(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナーゲノムをアガロース中に包埋し、ドナーゲノムを脱タンパク質化し、そしてドナーゲノムをアガロースから精製することにより、第一のマイコプラズマ種からドナーゲノムを調製すること、
第二のマイコプラズマ種からレシピエント細胞を調製すること、ここで、第一の種および第二の種は、双方とも、同一の属からのものであり、そして
単離したドナーゲノムをレシピエント細胞に組込み、それによって、第一の種が提供するドナーゲノムがレシピエント細胞に移植されること、を含み、
ここでレシピエント細胞は、成長・分裂して、生成された細胞を第一の種の表現型に表現型的に形質転換するドナーゲノムによって支配される細胞を生成することができること
を特徴とする種間ゲノム移植方法。
【請求項２】
ドナーゲノムを、第一の種の細胞から単離することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ドナーゲノムを、合成的に調製することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ドナーゲノムが、選択マーカーを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質は、組込みの前にドナーゲノムから取り除かれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
レシピエント細胞は、移植されたドナーゲノムによって置き換えられるレシピエントゲノムを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ドナーゲノムが、レシピエントゲノム内のシーケンスを認識するが、ドナーゲノム内のシーケンスは認識しない制限エンドヌクレアーゼをエンコードすることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ドナーゲノムをメチル化することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ドナーゲノムは、ＧＡＴＣがＤａｍでメチル化されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第一の種は、マイコプラズマ・ミコイデス ラージコロニー（ＬＣ）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第二の種は、マイコプラズマ・カプリコルムであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、双方とも２００７年５月１日に出願されたＵ．Ｓ．仮出願６０/９２７，２５９及び６０/９２７，２９３に基づく優先権を主張する。これらの出願の内容は、それらの全体において本願明細書に引用によって組み込まれる。
【連邦政府支援研究発明に関する権利の宣言】
【０００２】
この研究は、（合衆国）国立衛生研究所及び国防総省からの資金提供によって部分的に支援された。合衆国政府は、本発明において所定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、一般的に、レシピエント宿主細胞におけるゲノム組込み方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
４つの天然の（ないし自然な）プロセスが、細菌細胞への大きなＤＮＡ分子の導入に関して記載（報告）されている。それらは、形質転換、形質導入、接合及び細胞融合である。これらの天然のメカニズムも、また報告された実験方法も、いずれも細菌（性）のゲノムを他の細菌細胞に挿入して、挿入ゲノムの遺伝子型及び表現型を有する新たな細胞にすることができない。他の種からのＤＮＡを用いる細菌の形質転換は、ルーチン的な作業であるが、小さなＤＮＡの分節（segments）を用いるにすぎない。穏やかに溶解された赤松枯草菌プロトプラスト（Bacillus subtilis protoplasts Akamatsu）及びその仲間から単離されたヌクレオチドを使用することは、遠位マーカー（distant markers）の同種間同時形質転換を示した。それらの最新の解析は、４．２Ｍｂｐの枯草菌ゲノムの少なくとも３０％がレシピエント細胞に組み換えられたと結論付ける。
【発明の概要】
【０００５】
一つの実施形態において、本願明細書に開示の発明は、第一の種からドナーゲノムを調製すること、第二の種からレシピエント細胞を調製すること、ここで、第一の種および第二の種は、双方とも、同一の属からのものであり、そして単離したドナーゲノムをレシピエント細胞に組込み、それによって、ドナーゲノムがレシピエント細胞を第一の種のそれ（表現型）に表現型的に形質転換することを含む種間ゲノム移植方法に関する。ドナーゲノムは、第一の種の細胞から単離することができ、あるいは合成的に調製することができる。ドナーゲノムは、選択マーカーを任意に含むことができる。本発明の１つの視点において、タンパク質は、組込みの前にドナーゲノムから取り除かれる。本発明の別の視点において、レシピエント細胞は、レシピエントゲノムを含む。ドナーゲノムは、レシピエントゲノム内のシーケンスを認識するが、ドナーゲノム（内のシーケンス）を認識しない制限エンドヌクレアーゼをエンコードすることができる。ドナーゲノムをメチル化することができ、例えば、ドナーゲノムは、ＧＡＴＣ（が）Ｄａｍ（で）メチル化され得る。本発明の更に別の視点において、第一の種は、マイコプラズマ・ミコイデス  ラージコロニー（ＬＣ）（Mycoplasma mycoides Large Colony）であり、第二の種は、マイコプラズマ・カプリコルム（Mycoplasma capricolum）である。
【０００６】
本発明の別の実施形態は、第一の種からドナーゲノムを調製すること、第二の種からレシピエントミニセルを調製すること、ここで、第一の種および第二の種は、双方とも、同一の属からのものであり、そして、レシピエントミニセルにドナーゲノムを組込み、それによって、ドナーゲノムが、レシピエント細胞を第一の種のそれ（表現型）に表現型的に形質転換することを含むミニセルにおけるゲノム組込み方法に関する。ドナーゲノムは、第一の種の細胞から単離することができ、あるいは合成的に調製することができる。ドナーゲノムは、選択マーカーを任意に含むことができる。本発明の１つの視点において、タンパク質は、組込みの前にドナーゲノムから取り除かれる。本発明の更なる別の視点において、第一の種は、マイコプラズマ・ミコイデス  ラージコロニー（ＬＣ）であり、第二の種は、マイコプラズマ・カプリコルムである。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
第一の種からドナーゲノムを調製すること、
第二の種からレシピエント細胞を調製すること、ここで、第一の種および第二の種は、双方とも、同一の属からのものであり、そして
単離したドナーゲノムをレシピエント細胞に組込み、それによって、ドナーゲノムがレシピエント細胞を第一の種のそれ（表現型）に表現型的に形質転換すること
を含む種間ゲノム移植方法。
［２］
ドナーゲノムを第一の種の細胞から単離することを特徴とする［１］に記載の方法。
［３］
ドナーゲノムを合成的に調製することを特徴とする［１］に記載の方法。
［４］
ドナーゲノムが、選択マーカーを含むことを特徴とする［１］に記載の方法。
［５］
タンパク質は、組込みの前にドナーゲノムから取り除かれることを特徴とする［１］に記載の方法。
［６］
レシピエント細胞は、レシピエントゲノムを含むことを特徴とする［１］に記載の方法。
［７］
ドナーゲノムが、レシピエントゲノム内のシーケンスを認識するが、ドナーゲノム内のシーケンスは認識しない制限エンドヌクレアーゼをエンコードすることを特徴とする［６］に記載の方法。
［８］
ドナーゲノムをメチル化することを特徴とする［１］に記載の方法。
［９］
ドナーゲノムは、ＧＡＴＣがＤａｍでメチル化されることを特徴とする［８］に記載の方法。
［１０］
第一の種は、マイコプラズマ・ミコイデス  ラージコロニー（LC）であることを特徴とする［１］に記載の方法。
［１１］
第二の種は、マイコプラズマ・カプリコルムであることを特徴とする［１］に記載の方法。
［１２］
第一の種からドナーゲノムを調製すること、
第二の種からレシピエントミニセルを調製すること、ここで、第一の種および第二の種は、双方とも、同一の属からのものであり、そして
レシピエントミニセルにドナーゲノムを組込み、それによって、ドナーゲノムが、レシピエント細胞を第一の種のそれ（表現型）に表現型的に形質転換すること
を含むミニセルにおけるゲノム組込み方法。
［１３］
ドナーゲノムを、第一の種の細胞から単離することを特徴とする［１２］に記載の方法。
［１４］
ドナーゲノムを、合成的に調製することを特徴とする［１２］に記載の方法。
［１５］
ドナーゲノムが、選択マーカーを含むことを特徴とする［１２］に記載の方法。
