(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において、蛍光実体及び第二の実体を含む蛍光分析物の血液クリアランスをモニタ又は決定する非侵襲性の方法であって、前記第二の実体が標的に特異的である少なくとも一つのエピトープ結合ドメインを含む診断的及び／又は治療的薬剤であり：
（ａ）  蛍光実体を励起するために、前記被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を照射する工程、
（ｂ）  前記被験体の眼を通し、（ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出される光を受信し、これにより前記蛍光分析物の血液クリアランスをモニタ又は決定する工程を含んでなる方法。
【請求項２】
被験体において、蛍光実体及び第二の実体を含む蛍光分析物の血液レベルを定量化する非侵襲性の方法であって、前記第二の実体が標的に特異的である少なくとも一つのエピトープ結合ドメインを含む診断的及び／又は治療的薬剤であり、
（ａ）  蛍光実体を励起するために、前記被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を照射する工程、
（ｂ）  前記被験体の眼を通し、（ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出される光を受信し、これにより蛍光分析物の血液レベルを定量化する工程を含んでなる方法。
【請求項３】
被験体の血液において、蛍光実体及び第二の実体を含む蛍光分析物の存在を決定する非侵襲性の方法であって、前記第二の実体が標的に特異的である少なくとも一つのエピトープ結合ドメインを含む診断的及び／又は治療的薬剤であり：
（ａ）  蛍光実体を励起するために、前記被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を照射する工程、
（ｂ）  前記被験体の眼を通し、（ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出される光を受信し、これにより前記被験体の血液における前記蛍光分析物の存在を決定する工程を含んでなる又はから成る方法。
【請求項４】
工程（ｂ）で受信される前記光が参照値と比較され、これにより：
（ｉ）  前記蛍光分析物の血液レベルを定量化する；又は
（ｉｉ）  前記蛍光分析物の血液クリアランスを決定する
請求項１又は２の何れか一つに記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）が、（ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出される光を受信する工程において、前記被験体の眼を通して放出された光の量を専ら決定し、これにより
（ｉ）  前記蛍光分析物の存在を決定する；
（ｉｉ）  前記蛍光分析物の血液レベルを定量化する；又は
（ｉｉｉ）  前記蛍光の血液クリアランスをモニタ又は決定する
工程により特徴付けられる請求項１から４の何れか一つに記載の方法。
【請求項６】
（ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出される前記光が、前記被験体の眼を通して専ら受信される請求項１から５の何れか一つに記載の方法。
【請求項７】
（ａ）において、少なくとも一つの予め定められた波長の前記励起光が、前記被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ専ら照射される請求項１から６の何れか一つに記載の方法。
【請求項８】
被験体の更なる領域から、（ａ）の予め定められたの波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出される光を決定する工程（ｃ）を更に含んでなる請求項１から７の何れか一つに記載の方法。
【請求項９】
蛍光分析物を励起するために、被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ照射される少なくとも一つの予め定められた波長の励起光の光軸、及び予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出される光の光軸が、互いに予め定められた角度で配置される請求項１から８の何れか一つに記載の方法。
【請求項１０】
蛍光分析物を励起するために、被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を照射するために使用される励起手段、及び予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出される光を受信するために用いられる光検出器が、空間的に離されている請求項１から９の何れか一つに記載の方法。
【請求項１１】
薬学的又は診断的組成物の分解動力学を決定するために、及び／又は物質の除去経路を評価するために、被験体の血液における薬剤、抗体又はそれらの機能的断片、タンパク質及び／又はペプチドの存在を決定するための、血液レベルを定量化するための、又は血液クリアランスをモニタ又は決定するための請求項１から１０の何れか一つに記載の方法。
【請求項１２】
（ｂ）において、（ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する前記光が光検出器で受信され、前記光検出器が、（ａ）で使用された、励起光の予め定められた波長を分離するためのハードウェア及び／又はソフトウェアフィルタを含む、請求項１から１１の何れか一つに記載の方法。
【請求項１３】
前記フィルタが（ａ）で使用された、励起光の予め定められた波長を拒絶する請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験体の血液において、蛍光実体及び第二の実体を有する蛍光分析物の存在を決定する、血中レベルを定量化する、及び／又は血液クリアランスをモニタ又は決定する非侵襲性の（非観血的な）方法に関し、（ａ）蛍光実体を励起するために、前記被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ少なくとも１つの予め定められた波長の励起光を照射する工程、（ｂ）前記被験体の眼を通し、（ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する前記蛍光分析物から放出される光を受信し、これによって前記被験体の血液における前記蛍光分析物の存在を決定する、血中レベルを定量化する、及び／又は血液クリアランスをモニタ又は決定する工程を含んでなる又はから成る。本発明は更に、前記方法の何れか一つにおける使用のための、前記請求項の何れか一つに規定される蛍光分析物又は蛍光標識に関する。本発明は更に、前記方法の何れか一つにおいて用いられる診断組成物の調整のための、前記請求項の何れか一つにおいて規定される蛍光分析物及び蛍光標識の使用に関する。本発明は更に、ここに規定される方法の何れかにおける使用のための装置に関する。
【０００２】
非侵襲性の画像処理法は、１８９５年のウィルヘルム・レントゲンによるＸ線の発見までさかのぼることができる。今日の医学は、画像処理技術及びそれらの利用の数における大幅な増加を示す。コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）及び核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）は、いくつかの古典的な非侵襲性画像処理技術である。これらの技術は、解剖学的、形態学的、生理学的変化に基づき、癌等の疾病の診断を可能にする。
【０００３】
しかしながら、これらの確立された技術の多くは、感度を欠き、特異的ターゲティングは低減され、また分子基盤における機能的変化を呈することが不可能であり、これにより基礎研究、前臨床的、及びトランスレーショナル利用において適切なツールではない。よって、疾患は、時間において形態学的に可視可能となる後期にのみ診断可能となる。
【０００４】
このために、研究者は、高感度及び高コントラストでの、遺伝子発現、受容体活性、シグナル経路、アポトーシス、及び多剤耐性の画像化のための分子機能画像処理技術に注目してきた（Weissleder and Mahmood, Radiology 2001; Vol. 219: 316-333）。
【０００５】
「古典的」画像診断、例えば核磁気共鳴画像法（ＭＲ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波（ＵＳ）画像処理等と比較して、光学分子イメージングなどの分子イメージングは、これらの分子的変化の終端効果の画像化ではなく、疾患の基である分子的異常を分析する。
【０００６】
蛍光及びバイオルミネセンス画像処理等の光学分子イメージングは、医学診断法において最も若い最新技術のうちの１つであり、分子レベルでの変化の画像処理に対する強力なツールとなった。この技術の目的は、疾患形成の間の分子的変化の可視化及び定量化である。
【０００７】
特に興味深いものでは、スペクトルウィンドウである近赤外線（ＮＩＲ）を放出する蛍光色素であり、ヘモグロビン及び水は最小限を吸収し、光子が組織内を数センチメートル透過することを可能にする。
【０００８】
標識として使用される蛍光色素は、近赤外範囲の光を吸収しなければならない。それらは、高い蛍光量子収量、高い水溶性及び光感受性を示さなければならない（Heiduschka等, Investigative Ophthalmology & Visual Science 2007; Vol. 48: 2814-2823）。これまでに、シアニン色素（Ｃｙ-色素）が、生物医学的研究において効果的で信頼性が高い蛍光色素であると証明された。近赤外線領域におけるそれらの蛍光により、光子は、組織に深く進行することが可能であり、またそれらは低組織自己蛍光に特徴付けられる。それらはｐＨ変化に対して光安定性であり非感受性である。シアニン色素の他に、アレクサ色素が、光学イメージング技術において使用される一般的な蛍光色素である。
【０００９】
初期段階で疾病を診断することは患者の予後にとって大きな利点となり、また適切な処置が遅れずに始めることができる。機能イメージング術能力は、細胞及び分子レベルでの機能的経路の研究、血管新生及び低酸素を評価する能力を含む。非侵襲性に生物学的プロセスを視覚化するために、また定量化を可能にするために、注射可能な造影剤が必要とされる。このプローブは、高感度で検出されることができる標識及び所望の標的に対し高親和性を呈するリガンドを有する。感度を高めるために標識特異的シグナルを強化するストラテジーが必要であり、最後にはなったが標識特異的シグナルを検出するために高解像度の画像診断技術が必要とされる（Hengerer and Mertelmeier, Electromedica 2001; Vol. 1: 44-49）。遺伝子レポーター及び外因性細胞トラッカー等の代替の標識技術は異なる標識ストラテジーに基づくが、これらは主にマウスモデル及び基礎的生物科学に限られていた。
【００１０】
光学分子技術は、癌の複雑さ、多様性及びインビボでの挙動を理解するためにますます用いられている。腫瘍は、細胞外受容体に特異的な標識抗体を使用して検出されることができる。遺伝子療法は分子マーカー遺伝子を使用してモニタされることができる。この技術は適切な標的構造物のインビボ及び／又はインビトロでの評価を可能にし、またこれらの構造物に対する治療の効果が決定されることが可能であり、薬剤開発を加速させた（Hengerer and Mertelmeier, Electromedica 2001; Vol. 1: 44-49; Hogemann and Weissleder, Radiologie 2001; Vol. 41: 116-120; Reiser等, Lehrbuch der Radiologie, Thieme Verlag, 2004; Cutler, Surg Gunecol Obstet 1929: 721-728）。現時点では、主にＣＴ、ＭＲＴ、ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴが、臨床試験での治療的効果を試験する一般的な画像処理技術である。
【００１１】
組織中を進行し組織成分と相互作用する光子が光学イメージング技術の基礎を形成する。光を用いた診断である光学イメージングは、１９２９年にカトラーによって初めて報告されたが、高感度ＣＣＤ検出システム及び蛍光色素の生化学マーカーとの結合の機会の発展のみであり、光学イメージングを研究者に注目させた（Ntziachristos and Bremer, Radiology 2003; Vol. 1: 195-208）。医学及び生物科学において、蛍光照明及び観察は最も急速に適応された画像処理技術の一つであった。多くの天然に生じる物質は、別の波長を有する光に曝される時、特定の波長の光を放射する。この出現は発光と呼ばれている。放射光が急速に生じる場合（約１００万分の１秒）蛍光として定義され、放射が１００万分の１秒より長くなる場合は発光はリン光と呼ばれる。この発生は長い間知られており、これらの蛍光分子は多くの生物学的システムにおける標識として非常に有効であると証明されている。蛍光を発する物質はほとんどの場合、励起光（λ吸収）の波長より長い波長で光（λ放出）を放出する。これらの波長間の差がストークスシフト（λストーク）と呼ばれ、励起及び放出波長間のエネルギー準位（ΔＥ）を表す。様々な励起波長が蛍光を励起する。この範囲が吸収スペクトルとして知られている。放出スペクトルも様々な波長を包含し、一蛍光物質がただ一つの励起波長に限られないことを示唆する。多くの生物学的物質は天然に蛍光性であり、特に多くのビタミン、幾つかのホルモン、及び種々の酵素及び構造タンパク質である。これらの分子はしばしば、インビボでの特定の蛍光標識研究を干渉するのに十分な強い蛍光を放出する。いわゆる自己蛍光は不必要なバックグラウンドをもたらすため、励起光及び放出光は共に高くフィルター処理される必要がある。励起光波長を制限することは、自己蛍光の量を低減しうる。放出光の波長範囲を制限することは、所望の特定の蛍光を観察し測定することを干渉する自己蛍光の量を最小化する。電磁スペクトルの近赤外範囲での光の放出する蛍光色素の発展により、より深い組織レベルにおけるインビボ診断が可能である。感度は、調査されるマーカーの量及び位置に依存する（Bremer and Ntziachristos, American Journal of Surgery 2001; Vol. 189: 389-392）。可視光は数ミリメートル内の深さの組織を透過可能であることに対して、近赤外線光子（６５０−９００ｎｍ）は数センチメートルの範囲においてより効率的に組織中を進行する。この現象の理由は、その波長範囲での水、メラニン及びヘモグロビンからの低い吸収係数である。このポジティブな組織特性のため、近赤外線波長範囲は「診断ウィンドウ」とも呼ばれる（Mahmood and Weissleder, Molecular cancer therapeutics 2003; Vol. 5: 489-496）。近赤外線スペクトルにおいて、光子は最小レベルで吸収され、組織自己蛍光は低減され、結果として最適な標的バックグラウンド比となる（Licha and Riefke, Photochemistry and Photobiology 2000; Vol. 3: 392-398）。
【００１２】
ヒト又は動物の体の機能をモニタすることが多くの状況において必要である。一般的に血液サンプルが被験体から採られ、成分が分光光度法、すなわち光学イメージング技術で測定された。分光光度計は、被験体と接触させることにより被験体の血液の成分を測定するために直接適用されることができ、例えば、改造コンタクトレンズシステム等の装置、すなわちインビボ光学イメージングシステムを使用する。
【００１３】
WO 90/12534、WO 02/071932及びWO 2006/079824が装置を記載し、特に、眼を介した、血中酸素レベル等のヒト又は身体の機能のリアルタイムのモニタリングに使用される改造コンタクトレンズシステムを記載する。これらの文献に記載される発明は、麻酔の間の特に眼を介した酸素濃度の測定に注目し、これは眼が脳の状態を評価するより直接的な方法を提供するためである。これは、眼動脈を通した眼への主要血液供給が内頸動脈の分岐であるためである。従って、眼は、脳の「ウィンドウ」として適切に称されることができる。
【００１４】
そこに記述される装置は、非侵襲性の分光光度法システムであり、先行技術（US 5,553,617及びUS 5,919,132）と比較して、虹彩の平面の中心に焦点を合わせることにより眼の軸に沿って光を照射し、これにより先行技術の欠点を克服するとされている。
【００１５】
これらの分光光度法技術の原理は、光が眼にもたらされることである。この光は眼を通過して、網膜によって反射される。（網膜からの）反射光及び反射光の強度がフォトダイオード又は他の光センサーを用いて測定され、そしてこの波長の透過率が算出される。眼が光を透過するよう設計された体の唯一の部分であるため、いわば分光光度計のキュベットとして作用する。
【００１６】
インビボでの分子イメージングは、例えば臨床画像診断等に影響を与える急速に進歩する分野である。光学分子イメージングは、光学コントラスト物質が被験体に導入もしくは被験体内で活性化される方法であり、光学コントラスト物質による結果として生じるシグナルは、例えば一以上の画像を提供するカメラ等の光検出器を使用して測定可能である。
【００１７】
光学分子プローブは入手可能であり、蛍光又は発光色素、又は吸収物質を含有することが可能であり、また特定の細胞タイプを標的とする及び標識するために、又はバイオルミネセンスのような生化学的プロセスを活性化するために使用されることができる。光学分子イメージングは、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、Ｘ線又は陽電子放出画像処理（ＰＥＴ）と比較して、このような蛍光、発光、又は吸収物質が小さい生体適合性分子でありえるという事実から利点を得る。
【００１８】
インビボでの光学分子イメージングが、様々な薬剤又は疾病の生理学的、病理的、薬理学的影響を研究するために小動物で典型的には実施される。分子イメージングはヒトにおいても実施可能であり、分子イメージングが画像診断において実質的な進歩を最終的に提供することが望まれる。小動物のインビボイメージングの利点は重要であり、なぜならこれは、プロセス及び反応がそれらの天然環境においてリアルタイムで可視化されることを可能にし、時間にわたり同じ小動物を用いて縦断的研究が実施されることを可能にし、治療に対する疾病の進行又は反応の評価を可能にするからである。更に、小動物のインビボイメージングは、研究のために必要な動物の数を減らし、また上皮内癌等の疾患徴候が動物ごとに異なる研究における分散を低減することができる。
【００１９】
例えば小動物における光学分子イメージングは、薬物開発及び疾患調査のために高特異的で生物学的適合性であるコントラスト剤の力を利用する。しかしながら、インビボでの光学イメージングの広範囲にわたる採用は、標的とされた内部臓器を明瞭に分解し識別することができないことにより抑止されてきた。この問題に対処するために開発された光トモグラフィー及び組合せのＸ線マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）の試みは、一般的に高価、複雑であり、又は真の解剖学的コレジストレーションが不可能である。
【００２０】
従って、Hillman and Moore, Nature Photonics (2007), Vol. 1: 526-530は、動的コントラストを使用した例えば小動物の分子イメージングのための全光型解剖学的コレジストレーション、つまり動的蛍光分子イメージング技術を提供した。彼らの技術は、例えば不活性色素の注入後に得られる時系列画像を使用する。色素のインビボでの分布動力学の差異は、組織の正確な描写及び識別を可能にする。
【００２１】
このようなコレジスタされた解剖学的マップは、再配置又は体重増加にかかわりなく縦断的な器官の識別を可能にし、同所性の疾患、診断及び治療の研究に対し高く改善された精度及び多様性を約束する。
まとめると、光学分子イメージングの非常に進歩した技術が入手可能であり、これは器官の正確な描写及び識別を可能にする。更には、光学分子イメージングに利用可能である近赤外線蛍光及び発光色素を含む様々な蛍光物質が入手可能である。
更には、眼は、少なくとも脳に対する「ウィンドウ」として有用であることが既に認識されている。
【００２２】
しかしながら、前述の試み及び非常に進歩した技術及び色素にもかかわらず、被験体の血液における外来及び天然の生理学的物質を質的に又は量的に決定する等の、臨床診断利用のための、商業的に現実的な非侵襲性のインビボ（リアルタイム）方法及び使用はまだ開発されていない。
【００２３】
このように、本発明の基礎をなしている技術的問題は、インビボで血液における蛍光分析物を非侵襲性にモニタ及び／又は定量化するための手段及び方法を提供することであった。
【００２４】
本発明はこの需要に取り組み、そして、技術的問題に対する解決策として、被験体の血液における蛍光分析物をインビボで且つ非侵襲的に、質的に及び／又は量的に決定するための手段及び方法並びに使用に関する実施態様を提供し、これにより、蛍光標識分析物が、光学分子イメージングによって被験体の眼を介して決定、定量化、又はモニタされる。
【００２５】
これらの実施態様は、ここに特徴付けられ記述され、請求の範囲に反映される。
【００２６】
ここで使用される場合は、単数形「a」「an」及び「the」は、特に明らかな記載がない限り複数形も含まれる。従って、例えば、「a reagent」への言及は一又は複数のこのような異なる試薬を含み、「the method」への言及は、変更又はここに記載される方法との置換が可能である当業者に公知である均等の工程及び方法も含む。
【００２７】
本開示において引用される全ての刊行物及び特許を、出典明示によりその全内容をここに援用する。引用により援用される材料が、本願明細書と相反する又は矛盾する場合は、本願明細書はそれらのいかなる材料にも優先する。
