(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＩＳＨ法を用いた細胞画像解析方法であって、
所定の細胞区画についてレポートする第１の蛍光レポーター分子と、所望の第１の遺伝子配列についてレポートする第２の蛍光レポーター分子と、所望の第２の遺伝子配列についてレポートする第３の蛍光レポーター分子とを含有する複数の細胞が容器に播種された状態にするステップ、
蛍光観察光学系を備えた細胞画像撮像装置を用いて、前記複数の細胞に対し、焦点面を同じＸＹ座標上でＺ座標を異ならせて複数撮像し、前記各蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを自動的に画像として入手するステップ、
前記入手した画像を用いて前記細胞区画を三次元の細胞区画として構築するステップ、
前記三次元に構築した細胞区画の区画内と区画外を識別するステップ、
前記三次元に構築し、認識した細胞区画の区画内に存在する、前記第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子から蛍光シグナルを夫々自動的に認識するステップ、
前記認識した第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルに対し、夫々の特徴量として、少なくとも強度、大きさ、蛍光若しくは発光領域の数を測定するステップ、
前記第２の蛍光レポーター分子と前記第３の蛍光レポーター分子のうち、短波長側の蛍光レポーター分子が発する蛍光の、長波長側の蛍光レポーター分子への漏れこみを検出して、長波長側の蛍光の発光であるとの誤認識を防止するステップを有し、
前記長波長側の蛍光の発光であるとの誤認識を防止するステップは、前記第２の蛍光レポーター分子、および前記第３の蛍光レポーター分子の夫々発光しているＸＹＺ座標位置が、同一位置にあるか否かを判定することにより行うことを特徴とするＦＩＳＨ細胞画像解析方法。
【請求項２】
前記測定した第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルの夫々の特徴量を用いて、予め規定した条件を満たす細胞の数を自動的に計測しその計測結果を表示するステップを有することを特徴とする請求項１に記載のＦＩＳＨ細胞画像解析方法。
【請求項３】
前記複数の細胞に対し、焦点面を同じＸＹ座標上でＺ座標を異ならせて複数撮像し、前記各蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを自動的に画像として入手するステップは、前記蛍光観察光学系に共焦点光学系を有する前記細胞画像撮像装置を用いて行うことを特徴とする請求項１に記載のＦＩＳＨ細胞画像解析方法。
【請求項４】
所定の細胞区画についてレポートする第１の蛍光レポーター分子と、所望の第１の遺伝子配列についてレポートする第２の蛍光レポーター分子と、所望の第２の遺伝子配列についてレポートする第３の蛍光レポーター分子を含有する複数の細胞の画像を取得する細胞画像撮像装置と、前記細胞画像撮像装置を介して取得された細胞画像を解析するコンピュータを備えた細胞画像解析装置を有する細胞画像解析システムであって、
前記細胞画像撮像装置は、試料に対する合焦位置をＺ方向に所定ピッチで連続的に変えて、各合焦位置における試料の像を結像する蛍光観察光学系と、前記蛍光観察光学系を介して結像された細胞像を撮像する撮像素子を有し、前記複数の細胞に対し、焦点面を同じＸＹ座標上でＺ座標を異ならせて複数撮像し、前記各蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを自動的に画像として入手し、
前記細胞画像解析装置は、前記コンピュータを、
前記細胞画像撮像装置を介して入手された画像を用いて前記細胞区画を三次元の細胞区画として構築する三次元細胞区画構築手段、
前記三次元細胞区画構築手段を介して三次元に構築された細胞区画の区画内と区画外を識別する細胞区画識別手段、
前記三次元細胞区画構築手段を介して三次元に構築され、前記細胞区画識別手段を介して認識された細胞区画の区画内に存在する、前記第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを夫々自動的に認識する蛍光シグナル認識手段、
前記蛍光シグナル認識手段を介して認識された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルに対し、夫々の特徴量として、少なくとも強度、大きさ、蛍光若しくは発光領域の数を測定する特徴量測定手段、
前記第２の蛍光レポーター分子と前記第３の蛍光レポーター分子のうち、短波長側の蛍光レポーター分子が発する蛍光の、長波長側の蛍光レポーター分子への漏れこみを検出して、長波長側の蛍光の発光であるとの誤認識を防止する誤認識防止手段、
として機能させる画像解析ソフトウェアを有し、
前記誤認識防止手段は、前記第２の蛍光レポーター分子、および前記第３の蛍光レポーター分子の夫々発光しているＸＹＺ座標位置が、同一位置にあるか否かを判定することを特徴とするＦＩＳＨ細胞画像解析システム。
【請求項５】
前記画像解析ソフトウェアは、前記コンピュータを、さらに、
前記特徴量測定手段を介して測定された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルの夫々の特徴量を用いて、予め規定した条件を満たす細胞の数を自動的に計測しその計測結果を表示する細胞数計測表示手段として機能させることを特徴とする請求項４に記載のＦＩＳＨ細胞画像解析システム。
【請求項６】
前記細胞画像撮像装置は、前記蛍光観察光学系に共焦点光学系を有することを特徴とする請求項４に記載のＦＩＳＨ細胞画像解析システム。
【請求項７】
