(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）ＥＴ−３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１１５）を培養し、菌体から、総リン脂質におけるプラズマローゲン型リン脂質の割合を示すアルデヒド／リン比（Ａ／Ｐ比）が菌湿重量換算で０．７以上で、且つ次の一般式（１）
【化１】
0005530696.tif 000007
（式中、Ｒ1は炭素数１５又は１７の分岐鎖のアルキル基を示し、Ｒ2は炭素数１５の分岐鎖のアルキル基を示し、Ｘはエタノールアミン残基、グリセロール残基、コリン残基、セリン残基、イノシトール残基又はアンモニウム基を示す。）
で表されるプラズマローゲン型リン脂質を５５質量％以上含むプラズマローゲン型リン脂質を採取する、プラズマローゲン型リン脂質の製造方法。
【請求項２】
Ｒ1が１３−メチル−テトラデシル基、１２−メチル−テトラデシル基、１５−メチル−ヘキサデシル基又は１４−メチル−ヘキサデシル基であり、Ｒ2が１３−メチル−テトラデシル基又は１２−メチル−テトラデシル基である請求項１記載のプラズマローゲン型リン脂質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なプラズマローゲン型リン脂質及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体膜を構成する主要な脂質であるリン脂質には、グリセロール骨格のα位に脂肪酸がエステル結合した一般的なリン脂質の他に、ビニルエーテル結合を持つプラズマローゲン（Ｐｌａｓｍａｌｏｇｅｎ）型リン脂質（以下、単に「ＰＬ」とも称する）が含まれている。ＰＬは、特に脳に多く含まれ、ヒト神経細胞や肝臓細胞における解毒などを司るペルオキシソームの構成必須脂質成分である。その化学構造はエタノールアミン型のものが多く、グリセロール骨格のβ位にはドコサヘキサエン酸やアラキドン酸等の高度不飽和脂肪酸を有する。
【０００３】
近年、ＰＬについて抗酸化作用や脳のシグナル伝達への関与等いくつか報告がなされている。例えば、老人性認知症患者においては認知症の進行に伴い脳内ＰＬの減少が認められたとの報告があり、ＰＬを飲食品や医薬品に含有させることにより、アルツハイマー病等の脳疾患を予防することが提案されている（例えば、特許文献１）。
【０００４】
ＰＬは、従来、牛の脳や心筋等から抽出・分離されているが、煩雑な操作を伴うばかりでなく、安定的な供給が難しいといった問題があった。また、ＰＬの化学合成品は存在しない。
そこで、ＰＬを工業的に有利に製造する検討が行われ、例えば、ホヤ、ヒトデ等の水産動物からプラズマローゲン含有脂質を抽出する方法（特許文献２）や、ニワトリ表皮中からプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンを含む複合脂質画分を抽出する方法（特許文献３）等が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−２６８０３号公報
【特許文献２】特開２００７−２６２０２４号公報
【特許文献３】特開２００６−２３２９６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、例えば特許文献２のようにホヤ等の水産動物からプラズマローゲン含有脂質を抽出する方法では、脂質中のＰＬ含量が低いため大量に供給することが難しく、また、抽出過程において内臓由来の有機錫等の毒性物質が混入する危険がある。ＰＬを飲食品や医薬品として使用することを考慮すると、純度を高くすることだけでなく、高い安全性が求められる。
一方、ルーメン細菌等の微生物が、ＰＬ含有リン脂質をその菌体内に含有していることが報告されており（Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６，２９−３７（１９７０）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１４１，Ｎｏ．２，８８８−８９８（１９８０））、この場合従来のような煩雑な抽出工程は不要であるが、ＰＬ含量が低いことと、培養時に硫化水素が発生するという問題があった。
【０００７】
