(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
極性頭部基と１つの炭化水素鎖を有する生物活性リゾ脂質を含む誘導体化生物活性リゾ脂質であって、
生物活性リゾ脂質の炭化水素鎖内の炭素原子が保護されていてもよいペンダントスルフヒドリル基で誘導体化されており、
生物活性リゾ脂質は、リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルイノシトールおよびリゾホスファチジルコリンからなる群から選択される
、誘導体化生物活性リゾ脂質。
【請求項２】
担体部分とコンジュゲートされた請求項１に記載の誘導体化生物活性リゾ脂質を含む、誘導体化生物活性リゾ脂質コンジュゲートであって、該担体部分がポリエチレングリコール、金コロイド、アジュバント、シリコーンビーズ、および担体タンパク質からなる群から選択され、該担体タンパク質がキーホールリンペットヘモシアニンおよびアルブミンからなる群から選択される、誘導体化生物活性リゾ脂質コンジュゲート。
【請求項３】
抗体産生を惹起するのに十分な量の請求項２に記載の誘導体化生物活性リゾ脂質コンジュゲートを免疫適格非ヒト動物に投与し、それによる該動物において抗体産生を惹起することを含む、抗体産生を惹起する方法、ここで
免疫適格非ヒト動物は哺乳動物であり、
該方法はさらにモノクローナル抗体としての抗体を産生する細胞系統を作出することを含み、
該モノクローナル抗体を産生する細胞系統は、免疫適格非ヒト哺乳類宿主から該誘導体化生物活性リゾ脂質コンジュゲートの生物活性リゾ脂質と特異的に反応性がある抗体産生細胞を単離、同定することにより得られ、
該同定は、誘導体化生物活性リゾ脂質コンジュゲートの誘導体化生物活性リゾ脂質で修飾した支持体を用いて、生物活性リゾ脂質と特異的に反応性がある抗体を産生する細胞を検出することを含む、
方法。
【請求項４】
（ａ）ヒト化抗体およびキメラ抗体からなる群から選択されるモノクローナル抗体の誘導体を作出すること（ｂ）モノクローナル抗体またはその誘導体を単離すること
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
生物活性リゾ脂質と特異的に反応性がある抗体を単離する方法であって、請求項１に記載の誘導体化生物活性リゾ脂質で修飾された支持体を用いて、誘導体化生物活性リゾ脂質の生物活性リゾ脂質と特異的に反応性がある抗体を溶液から単離し、それにより抗体を単離することを含む、方法。
【請求項６】
前記溶液が体液、組織サンプルおよび組織ホモジネートからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
生物活性リゾ脂質と特異的に反応性がある抗体を検出する方法であって、請求項１に記載の誘導体化生物活性リゾ脂質で修飾された支持体を用いて、誘導体化生物活性リゾ脂質の生物活性リゾ脂質と特異的に反応性がある抗体を試料から検出し、それにより抗体を検出することを含み、抗体が自己抗体、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体からなる群から選択される、方法。
【請求項８】
生物活性リゾ脂質がリゾホスファチジン酸である、請求項１に記載の誘導体化生物活性リゾ脂質または請求項２に記載の誘導体化生物活性リゾ脂質コンジュゲート。
【請求項９】
生物活性リゾ脂質がリゾホスファチジン酸である、請求項３〜７いずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の支援
本発明は、助成金申請ＮＣＩ  ２Ｒ４４ＣＡ１１０２９８−２に従い、米国政府が支援する基金に少なくとも一部基づいている。従って、米国政府は本明細書に記載されている発明において一定の権利を有し得る。
【０００２】
関連出願
本特許出願は、２００６年５月３１日出願の米国仮特許出願第６０／８１０，１８５号（弁理士整理番号ＬＰＴ−３１００−ＰＶ）、２００６年８月４日出願の米国仮特許出願第６０／８３５，５６９号（弁理士整理番号ＬＰＴ−３１００−ＰＶ２）および２００７年４月１６日出願の米国仮特許出願第６０／９２３，６４４号（弁理士整理番号ＬＰＴ−３１００−ＰＶ３）の優先権を主張するものである。これらの出願は、その目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる。
【０００３】
技術分野
本発明は、モノクローナル抗体、およびヒトおよび／または動物の疾病においてシグナル伝達分子としての役割を果たす生物活性脂質分子を含む免疫原に対する抗体を作製する方法に関する。本発明に従って取り組むことができるシグナル伝達生物活性脂質の１つの特定種がリゾ脂質である。特に好ましいシグナル伝達リゾ脂質はスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）および種々のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）である。本発明の抗体は、それを、中和免疫応答を惹起することなく、ヒトを含む特定の動物種での使用に好適となるようにさらに修飾することができる。このような抗体、ならびにその誘導体および変異体は、単独で、または他の治療薬および／または処置と組み合わせて、このような抗体を含む医薬組成物の送達によって、種々の疾病または障害の治療および／または予防に使用することができる。さらに、これらの抗体はまた、生体サンプルにおいて生物活性シグナル伝達脂質を検出するために使用することができ、それにより、限定されるものではないが、疾病の診断および／または予後ならびに特定の標的脂質の産生および／または作用を改変する新たな治療法の発見および開発を含む、多くの目的のために有用な情報が得られる。本発明の組成物によって影響を受ける疾病または症状としては、限定されるものではないが、過剰増殖、脈管形成、炎症、繊維症および／またはそれらに基礎にある病理の一部としてのアポトーシスを有する疾病が含まれる。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
１．緒論
以下の記載は本発明を理解する上で有用な情報を含む。このような情報は本明細書で特許請求される発明の先行技術である、または関連のものであること、あるいは明示的または暗示的に引用される刊行物はいずれも本明細書で特許請求される発明の先行技術である、または特には関連のものであることを認めるものではない。
【０００５】
２．背景
Ａ．生物活性シグナル伝達脂質
脂質およびそれらの誘導体は現在、単に細胞膜の単純な構造要素、可溶化剤、ビタミンやホルモンとしての飼料、またはβ−酸化、解糖もしくは他の代謝プロセスのエネルギー源としてではなく、医学的研究の重要な対象として認識されている。特に、ある種の生物活性脂質は動物およびヒト疾病において重要なシグナル伝達メディエーターとして機能する。原形質膜の脂質のほとんどはもっぱら構造的役割を果たしているが、それらのうちの少数のものは細胞外刺激を細胞へ中継することに関与している。「脂質シグナル伝達」とは、脂質シグナル伝達分子とその固有の特異的受容体との直接的相互作用を含む、第１または第２のメッセンジャーとして生物活性脂質を用いるいくつかの細胞シグナル伝達経路のいずれをも指す。脂質シグナル伝達経路は、増殖因子から炎症性サイトカインにわたる種々の細胞外刺激により活性化され、アポトーシス、分化および増殖などの細胞運命の決定を調節する。生物活性脂質シグナル伝達に対する研究は、ますます多くの生物活性脂質が同定され、それらの作用が特定されるにつれ、めざましい科学研究分野となっている。
【０００６】
生物活性脂質の例としては、アラキドン酸に由来するエイコサノイド（ＨＥＴＥ、カンナビノイド、ロイコトリエン、プロスタグランジン、リポキシン、エポキシエイコサトリエン酸およびイソエイコサノイドなどのエイコサノイド代謝産物を含む）、非エイコサノイドカンナビノイドメディエーター、リン脂質、およびそれらの誘導体（ホスファチジン酸（ＰＡ）およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）など）、およびカルジオリピン、ならびにリゾリン脂質（リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）および種々のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）など）が含まれる。生物活性シグナル伝達脂質性メディエーターとしてはまた、セラミド、セラミド−１−リン酸、スフィンゴシン、スフィンガニン、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）およびスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）などのスフィンゴ脂質が含まれる。スフィンゴ脂質およびそれらの誘導体は、重要な細胞プロセスに対して多面発現作用を有する細胞外および細胞内シグナル伝達分子の一群に相当する。生物活性シグナル伝達脂質の他の例としては、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＡ）、ジアシルグリセリド（ＤＧ）、スルファチド、ガングリオシドおよびセレブロシドが含まれる。
【０００７】
予期されるように、生物脂質（すなわち、天然、特に生物体内に存在する脂質）は一般に非免疫原であるか、または免疫原性が極めて弱い。脂質はそれ自体、従来、抗体に基づく治療および診断／予後のアプローチの標的としてはあまり考えて来られなかった。文献には、担体タンパク質とコンジュゲートされた誘導体化形態のホスファチジルセリン（ＰＳ）を標的とするモノクローナル抗体の報告が含まれている。ホスファチジルセリンは原形質膜のアミノリン脂質である。膜脂質面の欠如、特に、細胞表面におけるホスファチジルセリンの出現は、細胞の機能を変調し、細胞とその環境との相互作用に影響を及ぼす表面特性の変化の発現をもたらす[Zwaal and Schroit, (1997) Blood, 89:1121-1132]。例えば、ＰＳはアポトーシス中に、細胞膜の内葉（その正常な位置）から外葉に再分配する。
【０００８】
Diaz, Balasubramanian and Schroit [Bioconj. Chem. (1998) 9:250-254]は、ＰＳに対して特異的免疫応答を惹起する脂質抗原の生産を開示している。脂質の脂肪アシル側鎖を介したＰＳとタンパク質担体（ＢＳＡ）との共有結合は、エピトープとして完全なＰＳ頭部基（head group）を保存する。Schroit（米国特許第６，３００，３０８号、米国特許第６、８０６，３５４号）は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）もしくはホスファチジルコリン（ＰＣ）／ポリペプチドまたはＰＳ／ポリペプチドコンジュゲートと特異的に結合する、動物にＰＳ／ポリペプチドコンジュゲートまたはＰＣ／ポリペプチドコンジュゲートを投与することによって作製された抗体を開示している。ＰＳ、ＰＣ／ポリペプチドまたはＰＳ／ポリペプチドコンジュゲートを検出する方法もまた開示されている。ＰＳ／ポリペプチドコンジュゲート組成物を含む医薬組成物を動物に投与することにより、ＰＳと特異的に結合する抗体を作製するための方法も開示されており、そのコンジュゲートが投与される（すなわち、癌ワクチンとして）動物において癌を処置する方法も同様である。また、動物をβ２−糖タンパク質Ｉ／脂質複合体（すなわち、非共有結合的に結合された脂質および糖タンパク質）で免疫化することにより、癌治療のために自己免疫を誘発することも開示されている。これらの筆者らは、数種の自己免疫応答がβ２−糖タンパク質Ｉ／脂質複合体に対して向けられていると断言しており（引用、Schousboe, (1979) Biochim. Biophys. Acta, 579:396-408）、従って、抗複合体応答の生起は癌治療における実質的な進展と言える。
【０００９】
Thorpe, Schroitらは、血清または血清タンパク質β２−糖タンパク質Ｉ（β２−ＧＰＩ）の存在下で陰イオン性リン脂質と結合するモノクローナル抗体（３Ｇ４）を記載している。Luster et al., J. Biol. Chem. 281: 29863-29871。当初、陰イオン性リン脂質を特異的に標的とすることが記載され、この抗体はマウスの腫瘍の血管内皮細胞に局在する。Ran et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11:1551-1562。次に、この抗体は腫瘍血管上の陰イオン性リン脂質とβ２−ＧＰＩの複合体と結合し、従って、ＰＳと結合する抗体はβ２−ＧＰＩに依存することが示された。Huang et al (2005) Cancer Res. 65:4408-4416。この抗体はβ２ＧＰＩの二量体形成を介してβ２−ＧＰＩと内皮細胞の結合を促進する。実際、人工的なβ２−ＧＰＩ二量体は、抗体が存在しなくても内皮細胞膜と結合することができる。Luster et al., J. Biol. Chem. 281: 29863-29871。ヒト化型の３Ｇ４（タルバシン(Tarvacin)、バビツキシマブ(Bavituximab)）は癌およびウイルス疾病の治療のために臨床試験下にある。
【００１０】
Thorpeら（ＷＯ２００４／００６８４７）は、ＰＳと競合し、ＰＳとの結合をめぐって抗体３Ｇ４と競合する抗体、そのフラグメントまたは免疫複合体を開示している。Thorpeら（ＵＳ６，８１８，２１３、ＵＳ６，３１２，２９４およびＵＳ６，７８３，７６０）は、アミノリン脂質と結合し、治療薬が付着された治療用コンジュゲートを開示している。
【００１１】
Baldoら（米国特許第５，０６１，６２６号）は、抗体作製のために用いられる血小板活性化因子（ＰＡＦ）、ＰＡＦ類似体に対する抗体ならびにＰＡＦまたはＰＡＦ類似体を用いるイムノアッセイを開示している。ＰＡＦは、グリセロールのＣ−２（ｓｎ２）位が長鎖脂肪酸の代わりにアセチル基でエステル化されているコリンプラスマロゲンである。
【００１２】
Vielhaberらは、セラミドに特異的であると思われる２つの抗体試薬（一方は、ＩｇＭ高密度ポリクローナルマウス血清、他方は、ＩｇＭモノクローナル抗体）の特徴を報告している。モノクローナルの方はスフィンゴミエリンに特異的であることが分かり、抗血清の方はは種々のセラミド種とナノモル範囲で反応することが分かった。Vielhaber, G. et al., (2001) Glycobiology 11:451-457。また、セラミドに対する市販の抗体試薬がないことも挙げられ、Krishnamurthyらは最近、セラミドに対するウサギＩｇＧの生成を報告している(J. Lipid Res. (2007) 48:968-975)。
【００１３】
Ｂ．リゾ脂質
リゾ脂質は、可能性のあるアシル化位置の一方または双方にアシル基が存在しないために、極性頭部基（polar head group）と一本の炭化水素主鎖を含む低分子量脂質である。極性頭部基がｓｎ−３にあるのに対し、炭化水素鎖はｓｎ−２位および／またはＳＮ−１位に存在し得る（「リゾ」とは、もともと溶血と呼ばれており、ＩＵＰＡＣが脱アシル化を指すために再定義したものである）。“Nomenclature of Lipids, www.chem.qmul.ac.uk/iupac/lipid/lip1n2.html”参照。これらの脂質はシグナル伝達生物活性脂質を代表するものであり、それらの生物学的および医学的重要性は、治療、診断／予後、または研究目的で脂質シグナル伝達分子を標的とすることにより何が達成できるかということを強調している(Gardell, et al. (2006), Trends in Molecular Medicine, vol 12: 65-75)。医学的に重要なリゾ脂質の２つの特定の例として、ＬＰＡ（グリセロール主鎖）およびＳ１Ｐ（スフィンゴイド主鎖）がある。他のリゾ脂質としては、スフィンゴシン、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、スフィンゴシルホスホリルコリン（リゾスフィンゴミエリン）、セラミド、セラミド−１−リン酸、スフィンガニン（ジヒドロスフィンゴシン）、ジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸およびＮ−アセチル−セラミド−１−リン酸が含まれる。これに対し、Ｃ−１（ｓｎ１）にＯ−アルキル（−Ｏ−ＣＨ２−）またはＯ−アルケニルエーテルを、また、Ｃ−２にアシルを含むプラスマロゲンは、リゾ脂質属から除外される。
【００１４】
選択されたＬＰＡ、Ｓ１ＰおよびジヒドロＳ１Ｐの構造を以下に示す。
【化１】
0005600252.tif 000002
【００１５】
ＬＰＡは単一の分子存在ではなく、長さおよび飽和度の異なる脂肪酸を含む内在的構造変異体の集合体である(Fujiwara, et al. (2005), J Biol Chem, vol. 280: 35038-35050)。ＬＰＡの構造主鎖はホスファチジルコリン（ＰＣ）またはホスファチジン酸（ＰＡ）などのグリセロールに基づくリン脂質に由来している。Ｓ１Ｐなどのリゾスフィンゴ脂質の場合、ｓｎ−２のセラミド主鎖の脂肪酸は存在しない。Ｓ１Ｐ、ジヒドロＳ１Ｐ（ＤＨＳ１Ｐ）およびスフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）の構造主鎖はスフィンゴシンに基づき、スフィンゴミエリンに由来している。
【００１６】
ＬＰＡおよびＳ１Ｐは、同じクラスの複数のトランスメンブランドメインＧタンパク質共役（ＧＰＣＲ）受容体と結合することにより種々の細胞シグナル伝達経路を調節する(Chun J, Rosen H (2006), Current Pharm Des, vol. 12: 161-171, およびMoolenaar, WH (1999), Experimental Cell Research, vol. 253: 230-238)。Ｓ１Ｐ受容体はＳ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４およびＳ１Ｐ５（以前には、ＥＤＧ−１、ＥＤＧ−５／ＡＧＲ１６、ＥＤＧ−３、ＥＤＧ−６およびＥＤＧ−８）と呼ばれ、ＬＰＡ受容体はＬＰＡ１、ＬＰＡ２、ＬＰＡ３（以前には、ＥＤＧ−２、ＥＤＧ−４およびＥＤＧ−７）と呼ばれている。このファミリーの４番目のＬＰＡ受容体がＬＰＡ（ＬＰＡ４）として同定されており、これらのリゾリン脂質に対する他の推定受容体も報告されている。
【００１７】
Ｃ．リゾホスファチジン酸(lysophosphatidic acid)（ＬＰＡ）
ＬＰＡは、真核細胞および原核細胞の双方でリン脂質の生合成の前駆体として知られているが、ＬＰＡは活性化細胞、特に血小板により急速に産生され、放出され、特定の細胞表面受容体に作用することにより標的細胞に影響を及ぼすシグナル伝達分子として最近になってはじめて明らかになってきた（例えば、Moolenaar, et al. (2004), BioEssays, vol. 26: 870-881, およびvan Leewen et al. (2003), Biochem Soc Trans, vol 31: 1209-1212）。小胞体において合成され、より複雑なリン脂質へと処理される他、ＬＰＡは細胞の活性化後、既存のリン脂質の加水分解により生成され得、例えば、ＳＮ−２位は一般に、脱アシル化のために脂肪酸残基を欠いており、脂肪酸へとエステル化されたｓｎ−１ヒドロキシルだけが残る。さらに、ＬＰＡの産生における鍵酵素である自己毒素（リゾＰＬＤ／ＮＰＰ２）は、多くの腫瘍種が自己毒素をアップレギュレーションしていることから、癌遺伝子の産物であり得る(Brindley, D. (2004), J Cell Biochem, vol. 92: 900-12)。ヒト血漿および血清中のＬＰＡ濃度が、高感度かつ特異的ＬＣ／ＭＳ手順を用いてなされた測定値を含めて報告されている(Baker, et al. (2001), Anal Biochem, vol 292: 287-295)。例えば、新しく調製したヒト血清を２５℃で１時間放置したものでは、ＬＰＡ濃度はおよそ１．２μＭであると見積もられ、ＬＰＡ類似体１６：０、１８：１、１８：２および２０：４が優勢種であった。同様に、新しく調製したヒト血漿を２５℃で１時間放置したものでは、ＬＰＡ濃度はおよそ０．７μＭであると見積もられ、１８：１および１８：２ＬＰＡが優勢種であった。
【００１８】
ＬＰＡは、細胞増殖の誘導から、細胞移動の刺激および神経突起の退縮、ギャップ結合の閉塞、さらには粘菌の走化性に至るまで、広範囲の生物応答に影響を及ぼす(Goetzl, et al. (2002), Scientific World Journal, vol. 2: 324-338)。ＬＰＡの生物学についての知識体系は、ますます多くの細胞系がＬＰＡ応答性に関して試験されるにつれ増え続けている。例えば、現在、ＬＰＡは、細胞の成長および増殖を刺激する他、創傷修復および再生における重要な事象である細胞張力および細胞表面フィブロネクチン結合を促進することが知られている(Moolenaar, et al. (2004), BioEssays, vol. 26: 870-881)。最近、抗アポトーシス活性もＬＰＡに帰され、ペルオキシソーム増殖受容体γがＬＰＡの受容体／標的であることが最近報告されている(Simon, et al. (2005), J Biol Chem, vol. 280: 14656-14662)。
【００１９】
ＬＰＡは抗体産生のためには難しい標的であることが分かっているが、ＬＰＡに対するポリクローナルネズミ抗体の産生の科学文献において報告がある(Chen et al. (2000) Med Chem Lett, vol 10: 1691-3)。
【００２０】
Ｄ．スフィンゴシン−１−リン酸
Ｓ１Ｐは、細胞増殖のメディエーターであり、生存経路の活性化によってアポトーシスから保護する(Maceyka, et al. (2002), BBA, vol. 1585: 192-201,およびSpiegel, et al. (2003), Nature Reviews Molecular Cell Biology, vol. 4: 397-407)。ＣＥＲ／ＳＰＨレベルとＳ１Ｐの間のバランスが、細胞が細胞死経路へ向かうのか、アポトーシスから保護されるのかを決定するレオスタット機構となるのではないかと提案されている。このレオスタット機構の鍵となる調節酵素はスフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）であり、その役割は細胞死促進生物活性シグナル伝達脂質（ＣＥＲ／ＳＰＨ）を成長促進Ｓ１Ｐへ変換することである。Ｓ１Ｐは２つの運命を持ち、Ｓ１Ｐは、Ｓ１Ｐをホスホエタノールアミンとヘキサデカナールに切断する酵素Ｓ１Ｐリアーゼにより分解されるか、あるいは多くはないが、Ｓ１ＰホスファターゼによりＳＰＨへと加水分解され得る。
【００２１】
Ｓ１Ｐは、高レベルのＳＰＨＫを含み、Ｓ１Ｐ分解のための酵素を欠く血小板で豊富に生成され、貯蔵されている。血小板が活性化されると、Ｓ１Ｐが分泌される。さらに、例えば肥満細胞などの他の細胞種も、Ｓ１Ｐを分泌し得ると考えられている。ひと度、分泌されれば、Ｓ１Ｐは血清アルブミンおよびリポタンパク質などの担体タンパク質上に高濃度で結合されると考えられる。Ｓ１Ｐは、血漿中に高濃度で見られ、０．５〜５μＭの範囲の濃度が報告されている。Ｓ１Ｐの細胞内作用も示唆されている（例えば、Spiegel S, Kolesnick R (2002), Leukemia, vol. 16: 1596-602; Suomalainen, et al (2005), Am J Pathol, vol. 166: 773-81)。
【００２２】
細胞表面Ｓ１Ｐ受容体の広範囲な発現により、Ｓ１Ｐは、増殖、接着、収縮、運動性、形態形成、分化および生存を含む広域の細胞応答に影響を及ぼすことが可能となる。この応答範囲は細胞および組織系内のＳ１Ｐ受容体の重複した、または異なる発現パターンに依存することが明らかである。さらに、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）および繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む、Ｓ１Ｐと増殖因子シグナル伝達経路の間のクロストークも最近報告されている（例えば、Baudhuin, et al. (2004), FASEB J, vol. 18: 341-3）。Ｓ１Ｐを含む種々の細胞プロセスの調節は、中でも、ニューロンのシグナル伝達、血管緊張、創傷治癒、免疫細胞輸送、生殖および心血管機能に特に影響を有する。これらの系内のＳ１Ｐの内在レベルの変化は有害な影響を持ち、癌、心不全、感染性疾患および自己免疫疾患を含む数種の病的状態を誘発する。
【００２３】
Sabbadini博士により発明された癌治療のための最近の新しいアプローチには、単独で、またはアントラサイクリンなどの化学療法薬の投与を含む従来の抗癌処置と組み合わせて、Ｓ１Ｐの生体利用可能なレベルを引き下げることを含む。この目的で、Ｓ１Ｐに特異的な抗体の生成が記載されている。例えば、自己の米国特許出願第１０／８２０，５８２号参照。このような抗体は、血清からＳ１Ｐを選択的に吸収することができ、細胞外Ｓ１Ｐを中和するための分子スポンジとして働く。自己の米国特許第６，８８１，５４６号および同第６，８５８，３８３号および米国特許出願第１０／０２８，５２０号、同第１０／０２９，３７２号および同第１１／１０１，９７６号も参照。また、Ｓ１Ｐは脈管形成促進性であることも示されているので、この抗体の有効性に対する付加的利益は、血液供給の制限によって増殖中の腫瘍の栄養素および酸素を枯渇させるその能力である。
【００２４】
この抗Ｓ１Ｐアプローチに関して特に独特なのは、ＳＰＨＫなどの、スフィンゴ脂質代謝経路の鍵酵素を標的とするスフィンゴ脂質に基づく抗癌戦略が提案されているが、脂質性メディエーターＳ１Ｐそれ自体は、大きくはこの脂質標的を直接弱めることが困難なために、特に、第一に、Ｓ１Ｐなどの脂質標的に対する抗体を生成すること、第二に、実際にＳ１Ｐ標的に対して作製された抗体を検出することが困難なために、これまでは強調されて来なかった。すでに述べたように、他の脂質標的に向けられた治療および診断アプローチに関しても同様の難点が存在する。本発明は、特許性のある方法、特に生物活性脂質に対するモノクローナル抗体の生成を提供することにより、これら双方のジレンマに対する有効な解決法を提供する。
【発明の概要】
【００２５】
３．定義
【００２６】
本発明を詳しく述べる前に、本発明の文脈で用いるいくつかの用語を定義する。これらの用語の他のものは、必要に応じて本明細書の他所で定義する。特に断りのない限り、本明細書で用いられる技術用語はそれらの技術分野で認識されている意味を有する。
【００２７】
「抗Ｓ１Ｐ抗体」とは、Ｓ１Ｐと結合するいずれの抗体または抗体由来分子も指す。
【００２８】
「生物活性脂質」とは、脂質シグナル伝達分子を指す。生物活性脂質は、細胞外および／または細胞内シグナル伝達を媒介し、従って、分化、移動、増殖、分泌、生存および他のプロセスを変調することにより、多くの細胞種の機能の制御に関与するという点で構造脂質（例えば、膜結合リン脂質）とは区別される。in vivoにおいて、生物活性脂質は細胞外液中に見られ、そこでそれらは、例えばアルブミンおよびリポタンパク質などの血清タンパク質などの他の分子と複合体を形成しているか、または「遊離」形態、すなわち、別の分子種と複合体を形成していない可能性がある。細胞外メディエーターとして、いくつかの生物活性脂質は、膜結合型イオンチャネルまたはＧＰＣＲまたは酵素または因子（次に、細胞の機能または生存に変化をもたらす複雑なシグナル伝達系を活性化させる）を活性化することにより、細胞のシグナル伝達を変更する。細胞内メディエーターとして、生物活性脂質は、酵素などの細胞内成分、イオンチャネルまたはアクチンなどの構造要素と直接相互作用することによって、それらの作用を発揮し得る。生物活性脂質の代表例としては、ＬＰＡおよびＳ１Ｐがある。
【００２９】
生物活性脂質の例としては、セラミド、セラミド−１−リン酸、スフィンゴシン、スフィンガニン、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）およびスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）などのスフィンゴ脂質が含まれる。スフィンゴ脂質ならびにそれらの誘導体および代謝産物はスフィンゴイド主鎖（スフィンゴミエリンに由来する）を特徴とする。スフィンゴ脂質ならびにそれらの誘導体および代謝産物は、重要な細胞プロセスに対して多面発現作用を有する細胞外および細胞内シグナル伝達分子の一群である。これらにはスルファチド、ガングリオシドおよびセレブロシドが含まれる。他の生物活性脂質は、グリセロールに基づく主鎖を特徴とし、例えば。リゾリン脂質（リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）および種々のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）など）、ならびにホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＡ）、ホスファチジン酸、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、カルジオリピン、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）およびジアシルグリセリド（ＤＧ）がある。さらに他の生物活性脂質として、アラキドン酸に由来するものがあり、これらにはエイコサノイド（ＨＥＴＥ、カンナビノイド、ロイコトリエン、プロスタグランジン、リポキシン、エポキシエイコサトリエン酸およびイソエイコサノイドなどのエイコサノイド代謝産物を含む）、非エイコサノイドカンナビノイドメディエーターが含まれる。リン脂質およびそれらの誘導体を含む他の生物活性脂質も本発明に従って使用可能である。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態では、スフィンゴシンに基づく生物活性脂質（スフィンゴシンおよびＳ１Ｐなどのスフィンゴイド主鎖を有するもの）とは対照的に、酵素産生のためにグリセロールに基づく生物活性脂質（ＬＰＡなどのグリセロールに基づく主鎖を有するもの）を標的とすることが好ましいと考えられる。他の実施形態では、抗体生成のためにアラキドン酸由来の生物活性脂質を標的とすることが望ましく、他の実施形態では、スフィンゴイド由来の生物活性脂質ではなく、アラキドン酸由来およびグリセロール由来の生物活性脂質が好ましい。これらのアラキドン酸由来およびグリセロール由来の生物活性脂質は一緒に、本発明の文脈で、「非スフィンゴイド生物活性脂質」と呼ぶことがある。
【００３１】
本発明の生物活性脂質種から明らかに除外されるものは、主として細胞膜の内葉および／または外葉の構造材として機能するホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリン、ならびにそれらの代謝産物および誘導体である。
【００３２】
「バイオマーカー」とは、それを疾病の進行または処置の効果を評価するために有用なものとする特定の分子的特徴を有する体内の特定の生化学物質である。例えば、Ｓ１Ｐはある種の過剰増殖性症状および／または心血管症状のバイオマーカーである。
【００３３】
「担体」とは、ハプテンとコンジュゲートし、それによりハプテンを免疫原性とするのに適した部分を指す。代表的な、非限定クラスの担体はタンパク質であり、その例としては、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、ヘマグルタニン(hemaglutanin)、破傷風およびジフテリアトキソイドが挙げられる。本発明に従って使用するのに好適な他のクラスの担体および例は当技術分野で公知である。これらだけでなく、後に発見または発明される天然または合成担体も、本発明の適用に好適であり得る。
【００３４】
