(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
［Ｒ１Ｒ２Ｎ−ＣＨ（Ｒａ）−ＣＯ］ａ−（ＡＡ１）ｍ−（ＡＡ２）ｂ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｘ４−（ＡＡ３）ｎ−［ＮＨ−ＣＨ（Ｒｂ）−ＣＯＯＲ３］ｃ      （Ｉ）
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立に、
Ｈ、
場合によりヒドロキシル化および／または硫化されたＣ２〜Ｃ２２の直鎖状炭化水素基であり、前記基は飽和でも不飽和でもよく、
場合によりヒドロキシル化および／または硫化されたＣ３〜Ｃ２２の分枝状もしくは環状の炭化水素基であり、前記基は飽和でも不飽和でもよく、または
ビオチン基
を表し、
Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方は代替的に保護基または遮断基であってもよく、
ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖状アルキル基またはＣ３〜Ｃ４の分枝状アルキル基を表し、各アルキル基は、ＯＨ、ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＮＨ２−Ｓ−ＣＨ３、ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ２から成る群から選択される１つもしくは複数の置換基で、または環状もしくは複素環状の芳香族基で場合により置換されており、
ｂ＝１であり、ＡＡ２がグルタミン酸（Ｅ）であり、
Ｘ１がアスパラギン酸（Ｄ）であり、
Ｘ２がグルタミン酸（Ｅ）であり、
Ｘ３がプロリン（Ｐ）であり、
Ｘ４がグルタミン酸（Ｅ）であり、
Ｙ１がロイシン（Ｌ）であり、
Ｙ２がロイシン（Ｌ）であり、
Ｙ３がメチオニン（Ｍ）であり、
ｎ＝ｍ＝ａ＝ｃ＝０、または、ｎ＝ｍ＝ｃ＝０かつａ＝１のいずれかであり、 
全ての前記アミノ酸基は独立にＬ、ＤまたはＤＬ立体配置のものであってもよい）
を有する化合物。
【請求項２】
下記式（Ｉ）：
［Ｒ１Ｒ２Ｎ−ＣＨ（Ｒａ）−ＣＯ］ａ−（ＡＡ１）ｍ−（ＡＡ２）ｂ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｘ４−（ＡＡ３）ｎ−［ＮＨ−ＣＨ（Ｒｂ）−ＣＯＯＲ３］ｃ      （Ｉ）
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立に、
Ｈ、
場合によりヒドロキシル化および／または硫化されたＣ２〜Ｃ２２の直鎖状炭化水素基であり、前記基は飽和でも不飽和でもよく、
場合によりヒドロキシル化および／または硫化されたＣ３〜Ｃ２２の分枝状もしくは環状の炭化水素基であり、前記基は飽和でも不飽和でもよく、または
ビオチン基
を表し、
Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方は代替的に保護基または遮断基であってもよく、
ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖状アルキル基またはＣ３〜Ｃ４の分枝状アルキル基を表し、各アルキル基は、ＯＨ、ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＮＨ２−Ｓ−ＣＨ３、ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ２から成る群から選択される１つもしくは複数の置換基で、または環状もしくは複素環状の芳香族基  で場合により置換されており、
Ｘ１はアルギニン（Ｒ）またはアスパラギン酸（Ｄ）であり、
Ｘ２はグルタミン（Ｑ）またはグルタミン酸（Ｅ）であり、
Ｘ３はプロリン（Ｐ）であり、
Ｘ４はアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）であり、
Ｙ１はロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）であり、
Ｙ２はロイシン（Ｌ）であり、
Ｙ３はバリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）であり、
ＡＡ１およびＡＡ３は独立にアミノ酸基を示し、
ｂ＝１であり、ＡＡ２はグルタミン酸（Ｅ）であり、
ｎ＝ｍ＝ａ＝ｃ＝０、または、ｎ＝ｍ＝ｃ＝０かつａ＝１のいずれかであり、    
全ての前記アミノ酸基は独立にＬ、ＤまたはＤＬ立体配置のものであってもよく、
ただし、Ｘ１がアルギニン（Ｒ）であるとき、Ｙ３はメチオニン（Ｍ）以外である）
を有し、
ＤＥＲＱＰＬＬＶＥ、ＥＥＲＱＰＭＬＬＤ、ＡＥＤＥＰＬＬＭＥおよびＡＥＤＥＰＬＬＶＤからなる群から選ばれるものである、化合物。
【請求項３】
生理学的に許容される媒体中に請求項１または２に記載の少なくとも１つのペプチド化合物またはその混合物を含む化粧用または皮膚用の組成物。
【請求項４】
前記ペプチド化合物が、前記組成物の総重量に対し０．００１から２０重量％を占めることを特徴とする、請求項３に記載の化粧用または皮膚用の組成物。
【請求項５】
前記ペプチド化合物が、前記組成物の総重量に対し０．０１から１０重量％を占めることを特徴とする、請求項３に記載の化粧用または皮膚用の組成物。
【請求項６】
前記ペプチド化合物が、前記組成物の総重量に対し０．１から５重量％を占めることを特徴とする、請求項３に記載の化粧用または皮膚用の組成物。
【請求項７】
ヒトの皮膚の色素を除去することを意図した皮膚用製剤を製造するための、請求項３から６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘテロ四量体のアダプタータンパク質複合体（ＡＰ）により、より詳細には、チロシナーゼの輸送、ひいてはメラニン形成において鍵となる役割を有するＡＰ３およびＡＰ２のアダプター複合体により特異的に認識される、新規なペプチド化合物に関する。本発明はさらに、これらの化合物を含む化粧用組成物、そのような組成物をヒトの皮膚上に局所施用することを含む美容上のホワイトニング法、および、ヒトの皮膚の色素を除去することを意図した皮膚用製剤を製造するためのこの組成物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
老人性色素斑または褐色斑など皮膚の色素沈着異常を緩和する目的、または可能な限り明るい肌色を手に入れたいと熱望する消費者を満足させる目的で、化粧用および皮膚用の組成物中で使用するための新しいホワイトニング剤を抽出または合成するために、過去何年にもわたり広範な調査が行われてきた。
