルは、5'-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホルアミダイト用に反応時間を長くしたカップリング工程を導入することにより変更する。完全に保護したオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、濃縮アンモニア（NH40H）中で12〜16時間、55℃で脱保護する。次いで、脱保護オリゴを、適切な方法（沈殿、カラムクロマトグラフィー、真空中での容積減少、ならびにキャピラリー電気泳動および質量分析法による収率および純度の分光学的分析）で回収する。
【０２５２】
［2'-O-（2-メトキシエチル）］--［2'-デオキシ］--［2'-O-（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
［2'-O-（2-メトキシエチル）］--［2'-デオキシ］--［-2'-O-（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルアミダイトを2'-O-（メトキシエチル）アミダイトに置換し、2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドについて上述した手順により調製された。
【０２５３】
［2'-O-（2-メトキシエチル  ホスホジエステル］--［2'-デオキシホスホロチオエート］--［2'-O-（2-メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチド
［2'-O-（2-メトキシエチル ホスホジエステル）--［2'-デオキシホスホロチオエート］--［2'-O-（2-メトキシエチル） ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドについて上述した手順により、2'-O-メチル アミダイトを2'-O-（メトキシエチル）アミダイトに置換し、ヨウ素で酸化してキメラ構造のウイング部内でホスホジエステルヌクレオチド間結合を形成し、3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン 1,1-ジオキシド（Beaucage試薬）を利用して硫化することによりセンターギャップにホスホロチオエートヌクレオチド間結合を形成することによって、調製される。
【０２５４】
他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドおよび混合キメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参照として援用される米国特許第5,623,065号に従って合成される。
【０２５５】
実施例５
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2を標的とする二本鎖アンチセンス化合物の設計およびスクリーニング
本発明によれば、本発明のアンチセンス化合物およびその相補物を含み、二重鎖RNA（dsRNA）または短鎖干渉RNA（siRNA）としても知られる一連の核酸二本鎖は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2を標的とするように設計され得る。二本鎖のアンチセンス鎖の核酸塩基配列は、表1のオリゴヌクレオチドの少なくとも8核酸塩基部分を含む。鎖の末端は、1つ以上の天然または修飾された核酸塩基の付加により修飾されて、突出を形成し得る。次いで、dsRNAのセンス鎖を、アンチセンス鎖の相補物として設計および合成するが、これもまたいずれかの末端に修飾または付加を含み得る。例えば、ある態様において、dsRNA二本鎖の鎖は両方とも、中央の核酸塩基に対して相補的であり、各々が一方または両方の末端に突出を有するであろう。二本鎖のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、約17〜25ヌクレオチド、または約19〜23ヌクレオチドを含む。あるいは、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、20、21または22ヌクレオチドを含む。
【０２５６】
例えば、配列CGAGAGGCGGACGGGACCG（配列番号：489）およびデオキシチミジン（dT）の2つの核酸塩基突出を有するアンチセンス鎖を含む二本鎖は、以下の構造（アンチセンス配列番号：490および相補性配列番号：491）を有する:
0005420334.tif 000006
【０２５７】
突出は、1〜6核酸塩基の範囲内であり得、これらの核酸塩基は、標的核酸に対して相補的であり得るかまたはあり得ない。当業者は、突出は1、2、3、4、5または6核酸塩基長であり得ることを理解するであろう。別の態様において、二本鎖は、片方の末端のみに突出を有し得る。
【０２５８】
別の態様において、同じ配列CGAGAGGCGGACGGGACCG（配列番号：489）を有するアンチセンス鎖を含む二本鎖は、平滑末端（一本鎖突出を有しない）を用いて、以下のように調製され得る（アンチセンス配列番号：489および相補性配列番号：492）:
0005420334.tif 000007
【０２５９】
RNA二本鎖は、単分子または二分子であり得る;すなわち、2つの鎖は、単分子の一部であるか、または別々の分子であり得る。
【０２６０】
二本鎖のRNA鎖は、本明細書中で開示される方法により合成されるか、またはDharmacon Research Inc.,（Lafayette, CO）から購入し得る。相補鎖は合成されると、アニーリングする。一本鎖を等分し、50μMの濃度に希釈する。希釈すると、各鎖の30μLを、15μLのアニ−リング緩衝液の5x溶液と合わせる。当該緩衝液の最終濃度は、100 mM酢酸カリウム、30 mM HEPES-KOH（pH 7.4）および2 mM酢酸マグネシウムである。最終容積は、75μLである。この溶液を、90℃で1分インキュベートし、次いで、15秒間遠心分離する。管を37℃で1時間静置するが、このときにdsRNA二本鎖を実験に用いる。dsRNA二本鎖の最終濃度は20μMである。この溶液は、冷凍（-20℃）保存し得、5回まで凍結融解することができる。
【０２６１】
二本鎖アンチセンス化合物を調製し、そのジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2発現を調節する能力を評価する。
【０２６２】
細胞が80％のコンフルエンシーに達したとき、本発明の二本鎖アンチセンス化合物で処理する。細胞96ウェルプレートで生育させた細胞について、ウェルを200μLのOPTI-MEM-1血漿減少培地（GibcoBRL）で1回洗浄し、次いで、12μg／mLのLIPOFECTINTM試薬（Gibco BRL）を含む130μLのOPTI-MEM-1で処理し、所望の二本鎖アンチセンス化合物を最終濃度200 nMで得る。処理の5時間後、培地を新鮮な培地で置き換える。処理の16時間後に細胞を採取し、このときにRNAを単離して、標的の減少をRT-PCRにより測定する。
【０２６３】
実施例６
オリゴヌクレオチドの単離
制御された多孔質ガラス固相支持体からの切断および濃水酸化アンモニウム中で、55℃で12-16時間脱ブロック化した後、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを、3容積未満のエタノールを用いて、1 M NH40Acから沈殿によって回収する。合成したオリゴヌクレオチドを、電子スプレー質量分析法（分子量測定）およびキャピラリーゲル電気泳動により分析し、全長の少なくとも70％の物質であると決定した。この合成で得られたホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合の相対量を、-16 amu産物（＋／- 32＋／-48）に対する正確な分子量の比により測定した。いくつかの研究については、オリゴヌクレオチドを、Chiangら, J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171に記載のように、HPLCにより精製した。HPLCで精製した物質について得られた結果は、HPLCで精製しなかった物質について得られた結果と同様であった。
【０２６４】
実施例７
オリゴヌクレオチド合成-96ウェルプレートフォーマット
オリゴヌクレオチドは、固相P（III）ホスホルアミダイト化学により、96ウェル形式で同時に96配列を集めることができる自動化合成機で合成した。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、水性ヨウ素での酸化により得た。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、無水アセトニトリル中の3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン 1,1 ジオキシド（Beaucage 試薬）を利用した硫化により生じた。標準的な塩基保護β-シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトは、商業販売業者（例えば、PE-Applied Biosystems, Foster City, CAまたはPharmacia, Piscataway, NJ）から購入した。非標準的ヌクレオシドは、標準的なまたは特許された方法のように合成される。これらは、塩基保護β-シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトとして利用される。
【０２６５】
オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、濃NH40Hを用いて高温（55〜60℃）で12-16時間脱保護し、次いで、遊離した産物を減圧乾燥した。次いで、乾燥した産物を、滅菌水中に再懸濁してマスタープレートを得たが、ここから、全ての分析および試験プレート試料を、ロボットピペッターを利用して希釈する。
【０２６６】
実施例８
オリゴヌクレオチド分析-96ウェルプレート形式
各ウェルのオリゴヌクレオチドの濃度を、試料の希釈およびUV吸収スペクトル測定により評価した。個々の産物の全長完全性は、96ウェル形式（Beckman P／ACETMMDQ装置）のそれぞれにおけるキャピラリー電気泳動（CE）により評価したか、または個々に調製した試料については、市販のCE装置（例えば、Beckman P／ACETM5000, ABI 270装置）により評価した。基本および骨格の組成を、電子スプレー質量分析法を利用した化合物の質量分析により確認した。全てのアッセイ試験プレートを、単チャネルまたは多チャネルロボットピペッターを用いて、マスタープレートから希釈した。プレートは、プレート上の少なくとも85％の化合物が全長の少なくとも85％であった場合、許容可能であると判定した。
【０２６７】
実施例９
細胞培養およびオリゴヌクレオチド処理
アンチセンス化合物が標的核酸の発現に与える影響は、標的核酸が測定可能なレベルで存在する限り、多様な細胞型のいずれかで試験することができる。これは、例えば、PCRまたはノーザンブロット分析を用いて、常套的に測定することができる。以下の細胞型は、例示の目的のために提供されるが、標的が選択された細胞型中で発現する限り、他の細胞型も常套的に用いることができる。これは、例えば、ノーザンブロット分析、リボヌクレアーゼ保護アッセイまたはリアルタイムPCRのような、当該分野で常套的な方法により容易に測定することができる。
【０２６８】
T-24細胞:
ヒト移行細胞膀胱癌細胞株T-24は、American Type Culture Collection （ATCC） （Manassas, VA）から入手した。T-24細胞を、10％ウシ胎児血清（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）、ペニシリン（1mL当たり100単位）およびストレプトマイシン（1mL当たり100μg）（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）を補給した完全McCoy5A基礎培地（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）中で常套的に培養した。細胞を、90％コンフルエンスに達したときにトリプシン処理および希釈により常套的に継代培養した。RT-PCR分析で用いるため、細胞を、96ウェルプレート（Falcon-Primaria #353872）に、7000細胞／ウェルの密度で播種した。
【０２６９】
ノーザンブロッティングまたは他の分析のために、細胞は、100 mmまたは他の標準的な組織培養プレート上に播種され、適切な容積の培地およびオリゴヌクレオチドを用いて、同様に処理され得る。
【０２７０】
A549細胞:
ヒト肺癌細胞株A549は、American Type Culture Collection （ATCC） （Manassas, VA）から入手した。A549細胞を、10％ウシ胎児血清（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）、ペニシリン（1mL当たり100単位）およびストレプトマイシン（1mL当たり100μg）（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）を補給したDMEM基礎培地（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）中で常套的に培養した。細胞を、90％コンフルエンスに達したときにトリプシン処理および希釈により常套的に継代培養した。
【０２７１】
NHDF細胞:
ヒト新生児皮膚線維芽細胞（NHDF）は、Clonetics Corporation （Walkersville, MD）から入手した。NHDFは、供給業者により推奨されるように補給された線維芽細胞増殖培地（Clonetics Corporation, Walkersville, MD）中で常套的に維持した。細胞を、供給業者により推奨されるように、10回の継代培養まで維持した。
【０２７２】
HEK細胞:
ヒト胚ケラチノサイト（HEK）は、Clonetics Corporation （Walkersville, MD）から入手した。HEKは、供給業者により推奨されるように処方されたケラチノサイト増殖培地 （Clonetics Corporation, Walkersville, MD）中で常套的に維持した。細胞を、供給業者により推奨されるように、10回の継代培養まで常套的に維持した。
【０２７３】
3T3-L1細胞:
マウス胚脂肪細胞様細胞株3T3-L1は、American Type Culture Collection （Manassas, VA）から入手した。3T3-L1細胞を、DMEM、10％ウシ胎児血清（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）を補給した高グルコース（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）で常套的に培養した。細胞を、80％コンフルエンスに達したときにトリプシン処理および希釈により常套的に継代培養した。RT-PCR分析で用いるため、細胞を、96ウェルプレート（Falcon-Primaria #3872）に、4000細胞／ウェルの密度で播種した。
【０２７４】
ノーザンブロッティングまたは他の分析のために、細胞は、100 mmまたは他の標準的な組織培養プレート上に播種され、適切な容積の培地およびオリゴヌクレオチドを用いて、同様に処理され得る。
【０２７５】
初代マウス肝細胞:
初代マウス肝細胞は、Charles River Labsから購入したCD-1マウスから調製した。初代マウス肝細胞を、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン／ストレプトマイシン、1％抗生物質-抗有糸分裂剤（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）およびlOnMウシインスリン（Sigma- Aldrich, St. Louis, MO）を補給した肝細胞添加培地中で常套的に培養した。オリゴマー化合物のトランスフェクション実験に用いるため、細胞を、0.lmg／mlコラーゲンでコーティングした96ウェルプレート（Falcon-Primaria #3872）上に、およそ10,000細胞／ウェルの密度で播種した。
【０２７６】
アンチセンス化合物での処理:
