(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．３．１．４６）が増強され、前記ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ活性はメチオニンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有し、前記ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼが配列番号１４、１６、１８、２０又は２２のアミノ酸配列を有し；２）配列番号２９により表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドの発現により、アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４または１．１．１．３）が増強されており；３）シスタチオニンガンマシンターゼが弱化または不活性化されていることを特徴とする、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産することが可能なエシェリキア属(Escherichia sp.)由来菌株。
【請求項２】
前記菌株は、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシンまたはＬ−リシン生産菌株に由来する、請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
前記菌株は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ.）である、請求項１に記載の菌株。
【請求項４】
前記菌株は、Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリルリアーゼまたはＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリルリアーゼが弱化または不活性化されている、請求項１に記載の菌株。
【請求項５】
前記菌株はホモセリンキナーゼが弱化または不活性化されている、請求項１に記載の菌株。
【請求項６】
前記菌株は、本来のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性または本来のホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ活性が弱化または不活性化されている、請求項１に記載の菌株。
【請求項７】
前記菌株は、シスタチオニンガンマシンターゼをコードするｍｅｔＢ遺伝子、ホモセリンキナーゼをコードするｔｈｒＢ遺伝子、およびｍｅｔＡ遺伝子の転写調節因子であるｍｅｔＪ遺伝子が弱化または不活性化されている、請求項１に記載の菌株。
【請求項８】
前記微生物が、トレオニン生産菌株である大腸菌ＭＦ００１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＦ００１、寄託番号ＫＣＣＭ１０５６８）に由来する、請求項１に記載の菌株。
【請求項９】
前記微生物が、トレオニン生産菌株である大腸菌ＦＴＲ２５３３（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＦＴＲ２５３３、寄託番号ＫＣＣＭ１０５４１）に由来する、請求項１に記載の菌株。
【請求項１０】
前記微生物が、Ｏ−スクシニルホモセリン（O-succinylhomoserine） 生産菌株である大腸菌ＣＪＭ−Ａ１１（ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＣＪＭ−Ａ１１（ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ））（ＫＣＣＭ  １０９２２Ｐ）である請求項１に記載の菌株。
【請求項１１】
前記微生物が、Ｏ−スクシニルホモセリン（O-succinylhomoserine） 生産菌株である大腸菌ＣＪＭ２−Ａ１１（ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＣＪＭ２−Ａ１１（ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ））（ＫＣＣＭ  １０９２４Ｐ）である請求項１に記載の菌株。
【請求項１２】
１）請求項１〜１１のいずれか１項記載の菌株を発酵させる段階と、２）培地または菌株内でＯ−スクシニルホモセリンを生産する段階と、３）生産されたＯ−スクシニルホモセリンを分離する段階とを含む、Ｏ−スクシニルホモセリンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−メチオニン前駆体(Methionine Precursor)であるＯ−スクシニルホモセリン(O-succinylhomoserine)を生産する菌株、およびこの菌株を用いてＬ−メチオニン前駆体を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メチオニンは、ヒトに必要な必須アミノ酸の一つであって、飼料および飲食物添加剤だけでなく、医学溶剤および医学補充剤の合成原料としても使われる。メチオニンは、コリン（レシチン）およびクレアチンのような合成物の前駆体としての役割を果たすと同時に、システインおよびタウリンの合成原料としても使われる。また、メチオニンは硫黄(sulfur)を提供する役割を果たす。Ｓ−アデノシル−メチオニン(S-adenosyl-methionine)は、Ｌ−メチオニンに由来し、生体内メチル基を提供する役割を果たし、脳における様々な神経伝達物質の合成に関与する。メチオニンおよび／またはＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）は、生体内で肝と動脈の脂肪蓄積を抑制し、うつ病、炎症、肝疾患および筋肉痛を緩和させるなどの様々な役割を果たす。
今まで知られているメチオニンおよび／またはＳ−アデノシル−メチオニンの生体内(in vivo)機能は、次のとおりである。
１）脂肪代謝を促進する肝と動脈における脂肪蓄積を抑制し、脳、心臓および腎臓の血液循環を向上させる（非特許文献１）。
２）消化作用、毒性物質の解毒または排出、および鉛（Ｐｂ）などの重金属の排出を増進させる。
３）１日当たり８００〜１６００ｍｇの投与量で抗うつ剤として投与できる（非特許文献２）。
４）肝機能を増進させ（非特許文献３）、特に、アルコールによって引き起こされる肝疾患に効果的である（非特許文献４）。
５）骨関節疾患に対する抗炎症効果を示し、関節回復を促進する（非特許文献５）。
６）毛髪の必須栄養素である。毛髪に栄養を供給することにより、脱毛を防ぐ（非特許文献６）。
【０００３】
メチオニンは、動物飼料や食品、医薬品などに適用するために、化学的または生物学的に合成できる。
化学的な合成は、主に、５−（β−メチルメルカプトエチル）−ヒダントイン(5-(β-methylmercaptoethyl)-hydantoin)の加水分解反応によってメチオニンを生産する。ところが、このように化学的に合成されたメチオニンは、Ｌ型とＤ型の混合形態で生産されるという欠点を持っている。
生物学的な合成は、メチオニンの合成に関与するタンパク質を使用する方法である。Ｌ−メチオニンは、大腸菌(E.coli)においてｍｅｔＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＥおよびｍｅｔＨなどの遺伝子から発現する酵素の作用によってホモセリンから生合成される。特に、ｍｅｔＡは、メチオニン生合成の一番目の酵素であるホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ(succinyltransferase)をコードする遺伝子であって、ホモセリンをＯ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン(O-succinylhomoserine)に転換する機能を行う。ｍｅｔＢ遺伝子によってコードされるＯ−スクシニルホモセリンリアーゼ(O-succinylhomoserine lyase)またはシスタチオニンガンマシンターゼ(cystathionine gamma synthase)は、Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリンをシスタチオニンに転換する。ｍｅｔＣによってコードされるシスタチオニンベータリアーゼは、シスタチオニンをＬ−ホモシステインに転換する機能を行う。ｍｅｔＥによってコードされるコバラミン非依存性メチオニンシンターゼ(cobalamine-independent methionine synthase)と、ｍｅｔＨによってコードされるコバラミン依存性メチオニンシンターゼ(cobalamine-dependent methionine synthase)は、Ｌ−ホモシステインをＬ−メチオニンに転換する。ここに加えて、ｍｅｔＦによってコードされる５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase)と、ｇｌｙＡによってコードされるセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼとは一緒に作用し、Ｌ−メチオニンの合成に必須的なメチル基を提供するＮ（５）−メチルテトラヒドロ葉酸(N(5)-methyltetrahydrofolate)を合成する機能を行う。
