(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一組の平行に対向する二面と、
該二面に直交する少なくとも一組の平行に対向する二面を持つプリズムと、
前記何れかの二面のうちの何れか一面から所定の角度で前記プリズム内に光を入射する光入射手段とを備え、
前記一面の光入射部を除く部分と該一面と平行に対向する面とは、鏡面で構成されると共に、
前記光入射手段は、前記光入射部を持つ面に直交する前記一組の二面での全反射と前記鏡面での反射とが前記プリズム内で繰り返される入射角度θにて該プリズム内に光を入射し、且つ、最初の入射ポイントと、前記一組の二面での全反射と前記鏡面での反射とを経て前記光入射部を持つ面に戻って反射するポイントとのずれが、光の幅となるように、
光の幅＝｜２×[プリズムの厚さ−プリズムの長さ×ｔａｎ｛ｓｉｎ-1（光の入射側屈折率／プリズムの屈折率×ｓｉｎθ）｝］｜
の式を満たす前記入射角度θを選択したことを特徴とするエバネッセント波発生装置。
【請求項２】
一組の平行に対向する二面と、
該二面に直交する少なくとも一組の平行に対向する二面を持つプリズムと、
前記何れかの二面のうちの何れか一面から所定の角度で前記プリズム内に光を入射する光入射手段とを備え、
前記一面の光入射部を除く部分と該一面と平行に対向する面とは、鏡面で構成されると共に、
前記光入射手段は、前記光入射部を持つ面に直交する前記一組の二面のうちの何れか一面と該一面と平行に対向する一面に直接配置された容器面、若しくは、前記光入射部を持つ面に直交する前記一組の二面のうちの何れか一面と該一面と平行に対向する一面に媒体を介して配置された容器面での全反射と前記鏡面での反射とが前記プリズム内で繰り返される入射角度θにて該プリズム内に光を入射し、且つ、最初の入射ポイントと、前記一組の二面での全反射と前記鏡面での反射とを経て前記光入射部を持つ面に戻って反射するポイントとのずれが、光の幅となるように、
光の幅＝｜２×[プリズムの厚さ−プリズムの長さ×ｔａｎ｛ｓｉｎ-1（光の入射側屈折率／プリズムの屈折率×ｓｉｎθ）｝］｜
の式を満たす前記入射角度θを選択したことを特徴とするエバネッセント波発生装置。
【請求項３】
前記光入射部を持つ面に直交する前記一組の二面のうちの何れか一面は、鏡面で構成されることを特徴とする請求項１又は請求項２のエバネッセント波発生装置。
【請求項４】
前記光入射部を持つ面に直交する前記一組の二面、若しくは、前記光入射部を持つ面に直交する前記一組の二面のうちの何れか一面と該一面と平行に対向する一面に直接配置された容器面、或いは、前記光入射部を持つ面に直交する前記一組の二面のうちの何れか一面と該一面と平行に対向する一面に媒体を介して配置された容器面にて発生するエバネッセント波により測定サンプルの散乱光及び／又は蛍光を検出する手段を備えたことを特徴とする請求項１乃至請求項３の何れかに記載のエバネッセント波発生装置を用いた観察装置。
【請求項５】
前記散乱光及び／又は蛍光を波長に応じて選択的に通過させる複数種類のフィルタを備えたことを特徴とする請求項４に記載の観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エバネッセント波を発生させるエバネッセント波発生装置及びそれを用いた観察装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年組織工学では、細胞培養を基本とした組織再生の研究が注目を集め、医療の質までもかえると言われている。その中でも、培養した細胞を医療デバイスに付与することで移植時に生体との適合性をあげる技術（例えば、骨基材の上に培養細胞をのせる技術）や、各機能を有する細胞へ培養する技術（例えば、間葉系幹細胞から心筋、血管、皮膚などの細胞へ分化する技術）などが再生医療の発展により急速に進歩して来ている。このような細胞培養技術においては、培養された細胞の状態を評価した上で、医療目的で用いる必要があり、そのための装置や技術も組織工学の進歩と共に発展しつつある。
【０００３】
特に、エバネッセント波を用いた観察装置は、全反射面から細胞の一部（全反射面から上方約１００ｎｍ）だけを観察することができ、バックグラウンドを抑えた鮮明な観察図を得ることが可能であるため、培養容器に接触し増殖する細胞の状態を、より明確に観察することができるものとして注目されつつある。具体的に、この装置は、図３９に示すように観察する細胞の乗ったサンプル容器１４０の底面（屈折率境界面であり、全反射面となる）にプリズム１０５などを利用し、所定角度で励起光を照射して、サンプル容器１４０の底面（屈折率境界面、且つ、全反射面）で反射させ、そのとき全反射面の上に発生するエバネッセント波により全反射面から上方約１００ｎｍの間にある観察サンプル（細胞）を励起させるものである。
【０００４】
このように光（エバネッセント波）が到達する領域を約１００ｎｍに限定して、その領域にある観察サンプル（細胞）から発生した散乱光や蛍光を検出することで、観察サンプルの状況をより明確に検出することが可能となり、バックグラウンドのノイズを抑えることができるようになり、より鮮明な蛍光観察が可能になった。しかしながら、このような装置においても平面方向で観察できる範囲は全反射面で光が当たる場所だけとなる。即ち、観察できる範囲は、光線の幅（太さ）に依存する（図４０）。この問題を解決するためには、図４１の如く、全反射のポイントを増やすことで、エバネッセント波の発生範囲を広げることも、平面方向の観察範囲を広げる１つの手段である。特に、再生医療の分野などでは、細胞の局所的な観察ではなく、治療に用いる細胞サンプル全体の状態を短時間で観察したいとの要望が強かった。
【０００５】
このように観察範囲を広げるために、全反射面で複数回全反射を起させる装置も開発されて来ている（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
上記特許文献１に記載の装置は、スライドガラスの上に観察サンプルを配置し、このスライドガラスの側面から励起光を入射させて、当該スライドガラスを励起光の伝搬する光路としたものである。即ち、スライドガラスの側面からこのスライドガラス内に入射した励起光は、一面と他面とでそれぞれ全反射しながら、当該スライドガラス内を進み、反対の側面から出ることとなる。このとき、励起光が全反射した箇所（ポイント）ではエバネッセント波が発生するので、そのエバネッセント波の到達領域にある細胞から散乱光や蛍光を発生させることができる。このような装置により、観察範囲を面に拡大することができるようになった。
