(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体又は検体に付された蛍光物質が表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を測定する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、
所定の面上に金属膜が形成されるプリズムを含む分析チップを着脱できるように保持可能なチップ保持部と、
前記チップ保持部で保持された状態の前記分析チップに含まれるプリズムの金属膜で反射されるように当該プリズム内に直線偏光された励起光を入射させる光源部と、
前記光源部と前記プリズムとの間における前記励起光の光路上に配置される１／２波長板を有し且つこの１／２波長板が当該１／２波長板を通過した励起光の前記金属膜に対する偏向方向が変わるように回転可能である偏光方向調整部と、
前記励起光が金属膜で反射されることにより当該金属膜及びこれと隣接する領域において生じる光の光量を測定可能な光測定部と、
前記光測定部によって測定される光に含まれる前記蛍光の光量に基づき前記検体の分析を行う制御処理部と、を備え、
前記制御処理部は、前記金属膜に対するＰ波方向と前記プリズムの光学主軸とのなす角であるズレ角に基づいて前記光測定部により測定される蛍光の光量を補正し、
前記ズレ角は、前記光源部が励起光を射出した状態で前記偏光方向調整部の１／２波長板を回転させつつ前記光測定部によって前記金属膜及びこれと隣接する領域で生じる光を測定することにより得られる最大光量と最小光量とから求められることを特徴とする表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
【請求項２】
検体又は検体に付された蛍光物質が表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を測定する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、
所定の面上に金属膜が形成されたプリズムと、
前記金属膜で反射されるように前記プリズム内に直線偏光された励起光を入射させる光源部と、
前記光源部と前記プリズムとの間における前記励起光の光路上に配置される１／２波長板を有し且つこの１／２波長板が当該１／２波長板を通過した励起光の前記金属膜に対する偏向方向が変わるように回転可能である偏光方向調整部と、
前記励起光が金属膜で反射されることにより当該金属膜及びこれと隣接する領域において生じる光の光量を測定可能な光測定部と、
前記光測定部によって測定される光に含まれる前記蛍光の光量に基づき前記検体の分析を行う制御処理部と、を備え、
前記制御処理部は、前記金属膜に対するＰ波方向と前記プリズムの光学主軸とのなす角であるズレ角に基づいて前記光測定部により測定される蛍光の光量を補正し、
前記ズレ角は、前記光源部が励起光を射出した状態で前記偏光方向調整部の１／２波長板を回転させつつ前記光測定部によって前記金属膜及びこれと隣接する領域で生じる光を測定することにより得られる最大光量と最小光量とから求められることを特徴とする表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
【請求項３】
前記偏光方向調整部は、前記１／２波長板を回転させる回転駆動部を有し、
前記制御処理部は、前記光源部と前記回転駆動部と前記光測定部とを制御すると共に、
前記光源部が励起光を射出した状態で前記回転駆動部によって前記１／２波長板を回転させつつ前記光測定部によって前記金属膜及びこれと隣接する領域で生じる光を測定することにより得られる最大光量と最小光量とから前記ズレ角を求めるズレ角導出部と、
前記光測定部により測定される前記蛍光の光量を前記ズレ角導出部で求められるズレ角に基づいて補正する補正部と、を備えることを特徴とする請求項１又は２に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
【請求項４】
前記ズレ角導出部は、前記ズレ角をθｉ、前記最大光量をＤＲｍａｘ、前記最小光量をＤＲｍｉｎ、前記励起光が前記金属膜で反射した状態で且つ当該金属膜に表面プラズモン共鳴が生じてない状態のときに前記光測定部により測定される光の光量である表面拡散光量をＳＫ、としたときに、以下の式（１）によって前記ズレ角を求めることを特徴とする請求項３に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
【数１】
0005472033.tif 000019
【請求項５】
前記制御処理部は、前記表面拡散光量を格納可能な記憶部を有し、
前記ズレ角導出部は、この記憶部に格納された前記表面拡散光量を用いて前記ズレ角を求めることを特徴とする請求項４に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
【請求項６】
前記光測定部は、前記金属膜及びこれと隣接する領域で生じた光に含まれる前記蛍光の光量を測定し、
前記ズレ角導出部は、前記光源部が励起光を射出した状態で前記偏光方向調整部の１／２波長板を前記回転駆動部によって回転させつつ前記光測定部によって測定する前記蛍光の最大蛍光量と最小蛍光量とから前記ズレ角を求めることを特徴とする請求項３に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
【請求項７】
前記ズレ角導出部は、前記ズレ角をθｉ、前記最大蛍光量をＳｍａｘ、前記最小蛍光量をＳｍｉｎ、としたときに、以下の式（２）によって前記ズレ角を求めることを特徴とする請求項６に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
【数２】
0005472033.tif 000020
【請求項８】
前記プリズム内に入射した励起光が複屈折しない場合に前記光測定部によって測定される蛍光の光量を求めるための補正値を前記ズレ角導出部で求められたズレ角から求める補正値導出部を備え、
前記補正値導出部は、前記補正値をＫとしたときに、以下の式（３）によって前記補正値を求めることを特徴とする請求項４，５，７のいずれか１項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
【数３】
0005472033.tif 000021
【請求項９】
前記プリズムは、誘電体により形成されていることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
【請求項１０】
検体又は検体に付された蛍光物質が表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を測定する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、
所定の面上に金属膜が形成されたプリズムを用意し、前記金属膜上に前記検体を含む試料液を流す準備工程と、
前記金属膜に表面プラズモン共鳴を生じさせるための直線偏光された励起光が前記金属膜で反射されるように当該励起光をプリズム内に入射させ、その状態を保ちつつ当該金属膜に対する励起光の偏光方向を変えながら前記励起光が前記金属膜で反射されることにより当該金属膜及びこれに隣接する領域で生じる光の光量を測定する測定工程と、
前記測定工程で測定された最大光量と最小光量とから前記金属膜に対するＰ波方向と前記プリズムの光学主軸とのなす角であるズレ角を求めるズレ角導出工程と、
前記励起光が前記金属膜で反射することにより当該金属膜及びこれに隣接する領域で生じる光に含まれる蛍光の光量を測定し、この光量を前記ズレ角導出工程で求めたズレ角に基づいて補正することによって前記検体の検出を行う分析工程と、を備えることを特徴とする表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：ＳＰＲ）を利用して試料液中に含まれる検体の検出を行う表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質やＤＮＡ等を検出するバイオ測定において、検体（被検出物質）を高感度に検出する方法として、表面プラズモン共鳴蛍光分析（表面プラズモン励起増強蛍光分光：ＳＰＦＳ）法が知られている。
【０００３】
ＳＰＦＳ法は、金や銀等からなる金属膜が所定の面上に形成されたプリズムにおいて、全反射条件でプリズム側から金属膜に励起光を入射させ、屈折率の異なるプリズムと金属膜との界面で励起光が全反射する際にこの界面からしみ出す光（エバネッセント波）を利用する。具体的に、ＳＰＦＳ法は、励起光が全反射する際にしみ出すエバネッセント波によって、金属膜の表面上に流した試料液中に含まれる検体又はこの検体に付された蛍光物質（標識物質）が励起されて発する蛍光（励起蛍光）を分析することにより、上記検体の存在又はその量を検出することができる。
【０００４】
このようなＳＰＦＳ法を利用する光学測定において、金属膜での表面プラズモン共鳴の励起には励起光のＰ波成分しか寄与しないため、金属膜にＰ波偏光した励起光を入射させる。
【０００５】
しかし、検査毎にプリズムを交換して検体の検出を行う場合、Ｐ波偏光した同一の励起光をプリズムに照射しても、金属膜に入射する励起光のＰ波成分の光量が一定せず、測定結果にばらつきが生じる。これは、プリズム内に入射した励起光が複屈折することにより位相回転が生じることに起因している。
【０００６】
具体的には、プリズム内に入射した励起光は、複屈折による位相回転によってＳ波成分が生じるとこれに伴ってＰ波成分が減少する。また、複屈折は、プリズムの成形時に発生するプリズム内の密度差によって生じるため、プリズム毎に複屈折率が異なる。そのため、偏光方向が同じ励起光をプリズムに照射してもプリズム毎に金属膜に入射する励起光のＰ波成分の光量にばらつきが生じる。特に、プリズムが一般に複屈折の度合いの大きな樹脂等の誘電体によって形成されている場合、プリズム毎の複屈折の度合いのばらつきが大きくなり金属膜に入射するＰ波成分の光量のばらつきが顕著になる。
【０００７】
金属膜に入射する励起光のＰ波成分の光量がばらつくと、表面プラズモン共鳴に基づくエバネッセント波（増強電場）のしみ出し量にもばらつきが生じる。このように、プリズム毎に金属膜に入射する励起光のＰ波成分の光量が一定せずにエバネッセント波のしみ出し量がばらつくと、同じ試料液に対する検体の検出を行っても、プリズム毎に測定される励起蛍光の光量がばらつくため、測定結果（検体の分析結果）にばらつきが生じる。即ち、ＳＰＦＳ法を利用する光学測定において検査毎にプリズムを交換する場合には、プリズム毎の複屈折の度合いのばらつきが検体の測定結果に影響する。
【０００８】
そこで、検査毎にプリズムを交換して検体の検出を行う場合に各プリズムにおける金属膜に入射する励起光のＰ波成分の光量を一定にして、プリズム毎の複屈折の度合いのばらつきの測定結果への影響を抑えた分析装置が開発された（特許文献１参照）。
【０００９】
この分析装置では、励起光光源からプリズムまでの間の励起光の光路上に当該励起光の偏光状態を調整するための偏光状態調整部が設けられている。
【００１０】
この偏光状態調整部は、１／２波長板や１／４波長板等の複数の偏光素子と、これら各偏光素子をそれぞれ駆動するアクチュエータ等の複数の駆動装置と、金属膜で反射された後の励起光（反射励起光）の光量を測定する受光部と、を備える。この偏光状態調整部が設けられた分析装置は、反射励起光の光量に基づいて、駆動装置により各偏光素子をそれぞれ駆動してその位置や姿勢を調整することにより励起光の偏光状態を調整する。具体的には、この分析装置では、プリズムに入射する前の励起光の偏光方向の傾きや偏光状態の広がり具合等を複数の偏光素子によって調整することによって、金属膜にＰ波偏光の励起光が入射するようにしている。これにより、プリズム毎の複屈折の度合いのばらつきの測定結果への影響が抑えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００９−２３６７０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、上記の分析装置では、受光部で測定した反射励起光の光量をフィードバックしながら複数の偏光素子の位置や姿勢をそれぞれ調整するため、この調整のための時間が必要となり検体の分析に時間がかかる。
