(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｃｌ−１とＵＳＰタンパク質の相互作用が関与している癌処置用薬剤のスクリーニング手段としての、
ａ）ＵＳＰ４６（配列番号１）、ＵＳＰ２６（配列番号２）、ＵＳＰ３８（配列番号３）、またはＵＳＰ４２（配列番号４）からなるポリペプチド；
ｃ）ＵＳＰ４６（配列番号１）、ＵＳＰ２６（配列番号２）、ＵＳＰ３８（配列番号３）、またはＵＳＰ４２（配列番号４）からなるポリペプチドと９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む脱ユビキチン化活性を示すポリペプチド
からなる群から選択されるＵＳＰポリペプチドの使用。
【請求項２】
Ｍｃｌ−１とＵＳＰタンパク質の相互作用が関与している癌処置用薬剤のスクリーニング手段としての、ポリペプチドＵＳＰ４６（配列番号１）からなるポリペプチドまたはＵＳＰ４６（配列番号１）からなるポリペプチドと９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む脱ユビキチン化活性を示すポリペプチドの請求項１記載の使用。
【請求項３】
Ｍｃｌ−１とＵＳＰタンパク質の相互作用が関与している癌処置用薬剤のスクリーニング手段としての、請求項１記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換され、そしてそのポリペプチドを発現する細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用。
【請求項４】
ａ）請求項３記載の細胞を、試験される化合物と接触させ；そして
ｂ）Ｍｃｌ−１が安定化されているかどうか分析し；
ｃ）Ｍｃｌ−１の脱安定化剤を選択する
工程を含むＭｃｌ−１とＵＳＰタンパク質の相互作用が関与している癌処置用薬剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのスクリーニング方法。
【請求項５】
ａ）請求項３記載の細胞を、試験される化合物と接触させ；そして
ｂ）Ｍｃｌ−１のユビキチン化の割合を分析する
工程を含むＭｃｌ−１とＵＳＰタンパク質の相互作用が関与している癌処置用薬剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌処置用薬剤のスクリーニング手段としての、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ２６、ＵＳＰ３８、ＵＳＰ４２またはＵＳＰ４６からなる群から選択されるポリペプチドの使用に関する。
【０００２】
そもそも分化している骨髄系細胞中に同定された骨髄細胞白血病−１（Ｍｃｌ−１）は、抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバー（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−Ｗ、Ａ１）に属する。Ｍｃｌ−１は、様々な死の刺激、特にＤＮＡ損傷により誘導されるアポトーシスの初期の段階で作用し、主要な生存因子としての役割を果たす。より正確には、Ｍｃｌ−１は、ミトコンドリアからのシトクロムＣの放出を導く事象のカスケードに干渉することにより細胞の生存を促進するが、短い半減期のタンパク質である。Ｍｃｌ−１を制御する過程は、このように、癌のような病理学的状態において決定的に重要である。
【０００３】
Ｍｃｌ−１の分解はプロテアソーム阻害剤により阻止でき、アポトーシスにおけるユビキチン−プロテアソーム経路への役割を示唆する。
【０００４】
ユビキチン−仲介性の分解は、Ｅ１−活性化酵素、Ｅ２−結合酵素、および基質特異性を決定するＥ３ユビキチンリガーゼを含む一連の酵素反応を介してユビキチン部分でタンパク質がタグ付けされる、固く制御された過程である。タンパク質は、その後、プロテアソームにより分解される。逆の過程も起こり、ユビキチン鎖の除去、つまり脱ユビキチン化に至る。この後者の反応は、部分的に、ユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ）と呼ばれる酵素により実施され、通常状態の基質の回復となる。
【０００５】
ユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ）は、脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）の巨大なファミリーに属する。ヒトゲノムは、プロテアーゼのスーパーファミリーに属する約９５の推定上の脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）をコードする。これらの酵素は、５つのサブファミリーに分割され、それらの中で最もよく知られたサブクラスは、ＵＳＰ（ユビキチン特異的プロテアーゼ）およびＵＣＨ（ユビキチンＣ−末端ヒドラーゼ）である。６０のヒトＵＳＰタンパク質は、システインプロテアーゼであり、その触媒ドメインは、「システインボックス」および「ヒスチジンボックス」を含む。ＵＳＰの主な機能は、特異的なタンパク質基質からのユビキチンの除去である。
【０００６】
プロテアソーム阻害剤での臨床上の成功は、Ｅ３またはＵＳＰのようなユビキチン−プロテアソーム経路の他のステップを調節することが、治療上より特異的でより効率的に成功するであろうという概念を強化する。
【０００７】
Ｍｃｌ−１のポリ−ユビキチン化に必要で十分な、Ｍｕｌｅ／ＡＲＦ−ＢＰ１／ＵｒｅＢ１と命名されたＥ３リガーゼの同定も、出版物に報告された。興味深いことに、Ｍｕｌｅの発現のダウンレギュレーションは、Ｍｃｌ−１の安定化および蓄積を生じ、細胞が、遺伝毒性の薬剤による致死に対し、より抵抗性となるように導く。
【０００８】
本発明に開示される結果は、Ｍｃｌ−１に特異的なＵＳＰが存在し、それ故アポトーシスを制御する細胞性Ｍｃｌ−１の安定化に作用するであろうことを示唆する。これらのＵＳＰの阻害は、プロテアソームによるＭｃｌ−１の分解の増加を導き、アポトーシスの開始を促進するであろう。この観察は、小分子化合物でＭｃｌ−１制御ＵＳＰタンパク質を阻害することにより、Ｍｃｌ−１を標的とする新規の方法を提供する。
