(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有し、アルギン酸の１価金属塩の硬化剤を含有しないことを特徴とし、関節内に注入投与する、関節リウマチ治療用組成物。
【請求項２】
低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有し、アルギン酸の１価金属塩の硬化剤を含有しないことを特徴とし、関節内に注入投与する、関節リウマチにおける滑膜組織変性抑制用組成物。
【請求項３】
低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有し、アルギン酸の１価金属塩の硬化剤を含有しないことを特徴とし、関節内に注入投与する、関節リウマチにおける関節破壊抑制用組成物。
【請求項４】
細胞を含有しないことを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩は、ゲルろ過クロマトグラフィーにおける重量平均分子量が５０万以上であることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、獣医用などを含む、関節疾患治療用組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば関節軟骨は硝子軟骨であり、少数の細胞、コラーゲン性の細胞外マトリックス、多くのプロテオグリカンおよび水からなる。骨の場合、血管や神経ネットワークが存在し、自己修復能を有するため、骨折したときでも、十分に骨折部分が修復されることが多い。しかし、関節軟骨には血管および神経ネットワークが存在しない。このため、自己修復能がほとんどなく、特に大きな軟骨欠損部が形成された場合、軟骨欠損部は十分には修復されない。修復される部分にしても、硝子軟骨と力学的特性の異なる線維軟骨が形成される。このため、軟骨欠損が形成されると、関節痛および関節機能の喪失がもたらされ、しばしば変形性関節症へと発展する。また、加齢や関節の酷使によって関節軟骨の表面の磨耗が始まった変形性関節症の初期段階から、病状が進行した結果として、広範な領域での軟骨欠損に至ることもある。
変形性関節症（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＯＡ）は、加齢や関節の酷使によって関節軟骨が磨耗減少する退行性疾患であるが、磨耗という力学的原因のみでなく、滑膜細胞や軟骨細胞による炎症性サイトカインの産生、炎症性サイトカインによる発痛物質や蛋白質分解酵素の誘導などの局所炎症反応が関節破壊に関与していると言われている。すなわち、関節軟骨の磨耗（機械的損傷）に伴い、関節組織内で炎症反応が惹起され、炎症反応による自己破壊的軟骨損傷が進行し、関節機能が低下することで機械的損傷が更に進行する、といった悪循環により病態が悪化していく。変形性関節症の治療は、患部の疼痛や炎症の除去に主眼が置かれ、海外では非ステロイド性抗炎症剤の投与が主流である。しかし高年齢者では腎機能が低下してくることもあり、非ステロイド性抗炎症剤の連続的な経口投与は、安全性の観点から困難な場合もある。軟骨関節液の成分の一つであるヒアルロン酸を製剤化した製品は、関節腔内に投与することで関節の潤滑機能を改善し、かつ疼痛抑制作用も有することから、変形性関節症における関節機能改善剤として多く使用されている。しかし、軟骨およびその周囲組織の変性が進んだ重度の変形性関節症においては、最終的には人工関節への置換を行う以外に方法がなく、組織の変性の進行を抑制し、さらには改善するような新たな治療薬の開発が待ち望まれている疾患の一つである（文献１）。
関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＲＡ）は、未だにその発症メカニズムは解明されていないが、滑膜の炎症・異常増殖と、活性化Ｔ細胞による過剰な免疫応答が関与しており、その結果として関節組織の破壊が進行するといわれている。関節組織の変性を伴うという点ではＯＡと類似の症状を示すが、ＲＡは自己免疫疾患の一種とされており、両者の病態は異なっている。近年、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αをターゲットとした生物学的製剤がＲＡ治療剤として用いられるようになった。これらの製剤は、抗ＴＮＦ−α抗体やＴＮＦ受容体を有効成分とし、ＴＮＦ−αの働きを阻害することで、関節破壊の防止に寄与すると考えられている。一方で、全身性にＴＮＦ−αの働きを阻害することから、肺炎、結核などの感染症をはじめとする重篤な副作用も臨床上問題となっている。関節組織の変性の進行を抑制でき、かつ安全性の高い新たな治療薬が必要とされている。
アルギン酸は、褐藻類に多く存在する高分子多糖類であって、Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）とＬ−グルロン酸（Ｇ）という２種類のウロン酸が直鎖状に重合したポリマーである。アルギン酸は、溶液状態では粘性を示すとともに、２価以上の陽イオン存在下ではゲル化するという性質を有することから、増粘剤やゲル化剤として食品、化粧品、医薬製剤の基剤などに広く使われている。ゲル化するという性質を活用し、細胞を懸濁したアルギン酸溶液をカルシウムイオン溶液に滴下することにより細胞を包埋したビーズを作製するといった技術にも用いられてきた。このようなビーズに軟骨細胞等を包埋し、軟骨損傷部に移植するという試みがなされている。文献２には、アルギン酸は、軟骨損傷部にいかなる不利な影響を与えないキャリアとして使用ができ、アルギン酸自体はいかなる治療効果も持たないと考察されている。また、文献３には、アルギン酸ナトリウム溶液に軟骨細胞を懸濁し、ウサギ軟骨欠損部に注入後、表面をＣａＣｌ２溶液で硬化させた移植物において、正常な軟骨組織が形成されたが、細胞を含有させずアルギン酸のみを軟骨欠損部に適用した場合は、線維軟骨が形成されたことが開示されている。文献４では、可溶性アルギン酸塩と不溶性アルギン酸塩／ゲルとを混合した自己ゲル化性アルギン酸組成物に、軟骨細胞を含有させ軟骨欠損部に注入する、硬化性組成物が開示されている。
このように、アルギン酸は軟骨細胞等の担体として使用できるバイオポリマーであることは知られており、そのゲル化能を活用して、細胞とともに軟骨欠損部に注入して硬化させる移植担体としての使用が試みられてきた。しかし、細胞を含有しないアルギン酸組成物の治療効果は知られておらず、硬化性でないアルギン酸組成物を関節疾患へ適用する試みはなされていなかった。
［文献］
１．Ｈａｒｕｍｏｔｏ  Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．”，Ｃｌｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，Ｖｏｌ．１８，２００６：ｐｐ２９８−３０６
２．Ｃａｙ  Ｍ．Ｍｉｅｒｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−β  ｉｎ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ａｌｇｉｎａｔｅ  Ｂｅａｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｒｔｉｃｕｌａｒ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｂｂｉｔ″，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ  ８（Ｏｃｔｏｂｅｒ），２００２：ｐｐ８９２−９００
３．Ｅ．Ｆｒａｇｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ，″Ａｒｔｉｃｕｌａｒ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  Ｒａｂｂｉｔｓ  ｂｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｌｌｏｇｅｎｉｃ  Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  Ａｌｇｉｎａｔｅ″，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｖｏｌ．２１，２０００：ｐｐ７９５−８０１
４．国際公開２００６／０４４３４２号パンフレット
【発明の開示】
【０００３】
変形性関節症の治療薬には、軟骨を磨耗より保護する効果、磨耗や炎症による軟骨の変性変化を抑制する効果、軟骨損傷部を修復させる効果、炎症や疼痛を抑制する効果など、複合的な効果を併せ持つことが求められる。関節における炎症を抑制し、疼痛を抑制できる薬剤が得られれば、肩関節周囲炎の治療や、慢性関節リウマチにおける関節痛の抑制へも応用可能となる。
関節リウマチの治療薬には、滑膜細胞の異常増殖の抑制、過剰な免疫反応に伴う骨軟骨組織の破壊の抑制といった治療効果を有するとともに、副作用が少なく安全性が高いという性質が求められている。ＲＡは自己免疫疾患であるという性質上、治療効果を得ようとすると免疫抑制的な副作用を避けることが困難であるのが現状である。ＲＡに使用可能な医薬品の中で比較的安全性の高いものとしてヒアルロン酸製剤が知られているが、ヒアルロン酸の関節内注入はＲＡにおける疼痛抑制を目的として使用されており、ＲＡの治療剤とはみなされていない。すなわち、ＲＡに対する治療効果と高い安全性を両立する新たな薬剤の提供が課題となっている。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、実質的に炎症、または発熱を惹起しない程度にまでエンドトキシンレベルを低下させたアルギン酸の１価金属塩を含有する組成物を関節内に注入投与することにより、実験的変形性関節症モデルにおいて、軟骨変性変化を抑制し、軟骨を保護する効果が得られることを見出した。また、実験的関節炎疼痛モデルにおいて、同組成物に関節炎による疼痛を抑制する効果があることを見出した。さらに、実験的関節リウマチモデルにおいて、同組成物に滑膜組織の変性を抑制し、骨軟骨組織の破壊・変性を抑制する効果があることを見出し、本発明を完成させた。
変形性関節症において、関節液の主成分であるヒアルロン酸以外の物質で、このような軟骨組織への複合的な効果を有することが実証されたのは初めてである。海藻由来のポリマーであり、動物の体内には元来存在しないアルギン酸が、このような効果を有していることは驚くべきことであった。
関節リウマチは自己免疫疾患の一種であり、変形性関節症とは病態が異なっている。関節リウマチにおいて、関節組織の変性・破壊の進行を抑制する「疾患修飾薬（ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｄｒｕｇ）」としての機能を有する薬剤は、抗ＴＮＦα抗体やメトトレキサートといった全身性に作用する免疫調節剤が主である。アルギン酸と類似の多糖類であるヒアルロン酸は変形性関節症の治療剤であるが、関節リウマチにおいては関節疼痛の対症療法に用いられているのみである。したがって、アルギン酸において変形性関節症で治療効果が得られていても、関節リウマチにおいて治療効果を有するかどうかは予測困難であった。アルギン酸のような、食品や医薬品基剤として汎用されている安全性の高い天然由来の多糖類ポリマーが、関節内投与により関節リウマチの疾患修飾薬として機能することは、驚くべきことであった。
すなわち、本発明は、関節疾患患者の関節内へ注入投与することで、治療効果を得ることのできる組成物を提供する。
（１−１）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有し、関節内に注入投与する、関節疾患治療用組成物。
（１−２）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、軟骨変性変化抑制用組成物。
（１−３）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、軟骨保護用組成物。
（１−４）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、軟骨修復用組成物。
（１−５）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、関節疼痛抑制用組成物。
（１−６）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、関節炎症抑制用組成物。
（１−７）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、関節機能改善用組成物。
（１−８）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、変形性関節症治療用組成物。
（１−９）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、肩関節周囲炎治療用組成物。
（１−１０）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、関節リウマチにおける関節疼痛抑制用組成物。
（１−１１）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、関節リウマチ治療用組成物。