「化学療法薬」とは、抗癌剤および他の抗過剰増殖剤を意味する。簡単には、「化学療法薬」とは、細胞および組織を破壊することを意図した化学物質を指す。このような薬剤としては、限定されるものではないが、ＤＮＡ傷害薬およびＤＮＡ合成を阻害する薬剤：アントラサイクリン（ドキソルビシン(doxorubicin)、ドノルビシン(donorubicin)、エピルビシン(epirubicin)）、アルキル化剤（ベンダムスチン(bendamustine)、ブスルファン(busulfan)、カルボプラチン(carboplatin)、カルムスチン(carmustine)、クロラムブシル(chlorambucil)、シクロホスファミド(cyclophosphamide)、ダカルバジン(dacarbazine)、ヘキサメチルメラミン(hexamethylmelamine)、イフォスファミド(ifosphamide)、ロムスチン(lomustine)、メクロレタミン(mechlorethamine)、メルファラン(melphalan)、ミトタン(mitotane)、マイトマイシン(mytomycin)、ピポブロマン(pipobroman)、プロカルバジン(procarbazine)、ストレプトゾシン(streptozocin)、チオテパ(thiotepa)およびトリエチレンメラミン(triethylenemelamine)）、白金誘導体（シスプラチン(cisplatin)、カルボプラチン(carboplatin)、シスジアミン−ジクロロ白金）、ならびにトポイソメラーゼ阻害剤（カンプトサー(Camptosar)）；カペシタビン(capecitabine)、クロロデオキシアデノシン(chlorodeoxyadenosine)、シタラビン(cytarabine)（およびその活性化形態、ａｒａ−ＣＭＰ）、シトシンアラビノシド、デカルバジン(dacabazine)、フロクスウリジン(floxuridine)、フルダラビン(fludarabine)、５−フルオロウラシル、５−ＤＦＵＲ、ゲムシタビン(gemcitabine)、ヒドロキシ尿素、６−メルカプトプリン、メトトレキサート(methotrexate)、ペントスタチン、トリメトレキサート、６−チオグアニン）などの抗代謝産物；抗脈管形成剤（ベバシズマブ(bevacizumab)、サリドマイド(thalidomide)、サニチニブ(sunitinib)、レナリドミド(lenalidomide)、ＴＮＰ−４７０、２−メトキシエストラジオール、ラニビズマブ(ranibizumab)、ソラフェニブ(sorafenib)、エルロチニブ(erlotinib)、ボルテゾミブ(bortezomib)、ペガプタニブ(pegaptanib)、エンドスタチン(endostatin)）；血管障害剤（フラボノイド／フラボン、ＤＭＸＡＡ、コンブレタスタチン誘導体（例えば、ＣＡ４ＤＰ、ＺＤ６１２６、ＡＶＥ８０６２Ａなど）；抗体（ヘルセプチン(Herceptin)、アバスチン(Avastin)、パノレックス(Panorex)、リツキシン(Rituxin)、ゼバリン(Zevalin)、マイロターグ(Mylotarg)、キャンパス(Campath)、ベキサール(Bexxar)、エルビタックス(Erbitux)）などの生物製品；内分泌療法：アロマターゼ阻害剤（４−ヒドロアンドロステンジオン(4-hydroandrostendione)、エキセメスタン(exemestane)、アミノグルテヒミド(aminoglutehimide)、アナストラゾール(anastrazole)、レトゾール(letozole)）、抗エストロゲン作用薬（タモキシフェン(Tamoxifen)、トレミフィン(Toremifine)、ラオキシフェン(Raoxifene)、ファスロデックス(Faslodex)）、ステロイド（デキサメタゾン(dexamethasone)など）；免疫調節剤：サイトカイン（ＩＦＮ−βおよびＩＬ２など）、インテグリン、他の接着タンパク質およびマトリックスメタロプロテイナーゼに対する阻害剤；ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（スベロイルアニリドヒドロキサム酸など）；イマチニブ（グリベック(Gleevec)）のようなチロシンキナーゼ阻害剤などのシグナル伝達阻害剤；１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシンなどの熱ショックタンパク質阻害剤；全てのトランスレチノイン酸などのレチノイド；増殖因子受容体または増殖因子自体の阻害剤；タキソイド（パクリタキセル(paclitaxel)、ドセタキセル(docetaxel)、タキソテール(taxotere)、ＢＡＹ５９−８８６２）、ナベルビン(navelbine)、ビンブラスチン(vinblastine)、ビンクリスチン(vincristine)、ビンデシン(vindesine)およびビノレルビン(vinorelbine)などの抗有糸分裂化合物および／またはチューブリン脱重合薬；ＣＯＸ阻害剤および細胞周期レギュレーター、例えば、チェックポイントレギュレーターおよびテロメラーゼ阻害剤などの抗炎症薬が含まれる。
【００３５】
「併用療法」とは、示された治療効果を得るために少なくとも２つの異なる療法の提供を含む治療計画を指す。例えば、併用療法は、例えば即効性化学療法薬と抗脂質抗体などの、２種類以上の化学的に異なる有効成分の投与を含み得る。あるいは、併用療法は単独、または放射線療法および／または外科術などの他の処置の送達と組合せた、抗脂質抗体および／または１以上の化学療法薬の投与を含み得る。２種類以上の化学的に異なる有効成分の投与という場合、これらの有効成分は同じ組成物の一部として、または異なる組成物として投与することができる。別個の組成物として投与する場合、異なる有効成分を含む組成物は同時または違う時間に、同じまたは異なる経路で、同じまたは異なる投与計画を用いて投与することができる（全て、特定の文脈の必要に応じ、また、担当医の判断に応じる）。同様に、単独または１以上の化学療法薬と組み合わせた、１以上の抗脂質抗体種、例えば抗ＬＰＡ抗体を、例えば放射線および／または外科術と併用する場合、これらの薬剤は外科術または放射線処置の前または後に送達することができる。
【００３６】
「誘導体化生物活性脂質コンジュゲート」とは、担体と共有結合的にコンジュゲートされている誘導体化生物活性脂質を指す。担体はタンパク質分子であってもよいし、あるいはポリエチレングリコール、金コロイド、アジュバントまたはシリコーンビーズなどの部分であってもよい。誘導体化生物活性脂質コンジュゲートは本発明に従って抗体応を生じるために免疫原として使用することができ、同じまたは異なる生物活性脂質コンジュゲートを、このようにして産生された抗体を検出するための検出試薬として使用することもできる。いくつかの実施形態では、誘導体化生物活性脂質コンジュゲートは、検出のために使用する場合、固体支持体に結合されている。
【００３７】
「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体に由来する抗体抗原結合部分と反応する抗原の部分を指す。
【００３８】
「ハプテン」とは、非免疫原であるが、抗体または抗体に由来する抗原結合部分と反応することができる物質である。言い換えれば、ハプテンは抗原性の特性を有し、免疫原性の特性は持たない。
【００３９】
「過剰増殖性障害」とは、限定されるものではないが、癌および良性腫瘍を生じる器官および組織細胞の制御されない増殖を含む、制御されない増殖細胞に関連する疾病および障害を指す。内皮細胞に関連する過剰増殖性障害は、血管腫、子宮内膜症、肥満、加齢性黄斑変性および種々の網膜症などの脈管形成の疾病、ならびにアテローム性動脈硬化症の処置におけるステント留置の結果として再狭窄を引き起こす内皮細胞および平滑筋細胞の増殖を起こし得る。繊維芽細胞を含む過剰増殖性障害（すなわち、繊維形成）としては、限定されるものではないが、加齢性黄斑変性、心筋梗塞に関連する心臓のリモデリングおよび心不全などの過剰瘢痕（すなわち、繊維症）、外科術または損傷の結果として通常起こるものなどの過剰な創傷治癒、ケロイド、ならびに繊維性腫瘍およびステント留置が含まれる。
【００４０】
「免疫原」とは、免疫原が投与された動物において特異的免疫応答、特に抗体応答を誘導し得る分子である。本発明では、免疫原は担体とコンジュゲートされた誘導体化生物活性脂質、すなわち、「誘導体化生物活性脂質コンジュゲート」である。免疫原として用いる誘導体化生物活性脂質コンジュゲートは、免疫原に応答して生成される抗体の検出のための捕捉材料として使用することができる。よって、免疫原はまた検出試薬としても使用可能である。あるいは、捕捉材料として用いられる誘導体化生物活性脂質コンジュゲートは、免疫原におけるものとは異なるリンカーおよび／または担体部分を有し得る。
【００４１】
生物学的現象に関して「阻害する」ことは、低下させる、抑制する、または遅延させることを意味する。例えば、「腫瘍形成の阻害」をもたらす処置は、腫瘍を全く形成しないこと、または非処置対照の場合よりもゆっくり形成する、もしくは数が少ないことを意味し得る。
【００４２】
本発明に関して、「液体組成物」とは、製造者からエンドユーザー（例えば、医師または看護士）へ供給される充填済みの最終形態において、固体とは対照的に、液体または溶液であるものを指す。ここで、「固体」とは、液体または溶液でない組成物を指す。例えば、固体としては、リオフィライゼーション、凍結乾燥、沈殿および同様の手法によって調製された乾燥組成物が含まれる。
【００４３】
「単剤療法」とは、一回量としての投与であれ、経時的に数回量の投与であれ、１種類の治療上有効量の化合物の送達に基づく処置計画を指す。
【００４４】
「新生物」とは、異常、かつ、制御されない細胞成長を指す。「新生物」、または腫瘍は、異常で、制御されず、無秩序な細胞成長の増殖であり、一般に癌と呼ばれる。新生物は良性または悪性であり得る。破壊的な増殖、侵襲および転移の特性を持っていれば、新生物は悪性、または癌性である。侵襲性とは、組織の境界を規定している基底膜を破り、それによりしばしば身体の循環系に入り込む、周囲組織の浸潤または破壊による新生物の局部的拡散を指す。転移とは一般に、リンパ系または血液循環系による腫瘍細胞の播種を指す。転移とはまた、漿液腔、またはくも膜下もしくは他の空間を通じた直接的拡大による腫瘍細胞の移動を指す。転移の過程を通じた、腫瘍細胞の身体の他の部位への移動は最初に出現した部位から離れた領域に新生物を形成する。
【００４５】
本発明の「特許性のある」組成物、方法、機械または製品とは、その対象が、分析が行われる時点で特許性に関する全ての法定要件を満たすことを意味する。例えば、新規性または非自明性などに関しては、その後の研究により、１以上のクレームが新規性、非自明性などを無効にするような１以上の実施形態を包含することが明らかになれば、「特許性のある」実施形態とに定義によって制限されるクレームは具体的にその非特許性の実施形態を排除する。また、本明細書に添付されるクレームは、最も広い合理的範囲を示すとともに、それらの有効性を保持するように解釈されるべきである。さらに、特許性に関する１以上の法定要件が補正される場合、または特許性に関する特定の法定要件が、本願が出願または特許として発行された時から１以上の補正クレームの有効性が疑問視されるまで満たされているかどうかを評価するためにその標準が変化する場合には、これらのクレームは、（１）それらの有効性を保持し、（２）その状況下で最も広い合理的解釈を与えるように解釈されるべきである。
【００４６】
「医薬上許容される塩」とは、本発明の薬剤および化合物の生物学的有効性および特性を保持し、かつ、生物学的に、または他の点で不都合がない塩を指す。多くの場合、本発明の薬剤および化合物は、荷電基、例えば、荷電アミノ基および／またはカルボキシル基またはそれに類似する基の存在のために酸塩および／または塩基塩を形成することができる。医薬上許容される酸付加塩は無機酸および有機酸から製造することができ、医薬上許容される塩基付加塩は無機および有機塩基から製造することができる。医薬上許容される塩に関しては、Berge, et al. (1977) J. Pharm. Sci., vol. 66, 1-19を参照。
【００４７】
「複数」とは、１を超えることを意味する。
【００４８】
「分離された」、「精製された」、「単離された」とは、サンプル保持容器に入ったサンプルの１以上の成分が、その容器内に存在する１以上の他のサンプル成分から物理的に取り出される、または取り出されている、あるいは１以上の他のサンプル成分の存在が希釈されていることを意味する。分離または精製工程で取り出し、または希釈可能なサンプル成分としては、化学反応生成物、非反応化学物質、タンパク質、炭水化物、脂質および非結合分子が含まれる。
【００４９】
本明細書において「種」とは、例えば、化学療法薬の特定種など、様々な文脈で用いられる。各文脈で、この用語は、特定の文脈で用いられる種類の化学的に区別されない分子集団を指す。
【００５０】
「特異的に会合する（specifically associate）」および「特異的に結合する」などとは、２つの分子間の特異的、非無作為の相互作用を指し、この相互作用は、それらの分子間の適当な化学的または分子的相互作用を可能とする構造的、疎水的／親水的、および／または電気的特徴の存在に依存している。抗体はその標的抗原のエピトープと「結合する」または「相互作用する」（または同等に「に対して反応性がある」）と言うことができる。抗体は当技術分野で一般に、抗体の抗原との結合に関して、それらの抗原「に対して」または短く「に」と記載される。
【００５１】
本明細書において「安定な」とは、２つの分子（例えば、ペプチドとＴＬＲ分子）が所望の目的または操作のために維持され得るのに十分安定である２分子間の相互作用を指す。例えば、ペプチドとＴＬＲ分子の間の「安定な」相互作用は、そのペプチドが、所望の効果を達成するのに十分な期間、ＴＬＲ分子と結合し、かつ、結合を維持するものを指す。
【００５２】
「対象」または「患者」は、本発明の分子によって達成され得る処置を必要とする動物を指す。本発明に従って処置され得る動物としては脊椎動物を含み、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタおよび霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類を含む）などの動物が特に好ましい例である。
【００５３】
「サロゲートマーカー」とは、病態に対する処置の効果を間接的に示す、体内の生物活性の検査指標を指す。過剰増殖性症状および／または心血管症状に関するサロゲートマーカーの例としては、ＳＰＨＫおよび／またはＳ１ＰＲが含まれる。
【００５４】
「治療上有効な量」（または「有効量」）とは、そのような処置を必要とする対象に投与した際に処置を達成するのに十分な有効成分、例えば、本発明の薬剤の量を指す。よって、本発明の組成物の治療上有効な量を構成するものは、当業者により容易に決定することができる。癌療法に関して、「治療上有効な量」とは、特定の癌に関連する１以上の遺伝子の発現の増強または低減、腫瘍負荷の低減、癌細胞の溶解、生体サンプル（例えば、生検、および全血、血漿、血清、尿などの体液のアリコート）における１以上の癌細胞死マーカーの検出、誘導型アポトーシスまたは他の細胞死経路の誘導などを含む、癌細胞の生存または代謝に関連する１以上のパラメーターにおいて客観的に測定される変化をもたらすものである。もちろん、治療上有効な量は、処置される特定の対象および症状、対象の体重および齢、病態の重篤度、選択される特定の化合物、準拠する投与計画、投与のタイミング、投与様式などによって異なり、これらは全て、当業者により容易に決定することができる。併用療法に関して、特定の有効成分の治療上有効な量を構成するものは、単剤療法（すなわち、有効成分として１つの化学存在だけを用いる治療計画）として投与される場合の有効成分の治療上有効な量を構成するものとは異なり得ると考えられる。
【００５５】
「処置」または「処置する」とは、疾病または障害に対する防止または保護（すなわち、臨床徴候の発症を引き起こさない）；疾病または障害の阻害（すなわち、臨床徴候の発症の阻止、遅延または抑制）；および／または疾病または障害の緩和（すなわち、臨床徴候の回復を生じる）を含む、疾病または障害の処置を意味する。当然のことながら、「防止」と「抑制」の間の区別は、最終的に誘発される事象が未知であるか、または隠れているために常に可能であるわけではない。よって、「予防」とは、「防止」と「抑制」の双方を含む「処置」の一種をなすと理解される。よって、「保護」には「予防」が含まれる。
【００５６】
「治療計画」とは、化学療法薬および細胞傷害性薬剤、放射線療法、外科術、遺伝子療法、ＤＮＡワクチンおよび療法、ｓｉＲＮＡ療法、抗脈管形成療法、免疫療法、骨髄移植、アプタマーおよび他の生物製品（抗体および抗体変異など）、受容体デコイおよび他のタンパク質に基づく治療薬を用いる疾病または障害の処置を意味する。
【００５７】
発明の概要
本発明の目的は、動物、特に哺乳類、特にヒトにおいて疾病プロセスに関連、関与またはそうでなければ関連づけられている生物活性脂質と反応性がある特許性のある組成物ならびに抗体、特にモノクローナル抗体、およびその誘導体を作製する方法を提供することである。
【００５８】
よって、本発明の一態様は、特許性のある生物活性脂質反応性抗体を生起するために使用可能な特許性のある免疫原を製造するために用いられる特許性のある中間体に関する。この特許性のある化合物種は、各々、極性頭部基と少なくとも１つの炭化水素鎖を有する生物活性脂質を含み、その炭化水素鎖内の炭素原子が、保護されていてもされていなくてもよいペンダント反応性基［例えば、スルフヒドリル（チオール）基、カルボン酸基、シアノ基、エステル、ヒドロキシ基、アルケン、アルキン、酸塩化物基またはハロゲン原子］で誘導体化されている、誘導体化生物活性脂質を含む。代表的な生物活性脂質としては、リゾ脂質、例えば、スフィンゴ脂質およびスフィンゴ脂質代謝産物、例えば、セラミド、セラミド−１−リン酸、Ｎ−アセチル−セラミド−１−リン酸、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）、スフィンゴシン、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）、ジヒドロスフィンゴシンおよびジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸が含まれる。他の生物活性脂質としては、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）などのリゾ脂質、ならびにリゾホスファチジルイノシトール（ＬＰＩ）またはリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）などのリゾホスファチジン酸代謝産物または前駆体が含まれる。ＬＰＡに関して、反応性基の位置の例としては、炭化水素鎖内の炭素原子またはリゾホスファチジン酸部分のグリセロール主鎖のＳＮ−１位への反応性基の付加が含まれる。特に好ましい誘導体化生物活性脂質としては、ＬＰＡおよびＳ１Ｐのスルフヒドリル誘導体が含まれる。
【００５９】
本発明の関連の態様は、本発明の誘導体化生物活性脂質から産生される免疫原に関する。一般に、このような免疫原は、担体に共有結合されている誘導体化生物活性脂質を含む。好適な担体部分の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびアルブミンなどの担体タンパク質、ポリエチレングリコール、金コロイド、アジュバントまたはシリコーンビーズが挙げられる。本発明の免疫原の好ましい実施形態としては、ＫＬＨまたはアルブミンに共有結合されているＬＰＡのスルフヒドリル誘導体が含まれる。スフィンゴ脂質に基づく免疫原の例としては、好ましい免疫原実施例としては、ＫＬＨまたはアルブミンに共有結合されているＳ１Ｐのスルフヒドリル誘導体が含まれる。
【００６０】
本発明の免疫原は、誘導体化生物活性脂質と担体部分を、その担体と生物活性脂質の間の共有結合がペンダント反応性基を介して生じ、特定種の生物活性脂質−担体免疫原を産生することを可能とする条件下で反応させることにより製造される。次に、このような免疫原を好ましくは単離または精製した後、所望の免疫原の１回または数回の投与（典型的には注射による）を含み得る免疫化手順の一部として宿主動物に投与する。この態様の好ましい実施形態において、誘導体化生物活性脂質のペンダント反応性基は好適な保護基で保護され、これは担体と生物活性脂質を共有結合させるのに用いられる化学法の前または化学法の一部として除去され、この誘導体化生物活性脂質は「脱保護」される。
【００６１】
上述のように、本発明の別の態様は、生物活性脂質に対して反応性があるモノクローナル抗体を作製する方法に関する。このような方法では、免疫適格宿主動物（例えば、マウス、ラット、モルモットまたはウサギなどの齧歯類）を本明細書に記載の生物活性脂質免疫原で免疫化する。免疫化の後、この宿主はその生物活性脂質に対する抗体応答を生じ、その結果、その免疫原中に存在する特定の生物活性脂質に反応性がある抗体を産生する。生じる抗体はポリクローナルであってもよいが、好ましくは、モノクローナルである。モノクローナル抗体に関しては、所望の抗体を産生する細胞系統を好ましくはクローニングし、所望の脂質特異的抗体を所望の量で産生させるように不死化する。好ましい実施形態では、所望のモノクローナル抗体、例えば、ＬＰＡに対して反応性があるモノクローナル抗体を用いて、キメラまたはヒト化抗体または抗体フラグメントなどの抗体誘導体を作製する。いくつかの実施形態では、完全ヒト化抗体は、適格ヒト系のいくつか、または全てを含むように操作された動物、例えば、マウスまたはラットを免疫化することにより、作製することができる。
【００６２】
脂質は一般に、抗体産生に特に従いにくい分子種であることが知られている。本発明の一面は、この問題が、少なくとも一部には、特定の標的脂質種に対して反応性がある抗体を検出することが困難であることにあるという認識の上にある。しかしながら、この問題は、リゾ脂質またはスフィンゴ脂質またはスフィンゴ脂質代謝産物などの特定の標的生物活性脂質の誘導体化形態を用いることで精緻に克服することができる。
【００６３】
ある好ましい実施形態では、このような誘導体化生物活性脂質は、検出される抗体を作製するために用いた免疫原中に存在する特定の生物活性脂質のエピトープに対して反応性がある抗体を同定するために使用可能である。この役割を果たすため、特定の誘導体化生物活性脂質または誘導体化生物活性脂質コンジュゲートを固体支持体、好ましくは、ＥＬＩＳＡプレート、Ｂｉａｃｏｒｅチップなどのアッセイデバイスの固相に結合させることができる。固体支持体に結合させることで、抗体の結合および検出中に生物活性脂質が洗い流される可能性が最小となる。
【００６４】
本発明の別の態様は、担体と、本発明の単離された免疫により誘導される物質、例えば、モノクローナル抗体もしくは抗体フラグメント、変異体または誘導体とを含む医薬組成物または獣医薬組成物に関する。好ましい担体としては、特に、その組成物がヒトにおける治療的使用を意図する場合には、医薬上許容されるものが含まれる。非ヒト治療適用（例えば、同伴動物、家畜、魚類または家禽類の処置）では、獣医学用に許容される担体を使用することができる。
【００６５】
本発明の関連の態様は、防止または予防的処置および投与を含む、使用または処置方法に関する。このような方法は一般に、治療的処置または予防的処理を必要とする対象（例えば、哺乳類、特にヒト患者）に、所望の処置を達成するのに有効な量の、生物活性脂質標的に対して反応性がある免疫により誘導される物質（immune-derived moiety）を投与することを含む。いくつかの実施形態では、生物活性脂質標的は非スフィンゴイド生物活性脂質である。治療上有用な免疫により誘導される物質の１つの好ましい例は、ＬＰＡなどのリゾ脂質に対して反応性があるヒト化モノクローナル抗体である。好ましくは治療組成物の一部としての、本発明の免疫により誘導される物質の投与経路は、局所的処置が望まれるか、全身処置が望まれるかによって、また、処置される領域によって異なる。投与は局所（経皮、眼内および粘膜（膣、子宮内および直腸送達）、肺送達、気管内、鼻腔内および上皮送達）、経口または非経口であり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または注入；または頭蓋内、例えばくも膜下腔内または心室内投与が含まれる。
【００６６】
本発明の他の態様は、種々の診断、予後および／または研究を可能とする方法に関する。このような態様の１つは、動物由来または抗体ライブラリー由来の体液または組織サンプル中の、天然生物活性脂質に対する自己抗体の存在を検出するための誘導体化脂質類似体の使用を含む。別のこのような態様は、スフィンゴ脂質またはその代謝産物以外の標的生物活性脂質を検出する方法に関する。一般に、このような方法は、免疫により誘導される物質とそれが反応性を持つ標的生物活性脂質の結合を含む。結合の検出は、例えば、標的生物活性脂質を含むことが分かっている、または含むことが疑われるサンプル（例えば、生検、または体液もしくは液体サンプル、例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液、涙、脳脊髄液、細胞培養液など）を免疫により誘導される物質に、その免疫により誘導される物質と、もしサンプル中に存在すれば、標的生物活性脂質の結合を可能とする条件下で曝すことにより果たすことができる。
【００６７】
このような診断方法を行うためには試薬が必要であり、本発明の誘導体化脂質を用いた診断試薬は本発明の別の態様に相当する。このような試薬が得られれば、このような試薬を用いた診断アッセイが作製され得る。
【００６８】
本発明のこれら、また、その他の態様および実施形態を、以下の節でさらに詳しく述べる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明の免疫原の鍵成分、ならびにＥＬＩＳＡおよびＢｉａＣｏｒｅアッセイのレイダウン材料(laydown material)の鍵成分として使用された典型的なチオール化Ｓ１Ｐ類似体を製造するための有機合成スキーム。
【図２】図３のチオール化ＬＰＡ類似体の合成に用いるチオール化脂肪酸を製造するための有機合成スキーム。
【図３】本発明の免疫原の鍵成分、ならびにＥＬＩＳＡおよびその他のアッセイのレイダウン材料の鍵成分であるチオール化ＬＰＡ類似体を製造するための有機合成スキーム。
【図４】抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂはＳ１Ｐに特異的であり、感受性があり、構造的に類似する生物活性脂質を認識しない。パネルＡ  プレート上での、Ｓ１Ｐ、ＳＰＨ、ＬＰＡ、ＳＰＣおよびｍＡｂ結合をめぐってＳ１Ｐと競合する他の構造的に類似する生体脂質を用いた競合的ＥＬＩＳＡ。遊離型のＳ１ＰまたはＤＨ−Ｓ１Ｐだけが結合に関して競合し、このことは抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂの特異性を証明する。ＳＰＣはわずかだけ結合に関して競合する。パネルＢ  特異性の評価に用いた生物活性脂質の構造。
【図５】抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂと、Ｂｉａｃｏｒｅマレイミド表面ＣＭ５センサーチップにつなぎ止められたチオ−Ｓ１Ｐとの結合速度のＢｉａＣｏｒｅ分析。センサーグラムを作製するために、種々の希釈率の抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂをフローセルに適用した。
【図６】ネズミＳｐｈｉｎｇｏｍａｂ（商標）のマウスＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列。ＣＤＲ残基が四角で囲まれている。
【図７】ネズミＳｐｈｉｎｇｏｍａｂ（商標）のＶＨおよびＶＬドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。
【図８】ネズミＳｐｈｉｎｇｏｍａｂ（商標）およびネズミＳｐｈｉｎｇｏｍａｂ（商標）に由来するキメラＳＩＰ−結合抗体の結合研究のＥＬＩＳＡ結果を示すグラフ。
【図９】実施例６に記載のように、チオール化Ｓ１Ｐ類似体でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートへのネズミおよびキメラｍＡｂの結合を示す直接的ＥＬＩＳＡ。データは、キメラｍＡｂ（ｃα−Ｓ１Ｐ  ＩｇＧ）は、完全ネズミｍＡｂ（ｍα−Ｓ１Ｐ  ＩｇＧ）に比べて、高くはないにしても同等の結合性能を有していることを示す。
【００７０】
当業者ならば分かるであろうが、以下の記載は本発明のある特定の好ましい実施形態を詳細に記載し、従って、単に代表例であって、本発明の実際の範囲を表すものではない。本発明を詳細に記載する前に、記載されている特定の分子、系および方法論は変更可能であるので、本発明はこれらに限定されるものではないと理解される。また、本明細書で用いる用語は単に特定の実施形態を記載するためのものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではないと理解される。
【００７１】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒトおよび／または動物の疾病において、シグナル伝達分子としての役割を果たす生物活性脂質分子に対する抗体を作製および同定する組成物および方法に関する。本発明はまた、これらの抗体自体、ならびにそれらの治療的、診断的およい研究試薬としての使用方法に関する。
【００７２】
１．抗体を産生および同定するための方法
脂質は一般に、抗体産生に特に従いにくい分子種であることを知られている。抗体産生は一般に動物において所望の抗体応答を生じる好適な免疫原が準備されなければならないことと、生じた抗体（存在する場合）が検出可能でなければならないことの２つに分かれたプロセスとして表すことができる。
【００７３】
上述のように、有効な抗体産生には抗体生成と抗体検出の双方が必要である。以下の実施例に開示されるように、特定の生物活性脂質に対する抗体の生成は、誘導体化生物活性脂質を免疫原として用いて達成された。これらの実施例では、チオール化生物活性脂質（例えばＳ１Ｐ）類似体がキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と、または脂肪酸不含ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と、製造者が推奨するプロトコールを用い、ＳＭＣＣ(Pierce, Rockford IL)によってコンジュゲートされた。ＳＭＣＣは、第一級アミンおよびスルフヒドリル基と反応するヘテロ二機能性架橋剤であり、好ましい架橋剤に相当する。また、マレイミド活性化タンパク質には、ヨードアセトアミド（ＩＯＡ）も使用可能である。
【００７４】
しかしながら、当技術分野で公知の他の免疫原および抗体作製法を使用することもできる。例えば、リン脂質種に対する抗体が、リポソームを用いた免疫化(Maneta-Peyret et al., 1988, 1989; Benerji and Alving, 1990)または単量体リン脂質の、タンパク質への吸着(Tamamura et al., 1971; Maneta-Peyret et al., 1989)、細菌への吸着(Umeda et al., 1989)、アクリルアミドへの吸着(Maneta-Peyret et al., 1988, 1989)および金への吸着[Tomii et al., (1991) Jpn J. Med Sci. Biol. 44:75-80]によって作製されている。多くの場合、生物活性脂質の、エマルションまたはリポソーム複合体としての提供は、ＩｇＧに比べて特異性、感受性および／または生物活性の限定されたＩｇＭをもたらした。例えば、セラミドに特異的であると思われる２つの市販の試薬（一方は、ＩｇＭ富化ポリクローナルマウス血清、他方は、ＩｇＭモノクローナル抗体）が同定されている。モノクローナルの方はスフィンゴミエリンに対して特異的であることが分かり、抗血清の方は種々のセラミド種とナノモル範囲で反応することが分かった。Vielhaber, G. et al., (2001) Glycobiology 11:451-457。これとは異なるアプローチで、Ran et al. [(2005) Clin. Cancer Res. 11:1551-1562]は、過酸化物で処理した（細胞の内面に陰イオン性リン脂質の輸送を生じさせることを意図する）ｂ．Ｅｎｄ３内皮細胞を免疫原として用いて、陰イオン性リン脂質に特異的な抗体の生成を惹起した。このように、所望の抗原性標的に対する抗体応答を惹起させ得る多くの方法が知られており、得られる抗体が検出可能であり、かつ、所望の生物活性脂質と反応性があることが示される限り、これらのうちのいずれを本発明で用いてもよい。