【０００３】
メラニン形成に対して作用する多様なホワイトニング剤が、この目的に向けて提案されてきた。しかし、その中には、わずかなメラニン形成阻害効果しか示さず十分なホワイトニング効果をもたらすことに失敗するものもあれば、より有効ではあっても、ヒトの皮膚細胞に対して毒性を有することから必ず副作用を伴うため、化粧品において使用することは相当危険であると証明されているものもある。この毒性は、こうしたホワイトニング剤が、毒素を産生しながら細胞を殺してそれを皮膚に強制排除させることによりメラニン形成の根本的な機序を妨げるという事実によるものである。
【０００４】
例えば、ヒドロキノンは、メラニン形成細胞に対しとりわけ刺激性および細胞毒性のある化合物であり、これを全部または部分的に置き換えることが多くの研究者により企図されてきた。前述の欠点を克服するため、例えば、ヒドロキノンの脂肪酸エステルまたはグリコシルエーテルなどの活性化合物の誘導体を色素除去剤として使用することが提唱されてきた。残念ながら、ヒドロキノンより光安定性が高く毒性が低くても、アルブチンなどのこうした誘導体は、色素異常の側面を改善する活性がヒドロキノンより低い。
【０００５】
メラニン形成の機序には関与しないが、チロシナーゼに対し、その活性化を防止することにより上流で作用し、結果としてはるかに毒性が低い他の物質が探求されてきた。チロシナーゼは、メラニン合成において鍵となる酵素とみなされ、最初の２つの反応、すなわち、Ｌ−チロシンから３，４−ジヒドロフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）へのヒドロキシル化と、ＤＯＰＡからＤＯＰＡキノンへの酸化とを触媒する。コウジ酸は、この酵素の活性部位中に存在する銅と複合体を形成することによりチロシナーゼ活性化を阻害する物質として、一般に使用される。残念ながら、この化合物は、アレルギー反応を引き起こすことがある（Ｎａｋａｇａｗａら、Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ、１９９５より）。加えて、この化合物は溶液中で不安定であり、そのことが、この化合物を含有する組成物の製造をいくらか複雑にしている。
【０００６】
チロシナーゼ活性に対して作用する他のホワイトニング剤は植物抽出物であるが、その有効性は必ずしも満足なものではない。このような公知のホワイトニング剤の限られた有効性について可能な説明は、こうしたホワイトニング剤はメラノソーム内部のチロシナーゼに対して適切な接近手段をもたないということである。事実、メラノソーム膜は、メラニン形成中に生じる非常に毒性の強い代謝産物（キノン）から細胞を保護する、非常に不透過性の高い構造物である。
【０００７】
皮膚のメラニン形成を阻害するための別のアプローチは、チロシナーゼの成熟過程に働きかけることである。例えばツニカマイシンがこの目的に向けて提案されているが、それは、この化合物は、チロシナーゼが成熟してゴルジからメラノソームへ遊走するのに必要なそのグリコシル化を妨害するからである。しかし、グリコシル化の阻害は、非特異的であり、この化合物の化粧品使用を不適当なものとするいくつかの副作用を伴う。同様に、チロシナーゼの立体配座を改変してその安定性を低下させ、チロシナーゼを分解経路（小胞体関連分解、または、エンドソーム系／リソソーム系を通るもの）に向かわせることが可能な他の作用剤が提案されてきた。しかし、このアプローチの主な欠点は、これにより他のタンパク質の成熟までも妨げられ、ひいてはメラニン形成以外のいくつかの生物学的機序が変質しかねないことである。これもまた、化粧品用としては考えられない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、公知の作用剤と同程度有効に、またはそれよりさらに良好に作用するが欠点を呈さない、すなわち、皮膚に対して非刺激性、非毒性および／または非アレルゲン性であり、組成物中で安定な、ヒトの皮膚を脱色するための作用剤に対する必要性が未だ存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この必要性を満たすため、本発明は、メラノソーム形成の上流で、その膜が形成される相当前に作用することから、安全性が高まるだけでなく非常に有効な、色素沈着過程を阻害するための代替的な方式を使用する。より具体的には、本発明の新規な化合物は、メラノソームへのチロシナーゼの細胞内輸送を妨げるように考えられている。したがって、活性剤のその生物学的標的への接近可能性の問題は克服される。さらに、これらの化合物は、ＴＧＮ（トランスゴルジ網）からメラノソームへのチロシナーゼ輸送を阻害し、および／または減少させるので、メラニン形成に対してかなり特異的な活性を有する。したがって、この化合物は、他に生物学的過程があってもそれを妨げにくく、それにより化粧品用途に十分適したものとなる。
【００１０】
メラノソームは、色素合成に関わる酵素（例えばチロシナーゼのような）が存在する点で、リソソームとは異なる。チロシナーゼは、成熟中のメラノソーム中で活性をもつのみで、その生合成経路の他の細胞小器官中では活性をもたない。したがって、本発明者らが選択するアプローチは、細胞質ゾルのヘテロ四量体のアダプター複合体（ＡＰ）、具体的には、細胞内の局在化機構の鍵となる要素であるＡＰ−２およびＡＰ−３（Ｈｏｎｉｎｇら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１７、ｎｏ５、１３０４〜１３１４、１９９８およびＨｏｎｉｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．、２００５、１８、５１９〜５３１）へのチロシナーゼの結合を遮断するために短鎖ペプチドを使用することである。ＡＰ複合体の主要機能の１つは、チロシナーゼなどの膜タンパク質を、同タンパク質の細胞内末端中に位置する短鎖ペプチド配列を介して結合させることである。積荷タンパク質上に細胞質局在化シグナルを結合させることにより、ＡＰ複合体はドナー膜上の小区画に積荷を補充し、この小区画が出芽して、標的膜と融合することが意図された小胞または細管を形成する（Ｂｏｎｉｆａｃｉｏ  ａｎｄ  Ｔｒａｕｂ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７２、３９５〜４４７、２００３）。
【００１１】
