(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のオリゴヌクレオチドであって、それぞれのオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＸｐＺｑを有し、式中、
Ｎは、アデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）、およびチミジン／ウリジン（Ｔ／Ｕ）から成る群から選択される、４重縮重ヌクレオチドであり、
Ｘは、Ｂ、Ｄ、Ｈ、およびＶから成る群から選択される、３重縮重ヌクレオチドであって、Ｂは、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕから成る群から選択され、Ｄは、Ａ、Ｇ、およびＴ／Ｕから成る群から選択され、Ｈは、Ａ、Ｃ、およびＴ／Ｕから成る群から選択され、Ｖは、Ａ、Ｃ、およびＧから成る群から選択される、３重縮重ヌクレオチドであり、
Ｚは、Ｋ、Ｍ、Ｒ、およびＹから成る群から選択される、２重縮重ヌクレオチドであって、Ｋは、ＧおよびＴ／Ｕから成る群から選択され、Ｍは、ＡおよびＣから成る群から選択され、Ｒは、ＡおよびＧから成る群から選択され、Ｙは、ＣおよびＴ／Ｕから成る群から選択される、２重縮重ヌクレオチドであり、
ｍ、ｐ、およびｑは、整数であり、ｍは、０または２〜２０の間の整数であり、ｐおよびｑは、０〜２０の間の整数であるが、ただし、２つの整数が０ではないか、または、ｍおよびｑの両方が０であるかのどちらか一方であり、さらに、少なくとも２つのＮ残基を有する、Ｎを含むオリゴヌクレオチドは、前記２つのＮ残基を分離させる、少なくとも１つのＸまたはＺ残基を有する、
複数のオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
１つの整数が、０であり、前記オリゴヌクレオチドの式が、ＮｍＸｐ、ＮｍＺｑ、およびＸｐＺｑから成る群から選択され、式中、ｍは、２〜８の間の整数であり、ｐおよびｑは、それぞれ、１〜８の間の整数であり、前記２つの整数の合計が、９である、請求項１に記載の複数のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
ｍおよびｑの両方が、０であり、前記オリゴヌクレオチドの式は、Ｘｐであって、式中、ｐが、２〜２０の間の整数である、請求項１に記載の複数のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
それぞれのオリゴヌクレオチドが、５′末端に非縮重ヌクレオチドの配列をさらに含み、前記非縮重配列が、前記複数のオリゴヌクレオチドの中で一定であり、前記一定の非縮重配列が、１４ヌクレオチド〜２４ヌクレオチド長である、請求項１に記載の複数のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
標的核酸群を増幅するための方法であって、
（ａ）前記標的核酸群を複数のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させて、複数の核酸プライマー二本鎖を形成するステップであって、前記オリゴヌクレオチドプライマーのそれぞれが、式ＮｍＸｐＺｑを有し、式中、
Ｎは、アデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）、およびチミジン／ウリジン（Ｔ／Ｕ）から成る群から選択される、４重縮重ヌクレオチドであり、
Ｘは、Ｂ、Ｄ、Ｈ、およびＶから成る群から選択される、３重縮重ヌクレオチドであって、Ｂは、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕから成る群から選択され、Ｄは、Ａ、Ｇ、およびＴ／Ｕから成る群から選択され、Ｈは、Ａ、Ｃ、およびＴ／Ｕから成る群から選択され、Ｖは、Ａ、Ｃ、およびＧから成る群から選択される、３重縮重ヌクレオチドであり、
Ｚは、Ｋ、Ｍ、Ｒ、およびＹから成る群から選択される、２重縮重ヌクレオチドであって、Ｋは、ＧおよびＴ／Ｕから成る群から選択され、Ｍは、ＡおよびＣから成る群から選択され、Ｒは、ＡおよびＧから成る群から選択され、Ｙは、ＣおよびＴ／Ｕから成る群から選択される、２重縮重ヌクレオチドであり、
ｍ、ｐ、およびｑは、整数であり、ｍは、０または２〜２０の間の整数であり、ｐおよびｑは、０〜２０の間の整数であるが、ただし、２つの整数が０ではなく、さらに、少なくとも２つのＮ残基を有する、Ｎを含むオリゴヌクレオチドは、前記２つのＮ残基を分離させる少なくとも１つのＸまたはＺ残基を有する、
ステップと、
（ｂ）前記複数の核酸プライマー二重鎖を複製して、複製鎖のライブラリーを作成するステップであって、複製鎖の量がステップ（ａ）で使用する標的核酸の量を超過し、前記超過が前記標的核酸群の増幅を示唆する、ステップと、
を含む、方法。
【請求項６】
前記複数のオリゴヌクレオチドプライマーの式が、ＮｍＸｐ、ＮｍＺｑ、およびＸｐＺｑから成る群から選択され、ｍは、２〜８の間の整数であり、ｐおよびｑは、それぞれ、１〜８の間の整数であり、前記２つの整数の合計が、９である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｎを含む前記オリゴヌクレオチドプライマーが、３つ以下の連続Ｎ残基を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドプライマーのそれぞれが、ＫＮＮＮＫＮＫＮＫ、ＮＫＮＮＫＮＮＫＫ、およびＮＮＮＫＮＫＫＮＫから成る群から選択される配列を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
それぞれのオリゴヌクレオチドプライマーは、５′末端に非縮重ヌクレオチドの配列をさらに含み、前記非縮重配列が、複数のオリゴヌクレオチドの中で一定であり、前記一定の非縮重配列が、１４ヌクレオチド〜２４ヌクレオチド長である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的核酸の複製が、エキソ−マイナスクレノウＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−マイナスＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａポリメラーゼ、ベントＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＤＮＡポリメラーゼ、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、それらの変異体、およびそれらの混合物から成る群から選択される酵素によって触媒される、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、複製鎖の前記ライブラリーを増幅するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
増幅が、前記複製鎖の終端における一定領域に相補的であるプライマー、および一対のプライマーから成る群から選択される、少なくとも１つのプライマーを使用する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記増幅されたライブラリーが、前記ポリメラーゼ連鎖反応中の少なくとも１つの修飾ヌクレオチドの取り込みによって標識され、前記修飾ヌクレオチドが、蛍光標識されたヌクレオチド、アミノアリル−ｄＵＴＰ、ブロモ−ｄＵＴＰ、およびジゴキシゲニン標識されたヌクレオチドから成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的核酸が、機械的、化学的、熱的、および酵素的手段から成る群から選択される方法によって断片化される、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的核酸が、ＤＮＡであり、前記複製が、エキソ−マイナスクレノウＤＮＡポリメラーゼによって触媒され、および前記増幅が、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによって触媒される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的核酸が、ＲＮＡであり、前記複数のオリゴヌクレオチドプライマーが、オリゴｄＴプライマーをさらに含み、前記複製が、ＭＭＬＶ逆転写酵素および／またはエキソ−マイナスクレノウＤＮＡポリメラーゼによって触媒され、前記増幅が、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによって触媒される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記複製が、前記オリゴｄＴプライマーおよびＭＭＬＶ逆転写酵素を使用する第１の反応と、前記複数のオリゴヌクレオチドプライマーおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用する第２の反応とを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
標的核酸を増幅するためのキットであって、
（ａ）複数のオリゴヌクレオチドプライマーであって、それぞれのオリゴヌクレオチドプライマーは、式ＮｍＸｐＺｑを有し、式中、
Ｎは、アデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）、およびチミジン／ウリジン（Ｔ／Ｕ）から成る群から選択される、４重縮重ヌクレオチドであり、
Ｘは、Ｂ、Ｄ、Ｈ、およびＶから成る群から選択される、３重縮重ヌクレオチドであって、Ｂは、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕから成る群から選択され、Ｄは、Ａ、Ｇ、およびＴ／Ｕから成る群から選択され、Ｈは、Ａ、Ｃ、およびＴ／Ｕから成る群から選択され、Ｖは、Ａ、Ｃ、およびＧから成る群から選択される、３重縮重ヌクレオチドであり、
Ｚは、Ｋ、Ｍ、Ｒ、およびＹから成る群から選択される、２重縮重ヌクレオチドであって、Ｋは、ＧおよびＴ／Ｕから成る群から選択され、Ｍは、ＡおよびＣから成る群から選択され、Ｒは、ＡおよびＧから成る群から選択され、Ｙは、ＣおよびＴ／Ｕから成る群から選択される、２重縮重ヌクレオチドであり、
ｍ、ｐ、およびｑは、整数であり、ｍは、０または２〜２０の間の整数であり、ｐおよびｑは、０〜２０の間の整数であるが、ただし、２つの整数が０ではなく、さらに、少なくとも２つのＮ残基を有する、Ｎを含むオリゴヌクレオチドは、前記２つのＮ残基を分離させる少なくとも１つのＸまたはＺ残基を有する、複数のオリゴヌクレオチドプライマーと、
（ｂ）複製酵素と、
を備える、キット。
【請求項１９】
前記複数のオリゴヌクレオチドプライマーの式が、ＮｍＸｐ、ＮｍＺｑ、およびＸｐＺｑから成る群から選択され、ｍが、２〜８の間の整数であり、ｐおよびｑが、それぞれ、１〜８の間の整数であり、前記２つの整数の合計が、９である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
Ｎを含む前記複数のオリゴヌクレオチドプライマーが、３つ以下の連続Ｎ残基を有する、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチドプライマーのそれぞれが、ＫＮＮＮＮＫＮＫＮＫ、ＮＫＮＮＫＮＮＫＫ、およびＮＮＮＫＮＫＫＮＫから成る群から選択される配列を有する、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記複数のオリゴヌクレオチドプライマーが、オリゴｄＴプライマーをさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２３】
それぞれのオリゴヌクレオチドプライマーは、５′末端に非縮重ヌクレオチドの配列をさらに含み、前記非縮重配列が、前記複数のオリゴヌクレオチドの中で一定であり、前記一定の非縮重配列が、１４ヌクレオチド〜２４ヌクレオチド長である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２４】
前記複製酵素が、エキソ−マイナスクレノウＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−マイナスＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａポリメラーゼ、ベントＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＤＮＡポリメラーゼ、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、それらの変異体、およびそれらの混合物から成る群から選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２５】
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、セミランダム配列を含むオリゴヌクレオチドに関する。具体的には、セミランダム配列は、実質的に非相補的である縮重ヌクレオチドを含む。さらに、該縮重オリゴヌクレオチドは、標的核酸群を増幅するために使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
多くの研究および診断分野において、実施可能である分析の種類は、使用可能な核酸の数量によって限定される。このため、少量の核酸を増幅するためのさまざまな技術が開発されてきた。これらには、全体の出発ゲノムまたはトランスクリプトームの偏りのない表示を提供するように設計された非特異的増幅技術である、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）および全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）手順が含まれる。
【０００３】
これらの増幅技術の多くは、オリゴヌクレオチドのそれぞれがランダム配列（つまり、ヌクレオチドのそれぞれは、いかなるヌクレオチドであってもよい）、または非相補的可変配列（つまり、ヌクレオチドのそれぞれは、２つの非相補的ヌクレオチドのいずれかであってもよい）を含む、縮重オリゴヌクレオチドプライマーを使用する。ランダムプライマーの相補性は、過剰なプライマー二量体形成をもたらし、還元配列複雑性を有する非相補的可変プライマーを使用する増幅は、核酸の出発群の不完全被覆によって特徴付けられる。
【０００４】
