(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列が配列番号１の核酸配列を含む、ｓｏｄ−３プロモーターの生物学的活性を示すプロモーターを含む単離された核酸分子。
【請求項２】
核酸分子が、ＤＮＡ分子である、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
核酸分子が、ＲＮＡ分子である、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
核酸配列は配列番号１である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子、および、レポーター遺伝子の活性を付与する核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
核酸分子としてＤＮＡを含む請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
ＤＮＡ分子は、真核細胞において、レポーター遺伝子の翻訳可能なＲＮＡの転写および合成を確実にする調節要素に連結している、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子、または、請求項６〜８のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された、トランスジェニック宿主細胞。
【請求項１０】
線虫細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
宿主細胞を請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子、または、請求項６〜８のいずれか一項に記載のベクターでトランスフェクトする工程を含む、トランスジェニック宿主の製造方法。
【請求項１２】
宿主は線虫であり、宿主細胞は線虫細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の宿主細胞を含むトランスジェニック宿主。
【請求項１４】
請求項１０に記載の線虫細胞を含む線虫である、トランスジェニック宿主。
【請求項１５】
調査中の生物の発達段階の進行に影響を受けない、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路を調節する化合物を同定するための方法における、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸、または、請求項６〜８のいずれか一項に記載のベクター、または、請求項９もしくは１０に記載の宿主細胞、または１３もしくは１４に記載の宿主、の使用。
【請求項１６】
ＤＡＦ−２／ＩＲ経路、ＡＫＴ経路のモジュレーター、キナーゼのリン酸化、ホスファターゼの脱リン酸化、および／または、１またはそれ以上のＦＯＸＯ活性を変更するその他の酵素活性のモジュレーターを同定する方法であって：
（ａ）ＤＡＦ−２／ＩＲ経路を不活化した成虫のトランスジェニックＣ．エレガンス（ただし、ｄａｆ−２（ｅ１３６８）は除く）と、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路、ＡＫＴ経路、キナーゼのリン酸化、ホスファターゼの脱リン酸化、および／または、１またはそれ以上のＦＯＸＯ活性を変更するその他の酵素活性を調節する能力に関して試験しようとする１またはそれ以上の化合物とを接触させること（該トランスジェニックＣ．エレガンスは、
（ｉ）プロモーターの核酸配列が、
（1）配列番号１の核酸配列を含む核酸配列；
（2）（1）に記載の核酸配列と９０％またはそれ以上の配列同一性を有する、ｓｏｄ−３プロモーター活性を有し、そして少なくとも１つのフォークヘッド型転写因子の結合部位を含む核酸配列；および、
（3）（1）または（2）に記載の核酸配列の、ｓｏｄ−３プロモーター活性を有し、そして少なくとも１つのフォークヘッド型転写因子の結合部位を含むフラグメント、
からなる群より選択される、ｓｏｄ−３プロモーターの生物学的活性を示すプロモーター、
ならびに、
