(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高度に濃縮された抗体組成物を調製するための方法であって、前記方法は
（ａ）第一抗体調製物に第一限外濾過を施して、第一限外濾過の保持液を含む第二抗体調製物を提供し、
（ｂ）第二抗体調製物にダイアフィルトレーションを施して、ダイアフィルトレーションの保持液を含むダイアフィルトレーションされた中間抗体調製物を提供し、
（ｃ）ダイアフィルトレーションされた中間抗体調製物に第二限外濾過を施して、第二限外濾過の保持液を含む第三抗体調製物を提供することを含んでなり、
第一限外濾過、第二限外濾過及びダイアフィルトレーションが３５℃〜５０℃で達成され、前記方法で濃縮される抗体が抗ＩｇＥ抗体ｒｈｕＭＡｂ  Ｅ２５又はその抗原結合断片である、方法。
【請求項２】
前記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一限外濾過、第二限外濾過及びダイアフィルトレーションの一以上が、４５℃プラス又はマイナス５℃で達成される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第一限外濾過、第二限外濾過及びダイアフィルトレーションの一以上が４５℃で達成される請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が４０℃〜５０℃の温度で実施される請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
第一抗体調製物が、リットル当たり０．１〜１０グラムのタンパク質濃度を有している請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
第一抗体調製物が、リットル当たり１〜５グラムのタンパク質濃度を有している請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第二抗体調製物が、リットル当たり１０〜５０グラムのタンパク質濃度を有している請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
第二抗体調製物が、リットル当たり２０〜５０グラムのタンパク質濃度を有している請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第二抗体調製物が、リットル当たり２０〜４０グラムのタンパク質濃度を有している請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第三抗体調製物が、リットル当たり５０〜２５０グラムのタンパク質濃度を有している請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
第三抗体調製物が、リットル当たり１００〜２３０グラムのタンパク質濃度を有している請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
第三抗体調製物が、リットル当たり１７０〜２００グラムのタンパク質濃度を有している請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
中間抗体調製物がリットル当たり２５〜３５グラムのタンパク質濃度を有し、第三抗体調製物がリットル当たり１７０〜２００グラムのタンパク質濃度を有する請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
第一限外濾過により第一抗体調製物が濃縮されて、リットル当たり３０グラムのタンパク質濃度を有する第二抗体調製物が提供され、第二限外濾過により中間抗体調製物が濃縮されて、リットル当たり１７０〜２００グラムのタンパク質濃度を有する第三抗体調製物が提供される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
方法が１〜１０時間で達成される請求項１から１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
方法が２〜５時間で達成される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
方法が３時間で達成される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
第一及び第二限外濾過が、５〜５０キロダルトンの公称孔径を有する限外濾過膜を用いて達成される請求項１から１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
第一及び第二限外濾過が、１０〜３０キロダルトンの公称孔径を有する限外濾過膜を用いて達成される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第一抗体調製物が、１００〜２００キロダルトンの見かけ分子量を有する抗体を含む請求項１から２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
第一抗体調製物が、１５０キロダルトンの見かけ分子量を有する抗体を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
濾過工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が限外濾過膜を利用する請求項１から２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
第一限外濾過及び第二限外濾過が、同じ限外濾過膜により達成される請求項１から２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
濾過工程（ａ）で利用された限外濾過膜が工程（ｂ）及び（ｃ）で使用される請求項１から２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
第一限外濾過、第二限外濾過、及びダイアフィルトレーションが、限外濾過膜を通るタンジェンシャルフロー濾過により達成される請求項１から２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
第一限外濾過、第二限外濾過、及びダイアフィルトレーションが、同じ限外濾過膜を通るタンジェンシャルフロー濾過により達成される請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
第一限外濾過と第二限外濾過が、再生セルロース複合体限外濾過膜で達成される請求項１から２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ダイアフィルトレーションにより、一定容量、一定濃度又はその双方でのバッファー交換が達成される請求項１から２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ダイアフィルトレーションにより、５〜１５倍容量のバッファー交換が達成される請求項１から２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ダイアフィルトレーションにより、８倍容量のバッファー交換が達成される請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
工程（ｂ）が２以上のダイアフィルトレーション工程を含む請求項１から３１の何れか一項に記載の方法。
【請求項３３】
第一ダイアフィルトレーション工程により４倍容量のバッファー交換が達成され、第二ダイアフィルトレーション工程により４倍容量のバッファー交換が達成される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ダイアフィルトレーションにより、第一バッファーが第二バッファーに交換される請求項１から３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ダイアフィルトレーションにより、工程（ａ）とは異なる組成を有するバッファーに交換される請求項１から３４の何れか一項に記載の方法。
【請求項３６】
第一バッファーが、水性塩化ナトリウムとＴＲＩＳバッファーの混合物を含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
第二バッファーが、水性塩化ヒスチジンと塩化アルギニンの混合物を含む請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
第三抗体調製物の収率が、第一抗体調製物におけるタンパク質の重量の７０重量％を越える請求項１から３７の何れか一項に記載の方法。
【請求項３９】
第三抗体調製物の収率が、第一抗体調製物におけるタンパク質の重量の８０〜１００重量％である請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
第三抗体調製物の収率が、第一抗体調製物におけるタンパク質の重量の９８重量％を超える請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
第一限外濾過が、０．５Ｌ／分／ｆｔ２〜５Ｌ／分／ｆｔ２の再循環速度を有する請求項１から４０の何れか一項に記載の方法。
【請求項４２】
限外濾過及びダイアフィルトレーションが、５〜５０ｐ.ｓ.ｉの膜間圧で達成される請求項１から４１の何れか一項に記載の方法。
【請求項４３】
限外濾過及びダイアフィルトレーションが、１０〜５０ｐ.ｓ.ｉの膜間圧で達成される請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
工程（ｃ）のためのスループットが、８０ｇ/ｆｔ２/ｈｒ、１２０ｇ/ｆｔ２/ｈｒ、１３５ｇ/ｆｔ２/ｈｒ、１４５ｇ/ｆｔ２/ｈｒ、１７５ｇ/ｆｔ２/ｈｒ、１８０ｇ/ｆｔ２/ｈｒ、２６５ｇ/ｆｔ２/ｈｒ、２８５ｇ/ｆｔ２/ｈｒ又は２９０ｇ/ｆｔ２/ｈｒである請求項１から４３の何れか一項に記載の方法。
【請求項４５】
凝集した汚染物質のレベルは、５重量％未満である請求項１から４４の何れか一項に記載の方法。
【請求項４６】
凝集した汚染物質のレベルは、２重量％未満である請求項１から４５の何れか一項に記載の方法。
【請求項４７】
１００ＣＦＵ／ｍＬ未満の検出可能なバイオバーデンを有する抗体濃縮液が提供される請求項１から４６の何れか一項に記載の方法。
【請求項４８】
第三抗体調製物が１．８ＣＦＵ／ｍＬの検出可能なバイオバーデンを有する請求項１から４７の何れか一項に記載の方法。
【請求項４９】
第三抗体調製物が０．１３ＣＦＵ／ｍＬ未満の検出可能なバイオバーデンを有する請求項１から４８の何れか一項に記載の方法。
【請求項５０】
第一抗体調製物が工程（ａ）より前に精製工程を受けている請求項１から４９の何れか一項に記載の方法。
【請求項５１】
第一抗体調製物に含まれる抗体が工程（ａ）より前に９９．８％の純度である請求項１から５０の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
(背景)
生物学的物質を、単離、精製及び濃縮するための方法は既知であり、例えばクロマトグラフィー、限外濾過、及び凍結乾燥が含まれ、一般的には、R. Hatti-Kaulら,「Downstream Processing in Biotechnology」, Basic Biotechnology, Chap. 9, 187-211頁, 第2版, Cambridge University Press(2001)を参照のこと。ヒトへの投与のための濃縮モノクローナル抗体調製物の製造方法は知られており、例えば限外濾過を使用し、得られた濾液を再循環させる米国特許第６２５２０５５号を参照のこと。
利用可能な抗体濃縮法に関連したいくつかの課題には、例えば低い流束、長いプロセス時間、大きな膜面積、機械的回収収率及び損失、操業者への依存性の高い処理又はハンドリング、低い物質移動速度、エネルギー効率の悪さ、及び濃縮装置に対する液圧制限が含まれる。これらの課題や他の課題のため、全製造コストが高くなり、最終的には治療薬の消費者に大きな負担がかかっていた。
高度に濃縮されたタンパク質製剤、例えば液体抗体調製物やその治療用製品を調製するための改善された方法が必要である。
【０００２】
(概要)
概括的には、本明細書は、一般に、タンパク質の濃縮法、例えば抗体調製物の濃縮方法、そのような調製物を含む医薬製剤、ヒトの治療又は動物の治療におけるその使用に関する。
実施態様では、本明細書は、高度に濃縮されたタンパク質、例えば抗体調製物を調製するための方法；本方法により調製された治療用製品、例えば治療用抗体産物を提供する。従って、本明細書は、第一抗体調製物に第一限外濾過を施して第二抗体調製物を提供し；第二抗体調製物にダイアフィルトレーションを施して(diafiltering)、ダイアフィルトレーションされた中間抗体調製物を提供し；ダイアフィルトレーションされた中間抗体調製物に第二限外濾過を施して、第三抗体調製物を提供することを含み、第一限外濾過、第二限外濾過及びダイアフィルトレーションの一以上が、例えば約３０℃〜約５０℃という高い温度で達成されるタンパク質の濃縮方法を提供する。
【０００３】
また本明細書は、実施態様において、第一タンパク質混合物に第一限外濾過を施して第二タンパク質混合物を提供し；第二タンパク質混合物にダイアフィルトレーションを施して、ダイアフィルトレーションされたタンパク質混合物を提供し；ダイアフィルトレーションされたタンパク質混合物に第二限外濾過を施して、第三タンパク質混合物を提供することを含み、第一限外濾過、ダイアフィルトレーション、及び第二限外濾過の一以上が、例えば約４５℃で実施されるタンパク質の濃縮方法を提供する。
さらに本明細書は、実施態様において、上述の方法により調製される高度に濃縮された抗体組成物を提供する。
【０００４】
(詳細な説明)
本明細書の様々な実施態様を、図面がある場合は、図面を参照しながら詳細に説明する。様々な実施態様の参照は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲はここに添付される特許請求の範囲によってのみ限定される。さらに、この明細書に記載される全ての実施例は、限定することを意図しているものではなく、特許請求の範囲に記載の発明に対する多くの可能な実施態様のいくつかを単に説明しているのに過ぎない。
【０００５】
特に別の定義を記載していない場合は、次の定義が使用される：
「限外濾過する」、「限外濾過」、「限外濾過された」、「ＵＦ」及び類似用語は、例えば適切な物理的及び化学的性質を有する合成半透膜を使用し、主として分子サイズ及び形状に基づき、混合物中の分子を区別し、異なる分子の分離を達成するか、又は類似分子の濃縮を達成することを意味する。