試料に対する合焦位置をＺ方向に所定ピッチで連続的に変えて、各合焦位置における試料の像を結像する蛍光観察光学系と、前記蛍光観察光学系を介して結像された細胞像を撮像する撮像素子を有し、所定の細胞区画についてレポートする第１の蛍光レポーター分子と、所望の第１の遺伝子配列についてレポートする第２の蛍光レポーター分子と、所望の第２の遺伝子配列についてレポートする第３の蛍光レポーター分子を含有する複数の細胞に対し、焦点面を同じＸＹ座標上でＺ座標を異ならせて複数撮像し、前記各蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを自動的に画像として入手する細胞画像撮像装置を有する細胞画像解析システムに備わる、該細胞画像撮像装置を介して取得された細胞画像を解析するコンピュータを備えた細胞画像解析装置であって、
前記コンピュータを、
前記細胞画像撮像装置を介して入手された画像を用いて前記細胞区画を三次元の細胞区画として構築する三次元細胞区画構築手段、
前記三次元細胞区画構築手段を介して三次元に構築された細胞区画の区画内と区画外を識別する細胞区画識別手段、
前記三次元細胞区画構築手段を介して三次元に構築され、前記細胞区画識別手段を介して認識された細胞区画の区画内に存在する、前記第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを夫々自動的に認識する蛍光シグナル認識手段、
前記蛍光シグナル認識手段を介して認識された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルに対し、夫々の特徴量として、少なくとも強度、大きさ、蛍光若しくは発光領域の数を測定する特徴量測定手段、
前記第２の蛍光レポーター分子と前記第３の蛍光レポーター分子のうち、短波長側の蛍光レポーター分子が発する蛍光の、長波長側の蛍光レポーター分子への漏れこみを検出して、長波長側の蛍光の発光であるとの誤認識を防止する誤認識防止手段、
として機能させる画像解析ソフトウェアを有し、
前記誤認識防止手段は、前記第２の蛍光レポーター分子、および前記第３の蛍光レポーター分子の夫々発光しているＸＹＺ座標位置が、同一位置にあるか否かを判定することを特徴とするＦＩＳＨ細胞画像解析装置。
【請求項８】
前記画像解析ソフトウェアは、前記コンピュータを、さらに、
前記特徴量測定手段を介して測定された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルの夫々の特徴量を用いて、予め規定した条件を満たす細胞の数を自動的に計測しその計測結果を表示する細胞数計測表示手段として機能させることを特徴とする請求項７に記載のＦＩＳＨ細胞画像解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光物質等で標識したヌクレオチドプローブを目的とする遺伝子とハイプリダイゼーションさせ、蛍光顕微鏡等で検出する「ＦＩＳＨ法」を用いた、細胞診断や分子細胞遺伝学研究などに用いるＦＩＳＨ細胞画像解析方法、ＦＩＳＨ細胞画像解析システム及びＦＩＳＨ細胞画像解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＦＩＳＨ法を用いた癌の細胞診断や分子細胞遺伝学研究等の分野では、例えば、次の非特許文献１に記載の、自動化された蛍光顕微鏡をベースにした細胞画像取得装置や、特許文献１に記載の装置等を用いて、二次元細胞画像を取得し、その二次元細胞画像を元に目的の蛍光スポットの発光を画像処理にて検出し、その細胞に特定の遺伝子配列が含まれているか否かの判定や、染色体異常の検出が行われている。
【０００３】
例えば、細胞核内の染色体上において、癌関連遺伝子の遺伝的異常があるか否かを判定するために、細胞核全体をＤＡＰＩで染色し、続いて、コントロールとなるプローブを例えば、ＦＩＴＣで標識し、目的部位とハイブリダイズするプローブをＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ等で標識する。次いで、細胞内でハイブリダイズさせ、自動化された蛍光顕微鏡をベースにした、例えば、非特許文献１に記載の細胞画像取得装置などで、ＤＡＰＩ，ＦＩＴＣ，Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄそれぞれのチャネルに適した励起光を照射し、各々の励起光によって得られたカラーチャネル毎の蛍光画像を二次元細胞画像として取得し、その画像を元に目的とする蛍光スポットの発光を検出および測定し、その細胞に染色体異常が含まれているか否かを判定する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４０２９９８３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】オリンパス株式会社ホームページ、「細胞イメージ解析システム CELAVIEW RS100」、[online]、http://www.olympus.co.jp/jp/lisg/genome/product/rs100/
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の二次元細胞画像を用いたＦＩＳＨ法での細胞画像の解析には、次の(1)〜(4)に示すような問題があった。
【０００７】
(1)細胞の三次元構造に伴う問題
三次元構造を有する細胞核内では、目的とする染色体自体が三次元的に配置されている。一般に、顕微鏡などの蛍光観察光学系を有する細胞画像取得装置では、焦点面での蛍光は明るく観察・撮像ができるが、焦点面から外れた蛍光は暗く、もしくは取得できないことが多い。しかるに、非特許文献１や特許文献１に記載の従来の細胞画像取得装置において撮像された二次元細胞画像は、三次元構造の細胞における一つのＺ位置での面に焦点を合わせて撮像した画像であり、その面には蛍光スポットが存在していない（即ち、蛍光スポットは焦点面から外れたＺ位置に存在する）場合がある。そのような場合、撮像された画二次元細胞画像には、上述のように取得すべき蛍光が非常に暗く、もしくは全く取得できない事態が発生し、その結果、コントロール及び目的部位が画像解析出来ず、目的部位が発現しているにもかかわらず、発現していない細胞として判断され、遺伝子配列等の判定について正しい判定を下すことができない。