（１−１２）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、関節リウマチにおける滑膜組織変性抑制用組成物。
（１−１３）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、関節リウマチにおける関節破壊抑制用組成物。
（１−１４）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節疾患に関連する病態を緩和、改善または治癒する効果を有する、関節内注入用組成物。
（１−１５）前記の、関節疾患に関連する病態を緩和、改善または治癒する効果が、軟骨変性変化の抑制、軟骨の保護、軟骨の修復、関節疼痛の抑制、関節炎症の抑制、関節機能の改善、滑膜組織変性の抑制、骨軟骨破壊の抑制および関節破壊の抑制からなる群より選ばれる少なくとも一つである、（１−１４）に記載の組成物。
（１−１６）前記アルギン酸の１価金属塩がアルギン酸ナトリウムである、上記（１−１）ないし（１−１５）のいずれか１つに記載の組成物。
（１−１７）前記アルギン酸ナトリウムは、ゲルろ過クロマトグラフィーにおける重量平均分子量が５０万以上であるアルギン酸ナトリウムである、上記（１−１６）に記載の組成物。
（１−１８）細胞（例えば、軟骨組織再生のための細胞）を含有しないことを特徴とする、上記（１−１）ないし（１−１７）のいずれか１つに記載の組成物。
（１−１９）アルギン酸の１価金属塩の硬化剤を含有しないことを特徴とする、上記（１−１）ないし（１−１８）のいずれか１つに記載の組成物。
（１−２０）ゲルろ過クロマトグラフィーにおける重量平均分子量が５０万以上である低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムを有効成分として含有し、細胞を含有せず、非硬化性であることを特徴とする、関節内に注入投与する、関節リウマチ治療用組成物。
さらに、本発明は、関節疾患およびそれに関連する病態の治療方法を提供する。
（２−１）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、関節疾患治療方法。
（２−２）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、軟骨変性変化抑制方法。
（２−３）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、軟骨保護方法。
（２−４）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、軟骨修復方法。
（２−５）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、関節疼痛抑制方法。
（２−６）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、関節炎症抑制方法。
（２−７）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、関節機能改善方法。
（２−８）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、変形性関節症治療方法。
（２−９）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、肩関節周囲炎治療方法。
（２−１０）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、関節リウマチにおける関節疼痛抑制方法。
（２−１１）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、関節リウマチ治療方法。
（２−１２）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、関節リウマチにおける滑膜組織変性抑制方法。
（２−１３）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、関節リウマチにおける関節破壊抑制方法。
（２−１４）低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、関節疾患に関連する病態を緩和、改善または治癒する方法。
（２−１５）前記の、関節疾患に関連する病態を緩和、改善または治癒する効果が、軟骨変性変化の抑制、軟骨の保護、軟骨の修復、関節疼痛の抑制、関節炎症の抑制、関節機能の改善、滑膜組織変性の抑制、骨軟骨破壊の抑制および関節破壊の抑制からなる群より選ばれる少なくとも一つである、（２−１４）に記載の方法。
（２−１６）前記アルギン酸の１価金属塩がアルギン酸ナトリウムである、上記（２−１）ないし（２−１５）のいずれか１つに記載の方法。
（２−１７）前記アルギン酸ナトリウムは、ゲルろ過クロマトグラフィーにおける重量平均分子量が５０万以上であるアルギン酸ナトリウムである、上記（２−１６）に記載の方法。
（２−１８）前記組成物が、細胞（例えば、軟骨組織再生のための細胞）を含有しないことを特徴とする、上記（２−１）ないし（２−１７）のいずれか１つに記載の方法。
（２−１９）前記組成物が、アルギン酸の１価金属塩の硬化剤を含有しないことを特徴とする、上記（２−１）ないし（２−１８）のいずれか１つに記載の方法。
（２−２０）ゲルろ過クロマトグラフィーにおける重量平均分子量が５０万以上である低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムを有効成分として含有し、細胞を含有せず、非硬化性であることを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、関節リウマチ治療方法。
本発明の関節疾患治療用組成物は、液体状態で関節内に注入することで、関節疾患および関節疾患に関連する病態の進行を抑え、症状を緩和しあるいは治癒することができる。本発明の１つの態様の組成物は、軟骨の機械的損傷に対し修復・保護・変性抑制効果を発揮するとともに、関節組織での炎症反応および疼痛を抑制する。さらに、自己免疫反応に伴う滑膜組織の変性を抑制し、骨軟骨破壊を抑制し、関節破壊に対して治療効果を発揮する。これらの複合的効果を通して関節疾患における関節機能の改善に寄与する。特に、変形性関節症の治療、肩関節周囲炎の治療、関節リウマチにおける関節痛の緩和、関節リウマチの治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、実施例１のうさぎ軟骨修復モデルにおける全体観察のスコア基準を示す図である。
図２は、実施例１のうさぎ軟骨修復モデルにおける染色のスコア基準を示す図である。
図３は、実施例１のうさぎ軟骨修復モデルにおける、Ａ）コントロール群（ｅｍｐｔｙ）の組織の染色写真である。（Ａ）は４週後、（Ｂ）は１２週後を示す。左から順に、Ｈ−Ｅ染色、サフラニンＯ染色、タイプＩコラーゲン、タイプＩＩコラーゲン免疫染色の結果である。
図４は、実施例１のうさぎ軟骨修復モデルにおける、Ｃ）食品グレードアルギン酸＋細胞あり群の染色写真である。（Ａ）は４週後、（Ｂ）は１２週後、染色方法については図３と同様である。
図５は、実施例１のうさぎ軟骨修復モデルにおける、Ｄ）精製アルギン酸群（細胞なし）の染色写真である。（Ａ）は４週後、（Ｂ）は１２週後、染色方法については図３と同様である。
図６は、実施例１のうさぎ軟骨修復モデルにおける、Ｅ）精製アルギン酸＋細胞あり群の染色写真である。（Ａ）は４週後、（Ｂ）は１２週後、染色方法については図３と同様である。
図７は、実施例１のうさぎ軟骨修復モデルにおける全体観察および染色のスコア結果を示す図である。
図８は、実施例１のうさぎ軟骨修復モデルにおける、精製アルギン酸群の、Ｄ）群、Ｅ）群についての機械的強度測定の結果を示す図である。
図９は、実施例３のウサギ変形性関節症モデルにおける膝関節の外観を示す写真である。
図１０は、実施例３のウサギ変形性関節症モデルにおける膝関節組織の染色写真である。
図１１は、実施例４のウサギ変形性関節症モデルにおける膝関節について、ｉｎｄｉａ  ｉｎｋ染色後の外観を示す写真である。図中、丸で囲まれた部分は、ｉｎｄｉａ  ｉｎｋにより着色した軟骨損傷部と正常軟骨の境目を示している。Ａ）コントロール群、Ｂ）１％ヒアルロン酸ナトリウム投与群、Ｃ）２％アルギン酸ナトリウム投与群（分子量４０万）、Ｄ）２％アルギン酸ナトリウム投与群（分子量１００万）、Ｅ）２％アルギン酸ナトリウム投与群（分子量１７０万）である。なお、写真は複数標本のうちの一例である。
図１２は、実施例４のウサギ変形性関節症モデルにおける、ｉｎｄｉａ  ｉｎｋ染色による膝関節の肉眼的所見をスコア化した結果である。ＮＳ，ＨＡ，ＡＬ４０，ＡＬ１００およびＡＬ１７０はそれぞれ、Ａ）〜Ｅ）（図１１と同じ）に対応する。ｇｒａｄｅ１は、ｉｎｄｉａ  ｉｎｋによる染色および無傷の表面（ｎｏ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ  ｉｎｋ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ｉｎｔａｃｔ  ｓｕｒｆａｃｅ）を示す。ｇｒａｄｅ２は、ｉｎｄｉａ  ｉｎｋによる局所的な染色および表面に軽い損傷があること（ｍｉｎｉｍａｌ  ｆｏｒｃａｌ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ  ｉｎｋ，ｍａｉｌｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｉｒｒｅｇｕｒａｌｉｔｙ）を示す。ｇｒａｄｅ３は、ｉｎｄｉａ  ｉｎｋによる大きくくっきりとした染色および明白なフィブリル化（ｅｖｉｄｅｎｔ  ｌａｒｇｅ  ｆｏｒｃａｌ  ｄａｒｋ  ｐａｔｃｈｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ  ｉｎｋ，ｏｖｅｒｔ  ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ）を示す。ｇｒａｄｅ４ａは、２ｍｍ未満の軟骨損傷（ｅｒｏｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ＜２ｍｍ）を示す。ｇｒａｄｅ４ｂは、２ｍｍ−５ｍｍの軟骨損傷（ｅｒｏｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ２−５ｍｍ）を示す。ｇｒａｄｅ４ｃは、５ｍｍを超える軟骨損傷（ｅｒｏｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ＞５ｍｍ）を示す。
図１３は、実施例４のウサギ変形性関節症モデルにおける、膝関節組織のサフラニン−Ｏ染色写真である。Ａ）〜Ｅ）は図１１と同じ。なお、写真は複数標本のうちの一例である。
図１４は、実施例４のウサギ変形性関節症モデルにおける、病理組織総合評価をスコア化した結果である。ＮＳ，ＨＡ，ＡＬ４０，ＡＬ１００およびＡＬ１７０はそれぞれ、Ａ）〜Ｅ）（図１１と同じ）に対応する。
図１５は、実施例６のラット実験的関節炎疼痛モデルにおける、歩行状態スコアの経時的変化を示す図である。Ａ）コントロール群（ＮＳ）、Ｂ）１％ヒアルロン酸ナトリウム投与群（１％ＨＡ）、Ｃ）２％アルギン酸ナトリウム投与群（分子量１００万）（２％ＡＬ１００）、Ｄ）１％アルギン酸ナトリウム投与群（分子量１７０万）（１％ＡＬ１７０）、Ｅ）２％アルギン酸ナトリウム投与群（分子量１７０万）（２％ＡＬ１７０）である。＊：ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＮＳ。
図１６は、実施例７のウサギ肩腱板断裂モデルにおける上腕骨骨頭部の標本写真である。黒矢印は軟骨損傷部を示す。Ｃｏｎｔｒｏｌは生理食塩水投与群、ａｌｇｉｎａｔｅはアルギン酸投与群を表す。
図１７は、実施例８のウサギ変形性関節症モデルの膝関節標本の摩擦係数を示すグラフである。縦軸は摩擦係数を表す。Ｃｏｎｔｒｏｌ（ｎｏｒｍａｌ）は正常関節、ＨＡ（ＯＡ）はヒアルロン酸投与したＯＡ関節、ＡＬ１００（ＯＡ）はアルギン酸投与したＯＡ関節を表す。
図１８は、実施例９のラット・コラーゲン誘発関節炎モデルにおける、抗原感作後の関節炎発症の程度の時間推移を表すグラフである。縦軸は関節炎スコア、横軸は抗原感作後の日数を表す。Ａ）コントロール群、Ｂ）１％ヒアルロン酸ナトリウム投与群、Ｃ）２％アルギン酸ナトリウム投与群（分子量１００万）、Ｄ）１％アルギン酸ナトリウム投与群（分子量１７０万）、Ｅ）２％アルギン酸ナトリウム投与群（分子量１７０万）である。
図１９は、実施例９のラット・コラーゲン誘発関節炎モデルにおける、膝関節の滑膜組織の組織学的評価をスコア化した結果である。Ａ〜Ｅは図１８と同じ。＊：ｐ＜０．０５  ｖｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ。
図２０は、実施例９のラット・コラーゲン誘発関節炎モデルにおける、膝関節の膝蓋骨の組織学的評価をスコア化した結果である。Ａ〜Ｅは図１８と同じ。＊：ｐ＜０．０５  ｖｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ。
図２１は、実施例９のラット・コラーゲン誘発関節炎モデルにおける、膝関節の大腿骨外側顆の組織学的評価をスコア化した結果である。Ａ〜Ｅは図１８と同じ。＊：ｐ＜０．０５  ｖｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の実施の形態は本発明を説明するための例示であり、本発明はその要旨を逸脱しない限りさまざまな形態で実施することができる。
