(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
ａ．核酸を含む生物材料を生物試料から抽出する工程、
ｂ．生物材料を、配列番号１〜２８のいずれか１つを有する核酸配列を有する標的遺伝子に特異的な試薬から選択される２８個の特異的試薬と接触させる工程、
ｃ．前記標的遺伝子の２８個の発現を分析する工程、及び
ｄ．配列番号１〜１８の核酸配列を有する標的遺伝子の発現が、予後が良好な患者に由来する生物材料と比較して増加し、配列番号１９〜２８の核酸配列を有する標的遺伝子の発現が、予後が良好な患者に由来する生物材料と比較して減少した場合に、予後不良であると判定する工程：
を含むことを特徴とする
敗血症症候群の予後の判定方法。
【請求項２】
以下の工程：
ａ．核酸を含む生物材料を生物試料から抽出する工程、
ｂ．生物材料を、配列番号１、３、７、９〜１５及び１７〜２８のいずれか１つを有する核酸配列を有する標的遺伝子に特異的な試薬から選択される２２個の特異的試薬と接触させる工程、
ｃ．前記標的遺伝子の２２個の発現を分析する工程、及び
ｄ．配列番号１、３、７、９〜１５、及び１７〜１８の核酸配列を有する標的遺伝子の発現が、予後が良好な患者に由来する生物材料と比較して増加し、配列番号１９〜２８の核酸配列を有する標的遺伝子の発現が、予後が良好な患者に由来する生物材料と比較して減少した場合に、予後不良であると判定する工程：
を含むことを特徴とする
敗血症症候群の予後の判定方法。
【請求項３】
生物試料は血液試料である
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の判定方法。
【請求項４】
工程ｂ．の特異的試薬は、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブを含む
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の判定方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブは基体上に固定されている
ことを特徴とする請求項４に記載の判定方法。
【請求項６】
敗血症症候群の予後を判定するための、配列番号１、３、７、９〜１５及び１７〜２８のいずれか１つを有する核酸配列を有する標的遺伝子に特異的なプローブから選択される２２個のハイブリダイゼーションプローブを有する基体の使用。
【請求項７】
敗血症症候群の予後を判定するための、配列番号１、３、７、９〜１５及び１７〜２８のいずれか１つを有する核酸配列を有する標的遺伝子に特異的な２２個の試薬の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、敗血症症候群の診断及び／又は予後診断方法に関する。また、本発明は、敗血症症候群の診断及び／又は予後診断用のキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
感染に対する全身性の反応である敗血症症候群は、集中治療室における死亡の主原因の１つである。これは、細菌、ウイルス、真菌又は寄生虫による感染によって生じ得る。この敗血症症候群のうち、以下のものは、重篤度の順位が徐々に高くなる点で区別することができる：敗血症、重症敗血症及び敗血症ショック。そのため、１９９２年に、専門家らにより、これらの３つの臨床的な症候群を定義するための基準が提起された（非特許文献１）：
・例えば、敗血症は、感染に関係する炎症性の全身反応である、
・重症敗血症は、少なくとも１つの臓器の機能不全を伴う敗血症である、
・敗血症ショックは、持続する低血圧症を伴い、以下によって定義することができる重症敗血症である：
○特定の感染部位の存在、
○以下の兆候の少なくとも３つによって現れる全身性の炎症反応：ａ）体温が３８℃より高いか又は３６℃より低い；ｂ）心拍が１分間に９０回より多い；ｃ）呼吸速度が１分間に２０回より遅い；ｄ）白血球数が１２，０００個／ｍｍ３より多いか又は４，０００個／ｍｍ３より少ない、
○適切な充填（ｆｉｌｌｉｎｇ）とバソプレッシン処理をしたにもかかわらず、低血圧症が持続する。
【０００３】
一般的に、敗血症、重症敗血症及び敗血症ショックの兆候は類似しており、これらの３種類の症状の間の差は主として、全生体機能の乱れの程度に現れる。敗血症ショックにおいては、動脈圧の低下、頻脈、多呼吸、皮膚の赤い炎症、低体温又は高体温、体の震えが、主に観察される。また、これらの兆候には「標的」臓器の機能不全も伴い、感染部位から離れた臓器の機能の機能障害が伴って（腎臓、肺、中枢神経系、消化器系及び造血系が罹患する場合が最も多い）、乏尿症（＜０．５ｍｌ／ｋｇ／時間）、腎不全、低酸素血症、血小板減少症、興奮及び混乱状態として現れる。
【０００４】
敗血症の段階から重症敗血症の段階へ、さらに敗血症ショックの段階へという敗血症症候群の進行は体系的ではない。というのは、敗血症患者のおよそ６４％しか重症敗血症を発症せず、また重症敗血症の患者の２３％しか敗血症ショックへと進行しないからである。敗血症ショックというこの最終的な段階の前に、生理病理学的プロセスを妨害しそして変更させるために、患者は所定の処置をうけなければならない。したがって、十分な血流学的状態に回復させること、及び、効果的な換気を確実に実施する必要がある。さらに、ショックの対症療法及び抗生物質による処置（可能な限り早く、細菌学的データに適しているもの）を制御することも必要である。
【０００５】
したがって、敗血症症候群、特に敗血症ショックを発症する患者は、比較的簡単な処置（例えば、細菌学的試験により感染源を示す前に、広域抗生物質での処置を設定すること）によって改善する可能性があるが、それよりはるかに重症の敗血症症候群を発症する他の患者には、強力で大規模な処置（例えば、注射費用が非常に高い活性化プロテインＣの注射）が必要である。このような処置は高価であるだけではなく、患者は非常に重い副作用のリスク（血液凝固の問題など）にもさらされる。したがって、この処置は、上記の処置が確実に必要とされる予後不良の患者についてのみ提案されるべきである。
【０００６】
結果として、敗血症症候群の初期診断は不可欠であり、それによって患者にとって適切な処置を提案することが可能となる。さらに、それぞれの患者に適切な処置を提供するためには、さらには可能な限り早く予後不良の敗血症症候群患者及び徹底的な治療を要する患者及び予後の良好な患者を区別するためには、敗血症症候群、特に敗血症ショックの予後診断が不可欠である。最後に、大きな臨床的兆候が現れる前に可能な限り早く介入できるようにするために、敗血症を発症する恐れのある患者、例えば、外科手術又は移植を受けた患者や免疫抑制患者を観察することも非常に有効である。
【０００７】
現在、敗血症症候群、特に敗血症ショックの診断及び予後診断は、原則として、内臓の機能不全の数、対症療法に対する応答、及び、最初の感染部位と二次感染の可能性がある任意の部位とについて医学的及び／又は外科的治療を実施できる程度に基づいている。
【０００８】
しかし、これには、進行した段階の敗血症症候群、特に敗血症ショックのみにしか適用できず、患者の生存可能性が減少するという欠点がある。また、敗血症症候群の診断及び予後診断は、この症候群に関係している特定のタンパク質又は可溶性因子の検出に基づいて実施することもできる。したがって、敗血症症候群の発症中に関与している特定のサイトカインをアッセイすることは、敗血症症候群を診断する手段となり得、また予後診断を形成する手段でもあり得る。
【０００９】
また、ＩＬ−１（インターロイキン−１）の血漿含有量と予後不良の敗血症症候群との間に明確な相関関係があるということについて記載している文献がある（非特許文献２）。しかし、それ以外の文献では、ＩＩ−１と敗血症症候群の予後不良の間には相関関係がないことも見出されており、このことから、この要素は非常に多様であるということが示唆される。さらに、高投与量のＴＮＦ（腫瘍壊死因子）もまた予後不良に関係している（非特許文献３）。ＴＮＦ−α、そしてＩＬ−１βは、敗血症状態が引き起こされた後に単球から放出される最初の２つの炎症性サイトカインである。
【００１０】
上記以外に、血漿ＩＬ−１０（インターロイキン−１０）含有量は予後不良の敗血症患者において高い一方、予後の良好な敗血症患者においては有意に減少しており、また正常な患者においては検出できないことを示した（非特許文献４）。ＩＬ−１０は、ＴＮＦ−αの生産及びＩＬ−１βの生産を阻害するため極めて重要な抗炎症性サイトカインであり、免疫麻痺状態の構築に関与している。しかし、こうしたＩＬ−１０含有量の増加は、敗血症ショック患者の８０％においてしか検出できないため、この要素の検出だけでは敗血症ショック発症の予後診断としてはいまだ不十分である。
【００１１】
特許文献１においては、ＥＬＩＳＡ型免疫ブロッティング技術によるＨＭＧ１（高移動性グループ１タンパク質）の血清濃度測定を含む、敗血症症候群の重篤度の予後診断方法が記載されている。ＨＭＧ１は、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βとは異なって、敗血症症候群の後期炎症性媒介因子として記載されている。高濃度のＨＭＧ１は予後不良に関係し、血清ＨＭＧ１濃度は正常な患者においては検出されない。一方、マウスにおけるＨＭＧ１遺伝子の転写後調節について記載されており、このことから、この遺伝子の発現はタンパク質レベルでしか分析するべきではないことが示唆される（非特許文献５）。
【００１２】
特許文献２によっては、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、ＨＭＧ１、Ｔ−ｂｅｔ、ＩＬ−１β、ＴＮＦα及びＧＡＴＡ−３から選択される少なくとも２つの標的遺伝子の発現を判定する、敗血症症候群の予後診断方法が提供されている。このようなパネルを使用することによって、予後の良好な患者と予後不良の患者とを８０％を超える割合で分類することが可能となる。しかし、患者を可能な限り早く徹底して処置するためには、特に、予後不良の患者の分類に関して、分類割合をさらに高めることが必要であろう。
【特許文献１】米国特許第ＵＳ−Ｂ−６，３０３，３２１号
【特許文献２】特許出願ＷＯ０４／１０８９５７
【非特許文献１】Ｒ．Ｃ．Ｂｏｎｅら，Ｔｈｅ  ＡＣＣＰ／ＳＣＣＭ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｓｔ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ／Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｃｈｅｓｔ  １０１（６）：１６４４−１６５５，１９９２
【非特許文献２】Ｔｈｉｊｓ＆Ｈａｃｋ，Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ３１：Ｓ２５８−２６３，１９９５
【非特許文献３】Ｃａｓｅｙら，Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１９９３．１１９：７７１−７７８