したがって、依然高い配列多様性を有するが、実質的に非相補的であるオリゴヌクレオチドプライマーの必要性が存在する。そのようなプライマーは、標的核酸全体にわたって最大数の配列にハイブリダイズすることが可能である一方、自己ハイブリダイズする傾向または他のプライマーとクロスハイブリダイズする傾向を、最小限に抑えることができる。そのようなプライマーは、ＷＧＡまたはＷＴＡ技術において非常に有用であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一態様は、オリゴヌクレオチドのそれぞれが式ＮｍＸｐＺｑを有し、式中、Ｎ、Ｘ、およびＺは、縮重ヌクレオチドであり、ｍ、ｐ、およびｑが、整数である、複数のオリゴヌクレオチドを含む。具体的には、ｍは、０または、２〜２０の間の整数であり、ｐおよびｑは、０〜２０の間の整数であるが、ただし、２つの整数が０ではないか、またはｍおよびｑの両方が０であるかのどちらか一方であり、さらに、少なくとも２つのＮ残基を有する、Ｎを含むオリゴヌクレオチドは、２つのＮ残基を分離する少なくとも１つのＸまたはＺ残基を有する。Ｎは、４重縮重ヌクレオチドである、つまり、アデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）、およびチミジン／ウリジン（Ｔ／Ｕ）であってもよい。Ｘは、Ｂ、Ｄ、Ｈ、およびＶから成る群から選択される３重縮重ヌクレオチドであって、Ｂは、Ｃ、Ｇ、またはＴ／Ｕであってもよく、Ｄは、Ａ、Ｇ、またはＴ／Ｕであってもよく、Ｈは、Ａ、Ｃ、またはＴ／Ｕであってもよく、Ｖは、Ａ、Ｃ、またはＧであってもよい。Ｚは、Ｋ、Ｍ、Ｒ、およびＹから成る群から選択される２重縮重ヌクレオチドであって、Ｋは、ＧまたはＴ／Ｕであってもよく、Ｍは、ＡまたはＣであってもよく、Ｒは、ＡまたはＧであってもよく、Ｙは、ＣまたはＴ／Ｕであってもよい。
【０００６】
本発明の別の態様は、標的核酸群を増幅するための方法を提供する。該方法は、標的核酸群を複数のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させて、複数の核酸−プライマー二本鎖を形成するステップを含む。オリゴヌクレオチドプライマーのそれぞれは、式ＮｍＸｐＺｑを有し、式中、Ｎ、Ｘ、およびＺは、上述で定義した縮重ヌクレオチドであり、ｍ、ｐ、およびｑは、整数である。具体的には、ｍは、０であるか、または２〜２０の範囲の整数のどちらか一方であり、ｐおよびｑは、０〜２０の間の整数であるが、ただし、２つの整数は、０ではなく、さらに、少なくとも２つのＮ残基を有する、Ｎを含むオリゴヌクレオチドは、２つのＮ残基を分離する少なくとも１つのＸまたはＺ残基を有する。該方法は、複数の核酸−プライマー二本鎖を複製して、複製鎖のライブラリーを形成するステップをさらに含む。さらに、ライブラリー内の複製鎖の量は、出発標的核酸の量を超過し、それは、標的核酸群の増幅を示唆する。
【０００７】
本発明のさらに別の態様は、標的核酸群を増幅するためのキットを提供する。該キットは、複数のオリゴヌクレオチドプライマーおよび複製酵素を含む。それぞれのオリゴヌクレオチドプライマーは、式ＮｍＸｐＺｑを有し、式中、Ｎ、Ｘ、およびＺは、上述で定義した縮重ヌクレオチドであり、ｍ、ｐ、およびｑは、整数である。具体的には、ｍは、０であるか、または、２〜２０の間の整数のどちらか一方であり、ｐおよびｑは、０〜２０の間の整数であるが、ただし、２つの整数は、０ではなく、さらに、少なくとも２つのＮ残基を有する、Ｎを含むオリゴヌクレオチドは、２つのＮ残基を分離する少なくとも１つのＸまたはＺ残基を有する。
【０００８】
本発明の他の態様および特性を、本出願においてより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】増幅ｃＤＮＡおよび非増幅ｃＤＮＡのリアルタイム定量ＰＣＲを示す。それぞれのプライマーセットのデルタＣ（ｔ）値が、非増幅ｃＤＮＡ（薄い灰色のバー）、Ｄ増幅ｃＤＮＡ（暗い灰色のバー）、およびＫ増幅ｃＤＮＡ（白いバー）についてプロットされている。
【図２Ａ】増幅ｃＤＮＡおよび非増幅ｃＤＮＡのマイクロアレイ分析を示す。増幅ｃＤＮＡ標的のログベース２の比率が、非増幅ｃＤＮＡ標的のログベース２の比率に対してプロットされている。図２Ａは、Ｄ増幅ｃＤＮＡを示す。
【図２Ｂ】増幅ｃＤＮＡおよび非増幅ｃＤＮＡのマイクロアレイ分析を示す。増幅ｃＤＮＡ標的のログベース２の比率が、非増幅ｃＤＮＡ標的のログベース２の比率に対してプロットされている。図２Ｂは、Ｋ増幅ｃＤＮＡを示す。
【図３】好適な中断されたＮライブラリー合成プライマーまたは対照プライマー（１Ｋ９および１Ｄ９）によって、ＮａＯＨ分解ＲＮＡから増幅したＷＴＡ生成物のアガロースゲル画像を示す。ゲルのそれぞれに供される分子の大きさの標準（ｂｐ）を左側に示し、ＲＮＡのＮａＯＨへの暴露時間（分）を右側に示す。
【図４】好適な中断されたＮライブラリー合成プライマーまたは対照プライマー（１Ｋ９および１Ｄ９）によって増幅したＷＴＡ生成物アガロースゲル画像を示す。ライブラリー合成は、ＲＮＡの存在（＋）または欠如（−）下、およびＭＭＬＶ逆転写酵素またはＭＭＬＶ逆転写酵素およびクレノウエキソ−マイナスＤＮＡポリメラーゼ（ＭＫ）のいずれか一方を用いて実施した。ライブラリー増幅は、ＪＵＭＰＳＴＡＲＴ（登録商標）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＪＳＴ）またはＫＬＥＮＴＡＱ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＴ）のいずれかによって触媒された。それぞれのゲルに供された分子の大きさの標準（ｂｐ）を左側に示し、異なる反応条件を右側に示す。
【図５】５つの最も好適な中断されたＮライブラリー合成プライマー、好適なプライマーのさまざまな組み合わせ、または対照プライマーによって増幅したＷＴＡ生成物のアガロースゲル画像を示す。ライブラリー合成は、さまざまな濃度のそれぞれのプライマーまたはプライマーセットで実施した。プライマー濃度（左から右に、１０、２、０．４、または０．０８μＭ）は、画像の上部に三角形で図示する。所与のセット内のプライマーを画像の右側に記載する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
４重縮重ヌクレオチド、３重縮重ヌクレオチド、および／または２重縮重ヌクレオチドの混合物を含むオリゴヌクレオチドは、標的核酸の例示的増幅の配列多様性を十分保持しながら、分子内および／または分子間相互作用を減少させたことが明らかになっている。セミランダム領域を含む、これらのオリゴヌクレオチドは、標的核酸全体にわたる多くの配列にハイブリダイズし、標的核酸の複製および増幅のための多くプライミング部位を提供することが可能である。しかしながら、同時に、これらのオリゴヌクレオチドは、一般的に、自己ハイブリダイズしてプライマー二次構造を形成することも、クロスハイブリダイズしてプライマー−二量体対を形成することもない。
【００１１】
（Ｉ）複数のオリゴヌクレオチド
本発明の一態様は、セミランダム配列を含む複数のオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドのセミランダム配列は、実質的に非相補的であるヌクレオチドを含み、それによって、複数のオリゴヌクレオチドの分子内および分子間相互作用を減少させる。しかしながら、オリゴヌクレオチドのセミランダム配列は、最大数の標的核酸群内に含まれる配列へのハイブリダイゼーションを可能にするために実質的配列多様性も提供する。本発明のオリゴヌクレオチドは、非ランダム配列をさらに含んでもよい。
【００１２】
（ａ）セミランダム配列
複数のオリゴヌクレオチドのセミランダム配列は、縮重ヌクレオチドを含む（表Ａ参照）。縮重ヌクレオチドは、２重縮重（つまり、２つのヌクレオチドのうちの１つであってもよい）、３重縮重（つまり、３つのヌクレオチドのうちの１つであってもよい）、または４重縮重（つまり、４つのヌクレオチドのうちの１つであってもよい）を有してもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、縮重するため、それらは、類似するが同一ではないオリゴヌクレオチドの混合物である。オリゴヌクレオチドの完全縮重は、以下のとおり算出してもよく、
縮重＝２ａＸ３ｂＸ４ｃ
式中、「ａ」は、２重縮重ヌクレオチドの総数（Ｚとして上述に定義）であり、「ｂ」は、３重縮重ヌクレオチドの総数（Ｘとして上述に定義）であり、「ｃ」は、４重ヌクレオチドの総数（Ｎとして上述に定義）である。
【００１３】
縮重ヌクレオチドは、相補的、非相補的、部分的に相補的であってもよい（表Ａ参照）。ヌクレオチドの間の相補性は、特異的な水素結合を介するワトソンクリック塩基対を形成する能力を指す（例えば、ＡおよびＴは、２つの水素結合を介する塩基対であり、ＣおよびＧは、３つの水素結合を介する塩基対である）。
表Ａ：縮重ヌクレオチド
【数１】
0005637853.tif 000002
*A＝アデノシン、C＝シチジン、G＝グアノシン、T＝チミジン、U＝ウリジン
【００１４】
本出願に使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上のヌクレオチドを含む分子を指す。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドは、標準的な４つのヌクレオチド（つまり、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕ）、ならびにヌクレオチドアナログを含んでもよい。ヌクレオチドアナログは、修飾されたプリンまたはピリミジン塩基および／または修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチドアナログは、自然発生するヌクレオチド（例えば、イノシン）、または自然発生しないヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチドの糖および塩基部分の修飾における制限されない例には、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の追加（または除去）、ならびに塩基の炭素および窒素原子の他の原子との置換（例えば、７−デアザプリン）が含まれる。ヌクレオチドアナログには、ジオデキシヌクレオチド、２′−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルホリノも含まれる。オリゴヌクレオチドの骨格は、ホスホジエステル結合、ならびに、ホスホロチオエート結合、ホスホラミダイト結合、またはホスホロジアミダイト結合を含んでもよい。
【００１５】
本発明の複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＸｐＺｑを有し、式中、
Ｎは、アデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）、およびチミジン／ウリジン（Ｔ／Ｕ）から成る群から選択される、４重縮重ヌクレオチドであり、
Ｘは、Ｂ、Ｄ、Ｈ、およびＶから成る群から選択される、３重縮重ヌクレオチドであって、Ｂは、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕから成る群から選択され、Ｄは、Ａ、Ｇ、およびＴ／Ｕから成る群から選択され、Ｈは、Ａ、Ｃ、およびＴ／Ｕから成る群から選択され、Ｖは、Ａ、Ｃ、およびＧから成る群から選択される、３重縮重ヌクレオチドであり、
Ｚは、Ｋ、Ｍ、Ｒ、およびＹから成る群から選択される、２重縮重ヌクレオチドであって、Ｋは、ＧおよびＴ／Ｕから成る群から選択され、Ｍは、ＡおよびＣから成る群から選択され、Ｒは、ＡおよびＧから成る群から選択され、Ｙは、ＣおよびＴ／Ｕから成る群から選択される、２重縮重ヌクレオチドであり、
ｍ、ｐ、およびｑは、整数であり、ｍは、０または２〜２０の間の整数であり、ｐおよびｑは、０〜２０の間の整数であるが、ただし、２つの整数が０ではないか、または、ｍおよびｑの両方が０であるかのどちらか一方であり、さらに、少なくとも２つのＮ残基を有する、Ｎを含むオリゴヌクレオチドは、前記２つのＮ残基を分離させるＸまたはＺ残基を有する。
【００１６】
複数のオリゴヌクレオチドは、相補的な４重縮重ヌクレオチドおよび／または部分的に非相補的な３重縮重ヌクレオチドおよび／または非相補的な２重縮重ヌクレオチドを含む。さらに、Ｎ残基を含むオリゴヌクレオチドでは、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＸまたはＺ残基によって分離する。したがって、部分的に非相補的な３重縮重ヌクレオチドおよび／または非相補的な２重縮重ヌクレオチドは、相補的なＮ残基を中断する。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、実質的に非相補的である。
【００１７】
したがって、式ＮｍＸｐＺｑの２つの整数がゼロではない、いくつかの実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式Ｎ２−２０Ｘ１−２０Ｚ１−２０（またはＮＸＺ）、式Ｎ０Ｘ１−２０Ｚ１−２０（またはＸＺ）、式Ｎ２−２０Ｘ０Ｚ１−２０（またはＮＺ）、または式Ｎ２−２０Ｘ１−２０Ｚ０（またはＮＸ）のいずれかを有してもよい（具体的な式は、表Ｂ参照）。適宜に、式ＮＸＺを有するオリゴヌクレオチドは、長さ約４ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチドの範囲であってもよい。より具体的には、式ＮＸＺを有するオリゴヌクレオチドは、約４８ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド長、約３６ヌクレオチド〜約４８ヌクレオチド長、約２４ヌクレオチド〜約３６ヌクレオチド長、約１４ヌクレオチド〜約２４ヌクレオチド長、または約４ヌクレオチド〜約１４ヌクレオチド長であってもよい。式ＸＺを有するオリゴヌクレオチドは、約２ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド長であってもよい。より具体的には、この式を有するオリゴヌクレオチドは、約２４ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド長、約１４ヌクレオチド〜約２４ヌクレオチド長、または約２ヌクレオチド〜約１４ヌクレオチド長であってもよい。最後に、式ＮＺまたは式ＮＸを有するオリゴヌクレオチドは、約３ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド長であってもよい。より具体的には、これらの式を有するオリゴヌクレオチドは、約２４ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド長、約１４ヌクレオチド〜約２４ヌクレオチド長、または約３ヌクレオチド〜約１４ヌクレオチド長であってもよい。
表Ｂ：例示的なオリゴヌクレオチドの式.