【００７５】
抗体の生成は、もちろん必要であるが、抗体が検出できなければ十分ではない。よって、本発明の一面は、生物活性脂質に対する抗体を産生するための他のこれまでの不都合が少なくとも検出工程における欠点に帰すことができるという認識の上にある。この検出の問題は、以下の実施例で、誘導体化生物活性脂質を用いることで精緻に克服することができる。誘導体化生物活性脂質は、検出される抗体を作製するために用いた免疫原中に存在する特定の生物活性脂質のエピトープに対して反応性がある抗体を検出および同定するために使用され、検出のために誘導体化形態で用いられる生物活性脂質は、抗体が作製されたものと同じエピトープを含む。この役割を果たすため、誘導体化脂質を、ＥＬＩＳＡプレート、Ｂｉａｃｏｒｅチップなどのアッセイデバイスの固相に結合させることができる。いくつかの実施形態では、誘導体化生物活性脂質は固体支持体に直接、共有結合的にコンジュゲートされる。例としては、誘導体化脂質を、以下の実施例に記載されるように、活性化ＢｉａＣｏｒｅチップに共有結合的にコンジュゲートさせることができる。他の実施形態では、誘導体化生物活性脂質は、担体部分に共有結合的にコンジュゲートされ、「誘導体化生物活性脂質コンジュゲート」とし、次にこれを固体支持体に結合させる。一例として、以下の実施例に記載されるように、ＢＳＡに共有結合的にコンジュゲートされた誘導体化脂質はＥＬＩＳＡ用のレイダウン材料（捕捉材料）として用いられる。いずれかの実施形態で、誘導体化生物活性脂質と固体支持体との結合は、いくつかの検出法のリスクと同様に、洗い流されにくい安定な検出手段を提供する。抗体の検出は、種々の方法で達成することができる。本発明の好ましい実施形態では、検出はＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）標識不含相互作用分析、または誘導体化生物活性脂質が固体支持体に結合される、他の固相に基づく慣例の検出手段による。他の固体支持体の例としては、限定されるものではないが、アフィニティカラム、ガラスまたは合成ビーズ、マルチウェルプレートなどが挙げられる。
【００７６】
検出工程で用いられる誘導体化生物活性脂質コンジュゲートは、免疫原として用いるものと同じ誘導体化生物活性脂質コンジュゲートであってもよいし、あるいは誘導体化生物活性脂質を、免疫原として用いるコンジュゲートのものとは異なる担体とコンジュゲートさせてもよい。いくつかの実施形態では、例えば、ＥＬＩＳＡ用のレイダウンとして、検出工程では、交差反応性を最小にするために、免疫原として用いるものとは異なる誘導体化生物活性脂質コンジュゲートを使用することが好ましい。例としては、この担体はＢＳＡ（特に検出工程では好ましくは脂肪酸不含）、ＫＬＨまたは当技術分野で公知の他の担体であり得る。誘導体化生物活性脂質とタンパク質担体をコンジュゲートさせるのに用いる架橋剤は、例えば、ＳＭＣＣまたはＩＯＡであり得る。１つの好ましい実施形態では、免疫原はＳ１Ｐ−ＩＯＡ−ＫＬＨであり、Ｓ１Ｐ−ＳＭＣＣ−ＢＳＡ（脂肪酸不含ＢＳＡ）がＥＬＩＳＡの捕捉レイダウン材料であり、ここで、Ｓ１Ｐとは、架橋剤（この場合、ＩＯＡまたはＳＭＣＣ）と反応して、タンパク質担体（この場合、ＫＬＨまたはＢＳＡ）との共有結合を形成する誘導体化Ｓ１Ｐを指す。
【００７７】
２．化合物
「抗体」（「Ａｂ」）または「免疫グロブリン」（Ｉｇ）とは、抗原またはエピトープと結合し得る免疫グロブリン遺伝子に由来する、またはその後のモデリングされた、またはそれによってコードされている任意の形態のペプチド、ポリペプチドまたはその断片を指す。例えば、Immunobiology, Fifth Edition, C. A. Janeway, P. Travers, M., Walport, M.J. Shlomchiked., ed. Garland Publishing (2001)参照。抗体分子または免疫グロブリンは、通常、２つの異なる種のポリペプチド鎖からなる、分子量およそ１５０ｋＤａの大きな糖タンパク質分子である。一方のポリペプチド鎖は「重」（Ｈ）鎖と呼ばれ、およそ５０ｋＤａである。他方のポリペプチドは「軽」（Ｌ）鎖と呼ばれおよそ２５ｋＤａである。各免疫グロブリン分子は通常、２本の重鎖と２本の軽鎖からなっている。この２本の重鎖はジスルフィド結合により互いに連結され、その数は異なる免疫グロブリンイソ型間では異なっている。各軽鎖は１つの共有結合的ジスルフィド結合によって重鎖に連結されている。ある天然抗体分子では、２本の重鎖と２本の軽鎖は同一であって、２つの同じ抗原結合部位持っており、従って、二価である、すなわち、２つの同じ分子と同時に結合する能力を持っていると言える。
【００７８】
いずれかの脊椎動物種に由来する抗体分子の「軽」鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明瞭に異なる種、カッパ（ｋ）とラムダ（λ）のいずれかに割り付けることができる。これら２種の軽鎖の比率は種ごとに異なる。例として、平均ｋ／λ比は、マウスでは２０：１、ヒトでは２：１、ウシでは１：２０である。
【００７９】
いずれかの脊椎動物種に由来する抗体分子の「重」鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、イソ型と呼ばれる５つの明瞭に異なる種のいずれかに割り付けることができる。いくつかのイソ型は、数種の亜種を持っている。５つの主要な免疫グロブリンクラスが、免疫グロブリン（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）および免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）である。ＩｇＧは最も多いイソ型であり、数種のサブクラス（ヒトでは、ＩｇＧ１、２、３および４）を有する。Ｆｃフラグメントおよびヒンジ領域は異なるイソ型の抗体では異なるので、それらの機能特性を決定づける。しかしながら、これらのドメインの全体的な構成は全てのイソ型で同様である。
【００８０】
本明細書において「抗体フラグメント」およびその文法的変形は、完全抗体の抗原結合部位または可変領域を含む完全抗体の一部を指し、この部分は完全抗体のＦｃ領の定常重鎖ドメイン（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を欠いていてもよい。あるいは、定常重鎖ドメイン（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）の部分は「抗体フラグメント」に含まれていてもよい。抗体フラグメントの例は抗原結合を保持するものであり、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄおよびＦｖフラグメント；ダイアボディー；トリアボディー；単鎖抗体分子（ｓｃ−Ｆｖ）；ミニボディー、ナノボディー、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれる。例として、Ｆａｂフラグメントはまた軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。
【００８１】
「可変領域」とは、抗体分子またはそのフラグメントのＮ末端配列を指す。一般に、これら４つの鎖の各々はそのアミノ末端部分に可変（Ｖ）領域を有し、これはイソ型を決定する抗原結合部位および定常（Ｃ）領域に寄与する。軽鎖は多くの非共有結合的相互作用によって、また、ジスルフィド結合によって重鎖と結合され、重鎖および軽鎖のＶ領域は抗体分子の各腕で、２つの同じ抗原結合部位を形成するように対をなす。いくつかのアミノ酸残基が軽鎖および重鎖可変ドメイン間の界面をなしていると考えられている（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991); Clothia et al., J. Mol. Biol., vol. 186:651 (1985)参照）。
【００８２】
変異性は抗体の可変ドメイン中に一様に分布しているのではなく、軽鎖および重鎖可変ドメインの双方に「相補性決定領域」（ＣＤＲ）または「超可変領域」と呼ばれる３つのセグメントに集中していることを注記しておく。可変ドメインのより保存性の高い部分は「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、３つのＣＤＲによって接続された４つのＦＲ領域を含む。各鎖のこれらのＣＤＲはＦＲ領域によってともに近接して保持されており、他の鎖のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)参照）。合わせて考えると、これら６つのＣＤＲは抗体分子の結合特性に寄与している。しかしながら、１本の可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３つだけ含むＦｖの半分）であっても抗原を認識し、抗原と結合する能力を有する（Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)参照）。
【００８３】
「定常ドメイン」とは、抗体重鎖または軽鎖のＣ末端領域を指す。一般に、これらの定常ドメインは抗原に対する抗体分子の結合特性に直接的な関与はしないが、抗体依存性の細胞傷害性における抗体の関与といった種々のエフェクター機能を発揮する。ここで、「エフェクター機能」とは、Ｆｃドメインと免疫系のタンパク質との分子的相互作用による免疫細胞の動員により媒介される、抗体の様々な生理学的作用（例えば、オプソニン作用、細胞溶解、肥満細胞、好塩基球および好酸球分解および他のプロセス）を指す。重鎖のイソ型は抗体の機能的特性を決定する。それらの明瞭に異なる機能特性は、重鎖のカルボキシ末端部分によって付与され、それらは軽鎖に関連しない。
【００８４】
「変異体」とは、抗体の天然のアミノ酸配列と、少なくとも１つのアミノ酸残基改変で異なるアミノ酸配列を指す。天然型または親または野生型アミノ酸配列とは、天然に見られる抗体のアミノ酸配列を指す。抗体分子の「変異体」としては、限定されるものではないが、Ｆｃ領域、Ｆａｂ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジ領域を含む、軽鎖および／または重鎖の可変領域または定常領域内の変化が含まれる。
【００８５】
「特異的」とは、その標的エピトープへの、抗体の選択的結合を指す。抗体分子は、与えられた条件セット下で、所望の抗原に対する結合と、無関連の抗原または類似体抗原または抗原混合物とを比較することに体抗原または抗原混合物とを比較することにおり、結合の特異性に関して試験することができる。好ましくは、本発明の抗体は、無関連の抗原と、または標的抗原の類似体とさえ、有意な結合をしない。ここで、「抗原」とは、抗原と結合する抗体分子または免疫により誘導される物質によって認識され、結合する分子を指す。抗体が結合する抗原の特的部分は「エピトープ」と呼ばれる。「ハプテン」とは、ほとんどの状況下で、例えばタンパク質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金コロイド、シリコーンビーズなどの担体と結合された場合にのみ免疫応答を惹起する（すなわち、抗原として働く）ことができる小分子を指す。この担体は、それ自体によっても免疫応答を惹起しないものであり得る。
【００８６】
「抗体」とは、最も広い意味で用いられ、モノクローナル、ポリクローナル、多重特異性（例えば、抗体の各腕が同じまたは異なる抗原の異なるエピトープと反応性がある二重特異性）、ミニボディー、ヘテロコンジュゲート、ダイアボディー、トリアボディー、キメラおよび合成抗体、ならびに所望の結合特性および／または生物活性で抗原と特異的に結合する抗体フラグメントを包含する。
【００８７】
「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）とは、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体または抗体集団を指し、特定の方法による抗体の産生を必要として構築されるものではない。例えば、モノクローナル抗体は、Kohler G. and Milstein C. (1975), Nature, vol. 256:495-497が最初に記載したハイブリドーマ法によって、または組換えＤＮＡ法によって作製することができる。
【００８８】
「キメラ」抗体（または免疫グロブリン）とは、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属す抗体中の対応する配列と同一または相同であるが、その鎖の残りの部分は別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属す抗体中の対応する配列と同一または相同である重鎖および／または軽鎖を含む分子、ならびに所望の生物活性を示す限り、このような抗体のフラグメントを指す(Cabilly, et al., infra; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 81:6851 (1984))。
【００８９】
「ヒト化抗体」とは、ヒト配列の代わりに非ヒト（例えばネズミ）抗体に由来する選択された配列も含むヒト抗体を意味する。ヒト化抗体は、保存的アミノ酸置換、またはその結合活性および／または生物活性を有意に変化させない、同じ種または異なる種に由来する非天然残基を含み得る。このような抗体は非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、ほとんどの部分では、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特性を有するマウス、ラット、ラクダ、ウシ、ヤギまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基で置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含むこともできる。これらの改変は抗体の性能をさらに精密にし、最大限とするために行われる。よって、一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一態様では２つの可変ドメインを全て含み、この場合、全ての、または全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、全ての、または実質的に全てのＦＲ領域ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は所望により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、またはヒト免疫グロブリンのそれも含む。例えば、Cabilly, et al., 米国特許第４，８１６，５６７号；Cabilly, et al.,欧州特許第０，１２５，０２３  Ｂ１号；Boss, et al., 米国特許第４，８１６，３９７号；Boss, et al.,欧州特許第０，１２０，６９４  Ｂ１号；Neuberger, et al., ＷＯ８６／０１５３３；Neuberger, et al.,欧州特許第０，１９４，２７６  Ｂ１号；Winter, 米国特許第５，２２５，５３９号；Winter,欧州特許第０，２３９，４００  Ｂ１号；Padlan, et al.,欧州特許出願第０，５１９，５９６  Ａ１号;Queen, et al. (1989), Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, vol. 86:10029-10033参照。
【００９０】
「完全ヒト」抗体とは、免疫原とともに提供された際に、必ずしもＣＤＲグラフトを必要としないヒト抗体を産生し得る遺伝的に操作された（すなわち、トランスジェニック）マウス（例えば、Medarexから）で産生された抗体を指し得る。これらの抗体は、非ヒト抗体遺伝子が抑制され、ヒト抗体遺伝子発現と置換されているマウスなどの動物に由来する完全ヒト型（１００％ヒトタンパク質配列）である。出願者らは、これらの遺伝的に操作されたマウスまたは関連のＣＤＲのヒトフレームワークを生成し得る他の動物に提供された際に生物活性脂質に対して抗体が生成され得ると考えている。
【００９１】
「二重特異性抗体」とは、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体またはモノクローナル抗体を指し得る。一実施形態では、これらのエピトープは同じ抗原に由来する。別の実施形態では、これらのエピトープは２つに異なる抗原に由来する。二重特異性抗体を作製する方法は当技術分野で公知である。例えば、二重特異性抗体は２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現を用いて、組換え的に産生させることができる。あるいは、二重特異性抗体は化学的結合を用いて作製することもできる。当業者ならば、当技術分野で公知であるようなこれら、または他の方法を用いて二重特異性抗体を生産することができる。二重特異性抗体には、二重特異性抗体フラグメントが含まれる。本発明に包含される二重特異性抗体の一例としては、Ｓ１ＰエピトープおよびＬＰＡエピトープに対して結合特性を有する抗体であり、従って、Ｓ１ＰおよびＬＰ１の双方を認識し、それらと結合することができる。本発明に包含される二重特異性抗体の別の例としては、生物活性脂質由来のエピトープおよび細胞表面抗原由来のエピトープに結合特性を有する抗体がある。よって、この抗体は生物活性脂質を認識し、それと結合することができ、例えば標的化のために細胞を認識し、それと結合することができる。
【００９２】
「ヘテロコンジュゲート抗体」とは、２つの共有結合的に結合された抗体を指す。このような抗体は、架橋剤の使用を含む合成タンパク質化学における公知の方法を用いて作製することができる。本明細書におい「コンジュゲート」とは、１以上の抗体フラグメントまたは結合部分と１以上のポリマー分子の共有結合によって形成された分子を指す。
【００９３】
「生物学的に活性」とは、所望のエピトープと結合することができ、かつ、何らかの方法で生物学的作用を発揮し得る抗体または抗体フラグメントを指す。生物学的効果としては、限定されるものではないが、成長シグナルの調節、抗アポトーシスシグナルの調節、アポトーシスシグナルの調節、エフェクター機能カスケードの調節および他のリガンド相互作用の調節が挙げられる。
【００９４】
「組換えＤＮＡ」とは、ヒトにより操作、作出または改変された核酸およびそれらから発現される遺伝子産物を指す。「組換え」ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって、例えば、所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードする外来ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から産生されたポリペプチドまたはタンパク質である。「合成」ポリペプチドまたはタンパク質は化学合成によって製造されたものである。
【００９５】
「発現カセット」とは、構造遺伝子（すなわち、本発明の抗体などのタンパク質コード配列）の、このような配列に適合した宿主での発現に影響を及ぼし得るヌクレオチド分子を指す。発現カセットとしては、ポリペプチドコード配列と、また所望により、例えば転写終結シグナルなどの他の配列と、作動可能なように連結された少なくとも１つのプロモーターを含む。また、例えばエンハンサーなど、発現の達成に必要または有用な付加的調節エレメントを用いてもよい。よって、発現カセットはプラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、任意の形態の組換え型の「裸のＤＮＡ」ベクターなどを含む。
【００９６】
「ベクター」または「プラスミド」または「発現ベクター」とは、１以上の組換え遺伝子の発現を果たすために細胞内で一時的または安定的に維持可能な核酸を指す。ベクターは単独、または他の化合物と複合体を形成した核酸を含み得る。ベクターは所望により、ウイルスまたは細菌核酸および／またはタンパク質、および／または膜を含み得る。ベクターは、限定されるものではないが、ＤＮＡ断片を結合させ、複製可能となるレプリコン（例えば、ＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）を含む。よって、ベクターは、限定されるものではないが、ＲＮＡ、自律的自己複製環状または直鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを含み、発現プラスミドおよび非発現プラスミドの双方を含む。「プラスミド」は、商業的に入手可能であり、制限無く、公的に入手可能であるか、または公開されているプロトコールで報告されているように入手可能なプラスミドから構築することができる。さらに、発現ベクターはまた、真核細胞培養ではジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性など、あるいは大腸菌(E. coli)ではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性など、形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するための遺伝子も含み得る。
【００９７】
「プロモーター」は、細胞内でコード配列の転写を駆動し得る全ての配列を含む。よって、本発明の構築物用いるプロモーターは、遺伝子シス転写の時期および／または速度の調節または変調に関与する作用転写制御エレメントおよび調節配列を含む。例えば、プロモーターは、転写調節に関与する、エンハンサー、プロモーター、転写ターミネーター、複製起点、染色体組込み配列、５’および３’非翻訳領域、またはイントロン配列を含む、シス作用転写制御エレメントであり得る。本発明での使用に好適な転写調節領域としては、限定されるものではないが、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、および原核生物のまたは真核細胞またはそれらのウイルスにおいて遺伝子発現を制御することが知られている他のプロモーターが含まれる。
【００９８】
Ａ．スフィンゴ脂質に対する抗体
本発明は、スフィンゴ脂質を含む、特定の生物活性脂質に対して抗体を作製する方法を提供する。「スフィンゴ脂質」とは、http//www.lipidmaps.orgによって定義されているようなスフィンゴ脂質を指し、次のものが含まれる：スフィンゴイド塩基［スフィング−４−エニン（スフィンゴシン）、スフィンガニン、４−ヒドロキシスフィンガニン（フィトスフィンゴシン）、スフィンゴイド塩基ホモログおよび変異体、スフィンゴイド塩基１−リン酸、リゾスフィンゴミエリンおよびリゾグリコスフィンゴ脂質；Ｎ−メチル化スフィンゴイド塩基およびスフィンゴイド塩基類似体を含む］；セラミド［Ｎ−アシルスフィンゴシン（セラミド）、Ｎ−アシルスフィンガニン（ジヒドロセラミド）、Ｎ−アシル−４−ヒドロキシスフィンガニン（フィトセラミド）、アシルセラミドおよびセラミド１−リン酸を含む］；ホスホスフィンゴ脂質［セラミドホスホコリン（スフィンゴミエリン）、セラミドホスホエタノールアミンおよびセラミドホスホイノシトールを含む］；ホスホノスフィンゴ脂質；中性グリコスフィンゴ脂質［単純Ｇｌｃ系（ＧｌｃＣｅｒ、ＬａｃＣｅｒなど、ＧａｌＮＡｃｂ１−３Ｇａｌａ１−４Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃ−（Ｇｌｏｂｏ系）、ＧａｌＮＡｃｂ１−４Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃ−（Ｇａｎｇｌｉｏ系）、Ｇａｌｂ１−３ＧｌｃＮＡｃｂ１−３Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃ−（Ｌａｃｔｏ系）、Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ１−３Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃ−（Ｎｅｏｌａｃｔｏ系）、ＧａｌＮＡｃｂ１−３Ｇａｌａ１−３Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃ−（Ｉｓｏｇｌｏｂｏ系）、ＧｌｃＮＡｃｂ１−２Ｍａｎａ１−３Ｍａｎｂ１−４Ｇｌｃ−（Ｍｏｌｌｕ系）、ＧａｌＮＡｃｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ１−３Ｍａｎｂ１−４Ｇｌｃ−（Ａｒｔｈｒｏ系）、Ｇａｌ−（Ｇａｌａ系）または他の中性グリコスフィンゴ脂質を含む］；酸性グリコスフィンゴ脂質［ガングリオシド、スルホグリコスフィンゴ脂質（スルファチド）、グルクロンスフィンゴ脂質、ホスホグリコスフィンゴ脂質および他の酸性グリコスフィンゴ脂質；塩基性グリコスフィンゴ脂質；両性グリコスフィンゴ脂質；砒素スフィンゴ脂質および他のスフィンゴ脂質。
【００９９】
抗スフィンゴ脂質抗体は、以下にさらに詳細に記載されるように、過剰増殖性障害および心血管または脳血管疾患および障害などの障害の処置または予防に有用である。特定の実施形態では、本発明は、Ｓ１ＰおよびＳ１Ｐそれ自体を含むその変異体｛スフィンゴシン−１−リン酸［スフィンゲン−１−リン酸；Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン−１−リン酸；スフィング−４−エニン−１−リン酸；（Ｅ，２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−オクタデク−４−エノキシ］ホスホン酸］（ＣＡＳ２６９９３−３０−６）として定義｝、またはＤＨＳ１Ｐ｛ジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸［スフィンガニン−１−リン酸；［（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−オクタデクオキシ］ホスホン酸；Ｄ−エリスロ−ジヒドロ−Ｄ−スフィンゴシン−１−リン酸］（ＣＡＳ１９７９４−９７−９）として定義｝に対する抗体を作製する方法に向けられる。また、ＳＰＣ｛スフィンゴシルホスホリルコリン、リゾスフィンゴミエリン、スフィンゴシルホスホコリン、スフィンゴシンホスホリルコリン、エタンアミニウム；２−（（（（２−アミノ−３−ヒドロキシ−４−オクタデセニル）オキシ）ヒドロキシホスフィニル）オキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−、クロリド、（Ｒ−（Ｒ＊，Ｓ＊−（Ｅ）））、２−［［（Ｅ，２Ｒ，３Ｓ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−オクタデク−４−エノキシ］−ヒドロキシ−ホスホリル］オキシエチル−トリメチル−アザニウムクロリド（ＣＡＳ１０２１６−２３−６）］として定義｝に対する抗体も有用であり得る。
【０１００】
１．精製抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体
特異的モノクローナル抗Ｓ１Ｐ抗体（抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂ）を記載する。この抗体はＳ１Ｐを選択的に吸収し、それによりこの脈管形成促進、繊維形成促進性および腫瘍促進性の因子の有効in vivo細胞外濃度を低下させるための治療用分子スポンジとして使用することができる。この結果、腫瘍体積および転移能の低下、ならびに、そうでなければ成長中の腫瘍に供給が可能な新血管形成の同時遮断をもたらし得る。この抗体（および同等の活性を有する分子）はまた、例えば、加齢性黄斑変性ならびに多くの癌で見られるような望ましくない内皮細胞の増殖を含む、Ｓ１Ｐにより影響を受ける他の過剰増殖性障害を処置するためにも使用可能である。さらに、このＳ１Ｐの、アポトーシスから細胞を保護する能力は、標準的なアポトーシス誘導化学療法薬の効力の増強をもたらす抗体などの薬剤によって回復させることができる。
【０１０１】
Ｂ．他の生物活性シグナル伝達脂質に対する抗体
本明細書に記載の方法は、スフィンゴ脂質の範囲を超えた多くのさらなる細胞外および細胞内生物活性脂質（例えば、ＳＰＣ、セラミド、スフィンゴシン、スフィンガニン、Ｓ１Ｐおよびジヒドロ−Ｓ１Ｐ）に対するモノクローナル抗体を作製するために使用することができる。他の生物活性脂質クラスとしては、ロイコトリエン、エイコサノイド、エイコサノイド代謝産物（ＨＥＴＥ、プロスタグランジン、リポキシン、エポキシエイコサトリエン酸およびイソエイコサノイドなど）、非エイコサノイドカンナビノイドメディエーター、リン脂質およびそれらの誘導体（ホスファチジン酸（ＰＡ）およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）など）、カルジオリピン、およびリゾリン脂質（リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）およびリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）など）が含まれる。要するに、本発明は、重要な細胞プロセスに対して多面発現作用を有する所望の細胞外および／または細胞内シグナル伝達生物活性脂質のいずれに適用するためにも適合させることができる。生物活性脂質の他の例としては、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＡ）、ジアシルグリセリド（ＤＧ）、スルファチド、ガングリオシド、グロボシドおよびセレブロシドが含まれる。
【０１０２】
Ｃ．コンジュゲート
【０１０３】
本明細書に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントはin vitroにおいて単独で使用することもできるし、あるいは非誘導体化または非コンジュゲート形態で対象に投与することもできる。他の実施形態では、このような抗体、誘導体および変異体は誘導体化することもできるし、または１以上の分子存在と結合させることができる。他の分子存在としては、天然、組換えまたは合成ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質、非ペプチド性化学化合物、例えば、同位体、小分子治療薬などが含まれる。好ましい小分子としては、放射性標識、蛍光薬剤および小分子化学療法薬が含まれる。好ましいタンパク質としては、増殖因子、サイトカインおよび抗体（同一の抗体およびそのような抗体の誘導体または変異体を含む）が含まれる。これらの有効成分は、他の因子の中でも有効成分および意図する適用を考慮し、好適ないずれかの方法によって連結することができる。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合または他の好適なアプローチによって他の分子と機能的に連結させることができる。
【０１０４】
よって、本発明は、本発明の１以上のモノクローナル抗体またはその変異体もしくは誘導体と他の有効成分との間で形成されるコンジュゲートを意図する。このようなコンジュゲートは共有結合性であっても非共有結合性であってもよく、リンカーを介して、または有効成分間で直接的に生じるものでもよい。このようなコンジュゲートの例としては、本発明の１以上のモノクローナル抗体（またはその抗原結合ドメイン）が、同じまたは異なるクラスの別の治療用モノクローナル抗体と連結されたものを含む。あるいは、本発明のモノクローナル抗体または抗体誘導体もしくは変異体は、例えば、小分子化学療法薬または放射性同位元素などの違うクラスの治療薬と連結させることもできる。いくつかの実施形態では、２種類以上の異なる治療薬（そのうち少なくとも１つは本発明の化合物である）の各々１以上が多価スキャフォールドによって連結させることができる。
【０１０５】
コンジュゲートの代わりに、本発明のモノクローナル抗体または抗体誘導体もしくは変異体を１以上の異なる治療薬と単純に結合させることもできる。一例として、本発明のモノクローナル抗体は、例えばリポソーム、ミセル、ナノ粒子など、対象に投与するのに好適な送達ビヒクル中に、１以上の他種治療薬と組み合わせることができる。
【０１０６】