（ii）レポーター遺伝子の活性を付与する核酸配列
を含む核酸分子、を含む）；
（ｂ）試験しようとする１またはそれ以上の化合物の非存在下および存在下で、場合により１またはそれ以上の適切な参照化合物の存在下で、レポーター遺伝子活性を測定すること；
（ｃ）工程（ｂ）のレポーター遺伝子活性を比較すること；および、
（ｄ）調節化合物を選択すること、
を含む、上記方法。
【請求項１７】
１つまたはそれ以上のＦＯＸＯが活性化された、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
１つまたはそれ以上のＦＯＸＯがＤＡＦ−１６を含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
インスリン／ＩＧＦ−１受容体のようなＡＫＴを調節する化合物または上流調節因子を同定するための、フォークヘッド型転写因子依存性ｓｏｄ−３プロモーターに基づくスクリーニング分析である。
【０００２】
本発明は、ＦＯＸＯフォークヘッド型転写因子活性（「ＦＯＸＯ活性」）を直接的または間接的に調節する化合物のスクリーニングおよび同定プロセス、前記プロセスに適したトランスジェニックＣ．エレガンス、前記プロセスによって同定されたＦＯＸＯ活性を調節する化合物、このような化合物の、疾患の治療および医薬品の製造のための使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ．エレガンスは、えさが豊富だと、成虫になるまでの４つの別個の幼虫段階（L１〜L４）を経て発達する。しかしながら、条件が不都合になると、発達は止まり、その代わりに分散や長期間の生存に特殊化した第三段階の幼虫が形成され、これは、耐性幼虫と呼ばれる。耐性幼虫はえさを必要とせず、長命であり、ストレス耐性である。耐性幼虫は、薄く、より暗い色であり、収縮した咽頭を有する点で、成虫と形態学的に区別することができる。形態学的な変化は、耐性幼虫と成虫における遺伝子発現パターンにおける劇的な変更に関連する。（Ｒｉｄｄｌｅ，１９８８年；ＲｉｄｄｌｅおよびＡｌｂｅｒｔ，１９９７年）。
【０００４】
これまでに、耐性幼虫において構成的な温度感受性を有する系統が同定されており、例えば、２５℃の制限的な温度で、これらの系統は、えさの存在下でも耐性幼虫を形成する（Ｇｅｍｓ，１９９８年）。これらの系統（ｄａｆ系という）の多くのが、線虫のインスリン／ＩＧＦ−１シグナル伝達経路に関与する後天的な遺伝子の突然変異を有することがわかった。表現型の研究により、特定のｄａｆ遺伝子を、ＤＡＦ−２／ＩＲ、ａｇｅ−１／ＰＩ−３キナーゼ、ｐｄｋ−１、ａｋｔ−１、ａｋｔ−２、および、ＦＯＸＯ転写因子ＤＡＦ−１６からなる遺伝経路と関連付けることができた（ＧｏｔｔｌｉｅｂおよびＲｕｖｋｕｎ，１９９４年；Ｒｉｄｄｌｅ，１９７７年；Ｒｉｄｄｌｅ等，１９８１年，Ｋａｅｓｔｎｅｒ等，２０００年）。
【０００５】
ノーザンブロッティングとＲＴ−ＰＣＲによって、ｓｏｄ−３遺伝子の発現は、ＤＡＦ−２／インスリン受容体経路における突然変異によって調節されることが示された（ＨｏｎｄａおよびＨｏｎｄａ，１９９９年）。特定の突然変異体系統におけるＤＡＦ−２機能の不活性化により、ｓｏｄ−３発現の強いアップレギュレーションが起こる。ＨｏｎｄａおよびＨｏｎｄａは、ＤＡＦ−１６は、ｓｏｄ−３遺伝子を活性化する転写因子であること、および、ＤＡＦ−１６は、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路によって阻害されることを示唆している。
【０００６】
その上、転写因子ＤＡＦ−１６に結合するコンセンサス配列が同定されており、この配列は、ｓｏｄ−３上流の調節領域に存在することが示された（Ｆｕｒｕｙａｍａ等，２０００年）。このような最小限のプロモーターに融合した結合モチーフは、哺乳動物組織培養系においてインスリンで調節される発現を起こすには十分である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＤＡＦ−２／インスリン受容体経路およびその構成要素はヒトにおいて極めてよく保存されているため、ヒトにおけるインスリン／ＩＧＦ−１シグナル伝達のモジュレーターを同定するのに耐性幼虫の表現型を使用することが提唱されている（ＷＯ９８／５１３５１Ａ１）。しかしながら、従来技術による分析システムでは、耐性幼虫の発達プログラムが完了するまで長いインキュベート時間が必要となる（通常３〜５日間）。このような長時間により、分析成分の分解が起こる。その上、耐性幼虫の不浸透性のクチクラ構造は、食物摂取の減少と共に、幼虫への化合物吸収を阻害する可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
