(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖が配列番号３０を含む核酸配列によってコードされ、重鎖が配列番号３２を含む核酸配列によってコードされることを特徴とする、抗ＣＤ２０抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の抗ＣＤ２０抗体を含む医薬組成物。
【請求項３】
薬理学的に許容できる担体を更に含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
リンパ腫の治療のための医薬の調製における、請求項１に記載の抗ＣＤ２０抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な変異Ｆｃ領域を含むポリペプチドに関する。具体的には、本発明の新規な変異Ｆｃ領域は、本願明細書において記載される少なくとも１つのアミノ酸置換で含み、アミノ酸置換が欠失している母体免疫グロブリンと比べて、本発明の変異Ｆｃ領域を含む免疫グロブリンにおけるエフェクター機能又は血清半減期を改変する。更に、本発明は、モノクローナル抗体のエフェクター機能を改変する方法、又は、本発明の変異Ｆｃ領域が作動可能な状態で付着されるポリペプチドの血清半減期を延長させる方法を提供する。ポリペプチド、タンパク質、特にモノクローナル抗体の治療的な使用が開示される。
【背景技術】
【０００２】
ヒト治療法における使用において、米国で現在承認される少なくとも１７種類のモノクローナル抗体が存在する。更に、例えば、移植拒絶、ガン、炎症性疾患、敗血症、腎炎、アルツハイマー疾患、アレルギー、糖尿病、自己免疫疾患、関節炎、多発性硬化症、及び、感染症を含む様々な疾患又は障害の治療のため、臨床試験中の数百種類のモノクローナル抗体、及び、前臨床前試験中の数千種類のモノクローナル抗体が存在する。治療用モノクローナル抗体の分野は、近年において急成長する位置づけとなっている。ワクチン後、抗体（又は免疫グロブリン「Ｉｇ」）は、２番目に多くの一般的な種類の臨床的に試験される生物薬剤を構成する（Ｓｔｏｃｋｗｉｎ，  Ｌ．Ｈ．他  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，  ３１：４３３−４３６，  ２００３）。
【０００３】
実質的に、遺伝子工学は、治療用モノクローナル抗体の分野の成長に関与する。潜在する治療用モノクローナル抗体の効果は、抗体のタンパク質配列への適度な変化によって異なる。モノクローナル抗体の可変領域における単一アミノ酸変化は、抗体属性（例えばＫｏｎ速度又はＫｏｆｆ速度）と同様、抗体が抗原エピトープに結合する親和性を改変する潜在性を有する。このようなアミノ酸変化は、治療用としてモノクローナル抗体の成功又は失敗を測定することができる。同様に、モノクローナル抗体のＦｃ領域のアミノ酸配列における適度の変化は、Ｆｃ領域が作動可能な状態で結合される抗体のエフェクター機能の属性又はタンパク質の半減期において重大な変化を引き起こす。
【０００４】