【非特許文献４】Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌｌ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７５：１１８−１２２，１９９７
【非特許文献５】Ｗａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，第２８５巻、２４８−２５１頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、敗血症症候群、例えば、具体的には、敗血症ショックの診断及び／又は予後診断のための新規で信頼できるツールを提供することによって、先行技術の欠点を解決することを提案する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
驚くべきことに、本発明者らによって、以下の表１に示されるように、２８個の遺伝子から選択した標的遺伝子の発現を分析することは、予後の良好な患者と予後不良の患者との区別に対して極めて関係が深いことが明らかになった。このようなパネルを使用することによって、特に、予後不良の患者を１００％の割合で分類することが可能となる。
【００１５】
表１  本発明の２８種類の遺伝子のリスト
【００１６】
【表１】
0005552211.tif 000002
【００１７】
いくつかの変異体が同じ標的遺伝子について存在する場合もある。本発明は全ての変異体に関係している。これらの遺伝子に対して多様なイソ型が存在する場合には、上記の表に示されたものだけではなく、全てのイソ型が本発明に関係するということが明確に理解される。この点において、特に、配列番号８の標的遺伝子には３種類の変異体が存在する；上記の表には第１の変異体のみが示されているが、第２の変異体（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿１５３０４７）及び第３の変異体（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿１５３０４８）も同様に本発明の目的に関係しているということに注目すべきである。
【００１８】
同様に、配列番号２０の標的遺伝子については２種類の変異体が存在している；上記の表には第１の変異体のみが示されているが、第２の変異体（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０３２９６０）も同様に本発明の目的に関係している。同様に、配列番号２２の標的遺伝子については２種類の変異体が存在している；上記の表には第１の変異体のみが示されているが、第２の変異体（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿１９８９２６）も同様に本発明の目的に関係している。最後に、配列番号２５の標的遺伝子については１１種類の変異体が存在している；上記の表には第１の変異体のみが示されているが、他の変異体（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿１３９００２；ＮＭ＿１３９００３；ＮＭ＿１３９００４；ＮＭ＿１３９００５；ＮＭ＿１３９００６；ＮＭ＿１３９００７；ＮＭ＿１３９００８；ＮＭ＿１３９００９；ＮＭ＿１３９０１０；ＮＭ＿１３９０１１）も同様に本発明の目的に関係している。
【００１９】
この趣旨で、本発明は、
以下の工程：
ａ．生物材料を生物試料から抽出する工程、
ｂ．生物材料を、配列番号１〜２８のいずれか１つを有する核酸配列を有する標的遺伝子に特異的な試薬から選択される少なくとも１つの特異的試薬と接触させる工程、
ｃ．上記標的遺伝子の少なくとも１つの発現を判定する工程：
を含むことを特徴とする
患者に由来する生物試料に基づく敗血症症候群の診断／予後診断方法
に関する。
【００２０】
本発明の目的のために、用語「生物試料」は、以下に規定されるような生物材料を含んでいてよい、患者から採取した任意の試料を意味するものとする。この生物試料は具体的には、患者由来の血液、血清、唾液、組織又は循環細胞試料であってよい。この生物試料は、当業者に公知の任意の試料採取方法によって得られる。本発明の好ましい実施形態によれば、患者から採取する生物試料は血液試料である。
【００２１】
本発明の方法の工程ａ）においては、生物材料を、当業者に周知の核酸抽出及び精製プロトコルのいずれかによって生物試料から抽出する。本発明において、用語「生物材料」は、標的遺伝子の発現を検出することが可能な任意の材料を意味するものとする。生物材料には、具体的には、タンパク質又は核酸、例えば、具体的には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）が含まれていてよい。核酸は、具体的には、ＲＮＡ（リボ核酸）であってよい。本発明の好ましい実施形態によれば、工程ａ）で抽出された生物材料には、核酸、好ましくはＲＮＡが含まれ、さらに好ましくは総ＲＮＡが含まれる。総ＲＮＡには、トランスファーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）（例えば、標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡであるが、任意の他の遺伝子から転写されたｍＲＮＡであってもよい）、及び、リボソームＲＮＡが含まれる。生物材料には、標的遺伝子に特異的な材料（例えば、具体的には、標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡ、又は、これらのｍＲＮＡに由来するタンパク質）が含まれるが、これには、標的遺伝子に特異的ではない材料（例えば、具体的には、標的遺伝子以外の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、標的遺伝子以外の遺伝子に由来するｒＲＮＡ）も含まれる場合がある。
【００２２】
例えば、核酸の抽出は以下によって行うことができる：
−患者の細胞に含まれる核酸を放出させるために、生物試料中に存在している細胞を溶解させることからなる工程。
例えば、複数の特許出願に記載されているような溶解の方法を使用することができる：
○磁気による溶解と機械的溶解の組み合わせに関するＷＯ００／０５３３８
○電気的溶解に関するＷＯ９９／５３３０４
○機械的溶解に関するＷＯ９９／１５３２１。
【００２３】
当業者は、熱ショック若しくは浸透圧ショック、又は、グアニジウム塩等のカオトロピック剤を使用した化学溶解（米国特許第５，２３４，８０９号）等の他の周知の溶解方法を使用してもよい。
−溶解工程で放出された他の細胞構成要素から核酸を分離するための精製工程。概してこの工程では核酸の濃縮が可能であり、かつ、この工程はＤＮＡ又はＲＮＡの精製に利用することができる。例えば、吸着又は共有原子価により必要に応じてオリゴヌクレオチドでコーティングされた磁性粒子（この点で、米国特許第４，６７２，０４０号及び米国特許第５，７５０，３３８号を参照のこと）を使用可能であり、例えば、この磁性粒子に付着する核酸は洗浄工程によって精製することができる。引き続いて上記核酸の増幅が望まれる場合に、この核酸精製工程は特に有利である。この磁性粒子の特に有利な実施形態は、特許出願ＷＯ−Ａ−９７／４５２０２及びＷＯ−Ａ−９９／３５５００に記載される。核酸の精製方法の別の有利な例は、カラムの形態での、又は、不活性粒子（Ｂｏｏｍ  Ｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９０、ｎ°２８（３）、ｐ．４９５〜５０３）若しくは磁性粒子（Ｍｅｒｃｋ社：ＭａｇＰｒｅｐ（登録商標）Ｓｉｌｉｃａ，Ｐｒｏｍｅｇａ社：ＭａｇｎｅＳｉｌ（商標）常磁性粒子）の形態でのシリカの使用である。これ以外に、カラムにおける、又は、常磁性粒子型（Ｗｈａｔｍａｎ社：ＤＥＡＥ−ｍａｇａｒｏｓｅ）（Ｌｅｖｉｓｏｎ  ＰＲら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、１９９８、ｐ．３３７〜３４４）におけるイオン交換樹脂に基づく方法も非常に広範に使用される。本発明に大いに関連している別の方法は、金属酸化物支持体（Ｘｔｒａｎａ社：Ｘｔｒａ−Ｂｉｎｄ（商標）マトリックス）への吸着であるが、これに限定されない。
【００２４】
生物試料からＤＮＡを特異的に抽出したい場合、具体的にフェノール、クロロホルム及びアルコールを使用して抽出し、タンパク質を除去して、ＤＮＡを１００％エタノールで沈殿させることができる。その後、ＤＮＡを遠心分離によってペレット化し、洗浄して再度溶解させることができる。
【００２５】
続いて生物試料からＲＮＡを抽出したい場合、具体的にフェノール、クロロホルム及びアルコールを使用して抽出し、タンパク質を除去して、ＲＮＡを１００％エタノールで沈殿させることができる。その後、ＲＮＡを遠心分離によってペレット化し、洗浄して再度溶解させることができる。
【００２６】
工程ｂ）において、かつ、本発明において、用語「特異的試薬」は、上記で定義された生物材料と接触した場合に、上記標的遺伝子に特異的な材料と結合する試薬を意味するものとする。例えば、特異的試薬と生物材料が核酸起源である場合は、特異的試薬を生物材料と接触させることによって、特異的試薬を標的遺伝子に特異的な材料とハイブリダイズさせることができる。用語「ハイブリダイゼーション」は、適切な条件下で、２つのヌクレオチド断片が安定かつ特異的な水素結合で結合し、その結果、二本鎖の複合体を形成するプロセスを意味するものとする。この水素結合は、相補的塩基アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）（又はウラシル（Ｕ））との間（Ａ−Ｔ結合を指す）、あるいは、相補的塩基グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）との間（Ｇ−Ｃ結合を指す）の間に生じる。２つのヌクレオチド断片のハイブリダイゼーションが完全なものである場合（この場合、相補的ヌクレオチド断片又は配列と呼ばれる）、すなわち、このハイブリダイゼーションの間に得られる二本鎖複合体は、Ａ−Ｔ結合及びＣ−Ｇ結合のみを含む。このハイブリダイゼーションが部分的なものである場合（この場合、十分に相補的なヌクレオチド断片又は配列と呼ばれる）、すなわち、得られた二本鎖複合体は、二本鎖複合体を形成できるＡ−Ｔ結合及びＣ−Ｇ結合を含むだけでなく、相補的塩基に結合しない塩基をも含む。２つのヌクレオチド断片の間のハイブリダイゼーションは、使用される作動条件及び特にストリンジェンシーに依存する。ストリンジェンシーは、特に２つのヌクレオチド断片の塩基組成に応じて、かつ、これら２つのヌクレオチド断片間のミスマッチの程度によって規定される。また、ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度及び種類、変性剤の性質及び濃度、並びに／又は、ハイブリダイゼーション温度等の、反応パラメータにも依存するであろう。これらのデータは全て既知のものであり、当業者であれば適切な条件を決定することができる。一般的に、ハイブリダイズさせるヌクレオチド断片の長さによって、濃度約０．５〜１Ｍの食塩水中におけるハイブリダイゼーション温度は約２０〜７０℃、特に３５〜６５℃である。