従って、本発明の課題は、安全性の高いプラズマローゲン型リン脂質を、簡便に且つ効率良く製造することのできる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討したところ、チーズ等の製造に用いられている安全性の高いプロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物の細胞膜にＰＬが高濃度に蓄積されていることを見出した。そして、さらに当該菌体内に蓄積されたＰＬが、グリセロール骨格のα位及びβ位に分岐状アルキル基を有する新規化合物を含むものであることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、次の一般式（１）
【００１０】
【化１】
0005530696.tif 000002
【００１１】
（式中、Ｒ1は炭素数１５又は１７の分岐鎖のアルキル基を示し、Ｒ2は炭素数１５の分岐鎖のアルキル基を示し、Ｘはエタノールアミン残基、グリセロール残基、コリン残基、セリン残基、イノシトール残基又はアンモニウム基を示す。）
で表されるプラズマローゲン型リン脂質を提供するものである。
また、本発明は、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）に属する微生物を培養し、菌体からプラズマローゲン型リン脂質を採取するプラズマローゲン型リン脂質の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、プラズマローゲン型リン脂質を簡便な操作で容易に、しかも効率良く得ることができ、安全性の高いプラズマローゲン型リン脂質を大量に安定的に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】一次元薄層クロマトグラフィーによるリン脂質画分の展開結果を示す図である。
【図２】二次元薄層クロマトグラフィーによるリン脂質画分の展開結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
一般式（１）中、Ｒ1は炭素数１５又は１７の分岐鎖のアルキル基を示す。分岐鎖のアルキル基としては、末端がイソプロピル基であるイソ型又は末端がｓｅｃ−ブチル基であるアンチイソ型が好ましい。具体的には、１３−メチル−テトラデシル基、１２−メチル−テトラデシル基、１５−メチル−ヘキサデシル基、１４−メチル−ヘキサデシル基等が挙げられる。
【００１５】
一般式（１）中、Ｒ2で示される炭素数１５の分岐鎖のアルキル基としては、上記と同義である。
【００１６】
一般式（１）中、Ｘはエタノールアミン残基、グリセロール残基、コリン残基、セリン残基、イノシトール残基又はアンモニウム基を示すが、エタノールアミン残基又はグリセロール残基が好ましい。
【００１７】
本発明のプラズマローゲン型リン脂質は、常法に従って、プロピオニバクテリウム属に属する微生物を培養し、菌体からリン脂質画分を抽出することにより得ることができる。
【００１８】
ここで、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）に属する微生物としては、例えば、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（Ｐ．ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）、プロピオニバクテリウム・オーストラキエンス（Ｐ．ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｅ）、プロピオニバクテリウム・アラビノサム（Ｐ．ａｒａｂｉｎｏｓｕｍ）、プロピオニバクテリウム・アビダム（Ｐ．ａｖｉｄｕｍ）、プロピオニバクテリウム・シクロヘキサニカム（Ｐ．ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｉｃｕｍ）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ・サブスピーシーズ・フロイデンライヒ（Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ・サブスピーシーズ・シェルマニー（Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．Ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム・グラニュロサム（Ｐ．