本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体または抗体誘導体もしくは変異体、例えば特定の標的生物活性脂質に対して反応性がある１以上のＣＤＲをタンパク質またはポリペプチドとコンジュゲートさせることを意図する。一例として、免疫グロブリン重鎖または軽鎖の可変領域に由来する１以上のＣＤＲをモノクローナル抗体にグラフトすることができる。
【０１０７】
３．適用
本発明は、癌、繊維症および脈管形成などの過剰増殖性障害、ならびに心血管疾患、心疾患および他の疾患、障害または身体傷害、および／または脳血管疾患および障害を処置または予防するための組成物および方法に向けられ、そこで、治療薬は、望ましくない、有毒なおよび／または生物活性のある脂質、またはその前駆体もしくは代謝産物の活性または濃度が変化した患者へ投与される。本発明の治療方法および組成物は、ある特定の望ましくないまたは有毒な脂質の吸収、相対的および／または利用濃度および／または活性を変化させることにより作用する。ここで、「有毒」とは、例えばシグナル伝達分子としてなど、疾病プロセスにおける特定の脂質の関与を指す。
【０１０８】
特定の理論に縛られるものではないが、ＬＰＡなどの脂質および／またはそれらの代謝産物の不適切な濃度は、心疾患、神経因性疼痛、癌、脈管形成、炎症および脳血管疾患（脳卒中様内耳障害を含む）を含む種々の疾病および障害を引き起こす、またはその発症に寄与すると考えられている（例えば、Scherer, et al. (2006), Cardiovascular Research, vol. 70; 79-87参照）。本組成物および方法はそれ自体、特に、特定の標的脂質、例えばＬＰＡの有効in vivo濃度を低下させることにより、これらの疾病および障害を処置するために使用可能である。本発明に従って処置され得るいくつかの疾病種を以下に記載する。
【０１０９】
Ａ．過剰増殖性疾患および障害
ｉ．癌
１つの癌療法は、単独で、またはアントラサイクリンなどの化学療法薬の投与を含む従来の抗癌処置と組み合わせて、腫瘍プロモーターＳ１Ｐのレベルを低下させることである。この目的で、Ｓ１Ｐに特異的であり、血清からＳ１Ｐを選択的に吸収し、細胞外Ｓ１Ｐを中和するための分子スポンジとして働き得るモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を開発した。Ｓ１Ｐは脈管形成促進性であることが示されているので、増殖中の腫瘍の血液供給を断つ抗体の能力から、抗体の有効性に対して付加利益が引き出すことができる。よって、別のスフィンゴ脂質に基づく抗新生物戦略は、ＣＥＲおよびＳＰＨ産生の既知のアクチベーター（ドキソルビシンおよび関連のアントラサイクリングリコシド、放射線療法など）を、Ｓ１Ｐレベルを低下させる戦略と組み合わせることを含む。
【０１１０】
ＳＰＨＫなどのスフィンゴ脂質代謝経路の鍵酵素を標的とするスフィンゴ脂質に基づく抗癌戦略が提案されているが、Ｓ１Ｐ自体は、主としてこの標的および関連の標的を攻撃することが困難であるために強調されて来なかった。本明細書に記載されているように、生理学的範囲でＳ１Ｐを認識し、分子組合せによってＳ１Ｐを中和することができる、Ｓ１Ｐに特異的の高いモノクローナル抗体が作製された。この抗体（およびその誘導体）の使用は増殖中の腫瘍細胞から重要な増殖因子および生存因子を取り上げる。さらに、このような抗体に基づく癌療法の使用はまた、外科術、放射線療法および／または細胞傷害性抗癌薬の投与などの従来の癌治療と組み合わせた場合にも有効であり得る。細胞傷害性薬剤の例としては、例えば、アントラサイクリン系の薬剤、ビンカアルカロイド、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞傷害性ヌクレオシド、タキサン、エポチロン、ディスコデルモリド(discodermolide)、プテリジン系の薬剤、ダイネン(diynene)およびポドフィロトキシン(podophyllotoxin)が挙げられる。これらのクラスのメンバーとしては、例えば、ドキソルビシン(doxorubicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、ダウノルビシン(daunorubicin)、アミノプテリン(aminopterin)、メトトレキサート(methotrexate)、メトプテリン(methopterin)、ジクロロメトトレキサート(dichloromethotrexate)、マイトマイシンＣ(mitomycin C)、ポルフィロマイシン(porfiromycin)、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、ゲムシタビン(gemcitabine)、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシンまたはポドフィロトキシン誘導体（エトポシド、エトポシドリン酸またはテニポシドなど）、メルファラン(melphalan)、ビンブラスチン(vinblastine)、ビンクリスチン(vincristine)、ロイロシジン(leurosidine)、ビンデシン(vindesine)、ロイロシン(leurosine)、パクリタキセルなどが挙げられる。他の抗悪性腫瘍薬としては、エストラムスチン(estramustine)、シスプラチン(cisplatin)、カルボプラチン(carboplatin)、シクロホスファミド、ブレオマイシン、ゲムシチビン(gemcitibine)、イフォスファミド(ifosamide)、メルファラン、ヘキサメチルメラミン、チオテパ(thiotepa)、シタラビン(cytarabin)、イダトレキサート(idatrexate)、トリメトレキサート、ダカルバジン(dacarbazine)、Ｌ−アスパラギナーゼ、カンプトテシン(camptothecin)、ＣＰＴ−１１、トポテカン(topotecan)、ａｒａ−Ｃ、ビカルタミド(bicalutamide)、フルタミド(flutamide)、ロイプロリド(leuprolide)、ピリドベンゾインドール誘導体、インターフェロンおよびインターロイキンが挙げられる。他の細胞傷害性薬剤も当技術分野でよく知られている。抗体の単独投与も疾病の進行の遅延に有効性を有し得るが、抗体に基づく併用療法は、それらの有毒副作用を最小限にしつつ細胞をアポトーシスに感受性とすることによって、化学療法薬の有効性を高めることができる。実際、抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂの、ヒト癌のマウスモデルおよび同種移植マウスモデルで腫瘍進行遅延させる能力は、ヒトおよび動物双方の腫瘍の処置において抗Ｓ１Ｐ抗体アプローチの有用性を実証している。さらに、異種移植モデルで数種のヒト癌（例えば、卵巣癌、乳癌、肺癌および黒色腫）が処置可能であるという発見は、これらの抗Ｓ１Ｐ抗体アプローチがある癌細胞種または癌組織種に限定されないことを証明する。
【０１１１】
ＬＰＡは、細胞増殖、分化、脈管形成および運動を含む複数の細胞応答を媒介する。多数の一連の実験的知見が、細胞外ＬＰＡが、腫瘍細胞の増殖、生存、侵入を刺激することにより、また、脈管形成および転移を誘発することにより、数種のヒト癌の進行に重要な役割を果たしていることを示唆している。さらに、ＬＰＡは種々の腫瘍細胞種をアポトーシスから保護する。ＬＰＡは卵巣癌および乳癌に以前から関連づけられており[Fang, X., et al., (2002) Biochim Biophys Acta, 1582: 257-64]、患者の血液および腹水の双方でＬＰＡレベルの上昇が見られており、腫瘍の進行、脈管形成および転移能との相関が見出されている。さらにまた、主としてＬＰＡの産生を担う酵素である自己毒素（ＡＴＸ）は、黒色腫、肺癌、神経芽腫、肝細胞癌および多形性膠芽腫を含むヒト腫瘍の転移および浸潤特性との相関が見出されている。よって、ＬＰＡは癌療法の革新的かつ有望な標的であると認識されている[Mills, G.B. and W.H. Moolenaar (2003) Nat Rev Cancer, 3: 582-91]。
【０１１２】
ＬＰＡを抗ＬＰＡ抗体（本明細書に記載のものなど）で中和することは、癌処置における新規な抗脈管形成的および抗転移的治療アプローチとなると考えられている。ＬＰＡに対するモノクローナル抗体は、ＬＰＡと選択的に結合し、それによりＬＰＡの有効in vivo細胞外レベルを低下させる「スポンジ」として働くと考えられる。これにより腫瘍形成および腫瘍増殖ならびに血管形成および転移能の同時遮断がもたらされると考えられる。さらに、ＬＰＡの、細胞をアポトーシスから保護する能力は、おそらく抗体中和の結果として消失すると思われ、従って、標準的なアポトーシス誘導化学療法薬の有効性が高まる。
【０１１３】
ｉｉ．脈管形成
脈管形成は、既存の血管から新たな血管が形成されるプロセスである。今日、腫瘍増殖は新血管新生に依存していることが科学的に十分受け入れられているので、現在、固形腫瘍および循環腫瘍に関連する脈管形成は腫瘍形成の重要な成分であると考えられている。Ｓ１ＰおよびＬＰＡは双方とも脈管形成プロセスに重要であると思われる。
【０１１４】
ＬＰＡは、その脈管形成促進作用によって腫瘍形成に寄与すると考えられる癌遺伝子ＧＲＯαの主要なレギュレーターである(Lee, et al (2006), Cancer Res, vol. 66: 2740-8)。ＬＰＡはまた、脈管形成プロセスの基礎にある細胞移動において認識されている作用因子であるマトリックスメタロプロテイナーゼ−２の発現も増強する(Wu, et al. (2005), Endocrinology, vol. 146: 3387-3400)。
【０１１５】
Ｓ１Ｐは、ヒト静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＤＮＡ合成および走化性運動を刺激すると同時に、初期血管形成に不可欠な多細胞構造の分化を誘導する。Ｓ１Ｐはまた、骨髄由来内皮細胞前駆体の、新血管新生部位への移動も促進し、Ｓ１Ｐ受容体を過剰発現する細胞は抗脈管形成薬、サリドマイド(thalidomide)およびネオバスタット(neovastat)に耐性がある。よって、Ｓ１Ｐ、および特にＳ１受容体は脈管形成および新血管新生に必要である。最後に、Ｓ１ＰとＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦおよびＩＬ−８などの他の脈管形成促進性増殖因子との間でクロストークが起こる。例えば、Ｓ１ＰはＥＧＦ受容体とＶＥＧＦ２受容体をトランス活性化し、ＶＥＧＦはＳ１Ｐ受容体の発現をアップレギュレーションする(Igarashi, et al. (2003), PNAS (USA), vol. 100: 10664-10669)。
【０１１６】
言うまでもないが、脈管形成の臨床対照は、癌、および加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）および子宮内膜症などの他の脈管形成依存疾患の処置の重要な成分である。また、腫瘍の脈管形成に関与している血管内皮細胞は癌細胞ほど容易には突然変異しないので、抗脈管形成治療薬も特に有望であり、結果として、血管内皮細胞は、長期療法に対して癌細胞よりも耐性を獲得しにくく、それらを有用な治療標的とする。
【０１１７】
Ｓ１Ｐは、腫瘍の脈管形成に重要であり得る、可能性のある脈管形成促進性増殖因子であることを示唆する数系統の証拠があり、これには、ＨＵＶＥＣを用いた種々のin vitroアッセイにおいて抗Ｓ１Ｐ抗体が、Ｓ１Ｐにより誘発された管形成、血管内皮細胞の移動および細胞死からの保護を中和できること；高いレベルのＳ１Ｐを発現する乳腺癌ＭＣＦ−７細胞の、ヌードマウスの乳房脂肪体への注射が、対照細胞を用いた場合よりもより大きく、より多い脈管形成依存性腫瘍の増加をもたらすこと；正所性ネズミ黒色腫同種移植モデルにおいて、抗Ｓ１Ｐ抗体が腫瘍関連脈管形成を劇的に減らし得ること；Ｓ１Ｐがマウスに移植したマトリゲル(Matrigel)プラグへの新しい毛細血管の成長を高め、この作用が抗Ｓ１Ｐ抗体の全身投与によって中和可能であること；ネズミマトリゲルプラグアッセイにおいて、抗Ｓ１Ｐ抗体のin vivo投与が、脈管形成促進性増殖因子により誘導された脈管形成（例えば、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦによる）を完全に中和できること；Ｓ１Ｐがin vitroおよびin vivoにおいて腫瘍からのｂＦＧＦおよびＶＥＧＦの放出を刺激し、この作用が抗Ｓ１Ｐ抗体によって回復可能であること；Ｓ１Ｐが、多形性膠芽腫細胞を含む、多数の異なる癌細胞種のin vitroにおいて運動性および浸潤を高めること；および抗Ｓ１Ｐ抗体が、ＡＭＤの動物モデルに関連する新血管新生を有意に低下させることが含まれる。
【０１１８】
このような脈管形成依存性腫瘍におけるＳ１Ｐの重要性から、Ｓ１Ｐは癌処置の優れた標的となる。実際、細胞外Ｓ１Ｐの抗体中和は、腫瘍増殖を支えるのに必要な栄養素および酸素の同時的欠乏による血管形成の阻害の結果として、ヒトを含む哺乳類における癌の進行顕著な低下をもたらし得る。よって、抗Ｓ１Ｐ抗体は、（１）腫瘍細胞増殖に対する直接的作用；（２）血管内皮細胞に対する間接的な抗脈管形成作用；および（３）他の脈管形成促進性増殖因子の放出および作用を防ぐ間接的な抗脈管形成作用を含むいくつかの作用機序を有する。従って、抗Ｓ１Ｐ抗体はまた、抗脈管形成療法に加え、抗転移治療薬としても役立ち得る。
【０１１９】
脈管形成の制御は、加齢性黄斑変性、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、子宮内膜症および関節リウマチなど、癌以外の他の脈管形成依存性疾患の処置の重要な成分である(Carmeliet, P. (2005), Nature, vol. Vol. 438(15): 932-6)。
【０１２０】
抗脈管形成治療薬はまた、腫瘍脈管形成に関与する血管内皮細胞は癌細胞ほど容易には突然変異しないので、抗脈管形成治療薬も特に有望であり、結果として、血管内皮細胞は、長期療法に対して癌細胞よりも耐性を獲得しにくく、それらを有用な治療標的とする。ＳＩＰ抗体およびその誘導体はまた、ＡＭＤに関連する脈管形成とともに見られるような、異常な内皮細胞増殖により引き起こされるものなど、Ｓ１Ｐ活性に関連する他の過剰増殖性障害の処置に有用であり得る。
【０１２１】
ｉｉｉ．          繊維形成および瘢痕形成
（ａ）Ｓ１Ｐ、繊維芽細胞およびリモデリングプロセス
心臓繊維芽細胞、特に筋繊維芽細胞は、心筋梗塞（ＭＩ）の細胞死および炎症に応答した瘢痕形成における重要な細胞エレメントである。筋繊維芽細胞コラーゲン遺伝子発現はリモデリングを証明するものであり、瘢痕形成に必要である。その他の活性に加え、Ｓ１Ｐは、血小板の活性化、脈管形成の刺激および平滑筋機能の増進の他、繊維芽細胞の移動および増殖を活性化させることによって創傷治癒に絶大な寄与を果たす炎症性メディエーターでもある。よって、おそらく損傷を受けた心筋によって局部的に産生されるＳ１Ｐは、特に心臓の筋繊維芽細胞を活性化させることにより、心臓のリモデリングおよび不全に関連する不適応性創傷治癒の一因となり得る。
【０１２２】
細胞の、Ｓ１Ｐに対する一般的応答には、細胞死からの保護；増殖の刺激；および移動性応答の促進の３つがある。よって、Ｓ１Ｐの活性または特定の障害、細胞系統などとの関与は、この種のアッセイをこの目的に適合させることにより評価することができる。繊維芽細胞は創傷治癒を促進する３つ全ての方法でＳ１Ｐに応答するという証拠がある。例えば、以下の実施例の節のいくつかの例で、Ｓ１Ｐは、心筋繊維芽細胞の活性（増殖、移動およびコラーゲン遺伝子発現）を促進することによってリモデリングに寄与することを示す証拠が提示されている。
【０１２３】
抗Ｓ１Ｐ抗体または抗体誘導体はまた、外科術に伴う過剰な瘢痕形成を防止する。損傷または外科術後の過剰な瘢痕形成は、胎児皮膚組織では問題とならず、成体では問題となり(Adzick and Lorenz (1994), Ann Surg, vol. 220: 10-18)、損傷後の成体皮膚組織における過剰なＴＧＦ−βに起因する。Ｓ１Ｐは、強力なアクチベーターとしてＴＧＦ−βシグナル伝達経路に関連づけられている。よって、抗Ｓ１Ｐ抗体は損傷または外科術後の過剰な瘢痕形成を制限すると予想される。
【０１２４】
（ｂ）ＬＰＡおよびＳ１Ｐによる細胞死からの保護
ＬＰＡは、アポトーシスから癌細胞を保護する因子である。よって、上記で詳しく述べたように、ＬＰＡに対する抗体は例えば、癌細胞を化学療法に対してより感受性とする。このことは実際に、新たに開発された抗ＬＰＡモノクローナル抗体を用いた以下の実施例で証明された。
【０１２５】
多くの細胞種の場合と同様に、繊維芽細胞はＳ１Ｐの添加によってアポトーシスから直接保護され、アポトーシスはＳＰＨＫの阻害剤によって促進され、Ｓ１ＰはシトクロムＣの放出、および結果としてのカスパーゼの活性化を遮断する。さらに、ＳＰＨＫ１でトランスフェクトされた繊維芽細胞はアポトーシスからの保護を示し、この作用は原形質膜へのＳＰＨＫ１の輸送に依存している可能性がある。ＳＰＨＫ１はＡｋｔをアップレギュレーションし、それによりＢｃｌ−２ファミリーメンバーを調節し、アポトーシスから保護するということは十分確立されている。また、Ｓ１Ｐ３はマウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）におけるＡｋｔのリン酸化に必要である。また、ＳＰＨＫのアップレギュレーションと結果としてのＳ１Ｐレベルの上昇は心臓繊維芽細胞をアポトーシスから保護する。
【０１２６】
Ｓ１Ｐの上流代謝産物であるセラミドは、細胞死を誘導するミトコンドリアタンパク質の転写を増強するとともに、ミトコンドリアの膜電位を低下させる。レオスタット機構のために、Ｓ１Ｐは反対の作用を有し、心筋繊維芽細胞（すなわち、心臓の完全に分化した繊維芽細胞）をアポトーシスから保護する。実際に、Ｓ１Ｐは保護機構としての自食作用を活性化させることすらある。これらの作用は中和抗Ｓ１Ｐ抗体（またはＳ１Ｐと結合して、それを隔離する働きをする他の分子）によって逆転され得る。
【０１２７】
Ｂ．疼痛
生物活性脂質は、神経因性疼痛および化学療法に関連する疼痛を含む、疼痛の病因に重要な役割を果たすと考えられている。
【０１２８】
神経因性疼痛の発生におけるＬＰＡシグナル伝達の重要な役割は、ＬＰＡ１受容体を欠いたマウスの使用を含む、種々の薬理学的および遺伝学的アプローチを用いて確立されている（例えば、Ueda, et al. (2006), Pharmacol Ther, vol. 109: 57-77; Inoue, et al. (2004), Nat Med., vol. 10: 712-8参照）。神経損傷を有する野生型動物は、背根の脱髄および脊髄背角内のタンパク質キナーゼＣイソ型と背根神経節中の２１カルシウムチャネルサブユニット双方の発現上昇と並行して挙動性異痛症および痛覚過敏症を発症する。ＬＰＡのくも膜下腔内注射は神経結紮後に見られたものと同様の挙動的、形態的および生化学的変化を誘発した。これに対し、Ｒｈｏ−Ｒｈｏキナーゼ経路を活性化する単一のＬＰＡ受容体（ＬＰＡ−１、ＥＤＧ−２とも呼ばれる）を欠いたマウスは、末梢神経損傷後に神経因性疼痛に徴候を発症しない。ＲｈｏおよびＲｈｏキナーゼの阻害剤も、これらの神経因性疼痛徴候を防いだ。これらの結果は、神経因性疼痛の誘発には受容体により媒介されるＬＰＡシグナル伝達が重要であること、およびＬＰＡに対する抗体はこの症状を患う個体において神経因性疼痛を緩和し得ることを意味する[Moulin, DE (2006), Pain Res Manag, vol. 11, Suppl A: 30A-6A]。
【０１２９】
他の疼痛に関して、化学療法に関連するものとして、主要な用量制限毒性の多くの小分子化学療法薬がある。実際、化学療法誘導性疼痛の多くの場合が報告されている。例えば、タイヘイヨウイチイTaxus brevifoliaに由来する抗新生物薬パクリタキセル（タキソール）は、卵巣癌、乳癌および非小細胞肺癌を含む種々の癌を処置するために用いられる。しかしながら、パクリタキセルの有効性は、しびれや灼熱痛などの重篤な有痛性末梢神経障害高い二次的発生により制限されている。このような疼痛に関連する生物活性脂質、例えばＬＰＡに対するモノクローナル抗体（またはその脂質結合部分を含むこのような抗体の誘導体）を、化学療法薬に関連する疼痛を軽減するために、パクリタキセルと組み合わせて投与することができる。このようなモノクローナル抗体または抗体誘導体と組み合わせて用いる場合、この用量制限毒性を緩和する結果として、投与するパクリタキセルの量はいっそう高く（従って、いっそう有効に）することができる。いくつかの実施形態では、化学療法薬（または他の薬剤）は、例えば、小分子化学療法薬と抗体を共有結合させることにより、小分子化学療法薬と多価スキャフォールドを結合させ、またこれと、標的生物活性脂質に対して特異的に反応性のあるモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体に由来する少なくとも１つの生物活性脂質結合ドメインを結合させるなど、抗体または抗体誘導体とコンジュゲートまたはそうでなければ結合させることができる。
【０１３０】
Ｃ．心血管疾患および障害
虚血性心疾患は米国の主要な死因である。毎年およそ１５００万人が心臓発作（心筋梗塞）を被り、その約３分の１（すなわち、約５００，０００人）が死に至っている。さらに、約６７５万人の米国人が心虚血の最も多い発現である狭心症を患っている。米国だけで、虚血性心疾患で生きている患者は総計、１３００万人を超える。「虚血」は、一般には、供給を行う血管の収縮または遮断によって引き起こされる、身体のある部分への酸素を含んだ血液の流れが不十分になることに伴う症状である。虚血は、血流が臨界レベル下回った時に起こる。この血流の低下は、（ｉ）塞栓（血餅）による血管の遮断；（ｉｉ）アテローム性動脈硬化症による血管の遮断；（ｉｉｉ）血管の破れ（出血性脳卒中）；（ｉｖ）急性血管収縮による血管の遮断；（ｖ）心筋梗塞（心停止時に器官への血流が低下し、虚血が起こる）；（ｖｉ）外傷；（ｖｉｉ）外科術の目的を達成するために、組織または器官への血流を低下または停止させる必要がある外科術（例えば、血管形成術、心肺／心臓移植）；（ｖｉｉｉ）ドブタミン(dobutamine)またはアデノシンなどの特定の薬剤に対する曝露(Lagerqvist, et al.(1992), Br. Heart J., vol. 68:282-285)；または（ｉｘ）心臓毒性のあるドキソルビシンなどの抗新生物薬および他の化学療法薬から起こり得る。
【０１３１】
血液の流量（容量／時間）がたとえ十分であっても、虚血は低酸素症、すなわち、血液の酸素含量が罹患領域の通常の細胞酸素要求を満たすのに不十分である状態によって起こる場合もある。低酸素血液は、定義上、酸素正常状態の血液、すなわち、酸素含量が通常の細胞酸素要求を満たすのに十分である血液とは明確に異なる。低酸素症状は、限定されるものではないが、高血圧症、不整脈、敗血性ショック、外傷、心筋症およびうっ血性心疾患などの心臓のポンプ機能に悪影響を及ぼす心不全の形態から起こり得る。
【０１３２】
心筋虚血障害は、心血流が制限された場合（虚血）、および／または心筋への酸素供給が悪くなり（低酸素症）、心臓の酸素要求が供給に見合わない場合に起こる。動脈硬化症、特にアテローム性動脈硬化症から起こる冠動脈疾病（ＣＡＤ）は、虚血の最も多い原因であり、安定または不安定狭心症などの症候を有する。ＣＡＤは急性心筋梗塞（ＡＭＩ）および心性突然死を招き得る。心不全が起こる虚血症状の範囲は、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）と呼ばれる。再潅流は、特に、抗凝集薬、血小板溶解薬または抗狭心症薬を用いた場合、または血管形成術または冠動脈グラフトによって心血管が外科的に開口された場合に、虚血の結果として起こる場合が多い。
【０１３３】
現在のところ、急性心筋梗塞および他の心疾患の処置としては、限定されるものではないが、機械的デバイスとそれに不随する、例えば冠動脈血管形成術などの処置；ストレプトキナーゼ、ｔＰＡおよびその誘導体などの血小板溶解薬が含まれる。これらの療法に対するアジュバントとしては、β遮断薬、アスピリンおよびヘパリン、および糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤が含まれる。ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤は血小板凝集および血栓形成を軽減する。例としては、モノクローナル抗体（例えば、アブシキマブ(abciximab)）、環状ペプチド（例えば、エプチフィバチド(eptifibatide)）および非ペプチドペプチドミメティクス（例えば、チロフィビアン(tirofibian)、ラミフィバン(lamifiban)、キセミロフィバン(xemilofiban)、シブラフィバン(sibrafiban)およびレフダラフィビアン(lefradafibian)）が挙げられる。
【０１３４】
予防的処置としては、例えば、食事管理および薬理学的介入などによって患者のコレステロールレベルを低下させるものが含まれる。スタチン類は、コレステロールレベルを低下させるために用いられる薬剤の一種である。スタチン類は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの活性を阻害し、肝臓のコレステロール受容体の産生を増強することによって作用すると考えられている。肝臓のコレステロール受容体はコレステロールと結合し、血液からこれを除去する。このような薬剤としては、ロバスタチン(lovastatin)、シンバスタチン(simvastatin)、プラバスタチン(pravastatin)およびフルバスタチン(fluvastatin)が含まれる。これらの、またその他のスタチン類は冠動脈疾患の進行を遅くし、患者のアテローム斑の退縮を誘発するが、このような薬剤の使用からの副作用の範囲は完全には理解されていない。
【０１３５】
言うまでもないが、生物活性脂質に対して反応性があるモノクローナル抗体および誘導体、ならびにその他のフラグメントおよび変異体は、心臓療法を達成するために、単独または薬剤および／または外科術による処置を含む他の治療アプローチと組み合わせて使用することができる。ここで、「心臓療法」とは、虚血、ＡＭＩ、ＣＡＤおよびＡＣＳを含む心筋の疾患、障害、または物理的外傷、ならびに介入性心臓病学、または哺乳類、特にヒトにおいて虚血もしくは虚血／再潅流傷害を引き起こし得る他の外科的もしくは医学的処置もしくは療法の際またはその結果として起こり得る外傷または心臓細胞および組織の損傷の予防および／または治療を指す。
【０１３６】
心臓および脳の他、抗Ｓ１Ｐアプローチはまた、種々の内耳病態などの血管に基づく、脳卒中様の症状にも適用することができる(Scherer, et al. (2006), Cardiovasc Res, vol. 70:79-87)。
【０１３７】
Ｄ．脳血管疾患および障害
脳虚血を受けた患者は多くの場合、一時的な神経障害から不可逆的な傷害（脳卒中）または死に至るまでの障害を被る。脳虚血、すなわち、脳神経系への血流の低下または停止は局部的または全体的のいずれかとして特徴付けることができる。局部的脳虚血は、頭蓋内または頭蓋外の脳血管の部分的または完全な閉塞から起こる脳血管内の血流の停止または低下を指す。このような閉塞は一般に、脳神経系の局部的関与を反映する、少なくとも２４時間持続し、脳循環の障害の結果である、神経障害の急性発生を特徴とする症候群である。局部的脳虚血の他の原因としては、くも膜下出血または医原性介入による血管攣縮が含まれる。
【０１３８】
全脳虚血とは、全身循環不全から起こる脳血管内の血流の低下を指し、これは即座に組織への酸素および栄養の低下をもたらす。よって、全脳虚血は心臓性能の重大な低下から起こり、ＡＭＩにより起こることが最も多いが、厄介な原因としては、急性心筋炎または心停止もしくは長期間の心肺バイパス後の心筋収縮性の低下から起こるポンプ不全；重篤な弁膜症性狭窄、大量の大動脈または僧帽弁逆流、および急性後天性心室中隔欠損などの機械的異常；ならびに心室細動などの心不整脈、または頸動脈血管形成術、ステント留置、動脈内膜切除術、心臓カテーテル法、電気生理学的研究および血管形成術などの介入法が含まれる。
【０１３９】
脳卒中および／またはＭＩ後の虚血傷害は一般に、重要な細胞の脱分極による細胞死をもたらすが、細胞内Ｎａ＋およびＣａ＋＋が上昇した後、細胞死が起こる。このプロセスを制御する１つのチャネルが、非電圧依存性チャネルTransient Receptor Potential Proteinであり、最近、Ｓ１ＰがＧＰＣＲ依存性機構を介したこのチャネルのアクチベーターとして同定された。さらに、Transient Receptor Potential Protein、スフィンゴシンキナーゼ１およびスフィンゴキナーゼ２は、心血管病理生物学を調節すると考えられている重要なマスタースイッチＥｇｒ−１(Khachigian, LM (2006), Circ Res, vol. 98: 186-91)および神経細胞の細胞死に重要な役割を果たす転写因子Ｓｐ１(Simard, et al. (2006), Nat Med., vol. 12: 433-40)とプロモーター領域を共有している。これらの知見に基づけば、Ｓ１Ｐに対する抗体は、虚血後低酸素症によって引き起こされる細胞死を軽減するものと予測される。
【０１４０】
当業者ならば、脳卒中を有している、または脳卒中、脳虚血、頭部外傷または癲癇のリスクを有している患者を容易に特定することができる。例えば、脳卒中のリスクのある患者としては、高血圧症を有する、または大手術を受けている患者が含まれる。従来、急性虚血性脳卒中の救急管理は、主として一般支持療法、例えば、水分補給、神経学的状態の監視、血圧管理および／または抗血小板または抗凝固療法からなる。脳卒中患者にヘパリンが投与されてきたが、有効性は限定され、一貫したものではない。場合によっては、循環中に吸収されたり、または数日かかって断片化され、遠位に運ばれたりする血栓もあるため、虚血それ自体は経時的に消散する。組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）は急性脳卒中を処置するために認可されているが、このような全身処置は脳内出血および他の出血性合併症のリスクの上昇に関連づけられている。血小板溶解薬およびヘパリンの投与の他、現在、閉塞性局部的脳虚血を受けている患者向けに市販されている治療選択肢はない。血管攣縮は血管拡張薬に部分的に応答する可能性がある。損傷部を物理的に除去するために頸動脈内に侵襲性が最小限のデバイスを置くことを含む、神経血管術の新たな開発分野は、将来的にこれらの患者の治療選択肢を提供するかもしれないが、この種の操作はそれ自体血管攣縮をもたらすことがある。
【０１４１】
言うまでもないが、生物活性脂質に対する抗体、抗体誘導体および他の免疫により誘導される物質は、脳血管療法を果たすために、単独で、または薬剤処置および／または外科術を含む他の治療アプローチと組み合わせて用いることができる。ここで、「脳血管療法」は、脳虚血および／または低酸素症に関連する疾病および障害の予防および／または処置に向けた療法を指す。特に注目されるのは、心疾患から起こる全虚血による脳虚血および／または低酸素症、ならびに哺乳類、特にヒトにおいて虚血性または虚血／再潅流脳血管傷害を引き起こし得る外傷または外科的もしくは医学的処置もしくは療法である。
【０１４２】
Ｅ．生物活性脂質と結合する抗体の診断適用およびセラノスティック(theranostic)適用
疾病における種々の生物活性脂質の役割が解明されるにつれ、診断およびセラノスティックにおける生物活性脂質の抗体結合剤の新たな役割も考えられる。本発明によれば、固体支持体に結合された誘導体化脂質を用い、生物活性脂質の検出を高めるための方法が提供される。抗体の生産および同定ならびに研究におけるこれらの方法の使用の他、生物活性脂質の高い検出は、生物活性脂質に関連する疾病の価値ある診断アプローチも提供し得る。他の技術と組み合わせると、最適な患者の処置をデザインするためのセラノスティックアプローチが提供される。１つの非限定例は、癌のバイオマーカーとしてのＳ１Ｐの役割に関する診断およびセラノスティック法における抗Ｓ１Ｐ抗体の使用である。ＬＰＡまたは他の生物活性脂質に対する抗体を用い、他の疾病適応のための診断法およびセラノスティック法も考えられる。
【０１４３】