［１６］
タンパク質は、組込みの前にドナーゲノムから取り除かれることを特徴とする［１２］に記載の方法。
［１７］
第一の種は、マイコプラズマ・ミコイデス  ラージコロニー（LC）であることを特徴とする［１２］に記載の方法。
［１８］
第二の種は、マイコプラズマ・カプリコルムであることを特徴とする［１２］に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、種々の制限修飾系を示す。
【０００８】
【図２】図２は、メチル化ゲノムＤＮＡを示す。
【０００９】
【図３】図３は、図２に示したメチル化ゲノムＤＮＡと対比させて、メチル化ゲノムＤＮＡを示す。
【００１０】
【図４】図４は、ＦｔｓＺの過剰発現に起因する変化した細胞形態を有するマイコプラズマ細胞の位相差顕微鏡写真を示す。
【００１１】
【図５】図５は、ＦｔｓＺタンパク質を過剰発現して、細長い細胞になり、ドナーゲノムの移植においてレシピエントとして使用することができるマイコプラズマ細胞の位相差顕微鏡写真及び落射蛍光顕微鏡写真を示す。
【００１２】
【図６】図６は、制限酵素Ｍｂｏ  Ｉの存在中におけるＭ・ミコイデスＬＣゲノムＤＮＡの増強された移植を示す。精製したＭ・ミコイデスＬＣゲノムＤＮＡを制限酵素Ｍｂｏ  Ｉの段階希釈液（物）と混合し、その混合溶液（物）をＭ・カプリコルムレシピエント細胞に移植し、選択培地に蒔く（プレーティングする）ことによって移植細胞を回収した。ドナーＭ・ミコイデスゲノムＤＮＡの天然の（自然な）メチル化は、それが酵素によって切断されることを防ぐ。これに対して、レシピエントＭ・カプリコルム細胞のゲノムＤＮＡは、Ｍｂｏ  Ｉに対して感受性である。ドナーＤＮＡ及び酵素の同時形質転換は、レシピエント細胞のゲノムＤＮＡを選択的に損なわせ（compromise）、このことが、回収された移植細胞の数に反映される。このメカニズムは、酵素濃度を増加することで移植細胞の収率が増加するという事象と一致する。プレート番号は、グラフの底辺にリストされている。プレート１  ゲノムＤＮＡ非添加；プレート２  レシピエント細胞なし；プレート３  ゲノムＤＮＡ及び１０μｌのＭｂｏ  Ｉ；プレート４  ゲノムＤＮＡ及び１μｌのＭｂｏ  Ｉ；プレート５  ゲノムＤＮＡ及び０．１μｌのＭｂｏ  Ｉ；プレート６  ゲノムＤＮＡ及び０．０１μｌのＭｂｏ  Ｉ；プレート７  ゲノムＤＮＡ、Ｍｂｏ  Ｉ無し。
【００１３】
【図７】図７は、ブロック内のＤＮＡが、無傷（intact）及び環状であったこと、その一方では、ゲルの中に移動したバンドの中のＤＮＡは直線状であったことを示す。（Ａ）は、Ｍ・ミコイデスＬＣのＤＮＡを含むプラグを載せた（ロードした）パルスフィールドゲルを示す。０．５ｘ  ＴＢＥバッファーのゲルを２０時間電気泳動し、次にＳＹＢＲゴールドで染色した。マーカーレーンは、ＢｉｏＲａｄ（社）の出芽酵母ゲノムＤＮＡサイズマーカーを含む。プラグ内に残る多量のＤＮＡに注目。（Ｂ）では、プラグは、ＰＦＧＥ前（ＢＰＦＧＥ）又はＰＦＧＥ後（ＡＰＦＧＥ）の何れか、そして、ＰＦＧＥ後に生じたゲノムサイズバンド［であり］、そしてＰｌａｓｍｉｄ−Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ヌクレアーゼによる処理あり又は無しの何れかを示す。ヌクレアーゼ酵素は、直線状ＤＮＡを消化（切断）するが、環状２本鎖ＤＮＡに対する影響を有さない。これらのデータは、ゲルの中に移動したＤＮＡのバンドがエキソヌクレアーゼ感受性であり、従って直線状であったことを指し示す。
【００１４】
【図８】図８は、Ｍ・カプリコルム、Ｍ・ミコイデスＬＣ及び一連の移植クローンのサザンブロット解析を示す。ゲノムＤＮＡを、ＨｉｎｄIIIで消化（切断）し、１％アガロースゲルで電気泳動した。ＤＮＡを、Ｎ＋ナイロンメンブレンに転写し、ＩＳ１２９６特異的プローブでプローブした。移植細胞における更なる（付加的な）ＩＳ１２９６バンドは、移植の際に、ＩＳ要素がＭ・カプリコルムの環境に移動させられたときの、ＩＳ要素(エレメント)の突発的な拡大の結果であり得る。
【００１５】
【図９】図９は、プロテオミクス解析を示す。２次元ゲルは、Ｍ・ミコイデスＬＣ（Ａ）、Ｍ・カプリコルム（Ｂ）、移植クローン（Ｃ）からの細胞溶解液を使用して泳動された。固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）細長片（ストリップ）（ｐＨは、４〜７に渡る）での第一次元のタンパク質のスポット（点）の分離、及び第二のＳＤＳ−ＰＡＧＥ次元（分子量８〜２００ｋＤａ）におけるタンパク質のスポットの分離に、標準的な条件を使用した。ゲルを、クーマシーブリリアントブルー  Ｇ−２５０で染色し、９６個のスポットを各々のゲルから切り出した。スポット７１（ゲルＡ）、スポット２３（ゲルＢ）及びスポット８（ゲルＣ）は、酢酸キナーゼとして同定された。Ｍ・カプリコルムの酢酸キナーゼは、明確なアルカリｐＨ移動（シフト）（ゲルＢ）を示した。トリプシン消化し、ＭＡＬＤＩ質量分析解析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ＡＢＩ  ４７００  プロテオミクス分析装置）した酢酸キナーゼのペプチド（スポット８、ゲルＣ）に関するシーケンスカバーマップ（coverage map）は、２つのマイコプラズマ種に同一のペプチド（赤色）及びＭ・ミコイデスＬＣにのみ存在するペプチド（青色）を局在させる。
【００１６】
【図１０】図１０は、アガロースブロック内で単離されたＭ・ミコイデスＬＣ  ＤＮＡのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動解析を示し、検出可能なレベルのＤＮＡ関連タンパク質が無かったことを示す。ゲルは、銀染色した。左パネルにおいて「無傷の細胞」とラベルされた３つのレーンは、ＳＤＳ中で煮沸されゲルに載せられたＭ・ミコイデスＬＣ細胞の３つの［段階］希釈物（液）であった。中央パネルは、ＰＦＧＥ前（Ｂ）又はＰＦＧＥ後（Ａ）のいずれかの、ＳＤＳ中で煮沸されタンパク質ゲルに載せられたＭ・ミコイデスＬＣ  ＤＮＡを有するアガロースブロックを含む。右パネルにおいて、ゲルの最上部にある物質がタンパク質であったか、或いはＤＮＡであったかを決定するために、ＰＦＧＥ前及びＰＦＧＥ後のブロックをＤＮａｓｅ  Ｉで処理した。そのパネルにおいて、マーカーの１つは、ＤＮａｓｅ  Ｉであった。
【００１７】
【図１１】図１１は、移植前のＭ・ミコイデスＬＣドナーゲノムＤＮＡの形態に対するストレプトマイシンの影響を示す。ゲノムＤＮＡは、本願明細書に記載のようにＭ・ミコイデスＬＣ細胞から穏やかに単離された。細胞は、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）（Ａ）、又はテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１０μｇ／ｍｌ）（Ｂ）が添加されたＳＰ４培地中で成長させた。脱タンパク質化したＤＮＡをＳＹＢＲゴールド（１Ｘ、Molecular Probes（社））で１５分間、室温で染色した。７μｌの細胞をスライドガラスに載せ、蛍光顕微鏡（ｘ１０００）（Zeiss（社） Axioskop ２プラス）によって可視化した。
【００１８】
【図１２】図１２は、１７％のウシ胎仔血清及び０．５％のグルコースを添加したＳＯＢ培地中で成長させ、３７℃で１８時間の成長後に、ｐＨが７．５（Ａ）又は６．２であった時のＭ・カプリコルムレシピエント細胞の形態に対するｐＨの影響を示す。５００μｌの細胞を５分間、２２００ｇ、１０℃で遠心分離し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。細胞を１５分間室温でＳＹＢＲゴールド（１Ｘ、Molecular Probes（社））の添加によって染色した。７μｌの細胞をスライドガラスに載せ、蛍光顕微鏡（ｘ１０００）（Zeiss（社）Axioskop ２プラス）によって可視化した。
【００１９】
【図１３】図１３は、野生型ストレイン及び移植（細胞）（CL１１．１）双方のＭ・カプリコルム及びＭ・ミコイデスＬＣ特異的なＰＣＲ増幅を示す。
【００２０】
【図１４】図１４は、３０個の異なるＭ・ミコイデスＬＣフィルタークローン（filter clones）（Ａ）および〜５０個の移植（細胞ないしクローン）（Ｂ）のサザンブロットを示す。ブロットをＩＳ１２９６挿入シーケンスにハイブリダイズしたＰＣＲ単位複製配列（アンプリコン）でプローブした。全てのサンプルはＩＳ１２９６の複数コピーを有するが、異なるサンプルは、わずかに異なるパターンをブロットに有し、要素の移動を指し示した。移植（細胞）に関して、ドナーゲノムは単レーンに示される。
【００２１】
【図１５】図１５は、Ｍ・カプリコルムのＶｍｃＥ及びＶｍｃＦ表面抗原に特異的なポリクローナル抗体、又はＭ・ミコイデスＬＣのＶｃｈＬ表面抗原に特異的なモノクローナル抗体でプローブされたＭ・ミコイデスＬＣ（ゲノムのドナー）、Ｍ・カプリコルム（レシピエント細胞）及び４つの異なる実験からの移植（細胞ないしクローン）のコロニーハイブリダイゼーションを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の詳細な記載