【０００８】
(2)細胞の外側に存在するゴミ等による悪影響
また、細胞の外側で、かつ非常に近隣に蛍光を発してしまうゴミなどが存在する場合、目的部位の蛍光スポットとゴミとが重なり合った状態で撮像され、目的部位の発現なのかゴミなのかの判定が非常に困難になる。
【０００９】
(3)蛍光スポットがＺ方向に重なっている場合の問題
また、細胞核内で同一蛍光色の蛍光スポットがＺ方向に重なり合っている場合、スポットが実際には二つ存在するにもかかわらず、画像上では一つとして認識されてしまい、正しい結果を得られない。
【００１０】
(4)蛍光波長の漏れこみによる悪影響
また、一般に、短波長側の蛍光が長波長側の蛍光に漏れこみを起すことがある。例えば、コントロールとなるプローブを緑色の蛍光を発するＦＩＴＣ等で染色し、目的部位とハイブリダイズするプローブを赤色の蛍光を発するＴｅｘａｓ  Ｒｅｄで染色したとする。蛍光波長は、ＦＩＴＣ（５２０ｎｍ）の方がＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（６２０ｎｍ）よりも短波長である。また、このとき、コントロールの蛍光スポットが二つ光るものが正常細胞と定義し、コントロールの蛍光スポット二つと赤色の蛍光スポット二つの両方が光る細胞ががん細胞等の異常な細胞であると定義するものとする。その場合において、ＦＩＴＣ用の励起光を照射したときにＦＩＴＣの蛍光がＴｅｘａｓ  Ｒｅｄに漏れこみ、本来はＴｅｘａｓ  Ｒｅｄの励起波長のみで蛍光を発するはずのスポットが発光してしまうことが起こりうる。このような蛍光波長の漏れこみが生ずると、コントロールの蛍光スポットが四つ光っているように誤認識され、異常な細胞としてカウントから排除されてしまう。
【００１１】
本発明は、このような従来の問題点に鑑みてなされたものであり、細胞核内における蛍光スポットの三次元的な配置に影響されることなく、細胞外のゴミ等による発光と誤認識することなく、さらには蛍光波長の漏れこみ等にも影響されることなく、目的とする蛍光スポットを正確に検出することが可能なＦＩＳＨ細胞画像解析方法、ＦＩＳＨ細胞画像解析システム及びＦＩＳＨ細胞画像解析装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、本発明によるＦＩＳＨ細胞画像解析方法は、ＦＩＳＨ法を用いた細胞画像解析方法であって、所定の細胞区画についてレポートする第１の蛍光レポーター分子と、所望の第１の遺伝子配列についてレポートする第２の蛍光レポーター分子と、所望の第２の遺伝子配列についてレポートする第３の蛍光レポーター分子とを含有する複数の細胞が容器に播種された状態にするステップ、蛍光観察光学系を備えた細胞画像撮像装置を用いて、前記複数の細胞に対し、焦点面を同じＸＹ座標上でＺ座標を異ならせて複数撮像し、前記各蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを自動的に画像として入手するステップ、前記入手した画像を用いて前記細胞区画を三次元の細胞区画として構築するステップ、前記三次元に構築した細胞区画の区画内と区画外を識別するステップ、前記三次元に構築し、認識した細胞区画の区画内に存在する、前記第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを夫々自動的に認識するステップ、前記認識した第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルに対し、夫々の特徴量として、少なくとも強度、大きさ、蛍光若しくは発光領域の数を測定するステップ、前記第２の蛍光レポーター分子と前記第３の蛍光レポーター分子のうち、短波長側の蛍光レポーター分子が発する蛍光の、長波長側の蛍光レポーター分子への漏れこみを検出して、長波長側の蛍光の発光であるとの誤認識を防止するステップを有し、前記長波長側の蛍光の発光であるとの誤認識を防止するステップは、前記第２の蛍光レポーター分子、および前記第３の蛍光レポーター分子の夫々発光しているＸＹＺ座標位置が、同一位置にあるか否かを判定することにより行うことを特徴としている。
【００１５】
また、本発明のＦＩＳＨ細胞画像解析方法においては、前記測定した第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルの夫々の特徴量を用いて、予め規定した条件を満たす細胞の数を自動的に計測しその計測結果を表示するステップを有するのが好ましい。
【００１６】
また、本発明のＦＩＳＨ細胞画像解析方法においては、前記複数の細胞に対し、焦点面を同じＸＹ座標上でＺ座標を異ならせて複数撮像し、前記各蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを自動的に画像として入手するステップは、前記蛍光観察光学系に共焦点光学系を有する前記細胞画像撮像装置を用いて行うのが好ましい。
【００１７】
また、本発明によるＦＩＳＨ細胞画像解析システムは、所定の細胞区画についてレポートする第１の蛍光レポーター分子と、所望の第１の遺伝子配列についてレポートする第２の蛍光レポーター分子と、所望の第２の遺伝子配列についてレポートする第３の蛍光レポーター分子を含有する複数の細胞の画像を取得する細胞画像撮像装置と、前記細胞画像撮像装置を介して取得された細胞画像を解析するコンピュータを備えた細胞画像解析装置を有する細胞画像解析システムであって、前記細胞画像撮像装置は、試料に対する合焦位置をＺ方向に所定ピッチで連続的に変えて、各合焦位置における試料の像を結像する蛍光観察光学系と、前記蛍光観察光学系を介して結像された細胞像を撮像する撮像素子を有し、前記複数の細胞に対し、焦点面を同じＸＹ座標上でＺ座標を異ならせて複数撮像し、前記各蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを自動的に画像として入手し、前記細胞画像解析装置は、前記コンピュータを、前記細胞画像撮像装置を介して入手された画像を用いて前記細胞区画を三次元の細胞区画として構築する三次元細胞区画構築手段、前記三次元細胞区画構築手段を介して三次元に構築された細胞区画の区画内と区画外を識別する細胞区画識別手段、前記三次元細胞区画構築手段を介して三次元に構築され、前記細胞区画識別手段を介して認識された細胞区画の区画内に存在する、前記第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを夫々自動的に認識する蛍光シグナル認識手段、前記蛍光シグナル認識手段を介して認識された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルに対し、夫々の特徴量として、少なくとも強度、大きさ、蛍光若しくは発光領域の数を測定する特徴量測定手段、前記第２の蛍光レポーター分子と前記第３の蛍光レポーター分子のうち、短波長側の蛍光レポーター分子が発する蛍光の、長波長側の蛍光レポーター分子への漏れこみを検出して、長波長側の蛍光の発光であるとの誤認識を防止する誤認識防止手段、
として機能させる画像解析ソフトウェアを有し、前記誤認識防止手段は、前記第２の蛍光レポーター分子、および前記第３の蛍光レポーター分子の夫々発光しているＸＹＺ座標位置が、同一位置にあるか否かを判定することを特徴としている。
【００２０】
また、本発明のＦＩＳＨ細胞画像解析システムにおいては、前記画像解析ソフトウェアは、前記コンピュータを、さらに、前記特徴量測定手段を介して測定された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルの夫々の特徴量を用いて、予め規定した条件を満たす細胞の数を自動的に計測しその計測結果を表示する細胞数計測表示手段として機能させるのが好ましい。
【００２１】
また、本発明のＦＩＳＨ細胞画像解析システムにおいては、前記細胞画像撮像装置は、前記蛍光観察光学系に共焦点光学系を有するのが好ましい。
【００２２】
また、本発明によるＦＩＳＨ細胞画像解析装置は、試料に対する合焦位置をＺ方向に所定ピッチで連続的に変えて、各合焦位置における試料の像を結像する蛍光観察光学系と、前記蛍光観察光学系を介して結像された細胞像を撮像する撮像素子を有し、所定の細胞区画についてレポートする第１の蛍光レポーター分子と、所望の第１の遺伝子配列についてレポートする第２の蛍光レポーター分子と、所望の第２の遺伝子配列についてレポートする第３の蛍光レポーター分子を含有する複数の細胞に対し、焦点面を同じＸＹ座標上でＺ座標を異ならせて複数撮像し、前記各蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを自動的に画像として入手する細胞画像撮像装置を有する細胞画像解析システムに備わる、該細胞画像撮像装置を介して取得された細胞画像を解析するコンピュータを備えた細胞画像解析装置であって、前記コンピュータを、前記細胞画像撮像装置を介して入手された画像を用いて前記細胞区画を三次元の細胞区画として構築する三次元細胞区画構築手段、前記三次元細胞区画構築手段を介して三次元に構築された細胞区画の区画内と区画外を識別する細胞区画識別手段、前記三次元細胞区画構築手段を介して三次元に構築され、前記細胞区画識別手段を介して認識された細胞区画の区画内に存在する、前記第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを夫々自動的に認識する蛍光シグナル認識手段、前記蛍光シグナル認識手段を介して認識された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルに対し、夫々の特徴量として、少なくとも強度、大きさ、蛍光若しくは発光領域の数を測定する特徴量測定手段、前記第２の蛍光レポーター分子と前記第３の蛍光レポーター分子のうち、短波長側の蛍光レポーター分子が発する蛍光の、長波長側の蛍光レポーター分子への漏れこみを検出して、長波長側の蛍光の発光であるとの誤認識を防止する誤認識防止手段、
として機能させる画像解析ソフトウェアを有し、前記誤認識防止手段は、前記第２の蛍光レポーター分子、および前記第３の蛍光レポーター分子の夫々発光しているＸＹＺ座標位置が、同一位置にあるか否かを判定することを特徴としている。
【００２５】
また、本発明のＦＩＳＨ細胞画像解析装置においては、前記画像解析ソフトウェアは、前記コンピュータを、さらに、前記特徴量測定手段を介して測定された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルの夫々の特徴量を用いて、予め規定した条件を満たす細胞の数を自動的に計測しその計測結果を表示する細胞数計測表示手段として機能させるのが好ましい。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、細胞核内における蛍光スポットの三次元的な配置に影響されることなく、細胞外のゴミ等による発光と誤認識することなく、さらには蛍光波長の漏れこみ等にも影響されることなく、目的とする蛍光スポットを正確に検出することができるＦＩＳＨ細胞画像解析方法、ＦＩＳＨ細胞画像解析システム及びＦＩＳＨ細胞画像解析装置が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の一実施形態にかかるＦＩＳＨ細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
【図２】本実施形態のＦＩＳＨ細胞画像解析システムにおける処理手順を示すフローチャートで、(a)は細胞の標識から細胞画像の解析・出力までの全体の処理手順を示すフローチャート、(b)は細胞画像の解析及び出力処理における処理手順を示すフローチャートである。
