(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
主菌及び従菌を含む活性酸素を分解する混合物であって、  前記主菌は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４３９として寄託された新規微生物イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌株を含み、かつ、カタラーゼ活性を示し、  前記従菌は、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（ＥＵＳ）菌及び／又はラネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）属（Ｃｉｔ）菌を含み、 前記（ＥＵＳ）菌は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４５０として寄託された新規微生物（ＥＵＳ）菌株であり、 前記（Ｃｉｔ）菌は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４４０として寄託された新規微生物（Ｃｉｔ）菌株であることを特徴とする混合物。
【請求項２】
主菌及び従菌を用いてカタラーゼを産生する方法において、  前記主菌は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４３９として寄託された新規微生物イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌株を含み、かつ、カタラーゼ活性を示し、  前記従菌は従属栄養細菌であり、 前記従菌は、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（ＥＵＳ）菌及び／又はラネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）属（Ｃｉｔ）菌を含み、 前記（ＥＵＳ）菌は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４５０として寄託された新規微生物（ＥＵＳ）菌株であり、 前記（Ｃｉｔ）菌は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４４０として寄託された新規微生物（Ｃｉｔ）菌株であり、  前記主菌を培養して増殖して増殖主菌溶液を生成する工程と、  前記増殖主菌溶液に前記従菌を所定の割合で添加して混合培養溶液とする工程と、  前記混合培養溶液を用いて培養し、カタラーゼを産生させる工程と、を含むカタラーゼの産生方法。
【請求項３】
主菌及び従菌を含む活性酸素を分解する混合物であって、  前記主菌は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４３９として寄託された新規微生物イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌株を含み、かつ、カタラーゼ活性を示し、  前記従菌は、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（ＥＵＳ）菌及び／又はラネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）属（Ｃｉｔ）菌を含み、 前記（ＥＵＳ）菌は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４５０として寄託された新規微生物（ＥＵＳ）菌株であり、 前記（Ｃｉｔ）菌は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４４０として寄託された新規微生物（Ｃｉｔ）菌株である、混合物を用いて、活性酸素を分解する方法。
【請求項４】
主菌及び従菌を含む活性酸素を分解する混合物であって、  前記主菌は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４３９として寄託された新規微生物イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌株を含み、かつ、カタラーゼ活性を示し、  前記従菌は、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（ＥＵＳ）菌及び／又はラネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）属（Ｃｉｔ）菌を含み、 前記（ＥＵＳ）菌は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４５０として寄託された新規微生物（ＥＵＳ）菌株であり、 前記（Ｃｉｔ）菌は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４４０として寄託された新規微生物（Ｃｉｔ）菌株である、混合物を用いて、過剰な活性酸素により殺菌した後に、残存活性酸素を無毒化することを特徴とする方法。
【請求項５】
光触媒を施した第１の試料に、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４３９として寄託された新規微生物イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌株と、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４５０として寄託されたミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（ＥＵＳ）菌株及び／又は受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４４０として寄託されたラネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）属（Ｃｉｔ）菌株と、を含む培養液を滴下する工程と、 同じ光触媒を施した第２の試料に、紫外線耐性のある微生物を含む培養液を滴下する工程と、  前記第１及び第２の試料に紫外線を所定の強さで、所定時間、均等に照射する工程と、  前記第１及び第２の試料のそれぞれの微生物が紫外線照射後に生存しているかを調べる工程と、を含む光触媒の評価方法。
【請求項６】
前記新規微生物（ＳＷ１）菌株は、１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が、配列番号１に記載の塩基配列であり、
前記（ＥＵＳ）菌は、１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が、配列番号２に記載の塩基配列であり、
前記（Ｃｉｔ）菌は、１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が、配列番号３に記載の塩基配列である、ことを特徴とする請求項１に記載の混合物。
【請求項７】
前記新規微生物（ＳＷ１）菌株は、１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が、配列番号１に記載の塩基配列であり、
前記（ＥＵＳ）菌は、１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が、配列番号２に記載の塩基配列であり、
前記（Ｃｉｔ）菌は、１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が、配列番号３に記載の塩基配列である、ことを特徴とする請求項２に記載の産生方法。
【請求項８】
前記新規微生物（ＳＷ１）菌株は、１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が、配列番号１に記載の塩基配列であり、
前記（ＥＵＳ）菌は、１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が、配列番号２に記載の塩基配列であり、