【０００４】
Ｌ−メチオニンは、前記酵素による連鎖的な有機反応によって合成され、前記タンパク質、または前記タンパク質に影響するタンパク質に遺伝的な操作を加える場合、Ｌ−メチオニンの合成を増加させることができる。例えば、特許文献１は、エシェリキア属(Escherichia sp.)に属するゲノム上に、ｔｈｒＢＣとｍｅｔＪを除去してｍｅｔＢＬを過発現させ、ｍｅｔＫをリーキー型に製作してＬ−メチオニンを生産する方法を開示している。また、特許文献２は、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)に属し、ｍｅｔＤ（Ｌ−メチオニン合成阻害剤）遺伝子をノックアウト(Knock-out)した菌株を使用する方法を開示している。特許文献３は、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ｍｅｔＦ）の発現を増加させてＬ−メチオニンの生産を増加させる方法を開示している。
また、生物学的方法によって生産されるメチオニンは、Ｌ型であるという利点があるが、その量は極めて微量である。これはメチオニン生合成経路が非常によく調節されるフィードバック体系を持っているためである。メチオニンが一定の水準以上に合成されると、最終産物としてのメチオニンがメチオニン生合成を開始する初期タンパク質をコードするｍｅｔＡ遺伝子の転写をフィードバックで抑制する。ｍｅｔＡ遺伝子は、転写段階ではメチオニンによって阻害され、翻訳段階では細胞内プロテアーゼによって分解されるメカニズムでメチオニンの量を調節するので、ｍｅｔＡ遺伝子の高発現のみではメチオニンの量を一定の水準以上に増加させることができない（非特許文献７）。したがって、以前の多くの特許らは、フィードバック調節体系からｍｅｔＡ遺伝子のフィードバックを解除する研究に集中している（特許文献４および特許文献５）。
【０００５】
特許文献６は、硫黄の源泉としてシステインを使用せず、直接メチルメルカプタン（ＣＨ３ＳＨ）または硫化水素（Ｈ２Ｓ）を使用するように変形されたシスタチオニンシンターゼ（Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼ）によってホモシステインまたはメチオニンを合成する方法について開示している。ところが、シスタチオニンシンターゼは、細胞で様々なメチオニン前駆体と結合することができ、それにより高い水準の副産物を生産することができると知られている。例えば、シスタチオニンシンターゼは、Ｏ−スクシニルホモセリンとホモシステインの付随反応によって高い水準のホモランチオニン(homolanthionin)を蓄積すると報告された（非特許文献８）。したがって、シスタチオニンシンターゼの過発現は、付随反応の増加に起因した細胞内反応の効率性を減少させることができる。また、この方法では、細胞内のメチオニン代謝経路を用いるため、酵素の反応過程が非効率的であり、細胞に激しい毒性を持つＨ-２ＳまたはＣＨ３ＳＨを使用するという点で実効性が低下し、メチオニン合成経路のフィードバック調節によって十分な量のメチオニンを合成することができないという問題がある。
このような問題を解決するために、本発明者らは、２段階、（１）大腸菌(E.coli)の発酵によってＬ−メチオニン前駆体を生産する段階と、（２）酵素反応によってＬ−メチオニン前駆体をＬ−メチオニンに転換する段階とを含む過程を開発したことがある（特許文献７）。前記２段階の過程による場合、硫化物特有の基質毒性問題、メチオニンとＳＡＭｅによる菌株のフィードバック調節問題、細胞内酵素（例えば、シスタチオニンガンマシンターゼ、Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリルリアーゼ、およびＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリルリアーゼ）による中間産物の分解活性問題を全て解決することができる。しかも、Ｄ−メチオニンとＬ−メチオニンとの混合形態を生産する化学的な合成方法に比べ、前記２段階の過程はＬ−メチオニンのみを選択的に生産するのに非常に効果的である。
前記２段階の過程で、メチオニン前駆体の生産量はメチオニン生産量増加の核心要素の一つである。メチオニン前駆体であるＯ−アセチルホモセリンの合成量を増加させるために、強力なアスパルトキナーゼ、ホモセリントランスフェラーゼおよびＯ−アセチルホモセリントランスフェラーゼの組み合わせが非常に重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】日本特開２０００−１３９４７１号公報
【特許文献２】米国特許公開第２００３／００９２０２６号明細書
【特許文献３】米国特許公開第２００２／００４９３０５号明細書
【特許文献４】国際特許公開第２００５／１０８５６１号パンフレット
【特許文献５】国際特許公開第２００５／１４０３８１３号パンフレット
【特許文献６】米国特許公開第２００５／００５４０６０号明細書
【特許文献７】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００３６５０明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J Hepatol. Jeon BR et al., 2001 Mar; 34(3): 395-401
【非特許文献２】Am J Clin Nutr. Mischoulon D. et al., 2002 Nov; 76(5): 1158S-61S
【非特許文献３】FASEB J. Mato JM., 2002 Jan; 16(1): 15-26
【非特許文献４】Cochrane Database Syst Rev., Rambal A., 2001; (4): CD002235
【非特許文献５】ACP J Club. Sander O., 2003 Jan-Feb; 138(1): 21, J Fam Pract., Soeken KL et al., 2002 May; 51(5): 425-30
【非特許文献６】Audiol Neurootol., Lockwood DS et al., 2000 Sep-Oct; 5(5): 263-266
【非特許文献７】Dvora Biran, Eyal Gur, Leora Gollan and Eliora Z. Ron: Control of methionine biosynthesis in Escherichia coli by proteolysis: Molecular Microbiology (2000) 37(6), 1436-1443
【非特許文献８】J.Bacteriol (2006) vol 188:p609-618
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このような背景の下に、本発明者らは、１）ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．３．１．４６）が導入および増進され、前記ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼはメチオニンに対するフィードバック抵抗性を有し；２）アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４または１．１．１．３）が増進された、Ｏ−スクシニルホモセリン生産菌株を開発した。この菌株は、培養液中のメチオニン濃度を問わずにＬ−メチオニン前駆体を高濃度で生産することが可能な濃度を有し、Ｌ−メチオニン前駆体の生産を著しく増加させることができる。