【図３】ＦＩＳＨ法でハイブリダイズされた細胞核と該細胞核内の蛍光スポットの一例を模式的に示す説明図であり、(a)はＺ方向に沿う断面図、(b)は(a)に示される細胞核をＺ位置がａであるＸＹ平面で撮像したときの画像を示す図、(c)は(a)に示される細胞核をＺ位置がｂであるＸＹ平面で撮像したときの画像を示す図である。
【図４】ＦＩＳＨ法でハイブリダイズされたコントロールの蛍光スポットと目的部位の蛍光スポットの両方が発光している細胞核の一例を示す説明図で、(a)はＺ方向に沿う断面図、(b)は(a)に示される細胞核をＺ位置がａであるＸＹ平面で撮像したときの画像を示す図である。
【図５】ＦＩＳＨ法でハイブリダイズされた一つの細胞核と該細胞核内で発現しているコントロールの蛍光スポット及び目的部位の蛍光スポットと、細胞核の周辺に存在するコントロールと同じ蛍光を発する異物を示すとともに、細胞核を含む周囲を、焦点面を同じＸＹ座標上でＺ座標を異ならせて複数撮像するときの各Ｚ位置の一例を示す説明図である。
【図６】図５に示す各Ｚ位置で撮像したＸＹ平面の画像を夫々示す説明図である。
【図７】Ｚ方向に異なる複数の焦点面で撮像された細胞核の画像を用いて細胞核を三次元に構築する手法の一例を示す説明図で、(a)はＺ方向に異なる複数の焦点面で撮像された細胞核の画像における隣接する部分をつなぎ合わせる状態を概念的に示す図、(b)は(a)の手法により三次元に構築された細胞核を示す図である。
【図８】ＦＩＳＨにおける短波長側の蛍光の長波長側への漏れこみの一例を示す説明図で、(a)はＦＩＴＣの励起光でコントロールの蛍光スポットを発光させているときに、目的部位の蛍光スポットが短波長側の蛍光の漏れこみによって発光している状態を示す図、(b)はＴｅｘａｓ  Ｒｅｄの励起光を照射したときに発光する目的部位の蛍光スポットを示す図である。
【図９】蛍光スポットの個数、蛍光スポット内の平均輝度、領域の大きさをウェルごとに示す一覧表の一例を示す図である。
【図１０】対物レンズの屈折率と細胞が載置される容器底面の屈折率との違いから、細胞内部に結ばれる焦点のＺ方向の移動距離と対物レンズの移動距離が異なる状態を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、図面に基づき、本発明の実施の形態を説明する。
図１は本発明の一実施形態にかかるＦＩＳＨ細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。図２は本実施形態のＦＩＳＨ細胞画像解析システムにおける処理手順を示すフローチャートで、(a)は細胞の標識から細胞画像の解析・出力までの全体の処理手順を示すフローチャート、(b)は細胞画像の解析及び出力処理における処理手順を示すフローチャートである。
本実施形態のＦＩＳＨ細胞画像解析システムは、細胞画像撮像装置１と細胞画像解析装置２を有する。
細胞画像撮像装置１は、例えば、コンフォーカル顕微鏡で構成されており、蛍光観察光学系１ａと、撮像素子１ｂを有する。
蛍光観察光学系１ａは、光源、照明レンズ、複数種類の励起フィルタをターレット等に備えた励起光切換手段、対物レンズ、吸収フィルタ、結像レンズ、ピンホール等、一般的なコンフォーカル蛍光顕微鏡における照明光学系及び観察光学系（図示省略）で構成され、試料に対する合焦位置をＺ方向に所定ピッチで連続的に変えて、各合焦位置における試料の像を撮像素子１ｂの撮像面に結像する。
撮像素子１ｂは、蛍光観察光学系１ａを介して結像された細胞像を撮像する。
そして、細胞画像撮像装置は、所定の細胞区画についてレポートする第１の蛍光レポーター分子と、所望の第１の遺伝子配列についてレポートする第２の蛍光レポーター分子と、所望の第２の遺伝子配列についてレポートする第３の蛍光レポーター分子を含有する複数の細胞に対し、焦点面を同じＸＹ座標上でＺ座標を異ならせて複数撮像し、各蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを自動的に画像として入手する。
【００２９】
細胞画像解析装置２は、コンピュータと、画像解析ソフトウェアを備えて構成されている。
画像解析ソフトウェアは、コンピュータを三次元細胞区画構築手段２ａ、細胞区画識別手段２ｂ、蛍光シグナル認識手段２ｃ、特徴量測定手段２ｄとして機能させ、さらには、誤認識防止手段２e、細胞数計測表示手段２ｆとして機能させるように構成されている。
三次元細胞区画構築手段２ａは、細胞画像撮像装置１を介して入手された画像を用いて細胞区画を三次元の細胞区画として構築する。
細胞区画識別手段２ｂは、三次元細胞区画構築手段２ａを介して三次元に構築された細胞区画の区画内と区画外を識別する。
蛍光シグナル認識手段２ｃは、三次元細胞区画構築手段２ａを介して三次元に構築され、細胞区画識別手段２ｂを介して認識された細胞区画の区画内に存在する、第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを夫々自動的に認識する。
特徴量測定手段２ｄは、蛍光シグナル認識手段２ｃを介して認識された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルに対し、夫々の特徴量として、少なくとも強度、大きさ、蛍光若しくは発光領域の数を測定する。
誤認識防止手段２ｅは、第２の蛍光レポーター分子と第３の蛍光レポーター分子のうち、短波長側の蛍光レポーター分子が発する蛍光の、長波長側の蛍光レポーター分子への漏れこみを検出して、長波長側の蛍光の発光であるとの誤認識を防止する。
細胞数計測表示手段２ｆは、特徴量測定手段２ｄを介して測定された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルの夫々の特徴量を用いて、予め規定した条件を満たす細胞の数を自動的に計測しその計測結果を表示する。
【００３０】
次に、このように構成された本実施形態のＦＩＳＨ細胞画像解析システムを用いた細胞の標識から画像解析・出力までの全体の処理手順について説明する。