より具体的には、チロシナーゼはＡＰ−３と高い親和性相互作用を有することが実証されている。ＡＰ−３は、４つのサブユニット、すなわち、δ−アダプチン、β３Ａ−アダプチン、中鎖μ３Ａおよび小鎖σ３Ａから構成されるアダプター複合体である。μ３鎖はチロシンベースの局在化シグナルと相互作用できること、また、ＡＰ−３は、メラノソームへのチロシナーゼの輸送に関与するジロイシンベースのシグナルと結合することが実証されている（ＤＥＬＬ’ＡＮＧＥＬＩＣＡ  ＥＣら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１６、９１７〜９２８、１９９７）。したがって、ＡＰ３とチロシナーゼとの間の結合を防止することにより、メラノソームの形成、ひいてはメラニン形成におけるチロシナーゼの取込みが阻害されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の多様な化合物が、チロシンベースのシグナルを含有するＴＧＮ３８ペプチドへのＡＰ−２の結合に及ぼす阻害効果を示すヒストグラムである。
【図２】本発明の多様な化合物が、チロシンベースのシグナルを含有するＬａｍｐ−１ペプチドへのＡＰ−３の結合に及ぼす阻害効果を示すヒストグラムである。
【図３】本発明の多様な化合物が、ジロイシンベースの局在化シグナルを含有するチロシナーゼへのＡＰ−２の結合に及ぼす阻害効果を示すヒストグラムである。
【図４】本発明の多様な化合物が、ジロイシンベースの局在化シグナルを含有するチロシナーゼへのＡＰ−３の結合に及ぼす阻害効果を示すヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の新規な化合物は、本発明者らの知る限り、記載されたこと、または化粧品中でこれまでに使用されたことのないペプチド化合物である。
【００１４】
したがって、本発明は、以下の式（Ｉ）：
［Ｒ１Ｒ２Ｎ−ＣＨ（Ｒａ）−ＣＯ］ａ−（ＡＡ１）ｍ−（ＡＡ２）ｂ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｘ４−（ＡＡ３）ｎ−［ＮＨ−ＣＨ（Ｒｂ）−ＣＯＯＲ３］ｃ      （Ｉ）
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立に、
・Ｈ、
・場合によりヒドロキシル化および／または硫化されたＣ２〜Ｃ２２の直鎖状炭化水素基であり、該基は飽和でも不飽和でもよく、
・場合によりヒドロキシル化および／または硫化されたＣ３〜Ｃ２２の分枝状もしくは環状の炭化水素基であり、該基は飽和でも不飽和でもよく、または
・ビオチン基
を表し、
Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方は代替的に保護基または遮断基であってもよく、
ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖状アルキル基またはＣ３〜Ｃ４の分枝状アルキル基を表し、各アルキル基は、ＯＨ、ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＮＨ２−Ｓ−ＣＨ３、ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ２から成る群から選択される１つもしくは複数の置換基で、または環状もしくは複素環状の芳香族基で場合により置換されており、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ４はそれぞれ独立に極性のアミノ酸基を表し、
Ｘ３は、好ましくは荷電していない、小鎖のアミノ酸基であり、
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３はそれぞれ独立に疎水性のアミノ酸基を表すが、ただしＹ１およびＹ２の少なくとも一方はロイシンまたはイソロイシンであり、
ＡＡ１、ＡＡ２およびＡＡ３は独立にアミノ酸基を示し、この場合、ｍおよびｎが１を超えるときは、ＡＡ１およびＡＡ３のアミノ酸基はそれぞれ同じであっても異なっていてもよく、
ｍおよびｎは独立に０から１０の範囲の整数を表し、
ａ、ｂおよびｃは独立に０または１であり、
全ての該アミノ酸基は独立にＬ、ＤまたはＤＬ立体配置のものであってもよく、
ただし、Ｘ１がアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）であるとき、Ｙ３はメチオニン（Ｍ）以外である）
を有する化合物に関する。
【００１５】
「保護基または遮断基」は、例えば分子のカルボキシル基で反応が起こる際にペプチド中のアミノ基の反応性を妨げる能力のある任意の化学部分を意味することを意図したものである。例示的な保護基としては、ｔＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）基、Ｚ（ベンゾイルカルボニル）基、Ｆｍｏｃ（フルオレニルメチルオキシカルボニル）基およびＡｌｌｏｃ（アリルオキシカルボニル）基が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド合成において有用なこれらの、および追加的な保護基および遮断基は、当技術分野では周知である。
【００１６】
さらに、用語「炭化水素基」は、その構造中、例えばその主鎖中に炭素原子および水素原子を有する任意の基を意味することを意図したものである。この炭化水素基は、酸素原子および／または窒素原子など他の原子を含んでいてもよい。Ｒ１および／またはＲ２の炭化水素基の非限定的な例は、アルキルカルボニル基およびアルケニルカルボニル基である。中でも、パルミトイル基など６から２０個の炭素原子を有するアルキルカルボニル基が好ましい。Ｒ３の炭化水素基の非限定的な例は、１から２０個の炭素原子を含むアルキル基およびアルケニル基である。
【００１７】
極性のアミノ酸基の中では、以下から成る群から選択されるものを挙げることができる：アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、トレオニン（Ｔ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）。
【００１８】
小鎖のアミノ酸基の中では、以下から成る群から選択されるものを挙げることができる：プロリン（Ｐ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）およびグリシン（Ｇ）。
【００１９】
疎水性のアミノ酸基の中では、以下から成る群から選択されるものを挙げることができる：アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、システイン（Ｃ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、ヒスチジン（Ｈ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）およびフェニルアラニン（Ｆ）。