配列又はヌクレオチド断片又はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、リン酸エステル結合によりまとまっている一連のヌクレオチドモチーフであり、これはヌクレオチドモチーフにハイブリダイズ可能な天然の核酸の情報配列を特徴とするものであり、上記一連のヌクレオチドモチーフは、異なる構造のモノマーを含んでいてよく、かつ、天然の核酸分子から及び／又は遺伝子組換えによって及び／又は化学合成によって取得可能である。モチーフは、構成要素が糖、リン酸基及び窒素性塩基である天然の核酸ヌクレオチドであってよいモノマーの誘導体である；ＤＮＡにおいて、糖は２−デオキシリボースであり、ＲＮＡにおいて、糖はリボースである；ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれの場合であるかによって、窒素性塩基がアデニン、グアニン、ウラシル、シトシン及びチミンから選択される；あるいは、モノマーは、これらの３つの構成要素の少なくとも１つが修飾されたヌクレオチドである；例えば、この修飾は、塩基のレベルで、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジン又はハイブリダイゼーション可能な他の任意の修飾塩基等の修飾塩基によって、又は、糖のレベルで、例えばポリアミンによる少なくとも１つのデオキシリボースの置換によって（Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４、１４９７〜１５００（１９９１））、又は、リン酸基のレベルで、例えば具体的には二リン酸エステル、アルキルリン酸エステル、アリールリン酸エステル及びホスホロチオエートから選択されるエステルによるリン酸基の置換のいずれかで生じ得る。
【００２７】
本発明の特定の実施形態によれば、特異的試薬は少なくとも１つの増幅プライマーを含む。本発明の目的のために、用語「増幅プライマー」は、酵素的重合（例えば酵素的増幅反応）を開始できる核モチーフを５〜１００、好ましくは核モチーフを１５〜３０含むヌクレオチド断片を意味するものとする。用語「酵素的増幅反応」は、少なくとも１つの酵素の作用によってヌクレオチド断片の複数のコピーを生成するプロセスを意味するものとする。このような増幅反応は当業者に公知であり、具体的には下記の技術を挙げることができる：
【００２８】
−  米国特許第４６８３１９５号、米国特許第４６８３２０２号及び米国特許第４８００１５９号に記載されるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；
−  例えば欧州特許出願第０２０１１８４号に開示されるＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）；
−  国際特許出願ＷＯ９０／０１０６９に記載されるＲＣＲ（修復連鎖反応（ｒｅｐａｉｒ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ））；
−  国際特許出願ＷＯ９０／０６９９５による３ＳＲ（自立配列複製（ｓｅｌｆ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ））；
−  国際公開ＷＯ９１／０２８１８によるＮＡＳＢＡ法（核酸配列増幅法）
−  米国特許第５３９９４９１号によるＴＭＡ法（転写介在増幅法）。
【００２９】
酵素による増幅がＰＣＲである場合は、特異的試薬には、標的遺伝子に特異的な少なくとも２つの増幅プライマーが含まれ、これらによって標的遺伝子に特異的な材料の増幅が可能となる。したがって、標的遺伝子に特異的な材料には、好ましくは、標的遺伝子に由来するメッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られる相補的ＤＮＡ（この場合、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡと呼ばれる）、又は、標的遺伝子に特異的なｃＤＮＡの転写によって得られる相補的ＲＮＡ（この場合、標的遺伝子特異的ｃＲＮＡと呼ばれる）が含まれる。酵素による増幅が、逆転写反応後に実施されるＰＣＲである場合には、ＲＴ−ＰＣＲと呼ばれる。
【００３０】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、工程ｂ）の特異的試薬は、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブを含む。
【００３１】
用語「ハイブリダイゼーションプローブ」は、標的遺伝子に特異的な物質と共に所定の条件下でハイブリダイゼーション複合体を形成するためのハイブリダイゼーション特異性を有するヌクレオチドモチーフを少なくとも５、例えば核モチーフを５〜１００、特に核モチーフを１０〜３５含むヌクレオチド断片を意味するものとする。
【００３２】
本発明においては、標的遺伝子に特異的な材料は、標的遺伝子に由来するメッセンジャーＲＮＡに含まれるヌクレオチド配列（この場合、標的遺伝子特異的ｍＲＮＡと呼ばれる）、上記メッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られた相補的ＤＮＡに含まれるヌクレオチド配列（この場合、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡと呼ばれる）、あるいは、上記のように、上記ｃＤＮＡの転写によって得られた相補的ＲＮＡに含まれるヌクレオチド配列（この場合、標的遺伝子特異的ｃＲＮＡと呼ばれる）であってよい。
【００３３】
ハイブリダイゼーションプローブは、その検出のためのマーカーを含んでいてよい。用語「検出」は、物理的方法による直接的検出、又は、標識を使用する検出方法による間接的検出のいずれかを意味するものとする。核酸の検出のために、多くの検出方法が存在する［例えば、Ｋｒｉｃｋａら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，Ｎｏ．４５（４），ｐ．４５３−４５８、又は、Ｋｅｌｌｅｒ  Ｇ．Ｈ．ら，ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３，ｓｅｃｔｉｏｎ  ５  ａｎｄ  ６，ｐ．１７３−２４９を参照のこと］。用語「標識」は、検出可能なシグナルを発生可能なトレーサーを意味するものとする。これらのトレースとしては、例えば比色法、蛍光又は発光により検出され得るシグナルを生じる酵素が挙げられ、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ；蛍光、ルミネセンス又は染料化合物等の発色団；電子顕微鏡法によって又は導電率等のそれらの電気的性質によって、電流測定法又はボルタンメトリー法によって、あるいはインピーダンス測定によって検出可能な、高電子密度の基；回折、表面プラズモン共鳴若しくは接触角変動のような光学的方法により、又は、原子力顕微鏡、トンネル効果などの物理的方法により検出され得る基；３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性分子が含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明の目的のために、ハイブリダイゼーションプローブは「検出」プローブであってもよい。この場合、「検出」プローブは、上記に定義されるような標識によって標識される。検出プローブは、具体的には、Ｔｙａｇｉ  ＆  Ｋｒａｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈ，１９９６，１４：３０３〜３０８）によって記載されるような「分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ）」検出プローブであってよい。この「分子ビーコン」は、ハイブリダイゼーション中に蛍光を発する。分子ビーコンはステムループ型構造を有し、フルオロフォア及び「クエンチャー」基を含む。特異的なループ配列とその相補的な標的核酸配列とが結合することにより、適切な波長での励起の間にステムの立体構造の消失及び蛍光シグナルの放出が引き起こされる。
【００３５】
ハイブリダイゼーション反応の検出のためには、直接的（具体的には、標的配列の中に標識を取り込ませることによる）又は間接的（具体的には、上記で定義されたような検出プローブを使用することによる）に標識された標的配列を使用することができる。具体的には、ハイブリダイゼーション工程の前に、例えば、酵素による増幅反応の間に標識されたデオキシリボヌクレオチド３リン酸を使用して、標的配列を標識及び／又は切断することからなる工程を実行することができる。切断は、具体的には、イミダゾール又は塩化マンガンの作用によって行うことができる。また、増幅工程の後に、例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９１／１９８１２号に記載されたサンドウィッチハイブリダイゼーション技術により検出プローブをハイブリダイズすることによって、標的配列を標識することができる。核酸を標識するための別の特定の好ましい方法は、フランス国出願ＦＲ２７８００５９号に記載される。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態によれば、検出プローブはフルオロフォア及びクエンチャーを含む。本発明の更に好ましい実施形態によれば、ハイブリダイゼーションプローブはＦＡＭ（６−カルボキシフルオレッセン）又はＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）フルオロフォアをその５’末端に含み、クエンチャー（ダブシル）をその３’末端に含む。ハイブリダイゼーションプローブは、「“捕捉”プローブ」であってもよい。この場合、“捕捉”プローブは、固定されているか、又は、任意の適切な手段で、すなわち、直接的に又は間接的に、例えば共有結合又は吸着により、固相基体上に固定されていてよい。必要に応じて化学修飾した合成材料又は天然材料を固相支持体として用いることができ、特に、セルロース系材料などの多糖類（例えば、紙、酢酸セルロース及びニトロセルロース又はデキストランなどのセルロース誘導体、特にスチレン系モノマーに基づくポリマー、コポリマー、綿などの天然繊維、並びに、ナイロンなどの合成繊維；シリカ、水晶、ガラス又はセラミックなどの無機材料；格子；磁性粒子；金属誘導体、ゲルなどが挙げられる。固相基体は、マイクロタイタープレート、ＰＣＴ特許出願ＷＯ−Ａ−９４／１２６７０号に記載の膜、又は、粒子の形態であってよい。さらに、基体上に（それぞれが標的遺伝子に特異的な）いくつかの異なる捕捉プローブを固定することもできる。特に、多くのプローブを固定できるバイオチップを基体として使用してもよい。
【００３７】