それゆえに、本発明の根本的な問題は、Ｃ．エレガンス耐性幼虫に依存しておらず、上述の不利益を克服した、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路を調節する化合物を同定するプロセスを提供することである。本発明のプロセス（すなわち本発明の分析システム）は、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路に直接的に関連するデータ読み出しに依存しており、さらに、調査中の生物の発達段階の進行の影響を受けないシステムであり、ここで、上記生物は、好ましくは哺乳動物および線虫細胞、特に線虫細胞、例えばＣ．エレガンスである。その上、本分析は、調査しようとする化合物の存在下での短時間のインキュベート（好ましくは約８〜１２時間以内）の後、定量的なデータ読み出しが提供されるものとする。従来技術の分析システムに比べて、本分析で用いられたレポーターに応じて、定量的なデータ読み出しを得ることができる。
【０００９】
本発明において、驚くべきことに、ｓｏｄ−３遺伝子のプロモーター要素の生物学的活性を有する核酸分子の使用は、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路、例えばｓｏｄ−３プロモーターの活性を調節する遺伝子または化合物の同定に関して多大な利点を有することが発見され、このようなｓｏｄ−３プロモーターとしては、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｒ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ｕｎｄ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（マシェローダーヴェーク（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ）１ｂ，Ｄ−３８１２４ブラウンシュヴァイク，ドイツ）に、ＤＳＭＺ番号１４９１２で、２００２年４月４日に寄託されたもの（ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩでエンドヌクレアーゼ消化した後の、１０９８ｂｐのフラグメント）があり、特に配列番号１に記載のｓｏｄ−３プロモーターである。この調節ＤＮＡフラグメントは、ａｋｔ−１を介してＤＡＦ−２／ＩＲ経路に機能的に連結した、ＦＯＸＯ  ＤＡＦ−１６の結合部位を含む。現在のｄａｆ２／ＩＲシグナル伝達経路の情報にもかかわらず、Ｃ．エレガンスのシグナル伝達活性をモニターするのに適した敏感なプロモーター要素は当業界において既知ではない。ｓｏｄ−３プロモーターがレポーター遺伝子に融合している場合、ＤＡＦ−２／ＩＲ活性の迅速な定量が達成できる。それによって、本発明は、ＤＡＦ−２／ＩＲ活性の定量は、系統のバックグラウンド、または、Ｃ．エレガンスの発達段階（これらは従来技術では同時に起こる）に依存しないという大きな利点を提供する。
【００１０】