【００２０】
このペプチドのアミノ末端およびＣ末端の方向は、前述の化合物の阻害効果に無関係であることに注目すべきである。
【００２１】
式（Ｉ）中の角括弧間の基は、本発明の化合物の溶解性、膜透過および／または検出を促進するため、または単に分解に対しペプチドを保護するために、有利に存在できる（ａおよび／またはｃは１である）。このような基は、ＡＰ−２および／またはＡＰ−３アダプター複合体へのこれらのペプチドの結合を強化するためにも有用である可能性がある。
【００２２】
前記の式（Ｉ）においては、
・ＡＡ２および／またはＸ４は極性のアミノ酸基を示し、該基は好ましくは荷電し、より好ましくは負に荷電しており、および／または
・Ｘ１は荷電した極性のアミノ酸基であり、および／または
・Ｘ３はプロリン（Ｐ）であり、および／または
・Ｙ１および／またはＹ２および／またはＹ３は、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）またはロイシン（Ｌ）など脂肪族のアミノ酸基であり、
ただし、Ｘ１がアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）であるとき、Ｙ３はメチオニン（Ｍ）以外である
ことが好ましい。
【００２３】
本発明の好ましい一実施形態によれば、
・ｂ＝１であり、ＡＡ２はグルタミン酸（Ｅ）であり、
・Ｘ１はアルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）であり、
・Ｘ２はグルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン（Ｎ）であり、
・Ｘ３はプロリン（Ｐ）であり、
・Ｘ４はアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）であり、
・Ｙ１はロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）またはイソロイシン（Ｉ）、好ましくはロイシン（Ｌ）であり、
・Ｙ２はロイシン（Ｌ）であり、
・Ｙ３はバリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）であり、および／または
・ｎ＝ｍ＝ａ＝ｃ＝０、または、ｎ＝ｍ＝ｃ＝０かつａ＝１のいずれかであり、
ただし、Ｘ１がアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）であるとき、Ｙ３はメチオニン（Ｍ）以外である。
【００２４】
より好ましくは、前述の条件が全て満たされる。
【００２５】
本発明の最も好ましい一実施形態では、
・ｂ＝１であり、ＡＡ２がグルタミン酸（Ｅ）であり、
・Ｘ１がアスパラギン酸（Ｄ）であり、
・Ｘ２がグルタミン酸（Ｅ）であり、
・Ｘ３がプロリン（Ｐ）であり、
・Ｘ４がグルタミン酸（Ｅ）であり、
・Ｙ１がロイシン（Ｌ）であり、
・Ｙ２がロイシン（Ｌ）であり、
・Ｙ３がメチオニン（Ｍ）であり、
・ｎ＝ｍ＝ａ＝ｃ＝０、または、ｎ＝ｍ＝ｃ＝０かつａ＝１のいずれかである。
【００２６】
より好ましくは、後者の場合は、Ｒａ＝ＣＨ３、Ｒ１＝Ｈであり、Ｒ２＝ＣＯ−（ＣＨ２）１４−ＣＨ３である。
【００２７】
最も好ましい別の実施形態では、
・ｂ＝２であり、
・ＡＡ２基のそれぞれがグルタミン酸（Ｅ）であり、
・Ｙ１＝Ｙ２＝ロイシン（Ｌ）である。
【００２８】
このペプチドは、従来の化学合成により、または任意の種のタンパク質発現系中の融合タンパク質として、または酵素的合成により（Ｋｕｌｉｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、１９８０）、構成アミノ酸またはその誘導体から生じさせてもよい。本発明のペプチドは、さらに、バイオ技術（微生物（遺伝子工学による改変の有無を問わない）の使用）によって得ることができる。すなわち、本発明によるペプチドは、遺伝子工学により細菌の菌株（改変の有無を問わない）を発酵させて、先述の配列のペプチドおよびその断片を作製することによって得ることもできる。本発明のペプチドは、天然のタンパク質から、すなわち、動物または植物由来のタンパク質を抽出してから、制御された加水分解（平均サイズおよび小型のペプチド断片が放出されるが、ただし、放出された要素は式（Ｉ）に含まれる配列を少なくとも含有する）を行うことによって得ることもできる。関連のタンパク質を抽出してからそれを加水分解するか、または最初に未精製抽出物に対して加水分解を実施してからペプチド断片を精製するか、そのいずれかが可能であるが、必要というわけではない。当業者であれば、タンパク質およびペプチドの合成、抽出および精製について、より簡単またはより複雑な他のプロセスを考えることができる。したがって、本発明のペプチド化合物は、天然または合成由来のものであってもよい。好ましくは、本発明のペプチド化合物は、化学合成によって得る。
【００２９】
本発明はさらに、生理学的に許容される媒体中に前述のとおりの少なくとも１つのペプチド化合物またはその混合物を含む化粧用または皮膚用の組成物にも関する。
【００３０】
「生理学的に許容される媒体」とは、皮膚上への局所施用に適応させた担体を示すことを意図している。この媒体は、好ましくは化粧品として許容され、すなわち、ヒトの皮膚上に施用した際に実質的な刺激作用、発赤または発熱を一切引き起こさない。
【００３１】
この組成物中に含まれる式（Ｉ）の化合物の量は、必要なホワイトニング効果をもたらすのに十分な任意の量であってもよい。例えば、この化合物は、組成物の総重量に対し０．００１から２０重量％、より好ましくは０．０１から１０重量％、さらにより好ましくは０．１から５重量％を占めてもよい。
【００３２】
この組成物は、固体、半固体または液体であってもよい。この組成物は、例えば、粉末、軟膏、ペースト、クリーム、流体、乳液、化粧水、ローション、セラム、ゲル、泡、シートマスクなどの顔用マスク、水分の多いまたは無水のスティック等の形態をしていてもよい。好ましくは、この組成物は水を含む。より好ましくは、この組成物は、ゲルの形態、または、水中油もしくは油中水、例えばシリコン中水、エマルションの形態をしている。あるいは、この組成物は、多相エマルション、マイクロエマルション、ナノエマルションまたは分散系の形態をしていてもよい。
【００３３】
本発明による組成物は、以下から選択される少なくとも１つの化合物などの多様な添加物を含有してもよい：