本発明の目的は、１）ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．３．１．４６）が導入および増進され、前記ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼはメチオニンに対するフィードバック抵抗性を有し；２）アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４または１．１．１．３）が増進された、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産することが可能なエシェリキア属(Escherichia sp.)由来菌株を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記菌株を用いてＬ−メチオニン前駆体を生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一つの様態において、本発明は、１）ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．３．１．４６）が導入および増進され、前記ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼはメチオニンに対するフィードバック抵抗性を有し；２）アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４または１．１．１．３）が増進された、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産することが可能なエシェリキア属(Escherichia sp.)由来菌株を提供する。
本願で使用される用語「Ｌ−メチオニン前駆体」とは、メチオニン特化代謝経路の一部分である代謝物質、またはこの代謝物質から派生した物質をいう。特に、本願におけるＬ−メチオニン前駆体とはＯ−スクシニルホモセリンを意味する。
本願で使用される用語「Ｌ−メチオニン前駆体生産菌株」とは、Ｌ−メチオニン前駆体を生物体内で生産することが可能な原核または眞核微生物菌株であって、本発明に係る操作によってＬ−メチオニン前駆体を蓄積することが可能な菌株をいう。例えば、菌株はエシェリキア属(Escherichia sp.)、エルウィニア属(Erwinia sp.)、セラシア属(Serratia sp.)、プロビデンシア属(Providencia sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacteria sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、レプトスピラ属 (Leptospira)、サルモネラ属(Salmonellar sp.)、ブレビバクテリウム属(Brevibacteria sp.)、ヒポモナス属(Hypomonas sp.)、クロモバクテリウム属(Chromobacteria sp.)、およびノカルジア属(Nocardia)、またはカビ類(fungi)または酵母類(yeast)に属する微生物菌株を含むことができる。好ましくは、エシェリキア属、コリネバクテリウム属およびレプトスピラ属の微生物菌株と酵母である。さらに好ましくはエシェリキア属の微生物菌株であり、最も好ましくは大腸菌(E.coli)である。
【００１０】
様々な具体例として、本発明は、前記菌株から完全なＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンの分解に関与する遺伝子を欠損または弱化させ、フィードバック抵抗性があるＯ−スクシニルホモセリンの合成に関与する遺伝子を導入または増強させた菌株をＬ−メチオニン前駆体の生産菌株として提供する。また、本発明は、Ｏ−スクシニルホモセリンの生産を増強させるために、トレオニン生合成経路を遮断または弱化させた菌株を提供する。また、本発明は、アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼが過発現し或いは活性増強された菌株を提供する。また、本発明は、フィードバック調節体系から自由なホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼの導入、過発現または活性増強されると同時に、アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼが過発現または活性増強された菌株を提供する。
さらに詳しくは、本発明は、Ｌ−メチオニン前駆体の分解に関与するｍｅｔＢ遺伝子、トレオニン生合成経路に関与するｔｈｒＢ遺伝子、およびＬ−メチオニン前駆体生産遺伝子の転写を調節するｍｅｔＪ遺伝子を欠損させたＬ−メチオニン前駆体生産菌株を提供する。また、本発明は、メチオニン前駆体の合成に関与する本来のｍｅｔＡまたはｍｅｔＸ遺伝子をノックアウトし、フィードバックが解除された外部のｍｅｔＡ遺伝子を導入したＬ−メチオニン前駆体生産菌株を提供する。また、本発明は、ｔｈｒＡ遺伝子によってコードされる活性を増強させたＬ−メチオニン前駆体生産菌株を提供する。
さらに好ましくは、本発明は、本来のｍｅｔＡまたはｍｅｔＸ遺伝子をノックアウトし、フィードバック抵抗性ｍｅｔＡ遺伝子を導入し、ｔｈｒＡ遺伝子を増進させたＬ−メチオニン前駆体生産菌株を提供する。
【００１１】
より望ましくは, 本発明はまた L-メチオニン前駆体合成に関与する本来の metA または metX 遺伝子をノックアウッさせて, フィードバックが解除された外部 metX 遺伝子を取り入れて, thrA 遺伝子によってコーディングされる活性を増強させた L-メチオニン前駆体生産菌株を提供する.
本願で使用される用語「非活性」 の減衰または欠失をいう。遺伝子の欠失は、遺伝子を切断しあるいは染色体上に特定の遺伝子配列を挿入してタンパク質の配列を変形させることにより行われる。ここで、「減衰(attenuation)」または「弱化(weakening)」という用語は、微生物菌株において相応するＤＮＡによってコードされる少なくとも一つの酵素に対する細胞内活性を除去または減少させることを意味する。例えば、遺伝子のプロモーター部位および５’−ＵＴＲ部位の塩基配列を変形させることによりタンパク質の発現を弱化させるか、あるいは当該遺伝子のＯＲＦ部位に突然変異を導入することによりタンパク質の活性を弱化させることができる。減衰の測定によれば、相応するタンパク質の濃度または活性は一般に野生型(wild-type)または初期微生物菌株の濃度または活性に比べて０〜７５％、０〜５０％、０〜２５％、０〜１０％または０〜５％に減少する。
減衰を成すために、例えば、遺伝子の発現または酵素タンパク質の触媒活性を減少または除去することができ、前記２つの方法を選択的に組み合わせることができる。
適切な培養によって、あるいは遺伝子発現の信号構造の変形によって、あるいはアンチセンス−ＲＮＡ技術によって遺伝子発現を減少させることができる。例えば、遺伝子発現の信号構造は、例えばリプレッサー(repressor)遺伝子、アクチベータ(activator) 遺伝子、オペレーター(operator)、プロモーター、アテニュエーター(attenuator)、リボソーム結合部位、開始コドン(codon)およびターミネーター(terminator)である。これに関連し、ＪｅｎｓｅｎおよびＨａｍｍｅｒ(Biotechnology and Bioengineering 58: 191 195 (1998)) 、ＣａｒｒｉｅｒおよびＫｅａｓｌｉｎｇ(Biotechnology Progress 15: 58 64 (1999)) 、ＦｒａｎｃｈおよびＧｅｒｄｅｓ(Current Opinion in Microbiology 3: 159 164 (2000)) 、並びに遺伝学科分子生物学の公知の教科書であるＫｎｉｐｐｅｒｓ("Molecular Genetics", 6th edition, 1995)またはＷｉｎｎａｃｋｅｒ("Genes and Clones", 1990)などを参考することができる。
【００１２】