特に明記しない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」なる用語は、該一連のなかの全要素に言及していると理解されなければならない。当業者は、常套的な実験のみを使用して、本願明細書に記載される本発明の特定の実施態様の多くの均等物を認識又は確認するであろう。このような均等物は、本発明により包含されるものとする。
【００２８】
本願明細書及び続く請求項を通して、文脈が特に限定しない限り、語「含む（comprise）」、及び「含む（comprises）」及び「含んでなる（comprising）」等の変異形は、明記された数字又は工程、又は数字もしくは工程の群の包含を意味し、何れかの他の数字又は工程、又は数字もしくは工程の群を除外するのではないことが理解される。
【００２９】
幾つかの文書が、本明細書の全体を通して引用される。本願明細書において引用される各文書（全ての特許、特許出願、科学的刊行物、製造者の仕様書、指示等を含む）は、前後の位置に関係無く、出典明示によりその全内容をここに援用する。本願明細書において何も、本発明が、従来技術によるそのような開示に先行する権利がないという承認として解釈されるものではない。
【００３０】
薬物動態学は、投与後に体が特定の薬剤にどうのように影響するかを記述する。従って「薬物動態学」は、投与された薬剤の吸収及び分布のメカニズム、薬剤作用が開始する割合及び効果の持続時間、体内における物質の（例えば酵素による）化学変化、及び薬剤の代謝物の排泄の経路及び効果の研究を含む。従って、薬物動態学は、生命システムにおける化合物の代謝にアプローチする合理的手段を提供する。薬物動態学の式及びモデルの総説については、例えばPoulin and Theil, J Pharm Sci. (2000), Vol. 89: 16-35; Slob等, Crit Rev Toxicol. (1997), Vol. 27: 261-272; Haddad等, Toxicol Lett. (1996), Vol. 85: 113-126; Hoang, Toxicol Lett. (1995), Vol. 79 :99-106; Knaak等, Toxicol Lett. (1995), Vol. 79) :87-98; and Ball and Schwartz, Comput Biol Med. (1994), Vol. 24 :269-276を参照のこと。実際では、薬物動態学は主に薬剤物質に適用されるが、原則としては生物に経口摂取又は他の方法で外部から送達された例えば栄養分、代謝物、ホルモン、毒素等のあらゆる種類の化合物に対して関係する。
【００３１】
本発明の開示まで、薬物動態学（ＰＫ）の「一般的な」測定は、薬剤のｉ．ｖ．（静脈内）又はｉ．ｐ．（腹腔内）注射によって従来通りに実施された。投与後の異なる時間点で、採血され、薬剤血清レベルが異なる分析法（例えばＥＬＩＳＡ、ＳＥＣ、ＨＰＬＣ、非標識又は放射標識化合物を用いた液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法）により定量化される。統計学的に意味があるデータを得るために、約３から５匹のマウスが、血清ピークレベル（tmax）及び血清薬剤半減期（t1/2）を得るための各時点で典型的には使用された。一つの研究のために約９から１５匹のマウス（例えば連続採血法で７時間点及び各時間点に対して３から５匹のマウス）が必要となる。tmax及びt1/2は双方ともに内挿により決定され、これらはそれらの値の正確性に影響しうる（図１、２）。マウスは、ＰＫ研究の終了後に殺される。
【００３２】
それらとは対照的に、我々は、血液中の、及び必要であれば所望の時間にわたり一被験体（例えばマウス）において同時に血液中及び器官内の、蛍光分析物のレベル（例えば薬剤レベル）の非侵襲性で連続的なリアルタイムのモニタリングを可能にする方法及び対応する装置を提案する。血液サンプルを採ることによる蛍光分析物（例えば蛍光標識薬剤等）の定量化は、ＰＫデータを得るのにほとんど必要なく、動物を殺す必要もない。我々は、３つの異なる化合物を評価することによりこの方法の有用性を実証した：
１．インドシアニングリーン：蛍光色素
２．パミドロン酸：蛍光標識ビスホスホネート
３．受容体チロシンキナーゼに対するＣｙ５標識モノクローナル抗体。
【００３３】
我々は、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）蛍光色素を用いて、この新規な方法の技術的な実現可能性をまず評価した。マウスに静脈内注射される場合、ＩＣＧはおよそ２〜４分（１、２）で循環から除去され、肝臓（３）に蓄積する。吸入麻酔を受けた雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスはイメージングチャンバ（図３）に置かれ、２０μｇ／２００μｌの用量で静脈内注射された。眼内の蛍光シグナル強度測定は、ＩＣＧの静脈内注射の１０秒前に開始され、画像は８分にわたり５００ｍｓの取得時間で毎秒記録した。ＩＣＧは、６７１から７０５ｎｍの波長範囲の光によって励起され、放出は８２０ｎｍで検出された。眼領域内の蛍光シグナル強度の最高値を１００に正規化し、図５、６において示されるデータは、２分でtmaxに達し、蛍光強度の半減期は６．６分であることを示す。第二の実験では、ｓ．ｃ．増殖腫瘍（Ｃａｌｕ３）を持つＢＡＬＢ／ｃヌードマウスがＩＣＧを静脈内注射され、眼、肝臓、腎臓、脳及び腫瘍領域のシグナル強度がモニタされた。この実験では、tmaxは１．２分であった。シグナル強度はその後減少し（t1/2＝５．４分）肝臓への蓄積が観察され３．８分でプラトーに達した（図７）。これらの結果は公開データと一致する。実施例１に示される可能性調査の成功終了後、我々は、蛍光標識ビスホスホネート（パミドロン酸）を評価した。ビスホスホナート（例えばパミドロン酸；ＭＷ２７９）は、骨疾患の治療に臨床的に有用である。（静脈内注射後）パミドロン酸は、２０〜３０分の範囲の血清半減期を有し、骨（脛骨）が調査した全組織の中で最も高い濃度を有した。Pongchaidecha M等 Clearance and tissue uptake following 4-hour and 24-hour infusions of pamidronate in rats. Drug Metab Dispos 1993;21(1):100-104 Daley-Yates等 A comparison of the pharmacokinetics of 14C-labelled ADP and 99mTc-labelled ADP in the mouse. Calcif Tissue Int 1988;43:125-127.  我々は、蛍光標識パミドロン酸を使用し、マウスの眼及び全身画像内における蛍光強度を測定することにより、t max及びt1/2血漿レベルを算出し、記載の動態学をモニタした。静脈内注射の後、パミドロン酸は、２０〜３０分の範囲の血清半減期を有し、骨（脛骨）が調査した全組織の中で最も高い濃度を有した（４、５）。OsteoSense（２００μｌＰＢＳに２ｎＭｏｌ）が静脈内注射され、蛍光シグナル強度が５秒ごと記録された（獲得時間：３０００ｍｓ；励起波長：６１５〜６６５ナノメートル；放出波長：７８０ナノメートル）。血清t1/2は３４分（図７、８）であり、脊椎及び後肢への蓄積は４．４時間及び４８時間で明瞭に実証された（図９）。両観察は公開データと一致する。最後に、受容体チロシンキナーゼを標的とする非標識及びＣｙ５標識モノクローナル抗体のt1/2が比較された。一般的な測定は用量５ｍｇ／ｋの静脈内注射で７．７時間のt1/2を示した（図１０）。光学イメージングを使用し、用量２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射で、t1/2は３．０５時間であった（図１１）。
【００３４】
これらの結果は、麻酔された動物の眼内の蛍光シグナル強度を単に測定することによりtmax及びt1/2が容易に実施できることを実証する。従来の技術と比較して、この新たな試みはＰＫ研究の性能を改善し、これは薬剤の定量化及びデータ内挿が必要ないからである。更に、マウスの数が著しく低減され、マウスが殺される必要がない。薬剤の蓄積及び異なる器官からのt1/2値は、時間分解及びオンラインで得られることができる。総合すると、この手法は１匹の動物における多数の測定を可能にする（tmax及びt1/2の精度を改善する）。従来の方法と比較して、作業時間が著しく低減され、血液サンプルの混合が防がれ、非放射性物質の使用は放射化学への注意無しで通常の実験方法により更なる分析を可能にする。tmax及びt1/2に加えて、器官分布が追跡されることができる。このような同時測定は、血清におけるt1/2と比較して、興味の器官への蓄積に関する情報を容易にする（例えば血液脳関門浸透の徴候）。薬剤（低分子量物質、ペプチド、タンパク質、抗体及びｓｉＲＮＡ）は、異なる有機蛍光色素を用いて容易に標識されることができる。しかしながら、標識された薬剤を用いたこのようなインビボ研究を実施する前に、非標識薬剤と比較して違いがないことを機能的分析は示さなければならない。ヘモジュベリンに関して、インビトロ実験は、非標識及びＣｙ５標識ヘモジュベリンは、ＨｅｐＧ２細胞におけるＢＭＰ-２誘導のヘプシジンｍＲＮＡのアップレギュレーションを遮断するそれらの能力において異ならないことを確認した。また、Biacoreデータは、Ｃｙ５標識ハーセプチンが、非標識ハーセプチンと比較して同じ結合特性を有すること及びＨｅｒ２発現腫瘍細胞と結合することを示した。受容体チロシンキナーゼを標的とする標識抗体は受容体の内部移行を導く。動物が犠牲にされないので、同じ及び／又は他の薬剤（第一とは異なる放出スペクトルを有する蛍光色素で標識される）の多数の適用が、薬剤-薬剤相互作用に関する情報を得るために使用されることができる。更に、静脈内、腹腔内、経口、吸入、経鼻及び経皮適用後に薬用量の最適化、及び新規に設計された製剤が、正常及び遺伝子操作された（例えばＦｃＲｎノックアウト又はｈｕ ＦｃＲｎトランスジェニック）マウスで評価されることができる。イメージング方法の特別な発展は、インビボ状況下での薬剤の能力及びドラッグデリバリーシステムの視覚化を可能にする。薬剤の位置及び濃度に関する詳細で定量的な情報が、時間の関数として得られることができ、これにより生物学的効果のより深い理解を可能にする。この情報は最適化された薬剤の設計にとって重要である。
【００３５】
従って、本発明によって提供される新規な非侵襲性のイメージング方法の影響は重大である。第一に、新規な方法は、蛍光標識された薬剤などの蛍光分析物の薬物動態学をインビボでリアルタイムに評価するために使用されることができる。これは、次に、薬物開発、薬物試験、及び任意の被験体（例えばヒト患者）に対する適切な治療及び治療変更の選択、及び投薬量の最適化に影響することが考えられる。例えば、患者依存型治療を確立することが可能であり、すなわち、任意のセットの薬剤又は製剤の薬物動態学に基づいて、各患者に対して最良の薬物療法、つまり個別化医療を見つけることが可能である。事実、薬物動態学プロファイルは非侵襲性にリアルタイムで各一被験体について評価されることができ、速いフィードバックを可能にし、従って例えば体重、性別、年齢、健康の状態、疾患の経過等の被験体の特性に依存した各一被験体に最適な医療のために行われることができる。
第二に、本発明の新規な分子イメージング／定量化方法及び装置は、生命システムのインタクトな微小環境において何れの種類の薬剤を研究することを可能にする。新規なイメージング装置、使用、及び方法は、癌、心血管、神経変性、炎症性、伝染性、及び他の疾患を含む多数の異なる疾患のコントロール及び根絶を促進するように計画された多種多様な新規な生物学的、免疫学的、分子的治療法において応用範囲が広い。更に、記載されている検出システム及び方法は、シームレス（seamless）疾患検出及び併用設定における治療に対する幅広い応用を有する。
第三に、新規な方法及び装置は、多くの疾患の基礎を形成する病原体の存在を、インビボでだけでなくリアルタイムで検出することができる。
第四に、新規な方法は、薬力学において用いられることができ「ＰＤ」と省略されることがあり、薬物動態学と併せて言及される時には「ＰＫＰＤ」と称することができる。薬力学は、体への、又は体上又は体内の微生物又は寄生虫への薬剤の生理学的効果、及び薬物作用のメカニズム、及び薬剤濃度及び効果の関係の研究である。
【００３６】
光学イメージングは非侵襲性及び非イオン性様式であり、異なる利用に対する診断手段として出てきた。この技術は、単純であるが高感度様式の分子イメージング調査を提案する。血中のピークの薬剤濃度、半減期、及び器官への蓄積の非侵襲性の可視化が、蛍光標識分析物を使用することにより実施されることができる。測定は連続的に実行されることができ、従って秒のオーダーでの時間分解能を有するＰＫ分析の可能性を与える。数時間の期間にわたる多重測定（獲得時間は通常１秒以下）により、「動力学的動画（kinetic movies）」が作成されることができ、血清ピークレベル、血中における半減期、投与後すぐの理論上の濃度、及び異なる器官への分布／蓄積を算出することを可能にする。
【００３７】
このように、第一の態様では、本発明は、被験体の血液において、蛍光実体及び第二の実体を有する蛍光分析物の存在を決定する非侵襲性の方法であって：
（ａ）  蛍光実体を励起するために、前記被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域へ、少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を照射する工程、
（ｂ）  前記被験体の眼を通し、（ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出される光を受信し、これにより前記被験体の血液における前記蛍光分析物の存在を決定する工程
から成る又はを含んでなる方法を提供する。
【００３８】
「存在を決定する」とは、被験体の血液（又は血液循環システム）における蛍光分析物の定性的検出を意味し、これにより蛍光分析物がそこ（血液及び／又は血液循環システム）にあるかどうか決定することを可能にする。
【００３９】
更なる態様では、本発明は、被験体において、蛍光実体及び第二の実体を有する蛍光分析物の血液レベルを定量化する非侵襲性の方法であって、
（ａ）  蛍光実体を励起するために、前記被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を照射する工程、
（ｂ）  前記被験体の眼を通し、（ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出される光を受信し、これにより蛍光分析物の血液レベルを定量化する工程を含んでなる方法を提供する。
【００４０】
この目的のために、被験体に問題の分析物の規定量を投与し、血液中の前記分析物の量を定量化するために前記被験体から血液サンプルを採り、そして、その後、本発明の方法により得られる（同時に又は連続的に得られる）蛍光シグナルとこれらのデータを相関／比較することが想定される。一旦その相関が得られると、もはやその当被験体から血液サンプルを採る必要がなく、つまり一旦データが相関されると、蛍光分析物の血液レベルを本発明の方法によって定量化することが可能であることが理解できるだろう。
【００４１】
あるいは及び／又は加えて、本発明の方法によって得られた蛍光シグナルを、既に知られている（例えば従来技術で発表されている）又は一般的な方法によって予め又は後で評価された血清レベルデータ（血液サンプルを含む）と比較することが想定される。
【００４２】
このように、好ましい実施態様では、工程（ｂ）で受信された前記光が参照値と比較され、これにより：
（ｉ）  前記蛍光分析物の血液レベルを定量化する。
【００４３】
本発明はまた、被験体において、蛍光実体及び第二の実体を有する蛍光分析物の血液クリアランスをモニタ又は決定する非侵襲性の方法であって、
（ａ）  蛍光実体を励起するために、前記被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を照射する工程、
（ｂ）  前記被験体の眼を通し、（ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出される光を受信し、これにより前記蛍光分析物の血液クリアランスをモニタ又は決定する工程
を含んでなる方法を提供する。
【００４４】
好ましい実施態様では、工程（ｂ）で受信された前記光は参照値と比較され、これにより
（ｉｉ）前記蛍光分析物の血液クリアランスを決定する。
【００４５】
用語「血液クリアランス」は、生物学的半減期、tmax及び／又はt1/2の決定及び／又はモニタリングを含む。
【００４６】
用語「生物学的半減期」とは、分析物が、その活性、例えば生物学的、薬理学的、又は生理学的活性の半分を失うのにかかる時間を意味する。
【００４７】
用語「tmax」は、ここで使用される場合、最高血中濃度に達する時間である。最高血中濃度は、被験体の血液に存在する化合物の量である。
【００４８】
「T1/2」は、体内の分析物の総量又は血液における物質の濃度が半分に減少するのに必要な時間である。t1/2はまた、物質（例えば薬剤）が止められた後、体又は血液から分析物を効果的に除去するのにどれくらいの時間がかかるか決定するために使用されることができる。半減期についての知識は、例えば、所望の血中濃度を得るための薬の投与の頻度（１日当たりの摂取回数）の決定のために有用である。
【００４９】
本発明の方法は、例えば、期間にわたり蛍光シグナルをモニタすることによってt max及びt1/2を決定することを可能にする。このように、最大シグナル強度及び最低シグナル強度を決定することによって、t max及びt 1/2は決定されることができる。従って、通常t max及びt 1/2を決定するようには、予め定められた間血液サンプルを採る必要がない。
【００５０】
しかしながら、t max及び／又はt 1/2は任意で、通常の方法で血液サンプルを採ることによって決定されてもよい。そして、t max及びt 1/2値は、本発明の方法によって決定されるt max及びt 1/2値と比較され得る。このように、本発明の方法は、例えば薬の投与が改善することを可能にし、つまり目的は、被験体の対し最高の有効性及び最小限の副作用を確実にする投薬量で各薬剤の処方に達することである。
【００５１】
「蛍光分析物の血液クリアランスをモニタ又は決定すること」とは更に、被験体の血液又は血液循環から除去される時間あたりの蛍光分析物の量がモニタ又は決定されることを含む。実質的な血漿タンパク質結合を呈する蛍光分析物については、クリアランスは通常、遊離濃度ではなく全濃度（遊離+タンパク質結合）として定義される。
分析物は、例えば、腎臓、肝臓、腸、肺、又は専門的な抗原提示細胞等の免疫系により処理されることにより濾過又は除去され得る。これらのデータは、本発明の方法によって得られた結果に加えて得られることができる（下で更に説明される）。
【００５２】
腎臓の他の部位では、しかしながら、クリアランスは濾過よりむしろ膜輸送タンパク質によって成され、広範な血漿タンパク質結合は毛細血管床内にわたり遊離物質の濃度をかなり一定に保つことによりクリアランスを増加し得、毛細管を通る遊離物質の減少された濃度によるクリアランスの減少を阻害する。
【００５３】
分析物は、また、例えば、腫瘍又は固形腫瘍への抗体の結合などの標的媒介クリアランスによって濾過又は除去されうる。
【００５４】
用語「腫瘍」は、ここで使用される場合、無秩序な細胞増殖によって典型的に特徴付けられる哺乳類動物生理的状態を意味又は記述する。腫瘍の例は、限定するものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫（髄芽細胞腫及び網膜芽細胞腫を含む）、肉腫（脂肪肉腫及び滑膜細胞肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍（カルチノイド腫瘍、ガストリノーマ及びすい島細胞癌を含む）、中皮腫、シュワン腫（聴神経腫を含む）、髄膜腫、腺癌及び黒色腫を含む。
【００５５】
用語「固形腫瘍」は、本願明細書において用いられる場合、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵嚢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓又は腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門の癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆管の腫瘍、並びに頭頚部癌の群から選択される腫瘍を意味し、好ましくは乳癌である。
【００５６】
方法の意図に従い、本発明の方法において単独で又は何れかの組合せで使用されることができる少なくとも３つの異なる光源-検出技術がある。
【００５７】
最も単純なものは持続波（ＣＷ）イメージングである。この技術は、一定強度の励起光を使用し、複数の光源-検出器対を用いて（１）励起フルオロフォアの分布によるシグナル又は（２）（組織吸収及び散乱による）光の減衰を測定する。該技術は、技術的に比較的単純で、通常最高のシグナル対ノイズ（ＳＮＲ）特性をもたらす。
【００５８】
より精巧な方法は、単一又は多数の周波数で強度変調（ＩＭ）励起光を使用することである。この方法では、入射光に対する変調光の減衰及び位相変位が、複数の光源-検出器対に対して測定されることができる。強度減衰を得るＣＷ測定と比較して、ＩＭ技術は２つの情報、すなわち光源-検出器対につき強度減衰及び位相変位を提供する。振幅及び位相は、通常無相関の測定値であり、固有コントラストの吸収及び散乱係数をより効率的に決定することができる。蛍光モードにおいて、該技術は、２組の情報、色素濃度及び蛍光寿命を画像化することができる。
【００５９】