・油：とりわけ、ジメチルポリシロキサン（ジメチコン）、ポリアルキルシクロシロキサン（シクロメチコン）およびポリアルクリ（polyalkly）フェニルシロキサン（フェニルジメチコン）など、揮発性または不揮発性の、直鎖状または環状のシリコーン油；フッ化油、安息香酸アルキルおよび分枝状炭化水素（ポリブテンなど）などの合成油；植物油、および、とりわけ大豆またはホホバの油；ならびに、パラフィン油などの鉱油から選択できる、
・蝋：オゾケライト、ポリエチレン蝋、蜜蝋またはカルナウバ蝋など、
・シリコーンエラストマー：とりわけ、触媒の存在下で、少なくとも１つの反応基（とりわけ、水素またはビニル）を有し少なくとも１つの末端および／または側鎖のアルキル基（とりわけメチル基）またはフェニル基をもつポリシロキサンを、有機水素ポリシロキサンなどの有機ケイ素と反応させることにより得られるもの、
・界面活性剤：好ましくは乳化剤であり、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性または両性のいずれであってもよく、ならびに、とりわけ、脂肪酸とポリオールとのエステル（脂肪酸とグリセロールとのエステル、脂肪酸とソルビタンとのエステル、脂肪酸とポリエチレングリコールとのエステルなど）；脂肪酸とショ糖とのエステル；脂肪アルコールとポリエチレングリコールとのエステル；アルキルポリグルコシド；改変されたポリシロキサンポリエーテル；ベタインおよびその誘導体；ポリクオタニウム；エトキシル化された脂肪アルコールの硫酸塩；スルホスクシネート；サルコシネート；アルキルリン酸およびジアルキルリン酸およびそれらの塩；ならびに脂肪酸の石鹸、
・共界面活性剤：直鎖状脂肪アルコール、ならびに、とりわけ、ヘキサデシルアルコールおよびステアリルアルコールなど、
・増粘剤および／またはゲル化剤、ならびに、とりわけ、アクリルアミドエチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）および／またはアクリルアミドおよび／またはアクリル酸および／またはアクリル酸の塩もしくはエステルの、親水性または両親媒性で架橋型または非架橋型のホモポリマーおよびコポリマー；キサンタンゴムまたはグアーゴム；セルロース誘導体；ならびにシリコーンゴム（ジメチコノール）、
・湿潤剤：ギルセリン（gylcerin）、プロピレングリコールおよび糖を包含するポリオール、ならびに、ヒアルロン酸などのムコ多糖類ならびにその塩およびエステルなど、
・経皮吸収を促進するための作用剤：アルコール、脂肪アルコールおよび脂肪酸、ならびにそのエステルまたはエーテル誘導体、ピロリドン、テルペン、精油およびα−ヒドロキシ酸など、
・着色料、
・保存料、
・光学的調整剤またはソフトフォーカス剤：無着色および着色された、有機および無機材料など。使用してもよい材料の中には、有機色素、無機色素、ポリマーおよび充填剤が含まれる。本発明品中に存在してもよい粒子は、天然、合成または半合成のものであってもよい。これらの光学的調整剤は、小板形状、球状、細長いもしくは針状の形状、または不規則な形状で、表面はコーティングされていてもいなくてもよく、多孔質または非多孔質、荷電または非荷電のものであってもよい。本発明において有用なそのような粒子としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：雲母、ゼオライト、カオリン、シリカ、窒化ホウ素、ラウロイルリシン、ナイロン、ポリエチレン、タルク、スチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、エチレン／アクリル酸コポリマー、酸化アルミニウム、シリコーン樹脂、炭酸カルシウム、酢酸セルロース、ＰＴＦＥ、ポリメタクリル酸メチル、デンプン。この粒子は、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．によりＴＩＭＩＲＯＮ（登録商標）、ＣＯＬＯＲＯＮＡ（登録商標）の商品名で供給されているもの、および、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ  Ｃｏ．によりＦＬＡＭＥＮＣＯ（登録商標）、ＴＩＭＩＣＡ（登録商標）の商品名で供給されているものなど、パール光沢付きの干渉色素であってもよい。さらに、この粒子は、タルク／二酸化チタン／アルミナ／シリカ複合材料粉末などの複合材料粉末、例えば、Ｃｏｖｅｒｌｅａｆ  ＡＲ−８０（登録商標）の商品名でＣａｔａｌｙｓｔ＆Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社により販売されているものなどであってもよい。当然ながら、この調合物は、それぞれが特定の視覚的利益の特徴を有する光学的調整剤の混合物を含有することで視覚効果の組合せを創出してもよい、
・金属イオン封鎖剤：ＥＤＴＡ塩など、
・香料、
・ならびにその混合物。なお、このリストは限定的なものではない。
【００３４】
そのような添加物の他の例は、とりわけＣＴＦＡ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ刊、第１０版、２００４）中に挙げられている。
【００３５】
さらに、本発明の局所用組成物は、多様な活性剤を適切に含有してもよく、こうした活性剤は、以下から成る群から選択してもよい：
・抗酸化物質：アスコルビン酸およびその誘導体（パルミチン酸アスコルビル、テトライソパルミチン酸アスコルビル、アスコルビルグルコシド、アスコルビルリン酸マグネシウム、アスコルビルリン酸ナトリウムおよびソルビン酸アスコルビルなど）；トコフェロールおよびその誘導体（酢酸トコフェリル、ソルビン酸トコフェリル、ならびに、トコフェロールの他のエステルなど）；ＢＨＴおよびＢＨＡ；ならびに植物抽出物（例えば、コンドラス・クリプサス（Chondrus cripsus）、イワベンケイ属、高度好熱菌（Thermus thermophilus）、マテ茶葉、オークウッド、カユラペットバーク（kayu rapet barｋ）、桜の葉およびイランイランの葉由来のもの）など、
・抗加齢剤：アシルアミノ酸（例えば、ＳＥＤＥＲＭＡ製のＭａｘｉｌｉｐ、Ｍａｔｒｉｘｙｌ３０００もしくはＢｉｏｐｅｐｔｉｄｅ  ＣＬまたはＳＥＰＰＩＣ製のＳｅｐｉｌｉｆｔ）、エンドウ（Pisum sativum）抽出物、加水分解大豆タンパク質、メチルシラノール誘導体（マンヌロン酸メチルシラノールなど）、加水分解ペポカボチャ（cucurbita pepo）種子油粕、セネデスムス（Scenedesmus）抽出物など、
・抗汚染剤：ワサビノキ（Moringa pterygosperma）の種子抽出物など、
