(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面にコポリマーが共有結合した、ヒドロキシル含有ベース支持体をベースとするイオン交換クロマトグラフィーのための分離材料であって、
ａ）ベース支持体が、脂肪族ヒドロキシル基を含み、
ｂ）共有結合したコポリマーが、末端モノマー単位を介して支持体に結合しており、
ｃ）コポリマーが、少なくとも２種の異なるモノマー単位を含み、
ｄ）モノマー単位が、線状に結合しており、
ｅ）コポリマーが、
スルホン酸またはカルボン酸の形態で負電荷を有し、さらにエステルまたはアミド基および合計で最大８個のＣ原子のアルキルおよび／またはアルキレン基を含むがアリール基を含まない、あるいは
スルホン酸またはカルボン酸の形態で負電荷を有し、さらにアルキルおよび／またはアルキレン基を含むがアリール基を含まない
少なくとも１種のモノマー単位を含み、
ｆ）コポリマーが、疎水性基として、４〜１８個のＣ原子を有する直鎖状もしくは分枝状アルキルまたは対応するアリール基を有し、かつエステルまたはアミド基を含む、少なくとも１種のモノマー単位を含み、また
ｇ）負電荷を有するモノマー単位対疎水性基を含むモノマー単位の比率が、９９：１〜１０：９０の範囲である
ことを特徴とする、前記分離材料。
【請求項２】
ａ）ベース支持体が、脂肪族ヒドロキシル基を含み、
ｂ）共有結合したコポリマーが、末端モノマー単位を介して支持体に結合しており、
ｃ）コポリマーが、少なくとも２種の異なるモノマー単位を含み、
ｄ）モノマー単位が、線状に結合しており、
ｅ）コポリマーが、一般式（１）
【化１】
0005420531.tif 000020
式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＹは、互いに独立してＨもしくはＣＨ３を示し、
Ｒ３は、Ｒ４−ＳＯ３ＭもしくはＲ４−ＣＯＯＭを示し、
Ｒ４は、２〜４個のＣ原子を有する直鎖状もしくは分枝状アルキレンを示し、
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、ＫもしくはＮＨ４を示す、
あるいは、一般式（２）
【化２】
0005420531.tif 000021
式中、
Ｒ７およびＲ８は、互いに独立してＨもしくはＣＨ３を示し、または
Ｒ７は、Ｚ＝ＭかつＲ８＝Ｈである場合にはＣＯＯＭを示し、
Ｚは、Ｍ、Ｒ４−ＣＯＯＭもしくはＲ４−ＳＯ３Ｍを示し、ここで
Ｒ４は、２〜４個のＣ原子を有する直鎖状もしくは分枝状アルキレンを示し、
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、ＫもしくはＮＨ４を示す、
で表される、負の電荷を有する少なくとも１種のモノマー単位、あるいは、
各々の場合において少なくとも１種の一般式（１）で表されるモノマー単位および一般式（２）で表されるモノマー単位を含み、および
ｆ）コポリマーが、疎水性特性をコポリマーに付与し、一般式（１）、
式中、
Ｒ１は、ＨまたはＣＯＯＭを示し、
Ｒ２は、ＨまたはＣＨ３を示し、
ＹおよびＲ３は、１８個までのＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキルを示し、ここでＹおよびＲ３は一緒に、少なくとも６個のＣ原子を有し、
あるいは、
Ｙは、Ｈを示し、
および
Ｒ３は、６〜１８個のＣ原子を有する直鎖状もしくは分枝状アルキルを示し、
あるいは、
Ｙは、Ｈを示し、
および
Ｒ３は、アリールまたはＲ６−アリールを示し、
あるいは、
Ｙは、ＨまたはＣＨ３を示し、
および
Ｒ３は、Ｒ４−ＣＯＮＨＸを示し、
Ｘは、６〜１８個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、アリールまたはＲ６−アリールを示し
Ｒ４は、２〜４個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し
Ｒ６は、１〜４個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、ここでメチレン基は、Ｏにより置き換えられていてもよく、ＣＯＯＭにより置換されていてもよく、
および
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、ＫまたはＮＨ４を示す、
で表される、疎水性基を含む少なくとも１種のモノマー単位、あるいは、一般式（２）、
式中、
Ｒ７は、Ｈを示し、
Ｒ８は、ＨまたはＣＨ３を示し、
Ｚは、４〜１８個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、アリール、Ｒ６−アリールまたはＲ４−ＣＯＮＨＸを示し、
Ｘは、６〜８個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、アリール、Ｒ６−アリールを示し、
および
Ｒ６は、１〜４個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示す、
で表される対応するモノマー単位を含み、
ｇ）負の電荷を有するモノマー単位対疎水性基を含むモノマー単位のモル比が、９９：１〜１０：９０の範囲である
ことを特徴とする、請求項１に記載の分離材料。
【請求項３】
ｃ）コポリマーが、少なくとも２種の異なるモノマー単位を含み、
ｅ）コポリマーが、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−アクリルアミドエタンスルホン酸、カルボキシメチルアクリルアミド、カルボキシエチルアクリルアミド、カルボキシプロピルアクリルアミド、カルボキシメチルメタクリルアミド、カルボキシエチルメタクリルアミド、カルボキシプロピルメタクリルアミド、マレイン酸、アクリル酸およびメタクリル酸系からの、負の電荷を有する少なくとも１種のモノマー単位を含み、
ｆ）コポリマーが、一般式（１）
【化３】
0005420531.tif 000022
式中、
Ｒ１は、Ｈを示し、
Ｒ２は、ＨまたはＣＨ３を示し、
Ｙは、Ｈを示し、
および
Ｒ３は、アリールまたはＲ６−アリールを示し、
あるいは、
Ｙは、ＨまたはＣＨ３を示し、
および
Ｒ３は、Ｒ４−ＣＯＮＨＸを示し、ここで
Ｘは、アリールまたはＲ６−アリールを示し、
Ｒ４は、メチレン、エチレン、プロピレンを示し、
Ｒ６は、１〜４個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、ここでメチレン基は、Ｏにより置き換えられてもよく、ＣＯＯＭにより置換されてもよく、
および
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、ＫまたはＮＨ４を示す、
で表される、疎水性基を含む少なくとも１種のモノマー単位を含む
ことを特徴とする、請求項１または２に記載の分離材料。
【請求項４】
ｃ）コポリマーが、少なくとも２種の異なるモノマー単位を含み、
ｅ）コポリマーが、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−アクリルアミドエタンスルホン酸、カルボキシメチルアクリルアミド、カルボキシエチルアクリルアミド、カルボキシプロピルアクリルアミド、カルボキシメチルメタクリルアミド、カルボキシエチルメタクリルアミド、カルボキシプロピルメタクリルアミド、マレイン酸、アクリル酸およびメタクリル酸系からの、負の電荷を有する少なくとも１種のモノマー単位を含み、
ｆ）コポリマーが、一般式（１）
【化４】
0005420531.tif 000023
式中、
Ｒ１は、Ｈを示し、
Ｒ２は、ＨまたはＣＨ３を示し、
Ｙは、Ｈを示し、
および
Ｒ３は、フェニル、ベンジル、フェニルエチルまたはフェノキシエチルを示し、
あるいは、
Ｙは、ＨまたはＣＨ３を示し、
および
Ｒ３は、Ｒ４−ＣＯＮＨＸを示し、ここで
Ｘは、フェニル、ベンジルまたはフェニルエチルを示し、
また
Ｒ４は、メチレン、エチレン、プロピレン、アクリロイルフェニルグリシンまたはアクリロイルフェニルアラニンを示す、
で表される、疎水性基を含む少なくとも１種のモノマー単位を含む
ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の分離材料。
【請求項５】
ａ）コポリマーが、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸または／および２−アクリルアミドエタンスルホン酸を、負電荷を有するモノマー単位として含み、
ｂ）負電荷を有するモノマー単位対疎水性のフェニル、ベンジルまたはフェニルエチル基を含むモノマー単位の比率が、７０：３０〜３０：７０の範囲である
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の分離材料。
【請求項６】
ａ）コポリマーが、アクリル酸または／およびメタクリル酸を、負電荷を有するモノマー単位として含み、
ｂ）負電荷を有するモノマー単位対疎水性のフェニル、ベンジルまたはフェニルエチル基を含むモノマー単位のモル比が、９５：５〜７０：３０の範囲であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の分離材料。
【請求項７】
ａ）コポリマーが、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸および２−アクリルアミドエタンスルホン酸系からのモノマーを、負電荷を有するモノマー単位として含み、
ｂ）アクリル酸およびメタクリル酸系からのモノマー、および
ｂ）負電荷を有するモノマー単位対疎水性のフェニル、ベンジルまたはフェニルエチル基を含むモノマー単位のモル比が、９５：５〜３０：７０の範囲である、ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の分離材料。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の分離材料の製造方法であって、負電荷を有する官能基を含む少なくとも１種のモノマー単位を、疎水性基を含む少なくとも１種のモノマー単位と、および任意に親水性特性を有する中性のモノマーと、ヒドロキシル含有無機、有機または複合支持材料上に、１段階または多段階反応においてグラフト重合させることを特徴とする、前記方法。
【請求項９】
負電荷を有する官能基を含む少なくとも１種のモノマー単位を、疎水性基を含む少なくとも１種のモノマー単位と共に、および任意に親水性特性を有する中性のモノマーと共に、アセトン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン系からの共溶媒を加えて、セリウム（ＩＶ）イオンの存在下で、希酸に溶解し、ヒドロキシル含有ベース支持体上にグラフト重合させることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ａ）一般式（１）
【化５】
0005420531.tif 000024
式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＹは、互いに独立して、ＨまたはＣＨ３を示し、
Ｒ３は、Ｒ４−ＣＯＯＭを示し、
Ｒ４は、２〜４個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、ＫまたはＮＨ４を示す、
で表される、カルボキシル基を含む少なくとも１種のモノマー
および／または一般式（２）
【化６】
0005420531.tif 000025
式中、
Ｒ７およびＲ８は、互いに独立して、ＨまたはＣＨ３を示し、あるいは、
Ｒ７は、Ｚ＝ＭかつＲ８＝Ｈである場合にはＣＯＯＭを示し、
Ｚは、ＭまたはＲ４−ＣＯＯＭのいずれかを示し、ここで
Ｒ４は、２〜４個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、
および
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、ＫまたはＮＨ４を示す、
で表される、カルボキシル基を含むモノマーを、任意に水溶性モノマーと共に、ヒドロキシル含有無機、有機または複合支持材料上にグラフト重合させ、
ｂ）その後グラフト重合させたカルボキシル基のいくつかを、アミンをカップリングさせることによりアミド基に変換する
ことを特徴とする、請求項８または９に記載の分離材料の製造方法。
【請求項１１】
ａ）一般式（１）
【化７】
0005420531.tif 000026
式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＹは、互いに独立してＨまたはＣＨ３を示し、
Ｒ３は、Ｒ４−ＣＯＯＭを示し、
Ｒ４は、２〜４個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、および
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、ＫまたはＮＨ４を示す、
および／または一般式（２）
【化８】
0005420531.tif 000027
式中、
Ｒ７およびＲ８は、互いに独立してＨまたはＣＨ３を示し、あるいは、
Ｒ７は、Ｚ＝ＭかつＲ８＝Ｈである場合にはＣＯＯＭを示し、
Ｚは、ＭまたはＲ４−ＣＯＯＭを示し、
Ｒ４は、２〜４個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、
また
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、ＫまたはＮＨ４を示す、
で表される、カルボキシル基を含む少なくとも１種のモノマーを、
任意に他の水溶性モノマーと共に、負に帯電した基の比率がモノマーの合計量に対して１〜１００ｍｏｌ％となるように水に溶解し、
ｂ）得られた溶液を、沈降した支持材料１リットル当たり０．０５〜１００ｍｏｌの全モノマーを用いるように、支持材料と混合し、
ｃ）鉱酸に溶解したセリウム（ＩＶ）塩を、得られた懸濁液に加え、０〜５の範囲のｐＨおよび０．００００１〜５ｍｏｌ／ｌのセリウム（ＩＶ）濃度を生じさせ、また
ｄ）反応混合物を、０．５〜７２時間以内でグラフト重合させ、
ｅ）アミンまたはアミン混合物を、グラフト重合したカルボキシル基のカップリングによる修飾のために用い、
ｆ）用いるアミンの合計量は、支持体に結合するカルボキシル基に対して０．０１〜１００：１のモル比であり、これを支持体に結合する帯電した基に対して０．０１：１〜２０：１のモル比で用いるカップリング試薬の存在下でアミド基に変換し、
ｇ）アニリン、ベンジルアミン、４−フルオロベンジルアミン、４−メトキシベンジルアミン、ナフチルメチルアミン、フェナシルアミン、フェニルエチルアミン、フェノキシエチルアミン、トリプタミンまたはチラミンの群からの、６〜１８個のＣ原子を有するアルキル、アリールまたはアリールアルキルアミンを、遊離アミンとして、または塩酸塩として、カップリングのために用いる
ことを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の分離材料を製造するための請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれかに記載の分離材料を含む、クロマトグラフィーカラム。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれかに記載の分離材料のクロマトグラフィーカラムにおける使用。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれかに記載の分離材料のバイオポリマーを液体媒体から除去するための使用。
【請求項１５】
バイオポリマーを、１〜２０ｍＳ／ｃｍの電解伝導度および４より大きいｐＨを有する水性液体に溶解することを特徴とする、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
イオン性基および任意に疎水性基との相互作用により分離材料に結合したバイオポリマーを、
溶液中の
ａ）イオン強度を増加させ、および／または
ｂ）ｐＨを変更し、
および／または
ｃ）吸着緩衝液のものとは異なる極性を有する溶離液を用いることにより
脱着させることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善された結合能を有する分離材料、この調製、および帯電したバイオポリマーを液体から除去するためのこの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術
クロマトグラフィーは、タンパク質を単離するための最も好適な方法の１つである。モノクローナル抗体を、例えばプロテインＡリガンドを用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。細胞培養上清からリガンドへの結合は、ｐＨおよび塩濃度を適合させずに可能である。しかし、これらの吸着剤は、これらの高い費用のために、およびリガンドの流出(bleeding-out)のために、限られた範囲で用いられるに過ぎない。
【０００３】
高い能力のイオン交換樹脂を用いることは、好ましい選択肢である。しかし、イオン交換体への結合が起こるように細胞培養上清の伝導値(conduction value)を低下させなければならない。これは、脱塩によって、または上清の希釈によって行うことができる。特に大量生産プロセスの場合においては、両方の可能性は所望されない。