【数２】
0005637853.tif 000003
【００１８】
代替的実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＸｐを有してもよく、式中、ＮおよびＸは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜１３の範囲であり、ｐは、１〜１２の範囲であり、ｍおよびｐの合計は、１４であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＸ残基によって分離される。別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＸｐを有してもよく、式中、ＮおよびＸは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜１２の範囲であり、ｐは、１〜１１の範囲であり、ｍおよびｐの合計は、１３であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＸ残基によって分離される。さらに別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＸｐを有してもよく、式中、ＮおよびＸは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜１１の範囲であり、ｐは、１〜１０の範囲であり、ｍおよびｐの合計は、１２であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＸ残基によって分離される。別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＸｐを有してもよく、式中、ＮおよびＸは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜１０の範囲であり、ｐは、１〜９の範囲であり、ｍおよびｐの合計は、１１であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＸ残基によって分離される。さらに別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＸｐを有してもよく、式中、ＮおよびＸは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜９の範囲であり、ｐは、１〜８の範囲であり、ｍおよびｐの合計は、１０であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＸ残基によって分離される。さらに別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＸｐを有してもよく、式中、ＮおよびＸは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜７の範囲であり、ｐは、１〜６の範囲であり、ｍおよびｐの合計は、８であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＸ残基によって分離される。別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＸｐを有してもよく、式中、ＮおよびＸは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜６の範囲であり、ｐは、１〜５の範囲であり、ｍおよびｐの合計は、７であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＸ残基によって分離される。さらに別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＸｐを有してもよく、式中、ＮおよびＸは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜５の範囲であり、ｐは、１〜４の範囲であり、ｍおよびｐの合計は、６であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＸ残基によって分離される。好適な実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＸｐを有してもよく、式中、ＮおよびＸは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜８の範囲であり、ｐは、１〜７の範囲であり、ｍおよびｐの合計は、９であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＸ残基によって分離される。表Ｃは、この好適な実施形態、つまり９−ヌクレオチド長のセミランダム領域の（５′〜３′）配列を示す。
表Ｃ：例示的セミランダム領域のヌクレオチド配列５′〜３′
【数３】
0005637853.tif 000004
0005637853.tif 000005
0005637853.tif 000006
【００１９】
さらに別の代替的実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＸｐを有してもよく、式中、ＮおよびＸは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜１３の範囲であり、ｐは、１〜１２の範囲であり、ｍおよびｐの合計は、６〜１４の範囲であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＸ残基によって分離され、３つ以上の連続Ｎ残基は存在しない。したがって、この実施形態では、部分的に非相補的な３重縮重ヌクレオチドは、相補的な４重縮重ヌクレオチド（Ｎ）のロングラン（?４）が存在しないように、該配列全体にわたって散在する。一般的に、そのような設計は、複数のオリゴヌクレオチド内の自己ハイブリダイゼーションおよび／またはクロスハイブリダイゼーションを低減し得る。例示的実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＸｐを有してもよく、式中、ＮおよびＸは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜８の範囲であり、ｐは、１〜７の範囲であり、ｍおよびｐの合計は、９であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＸ残基によって分離され、３つ以上の連続Ｎ残基は存在しない。表Ｄは、この好適な実施形態、つまり、３つ以上の連続残基を有さない、９−ヌクレオチド長のセミランダム領域の（５′〜３）配列を記載する。
表Ｄ：３つ以上の連続Ｎ残基を有さない、例示的セミランダム領域のヌクレオチド配列（５′〜３′）
【数４】
0005637853.tif 000007
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【００２０】
さらに別の代替的実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＺｑを有してもよく、式中、ＮおよびＺは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜１３の範囲であり、ｑは、１〜１２の範囲であり、ｍおよびｑの合計は、１４であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＺ残基によって分離する。別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＺｑを有してもよく、式中、ＮおよびＺは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜１２の範囲であり、ｑは、１〜１１の範囲であり、ｍおよびｑの合計は、１３であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＺ残基によって分離する。さらに別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＺｑを有してもよく、式中、ＮおよびＺは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜１１の範囲であり、ｑは、１〜１０の範囲であり、ｍおよびｑの合計は、１２であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＺ残基によって分離する。別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＺｑを有してもよく、式中、ＮおよびＺは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜１０の範囲であり、ｑは、１〜９の範囲であり、ｍおよびｑの合計は、１１であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＺ残基によって分離する。さらに別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＺｑを有してもよく、式中、ＮおよびＺは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜９の範囲であり、ｑは、１〜８の範囲であり、ｍおよびｑの合計は、１０であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＺ残基によって分離する。さらに別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＺｑを有してもよく、式中、ＮおよびＺは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜７の範囲であり、ｑは、１〜６の範囲であり、ｍおよびｑの合計は、８であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＺ残基によって分離する。別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＺｑを有してもよく、式中、ＮおよびＺは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜６の範囲であり、ｑは、１〜５の範囲であり、ｍおよびｑの合計は、７であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＺ残基によって分離する。さらに別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＺｑを有してもよく、式中、ＮおよびＺは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜５の範囲であり、ｑは、１〜４の範囲であり、ｍおよびｑの合計は、６であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＺ残基によって分離する。好適な実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＺｑを有してもよく、式中、ＮおよびＺは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜８の範囲であり、ｑは、１〜７の範囲であり、ｍおよびｑの合計は、９であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＺ残基によって分離する。表Ｅは、この好適な実施形態、つまり、９−ヌクレオチド長のセミランダム領域の（５′〜３′）配列を示す。
表Ｅ：例示的セミランダム領域のヌクレオチド配列（５′〜３）
【数５】
0005637853.tif 000009
0005637853.tif 000010
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【００２１】