【０００９】
本発明の第一の目的は、
癌処置用薬剤のスクリーニング手段としての、
ａ）ＵＳＰ１３、ＵＳＰ２６、ＵＳＰ３８、ＵＳＰ４２またはＵＳＰ４６からなるポリペプチド；
ｂ）ポリペプチドＵＳＰ１３、ＵＳＰ２６、ＵＳＰ３８、ＵＳＰ４２またはＵＳＰ４６の、脱ユビキチン化活性を示す機能的フラグメント；
ｃ）ＵＳＰ１３、ＵＳＰ２６、ＵＳＰ３８、ＵＳＰ４２またはＵＳＰ４６からなり、脱ユビキチン化活性を示すポリペプチドと８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドの使用である。
【００１０】
本発明に開示されるＭｃｌ−１制御ＵＳＰは、ＵＳＰ１３（ＧＩ：４５０７８４８）、ＵＳＰ２６（ＧＩ：１３９９４２６７）、ＵＳＰ３８（ＧＩ：３１５５９７７４）、ＵＳＰ４２（ＧＩ：７９７５０９４３）、ＵＳＰ４６（ＧＩ：３１３７７７０８）であり、
前駆融合タンパク質の一部分としてのユビキチンにつながるペプチド結合を切断して、フリーのユビキチン部分を遊離させるか、またはタンパク質にユビキチンを結合させる（翻訳後）結合を切断できる。
【００１１】
特定の態様では、本発明は、癌処置用薬剤のスクリーニング手段としての、ＵＳＰ４６、その機能的フラグメント、またはその実質的に相同な配列の使用を提供する。
【００１２】
ＵＳＰ４６は、ＵＣＨドメイン、脱ユビキチン化機能に関与する触媒ドメインを含む未知の機能の小さな３６６アミノ酸長のタンパク質である。ＵＳＰ４６は、ヒト組織に広く分布することおよびインビトロで活性であることが発見された。近年、隣接遺伝子としてＵＳＰ４６を含むクロモソーム４ｑ１２上のアンプリコンが、神経膠芽腫において記載された。ＵＳＰ４６遺伝子増幅は、いくつかの神経膠芽腫および神経膠芽腫細胞培養物中に検出された。ＵＳＰ４６配列分析は、タンパク質配列で８８％の同一性および核酸配列で７６％の同一性を示す、ヒトパラログＵＳＰ１２＝ＵＢＨ１（ＮＰ＿８７２２９４）を同定した。さらに、ＵＳＰ４６およびＵＳＰ１２の触媒ドメインは、タンパク質配列で１００％の同一性を示す。生物化学アッセイは、ヒトＵＢＨ１と９８．３％のアミノ酸同一性を有するマウスＵＢＨ１が脱ユビキチン化酵素活性を示すことを明らかにした。
【００１３】
「機能的フラグメント」は、ユビキチンとのペプチド結合を加水分解する能力のような一つ以上のタンパク質の生物学的活性を保持するか、または例えば、触媒部位、ＵＳＰの特徴、システインもしくはヒスチジンユビキチン認識部位を含むドメイン、ユビキチン結合部位、またはプロテアーゼの他の機能を実施するために重要な部位のようなドメインまたはモチーフを含む。
【００１４】
用語「相同性」および「実質的に相同」は、配列に関して本明細書において使用される時、配列が、その対応する参照配列と比較される時、実質的に同じ構造および機能を有することを意味する。参照配列中のある部位が同じアミノ酸で占有される時、その分子はその部位で相同である（つまり、その部位で同一性がある）。実質的に相同な配列と参照配列間の相同性のパーセンテージは、望ましくは少なくとも８５％、より望ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも９５％、さらにもっと好ましくは、少なくとも９９％である。
【００１５】
本発明の第二の面で、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ２６、ＵＳＰ３８、ＵＳＰ４２またはＵＳＰ４６、その機能的なフラグメントまたは実質的に相同な配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換される細胞の使用が提供される。その細胞は、癌処置用薬剤のスクリーニング手段としてのポリペプチドを発現する。
【００１６】
表現「スクリーニング手段」は、本明細書において使用される時、スクリーニングに使用される手段、特にスクリーニングに使用されるポリペプチドまたはポリペプチドを発現する細胞を意味する。
【００１７】
本明細書において使用される時、表現「癌処置用薬剤」は、癌を患う患者の治癒用の薬物だけでなく、癌の進行を阻害する薬物も含む。「癌の処置」は、癌の予防的または好ましくは治療的（対症的、治癒的、症状−緩和的、症状−減少的、疾患もしくは症状抑制的、進行遅延的を含むが限定されない）処置を意味する。
【００１８】
用語「癌」は、好ましくは次に記載するものを含むが、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、カポジ肉腫もしくは隆起性皮膚線維肉腫のような軟部肉腫）のような固形癌（良性もしくは特に悪性型を含む）、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、セミノーマ、カルチノイド、肥満細胞癌、肺小細胞癌もしくは肺大細胞癌のような肺癌、小細胞気管支癌のような気管支癌、セミノーマ、未分化胚細胞腫、精巣上皮内腫瘍、メラノーマ、乳癌、神経芽細胞腫、甲状腺乳頭癌／濾胞性甲状腺癌、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性内分泌腫瘍症２型（ＭＥＮ２）、褐色細胞腫、例えば甲状腺髄様癌、副甲状腺過形成／副甲状腺腫のような甲状腺癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸腺腫、卵巣癌、前立腺癌、神経膠芽腫、脳腫瘍、前立腺癌（腺癌および骨転移も含む）、悪性神経膠腫（未分化星状細胞腫／神経膠芽腫）、膵臓癌、悪性胸膜中皮腫、血管芽細胞腫、血管腫、腎臓、肝臓、副腎、膀胱、胃（特に胃腫瘍）、直腸、膣、子宮頸部、子宮内膜の癌、多発性骨髄腫、頭頸部癌、例えば頭頸部の扁平上皮癌、例えば乳癌、悪性腎硬化症の場合、新形成、特に上皮系形質の新形成など；またはさらに他の過形成もしくは増殖性疾患に限定されない、様々な増殖性疾患を意味する。
【００１９】