用語「“バイオチップ”」は、多数の捕捉プローブが所定の位置に結合した、小さな固相基体を意味するものとする。バイオチップ又はＤＮＡチップの概念は、１９９０年代初頭から始まった概念である。これは、マイクロエレクトロニクス、核酸化学、画像分析及び情報技術を統合した複数の学科の技術に基づくものである。作動の原理は、分子生物学：ハイブリダイゼーション現象、すなわち、２つのＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列の塩基の相補性による対形成を基礎にして構築される。バイオチップ法は、固相基体に結合した捕捉プローブの使用に基づくものであり、蛍光色素で直接的に又は間接的に標識された標的ヌクレオチド断片の試料が上記プローブに作用する。捕捉プローブは、基体又はチップ上に特異的に位置しており、それぞれのハイブリダイゼーションにより、標的ヌクレオチド断片に関連して、情報の特定の一部が得られる。得られた情報が蓄積されることによって、例えば、１つ又はそれ以上の標的遺伝子の発現レベルを定量できる。標的遺伝子の発現を分析するため、標的遺伝子の全て又は一部に対応していて、ｍＲＮＡに転写される、多数のプローブを有する基体を調製することができる。本発明の目的のために、用語「低密度基体」は、プローブを５０未満含む基体を意味するものとする。本発明の目的のために、用語「中密度基体」は、プローブを５０〜１０，０００含む基体を意味するものとする。本発明の目的のために、用語「高密度基体」は、プローブを１０，０００より多く含む基体を意味するものとする。
【００３８】
その後、分析対象である、標的遺伝子に特異的なｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを、例えば特異的な捕捉プローブとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、基体又はチップを洗浄し、標識されたｃＤＮＡ又はｃＲＮＡ／捕捉プローブ複合体を、例えば蛍光色素型の標識と結合した、高親和性のリガンドを用いて顕現化する。蛍光を例えばスキャナで読み取り、蛍光分析を情報技術により処理する。例えば、アフィメトリクス社により開発されたＤＮＡチップを挙げることができる（“Ａｃｃｅｓｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  ＤＮＡ  ａｒｒａｙｓ”，  Ｍ，Ｃｈｅｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，２７４，６１０−６１４，  “Ｌｉｇｈｔ−ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ”，  Ａ．Ｃａｖｉａｎｉ  Ｐｅａｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１，５０２２−５０２６）。
【００３９】
この技術において、捕捉プローブは一般的に大きさが小さく、約２５ヌクレオチドである。バイオチップの他の例は、Ｇ．Ｒａｍｓａｙによる刊行物であるＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，Ｎｏ．１６，ｐ．４０−４４；  Ｆ．Ｇｉｎｏｔ，Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ，１９９７，Ｎｏ．１０，ｐ．１−１０；  Ｊ．Ｃｈｅｎｇら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，１９９６，Ｎｏ．１（３），ｐ．１８３−２００；  Ｔ．Ｌｉｖａｃｈｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，Ｎｏ．２２（１５），ｐ．２９１５−２９２１；  Ｊ．Ｃｈｅｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，Ｎｏ．１６，ｐ．５４１−５４６、又は、米国特許ＵＳ−Ａ−４，９８１，７８３号、米国特許ＵＳ−Ａ−５，７００，６３７号、米国特許ＵＳ−Ａ−５，４４５，９３４号、米国特許ＵＳ−Ａ−５，７４４，３０５号及び米国特許ＵＳ−Ａ−５，８０７，５２２号に記載される。固相基体の主な特徴は、捕捉プローブの標的ヌクレオチド断片へのハイブリダイゼーション特性を保持する一方、検出方法についてはバックグラウンドノイズが最小であるものでなければならない。
【００４０】
主要な３種の構成は、プローブを基体上に固定できるか否かによって識別できる。
【００４１】
まず第１に、予め合成されたプローブを正確に配置することからなる第１の技術がある。プローブの結合は、マイクロピペット又はマイクロドットによる、あるいは、インクジェットデバイスによる、直接的な移動によって実施される。この技術によって、数塩基（５から１０）から、上限で比較的大きな６０塩基（プリント）から数百塩基（マイクロデポジション）までの範囲の大きさを有するプローブの結合が可能となる。
【００４２】
プリントは、インクジェットプリンターによって使用される方法の適用である。４０００滴／秒に達し得る速度の非常に小さい流体スフェア（容量＜１ｎｌ）の推進に基づく。プリントにおいて、流体を放出するシステムとそれを沈着させる表面との間は全く接触しない。
【００４３】
マイクロデポジションは、スライドガラスの表面に長さ数十〜数百塩基のプローブを結合させることからなる。これらのプローブは、通常は、データベースから抽出し、増幅して精製した産物の形態である。この技術により、４ｃｍ２に少し満たない表面積上のＤＮＡに、認識領域と呼ばれるおよそ１００００個のスポットを有するマイクロアレイと呼ばれるチップを得ることができる。しかし、直径０．５〜１ｍｍで最大密度２５スポット／ｃｍ２の、通常はＰＣＲで増幅した産物を有する、「マイクロアレイ」と呼ばれるナイロンメンブレンの使用を忘れてはならない。この非常に柔軟な技術は、多くの研究室で使用されている。本発明においては、後者の技術はバイオチップに含まれると考えられる。しかし、国際特許出願番号ＷＯ−Ａ−００／７１７５０及びＦＲ００／１４８９６の場合のように、特定の容量の試料をマイクロ滴定プレートの底のそれぞれのウェルに沈着させることができ、また、別の国際特許出願ＦＲ００／１４６９１に記載されているように、互いに異なる特定の数の液滴を１つの同じペトリ皿の底に沈着させることもできる。
【００４４】
基体又はチップにプローブを結合させるための第２の技術は、ｉｎ  ｓｉｔｕ合成と呼ばれる。この技術によれば、チップの表面に短いプローブが直接製造される。これは、ｉｎ  ｓｉｔｕオリゴヌクレオチド合成（具体的には、国際特許出願番号ＷＯ８９／１０９７７及び同ＷＯ９０／０３３８２を参照のこと）に基づき、そして、オリゴヌクレオチド合成装置によるプロセスに基づく。これは、反応チャンバーを移動させることからなり、ここでは、オリゴヌクレオチド伸張反応はガラス表面に沿って起こる。
【００４５】
最後に、第３の技術は、フォトリソグラフィーと呼ばれる。これは、アフィメトリクス社によって開発されたバイオチップに関係しているプロセスである。これもまたｉｎ  ｓｉｔｕ合成である。フォトリソグラフィーは、マイクロプロセッサー技術に由来する。チップの表面は、光で活性化させることができる光解離性の化学基の結合によって改良される。一旦照射されると、これらの基は、オリゴヌクレオチドの３’末端と反応することができる。所定の形状のマスクでこの表面を保護することによって、４種類のヌクレオチドの１つ又は他のものへの結合が望ましいチップ領域を選択的に照射し、これにより、活性化させることができる。様々なマスクの連続的な使用によって、保護／反応のサイクルを交互に行うことが可能となり、したがって、およそ数十マイクロ平方メートル（μｍ２）のスポット上にオリゴヌクレオチドプローブを製造できる。この解析によって、数平方センチメートル（ｃｍ２）の表面領域上に最大で数十万のスポットを作成することができる。フォトリソグラフィーは、平行してバルクで、わずか４×Ｎ回のサイクルでＮ体（Ｎ-ｍｅｒ）のチップを作成することが可能であるという利点を有する。これらの技術の全てを本発明とともに使用することができる。本発明の好ましい実施形態によれば、上記で定義された工程ｂ）の少なくとも１つの特異的試薬には、基体上に固定化することが好ましい少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブが含まれる。この基体は、好ましくは、上記で定義された低密度、高密度又は中密度の基体である。
【００４６】
多数のプローブを含む、基体上でのこれらのハイブリダイゼーション工程は、上記で定義されたように酵素による増幅反応工程によって、標的の遺伝物質の量を増加させることができる。
【００４７】
工程ｃ）においては、標的遺伝子の発現の判定は、当業者に公知の任意のプロトコルによって行うことができる。
【００４８】
一般的には、標的遺伝子の発現は、所定の瞬間に標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＭＡ）を検出すること、又は、これらのｍＲＮＡに由来するタンパク質を検出することによって分析することができる。
【００４９】
本発明は、好ましくは、当業者に周知のプロトコルのいずれかにしたがう、この標的遺伝子に由来するｍＲＮＡの検出による標的遺伝子の発現の判定に関する。本発明の具体的な実施形態によれば、いくつかの標的遺伝子の発現は、いくつかの異なるｍＲＮＡ（それぞれのｍＲＮＡが標的遺伝子に由来する）の検出によって同時に判定される。
【００５０】
特異的試薬に少なくとも１つの増幅プライマーが含まれる場合は、本発明の方法の工程ｃ）において、以下の方法において標的遺伝子の発現を判定することが可能である：
【００５１】
１）生物材料として、上記に示された生物試料から総ＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）及びメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む）が抽出された後、逆転写工程が、上記ｍＲＮＡの相補的ＤＮＡ（すなわちｃＤＮＡ）を得るために実施される。例えば、この逆転写反応は逆転写酵素を使用して行うことができ、これによって、ＲＭＡ断片から相補的ＤＮＡ断片を得ることができる。具体的には、ＡＭＶ（鳥類筋芽細胞腫ウイルス（Ａｖｉａｎ    Ｍｙｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ））又はＭＭＬＶ（マウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ））に由来する逆転写酵素を使用することができる。より具体的にｍＲＮＡのｃＤＮＡだけを得たい場合には、この逆転写工程を、チミン塩基のみを含むヌクレオチド断片（ポリＴ）の存在下で実施する。チミン塩基のみを含むヌクレオチド断片は、ｍＲＮＡのポリＡ配列に対して相補性によってハイブリダイズし、その結果、ポリＴ−ポリＡ複合体が形成され、これは、その後、逆転写酵素によって実施される逆転写反応の開始点として作用する。次いで、標的遺伝子に由来するｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ（標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ）及び標的遺伝子以外の遺伝子に由来するｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ（標的遺伝子に特異的ではないｃＤＮＡ）が得られる。