第三の方法（時間分解（ＴＲ）技術）は、眼及び／又は組織に入射される短パルスの励起光を使用する。該技術は光源-検出器対に対し検出光子が媒体に進行する時間の分布を分解する。時間分解法は光源-検出器対につき最も高い情報を含み、多周波数で同時に実施されたＩＭ法のみに匹敵する。これは、前の二つ方法によって使われる連続波成分（ｆ＝０  ＭＨｚ）を含み、時間分解データのフーリエ変換が１ＧＨｚまでの多周波数で情報を生産することを考えると容易に説明されることができる。従って、時間分解法は、ＣＷシステムとの直接比較のためのＣＷ成分を提供し、更に、（フーリエ変換を経て）多周波数での強度減衰及び位相変位測定を提供し、固有の吸収及び散乱、またフルオロフォア濃度及び蛍光寿命を画像化することができる。
【００６０】
蛍光イメージングでは、少なくとも１、すなわち１、２、３、４、５又はそれ以上の予め定められた波長を含んでなる予め定められた帯域幅を有するフィルタ処理光又はレーザーが励起光の光源として使用される。「予め定められた帯域幅」は、励起光が、（蛍光実体及び／又は蛍光分析物から成る）それぞれのフルオロフォアから蛍光光を励起することができる予め定められたスペクトル成分（単一波長、単一バンドの波長、一以上の波長又は一以上のバンドの波長を含む）を含むことを意味する。一以上の予め定められた波長が使用される場合、これらの少なくとも２つの波長が識別されている又は識別可能であることが好ましい。ここで使用する場合、用語「励起光」は、励起光源により発生された光を記述するために使用される。励起光は、限定するものではないが、フルオロフォアから蛍光を励起することが可能であるスペクトル光成分（すなわち波長）を含む。蛍光光を励起することが可能な励起光のスペクトル成分は、単一波長、単一バンドの波長、一以上の波長又は一以上のバンドの波長を含むことができる。蛍光光を励起することが可能な励起光のスペクトル成分は、約４００〜７００ナノメートル（ｎｍ）の可視スペクトル領域囲の一以上の波長を含むことができる。しかしながら、蛍光光を励起することが可能な励起光のスペクトル成分は、他のスペクトル領域の一以上の波長も含むことが可能であり、例えば、約７００〜１０００ナノメートルの近赤外線の（ＮＩＲ）スペクトル領域、又は約１〜４００ナノメートルの紫外線（ＵＶ）スペクトル領域が可能である。励起光は、蛍光を励起しないスペクトル成分を更に含むことができる。蛍光光を励起することが可能な励起光のスペクトル成分は、それらが励起する蛍光より短い波長を有することができる。しかしながら、他の設定では、励起光の幾つかの更なるスペクトル成分は、それらが励起する蛍光より長い波長を有することができる。好ましい実施態様では、励起光は、約６７１〜７０５ｎｍ（ＩＣＧ）の範囲のスペクトルバンドを含む。
【００６１】
励起光は、強度において連続的、波において連続、パルス、又は調整され得（例えば周波数又は振幅によって）又は、それの何れかの適切な組合せでもあってもよい。幾つかの実施態様では、励起光はコヒーレント光、例えばレーザー光である。他の実施態様では、励起光はインコヒーレント光、例えばＬＥＤから発生する光子又は黒体放射から生成されたフィルタ処理光である（例えば白熱、ハロゲン又はキセノン球）。他の実施態様では、励起光は、コヒーレント及びインコヒーレント光の組合せである。
【００６２】
本発明の実行に有用であるイメージングシステムは、好ましくは３つの基本構成要素を含む：（１）励起光、（２）励起光及び放出光を分離又は識別する手段（好ましくは、励起光及び／又は検出システムに適切とされるソフトウェア及び／又はハードウェアフィルタ）、及び（３）本発明の少なくとも一つの蛍光標識から及び／又は蛍光実体から及び／又は蛍光分析物から放出された光を受信する検出システム（光検出器）。光源（励起手段）が、予め定められた又は調節可能なフィルタを任意に具備しうる（ｉ）と想定される。光源は、適切にフィルタ処理された白色光（すなわち広帯域光源の帯域通過光）でありえる。例えば、１５０ワットのハロゲンランプからの光は、適切なバンドパスフィルタに通されることができる。幾つかの実施形態では、光源はレーザーである。例えば、Boas等, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4887-4891; Ntziachristos等, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:2767-2772; Alexander, 1991, J. Clin. Laser Med. Surg. 9:416-418を参照。イメージングのための近赤外線レーザに関する情報は、http://www.imds.com及び様々な他の周知の供給源で見つかることができる。ハイパス又はバンドパスフィルタ（例えば７００ｎｍ）を、発光（放出光）を励起光から分離するために用いることができる。何れの適切な光検出／画像記録要素（光検出器）、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）システム、フォトダイオード、光導電セル、相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）又は光電増倍管が、本発明で用いられることができる。前記要素は、下で本願明細書において更に詳細に説明される。光検出／画像記録の選択は、使用される集光／画像形成要素のタイプを含む要因に依存する。適切な要素を選択し、本発明のイメージングシステムにそれらを組み合わせ、システムを作動することは、当技術分野において通常の技術の範囲内である。
【００６３】
励起光は角膜から目の網膜まで進み、それにより、それは瞳孔を通過する。励起光が蛍光標識に遭遇する時、光が吸収される。蛍光標識が励起された後にその基底状態に緩和する時に蛍光は起こる。蛍光標識は、次に、検出可能に異なる（識別可能な）特性、すなわちスペクトル特性、例えば励起光からわずかに長い波長等を有する光を発する。吸収されたエネルギーの一部は熱に変わる。エネルギーのこの損失によって、短い励起波長から長い放出波長への波長シフトが生じる。この過程は、ストークスシフトとして知られている。しかしながら、Xu等 (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10763-10768に記述されているような異なる光学現象も、蛍光を生成するために用いることができる。
【００６４】
被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ照射された励起光は、それぞれの眼の光軸に沿って又はそうではなく進み得、又は励起光のある部分はそれぞれの眼の光軸に沿って進み、他の部分は異なる。また、例えば、好ましくは識別可能である複数の励起光に至る複数光源の場合では、励起光の一部はそれぞれの眼の光軸に沿って進み、他の部分は異なる。眼の「光軸」は、周知の用語であり、眼の中心を通りその前及び後面に垂直である仮想的な線として、もしくは角膜の前面又は角膜頂と眼球の最も遠い後部との間の最も長い矢状面距離として定義される（両定義とも当技術分野おいてよく受け入れられている）。
【００６５】
本発明の関連において、少なくとも１、すなわち１、２、３、４、５又はそれ以上の予め定められた、好ましくは識別された又は識別可能な波長を含んでなる励起光が、被験体の指定された領域、被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる前記指定された領域上へ照射されることが想定される。「被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域」は、多くて（最大で）被験体の全身又は体の何れかのより小さい部分を包含し、前記より小さい部分は少なくとも被験体の瞳孔の少なくとも一部（例えば頭部、又は頭部及び肩、又は頭部及び体の上部）を含んでなる。前記指定された領域は、被験体の眼より小さくてもよく又は被験体の眼より大きくてもよい。前記指定された領域は、被験体の瞳孔全体又は眼全体（すなわち眼球）を含むことが好ましく、眼全体であることが好ましい。「眼全体」は、具体的には眼の見える（外側から見ることが可能な）部分を含む。
【００６６】
「眼」、「眼球」又は「眼全体」は互換的に使用される。「眼」は被験体の片眼又は被験体の両眼を含む。
【００６７】
画像処理システムの例はＭＡＥＳＴＲＯシステムであり、図３において例証される。それは近赤外線蛍光イメージングシステムである。ＭＡＥＳＴＲＯシステムが、本発明の実施態様と連結して利用され得る好ましい画像処理システムである。
【００６８】
ＭＡＥＳＴＲＯシステムは、非侵襲性のインビボ蛍光測定を可能にする、平面蛍光反射画像処理システムである。このマルチスペクトル分析では、一連の画像が、特定の波長で捕えられる。捕えられる波長の範囲は、標本に存在する標識の、予想されるスペクトル放出範囲を包含しなければならない。結果は、「イメージキューブ」と呼ばれる一連の画像であり、自己蛍光及び特定標識双方の個々のスペクトルを決定するために用いられるのが、この一連の画像内のデータである。生物学的興味の多くの標識は、非常に類似した発光スペクトルを有し、高価な狭帯域フィルタを使用した分離が難しい又は不可能である。単一ロングパス放出フィルタは、放出フィルタの大きなコレクションを交換する。皮膚、毛皮、皮脂腺の天然の自己蛍光に加えて、共生生物（菌類、ダニ、その他）及び摂取食物（葉緑素）からの異なった自己蛍光がある。マルチスペクトル分析は、所望のシグナル及び自己蛍光のシグナルの発光スペクトルが分かっている限りは、放出された蛍光光の線形信号混成の数学的な解きほぐし（非混合）によって、サンプルに適用された特定の標識から、これらの全シグナルてを分けることが出来る。
【００６９】
ＭＡＥＳＴＲＯシステムを用いた測定は、以下の通りに動作する：照明モジュールは白色光を励起するキセノン灯（Cermax）を備えている。下流に連結された励起フィルタ（実験者によって選ばれる）を通して、光は実験のために所望の波長範囲に区切られ、そして、画像処理モジュールに光ファイバを経て伝導される。ここでは、制限された光は、麻酔された試験動物を照らす、４つの光ファイバに分配される。ＭＡＥＳＴＲＯシステムは、自動的に最適露光時間を選択するので、露光過度の危険がない。活性化された蛍光プローブの放出された蛍光光は、放出フィルタ（表１を参照）によって選択され、液晶（ＬＣ）を通って高感度冷却ＣＣＤカメラに伝導される。液晶は、カメラを、特定波長の選択的な画像の記録を可能にする。波長測定範囲は、選択されたフィルタセット（青、緑、黄色、赤、深い赤、ＮＩＲ）に依存し、画像は１０ｎｍごとに記録される。各一つの画像のスペクトル情報は、「イメージキューブ」と呼ばれる一つの「画像パッケージ」に組み込まれる。
0005426026.tif 000002
【００７０】
ＭＡＥＳＴＲＯシステムを用いる分析は、以下の通りに機能する：
各記録は、４０９６の異なるグレイスケールにおいて図示されることが出来る、１２ビットの白黒の画像から成り、従って、放出強度における最小差間を区別することが出来る。対照的に、ヒトの目は、３０-３５の間グレイスケールを区別することが可能である。放出強度に対するこれらの値（グレイスケール）が、波長範囲に対して示され、そして、その結果、各プローブ及び組織自己蛍光の発光スペクトルを得る。ソフトウェアは、３つの基本的な色（赤い、緑の、青い）をイメージキューブのために使用される波長範囲に再分割し、それによって、白黒画像がカラー画像（ＲＧＢ画像、図６Ｂを参照）に変わる。これらの得られたマルチスペクトル情報から、システムは、注入されたプローブ及び何れの由来からの自己蛍光を区別することが可能である。プログラムはスペクトルライブラリを使用し、ここでは各純プローブからの単スペクトル及び何れの注入無しの実験動物（Ｂａｌｂｃ／ヌード又はＳｃｉｄ Ｂｅｉｇｅマウス）を画像処理することにより得られるスペクトル（マウス自己蛍光）である。純画像及び自己蛍光の正確なスペクトルを知ることによって、システムは、全画像を所望のスペクトルに対してフィルタ処理し、色をそれらの各々に割り当てることが可能である。生成された画像（分離合成画像（unmixed composite image））は、存在スペクトルを異なる色で示す。プローブシグナルの強度分布を可視化するために、シグナルを疑似色で図示することが可能であるが、低強度は青、そして、高強度の領域は赤である。それの他に、プローブのシグナル強度の検出限度を決めることが出来て、巡回プローブのシグナル及び非特異的な結合を低減することを可能にする。
【００７１】
ＭＡＥＳＴＲＯシステムを用いた比較及び定量化は、以下の通りに機能する：
画像の蛍光色素分子領域を比較するＭＡＥＳＴＲＯの能力は、治療の間、腫瘍蛍光シグナル強度を比較することを容易にする。プログラムは、腫瘍領域における異なるシグナル強度の比較（比較画像）のためのツールを提供する。全ての画像は最適露光時間で撮られるので、それらはシグナルの強度に依存して異なる。信頼性が高い比較のためには、画像は１つの露光時間に標準化され、シグナル強度における差異を示すこととなる。測定領域を手動で描き変更することにより、シグナル強度は強度値において定量化されることが出来る。一旦測定領域が腫瘍周辺で選ばれると、複製され、比較される次の画像へ移されることが出来る。各領域は、現在の設定（ステージ高さ（stage height）及びビニング）に基づいて、ピクセル及びｍｍ２において算出される。結果として、それは、作られた測定領域内で、平均シグナル、トータルシグナル、最大シグナル、及び平均シグナル／露光時間（１／ｍｓ）に関する情報を伝える（図７を参照）。
【００７２】
本発明と関連して適用されることができる他の画像処理技術は、ＦＭＴ技術（蛍光分子断層撮影）であり、レーザーに基づく三次元画像処理システムであり、小動物モデルにおいて非侵襲性の、全身の、深部組織のイメージングを提供し、蛍光源の３Ｄ再構築を生成及び／又は蛍光標識分析物の蛍光の測定を可能にする。ＦＭＴ技術は、例えばUS 6,615,063に記載されている。
【００７３】
本発明と関連して利用されうる更なる画像処理技術は、WO2007/143141に記載される光学イメージング方法である。指定された領域を含む被験体の画像を生成するためのこの画像処理技術は：光検出器を使用して、被験体内の標的とされた光学コントラスト物質（蛍光色素又は標識、発光色素又は吸収色素）の時系列の画像データセットを取得する工程であって、各画像データセットは選択された時間に取得され、同じ複数のピクセルを有し、各ピクセルは関連値を持つ工程、複数の特徴的な経時変化を識別するために画像データセットを分析する工程、複数の特徴的な経時変化を識別するために画像データセットを決定する工程、各々の経時変化に対応する複数のピクセルからの各ピクセルセットを決定する工程、及び各ピセクルセットを識別された構造と関連付ける工程、及び被験体の画像を生成する工程を含む。
【００７４】
本発明の方法の更なる実施態様では、上記の方法の工程（ａ）及び／又は（ｂ）は、眼の目の瞳孔の位置を決定する工程を更に含む。瞳孔の位置は、本発明の方法の工程（ａ）及び／又（ｂ）の前、間、及び／又は後に決定されることができる。眼の瞳孔の位置を決定するために必要である手段及び方法は、技術者にとってよく知られており、US 5,784,145又はUS 6,820,979に記載されている瞳孔計によって例証されることができる。
また、本発明の方法は更に、
（ｉ）  工程（ａ）の瞳孔の前記部分の面積を決定すること、及び／又は
（ｉｉ）  工程（ｂ）の前記眼の瞳孔の面積を決定すること
を含むことが想定される。
【００７５】
工程（ａ）及び（ｂ）において、異なる、すなわち同一ではない指定領域が使用されることが所望又は生じうることが理解され、例えば、より大きい面積が励起され、より小さい面積が放出された光を受信するために使用される状況になる（又はその逆）。従って、面積あたりの励起光及び／又は放出光の強度を決定／評価することが可能となるために、眼の網膜、瞳孔の前記部分の面積を決定することが所望／必要となり得る。これはシグナルを調整するためになされ得る。瞳孔の面積を決定するのに必要である手段及び方法は、熟練した技術者にとって周知であり、例えば標準の瞳孔計を変更することによって成され、例えばUS 5,784,145又はUS 6,820,979に記載される。
【００７６】
また、被験体の両眼の指定された領域が、識別可能な及び／又は同一の励起光で励起され、両眼が同時に又は連続的に励起されることが想定される。本発明は、従って、同時に又は連続的に、少なくとも２つの異なる蛍光分析物、蛍光標識、又は蛍光実態を選択的に検出、定量化、モニタ等するための方法であって、一つシグナルは一方の眼を通して決定され、他のシグナルが被験体の他方の眼を通して決定される方法も考える。あるいは又は加えて、互いに識別可能な少なくとも２つの蛍光分析物が、被験体の同一の眼を通し、同時に又は連続的に決定／モニタ／定量化されることが想定される。この目的を達成するために、少なくとも２つの蛍光分析物の「異なる」蛍光特性が、例えばソフトウェア支援評価等により、後に「分離」され得る。一又は複数の異なるフルオロフォアの放出を分離するための手段及び方法は、当業者に周知である。
【００７７】
本発明は、被験体の血液中の蛍光分析物の存在、薬物動態等を決定、定量化等するための方法に関するため、励起光は、被験体の眼の網膜の少なくとも指定された領域に達するように照射されなければならないことが理解されるだろう。
【００７８】
少なくとも一つの本発明の蛍光標識から及び／又は蛍光実体から及び／又はの蛍光分析物から放出される光は、被験体の眼を通し受信される。「眼を通し」とは、検出システムが、被験体の眼の網膜の血流／血液循環システム中を移動する、少なくとも一つの蛍光標識、実体又は分析物から発された光を受信することを意味する。従って、「眼を通し」とは、放出された光が、網膜（特に網膜の血液循環システムの指定された領域から）、瞳孔及び／又は眼の指定された領域から少なくとも受信されることを含む。従って、「指定された領域」は、多くて（最大で）被験体の全身又は体の何れかのより小さい部分を包含し、前記より小さい部分は、例えば頭部、又は頭部及び肩、又は頭部及び体の上部等、少なくとも被験体の網膜の少なくとも一部（血液循環システムを含む）。前記指定された領域は、被験体の瞳孔全体又は眼全体（すなわち眼球）を含むことが好ましく、眼全体であることが好ましい。あるいは、前記指定された領域は、被験体の眼より小さいか又は被験体の眼より大きい。「眼」とは、本発明に関連して使用される場合、被験体の片目又は被験体の両目を含む。
【００７９】
前記指定された領域は、光検出器を調整することによって得られることが可能であり、すなわち指定された領域から光を受信するようハードウェアを調整することによって、及び／又は指定された領域を評価する「ソフトウェアフィルター」によって得られることが可能である。
【００８０】
また、本発明の方法では、少なくとも一つの予め定められた波長の前記励起光は、前記被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ専ら向けられることが想定される。「専ら」とは、これに関しては、前記励起光が、被験体の何れかの他の部分にではなく、多くて（最大）で被験体の一方又は両方の眼（又は眼のより小さい部分）に向けられることを意味する。
【００８１】
また、本発明の方法において、（ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する前記蛍光分析物から放出される前記光が、前記被験体の眼を通して専ら受信されることが想定される。「専ら」は、これに関しては、具体的には、血液における前記蛍光分析物の存在を決定し、蛍光分析物の血液レベルを定量化、又は前記蛍光分析物の血液クリアランスをモニタ又は決定するために、眼を除く、被験体の何れかの他の領域からの何れかの放出光の受信を除外（例えば、ハードウェアを調整することによって）及び／又は評価することを除外する（例えばソフトウェア・フィルタによって）。「眼」とは、これにより、被験体の瞳孔、瞳孔及び虹彩又は眼全体を含む眼の何れかの部分を含み、眼全体が好ましい。「眼全体」は、また、被験体の眼の見える（外側から見える）部分を含む。このように、眼を除く、被験体の何れかの他の領域からの放出光は決定されないことが想定される。
【００８２】
本発明の方法の好ましい実施態様では、（ｉ）前記励起光は被験体の指定された領域上へ向けられ、前記指定された領域は、体全体より小さい（しかし、少なくともまだ被験体の一部の瞳孔を含む）か、被験体の眼全体より大きい。この点に関しても、蛍光分析物から放出される前記光が、前記被験体の眼、好ましくは眼球を通し専ら受信されることが好ましい。
【００８３】
本発明の方法の別の好ましい実施態様では、前記励起光は被験体の指定された領域上へ向けられ、蛍光分析物から放出される前記光は前記被験体の眼を通し専ら受信される。  
【００８４】
被験体の眼を通し受信される放出光は、それぞれの眼の光軸に沿って又はそうではなく進み得、又は励起光のある部分はそれぞれの眼の光軸に沿って進み、他の部分は異なる。眼の「光軸」は、ここの他所で定義される。
【００８５】
本発明の方法は、励起光の光軸が、放出光の光軸と完全に同一、同一でない、又は一部だけ同一である実施態様を更に含む。
【００８６】