「形質転換された細胞」は、本明細書において使用される時、任意の方法、例えば、エレクトロポレーション、カルシウムリン酸沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染などによって細胞に導入された異種ＤＮＡを含む原核または真核細胞を意味する。
【００２０】
「ベクター」は、異種核酸を挿入でき、その後、適切な宿主細胞に導入できる核酸分子である。ベクターは好ましくは一つ以上の複製起点と、組み換えＤＮＡを挿入できる一つ以上の部位を有する。一般的なベクターはプラスミド、ウイルスゲノムおよび人工的なクロモソームを含む。
【００２１】
本発明の第三の面は、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ２６、ＵＳＰ３８、ＵＳＰ４２もしくはＵＳＰ４６、その機能的フラグメントもしくは実質的に相同な配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された細胞またはその細胞膜を試験される化合物と接触させ、そしてＭｃｌ−１が安定化されているかどうかを分析することを必要とする癌処置用薬剤のスクリーニングのための方法を含む。
【００２２】
１つの好ましい面では、本発明のスクリーニング方法において、癌処置用薬剤はＭｃｌ−１を不安定化させる薬剤である。別の面では、癌処置用薬剤は、本発明のＵＳＰの触媒活性の阻害剤である。好ましくは、本発明のスクリーニング方法において、癌処置用薬剤は、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ２６、ＵＳＰ３８、ＵＳＰ４２もしくはＵＳＰ４６、その機能的フラグメントまたは実質的に相同な配列からなるポリペプチドの阻害剤である。
【００２３】
本明細書において使用される時、「安定化」および「不安定化」はＭｃｌ−１の半減期アッセイに関係する。
【００２４】
別の好ましい面は、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ２６、ＵＳＰ３８、ＵＳＰ４２もしくはＵＳＰ４６、その機能的フラグメントもしくは実質的に相同な配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された細胞またはその細胞膜を試験される化合物と接触させ、そしてユビキチン化の割合を分析することを必要とする癌処置用薬剤のスクリーニングのための方法を提供する。
【００２５】
好ましくは癌処置用薬剤は、ユビキチン化基質つまりユビキチン化Ｍｃｌ−１の増加を誘導するＵＳＰの阻害剤である。
【００２６】
薬剤スクリーニングアッセイにおける細胞ベースのシステムはユビキチン特異的プロテアーゼを発現する天然または組み換え宿主細胞を含みうる。
【００２７】
ユビキチン特異的プロテアーゼを調節する同定された薬剤は、ユビキチン化基質に対するアフィニティーを増加または減少させることができ、ＵＳＰに対する既知の結合分子への結合の割合を上昇または減少させることができ、ユビキチンプロテアーゼに対する既知の結合分子と競合または置換することができる。
【００２８】
しかしながら別の面では、本発明は、本発明のポリペプチドＵＳＰ１３、ＵＳＰ２６、ＵＳＰ３８、ＵＳＰ４２またはＵＳＰ４６の活性を減少させる薬剤の有効量を、それを必要としている患者に投与することを含む癌処置のための方法に向けられる。
【００２９】
別の面は、本発明において開示されたポリペプチド、例えば、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ２６、ＵＳＰ３８、ＵＳＰ４２またはＵＳＰ４６の活性を減少させる薬剤および癌に対して活性な薬剤の有効量を、それを必要としている患者に投与することを含む癌処置のための方法に向けられる。
【００３０】
「活性を減少させる薬剤」は、本明細書において使用される時、ユビキチン特異的プロテアーゼの触媒／脱ユビキチン化活性、またはユビキチン特異的プロテアーゼと通常ユビキチン特異的プロテアーゼと相互作用する標的分子との間の相互作用を阻害する能力を有する化合物を意味しうる。標的はユビキチンまたはユビキチン化基質でありうる。
【００３１】
本明細書において使用される時、表現「癌に対して活性な薬剤」は、アロマターゼ阻害剤；抗エストロゲン剤；トポイソメラーゼＩ阻害剤；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤；微小管活性剤；アルキル化剤；ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤；細胞分化過程を誘導する化合物；シクロオキシゲナーゼ阻害剤；ＭＭＰ阻害剤；ｍＴＯＲ阻害剤；抗悪性腫瘍性代謝拮抗剤、プラチン化合物；タンパク質または脂質リン酸化酵素活性を標的とする／減少させる化合物およびさらに抗血管新生化合物；タンパク質または脂質ホスファターゼ活性を標的とする、減少させるまたは阻害する化合物；ゴナドレリンアゴニスト；抗アンドロゲン剤；メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤；ビスホスホネート；生物学的応答調節物質；抗増殖性抗体；ヘパラナーゼ阻害剤；Ｒａｓ発癌性アイソフォームの阻害剤；テロメラーゼ阻害剤；プロテアソーム阻害剤；血液系腫瘍の処置に使用される薬剤；Ｆｌｔ−３の活性を標的とする、減少させるまたは阻害する化合物；Ｈｓｐ９０阻害剤；およびテモゾロミドを含むが限定されない抗増殖性薬剤に関する。
【００３２】
特定の態様において、癌に対して活性な薬剤は、Ｍｃｌ−１およびＡ１、抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーのメンバーに対して低いアフィニティーを有し、そして高いＭｃｌ−１内在性レベルを有する細胞に限定的な細胞毒性効果を示しうるＡＢＴ７３７である。
【００３３】
最終的に、小分子化合物でＵＳＰ４６を阻害することは、Ｍｃｌ−１標的化を促進することができ、Ｂｃｌ−２／Ｂｃｌ−ＸＬ阻害剤に対する感受性をもたらすことができる。
【００３４】