【０００４】
塩類（高い伝導値）の存在下で、電荷は遮蔽される。それにもかかわらず、比較的高い伝導値にてイオン交換体に結合するのを可能にするために、タンパク質とクロマトグラフィー支持体との間の少なくとも１つの第２の相互作用が、イオン相互作用に加えて存在しなければならない。
【０００５】
アニオン性基に加えてさらに官能基を含み、塩の存在下でバイオポリマーに結合する分離材料は、文献で知られている。
US 5,652,348 (Burton et al.)には、非イオン化リガンドを用いる、イオン化リガンドの疎水性修飾により得られるクロマトグラフィー樹脂およびこれらの使用が開示されている。ここでの結合は、疎水性相互作用を支持する条件の下で生じる。脱着は異なるｐＨにて行われ、これは、樹脂が親水性となり、電荷を得、結合したタンパク質（同一の電荷の）が反発されることを意味する。
【０００６】
Burtonらは(Biotechnology and Bioengineering 1997, 56, 45-55)、芳香族アミンへのカップリングによって部分的に修飾されたカルボキシルマトリックス上でのキモシンの精製を記載している。
EP 1 094 899には、カチオン交換体を用いて生体分子、特にタンパク質を除去する方法であって、結合を＞１５ｍＳ／ｃｍにて行い、溶出を比較的高いイオン強度にて行うことを特徴とする、前記方法が開示されている。カチオン交換リガンドは、ここでは、第２の官能基およびスペーサーを介して支持マトリックスに結合している。
【０００７】
US 7,067,059には、混合モードのカチオン交換体リガンドを含むクロマトグラフィーゲルの調製方法がクレームされており、ここで、調製を、環状ホモシステイン化合物を用いて行い、この結果、開環により、少なくとも２つの官能基を含む基が得られる。
US 6,852,230およびEP 1 345 694には、ペプチド構造を有する帯電した生体分子の結合および除去のためにイオン交換体を用いることが記載およびクレームされており、ここで、脱着段階の後に、塩を含まない、または塩が減少した溶液が存在し、したがって脱塩は同時に開始する。
【０００８】
US 7,008,542には、物質、特に１０００ダルトンより大きい分子量を有する生体有機分子を除去する方法であって、支持マトリックスを用いて行う、前記方法がクレームされている。後者は、少なくとも２種の構造的に異なるリガンドを含み、ここで、少なくとも１種のリガンドはイオン交換体である。典型的なリガンドは、＜１０００Ｄａの分子量を有する。
US 7,144,743には、アニオン性基により置換されているクロマトグラフィーのための多環式リガンドが記載されている。
【０００９】
対応する官能化されたモノマーを多数の異なる表面にグラフトさせることにより得られる官能化された直線状ポリマーは、長年にわたり知られている。官能化が化学的に結合したアニオン性基を伴う場合には、対応する材料を、カチオン交換クロマトグラフィーのために用いることができる(W. Mueller, J. Chromatography 1990, 510, 133-140)。バイオポリマーの分別を意図する比較的多数の考えられるグラフトポリマー構造は、特許EP 0 337 144またはUS 5,453,186に示されている。共重合によって得られる１種より多いモノマー単位を含むグラフトポリマーはまた、特許文献から知られている。しかし、モノマーの組み合わせは、文献において簡単に論じられているに過ぎない：次に、好適な交換体を得るために、共重合のためのモノマーを、両方のモノマーが塩基性もしくは酸性基を含むか、またはモノマーの１種が中性であるように選択しなければならない。グラフトポリマーの三元モノマー混合物または化学的修飾は、明白に述べられていない。
【００１０】
タンパク質と、遊離または可溶性の合成高分子電解質、例えば疎水的に修飾されたポリ（アクリル酸）およびＢＳＡなどとの相互作用は、Biomacromolecules 2003, 4, 273-282において調査され、議論されている。
このように、カチオン交換体を修飾するための多くの方法は、特許文献および雑誌文献から知られている。混合モードで作動するリガンドを含む吸着剤を調製するための種々の方法もまた、知られている。しかし、細胞培養上清からタンパク質、特に抗体を結合するのに適する商業的に入手できる吸着剤は少数に過ぎない。
【００１１】
リガンドとして２−メルカプト−５−ベンズイミダゾールスルホン酸により誘導体化される、US 7,144,743に記載されているクロマトグラフィーゲルは、３０ｍｇ／ｍｌまでのＩｇＧを結合することができる。名称MBI HyperCel（登録商標）の下で商業的に入手できる対応する製品を用いるGammanormについての本発明者ら自身の測定により、ｐＨ５および１４０ｍＭのＮａＣｌ（１０％破過）にて２３ｍｇ／ｍｌの結合が示された。
同一の会社によって市販されている他の製品の場合において、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）を用いる。この製品を用いて、約３２ｍｇ／ｍｌまでのポリクローナルヒトＩｇＧを結合することができる。
【００１２】
名称Capto MMC（登録商標）の下で市販されている他の商業的に入手できる製品を用いる際に、ｐＨ５．５および１５０ｍＭのＮａＣｌにて７ｍｇ／ｍｌの動的結合能（１０％破過）が、ヒトＩｇＧについて見出された。多様なリガンドが、US 7,067,059に記載されている製品を調製するために用いられる。しかし、このゲルは、特に抗体のために開発されておらず、４５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを結合する。
【００１３】
さらに、緩衝液から抗体を結合することができるに過ぎない合成リガンドを含む他の商業的に入手できる製品がある。細胞培養上清を処理するために用いる際には、不満足な結合が得られるかまたは結合が得られない。この結果はおそらく、干渉挙動を有する細胞培養上清中の成分により生じる。
【００１４】
能力、処理量、経済効率または選択性に関する利点を有する、抗体を精製するための吸着剤の供給に対する要求が継続してある(J. Chromatography B 2007, 848, 48 - 63)。ポリマーは、これ自体クロマトグラフィー支持体の表面修飾に高度に適する。その理由は、官能基の広範囲の選択が、特に多機能材料の合成のためにも有用であり、多数の官能基を含む厚い層を構築することが可能であるからである。特に、高い能力のクロマトグラフィー材料を、「柔軟な」ポリマー層で表面を被覆することにより作成することができる(J. Chromatography 1993, 631, 107 - 114)。
【００１５】
しかし、安価な出発材料を用いて、簡単に実行できるプロセスにより調製することができ、伝導性を顕著に低下させずに細胞培養上清または他の生物学的液体を分離するために用いる際に、これらが産業的規模で用いるのに適するような、特にモノクローナル抗体に関して高い分離活性を有する分離材料は、現在まで知られていない。
【発明の概要】
【００１６】
目的
したがって、本発明の目的は、細胞培養上清からのタンパク質についての、特にまた抗体についての改善された結合能を有し、調製の用途のために産業的規模で用いるのに適する分離材料を提供することにある。
【００１７】
したがって、特に、本発明の目的は、通常細胞培養上清中に存在する伝導値において、現在商業的に入手できるカチオン交換体、例えばFractogel（登録商標）ＥＭＤ  ＳＯ３−（Ｍ）またはFractogel（登録商標）ＥＭＤ  ＣＯＯ−（Ｍ）よりも、他の点では同一の条件の下で高いタンパク質結合能を有する材料を調製することにある。ここで、タンパク質が、特に動的な条件の下、比較的速い速度でクロマトグラフィープロセス中に存在するような短い分離材料との接触時間を有するに過ぎない場合には、ここでのタンパク質結合能は、用いるタンパク質の良好な回収に伴って高くなければならない。したがって、本発明の目的は、塩耐容性のカチオン交換体の合成およびタンパク質精製におけるこの使用である。
本発明のさらなる目的は、分離材料の特性を顕著に変化させずにｐＨ≧１３にて精製または再生を促進する、アルカリに安定な分離材料を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、クロマトグラフィー支持体に結合するグラフトコポリマーの２種の調製法を概略的に示した図である。
【図２】図２は、Fractogel・SO3/COOおよびFractogel・SO3/COO/ベンジルの分配係数を示した図である。
【図３】図３は、モノクローナル抗体を用いた結合実験のクロマトグラムを示した図である。
【００１９】
本発明の目的の達成および本発明の主題
本発明の目的は、共有結合したコポリマーにより、ヒドロキシル含有無機、有機または複合支持材料の表面を誘導体化することにより調製することができる、新規な分離材料を提供することにより達成され、ここでコポリマーは、少なくとも２種の異なるモノマー単位から構成されるグラフトポリマーであり、またここでこれらのモノマー単位の少なくとも１種は、負の電荷を有する官能基を含み、これらのモノマー単位の少なくとも１種は、コポリマーに、負電荷に加えて疎水性特性を付与する疎水性基を含む。分離材料の表面に結合したグラフトポリマーの特性は、負に荷電した基として少なくとも１つのカルボキシルおよび／またはスルホン酸基を含み、さらに合計で最大８個のＣ原子を有するエステルまたはアミド基ならびにアルキルおよび／またはアルキレン基を含むが、アリール基を含まない、少なくとも１種のモノマー単位を用いて、これを調製することができることである。他の変形態様は、これがスルホン酸またはカルボン酸の形態で負の電荷を有し、さらにアルキルおよび／またはアルキレン基を含むがアリール基を含まない。
【００２０】
さらに、コポリマーは、特に、４〜１８個のＣ原子を有する直鎖状もしくは分枝状アルキルまたは対応するアリール基を有する少なくとも１種のモノマー単位を疎水性基として含み、エステルまたはアミド基を含む。支持材料に結合するグラフトポリマーは、負電荷を有するモノマー単位対疎水性基を含むモノマー単位のモル比が９９：１〜１０：９０の範囲であるモノマー単位から、構成される。コポリマーの形態で分離材料の表面に共有結合したグラフトポリマーの調製を、好ましくは一般式（１）
【化１】
0005420531.tif 000002
【００２１】
式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＹは、互いに独立してＨもしくはＣＨ３を示し、
Ｒ３は、Ｒ４−ＳＯ３ＭもしくはＲ４−ＣＯＯＭを示し、
Ｒ４は、２〜４個のＣ原子を有する直鎖状もしくは分枝状アルキレンを示し、
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、ＫもしくはＮＨ４を示す、
【００２２】
あるいは、一般式（２）
【化２】
0005420531.tif 000003
式中、
Ｒ７およびＲ８は、互いに独立してＨもしくはＣＨ３を示し、または
Ｒ７は、Ｚ＝ＭかつＲ８＝Ｈである場合にはＣＯＯＭを示し、
Ｚは、Ｍ、Ｒ４−ＣＯＯＭもしくはＲ４−ＳＯ３Ｍを示し、ここで
Ｒ４は、２〜４個のＣ原子を有する直鎖状もしくは分枝状アルキレンを示し、
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、ＫもしくはＮＨ４を示す、
で表される、負の電荷を有する少なくとも１種の水溶性モノマー単位、
あるいは各々の場合において少なくとも１種の一般式（１）で表されるモノマー単位および一般式（２）で表されるモノマー単位、
【００２３】
ならびに疎水性特性をコポリマーに付与し、一般式（１）、式中、
Ｒ１は、ＨまたはＣＯＯＭを示し、
Ｒ２は、ＨまたはＣＨ３を示し、
ＹおよびＲ３は、１８個までのＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキルを示し、ここでＹおよびＲ３は一緒に、少なくとも６個のＣ原子を有し、
あるいは、
【００２４】
Ｙは、Ｈを示し、
および
Ｒ３は、６〜１８個のＣ原子を有する直鎖状もしくは分枝状アルキルを示し、
あるいは、
Ｙは、Ｈを示し、
および
Ｒ３は、アリールまたはＲ６−アリールを示し、
あるいは、
【００２５】
Ｙは、ＨまたはＣＨ３を示し、
および
Ｒ３は、Ｒ４−ＣＯＮＨＸを示し、
Ｘは、６〜１８個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、アリールまたはＲ６−アリールを示し
Ｒ４は、２〜４個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し
Ｒ６は、１〜４個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、ここでメチレン基は、Ｏにより置き換えられていてもよく、ＣＯＯＭにより置換されていてもよく、
また
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、ＫまたはＮＨ４を示す、
で表される疎水性基を含む少なくとも１種の他のモノマー単位、
【００２６】
あるいは一般式（２）、
式中、
Ｒ７は、Ｈを示し、
Ｒ８は、ＨまたはＣＨ３を示し、
Ｚは、４〜１８個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、アリール、Ｒ６−アリールまたはＲ４−ＣＯＮＨＸを示し、
Ｘは、６〜８個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、アリール、Ｒ６−アリールを示し、
また
Ｒ６は、１〜４個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示す、
で表される疎水性基を含む対応するモノマー単位を用いて行い、
ここで、負の電荷を有するモノマー単位対疎水性基を含むモノマー単位のモル比は、９９：１〜１０：９０の範囲である。
【００２７】
このタイプの共有結合したグラフトポリマーを、同様に、一般式（１）
【化３】
0005420531.tif 000004
または一般式（２）
【化４】
0005420531.tif 000005
【００２８】
式中、
Ｙは、Ｒ５−ＣＯＯＭを示し、
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、
Ｈ、１〜６個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、カルボキシル、カルボキシメチルを示し、
Ｒ３は、Ｈ、１〜６個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、Ｙを示し、
Ｒ５は、８個までのＣ原子を有し、任意にアルコキシまたはカルボキシル基により単置換または多置換されている直鎖状または分枝状アルキレン、または／および
１０個までのＣ原子を有し、任意にアルキル、アルコキシまたはカルボキシル基により単置換または多置換されているアリーレンを示し、
および
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、ＫまたはＮＨ４を示し、
Ｚは、ＭまたはＹを示す、
で表される少なくとも１種の水溶性モノマー単位を用いて、調製することができる。
【００２９】
さらに、このタイプの分離材料をまた、一般式（１）または（２）で表され、式中
Ｙは、Ｒ４−ＳＯ３Ｍを示し、
また
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、Ｈ、１〜６個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキルを示し、
Ｒ３は、Ｈ、１〜６個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキルを示し、
Ｒ４は、メチレン、エチレン、プロピレン、ヘキシレン、イソプロピレン、イソブチレンまたはフェニレンを示す、
少なくとも１種の水溶性モノマー単位を用いて、調製することができる。
【００３０】
用いる一般式（１）または式（２）で表される水溶性モノマー単位のラジカルＹはまた、以下の意味を採ってもよい：
Ｙは、Ｒ５−ＣＯＯＭを示し、
ここで同時に、
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、
Ｈ、１〜６個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキルを示し、
Ｒ３は、Ｈ、１〜６個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキルを示し、
Ｒ４は、メチレン、エチレン、ヘキシレン、プロピレン、イソプロピレン、イソブチレンまたはフェニレンを示す。
【００３１】
特に好ましいのは、少なくとも２種の異なるモノマー単位を含み、ここでコポリマーが、各々の場合において、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−アクリルアミドエタンスルホン酸、カルボキシメチルアクリルアミド、カルボキシエチルアクリルアミド、カルボキシプロピルアクリルアミド、カルボキシメチルメタクリルアミド、カルボキシエチルメタクリルアミド、カルボキシプロピルメタクリルアミド、マレイン酸、アクリル酸およびメタクリル酸の群から選択された、負電荷を有する少なくとも１種のモノマー単位、ならびに各々の場合において、一般式（１）