ｇｒａｎｕｌｏｓａｍ）、プロピオニバクテリウム・イノキュウム（Ｐ．ｉｎｎｏｃｕｕｍ）、プロピオニバクテリウム・ジェンセニー（Ｐ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム・リンホフィラム（Ｐ．ｌｙｍｐｈｏｐｈｉｌｕｍ）、プロピオニバクテリウム・ミクロアエロフィルム（Ｐ．ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、プロピオニバクテリウム・プロピオニキュム（Ｐ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、プロピオニバクテリウム・トエニー（Ｐ．ｔｈｏｅｎｉｉ）等が挙げられる。なかでもプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒが好ましく、特にプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）ＥＴ−３株（平成１３年８月９日付で、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１１５として寄託）が好ましい。
【００１９】
プロピオニバクテリウム属に属する微生物を培養する培地は、プロピオン酸菌の培養に用いられるものであれば特に制限されないが、炭素源を含有する培地が好ましく、本発明における炭素源とは、プロピオン酸菌が資化できる炭素源をいう。例えば、乳糖、ブドウ糖、乳酸、グリセロール、グルテン、セルロース等が挙げられ、特にブドウ糖、乳糖が好ましい。このうち、炭素源として乳糖を含有させた培地としては、ホエイ粉、カゼイン、脱脂粉乳、或いはホエイを透析処理して乳糖含量を減らしたホエイ蛋白質濃縮物、或いは乳糖含量を更に高純度に分離したホエイ蛋白質分離物が挙げられる。これらはそのまま、或いはプロテアーゼ処理して用いることも可能である。また、培地には、必要に応じて、乳清ミネラル等のミネラル類；トリプチケース等のペプトン；酵母エキス、フィトン、大豆エキス等を添加してもよく、これらを多く含有する食品を用いることもできる。あるいはこれらの酵素処理物を用いてもよい。培地成分は、市販品を用いてもよい。
【００２０】
微生物の培養は、公知の各種好気的又は嫌気的培養方法を用いることができるが、液体培地による嫌気培養法が大量生産の点から好ましい。嫌気的条件は、例えば窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス、水素ガス、その他不活性ガスを１種又は２種以上組み合わせることが可能で、中でも窒素ガス又は炭酸ガス雰囲気下の条件とするのが好ましい。プロピオニバクテリウム属に属する微生物の培地への添加量は、必要に応じて適宜変更し得る。
【００２１】
嫌気的培養法における培養中の培養温度は２０〜４０℃が好ましく、２５〜４０℃がより好ましい。また、このときの培地ｐＨ（２５℃）は中性〜微酸性、具体的にはｐＨ５．０〜８．０に調整することが好ましく、６．０〜７．５がより好ましく、さらに好ましくは６．２〜７．０である。当該培養期間は０．５〜１２日間が好ましく、１〜１２日間がより好ましい。ｐＨを調整する緩衝剤としては、炭酸、酢酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸、グルコン酸、酒石酸等の有機酸塩、リン酸、塩酸、硫酸等の無機塩、水酸化ナトリウム等の水酸化物、アンモニア又はアンモニア水等が挙げられ、これらを単独又は２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００２２】
また、好気的培養法における培養中の培養温度は２０〜４０℃が好ましく、３０〜４０℃がより好ましい。また、このときの培地ｐＨは中性〜微酸性、具体的には５．０〜８．０に調整することが好ましく、６．０〜７．５がより好ましく、さらに好ましくは６．２〜７．０である。当該培養期間は１〜１０日間が好ましく、３〜７日間がより好ましい。
【００２３】
培養終了後、通常の遠心分離法等によって集菌する。菌体は生菌を用いてもよいが、死菌であってもよく、湿潤菌体、乾燥菌体（噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、ドラム乾燥などによって得られる）等であってもよい。また、培養液そのものを用いてもよく、滅菌処理した培養液を用いてもよい。なかでも、生菌を用いるのが好ましい。