ゲノムの化学合成が、近年記述（報告）されている。Gibson, et al.,「Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome」、Science（２００８年２月２９日）Vol. ３１９. no. ５８６７, pp. １２１５〜１２２０、及び代理人事件整理番号（Attorney Docket No.）６１６８７−３０００８００、６１６８７−３０００８０１、６１６８７−３０００８０２及び６１６８７−３０００８０３、これらの全ては引用によってそれらの全体において［本願明細書に］組み込まれる。この方法論は、細胞の生育に要求される遺伝子の最小セットに関する仮説を試験する手段としての使用、並びに、所望の代謝経路をエンコードするように選択された遺伝子を含有するカスタマイズ化された合成ゲノムを構築するための使用を含む、いくつかの使用に有用である。一度、合成ゲノムが構築されると、それは、エンコードしたゲノムの指示（instructions）を発現することができる細胞環境に導入されなければならない。本願明細書に開示の発明は、第一の種（ドナー）から単離されたゲノムを適切に調製された第二の種（レシピエント）の細胞に移植することができることを示す。ドナーの遺伝性物質（ないし遺伝子材料：genetic material）のレシピエント宿主細胞への導入は、供与される遺伝子材料の操作の結果として、効率的にレシピエント宿主細胞を、遺伝性物質のドナーの属及び種に属するものとして機能的に分類される（クラス分けされる）新たなる細胞に変える。
【００２３】
任意の属及び種のドナー及びレシピエント細胞を、開示した方法で使用することができる。好ましくは、ドナー染色体は、レシピエント宿主細胞と同じ属の起源の生命体に由来する。例えば、種々のマイコプラズマ種からのドナーは、直接的（天然の素材から単離されたゲノムの形態で）、あるいは間接的（ゲノムが合成的に調製され、マイコプラズマ前駆体（上）に構築される）のどちらかで開示した発明での使用のために、遺伝性物質を提供することに使用することができる。
【００２４】
開示した発明（本願発明）は、ドナーの遺伝性物質のレシピエント宿主細胞への移植に関し、ここで、ドナー遺伝性物質は、機能的であり、レシピエント宿主細胞を支配する。レシピエント宿主細胞の支配は、いくつかの異なる方法を介して達成することができる。該方法は、２つの一般的なカテゴリー（それらのゲノムを保持するレシピエント細胞を使用するための方法、及び内因性ゲノムを欠くレシピエント細胞を使用するための方法）に分けることができる。
内因性宿主ゲノムの取り換え
【００２５】
内因性ゲノムを含むレシピエント細胞を使用する移植方法は、好ましくは内因性ゲノムをドナーゲノムによってエンコードされた１以上の生成物によって不活性化することによる方法を含む。本願明細書において提供される種々の方法の実施形態によれば、ドナー染色体又はゲノムは、調製され、宿主細胞に導入される。ドナーゲノムは、レシピエント細胞への導入の際に、レシピエントゲノムを不活性化するか、あるいは、破壊する役割を果たす１以上のシステムをエンコードすることができる。種々のシステムがこの目的を達成する使用のために考えられる。例えば、レシピエントゲノムに対する特異性を有する制限エンドヌクレアーゼを、ドナーゲノム又は染色体によってエンコードすることができる。レシピエントゲノムの再生成又は機能を防ぐ阻害（抑制）性ＲＮＡなどの他のシステムも含むことができる。そのような阻害性ＲＮＡの例は、レシピエントゲノムの複製開始点（ないし起点：origin）を標的にするものだろう。ドナーによるこの阻害性ＲＮＡの生成は、内因性染色体の複製を防止（ないし阻害）するが、その代わりに、ドナーゲノムにレシピエント細胞の制御を行わせ、娘細胞への組込み用の遺伝性物質（genetic material）を提供する。
【００２６】
本発明の一つの実施形態において、ドナーゲノムは、その作用がドナーゲノムに関しては遮断（ブロック）又は阻害されるが、内因性レシピエントゲノムに対しては機能的である１以上の制限エンドヌクレアーゼをエンコードする。例えば、非常に稀な部位（複数）で切断する制限エンドヌクレアーゼを選択し、それらの部位を欠く［ように］ドナーゲノム又は染色体を部分的に修飾する（ないし調整、操作）する（tailor）ことが可能である。好ましい実施形態において、この遮断（ブロッキング）は、ドナーゲノムのメチル化によって達成される。別の実施形態において、ドナーゲノム又は染色体を、ドナー染色体の宿主又はレシピエント細胞への組込み又は移植の前又は後にメチル化することができる。さらに、ドナー染色体のメチル化は、自然に又はインビトロ環境内などのように人工的に起こすことができる。
【００２７】
レシピエント細胞内の内因性染色体は、メチル化されなくても良いし、及び／又は、エンドヌクレアーゼの活性からゲノムを保護しない部位でのメチル化のように不適切にメチル化されても良い。ドナー染色体からの制限酵素の発現により、制限酵素は、特異的な部位（複数）でレジデント染色体を切断することができる。更なる方法では、適切な制限エンドヌクレアーゼは、移植プロセスに含まれる。制限エンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼの宿主細胞への導入直後又はそのほとんど直後にレジデント染色体の分解を開始し、ドナーゲノムからの制限エンドヌクレアーゼの発現のために必要な時間に比べて時間を節約する（セーブする）。
【００２８】
メチルディレクテッドエンドヌクレアーゼ（メチル化ＤＮＡの切断に指向された）は、レシピエント細胞内でメチラーゼを生成し、かつドナー染色体からメチルディレクテッド制限酵素を生成すること又はメチルディレクテッド制限酵素とドナー染色体との同時移植によって採用することができる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、レシピエントは、酵素の認識部位（複数）を含むので制限エンドヌクレアーゼに対して感受性である。ドナー染色体は、そのようなシーケンスを有さないだろうが、その酵素を生成するだろうし、その酵素と同時移植されるだろうし、あるいはレシピエントをその酵素で前処理することができた。同様に、レジデント染色体に特異的なシーケンスを標的にする化学酵素性ヌクレアーゼ（chemioenzymatic nucleases［sic, chemoenzymatic nucleases］）、化学性ヌクレアーゼ及び修飾試薬の同時形質転換を使用することができる。全て、又はいくつかのこれらのアプローチは、移植の前、中及び／又は後に、選択的にレジデント染色体を損なうように処方することができる。認識部位を改修する(tailored)酵素の生成と一緒に利用可能な制限エンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼの範囲は、このアプローチを広範囲に適用可能にする。
【００３０】
その代わりに、レシピエント細胞を、ヌクレオチド類似体の存在中で［成長させる］ことができ、したがって、そのような類似体は、レジデント染色体内でのみ存在することができる。その後、該類似体を、ドナー染色体によってエンコードされたエージェント又はドナー染色体と同時形質転換されたエージェントによって標的にすることができる。レジデント染色体は、そのような病変部位（lesion）を修復する遺伝子学的な能力の存在を伴って、あるいはその存在なしに、選択的に損なわれる（compromised）。
【００３１】
本願明細書において提供される種々の方法によれば、マイコプラズマ・ミコイデスＬＣは、複数の制限修飾系（そのほとんどが、Ｍ・カプリコルムにおける単一の制限修飾系と異なる）をエンコードする。（図１）Ｍ・ミコイデスＬＣ及びＭ・カプリコルムの双方は、ウェスタンブロット解析におけるメチル化アデニンに特異的な抗体の認識によって決定されるように、それらのゲノムＤＮＡにメチル化アデニンを含むが（図２）、Ｍ・ミコイデスＬＣは、ｄａｍ遺伝子（Ｄａｍメチラーゼ）によってエンコードされた大腸菌メチラーゼのオーソログによってＧＡＴＣシーケンスにおいて部位特異的にメチル化されるように見え、これに対して、Ｍ・カプリコルムは、そのように見えない。ＤＡＭメチラーゼは、Ｓ−アデノシルメチオニンからシーケンス「ＧＡＴＣ」内のアデニン残基のＮ６位置（ポジション）にメチル基を移動させる。このシステム及び方法のバイアビリティは、（以下の）２つの要素によって証明される；第一に、アデニンメチル化ＧＡＴＣシーケンスで特異的に切断する制限エンドヌクレアーゼＤｐｎ  Ｉに対するＭ・ミコイデスＬＣゲノムＤＮＡの感受性、及び、ＧＡＴＣシーケンスにおけるアデニンのメチル化によってブロックされる制限酵素Ｍｂｏ  Ｉに対する抵抗性、第二に、Ｍ・カプリコルムゲノムＤＮＡのＤｐｎ  Ｉに対する抵抗性、及びＭｂｏ  Ｉに対する感受性（図３）。