【化５】
0005420531.tif 000006
【００３２】
式中、
Ｒ１は、Ｈを示し、
Ｒ２は、ＨまたはＣＨ３を示し、
Ｙは、Ｈを示し、
および
Ｒ３は、アリールまたはＲ６−アリールを示し、
あるいは、
Ｙは、ＨまたはＣＨ３を示し、
および
Ｒ３は、Ｒ４−ＣＯＮＨＸを示し、ここで
Ｘは、アリールまたはＲ６−アリールを示し、
Ｒ４は、メチレン、エチレン、プロピレンを示し、
Ｒ６は、１〜４個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、ここでメチレン基は、−Ｏ−により置き換えられていてもよく、ＣＯＯＭにより置換されていてもよく、
および
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、ＫまたはＮＨ４を示す、
で表される、疎水性基を含む少なくとも１種のモノマー単位を含むコポリマーを含む、このタイプの分離材料である。
【００３３】
好ましいのは、さらに、コポリマーが、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−アクリルアミドエタンスルホン酸、カルボキシメチルアクリルアミド、カルボキシエチルアクリルアミド、カルボキシプロピルアクリルアミド、カルボキシメチルメタクリルアミド、カルボキシエチルメタクリルアミド、カルボキシプロピルメタクリルアミド、マレイン酸、アクリル酸およびメタクリル酸の群から選択された、負電荷を有する少なくとも１種のモノマー単位を含み、コポリマーが、一般式（１）
【化６】
0005420531.tif 000007
【００３４】
式中、
Ｒ１は、Ｈを示し、
Ｒ２は、ＨまたはＣＨ３を示し、
Ｙは、Ｈを示し、
および
Ｒ３は、フェニル、ベンジル、フェニルエチルまたはフェノキシエチルを示し、
あるいは、
Ｙは、ＨまたはＣＨ３を示し、
および
Ｒ３は、Ｒ４−ＣＯＮＨＸを示し、ここで
Ｘは、フェニル、ベンジルまたはフェニルエチルを示し、
および
Ｒ４は、メチレン、エチレン、プロピレン、アクリロイルフェニルグリシンまたはアクリロイルフェニルアラニンを示す、
で表される疎水性基を含む少なくとも１種のモノマー単位を含む、このタイプの分離材料である。
【００３５】
メタクリルアミド類、アクリルアミド類または不飽和カルボン酸類の群から選択される少なくとも１種の化合物を用いて調製された対応する分離材料は、特に有利な特性を有する。
【００３６】
本発明は特に、上記の分離材料に関し、これを調製するために、スルホアルキルアクリレート類、例えば３−スルホプロピルアクリレートまたは２−スルホエチルアクリレート、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸、アリルスルホン酸およびビニルトルエンスルホン酸の群から、またはスルホアルキルメタクリレート類、例えば２−スルホエチルメタクリレートまたは３−スルホプロピルメタクリレートの群から選択される少なくとも１種の化合物を用いる。
【００３７】
しかし、マレイン酸、桂皮酸、イタコン酸、シトラコン酸、メサコン酸もしくはフマル酸の群、またはカルボキシアルキルアクリレート類、例えばカルボキシエチルアクリレート、またはカルボキシアルキルメタクリレート類の群から選択される少なくとも１種の化合物をまた、本発明において、好適な誘導体化された分離材料を調製するために用いることができる。
【００３８】
本発明の目的に高度に適する分離材料を、さらに、カルボキシメチルアクリルアミド、カルボキシエチルアクリルアミド、アクリロイル−ガンマ−アミノ酪酸およびアクリロイルフェニルアラニン、アクリル酸、メタクリル酸およびエタクリル酸の群から選択される少なくとも１種の化合物を用いて、調製することができる。
【００３９】
特に好ましいのは、表面上に共有結合したグラフトポリマーを含み、好適な数の炭素原子を有する少なくとも１種のアルキルまたはアリール基の形態で顕著な疎水性成分を有する少なくとも１種のモノマー単位を用いて調製された、分離材料である。このタイプの分離材料は、除去されるべきバイオポリマーと、グラフトポリマーの疎水性成分および帯電した成分の両方によって相互作用する可能性のために、本発明おいて特に有効であることが明らかになった。
【００４０】
したがって、アルキルビニルケトン類、アリールビニルケトン類、アリールアルキルビニルケトン類、スチレン、アルキルアクリレート類、アリールアクリレート類、アリールアルキルアクリレート類、アルキルアリールアクリレート類、アルキルメタクリレート類、アリールメタクリレート類、アリールアルキルメタクリレート類およびアルキルアリールメタクリレート類の群から選択される疎水性成分を有する、少なくとも１種のモノマー単位を用いた誘導体化が、特に望ましい。
【００４１】
特に有効な分離材料をまた、疎水性成分を有し、ここでＹ＝Ｒ６であり、またここで、
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、
Ｈ、６個までのＣ原子を有する非分枝状または分枝状アルキルを示し、
Ｒ３および／またはＲ６は、互いに独立して、
Ｈ、非分枝状または分枝状アルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキルを示し、
ここでアルキル基は、オキソ基を有していてもよく、
ここでアルキルおよび／またはアリール基は、アルコキシ、フェノキシ、シアノ、カルボキシル、アセトキシまたはアセトアミノ基により単置換または多置換されていてもよく、
またここで、Ｒ３およびＲ６は一緒に、少なくとも６個のＣ原子を有する、
一般式（１）で表される少なくとも１種のモノマー単位を用いて、調製することができる。
【００４２】
したがって、本発明の分離材料を、疎水性成分を有し、一般式（１）、式中、
Ｒ３、Ｒ６は、互いに独立して、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、２−、３−または４−オキサペンチル、２−、３−、４−または５−オキサヘキシル、２−、３−、４−、５−または６−オキサヘプチル、３−ブトキシプロピル、イソプロピル、３−ブチル、イソブチル、２−メチルブチル、イソペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−オキサ−３−メチルブチル、２−メチル−３−オキサヘキシル、２−フェニル−２−オキソエチル、フェノキシエチル、フェニル、ベンジル、フェニルエチルおよびフェニルプロピルを示し、
またここで、Ｒ３およびＲ６が一緒に少なくとも６個のＣ原子を有する、
で表される少なくとも１種のモノマー単位を用いて、調製することができる。
【００４３】
したがって、本発明の分離材料を、好ましくは、負電荷を有する官能基を含むこれらのモノマー単位の少なくとも１種、ならびに負電荷に加えて疎水性特性をコポリマーに付与する疎水性基を含む少なくとも１種のモノマー単位、ならびに任意に親水性であり得る少なくとも１種の中性モノマー単位を用いて、調製する。
【００４４】
特に好ましいのは、親水性であってもよく、一般式（１）、式中Ｙ＝Ｒ６であり、および、
Ｒ１、Ｒ２は、互いに独立してＨまたはメチルを示し、
Ｒ３、Ｒ６は、互いに独立してＨ、アルキル、アルコキシアルキルを示し、各々は４個までのＣ原子を有する、で表される、少なくとも１種の中性モノマー単位を用いて調製された、このタイプの分離材料である。
【００４５】
極めて特に好ましいのは、親水性であってもよく、一般式（１）、
式中Ｙ＝Ｒ６であり、ここで、
Ｒ１、Ｒ２は、互いに独立してＨまたはメチルを示し、
Ｒ３、Ｒ６は、互いに独立してＨ、メチル、エチル、ブチル、イソプロピル、３−ブチル、イソブチル、メトキシエチルまたはエトキシエチルを示す、で表される、少なくとも１種の中性モノマー単位を含む分離材料である。
【００４６】
したがって、分離材料を調製するために、アクリルアミド（ＡＡｍ）、ジメチルアクリルアミド、メタクリルアミド、イソプロピルアクリルアミド、メトキシエチルアクリルアミドおよびエトキシエチルアクリルアミドの群から、またはメチルアクリレートおよびメチルメタクリレートの群から選択される少なくとも１種の中性のモノマー単位を用いることができ、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、アクリル酸、Ｎ−アリールアルキルアクリルアミド類、例えばベンジルアクリルアミドおよびアクリロイルフェニルアラニンなど、Ｎ−カルボキシアルキルアクリルアミド類、例えばアクリロイル−ガンマ−アミノ酪酸など、ならびにＮ−アルキルアクリルアミド類の群から選択される２種または３種のモノマーを用いる。
【００４７】
本発明は、特に、上記のように、負電荷を有する単位対芳香族基を含む単位のモル比が９９：１〜１０：９０の範囲、好ましくは９６：４〜４０：６０の範囲にある、分離材料に関する。
【００４８】
次にここで、コポリマーが、負電荷を有するモノマー単位（１種または２種以上）として２−アクリルアミド−２メチルプロパンスルホン酸または／および２−アクリルアミドエタンスルホン酸を含み、ここで負電荷を有するモノマー単位対疎水性のフェニル、ベンジルまたはフェニルエチル基を含むモノマー単位のモル比が７０：３０〜３０：７０の範囲にある分離材料は、特に良好な特性を有する。
【００４９】
特に良好な特性を有するさらなる分離材料は、コポリマーが、負電荷を有するモノマー単位としてアクリル酸または／およびメタクリル酸を含み、ここで負電荷を有するモノマー単位対疎水性のフェニル、ベンジルまたはフェニルエチル基を含むモノマー単位のモル比が９５：５〜７０：３０の範囲のものである。
【００５０】
そのうえ、コポリマーが、負電荷を有するモノマー単位として２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸および２−アクリルアミドエタンスルホン酸の系からのモノマー、ならびにアクリル酸およびメタクリル酸の系からのモノマーを含み、ここで負電荷を有するモノマー単位対疎水性のフェニル、ベンジルまたはフェニルエチル基を含むモノマー単位のモル比が９５：５〜３０：７０の範囲である、このタイプの分離材料が、使用の際に極めて良好であると明らかになった。
【００５１】
この目的は、特に、帯電した基としてスルホン酸基のみを含む表面に共有結合したポリ（アクリルアミド）グラフトポリマーの帯電した基の比率が、グラフトポリマーの合計重量に対して３５〜７０ｍｏｌ％の範囲である分離材料により、達成される。本発明の目的はさらに、帯電した基としてカルボキシル基のみを含むグラフトポリマーの帯電した基の比率が、グラフトポリマーの合計重量に対して６０〜９８ｍｏｌ％の範囲である対応する分離材料により、達成することができる。
【００５２】
本発明の分離材料は、クロマトグラフィーカラムにおける使用に特に高度に適する。本発明は、このように、記載した本発明の分離材料を含むクロマトグラフィーカラムにも関する。
【００５３】
特に、本発明において特徴づけられる分離材料はまた、バイオポリマーを液体媒体から除去するのに特に高度に適する。
【００５４】
バイオポリマーを、これらの分離材料により、６ｍＳ／ｃｍより高い、好ましくは９ｍＳ／ｃｍより高い電解伝導度を有する液体から簡単かつ効果的に吸着させることができ、一方１〜２０ｍＳ／ｃｍの範囲の電解伝導度および４より大きいｐＨを有する水性液体中において、対応するバイオポリマーを溶解した形態にするかまたは脱着することができることは、特に有利であることが明らかになった。
【００５５】
したがって、これらの分離材料は、５．５のｐＨを有し、６ｍＳ／ｃｍより高い、好ましくは９ｍＳ／ｃｍより高い電解伝導度を有する水性液体から抗体を吸着するのに適し、したがって生体液体から除去するために簡単な方法で用いることができる。その後、負荷させた分離材料を処理し、バイオポリマーを好適な液体と共に溶出させることができる。
【００５６】
本発明は、イオン強度を増大させることにより、および／または溶液中のｐＨを変更することにより、および／または吸着緩衝液のものとは異なる極性を有する溶離液を用いることにより、イオン性基、および任意に疎水性基と相互作用させることにより、分離材料に結合するバイオポリマーを脱着させることによってバイオポリマーを液体から除去することを特徴とする、分離材料の使用に関する。
【００５７】
本発明のこのような分離材料を調製するのに適するプロセスを、負電荷を有する官能基を含む少なくとも１種のモノマー単位を、疎水性基を含む少なくとも１種のモノマー単位と、および任意に親水性特性を有する中性のモノマーと、ヒドロキシル含有無機、有機または複合支持材料上で、１段階または２段階反応においてグラフト重合させることにより行う。この目的のために、例えば、負電荷を有する官能基を含む少なくとも１種のモノマー単位を、疎水性基を含む少なくとも１種のモノマー単位および任意に親水性特性を有する中性のモノマーを含む希酸に、セリウム（ＩＶ）イオンの存在下で共溶媒を加えて溶解し、ヒドロキシル含有無機、有機または複合支持材料上でグラフト重合させる。
【００５８】
上記で特徴づけした分離材料を調製するための本発明の方法は、特に、
ａ）一般式（１）
【化７】
0005420531.tif 000008
式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＹは、互いに独立して、ＨまたはＣＨ３を示し、
Ｒ３は、Ｒ４−ＣＯＯＭを示し、
Ｒ４は、２〜４個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、ＫまたはＮＨ４を示す、
で表される、カルボキシル基を含む少なくとも１種のモノマー
【００５９】
および／または一般式（２）
【化８】
0005420531.tif 000009
式中、
Ｒ７およびＲ８は、互いに独立して、ＨまたはＣＨ３を示し、あるいは、
Ｒ７は、Ｚ＝ＭかつＲ８＝Ｈである場合にはＣＯＯＭを示し、
Ｚは、ＭまたはＲ４−ＣＯＯＭのいずれかを示し、ここで
Ｒ４は、２〜４個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、
および
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、ＫまたはＮＨ４を示す、
で表される、カルボキシル基を含むモノマーを、任意に水溶性モノマーと共に、ヒドロキシル含有無機、有機または複合支持材料上にグラフト重合させ、
ｂ）その後グラフト重合させたカルボキシル基のいくつかを、アミンとのカップリングによりアミド基に変換する
ことを特徴とする。
【００６０】
この方法の選択された変形態様は、
ａ）一般式（１）
【化９】
0005420531.tif 000010
式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＹは、互いに独立してＨまたはＣＨ３を示し、
Ｒ３は、Ｒ４−ＣＯＯＭを示し、
Ｒ４は、２〜４個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、および
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、ＫまたはＮＨ４を示す、
【００６１】
および／または一般式（２）
【化１０】
0005420531.tif 000011
式中、
Ｒ７およびＲ８は、互いに独立してＨまたはＣＨ３を示し、あるいは、
Ｒ７は、Ｚ＝ＭかつＲ８＝Ｈである場合にはＣＯＯＭを示し、
Ｚは、ＭまたはＲ４−ＣＯＯＭを示し、
Ｒ４は、２〜４個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、
および
Ｍは、Ｈ、Ｎａ、ＫまたはＮＨ４を示す、
で表される、カルボキシル基を含む少なくとも１種のモノマーを、
任意に他の水溶性モノマーと共に、負に帯電した基の比率がモノマーの合計量に対して１〜１００ｍｏｌ％となるように水に溶解し、      
【００６２】
ｂ）得られた溶液を、沈降した支持材料１リットル当たり０．０５〜１００ｍｏｌの全モノマーを用いるように支持材料と混合し、
ｃ）鉱酸に溶解したセリウム（ＩＶ）塩を、得られた懸濁液に加え、０〜５の範囲のｐＨおよび０．００００１〜５ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．００１〜０．１ｍｏｌ／ｌのセリウム（ＩＶ）濃度を生じさせ、また
ｄ）反応混合物を、０．５〜７２時間以内でグラフト重合させ、
ｅ）アミンまたはアミン混合物を、グラフト重合したカルボキシル基のカップリングによる修飾のために用い、
【００６３】
ｆ）用いるアミンの合計量は、支持体に結合するカルボキシル基に対して０．０１〜１００：１のモル比であり、支持体に結合する帯電した基に対して０．０１：１〜２０：１のモル比で用いるカップリング試薬の存在下でアミド基に変換し、
ｇ）アニリン、ベンジルアミン、４−フルオロベンジルアミン、４−メトキシベンジルアミン、ナフチルメチルアミン、フェナシルアミン、フェニルエチルアミン、フェノキシエチルアミン、トリプタミンまたはチラミンの群からの、６〜１８個のＣ原子を有するアルキル、アリールまたはアリールアルキルアミンを、遊離アミンとして、または塩酸塩として、カップリングのために用いる
ことからなる。
【００６４】