【００１３】
また、上記の分析装置では、複数の偏光素子と各偏光素子を駆動する複数の駆動装置とが必要であるため、当該分析装置の小型化を図ることが難しかった。
【００１４】
そこで、本発明は、上記問題点に鑑み、プリズム毎の複屈折の度合いのばらつきの測定結果への影響を抑制すると共に、分析時間の短縮及び装置の小型化を図ることができる表面プラズモン共鳴蛍光分析装置、及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
そこで、上記課題を解消すべく、本発明は、検体又は検体に付された蛍光物質が表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を測定する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、所定の面上に金属膜が形成されるプリズムを含む分析チップを着脱できるように保持可能なチップ保持部と、前記チップ保持部で保持された状態の前記分析チップに含まれるプリズムの金属膜で反射されるように当該プリズム内に直線偏光された励起光を入射させる光源部と、前記光源部と前記プリズムとの間における前記励起光の光路上に配置される１／２波長板を有し且つこの１／２波長板が当該１／２波長板を通過した励起光の前記金属膜に対する偏向方向が変わるように回転可能である偏光方向調整部と、前記励起光が金属膜で反射されることにより当該金属膜及びこれと隣接する領域において生じる光の光量を測定可能な光測定部と、前記光測定部によって測定される光に含まれる前記蛍光の光量に基づき前記検体の分析を行う制御処理部と、を備える。そして、前記制御処理部は、前記金属膜に対するＰ波方向と前記プリズムの光学主軸とのなす角であるズレ角に基づいて前記光測定部により測定される蛍光の光量を補正し、前記ズレ角は、前記光源部が励起光を射出した状態で前記偏光方向調整部の１／２波長板を回転させつつ前記光測定部によって前記金属膜及びこれと隣接する領域で生じる光を測定することにより得られる最大光量と最小光量とから求められることを特徴とする。
【００１６】
また、上記課題を解消すべく、本発明は、検体又は検体に付された蛍光物質が表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を測定する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、所定の面上に金属膜が形成されたプリズムと、前記金属膜で反射されるように前記プリズム内に直線偏光された励起光を入射させる光源部と、前記光源部と前記プリズムとの間における前記励起光の光路上に配置される１／２波長板を有し且つこの１／２波長板が当該１／２波長板を通過した励起光の前記金属膜に対する偏向方向が変わるように回転可能である偏光方向調整部と、前記励起光が金属膜で反射されることにより当該金属膜及びこれと隣接する領域において生じる光の光量を測定可能な光測定部と、前記光測定部によって測定される光に含まれる前記蛍光の光量に基づき前記検体の分析を行う制御処理部と、を備える。そして、前記制御処理部は、前記金属膜に対するＰ波方向と前記プリズムの光学主軸とのなす角であるズレ角に基づいて前記光測定部により測定される蛍光の光量を補正し、前記ズレ角は、前記光源部が励起光を射出した状態で前記偏光方向調整部の１／２波長板を回転させつつ前記光測定部によって前記金属膜及びこれと隣接する領域で生じる光を測定することにより得られる最大光量と最小光量とから求められることを特徴とする。
【００１７】
これらの発明によれば、プリズム内で励起光が複屈折した状態で測定された蛍光の光量をズレ角に基づいて補正することにより、プリズム内で励起光が複屈折せずに金属膜に入射（金属膜で反射）したときに測定される蛍光の光量（複屈折に基づく誤差を抑えた蛍光の光量）が得られる。これにより、検査毎にプリズムを交換しても、各プリズムにおいて複屈折による位相回転が生じることなく励起光が金属膜に入射した場合に測定される蛍光の光量をそれぞれ得ることができるため、プリズム毎の複屈折の度合いのばらつきに起因する測定誤差を効果的に抑制することができる。
【００１８】
しかも、１／２波長板を回転させつつ金属膜及びその隣接する領域で生じる光の光量を測定するだけで測定値に含まれる誤差を低減できるため、従来の分析装置のように反射励起光の光量を測定してその測定結果をフィードバックしながら複数の偏光素子の位置や姿勢をそれぞれ調整する必要がなく、検体の分析時間を短縮することが可能となる。
【００１９】
さらに、これらの発明によれば、１／２波長板を回転可能に１つ設ければよく、複数の偏光素子とこれらの位置と姿勢とをそれぞれ制御する駆動装置とを備えた従来の分析装置に比べ、分析装置の構成の簡素化及び小型化を図ることが可能となる。
【００２０】
本発明に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置では、前記偏光方向調整部は、前記１／２波長板を回転させる回転駆動部を有し、前記制御処理部は、前記光源部と前記回転駆動部と前記光測定部とを制御すると共に、前記光源部が励起光を射出した状態で前記回転駆動部によって前記１／２波長板を回転させつつ前記光測定部によって前記金属膜及びこれと隣接する領域で生じる光を測定することにより得られる最大光量と最小光量とから前記ズレ角を求めるズレ角導出部と、前記光測定部により測定される前記蛍光の光量を前記ズレ角導出部で求められるズレ角に基づいて補正する補正部と、を備えることが好ましい。
【００２１】
かかる構成によれば、分析装置において自動的に補正値の導出と、複屈折に基づく誤差が抑えられた蛍光の光量の検出と、検体の分析とが行われる。
【００２２】
このとき、前記ズレ角導出部は、前記ズレ角をθｉ、前記最大光量をＤＲｍａｘ、前記最小光量をＤＲｍｉｎ、前記励起光が前記金属膜で反射した状態で且つ当該金属膜に表面プラズモン共鳴が生じてない状態のときに前記光測定部により測定される光の光量である表面拡散光量をＳＫ、としたときに、以下の式（１）によって前記ズレ角を求める。
【数１】
0005472033.tif 000002
【００２３】
尚、前記表面プラズモン共鳴蛍光分析装置において、前記制御処理部が、前記表面拡散光量を格納可能な記憶部を有し、前記ズレ角導出部が、この記憶部に格納された前記表面拡散光量を用いて前記ズレ角を求めるように構成されれば、検査毎に表面拡散光量の測定を行わなくてもズレ角を求めることができ、検体の分析時間を短縮することができる。
【００２４】
本発明の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置では、前記表面プラズモン共鳴蛍光分析装置において、測定される蛍光（検体又はこれに付される蛍光物質が発する蛍光）がプリズム内で生じる自家蛍光よりも大きい場合には、前記光測定部が、前記金属膜及びこれと隣接する領域で生じた光に含まれる前記蛍光の光量を測定し、前記ズレ角導出部が、前記光源部が励起光を射出した状態で前記偏光方向調整部の１／２波長板を前記回転駆動部によって回転させつつ前記光測定部によって測定する前記蛍光の最大蛍光量と最小蛍光量とから前記ズレ角を求めてもよい。
【００２５】
この場合、光測定部は金属膜及びこれに隣接する領域で生じる光に含まれる蛍光だけを測定できればよく、構成を簡素化することが可能となる。
【００２６】
詳しくは、金属膜で生じた表面プラズモン共鳴に起因し、この金属膜及びこれに隣接する領域で生じる光としては、例えば、プラズモン散乱光やラマン散乱光といった散乱光や、蛍光物質等がエバネッセント波（増強電場）に励起されて発する蛍光等がある。これら散乱光と蛍光とは光量が大きく異なるため、各光を測定するには、各光量に応じた複数の光量測定装置を切り換え可能に配置したり、一つの光量測定装置で測定する場合には減光フィルター等の減光部材を光量測定装置の受光部の前に出し入れ可能にして受光部に入射する光量を調整できるようにしなければならず、光測定部の構成が非常に複雑になると共に装置の小型化が図れない。しかし、光測定部が蛍光の光量のみを測定する場合には、減光部材等がなくてもよいため、散乱光と蛍光とを測定する光測定部に比べて構成を簡素化することができる。
【００２７】
このように、光測定部が蛍光のみを測定する場合、前記ズレ角導出部は、前記ズレ角をθｉ、前記最大蛍光量をＳｍａｘ、前記最小蛍光量をＳｍｉｎ、としたときに、以下の式（２）によって前記ズレ角を求める。
【数２】
0005472033.tif 000003
【００２８】
ここで、本発明に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置では、ズレ角導出部が上記の最大光量と最小光量とからズレ角θｉを求める構成であっても、上記の最大蛍光量と最小蛍光量とからズレ角θｉを求める構成であっても、前記プリズム内に入射した励起光が複屈折しない場合に前記光測定部によって測定される蛍光の光量を求めるための補正値を前記ズレ角導出部で求められたズレ角から求める補正値導出部を備え、前記補正値導出部は、前記補正値をＫとしたときに、以下の式（３）によって前記補正値を求める。
【数３】
0005472033.tif 000004
【００２９】
尚、前記プリズムは、誘電体により形成されている場合には、上記の各効果がより顕著に得られる。即ち、樹脂等の誘電体で形成されるプリズムはガラスのプリズムに比べて複屈折の度合いが大きいことから、プリズム毎の複屈折の度合いのばらつきも大きくなるが、当該表面プラズモン共鳴蛍光分析装置では、プリズム毎の複屈折の度合いのばらつきの測定結果への影響が効果的に抑制されるため、検査毎にプリズムを交換しても、検体の検出を精度よく行うことが可能である。
【００３０】
また、上記課題を解消すべく、本発明は、検体又は検体に付された蛍光物質が表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を測定する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、所定の面上に金属膜が形成されたプリズムを用意し、前記金属膜上に前記検体を含む試料液を流す準備工程と、前記金属膜に表面プラズモン共鳴を生じさせるための直線偏光された励起光が前記金属膜で反射されるように当該励起光をプリズム内に入射させ、その状態を保ちつつ当該金属膜に対する励起光の偏光方向を変えながら前記励起光が前記金属膜で反射されることにより当該金属膜及びこれに隣接する領域で生じる光の光量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定された最大光量と最小光量とから前記金属膜に対するＰ波方向と前記プリズムの光学主軸とのなす角であるズレ角を求めるズレ角導出工程と、前記励起光が前記金属膜で反射することにより当該金属膜及びこれに隣接する領域で生じる光に含まれる蛍光の光量を測定し、この光量を前記ズレ角導出工程で求めたズレ角に基づいて補正することによって前記検体の検出を行う分析工程と、を備えることを特徴とする。
【００３１】
この発明によれば、検査毎にプリズムを交換しても、プリズム毎の複屈折の度合いのばらつきに関わりなく、複屈折による位相回転が生じることなく励起光が金属膜に入射した場合に生じる蛍光の光量（複屈折に基づく誤差が抑えられた蛍光の光量）を検出することができ、その結果、プリズム毎の複屈折の度合いのばらつきの測定結果への影響を効果的に抑制することができる。
【発明の効果】
【００３２】