別の代替的実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＺｑを有してもよく、式中、ＮおよびＺは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜１３の範囲であり、ｑは、１〜１２の範囲であり、ｍおよびｑの合計は、６〜１４であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＺ残基によって分離し、３つ以上の連続Ｎ残基は存在しない。したがって、この実施形態では、非相補的な２重縮重ヌクレオチドは、相補的な４重縮重ヌクレオチド（Ｎ）のロングラン（?４）が存在しないように、該配列全体にわたって散在する。一般的に、そのような設計は、複数のオリゴヌクレオチド内の自己ハイブリダイゼーションおよび／またはクロスハイブリダイゼーションを低減し得る。例示的実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＮｍＺｐを有してもよく、式中、ＮおよびＺは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｍは、２〜８の範囲であり、ｑは、１〜７の範囲であり、ｍおよびｑの合計は、９であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＸ残基によって分離され、３つ以上の連続Ｎ残基は存在しない。表Ｆは、この好適な実施形態、つまり、３つ以上の連続残基を有さない、９−ヌクレオチド長のセミランダム領域の（５′〜３′）配列を記載する。
表Ｆ：３つ以上の連続Ｎ残基を有さない例示的セミランダム領域のヌクレオチド配列（５′〜３′）
【数６】
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【００２２】
別の代替的実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＸｐＺｑを有してもよく、式中、ＸおよびＺは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｐおよびｑは、１〜１３の範囲であり、ｍおよびｑの合計は、１４である。別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＸｐＺｑを有してもよく、式中、ＸおよびＺは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｐおよびｑは、１〜１２の範囲であり、ｍおよびｑの合計は、１３である。さらに別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＸｐＺｑを有してもよく、式中、ＸおよびＺは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｐおよびｑは、１〜１１の範囲であり、ｍおよびｑの合計は、１２である。さらに別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＸｐＺｑを有してもよく、式中、ＸおよびＺは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｐおよびｑは、１〜１０の範囲であり、ｍおよびｑの合計は、１１である。別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＸｐＺｑを有してもよく、式中、ＸおよびＺは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｐおよびｑは、１〜９の範囲であり、ｍおよびｑの合計は、１０である。さらに別の代替的実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＸｐＺｑを有してもよく、式中、ＸおよびＺは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｐおよびｑは、１〜８の範囲であり、ｍおよびｑの合計は、９である。さらに別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＸｐＺｑを有してもよく、式中、ＸおよびＺは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｐおよびｑは、１〜７の範囲であり、ｍおよびｑの合計は、８である。さらに別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＸｐＺｑを有してもよく、式中、ＸおよびＺは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｐおよびｑは、１〜６の範囲であり、ｍおよびｑの合計は、７である。さらなる実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式ＸｐＺｑを有してもよく、式中、ＸおよびＺは、上述で定義したヌクレオチドであり、ｐおよびｑは、１〜５の範囲であり、ｍおよびｑの合計は、６である。
【００２３】
ｍおよびｑの両方が０である、さらに別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、式Ｘｐを有し、式中、Ｘは、３重縮重ヌクレオチドであり、ｐは、２〜２０の間の整数を示す。したがって、複数のオリゴヌクレオチドは、以下の式：Ｂ２−２０、Ｄ２−２０、Ｈ２−２０、またはＶ２−２０を有してもよい。これらの式を有する複数のオリゴヌクレオチドは、約２ヌクレオチド〜約８ヌクレオチド長、約８ヌクレオチド〜約１４ヌクレオチド長、または約１４ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド長の範囲であってもよい。好適な実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、約９ヌクレオチド長であってもよい。
【００２４】
（ｂ）任意の非ランダム配列
上述のオリゴヌクレオチドは、標準（非縮重）ヌクレオチドを含む非ランダム配列をさらに含んでもよい。該非ランダム配列は、各オリゴヌクレオチドの５′末端に位置する。一般的に、非縮重ヌクレオチドの配列は、複数のオリゴヌクレオチドの中でも一定である。典型的に、一定の非縮重配列は、ユニバーサルプライミング部位等の周知の配列を含む。好適なユニバーサルプライミング部位の制限されない例には、Ｔ７プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列、Ｍ１３順方向配列、またはＭ１３逆方向配列が含まれる。あるいは、一定の非縮重配列は、増幅される核酸に存在しない、いかなる人工配列を実質的に含んでもよい。一実施形態では、一定の非縮重配列は、配列５′−ＧＴＡＧＧＴＴＧＡＧＧＡＴＡＧＧＡＧＧＧＴＴＡＧＧ−３′（配列番号３）を含んでもよい。別の実施形態では、一定の非縮重配列は、配列５′−ＧＴＧＧＴＧＴＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＴＴＧＧ−３′（配列番号２８）を含んでもよい。
【００２５】
一定の非縮重配列は、約６ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド長であってもよい。一実施形態では、一定の非縮重配列は、約１０ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド長であってもよい。別の実施形態では、一定の非縮重配列は、約１４ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド長であってもよい。さらに別の実施形態では、一定の非縮重配列は、約１８ヌクレオチド〜約２６ヌクレオチド長であってもよい。さらに別の実施形態では、一定の非縮重配列は、約２２ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド長であってもよい。
【００２６】
いくつかの実施形態では、付加的なヌクレオチドは、複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれの一定の非縮重配列の５′末端に追加されてもよい。例えば、ヌクレオチドは、複数のオリゴヌクレオチドの融解温度を上昇するために追加されてもよい。付加的なヌクレオチドは、Ｇ残基、Ｃ残基、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。付加的なヌクレオチドの数は、約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドの範囲、望ましくは、約３ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドの範囲、さらに望ましくは、約４ヌクレオチドであってもよい。
【００２７】
（ＩＩ）標的核酸群を増幅する方法
本発明の別の態様は、後でさらに増幅し得る増幅可能な分子のライブラリーを作成して標的核酸群を増幅する方法を提供する。増幅可能な分子のライブラリーは、標的核酸全体にわたって複数の複製開始部位を提供するために、本発明の複数の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、連続する独自の方法で生成される。縮重オリゴヌクレオチドプライマーのセミランダム配列は、依然配列多様性を提供しながら、複数のオリゴヌクレオチドプライマーの分子内および分子間相互作用を最小限にし、それによって、全体の標的核酸の複製を促進する。したがって、標的核酸は、いかなる所与の配列表示を損なわず、著しい偏向（つまり、３′末端偏向）なく増幅し得る。増幅された標的核酸は、全ゲノムまたは全トランスクリプトームであってもよい。
【００２８】
（ａ）ライブラリーの作成
標的核酸群を代表する増幅可能な分子のライブラリーは、標的核酸を本発明の複数の縮重オリゴヌクレオチドプライマーと接触させることによって生成される。該縮重オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸全体にわたって若干均一に散在した無作為部位でハイブリダイズして、標的核酸の複製のために複数のプライミング部位を提供する。該標的核酸は、複製中に複製された鎖が置換され、さらなる回数の複製のテンプレートとなる様に、鎖置換活性を有する酵素で複製されてもよい。あるいは、標的核酸は、２段階プロセス、つまり、第１の鎖ｃＤＮＡが逆転写酵素で合成され、第２の鎖ｃＤＮＡが鎖置換活性を有さない酵素で合成されるプロセスを介して複製されてもよい。いずれかの方法の結果として、複製された鎖の量は、開始標的核酸の量を超過し、それは、標的核酸の増幅を示唆する。
【００２９】
（ｉ）標的核酸
標的核酸群は、多様であり得、変化する。一実施形態では、標的核酸群は、ゲノムＤＮＡであってもよい。ゲノムＤＮＡは、真核細胞、真正細菌細胞、古細菌細胞、またはウイルスの核またはオルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体、またはキネトプラスト）内に自然発生する、１つもしくは複数の染色体ＤＮＡ分子を指す。これらの分子は、ＲＮＡに転写される配列、ならびにＲＮＡに転写されない配列を含む。その場合、ゲノムＤＮＡは、生物体の全ゲノムを含んでもよい、または単染色体またはその断片等のゲノムの一部を含んでもよい。
【００３０】
別の実施形態では、標的核酸群は、ＲＮＡ分子群であってもよい。ＲＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡ分子、または小ＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子群は、１つの細胞または細胞群内に発現したすべてのＲＮＡ分子のセットとして定義されるトランスクリプトームを含んでもよい。ＲＮＡ分子のセットは、メッセンジャーＲＮＡおよび／またはミクロＲＮＡおよび他の小ＲＮＡを含んでもよい。トランスクリプトームという用語は、所与の生物体内のＲＮＡ分子の全体集合、または特定の細胞種内に存在するＲＮＡ分子の特異的なサブセットを指してもよい。
【００３１】
標的核酸群は、真核生物、真正細菌、古細菌、またはウイルスから派生し得る。適切な真核生物の制限されない例には、ヒト、マウス、哺乳類、脊椎動物、無脊椎動物、植物、菌類、酵母菌、および原虫が含まれる。好適な実施形態では、核酸群は、ヒトから派生する。制限されない標的核酸源には、ゲノムＤＮＡ調製物、全ＲＮＡ調製物、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ調製物、ポリ（Ａ）″ＲＮＡ調製物、小ＲＮＡ調製物、単一細胞、細胞溶解物、培養細胞、組織試料、固定組織、凍結組織、包埋組織、生検組織、組織スワブ、または生体液が含まれる。適切な体液は、全血、軟膜、血清、唾液、髄液、胸水、リンパ液、母乳、痰、精液、および尿を含むが、それらに限定されない。
【００３２】