従って、本発明の一実施形態は、ｓｏｄ−３プロモーターの生物学的活性を示すプロモーターを含む単離された核酸分子である。好ましくは、本発明の核酸配列は、以下からなる群より選択される：（ａ）配列番号１の核酸配列を含む核酸配列；（ｂ）ｓｏｄ−３プロモーター活性を有する（ａ）の核酸配列に対して８０％、９０％、９５％またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列；（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸配列の、ｓｏｄ−３プロモーター活性を有するフラグメント；および、（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸配列の、ｓｏｄ−３プロモーター活性を有する誘導体であって、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり、より好ましくは配列番号１に対して８０％、９０％、９５％またはそれ以上の配列同一性を有する誘導体である。本発明に係る核酸分子のさらにより好ましい実施形態は、線虫、好ましくはＣ．エレガンスにおいて、ｓｏｄ−３プロモーターの生物学的活性を示すプロモーターを含む。
【００１１】
本発明によれば、ｓｏｄ−３プロモーターの生物学的活性を示すプロモーターは、フォークヘッド型転写因子、好ましくはＦＯＸＯフォークヘッド型転写因子（以下「ＦＯＸＯ」）、特にＤＡＦ−１６に反応性を有するあらゆるプロモーターを意味する。このようなプロモーターとしては、例えば、ＦＯＸＯ１ａ、ＦＯＸＯ３ａ、または、ＦＯＸＯ４反応性プロモーターが挙げられる（Ｋａｅｓｔｎｅｒ等，２０００年）。
【００１２】
本発明によれば、用語「フラグメント」は、ｓｏｄ−３プロモーターの生物学的活性を示すのに十分な長さを有する、本発明の核酸分子のあらゆる部分を意味する。
【００１３】
本発明によれば、用語「誘導体」は、その配列が、本発明の核酸分子の配列とは１またはそれ以上の位置で異なっていてもよいが、本発明の核酸分子の配列と高い相同性を示すことを意味する。従って、「相同体」は、少なくとも５０％の配列同一性を有するものを意味し、特に少なくとも６０％、好ましくは８０％超、さらにより好ましくは９０％超の配列同一性を有する。上述の核酸分子に関するかたより（ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）は、欠失、置換、挿入または組換えによってによって生じたものと考えられる。その上、相同性は、機能的および／または構造的に等価であることを意味する。
【００１４】
本発明の他の実施形態は、本発明に係る、ｓｏｄ−３プロモーター活性を示す前記核酸配列、および、レポーター遺伝子の活性を付与する核酸配列を含む単離された核酸分子（「融合分子」）；本発明に係る核酸分子を含むベクター（これはさらに、場合により、真核細胞においてレポーター遺伝子の翻訳可能なＲＮＡの転写および合成を確実にする調節要素（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）モジュレーターに連結していてもよい）、または、本発明の核酸分子またはベクターで形質転換されたトランスジェニック宿主細胞である。
【００１５】
本発明のさらなる他の実施形態は、本発明の核酸分子またはベクターでトランスフェクトされたトランスジェニック宿主または宿主細胞であり、これらは好ましくは線虫由来であり、および、それらの製造方法であり、本方法において、本発明の核酸分子またはベクターの使用よってトランスジェニック宿主細胞（好ましくは線虫由来）を生成する工程を含む。
【００１６】
本発明のさらなる他の実施形態は、本発明に係る、前記トランスジェニック細胞またはトランスジェニック生物、好ましくは線虫（例えばＣ．エレガンス）を含む、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路、ＡＫＴ経路のモジュレーター、および／または、１またはそれ以上のＦＯＸＯのキナーゼのリン酸化のモジュレーターを同定するプロセス（すなわち本発明に係る「スクリーニング分析」）である。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態は、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路、ＡＫＴ経路のモジュレーター、キナーゼのリン酸化、ホスファターゼの脱リン酸化、および／または、分子組成、安定性（すなわち半減期）、亜細胞の配置、または１もしくはそれ以上のＦＯＸＯ活性を変更する他の活性（例えば酵素）を同定するプロセスであって、本プロセスは、以下を含む：