酵素タンパク質の触媒活性の変化または減少を誘導する突然変異は、当業界によく知られている。例えば、ＱｉｕおよびＧｏｏｄｍａｎ(Journal of Biological Chemistry 272: 8611 8617 (1997))、Ｙａｎｏ等(Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95: 5511 5515 (1998))、並びにＷｅｎｔｅおよびＳｃｈａｃｈａｍａｎｎ(Journal of Biological Chemistry 266: 20833 20839 (1991)の論文、またはＨａｇｅｍａｎｎ("General Genetics", 1986)などを参考することができる。
できる限り、突然変異は転移(transitions)、転換(transversions)、挿入(insertions)および欠失(deletions)による突然変異である。酵素活性に関わるアミノ酸配列の変化有無に応じてミスセンス(missense)突然変異またはノンセンス(nonsense)突然変異に区分することができる。遺伝子の少なくとも一つの塩基対において、この突然変異は間違ったアミノ酸を導入し、翻訳が速やかな中断を誘導する。もし停止コドンが突然変異の結果としてコーディング地域に形成されると、これも翻訳の未成熟終了(termination)を誘導する。典型的に多数のコドンが欠失されると、酵素活性が完全に損失してしまう。このような突然変異の発生に関する具体的な内容は、Ｋｎｉｐｐｅｒｓ("Molecular Genetics", 6th edition, 1995)、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ ("Genes and Clones", , 1990)またはＨａｇｅｍａｎｎ("General Genetics", 1986)などの著名な遺伝学および分子生物学教科書を参考することができる。
【００１３】
本願で使用される用語「増進(enhancement)」とは、相応するＤＮＡによってコードされる酵素の細胞内活性の増加をいう。酵素の細胞内活性の増進は遺伝子の過発現によってなされ得る。目的遺伝子の過発現は、前記遺伝子のプロモーター地域または５’−ＵＴＲ地域の塩基配列を変形させることによりタンパク質の発現を増進させることができ、目的の遺伝子を染色体上に追加導入することにより発現を強化させることができ、目的の遺伝子をベクター上に自己プロモーターまたは強化された別個のプロモーターと共に導入して菌株に形質転換させることによりタンパク質の発現量を強化させることができる。また、酵素の細胞内活性の増進は、目的遺伝子のＯＲＦ(open reading frame)地域に突然変異を導入することによりなされ得る。増進の測定によれば、相応するタンパク質の活性または濃度が野生型タンパク質または初期の微生物菌株における活性または濃度を基準として、一般に最少１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％または５００％、最大１０００％または２０００％まで増加することが分かる。
本発明の具体的な実施様態において、Ｌ−メチオニン前駆体生産菌株を準備する方法は次のとおりである。
第１段階として、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンなどのＬ−メチオニン前駆体を蓄積するために、シスタチオニンガンマシンターゼ、Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリルリアーゼまたはＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリルリアーゼなどのタンパク質をコードする遺伝子を菌株において欠損または弱化させる。
【００１４】
シスタチオニンガンマシンターゼをコードする遺伝子を通称「ｍｅｔＢ」と表示し、Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリルリアーゼをコードする遺伝子を通称「ｍｅｔＺ」と表示し、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリルリアーゼをコードする遺伝子を通称「ｍｅｔＹ」と表示する。前述した活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、例えば、大腸菌(Escherichai coli.)における公知のｍｅｔＢである。この遺伝子のゲノム塩基配列は以前の文献「Blattner et. al., Science 277: 1453-1462 (1997)」によって公開されたＥ．ｃｏｌｉのゲノム塩基配列（ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＣ７５８７６）から得ることができる。また、前記遺伝子配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ、National Center for Biotechnology Information）および日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ、DNA Data Bank Japan）から得ることができる。この他にも、同じ活性を持つ遺伝子として、コリネバクテリウムのｍｅｔＢとｍｅｔＹ、シュードモナス(Pseudomonas.)由来のｍｅｔＺなどを例示することができる。
シスタチオニンガンマシンターゼまたはＯ−スクシニルホモセリンスルフヒドリルリアーゼまたはＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリルリアーゼは、次の反応式に示すように、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをシスタチオニンまたはホモシステインに転換する能力を持っている。よって、この活性を持つ遺伝子を弱化させる場合、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンが培養液に過量蓄積される。
Ｌ−システイン＋Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン⇔スクシネート＋シスタチオニン
Ｌ−システイン＋Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン⇔アセテート＋シスタチオニン
ＨＳ−＋Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン⇔スクシネート＋ホモシステイン
ＨＳ−＋Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン⇔アセテート＋ホモシステイン
【００１５】
第２段階として、第１段階で準備された菌株にホモセリンキナーゼをコードするｔｈｒＢ遺伝子を除去または弱化させる。ＴｈｒＢ遺伝子はホモセリンからＯ−ホスホホモセリン(phosphohomoserine)の合成を随伴し、次いでｔｈｒＣ遺伝子によってトレオニンに転換される。合成されたホモセリンが全量メチオニンの前駆体合成に利用できるようにするために、ｔｈｒＢ遺伝子を欠損または弱化させる。
第３段階として、メチオニン合成経路の転写調節因子を欠損または弱化させる。メチオニン合成を随伴するｍｅｔＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＥおよびｍｅｔＦ遺伝子は、フィードバック調節体系によって抑制される。ｍｅｔＪ遺伝子はＥ．ｃｏｌｉにおける典型的な転写調節因子である。メチオニン前駆体を合成するためにｍｅｔＡまたはｍｅｔＸ遺伝子を過発現させなければならず、このためにｍｅｔＪの除去が必要である。よって、Ｅ．ｃｏｌｉからｍｅｔＪを除去すると、ｍｅｔＡまたはｍｅｔＸ遺伝子の発現が常に促進された状態となり、Ｌ−メチオニン前駆体を大量生産することができる。
前記第２段階と前記第３段階は、前駆体生産菌株によって異なり、前駆体生産菌株を製作するために必須的ではない。より好ましくは、エシェリキア属の微生物における前駆体生産経路を強化するために行うことができる。
【００１６】
第４段階として、メチオニン生合成経路の第１過程を媒介するフィードバック抵抗性ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼが導入される。ｍｅｔＡは、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼの活性を持つタンパク質をコードする遺伝子の通称である。