「ダイアフィルトレーションする」、「ダイアフィルトレーション」、「ダイアフィルトレーションされた」、「ダイアフィルトレーション化」、「ＤＦ」及び類似用語は、例えば限外濾過膜を使用し、タンパク質、ペプチド、核酸、又は他の生体分子を含む混合物又は溶液から、溶媒又は塩を除去し、置き換え、又はその濃度を低下させることを意味する。
【０００６】
「膜間圧」又は「ＴＭＰ」とは、ＴＭＰ[バール]＝[(ＰＦ＋ＰＲ)／２]−Ｐｆとして算出される膜の供給液側から濾液側への平均適用圧を意味し、ここでＰＦは供給液圧、ＰＲは保持液圧、Ｐｆは濾液圧である。
「タンジェンシャルフロー濾過」、「クロスフロー濾過」、「ＴＦＦ」及び類似用語は、溶質含有溶液がＵＦ膜を接線方向に横切って通過し、より小さな分子量の塩又は溶質が適用圧により通過する濾過方式を意味する。
【０００７】
「抗体」とは最も広義に使用され、特にインタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも二つのインタクトな抗体から形成される多重特異的抗体(例えば、二重特異的抗体)、及びそれらが所望の生物活性を示す限りは抗体断片をカバーする。抗体は、特定の抗原を認識して結合可能な、免疫系により生じるタンパク質である。その構造に関して記載すると、抗体は、２つの重鎖と２つの軽鎖の４つのアミノ酸鎖からなるＹ字形のタンパク質である。この説明に対して十分な単純化されたモデルでは、各抗体は、主として可変領域と定常領域の２つの領域を有する。Ｙのアームの末端に位置する可変領域は、標的抗原に結合して相互作用する。この可変領域には、特定の抗原上の特異的な結合部位を認識して結合する相補性決定領域(ＣＤＲ)が含まれる。Ｙの尾部に位置する定常領域は、免疫系により認識され、相互作用する(Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik(2001) Immuno Biology, 5版, Garland Publishing, New York)。標的抗原は、一般に、複数の抗体上のＣＤＲにより認識されるエピトープとも呼ばれる多くの結合部位を有している。異なったエピトープに特異的に結合する各抗体は異なった構造を有している。よって、ある抗原は一を超える対応する抗体を有し得る。
【０００８】
基本的な４鎖抗体単位は、２つの同一の軽(Ｌ)鎖と２つの同一の重(Ｈ)鎖からなるヘテロ四量体糖タンパク質である(ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる付加的なポリペプチドを備えた５つの基本的ヘテロ四量体からなり、よって１０の抗原結合部位を含む一方、分泌ＩｇＡ抗体は重合して、Ｊ鎖と共に２−５の基本的４鎖単位を含む多価集合体を形成することができる)。ＩｇＧの場合、４鎖単位は一般的に約１５００００ダルトンである。各Ｌ鎖は一つの共有ジスルフィド結合によりＨ鎖に連結している一方、２つのＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じて一又は複数のジスルフィド結合により互いに連結されている。また各Ｈ及びＬ鎖は、規則的に離間した鎖内(intrachain)ジスルフィド架橋を有している。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン(ＶＨ)と、これに続くα及びγ鎖それぞれに対しては３つの定常ドメイン(ＣＨ)と、μ及びεアイソタイプに対しては４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン(ＶＬ)と、これに続く定常ドメイン(ＣＬ)をその他端に有する。ＶＬはＶＨに整列しており、ＣＬは重鎖の第１定常ドメイン(ＣＨ１)に整列している。特定のアミノ酸残基は軽鎖と重鎖の可変ドメインの界面を形成すると考えられている。ＶＨとＶＬは対になって単一の抗原結合部位を形成する。異なったクラスの抗体の構造及び特性について、例えば、Basic and Clinical Immunology, 8版, D. Stites, A. Terr及びT. Parslow編, Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, 71頁, 6章を参照のこと。
【０００９】
任意の脊椎動物種からのＬ鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ及びラムダと呼ばれる明確に区別される２つのタイプのタイプを割り当てることができる。それらの重鎖の定常ドメイン(ＣＨ)のアミノ酸配列に基づき、免疫グロブリンは、種々のクラス又はアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンには、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと命名された重鎖を有するＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つのクラスがある。γ及びαクラスはさらにＣＨ配列及び機能の比較的小さな差異に基づいてサブクラスに分割され、例えばヒトでは、次のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を発現する。
【００１０】
「可変」なる用語は、可変ドメインの所定のセグメントが抗体間で配列の点で広範囲に相違していることを意味する。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を定める。しかしながら、可変性は可変ドメインの約１１０アミノ酸スパンにわたって均一に分布しているのではない。むしろ、Ｖ領域は、それぞれ９−１２アミノ酸長である「高頻度可変領域」と呼ばれる極度の可変性のより短い領域により分離した１５−３０のアミノ酸のフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる相対的に不変の伸長部からなる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々、主としてβ-シート配置をとり、３つの高頻度可変領域によって連結され、β-シート構造を連結し、場合によってはその一部を形成することもある４つのＦＲを含む。各鎖の高頻度可変領域はＦＲによって極く近傍に一緒に保持され、他の鎖からの高頻度可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照)。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接は関係しないが、例えば抗体依存性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)への抗体の関与のような様々なエフェクター機能を示す。
【００１１】
ここで使用される場合、「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合性に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は、一般的に「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(例えば、ＶＬ中のおよそKabat残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)及びＶＨのおよそKabat残基３１−３５Ｂ(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)(上掲のKabatら)、及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(例えば、ＶＬのおよそChothia残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及びＶＨの２６−３２(Ｈ１)、５２Ａ−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３)(Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含む。
【００１２】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団からの抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個々の抗体が、一般的に少量で存在する変異体等の、モノクローナル抗体の生産中に生じうる可能な変異体を除いて、同一であり及び／又は同じエピトープ(類)に結合する。このようなモノクローナル抗体は、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を有する抗体を含み、ここで、標的結合ポリペプチド配列が、複数のポリペプチド配列からの単一標的結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスにより得られている。例えば選択プロセスは、複数のクローン、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールからの独特のクローンの選択とすることができる。選択された標的結合配列は、例えば標的に対する親和性を改善するため、標的結合配列をヒト化するため、細胞培養における生産性を改善するため、インビボでの免疫原性を低下させるため、多重特異的抗体を産生させるため等々のために、さらに改変することができ、また改変した標的結合配列を有する抗体もまた本発明のモノクローナル抗体であると理解されるべきである。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物と比べて、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、それらが他の免疫グロブリンによって典型的には汚染されていない点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産することを必要とすると解釈されてはならない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法(例えば、Kohlerら, Nature, 256, 495 (1975)；Harlowら, Antibodies：A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerlingら, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, 563-681,(Elsevier, N.Y., 1981))、組換えＤＮＡ法(例えば、米国特許第４８１６５６７号参照)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clacksonら, Nature, 352：624-628(1991)；Marksら, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)；Sidhuら, J. Mol. Biol. 338(2)：299-310(2004)；Leeら, J. Mol. Biol. 340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34)：12467-12472(2004)；及びLeeら, J. Immunol. Methods 284(1-2)：119-132(2004)、及びヒト免疫グロブリン座位又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有するヒト又はヒト様抗体を動物中で生成させるための技術(例えば、国際公開第１９９８／２４８９３号；国際公開第１９９６／３４０９６号；国際公開第１９９６／３３７３５号；国際公開第１９９１／１０７４１号；Jakobovitsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90：2551(1993)；Jakobovitsら, Nature, 362：255-258(1993)；Bruggemannら, Year in Immuno, 7：33(1993)；米国特許第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５５９１６６９号(全てGenPharm)；同第５５４５８０７号；国際公開第１９９７／１７８５２号；米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；及び同第５６６１０１６号；Marksら, Bio/Technology, 10：779-783(1992)；Lonbergら, Nature, 368：856-859(1994)；Morrison, Nature, 368：812-813(1994)；Fishwildら, Nature Biotechnology, 14：845-851(1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14：826(1996)；及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol., 13：65-93(1995)を参照)を含む様々な技術により作製されうる。
【００１３】
「キメラ」抗体(免疫グロブリン)は、特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である重鎖及び／又は軽鎖の一部、並びにそれが所望の生物活性を有する限りそれら抗体の断片を有する(米国特許第４８１６５６７号; Morrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。ここで使用されるヒト化抗体は、キメラ抗体のサブセットである。
【００１４】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体ある。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン(レシピエント又はアクセプター抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性、例えば結合親和性をさらに洗練するためになされる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、全てあるいはほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものであるが、ＦＲ領域は、結合親和性を改善する一又は複数のアミノ酸置換基を含んでいてよい。ＦＲにおけるこれらのアミノ酸置換基の数は、典型的には、Ｈ鎖で６を越えず、Ｌ鎖で３を越えない。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒトの免疫グロブリンのものを含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Reichmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。