添付の実施例に見られるように、前記被験体の一方及び／又は両方の眼から受信される蛍光シグナル（放出）を単純に決定することにより、被験体の血液及び／又は血液循環における興味の蛍光分析物の、存在、量、半減期、動態学を非侵襲的に決定することが可能となる。言い換えると、当技術分野において、被験体に投与された蛍光化合物が、とりわけ前記前記被験体の眼から受信されるシグナルに結果としてなることが知られていたが、前記被験体の血液（血液循環）で生じる状況をシグナルが正確に反映する（時間にわたって質的に又は量的に）ことは明瞭にされていなかった。従って、被験体の眼を通して受信される放出光は、眼の蛍光分析物の分布を正確には表さないが、代わりに、血液又は血液循環における前記分析物の分布を反映する。被験体の眼から得られるシグナルの血液中の前記分析物の実際の状況（濃度、存在等）との相関は、従来技術において開示も示唆もされていない。このように、その知識だけによって、被験体の血液の蛍光分析物の存在を確実に検出して、除外することが現在可能である。例えば、ある時点で蛍光分析物を投与し、暫く後に（例えば予め定められた期間の後に）その存在を検出し、シグナルが検出可能でない場合は、分析物がそれぞれの被験体の血液にもはや存在しないと結論することが可能となる。同様に、インビボ状況下で、蛍光分析物の生物学的半減期を決定することが非常に容易となり、これは、非常に短い時間間隔で放出光のシグナル強度（及びこれにより前記分析物の理論上の量）を決定することが可能であり、これによりそれぞれの被験体の血液から蛍光分析物の分解及び／又は分泌及び／又はクリアランスの経過をかなりの精度で示すことが可能である。この測定は非侵襲性であり、従って、例えばヒト以外の試験動物等の被験体にストレスが無く、このため、２つの測定間の時間間隔を最小化することを可能にする。蛍光分析物の分泌経路及び／又は前記分析物の器官分布を評価することを望まれることが考えられる。更に、本発明は、スクリーニングシステムを提供し、好ましくは非ヒト試験動物において、異なる第二の実体（例えば、異なる薬剤又は相互作用パートナー、すなわち互いに特異的に相互作用する２つ以上の結合パートナー、例えば抗原-抗体、抗体-抗体、多量体タンパク質複合体、タンパク質-タンパク質結合、レクチン-糖結合等）によって特徴付けられる、及び識別可能な蛍光標識（例えば放出スペクトルが異なる、及び／又は、ＦＲＥＴ効果の評価に適している）で標識された少なくとも２つの蛍光分析物を使用することによって、これらの２つの第二の実体間のインビボでの相互作用を評価する（これによって２つの実体がインビボで相互作用するかどうか評価する）、又は前記相互作用を増加（アゴニスト）又は減少（アンタゴニスト）する物質をスクリーニングする。
【００８７】
提案された非侵襲性の方法は、このように、著しく動物の数を減らし、動物のストレスを最小化し、データセットの質を改善し、時間及び経費に関して分析的効率を高めることによって、例えば血清ピークレベル（t max）、血清半減期（t1/2）及び／又はc0を決定することを可能にする。更には、本発明の方法は、当技術分野で知られるインビボでのイメージング法と（例えば、興味がある化合物の薬理学的プロファイルに対する更なる洞察を得る蛍光分析物の（任意で時間依存的な）器官分布を検出するために体全体のインビボイメージング）組合わすことが可能である。また、本発明の方法により、血流と共に／中を巡る薬剤の存在を検出することが可能となり、例えば、病原体の存在を、インビボで非侵襲性に、場合によってはリアルタイムで又は時間にわたり決定する。この目的のために、例えば病原体等の標的に特異的であるエピトープ結合ドメインを有する蛍光分析物、標識又は実体を投与し、それぞれの被験体の眼を通り放出された光を受信することによって血液における前記標的の存在を決定することが想定される。活性された又は活性可能な蛍光標識／実体が、この点に関しては好ましい。あるいは、また、例えば病原体等の標的に特異的であるエピトープ結合ドメインを有する蛍光分析物、標識又は実体を投与し、該標的効果に影響を及ぼすと知られている又は想定される試験化合物（例えば薬剤）の存在（又は投与）に対して前記標的の存在を決定し、それぞれの被験体の眼を通り、放出された光を受信することによって前記影響を決定することが想定される。試験化合物が効果的であると仮定するならば、例えば標的は血流から除去され、これは前記被験体の眼を通り、受信される蛍光シグナルの欠如により示される。本発明の方法は、従って、治療薬のスクリーニング、治療薬の最適化、治療薬の薬物動態学的プロファイルの決定、製剤のスクリーニング、投与の適切な方法の決定（i.v.、i.pその他）等のために用いられることができる。
【００８８】
本発明の方法は、非侵襲性である。「非侵襲性」とは、ここで使用される場合、本発明の方法、使用及び／又は装置が、皮膚損傷、特に被験体の眼の角膜又は強膜の損傷を作らず、しかし角膜又は強膜を含む眼と放射線の接触、同様に放射線による角膜又は強膜を含む眼の透過を可能にし又は関与する。放射線療法は、それにより、例えば励起光、放出光等の全種類の光を含み、これは本発明と関連してここに記述される。被験体の眼の「角膜」は、虹彩、瞳孔及び前房をカバーする眼の透明な正面部分である。「強膜」は、コラーゲン及び弾性繊維を含有する眼の不透明な、繊維性の、保護的な、外側の層であり、眼球の結合組織層の後部６分の５を形成する。
【００８９】
「瞳孔」は、目に入る光（例えば励起光）の量を制御する目の虹彩の中央に位置する円形開口部である。虹彩は収縮構造であり、主に平滑筋から成り、瞳孔を囲む。励起光等の光は瞳孔を通り目に入り、虹彩は瞳孔のサイズを制御することによって光の量を調整する。光学用語では、解剖学的瞳孔は眼の開口であり、虹彩は開口絞りである。眼の外側から見られる瞳孔の像は入射瞳である。光学システムにおいて、入射瞳は、光を受けることが出来るシステムの入口で領域を定める仮想開口である。本発明の関係において、「瞳孔」又は「入射瞳」は互換的に使用されうる。
【００９０】
本発明によって提供される、イメージング方法の特別な発展は、血流における何れの分析物のパフォーマンスの視覚化を可能にし、例えばインビボ条件での薬剤及びドラッグデリバリーシステムの可視化を可能にする。薬及び担体の位置及び濃度に関する詳細で定量的な情報は、時間の関数として得られることができ、これにより、生物学的影響のより深い理解を可能にする。この情報は、最適化された薬財及び／又はドラッグデリバリーシステムの設計にとって重要である。一般に、示される技術は、（ａ）例えば薬剤の（化学的）修飾により任意の薬剤を最適化するため、（ｂ）所望の第二の実体又は蛍光分析物に対して新規に設計された製剤を評価／最適化するため、；（ｃ）第二の実体又は蛍光分析物の適用量を評価／最適化するため；（ｄ）所望の第二の実体又は蛍光分析物の異なるルート、例えば、全身性又は局所性、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、真皮、硬膜外、経口、心室内、くも膜下腔内注入、又は例えば吸入器又は噴霧器を用いた経肺投与、を評価する／最適化するために使用されることができる。それらの発光スペクトルにおいて異なる蛍光標識で標識された異なる第二の実体（例えば異なる薬剤）を用いて、これらの２つの第二の実体間（例えば薬剤-薬剤）での相互作用研究が実施されることができる。更に、薬物動態学的データが、この新規な方法を用いて、疾患領域及び／又は遺伝子的に操作された全臨床モデル（例えばＦｃＲｎノックアウト）において作成されることができる。
【００９１】
ここに記載される非侵襲性の方法は、このように、血液における蛍光分析物の存在、量、動態学（例えば血漿クリアランス）を、リアルタイムで及び／又は期間にわたって決定、定量化又はモニタすることが可能である。前記期間は実験／方法の意図に依存し、すなわち、数日又は数週の期間かかり得る抗体の血中濃度の分析（濃度-時間プロファイルにより例示される）が所望され得、又数分内又は数秒内で生じうる急速分解可能な分析物の半減期を分析することが所望されうる。物質の生物学的半減期又は排出半減期は、物質（薬剤、放射性核種、又はその他）が、その薬理学的、生理学的、放射線学的活性の半分を失うのに必要とする時間である。本発明の方法により、血液サンプルを採る必要なく（すなわち非侵襲性の方法で）、期間にわたり、インビボで、リアルタイムに何れかの所望の蛍光分析物の血中濃度（例えば血漿クリアランス）を決定することが可能となる。期間にわたりとは、限定するものではないが、１、２、３、４、５又はそれ以上の月、日、時間、分又は秒の時間間隔を含む。時間間隔は、例えば、被験体に摂食をさせる、（必要とされれば）麻薬処理を更新する、眼球を湿らせる等のために必要であれば一以上の中断を含みうる。
【００９２】
「血液」は、血漿及び血液の細胞要素を含む全血液を意味する。「血漿」又は「被験体の血漿」は、ここで使用される場合、全血液において血液細胞が通常懸濁される血液の液体成分を意味する。本発明の方法に関連することにおいて、蛍光分析物の存在、血中濃度及び／又は血液クリアランスは全血液において決定されることになる。そこにおいて、前記蛍光分析物は、浮遊性（非結合）及び／又は結合されうる。「結合」は、例えば全血液の細胞成分、病原体、抗体及び／又はそれらの機能的断片、タンパク質（例えばヒト血清アルブミン、リポタンパク質、糖タンパク質、α、β及びγグロブリンのような血漿内のタンパク質）、ペプチド、酵素、毒素、ビタミン、ホルモン類、サイトカイン、治療薬/化合物（薬剤）、核酸、受容体、受容体リガンド、腫瘍細胞のような細胞標的、血液中を巡る（微小）転移又は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、腫瘍抗原、腫瘍マーカ、例えばβ-ＨＣＧ、ＣＡ １５-３、ＣＡ １９-９、ＣＡ ７２-４、ＣＦＡ、ＭＵＣ-１、ＭＡＧＥ、ｐ５３、ＥＴＡ、ＣＡ-１２５、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ等、薬剤、又は（ａ）血液に存在し（ｂ）例えば、抗原-抗体結合；受容体-リガンド結合、核酸ハイブリダイゼーションに基づく結合、レクチン-糖結合、タンパク質-タンパク質結合、タンパク質-核酸-結合等の何れかの適切な結合反応により本発明の蛍光分析物に結合する及び／又は結合される物質の他の何れかの種類、に例えば結合する及び／又は結合される蛍光分析物を含む。「細胞成分」は、赤血球（赤血球（erythrocytes））、白血球（例えば白血球）及び血小板を含む血液細胞を含む。血液の細胞成分に加えて存在し得る「細胞性標的」は、全血液に存在すると知られている又は考えられている何れかの他の細胞タイプを含み得、例えば腫瘍細胞及び／又は転移である。
【００９３】
本発明の蛍光分析物は、少なくとも２つの異なる実体、すなわち蛍光実体及び第二の実体をを有する。しかしながら、蛍光分析物が、更なる実体、血漿半減期を強化する保護基及び／又は化学発光又は放射性標識等の更なる非蛍光標識を有することも考察される。
【００９４】
また、本発明の蛍光分析物は、（ａ）（例えば、蛍光実体に結合した第二の実体Ｘを含む）蛍光分析物及び（ｂ）何れの蛍光実体／標識の無い前記第二の実体Ｘを本質的に含んでなる混合物として使用されることが想定される。非標識第二の実体Ｘ及び標識第二の実体Ｘ（すなわちＸを含んでなる蛍光分析物）間の配分は可変的であり、１：１０、１：５、１：１、２：１、５：１、１０：１、１００：１、１０００：１及びその他の比率を含む。混合物における前記第二の実体Ｘの全量と比較した時に、上述した混合物が、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０，５％、０，１％、０，０１％、０，００１％等と等しい又はそれ未満の蛍光標識された第二の実体Ｘ（蛍光分析物）を含むことが好ましい。このような混合物は、WO2008/119493に記載されている。
【００９５】
「蛍光実体」は、ここに開示される方法／使用／装置をによって、本発明の蛍光分析物の検出を可能にする少なくとも一つの蛍光標識であるか、又はを含む。蛍光分析物の蛍光実体は、第二の実体に直接及び／又は間接的に付着される蛍光標識の集合であると理解される。
【００９６】
蛍光実体は、少なくとも一つの蛍光標識を含み得又は少なくとも一つの蛍光標識が結合され得るスペーサーを含むことができる。前記スペーサーはミクロスフェアに例示され、例えばラテックスビーズ、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリマー骨格、又は他の成分、例えば合成部分であり、少なくとも１つの蛍光標識、及び適用可能であれば消光剤が共有結合される分解可能な結合を含んでなる。ポリマー骨格は、生体適合性ポリマーの何れかでありえる。例えば、それは、ポリペチド、多糖、核酸又は合成重合体でありえる。骨格として有用なポリペチドは、例えば、ポリリシン、アルブミン及び抗体を含む。ポリ（Ｌ-リシン）は、好ましいポリペチド骨格である。骨格は、また、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ（グリコール酸／乳酸共重合体）酸、ポリジオキサノン、ポリバレロラクトン、ポリ-ε-カプロラクトン、ボリ（３-ヒドロキシ酪酸）、ボリ（３-ヒドロキシ吉草酸）ポリ・タルトロン酸、及びボリ（β-マロン酸）等の合成ポリマーが可能である。ポリマー骨格は、生体適合性（例えば毒性及び免疫原性）、血清半減期、（例えば、スペーサ及び保護基を抱合するための）有益な官能基、及びコスト等への考慮に依存する。ポリマー骨格の有用なタイプは、ポリペチド（ポリアミノ酸）、ポリエチレンイミン、多糖、アミノ化多糖、アミノ化オリゴ糖、ポリアミドアミン、ポリアクリル酸及び多価アルコールを含む。幾つかの実施態様では、骨格は、Ｌアミノ酸、Ｄ-アミノ酸又はそれらの組合せから形成されるポリペチドを含む。これらのポリペプチドは、例えば、アルブミン等の天然に生じるタンパク質、ポリリシン等のホモポリマー、Ｄ-ｔｙｒ-Ｄ-ｌｙｓコポリマー等のコポリマーに同一又は類似のポリペチドでありえる。リジン残基がポリマー骨格に存在する場合、リジン残基の側鎖上のｅアミノ基は、スペーサに対する共有結合結合のための便利な反応基として役立つことができる。ポリマー骨格がポリペチドである場合、好ましくは、プローブの分子量は２ｋＤから１０００ｋＤである。より好ましくは、その分子量は、４ｋｄから５００ｋｄである。
【００９７】
蛍光実体（並びに蛍光分析物）は、スペーサ、例えばポリマー骨格に、共有結合して連結される一以上の保護鎖を含むことができる。適切な保護鎖は、ポリエチレングリコール、メトキシ・ポリエチレングリコール、メトキシ・ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール及びメトキシ・ポリプロピレングリコールのコポリマー、デキストランを有し、ポリ乳ポリ・グリコール酸を含む。
【００９８】
「蛍光標識」は、ここで使用される場合、フルオロフォアを含有する分子を特徴とする。フルオロフォア（時々蛍光色素とも呼ばれる）は、特定の波長のエネルギーを吸収し異なる波長でエネルギーを再放出する分子の官能基である。前記異なる波長は、前記特定の（予め定められた）波長と比較と比較される場合、特定の（予め定められた）波長と識別可能である波長で再放出され、例えばより長い波長で又はより短い波長で再放出される、後者の場合は減少した強度で放出される。放出されたエネルギーの量及び波長は、フルオロフォア及びフルオロフォアの化学的環境に依存する。
【００９９】
波長がより短い波長で再放出される原理は、多光子蛍光励起において適用される;Xu等 (1996), Proc. Nathl. Acad. Sci. 93, 10763-10768を参照。多光子蛍光励起が、本発明の関連において使われることが可能である。例えば、サンプルは、使用されているフルオロフォアの吸収ピークの約２倍の波長で照射される。例えば、約５００ｎｍの吸収ピークを有するフルオレセインの場合、１０００ｎｍの励起が使用されることができる。基本的に、フルオロフォアの励起はこの波長で起こらない。しかしながら、高いピーク出力のパルスーザーが使われる場合（平均出力レべルが適度で標本に損傷を与えない）、２光子イベントが焦点で起こる。この点で、光子密度は十分に高くなり、２つの光子が基本的に同時にフルオロフォアによって吸収されることができる。これは、吸収される２つの合計と等しいエネルギー有する単一光子に等しい。このように、フルオロフォア励起は（必要とされる）焦点でのみ起こり、これにより焦点からずれたフルオロフォアの励起を除外し、オプティカルセクショニングが得られる。
【０１００】
３光子励起が、また、本発明の関連において使用されることができる。この場合、３つの光子が同時に吸収され、励起エネルギーを事実上３倍にする。この技術を使用して、ＵＶ励起フルオロフォアは、ＩＲ励起によって画像化されることができる。励起レベルが励起出力の三乗に依存するため、二次出力依存がある２光子励起と比較して（同じ励起波長に対して）改善される。複数標識サンプルが単一ＩＲ励起光源使用し、２及び３光子励起の組合せによって画像化されることができるようフルオロフォアを選択することが可能である。
【０１０１】
２光子励起顕微鏡が、また、本発明の関連において使用されることができる。これは、１ミリメートルの深さまで生存組織を画像化することを可能にする蛍光画像処理技術である。
【０１０２】
２光子励起の概念は、低いエネルギーの２つの光子が量子イベントにおいてフルオロフォアを励起することができるという考えに基づき、２つの励起性光子のどちらよりも典型的に高いエネルギーで蛍光光子の放出となる。２つの光子のほぼ同時の吸収の確率は、極めて低い。従って、高フラックスの励起光子が一般的に必要であり、通常１フェムト秒のレーザーである。
【０１０３】
２光子吸収はレーザースキャナーの使用と組合せられる。［４］２光子励起顕微鏡では、赤外線のレーザビームが対物レンズを通り焦点に集まる。通常使用されるＴｉ-サファイヤ・レーザーはおよそ１００フェムト秒のパルス幅及び約８０ＭＨｚの繰り返し率を有し、２光子吸収に必要とされる高い光子密度及びフラックスを可能にし、広範囲にわたる波長に調節可能である。
【０１０４】
最も一般的に用いられるフルオロフォアは４００−５００ｎｍの範囲の励起スペクトルを有し、フルオロフォアを励起するために使用されるレーザーは、~７００−１０００ｎｍの（赤外線の）範囲にある。フルオロフォアが同時に2つの赤外線光子を吸収する場合、それは励起状態に上がるのに十分なエネルギーを吸収する。次にフルオロフォアは、使用されるフルオロフォアのタイプに依存する波長を有する単一光子を発する（典型的には可視スペクトル）。フルオロフォアを励起するために２つの光子が吸収される必要があるため、フルオロフォアからの蛍光放出の確率は励起強度に対し二次曲線的に増加する。従って、レーザビームがより拡散するところより強く集光されるところで、より大きい２光子蛍光は発生する。
【０１０５】
本発明の蛍光実体は、少なくとも１、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又はそれ以上の蛍光標識を有することが想定される。これらの蛍光標識は同一又は異なってもよく、すなわち、蛍光実体は、本発明の関係において使用される場合、ちょうど１種類の蛍光標識又は少なくとも２、３、４、５又はそれ以上の異なる種類の蛍光標識を有することが想定される。「ちょうど１種類」とは、蛍光標識が全く同一のフルオロフォアを含むことを意味し、異なる種類とは、異なる蛍光標識が異なるフルオロフォアを含有し、これによって異なる吸収及び／又は放射特性を示すことを意味する。これらの「異なる」特性とは、例えばソフトウェア支援評価により後に「非混合」されうる。一以上の異なるフルオロフォアの放出を非混合にする手段及び方法は、熟練した技術者にとって周知である。
【０１０６】
蛍光標識は、蛍光分析物のスペーサ又は第二の実体に共有結合的に及び／又は非共有結合的に連結されることが可能であり、何れかの適切な蛍光標識上の反応基及びスペーサ又は第二の実体上の適合性の官能基を用いて成される。
【０１０７】
本発明の関係することにおいて、前記蛍光標識は、量子ドット剤、蛍光タンパク質、蛍光色素、ｐＨ感受性蛍光色素、電位感受性蛍光色素、及び／又は蛍光標識マイクロスフィアからなる郡から好ましくは選択される。
【０１０８】
量子ドット剤又は「量子ドット」は、ナノクリスタルとしても知られ、半導体として知られる材料の特別な種類であり、ＩＩ〜ＶＩ、ＩＩＩ〜Ｖ又はＩＶ〜ＶＩ族の物質から成る結晶である。
【０１０９】
「蛍光タンパク質」は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＣＦＰ、ＹＦＰを含み、増強されてもよい。更なる蛍光タンパク質は、Zhang, Nat Rev Mol Cell Biol. 2002, 12, pages 906-18 or in Giepmans, Science. 2006, 312, pages 217-24に記載される。
【０１１０】
「蛍光色素」は、全ての種類の蛍光標識を含み、限定するものではないが、例えばＦＩＴＣ等の全ての誘導体を含むフルオレセイン；例えばテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）及びそのイソチオシアネート誘導体（ＴＲＩＴＣ）、スルホローダミン１０１（及びそのスルホニルクロリド形 Texas Red）、ローダミンレッド、及び例えばAlexa 546、Alexa 555、Alexa 633、DyLight 549及びDyLight 633等の新規なフルオロフォアを含むローダミン他の誘導体等の全ての誘導体を含むローダミン；アレクサ・フルーア（蛍光色素のアレクサ・フルーアファミリーはMolecular Probesによって生成される）；DyLight Fluor、Dyomics, ATTO Dyesにより生成され、ジーゲンのATTO-TEC GmbHにより製造される一連の蛍光標識及び色素を代表する、WO/2007/067978日本；LaJolla Blue(Diatron, Miami, Fla.)；インドシアニングリーン（ＩＣＧ）及びその類似体(Licha等, 1996, SPIE 2927:192-198; Ito等, U.S. Pat. No. 5,968,479)；インドトリカルボシアニン（ＩＴＣ;WO98/47538）、及びキレート化ランタニド化合物を含む。蛍光ランタニド金属は、ユウロピウム及びテルビウムを含む。
【０１１１】
上述したように、分析物は、また、近赤外線（ＮＩＲ）蛍光標識で標識されることができる。近赤外線スペクトルにおける励起及びの放出波長を有するＮＩＲ蛍光標識、すなわち６４０−１３００ｎｍ、好ましくは６４０−１２００ｎｍ、及びより好ましくは６４０−９００ｎｍが使用される。電磁スペクトルのこの領域の使用は、組織透過を最大にし、例えばヘモグロビン（＜６５０ｎｍ）及び水（＞１２００ｎｍ）等の生理学的に豊富な吸収体による吸収を最小化にする。インビボでの使用のための理想的な近赤外線の蛍光色素は：
（１）  狭いスペクトル特性、
（２）  高感受性（量子収率）、
（３）  生体適合性、
（４）  分離された吸収及び励起スペクトル、及び
（５）  光安定性。
を呈する
【０１１２】