１．概要
「軟骨」は、関節、胸郭壁、椎間板、半月板や、喉頭、気道、耳などの管状構造にみられ、硝子軟骨、弾性軟骨、線維軟骨の３種に分類できる。例えば、関節軟骨は硝子軟骨であり、軟骨細胞、コラーゲン性の細胞外マトリックス、プロテオグリカンおよび水からなり、血管が分布していない。硝子軟骨は、タイプＩＩコラーゲンに富み、抗タイプＩＩコラーゲン抗体により染色される、プロテオグリカンを染色するサフラニン−Ｏ染色で赤色に染色される、などの特徴を有する。「軟骨損傷」とは、加齢や外傷、その他様々な要因によって、軟骨が障害を受けている状態をいい、例えば、何らかの要因で、軟骨の独特の粘弾性（荷重がかかるとゆっくりと縮んで，荷重がとれるとゆっくりと元に戻る）が低下し、可動性を保ちながら荷重を支えることに支障をきたすなど、軟骨の機能が低下した状態を含む。変形性関節症、関節リウマチなどの疾患においても、軟骨損傷が見られる。
本発明において、「関節疾患」とは、軟骨、軟骨組織および／または関節組織（滑膜、関節包、軟骨下骨など）が機械的刺激や炎症反応により傷害されることにより生じる疾患をいう。「関節疾患治療」とは、機械的刺激や炎症反応により傷害された組織の各種病態を緩和し、改善し、および／または治癒することをいう。たとえば、変形性関節症においては、関節軟骨の磨耗、軟骨組織の変性、滑膜の炎症、炎症に伴う疼痛などの病態が複合的に発生する。一方で、肩関節周囲炎では、滑膜や関節包の炎症とそれに伴う疼痛が主であり、軟骨の磨耗や変性は認めないこともある。関節リウマチは、未だにその発症メカニズムは解明されていないが、自己免疫反応による炎症性サイトカインにより、滑膜組織や軟骨組織が破壊されると考えられている。このように、関節疾患は、複合的な病態を呈する疾患であり、その治療薬は、軟骨を磨耗より保護する効果、磨耗や炎症による軟骨の変性変化を抑制する効果、軟骨損傷部を修復させる効果、炎症や疼痛を抑制する効果、滑膜組織の変性を抑制する効果、骨軟骨破壊を抑制する効果など、複合的な効果を併せ持つことが求められる。本発明の、「低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有する組成物」は、軟骨を機械的刺激より保護する効果、磨耗や炎症による軟骨の変性変化を抑制する効果、軟骨損傷部を修復させる効果、関節組織の炎症や疼痛を抑制する効果、滑膜組織の変性を抑制する効果、および、骨軟骨破壊を抑制する効果を併せもつ。これにより、関節疾患の進行を抑え、症状を緩和し、改善し、および／または治癒することができる。特に、変形性関節症の治療、肩関節周囲炎の治療、関節リウマチにおける関節痛の緩和、関節リウマチの治療に有用である。
また、「関節内に注入投与する」とは、流動性を有する液状の組成物を、関節腔内、滑液包内、腱鞘内などに、注入することをいう。変形性関節症および関節リウマチの治療に用いる場合は、組成物を関節腔内に注入して適用することが好ましい。なお、変形性関節症および関節リウマチは膝、肩、股、腰、足首、手首、指などの体の各関節に発生しうるが、本発明の組成物はいずれの関節にも適用しうる。
２．アルギン酸の１価金属塩
本発明の関節疾患治療用組成物に含有させる「アルギン酸の１価金属塩」は、アルギン酸の６位のカルボン酸の水素原子を、Ｎａ＋やＫ＋などの１価金属イオンとイオン交換することでつくられる水溶性の塩である。アルギン酸の１価金属塩としては、具体的には、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウムなどを挙げることができるが、特には、市販品により入手可能なアルギン酸ナトリウムが好ましい。
本発明に用いる「アルギン酸」は、生分解性の高分子多糖類であって、Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）とＬ−グルロン酸（Ｇ）という２種類のウロン酸が直鎖状に重合したポリマーである。より具体的には、Ｄ−マンヌロン酸のホモポリマー画分（ＭＭ画分）、Ｌ−グルロン酸のホモポリマー画分（ＧＧ画分）、及びＤ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸がランダムに配列した画分（ＭＧ画分）が任意に結合したブロック共重合体である。アルギン酸のＤ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸の構成比（Ｍ／Ｇ比）は、主に海藻等の由来となる生物の種類によって異なり、また、その生物の生育場所や季節による影響を受け、Ｍ／Ｇ比が約０．４の高Ｇ型からＭ／Ｇ比が約５の高Ｍ型まで高範囲にわたる。
アルギン酸の１価金属塩は高分子多糖類であり、分子量を正確に定めることは困難であるが、一般的に重量平均分子量で１万〜１０００万、好ましくは５万〜３００万の範囲である。ゲルろ過クロマトグラフィーにおける重量平均分子量が約１００万および約１７０万のアルギン酸ナトリウムは、分子量が約４０万のアルギン酸ナトリウムに比べ、軟骨変性変化抑制効果、軟骨保護効果、軟骨修復効果、および関節疼痛抑制効果に優れていた。通常、高分子多糖類の分子量をゲルろ過クロマトグラフィーにより算出する場合、１０〜２０％の測定誤差を生じうる。例えば、４０万であれば３２〜４８万、５０万であれば４０〜６０万、１００万であれば８０〜１２０万程度の範囲で値の変動が生じうる。したがって、アルギン酸の１価金属塩について、関節疾患への効果が特に優れている好適な重量平均分子量範囲は、少なくとも５０万以上、より好ましくは６５万以上、さらに好ましくは８０万以上である。分子量が高すぎるものは製造が困難であるとともに、水溶液とする際に粘度が高くなりすぎる、溶解性が低下するなどの問題を生じるため、重量平均分子量が５００万以下であることが好ましく、より好ましくは３００万以下である。
一般に天然物由来の高分子物質は、単一の分子量を持つのではなく、種々の分子量を持つ分子の集合体であるため、ある一定の幅を持った分子量分布として測定される。代表的な測定手法はゲルろ過クロマトグラフィーである。ゲルろ過クロマトグラフィーにより得られる分子量分布の代表的な情報としては、重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）、分散比（Ｍｗ／Ｍｎ）が挙げられる。
分子量の大きい高分子の平均分子量への寄与を重視したのが重量平均分子量であり、下記式で表される。
Ｍｗ＝Σ（ＷｉＭｉ）／Ｗ＝Σ（ＨｉＭｉ）／Σ（Ｈｉ）
数平均分子量は、高分子の総重量を高分子の総数で除して算出される。
Ｍｎ＝Ｗ／ΣＮｉ＝Σ（ＭｉＮｉ）／ΣＮｉ＝Σ（Ｈｉ）／Σ（Ｈｉ／Ｍｉ）
ここで、Ｗは高分子の総重量、Ｗｉはｉ番目の高分子の重量、Ｍｉはｉ番目の溶出時間における分子量、Ｎｉは分子量Ｍｉの個数、Ｈｉはｉ番目の溶出時間における高さである。
軟骨損傷部における軟骨再生効果（特に硝子軟骨再生効果）、関節疾患治療における軟骨修復効果、軟骨変性変化抑制効果、および／または軟骨保護効果は、分子量の大きい分子種の寄与が大きいと考えられるため、分子量の指標としては重量平均分子量を用いればよい。
天然物由来の高分子物質の分子量測定では、測定方法により値に違いが生じうることが知られている（ヒアルロン酸の例：Ｃｈｉｋａｋｏ  ＹＯＭＯＴＡ  ｅｔ．ａｌ．Ｂｕｌｌ．Ｎａｔｌ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．１１７，ｐｐ１３５−１３９（１９９９）、Ｃｈｉｋａｋｏ  ＹＯＭＯＴＡ  ｅｔ．ａｌ．Ｂｕｌｌ．Ｎａｔｌ．Ｉｎｓｔ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．１２１，ｐｐ３０−３３（２００３））。アルギン酸塩の分子量測定については、固有粘度（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）から算出する方法、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ（Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｗｉｔｈ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎｇｌｅ  Ｌａｓｅｒ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）により算出する方法が記載された文献がある（ＡＳＴＭ  Ｆ２０６４−００（２００６），ＡＳＴＭ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ発行）。なお、当該文献では、サイズ排除クロマトグラフィー（＝ゲルろ過クロマトグラフィー）により分子量を測定するにあたっては、プルランを標準物質として用いた較正曲線により算出するだけでは不十分とし、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＬＳ）を併用すること（＝ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによる測定）を推奨している。また、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによる分子量を、アルギン酸塩のカタログ上の規格値として用いている例もある（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ社、ＰＲＯＮＯＶＡＴＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｌｇｉｎａｔｅｓ  ｃａｔａｌｏｇｕｅ）。
本発明者らは、分子量の異なるアルギン酸ナトリウムについて、ＯＡモデル等で治療効果に差があることを見出しており、それらのアルギン酸について、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量測定と、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによる分子量測定を行った。その結果、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量のほうが、アルギン酸塩の粘度や治療効果との関連性が高いことがわかった。すなわち、関節疾患治療用組成物に用いるアルギン酸塩の、好適な分子量範囲を特定するパラメーターとしては、一般に推奨されているＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによる測定より、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が適していることを新たに見出した。したがって、本明細書中においてアルギン酸塩の分子量を特定する場合は、特段のことわりがない限り、ゲルろ過クロマトグラフィーにより算出される重量平均分子量である。
ゲルろ過クロマトグラフィーの好適な条件は実施例に準ずる。代表的な条件としては、プルランを標準物質とした較正曲線を用いることが挙げられる。標準物質として用いるプルランの分子量としては、少なくとも１６０万、７８．８万、４０．４万、２１．２万および１１．２万のものを標準物質として用いることが好ましい。その他、溶離液（２００ｍＭ硝酸ナトリウム溶液）、カラム条件などを特定できる。カラム条件としては、ポリメタクリレート樹脂系充填剤を用い、排除限界分子量１０００万以上のカラムを少なくとも１本用いることが好ましい。代表的なカラムは、ＴＳＫｇｅｌ  ＧＭＰＷｘ１（直径７．８ｍｍ×３００ｍｍ）（東ソー株式会社製）である。
アルギン酸の１価金属塩は、褐藻類から抽出された当初は、分子量が大きく、粘度が高めだが、熱による乾燥、凍結乾燥、精製などの過程で、分子量が小さくなり、粘度は低めとなる。したがって、製造の各工程において適切な温度管理をすることにより、分子量の異なるアルギン酸の１価金属塩を製造することができる。製造の各工程における温度が低めとなるよう管理することで分子量の大きいアルギン酸の１価金属塩が得られ、温度が高くなるほど分子量の小さいアルギン酸の１価金属塩が得られる。また、原料とする褐藻類を適宜選択する、あるいは、製造工程において、分子量による分画を行う、などの手法によっても、分子量の異なるアルギン酸の１価金属塩を製造することができる。さらに、各手法で製造したアルギン酸の１価金属塩について、分子量あるいは粘度を測定した後、異なる分子量あるいは粘度を持つ別ロットのアルギン酸の１価金属塩と混合することにより、目的とする分子量を有するアルギン酸の１価金属塩とすることも可能である。
本発明に用いるアルギン酸は、天然由来でも合成物であってもよいが、天然由来であるのが好ましい。天然由来のアルギン酸としては、例えば、褐藻類から抽出されるものを挙げることができる。アルギン酸を含有する褐藻類は世界中の沿岸域に繁茂しているが、実際にアルギン酸原料として使用できる海藻は限られており、南米のレッソニア、北米のマクロシスティス、欧州のラミナリアやアスコフィラム、豪のダービリアなどが代表的なものである。アルギン酸の原料となる褐藻類としては、例えば、レッソニア（Ｌｅｓｓｏｎｉａ）属、マクロシスティス（Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）属、ラミナリア（Ｌａｍｉｎａｒｉａ）属（コンブ属）、アスコフィラム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、ダービリア（Ｄｕｒｖｉｌｌｅａ）属、アラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ）属、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ）属などがあげられる。