以上より、本発明によれば、プリズム毎の複屈折の度合いのばらつきの測定結果への影響を抑制すると共に、分析時間の短縮及び装置の小型化を図ることができる表面プラズモン共鳴蛍光分析装置、及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】第１実施形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置において分析チップが設置された状態の構成を示すブロック図である。
【図２】前記表面プラズモン共鳴蛍光分析装置におけるチップ保持部及びこのチップ保持部に保持された状態の分析チップの構成を示す拡大図である。
【図３】前記表面プラズモン共鳴蛍光分析装置における励起光の偏光状態及び金属膜における励起光の照射領域を示す図である。
【図４】前記表面プラズモン共鳴蛍光分析装置の測定光学系を説明するための図である。
【図５】第１実施形態及び第２実施形態の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置における制御処理部の機能ブロック図である。
【図６】第１実施形態及び第２実施形態の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置において検体を分析するときの基本シーケンスを示すフローチャートである。
【図７】第１実施形態の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置における共鳴角走査シーケンスを示すフローチャートである。
【図８】第１実施形態及び第２実施形態の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置における最適位置走査シーケンスを示すフローチャートである。
【図９】第１実施形態及び第２実施形態の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置における複屈折測定シーケンスを示すフローチャートである。
【図１０】第１実施形態の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置における励起蛍光測定シーケンスを示すフローチャートである。
【図１１】前記表面プラズモン共鳴蛍光分析装置における反射部材の第２の位置決めを説明する図である。
【図１２】長軸回転量（ズレ角）θｉと補正値Ｋとを説明するための図である。
【図１３】第２実施形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置において分析チップが設置された状態の構成を示す機能ブロック図である。
【図１４】第２実施形態の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置における共鳴角走査シーケンスを示すフローチャートである。
【図１５】第２実施形態の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置における励起蛍光測定シーケンスを示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明の第１実施形態について、添付図面を参照しつつ説明する。
【００３５】
本実施形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置（以下、単に「分析装置」とも称する。）は、プリズムに全反射条件で入射した励起光の反射界面からしみ出すエバネッセント波（増強電場）を利用して被検出物質（以下、単に「検体」とも称する。）に標識された（付された）蛍光物質を励起させ、これにより生じた蛍光の光量を検出することによって検体の検出を行う装置である。
【００３６】
分析装置は、図１に示されるように、分析チップ５０を保持するチップ保持部１２と、チップ保持部１２に保持された状態の分析チップ５０に励起光を出射する励起光射出部２０と、分析チップ５０で生じた光の強度を測定する光測定部４０と、これらチップ保持部１２、励起光射出部２０、及び光測定部４０等の分析装置１０の各構成要素の制御を行うと共に各種演算処理を行う制御処理部１４（制御部）と、演算結果等の各種情報を表示する表示部１６とを備える。また、分析装置１０は、患者からの血液等の前処理を行う前処理部（図示省略）も備える。この前処理部は、試薬チップ（図略）を受け入れ、この試薬チップに注入されている血液等の前処理（血球分離や希釈、混合等）を行って試料液を生成し、この試料液を分析チップ５０に注入する部位である。試薬チップには、複数の収納部が設けられ、各収納部には血液等の他に、試薬、希釈液、洗浄液等が個別に封入されている。
【００３７】
分析チップ５０は、図２にも示されるように、プリズム５１と、プリズム５１の表面に形成される金属膜５５と、金属膜５５上を当該金属膜５５に接しつつ検体を含む試料液や洗浄液等が流れる流路５８を形成する流路部材５７とを備える。本実施形態の分析チップ５０は、検体の検出（分析）毎に交換される。
【００３８】
プリズム５１は、励起光射出部２０からの励起光αを内部に入射させる入射面５２と、この内部に入射した励起光αが反射される金属膜５５が形成される成膜面（所定の面）５３と、金属膜５５で反射された励起光αがプリズム５１の外部に射出される射出面５４とをその表面に含み、透明なガラス又は樹脂により形成されている。射出面５４は、励起光αが金属膜５５（詳細には、金属膜５５と成膜面５３との界面）で反射した後に最初に当る面であり、金属膜５５で反射した励起光αのＳ波成分の光がプリズム５１の内部で留まらないように、入射面５２と同様に、光学面に形成される。本実施形態のプリズム５１は、複屈折特性を有する。具体的に、プリズム５１は、屈折率が１．４〜１．６程度の透明な樹脂（誘電体）により形成される。尚、プリズム５１は、ガラスにより形成されてもよい。また、プリズム５１は、入射面５２と成膜面５３と射出面５４とをその表面に含み、入射面５２から内部に入射した励起光αが成膜面５３上の金属膜５５で全反射され、この励起光α（詳細には、励起光αのＳ波成分）が内部で乱反射して留まらずに射出面５４から外部に射出されるような形状であればよい。
【００３９】
金属膜５５は、プリズム５１の成膜面５３上に成膜（形成）された金属製の薄膜であり、本実施形態では、金により形成されている。この金属膜５５は、全反射条件でプリズム５１内に入射した励起光αが金属膜５５と成膜面５３との界面で全反射することにより生じるエバネッセント波（増強電場）を増幅するための部材である。即ち、成膜面５３上に金属膜５５を設けてこの金属膜５５に表面プラズモン共鳴を生じさせることにより、金属膜５５のない面（成膜面５３）で励起光αを全反射させてエバネッセント波を生じさせる場合に比べ、形成されるエバネッセント波を増幅させる（即ち、金属膜５５の表面５５ａ近傍に増強電場を形成する）ことができる。
【００４０】
尚、金属膜５５の素材は、金に限定されず、表面プラズモン共鳴を生じさせる金属であればよく、例えば、銀、銅、アルミ等（合金を含む）であってもよい。
【００４１】
また、金属膜５５の表面（プリズム５１と反対側の面）５５ａには、特定の抗原を捕捉するための捕捉体５６が固定されている。この捕捉体５６は、表面処理によって金属膜５５の表面５５ａに固定される。
【００４２】
流路部材５７は、プリズム５１の成膜面５３上に設けられ、この成膜面５３と共に試料液が流れる流路５８を形成する。この流路部材５７は、透明な樹脂により形成され、接着剤、レーザ溶着や超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着等によりプリズム５１に接合されている。流路５８は、金属膜５５と試料液とが接する領域が光測定部４０の測定領域よりも広くなるような形状を有する。
【００４３】
このように構成される分析チップ５０は、分析装置１０の前処理部に設置されると、この前処理部において前処理が終わった試料液が流路５８内に注入（供給）される。そして、試料液が注入された分析チップ５０は、金属膜５５上に固定された捕捉体５６と検体（特定の抗原）との反応が終了するとチップ保持部１２まで搬送され、このチップ保持部１２に所定の姿勢で保持される。
【００４４】
チップ保持部１２は、検体の検出のときに分析チップ５０を保持する。具体的に、このチップ保持部１２は、励起光射出部２０から射出された励起光αが全反射条件で入射面５２からプリズム５１の内部に入射してこの入射した励起光αが金属膜５５で反射されるような姿勢で分析チップ５０を着脱可能に保持する。本実施形態のチップ保持部１２は、流路部材５７の下側にプリズム５１が位置する姿勢で分析チップ５０を保持する。
【００４５】
尚、分析装置１０には、射出面５４から射出された光の影響が光測定部４０に及ばないように、チップ保持部１２が保持した状態の分析チップ５０の射出面５４近傍に光吸収体（図示省略）が配置されている。
【００４６】
励起光射出部２０は、チップ保持部１２で保持された状態の分析チップ５０に含まれるプリズム５１の金属膜５５で反射されるように当該プリズム５１内に励起光αを入射させる。具体的に、励起光射出部２０は、直線偏光された励起光を射出する光源部２１と、光源部２１から出射された励起光αをプリズム５１の入射面５２まで案内する励起光学系３０と、を有する。
【００４７】
光源部２１は、励起光源２２を含む光源ユニット部２３と、励起光源２２から射出された励起光αを整波する第１整波部２４と、を有する。本実施形態の光源部２１は、下方に向けて励起光αを射出し、励起光源２２として、レーザーダイオードが用いられる。
【００４８】
光源ユニット部２３は、励起光源２２と、この励起光源２２の温度調整（温調）を行う温調回路２５とを有する。この光源ユニット部２３は、励起光源２２が射出した励起光αの平行化（コメリート）を行うと共に、プリズム５１の金属膜５５に励起光αが短軸側から入射するように励起光源２２の姿勢を調整・保持する。これは、励起光源（レーザーダイオード）２２から射出される励起光αが、コメリート化しても形状が扁平であり且つ偏光方向が概ね一方向に偏っているため、励起光源２２の姿勢を調整・保持することによって、励起光αが成膜面５３に対して全反射条件（成膜面５３に対して浅い角度）で入射したときに、励起光αの成膜面５３における照射領域の輪郭形状が凡そ円形に為るようにするためである（図３参照）。
【００４９】
温調回路２５は、励起光源（レーザーダイオード）２２の温調を行うための回帰回路である。具体的に、励起光源２２が温度によって射出する光の波長と射出エネルギーとが変動するため、温調回路２５は、コリメート後に励起光αの光線から分岐させた光線光量をフォトダイオード等（図示省略）により監視し、射出される励起光αの波長及び光量が一定となるように励起光源２２の温度を調整する。
【００５０】
第１整波部２４は、複数のフィルターによって光源ユニット部２３から射出された励起光αを整波して偏光方向が一意な励起波長にする。具体的に、第１整波部２４は、第１バンドパスフィルター（以下、単に「第１ＢＰＦ」と称する。）２６と、直線偏光フィルター（以下、単に「ＬＰＦ」と称する。）２７と、第１ＮＤフィルター（以下、単に「第１ＮＤＦ」と称する。）２８とを有する。第１ＢＰＦ２６は、励起光源２２からの射出光が若干の波長分布幅を有しているため、これを中心波長のみの挟帯域にろ波する。また、ＬＰＦ２７は、励起光源２２からの射出光が若干の異位相差成分を有しているため、これを純粋な直線偏光にろ波する。また、第１ＮＤＦ２８は、いわゆる減光フィルターであり、励起光源２２から射出された光を減光して、光源部２１から射出される励起光αの光量を調整する。尚、励起光源２２から射出される射出光の強度によっては、第１整波部２４に第１ＮＤＦ２８が設けられなくてもよい。
【００５１】
励起光学系３０は、光源部２１からチップ保持部１２に保持された状態の分析チップ５０のプリズム５１まで励起光αを案内する。この励起光学系３０は、励起光αの偏光方向を変更する偏光方向調整部３１と、励起光αのビームの輪郭形状等を調整する整形光学系３２と、励起光αのプリズム５１内への入射経路を変更して金属膜５５における励起光αの反射位置や金属膜５５に対する励起光αの入射角θを変更する入射経路調整部３５と、を有する。
【００５２】