いくつかの実施形態では、標的核酸は、複数のオリゴヌクレオチドプライマーとの接触前に無作為に断片化されてもよい。標的核酸は、核酸を毛細管またはオリフィスに通過させる、核酸を超音波分解する、および／または核酸を噴霧して核酸を物理的にせん断する等の機械的手段で無作為に断片化されてもよい。あるいは、核酸は、酸加水分解、アルカリ加水分解、ホルマリン固定、金属錯体（例えば、ポルフィリン）による加水分解、および／またはヒドロキシルラジカルによる加水分解等の化学的手段で無作為に断片化されてもよい。標的核酸は、低イオン強度および中性ｐＨの溶液中の核酸を加熱する等の熱的手段で無作為に断片化されてもよい。温度は、約９０℃〜約１００℃の範囲であってもよく、好適には、約９５℃である。低イオン強度の溶液は、約７．５〜約８．５のｐＨを有する、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭのトリスＨＣＩおよび約０．１ｍＭ〜約１ｍＭのＥＤＴＡを含む。加熱時間の持続時間は、約１分〜約１０分の範囲であってもよい。あるいは、核酸は、ＤＮａｓｅＩまたはＲＮａｓｅによる部分消化等の酵素的方法によって断片化されてもよい。あるいは、ＤＮＡは、二価陽イオンの存在下で複数のテトラヌクレオチド認識配列（例えば、ＣｖｉＪＩ）を認識する制限エンドヌクレアーゼによる消化によって断片化されてもよい。核酸を断片化するために使用する方法によって、断片の大きさは、約１００塩基対〜約５０００塩基対、または約５０ヌクレオチド〜約２５００ヌクレオチドの範囲であってもよい。
【００３３】
標的として使用可能な核酸の量は、核酸の種類および質によって多様であり得、変化する。一般的に、標的核酸の量は、約０．１ピコグラム（ｐｇ）〜約１，０００ナノグラム（ｎｇ）の範囲であってもよい。標的核酸がゲノムＤＮＡである実施形態では、標的ＤＮＡの量は、細菌の単純なゲノム等の単純なゲノムでは約１ｎｇ、ヒトの複雑なゲノム等の複雑なゲノムでは約１０ｎｇ、単一ヒト細胞では約５ｐｇ、または固定組織から抽出された部分的に分解したＤＮＡでは、約２００ｎｇであってもよい。標的核酸が高品質の全ＲＮＡである実施形態では、標的ＲＮＡの量は、約０．１ｐｇ〜約５０ｎｇ、さらに好適には、約１０ｐｇ〜約５００ｐｇの範囲であってもよい。標的核酸が部分的に分解した全ＲＮＡである他の実施形態では、標的ＲＮＡの量は、約２５ｎｇ〜約１，０００ｎｇの範囲であってもよい。標的核酸が単一細胞からのＲＮＡである実施形態では、当業者は、細胞内のＲＮＡの量が異なる細胞種の中で異なることを理解する。
【００３４】
（ｉｉ）複数のオリゴヌクレオチドプライマー
標的核酸と接触した複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、上記のセクション（１）（ａ）に記載した。該オリゴヌクレオチドプライマーは、完全（つまり、４重）縮重および部分的（つまり、３重および／または２重）縮重ヌクレオチドの混合物を含むセミランダム領域を含む。該部分的縮重ヌクレオチドは、少なくとも１つの２重または３重縮重ヌクレオチドが、少なくとも２つの４重縮重ヌクレオチドを分離するように、完全な縮重ヌクレオチドの中で分散する。非相補的な２重縮重ヌクレオチドおよび／または部分的に非相補的な３重縮重ヌクレオチドの存在により、高配列多様性を提供しながら、完全な縮重ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーの自己ハイブリダイズおよび／またはクロスハイブリダイズする能力が低下する。
【００３５】
好適な実施形態では、本発明の方法に使用する複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、式ＮｍＸｐ、ＮｍＺｑ、またはそれらの組み合わせを有し、式中、Ｎ、Ｘ、およびＺは、上述で定義した縮重ヌクレオチドであり、ｍは、２〜１３の間の整数であり、ｐおよびｑは、１〜１２の間の整数であり、２つの整数の合計は、６〜１４であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＸまたはＺ残基によって分離する。別の好適な実施形態では、該方法に使用する複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、式ＮｍＸｐ、ＮｍＺｑ、またはそれらの組み合わせを有し、式中、Ｎ、Ｘ、およびＺは、上述で定義した縮重ヌクレオチドであり、ｍは、２〜８の間の整数であり、ｐおよびｑは、１〜７の間の整数であり、２つの整数の合計は、９であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＸまたはＺ残基によって分離し、３つ以上の連続Ｎ残基は、存在しない（表ＤおよびＦ参照）。好適な実施形態では、Ｘは、Ｄであり、Ｙは、Ｋである。特に好適な実施形態では、本発明の方法に使用する複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、以下の（５′−３′）配列（ＫＮＮＮＫＮＫＮＫ、ＮＫＮＮＫＮＮＫＫ、およびＮＮＮＫＮＫＫＮＫ）を有する。好適なオリゴヌクレオチドプライマーは、上記のセクション（１）（ｂ）に記載するとおり、それぞれのオリゴヌクレオチドの５′末端に一定の非縮重配列をさらに含んでもよい。
【００３６】
標的核酸と接触する複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、単一配列を有してもよい。例えば、複数の縮重オリゴヌクレオチドプライマーの（５′−３′）配列は、ＸＮＮＮＸＮＸＮＸであってもよい。このオリゴヌクレオチドプライマーの縮重は、上述の式（つまり、縮重＝８２，９４４＝３４Ｘ４５）を用いて算出されてもよい。あるいは、標的核酸に接触する複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、異なる配列を有する縮重オリゴヌクレオチドプライマーの混合物であってもよい。該混合物は、２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマー、３つの縮重オリゴヌクレオチドプライマー、４つの縮重オリゴヌクレオチドプライマー等を含んでもよい。一例として、該混合物は、以下の（５′−３′）配列（ＸＮＮＮＸＮＸＮＸ、ＮＮＮＸＮＸＸＮＸ、ＸＸＸＮＮＸＸＮＸ）を有する３つの縮重オリゴヌクレオチドプライマーを含んでもよい。この例では、オリゴヌクレオチドプライマーの混合物の縮重は、２１２，５４４［＝（３４Ｘ４５）＋（３４Ｘ４５）＋（３６Ｘ４３）］である。該混合物は、３重縮重ヌクレオチドおよび／または２重縮重ヌクレオチドを有する縮重オリゴヌクレオチドプライマー（つまり、式ＮｍＸｐおよび／またはＮｍＺｑ）を含んでもよい。
【００３７】
本発明の複数の縮重オリゴヌクレオチドプライマーに表される多数の配列のため、オリゴヌクレオチドプライマーのサブセットは、一般的に、標的核酸群全体にわたって分散する多くの相補的配列を有する。適宜に、相補的なオリゴヌクレオチドプライマーのサブセットは、標的拡散とハイブリダイズし、それによって、複数の核酸−プライマー二本鎖を形成し、核酸複製のための複数のプライミング部位を提供する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドプライマーに加え、オリゴｄＴまたはアンカーオリゴｄＴプライマーも、標的核酸群と接触してもよい。アンカーオリゴｄＴプライマーは、ＶＮで表される２つのさらなるリボヌクレオチドが続く、デオキシチミジル酸（ｄＴ）残基の（５′〜３′）鎖を含んでもよく、式中、Ｖは、Ｇ、Ｃ、またはＡのいずれかであり、Ｎは、Ｇ、Ｇ、Ａ、またはＵのいずれかである。ＶＮリボヌクレオチドアンカーにより、該プライマーは、メッセンジャーＲＮＡがｃＤＮＡに逆転写されてもよいように、標的メッセンジャーＲＮＡのポリ（Ａ）尾部の５′末端でのみハイブリダイズすることが可能になる。当業者は、オリゴｄＴプライマーが他のヌクレオチドおよび／または他の特性を含んでもよいことを理解する。
【００３９】
（ｉｉｉ）標的核酸の複製
プライムされる標的核酸は、鎖置換活性を有する酵素によって複製されてもよい。適切な鎖置換ポリメラーゼの例は、エキソ−マイナスクレノウＤＮＡポリメラーゼ（つまり、５′→３′および３′→５′エキソヌクレアーゼ活性の両方が欠乏するＤＮＡＰｏｌＩの大きな断片）、エキソ−マイナスＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（つまり、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（登録商標）バージョン２．０、ＵＳＢ社、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａポリメラーゼ、ベントＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＤＮＡポリメラーゼ、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、それらの変異体、またはそれらの混合物を含むが、それらに限定されない。一実施形態では、鎖置換ポリメラーゼは、エキソ−マイナスクレノウＤＮＡポリメラーゼであってもよい。別の実施形態では、鎖置換ポリメラーゼは、ＭＭＬＶ逆転写酵素であってもよい。さらに別の実施形態では、鎖置換ポリメラーゼは、ＭＭＬＶ逆転写酵素およびエキソ−マイナスクレノウＤＮＡポリメラーゼの両方を含んでもよい。
【００４０】
あるいは、プライムされる標的核酸は、２段階プロセスを介して複製されてもよい。つまり、ｃＤＮＡの第１の鎖は、逆転写酵素によって合成されてもよく、次いで、ｃＤＮＡの第２の鎖は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等の鎖置換活性を有さない酵素によって合成されてもよい。
【００４１】
鎖置換酵素または複製酵素は、相補的な配列間のハイブリダイゼーション、ならびにハイブリダイズされたプライマーの伸長、つまり核酸の複製を可能にする条件下で、標的核酸および複数の縮重オリゴヌクレオチドプライマーとともにインキュベートした。一般的に、インキュベーションの条件は、相補的な配列間のハイブリダイゼーションを可能にするが、不適合配列間（つまり相補性を有さない、または制限された相補性を有する配列）のハイブリダイゼーションを不可能にするように選択される。インキュベーションの条件は、プライマー伸長を最適化し、鎖置換活性を促進するようにも選択される。複製中、置換された単鎖は、オリゴヌクレオチドプライマーハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長の新たなテンプレートになるように生成される。したがって、一般的に、インキュベーションの条件は、ハイブリダイゼーションおよび複製双方を可能にする温度でのインキュベーションであり、最適ｐＨ、イオン強度、およびＭｇ２＋イオン濃度の溶液を含む。
【００４２】
一般的に、ライブラリー合成バッファは、約６．５〜約９．５のＨ、好適には、約７．５のｐＨで動作するｐＨ修飾剤またはバッファリング剤を含む。最適なｐＨ修飾剤の代表的な例には、トリスバッファ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ビシン、トリシン、ＴＥＳ、またはＰＩＰＥＳが含まれる。ライブラリー合成バッファは、約１ｍＭ〜約２００ｍＭの範囲の濃度における、ＮａＣｌ等の一価塩を含んでもよい。ライブラリー合成バッファ内のＭｇＣ２の濃度は、約５ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲であってもよい。デオキシヌクレオチド三リン酸（つまり、ｄＮＴＰ）の必要な混合物は、ライブラリー合成バッファ内に提供されてもよい、または、個別に提供されてもよい。インキュベーションの温度は、使用するポリメラーゼによって、約１２℃〜約７０℃の範囲であってもよい。インキュベーションの時間は、約５分〜約４時間の範囲であってもよい。一実施形態では、インキュベーションは、例えば、３０℃で約１時間の単一の等温段階を含んでもよい。別の実施形態では、インキュベーションは、一定サイクル数（例えば、１５〜２０サイクル）の短時間（例えば、約１〜２分）でいくつかの温度段階（例えば、１６℃、２４℃、および３７℃）によるサイクルによって実施されてもよい。さらに別の実施形態では、インキュベーションは、約１０〜３０分持続する連続的な等温段階を含んでもよい。例として、インキュベーションは、１８℃で１０分間、２５℃で１０分間、３７℃で３０分間、および４２℃で１０分間のステップを含んでもよい。反応バッファは、単一鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）またはヘリカーゼ等の鎖置換を促進する因子をさらに含んでもよい。ＳＳＢまたはヘリカーゼは、細菌性、ウイルス性、または真核性起源であってもよい。複製反応は、十分な量のＥＤＴＡを添加してＭｇ２＋イオンをキレートするか、または酵素を加熱不活性化させて終了し得る。 
【００４３】
鎖置換酵素によって無作為にプライムされた標的核酸の複製は、約１００塩基対〜約２０００塩基対長であり、平均の約４００〜約５００塩基対長である、重複する分子のライブラリーを作成する。いくつかの実施形態では、複製された鎖のライブラリーは、複数のオリゴヌクレオチドプライマーの一定の非縮重配列に対応する一定の非縮重末端配列で隣接されてもよい。
【００４４】
（ｂ）ライブラリーの増幅