細胞が65-75％コンフルエンシーに達したとき、それらをオリゴヌクレオチドで処理する。96ウェルプレートで増殖した細胞について、ウェルを、100μLのOPTI-MEMTM-1血清使用量低減培地（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）で1回洗浄し、次いで、100μMのオリゴヌクレオチド当たり2.5または3μg／mLのLIPOFECTINTM試薬（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）を含む130μLのOPTI-MEMTM-1培地で処理した。細胞を処理し、データを3連で得た。37℃での4-7時間の処理後、培地を新鮮な培地と交換した。オリゴヌクレオチド処理の16-24時間後、細胞を採集した。
【０２７７】
用いたオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株によって変動する。特定の細胞株について最適なオリゴヌクレオチド濃度を決定するために、細胞を、一定範囲の濃度で、陽性対照オリゴヌクレオチドで処理する。ヒト細胞について、陽性対照オリゴヌクレオチドは、ヒトH-rasに標的化したISIS 13920
（
0005420334.tif 000008
、配列番号：１）、
またはヒトJun-N末端キナーゼ-2（JNK2）に標的化したISIS 18078
（
0005420334.tif 000009
、配列番号：２）のいずれかから選択される。両方の対照は、ホスホロチオエート骨格を有する2'-O-メトキシエチルギャップマー（太字で示す2'-O-メトキシエチル）である。マウスまたはラット細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、マウスおよびラットc-rafの両方に標的化したISIS 15770、
0005420334.tif 000010
、配列番号：３、ホスホロチオエート骨格を有する2'-O-メトキシエチルギャップマー（太字で示す2'-O-メトキシエチル）である。次いで、c-H-ras（ISIS 13920に対して）、JNK2（ISIS 18078に対して）またはc-raf（ISIS 15770に対して）mRNAについて80％阻害を生じる陽性対照オリゴヌクレオチドの濃度を、当該細胞株の引き続く実験における新しいオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として利用する。80％阻害が達成できない場合、c-H-ras、JNK2またはc-raf mRNAの60％阻害を生じる陽性対照オリゴヌクレオチドの最低濃度を、該細胞株の引き続く実験における新規オリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として用いる。60％阻害が達成されない場合、当該特定の細胞株は、オリゴヌクレオチドトランスフェクション実験に不適切であるとみなす。本明細書中で用いるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、50 nM〜300 nMである。
【０２７８】
実施例１０
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2発現のアンチセンス調節は、当該分野で公知の種々の方法でアッセイすることができる。例えば、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNAレベルは、例えば、ノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）またはリアルタイムPCRにより定量することができる。定量リアルタイムPCRが現在のところ好ましい。RNA分析は、全細胞RNAまたはポリ（A）＋mRNA上で行うことができる。本発明のRNA分析の好ましい方法は、本明細書中の他の実施例に記載の全細胞RNAの使用である。RNAの単離の方法は当該分野で周知である。ノーザンブロット分析もまた当該分野で常套的である。リアルタイム定量（PCR）は、PE-Applied Biosystems, Foster City, CAから市販されている市販のABI PRISMTM7600、7700または7900 Sequence Detection Systemを用い、製造業者の使用説明書に従って簡便に達成することができる。
【０２７９】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のタンパク質レベルは、免疫沈降、ウエスタンブロット分析（免疫ブロッティング）、酵素結合イムノソルベント検定法（ELISA）または蛍光活性化細胞選別機（FACS）等の当該分野で周知の種々の方法で定量することができる。ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2に指向した抗体は、抗体のMSRSカタログ（Aerie Corporation, Birmingham, MI）等の種々の供給源から同定されかつ得ることができるか、あるいは、当該分野で周知の従来のモノクローナルまたはポリクローナル抗体産生方法により調製することができる。
【０２８０】
実施例１１
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2阻害剤を使用するための表現型アッセイの設計
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2阻害剤を、本明細書中で開示された方法により同定し、該化合物を、特定の疾患状態または状態の治療の効率を予測できる測定可能な終点をそれぞれ有する1つまたはそれ以上の表現型アッセイでさらに研究する。
【０２８１】
表現型アッセイ、それらの使用のためのキットおよび試薬は当業者に周知であり、健康および疾患におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2の役割および／または関連を研究するために、本明細書中で用いられる。いくつかの商業用の供給業者のいずれか1つから購入できる代表的な表現型アッセイには、細胞生存率、細胞毒性、増殖または細胞生存を測定するもの（Molecular Probes, Eugene, OR; PerkinElmer, Boston, MA）、酵素アッセイを含むタンパク質ベースのアッセイ（Panvera, LLC, Madison, WI ; BD Biosciences, Franklin Lakes,NJ ; Oncogene Research Products, San Diego, CA）、細胞調節、シグナル伝達、炎症、酸化プロセスおよびアポトーシス（Assay Designs Inc., Ann Arbor, MI）、トリグリセリド蓄積（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）、血管新生アッセイ、管形成アッセイ、サイトカインおよびホルモンアッセイならびに代謝アッセイ（Chemicon International Inc., Temecula, CA; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）が挙げられる。
【０２８２】
ある非限定的実施例では、特定の表現型アッセイに適切であると決定された細胞（すなわち、乳癌の研究のために選択されたMCF-7細胞;肥満の研究のための脂肪細胞）を、インビトロの研究から同定されたジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2阻害剤ならびに上述の方法で測定された最適濃度の対照化合物で処理する。処理期間の最後に、処理および未処理細胞を、アッセイに特有の1つ以上の方法で分析して、形質の結果および終点を決定する。
【０２８３】
形質終点には、時間または処理用量に対する細胞形態の変化、ならびにタンパク質、脂質、核酸、ホルモン、糖類または金属のような細胞成分のレベルの変化が挙げられる。pH、細胞周期の段階、細胞による生物学的指標の摂取または排出を含む細胞状態の測定もまた、目的の終点である。
【０２８４】
処理後の細胞における1つ以上の遺伝子の発現の分析もまた、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2阻害剤の効率または効力の指標として用いられる。Hallmark遺伝子、あるいは特定の疾患状態、状態または表現型に関連することが疑われる遺伝子は、処理および未処理細胞の両方において測定される。
【０２８５】
実施例１２
RNA単離
ポリ（A）＋mANA単離
ポリ（A）＋mRNAを、Miuraら（Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764）に従って単離した。ポリ（A）＋mRNAを単離する他の方法は、当該分野で常套的である。簡潔には、96ウェルプレート上で増殖した細胞について、増殖培地を細胞から除去し、各ウェルを200μLの冷PBSで洗浄した。60μL溶解緩衝液（10 mM Tris-HCl、pH 7.6、1 mM EDTA、0.5 M NaCl、0.5％ NP-40、20 mM バナジル-リボヌクレオシド複合体）を各ウェルに添加し、プレートを穏やかに攪拌し、次いで、室温で5分インキュベートした。55μLの溶解物を、オリゴd（T）被覆96ウェルプレート（AGCT Inc., Irvine CA）に移した。プレートを室温で60分インキュベートし、200μLの洗浄緩衝液（10 mM Tris-HCl pH 7.6, 1 mM EDTA, 0.3 M NaCl）で3回洗浄した。最後の洗浄後、プレートをペーパータオル上にブロットして過剰な洗浄緩衝液を除去し、次いで5分間風乾した。70℃に予熱した60μlの溶出緩衝液（5 mM Tris-HCl pH 7.6）を各ウェルに添加し、プレートを90℃のホットプレート上で5分間インキュベートし、次いで、溶出液を新鮮な96ウェルプレートに移した。
【０２８６】
100 mmまたは他の標準的なプレートで増殖した細胞は、適当な容積の全ての溶液を用いて同様に処理することができる。
【０２８７】
全RNA単離
Qiagen, Inc.（Valencia, CA）から購入したRNEASYTM96キットおよび緩衝液を用い、製造業者が推奨する手順に従って、全RNAを単離した。手短にいえば、96ウェルプレート上で増殖した細胞について、増殖培地を細胞から除去し、各ウェルを200μLの冷PBSを用いて洗浄した。150μLの緩衝液RLTを各ウェルに添加し、プレートを20秒間激しく振とうした。次いで、150μLの70％エタノールを各ウェルに添加し、内容物を、3回上下にピペッティングすることにより混合した。次いで、試料を、廃液回収トレーを備え、かつ減圧源に取り付けられたQIAVACTMマニホルドに取り付けられた、RNEASYTM96ウェルプレートに移した。1分間減圧した。500μLの緩衝液RW1を、RNEASYTM96プレートの各ウェルに添加し、15分インキュベートし、再び1分間減圧した。追加の500μLの緩衝液RW1を、RNEASYTM96プレートの各ウェルに添加し、2分間減圧した。次いで、1 mLの緩衝液RPEをRNEASYTM96プレートの各ウェルに添加し、90秒間減圧した。次いで、緩衝液RPEでの洗浄を繰り返し、さらに3分間減圧した。次いで、プレートをQIAVACTMマニホルドから取り外し、ペーパータオルにブロットし、乾燥させた。次いで、プレートを、1.2 mL回収管を含む回収管ラックを備えたQIAVACTMマニホルドに再び取り付けた。次いで、140μLのRNアーゼを含まない水を各ウェルにピペッティングし、1分間インキュベートし、次いで3分間減圧することにより、RNAを溶出させた。
【０２８８】
繰り返しのピペッティングおよび溶出工程は、QIAGEN（登録商標）Bio-RobotTM9604機器（Qiagen, Inc., Valencia CA）を用いて自動化され得る。基本的に、培養プレート上で細胞を溶解した後、プレートをロボットデッキに移し、ここでピペッティング、DNase処理および溶出工程を行う。
【０２８９】
実施例１３
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNAレベルのリアルタイム定量PCR分析
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNAレベルの定量は、ABI PRISMTM7600、7700または7900 Sequence Detection System（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）を用い、製造業者の使用説明書に従って、リアルタイム定量PCRにより達成した。これは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物のリアルタイムでの高スループット定量を可能にする、閉鎖した管の非ゲルベースの蛍光検出システムである。PCRが完了した後に増幅産物を定量する標準的なPCRとは対照的に、リアルタイム定量PCRの産物は、それらが蓄積されるにつれて定量される。これは、フォワードおよびリバースPCRプライマーの間で特異的にアニ−リングし、かつ2つの蛍光色素を含むオリゴヌクレオチドプローブを、PCR反応に含むことにより達成される。レポーター色素（例えば、PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Operon Technologies Inc., Alameda, CAまたはIntegrated DNA Technologies Inc., Coralville, IAのいずれかから入手したFAMまたはJOE）をプローブの5'末端に付加させ、クエンチャー色素（例えば、PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Operon Technologies Inc., Alameda, CAまたはIntegrated DNA Technologies Inc., Coralville, IAのいずれかから入手したTAMRA）をプローブの3'末端に付加させる。プローブおよび色素がインタクトである場合、レポーター色素発光を、3'クエンチャー色素の近傍でクエンチングする。増幅の間、プローブの標的配列へのアニーリングにより、Taqポリメラーゼの5'-エキソヌクレアーゼ活性により切断され得る基質を生じる。PCR増幅サイクルの伸長期の間、プローブのTaqポリメラーゼによる切断により、プローブの残りから（すなわち、クエンチャー部分から）レポーター色素が放出され、配列特異的蛍光シグナルが生じる。各サイクルについて、さらなるレポーター色素分子を、それらの各々のプローブから切断し、蛍光強度を、通常の間隔で、ABI PRISMTMSequence Detection System内に配置したレーザー光学機械によりモニタリングする。各アッセイにおいて、未処理対照試料からのmRNAの連続的希釈を含む一連の平行反応により、標準曲線が得られ、これを、試験試料のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の阻害率を定量するのに用いる。
【０２９０】
定量PCR分析に先立ち、測定される標的遺伝子に特異的なプライマー-プローブセットがGAPDH増幅反応で「マルチプレックス化（multiplexed）」される能力を評価する。重複化の際、標的遺伝子および内部標準遺伝子GAPDHを、単一の試料中で同時に増幅する。この分析において、未処理細胞から単離したmRNAを連続的に希釈する。各希釈物を、GAPDHのみ、標的遺伝子のみ（「シングルプレックス化（single-plexing）」）または両方（マルチプレックス化）に特異的なプライマー-プローブセットの存在下で増幅する。PCR増幅後、希釈の機能としてのGAPDHおよび標的mRNAシグナルの標準曲線を、シングルプレックス化およびマルチプレックス化試料の両方から得る。マルチプレックス化試料から得たGAPDHおよび標的シグナルの勾配および相関係数の両方が、シングルプレックス化試料から得た対応する値の10％の範囲内であれば、該標的に特異的なプライマー-プローブセットは、マルチプレックス化可能であるとみなす。PCRの他の方法もまた当該分野で公知である。
【０２９１】