フィードバック抵抗性ｍｅｔＡ遺伝子の突然変異によってフィードバック抵抗性ホモセリンＯ−スクシニルの活性が発生する。ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００９１４６は、フィードバック抵抗性ｍｅｔＡ遺伝子の製造方法を開示している。前記国際特許に含まれた一般な情報は本発明の範囲に含まれる。本発明において、フィードバック抵抗性ｍｅｔＡ１０遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は配列番号１８に、ｍｅｔＡ１１遺伝子は配列番号２０に、ｍｅｔＡ３２遺伝子は配列番号１４に、ｍｅｔＡ３７遺伝子は配列番号１６に、ｍｅｔＡ４１遺伝子は配列番号２１にそれぞれ示されている（ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００９１４６）。また、本発明では、前記ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーは配列番号３０のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＡＰ ００４５１４によるアミノ酸配列）のうち２４、２９、７９、１１４、１４０、１６３、２２２、２７５、２９０、２９１、２９５、２９７、３０４または３０５番の位置の少なくとも一つに突然変異を持っている。
ｍｅｔＡ遺伝子の導入および増進は、遺伝子の導入によって、または５’−ＵＴＲのヌクレオチド配列と遺伝子のプロモーター地域の変形によって、または目的遺伝子のＯＲＦ地域への突然変異導入によってなされ得る。フィードバック調節体系から解除された突然変異ｍｅｔＡ遺伝子の導入によって、培地内メチオニンの濃度を問わずにＬ−メチオニン前駆体の生成が増加する。
また、Ｏ−スクシニルホモセリンの生産は、染色体から本来のｍｅｔＡ遺伝子を除去し、そこに突然変異ｍｅｔＡ遺伝子を導入することにより、さらに増加できる。ｍｅｔＪ遺伝子の欠損によってプロモーターの活性が増進されたｍｅｔＡプロモーターの下で、フィードバック抵抗性ｍｅｔＡ遺伝子はさらに多くのＯ−スクシニルホモセリンを生産することができる。
【００１７】
第５段階として、Ｏ−スクシニルホモセリンの前駆体であるホモセリンの合成を増加させるために、アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を増進させる。ｔｈｒＡは、アスパルトキナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を持つペプチドをコードする遺伝子の通称である。ｔｈｒＡ遺伝子活性の増進は、ｔｈｒＡ遺伝子に突然変異を導入することにより、あるいは染色体上にｔｈｒＡ遺伝子を多数導入することにより、あるいはｔｈｒＡを含むプラスミドを導入することにより行われる。
好ましくは、アスパルトキナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼは、Ｕｎｉｐｒｏデータベース登録番号ＡＰ＿０００６６６の遺伝子によってコードされる。さらに好ましくは、ｔｈｒＡ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号２９に示されたが、アミノ酸位置３４５に突然変異を持っている。ＴｈｒＡ活性の増進は、ｔｈｒＡ遺伝子への突然変異導入によって染色体上に目標の遺伝子をさらに導入し、過程処理されたプラスミドをさらに導入することによりなされ得る。
Ｌ−メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンは、前記第１段階〜第５段階の全体過程または一部分を用いることにより菌株に蓄積できる。
Ｌ−メチオニン前駆体生産菌株は、Ｌ−リシン(lysine)、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン(isoleusine)を生産する菌株を用いて製造することができる。好ましくは、Ｌ−トレオニンを生産する菌株を使用することにより製造する。この場合には、既にホモセリンまでの合成が円滑に行われた菌株であって、さらに多くのメチオニン前駆体を合成することができる。したがって、トレオニン生産菌株を用いて、トレオニン生合成経路に関与する遺伝子、およびｍｅｔＡ、ｍｅｔＹ、ｍｅｔＺを欠損または弱化させることにより、メチオニン前駆体を蓄積することができる。
【００１８】
本願で使用される用語「Ｌ−トレオニン生産菌株」とは、生体内でＬ−トレオニンを生産することが可能な原核または眞核微生物菌株をいう。例えば、エシェリキア属(Escherichia sp.)、エルウィニア属(Erwinia sp.)、セラシア属(Serratia sp.)、プロビデンシア属(Providencia sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacteria sp.)、またはブレビバクテリウム属(Brevibacteria sp.)に属するＬ−トレオニン生産微生物菌株が含まれ得る。これらの中でも、エシェリキア属(Escherichia sp.)が好ましく、大腸菌(Escherichia coli)がさらに好ましい。
本発明の好適な具体例において、Ｌ−トレオニンを生産するＥ．ｃｏｌｉ突然変異菌株であるＴＦ４０７６（ＫＦＣＣ１０７１８、韓国特許公告第９２−８３６５号）から形質転換されたＬ−トレオニン生産および独立菌株としてのＣＪＭ００２を使用した。ＴＦ４０７６は、メチオニン要求性、メチオニン類似体（例えば、α−アミノ−β−ヒドロキシバレリアン酸、ＡＨＶ）、リシン類似体（例えば、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン、ＡＥＣ）に対する耐性、イソロイシン類似体（例えば、α−アミノ酪酸）に対する耐性などの特徴を持つ。ＴＦ４０７６はメチオニン要求性菌株であって、細胞内でメチオニンは合成できない。本発明者らはこのようなメチオニン要求性を解除してメチオニン生産菌株として用いるために、ＮＴＧを使用した人工的な突然変異法を用いて、メチオニン要求性が解除されたトレオニン生産菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＪＭ００２を製造した。前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＪＭ００２は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＦ００１と命名し、２００４年４月９日にＫＣＣＭ（Korean Culture Center of Microorganism、韓国ソウル市西大門区弘済１洞ユリムビル３６１−２２１）に寄託番号ＫＣＣＭ−１０５６８で寄託した。
本発明において、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＪＭ００２菌株のｍｅｔＢ、ｔｈｒＢ、ｍｅｔＪおよびｍｅｔＡ遺伝子を欠損させた後、フィードバック抵抗性ｍｅｔＡを導入した。このように製造された最終的なＬ−メチオニン前駆体生産菌株はＣＪＭ−Ａ１１と命名した。ＣＪＭ−Ｘ菌株をｔｈｒＡ発現ベクターで形質転換させ、これをＣＪＭ−Ａ１１（ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ）と命名した。このように製造したＯ−スクシニルホモセリン生産菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣＪＭ−Ａ１１は２００８年１月２３日に寄託番号ＫＣＣＭ１０９２２Ｐで寄託した。
【００１９】
本発明の好適な具体例において、ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００３４４で開示されたＬ−トレオニン生産菌株ＦＴＲ２５３３を使用することができる。ＦＴＲ２５３３は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ寄託番号ＫＣＣＭ１０２３６から派生したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＦＲ７６２４に由来した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ寄託番号ＫＣＣＭ１０２３６は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＦ４０７６に由来した。 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ寄託番号ＫＣＣＭ１０２３６は、ＰＥＰからオキサロ酢酸(oxaloacetate)形成の触媒として作用するｐｐｃ遺伝子とアスパラギン酸塩からトレオニンを生合成するために必要な酵素、例えばｔｈｒＡ：アスパルトキナーゼ１−ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ｔｈｒＢ：ホモセリンキナーゼ、ｔｈｒＣ：トレオニンシンターゼを高水準で発現するので、Ｌ−トレオニンの生産を増加させることができる。また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＦＴＲ７６２４（ＫＣＣＭ１０５３８）はＬ−トレオニン生合成のために必要なｔｙｒＢ遺伝子の発現を抑制する非活性ｔｒｙＲ遺伝子を持っている。また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＦＴＲ２５３３（ＫＣＣＭ１０５４１）は、非活性化されたｇａｌＢ遺伝子を持つＬ−トレオニン生産菌株であると同時に、Ｌ−トレオニン生産Ｅ．ｃｏｌｉ突然変異菌株である。