様々な近赤外線（ＮＩＲ）蛍光標識が、市販され、この発明による蛍光実体を調製するために用いることが可能である。例示的なＮＩＲＦ標識には、以下が含まれる：Ｃｙ５．５、Ｃｙ５、及びＣｙ７（Amersham, Arlington Hts., IL; IRD41 and IRD700 (LI-COR, Lincoln, NE）；ＮＩＲ-Ｉ（Dejindo, Kumamoto, Japan）；LaJoIIa Blue (Diatron, Miami, FL)；インドシアニングリーン（ＩＣＧ）及びその類似体（Licha, K.,等, SPIE-The International Society for Optical Engineering 1996; Vol. 2927: 192-198; US 5,968,479）；及びキレート化ランタニド化合物及びＳＦ６４、５-２９、５-３６及び５-４１（WO 2006/072580から）。蛍光ランタニド金属は、ユーロピウム及びテルビウムを含む。ランタニドの蛍光特性はLackowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Ed., Kluwer Academic, New York, (1999)に記載されている。
【０１１３】
「蛍光ミクロスフェア」は、WO/2007/067978に詳細に記載され、出典明示によりその全内容をここに援用する。
【０１１４】
本発明の更なる実施態様では、蛍光実体の少なくとも一つの蛍光標識が活性化可能である。また、蛍光実体が活性化可能であることが想定される。
【０１１５】
前述したように、蛍光色素によって放出されるエネルギーの量及び波長が、フルオロフォア及びフルオロフォアの化学的環境双方に依存することが知られている。従って、蛍光色素はｐＨ感受性に又は電位感受性に反応し得、すなわち、それらは化学的環境のこの種の変化によって活性化可能である。更なる活性化可能な蛍光標識が、例えばUS 2006/0147378 A1, US 6592847, US 6,083,486, WO/2002/056670又はUS 2003/0044353 A1に詳細に記載され、出典明示によりその全内容をここに援用する。
【０１１６】
蛍光標識／実体の「活性化」よりとは、標識／実体の例えば光学的性質の検出可能な特性を変える、標識／実体への何れかの変化を意味する。これは、例えば光学的性質、例えば蛍光シグナル振幅における変化（例えば非クエンチング及びクエンチング）、波長、蛍光寿命、スペクトル特性又は極性における変化等の特性における検出可能な差異となる、標識/実体の修飾、変更、又は結合（共有結合又は非共有結合）の何れかを含むが、これに限定されない。光学的性質は、例えば、電磁スペクトルの、可視、紫外線、近赤外線、赤外線領域における波長を含む。活性化は、限定するものではないが、酵素的切断、酵素的変換、リン酸化又は脱リン酸化、結合によるコンフォメーション変化、酵素媒介スプライシング、フルオロフォアの酵素媒介トランスファー、相補ＤＮＡ又はＲＮＡのハイブリダイゼーション、Na+、K+、Ca2+、Cl-又は他のアナライト等のアナライトとの会合等のアナライト結合、プローブ環境の疎水性の変化、及びフルオロフォアの化学修飾により成されうる。光学的性質の活性化は、限定するものではないが例えば磁気緩和及びバイオルミネセンス等の、他の検出可能な特性における変更を伴いうる。
【０１１７】
本発明の更なる実施態様では、一旦前記第二の実体のエピトープ結合ドメインがその標的と結合すると、蛍光分析物の少なくとも一つの蛍光標識が活性化される。また、一旦前記第二の実体のエピトープ結合ドメインがその標的と結合すると、蛍光実体が活性化されることが想定される。
【０１１８】
「活性化される」とは、ここで前述された活性化可能な蛍光標識の活性化を含む。例えば、本発明の蛍光分析物は、タンパク質的切断により（例えば切断可能スカベンジャーの放出をする酵素的切断、このようなシステムは例えばUS 2006/0147378 A1, US 6592847, US 6,083,486, WO/2002/056670 or US 2003/0044353 A1に記載される）活性化される少なくとも一つの活性化可能な蛍光標識を含有することが想定される。「活性化される」とは「ＦＲＥＴに基づく」効果も含む。フォースター共鳴エネルギー転送（ＦＲＥＴと省略される）は、蛍光共鳴エネルギー転送、共鳴エネルギー転送（ＲＥＴ）又は電子エネルギー転移（ＥＥＴ）としても知られ、２つのフルオロフォア間のエネルギー転送を説明するメカニズムである。ＦＲＥＴは、ドナー及びアクセプターフルオロフォア間の近接の指標を提供する。ドナーが規定の周波数の入射放射線で励起される時、ドナーが蛍光として通常放出するエネルギーの幾らかが、アクセプターに移動され、アクセプターがドナーに十分近接している（典型的には、ほとんどのドナーフルオロフォアに対して約５０オングストローム内）。アクセプターに移動したエネルギーの少なくとも一部が、アクセプターの蛍光周波数で放射として放出される。ＦＲＥＴは、様々な情報源において更に記述され、例えば「ＦＲＥＴイメージング」(Jares-Erijman, E.A, and Jovin, T.M, Nature Biotechnology, 21(11), (2003), pg 1387-1395)に記述され、全ての目的に対して出典明示によりその全内容をここに援用する。かかるＦＲＥＴ効果に基づくスクリーニングは周知であり、例えばWO2006107864に記載され、その全内容をここに援用する。
【０１１９】
本発明の蛍光分析物は、第二の実体を更に有する。前記第二の実体は、このように通常「分析物」であり、すなわち、その存在、量、動態学、血液クリアランス等が、ここに開示される方法、使用、及び装置により決定される分析物である。この目的のために、前記第二の実体は、蛍光実体に連結され、そして蛍光分析物は、本発明の手段及び方法により、決定、定量化、モニタ等される。本発明の蛍光分析物の第二の実体が、蛍光実体に直接又は間接的に結合される第二の実体の集合であることが理解される。例えば、本発明の蛍光分析物が、１以上、すなわち２  、３、４、５又はそれ以上の第二の実体を有することが考えられる。前記第二の実体は、互いに同一及び／又は異なることが可能である。
【０１２０】
また、一旦それが第二の実体と結合すると、蛍光実体が活性化されることが想定される（例えば上記したＦＲＥＴ-効果に基づく）。前記活性化は、インビトロで起こることができ、また、あるいは、前記活性化はインビボで起こることができ、すなわち、方法は前記蛍光実体が前記被験体において活性化されることが想定される。「活性化される」とは、受動的な様式で起こることができ、これは、活性化可能な蛍光標識によって特徴付けられる蛍光分析物が被験体に投与され、その検出可能な特性が被験体において変更される（例えばＦＲＥＴ-効果又はタンパク質分解効果による）；又はそれらは能動的な様式で起こることが可能であり、例えばインビボで蛍光標識/実体を活性化するプロテアーゼを投与することによって成される。
【０１２１】
蛍光標識／実体の活性化は、好ましくは、本発明の方法の工程（ｂ）に先行、すなわち前記蛍光分析物から放出される光を受信する工程に先行することが理解される。あるいは、前記活性化及び前記受信は同時に生じる。
【０１２２】
また、本発明の方法に関係することにおいて、前記蛍光分析物、蛍光実体、蛍光標識、第二の実体及び／又は前記標的が前記被験体に投与されることが想定される。
【０１２３】
あるいは、本発明の方法の何れも、前記蛍光分析物、蛍光実体、蛍光標識、第二の実体及び／又は前記標的を前記被験体に投与する工程を含まないことが想定される。
【０１２４】
ここに記載される方法に関係することにおいて、前記蛍光分析物、前記蛍光実体及び／又は前記標的の前記投与が、本発明の方法の工程（ｂ）に先行、すなわち前記蛍光分析物から放出される光を受信する工程に先行することが理解される。
【０１２５】
用語「第二の実体」は、その存在、薬物動態学、血漿クリアランス、生物学的半減期、ピークレベル等が、本発明の方法、使用及び装置により決定、定量化、モニタ等されることを意味する。従って、用語「第二の実体」は、限定するものではないが、病原体、エピトープ結合ドメイン（それらの標的に結合又は非結合の）、抗体及び／又は機能的断片（それらの標的に結合又は非結合の）、タンパク質（例えばヒト血清アルブミン、リポタンパク質、糖タンパク質、α、β及びγグロブリンのような血漿内のタンパク質）、ペプチド、酵素、毒素、ビタミン、多糖、脂質、ホルモン類、サイトカイン、治療薬／化合物（薬剤）、核酸（例えばｓｉＲＮＡ）、受容体（それらのリガンドに結合又は非結合の）、受容体リガンド（それらの受容体に結合又は非結合の）、例えば血中を移動する腫瘍細胞又は（微少）転移等の細胞標的、腫瘍抗原、β-ＨＣＧ、ＣＡ１５-３、ＣＡ１９-９、ＣＡ７２-４、ＣＦＡ、ＭＵＣ-１、ＭＡＧＥ、ｐ５３、ＥＴＡ、ＣＡ-１２５、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ等の腫瘍マーカ、又は血液におけるその存在に関心がある他の何れかの物質を含む。上記の用語はここの他所にて定義されている。
【０１２６】
「第二の実体」が医療関係において、すなわち、エクスビボ及び／又はインビボでの、治療的及び／又は診断的な活性/能力を表示することにおいて有益な効果を呈する。従って、本発明の一実施態様では、前記第二の実体は診断的及び／又は治療的な薬剤を含んでなる。
【０１２７】
「病原体」は、その宿主に疾患又は疾病引き起こすものを意味する。従って、病原体は、全ての種類の細菌、例えば、エシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、クレブシェラ属、ビブリオ属、パスツレラ属、ボレリア属、レプトスピラ属、カンピロバクター属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、エルシニア属、トレポネーマ属、リケッチア属、クラミジア属、マイコプラズマ属、コキシエラ属、ナイセリア属、リステリア属、ヘモフィルス属、ヘリコバクター属、レジオネラ属、シュードモナス属、ボルデテラ属、ブルセラ属、ブドウ球菌属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、バシラス属、マイコバクテリア属、ノカルジア属等の種；ウィルス、例えばピコルナウイルス科、カリシウイルス科、レオウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、コロナウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、レトロウイルス科、パルボウイルス科、パポバウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、インフルエンザウィルス、ヘルペスウィルス、ポックスウイルス、知られている全ての亜型及び変異を含み、ＨＢＶ、ＨＣＶ及びＨＩＶが好ましい；真菌、例えばアスペルギルス属、カンジダ属、クリプトコックス属、ヒストプラスマ属、ブラストミセス属、パラコッカス属（Paracoccoides）、ケカビ属、カーブラリア属、フザリウム属等の種等であり、菌類胞子、プロトゾア又は寄生原虫を含み、例えば赤痢アメーバ又はアピコンプレクサに属する種（特にAdeleorina、Haemosporida及びEimeriorina、マラリア原虫の種が好ましい）及び／又は内寄生性生物を含む。血液由来病疾患（blood-borne diseases）引き起こす病原体が好ましい。「血液由来病原体」は、血液のコンタミネーションにより拡散が可能なものである。
【０１２８】
用語「抗体」は、標的に結合するモノクローナル又はポリクローナル抗体（Harlow and Lane, 「Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, USA, 1988を参照）、又はその結合特異性を保持する又は基本的に保持する前記抗体の誘導体を意味する。このような抗体の好ましい誘導体は、例えば、マウス又はネズミの可変領域及びヒトの定常領域を含んでなるキメラ抗体である。用語「機能的断片」は、ここで使用される場合、抗体の結合特異性を保持する又は基本的に保持する、ここに記載される抗体の断片を意味し、例えば分離された軽及び重鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ／ｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２である。用語「抗体」は、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）又は抗体-融合タンパク等の、二官能性（二重特異性）抗体及び抗体構造物も含む。用語「ｓｃＦｖ断片」（単鎖Ｆｖ断片）は、当技術分野において理解され、その小さいサイズ及び組換え的にこのような断片を生成する可能性により好ましい。前記抗体又は抗体結合部分は、ヒト抗体又はヒト化抗体である。用語「ヒト化抗体」は、本発明によれば、非ヒト起源の抗体であり、可変領域における少なくとも一つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えばＣＤＲ３等、好ましくは全６のＣＤＲが所望の特異性を有するヒト起源の抗体のＣＤＲと置換されている。場合によっては、抗体の非ヒト定常領域は、ヒト抗体の一又は複数の定常領域と置換されている。ヒト化抗体の生産方法は、例えばEP-A1 0 239 400及びWO90/07861に記載されている。用語抗体又はその機能的断片は、WO 94/04678, WO 96/34103 and WO 97/49805, WO 04/062551, WO 04/041863, WO 04/041865, WO 04/041862 and WO 04/041867に記載される重鎖抗体及びその可変ドメイン；並びに一般的な４鎖抗体分子の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）又は軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に基づく又は由来するドメイン抗体又は「ｄＡｂ’ｓ」を含む。
【０１２９】
本発明の蛍光分析物及び／又は第二の実体は、少なくとも１、すなわち１、２、３、４、５又はそれ以上の「エピトープ結合ドメイン」を含有しうる。用語「エピトープ結合ドメイン」は、上記の抗体又はその機能的断片の他に、例えば病原体、タンパク質、ペプチド、酵素、毒素、ビタミン、多糖、脂質、ホルモン類、サイトカイン、治療薬／化合物（薬剤）、核酸（例えばｓｉＲＮＡ）、受容体、受容体リガンド、腫瘍細胞等の細胞標的又は血液中を移動する（微小）転移、腫瘍抗原、腫瘍マーカ等に結合する（特に結合する）他の結合実体を含む。
【０１３０】
用語「標的」又は「標的分子」は、ここで使用される場合、エピトープ結合ドメインが結合する何れかの関心の生体分子を意味する。例示的な標的は、限定するものではないが、分泌されたペプチド増殖因子、医薬品、細胞シグナリング分子、血液タンパク質、細胞表面受容体分子の部分、核内受容体の部分、ステロイド分子、ウィルスタンパク質、糖、酵素、酵素の活性部位、酵素の結合部位、酵素の部分、小分子薬剤、細胞、菌体、タンパク質、タンパク質のエピトープ、タンパク質-タンパク相互作用に関係するタンパク質の表層、細胞表面エピトープ、診断タンパク質、診断用マーカー、植物タンパク質、タンパク質-タンパク相互作用に関係するペプチド及び食品成分を含む食品を含む。標的は、生物学的状態、例えば植物又は動物における疾患又は障害並びに病原体の存在に関連しうる。標的が特定の生物学的状態に「関連する」時、標的の有無又は標的の特定の量の存在は、生物学的状態を同定することができる。
【０１３１】
ここで使用する場合、標的及びエピトープ結合ドメイン間の相互作用と関連した用語「結合する」は、エピトープ結合ドメインが、一般のタンパク質との会合と比較して（すなわち非特異的結合）統計学的に有意の程度に標的と会合する（例えば相互作用する又は複合体を形成する）ことを示す。このように、用語「エピトープ結合ドメイン」は、また、標的との統計学的に有意な会合又は結合を有するドメインを意味することが理解される。
【０１３２】
用語「エピトープ結合ドメイン」は、例えば、異なるＶ領域又はドメインの、抗原又はエピトープに個々に（特異的に）結合するドメインを含み、これはドメイン抗体（ｄＡｂ）、例えばヒト、ラクダ又はサメ免疫グロブリン単可変ドメイン、又は以下から成る群から選択されるスカフォールドの誘導体であるドメインでありうる、ＣＴＬＡ-４（Evibody）；リポカリン；プロテインＡ由来分子、例えばプロテインＡのＺドメイン（Affibody、SpA）、Ａ-ドメイン（Avimer/Maxibody）；熱ショックタンパク質、例えばＧｒｏＥＩ及びＧｒｏＥＳ；トランスフェリン（trans- body）；アンキリンリピートタンパク質（DARPin）；ペプチドアプタマー；Ｃ-タイプレクチンドメイン（テトラネクチン）;ヒトγ-クリスタリン及びヒトユビキチン（affilins）;ＰＤＺドメイン;ヒトプロテアーゼ阻害薬のサソリ毒素クニッツタイプドメイン；及びフィブロネクチン（adnectin）;天然リガンドの他のリガンドに対する結合を得るためにタンパク質操作に課された。ＣＴＬＡ-４（細胞傷害性Tリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４+ Ｔ細胞に発現されるＣＤ２８ファミリー受容体。その細胞外ドメインは、Ｉｇフォールド様可変ドメインを有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異なる結合特性を与えるために異種配列で置換されることができる。異なる結合特異性を有するよう設計されたＣＴＬＡ-４分子はEvibodiesとしても知られる。更なる詳細は、Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001 )を参照のこと。
【０１３３】
リポカリンは、例えばステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質等の小疎水性分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。それらは異なる標的抗原と結合するよう設計されることができる、円錐構造の開放端に多くのループを有する剛性β-シート二次構造を有する。アンチカリンは、１６０−１８０の間のアミノ酸のサイズでありリポカリンに由来する。更なる詳細は、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US7250297B1 and US20070224633を参照のこと。
【０１３４】
affibodyは、抗原に結合するよう設計可能である黄色ブドウ球菌のプロテインＡに由来するスカフォールドである。ドメインは、およそ５８アミノ酸の３ヘリックス束から成る。ライブラリが表面残基のランダム化によって作製された。更なる詳細はProtein Eng. Des. SeI. 17, 455-462 (2004) and EP1641818A1を参照のこと。
【０１３５】
Avimersは、Ａ-ドメインスカフォールドに由来するマルチドメインタンパク質である。およそ３５アミノ酸の天然ドメインが、規定されたジスルフィド結合構造を採用する。多様性は、Ａ-ドメインのファミリーにより呈される天然変異のシャッフルにより生成される。更なる詳細はNature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) and Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)を参照のこと。
【０１３６】
トランスフェリンは、単量体血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容表面ループにおける、ペプチド配列の挿入によって異なる標的抗原を結合するよう設計されることができる。操作されたトランスフェリンスカフォールドの例はTrans-bodyを含む。更なる詳細はJ. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)を参照のこと。
【０１３７】
設計アンキリンリピートタンパク質（DARPins）は、細胞骨格への膜内在性タンパク質の接着を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単アンキリンリピートは、２つのα-ヘリックス及びβ-ターンからなる３３残基モチーフである。それらは、各リピートの最初のα-ヘリックス及びβ-ターンにおける残基をランダム化することにより、異なる標的結合に結合するよう操作されることができる。それらの結合面は、モジュールの数を増加することによって増加することができる（親和性成熟の方法）。更なる詳細はJ. MoI. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) and J. MoI. Biol. 369, 1015-1028 (2007) and US20040132028A1を参照のこと。
【０１３８】
フイブロネクチンは、テストと結合するために設計されることができる足場である。Adnectinsにはヒトのフィブロネクチン・タイプＩＩＩ（ＦＮ３）の１５の反復単位の第１０の領域の自然なアミノ酸配列の背骨を含む。
β-サンドイッチの一端の３つのループは、Adnectinが特に興味がある治療的な標的を認識することを可能にするために設計されることができる。詳しくは、Protein英Des. SeI. 18、435-444（2005）、US20080139791、WO2005056764及びUS6818418B1を参照。
【０１３９】
ペプチドアプタマーは、典型的には活性部位に拘束可変ペプチドループを有する（ＴｒｘＡ）定常スカフォールドタンパク質から成る、コンビナトリアル認識分子である。更なる詳細はExpert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)を参照のこと。
【０１４０】
ミクロボディーは、３−４のシステイン架橋を有する長さ２５−５０アミノ酸の天然に生じるマイクロタンパク質に由来し、マイクロタンパク質の例は、ＫａｌａｔａＢＩ及びコノトキシン及びノッチンを含む。マイクロタンパク質はループを有し、マイクロタンパク質の全体のフォールドに影響することなく２５アミノ酸までを含むよう操作することが可能である。操作されたノッチンドメインの更なる詳細はＷＯ２００８０９８７９６を参照のこと。