偏光方向調整部３１は、１／２波長板３３と、この１／２波長板３３を回転させる回転駆動部３４と、を有する。
【００５３】
１／２波長板３３は、励起光学系３０の光路上に配置され、励起光αの偏光方向を連続的に回転させる偏光回転子として用いられる。回転駆動部３４は、１／２波長板３３を回転させることにより、金属膜５５に対する励起光αの偏光方向を回転させる。本実施形態の回転駆動部３４は、ステップモーターを有し、制御処理部１４からの指示信号に基づいてステップモーターにより１／２波長板３３を回転させる。このように１／２波長板３３を回転させると、第１整波部２４において直線偏光された励起光αの偏光方向が回転し、これにより、金属膜５５に入射する励起光αにおけるＰ波成分の量とＳ波成分の量とが変化する。即ち、回転駆動部３４が１／２波長板３３を回転させることにより、金属膜５５においてエバネッセント波が最大限しみ出す条件（即ち、金属膜５５の表面５５ａ近傍に形成される増強電場の電場増強度が最大となる条件）から全くしみ出さない条件（即ち、金属膜５５の表面５５ａ近傍に増強電場が全く形成されない条件）まで偏光方向を自在に変化させることが可能となる。
【００５４】
整形光学系３２は、金属膜５５における励起光αの照射領域の輪郭が所定の直径を有する円形になるように、スリットやズーム機能等によって励起光αのビームサイズやビームの輪郭形状を調整する。尚、本実施形態の金属膜５５における励起光αの照射領域は、光測定部４０における測定領域よりも小さくなるように調整される（図１０（Ｂ）参照）。これにより、金属膜５５における励起光αの照射領域が僅かにずれても、表面プラズモン共鳴やこれに基づく増強電場に起因する光を光測定部４０が測定することができる。
【００５５】
入射経路調整部３５は、光源部２１からの励起光αを反射する反射部材３６と、この反射部材３６を駆動する反射部材駆動部（駆動部）３７とを有する。
【００５６】
反射部材３６は、励起光αを反射する反射面３６ａを有する。本実施形態では、反射部材３６として反射鏡が用いられる。この反射部材３６は、反射面３６ａに入射する前の励起光αと当該反射面３６ａで反射された後の励起光αとにおいて位相のずれや減光等が生じない誘電体多層膜、即ち、励起光波長においてＰ波成分とＳ波成分とのいずれとも波長依存性をなくした誘電体多層膜が反射面３６ａ上に成膜されている。これにより、当該分析装置１０における検体の検出精度及び感度が向上する。
【００５７】
また、反射部材３６の裏面３６ｂには、励起光αを反射することなく吸収する無反射光吸収物質（例えば、吸収型ＮＤフィルム、植毛布等）が貼り付けられている。
【００５８】
反射部材駆動部３７は、ステージ３７ａと、このステージ３７ａに設けられ、反射部材３６を支持すると共に回転駆動する回転駆動機構（図示省略）と、ステージ３７ａを往復駆動する往復駆動機構（図示省略）とを有する。
【００５９】
回転駆動機構は、反射部材３６を回転させる（図１の矢印β参照）ことにより反射面３６ａの向きを変える。具体的に、回転駆動機構は、反射部材３６に入射する励起光αの光路と反射部材３６で反射後の励起光αの光路とを含む面（図１の紙面）と直交する姿勢の反射面３６ａがこの直交姿勢を維持しつつ前記光路を含む面に沿って回転するように、制御処理部１４の指示信号に基づいて反射部材３６を回転させる。この回転駆動機構は、回転モーターを有し、この回転モーターによって直接又は間接的に反射部材３６を回転駆動して反射面３６ａの向きを変える。また、回転駆動機構は、制御処理部１４からの指示信号に基づいて、光源部２１からの励起光αが反射部材３６の裏面３６ｂに入射するまで反射部材３６を回転させることもある。本実施形態では、重心が回転中心近くを通るように反射部材３６が回転駆動機構に取り付けられ、回転モーターのトルクは、十分に設定されている。本実施形態の回転モーターは、高分解能のステップモーターであり、制御処理部１４からの指示信号によって、所定の間隔で反射部材３６を回転させることができる。前記所定の間隔は、反射面３６ａの向きの調整における分解能に関係し、本機の性能によって適宜に設定される。
【００６０】
往復駆動機構は、ステージ３７ａ、即ち、反射部材３６を光源部２１からの励起光αの光軸に沿って直線的に移動させる（図１における矢印γ参照）。本実施形態の往復駆動機構は、光源部２１からの励起光αの光軸方向、即ち、上下方向にステージ３７ａを往復駆動させる。具体的に、往復駆動機構では、制御処理部１４からの指示信号によりステップモーターが制御され、このステップモーターにより駆動されるねじ送り機構によって回転駆動機構及び反射部材３６が搭載されたステージ３７ａが上下方向に往復移動する。即ち、往復駆動機構は、制御処理部１４の指示信号に従い、光源部２１からの励起光αの光軸に対する反射面３６ａの向きを一定に保ったまま反射部材３６を光源部２１からの励起光αの光軸上の所定位置に高精度に移動させる。
【００６１】
光測定部４０は、受光部４１と、分析チップ５０から受光部４１まで光を案内する測定光学系４２と、測定光学系４２において案内される光を整波する第２整波部４３と、を有し、分析チップ５０の金属膜５５及びこれと隣接する領域で生じる光（以下、単に「金属膜５５で生じる光」とも称する。）の強度を測定する。
【００６２】
受光部４１は、光を受光してその強度（光量）に応じた強度信号を出力する。本実施形態では、検体に標識された蛍光物質を励起させることによって生じる蛍光等の微弱な光を検出するため、受光部４１として感度とＳ／Ｎ比の高い光電子倍増管（Photomultiplier Tube：ＰＭＴ）が用いられる。尚、受光部４１は、ＰＭＴに限定されず、冷却ＣＣＤ型イメージセンサ等であってもよい。
【００６３】
測定光学系４２は、図４にも示されるように、迷光の影響を受け難い共役光学系であり、集光レンズ４４と結像レンズ４５とを有する。本実施形態の測定光学系４２は、群間、即ち、集光レンズ４４と結像レンズ４５との間を進行する光が平行光若しくは略平行光となる２群共役光学系である。
【００６４】
第２整波部４３は、測定光学系４２において案内される光から励起光成分（例えば、プラズモン散乱光やラマン散乱光、拡散光等）を除去し、測定光学系４２において案内される光の光量を調整する。この第２整波部４３は、第２バンドパスフィルター（第１の光フィルター）４６と、第２ＮＤフィルター（第２の光フィルター）４７と、各フィルター４６，４７の位置の切り換えを行う位置切換部４８と、を有する。
【００６５】
第２バンドパスフィルター（以下、単に「第２ＢＰＦ」と称する。）４６は、励起光αの波長（励起波長）の光を遮る。これにより、第２ＢＰＦ４６は、受光部４１に蛍光（検体に標識された蛍光物質が増強電場により励起して生じた光）以外の波長の光（例えば、励起光射出部２０からの漏れ光やプラズモン散乱光、拡散光等）が入射することを防ぐことができる。即ち、第２ＢＰＦ４６は、受光部４１に入射する光からノイズ成分を除去し、これにより受光部４１における微弱な蛍光の検出精度及び感度の向上を図ることができる。
【００６６】
第２ＮＤフィルター４７（以下、単に「第２ＮＤＦ」と称する。）は、いわゆる減光フィルターであり、入射した光を減衰させて出射する。この第２ＮＤＦ４７は、測定光学系４２において案内されるプラズモン散乱光や拡散光等を減光して、微弱な光（本実施形態では蛍光）を検出するための受光部（本実施形態ではＰＭＴ）４１でプラズモン散乱光等を測定することを可能とする。即ち、検体の検出のときに測定する励起蛍光の光量に比べて、増強電場が最大となる励起光αの入射角θ１を求めるために測定する光の光量が非常に大きいため、共通の受光部４１を用いる場合には、第２ＮＤＦ４７により増強電場が最大になる励起光αの入射角θ１を求めるために測定する光を減光することにより、受光部４１が損傷するのを防ぐことができる。
【００６７】
これら第２ＢＰＦ４６と第２ＮＤＦ４７とは、光軸に対して略垂直な同一平面（詳しくは、測定光学系４２を進む光の光軸と略直交する平面）に沿って並ぶように共通の保持フレーム４９に保持されている。
【００６８】
位置切換部４８は、第２ＢＰＦ４６及び第２ＮＤＦ４７の位置をフィルタリング位置と退避位置との間で切り換える。尚、フィルタリング位置とは、測定光学系４２における光路上の位置である。具体的に、フィルタリング位置は、集光レンズ４４と結像レンズ４５との間において、各フィルター４６，４７がこれらレンズ４４，４５間の平行光若しくは略平行光の光軸と直交し且つ当該平行光若しくは略平行光を横断する位置である。これにより、分析装置１０では、検体を精度よく検出することができる。これは、第２ＢＰＦ４６又第２ＮＤＦ４７がレンズ４４，４５間を進行する平行光等の光軸に対して傾斜していると、第２ＢＰＦ４６又は第２ＮＤＦ４７を通過した光の光軸がシフトするため、光測定部４０における測定精度が低下する。一方、退避位置とは、測定光学系４２における光路から外れた位置である。
【００６９】
位置切換部４８は、第２ＢＰＦ４６がフィルタリング位置のときに第２ＮＤＦ４７が退避位置となり（図４参照）、第２ＢＰＦ４６が退避位置のときに第２ＮＤＦ４７がフィルタリング位置となるように、各フィルター４６，４７の位置をそれぞれ切り換える。本実施形態の位置切換部４８は、第２ＢＰＦ４６と第２ＮＤＦ４７とが並んでいる平面に沿って保持フレーム４９を往復移動させる（図４の矢印δ参照）ことにより、各フィルター４６，４７の位置の切り換えを行う。これにより、１つの駆動源によって、二つのフィルター４６，４７の位置の切り換えを同時に行うことができる。
【００７０】
この位置切換部４８は、制御処理部１４からの指示信号に従って各フィルター４６，４７の位置の切り換えを行う。
【００７１】
尚、本実施形態の第２整波部４３には、第２ＢＰＦ４６と第２ＮＤＦ４７とが設けられているが、測定される光の強度が受光部４１の許容量を超えなければ、第２ＮＤＦ４７がなくてもよい。また、測定する光によって受光部を切り換える、即ち、蛍光を受光するための受光部４１と、蛍光よりも光量の大きな光を受光するための受光部とを切り換える場合にも、第２ＮＤＦ４７がなくてもよい。
【００７２】
また、本実施形態では、保持フレーム４９を位置切換部４８により往復移動させることによって、各フィルター４６，４７の位置の切り換えを行っているが、これに限定されない。例えば、第２ＢＰＦ４６と第２ＮＤＦ４７とが同一平面上に並ぶようにこれら各フィルター４６，４７を円板状の保持フレームが保持し、位置切換部がこの第２ＢＰＦ４６と第２ＮＤＦ４７との中間位置を回転中心にして円板状の保持フレームを回転させることにより、各フィルター４６，４７の位置の切り換えを行ってもよい。また、位置切換部が２つの駆動源を有し、第２ＢＰＦ４６の位置の切り換えと第２ＮＤＦ４７の位置の切り換えと別々の駆動源により行ってもよい。
【００７３】
制御処理部１４は、当該分析装置１０を構成する各構成要素の制御を行う。例えば、当該分析装置１０が検体を分析するときに、制御処理部１４が、光源部２１、偏光方向調整部３１、入射経路調整部３５、及び光測定部４０等を制御し、これにより、当該分析装置１０では、共鳴角走査工程、最適位置走査工程、複屈折測定工程、励起蛍光測定工程等が行われる。
【００７４】
本実施形態の制御処理部１４は、例えば、図５に示されるように、ズレ角導出部１４１、補正値導出部１４２、補正部１４３等を備える。
【００７５】
ズレ角導出部１４１は、金属膜５５に対するＰ波方向と複屈折特性を有するプリズム５１の光学主軸とのなす角であるズレ角（長軸回転角）θｉを求める。具体的に、ズレ角導出部１４１は、光源部２１が励起光αを射出した状態で回転駆動部３４によって１／２波長板３３を回転させつつ光測定部４０によって金属膜５５及びこれと隣接する領域で生じる光を測定することにより得られる最大光量と最小光量とからズレ角θｉを求める。
【００７６】
補正値導出部１４２は、ズレ角導出部１４１で求められたズレ角θｉから補正値（補正係数）Ｋを求める。この補正値Ｋは、光測定部４０により測定した光の光量を補正するために用いられる。具体的に、この補正値Ｋは、光測定部４０で測定された蛍光の光量を当該補正値Ｋによって補正することで、プリズム５１内に入射した励起光αが複屈折しない状態（即ち、複屈折による位相回転が生じていない状態）で金属膜５５に入射したときに光測定部４０により測定される蛍光の光量（複屈折に基づく誤差が抑えられた蛍光の光量）が得られる。