全体の処理は、図２(a)に示すように、細胞の標識（ステップＳ１）、細胞画像撮像装置１による細胞像の撮像（ステップＳ２）、細胞画像解析装置２による細胞画像の解析（ステップＳ３）、細胞画像解析装置２による解析結果の出力（ステップＳ４）の順で行う。
【００３１】
標識処理段階（ステップＳ１）
標識処理段階では、所定の細胞区画についてレポートする第１の蛍光レポーター分子と、所望の第１の遺伝子配列についてレポートする第２の蛍光レポーター分子と、所望の第２の遺伝子配列についてレポートする第３の蛍光レポーター分子とを含有する複数の細胞が、例えば、マルチウェルプレート、ディッシュ、スライドガラスなどの容器に播種された状態にする。
具体的には、本実施形態では、所定の細胞区画についてレポートする第１の蛍光レポーター分子としてＤＡＰＩを用いて細胞核を染色する。また、第１の遺伝子配列についてレポートする第２の蛍光レポーター分子として、ＦＩＴＣを用いてコントロールとなるプローブを標識する。また、所望の第２の遺伝子配列についてレポートする第３の蛍光レポーター分子として、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄを用いて目的部位とハイブリダイズするプローブを標識する。そして、これらのレポーター分子を含有する複数の細胞が、例えば、マルチウェルプレートに播種された状態にする。
【００３２】
細胞の構造１
図３はＦＩＳＨ法でハイブリダイズされた細胞核と該細胞核内の蛍光スポットの一例を模式的に示す説明図であり、(a)はＺ方向に沿う断面図、(b)は(a)に示される細胞核をＺ位置がａであるＸＹ平面で撮像したときの画像を示す図、(c)は(a)に示される細胞核をＺ位置がｂであるＸＹ平面で撮像したときの画像を示す図である。図３(a)中、αは細胞核、βはＦＩＳＨ法におけるコントロールと呼ばれる蛍光スポットである。
細胞核αは、ＤＡＰＩで染色されており、３５８ｎｍを中心波長とする励起光により、４６１ｎｍを中心波長とする蛍光を発する。この蛍光により、細胞の核の形状およびその存在を確認することができる。
蛍光スポットβは、どの細胞にも存在する特定のＤＮＡ配列と相補的な配列を持つプローブを蛍光物質の一つであるＦＩＴＣで標識したものであって、ハイブリダイズが正しく行われた細胞かどうかを見分ける指標となるものであり、４９４ｎｍを中心波長とする励起光により、５２０ｎｍを中心波長とする蛍光を発する。ＦＩＳＨ法を用いた細胞の認識および判定では、コントロールである蛍光スポットβが規定数だけ正しく発光している細胞を対象とする。ここでは、コントロールである蛍光スポットβが二つ発光している細胞が、判定の対象となる細胞であるものとする。
図３の例では、二つのコントロールである蛍光スポットβは、図３(a)に示すように、Ｚ方向に離散して存在している。このように、コントロールである蛍光スポットβがＺ方向に大きく離散して存在している場合には、撮像する細胞の焦点面のＺ位置によって確認できる発光数が変化し、例えば、図３(b)や、図３(c)に示すように、Ｚ位置がａ又はｂのいずれか一方であるＸＹ平面の画像では、コントロールである蛍光スポットβを一つだけしか確認できないことが起こり得る。
【００３３】
細胞の構造２
図４はＦＩＳＨ法でハイブリダイズされたコントロールの蛍光スポットと目的部位の蛍光スポットの両方が発光している細胞核の一例を示す説明図で、(a)はＺ方向に沿う断面図、(b)は(a)に示される細胞核をＺ位置がａであるＸＹ平面で撮像したときの画像を示す図である。図４(a)中、γはＦＩＳＨ法によって蛍光を発する目的部位を示す蛍光スポットである。
蛍光スポットγは、例えば、がん細胞に特異的に発現する特定のＤＮＡ配列と相補的な配列を持つプロープを蛍光物質の一つであるＴｅｘａｓ  Ｒｅｄで標識したものであり、５８７ｎｍを中心波長とする励起光により、６２０ｎｍを中心波長とする蛍光を発する。ここでは、二つのコントロールである蛍光スポットβと、二つのＴｅｘａｓ  Ｒｅｄにより発光する蛍光スポットγの両方が発光している細胞ががん細胞として判定されるものとする。
図４の例では、二つのコントロールである蛍光スポットβは、図４(a)に示すように、ＸＹ座標が同じでＺ方向での位置が異なって存在している。このため、図４(b)に示すＺ位置がａであるＸＹ平面の画像では、コントロールである蛍光スポットβを一つだけしか確認できない。一方、二つの目的部位を示す蛍光スポットγは、ＸＹＺ方向に離散しているため、蛍光スポットγを二つとも判別できる。
【００３４】
上述のように、細胞は立体構造を有し、蛍光スポットの位置もＸＹＺ方向に離散して存在することがあり、蛍光スポットがＺ方向に重なっている場合にはＸＹ平面からは重なっている一方の蛍光スポットの確認が漏れてしまうおそれがあるので、正しい細胞判定を行うためには、細胞の三次元構造を考慮に入れた解析が必要である。
【００３５】
撮像処理段階（ステップＳ２）
そこで、本発明者は、細胞を三次元で撮像し、三次元で解析する方法として本発明のＦＩＳＨ細胞画像解析方法を着想するに至った。
撮像処理段階では、コンフォーカル顕微鏡で構成された細胞画像撮像装置１の蛍光観察光学系１ａが、各チャネルの蛍光ごとに、試料に対する合焦位置をＺ方向に所定ピッチで連続的に変えて、各合焦位置における試料の像を結像し、撮像素子１ｂが蛍光観察光学系１ａを介して結像された細胞像を撮像することにより、複数の細胞に対し、焦点面を同じＸＹ座標上でＺ座標を異ならせて複数撮像し、各蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを自動的に画像として入手する。
【００３６】
図５はＦＩＳＨ法によってハイプリダイズされた一つの細胞核αと、その内部で発現しているコントロールである蛍光スポットβおよび目的部位の蛍光スポットγと、細胞核αの周辺に存在するコントロールである蛍光スポットβと同じ蛍光を発する異物δを示している、細胞核αのＺ方向に沿う断面図である。図５はさらに、細胞核αを含む周囲を、同じＸＹ座標上でＺ位置がａからｔまで異なる複数の焦点面で、ａからtの順番で撮像する一例を示している。蛍光撮像に際しては、共焦点光学系を用いる。共焦点光学系を用いると、一般的な結像光学系よりも、Ｚ方向の分解能を２０倍程度向上させることができ、焦点位置以外からの蛍光の影響を大幅に軽減することができるので好ましい。