本発明の具体的な実施例において、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦＴＲ２５３３菌株のｍｅｔＢ、ｔｈｒＢ、ｍｅｔＪおよびｍｅｔＡ遺伝子を欠損させた後、フィードバック抵抗性ｍｅｔＡ遺伝子を導入した。このように製造された最終的なＬ−メチオニン前駆体はＣＪＭ２−Ａｌｌと命名した。ＣＪＭ２−Ａｌｌ菌株をｔｈｒＡ発現ベクターで形質転換させ、これをＣＪＭ２−Ａｌｌ（ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ）と命名した。前記方法によって製造したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣＪＭ２−Ａｌｌ（ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ）は、２００８年２月１２日に寄託番号ＫＣＣＭ１０９２４Ｐで寄託した。
別の様態において、本発明は、Ｌ−メチオニン前駆体を生産する方法に関するものである。具体的には、本発明は、ａ）前記微生物菌株を発酵させる段階と、ｂ）培地または菌株内でＯ−スクシニルホモセリンを培養する段階、およびｃ）Ｏ−スクシニルホモセリンを分離する段階を含んでなる、Ｏ−スクシニルホモセリンの生産方法に関する。
前記で製造されたＬ−メチオニン前駆体生産菌株の培養は、当業界における公知の適切な培地と培養条件によって行われ得る。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して使用することができる。前記培養方法は、例えば回分式、連続式および流加式培養を含むが、これに限定されない。このような様々な培養方法は、例えば、文献「"Biochemical Engineering"by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176.」に開示されている。
【００２０】
培養に使用される培地は、特定菌株の要求条件を適切に満足させなければならない。様々な微生物培養培地は、例えば、文献「"Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981.」に開示されている。これらの培地は多様な炭素源、窒素源および微量元素成分を含む。炭素源は、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、フルクトース、マルトース、スターチおよびセルロースなどの炭水化物；大豆油(soybean oil)、ヒマワリ油(sunflower oil)、ヒマシ油またはココナツオイルなどの脂肪；パルミチン酸(palmitic acid)、ステアリン酸(stearic acid)およびリノール酸(linoleic acid)などの脂肪酸；グリセロールおよびエタノールなどのアルコールと酢酸などの有機酸を含む。これらの炭素源は単独でまたは組み合わせて使用できる。窒素源としては、ペプトン、酵母抽出液(yeast extract)、肉汁(gravy)、麦牙抽出液(malt extract)、コーンスティープリカー(corn steep liquor（ＣＳＬ）)およびベスン粉(bean flour)などの有機窒素源および尿素(urea)、硫酸アンモニウム(ammonium sulfate)、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなどの無機窒素源を含む。これらの窒素源は単独でまたは組み合わせて使用できる。前記培地には、リン酸源としてさらにリン酸二水素カリウム(potassium dihydrogen phosphate)、リン酸水素二カリウム(dipotassium hydrogen phosphate)および相応するナトリウム含有塩(sodium-containing salts)を含むことができる。また、培地は硫酸マグネシウム(magnesium sulfate)または硫酸鉄(iron sulfate)などの金属を含むことができる。また、アミノ酸、ビタミンおよび適切な前駆体などが添加できる。これらの培地または前駆体は培養物に回分式または連続式で添加できる。
また、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸などの化合物を適切な方式で添加することにより、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を使用することにより培養する間に気泡の生成を抑えることができる。また、培養液の好気性条件を保つために、培養液内に酸素または酸素含有ガス（例えば、空気）が注入できる。培養物の温度は一般に２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃である。培養の期間はＬ−メチオニン前駆体の生産が所望の水準に到達するまで続くことができ、好ましい培養時間は１０〜１６０時間である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のメチオニン前駆体生産菌株を使用する場合、メチオニンは、典型的な化学的メチオニン合成方法より環境親和的に生産することができる。また、本発明に係る菌株から生産されたＯ−スクシニルホモセリンから転換されたＬ−メチオニンは、動物飼料または動物飼料添加剤だけでなく、ヒトの食品または食品添加剤の生産に広く使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】メチオニン前駆体生産菌株の遺伝的操作を説明する図である。
【図２】メチオニン生産のための２段階過程の化学的な構造を説明した図である。
【図３】フィードバック抵抗性ｍｅｔＡ遺伝子の発現のためのｐＭｅｔＡ−ＣＬの開裂地図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を実施例によってさらに詳しく説明する。但し、これらの実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明を限定するものではない。
実施例１：メチオニン前駆体生産菌株の製造
<１−１>ｍｅｔＢ遺伝子の欠損
Ｅ．ｃｏｌｉ菌株においてシスタチオニンシンターゼをコードするｍｅｔＢ遺伝子を欠損させるために、ＦＲＴ−ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＰＣＲ ｄｅｌｅｔｉｏｎ方法を行った（ＰＮＡＳ（２０００）ｖｏｌ９７：Ｐ６６４０〜６６４５）。配列番号１および配列番号２のプライマーを用いてｐＫＤ３ベクター（ＰＮＡＳ（２０００）ｖｏｌ９７：Ｐ６６４０〜６６４５）を鋳型としてＰＣＲ反応によって欠損カセットを構成した。ＰＣＲは、９４℃で３０秒の変性過程(denaturation)、５５℃で３０秒のアニーリング過程(annealing)および７２℃で１分の伸長過程を１サイクルとして、これを３０サイクル繰り返すことにより行った。
【００２４】