【００３２】
いくつかの実施形態において、１以上のレジデントゲノムに存在しないドナーゲノムの制限エンドヌクレアーゼは、レジデントゲノムを切断する。例えば、Ｍ・ミコイデスＬＣゲノム（ＧＡＴＣ（が）Ｄａｍ（で）メチル化される）がＭ・カプリコルム細胞（ＧＡＴＣ  Ｄａｍメチル化されない）に移植される場合、移植ゲノムから転写されたＭ・ミコイデスＬＣ制限酵素（非メチル化ＧＡＴＣシーケンスを切断する）の発現は、レジデントＭ・カプリコルムゲノムを多くの断片（pieces）へ切断するという結果になる。そのとき、移植されたＭ・ミコイデスＬＣは、ゴーストＭ・カプリコルム細胞を自由に利用する。Ｍ・カプリコルムに存在しないＭ・ミコイデスＬＣの他の制限エンドヌクレアーゼも、レジデントゲノムを切断することができる。
【００３３】
天然の又は合成のＭ・ゲニタリウム（M. genitalium）ゲノム（あるいは、天然又は合成の他のゲノム）の効率的なゲノム移植は、適切な制限修飾系を有するゲノムを供給することによって、本願明細書において提供される１つの方法に従って達成することができる。この方法は、２つのステップにおいて実行することができる。第一に、大腸菌Ｄａｍメチラーゼ遺伝子をＭ・ゲニタリウムゲノムにクローンして、Ｍ・ゲニタリウム細胞がＤａｍメチル化されるゲノムを有するようにする。第二に、対応する制限エンドヌクレアーゼの遺伝子をメチラーゼを含むクローンに加える。この例は、大腸菌遺伝子を含むが、制限メチル化システムは、種々の生命体からのものであり得る。そのように遺伝子操作されたゲノムは、メチル化されて、それ自身の制限システムから保護される。適切なメチル化を欠く感受性ストレインへの移植は、レジデント染色体の分解（ないし変性：degradation）を起こす。合成ゲノムに関して、ゲノムが宿主生命体内で組み立てられる（ないしアッセンブルする）（かつ、不活性化する）場合、合成ゲノムのメチル化を、宿主クローニングストレインによって提供することができる。代わりのシステム及び方法によれば、メチル化は、移植の前にインビトロで行うことができ、あるいは、ドナーゲノムを、関連性のある制限エンドヌクレアーゼに対して抵抗性であるように合成することができる。ドナーゲノムの抵抗性は、他の方法によって達成することができ、そして、本願明細書において提供される種々の方法の範囲に含まれると評価されるだろう。
【００３４】
種々の化合物または刺激にレシピエント細胞を曝すことによって、レシピエント細胞ゲノムが複製できないようにすることもできる。例えば、クロスリンク、あるいは他の方法でレシピエントゲノムが複製できないようにするが、しかしその後、システムから取り除かれる化合物に、レシピエント細胞を曝すことができる。レシピエント細胞を、放射線照射することもでき、それによって、内因性ゲノムは複製できないようにするが、移植されたドナー染色体の機能を維持したままにすることができる。
【００３５】
更なるシステム及び方法によれば、レジデント染色体を、事実上の変更なしに選択的に損なわせる（compromised）ことができる。適切に設置されたｌｏｘ−Ｐサイトは、決定的に重要な複製構成成分（複製の開始点及び終結点など）をレジデント染色体から選択的に取り除くことができる。染色体は実質的に無傷（intact）で残るが、複製したとしても、不完全である。それに比べ、そのような認識部位がないドナー染色体は、Ｃｒｅ  ｌｏｘ−Ｐ組み換えの存在中に、より容易にコピーすることができる。複製開始点又は複製終結点以外の部位は、同様に、レジデント染色体が効率的にその複製する能力又は機能を失わせるようにし、それによってそれを損なわせることができる。同様に、小（small）ＲＮＡの発現は、休止状態の大腸菌を作ることができる。このＲＮＡは、複製に干渉する。ドナー染色体を、このＲＮＡに対して、あるいは同様のエージェントに対して非感受性にすることができる。そのような場合、非感受性ドナー染色体からのＲＮＡの発現、又は、非感受性ドナー染色体とＲＮＡとの同時移植は、染色体それ自体を顕著に変化させることなく、レジデント染色体の複製を選択的に損なわせる。Ｔ４−ファージ  Ｎｄｄタンパク質も、大腸菌染色体が正しく機能することを妨げるが、染色体は、本質的に変化が無い状態で残る。そのタンパク質は、ファージゲノムに対して同様の作用を有さない。Ｎｄｄなどのタンパク質は、ドナー染色体がコピーされる能力に影響を与えることなく、レジデント染色体の複製を選択的に停止することに使用することができる。
アクロモソーマル宿主細胞
【００３６】
記載の本発明の代わりの一実施形態は、アクロモソーマル（achromosomal）宿主細胞あるいはレシピエント細胞の使用を必要とする。アクロモソーマル細胞（ミニセルとしても知られる）は、典型的には、異常（aberrant）な細胞分裂の産物であり、ＲＮＡ及びタンパク質を含むが、染色体ＤＮＡをほとんど、あるいは全く含まない。ミニセルは、染色体ＤＮＡが欠如した細胞の類縁体（derivative）であり、ときには、無核細胞と称される。真正細菌の細胞、及び古細菌の細胞は、真核細胞とは異なり、核（染色体を包む明瞭な細胞小器官）を有さないので、これらの非真核生物のミニセルは、「無核の（anucleate）」に対して、より的確には「染色体がない（without chromosomes）」あるいは「アクロモソーマル（ないし染色体欠如：achromosomal）」と記載される。それにもかかわらず、本発明の分野における通常の知識を有する者は、細菌（性）のミニセルを称するときに、他のミニセルに加えて、用語「無核の」をしばしば使用する。従って、本願の開示（明細書及び特許請求の範囲）において、用語「ミニセル」は、染色体を欠如した真正細菌の細胞の類縁体（ないし誘導体）、染色体（１以上）を欠如した古細菌の細胞の類縁体（ないし誘導体）、及び真核細胞の無核の類縁体を包含する。しかしながら、いくつかの関連分野では、用語「無核のミニセル」又は「無核の細胞」を、ルーズに、上述のミニセルのタイプの何れかを称することに使用し得ることが理解される。外来性ゲノム又は人工染色体からのタンパク質合成を許容し、管理する酵素性機構をミニセルの細胞質が含むという点で、ミニセル又はゴースト細胞は、それらの内因性ゲノム又は人工的な細胞様構造（リポソームなど）を保持するレシピエント細胞を上回るいくつかの利点を有する。
【００３７】
種々の細菌が、ミニセルを生成することが示されている。例えば、U．S．特許Nｏ．４，１９０，４９５（これをもって該特許の全体が本書に引用によって組みまれる）は、タンパク質の組み換え発現に有用であると述べられるミニセルを生じる大腸菌のストレインを示す。U．S．特許Nｏ．７，１８３，１０５（これをもって該特許の全体も本書に引用によって組みまれる）は、真正細菌のミニセルの生成及び核酸送達のためのベクターとしてのそれらの使用を記載する。
【００３８】
ミニセル又はゴースト細胞は、ドナーゲノムを受け、そして、ドナーゲノムを発現する娘細胞を生成するためのレシピエント細胞として使用することができる。しかしながら、ゴースト細胞として標的されているレシピエント細胞がドナーゲノムを分解する制限ヌクレアーゼを合成するときに、それが防止されないならば、このプロセスは限定される。従って、ゴースト細胞合成及び娘細胞の生成のためのゲノムの組込み方法のニーズがある。
【００３９】
ミニセルは、分裂又は成長（ないし増殖）できないが、それにもかかわらず、機能する細胞壁、細胞膜、リボソーム、エネルギー生成システムを含み、それらのシステムの完全性を長期間維持することができる。本願明細書の提供のシステム及び方法の１つによれば、マイコプラズマミニセルは、染色体分離（segregation）（ＳＭＣ、ｓｃｐＡ、ｓｃｐＢ、ｇｙｒＢ）及び細胞分裂（ｆｔｓＺ）に含まれるいくつかの遺伝子の破損又は過剰発現を介して、生成することができる。例えば、Ｍ・ゲニタリウム、Ｍ・カプリコルム及び／又はマイコプラズマ・allagatorisにおいて発見されたようなｆｔｓＺ遺伝子は、これらの各マイコプラズマからのｏｒｉＣ領域（部分）を含むシャトルプラスミドにクローンされる。ｆｔｓＺタンパク質の過剰発現は、長さが可変の（不定の）繊維状の細胞と一緒に、小さく（samll-）染色体が無い細胞の出現を導く。（図４、図５）
【００４０】
加えて、移植の前にレジデント染色体を破壊するために処理することができるであろういくつか又は全ての方法と共に、広範囲の前処理（メチル化又はソラーレン処理を含む前処理を含む）を使用することができる。レジデント染色体を破壊するあるいは不活性化するための任意の遺伝子的な、化学的な、あるいは物理的な方法が、本発明の範囲に含まれる。
【００４１】
さらに別のシステム及び方法において、温度感受性ＤＮａｓｅは、レシピエント細胞ゲノムを第一の温度で分解することに利用することができ、そして、次に、該ＤＮａｓｅは、移植に使用される第二の温度で不活性化される。同様に、染色体の破壊方法は、可逆性（リバーシブル）のＤＮａｓｅ（コリシンＥ２）を採用することができる。この酵素及びそのホモログは、免疫性タンパク質によって容易に不活性化される。レシピエント細胞におけるコリシンＥ２の活性化、生成、又は添加は、そのゲノムを分解するが、その一方では、その後の対応する免疫性タンパク質の活性化、生成、又は添加は、後に加えられたドナー染色体を保護する。