【００５２】
２）標的遺伝子に特異的な増幅プライマーを、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ及び標的遺伝子に特異的ではないｃＤＮＡと接触させる。標的遺伝子に特異的な増幅プライマーは標的遺伝子特異的ｃＤＮＡとハイブリダイズし、そして標的遺伝子に由来するｍＲＮＡを起源とするｃＤＮＡの既知長さの所定領域が特異的に増幅される。標的遺伝子に特異的ではないｃＤＮＡは増幅されないが、多量の標的遺伝子特異的ｃＤＮＡが得られる。本発明においては、無差別に、「標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ」又は「標的遺伝子に由来するｍＲＮＡを起源とするｃＤＮＡ」と呼ばれる。この工程は、具体的には、ＰＣＲ型の増幅反応によって、又は、上記で定義された他の任意の増幅技術によって行うことができる。ＰＣＲによっては、いくつかの異なるｃＤＮＡ（それぞれが異なる標的遺伝子に特異的である）を、いくつかの対の異なる増幅プライマー（それぞれが標的遺伝子に特異的である）を使用することによって同時に増幅することも可能であり、したがって、多重増幅と呼ばれる。
【００５３】
３）標的遺伝子の発現は、上記工程２）で得られた標的遺伝子特異的ｃＤＮＡを検出及び定量することによって判定される。この検出は、それらの大きさにしたがって標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの電気泳動後に行うことができる。移動用のゲル及び媒体はエチジウムブロマイドを含むものであってよく、これによって、所定の移動時間の経過後に、ＵＶ（紫外線）照射台の上にゲルを置き、光シグナルの放射によって標的遺伝子特異的ｃＤＮＡを直接検出することができる。標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの量が多ければ多いほど、この光シグナルは明るくなる。これらの電気泳動技術は当業者に周知である。また、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡは、飽和まで増幅反応を実施することによって得られた定量範囲により、検出及び定量することもできる。種々の工程（逆転写、ＰＣＲなど）中に観察され得る酵素効率の変動性を考慮するためには、様々な患者グループにおける標的遺伝子の発現を、様々な患者グループ間で発現が類似している「ハウスキーピング」遺伝子の発現を同時に判定することによって標準化することができる。このように、ハウスキーピング遺伝子の発現に対する標的遺伝子の発現の割合を明確にすることによって（すなわち、ハウスキーピング遺伝子特異的ｃＤＮＡの量に対する標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの量の割合を明確にすることによって）、種々の実験の間でのあらゆる変動性が補正される。当業者は、以下の刊行物を具体的に引用することができる：Ｂｕｓｔｉｎ  ＳＡ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２００２，２９：２３−３９；Ｇｉｕｌｉｅｔｔｉ  Ａ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，２５：３８６−４０１。
【００５４】
特異的試薬に少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブが含まれる場合は、標的遺伝子の発現は以下の方法で決定することができる。
【００５５】
１）生物材料として、上記に示す生物試料から総ＲＮＡを抽出した後、逆転写工程を上記のように実施して、標的遺伝子に由来するｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ（標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ）、及び、標的遺伝子以外の遺伝子に由来するｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ（標的遺伝子に特異的ではないｃＤＮＡ）を得る。
【００５６】
２）ｃＤＮＡの全てを基体と接触させる。基体上には、発現の分析が望まれる標的遺伝子に対して特異的な捕捉プローブが固定されていて、これによって、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡと捕捉プローブとの間でのハイブリダイゼーション反応が実施され、標的遺伝子に特異的ではないｃＤＮＡは捕捉プローブにハイブリダイズしない。ハイブリダイゼーション反応は、上記に示される全ての材料を含む固体の基体上で実施することができる。好ましい実施形態によれば、ハイブリダイゼーションプローブは基体上に固定される。好ましくは、基体は、上記で定義されたような低密度、高密度又は中密度の基体である。ハイブリダイゼーション反応は、上記に記載されたように、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの酵素による増幅からなる工程によって進行させることができ、その結果、多量の標的遺伝子特異的ｃＤＮＡが得られ、そして標的遺伝子特異的ｃＤＮＡが標的遺伝子に特異的な捕捉プローブにハイブリダイズできる可能性が高くなる。
【００５７】
ハイブリダイゼーション反応は、例えば増幅反応用の標識デオキシリボヌクレオチド３リン酸を使用して、上記に記載されたような標的遺伝子特異的ｃＤＮＡを標識及び／又は切断することからなる工程によっても進行させることができる。切断は、具体的には、イミダゾール及び塩化マンガンの作用によって行うことができる。標的遺伝子特異的ｃＤＮＡはまた、例えば、文献ＷＯ−Ａ−９１／１９８１２に記載されているサンドイッチハイブリダイゼーション技術にしたがって標識されたプローブにハイブリダイズさせることによって、増幅工程の後で標識することもできる。核酸の標識及び／又は切断のための他の好ましい具体的方法は、国際出願番号ＷＯ９９／６５９２６、同ＷＯ０１／４４５０７、同ＷＯ０１／４４５０６、同ＷＯ０２／０９０５８４、同ＷＯ０２／０９０３１９に記載されている。
【００５８】
３）続いて、ハイブリダイゼーション反応の検出からなる工程を実施する。検出は、基体を用いることによって行うことができ、基体の上では、標的遺伝子に特異的な捕捉プローブが、標識で標識された「検出」プローブと接触している標的遺伝子特異的ｃＤＮＡとハイブリダイズさせられ、そして、標識によって放射されるシグナルが検出される。標的遺伝子特異的ｃＤＮＡが標識で予め標識されている場合は、標識によって放射されるシグナルが直接検出される。
【００５９】
本発明の方法の工程ｂ）において接触させる少なくとも１つの特異的試薬に少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブが含まれる場合は、標的遺伝子の発現は以下の方法で判定することもできる。
【００６０】
１）生物材料として、上記に示された生物試料から総ＲＮＡを抽出した後、上記に記載されたように逆転写工程が実施され、これによって生物材料のｍＲＮＡのｃＤＮＡが得られる。ｃＤＮＡの相補的ＲＮＡの重合が、続いて、Ｔ７ポリメラーゼ酵素を使用して実施される。Ｔ７ポリメラーゼ酵素は、プロモーターの制御下で機能し、これによって、ＤＮＡ鋳型から相補的ＲＮＡを得ることが可能となる。次いで、標的遺伝子に特異的なｍＲＮＡのｃＤＮＡのｃＲＮＡ（この場合、標的遺伝子特異的ｃＲＮＡと呼ばれる）及び標的遺伝子に特異的ではないｍＲＮＡのｃＤＮＡのｃＲＮＡが得られる。
【００６１】
２）ｃＲＮＡの全てを基体と接触させる。基体上には、発現の分析が望まれる標的遺伝子に特異的な捕捉プローブが固定されていて、これによって、標的遺伝子特異的ｃＲＮＡと捕捉プローブとの間でハイブリダイゼーション反応が実施され、標的遺伝子に特異的ではないｃＲＮＡは捕捉プローブにハイブリダイズしていない。いくつかの標的遺伝子の発現を同時に分析したい場合には、いくつかの異なる捕捉プローブ（それぞれが標的遺伝子に特異的である）を基体上に固定することができる。ハイブリダイゼーション反応はまた、上記に記載されたような、標的遺伝子特異的ｃＲＮＡを標識及び／又は切断することからなる工程によっても進行させることができる。
【００６２】
３）続いて、ハイブリダイゼーション反応の検出からなる工程を実施する。検出は基体を用いて行うことができ、基体の上で、標的遺伝子に特異的な捕捉プローブと、標識で標識された「検出」プローブと接触している標的遺伝子特異的ｃＲＮＡとをハイブリダイズさせて、標識により放射されるシグナルを検出する。標的遺伝子特異的ｃＲＮＡが標識で予め標識されている場合は、標識によって放射されるシグナルが直接検出される。ｃＲＮＡの使用は、多数のプローブをハイブリダイズさせるバイオチップ型の基体を使用する場合には特に有効である。
【００６３】
本発明の具体的な実施形態によれば、工程Ｂ及びＣが同時に実施される。この好ましい方法は、具体的には、「リアルタイムＮＡＳＢＡ」によって行うことができる。このグループでは、ＮＡＳＢＡ増幅技術と「分子ビーコン」を使用するリアルタイム検出が１工程にまとめられている。ＮＡＳＢＡ反応はチューブの中で実施され、１本鎖ＲＮＡを生じる。特異的「分子ビーコン」はこれと同時にハイブリダイズすることができ、蛍光シグナルを生じることができる。新しいＲＮＡ分子の形成は、蛍光読取装置のシグナルを持続的に確認することによってリアルタイムで測定される。ＲＴ−ＰＣＲ増幅とは異なり、ＮＡＳＢＡ増幅は、試料中において、ＤＮＡの存在下で起こり得る。したがって、ＲＮＡ抽出中にＤＮＡが実際に完全に排除されていることを確認する必要はない。
【００６４】
次いで、配列番号１〜２８のいずれか１つから選択された標的遺伝子の発現の分析によって、敗血症症候群の診断／予後診断用のツールを得ることが可能となる。
【００６５】
好ましくは、配列番号１、２、４〜８、１１及び１６の標的遺伝子によって、２つのグループの患者を区別することが可能となる。
【００６６】
例えば、予後診断が不明の患者における標的遺伝子の発現を分析し、そして予後が良好な（ＧＰ）患者における標的遺伝子についての既知の平均発現値と、予後不良（ＰＰ）の患者における標的遺伝子についての既知の平均発現値とを比較することによって、適切な処置を患者に提供することが可能である。
【００６７】
別の好ましい実施形態によれば、工程ｂ）において、配列番号１〜２８のいずれか１つを有する核酸配列を有する標的遺伝子に特異的な試薬から選択される、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個の特異的試薬と生物材料を接触させ、そして工程ｃ）において、上記標的遺伝子の少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個の発現を判定する。
【００６８】
