(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）により示される化合物又は製薬上許容されるその塩。
【化１】
0005637426.tif 000008
【請求項２】
請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物又は製薬上許容されるその塩を含有する、細胞周期阻害剤。
【請求項３】
請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物又は製薬上許容されるその塩、及び賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項４】
細胞増殖に起因する疾患を予防又は治療するための、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記細胞増殖に起因する疾患が癌である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
以下のステップ：
（ａ）チョーノピクニス・アルバ（Ｃｈａｕｎｏｐｙｃｎｉｓ  ａｌｂａ）ＲＫ９９−Ｆ３３株（ＮＩＴＥ  Ｐ−７６０）において、テルペンドール生合成系でｐａｘＰ遺伝子又はｔｅｒＰ遺伝子の発現を低減するステップ、及び
（ｂ）得られた微生物を培養し、産生される化合物を回収するステップ
を含む、請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞周期阻害活性を有する新規化合物、該化合物を含有する医薬組成物、該化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍（癌）などの異常な細胞増殖に関連する疾患の治療のためのアプローチとして、細胞周期を停止させる手法が提案されている。そのようなアプローチを介する抗癌剤のうち現在有効性が認められているものとして、細胞分裂において重要な役割を果たす微小管の機能を阻害する薬物が挙げられる。
【０００３】
例えば、酒石酸ビノレルビン（ナベルビン（登録商標）注、協和発酵キリン）は、微小管重合を阻害し、悪性腫瘍に対する臨床効果が既に証明されている。しかし、微小管は癌細胞だけでなく正常細胞でも重要な役割を担っているため、微小管重合に作用する上記のような薬物は、手足のしびれを主症状とする神経障害などの副作用を有する。
【０００４】
そこで、細胞周期を停止させるアプローチを介する新たな抗癌剤として、細胞分裂に関与するタンパク質であるキネシンＥｇ５の阻害剤を用いることが提案されている。キネシンＥｇ５阻害剤は微小管の機能を阻害しないので、上記の微小管重合阻害剤のような副作用は有しないと期待される。
【０００５】
キネシンＥｇ５阻害剤として、テルペンドールＥが見出された（非特許文献１）。テルペンドールＥは、癌細胞の細胞周期をＭ期で停止させる。しかし、テルペンドールＥは、その細胞周期阻害活性が従来の細胞周期阻害剤よりも弱いという欠点を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｎａｋａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０：１３１−１３７，２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、新たな作用機序を有する抗癌剤として、キネシンＥｇ５阻害剤が注目されている。現在特定されているＥｇ５阻害剤であるテルペンドールＥの細胞周期阻害活性は十分なものではないため、これを上回る阻害活性を有するキネシンＥｇ５阻害剤が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、テルペンドールＥ産生微生物のテルペンドール生合成系に関与する遺伝子の発現を操作することにより、新規なテルペンドール類縁化合物を合成することに成功し、それら化合物の中から、テルペンドールＥよりも優れた細胞周期阻害活性を有する新規化合物を見出した。
【０００９】
したがって、本発明は具体的には以下の特徴を有する。
〔１〕式（Ｉ）により示される化合物又は製薬上許容されるその塩。
【００１０】
【化１】
0005637426.tif 000002
〔２〕上記〔１〕に定義される式（Ｉ）の化合物又は製薬上許容されるその塩を含有する、細胞周期阻害剤。
〔３〕上記〔１〕に定義される式（Ｉ）の化合物又は製薬上許容されるその塩、及び賦形剤を含有する医薬組成物。
〔４〕細胞増殖に起因する疾患を予防又は治療するための、上記〔３〕に記載の医薬組成物。
【００１１】
〔５〕前記細胞増殖に起因する疾患が癌である、上記〔４〕に記載の医薬組成物。
〔６〕以下のステップ：
（ａ）チョーノピクニス属微生物において、テルペンドール生合成系中でパスパリンから１３−デスオキシパキシリンへの変換に関与する遺伝子の発現を低減するステップ、及び