本発明の方法を行うために、用いる希酸は、１〜０．００００１ｍｏｌ／ｌの範囲の濃度の硫酸、塩酸および硝酸の群からの酸であり、ここで酸を、３０：７０〜９８：２の容積比において共溶媒と混合する。用いる共溶媒を、ジオキサン、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドおよびテトラヒドロフランの群から選択される少なくとも１種の溶媒とすることができる。
【００６５】
所望の特性を有する誘導体化された分離材料を得るために、疎水性成分の比率がモノマーの合計量に対して１〜９０ｍｏｌ％であり、ここで沈降した支持材料１リットル当たり０．０５〜１００ｍｏｌのモノマーを用いるような、互いに対する比率で、帯電したモノマーおよび疎水性モノマーを用いて、当該プロセスを行う。
【００６６】
本発明の方法を行う選択された形態は、官能化された（メタ）アクリルアミド類および（メタ）アクリル酸を、ヒドロキシル含有無機、有機または複合支持材料の表面上に、１段階反応においてグラフト重合することからなる。
【００６７】
本発明の方法の他の変形態様は、親水性モノマーを、液体反応媒体中でヒドロキシル含有無機、有機または複合支持材料上でグラフト重合し、得られたグラフトポリマーを、第２の段階においてポリマー類似反応(polymer-analogous reaction)により疎水的に修飾することからなる。
【００６８】
分離材料を調製するための本発明の方法を、好ましくは、
ａ）親水性モノマーを水に溶解し、これを任意に、負に荷電した基の比率がモノマーの合計量に対して１〜１００ｍｏｌ％であるような比率で、他のモノマーと混合し、
ｂ）沈降したポリマー材料１リットル当たり０．０５〜１００ｍｏｌの全モノマーを、用いるように得られた溶液を支持材料と混合し、
ｃ）鉱酸に溶解したセリウム（ＩＶ）塩を得られた懸濁液に加え、０〜５の範囲のｐＨにさせ、
ｄ）０．５〜７２時間以内で反応混合物をグラフト重合させる
ことにより行う。
【００６９】
疎水性修飾のために用いるモノマー単位を、好ましくは、ここでは支持体に結合した帯電した基に対して１００〜１０，０００ｍｏｌ％過剰で、カップリング試薬の存在下で用い、ここで後者を、支持体に結合した帯電した基に対して６０〜２０００ｍｏｌ％過剰で用いる。
【００７０】
したがって、本発明はまた、このようにして得られる分離材料に関し、これは、クロマトグラフィーカラムの形態であってもよく、これは、グラフト重合により本発明に従って誘導体化されている。
【００７１】
本発明は同様に、バイオポリマーを液体媒体から除去するための、特にタンパク質を液体媒体から除去するための、または抗体を液体媒体から除去するための、本発明の分離材料の使用を包含する。バイオポリマーがイオン性基と、および任意に支持材料の表面に共有結合したグラフトポリマーの疎水性基と相互作用する場合には、除去は特に選択的である。バイオポリマーをここで、グラフトポリマーの帯電した成分と、およびまた疎水性の成分と相互作用することにより、吸着させる。液体から除去された吸着されたバイオポリマーのその後の分離を、再度イオン性の、および任意に疎水性の基との相互作用により分離材料に結合したバイオポリマーを、
溶液中の
ａ）イオン強度を増加させ、および／または
ｂ）ｐＨを変更することにより、
および／または
ｃ）吸着緩衝液とは異なる極性を有する好適な溶離液により、
脱着させることにより、行うことができる。
【００７２】
したがって、以下に記載する本発明は、多孔質粒子のヒドロキシル含有表面上のグラフトコポリマーまたは対応する好適な成形品の製造であって、グラフトポリマーを、２種または３種以上の繰り返し単位から構成し、ここで当該単位の少なくとも１種は負電荷を有し、少なくとも１種の単位は疎水性基に結合しており、グラフトポリマーが帯電した物質、特に細胞培養物および細胞培養物上清中に見出される帯電した物質を、イオン性相互作用により結合することができることを特徴とする、前記製造に関する。
【００７３】
支持表面に結合している柔軟なグラフトポリマー、いわゆる「触手」をイオン交換基として用いることは、知られている。このように、商業的に入手できるカチオン交換体であるFractogel（登録商標）ＥＭＤ  ＳＯ３−（Ｍ）中のグラフトポリマーは、スルホン酸基を含む１種の繰り返し単位のみから構成されている。カチオン交換体Fractogel（登録商標）ＥＭＤ  ＣＯＯ−（Ｍ）は同様に、繰り返されている親水性単位のみからなる。これらのカチオン交換体は、ＩｇＧが１０ｍＳ／ｃｍより大きい伝導値を有する溶液中、即ち、例えば１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶液中に位置する場合には、例えば免疫グロブリン（ＩｇＧ）に対して低い結合能を示すにすぎない。
【００７４】
特許EP 0 337 144またはUS 5,453,186には、塩耐容性のイオン交換体を合成するにあたり好ましいモノマーの組み合わせについての情報は、示されていない。種々のグラフトポリマーを調製する本発明者ら自身の試行を通してのみ、疎水性モノマーと負に荷電したモノマーとの組み合わせが、特に計画されている使用に適することが、明らかになった。例えば表１に列挙されている官能化されたアクリルアミドおよびアクリル酸を、好ましくは一連のグラフト実験のために用いた。その理由は、これから生成するポリマーがアルカリ性条件下で加水分解安定性であるからである。調査のために、材料に、何時間にもわたり０．１Ｍ〜１．０Ｍの水酸化ナトリウム溶液での処理を施した。水溶液における特性のより詳細な調査により、得られた新規な表面構造が、これらの疎水性特性にもかかわらず極めて良好な膨潤特性を有することが示された。これは、明らかに、文献(W. Shi et al.、J. Chromatography A、2001、924、123-135)で知られるように、得られたポリ（アクリルアミド）類が水溶液中で水素結合を形成することができるという事実に起因し得る。
【００７５】
本発明の分離材料を調製するために、親水性クロマトグラフィー支持体、例えば商業的に入手できるToyopearl HW-65（Ｓ）および（Ｍ）と同一であるFractogel TSK HW65（Ｓ）または（Ｍ）を、用いることができる。この支持体を、グラフトコポリマーにより修飾する。クロマトグラフィー支持体に結合するグラフトコポリマーは、２種の異なる調製経路により得られる：
【００７６】
ａ）クロマトグラフィー支持体の表面上のすべての官能基の導入を、単一のグラフト重合段階により、１段階グラフト重合において行う、
または、
ｂ）２段階方法において、先ず好適な親水性単位によるグラフティングを行い、続いてグラフトポリマー上でのポリマー類似反応により、疎水性基を導入する。
【００７７】
本発明の材料を調製するために、他のクロマトグラフィー支持体もまた、用いることができる。しかし、このための必要条件は、用いる材料が、グラフト重合反応にアクセス可能な反応性基、特にＯＨ基を含むことである。したがって、好適な支持材料をまた、例えば有機ポリマーから調製することができる。このタイプの有機ポリマーを、多糖類、例えばアガロース、デキストラン、デンプン、セルロースなど、または合成ポリマー、例えばポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（アクリレート）、ポリ（メタクリレート）、親水的に置換されたポリ（アルキルアリルエーテル）、親水的に置換されたポリ（アルキルビニルエーテル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（スチレン）および対応するモノマーのコポリマーとすることができる。これらの有機ポリマーをまた、好ましくは架橋した親水性ネットワークの形態で用いることができる。これはまた、スチレンおよびジビニルベンゼンから製造されたポリマーを含み、これを、好ましくは他の疎水性ポリマーと同様に、親水性化された形態で用いることができる。
【００７８】
あるいはまた、無機物質、例えばシリカ、酸化ジルコニウム、二酸化チタン、酸化アルミニウムなどを、支持体として用いることができる。複合材料を用いることは、同等に可能である。即ち、例えば、本発明の分離材料を、例えば無機粒子または成形品の表面を誘導体化し、これを本発明の方法において誘導体化することにより、得ることができる。この例は、磁化可能な粒子の、または磁化可能なコアの共重合によりこれら自体磁化され得る粒子である。
【００７９】
しかし、好ましいのは、加水分解に対して安定であるか、または困難を伴って加水分解され得るに過ぎない親水性支持材料を用いることである。その理由は、本発明の材料が、長期の使用期間にわたってｐＨ≧１３にてアルカリ清浄または再生に耐えなければならないからである。支持体は、すでに低分子量のリガンドを有していてもよい。リガンドは、１種または２種以上の帯電した基、疎水性基または水素結合を形成することができる基を有していてもよい。好ましいのは、負に荷電した基を含むリガンドである。
【００８０】
支持材料はまた、粒子の大きさが２〜１０００μｍであり得る、不規則な形状の、または球状の粒子からなっていてもよい。好ましいのは、３〜３００μｍの粒子の大きさである。
支持材料は、特に、非孔質であるかまたは好ましくは多孔質粒子の形態であってもよい。孔の大きさは、２〜３００ｎｍであり得る。好ましいのは、５〜２００ｎｍの孔の大きさである。
支持材料は、同様に、また膜、繊維、中空繊維、コーティングまたはモノリシック成形品の形態であってもよい。モノリシック成形品は、例えば円筒形の形態での三次元物体である。
【００８１】
図１は、上述の２種の調製法を概略的に示す。詳細に、この図面は、以下のものを示す：
アニオン性基を含むモノマー４および疎水性モノマー５を、親水性支持表面１上に直接混合物としてグラフトし、アニオン性および疎水性基を含む化学的に修飾された表面３を得ることができる。モノマー４がカルボキシル基を含む場合には、親水性アニオン性表面２を先ず形成し、その後、例えばカップリング試薬としてアリールアルキルアミンおよびカルボジイミドを用いた疎水性修飾により、３に変換することができる。モノマー４は親水性モノマーの混合物であり得、モノマー５は疎水性モノマーと中性モノマーとの混合物であり得る。
【００８２】
１段階グラフト重合のために、例えばスルホン酸基またはカルボキシル基を含む少なくとも１種の負に荷電したモノマーを用いる。スルホン酸基を含む好適なモノマーは、例えばビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸、アリルスルホン酸、ビニルトルエンスルホン酸、式２、式中Ｚ＝Ｒ４−ＳＯ３Ｍであり、ここでＲ７およびＲ８は、互いに独立して水素または６個までのＣ原子を有するアルキル、好ましくは水素またはメチル、カルボキシルまたはカルボキシメチルの意味を有し、ここでＲ４は、１〜８個のＣ原子を有する直鎖状アルキレン、例えばメチレン、エチレン、プロピレンもしくはヘキシレン、または１〜８個のＣ原子を有する分枝状アルキレン基、例えばイソプロピレンもしくはイソブチレンであってもよい、で表されるアクリレートである。
【００８３】
アルキレン基は、任意にアルコキシまたはカルボキシル基により単置換または多置換されていてもよい。Ｒ４は、同様に、１０個までのＣ原子を有するアリーレン基、例えばフェニレンの意味を有することができる。アルキレン基は、１〜４個のＣ原子を有するアルキル基、アルコキシまたはカルボキシル基により、任意に単置換または多置換、好ましくは単置換または二置換、特に単置換されていてもよい。Ｒ４はまた、１つの鎖のアルキレンおよびアリーレン基、またはアリーレンおよびアルキレン基からなっていてもよい。Ｍは、水素原子または金属カチオン、例えばナトリウムもしくはカリウム、またはアンモニウムカチオンである。Ｍを、モノマーが水溶性であるように選択する。
【００８４】
スルホアルキルアクリレート、例えば３−スルホプロピルアクリレートまたは２−スルホエチルアクリレート、およびスルホアルキルメタクリレート、例えば３−スルホプロピルメタクリレートまたは２−スルホエチルメタクリレートが、例として示される。好ましいのは、式１、式中Ｒ３＝Ｒ４−ＳＯ３Ｍであり、ここでＲ１、Ｒ２およびＹは、互いに独立して、水素または６個までのＣ原子を有するアルキル、好ましくは水素またはメチルの意味を有し、Ｒ１およびＲ２は同様に、互いに独立してカルボキシルまたはカルボキシメチルであってもよく、Ｒ３はまた、Ｒ４−ＳＯ３Ｍであってもよく、またここでＲ４は、１〜８個のＣ原子を有する直鎖状アルキレン基、例えばメチレン、エチレン、プロピレンもしくはヘキシレン、または１〜８個のＣ原子を有する分枝状アルキレン、例えばイソプロピレンもしくはイソブチレンであり得る、で表される、アクリルアミドを用いることである。
【００８５】
アルキレン基は、任意にアルコキシまたはカルボキシル基により単置換または多置換されていてもよい。Ｒ４は、同様に、１０個までのＣ原子を有するアリーレン基、例えばフェニレンの意味を有していてもよい。アルキレン基は、任意に、１〜４個のＣ原子を有するアルキル基、アルコキシまたはカルボキシル基により単置換または多置換、好ましくは単置換または二置換、特に単置換されていてもよい。Ｒ４はまた、１つの鎖のアルキレンおよびアリーレン基、またはアリーレンおよびアルキレン基からなっていてもよい。Ｍは、水素原子または金属カチオン、例えばナトリウムもしくはカリウム、またはアンモニウムカチオンである。Ｍを、モノマーが水溶性であるように選択する。本明細書中で例により述べることができる好適なアクリルアミドは、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）および２−アクリルアミドエタンスルホン酸である。
【化１１】
0005420531.tif 000012
【００８６】
カルボキシル基を含む好適なモノマーは、例えば式２、式中Ｚ＝Ｒ５−ＣＯＯＭであり、ここでＲ１およびＲ２が互いに独立して、水素または６個までのＣ原子を有するアルキル、好ましくは水素またはメチル、カルボキシルまたはカルボキシメチルの意味を有することができ、ここでＲ５が１〜８個のＣ原子を有する直鎖状アルキレン基、例えばメチレン、エチレン、プロピレンもしくはヘキシレン、または１〜８個のＣ原子を有する分枝状アルキレン基、例えばイソプロピレンもしくはイソブチレンであり得る、で表されるケイ皮酸またはアクリレートであり得る。アルキレン基は、任意にアルコキシまたはカルボキシル基により単置換または多置換されていてもよい。Ｒ５は、同様に１０個までのＣ原子を有するアリーレン基、例えばフェニレンの意味を有していてもよい。
【００８７】
アルキレン基は、任意に、１〜４個のＣ原子を有するアルキル基、アルコキシまたはカルボキシル基により単置換または多置換、好ましくは単置換または二置換、特に単置換されていてもよい。Ｒ５はまた、１つの鎖のアルキレンおよびアリーレン基、またはアリーレンおよびアルキレン基からなっていてもよい。Ｍは、水素原子または金属カチオン、例えばナトリウムもしくはカリウム、またはアンモニウムカチオンである。Ｍを、モノマーが水溶性であるように選択する。カルボキシエチルアクリレートなどのカルボキシアルキルアクリレートおよびカルボキシアルキルメタクリレートを例として示す。
【００８８】
好ましいのは、式１、式中Ｒ３＝Ｒ５−ＣＯＯＭであり、ここでＲ１、Ｒ２およびＹが、互いに独立して水素または６個までのＣ原子を有するアルキル、好ましくは水素またはメチルの意味を有し、Ｒ１およびＲ２が同様に、互いに独立してカルボキシルまたはカルボキシメチルであり得、Ｒ３はまたＲ５−ＣＯＯＭであり得、ここでＲ５は、１〜８個のＣ原子を有する直鎖状アルキレン基、例えばメチレン、エチレン、プロピレンもしくはヘキシレン、または１〜８個のＣ原子を有する分枝状アルキレン、例えばイソプロピレンもしくはイソブチレンであり得る、で表されるアクリルアミドを用いることである。アルキレン基は、任意にアルコキシまたはカルボキシル基により単置換または多置換されていてもよい。
【００８９】
Ｒ５は、同様に１０個までのＣ原子を有するアリーレン基、例えばフェニレンの意味を有していてもよい。アルキレン基は、任意に、１〜４個のＣ原子を有するアルキル基、フェニル、フェニルメチル、アルコキシまたはカルボキシル基により単置換または多置換、好ましくは単置換または二置換、特に単置換されていてもよい。Ｒ５はまた、１つの鎖のアルキレンおよびアリーレン基、またはアリーレンおよびアルキレン基からなっていてもよい。Ｍは、水素原子または金属カチオン、例えばナトリウムもしくはカリウム、またはアンモニウムカチオンである。Ｍを、モノマーが水溶性であるように選択する。本明細書中で述べることができる好適なアクリルアミドの例は、アクリロイル−ガンマ−アミノ酪酸である。
【００９０】
特に好ましいのは、式２、式中Ｚ＝Ｍであり、ここでＲ７およびＲ８が互いに独立して水素または６個までのＣ原子を有するアルキル、好ましくは水素またはメチル、カルボキシルまたはカルボキシメチルの意味を有することができる、で表される不飽和カルボン酸を用いることである。Ｍは、水素原子または金属カチオン、例えばナトリウムもしくはカリウム、またはアンモニウムカチオンである。Ｍを、モノマーが水溶性であるように選択する。マレイン酸、イタコン酸、シトラコン酸、メサコン酸またはフマル酸を、例として示すことができる。これらの中で、特に好ましいのは、式２、式中Ｚ＝Ｍであり、ここでＲ７が水素を示し、Ｒ８が水素または３個までのＣ原子を有するアルキルを示す、で表されるモノマーである。アクリル酸（ＡＡ）、メタクリル酸またはエタクリル酸を、この目的のために例として示すことができる。
【化１２】
0005420531.tif 000013
【００９１】