【０１４１】
他のエピトープ結合ドメインは、異なる標的抗原結合特性を設計するためにスカフォールドとして用いられたタンパク質を含み、ヒトγ-クリスタリン及びヒトユビキチン（affilins）、ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツタイプドメイン、Ｒａｓ-結合タンパク質ＡＦ-６のＰＤＺ-ドメイン、サソリ毒素（charybdotoxin）、Ｃ-タイプ・レクチンドメイン（tetranectins）を含み、Chapter 7 - Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dubel) and Protein Science 15:14-27 (2006)において概説される。本発明のエピトープ結合ドメインは、これらの代替タンパク質ドメインの何れかに由来することができる。更なる「エピトープ結合ドメイン」の例は、受容体（特異的にそれらのリガンドと結合する）、レクチン（特異的に多糖と結合する）、Ｚｎフィンガー及びロイシンジッパー（核酸と結合する）、酵素（特異的にそれらの基質と結合する）、ウイルス及び細菌（例えばそれらの標的細胞に特異的に結合する）、核酸（特異的に互いにハイブリッド形成する）等である。
【０１４２】
治療剤（薬）として作用する治療的「エピトープ結合ドメイン」、及び治療的抗体又はそれらの機能的断片が好ましい。特に好ましいものは、アレムツズマブ、アポリズマブ、セツキシマブ、エピラツズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ニモツズマブ、マパツズマブ、マツズマブ、rhMab ICR62、rhMab B-Ly1及びペルツズマブである。
【０１４３】
「治療薬」は、治療的化合物の主要な目的が、特定疾患の症状又は有害医療状態の改善である薬剤である。用語「疾患」は、ここで使用される場合、何れかの障害性又は正常に機能しない器官、部分、構造、又は遺伝的又は発達異常の影響から生じる体のシステム、感染、毒、栄養欠乏又は不均衡、毒性、又は好ましくない環境因子；疾病（illness）；病的状態（sickness）；又は病気（ailment）を意味する。用語「症状」は、ここで使用される場合、特定の疾患を又は障害に起因しまた伴う何れかの現象を意味し、指標として役に立つ。「治療薬」又は「治療化合物」は、これに限定するものではないが、抗細菌性、抗真菌性、抗ウイルス性、抗増殖性、免疫抑制性、免疫活性性、鎮痛性、抗悪性腫瘍薬又はヒスタミン受容体拮抗薬を含む。用語「疾患」は、更に、生存動物の正常な状態の何れかの障害又は生体機能の能力を妨害又は変更するその一部を含み、典型的には識別可能な兆候又は症状により明らかにされる。例えば、疾患は、限定するものではないが、癌疾患、心臓血管疾患、神経変性疾患、免疫疾患、自己免疫性疾患、遺伝性疾患、感染症、骨疾患及び環境性疾患を含みうる。
【０１４４】
用語「抗菌薬」は細菌に対して増殖阻害又は増殖制限活性を有する何れかの化合物に関し、例えば[β]-ラクタム抗生物質又はキノロン抗生物質を含む。用語は更に、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリン、アモキシシリン、アンピシリン、セファロスポリン、セフォタキシム、セフトリアキソン、リファンピン、ミノサイクリン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、エリスロマイシン、テトラサイクリン、ゲンタミシン、マクロライド、キノロン、[β]-ラクトン、Ｐ-ラクタマーゼ阻害剤、サリチルアミド、及びバンコマイシン、サルファニルアミド、スルファメトキサゾール、スルファセタミド、スルフイソキサゾール、スルファジアジン、ペニシリン、例えばペニシリンＧ及びＶ、メチシリン、オキサシリン、ナフィシリン、アンピシリン、アモキシシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリン及びピペラシリン、セファロスポリン、例えばセファロチン、セファゾリン、セファレキシン、セファドロキシル、セファマンドール、セホキシチン、セファクロール、セフロキシン、ロラカルベフ、セホニシド、セフォテタン、セホラニド、セフォタキシム、セフポドキシム、プロキセチル、セフチゾキシム、セホペラゾン、セフタジジム及びセフェピム、アミノグリコシド、例えばゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルミシン、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン等、テトラサイクリン、例えばクロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン及びミノサイクリン、及びマクロライド、例えばエリスロマイシン、クラリスロマイシン及びアジスロマイシン又はそれらの類似体。
【０１４５】
用語「抗真菌剤」は真菌種に対して増殖阻害又は増殖制限活性を有する何れかの化合物に関し、例えばアンフォテリシン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ナイスタチン、クロトリマゾール、フルコナゾール、シクロピロックス、エコナゾール、ナフチフィン、テルビナフィン及びグリセオフルビン等である。
【０１４６】
用語「抗ウイルス剤」はウィルス種に対して増殖阻害又は増殖制限活性を有する何れかの化合物に関し、例えばアシクロビル、ファムシクロビル、ガンシクロビル、ホスカルネット、イドクスウリジン、ソリブジン、トリフルリジン（トリフルオロピリジン）、バラシクロビル、シドホビル、ジダノシン、スタブジン、ザルシタビン、ジドブジン、リバビリン及びリマンタジン等である。
【０１４７】
用語「抗増殖剤」は、細胞増殖を阻害又は制限する何れかの化合物に関し、例えばメトトレキセート、アザチオプリン、フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、６‐チオグアニン、シクロホスファミド、塩酸メクロレタミン、カルムスチン、サイクロスポリン、タキソール、タクロリムス、ビンブラスチン、ダプソン、ネドクロミル、クロモリン（クロモグリク酸）及びスルファサラジン等である。
【０１４８】
用語「免疫抑制剤」は、免疫システムの活性の阻害又は防止を導く何れかの化合物に関し、例えばグルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、イムノフィリン又はＴＮＦ-結合タンパク質に作用する薬剤等である。用語は、また、シクロホスファミド、アンスラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アザチオプリン、メルカプトプリン、メトトレキサートサイクロスポリン、抗ＩＬ−２受容体抗体、抗ＯＫＴ３抗体及び抗ＣＤ３抗体、及びＴＮＦ−α結合モノクローナル抗体、例えばインフリキシマブ（Remicade（登録商標））、エタナーセプト（Enbrel（登録商標））又はadalimumab（Humira（登録商標）を含む。
【０１４９】
用語「鎮痛剤」は、痛みを鎮めるために使用される何れかの化合物に関し、例えば例えばリドカイン、ブピバカイン、ノボカイン、プロカイン、テトラカイン、ベンゾカイン、コカイン、メピバカイン、エチドカイン、プロパラカイン、ロピバカイン及びプリロカイン等である。
【０１５０】
用語「抗悪性腫瘍薬」は腫瘍の増殖を阻害及び撃退する何れかの化合物に関し、例えば、ペントスタチン、６‐メルカプトプリン、６‐チオグアニン、ＭＴＸ、ブレオマイシン、エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ヒドロキシ尿素、５‐フルオロウラシル、シタラビン、フルダラビン、マイトマイシン、シスプラチン、プロカルバジン、ダカルバジン、パクリタキセル、ドセタキセル、コルヒチン及びビンカアルカロイド等である。
【０１５１】
用語「ヒスタミン受容体拮抗剤」はヒスタミンの放出又は作用を阻害するよう作用する何れかの化合物に関し、例えば２-メチルヒスタミン、２-ピリジルエチルアミン、２-チアゾリルエチルアミン、（Ｒ）-ａ-メチルヒスタミン、イムプロミジン、ジマプリット、４（５）-メチルヒスタミン、ジフェンヒドラミン、ピリラミン、プロメタジン、クロルフェニラミン、クロルシクリジン、テルフェナジン等である。
【０１５２】
用語「毒素」は、本発明に関連することにおいては、酵素又は細胞受容体等の生物学的高分子と相互作用することにより、体組織との接触又はを伴う吸収に際して疾患又は細胞死を引き起こすことが可能な何れかの分子に関する。用語は、限定するものではないが、ボツリヌス毒素、テタヌストキシン、百日咳毒素、熱安定性及び熱不安定な大腸菌エンテロトキシン、コレラ毒素、志賀毒素、細胞致死性膨張性毒素、気管細胞毒素、ジフテリア毒素、クロストリジウム毒素、テトロドトキシン、バトラコトキシン、モーロトキシン、アジトキシン、カリブドトキシン、マーガトキシン、スロトキシン、スキラトキシン、カルシセプチン、タイカトキシン及びカルシクルジンを含む。
【０１５３】
用語「ホルモン」は、メッセンジャーとして、血液を介して一細胞（又は細胞群）から別のところへシグナルを運ぶ何れかの化合物に関し、例えばプロスタグランジン、セロトニン、ヒスタミン、ブラジキニン、カリクレイン、及び胃腸ホルモン、放出ホルモン、下垂体ホルモン、インスリン、バソプレシン（ＡＤＨ）、グルカゴン、エンケファリン、カルシトニン及びコルチコステロイド等である。
【０１５４】
用語「ビタミン」は、生物により栄養分として少量必要とされる何れかの化合物に関し、例えばビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ９、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ、Ｅ又はＫ等である。
【０１５５】
用語「受容体分子」は、リガンドに結合し典型的にはシグナルを伝達する、細胞膜上又は細胞質又は細胞核内のタンパク質に関し、例えば代謝型受容体、ＧＴＰタンパク質結合受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、アデノシン受容体、アドレナリン受容体、ＧＡＢＡ受容体、アンギオテンシン受容体、カンナビノイド受容体、コレシストキニン受容器、ドーパミン受容体、グルカゴン受容器、代謝型グルタミン酸受容体、ヒスタミン受容器、嗅覚受容、オピオイド受容体、ケモカイン受容体、カルシウム感知受容体、ソマトスタチン受容体、セロトニン受容体、セクレチン受容体又はＦｃ受容体等である。
【０１５６】
用語「サイトカイン」は、体液性調節因子として作用する可溶性タンパク質及びペプチドに関し、正常又は病的状態において、個々の細胞及び組織の機能的活性を変更し、また細胞間の相互作用を媒介し、細胞外環境で起こるプロセスを調節する。用語は、Ｔｈ１ Ｔ-ヘルパーによって生産されるタイプ１サイトカイン、Ｔｈ２ Ｔ-ヘルパー細胞によって生産されるタイプ２サイトカイン、インターロイキン、ケモカイン又はインターフェロン、例えばＩＬ-１ｒａ（拮抗剤）、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、Ｅｐｏ、Ｇ-ＣＳＦ、ＧＨ、ＰＲＬ、ＩＰ１０、Ｉ３０９、ＩＦＮ-α、ＩＦＮ-β、ＩＦＮ-γ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２（ｐ３５+ ｐ４０）、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７ Ａ−Ｆ、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２３（ｐ１９ + ｐ４０）、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７（ｐ２８ -ＥＢＩ３）、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５（ｐ３５-ＥＢＩ３）、ＬＴ-α、ＬＴ-β、光、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦＡＳＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４-1ＢＢＬ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫ、ＧＭ-ＣＳＦ、Ｍ-ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＬ１-α、ＩＬ１-β、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ｉｎｔ-２、ＫＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦアルファ、ＴＧＦベータ、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦベータ、ベータセルリン、SCDGF、アンフィレギュリン又はＨＢ-ＥＧＦを包含し、当業者にとって公知であり、また例えばTato, C.M. & Cua, D.J. (Cell 132: 900; Cell 132: 500, Cell 132: 324, (2008)) or from Cytokines & Cells Online Pathfinder Encyclopaedia (http://www.copewith-cytokines.de)から得られることが可能でる。用語「炎症性サイトカイン」もまた考慮される。用語「炎症性サイトカイン」は、炎症に有利に働く免疫調節性サイトカインを意味する。典型的には、炎症性サイトカインは、ＩＬ-1-α、ＩＬ-1-β、ＩＬ-6及びＴＮＦアルファを含む。これらの炎症性サイトカインは、初期反応の主に原因となる。他の炎症性メディエーターは、ＬＩＦ、ＩＦＮ-ガンマ、ＩＦＮ-アルファ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＴＧＦ-ベータ、ＧＭ-ＣＳＦ、ＴＷＥＡＫ、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-１７、ＩＬ-１８、ＩＬ-１９、ＩＬ-２０、ＩＬ-８、ＩＬ-１６、ＩＬ-２２、ＩＬ-２３、ＩＬ-３１、ａｎｄ  ＩＬ-３２を含む(Tato, C.M. & Cua, D.J. Cell 132:900; Cell 132:500, Cell 132, 324 (2008))。これらの炎症誘発性サイトカインは、内因性発熱物質（ＩＬ-１、ＩＬ-６、ＴＮＦ−アルファ)として作用し、マクロファージ及び間葉系細胞（線維芽細胞、上皮及び内皮細胞を含む）双方による２次メディエーター及び炎症誘発性サイトカインの合成を上方制御し、急性期タンパク質の生産を刺激し、又は炎症性細胞を誘引しうる。好ましくは用語「炎症誘発性サイトカイン」は、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ-１５、ＩＦＮ-ガンマ、ＩＦＮ-アルファ、ＩＬ-１-ベータ、ＩＬ-８、ＩＬ-１６及びＩＬ-２２に関する。
【０１５７】
用語「核酸」は、当業者に公知の何れかの核酸に関し、例えばポリヌクレオチド、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ又はそれの誘導剤等である。好ましくは、用語はＤＮＡ及びＲＮＡの形態のオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド、及びそれらの類似体を意味し、例えば一本鎖又は二本鎖標的に対するアンチセンス配列等の相補標的に対するハイブリダイゼーションのために、又は配列によりコード化された核酸転写物又はタンパク質を発現するために設計された選択配列を有した。類似体は、帯電及び好ましくは無電荷主鎖の類似体、例えばホスホネート、メチルホスホナート、ホスホロアミド酸、好ましくはＮ-３'又はＮ-５'、チオリン酸塩、無電荷モルフォリノベースポリマー、及びタンパク質核酸（ＰＮＡ）を含む。このような分子は、様々な治療計画において使用されることができ、例えば酵素補充療法、遺伝子治療及びアンチセンス療法を含む。更には、用語はｓｉＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡを意味する。全４つの天然の核酸塩基を含有するＰＮＡは、ワトソン-クリック塩基対合則に従い相補オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、塩基対認識において真のＤＮＡ模倣物である（Egholm等 Nature 365:566-568 (1993)）。ＰＮＡの主鎖はリン酸エステルよりむしろペプチド結合によって形成され、アンチ-センス利用によく適している。
【０１５８】
用語「タンパク質」は、何れの興味のポリポプチドを含み、治療的に活性なタンパク質、酵素、マーカータンパク質等を含む。
本発明の方法及び使用及び装置の別の実施態様では、蛍光実体は蛍光分析物である。これは、蛍光実体は分析物それ自体であり、すなわち、蛍光分析物は少なくとも一つの蛍光実体を含むが第二の実体は含まない。
【０１５９】
本発明の一実施態様では、前記第二の実体は、前記蛍光実体で直接標識される。用語「直接標識する」は、蛍光実体及び第二の実体が互いに共有結合されることを含む。前記共有結合は、蛍光標識（一又は複数）及び第二の実体の間で、及び／又は蛍光標識が連結されるスペーサ（一又は複数）及び第二の実体の間で形成されることができる。第二の実体が直接一以上の蛍光標識で直接標識される場合、これらの蛍光標識の幾つか（又は一つ）が第二の実体に共有結合され、他（一又は複数）が前記第二の実体に共有結合するスペーサー（一又は複数）に連結されることが想定される。スペーサーは本明細書の他所で規定されている。
【０１６０】
ＮＩＲ蛍光標識を含む蛍光標識を結合する方法は、当技術分野でよく知られている。抗体に対するこれらの標識のコンジュゲーション技術は、この数年の間著しく成長し、Aslam, M., and Dent, A., Bioconjugation (1998) 216-363, London, and in the chapter "Macromolecule conjugation" in Tijssen, P., "Practice and theory of enzyme immunoassays" (1990), Elsevier, Amsterdamに詳細な説明が記載される。
適切なカップリング化学は上記文献（Aslam, 上掲）から知られる。蛍光標識は、どの結合部分（coupling moiety）が存在するかに依存し、水溶性又は有機媒体において抗体と直接反応することができる。結合部分は、抗体に蛍光色素標識を化学的に結合するために使用される反応基又は活性化基である。蛍光色素標識は、抗体に直接結合、又はスペーサーを介して抗体に結合し、抗体及びＮＩＲ蛍光標識を含んでなるＮＩＲ蛍光標識コンジュゲートを形成することが可能である。使用されるスペーサーは、適切に長いインビボ持続性（半減期）を本質的に有するよう選択又は設計されうる。
【０１６１】
本発明の方法の別の実施態様では、前記第二の実体は間接的に前記蛍光実体に標識される。用語「間接的に標識される」とは、蛍光実体及び第二の実体が互いに非共有結合されることを意味する。「非共有結合」は、（ａ）蛍光実体が第二の実体にインターカレートすること（例えば核酸にインタカレートするエチジウムブロマイド）；及び（ｂ）非共有結合様式で互いに特異的に相互作用する２つの結合パートナーに基づく適切な結合反応の何れかの種類、例えば、抗原−抗体結合；受容体-リガンド結合、核酸ハイブリダイゼーションに基づく結合、レクチン-糖結合、タンパク質-タンパク質結合、タンパク質-核酸結合、ビオチン-ストレプトアビジン、ＤＩＧ-抗ＤＩＧ抗体等を含む。これに関することにおいては、結合実体は一結合パートナーに結合され、第二の実体は、前記結合パートナーの特定の対応物に結合するか、又は前記結合パートナーの前記特定の対応物である。例えば、抗体又は抗体断片は、製造され、一般的な抗体技術を用いて本発明の蛍光実体又は第二の実体に結合されることができる（例えば、Folli等, 1994, 「Antibody-Indocyanin Conjugates for Immunophotodetection of Human Squamous Cell Carcinoma in Nude Mice,」 Cancer Res. 54:2643-2649; Neri等, 1997, 「Targeting By Affinity-Matured Recombinant Antibody Fragments of an Angiogenesis Associated Fibronectin Isoform,」 Nature Biotechnology 15:1271-1275を参照）。前記抗体又はそれの機能的断片は、次に、既に存在するか、又は蛍光分析物の「第二部分」に人工的に導入される特定のエピトープに結合され得、すなわち、蛍光実体は抗体又はその断片に結合され、そして、抗体又はその断片に特異的に結合されるエピトープは存在するか又は第二の実体に導入されなければならない。又はその逆も同じである。同様に、受容体結合ポリペチド及び受容体結合多糖が、周知の技術を使用して、製造され本発明の蛍光又は第二の実体にコンジュゲートされることができる。
【０１６２】
間接的標識は、インビトロで又はインビボで実行されることができる。
【０１６３】
また、前記第二の実体が一度に、直接的に及び間接的に標識されることが想定される。例えば、一つの蛍光標識が共有結合で結合され、別の蛍光標識が、第二の実体のＤＩＧ標識を認識する抗ＤＩＧ抗体に結合される。
【０１６４】
本発明の方法の更なる実施態様では、前記蛍光実体は、前記第二の実体に特異的である少なくとも一つのエピトープ結合ドメインを含有する。本発明の方法の別の実施態様では、前記第二の実体は、前記蛍光実体に特異的である少なくとも一つのエピトープ結合ドメインを含有する。「少なくとも一つ」とは、一種（同じ特異性を有する）又は異なる種（異なる特異性を有する）であり得る、１、２、３、４、５又はそれ以上のエピトープ結合ドメインを含む。特に、第二の実体は、少なくとも２つの異なるエピトープ結合ドメインを含有し得、少なくとも一つは蛍光実体に特異的であり、少なくとも一つは標的に特異的である。本発明の特に好ましい実施態様では、前記第二の実体はＤＩＧに結合し、前記蛍光実体は抗ＤＩＧ抗体に結合し、その逆も同じである。