その結果として得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．２ｋｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡ断片はｐＫＤ４６ベクター（ＰＮＡＳ（２０００）ｖｏｌ９７：Ｐ６６４０〜６６４５）を予め形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ１２）Ｗ３１１０菌株にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションのために、ｐＫＤ４６で形質転換されたＷ３１１０菌株は、１００μｇ／Ｌアンピシリンと５ｍＭ Ｌ−アラビノースが含まれたＬＢ培地を用いて、ＯＤ６００が０．６に到達するまで３０℃で培養した。滅菌蒸留水で２回、１０％グリセロールで１回洗浄して使用した。エレクトロポレーションは２５００Ｖで加えた。回収された菌株を２５μｇ／Ｌのクロラムフェニコール(chloramphenicol)を含んだＬＢ平板培地に塗抹して３７℃で一晩培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
【００２５】
選別された菌株は、菌株を鋳型として同一のプライマーを用いて同一の条件でＰＣＲした後、１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが１．２Ｋｂと観察されることを確認することにより、ｍｅｔＢ遺伝子の欠損を確認した。確認された菌株はさらにｐＣＰ２０ベクター（ＰＮＡＳ（２０００）ｖｏｌ９７：Ｐ６６４０〜６６４５）で形質転換させてＬＢ培地で培養した。その後、再び同一条件のＰＣＲによって１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが１５０ｂｐに小さくなった最終ｍｅｔＢ遺伝子欠損菌株を製作し、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認した。製作された菌株をＷ３−Ｂと命名した。
【００２６】
<１−２>ｔｈｒＢ遺伝子の欠損
ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子としてのｔｈｒＢ遺伝子を欠損させることにより、ホモセリンからＯ−スクシニルホモセリンの合成量を増加させようとした。特にトレオニン生産菌株を用いる場合、ホモセリンの利用活性が非常に大きいため、この遺伝子の欠損が必ず必要である。前記製作されたＷ３−Ｂ菌株からｔｈｒＢ遺伝子を欠損させるために、ｍｅｔＢ遺伝子欠損時と同一のＦＲＴ ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＰＣＲ ｄｅｌｅｔｉｏｎ方法を使用した。
ｔｈｒＢ欠損カセットを製作するために、ｐＫＤ４ベクター（ＰＮＡＳ（２０００）ｖｏｌ１９７：Ｐ６６４０〜６６４５）を鋳型として、配列番号３、４のプライマーを用いて、９４℃で３０秒の変性段階、５５℃で３０秒のアニーリング段階および７２℃で１分の延長段階を１サイクルとして、これを３０サイクル繰り返すＰＣＲ反応を行った。
その結果として得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．６ｋｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡ断片をｐＫＤ４６ベクターで予め形質転換させたＷ３−Ｂ菌株にエレクトロポレーションした。回収された菌株を、５０μｇ／Ｌのカナマイシンを含んだＬＢ平板培地に塗抹し、３７℃で一晩培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
【００２７】
選別された菌株は菌株を直接鋳型として配列番号３、４のプライマーを用いて同一の条件でＰＣＲした後、１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが１．６Ｋｂと確認される菌株を選別することにより、ｔｈｒＢ遺伝子の欠損を確認した。確認された菌株はさらにｐＣＰ２０ベクターで形質転換させてＬＢ培地で培養し、さらに同一条件のＰＣＲによって１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが１５０ｂｐに小さくなった最終ｔｈｒＢ遺伝子欠損菌株を製作し、カナマイシンマーカーが除去されたことを確認した。製作された菌株はＷ３−ＢＴ菌株と命名した。
【００２８】
<１−３>ｍｅｔＪ遺伝子の欠損
メチオニン前駆体の合成に関与するｍｅｔＡ遺伝子の調節遺伝子であるｍｅｔＪ遺伝子を欠損させるために、ｍｅｔＢ遺伝子欠損時と同一のＦＲＴ ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＰＣＲ ｄｅｌｅｔｉｏｎ方法を使用した。ｍｅｔＪ遺伝子欠損カセットを製作するために、配列番号５、６のプライマーを用いて、９４℃で３０秒の変性(denaturation)段階、５５℃で３０秒のアニーリング(annealing)段階および７２℃で１分の延長(extension)段階を１サイクルとして、これを３０サイクル繰り返し行った。
その結果として得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．２ｋｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡ断片をｐＫＤ４６ベクターで予め形質転換させたＷ３−ＢＴ菌株にエレクトロポレーションした。回収された菌株を、クロラムフェニコールを含んだＬＢ平板培地に塗抹して３７℃で一晩培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
選別された菌株を直接鋳型として配列番号７、８のプライマーを用いて同一の条件でＰＣＲした後、１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが１．６Ｋｂに変化することを確認することにより、ｍｅｔＪ遺伝子の欠損を確認した。確認された菌株はさらにｐＣＰ２０ベクターで形質転換してＬＢ培地で培養し、さらに同一条件のＰＣＲによって１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが６００ｂｐに小さくなった最終ｍｅｔＪ遺伝子欠損菌株を製作し、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認した。製作された菌株をＷ３−ＢＴＪと命名した。
【００２９】
<１−４>ｍｅｔＡ遺伝子の欠損
染色体にフィードバック抵抗性ｍｅｔＡ遺伝子を導入するために、Ｗ３−ＢＴＪ菌株の染色体上で本来のｍｅｔＡ遺伝子を欠損させた。ｍｅｔＡ遺伝子を除去するために、ＦＲＴ ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＰＣＲ ｄｅｌｅｔｉｏｎ方法を行った。
ｍｅｔＡ遺伝子欠損カセットを製作するために、配列番号９、１０のプライマーを用いて、９４℃で３０秒の変性段階、５５℃で３０秒のアニーリング段階および７２℃で１分の延長段階を１サイクルとして、これを３０サイクル繰り返し行った。
その結果として得られたＰＣＲ産物は、１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．２ｋｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡ断片をｐＫＤ４６ベクターで予め形質転換させたＷ３−ＢＴ菌株にエレクトロポレーションした。回収された菌株を、クロラムフェニコールを含んだＬＢ平板培地に塗抹して３７℃で一晩培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
【００３０】
選別された菌株を直接鋳型として配列番号９、１０のプライマーを用いて同一の条件でＰＣＲした後、１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが１．１Ｋｂｐに変化することを確認することにより、ｍｅｔＡ遺伝子の欠損を確認した。確認された菌株はさらにｐＣＰ２０ベクターで形質転換してＬＢ培地で培養し、さらに同一条件のＰＣＲによって１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが１００ｂｐに小さくなった最終ｍｅｔＡ遺伝子欠損菌株を製作し、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認した。製作された菌株をＷ３−ＢＴＪＡと命名した。
【００３１】
<１−５>フィードバック抵抗性ｍｅｔＡ遺伝子の導入
Ｌ−メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンの生産を増加させるために、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼをコードするフィードバック抵抗性ｍｅｔＡ遺伝子を過発現させた。