【００２４】
菌体からリン脂質を抽出するのに使用する有機溶媒は、特に制限されず、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、へキサン、酢酸エチル、アセトン、ジエチルエーテル、クロロホルム等が挙げられる。これらは１種又は２種以上を適宜選択して用いることができる。リン脂質の抽出画分は、ロータリーエバポレーター等を使用し濃縮するのが好ましい。また、必要に応じて、弱アルカリ処理等によりプラズマローゲン型リン脂質の精製を行ってもよい。
【００２５】
かくして得られるリン脂質には、プラズマローゲン型リン脂質が多く含まれる。本発明において、総リン脂質におけるプラズマローゲン型リン脂質の割合を示すアルデヒド／リン比（Ａ／Ｐ比）は、菌湿重量換算で、０．４５以上であるのが好ましく、さらに０．５以上、特に０．７以上であるのが好ましい。なお、リン脂質には、プラズマローゲン型リン脂質以外の公知のリン脂質、例えばグリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、リゾリン脂質等が含まれていてもよい。また、リン脂質以外の脂質成分（油脂等）が含まれていてもよい。
【００２６】
また、本発明のプラズマローゲン型リン脂質は、上記一般式（１）で表されるプラズマローゲン型リン脂質の含有量が４０質量％（以下、単に「％」とする）以上であるのが好ましく、さらに５０％以上、特に５５％以上であるのが好ましい。
【００２７】
プラズマローゲン型リン脂質の組成は、常法に従って測定することができる。例えば、グリセロール骨格のα位の炭化水素基部分、β位の脂肪酸部分の分析は、ガスクロマトグラフィーで評価することにより行うことができる。また、リン脂質の親水基部分の分析は、公知の分離法、例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、カラムクロマトグラフィー法、質量分析法、アセトン分画等の溶媒分画法等を用いて行うことができる。具体的には、後記記載の方法で測定することができる。
【００２８】
プラズマローゲン型リン脂質は、コレステロールを含むリン脂質膜の酸化安定性、細胞膜やリポタンパク質の抗酸化性に寄与し、また脳のシグナル伝達に重要な役割を有することから、本発明のプラズマローゲン型リン脂質を、例えば、医薬として投与することにより、或いは特定保健用食品等の特別用途食品、栄養機能食品として摂取することにより、あるいはまた、各種食品（牛乳、発酵乳、ヨーグルトその他）に添加しておきこれを摂取することによって、生体内組織の脂質の過酸化を抑制し、また、アルツハイマー病等の脳疾患を予防・治療等することが可能である。
【００２９】
本発明のプラズマローゲン型リン脂質を医薬品として使用する場合には、種々の形態で投与することができる。その形態として、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与をあげることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主剤に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味、矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化することができる。
【００３０】
また、本発明に係るプラズマローゲン型リン脂質を飲食品として使用する場合には、各種補助剤や他の飲食品を用いて、ドリンク、錠剤、その他各種の飲食品にしたり、飲食品に直接添加したりする等、各種の方法を利用することができる。このように飲食品にすることで、長期間に亘って摂取することが可能である。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００３２】
実施例１
＜試薬＞
・２％  ２，４−ジニトロフェニルヒドラジンＨＣｌメタノール液；予め乾燥しておいた２，４−ジニトロフェニルヒドラジンを、ＨＣｌメタノール液に２％（ｇ／ｖｏｌ）になるように溶解した。
・ＨＣｌメタノール液；メタノール（５００ｍｌ）に、乾燥ＨＣｌガスを吹き込み調製した。
・ＮａＯＨ・ペルオキソ二硫酸カリウム溶液；水５００ｍｌにＮａＯＨ  ３．５ｇを溶かした後、ペルオキソ二硫酸カリウム１５ｇを溶解した。