【００４２】
種々の実施形態及び方法が本願明細書に記載されるが、それらは、例として表されているのみにすぎず、限定的ではないと理解されるべきである。さらに、好ましい実施形態の幅及び範囲は、上記の例示的な実施形態のいずれによっても限定されるべきでない。
商業利用性
【００４３】
細菌のホールゲノムを合成する能力は近年報告されている。この技術を使用して、現在、ワクチン、バイオ燃料及び工業的に有用な酵素などの種々の商業利用製品を製造することができる代謝経路をエンコードするゲノムを合成することができる。
【００４４】
本願明細書に記載の技術は、生命体からの免疫反応を誘導する免疫学的な組成物を提供することに有用である。例えば、本願明細書に記載の技術はワクチン組成物を提供するために使用することができる。ほとんどの効果的なワクチンは、いつも、生細胞又はウィルスを採用する。ポリオ、ワクシニア又はＢＣＧを考察されたい。肺炎連鎖球菌又はサルモネラｓｐ（Salmonella sp.）などのいくつかの病原性細菌のストレインは、それらを効果的なワクチンにすることができた免疫（抗）原性の特徴を有するが、しかしながら、現在では、それら生命体から効率的にそれらの病原性を取り除き、その一方では、それらの抗原性を保持することができていない。その作業は、現在のゲノム操作技術にとっては複雑過ぎる。未知の機能の遺伝子、及び潜在的なワクチンゲノムから削除する又は不活性化する必要がある知られた機能の遺伝子が多くあり過ぎる。遺伝子の除去は、個々にそして組み合わせで行われる必要があるだろう。その作業を行うには、単純にテストする可能性が多くあり過ぎる。
【００４５】
合成ゲノムの技術の使用して、ゲノムを所与の生命体からの個々の遺伝子又はゲノムの領域（部位）を含む合成カセットから組合せ的に組み立てる（アッセンブルする）ことができ、多くの異なる変種（ないしバリエーション）のゲノムが生成された。このプロセスは、特定の削除及びランダムな削除の組合せであり得た。これらの異なるゲノムの集まり（populations）を適切なレシピエント細胞に移植することができ、移植（細胞）は、抗原性及び病原性の欠如を探索するインビトロ及び／又はインビボのアッセイにおいてスクリーニングされた。従って、非合成のゲノム技術を使用して行うことができたよりも速やかで、安価な方法で、更なる候補ワクチンを作ること及び適切な活性に関してスクリーニングすることができた。
【００４６】
本願明細書に記載の方法は、細菌マイコプラズマ・ミコイデス  スモール（small）コロニーに起因する伝染性ウシ胸膜肺炎（contagious bovine pleuro pneumonia: CBPP）症を処置することおよび予防することに効果的な組成物を製造することに使用することができる。この病気（肺ペストとしても知られた）は、ウシ、ヤク、水牛、ゼブ（zebu）の主要な病原である。この病気は、アフリカ、中東、南ヨーロッパ、並びにアジアの各地に広範囲に広がる。改良ワクチンに関する実際のニーズがある。この病気の生命体は、ゲノム移植を表すために本願明細書において使用されたＭ・ミコイデス  ラージコロニー  ストレイン  ＧＭ１２に系統学的に密接に関係する細菌である。Ｍ・ミコイデス  スモールコロニーは、ゲノム操作を容易に受け入れない。上述の合成Ｍ・ゲニタリウムゲノムを生成することに使用された合成ゲノム技術を使用して、Ｍ・ミコイデス  スモールコロニー細菌からの種々の抗原遺伝子を、Ｍ・ミコイデス  ラージコロニー遺伝子ゲノムにクローンすることができた。本願明細書に記載の方法は、Ｍ・ミコイデス  スモールコロニー遺伝子が加えられ、選択されたＭ・ミコイデス  スモールコロニー抗原を発現するＭ・ミコイデス  ラージコロニー細胞を生成する、多くの異なるバージョンのＭ・ミコイデス  ラージコロニーゲノムを移植することができた。種々の異なるＭ・ミコイデス  スモールコロニー抗原遺伝子の個々及び組合せが、使用のために考慮される。いくつかのこれらの突然変異体は、生ワクチンとして機能するだろう。
【００４７】
本願明細書に記載の方法は、バイオ燃料を発展するためにも有用である。いくつかの真核生物の藻類は、それらの乾燥重量の７０％と同程度を、油として合成する。光合成の産物であるこれらの油は、理想的なバイオ燃料であった。これらの油を生成する生命体は、砂漠内の泉の中で成長させることができるので、バイオ燃料生成のために耕作可能な耕地は失われないだろう。これらの藻類に伴う１つの問題は、それらがゆっくり成長することである。ゲノム組み立て（アセンブリー）技術を使用して、我々は、これらの経路を構成する酵素をエンコードする遺伝子をクローンすることができ、そして、転写プロモーター、翻訳シグナル、コドンの最適化を変更することによって、真核生物の遺伝子発現の代わりに原核生物の遺伝子発現を許容するように遺伝子を再構成することができた。代謝経路をエンコードするこれらの遺伝子のカセットを、光合成細菌のゲノムに組み入れることができ、その結果としてのキメラゲノムが、光合成の結果として同様の油を生成することができた。これらのゲノムは、次に、適切なレシピエント細胞に移植されるだろう。
【００４８】
開示の発明は、工業的な酵素又は工業的な生命体の製造に関する利用性も有する。開示の方法は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）及びクロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）のキメラである遺伝子（グルコースからエタノールを合成するために必要な酵素をエンコードする前者の種からの遺伝子、及び効率的にセルロースを分解することができるセルラーゼをエンコードする後者の種からの遺伝子を有する）を構築するために使用することができる。そのゲノムを適切なレシピエント細胞に移植することができ、エタノールを生成するために効率よくセルロースを分解することができた細胞を生成することができた。
【実施例】
【００４９】
以下の実施例は、本発明を説明するために提供され、本発明を限定するためではない。
【実施例１】
【００５０】
マイコプラズマ・カプリコルム  レシピエント細胞へのマイコプラズマ・ミコイデス  ラージコロニー（ＬＣ）ゲノムの移植
マイコプラズマ（モリキュート網のメンバー）は、合成細胞を構築するために選択された。この選択は、この細菌の分類単位に特異的な特徴の数に基づいた。マイコプラズマの本質的な特徴は、小さいゲノム、ほとんどの種によるトリプトファン（停止コドンではなく）をエンコードするＵＧＡの使用、そして細胞壁の完全な欠如である。小さいゲノムは、合成し易く、取り扱い中に壊れにくい。遺伝子コードの変化は、マイコプラズマのタンパク質の発現を低減（ないし制限）するので、大腸菌におけるクローニングを促進する。細胞壁の欠如は、これらの細菌の外部表面を真核細胞の細胞膜と同様にし、確立された真核細胞への大きなＤＮＡ分子の挿入方法を我々が使用できるようにすることによって、レシピエント細胞内にゲノムを組み込む我々の作業を単純化することができる。
【００５１】
我々の合成ゲノムは、純粋（ないし無菌）培養において成長する全ての細胞の（中で）、最小ゲノム（５８０Ｋｂ）を有するマイコプラズマ・ゲニタリウムに基づくだろう。我々の合成ゲノムは、Ｍ・ゲニタリウム染色体をモデルとするが、ゲノム組込み方法は、２つの高速成長マイコプラズマ種（マイコプラズマ・ミコイデス亜種  ミコイデス  ラージコロニー  ストレイン  ＧＭ１２、及びマイコプラズマ・カプリコルム亜種  カプリコルム  ストレイン  California kid）を、ドナー及びレシピエント細胞としてそれぞれ使用して発展した。これらの生命体は、双方ともヤギの日和見病原性菌であるが、ＢＬ２条件下の研究室内で成長（ないし増殖）させることができる。それらは、それぞれ８０分毎及び１００分毎に分裂するが、これに対し、Ｍ・ゲニタリウム（この生命体は、近年発表された合成ゲノムのモデルであった）は、９−１０時間毎にのみ分裂する。これらの高速成長マイコプラズマの使用は、合成Ｍ・ゲニタリウムゲノムの移植方法を発展する我々の作業を加速させた。
【００５２】
Ｍ・ミコイデスＬＣ及びＭ・カプリコルムは、マイコプラズマのミコイデス亜種内の別々の種である。双方のゲノムをシーケンスし、関連性の度合いを決定した。２つのゲノムの比較は、１，０８３，２４１ｂｐのＭ・ミコイデスＬＣゲノムのドラフトシーケンスの７６．４％を、１，０１０，０２３ｂｐのＭ・カプリコルムゲノム（Genbank 寄託番号NＣ００７６３３．５）にマップさせることができ、この内容が、平均で９１．５％のヌクレオチドの同一性（ないし相同性）で一致することを示した。残りの〜２４％のＭ・ミコイデスＬＣゲノムは、Ｍ・カプリコルムに見られなかった多くの挿入シーケンスを含む。このホールゲノムショットガンプロジェクトは、プロジェクト寄託番号ＡＡＺＫ００００００００の下でＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。この実施例において記載のバージョンは、最初のバージョンＡＡＺＫ０１００００００である。