遺伝子標的の量は、リアルタイムPCRにより得られる。リアルタイムPCRに先立ち、相補DNA（cDNA）を得るため、単離したRNAを、逆転写酵素（RT）反応に供する。次いで、得られたcDNAについて、リアルタイムPCRを行う。逆転写酵素およびPCR試薬は、Invitrogen Corporation（Carlsbad, CA）から入手した。RT（リアルタイムPCR反応）は、20μLのPCRカクテル（2.5x PCR緩衝液−MgCl2、6.6 mMのMgCl2、それぞれ375μMのdATP、dCTP、dCTPおよびdGTP、それぞれ375 nMのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、125 nMのプローブ、4単位のRNアーゼ阻害剤、1.25単位のPLATINUM（登録商標）Taqポリメラーゼ、5単位のMuLV逆転写酵素、ならびに2.5x ROX色素）を30μLの全RNA溶液（20-200 ng）を含む96-ウェルプレートに添加することにより行った。RT反応は、30分間48℃でインキュベーションすることにより行った。10分間95℃でインキュベーションすることによりPLATINUM（登録商標）Taqポリメラーゼを活性化した後、40サイクルの2工程PCRプロトコールを95℃で15秒間（変性）、次いで60℃で1.5分（アニーリング／伸長）で行った。RT（リアルタイムPCR）により遺伝子標的の量を得る方法は、しばしば、単にリアルタイムPCRと呼ばれる。
【０２９２】
リアルタイムPCRにより得られた遺伝子標的の量を、GAPDH（発現が一定である遺伝子）の発現レベルのいずれかを用いて、あるいはRIBOGREENTM試薬（Molecular Probes, Inc. Eugene, OR）を用いて全RNAを定量することによって標準化する。GAPDH発現は、リアルタイムPCRにより、標的と同時に、マルチプレックス化によりまたは別々に作動させてリアルタイムに定量する。全RNAは、RIBOGREENTMRNA定量試薬（Molecular Probes, Inc. Eugene, OR）を用いて定量する。RIBOGREENTM試薬によるRNA定量方法は、Jones, L. J.,ら, （Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374）に教示される。
【０２９３】
このアッセイにおいて、170μLのRiboGreenTM作動薬（l0mM Tris-HCl中で1:350に希釈されたRIBOGREENTM試薬、1 mM EDTA, pH 7.5）を、30μLの精製した細胞RNAを含む96ウェルプレート中にピペッティングした。プレートを、CytoFluor 4000装置（PE Applied Biosystems）中で、485 nmでの励起および530 nmでの発光を用いて読み取った。
【０２９４】
ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2に対するプローブおよびプライマーは、公開された配列情報（本明細書中で配列番号：４として援用されるGENBANK（登録商標）受託番号NM_032564.2）を用いて、ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2配列にハイブリダイズするように設計した。ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2について、PCRプライマーは、フォワードプライマー:CATACGGCCTTACCTGGCTACA（配列番号：５）、リバースプライマー:CAGACATCAGGTACTCCCTCAACA（配列番号：６）であり、PCRプローブは、FAM-TGGCAGGCAACTTCCGAATGCC-TAMRA（配列番号：７）であった（FAMは蛍光色素であり、TAMRAはクエンチャー色素である）。ヒトGAPDHについて、PCRプライマーは、フォワードプライマー:GAAGGTGAAGGTCGGAGTC（配列番号：８）、リバースプライマー:GAAGATGGTGATGGGATTTC（配列番号：９）であり、PCRプローブは、5'JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA3'（配列番号：10）（JOEは蛍光レポーター色素であり、TAMRAはクエンチャー色素）であった。
【０２９５】
マウスジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2に対するプローブおよびプライマーは、公開された配列情報（本明細書中で配列番号：11として援用されるGENBANK（登録商標）受託番号AK002443.1）を用いて、マウスジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2配列にハイブリダイズするように設計された。マウスジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2について、PCRプライマーは、フォワードプライマー:ACTCTGGAGGTTGGCACCAT（配列番号：12）、リバースプライマー:GGGTGTGGCTCAGGAGGAT（配列番号：13）であり、PCRプローブは、FAM-CAGCGTTGCTCTGGCGCA-TAMRA（配列番号：14）であった（FAMは蛍光レポーター色素であり、TAMRAはクエンチャー色素である）。マウスGAPDHについて、PCR プライマーは、フォワードプライマー:GGCAAATTCAACGGCACAGT（配列番号：15）、リバースプライマー:GGGTCTCGCTCCTGGAAGAT（配列番号：16）であり、PCRプローブは、5'JOE-AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC-TAMRA3'（配列番号：17）（JOEは蛍光レポーター色素であり、TAMRAはクエンチャー色素）であった。
【０２９６】
実施例１４
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNAレベルのノーザンブロット分析
アンチセンス処理の18時間後、細胞単層を冷PBSで2回洗浄し、1 mLのRNAZOLTM試薬（TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX）中で溶解した。全RNAを、製造業者が推奨するプロトコールに従って調製した。20μgの全RNAを、MOPS緩衝液システム（AMRESCO, Inc. Solon, OH）を用いて、1.1％のホルムアルデヒドを含む1.2％アガロースゲルを通して電気泳動することにより分画した。RNAを、Northern／Southern Transfer buffer system（TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX）を用いる一晩の毛細管移動により、ゲルからHYBONDTM-N＋ナイロン膜（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）に移した。RNAの移動は、UV可視化により確認した。STRATALINKERTMUV Crosslinker 2400機器（Stratagene, Inc, La Jolla, CA）を用いるUV架橋により膜を固定化し、次いで、QUICKHYBTMハイブリダイゼーション溶液（Stratagene, La Jolla, CA）を用い、ストリンジェントな条件についての製造業者の推奨を用いてプローブした。
【０２９７】
ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2を検出するため、フォワードプライマーCATACGGCCTTACCTGGCTACA（配列番号：５）およびリバースプライマーCAGACATCAGGTACTCCCTCAACA（配列番号：６）を用いるPCRにより、ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2特異的プローブを調製した。負荷および移動効率の変動について標準化するため、膜をストリッピングし、ヒトグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）RNA（Clontech, Palo Alto, CA）についてプローブした。
【０２９８】
マウスジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2を検出するため、フォワードプライマーACTCTGGAGGTTGGCACCAT（配列番号：12）およびリバースプライマーGGGTGTGGCTCAGGAGGAT（配列番号：13）を用いるPCRにより、マウスジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2特異的プローブを調製した。負荷および移動効率の変動について標準化するため、膜をストリッピングし、マウスグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）RNA（Clontech, Palo Alto, CA）についてプローブした。
【０２９９】
ハイブリダイズした膜を、PHOSPHORIMAGERTMおよびIMAGEQUANTTMソフトウェアV3.3（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）を用いて視覚化し、定量した。データを、未処理対照のGAPDHレベルに対して標準化した。
【０３００】
実施例１５
2'-MOEウイングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2発現のアンチセンス阻害
本発明に従い、一連のアンチセンス化合物を、公開された配列（本明細書中で配列番号：４として援用されるGENBANK（登録商標）受託番号NM_032564.2、本明細書中で配列番号：18として援用されるGenBank受託番号NT_033927.5のヌクレオチド配列のヌクレオチド5669186〜5712008）を用いて、ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2RNAの異なる領域を標的化するように設計した。化合物を、表1に示す。「標的部位」は、化合物が結合する特定の標的配列上の第1の（5'最末端）ヌクレオチド番号を示す。表1中の全ての化合物は、両側（5'および3'方向）に5ヌクレオチドの「ウイング」が隣接する10の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央の「ギャップ」領域から構成される20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウイングは2'-O-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート（P＝S）である。全てのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。化合物がヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNAレベルに与える影響を、本明細書中の他の実施例に記載した定量リアルタイムPCRにより分析した。データは、A549細胞を125 nMの本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した3回の実験の平均である。「N.D.」が存在する場合は、「データがない」ことを示す。ISIS 18078 （配列番号：２）は、本アッセイで陰性対照として用いた。
【０３０１】
【表１】
0005420334.tif 000011
0005420334.tif 000012
【０３０２】
表1に示すように、配列番号：20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、60、61、62、63、64、65、66、68、69、70、71、72、73、75、76、77、78、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、94、95、96および97は、本アッセイにおいてヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2発現の少なくとも40％阻害を示したので、好ましい。より好ましくは、配列番号：65、26、29および35である。これらの好ましい配列が相補的である標的領域は、本明細書中で「好ましい標的セグメント」と呼ばれ、それ故に本発明の化合物の標的化に好ましい。これらの好ましい標的セグメントを、表3に示す。これらの配列は、チミン（T）を含むことが示されているが、当業者は、RNA配列においてチミン（T）は一般的にウラシル（U）で置換されることを理解するであろう。配列は、表1に示す好ましいアンチセンス化合物の逆の相補性を示す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸上の第1の（5'最末端）ヌクレオチド番号を示す。好ましい標的セグメントのそれぞれが見出された種もまた、表3に示す。
【０３０３】
実施例１６
2'-MOEウイングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるマウスジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2発現のアンチセンス阻害
本発明に従い、一連のアンチセンス化合物を、公開された配列（本明細書中で配列番号：11として援用されるGENBANK（登録商標）受託番号AK002443.1）を用いて、マウスジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2RNAの異なる領域を標的化するように設計した。化合物を、表2に示す。「標的部位」は、化合物が結合する特定の標的核酸上の第1の（5'最末端）ヌクレオチド番号を示す。表2中の全ての化合物は、両側（5'および3'方向）に5ヌクレオチドの「ウイング」が隣接する10の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央の「ギャップ」領域から構成される20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウイングは2'-O-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート（P＝S）である。全てのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。化合物がマウスジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNAレベルに及ぼす影響を、本明細書中の他の実施例に記載した定量リアルタイムPCRにより分析した。データは、3T3-L1細胞を150 nMの本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した3回の実験の平均である。「N.D.」が存在する場合は、「データがない」ことを示す。ISIS 18078（配列番号：２）は、本アッセイで陰性対照として用いた。
【０３０４】
【表２】
0005420334.tif 000013
0005420334.tif 000014
【０３０５】
表2に示すように、配列番号：21、25、26、38、39、47、101、109、114、115、120、121、122、123、124、127、128、130、133、136および142は、本実験においてマウスジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2発現の少なくとも35％阻害を示したので、好ましい。より好ましくは、配列番号：142、109および121である。これらの好ましい配列が相補的である標的領域は、本明細書中で「好ましい標的セグメント」と呼ばれ、それ故に本発明の化合物による標的化に好ましい。これらの好ましい標的セグメントを、表3に示す。これらの配列は、チミン（T）を含むことが示されているが、当業者は、RNA配列においてチミン（T）は一般的にウラシル（U）で置換されることを理解するであろう。配列は、表1および2に示す好ましいアンチセンス化合物の逆の相補性を示す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸上の第1の（5'最末端）ヌクレオチド番号を示す。好ましい標的セグメントのそれぞれが見出された種もまた、表3に示す。
【０３０６】
【表３】
0005420334.tif 000015
0005420334.tif 000016
0005420334.tif 000017
【０３０７】
これらの「好ましい標的セグメント」は、実験により、本発明のアンチセンス化合物とのハイブリダイゼーションに開放しており、かつ接触可能なことが見出されたので、当業者は、これらの好ましい標的セグメントに特異的にハイブリダイズし、かつ結果としてジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2発現を阻害する他の化合物を包含する本発明のさらなる態様を、常套的な実験だけを用いて、理解するかまたは確認することができるであろう。