抗体のＦｃ領域（つまり、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、及び一部のヒンジ領域にわたる抗体の重鎖のカルボキシ末端（図１参照））は、変異性において制限され、抗体が果たす生理的役割をもたらすのに関与する。抗体のＦｃ領域に起因するエフェクター機能は、抗体の分類及びサブクラスによって異なり、かつ、（ｉ）例えば、抗体を覆われた粒子の食細胞活動及び破壊、免疫複合体の除去、炎症伝達物質の放出、抗体の経胎盤伝達、並びに、免疫グロブリン産生の制御を含む、Ｆｃ領域を介して様々な生物反応を誘発する細胞上の特定のＦｃ受容体（「ＦｃＲ」）への抗体の結合と、（ｉｉ）Ｆｃ領域がＣ１ｑ補体成分と結合することによって、標的細胞溶解現象を導く補体活性化の古典経路を開始する補体依存性細胞障害作用（「ＣＤＣ」）と、（ｉｉｉ）特定のヒト免疫系細胞、例えば、Ｆｃγ受容体を介した貪食細胞及びＮＫ細胞が、免疫細胞上の特異抗体結合する受容体を介して抗体のＦｃ領域に結合し、その後、抗体が結合する物質の破壊の信号を送る、抗体依存の細胞媒介性細胞障害反応（「ＡＤＣＣ」）と、及び、（ｉｖ）肥満細胞、好塩基球、及び、好酸球への結合と、を含む。Ｆｃ領域が特定のＦｃＲ（例えばＦｃＲｎ）に結合するか、或いは、Ｆｃ領域がＣＤＣ又はＡＤＣＣを媒介することができるレベルが治療用タンパク質、特に、モノクローナル抗体の有効性又は半減期を測定するための重要な要素である。
【０００５】
ヒトＩｇＧのＦｃ領域におけるアミノ酸の詳細な修飾は、治療用タンパク質、特にモノクローナル抗体の開発に関連する構造機能相関情報を得る研究の活発な領域である（Ｆｃ領域が作動可能に結合されるポリペプチドの血清半減期の改変に関する米国特許第６，１６５，７４５号明細書及び国際公開第２００４／０３５７５２号パンフレット、及び、修飾されたＦｃ領域を含むモノクローナル抗体のエフェクター機能の改変に関する米国特許第６，７３７，０５６号明細書及び国際公開第２００４／０２９２０７号パンフレットを参照）。
【０００６】
新規な治療用タンパク質（特にモノクローナル抗体）の開発は、対象とする抗体に所望の有益な属性を与えるように特定のアミノ酸改質によってＦｃ領域を合理的に設計することによって利益をもたらす。Ｆｃ領域における同じ特定のアミノ酸改質によって、全てのモノクローナル抗体が治療用として改善されることが期待されるというわけでない。ある標的抗原と結合する治療用モノクローナル抗体は、特定のエフェクター機能における増加によって利益をもたらす一方、異なる標的抗原と結合する異なる治療用モノクローナル抗体が、異なるエフェクター機能の増加又は減少によって利益をもたらす。ある治療用モノクローナル抗体は、大きな親和性で特定のＦｃ受容体と結合することによって利益をもたらす一方、別の抗体は、低い親和性においてＦｃ受容体に結合し、速い速度で身体から除去することによって治療的に改善される。更にまた、特定のＦｃ領域アミノ酸改質又は置換、及び、治療用抗体に利点をもたらす効果は、抗体が結合する抗原標的及び／又は抗体によって改善する疾患又は障害に依存する。
【０００７】