【００５３】
いくつかの方法が、この種間ゲノム移植を達成するために探求（ないし調査）された。このプロセスは、３つのキーとなる段階：（１）Ｍ・ミコイデスＬＣからの無傷のドナーゲノムの単離、（２）レシピエントＭ・カプリコルム細胞の調製、（３）レシピエント細胞への単離されたゲノムの組込み、を有した。Ｍ・ミコイデスＬＣの複製開始点（ｏｒｉＣ）を含むプラスミドは、Ｍ・カプリコルム内で複製することができるが、これに対して、Ｍ・カプリコルムのｏｒｉＣを有するプラスミドは、Ｍ・ミコイデスＬＣ内で複製しないという知見（ないし観察結果）に基づいて、このゲノム移植の方向性が選択された。
ドナーゲノムＤＮＡの調製
【００５４】
溶液中のホール染色体の操作は、破損（ないし切断）を引き起こし得る剪断応力（shear forces）にＤＮＡを曝す。従って、アガロースブロックに細胞を懸濁することによって界面活性剤及びタンパク質分解酵素の処理中においてゲノム操作を最小化することが重要であった。細胞を元々保持したアガロース内に結果としてできる空洞（cavern）の中に無傷の染色体を固定化した。消化（分解）されたタンパク質成分、脂質、ＲＮＡ及び剪断されたゲノムＤＮＡは、固定化した無傷（intact）のゲノムＤＮＡから、透析又は電気泳動して分離することができた。
【００５５】
無傷のホールゲノムＤＮＡの単離を、ＢＩＯ−ＲＡＤ（社）のＣＨＥＦ  哺乳類ゲノム用ＤＮＡプラグキットを使用して行った。簡単に説明すると、テトラサイクリン耐性（ｔｅｔＭ）及びβガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）を有するＭ・ミコイデスＬＣ細胞を１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及び１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが添加されたＳＰ４培地内で３７℃で適当な密度まで成長（増殖）させた。培地へのストレプトマイシンの添加は、後述で議論されるだろう。５０〜１００ｍｌの培養細胞を、４，５７５ｇ、１５分間、１０℃の遠心分離によってペレット状にした。細胞を２０ｍｌの１０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ６．５、０．５Ｍ  スクロース添加（溶液）に再懸濁し、上述のようにペレット状にし、１ｍｌ（〜１〜５ｘ１０９細胞／ｍｌ）に［なるように］再び再懸濁した。細胞懸濁液を１５分間、５０℃でインキュベートし、次に、等容量の２％低融点（ＬＭＰ）アガロース／１Ｘ  ＴＡＥバッファー（in 1X TAE buffer）［４０ｍＭ  トリス酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ］と混合した。５０℃で５分間［インキュベートした］後、細胞及びＬＭＰアガロースの混合溶液（２ｍｌ）を１００ｐｌ［sic、μｌ］アリコットづつプラグモールドに分注した。２０個のプラグを４℃で固形化した。２４０ｐｌ［sic、μｌ］のプロテイナーゼＫを含む６ｍｌのプロテイナーゼＫ反応バッファー［１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、０．２％  デオキシコール酸ナトリウム、１％  ラウリルサルコシンナトリウム］を添加することによって、５０℃で２４時間、包埋したマイコプラズマ細胞を溶解し、タンパク質を消化した。次に、２０個のプラグを室温で、１時間、２０ｍｌの１Ｘ  ＴＥバッファー［トリス−ＨＣｌ（２０ｍＭ）−ＥＤＴＡ（５０ｍＭ）、ｐＨ  ８．０１］中で攪拌（アジテーション）で４回洗浄し、１０ｍｌのＴＥバッファー中で４℃で保管した。
【００５６】
穏やかなゲノムＤＮＡの調製は、無傷の環状分子をもたらしたことを確認した。いくつかのアガロースプラグを、Contour-clamped Homogeneous Electric Field（ＣＨＥＦ  ＤＲIII、ＢＩＯ−ＲＡＤ（社））を用いて、１％  ＬＭＰゲルでＴＡＥ中のパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）に供した。パルスタイムは、２４時間に渡り、３．５Ｖ／ｃｍで６０秒から１２０秒までに勾配させた。移動の後、ウェルからプラグを取り除き、１０ｍｌのバッファー［トリス−ＨＣｌ（２０ｍＭ）−ＥＤＴＡ（５０ｍＭ）、ｐＨ  ８．０１］中で４℃で、染色体移植実験の無傷のゲノムＤＮＡの実験材料として使用するまで保管した。ＰＦＧＥの間、無傷の環状細菌染色体は、アガロース中に保持されて、移動しないようにすることができるが、これに対して、直線化した全長ＤＮＡ、並びに、小さいＤＮＡ断片、ＲＮＡ、タンパク質及び界面活性剤及び酵素による消化後に残っている電化を帯びた他の全ての細胞分子は、電気泳動され、プラグの外に出た。図７Ａに示した、SYBRゴールド（Molecular Probes（社））染色したパルスフィールドゲルは、１．１２５ＭＢの直線状ＤＮＡサイズマーカー（ほとんどＭ・ミコイデスＬＣゲノムと同じサイズ）と共に電気泳動されたＤＮＡのバンドと、ウェル（複数）の位置に強いバンドとを示し、多量のＤＡＮがプラグ内にまだあったことを示唆した。プラグ及び切除された１．１２５ＭＢのバンドのPlasmid-Safe ATP-dependent ＤＮＡｓｅ（EPICENTRE BIOTECHNOLOGIES（社））を用いた広範囲の消化は、プラグ内のＤＮＡの量を比較的に変化させることなく残したが、その一方では、１．１２５ＭＢのバンド内のＤＮＡは分解された（図７Ｂ）。Plasmid-Safe ATP-dependent ＤＮａｓｅは、直線状２本鎖ＤＮＡをデオキシヌクレオチドまで消化し、そして、より低い効率で、閉環状及び直線状１本鎖ＤＮＡを消化する。その酵素は、ニック状又は閉環状の２本鎖ＤＮＡあるいはスーパーコイル状のＤＮＡに対しては活性を有さない。これは、多量の環状ゲノムＤＮＡがプラグ内にあったことを指し示す。
【００５７】
プラグに包埋されたＤＮＡが裸状態であったことを確認するために、プラグを分析した。ＳＤＳ中で煮沸した後に、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに載せられた（ロードされた）プラグは、検出可能レベルのタンパク質を示さず、少なくともＤＮＡの大部分は裸状態であることを指し示した（図１０）。さらに、染色体の脱タンパク質化の効率の証拠が、より敏感な技術である質量分析解析から来る。いずれのＭ・ミコイデスＬＣペプチドもＰＦＧＥ前にアガロースプラグ内に存在せず、かろうじて検出可能な量の異なるＭ・ミコイデスＬＣペプチドがＰＦＧＥの後にプラグ内にわずかに存在した。別々のプラグは、別々のペプチドを有した。
【００５８】
ドナーゲノム調製の最終ステップは、アガロース包埋からのＤＮＡの遊離を必要とした。移植実験の前に、Ｍ・ミコイデスＬＣゲノムＤＮＡ（ＰＦＧＥの前又は後）を含むアガロースプラグを２回、３０分間、１ｍｌの０．１Ｘ  ＴＥバッファー［トリス−ＨＣｌ（２ｍＭ）−ＥＤＴＡ（５ｍＭ）、ｐＨ  ８．０１］で穏やかに攪拌して洗浄した。バッファーを完全に取り除き、アガロースプラグを１０分の１の量の１０ｘ  β−アガラーゼバッファー［１０ｍＭ  ビストリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ６．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ］で６５℃で１０分間融解した。融解したアガロースを４２℃まで１０分間冷却し、１００μｌのプラグごとに２．５ユニットのβ−アガラーゼＩ（NEW ENGLAND BIOLABS（社））で同じ温度で一晩インキュベートした。各プラグは、およそ１０μｇのＤＮＡ（〜８ｘ１０９ゲノム）を含むと計算された。すなわち、これらのデータは、プラグが多量の無傷で、環状、ス−パーコイル状で、かつ裸状態のＭ・ミコイデスＬＣからのゲノムＤＮＡを含んだことを示唆した。
【００５９】
アミノグリコシド（系）抗生物質ストレプトマイシンを含む培地で成長したＭ・ミコイデスＬＣ細胞からのドナーゲノムＤＮＡの調製は、ゲノム移植の効率を２倍にした。ゲノムに緊密性を誘導することができるストレプトマイシンは、ドナーゲノムの態様を変化させた。ストレプトマイシンなしで成長した細胞から単離されたドナーＤＮＡの蛍光顕微鏡写真は、明るいドットがほとんど混ざってないＤＮＡ繊維のごたまぜを示す（図１１Ａ）。Ｍ・ミコイデスＬＣ培養細胞をストレプトマイシンを含むＳＰ４培地で成長させた場合、繊維というよりも明るいドットとして見えるＤＮＡの分画は、さらに増強した（図１１Ｂ）。明るいドットは、環状、スーパーコイル状態のゲノムを表すことができると信じられる。