【特許文献１】特開平９−６１３４６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、このようなエバネッセント波を用いた装置において、広範囲で、高感度な観察面を得るためには、全反射の回数をより多くすると共に、各面の全反射のポイントがより密となる、即ち、全反射面において全反射のポイントの密度を上げる必要がある。しかしながら、上記装置を用いた場合、全反射の回数を多くするためには、スライドガラスの厚さをより薄くする必要があるが、スライドガラスの厚さを薄くするには限界があるため、高感度な観察を実現することが出来なかった。
【０００８】
このような問題に鑑みて、本発明は、係る従来の技術的課題を解決するために成されたものであり、広範囲、且つ、高密度で全反射を起させてエバネッセント波を得ることができるエバネッセント波発生装置と、このエバネッセント波発生装置を用いて細胞など観察対象物質の観察を高感度、且つ、広範囲で実現できる観察装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
請求項１の発明のエバネッセント波発生装置は、一組の平行に対向する二面と、この二面に直交する少なくとも一組の平行に対向する二面を持つプリズムと、何れかの二面のうちの何れか一面から所定の角度でプリズム内に光を入射する光入射手段とを備え、一面の光入射部を除く部分とこの一面と平行に対向する面とは、鏡面で構成されると共に、光入射手段は、光入射部を持つ面に直交する一組の二面での全反射と鏡面での反射とがプリズム内で繰り返される入射角度θにてこのプリズム内に光を入射し、且つ、最初の入射ポイントと、前記一組の二面での全反射と鏡面での反射とを経て光入射部を持つ面に戻って反射するポイントとのずれが、光の幅となるように、
光の幅＝｜２×[プリズムの厚さ−プリズムの長さ×ｔａｎ｛ｓｉｎ-1（光の入射側屈折率／プリズムの屈折率×ｓｉｎθ）｝］｜
の式を満たす前記入射角度θを選択したことを特徴とする。
【００１０】
請求項２の発明のエバネッセント波発生装置は、一組の平行に対向する二面と、この二面に直交する少なくとも一組の平行に対向する二面を持つプリズムと、何れかの二面のうちの何れか一面から所定の角度でプリズム内に光を入射する光入射手段とを備え、一面の光入射部を除く部分とこの一面と平行に対向する面とは、鏡面で構成されると共に、光入射手段は、光入射部を持つ面に直交する一組の二面のうちの何れか一面とこの一面と平行に対向する一面に直接配置された容器面、若しくは、光入射部を持つ面に直交する一組の二面のうちの何れか一面とこの一面と平行に対向する一面に媒体を介して配置された容器面での全反射と鏡面での反射とが前記プリズム内で繰り返される入射角度θにてこのプリズム内に光を入射し、且つ、最初の入射ポイントと、前記一組の二面での全反射と鏡面での反射とを経て光入射部を持つ面に戻って反射するポイントとのずれが、光の幅となるように、
光の幅＝｜２×[プリズムの厚さ−プリズムの長さ×ｔａｎ｛ｓｉｎ-1（光の入射側屈折率／プリズムの屈折率×ｓｉｎθ）｝］｜
の式を満たす前記入射角度θを選択したことを特徴とする。
【００１１】
請求項３の発明のエバネッセント波発生装置は、上記各発明において光入射部を持つ面に直交する一組の二面のうちの何れか一面は、鏡面で構成されることを特徴とする。
【００１２】
請求項４の発明の観察装置は、光入射部を持つ面に直交する一組の二面、若しくは、光入射部を持つ面に直交する一組の二面のうちの何れか一面とこの一面と平行に対向する一面に直接配置された容器面、或いは、光入射部を持つ面に直交する一組の二面のうちの何れか一面とこの一面と平行に対向する一面に媒体を介して配置された容器面にて発生するエバネッセント波により測定サンプルの散乱光及び／又は蛍光を検出する手段を備えたことを特徴とする請求項１乃至請求項３の何れかに記載のエバネッセント波発生装置を用いたものである。
【００１３】
請求項５の発明の観察装置は、請求項４に記載の発明において散乱光及び／又は蛍光を波長に応じて選択的に通過させる複数種類のフィルタを備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
請求項１の発明のエバネッセント波発生装置によれば、一組の平行に対向する二面と、この二面に直交する少なくとも一組の平行に対向する二面を持つプリズムと、何れかの二面のうちの何れか一面から所定の角度でプリズム内に光を入射する光入射手段とを備え、一面の光入射部を除く部分とこの一面と平行に対向する面とは、鏡面で構成されると共に、光入射手段は、光入射部を持つ面に直交する一組の二面での全反射と鏡面での反射とがプリズム内で繰り返される入射角度θにてこのプリズム内に光を入射するので、光入射部を持つ面に直交する一組の二面でより多くの全反射を高密度で生じさせて、広範囲の領域で簡便にエバネッセント波を発生することができるようになる。
【００１５】
これにより、当該エバネッセント波発生装置を用いて細胞等の観察を広範囲、且つ、高感度で実現可能となる。特に、最初の入射ポイントと、前記一組の二面での全反射と鏡面での反射とを経て光入射部を持つ面に戻って反射するポイントとのずれが、光の幅となるように、
光の幅＝｜２×[プリズムの厚さ−プリズムの長さ×ｔａｎ｛ｓｉｎ-1（光の入射側屈折率／プリズムの屈折率×ｓｉｎθ）｝］｜
の式を満たす前記入射角度θを選択したので、全反射のポイントを密にして、光の漏れを無くした効率の良い全反射面を得ることが可能となり、広範囲に渡って高感度の観察面を得ることができるようになる。
【００１６】
請求項２の発明のエバネッセント波発生装置によれば、一組の平行に対向する二面と、この二面に直交する少なくとも一組の平行に対向する二面を持つプリズムと、何れかの二面のうちの何れか一面から所定の角度でプリズム内に光を入射する光入射手段とを備え、一面の光入射部を除く部分とこの一面と平行に対向する面とは、鏡面で構成されると共に、光入射手段は、光入射部を持つ面に直交する一組の二面のうちの何れか一面とこの一面と平行に対向する一面に直接配置された容器面、若しくは、光入射部を持つ面に直交する一組の二面のうちの何れか一面とこの一面と平行に対向する一面に媒体を介して配置された容器面での全反射と鏡面での反射とが前記プリズム内で繰り返される入射角度θにてこのプリズム内に光を入射するので、光入射部を持つ面に直交する一組の二面のうちの何れか一面とこの一面に平行に対向する一面に直接配置された容器面、若しくは、光入射部を持つ面に直交する一組の二面のうちの何れか一面とこの一面と平行に対向する一面に媒体を介して配置された容器面でより多くの全反射を高密度で生じさせて、広範囲の領域で簡便にエバネッセント波を発生することができるようになる。
【００１７】