【００７７】
補正部１４３は、補正値導出部１４２により求められた補正値Ｋによって光測定部４０により測定された蛍光の光量を補正する。具体的に、補正部１４３は、当該分析装置１０において検体を分析するときに、光測定部４０（詳しくは、受光部４１）から送られてきた出力信号に基づいて演算し、この光測定部４０により測定された蛍光に関する分析を行う。例えば、補正部１４３は、光測定部４０により検出した単位面積あたりの蛍光の数のカウントや時間の経過に伴う蛍光の増加量の算出等を行う。そして、補正部１４３は、蛍光の数のカウント結果や蛍光の増加量の算出結果を補正値Ｋによって補正する。
【００７８】
制御処理部１４での演算結果は、この制御処理部１４に接続される表示部１６に出力される。尚、制御処理部１４による具体的な制御や演算についての詳細は後述する。
【００７９】
表示部１６は、制御処理部１４からの出力信号に基づき、演算結果を表示する。表示部１６は、液晶ディスプレイ等のように演算結果等を画面に表示するものでもよく、プリンター等のように演算結果等をプリントアウトするものであってもよい。また、これらを組み合わせたものでもよい。
【００８０】
このように構成される分析装置１０における検体の分析について、図６乃至図１０も参照しつつ以下に説明する。尚、制御処理部１４による分析装置１０の各構成要素の制御、及び制御処理部１４で行われる演算等についての詳細も併せて説明する。
【００８１】
図６は、当該分析装置１０において検体を分析するときの基本シーケンスを示すフローチャートであり、図７は、共鳴角走査シーケンスを示すフローチャートであり、図８は、最適位置走査シーケンスを示すフローチャートであり、図９は、複屈折測定シーケンスを示すフローチャートであり、図１０は、励起蛍光測定シーケンスを示すフローチャートである。
【００８２】
<前処理工程>
患者から血液等が採取され、この採取された血液等が試薬チップに注入される。この血液等が注入された試薬チップが分析装置１０の前処理部にセットされる。制御処理部１４は、前処理部により、このセットされた試薬チップの血液等の前処理（血球分離や希釈、混合等）を行い試料液を生成する。この状態で、分析チップ５０が前処理部に設置されると、制御処理部１４は、前処理部により、前処理の終わった試料液を分析チップ５０の流路５８内に注入し、金属膜５５の表面に固定された捕捉体５６に検体（特定の抗原）を捕捉させる（即ち、捕捉体５６と検体とを反応させる）。本実施形態では、蛍光物質（本実施形態では、蛍光色素）が標識された検体を捕捉体５６に捕捉させているが、これに限定されず、捕捉体５６に検体を捕捉させた後に分析チップ５０に蛍光物質を注入し、捕捉体５６に捕捉された状態の検体に対して蛍光物質を標識してもよい。
【００８３】
このように反応が行われた分析チップ５０は、チップ保持部１２まで搬送され、チップ保持部１２に保持される（ステップＳ１）。
【００８４】
<励起光源２２の温調>
一方、励起光源（本実施形態では、レーザーダイオード）２２は、波長変動の少ない安定的な波長の出力光を出力させるために、温調回路２５によって常に温調されて定温に維持される。これは、波長がずれると表面プラズモン共鳴条件やエバネッセント波（増強電場）のしみ出し量が変化するため、血液中のタンパク質等を定量する装置においては必須である。維持温度になるまでに時間がかかるため、通常、分析装置１０の電源投入時から励起光源２２は、温調回路２５によって常に温度維持される。
【００８５】
<共鳴角走査工程>
分析チップ５０がチップ保持部１２に保持されると、制御処理部１４は、当該分析チップ５０における最適な表面プラズモン共鳴条件の走査（共鳴角走査）を行う。そして、この走査の結果に基づき、制御処理部１４は、金属膜５５で生じる増強電場の電場強度が最も大きくなる入射角である励起入射角θ１で励起光αが金属膜５５に入射するように、反射部材３６の位置決め（第１の位置決め）を行う（ステップＳ２）。
【００８６】
具体的には、制御処理部１４が反射部材駆動部３７によって反射部材３６を駆動することにより、分析チップ５０に含まれるプリズム５１の金属膜５５への励起光αの入射条件（励起入射角θ１）の走査を行う。詳しくは、分析チップ５０に含まれるプリズム５１の材質、形状、流路充填液（試料液）屈折率等により、当該プリズム５１の金属膜５５において表面プラズモン共鳴に基づく増強電場（エバネッセント波）の強度が最も大きくなる励起光の入射角θ１は決まっている。しかし、捕捉体５６に捕捉された検体の分子量やこの分子を構成する物質、プリズム５１側の製造誤差等により、励起光入射条件（励起入射角θ１）のゆらぎが発生する。このため、設計に基づく励起入射角θ１ａを中心にして±１０°未満の入射角度となるように励起光αが金属膜５５に入射され、このときに金属膜５５で生じる光の強度に基づいて当該分析チップ５０における励起入射角θ１が求められる。
【００８７】
より詳しくは、先ず、制御処理部１４が第２整波部４３の位置切換部４８により第２ＢＰＦ４６を退避位置に移動させると共に第２ＮＤＦ４７をフィルタリング位置に移動させる（ステップＳ２１）。このとき、偏光方向調整部３１の１／２波長板３３は、励起光射出部２０から励起光αが射出されたときに、金属膜５５へ入射する励起光αにおいてＰ波成分が最も多くなるように設計的に求められた状態（初期状態）となっている。
【００８８】
制御処理部１４は、反射部材駆動部３７の回転駆動機構と往復駆動機構とにより、反射部材３６を最大離反位置に移動させる（ステップＳ２２）。この最大離反位置とは、励起光射出部２０から励起光αが射出されたときに、励起光αが金属膜５５の特定の位置（光測定部４０の測定領域内）で反射された状態で、且つ、金属膜５５の表面５５ａ近傍領域にエバネッセント波がしみ出さない入射角θとなる反射部材３６の位置及び反射面３６ａの向きである。
【００８９】
この状態で、制御処理部１４は、光測定部４０により金属膜５５で生じた光の強度を測定し、その結果を、光測定部４０（詳しくは受光部４１）からの出力信号によって取得する。この反射部材３６が最大離反位置のときに光測定部４０が測定する光は、プリズム５１における表面拡散光（又は表面散乱光）ＳＫである。
【００９０】
制御処理部１４は、励起光αの金属膜５５に対する入射角θと光測定部４０により測定した光の強度とを関連付けて記憶する（ステップＳ２３）。このとき、第２ＢＰＦ４６が退避位置であるため、受光部４１が受光する光には、励起光αの励起波長と同じ波長の光が含まれる。この励起波長と同じ波長の光は、具体的には、金属膜５５で生じたプラズモン散乱光やラマン散乱光、拡散光等である。これら励起波長と同じ波長の光は、金属膜５５で生じた表面プラズモン共鳴により増強されるため、検体に標識された蛍光物質が励起して発した励起蛍光に比べて光量が十分に大きい。そこで、制御処理部１４が位置切換部４８により第２ＢＰＦ４６を測定光学系４２の光路上から退避させることで、受光部４１が励起波長の光を受光することができ、これにより、金属膜５５で生じる光の強度を精度よく測定することができる。
【００９１】
尚、本実施形態では、光量の小さな励起蛍光を測定する受光部４１によって、励起蛍光よりも光量が非常に大きな表面プラズモン散乱光や拡散光等を測定するため、第２ＢＰＦ４６を退避位置に退避させると共に第２ＮＤＦ４７をフィルタリング位置に移動させることにより、同一の受光部（本実施形態ではＰＭＴ）４１により、両光（散乱光等と励起蛍光）の強度を測定することができる。
【００９２】
制御処理部１４は、光源部２１から励起光αを射出させた状態で、入射経路調整部３５により金属膜５５上の照射位置をずらさないように回転駆動機構により反射面３６ａの向きを回転させる（ステップＳ２４）と共に往復駆動機構により反射部材３６の位置を移動させる（ステップＳ２５）。具体的には、制御処理部１４は、反射部材３６の位置と、その位置において反射面３６ａで反射された励起光αがプリズム５１内に入射して金属膜５５の特定の位置に到達する反射面３６ａの向きと、を対応づけてテーブルとして予め記憶している。そして、制御処理部１４は、このテーブルに基づいて回転駆動機構と往復移動機構とを制御して反射部材３６を移動させる。これにより、反射部材３６の位置の変更と反射面３６ａの向きの調整とを機構的に互いにリンクしていない往復駆動機構と回転駆動機構とによって行っても、金属膜５５における励起光αの照射位置を変えることなく金属膜５５に対する入射角θだけを変更することができる。
【００９３】
尚、このステップＳ２４とステップＳ２５とは、いずれか一方のステップを先に行った後に他方のステップを行ってもよく、また、両ステップを同時に行ってもよい。このとき、光測定部４０が金属膜５５で生じた光の強度を測定してその測定結果を制御処理部１４に出力し、制御処理部１４が入射角θと関連付けてこの測定結果を記憶する（ステップＳ２６）。
【００９４】
これが繰り返され、制御処理部１４は、金属膜５５における照射位置がずれないようにして入射角θを変更しつつ光測定部４０により光の強度を測定し、その測定結果を記憶する（ステップＳ２７）。
【００９５】
制御処理部１４は、所定の走査領域（例えば、設計に基づく励起入射角θ１ａを中心にして±１０°未満の入射角θ）での光測定部４０による光の強度を測定すると、光源部２１からの励起光αの射出を止める。そして、制御処理部１４が、記憶した光量の最大値と最小値とを選出し、これらを記憶する（ステップＳ２８）と共に、最大光量が得られたときの反射部材３６の位置と反射面３６ａの向きとなるように反射部材駆動部３７によって反射部材３６を駆動する（ステップＳ２９）。
【００９６】
<最適位置走査工程>
反射部材３６の第１の位置決めが終わると、制御処理部１４は、金属膜５５への励起光αの照射位置（入射位置）が光測定部４０の測定領域の中心部となるように、反射部材３６の位置決め（第２の位置決め）を行う（ステップＳ３）。
【００９７】
詳しくは、先ず、制御処理部１４は、反射部材駆動部３７の往復駆動機構によって反射部材３６を上端位置に移動させる（ステップＳ３１）。この上端位置とは、励起光αが金属膜５５に入射したときに、その入射位置が光測定部４０の測定領域よりも外側となる位置である（図１１（Ａ）の位置Ａ参照）。制御処理部１４は、反射部材３６がこの位置のときに光源部２１により励起光αを射出させ、このときに金属膜５５で生じる光の強度を光測定部４０により測定し、その測定結果を記憶する（ステップＳ３２）。制御処理部１４は、反射部材３６が下端位置か否かを判断する（ステップＳ３３）。この下端位置についての詳細は後述する。制御処理部１４は、反射部材３６が下端位置でないと判断すると、往復駆動機構によって反射部材３６を所定量下方に移動させる（ステップＳ３４）。このとき、制御処理部１４は、回転駆動機構により反射部材３６を回転させることなく、往復駆動機構のみによって反射部材３６を移動させる。即ち、制御処理部１４は、光源部２１からの励起光αに対する反射面３６ａの向きを変えることなく、反射部材３６の位置のみを移動させる。反射部材３６が移動後、制御処理部１４は、光源部２１から励起光を射出させ、このときに金属膜５５で生じる光の強度を光測定部４０により測定し、その測定結果を記憶する（ステップＳ３２）。そして、制御処理部１４は、反射部材３６が下端位置か否かを判断する（ステップＳ３３）。制御処理部１４は、反射部材３６が下端位置に移動するまで、このステップＳ３２〜ステップＳ３４を順に繰り返す。
【００９８】