レシピエント細胞調製及びゲノム移植反応条件
【００６０】
Ｍ・カプリコルムレシピエント細胞を、培地のｐＨが６．２になるまで３７℃でインキュベートした１７％ウシ胎仔血清及び０．５％グルコースを含むＳＯＢ培地の６ｍｌ培地内で調製し、次に細胞を４，５７５ｇ、１５分間、１０℃で遠心分離することによってペレット化した。更なる成長は、培地をさらに酸化して、レシピエント細胞をゲノム移植用により適さなくすることが見出された。ｐＨが７．４から６．２まで減少すると、規則的な卵型のＭ・カプリコルム細胞が劇的に形を変えた。細胞は、より長く、より薄くないし細く、分枝状である（図１２）。細胞を一度、［トリス  １０ｍＭ−NaCl  ２５０mM （pH  ６．５）］で洗浄し、２００μｌのＣａＣｌ２（０．１Ｍ）で再懸濁し、氷（上）で３０分間保持した。その期間中、穴が大きいゲノムピペットチップを使用して、２０μｌのβ―アガラーゼ処理した複数のプラグ（〜５０ｎｇ／μｌ）を、デリケートに血清を含まない４００μｌのＳＰ４培地（ＳＰ４（−））の中に移し、３０分間室温でインキュベートした。ゲノム移植のために、１０μｇの酵母ｔＲＮＡ（Invitrogen）と混合したＭ・カプリコルム細胞を２０μｌのＭ・ミコイデスＬＣホールゲノムＤＮＡを含む４００μｌのＳＰ４（−）の中に穏やかに移した。等量の２ｘ融合バッファー［トリス  ２０mM、ＮａＣｌ  ５００mM、ＭｇＣｌ２  ２０mM、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００  １０％］を加え、内容物（液）をチューブを揺り動かすことによって穏やかに１分間混合した。５０分間３７℃で［インキュベートした］後、１０ｍｌのＳＰ４を加え、３時間３７℃でインキュベートして細胞を回復させた。最後に、細胞を４,５７５g、１５分間、１０℃で遠心分離し、０．７ｍｌのＳＰ４に再懸濁し、そして、３μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及び１５０μｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌを含むＳＰ４アガー（寒天）プレート上に蒔いた。抗生物質クロラムフェニコール及びストレプトマイシンなどの他の抗生物質での処理は、移植の効率を顕著に増加させることも観察されている。
【００６１】
プレートを３７℃でインキュベートし、〜３日後、大きく青いコロニー（推定上のＭ・ミコイデスＬＣ）が形成された。我々の移植培養細胞がドナーゲノム細胞調製プロセスからのＭ・ミコイデスＬＣ細胞でコンタミするリスクを最小化するために、３つの別々の覆い（hoods）を細胞培養作業に使用した（１つは、Ｍ・ミコイデスＬＣドナー細胞調製用であり、１つは、Ｍ・カプリコルム用であり、１つは、移植クローンを用いる作業用である）。ときどき、〜１０日後、（より）小さいコロニー（推定上カプリコルム、青と、白の両方）が可視化した。個々のコロニーを選び取り、５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むブイヨン培地中で成長させた。増殖中に、テトラサイクリン濃度を徐々に１０μｇ／ｍｌまで増加させた。最初に開発されたとき、この技術は、全てのプラグにＰＦＧＥを施したが、後に、このステップは必要ないことがわかった。プラグのＰＦＧＥの結果としての移植収率において顕著な差は観察されなかった。
【００６２】
各実験において２つのネガティブコントロールが含まれた。Ｍ・ミコイデスゲノムＤＮＡが生育可能な細胞を含まなかったことを確証するために、１つのコントロールは、Ｍ・カプリコルムレシピエント細胞を使用しないことを除き、正確に上述のように処理した。同様に、別のコントロールにおいて、Ｍ・カプリコルムレシピエント細胞をいずれのドナーＤＮＡを使用することなく、偽（模倣）移植した（mock transplanted）。一連の実験の結果を表１に示す。レシピエント細胞を欠くコントロール（複数）において、いずれもコロニーは全く観察されず、したがって、ドナーＤＮＡは、生育可能なコンタミとしてのＭ・ミコイデスＬＣ細胞を少しも含まなかった。
表１．  コントロールを示す一連の実験の結果
0005637846.tif 000002
＊  この実験の後、６回の実験を行ったが、移植クローンを全く生じなかったことを表１にはリストしなかった。
†  これらの実験におけるより高いゲノム移植効率は、Ｍ・ミコイデスＬＣドナーゲノムを成長させることに使用したＳＰ４培地におけるストレプトマイシンの含有に起因した。
推定上の移植（細胞）の解析
【００６３】
Ｍ・ミコイデスＬＣゲノム移植から結果として得られた青く、テトラサイクリン耐性のコロニーは、あたかもゲノムがうまく（成功して）移植されたと期待（予測）されよう。しかしながら、その表現型を有するコロニーは、ｔｅｔＭ及びｌａｃＺ遺伝子を含むＭ・ミコイデスＬＣゲノムＤＮＡのフラグメントのＭ・カプリコルムゲノムへの組み換えの結果でもあり得る。組み換えを除外するために、移植クローンの表現型及び遺伝子型を調査した。
遺伝子型解析
【００６４】
推定上の移植（クローンないし細胞）が選択されたｔｅｔＭ及びｌａｃＺマーカー遺伝子以外のＭ・ミコイデスＬＣシーケンスを有するか否かを決定するために、いくつかの移植クローンを各々の種に特異的なプライマーを使用してＰＣＲによって解析した。ＰＣＲプライマーの特異性は、シーケンスされたＭ・ミコイデスＬＣゲノムにおいては１１コピーが存在するが、Ｍ・カプリコルムゲノムには不在のＩＳ１２９６挿入シーケンスに使用された。同様に、Ｍ・ミコイデスＬＣには存在しないＭ・カプリコルムのアルギニンデイミナーゼ遺伝子に特異的なＰＣＲプライマーを使用した。ＩＳ１２９６ＰＣＲは、テンプレートがＭ・ミコイデス野生型ストレインであった場合、又は移植クローンの１つであった場合にのみ単位複製配列を生成した。同様に、Ｍ・カプリコルムアルギニンデイミナーゼＰＣＲは、Ｍ・カプリコルムテンプレートＤＮＡを使用した場合には単位複製配列を生成したが、Ｍ・ミコイデスＬＣ野生型ＤＮＡ、或いは移植クローンからのＤＮＡを使用した場合には単位複製配列を生成しなかった。ＰＣＲ実験は、Ｍ・カプリコルムゲノム内に、ＩＳ１２９６、ｔｅｔＭ遺伝子及びｌａｃＺ遺伝子を含むＭ・ミコイデスＬＣゲノムのフラグメントが、それらがアルギニンデイミナーゼ遺伝子を破壊するように、組み換えられたという可能性も残した（図１３）。ゲノム全体に着目する、より確信する遺伝子型解析は、ドナー及びレシピエントマイコプラズマ、そして、一連の推定上の移植（細胞）のサザンブロット解析を使用した。それらの種の各々からのゲノムＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで消化し、１％アガロースゲル（上）で泳動した。サザンブロットを調製し、ＩＳ１２９６シーケンスでプローブした。期待（予測）したように、プローブは野生型Ｍ・カプリコルムのレーンに全くハイブリダイズしなかった（図８）。この解析は、得られた全ての移植細胞（＞２００）、並びに一連のＭ・ミコイデスＬＣクローンについて行われた（図１４）。いくつかは、バンディング（banding）パターンにおいてバリエーションを示したが、野生型Ｍ・ミコイデス及び推定上の移植（細胞）の多くのサザンブロットが同一であったことが観察された。これはＩＳ要素の転移の結果であったと思われた。３０個の非移植Ｍ・ミコイデスＬＣサンプル及び７１個の移植細胞を用いたブロットの解析は、移植細胞におけるＩＳ１２９６含有フラグメントにおける更なる多様性を示す。ドナーゲノムがＭ・カプリコルム細胞質の中に導入された移植の初期の段階においては、抑制が無いことがあり得るが、これに対し、Ｍ・ミコイデスＬＣ細胞内ではＩＳ１２９６要素の移動度（性）を多少抑制することができると、仮定された。次に、２つの移植クローンから生成されたホールゲノムライブラリのサンプルシークエンシングを行った。各クローンのゲノムからの１３００を上回るシーケンスの解読文（結果）（＞１Ｘゲノムをカバー）の解析は、全ての解読文（結果）がＭ・ミコイデスＬＣシーケンスと一致したことを示した。Ｍ・カプリコルムに特有のシーケンスは無かった。Ｍ・ミコイデスＬＣ又はＭ・カプリコルムゲノムシーケンスと一致しなかった２４個の解読文（結果）は、ほとんどが、Ｍ・ミコイデスＬＣに��ける活性化トランスポゾンに起因すると予測され、そして、ライブラリ作成の部分とも予測される、非常に短い解読文（結果）（＜２００ベース）又はキメラクローンの結果のいずれかであった。上述の結果は、Ｍ・ミコイデスＬＣゲノムがうまく（成功的に）Ｍ・カプリコルムに導入され、その後、抗生物質による選択中にカプリコルムゲノムの欠落が起こるという仮説と全て一致した。
表現型解析
【００６５】