【０３０８】
本発明によれば、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、外部ガイド配列（EGS）オリゴヌクレオチド、代替のスプライサー、および標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズする他の短いオリゴマー化合物を含む。
【０３０９】
実施例１７
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2タンパク質レベルのウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析（免疫ブロット分析）は、標準的な方法を用いて行う。細胞を、オリゴヌクレオチド処理の16〜20時間後に採取し、PBSで1回洗浄し、Laemmli緩衝液（100μl／ウェル）中に懸濁し、5分間煮沸し、16％SDS-PAGEゲル上に装填した。ゲルを、1.5時間、150Vで作動させ、ウエスタンブロッティング用の膜に移した。ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2に指向した適切な一次抗体を、一次抗体種に対して指向した、放射標識または蛍光標識した二次抗体と共に用いた。バンドをPHOSPHORIMAGERTM機器（Molecular Dynamics, Sunnyvale CA）を用いて可視化した。
【０３１０】
実施例１８
アンチセンス阻害がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2レベルに及ぼす影響:食餌誘導性肥満モデルのインビボ研究
C57BL／6マウス株は、高脂血症誘発性アテローム性動脈硬化のプラーク形成に感受性を有することが報告されている。従って、これらのマウスに高脂肪食を与え、以下の研究に用いて、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2アンチセンスオリゴヌクレオチドが食餌誘導性肥満モデルにおけるmRNA発現に及ぼす効果を評価した。
【０３１１】
6週齢の雄性C57BL／6マウスを、Jackson Laboratories （Ben Harbor, ME）から購入した。マウスに、通常のげっ歯動物用食餌（#8604, Harlan-Teklad, Madison, WI）を5日間与え、次いで、脂質由来のカロリーを60％含む高脂肪食の上に置いた（Research Diet D12492, Research Diets Inc., New Brunswick, NJ）。高脂肪食の8週間後、マウスを、体重に基づいて、8匹ずつの3つの処理群のうちの1つに分類した。ある群は、25 mg／kgの用量で1週間に2回、7週間にわたってISIS 217376（配列番号：142）の皮下注射を受けた。第2の群は、25 mg／kgの用量で1週間に2回、7週間にわたって対照オリゴヌクレオチドISIS 141923（CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC、配列番号：229）の皮下注射を受けた。オリゴヌクレオチドを、注射のために0.9％生理食塩水に溶解させた。第3の群は、1週間に2回、7週間にわたって生理食塩水の皮下注射を受けた。この生理食塩水を注射した群は、オリゴヌクレオチド処理群と比較する対照群として働いた。
【０３１２】
8匹のC57Bl／6マウスの群には、通常のげっ歯動物用食餌を与え、生理食塩水で処理し、これを正常な痩身群として用いた。
【０３１３】
いかなる公知の遺伝子にも相補的ではないISIS 141923は、両側（5'および3'方向）に5ヌクレオチドの「ウイング」が隣接する10の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央の「ギャップ」領域から構成される20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウイングは2'-O-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート（P＝S）である。全てのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。
【０３１４】
7週間の処理期間後、マウスを屠殺し、肝臓、褐色脂肪組織（BAT）および白色脂肪組織（WAT）においてジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2（DGAT2）mRNAレベルを評価した。加えて、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ1（DGAT1）mRNAレベルを、これらの組織中で測定した。mRNA発現レベルを、本明細書中の他の実施例に記載のリアルタイムPCRにより定量した。結果を表4に示し、生理食塩水で処理した、高脂肪食を摂取したマウスに対する阻害率で表す。数字の前の「＋」は、遺伝子発現が阻害されたのではなく増加したことを示す。
【０３１５】
【表４】
0005420334.tif 000018
【０３１６】
データは、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理により、肝臓、褐色脂肪組織および白色脂肪組織における標的mRNAの発現が効果的に阻害され得ることを示す。ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ1発現レベルは、肝臓および褐色脂肪組織で低下した。
【０３１７】
体重および食餌の摂取を、研究の間にわたってモニタリングした。代謝速度を、代謝室（Oxymax System, Columbus Instruments, Columbus, OH）中で間接熱量測定法を用いて測定した。脂肪組織重量もまた、研究の最後に測定した。体重、脂肪組織重量、食餌摂取および代謝速度は、ISIS 217376で処理した食餌誘導性肥満マウスで変化しなかった。
【０３１８】
同様の研究で、動物に、1週間に2回、生理食塩水、25 mg／kgのISIS 217376または25 mg／kgのISIS 141923を、5週間の期間にわたって皮下注射した。これらのマウスにおいて、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNAは、肝臓および白色脂肪脂質組織でおよそ90％減少した。
【０３１９】
実施例１９
脂質およびグルコース代謝のマーカーへのジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のアンチセンス阻害の影響
本発明に従って、実施例18に記載のように、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理を受けた食餌誘導性肥満マウスにおける脂質およびグルコース代謝に対してISIS 217376（配列番号：142）が影響を与える能力を試験した。7週間の処理期間の最後に、これらのマウスの血清遊離脂肪酸レベルを、NEFA Cアッセイキット（part #994-75409, Wako Chemicals, GmbH, Germany）を用いてさらに評価した。7週間の処理期間の最後に、トリグリセリド（TRIG）、コレステロール（総コレステロール（CHOL）ならびに高密度リポタンパク質（HDL）および低密度リポタンパク質コレステロール（LDL）を含む）もまた測定したが、これらは全て、Hitachi717（登録商標）分析機器（Roche Diagnostics, Indianapolis, IN）を用いて測定した。生理食塩水対照に対する減少百分率で表されるデータを、表5に示す。
【０３２０】
【表５】
0005420334.tif 000019
【０３２１】
この結果は、実施例18で示されるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2発現のアンチセンス阻害が、血清遊離脂肪酸、血清トリグリセリドおよび総コレステロールにそれぞれ335、41％および31％と有意な低下をもたらすことを示す。さらに、HDLコレステロールが減少した。LDLコレステロールレベルには有意な変化は観察されなかった。
【０３２２】
血漿グルコース濃度（n＝8マウス）を、処理の第0週（研究の開始）、第3週および第7週（研究の最後）に、YSI2700 SelectTM Biochemistry Analyzer （YSI Inc., Yellow Spring, Ohio）を用いた常套的な臨床的分析により測定した。血漿インスリンレベル（n＝6〜8マウス）を、第0週、第3週および第7週において摂食状態で、および第4週に4時間の絶食後に、インスリンELISAキット（#10-1137-10, ALPCO Diagnostics, Windham, NH）を用い、製造業者の使用説明書に従って測定した。4週間の処理後、インスリン耐性試験（n＝8マウス）を、3時間の絶食後に行った。5週間の処理後、耐糖能試験（n＝8マウス）を、一晩の絶食後に行った。耐性試験については、1.0 g／kgのグルコースまたは0.5単位／kgのインスリンを腹腔内投与した後に、ベースライン尾血液グルコース測定値を得た。尾血液グルコースレベルは、グルコースまたはインスリンでの負荷の15、30、60、90および120分後に、Glucometer（登録商標）機器（Abbott Laboratories, Bedford, MA）を用いて測定した。
【０３２３】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2に標的化したアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理により、血漿インスリンレベルが第4週において絶食状態で50％、および第7週において摂食状態で69％減少した。血漿グルコースレベルは、食餌誘導性肥満マウスにおけるISIS 217376での処理では変化しなかった。インスリン感受性または耐糖能のいずれも、ISIS 217376での処理では改善されなかった。
【０３２４】
実施例２０
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のアンチセンス阻害が食餌誘導性肥満マウスにおける肝臓トリグリセリドおよび脂肪症に及ぼす影響
本発明に従い、ISIS 217376（配列番号：142）が食餌誘導性肥満マウスの肝臓におけるトリグリセリドおよびグリコゲン含有量に影響を及ぼす能力を試験した。実施例18に記載のようにアンチセンスオリゴヌクレオチド処理を受けた食餌誘導性肥満マウスを、肝臓トリグリセリドおよびグリコゲン含有量について7週間の処理期間の終わりにさらに評価した。肝臓組織の肝臓トリグリセリド濃度の生化学的分析および組織学的検査により評価される肝細胞トリグリセリド含有量を、肝臓脂肪症、すなわち肝臓における脂質の蓄積の評価に用いた。肝臓組織トリグリセリド濃度を測定するため、HPLC-グレードアセトン中の肝臓組織から、重量：容積比1:20を用いてトリグリセリドを抽出した。トリグリセリドを、Infinity Triglycerides Reagent Kit（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を用いて測定した。肝臓および筋肉グリコゲン濃度を、Desaiら（Diabetes, 2001,50, 2287-2295）に記載のように測定した。グリコゲン濃度を測定するため、肝臓および筋肉の組織を、0.03 N HCl中で（最終濃度0.5 mg／mLまで）ホモジナイズした。100μLのホモジネートを、400μLの1.25 N HClと混合し、100℃で1時間加熱した。試料を14,000rpmで遠心分離した後、10μLの上清を、1 mLのグルコースオキシダーゼ試薬（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）と混合した。37℃で10分インキュベーションした後、吸光度は505 nmであった。ウサギ肝臓由来のII型グリコゲンを用いて標準曲線を得、グリコゲン濃度を決定するのに用いた。肝臓脂質およびグリコゲン含有量（n＝8マウス）についてのデータを表6に示すが、生理食塩水で処理した高脂肪食マウスに対する減少率として表す。
【０３２５】
【表６】
0005420334.tif 000020
【０３２６】
表6の結果は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2に標的化したアンチセンスオリゴヌクレオチドでの7週間の処理により、生理食塩水および対照オリゴヌクレオチドで処理したマウスと比較して、肝臓トリグリセリド含有量の56％もの顕著な減少が生じたことを示し、このことは、肝臓脂肪症が改善されたことを示す。7週間の肝臓グリコゲン含有量は、表6に示すように、ISIS 217376での処理によって変化しなかった。
【０３２７】
5週間の研究において、肝臓トリグリセリド含有量は、処理期間の最後に62％低下した。5週間の処理後の筋肉グリコゲン含有量は、ISIS 217376での処理によっても変化しなかった。
【０３２８】
肝臓トリグリセリドの減少はまた、肝臓組織（n＝4マウス）の組織学的検査によっても評価された。肝臓組織を10％中性緩衝化ホルマリンで固定化し、パラフィンろう中に包埋した。複数の隣接する4μm切片を切り出し、スライドガラスに載せた。脱水後、切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色して、核および細胞質をそれぞれ染色した。この組織学的分析により、7週間のISIS 217376での処理後、生理食塩水で処理したマウスまたはISIS 141923で処理したマウスと比較して、肝臓脂肪症が顕著に改善されたことが明らかになった。従って、肝臓脂肪症の改善は、組織学的方法および生化学的方法の両方で示された。
【０３２９】
実施例２１
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のアンチセンス阻害が肝臓の脂質生成遺伝子および糖新生遺伝子に及ぼす影響
本発明に従い、ISIS 217376 （配列番号：142）が、脂肪酸合成およびグルコース代謝に関与する遺伝子の発現に影響を及ぼす能力を試験した。7週間の処理終了時に、実施例18に記載のようにアンチセンスオリゴヌクレオチド処理を受けた食餌誘導性肥満マウスにおいて、脂質代謝、糖新生およびグルコース代謝に関与する遺伝子の発現レベルをさらに評価した。肝臓および白色脂肪組織におけるmRNAレベルを、表7に記載のGenBank（登録商標）受託番号を用いて生成したプライマープローブセットを用いて、本明細書中の他の実施例に記載のリアルタイムPCRにより定量した。結果を、生理食塩水で処理した高脂肪食対照マウスに対する変化率（％）で表し、これを表7に示す（n＝6〜8マウス）。
【０３３０】
【表７】
0005420334.tif 000021
【０３３１】
これらのデータは、ISIS 217376での処理は、食餌誘導性肥満マウスにおけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNAの発現の減少に加えて、脂質代謝に関与するさらなる遺伝子の発現を同時に減少させることを示す。例えば、肝臓では、トリグリセリド合成（例えば、グリセロールキナーゼ）、デノボ脂肪酸合成（例えば、ATP-クエン酸リアーゼ、アセチル-CoAカルボキシラーゼ1、アセチル-CoAカルボキシラーゼ2および脂肪酸シンターゼ）、脂肪酸酸化（例えば、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼI）、脂肪酸不飽和化（例えば、ステアロイル-CoAデサチュラーゼ1）およびコレステロール合成（例えば、HMG-CoA還元酵素）に関与する遺伝子の発現において減少が観察された。さらに、グリコゲン代謝に関与するグリコゲンホスホリラーゼの発現は、食餌誘導性肥満マウスのISIS 217376での処理後に減少した。脂肪組織における脂肪酸貯蔵に関与するリポタンパク質リパーゼは、同様に、発現の減少を示した。脂質代謝において肝臓転写因子として機能するステロール調節結合因子タンパク質1の発現は、ISIS 217376で処理した食餌誘導性マウスでは、対照群と比較して低下した。糖新生に関係する遺伝子（例えば、グルコース-6-ホスファターゼおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ1）、肝臓および脂肪におけるグルコース取り込みに関係する遺伝子（例えば、2型グルコーストランスポーターおよび4型グルコーストランスポーター）ならびに脂肪における脂質ホメオスタシスに関係する遺伝子（例えば、ホルモン感受性リパーゼおよびリポタンパク質リパーゼ）の発現レベルは、顕著には減少しなかった。