（ｂ）得られた微生物を培養し、産生される化合物を回収するステップ
を含む、上記〔１〕に定義される式（Ｉ）の化合物の製造方法。
〔７〕チョーノピクニス属微生物が、チョーノピクニス・アルバ（Ｃｈａｕｎｏｐｙｃｎｉｓ  ａｌｂａ）ＲＫ９９−Ｆ３３株（ＮＩＴＥ  Ｐ−７６０）である、上記〔６〕に記載の方法。
〔８〕パスパリンから１３−デスオキシパキシリンへの変換に関与する遺伝子がｐａｘＰ又はｔｅｒＰである、上記〔６〕又は〔７〕に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、新規な細胞周期阻害剤が提供され、これは抗癌剤としての用途を有する。したがって、本発明により、副作用の少ない効果的な新規抗癌剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】Ｐ−２７株により産生されたテルペンドール類化合物のＮＭＲ解析の結果である。
【図１−２】Ｐ−２７株により産生されたテルペンドール類化合物のＮＭＲ解析の結果である。
【図１−３】Ｐ−２７株により産生されたテルペンドール類化合物のＮＭＲ解析の結果である。
【図１−４】Ｐ−２７株により産生されたテルペンドール類化合物のＮＭＲ解析の結果である。
【図２】Ｋ５６２細胞に対する細胞周期阻害活性の解析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、式（Ｉ）により示される化合物、又は製薬上許容されるその塩に関する。
【００１５】
【化２】
0005637426.tif 000003
【００１６】
本明細書で使用される「製薬上許容される塩」という用語は、適切な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応等なしにヒトおよび動物の組織に接触させて使用するのに適する塩を表す。製薬上許容される塩は、当技術分野、例えば、Ｓ．Ｍ  Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９７７、６６：１〜１９において、知られる塩を含む。塩は、本発明の化合物の最終単離及び精製中に、遊離塩基と適切な無機酸又は有機酸とを反応させることによって調製することができる。代表的な酸付加塩には、以下のものに限定されないが、例えば、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギル酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等が含まれる。
【００１７】
本発明の化合物には、酸付加塩の他に、溶媒和物、中間体などの誘導体、光学異性体などの異性体が含まれる。
【００１８】
誘導体には、フェニル基上に１〜４個の置換基（例えば、アルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、カルボキシル、アミノ、アルキルアミド、アルキルオキシなど）を含む化合物、水酸基をアルキルカルボニルオキシに変換した化合物などが含まれる。ハロゲンとは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素である。アルキルとは、飽和又は不飽和アルキルであり、好ましくは、低級飽和アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル等である。
【００１９】
本発明の化合物は、以下の実施例において実証するように、強い細胞周期阻害活性を有する。
【００２０】
細胞周期の一連の過程は、以下のように規定される：静止期又は休止期の状態（Ｇ０期）に始まり、細胞増殖及び染色体複製のための準備が行なわれる（Ｇ１期）。続いてＤＮＡ合成期（Ｓ期）を経て、細胞が分裂するための準備が行なわれ（Ｇ２期）、続く有糸分裂により細胞周期が完結し（Ｍ期）、分裂した娘細胞へと遺伝情報が引き継がれる。
【００２１】
キネシンＥｇ５は、細胞周期のＭ期において中心体の分離に必要とされる。したがって、Ｅｇ５を阻害することにより、細胞周期をＭ期で停止させることができる。
【００２２】
テルペンドールＥは、初めて発見された、天然に存在するキネシンＥｇ５阻害剤である（Ｎａｋａｗｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０：１３１−１３７，２００３）。テルペンドールＥは、インドールジテルペンに分類される。インドールジテルペンは、一部の糸状菌が産生する多様な構造を有する化合物の総称である。３種類のインドールジテルペン産生菌（ペニシリウム・パキシリ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐａｘｉｌｌｉ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、ネオチフォジウム・ロリィ（Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ  ｌｉｌｉｉ））の解析から、インドールジテルペンには共通の生合成経路が存在することが示されている（Ｓａｉｋｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｙｃｏｌ．Ｒｅｓ．，１１２：１８４−１９９，２００８）。