【００１５】
「抗体断片」はインタクト抗体の一部、好ましくはインタクト抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体(米国特許第５６４１８７０号、実施態様２；Zapataら, Protein Eng.,8(10)：1057-1062(1995))；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異的抗体が含まれる。
【００１６】
抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と称される２つの同一の抗原結合断片と、その名称が容易に結晶化する能力を表す、残りの「Ｆｃ」断片が生産される。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン(ＶＨ)とＬ鎖全体、及び一つの重鎖の第１の定常ドメイン(ＣＨ１)とからなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に対して一価である、すなわち単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理により、抗原を架橋結合でき、二価の抗原結合活性を有するＦａｂ断片に連結した２つのジスルフィドにほぼ相当する、単一の大きなＦ(ａｂ')２が生じる。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されていることによりＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基(類)が遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００１７】
Ｆｃ断片は、ジスルフィドにより互いに保持された双方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を有する。抗体のエフェクター機能はＦｃ領域における配列により決定され、該領域はある種の細胞に見出されるＦｃレセプター(ＦｃＲ)により認識される部分でもある。
【００１８】
「Ｆｖ」は、完全な抗原-認識及び-結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合に対するアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を付与する６つの高頻度可変ループ(Ｈ及びＬ鎖からそれぞれ３つのループ)が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
【００１９】
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」と略記される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に連結するＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨとＶＬドメインの間にさらに含む。ｓＦｖの概説については、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと。
【００２０】
本発明の方法に使用される、例えば、組成物中の成分量、活性剤濃度、バッファー容量、ダイアボリューム(diavolumes)、孔径、見かけ分子量、分子量カットオフ値、プロセス温度、プロセス時間、収率、流量、圧力、バイオバーデン、及び類似値、並びにその範囲を修飾している「約」とは、例えば、濃縮液又は使用溶液の作製に使用される典型的な測定及び操作手順；これらの手順における不注意による誤差；製造法、供給源、組成物の製造又は方法の実施に使用される成分の純度の差、並びに同様の考慮事項を通して生じ得る数値における変動を意味する。また「約」なる用語は、特定の初期濃度を有する組成物又は混合物の熟成により相違する量をも包含する。さらに「約」なる用語は、特定の初期濃度を有する組成物又は混合物の混合又はプロセシングにより相違する量をも包含する。「約」なる用語により修飾されていてもいなくとも、特許請求の範囲には、その量に対する均等物が含まれる。
【００２１】
「本質的になる」とは、特許請求の範囲に列挙された工程及び成分に加えて、組成物の基本的及び新規の特性に実質的に影響を与えない他の工程及び要因、例えば多様な工程又はバッファー媒質を含む、濃縮されたタンパク質組成物又は抗体組成物を得る方法を意味する。本明細書の組成物及び方法の基本的な特性に実質的に影響を与える成分は、例えば、バイオバーデン、例えば汚染物質に伴う所望しない毒性又は刺激性を含む、所望しない特徴をもたらす。
【００２２】
ここで使用される場合、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」、及びその対応する定冠詞「ｔｈｅ」は、特に示さない限りは、少なくとも一つ、もしくは一又は複数であることを意味すると理解される。
【００２３】
本明細書は、実施態様において、上述の方法とその濃縮された抗体生成物を提供する。
本明細書の実施態様では、調製方法及びその生成物は、高度に濃縮された抗体調製物及び類似の調製物を調製する際に、例えば天然又は合成源からタンパク質もしくは類似した物質を精製し濃縮する際に使用可能であり、その生成物は、病理的状態、例えば喘息、癌、乾癬の治療、血管形成阻害及び類似の病理的状態を治療するのに有用でありうる。
【００２４】
本明細書の高度に濃縮された抗体組成物を調製するための上述の方法の実施態様では、本明細書の調製プロセス及び生成物を如何にして作製し、使用するかが、以下、さらに例証されている。
本明細書の実施態様では、例えば記載順に次の工程を達成することによって、高度に濃縮された抗体組成物を調製するための方法が提供される：
例えば、リットル当たり約０．１〜約１０グラム(ｇ／Ｌ)の濃度を有する第一抗体調製物に第一限外濾過を施して、例えばリットル当たり約１０〜約５０グラムのより大きな抗体濃度を有する第二抗体調製物を保持液として提供し；
得られた第二抗体調製物にダイアフィルトレーションを施して、得られた第二抗体調製物保持液とほぼ同濃度を有する、ダイアフィルトレーションされた、すなわち一定容量でバッファー交換を遂行するためにダイアフィルトレーションされた中間抗体調製物を保持液として提供し；
ダイアフィルトレーションされた中間抗体調製物に第二限外濾過を施して、例えばリットル当たり約１５０〜２００グラムのより大きな抗体濃度を有する第三抗体調製物を保持液として提供する。
本明細書の製造方法は、例えばここに開示し例証するように、任意工程の生成物回収工程又は工程群をさらに含むことができる。
【００２５】
本明細書の上述した方法の実施態様では、一又は複数の第一限外濾過、ダイアフィルトレーション、及び第二限外濾過は、例えば約３０℃〜約７０℃で達成することができる。実施態様では、これらの工程は約３０℃〜約５０℃でも達成することができる。実施態様では、これらの工程は、例えば約３５℃〜約５０℃でも達成することができる。実施態様では、これらの工程は、例えば約４５℃、例えば約４５℃プラス又はマイナス５℃で達成することもできる。抗体調製物の種類に応じて、約７０℃を超える温度で達成される方法では、劣化の兆候、例えば変性、凝集、及び類似の現象が、調製物に表れることもある。約３０〜約３５℃以下の温度で達成される方法では、典型的には所望しない程に流量が低下し、プロセス時間は所望しない程長くなり、低温でのプロセスを、効率的な商業的生産ではあまり魅力のないものにする。
【００２６】
実施態様において、第一抗体調製物は、例えばリットル当たり約０．１〜約１００グラム(ｇ／Ｌ)の抗体濃度を有する。抗体濃度は、例えば遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、及び類似手順のような、タンパク質又は抗体の他の精製工程又は方法で典型的には利用可能な一般的な濃度である。第一限外濾過により得られうる第二抗体調製物は、例えばリットル当たり約１０〜約５０グラム、例えばリットル当たり約２０〜約４０グラム、例えばリットル当たり３０グラムの抗体濃度を有することができる。中間抗体調製物の抗体濃度の範囲は、例えばファクターのバランス、例えば第二抗体調製物を含む特定のバッファーで達成可能なサンプル容量及びサンプル流束に依存する可能性がある。中間抗体調製物は、例えばリットル当たり約２５〜約３５グラムの抗体濃度を有することができるし、第三抗体調製物は、例えばリットル当たり約１７０〜約２００グラムの抗体濃度を有することができる。第三抗体調製物は、実施態様では、例えばリットル当たり約５０〜約２５０グラム、例えばリットル当たり約１００〜約２３０グラム、リットル当たり約１７０〜約２００グラム、例えばリットル当たり１８５グラムの抗体濃度を有することができる。
【００２７】
本明細書の理解の際に、当業者にとって、中間抗体調製物及び第三抗体調製物が、例えば、第一及び第二限外濾過濃縮から得られる抗体濃度の差異、及びダイアフィルトレーションバッファー交換から得られる懸濁バッファー媒質の差異を除き、同じ限外濾過保持液を含有していることは明らかであろう。よって、本明細書の実施態様では、標的タンパク質又は抗体生成物に分解等の組成変化があったとしても、それはほんの少しである。
【００２８】
一般的な限外濾過濃縮法は、一般には多くの時間を要し、非常に長いプロセス時間、例えば数日から数週間かかるといったスループット効率が低く、非常に少量しか処理できず、又はその双方である。
実施態様において、本明細書のタンパク質濃縮方法は、例えば約１〜１０時間、好ましくは約２〜５時間、より好ましくは約３時間で達成可能である。好ましくは流束スループットは高く、膜面積は小さい。
【００２９】
実施態様では、第一限外濾過は、例えば全プロセス時間の約３５％で達成可能である。よって、例えば全プロセス時間が約３時間である本明細書の濃縮及び精製方法では、第一限外濾過は約４５分で達成可能である。実施態様では、第二限外濾過は、例えば全プロセス時間の約１５％で達成可能である。よって、例えば全プロセス時間が約３時間である本明細書の方法では、第二限外濾過は約１５分で達成可能である。ダイアフィルトレーションは、例えば全プロセス時間の約５０％で達成可能である。よって、例えば全プロセス時間が約３時間である本明細書の方法では、ダイアフィルトレーションは約９０〜約１２０分で達成可能である。
【００３０】
実施態様では、第一限外濾過と第二限外濾過は、例えば約５〜約５０キロダルトンの分子量カットオフ値、又は公称孔径を有する限外濾過膜を用いて達成することができる。他の適切な公称孔径は、例えば約１０〜約４０キロダルトンである。さらに他の適切な孔径又は分子量カットオフ値は約３０キロダルトンである。
【００３１】
実施態様では、第一抗体調製物は、例えば約１００〜約２００キロダルトンの見かけ分子量を有する抗体を含むことができる。他の実施態様では、第一抗体調製物は、例えば抗体調製物が抗ＩｇＥ抗体又はＩｇＥを含有している場合、例えば約１５０キロダルトンの見かけ分子量を有する抗体を含有可能であり、例えばジェネンテック社が譲受人の米国特許第６１７２２１３号を参照のこと。
【００３２】
本明細書での使用に適した他の抗体には癌治療抗体が含まれ、一般的には、例えばＰＣＴ／ＵＳ０２／１９５９２号；ＰＣＴ／ＵＳ０１／２０１１８号；ＰＣＴ／ＵＳ０１／２５４６４号；ＰＣＴ／ＵＳ０１／２６６２６号；ＰＣＴ／ＵＳ０２／２８８５９号；ＰＣＴ／ＵＳ０２／４１７９８号；ＰＣＴ／ＵＳ０２／１２２０６号；ＰＣＴ／ＵＳ０３／１１１４８号；ＰＣＴ／ＵＳ０２／１２６１９号；及びＰＣＴ／ＵＳ０２／３３０５０号を参照のこと。本明細書での使用に適したさらなる他の抗体には、ヒト、非ヒト、マウス、ハイブリッド、及びキメラ形態を含む、抗ＣＤ２０抗体等の抗体が含まれる。例えば、米国特許第６５８２９５９号(ＶＥＧＦ)、及び米国特許出願第２００２／０１２２７９７号Ａ１(ヒトＶＥＧＦ)を参照のこと。
【００３３】
実施態様では、本明細書の範囲に含まれる抗体には、由来となる種又は免疫グロブリンのクラスもしくはサブクラスの指定にかかわらず、ハイブリッド及び組換え抗体(例えば、「ヒト化」及び「ヒト」抗体)、並びに抗体断片(例えば、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ)が含まれる。米国特許第４８１６５６７号；Mage及びLamoyi, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 79-97, Marcel Dekker, Inc., New York(1987)が参照される。
【００３４】
また「モノクローナル抗体」を使用してもよく、該モノクローナル抗体は、例えば、Clacksonら(1991), Nature, 352：624-628及びMarksら(1991), J. Mol. Biol. 222: 581-597に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することができる。モノクローナル抗体は、その重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、残りの鎖が、他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同のものである「キメラ」抗体、並びに所望の生物学的活性を表す限り、このような抗体の断片を含む(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrisonら(1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855)。キメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば、旧世界サル、類人猿等)由来の可変ドメイン抗原-結合配列とヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含むことができる。
【００３５】
モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は他の抗体により汚染されることなく合成されるという利点がある。よって「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得られているという抗体の特徴を示す、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在し得る自然に生じる可能な突然変異を除いて同一であり、抗体を何か特定の方法により産生することを必要とすると考えてはいけない。例えば、本明細書で使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler及びMilstein, Nature, 256:495(1975)に記載されたハイブリドーマ法を使用して作製することができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作製することができる。抗体産生のための他の既知の方法は、例えばGoding, Monoclonal Antibodies：Principles及びPractice, 59-103, Academic Press(1986)；Kozbor, J. Immunol., 133：3001(1984)に記載されている。Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63, Marcel Dekker, Inc, New York(1987)。
【００３６】
モノクローナル抗体(ＭＡｂｓ)を産生するために、種々の方法が使用されている。単一タイプの抗体を産生させるクローン化細胞株について言及するハイブリドーマ技術は、マウス(ネズミ科動物)、ハムスター、ラット及びヒトを含む、様々な種の細胞を使用する。ＭＡｂｓを調製するための他の方法では、組換えＤＮＡ技術を含む遺伝子工学を使用する。これらの技術から作製されるモノクローナル抗体には、とりわけ、キメラ抗体及びヒト化抗体が含まれる。キメラ抗体は、一タイプを超える種からのＤＮＡコード領域を組合せたものである。例えば、キメラ抗体は、マウスの可変領域とヒトの定常領域に由来するものでありうる。ヒト化抗体は、非ヒト部分を含んでいても、大部分はヒトから生じる。キメラ抗体と同様、ヒト化抗体は完全なヒト定常領域を含んでいてもよい。しかし、キメラ抗体とは異なり、可変領域は部分的にヒトに由来するものであってよい。多くの場合、ヒト化抗体の非ヒトの合成部分はマウス抗体のＣＤＲから生じる。いずれにしろ、これらの領域は、抗体が特定の抗原を認識して結合できるようにするために重要である。
【００３７】
示したように、マウス抗体は、抗体技術において重要な役割を担っている。マウス抗体は診断及び短時間での治療に有用であるが、有害な免疫原性応答の危険性を増加させることなく、長期間にわたって人々に投与することはできない。ヒト抗マウス抗体(ＨＡＭＡ)と呼ばれるこの応答は、ヒト免疫系が異物としてマウス抗体を認識し、それを攻撃した場合に生じる。ＨＡＭＡ応答は毒素ショック、さらには死の原因にさえなり得る。キメラ及びヒト化抗体は、投与される抗体の非ヒト部分を最小にすることにより、ＨＡＭＡ応答の可能性を低減させる。さらに、キメラ及びヒト化抗体は、抗体依存性細胞傷害等の二次的なヒト免疫応答を活性化させるというさらなる有益性を有する。
【００３８】
「インタクト」抗体は、抗原-結合可変領域、並びに軽鎖定常ドメイン(ＣＬ)及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)又はそのアミノ酸配列変異体であってよい。インタクト抗体は、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異Ｆｃ領域)に起因するそれらの生物活性を意味する一又は複数の「エフェクター機能」を有しうる。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ＡＤＣＣ)；ファゴサイトーシス；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ)のダウンレギュレーション等が含まれる。
【００３９】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、インタクト抗体には種々の「クラス」が割り当てられる。インタクト抗体には５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２等の「サブクラス」(アイソタイプ)にさらに分割される。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置はよく知られている。
【００４０】
実施態様では、第一限外濾過により第一抗体調製物が濃縮され、リットル当たり約３０グラムの抗体濃度を有する第二抗体調製物が提供され、第二限外濾過により中間抗体調製物(ダイアフィルトレーションにより得られる)が濃縮され、例えばリットル当たり約１７０〜約２００グラムの抗体濃度を有する第三抗体調製物が提供される。第一限外濾過と第二限外濾過は、同じ限外濾過膜を用いて達成することができ、所望されるならば、操作性、損失、漏出、及び収率、効率性及び経済性に対する類似の影響を最小にするために、同じ容器又はプロセス循環系内で達成することができる。第一限外濾過と第二限外濾過は、任意の適切な限外濾過装置又は限外濾過膜を用いて達成することができる。限外濾過及びダイアフィルトレーションを達成するためにタンジェンシャルフロー濾過(ＴＦＦ)操作が可能な多くの適切な限外濾過装置及び限外濾過膜が、例えばMillipore, Pall Corp, Sartorius等の供給元から市販されている。実施態様では、適切な限外濾過膜は、例えば任意の再生セルロース複合体であってよく、該合成物は、ポリエーテルスルホン等の、他の入手可能な限外濾過膜と比較して、比較的低いタンパク質吸着特性を有する。
【００４１】
ダイアフィルトレーション操作は、第一及び第二抗体調製物に存在している第一バッファー組成物を、第三抗体調製物に所望される第二バッファーに交換するものである。実施態様では、第一バッファーは、例えば水性塩化ナトリウムとＴＲＩＳバッファーとの混合物を含有可能であり、第二バッファーは、例えば水性塩化ヒスチジンと塩化アルギニンの混合物を含有可能である。ダイアフィルトレーションは、一定容量、一定濃度又は双方でのバッファー交換を達成することができる。実施態様では、ダイアフィルトレーションは、一定容量と一定濃度でのバッファー交換を達成する。ダイアフィルトレーションは、例えば約５〜約１５倍容量(すなわちダイアボリューム)のバッファー交換を達成することができる。またダイアフィルトレーションは、例えば約８倍容量(８ダイアボリューム)、すなわち交換される抗体調製物を含有するサンプルの８倍容量のバッファー交換を達成することができる。例えば、１０リットルの抗体調製物は、５倍(ダイアボリューム)、すなわち５０リットル容量の交換用バッファーとダイアフィルトレーションすることができる。交換容量及び交換容量のための優先因子は、ファクターのバランス、例えばプロセスのスループット効率、生成物の純度、政府及び顧客-患者の容認基準及び類似の基準を考慮し、例えば、第一抗体調製物におけるバッファー(例えば第一バッファー)の濃度及び種類、及び同様の考慮事項に依存しうる。
【００４２】
第一限外濾過、第二限外濾過、及びダイアフィルトレーションは、好ましくは限外濾過膜を通過するタンジェンシャルフロー濾過(ＴＦＦ方式)で達成され、該限外濾過膜は、好ましくは各工程に対して同じ膜である。最終プール(すなわち第三抗体調製物)中の生成物の収率は、第一抗体調製物中の抗体の重量に基づき、例えば約７０重量％以上、例えば約８０〜約１００重量％とすることができる。第三抗体調製物の収率は、第一抗体調製物中の抗体重量に基づき、実施態様では約９０重量％以上、実施態様では約９５重量％以上、さらなる実施態様では約９８重量％以上とすることができる。
【００４３】
第一限外濾過は、例えば約５０〜１０００ｍＬ／分、好ましくは約１００〜１０００ｍＬ／分の再循環速度を有しうる。再循環速度は、利用可能な膜面積に従って測定することができ、例えば５、２０、２００、１０００平方フィートの膜面積及び同様の面積はさらなる高速の再循環速度を可能にする。よって、実施態様では、適切に測定される再循環速度は、例えば約０．５Ｌ／分／ｆｔ２〜約５Ｌ／分／ｆｔ２とすることができる。限外濾過及びダイアフィルトレーションは、例えば約５〜約５０ｐ.ｓ.ｉの膜間圧で達成することができる。限外濾過及びダイアフィルトレーションは、例えば約１０〜約５０ｐ.ｓ.ｉの膜間圧で達成することができる。本明細書の実施態様では、より希釈された抗体製剤のための抗体濃縮液を調製する方法が提供され、該抗体濃縮液は、例えば約１００ＣＦＵ／ｍＬ未満といった、検出限界以下の最小のバイオバーデンを有する。
【００４４】
本明細書の抗体組成物は、例えば約１００ｇ／Ｌ(ｍｇ／ｍＬ)以上、例えば約１２０〜約１７０ｇ／Ｌの濃度でヒトに投与される濃縮モノクローナル抗体調製物でありうる。
【００４５】
本明細書の抗体組成物は、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの群；そのサブクラスの免疫グロブリン；その組換え体；その断片；及び上述した任意のものの混合物であってよい。本明細書の好ましい抗体組成物は、組換えヒト化抗ＩｇＥ抗体を含む。本明細書の抗体組成物はバッファーを含みうる。好ましいバッファーは、例えば水性塩化ヒスチジン及び塩化アルギニンの混合物でありうる。
【００４６】
本明細書の調製方法は、図１に示すように、好ましくは、同じ装置において、オペレータ介入なしに又は最小のオペレータ介入をもって、達成される。
【００４７】
第一抗体調製物は、種々の化学的、物理的、機械的又は非機械的、又は生化学的方法、例えば粉砕、超音波処理、ホモジナイズ、酵素消化、溶媒抽出、遠心分離、クロマトグラフィー、及び類似方法、及びそれらの組合せを使用して提供又は調製することができ、例えば上述したR.Hatti-Kaulら,「Downstream Processing in Biotechnology」, Basic Biotechnology, Chap. 9を参照のこと。第三抗体調製物は、所望されるならば、例えばナノ濾過(例えば二価イオンの除去)、逆浸透(例えば一価イオンの除去)、及び類似の液体精製法を使用するさらなるプロセスにかけることができる。本明細書の第三抗体調製物は、包装し、保存し、又は直接使用することができる。第三抗体調製物は、所望されるならば、例えばさらなる濃縮工程、例えば乾燥、凍結乾燥、凍結乾燥-再構成、及び類似方法を使用してさらにプロセシングすることができる。得られた濃縮第三抗体生成物は、所望されるならば、適切な液体を用いて、後の時点で再構成することもできる。
【００４８】
図面において、図１は、本明細書の実施態様において、主要の供給及び保持容器となる再循環タンク(１２０)に連通する、ＵＦ-ＤＦ膜(１１５)を備えたＴＦＦ限外濾過-ダイアフィルトレーション(ＵＦ-ＤＦ)装置(１１０)を有する限外濾過-ダイアフィルトレーションシステム(１００)を含む、調製方法を達成するための装置を例示する。実施態様では、タンク(１２０)は、例えば水、グリコール、又はそれらの混合物等の適切な熱伝達流体、再循環用ポンプ等の流量調節器(１２７)、ヒーター(図示せず)を含む循環加熱液体システム又はレオスタット抵抗ヒーター部材等のサーモスタット又は温度制御加熱部材(１２６)、保温ジャケット(１２５)を具備する温度制御システムを有しうる。全ての循環系内構成部材又は循環系内フロー又はプロセスに寄与する構成部材、例えば配管、バルブ、ポンプ、タンク、及び類似の構成部材は、場合によっては断熱されていてもよいし、又は場合によっては温度仕様に対して密な制御を維持し、フィルターチャンバー(１１０)と再循環タンク(１２０)内及びそれらの間の再循環流体循環系における温度逸脱を回避するため、外部加熱に適合されていてもよい。実施態様では、システム(１００)が、例えばバッチ供給方式(fed-batch mode)で第一限外濾過(ultrafiltration)又は第一限外濾過化(ultrafiltering)を遂行している場合、システムは、再循環用供給タンク(１２０)と流体流通可能に連通し、例えば再循環タンク(１２０)からの消費された液相の補足、補充、不足分の埋め合わせに使用される任意的な供給タンク(１２８)を具備せしめてもよい。
【００４９】
ポンプ(１３０)は、タンク(１２０)からの供給液をＵＦ／ＤＦ装置(１１０)を通して送り出し、その後、得られた保持液(供給液の濾過されていないか又は膜排除部分)を再循環タンク(１２０)まで再循環させる。第２タンク(１４０)はバッファーを保持し、場合によっては、一定容量のダイアフィルトレーション中、主循環系(１１０-１２０ループ)中に移送する(図示しない)。例えば、主循環系に投入されるバッファーの添加速度及び容量は、好ましくは、濾液が膜(１１５)を通って主循環系から逸脱するのと同じ速度及び容量である。バッファータンク(１４０)は、場合によってはジャケット(１４３)で断熱することもでき、上述した加熱部材及び再循環ポンプ(図示せず)の均等物を具備せしめることもできる。任意的な不活性ガス源(１４５)、例えば窒素又は他の圧縮ガス源を、例えば生成物回収、保持液戻りの加圧、酸素脱気、フラッシング、洗浄、膜の完全性の試験、及び類似操作のために使用することができる。第３タンク(１６０)は、装置(１１０)から出た濾液を収集し、回収するために使用される。バルブ(１５０、１７０)は、必要に応じて、システムにおける方向及び場合によっては液体の流量を調節するために使用することができる。全てのバルブとポンプは、手動、協調コンピュータ制御、又はその双方により作動させることができる。任意的な第４のタンク(１９０)と出口流れは、例えば任意的なモニター装置(１８０)、例えば光学密度計、任意的なフィルター(群)(１８５)、例えば保護フィルター、製品用フィルター(product filter)、及び類似の任意的なサブシステムを具備する場合に、補助廃棄フラッシュ、生成物回収、又はモニターシステムを提供することができる。実施態様では、主流体循環系(１１０-１２０ループ)には、場合によってはインラインモニターシステムを具備させることができる。
【００５０】
本明細書の方法により調製された濃縮抗体調製物は、筋肉内(ＩＭＩＧ)又は静脈内(ＩＶＩＧ)の何れかの投与のための免疫グロブリン製品を含む、ヒトの治療のための投与に使用することができる。本明細書の濃縮抗体調製物は、安定剤、例えば緩衝アミノ酸塩溶液、単糖類、又は類似の安定剤、適切なイオンキレート剤、例えばＥＤＴＡ又はクエン酸イオン、及びそれらの組合せを含有せしめることが可能で、例えば、Wang, Y.-C.J.ら,「Parenteral formulations of proteins and peptides：stability and stabilizers」,J. Parenteral Sci. Technol., 42, Suppl. S3-S26(1988)を参照のこと。特開平０１−２６８６４６号公報(AN89-359879)のダーウェント要約には、出願が、０．１マイクログラム／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度を有するＩｇＧ３モノクローナル抗体の注射用調製物について記載していることが報告されている。これらの公報に開示されている主題事項は、本明細書の範囲外であると考える。