最近、科学文献が、Ｓ１Ｐが、腫瘍細胞から放出される可能性ある強力な腫瘍形成性増殖因子であること、およびＳ１Ｐが初期段階の癌検出の新規なバイオマーカーであり得ることを示唆した。Ｓ１Ｐの産生を担う酵素であるＳＰＨＫは、様々な癌種において有意にアップレギュレーションされている(French, Schrecengost et al. 2003)。ＳＰＨＫ活性は、悪性乳癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、子宮癌、腎臓癌および直腸癌では、隣接する正常組織に比べて２〜３倍アップレギュレーションされている。これらの研究者らはまた、ＳＰＨＫの発現は患者ごとに異なることを示したが、これは幾人かの患者の腫瘍が、同じ腫瘍種を有する他の患者のものよりもＳ１Ｐに対する依存性が大きい可能性があることを示唆する。市販のゲノミクスデータベース(ASCENTA, Genelogic Inc., Gaithersburg MD)を検索すると、ＳＰＨＫの相対的発現が一般に多種の悪性腫瘍で有意に上昇していることが確認される。
【０１４４】
最近の刊行物はまた、Ｓ１Ｐが新規な癌バイオマーカーであり得ることも示唆している[Xu, Y. et al., (1998) JAMA 280: 719-723; Shen, Z. et al., (2001) Gynecol Oncol 83: 25-30; Xiao, Y.J. et al., (2001) Anal Biochem 290(2): 302-13; Sutphen (2004) Cancer Epidemiology 13(7) 1185-91]。例えば、Sutphenらは、初期段階の卵巣癌患者で血清Ｓ１Ｐレベルが上昇していることを示している(Sutphen 2004)。これらのデータから、乳癌患者でもそれらのＳ１Ｐ依存性においていくらかの変動を示すことが推定される。考え合わせると、これらの予備知見は、患者の生検組織、血液、尿またはその他の組織または体液サンプルがＳ１Ｐレベルの上昇を示せば、個々の患者に対する抗Ｓ１Ｐ療法、例えば抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂ療法の成功が予測され得る。
【０１４５】
体液におけるＳ１Ｐの使用の可能性は次の特許で開示されており、これらは全て、本願と同一譲渡人に譲渡されたものである。ＵＳ６，５３４，３２３、ＵＳ６，５３４，３２２；ＵＳ６，２１０，９７６；ＵＳ６，８５８，３８３；ＵＳ６，８８１，５４６；ＵＳ７，１６９，３９０およびＵＳ６，５００，６３３。
【０１４６】
たとえヒト化抗体の毒性が低く、治療係数が大きいとしても、患者や医療提供者にとって極めてコストが高い。よって、抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂ治療薬に応答する可能性の高い患者にこのような処置の有用性を向けると、リスクが低くなり、コストが最小となるとともに、最適な患者利益が提供される。
【０１４７】
以下に、改良された疾病管理のための生体脂質診断薬および治療薬のいくつかの提案される適用の概略を示す。
１．Ｓ１Ｐは、特にスフィンゴ脂質に基づくゲノミクスと組み合わせた場合、個々の患者の治療効力を推定するためのバイオマーカーとして使用可能である。最近の知見に基づけば、本発明者らは、Ｓ１Ｐの豊富な血清供給源に加え、Ｓ１Ｐ依存性腫瘍がそれら固有のＳ１Ｐを産生し得ることを予測している。急速進行性腫瘍はそれら固有の増殖因子を産生する戦略を利用しており、本発明者らは、Ｓ１Ｐがその増殖因子の１つであると提案する。よって、個々の患者からの全Ｓ１Ｐの血清、血漿または尿測定は、患者の転帰の１つの予測因子となる。さらに、Ｓ１Ｐの産生は、腫瘍それ自体および腫瘍の微小環境（例えば、間質液）に集中される。以下の実施例１１は、腫瘍それ自体によるＳ１Ｐ産生を評価するための腫瘍切片の免疫組織化学的方法における抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂの使用を記載している。ＳＰＨＫのアップレギュレーションは有用であることが分かるが、キナーゼは酵素であることから、Ｓ１Ｐ産生によって測定されたシグナルは、キナーゼそれ自体のＲＮＡまたはタンパク質発現による場合よりもはるかに高いと考えられる。さらに、腫瘍がＳ１Ｐ−受容体およびＳＰＨＫ発現のアップレギュレーションを示す患者は、増殖因子としてのＳ１Ｐに頼る腫瘍を有する可能性が高いと仮定される。これらの患者は本発明者らの推定抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂ療法から最も利益を受けると考えられる。従って、Ｓ１Ｐ受容体およびＳＰＨＫの相対的発現に関する定量的ＰＣＲによって分析された生検組織からのバイオアッセイは強力なセラノスティックプラットフォームを提供する。このセラノスティックプラットフォームは、疾病のサロゲートマーカーとしてのＳ１Ｐ関連タンパク質マーカーのゲノミクスまたはプロテオミクス定量と組み合わせた血清Ｓ１Ｐマーカー分析からなる。この新規なマルチマーカー分析は、抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂ（SPHINGOMAB（商標））に基づく療法に対する個々の応答性を推定するための極めて強力なプラットフォームを提供する。
【０１４８】
２．Ｓ１Ｐは、治療計画の用量漸増を行うためのサロゲートマーカーとして使用可能である。抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂで処置される患者の血清Ｓ１Ｐの濃度は、処置コースを評価するためのサロゲートマーカーとして使用される可能性を有する。患者の血清、血漿または尿サンプルを用いたＥＬＩＳＡに基づくプラットフォームにより、Ｓ１Ｐバイオマーカーレベルの正確な測定および個体の抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂ投与計画のより厳密な決定が可能となる。サロゲートマーカーレベルは、医療計画の有効性を決定するために、標準的な臨床エンドポイントと組み合わせて使用することができる。
【０１４９】
３．Ｓ１Ｐは、癌の早期検出のためのスクリーニングツールとして使用可能である。癌の早期検出は、進行段階と療法の成功の強い関連のために着目される。病期Ｉの卵巣癌は、患者の大多数が無症候であるという事実のために検出が極めて困難である。卵巣癌と診断された時には、ほとんどの患者がこの疾病の最終病期である。初期段階での検出は患者の転帰に明らかな利益を示す。上記のように、卵巣癌患者の血清はＳ１Ｐの２倍の上昇を含み、この上昇は本発明者らの現行のＥＬＩＳＡプラットフォームで容易に検出することができる。卵巣癌を含む多くの固形腫瘍種はＳＰＨＫ発現の上昇を示すことから、これらの癌を有する患者の多くは、疾病進行の初期に臨床家が介入可能な血中および／または尿のＳ１Ｐ上昇を示すと予測される。
【０１５０】
本明細書に記載される誘導体化生物活性脂質はまた、患者の体液または組織サンプル中に抗体レベルを検出するためにも使用することができる。以下のものに限定されるものではないが、血中の抗スフィンゴ脂質抗体の存在を検出するこのようなイムノアッセイは、慢性虚血症状、癌または多発性硬化症などの自己免疫疾患を有する患者におけるスフィンゴ脂質の上昇に関する間接的試験のために使用することができる。このアッセイは、結腸直腸癌を有する患者に見られる抗ラクトシルスフィンゴシン抗体(Jozwiak W. & J. Koscielak, Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 18:617-621, 1982)およびらい病患者の血清中で検出される抗ガラクトセレブロシド抗体(Vemuri N. et al., Leprosy Rev. 67:95-103, 1996)との類似により、スフィンゴ脂質の血中レベルの上昇の結果として患者が抗スフィンゴ脂質抗体を産生するという仮定に基づくものである。
【０１５１】
Ｆ．研究
本発明の生物活性シグナル伝達脂質標的は、所望の活性を有する、例えば、所望でない生物活性シグナル伝達脂質を産生する反応を触媒する酵素を阻害する、または生物活性シグナル伝達脂質とその受容体との結合を遮断するものを同定するための候補化合物をスクリーニングするためのハイスループットスクリーニングアッセイでの使用に容易に適合させることができる。このようにして同定された化合物は従来の「リード化合物」として役立つか、あるいはそれら自体、治療薬として使用することができる。本発明のスクリーニング法は、多様な分子のライブラリーから所望の活性を有する１以上の化合物を同定するためのスクリーニングアッセイを用いることを含む。「スクリーニングアッセイ」は、予め選択された活性を有するコレクション内の化合物を同定する、単離する、かつ／またはその構造を決定するようデザインされた選択アッセイである。このコレクションは、当技術分野で公知の方法に従って作製される従来のコンビナトリアルライブラリーであってよく、あるいは潜在的生物活性シグナル伝達活性関して予め選択された広範囲の有機構造または構造であり得る。「同定する」とは、所望の活性を有する化合物が単離され、その化学構造が決定される（限定されるものではないが、核酸およびポリペプチドの、それぞれヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の決定を含む）、その上に、またはその代わりに、スクリーニングされた活性を有する化合物を精製することを意味する。タンパク質−タンパク質相互作用、酵素触媒、小分子−タンパク質結合から細胞機能に至るまでの範囲の広範な系における活性に関して試験するための生化学アッセイおよび生物学アッセイがデザインされる。
【発明を実施するための形態】
【０１５２】
以下、詳細な実施例を参照して、本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０１５３】
実施例１            Ｓ１Ｐの代表的チオール化類似体を作製するための合成スキーム
本実施例に記載する合成アプローチは、主として従来の有機化学を用い、構造要素を順次付加することによって抗原の産生をもたらす。本実施例に記載されるアプローチのスキームは図１に示され、以下の合成説明の化合物番号は図１の符番された構造を指す。
【０１５４】
この合成アプローチは市販の１５−ヒドロキシルペンタデシン１で開始し、ヒドロキシル置換を促進するために１５−ヒドロキシ基を塩化メチルスルホニルにより活性化させてスルホネート２を生成した。このスルホネートをｔ−ブチルチオールで置換して保護されたチオエーテル３を得、これをガーナー(Garner)のアルデヒドと縮合させて４を生成した。このアルキン部分をアルケン（５）へ穏やかに還元した後、このオキサゾリデン環を、酸を触媒として開環し、Ｓ保護およびＮ保護されたチオール置換スフィンゴシン６を得た。この最終工程では、酸を触媒とする開環中のＮ−ＢＯＣ基の損失を軽減するために二炭酸ジ−ｔ−ブチルによる際誘導体化を用いた。
【０１５５】
言うまでもないが、化合物６はそれ自体、スフィンゴシンに対する抗体を作製するためのハプテンを調製するための抗原として、あるいはチオール化Ｓ１Ｐ類似体を調製するための２つの異なる合成アプローチのための出発材料として使用することができる。１つのアプローチでは、化合物６をリン酸トリメチルでリン酸化して化合物７を生成した。化合物７を臭化トリメチルシリルで処理し、リン酸塩からメチル基、および第一級アミンからｔ−ブチルオキシカルボニル基の双方を除去すると、硫黄上に唯一の保護基としてｔ−ブチル基を有する化合物８が得られた。この基を除去するために、このｔ−ブチル基をＮＢＳで置換してジスルフィド９を形成し、次にこれを還元してチオール化Ｓ１Ｐ類似体１０を形成した。
【０１５６】
別のアプローチは、化合物６をＮＢＳＣｌで直接処理してジスルフィド１１を形成し、次にこれを還元してＮ保護チオール化Ｓ１Ｐ類似体１２を形成した。この化合物を弱酸で処理してチオール化スフィンゴシン類似体１３を得、これを例えばスフィンゴシンキナーゼで酵素的にリン酸化してチオール化Ｓ１Ｐ類似体１０を得ることができる。
【０１５７】
示されている合成アプローチは、特に、保護および脱保護試薬の選択、例えば、チオールを脱保護するための、実施例３に記載のトリメチルジスルフィドトリフレートの使用に関して、改変が可能である。
【０１５８】
化合物２  １（１０．３ｇ、４５．８９ｍｍｏｌ）を入れた５００ｍＬ  ＲＢフラスコにＤＣＭ（４００ｍＬ）を加え、得られた溶液を０℃に冷却した。次に、ＴＥＡ（８．３４ｇ、８２．６０ｍｍｏｌ、９．５ｍＬ）を全て一度に加えた後、ＭｓＣｌ（７．８８ｇ、６８．８４ｍｍｏｌ、５．３ｍＬ）を１０分かけて滴下した。この反応物を室温で０．５時間、すなわち、出発材料が消失するまで（Ｒｆ＝０．６５、５：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）攪拌した。反応をＮＨ４Ｃｌ（３００ｍＬ）でクエンチし、ＤＣＭで抽出した（２×２００ｍＬ）。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濾液を蒸発させて固体とした（１３．８６ｇ、収率９９．８％）。
1H NMR (CDCl3) δ4.20 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.98 (s, 3H), 2.59 (td, J = 7 Hz, 3 Hz, 2H), 1.917 (t, J = 3 Hz, 1H), 1.72 (四重線, J =  7.5 Hz, 2H), 1.505 (四重線, J = 7.5 Hz, 2H), 1.37 (br s, 4H), 1.27 (br s, 14H)。13C{1H} NMR (CDCl3-) δ85.45, 70.90, 68.72, 46.69, 38.04, 30.22, 30.15, 30.14, 30.07, 29.81, 29.76, 29.69, 29.42, 29.17, 26,09, 19.06, 9.31
化合物２のＨＲＭＳ分析（ＥＳ−ＴＯＦ）で見られた主要イオンはｍ／ｚ＝３２５．１８０４であった（Ｃ１６Ｈ３０Ｏ３Ｓ：Ｍ＋Ｎａ＋の理論値は３２５．１８０８）。
【０１５９】
化合物３  三口１Ｌ  ＲＢフラスコにｔ−ブチルチオール（４．５４ｇ、５０．４０ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（２００ｍＬ）を入れた後、氷浴中に置いた。ｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン中１．６Ｍを３１．５ｍＬ）を３０分かけて加えた。次に、ＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶かした化合物２（１３．８６ｇ、４５．８２ｍｍｏｌ）を２分かけて加えた。この反応物を１時間、すなわち、出発材料が消失するまで（Ｒｆ＝０．７、１：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）攪拌した。反応を飽和ＮＨ４Ｃｌ（５００ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯ２（２×２５０ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濾液を蒸発させて黄色油状物を得た（１１．６７ｇ、収率８６％）。
1H NMR (CDCl3) δ2.52 (t, J =  7.5 Hz, 2H), 2.18 (td, J = 7 Hz, 2.5 Hz, 2H), 1.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 1.55 (四重線, J = 7.5 Hz, 2H), 1.51 (四重線, J = 7 Hz, 2H), 1.38 (br s, 4H), 1.33 (s, 9H), 1.26 (s, 14H)。13C{1H} NMR (CDCl3-) δ85.42, 68.71, 68.67, 54.07, 42.37, 31.68, 30.58, 30.28, 30.26, 30.19, 30.17, 29.98, 29.78, 29.44, 29.19, 29.02, 19.08
【０１６０】
化合物４  化合物３（５．０ｇ、１６．８５ｍｍｏｌ）を入れた２５０ｍＬシュレンクフラスコを排気し、３回窒素を充填した後、乾燥ＴＨＦ（１５０ｍＬ）を加えた。得られた溶液を−７８℃に冷却した。次に、ｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン中１．６Ｍを１０．５ｍＬ）を２分かけて加え、この反応混合物を−７８℃で１８分間攪拌した後、２０分間冷却浴を外した。１５分後、乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）中、ガーナーのアルデヒド(aldeyde)（３．３６ｇ、１４．６５ｍｍｏｌ）を５分かけて加えた。２０分後、冷却浴を外した。２．７時間後の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、ガーナーのアルデヒドが消失したことを示す。反応を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（３００ｍＬ）でクエンチし、Ｅｔ２Ｏ（２×２５０ｍＬ）で抽出した。合わせたＥｔ２Ｏ相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濾液を蒸発させて粗化合物４とそのｓｙｎジアステレオマー（図１には示されていない）を黄色油状物として得た（９．０６ｇ）。次に、この材料をそれ以上の精製を行わずに次の工程で用いた。
【０１６１】
化合物５  化合物４中の三重結合を還元するため、この油状物を窒素下、乾燥Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ）に溶かした。得られた溶液に室温で、ＲＥＤ−Ａｌ（トルエン中６５％を２０ｍＬ）を、水素ガス（Ｈ２）の発生を制御するためにゆっくり加えた。この反応物を室温で一晩、すなわち、ＴＬＣが出発材料の消失を示すまで（１：１ＥｔＯＡｃ：ヘキサン中、Ｒｆ＝０．６）攪拌し、冷ＭｅＯＨまたはＮＨ４Ｃｌ水溶液を、Ｈ２の発生を制御するためにゆっくりクエンチした。得られた白色懸濁液をセライトパッドで濾過し、濾液をＥｔＯＡｃ（２×４００ｍＬ）で抽出した。合わせたＥｔＯＡｃ抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濾液を蒸発させて粗化合物５とそのｓｙｎジアステレオマー（図１には示されていない）を黄色油状物として得た（７．５９ｇ）。
【０１６２】
化合物６  化合物５を含む油状物をＭｅＯＨ（２００ｍＬ）に溶かし、ＰＴＳＡ水和物（０．６３ｇ）を加え、この溶液を室温で１日、次いで、５０℃で２日攪拌し、この時点でＴＬＣは全ての出発材料（５）が消失したことを示した。しかしながら、極性材料がいくらか存在し、酸がＢＯＣ基を一部切断したことが示唆される。この反応を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（４００ｍＬ）を加えることで後処理し、エーテル（３×３００ｍＬ）で抽出した。合わせたエーテル相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濾液を蒸発乾固させると、５．１４ｇの油状物が得られた。アミンが生じたら再保護するために、粗生成物をＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）に溶かし、これにＢＯＣ２Ｏ（２．４４ｇ）およびＴＥＡ（１．７ｇ）を加えた。ＴＬＣ（１：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）がベースラインに材料が残っていないことを示したら、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（２００ｍＬ）を加え、有機相を分離した後、混合物をＣＨ２Ｃｌ２（３×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濾液を濃縮乾固させて黄色油状物（７．７ｇ）を得、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ勾配（１：１まで）を用いたシリカカラムでのクロマトグラフィーに付し、ジアステレオマーを分離した。１：１ＰＥ／ＥｔＯＡｃを用いたＴＬＣにより、ａｎｔｉ異性体化合物６のＲｆは０．４５であった。ｓｙｎ異性体（図１には示されていない）ではＲｆは０．４０であった。化合物６の収量は２．４５ｇ（ガーナーのアルデヒドに基づき全体で３９％）であった。
ａｎｔｉ異性体の1H NMR (CDCl3) δ1.26 (br s, 20H), 1.32 (s, 9H), 1.45 (s, 9H), 1.56 (四重線, 2H, J = 8 Hz), 2.06 (q, 2H, J = 7 Hz), 2.52 (t, 2H, J = 7 Hz), 2.55 (br s, 2H), 3.60 (br s, 1H), 3.72 (ddd, 1H, J = 11.5 Hz, 7.0 Hz, 3.5 Hz), 3.94 (dt, 1H, J = 11.5 Hz, 3.5 Hz), 4.32 (d, 1H, J = 4.5 Hz), 5.28 (br s, 1H), 5.54 (dd, 1H, J = 15.5 Hz, 6.5 Hz), 5.78 (dt, 1H, J = 15.5 Hz, 6.5 Hz)。13C {1H} NMR (CDCl3) δ 156.95, 134.80, 129.66, 80.47, 75.46, 63.33, 56.17, 42.44, 32.98, 31.70, 30.58, 30.32, 30.31, 30.28, 30.20, 30.16, 30.00, 29.89, 29.80, 29.08, 29.03
【０１６３】
分析  C27H53NO4Sの理論値理：C, 66.48; H, 10.95; N, 2.87。側定値:C, 65.98; H, 10.46; N, 2.48。
【０１６４】
化合物７  乾燥ピリジン（２ｍＬ）に溶かしたアルコール化合物６（６０９．５ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣＢｒ４（６４７．２ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ、１．５６当量）を溶かした。このフラスコを氷浴中で冷却し、Ｐ（ＯＭｅ）３（２８４．７ｍｇ、２．２９ｍｍｏｌ、１．８４当量）を２分かけて滴下した。４分後、氷浴を外し、１２時間後、混合物をエーテル（２０ｍＬ）で希釈した。得られた混合物をＨＣｌ水溶液（１０ｍＬ、２Ｎ）で洗浄してエマルションを形成させ、これを水（２０ｍＬ）で希釈して分離させた。水相をエーテル（２×１０ｍＬ）、次いでＥｔＯＡｃ（２×１０ｍＬ）で抽出した。エーテル抽出液と最初のＥｔＯＡｃ抽出液を合わせ、ＨＣｌ水溶液（１０ｍＬ、２Ｎ）、水（１０ｍＬ）および、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１０ｍＬ）で洗浄した。最後のＥｔＯＡｃ抽出液を、これらの水性洗液を逆抽出するための用いた。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濾液を濃縮すると粗生成物（１．１６ｇ）が残り、ＣＨ２Ｃｌ２、次いでＣＨ２Ｃｌ２−ＥｔＯＡｃ（１：２０、１：６、１：３および１：１−生成物が溶出しはじめたら、６：４、７：３）を用いたシリカ（３×２２ｃｍカラム）でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。初期の画分に５６．９ｍｇの油状物が含まれていた。後の画分が無色透明な油状物としての生成物（化合物７、４７６．６ｍｇ、６４％）が提供された。
【０１６５】
分析  C29H58NO7PS (595.82) の理論値: C, 58.46; H, 9.81; N, 2.35。測定値: C, 58.09; H, 9.69; N, 2.41。
【０１６６】
化合物８  化合物７（３３３．０ｍｇ、０．５５９ｍｍｏｌ）と攪拌子を入れたフラスコを排気し、窒素を充填した。アセトニトリル（４ｍＬ、ＣａＨ２から蒸留）をシリンジで注入し、この時、溶液の入ったフラスコを氷浴中で冷却した。シリンジを用い、（ＣＨ３）３ＳｉＢｒ（４３８．７ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ、５．１３当量）を１分かけて加えた。３５分後、アセトニトリル（１ｍＬ）を追加してフラスコの上部をすすぎ、氷浴を外した。さらに８０分後、アリコートを取り出し、溶液をその上に窒素ガスを吹き入れて乾燥させ、残渣をＣＤＣｌ３にて１Ｈ  ＮＭＲで分析したところ、Ｐ−ＯＣＨ３部分に起因するピークの痕跡だけが示された。２０分後、この反応混合物に水（０．２ｍＬ）を加えた後、このＣＤＣｌ３溶液を、アリコートを分析するのに用い、混合物をロータリーエバポレーターでおよそ０．５ｍＬ量まで濃縮した。アセトン（３ｍＬ）を少量ずつ使用し、残渣を、風袋を計った試験管に移し、淡褐色溶液を形成させた。水（３ｍＬ）を少量ずつ加えた。０．３ｍＬを加えた後、曇りが見られた。計１ｍＬの後、粘稠な沈殿が生じた。さらに０．６ｍＬの水を加えたところ、より曇りの多いガム質が分離したが、最後の水を追加しても混合物の外観に変化はないようであった。全体として、この方法は数時間にわたって達成された。試験管を遠心分離し、上清をピペットで除去した。固体（もはや粘稠ではない）をＰ４Ｏ１０で真空乾燥させると、化合物８（２５８．２ｍｇ、９５％）が一水和物として残った。
【０１６７】
分析  C22H46NO5PS+H2O (485.66) の理論値: C, 54.40; H, 9.96; N, 2.88。測定値: C, 54.59; H, 9.84; N, 2.95。
【０１６８】
化合物９  グローブボックス内で攪拌子の入った試験管に化合物８（２０２．６ｍｇ、０．４１７ｍｍｏｌ）を加え、乾燥ＴＨＦ（３ｍＬ）および氷ＨＯＡｃ（３ｍＬ）を加えた。ＮＢＳＣｌ（９０ｍｇ、０．４７５ｍｍｏｌ、１．１４当量）を加え、０．５時間後、透明な溶液が得られた。計９時間後、アリコートを蒸発乾固させ、残渣をＣＤＣｌ３にて１Ｈ  ＮＭＲにより分析した。ＣＨ２ＳｔＢｕおよびＣＨ２ＳＳＡｒに相当するピークは、反応が約７５％完了したことを示し、ＣＤＣｌ３中の純粋なＮＢＳＣｌの場合と比較したところ、反応物中に試薬の残存はないことが示された。従って、追加（２４．７ｍｇ、０．１３０ｍｍｏｌ、０．３１当量）を行った後、３時間後にさらに追加を行った（１９．５ｍｇ、０．１０３ｍｍｏｌ、０．２５当量）。さらに１時間後、すすぎのためにＴＨＦ（２ｍＬ）を用い、混合物を新しい試験管に移し、水（１ｍＬ）を加えた。
【０１６９】
化合物１０  上記の化合物９の透明な溶液に、ＰＭｅ３（８２．４ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ、塩化２−ニトロベンゼンスルフェニルの添加総量の１．５２倍）を加えた。この混合物は温かくなり、曇りが出、経時的に沈殿が生じた。４．５時間後、メタノールを加え、この試験管を遠心分離した。この沈殿は安定させるのが難しく、試験管の底１ｃｍを占めていた。透明な黄色の上清をピペットで取り出した。メタノール（５ｍＬ、窒素で酸素を除去）を加え、この試験管を遠心分離し、上清をピペットで除去した。このサイクルを３回繰り返した。濃縮し、最終のメタノール洗浄を行ったところ、４．４ｍｇの残渣だけが残った。この嵩のある固体残渣をＰ４Ｏ１０で真空乾燥させると、化合物１０（１１８．２ｍｇ、６８％）が一塩酸塩として残った。
【０１７０】
分析  C18H38NO5S+HCl (417.03) の理論値: C, 51.84; H, 9.43; N, 3.36。測定値: C, 52.11; H, 9.12; N, 3.30。
【０１７１】
化合物１１  化合物６（１．４５ｇ、２．９７ｍｍｏｌ）をＡｃＯＨ（２０ｍＬ）に溶かし、ＮＢＳＣｌ（０．５６ｇ、２．９７ｍｍｏｌ）を全て一度に加えた。この反応物を３時間、すなわち、ＴＬＣ［生成物Ｒｆ＝０．６５、出発材料Ｒｆ＝０．４５、１：１ＥｔＯＡｃ／ヘキサン］により出発材料が消失し、生成物の出現が見られるまで攪拌した。この反応物を高真空系で濃縮乾固させ、残渣をＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（１０：１  １００ｍＬ）に溶かした。
【０１７２】
化合物１２  化合物１１を含んだ上記の溶液に、Ｐｈ３Ｐ（０．２．３３ｇ、８．９１ｍｍｏｌ）を全て一度に加え、この反応物を３時間、すなわち、出発材料が消失するまで攪拌した。この粗反応混合物を高真空系で濃縮乾固させると、化合物１２を含んだ残渣が残った。
【０１７３】
化合物１３  化合物１２を含む上記の残渣をＤＣＭ（５０ｍＬ）およびＴＦＡ（１０ｍＬ）に溶かした。この混合物を室温で５時間攪拌し、濃縮乾固させた。この残渣をシリカゲルカラムにのせ、純粋なＤＣＭ、次いで５％ＭｅＯＨを含有するＤＣＭ、その後、１０％ＭｅＯＨを用いてクロマトグラフィーに付し、最終生成物の化合物１３を粘稠な白色固体として得た（０．４５ｇ、５から４６％収率）。
1H NMR (CDCl3) δ1.27 (s), 1.33 (br m,), 1.61 (p, 2H, J = 7.5 Hz), 2.03 (br d, 2H, J = 7 Hz), 2.53 (q, 2H, J = 7.5 Hz), 3.34 (br s, 1H), 3.87 (br d, 2H, J = 12 Hz), 4.48 (br s, 2H), 4.58 (br s, 2H), 5.42 (dd, 1H, J = 15 Hz, 5.5 Hz), 5.82 (dt, 1H, J = 15 Hz, 5.5 Hz), 7.91 (br s, 4H)。13C{1H} NMR (CDCl3-) δ136.85, 126.26, 57. 08, 34.76, 32.95, 30.40, 30.36, 30.34, 30.25, 30.19, 30.05, 29.80, 29.62, 29.09, 25.34。
【０１７４】
実施例２  チオール化脂肪酸を製造するための合成スキーム
本実施例に記載する合成アプローチは、タンパク質または他の担体とさらに複合体形成が可能であり、かつ、免疫応答を惹起するために動物に投与することができる、より複雑な脂質構造に組み込まれるチオール化脂肪酸の製造を詳説する。このアプローチでは、通常の有機化学を用いる。本実施例でとるアプローチを示すスキームは図２に示され、以下の合成説明の化合物番号は図２の符番された構造を指す。
【０１７５】
２種類の合成を記載する。最初の合成は、Ｃ−１２チオール化脂肪酸に関し、市販の１２−ドデカン酸、化合物１４で始める。次に、臭素をｔ−ブチルチオールで置換し、保護されたＣ−１２チオール化脂肪酸、化合物１５を得る。もう１つの合成は、Ｃ−１８チオール化脂肪酸に関し、市販の９−ブロモ−ノナノール（化合物１６）で始める。化合物１６のヒドロキシル基を、ジヒドロピラン基(dihydroyran group)を加えることで保護し、得られた化合物１７を、グリニャール反応によりこの臭素化材料の半分の活性化によって二量体化した後、もう半分を加えた。酸を触媒としたこのジヒドロピラン保護基の除去を行った後に生じた１８−ヒドロキシオクタデカノール（化合物１８）を選択的に一臭素化して化合物１９を形成させる。この反応中、そのアルコール基の約半数が、メタンスルホン酸エステルの形成による求核置換のために活性化される。次に、このアルコールを酸化させて１８−ブロモカルボン酸、化合物２０を形成し、その後これをｔ−ブチルチオールで処理し、臭素を脱離させて、保護されたチオール化Ｃ−１８脂肪酸、化合物２１を生成させる。
【０１７６】
これらの保護されたチオール化脂肪酸である各ｔ−ブチルチオエーテルを複合脂質に組み込み、例えば、実施例１および３に記載の脱保護アプローチを用いて保護基を除去することができる。得られた遊離チオールを用いて、次に、タンパク質または他の担体と複合体を形成させることができ、その後、このハプテンを動物に接種する。
【０１７７】
Ａ．Ｃ−１２チオール化脂肪酸の合成