フィードバック抵抗性ｍｅｔＡ１０遺伝子は配列番号１７に示されており、これをコードするアミノ酸配列は配列番号１８に示されている。ｍｅｔＡ１１遺伝子は配列番号１９に示されており、これをコードするアミノ酸配列は配列番号２０に示されている。ｍｅｔＡ３２遺伝子は配列番号１３に示されており、これをコードするアミノ酸配列は配列番号１４に示されている。ｍｅｔＡ３７遺伝子は配列番号１５に示されており、これをコードするアミノ酸配列は配列番号１６に示されている。ｍｅｔＡ４１遺伝子は配列番号２１に示されており、これをコードするアミノ酸配列は配列番号２２に示されている（ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００９１４６）。
ＰＣＲは、前記遺伝子を鋳型として配列番号１１、１２をプライマーとして用いて、９４℃で３０秒の変性段階、５５℃で３０秒のアニーリング段階および７２℃で２分のアニーリング段階を１サイクルとして、これを２５サイクル繰り返すことにより行った。
その結果として得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動した後、１．２ｋｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍａＩｄｍで切断されたｐＣＬ１９２０ベクターに連結した。連結されたベクターでＥ．ｃｏｌｉを形質転換させ、５０μｇ／Ｌのスペクチノマイシンが含まれたＬＢ培地で培養した後、選別した。製造されたベクターの構成を図３に示した。
【００３２】
このように製造されたベクターをＷ３−ＢＴＪＡ菌株にそれぞれエレクトロポレーションし、菌株の生産能力を実施例２−１で説明されたようにフラスコ培養を用いて検定した。変形された菌株のＯ−スクシニルホモセリン生産能力は、野生型菌株のＯ−スクシニルホモセリン生産能力を１００％としてそれぞれ測定した。その結果、変形された菌株全ては野生型の生産量に比べて著しく増加した。特に、ｍｅｔＡ１１、ｍｅｔＡ１０およびｍｅｔＡ３２で最も効果的な生産を示した。
【００３３】
【表１】
0005525746.tif 000002
【００３４】
【表２】
0005525746.tif 000003
【００３５】
最も効果的な生産を示すｐＭｅｔＡ１０−ＣＬ、ｐＭｅｔＡ１１−ＣＬおよびｐＭｅｔＡ３２−ＣＬの安定的な発現のために、これらの遺伝子をＥ．ｃｏｌｉの染色体に導入した。
まず、ｐＫＤ３ベクターを使用し、クロラムフェニコールマーカー遺伝子を鋳型として配列番号２３、２４のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片はゲル−抽出によって精製した。ｍｅｔＡ遺伝子は配列番号９、１０をプライマーとしてＰＣＲ増幅し、ｍｅｔＡ遺伝子の３’−ＵＴＲ地域は鋳型としてＷ３１１０ｗｔ染色体を使用して配列番号２５、２６をプライマーとしてＰＣＲ増幅した。その結果として得られたＰＣＲ産物はゲル−抽出によって分離し、断片の混合物は配列番号９、２６をプライマーとしてＰＣＲ増幅することにより、クロラムフェニコール標識を含んだｍｅｔＡ遺伝子断片を製造した。回収されたＤＮＡ断片を、ｐＫＤ４ベクターで形質転換されたＷ３ＢＴＪＡ菌株にエレクトロポレーションし、クロラムフェニルコール抵抗性菌株を選別し、配列番号９、１０のプライマーを用いて、ｍｅｔＡが成功的にクローニングされたことを確認した。変形されたｍｅｔＡ遺伝子１０、１１および３２が導入されたものと確認された菌株は、それぞれＷ３ＢＴＪ−Ａ１０、１１および３２と命名した。各菌株のＯ−スクシニルホモセリン生産量は各ｍｅｔＡプラスミドを含有しているＷ３−ＢＴＪＡの生産量と同様であった。
【００３６】
<１−６>ｔｈｒＡ遺伝子の過発現
Ｏ−スクシニルホモセリンの生産をさらに効果的に増加させるために、ｔｈｒＡ遺伝子を過発現させた。
このために、Ｌ−トレオニン生産菌株であるＥ．ｃｏｌｉ ＣＪＭ００２（ＫＣＣＭ１０５６８）の染色体を鋳型として配列番号２７、２８のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。増幅されたＤＮＡ断片は、ゲル−抽出によって分離し、制限酵素ＥｃｏＲＶを用いてｐＣＬ１９２０ベクターのＣＪ１プロモーターに連結し、スペクチノマイシン(spectinomycin)を５０μｇ／Ｌ含有するＬＢ培地で選別した。選別されたベクターはｐＣＪ−ｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬと命名した。ｔｈｒＡ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号２９に示され、アミノ酸位置３４５に突然変異を持っている。また、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０菌株の野生型ｔｈｒＡ遺伝子は、前述した方法と同様の方法でＰＣＲ増幅し、ｐＣＪ−ｔｈｒＡ−ＣＬと命名したベクターにクローニングした。このベクターはそれぞれＷ３ＢＴＪ−Ａ１１でエレクトロポレーションし、各菌株のＯ−スクシニルホモセリン生産量を実施例２−１で説明されたフラスコ培養で検定した。その結果、突然変異形態のｔｈｒＡ遺伝子を持つベクターで形質転換された菌株は最も高い水準でＯ−スクシニルホモセリンを蓄積した。
【００３７】
【表３】
0005525746.tif 000004
【００３８】
<１−７>Ｌ−トレオニン生産菌株の転換
メチオニン要求性が解除されたＬ−トレオニン生産菌株である大腸菌ＣＪＭ００２（ＫＣＣＭ−１０５６８号）を用いて、前記１−１〜１−５と同様の方法でＯ−スクシニルホモセリン生産菌株を製作した。染色体上に突然変異ｍｅｔＡ遺伝子を含有する菌株をそれぞれＣＪＭ−Ａ１０、ＣＪＭ−Ａ１１およびＣＪＭ−Ａ３２と命名した。また、ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００３４４に記載されたＬ−トレオニン生産菌株である大腸菌ＦＴＲ２５３３（ＫＣＣＭ１０５４１）を用いて、前記１−１〜１−５と同様の方法でメチオニン前駆体生産菌株を製作し、これをＣＪＭ−Ａ１１と命名した。また、それぞれの菌株は実施例１−６に説明されたようにｔｈｒＡ発現ベクターで形質転換させた。実施例２−１に記載されたフラスコ培養によってこれら菌株のメチオニン前駆体生産量を測定した。その結果、ｐＣＪ―ｔｈｒＡ（ｍ）−ＣＬプラスミドを含有するＣＪＭ−Ａ１１は最も高いＯ−スクシニルホモセリンの生産を示した。
【００３９】
【表４】
0005525746.tif 000005
【００４０】
実施例２：Ｌ−メチオニン前駆体の生産のための発酵
<２−１>フラスコ培養実験
実施例１で製作された菌株のメチオニン前駆体生産量を実験するために、三角フラスコ培養を行った。平板ＬＢ培地に各菌株を接種して３１℃で一晩培養した。単一コロニーを３ｍＬのＬＢ培地に接種した後、３１℃で５時間培養し、さらに２５ｍＬのメチオニン前駆体生産培地を含んだ２５０ｍＬの三角フラスコに２００倍希釈して３１℃の２００ｒｐｍで６４時間培養し、ＨＰＬＣ分析によってメチオニン前駆体生産量を比較した。その結果、メチオニン生産能力はメチオニン要求性に対して自由なＬ−メチオニン生産菌株から製造されたメチオニン前駆体生産菌株において著しい増加を示した。
【００４１】
【表５】
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【００４２】
<２−２>大容量発酵
Ｏ−スクシニルホモセリンを大量生産するために、Ｏ−スクシニルホモセリン生産能力を示す幾つかの菌株を選択して５Ｌの発酵槽で培養した。それぞれの菌株を、抗生剤スペクチノマイシンの含有された平板ＬＢ培地に接種して３１℃で一晩培養した。その後、単一コロニーを、スペクチノマイシンを含有するＬＢ培地１０ｍＬに接種した後、３１℃で５時間培養した。培養液は、２００ｍＬのメチオニン前駆体シード培地を含有する１０００ｍＬの三角フラスコに１００倍希釈して３１℃、２００ｒｐｍで３〜１０時間培養した後、５Ｌの発酵槽に接種して流加式(Fed batch)培養発酵法で２０〜１００時間培養した。このように培養した発酵液でメチオニン前駆体の濃度をＨＰＬＣで分析した結果は、表７のとおりであった。
【００４３】
【表６】
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【００４４】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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