（ａ）トランスジェニックＣ．エレガンス（好ましくはＬ１幼虫）と、適切な条件下で、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路、ＡＫＴ経路、キナーゼのリン酸化、ホスファターゼの脱リン酸化、および／または、分子組成、安定性（すなわち半減期）、亜細胞の配置、または１もしくはそれ以上のＦＯＸＯ活性を変更する他の活性（例えば酵素）を調節する能力に関して試験しようとする１またはそれ以上の化合物（例えば酵素）とを接触させること（前記トランスジェニックＣ．エレガンス、好ましくはＬ１幼虫は、レポーター遺伝子に融合した本発明の核酸分子、または、前記融合分子を含む本発明のベクターを含む）；
（ｂ）試験しようとする１またはそれ以上の化合物の存在下で、前記レポーター遺伝子
活性を測定すること；
（ｃ）試験しようとする１またはそれ以上の化合物の非存在下で、場合により、１またはそれ以上の適切な参照化合物の存在下で、前記レポーター遺伝子活性を測定すること；
（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）のレポーター遺伝子活性を比較すること；および、
（ｄ）ＤＡＦ−２／ＩＲ経路、ＡＫＴ経路の調節化合物、キナーゼのリン酸化、ホスファターゼの脱リン酸化、および／または、分子組成、安定性（すなわち半減期）、亜細胞の配置、または１もしくはそれ以上のＦＯＸＯ活性を変更する他の活性（例えば酵素）を選択すること。
【００１８】
本発明の他の実施形態は、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路のモジュレーターを同定するプロセスであり、本プロセスは、以下を含む：
（ａ）トランスジェニックＣ．エレガンスのＬ１幼虫と、ストレス条件下でＤＡＦ−２／ＩＲ経路を調節する能力に関して試験しようとする１またはそれ以上の化合物とを接触させること（前記Ｌ１幼虫は、レポーター遺伝子に融合した本発明の核酸分子、または、前記融合分子を含む本発明のベクターを含む）；
（ｂ）試験しようとする１またはそれ以上の化合物の非存在下および存在下で、場合により１またはそれ以上の適切な参照化合物の存在下で、工程（ａ）の条件下で耐性幼虫状態になるＬ１幼虫の量を測定すること；
（ｃ）工程（ｂ）に従って耐性幼虫状態になったＬ１幼虫の量を比較すること；および、
（ｄ）ＤＡＦ−２／ＩＲ経路の調節化合物を選択すること。
【００１９】
本発明によれば、用語「モジュレーター」は、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路、ＡＫＴ経路、キナーゼのリン酸化、ホスファターゼの脱リン酸化、および／または、分子組成、安定性（すなわち半減期）、亜細胞の配置、または１もしくはそれ以上のＦＯＸＯ活性を変更する他の活性（例えば酵素）に対して阻害、活性化または調節作用を有するあらゆる化学分子または遺伝学的要素（例えは酵素）を意味する。
【００２０】
本発明によれば、用語「適切な参照化合物」は、バナジン酸塩、例えば、オルトバナジン酸ナトリウム、モノペルオキソ（ピコリン酸）オキソバナジン酸塩（Ｖ）、または、ビスペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）オキソバナジン酸カリウム（Ｖ）を意味する。
【００２１】
本発明によれば、用語「適切な条件」は、当業者既知のＣ．エレガンスに適したあらゆる培養条件を意味する（例えば、Ｓ．ｕｌｓｔｏｎおよびＨｏｄｇｋｉｎ，１９８０年を参照）。
【００２２】
本発明によれば、用語「ストレス条件」は、Ｃ．エレガンスに適しているが、適切な条件と異なっており、実質的に幼虫を殺さないような部分的に適切な、当業者既知のあらゆる培養条件を意味し、好ましくは、耐性幼虫形成を誘導することがわかっている条件である（例えば、ＳｕｌｓｔｏｎおよびＨｏｄｇｋｉｎ，１９８０年を参照）。
【００２３】
従来の分析（例えば、耐性幼虫状態からの脱出を利用した分析）と比較すると、本発明のスクリーニング分析は、本分析のパフォーマンス速度、定量の実行可能性、および、副作用（例えば発達上の副作用）の回避に関して多大な利点を示す。
【００２４】