【００２３】
例として、ペニシリウム・パキシリのパキシリン（ｐａｘｉｌｌｉｎｅ）生合成系について説明する。ＩＰＰ、ＦＰＰ、及びインドール−３−グリセロールリン酸から、ＰａｘＧ、ＰａｘＢ、ＰａｘＭ及びＰａｘＣを含む少なくとも４種類の酵素の作用により、最初の検出可能な中間体であるパスパリン（ｐａｓｐａｌｉｎｅ）が生成される。パスパリンはＰａｘＰ（シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ）により１３−デスオキシパキシリンに変換され、さらにＰａｘＱ（シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ）によりパキシリンに変換される。上記の３種類の糸状菌で、この経路は共通していると考えられている。テルペンドールＥは、共通の生合成中間体であるパスパリンのＣ１１水酸化により生成されると推測される。
【００２４】
本発明者らは、テルペンドールＥ産生菌であるチョーノピクニス・アルバ（Ｃｈａｕｎｏｐｙｃｎｉｓ  ａｌｂａ）ＲＫ９９−Ｆ３３株（ＮＩＴＥ  Ｐ−７６０）において、パスパリンから１３−デスオキシパキシリンへの変換を担うＰａｘＰをコードするｐａｘＰ遺伝子のオルソログ（ｔｅｒＰ）を破壊することにより、上記の共通代謝経路中のパスパリンから１３−デスオキシパキシリンへの変換を低減させ、それによりテルペンドールＥ、及びその誘導体の生合成を強化した。その結果、本発明の式（Ｉ）の化合物を得た。
【００２５】
チョーノピクニス・アルバの培養は、ＰＤＡ培地（３．９％ポテトデキストロース・アガー、Ｄｉｆｃｏ社）、ＰＤ培地（２．４％ポテトデキストロース、Ｄｉｆｃｏ社）、又はＦＤＹ培地（１．５％グルコース、１．５％可溶性デンプン、１％コーンスティープリカー、１％乾燥イースト、０．３％麦芽抽出物、０．０３％ＭｇＳＯ４／７Ｈ２Ｏ、０．１％ＫＨ２ＰＯ４、０．１％寒天、ｐＨ６．０）中で、２８℃で行なうことができる。
【００２６】
目的化合物の回収及び精製は、溶媒抽出、結晶化、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどにより行うことができる。
【００２７】
以下の実施例に示すように、式（Ｉ）の化合物は、腫瘍由来細胞に対して、テルペンドールＥをはるかに上回る細胞周期阻害活性を示した。
【００２８】
したがって、本発明は、式（Ｉ）により示される化合物又は製薬上許容されるその塩を含有する、細胞周期阻害剤にも関する。
【００２９】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、その構造上の類似性から、テルペンドールＥと同様、キネシンＥｇ５を阻害することにより細胞周期阻害活性を示すものと考えられる。
【００３０】
また、細胞周期阻害活性を有する本発明の化合物は、細胞分裂に関連する種々の疾患の治療薬において有効成分として使用することができる。
【００３１】
したがって、本発明は、式（Ｉ）により示される化合物又は製薬上許容されるその塩、及び賦形剤を含有する医薬組成物に関し、該医薬組成物は、好ましくは細胞増殖に起因する疾患を予防又は治療するためのものである。好ましい実施形態において、細胞増殖に起因する疾患とは癌である。
【００３２】
本発明において、癌としては、例えば、腎細胞癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病；慢性白血病、真性赤血球増多症、リンパ腫、及び多発性骨髄腫が挙げられる。
【００３３】
例えば、周知の製剤技術を適用して、本発明の化合物を医薬組成物とすることができる。本発明の医薬組成物を、抗癌剤（すなわち、癌治療剤）、あるいはその他の医薬として使用する場合、その投与形態としては、例えば注射剤、インプラント、エアゾール剤、座剤、貼布剤、パップ剤、ローション剤、リニメント剤、軟膏剤、若しくは点眼剤等による非経口投与、又は錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤若しくはシロップ剤等による経口投与を挙げることができる。これらの製剤は、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定化剤、矯味矯臭剤、希釈剤などの添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【００３４】