本発明は、さらに、ＨＣＴ１１６、ＨｅＬａ、ＰＣ−３、Ｈ１９６およびＨ１７０３細胞系おのおのに対応する、結腸癌、子宮頸癌、前立腺癌および肺癌の細胞系などの異なる細胞系において、ＵＳＰ４６のサイレンシングに続くＡＢＴ−７３７の感作を同定した。
【００３５】
しかしながら別の面では、本発明は、本発明において開示されたポリペプチド、例えば、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ２６、ＵＳＰ３８、ＵＳＰ４２またはＵＳＰ４６の活性を減少させる薬剤の有効量を、それを必要としている患者に投与することを含む癌の進行の遅延のための方法に向けられる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１．１】ＨＣＴ１１６細胞における、シクロヘキシミド処理のｔ＝０、３０分または１時間でのＵＳＰサイレンシングに続くＭｃｌ−１調節の模式的表示である。Ｍｃｌ−１の増加および減少はおのおの青および緑で示され、ｓｉＲＮＡ毒性は灰色で示される。色の欠如は効果の欠如に対応する。確認実験のために選択されたＵＳＰは、緑で強調される（ＵＳＰ５、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ１９、ＵＳＰ２１、ＵＳＰ２２、ＵＳＰ２６、ＵＳＰ２８、ＵＳＰ３８、ＵＳＰ４２およびＵＳＰ４６）。ＵＳＰのペアを標的とするために設計されたｓｉＲＮＡは、表の右側に示される。
【図１．２】ＨＣＴ１１６細胞における、シクロヘキシミド処理のｔ＝０、３０分または１時間でのＵＳＰサイレンシングに続くＭｃｌ−１調節の模式的表示である。Ｍｃｌ−１の増加および減少はおのおの青および緑で示され、ｓｉＲＮＡ毒性は灰色で示される。色の欠如は効果の欠如に対応する。確認実験のために選択されたＵＳＰは、緑で強調される（ＵＳＰ５、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ１９、ＵＳＰ２１、ＵＳＰ２２、ＵＳＰ２６、ＵＳＰ２８、ＵＳＰ３８、ＵＳＰ４２およびＵＳＰ４６）。ＵＳＰのペアを標的とするために設計されたｓｉＲＮＡは、表の右側に示される。
【図１．３】ＨＣＴ１１６細胞における、シクロヘキシミド処理のｔ＝０、３０分または１時間でのＵＳＰサイレンシングに続くＭｃｌ−１調節の模式的表示である。Ｍｃｌ−１の増加および減少はおのおの青および緑で示され、ｓｉＲＮＡ毒性は灰色で示される。色の欠如は効果の欠如に対応する。確認実験のために選択されたＵＳＰは、緑で強調される（ＵＳＰ５、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ１９、ＵＳＰ２１、ＵＳＰ２２、ＵＳＰ２６、ＵＳＰ２８、ＵＳＰ３８、ＵＳＰ４２およびＵＳＰ４６）。ＵＳＰのペアを標的とするために設計されたｓｉＲＮＡは、表の右側に示される。
【図２】ＨＣＴ１１６細胞におけるＵＳＰ１３スクリーニング。ＨＣＴ１１６細胞において、Ｌｕｃ（ルシフェラーゼ、ネガティブコントロール）、Ｍｃｌ−１（ポジティブコントロール）またはＵＳＰ１３（ｓｉＲＮＡ１３ｖ１、ｓｉＲＮＡ１３ｖ２、ｓｉＲＮＡ１３ｖ３）を標的とする様々なｓｉＲＮＡの存在下、内在性Ｍｃｌ−１の発現を明らかにするウエスタンブロット（抗Ｍｃｌ−１）。より弱い曝露もＢに示される。抗ｓｔａｔ３抗体はローディングコントロールとして使用された。タイムコースは、分析の前に細胞がタンパク質合成阻害剤（シクロヘキシミド）に曝露された時間に対応する。
【図３】ＨＣＴ１１６細胞におけるＵＳＰ２６スクリーニング。ＨＣＴ１１６細胞において、Ｌｕｃ（ルシフェラーゼ、ネガティブコントロール）、Ｍｃｌ−１（ポジティブコントロール）またはＵＳＰ２６（ｓｉＲＮＡ２６ｖ１、ｓｉＲＮＡ２６ｖ２、ｓｉＲＮＡ２６ｖ３）を標的とする様々なｓｉＲＮＡの存在下、内在性Ｍｃｌ−１の発現を明らかにするウエスタンブロット（抗Ｍｃｌ−１）。抗ｓｔａｔ３抗体はローディングコントロールとして使用された。タイムコースは、分析の前に細胞がタンパク質合成阻害剤（シクロヘキシミド）に曝露された時間に対応する。
【図４】ＨＣＴ１１６細胞におけるＵＳＰ３８スクリーニング。ＨＣＴ１１６細胞において、Ｌｕｃ（ルシフェラーゼ、ネガティブコントロール）、Ｍｃｌ−１（ポジティブコントロール）またはＵＳＰ３８（ｓｉＲＮＡ３８ｖ１、ｓｉＲＮＡ３８ｖ２、ｓｉＲＮＡ３８ｖ３）を標的とする様々なｓｉＲＮＡの存在下、内在性Ｍｃｌ−１の発現を明らかにするウエスタンブロット（抗Ｍｃｌ−１）。抗ｓｔａｔ３抗体はローディングコントロールとして使用された。タイムコースは、分析の前に細胞がタンパク質合成阻害剤（シクロヘキシミド）に曝露された時間に対応する。
【図５】ＨＣＴ１１６細胞におけるＵＳＰ４２スクリーニング。ＨＣＴ１１６細胞において、Ｌｕｃ（ルシフェラーゼ、ネガティブコントロール）、Ｍｃｌ−１（ポジティブコントロール）またはＵＳＰ４２（ｓｉＲＮＡ４２ｖ１、ｓｉＲＮＡ４２ｖ２、ｓｉＲＮＡ４２ｖ３）を標的とする様々なｓｉＲＮＡの存在下、内在性Ｍｃｌ−１の発現を明らかにするウエスタンブロット（抗Ｍｃｌ−１）。抗ｓｔａｔ３抗体はローディングコントロールとして使用された。タイムコースは、分析の前に細胞がタンパク質合成阻害剤（シクロヘキシミド）に曝露された時間に対応する。
【図６】ＨＣＴ１１６細胞におけるＵＳＰ４６スクリーニング。ＨＣＴ１１６細胞において、Ｌｕｃ（ルシフェラーゼ、ネガティブコントロール）、Ｍｃｌ−１（ポジティブコントロール）またはＵＳＰ４６（ｓｉＲＮＡ４６ｖ１、ｓｉＲＮＡ４６ｖ２、ｓｉＲＮＡ４６ｖ３）を標的とする様々なｓｉＲＮＡの存在下、内在性Ｍｃｌ−１の発現を明らかにするウエスタンブロット（抗Ｍｃｌ−１）。抗ｓｔａｔ３抗体はローディングコントロールとして使用された。タイムコースは、分析の前に細胞がタンパク質合成阻害剤（シクロヘキシミド）に曝露された時間に対応する。