・角質溶解剤：α−ヒドロキシ酸（例えば、グリコール酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、マンデル酸または酒石酸）およびβ−ヒドロキシ酸（例えばサリチル酸）ならびにそのエステル（Ｃ１２〜１３の乳酸アルキルなど）、および、これらのヒドロキシ酸を含有する植物抽出物（ハイビスカス・サブドリファ（Hibiscus sabdriffa）抽出物など）など、
・収斂剤：マンサク抽出物など、
・保湿剤：植物抽出物（西洋栗（Castanea sativa）抽出物、加水分解ヘーゼルナッツタンパク質、チュベローズ（Polyanthes tuberosa）の多糖、アルガン（Argania spinosa）の核油など）、および、特にＭａｒｕｚｅｎ（日本）社によりＰｅａｒｌ  Ｅｘｔｒａｃｔ（登録商標）の商品名で販売されている、コンキオリンを含有する真珠抽出物；２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンのホモポリマーおよびコポリマー（ＮＯＦ製のＬｉｐｉｄｕｒｅ  ＨＭおよびＬｉｐｉｄｕｒｅ  ＰＢＭなど）；糖類（グルコース、フルクトース、マンノースまたはトレハロースなど）；グリコサミノグリカンおよびその誘導体（ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウムおよびアセチル化ヒアルロン酸など）；パンテノール；アラントイン；アロエベラ；遊離アミノ酸およびその誘導体；グルコサミン；クエン酸；尿素およびその誘導体ならびにセラミドなど、
・皮膚軟化剤：ポリメタクリル酸グリセリルなど；抗炎症剤：ビサボロール、アラントイン、トラネキサム酸、酸化亜鉛、イオウ酸化物およびその誘導体、硫酸コンドロイチン、グリチルリチン酸およびその誘導体（グリチルリチネートなど）など、
・ならびにその混合物。
【００３６】
この局所用組成物は、有機および／または無機の日焼止め剤を含んでもよい。有機日焼止め剤の中でも、ブチルメトキシジベンゾイルメタン（ＨＯＦＦＭＡＮＮ  ＬＡ  ＲＯＣＨＥ製のＰａｒｓｏｌ１７８９）などのジベンゾイルメタン誘導体、エチルヘキシルメトキシシンナメート（ＨＯＦＦＭＡＮＮ  ＬＡ  ＲＯＣＨＥ製のＰａｒｓｏｌ  ＭＣＸ）などのケイ皮酸誘導体、サリチレート、パラアミノ安息香酸、β−β’−ジフェニルアクリレート誘導体、ベンゾフェノン誘導体、テレフタリリデンジカンフルスルホン酸などのベンジリデンカンフル誘導体、フェニルベンズイミダゾール誘導体、トリアジン誘導体、フェニルベンゾトリアゾール誘導体、アントラニル酸誘導体を挙げることができるが、その全ては、コーティングされているか、またはカプセルに封入されていてもよい。無機光防護剤の中でも、コーティングされているか、またはされていない金属酸化物から形成される色素または代替的にナノ色素（例えば、酸化チタン、酸化鉄、酸化亜鉛、酸化ジルコニウムまたは酸化セリウムのナノ色素など）を挙げることができるが、これらは全てそれ自体が周知の紫外線防護剤である。
【００３７】
加えて、本発明の局所用組成物のｐＨは、好ましくは４から８の範囲内、好ましくは４．５から７である。
【００３８】
本発明による化粧用組成物は、メラニン形成（ステージＩ）の機序に関与する構造タンパク質の合成を遮断することが可能な少なくとも１つのホワイトニング剤（メラニン形成細胞に特異的な糖タンパク質Ｐｍｅｌ１７など）を含有してもよい。そのような活性剤は、Ｎｉｋｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（日本）により販売されているトラネキサム酸セチルエステル（トランス４（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸ヘキサデシルエステルヒドロクロリド）またはＢＡＳＦによりＣｙｔｏｖｅｃｔｏｒ（登録商標）の商品名で販売されているフェルラ酸Ｃｙｔｏｖｅｃｔｏｒ（水、グリコール、レシチン、フェルラ酸、ヒドロキシエチルセルロース）であってもよい。
【００３９】
変形として、または加えて、本発明による組成物は、メラニン合成に対する阻害効果および／またはＭＩＴＦ発現に対する阻害効果および／または抗チロシナーゼ活性および／またはエンドセリン１合成に対する阻害効果を有するホワイトニング剤（特に、Ｍａｒｕｚｅｎ社によりＬｉｃｏｒｉｃｅ  ｅｘｔｒａｃｔ（登録商標）の商品名で販売されている甘草抽出物（甘草（glycyrrhiza glabra）抽出物）など）を含んでもよい。
【００４０】
変形として、または加えて、本発明による組成物は、ビタミンＣ化合物など抗酸化効果も有するホワイトニング剤を含んでもよく、そうしたホワイトニング剤としては、アスコルビン酸塩、脂肪酸またはソルビン酸のアスコルビルエステルおよび他のアスコルビン酸誘導体、例えば、リン酸アスコルビル（リン酸アスコルビルマグネシウムおよびリン酸アスコルビルナトリウムなど）またはアスコルビン酸の糖エステル（これには、例えば、アスコルビル−２−グルコシド、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルＬ−アスコルベート、または６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルＬ−アスコルベートが含まれる）が挙げられる。このタイプの活性剤は、特に、ＤＫＳＨ社によりＡｓｃｏｒｂｙｌ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（登録商標）の商品名で販売されている。
【００４１】
本発明による組成物中には、他のホワイトニング剤が含まれていてもよい。フサザキスイセン（Narcissus tazetta）抽出物などの植物抽出物；アルブチン；コウジ酸；エラグ酸；システイン；４−チオレゾルシン；レゾルシノールまたはルシノールまたはその誘導体；グリチルリチン酸およびヒドロキノン−β−グルコシドなどの色素除去剤を挙げることができる。
【００４２】
本発明によるこれらの組成物は、以下のような後天性の色素沈着過剰による不規則な色素沈着斑の症例において、ヒトの皮膚の色素を除去するために使用してもよい：肝斑（褐色斑）；炎症後の黒皮症；日光性色素斑；加齢斑（レンティゴセナイル（lentigo senile））；多くの場合、経口避妊薬もしくは他のホルモン薬などの薬物使用中、または香水を付けた後、または妊娠期間中に日光を浴びた際に皮膚上に現れる色素沈着斑；化学剥皮および皮膚切除により生じるか、レーザーによる表面再生の前後またはレーザー除毛の前後に生じる変色；外傷後の有色の角化症もしくは色素脱失（瘢痕）など。さらに、これらの組成物は、肌色または前述の色素沈着過剰および色素脱失の形態を薄く／明るくするために使用してもよい。
【００４３】
したがって、本発明は、前記のような化粧用組成物をヒトの皮膚上に局所施用することを含む、ヒトの皮膚をホワイトニング、脱色または薄色化するための美容法にも関する。