本発明に係る分析システムを実施するのに適した定量可能なレポーター遺伝子は、酵素または蛍光特性によって検出することができるタンパク質をコードしていてもよく、このようなタンパク質としては、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、分泌されたアルカリホスファターゼ、緑色蛍光タンパク質、サンゴ礁蛍光タン
パク質、または、当業者既知のその他のレポーターが挙げられる（例えば、Ｈｉｌｌ等，２００１年）。レポーター活性は、生物の溶解産物で測定してもよいし、または、インサイチュで生きている細胞または動物で測定してもよい。
【００２５】
ＤＡＦ−２／ＩＲまたはＡＫＴ経路の阻害剤の同定においてレポーターの活性化が確認されれば、レポーター活性のダウンレギュレーションは、前記経路のアクチベーターを示す。このようなレポーターは、野生型Ｃ．エレガンスにおいて用いてもよいし、または、例えば耐性幼虫経路に関する遺伝子に突然変異を含む可能性のある特定の系統（好ましくはｄａｆ−２突然変異体系統）と組合わせて用いてもよい。
【００２６】
ＤＡＦ−２／ＩＲ経路の要素のシグナル伝達を阻害する同定された化合物は、腫瘍学と心臓肥大症の分野における治療剤として有望な候補であり、一方で、前記経路のアクチベーターは、糖尿病、脳／心臓の虚血、または、神経変性病の治療における治療剤として有望な候補である。
【００２７】
以下の実施例は本発明を限定するのではなく、単に本発明の概念を説明するものとする。
【００２８】
材料および方法
以前に説明された通りに、プロテイナーゼＫとフェノール抽出を用いて野生型Ｃ．エレガンス（Ｎ２）からゲノムＤＮＡを調製した（ＳｕｌｓｔｏｎおよびＨｏｄｇｋｉｎ，１９８０年）。
【００２９】
Ｆｉｒｅ等（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４８巻，１９章（Ｃ．ＭｅｌｌｏおよびＡ．Ｆｉｒｅ），アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ））に従って、Ｃ．エレガンスベクターｐＰＤ４９．２６、および、ｐＰＤ９５．７５を用いた。
【００３０】
実施例１：ｓｏｄ−３プロモーターの単離
ｓｏｄ−３遺伝子の調節配列を単離するために、開始コドンの１２６６ｂｐ上流を、野生型Ｃ．エレガンス（Ｎ２，Ｂｒｉｓｔｏｌ，Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ，２５０  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，ミネソタ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ），１４４５ゴートナーアベニュー，セントポール，ミネソタ州５５１０８−１０９５，米国）のゲノムＤＮＡから、上流プライマーｓｏｄ−５Ｕ（配列番号２）と、下流プライマーｓｏｄ−３Ｕ（配列番号３）とを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し、３’ＢａｍＨＩ制限部位をＰＣＲ産物に付加した。用いられたオリゴヌクレオチドプライマーは以下の通りである：
フォワードｓｏｄ−５Ｕ：５’−ａｇｔｔｔｔａａａｇａｔｔｔｔａｔｔｃａｔａｇｔｃｃ−３’（配列番号２）；
リバースｓｏｄ−３Ｄ：５’−ｇｇａｔｃｃｔｔｔａｔｔｃａｃｔｇａａａａｔｔａｇａａｇａｔｔ−３’（配列番号３）。
それに続いて、得られた１２６６ｂｐのＰＣＲ産物の同定を配列解析によって確認した。ｐＰＤ４９．２６主鎖に、ａ）ｓｏｄ−３プロモーターの１０９８ｂｐのＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとのフラグメント、および、ｂ）ｐＰＤ９５．７５（ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩのフランキング制限部位を含む）から増幅した、ＧＦＰのＰＣＲフラグメントをクローニングすることによって、ＧＦＰ発現ベクターをアセンブルした。
得られたｓｏｄ−３：：ＧＦＰ融合体を含むＣ．エレガンス発現ベクターを、ｐＭＧＣ２−２４と命名した。
【００３１】