前記（Ｃｉｔ）菌は、１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が、配列番号３に記載の塩基配列である、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記新規微生物（ＳＷ１）菌株は、１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が、配列番号１に記載の塩基配列であり、
前記（ＥＵＳ）菌は、１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が、配列番号２に記載の塩基配列であり、
前記（Ｃｉｔ）菌は、１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が、配列番号３に記載の塩基配列である、ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記新規微生物（ＳＷ１）菌株は、１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が、配列番号１に記載の塩基配列であり、前記ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（ＥＵＳ）菌は、１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が、配列番号２に記載の塩基配列であり、
前記ラネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）属（Ｃｉｔ）菌は、１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が、配列番号３に記載の塩基配列である、ことを特徴とする、請求項５に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性酸素に対する耐性を有する菌等及びそれらの利用方法、並びに、該方法を適用可能な装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
カタラーゼは過酸化水素を水と酸素に分解する反応を触媒する酵素であり、動植物や微生物に広く分布していることが知られている。市販のものとしても、牛肝臓由来やアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属のカビ由来のカタラーゼなど様々な起源のものがある。また、これまでに高濃度の過酸化水素を含む工場排水から過酸化水素に対して耐性を有する新菌株イグジオバクテリウム・オキシドトレリカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｘｉｄｏｔｏｌｅｒｉｃｕｍ）を単離し、その細胞抽出液が強いカタラーゼ活性を有することが開示されている（例えば、特許文献３）。【０００３】
通常過酸化水素からは活性酸素が生じるが、活性酸素は細胞にダメージを与えるものとして近年その無害化が注目されている。カタラーゼは、過酸化水素からこのような活性酸素の発生を低減することができる酵素であり、健康食品や飲料、その他の分野における応用が期待される。【０００４】
ところで、過酸化水素水等から生じるものと同様な活性な酸素は、酸化チタン等を含むいわゆる光触媒によっても生成することができる。即ち、光触媒により、水が分解され、活性な酸素が発生する。このような活性な酸素は、滅菌や抗菌効果があり、滅菌作用や抗菌作用が望まれる部分に適用する材料として一般に市販されている。しかしながら、光触媒においては、原料組成物が同一であっても、触媒活性が同程度であるとは限らず、その評価は必ずしも容易ではない。特に、滅菌や抗菌効果は、菌が生息できる比較的マイルドな環境下で評価しなければならず、対照実験を行った場合であっても、滅菌や抗菌効果を確認することは容易ではない。そこで、光触媒の作用環境下で生成される活性な酸素を分解してベースとなる状態を、菌が生息できる比較的マイルドな環境下で作り出すことが望まれる。【０００５】
一般に活性酸素は強い殺菌作用があり、上述の光触媒以外にも、広い分野において活用されている。例えば、次亜塩素酸ナトリウムは、活性酸素によって殺菌作用を示し、家庭用に販売されている液体の塩素系漂白剤、殺菌剤（洗濯用、キッチン用、ほ乳ビンの殺菌用など）などに使用されている。次亜塩素酸ナトリウムを希釈した水溶液はアンチホルミンという名称で食品添加物としても使われている。殺菌剤としては野菜、果実などの消毒にも用いられる。医療機関などで消毒薬として使用されることも多い。各種細菌やウイルスに効果を示すため、医療器具やリネンの消毒に使用されている。しかしながら、活性酸素がそのまま残っている場合は、やはり人体に有害であるので、何らかの方法で無毒化することが好ましい。その無毒化の方法は、過剰に行っても有害とならない方法が好ましい。【０００６】
従って、過酸化水素水や次亜塩素酸ナトリウム等から生じるものと同様な活性な酸素を高効率で分解できるカタラーゼ活性の高い酵素があると便利である。これまで、カタラーゼ活性の高い酵素を産生する菌やその遺伝子等が開示されているが、より高いカタラーゼ活性が望まれている（例えば、特許文献１から３、非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０００−５１３５７４号公報
【特許文献２】特開２００２−２５３２１５号公報
【特許文献３】特開２００５−２０４５５９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】IsaoHara, Nobutoshi Ichise, Kiyoshi Kojima, Hidemasa Kondo, Satoru Ohgiya,Hidetoshi Matsuyama, and IsaoYumoto;"Relationshipbetween the Size of the Bottleneck 15Åfrom Iron in the Main Channel and the Reactivity ofCatalase Corresponding to the Molecular Size of Substrates"; Biochemistry, Vol. 46, No. 1, 2007, p.11-22.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
一般に、細菌の一種であるＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ（ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）、カビの一種であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ及びＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓａｕｒａｎｔｉｃｕｓ由来のカタラーゼは比較的温度安定性には優れているが、カタラーゼの活性が高くなく、より高いカタラーゼ活性の酵素を産生する微生物があれば好ましい。更に、そのような微生物の産生能力を更に向上させる環境を作り出すことができれば、より好ましい。そして、このような細菌を含む微生物を用いて、活性酸素で殺菌を行った場合の無毒化ができればより好ましい。また、光触媒の評価もできれば、更に好ましい。そこで、このような微生物を提供し、また、その好ましい環境を提供し、更に、それらを応用して、活性酸素の上手な利用方法を提供することを目的とし、そのような利用方法を使う殺菌や光触媒の評価方法を提供し、そのような方法を活用する装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述のような課題に鑑みて、鋭意研究をすることにより、高いカタラーゼ活性の酵素を産生する微生物として、イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌を単離することができた。このように、過酸化水素耐性能を持ち高い過酸化水素分解活性を有するイグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属に属する新規微生物（ＳＷ１）菌株を提供する。特に、独立行政法人製品評価技術基盤機構に２００７年１０月２４日に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４３９として寄託されたイグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌を提供する。また、その菌のカタラーゼ活性が特に高くなる環境を提供する。そして、これらを利用する殺菌及び／又は滅菌方法、光触媒の評価方法を提供する。より具体的には以下の通りである。【００１１】