例えば、賦形剤としては、デンプン、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン等のデンプン、乳糖、結晶セルロース、リン酸水素カルシウム等を挙げることができる。
【００３５】
コーティング剤としては、例えば、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、セラック、タルク、カルナウバロウ、パラフィン等を挙げることができる。結合剤としては、例えばポリビニルピロリドン、マクロゴール及び前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。崩壊剤としては、例えば前記賦形剤と同様の化合物及びクロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。安定化剤としては、例えばメチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及びソルビン酸を挙げることができる。矯味矯臭剤としては、例えば通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。
【００３６】
また、液剤を製造するための溶媒としては、生理食塩液、精製水、蒸留水、エタノール、フェノール、クロロクレゾール等を使用することができる。界面活性剤又は乳化剤としては、例えば、ポリソルベート８０、ステアリン酸ポリオキシル４０、ラウロマクロゴール等を挙げることができる。
【００３７】
本発明の医薬組成物を、抗癌剤として使用する場合、本発明の化合物基準での本発明の医薬組成物の使用量は、症状、年齢、投与方法等により異なる。例えば腹腔内投与の場合、患者（温血動物、特にヒト）に対して１日あたり、下限として０．０１ｍｇ（好ましくは０.１ｍｇ）、上限として、２０００ｍｇ（好ましくは５００ｍｇ、より好ましくは１００ｍｇ）を１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。静脈内投与の場合には、成人に対して１日当たり、下限として０．００１ｍｇ（好ましくは０．０１ｍｇ）、上限として、５００ｍｇ（好ましくは５０ｍｇ）を１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。
【００３８】
本発明はまた、以下のステップ：
（ａ）チョーノピクニス属微生物において、テルペンドール生合成系中でパスパリンから１３−デスオキシパキシリンへの変換に関与する遺伝子の発現を低減（抑制を含む）するステップ、及び
（ｂ）得られた微生物を培養し、産生される化合物を回収するステップ
を含む、上記式（Ｉ）の化合物の製造方法にも関する。
【００３９】
好ましくは、前記チョーノピクニス属微生物は、チョーノピクニス・アルバ（Ｃｈａｕｎｏｐｙｃｎｉｓ  ａｌｂａ）ＲＫ９９−Ｆ３３株（ＮＩＴＥ  Ｐ−７６０）である。また、好ましくは、前記テルペンドール生合成系中でパスパリンから１３−デスオキシパキシリンへの変換に関与する遺伝子は、ｐａｘＰ又はｔｅｒＰである。チョーノピクニス・アルバ（Ｃｈａｕｎｏｐｙｃｎｉｓ  ａｌｂａ）ＲＫ９９−Ｆ３３株は、平成２１年５月２０日に、製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−７６０として寄託された。
【００４０】
チョーノピクニス属微生物の目的遺伝子の発現低減のための改変は、例えば、以下の実施例に詳細に記載するように、アグロバクテリウム媒介遺伝子改変を用いて行なうことができる。テルペンドール生合成系に関与する遺伝子としては、例えば、ペニシリウム・パキシリのｐａｘＰ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２７９８０８）、及びｐａｘＱ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２７９８０８）が挙げられる。チョーノピクニス属微生物におけるこれらの遺伝子のオルソログは、公知の遺伝子組み換え法などにより当業者が容易に同定することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）。遺伝子の改変は、当該遺伝子のコード領域全体の欠失、コード領域の一部欠失、コード領域への耐性遺伝子などの外来性遺伝子の挿入又は外来性遺伝子でのコード領域の置換、又は調節領域の破壊などにより行なうことができる。
【実施例】
【００４１】
以下に、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００４２】
［実施例１］
本発明の化合物の生成
１−１．菌株、培地、培養及び形質転換