【０３３２】
これらのデータは、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のアンチセンス阻害が、脂質生成経路における遺伝子のダウンレギュレーションを生じることを示す。
【０３３３】
実施例２２
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のアンチセンス阻害が肥満のob／obマウスモデルにおいて及ぼす影響
レプチンは、食欲を調節する、脂肪により産生されるホルモンである。ヒトおよび非ヒト動物の両方において、このホルモンが欠如すると、肥満を生じる。ob／obマウスは、レプチン遺伝子に変異を有し、それにより肥満および高血糖を生じる。従って、これらのマウスは、肥満および肥満を減少させるように設計された処理の研究のための有用なモデルである。
【０３３４】
本発明に従って、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のアンチセンス阻害の影響を、肥満のob／obマウスモデルで研究した。6〜7週齢の雄性ob／ob（C57Bl／6J-Lepob／Lepob）マウスをJackson Laboratories （Bar Harbor, ME）から購入した。1週間の順化期間の間および本研究にわたって、マウスに、脂肪含有量が10-15％の食餌（Labdiets #5015, Purina, St. Louis, MO）を与えた。1週間の順化期間後、マウスを、本明細書中に記載のようにGlucometer（登録商標）機器（Abbott Laboratories, Bedford, MA）を用いて測定した体重および尾血中グルコースに基づいて、処理群に配置した。4週間の期間、マウスに、ISIS 217376（配列番号：142）またはISIS 116847（CTGCTAGCCTCTGGATTTGA、配列番号：230）を、25 mg／kgの用量で、週2回皮下注射した。ISIS 116847は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2遺伝子を標的化せず、これを対照として用いた。生理食塩水を注射したマウスの群は、オリゴヌクレオチドで処理した動物と比較する対照群として働いた。各群は、10匹の動物を含んでいた。
【０３３５】
ISIS 116847は、両側（5'および3'方向）に5ヌクレオチドの「ウイング」が隣接する10の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央の「ギャップ」領域から構成される20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウイングは2'-O-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート（P＝S）である。全てのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。生理食塩水を注射したマウスの群は、未処理対照として働いた。各処理群は、8匹のマウスから構成された。
【０３３６】
4週間の処理期間の最後に、マウスを屠殺し、標的の発現およびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ1の発現を、肝臓および脂肪組織において測定した。mRNA発現を、本明細書中の他の実施例に記載のリアルタイムPCRにより定量した。これらの器官もまた秤量した。データは、生理食塩水対照に対する阻害率で表し、これらを表8に示す。数字の前の「＋」は、遺伝子発現が阻害されたのではなく増加したことを示す。
【０３３７】
【表８】
0005420334.tif 000022
【０３３８】
表8に示す結果は、ob／obマウスのISIS 217376での処理が、肝臓および脂質組織の両方において、標的mRNAの発現は、それぞれ、83％および90％と、効果的に阻害したことを示す。肝臓の重量は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したob／obマウスにおいて21％減少したが、脂肪組織の重量は有意に変化しなかった。ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ1 mRNA発現の有意な減少は観察されなかった。
【０３３９】
研究期間の間、体重および食餌摂取をモニタリングしたが、ISIS 217376で処理したマウスでは、食塩水で処理したマウスに比べて変化は観察されなかった。同様に、脂肪組織重量にも変化は観察されなかった。本明細書中に記載されるように測定された代謝速度もまた、ISIS 217376での処理後に変化しなかった。
【０３４０】
脂質生成に関与する遺伝子、例えば、脂肪酸シンターゼ、アセチル-CoAカルボキシラーゼ1およびアセチル-CoAカルボキシラーゼ2の発現は、ISIS 217386での処理後に減少した。
【０３４１】
実施例２３
ob／obマウスにおけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のアンチセンス阻害が血清および肝臓脂質含有量に与える影響
本発明に従って、ISIS 217376（配列番号：142）がob／obマウスの血清脂質および遊離脂肪酸、ならびに組織トリグリセリドレベルに及ぼす影響を試験した。
【０３４２】
実施例22記載のようにアンチセンスオリゴヌクレオチド処理を受けたob／obマウスを、4週間の処理期間終了時に、血清遊離脂肪酸、血清コレステロール（CHOL）、ならびに血清、肝臓組織および脂質組織トリグリセリド（TRIG）についてさらに評価した。これらの全ては、本明細書中に記載のように測定した。肝臓脂肪症、すなわち、肝臓中での脂質の蓄積を、本明細書中に記載のように、生化学的および組織学的に評価した。表9に示す、血清および組織脂質レベルを記載したデータは、生理食塩水で処理した対照ob／obマウスに対する減少率として表した。実施例22と同様に、結果は、8匹のマウスからの測定値の平均である。
【０３４３】
【表９】
0005420334.tif 000023
【０３４４】
データは、ob／obマウスにおけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のアンチセンス阻害が、肝臓組織においてトリグリセリドレベルの21％の減少および血清遊離脂肪酸の22％の減少を生じることを示す。肝臓組織トリグリセリド含有量の減少は、肝臓脂肪症の改善を示す。さらに、肝臓組織の組織学的評価は、肝臓脂肪症の顕著な改善を示した。血清トリグリセリド、脂肪組織トリグリセリドまたはコレステロールには有意な変化は観察されなかった。
【０３４５】
実施例２４
ob／obマウスにおけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のアンチセンス阻害後の血漿インスリンおよびグルコースレベル
本発明に従い、実施例22に記載のように処理したob／obマウスのインスリンおよびグルコースレベルをさらに評価した。血漿グルコースを、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理の開始、ならびに処理の2週間および4週間後に測定した。血漿インスリンを、処理の2週間および4週間後に、本明細書中に記載のように測定した。処理の3週間後、それぞれ16時間および4時間絶食したマウスにおいて、耐糖能試験およびインスリン耐性試験もまた（本明細書中に記載のように）行った。生理食塩水で処理した対照ob／obマウスに対して、ISIS 217376を受けたob／obマウスの血漿インスリンは、2週間および4週間のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理の両方において43％減少した。血漿グルコースレベルには有意な変化は観察されず、耐糖能またはインスリン感受性にも改善は観察されなかった。
【０３４６】
実施例２５
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のアンチセンス阻害が肥満のdb／dbマウスモデルにおいて及ぼす影響
レプチンホルモン受容体マウスにおける欠損もまた肥満および高血糖を生じる。これらのマウスは、ob／obマウスと同様、db／dbマウスと呼ばれ、肥満のマウスモデルとして用いられる。
【０３４７】
本発明に従い、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のISIS 217276（配列番号：142）でのアンチセンス阻害のdb／dbマウスにおける影響を研究した。7日の順化期間の間および本研究にわたって、6週齢の雄性db／db（C57Bl／6J-Leprdb／Leprdb）マウスに、脂質含有量が15-20％の食餌（Labdiets #5008, Purina, St. Louis, MO）を与えた。順化期間後、マウスを、Glucometer（登録商標）機器（Abbott Laboratories, Bedford, MA）を用いて、本明細書中に記載のように測定した体重および尾血中グルコースに基づいて、処理群に配置した。5週間の期間、マウスに、ISIS 217376（配列番号：142）または対照オリゴヌクレオチドISIS 116847（CTGCTAGCCTCTGGATTTGA、配列番号：230）を、25 mg／kgの用量で、週2回皮下注射した。生理食塩水を注射したマウスの群は未処理対照群として働いた。各処理群は、10匹のマウスを含んでいた。
【０３４８】
5週間の処理期間後に、マウスを屠殺し、肝臓、褐色脂肪組織（BAT）および白色脂肪組織（WAT）においてジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNAレベル（n＝4マウス）を評価した。ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ1 mRNAレベルもまた、これらの組織中で測定した。mRNA発現レベルを、本明細書中の他の実施例に記載されるように、リアルタイムPCRにより定量した。加えて、肝臓トリグリセリド（n＝6マウス）および血漿グルコース（n＝8マウス）を、本明細書中に記載のように測定した。結果を表10に示し、生理食塩水で処理したマウスに対する阻害率（mRNA発現について）または減少（グルコースおよびトリグリセリドについて）として表現した。遺伝子発現または肝臓トリグリセリドの増加は、数字の前の「＋」で示す。肝臓脂肪症、すなわち肝臓中での脂質の蓄積を評価するため、肝臓組織試料を、本明細書中に記載のように、組織学的検査用に処理した。肝臓切片を、脂質の沈着を可視化するのに通常用いられるオイルレッドO染色液で染色し、ヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色して、核および細胞質をそれぞれ可視化した。
【０３４９】
【表１０】
0005420334.tif 000024
【０３５０】
これらのデータは、標的mRNA発現がISIS 217376で処理したdb／dbマウスの肝臓、白色脂肪および褐色脂肪組織においてそれぞれ95％、80％および87％と、効果的に阻害されたことを示す。さらに、db／dbマウスにおけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2発現の阻害は、生化学的に測定される肝臓トリグリセリド含有量の41％の減少および組織学的に測定される脂質蓄積の顕著な減少を示し、このことは、肝臓脂肪症の改善を示す。血漿グルコースの有意な変化は観察されなかった。
【０３５１】
脂質生成に関与する遺伝子、例えば、脂肪酸シンターゼ、アセチル-CoAカルボキシラーゼ1およびアセチル-CoAカルボキシラーゼ2の発現は、ISIS 217386での処理後に減少した。
【０３５２】
これらのデータは、本明細書中に記載のデータと共に、食餌誘導性肥満、レプチン欠損およびレプチンシグナルの欠損のマウスモデルにおけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のアンチセンス阻害が肝臓脂肪症および肝臓での脂質生成、ならびに高脂血症を減少させたことを示す。
【０３５３】
実施例２６
ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2標的化siRNAの設計およびスクリーニング
さらなる態様において、一連の核酸二本鎖（siRNA）を、ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNA（配列番号：４）に標的化するよう設計し、これを表11に示す。表11の全ての化合物は、19ヌクレオチド長であって、化合物にわたってホスホジエステルヌクレオシド間結合（主鎖）を有するオリゴリボヌクレオチドである。化合物を、平滑末端を用いて、本明細書中に記載のように調製した。表11は、siRNAのアンチセンス鎖、ならびにセンス鎖を示す。これらの配列は、ウラシル（U）を含むことが示されているが、当業者は、DNA配列においてウラシル（U）は一般的にチミン（T）で置換されることを理解するであろう。「標的部位」は、化合物が結合する特定の標的配列上の第1の（5'最末端）ヌクレオチド番号を示す。
【０３５４】
表11中の化合物がA549細胞中のヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNAレベルに及ぼす影響を試験した。ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2を標的にしないsiRNA対照は、ISIS 335449（TTTGTCTCTGGTCCTTACTT；本明細書中で配列番号：231として援用される）およびその相補鎖の二本鎖、ならびにISIS 359661（TTATCGCTTCTCGTTGCTT；本明細書中で配列番号：232として援用される）およびその相補鎖の二本鎖を含んでいた。ISIS 335449は、20ヌクレオチド長であって、化合物全体にわたってホスホジエステルヌクレオシド間結合（主鎖）を有するオリゴリボヌクレオチドである。ISIS 359661は、19ヌクレオチド長であって、化合物全体にわたってホスホジエステルヌクレオシド間結合（主鎖）を有するオリゴリボヌクレオチドである。ISIS 335449およびISIS 359661のいずれも、ならびにそれらの相補鎖も、平滑末端を有するように調製された。対照RNアーゼHオリゴヌクレオチドは、ギャップマーISIS 141923（配列番号：229）およびISIS 129700（TAGTGCGGACCTACCCACGA；本明細書中で配列番号：233として援用される）であったが、そのいずれも、ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2を標的としない。ISIS 129700は、5'および3'末端に5ヌクレオチドの「ウイング」および6ヌクレオチドの「ウイング」がそれぞれ隣接する9の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央の「ギャップ」領域から構成される20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウイングは2'-O-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート（P＝S）である。全てのシチジンは、5-メチルシチジンである。
【０３５５】
A549細胞を、15μg／mLのLIPOFECTINTM試薬（Invitrogenと混合した150 nMのsiRNA化合物で処理した。
【０３５６】
A549細胞を、15μg／mLのLIPOFECTINTM試薬（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）と混合した150 nMのsiRNA化合物、または15 μg／mLのLIPOFECTINTM試薬と混合した150 nMの一本鎖オリゴヌクレオチドで4時間処理し、次いで、正常な増殖培地中で20時間培養した。
【０３５７】
ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNAの発現を、本明細書中に記載のように、定量リアルタイムPCRにより測定した。結果を、dsRNA化合物またはRNアーゼHオリゴヌクレオチドで処理していない未処理対照細胞に対して標準化した。データは、2回の実験の平均であり、表11に示す。「N.D.」が存在する場合、「測定しなかった」ことを示す。