（１）受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４３９として寄託された新規微生物（ＳＷ１）菌株。【００１２】
（２）イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属に属する新規微生物であって、１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が、配列番号１に記載の塩基配列である上記（１）に記載の微生物。【００１３】
（３）受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４５０として寄託された新規微生物（ＥＵＳ）菌株。【００１４】
（４）ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する新規微生物であって、１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が、配列番号２に記載の塩基配列である上記（３）に記載の微生物。【００１５】
（５）受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４４０として寄託された新規微生物（Ｃｉｔ）菌株。【００１６】
（６）ラネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）属に属する新規微生物であって、１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が、配列番号３に記載の塩基配列である上記（５）に記載の微生物。【００１７】
（７）主菌及び従菌を含む活性酸素を分解する混合物であって、前記主菌はカタラーゼ活性を示し、前記従菌は従属栄養細菌であることを特徴とする混合物。【００１８】
（８）前記主菌は、イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌を含むことを特徴とする上記（７）に記載の混合物。【００１９】
（９）前記従菌は、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（ＥＵＳ）菌及び／又はラネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）属（Ｃｉｔ）菌を含むことを特徴とする上記（７）又は（８）に記載の混合物。【００２０】
（１０）上記（７）から（９）のいずれかに記載の混合物を用いて、活性酸素を分解する方法。【００２１】
（１１）上記（１）から（６）のいずれかの新規微生物を用いて、過剰な活性酸素により殺菌した後に、残存活性酸素を無毒化することを特徴とする方法。【００２２】
（１２）上記（１０）又は（１１）に記載の方法を用いる光触媒の評価方法。【００２３】
（１３）上記（１０）又は（１１）に記載の方法を利用した２４時間浴水浄化循環装置。また、上記（１０）又は（１１）に記載の方法を利用した給湯システムも提供できる。更に、上記（１０）又は（１１）に記載の方法を用いる給湯浄化方法も提供できる。このような浴水浄化循環装置（例えば、２４時間風呂）若しくは給湯システムは、給湯槽若しくは浴槽と、バルブを介して若しくは介さずに槽外に排出又は槽内に給湯する配管と、いずれかの位置に設けられる給湯のお湯を加圧するポンプと、配管の一部を代用した場合を含む薬剤槽と、ろ過槽（ろ過装置のろ過槽を含む）と、配管を特殊形状（例えば、ジグザグに折り返すものやコイル状に巻いたものを含む如何なる形状も含む無害化槽とを含んで構成される。前記薬剤槽では、活性酸素を発生する薬品等が添加されてよい。例えば、レジオネラ菌等の細菌を殺すのに十分な濃度（例えば、薬剤槽における濃度又は薬剤槽に接続される配管中の濃度）となるように十分な量の次亜塩素酸ナトリウムが添加される。前記ろ過槽でろ過され、前記無害化槽（生物処理槽を含んでよい）へお湯が流される。生物処理槽には、バイオペレット等が配置されてよく、主菌となるイグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属  （ＳＷ１）菌等が担持されたペレットが備えられてよい。補助菌を備えるバイオペレットを用いてもよく、両バイオペレットが混合した状態で前記無害化槽に備えられてよい。【００２４】
以上のような新規微生物により、効率的にカタラーゼを産生させることができる。また、これにより、酸化処理等に使用した後の過剰の過酸化水素をマイルドな条件で消滅させることもできる。また、光触媒の作用環境下で生成される活性な酸素を分解してベースとなる状態を、菌が生息できる比較的マイルドな環境下で作り出すことも可能である。【００２５】
カタラーゼ活性のある新規微生物は、必ずしも過酸化水素が存在する環境で最も効率よく過酸化水素を分解できるとは限らない。また、このような新規微生物にとって、カタラーゼ活性がより高い環境を、別の微生物が作り出すこともあり得る。そして、このようにして、元々高いカタラーゼ活性のある新規微生物の活性を更に高めることができる。また、これらの微生物を利用して、穏やかな条件で活性酸素の量（濃度）を低減することができ、食品、飲料、その他の摂取物に活用することにより、老化防止剤としても使用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】単独の場合のＯＤ値の時間変化を示すグラフである。
【図２】単独の場合のカタラーゼ活性の時間変化を示すグラフである。
【図３Ａ】複合の場合のＯＤ値の時間変化を示す全体グラフである。
【図３Ｂ】複合の場合のＯＤ値の時間変化を示すグラフ（０から４時間）である。
【図３Ｃ】複合の場合のＯＤ値の時間変化を示すグラフ（３．５から７時間）である。
【図４】複合の場合のカタラーゼ活性の時間変化を示すグラフである。
【図５】殺菌装置を組込んだ給湯システムの概略模式図である。
【図６】薬剤槽の概略模式図である。
【図７】無害化槽の概略模式図である。
【図８】バイオ処理槽の概略模式図である。
【図９】光触媒評価装置の概略模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の実施例についてより詳しく説明する。なお、同一要素には同一符号を用い、重複する説明は省略する。
【００２８】
日本国静岡県にある安倍川より、水試料を採取し、下記のような条件で培養した。採取した地点は、安倍川中流沿岸にある有東木地区である。この採取日時は、２００６年８月１２日の午前１０：００頃であった。このときの気温は、２８．３℃で、水温は１６．８℃（但し、河川流入地点では２０．３℃）であった。培養に用いる培地は、それぞれ、標準寒天培地（日水製薬株式会社製  顆粒型）、ニュートリエントブロス寒天培地（Ｏｘｉｏｉｄ社製  粉末型）、そして、Ｒ２Ａ培地（日本製薬株式会社製  粉末型）を用いた。このときの温度は、３０℃及び３７℃であった。また、培養時間は、１２〜２４時間とした。
【００２９】
次に、下記のような条件で、目的とするイグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌を単離した。単離方法は、釣菌単離であった。上述する標準寒天培地に生育したコロニーを白金耳を用いて釣菌し、各々の液体培地で３７℃で、１２時間培養後、白金耳で寒天培地上にストリークして単離コロニーを得た。それ以外の培地として、ニュートリエントブロス寒天培地及び液体培地（振盪培養）を用いた。また、培養温度は、３７℃で、培養時間としては、１２時間（液体培地）及び２４時間（寒天培地）を用いた。
【００３０】
単離したイグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌について、ＰＣＲ法により１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、以下のような解析を行った。
【００３１】
（遺伝子の特定）