【図７】ＰＣ３細胞におけるフェノタイプ／サイレンシング相関性研究。Ｍｃｌ−１内在性レベルが、ルシフェラーゼ、Ｍｃｌ−１またはＵＳＰ４６を標的とするいくつかのｓｉＲＮＡ存在下、ＰＣ３細胞において決定された（Ａ）。抗アクチン抗体はローディングコントロールとして使用された。Ｍｃｌ−１（Ｂ）およびＵＳＰ４６（Ｃ）ｍＲＮＡレベルは、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ、ネガティブコントロール）、Ｍｃｌ−１またはＵＳＰ４６を標的とするｓｉＲＮＡのＰＣ３トランスフェクション後、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定された。結果は、四つの値の平均＋／−標準偏差として示される。
【図８】Ｈ１９６細胞におけるフェノタイプ／サイレンシング相関性研究。Ｍｃｌ−１内在性レベルが、ルシフェラーゼ、Ｍｃｌ−１またはＵＳＰ４６を標的とするいくつかのｓｉＲＮＡ存在下、Ｈ１９６細胞において決定された（Ａ）。抗アクチン抗体はローディングコントロールとして使用された。Ｍｃｌ−１（Ｂ）およびＵＳＰ４６（Ｃ）ｍＲＮＡレベルは、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ、ネガティブコントロール）、Ｍｃｌ−１またはＵＳＰ４６を標的とするｓｉＲＮＡのＨ１９６トランスフェクション後、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定された。結果は、四つの値の平均＋／−標準偏差として示される。
【図９】Ｈ１７０３細胞におけるフェノタイプ／サイレンシング相関性研究。Ｍｃｌ−１内在性レベルが、ルシフェラーゼ、Ｍｃｌ−１またはＵＳＰ４６を標的とするいくつかのｓｉＲＮＡ存在下、Ｈ１７０３細胞において決定された（Ａ）。抗アクチン抗体はローディングコントロールとして使用された。Ｍｃｌ−１（Ｂ）およびＵＳＰ４６（Ｃ）ｍＲＮＡレベルは、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ、ネガティブコントロール）、Ｍｃｌ−１またはＵＳＰ４６を標的とするｓｉＲＮＡのＨ１７０３トランスフェクション後、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定された。結果は、四つの値の平均＋／−標準偏差として示される。
【図１０】ＨＥＫ２９３細胞におけるフェノタイプ／サイレンシング相関性研究。Ｍｃｌ−１内在性レベルが、ルシフェラーゼ、Ｍｃｌ−１またはＵＳＰ４６を標的とするいくつかのｓｉＲＮＡ存在下、ＨＥＫ２９３細胞において決定された（Ａ）。抗アクチン抗体はローディングコントロールとして使用された。Ｍｃｌ−１（Ｂ）およびＵＳＰ４６（Ｃ）ｍＲＮＡレベルは、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ、ネガティブコントロール）、Ｍｃｌ−１またはＵＳＰ４６を標的とするｓｉＲＮＡのＨＥＫ２９３トランスフェクション後、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定された。結果は、四つの値の平均＋／−標準偏差として示される。
【図１１】Ｈｅｌａ細胞におけるフェノタイプ／サイレンシング相関性研究。Ｍｃｌ−１内在性レベルが、ルシフェラーゼ、Ｍｃｌ−１またはＵＳＰ４６を標的とするいくつかのｓｉＲＮＡ存在下、Ｈｅｌａ細胞において決定された（Ａ）。抗アクチン抗体はローディングコントロールとして使用された。Ｍｃｌ−１（Ｂ）およびＵＳＰ４６（Ｃ）ｍＲＮＡレベルは、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ、ネガティブコントロール）、Ｍｃｌ−１またはＵＳＰ４６を標的とするｓｉＲＮＡのＨｅｌａトランスフェクション後、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定された。結果は、四つの値の平均＋／−標準偏差として示される。
【図１２】ＨｅＬａ細胞のＡＢＴ−７３７への感作に対するＵＳＰ４６サイレンシングの影響。カスパーゼ３アッセイが、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ、ネガティブコントロール）、ｍｃｌ−１またはＵＳＰ−４６を標的とするｓｉＲＮＡをトランスフェクションされ、ＤＭＳＯ（ネガティブコントロール）またはＡＢＴ−７３７（３〜１０μM）で６時間処理されたＨｅＬａ細胞におけるカスパーゼ３活性をモニターするために使用された。細胞ライセートがカスパーゼ活性について試験された（Ａ）。結果は、三つの値の平均＋／−標準偏差として示され、二回の独立した実験の代表値である。Ｍｃｌ−１内在性レベルおよび断片化されたＰＡＲＰも、ルシフェラーゼ、Ｍｃｌ−１またはＵＳＰ４６を標的とするｓｉＲＮＡの存在下決定された（Ｂ）。抗−ｓｔａｔ３抗体がローディングコントロールとして使用された。
【図１３】ｌｕｃ、ｍｃｌ−１、ＵＳＰ４６ｖ１、ＵＳＰ４６ｖ４またはＵＳＰ４６プールのｓｉＲＮＡをトランスフェクションされたＨｅＬａ癌細胞のフローサイトメトリー。細胞サイクルはｓｉＲＮＡトランスフェクション後７２時間、ＡＢＴ−７３７処理（３μM）後１８時間に決定された。
【図１４】ｓｉＲＮＡトランスフェクション後７２時間およびＡＢＴ−７３７処理後２４時間に決定されたＨｅＬａ細胞におけるＡＢＴ−７３７誘導ｓｕｂＧ１移行。ｓｕｂＧ１（＜２Ｎ）の細胞のパーセンテージは、２つの値の平均＋／−標準偏差である（Ａ）。内在性Ｍｃｌ−１レベルもルシフェラーゼ、Ｍｃｌ−１またはＵＳＰ４６を標的とするｓｉＲＮＡの存在下決定された。抗Ｓｔａｔ３抗体は、ローディングコントロールとして使用された（Ｂ）。
【図１５】Ｅ．ｃｏｌｉから精製された野生型および触媒に関する変異体（Ｃ４４Ａ）のＧＳＴ−ＵＳＰ４６タンパク質の脱ユビキチン化活性。野生型および触媒に関する変異体のＵＳＰ４６タンパク質の酵素活性はインビトロで様々な酵素濃度および固定されたインキュベーション時間（９０分）で、基質としてＵｂＡＭＣ（４００nM）を用いて評価された（Ａ）。野生型および触媒に関する変異体のＵＳＰ４６タンパク質の固定された濃度の酵素（４００nM）および基質（８００nM）での酵素活性の速度論的アッセイ（Ｂ）。すべての結果は三つの値の平均＋／−標準偏差で記載される。
【００３７】
実施例
１  材料および方法
１．１  ｓｉＲＮＡ設計および合成