【００５１】
本明細書の調製物は、凝集体を実質的に含有しないものでありうる。凝集した汚染物質の許容可能レベルは、例えば約５重量％未満、理想的には２重量％未満である。０．２重量％程の低いレベルを達成することもできるが、典型的には、凝集した汚染物質は約１重量％である。また実施態様では、調製物は、例えばグリシン及び／又はマルトース等の、ポリクローナル製剤を安定化させるために伝統的に使用されている賦形剤を、好ましくは含有せしめないこともできる。
【００５２】
本明細書では、調製物中の抗体が組換え抗体であり、１００ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは１５０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度とできることを特徴とする、ヒトに投与されるモノクローナル抗体調製物を提供できる。本調製物は、好ましくは任意のタンパク質凝集体を実質的に含有しない。
【００５３】
本明細書の医薬製剤のｐＨは、特定の投与経路に依存している。しかしながら、濃縮溶液中の抗体濃度を最大にするために、溶液のｐＨは、抗体の等電点(ｐＩ)のｐＨとは異なるようにすべきである。
【００５４】
本明細書の実施態様では、モノクローナル調製物はヒト治療に使用されると想定することができる。種々のヒトの疾患、例えば癌又は感染症、例えば上述したもの、免疫機能障害、例えばＴ細胞媒介性疾患、特に重度の脈管炎、関節リウマチ、全身性ループス(systemic lupus)、また自己免疫疾患、例えば多発性硬化症、移植片対宿主病、乾癬、若年発症糖尿病、シェーグレン病、甲状腺疾患、重症筋無力症、移植片拒絶反応、炎症性大腸炎、喘息、ＩｇＥ媒介性疾患、及び類似の疾患又は病状、又はそれらの合併症を処置することができる。
【００５５】
よって、本明細書は、実施態様において、上述した疾患及び類似の疾患の任意のものを治療するための医薬の製造における、ここに記載した濃縮モノクローナル抗体調製物の使用を提供する。また、本明細書の調製物の治療的有効量を個体に投与することを含む、任意のそのような疾患を患っているヒトの治療方法が提供される。このような抗体調製物の用量は、処置される病状や処置受容者により変わるが、例えば、成人患者では約５０〜２０００ｍｇ、好ましくは約１００〜約１０００ｍｇの範囲で、１〜３０日の期間、毎日又は毎週投与することができ、必要に応じて繰り返すこともできる。投薬は、単一又は複数回で投与されうる。
【００５６】
方法の記載
製剤工程により、典型的には、例えばイオン交換クロマトグラフィーから生じる精製されたバルク薬剤物質が、最終的な賦形剤組成物及び濃度に交換される。小分子除去を除き、典型的には、この工程では達成される精製はない。重要なのは、高収率、バッファー交換、及び製剤工程の堅牢性（ロバスト性）であった。ＴＦＦ(タンジェンシャルフロー濾過)を介した製剤中、タンパク質含有供給液を、膜システムを通して移送し、リサイクル(再循環)容器まで戻した。ＴＦＦ膜はタンパク質(保持液の一部)を保持する一方、濾液(又は透過液)は、圧力により膜を通って流通した。圧力は膜間圧(ＴＭＰ)と呼ばれ、典型的には保持液圧制御バルブを使用して制御される。本方法は、通常、一連の第一限外濾過(濃縮)、ダイアフィルトレーション(一定容量のバッファー交換)、及び第二限外濾過(さらなる濃縮)により達成された。プロセスのバッファー成分の除去に必要なダイアボリューム(容積等価量)の数は、容易に算出するか又は実験的に決定することができる。
【００５７】
抗ＩｇＥに対する一般的なＵＦ／ＤＦプロセス
クロマトグラフィーからのアニオン交換プールのｐＨを、０．５Ｍのリン酸水溶液を使用して約６のｐＨに調節した。ｐＨ調節したアニオン交換プールを、１００００−３００００ダルトンの公称分子カットオフ値を有する膜を使用し、本明細書の限外濾過／ダイアフィルトレーション(ＵＦ／ＤＦ)プロセスにより製剤化した。プロセシング前に、ＵＦ膜をダイアフィルトレーション用バッファー(０．０２Ｍのヒスチジン、０．２Ｍのアルギニン-ＨＣｌ、ｐＨ６)で平衡にした。
【００５８】
ついで、アニオン交換からの生成物(アニオン交換プール)をシステムに添加し、第一限外濾過により中間濃縮液に濃縮した。ついで、プールをその製剤(０．２Ｍのヒスチジン、０．２Ｍのアルギニン-ＨＣｌ、ｐＨ６)にダイアフィルトレーション(８ｘ又はダイアボリューム)した。ついで、プールを、最終バルク濃度＞１７０ｇ／Ｌまで第二限外濾過により濃縮し、０．２２マイクロメーターの滅菌フィルターを通して回収した。ＵＦ／ＤＦプロセス全体を約４５℃の温度設定点で実施した。この温度制御は、入ってくるアニオン交換プール、ダイアフィルトレーション用バッファーの温度制御を使用し、またここで例証したＵＦ／ＤＦプロセス用のジャケット装備再循環容器を使用することにより達成した。
【００５９】
ＵＦ／ＤＦ後、回収したプールを、０．０２Ｍのヒスチジン、０．２Ｍのアルギニン-ＨＣｌ、０．０４％のポリソルベート-２０、ｐＨ６(最終製剤)に約１５０ｇ／Ｌのバルク濃度まで希釈した(調整した)。調整工程中、バルクの温度を周囲温度まで戻した。調整後、調製されたバルクを、０．２２マイクロメーターの滅菌フィルターを通して再度回収した。
【００６０】
ＵＦ／ＤＦシステムは、０．１Ｎの水酸化ナトリウムを用いて再生し、１．４％のMinncare(登録商標)で消毒することができる。使用しない場合、システムは０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に保存することができる。ＵＦ／ＤＦ膜は、キャンペーンの間、例えば０．１％のRoccal(登録商標)／２０％のグリセロール-水溶液に保存することができる。
【００６１】
一般的な限外濾過／ダイアフィルトレーションプロセス手順
操作パラメータ：供給液の流速、０．５Ｌ／分／ｆｔ２。一定の保持液圧(例えば、約１０ｐｓｉｇ)の制御を、洗浄及び使用前の平衡化のために使用したが、Ｃｗａｌｌ、一定の保持液圧又は一定のＴＭＰをプロセシングに使用した。
使用前平衡化：膜が適切に平衡化していることを確実にするために、使用前に、次の調製を、清浄にされたPellicon-２カセット膜について行った。
0005426641.tif 000002
【００６２】
プロセス使用：次の工程を、例えばQ-Sepharoseクロマトグラフィー工程等の、先の分離工程から得られた最初のアニオン交換プール(Ｑ-プール)に対して実施した：
約５ｇ／Ｌの濃度から、ダイアフィルトレーションのための濃度(ＣＤＦ)まで、第一限外濾過をする又は第一限外濾過化(ＵＦ１)；
ＤＦ用バッファーの４(４)のダイアフィルトレーションボリューム(ＤＶ)を用いたダイアフィルトレーション又はダイアフィルトレーション化(ＤＦ１)；
ＤＦ用バッファーの４(４)ダイアフィルトレーションボリューム(ＤＶ)を用いた連続したダイアフィルトレーション(ＵＦ２)；
最終濃度(ＣＦｉｎａｌ)まで第二限外濾過をする又は第二限外濾過化(ＵＦ２)；及び
任意的な生成物回収。
【００６３】
前述の工程を、典型的には、例えば１５分、低ｄＰリサイクル(mix)にて達成した。
使用後の掃除：次表に記載の順と条件を、使用直後のPellicon-2カセット膜の掃除に使用した。
0005426641.tif 000003
【００６４】
ＴＦＦにおける操作方式の定義：
濾液開放の単一パス(ＳＰＦＯ)。保持液と濾液をドレインに導く。濾液用バルブを開放する。
濾液開放の全リサイクル(ＴＲＦＯ)。保持液と濾液をリサイクル容器に導く。濾液用バルブを開放する。
バッチ供給限外濾過(ＦＢ-ＵＦ)。保持液をリサイクルタンクに導き、濾液をドレインに導き、入ってくるプールをリサイクルタンクに移す。
バッチ限外濾過(Ｂ-ＵＦ)。保持液をリサイクルタンクに導き、濾液をドレインに導く。
ダイアフィルトレーション(ＤＦ)。保持液をリサイクルタンクに導き、濾液をドレインに導き、ダイアフィルトレーション用バッファーをリサイクルタンクに移す。
ｄＰは差圧を意味する。
生成物移送。限外濾過膜装置とリサイクルタンクを、プールタンクに開放する。窒素オーバーレイ圧を制御する。まずリサイクルポンプを使用し、次にマニュアルの蠕動ポンプを使用し、プールを移す。
供給液移送。入ってくるプールはリサイクルタンクにポンプ移送する。
濾液閉止の全リサイクル(ＴＲＦＣ)。保持液をリサイクル容器に導く。濾液バルブを閉止する。
「Ｑ-プール」とは、「調整プール」とも称され、例えばバッファーで調整された上述のQ-Sepharoseクロマトグラフィー工程から得られたタンパク質プールを意味する。
ＷＦＩは注射用の水を意味する。
【実施例】
【００６５】
次の実施例は、上述した開示を使用する方法をさらに詳細に記載し、本明細書の種々の側面を実施するのに考慮される最良の形態を説明するためのものである。これらの実施例は、この開示の真の範囲を限定するものでは決してなく、むしろ例証目的のために提供されると理解される。
【００６６】
実施例１
ｒｈｕＭＡｂ Ｅ２５の高濃度製剤化
パイロット規模のＵＦシステムを使用して、ｒｈｕＭＡｂ Ｅ２５(ＩｇＥを標的とする組換えヒトモノクローナル抗体、米国特許第６１７２２１３号)を濃縮／製剤した。Millipore Pelicon限外濾過／ダイアフィルトレーションシステムを、５．７平方フィート、１００００ダルトンの再生セルロース複合膜を用いて構築した。システムは、膜ホルダー、Waukeskaw Model 6 ロータリーローブ供給ポンプ、1/2"の３１６Ｌステンレス鋼製再循環配管、及び再循環容器からなる。圧力表示器／トタンスミッター(Anderson)を、膜ホルダーの入口(供給液)、出口(保持液)及び透過部(濾液)に配した。流量メーター(Yokogawa ADMAG)を膜ホルダーの入口(供給液)と透過部(濾液)に配した。背圧調節バルブ(Mikroseal)を膜ホルダーの出口に位置せしめ、保持液圧を制御し、膜間圧(ＴＭＰ)を達成した。４０リットルの３１６Ｌステンレス鋼製のジャケット装備タンクを再循環タンクに使用した。このタンクにレベル表示器、頂部搭載攪拌機(Lightnin)、ボルテックスブレーカー、及び底弁(NovAseptic)を取り付けた。温度制御は、タンクのジャケットに供給する温度調節されたグリセロールの使用で達成した。
【００６７】
この運転中の供給液の流量は、一定流量２．８５Ｌ／分(０．５Ｌ／分／ｆｔ２)に設定した。全ての使用前及び使用後の操作中、保持液圧の制御は、１０ｐｓｉｇの定数に設定した。限外濾過及びダイアフィルトレーション操作中、システムではＣｗａｌｌ制御スキームを使用して、膜を通過する流束を制御した。例えばR. van Reisら, Constant Cwall Ultrafiltration Process Control, J. of Membrane Science, 130(1997), 123-140を参照のこと。
【００６８】
プロセス開始前に、システム保存溶液(０．１ＮのＮａＯＨ)を、まず２Ｌ／ｆｔ２の精製水(ＰＷ)と共に、ついで１Ｌ／ｆｔ２のダイアフィルトレーション用バッファー(５０ｍＭのヒスチジン／ｐＨ６．０)と共に、単一のドレインへのパスモードで流した。フラッシング後、０．５Ｌ／ｆｔ２のダイアフィルトレーション用バッファーを１０分間、再循環させることにより、システムを平衡にした。再循環溶液のｐＨを調べて、平衡を確認した。ついで、タンク中のレベルを測定可能な最小値まで低下させ、入ってくるタンパク質プールの希釈度を最低にした。上述したQ-Sepharoseクロマトグラフィー工程により得られたタンパク質プールは、３．２ｇＥ２５／Ｌであることが測定され、４３．１Ｌ容量を有していた。タンパク質は、２５ｍＭのＴＲＩＳバッファーと約２００ｍＭのＮａＣｌの溶液中に存在し、ｐＨを６．２に調節した。運転を開始するため、タンパク質プールを再循環容器に移した。容器中において、頂部搭載のインペラでプールを攪拌し、温度を周囲温度(２０−２５℃)に維持した。
【００６９】
プロセス実施中、プールはＵＦ１方式で５０ｇＥ２５／Ｌ(約２．８Ｌ)まで濃縮された。ダイアフィルトレーションの開始時において、再循環容器の温度設定点は４０℃まで上昇した。温度の上昇及び制御は、タンクの外側ジャケットに温グリコールを流通させることにより影響を受けた。ついで、プールを８ダイアボリュームのダイアフィルトレーション用バッファーを用いてダイアフィルトレーションした。システムから出て行く濾液の流量に、再循環タンクに移ってくるバッファー溶液の流量を一致させることにより達成される一定容量で、ダイアフィルトレーションを実施した。ダイアフィルトレーション終了時、プールをＵＦ２モードでさらに濃縮した。この段階はまた４０℃の高温設定点を使用して実施した。この最終濃度の目標は１１０ｇ／Ｌであった。これは、供給流量を低下させる必要なく達成された。次に、供給ポンプを制御して、供給流路にわたって５-１０ｐｓｉｇの圧損を維持する低圧損混合を実施した。サンプルを再循環タンクから取り出し、約１２０ｇ／Ｌの最終バルク濃度が測定された。表１に、ＵＦ１、ＤＦ(ＤＦ１＋ＤＦ２)及びＵＦ２のスループット及び流束の結果を纏める。
0005426641.tif 000004
【００７０】
図２は、ＵＦ１(１０)、ＤＦ(２０)、ＵＦ２(３０)を含むプロセスの種々の段階又は方式中における、供給液の流量(２１０)、タンク温度(２２０)、供給ｄＰ(２３０)、ＴＭＰ(２４０)、及び濾液の流量(２５０)パラメータに対する経時的に観測又は測定されたプロセス値を示す。
図３は、Ｅ２５濃度(３１０)、流束(３２０)、及びＴＭＰ(２４０)に対する経時的に観測又は測定されたプロセス値を示す。
図４は、３７℃でのＵＦ１(４１０)及びＵＦ２(４２０)に対して観測された圧損対タンパク質濃度に対する経時的に観測又は測定されたプロセス値を示す。
【００７１】
タンパク質プールを一連の工程により回収した。まず、再循環タンクのプールを、ロータリーローブ供給ポンプを使用し、Millipac 200、０．２２ミクロンの滅菌グレードフィルターを通してタンクからポンプ移送した。次に、タンパク質溶液を保持液ラインの最も高い位置に５ｐｓｉｇの窒素ガスを吹き込んで、配管及び膜装置から排出した。最終段階は、５ｐｓｉｇの窒素ガスをまた使用するタンクと供給ラインへのガス吹き込みであった。
【００７２】