抗体のＦｃ領域に関連する特定のエフェクター機能を改変する方法及び組成物は、所望の属性を有する新規な治療用抗体を生成するとともに、既存の治療用抗体の属性を改善するのに必要である。変異Ｆｃ領域を有するモノクローナル抗体は、例えば、炎症性疾患、ガン、自己免疫不全、細胞信号伝達障害、及び感染症を含む様々な疾患又は障害を治療するために使用される。更に、血清半減期を増加させて少量の用量に抑えるか、或いは、血清半減期を減少させて身体から速く除去させるように促すといった、治療用タンパク質の血清半減期を改変する方法及び組成物は、治療用抗体のみならず他のタンパク質の産生の利点をもたらす。
【０００８】
治療用タンパク質（特にモノクローナル抗体）の有効性を改善するために必要とされるものは、改善した属性を有する変異Ｆｃ領域である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、変異Ｆｃ領域（即ち、本願明細書に記載のアミノ酸置換を含むＦｃ領域（例えば表１参照））を提供し、前記変異Ｆｃ領域を含むポリペプチドに有益な属性を与える。
【００１０】
本発明の変異Ｆｃ領域を生成するアミノ酸置換の母体Ｆｃ領域のＦｃの位置は、２７９位、３４１位、３４３位、及び３７３位であり、Ｆｃ領域における残基の番号付け、つまり、位置番号は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けである（本願明細書中の図２を参照）。本発明は、母体Ｆｃ領域の２７９位、３４１位、３４３位、又は３７３位、或いは、それらの組合せにおけるアミノ酸置換を含む変異Ｆｃ領域を提供する。母体Ｆｃ領域は、２７９位、３４１位、３４３位、及び３７３位以外の位置における変性のアミノ酸残基を任意に有する。ヒトＩｇＧの位置における天然のアミノ酸残基は、バリン（２７９）、グリシン（３４１）、プロリン（３４３）、及びチロシン（３７３）である。
【００１１】
本発明の全体にわたる好ましい実施形態において、母体Ｆｃ領域に存在して置換されるアミノ酸残基は、自然発生のアミノ酸残基である。特に明記しない限り、母体Ｆｃ領域は、天然又は変性のＦｃ領域であり、好ましくはヒト起源又は実質的にヒト起源のＦｃ領域である。母体Ｆｃ領域のアミノ酸配列は、好ましくは配列番号１、２、３、又は４で示される。好ましくは、母体Ｆｃ領域は、本発明の変異Ｆｃ領域を生成するために置換される位置に存在する天然のアミノ酸残基を有する。更に、全体にわたって、本願明細書に記載されているように、変異Ｆｃ領域は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように修飾される母体Ｆｃ領域であることが理解される。更に、母体Ｆｃ領域が変異Ｆｃ領域を生成するために置換されるアミノ酸残基を含む、全長Ｆｃ又はその一部であると理解される。
【００１２】
更なる本発明は、ポリペプチド（好ましくはモノクローナル抗体）を提供し、母体Ｆｃ領域と比較して、２７９位、３４１位、３４３位、又は３７３位において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異Ｆｃ領域（又はその機能性フラグメント）を含む。Ｆｃ位置である２７９位、３４１位、３４３位、又は３７３位において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異Ｆｃ領域は、変異Ｆｃ領域と同じ種類の天然のＦｃ領域に存在するアミノ酸残基と比較して、少なくとも１つの付加的なアミノ酸置換をＦｃ領域に更に含む。