分子中で顕著な疎水性成分を有する少なくとも１種の疎水性モノマーは、１段階グラフト重合のためのさらなる成分として必要とされる。したがって、好適な疎水性モノマーは、少なくとも１種のアルキルもしくはアリール基または分子の疎水性特性を生じる他の基を含む。好ましいのは、疎水性特性が好適な数の炭素原子を有するアルキル基により、またはアリール基により生じるモノマーである。用いる疎水性モノマーは、好ましくは、アルキルまたはアリール基を含むモノマーである。本発明において用いるのに適する疎水性モノマーは、例えば式（２）、式中Ｒ７は水素の意味を有し、Ｒ８は水素またはメチルを示し、Ｚは４〜１８個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、アリール、Ｒ６−アリールまたはＲ４−ＣＯＮＨＸを示し、ここでＸが６〜８個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、アリール、Ｒ６−アリールを示し、Ｒ６が１〜４個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示す、で表されるアクリレートであり、ブチルアクリレートおよびブチルメタクリレートを例として示すことができる。
【００９２】
好ましいのは、一般式１、式中Ｒ１およびＲ２が互いに独立して水素または６個までのＣ原子を有するアルキル、好ましくは水素またはメチルの意味を有し、ここでＹおよび／またはＲ３が互いに独立して、ＹおよびＲ３が一緒に少なくとも６個のＣ原子、好ましくは６〜１８個のＣ原子を有するアルキルの意味を有し、メチレン基がＯ、アリール、アルキルアリール、アリールアルキルにより置換されていてもよく、ここでアルキルおよび／またはアリール基がアルコキシ、シアノ、カルボキシル、アセトキシまたはアセトアミノラジカルにより単置換または多置換、好ましくは単置換または二置換、特に単置換されていてもよく、したがって、Ｙおよび／またはＲ３が好ましくは、互いに独立してメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、２−、３−または４−オキサペンチル、２−、３−、４−または５−オキサヘキシル、２−、３−、４−、５−または６−オキサヘプチル、３−ブトキシプロピル、イソプロピル、３−ブチル、イソブチル、２−メチルブチル、イソペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−オキサ−３−メチルブチル、２−メチル−３−オキサヘキシルを示す、で表されるアクリルアミドである。
【００９３】
Ｙおよび／またはＲ３は、好ましくはまた、互いに独立して、好ましくはシアノ、シアノアルキル、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキルにより、好ましくはｐ位において単置換されている、フェニル基の意味を有することができる。Ｙおよび／またはＲ３は、好ましくは、互いに独立して、フェニルオキシアルキル基、例えばフェノキシエチル、またはフェニルアルキル基を意味し、特に、Ｙおよび／またはＲ３は、特に好ましくは、互いに独立して、ベンジル、フェニルエチル、フェニルプロピルを意味する。アルキル基は、オキソ基を有することができる。
【００９４】
疎水性モノマーは、この場合において、特に好ましくは、式１、式中Ｒ１およびＲ２が互いに独立して水素または６個までのＣ原子を有するアルキル、好ましくは水素またはメチルの意味を有し、ここでＹは、水素の意味を有し、ここでＲ３は、アルキルの意味を有し、ここでＲ３は、少なくとも６個のＣ原子、好ましくは６〜１８個のＣ原子を有し、メチレン基は、Ｏ、アリール、アルキルアリール、アリールアルキルにより置き換えられていてもよく、ここで、アルキルおよび／またはアリール基は、アルコキシ、シアノ、カルボキシル、アセトキシまたはアセトアミノラジカルにより単置換または多置換、好ましくは単置換または二置換、特に単置換されていてもよい、で表されるアクリルアミドである。
【００９５】
したがって、Ｒ３は、好ましくはヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、２−、３−、４−、５−または６−オキサヘプチル、３−ブトキシプロピル、２−メチル−３−オキサヘキシルを示す。Ｒ３は、好ましくはまた、フェニル基の意味を有することができ、これは、好ましくはシアノ、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキルにより、好ましくはｐ位において単置換されている、フェニル基の意味を有することができる。Ｒ３は、好ましくはフェニルオキシアルキル基、例えばフェノキシエチル、またはフェニルアルキル基を意味し、特にＲ３は、特に好ましくはベンジル、フェニルエチル、フェニルプロピルを意味する。アルキル基は、２−フェニル−２−オキソエチルにおけるように、オキソ基を有することができる。モノマーアクリロイルグリシンアラニン、アクリロイルフェニルアラニン、ベンジルアクリルアミド、オクチルアクリルアミドを、本明細書中で例として示すことができる。
【００９６】
さらに、好ましくは親水性である中性のモノマーを、任意に１段階グラフト重合において加えることができる。このようにして、グラフトポリマーの電荷密度を上昇させずに、水性媒体中でのグラフトポリマーの膨潤挙動を改善することが、可能である。この目的のために適する中性のモノマーは、例えば低級アルキルアクリレート、例えばメチルアクリレート、低級アルキルメタクリレート、例えばメチルメタクリレートである。
【００９７】
好ましいのは、一般式１、式中Ｙ＝Ｒ６であり、ここでＲ１およびＲ２が互いに独立して水素またはメチルであり、またここで、Ｒ３およびＲ６が互いに独立して水素または４個までのＣ原子を有するアルキルを示す、で表されるアクリルアミドを用いることである。したがって、Ｒ３および／またはＲ６は、水素または低級アルキルを示す。後者は、好ましくは、本明細書中ではメチル、エチル、ブチル、イソプロピル、３−ブチルまたはイソブチルの意味を有し、さらに４個までのＣ原子を有するアルコキシアルキル、例えばメトキシエチルまたはエトキシエチルの意味を有する。アクリルアミド（ＡＡｍ）、ジメチルアクリルアミド、メタクリルアミド、イソプロピルアクリルアミド、メトキシエチルアクリルアミドおよびエトキシエチルアクリルアミドを、本明細書中で例として示すことができる。
【００９８】
実際のグラフト重合反応を、ヒドロキシル含有支持体上でセリウム（ＩＶ）により開始することができる。この反応を、通常希薄な鉱酸中で、例えば希硝酸中で行い、ここで疎水性モノマーは、難溶性であるかまたは不溶性である。反応をまた、希硫酸または塩酸中で行うことができる。しかし、これを、好ましくは希硝酸中で行う。可溶化剤または共溶媒、好ましくはジオキサンを加えることにより、疎水性モノマーを溶解し、グラフトするのが可能になる。用いることができる共溶媒はまた、アセトン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフランである。しかし、ジオキサンを特に好ましくは用いる。その理由は、これがセリウム（ＩＶ）により開始される反応において最も高いグラフト収率および最少の副産物を提供するからである。
【００９９】
本明細書中で、グラフト重合のための他の方法もまた用いることができることに、さらに注意しなければならない。好ましいのは、除去しなければならない副産物、例えば非共有的に結合したポリマーなどがわずかに生成するに過ぎない方法である。制御されたフリーラジカル重合を用いる方法、例えば原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）の方法は、特に興味深いと見られる。ここでの第１段階において、開始基を、所望の密度で支持表面に共有結合させる。開始基は、例えばエステル官能基を介して結合したハロゲン化物、例えば２−ブロモ−２−メチルプロピオン酸エステルであり得る。グラフト重合を、第２の段階において銅（Ｉ）塩の存在下で行う。
【０１００】
疎水性モノマーが完全に液相に溶解せず、これが、例えば反応溶液が曇ることまたは第２の液相の小滴から明白である場合には、グラフト化は、２種のモノマーの反応により発生するが、得られた生成物は、むしろより通常のイオン交換体のように挙動する。したがって、この場合における特性は、主に帯電したモノマー単位により決定される。これは、グラフトコポリマーを、グラフトポリマーにおける帯電した、および疎水性の官能が、溶液中で互いに協働することができるように調製しなければならないことを意味する。したがって、当該反応について、希酸および共溶媒を特定の反応に最も好ましい比率で使用することを、試行する。
【０１０１】
グラフト重合を行うために、酸を通常、１〜０．００００１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．１〜０．００１の範囲の濃度を有する水溶液中で、用いる。０．０５〜０．００５ｍｏｌ／ｌの範囲の濃度で用いる希硝酸を、極めて特に好ましく用いる。反応を行うために、希酸対好適な共溶媒の体積比を、３０：７０〜９８：２の範囲とすることができる。４０：６０〜９０：１０の体積比を、好ましくは用いる。用いる希酸および共溶媒が４５：５５〜７５：２５の範囲の体積比である場合に、特に良好な結合能が見出される。このことは、特に、スルホン酸基を含むモノマーを希硝酸中で用い、ジオキサンを共溶媒として用いる場合に該当する。
【０１０２】
対照的に、過度に多量の共溶媒を加える場合には、グラフトポリマーの収率は低下する。この結果、過度に少量のタンパク質が、得られる誘導体化された分離材料に結合し得る。支持材料上のグラフトポリマーの収率は、疎水性モノマーのさらなる溶液を共溶媒の存在下で、すでに開始した帯電したモノマーとのグラフト重合に加えることにより、増大させることができる。
【０１０３】
さらなる一連の実験により、好適な支持材料を以下の表中に述べるモノマーとグラフト重合させた場合に、グラフト重合により誘導体化され、本発明に従って改善された特性を有する分離材料が得られることが、示された。
【０１０４】
【表１】
0005420531.tif 000014
【０１０５】
好適な支持体、例えば商業的に入手できるToyopearl HW-65（Ｍ）（製造者：東ソー、日本国、またEP 0 006 199に記載されている）と同一であるFractogel TSK HW65（Ｍ）上の以下の支持体に結合したグラフトコポリマーを、２種または３種のモノマーの組み合わせにより、例により調製し、これらの特性、特にこれらの結合能に関して調査した：
【０１０６】
ベンジルアクリルアミドとのポリ（ＡＭＰＳ、ＡＡ、ＡｒＡＡｍ）
ベンジルアクリルアミドとのポリ（ＡＭＰＳ、ＡｒＡＡｍ）
ベンジルアクリルアミド、アクリロイルフェニルアラニンとのポリ（ＡＡ、ＡｒＡＡｍ）
ベンジルアクリルアミドとのポリ（ＡＭＰＳ、ＡｒＡＡｍ、ＡＡｍ）
ベンジルアクリルアミドとのポリ（ＡＡ、ＡｒＡＡｍ、ＡＡｍ）
カルボキシプロピルアクリルアミドおよびベンジルアクリルアミドとのポリ（ＣＡＡＡｍ、ＡｒＡＡｍ）
ブチルアクリルアミドとのポリ（ＡＭＰＳ、ＡｌｋｙｌＡＡｍ）
【０１０７】
低級アルキルアクリルアミド（ＡｌｋｙＡＡｍ）、例えばブチルアクリルア
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ミドを、スルホン酸基を含むモノマー、例えばＡＭＰＳと共重合させることができるが、誘導体化された支持材料は、既知の分離材料、例えば純粋なＡＭＰＳから製造されたグラフトポリマーのものの領域において免疫グロブリン（ＩｇＧ）に対する結合能のみを示すことが、見出された。
【０１０８】
この点について、より高級のアルキル基、例えばオクチル基が、タンパク質の結合に対する明確な貢献をなすことが、見出された。しかし、驚くことに、調査の過程で、芳香族モノマー（例えばＡｒＡＡｍ）を反応混合物と、塩耐容性のイオン交換体を調製している間に混合することが特に有利であることが、明らかになった。これらのモノマーにより、疎水性基がイオン性表面修飾中に保持されるのが可能になる。加える芳香族モノマーの量に応じて、得られた材料の疎水性特性は増大し、したがって結合能は、当該結合能がグラフトポリマー中の疎水性基のモル分率に応じてこれ自体影響され得るように影響される。また、互いに対するモノマーの比率を、選択されたモノマーの組み合わせに応じて、および重合条件に応じて異なって選択して、高い結合能を達成しなければならないことが、見出された。
【０１０９】
ポリ（アクリルアミド）グラフトポリマーが帯電した基としてスルホン酸基のみを含む場合には、特に有利な特性は、帯電した基の比率がグラフトポリマーの合計量に対して３５〜７０ｍｏｌ％である場合に見出される。１００ｍｏｌ％の帯電した基を含む分離材料は、疎水性基を含まない純粋なカチオン交換体に相当する。
【０１１０】
グラフトポリマーが、例えばアクリル酸とのコポリマー中で、他の帯電した基に加えてカルボキシル基を含むか、またはこのタイプの帯電した基のみが存在する場合には、異なる状況が発生する。このような場合において、帯電した基の比率がグラフトポリマーの合計量を基準として６０〜９８ｍｏｌ％である場合に、改善された結合能が見出される。帯電した基の比率が７０〜９５ｍｏｌ％の範囲にある材料について、特に有利な特性が見出された。
【０１１１】
有利な特性を有するグラフトポリマーを得るために、帯電したモノマーと疎水性モノマーとを、疎水性成分の比率がモノマーの合計量に対して１〜９０ｍｏｌ％であるような互いに対する比率において混合し、好ましいのは、モノマーの合計量を基準として３〜７０ｍｏｌ％の範囲の比率である。ＡＭＰＳの使用に際して、疎水性成分の比率を、特に、これがモノマーの合計量を基準として２０〜６０ｍｏｌ％の範囲でにあるように選択する。ＡＡの使用に際して、疎水性成分の比率が５〜５０ｍｏｌ％の範囲である場合に、グラフトポリマーの特に良好な特性が達成される。本発明の分離材料を調製するために、モノマーを通常、支持材料に過剰に加える。沈降したポリマー材料１リットル当たり０．０５〜１００ｍｏｌの合計モノマーを用い、好ましくは０．１５〜２５ｍｏｌ／ｌを用いる。
【０１１２】
沈降した支持材料は、懸濁液からの沈降により得られ、これを上清溶媒から遊離させた、湿潤した支持材料を意味するものと解釈される。対応する支持材料を、通常湿潤状態において保存する。本発明による使用のために、上清溶媒を、予め吸引により除去する。その後、誘導体化を行うために、測定した容積または秤量した量（フィルター湿潤ゲル）を、好適な容積または好適な量のモノマー溶液中に懸濁させ、グラフト重合させる。支持材料は、ヒドロキシル含有無機、有機または複合支持材料であり得る。したがって、これはまた、有機ポリマー材料であり得る。
【０１１３】
第２の調製の変形態様が、２段階方法と同様に、追加の反応段階の欠点を有するが、グラフト重合は、加える共溶媒の有効性によっては限定されない。最初のグラフト重合段階において、液体反応媒体に容易に可溶である親水性モノマーのみをグラフトさせるのが、好ましい。ここでは、少なくとも１種のモノマーが、カルボキシル基を含む。次に、グラフトポリマーを、第２の段階においてポリマー類似反応により疎水的に修飾することができる。この段階を、例えば、ベンジルアミンを水溶性カルボジイミドとカップリングさせてポリ（アクリル酸）グラフトポリマーとし、グラフトしたポリ（ベンジルアクリルアミド）を得ることにより、行うことができる。
【０１１４】
２段階プロセスのために用いることができるモノマーは、１段階グラフト重合についてすでに述べたモノマーである。カルボキシル基を含むモノマーを、単独で、または疎水性、中性のモノマーとの、および／またはスルホン酸基を含むモノマーとの混合物として、グラフト重合において用いることができる。好ましいのは、中性のモノマーとの、および／またはスルホン酸基を含むモノマーとの混合物を用いることである。特に好ましいのは、カルボキシル基を含む水溶性モノマーまたは、カルボキシル基を含む水溶性モノマーとさらなる水溶性モノマーとの混合物である。したがって、以下の一般式（１）
【化１３】
0005420531.tif 000016
【０１１５】
式中、Ｒ１、Ｒ２およびＹは、互いに独立してＨまたはＣＨ３を示し、Ｒ３は、Ｒ４−ＣＯＯＭの意味を有し、ここでＲ４は、２〜４個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、Ｍは、Ｈ、Ｎａ、ＫまたはＮＨ４を示す、
あるいは一般式（２）
【化１４】
0005420531.tif 000017
【０１１６】
式中、Ｒ７およびＲ８は、互いに独立してＨまたはＣＨ３を示し、ＺはＭまたはＲ４−ＣＯＯＭのいずれかを示し、ここでＲ４は、２〜４個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、Ｒ７はまた、ＺがＭでありＲ８がＨである場合にはＣＯＯＭを示すことができ、ＭはＨ、Ｎａ、ＫまたはＮＨ４を示す、
で表される、カルボキシル基を含む水溶性モノマーが、特に好ましい。
【０１１７】