以下の実験方法において、具体的に記載していない手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの教科書（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）などの慣用の教科書に記載されているように行なった。
【００４３】
テルペンドールＥ産生株であるチョーノピクニス・アルバ（Ｃｈａｕｎｏｐｙｃｎｉｓ  ａｌｂａ；以下、「Ｃ．アルバ」とも記載）ＲＫ９９−Ｆ３３（ＮＩＴＥ  Ｐ−７６０）（Ｎａｋａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，上掲）は、ＰＤＡ培地（３．９％ポテトデキストロース・アガー、Ｄｉｆｃｏ社）、ＰＤ培地（２．４％ポテトデキストロース、Ｄｉｆｃｏ社）、又はＦＤＹ培地（１．５％グルコース、１．５％可溶性デンプン、１％コーンスティープリカー、１％乾燥イースト、０．３％麦芽抽出物、０．０３％ＭｇＳＯ４／７Ｈ２Ｏ、０．１％ＫＨ２ＰＯ４、０．１％寒天、ｐＨ６．０）中で、２８℃で培養した。Ｃ．アルバの形質転換は、アグロバクテリウム媒介形質転換法（ＡＴＭＴ）により行なった（Ｍｏｔｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，４７：２９８−３０６，２００８）。アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８株を、Ｃ．アルバ株の分生子懸濁液と共培養した後、５００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ（和光純薬工業）で選択した。Ｃ．アルバの形質転換体を培養する際は、必要に応じて２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢを添加した。プラスミドは大腸菌ＤＨ５α株で増殖させた。大腸菌はＬＢ培地中で培養し、形質転換は標準的方法で行なった（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）。
【００４４】
１−２．遺伝子操作
Ｃ．アルバのゲノムＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  ｔｏｔａｌ  ＤＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて調製した。ＰＣＲ増幅は、サーマルサイクラー（モデルＴＰ２４０、宝酒造）、及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（東洋紡）又はＢｌｅｎｄ  Ｔａｑ  Ｐｌｕｓ（東洋紡）ＤＮＡポリメラーゼを用いて行なった。プラスミド構築には、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼであるＫＯＤ  Ｐｌｕｓを用いた。通常のＰＣＲでは、Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ  Ｐｌｕｓを用いた。ＰＣＲ産物は、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングし、必要に応じて塩基配列決定を行った。ＤＮＡ塩基配列決定は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖｅｒ．３．１サイクルシーケンシングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）及び３７３０ｘｌ  ＤＮＡアナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行なった。ＤＮＡ及びアミノ酸配列データの解析は、ＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて行なった。
【００４５】
１−３．インドールジテルペン生合成遺伝子改変株の作製
上記のインドールジテルペン共通代謝経路中のパスパリンから１３−デスオキシパキシリンへの変換を担うＰａｘＰをコードするｐａｘＰ遺伝子のオルソログ（ｔｅｒＰ）を破壊したＣ．アルバ株を、以下のように作製した。
【００４６】
表１に示すプライマーを用いた。
【００４７】