３．低エンドトキシン処理
本発明の関節疾患治療用組成物に含有されるアルギン酸の１価金属塩は、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩である。低エンドトキシンとは、実質的に炎症、または発熱を惹起しない程度にまでエンドトキシンレベルを低下させたものである。すなわち、低エンドトキシン処理に供されたものである。驚くべきことに、低エンドトキシン処理することで、組成物を軟骨損傷部に適用したときに、軟骨再生作用をより高めることができる上に、軟骨下骨の再生が促進され、患部の機械的強度を高めることもできることが分かった。すなわち、本発明の組成物において低エンドトキシンアルギン酸を用いることにより、周囲の軟骨における変性や炎症反応が少なく、生体親和性の高い組成物とすることができる。
低エンドトキシン処理は、公知の方法またはそれに準じる方法によって行うことができる。例えば、ヒアルロン酸ナトリウムを精製する、菅らの方法（例えば、特開平９−３２４００１号公報など参照）、β１，３−グルカンを精製する、吉田らの方法（例えば、特開平８−２６９１０２号公報など参照）、アルギネート、ゲランガム等の生体高分子塩を精製する、ウィリアムらの方法（例えば、特表２００２−５３０４４０号公報など参照）、ポリサッカライドを精製する、ジェームスらの方法（例えば、国際公開第９３／１３１３６号パンフレットなど参照）、ルイスらの方法（例えば、米国特許第５５８９５９１号明細書など参照）、アルギネートを精製する、ハーマンフランクらの方法（例えば、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９４）４０：６３８−６４３など参照）等またはこれらに準じる方法によって実施することができる。本発明の低エンドトキシン処理は、それらに限らず、洗浄、フィルター（エンドトキシン除去フィルターや帯電したフィルターなど）によるろ過、限外ろ過、カラム（エンドトキシン吸着アフィニティーカラム、ゲルろ過カラム、イオン交換樹脂によるカラムなど）を用いた精製、疎水性物質、樹脂または活性炭などへの吸着、有機溶媒処理（有機溶媒による抽出、有機溶剤添加による析出・沈降など）、界面活性剤処理（例えば、特開２００５−０３６０３６号公報など参照）など公知の方法によって、あるいはこれらを適宜組合せて実施することができる。これらの処理の工程に、遠心分離など公知の方法を適宜組み合わせてもよい。アルギン酸の種類に合わせて適宜選択するのが望ましい。
エンドトキシンレベルは、公知の方法で確認することができ、例えば、リムルス試薬（ＬＡＬ）による方法、エントスペシー（登録商標）ＥＳ−２４Ｓセット（生化学工業株式会社）を用いる方法などによって測定することができる。本発明の組成物に含有されるアルギン酸のエンドトキシンの処理方法は特に限定されないが、その結果として、アルギン酸の１価金属塩のエンドトキシン含有量が、リムルス試薬（ＬＡＬ）によるエンドトキシン測定を行った場合に、５００エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｇ以下であること好ましく、さらに好ましくは、１００ＥＵ／ｇ以下、とりわけ好ましくは５０ＥＵ／ｇ以下、特には３０ＥＵ／ｇ以下である。低エンドトキシン処理されたアルギン酸ナトリウムは、例えば、Ｓｅａ  Ｍａｔｒｉｘ（滅菌）（（株）キミカ−（株）持田インターナショナル）、ＰＲＯＮＯＶＡＴＭ  ＵＰ  ＬＶＧ（ＦＭＣ）など市販品により入手可能である。
４．アルギン酸の１価金属塩の溶液の調製
本発明の関節疾患治療用組成物は、アルギン酸の１価金属塩の溶液を用いて調製してもよい。アルギン酸の１価金属塩の溶液は、公知の方法またはそれに準じる方法により調製することができる。すなわち、本発明で用いられるアルギン酸の１価金属塩は、前述の褐藻類を用いて、酸法、カルシウム法など公知の方法により製造することができる。具体的には、例えば、これらの褐藻類から、炭酸ナトリウム水溶液などのアルカリ水溶液を用いて抽出した後、酸（例えば、塩酸、硫酸など）を添加することによってアルギン酸を得ることができ、アルギン酸のイオン交換によりアルギン酸の塩を得ることができる。前述のとおり、低エンドトキシン処理を行う。アルギン酸の塩の溶媒は、生体へ適用可能な溶媒であれば特に限定されないが、例えば、精製水、蒸留水、イオン交換水、ミリＱ水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。これらは、滅菌されていることが好ましく、低エンドトキシン処理されたものが好ましい。例えば、ミリＱ水をろ過滅菌して用いることができる。また、本発明の組成物を得るための操作は全てエンドトキシンレベル、および、細菌レベルの低い環境下で行うことが望ましい。例えば、操作はクリーンベンチで、滅菌器具を使用して行うことが好ましく、使用する器具を市販のエンドトキシン除去剤で処理してもよい。
好ましいエンドトキシンレベルを示すまで精製したアルギン酸の１価の塩を用いて、上記のように組成物を作製した場合には、組成物のエンドトキシン含有量は、通常、５００ＥＵ／ｇ以下であり、さらに好ましくは３００ＥＵ／ｇ以下、とりわけ好ましくは１５０ＥＵ／ｇ以下である。
５．関節疾患治療用組成物の粘度
本発明の関節疾患治療用組成物を関節内に注入する場合の粘度は、関節疾患の治療効果が得られれば特に限定はされないが、好ましくは１００ｍＰａ・ｓ〜２００００ｍＰａ・ｓである。例えば、上記溶媒などを用いて、適度な粘度に調製することができる。このような粘度範囲であれば、シリンジ等で関節内に注入することができる。好ましくは、１５０ｍＰａ・ｓ〜１５０００ｍＰａ・ｓ、より好ましくは２００ｍＰａ・ｓ〜１００００ｍＰａ・ｓ、とりわけ好ましくは２５０ｍＰａ・ｓ〜６０００ｍＰａ・ｓである。適度な粘度とすることで関節液のクッションとしての機能を補う効果も果たすことができ、関節液中に分散した状態で関節疾患を治療する効果を発揮することが可能となる。
関節疾患治療用組成物の粘度は、例えば、アルギン酸の１価金属塩の溶液中のアルギン酸濃度、アルギン酸の分子量等を制御することにより調整することができる。
アルギン酸の１価金属塩の溶液の粘度は、溶液中のアルギン酸濃度が高い場合に高く、溶液中のアルギン酸濃度が低い場合に低くなる。アルギン酸の１価金属塩の溶液中の好ましいアルギン酸濃度は、分子量の影響を受けるので、一概にはいえないが、おおよそ０．２％ｗ／ｖ〜５％ｗ／ｖ程度であり、さらに好ましくは、０．５％ｗ／ｖ〜３％ｗ／ｖ程度で、とりわけ好ましくは１％ｗ／ｖ〜２．５％ｗ／ｖである。
低い濃度のアルギン酸の１価金属塩の溶液により、高い粘度の組成物を得るためには、分子量の高いアルギン酸の１価金属塩を選択することができる。アルギン酸の１価金属塩の溶液の粘度は、Ｍ／Ｇ比によって影響を受けるため、例えば、溶液の粘度等により好ましいＭ／Ｇ比を有するアルギン酸を適宜選択することができる。本発明に用いるアルギン酸のＭ／Ｇ比は、約０．４〜４．０であり、好ましくは約０．８〜３．０、より好ましくは約１．０〜１．６である。
前述のように、Ｍ／Ｇ比が主に海藻の種類によって決まることなどから、原料として用いられる褐藻類の種類はアルギン酸の１価金属塩の溶液の粘度に影響を及ぼす。本発明で用いられるアルギン酸としては、好ましくは、レッソニア属、マクロシスティス属、ラミナリア属、アスコフィラム属、ダービリア属の褐藻由来であり、より好ましくはレッソニア属の褐藻由来であり、特に好ましくはレッソニア・ニグレッセンズ（Ｌｅｓｓｏｎｉａ  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）由来である。
６．  アルギン酸の１価金属塩含有関節疾患治療用組成物の製剤化及び適用
本発明の関節疾患治療用組成物は、ヒト又はヒト以外の生物、例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ウマなどの非ヒト哺乳動物の関節内に注入投与し、関節疾患の治療を行うために用いられる。
本発明の関節疾患治療用組成物の形態は、流動性のある液体状、すなわち、溶液状である。本発明において「流動性を有する」とは、その形態を不定形に変化させる性質を持つことを意味する。好ましくは、例えば、組成物をシリンジなどに封入し、患部へ注入することができるような流動性を有することが望ましい。溶液状である本発明の組成物は、シリンジ、ゲル用ピペット、専用注射器などで関節内に容易に適用することができる。
本発明の関節疾患治療用組成物は、変形性関節症、肩関節周囲炎、関節リウマチなどの関節疾患において、軟骨の修復効果、軟骨変性変化の抑制効果、軟骨保護効果、関節組織の炎症を抑制する効果、関節組織の炎症による疼痛を抑制する効果、滑膜組織変性の抑制効果、および／または骨軟骨破壊の抑制効果を有し、関節疾患の治療効果を発揮する。これらの複合的な効果を通して、関節機能を改善し、関節破壊を抑制する。
本発明の関節疾患治療用組成物の態様の１つは、変形性関節症治療用組成物である。変形性関節症のように、軟骨損傷が関節軟骨の広範にわたる場合、または、明らかな軟骨欠損は生じていないものの、軟骨表面の平滑さが乱れ変性変化が始まっているような、比較的初期の変形性関節症によく見られるタイプの軟骨損傷を治療したい場合には、本発明の組成物を関節腔内に注入し、関節液内にいきわたらせるように適用することが好ましい。アルギン酸の１価金属塩が軟骨損傷部に接触することで、軟骨損傷部における関節の修復を促進し、炎症や磨耗による軟骨の変性変化を抑制し、軟骨を保護する。また、有効成分であるアルギン酸の１価金属塩が関節液内にいきわたることにより、滑膜組織を含めた周辺組織の炎症反応を抑制し、疼痛を抑制する効果を発揮する。同時に、関節液内にアルギン酸の１価金属塩が存在することで、クッションおよび潤滑油としての関節液の機能を補う役割を果たす。
本発明の関節疾患治療用組成物の別の態様の１つは、肩関節周囲炎治療用組成物である。肩関節周囲炎では、滑膜や関節包の炎症とそれに伴う疼痛が主であり、軟骨の磨耗や変性は認めないこともある。アルギン酸の１価金属塩は、滑膜組織を含めた周辺組織の炎症反応を抑制し、疼痛を抑制する効果を発揮するため、本発明の組成物を肩関節腔内、肩峰下滑液包内、または上腕二頭筋長頭腱腱鞘内などに投与することで、肩関節周囲炎を治療することができる。
本発明の関節疾患治療用組成物の別の態様の１つは、関節疼痛抑制用組成物である。関節疼痛は、上述のような変形性関節症、肩関節周囲炎等のほか、関節リウマチにおいてしばしば問題となる。本発明の好ましい態様の一つは、関節リウマチにおける関節疼痛の治療用組成物であり、特に好ましくは、慢性関節リウマチにおける膝関節疼痛抑制用組成物である。関節リウマチは、未だにその発症メカニズムは解明されていないが、自己免疫反応による炎症性サイトカインにより、滑膜組織や軟骨組織が破壊されると考えられている。アルギン酸の１価金属塩は、滑膜組織を含めた周辺組織の炎症反応を抑制し、疼痛を抑制する効果を発揮するため、本発明の組成物を、関節リウマチを罹患した関節内に投与することで、炎症反応とそれに伴う疼痛を抑制することができる。
本発明の関節疾患治療組成物の別の態様の１つは、関節リウマチ治療用組成物である。本発明の組成物は、自己免疫反応に伴う滑膜組織の変性を抑制し、骨軟骨破壊を抑制する。また、自己免疫反応によって関節組織に変性が生じると、関節本来の滑らかな動きができなくなり、軟骨に変形性関節症と同様の機械的損傷が加わるようになる。本発明の組成物はこのような軟骨損傷部における関節の修復を促進し、炎症や磨耗による軟骨の変性変化を抑制し、軟骨を保護する。本発明の組成物は、このような複合的な効果を通して、関節リウマチにおける関節破壊を抑制し、治療効果を発揮する。
本発明の関節疾患治療組成物の別の態様の１つは、関節疾患に伴う各種病態を緩和し、改善し、および／または治癒する組成物である。関節疾患では、軟骨、軟骨組織および／または関節組織（滑膜、関節包、軟骨下骨など）が機械的刺激や炎症反応により傷害され、関節軟骨の磨耗、機械的刺激や炎症反応による軟骨組織の変性変化、滑膜など関節組織の炎症、炎症に伴う関節疼痛、滑膜組織の変性、骨軟骨組織の破壊などの病態が複合的に発生する。本発明の組成物は、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有し、軟骨を機械的刺激より保護する効果、磨耗や炎症による軟骨の変性変化を抑制する効果、軟骨損傷部を修復させる効果、関節組織の炎症や疼痛を抑制する効果、滑膜組織の変性を抑制する効果、および、骨軟骨破壊を抑制する効果を併せもつ。これにより、関節疾患の進行を抑え、症状を緩和し、改善し、および／または治癒することができる。また、本発明の関節疾患治療組成物は、これらの病態の緩緩和、改善、および／または治癒を通して、関節機能を改善する効果を有する。関節機能の改善とは、関節可動域の改善、日常生活動作の改善などを意味する。