単離菌を上述する液体培地で培養後、遠心回収（３０００ｒｐｍで５分から１５分）した。ＤＮＡ抽出キットを用いてＤＮＡ試料とし、細菌の遺伝学的分類に用いられる１６Ｓ領域（１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子）を標的として遺伝子を部分増幅し、電気泳動により増幅バンドを確認した。電気泳動ゲルからＤＮＡを切り出して精製し、再度部分的に増幅し、精製後シーケンス反応を行いシーケンサーで塩基配列を確定した。そして、塩基配列をデータベース（ＮＣＩＮＢ；ｂｌａｓｔ）と照合し、相同性から同定した。このときの培養条件として、ニュートリエントブロス液体培地（Ｏｘｉｏｉｄ社製  粉末型）を用い、３７℃で、１２時間培養を行った。ＤＮＡの抽出は、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。このとき、サーマルサイクラーとしては、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００  （ＡＢＩ社製）を用いた。また、Ｐｒｉｍｅｒとして、１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出用プライマー（島津評論  ｖｏｌ．５７  ｐ１２１−１３１  ２０００年）を用いた。遺伝子増幅酵素としては、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（ＡＢＩ社製）を用いた。また、シーケンサーは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００−Ａｖａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ社製）を用い、シーケンス試薬としては、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏ  ３．１を用いた。これにより、配列表１のような塩基配列の結果を得た。類似した塩基配列とアラインメントを取り近隣結合法により系統樹を作成したところ、イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属することが分かった。具体的には、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を調べ、１５２３  ｂｐ  の塩基配列により、イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌とした。
【００３２】
本発明のイグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌は次のような特性を有する。
・形態学的特性
グラム染色：陽性
芽胞：無し
菌形：球桿菌
・培地における生育特性
（１）肉汁寒天平板培養
（２）肉汁液体培養
色調：黄色〜黄褐色
形：円形
表面：平滑
・生理・生化学的特性
グラム染色性：有
カタラーゼ試験：陽性
・各温度における生育
−１℃：−
４℃：＋
３０℃：＋
４５℃：＋
・近縁菌種とのＤＮＡ−ＤＮＡ  相同性
【００３３】
（次亜塩素酸及び過酸化水素耐性能）
（ア）イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌、並びに、（イ）大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）及び黄色ブドウ球菌（Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ）の混合、について、それぞれ次亜塩素酸耐性を調べた。具体的には、ニュートリエントブロス液体培地を準備し、温度３７℃で、６時間培養を行った。（ア）のＳＷ１菌については、次亜塩素酸ナトリウム２０ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、５００ｐｐｍをそれぞれ添加した３種類を、（イ）の大腸菌及び黄色ブドウ球菌については、次亜塩素酸ナトリウム２０ｐｐｍ、２００ｐｐｍをそれぞれ添加した２種類を準備した。その結果、ＳＷ１菌については、５００ｐｐｍ添加であっても生育するが、大腸菌及び黄色ブドウ球菌については、２０ｐｐｍ、２００ｐｐｍのいずれにおいても生育が見られなかった。
【００３４】
次に、Ｒ２Ａ寒天培地に（ア）のＳＷ１菌を均一に捲き、次亜塩素酸ナトリウムを０．０００５％、０．００５％、０．０５％、０．５％、５％染み込ませたペレットをおいたところ、０．５％、５％のペレットの回りでは、育成の阻害が認められたが、他には阻害は認められなかった。一方、過酸化水素を０．００３％、０．０３％、０．３％、３％、３０％染み込ませたペレットをおいたところ、３％、３０％のペレットの回りでは、育成の阻害が認められたが、他には阻害は認められなかった。また、ＳＷ１菌及び黄色ブドウ球菌を均一に捲き、過酸化水素を０．００００３％、０．０００３％、０．００３％、０．０３％、０．３％染み込ませたペレットをおいたところ、ＳＷ１菌には育成阻害が認められなかったが、黄色ブドウ球菌には０．３％で育成阻害が認められた。
【００３５】
以上より、本発明のイグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌は、黄色ブドウ球菌よりも次亜塩素酸ナトリウム及び過酸化水素に対する耐性が高いことがわかった。
【００３６】
次に、同じ試料から、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌及びラネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）属菌を下記のような条件で単離した。
【００３７】
（単離方法）
これらの菌は、単離方法として、釣菌単離方法による。これらの菌は、Ｒ２Ａ寒天培地に生育したコロニーを、個々に釣菌してリン酸緩衝液１００μＬ（マイクロリットル）に懸濁し、コンラージ棒を用いて新たなＲ２Ａ寒天培地に塗布し、３７℃で、２４時間培養することにより、単離した。このときの培地は、Ｒ２Ａ寒天培地であり、培養温度を３７℃として、２４時間培養を行った。
【００３８】
単離したミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌及びラネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）属菌を以下のような条件で調べたところ、配列表の配列番号２及び３のような配列であった。具体的には、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌については、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を調べ、１４８３  ｂｐ  の塩基配列により、特定した。このミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌は、独立行政法人製品評価技術基盤機構に２００７年１１月１日に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４５０として寄託（ＥＵＳ）した。また、ラネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）属菌については、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を調べ、１５０４  ｂｐ  の塩基配列により、特定した。このラネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）属菌は、独立行政法人製品評価技術基盤機構に２００７年１０月２４日に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４４０として寄託（Ｃｉｔ）した。
【００３９】
（遺伝子の特定）