ホスホルアミダイドを用いて化学的に合成された１９−merのｓｉＲＮＡはプロリゴより購入された。ｓｉＲＮＡは、Ｔｕｓｃｈｌおよび同僚により記載されたように(Elbashir et al. (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411, 494-8)、熱力学的な特徴に対する特別な注意と共に設計された(Khvorova et al. (2003). Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell 115, 209-16)。ｓｉＲＮＡ特異性の研究に捧げられる手段は、インハウスで開発された。短く言えば、ＮＣＢＩ  ＮＲおよびＥＳＴデータベースがＢＬＡＳＴアルゴリズムによりそれぞれｓｉＲＮＡおよび標的遺伝子と共に必要とされた。無関係なＮＲまたはＥＳＴエントリーと完全に（１９／１９）または部分的に（１８／１９ヌクレオチド）マッチするｓｉＲＮＡは退けられた。
【００３８】
１．２  細胞培養およびトランスフェクション
ヒト結腸癌ＨＣＴ１１６細胞は、１０％ＦＢＳを含むマッコイ５Ａ培地中に維持された。培地には、１００ユニット/mlペニシリンおよび０．１mg/mlストレプトマイシンが添加され、細胞系は５％ＣＯ２を含む加湿された大気中３７℃でインキュベーションされた。
【００３９】
スクリーニングのために、指示された量のｓｉＲＮＡ（４０pmol、最終72nM）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、２μlのオリゴフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合体化させ、細胞を蒔く前に２４穴プレートに添加した。１５００００のＨＣＴ１１６細胞が次に蒔かれた。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭは、トランスフェクション後、５時間で適当な培地と交換された。トランスフェクションの７２時間後および回収の前、細胞は３０分間もしくは１時間シクロへキシミド（３０μg/ml）で処理された、もしくは処理されなかったか、または９０分間ＭＧ１３２（３０μM）で処理された。
【００４０】
１．３  細胞ライセートの調製およびウエスタンブロット分析
細胞は、一度、冷却されたＰＢＳ中洗浄され、トリプシン処理により回収された。浮遊しトリプシン処理された細胞は貯蔵され、遠心分離により回収された。細胞ペレットは、溶解バッファー（１×プロテアーゼ阻害剤混合物を含む２％ＳＤＳ、Ｓｉｇｍａ）中、再懸濁され、１０分間１００℃に置かれ、５秒間超音波処理された。タンパク質は、製造者の説明書に従いビシンコニン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて定量化された。ライセートはＳＤＳ−ポリアクリルアミド（１０％）ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離され、ニトロセルロース膜にトランスファーされ、Ｍｃｌ−１ウサギポリクローナル抗体（ｓｃ−８１９；ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、Ｓｔａｔ３ウサギポリクローナル抗体（９１３２；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、アクチンマウスモノクローナル抗体（Ａ４７００；Ｓｉｇｍａ）、またはＧＡＰＤＨマウスモノクローナル抗体（Ａｂ８２４５；ＡｂＣａｍ）で探索された。ＨＲＰ結合抗ラビット抗体（７０７４；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）およびＨＲＰ結合抗マウス抗体（１１５−０３５−００３；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）は二次抗体として使用された。シグナルは、製造者の説明書に従い、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出された。
【００４１】
１．４  細胞培養、トランスフェクションおよび薬理学的処理
使用されたすべての細胞系は、それぞれの培地に維持された。すべての培地は１００ユニット/mlのペニシリンおよび０．１mg/mlのストレプトマイシンが添加され、細胞系は５％ＣＯ２を含む加湿された大気中３７℃でインキュベーションされた。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションのために、ｓｉＲＮＡ（４０pmol、最終７２nM）はＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中２μlのオリゴフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合体化され、細胞を蒔く前に２４穴プレートに添加された。すべての条件においてＯｐｔｉ−ＭＥＭは、トランスフェクション後５時間で適当な培地で置換された。Ｈｉｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）が使用された時、ｓｉＲＮＡ（４０pmol、最終７２nM）は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３μlのＨｉｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体化され、細胞を蒔いた後、２４穴プレートに添加された。トランスフェクションの４８時間または７２時間後および回収の前、細胞は、指示された時点に指示された濃度でＡＢＴ７３７で処理された、またはされなかった。
【００４２】
Ｈ１７０３細胞のようなトランスフェクションが困難な細胞は、ＡＭＡＸＡ方式を用いてトランスフェクションされた。細胞は、最初に、特別なキュベット中、興味のあるｓｉＲＮＡの存在下懸濁される。使用される細胞系に従って規定された電気パルスが、次に、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置中送達された。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒでトランスフェクションされた細胞は、次に、製造者の説明書に従って、２４穴または６穴プレートに蒔かれ、上記記載の様にＡＢＴ７３７で処理された。