本発明の関節疾患治療用組成物を関節内に適用する場合は、投与量は投与対象となる関節の関節液等の量に応じて適宜決めればよく、特に限定されないが、ヒト膝関節や肩関節に投与する場合は、通常１〜５ｍＬ、より好ましくは２〜３ｍＬである。また、投与は、例えば１週間毎に連続５回連続行い、その後２〜４週間に１回を継続するといった方法をとりうる。特にこれに限定されるものではなく、症状と効果に応じて適宜増減可能である。例えば、２週に１回、１月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、または６ヶ月に１回の投与を適宜継続するといった方法もとりうる。アルギン酸は動物の体内に元来存在しない物質であるため、動物はアルギン酸を特異的に分解する酵素を保有していない。アルギン酸は動物体内においては、通常の加水分解により徐々に分解されるが、ヒアルロン酸等のポリマーに比べ体内の分解が緩やかであり、関節内に投与した場合、長期間の効果持続が期待できる。
本発明の関節疾患治療用組成物は、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする。本発明者らは、アルギン酸を生体の関節内に投与した場合に、アルギン酸自体が軟骨組織および関節組織への治療効果を発揮することを初めて見出した。アルギン酸の１価金属塩とは、好ましくはアルギン酸ナトリウムであり、更に好ましくはゲルろ過クロマトグラフィーにおける重量平均分子量が５０万以上であるアルギン酸ナトリウムである。有効成分として含有するとは、アルギン酸が患部に適用された際に、軟骨組織および関節組織への治療効果を発揮できる量で含有されていればよく、少なくとも、組成物全体の０．１％ｗ／ｖ以上であることが好ましい。より好ましくは０．５％ｗ／ｖ以上、特に好ましくは１〜３％ｗ／ｖである。
本発明の軟骨再生用又は軟骨疾患治療用組成物には、必要に応じて、他の医薬活性成分や、慣用の安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤等、通常医薬に用いられる成分を本発明の組成物に含有させることもできる。
尚、本発明の１つの態様では、本発明の組成物は、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩以外に、軟骨あるいは関節組織に対し薬理作用を発揮する成分を含まない。低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩のみを有効成分として含有する組成物においても、充分な関節疾患治療効果を発揮しうる。
例えば、施術の手技が簡便で、生体に対しても、軟骨細胞、骨膜採取、骨髄採取などの過度の負担を与えることなく、生体由来や培養工程由来のウイルス等の感染の危険を軽減するためには、細胞を含有しない組成物とすることが好ましい。細胞とは、具体的には、軟骨組織再生のための細胞であり、例えば、骨髄間葉系幹細胞、骨髄間葉系間質細胞、軟骨前駆細胞、軟骨細胞、滑膜細胞、血球系幹細胞、ＥＳ細胞等の細胞が挙げられる。本発明の関節疾患治療用組成物は、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分とする組成物であり、アルギン酸自体に関節疾患の治療効果があることを見出したことに基づいている。好適な治療用組成物の例は、ゲルろ過クロマトグラフィーにおける重量平均分子量が５０万以上である、低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムを有効成分として含有し、細胞を含有しないことを特徴とする、関節内に注入投与する、関節疾患治療用組成物であり、従来用いられているヒアルロン酸製剤より優れた治療効果を発揮することができる。
本発明の関節疾患治療用組成物は、アルギン酸の１価金属塩に対する硬化剤を含まないことが好ましい。アルギン酸の１価金属塩に対する硬化剤とは、アルギン酸の１価金属塩と溶液中で共存させると、アルギン酸を硬化させるあるいはゲル化させる成分のことであり、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋などの２価以上の金属イオン化合物、分子内に２〜４個のアミノ基を有する架橋性試薬などが挙げられる。より具体的には、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＣａＳＯ４、ＢａＣｌ２、グルコン酸カルシウム、アルギン酸カルシウム塩などを挙げることができる。これらの成分をアルギン酸が硬化／ゲル化する程度まで含有すると、アルギン酸のゲル化によりシリンジ等での注入が困難になる、関節内でアルギン酸が多量に固化することにより関節の機能を妨げる、などの問題が生じることがある。硬化性の組成物は、軟骨欠損部などの穴に充填して用いるのには適している。一方で、本発明の組成物のように、関節内にいきわたらせ、変形性関節症や関節リウマチの関節組織全体へ複合的な治療効果を発揮させるためには、組成物自体は非硬化性であることが望ましい。一般的な薬剤溶解液には、ごく微量の２価金属イオン等が含まれていることもあるが、アルギン酸の１価金属塩の硬化／ゲル化を意図した添加でないかぎり、ここでいう硬化剤には該当しない。本発明の組成物の好ましい態様の一つは、アルギン酸の１価金属塩の硬化剤を、アルギン酸が硬化／ゲル化する程度にまで含有しない組成物である。還言すれば、本発明の組成物の好ましい態様の一つは、非硬化性の組成物である。
さらに、本発明は、前記本発明の関節疾患治療用組成物を用いる、関節疾患の治療方法を提供する。本発明の関節疾患の治療方法は、前記本発明の関節疾患治療用組成物を関節内に投与することにより、関節疾患の進行を抑え、症状を緩和し、改善し、および／または治癒する。前記本発明の関節疾患治療用組成物を関節内に投与することで、軟骨変性変化の抑制、軟骨の保護、軟骨の修復、関節疼痛の抑制、関節炎症の抑制、滑膜組織変性の抑制、および骨軟骨破壊の抑制からなる群より選ばれる少なくとも一つの効果を発揮し、関節疾患の進行を抑え、症状を緩和し、改善し、および／または治癒する。これらの複合的な効果を通して、関節機能を改善し、関節破壊を抑制する。
本発明の関節疾患治療用組成物を関節内に適用する方法は、特に限定されないが、例えば、シリンジ、ゲル用ピペット、専用充填器などで関節内に直接注入するようにして良い。関節内に注入して適用する場合、１８Ｇ〜２７Ｇの針を使用するのが好ましい。「関節内に注入投与する」とは、流動性を有する液状の組成物を、関節腔内、滑液包内、腱鞘内などに、注入することをいう。変形性関節症および関節リウマチの治療に用いる場合は、組成物を関節腔内に注入して適用することが好ましい。なお、変形性関節症および関節リウマチは膝、肩、股、腰、足首、手首、指などの体の各関節に発生しうるが、本発明の組成物はいずれの関節にも適用しうる。
また、本発明の組成物を投与する前に、あるいは同時に、あるいは後で、ストレプトマイシン、ペニシリン、トブラマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、及びアンホテリシンＢ等の抗生物質、アスピリン、非ステロイド性解熱鎮痛剤（ＮＳＡＩＤｓ）、アセトアミノフェン等の抗炎症薬、ステロイド剤等の併用薬を投与するようにしても良い。これらの薬剤は本発明の組成物に混入して用いてもよい。
７．関節疾患治療用キット
さらに、本発明は、関節疾患治療用キットを提供する。キットには、前記本発明の関節疾患治療用組成物、シリンジ、ゲル用ピペット、専用充填器、取り扱い説明書等を含めることができる。キットとして好適な具体例としては、一体成型され、隔壁により仕切られた二つの部屋からなるシリンジの１室にアルギン酸の１価金属塩を封入し、他方の部屋に溶解液としての生理食塩液を含む溶液を封入し、両部屋の隔壁を用時容易に開通できるよう構成し、用時両者を混合・溶解して用いることのできるキットとする。他の例としては、アルギン酸の１価金属塩溶液をプレフィルドシリンジに封入し、使用時に調製操作なくそのまま投与できるキットとする。さらに、キットには、ストレプトマイシン、ペニシリン、トブラマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、及びアンホテリシンＢ等の抗生物質、アスピリン、非ステロイド性解熱鎮痛剤（ＮＳＡＩＤｓ）、アセトアミノフェン等の抗炎症薬、ステロイド剤等の併用薬を含めることもできる。
本キットを用いることにより、関節疾患治療を円滑に行うことができる。
なお、本明細書において引用した全ての刊行物、例えば、先行技術文献および公開公報、特許公報その他の特許文献は、その全体が本明細書において参照として組み込まれる。また、本明細書は、日本国特許出願である特願２００７−２７７００５号および国際特許出願であるＰＣＴ／ＪＰ２００８／５２９９９の開示内容を包含する。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
うさぎ軟骨修復モデル
（１）移植細胞の作成
移植細胞とするため、骨髄間葉系間質細胞（ＢＭＳＣ：Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｅｓｅｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）を単離し、培養した。ＢＭＳＣには、骨髄間葉系幹細胞の他、血球系細胞なども含まれる。４ヶ月齢の日本白うさぎの脛骨より骨髄１０ｍＬを採取し、Ｃａ・ＭｇフリーのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌａｂ．）で２回洗浄後、ＤＭＥＭ−ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ（ＤＭＥＤ−ＨＧ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に懸濁した。血液塊を孔径７０μｍのセル・ストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ  Ｃｏ．Ｌｔｄ）により除去した。細胞を、ＤＭＥＭ−ＨＧ、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、１％抗生物質（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ  １００Ｘ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ，Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）の培養メディウム中、１００ｍｍの培養皿で、３７℃、５％ＣＯ２、加湿下でインキュベートした。培養メディウムを３日毎に交換し、接着性のない細胞を除去した。接着性のある細胞を１０〜１４日間単層培養後、トリプシン・ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）ではがして、計数し、３日毎に継代した。
（２）方法
（施術）
メス日本白うさぎ４０匹（体重２．６〜２．９ｋｇ）を、イソフラン・Ｏ２ガスとペントバルビタール静注（０．０５ｍｇ／ｋｇ）により麻酔し、抗生物質（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｇ，Ｍｅｉｊｉ−Ｓｅｉｋａ，Ｊａｐａｎ）の筋注後、脚を剃毛した。前中央部を２ｃｍ切開し、傍内側膝蓋アプローチにより、顆間部に到達した。パワードリル（Ｒｅｘｏｎ，Ｊａｐａｎ）を使って、大腿骨滑車の骨軟骨欠損（直径５ｍｍ、深さ２ｍｍ）を作成した。ひざを生理食塩水で潤し、欠損部に出血がないことを確認し、欠損部を乾燥させた。
本実施例では、以下の５群に分けて、実験を行った。
Ａ）コントロール群（ｅｍｐｔｙ）、
Ｂ）食品グレードアルギン酸群（細胞なし）
Ｃ）食品グレードアルギン酸＋細胞あり（２．５×１０７個／ｍＬ）群、
Ｄ）精製アルギン酸群（細胞なし）、
Ｅ）精製アルギン酸＋細胞あり（２．５×１０７個／ｍＬ）群
Ａ）のコントロール群は、欠損部に何も適用しなかったものである。また、Ｂ）の食品グレードアルギン酸群（細胞なし）は、２％ｗ／ｖの食品グレードのアルギン酸ナトリウム溶液を欠損部に適用したもの、Ｄ）の精製アルギン酸群（細胞なし）は、２％ｗ／ｖの精製アルギン酸ナトリウム溶液を欠損部に適用したものである。食品グレードのアルギン酸は、和光純薬工業（株）、アルギン酸ナトリウム５００（番号１９９−０９９６１）を用い、精製アルギン酸は（株）キミカ−（株）持田インターナショナル、Ｓｅａ  Ｍａｔｒｉｘ（滅菌）（製造番号Ｂ５Ｙ０１）を用いた。さらに、Ｃ）食品グレードアルギン酸＋細胞あり群、Ｅ）精製アルギン酸＋細胞あり群は、（１）で得られた細胞を、２％ｗ／ｖの食品グレードのアルギン酸ナトリウム溶液または２％ｗ／ｖの精製アルギン酸ナトリウム溶液に懸濁し、関節軟骨の欠損部に適用したものである。  市販のＬＡＬアッセイキット（Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ｃｏｌｏｒ  ＫＹ  Ｔｅｓｔ  Ｗａｋｏ，Ｗａｋｏ，Ｊａｐａｎ）により、エンドトキシンレベルを測定したところ、精製アルギン酸ナトリウムでは、５．７６ＥＵ（エンドトキシン単位）／ｇ、食品グレードアルギン酸ナトリウムでは、７５９５０ＥＵ／ｇであり、精製アルギン酸ナトリウムのエンドトキシンレベルは食品グレードのアルギン酸ナトリウムに比べて極めて低かった。すなわち、精製アルギン酸ナトリウムは、低エンドトキシン処理されたものであった。また、精製アルギン酸ナトリウムの重金属含量は、２０ｐｐｍ以下であり、硫酸鉛は、０．９８％以下、ヒ素は２ｐｐｍ以下であった。
アルギン酸ナトリウム溶液の濃度を２％ｗ／ｖとしたのは、粘度を施術に適した５０００ｍＰａ・ｓ〜６０００ｍＰａ・ｓにすることができるからである。欠損部が上を向く姿位でうさぎを固定し、ゲル用ピペットを用いて、各組成物を欠損部に適用した。