実施例２：トランスジェニックＣ．エレガンス
ｄａｆ−２（ｅ１３６８）動物およびトランスジェニック動物を標準的な手順に従って得た（ＭｅｌｌｏおよびＦｉｒｅ，１９９５年）。ＭｅｌｌｏおよびＦｉｒｅの方法とは異なり、プラスミドｐＭＧＣ２−２４を、インジェクションマーカーｔｔｘ−３：：ＧＦＰと共に、前記動物の性腺に注入した。３種の独立した系がＧＦＰ陽性動物の単離によって単離された。
【００３２】
実施例３：ＤＡＦ−２／インスリン受容体経路に特異的な読み出し
様々な温度でｄａｆ−２（ｅ１３６８）動物におけるｓｏｄ−３：：ＧＦＰの発現を比較することによって、ｓｏｄ−３プロモーターの調節が実証された。ｄａｆ−２（ｅ１３６８）系統は、ＤＡＦ−２／ＩＲのリガンド結合ドメインにおける温度感受性の突然変異を含み、２５℃でＤＡＦ−２の不活性化を起こす。許容できる温度（１５℃）で４日間Ｌ１幼虫を成長させた際、成虫動物の尾、頭部および陰門においてＧＦＰの弱い発現を検出することができた。ＧＦＰの全体的な発現は極めて低かった。これは、２５℃の制限的な温度でＬ１幼虫を成長させると、ＤＡＦ−２の不活性化を伴って劇的に変化した。これらの条件下で、Ｃ．エレガンスは、耐性幼虫で停止し、ＧＦＰ蛍光は、全動物で強くアップレギュレートされた。ｄａｆ−１６遺伝子にさらなる欠失を有するｄａｆ−２（ｅ１３６８）系では、ｓｏｄ−３：：ＧＦＰのアップレギュレーションはなくなった。同様に、これらの実験条件下で、正常なＤＡＦ−２／ＩＲ機能を有する野生型Ｎ２の幼虫を２５℃で維持すると、耐性幼虫を形成しなかっただけでなく、ｓｏｄ−３発現の増加に応答もしなかった。
それゆえに、ｓｏｄ−３：：ＧＦＰ発現の調節は、２５℃でのｄａｆ−２（ｅ１３６８）系におけるＤＡＦ−２／ＩＲ経路の不活性化と関連していた。このデータは、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路が、転写因子ＤＡＦ−１６を阻害するように作用し、別な方法でｓｏｄ−３遺伝子の転写を活性化するモデルと一致している。それゆえに、上記レポーターは、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路がスイッチオフされると活性化され、ＤＡＦ−２／ＩＲ経路がスイッチオンされると不活性化される。
【００３３】
実施例４：ｓｏｄ−３：：ＧＦＰレポーターは、発達段階とは無関係に調節される
ｓｏｄ−３：：ＧＦＰレポーターを含むｄａｆ−２（ｅ１３６８）動物を、成虫への発達を終えるまで１５℃に維持し、続いて、２５℃（制限的な温度）で成虫に変化させ、ＤＡＦ−２／ＩＲを不活性化した。耐性幼虫で観察されるように、制限的な温度に晒された成虫もまた、許容できる温度（１５℃）で維持された動物に比べてさらに多くのＧＦＰを示した。比重走査により、ＧＦＰの平均が、２．６±１．７（許容できる温度）から、５３．５±１４．６（制限的な温度）へ増加したことが明らかになった。成虫におけるＧＦＰ発現の増加の規模は、２５℃で即座に変化して耐性幼虫になるＬ１で観察される増加の規模と同じオーダーである（平均ＧＦＰ：８７．８±３５．３）。この結果により、ｓｏｄ−３プロモーターの調節は、Ｃ．エレガンスの発達段階とは無関係であること、および、ｄａｆ−２／ＩＲ遺伝子の不活性化の結果としてｓｏｄ−３プロモーターのアップレギュレーションがあらゆる時点で誘導され得ることがが示される。その結果として、成虫Ｃ．エレガンスを用いたスクリーニングにｓｏｄ−３Ｃ．エレガンス系を用いることができ、従って、化合物が線虫の発達を妨害することを防ぐことができる。加えて、本分析は発達プログラムの完了に無関係であるため、インキュベート時間を短くすることができる。
【００３４】
配列番号１（ｓｏｄ−３プロモーター（ＤＳＭＺプラスミドｐＭＧＣ２−２４のＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩとのフラグメント））。配列は、制限部位ＨｉｎｄＩＩＩで始まり、制限部位ＢａｍＨＩで終わっている：
【化１】
0005380518.tif 000002
【００３５】
文献：
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