制御処理部１４は、光測定部４０により測定した光の強度が記憶した各光量のうちの最大光量から光量が５０％減少したか否かにより、反射部材が下端位置に到達したか否かを判断する。詳しくは、最初は、金属膜５５において励起光αの照射領域が光測定部４０の測定領域の外であるため、光測定部４０により測定される光量が小さい。そして、反射部材３６が次第に下方に移動して、励起光αの照射領域が光測定部４０の測定領域内に入ってくると（図１１(Ａ)の位置Ｂ参照）、光測定部４０により測定される光の光量が次第に大きくなり、更に反射部材３６が下方に移動して励起光αの照射領域全体が光測定部４０の測定領域内に完全に含まれた状態となったとき（図１１（Ａ）の位置Ｃ参照）に光測定部４０により測定される金属膜５５で生じる光の光量が最大となる。そして、更に反射部材３６が下方に移動すると、励起光αの照射領域が光測定部４０の測定領域における反対側の端部から外側に移動する（図１１(Ａ)の位置Ｄ参照）ため、光測定部４０により測定される光の光量が減少する（即ち、ケラレ（光量落ち）が発生する）。制御処理部１４は、これらの光の強度とその強度が測定されたときの反射部材３６の上下方向の位置とを関連付けて記憶すると共に、測定される光の強度が最大光量の５０％落ちとなったか否かを判断する。そして、制御処理部１４は、光測定部４０により測定される光の強度が最大強度の５０％落ちとなったときに、反射部材３６が下端位置に到達したと判断する。
【００９９】
制御処理部１４は、反射部材３６が下端位置に移動したと判断すると、記憶している光量の各値から最大光量の５０％落ちとなっている値を選出する（ステップＳ３５）。このとき、選出される値は、２つある（図１１(Ａ)の位置Ｂと位置Ｄ参照）。制御処理部１４は、光測定部４０により測定される光量が最大光量５０％落ちとなったときの反射部材３６の位置をそれぞれ選出し、その中心位置（図１１(Ａ)の位置Ｃｅ参照）を算出し、これを記憶する（ステップＳ３６）。そして、制御処理部１４は、往復動駆動機構により反射部材３６を移動させて、求めた中心位置Ｃｅに照射領域を移動させる（ステップＳ３７、図１１（Ｂ）参照）。
【０１００】
これにより、光測定部４０により測定される分析チップ５０毎の自家蛍光の光量を一定にすることができる。詳しくは、プリズム５１内を進行する励起光αにより、プリズム５１内部で蛍光が発生する（自家蛍光）。この蛍光は、金属膜５５で生じる散乱光等（プラズモン散乱光や拡散光等）に比べて微弱であるが、試料液中の検体の濃度が低い場合にこの検体に標識された蛍光物質が発する励起蛍光と比べると同等レベルとなるため、励起蛍光の測定においてノイズとなる。この自家蛍光は微弱であるため、励起蛍光の測定においてノイズとなり得るのは、金属膜５５における励起光αの照射領域近傍の光が殆どである。表面プラズモン共鳴が生じているときに金属膜５５で反射される励起光αは殆んどなくなるため、光測定部４０の測定領域の入射側（図１１（Ａ）における左側）からの自家蛍光が問題となる。この自家蛍光の光量は、光路長に比例するため、光測定部４０の測定領域にある入射側の光路長が一定になるように励起光αの照射位置を調整することが必要となる。そこで、上記のようにして、光測定部４０の測定領域において励起光αの照射位置が常に中心となるように調整することにより、光測定部４０の測定領域における励起光αの入射側の光路長が一定となり、その結果、分析チップ５０（プリズム５１）毎の自家蛍光の差が抑えられ、検体の分析精度を向上させることができる。
【０１０１】
<複屈折測定工程>
次に、励起光αがプリズム５１中を進行する際に複屈折が生じるため、制御処理部１４は、この複屈折を測定し（ステップＳ４）、検体に標識された蛍光物質からの励起蛍光の測定の際にこれを考慮することにより、検体の測定精度を向上させる。詳しくは、複屈折は、媒体中を光が透過する際に生じる。光が樹脂等の誘電体を透過する場合に複屈折は大きくなる。この複屈折は、媒体中の密度差等によって生じ、この密度差は媒体の成形時に生じる。そのため、個々のプリズム５１によって複屈折の度合いが異なる。複屈折によりプリズム５１中を進む励起光αに位相回転が生じ、金属膜５５に対してＰ波だけ入射させたいにも関わらず、この複屈折による位相回転によって励起光αにＳ波成分が生じる。この複屈折によって生じたＳ波成分の量に応じて増強電場によって励起された励起蛍光の光量が減少する。そのため、制御処理部１４（詳しくは、補正部１４３）がこの減少分を補正することにより、分析装置１０における検体の検出精度及び感度が向上する。
【０１０２】
具体的に、制御処理部１４（詳しくは、ズレ角導出部１４１）は、光源部２１から励起光αを射出させ、光測定部４０により金属膜５５で生じた光の強度を測定する。このとき、１／２波長板３３は、初期状態である（ステップＳ４１）。そして、制御処理部１４（ズレ角導出部１４１）は、回転駆動部３４によって１／２波長板３３を回転させつつ、光測定部４０により測定した光の強度を１／２波長板３３の回転位置（初期状態からの回転角度）と関連付けて記憶する（ステップＳ４２及びステップＳ４３）。制御処理部１４（ズレ角導出部１４１）が１／２波長板３３を回転させることにより、金属膜５５に入射する励起光αのＰ波成分とＳ波成分とが増減し、これに伴って、１／２波長板３３を回転させた状態で光測定部４０により測定される光の強度が増減する。このとき、励起光αにおいてＰ波成分が多くなるとこれに伴ってＳ波成分が少なくなり、Ｐ波成分が少なくなるとこれに伴ってＳ波成分が多くなる。そして、金属膜５５に入射する励起光αにおいてＰ波成分が多くなるほど光測定部４０により測定される光の強度が大きくなり、Ｓ波成分が多くなるほど光測定部４０により測定される光の強度が小さくなる。これは、Ｐ波成分は表面プラズモン共鳴に寄与するが、Ｓ波成分は表面プラズモン共鳴に寄与しないためである。
【０１０３】
制御処理部１４（ズレ角導出部１４１）は、光測定部４０により測定される光の光量の最大値ＤＲｍａｘと最小値ＤＲｍｉｎが得られるまで、ステップＳ４２及びステップＳ４３を順に繰り返す（ステップＳ４４）。制御処理部１４（ズレ角導出部１４１）は、最大値ＤＲｍａｘと最小値ＤＲｍｉｎとが得られると、記憶した光量からこれら最大値ＤＲｍａｘと最小値ＤＲｍｉｎとを選出し（ステップＳ４５）、これらの各値を記憶すると共に、これら各値が得られたときの１／２波長板３３の回転位置（具体的には、最大値ＤＲｍａｘが得られたときの第１回転位置と、最小値ＤＲｍｉｎが得られたときの第２回転位置と）を記憶する。
【０１０４】
次に、制御処理部１４（ズレ角導出部１４１）は、記憶した最大値ＤＲｍａｘ及び最小値ＤＲｍｉｎと、共鳴角走査工程において記憶していた表面拡散光（ＳＫ）の強度とから、以下の式（４）により、当該プリズム５１での複屈折によるズレ角（長軸回転量）θｉを求める。そして、制御処理部１４（補正値導出部１４２）は、ズレ角θｉから式（５）により補正値Ｋを導出する。制御処理部１４は、このように求めたズレ角θｉと補正値Ｋとを記憶する（ステップＳ４６）。
【数４】
0005472033.tif 000005
【数５】
0005472033.tif 000006
【０１０５】
そして、制御処理部１４は、回転駆動部３４により最大値（ＤＲｍａｘ）が得られたときの回転位置まで１／２波長板３３を回転させる。これにより、Ｐ波成分が最も多い状態で（即ち、Ｓ波成分が最も少ない状態で）励起光αが金属膜５５に入射する。
【０１０６】
ここで、上記のズレ角θｉと補正値Ｋとについて説明する。
【０１０７】
複屈折特性を有するプリズム５１は、光学主軸（遅相軸と進相軸）を有し、この光学主軸と当該プリズム５１への入射光（本実施形態における励起光α）の偏光方向との関係よって励起光αの偏光状態を変化させる。例えば、金属膜５５に対するＰ波方向とプリズム５１の光学主軸とのなす角（ズレ角）がθｉのときに、光学主軸と励起光αの偏光方向とが一致しない場合は、当該プリズム５１内を進行して金属膜５５に入射する励起光αの偏光状態は、位相回転により楕円偏光となる（図１２（Ａ）参照）。そして、光学主軸と励起光αの偏光方向とが同じ場合は、当該プリズム５１内を進行して金属膜５５に入射する励起光αの偏光方向は光学主軸と同じであり、光測定部４０により測定される光の光量が最大となる(図１２（Ｂ）参照)。一方、光学主軸と励起光αの偏光方向とが９０°ズレている場合は、当該プリズム５１内を進行して金属膜５５に入射する励起光αの偏光方向は光学主軸と直交する方向となり、光測定部４０により測定される光の光量が最小となる（図１２（Ｃ）参照）。
【０１０８】
このようにＰ方向とのズレ角をθｉとしたときに、最大値（最大光量の値）ＤＲｍａｘは、元光量比（複屈折がない状態で測定される光量との比）でｃｏｓ２θｉ、最小値（最大光量の値）ＤＲｍｉｎは、元光量比でｓｉｎ２θｉとなる。この最大値ＤＲｍａｘと最小値ＤＲｍｉｎとが得られれば、θｉを以下の式（６）により求めることができる。
【数６】
0005472033.tif 000007
このズレ角θｉが求まれば、プリズムにおいて複屈折がない場合に光測定部４０により測定される光の光量が以下の式（７）及び式（８）から得られる。
【数７】
0005472033.tif 000008
これより、
【数８】
0005472033.tif 000009
が得られる。
【０１０９】
<励起蛍光測定工程>
次に、制御処理部１４は、第１及び第２の位置決めが行われた状態の反射部材３６に対して光源部２１により励起光αを照射する。これにより、励起光αが金属膜５５に表面プラズモン共鳴を生じさせ、これに基づく増強電場によって金属膜５５の捕捉体５６に捕捉された検体に標識された蛍光物質が励起して蛍光（励起蛍光）を発する。そして、制御処理部１４は、光測定部４０により励起蛍光の測定を行う（ステップＳ５）。
【０１１０】
具体的に、制御処理部１４は、位置切換部４８により第２ＢＰＦ４６をフィルタリング位置に移動させると共に、第２ＮＤＦ４７を退避位置に退避させる（ステップＳ５１：図１及び図４参照）。そして、制御処理部１４は、光源部２１から射出される励起光αが反射部材３６の裏面３６ｂに設けられた無反射光吸収物質に入射するように、反射部材駆動部３７の回転駆動機構により反射部材３６を回転させる（ステップＳ５２）。これにより、プリズム５１に励起光αが入射していない状態となり、制御処理部１４は、この状態で光測定部４０により測定を行い、このときの光測定部４０からの出力（暗ノイズＤＮ）を記憶する（ステップＳ５３）。制御処理部１４は、再び、反射部材３６の反射面３６ａに光源部２１からの励起光αが入射するように、反射部材駆動部３７の回転駆動機構により反射部材３６を回転させる（ステップＳ５４）。このときの反射面３６ａの向きは、共鳴角走査工程のステップＳ２９において設定された向きである。
【０１１１】
制御処理部１４は、光源部２１から励起光αを射出させ、金属膜５５近傍に生じた増強電場に起因する励起蛍光の光量を光測定部４０により測定し、これを記憶する（ステップＳ５５）。これにより、制御処理部１４は、測定最大光量（第１光量値）Ｓｍａｘを得る。これは、複屈折測定工程において、励起光αを金属膜５５に入射させたときに金属膜５５で生じる光の強度が最大値ＤＲｍａｘとなる第１回転位置に１／２波長板３３を回転させているため、金属膜５５近傍の増強電場の強度が最も大きくなっているからである。
【０１１２】
次に、制御処理部１４は、回転駆動部３４により、複屈折工程において励起光αを金属膜５５に入射させたときに金属膜５５で生じる光の強度が最小値ＤＲｍｉｎとなる第２回転位置に１／２波長板３３を回転させる（ステップＳ５６）。そして、制御処理部１４は、光測定部４０により励起蛍光の光量を測定し、これを記憶する（ステップＳ５７）。これにより、制御処理部１４は、測定最小光量（第２光量値）Ｓｍｉｎを得る。
【０１１３】
制御処理部１４（詳しくは、補正部１４３）は、記憶している測定最大光量Ｓｍａｘと、測定最小光量Ｓｍｉｎと、暗ノイズＤＮとから、以下の式（９−１）〜式（１３−２）に示すようにして、プリズムにおける自家蛍光の光量ｈを導出する。ここで、Ｓｍａｘが得られたときの励起蛍光の光量をＨ１、自家蛍光の光量をｈ１とし、Ｓｍｉｎが得られたときの励起蛍光の光量をＨ２、自家蛍光の光量をｈ２とする。
【０１１４】
まず、
【数９】
0005472033.tif 000010
より、
【数１０】
0005472033.tif 000011
【０１１５】
また、
【数１１】
0005472033.tif 000012
より、
【数１２】
0005472033.tif 000013
【０１１６】
そして、式（１０）と式（１２）とにより、