さらなる水溶性モノマーは、カルボキシル基を含み、ここで基Ｒ４−ＣＯＯＭがＲ４−ＳＯ３Ｍにより置き換えられている水溶性モノマー、または１段階グラフト重合についてすでに述べた中性のモノマーの対応するスルホン酸類とすることができる。カルボキシル基を含む水溶性モノマーの例は、アクリル酸、カルボキシエチルアクリルアミド、カルボキシエチルアクリレート、カルボキシエチルメタクリルアミド、カルボキシメチルアクリルアミド、カルボキシメチルアクリレート、カルボキシメチルメタクリルアミド、カルボキシプロピルアクリルアミドおよびカルボキシプロピルメタクリルアミド、メタクリル酸およびマレイン酸である。さらなる水溶性モノマーの例は、アクリルアミド、２−アクリルアミドエタンスルホン酸、ＡＭＰＳ、イソプロピルアクリルアミド、メチルアクリレート、メチルメタクリレート、２−スルホエチルアクリレート、２−スルホエチルメタクリレート、３−スルホプロピルアクリレート、３−スルホプロピルメタクリレートである。
【０１１８】
ベンジルアミンの例えばポリ（アクリロイル−ガンマ−アミノ酪酸）グラフトポリマーへのカップリング反応において、ベンジルアミンを、支持体に結合したカルボキシル基に対して約４０００ｍｏｌ％の過剰で用いる場合には、事実上すべてのカルボキシル基を反応させることが、可能である。支持体に結合したカルボキシル基に対して３００ｍｏｌ％の過剰の結合試薬ＥＤＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩）で、存在するカルボキシル基の約９０％のアミド基への変換が、達成される。しかし、本発明における反応の目的は、カルボキシル基のいくらかのみを反応させて、十分なイオン交換基が依然としてグラフトポリマー中に存在するようにすることである。上記の例において、６０ｍｏｌ％のみのＥＤＣを用いる場合には、約３０％のみのカルボキシル基が反応し、塩の存在下での生成物の結合能は、上記の場合におけるよりも２倍高い。
【０１１９】
過剰のカップリングするべきモノマーを、反応したカルボキシル基の所望の比率がどれだけ高く意図されるかに応じて選択する。したがって、過剰のカップリングするべきモノマーを、支持体に結合したカルボキシル基に対して１００〜１０，０００ｍｏｌ％の範囲とすることができ、一方カップリング試薬を、支持体に結合したカルボキシル基に対して６０〜２０００ｍｏｌ％の範囲で、過剰に用いる。カップリングするべきモノマーの、およびまたカップリング試薬の両方の比率を、当然十分なカルボキシル基が反応することができ、かつ第２の反応段階を行った後に有利な、または改善された特性を有し、目的の分子、例えば帯電したバイオポリマーを液体、例えば細胞培養上清から除去するのに適する分離材料を調製することが可能であるるように、選択する。
【０１２０】
例えばポリ（アクリル酸）の高い表面密度において、存在するカルボキシル基の約３０％は、過剰のアミン、および支持体に結合したカルボキシル基に対するＥＤＣの欠乏の場合において、選択された条件下で反応した。しかし、大過剰のカップリング試薬によっても、カルボキシル基のより高い割合が反応するのが可能になる。しかし、産業的規模での反応の場合におけるこの手順の欠点は、２段階調製の費用が顕著に増大することである。したがって、経済的理由により、この手順は真実の代替法ではない。
【０１２１】
顕著により好ましいのは、カルボキシルまたはスルホン酸基を含むモノマーの混合物からグラフトコポリマーを調製することである。前駆体としてのＡＭＰＳとＡＡとの混合物を、本明細書中で例により述べることができる。その理由は、スルホン酸基のために、カルボキシル基の任意に完全な変換の場合においてさえも、イオン交換基が依然としてグラフトポリマー中に存在するからである。特に、すでに上記で記載したように、低いグラフトポリマー密度において、支持体に結合したカルボキシル基に対して少なくとも３００ｍｏｌ％の過剰のカップリング試薬ＥＤＣにより、完全な変換を達成することができる。
【０１２２】
しかし、カルボキシル基は、ここでは、一般的に高いグラフトポリマー密度において常に完全に反応することができるわけではない。したがって、約３０ｍｏｌ％のＡＭＰＳ単位と７０ｍｏｌ％のアクリル酸単位とからなるグラフトポリマーへのベンジルアミンのカップリングにより、約２０ｍｏｌ％のベンジルアクリルアミド単位に加えて、５０ｍｏｌ％のアクリル酸単位を依然として含むグラフトポリマーが得られることが、見出された。したがって、これは、３種のモノマー単位からなるが、最初の合成計画では、１００〜１５０ｍｏｌ％のＥＤＣを用いることにより完全な変換が予想され、２種の単位のみが存在するはずであった。
【０１２３】
ＡＭＰＳとＡＡとからなるグラフトポリマーに対するポリマー類似反応について、例えば、沈降したポリマー材料１リットルあたり３ｍｏｌのベンジルアミンを用いる。０．２ｍｏｌ／ｌのＥＤＣをカップリング試薬として加え、これは、支持体に結合したカルボキシル基に対してほぼ１００ｍｏｌ％に相当する。
【０１２４】
疎水性修飾のためのカルボキシル基を含む好適なグラフトポリマーを得るために、少なくとも１種のカルボキシル基を含むモノマーを、一般的に水に溶解し、場合によっては存在する他のモノマーと混合して、カルボキシル基を含む成分の比率がモノマーの合計量に対して１〜１００ｍｏｌ％、好ましくは１０〜１００ｍｏｌ％であるようにする。モノマーを、通常支持材料に過剰に加える。沈降するポリマー材料１リットル当たり０．０５〜１００ｍｏｌの全モノマーを用い、好ましいのは、０．１５〜２５ｍｏｌ／ｌを用いることである。
【０１２５】
理想的には同様に酸素から遊離させた、セリウム（ＩＶ）塩を鉱酸に溶解した溶液、好ましくは硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）を硝酸に溶解した溶液を、水性懸濁液に加え、５〜９５℃、好ましくは２０〜７０℃の温度にて撹拌しながら酸素から遊離させ、その後、この温度にて０．５〜７２時間、好ましくは２〜２０時間継続して撹拌する。セリウム（ＩＶ）塩溶液を加えた後に生じる水溶液の濃度を、ｐＨが０〜５、好ましくは１〜３であるように選択する。セリウム（ＩＶ）濃度を、これが反応溶液中で０．００００１〜０．５ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．００１〜０．１ｍｏｌ／ｌであるように設定する。
【０１２６】
表２は、ＡＭＰＳとＡＡとの支持体に結合したグラフトコポリマー（Fractogel（登録商標）TSK HW65 M上）にカップリングした第一アミンの例を示す。また、複数のアミンを支持材料にカップリングさせるか、またはアミンの混合物をカップリング反応のために用いることも可能である。対応する例をまた、表３に示す。また、１段階グラフト重合の場合において疎水性モノマー単位としてすでに述べた、アクリルアミドを生じるすべてのアミンを、用いることができる。例えばグラフトポリマーの、ＥＤＣを用いて調製したヒドロキシスクシンイミドエステル類を介しての代替のカップリング方法を、アミン単位のカルボキシル基へのカップリングの場合において選択しなければならないことは、当業者に知られている。
【０１２７】
また、いくつかの場合においては１段階合成によってすでに調製されていてもよい、芳香族基を含むグラフトコポリマーの場合におけるように、グラフトポリマーの中のアルキル基、例えばオクチル基と共にスルホン酸およびカルボキシル基がまた、非疎水的に修飾されたカチオン交換体と比較して結合特性の改善をもたらすことが、見出された。
【０１２８】
このように、異なる疎水性成分、しかし同一のグラフト密度を有するグラフトポリマーを、２段階合成により単純な様式で、例えばポリ（アクリル酸）前駆体から開始して調製することができる。表３において、６〜８行に示す例の結果は、グラフトポリマー中に種々の比率（単位ｍｏｌ％）のベンジル基を有するこのような一連のものを示す。また、実験により、グラフトポリマー中約２５ｍｏｌ％のベンジル基において、結合最適条件があることが示された。ポリクローナルＩｇＧの回収が高くなるに伴って、ベンジル基はグラフトポリマー中により少量で存在する。モノクローナル抗体を用いた実験により、約２５ｍｏｌ％のベンジル基がグラフトポリマー中にある場合において、回収はまた約１００％であることが示された。モノクローナルタンパク質の場合における溶出を、より容易に最適化することができる。その理由は、ポリクローナルタンパク質とは対照的に、極めて類似した種を溶解して除去しなければならないからである。
【０１２９】
分離材料を評価するために、７５ｍＭおよび１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液中のポリクローナルヒトＩｇＧ（Gammanorm）の静的結合能を、一般的にｐＨ５〜７の範囲において調査する。１５０ｍＭの塩濃度の伝導値は、細胞培養上清のものに相当する（しばしば１０〜１５ｍＳ／ｃｍ）。結合能を、塩濃度を約１ＭのＮａＣｌに増加することによりＩｇＧを溶出させた後に、決定する。
【０１３０】
動的結合能を、同様に１５０ｍＭの塩化ナトリウムの存在下で決定する。このために、ＩｇＧ溶液での充填を、１０％破過まで行う。溶出を、結合緩衝液のｐＨにて塩濃度を約１ＭのＮａＣｌに増大させることにより行う。ＩｇＧの回収の改善を、塩濃度およびｐＨを同時に上昇させることにより達成することができる。
【０１３１】
表３の例は、グラフトコポリマーを有する分離材料が、グラフトポリマー中に疎水性部分を有しない比較のゲルよりも顕著に高い動的結合能を達成することを示す。高い結合能が、ｐＨ５．５にてグラフトコポリマーにより達成される。このｐＨにて、グラフトコポリマーは負に帯電する。対照的に、ＩｇＧは、負の電荷よりも正の電荷を多大に有する（ｐＨ＜ｐＩ）。結合は、このように主にイオン相互作用により生成する。ポリクローナルＩｇＧの正電荷がｐＨ６．５に再緩衝する(re-buffer)ことにより低減され、このｐＩに接近する場合には、１０％の破過値が、極めて少量のＩｇＧですでに達成される。この結合挙動は、これらの合成がグラフト重合段階により、または好適な親水性グラフトポリマーの疎水性の修飾によってのみ直接行われるか否かとは無関係に、すべてのグラフトコポリマーにより示される。
【０１３２】
要するに、細胞培養上清中に通常存在する伝導値において、イオン交換クロマトグラフィーに特に適する分離材料は、スルホン酸もしくはカルボン酸の形態で負電荷を有し、さらにエステルまたはアミド基および合計で最大８個のＣ原子のアルキルおよび／またはアルキレン基を含むが、アリール基を含まない、またはスルホン酸もしくはカルボン酸の形態で負電荷を有し、さらにアルキルおよび／またはアルキレン基を含むが、アリール基を含まないモノマー単位から少なくともなり、かつ、エステル基および、疎水性基として４〜１８個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキルまたはアリール基を有する、および少なくとも１個のアミド基および、疎水性基として合計６〜１８個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキルまたはアリール基を含む少なくとも１種のモノマー単位を含むグラフトコポリマーを含むことを、述べることができる。負電荷を有するモノマー単位対疎水性基を含むモノマー単位の比率は、好ましくは９９：１〜１０：９０の範囲にある。
【０１３３】
グラフトポリマーの疎水性部分により、結合がより高い塩濃度にて起こるのが可能になる。その理由は、純粋なカチオン交換体中の電荷が存在する塩イオンにより遮蔽され、したがってイオン性相互作用がタンパク質を分離材料に結合させるには過度に弱いからである。タンパク質との追加の疎水性−疎水性相互作用により、十分強力な結合が可能になる。
【０１３４】
この疎水性相互作用は、おそらくまた、グラフトポリマー鎖内またはこの間で発生し、これらの鎖の可逆的結合をもたらす(C. Tribet, Biochimie, 1998, 80, 461-473)。特徴づけのために、多孔質支持体上での２段階合成において調製された疎水的に修飾されたグラフトコポリマーおよび、Fractogel（登録商標）ＴＳＫ  ＨＷ６５  Ｍに結合したこのポリ（ＡＭＰＳ、ＡＡ）前駆体を、したがって、逆サイズ排除クロマトグラフィー（図２）により分析した。２種のゲルが同一のグラフト密度を有するが、疎水性グラフトコポリマーの孔系が、特に１Ｍの塩化ナトリウムの存在下で、非結合条件下でよりアクセス可能であることが、見出された。したがって、より疎水性のグラフトポリマーが、高い塩の条件下で多孔質支持体の表面上により密に存在する。それにもかかわらず、より疎水性のグラフトポリマーを有する孔系はまた、塩化ナトリウム濃度を低下させることで、より小さい分配係数ＫＤを示す。したがって、この表面構造は、１Ｍより低い塩化ナトリウム濃度にて大幅に膨潤し、水性緩衝液中で溶解する成分に極めて容易にアクセス可能である。
【０１３５】
本発明の材料を、帯電したバイオポリマーを分離するために用いることができる。これらを、好ましくは、抗体部分を含む抗体断片または融合タンパク質からタンパク質、特にポリクローナルまたはモノクローナルであってもよい抗体を分離するために用いる。しかし、他のバイオポリマー、例えばポリペプチド、核酸、ウイルス、真核細胞または原核細胞もまた、分離することができる。当該分離により、バイオポリマーが精製、単離または除去されるのが可能になる。
【０１３６】
目的分子を、試料からの少なくとも１種または２種以上の他の物質から分離し、ここで目的分子を含む試料を液体に溶解し、これを本発明の材料と接触させる。接触時間は、通常３０秒〜２４時間の範囲である。本発明の分離材料を含むクロマトグラフィーカラムに液体を通じることにより液体クロマトグラフィーの原理に従って行うことが有利である。
【０１３７】
液体は、単にこの重力によりカラム中を通過するか、またはポンプによりポンプ輸送され得る。代替法はバッチクロマトグラフィーであり、ここで、目的分子またはバイオポリマーが分離材料と結合することができる必要がある限りは、分離材料を、撹拌するかまたは振盪することにより液体と混合する。同様に、クロマトグラフィー流動床の原理に従って、例えば分離材料（ここで分離材料は、その高い密度および／または磁心のために所望の分離に適するように選択される）を含む懸濁液中に、分離すべき液体を導入することにより行うことが可能である。
【０１３８】
目的分子は、通常本発明の材料に結合する。その後、分離材料を、洗浄緩衝液で洗浄することができ、これは、好ましくは、目的分子を分離材料と接触させる液体と同一のイオン強度および同一のｐＨを有する。洗浄緩衝液は、分離材料に結合しないすべての物質を除去する。好適な緩衝液でのさらなる洗浄段階を、続けてもよい。結合した目的分子の脱着を、溶離液中のイオン強度を増加させることにより行う。溶離液中のｐＨを変化させることにより、好ましくはｐＨを上昇させることにより、吸着緩衝液のものとは異なる極性を有する溶離液を用いることにより、または所望により溶離液に溶解した界面活性剤を用いることにより、溶出は、好ましくはイオン強度の増加と組み合わせて同様に可能である。したがって、目的分子を、溶離液中に精製され、濃縮された形態で得ることができる。目的分子は、脱着後に通常７０％〜９９％、好ましくは８５％〜９９％、特に好ましくは９０％〜９９％の純度を有する。
【０１３９】
しかし、また目的分子が液体中に残留し、他の共存物質が分離材料に結合することも可能である。その後、目的分子を、スルーフロー(through-flow)でカラム溶出液を採集することにより、直接得る。特定のバイオポリマーを分離材料に結合させるために、条件、特にｐＨおよび／または伝導率をどのように適合させるか、または精製作業が目的分子を結合させないのが有利か否かは、当業者に知られている。
【０１４０】
バイオポリマーは主に、しかし排他的にではなく、液体源から発生するか、またはこの中、例えば体液、例えば血液、血清、唾液または尿、器官エキス、ミルク、乳清、植物エキス、細胞エキス、細胞培養物、発酵ブロス、動物性エキス中に存在する。抗体は、例えば齧歯動物からの哺乳類細胞またはハイブリドーマ細胞から発生していてもよい。
【０１４１】
本発明の分離材料を、バイオポリマーのための精製操作(work-up)プロセスの最初のクロマトグラフィー精製段階（捕獲段階）において用いることができる。固体含有粗溶液、例えば細胞懸濁液または細胞ホモジネートを、先ず捕獲段階の前に濾過して、粗い不純物、例えば細胞全体または細胞片を除去するのが、通常有利である。本発明の利点は、上記のように、細胞培養上清のイオン強度を適合させる必要がないことにある。バイオポリマーの所望の純度が未だ達成されていない場合には、通常、捕獲段階に、種々の残留不純物を除去することができる他の分離材料を用いたさらなるクロマトグラフィー精製段階を続ける。分離材料を用いる一連のものがプロセスの全体的な性能に影響を及ぼし得るため、特定の場合においては、第２の、第３の、または第４の精製段階まで本発明の分離材料を用いないのが、有利であり得る。
【０１４２】
本発明は同様に、液体中の１種または２種以上の他の物質からバイオポリマーを精製または分離するためのキットに関する。キットは、本発明の分離材料を充填したクロマトグラフィーカラム、１種または２種以上の緩衝液および書面での指示を有する添付文書からなる。液体を、緩衝液を用いて例えば５．５のｐＨに調整し、クロマトグラフィーカラムと接触させる。カラムを先ず、洗浄緩衝液で洗浄し、非結合性成分の１つの画分を得、次にバイオポリマーを、より高いイオン強度の溶離緩衝液を用いて、例えば１ＭのＮａＣｌ溶液を用いて脱着し、第２の画分中に得る。
【０１４３】
本記載により、当業者は、本発明を包括的に適用することが可能になる。したがって、さらなるコメントがなくても、当業者は上記の記載を最も広い範囲で利用することができると、推測される。
不明な点がある場合には、引用した刊行物および特許文献を参照しなければならないことは、言うまでもない。したがって、これらの文献は、本記載の開示内容の一部と見なされる。
【０１４４】
より良好に理解するために、また本発明を例示するために、本発明の保護の範囲にある例を、以下に示す。これらの例はまた、可能な変形態様を例示する作用を奏する。しかし、記載した本発明の原理の一般的な有効性のために、例は、本出願の保護の範囲をこれらのみに減少させるには適さない。
【０１４５】
さらに、示された百分率範囲からより高い値が生じ得る場合であっても、示す例において、およびまた記載の残部において、組成物中に存在する成分の量は、常に、全体の組成物を基準として、加えて１００重量％または１００ｍｏｌ％となるに過ぎず、これを超えることができないことは、当業者には言うまでもない。他に示さない限り、比率を除いて、％データは重量％またはｍｏｌ％であり、これを、容積データにおいて示し、例えば溶離液は、これを調製するために、特定の容積比の溶媒を、混合物中で用いる。
例および記載ならびに特許請求の範囲中に示す温度は、常に℃である。
【０１４６】
例
例１：
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびベンジルアクリルアミドからグラフトコポリマーを調製するための手順（バッチ０５ＳＷ１３６）
手順：
７０ｇのフィルター湿潤Fractogel TSK HW65（M）（希薄な鉱酸および脱イオン水で洗浄した）、３２．３ｇのベンジルアクリルアミドを２５０ｍｌのジオキサンに溶解した溶液および４１．５ｇの２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸の溶液および２５ｇの３２％水酸化ナトリウム溶液を５０ｍｌの脱イオン水に溶解した溶液の懸濁液を、パドル攪拌機を有するガラス反応装置中で調製する。懸濁液を、脱イオン水で４７５ｍｌとし、３２％水酸化ナトリウム溶液または６５％硝酸を用いてｐＨ４に調整する。
【０１４７】
１３．７ｇの硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）および１．２ｇの６５％硝酸を２５ｍｌの脱イオン水中に含む開始溶液を、最初に圧力を平衡にした滴下漏斗中に導入する。装置全体を、繰り返し（３回）排気および窒素での減圧により不活性にする。その後、装置中の懸濁液を、７０℃に加温する。
【０１４８】
開始溶液を、７０℃の内部温度にて撹拌しながら不活性化した懸濁液に加える。懸濁液を、窒素の穏やかな流れの下で７０℃にて１７時間撹拌する。次に、反応溶液を、吸引によりガラスフィルターフリット（Ｐ２）を通して濾過し、フリット上のゲルを、各々の場合において１００ｍｌの洗浄溶液で以下のように洗浄する：
８×０．５Ｍ硫酸、０．２Ｍアスコルビン酸
３×脱イオン水
２×１Ｍ水酸化ナトリウム溶液
４×脱イオン水
５×アセトン
５×水
【０１４９】
ゲルを、２００ｍｌの脱イオン水に懸濁させ、２５％塩酸を用いてｐＨ７に調整する。ゲルを、２０％のエタノール中で室温にて保存する。
【０１５０】
例２：
アクリル酸およびベンジルアクリルアミドからグラフトコポリマーを調製するための手順（バッチ０６ＳＷ２９７）
手順：
７７．９ｇのフィルター湿潤Fractogel TSK HW65（M）（希薄な鉱酸および脱イオン水で洗浄した）、１．３４ｇのベンジルアクリルアミドを１４．５ｍｌのジオキサンに溶解した溶液および１８．０ｇのアクリル酸を５０ｍｌの脱イオン水に溶解した溶液の懸濁液を、パドル攪拌機を有するガラス反応装置中で調製する。懸濁液を、３２％水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ４に調整し、脱イオン水で３７５ｍｌとする。
【０１５１】
さらに６．７２ｇのベンジルアクリルアミドを、圧力を平衡にした滴下漏斗中で７３ｍｌのジオキサンに溶解し、脱イオン水で１００ｍｌとする。
９．６ｇの硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）および１．２ｇの６５％硝酸を２５ｍｌの脱イオン水中に含む開始溶液を、最初に、圧力を平衡にした第２の滴下漏斗中に導入する。装置全体を、繰り返し（３回）排気および窒素での減圧により不活性にする。その後、装置中の懸濁液を、５５℃に加温する。
【０１５２】
開始溶液を、５５℃の内部温度にて撹拌しながら不活性化した懸濁液に加える。懸濁液を、窒素の穏やかな流れの下で５５℃にて撹拌し、２０ｍｌのベンジルアクリルアミド／ジオキサン溶液を、３０分おきに加える。全体で、開始溶液を加えた後に、反応懸濁液を、５５℃にてさらに１７時間撹拌する。次に、反応溶液を、吸引によりガラスフィルターフリット（Ｐ２）を通して濾過し、フリット上のゲルを、各々の場合において１００ｍｌの洗浄溶液で以下のように洗浄する：
２×０．５Ｍ硫酸／０．２Ｍアスコルビン酸−アセトン１：１（Ｖ／Ｖ）
８×０．５Ｍ硫酸、０．２Ｍアスコルビン酸
３×脱イオン水
２×１Ｍ水酸化ナトリウム溶液
【０１５３】
ゲルを、２００ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウム溶液に懸濁させ、２０時間振盪し、フリット上で吸引により濾過した後に、ゲルを、各々の場合において１００ｍｌの洗浄溶液で以下のようにさらに洗浄する：
２×１Ｍ水酸化ナトリウム溶液
５×脱イオン水
ゲルを、２００ｍｌの脱イオン水に懸濁させ、２５％塩酸を用いてｐＨ７に調整する。ゲルを、２０％エタノール中で室温にて保存する。
【０１５４】
例３：
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、アクリル酸およびベンジルアクリルアミドからグラフトコポリマーを調製するための手順（バッチ０６ＳＷ０８５）
手順：
６９ｇのフィルター湿潤Fractogel TSK HW65（M）（希薄な鉱酸および脱イオン水で洗浄した）、３２．２ｇのベンジルアクリルアミドを２５０ｍｌのジオキサンに溶解した溶液、２５．９ｇの２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ならびに１５．６ｇの３２％水酸化ナトリウム溶液を５０ｍｌの脱イオン水に溶解した溶液および９．０ｇのアクリル酸の懸濁液を、パドル攪拌機を有するガラス反応装置中で調製する。懸濁液を、脱イオン水で４７５ｍｌとし、３２％水酸化ナトリウム溶液または６５％硝酸を用いてｐＨ４に調整する。
【０１５５】
１３．７ｇの硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）および１．２ｇの６５％硝酸を２５ｍｌの脱イオン水中に含む開始溶液を、最初に、圧力を平衡にした滴下漏斗中に導入する。装置全体を、繰り返し（３回）排気および窒素での減圧により不活性にする。その後、装置中の懸濁液を、５５℃に加温する。
【０１５６】
開始溶液を、５５℃の内部温度にて撹拌しながら不活性化した懸濁液に加える。懸濁液を、窒素の穏やかな流れの下で５５℃にて１７時間撹拌する。次に、反応溶液を、吸引によりガラスフィルターフリット（Ｐ２）を通して濾過し、フリット上のゲルを、各々の場合において１００ｍｌの洗浄溶液で以下のように洗浄する：
８×０．５Ｍ硫酸、０．２Ｍアスコルビン酸
３×脱イオン水
２×１Ｍ水酸化ナトリウム溶液
【０１５７】
ゲルを、２００ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウム溶液に懸濁させ、２０時間振盪し、フリット上で吸引により濾過した後に、ゲルを、各々の場合において１００ｍｌの洗浄溶液で以下のようにさらに洗浄する：
２×１Ｍ水酸化ナトリウム溶液
４×脱イオン水
５×０．５Ｍ硫酸、０．２Ｍアスコルビン酸
５×脱イオン水
ゲルを、２００ｍｌの脱イオン水に懸濁させ、２５％塩酸を用いてｐＨ  ７に調整する。ゲルを、２０％エタノール中で室温にて保存する。
【０１５８】
例４：
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸からグラフトコポリマーを調製するための手順（バッチ０５ＰＰ１３１）
手順：
１４０ｇのフィルター湿潤Fractogel TSK HW65（M）（希薄な鉱酸および脱イオン水で洗浄した）および３３．６ｇの３２％水酸化ナトリウム溶液を１２０ｍｌの脱イオン水に溶解した溶液、４６．６ｇの２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（氷冷しながら添加）および１６．２ｇのアクリル酸の懸濁液を、パドル攪拌機を有するガラス反応装置中で調製する。懸濁液を、脱イオン水で４００ｍｌとし、６５％硝酸を用いてｐＨ３に調整する。
【０１５９】
２．８ｇの硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）および０．７ｇの６５％硝酸を５０ｍｌの脱イオン水中に含む開始溶液を、最初に、圧力を平衡にした滴下漏斗中に導入する。装置全体を、繰り返し（３回）排気および窒素での減圧により不活性にする。その後、装置中の懸濁液を、４２℃に加温する。
【０１６０】
開始溶液を、４２℃の内部温度にて撹拌しながら不活性化した懸濁液に加える。懸濁液を、窒素の穏やかな流れの下で４２℃にて５時間、その後室温にてさらに１７時間撹拌する。次に、反応溶液を、吸引によりガラスフィルターフリット（Ｐ２）を通して濾過し、フリット上のゲルを、各々の場合において２００ｍｌの洗浄溶液で以下のように洗浄する：
７×脱イオン水
８×１Ｍ硫酸、０．２Ｍアスコルビン酸
５×脱イオン水
３×１Ｍ水酸化ナトリウム溶液
３×脱イオン水
１×５０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０
２×脱イオン水
２×２０％エタノール／１５０ｍＭ塩化ナトリウム
ゲルを、２０％エタノール／１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中で室温にて保存する。
【０１６１】
例５：
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸からグラフトコポリマーを調製するための手順（バッチ０６ＰＰ０６６）
手順：
２１０ｇのフィルター湿潤Fractogel TSK HW65（M）（希薄な鉱酸および脱イオン水で洗浄した）および５６．１ｇの３２％水酸化ナトリウム溶液を１５０ｍｌの脱イオン水に溶解した溶液、７７．７ｇの２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（氷冷しながら添加）および２７．０ｇのアクリル酸の懸濁液を、パドル攪拌機を有するガラス反応装置中で調製する。懸濁液を、脱イオン水で６６０ｍｌとし、６５％硝酸を用いてｐＨ３に調整する。
【０１６２】
２０．７ｇの硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）および７．２ｇの６５％硝酸を９０ｍｌの脱イオン水中に含む開始溶液を、最初に、圧力を平衡にした滴下漏斗中に導入する。装置全体を、繰り返し（３回）排気および窒素での減圧により不活性にする。その後、装置中の懸濁液を、５５℃に加温する。
【０１６３】
開始溶液を、５５℃の内部温度にて撹拌しながら不活性化した懸濁液に加える。懸濁液を、窒素の穏やかな流れの下で５５℃にて３時間撹拌する。次に、反応溶液を、吸引によりガラスフィルターフリット（Ｐ２）を通して濾過し、フリット上のゲルを、各々の場合において３００ｍｌの洗浄溶液で以下のように洗浄する：
７×脱イオン水
８×０．５Ｍ硫酸、０．２Ｍアスコルビン酸
５×脱イオン水
２×１Ｍ水酸化ナトリウム溶液
【０１６４】
ゲルを、６００ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウム溶液に懸濁させ、２０時間振盪し、フリット上で吸引により濾過した後に、ゲルを、各々の場合において１００ｍｌの洗浄溶液で以下のようにさらに洗浄する：
２×１Ｍ水酸化ナトリウム溶液
３×脱イオン水
１×５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０
２×脱イオン水
２×２０％エタノール／１５０ｍＭ塩化ナトリウム
ゲルを、２０％エタノール／１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中で室温にて保存する。
【０１６５】
例６：
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸からグラフトコポリマーを調製するための手順（バッチ０６ＰＰ１８９）
手順。２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸からのグラフトコポリマー（バッチ０６ＰＰ０６６）の調製についての手順を参照。２×０．５Ｍ硫酸、０．２Ｍアスコルビン酸を用いたさらなる洗浄段階のみを、加えた。
【０１６６】
例７：
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸を含むグラフトコポリマーにベンジルアミンをカップリングさせるための手順（バッチ０６ＰＰ２６２）
手順：
Fractogel上の２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸を含む４０ｍｌの沈降したグラフトコポリマー（バッチ０６ＰＰ１８９）を、各々の回４０ｍｌの水で８回洗浄し、ガラスフィルターフリット上で吸引により濾過する。
【０１６７】
フィルター湿潤ゲルを、１２．８ｇのベンジルアミンを３２ｍｌの脱イオン水に溶解した溶液中に懸濁させ、パドル攪拌機を有するガラス装置中で３２％塩酸を用いてｐＨ４．７に調整する。ｐＨをチェックし、必要に応じて調整した後に、０．８ｇのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を加える。
懸濁液を攪拌し、この間ｐＨを、６％水酸化ナトリウム溶液を加えることによりｐＨ４．７に保持する。３時間後、さらに０．８ｇのＥＤＣを加える。ｐＨを、６％水酸化ナトリウム溶液を加えることによりｐＨ４．７にさらに保持し、最低１時間モニタリングする。
【０１６８】
反応溶液を１７時間攪拌した際に、これを、ガラスフィルターフリット（Ｐ２）を通して吸引しながら濾過し、フリット上のゲルを、各々の場合において４０ｍｌの洗浄溶液で以下のように洗浄する：
１０×脱イオン水
３×１Ｍ塩化ナトリウム溶液
５×５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０
２×２０％エタノール／１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液
ゲルを、２０％エタノール／１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中で室温にて保存する。
【０１６９】
例８：
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸を含むグラフトコポリマーにベンジルアミンをカップリングするための手順（バッチ０６ＰＰ３４５）
手順。２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸を含むグラフトコポリマーにベンジルアミンをカップリングさせるための手順（バッチ０６ＰＰ２６２）を参照。０．６ｇのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を、各々の場合において加える。
【０１７０】
例９：
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸を含むグラフトコポリマーにベンジルアミンをカップリングするための手順（バッチ０６ＰＰ３４６）
手順。２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸を含むグラフトコポリマーにベンジルアミンをカップリングさせるための手順（バッチ０６ＰＰ２６２）を参照。１．０ｇのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を、各々の場合において加える。
【０１７１】
例１０：
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸および４−アクリルアミド酪酸からグラフトコポリマーを調製するための手順（バッチ０６ＳＷ０５５）
手順：
７０ｇのフィルター湿潤Fractogel TSK HW65（M）（希薄な鉱酸および脱イオン水で洗浄した）および１６．８ｇの３２％水酸化ナトリウム溶液を７５ｍｌの脱イオン水に溶解した溶液、１３．３ｇの２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（氷冷しながら添加）および１７．７ｇの４−アクリルアミド酪酸の懸濁液を、パドル攪拌機を有するガラス反応装置中で調製する。懸濁液を、脱イオン水で２００ｍｌとし、６５％硝酸を用いてｐＨ３に調整する。
【０１７２】
６．２ｇの硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）および０．４ｇの６５％硝酸を２５ｍｌの脱イオン水中に含む開始溶液を、最初に、圧力を平衡にした滴下漏斗中に導入する。装置全体を、繰り返し（３回）排気および窒素での減圧により不活性にする。その後、装置中の懸濁液を、５５℃に加温する。