Ｂ）〜Ｅ）の各群とも、アルギン酸ナトリウム溶液の粘度が適度であったので、関節液により流れやすい条件にも関わらず、アルギン酸ナトリウム溶液が欠損部から流れることはなかった。その後、移植片の表面に１００ｍＭのＣａＣｌ２溶液約０．５ｍｌを２７Ｇの針の注射器で１０秒間ゆっくりとかけ続けた。移植片の表面層は直ちにゲル化し、移植細胞が患部から外れることはなかった。生理食塩水でＣａＣｌ２溶液を洗浄した。さらなる固定は必要なく、施術後、患部を縫合した。ウサギは自由に動くことができた。
被験体のうさぎに、施術後４週後又は１２週後に過量のペントバルビタールを静注し安楽死させた。そして、その大腿の末端部を動力のこぎりで切除した。
（全体観察）
肉眼で外観全体を観察し、スコア化した。スコア化は、Ｇａｂｒｉｅｌｅ  Ｇ．らの方法（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  ２１（２０００）２５６１−２５７４）を参考に、図１の基準により得点化した。
（染色）
その後、被験体をパラホルムアルデヒドで固定し、脱灰、パラフィン固定した。欠損部中央から５μｍ部分を、サフラニンーＯ、Ｈ−Ｅ染色、抗タイプＩコラーゲン、抗タイプＩＩコラーゲン免疫染色を実施した。新たに形成した軟骨組織を評価するため、図２に記載したスコアリングシステムを使って、顕微鏡で評価した。スコアリングは、独立した、ブラインドされた観察者が行った。
（機械的強度測定）
患部の機械的強度を圧入テストにより測定した。大腿骨膝関節を上に向けて、強固にクランプ固定した。実験は室温で行った。インデンターを自動で再生軟骨の中心に向けて動かし、負荷（Ｎ）に対する移動（ｍｍ）を記録した。新生された組織の厚さは、組織切片から計測した。負荷―ひずみ曲線の直線部分からヤング係数を得た。
（３）結果
染色の結果を図３〜６に示した。
Ｈ−Ｅ染色、サフラニンＯ染色、抗タイプＩＩコラーゲン免疫染色の結果、Ｅ）の精製アルギン酸＋細胞あり群（図６）において、４週後の早い段階から、他の群と比較して、最も優れた、硝子軟骨、タイプＩＩコラーゲンの形成が確認された。１２週においては、約８０％の軟骨再生が見られた。Ｈ−Ｅ染色の結果から、軟骨下骨の形成も極めて良好なことが分かる。サフラニンＯ染色では、プロテオグリカンの形成が見られ、細胞外マトリックスの形成も確認できる。一方、Ｈ−Ｅ染色、抗タイプＩコラーゲン免疫染色によれば、線維軟骨の形成はほとんど見られなかった。
Ｄ）の精製アルギン酸群（細胞なし）（図５）は、Ｃ）の食品グレードアルギン酸＋細胞あり群（図４）と比較して、硝子軟骨、タイプＩＩコラーゲン、軟骨下骨の形成とも良好であった。細胞を包埋しないＤ）群において、硝子軟骨細胞による軟骨再生が得られたのは、驚くべき結果であった。また、細胞を包埋しないＤ）群が、細胞を包埋したＣ）群と比較して、軟骨損傷の再生能力に優れていることは、予想外の結果であった。
一方、欠損部に何も適用しなかったＡ）コントロール群（図３）は、軟骨細胞、タイプＩＩコラーゲンの新生はほとんど見られなかった。
肉眼で外観全体を観察しスコア化した評価結果（Ｍａｃｒｏ）、および、上記染色による観察をスコア化した評価結果（Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ）を図７に示した。
１２週における、ＭａｃｒｏとＨｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌの結果を合わせた総合スコア（ｔｏｔａｌ  ｓｃｏｒｅ）は、Ｅ）精製アルギン酸＋細胞あり群  ２２．７１点、Ｄ）精製アルギン酸群（細胞なし）１９．５７点、Ｃ）食品グレードアルギン酸＋細胞あり群  １４．７５点、Ｂ）食品グレードアルギン酸群（細胞なし）１０．２５点、Ａ）コントロール群（ｅｍｐｔｙ）８．４３点と、Ｅ）精製アルギン酸＋細胞あり群が最も優れ、次いで、Ｄ）精製アルギン酸群（細胞なし）、Ｃ）食品グレードアルギン酸＋細胞あり群の順であった。細胞を包埋しないＤ）群が、細胞を包埋するＣ）群と比較して、総合スコア（ｔｏｔａｌ  ｓｃｏｒｅ）において優れ、軟骨損傷の再生能力に優れていることは、全く予想外の結果であった。
肉眼による外観全体の評価（Ｍａｃｒｏ−ｔｏｔａｌ）、染色による評価（Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ−ｔｏｔａｌ）とも、スコア化の結果は、いずれも、上記と同様、Ｅ）精製アルギン酸＋細胞あり群が最も優れ、次いで、Ｄ）精製アルギン酸群（細胞なし）の順であった。
Ｍａｃｒｏの評価項目を見ると、精製アルギン酸を用いた、Ｄ）群、およびＥ）群は、食品グレードアルギン酸を用いたＢ）群、Ｃ）群と比較して、端部融合（新生細胞、元の軟骨に対するもの）（（Ｅｄｇｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ（ｎｅｗ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｏ  ｎａｔｉｖｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ））、軟骨表面の滑らかさ（Ｓｍｏｏｔｈｎｅｓｓ  ｏｆ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｓｕｒｆａｃｅ）、軟骨表面、充填度（Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｓｕｒｆａｃｅ，ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｆｉｌｌｉｎｇ）、軟骨の色、新生軟骨の不透明さ、透明性（ｃｏｌｏｒ  ｏｆ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ，ｏｐａｃｉｔｙ  ｏｒ  ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｏｃａｒｔｉｌａｇｅ）の全ての項目において優れていた。
Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌの評価項目を見ると、精製アルギン酸を用いた、Ｄ）群、およびＥ）群は、特に、支配的な組織の性質（Ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ）、表面の秩序（ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｇｕｌａｒｉｔｙ）、構造的な完全性、均質性（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ，ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）、厚さ（Ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）、周囲の軟骨への結合（Ｂｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、周囲の軟骨における変性変化（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、炎症反応（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の項目において、食品グレードアルギン酸を用いたＢ）群、Ｃ）群を上回る高スコアであった。
以上より、Ｄ）群、Ｅ）群は、硝子軟骨、タイプＩＩコラーゲン、軟骨下骨の形成など、軟骨損傷における軟骨細胞、軟骨組織の形成が極めて良好であった。線維軟骨の形成はほとんど見られなかった。
精製アルギン酸は新生した組織のホスト組織への融合性がよく、周囲の軟骨における変性や炎症反応が少なく、生体親和性が高いことが分かる。
精製アルギン酸群Ｄ）群、Ｅ）群についての機械的強度測定の結果を図８に示した。
精製アルギン酸群についての機械的強度測定の結果、正常な軟骨組織のヤング係数の１０に対して、Ｅ）精製アルギン酸＋細胞あり群は８と、ほぼ、損傷のない正常な状態にまで、強度の回復が見られた。このことから、細胞を包埋した本発明の組成物は、機械的強度に優れ、強度のある硝子軟骨が再生し、軟骨下骨の形成も良好であることが裏付けられた。
【実施例２】
【０００７】
精製アルギン酸ナトリウムの分子量分布測定
（１）方法
精製アルギン酸ナトリウムの分子量分布測定を、以下の条件にて、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｌａｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により行った。
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＧＭＰＷｘ１  ２本  ＋  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ２５００ＰＷｘ１  １本（東ソー株式会社製）
（直径７．８ｍｍ×３００ｍｍ×３本）
カラム温度：４０℃
溶離液：２００ｍＭ  硝酸ナトリウム水溶液
試料濃度：０．０５％
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：２００μＬ
検出器：ＲＩ（示差屈折計）
標準物質：プルラン、グルコース（分子量１６０万、７８．８万、４０．４万、２１．２万、１１．２万、４．７３万、２．２８万、１．１８万、５９００、１８０）
（２）結果
【表１】
0005491866.tif 000002
（３）考察
実施例１のうさぎ軟骨修復モデルにおいて使用した精製アルギン酸ナトリウムの重量平均分子量は、上記方法による測定では１７０万であった。実施例１に示したように、当該アルギン酸は、細胞あり、なしの両方でうさぎ軟骨修復モデルにおいて硝子軟骨再生効果が認められた。一方で、文献３では、低エンドトキシンアルギン酸（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ社、ＰｒｏｎｏｖａＴＭＬＶＧ、現ＰｒｏｎｏｖａＴＭＵＰ  ＬＶＧ）を用いて同様の実験を行っているが、細胞を含有させずアルギン酸のみを軟骨欠損部に適用した場合は、線維軟骨が形成されることが開示されている。なお、ＰｒｏｎｏｖａＴＭＬＶＧを滅菌した製品がＰｒｏｎｏｖａＴＭＳＬＧ２０であり、その重量平均分子量は、上記方法による測定では、４４万であった。Ｓｅａ  ＭａｔｒｉｘＴＲとＰｒｏｎｏｖａＴＭは、低エンドトキシンアルギン酸であるという点では共通しているが、両者のアルギン酸は、分子量の点で相違があり、この相違が軟骨再生効果の差異に繋がっているものと考えられる。粘度はアルギン酸の濃度により調節が可能であるが、異なる濃度のアルギン酸ゲル（０．５〜４％）に軟骨細胞を包埋してマウス皮下に移植し、軟骨形成を確認した実験において、アルギン酸の濃度は軟骨形成効果に影響しなかったとの報告もある（Ｋｅｉｔｈ  Ｔ．Ｐａｉｇｅ  ｅｔ  ａｌ，″Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ａｌｇｉｎａｔｅ−Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ″，Ｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ｖｏｌ．９７：１９９６  ｐ．１６８−１７８）。したがって、Ｓｅａ  ＭａｔｒｉｘＴＲとＰｒｏｎｏｖａＴＭの両アルギン酸の軟骨再生効果の差異は、分子量に起因するものと考えられる。すなわち、低エンドトキシンアルギン酸を用いることにより、周囲の軟骨における変性や炎症反応が少なく、生体親和性の高い組成物とすることができるが、それに加えて高分子量のアルギン酸とすることにより、細胞を包埋しない場合においても硝子軟骨を再生できる、軟骨再生効果に非常に優れた軟骨再生用または治療用組成物とすることができることがわかった。分子量としては、重量平均分子量で少なくとも５０万以上、好ましくは６５万以上の低エンドトキシンアルギン酸が軟骨再生に有用であり、より好ましくは１００〜２００万、特に１５０〜２００万程度の分子量のものが好適であることがわかった。
【実施例３】
【０００８】
ウサギ変形性関節症モデル（前十字靭帯（ＡＣＬ）切除モデル）
（１）方法
メス日本白うさぎ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｗｈｉｔｅ  ｒａｂｂｉｔ；体重２．６〜２．９ｋｇ）を用いて両膝関節に対し、Ｖｉｇｎｏｎ  Ｅらの方法に準じてＯＡモデルを作成した（Ｖｉｇｎｏｎ  Ｅ，Ｂｅｊｕｉ  Ｊ，Ｍａｔｈｉｅｕ  Ｐ，Ｈａｒｔｍａｎｎ  ＪＤ，Ｖｉｌｌｅ  Ｇ，Ｅｖｒｅｕｘ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １９８７；１４（Ｓｐｅｃ  Ｎｏ）：１０４−６）。以下の４群について各３匹（６膝）を用意した。
Ａ）コントロール群（生理食塩水投与）、
Ｂ）１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液投与群（分子量約９０万、粘度約２３００ｍＰａ・ｓ）
Ｃ）１％精製アルギン酸ナトリウム溶液投与群（分子量約１７０万、粘度約５００ｍＰａ・ｓ）
Ｄ）２％精製アルギン酸ナトリウム溶液投与群（分子量約１７０万、粘度約５０００ｍＰａ・ｓ）