【０３５８】
【表１１】
0005420334.tif 000025
0005420334.tif 000026
【０３５９】
これらのデータは、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2に標的化したsiRNA、例えば、ISIS 361888、ISIS 361892、ISIS 361893、ISIS 361901およびISIS 361902の二本鎖、ならびにそれらの各相補鎖が、標的mRNAの発現を阻害したことを示した。
【０３６０】
実施例２７
マウス初代肝細胞における、マウスジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNA発現の阻害：用量応答の研究
さらなる態様では、マウスジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2に標的化した4つのオリゴヌクレオチドを、さらなる用量応答の研究のために選択した。これらの化合物は、ISIS 217312（配列番号：21）、ISIS 217311（配列番号：109）、ISIS 217352（配列番号：121）およびISIS 217376 （配列番号：142）であった。ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2に標的化しないISIS 129690（TTAGAATACGTCGCGTTATG、本明細書中で配列番号：271として援用される）およびISIS 129696（ATTCGCCAGACAACACTGAC、本明細書中で配列番号：272として援用される）が対照として働いた。ISIS 129690およびISIS 129696は、両側（5'および3'方向）に5ヌクレオチドの「ウイング」が隣接する10の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央の「ギャップ」領域から構成される20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウイングは2'-O-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート（P＝S）である。全てのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。
【０３６１】
初代マウス肝細胞を、Charles River Labs（Wilmington, MA）から購入したCD-1マウスから調製した。初代マウス肝細胞を、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン／ストレプトマイシン、2 mM L-グルタミンおよび.01 M HEPES（培地および補助剤は、Invitrogen Corporation, Carlsbad, CAから入手した）を添加したWilliam培地E中で常套的に培養した。オリゴヌクレオチドトランスフェクション実験に用いるため、細胞を、0.l mg／mlコラーゲンでコーティングした96ウェルプレート（Falcon-Primaria #3872, BD Biosciences）中に、およそ10,000細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、100 nM当たり2.5μlのオリゴヌクレオチドを含むOPTI-MEMTM培地を用いてトランスフェクションした。
【０３６２】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNA発現を、本明細書中に記載のリアルタイムPCRにより定量した。これらの研究の結果を表12に示す。データは、3回の実験の平均値であり、未処理対照の阻害率として表される。各オリゴヌクレオチドについてのIC50もまた示すが、これは、標的発現の50％阻害に必要な濃度を表す。「N.D.」が存在する場合、測定しなかったことを示す。
【０３６３】
【表１２】
0005420334.tif 000027
【０３６４】
表12に示すように、ISIS 217311、ISIS 217312、ISIS 217352およびISIS 217376は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNAの発現を用量依存性の様式で阻害した。
【０３６５】
実施例２８
初代マウス肝細胞におけるマウスジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2の阻害:さらなる用量応答の研究
さらなる態様において、さらなるアンチセンス化合物を、公開された配列データ（GenBank受託番号AF384160.1、本明細書中で配列番号：273として援用される）を用いて、マウスジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2RNAを標的化するように設計した。化合物は、ISIS 287498（ATGCACTCGAGAACTCGGTA、本明細書中で配列番号：274として援用される）と呼ばれ、標的部位は、配列番号：４の3'UTR領域のヌクレオチド1277である。
【０３６６】
ISIS 287498およびISIS 217352 （配列番号：121）がマウスジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNAに及ぼす影響を分析した。対照オリゴヌクレオチドは、ISIS 129686（CGTTATTAACCTCCGTTGAA、本明細書中で配列番号：275として援用される）および129690（配列番号：271）であった。ISIS 129686およびISIS 129690は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2に標的化されない。ISIS 129686およびISIS 287498は、両側（5'および3'方向）に5ヌクレオチドの「ウイング」が隣接する10の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央の「ギャップ」領域から構成される20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウイングは2'-O-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート（P＝S）である。全てのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。
【０３６７】
実施例27に記載のように単離および培養した初代マウス肝細胞を、50、100、200および400 nMのISIS 287498、ISIS 217352、ISIS 129686およびISIS 129690で処理した。ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNAレベルを、本明細書中に記載のリアルタイムPCRにより定量した。これらの研究の結果を、表13に示す。データは、3回の実験の平均値であり、未処理対照細胞における発現に対して標準化した阻害率で表す。
【０３６８】
【表１３】
0005420334.tif 000028
【０３６９】
表13に示すように、ISIS 217352およびISIS 287498は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNAの発現を用量依存性の様式で阻害した。
【０３７０】
実施例２９
ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2を標的とする2'-MOEウイングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
さらなる態様において、さらなる一連のアンチセンス化合物を、公開された配列データ（配列番号4および配列番号18）を用いて、ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2RNAの異なる領域を標的化するように設計した。化合物を、表14および15に示す。「標的部位」は、化合物が結合する特定の標的配列上の最初の（最も5'側）ヌクレオチド番号を示す。表14および15の全ての化合物は、20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。表14の化合物は、10個の2'-デオキシヌクレオチドからなる中心「ギャップ」領域から構成され、該領域は、両側（5'および3'方向）で5ヌクレオチドの「ウイング」と隣接する。ウイングは2'-O-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドから構成される。表15の化合物は、16個の2'-デオキシヌクレオチドからなる中心「ギャップ」領域から構成され、該領域は、両側（5'および3'方向）で2ヌクレオチドの「ウイング」と隣接する。ウイングは2'-O-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドから構成される。全ての化合物において、ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート（P＝S）である。全てのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。
【０３７１】
【表１４】
0005420334.tif 000029
0005420334.tif 000030
【０３７２】
【表１５】
0005420334.tif 000031
0005420334.tif 000032
【０３７３】
実施例３０
2'-MOEウイングおよびデオキシギャップを有し、ラットジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2に標的とするキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
さらなる態様において、一連のアンチセンス化合物を、公開された配列データ（本明細書中で配列番号412として援用されるGenBank受託番号XM_341887.1、相補鎖が本明細書中で配列番号413として援用されるGenBank受託番号AA956461.1）を用いて、ラットジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 RNAの異なる領域を標的化するように設計した。化合物を、表16に示す。「標的部位」は、化合物が結合する特定の標的配列上の最初の（最も5’側）ヌクレオチド番号を示す。表16の全ての化合物は、10個の2'-デオキシヌクレオチドからなる中心「ギャップ」領域から構成される20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、該領域は、両側（5'および3'方向）で5ヌクレオチドの「ウイング」と隣接する。ウイングは2'-O-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート（P＝S）である。全てのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。
【０３７４】
【表１６】
0005420334.tif 000033
0005420334.tif 000034
【０３７５】
実施例３１
2'-MOEウイングおよびデオキシギャップを有し、マウスジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2発現を標的とするアンチセンスキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの設計
さらなる態様において、アンチセンス化合物ISIS337205（本明細書中で配列番号485として援用されるATGCACTCAAGAACTCGGTA）を、公開された配列データ（配列番号11）を用いて、マウスジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 RNAの3'UTR領域を標的とするように設計した。ISIS 337205は、14個の2'-デオキシヌクレオチドからなる中心「ギャップ」領域から構成される20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、該領域は、両側（5'および3'方向）で3ヌクレオチドの「ウイング」と隣接する。ウイングは2'-O-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート（P＝S）である。全てのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。
【０３７６】
実施例３２
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のアンチセンス阻害が初代げっ歯類肝細胞におけるトリグリセリド合成に及ぼす影響
肝臓および白色脂肪組織中で豊富に発現されるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2は、トリグリセリド合成に関与し、その活性もまた内因性脂肪酸合成経路に密接に関連する。従って、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のアンチセンス阻害が肝細胞におけるトリグリセリド合成に影響するかどうかを決定することは興味深い。さらなる態様において、ラットおよびマウス肝細胞を単離し、ISIS 217357（配列番号123）およびISIS 217376（配列番号142）でそれぞれ処理した。ISIS 217357は、ラットジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2に対して100％相補性を示す交差種オリゴヌクレオチドである。
【０３７７】
初代肝細胞を、C57BL／6JマウスまたはSprague Dawleyラット（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）から単離した。動物を、常套的手順に従って麻酔した。初めに、10 mM Hepesおよび0.5 mM EGTA（pH 7.4）を含む、Ca2＋／Mg2＋非含有Hank平衡塩溶液（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）で約3分、引き続いて消化緩衝液（William培地E、10 mM Hepes、2 mMグルタミン酸、Rocheの0.63 mg／mlコラゲナーゼB、および0.01 mg／mlのゲンタマイシン）で約5分、門脈から肝臓を灌流した。灌流した肝臓をマウスまたはラットから取り出し、氷冷した洗浄緩衝液（コラゲナーゼを含まないが、10％ウシ胎児血清を添加した上記消化緩衝液）中で撹拌することにより分解した。採取した細胞を、500 rpmで4分間、CR412TM遠心分離機（Jouan Inc, Winchester, VA）中で回転させることにより、実質細胞を非実質細胞から分離した。次いで、細胞を、冷PBSで2回洗浄した。トリパンブルーでの染色で評価される生存率が85％を超える実質肝細胞を、培養培地（10％ウシ胎児血清および10 nmインスリンを有するWilliam 培地 E）中の1プレート当たり1,000,000細胞で、I型コラーゲンでコーティングした60 mm培養プレート（BD Biosciences）上に播種し、37℃および5％CO2で一晩培養した。
【０３７８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドでの形質転換のために、培養培地を吸引し、肝細胞をPBSで1回洗浄し、次いで、1 mlの形質転換混合物（150 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび4.5μg／mLのLIPOFECTINTM試薬（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）を含んだ）を用いて、William培地E中で4〜6時間インキュベートした。次いで、混合物を吸引し、約24時間にわたって培養培地で置換した。
【０３７９】