限外濾過、ダイアフィルトレーション、又は回収工程の一又は複数で使用される高温が粘性効果を低下させるため、周囲温度で実施する場合、実施例１と比較して生成物回収度が改善されていると考えられた。例えば、生成物回収中に温度制御を停止すると、この操作中にシステムはゆっくりと冷却され、膜装置からの回収が困難になった。あるいは、回収は、まず膜ホルダーから、ついで再循環容器から実施することができる。
【００７３】
回収中の損失量を測定するために、１．７４ＬのＤＦ用バッファーをシステムに添加し、約５分再循環させ、上述したものと同じ順序を使用して回収した。ついで、この容量を、他のプールと共に、タンパク質濃度について分析した。結果を表２に纏める。
0005426641.tif 000005
【００７４】
プロセシング後、膜を、０．１ＮのＮａＯＨを使用し、１Ｌ／ｆｔ２の単一パスフラッシュと、続く０．５Ｌ／ｆｔ２の３０分の全再循環によって再生させた。これに、１Ｌ／ｆｔ２のＰＷ(純水)フラッシュを続けた。これに、３０分間、３００ｐｐｍのMinncare(登録商標)溶液の全再循環を続けた。１Ｌ／ｆｔ２のＰＷでシステムを再度フラッシングし、最終的に０．１ＮのＮａＯＨで１５分間再循環させ、保存した。回収したプールを８０ｇＥ２５／Ｌまで希釈し、５０ｍＭのヒスチジン／１５０ｍＭのトレハロース／０．０２％のポリソルベート２０／ｐＨ６．０の最終製剤に調整した。生成物の品質を、入ってきたＱ-プールと最終的に回収されたバルクの双方について、サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)により評価した。このデータを表３に纏める。
0005426641.tif 000006
【００７５】
比較例２
周囲温度でのｒｈｕＭＡｂ Ｅ２５の高濃度製剤化
実施例１を次の点を除いて繰り返した。プロセスの前に、システム保存溶液(０．１ＮのＮａＯＨ)を、最初に２Ｌ／ｆｔ２の純水(ＰＷ)と共に、ついで１Ｌ／ｆｔ２のダイアフィルトレーション用バッファー(２０ｍＭのヒスチジン／ｐＨ６．０)と共に、ドレイン方式まで単一パスで流した。フラッシング後、０．５Ｌ／ｆｔ２のダイアフィルトレーション用バッファーを１０分間、再循環させることにより、システムを平衡にした。再循環溶液のｐＨを調べて、平衡を確認した。ついで、タンク中のレベルを測定可能な最小値まで低下させ、入ってくるタンパク質プールの希釈度を最低にした。
上述したQ-Sepharoseクロマトグラフィー工程により得られたタンパク質プールは、３．３ｇＥ２５／Ｌであると測定され、３３．３Ｌ容量を有していた。タンパク質は、２５ｍＭのＴＲＩＳバッファーと約２００ｍＭのＮａＣｌの溶液中に存在し、ｐＨを６．２に調節した。運転を開始するため、タンパク質プールを再循環容器に移した。容器において、頂部搭載インペラでプールを攪拌し、温度を周囲温度(２０−２５℃)で維持した。プロセス中、プールをＵＦ１方式で５０ｇＥ２５／Ｌ(約２．２Ｌ)まで濃縮した。ついで、プールを８ダイアボリュームのダイアフィルトレーション用バッファーを用いてダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションを、システムから出て行く濾液の流量に、再循環タンクに移ってくるバッファー溶液の流量を一致させることにより達成される一定容量で実施した。また周囲温度でダイアフィルトレーションを実施した。ダイアフィルトレーションが終了したところで、プールをＵＦ２モードでさらに濃縮した。この最終濃度の目標は１１０ｇ／Ｌであった。しかしながら、供給流路における高い圧損のため、この濃度は達成されなかった。この濃度を達成する試みにおいて、供給流路における圧損が５０ｐｓｉｇに達していたため、供給液の流量を約８０ｇＥ２５／Ｌのバルク濃度で１．４Ｌ／分まで低下させた。５０ｐｓｉｇの高い圧損に到達するまでＵＦ２を続け、プロセスを停止させた。次に、フィードポンプを使用し、供給流路において５ｐｓｉｇの圧損を維持する低い圧損混合を試みた。再度、ロータリーローブポンプが過剰圧に達したため、タンパク質溶液の粘性が達成を困難にした。サンプルを再循環タンクから取り出し、約１０４ｇ／Ｌの最終バルク濃度であることが測定された。表４に、ＵＦ１、ＤＦ(ＤＦ１＋ＤＦ２)、及びＵＦ２段階中に測定されたスループット値及び流束を纏めた。
0005426641.tif 000007
【００７６】
図５は、ＵＦ１(１０)、ＤＦ(２０)、ＵＦ２(３０)を含むプロセスの種々の段階及び方式中における供給液流量(２１０)、タンク温度(２２０)、供給ｄＰ(２３０)、ＴＭＰ(２４０)、及び濾液流量(２５０)パラメータに対する経時的に観測又は測定されたプロセス値を示す。
図６は、Ｅ２５濃度(３１０)、流束(３２０)、及びＴＭＰ(２４０)に対する経時的に観測又は測定されたプロセス値を示す。
図７は、２４℃でのＵＦ１(４１０)及びＵＦ２(４２０)に対して観測された圧損対タンパク質濃度に対する経時的に観測又は測定されたプロセス値を示す。
【００７７】
タンパク質プールを複数の工程により回収した。まず、再循環タンクのプールを、ロータリーローブ供給ポンプを使用し、Millipac 200、０．２２ミクロンの滅菌グレードフィルターを通してタンクからポンプ移送した。次に、タンパク質溶液を、保持液ラインの最も高い位置に５ｐｓｉｇの窒素ガスを吹き込んで、配管及び膜ユニットから排出した。ここでの生成物回収度は、粘性のある性質の溶液であるため、非常に乏しかった。最終段階は、５ｐｓｉｇの窒素ガスをまた使用するタンクと供給ラインへのガス吹き込みであった。
【００７８】
回収中の損失量を測定するために、１．８５ＬのＤＦ用バッファーをシステムに添加し、約５分再循環させ、実施例１の順序を使用して回収した。ついで、この容量を他のプールと共にタンパク質濃度のために分析した。結果を表５に纏める。
0005426641.tif 000008
【００７９】
プロセシング後、膜を、０．１ＮのＮａＯＨ、１Ｌ／ｆｔ２の単一パスフラッシュを使用し、続いて０．５Ｌ／ｆｔ２の３０分の全再循環で再生させた。これに、１Ｌ／ｆｔ２のＰＷフラッシュを続けた。これに、３０分間、３００ｐｐｍのMinncare(登録商標)溶液の全再循環を続けた。１Ｌ／ｆｔ２のＰＷにより、システムを再度フラッシングし、最終的に０．１ＮのＮａＯＨで１５分間再循環させ、保存した。回収したプールを８０ｇＥ２５／Ｌまで希釈し、２０ｍＭのヒスチジン／２５０ｍＭのスクロース／０．０２％のポリソルベート２０／ｐＨ６．０の最終調製物に調整した。生成物の品質を、入ってきたＱ-プールと最終的に回収されたバルクの双方について、サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)により評価した。このデータを表６に纏める。
0005426641.tif 000009
【００８０】
実施例３
最初のバッチ供給方式を用いたｒｈｕＭＡｂ Ｅ２６の高濃度調製物
実施例１を次の点を除いて繰り返した。ｒｈｕＭＡｂＥ２６(ＩｇＥを標的とする組換えヒトモノクローナル抗体)を濃縮／調製した。この実施例の生成物を毒性評価に使用した。Millipore Pelicon限外濾過／ダイアフィルトレーションシステムを、１１．４平方フィート３００００-ダルトンの再生セルロース複合膜を用いて組み立てた。供給液の流量を５．０Ｌ／分(０．４４Ｌ／分／ｆｔ２)の一定流量に設定した。限外濾過及びダイアフィルトレーション操作中、保持液圧を約６−８ｐｓｉｇに維持した。前のQ-Sepharoseクロマトグラフィー工程により得られたタンパク質プールは、６．７ｇＥ２６／Ｌであると測定され、５９．３Ｌ容量を有していた。
【００８１】
入ってくるプールは再循環容器よりも多いので、ＵＦ１プロセスはバッチ供給モードで開始した。このモードにおいて、濾液がＴＦＦ膜を通ってドレインまで通過するのとほぼ同じ速度で、Ｑ-プールを再循環容器に添加した。残存Ｑ-プールを再循環容器に移した後、バッチモードでＵＦ１プロセスを続けた。ＵＦ１の間に、プールを５０ｇＥ２６／Ｌ(約７．９Ｌ)まで濃縮した。ダイアフィルトレーションの開始時、再循環容器の温度設定点を４０℃まで上昇させた。温度の上昇及び制御は、タンクの外側ジャケットを通して流れてくる温グリコールに影響を受けた。ついで、プールを８ダイアボリュームのダイアフィルトレーション用バッファーを用いてダイアフィルトレーションした。システムから出て行く濾液の流量に、再循環タンクに移送されてくるバッファーの流量を一致させることにより達成される一定容量で、ダイアフィルトレーションを実施した。ダイアフィルトレーションが終了したところで、プールをＵＦ２モードで、１０９ｇＥ２６／Ｌ(３．６Ｌ)の最終濃度までさらに濃縮した。この段階はまた４０℃の高温設定点を使用して実施した。次に、フィードポンプを制御し、供給流路において５−１０ｐｓｉｇの圧損が維持されるようにした低圧損混合を実施した。表７に、ＵＦ１、ＤＦ(ＤＦ１＋ＤＦ２)及びＵＦ２のスループット及び流束の結果を纏める。
0005426641.tif 000010
【００８２】
図８は、供給液の流量(２１０)、タンク温度(２２０)、供給ｄＰ(２３０)、ＴＭＰ(２４０)、及び濾液の流量(２５０)に対する経時的に観測又は測定されたプロセス値を示す。
図９は、Ｅ２６濃度(９１０)、流束(９２０)、及びＴＭＰ(９４０)に対する経時的に観測又は測定されたプロセス値を示す。
図１０は、ＵＦ１(１０１０)及びＵＦ２(１０２０)において観測された圧損対タンパク質濃度に対する経時的に観測又は測定されたプロセス値を示す。
【００８３】
生成物回収の直前に、１０ｍＬのサンプルをバイオバーデンの検出及び滴定のために分析した。典型的な拒絶限界はｍＬ当たり１０００コロニー形成単位(ＣＦＵ)である。このテストの結果は１．８ＣＦＵ／ｍＬであり、この工程では適切な値であり、拒絶限界より十分に低い。回収中の損失量を測定するために、９０８．１ｍＬのＤＦ用バッファーをシステムに添加し、約５分再循環させ、上述したものと同じ順序を使用して回収した。ついで、この容量を、他のプールと共に、タンパク質濃度のために分析した。表８にその結果を纏める。
0005426641.tif 000011
【００８４】
回収したプールを８０ｇＥ２６／Ｌまで希釈し、５０ｍＭのヒスチジン／１５０ｍＭのトレハロース／０．０２％のポリソルベート２０／ｐＨ６．０の最終調製物に調整した。生成物の品質を、入ってきたＱ-プール、ＵＦ１後の保持プール、ＤＦ後の保持プール、及び最終回収バルクに対して、サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)により評価した。このデータを表９に纏める。
0005426641.tif 000012
【００８５】
実施例４
毒性評価のためのｒｈｕＭＡｂＥ２６の高濃度製剤−１０ｋＤと３０ｋＤの比較
実施例３を次の点を除いて繰り返した。２つのパイロット規模のＵＦシステムを使用し、ｒｈｕＭＡｂ Ｅ２６を濃縮／調製した。２つのMillipore Pelicon限外濾過／ダイアフィルトレーションシステムを、１１．４平方フィートの再生セルロース複合膜で、一方が１００００ダルトンの孔径、他方が３００００ダルトンの孔径のものを用いて、組み立てた。保持液圧は約６−９ｐｓｉｇに維持した。
【００８６】
１０ｋＤのプロセス
前のQ-Sepharoseクロマトグラフィー工程により得られたタンパク質プールは、５．８５ｇＥ２６／Ｌであると測定され、６２．４Ｌ容量を有していた。ＵＦ１の間に、プールを５０ｇＥ２６／Ｌ(約７．３Ｌ)まで濃縮した。ダイアフィルトレーションが終了したところで、プールをＵＦ２モードで、１０７．５ｇＥ２６／Ｌ(３．４Ｌ)の最終濃度までさらに濃縮した。表１０に、ＵＦ１、ＤＦ及びＵＦ２のスループット及び流束の結果を纏める。
0005426641.tif 000013
【００８７】
回収中の損失量を測定するために、９８７ｍＬのＤＦ用バッファーをシステムに添加し、約５分再循環させ、上述したものと同じ順序を使用して回収した。ついで、この容量を、他のプールと共に、タンパク質濃度のために分析した。結果を表１１に纏める。
0005426641.tif 000014
【００８８】
図１１は、１０ｋＤプロセスにおける、ＵＦ１(１０)、ＤＦ(２０)、ＵＦ２(３０)、及び低ｄＰ(４０)を含むプロセスの種々の段階又はモードに対する供給液流量(２１０)、タンク温度(２２０)、供給ｄＰ(２３０)、ＴＭＰ(２４０)、及び濾液流量(２５０)に対する経時的に観測又は測定されたプロセス値を示す。
図１２は、１０ｋＤプロセスにおける、ＵＦ１(１０)、ＤＦ(２０)、ＵＦ２(３０)、及び低ｄＰ(４０)を含むプロセスの種々の段階又はモードに対するＥ２６濃度(１２１０)、流束(１２２０)、及びＴＭＰ(１２４０)に対する経時的に観測又は測定されたプロセス値を示す。
図１３は、１０ｋＤプロセスにおける、ＵＦ１(１３１０)及びＵＦ２(１３２０)において観測された圧損対タンパク質濃度に対する経時的に観測又は測定されたプロセス値を示す。
【００８９】
３０ｋＤのプロセス
前のQ-Sepharoseクロマトグラフィー工程により得られたタンパク質プールは、５．８５ｇＥ２６／Ｌであると測定され、６４．５Ｌ容量を有していた。ＵＦ１の間に、最初のプールを５０ｇＥ２６／Ｌ(約７．５Ｌ)まで濃縮した。ダイアフィルトレーションが終了したところで、プールをＵＦ２モードで、１１７．５ｇＥ２６／Ｌ(３．２Ｌ)の最終濃度までさらに濃縮した。表１２に、ＵＦ１、ＤＦ及びＵＦ２のスループット及び流束の結果を纏める。
0005426641.tif 000015
【００９０】
回収中の損失量を測定するために、９１８ｍＬのＤＦ用バッファーをシステムに添加し、約５分再循環させ、上述したものと同じ順序を使用して回収した。回収したプールを８０ｇＥ２６／Ｌまで希釈し、５０ｍＭのヒスチジン／１５０ｍＭのトレハロース／０．０２％のポリソルベート２０／ｐＨ６．０の最終調製物に調整した。結果を表１３に纏める。
0005426641.tif 000016
【００９１】
図１４は、３０ｋＤプロセスにおける、ＵＦ１(１０)、ＤＦ(２０)、ＵＦ２(３０)、及び低ｄＰ(４０)を含むプロセスの種々の段階又はモードに対する供給液流量(２１０)、タンク温度(２２０)、供給ｄＰ(２３０)、ＴＭＰ(２４０)、及び濾液流量(２５０)に対する経時的に観測又は測定されたプロセス値を示す。
図１５は、３０ｋＤプロセスにおける、ＵＦ１(１０)、ＤＦ(２０)、ＵＦ２(３０)、及び低ｄＰ(４０)を含むプロセスの種々の段階又はモードに対するＥ２６濃度(１５１０)、流束(１５２０)、及びＴＭＰ(１５４０)に対する経時的に観測又は測定されたプロセス値を示す。
図１６は、３０ｋＤプロセスにおける、ＵＦ１(１６１０)及びＵＦ２(１６２０)に対して観測された圧損対タンパク質濃度に対する経時的に観測又は測定されたプロセス値を示す。
【００９２】
実施例５
液状ｒｈｕＭＡｂ Ｅ２５のスケールアップ
実施例１を次の点を除いて繰り返した。