これにより、当該エバネッセント波発生装置を用いて細胞等の観察を広範囲、且つ、高感度で実現可能となる。特に、最初の入射ポイントと、前記一組の二面での全反射と鏡面での反射とを経て光入射部を持つ面に戻って反射するポイントとのずれが、光の幅となるように、
光の幅＝｜２×[プリズムの厚さ−プリズムの長さ×ｔａｎ｛ｓｉｎ-1（光の入射側屈折率／プリズムの屈折率×ｓｉｎθ）｝］｜
の式を満たす前記入射角度θを選択したので、全反射のポイントを密にして、光の漏れを無くした効率の良い全反射面を得ることが可能となり、広範囲に渡って高感度の観察面を得ることができるようになる。
【００１８】
また、請求項３の発明では、上記各発明において光入射部を持つ面に直交する一組の二面のうちの何れか一面は、鏡面で構成されるので、光入射部を持つ面に直交する一組の二面のうちの何れか一面、若しくは、この一面に直接配置された容器面、或いは、当該一面に媒体を介して配置された容器面のみで光を全反射させることができる。特に、全反射させる面にゴミなどの不純物が付着すると、そこで光の散乱が起こり難くなり、全反射が得られなくなるので、全反射させる面、若しくは、当該一面に直接配置された容器面、或いは、媒体を介して配置された容器面のみとすることで、光の伝達の不具合が生じる不都合を極力抑えることができるようになる。
【００１９】
請求項４の発明の観察装置によれば、請求項１乃至請求項３の何れかに記載のエバネッセント波発生装置の光入射部を持つ面に直交する一組の二面、若しくは、光入射部を持つ面に直交する一組の二面のうちの何れか一面とこの一面と平行に対向する一面に直接配置された容器面、或いは、光入射部を持つ面に直交する一組の二面のうちの何れか一面とこの一面と平行に対向する一面に媒体を介して配置された容器面にて発生するエバネッセント波により測定サンプルの散乱光及び／又は蛍光を検出する手段を備えたので、細胞などの観察対象物質となる測定サンプルの散乱光や蛍光を検出することができるようになる。
【００２０】
これにより、上記各発明のエバネッセント波発生装置を用いて測定サンプルの散乱光や蛍光を検出することが可能となり、従来の装置のような局所的な観察範囲でなく、広範囲に渡り、且つ、高感度な観察を可能とした観察装置を構築することができるようになる。特に、プリズム面に直接配置することができない測定サンプル、例えば、培養容器中の細胞などを観察する場合にも有効であると共に、媒体が挿入されるものとすれば、プリズムと容器を密着させて屈折率を調節でき、且つ、容器と測定サンプルの境界面での全反射を起こすことができるようになる。
【００２１】
更に、上記請求項４の発明において請求項５の如く散乱光及び／又は蛍光を波長に応じて選択的に通過させる複数種類のフィルタを備えるものとすれば、観察の目的等に応じて検出する波長を自在に選択することができるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、図面に基づき本発明の実施形態を詳述する。
【実施例１】
【００２３】
図１は本発明の一実施例のエバネッセント波発生装置１を備えた観察装置Ｓ１の構成図を示している。この観察装置Ｓ１は、後述するエバネッセント波発生装置１と、光検出手段２０とを備える。具体的に、本実施例の観察装置Ｓ１は、エバネッセント波発生装置１により発せられたエバネッセント波を細胞等の観察対象物質となる測定サンプル（本実施例では測定対象を励起光の照射により蛍光を発する細胞とする）が収容されたサンプル容器４０の下面から照射することにより、細胞から散乱光や蛍光をサンプル容器４０の一方（図１では上方）に配置された光検出手段２０にて検出する構成とされている。
【００２４】
上記光検出手段２０は、前記エバネッセント波発生装置１からの励起光により細胞からの散乱光や蛍光を検出するための手段である。本実施例の光検出手段２０は、細胞からの散乱光や蛍光を集光するための対物レンズ４５と、散乱光や蛍光から特定の波長を除去する光フィルタ４６と、この光フィルタ４６を通過した散乱光や蛍光を結像する結像レンズ４７と、結像レンズ４７からの光像を二次元的に検出し撮像するＣＣＤカメラ４８から構成されている。尚、散乱光や蛍光を検出する手段は、実施例の光検出手段２０に限らず、散乱光や蛍光を検出できるものであればどのような検出手段であっても差し支えない。例えば、実施例では、ＣＣＤカメラ４８を用いるものとしたが、フォトダイオード等の受光素子を用いても構わない。尚、図１において、５０はレンズ、５２は光ファイバーであり、散乱光や蛍光を効率よく集光し、受光素子に導くためのものである。
【００２５】
次に、前述した本発明のエバネッセント波発生装置１について説明する。本発明のエバネッセント波発生装置１は、一組の平行に対向する二面とこの二面に直交する少なくとも一組の平行に対向する二面を持つプリズム５と、何れかの二面のうちの何れか一面から所定の角度でプリズム５内に光を入射する光入射手段１０とを備えたものである。
【００２６】
実施例のプリズム５はＢＫ７（ＳＣＨＯＴＴ  ＧＬＡＳＳ社製）から成るもので、この屈折率は１．５２である。このプリズム５は、一組の平行に対向する二面５Ａ、５Ｂとこの二面に直交する一組の平行に対向する二面５Ｃ、５Ｄを持つ。具体的に本実施例のプリズム５は、図２に示すように長手方向の寸法（長さ）Ｌが８２ｍｍ、高さ方向の寸法（厚み）Ｔが３６ｍｍの直方体にて構成されている。そして、上記一面５Ａには後述する光入射手段１０からの励起光の光入射部８が構成されている。この光入射部８は、光入射手段１０からの励起光をプリズム５内に入射するための励起光入射ポイントである。また、この一面５Ａの上記光入射部８を除く部分とこの一面５Ａと平行に対向する面５Ｂとは、鏡面７で構成されている。
【００２７】
鏡面７はプリズム５の一面５Ａ（図２では前面）とそれに対向する面５Ｂ（図２では背面）の上端部及び下端部を除く部分にそれぞれ構成されている。本実施例の鏡面７は、高さ方向の寸法（厚さ）が１９ｍｍであり、プリズム５の各面５Ａ、５Ｂの高さ方向の中心と該鏡面７の高さ方向の中心とが略同一となるように当該面５Ａ、５Ｂに設けられている。
【００２８】
尚、本実施例では励起光入射ポイントとしての光入射部８を鏡面の下側として、ここから励起光をプリズム５内に入射するものとするが、これに限らず、光入射部８を鏡面の上側としても構わない。また、この実施例では、鏡面７を一面５Ａ（図２では前面）とそれに対向する面５Ｂ（図２では背面）の上端部及び下端部を除く部分にそれぞれ構成するものとしたが、鏡面７の構成はこれに限定されるものでなく、例えば、図２５乃至図３０に示すように種々の構成が適用可能である。即ち、一面５Ａは、少なくとも光入射手段１０からの励起光をプリズム５内に入射させる光入射部８以外の面に鏡面７が構成されていればどのような構成であれば、図２及び図３０乃至図２８の構成に限らず有効である。特に、一面５Ｂにおいては、図３１に示すように全面を鏡面７としても構わない。