当該方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスによって、ライブラリーを増幅する方法をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、上述のとおり、複製された鎖のライブラリーは、一定の非縮重末端配列によって隣接されてもよい。別の実施形態では、少なくとも１つのアダプターは、分子のライブラリーが増幅可能であるように、ライブラリーの複製された鎖の末端のそれぞれに結合されてもよい。該アダプターは、上述のとおり、ユニバーサルプライミング配列、またはポリＧまたはポリＣ等のホモポリマー状配列を含んでもよい。適切なリガーゼ酵素および連結反応技術が、当該技術において周知である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ＰＣＲは、ライブラリー分子の一定の末端配列に相補的である単一増幅プライマーを使用して実施されてもよい。他の実施形態では、ＰＣＲは、一対の増幅プライマーを使用して実施されてもよい。すべての実施形態において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ増幅プロセスを触媒する。適切な熱安定性のＤＡポリメラーゼの制限されない例は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ（ベントとも言われる）ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｆｌＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、それらの変異体、およびそれらの混合物が含まれる。該ＰＣＲプロセスは、３段階（つまり、変性、アニーリング、および伸長）、または２段階（つまり、変性およびアニーリング／伸長）を含んでもよい。アニーリングまたはアニーリング／伸長ステップの温度は、増幅プライマーによって異なる。つまり、それは、ヌクレオチド配列、融解温度、および／または濃度である。アニーリングまたはアニーリング／伸長ステップの温度は、約５０℃〜約７０℃の範囲であってもよい。好適な実施形態では、アニーリングまたはアニーリング／伸長ステップの温度は、約７０℃であってもよい。ＰＣＲステップの時間も異なり得る。変性ステップの時間は、約１０秒〜約２分の範囲であってもよく、アニーリングまたはアニーリング／伸長ステップの時間は、約１５秒〜約１０分の範囲であってもよい。サイクルの総数は、標的核酸の量および質によっても異なり得る。サイクル数は、約５サイクル〜約５０サイクル、約１０サイクル〜約３０サイクル、より好適には、約１４サイクル〜約２０サイクルの範囲であってもよい。
【００４６】
一般的に、ライブラリーのＰＣＲ増幅は、適切な増幅バッファの存在下で実施される。ライブラリー増幅バッファは、ｐＨ修飾剤、二価陽イオン、一価陽イオン、および洗剤またはＢＳＡ等の安定化剤を含んでもよい。適切なｐＨ修飾剤は、反応のｐＨを約８．０〜約９．５に維持する、当該技術において周知のものを含む。適切な二価陽イオンは、マグネシウムおよび／またはマンガンを含み、適切な一価陽イオンは、カリウム、ナトリウムおよび／またはリチウムを含む。含んでもよい洗剤は、ポリ（エチレングリコール）４−ノンフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート、Ｔｗｅｅｎ２０、およびノニデットＮＰ４０を含む。増幅バッファに含んでもよい他の薬剤は、グリセロールおよび／またはポリエチレングリコールを含む。増幅バッファは、ｄＮＴＰの必要な混合物も含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅は、増幅されたライブラリーがダウンストリーム分析に標識されるように、修飾されたヌクレオチドの存在下で実施されてもよい。適切な修飾されたヌクレオチドの制限されない例は、蛍光標識されたヌクレオチド、アミノアリル−ｄＵＴＰ、ブロモ−ｄＵＴＰ、またはジゴキシゲニン標識されたヌクレオチド三リン酸を含む。
【００４７】
増幅されたライブラリーに表される標的核酸の割合は、標的核酸の種類および質によって多様であり得、変化する。該増幅されたライブラリーは、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％、または約９９．５％の標的核酸で表されてもよい。増幅倍数も標的核酸によって異なり得る。増幅倍数は、約１００倍、３００倍、約１０００倍、約１０，０００倍、約１００，０００倍、または約１，０００，０００倍であってもよい。例えば、約５ｎｇ〜約１０ｎｇの標的核酸は、約５μｇ〜約５０μｇの増幅されたライブラリー分子に増幅されてもよい。さらに、増幅されたライブラリーは、ＰＣＲによって再増幅されてもよい。
【００４８】
増幅されたライブラリーは、次の使用の前に残留増幅プライマーおよびヌクレオチドを除去するために精製されてもよい。スピンカラムクロマトグラフィーまたはろ過技術等の核酸の精製方法は、当該技術において周知である。
【００４９】
増幅されたライブラリーのダウンストリーム使用は、異なり得る。増幅されたライブラリーの制限されない使用は、定量リアルタイムＰＣＲ、マイクロアレイ分析、シークエンシング、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）分析、マイクロサテライト分析、縦列型反復配列（ＳＴＲ）分析、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、およびクロマチン免疫沈降（ＣｈｉＰ）を含む。
【００５０】
（ＩＩＩ）標的核酸群を増幅するためのキット
本発明のさらなる態様は、標的核酸群を増幅するためのキットを含む。当該キットは、上記のセクション（Ｉ）で定義された複数のオリゴヌクレオチドプライマー、および上記のセクション（ＩＩ）（ａ）（ｉｉｉ）で定義された複製酵素を含む。
【００５１】
好適な実施形態では、該キットの複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、式ＮｍＸｐ、ＮｍＺｑ、またはそれらの組み合わせを有してもよく、式中、Ｎ、Ｘ、およびＺは、上述で定義した縮重ヌクレオチドであり、ｍは、２〜１３の間の整数であり、ｐおよびｑは、それぞれ１〜１１の間の整数であり、２つの整数の合計は、６〜１４の間であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＸまたはＺ残基によって分離する。例示的実施形態では、該キットの複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、式ＮｍＸｐ、ＮｍＺｑ、またはそれらの組み合わせを有してもよく、式中、Ｎ、Ｘ、およびＺは、上述で定義した縮重ヌクレオチドであり、ｍは、２〜８の間の整数であり、ｐおよびｑは、それぞれ１〜７の間の整数であり、２つの整数の合計は、９であり、少なくとも２つのＮ残基は、少なくとも１つのＸまたはＺ残基によって分離し、３つ以上の連続Ｎ残基は存在しない。好適な実施形態では、Ｘは、Ｄであり、Ｙは、Ｋである。特に好適な実施形態では、該キットの複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、以下の（５′−３′）配列（ＫＮＮＮＫＮＫＮＫ、ＮＫＮＮＫＮＮＫＫ、およびＮＮＮＫＮＫＫＮＫ）を有する。いくつかの実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、オリゴｄＴプライマーをさらに含んでもよい。上記のセクション（Ｉ）（ｂ）に記載のとおり、該キットの複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、プライマーのそれぞれの５′末端に一定の非縮重配列もさらに含んでもよい。
【００５２】
上記のセクション（ＩＩ）（ａ）（ｉｉｉ）に記載するとおり、該キットは、ライブラリー合成バッファをさらに含んでもよい。上記のセクション（ＩＩ）（ａ）（ｉ）に記載するとおり、該キットの別の任意の要素は、標的核酸を断片化するための手段である。上記のセクション（ＩＩ）（ｂ）に記載するとおり、該キットは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１つの増幅プライマー、およびライブラリー増幅バッファもさらに含んでもよい。
【００５３】
定義
本発明の理解を容易にするために、以下にいくつかの用語を記載する。
【００５４】
本出願に使用する「相補的または相補性」という用語は、特異的な水素結合を介して、少なくとも１つのワトソンクリック塩基対を形成する能力を指す。「非相補的または非相補性」という用語は、特異的な水素結合を介して、少なくとも１つのワトソンクリック塩基対を形成できない能力を指す。
【００５５】
「ゲノムＤＮＡ」は、真核細胞、真正細菌細胞、古細菌細胞、またはウイルスの核または細胞小器官内（例えば、ミトコンドリア、葉緑体、またはキネトプラスト）に自然発生する、１つもしくは複数の染色体ポリマーデオキシリボ核酸分子を指す。これらの分子は、ＲＮＡに転写される配列、およびＲＮＡに転写されない配列を含む。
【００５６】
本出願に使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、二本鎖ハイブリッドを形成するための、２つの相補的な一本鎖の核酸分子を含む塩基との間の水素結合、または塩基対合のプロセスを指す。一般的に、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」は、温度およびイオン強度の条件によって決定される。一般的に、核酸ハイブリッド安定性は、ハイブリッドが限定条件下で５０％変性する温度である、融解温度つまりＴｍで表される。方程式は、所与のハイブリッドのＴｍを推定するために得られ、方程式は、核酸のＧ＋Ｃ量、ハイブリッドの特質（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ等）、核酸プローブの長さ等（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｅｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，  Ｃｈａｐｔｅｒ９）を考慮する。ハイブリダイゼーションに基づく多くの反応（例えばポリメラーゼ反応、増幅反応、連結反応等）では、一般的に、反応の温度が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。
【００５７】
一般的に使用される「プライマー」という用語は、核酸鎖またはＤＮＡ複製の開始点となる遊離３′ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチドを指す。
【００５８】
本出願に使用される「トランスクリプトーム」という用語は、１つの細胞または細胞群に発現したすべてのＲＮＡ分子のセットとして定義される。ＲＮＡ分子のセットは、メッセンジャーＲＮＡおよび／またはミクロＲＮＡおよび他の小ＲＮＡを含んでもよい。当該用語は、所与の生物体内のＲＮＡ分子の合計セット、または特定の細胞種に存在するＲＮＡ細胞の特異的なサブセットを指してもよい。
【実施例】
【００５９】
以下の実施例は、本発明のさまざまな実施形態を明示するために含まれる。当業者は、以下に続く実施例に開示する技術が本発明の実践において十分に機能するように発明者によって発見された技術を示すことを理解するであろう。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、開示される具体的な実施形態において多くの変更が行われ得るが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同一または同様の結果が得られることを理解し、したがって、上記の説明および以下に記載する実施例に示す多くの事項は、例証であり、制限する意味ではないことを理解されたい。
【００６０】
実施例１：Ｄ９ライブラリー合成プライマーの分析
ＷＧＡおよびＷＴＡ用途に使用するプライマーの縮重を増加する目的において、セミランダム領域が９つのＤ残基（Ｄ９）を含んだライブラリー合成プライマーを、合成した。当該プライマーは、一定（ユニバーサル）の５′領域も含んだ。多くのアンプリコンを効果的に増幅するこのプライマーの能力を、セミランダム領域が９つのＫ残基（Ｋ９）を含む標準的ライブラリー合成プライマー（例えば、ルビコンＴＲＡＮＳＰＬＥＸ（登録商標）全トランスクリプトーム増幅（ＷＡＴ）キット、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯで提供されたもの）の能力と比較した。Ｋ９およびＤ９で増幅した両方のｃＤＮＡを、ｑＰＣＲおよびマイクロアレイ分析によって、未増幅のｃＤＮＡと比較した。
【００６１】
（ａ）未増幅の対照ｃＤＮＡ合成