単離したプレート上の菌を回収し、ＤＮＡ抽出キットを用いてＤＮＡ試料とした。細菌の遺伝学的分類に用いられる１６Ｓ領域（１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子）を標的として遺伝子を部分増幅し、電気泳動により増幅バンドを確認した。電気泳動ゲルからＤＮＡを切り出して精製し、再度部分的に増幅し、精製後シーケンス反応を行いシーケンサーで塩基配列を確定した。塩基配列をデータベース（ＮＣＩＮＢ；ｂｌａｓｔ）と照合し、相同性から同定した。このときの培養条件として、ニュートリエントブロス液体培地を用い、温度３７℃で、１２時間培養を行った。このとき、ＤＮＡ抽出には、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いた。また、サーマルサイクラーとしては、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００  （ＡＢＩ社製）を用いた。また、プライマーとしては、１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出用プライマー（島津評論  ｖｏｌ．５７  ｐ１２１−１３１  ２０００年）を用いた。更に、遺伝子増幅酵素としては、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（ＡＢＩ社製）を用いた。そして、シーケンサーとしては、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００−Ａｖａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ社製）を用いた。このときのシーケンス試薬としては、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏ  ３．１を用いた。
【００４０】
上述する菌について、（Ａ）イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌、（Ｂ）大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、（Ｃ）黄色ブドウ球菌（Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ）、（Ｄ）乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、（Ｅ）納豆菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、（Ｆ）ラネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）属菌、（Ｇ）ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌、（Ｈ）ラネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）属菌及びミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌（Ｆ及びＧ）混合培養、そして、（Ｉ）安倍川の水そのものを、以下（Ａ〜Ｉ）のような条件でそれぞれ培養した。
【００４１】
（培養条件）
（Ａ〜Ｅ）においては、液体窒素中保存菌株（１〜２×１０８〜１０９）を２０μＬ（マイクロリットル）ずつ接種した。
（Ｆ〜Ｈ）においては、Ｒ２Ａ寒天培地上に生育したコロニーを釣菌してリン酸緩衝液１００μＬ（マイクロリットル）に懸濁した。ここで、（Ｆ）及び（Ｇ）は、２０μＬ（マイクロリットル）ずつ接種した。そして、（Ｈ）においては、各２０μＬ（マイクロリットル）ずつ接種した。以下に各々の条件を並べる。
（Ａ）培地：ニュートリエントブロス液体培地
温度：３７℃  
時間：１２時間  振盪培養
（Ｂ）培地：ＬＢ液体培地
温度：３７℃  
時間：１２時間  振盪培養
（Ｃ）培地：標準液体培地
温度：３７℃  
時間：１２時間  振盪培養
（Ｄ）培地：ＧＡＭ液体培地
温度：３７℃  
時間：２４時間  嫌気培養
（Ｅ）培地：標準液体培地
温度：３７℃  
時間：１２時間  振盪培養
（Ｆ）培地：Ｒ２Ａ液体培地
温度：３７℃  
時間：１２時間  振盪培養
（Ｇ）培地：Ｒ２Ａ液体培地
温度：３７℃  
時間：１２時間  振盪培養
（Ｈ）培地：Ｒ２Ａ液体培地
温度：３７℃  
時間：１２時間  振盪培養
（Ｉ）１０倍濃度で標準液体培地を調整し、採水した安倍川の水で１０倍に希釈した。
培地：標準液体培地
温度：３７℃  
時間：１２時間  振盪培養
（Ａ）〜（Ｉ）各々の培養菌液は、１００μＬ（マイクロリットル）をＬ字管に調整したニュートリエントブロス液体培地の、１０ｍＬ（ミリリットル）中に添加し、３７℃で振盪培養した。
【００４２】
それぞれ単独培養（ニュートリエントブロス液体培地の１０ｍＬ（ミリリットル）において、３７℃にて培養）において、０〜７時間（１時間毎）及び１２時間後のＯＤ値（濁度）とカタラーゼ活性を測定した。カタラーゼ活性測定は、発酵管を用いた過酸化水素分解反応によって行なった。それぞれの測定結果を図１及び図２に示す。
【００４３】
（カタラーゼ活性試験）
カタラーゼ活性試験は、１０ｍＬ（ミリリットル）の発酵管（旭硝子社製のアインホルン型）中に３％過酸化水素水を充填し、マイクロピペットを用いて上述の培養後菌液を１ｍＬ（ミリリットル）だけ、挿入添加し、カタラーゼにより分解発生する酸素ガス量を測定した。
【００４４】
（Ａ）においては、６時間でプラトー（培養停滞：１〜２×１０９個／ｍＬ（ミリリットル））に達することがわかる。また、カタラーゼ活性は、酸素５ｍＬ（ミリリットル）／１ｍＬ（ミリリットル）菌液であった。（Ｂ）においては、７時間でプラトーに達することがわかる。カタラーゼ活性は、酸素０．０５ｍＬ（ミリリットル）／１ｍＬ（ミリリットル）菌液であった。（Ｃ）においては、生育は極めて遅いことがわかる。カタラーゼ活性は、酸素０．０５ｍＬ（ミリリットル）／１ｍＬ（ミリリットル）菌液であった。（Ｄ）においては、生育は極めて遅いことがわかる。カタラーゼ活性は確認できなかった。（Ｅ）においては、６〜７時間でプラトー（培養停滞：０．５〜１×１０９個／ｍＬ（ミリリットル））に達することがわかる。カタラーゼ活性は、酸素０．８ｍＬ（ミリリットル）／１ｍＬ（ミリリットル）菌液であった。（Ｆ）においては、６〜７時間でプラトー（培養停滞：０．５〜１×１０８個／ｍＬ（ミリリットル））に達することがわかる。カタラーゼ活性は、酸素０．０１ｍＬ（ミリリットル）／１ｍＬ（ミリリットル）菌液であった。（Ｇ）においては、菌の生育は確認できなかった。カタラーゼ活性も確認できなかった。（Ｈ）においては、１２時間まで成長を続けることがわかる。カタラーゼ活性は、酸素０．１ｍＬ（ミリリットル）／１ｍＬ（ミリリットル）菌液であった。（Ｉ）においては、７時間でプラトーに達することがわかる。カタラーゼ活性は、酸素０．２ｍＬ（ミリリットル）／１ｍＬ（ミリリットル）菌液であった。ここで、（Ｉ）の中には（Ａ）の菌株も存在するが、水そのものの培養ではカタラーゼは獲得できなかった。
【００４５】
次に、（Ａ）のイグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌を主菌株として、従菌株としての（Ｂ）から（Ｉ）を混合して培養し、同様にＯＤ値とカタラーゼ活性を測定した。それぞれの測定結果を表１及び表２並びに図３Ａから図４に示す。
【００４６】
（カタラーゼ活性の測定）
上述（Ａ）培養液１００μＬ（マイクロリットル）と、（Ｂ）〜（Ｉ）の各々の培養菌液の１００μＬ（マイクロリットル）をＬ字管に調整したニュートリエントブロス液体培地１０ｍＬ（ミリリットル）中に添加し（（ＡＢ）、（ＡＣ）、（ＡＤ）、（ＡＥ）、（ＡＦ）、（ＡＧ）、（ＡＨ）、（ＡＩ））、３７℃で振盪培養した。カタラーゼ活性試験は、１０ｍＬ（ミリリットル）発酵管（アインホルン型）中に３％過酸化水素水を充填し、マイクロピペットを用いて上述の培養後菌液を１ｍＬ（ミリリットル）だけ、挿入添加し、カタラーゼにより分解発生する酸素ガス量を測定した。
【００４７】
【表１】
0005525445.tif 000002
【００４８】
【表２】
0005525445.tif 000003
【００４９】