さらに具体的には、本発明者らによって、上記で定義されたような２８種類の遺伝子のパネルの発現の同時分析ハ、ＧＰ患者とＰＰ患者との区別に対して関連性が高いことが明らかにされた。これに関して、本発明は、
以下の工程：
ａ．生物材料を生物試料から抽出する工程、
ｂ．生物材料を、配列番号１〜２８のいずれか１つを有する核酸配列を有する標的遺伝子に特異的な試薬から選択される少なくとも２８個の特異的試薬と接触させる工程、
ｃ．上記標的遺伝子の少なくとも２８個の発現を判定する工程：
を含むことを特徴とする
上記で定義された方法にも関する。
【００６９】
これに関して、配列番号１、３、７、９〜１５及び１７〜２８の遺伝子を含む２２個の特異的遺伝子のパネルの発現によって、良好な結果を得ることが可能となる。なぜなら、これによって、予後の良好な患者のうちの９２％、そして予後不良の患者の１００％を正確に分類することが可能となるからである。これに関して、本発明は、
以下の工程：
ａ．生物材料を生物試料から抽出する工程、
ｂ．生物材料を、配列番号１、３、７、９〜１５及び１７〜２８のいずれか１つを有する核酸配列を有する標的遺伝子に特異的な試薬から選択される少なくとも２２個の特異的試薬と接触させる工程、
ｃ．上記標的遺伝子の少なくとも２２個の発現を判定する工程：
を含むことを特徴とする
患者に由来する生物試料に基づく敗血症症候群の診断／予後診断方法に関する。
【００７０】
診断ツールを得る場合には、限られた遺伝子のパネルの使用が特に適している。実際、約２０個の遺伝子の発現を分析する際には、ＤＮＡチップの特注による製造は必要なく、またこの分析は、ＰＣＲ又はＮＡＳＢＡ技術によって、あるいは、低密度チップ技術によって直接行うことができ、こうすることによって、相当な経済的価値が提供され、かつ、実施が簡易になる。
【００７１】
また、本発明は、配列番号１〜２８のいずれか１つを有する核酸配列を有する標的遺伝子に特異的なプローブから選択される少なくとも２８個のハイブリダイゼーションプローブを含む、上記で定義されたような基体にも関する。
【００７２】
本発明の別の実施形態によれば、基体は、配列番号１、３、７、９〜１５及び１７〜２８のいずれか１つを有する核酸配列を有する標的遺伝子に特異的なプローブから選択される少なくとも２２個のハイブリダイゼーションプローブを含む。
【００７３】
本発明の別の実施形態によれば、基体は、配列番号１〜２８のいずれか１つを有する核酸配列を有する少なくとも１つの標的遺伝子に特異的な少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブを含み、好ましくは、配列番号１、２、４〜８、１１及び１６のいずれか１つを有する核酸配列を有する少なくとも１つの標的遺伝子に特異的な少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブを含む。
【００７４】
最後に、本発明は、敗血症症候群の診断／予後診断用の、上記で定義されたような基体の使用に関する。
【００７５】
また、本発明は、敗血症症候群の診断／予後診断用の、上記で定義されたような、配列番号１〜２８のいずれか１つを有する核酸配列を有する標的遺伝子に特異的な少なくとも２８個の試薬の使用にも関する。好ましくは、本発明は、敗血症症候群の診断／予後診断用の、上記で定義されたような、配列番号１、３、７、９〜１５及び１７〜２８のいずれか１つを有する核酸配列を有する標的遺伝子に特異的な少なくとも２２個の試薬の使用に関する。
【００７６】
また、本発明は、敗血症症候群の診断／予後診断用の、上記で定義されたような、配列番号１、２、４〜８、１１及び１６のいずれか１つを有する核酸配列を有する標的遺伝子に特異的な少なくとも１つの試薬の使用にも関する。
【００７７】
最後に、本発明は、上記で定義されたような基体を含む、敗血症症候群の診断／予後診断用のキットに関する。
【００７８】
また、本発明は、敗血症症候群の診断／予後診断用のキットであって、敗血症症候群の診断／予後診断用の、上記で定義されたような、配列番号１〜２８のいずれか１つを有する核酸配列を有する標的遺伝子に特異的な少なくとも２８個の試薬を含むことを特徴とするキットに関する。好ましくは、本発明は、敗血症症候群の診断／予後診断用のキットであって、敗血症症候群の診断／予後診断用の、上記で定義されたような、配列番号１、３、７、９〜５及び１７〜２８のいずれか１つを有する核酸配列を有する標的遺伝子に特異的な少なくとも２２個の試薬を含むことを特徴とするキットに関する。
【００７９】
また、本発明は、敗血症症候群の診断／予後診断用のキットであって、敗血症症候群の診断／予後診断用の、上記で定義されたような、配列番号１、２、４〜８、１１及び１６のいずれか１つを有する核酸配列を有する標的遺伝子に特異的な少なくとも１つの試薬を含むことを特徴とするキットにも関する。
【００８０】
言うまでもなく、本明細書中で上記に示される定義は全て、本発明の実施形態の全てに適用される。
【００８１】
（図面の説明）
添付の図面は説明用の例示であって、本質的に何ら限定的なものではない。これによって、本発明をより完全に理解することが可能となるであろう。
【００８２】
図１は、アフィメトリクスバイオチップ上の２９個のプローブのセットを用いて測定した本発明の２８個の遺伝子の発現を使用する、１３人のＰＰ患者（ＮＳとも呼ばれる）と２６人のＧＰ患者（Ｓとも呼ばれる）から得られた３８の血液の試料の階層的クラスタ分析を示す。Ｓｐｏｆｉｒｅソフトウェアの階層的クラスタ機能を使用して、縦列方向でＰＰ患者とＧＰ患者を整理し、横列方向で遺伝子を整理することによって、比較可能な発現特性を有する患者又は遺伝子の位置を隣接させる。個人の相関係数を、複数の遺伝子及び患者についての類似度指数として使用した。続いて、最初に、計算上の平均を使用する非加重結合法（ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｐａｉｒ  ｇｒｏｕｐ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ  ａｖｅｒａｇｅ、ＵＰＧＭＡ）、クラスタ解析法、そして次に、全ての試料の平均値を使用することによって、患者と遺伝子とをそれぞれ体系化することが可能となった。結果は、《Ａｆｆｙ》ソフトウェアで標準化したアフィメトリクス蛍光レベルに対応していた。遺伝子間での発現の本質的な差を考慮するために、低中心の正常基準（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｃｅｎｔｅｒｅｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｌａｗ）を適用することによって、個々の遺伝子の発現のレベルを標準化した。白色は、低レベルの発現を示し、灰色は中間のレベルの発現を示し、黒色は高レベルの発現を示す。系統樹（ｄｅｎｄｏｇｒａｍ）の枝の高さは、発現特性間での類似性の指数を示す。
【００８３】
図２は、敗血症ショック患者の血液中のＣＸ３ＣＲ１  ｍＲＮＡの定量を示す。遺伝子の発現レベルは、５０人の敗血症ショック患者（１９人のＰＰと２１人のＧＰ）及び２１人の正常なボランティアにおいて、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ＰＰＩＢハウスキーピング遺伝子の発現のレベルに対して、結果を標準化した。結果は、中央値、第２５百分位数、第７５百分位数で示した。ＧＰとＰＰの間での統計学的比較は、ノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験によって行った。
【００８４】
図３は、敗血症ショック患者の血液中で定量したＣＸ３ＣＲ１  ｍＲＮＡの定量を示す。遺伝子の発現レベルを、３７人の敗血症ショック患者（１２人のＰＰと２１人のＧＰ）において定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。それぞれの患者について、ＰＡＸ遺伝子試料を、Ｄ１とＤ３の間で、またＤ４とＤ１０の間で得た。ＰＰＩＢハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して、結果を標準化した。ＰＰ及びＧＰにおける、Ｄ１〜Ｄ３の間及びＤ４〜Ｄ１０の間でのＣＸ３ＣＲ１の遺伝子発現レベルの展開を、ノンパラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎ試験によって行った。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８５】
以下の実施例は説明のために提供され、本質的に何ら限定的なものではない。これによって、本発明をより完全に理解することが可能となるであろう。
【００８６】
実施例１：敗血症症候群の診断／予後診断のための発現特性の調査
生物試料の特性；敗血症症候群を発症している、Ｌｙｏｎ−Ｓｕｄ  ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｃｅｎｔｅｒの外科又は内科集中治療室の患者について研究を行った。研究に含めるためには、患者は以下の基準を満たしている必要があった：年齢が１８歳を超える；先に記載したコンセンサス会議による敗血症ショックの存在；併存疾患（転移性のガン、悪性血液疾患、Ｉ型糖尿病、慢性的な肝臓病理、慢性腎不全、ＡＩＤＳ）がないこと。研究の目的は、敗血症ショックによって誘導される遅発性死亡を研究することであったので、症候群の最初の４８時間の間に死亡した患者は研究から除外した。実施した全ての患者について処置は同じとした。
【００８７】
カテコールアミンの最初の投与日を敗血症ショックのＤ１として、それぞれの患者を、最長で２８日間観察した。この期間に観察された死亡に基づいて、患者（ＰＰ）１０人のグループと患者（ＧＰ）２１人のグループについて研究を実施した。続いて、本発明の遺伝子パネルを、同じ基準に基づいて、採用した２つのグループの患者（ＰＰ患者３人の１つのグループとＧＰ患者４人の１つのグループ）を使用して盲検を用いて確認した。ゲノム分析を、Ｄ２とＤ４の間で得られた試料を使用して行った。グループ全体の人口統計学的特徴を以下の表に示す。
【００８８】
【表２】
0005552211.tif 000003
【００８９】
ａ：生存者（ｎ＝２５）と非生存者（ｎ＝１３）の全人数の比較
ｂ：中央値（Ｑ１−Ｑ３）
ＣＯＰＤ：慢性閉塞性肺疾患  
【００９０】
生物試料からの生物材料（総ＲＮＡ）の抽出：