一本鎖ｃＤＮＡは、ＭＭＬＶ逆転写酵素（カタログ番号Ｍ１２０３：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に記載した手順に続き、１μＭオリゴｄＴ１９プライマーを使用して、５０マイクロリットルの反応液当たり１マイクログラムの総ＲＮＡの濃度で、３０マイクログラムの全ヒト肝臓ＲＮＡ（カタログ番号７９６０、Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）およびＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＵＦＲ）全ＲＮＡ（カタログ番号７４０００、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から調製した。
【００６２】
（ｂ）Ｄ増幅されたｃＤＮＡ合成
２５マイクロリットル当たり１マイクログラムのヒト肝臓またはＵＨＲ総ＲＮＡおよび１μＭのオリゴｄＴプライマー（５′−ＧＴＡＧＧＴＴＧＡＧＧＡＴＡＧＧＡＧＧＧＴＴＡＧＧＴ１９−３′、配列番号１）を、７０℃で５分間インキュベーションし、氷の上で急速冷却した直後に、１０単位／マイクロリットルのＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｘＰＣＲバッファ（カタログ番号Ｐ２１９２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、３ｍＭ最終濃度に添加された塩化マグネシウム（カタログ番号Ｍ８７８７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５００μＭｄＮＴＰ、および２．５％（体積）のリボヌクレアーゼ阻害剤（カタログ番号Ｒ２５２０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、３７℃で５分間、４２℃で４５分間、９４℃で５分間インキュベーションし、氷の上で急速冷却した。
【００６３】
相補的第２のｃＤＮＡ鎖は、１μＭのＤ９ライブラリー合成プライマー（５′−ＧＴＡＧＧＴＴＧＡＧＧＡＴＡＧＧＡＧＧＧＴＴＡＧＧＤ９−Ｓ′、配列番号２）、０．１６５単位／マイクロリットルＪＵＭＰＳＴＡＲＴ（登録商標）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号Ｄ３４４３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１８単位／マイクロリットルクレノウエキソーマイナスＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号７０５７、ＵＳＢ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）、１ｘＰＣＲバッファ（上記参照）、５．５ｍＭの添加された塩化マグネシウム（上記参照）、および５００μＭのｄＮＴＰを使用して合成した。該混合物は、１８℃で５分間、２５℃で５分間、３７℃で５分間、および７２℃で１５分間インキュベーションした。
【００６４】
二本鎖ｃＤＮＡは、０．０５単位／マイクロリットルＪＵＭＰＳＴＡＲＴ（登録商標）Ｔａｑ（上記参照）、１ＸＰＣＲバッファ（カタログ番号Ｄ４５４５、塩化マグネシウムなし、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１．５ｍＭの塩化マグネシウム（上記参照）、２００μＭのｄＮＴＰおよび２μＭのユニバーサルプライマー５′−ＧＴＡＧＧＴＴＧＡＧＧＡＴＡＧＧＡＧＧＧＴＴＡＧＧ−Ｓ′（配列番号３）を使用して、増幅した。熱サイクルパラメータは、９４℃で９０秒に次いで、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で２分間の１７サイクルであった。
【００６５】
（ｃ）Ｋ増幅されたｃＤＮＡ合成
増幅されたｃＤＮＡは、Ｒｕｂｉｃｏｎ  Ｔｒａｎｓｐｌｅｘ（登録商標）ＷＴＡキット（上記参照）の合成要素および手順を使用して、０．２マイクログラムの総ＲＮＡ（上記参照）から調製した。
【００６６】
（ｄ）ＲＮＡの除去およびｃＤＮＡの精製
未増幅の対照ｃＤＮＡおよび増幅されたｃＤＮＡにおける総ＲＮＡテンプレートは、０．５ＭのＥＤＴＡの１／３最終ｃＤＮＡ／増幅反応量、および１ＭのＮａＯＨの１／３最終ｃＤＮＡ／増幅反応量の（配列における）を添加し、６５℃で１５分間インキュベーションして分解した。次いで、反応は、１ＭのトリスＨＣＩ、Ｈ７．４の５／６最終ｃＤＮＡ／増幅反応量で中和し、上述のＧｅｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎｕｐキット（カタログ番号ＮＡ１０２０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して精製した。
【００６７】
（ｅ）定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析
増幅されたｃＤＮＡおよび未増幅の対照ｃＤＮＡは、２ＸＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＪＵＭＰＳＴＡＲＴ（登録商標）Ｔａｑ（カタログ番号Ｓ４４３８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に定められた条件を使用して、２５０ｎＭのヒトプライマー対（表１参照）とともに、リアルタイム定量ＰＣＲによって分析した。サイクル条件は、９４℃で１．５分の１サイクル、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２．５分の３０回のサイクルであった。
ｑＰＣＲに使用したプライマー
【表１】
0005637853.tif 000015
【００６８】
蛍光が規定の閾値レベルを超過する間のＰＣＲサイクルを表すＣ（ｔ）値は、それぞれの反応で決定された。平均デルタＣ（ｔ）［ΔＣ（ｔ）］は、算出して、そのＰＣＲテンプレートの種類の個別のΔＣ（ｔ）値から差し引いた。図１は、異なるプライマーセットの機能としてのｃＤＡＮ群のそれぞれのΔＣ（ｔ）肝臓-ＵＨＲを示す。結果は、ΔＣ（ｔ）で示すとおり、Ｄ増幅されたｃＤＮＡおよびＫ増幅されたｃＤＮＡのヒト肝臓およびＵＨＲｃＤＮＡアンプリコン濃度の比率が、未増幅の総ＲＮＡ内に表される初期のｍＲＮＡレベルの比率を綿密に反映する。
【００６９】
（ｆ）マイクロアレイ分析
標的ｃＤＮＡは、Ｋｒｅａｔｅｃｈ社のＵＬＳ（登録商標）システム（Ｋｒｅａｔｅｃｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ、標識は、Ｍｏｇｅｎｅ，  ＬＣ，  ＮＩＤＵＳ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ，  ８９３  Ｎｏｒｔｈ  Ｗａｒｓｏｎ  Ｒｏａｄ，  Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，６３１４１によって実施された）を使用して標識された。精製された未増幅のｃＤＮＡ、Ｄ増幅されたｃＤＮＡおよびＫ増幅されたｃＤＮＡは、マイクロアレイ分析用にＭｏｇｅｎｅ，  ＬＣに送った。このために、７５０ナノグラムの標的を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｈｉｐ（カタログ番号Ｇ４１１２Ａ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）でインキュベーションした。
【００７０】
図２は、各アレイプローブのヒト肝臓およびＵＨＲ標的を表すスポット強度を示す。増幅されたｃＤＮＡ標的のログベース２の比率を、未増幅のｃＤＮＡ標的のログベース２の比率に対してプロットした。約５Ｘバックグランド（＞２５０）の強度のみをこの分析に含めた。結果は、Ｄ増幅（図２Ａ）およびＫ増幅（図２Ｂ）されたｃＤＮＡが同様のプロファイルを有したことを明らかにした。
【００７１】
実施例２：３８４個の高縮重プライマーの選択.
ライブラリー合成プライマーの縮重をさらに増大するために、セミランダム領域は、Ｎ残基、ならびにＤまたはＫ残基のいずれかを含むように修飾した。Ｎの追加は、配列多様性を増大させ、ＫまたはＤ残基によるＮの阻害が、プライマーの分子内および分子間相互作用を減少させるものと推論した。表２は、２５６個の考えられるＫで中断されたＮ配列（１Ｋ９とも言われる対照Ｋ９配列を含む）を記載し、表３は、２５６個の考えられるＤで中断されたＮ配列（１Ｄ９とも言われる対照Ｄ９配列を含む）を記載する。
【００７２】
実行可能な実施例を調査および提供するためのプライマーの数を最小限にする目的で、評価するためのプライマーの数を３８４個に制限するように決定した。第１の削除は、４つ以上の縮重Ｎがプライマー二量体形成の実質的な機会を提供し得ると考えられたため、４つ以上の隣接するＮ残基を含む配列をすべて除去することであった。Ｎは、二量体形成の実質的な機会を提供し得る。これは、ＫまたはＤで中断されたＮ配列の数を２５６から２０８に減少させた。残りの１６個のプライマー（つまり、２０８から１９２）は、３′の多様性および自己相補性に基づいて、除去した。該１６個のうち、６個は、５０％のプールは、最終の２つの３′ヌクレオチドにおいて自己相補性であるため、最大３′縮重が最後から２番目の位置を確保する３′末端近くのＮを有する２つの候補配列を保持することによって維持される、８個の考えられるＮ１Ｘ８配列を含んだ。残りの１０個の配列は、自己相補性（つまり、Ｋ／ＤをＮと対合する中心Ｎについて回帰性であった縮重配列、例えば、ＮＫＮＮＮＫＫＮＫ、ＮＮＫＫＮＮＮＫＫ等）に基づき除去した。表４は、その後のスクリーニングのために選択した、最終の３８４個の中断されたＮ配列を記載する。
考えられる９ｍｅｒＫＮ配列
【表２】
0005637853.tif 000016
0005637853.tif 000017
考えられる９ｍｅｒＤＮ配列
【表３】
0005637853.tif 000018
0005637853.tif 000019
さらなるスクリーニングに選択された３８４個の中断されたＮ配列
【表４】
0005637853.tif 000020
0005637853.tif 000021
0005637853.tif 000022
0005637853.tif 000023
【００７３】
実施例３：５つの最良の中断されたＮライブラリー合成プライマーの同定
３８４個の中断されたＮ配列は、３８４個のライブラリー合成プライマーを形成するために使用した。それぞれのプライマーは、一定の５′ユニバーサル配列（５′−ＧＴＧＧＴＧＴＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＴＴＧＧ−３′、配列番号２８）および表４に記載する９−ｍｅｒの中断されたＮ配列の１つを含んだ。該プライマーは、全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）にそれらを使用してスクリーニングした。ＷＴＡスクリーニングプロセスは、３つのステップ（１．ライブラリー合成、２．ライブラリー増幅、３．遺伝子特異的ｑＰＣＲ）で実施した。
【００７４】
（ａ）ライブラリー合成および増幅
それぞれのライブラリー合成反応液は、２．５μｌの１．６６ｎｇ／μｌ総ＲＮＡ（肝臓）および２．５μｌの５μＭの３８４個のライブラリー合成プライマーのうちの１つを含んだ。混合物を７０℃に５分間加熱し、次いで、氷の上で冷却した。それぞれの反応混合物に、２．５μｌのライブラリーマスターミックスを添加した（上述のとおり、マスターミックスは、１．５ｍＭのｄＮＴＰ、３ＸＭＭＬＶ反応バッファ、２４単位／μｌのＭＭＬＶ逆転写酵素、および１．２単位／μｌのクレノウエキソ−マイナスＤＮＡポリメラーゼを含んだ）。該反応液を混合し、１８℃で１０分間、２５℃で１０分間、３７℃で３０分間、４２℃で１０分間、９５℃で５分間インキュベーションし、次いで、希釈まで４℃で保管した。
【００７５】
ライブラリー反応生成物のそれぞれは、７０μｌのＨ２Ｏを添加して希釈した。ライブラリーは、１０μｌの希釈されたライブラリーおよび１０μｌの２Ｘ増幅ミックス（２Ｘ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＪＵＭＰＳＴＡＲＴ（登録商標）Ｔａｑ  ＲＥＡＤＭＩＸ（登録商標）、および５μＭのユニバーサルプライマー、５′−ＧＴＧＧＴＧＴＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＴＴＧＧ−３′、配列番号２８）を混合して増幅した。ＷＴＡ混合物に、９５℃で３０分間および７０℃で５分間の２５回のサイクルを行なった。
【００７６】
（ｂ）ｑＰＣＲ反応