【００４３】
１．５  脱ユビキチン化アッセイ
脱ユビキチン化酵素活性は、基質としてユビキチン−ＡＭＣまたはＵｂ−ＡＭＣ（ユビキチン−７−アミド−４−メチルクマリン、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｕ−５５０）を用い、かつて記載されたように（Dang et al. (1998) Kinetic and mechanistic studies on the hydrolysis of ubiquitin C-terminal 7-amido-4-methylcoumarin by deubiquitinating enzymes. Biochemistry. 37(7):1868-79）、蛍光定量的なアッセイでモニターされた。ユビキチンのＣ−末端から放出されたＡＭＣは、増強された蛍光を示し、それは蛍光リーダーでモニターできる。酵素および基質の両方が、実行の度、ＵＳＰ４６反応バッファー（５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．４］、０．５mM  ＥＤＴＡ、０．０５mg/ml  ＢＳＡ、５mM  ＤＴＴ）中、新しく調製された。ＵＳＰ４６およびＵｂ−ＡＭＣの反応混合物は、室温で２時間インキュベーションされ、反応は１０μlの酢酸（最終濃度２５０mM）を添加することによって停止された。蛍光発光強度はＰＨＥＲＡｓｔａｒ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）機器で測定され、クマリンフィルターセット（λｅｘ＝３６０nm、λｅｍ＝４６０nm）を使用した。
【００４４】
２．  結果
２．１  ＨＴＣ１１６細胞におけるＵＳＰスクリーニング
Ｍｃｌ−１脱ユビキチン化、従ってＭｃｌ−１の安定化に関連するユビキチン特異的プロテアーゼを同定するために、全ＵＳＰファミリーがＨＣＴ１１６癌細胞におけるＭｃｌ−１の半減期についてＲＮＡ干渉によりスクリーニングされた。スクリーニングされた６０個のＵＳＰタンパク質のうち、１０個のＵＳＰ（ＵＳＰ５、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ１９、ＵＳＰ２１、ＵＳＰ２２、ＵＳＰ２６、ＵＳＰ２８、ＵＳＰ３８、ＵＳＰ４２およびＵＳＰ４６）は所望のフェノタイプ、つまり、実質的なＭｃｌ−１の減少を有して同定された（特定の時点において、３個のｓｉＲＮＡのうち少なくとも２個が５０％より多いＭｃｌ−１の減少を示した。）。ＵＳＰサイレンシングおよびシクロヘキシミド処理後の、Ｍｃｌ−１調節の模式的表示が図１に示される。
【００４５】
２．２  選択されたＵＳＰに関する確認実験
一次スクリーニングで得られた結果を確認するために、独立した実験が１０個の選択されたＵＳＰについて実施された。データは一次スクリーニングの結果の１０個のＵＳＰのうち５個のＵＳＰ（ＵＳＰ１３、ＵＳＰ２６、ＵＳＰ３８、ＵＳＰ４２およびＵＳＰ４６）について確認された。確認実験のウエスタンブロットの結果は図２から図６に示される。これらの結果は、シクロヘキシミド処理後（異なるタイミングでのＬｕｃ  ｓｉＲＮＡを比較）およびＭｃｌ−１サイレンシング後、内在性Ｍｃｌ−１の有意な減少が観察されたことを明らかにした。興味深いことに、これらのタンパク質中、３個の異なるＵＳＰは、３個のうち２個のｓｉＲＮＡで、Ｍｃｌ−１の定常状態レベルに有意な効果を有することが示された：ＵＳＰ１３、ＵＳＰ４２およびＵＳＰ４６。
【００４６】
それ故、ＨＣＴ１１６細胞におけるＭｃｌ−１の半減期に関するＲＮＡ干渉による６０個のヒトＵＳＰのスクリーニングから、Ｍｃｌ−１安定化について５個のＵＳＰ（ＵＳＰ１３、ＵＳＰ２６、ＵＳＰ３８、ＵＳＰ４２およびＵＳＰ４６）の関与が確認された。すべてのこれらのタンパク質は、触媒活性に必須なアミノ酸を含み、それ故、機能的な脱ユビキチン化活性を示唆する。実際、ＵＳＰ４２、ＵＳＰ４６およびＵＳＰ３８はかつてインビトロで活性であることが示された。
【００４７】
２．３  ＰＣ３、Ｈ１９６、Ｈ１７０３、ＨＥＫ２９３およびＨｅＬａ細胞におけるＭｃｌ−１  ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルに対するＵＳＰ４６サイレンシングの効果
ＰＣ３、Ｈ１９６、Ｈ１７０３、ＨＥＫ２９３およびＨｅＬａ細胞における内在性Ｍｃｌ−１タンパク質レベルに対するＭｃｌ−１  ｓｉＲＮＡの効果がモニターされ、Ｍｃｌ−１レベルの強力な減少が示され、これらの細胞系における非常によいトランスフェクション効率を示唆した（おのおの図７から図１０）。その意味で、内在性Ｍｃｌ−１タンパク質レベルは、ＵＳＰ４６サイレンシング後評価された。ＰＣ３、Ｈ１９６、Ｈ１７０３、ＨＥＫ２９３およびＨｅＬａ細胞において、独立したＵＳＰ４６  ｓｉＲＮＡによるＭｃｌ−１タンパク質レベルの有意な減少が観察される（ＵＳＰ４６ｖ３、ＵＳＰ４６ｖ４および活性ＵＳＰ４６  ｓｉＲＮＡのプール）（おのおの図７から図１１）。
【００４８】
内在性Ｍｃｌ−１  ｍＲＮＡレベルは、次に、ＰＣ３、Ｈ１９６、Ｈ１７０３、ＨＥＫ２９３およびＨｅＬａ細胞において、ＵＳＰ４６によるＭｃｌ−１レベルの転写調節を除外するために、定量的ＰＣＲによって決定された。ＵＳＰ４６サイレンシング後のＭｃｌ−１  ｍＲＮＡレベルに有意な減少は観察されず（おのおの図７から図１１）、ＰＣ３、Ｈ１９６、Ｈ１７０３、ＨＥＫ２９３およびＨｅＬａ細胞におけるＵＳＰ４６仲介Ｍｃｌ−１調節が転写後の事象であることを示す。最後に、コントロールとして、ＵＳＰ４６を標的とするすべての試験されたｓｉＲＮＡはＵＳＰ４６  ｍＲＮＡレベルに影響を与えた：
ＰＣ３細胞において＞６８％の減少
Ｈ１９６細胞において＞６２％の減少
Ｈ１７０３細胞において＞４６％の減少