【００２９】
一方、前述した光入射手段１０は、前述したプリズム５内に所定の角度で光を入射する励起光源である。本実施例の光入射手段１０は、ランプ（例えば、水銀ランプ等）と光学フィルタとレンズから構成されている。このランプの光は、種々の成分の波長を含んでいるが、光学フィルタを通過させることで、特定波長以外の光のみが光学フィルタによりカットされ、特定波長の光（予め設定された波長の光）のみが光学フィルタを透過し、この通過した光が励起光として、レンズ及び波長板１１を介して射出されることとなる。
【００３０】
当該光入射手段１０から射出される励起光は、いかなる波長でも良いが検出したい細胞の特性に合わせて、波長を選択するものとしても良い。
【００３１】
ところで、従来のエバネッセント波を用いた観察装置では、図４０に示すように細胞等の下面の一点に励起光を照射して、そこで全反射させエバネッセント波を発生させて、そのエバネッセント波の到達領域において散乱光や蛍光を発生させるものであった。即ち、このような従来の装置において観察できるのは、局所的な観察範囲、即ち、励起光を全反射させた箇所にあるピントのあった近傍の細胞のみであり、広範囲な観察を行うことができなかった。特に、再生医療の分野では、係る局所的な観察よりも全体の状態を短時間で観察したいという要望が強かった。
【００３２】
このように、より広範囲での観察を可能とするためには、対象となる細胞など（観察対象物質）の下面でより多く全反射を起こさせて、広範囲の領域で全反射によるエバネッセント波を得なければならない。このような広範囲での観察を目的として、図３８に示すスライドガラス６０上に細胞を配置し、当該スライドガラス６０内に光を入射して該光を伝搬させる光路としたエバネッセント波発生装置も開発されて来ている。この場合、一端側面からスライドガラス６０内に入射した励起光は当該スライドガラス６０の一面６０Ａと他面６０Ｂとでそれぞれ全反射しながらスライドガラス６０内を進み、他端側面から出ることとなる。このとき、光が全反射した箇所ではエバネッセント波が発生し、そのエバネッセント波の到達領域にある細胞から散乱光や蛍光を発生させることができる。
【００３３】
上記の如くスライドガラス６０上に細胞を配し、そのスライドガラス６０に光を伝搬させて全反射を複数起こさせることで、細胞の下面により多くのエバネッセント波を発生させることが可能となり、観察範囲を面に拡大することができるようになった。
【００３４】
ところで、このようなエバネッセント波を用いた装置において、広範囲で、高感度な観察面を実現するためには、全反射の回数をより多くすると共に、各面の全反射のポイントがより密となる、即ち、全反射面において全反射をより密に生じさせる必要がある。この場合、上記装置では、スライドガラス６０の厚さをより薄くしなければならないが、スライドガラスの厚さを薄くするには限界があるため、従って、全反射のポイントを密とすることが困難で、高感度な観察を実現することが出来なかった。
【００３５】
そこで、本発明では、上述したようにプリズム５と、このプリズム５の一組の平行に対向する二面５Ａ、５Ｂに鏡面７を構成し、鏡面７が構成された二面５Ａ、５Ｂに直交する一組の平行に対向する二面５Ｃ、５Ｄ、若しくは、面５Ｄとこの面５Ｄと平行に対向する一面５Ｃに直接配置されたサンプル容器４０の面、或いは、面５Ｄとこの面５Ｄとへ以降に対向する一面５Ｃに屈折率を調整するための媒体（イマルジョンオイル、オイル、ショ糖や食塩などの水溶液、ゲル、シリコン等）を介して配置されたサンプル容器４０の面での全反射と鏡面７での反射が繰り返されるような角度でプリズム５内に光入射手段１０からの励起光を入射するものとする。
【００３６】
この場合、上述したように光入射手段１０からの励起光がプリズム面５Ｃ、５Ｄ、若しくは、これらプリズム面５Ｃ、５Ｄに直接配置されたサンプル容器４０の面、或いは、各プリズム面５Ｃ、５Ｄに屈折率を調整するための媒体を介して配置されたサンプル容器４０の面で全反射と鏡面７での反射が繰り返されるような角度でプリズム５内に入射させて、各プリズム面５Ｃ、５Ｄにおける全反射のポイントを密となる最適な角度を求める必要がある。
【００３７】
上記最適な角度は、プリズム５の面５Ｃに直接対象物質を配置する場合には、プリズムの材質（特に、屈折率）、長さ寸法Ｌや厚さ寸法Ｔ、対象物質の屈折率を考慮して設定する必要がある。また、図１の装置Ｓ１の如くプリズム面５Ｃにサンプル容器４０を配置しこのサンプル容器４０内に観察対象物質となる測定サンプルを収容する場合には、上記に加えてサンプル容器４０の材質（特に、屈折率）、厚さ寸法等も考慮する必要がある。更に、サンプル容器４０を屈折率を調整するための媒体を介してプリズム面５Ｃに配置する場合には、この屈折率を調整するための媒体の屈折率等も考慮しなければならない。
【００３８】
本実施例では、上述したプリズム５の面５Ｃに直接、測定サンプル（例えば、培養細胞など）を載せた場合における最適な入射角度の決定方法について説明する。この場合、全反射面はプリズム５のプリズム面５Ｃと検出対象との境界面となる。
【００３９】
先ず、光入射手段１０からプリズム５内に或る角度、例えば、図３に示すように３７度で励起光を入射させた場合、プリズム面５Ｃで起こる全反射の角度（全反射角）をスネルの式（数式（１））より求める。
ｎ１×ｓｉｎθ１＝ｎ２×ｓｉｎθ２  ・・・（１）
この場合、数式（１）において、ｎ１は空気の屈折率（即ち、１である）、ｎ２はプリズム５の屈折率（上述した１．５２）、θ１は光入射手段１０からの励起光の入射角度（ここでは３７度）、θ２はプリズム５に入射した直後の励起光の角度となるので（図３参照）、
１ｓｉｎ３７＝１．５２ｓｉｎＸ
Ｘ＝２３．３２
となる。Ｘは上述したようにプリズム５に入射した直後の励起光の角度であり、プリズム５に入射した直後の励起光の角度とプリズム面５Ｃで生じる反射の角度（全反射角）との和は、９０度となるので、
全反射角＋Ｘ＝９０
即ち、
全反射角＝９０−Ｘ
となり、Ｘに上記算出値を代入すると、
全反射角＝９０−２３．３２＝６６．６８
従って、プリズム５に３７度の入射角度で光入射手段１０から励起光を入射させた場合、プリズムにおける全反射角は６６．６８度となる。
【００４０】
以上より、光入射手段１０からプリズム５内に入射する励起光の入射角度θ１の場合のプリズム面５Ｃにおける全反射角Ａは、励起光入射側の屈折率をｎ１、プリズム５の屈折率をｎ２とすると、以下数式（２）から導くことができる。
Ａ＝９０−ｓｉｎ-1（ｎ１×ｓｉｎθ１／ｎ２）・・・（２）
【００４１】