ＷＴＡ生成物のそれぞれは、下記の表５に示すとおり、１８０μｌのＨ２Ｏで希釈し、一連の「淘汰する」ｑＰＣＲを実施した。これらのｑＰＣＲ反応に使用する遺伝子特異的プライマーは、表６に記載する。反応混合物のそれぞれは、１０μｌの希釈されたＷＴＡ生成物ライブラリーおよび１０μｌの２倍増幅ミックス（２Ｘ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＪＵＭＰＳＴＡＲＴ（登録商標）ならびに０．５μｌの遺伝子特異的プライマーのそれぞれ）を含んだ。該混合物は、９４℃に２分間加熱し、次いで、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で３０秒のサイクルを４０回実施した。該プレートは、７２、７６、８０、および８４℃で解読した（ＭＪ  Ｏｐｔｉｃｏｍ  Ｍｏｎｉｔｏｒ２サーマルサイクラー、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）。蛍光が所定の閾値を超過する間のＰＣＲサイクルを表すＣｔ値は、それぞれの反応で決定した。
スクリーニング戦略
【表５】
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遺伝子特異的ＰＣＲプライマーの配列
【表６】
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【００７７】
第１のｑＰＣＲスクリーニングは、ベータアクチン遺伝子の増幅を含んだ。反応は、４つの９６ウェルプレートで実施した。プレートとプレートの差異を軽減するために、プレートのそれぞれの平均Ｃｔを算出し、プレート上の反応のそれぞれのデルタＣｔ（ΔＣｔ）をＣｔ（平均）−Ｃｔ（反応）として決定した。４つのｑＰＣＲプレートからのデータを、単一の表にまとめ、デルタＣｔで分類した（表７）。表の調査から、明らかなプレートの偏向がないことが明らかになった（つまり、デルタＣｔの分布は、４つのプレート間で統計的に分布されたと思われる）。
第１のｑＰＣＲスクリーニング−ベータアクチンの増幅
【表７】
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【００７８】
次いで、上位９６個のＷＴＡ生成物（表７の影部分）に、単一プレート内でＮＭ＿００１７９９のプライマーを使用して第２のｑＰＣＲスクリーニングを実施した。表８は、それぞれの反応の増幅およびＣｔ値の効率を示す。ＷＴＡ生成物は、最低Ｃｔ〜最大Ｃｔでランク付けした。
第２のｑＰＣＲスクリーニング−ＮＭ＿００１７９９の増幅
【表８】
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【００７９】
次いで、最低Ｃｔを有する４８個のＷＴＡ（表８の影部分）は、また単一プレート内でＮＭ＿００１５７０−［２２３４８］−０１（スクリーニング３ａ）およびヒトＢ２Ｍ参照遺伝子（スクリーニング３ｂ）のプライマーを使用してｑＰＣＲ増幅した。ＨＢ２参照遺伝子は特に診断的でなかったため、ＷＴＡ生成物は、ＮＭ＿００１５７０−［２２３４８］−０１の最低Ｃｔに基づきランク付けした（表９参照）。
第３のｑＰＣＲスクリーニング
【表９】
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【００８０】
最低Ｃｔを有する１４個のＷＴＡ生成物（表９の影部分）、ならびに１Ｋ９および１Ｄ９プライマーで増幅された生成物に、第４のｑＰＣＲスクリーニングン（つまり、スクリーニング４ａ〜ｆ）を実施した。現在のＷＧＡおよびＷＴＡプライマーが、Ｋ９領域を含み、Ｄ９が、Ｋに相対する縮重を増加させる第１世代の試みであるため、１Ｋ９および１Ｄ９プライマーも、スクリーニングに含めた。従来どおり、すべての反応は、単一の９６ウェルプレート内で実施した。表１０は、それぞれの反応の増幅効率およびＣｔ値を示す。１６個の中断されたＮライブラリー合成プライマーのうち、５個は、ＮＭ＿００３２３４ｑＰＣＲの高いＣｔの組み合わせ、および／またはヒトゲノムからのより少ない数の考えられるＷＴＡアンプリコンのいずれかの理由により、さらなる考慮事項から外した。残りの１１個のプライマーは、第４のスクリーニングの６つのｑＰＣＲのそれぞれのＣｔで分類した。それぞれの分類で、プライマーのそれぞれには、ランク番号（１＝最高ランク、１１＝最低ランク）を付けた。得られたランク番号は、それぞれのプライマー設計に積算した（表１１参照）。ランク番号の合計は、プライマーのランク付けを提供するために分類した。当該プロセスによって、１１個のうち９個の中断されたＮプライマーは、第４のスクリーニングに有意量の増幅可能なテンプレートを提供する同様の能力を有したことが明らかになった。
第４のｑＰＣＲスクリーニング
【表１０】
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第４のｑＰＣＲスクリーニング後のプライマーのランク付け
【表１１】
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【００８１】
これらの実験と平行して、３８４個のプライマー設計のそれぞれから生じる、考えられるヒトトランスクリプトーム由来のアンプリコンの数は、生物情報学的に決定した。４つのｑＰＣＲスクリーニングにおいて同定された９つの配列のうち、８つは、ヒトトランスクリプトーム（１Ｄ９は、ｑＰＣＲスクリーニング３におけるアンプリコンの損失により、さらなる評価から外した）から形成された潜在的なアンプリコンの数によってランク付けした。この分析は、５つの配列（つまり、１１Ｋ４、１５Ｋ４、１９Ｋ４、２５Ｋ４、および２７Ｋ４）を同定し、それぞれは、ヒトトランスクリプトームから約１００万のアンプリコンを形成した。
【００８２】
実施例４：例示的プライマーを同定するための付加的スクリーニング
（ａ）分解したＲＮＡの増幅
ＷＴＡプロセスの所望の態様は、分解したＲＮＡを増幅する能力である。スクリーニング４からの上位９つの中断されたＮライブラリー合成プライマー（表１１参照）ならびに１Ｋ９および１Ｄ９プライマーを使用して、ＮａＯＨ消化されたＲＮＡを増幅した。簡潔に言えば、２０μｌの水中の５μｇの肝臓の総ＲＮＡに、２０μｌの０．１ＭＮａＯＨを添加した。該混合物は、２５℃で０分間〜１２分間インキュベーションした。０、１、２、３、４、６、８、および１２分間の時点で、２μｌのアリコートを除去し、１００μｌの１０ｍＭトリス−ＨＣＩ、ｐＨ７中で急冷した。ＷＴＡは、上述と同様に実施した。つまり、ライブラリー合成では、２μｌのＮａＯＨで消化されたＲＮＡ、２μｌの５μＭのライブラリー合成プライマーを７０℃で５分間加熱し、４μｌの２倍ＭＭＬＶバッファ、１０Ｕ／μｌのＭＭＬＶ、および１ｍＭのｄＮＴＰを添加し、４２℃で１５分間インキュベートし、および３０μｌのＨ２Ｏで希釈する。増幅は、８μｌの希釈されたライブラリーと１２μｌの増幅ミックス（２Ｘ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＪＵＭＰＳＴＡＲＴ（登録商標）Ｔａｑ  ＲＥＡＤＹＭＩＸ（登録商標）、および５μＭのユニバーサルプライマー）を混合して行う。アガロースゲル電気泳動によるＷＴＡ生成物の分析から、すべてのプライマー（１Ｋ９および１Ｄ９ライブラリー合成プライマーを除く）が、比較的高いレベルのＷＴＡアンプリコンを形成した（図３参照）ことが明らかになった。
【００８３】
（ｂ）ＷＴＡスクリーニング
理想的なライブラリー合成プライマーの別の所望の特性は、最小限のプライマー二量体を形成する、またはそれを形成しないことである。上述の分解されたＲＮＡ実験に使用する１１個の中断されたＮプライマーに、テンプレートの欠損した状態を除いてＷＴＡを実施した。ライブラリー合成は、ＭＭＬＶ逆転写酵素、またはＭＭＬＶおよびクレノウエキソ−マイナスＤＮＡポリメラーゼの両方のどちらかの存在下でも実施した。ライブラリー増幅は、ＪＵＭＰＳＴＡＲＴ（登録商標）ＴａｑまたはＫＬＥＮＴＡＱ（登録商標）（Ｓｉｍｇａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のいずれか一方によっても触媒した。図４は、ＭＭＬＶおよびクレノウエキソ−マイナスＤＮＡポリメラーゼの組み合わせによる合成、およびＪＵＭＰＳＴＡＲＴ（登録商標）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる増幅が高いレベルのアンプリコンを提供したことを示す。さらに、この実験は、プライマー二量体の形成は、これらの１１個のライブラリー合成プライマーのどのプライマーにおいても、有意な問題ではないことを明らかにした（ＲＮＡテンプレートを使用しないゲル参照）。
【００８４】
（ｃ）最終選択
好適なライブラリー合成プライマーは、分子内および／または分子間プライマーの特異的相互作用（たとえば、プライマー二量体）による感度の損失なく、最大数のアンプリコンを提供するプライマーであってもよい。したがって、ｑＰＣＲ淘汰実験、プライマー二量体分析、およびバイオインフォマティック分析は、これらの要件を満たす５つの中断されたＮ配列を明らかにした。つまりライブラリー合成に使用されたときに、すべてのｑＰＣＲスクリーニングに増幅可能なテンプレートを提供したＷＴＡ生成物を産出した、５つの配列（つまり、１１Ｋ４、１５Ｋ４、１９Ｋ４、および２７Ｋ４）は、テンプレートの存在なく、最少量のプライマー二量体を産出し、ヒトトランスクリプトームから少なくとも１００万個のＷＴＡアンプリコンを形成することが可能であった。
【００８５】
これらの好適な配列のうちの１つは、ライブラリー合成プライマーとしての使用に無作為に選択し得るが、これらの配列のいくつかまたはすべての混合物は、好適であり得ると推論した。反対に、それらのいくつかまたはすべての混合物は、有害なプライマーとプライマーとの相互作用も可能にし得る。これらの可能性は、ライブラリーが個別のプライマー、または好適なプライマーのいくつかの混合物または５つすべて、ならびにＫ９、Ｄ９、またはＮ９配列を含むプライマーを使用して合成される、ＷＴＡを実施して調査した。潜在的な有害な相互作用は、高濃度のライブラリー合成プライマーによるライブラリー合成を実施して調査した。したがって、標準的ＷＴＡ反応ライブラリーは、１０μＭ、２μＭ、０．４μＭ、または０．０８μＭのライブラリー合成プライマーの存在下で実施した。ＷＴＡ生成物は、アガロースゲル電気泳動によって分析した。ＷＴＡ生成物を、同じくＮＭ＿００１５７０プライマー（配列番号３３および３４）を使用する、ＳＹＢＲ（登録商標）ｇｒｅｅｎ媒介ｑＰＣＲ増幅で分析した。
【００８６】
図５に示すとおり、ＷＴＡ生成物の収率は、ライブラリー合成プライマーの濃度に左右された。さらに、プライマー二量体の徴候は、Ｎ９プライマーの最大濃度（Ｎレーン参照）でのみ存在した。プライマー相互作用の可能性は、プライマー／プライマーとの組み合わせのそれぞれのｑＰＣＲからデルタＣｔを算出して推定した。つまり、１０μＭと２μＭとの間、２μＭと０．４μＭとの間、および０．４μＭと０．０８μＭとの間のＣｔの差異である。負のデルタＣｔは、有害なプライマーとプライマーとの相互作用として解釈した。１５Ｋ４のみが、高濃度において適度の有害相互作用を有し、１５Ｋ４および１９Ｋ４を含んだ、ほとんどのあらゆる組み合わせも、有意に有害であったことが発見された。さらに、１９Ｋ４および２５Ｋ４の組み合わせも、負の相互作用を呈した。
個別のプライマーまたはプライマーの組み合わせを使用するｑＰＣＲ
【表１２】
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*１１＝１１Ｋ４プライマー。１５＝１５Ｋ４プライマー、１９＝１９Ｋ４プライマー、２５＝２５Ｋ４プライマー、２７＝２７Ｋ４プライマー.
**１＝１０μＭ、２＝２μＭ、３＝０．４μＭ、４＝０．０８μＭ
【００８７】
プライマーの組み合わせが有し得る、いかなる考えられる負の影響のほかに、それらの分岐配列をプライムする能力は、個別の配列のペアワイズアライメントによって調査した。５つの中断されたＮは、プライマーの中で重複する最大数のＮを有するように整列させた（表１３参照）。さらに、ペアワイズＫ−Ｎの不適合は、それぞれの考えられる対合について計算した（表１４参照）。
ペアワイズアライメント
【表１３】
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不適合
【表１４】
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【００８８】
これらの分析は、このセットのプライマー内の最大の分岐は、１１Ｋ４、１９Ｋ４、および２７Ｋ４プライマーで起こることを明らかにした。したがって、最少のプライマー相互作用を伴う最大のプライミングの分岐は、１１Ｋ４（つまり、ＫＮＮＮＫＮＫＮＫ）、１９Ｋ４（つまり、ＮＫＮＮＫＮＮＫＫ）、および２７Ｋ４（つまり、ＮＮＮＫＮＫＫＮＫ）から成るプライマーの混合物の使用により生じた。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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