【００１３】
一実施形態において、変異Ｆｃ領域（即ち、母体Ｆｃ領域の変異体）は、以下から選択される少なくとも１、２、３、又はそれ以上のアミノ酸置換を含む。
２３５Ｇ、２３５Ｒ、２３６Ｆ、２３６Ｒ、２３６Ｙ、２３７Ｋ、２３７Ｎ、２３７Ｒ、２３８Ｅ、２３８Ｇ、２３８Ｈ、２３８Ｉ、２３８Ｌ、２３８Ｖ、２３８Ｗ、２３８Ｙ、２４４Ｌ、２４５Ｒ、２４７Ａ、２４７Ｄ、２４７Ｅ、２４７Ｆ、２４７Ｍ、２４７Ｎ、２４７Ｑ、２４７Ｒ、２４７Ｓ、２４７Ｔ、２４７Ｗ、２４７Ｙ、２４８Ｆ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｗ、２４９Ｌ、２４９Ｍ、２４９Ｎ、２４９Ｐ、２４９Ｙ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｗ、２５４Ｄ、２５４Ｅ、２５４Ｆ、２５４Ｇ、２５４Ｈ、２５４Ｉ、２５４Ｋ、２５４Ｌ、２５４Ｍ、２５４Ｎ、２５４Ｐ、２５４Ｑ、２５４Ｒ、２５４Ｖ、２５４Ｗ、２５４Ｙ、２５５Ｋ、２５５Ｎ、２５６Ｈ、２５６Ｉ、２５６Ｋ、２５６Ｌ、２５６Ｖ、２５６Ｗ、２５６Ｙ、２５７Ａ、２５７Ｉ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｓ、２５８Ｄ、２６０Ｓ、２６２Ｌ、２６４Ｓ、２６５Ｋ、２６５Ｓ、２６７Ｈ、２６７Ｉ、２６７Ｋ、２６８Ｋ、２６９Ｎ、２６９Ｑ、２７１Ｔ、２７２Ｈ、２７２Ｋ、２７２Ｌ、２７２Ｒ、２７９Ａ、２７９Ｄ、２７９Ｆ、２７９Ｇ、２７９Ｈ、２７９Ｉ、２７９Ｋ、２７９Ｌ、２７９Ｍ、２７９Ｎ、２７９Ｑ、２７９Ｒ、２７９Ｓ、２７９Ｔ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、２８０Ｔ、２８３Ｆ、２８３Ｇ、２８３Ｈ、２８３Ｉ、２８３Ｋ、２８３Ｌ、２８３Ｍ、２８３Ｐ、２８３Ｒ、２８３Ｔ、２８３Ｗ、２８３Ｙ、２８５Ｎ、２８６Ｆ、２８８Ｎ、２８８Ｐ、２９２Ｅ、２９２Ｆ、２９２Ｇ、２９２Ｉ、２９２Ｌ、２９３Ｓ、２９３Ｖ、３０１Ｗ、３０４Ｅ、３０７Ｅ、３０７Ｍ、３１２Ｐ、３１５Ｆ、３１５Ｋ、３１５Ｌ、３１５Ｐ、３１５Ｒ、３１６Ｆ、３１６Ｋ、３１７Ｐ、３１７Ｔ、３１８Ｎ、３１８Ｐ、３１８Ｔ、３３２Ｆ、３３２Ｇ、３３２Ｌ、３３２Ｍ、３３２Ｓ、３３２Ｖ、３３２Ｗ、３３９Ｄ、３３９Ｅ、３３９Ｆ、３３９Ｇ、３３９Ｈ、３３９Ｉ、３３９Ｋ、３３９Ｌ、３３９Ｍ、３３９Ｎ、３３９Ｑ、３３９Ｒ、３３９Ｓ、３３９Ｗ、３３９Ｙ、３４１Ｄ、３４１Ｅ、３４１Ｆ、３４１Ｈ、３４１Ｉ、３４１Ｋ、３４１Ｌ、３４１Ｍ、３４１Ｎ、３４１Ｐ、３４１Ｑ、３４１Ｒ、３４１Ｓ、３４１Ｔ、３４１Ｖ、３４１Ｗ、３４１Ｙ、３４３Ａ、３４３Ｄ、３４３Ｅ、３４３Ｆ、３４３Ｇ、３４３Ｈ、３４３Ｉ、３４３Ｋ、３４３Ｌ、３４３Ｍ、３４３Ｎ、３４３Ｑ、３４３Ｒ、３４３Ｓ、３４３Ｔ、３４３Ｖ、３４３Ｗ、３４３Ｙ、３７３Ｄ、３７３Ｅ、３７３Ｆ、３７３Ｇ、３７３Ｈ、３７３Ｉ、３７３Ｋ、３７３Ｌ、３７３Ｍ、３７３Ｎ、３７３Ｑ、３７３Ｒ、３７３Ｓ、３７３Ｔ、３７３Ｖ、３７３Ｗ、３７５Ｒ、３７６Ｅ、３７６Ｆ、３７６Ｇ、３７６Ｈ、３７６