次に、前記数式（１）によりプリズム５のプリズム面５Ｃに対象物質を配置した場合、その対象物質の下面で全反射が起こる角度（全反射角）を求める。この場合、数式（１）において、ｎ１はプリズム５の屈折率（上述した１．５２）、ｎ２は測定サンプルの屈折率、θ１は全反射が起こる角度Ｂ、θ２は９０度となる。
【００４２】
ここで、図４に示す如くプリズム５のプリズム面５Ｃに配置する測定サンプルを水とすると、水の屈折率は１．３３であるので、
ｎ１×ｓｉｎθ１＝ｎ２×ｓｉｎθ２
１．５２×ｓｉｎＢ＝１．３３×ｓｉｎ９０
ｓｉｎＢ＝１．３３／１．５２
Ｂ＝６１．０４４９８
となる。従って、対象物質が水の場合、プリズム面５Ｃで生じる反射の角度（全反射角）が６１．０５度以上になると全反射が起こることとなる。
【００４３】
一方、プリズム５のプリズム面５Ｃに配置する測定サンプルを、例えば、屈折率が１．３８の細胞とすると、
ｎ１×ｓｉｎθ１＝ｎ２×ｓｉｎθ２
１．５２×ｓｉｎＢ＝１．３８×ｓｉｎ９０
ｓｉｎＢ＝１．３８／１．５２
Ｂ＝６５．２１６
となる。従って、測定サンプルが屈折率１．３８の細胞である場合には、プリズム面５Ｃで生じる反射の角度（全反射角）が６５．２２度以上になると全反射が起こることとなる。
【００４４】
以上の結果に基づき、プリズム面５Ｃで全反射が起こる角度以上となる入射角度の範囲で、プリズム５内に光入射手段１０から励起光を入射して、プリズム面５Ｃに生じる全反射の入射角度依存性について調べた。この結果を、図５乃至図９に示す。図５乃至図９は各入射角度でプリズム５内に励起光を入射した場合にプリズム５内を通過する励起光の光路を示している。尚、図６乃至図９ではプリズム５の面５Ａ及び面５Ｂに設けられた鏡面７を省略しているが、実際には図５に示すように鏡面７が存在する。
【００４５】
図５に示すように、プリズム５に入射角度３４度で励起光を入射した場合、プリズム５内に入射した励起光は、当該プリズム５内を充分に繰り返すことなく、太線矢印の如く面５Ａ、５Ｂの鏡面７が配置されていない部分からすぐに漏れてしまい、プリズム面５Ｃ（プリズム面５Ｄも同様）における全反射のポイントを密にすることができなかった。
【００４６】
また、図６はプリズム５に入射角度３５度で励起光を入射した場合の結果である。この場合も、前記図７と同様にプリズム５内に入射した励起光は、面５Ａ、５Ｂの鏡面７が配置されていない部分からすぐに漏れてまうため（図６に示す太線矢印）、プリズム面５Ｃ（プリズム面５Ｄも同様）における全反射のポイントを密にすることができなかった。
【００４７】
図７はプリズム５に入射角度３６度で励起光を入射した場合の結果である。この場合、面５Ａ、５Ｂの鏡面７が配置されていない部分からすぐに漏れずに、励起光がプリズム５内をくり返し反射するようになった。従って、プリズム面５Ｃ（プリズム面５Ｄも）における全反射のポイントを比較的密な状態とすることができるようになった。
【００４８】
更に、図８はプリズム５に入射角度３７度で励起光を入射した場合の結果である。この場合、プリズム５からすぐに漏れずに、励起光がプリズム５内を繰り返し反射するようになった。従って、プリズム面５Ｃ（プリズム面５Ｄも）における全反射のポイントをより密な状態とすることができるようになる。
【００４９】
そして、図９はプリズム５に入射角度３８度で励起光を入射した場合の結果である。この場合には、プリズム５に入射した励起光は、面５Ａ、５Ｂの鏡面７で反射することなく、太線矢印で示すように全て面５Ａ、５Ｂの鏡面７が配置されていない部分から漏れてしまった。
【００５０】
以上の結果から、上記プリズム５を用いた場合、図８に示すように入射角度を３７度とした場合にプリズム面５Ｃ（プリズム面５Ｄも同様）における全反射のポイントを最も密な状態とすることができることがわかった。
【００５１】
他方、図１０は、上記プリズム５以外のプリズムを用いた場合に、プリズム面において最も好ましい高密度な全反射を生じさせることができた結果を示している。この場合、用いたプリズムは、上記プリズム５と厚さ寸法が同じで（３６ｍｍ）、長さ寸法が異なる（７７ｍｍ）のプリズム６を用いた。また、プリズム６の材質は、上記プリズム５と同じ、ＢＫ７（ＳＣＨＯＴＴ  ＧＬＡＳＳ社製）であり、屈折率も同様に１．５２である。
【００５２】
このプリズム６を用いた場合には、図１０に示す如く入射角度を４０度とした場合にプリズム面６Ｃ（プリズム面６Ｄも同様）における全反射のポイントを最も密な状態とすることができた。
【００５３】
このように、同じ材質のプリズムを用いた場合であっても、厚さ寸法と長さ寸法との比率を変更することで、プリズムにおいて全反射のポイントが変わるため、最適な入射角度が相違することがわかった。そこで、厚さ寸法と長さ寸法の比率の異なる幾つかのプリズムを用いて入射角度とそのとき、プリズム面における全反射のポイントの密度を測定した。その結果を図１１に示す。図１１は、各比率（長さ寸法／厚さ寸法）のプリズムを用いて、入射角度を変更した場合におけるプリズム面に生じる全反射のポイントの密度、即ち、プリズム面１ｍｍ単位辺りにおける全反射の生じた回数を示している。図１１において、比率が２．２８のプリズムを用い、入射角度３６度とした結果（即ち、全反射のポイントの密度０．１４３３（回／ｍｍ））が前記プリズム５を用いた図７の結果に相当し、同比率（２．２８）のプリズムを用いて、入射角度を３７度とした結果が前記図８の結果に相当する。
【００５４】
図１１において、プリズム面１ｍｍ単位辺りにおける全反射の生じた回数が０．０９（回／ｍｍ）〜０．１４（回／ｍｍ）である場合には、プリズム面の全面にて全反射を得ることができたが、全反射のポイントを密とすることができなかった。従って、充分な感度を得ることが出来ないものと考えられる。一方、０．１４（回／ｍｍ）〜０．３５（回／ｍｍ）となる場合、プリズム面の全面に全反射を得ることができ、且つ、全反射のポイントが比較的密な状態となった。従って、良好な感度を得ることが出来るものと考えられる。更に、プリズム面１ｍｍ単位辺りにおける全反射の生じた回数が０．３５（回／ｍｍ）以上となると、全反射のポイントがより密な状態となった。
【００５５】
図１２に、上記図１１のプリズム面１ｍｍ単位辺りにおける全反射の生じた回数が０．０９（回／ｍｍ）〜０．１４（回／ｍｍ）を１、０．１４（回／ｍｍ）〜０．３５（回／ｍｍ）を２、０．３５（回／ｍｍ）以上を３としてプリズム面における全反射のポイントの密度を１〜３で評価した。このように、各プリズムに応じて、図１２に示す密度の評価値が２以上となるような入射角度を選択することで、広範囲にわたって感度の良好な観察面を得ることができるようになり、好ましくは、密度の評価値が３となるような入射角度を選択することで、広範囲で、且つ、より高感度な観察面を得ることができる。
【００５６】