生産規模のＵＦシステムを使用し、液状のｒｈｕＭＡｂ Ｅ２５(ＩｇＥを標的とする組換えヒトモノクローナル抗体)を濃縮／調製した。生成物は、治療的用途及びヒトバイオ-等価試行に使用することができる。Millipore Pelicon限外濾過／ダイアフィルトレーションシステムを、３００００ダルトンの孔径を有する、２２６平方フィートの再生セルロース複合膜を用いて組み立てた。各システムは、膜ホルダー、Viking S3S ロータリーローブ供給ポンプ、１1/2"の３１６Ｌステンレス鋼製再循環配管、及び２５０Ｌの再循環容器からなる。
【００９３】
一つの２５０リットルの３１６Ｌステンレス鋼製でジャケットが施されたタンクを、再循環容器に使用した。このタンクの温度制御は、タンクのジャケットに供給される温度調節されたグリコールにより達成された。タンクのジャケットに供給されるグリコールの温度は、それぞれ蒸気供給熱交換器又は冷グリコール供給を使用し、上昇又は低下させた。
【００９４】
この運転のために、供給液の流量を１１４Ｌ／分(０．５Ｌ／分／ｆｔ２)の一定流量に設定した。ダイアフィルトレーション用バッファー(２０ｍＭのヒスチジン／２００ｍＭの塩化アルギニン／ｐＨ６．０)を分離タンクにおいて調製した。このバッファーの温度を、プロセス前に４５℃に設定した。これにより、プロセス中、正確に温度制御することができた。
【００９５】
プロセシング前に、システム保存溶液(０．１ＮのＮａＯＨ)を、まず１Ｌ／ｆｔ２の注射用の水(ＷＦＩ)と共に、ついで１Ｌ／ｆｔ２のダイアフィルトレーション用バッファーと共に、ドレインまでの単一パスモードでフラッシングした。フラッシング後、０．５Ｌ／ｆｔ２のダイアフィルトレーション用バッファーを１０分間、再循環させることにより、システムを平衡にした。再循環溶液のｐＨを調べて、平衡を確認した。
【００９６】
前のQ-Sepharoseクロマトグラフィー工程により得られたタンパク質プールは、５．２５６２ｇＥ２５／Ｌであると測定され、１．１４１Ｌ容量を有していた。タンパク質は、２５ｍＭのＴＲＩＳバッファーと約２００ｍＭのＮａＣｌの溶液中に存在しており、ｐＨを６．２に調節した。運転の直前、このプールの温度設定点を４５℃に設定した。運転を開始するため、タンパク質プールを、０．２２ミクロンの滅菌グレードフィルターを通して再循環容器に、タンクの約２００Ｌのレベルまで移した。容器中、頂部搭載インペラでプールを攪拌し、温度を約(４０−５０℃)に維持した。入ってくるプールは再循環容器よりも多いので、ＵＦ１プロセスはバッチ供給モードで開始した。このモードにおいて、濾液がＴＦＦ膜を通ってドレインに通過するのとほぼ同様の速度で、Ｑ-プールを再循環容器に添加した。残存Ｑ-プールを再循環容器に移した後、バッチモードでＵＦ２プロセスを続けた。ＵＦ１方式の間、プールを約３０ｇＥ２５／Ｌ(約２００Ｌ)まで濃縮した。ついで、プールを８ダイアボリュームのダイアフィルトレーション用バッファーを用いてダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション中、温度を４０℃〜５０℃で維持した。システムから出て行く濾液の流量に、再循環タンクに移送されてくるバッファーの流量を一致させることにより達成される一定容量で、ダイアフィルトレーションを実施した。ダイアフィルトレーションが終了したところで、プールをＵＦ２モードで、＞１７０ｇＥ２５／Ｌ(３５Ｌ)の最終濃度設定点までさらに濃縮した。またこのＵＦ２方式の段階は、４５℃＋／−５℃の高温設定点でも実施した。次に、低圧損混合を実施し、ここでフィードポンプを制御し、供給流路において５−１０ｐｓｉｇの圧損が維持されるようにした。サンプルを抜き出し、ｓｐｅｃスキャンを実施して、回収前の濃度を確認した。このサンプルの濃度は２１９ｇＥ２５／Ｌであった。表１４に、ＵＦ１、ＤＦ(ＤＦ１＋ＤＦ２)及びＵＦ２段階中に測定されたスループット及び流束を要約する。
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【００９７】
生成物回収の直前に、３０ｍＬのサンプルを抜き出し、バイオバーデンの検出及び滴定に出した。結果は＜０．１３ＣＦＵ／ｍＬであった。タンパク質プールを一連の工程により回収した。まず、保持液ラインに添加された５ＬのＤＦ用バッファーを使用し、単一パスモードで、膜から生成物を排出した。生成物を、７．４ｆｔ２、０．２２ミクロンの滅菌グレード保護フィルターと、続いての２ｆｔ２、０．２２ミクロンの滅菌グレード最終フィルターを通して、回収タンク中に濾過した。ついで、再循環タンクのプールを、ロータリーローブ供給ポンプを使用しタンクからポンプ移送した。次に、残ったタンパク質溶液を、５ｐｓｉｇの窒素ガスを吹き込んで、タンク及び供給ラインから排出した。最終段階は膜ユニットへの吹き込みであり、最初の生成物の代わりに今はほとんどＤＦ用バッファーを含んでいた。この段階ではまた保持液ラインの最も高い位置に適用される５ｐｓｉｇの窒素ガスを使用した。回収したプールを、まず、ＤＦ用バッファーを使用して約１５３ｇＥ２５／Ｌまで希釈した。最後に、プールを、２０ｍＭのヒスチジン／２００ｍＭのアルギニン-ＨＣｌ／０．０４％のポリソルベート２０／ｐＨ６．０の最終調製物に調整した。ついで、回収したプール、希釈したプール、及び調整したプール(Ｑ-プール)の容量を、タンパク質濃度のためにそれぞれ分析した。結果を表１５に纏める。
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図１７は、ＵＦ１(１０)、ＤＦ１(２０)、ＤＦ２(２５)、ＵＦ２(３０)、及び低ｄＰ(５０)を含むプロセスの様々な段階又はモード中に対する供給液流量(２１０)、タンク温度(２２０)、供給ｄＰ(２３０)、ＴＭＰ(２４０)、及び濾液流量(２５０)のパラメータを示す。
【００９８】
実施例６
液状ｒｈｕＭＡｂ Ｅ２５調製物
実施例５を次の点を除いて繰り返した。生産規模のＵＦシステムを使用し、液状のｒｈｕＭＡｂ Ｅ２５(Ｅ２５、ＩｇＥを標的とする組換えヒトモノクローナル抗体)を濃縮／製剤化した。Millipore Pelicon限外濾過／ダイアフィルトレーションシステムを、３００００-ダルトンの孔径を有する２２６平方フィートの再生セルロース複合膜を用いて組み立てた。各システムは、膜ホルダー、Viking S3S ロータリーローブ供給ポンプ、１1/2"の３１６Ｌステンレス鋼製再循環配管、及び２５０Ｌの再循環容器からなる。一つの２５０リットルの３１６Ｌステンレス鋼製でジャケットが施されたタンクを、再循環容器に使用した。供給液の流量を１１４Ｌ／分(０．５Ｌ／分／ｆｔ２)の一定流量に設定した。全ての使用前操作及び使用後操作中、保持液圧の制御は、１０ｐｓｉｇの定圧に設定した。限外濾過及びダイアフィルトレーション操作中、システムではＣｗａｌｌ制御スキームを使用して、膜を通過する流束を制御した。ダイアフィルトレーション用バッファー(２０ｍＭのヒスチジン／２００ｍＭの塩化アルギニン／ｐＨ６．０)を分離タンクにおいて調製した。このバッファーの温度を、プロセス前に４５℃に設定した。これにより、全プロセス中、正確に温度制御することができた。前のQ-Sepharoseクロマトグラフィー工程により得られたタンパク質プールは、５．５４３８ｇＥ２５／Ｌであると測定され、１．０８２Ｌ容量を有していた。タンパク質は、２５ｍＭのＴＲＩＳバッファーと約２００ｍＭのＮａＣｌの溶液中に存在しており、ｐＨを６．２に調節した。運転の直前、このプールの温度設定点を４５℃に設定した。運転を開始するため、タンパク質プールを、０．２２ミクロンの滅菌グレードフィルターを通して再循環容器に、タンクの約２００Ｌのレベルまで、移した。容器中において、頂部搭載インペラでプールを攪拌し、温度を周囲(４０-５０℃)で維持した。入ってくるプールは再循環容器よりも多いので、ＵＦ１プロセスはバッチ供給モードで開始した。このモードにおいて、濾液がＴＦＦ膜を通ってドレインまで通過するのとほぼ同じ速度で、Ｑ-プールを再循環容器に添加した。残存Ｑ-プールを再循環容器に移した後、バッチモードでＵＦ１プロセスを続けた。ＵＦ１の間に、プールを約３０ｇＥ２５／Ｌ(約２００Ｌ)まで濃縮した。ついで、プールを８ダイアボリュームのダイアフィルトレーション用バッファーを用いてダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション中、温度を４０〜５０℃の間に維持した。システムから出て行く濾液の流量に、再循環タンクに移送されてくるバッファーの流量を一致させることにより達成される一定容量で、ダイアフィルトレーションを実施した。ダイアフィルトレーションが終了したところで、プールをＵＦ２モードで、１７０ｇＥ２５／Ｌ(３５Ｌ)より大きい最終濃度設定点までさらに濃縮した。この段階はまた４５℃＋／−５℃の高温設定点で実施した。次に、フィードポンプを制御し、供給流路において５−１０ｐｓｉｇの圧損が維持されるようにした低圧損混合を実施した。サンプルを抜き出し、ｓｐｅｃスキャンを実施して、回収前の濃度を確認した。このサンプルの濃度は１９１ｇＥ２５／Ｌであり、プール容量は３１．９Ｌであった。経時的なプロセスパラメータのグラフを、上述の図１７で観測され要約されたものと比較した。
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【００９９】
生成物回収の直前に、３０ｍＬのサンプルを抜き出し、バイオバーデンの力価について分析した。このテストの結果は検出限界以下(＜０．１３ＣＦＵ／ｍＬ)であった。
タンパク質プールを一連の工程により回収した。まず、保持液ラインに添加された５ＬのＤＦ用バッファーを使用し、単一パスモードで、膜から生成物を排出した。生成物を、７．４ｆｔ２、０．２２ミクロンの滅菌グレード保護フィルター、続いて２ｆｔ２、０．２２ミクロンの滅菌グレード保護フィルターを通して、回収タンク中に濾過した。ついで、再循環タンクのプールを、ロータリーローブ供給ポンプを使用しタンクからポンプ移送した。次に、残ったタンパク質溶液を、５ｐｓｉｇの窒素ガスを吹き込んで、タンク及び供給ラインから排出した。最終段階は、最初の生成物の排出から、ほとんどのＤＦ用バッファーを含有している膜ユニットの吹き込みであった。また、この段階では、未透過流れラインの最も高い位置に適用される５ｐｓｉｇの窒素ガスを使用した。まず、回収したプールを、ＤＦ用バッファーを使用して約１５３ｇＥ２５／Ｌまで希釈した。最後に、プールを、２０ｍＭのヒスチジン／２００ｍＭのアルギニン-ＨＣｌ／０．０４％のポリソルベート２０／ｐＨ６．０の最終調製物に調整した。ついで、回収したプール、希釈したプール、及び調整したプールの容量を、タンパク質濃度について分析した。結果を表１５に要約する。プロセス後、上述したようにして膜を再生させた。
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【０１００】
実施例７
生成物の品質に対する高い温度の影響
ヒスチジン及びＱバッファー中に入れた３０ｇ／Ｌ及び１５０ｇ／ＬのＥ２５サンプルを、様々な温度で２４時間保持した。サンプルを、濁度測定及びＳＥＣアッセイのために取り出した。Ｑバッファー中の３０ｇ／ＬのＥ２５に対する濁度対温度の結果を図１８に示す。図１９は、２３℃、４０℃、５０℃、６０℃及び７０℃の温度において経時的に観測したＥ２５(５０ｍＭのヒスチジンバッファー中に１５０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．０)の可溶性凝集体の量を示す。これらの温度のそれぞれに対して、４通りの時間間隔(０時間、４時間、７．５時間及び２４時間)を、図１８及び１９中、１８１０及び１９１０として、左から右へ４本のバー群として示す。溶液濁度は、本質的に６０℃で２４時間後も変化しなかった。７０℃以下では、Ｅ２５の有意な溶解性凝集物は観測されず、生成物サンプルが少なくとも６０℃で少なくとも２４時間、実質的に安定していることが示唆される。
【０１０１】
実施例８
バイオバーデンに対する高い温度の影響
アルギニン及びヒスチジンバッファー中に入れた３０ｇ／ＬのＥ２５サンプルに、２つの誘発生物体：グラム陽性菌(Staphylococcus aureus)；及びグラム陰性菌(Pseudomonas chlororaphis)のｍＬ当たり１０３コロニー形成単位を播種した。サンプルを１．５時間及び６時間後に取り出した。図２０及び２１の棒グラフに示されている結果は、これらの誘発生物体の双方とも、温度の上昇に伴い減少していることを示している。それぞれの観測された時間間隔に対する３通りの温度間隔(温度２５℃、４０℃及び５０℃の時間)は、図２０及び２１において、２０１０及び２１１０として、左から右へ３本のバー群として示す。示された播種は、３０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有するアルギニンバッファー中において実施した。
【０１０２】
実施例９
プロセス流束に対する高い温度の影響
０．２Ｍのアルギニン、２５ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０のバッファー中に入れた１０ｇ／ＬのＥ２５サンプルを、流束対膜間圧(ＴＭＰ)に対するそれらの影響のために評価した。図２２は、システム温度の上昇により、ＵＦ／ＤＦ操作中にプロセス流束が増加することを示している。様々なバルク濃度、及び２３℃(２２１０)、４０℃(２２２０)及び４６℃(２２３０)の３通りの異なる温度で、流束偏位を実施した。物質移動係数及び濾液流束は約２〜約３倍に増加し、プロセス時間はかなり低減した。
【０１０３】
実施例１０
ｒｈｕＭＡｂ抗ＣＤ２０(「２Ｈ７」) の高濃度製剤化
パイロット規模のＵＦシステムを使用し、ｒｈｕＭＡｂ抗ＣＤ２０(２Ｈ７；組換えヒトモノクローナル抗体)を濃縮し、製剤化した。実施例１を次の点を除いて繰り返した。Millipore Pelicon限外濾過／ダイアフィルトレーションシステムは、３００００ダルトンの孔径を有する１７．５平方フィートの再生セルロース複合膜を用いて組み立てた。システムは、膜ホルダー、Viking S1 L ロータリーローブ供給ポンプ、1/2"の３１６Ｌステンレス鋼製再循環配管、及び４０-Ｌの再循環容器からなる。背圧調節弁は、H.D. Baumann,Inc.製であった。タンクジャケットに供給されるグリコールの温度は、電気熱交換器、冷グリコールの供給、又は双方を使用し、必要に応じて上昇又は低下させて調節した。
【０１０４】
この運転中、供給液の流量は、８．５Ｌ／分(約０．５Ｌ／分／ｆｔ２)の一定流量に設定した。図２３は、ＵＦ１(１０)、ＤＦ１(２０)及びＵＦ２(３０)を含むプロセスの種々の段階又はモードにおいての０〜２０のスケールでの供給液の流量(２１０)、２〜１２のスケールでのｐＨ(２１２)、０〜５のスケールでの濾液の流量(２５０)、０〜４５のスケールでのリサイクルタンクのレベル(２３２０)、０〜１００のスケールでの保持液ｄＰ(２３５０)に対する経時的な値の傾向を示す。
【０１０５】