・モリブデン酸アンモニウム溶液；（ＮＨ4）６Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ  ９．６ｇを、水に溶かして１０００ｍｌとした。
・酒石酸アンチモニルカリウム溶液；酒石酸アンチモニルカリウム０．６６７ｇを水に溶かして１００ｍｌとした。
・アスコルビン酸溶液；Ｌ−アスコルビン酸１０ｇを水に溶かして１００ｍｌとした。
・Ｄｉｔｔｍｅｒ−Ｌｅｓｔｅｒ試薬；（Ａ液）１２．５Ｍ  Ｈ2ＳＯ4  １Ｌに三酸化モリブデン４０．１ｇを加え、緩やかに煮沸して溶解した。（Ｂ液）Ａ液  ５００ｍｌに粉末モリブデン１．７８ｇ  を加え１５分間煮沸した後、室温に戻し、上清をデカンテーションで採取した。使用時に、Ａ液とＢ液を等量混ぜ、さらに混合液の２倍量の水を加えた後、ＴＬＣプレートに噴霧した。
【００３３】
＜方法＞
１．菌の培養
供試菌；Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉＥＴ−３株（明治乳業生菌）
培地；ＴＹＧ培地（トリペプトン  １％、酵母エキス  １％、グルコース  ０．５％、ＮａＣｌ  ０．５％、レサズリン（１ｍｇ／ｍＬ）  １ｍＬ／Ｌ、１Ｍ  ＮａＯＨ（培地ｐＨ調整用））
【００３４】
（１）上記成分（トリペプトン、酵母エキス、グルコース、ＮａＣｌ）を計量し、ビーカーに入れ、蒸留水を加えてスターラーで撹拌した後、レサズリンを加え、ｐＨを７．０に調整し、その後蒸留水を加え最終調製量までｆｉｌｌ  ｕｐし、培地を調製した。
（２）１２０℃で５分間オートクレーブした後、Ｎ2ガスを吹き込みながら、分注した。さらに、１１８℃で１０分間オートクレーブした。
（３）菌を接種後、３０℃で、約４８時間嫌気培養した。
【００３５】
２．リン脂質の抽出
（１）集菌後、菌体を０．０５Ｍ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。
（２）（１）の菌に、エタノール：エーテル（３：１）を混合し、リン脂質を抽出後、遠心し、上清をエバポレータ用ナス型フラスコに移した。
（３）（２）の残渣に、クロロホルム：メタノール（１：３）を混合し、脂質を抽出後、遠心し、上清を（２）で用意したエバポレータ用ナス型フラスコに移した（エタノール：エーテル（３：１）と混合）。
（４）回収した上清の混合液をエバポレータで濃縮乾固した。
（５）（４）のナス型フラスコにジエチルエーテルを入れ、リン脂質を溶解した後、下記の分析に供した。
【００３６】
３．アルデヒド／リン比（Ａ／Ｐ比）の測定
上記より得られたサンプルを、１０μｌ、５０μｌ、１００μｌに分注した（各３本×アルデヒド定量用・リン定量用）。
【００３７】
（１）アルデヒドの定量
(i)シリカゲル薄層プレートに、スタンダード（パルミトアルデヒド-２，４-ジニトロフェニルヒドラゾン誘導体）と分注したサンプルをスポットした。別にＢｌａｎｋも設けた。ドライヤー（冷風）で乾かした後、原点部分に２％  ２，４−ジニトロフェニルヒドラジンＨＣｌメタノール液を噴霧した。
(ii)３０〜６０分後、石油エーテル：エーテル（８：２）で展開した。
(iii)展開終了後、スタンダードと同Ｒｆ値を示す黄色スポットをかきとり、エッペンドルフチューブへ入れた。
(iv)(iii)に、クロロホルム１ｍＬを入れて混和し、遠心後、上清を別のエッペンドルフチューブへ移した。
(v)(iv)をサンプルとして、分光光度計で波長３７０ｎｍにおける吸光度を測定した。
(vi)検量線から濃度を読み取り、アルデヒド含量を定量した。
【００３８】
（２）リンの定量
(i)分注したサンプルを分解瓶に移した。これをデシケーターに入れ、乾燥させた。
(ii)(i)の分解瓶に蒸留水を入れ、次にＮａＯＨ・ペルオキソ二硫酸カリウム溶液を加え、密栓し（バイアル瓶用テフロン（登録商標）ラミネート栓使用）、混和した。同様の手順でＢｌａｎｋも作成した。
(iii)(ii)を１２０℃で３０分間オートクレーブした。
(iv)サンプルを５０ｍｌ比色管にいれ、分解瓶の洗液も加え、蒸留水で２０ｍｌにｆｉｌｌ  ｕｐした。
(v)１％フェノールフタレインアルコール指示薬を１滴加え、０．０４Ｍ  ＮａＯＨ（または０．０２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4）で中和した。