化合物１５  ｔ−ブチルチオール（１２．９３ｇ、１４３ｍｍｏｌ）を乾燥したシュレンクフラスコに加え、この系を窒素下に置くためにシュレンク法を用いた。乾燥、脱気したＴＨＦ（２５０ｍＬ）を加え、このフラスコを氷浴中で冷却した。ｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン中２．５Ｍを５５ｍＬ、１３７．５ｍｍｏｌ）をシリンジで１０分かけてゆっくり加えた。この混合物を０℃で１時間攪拌した。このブロモ酸、化合物１４（１０ｇ、３６ｍｍｏｌ）を固体として加え、この反応を加熱し、６０℃で２４時間攪拌した。この反応を２Ｍ  ＨＣｌ（２５０ｍＬ）でクエンチし、エーテル（２×３００ｍＬ）で抽出した。合わせたエーテル相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濾液を回転蒸発により濃縮し、チオエーテル酸、化合物１５（１０ｇ、収率９９％）をベージュの固体として得た。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 1.25-1.35 (br s,12 H), 1.32 (s, 9 H), 1.35-1.40 (m, 2 H),  1.50-1.60 (m, 2H), 1.60-1.65 (m, 2 H), 2.35 (t, 2 H, J = 7.5 Hz), 2.52 (t, 2 H, J = 7.5 Hz)
ＨＲＭＳ（ＥＳ−ＴＯＦ）において主要イオンはｍ／ｚ３１１．２０２０、Ｍ＋Ｎａ＋の理論値３１１．２０１５に見られた。
【０１７８】
Ｂ．Ｃ−１２チオール化脂肪酸の合成
化合物１７  乾燥シュレンクフラスコに化合物１６（５０ｇ、２２４．２ｍｍｏｌ）を入れ、ナトリウム／ベンゾフェノンから蒸留した乾燥、脱気したＴＨＦ（２５０ｍＬ）に溶解した。フラスコを氷浴中に冷却した後、ＰＴＳＡ（０．５ｇ、２．６ｍｍｏｌ）を加えた。次に、乾燥、脱気したＤＨＰ（３６ｇ、４２．８ｍｍｏｌ）を５分かけてゆっくり加えた。この混合物を室温まで温め、一晩攪拌し、ブロモアルコールのスポットの完全消失によって反応が行われたと思われるまで、ＴＬＣ（１０：１  ＰＥ：ＥｔＯＡｃ）によりモニタリングした。次に、ＴＥＡ（１ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加えて、ＰＴＳＡをクエンチした。次に、この混合物を冷重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、ＥｔＯＡｃで抽出した（３×２５０ｍＬ）。その後、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮し、６８．２ｇの粗生成物を得、カラムクロマトグラフィー（１０：１  ＰＥ：ＥｔＯＡｃ）により精製し、６０ｇ（収率９９％）の無色の油状物として得た。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 1.31 (br s, 6 H), 1．41-1.44 (m, 2 H), 1.51-1.62 (不明瞭な多重線, 6 H), 1.69-1.74 (m, 1 H), 1.855 (四重線, J = 7.6 Hz, 2 H), 3.41 (t, J = 7 Hz, 2 H), 3.48-3.52 (m, 2 H), 3.73 (dt, 2 H, J = 6.5 Hz), 3.85-3.90 (m, 2 H), 4.57 (t, 2 H, J = 3 Hz)
【０１７９】
化合物１８  マグネシウム切削屑（２．９８ｇ、１２５ｍｍｏｌ）を火炎乾燥させたシュレンクフラスコにヨウ素の結晶とともに加えた。次に、ナトリウムから蒸留した乾燥ＴＨＦ（２００ｍＬ）を加え、この系を、シュレンク法を用いて脱気した。次に、化合物１７（３０ｇ、９７ｍｍｏｌ）をマグネシウムに１０分かけてゆっくり加え、この溶液を６５℃の油浴中に置き、一晩攪拌した。反応は、ＴＬＣにより、アリコートをアセトンでクエンチし、１０：１  ＰＥ：ＥｔＯＡｃ混合物にてＲＦの変化を観察することによって完了したものと思われた。次に、このグリニャール溶液をカニューレにより、窒素下にさらなる化合物１７（３０ｇ、９７ｍｍｏｌ）を含む三口フラスコに移した。次に、この得られた混合物の入ったフラスコを氷浴中で０℃に冷却した後、Ｌｉ２ＣｕＣｌ４溶液（１Ｍを３ｍＬ）をシリンジで加えた。反応混合物は数分内に濃青色に変わった。この混合物を一晩攪拌した。翌朝、ＴＬＣ（１０：１  ＰＥ：ＥｔＯＡｃ）により反応は完了したものと思われ、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液でクエンチした後、エーテル（３×２５０ｍＬ）で抽出した。エーテル層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して粗生成物（４０ｇ）を得、これをＭｅＯＨに溶かした。次に、濃ＨＣｌ（０．５ｍＬ）を加えたところ、白色エマルションが形成し、これを３時間攪拌した。次に、白色エマルションを濾過し、１６ｇ（収率５８％）の純粋なジオール、化合物１８を得た。
1H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 1.26 (br s, 24 H), 1.41-1.42 (m, 4 H), 1.51-1.68 (m, 4 H), 3.65 (t, 4 H, J = 6.5 Hz)
【０１８０】
化合物１９  窒素下、乾燥シュレンクフラスコに対称ジオール、化合物１８（１１ｇ、３８．５ｍｍｏｌ）を加えた後、ナトリウムから蒸留した乾燥ＴＨＦ（７００ｍＬ）を加えた。この系を脱気し、フラスコを氷浴中に置いた。ジイソプロピルエチルアミン（６．８２ｍＬ、４２．３ｍｍｏｌ）をシリンジで加えた後、ＭｓＣｌ（３．９６ｇ、３４．４ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、この混合物を１時間攪拌した。反応を飽和ＮａＨ２ＰＯ４溶液（３００ｍＬ）でクエンチした後、ＥｔＯＡｃ（３×３００ｍＬ）で抽出した。次に、有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、ジオール、一メシル酸塩および二メシル酸塩の混合物１４ｇを得た。ＮＭＲは、ＣＨ２ＯＨ：ＣＨ２Ｏプロトンの１：０．８混合物を示した。次に、この混合物を乾燥ＴＨＦ（５００ｍＬ）に溶かし、酸素を除去し、それにＬｉＢｒ（３．５ｇ、４０．２３ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を一晩還流させたところで、反応を水（１５０ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（３×２５０ｍＬ）で抽出した。次に、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮して臭素化生成物の混合物を得、これを次にフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ）により精製し、化合物１９（３．１ｇ、収率２５％）を白色粉末として得た。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 1.26 (br s, 26 H), 1.38-1.46 (m, 2 H), 1.55 (四重線, 2 H, J = 7.5 Hz), 1.85 (四重線, 2 H, J = 7.5 Hz), 3.403 (t, 2 H, J = 6.8 Hz), 3.66 (t. 2 H, J = 6.8 Hz)
【０１８１】
化合物２０  丸底フラスコに化合物１９（２．０１ｇ、５．７３ｍｍｏｌ）を入れ、固体を試薬級アセトン（１５０ｍＬ）に溶かした。同時に、ジョーンズ試薬を、Ｈ２ＳＯ４（４ｍＬ）にＣｒＯ３（２．２５ｇ、２２ｍｍｏｌ）を溶かした後に１０ｍＬの冷水をゆっくり加え、この溶液を１０分間攪拌することで作製した。この冷ジョーンズ試薬を丸底フラスコに５分かけてゆっくり加え、その後、この溶液を１時間攪拌した。得られた橙色の溶液は数分以内に緑色になった。次に、この混合物を水（１５０ｍＬ）でクエンチし、エーテル（３×１５０ｍＬ）で２回抽出した。次に、エーテル層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮し、化合物２０（２．０８ｇ、収率９８％）を白色粉末として得た。
1H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 1.27 (br s, 26 H), 1.58-1.71 (m, 2 H), 1.77-1.97 (m, 2H), 2.36 (t, 2 H, J = 7.4 Hz), 3.42 (t, 2 H, J = 7 Hz)
【０１８２】
化合物２１  乾燥シュレンクフラスコにｔ−ブチルチオール（１１．３２ｇ、１２５ｍｍｏｌ）を加え、ナトリウムから蒸留した乾燥ＴＨＦ（４５０ｍＬ）を加えた。窒素を通じてこの溶液の酸素を除去した後、フラスコを氷浴中に置いた。次に、ヘキサン中、ｎ−ＢｕＬｉの溶液（１．６Ｍを７０ｍＬ）をシリンジで１０分かけてゆっくり加えた。この混合物を１時間攪拌した後、化合物２０（５．５ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）を加え、溶液を６０℃で一晩還流させた。翌朝、アリコートを後処理し、ＮＭＲで分析したところ、反応は完了したものと思われた。反応をＨＣｌ（２Ｍを２００ｍＬ）でクエンチし、エーテル（３×２５０ｍＬ）で抽出した。次に、エーテル層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濾液を濃縮し、生成物化合物２１を白色固体として得た（５ｇ、収率９０％）。
1H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 1.26 (br s, 26 H), 1.32 (br s, 9 H), 1.48-1.70 (m, 4 H), 2.35 (t, 2 H, J = 7.3 Hz), 2.52 (t, 2 H, J = 7.3 Hz)。13C NMR (CDCl3, 200 MHz) δ ｓ24.69, 28.35, 29.05, 29.21, 29.28, 29.39, 29.55, 29.89, 31.02(3C), 33.98, 41.75, 179.60。
【０１８３】
実施例３  ＬＰＡのチオール化類似体を製造するための合成スキーム
本実施例に記載する合成アプローチにより、チオール化ＬＰＡの沈殿が得られる。このＬＰＡ類似体を次に、さらに例えばタンパク質担体などの担体と複合体を形成させ、これをその後、ＬＰＡに対して免疫応答を惹起するために動物に投与することができる。このアプローチでは有機化学と酵素反応の双方を用い、合成スキームを図３に示す。以下の合成説明の化合物番号は図３の符番された構造を指す。
【０１８４】
出発材料は実施例２の化合物１５および鏡像異性体的に純粋なグリセロホスホコリン（化合物２２）であった。エステル化を促進するためにＤＣＣを用い、これらの２種類の化学物質を合わせると、ジ−アセチル化生成物、化合物２３が得られた。１つの合成プロセスの変形形態では、得られたジ−アシル化グリセロホスホコリンをまずホスホリパーゼ−Ａ２で処理して、グリセロール主鎖のＳＮ−２位の脂肪酸を除去し、化合物２４を得た。この物質をさらに別の酵素、ホスホリパーゼ−Ｄで処理してコリンを除去し、化合物２６を形成させた。もう１つの合成プロセスの変形形態では、ホスホリパーゼ−Ｄ処理の後にホスホリパーゼ−Ａ２処理を行って化合物２５を得、その後、化合物２５をホスホリパーゼ−Ｄで処理して化合物２６を得る。両変形形態とも同じ生成物ホスファチジン酸誘導体、化合物２６が得られる。次に、化合物２６のｔ−ブチル保護基を、まず、トリメチルジスルフィドトリフレートを用いて除去して化合物２７を得た後、ジスルフィドを還元して所望のＬＰＡ誘導体、化合物２８を得る。当業者には分かるであろうが、実施例１に記載されている一連のニトロベンジルスルフェニル反応を用いて化合物２８を得ることもできる。
【０１８５】
化合物２３  火炎乾燥させたシュレンクフラスコにチオエーテル酸、化合物１５（１０ｇ、３５．８ｍｍｏｌ）、化合物２２（グリセロホスホコリン−ＣｄＣｌ２複合体、４．２５ｇ、８．９ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（７．３２ｇ、３５．８ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（２．１８ｇ、１７．８ｍｍｏｌ）を加え、その後、このフラスコを排気し、窒素を充填した。最少量の乾燥、脱気したＤＣＭ（１００ｍＬ）を加えると、曇りのある混合物となった。このフラスコをホイルで覆った後、ＴＬＣ（シリカ、１０：５：１  ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：濃ＮＨ４ＯＨ）により完了するまで攪拌した。化合物１６が不溶性であった場合はそのＴＬＣによるモニタリングをやめたが、Ｒｆ０．１の生成物スポットが強度を増さないと判断された際に反応を停止した。これには一般に３〜４日を要し、場合によってはＤＣＣおよびＤＭＡＰを追加した。完了したところで、反応混合物を濾過し、濾液を濃縮し、黄色油状物を得、上記の溶媒系を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製し、（ＣＨ３）３Ｎ−、−ＣＨ２ＳｔＢｕおよび−ＣＨ２ＣＯＯ−部分のピーク積分との比較から見積もったところ、化合物２３とさらなるアシル化生成物の５：１比の混合物を含んだ３．６ｇ（収率５０％）の透明なワックスを得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）によるこの油状物の分析により、ｍ／ｚ８２０．４９７２、Ｍ＋Ｎａ＋＝Ｃ４０Ｈ８０ＮＮａＯ８ＰＳ２＋の理論値８２０．４９６０に主要イオンが得られた。
【０１８６】
Ａ．合成変異体１−ホスホリパーゼ−Ａ２処置
化合物２４  上記のような化合物２３とさらなるアセチル化生成物の混合物（３．１ｇ、３．９ｍｍｏｌ）をＥｔ２Ｏ（４００ｍＬ）およびメタノール（３０ｍＬ）に溶かした。ホウ酸塩バッファー（１００ｍＬ、ｐＨ７．４  ０．１Ｍ、ＣａＣｌ２中０．０７２ｍＭ）、次いで、ホスホリパーゼ−Ａ２（ミツバチ毒液由来、１３０単位、Sigma）を加えた。得られた混合物を１０時間攪拌し、この時点でＴＬＣ（シリカ、ＭｅＯＨ：水  ４：１−従前の溶媒系１０：５：１  ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：濃ＮＨ４ＯＨは効果的でないことが分かった）は、出発材料（Ｒｆ＝０．７）は存在せず、新しいスポット（Ｒｆ＝０．２）が出現したことを示した。有機層と水層を分離し、水層をエーテル（２×２５０ｍＬ）で洗浄した。生成物を水層からＤＣＭ：ＭｅＯＨの混合物（２：１、２×５０ｍＬ）で抽出した。次に、有機層を回転蒸発により濃縮して生成物を白色ワックス（１．９ｇ、収率８６％）として得、ＮＭＲは純粋な生成物（化合物２４）であることを示した。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 1.25-1.27 (br s, 12 H), 1.31 (s, 9 H), 1.35-1.45 (m, 2 H), 1.52-1.60 (m, 4 H), 2.31 (t, 2 H, J = 7.5 Hz), 2.51 (t, 2 H, J = 7.5 Hz), 3.28 (br s, 9 H) 3.25-3.33 (br s, 2 H), 3.78-3.86 (m, 1 H), 3.88-3.96 (m, 2 H), 4.04-4.10 (m, 2 H), 4.26-4.34 (m, 2 H)。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）によるこのワックスの分析により、ｍ／ｚ  ５５０．２９３６、  Ｍ＋Ｎａ＋の理論値５５０．２９４３（Ｃ２４Ｈ５０ＮＮａＯ７ＰＳ２＋）、およびｍ／ｚ５２８．３１１５、ＭＨ＋の理論値５２８．３１２４（Ｃ２４Ｈ５１ＮＯ７ＰＳ２＋）に主要イオンが得られた。
【０１８７】
分析  C24H50NO7PS + 2 H2O (563.73) の理論値: C, 51.13; H, 9.66; N, 2.48。測定値: C, 50.90; H, 9.37; N, 2.76。
【０１８８】
化合物２６  リゾ化合物２４（１．５ｇ、２．７ｍｍｏｌ）をｓｅｃ−ブタノール（５ｍＬ）とＥｔ２Ｏ（２００ｍＬ）の混合物に溶かし、得られた曇りのある混合物を曇りが消えるまで音波処理を施した。バッファー（２００ｍＬ、ｐＨ５．８、０．２Ｍ  ＮａＯＡｃ、０．０８Ｍ  ＣａＣｌ２）、次いで、キャベツ抽出液（９ｍｇタンパク質／ｍＬを含むサボイキャベツからの抽出液８０ｍＬ（ホスホリパーゼ−Ｄ含有）を加えた。この反応物を１日攪拌し、ＴＬＣ（Ｃ１８  ＲＰ  ＳｉＯ２、５：１  ＡＣＮ：水）によりモニタリングし、出発材料と生成物のＲｆはそれぞれ０．３および０．０５であった。この反応を完了させるため、必要に応じて、キャベツ抽出液（５０ｍＬ）を追加し、反応物をさらに１日攪拌した。変換が完了するよう、必要に応じてこの過程をさらに２回繰り返した。反応が完了したところで、混合物をロータリーエバポレーターで濃縮してエーテルを除去した後、ＥＤＴＡ溶液（０．５Ｍ、２５ｍＬ）を加え、生成物をＭｅＯＨ：ＤＣＭの５：４混合物（３００ｍＬ）に抽出した。有機層を濃縮した後、ＤＣＭおよびアセトンから残渣を再結晶させ、純粋な生成物を得た（０．９ｇ、収率７５％）。
1H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 1.25-1.27 (br s, 12 H), 1.33 (s, 9 H), 1.52-1.60 (m, 4 H), 2.34 (t, 2 H, J = 7.5 Hz), 2.52 (t, 2 H, J = 7.5 Hz), 3.6-3.8 (br s, 1 H), 3.85-3.97 (br s, 2 H), 4.02- 4.18 (m, 2 H)
【０１８９】
化合物２７  保護サンプルＬＰＡ、化合物２６（、０．１５０ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）をメタノール洗浄し、グローブボックス内のバイアルに加えた。次に、これをＡｃＯＨ：ＴＨＦ混合物（１：１、１０ｍＬ）に懸濁させたが、これは１時間の音波処理を行った後でも完全に溶けなかった。その後、固体［Ｍｅ２ＳＳＭｅ］ＯＴｆ（０．１１４ｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を加えた。これを１８時間攪拌した。反応は、アリコートを取り出し、それを真空下で濃縮乾固させ、その残渣を、硫黄に最も近いＣＨ２ピークの１Ｈ  ＮＭＲシフトを観察するためにＣＤ３ＯＤｅに再溶解または懸濁させることによりモニタリングした。出発材料は２．５２ｐｐｍにピークを持っていたが、この連結で生じた不斉ジスルフィドは２．７ｐｐｍ前後にピークを持っていた。この材料（化合物２７）は、それ以上単離または特性決定しなかった。
【０１９０】
化合物２８  化合物２７を含有する混合物を水（１００μＬ）で、またその直後にＰＭｅ３（０．１１ｇ、１．４ｍｍｏｌ）で処置した。３時間攪拌した後、溶媒を真空除去し、不溶性の白色固体を得た。メタノール（５ｍＬ）を加え、この混合物を遠心分離し、母液をデカントした。真空濃縮を行い、１２０ｍｇ（収率９１％）の化合物２８をベージュの固体として得た。化合物２８は、ジスルフィド結合の形成によって例えば、アルブミンまたはＫＬＨなどの担体とコンジュゲート可能なチオール化ＬＰＡハプテンである。化合物２８の特性：1H NMR (1:1 CD3OD:CD3CO2D, 500 MHz) δ 1.25-1.35 (br s, 12 H), 1.32-1.4 (m, 2 H), 1.55-1.6 (m, 4 H), 2.34 (t, 2H, J = 7), 2.47 (t, 2H, J = 8.5), 3.89-3.97 (br s, 2 H), 3.98-4.15 (m, 2 H), 4.21 (m, 1H)。メタノールに溶解したサンプルの陰イオンＥＳは、ｍ／ｚ＝３８５．１に主要イオンを生じた。
【０１９１】
実施例４  Ｓ１Ｐに対する抗体
治療抗体の１種は、望ましくないスフィンゴ脂質と特異的に結合して、例えば、（１）心臓毒性、腫瘍形成作用または脈管形成作用などの望ましくない作用を促進する、望ましくない、有毒なスフィンゴ脂質の有効濃度（および／またはそれらの代謝前駆体の濃度を低下させる；（２）望ましくない、有毒な、腫瘍形成性または脈管形成性スフィンゴ脂質とそれらの細胞受容体との結合を阻害する、および／またはそのような受容体との結合に利用可能なスフィンゴ脂質の濃度を低下させる、などの有益な作用を達成する。このような治療作用の例としては、限定されるものではないが、利用可能なＳ１Ｐのin vivo血清濃度を低下させ、これにより、Ｓ１Ｐの腫瘍形成作用および脈管形成作用ならびにｐｏｓｔ−ＭＩ後心不全、癌または繊維形成疾患(fibrongenic deseases)におけるその役割を遮断または少なくとも制限するための抗Ｓ１Ｐ抗体の使用がある。
【０１９２】
チオール化Ｓ１Ｐ（図１の化合物１０）は、Ｓ１Ｐの不可欠な構造的特徴とＫＬＨなどの担体部分を架橋することができる反応性基（すなわち、スルフヒドリル基）を含むように合成された。免疫化に先立ち、標準的なプロトコールを用い、このチオ−Ｓ１Ｐ類似体を、タンパク質担体（例えば、ＫＬＨ）と架橋するＩＯＡまたはＳＭＣＣを介してコンジュゲートさせた。ＳＭＣＣは、第一級アミンおよびスルフヒドリル基と反応するヘテロ二機能性架橋剤であり、好ましい架橋剤に相当する。
【０１９３】
Ｓｗｉｓｓ  ＷｅｂｓｔｅｒまたはＢＡＬＢ−Ｃマウスに、２か月にわたって４回、５０μｇの免疫原（ＳＭＣＣを補助としたチオール化Ｓ１ＰとＫＬＨのコンジュゲート）を注射により感作させた。２回目、３回目および４回目の感作の２週間後に血清サンプルを採取し、抗Ｓ１Ｐ抗体が存在するかどうか直接的ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。次に、この抗体が高力価を示した動物の脾臓を用い、標準的な融合手順でハイブリドーマを作製した。得られたハイブリドーマを密集するまで増殖させた後、ＥＬＩＳＡ分析のために細胞上清を採取した。感作させた５５匹のマウスのうち、８匹が良好な応答個体であり、Ｓ１Ｐに反応性のある抗体の有意な血清力価を示した。次に、確立された手順を用い、これらのマウスの脾臓と骨髄腫細胞を行った。得られた１，５００のハイブリドーマを次に、直接的ＥＬＩＳＡによりスクリーニングしたところ、２８７の陽性ハイブリドーマが得られた。直接的ＥＬＩＳＡによりスクリーニングされたこれら２８７ハイブリドーマのうち、１５９が有意な力価を示した。この１５９の各ハイブリドーマを次に、２４ウェルプレートに拡張した。拡張したハイブリドーマの細胞馴化培地を次に、目的の抗体を分泌し得る安定なハイブリドーマを特定するために再スクリーニングした。６０の最大力価の安定なハイブリドーマに対して競合的ＥＬＩＳＡ法を行った。
【０１９４】
５５匹のマウスおよびほぼ１，５００のハイブリドーマのうち、１個のハイブリドーマが、最終的に真のモノクローナル抗体を生成するのに必要とされるような、制限希釈クローニングを正当化した性能特徴を示したことが分かった。このプロセスで４７のクローンが得られ、その大部分がＳ１Ｐ抗体産生陽性であると思われた。これらの４７クローンのうち、６クローンを２４ウェルプレートに拡張し、その後、競合的ＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングした。陽性を維持していた４クローンから、１クローンを選択し、Ｓ１Ｐモノクローナル抗体の大規模生産を開始した。ＳＣＩＤマウスにこれらの細胞を注射し、得られた            腹水をタンパク質Ａ精製し（収率５０％）、内毒素レベルを分析した（＜３ＥＵ／ｍｇ）。１回目の腹水生産では、５０匹のマウスに注射を行い、計１２５ｍＬの腹水が得られた。これらの抗体のイソタイプはＩｇＧ１カッパと分類され、ＨＰＬＣにより純度＞９５％であると推定された。抗体を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．２）を含む２０ｍＭナトリウムリン酸中に調製し、−７０℃で保存した。
【０１９５】
この陽性ハイブリドーマクローン（クローン３０６Ｄ３２６．２６と呼称）をＡＴＣＣに寄託し（セーフティー・デポジット・ストレージ・ナンバーＳＤ−５３６２）、Ｓ１Ｐに対する最初のネズミｍＡｂに相当する。このクローンはまた、「ヒト化」抗体変異体の作製に使用可能な抗体重鎖および軽鎖の可変領域、ならびにキメラ抗体の構築に必要な配列情報を含んでいる。
【０１９６】
Ｓ１Ｐ特異的抗体の血清および細胞上清のスクリーニングは、抗体として実施例１に記載のチオール化ＳＩＰ類似体（すなわち、化合物１０）を用い、直接的ＥＬＩＳＡによって行った。標準的なＥＬＩＳＡは、一次インキュベーションの際に、５０μｌのサンプル（血清または細胞上清）を等量のＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）に希釈すること以外は、下記のように行った。ＥＬＩＳＡは、結合バッファー（３３．６ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３；ｐＨ９．５）中、ＢＳＡとコンジュゲートした化学合成化合物１０  ０．１μｇをコーティングした９６ウェルhigh binding ELISAプレート(Costar)内で行った。このチオール化Ｓ１Ｐ−ＢＳＡをこれらのＥＬＩＳＡプレートウェル中で、３７℃にて１時間、４℃で一晩インキュベートした。次に、これらのプレートをＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１０．１４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．４）で４回洗浄し、室温で１時間、ＰＢＳでブロッキングした。一次インキュベーション工程では、７５μＬのサンプル（測定するＳ１Ｐを含む）を、ＰＢＳＴに希釈した０．１μｇ／ｍＬの抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂ  ２５μＬとともにインキュベートし、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに加えた。サンプルにつき３反復のウェルで行った。室温で１時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳで４回洗浄し、ウェル当たり１００μｌの０．１μｇ／ｍＬ  ＨＲＰヤギ抗マウス二次抗体(Jackson Immunoresearch)とともに室温で１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、テトラメチルベンジジン(Sigma)に１〜１０分間曝した。この検出反応を、等量の１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることで停止させた。これらのサンプルの光学密度を、ＥＬ−Ｘ−８００  ＥＬＩＳＡプレートリーダー(Bio-Tech)を用い、４５０ｎｍで測定することにより決定した。
【０１９７】
交差反応性については、次の変更以外は上記と同様にして競合的ＥＬＩＳＡ法を行った（図４）。一次インキュベーションは、競合因子（Ｓ１Ｐ、ＳＰＨ、ＬＰＡなど）およびビオチンコンジュゲート抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂからなった。精製モノクローナル抗体のビオチン化は、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ビオチン化キット(Pierce)を用いて行った。ビオチンの組み込みは、キットプロトコールに従って行い、抗体当たりのビオチン分子が７〜１１個の範囲とした。競合因子は次のように調製した：脂質ストックを音波処理し、アルゴン下で乾燥させた後、ＤＰＢＳ／ＢＳＡ［ＤＰＢＳ(Invitrogen 14040-133)中１ｍｇ／ｍｌ脂肪酸不含ＢＳＡ(Calbiochem)］で再構成した。精製抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂを必要に応じてＰＢＳ／０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で希釈した。競合因子および抗体の溶液を、１部の抗体に対して３部の競合因子となるようにともに混合した。シグナル生成のためにＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン二次抗体(Jackson Immunoresearch)を用いた。
【０１９８】
図４に示される競合的ＥＬＩＳＡ法データのもう１つの側面は、抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂがチオール化Ｓ１Ｐ類似体（化合物１０）と、この競合実験に加えられた天然Ｓ１Ｐを区別することができないということである。このことはまた、この類似体が二重結合を用いずに構築されていることから（実施例３に記載のＬＰＡ類似体に関しても同様であるように）、この抗体が酸化生成物を認識しないことを示す。また、この抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂを、室温で４８時間静置した、二重結合を含む天然産物に対しても試験した。天然Ｓ１Ｐの逆相ＨＰＬＣは、これまでに報告されている方法(Deutschman, et al. (July 2003), Am Heart J., vol. 146(1):62-8)に従って行ったところ、これらの結果は保持時間に違いはないことを示した。さらに、図４に示されている種々の脂質に対するモノクローナル抗体の結合特性を比較すると、この抗体により認識されるエピトープが、天然Ｓ１Ｐの二重結合の領域に炭化水素鎖を含まないことが示された。一方、モノクローナル抗体により認識されるエピトープは、遊離リン酸を伴うスフィンゴシン塩基主鎖上にアミノアルコールを含む領域である。この遊離リン酸がコリンと結合していれば（ＳＰＣの場合）、この結合はいくらか低下する。このアミノ基が脂肪酸へとエステル化されていれば（Ｃ１Ｐの場合）、抗体結合は見られない。スフィンゴシンアミノアルコール主鎖がグリセロール主鎖に置換されていれば（ＬＰＡの場合）、ＳＩＰ特異的モノクローナルは結合を示さない。これらのエピトープマッピングデータは、モノクローナル抗体により認識されるＳ１Ｐ上にはただ１つのエピトープが存在すること、およびこのエピトープはＳ１Ｐの独特な極性頭部基によって定義されることを示す。
【０１９９】
ＥＬＩＳＡ測定を用いた同様の実験で、好適な対照材料を、この抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体がタンパク質担体または架橋剤をいずれも認識しなかったことを確認するために評価した。例えば、通常の架橋剤ＳＭＣＣは、ＥＬＩＳＡのレイダウン材料としてのチオール化Ｓ１ＰとＢＳＡのコンジュゲーションにおいてＩＯＡと交換した。ＩＯＡを用いた場合、抗体の結合特性はＢＳＡ−ＳＭＣＣ−チオール化Ｓ１Ｐを用いた場合とほぼ同一であった。同様に、ＫＬＨはレイダウン材料としてのチオール化Ｓ１Ｐと複合体を形成させたタンパク質としてＢＳＡと交換した。この実験において、抗体の結合特性において有意な違いはなかった。
【０２００】
結合速度：Ｓ１Ｐとその受容体の結合速度は、脂質の性質のために問題視されてきた。多くの問題が、脂質の不溶性に関連するものであった。ＢＩＡｃｏｒｅ測定では、これらの問題を、Ｓ１ＰをＢＩＡｃｏｒｅチップに直接固定することで克服した。次に、抗体をチップの表面に流し、光学密度の変化を測定し、抗体とＳ１Ｐの結合特性を決定した。この抗体の二価結合の性質を回避するため、Ｓ１Ｐをチップ上に低密度でコーティングした。さらに、このチップを種々の密度のＳ１Ｐ（７、２０および１０００ＲＵ）でコーティングし、抗体結合データを１：１相互作用モデルに包括的に当てはめた。図５は、３種類の異なるＳ１Ｐ密度での、モノクローナル抗体とＳ１Ｐの結合による光学密度の変化を示している。全体として、Ｓ１Ｐに対するモノクローナル抗体の親和性は、結合データを分析するために一価結合モデルが用いられたか二価結合モデルが用いられたかによって、およそ８８ピコモル（ｐＭ）〜９９ｎＭの範囲で極めて高いと判定された。
【０２０１】
実施例５  Ｓ１Ｐモノクローナル抗体の可変ドメインのクローニングおよび特性決定
Ａ．導入