【０１６５】
本発明の蛍光分析物に存在する蛍光実体が、第二の実体の所望の特性を変更することが生じうる（例えばその薬物動態学的プロファイル、生物学的半減期等）。従って、本発明の方法によって得られた結果を調節／校正するために、例えば血液サンプルを採る等の「一般的な方法」により非標識の第二の実体を用いて得られたデータを、本発明の方法によって得られた結果と比較することが所望されうる。従って、本発明の方法及び／又は装置を調節／校正又は最適化することが想定される。更に、蛍光分析物の特定の特性（例えば、その薬物動態学的特徴、例えば、血漿中の安定性、血漿クリアランス、標的親和性、血中ピークレベル（t max）、血漿半減期等）を調節／校正することが想定される。
この目的のために、蛍光実体のインビボ特性（例えばその薬物動態学的特徴）を非標識の第二の実体のその特性に調整するために、例えば、異なる蛍光標識、蛍光分析物あたりの異なる標識の量、及び／又は蛍光実体（例えば、異なるスペーサ、及び／又は分子スペーサあたりの異なる量のフルオロフォア分子によって特徴付けられる）を選択するできる。従って、本発明の方法は、（ａ）蛍光実体の薬物動態学的特徴を調整するために；及び／又は（ｂ）蛍光標識分析物で得られたデータと非標識分析物（例えば第二の実体）で得られたデータと相関するため；及び／又は（ｃ）蛍光標識を最適化するために（定性的及び定量的に、すなわち、異なるフルオロフォアの選択、及び／又は第二の実体の分子あたりのフルオロフォア分子の異なる濃度の選択、及び／又は蛍光実体のスペーサーの分子当たりのフルオロフォア分子の異なる濃度の選択が所望されうる）、本発明の方法によって得られたデータを、非標識分析物（例えば第二の実体）で得られたデータと比較する工程を更に含みうる。「非標識分析物（例えば第二の実体）」は、前記分析物が蛍光性に標識されていないことを意味し、すなわち全く標識されていないか、又は放射標識等の他の非蛍光標識で標識されうる。
【０１６６】
「被験体」は、本発明に関係することにおいては、血液循環システム及び少なくとも一つの目を有する何れかの動物を含む。「眼」は、この関係において、少なくとも瞳孔及び網膜を含み、前記網膜は血液が供給される。好ましくは前記被験体は、脊椎動物、より好ましくは哺乳類動物である。前記哺乳類動物被験体が非ヒト動物、ヒト、サル（例えばカニクイザル）、マウス、ネズミ、モルモット、ウサギ、ウマ、ラクダ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヤギ又は家禽であることがより好ましい。被験体がマウス、ネズミ、ウサギ及び／又はヒトであることがより好ましい。
【０１６７】
非ヒト被験体は、特定の疾患又は障害のモデルを表しうる。また、本発明の被験体が異種移植片、好ましくは腫瘍を有することが想定される。
【０１６８】
また、本発明の被験体は、蛍光分析物、蛍光実体、蛍光標識、第二の実体、及び／又は標的が投与される被験体であることが想定される。あるいは、本発明の被験体は、本発明の蛍光分析物、蛍光実体、蛍光標識、第二の実体、及び／又は標的を受けた被験体である（つまり、被験体は前述の実体が予め投与された被験体）。「予め投与」とは、この点においては、実体が、本発明の方法（及び全ての関連する実施態様）の前に、つまり本発明の方法が実行される前に、被験体に投与されていることを含む。更に、本発明の被験体は、本発明の蛍光分析物、蛍光実体、蛍光標識、第二の実体及び／又は標的を有する被験体であることが想定される。
【０１６９】
本発明の方法は、（ｃ）被験体の更なる領域からの、（ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する前記蛍光分析物から放出される光を決定する工程を更に含むことができる。
【０１７０】
「被験体の更なる領域から」とは、何れかの種類の測定のために関心となりうる、眼又は眼の部分以外の、被験体の更に規定された又は区別された部分又は領域を意味する。例えば、蛍光分析物の器官分布及び／又は蓄積及び／又は分泌（分泌経路の決定）及び／又は代謝（例えば薬剤の代謝物の生成）が検出及び／又は評価されることが想定される。「更なる領域」は、従って、例えば、被験体の器官の一部、器官、血管ネットワーク又は神経細胞システムを含む。また、薬剤の効果（例えば薬剤が標的に到達したか？）を評価するため、薬剤の再投与が必要か（例えば薬剤がまた標的に存在するか否か？）評価するため、本発明の方法によって得られたデータを、上述の更なるデータと相関させることが想定される。
【０１７１】
「器官」は、この点においては、消化系（唾液腺、食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、直腸及び肛門を含む）；内分泌系（視床下部、下垂体又は脳下垂体、松果体又は松果腺、甲状腺、副甲状腺の及び副腎、すなわち副腎等の内分泌腺を含む）；外皮系（皮膚、髪及び爪を含む）；リンパ系（リンパ系、リンパ節、扁桃、アデノイド、胸腺及び脾臓を含む）；筋肉系；神経系（脳、脊髄、末梢神経及び神経を含む）；生殖器系（卵巣、卵管、子宮、膣、乳腺、精巣、輸精管、精嚢、前立腺及び陰茎を含む）；呼吸器系（咽頭、喉頭、気管、気管支、肺及び隔膜を含む）；骨格系（骨、軟骨、靭帯及び腱を含む）；及び尿路系（尿の体液平衡、電解質均衡及び排出に関係する腎臓、尿管、膀胱及び尿道を含む）から選択される一以上の器官を含む。
【０１７２】
心臓、肝臓、腎臓、脾臓、膀胱、肺及び脳が好ましく；膀胱及び／又は肝臓がより好ましい。
【０１７３】
本発明は、また、（ｂ）において、（ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する前記光が光検出器で受信される本発明の方法に関する。
【０１７４】
用語「光検出器」は、光エネルギー又は他の電磁気エネルギーを測定可能な電気シグナルに変換することが可能な何れかの適切な光検出器又は画像記録システムを含む。光検出器は、時々、フォトディテクター又はフォトセンサーとも呼ばれる。光検出器は、電荷結合素子（ＣＣＤ）、フォトダイオード、光導電セル、相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）、光電増倍管、フォトレジスター、フォトトランジスター、逆バイアスＬＥＤ、又は極低温検出器等により例示される。ＣＣＤ及びＣＭＯＳが好ましい。
【０１７５】
光検出器が、任意にレンズシステム及び／又はカメラを含む画像処理装置である又はを具備することが想定される。あるいは、放出された／放出光を検出するために感度を増加するための特性を含むことも想定され、例えばイメージ増強管、大きいオンチップマイクロレンズ等であり、チップの非効率領域を減らし、また全体の量子効率を改善する。あるいは、薄い裏面照射冷却ＣＣＤ又はイメージ増強管を具備するＣＣＤが使用されることができる。生物組織の標的領域のフルオロフォアの濃度及び量子効率は、感度に影響する更なる要因である。感度を改善する方法は、改善された量子効率を有するフルオロフォアを開発することによって、並びにより少ないクエンチングのフルオロフォアの使用により成される。更に、更に離れた励起及び放出スペクトルによってフルオロフォアが使用されると、それぞれの蛍光光子のより大きい割合を集めるために、光学帯域フィルターの通過帯域が、クロストークを増加することなく広げられることができる。全てのこれらのスーク邸は当業者に周知であり、ＷＯ２００５／０６２９８７の実施例に例示されている。
【０１７６】
イメージング装置は、光検出器から複数の画像を取得するよう調節された画像取込プロセッサーを更に具備してもよい。複数の画像の各画像は、それぞれの露光時間を有する。画像取込装置は、複数の画像の各画像に関連するそれぞれの露光時間を動的に調節するよう調節された露光プロセッサーを含むことができる。イメージングシステムは、更にディスプレイ及び格納手段を含んでもよく、例えば、画像取得プロセッサーに連結され、複数の画像を取得し格納するよう調節され、それぞれの露光時間を取得し格納するよう調節されたメモリである。
イメージング装置は、算出された画像の生成を可能にする画像処理ソフトウェアを更に具備しうる。例えば、リアルタイム又はリアルタイムに近い画像ストリームがオーバーレイ、偽色画像、画像減算、又は分割画像として表示される。他の数学的機能が、画像を処理するために使用されることが可能であり、ノイズフィルタリング技術、比率イメージング、閾値検出及び／又は生物学的情報の検出を容易にするための事前の確立分析を含む。
【０１７７】
本発明に関連して使用されうる光検出器は、任意に、（ｉ）好ましくは前記検出器の上流の予め規定された又は調節可能なフィルター（ハードウェアフィルタ）具備し、及び／又は（ｉｉ）本発明の方法の工程（ａ）において（つまりここに記載される指定された領域に励起光を向ける工程において）使用された励起光の予め定められた波長を分離（ソフトウェアフィルタ）しうる。
【０１７８】
光学フィルターは、特定の特性（しばしば特定の範囲の波長）を有する光を選択的に透過し、残りを遮断する。前記特性は予め定められたフィルターにおいて固定され、調節可能フィルターにおいて変更される。光学イメージングシステムにおいて透過及び／又は反射される波長帯域は、例えば、入射ビームの入射角の変更により調節されることができる。この入射角の選択は、透過されるスペクトル帯域及び反射されるスペクトル帯域の微調整を可能にする。
【０１７９】
前記予め定められた又は調節可能なフィルターは、好ましくは「前記検出器の上流」であり、すなわち光検出器及び被験体の間のどこかに提供される。
【０１８０】
「ソフトウェアフィルター」を、ハードウェアフィルターと組み合わせて、又はハードウェアフィルターの代わりに使用することがまた想定できる。ソフトウェアフィルターは、励起光の予め定められた波長の分離を可能にし、すなわちこれにより励起光の波長を差し引くことが可能である。
【０１８１】
前記フィルター（ハードウェア）が、本発明の方法の工程（ａ）において使用される励起光の予め定められた波長を特異的に拒絶することが好ましい。
【０１８２】
本発明は、工程（ｂ）が、（ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する前記蛍光分析物から放出される光を受信し、前記被験体の眼を通り放出された光の量を専ら決定し、これにより：
（ｉ）  前記蛍光分析物の存在を決定する；
（ｉｉ）  前記蛍光分析物の血液レベルを定量化する；又は
（ｉｉｉ）  又は前記蛍光の血液クリアランスをモニタ又は決定
する工程によって特徴付けられる方法に更に関する。
【０１８３】
更なる実施態様では、本発明は、蛍光分析物を励起するために被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域に少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を向けるために使用される励起手段の光軸、及び波長と識別可能な波長を有する前記蛍光分析物から放出される光を受信するために使用される光検出器の光軸が、互いに平行に及び／又は互いに角度を有して配置される、ここに開示される方法に関する。前記配置は、固定されてもよく又は調節可能であってもよい。励起手段及び／又は光検出器が可動性であることも想定される。「励起手段」は、これにより、励起光を提供する光源（及び任意にフィルタ）を具備する。
【０１８４】
本発明の方法は、励起光の光軸（一又は複数）が、放出光の光軸と完全に一致、一致しない、又は一部のみ一致する実施態様を更に含む。従って、励起光（一又は複数）の光軸が、放出光の光軸と角度を有することも想定される。
【０１８５】
本発明は、また、被験体の瞳孔の少なくとも少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を照射し前記蛍光分析物を励起するために使用される励起手段、及び予め定められた波長と識別可能な波長を有する前記蛍光分析物から放出される光を受信するために使用される光検出器が、空間的に離されいてる又は一体化されている（ユニット）方法が想定される。
【０１８６】
以下の、非制限的な技術分野のリストは、本発明の広範な利用を説明する。本発明の方法及び／又は装置が以下に対して使用されうる：
（ａ）  被験体の血液中の分析物の存在を決定する；
（ｂ）  被験体の血液中の分析物の生物学的半減期（t1/2）を決定する；
（ｃ）  被験体の血液中の分析物の血液レベルを定量化する、
（ｄ）  被験体の血液中の分析物の血液クリアランスをモニタ又は決定する；
（ｅ）  被験体の血液中の分析物の血清ピークレベル（t max）を決定する；
（ｆ）  被験体の血液中の分析物の理論上の濃度を決定する；
（ｇ）  被験体の血液中の飽和速度を評価し、これにより、例えば、腫瘍等に結合した抗体の量を決定する；
（ｈ）  被験体の血液中の薬剤的又は診断的組成物の分解動力学を決定する；
（ｉ）  被験体の血液中の分析物の排せつ動態及び／又は経路を評価する；
（ｊ）  被験体の血液中の分析物の薬物動態学を評価する；
（ｋ）  被験体の血液中の分析物のバイオアベイラビリティを決定する。バイオアベイラビリティは、被験体の体循環に達した分析物の投与された用量のパーセンテージ又は割合である。バイオアベイラビリティを変更する要因の例は、投与薬剤の固有の溶解及び吸収特性（例えば塩、エステル）、剤形（例えば錠剤、カプセル）、投与経路、胃腸管における有効成分の安定性、及び体循環に達する前の薬物代謝の程度；等を含む。
【０１８７】
本発明の方法/装置の更なる適用が、本願明細書の他所に例示される。用語「分析物」は、ここにおいては、蛍光分析物、第二の実体、標的等と同等に扱い本願明細書において記載されている。
【０１８８】
本発明は、また、本発明の方法における使用のためのここに規定される蛍光分析物又は蛍光標識を想定する。
【０１８９】
本発明は、更に、好ましくは本発明の方法で使用される、薬剤的及び／又は診断的組成物の調整のための、ここに規定される蛍光分析物又は蛍光標識の使用に関する。
【０１９０】
「薬剤的及び／又は診断的組成物」は、本発明の蛍光分析物、第二の実体、蛍光標識、標的等、及び任意に薬剤的に又は診断的に許容可能な担体及び／又は希釈剤を含みうる。
【０１９１】
適切な担体及び／又は希釈剤は当分野において周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン、例えば油／水エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌液等を含む。このような担体を含んでなる組成物は、周知の一般的な方法により調合されることができる。
【０１９２】
好ましい実施態様では、前記装置は：
（ａ）  蛍光分析物を励起するために、被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を照射する励起手段；及び
（ｂ）  （ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記分析物から放出された光を専ら受信する光検出器を具備する。
【０１９３】
別の実施態様では、前記装置は、
（ａ）  蛍光分析物を励起するために、被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ専ら、少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を照射する励起手段；及び
（ｂ）  （ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出された光を受信する光検出器を具備する。
【０１９４】
本発明は、また：
（ａ）  蛍光分析物を励起するために、被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ専ら、少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を照射する励起手段；及び
（ｂ）  （ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出された光を専ら受信する光検出器を具備する装置に関する。
【０１９５】
本発明は更に：
（ａ）  蛍光分析物を励起するために、被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ、少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を照射する励起手段；及び
（ｂ）  （ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出された光を受信する光検出器；及び
（ｃ）  前記被験体の眼を通し放出された光の量を専ら決定する手段を具備する装置に関する。
【０１９６】
本発明の装置の好ましい実施態様では、前記光検出器は、前記検出器の上流に連結される予め定められた又は調節可能なフィルターを具備する。好ましくは、前記フィルターは励起光の少なくとも一つの予め定められた波長を拒絶する。
【０１９７】
本発明の装置の更なる好ましい実施態様では、前記光検出器は、（ａ）において使用された、予め定められた波長の励起光を分離する。
【０１９８】
また、前記励起手段の光軸、及び（ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出される光を受信するために使用される光検出器の光軸が、互いに平行に及び／又は互いに角度を有して配置されることが想定される。
【０１９９】
本発明の装置の更なる実施態様では、前記励起手段及び前記光検出器は、空間的に離されているか又は一体化されている（すなわちユニットを形成する）。また、前記励起手段及び／又は前記光検出器が可動性であることが想定される。
【０２００】
本発明の装置は：
（ｉ）  眼の瞳孔の位置；及び／又は
（ｉｉ）  工程（ａ）における瞳孔の前記部分の面積、及び／又は工程（ｂ）における前記眼の瞳孔の面積
を決定する手段を任意に具備することができる。
【０２０１】
本発明の装置が、眼鏡である又はを含むことが想定される。
【０２０２】
本発明の装置が、このように、被験体の眼の角膜と直接接触しないことが好ましい。本発明の装置がコンタクトレンズとして形成されないことが特に好ましい。
【０２０３】
この開示は、明示によりその全内容をここに援用する添付の図面とともに最も理解されることができる。更に、本発明の更なる理解及びその多くの利点は、以下の実施例から得られ、例証として示し制限することを意図するものでない。
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】内挿によるt max及びt1/2の決定がこれらの値の正確さに影響し得ること示す理論的実施例。
【図２】内挿によるt max及びt1/2の決定がこれらの値の正確さに影響し得ること示す理論的実施例。
【図３】光学イメージング機器：本発明の光学イメージング機器の代表実施例。麻酔されたマウスがイメージングチャンバ（１）に置かれ、標識薬剤が注射され特定波長の光で照射される（２）。調査下の物体内の蛍光色素からの放射光は（３）、ＣＣＤカメラ（５）により検出される前に放出フィルタ（４）を通過する。生じた画像は選択された波長に従いグレースケール（６）又は偽カラー画像としてＰＣに表示され、更に処理されることができる（７）。
【図４】マウスの眼内ＩＣＧの蛍光強度のモニタリング：吸入麻酔された雌のＢＡＬＢ／ｃヌードをイメージングチャンバ内に置き、ＩＣＧ（２０μｇ／２００μｌ）を静脈内注入射した。蛍光シグナル強度の測定をＩＣＧの注射の１０秒前に始めた。関心領域の画像を８分の期間にわたり５００ｍｓの獲得時間で毎秒記録した。ＩＣＧを６７１〜７０５ｎｍの範囲の波長の光で励起し放出は８２０ｎｍで検出した。次にこれらの領域からの蛍光強度を算出し時間の関数としてプロットした。
【図５】データの内挿無しのt max及びt1/2の簡易計算。
【図６】異なるマウス器官のＩＣＧの蛍光強度のモニタリング：Ｃａｌｕ３異種移植片の蛍光シグナル強度を前述のように測定した。ＲＯＩを、被験体の解剖学的画像を使用して眼、肝臓、腎臓、脳及び皮下増殖腫瘍に設定した。次にこれらの領域からの蛍光強度を算出し時間の関数としてプロットした。
【図７】全身マウスにおけるパミドロン酸の蛍光強度のモニタリング：蛍光標識ビスホスホネート（OsteoSense; VisenMedical, Woburn, USA）を静脈内注入（２００μｌＰＢＳに２ｎＭｏｌ）し、４．４時間にわたり蛍光シグナル強度を記録した（獲得時間：３０００ｍｓ；励起波長：６１５〜６６５ｎｍ；放出波長：７８０ｎｍ）。眼内蛍光強度を算出し時間の関数としてプロットした。
【図８】データの内挿無しのt max及びt1/2の簡易計算。
【図９】標的器官におけるパミドロン酸の蓄積の確認：マウスに２ｍｍｏｌ OsteoSense750を注入しその４８時間後ＮＩＲＦを測定した。
【図１０】抗受容体チロシンキナーゼＡｂの一般的なＰＫ測定。
【図１１】マウスの眼内標識抗ＲＴＫ Ａｂの蛍光強度のモニタリング：受容体チロシンキナーゼに対するＣｙ５標識ｍＡｂを静脈内注入し（２．５ｍｇ／ｋｇ）、蛍光シグナル強度を３時間にわたって記録した（獲得時間：５００ｍｓ；励起波長：６１５〜６６５ｎｍ；放出波長：７２０ｎｍ）。眼内の蛍光強度を算出し時間の関数としてプロットした。
【０２０５】
実施例
以下の実施例は、本発明を例証する。これらの実施例は、本発明の範囲を制限するとして解釈されるべきではない。この実施例は例証のために含まれ、本発明は請求の内容のみにより制限される。
【０２０６】
一匹のマウスにおける少なくとも４時間の期間にわたる、血漿／血清における薬剤レベルの連続的なモニタリング、及び臓器分布の同時の測定を提案する。我々は、３つの異なる化合物を評価することによって、この方法の有用性を示す：
１．インドシアニングリーン：蛍光色素
２．パミドロン酸：蛍光標識ビスホスホネート
３．受容体チロシンキナーゼに対するＣｙ５標識モノクローナル抗体