【００４４】
本発明はさらに、ヒトの皮膚の色素を除去することを意図した皮膚用製剤を製造するための、前述の組成物の使用にも関する。
【００４５】
前述のプロセスおよび使用を実施してもよい皮膚領域は、顔の皮膚、胸部の皮膚、手および腕の皮膚または脚の皮膚など、好ましくは頭皮を除くヒトの皮膚の任意の領域であってもよい。
【００４６】
本発明は、添付の図面と併せて以下の非限定的な実施例を参照することにより、さらによく理解されるであろう。
【実施例】
【００４７】
以下の実施例は、本発明の範囲内の実施形態をさらに例示するものである。この実施例は、単に例示の目的で示すものであり、本発明を制限するものではないと解釈されたく、その理由は、本発明の範囲から逸脱しなくても本発明の多くの変形が可能だからである。
【００４８】
［実施例１］
結合テスト：本発明による化合物の、ＡＰ−２およびＡＰ−３アダプター複合体との相互作用の試験
合成：
Ｆｍｏｃ［（Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカルボニル）で保護されベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェートで活性化されたアミノ酸とペプチド合成機とを用いて、本発明に従うペプチド化合物を５種合成した。樹脂および保護基からの切断後、Ｄｅｌｔａ  Ｐａｃ  Ｃ−１８カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および０．１％トリフルオロ酢酸、水中の０〜５０％アセトニトリルの５０分間の溶出を用いた逆相ＨＰＬＣにより、ペプチドを精製した。全てのペプチドの純度は９０％以上であり、ＨＰＬＣ、紫外線分光法および質量分析によりこれを確認した。全てのペプチドを凍結乾燥させて、使用するまで−２０℃で保管した。バイオセンサー実験に先立ち、全てのペプチドをＨＰＬＣ−純Ｈ２Ｏ中で溶解させてストック濃度５ｍＭとした。凍結／解凍の繰返しを避けるため、このストックの一定分量を凍結させた。
【００４９】
このようにして作製した化合物は、以下のペプチド配列にあった：
化合物１：ＤＥＲＱＰＬＬＶＥ
化合物２：ＥＥＲＱＰＭＬＬＤ
化合物３：ＡＥＤＥＰＬＬＭＥ
化合物４：ＡＥＤＥＰＬＬＶＤ
化合物５：ＭＶＥＥＮＰＩＬＭＥ
【００５０】
これらのペプチドのいずれも、いかなる公知のヒトタンパク質中にも見出されない。これらの化合物を、メラニン形成過程において鍵となる要素であるアダプター複合体（ＡＰ−２およびＡＰ−３など）のヒトチロシナーゼ末端への結合を遮断する能力についてテストした。
【００５１】
テストプロトコール：
ＡＰ−２およびＡＰ−３などのアダプターが局在化シグナル含有ペプチドと結合することは、十分確立されている。中でも、ＴＧＮ３８のチロシンベースのシグナルは、これまでに知られている最も効率的なＡＰ−２結合配列であり、これに対し、Ｌａｍｐ−１由来の同タイプのシグナルは、ＡＰ−１およびＡＰ−３と結合することから、本発明者らの実験においてＡＰ−３結合についての対照として使える。
【００５２】
ヒトチロシナーゼは、その細胞質末端の配列中にチロシン残基も含有するが、この残基は、アダプター結合については関係がない。その代わり、この末端は、ＡＰ−２およびＡＰ−３などのアダプターによって結合するジロイシンベースの局在化シグナルを含有する。
【００５３】
アダプターとチロシナーゼ末端ペプチドとの間の結合は、表面プラズモン共鳴に基づくＢＩＡｃｏｒｅ３０００バイオセンサー（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてリアルタイムで記録した。チオールカップリングを用いてＣＭ５センサー表面の表面上にチロシナーゼ末端ペプチド（配列：−ＣＲＨＫＲＫＱＬＰＥＥＫＱＰＬＬＭＥＫＥＤＹＨＳＬＹＱＳＨＬ）を固定化した結果、≦３００ＲＵのペプチドが固定化された。手短に言えば、ＣＭ５の表面を、ＥＤＣ／ＮＨＳを用いて流速１０μｌ／分で２分間活性化させてから、ＰＤＥＡを用いてさらに２分間改変させた。次いで、ペプチドを、ｐＨ４．５の１０ｍＭ酢酸ナトリウム中に５μｇ／ｍｌの濃度で流速５μｌ／分にて１分間注入した。次に、流速を２０μｌ／分に調節し、５０ｍＭシステイン、１Ｍ  ＮａＣｌの注入により、残っている活性基を遮断した。ペプチド固定化に次いで、緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０，００５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて流速３０μｌ／分で表面を洗浄した。次に、精製したアダプターを緩衝液Ａ中の１００〜１０００ｎＭの範囲の濃度で２分間注入してから、２分間解離させた。５０ｍＭ  ＮａＯＨおよび１０ｍＭ  ＮａＯＨ、０，５％ＳＤＳを用いて２０秒のパルス注入を２回行うことにより表面を再生させた。ＡＰ−２およびＡＰ−３アダプターの配列特異的な結合についての対照として、チロシンベースの局在化シグナルペプチドであるＴＧＮ３８（配列−ＣＲＰＫＡＳＤＹＱＲＬ）およびＬａｍｐ−１（配列−ＣＲＫＲＳＨＡＧＹＱＴＩ）を、チロシナーゼペプチドについて記載したのと全く同じようにセンサー表面に固定化した。
【００５４】
競合実験については、注入に先立ち１０分間、２００ｎＭのアダプターを、１０〜１０００倍モル過剰の、化合物ペプチド５種のうち１種と共にインキュベートした。固定化されたチロシナーゼ末端に結合するアダプターの比較のために、注入（結合期間）の終了時点および解離期間後のＲＵ値を評価した。
【００５５】
結果：
この実験の結果を添付の図面上に示す。
【００５６】
図１に示すように、本発明の化合物５種は、ＡＰ−２ヘテロ四量体のμ２鎖に結合することが知られているペプチドであることから陽性対照として使用したＲＰＫＡＳＤＹＱＲＬと比較して、ＴＧＮ３８へのＡＰ−２の結合を有意には阻害しなかった。したがって、このテスト化合物はＡＰ−２のμ２鎖に結合しないと推論できる。
【００５７】
さらに、図２に示すように、本発明の化合物５種は、ＡＰ−３ヘテロ四量体のμ３鎖に結合することが知られているペプチドであることから陽性対照として使用したＲＫＲＳＨＡＧＹＱＴＩと比較して、Ｌａｍｐ−１へのＡＰ−３の結合を有意には阻害しなかった。したがって、このテスト化合物はＡＰ−３のμ３鎖に結合しないと推論できる。
【００５８】
［実施例２］
結合テスト：本発明による化合物が、ＡＰ−２およびＡＰ−３へのチロシナーゼ結合に及ぼす阻害効果の試験
実施例１で合成した化合物５種がＡＰ−２およびＡＰ−３へのチロシナーゼの結合に及ぼす効果を定量するために、実施例１に記載したものと同様のテストを行った。阻害のために使用したアダプターおよび可溶性ペプチドのモル量は、実施例１に概要を説明したものと全く同じであった。