移植クローンの表現型を２つの方法で調査した。１つは（第一に）、これら２つのマイコプラズマの各々に特徴的な単一の遺伝子生成物に着目した。コロニーウエスタンブロットを使用して、ドナー及びレシピエント細胞コロニー、そして４つの異なる移植（細胞）からのコロニーを、Ｍ・カプリコルムのＶｍｃＥ及びＶｍｃＦの表面抗原に特異的なポリクローナル抗体で、そして、Ｍ・ミコイデスＬＣのＶｃｈＬの表面抗原に特異的なモノクローナル抗体でプローブした。双方のアッセイにおいて、Ｍ・ミコイデスＬＣ  ＶｃｈＬ（特異的抗体）がＭ・ミコイデスＬＣのブロットに結合したのと同様の輝度で、移植細胞のブロットは、Ｍ・ミコイデスＬＣ  ＶｃｈＬ特異的抗体を結合させた（図１５）。同様に、移植細胞のブロットは、Ｍ・カプリコルムＶｍｃＥ及びＶｍｃＦに特異的な抗体を結合させなかった。さらに、全ての３つのストレインの細胞溶解液を、２次元電気泳動（２−ＤＥ）ゲルにおける差の表示を使用するプロテオミクス解析に供し、次に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（matrix-assisted laser desorption ionization：MALDI）質量分析を使用してタンパク質のスポットの同定を行った。顕著に、Ｍ・ミコイデスＬＣ及び移植クローンの２−ＤＥのスポットのパターンは、２−ＤＥの限度内で同様であったが、その一方では、Ｍ・カプリコルムの２−ＤＥのスポットのパターンは、非常に異なった。５０％を上回るそれぞれのスポットを、ゲル間で一致させることができなかった（図９Ａ−Ｃ）。移植細胞のプロテオームは、Ｍ・ミコイデスＬＣのプロテオームと同じであり、Ｍ・カプリコルムの特徴を少しも有さないという更なる証拠をＭＡＬＤＩ−ＭＳのデータから得た。移植細胞のおよそ９０個の同定したスポットに関して、Ｍａｓｃｏｔアルゴリズムで得られた信頼度のスコアは、高いシーケンス相同性にもかかわらず、Ｍ・カプリコルムタンパク質に比べＭ・ミコイデスＬＣの方が例外なく等しいか又は高かった。９４個のＭＳ／ＭＳスコアは、Ｍ・ミコイデスＬＣのタンパク質におけるペプチドシーケンスとユニークに一致し（Ｍａｓｃｏｔの期待値は、０．１１及び３．８ｘ１０−１１の間）、いずれのペプチドもＭ・カプリコルムにユニークに一致しなかったという結果を得た。例えば、図９Ｄは、それぞれのＭ・ミコイデスＬＣのタンパク質のシーケンスにのみ一致する酢酸キナーゼのペプチドを表す。したがって、表現型アッセイも、移植細胞がＭ・ミコイデスＬＣであること、及びＭ・ミコイデスＬＣゲノムの移植の後であり、かつ、細胞分裂の際に２つのゲノムに分離する前のドナー及びレシピエント細胞ゲノム間の組み換えによって生じたＭ・カプリコルム−Ｍ・ミコイデスＬＣのモザイクの結果では無いことと一致した。
ゲノム移植効率の最適化
【００６６】
どの因子（要素）がゲノム移植効率を支配するのかを決定するために、移植実験において使用されたＭ・カプリコルムレシピエント細胞の数及びＭ・ミコイデスＬＣゲノムＤＮＡの量を変化させた。１０７〜５ｘ１０７個の細胞が使用された場合、移植細胞の収率（ないし移植効率:transplant yield）は最適であった。より低いドナーＤＮＡ濃度では、移植されたゲノムＤＮＡの量及び移植細胞の収率の間の比例関係があった。より高いドナーＤＮＡ濃度では、収率は、台地状（平坦な台面状）になった（表２）。後の実験において、上述した実験において使用されたように５％ＰＥＧ８０００（ＵＳＢ）の代わりに５％ＰＥＧ６０００（Ｆｌｕｋａ）を用いることは、およそ５倍の移植効率の増加をもたらしたことがわかった（表Ｓ３）。ドナーゲノムのＲＮａｓｅ処理が、移植（効率）を低減させないことも観察された。
表２  移植したＭ・ミコイデスＬＣゲノムＤＮＡの量を関数とするゲノム移植
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＊  ２つの異なるプレートで観察された移植コロニー
表３  ゲノム移植効率に対するＰＥＧの入手元及び分子量の影響
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【００６７】
これらのデータは、ある種から別の種へのホールゲノムの移植が、ドナーゲノムと同様の種である子孫をもたらすことを示す。しかしながら、それらは、移植のメカニズムを説明しない。マイコプラズマがそれらの細胞壁を欠く点で、哺乳類の細胞に類似するので、一連のアプローチが、大きなＤＮＡ分子を真核細胞へ転移させることに関して有効であるかを試験した。これらは、カチオン−界面活性剤媒介の形質移入、エレクトロポレーション、及び種々のカチオン性剤を使用するドナーゲノムの圧縮（コンパクション）を含んだ。これらのアプローチのいずれもホールゲノム移植に関する有効性を立証しなかったが、ＰＥＧをベースにした方法は、真核細胞に関して開発したＰＥＧ誘導性細胞融合法に類似と仮定できる。この仮説を検証するために、２つのＭ・カプリコルムの親ストレイン（１つは、染色体にｔｅｔＭマーカーを保有し、他の１つは、安定なｏｒｉＣプラスミド内にクロラムフェニコール耐性マーカー（ＣＡＴ）を有する）を双方とも「レシピエント」細胞として調製し、混合し、移植実験に関して上述のような融合バッファーの存在中でインキュベートした。５％ＰＥＧの存在中にのみ、双方の抗生物質に耐性がある子孫が低頻度で得られた。細胞をＣａＣｌ２で前処理した場合に、コロニーの数は、およそ３０ｘに増加した（表Ｓ４）。３０クローンのシーケンス解析は、全てのクローンが、細胞内に、予測した（期待した）染色体及びプラスミドの位置において、ｔｅｔＭ及びＣＡＴマーカーの両方を有することを示した。したがって、我々のＰＥＧをベースにした方法の下で、Ｍ・カプリコルム細胞が融合すると結論付けられた。これらの結果は、Ｍ・カプリコルム細胞の融合は５％ＰＥＧ中で最大であったことを表すShlomo Rottem氏の膜研究に一致する。唯小さいＤＮＡセグメントが転移されるのみであるにも拘らず、マイコプラズマ・プルモニス（Mycoplasma pulmonis）への遺伝子転移も、細胞が融合しやすい濃度でＰＥＧによって媒介された。いくつかの場合において、細胞が、裸状態のＭ・ミコイデスＬＣゲノムの周囲で融合することができることを想像することができる。これらのゲノムは、Ｍ・カプリコルム原形質内に捕捉されて、ｔｅｔＭタンパク質を発現し、一度テトラサイクリンを含むＳＰ４アガー培地上に蒔かれた場合に、大きな融合細胞をして成長・分裂せしめる。Ｍ・ミコイデスゲノムを欠く細胞は、成長しない。最終的には（eventually）、今やＰＥＧの不在において、細胞分裂及び染色体分離のプロセスを介して、テトラサイクリン耐性であるかにかかわらず正常の、β−ガラクトシダーゼを生成するＭ・ミコイデス細胞が、大きい青いコロニーをプレート上に生成する。この基本的なＰＥＧが媒介するゲノム移植のアプローチは、抗生物質耐性遺伝子を含む裸状態のゲノムで他の種が移植されることを許容することができる。文献（the literature）は、より多くの一般的な細菌（conventional bacteria）において、プロトプラスト又はスフェロプラストを作るための細胞壁の部分的な消化が、それらが多量の他のＤＮＡの組込みを受けることができるようにすることを示唆する。それにもかかわらず、この種のホールゲノムの転移は、自然には起こりそうに無い。ＳＤＳ及びプロテイナーゼＫ��理の不在時には、Ｍ・ミコイデスＬＣ細胞からの各様態（ヌクレオイド）は、それらが脱タンパク質化（deproteinized）されてしまうまで移植細胞を生成しないだろうということが観察された。自然に起こる脱プロテイン化かつ無傷（intact）の双方の状態にある自由浮遊性の細菌のゲノムはありそうにないので、ゲノム移植は、研究室にユニークな現象であろう。それにもかかわらず、細菌のＤＮＡ伝達（transfer）の５番目の形態が発見されたものであり、それは、修飾（修正）された天然のゲノム、あるいは合成生物学者によって開発されている方法によって生成される人工ゲノムを使用して新種生成のための基盤に、レシピエント細胞がなることを許容するものである。
表Ｓ４  Ｍ・カプリコルムにおける細胞融合
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ａ  ２つの親ストレインを、ゲノム移植実験に関して上記記載したように「レシピエント」細胞として同時に調製し、２ｘの融合バッファー［トリス  ２０mM、ＮａＣｌ  ５００mM、ＭｇＣｌ２  ２０mM、ポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ）１０％］の存在中で混合した。
ｂ  細胞外プラスミドＤＮＡの取り込みではなく、細胞融合に起因するコロニーを示すため、ＰＥＧ−細胞混合物（液）中の１０ユニットのＤＮａｓｅ  Ｉ（New England Biolabs（社））を添加。
ｃ  ２つの親ストレインを（ａ）に記載したように処理したが、２ｘ融合バッファー［トリス  ２０mM、ＮａＣｌ  ５００mM、ＭｇＣｌ２  ２０mM］は、ＰＥＧを全く含まなかった。
ｄ  ２つの親ストレインを（ａ）に記載したように処理したが、ＣａＣｌ２処理は省略した。細胞は、洗浄バッファー［トリス  １０mM、ｐＨ  ６．５、ＮａＣｌ  ２５０mM］の中で、氷上で、３０分間、プレインキュベートした。