Ｂ）〜Ｄ）の溶液は生理食塩水にて作成した。Ｃ）〜Ｄ）の精製アルギン酸ナトリウム
は、実施例１で用いている精製アルギン酸ナトリウム（（株）キミカ−（株）持田インターナショナル、Ｓｅａ  Ｍａｔｒｉｘ（滅菌）、製造番号Ｂ５Ｙ０１）と同一である。
前十字靭帯切除手術後、４週目、５週目、６週目、７週目、８週目に、上記Ａ）〜Ｄ）の各溶液を、関節腔内に投与した（週１回、計５回投与）。投与は、２７Ｇ針を用い、膝蓋骨腱を貫通させ、１回あたり０．３ｍＬ／膝を注入した。９週目にウサギを安楽死させ、膝関節組織標本を取得した。感染、異物反応などの炎症はすべての膝で認めなかった。
（２）結果
（全体観察）
肉眼で膝関節（大腿骨および脛骨の膝関節軟骨）外観全体を観察した。結果を図９に示す。Ａ群（生理食塩水投与）では肉眼的に軟骨欠損、骨棘などの変形性関節症の所見を多く認めた。他の群ではＡ群に比較して軟骨損傷の程度（大きさ、深さ）が軽かった。肉眼的所見をスコア化しても同様の結果であった。
（染色）
膝関節組織標本をパラホルムアルデヒドで固定し、脱灰、パラフィン固定した。サフラニン‐Ｏ染色により組織学的評価を行った。結果を図１０に示す。各図上部は大腿骨側軟骨であり、下部は脛骨側軟骨であり、軟骨変性の変化は両側軟骨において判定する。Ａ群（生理食塩水投与）では軟骨基質の染色性の低下、軟骨表面の粗さを認めた。Ｂ群（１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液投与）では軟骨表面はＡ群より平滑ではあるが、染色性の低下を認めた。Ｃ群（１％精製アルギン酸ナトリウム溶液投与）およびＤ群（２％精製アルギン酸ナトリウム溶液投与）では、軟骨表面は平滑であり、Ａ群およびＢ群と比べ染色性の低下は軽度であった。また軟骨表面にアルギン酸が残存していた。
以上より、アルギン酸ナトリウムの関節内注射はＡＣＬ切除ＯＡモデルにおいて、軟骨変性を抑制し、軟骨を保護する作用を示した。変形性関節症の治療薬として用いられている１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液投与と同等もしくはそれ以上の効果が認められた。また、アルギン酸ナトリウムが軟骨表面に付着していたことから、アルギン酸ナトリウムは関節軟骨と親和性を示し、軟骨表面を被覆・保護していることが確認された。
【実施例４】
【０００９】
ウサギ変形性関節症モデル（前十字靭帯（ＡＣＬ）切除モデル）における分子量の異なるアルギン酸の治療効果の評価
（１）方法
メス日本白色家兎（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｗｈｉｔｅ  ｒａｂｂｉｔ；体重２．６〜２．９ｋｇ）を用いて両膝関節に対し、Ｖｉｇｎｏｎ  Ｅらの方法に準じてＯＡモデルを作成した（Ｖｉｇｎｏｎ  Ｅ，Ｂｅｊｕｉ  Ｊ，Ｍａｔｈｉｅｕ  Ｐ，Ｈａｒｔｍａｎｎ  ＪＤ，Ｖｉｌｌｅ  Ｇ，Ｅｖｒｅｕｘ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １９８７；１４（Ｓｐｅｃ  Ｎｏ）：１０４−６）。以下の５群について各５匹（１０膝）を用意した。
Ａ）コントロール群（生理食塩水投与）、
Ｂ）１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液投与群（ＡＲＴＺ（登録商標）、科研製薬（株）、分子量約９０万、粘度約２３００ｍＰａ・ｓ）
Ｃ）２％精製アルギン酸ナトリウム溶液投与群（ＰｒｏｎｏｖａＴＭＳＬＭ２０、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ社、分子量約４０万）
Ｄ）２％精製アルギン酸ナトリウム溶液投与群（（株）キミカ製、滅菌、分子量約１００万）
Ｅ）２％精製アルギン酸ナトリウム溶液投与群（Ｓｅａ  Ｍａｔｒｉｘ（滅菌）、（株）キミカ製、分子量約１７０万）
Ｃ）〜Ｅ）の溶液は生理食塩水にて作成した。
前十字靭帯切除手術後、４週目、５週目、６週目、７週目、８週目に、上記Ａ）〜Ｅ）の各溶液を、関節腔内に投与した（週１回、計５回投与）。投与は、２７Ｇ針を用い、膝蓋腱を貫通させ、１回あたり０．３ｍＬ／膝を注入した。９週目にウサギを安楽死させ、膝関節組織標本を取得した。感染、異物反応などの炎症反応はすべての膝で認めなかった。
（２）結果
（全体観察）
肉眼で膝関節（大腿骨および脛骨の膝関節軟骨）外観全体を観察した。軟骨表面の損傷の程度を評価するのに、Ｃｈｏｊｉ  ＳＨＩＭＩＺＵらの方法に準じてｉｎｄｉａ  ｉｎｋで染色しスコア化を行った（Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  Ｖｏｌ．２５，ｐｐ１８１３−１８１９，１９９８）。肉眼的所見を図１１に示す。ｉｎｄｉａ  ｉｎｋの染色では、軟骨損傷部と正常軟骨の境目が着色する。Ａ群（生理食塩水投与）では肉眼的に深く広範な軟骨欠損、骨棘などの変形性関節症の所見を多く認めた。他の群ではＡ群に比較して軟骨損傷の程度（大きさ、深さ）が軽かった。肉眼的所見をスコア化した結果を図１２に示す。膝関節について、大腿骨内側顆（Ｍｅｄｉａｌ  Ｆｅｍｏｒａｌ  Ｃｏｎｄｙｌｅ：ＭＦＣ）、脛骨内側顆（Ｍｅｄｉａｌ  Ｔｉｂｉａｌ  Ｐｌａｔｅａｕ：ＭＴＰ）、大腿骨外側顆（Ｌａｔｅｒａｌ  Ｆｅｍｏｒａｌ  Ｃｏｎｄｙｌｅ：ＬＦＣ）、脛骨外側顆（Ｌａｔｅｒａｌ  Ｔｉｂｉａｌ  Ｐｌａｔｅａｕ：ＬＴＰ）の４箇所の観察を行った。いずれの部位においても、Ｂ〜Ｅ群はＡ群に比較して軟骨損傷の程度が軽かった。また、軟骨損傷の程度は、Ｂ群およびＣ群に比べ、Ｄ群およびＥ群にて軽度な傾向が認められた。アルギン酸の分子量の違いにより、軟骨変性変化抑制効果・軟骨保護効果・軟骨修復効果に差があると考えられた。
（プロテオグリカン染色）
膝関節組織標本をパラホルムアルデヒドで固定し、脱灰、パラフィン固定した。サフラニンーＯ染色により組織学的評価を行った。結果を図１３に示す。各図上部は大腿骨側軟骨であり、下部は脛骨側軟骨であり、軟骨変性の変化は両側軟骨において判定する。Ａ群（生理食塩水投与）では軟骨基質の染色性の低下、軟骨表面の粗さを認めた。Ｂ群（１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液投与）では軟骨表面はＡ群より平滑ではあるが、染色性の低下を認めた。アルギン酸ナトリウム溶液投与群（Ｃ〜Ｅ群）では、軟骨表面は平滑であり、Ａ群およびＢ群と比べ染色性の低下は軽度であった。また軟骨表面にアルギン酸が付着していた。
（病理組織総合評価）
肉眼的観察、染色による観察の総合的な評価として、Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ  ＫＩＫＵＣＨＩらの方法に準じたスコア化を行い、投与薬物の効果を評価した（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｖｏｌ．４，ｐｐ９９−１１０，１９９６）。大腿骨内側顆について、以下の８項目について各４段階評価し、合計点を変形性関節症病変スコアとした。
（１）軟骨表層の消失、（２）軟骨びらん、（３）線維化・亀裂、（４）可染色性プロテオグリカンの消失、（５）軟骨細胞の配列の乱れ、（６）軟骨細胞の消失、（７）軟骨下骨の消失、（８）軟骨細胞クラスターの形成。
有意差検定は群間はＡＮＯＶＡを行い、その後各群間の比較はｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔにてｐ＜０．０５を有意とした。
結果を図１４に示す。Ｂ〜Ｅ群は、Ａ群に対し、変形性関節症病変スコアが有意に低かった。また、高分子量アルギン酸投与群（Ｄ群、Ｅ群）では、ヒアルロン酸投与群（Ｂ群）よりも優れた効果が認められたが、低分子量アルギン酸投与群（Ｃ群）はヒアルロン酸投与群と同等程度であった。
以上より、アルギン酸ナトリウムの関節内注射はＡＣＬ切除ＯＡモデルにおいて、軟骨変性変化を抑制し、軟骨を保護する作用を示した。変形性関節症の治療薬として用いられている１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液投与と同等もしくはそれ以上の効果が認められた。特に、高分子量アルギン酸は、ヒアルロン酸よりも優れた治療効果を示した。なお、３種のアルギン酸は粘度の点での差違も存在するが、ヒアルロン酸より粘度の低いアルギン酸でもヒアルロン酸と同等以上の効果が認められていることから、治療効果の差は粘度によるものではなく、物質の違いおよび分子量の違いによるものと考えられる。
今回のＡＣＬ切除ＯＡモデルでは、ＡＣＬ切除後４週目より薬物の投与を開始した。従って、薬物投与群で認められた変形性関節症病変スコアの低下は、軟骨変性変化の抑制、軟骨保護による、病変進行の抑制効果に加え、既に発生した損傷に対する軟骨修復作用が合わさった結果であると考えられる。本実験の参考とした、上述のＴｏｓｈｉｙｕｋｉ  ＫＩＫＵＣＨＩらの論文では、ＡＣＬ切除後４週目には、生理食塩水投与群ではＯＡスコアが２０〜２５に達するとされている。本実験では、ＡＣＬ切除後４週目より薬剤の投与を開始しているので、ＯＡスコアが２０〜２５程度の状態から薬剤投与を開始した結果、薬剤の効果により軟骨の状態が改善してＯＡスコアが低下している可能性が考えられる。また、本評価系では、正常関節のスコアは８となるので、Ｅ群（分子量１７０万のアルギン酸）におけるＯＡ平均スコア（１１．３）は、正常関節に近い、非常に良好なスコアであると言える。
【実施例５】
【００１０】
アルギン酸の分子量測定手法の検討
天然物由来の高分子物質の分子量測定では、測定方法により値に違いが生じうることが知られている。ＡＳＴＭ  Ｆ２０６４−００（ＡＳＴＭ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ発行（２００６）；米国材料試験協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）は、工業材料規格および試験法規格の国際標準化・規格設定機関である）では、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ（Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｗｉｔｈ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎｇｌｅ  Ｌａｓｅｒ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）による測定が推奨されている。そこで、実施例４で用いたアルギン酸ナトリウムについて、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳと実施例２に記載のゲルろ過クロマトグラフィーによる測定法との比較を行った。なお、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳは、ゲルろ過クロマトグラフィーに多角度光散乱検出器（ＭＡＬＬＳ）を併用した測定法である。
（１）方法
ゲルろ過クロマトグラフィーによる測定は、実施例２と同一の方法で行った。ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによる測定は、以下の条件にて行った。
多角度光散乱検出器：Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＤＡＷＮ  ＨＥＬＥＯＳ
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＢ−８０６Ｍ  ２本（昭和電工株式会社製）
溶離液：２００ｍＭ  硝酸ナトリウム水溶液
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
（２）結果
【表２】
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ＡＬ１７０、ＡＬ１００、ＡＬ４０は、実施例４で用いた精製（低エンドトキシン）アルギン酸ナトリウムと同一である。
Ｍ１７０：（株）キミカー（株）持田インターナショナル、Ｓｅａ  Ｍａｔｒｉｘ（滅菌）、１％粘度約５００ｍＰａ・ｓ
ＡＬ１００：（株）キミカ製、滅菌、１％粘度約１００ｍＰａ・ｓ
ＡＬ４０：ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ社、ＰｒｏｎｏｖａＴＭＳＬＭ２０、１％粘度約３０ｍＰａ・ｓ
（３）考察
表２に示すように、３種のアルギン酸塩は、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳにおける分子量は、差異があるとは明確には言えない範囲の差しか認められず、ゲルろ過クロマトグラフィーによる測定結果とは大きな違いがあった。実施例４に示すように、用いた試料間には薬理効果において明確な差があったことから、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量のほうが、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによる分子量よりもアルギン酸塩の治療効果との関連性が高く関節疾患治療用組成物に用いるアルギン酸塩の、好適な分子量範囲を特定するパラメーターとしては、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が適していることがわかった。