ｔｅｒＰの上流配列を、Ｃ．アルバのゲノムＤＮＡからＸｈｏＩ−５’ｔｅｒＰ−Ｆプライマー及びＸｂａＩ−５’ｔｅｒＰ−Ｒプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。１．０ｋｂ増幅断片を精製し、ＸｈｏＩ及びＸｂａＩで消化し、精製した（断片１）。ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子発現ユニットをｐＣＳＮ４５（Ｍｏｔｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．，４２：２００−２１２（２００５））からＭｌｕＩ−ＨＹＧ−Ｆプライマー及びＸｂａＩ−ＨＹＧ−Ｒプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。１．６ｋｂ増幅断片を精製し、ＭｌｕＩとＸｂａＩで消化した後に、精製した（断片２）。ｔｅｒＰの下流配列をＣ．アルバのゲノムＤＮＡからＭｌｕＩ−３’ｔｅｒＰ−Ｆプライマー及びＳｓｅＩ−３’ｔｅｒＰ−Ｒプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。１．０ｋｂ増幅断片を精製し、続いてＭｌｕＩとＳｓｅＩで消化し、精製した（断片３）。ｐＢＩ１２１のｒｉｇｈｔ  ｂｏｒｄｅｒとｌｅｆｔ  ｂｏｒｄｅｒの間のベクター配列を、ｐＢＩ１２１を鋳型として用いて、ＸｈｏＩ−ＲＢプライマー及びＳｓｅＩ−ＬＢプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。８．７ｋｂ増幅断片を精製し、続いてＸｈｏＩとＳｓｅＩで消化し、精製した（断片４）。以上の４種の断片を連結することにより、ｔｅｒＰ遺伝子破壊用プラスミドｐＢＩ−ｔｅｒＰ：：ＨＰＨを構築した。ｐＢＩ−ｔｅｒＰ：：ＨＰＨで形質転換したＡ．ツメファシエンス株を用いて、Ｃ．アルバをＡＴＭＴ法で形質転換した。ｔｅｒＰ遺伝子破壊体はｔｅｒＰ  ＯＲＦの大部分を増幅するｔｅｒＰ−ｃｈｅｃｋ−Ｆプライマー及びｔｅｒＰ−ｃｈｅｃｋ−Ｒプライマーを用いるＰＣＲにより選択した。このＰＣＲでは、野生型株から１．２ｋｂのｔｅｒＰ  ＯＲＦ配列が増幅され、ｔｅｒＰ遺伝子破壊株からは１．６ｋｂのハイグロマイシンＢ耐性遺伝子発現ユニットが増幅され、ｅｃｔｏｐｉｃ形質転換体では両方の断片が増幅される。ｔｅｒＰ遺伝子破壊株としてＰ−２７株を選択した。
【００４８】
Ｃ．アルバのｔｅｒＰ遺伝子全長配列を、配列番号１に示す。
【００４９】
【表１】
0005637426.tif 000004
【００５０】
１−４．テルペンドール類の精製、ＨＰＬＣ分析及び構造解析
テルペンドール類の生産培地として、上記のＦＤＹ培地を用いた。上記で得られたＰ−２７株を、ＦＤＹ培地中で１６０ｒｐｍ、２８℃で１２日間培養した。１Ｌの培養液に対して２倍量のアセトンを加えて攪拌し、上清を回収し、アセトンを除き、等量の酢酸エチルで２回抽出した後に、酢酸エチルを除去した。３９２ｍｇの抽出物濃縮残渣を得た。濃縮残渣にメタノールを加えて、エルゴステロール様結晶性沈殿物を濾別し、濾液を２分割し、２回に分けて定法に従って分取ＨＰＬＣを実施した。
【００５１】
ＨＰＬＣは以下の条件で行った。
【００５２】
テルペンドール化合物の分取ＨＰＬＣの条件（ＨＰＬＣ−１）
Ｗａｔｅｒｓ  ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９０  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ，ＵＶ−ＶＩＳ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ＵＶ７０２（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）
逆相カラム：ＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ  ２０×２５０ｍｍ（Ｓｅｎｓｈｕ  Ｐａｋ）
展開溶剤：アセトニトリルー水系グラジエント（０−１０ｍｉｎ  アセトニトリル２０−８０％、１０−２０ｍｉｎ  同８０−１００％、２０−６０ｍｉｎ  同１００％）、溶剤流速：８ｍＬ／ｍｉｎ、ＵＶモニター：２８１ｎｍ
【００５３】
テルペンドール化合物のＨＰＬＣ分析法ＨＰＬＣ−２）
Ｗａｔｅｒｓ  ６００  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ，Ｗａｔｅｒｓ  ９６６  Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
逆相カラム：４．６×２５０ｍｍカラム  ＯＤＳ−３，  （ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）
展開溶剤：アセトニトリルー水系グラジエント（０−１０ｍｉｎ  アセトニトリル２０−８０％、１０−２０ｍｉｎ  同８０−１００％、２０−５０ｍｉｎ  同１００％）、溶剤流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、ＨＰＬＣ分析法１の保持時間と異なる。
ＥＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の測定はＥＩ−ＭＳ（ＳＸ−１０２）ＪＥＯＬを使用した。
【００５４】