次に、反射パターン別の光の反射ポイントのずれと全面全反射の効率について説明する。図２３は、面５Ａに構成された鏡面７の下側から励起光を入射した場合の反射パターン、図２４は、面５Ａの鏡面７の上側から励起光を入射した場合の反射パターンの一例を示している。図２３の場合、光入射手段１０により面５Ａからプリズム５内に励起光を入射すると、入射した励起光は、プリズム面５Ｄで全反射し、次いで、面５Ｂの鏡面７で反射して、プリズム面５Ｃで全反射した後、面５Ａに戻る。そして、面５Ａの鏡面で反射し、再びプリズム面５Ｄで全反射を起こし、これらの過程を繰り返しながら全面全反射の状態を形成する。面５Ａでの最初の入射ポイントと、プリズム面５Ｄ、面５Ｂ及びプリズム面５Ｃを経た後、再び面５Ａに戻り、この面５Ａで反射するポイントとのずれをｋとすると、プリズム５の厚さ寸法Ｔと、プリズム５の長さ寸法Ｌ、光入射手段１０からプリズムに入射する光の入射角度θの関係は、以下の数式（３）で表すことができる。
ｋ＝２×[Ｔ−Ｌ×ｔａｎ｛ｓｉｎ-1（ｎ１／ｎ２×ｓｉｎθ）｝］・・・（３）
【００５７】
ここで、光入射手段１０から照射される励起光の光線密度が光線内で一定であると仮定すると、励起光の幅（光線幅）とｋとの間には以下の関係がある。即ち、図２３の如く面５Ａに構成された鏡面７の下側から励起光を入射すると、数式（３）にて算出されるｋを、ｋ＜０、或いは、ｋ＝０とした場合、プリズム５に入射した励起光は１回の全反射の後、全ての光が漏れる。また、０＜ｋ＜励起光の幅とすると、密な全反射ポイントを得ることができるが一部の光が漏れる。全反射のポイントの密度のみを考慮するとｋの値が０に近いほど全反射のポイントが増えるが漏れる光も多くなる。ｋ＝励起光の幅とすると、光が漏れることなく密な全反射を得ることができ、光の漏れを無くした最も効率のよい全反射面を得ることができる。更に、ｋ＞励起光の幅とすると、プリズム５内に全反射のポイントを得ることができるが、ｋと励起光の幅の差が大きくなるに伴い、全反射の密度が低下する。
【００５８】
一方、図２４の如く面５Ａの鏡面７の上側から励起光を入射すると、数式（３）にて算出されるｋを−ｋ＜０、或いは、−ｋ＝０とした場合、プリズム５に入射した励起光は１回の全反射の後、全ての光が漏れる。また、０＜−ｋ＜励起光の幅とすると、密な全反射ポイントを得ることができるが一部の光が漏れる。全反射のポイントの密度のみを考慮すると−ｋの値が０に近いほど全反射のポイントが増えるが漏れる光も多くなる。−ｋ＝励起光の幅とすると、光が漏れることなく密な全反射を得ることができ、光の漏れを無くした最も効率のよい全反射面を得ることができる。更に、−ｋ＞励起光の幅とすると、プリズム５内に全反射のポイントを得ることができるが、−ｋと励起光の幅の差が大きくなるに伴い、全反射の密度が低下する。
【００５９】
このように、光入射手段１０からプリズム５に入射する励起光の幅とｋをより近づけることで、全反射のポイントを密にして、光の漏れを無くした効率の良い全反射面を得ることができる。従って、広範囲に渡って高感度の観察面を得ることができるようになる。
【００６０】
以上詳述した如く面７が構成された面５Ａ、５Ｂに交差するプリズム面５Ｃ、５Ｄでの全反射と鏡面７での反射がプリズム５内で繰り返されるように光入射手段１０から励起光プリズムに入射する励起光の入射角度を決めることで、プリズム面５Ｃ、５Ｄでより多くの全反射を高密度で生じさせて、プリズム面５Ｃ、５Ｄの広範囲の領域で簡便に全反射によるエバネッセント波を得ることができるようになる。
【００６１】
これにより、当該エバネッセント波発生装置１を用いて測定サンプルの観察が広範囲、且つ、高密度で実現可能となる。即ち、当該エバネッセント波発生装置１をエバネッセント波発生装置のプリズム面にて発生するエバネッセント波により得られる散乱光や蛍光を検出する手段を備えた観察装置に適用することで、当該エバネッセント波発生装置１を用いて散乱光や蛍光を発生し、これを検出することが可能となる。従って、従来の装置のような局所的な観察範囲でなく、広い範囲に渡って高感度で測定サンプルを観察できる観察装置を構築することができる。
【００６２】
尚、図５乃至図１２に示す上記結果はプリズム面５Ｃに直接水と細胞を乗せた場合における結果である。従って、プリズム面５Ｃに直接配置することができない測定サンプル、例えば、培養容器中の細胞などを観察するには、図１の観察装置Ｓ１のようにプリズム５の上面にサンプル容器４０を載せて、測定サンプルをこの容器４０内に収容することが好ましい。
【００６３】
しかしながら、上記の場合には、プリズム面５Ｃとサンプル容器４０底面とを密着させることが困難となり、全反射面がプリズム面５Ｃとなって、当該プリズム面５Ｃで発生したエバネッセント波がサンプル容器４０内の測定サンプルに到達し難くなる恐れがあった。
【００６４】
そこで、上記の如くサンプル容器４０を用いる場合には、プリズム５の面５Ｃとサンプル容器４０とを密着させるためにサンプル容器４０と面５Ｃとの間に屈折率を調整するための媒体を挿入することが望ましい。このように、サンプル容器４０とこの容器４０が設置される面５Ｃとの間に媒体を挿入することで、面５Ｃとサンプル容器４０とを密着させて屈折率を調節でき、且つ、サンプル容器４０と測定サンプルの境界面で全反射を起こすことができるようになる。
【００６５】
尚、上述のようにサンプル容器４０と面５Ｃとの間に媒体を挿入する場合には、このサンプル容器４０の屈折率と上記媒体の屈折率も考慮して最適な入射角度を決定する必要がある。また、この際に媒体の屈折率と測定サンプルの屈折率の差で全反射の角度が変わるので（測定サンプルと媒体が直接接触しているとき）、その点にも留意する必要がある。この場合、媒体の屈折率は測定サンプルの屈折率より大きいことが必須条件となる。特に、プリズム５と略同一の屈折率を持つ媒体を用いるのが好ましいが、測定サンプルとの境界面で全反射するように注意して媒体を選択する必要がある。媒体としては、前述したようにオイル（イマルジョンオイルなど）、ショ糖や食塩などの水溶液、ゲル、シリコン等が考えられる。
【００６６】
尚、本発明のプリズムは、実施例に示す形状及び大きさに限定されるものでなく、例えば、図３２乃至図３６に示す形状のものを用いることも可能である。即ち、本発明では、一組の平行に対向する二面とこの二面に直交する少なくとも一組の平行に対向する二面を持つプリズムであって、何れかの二面のうちの何れか一面に光入射部が形成され、この光入射部を除く部分とこの一面と平行に対向する面に鏡面７が構成されたものであればどのような形状であっても有効である。
【００６７】