ＨＥＫ２９３細胞において＞９０％の減少
ＨｅＬａ細胞において＞８０％の減少が確認される（おのおの図７から図１１）。
【００４９】
これらの結果は、ＵＳＰ４６が、ＰＣ３、Ｈ１９６、Ｈ１７０３、ＨＥＫ２９３およびＨｅＬａ細胞系において、Ｍｃｌ−１安定化に関わることを示し、従って、ＨＣＴ１１６細胞での先の発見を確認する。
【００５０】
２．４  ＡＢＴ−７３７誘導ＨｅＬａ細胞死に対するＭｃｌ−１およびＵＳＰ４６サイレンシングの効果
このアッセイは、ＡＢＴ−７３７仲介アポトーシスに対するＨｅＬａ細胞の感作に対するＵＳＰ４６  ｓｉＲＮＡの効果を評価するために使用された。我々のポジティブコントロール、Ｍｃｌ−１  ｓｉＲＮＡは、カスパーゼ３活性の２．７倍の上昇により示されるように、ＡＢＴ−７３７仲介アポトーシスに対して細胞を感作した（図１２Ａ）。興味深いことに、ＵＳＰ４６ｖ１およびＵＳＰ４６ｖ４  ｓｉＲＮＡは、ＡＢＴ−７３７処理後、カスパーゼ３活性の有意な上昇となった（３μＭ  ＡＢＴ−７３７でｖ１：１．５倍；ｖ４：２倍誘導）（図１２Ａ）。重要なことに、Ｍｃｌ−１ノックダウンのレベルと緊密に相関した、ＡＢＴ−７３７により仲介されるカスパーゼ３活性の誘導が観察される（図１２Ｂ）。同じ条件でのＰＡＲＰ切断もモニターされ、Ｍｃｌ−１  ｓｉＲＮＡで切断されたＰＡＲＰバンドの増加、およびＵＳＰ４６  ｓｉＲＮＡで切断されたＰＡＲＰバンドの中程度の増加が観測され、それ故、カスパーゼの結果を確認した（図１２Ｂ）。
【００５１】
ＨｅＬａ細胞におけるＡＢＴ−７３７誘導アポトーシスに対する細胞の感作へのＵＳＰ４６  ｓｉＲＮＡの影響を確認するために、主にアポトーシスを反映するｓｕｂＧ１期の細胞の数が定量された。Ｍｃｌ−１  ｓｉＲＮＡと同様に、非処理ＨｅＬａ癌細胞において、ＵＳＰ４６  ｓｉＲＮＡはアポトーシスを誘導した（図１３Ａおよび図１４Ａ）。実際、Ｌｕｃ処理細胞は２１．４±０．６％のｓｕｂＧ１細胞を示し、一方、Ｍｃｌ−１処理細胞（４６．２±２．２％）、ＵＳＰ４６ｖ１処理細胞（３４±４％）、ＵＳＰ４６ｖ４処理細胞（２９．３±０．３％）およびＵＳＰ４６プール処理細胞（４０±１１％）は、より多い量のｓｕｂＧ１細胞を示した（図１３Ａおよび１４Ａ）。Ｌｕｃ処理細胞において、ＡＢＴ−７３７（３μM）存在下、ｓｕｂＧ１細胞の少しの増加が観察された（３５％±６．６％のｓｕｂＧ１細胞）（図１３Ａおよび図１４Ａ）。対照的に、細胞がＡＢＴ−７３７存在下Ｍｃｌ−１  ｓｉＲＮＡで処理された時、ｓｕｂＧ１細胞の強力な増加が示された（６３％±２％のｓｕｂＧ１細胞）（図１３Ａおよび１４Ａ）。興味深いことに、ＵＳＰ４６ｖ１、ＵＳＰ４６ｖ４、および活性ＵＳＰ４６  ｓｉＲＮＡのプールも、コントロールｓｉＲＮＡのトランスフェクションされた細胞と比較した時、ＡＢＴ−７３７処理されたｓｕｂＧ１細胞の顕著な増加を誘導した（ｖ１：６０．７％±５．４％；ｖ４：５１．３％±１．２％  プール：６２．４％±０．１％のｓｕｂＧ１細胞）（図１３Ａおよび１４Ａ）。ＡＢＴ−７３７の存在下、Ｍｃｌ−１ノックダウンのレベルと緊密に相関したｓｕｂＧ１誘導の程度が観察される（図１３Ｂ）。
【００５２】
結論として、Ｍｃｌ−１サイレンシングと同様に、ＵＳＰ４６サイレンシングは非処理ＨｅＬａ癌細胞においてＭｃｌ−１レベルを減少させアポトーシスを誘導し、ＡＢＴ−７３７誘導細胞死にＨｅＬａ細胞を感作する。興味深いことに、ＡＢＴ−７３７感作におけるこれらの違いは常にＭｃｌ−１レベルのサイレンシング効果と相関していた：ＵＳＰ４６  ｓｉＲＮＡトランスフェクション後、よりＭｃｌ−１が減少すれば、よりＵＳＰ４６仲介感作が観察される。ＵＳＰ４６サイレンシングは、カスパーゼ３アッセイ、ＰＡＲＰ切断およびｓｕｂＧ１分析により評価された時、ネガティブコントロール（Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ）とポジティブコントロール（Ｍｃｌ−１サイレンシング）の中間レベルで、細胞をＡＢＴ−７３７に対して有意に感作することが示された。まとめると、これらの結果は、ＨｅＬａ子宮頸癌細胞において、Ｍｃｌ−１調節に対するＵＳＰ４６の関与を確認する。同様の発見がＨＣＴ１１６、ＰＣ３、Ｈ１７０３およびＨ１９６細胞においても観察された。
【００５３】
２．５  インビトロでのＵＳＰ４６のタンパク質分解活性
インビトロで野生型および変異体両方の精製されたタンパク質の脱ユビキチン化活性が比較される。野生型および変異の酵素の両方は、Ｕｂ−ＡＭＣアッセイを用いて容量依存的反応において試験された（図１５）。興味深いことに、野生型ＵＳＰ４６タンパク質は、Ｕｂ−ＡＭＣを容量依存的に加水分解した。対照的に、触媒的に不活性な変異体の容量依存的効果が観察され、それ故、変異ＧＳＴ−ＵＳＰ４６と共精製された脱ユビキチン化活性がないことが示唆される（図１５Ａ）。これらの発見を確認するために、ＧＳＴ−ＵＳＰ４６の反応速度論的実験が実施される。酵素および基質の固定された濃度において、野生型ＵＳＰ４６タンパク質でＵｂ−ＡＭＣ加水分解の時間依存的増加が観測されるが、変異型では観察されない（図１５Ｂ）。まとめると、これらの結果は、正しいシグナル／バックグラウンド割合を伴う特異的なＵＳＰ４６仲介脱ユビキチン化活性の同定を確認する。
【００５４】
配列の説明
配列番号１：ＵＳＰ４６（ＧＩ：３１３７７７０８からのアミノ酸配列に基づく）
配列番号２：ＵＳＰ２６（ＧＩ：１３９９４２６７からのアミノ酸配列に基づく）
配列番号３：ＵＳＰ３８（ＧＩ：３１５５９７７４からのアミノ酸配列に基づく）
配列番号４：ＵＳＰ４２（ＧＩ：７９７５０９４３からのアミノ酸配列に基づく）
【図１．１】
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【図１．２】
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【図１．３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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