生体産物の産生は複雑であり、それは１つにはタンパク質それ自体の変動に関連した複雑性のためである。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）では、変動はタンパク質主鎖またはこれらのグリコシル化タンパク質に結合している炭水化物部分に局在している可能性がある。例えば、ヘテロ性は、選択的ジスルフィド対の形成、脱アミド化およびイソアスパルチル残基の形成、メチオニンおよびシステインの酸化、Ｎ末端グルタミン残基とピログルタメートの環化、ならびに哺乳類カルボキシペプチダーゼによるＣ末端リシンの部分的酵素切断によるものであり得る。一方、細胞培養中に導入される炭水化物のヘテロ性としては、フコース付加の違い、選択的マンノース分枝結合、および末端シアリル化の存在の違いが含まれる。さらに、グリコシル化パターンを変更するための突然変異誘発を行うことができる。また、酸化も問題の源となる。例えば、組換えヒト化モノクローナル抗体ＨＥＲ２は液体組成中で、強い光および高温に曝された際に酸化を受ける。興味深いことに、このような酸化は組成に依存することが報告されており(Lam, et al. (1997), Pharm. Sci., vol. 86: 1250-1255)、組成中にＮａＣｌが存在すれば、充填工程中にステンレス鋼容器またはステンレス鋼部品に接触した後に、高温で酸化の増加が起こるとされている。Ｆｃ領域の２５５番のメチオニン残基が酸化の主要部位であると決定された。組成中の金属イオンおよび過酸化物不純物の存在により生じたフリーラジカルにより引き起こされる酸化は、培地にメチオニンおよびチオスルフェートを添加することで消失した。これらの理由で、異種系での発現の増強、プロテアーゼ耐性、凝集の軽減および安定性の増強などのそれらの特性を改良するため、一般にプロセスエンジニアリングを抗体に適用する。
【０２０２】
この実施例は、Ｓ１Ｐに対するネズミｍＡｂのクローニングを報告する。この抗体はＳｐｈｉｎｇｏｍａｂ（商標）と呼ばれ、ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。全体的な戦略は、軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）双方のネズミ可変ドメインのクローニングからなる。３０６Ｄ  ＶＨのコンセンサス配列は、この定常領域フラグメントがγ２ｂイソ型に一致することを示す。このネズミ可変ドメインを軽鎖（ＣＬ）の定常ドメインと、また、重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２、ａｎｄ  ＣＨ３）の定常ドメインとともにクローニングし、キメラ抗体構築物を得た。また、Ｓｐｈｉｎｇｏｍａｂ（商標）は、ＣＤＲ２領域の重鎖上の５０番のＦａｂ領域に遊離システイン残基が存在するために独特である。この残基の置換は、処方および製造工程を大幅に助けるとともに、収率を向上させることができる。実際、抗体分子の生物物理学的特性を改良する試みにおいて、５０番のシステイン残基のアミノ酸残基パネルでの置換を、所望の置換を含む一連の構築物を作出することによって行った。これらの構築物を次に、哺乳類細胞で発現させ、種々の抗体変異体をＥＬＩＳＡアッセイにおいてＳ１Ｐとの結合に関して比較した。キメラ抗体と比較したところ、得られた置換Ｃｙｓ５０ＳｅｒおよびＣｙｓ５０Ａｒｇを含む突然変異体は、Ｓ１Ｐに対する結合の若干の低下を示したが、ＣｙｓをＰｈｅまたはＡｌａで置換した場合には、Ｓ１Ｐに対する結合は変化しなかった。
【０２０３】
Ｂ．材料および方法
１．抗体遺伝子のクローニング
抗Ｓ１Ｐハイブリドーマ細胞系統３０６Ｄ３２６．１（ＡＴＣＣ＃ＳＤ−５３６２）由来のクローンをＤＭＥＭ（ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）Ｉ、４５００ｍｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース、ピルビン酸ナトリウム；Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA、１１１−０３５−００３）、１０％ＦＢＳ（無菌胎児クローンＩ、Ｐｅｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、）および１Ｘグルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco/Invitrogen)を含むダルベッコの改変イーグル培地）で増殖させた。１０７ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット(Qiagen, Hilden Germany)に基づく手順を用いて単離した。このＲＮＡを用い、製造者のプロトコール(1st strand synthesis kit, Amersham Biosciences)に従い、第１鎖ｃＤＮＡを作製した。
【０２０４】
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）ｃＤＮＡを、ＭＨＶ７プライマー（ＭＨＶ７：５’−ＡＴＧＧＲＡＴＧＧＡＧＣＫＧＧＲＴＣＴＴＴＭＴＣＴＴ−３’［配列番号１］）をＩｇＧ２ｂ定常領域プライマーＭＨＣＧ１／２ａ／２ｂ／３混合物（ＭＨＣＧ１：５’−ＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧ−３’［配列番号２］；ＭＨＣＧ２ａ：５’−ＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧＧＧＣ−３［配列番号３］；ＭＨＣＧ２ｂ：５’−ＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＧＧＧ−３’［配列番号４］；ＭＨＣＧ３：５’−ＣＡＡＧＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＣ−３’［配列番号５］）と組み合わせて用いるＰＣＲにより増幅した。この反応生成物を、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニング（登録商標）キットおよび配列を用い、ｐＣＲ２．１（登録商標）−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター(Invitrogen)に連結した。次に、このベクターから重鎖の可変ドメインをＰＣＲにより増幅し、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＡｐａ  Ｉフラグメントとして挿入し、ＨＣＭＶｉプロモーター、リーダー配列およびγ−１定常領域を含む発現ベクターｐＧ１Ｄ２００（米国特許第７，０６０，８０８号参照）またはｐＧ４Ｄ２００（同参照）に連結し、プラスミドｐＧ１Ｄ２００３０６ＤＶＨを作製した。３０６Ｄ  ＶＨのコンセンサス配列（図６；配列番号６）は、定常領域フラグメントは、この定常領域フラグメントはγ２ｂイソ型と一致していることを示した。
【０２０５】
同様に、免疫グロブリンカッパ鎖可変領域（ＶＫ）は、ＭＫＶ２０プライマー（５’−ＧＴＣＴＣＴＧＡＴＴＣＴＡＧＧＣＡ−３’［配列番号７］）をκ定常領域プライマーＭＫＣ（５’−ＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧ−３’［配列番号８］）と組み合わせて用いて増幅した。この反応生成物を、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニング（登録商標）キットおよび配列を用い、ｐＣＲ２．１（登録商標）−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターに連結した。次に、この軽鎖の可変ドメインをＰＣＲにより増幅した後、Ｂａｍ  ＨＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩフラグメントとして、ＨＣＭＶプロモーター、リーダー配列およびヒトκ定常ドメイン発現ベクターｐＫＮ１００（米国特許第７，０６０，８０８号参照）に挿入し、プラスミドｐＫＮ１００３０６ＤＶＫを作製した。
【０２０６】
重鎖および軽鎖プラスミドｐＧ１Ｄ２００３０６ＤＶＨおよびｐＫＮ１００３０６ＤＶＫをＤＨ４ａ細菌に形質転換し、グリセロール中で保存した。大規模プラスミドＤＮＡを、製造者が記載しているようににて調製した（Qiagen、内毒素不含ＭＡＸＩＰＲＥＰ（商標）キット）。QiagenのQIAprep Spin MiniprepキットまたはEndoFree Plasmid Mega/Maxiキットを用いて生成したＤＮＡサンプルを、ＡＢＩ  ３７３０ｘｌ自動シーケンサーを用いて配列決定し、これはまた、蛍光シグナルをそれらの対応する核酸塩基配列に翻訳する。プライマーは５’および３’末端において、得られた配列が重複するようにデザインした。プライマーの長さは１８〜２４塩基であり、好ましくは、それらはＧＣ含量が５０％であり、推定される二量体または二次構造を含まない。Ｓｐｈｉｎｇｏｍａｂ（商標）からのマウスＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列を図６に示す（それぞれ配列番号６および９）。図６では、ＣＤＲ残基（Kabat, EA (1982), Pharmavol Rev, vol. 34: 23-38参照）を四角で囲み、下記表Ｉに示す。
【表１】
0005600252.tif 000003
【０２０７】
いくつかのキメラ抗体ＶＨおよびＶＬドメインの完全ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図７に示す。図７では、Ｋａｂａｔの方法(Kabat, et al. (1991), NIH National Technical Information Service, pp. 1-3242)に従って、アミノ酸配列を符番し、ＣＤＲを特定した。
【０２０８】
２．ＣＯＳ７の発現
非ヒト哺乳類系における抗体発現では、各プラスミド１０μｇを用い、エレクトロポレーション（１０７細胞／ｍ  ｌ０．７ｍｌ）により、プラスミドをアフリカミドリザル腎臓繊維芽細胞系統ＣＯＳ７にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を８ｍｌの増殖培地で４日平板培養した。キメラ３０６ＤＨ１×３０６ＤＶＫ−２抗体は、一時的同時トランスフェクトＣＯＳ細胞馴化培地にて１．５μｇ／ｍｌで発現された。この抗体とＳ１Ｐの結合を、Ｓ１Ｐ  ＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【０２０９】
キメラ抗体の発現レベルは、次のようにして定量的ＥＬＩＳＡで測定した。マイクロタイタープレート(Nunc MaxiSorp immunoplate, Invitrogen)を、ＰＢＳに希釈した０．４μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体(Sigma, St. Louis, MO)の１００μｌアリコートでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次に、これらのプレートを２００μｌ／ウェルの洗浄バッファー（１×ＰＢＳ、０．１％ＴＷＥＥＮ）で３回洗浄した。各希釈血清サンプルまたは融合物上清のアリコート２００μＬを、毒素をコーティングしたプレートに移し、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄バッファーで６回洗浄した後、ヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲート(Jackson Immuno Research)を各ウェルに１：５０００の希釈率で加えた。室温で１時間反応を行い、プレートを洗浄バッファーで６回洗浄し、１５０μＬのＫ−ＢＬＵＥ基質(Sigma)を各ウェルに加え、暗所、室温で１０分間インキュベートした。５０μｌのＲＥＤ  ＳＴＯＰ溶液(SkyBio Ltd.)を加えることで反応を停止させ、マイクロプレートリーダー３５５０(Bio-Rad Laboratories Ltd.)を用い、６５５ｎｍで吸収を測定した。これらの抗体結合実験からの結果を図８に示す。
【０２１０】
３．２９３Ｆの発現
ヒト系における抗体発現では、２９３フェクチン(Invitrogen)を用い、ヒト胚腎臓細胞系統２９３Ｆ(Invitrogen)にプラスミドをトランスフェクトし、培養に２９３Ｆ−ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍｅｄｉａ(Invitrogen)を用いた。軽鎖および重鎖プラスミドを双方とも０．５ｇ／ｍＬでトランスフェクトした。トランスフェクションは１０６細胞／ｍＬの細胞密度で行った。トランスフェクション３日後、２５℃で５分間、１１００ｒｐｍで遠心分離することにより上清を採取した。発現レベルを定量的ＥＬＩＳＡ（下記参照）により定量したところ、キメラ抗体では〜０．２５〜０．５ｇ／ｍと多様であった。
【０２１１】
４．定量的ＥＬＩＳＡ
マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート(Costar)を、１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）に希釈したウサギ抗マウスＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的抗体(Jackson Immuno Research)またはウサギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的抗体(Jackson Immuno Research)で、３７℃にて１時間コーティングした。プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ−２０で、３７℃にて１時間ブロッキングした。一次インキュベーションでは、非特異的マウスＩｇＧまたはヒトＩｇＧ、全分子（較正曲線に使用）の希釈液および測定サンプルをウェルに加えた。プレートを洗浄し、ウェル当たり１００μｌの１：４０，０００希釈ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス（Ｈ＋Ｌ）(Jackson Immuno Research)または１：５０，０００希釈ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）(Jackson Immuno Research)とともに３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、この酵素反応をテトラメチルベンジジン(Sigma)で検出し、１  Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることで停止させた。Thermo Multiskan EXを用い、４５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定した。生データを分析のためＧｒａｐｈＰａｄソフトウエアに移した。
【０２１２】
５．直接的ＥＬＩＳＡ
マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート(Costar)を、１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）に希釈したＳ１Ｐで一晩、３７℃にて１時間コーティングした。プレートをＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１０．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．４）で洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ−２０で、室温にて１時間または４℃にて一晩ブロッキングした。一次インキュベーション（室温で１時間）では、抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂおよび結合に関して試験するサンプルを用いた標準曲線を、次の希釈セット：０．４μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．０１２５μｇ／ｍＬおよび０μｇ／ｍＬを用いて構成し、１００μｌを各ウェルに加えた。プレートを洗浄し、ウェル当たり１００μｌのＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス（１：２０，０００希釈）(Jackson Immuno Research)または１：５０，０００希釈ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）(Jackson Immuno Research)とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄した後、この酵素反応をテトラメチルベンジジン(Sigma)で検出し、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることで停止させた。Thermo Multiskan EXを用い、４５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定した。生データを分析のためＧｒａｐｈＰａｄソフトウエアに移した。
【０２１３】
以下の表２は、変異株とキメラ抗体の比較分析を示す。これらの結果を作製するため、結合抗体を、ＨＲＰにコンジュゲートさせたマウスまたはヒトＩｇＧに特異的な二次抗体により検出した。この発色反応を測定し、光学密度（ＯＤ）として報告した。抗体パネルの濃度は０．１μｇ／ｍｌとした。二次抗体とＳ１Ｐコーティングマトリックスの相互作用だけを検出した。
【表２】
0005600252.tif 000004
【０２１４】
実施例６  Ｓ１Ｐに対するキメラｍＡｂ
本明細書において、「キメラ」抗体（または「免疫グロブリン」）とは、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属す抗体における対応配列と同一または相同な重鎖および／または軽鎖を含むが、残りの鎖は別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属す抗体における対応配列と同一または相同である分子、ならびに所望の生物活性を示す限り、このような抗体のフラグメントを指す(Cabilly et al., 前掲; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851 (1984))。
【０２１５】
Ｓ１Ｐに対するキメラ抗体は、特定のハイブリドーマ(ATCC safety deposit storage number SD-5362)由来のネズミ抗体の活性Ｓ１Ｐ結合領域をヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域とともに含む可変領域（Ｆｖ）を用いて作製された。これらのＦｃ領域は、ヒト抗体のＣＬ、ＣｈＬおよびＣｈ３ドメインを含んだ。特定の方法に限定されるものではなく、キメラ抗体はまたヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡまたはＩｇＭのＦｃ領域からも作製されている。当技術分野では言うまでもないことであるが、「ヒト化」抗体は、ネズミ抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１〜４）をＩｇＧ１のフレームワーク領域などのヒト抗体フレームワーク領域（例えば、Ｆｒ１、Ｆｒ４など）とともにグラフトすることにより作製可能である。図９は、レイダウン材料としてチオール化Ｓ１Ｐを用いる、直接的ＥＬＩＳＡ測定におけるキメラおよび完全ネズミｍＡｂの結合を示す。
【０２１６】
図９に示されている直接的ＥＬＩＳＡ実験は、Ｓ１Ｐに対するキメラ抗体の結合特性は完全ネズミモノクローナル抗体に対する結合特性と同等であった。ＥＬＩＳＡは、結合バッファー（３３．６ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３；ｐＨ９．５）中、ＢＳＡにコンジュゲートさせた０．１μｇの化学合成チオール化Ｓ１Ｐでコーティングした９６ウェルhigh-binding ELISAプレート(Costar)で行った。このチオール化Ｓ１Ｐ−ＢＳＡをＥＬＩＳＡプレートで３７℃にて１時間または４℃にて一晩インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１０．１４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．４）で４回洗浄し、ＰＢＳＴで室温にて１時間ブロッキングした。一次インキュベーション工程では、７５μＬのサンプル（測定するＳ１Ｐを含む）を、ＰＢＳＴに希釈した０．１μｇ／ｍＬ抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体２５μＬとともにインキュベートし、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに加えた。サンプルにつき３反復のウェルで行った。室温で１時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳで４回洗浄し、ウェル当たり１００μｌの０．１μｇ／ｍＬ  ＨＲＰヤギ抗マウス二次抗体(Jackson Immunoresearch)とともに室温で１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、テトラメチルベンジジン(Sigma)に１〜１０分間曝した。この検出反応を、等量の１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることで停止させた。これらのサンプルの光学密度を、ＥＬ−Ｘ−８００  ＥＬＩＳＡプレートリーダー(Bio-Tech)を用い、４５０ｎｍで測定することにより決定した。
【０２１７】
実施例４に記載の実験に関する場合と同様に、免疫動物の血清またはハイブリドーマなどの抗体産生細胞の細胞馴化培地（すなわち、上清）の抗体力価を測定する好ましい方法は、ＢＳＡなどのタンパク質担体と供給結合された標的リガンド（例えば、Ｓ１Ｐ、ＬＰＡなどのチオール化類似体）でＥＬＩＳＡプレートをコーティングすることを含む。
【０２１８】
特定の方法または例に限定されるものではなく、キメラ抗体は、ＬＰＡ、セラミド、スルファチド、セレブロシド、カルジオリピン、ホスホチジルセリン、ホスホチジルイノシトール、ホスファチジン酸、ホスホチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、エイコシノイド、およびその他のロイコトリエンなどのような他の脂質標的に対しても作製することができる。さらに、これらの脂質の多くは、所望によりグリコシル化および／またはアセチル化することもできる。
【０２１９】
実施例７  スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨキナーゼ）に関する抗体に基づくアッセイ
スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨキナーゼまたはＳＰＨＫ）は、ＳＰＨからＳ１Ｐへの変換を触媒する。ヒトＳＰＨ−キナーゼをコードする遺伝子配列は既に記載されている(Melendez et al., Gene 251:19-26, 2000)。ＳＰＨキナーゼの３つのヒトホモログ（ＳＫＡ、ＳＫＢおよびＳＫＣ）も記載されている（公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ００／５２１７３）。ネズミＳＰＨキナーゼはもまた記載されている(Kohama et al., J. Biol. Chem. 273:23722-23728, 1998;および公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／６１５８１)。公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／６１５８１は、スフィンゴシンキナーゼをコードする核酸を報告している。公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ００／５２１７３は、スフィンゴシンキナーゼのホモログをコードする核酸を報告している。他のＳＰＨキナーゼもまた報告されている。例えば、Pitson et al., Biochem J. 350:429-441, 2000;公開ＰＣＴ出願ＷＯ００／７００２８; Liu et al., J. Biol. Chem., 275:19513-19520, 2000;ＰＣＴ／ＡＵ０１／００５３９（ＷＯ０１／８５９５３として公開）；ＰＣＴ／ＵＳ０１／０４７８９（ＷＯ０１／６０９９０として公開）；およびＰＣＴ／ＥＰ００／０９４９８（ＷＯ０１／３１０２９として公開）参照。
【０２２０】
ＳＰＨキナーゼの阻害剤としては、限定されるものではないが、Ｎ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシン(Edsall et al., Biochem. 37:12892-12898, 1998)；Ｄ−スレオ−ジヒドロスフィンゴシン(Olivera et al., Nature 365:557-560, 1993)；およびスフィンゴイド塩基(Jonghe et al., “Structure-Activity Relationship of Short-Chain Sphingoid Bases As Inhibitors of Sphingosine Kinase”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 9:3175-3180, 1999)が含まれる。
【０２２１】
これらのおよびその他の、または可能性のあるＳＰＨキナーゼ阻害剤を評価するのに有用なＳＰＨキナーゼのアッセイとしては、Olivera et al., Methods in Enzymology, 311:215-223, 1999; Caligan et al., Analytical Biochemistry, 281:36-44, 2000に記載されているものがある。
【０２２２】
ＳＰＨキナーゼの阻害は、その基質であるＳＰＨの蓄積をもたらし、このＳＰＨは、Ｓ１Ｐ同様に、ある条件において望ましくないスフィンゴ脂質となり得ると考えられる。これらの望ましくない作用を回避または軽減するため、（ｉ）酵素が反応生成物としてＳ１Ｐを生じるもの（例えば、セラミドシンターゼなど、下記参照）ではない限り、ＳＰＨを基質として用いる酵素を刺激する薬剤、または（ｉｉ）ＳＰＨを生成物として生じる酵素を阻害する薬剤を投与することができる。
【０２２３】
特定の方法に限定されるものではなく、抗Ｓ１Ｐ抗体（例えば、モノクローナル抗Ｓ１Ｐ抗体）は、ＳＰＨキナーゼ活性のin vitroアッセイの試薬としても使用可能である。例えば、精製ＳＰＨＫを、ＰＢＳおよびキナーゼの基質であるＳＰＨ（例えば、脂肪酸不含ＢＳＡと複合体を形成）の存在下、マイクロタイタープレートのウェルに加えることができる。次に、生じた反応生成物Ｓ１Ｐに対し、抗Ｓ１Ｐ抗体（例えば、上記実施例４のモノクローナル抗Ｓ１Ｐ抗体）を用い、ＥＬＩＳＡを行うことができる。このようなアッセイでは、試験化合物によるＳＰＨＫの阻害の結果、ＳＰＨＫ阻害化合物を含まない対照反応よりも低いレベルのＳ１Ｐを生じる。このようなアッセイはハイスループット向けに構成することができ、従って、ＳＰＨＫ活性のモジュレーターのハイスループットスクリーニングアッセイの基礎として役立ち得る。
【０２２４】
実施例８  Ｓ１ＰリアーゼまたはＳＰＰ活性に関する抗体に基づくアッセイ
Ｓ１Ｐを分解する反応（すなわち、反応物としてＳ１Ｐを利用する反応）を触媒する酵素を刺激すると、Ｓ１Ｐ分子の分解の刺激が起こる。このような酵素としては、限定されるものではないが、下記のものが含まれる。
【０２２５】
Ｓ−１−Ｐリアーゼ：  Ｓ１Ｐリアーゼは、Ｓ１Ｐからエタノールアミン−Ｐ（ｔ−２−ヘキサデカナールとしても知られる）およびパルミトアルデヒドへの変換を触媒する(Veldhoven et al., Adv. Lipid Res. 26:67-97, 1993; Van Veldhoven, Methods in Enzymology, 311:244-254, 1999)。酵母(Lanterman et al., Biochem. J. 332:525-531, 1998)、ネズミ(Zhou et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 242:502-507, 1998)、およびヒト（公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／３８９８３）Ｓ１Ｐリアーゼ遺伝子が報告されている。公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／１６８８８は、Ｓ１ＰリアーゼＤＮＡおよびタンパク質配列を報告している。米国特許第６，１８７，５６２号および公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／３８９８３もまた、Ｓ１Ｐリアーゼを報告している。
【０２２６】
そのリアーゼを活性化する、またはそれをコードする遺伝子の発現を増強する小分子化合物を発見するための機能獲得アッセイを開発することができる。特定の方法に限定されるものではなく、in vitroまたは細胞に基づく形式において、加えられたＳＰＨからのＳ１Ｐの産生を測定するＥＬＩＳＡ形式で抗Ｓ１Ｐ抗体を使用することができる。直接的に酵素において、または間接的にその酵素をコードする遺伝子の発現レベルを高めることによって（例えば、遺伝子活性化、Ｓ１ＰリアーゼｍＲＮＡの安定性の増大などによる）Ｓ１Ｐリアーゼ活性を刺激することが確認された化合物はさらに検討することができ、化合物がそれ自体、Ｓ１Ｐレベルが毒性に関連している患者におけるＳ１Ｐの細胞外濃度の低下、例えば、癌、新血管および脳血管疾患、自己免疫障害、炎症性障害、脈管形成、繊維性疾患および加齢性黄斑変性の処置などに有用であることが分かる可能性がある。
【０２２７】
Ｓ１Ｐホスファターゼ：  Ｓ１Ｐホスファターゼ（ＳＰＰホスホヒドロラーゼとしても知られる）は、Ｓ−１−Ｐからスフィンゴシンへの変換を触媒する哺乳類酵素である(Mandala et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 95:150-155, 1998; Mandala et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 97:7859-7864, 2000; Mandala, Prostaglandins & other Lipid Mediators, 64:143-156, 2001; Brindley et al., Methods in Enzymology, 311:233-244, 1999)。２種のＳ−１−Ｐホスファターゼ、ＬＢＰ１とＬＢＰ２が酵母から単離されている(Mandala et al., J. Biol. Chem. 272:32709-32714, 1997)；ＰＣＴ／ＵＷ０１／０３８７９（ＷＯ０１／５７０５７として公開）。
【０２２８】
Ｓ１Ｐリアーゼの場合と同様に、Ｓ１Ｐホスファターゼを活性化する、またはそれをコードする遺伝子の発現を増強する化合物を発見するための機能獲得アッセイを開発することができる。例えば、in vitroまたは細胞に基づく形式において、加えられたＳＰＨからのＳ１Ｐの産生を測定するＥＬＩＳＡ形式で抗Ｓ１Ｐ抗体を使用することができる。直接的に酵素において、または間接的にその酵素をコードする遺伝子の発現レベルを高めることによって（例えば、遺伝子活性化、Ｓ１ＰホスファターゼｍＲＮＡの安定性の増大などによる）Ｓ１Ｐホスファターゼ活性を刺激することが確認された化合物はさらに検討することができ、化合物がそれ自体、Ｓ１Ｐレベルが毒性に関連している患者におけるＳ１Ｐの細胞外濃度の低下、例えば、癌、新血管および脳血管疾患、自己免疫障害、炎症性障害、脈管形成、繊維性疾患および加齢性黄斑変性の処置などに有用であることが分かる可能性がある。