【数１３】
0005472033.tif 000014
が得られる。
【０１１７】
そして、制御処理部１４（補正部１４３）は、複屈折測定工程で求めた補正値Ｋを用いて、
【数１４】
0005472033.tif 000015
から、励起蛍光の光量Ｈを導出し、これを記憶する（ステップＳ５８）。
【０１１８】
尚、プリズム５１が複屈折のない、若しくは微小な材料（樹脂も含む）で形成されている場合であれば、制御処理部１４は、以下の近似式（１５）により、励起蛍光の光量Ｈを求める。
【数１５】
0005472033.tif 000016
【０１１９】
さらに、暗ノイズ（ＤＮ）が非常に少ない測定系の場合には、制御処理部１４は、以下の近似式（１６）により、励起蛍光の光量Ｈを求める。
【数１６】
0005472033.tif 000017
【０１２０】
<記憶・表示工程>
以上のようにして制御処理部１４は、複屈折の影響等を取り除いた励起蛍光の光量Ｈを求めた後、これを検体番号と関連付けて記憶し、その他の記憶を消去する（ステップＳ６）。また、制御処理部１４は、この検体番号と関連付けて記憶した励起蛍光の光量Ｈに基づく情報を表示部１６に出力し、表示部１６がこれを表示する。
【０１２１】
最後に、制御処理部１４は、反射部材３６を初期位置に復帰させて（ステップＳ７）一連の測定を終了する。
【０１２２】
本実施形態によれば、光測定部４０によって測定された励起蛍光の光量を補正値Ｋによって補正することにより、プリズム５１内で励起光αが複屈折せずに金属膜５５に入射（金属膜５５で反射）したときに測定される蛍光の光量（複屈折に基づく誤差を抑えた蛍光の光量）が得られる。これにより、検査毎にプリズム５１を交換しても、各プリズム５１において複屈折による位相回転が生じることなく励起光αが金属膜５５に入射した場合に測定される蛍光の光量をそれぞれ得ることができるため、プリズム５１毎の複屈折の度合いのばらつきに起因する測定誤差を効果的に抑制することができる。
【０１２３】
しかも、１／２波長板３３を回転させつつ金属膜５５及びその隣接する領域で生じる光の光量を測定するだけで測定値に含まれる誤差を低減させることができるため、従来の分析装置のように反射励起光の光量を測定してその測定結果をフィードバックしながら複数の偏光素子の位置や姿勢をそれぞれ調整する必要がなく、検体の分析時間を短縮することが可能となる。
【０１２４】
さらに、本実施形態の分析装置１０によれば、励起光αの偏光方向の調整のために１／２波長板３３が１つあればよく、複数の偏光素子とこれらの位置と姿勢とをそれぞれ制御する駆動装置を備えた従来の分析装置に比べ、分析装置の構成の簡素化及び小型化を図ることが可能となる。
【０１２５】
また、本実施形態によれば、制御処理部１４によって自動的に補正値Ｋの導出と、複屈折に基づく誤差を抑えた蛍光の光量の検出と、検体の分析とが行われる。
【０１２６】
尚、分析装置１０において、制御処理部１４が、表面拡散光量ＳＫを格納可能な記憶部を有し、ズレ角導出部１４１が、この記憶部に格納された表面拡散光量ＳＫを用いてズレ角θｉを求めるように構成すれば、検査毎に表面拡散光量ＳＫの測定を行わなくてもズレ角θｉを求めることができ、検体の分析時間を短縮することができる。
【０１２７】
また、本実施形態によれば、高感度且つ高精度の検体の検出が可能となる。具体的には、表面プラズモン共鳴によって金属膜５５で生じる光の強度を測定することにより、金属膜５５の表面５５ａ近傍に形成される増強電場の強度が最大となる金属膜５５への励起入射角θ１が精度よく得られる。このとき、金属膜５５で生じる光は、プラズモン散乱光や表面拡散光等の励起波長の光であるため、この波長成分を遮る第２ＢＰＦ４６を退避位置にすることで、表面プラズモン共鳴に基づいて金属膜５５で生じる光の強度の増減を精度よく測定することができる。しかも、検体の検出時においては、測定光学系４２の光路上に第２ＢＰＦ４６を入れることで、光測定部４０において測定される光からプラズモン散乱光や表面拡散光等の励起波長の光の成分が除かれ、これにより、検体に標識された蛍起物質が発した励起蛍光を精度よく測定することができる。従って、測定により得られる信号のＳＮ比が高く、高精度且つ高感度な検体の検出が可能となる。
【０１２８】
また、本実施形態によれば、測定結果からプリズム５１における自家蛍光の影響を取り除くことができ、これにより、広範なダイナミックレンジを確保することができる。
【０１２９】
詳しくは、金属膜５５に対する励起光αの偏光方向を変えつつ金属膜５５生じる光を測定することにより検出された光の強度の増減から、金属膜５５で反射されるときの励起光においてＳ波成分（表面プラズモン共鳴に寄与する成分）が最も多くなるときの１／２波長板３３の回転位置と、Ｐ波成分（表面プラズモン共鳴に寄与する成分）が最も多くなるときの１／２波長板３３の回転位置とをそれぞれ求めることができる。そして、１／２波長板３３を調整して励起光αの偏光方向を金属膜５５での反射時においてＳ波成分が最も多くなる状態にして光測定部４０で励起蛍光を測定することにより、プリズム５１における自家蛍光の光量を求めることができる。これにより、１／２波長板３３を調整して励起光αの偏光方向を金属膜５５へ入射した時にＰ波成分が最も多くなる状態にして光測定部４０で励起蛍光を測定した結果から自家蛍光の影響を取り除き励起蛍光を抽出することが可能となる。その結果、当該分析装置１０によれば、自家蛍光の影響を抑えて励起蛍光を精度よく検出することが可能となり、広範なダイナミックレンジが確保される。
【０１３０】
また、本実施形態によれば、反射部材３６を駆動することによって金属膜５５に対する励起光αの入射角θを変えることができるため、入射角θの変更による金属膜５５における励起光αの反射位置のずれを抑えることができる。即ち、上記に構成によれば、反射部材３６の位置と反射面３６ａの向きとを変更・調整するだけで金属膜５５に対する励起光αの入射角θを変えることができるため、従来のように光源や複数のレンズ等からなる励起光学系全体を動かして入射角θを調整する場合に比べて可動部品の数及び可動部分の重量等が抑えられ、これにより、可動部分における駆動誤差やガタつきを抑制することができる。その結果、励起光αの入射角θを変更することによる金属膜５５での励起光αの反射位置のずれを好適に抑制することができる。
【０１３１】
しかも、プリズム５１内に１つの励起光αを入射させて金属膜５５近傍に表面プラズモン共鳴に基づく増強電場を生じさせるため、従来のように入射角θの異なる複数の励起光α、α、…をプリズム５１内に同時に入射させる場合のように自家蛍光の光量が増加することを防ぐことができる。これにより、表面プラズモン共鳴によって金属膜５５近傍に生じた光を測定して得られる信号において自家蛍光に起因するＳＮ比の低下を抑えることができる。
【０１３２】
また、本実施形態によれば、表面プラズモン共鳴によって増強電場の電場強度が最も大きくなるように、金属膜５５に対する励起光αの入射角θが精度よく設定される。具体的には、金属膜５５における反射光の角度スペクトルにおける吸収ピークと、増強電場の電場強度のピークとにはズレが生じるが、表面プラズモン共鳴に起因して生じる光（金属膜５５で生じる光）の強度ピークは、増強電場の電場強度のピークと一致する。そのため、この金属膜５５で生じる光の強度が最大となったときの反射部材３６の位置と反射面３６ａの向きとになるように反射部材３６を調整することで、金属膜５５に入射する励起光αが増強電場の電場強度が最も大きくなる励起入射角θ１となる。
【０１３３】
次に、本発明の第２実施形態について図１３及び図５を参照しつつ説明するが、上記第１実施形態と同様の構成には同一符号を用いると共に詳細な説明を省略し、異なる構成ついてのみ詳細に説明する。
【０１３４】
本実施形態の分析装置１０Ａでは、光測定部４０Ａの構成及び制御処理部１４Ａの構成が第１実施形態の分析装置１０の光測定部４０の構成及び制御処理部１４の構成と異なる（図１及び図５参照）。
【０１３５】
具体的には、光測定部４０Ａの第２整波部４３Ａは、第２ＢＰＦ４６を有する。この第２ＢＲＦ４６は、第１実施形態と異なり、測定光学系４２の光路上に固定されている。即ち、本実施形態の第２整波部４３Ａには、第１実施形態の第２整波部４３における第２ＮＤＦ４７と位置切換部４８とがない。
【０１３６】
また、制御処理部１４Ａのズレ角導出部１４１Ａは、光測定部４０Ａによって測定された励起蛍光の光量に基づいてズレ角θｉを求める。具体的に、ズレ角導出部１４１Ａは、光源部２１が励起光αを射出した状態で回転駆動部３４によって１／２波長板３３を回転させつつ光測定部４０Ａによって測定する励起蛍光の光量の最大値（最大蛍光量の値）Ｓｍａｘと最小値（最小蛍光量の値）Ｓｍｉｎとからズレ角θｉを求める。
【０１３７】
具体的に、ズレ角導出部１４１Ａは、最大値Ｓｍａｘと最小値Ｓｍｉｎとが得られれば、以下の式（１７）により、プリズム５１での複屈折によるズレ角（長軸回転量）θｉを求める。
【数１７】
0005472033.tif 000018
【０１３８】
このように構成される分析装置１０Ａにおける検体の分析について、図６，図８，図９，図１４及び図１５も参照しつつ以下に説明する。尚、図１４は、本実施形態の分析装置１０Ａにおける共鳴角走査シーケンスを示すフローチャートであり、図１５は、本実施形態の分析装置１０Ａにおける励起蛍光測定シーケンスを示すフローチャートである。
【０１３９】
<前処理工程>
第１実施形態と同様に、前処理工程において生成された試料液が分析チップ５０に注入され、捕捉程５６と検体とが反応する。反応が行われた分析チップ５０は、チップ保持部１２に搬送され、保持される（ステップＳ１）。
【０１４０】
<励起光源２２の温調>
第１実施形態と同様に、波長変動の少ない安定的な波長の出力光を励起光源２２に出力させるために励起光源２２が温調回路２５によって温調され、定温に維持される。
【０１４１】
<共鳴角走査工程>
分析チップ５０がチップ保持部１２に保持されると、制御処理部１４Ａは、共鳴角走査を行う。そして、制御処理部１４Ａは、反射部材３６の第１の位置決めを行う（ステップＳ２）。
【０１４２】
具体的には、制御処理部１４Ａが反射部材駆動部３７によって反射部材３６を駆動することにより、金属膜５５への励起光αの入射条件（励起入射角θ１）の走査を行う。
【０１４３】
詳しくは、偏光方向調整部３１の１／２波長板３３は、初期状態となっている。そして、制御処理部１４Ａは、光源部２１から励起光αを射出させた状態で、入射経路調整部３５により金属膜５５上の照射位置をずらさないように回転駆動機構により反射面３６ａの向きを回転させる（ステップＳ２４）と共に往復駆動機構により反射部材３６の位置を移動させる（ステップＳ２５）。このとき、第１実施形態の分析装置１０と異なり測定光学系４２の光路上に第２ＢＰＦ４６が固定されているため、この第２ＢＰＦ４６により励起波長の光が遮られて受光部４１には励起蛍光のみが到達する。これにより、光測定部４０Ａが励起蛍光の強度を測定してその測定結果を制御処理部１４Ａに出力し、制御処理部１４Ａが入射角θと関連付けてこの測定結果を記憶する（ステップＳ２６Ａ）。
【０１４４】
これが繰り返され、制御処理部１４Ａは、金属膜５５における照射位置がずれないようにして入射角θを変更しつつ光測定部４０Ａにより蛍光の強度を測定し、その測定結果を記憶する（ステップＳ２７）。
【０１４５】
制御処理部１４Ａは、所定の走査領域での光測定部４０Ａによる蛍光の強度を測定すると、光源部２１からの励起光αの射出を止める。そして、制御処理部１４Ａが、記憶した蛍光量の最大値Ｓｍａｘと最小値Ｓｍｉｎとを選出し、これらを記憶する（ステップＳ２８Ａ）と共に、最大値Ｓｍａｘが得られたときの反射部材３６の位置と反射面３６ａの向きとなるように反射部材駆動部３７によって反射部材３６を駆動する（ステップＳ２９）。
【０１４６】
<最適位置走査工程>
反射部材３６の位置決めが終わると、制御処理部１４Ａは、第１実施形態と同様にして、金属膜５５への励起光αの照射位置（入射位置）が光測定部４０Ａの測定領域の中心部となるように、反射部材３６の第２の位置決めを行う（ステップＳ３、及びステップＳ３１〜ステップＳ３７）。