２回目の分取ＨＰＬＣでは、溶出画分にエルゴステロール様物質のピークが重なるトラブルがあり、再度分取ＨＰＬＣを行なった。ＨＰＬＣ分析法（ＨＰＬＣ−２）により各画分を分析した結果、表２に示すように、２つの主要なテルペンドール化合物のピークが認められた。２つのピークは不純物が少なく、それぞれの画分を濃縮し、重量を測定した後、物性を測定することができた。
【００５５】
化合物の構造決定はＮＭＲにより行った。
【００５６】
結果を図１−１〜図１−４に示す。
【００５７】
得られた物質の重量及び構造解析から明らかになった物質名を、表２に記載する。また、推定分子式等の情報を表３に記載する。
【００５８】
【表２】
0005637426.tif 000005
【００５９】
【表３】
0005637426.tif 000006
【００６０】
Ｐ−２７株からはテルペンドールＥが大量産生されていた。また、２つ目のピークに対応する化合物は、新規化合物１１−ケトパスパリンであることが明らかになった。
【００６１】
［実施例２］
新規テルペンドール類縁体の生物活性
１．テルペンドール類の細胞周期阻害活性
ヒト前骨髄性白血病細胞であるＫ５６２細胞を、１０５細胞／５００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、ＤＭＳＯに溶解した被験化合物（２．３μＭ又は２３μＭ  テルペンドールＥ、２．３μＭ又は２３μＭ  １１−ケトパスパリン、１μＭ  ビンブラスチン、又はＤＭＳＯ対照）を示した最終濃度になるように添加し、２４時間インキュベートした。ＰＢＳで細胞を洗浄し、ヨウ化プロピジウムを用いて細胞内の核酸を染色し、フローサイトメトリーで蛍光量を測定した（Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２８：１０７−１１６，２００９）。
【００６２】
結果を図１に示す。４ＣのピークはＭ期の細胞、２ＣのピークはＧ０〜Ｇ２期の細胞を表す。細胞周期阻害活性が知られているビンブラスチン、及び新規に同定された１１−ケトパスパリンでは、Ｍ期で停止している細胞が多く見られた。この結果から、１１−ケトパスパリンがテルペンドールＥと比較して非常に強い細胞周期阻害活性を有することが示された。
【００６３】
２．テルペンドール類の細胞毒性
ヒト前骨髄性白血病細胞であるＫ５６２細胞（１．５×１０４細胞／ｍＬ）、ヒト線維肉腫由来ＨＴ１０８０細胞（０．３×１０４細胞／ｍＬ）、及びヒト子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞（０．６×１０４細胞／ｍＬ）を、示した密度で２００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。ＨＴ１０８０細胞及びＨｅＬａ細胞は、３７℃、５％ＣＯ２にて一晩培養した。細胞が接着後に、ＤＭＳＯに溶解した被験化合物を０．２μＬ添加し、４８時間インキュベートした。ＷＳＴ−８溶液（ナカライテスク、生細胞測定試薬ＳＦ）を２０μＬ添加し、プレートリーダーで４５０ｎｍでの吸光度を測定した（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１１：３６７−３７７，２００４）。
【００６４】
結果を表４に示す。
【００６５】
【表４】
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【００６６】
いずれの細胞種に対しても、１１−ケトパスパリンはテルペンドールＥと比較して２分の１以下のＩＣ５０値を示した。したがって、新規に同定された１１−ケトパスパリンは、腫瘍由来細胞に対してテルペンドールＥよりも顕著に細胞毒性が高かった。
【００６７】
以上より、新規に同定された１１−ケトパスパリンは、抗癌剤として有望であることが示された。
【００６８】
［実施例３］
１１−ケトパスパリンの化学合成
１１−ケトパスパリンは、既知の方法（Ｎａｋａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，上掲）で得られたテルペンドールＥをＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ試薬で酸化することにより調製することが可能であった（データは示していない）。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明によれば、細胞増殖阻害活性を有する新規化合物が提供され、該化合物は細胞増殖に関連する疾患の治療に有用である。したがって、本発明は医療、健康科学分野での利用可能性を有する。
【配列表フリーテキスト】
【００７０】
配列番号２〜１１：プライマー
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【配列表】
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