【０２２９】
実施例９  ＬＰＡに対するモノクローナル抗体の産生および特性決定
抗体の産生
天然ＬＰＡに対するポリクローナル抗体は文献で報告されているが(Chen JH, et al., Bioorg Med Chem Lett. 2000 Aug 7;10(15):1691-3)、モノクローナル抗体についての記載はない。実施例４に記載されているものと同様のアプローチを用い、ＬＰＡに対するモノクローナル抗体、架橋剤としてＩＯＡまたはＳＭＣＣのいずれかを用いた標準的な化学的架橋による、反応性ＳＨ基とタンパク質担体（ＫＬＨ）を介した類似体の架橋により形成されたハプテンの鍵成分としてのＣ−１２チオ−ＬＰＡ類似体（実施例３の化合物２８）を作製した。これを行うため、抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体の作製に関して実施例４に記載されている方法を用い、マウスをチオ−ＬＰＡ−ＫＬＨハプテン（この場合、チオール化ＬＰＡ：ＳＭＣＣ：ＫＬＨ）で免疫化した。ＬＰＡ単独に対して免疫化した８０匹のマウスのうち、ＬＰＡに対して最高の力価を示した（ハプテンに用いたものと同じＬＰＡ類似体（化合物２８）を、ＳＭＣＣを用いてＢＳＡにコンジュゲートし、ＥＬＩＳＡプレート上にレイダウンしたＥＬＩＳＡを用いて測定）５匹を、開発のハイブリドーマ段階に移行するために選択した。
【０２３０】
これら５匹の動物からの脾臓を採取し、標準的技術によりハイブリドーマを作製した。要するに、１匹のマウスがハイブリドーマ細胞系統となった（５０４Ａと呼称）。５０４Ａ系統の平板培養した全てのハイブリドーマのうち、６６がこれまでに記載したスクリーニングＥＬＩＳＡにより測定したところ、抗体産生陽性を示した。
【０２３１】
下記の表３は、チオール化ＬＰＡ類似体がヘテロ二機能性架橋剤を用いてＫＬＨに架橋されたＬＰＡ類似体ハプテンに応答した２匹のマウスの脾臓から作製したハイブリドーマ抗体の細胞上清の抗体力価を示す。これらのデータは、抗ＬＰＡ抗体が架橋剤ともタンパク質担体とも反応しないことを示している。重要なこととしては、これらのデータは、ハイブリドーマがＬＰＡに対する抗体を産生するが、Ｓ１Ｐに対する抗体は産生しないことを示している。
【表３】
0005600252.tif 000005
【０２３２】
マウスにおける抗ＬＰＡ  ｍＡｂの発生は、ＥＬＩＳＡ（１２：０および１８：１  ＬＰＡとの直接結合および競合ＥＬＩＳＡ）によりモニタリングした。免疫化したマウスの少なくとも半数に有意な免疫応答が見られ、最高の抗体力価を有する５匹を、脾臓融合後のハイブリドーマ細胞系統の開発を開始するために選択した。
【０２３３】
これら５つの融合物から作製された２０００を超えるハイブリドーマ細胞系統の初期スクリーニングの後、計２９の抗ＬＰＡ分泌ハイブリドーマ細胞系統が１８：１  ＬＰＡに高い結合を示した。これらのハイブリドーマ細胞系統のうち、２４をさらにサブクローニングし、ＥＬＩＳＡアッセイパネルで特性決定した。陽性を維持していた２４クローンから、６つのハイブリドーマクローンをさらなる特性決定のために選択した。それらの選択は、より優れた生化学的および生物学的特性に基づくものであった。
【０２３４】
直接的結合速度
６つの抗ＬＰＡ  ｍＡｂ（Ｂ３、Ｂ７、Ｂ５８、Ａ６３、Ｂ３Ａ６、Ｄ２２）と１２：０および１８：１  ＬＰＡ（０．１μＭ）との結合をＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＣ５０値を、６段階の漸増濃度のｍＡｂ（０〜０．４μｇ／ｍｌ）を用いた滴定曲線から算出した。ＥＣ５０は、最大結合の５０％を示す有効抗体濃度を表す。Ｍａｘは最大結合を示す（ＯＤ４５０として表示）。結果を表４に示す。
【表４】
0005600252.tif 000006
【０２３５】
速度パラメーターｋａ（結合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）およびＫＤ（結合平衡定数）を、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ装置を用い、６つの主要候補について測定した。この研究では、ＬＰＡはセンサー表面に固定し、抗ＬＰＡ  ｍＡｂは表面を横切る溶液に浮遊させた。示されているように、６種類全てのｍＡｂはＬＰＡと、０．３４〜３．８ｐＭの範囲の同等のＫＤ値、および同等の速度パラメーターで結合する。
【０２３６】
抗ＬＰＡネズミｍＡｂはＬＰＡと高親和性を示す
ＬＰＡは、１５０共鳴単位の範囲の密度でセンサーチップに固定した。各ｍＡｂに固定したＬＰＡに通し、結合／解離相の非線形回帰により速度定数を得た。誤差は、２反復の試験の少なくとも３回の測定を用い、標準偏差として示す。見掛けの親和性をＫＤ＝ｋａ／ｋｄにより求めた。ｋａ＝結合速度定数（Ｍ−１ｓ−１）  ｋｄ＝解離速度定数（ｓ−１）
【表５】
0005600252.tif 000007
【０２３７】
６種類の抗ＬＰＡ  ｍＡｂの特異性プロフィール
ＬＰＡの多くのイソ型に生物活性があることが確認されており、ｍＡｂは治療上関連のあるある範囲のそれらを全て認識することが好ましい。抗ＬＰＡ  ｍＡｂの特異性は、抗体が固定化された脂質混合物に競合因子としての脂質を加えた競合アッセイを用いて評価した。６種類のｍＡｂを用い、それらの特異性を評価するため、競合ＥＬＩＳＡアッセイを行った。１８：１  ＬＰＡをＥＬＩＳＡプレートに捕捉した。各競合因子としての脂質（最大１０μＭ）をＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）〜ＰＢＳで連続希釈した後、ｍＡｂ（３ｎＭ）でインキュベートした。次に、混合物をＬＰＡコーティングウェルに移し、結合抗体の量を、二次抗体を用いて測定した。データを最大シグナル（Ａ４５０）に対してノーマライズし、阻害率％として示す。アッセイは３反復で行った。ＩＣ５０：最大半分阻害濃度；ＭＩ：最大阻害（阻害剤の不在下での結合％）；---：阻害が弱いため評価せず。高い阻害結果は、抗体による競合因子としての脂質の認識を示す。表６に示されるように、全ての抗ＬＰＡ  ｍＡｂが異なるＬＰＡイソ型を認識した。
【表６】
0005600252.tif 000008
【０２３８】
興味深いことに、抗ＬＰＡ  ｍＡｂは、１２：０（ラウロイル）、１４：０（ミリストイル）、１６：０（パルミトイル）、１８：１（オレオイル）、１８：２（リノレオイル）および２０：４（アラキドノイル）ＬＰＡ間で識別可能であった。ＥＣ５０のランク順は不飽和脂質では１８：２＞１８：１＞２０：４、飽和脂質では１４：０＞１６：０＞１８：０であった。高い特異性を有するｍＡｂが最終的な薬剤開発に望ましい。抗ＬＰＡ  ｍＡｂの特異性を、ジステアロイル−ホスファチジン酸、リゾホスファチジルコリン、Ｓ１Ｐ、セラミドおよびセラミド−１−リン酸などのＬＰＡ関連生体脂質との結合に関して評価した。これら６種類の抗体のうち、ＬＰＡの直前の代謝前駆体であるジステアロイルＰＡおよびＬＰＣと交差反応性を示すものはなかった。
【０２３９】
実施例１０  抗ＬＰＡモノクローナル抗体の抗癌活性
癌細胞の増殖
ＬＰＡは、ＧＰＣＲ受容体を介したＧｉ、ＧｑおよびＧ１２／１３の刺激および下流シグナル伝達の活性化により、細胞の生存および増殖を支える強力な増殖因子である。細胞系統をＬＰＡ（０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ）に対するそれらの増殖応答に関して試験した。細胞増殖をChemicon (Temecula CA)製の細胞増殖アッセイキット（Ｐａｎｃ−１）およびPierce製のＣｅｌｌ−Ｂｌｕｅ力価（Ｃａｋｉ−１）を使用することによりアッセイした。各データ点は、３回の独立した実験の平均である。ＬＰＡは、ＳＫＯＶ３およびＯＶＣＡＲ３（卵巣癌）、Ｐａｎｃ−１（膵臓癌）、Ｃａｋｉ−１（腎臓癌細胞）、ＤＵ−１４５（前立腺癌）、Ａ５４９（肺癌）およびＨＣＴ−１１６（結腸直腸腺癌）細胞を含む７つのヒト由来腫瘍細胞系統ならびに１つのラット由来腫瘍細胞系統、ＲＢＬ−２Ｈ３（ラット白血病細胞）の増殖を用量依存的に増大させた。腫瘍由来細胞が通常、高い基底レベルの増殖を持っているとしても、ＬＰＡはほとんどの腫瘍細胞系統で増殖をさらに増大させることが明らかである。抗ＬＰＡ  ｍＡｂ（Ｂ７およびＢ５８）を、選択されたヒト癌細胞系統においてＬＰＡにより誘発される増殖を阻害する能力に関して評価した。このＬＰＡにより誘発される増殖の増大は、抗ＬＰＡ  ｍＡｂの添加により軽減されることが示された。
【０２４０】
抗ＬＰＡ  ｍＡｂは腫瘍細胞を化学療法薬に対して増感させる
臨床上適切なレベルの化学療法薬パクリタキセル（タキソール）に曝された際の、ＬＰＡの、アポトーシスから腫瘍細胞を保護する能力を調べた。ＳＫＶＯ３細胞を１％ＦＢＳ（Ｓ）、タキソール（０．５ｍＭ）、＋／−抗ＬＰＡ  ｍＡｂで２４時間処理した。ＬＰＡは、タキソールにより誘発されるアポトーシスからＳＫＶＯ３細胞を保護した。アポトーシスは、製造者(Promega)が推奨するようにカスパーゼ活性の測定によりアッセイした。予測通り、ＬＰＡは狂死したほとんどの癌細胞系統を、タキソールに誘発される細胞死から保護した。ＬＰＡ応答細胞の選択に抗ＬＰＡ抗体を加えた場合、この抗ＬＰＡ抗体は、細胞傷害性化学療法薬により誘発された細胞死から細胞を保護するＬＰＡの能力を遮断した。さらに、この抗ＬＰＡ抗体は、血清によりもたらされる保護を取り除くことができた。血清は約５〜２０ｍＭのＬＰＡを含むと見積もられる。ＳＫＯＶ３細胞におけるタキソールにより誘発されるカスパーゼ−３，７の活性化および細胞への血清の添加は細胞をアポトーシスから保護した。タキソールにより誘発されるカスパーゼ活性化は３種類全ての抗ＬＰＡ  ｍＡｂを培養培地に加えることで増強された。このことは、ＬＰＡの保護作用および抗アポトーシス作用が血清中に存在するＬＰＡの、選択抗体により媒介される中和によって取り除かれたことを示唆する。
【０２４１】
抗ＬＰＡ  ｍＡｂはＬＰＡにより媒介される腫瘍細胞の移動を阻害する
転移癌の重要な特徴は、腫瘍細胞が接触阻害から逃れ、それらの起源組織から移動するということである。ＬＰＡは、いくつかの癌細胞種において転移能を増進することが示されている。従って、本発明者らは、細胞単層スクラッチアッセイを用いることで、数種のヒト癌細胞系統で、抗ＬＰＡ  ｍＡｂの、ＬＰＡ依存性細胞移動を遮断する能力を調べた。細胞を９６ウェルプレートに播種し、密集するまで増殖させた。２４時間飢餓状態にした後、ウェルの中央をピペットチップで掻き取った。当技術分野で認知されている「スクラッチアッセイ」では、細胞は、細胞単層におけるスクラッチ傷に対して、スクラッチ部に向かって移動することによる定型的な様式で応答し、その傷を閉じる。移動および傷の封鎖の進行を、所望の時点での１０倍デジタル写真でモニタリングする。細胞は無処理（ＮＴ）、ＬＰＡ（２．５ｍＭ）処理またはｗ／ｏ  ｍＡｂ  Ｂ７（１０μｇ／ｍｌ）処理または非特異的抗体に適合するイソ型（ＮＳ）（１０μｇ／ｍｌ）処理であった。無処理細胞では、スクラッチの後に単層境界間に大きなギャップが残る。これに対し、ＬＰＡ処理細胞では、同じ時点で小さなギャップしか残っておらず、少数の細胞でギャップ間の接触が形成されている。ＬＰＡと抗ＬＰＡ抗体Ｂ７の双方で処理した細胞では、この時点でのギャップはＬＰＡのみで処理した場合よりも数倍大きかったが、無処理の対照細胞ほど大きくはなかった。このことは、抗ＬＰＡ抗体がＬＰＡにより刺激される腎細胞癌（Ｃａｋｉ−１）細胞の移動に対して阻害作用を持っていたことを示す。ｍＡｂｓ  Ｂ３およびＢ５８でも同様のデータが得られた。このことは、抗ＬＰＡ  ｍＡｂが、転移癌腫に元々由来する細胞系統の、ＬＰＡにより媒介される移動を軽減し得ることを示す。
【０２４２】
抗ＬＰＡ  ｍＡｂは腫瘍細胞からの腫瘍形成促進サイトカインの放出を阻害する
ＬＰＡは、増殖促進性の腫瘍微小環境をもたらし、脈管形成を促進することにより、癌の確立および進行に関与している。特に、ＩＬ−８およびＶＥＧＦなどの増殖促進因子の増加が癌細胞で見られている。ＩＬ−８は癌の進行および予後に強く関連づけられている。ＩＬ−８は、新血管新生の促進および好中球および内皮細胞の走化性の誘発を介して癌においてその作用を発揮し得る。さらに、ＩＬ−８の過剰発現は、多くのヒト癌種における薬剤耐性表現型の発生に関連づけられている。
【０２４３】
３種類の抗ＬＰＡ  ｍＡｂ（Ｂ３、Ｂ７およびＢ５８）を、in vitroＩＬ−８生産におけるそれらの低減能を非特異的抗体（ＮＳ）と比較して調べた。Ｃａｋｉ−１細胞を９６ウェルプレートに播種し、密集するまで増殖させた。一晩、血清飢餓状態にした後、細胞を、抗ＬＰＡ  ｍＡｂ  Ｂ３、Ｂ７、Ｂ５８またはＮＳ（非特異的）と伴って、または伴わずに１８：１  ＬＰＡ（０．２ｍＭ）で処理した。２４時間後、漸増濃度の抗ＬＰＡ  ｍＡｂ  Ｂ３、Ｂ７およびＢ５８の存在下、ＬＰＡ処理を行った、または行わなかった腎臓癌細胞（Ｃａｋｉ−１）の培養上清を採取し、市販のＥＬＩＳＡキット(HumanQuantikine Kit, R&D Systems, Minneapolis, MN)を用い、ＩＬ−８レベルを分析した。抗ＬＰＡ  ｍＡｂで前処理した細胞では、ＩＬ−８発現は用量依存的に有意に低下したが（０．１〜３０μｇ／ｍＬ  ｍＡｂ）、無処理細胞において、ＬＰＡはＩＬ−８の発現を平均１００％増加させた。他の周知の脈管形成促進因子ＶＥＧＦでも同様の結果が得られた。抗ＬＰＡ  ｍＡｂによるＩＬ−８放出の阻害はまた、膵臓細胞系統Ｐａｎｃ−１などの他の癌細胞系統でも見られた。これらのデータは、脈管形成促進因子放出の遮断はこれらの抗ＬＰＡ  ｍＡｂの付加的で潜在的に重要な作用であることを示唆する。
【０２４４】
抗ＬＰＡ  ｍＡｂはin vivoにおいて脈管形成を阻害する
抗ＬＰＡ  ｍＡｂ（Ｂ７）の１つを、マトリゲルプラグアッセイを用い、in vivoにおける、その脈管形成軽減能に関して調べた。このアッセイでは、ネズミ腫瘍に由来する基底膜を含む腫瘍残物の特許混合物マトリゲルを用いる。マトリゲルまたはその誘導体growth factor-reduced (GFR) マトリゲルを動物に皮下注射し、固化させて、「プラグ」を形成させる。置床前にこのマトリックスに脈管形成促進因子を混合すれば、このプラグは血管内皮細胞の侵入を受け、やがて血管が形成する。マトリゲルは単独で調製するか、あるいは組換え増殖因子（ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ）または腫瘍細胞と混合して、その後、６週齢のヌード（ＮＣｒ  Ｎｕ／Ｎｕ）雌マウスの側腹部に皮下注射することができる。この実施例では、Ｃａｋｉ−１（腎臓癌）細胞をマトリゲル内に導入し、十分なレベルのＶＥＧＦおよび／またはＩＬ８およびＬＰＡを産生させる。マトリゲル移植１日前からはじめて３日ごとに、生理食塩水または１０ｍｇ／ｋｇの抗ＬＰＡ  ｍＡｂ−Ｂ７で処理したマウス由来のＣａｋｉ−１細胞５×１０５個を含むマトリゲルプラグを作製した。プラグの内皮ＣＤ３１を染色した後、プラグ内に形成された微小血管構造の定量を行った。定量データは、３プラグからの１切片当たりの少なくとも１６視野の平均＋／−ＳＥＭであった。抗ＬＰＡ  ｍＡｂ  Ｂ７で処理したマウスからのプラグは、ＣＤ３１に対する内皮染色二よりアッセイされるように、生理食塩水処理マウスのプラグに比べ、血管形成に著しい低下を示した。染色された血管の定量は、生理食塩水処理動物に比べ、ｍＡｂ  Ｂ７処理動物のＣａｋｉ−１含有プラグでの脈管形成に５０％を超える低下を示す。これは、抗ＬＰＡ  ｍＡｂ処置の結果としての、腫瘍細胞の脈管形成における統計学的に有意な低下であった（スチューデントのＴ検定により判定したところ、生理食塩水に対するｍＡｂ  Ｂ７はｐ＜０．０５）。
【０２４５】
抗ＬＰＡ  ｍＡｂは腎臓および膵臓異種移植片において腫瘍進行を低下させる
抗ＬＰＡ抗体は、多様なヒト腫瘍細胞系統において、ＬＰＡにより誘発される腫瘍細胞増殖、移動、細胞死からの保護およびサイトカインの放出の低減に有効であることが示されている（上記）。次に、ｍＡｂ  Ｂ５８およびＢ７を腎臓癌および膵臓癌の異種移植モデルで試験した。以下は、この抗ＬＰＡ抗体アプローチの可能性のある抗腫瘍形成作用を示す予備的結果である。
【０２４６】
腫瘍は、標準的なプロトコールを用い、４週齢の雌ヌード（ＮＣｒ  Ｎｕ／Ｎｕ）マウスの左側腹部にＣａｋｉ−１およびＰａｎｃ−１ヒト腫瘍細胞を皮下注射することにより発達させた。Ｃａｋｉ−１では１０日後、Ｐａｎｃ−１では３０日後、固形腫瘍（〜２００ｍｍ３）が形成されたところで、マウスを処理群に無作為化した。処理は２５ｍｇ／ｋｇの抗ＬＰＡ  ｍＡｂまたはビヒクル（生理食塩水）の腹腔内投与により開始した。抗体を試験期間中、３日ごとに投与した。処理は、ｃａｋｉ−１腫瘍では２５ｍｇ／ｋｇの抗ＬＰＡ  ｍＡｂ  Ｂ５８、Ｐａｎｃ−１ではｍＡｂ  Ｂ７、または生理食塩水からなった。データは、ｃａｋｉ−１試験では７つの生理食塩水と６つのＢ５８処理マウス、また、ｐａｎｃ−１試験では４つの生理食塩水と５つＢ７処理マウスの平均＋／−ＳＥＭである。腫瘍体積は電子カリパスを用いて１日おきに測定し、腫瘍体積を式Ｗ２ｘＬ／２で求めた。その後、生理食塩水群で腫瘍が１５００ｍｍ３に達した際に動物を屠殺した。最終の腫瘍体積と重量を記録した。
【０２４７】
この予備試験では、腫瘍がおよそ４００〜５００ｍｍ３の達した後に、抗ＬＰＡ  ｍＡｂの腫瘍体積を低減する能力が明らかになった。この時点で、対照動物の腫瘍は増殖し続けたが、抗ＬＰＡ  ｍＡｂ処理動物の腫瘍は両異種移植モデルでより速度の遅い増殖を示した。データは、抗ＬＰＡ  ｍＡｂが、生理食塩水処理動物に比べた場合、ｃａｋｉ−１およびｐａｎｃ−１腫瘍の最終重量も低減したことを示す。
【０２４８】
抗ＬＰＡ  ｍＡｂは腫瘍を有する動物において循環脈管形成促進サイトカインのレベルを調節する
抗ＬＰＡ  ｍＡｂ（Ｂ５８およびＢ７）は、循環脈管形成促進サイトカインのレベルにも影響を及ぼした。抗ＬＰＡ  ｍＡｂ７（Ｐａｎｃ−１）で処理した動物において、インターロイキン−８（ＩＬ−８）の血清レベルは抗体処理動物では間出できなかったが、Ｐａｎｃ−１およびＣａｋｉ−１異種移植片ではそれぞれ８５日後および６３日後に検出できた。さらに重要なこととしては、腫瘍サイズとＩＬ−８レベルの間に強い相関があった（ｒ＝０．９８）。Ｃａｋｉ−１腫瘍を有する動物では、ヒトＩＬ−８の血清レベルはまた、生理食塩水処理（ｒ＝０．５５）に比べた場合、抗ＬＰＡ  ｍＡｂ５８処理（ｒ＝０．３４）によっても低減された。上述のように、循環サイトカインレベルの低減は、腫瘍細胞それ自体からのサイトカインの放出の直接的阻害によるものであると考えられる。これらのデータは、循環脈管形成促進化合物のレベルを低減しつつ、腫瘍進行を低下させる抗ＬＰＡ  ｍＡｂの能力を示す。
【０２４９】
抗ＬＰＡ  ｍＡｂは転移のネズミモデルにおいて腫瘍進行を低減する
腫瘍進行の１つの重要な特徴は、転移して、離れた部位に二次的な腫瘍節を形成する能力である。上記のin vitro試験は、細胞運動に関するスクラッチアッセイにおいて、腫瘍細胞に接触阻害を逃れて移動を促進させるＬＰＡの能力を示した。これらの試験では、抗ＬＰＡ  ｍＡｂはまた、ＬＰＡの腫瘍増殖促進エフェクターも阻害した。抗ＬＰＡ  ｍＡｂの、in vivoにおける腫瘍転移を阻害する有効性。腫瘍転移の現象は、動物モデルで模倣することが困難であった。多くの研究者が、腫瘍細胞を血流に直接注射する「実験的」転移モデルを利用している。
【０２５０】
血管形成は、血管数の増加が、細胞が循環に達するまでに進まなければならない距離が短くなるといくことを意味するので、転移に必須のプロセスである。抗ＬＰＡ  ｍＡｂは、抗ＬＰＡ  ｍＡｂがこの転移プロセスのいくつかの必須工程を遮断することができるという発見に基づき、in vivoにおいて腫瘍細胞転移を阻害すると考えられる。
【０２５１】
試験：  高転移性ネズミ黒色腫（Ｂ１６−Ｆ１０）を用い、in vivo転移に対する３種類の抗ＬＰＡ  ｍＡｂの治療作用を調べた。このモデルは自己毒素のｃＰＡ阻害剤に高い感受性があることが示されている。４週齢の雌（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスに、尾の静脈からＢ１６−Ｆ１０ネズミ黒色腫腫瘍細胞（５×１０４細胞／動物１００μＬ）の注射を施した。マウス（１群１０匹）に３日毎に２５ｍｇ／ｋｇの抗ＬＰＡ  ｍＡｂ（Ｂ３またはＢ７のいずれか）または生理食塩水を腹腔内注射により投与した。１８日後、肺を摘出し、分析した。肺器官は黒色腫細胞の好ましい転移部位であることから、転移節に関して緊密に評価した。組織学的検査で小さな病巣でも検出できるように、膨張と固定を同時に行うため、気管を通じて１０％緩衝ホルマリンで肺を膨張させた。肺を５葉に分離し、腫瘍を寸法によって分類し（大≧５ｍｍ；中１〜４ｍｍ；小＜１ｍｍ）、解剖顕微鏡下で計数した。この肺の検査において、腫瘍の数は抗体処理動物において明らかに減少した。ｍＡｂ  Ｂ３で処理した動物では、大腫瘍が２１％、中腫瘍が１７％および小腫瘍が２２％現象した。スチューデントのＴ検定による統計学的分析は、生理食塩水に対してｍＡｂ  Ｂ３で処理した動物の小腫瘍に関してｐ＜０．０５が示された。
【０２５２】
上記実施例で示したように、ここで、ＬＰＡの腫瘍形成作用は腎臓癌（例えばＣａｋｉ−１）および膵臓癌（Ｐａｎｃ−１）細胞系統にまで拡大されることが示された。ＬＰＡは両細胞系統において、腫瘍細胞の増殖、移動、ならびにＶＥＧＦおよびＩＬ−８などの脈管形成促進性および／または転移促進性の因子の放出を誘発する。ここで、３種類の高親和性および特異的モノクローナル抗ＬＰＡ抗体が脈管形成および転移に関するin vitro細胞アッセイパネルおよびin vivo腫瘍モデルにおいて有効性を示すことが示された。
【０２５３】
実施例１１  腫瘍生検材料の免疫組織化学
本実施例の目的は、Ｓ１Ｐに対して生じたｍＡｂを用いて生検材料においてＳ１Ｐを検出することが可能なことを示すことである。この免疫組織化学的（ＩＨＣ）方法は腫瘍におけるＳ１Ｐのレベル（腫瘍自体によって産生されると考えられる）を評価し、スフィンゴシンキナーゼのタンパク質またはＲＮＡ発現を測定するよりも感受性および特異性が高いものであり得る。さらに、このＩＨＣ法は、腫瘍から分泌されたＳ１Ｐは細胞外間隙（例えば、血漿コンパートメント）に希釈されるので、Ｓ１Ｐシグナルの現象を被らない。本発明者らは、マウスマトリゲル／異種移植モデルからのＵ９３７ヒト腫瘍切片（凍結；１０μｍ厚）におけるＳ１Ｐ含量を分析した。Ｕ９３７細胞（ヒトリンパ腫細胞系統；ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１５９３．２）を１０．５ｍｇ／ｍｌ濃度のマトリゲルマトリックスと混合した。Ｕ９３７を含むマトリゲルミックス６００μＬ（３０×１０６細胞／プラグ６００μｌ容）を４〜６週齢のｎｕ／ｎｕ雌マウスの右側腹部に移植し、３０日間増殖させた。これらの動物を屠殺し、マトリゲルプラグを切り取り、ＯＴＣに包埋し、ドライアイスおよびイソペンタン中で急速凍結した。その後、クリオスタットを用いて５μｍ切片とした。次に、切片を１０％中性緩衝ホルマリン（Sigma, St. Louis MO；カタログ番号：ＨＴ５０−１−１；ロット番号０２５Ｋ４３５３）中、室温で２０分間固定した後、切片とした。これらの切片を室温で５分間、ＰＢＳ中１００ｍＭグリシン（ｐＨ７．４）で洗浄し、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で２回洗浄した。切片を室温で２０分間、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎでブロッキングした。一次抗体（例えば、ネズミ抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂ）を１％／ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ中に希釈し（示されているように１：２５または１：５０）、腫瘍切片とともに室温で３時間インキュベートした。次に、切片を、穏やかに振盪しながら、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ中に希釈した二次抗体（ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＡｂ（１：２５０）およびＲＲＸコンジュゲート抗ラットＡｂ（１：２５００または１：５００）を腫瘍切片とともに室温で１時間インキュベートした。次に、切片をＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎにて５分間隔で６回洗浄した。切片を、ＰＢＳに希釈した（１：５０００）ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジラクテート（ＤＡＰＩ、１０ｍｇ；Sigma, St. Louis MO；カタログ番号Ｄ３５７１、ロット２２７７５）とともに室温で２０分間インキュベートすることにより、ＤＡＰＩで対比染色した。次に、切片をＰＢＳにて５分間隔で２回、およびＤＩ  Ｈ２Ｏで１回洗浄し、Ｇｅｌｖｉｔｏｌマウント媒体にマウントし、乾燥させた。用いた一次抗体は１．０ｍｇ／ｍｌに希釈したＬＴ１００２（ＬＨ−２；１５ｍｇ／ｍｌ）抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂであり、１％／ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ中１：２５の実施濃度で加えた。用いた二次抗体は、１％／ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎに１：２５０希釈したフルオレセイン（ＦＩＴＣ）コンジュゲートウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch, West Grove PA；カタログ番号３１５−０９５−００３；ロット番号：６７０３１）Ａｂであった。画像をDeltaVision deconvolution microscope system (Applied Precision, Inc., Issaquah, WA.)に取り込んだ。このシステムはＮｉｋｏｎ  ＴＥ−２００倒立落射蛍光顕微鏡に取り付けたＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  ＣＣＤを含む。一般に、〜０．２μｍ間隔で８〜１０の光学切片を取り込んだ。露光時間は各蛍光団に対してカメラ応答が直線的範囲となるように設定した。レンズは２０倍と１０倍を含んだ。これらのデータセットを、Silicon Graphics Octaneワークステーション上でＳｏｆｔＷｏｒｘソフトウエア(Applied Precision, Inc)を用い、デコンヴォルーションおよび分析を行った。
【０２５４】
このＩＨＣ法を用い、一次抗体として抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂを用いた場合、腫瘍生検画像にＳ１Ｐが容易に観察できた。これに対して、一次抗体を除いた対照サンプルではＳ１Ｐ染色は見られなかった。
【０２５５】
特定の理論に縛られるものではなく、またこれらの実施例に限定されるものではないが、バイオマーカーＳ１Ｐの測定は、Ｓ１Ｐ受容体に関する遺伝子発現およびスフィンゴシンキナーゼと組み合わせて使用することができ、これらは双方ともサロゲート癌マーカーとして役立ち得る。当技術分野で公知の遺伝子発現分析の方法例としては、ＤＮＡアレイまたはマイクロアレイ(Brazma and Vilo, FEBS Lett., 2000, 480, 17 24; Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2 16)、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の一連の分析）(Madden, et al., Drug Discov. Today, 2000, 5, 415 425)、ＲＥＡＤＳ（消化ｃＤＮＡの制限酵素増幅）(Prashar and Weissman, Methods Enzymol., 1999, 303, 258 72)、ＴＯＧＡ（total gene expression analysis）(Sutcliffe, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 1976 81)、タンパク質アレイおよびプロテオミクス(Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2 16; Jungblut, et al., Electrophoresis, 1999, 20, 2100 10)、発現配列タグ（ＥＳＴ）シーケンシング(Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2 16; Larsson, et al., J. Biotechnol., 2000, 80, 143 57)、サブトラクティブＲＮＡフィンガープリント法（ＳｕＲＦ）(Fuchs, et al., Anal. Biochem., 2000, 286, 91 98; Larson, et al., Cytometry, 2000, 41, 203 208)、サブトラクティブクローニング、ディファレンシャルディスプレー（ＤＤ）(Jurecic and Belmont, Curr. Opin. Microbiol., 2000, 3, 316 21)、比較ゲノムハイブリダイゼーション(Carulli, et al., J. Cell Biochem. Suppl., 1998, 31, 286 96)、ＦＩＳＨ（蛍光in situハイブリダイゼーション）技術(Going and Gusterson, Eur. J. Cancer, 1999, 35, 1895 904)および質量分析法(To, Comb. Chem. High Throughput Screen, 2000, 3, 235 41)が含まれる。
【０２５６】
本明細書で記載および特許請求される組成物および方法は全て、本開示に照らして過度な実験なく作製および実施することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して記載してきたが、当業者ならば、これらの組成物および方法に変形が適用できることが自明である。このような当業者に自明の同等の置換および変更は全て、添付の特許請求の範囲で定義されるような本発明の精神および範囲内にあるもと考えられる。
【０２５７】
本明細書に挙げられている特許、特許出願および刊行物は全て、本発明が属する技術分野の熟練者の水準を示す。特許、特許出願および刊行物は、それに優先するものまたは別の利益が請求されているものを含め、全てが、あたかも個々の刊行物が具体的かつ個々に出典明示により本明細書の一部とされることが示されている場合と同様に、出典明示により本明細書の一部とされる。
【０２５８】
本明細書に定義例示的に記載されている発明は、本明細書に具体的に開示されていない要素がなくても実施可能である。よって、例えば、本発明の各場合において、「含む」、「から本質的になる」および「からなる」とは、他の２つの用語のいずれとも置き換えることができる。用いられているこれらの用語および表現は、記載の用語として用いられ、限定するものではなく、このような用語および表現の使用において、示され、記載された特徴またはその一部の等価物を排除するものではなく、特許請求される本発明の範囲内で様々な変形や変更が可能であると認識される。従って、本発明は好ましい実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示されている概念の改変や変更も当業者であれば言及可能であり、また、このような変形や変更は添付の特許請求の範囲で定義されるような本発明の精神および範囲内にあるもとみなされる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１０】
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【図７−１１】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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