（ＡＡ）は、図１及び２の（Ａ）単独と同じものである。（ＡＢ）においては、 ７時間でプラトーに達することがわかる。（培養停滞：１〜２×１０９個／ｍＬ（ミリリットル））また、カタラーゼ活性は、酸素０．２ｍＬ（ミリリットル）／１ｍＬ（ミリリットル）菌液であった。（ＡＣ）においては、７時間でプラトーに達する。（培養停滞：１〜２×１０９個／ｍＬ（ミリリットル））カタラーゼ活性は、酸素３．７ｍＬ（ミリリットル）／１ｍＬ（ミリリットル）菌液であった。（ＡＤ）においては、７時間でプラトーに達する。（培養停滞：１〜２×１０９個／ｍＬ（ミリリットル））カタラーゼ活性は、酸素４．０ｍＬ（ミリリットル）／１ｍＬ（ミリリットル）菌液であった。（ＡＥ）においては、７時間でほぼプラトーに達する。（培養停滞：１〜２×１０９個／ｍＬ（ミリリットル））カタラーゼ活性は、酸素０．９ｍＬ（ミリリットル）／１ｍＬ（ミリリットル）菌液であった。（ＡＦ）においては、７時間でプラトーに達する。（培養停滞：１〜２×１０９個／ｍＬ（ミリリットル））カタラーゼ活性は、酸素２．５ｍＬ（ミリリットル）／１ｍＬ（ミリリットル）菌液であった。（ＡＧ）においては、７時間でプラトーに達する。（培養停滞：１〜２×１０９個／ｍＬ（ミリリットル））カタラーゼ活性は、酸素６．５ｍＬ（ミリリットル）／１ｍＬ（ミリリットル）菌液であり、（ＡＡ）の主菌株単独の活性を上回ることがわかる。（ＡＨ）においては、７時間でプラトーに達する。（培養停滞：１〜２×１０９個／ｍＬ（ミリリットル））カタラーゼ活性は、酸素５．５ｍＬ（ミリリットル）／１ｍＬ（ミリリットル）菌液であり、（ＡＡ）の主菌株単独の活性を上回ることがわかる。（ＡＩ）においては、７時間でプラトーに達する。（培養停滞：１〜２×１０９個／ｍＬ（ミリリットル））カタラーゼ活性は、酸素４．０ｍＬ（ミリリットル）／１ｍＬ（ミリリットル）菌液であった。
【００５０】
ここで、（Ｂ）大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）及び（Ｅ）納豆菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、生育速度が主菌株とほぼ同じであると考えられ、（Ｃ）黄色ブドウ球菌（Ｓ．  Ａｕｒｅｕｓ）及び（Ｄ）乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）は、ニュートリエントブロス培地ではほとんど生育しない。また、（Ｆ）ラネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）属菌や、（Ｇ）ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌は、生育速度が主菌株より遅い。
【００５１】
以上の結果から、大腸菌（Ｂ）、納豆菌（Ｅ）のように培養速度が近いと、競合により生育に必要な養分を取られてしまう（納豆菌ではナットウキナーゼによる分解も考えられるが、いずれにせよカタラーゼ活性は得られない）。黄色ブドウ球菌（Ｃ）及び乳酸菌（Ｄ）では、主菌株（Ａ）より若干低い活性であり、これら菌株が単独培養ではほとんど生育していないことと、安倍川の水培養（Ｉ）でも同程度であることから、生育が競合しない場合の結果と考えられる。
【００５２】
以上より、独立栄養細菌であるＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ  ｐｖ．  Ｃｉｔｒｉ類縁菌は、主菌株と競合し、カタラーゼ活性を低下させてしまうと考えられる。しかし、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌と混合することで、主菌株の単独培養よりも若干高いカタラーゼ活性が得られる。従属栄養細菌であるミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌のみの添加で最も高いカタラーゼ活性を得たことから、主菌株とミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌との混合培養が効果的である。ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌が従属栄養細菌であるがゆえ、分離・保存にはラネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）属菌が存在すると安定する。ただし、Ｒ２Ａ培地を用いることで、分離培養は可能である。
【００５３】
主菌株イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌（以下「Ｅｘ菌」という）の、単独培養で得られるカタラーゼ活性・酸素５．０ｍＬ（ミリリットル）／１ｍＬ（ミリリットル）培養液に対して、同じ安倍川の水より分離したミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌を添加し培養することで、カタラーゼ活性・酸素６．５ｍＬ（ミリリットル）／１ｍＬ（ミリリットル）培養液と、有意に増加がみられた。従って、主菌株イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌と、従菌株ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌の複合がより好ましい。
【００５４】
（イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌の量産可能性）
Ｅｘ菌の培養時に培地に耐性限界の次亜塩素酸ナトリウムを入れた場合及び入れない場合において、上述するような条件で１６時間培養した結果、細胞溶解法で取り出したカタラーゼの量及び性質について検討した。元菌（原液）、溶解（細胞溶解液（自家製：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液  ｐＨ７．５，  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，  ０．１％  ＳＤＳ，１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で溶解した溶液）、精製（ゲルクロマト（ＧＥ社製  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１０００））についてそれぞれ調べた。次亜塩素酸ナトリウムを添加した場合、活性のある６０ｋＤ（キロダルトン）カタラーゼの量が、元菌、溶解、精製の何れの場合でも次亜塩素酸ナトリウムを添加しなかった場合の量に比べ少なかった。また、次亜塩素酸ナトリウムを添加した場合、１２０ｋＤ（キロダルトン）カタラーゼの量が、次亜塩素酸ナトリウムを添加しなかった場合の量に比べ多かった。このことから、次亜塩素酸ナトリウムを添加した場合、活性のある６０ｋＤ（キロダルトン）カタラーゼが減量し、１２０ｋＤ（キロダルトン）に変化したことが認める。因みに、カタラーゼ単体の分子量は約２４ｋＤ（キロダルトン）である。このように培地に次亜塩素酸ナトリウムを添加することは、培地や培養タンクの滅菌のために有効である。例えば、大量培養時には、培地や培養タンクの滅菌は通常の実験室レベルの方法では困難である。しかし、次亜塩素酸ナトリウムを培地に添加するという方法であれば、大量培養にも比較的容易に行うことができる。但し、例えば、耐性限界まで添加してしまうとカタラーゼ産生には悪影響が上述するようにあると考えられる。そのため、添加濃度を検討したところ、次亜塩素酸ナトリウムの添加量は培地に対して０．０４％以下となるように添加することが好ましい。より好ましくは、０．０１％以下であり、更に好ましくは、０．００５％以下である。例えば、約０．００２％とすることもできる。一方、一般に濃度が低いと滅菌効果が低下するので、滅菌効果の観点からは、好ましくは、０．０００１％以上、より好ましくは、０．０００５％以上、更に好ましくは、０．０１％以上である。例えば、本実施例の場合は、０．００２％から０．００５％の範囲が特に好ましい。尚、この濃度は、次亜塩素酸ナトリウムの理論値に対するもので、例えば、３５％の次亜塩素酸ナトリウム溶液の場合、実際の添加量に３５％を乗じたものが次亜塩素酸ナトリウムの量となる。
【００５５】
Ｅｘ菌による実験室レベルの培養により生産されたカタラーゼと、約１ｔ（トン）のＥｘ菌培養により生産されたカタラーゼとを分子量により比較した。それぞれ所定の量の培養液を取り、それぞれＣＢＢ（クマシーブルー）染色により、また、抗体反応によるウエスタンブロッティングを用いて測定した。用いた試料は、実験室レベルにおいて、下記（１）から（６）の条件において培養したもの、通常の方法で約１ｔ（トン）培養したもので（７）沈殿前及び（８）沈殿後のものをそれぞれ比較した。具体的には、各５ｍＬ（ミリリットル）の菌液を凍結溶解して菌を破壊し、そのまま電気泳動した。