(vi)２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4  ５ｍｌ、モリブデン酸アンモニウム溶液５ｍｌを加えて混和後、混合試薬（酒石酸アンチモニルカリウム溶液：Ｌ−アスコルビン酸溶液（１：１））を調製し、これを４ｍｌ加え、蒸留水で５０ｍｌにｆｉｌｌ  ｕｐした。
(vii)(vi)をよく混和し、室温で１０分間置いたあと、分光光度計で波長８８０ｎｍにおける吸光度を測定した。検量線からリン含量を定量した。
【００３９】
（３）Ａ／Ｐ比の算出
上記（１）アルデヒドの定量結果、（２）リンの定量結果を基に下記式に従って算出した。
Ａ／Ｐ比＝アルデヒド含量（μｍｏｌ）／リン含量（μｍｏｌ）
【００４０】
４．リン脂質クラス分析
（１）一次元薄層クロマトグラフィー
(i)サンプルをシリカゲル薄層プレートにスポット後、ドライヤー（冷風）で原点を乾かした。
(ii)クロロホルム：メタノール：水（超純水）（６５：２５：４）で展開した。
(iii)展開終了後、プレートを真空デシケーターに入れ、吸引した。
(iv)ヨウ素、１％ニンヒドリン−アセトン溶液、Ｄｉｔｔｍｅｒ−Ｌｅｓｔｅｒ試薬で発色させた。
【００４１】
（２）二次元薄層クロマトグラフィー
(i)サンプルをシリカゲル薄層プレートにスポット後、ドライヤー（冷風）で原点を乾かした。
(ii)クロロホルム：メタノール：水（超純水）（６５：２５：４）で展開した。（一次元）
(iii)展開終了後、溶媒のあがった位置に鉛筆で線を引き、プレートを真空デシケーターに入れ、吸引した。
(iv)吸引後、真空デシケーターからプレートを取り出し、サンプルを展開した部分が原点となるようにプレートを９０℃回転させた。
(v)新たにサンプルを１点スポットし、ドライヤー（冷風）で乾かした。
(vi)クロロホルム：メタノール：２８％アンモニア水（６５：３５：８）で展開した。（二次元）
(vii)展開終了後、ｆｒｏｎｔ位置に鉛筆で線を引き、プレートを真空デシケーターに入れ、吸引した。
(viii)Ｄｉｔｔｍｅｒ−Ｌｅｓｔｅｒ試薬で発色させた。
【００４２】
５．プラズマローゲン型リン脂質クラスの分析
(i)シリカゲル薄層プレートにサンプルをスポットし、ドライヤー（冷風）で原点を乾かした。
(ii)クロロホルム：メタノール：水（超純水）（６５：２５：４）で展開した。
(iii)展開終了後、プレートを真空デシケーターに入れ、一晩吸引した。
(iv)翌日、真空デシケーターからプレートを取り出し、サンプルを展開した部分が原点となるようにプレートを９０℃回転させた。
(v)(iv)で定めた原点に、２％  ２，４−ジニトロフェニルヒドラジンＨＣｌメタノール液を噴霧した。
(vi)(v)を真空デシケーター中で約３０分吸引乾燥した。
(vii)(vi)を石油エーテル：エーテル（８：２）で展開した。
(viii)(vii)のプレートより、黄色のスポットをかきとり、それぞれエッペンドルフチューブに入れた。
(ix)(viii)にクロロホルム１ｍｌを加え、混和し、遠心した。遠心終了後、上清を別のエッペンドルフチューブへ移した。
(x)(ix)をサンプルとして、分光光度計で波長３７０ｎｍにおける吸光度を測定した。検量線から濃度を読み取り、アルデヒド含量を求めた。
【００４３】
６．プラズマローゲン型リン脂質における脂肪アルデヒド組成の分析
（１）ヒドラゾン誘導体の回収
(i)サンプルとスタンダードをシリカゲル薄層プレートにスポットし、ドライヤー（冷風）で原点を乾かした。
(ii)原点部分に２％  ２，４−ジニトロフェニルヒドラジンＨＣｌメタノール液を噴霧し、３０〜６０分後、石油エーテル：エーテル（８：２）で展開した。
(iii)展開終了後、サンプル部分より、スタンダードと同列の黄色いスポットをかきとり、試験管へ入れた。クロロホルムをいれ、よく混和後遠心し、上清（クロロホルム）を回収し、別の試験管へうつし、Ｎ2ガスで乾燥した。
【００４４】
（２）脂肪アルデヒドの再生
(iv)レブリン酸：１Ｎ  ＨＣｌ（９：１）とジクロロメタンを(iii)に入れ混和後、沸騰水中で１２分加熱した後、超純水を加えた。
(v)(iv)にヘキサンを加えて混和したあと、ヘキサンを回収し、別の試験管へうつし、Ｎ2ガスで乾燥した。
【００４５】
（３）脂肪アルコールへの還元
(vi)(v)に再びジエチルエーテルを入れ、そこへＬｉＡｌＨ4を加えた。５分間室温放置後超純水を加えた。
(vii)(vi)にジエチルエーテルを加え、１０Ｎ  Ｈ2ＳＯ4を３〜４滴加えた後、よく混和し、エーテル層を回収し、別の試験管にうつした。これをＮ2ガスで乾燥した。