【実施例６】
【００１１】
ラットの実験的関節炎疼痛に対するアルギン酸の効果
（１）方法
ラットの膝関節内に尿酸ナトリウムの針状結晶（ＭＳＵ）を注入して誘発させた関節炎では、疼痛のため歩行異常を呈する。Ｓｈｉｚｕｈｉｋｏ  ＩＨＡＲＡらの方法（Ｆｏｌｉａ  ｐｈａｒｍａｃｏｌ．ｊａｐｏｎ．，Ｖｏｌ．１００，ｐｐ３５９−３６５（１９９２））に準じて、ＭＳＵ投与ラット実験的関節炎疼痛モデルを作成し、アルギン酸ナトリウムの関節内投与の効果を検討した。
Ｃｒｌ：ＣＤ系雄性ラットを５週齢で購入し、１週間の馴化後実験に供した。麻酔下でラットの右膝関節内に５．０％ＭＳＵ生理食塩液懸濁液を０．０５ｍＬ注入し、２、４、６および２４時間後に歩行状態を観察した。歩行状態は正常歩行（０点）、軽い跛行（１点）、中程度の跛行（２点）、つま先立った歩行（３点）および３足歩行（４点）の５段階のスコアで評価した。以下の５群について各１０匹を用意した。
Ａ）コントロール群（生理食塩水投与）、
Ｂ）１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液投与群（ＡＲＴＺ（登録商標）、科研製薬（株）、分子量約９０万）
Ｃ）２％精製アルギン酸ナトリウム溶液投与群（（株）キミカ製、滅菌、分子量約１００万）
Ｄ）１％精製アルギン酸ナトリウム溶液投与群（Ｓｅａ  Ｍａｔｒｉｘ（滅菌）、（株）キミカ製、分子量約１７０万）
Ｅ）２％精製アルギン酸ナトリウム溶液投与群（Ｓｅａ  Ｍａｔｒｉｘ（滅菌）、（株）キミカ製、分子量約１７０万）
各溶液５０μＬを、ＭＳＵ注入の１時間前に同関節部位に投与した。
（２）結果および考察
歩行状態スコアの経時的変化を図１５に示す。１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液投与群（Ｂ群）および２％アルギン酸ナトリウム溶液投与群（Ｃ群、Ｅ群）の歩行状態スコアは、対照群（Ａ群）に対し有意に低く、疼痛抑制効果が認められた。分子量約１７０万のアルギン酸ナトリウムにおける１％溶液と２％溶液の比較では、濃度依存的な疼痛抑制効果が認められた（Ｄ群、Ｅ群）。また、分子量１００万と１７０万の２％アルギン酸ナトリウム溶液では、粘度がそれぞれ約３００ｍＰａ・ｓおよび約５０００ｍＰａ・ｓと異なっているが、同等の疼痛抑制効果を示した。
ＭＳＵは関節内において、滑膜細胞や好中球に直接または間接的に作用し、サイトカインなどの産生を介して関節炎を発症させると考えられている（上記Ｓｈｉｚｕｈｉｋｏ  ＩＨＡＲＡら論文）。すなわち、ＭＳＵにより炎症反応が誘発されその結果として疼痛を引き起こす。アルギン酸ナトリウム溶液は、該モデルにおいて疼痛抑制効果を示し、変形性関節症治療薬および慢性関節リウマチにおける関節痛抑制薬として用いられているヒアルロン酸ナトリウムと同等の効果が認められた。アルギン酸の１価金属塩は、炎症および疼痛を抑制する効果を有することが確認され、変形性関節症、肩関節周囲炎等の治療薬として有用であり、関節リウマチにおける関節疼痛への適用も可能であると考えられた。
また、分子量４３万のアルギン酸ナトリウム（（株）キミカ製、滅菌）では、分子量１００万のアルギン酸ナトリウムよりも疼痛抑制効果が弱い傾向が認められた。アルギン酸の分子量の違いにより疼痛抑制効果に差があると考えられた。
【実施例７】
【００１２】
ウサギ肩腱板断裂モデルにおけるアルギン酸関節内投与の効果
（１）肩腱板断裂モデルの作製
日本白色家兎を用い、肩腱板断裂モデルを作製した。塩酸ケタミンを使用した全身麻酔下に、両肩関節の毛刈後、滅菌操作で肩関節を後方アプローチにて展開した。Ｏｍｏｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｍｕｓｃｌｅを切離し、両側棘下筋腱とその上腕骨頭側の腱付着部に１０×７ｍｍの欠損部を作成した。右肩関節内に２％精製アルギン酸ナトリウム溶液（Ｓｅａ  Ｍａｔｒｉｘ（滅菌）（株）キミカ製、分子量約１７０万）０．３ｍＬを注入した。左肩関節内にはコントロールとして生理食塩水（大塚製薬）０．３ｍＬを同様の手技にて注入した。術後、両側上肢の固定は行わず飼育ケージの中での自由に運動させた。手術後、週１回、５週間（計５回）、右肩へのアルギン酸溶液投与、左肩への生理食塩水投与を継続した後に、ペントバルビタールの大量静脈内投与により安楽死させ、肩関節組織標本を取得した。
（２）結果
肉眼で上腕骨骨頭部を観察したところ、コントロール群では腱断裂部に沿った部位に高度な軟骨欠損が認められたが、アルギン酸投与群では明らかな軟骨損傷は認められなかった（図１６）。アルギン酸ナトリウムは軟骨保護効果を示し、軟骨損傷の発生ならびに進展を抑制した。
【実施例８】
【００１３】
ウサギ変形性関節症モデル（前十字靭帯（ＡＣＬ）切除モデル）の膝関節摩擦係数の測定
（１）方法
実施例４と同様の方法でウサギＯＡモデル作製し、１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液（ＡＲＴＺ（登録商標）、科研製薬（株）、分子量約９０万、粘度約２３００ｍＰａ・ｓ）を投与したＯＡ膝関節標本（ｎ＝４）と、２％精製アルギン酸ナトリウム溶液（（株）キミカ製、滅菌、分子量約１００万）を投与したＯＡ膝関節標本（ｎ＝４）を取得し、Ｔａｎａｋａ．Ｅ．らの方法（Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ．２００４  Ｍａｙ；８３（５）：４０４−７）に準じて膝関節摩擦係数を測定した。各薬剤の投与は実施例４と同様に行い、前十字靭帯切除手術後９週目にウサギを安楽死させ、膝関節標本を取得した。測定は、膝屈曲角３０度、荷重１．８ｋｇ、測定時間１２０秒で各標本５回行った。対照群は正常関節（ｎ＝１）とした。
（２）結果
アルギン酸を投与したＯＡ膝関節標本では、ヒアルロン酸を投与したＯＡ膝関節標本より有意に低い摩擦係数を示した（図１７）。本来、正常関節の摩擦係数は低い数値を示すが、ＯＡの病態が進むと摩擦係数が増加し、摩擦係数の増加がさらに組織の破壊を促進する。アルギン酸を投与したＯＡ膝関節標本において摩擦係数が低いのは、ＯＡの病態が軽度であり、組織が良い状態に保たれていることを反映していると考えられた。すなわち、実施例４における肉眼的所見および組織学的評価において観察された組織状態が、膝関節摩擦係数に反映されているものと考えられた。
【実施例９】
【００１４】
ラット・コラーゲン誘発関節炎に対するアルギン酸関節内投与の効果
コラーゲン誘発関節炎モデル（ＣＩＡ）は、病態がヒトの関節リウマチ（ＲＡ）と酷似しており、関節リウマチのモデルとして多用されている。ラット・コラーゲン誘発関節炎モデルを作製し、アルギン酸ナトリウムの関節内投与の効果を検討した。
（１）モデル動物の作製
１０週齢のＤＡ／Ｓｌｃ（ＳＰＦ）雄性ラットを購入し、１週間の馴化の後実験に供した。ウシＩＩ型コラーゲン（コラーゲン技術研究会）を０．０１ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液に１．５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、等量のＦｒｅｕｎｄ’ｓ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ）を用いて乳濁液を作製した。この乳濁液をラットの背部皮内４〜６ヵ所に合計０．４ｍＬ（コラーゲン量：３００μｇ）投与（感作）し、関節炎を誘発した。
（２）被験物質の投与
以下の５群について各１０匹を用意した。
Ａ）コントロール群（生理食塩液投与）
Ｂ）１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液投与群（ＡＲＴＺ（登録商標）、科研製薬（株）、分子量約９０万）
Ｃ）２％精製アルギン酸ナトリウム溶液投与群（（株）キミカ製、滅菌、分子量約１００万）
Ｄ）１％精製アルギン酸ナトリウム溶液投与群（Ｓｅａ  Ｍａｔｒｉｘ（滅菌）、（株）キミカ製、分子量約１７０万）
Ｅ）２％精製アルギン酸ナトリウム溶液投与群（Ｓｅａ  Ｍａｔｒｉｘ（滅菌）、（株）キミカ製、分子量約１７０万）
各投与物質の投与液量はいずれも０．０５ｍＬ／ｒａｔとし、１ｍＬ注射筒及び２６Ｇ注射針を用いて動物の左後肢膝関節腔内に投与した。投与回数は１日１回、感作後０（コラーゲン投与日）、５、１０、１５、２０日の５回投与した。
（３）関節炎発症の肉眼的観察
感作後毎日，下記に示した基準により，左後肢足部を肉眼的に観察し，関節炎発症の有無及びその程度を評価した。
スコア０：Ｎｏｒｍａｌ
スコア１：Ｒｅｄｎｅｓｓ  ｉｓ  ｓｅｅｎ．
スコア２：Ｒｅｄｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｓｌｉｇｈｔ  ｅｄｅｍａ  ａｒｅ  ｓｅｅｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ｔｏｅｓ．
スコア３：Ｅｄｅｍａ  ｅｘｔｅｎｄｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｔｏｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｗ
スコア４：Ｓｅｖｅｒｅ  ｅｄｅｍａ  ｉｓ  ｓｅｅｎ．
スコア５：Ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｊｏｉｎｔ  ｉｓ  ｓｅｅｎ．
結果を図１８に示す。コントロール群では関節炎の急激な発症が感作後１４日より認められ，関節炎の程度は２５日まで増強した。感作後２５日目までに、全ての群で同等の発症度が得られたが、ヒアルロン酸投与群（Ｂ群）およびアルギン酸ナトリウム溶液投与群（Ｃ、Ｄ、Ｅ群）ではコントロール群に比べ発症が遅延する傾向が認められた。遅延の程度は、ヒアルロン酸投与群（Ｂ群）よりアルギン酸ナトリウム溶液投与群（Ｃ、Ｄ、Ｅ群）において強く認められた。被験物質は、関節における炎症を抑制している可能性が考えられた。
（４）病理組織学的評価
感作後２５日に，動物を安楽死させ，左後肢膝関節組織を摘出し、ホルマリン液固定し、１０％ＥＤＴＡ水溶液にて脱灰後、パラフィン固定した。Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｅ  ｅｏｓｉｎ染色及びＳａｆｒａｎｉｎ０染色を行い、組織学的評価を行った。コラーゲン関節炎の評価項目及び評価基準に従って、各項目を変化なし（評点０）、軽微（評点１）、軽度（評点２）、中等度（評点３）、高度（評点４）の５段階で評価した。滑膜について、炎症細胞浸潤、滑膜細胞増生、肉芽組織形成、線維化を観察し、評点化した結果を図１９に示す。膝蓋骨について、関節軟骨表面へのパンヌス形成（滑膜増生を含む）、関節軟骨の破壊（変性、線維化を含む）、骨の破壊（吸収）、サフラニン０染色性低下（プロテオグリカンの減少）を観察し、評点化した結果を図２０に示す。骨棘形成（反応性類骨形成、骨膜性骨新生）の観察は、最も骨棘が形成されやすい大腿骨外側顆を対象とした。結果を図２１に示す。有意差検定は、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定により行った。
滑膜において、アルギン酸ナトリウム溶液投与群（Ｃ、Ｄ、Ｅ群）は、コントロール群に対し、有意な滑膜細胞増生抑制効果、肉芽組織形成抑制効果、ならびに線維化抑制効果を示した。また、高分子量のアルギン酸のほうがより強い効果を示した。
膝蓋骨において、アルギン酸ナトリウム溶液投与群（Ｃ、Ｄ、Ｅ群）は、パンヌス形成、関節軟骨の破壊、ならびに骨の破壊の項目において、抑制傾向を示した。
大腿骨外側顆において、アルギン酸ナトリウム溶液投与群（Ｃ、Ｄ、Ｅ群）は、骨棘形成の抑制傾向を示した。また、高分子量のアルギン酸のほうがより強い効果を示した。
関節リウマチの発症には、滑膜の炎症・異常増殖と、活性化Ｔ細胞による過剰な免疫応答が関与しており、その結果として関節組織の破壊が進行するといわれている。アルギン酸ナトリウム溶液は、コラーゲン誘発関節炎モデル動物において、関節内投与により、滑膜組織の変性を強力に抑制した。また、骨および軟骨の破壊・変性に対しても抑制傾向を示した。関節リウマチにおける関節痛の治療に用いられているヒアルロン酸ナトリウム溶液と比較して、優れた組織変性抑制効果が認められた。アルギン酸塩溶液の関節内注入により、組織病変の進行の抑制ならびに改善といった、関節リウマチの治療効果を得られるものと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００１５】
本発明の関節疾患治療用組成物は、液体状態で関節内に注入することで、軟骨の修復効果、軟骨変性変化の抑制効果、軟骨保護効果、関節組織の炎症を抑制する効果、および／または関節組織の炎症による疼痛を抑制する効果、滑膜組織の変性抑制効果、および／または骨軟骨破壊抑制効果を有し、関節疾患の治療効果を発揮する。特に、変形性関節症の治療、肩関節周囲炎の治療、関節リウマチにおける関節痛の緩和、関節リウマチの治療に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図７】
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【図１２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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