【０１７３】
開始溶液を、５５℃の内部温度にて撹拌しながら不活性化した懸濁液に加える。懸濁液を、窒素の穏やかな流れの下で５５℃にて３時間撹拌する。次に、反応溶液を、吸引によりガラスフィルターフリット（Ｐ２）を通して濾過し、フリット上のゲルを、各々の場合において１００ｍｌの洗浄溶液で以下のように洗浄する：
５×０．５Ｍ硫酸、０．２Ｍアスコルビン酸
３×脱イオン水
４×１Ｍ水酸化ナトリウム溶液
５×脱イオン水
１×５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０
３×脱イオン水
２×２０％エタノール／１５０ｍＭ塩化ナトリウム
ゲルを、２０％エタノール／１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中で室温にて保存する。
【０１７４】
例１１：
４−アクリルアミド酪酸からグラフトポリマーを調製するための手順（バッチ０５ＰＰ１１６）
手順：
２５．０ｇの３２％水酸化ナトリウム溶液を、２０．６ｇの４−アミノ酪酸を２００ｍｌの脱イオン水に溶解した溶液に、０〜５℃にて、パドル攪拌機を有するガラス反応装置中で加える。１８．２ｇの塩化アクリロイルおよび２５．０ｇの３２％水酸化ナトリウム溶液を、同時に２つの滴下漏斗から激しく攪拌しながら０〜５℃にて加える。次に、混合物を、室温にてさらに４５分間攪拌する。モノマー溶液を、６５％硝酸を用いてｐＨ２に酸性化する。
【０１７５】
７０ｇのフィルター湿潤Fractogel TSK HW65(M)（希薄な鉱酸および脱イオン水で洗浄した）を、モノマー溶液に懸濁させる。混合物を、脱イオン水で４５０ｍｌとし、６５％硝酸を用いてｐＨ２に調整する。
【０１７６】
２．７ｇの硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）および１．０ｇの６５％硝酸を５０ｍｌの脱イオン水中に含む開始溶液を、最初に、圧力を平衡にした滴下漏斗中に導入する。装置全体を、繰り返し（３回）排気および窒素での減圧により不活性にする。その後、装置中の懸濁液を、４２℃に加温する。
【０１７７】
開始溶液を、４２℃の内部温度にて撹拌しながら不活性化した懸濁液に加える。懸濁液を、窒素の穏やかな流れの下で４２℃にて５時間、およびその後室温にてさらに１７時間撹拌する。次に、反応溶液を、吸引によりガラスフィルターフリット（Ｐ２）を通して濾過し、フリット上のゲルを、各々の場合において２００ｍｌの洗浄溶液で以下のように洗浄する：
５×脱イオン水
８×０．５Ｍ硫酸、０．２Ｍアスコルビン酸
３×脱イオン水
２×１Ｍ水酸化ナトリウム溶液
２×脱イオン水
ゲルを、２００ｍｌの脱イオン水に懸濁させ、２５％塩酸を用いてｐＨ７に調整する。ゲルを、２０％エタノール中で室温にて保存する。
【０１７８】
例１２：
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸を含むグラフトコポリマーにアミン類をカップリングさせるための手順
手順：
Fractogel上の２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸を含む２０ｍｌの沈降したグラフトコポリマー（バッチ０６ＰＰ０６６または０５ＰＰ１３１）を、各々の回２０ｍｌの水で８回洗浄し、ガラスフィルターフリット上で吸引により濾過する。
【０１７９】
アミン溶液：５〜６０ｍｍｏｌのアミンを、２０ｍｌの脱イオン水（またはＤＭＦ／脱イオン水３：１）に溶解し、３２％塩酸を用いてｐＨ４．７に調整する（表２）。
ＥＤＣ溶液：２．４ｇのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を、４．８ｍｌの脱イオン水に溶解する。
フィルター湿潤ゲルを、密封可能なビーカー中でアミン溶液に懸濁させる。次に、１．２ｍｌのＥＤＣ溶液を加え、懸濁液を室温にて振盪する。３時間後、さらに１．２ｍｌのＥＤＣ溶液を加え、混合物をさらに１７時間振盪する。
【０１８０】
反応溶液を、吸引によりガラスフィルターフリットを通して濾過し、フリット上のゲルを、各々の場合において２０ｍｌの洗浄溶液で以下のように洗浄する：
（所望により５×ＤＭＦ）
５×脱イオン水
３×１Ｍ水酸化ナトリウム溶液／エタノール２：８（Ｖ／Ｖ）
【０１８１】
ゲルを、２０ｍｌの１Ｍの水酸化ナトリウム溶液／エタノール２：８に懸濁させ、２０時間振盪し、フリット上で吸引により濾過した後に、ゲルを、さらに各々の場合において２０ｍｌの洗浄溶液で以下のように洗浄する：
２×１Ｍ水酸化ナトリウム溶液／エタノール２：８
３×脱イオン水
１×５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０
２×脱イオン水
２×２０％エタノール／１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液
ゲルを、２０％エタノール／１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中で室温にて保存する。
【０１８２】
例１３：
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸および４−アクリルアミド酪酸を含むグラフトコポリマーにベンジルアミンをカップリングさせるための手順（バッチ０６ＳＷ０５８）
手順：
Fractogel上の２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸および４−アクリルアミド酪酸を含む２０ｍｌの沈降したグラフトコポリマー（バッチ０６ＳＷ０５５）を、各々の回２０ｍｌの水で５回、および各々の回２０ｍｌの０．１Ｍの２−モルホリノエタンスルホン酸溶液（ＭＥＳ緩衝液）、ｐＨ４．７で５回洗浄し、ガラスフィルターフリット上で吸引により濾過する。
【０１８３】
６．４ｇのベンジルアミンを、２０ｍｌの０．１ＭのＭＥＳ緩衝液に溶解し、３２％塩酸を用いてｐＨ４．７に調整する。
フィルター湿潤ゲルを、密封可能なビーカー中でベンジルアミン溶液に懸濁させる。０．４ｇのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を加え、懸濁液を、室温にて振盪する。３時間後、さらに０．４ｇのＥＤＣを加え、混合物をさらに１７時間振盪する。
【０１８４】
反応溶液を、吸引によりガラスフィルターフリットを通して濾過し、フリット上のゲルを、各々の場合において２０ｍｌの洗浄溶液で以下のように洗浄する：
１０×脱イオン水
３×１Ｍ塩化ナトリウム溶液
５×５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０
２×脱イオン水
２×２０％エタノール／１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液
ゲルを、２０％エタノール／１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中で室温にて保存する。
【０１８５】
ポリクローナルヒトＩｇＧ（Gammanorm）の静的結合能は、２０ｍＭのリン酸塩、７５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．５中で３０．９ｍｇのＩｇＧ／ｍｌであり、２０ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．５中で９．１ｍｇのＩｇＧ／ｍｌである。結合能を決定する方法を、例１５に記載する。
【０１８６】
例１４：
４−アクリルアミド酪酸を含むグラフトポリマーにベンジルアミンをカップリングさせるための手順（バッチ０５ＰＰ１１７／０５ＰＰ１１８）
手順：
Fractogel上の４−アクリルアミド酪酸を含む２０ｍｌの沈降したグラフトポリマー（バッチ０５ＰＰ１１６）を、各々の回２０ｍｌの水で５回、および各々の回２０ｍｌの０．１Ｍ  ３−モルホリノプロパンスルホン酸溶液（ＭＰＳ緩衝液）、ｐＨ４．７で５回洗浄し、ガラスフィルターフリット上で吸引により濾過する。
【０１８７】
変形態様Ａ：６．４ｇのベンジルアミンを、２０ｍｌの０．１ＭのＭＰＳ緩衝液に溶解し、３２％塩酸を用いてｐＨ４．７に調整する。
フィルター湿潤ゲルを、密封可能なビーカー中でアミン溶液に懸濁させる。０．４ｇのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を加え、懸濁液を、室温にて振盪する。３時間後、さらに０．４ｇのＥＤＣを加え、混合物をさらに１７時間振盪する。
【０１８８】
変形態様Ｂ：１．１ｇのベンジルアミンを、２０ｍｌの０．１ＭのＭＰＳ緩衝液に溶解し、３２％塩酸を用いてｐＨ４．７に調整する。
フィルター湿潤ゲルを、密封可能なビーカー中でアミン溶液に懸濁させる。０．０７ｇのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を加え、懸濁液を、室温にて振盪する。３時間後、さらに０．０７ｇのＥＤＣを加え、混合物をさらに１７時間振盪する。
【０１８９】
変形態様ＡまたはＢの反応溶液を、吸引によりガラスフィルターフリットを通して濾過し、フリット上のゲルを、各々の場合において２０ｍｌの洗浄溶液で以下のように洗浄する：
１０×脱イオン水
３×１Ｍ塩化ナトリウム溶液
５×５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０
ゲルを、２０％エタノール／１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中に室温にて保存する。
【０１９０】
２０ｍＭのリン酸塩、７５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．５中のポリクローナルヒトＩｇＧ（Gammanorm）の静的結合能は、変形態様Ａのゲルについて７．６ｍｇのＩｇＧ／ｍｌであり、変形態様Ｂのゲルについて１６．８ｍｇのＩｇＧ／ｍｌである。結合能を決定する方法を、例１５に記載する。
【０１９１】
例１５：
静的ＩｇＧ結合能（マイクロタイタープレート形式）の決定
すべてのゲル懸濁液を、２０％エタノール水を用いて、５０％のゲル沈降容積に調整した。フィルタープレートを、結合緩衝液で、および各々の場合において２０μｌの均質化したゲル懸濁液で満たす。次に、フィルタープレートを、真空ステーション上で吸引により濾過する。
深いウェルのプレートを、結合緩衝液で満たし、ＩｇＧ原液（ポリクローナルヒトＩｇＧ、Gammanorm, Octapharma）を加え、成分を混合する。
【０１９２】
２００μｌのＩｇＧ溶液を、フィルタープレート中のゲルに加え、プレートを１５分間シェーカー上で振盪する。フィルタープレートを、真空ステーション上で吸引により濾過する。これを、各々の回１００μｌの結合緩衝液で２回洗浄し、吸引により濾過する。各々の場合において、次に、２００μｌの溶離緩衝液（２０ｍＭのリン酸塩、１Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７）を、フィルタープレートに加え、これを５分間振盪する。上清を、真空ステーション上でＵＶプレート中に吸引させ、プレートを、２８０ｎｍにて光度計において測定する。
【０１９３】
溶出液から計算したゲル沈降物容積（ＩｇＧ  ＳＢＣ）１ｍｌあたりのＩｇＧ結合能を、表２に列挙する。用いる結合緩衝液は、２０ｍＭのリン酸塩、７５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．５および２０ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．５であった。
例１２からの分離材料の結合能を、表２に示す。
【０１９４】
例１６：
グラフトポリマーの化学的組成の決定
官能基をポリアクリルアミド鎖であるグラフトポリマーから、酸性加水分解により切断して除去することができる。官能基は、アミンとして遊離し、これを、オルトフタルジアルデヒドおよびメルカプトエタノールにより誘導体化した後に、ＨＰＬＣにより定量的に分析することができる。校正のために、市販のアミンを用いるか、またはモノマーを合成において用い、これを次に、グラフトポリマーと同様に加水分解しなければならない。
【０１９５】
１０００μｌの５Ｍ塩酸を、１０ｍｇの乾燥ゲルに加え、混合物を、超音波浴中で処理し、その後１ｍｌの圧力容器中で１２５℃にて１０時間加熱する。
室温に冷却した後、圧力容器を開放し、約２００μｌの上清をピペットで除去し、５分間遠心分離する（８０００ｒｐｍ）。
【０１９６】
４０μｌの透明な上清を、１７６μｌの１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いて中和し、３２５μｌの０．５Ｍホウ酸塩緩衝液、ｐＨ９．５および１１９μｌのアセトニトリル／水８：２（Ｖ／Ｖ）を加え、成分を混合する。１００ｍｇのオルトフタルアルデヒド、９ｍｌのメタノール、１ｍｌの０．５Ｍホウ酸塩緩衝液、ｐＨ９．５および１００μｌのメルカプトエタノールから調製した１００μｌのＯＰＡ試薬を加え、混合物を激しく振盪する。２分間の反応時間の後、試料を、ＨＰＬＣ（ＵＶ検出３３０ｎｍ）により分析する。
【０１９７】
帯電した基の数を、滴定により決定する。このために、ゲルを、０．５Ｍ塩酸と共に振盪し、０．００１Ｍ塩酸で洗浄する。このようにして帯電させたゲルを、０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液で滴定する。その後、ゲルを洗浄し、乾燥する。当量点を、第１の誘導体の生成により決定する。
結果を表３に列挙する。
【０１９８】
例１７：
動的ＩｇＧ結合能の決定
カラムに、１ｍｌの内容物を充填した。１９ｍｍの床の深さおよび２０％の圧縮を有するProteo-Cartカラムならびに１３ｍｍの床の深さおよび１０％の圧縮を有するSuperformanceカラム。当該カラムに、緩衝液Ａ（ポリクローナルヒトＩｇＧ、Gammanorm, Octapharmaから調製した）中で、１ｇ／ｌの内容物を有するＩｇＧ溶液を１０％破過まで流した。ここでの流速を、カラム中の接触時間が４分であるように選択した。緩衝液Ａで洗浄した後に、カラムを緩衝液Ｂで溶出させた。
【０１９９】
緩衝液Ａ：２５ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．５
緩衝液Ｂ：２５ｍＭのリン酸塩、１Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ６．５
または
緩衝液Ａ’：２５ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ５．５
緩衝液Ｂ’：２５ｍＭのリン酸塩、１Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ５．５
または
緩衝液Ａ’’：２５ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ５．５
緩衝液Ｂ’’：５０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液、２Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ９．０
結果を表３に列挙する。
【０２００】
例１８：
モノクローナル抗体を用いた結合実験
１ｍｌの容量のProteo-Cartカラム(Merck KgaA)に、例７に従って調製した分離材料（０６ＰＰ３４３）を充填し（１７％圧縮）、２５ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ５．５で平衡にする（約１２ｍＳ／ｃｍ）。２０ｍｇのキメラモノクローナル抗体（Clinical Cancer Research 1995, 1, 1311- 1318に記載されている、２５ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ５．５に溶解した）を含む試料を、０．２ｍｌ／分の流速にてカラムに適用する。溶出を、２５ｍＭのリン酸塩、１Ｍの塩化ナトリウムを含む溶液で、ｐＨ５．５にて行う。その後の溶出後の抗体の回収は、行った実験において９８％であった。
クロマトグラムを図３に示す。
【０２０１】
例１９：
サイズ排除クロマトグラフィー
これらの粘性の範囲により図２に図示する、種々の分子量を有するプルランの分配係数Ｋｄを、３種の塩濃度（０、０．１および１．０Ｍの塩化ナトリウム）にて、アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸を含むグラフトポリマーについて、ベンジルアミンのカップリングの前（Fractogel  ＳＯ３／ＣＯＯ）および後（Fractogel  ＳＯ３／ＣＯＯ／ベンジル）に、無勾配実験(isocratic experiment)により、実験的に決定した。
【０２０２】
【表２】
0005420531.tif 000018
【０２０３】
【表３】
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【図１】
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【図２】
0005420531.tif 000029
【図３】
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