（１）普通ブイヨン液体培地（０．１％肉エキス，０．２％酵母エキス，０．５％ペプトン，０．５％塩化ナトリウム，ｐＨ７．０±．）
（２）普通ブイヨン液体培地  ＋  次亜塩素酸ナトリウム  １μＬ（マイクロリットル）／２５ｍＬ（ミリリットル）
（３）ノーマルＬＢ（１．０％，０．５％酵母エキス，１．０％塩化ナトリウム）
（４）普通ブイヨン液体培地  ＋  次亜塩素酸ナトリウム  １μＬ（マイクロリットル）／２５ｍＬ（ミリリットル）
（５）普通ブイヨン液体培地  ＋  トリプトン（ＢＤ社製  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ）  １００ｍｇ（ミリグラム）／１０ｍＬ（ミリリットル）
（６）普通ブイヨン液体培地  ＋  トリプトン（ＢＤ社製  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ）  １００ｍｇ（ミリグラム）／１０ｍＬ（ミリリットル）  ＋  次亜塩素酸ナトリウム  １μＬ（マイクロリットル）／２５ｍＬ（ミリリットル）
【００５６】
ここで、標準試料として、牛肝臓由来カタラーゼ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製  Ｃａｔａｌａｓｅ，  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｌｉｖｅｒ）及びヒト血球由来カタラーゼ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製  Ｃａｔａｌａｓｅ，  Ｈｕｍａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ）についても同時に調べた。これらの標準試料は、主として６０ｋＤ（キロダルトン）のカタラーゼを含み、濃度が濃いため、バンドも大きくなった。試料（１）から（６）について、いずれも６０ｋＤ（キロダルトン）のカタラーゼが検出された。また、標準試料では更に低分子のものが認められたが、試料（１）から（６）の何れもサンプル量が少量（５ｍＬ（ミリリットル））のため検出できなかった。
【００５７】
培地の種類によるカタラーゼの出来具合を調べたところ、試料（１）から（６）については、大きな差はなかった。しかし、抗体反応の結果では（２）の「普通ブイヨン液体培地  ＋  次亜塩素酸ナトリウム  １μＬ（マイクロリットル）／２５ｍＬ（ミリリットル）」が一番明確なバンドであり、最も大量に発現していることが分かった。大量生産でも、酵素反応でカタラーゼのバンドが確認された。
【００５８】
因みに、中国で安価に販売されるカタラーゼ（Ｑｉｎｇｄａｏ  Ｅｃｏｌｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ製  http://www.ekl558.cn/）について同様に調べると、標準品に比べて不純物が多いことがわかった。実際に、このカタラーゼからは、ルミノール反応がみられ、これは抽出タンパク質ではなく、血液であることがわかった。尚、本発明の実施例に関するカタラーゼは、何れもルミノール反応はみられなかった。
【００５９】
以上のことを踏まえ、効率の良い大量培養について検討する。上述するように、主菌としてＥｘ菌と、従菌としてミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌の複合がより好ましいが、最初の段階から混合培養をしてしまうと、カタラーゼは作るものの菌の増殖が進み難いおそれがある。そのため、結果的にカタラーゼの培地相対的産生量が低下すると考えられる。これは、増殖する条件と、カタラーゼを産生する条件が、必ずしも一致しないからと考えられる。そこで、段階的に菌を増やす方法を用いることができる。
【００６０】
例えば、大量培養する際、２Ｌ（リットル）（２×１０１２個）のＥｘ菌の種菌を一晩（１６時間）で２００Ｌ（リットル）（２×１０１４個）に増やし、さらに２４時間で２〜５０００Ｌ（リットル）（２〜５×１０１４個）に増やす。１６時間培養する時にＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌（Ｇ）の種菌を作り、２４時間培養時に添加する。上述した実験において、Ｅｘ菌（Ａ）とミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌（Ｇ）は同量ずつ添加していたが、（Ｇ）を１／１００量でもカタラーゼ活性は上がると考えられる。そのため、６０ｋＤ（キロダルトン）のカタラーゼの産生効率の向上が期待される。
【００６１】
また、大量培養時には、培地の滅菌や培養タンクの消毒は、実験室レベルの方法（例えば、ブラシ等による洗浄等）では困難である。タンク内に大腸菌等の微生物が存在している場合、上述する実験の混合培養結果にあるように、カタラーゼ活性の著しい低下を招くおそれがある。そこで、次亜塩素ナトリウムに対する耐性能を利用して、大量の培地を作成する時に、次亜塩素酸ナトリウムを滅菌に充分な所定量を添加する（例えば、２００ｐｐｍ（パーツ・パー・ミリオン）以下）。これにより、Ｅｘ菌（Ａ）以外の菌を消毒することができる。
【００６２】
（大量培養後の菌の回収法と精製法）
大量に培養した場合、菌をどのように回収し、カタラーゼをどのように精製するかが重要である。そこで、例えば、タンク内で菌を沈殿させるために、ミョウバンを所定量（例えば、１ｋｇ（キログラム）／１ｔ（トン））を加えることができる。菌回収後、物理的に破壊して（フレンチプレス）、カタラーゼ溶液とすることができる。更に、１０〜３０ｋＤ（キロダルトン）と１００〜３００ｋＤ（キロダルトン）の透析膜を使って簡易精製することができる。
【００６３】
以上から、具体的な方法をまとめると次のようになる。
Ｉ．Ｅｘ菌の培養・増殖
Ｅｘ菌の増殖に最も好ましい条件（例えば、培地に約０．００１％の次亜塩素酸ナトリウムを添加したもの）で、Ｅｘ菌を増殖する。例えば、２Ｌ（リットル）（２×１０１２個）のＥｘ菌の種菌を［５００Ｌ（リットル）培地＋次亜塩素酸ナトリウム２０ｍＬ（ミリリットル）（３５％濃度原液）］の条件で、１６時間培養する。ここでは、主菌となる菌の増殖のための最適な条件を提供することが好ましい。例えば、主菌が活性酸素に対する耐性が高い場合、従菌を加えないので従菌の活性酸素対する耐性を考慮する必要がない。また、主菌の増殖を妨げる他の菌の増殖や生存を制限可能な条件（例えば、より高い濃度の活性酸素）を選択することもできる。特に高い活性酸素濃度での増殖は、増殖容器内の滅菌効果も期待できる。
ＩＩ．ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種菌の準備
Ｅｘ菌の増殖中にミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種菌を別途所定量（例えば、２Ｌ（リットル））準備する。ここでは、主菌とは異なる条件で従菌を繁殖させてもよい。また、必ずしも大量である必要がないならば、その他の菌の滅菌を事前に行ってから従菌を繁殖させることもできる。
ＩＩＩ．Ｅｘ菌及びミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種菌による混合培養
増殖したＥｘ菌（例えば、１６時間で２００Ｌ（リットル）（２×１０１４個））に、培地を所定量（例えば、４５００Ｌ（リットル））加え、更に、準備した所定量（例えば、２Ｌ（リットル））のミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種菌を添加して、所定時間（例えば、２４時間）培養し、所定量（例えば、２〜５０００Ｌ（リットル）（２〜５×１０１４個））まで増やす。ここで、所定量とは、主菌の活性を図るのに充分な量であればよい。例えば、主菌に対して、従菌の量が、０．００１％以上であることが好ましい。また、０．０１％以上であることがより好ましい。更に、０．１％以上であることが好ましい。また、従菌の量は主菌よりも多くてもよいが、カタラーゼの産生効率を考慮すれば、主菌と同量又はそれ以下が好ましい。好ましくは、２５％以下であり、条件によっては１０％以下である。
ＩＶ．培養タンクへミョウバンを所定量添加・分離精製
混合培養を行った培養タンクにミョウバンを所定量（例えば、１ｋｇ（キログラム）／１ｔ（トン））を加える。これにより、Ｅｘ菌等を沈殿させ、菌を回収する。そして、残りの溶液から、カタラーゼを透析膜又は限界ろ過により簡易精製することができる。