【０１４７】
<複屈折測定工程>
次に、制御処理部１４Ａは、第１実施形態同様に、プリズム５１における複屈折を測定し（ステップＳ４）、励起蛍光の測定の際にこれを考慮することにより、検体の測定精度を向上させる。
【０１４８】
具体的に、制御処理部１４Ａ（詳しくは、ズレ角導出部１４１Ａ）は、光源部２１から励起光αを射出させ、光測定部４０Ａにより励起蛍光の強度を測定する。このとき、１／２波長板３３は、初期状態である（ステップＳ４１）。そして、制御処理部１４Ａ（ズレ角導出部１４１Ａ）は、回転駆動部３４によって１／２波長板３３を回転させつつ、光測定部４０Ａにより測定した励起蛍光の強度を１／２波長板３３の回転位置と関連付けて記憶する（ステップＳ４２及びステップＳ４３）。
【０１４９】
制御処理部１４Ａ（ズレ角導出部１４１Ａ）は、光測定部４０Ａにより測定される励起蛍光の光量の最大値Ｓｍａｘと最小値Ｓｍｉｎが得られるまで、ステップＳ４２及びステップＳ４３を順に繰り返す（ステップＳ４４）。制御処理部１４Ａ（ズレ角導出部１４１Ａ）は、最大値Ｓｍａｘと最小値Ｓｍｉｎとが得られると、記憶した光量からこれら最大値Ｓｍａｘと最小値Ｓｍｉｎとを選出し（ステップＳ４５）、これらの各値を記憶する。
【０１５０】
次に、制御処理部１４Ａ（ズレ角導出部１４１Ａ）は、記憶した最大値Ｓｍａｘ及び最小値Ｓｍｉｎとから、上記の式（１７）により、当該プリズム５１での複屈折によるズレ角（長軸回転量）θｉを求める。そして、制御処理部１４Ａ（補正値導出部１４２）は、ズレ角θｉから第１実施形態と同様の式（５）により補正値Ｋを導出する。制御処理部１４Ａは、このように求めたズレ角θｉと補正値Ｋとを記憶する（ステップＳ４６）。
【０１５１】
<励起蛍光導出工程>
次に、制御処理部１４Ａは、検体の分析に必要な励起蛍光の光量を導出する（ステップＳ５Ａ）。
【０１５２】
具体的に、制御処理部１４Ａは、光源部２１から射出される励起光αが反射部材３６の裏面３６ｂに設けられた無反射光吸収物質に入射するように、反射部材駆動部３７の回転駆動機構により反射部材３６を回転させる（ステップＳ５２）。これにより、制御処理部１４Ａは、光測定部４０の出力により暗ノイズＤＮを検出し、これを記憶する（ステップＳ５３）。
【０１５３】
制御処理部１４（詳しくは、補正部１４３）は、記憶している最大値Ｓｍａｘと、予め記憶している所定の基準光量とを比較し（ステップＳ１５５）、最大値Ｓｍａｘが小さければ、表示部１６に出力信号を出力して「測定不能」や「十分健康」といった文言等を表示させる（ステップＳ１５６）。この基準光量は、試料液中の検体の量に基づいて検体を採取された人が健康か否かを判断するために設定された閾値である。具体的に、最大値Ｓｍａｘが基準光量より小さければ検体の量が少ないため、検体を採取された人は十分健康であると判断され、大きければ検体の量が多いため、検体を採取された人は病気であると判断され、検体の詳しい分析が行われる。
【０１５４】
最大値Ｓｍａｘが基準光量以上であれば、制御処理部１４Ａは、記憶している最大値Ｓｍａｘと、最小値Ｓｍｉｎと、上記で求めた暗ノイズＤＮとから、第１実施形態と同様の上記の式（９−１）〜式（１３−２）により、プリズム５１における自家蛍光の光量ｈを導出する。
【０１５５】
そして、制御処理部１４Ａ（補正部１４３）は、複屈折測定工程で求めた補正値Ｋを用いて、上記の式（１４）から励起蛍光の光量Ｈを導出し、これを記憶する（ステップＳ１５７）。
【０１５６】
<記憶・表示工程>
以上のようにして制御処理部１４Ａは、複屈折の影響等を取り除いた励起蛍光の光量Ｈを求めた後、これを検体番号と関連付けて記憶し、その他の記憶を消去する（ステップＳ６）。また、制御処理部１４Ａは、この検体番号と関連付けて記憶した励起蛍光の光量Ｈに基づく情報を表示部１６に出力し、表示部１６がこれを表示する。
【０１５７】
最後に、制御処理部１４Ａは、反射部材３６を初期位置に復帰させて（ステップＳ７）一連の測定を終了する。
【０１５８】
本実施形態の分析装置１０Ａによれば、光測定部４０によって測定された励起蛍光の光量を補正値Ｋによって補正することにより、複屈折に基づく誤差を抑えた蛍光の光量が得られる。これにより、検査毎にプリズム５１を交換しても、各プリズム５１において複屈折による位相回転が生じることなく励起光αが金属膜５５に入射した場合に測定される蛍光の光量をそれぞれ得ることができるため、プリズム５１毎の複屈折の度合いのばらつきに起因する測定誤差を効果的に抑制することができる。尚、当該分析装置１０Ａでは、光測定部４０によって測定される励起蛍光がプリズム内で生じる自家蛍光よりも十分に大きく且つズレ角が十分に大きい場合に上記の効果が好適に得られる。
【０１５９】
しかも、本実施形態の光測定部４０は、金属膜５５及びこれに隣接する領域で生じる光に含まれる蛍光だけを測定できればよく、構成を簡素化できる。詳しくは、金属膜５５で生じた表面プラズモン共鳴に起因し、この金属膜５５及びこれに隣接する領域で生じる光としては、例えば、プラズモン散乱光やラマン散乱光といった散乱光や、蛍光物質等がエバネッセント波（増強電場）に励起されて発する蛍光等がある。これら散乱光と蛍光とは光量が大きく異なるため、各光を測定するには、各光量に応じた複数の光量測定装置を切り換え可能に配置したり、一つの光量測定装置で測定する場合には第１実施形態のように第２ＮＤＦ４７等を受光部４１の前に出し入れ可能にして受光部４１に入射する光量を調整できるようにしなければならず、光測定部の構成が非常に複雑になると共に装置の小型化が図れない。しかし、光測定部４０が励起蛍光の光量のみを測定する場合には、散乱光と蛍光との両方を測定可能な第１実施形態の光測定部４０に比べて、光測定部の構成を簡素化することができる。
【０１６０】
尚、本発明の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法は、上記第１実施形態及び第２実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更を加え得ることは勿論である。
【０１６１】
上記第１実施形態及び第２実施形態の分析装置１０，１０Ａでは、検体の検出毎に分析チップ５０が交換されるが、これに限定されない。即ち、分析装置１０，１０Ａの一部に分析チップが組み込まれ、一つの分析チップを繰り返し利用して検体の検出を行う分析装置１０であってもよい。
【０１６２】
上記第１実施形態及び第２実施形態では、共鳴角走査工程において、制御処理部１４は、励起入射角θ１を求める際に、金属膜５５への励起光αの入射角θを連続的に変えながら金属膜５５で生じる光の強度を測定しているが、これに限定されない。
【０１６３】
例えば、制御処理部１４は、第１の範囲内で入射角θを断続的に（例えば、入射角を１°刻みで）変えながら各入射角θにおける金属膜５５で生じる光の強度を測定する第１の走査と、この第１の走査の結果に基づく第２の範囲内で入射角θを第１の走査より小さい間隔で（例えば、入射角を０．１°刻みで）断続的に若しくは連続的に変えつつ金属膜５５で生じる光の強度を測定する第２走査とを行うようにしてもよい。即ち、離散ステップによる第１の走査によって第２の走査の範囲を絞り込み、この絞り込んだ範囲内を細かく走査することにより、金属膜５５で生じる光が最大光量となる励起入射角θ１を求めてもよい。尚、第２の範囲は第１の範囲に含まれる。
【０１６４】
詳しくは、制御処理部１４は、例えば、設計に基づく励起入射角θ１ａを中心にして±１０°未満の入射角θの範囲（第１の範囲）内で１°刻みで入射角θを変更しつつ、各入射角θにおける金属膜５５で生じる光の強度を測定し（第１の走査）、その結果を対応する入射角θと関連付けて記憶する。そして、第１の走査において最大強度が得られた入射角θを中心にして±１°以内の入射角θの範囲（第２の範囲）内で０．１°刻み又は連続的に入射角θを変更しつつ金属膜５５で生じる光の強度を測定し（第２の走査）、その結果を対応する入射角θと関連付けて記憶する。そして、制御処理部１４は、この第２の走査において、最大強度が得られたときの入射角θを励起入射角θ１とする。このようにすれば、第１の範囲全体を細かく走査する場合に比べて、増強電場が最も大きくなる励起入射角θ１を効率よく求めることが可能となる。
【０１６５】
尚、共鳴角走査工程において第１の走査と第２の走査とを行う場合であって、チップ保持部１２に複数の分析チップ５０を順に保持させ、次々に検体の分析を行う分析装置１０においては、最初の分析チップ５０に対してのみ第１の走査を行い、２つ目以降の分析チップ５０に対しては、第２の走査のみを行うようにしてもよい。
【０１６６】
詳しくは、制御処理部１４は、最初の分析チップ５０に対し、上記と同様にして、例えば、設計に基づく励起入射角θ１ａを中心にして±１０°未満の入射角θの範囲（第１の範囲）内で１°刻みで入射角θを変更しつつ、各入射角θにおける金属膜５５で生じる光の強度を測定し（第１の走査）、その結果を対応する入射角θと関連付けて記憶する。そして、第１の走査において最大強度が得られた入射角θを中心にして±３°以内の入射角θの範囲（第２の範囲）内で０．１°刻み又は連続的に入射角θを変更しつつ金属膜５５で生じる光の強度を測定し（第２の走査）、その結果を対応する入射角θと関連付けて記憶する。そして、制御処理部１４は、この第２の走査において、最大強度が得られたときの入射角θを最初の分析チップ５０における励起入射角θ１とする。
【０１６７】
次に、２つ目の分析チップ５０に対し、制御処理部１４は、第１の走査を行うことなく、最初の分析チップ５０への第１の走査で得られた第２の走査範囲内で０．１°刻み又は連続的に入射角θを変更しつつ金属膜５５で生じる光の強度を測定し（第２の走査）、その結果を対応する入射角θと関連付けて記憶する。そして、制御処理部１４は、この第２の走査において、最大強度が得られたときの入射角θを２つ目の分析チップ５０における励起入射角θ１とする。このように、２つ目以降の分析チップ５０に対しては、最初の分析チップ５０によって得られた第２の範囲内での走査（第２の走査）のみを行うことにより、分析時間の短縮を図ることができる。
【符号の説明】
【０１６８】
１０，１０Ａ  表面プラズモン共鳴蛍光分析装置
１２   チップ保持部
１４，１４Ａ  制御処理部
２０   励起光射出部
２１   光源部
３０   励起光学系
３３   １／２波長板
３４   回転駆動部
３５   入射経路調整部
３６   反射部材
３６ａ 反射面
３７   反射部材駆動部
４０，４０Ａ  光測定部
４１   受光部
４２   測定光学系
４４   集光レンズ
４５   結像レンズ
４６   第２ＢＰＦ（第１の光フィルター）
４７   第２ＮＤＦ（第２の光フィルター）
４８   位置切換部
５０   分析チップ
５１   プリズム
５３   成膜面（所定の面）
５５   金属膜
１４１，１４１Ａ     ズレ角導出部
１４２ 補正値導出部
１４３ 補正部
ＤＮ   暗ノイズ
Ｋ     補正値（補正係数）
Ｓｍａｘ      測定最大光量，最大値
Ｓｍｉｎ      測定最小光量，最小値
α     励起光
θ     入射角
θ１   励起入射角
θｉ   ズレ角（長軸回転量）
【図１】
0005472033.tif 000022
【図２】
0005472033.tif 000023
【図３】
0005472033.tif 000024
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0005472033.tif 000029
【図９】
0005472033.tif 000030
【図１０】
0005472033.tif 000031
【図１１】
0005472033.tif 000032
【図１２】
0005472033.tif 000033
【図１３】
0005472033.tif 000034
【図１４】
0005472033.tif 000035
【図１５】
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