限外濾過及びダイアフィルトレーション操作中、システムでは、一定の保持液圧と、続いての一定の供給液／保持液差圧制御スキームを使用して、膜を通過する流束を制御した。ダイアフィルトレーション用バッファー(３０ｍＭの酢酸ナトリウム／ｐＨ４．９)は分離タンク中で調製した。プロセス全体において正確な温度制御をするために、このバッファーの温度をプロセシング前に４５℃に設定した。プロセシング前に、システム保存溶液(０．１ＮのＮａＯＨ)を、まず１Ｌ／ｆｔ２の注射用の水(ＷＦＩ)と共に、ついで１Ｌ／ｆｔ２のダイアフィルトレーション用バッファーと共に、単一のドレインへのパスモードで流した。フラッシング後、０．５Ｌ／ｆｔ２のダイアフィルトレーション用バッファーを１０分間、再循環させることにより、システムを平衡にした。再循環溶液のｐＨを調べて平衡を確認した。
【０１０６】
前のQ-Sepharoseクロマトグラフィー工程により得られたタンパク質プールは、２．３１ｇ２Ｈ７／Ｌであると測定され、３５６Ｌ容量を有していた。タンパク質は、０．５Ｍの酢酸で５．３にｐＨ調節された６ｍＭのＨＥＰＥＳ遊離酸／１９ｍＭのＨＥＰＥＳナトリウム塩及び２５ｍＭの酢酸ナトリウムの溶液中に存在していた。運転の直前、このプールの温度設定点を４５℃に設定した。運転を開始するため、タンパク質プールを、０．２２ミクロンの滅菌グレードフィルターを通して再循環容器に、タンクに約４０Ｌのレベルまで移した。容器中において、頂部搭載インペラでプールを攪拌して温度を４０−５０℃に維持した。
【０１０７】
入ってくるプールは再循環容器よりも多いので、ＵＦ１プロセスはバッチ供給モードで開始した(図２３を参照)。このモードでは、濾液がＴＦＦ膜を通ってドレインまで通過するのとほぼ同じ速度で、Ｑ-プールを再循環容器に添加した。残存Ｑ-プールを再循環容器に移した後、バッチモードでＵＦ１プロセスを続けた。ＵＦ１の間に、プールを約５０ｇ２Ｈ７／Ｌ(約１６Ｌ)まで濃縮した。ついで、プールを１０ダイアボリュームのダイアフィルトレーション用バッファーを用いてダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション中、温度を４０〜５０℃の間に維持した。システムから出て行く濾液の流量に、再循環タンクに移送されてくるバッファーの流量を一致させることにより達成される一定容量で、ダイアフィルトレーションを実施した。ダイアフィルトレーションが終了したところで、プールをＵＦ２モードで、１９０ｇ２Ｈ７／Ｌ(４．３Ｌ)の最終濃度目標設定点までさらに濃縮した。図２３において、この段階の終わりに、５０ｐｓｉｇへの定ｄＰ制御を導入したことに留意のこと。この段階はまた４５℃＋／−５℃の高温設定点で実施した。次に、フィードポンプを制御し、供給流路において２０ｐｓｉｇの圧損が維持されるようにした低圧損混合を実施した。サンプルを抜き出し、密度測定を実施して、回収前の濃度を確認した。このサンプルの濃度は１８９ｇ２Ｈ７／Ｌであった。表１６に、スループット及び流束の結果を纏める。
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【０１０８】
タンパク質プールを、複数の工程により回収した。まず、保持液ラインに添加された０．２ＬのＤＦ用バッファーを使用し、単一パスモードで、膜から生成物を排出した。生成物を、０．２２ミクロンの滅菌グレード最終フィルターを通して、回収タンク中に濾過した。ついで、再循環タンクのプールを、ロータリーローブ供給ポンプを使用しタンクからポンプ移送した。次に、残ったタンパク質溶液を、５ｐｓｉｇの窒素ガスを吹き込んで、タンク及び供給ラインから排出した。最終段階は膜装置への吹き込みであり、その装置は今最初の生成物の代わりにＤＦ用バッファーを含んでいる。この段階ではまた保持液ラインの最も高い位置に適用される５ｐｓｉｇの窒素ガスを使用した。
【０１０９】
必要であれば、回収したプールを、まず希釈用バッファー(３０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．３)を使用して、約１７５ｇ２Ｈ７／Ｌまで希釈した。最後に、プールを１５０ｇ２Ｈ７／Ｌの目標濃度まで希釈し、７×の調整用バッファー(３０ｍＭの酢酸ナトリウム、４９％のトレハロース、０．２１％のポリソルベート２０、ｐＨ５．３)により、３０ｍＭの酢酸ナトリウム、７％のトレハロース、０．０３％のポリソルベート２０、ｐＨ５の最終調製物に調整した。
ついで、回収したプール、希釈したプール、及び調整したプールの容量を、タンパク質濃度のために分析した。表１７はその結果を表す。
0005426641.tif 000022
【０１１０】
プロセシング後、膜を、０．１ＮのＮａＯＨ、１Ｌ／ｆｔ２の単一パスフラッシュの使用と、続いての０．５Ｌ／ｆｔ２の３０分の全再循環で再生させた。これに、１Ｌ／ｆｔ２のＰＷフラッシュを続けた。これに、３０分間、０．５Ｌ／ｆｔ２の１．４％Minncare溶液の全再循環を続けた。１Ｌ／ｆｔ２のＰＷを用いて、システムを再度フラッシングし、最終的に０．１ＮのＮａＯＨで１５分間再循環させ、保存した。
【０１１１】
実施例１１
ｒｈｕＭＡｂ 抗ＣＤ２０の高濃度調製物
パイロット規模のＵＦシステムを使用し、ＧＭＰ製造設備でのヒトフェーズＩ臨床試験に使用するためのｒｈｕＭＡｂ 抗ＣＤ２０(２Ｈ７)を濃縮し、製剤化した。実施例１０を次の点を除いて繰り返した。
前のQ-Sepharoseクロマトグラフィー工程により得られたタンパク質プールは、３．７２９ｇ２Ｈ７／Ｌであると測定され、２６２Ｌ容量を有していた。タンパク質は、０．５Ｍの酢酸で５．３にｐＨ調節された６ｍＭのＨＥＰＥＳ遊離酸／１９ｍＭのＨＥＰＥＳナトリウム塩及び２５ｍＭの酢酸ナトリウムの溶液中に存在していた。運転の直前、このプールの温度設定点を４５℃に設定した。運転を開始するため、タンパク質プールを、０．２２ミクロンの滅菌グレードフィルターを通して再循環容器に、タンクの約４０Ｌのレベルまで移した。容器中で、頂部搭載インペラでプールを攪拌し、温度を４０−５０℃に維持した。
【０１１２】
ＵＦ１の間、プールを約５０ｇ２Ｈ７／Ｌ(約２０Ｌ)まで濃縮した。図２４は、プロセシング中における−０．７１３９６３〜２９５．９８９のスケールでのリサイクルタンクレベル(２１０)、−０．２３７８９９〜９８．６６２９のスケールでの保持液ｄＰ(２４２０)、−０．３５６９８１〜１４７．９９４のスケールでの供給液流量(２５０)、−０．１１８９９４〜４９．３３１５のスケールでの濾液流量(２４５０)に対する経時的な値の傾向を示す。ついで、プールを１０ダイアボリュームのダイアフィルトレーション用バッファーを用いてダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション中、温度は４０〜５０℃の間に維持した。システムから除去される濾液の流量に、再循環タンクに移送されてくるバッファーの流量を一致させることにより達成した一定容量で、ダイアフィルトレーションを実施した。ダイアフィルトレーションが終了したところで、プールをＵＦ２モードで１９０ｇ２Ｈ７／Ｌ(５．２５Ｌ)の最終濃度目標設定点までさらに濃縮した。図２４において、この段階の終わりに４０ｐｓｉｇへの定ｄＰ制御を導入したことに留意のこと。この段階はまた４５℃＋／−５℃の高温設定点で実施された。次に、フィードポンプを制御して供給流路において２０ｐｓｉｇの圧損を維持するようにした低圧損混合を実施した。サンプルを抜き出して密度測定を実施し、回収前の濃度を確認した。このサンプルの濃度は１９４ｇ２Ｈ７／Ｌであった。表１８にスループット及び流束の結果を纏める。
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【０１１３】
生成物回収の直前に、３０ｍＬのサンプルを抜き出し、バイオバーデンの検出及び滴定に出した。結果は陰性(すなわち、＜０．１３ＣＦＵ／ｍＬ)であった。タンパク質プールを実施例１０の複数の工程により回収した。ついで、回収したプール、希釈したプール、及び調整したプールの容量を、タンパク質濃度のために分析した。表１９はその結果を表す。膜は実施例１０のようにして再生した。
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【０１１４】
実施例１２
ｒｈｕＭＡｂ抗ＣＤ２０ＧＭＰの高濃度製剤化
実施例１１を次の点を除いて繰り返した。前のQ-Sepharoseクロマトグラフィー工程により得られたタンパク質プールは、５．１０６ｇ２Ｈ７／Ｌであると測定され、１９６Ｌ容量を有していた。タンパク質は、０．５Ｍの酢酸で５．３にｐＨ調節された６ｍＭのＨＥＰＥＳ遊離酸／１９ｍＭのＨＥＰＥＳナトリウム塩及び２５ｍＭの酢酸ナトリウムの溶液中に存在していた。運転の直前、このプールの温度設定点を４５℃に設定した。運転を開始するため、タンパク質プールを、０．２２ミクロンの滅菌グレードフィルターを通して再循環容器に、タンクの約４０Ｌのレベルになるまで移した。容器中で、頂部搭載インペラでプールを攪拌し、温度を４０−５０℃に維持した。
【０１１５】
ＵＦ１の間、プールを約５０ｇ２Ｈ７／Ｌ(約２０Ｌ)まで濃縮した。図２５は、プロセシング中における０〜３００のスケールでのリサイクルタンクレベル(２１０)、０〜１００のスケールでの保持液ｄＰ(２５２０)、０〜１５０のスケールでの供給液流量(２５０)、０〜５０のスケールでの濾液流量(２５５０)に対する経時的な値の傾向を示す。プールは１０ダイアボリューム(１０×)のダイアフィルトレーション用バッファーを用いてダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション中、温度は４０〜５０℃の間に維持した。システムから除去される濾液の流量に、再循環タンクに移送されてくるバッファーの流量を一致させることにより達成した一定容量で、ダイアフィルトレーションを実施した。ダイアフィルトレーションが終了したところで、再びこの段階のまさに終了時点で定ｄＰ制御を利用して、プールをＵＦ２モードで１９０ｇ２Ｈ７／Ｌ(５．２６Ｌ)の最終濃度目標設定点までさらに濃縮した(図２５を参照)。この段階はまた４５℃＋／−５℃の高い温設定点で実施された。次に、フィードポンプを制御して供給流路において２０ｐｓｉｇの圧損を維持するようにした低圧損混合を実施した。サンプルを抜き出して密度測定を実施し、回収前の濃度を確認した。このサンプルの濃度は１９１ｇ２Ｈ７／Ｌであった。表２０にスループット及び流束の結果を纏める。
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【０１１６】
生成物回収の直前に、３０ｍＬのサンプルを抜き出し、バイオバーデンの検出及び滴定に出した。結果は陰性(すなわち、＜０．１３ＣＦＵ／ｍＬ)であった。タンパク質プールを実施例１１の複数の工程により回収した。ついで、回収したプール、希釈したプール、及び調整したプールの容量を、タンパク質濃度のために分析した。表２１はその結果を表す。膜は実施例１１のようにして再生した。
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【０１１７】
全ての刊行物、特許及び特許文献は、出典明示によりあたかも個々のものが援用されているかのように、その全体が出典明示によりここに援用される。本明細書は様々な特定かつ好適な実施態様及び技法について記載した。しかしながら、本明細書の精神及び範囲に入る限り、多くの変形や修正が可能であることが理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】本明細書の実施態様において、調製方法を達成するための装置を示す。
【図２】本明細書の実施態様において、本方法の様々な段階又は方式に対する様々な観測又は測定プロセス値を例示する。
【図３】本明細書の実施態様において、本方法の様々な段階又は方式に対する様々な観測又は測定プロセス値を例示する。
【図４】本明細書の実施態様において、本方法の様々な段階又は方式に対する様々な観測又は測定プロセス値を例示する。
【図５】本明細書の実施態様において、本方法の様々な段階又は方式に対する様々な観測又は測定プロセス値を例示する。
【図６】本明細書の実施態様において、本方法の様々な段階又は方式に対する様々な観測又は測定プロセス値を例示する。
【図７】本明細書の実施態様において、本方法の様々な段階又は方式に対する様々な観測又は測定プロセス値を例示する。
【図８】本明細書の実施態様において、本方法の様々な段階又は方式に対する様々な観測又は測定プロセス値を例示する。
【図９】本明細書の実施態様において、本方法の様々な段階又は方式に対する様々な観測又は測定プロセス値を例示する。
【図１０】本明細書の実施態様において、本方法の様々な段階又は方式に対する様々な観測又は測定プロセス値を例示する。
【図１１】本明細書の実施態様において、本方法の様々な段階又は方式に対する様々な観測又は測定プロセス値を例示する。
【図１２】本明細書の実施態様において、本方法の様々な段階又は方式に対する様々な観測又は測定プロセス値を例示する。
【図１３】本明細書の実施態様において、本方法の様々な段階又は方式に対する様々な観測又は測定プロセス値を例示する。
【図１４】本明細書の実施態様において、本方法の様々な段階又は方式に対する様々な観測又は測定プロセス値を例示する。
【図１５】本明細書の実施態様において、本方法の様々な段階又は方式に対する様々な観測又は測定プロセス値を例示する。
【図１６】本明細書の実施態様において、本方法の様々な段階又は方式に対する様々な観測又は測定プロセス値を例示する。
【図１７】本明細書の実施態様において、本方法の様々な段階又は方式に対する様々な観測又は測定プロセス値を例示する。
【図１８】本明細書の実施態様において、製品の品質に対する高い温度の影響を例示する。
【図１９】本明細書の実施態様において、製品の品質に対する高い温度の影響を例示する。
【図２０】本明細書の実施態様において、バイオバーデン制御に対する高い温度の影響を例示する。
【図２１】本明細書の実施態様において、バイオバーデン制御に対する高い温度の影響を例示する。
【図２２】本明細書の実施態様において、プロセス流束及びプロセス時間に対する高い温度の影響を例示する。
【図２３】本明細書の実施態様において、スケールアッププロセスの様々な段階又は方式に対する様々な観測又は測定プロセス値を例示する。
【図２４】本明細書の実施態様において、スケールアッププロセスの様々な段階又は方式に対する様々な観測又は測定プロセス値を例示する。
【図２５】本明細書の実施態様において、スケールアッププロセスの様々な段階又は方式に対する様々な観測又は測定プロセス値を例示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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