（４）アセチル化
(viii)ピリジン：無水酢酸（２：１）を(vii)の試験管に加え、よく混和後、３５℃のウォーターバスで１５分加温したあと、超純水を加えた。
(ix)(viii)にペンタンを入れよく混和した。その後ペンタンを回収し、別の試験管にうつした。
（ｘ）回収したペンタンに１Ｎ  ＨＣｌを加えて混和し、ピリジン臭を除いたあと、ペンタン層を回収した。これをガスクロマトグラフィーで分析した。なお、標準物質については、１２：０（ナカライテスク（株））、１４：０（ナカライテスク（株））、１５：０（シグマ社製）、１６：０（ナカライテスク（株））、１６：１（ナカライテスク（株））、１７：０（シグマ社製）、１８：０（ナカライテスク（株））、１８：１（ナカライテスク（株））を用い、イソおよびアンチイソ標準物質は、Ａｎaｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１９，１２４３−１２４９（２００３）記載の方法に従って調製した。
【００４６】
（分析条件）
ガスクロマトグラフ:  G３８１０F（Yanaco）
カラム：キャピラリーＧＣカラム：１２２−７０３２DB-WAX（Agilent Technologies）、３０ｍ×０．２５０ｍｍ、膜厚０．２５μｍ
キャリアガスI：He（ メイクアップガス）１３ｍＬ／ｍｉｎ
キャリアガスII: He（キャピラリーカラム）１ｍL/ｍｉｎ
スプリット比：２０：１
インジェクター：Ｔ＝２３０℃
ディテクター：ＦＩＤ、Ｔ＝２５０℃
オーブン温度：０．５℃／分で７０℃〜２００℃まで昇温
【００４７】
７．プラズマローゲン型リン脂質におけるリゾリン脂質脂肪酸組成の分析
（１）リゾリン脂質の分離、回収
(i)サンプルにＨＣｌメタノール液を加え、処理したものを、シリカゲル薄層プレートにスポットした。プレートを３レーンに分け、両端（発色用）と、中央部分（かきとり・分析用）にスポットした。
(ii)クロロホルム：メタノール：水（超純水）（６５：２５：４）で展開した。
(iii)展開終了後、両端を切り取り、Ｄｉｔｔｍｅｒ−Ｌｅｓｔｅｒ試薬で発色させた。
(vi)(iii)の結果をもとにして、リゾリン脂質のスポットと同Ｒｆ値の部分を発色せずに残しておいたプレート中央部分からかきとり、これを分解瓶に入れた。
(v)(vi)に０．５Ｎ  ＫＯＨを入れ、密栓し（テフロン（登録商標）栓使用）、よく混和したあと、オートクレーブした。（１１８℃、１０時間）
(vi)オートクレーブが終了した(v)のサンプルを試験管うつし、１Ｎ  ＨＣｌで酸性にした。
(vii)(vi)にジエチルエーテルを入れ、リゾリン脂質由来の脂肪酸を抽出した。脂肪酸をＮ2ガス下で乾燥した。
【００４８】
（２）脂肪アルコールへの還元
(viii)脂肪酸をジエーテル中でＬｉＡｌＨ4で脂肪アルコールに還元した後、Ｎ2ガスで乾燥した。
（３）アセチル化
(ix)ピリジン：無水酢酸（２：１）を(viii)の試験管に加え、よく混和後、３５℃のウォーターバスで１５分加温したあと、超純水を加えた。
(x)(ix)にペンタンを入れよく混和した。その後ペンタンを回収し、別の試験管にうつした。
(xi)回収したペンタンに１Ｎ  ＨＣｌを加えて混和し、ピリジン臭を除いたあと、ペンタン層を回収した。これをガスクロマトグラフィーで分析した。
【００４９】
ガスクロマトグラフ:  G３８１０F（Yanaco）
カラム：キャピラリーＧＣカラム：１２２−７０３２DB-WAX（Agilent Technologies）、３０ｍ×０．２５０ｍｍ、膜厚０．２５μｍ
キャリアガスI：He（ メイクアップガス）１３ｍＬ／ｍｉｎ
キャリアガスII: He（キャピラリーカラム）１ｍL/ｍｉｎ
スプリット比：２０：１
インジェクター：Ｔ＝２３０℃
ディテクター：ＦＩＤ、Ｔ＝２５０℃
オーブン温度：０．５℃／分で７０℃〜２００℃まで昇温
【００５０】
８．プラズマローゲン型リン脂質における脂肪アルデヒド及びリゾリン脂質脂肪酸における各種脂肪酸の割合の測定
それぞれのＧＣ分析チャートの各ピークから質量を測定し、全検出脂肪酸に対する各脂肪酸の含有割合（質量％）を求めた。
【００５１】
９．水分含量及び単位重量あたりにおける総リン脂質含量の測定
培地は上記と同様のＴＹＧ培地を用いた。