【００３７】
図６は図５に示す各Ｚ位置で撮像したＸＹ平面の画像を夫々示す説明図であり、Ｚ方向の複数の焦点面で撮像された細胞核およびその周辺の画像を示している。撮像されたaからtまでの各Ｚ位置での画像（図６では途中省略している画像がある）には、夫々、各Ｚ位置の焦点面で捉えられた各蛍光スポット（蛍光スポットβ，γ）が撮像されている。また、各Ｚ位置での画像は、細胞の各Ｚ位置での断面を示している。
本来、細胞の断面を撮像するときは、各励起光毎に光学系を切り替え、各々の蛍光色ごとに冷却ＣＣＤカメラなどで撮像する。本実施形態では、ＤＡＰＩ，ＦＩＴＣ，Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄの三色の蛍光を発することになるので、断面ごとに三枚ずつの画像を取得する。なお、図６においては、説明の便宜上、同じＺ位置ごとに各蛍光画像を重ね合わせて表示している。
図５及び図６に示す例では、Ｚ位置が異なるごとに、蛍光スポットが細胞核αの内部に存在することが確認できる画像と、細胞核αの外部に存在することが確認できる画像が得られている。
【００３８】
解析処理段階（ステップＳ３）
三次元座標上での細胞区画構築（ステップＳ３1）
解析処理段階では、まず、細胞画像解析装置２の三次元細胞区画構築手段２ａが、細胞画像撮像装置１を介して入手された画像を用いて細胞区画を三次元の細胞区画として構築する。
図７はＺ方向に異なる複数の焦点面で撮像された細胞核の画像を用いて細胞核を三次元に構築する手法の一例を示す説明図で、(a)はＺ方向に異なる複数の焦点面で撮像された細胞核の画像における隣接する部分をつなぎ合わせる状態を概念的に示す図、(b)は(a)の手法により三次元に構築された細胞核を示す図である。図7の画像は、ＤＡＰＩ用の励起フィルタおよび吸収フィルタおよびダイクロイックミラー等で構成された光学系により撮像されている。
ここで、三次元細胞区画構築手段２ａは、まず、適当な閾値を用いて、各Ｚ位置での細胞核画像の二値化を行い、このＺ位置での細胞核の特定を行う。ここでの閾値とは、ピクセルの輝度の閾値と、ピクセルの輝度の閾値で決められた輝度以上をもつピクセルの集合体の大きさ範囲（Ｍａｘ  Ａｒｅａ，Ｍｉｎ  Ａｒｅａ）の閾値の両方を意味する。本実施形態の細胞画像解析装置では、これらの閾値はユーザーが予め規定のＧＵＩ等から設定することができるようになっている。
三次元細胞区画構築手段２ａは、次いで、各Ｚ位置で特定された細胞核領域を用いて、Ｚ方向に隣接する二値化の結果を比較し、各Ｚ位置での画像における細胞核領域がＺ方向に連続する部分および細胞核領域が不連続となるＺ位置を判定することで、細胞核の三次元構造を構築する。この処理により、細胞核領域の内側、外側を三次元に識別でき、細胞核のＸＹＺ座標領域が決定される。
【００３９】
続いて、三次元細胞区画構築手段２ａは、コントロールである蛍光スポットおよび目的部位の蛍光スポットに対し細胞核と同様の解析を行い、三次元に構築する。図７の細胞核画像と同様に同じＺ位置で撮像された色別の蛍光スポット画像が撮像されるので、これらの画像に対しても、適当な閾値を用いて、各Ｚ位置での蛍光スポット画像の二値化を行い、このＺ位置での各蛍光スポットの特定を行う。ここでの閾値も、ピクセルの輝度の閾値と、ピクセルの輝度の閾値で決められた輝度以上をもつピクセルの集合体の大きさ範囲（Ｍａｘ  Ａｒｅａ，Ｍｉｎ  Ａｒｅａ）の閾値の両方を意味する。本実施形態の細胞画像解析装置では、これらの閾値もユーザーが予め規定のＧＵＩ等から設定することができるようになっている。
三次元細胞区画構築手段２ａは、次いで、各Ｚ位置で特定された各蛍光スポットの領域を用いて、Ｚ方向に隣接する二値化の結果を比較し、各Ｚ位置での画像における各蛍光スポット領域がＺ方向に連続する部分および各蛍光スポット領域が不連続となるＺ位置を判定することで、各蛍光スポットの三次元構造を構築し、夫々一個の蛍光スポットとして識別する。この処理により、コントロールである蛍光スポットおよび目的部位の蛍光スポットのＸＹＺ座標領域が決定される。
【００４０】
細胞区画の内外の識別（ステップＳ３2）
次いで、細胞区画識別手段２ｂが、三次元細胞区画構築手段２ａを介して三次元に構築された細胞区画の区画内と区画外を識別する。
【００４１】
第２、第３の蛍光シグナルの認識（ステップＳ３3）
次いで、蛍光シグナル認識手段２ｃが、三次元細胞区画構築手段２ａを介して三次元に構築され、細胞区画識別手段２ｂを介して認識された細胞区画の区画内に存在する、第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを夫々自動的に認識する。例えば、細胞核と各蛍光スポットが上記二種類の画像解析により三次元に構築された後、蛍光シグナル認識手段２ｃは、各蛍光スポットが、識別された細胞核のＸＹＺ座標領域内に存在するか否かを三次元構築された細胞核画像の情報と照
らし合わせて判定する。
【００４２】
誤認識チェック（ステップＳ３4）
図８はＦＩＳＨにおける短波長側の蛍光の長波長側への漏れこみの一例を示す説明図で、(a)はＦＩＴＣの励起光でコントロールの蛍光スポットを発光させているときに、目的部位の蛍光スポットが短波長側の蛍光の漏れこみによって発光している状態を示す図、(b)はＴｅｘａｓ  Ｒｅｄの励起光を照射したときに発光する目的部位の蛍光スポットを示す図である。
本来であれば、目的部位の蛍光スポットγが発光するのは、ＦＩＴＣの励起光でコントロールである蛍光スポットβの蛍光を発光させているときではなく、図８(b)に示すように、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄの励起光を照射したときである。しかし、短波長側の蛍光が、長波長側の蛍光に漏れこんで長波長側の蛍光物質が発光してしまう現象がまれに起こる。