更に、本実施例ではプリズム５の一組の平行に対向する二面５Ａ、５Ｂに鏡面７を構成するものとしたが、面５Ａ、５Ｂに加えて、図３７に示すように上記二面５Ａ、５Ｂに直交する一組の二面５Ｃ、５Ｄのうちの何れか一面（図３７では面５Ｄ）も鏡面７とすることもできる。この場合、一面５Ｃ、若しくは、当該一面５Ｃに直接配置されたサンプル容器４０面、或いは、一面５Ｃに媒体を介して配置されたサンプル容器４０面のみで光が全反射することとなる。特に、全反射させる面にゴミなどの不純物が付着すると、そこで光の散乱が起こり難くなり、全反射が得られなくなるという不都合が生じることとなる。そこで、図３７の如く、観察に用いる面５Ｃと平行に対向する面５Ｄも鏡面とすることで、全反射を面５Ｃ、若しくは、当該面５Ｃに直接配置されたサンプル容器４０面、或いは、媒体を介して配置されたサンプル容器４０面のみとし、光の伝達の不具合が生じる不都合を極力抑えることができるようになる。
【実施例２】
【００６８】
尚、上記実施例に示す観察装置Ｓ１は一つの光フィルタ４６を備えるものとしたが、これに限らず、図１３に示すように複数の光フィルタを有する光フィルタ切替手段３０を備えるものとしても差し支えない。具体的に、図１３に示す観察装置Ｓ２は、エバネッセント波発生装置１により発せられたエバネッセント波を測定サンプル（例えば、培養細胞）が収容されたサンプル容器４０の下面から照射することにより、散乱光や蛍光を発生させ、サンプル容器４０の一方(図１３では上方)に配置された対物レンズ４５、光フィルタ切替手段３０に設けられた何れかの光フィルタを順次通過させて、散乱光や蛍光から特定の波長の光を除去したものをＣＣＤカメラやフォトダイオード等の受光素子４９にて検出して撮像する構成とされている。尚、図１３において前記図１乃至図１２と同一の符号が付されたものは、同様、或いは、類似の効果又は作用を奏するものであるため、ここでは説明を省略する。
【００６９】
この光フィルタ切替手段３０は、上記受光素子４９にて検出する散乱光や蛍光を選別するためのものである。本実施例の光フィルタ切替手段３０は、散乱光や蛍光を波長に応じて選択的に通過させる複数種類の光フィルタを備えたターレット式の光フィルタターレットにて構成されている。
【００７０】
具体的に、本実施例の光フィルタターレットは、図１４に示すように回転モータ３１にて回転可能に構成された円盤状の基板３２に、この基板３２の中心から放射状、且つ、等間隔に４つの光フィルタ３５〜３８が配置され、基板３２の中心部に一端が取り付けられた回転軸３３を介して回転モータ３１により回転可能に設けられている。そして、図１４において回転軸３３の右側（図１４では光フィルタ３５の位置）が本実施例の観察装置Ｓ２における使用位置とされている。即ち、回転モータ３１により基板３２を回動させて、所定の使用位置（図１４の光フィルタ３５の位置）に移動させることで、散乱光や蛍光を波長に応じて各光フィルタ３５〜３８を選択的に使用することができる。このように、本実施例の観察装置Ｓ２は、散乱光や蛍光を波長に応じて選択的に通過させる複数種類の光フィルタ３５〜３８を備えるので、観察の目的等に応じて検出する波長を自在に選択することができる。
【００７１】
尚、実施例では、光フィルタ切替手段３０として上記のように光フィルタターレットを用いものとしたが、請求項４に記載のフィルタはこれに限定されるものでない。即ち、請求項４の発明は、散乱光や蛍光を波長に応じて選択的に通過させる複数種類のフィルタを備えたものであれば良く、例えば、図１５に示すように板状の基板３９に複数の光フィルタ（図１５では３つの光フィルタ３５〜３７）が長手方向で等間隔に配置され、長手方向に移動可能に構成したラックピニオン式の切替装置を用いても差し支えない。また、それ以外に、手動で複数種類のフィルタを切り替えるスライド式のものを用いるものとしても構わない。
【実施例３】
【００７２】
また、上記各実施例に示すエバネッセント波発生装置１において、励起光の入射位置を移動可能に構成することも可能である。励起光の入射位置を移動する方向としては、図１６及び図１７に示すＸ軸方向（即ち、長さＬ方向）と、Ｙ軸方向の２つの方向が考えられる。尚、図１６は図１或いは図１３のプリズム５とサンプル容器４０の斜視図であり、図１７は図１６のサンプル容器４０の平面図である。
【００７３】
この場合、プリズム５自体をＸ軸方向、或いは、Ｙ軸方向に移動可能に構成しても良いし、サンプル容器４０を移動可能に構成しても良い。また、光入射手段１０が、励起光の入射位置を移動する手段を備えるものとしても良い。
【００７４】
例えば、Ｙ軸方向に励起光の入射位置を移動可能とする場合には、光入射手段１０が図１８に示すようにスキャン装置７０（即ち、励起光の入射位置を移動する手段）を備えて、このスキャン装置７０を図１８に矢印に示す方向に移動させるビームスキャン方式により、励起光源７２からの励起光の入射位置をＹ軸方向に移動するものとすることができる。
【００７５】
また、図１９に示すようにガルバノミラー７５を設けて、光入射手段１０の励起光源７２からの励起光をガルバノミラー７５を介してプリズム５内に入射するよう構成しても構わない（ガルバノミラーによるスキャン方式）。この場合、ガルバノミラー７５を図１９に矢印で示す方向に移動することで、励起光源７２からの励起光の入射位置をＹ軸方向に移動することができる。
【００７６】
一方、上記各実施例に示すエバネッセント波発生装置１において、光入射手段１０は、励起光を拡幅する手段を備えて、この手段により、励起光の幅を変更可能に構成するものとしても差し支えない。例えば、図２０に示すようにビームエクスパンダ７８を設ければ、励起光源７２からの励起光を当該ビームエクスパンダ７８にて拡幅することができるようになる（ビームエクスパンダ光学系による拡幅方法）。
【００７７】
更にまた、上記実施例１に示すエバネッセント波発生装置１の光入射手段１０からの励起光の波長を変更可能に構成しても良い。具体的には、例えば、図２１に示すように波長の異なる励起光源を２つ以上備えて（図２１では励起光源１と励起光源２の２つ）、これらを選択的に使用できるように移動可能に設けるものとしても良いし、図２２に示すように励起光源１からの励起光を光ファイバ８０を介してコリメートレンズ８２に導き、同様に励起光源２からの励起光を光ファイバ８１を介してコリメートレンズ８２に導くように構成することで、当該コンメートレンズ８２の位置を移動し、２つ以上の励起光源（図２２では励起光源１と励起光源２の２つ）を選択的に使用することができる。
【００７８】
尚、各実施例では、測定サンプルをプリズム面５Ｃに載せるものとしたが、実際には鏡面７を構成した面５Ａ、５Ｂに交差する一対の対向面５Ｃ、５Ｄで励起光が全反射するので、このプリズム面５Ｄを用いることも可能である。しかしながら、各実施例のエバネッセント波発生装置１においてプリズム面５Ｄは下面となるため、実際には当該面５Ｄを用いることは困難である。従って、各実施例のエバネッセント波発生装置１では、上面となるプリズム面５Ｃを用いることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】本発明の一実施例のエバネッセント波発生装置を備えた観察装置の構成図である。（実施例１）