試料を、ＰＡＸＧｅｎｅ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ社  アメリカ合衆国フランクリンレイクス）の中に直接回収した。血液試料を採取して細胞の全溶解物を得る工程の後、チューブを室温に４時間置き、その後、生物材料の抽出までの間、−２０℃で保存した。より具体的には、このプロトコルでは、製造業者による推奨を見てＰＡＸＧｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ（登録商標）キット（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ社）を使用して、総ＲＮＡを抽出した。簡単に説明すると、チューブを遠心分離して（１０分間、３０００ｇ）、核酸のペレットを得た。このペレットを洗浄し、タンパク質の消化に必要なプロテイナーゼＫを含むバッファー中に取った（１０分間、５５℃）。さらに遠心分離（５分間、１９，０００ｇ）して細胞の破片を除去し、エタノールを添加して核酸結合条件を最適化した。総ＲＮＡは、ＰＡＸＧｅｎｅ  ＲＮＡスピンカラムに特異的に結合し、そしてその後の溶出の前に、混入しているＤＮＡの消化をＲＮＡｓｅを含まないＤＮＡｓｅセット（キアゲン社、英国クローリー）を使用して行った。総ＲＮＡの性質をＡＧＩＬＥＮＴ  ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社，ドイツ国Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ）を用いて分析した。総ＲＮＡには、トランスファーＲＮＡ，メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）及びリボソームＲＮＡが含まれている。
【００９１】
ｃＤＮＡの合成、ｃＲＮＡの入手、ｃＲＮＡの標識及び定量：本発明にしたがって標的遺伝子の発現を分析するために、上記のように精製した総ＲＮＡの中に含まれているｍＲＮＡの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、５μｇの総ＲＮＡから、４００ユニットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と１００ｐｍｏｌのＴ７プロモーターを含むポリＴプライマー（Ｔ７−オリゴ（ｄＴ）２４−プライマー、Ｐｒｏｌｉｇｏ社、フランス国パリ）を使用して得た。このように得られたｃＤＮＡを、次いで、フェノール／クロロホルムで抽出し、酢酸アンモニウムとエタノールで沈殿させ、そして２４μｌのＤＥＰＣ水に再溶解させた。続いて、この精製したｃＤＮＡ溶液２０μｌを、上記のようなＴ７ポリメラーゼのプロモーターを特異的に認識するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に供した。この転写によって、ｃＤＮＡのｃＲＮＡを得ることが可能となる。この転写は、Ｂｉｏａｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ニューヨーク州ファーミントン）を使用して行った。これによリ、ｃＲＮＡを得ること可能となるだけではなく、ｃＲＮＡの合成の間にビオチン化シチジン塩基及びウリジン塩基を取り込ませることも可能となる。
【００９２】
精製したｃＲＮＡを、続いて、分光光度分析によって定量し、そしてｃＲＮＡ溶液を、ｃＲＮＡが１μｇ／μｌの濃度となるように調整した。続いて、これらのｃＲＮＡの切断からなる工程を、９４℃で３５分間、断片化バッファー（トリス酢酸４０ｍＭ、ｐＨ８．１、酢酸カリウム１００ｍＭ、酢酸マグネシウム３０ｍＭ）を使用して行うことによって、ｃＲＮＡを加水分解し、３５〜２００ｂｐの断片を得た。この断片化が成功したことを、１．５％のアガロースゲル電気泳動によって確認した。
【００９３】
ＰＰ患者とＰＧ患者の間での発現特性の差異の実証：
これについては、それぞれの試料に由来する２０μｇの断片化ｃＲＮＡをハイブリダイゼーションバッファー（アフィメトリクス社）に添加し、この溶液２００μｌを、発現用チップ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３Ａ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）（アフィメトリクス社））と４５℃で１６時間接触させた。発現用チップには、アフィメトリクス社のインターネットサイト上に記載されているアフィメトリクス社のプロトコルにしたがって、およそ１４５００個の遺伝子を提示する２２２８３グループのプローブが含まれている。ハイブリダイゼーション及び洗浄能力を最良とするために、ビオチン化した（ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ及びｃｒｅ）「対照」ＲＮＡと記載されるＲＮＡとオリゴヌクレオチド（オリゴＢ２）とをハイブリダイゼーションバッファーの中に含めた。ハイブリダイゼーション工程の後、チップ上にハイブリダイズしたビオチン化ｃＲＮＡの溶液を、ストレプトアビジン−フィコエリスリンの溶液を使用して視覚化し、その後、シグナルを抗ストレプトアビジン抗体を使用して増幅した。ハイブリダイゼーションは、「ＧｅｎｅＣｈｉｐハイブリダイゼーションオーブン」（アフィメトリクス社）において実施し、アフィメトリクス社のプロトコルのＥｕｋ  ＧＥ−ＷＳ２Ｖ４プロトコルにしたがった。洗浄と視覚化の工程は、「Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４５０」（アフィメトリクス社）を用いて行った。続いて、それぞれのＵ１３３ＡチップについてＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ２５００Ａ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒを用いて解像度３ミクロンで分析し、チップ上でハイブリダイズした領域を正確に示した。このスキャナーを用いることによって、落射蛍光顕微鏡技術を使用してアルゴンレーザーで励起させた後に、蛍光分子によって放射されるシグナルを検出することが可能となる。このようにして、結合したｃＲＮＡの量に比例するシグナルを、それぞれの点について得た。続いて、シグナルをＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  ５．０ソフトウェア（ＭＡＳ５．０、アフィメトリクス社）を使用して分析した。
【００９４】
様々なチップを使用することによって得られる変動を防ぐために、全体的な標準化アプローチを、ＭＡＳ５．０ソフトウェア（アフィメトリクス社）を使用して行った。これによって、統計学的アルゴリズムにより遺伝子が発現されているかどうかを定義することが可能となる。複数のチップを互いに比較するため、生のデータ（「．ＣＥＬＬ」ファイル）を、「Ｒ」ソフトウェアの「Ａｆｆｙ」パッケージ（Ｇａｕｔｉｅｒ，Ｌ．ら，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２００４），ｐ．３０７−３１５）を使用して、等量分類（ｑｕａｎｔｉｌｅ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）工程によって処理した。Ｕ１３３Ａチップ上に示したそれぞれの遺伝子は、２５個のオリゴヌクレオチドのプローブの１１種類の対によってカバーされた。用語「プローブの対」は、標的遺伝子に由来するｃＲＮＡの１つと完全にハイブリダイズする（したがって、ＰＭ又は完全適合プローブと呼ばれる）第１のプローブと、プローブの中心部分が適合していないことを除いては第１のプローブと同じである第２のプローブ（したがって、ＭＭ又は不適合プローブと呼ばれる）を意味するものとする。非相補性配列の２つのヌクレオチド断片間におけるハイブリダイゼーションに対応するバックグラウンドノイズを概算するため、個々のＭＭプローブを使用した（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｎｏｔｅ“Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｇｕｉｄｅ”；Ｌｉｐｓｈｕｔｚら，（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１  Ｓｕｐｐｌ．，２０−２４）。研究した３８個の試料について、発現した遺伝子の平均値は３８．１±４．２％と示された。
【００９５】
発現データの分析は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌソフトウェア、ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖ７．１ソフトウェアについてのＳｐｏｔｆｉｒｅ判定サイト（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ  ＡＢ，スウェーデン・イェーテボリ）、及び、統計学的アルゴリズム：遺伝的アルゴリズム（Ｇａｕｔｉｅｒ，Ｌ．ら，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２００４），ｐ．３０７−３１５；Ｏｏｉ，Ｃ．Ｈ．及びＴａｎ，Ｐ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２００３），ｐ．３７−４４）を使用して行った。チップの、およそ１４５００個の遺伝子を示すプローブの２２２８３のグループに基づいて、本発明者らは、ＰＰ患者とＧＰ患者の区別を可能にする関連遺伝子を正式に選択した。
【００９６】
これについて、最初の工程は、全ての患者グループの間で同等の発現レベルを示す遺伝子を排除することからなるものであった。４つの工程を行った：
−全ての患者において発現していない遺伝子を排除した（ＭＡＳ５．０ソフトウェア）；
−蛍光中央値が２つのグループにおいて３０未満であった遺伝子を排除した；
−２つのうち１つのグループにおいて患者の少なくとも３０％において発現していなかった遺伝子を排除した；
−ＧＰ患者とＰＰ患者の間での発現中央値の比が０．７７〜１．３であった遺伝子を排除した。
【００９７】
これらの条件検索の適用に続いて、プローブの２２１６のグループを選択し、遺伝的アルゴリズム（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いた多様性分析の作業ベースとして使用した。
【００９８】
得られた結果：２８個の遺伝子のリストを特定した。ＢＰ患者と比較してＰＰ患者において観察されたこれらの遺伝子個々の発現の増加又は減少を表２に示す。
【００９９】
表２  ＰＰ患者とＧＰ患者において異なって発現していた２８個の遺伝子のリスト
【表３】
0005552211.tif 000004
【０１００】
＊と
【０１０１】
【数１】
0005552211.tif 000005
の印は、それぞれ、ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）補正又はベンジャミニ（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ）及びホッホバーグ（Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）補正を用いたＴ検定にしたがった、２つのグループ間における統計学的な差異をそれぞれ示す。これは、単離したこれらの遺伝子が、敗血症症候群の診断／予後診断に非常に関連性が深いことを示している。
【０１０２】
定量的ＲＴ−ＰＣＲによる確認