【００４３】
本実施形態の細胞画像解析装置では、このような蛍光の漏れこみによる蛍光スポットの誤検出を防ぐことができるようにしている。
即ち、誤認識防止手段２ｅが、第２の蛍光レポーター分子と第３の蛍光レポーター分子のうち、短波長側の蛍光レポーター分子が発する蛍光の、長波長側の蛍光レポーター分子への漏れこみを検出して、長波長側の蛍光の発光であるとの誤認識を防止する。
具体的には、上述した三次元座標上での細胞区画構築（ステップＳ３1）〜第２、第３の蛍光シグナルの認識（ステップＳ３3）の処理手順によって、三次元に構築され、且つ、細胞区画の区画内に存在するものと認識された、ＦＩＴＣで発光する細胞核内のコントロールである蛍光スポットのＸＹＺ座標とＴｅｘａｓ  Ｒｅｄで発光する目的部位の蛍光スポットのＸＹＺ座標とを比較する。そして、ＦＩＴＣで発光する蛍光スポットのＸＹＺ座標とＴｅｘａｓ  Ｒｅｄで発光する目的部位の蛍光スポットのＸＹＺ座標が同一の場合、このＸＹＺ座標が同じ蛍光スポットをコントロールの蛍光スポットではなく、目的部位の蛍光スポットとして認識する。
【００４４】
特徴量測定（ステップＳ３5）
次いで、特徴量測定手段２ｄが、蛍光シグナル認識手段２ｃ、誤認識防止手段２ｅを介して認識された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルに対し、夫々の特徴量として、少なくとも強度、大きさ、蛍光若しくは発光領域の数を測定し、例えば、蛍光レポーター分子ごとの蛍光スポットの個数、蛍光スポットの平均輝度、蛍光スポット領域の大きさ等を算出する。
このようにして測定、算出されたデータは、例えば、図９に示すような表で一覧表示することができる。図９の表中、“Ｗｅｌｌ”はマルチウェルプレートにおける各ウェルの番号、“Ｔｏｔａｌ”は各ウェルにおいて認識された細胞の総個数、“Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ”は各ウェルにおいてＴｅｘａｓ  Ｒｅｄが発光している細胞の個数、“Ｃｅｌｌ％”は（各ウェルにおいてＴｅｘａｓ  Ｒｅｄが発光している細胞の個数）／（各ウェルにおいて認識された細胞の総個数）を示している。
【００４５】
細胞数計測・表示（ステップ４）
次いで、細胞数計測表示手段２ｆが、特徴量測定手段２ｄを介して測定された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルの夫々の特徴量を用いて、予め規定した条件を満たす細胞の数を自動的に計測しその計測結果を表示する。
このとき、コントロールである蛍光スポット数が予めユーザーが設定した規定数を満たしている細胞を、抽出・カウントし、かつ、その抽出した細胞のうち、目的部位の蛍光スポットが発光している細胞の数をカウントして表示するようにするとよい。
【００４６】
さらに、本実施形態の細胞画像解析装置は、対物レンズのＺ方向への移動量の値を補正して、細胞核内のＺ方向の位置情報を演算出力する機能を有するようにするのが望ましい。
図１０に示すように、対物レンズの屈折率ｎ１と、細胞が載置される例えばマルチウェルプレート等の細胞培養容器の底面部の屈折率ｎ２の違いから、細胞内部に結ばれる焦点のＺ方向への移動距離Ｌ２と、実際の対物レンズの移動距離Ｌ１とが異なる場合がある。例えば、細胞の厚みが１００μｍあるときにおいて、その細胞の底面と上面とに焦点を合わせるための対物レンズの移動距離が８０μｍとなる場合がある。一般的に、対象物の厚みの情報を入手する場合、その情報源として焦点を合わせた対物レンズのＺ方向への移動量を用いることが多い。しかし、上述のように、対物レンズのＺ方向への移動量と対象物の厚みとが一致しない場合があるため、対物レンズの屈折率とマルチウェルプレートのような細胞培養容器の底面部の屈折率との差に基づく所定の補正値を用いて、対物レンズのＺ方向への移動量の値を補正して、細胞核内のＺ方向の位置情報を演算出力する機能を備えるようにするとよい。
【００４７】
本実施形態の細胞画像解析方法、細胞画像解析システム、及び細胞画像解析装置によれば、同じ細胞をＺ方向に複数枚撮像し、細胞核の三次元形状を構築し、細胞核の内側と外側の領域を認識し、細胞核に含まれているＦＩＳＨ法により蛍光を発する蛍光スポットを三次元で解析することが出来るため、蛍光スポットが重なって判別不能となることが無く、細胞全体から蛍光スポットを検出することができ、さらに、細胞の外側のゴミによる発光を誤認識することが無いので、正確なＦＩＳＨ法での細胞解析が出来る。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明のＦＩＳＨ細胞画像解析方法、ＦＩＳＨ細胞画像解析システム及びＦＩＳＨ細胞画像解析装置は、ＦＩＳＨ法を用いて細胞診断や細胞遺伝子学研究を行う分野に有用である。
【符号の説明】
【００４９】
１          細胞画像撮像装置
１ａ        蛍光観察光学系
１ｂ        撮像素子
２          細胞画像解析装置
２ａ        三次元細胞区画構築手段
２ｂ        細胞区画識別手段
２ｃ        蛍光シグナル認識手段
２ｄ        特徴量測定手段
２ｅ        誤認識防止手段
２ｆ        細胞数計測表示手段
α          細胞核
β          コントロールである蛍光スポット
γ          目的部位の蛍光スポット
δ          コントロールである蛍光スポットと同じ蛍光を発する異物
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
0005525776.tif 000008
【図９】
0005525776.tif 000009
【図１０】
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【図７】
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