【００５９】
陰性対照としては、実施例１で使用したものと同じ対照配列を使用したが、それは、チロシナーゼはＡＰ−２およびＡＰ−３のμ２およびμ３鎖にそれぞれ結合しないことがわかっているからである。さらに、陽性対照としてはＥＥＫＱＰＬＬＭＥを使用したが、それは、この配列は、ＡＰ−２およびＡＰ−３に結合することがわかっているヒトチロシナーゼの一部を内にもっているからである。
【００６０】
図３でわかるように、本発明の化合物５種は、チロシナーゼへのＡＰ−２の結合を強力に阻害し、化合物４が最も活性が高かった。
【００６１】
さらに、図４で示されるように、これらの化合物はチロシナーゼへのＡＰ−３の結合も非常に効率的に阻害し、この場合も化合物４が最も活性が高かった。
【００６２】
したがって、これらの実施例から、本発明による化合物はチロシナーゼへのＡＰ−２およびＡＰ−３の結合を有効に遮断することが実証される。よって、こうした化合物は、メラノソームへのチロシナーゼの正しい細胞内局在化、ひいてはメラニン合成を遮断することになると考えられる。
【００６３】
［実施例３］
本発明によるペプチドのメラニン形成細胞の細胞内透過の試験
テストプロトコール：
１ｇ／ｌのグルコースを含有しフェノールレッドを含有しないＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号１１８８００２８）に３ｇ／ｌのグルコース（Ｓｉｇｍａ、参照番号Ｇ７０２１）を添加したもの、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ＵＩ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号１５０７００６３）および１０％のウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０２７００９８）が入った９６ウェルのマイクロプレート中で、３７℃、５％のＣＯ２の条件でＢ１６メラノーマ細胞を培養した。２４時間後、この培養培地を、α−ＭＳＨの安定な誘導体、すなわちＮＤＰ−ＭＳＨ（ＮＬＥ−４−Ｄ−ＰＨＥ−７−Ａメラニン形成細胞刺激ホルモン、Ｓｉｇｍａ、参照番号Ｍ−８７６４）を含有するかまたはしない（対照）および本発明によるペプチド（実施例１の化合物３またはそのＮ−パルミトイル誘導体）を含有するかまたはしないＤＭＥＭ培地に置き換えた。ペプチドの透過を促進するために使用する作用剤であるリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号１５３８−１００）を用いた場合と用いない場合とで各ペプチドをテストした。次に、メラニン形成細胞を、３７℃、５％のＣＯ２の条件で７２時間インキュベートした。
【００６４】
インキュベーション期間の終了時点で培地を取り除き、ＰＢＳ溶液（リン酸緩衝生理食塩水）で細胞をすすいだ。対物２０倍での顕微鏡検査（Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｅｒ（登録商標）１００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅにおいて）、または、トリプシンでの酵素処理により細胞を剥がした後のフラックスサイトメトリー（Flux Cytometry）（Ｆｌｕｘ  ＦＡＣＳａｒｒａｙ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により、各ペプチドの透過を分析した。
【００６５】
結果：
以下の表１は、異なるペプチド濃度（４、２０、１００および５００μｇ／ｍｌ）での、Ｂ１６メラニン形成細胞中へのペプチド＋ＦＩＴＣ（イソチオシアン酸フルオレセイン）の透過量の測定値を示すものである。
【００６６】
【表１】
0005564422.tif 000002
【００６７】
蛍光顕微鏡検査における観察から、ペプチドは細胞中に透過すること、および、この透過量はリポフェクタミンを加えると増えることが明確に実証される。これらの結果は、蛍光強度はペプチド濃度に直接依存することを示したフラックスサイトメトリーにより確認された。
【００６８】
［実施例４］
実施例１の化合物３のＮ−パルミトイル誘導体がメラニン形成に及ぼす効果
テストプロトコール：
使用したプロトコールは、実施例３に記載のものと同じである。メラニン形成細胞を、３７℃、５％のＣＯ２の条件で９６時間インキュベートした。陽性対照としてコウジ酸を使用した。
【００６９】
インキュベーション期間の終了時点で、各試料について４０５ｎｍでの吸光度を測定することにより、メラニンの量を評価した。
【００７０】
結果：
以下の表２は、実施例１の化合物３のＮ−パルミトイル誘導体が、０．５、１、２．５、５および１０μｇ／ｍｌでメラニンの合成に及ぼす効果を示すものである。
【００７１】
【表２】
0005564422.tif 000003
【００７２】
ＮＤＰ−ＭＳＨが存在するということは、メラニンが形成されることを明確に意味した。このメラニン合成誘導は、３６から８０μｇ／ｍｌの間でテストしたコウジ酸により明確に阻害された。この結果により、テストの有効性が確認される。
【００７３】
リポフェクタミンの存在は、ＮＤＰ−ＭＳＨと共にインキュベートしたＢ１６メラニン形成細胞によるメラニンの合成に変化を及ぼさなかった。
【００７４】
リポフェクタミンの不在下で実施例１の化合物３のＮ−パルミトイル誘導体を用いて処理（１から１０μｇ／ｍｌの間でテストした）すると、ＮＤＰ−ＭＳＨにより高まったメラニン形成を明確に阻害できた（阻害率は９から２０％）。この阻害率は、リポフェクタミンが存在する場合に増加した（１から１０μｇ／ｍｌの間での阻害率は５から２９％）。
【００７５】
したがって、この試験から、実施例１の化合物３のＮ−パルミトイル誘導体など本発明によるペプチドは、メラニン形成細胞によるメラニンの合成を阻害することが確認される。
【００７６】
［実施例５］
化粧用組成物
これ以降に記載の組成物は、以下の成分から従来の方法により調製できる。含有量は組成物の総重量に対する重量比で表す。
【００７７】
【表３】
0005564422.tif 000004
【００７８】
【表４】
0005564422.tif 000005
【００７９】
【表５】
0005564422.tif 000006
【図１】
0005564422.tif 000007
【図２】
0005564422.tif 000008
【図３】
0005564422.tif 000009
【図４】
0005564422.tif 000010