【０２０７】
実施例１：インドシアニングリーン（ＩＣＧ）を用いた実現可能性研究
我々は最初にインドシアニングリーン（ＩＣＧ）蛍光色素を用いて、この新規な方法の技術的な実現可能性を評価した。マウスに静脈内注入した時、ＩＣＧはおよそ２〜４分（１、２）の内に循環から除去され、肝臓に蓄積された（３）。
【０２０８】
材料及び方法
吸入麻酔された雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスをイメージングチャンバ内に置き（図３）、２０μｇ／２００μｌの用量で静脈内注入射した。眼内の蛍光シグナル強度の測定をＩＣＧの静脈内注射の１０秒前に開始し、画像を８分の期間にわたり５００ｍｓの獲得時間で毎秒記録した。ＩＣＧを６７１〜７０５ｎｍの範囲の波長の光で励起し放出は８２０ｎｍで検出した。
【０２０９】
結果
眼の領域における蛍光シグナル強度の最高値を１００に対して正規化し、図４、５に示すデータは、t maxに２分で達したこと及び蛍光強度の半減期が６．６分であったことを示す。第２の実験では、皮下腫瘍（Calu3）を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにＩＣＧ  を静脈内注入し、眼、肝臓、腎臓、脳及び腫瘍領域のシグナル強度をモニタした。この実験では、t maxは１．２分であった。強度はその後減少し（t1/2 = ５．４分）、肝臓への蓄積が観察され３．８分でプラトーに達した（図６）。これらの結果は公開されたデータと一致する。
【０２１０】
実施例２：パミドロン酸、蛍光標識ビスホスホネートを用いた実現可能性研究
実施例１に示した実現可能性研究の成功完了後、我々は、蛍光標識ビスホスホネート（パミドロン酸）を評価した。ビスホスホネート（例えばパミドロン酸;MW 279）は骨疾患の治療に臨床的に有用である。パミドロン酸（静脈内注入後）は２０〜３０分の範囲の血清半減期を有し、骨（脛骨）が調査された全組織の中で最も高い濃度を持った。Clearance and tissue uptake following 4-hour and 24-hour infusions of pamidronate in rats. Drug Metab Dispos 1993;21(1):100-104 Daley-Yates等 A comparison of the pharmacokinetics of 14C-labelled ADP and 99mTc-labelled ADP in the mouse.我々は、蛍光標識パミドロン酸を使用し、マウスの眼及び全身画像内における蛍光強度を測定することにより、t max及びt1/2血漿レベルを算出し、記載の動態学をモニタした。静脈内注射の後、パミドロン酸は、２０〜３０分の範囲の血清半減期を有し、骨（脛骨）が調査した全組織の中で最も高い濃度を有した（４、５）。OsteoSense（２００μｌＰＢＳに２ｎＭｏｌ）が静脈内注射され、蛍光シグナル強度が５秒ごと記録された（獲得時間：３０００ｍｓ；励起波長：６１５〜６６５ナノメートル；放出波長：７８０ナノメートル）。血清t1/2は３４分（図７、８）であり、脊椎及び後肢への蓄積は４．４時間及び４８時間で明瞭に実証された（図９）。両観察は公開データと一致する。
【０２１１】
実施例３：受容体チロシンキナーゼを標的とする非標識及びＣｙ５標識モノクローナル抗体を用いた実現可能性研究
最後に、受容体チロシンキナーゼを標的とする非標識及びＣｙ５標識モノクローナル抗体のt1/2が比較された。一般的な測定は用量５ｍｇ／ｋの静脈内注射で７．７時間のt1/2を示した（図１０）。光学イメージングを使用し、用量２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射で、t1/2は３．０５時間であった（図１１）。
【０２１２】
考察
これらの結果は、t max及びt1/2が、麻酔をされた動物の眼内の蛍光シグナル強度を単純に測定することにより容易に算出されることを実証した。従来の技術とは対照的に、この新しい方法はＰＫ研究の精度を改善し、これは薬剤の定量化及びデータ内挿が必要ないからである。更にマウスの数は著しく減り、マウスは殺される必要がない。薬剤の蓄積及び異なる器官からのt1/2値に関する情報が、時間分解及びオンラインで得られることができた。
【０２１３】
総合すると、この手法は１匹の動物における多数の測定を可能にする（tmax及びt1/2の精度を改善する）。従来の方法と比較して、作業時間が著しく低減され、血液サンプルの混合が防がれ、非放射性物質の使用は放射化学への注意無しで通常の実験方法により更なる分析を可能にする。tmax及びt1/2に加えて、器官分布が追跡されることができる。このような同時測定は、血清におけるt1/2と比較して、興味の器官への蓄積に関する情報を容易にする（例えば血液脳関門浸透の徴候）。薬剤（低分子量物質、ペプチド、タンパク質、抗体及びｓｉＲＮＡ）は、異なる有機蛍光色素を用いて容易に標識されることができる。しかしながら、標識された薬剤を用いたこのようなインビボ研究を実施する前に、非標識薬剤と比較して違いがないことを機能的分析は示さなければならない。
【０２１４】
ヘモジュベリンに関して、インビトロ実験は、非標識及びＣｙ５標識ヘモジュベリンは、ＨｅｐＧ２細胞におけるＢＭＰ-２誘導のヘプシジンｍＲＮＡのアップレギュレーションを遮断するそれらの能力において異ならないことを確認した。また、Biacoreデータは、Ｃｙ５標識ハーセプチンが、非標識ハーセプチンと比較して同じ結合特性を有すること及びＨｅｒ２発現腫瘍細胞と結合することを示した。受容体チロシンキナーゼを標的とする標識抗体は受容体の内部移行を導く。
【０２１５】
動物が犠牲にされないので、同じ及び／又は他の薬剤（第一とは異なる放出スペクトルを有する蛍光色素で標識される）の多数の適用が、薬剤-薬剤相互作用に関する情報を得るために使用されることができる。更に、静脈内、腹腔内、経口、吸入、経鼻及び経皮適用後に薬用量の最適化、及び新規に設計された製剤が、正常及び遺伝子操作された（例えばＦｃＲｎノックアウト又はｈｕ ＦｃＲｎトランスジェニック）マウスで評価されることができる。
【０２１６】
イメージング方法の特別な発展は、インビボ状況下での薬剤の能力及びドラッグデリバリーシステムの視覚化を可能にする。薬剤の位置及び濃度に関する詳細で定量的な情報が、時間の関数として得られることができ、これにより生物学的効果のより深い理解を可能にする。この情報は最適化された薬剤の設計にとって重要である。
【０２１７】
参考文献：
1. Desmettre T et al. Fluorescence properties and metabolic features of indocyanine green (ICG) as related to angiography. Surv Ophthalmol 2000; 45:15-27。
2. Saxena V et al. Polymeric nanoparticulate delivery system for Indocyanine green: Biodistribution in healthy mice. International Journal of Pharmaceutics 2006; 308: 200-204。
3. Paumgartner G. The handling of indocyanine green by the liver. Schweiz Med Wochenschr. 1975;105(17 Suppl):1-30。
4. Pongchaidecha M et al. Clearance and tissue uptake following 4-hour and 24-hour infusions of pamidronate in rats. Drug Metab Dispos 1993;21(1):100-104。
5. Daley-Yates et al. A comparison of the pharmacokinetics of 14C-labelled ADP and 99mTc-labelled ADP in the mouse. Calcif Tissue Int 1988;43:125-127。
【０２１８】
本発明の更なる項目は以下の通りである。
１．  被験体において、蛍光実体及び第二の実体を含む蛍光分析物の血液クリアランスをモニタ又は決定する非侵襲性の方法であって：
（ａ）  蛍光実体を励起するために、前記被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を照射する工程、
（ｂ）  前記被験体の眼を通し、（ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記前記蛍光分析物から放出された光を受信し、これにより、前記蛍光分析物の血液クリアランスをモニタ又は決定する工程
を含んでなる方法。
【０２１９】
２．  被験体において、蛍光実体及び第二の実体を含む蛍光分析物の血液レベルを定量化する非侵襲性の方法であって：
（ａ）  蛍光実体を励起するために、前記被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を照射する工程、
（ｂ）  前記被験体の眼を通し、（ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記前記蛍光分析物から放出された光を受信し、これにより、蛍光分析物の血液レベルを定量化する工程
を含んでなる方法。
【０２２０】
３．  被験体の血液において、蛍光実体及び第二の実体を含む蛍光分析物の存在を決定する非侵襲性の方法であって：
（ａ）  蛍光実体を励起するために、前記被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を照射する工程、
（ｂ）  前記被験体の眼を通し、（ａ）の該予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記前記蛍光分析物から放出された光を受信する工程であって、これにより、前記蛍光分析物の存在を決定する工程
を含んでなる方法。
【０２２１】
４．  工程（ｂ）で受信された前記光が参照値と比較され、これにより：
（ｉ）前記蛍光分析物の血液レベルを定量化する；又は
（ｉｉ）又は前記蛍光分析物の血液クリアランスを決定する
項目１又は２の何れか一つに記載の方法。
【０２２２】
５．  前記第二の実体が診断用及び／又は治療用薬を含んでなる項目１から４の何れか一つに記載の方法。
【０２２３】
６．  前記第二の実体が、標的に特異的である少なくとも一つのエピトープ結合ドメインを有する前記項目の何れか一つに記載の方法。
【０２２４】
７．  前記第二の実体のエピトープ結合ドメインが一旦その標的と結合すると、前記蛍光実体に含有される蛍光標識が活性化される項目６に記載の方法。
【０２２５】
８．  前記標的が、抗体又はそれらの機能的断片、タンパク質、ペプチド、酵素、例えばｓｉＲＮＡ等の核酸、多糖、脂質、受容体、受容体リガンド、病原体、ウイルス、細菌、細胞、細胞標的、腫瘍抗原及び／又は薬剤である又はを含んでなる項目６に記載の方法。
【０２２６】
９．  前記第二の実体が前記蛍光実体で直接標識される前記項目の何れか一つに記載に記載の方法。
【０２２７】
１０．  前記第二の実体が前記蛍光実体で間接的に標識される前記項目の何れか一つに記載に記載の方法。
１１．  前記蛍光実体が、前記第二の実体に特異的であるエピトープ結合ドメインを有する項目１０に記載の方法。
【０２２８】
１２．  蛍光実体が活性化可能である前記項目の何れか一つに記載に記載の方法。
【０２２９】
１３．  一旦第二の実体と結合すると、前記蛍光実体が活性化される項目１０から１２の何れか一つに記載の方法。
【０２３０】
１４．  前記蛍光実体が前記被験体において活性化される項目１３に記載の方法。
【０２３１】
１５．  前記活性化が工程（ｂ）に先行する項目１４に記載の方法。
【０２３２】
１６．  蛍光分析物が蛍光実体である項目１から４の何れか一つに記載の方法。
【０２３３】
１７．  前記蛍光分析物が前記被験体に投与される前記項目の何れか一つに記載の方法。
【０２３４】
１８．  前記蛍光実体が前記被験体に投与される項目１１に記載の方法。
【０２３５】
１９．  前記標的が前記被験体に投与される項目８に記載の方法。
【０２３６】
２０．  前記蛍光分析物、前記蛍光実体及び／又は前記標的の前記投与が工程（ｂ）に先行する項目１７から１９の何れか一つに記載の方法。
【０２３７】
２１．  工程（ｂ）が、（ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出される光を受信し、前記被験体の眼を通り放出された光の量を専ら決定し、これにより：
（ｉ）  前記蛍光分析物の存在を決定する；
（ｉｉ）  前記蛍光分析物の血液レベルを定量化する；又は
（ｉｉｉ）  前記蛍光の血液クリアランスをモニタ又は決定する
工程により特徴付けられる前記項目の何れか一つに記載の方法。
【０２３８】
２２．  （ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出される前記光が、前記被験体の眼を通して専ら受信される前記項目の何れか一つに記載の方法。
【０２３９】
２３．  （ａ）において、少なくとも一つの予め定められた波長の前記励起光が、前記被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ専ら照射される前記項目の何れか一つに記載の方法。
【０２４０】
２４．  被験体の更なる領域から、（ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出される光を決定する工程（ｃ）を更に含んでなる前記項目の何れか一つに記載の方法。
【０２４１】
２５．  更なる領域が、器官、リンパ節、血管ネットワーク又は神経細胞系の少なくとも一部を含む項目２４に記載の方法。
【０２４２】
２６．  前記器官が、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、膀胱、肺及び脳からなる群から選択される項目２５に記載の方法であって、好ましくは膀胱及び／又は肝臓である方法。
【０２４３】
２７．  被験体が、動物、好ましくはヒトである前記項目の何れか一つに記載の方法。
【０２４４】
２８．  （ｂ）において、（ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記光が、光検出器を用いて受信される前記項目の何れか一つに記載の方法。
【０２４５】
２９．  光検出器が：
（ｉ）  前記探知器の上流に、予め定められた又は調整可能なフィルタを具備する、及び／又は
（ｉｉ）  （ａ）で使用された、励起光の予め定められた波長を分離する
項目２８に記載の方法。
【０２４６】
３０．  前記フィルタが、（ａ）で使用された、励起光の予め定められた波長を拒絶する項目２９に記載の方法。
【０２４７】
３１．  蛍光分析物を励起するために、被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を照射するために使用される励起手段の光軸、及び予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出される光受信するために使用される光検出器の光軸が、互いに予め定められた角度に設定される前記項目の何れか一項に記載の方法。
【０２４８】
３２．  蛍光分析物を励起するために、被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上へ少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を照射するために使用される励起手段、及び予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出される光を受信するために使用される光検出器が、空間的に離されている前記項目の何れか一項に記載の方法。
【０２４９】
３３．  前記光検出器が、フォトダイオード、光導電セル、電荷結合素子（ＣＣＤ）又は相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）である又はを具備する前記項目の何れか一項に記載の方法。
【０２５０】
３４．  薬学的又は診断的組成物の分解動力学を決定するために、及び／又は物質の除去経路を評価するために、被験体の血液における薬剤、抗体又はそれらの機能的断片、タンパク質、ペプチド、酵素、例えばｓｉＲＮＡ等の核酸、多糖、脂質、受容体、受容体リガンド、病原体、ウイルス、バクテリア、細胞、細胞標的及び／又は腫瘍抗原の存在を決定するための、血液レベルを定量化するための、又は血液クリアランスを決定するための前記項目の何れか一項に記載の方法。
【０２５１】
３５．  工程（ａ）及び／又は（ｂ）は、眼の瞳孔の位置を決定することを更に含む前記項目の何れか一つに記載の方法。
【０２５２】
３６．  
（ｉ）  工程（ａ）の瞳孔の前記部分の面積を決定する工程、及び／又は
（ｉｉ）  工程（ｂ）の前記目の瞳孔の面積を決定する工程
を更に含んでなる前記項目の何れか一つに記載の方法。
【０２５３】
３７．  量子ドット薬品、蛍光色素、ｐＨ感受性蛍光色素、電位感受性及び蛍光標識マイクロスフェアからなる群から選択される前記項目の何れか一つに記載される蛍光標識。
【０２５４】
３８．  前記方法の何れか一つにおける使用のための、前記項目の何れか一つに定められる蛍光分析物又は蛍光標識。
【０２５５】
３９．  前記方法の何れか一つに利用される診断的組成物の調製のための、前記項目の何れか一つに定められる蛍光分析物又は蛍光標識の使用。
【０２５６】
４０．  前記項目において定められる方法の何れかで用いられる装置。
【０２５７】
４１．  上で定めた方法の何れかで用いられる装置において：
（ａ）  蛍光分析物を励起するために、被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上に少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を照射する励起手段；
（ｂ）  （ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出された光を専ら受信するための光検出器を具備する装置。
【０２５８】
４２．  上で定めた方法の何れかで用いられる装置において：
（ａ）  蛍光分析物を励起するために、被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上に専ら、少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を照射する励起手段；
（ｂ）  （ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出された光を受信するための光検出器を具備する装置。
【０２５９】
４３．  上で定めた方法の何れかで用いられる装置において：
（ａ）  蛍光分析物を励起するために、被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上に専ら、少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を照射する励起手段；
（ｂ）  （ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出された光を専ら受信するための光検出器を具備する装置。
【０２６０】
４４．  上で定めた方法の何れかで用いられる装置において：
（ａ）  蛍光分析物を励起するために、被験体の瞳孔の少なくとも一部を含んでなる指定された領域上に少なくとも一つの予め定められた波長の励起光を照射する励起手段；
（ｂ）  （ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出された光を受信するための光検出器；及び
（ｃ）  前記被験体の眼を通して放出された光の量を専ら決定するための手段
を具備する装置。
【０２６１】
４５．  前記光検出器が、前記検出器の上流に連結される予め定められた又は調節可能なフィルターを含む項目４１から４４の何れか一つに記載の装置。
【０２６２】
４６．  前記光検出器が、（ａ）で使用された、励起光の予め定められた波長を分離する項目４１〜４５の何れか一つに記載の装置。
【０２６３】
４７．  前記フィルタが、（ａ）で使用された、励起光の少なくとも一つの予め定められた波長を拒絶する項目４５に記載の装置。
【０２６４】
４８．  前記励起手段の光軸、及び（ａ）の予め定められた波長と識別可能な波長を有する、前記蛍光分析物から放出される光を受信するために用いられる光検出器の光軸が、互いに予め定められた角度で配置される項目４１から４７の何れか一つに記載の装置。
【０２６５】
４９．  前記励起手段及び前記光検出器が空間的に離されている前記項目の何れか一つに記載の装置。
【０２６６】
５０．  前記励起手段及び／又は前記光検出器が可動性である項目４９に記載の装置。
【０２６７】
５１．  前記項目の何れか一つに記載の装置において：
（ｉ）  眼の瞳孔の位置；及び／又は
（ｉｉ）  工程（ａ）の瞳孔の前記部分の面積、及び／又は   工程（ｂ）の前記眼の瞳孔の面積を決定する手段を更に含んでなる装置。
【０２６８】
５２．  前記装置がアイグラスである又はを含む前記項目の何れか一つに記載の装置。
【図１】
0005426026.tif 000003
【図２】
0005426026.tif 000004
【図３】
0005426026.tif 000005
【図４】
0005426026.tif 000006
【図５】
0005426026.tif 000007
【図６】
0005426026.tif 000008
【図７】
0005426026.tif 000009
【図８】
0005426026.tif 000010
【図９】
0005426026.tif 000011
【図１０】
0005426026.tif 000012
【図１１】
0005426026.tif 000013