菌を４８時間培養後、遠心し、上清を除いた。これを−８０℃で凍らせたあと、凍結乾燥した。重量測定を行い、重量の変化が見られなくなった点で終了とした。測定した水分含量から、単位重量あたりにおける総リン脂質含量を算出した。リン脂質は、グリセリド骨格のα位及びβ位に炭素数１５のイソ体を有する総ホスファチジルグリセロールを対象とした。
【００５２】
＜結果＞
１．アルデヒド／リン比（Ａ／Ｐ比）
菌２０．５３ｇ（菌湿重量）におけるアルデヒド含量は５．７μｍｏｌ、リン含量は６．９μｍｏｌであった。従って、Ａ／Ｐ比は０．８３であり、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物には、プラズマローゲン型リン脂質が高濃度で蓄積されていることが確認された。
【００５３】
２．リン脂質のクラス組成
結果を図１及び図２に示す。総リン脂質中、グリセロール型とエタノールアミン型の割合は、約９：１であった。
【００５４】
３．プラズマローゲン型リン脂質のクラス組成
各リン脂質スポットより得られた脂肪アルデヒドの量（かきとったスポットに含まれる量）は、ホスファチジルグリセロール由来が７．８０×１０-2（μｍｏｌ）、ホスファチジルエタノールアミン由来が０．５５×１０-2（μｍｏｌ）であった。従って、プラズマローゲン型リン脂質中、グリセロール型とエタノールアミン型の割合は、約１５６：１１（９３．４％がグリセロール型、６．６％がエタノールアミン型）であることから、菌２０．５３ｇ（菌湿重量）中のアルデヒド含量５．７（μｍｏｌ）のうち、５．３２（μｍｏｌ）がグリセロール型であり、０．３８（μｍｏｌ）がエタノールアミン型であるものと計算できる。
【００５５】
４．脂肪アルデヒド組成及びその含有割合
結果を表１に示す。表１はガスクロマトグラフィーにおいて検出された順序（溶出順）に示されている。表１に示すとおり、グリセロール骨格のα位に炭素数１５又は１７の分岐型炭化水素基を有するプラズマローゲン型リン脂質が確認された。
【００５６】
【表１】
0005530696.tif 000003
【００５７】
５．リゾリン脂質脂肪酸組成及びその含有割合
結果を表２に示す。表２はガスクロマトグラフィーにおいて検出された順序（溶出順）に示されている。表２に示すとおり、グリセロール骨格のβ位に炭素数１５の分岐型脂肪酸残基を有するプラズマローゲン型リン脂質が確認された。
【００５８】
【表２】
0005530696.tif 000004
【００５９】
６．水分含量及び単位重量あたりにおける総リン脂質含量
菌２０．５３ｇ（菌湿重量）における水分含量は１６．９４ｇであった。
菌２０．５３ｇ（菌湿重量）中、総リン脂質含量は６．９μｍｏｌであったことから、リン重量を算出すると２１４．３１μｇ、グリセリド骨格のα位及びβ位に炭素数１５のイソ体を有するホスファチジルグリセロール重量は４．９３ｍｇであり、その単位重量あたりにおける総含量は、０．２４ｍｇ／ｇ（菌湿重量）、１．３７ｍｇ／ｇ（菌乾重量）と含有率が高かった。
【００６０】
比較例１
＜方法＞
１．生きたホヤ（１０個）から内臓を摘出し、上記実施例１の「２．リン脂質の抽出」と同様にしてリン脂質を抽出し、サンプルとした。
２．サンプルを、上記実施例１の「３．アルデヒド／リン比（Ａ／Ｐ比）の測定」、及び「６．プラズマローゲン型リン脂質における脂肪アルデヒド組成の分析」と同様にして分析した。
【００６１】
＜結果＞
１．アルデヒド／リン比（Ａ／Ｐ比）
ホヤ内臓中の総リン脂質におけるプラズマローゲン型リン脂質の割合（Ａ／Ｐ比）は、０．２５であった。
【００６２】
２．脂肪アルデヒド組成
結果を表３に示す。表３に示すとおり、ホヤの内臓から得られるプラズマローゲン型リン脂質は、グリセロール骨格のα位に主に炭素数１４，１６及び１８の直鎖状炭化水素基を有するものであった。
【００６３】
【表３】
0005530696.tif 000005
【００６４】
比較例２
サンプルとして牛脳由来のプラズマローゲン（エタノール型プラズマローゲン：９０％純標品、フナコシ薬品（株））を用いた。
＜方法＞
サンプルを、上記実施例１の「６．プラズマローゲン型リン脂質における脂肪アルデヒド組成の分析」と同様にして分析した。
【００６５】
＜結果＞
表４に示すとおり、牛脳由来のプラズマローゲンは、グリセロール骨格のα位に主に炭素数１６及び１８の直鎖状炭化水素基を有するものであった。
【００６６】
【表４】
0005530696.tif 000006
【図１】
0005530696.tif 000008
【図２】
0005530696.tif 000009