【図２】図１のエバネッセント波発生装置のプリズム及び鏡面を示す図である。
【図３】図２のプリズムに入射角度３７度で励起光を照射した場合の説明図である。
【図４】図２のプリズムのプリズム面に水、或いは、蛍光物質を配置した場合の説明図である。
【図５】図２のプリズムに入射角度３４度で励起光を入射させた場合におけるプリズム内の励起光の光路を示す図である。
【図６】図２のプリズムに入射角度３５度で励起光を入射させた場合におけるプリズム内の励起光の光路を示す図である。
【図７】図２のプリズムに入射角度３６度で励起光を入射させた場合におけるプリズム内の励起光の光路を示す図である。
【図８】図２のプリズムに入射角度３７度で励起光を入射させた場合におけるプリズム内の励起光の光路を示す図である。
【図９】図２のプリズムに入射角度３８度で励起光を入射させた場合におけるプリズム内の励起光の光路を示す図である。
【図１０】他のプリズムを用いて入射角度４０度で励起光を入射させた場合におけるプリズム内の励起光の光路を示す図である。
【図１１】各比率（長さ寸法／厚さ寸法）のプリズムを用いて、入射角度を変更した場合におけるプリズム面に生じる全反射のポイントの密度を示す図である。
【図１２】図１１の全反射のポイントの密度を１〜３で評価した図である。
【図１３】本発明の他の実施例の観察装置の構成図である。（実施例２）
【図１４】図１３の光フィルタ切替手段を示す図である。
【図１５】もう一つの光フィルタ切替手段を示す図である。
【図１６】図１或いは図１３のプリズムとサンプル容器の斜視図である。（実施例３）
【図１７】図１６のサンプル容器の平面図である。
【図１８】プリズムに入射する励起光の入射位置を移動する手段の一例を示す図である。
【図１９】プリズムに入射する励起光の入射位置を移動する手段の他の例を示す図である。
【図２０】プリズムに入射する励起光を拡幅する手段の一例を示す図である。
【図２１】プリズムに入射する励起光の波長を変更する一例を示す図である。
【図２２】プリズムに入射する励起光の波長を変更する他の例を示す図である。
【図２３】プリズム内での反射のパターンを示す図である。
【図２４】プリズム内での反射のパターンを示すもう一つの図である。
【図２５】鏡面の一例（第２の例）を示す図である。
【図２６】鏡面の一例（第３の例）を示す図である。
【図２７】鏡面の一例（第４の例）を示す図である。
【図２８】鏡面の一例（第５の例）を示す図である。
【図２９】鏡面の一例（第６の例）を示す図である。
【図３０】鏡面の一例（第７の例）を示す図である。
【図３１】鏡面の一例（第８の例）を示す図である。
【図３２】プリズムの一例（第２の例）を示す図である。
【図３３】プリズムの一例（第３の例）を示す図である。
【図３４】プリズムの一例（第４の例）を示す図である。
【図３５】プリズムの一例（第５の例）を示す図である。
【図３６】プリズムの一例（第６の例）を示す図である。
【図３７】他のプリズム及び鏡面を示すもう一つの図である。
【図３８】従来のエバネッセント波発生装置の光路を示す図である。
【図３９】従来のエバネッセント波発生装置を説明する図である。
【図４０】図３９のエバネッセント波発生装置のもう一つの説明図である。
【図４１】サンプルの観察範囲を広げる１つの手段を説明する図である。
【符号の説明】
【００８０】
Ｓ１、Ｓ２    観察装置
１  エバネッセント波発生装置
５、６    プリズム
５Ａ、５Ｂ  面
５Ｃ、５Ｄ  プリズム面
７    鏡面
８    入射部
１０  光入射手段
２０  光検出手段
３０  光フィルタ切替手段
３１  回転モータ
３２、３９  基板
３３  回転軸
３５〜３８、４６  光フィルタ（フィルタ）
４０  サンプル容器
４５  対物レンズ
４７  結像レンズ
４８  ＣＣＤカメラ
【図１】
0005426817.tif 000002
【図２】
0005426817.tif 000003
【図３】
0005426817.tif 000004
【図４】
0005426817.tif 000005
【図５】
0005426817.tif 000006
【図６】
0005426817.tif 000007
【図７】
0005426817.tif 000008
【図８】
0005426817.tif 000009
【図９】
0005426817.tif 000010
【図１０】
0005426817.tif 000011
【図１１】
0005426817.tif 000012
【図１２】
0005426817.tif 000013
【図１３】
0005426817.tif 000014
【図１４】
0005426817.tif 000015
【図１５】
0005426817.tif 000016
【図１６】
0005426817.tif 000017
【図１７】
0005426817.tif 000018
【図１８】
0005426817.tif 000019
【図１９】
0005426817.tif 000020
【図２０】
0005426817.tif 000021
【図２１】
0005426817.tif 000022
【図２２】
0005426817.tif 000023
【図２３】
0005426817.tif 000024
【図２４】
0005426817.tif 000025
【図２５】
0005426817.tif 000026
【図２６】
0005426817.tif 000027
【図２７】
0005426817.tif 000028
【図２８】
0005426817.tif 000029
【図２９】
0005426817.tif 000030
【図３０】
0005426817.tif 000031
【図３１】
0005426817.tif 000032
【図３２】
0005426817.tif 000033
【図３３】
0005426817.tif 000034
【図３４】
0005426817.tif 000035
【図３５】
0005426817.tif 000036
【図３６】
0005426817.tif 000037
【図３７】
0005426817.tif 000038
【図３８】
0005426817.tif 000039
【図３９】
0005426817.tif 000040
【図４０】
0005426817.tif 000041
【図４１】
0005426817.tif 000042