形質転換肝細胞におけるトリグリセリド合成は、トリチウム化グリセロール（［3H］グリセロール）のトリグリセリド中への取り込みを測定することにより決定した。形質転換の約24時間後、培養培地を、10％ウシ胎児血清、0.5％ウシ血清アルブミン（培地および添加剤はInvitrogen Corporation, Carlsbad, CAから入手した）および10 uCiの［3H］グリセロールを含み、0.5 mMのオレエートを含むかまたは含まない1 mlの高グルコースDMEM培地で置き換えた。オレエートは遊離脂肪酸であり、遊離脂肪酸はトリグリセリド合成の間にトリグリセリド中に取り込まれるので、オレエートをいくつかの細胞の培養培地に添加して、脂肪酸をさらに供給し、トリグリセリド合成を促進した。培養培地中に存在するインスリンもまたトリグリセリド合成を促進することが知られている。
【０３８０】
一晩培養を続けた後、細胞を採集した。採集した細胞の1つの少量の画分を、RNA抽出および遺伝子発現の分析に用いた。残りの画分は、ヘキサン:イソプロパノール（容積で3:2）混合物での脂質の抽出に用いた。抽出した脂質を、当該分野で常套的な方法により、薄層クロマトグラフィーによって分離した。トリグリセリド中に取り込まれた［3H］グリセロールの量を、液体シンチレーション計測により決定した。データは、未処理対照細胞に対して標準化し、培養された細胞サンプル中の1mg当たりの、1分当たりの崩壊（DPM）として表した。表17aおよび17bは、それぞれ、ラット初代肝細胞およびマウス初代肝細胞におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のアンチセンス阻害の影響を示す。
【０３８１】
リアルタイムPCR定量を行い、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNAレベルを測定した。用いたマウスプライマーおよびプローブは、配列番号12、13および14であった。ラットジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のために、プローブおよびプライマーを、公開された配列情報（配列番号XM_341887.1、配列番号412）を用いて、ラットジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2配列にハイブリダイズするように設計した。ラットジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2について、PCRプライマーは、順方向プライマー:GGAACCGCAAAGGCTTTGTA（配列番号486）、逆方向プライマー:AATAGGTGGGAACCAGATCAGC （配列番号487）であり、PCRプローブは、FAM-AGCTGGCCCTGCGCCATGG-TAMRA（配列番号488）（FAMは蛍光レポーター色素であり、TAMRAはクエンチャー色素である）。
【０３８２】
標的発現を、対照オリゴヌクレオチドISIS 141923で処理した細胞のそれに標準化した。
【０３８３】
【表１７】
0005420334.tif 000035
【０３８４】
これらのデータは、ラット肝細胞におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2の阻害により、トリグリセリド合成が、オレエートの非存在下および存在下でそれぞれ5倍および3倍も劇的に減少したことを示す。標的mRNA発現の阻害後、初代マウス肝細胞では、トリグリセリド合成は、オレエートの非存在下および存在下でそれぞれ2.5倍および5.4倍減少した。これらの減少は、遊離脂肪酸の添加または培地中のインスリン濃度にかかわらず起こった。
【０３８５】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2の阻害に応答する脂質合成遺伝子の発現レベルもまた測定した。GenBank（登録商標）データベースから得られる公開された配列情報を用いて設計されたプライマー-プローブセットを用いて、リアルタイムPCRを本明細書中に記載のように行ったが、これを表18および19に示す。初代ラット肝細胞および初代マウス肝細胞における遺伝子発現レベルを、ISIS 141923で処理した細胞におけるレベルに標準化し、これらをそれぞれ表18および19に示す。
【０３８６】
【表１８】
0005420334.tif 000036
【０３８７】
表18に示すように、ステアロイル-CoAデサチュラーゼ1、アセチル-CoAカルボキシラーゼ1およびアセチル-CoAカルボキシラーゼ2発現の減少を、オレエートの存在下および非存在下の両方で観察した。本明細書中に記載のように、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のアンチセンス阻害後、これらの遺伝子の減少もまたインビボで観察した。
【０３８８】
【表１９】
0005420334.tif 000037
【０３８９】
表19に示すように、オレエートの非存在下では、ISIS 217376での処理後の初代マウス肝細胞においてステアロイル-CoAデサチュラーゼ1の減少が観察された。この遺伝子の発現の減少はまた、マウスのISIS 217376での処理後にも観察された。
【０３９０】
実施例３３
痩身ラットにおけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のアンチセンス阻害
さらなる態様において、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のアンチセンス阻害の影響を、粗食を与えられた正常なラットにおいて研究した。6週齢の雄性Sprague Dawleyラットを、Charles River Laboratories （Wilmington, MA）から購入した。ラットを、通常のげっ歯類用食餌（粗食）の食餌で維持し、体重に基づいて3つの処理群のうちの1つに配置した。1つの処理群は、週に2回、生理食塩水の皮下注射を受けた。2つの処理群は、週に2回、50 mg／kgオリゴヌクレオチドの皮下注射を受けた;一方の群は、ISIS 217354（配列番号51）を受け、他方の群は、ISIS 217357（配列番号123）を受けた。ISIS 217354およびISIS 217357は、ヒト、ラットおよびマウスのジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2に100％相補性を示す交差種オリゴヌクレオチドである。
【０３９１】
ラットは全5回の投与を受け、オリゴヌクレオチドまたは生理食塩水の5回目および最終の投与の2日後に、屠殺された。
【０３９２】
研究の最後に、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNAレベルの定量的リアルタイムPCRのために、肝臓組織および白色脂肪組織（WAT）を回収した。リアルタイムPCRは、本明細書中に記載のように行った。データを表20に示すが、生理食塩水で処理したマウスにおけるmRNA発現レベルに対して標準化されている。
【０３９３】
【表２０】
0005420334.tif 000038
【０３９４】
これらのデータは、ISIS 217354およびISIS 217357が、痩身ラット由来の肝臓および白色脂肪組織においてジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNAの発現を阻害したことを示す。
【０３９５】
血漿コレステロールおよびトリグリセリドを、処理の開始（t＝0週）および終了（t＝2週）において本明細書中に記載の化学分析により測定した。トリグリセリドおよびコレステロールレベルを、表21aにmg／dLとして示す。
【０３９６】
【表２１ａ】
0005420334.tif 000039
【０３９７】
表21aに示すように、全ての処理群におけるコレステロールおよびトリグリセリドは、処理開始時には同様であったが、ISIS 217354またはISIS 217357での処理の2週間後には、生理食塩水で処理したマウスで観察されたレベルに対して、血漿コレステロールがそれぞれ56％および79％減少し、トリグリセリドがそれぞれ38％および64％減少した。
【０３９８】
処理の開始（t＝0週）および終了（t＝2週）において、血漿グルコースおよびインスリンを、それぞれYSI2700 SelectTMBiochemistry AnalyzerおよびELISAキットを用いて本明細書中に記載のように測定した。グルコースおよびインスリンレベルを、表21bにそれぞれmg／dLおよびng／mLとして示す。
【０３９９】
【表２１ｂ】
0005420334.tif 000040
【０４００】
これらのデータは、全ての処理群におけるインスリンレベルは、0週には同様であったが、ISIS 217354またはISIS 217357処理の2週間後には、生理食塩水で処理したマウスで観察されたレベルに対して、インスリンレベルがそれぞれ52％および40％減少したことを示す。処理の2週間後、オリゴヌクレオチドで処理したマウスでは、生理食塩水で処理したマウスに対して、グルコースレベルは変化しなかった。
【０４０１】
血清トランスアミナーゼALTおよびASTは、Olympus Clinical Lab Automation system（Olympus America Inc., Melville, NY）を用いて、常套的分析によって、処理の開始および終了時に測定した。ALTまたはASTの増加は、処理誘発毒性を示す。ALTおよびASTレベルを、表22に、1リットル当たりの単位（U／L）で示す。
【０４０２】
【表２２】
0005420334.tif 000041
【０４０３】
表22のデータは、ISIS 217354およびISIS 217357での処理から生じる毒性を示さなかった。
【０４０４】
研究の間にわたって、体重をモニタリングした。表23に示すように、全ての処理群で体重増加が観察されたので、体重増加はオリゴヌクレオチドでの処理に起因するものではなかった。食餌摂取もまた処理期間にわたってモニタリングしたが、変化は観察されなかった。
【０４０５】
【表２３】
0005420334.tif 000042
【０４０６】
これらのデータは、ラットジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2に標的化したアンチセンスオリゴヌクレオチドが、毒性を引き起こすことなく、痩身ラットにおける標的発現を効果的に阻害したことを明らかにする。さらに、インスリン、コレステロールおよびトリグリセリドレベルは、処理の2週間後に減少した。
【０４０７】
実施例３４
遺伝的肥満のラットモデルにおけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のアンチセンス阻害
Zucker肥満（fa／fa）ラットは、遺伝の常染色体劣性パターンを有する遺伝的肥満の例である。fa／fa動物における肥満は、過食、エネルギー消費の減少、温度調節発熱の不全、高インスリン症（インスリンの過剰産生）および高コルチコステロイド症（コルチコステロイドの過剰産生）と相関する。fa変異は、レプチン受容体の細胞外ドメインのアミノ酸置換として同定された。結果として、fa／fa動物は、上昇した血漿レプチンレベルを有し、かつ、外因性レプチン投与に耐性を有する。
【０４０８】
さらなる態様において、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のアンチセンス阻害の影響を、肥満のZucker fa／faラットモデルにおいて評価する。6週齢の雄性Zucker fa／fa ラットを、Charles River Laboratories （Wilmington, MA）から購入する。ラットを、通常のげっ歯類食餌で維持する。動物を、それぞれ6匹の動物の処理群に配置する。対照群は、週に2回、無菌リン酸緩衝化生理食塩水の皮下注射を受ける。オリゴヌクレオチド処理群は、週に2回、ラットジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2に標的化したアンチセンスオリゴヌクレオチドの皮下注射を受ける。例示のため、ラットを、25、37.5または50 mg／kgのISIS 217357 （配列番号123）で処理する。ラットは、8週間にわたって、合計16〜20回の投与を受ける。処理期間の最後に、ラットを屠殺する。
【０４０９】
体重および食餌摂取を、処理期間の開始に、およびその後は毎週測定する。身体組成を、処理期間開始の約3日前、ならびに処理の2、4および5週の間に測定する。
【０４１０】
血清を、最初の投与の2日前およびその後2週間毎に採取する。本明細書中に記載のように分析した血清サンプルを、Olympus Clinical Lab Automation System （Olympus America Inc.,Melville, NY）を用いる肝臓トランスアミナーゼALTおよびASTの測定；Hitachi717（登録商標）分析機器（Roche Diagnosis, Indianapolis, IN）を用いるトリグリセリドおよびコレステロールの測定；NEFA C アッセイキット（Wako Chemicals, GmbH, Germanyから入手したpart #994-75409）を用いる遊離脂肪酸の測定;ならびにYSI2700 SelectTMBio Chemistry Analyzer （YSI Inc., Yellow Spring, Ohio）を用いるグルコースの測定に供する。インスリンレベルを、ラット特異的ELISAキット（ALPCO Diagonistics, Windham, NH）を用いて測定する。
【０４１１】
オリゴヌクレオチド処理が耐糖に及ぼす影響を評価するため、経口耐糖試験を、5週間の間に本明細書中に記載のように行う。
【０４１２】
研究の最後に、肝臓組織および精巣上体脂肪組織を、RNA単離および定量的リアルタイムPCRのために回収する。これらの組織中のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼmRNAレベルを、本明細書中に記載のように測定する。
【０４１３】
常套的な組織学的分析のために、肝臓組織および精巣上体脂肪組織をまた回収する。組織を、まず、中性緩衝化ホルマリン中に固定し、続いて脱水し、パラフィンワックス中に包埋し、切り出しおよび染色する。ヘマトキシリンおよびエオシンを、核および細胞質をそれぞれ染色するために用い、オイルレッドOを、脂質を可視化するために用いる。
【０４１４】
研究の最後に、肝臓、脾臓、精巣上体脂肪および褐色脂肪脂質組織を秤量する。
【０４１５】
肝臓および脂質組織中での脂肪合成および糖新生の経路に関連する遺伝子の発現レベルを、定量的リアルタイムPCRを用いて測定する。例えば、測定された遺伝子は、トリグリセリド合成（例えば、グリセロールキナーゼ）、デノボ脂肪酸合成（例えば、ATP-クエン酸リアーゼ、アセチル-CoAカルボキシラーゼ1、アセチル-CoAカルボキシラーゼ2および脂肪酸合成酵素）脂肪酸酸化（例えば、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼI）、脂肪酸不飽和化（例えば、ステアロイル-CoAデサチュラーゼ1）およびコレステロール合成（例えば、HMG-CoA還元酵素）に関与する。さらに、グリコーゲン代謝に関与する遺伝子の発現レベル（例えば、グリコーゲンホスホリラーゼ）を測定する。加えて、脂肪酸貯蔵に関与する遺伝子（例えば、リポタンパク質リパーゼ）を測定する。肝細胞転写因子（例えば、ステロール調節結合因子タンパク質1）の発現の変化もまた測定する。糖新生（例えば、グルコース-6-ホスファターゼおよびホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ1）、肝臓および脂肪の両方におけるグルコース取り込み（例えば、グルコーストランスポーター2型およびグルコーストランスポーター4型）ならびに脂肪での脂質ホメオスタシス（例えば、ホルモン感受性リパーゼおよびリポタンパク質リパーゼ）に関する遺伝子の発現レベルもまた測定する。
【０４１６】
実施例３５
初代肝細胞におけるラットジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2のアンチセンス阻害：用量応答
さらなる態様において、ラットジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2に標的化したオリゴヌクレオチドを、初代ラット肝細胞における用量応答の研究のために選択した。試験したオリゴヌクレオチドは、ISIS 217320、ISIS 217336、ISIS 217353、ISIS 217354、ISIS 217356、ISIS 217357およびISIS 217376であった。
【０４１７】