別の分子生物学的技術によってこれらの結果を確認するために、特定の遺伝子を定量的ＲＴ−ＰＣＲによってアッセイした。簡単に説明すると、逆転写（ＲＴ）反応を最終容量２０μｌで行った。総ＲＮＡ（１μｇ）を１μｌのポリＴと共に、５０μＭ及び１μｌのｄＮＴＰ混合物（ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲシステム、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で混合し、その後、６５℃で５分間インキュベートした。氷中での冷却の後、溶液を、４μｌの５×ｃＤＮＡ合成バッファー、１μｌのＲＮＡｓｅ  ｏｕｔ（４０Ｕ／μｌ）、１μｌのＤＥＰＣ処理水、及び、１μｌのＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ（１５Ｕ／μｌ）（これらの製品は全て、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）による）と混合した。逆転写を５０℃で１時間行い、その後、８５℃で５分間インキュベートすることによって停止させた。最後に、ｃＤＮＡ溶液のそれぞれを、ＤＥＰＣ水溶液中に１／１０になるように希釈した。
【０１０３】
目的の遺伝子のそれぞれについては、標準物を、飽和するまで行ったＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅によって調製した。得られたアンプリコンを精製し（ＰＣＲ精製キット、Ｑｉａｇｅｎ社）、そして特有のアンプリコンの存在を、アガロースゲル電気泳動とエチジウムブロマイド染色によって確認した。
【０１０４】
シクロフィリン（ｃｙｃｏｐｈｉｌｉｎ）ＢをコードするペプチジルプロピルイソメラーゼＢ（ＰＰＩＢ）《ハウスキーピング》遺伝子からなる標準物は、Ｓｅａｒｃｈ−ＬＣ（ドイツ国ハイデルベルク）から入手した。
【０１０５】
リアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡの発現の分析
配列番号１、５、１１及び１６の標的遺伝子のｍＲＮＡを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ社）を使用して定量的リアルタイムＰＣＲによって定量した。ＰＣＲ反応は、Ｆａｓｔ−Ｓｔａｒｔ（登録商標）ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩリアルタイムＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して行った。個々のＰＣＲは、１μｌのＬＣ−Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、１μｌのＬＣ−Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ／Ｅｎｚｙｍｅ（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファー及びデオキシヌクレオチド３リン酸混合物を含む）、ＭｇＣｌ２（最終濃度３ｍＭ）、センスプライマーとアンチセンスプライマー（最終濃度０．５μＭ）、並びに、１０μｌのｃＤＮＡ溶液を含む、最終容量２０μｌで行った。９５℃で１０分間の変性工程の後、増幅を、４０サイクルの「タッチダウン」ＰＣＲプロトコル（９５℃で１０秒間、６８〜５８℃での１０秒間のハイブリダイゼーション、その後に、７２℃で１６秒間の伸張）によって行った。それぞれのサイクルの終わりに、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎによって放射された蛍光を測定した。
【０１０６】
増幅の特異性を確認するために、ＰＣＲ産物を融解曲線分析（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）−Ｒｏｃｈｅ社）に体系的に供した。このために、ＰＣＲ産物を、０．１℃／秒の増分で、５８から９８℃まで温度を上昇させて処理した。個々のＰＣＲ産物について、曲線の分析において、特異的な融点を特徴とする１つのピークが得られた。
【０１０７】
ＰＰＩＢハウスキーピング遺伝子とＩＬ−１β遺伝子（配列番号５）の定量に必要なプライマーの組み合わせは、Ｓｅａｒｃｈ−ＬＣ（ドイツ国ハイデルベルク）から入手した。ＰＰＩＢについては、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号はＭ６０８５７であり、１０５〜３３８位の領域を増幅させた。ＩＬ−１βについては、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号はＭ１５３３０であり、４３８〜６４２位の領域を増幅させた。配列番号１、１１及び１６の標的遺伝子を定量的に決定するために使用したプライマーの対、参照として使用したＧｅｎｂａｎｋ配列、並びに、アンプリコンの位置を以下の表に記載する。
【０１０８】
【表４】
0005552211.tif 000006
【０１０９】
ＰＰＩＢハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡの量に対する標的ｍＲＮＡの量を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いた比較定量技術によって分析した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ社）の「Ｓｅｃｏｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｍｅｔｈｏｄ」を使用して、個々の試料について横断点（Ｃｐ）を自動で決定した。Ｃｐの値は、蛍光がバックグラウンドのノイズとは有意に異なる場合のサイクル数と定義した。
【０１１０】
ひと続きの５種類の１０倍希釈をそれぞれの標準物について４つずつ行い、これによって、コピー数の対数の関数としてＣｐを表す検量線を作成した。標準希釈物を最適化して、これによって、検量線が標的遺伝子とハウスキーピング遺伝子についての予想される発現レベルをカバーできるようにした。標的遺伝子とハウスキーピング遺伝子のついてのＰＣＲ効率を示す比較用検量線を作成し、これを使用して、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて定量を行った。
【０１１１】
定量的ＲＴ−ＰＣＲによる配列番号１、５、１１及び１６の標的遺伝子のｍＲＮＡの定量的決定について得られた結果を、以下の表３に示す。結果は２５個の試料についてのものである（８人のＰＰと１７人のＧＰ）。最初に、バイオチップについて、次に、定量的ＲＴ−ＰＣＲ技術について得られた結果の相関関係を、Ｓｐｅａｒｍａｎの相関試験によって確立した。
【０１１２】
表３  アフィメトリクスと定量的ＲＴ−ＰＣＲの間での４つの遺伝子の発現レベルの比較
【０１１３】
【表５】
0005552211.tif 000007
【０１１４】
分析した４つの遺伝子について、有意な相関関係がアフィメトリクス社の結果と定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果の間で観察された。これによって、本発明の遺伝子の関連性が確認された。
【０１１５】
上の段落に記載したプロトコルと同じプロトコルにしたがうことにより、５０人の敗血症ショックの患者（１９人のＰＰと２１人のＧＰ）から得た血液試料から、ＣＸ３ＣＲ１  ｍＲＮＡを定量した。血液試料は、ショックの開始後の最初の７２時間の間に採取し、その後、第２の試料を、症候群の経過の間に採取した。ＣＸ３ＣＲ１の発現のレベルを、ＰＰＩＢハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して標準化した。結果を図２に示す。ＧＰとＰＰの間での比較を、ノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験を使用して行った。したがって、予後不良の要素としてＣＸ３ＣＲ１  ｍＲＮＡの発現を分析することが特に有効である。
【０１１６】
ＣＸ３ＣＲ１  ｍＲＮＡの発現レベルは、ＰＰ患者においては、経時的に有意な減少を示した。結果を図３に示す。経時的な発現の変化を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ試験を使用して試験した。
【０１１７】
したがって、この予後不良を確認するためには、経時的なＣＸ３ＣＲ１  ｍＲＮＡの発現を追跡することが特に有効である。
【０１１８】
遺伝子のパネルの発現の分析
本発明者らはまた、いくつかの遺伝子の発現の同時分析がＧＰ患者とＰＰ患者を区別することに極めて関連性が深いことも明らかにした。
【０１１９】
このように、本発明者らは、上記の２８個の遺伝子の発現の同時分析が、ＧＰグループとＰＰグループの２つを区別することに極めて関連性が深いことを明らかにした。
【０１２０】
結果を図１に示す。このリストにより、１つのグループのＧＰ患者に由来する試料のうちの８８％、そして他方のグループのＰＰ患者に由来する試料の１００％を正確に分類することが可能となる。
【０１２１】
加えて、本発明者らは、上記に記載した２８個のうち、配列番号１、３、７、９〜１５及び１７〜２８の遺伝子の発現の同時分析もまた、ＧＰグループとＰＰグループの２つを区別することに極めて関連性が深いことを明らかにした。
【０１２２】
結果を図２に示す。このリストにより、１つのグループのＧＰ患者に由来する試料のうちの９２％、そして他方のグループのＰＰ患者に由来する試料の１００％を正確に分類することが可能となる。
【０１２３】
上記の２８個の遺伝子のうち、配列番号１、２、４〜８、１１及び１６の９個の遺伝子のそれぞれにより、２つのグループの患者を区別することが可能となる。表４は、ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）補正又はベンジャミニ（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ）及びホッホバーグ（Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）補正を用いたＴ検定（Ｔ  ｔｅｔ）使用して計算したｐ値を示す。これらの遺伝子は全て、ＰＰと比較するとＧＰにおいて過剰発現されていた。
【０１２４】
表４  患者の２つのグループを区別するための遺伝子
【０１２５】
【表６】
0005552211.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１は、アフィメトリクスバイオチップ上の２９個のプローブのセットを用いて測定した本発明の２８個の遺伝子の発現を使用する、１３人のＰＰ患者（ＮＳとも呼ばれる）と２６人のＧＰ患者（Ｓとも呼ばれる）から得られた３８の血液の試料の階層的クラスタ分析を示す。
【図２】図２は、敗血症ショック患者の血液中のＣＸ３ＣＲ１  ｍＲＮＡの定量を示す。
【図３】図３は、敗血症ショック患者の血液中で定量したＣＸ３ＣＲ１  ｍＲＮＡの定量を示す。
【図１】
0005552211.tif 000009
【図２】
0005552211.tif 000010
【図３】
0005552211.tif 000011
【配列表】
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