尚、上述するＩからＩＶの工程では、Ｅｘ菌について述べてきたが、このような大量なカタラーゼの産生の方法は、他の菌種についても適用することが可能と考えられる。
【００６４】
これまでは、Ｅｘ菌等を培養等して、カタラーゼを産生する方法について述べてきた。以下は、このようにして産生されたカタラーゼを利用する方法等について述べる。図５は、循環湯を用いた殺菌装置を組込んだ給湯システムの概略図を示す。給湯システム１０は、浴槽１２に入ったお湯１４を排水蓋１６を開けることにより、槽外に排出し、給水蓋１８を開けることにより、槽内に湯を入れることができる。排水口から排水されたお湯は配管２０を通り、ポンプ２２により加圧され、薬剤槽２４へと押し上げられ、バルブ２６を通過して、ろ過装置２８へと流れる。ろ過装置２８を通ると、無害化槽３０を通り、バルブ３４を経て、配管３６を通り浴槽１２へと循環される。薬剤槽２４では、レジオネラ菌等の細菌を殺すのに十分な濃度となるように十分な量の次亜塩素酸ナトリウムが添加される。この薬剤槽２４は、図６に矢印２４ａで示すように下から入ったお湯が、上下にジグザグにお湯が流れ、矢印２４ｂの方向に排出される。このジグザグの流路では、中に入れられた薬剤ペレットに含まれる次亜塩素ナトリウムと循環するお湯が十分接触し、十分な量の次亜塩素酸ナトリウムが供給される。この十分な濃度の次亜塩素酸ナトリウムを含むお湯は、ろ過装置２８へと流れ、フィルタでトラップされたゴミに潜む細菌も殺しながら、ろ過され、無害化槽３０へと流れる。無害化槽３０は、図７に示すように、上部に撹拌槽４２が設けられ、矢印５０に従って流れてきたお湯の中の薬剤等の均一な混合及び温度調整や必要に応じてｐＨ調整を行うことができる。この槽を出るお湯は、矢印５２に従って、生物処理槽４４へと流入する。尚、上記撹拌槽４２は、省略してもよい。生物処理槽４４は、図８に示すように、薬剤槽２４や撹拌槽４２と類似のジグザグ流路を形成するＶ字型槽６０、６２、６４が備えられる。各Ｖ字槽の底部には、比重が１．１２２〜１．１２７のバイオペレット６８が配置され、イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌が担持されたペレットが備えられる。このイグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌は上述するように、次亜塩素酸ナトリウムに十分耐性があり、活性酸素を分解して、無害化する。ここでは、イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌単体を用いたバイオペレットを用いているが、これまで述べてきたように、上述の補助菌と共に用いてもよい。このバイオペレットは、微生物固定化法に基づく技術であり、ペレット化は、生物膜を利用して、活性炭などの多孔質に自然に固定する方法や、アクリルアミドなどに包括固定する方法等がある。一般には、前者が多く用いられている。また、別途生産したカタラーゼをここで添加してもよい。
【００６５】
ここで、通常のレジオネラ菌の消毒方法では、ヒータで７０℃以上に昇温するが、各部材の耐熱性を十分に上げる必要がある。また、お風呂に好ましい温度は４０℃前後であり、この温度に戻すために冷却が必要である。一方、本システムでは、４０℃あたりで次亜塩素酸ナトリウムが殺菌剤として有効に機能するだけでなく、その後工程の無害化槽３０で、イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌が最も効率よく機能する温度であり、エネルギーの無駄を省いて、効率が向上するという思わぬ効果をえることができる。
【００６６】
この生物処理槽４４を通過したお湯は、粗い膜４６によりバイオペレットをトラップする。このトラップは、両側のローラ４８により、所定時間が経つと、タイプライターのリボンと同じように新しい粗い膜４６が更新される。イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌が最も効率よく機能し、カタラーゼを産生して、カタラーゼが最も良く働く温度は、２５〜４２℃であるが、より好ましくは、３０〜４０℃、更に好ましくは、３６〜３８℃の３７℃前後であるので、十分な温度管理をすることが望ましく、ｐＨ６〜９の範囲が好ましいが、ｐＨ６〜８がより好ましく、約ｐＨ７が更に好ましい。また、上述する他の菌も最適な温度があるので、そのような温度管理やｐＨ管理が望ましい。
【００６７】
図９に光触媒評価装置の概略模式図を示す。光触媒評価装置８０は、ランプ８２（蛍光灯若しくはブラックライト）により照射される密閉容器８４の中にシャーレ８６が配置され、中に評価用微生物の乾燥を防ぐための水が入れられている。光触媒をコーティングしたガラス板９０が、シャーレ上に渡された木片の上に置かれる。ランプ８２の光は、天井の透明ガラス９２（好ましくは石英ガラス）を通ってこの板９０に照射される。この照射により、光触媒で活性酸素が作られると、評価用の微生物が死滅するので、この光触媒が有効に作用することがわかる。しかしながら、ブラックライトによる紫外線もまた、微生物を直接殺すこともできる。また、光触媒を塗布する際の有機溶媒も殺菌能を有する。そのため、光触媒の機能評価が完全にはできない。ここで、まず、イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌と同様に、所定の紫外線（例えば、ブラックライトによるもの）の照射では、死ぬことがない大腸菌等の評価用微生物を選出する。これにより、紫外線照射による微生物の死の可能性を排除することができる。このような大腸菌等を評価用微生物として、光触媒をコーティングしたガラス板、及び、していないガラス板に滴下して実験を行う。このとき、光触媒コーティングしたガラス板の菌が死に、そうでないガラス板が生きていたとしても、光触媒の効果であるのか有機溶媒の効果であるのかは明確にならない（有機溶媒のみを塗布しても、混合溶液での作用、揮発性、浸潤性に差があり正当評価できない）。そこで、ブラックライトによる紫外線の照射を行わないものをコントロールとして準備する。また、大腸菌等の評価用微生物とは別のガラス板を用意し、イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌を、光触媒をコーティングした板、及び、していない板に滴下して同時に実験を行い、菌がそのまま生きていることを確認する。このような実験を以下の表にまとめる。ここで、コーティングしたもので大腸菌数が減少あるいは死滅していれば、活性酸素（即ち、光触媒）のせいであることがわかる（Ｎｏ．２）。
【００６８】
【表３】
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【００６９】
以上述べてきたように、高いカタラーゼ活性及びそのような環境を作るための微生物をし、それらの微生物を有効利用する方法を提供できるので、活性酸素の上手な活用ができる。特に、高いカタラーゼ活性の酵素を産生する微生物として、イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌が単離されているので、極めて産生効率が高い。また、そのカタラーゼ活性が特に高くなる環境を見出すことができた。
【符号の説明】
【００７０】
Ａ    イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕ）属（ＳＷ１）菌
Ｇ    ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌
１０    給湯システム
１２    浴槽
２０、３６    配管
２２    ポンプ
２４    薬剤槽  
２６、３４    バルブ
２８    ろ過装置
３０    無害化槽
４２    撹拌槽
４４    生物処理槽
４６    粗い膜    
４８    ローラ    
６０、６２、６４    Ｖ字型槽
６８    バイオペレット
８０    光触媒評価装置
８２    ランプ
８６    シャーレ
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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