初代ラット肝細胞を、Sprague-Dawleyラット（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）から単離し、10％ウシ胎児、1％ペニシリン／ストレプトマイシン、2 mM L-グルタミンおよび.01 M HEPES（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）を添加したWilliams培地 E中で培養した。オリゴヌクレオチドトランスフェクション実験に用いるために、0.1 mg／mlコラーゲンでコーティングした96ウェルプレート（Falcon-Primaria #3872）中に、約10,000細胞／ウェルの密度で、細胞を播種した。
【０４１８】
細胞を、5、10、25、50、100および200 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、本明細書中に記載のように処理した。オリゴヌクレオチド処理細胞におけるラットジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2 mRNAの発現を、定量的リアルタイムPCRを用いて測定した。25、50、100および200 nM処理からのデータは、3回の実験から平均化し、未処理対照細胞に対する阻害率として、表24に示した。5 nMおよび10 nMでの処理は、ラットジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2発現を阻害しなかった。
【０４１９】
【表２４】
0005420334.tif 000043
【０４２０】
表24に示すように、本アッセイで試験したオリゴヌクレオチドは、初代肝細胞においてラットジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2発現を阻害した。ISIS 217336、ISIS 217353、ISIS 217356、ISIS 217357およびISIS 217376は、標的mRNAの発現を用量依存性の様式で阻害した。
【０４２１】
本明細書中で引用した全ての刊行物は、本明細書中で参考として援用される。本発明を、特に好ましい態様を参照しながら説明したが、本発明の趣旨から逸脱することなく改変がなされ得ることが理解されるであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【０４２２】
本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
［１］ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸分子を標的とする13〜40核酸塩基長のアンチセンス化合物であって、ここで前記化合物が、前記ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸分子に対して少なくとも70％相補的であり、かつここで前記化合物がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２mRNAの発現を少なくとも10％阻害する、アンチセンス化合物。
［２］前記化合物が配列番号：２１、２４、２５、２６、２８、２９、３５、３６、４７、４９、５７、６２、６５、６６、７１、７３、７７、８１、８２、９０、９２および９４からなる群より選択される配列を含む、［１］記載のアンチセンス化合物。
［３］１５〜３０核酸塩基長を含む、［２］記載のアンチセンス化合物。
［４］オリゴヌクレオチドを含む、［１］記載のアンチセンス化合物。
［５］DNAオリゴヌクレオチドを含む、［４］記載のアンチセンス化合物。
［６］RNAオリゴヌクレオチドを含む、［４］記載のアンチセンス化合物。
［７］キメラオリゴヌクレオチドを含む、［４］記載のアンチセンス化合物。
［８］前記化合物の少なくとも一部がRNAとハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド-RNA二本鎖を形成する、［４］記載のアンチセンス化合物。
［９］前記ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸分子と少なくとも80％の相補性を有する、［１］記載のアンチセンス化合物。
［１０］前記ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸分子と少なくとも90％の相補性を有する、［１］記載のアンチセンス化合物。
［１１］前記ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸分子と少なくとも95％の相補性を有する、［１］記載のアンチセンス化合物。
［１２］前記ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸分子と少なくとも99％の相補性を有する、［１］記載のアンチセンス化合物。
［１３］少なくとも1つの、修飾されたヌクレオシド間結合、糖部分または核酸塩基を有する、［１］記載のアンチセンス化合物。
［１４］少なくとも1つの2'-O-メトキシエチル糖部分を有する、［１］記載のアンチセンス化合物。
［１５］少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する、［１］記載のアンチセンス化合物。
［１６］少なくとも1つの5-メチルシトシンを有する、［１］記載のアンチセンス化合物。
［１７］ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の発現が阻害されるように細胞または組織を［１］記載の化合物と接触させることを含む、細胞または組織においてジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の発現を阻害する方法。
［１８］ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸分子の好ましい標的セグメントを、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の1つ以上の候補調節因子と接触させる工程、および
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の発現を調節するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２発現の1つ以上の調節因子を同定する工程
を含む、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の調節因子をスクリーニングする方法。
［１９］ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２発現の調節因子が、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、DNAオリゴヌクレオチド、RNAオリゴヌクレオチド、RNAとハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド−RNA二本鎖を形成することができる、前記RNAオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を有するRNAオリゴヌクレオチド、またはキメラオリゴヌクレオチドを含む、［１８］記載の方法。
［２０］配列番号：６もしくは７を含むプライマーまたは配列番号：８を含むプローブの少なくとも1つを用いて、試料中の、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸の存在を確認することを含む、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２発現と関連のある罹患状態を確認する、診断方法。
［２１］［１］の化合物を含む、キットまたは分析装置。
［２２］動物において、状態の重症度を改善または軽減する方法であって、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の発現が阻害されるように、かつ前記状態の1つ以上の物理的特徴の測定値が前記状態の重症度の軽減を示すように前記動物を有効量の［１］の化合物と接触させることを含む方法。
［２３］該状態が心臓血管障害である、［２２］記載の方法。
［２４］該状態が肥満である、［２２］記載の方法。
［２５］肥満が食餌誘導性である、［２４］記載の方法。
［２６］肥満の物理的特徴が、増大した脂肪である、［２５］記載の方法。
［２７］該状態が糖尿病である、［２４］記載の方法。
［２８］該状態がコレステロール血症である、［２４］記載の方法。
［２９］該症状が肝臓脂肪症である、［２４］記載の方法。
［３０］該動物が肥満である、［２４］記載の方法。
［３１］該動物が哺乳動物である、［２４］記載の方法。
［３２］動物における血清遊離脂肪酸を低下させる方法であって、前記動物と有効量の［４］の化合物とを接触させることを含む方法。
［３３］動物における血清トリグリセリドを低下させる方法であって、前記動物と有効量の［４］の化合物とを接触させることを含む方法。
［３４］動物におけるHDLコレステロールを低下させる方法であって、前記動物と有効量の［４］の化合物とを接触させることを含む方法。
［３５］動物における総血清コレステロールを低下させる方法であって、前記動物と有効量の［４］の化合物とを接触させることを含む方法。
［３６］動物における血漿または血清インスリンを低下させる方法であって、前記動物と有効量の［４］の化合物とを接触させることを含む方法。
［３７］動物における肝臓トリグリセリドを低下させる方法であって、前記動物と有効量の［４］の化合物とを接触させることを含む方法。
［３８］前記血漿インスリンレベルが前記接触の二週間後に低下する、［３６］記載の方法。
［３９］前記血漿インスリンレベルが前記接触の四週間後に低下する、［３６］記載の方法。
［４０］前記化合物が、配列番号：２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５６、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７５、７６、７７、７８、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９４、９５、９６、９７、１０１、１０９、１１４、１１５、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２７、１２８、１３０、１３３、１３６および１４２からなる群より選択される配列を含む、［１］記載の化合物。
［４１］前記化合物が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の5’-非翻訳領域（5’UTR）と特異的にハイブリダイズできるアンチセンス核酸分子を含む、［１］記載の化合物。
［４２］前記化合物が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の開始領域と特異的にハイブリダイズできるアンチセンス核酸分子を含む、［１］記載の化合物。
［４３］前記化合物が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２のコード領域と特異的にハイブリダイズできるアンチセンス核酸分子を含む、［１］記載の化合物。
［４４］前記化合物が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の終止領域と特異的にハイブリダイズできるアンチセンス核酸分子を含む、［１］記載の化合物。
［４５］前記化合物が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の3’-非翻訳領域と特異的にハイブリダイズできるアンチセンス核酸分子を含む、［１］記載の化合物。
［４６］前記化合物が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２のエキソン：イントロン領域と特異的にハイブリダイズできるアンチセンス核酸分子を含む、［１］記載の化合物。
［４７］前記化合物が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２のイントロン：エキソン領域と特異的にハイブリダイズできるアンチセンス核酸分子を含む、［１］記載の化合物。
［４８］動物の細胞または組織におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の発現を阻害する方法であって、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の発現が阻害されるように前記細胞または組織と［１］記載の化合物とを接触させることを含む方法。
［４９］前記組織が白色脂肪組織である、［４８］記載の方法。
［５０］前記組織が褐色脂肪組織である、［４８］記載の方法。
［５１］動物における脂肪酸合成を調節する方法であって、前記動物と［４］記載の化合物とを接触させることを含む方法。
［５２］動物における脂質生成を調節する方法であって、前記動物と［４］記載の化合物とを接触させることを含む方法。
［５３］動物における糖新生を調節する方法であって、前記動物と［４］記載の化合物とを接触させることを含む方法。
［５４］動物の肝重量を減少させる方法であって、前記動物と［４］記載の化合物とを接触させることを含む方法。
［５５］該動物が肥満である、［５４］記載の方法。
［５６］該動物が糖尿病である、［５４］記載の方法。
［５７］脂質生成の調節が、脂質生成遺伝子をコードする核酸のmRNAレベルの変化によって測定され、前記脂質生成遺伝子がグリセロールキナーゼ、ATP−クエン酸リアーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ１、アセチルCoAカルボキシラーゼ２、脂肪酸シンターゼ、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼI、ステアロイルCoAデサチュラーゼ、HMG-CoA還元酵素、リポタンパク質リパーゼおよびステロール調節結合因子タンパク質１からなる群より選択される、［５２］記載の方法。
［５８］部分的に二本鎖の化合物または完全に二本鎖の化合物を含む、［１］記載のアンチセンス化合物。
［５９］該二本鎖化合物がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードする核酸分子を標的とする19〜23核酸塩基長のsiRNAであり、かつ1つ以上の突出ヌクレオシドを一方または両方の末端に含む、［５８］記載のアンチセンス化合物。
［６０］該突出ヌクレオシドがデオキシチミジン（dT）である、［５９］記載のアンチセンス化合物。
［６１］突出ヌクレオシドの数が１〜６個である、［５９］記載のアンチセンス化合物。
［６２］突出ヌクレオシドの数が１〜４個である、［６１］記載のアンチセンス化合物。
［６３］突出ヌクレオシドの数が１〜２個である、［６２］記載のアンチセンス化合物。
［６４］該二本鎖化合物がジアシルグリセロールアシルトランシフェラーゼ２をコードする核酸分子を標的とする19〜23核酸塩基長のsiRNAであり、かつ平滑末端を含む、［５９］記載のアンチセンス化合物。
［６５］前記化合物が、配列番号：２３８、２４１、２４２、２４３、２５１および２５２からなる群より選択される配列を含む、［６４］記載のアンチセンス化合物。
［６６］心臓血管障害、肥満、糖尿病、コレステロール血症および肝臓脂肪症からなる群より選択される状態の重症度を改善または軽減させるために、ジアシルグリセロールアシルトランシフェラーゼ２の発現が阻害されるように、かつ前記状態の1つ以上の物理的特徴の測定値が前記状態の重症度の軽減を示すように、動物へ投与するための医薬の調製における、［１］記載の化合物の使用。
［６７］動物において血清遊離脂肪酸、血清トリグリセリド、HDLコレステロール、総血清コレステロール、血漿もしくは血清インスリン、または肝臓トリグリセリドを低下させるための医薬の調製における、［４］記載の化合物の使用。
［６８］ジアシルグリセロールアシルトランシフェラーゼ２の発現が阻害されるように動物の細胞または組織におけるジアシルグリセロールアシルトランシフェラーゼ２の発現を阻害するための動物への投与のための医薬の調製における、［１］記載の化合物の使用。
［６９］動物における脂肪酸合成、脂質生成または糖新生を調節するための、動物への投与のための医薬の調製における、［４］記載の化合物の使用。
［７０］動物の肝重量を減少させるための、動物への投与のための医薬の調製における、［４］記載の化合物の使用。
【配列表】
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