Ｉ、３７６Ｌ、３７６Ｍ、３７６Ｎ、３７６Ｐ、３７６Ｑ、３７６Ｒ、３７６Ｓ、３７６Ｔ、３７６Ｖ、３７６Ｗ、３７６Ｙ、３７７Ｇ、３７７Ｋ、３７７Ｐ、３７８Ｎ、３７９Ｎ、３７９Ｑ、３７９Ｓ、３７９Ｔ、３８０Ｄ、３８０Ｎ、３８０Ｓ、３８０Ｔ、３８２Ｄ、３８２Ｆ、３８２Ｈ、３８２Ｉ、３８２Ｋ、３８２Ｌ、３８２Ｍ、３８２Ｎ、３８２Ｐ、３８２Ｑ、３８２Ｒ、３８２Ｓ、３８２Ｔ、３８２Ｖ、３８２Ｗ、３８２Ｙ、３８５Ｅ、３８５Ｐ、３８６Ｋ、４２３Ｎ、４２４Ｈ、４２４Ｍ、４２４Ｖ、４２６Ｄ、４２６Ｌ、４２７Ｎ、４２９Ａ、４２９Ｆ、４２９Ｍ、４３０Ａ、４３０Ｄ、４３０Ｆ、４３０Ｇ、４３０Ｈ、４３０Ｉ、４３０Ｋ、４３０Ｌ、４３０Ｍ、４３０Ｎ、４３０Ｐ、４３０Ｑ、４３０Ｒ、４３０Ｓ、４３０Ｔ、４３０Ｖ、４３０Ｗ、４３０Ｙ、４３１Ｈ、４３１Ｋ、４３１Ｐ、４３２Ｒ、４３２Ｓ、４３８Ｇ、４３８Ｋ、４３８Ｌ、４３８Ｔ、４３８Ｗ、４３９Ｅ、４３９Ｈ、４３９Ｑ、４４０Ｄ、４４０Ｅ、４４０Ｆ、４４０Ｇ、４４０Ｈ、４４０Ｉ、４４０Ｋ、４４０Ｌ、４４０Ｍ、４４０Ｑ、４４０Ｔ、４４０Ｖ、又は４４２Ｋ。
【００１４】
好ましい実施形態において、変異Ｆｃ領域は、以下から選択される少なくとも１、２、３、又はそれ以上のアミノ酸置換を含む。
２３５Ｇ、２３６Ｆ、２３６Ｒ、２３６Ｙ、２３７Ｋ、２３７Ｎ、２３７Ｒ、２３８Ｅ、２３８Ｇ、２３８Ｈ、２３８Ｉ、２３８Ｌ、２３８Ｖ、２３８Ｗ、２３８Ｙ、２４５Ｒ、２４７Ａ、２４７Ｄ、２４７Ｅ、２４７Ｆ、２４７Ｍ、２４７Ｎ、２４７Ｑ、２４７Ｒ、２４７Ｔ、２４７Ｗ、２４７Ｙ、２４８Ｆ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｗ、２４９Ｌ、２４９Ｍ、２４９Ｎ、２４９Ｐ、２４９Ｙ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｗ、２５４Ｄ、２５４Ｅ、２５４Ｆ、２５４Ｇ、２５４Ｈ、２５４Ｉ、２５４Ｋ、２５４Ｌ、２５４Ｍ、２５４Ｎ、２５４Ｐ、２５４Ｑ、２５４Ｒ、２５４Ｖ、２５４Ｗ、２５４Ｙ、２５５Ｋ、２５５Ｎ、２５６Ｈ、２５６Ｉ、２５６Ｋ、２５６Ｌ、２５６Ｗ、２５７Ａ、２５７Ｉ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｓ、２５８Ｄ、２６０Ｓ、２６２Ｌ、２６４Ｓ、２６５Ｋ、２６５Ｓ、２６７Ｈ、２６７Ｉ、２６７Ｋ、２６８Ｋ、２６９Ｎ、２６９Ｑ、２７１Ｔ、２７２Ｈ、２７２Ｋ、２７２Ｒ、２７９Ａ、２７９Ｄ、２７９Ｇ、２７９Ｈ、２７９Ｎ、２７９Ｑ、２７９Ｓ、２７９Ｔ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、２８０Ｔ、２８３Ｆ、２８３Ｈ、２８３Ｋ、２８３Ｍ、２８３Ｒ、２８３Ｗ、２８５Ｎ、２８６Ｆ、２８８Ｎ、２８８Ｐ、２９２Ｅ、２９２Ｇ、２９２Ｉ、３０１Ｗ、３０４Ｅ、３０７Ｅ、３０７Ｍ、３１２Ｐ、３１５Ｆ、３１５Ｌ、３１５Ｐ、３１６Ｆ、３１７Ｐ、３１７Ｔ、３１８Ｎ、３１８Ｐ、３１８Ｔ、３３２Ｌ、３３２Ｍ、３３２Ｒ、３３２Ｓ、３３２Ｗ、３３９Ｄ、３３９Ｆ、３３９Ｉ、３３９Ｋ、３３９Ｍ、３３９Ｎ、３３９Ｑ、３３９Ｒ、３３９Ｓ、３３９Ｗ、３３９Ｙ、３４１Ｄ、３４１Ｅ、３４１Ｆ、３４１Ｈ、３４１Ｉ、３４１Ｋ、３４１Ｌ、３４１Ｍ、３４１Ｎ、３４１Ｐ、３４１Ｑ、３４１Ｒ、３４１Ｓ、３４１Ｔ、３４１Ｖ、３４１Ｗ、３４１Ｙ、３４３Ｄ、３４３Ｅ、３４３Ｇ、３４３Ｈ、３４３Ｋ、３４３Ｎ、３４３Ｑ、３４３Ｒ、３４３Ｓ、３４３Ｔ、３４３Ｗ、３４３Ｙ、３７３Ｄ、３７３Ｅ、３７３Ｇ、３７３Ｈ、３７３Ｉ、３７３Ｋ、３７３Ｌ、３７３Ｍ、３７３Ｑ、３７３Ｒ、３７３Ｓ、３７３Ｔ、３７３Ｗ、３７５Ｒ、３７６Ｇ、３７６Ｎ、３７６Ｐ、３７６Ｑ、３７６Ｒ、３７６Ｓ、３７６Ｔ、３７６Ｖ、３７６Ｗ、３７６Ｙ、３７７Ｇ、３７７Ｋ、３７７Ｐ、３７８Ｄ、３７８Ｎ、３７９Ｎ、３７９Ｑ、３７９Ｔ、３８０Ｎ、３８０Ｓ、３８０Ｔ、３８２Ｄ、３８２Ｆ、３８２Ｉ、３８２Ｋ、３８２Ｌ、３８２Ｑ、３８２Ｒ、３８２Ｓ、３８２Ｔ、３８２Ｖ、３８２Ｗ、３８２Ｙ、３８５Ｅ、３８６Ｋ、４２３Ｎ、４２４Ｈ、４２４Ｍ、４２４Ｖ、４２６Ｄ、４２６Ｌ、４２７Ｎ、４２９Ａ、４２９Ｆ、４２９Ｍ、４３０Ａ、４３０Ｄ、４３０Ｆ、４３０Ｇ、４３０Ｈ、４３０Ｉ、４３０Ｋ、４３０Ｌ、４３０Ｍ、４３０Ｎ、４３０Ｐ、４３０Ｑ、４３０Ｒ、４３０Ｓ、４３０Ｔ、４３０Ｖ、４３０Ｗ、４３０Ｙ、４３１Ｈ、４３１Ｋ、４３１Ｐ、４３２Ｒ、４３２Ｓ、４３８Ｋ、４３８Ｌ、４３８Ｔ、４３８Ｗ、４３９Ｅ、４４０Ｄ、４４０Ｉ、又は４４０Ｌ。
【００１５】
本発明の変異Ｆｃ領域は、好ましくは、本願明細書において記載される多くの実験法の１つを使用することを特徴とする。このような変異Ｆｃ領域は、変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体において改変したエフェクター機能又は改変した血清半減期、或いは、変異Ｆｃ領域が作動可能な状態で付着されるポリペプチドにおいて改変した血清半減期を示す。
【００１６】
好ましくは、本発明の変異Ｆｃ領域の母体Ｆｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、及びＩｇＤからなる群から選択されるヒト起源の天然又は生殖細胞系をコードしたＦｃ領域、もしくはその多形性の変異体、或いは、その機能性フラグメントである。母体Ｆｃ領域は、好ましくはＩｇＧ  Ｆｃ領域であり、より好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。母体Ｆｃ領域は、天然のＦｃ領域と比較して、本願明細書に記載される（つまり、表１に列挙される置換）以外の１つ以上の付加的なアミノ酸置換、特に、当該分野で公知、又は、米国特許第６，１６５，７４５号明細書又は米国特許第６，７３７，０５６号明細書、国際公開第２００４／０３５７５２号パンフレット又は国際公開第２００４／０２９２０７号パンフレット（これらは全体において本願明細書に組み込まれる）に記述されるような１つ以上のアミノ酸置換を任意に含み、このようなアミノ酸置換もまた、母体Ｆｃ領域に存在する場合、変異Ｆｃ領域を生成するために、その後置換される位置にない限り、本発明の変異Ｆｃ領域及び本発明の変異Ｆｃ領域を含むポリペプチドにおける変異Ｆｃ領域に存在する。
【００１７】
本発明は、ポリペプチド、好ましくはモノクローナル抗体を提供し、本発明の変異Ｆｃ領域、又はその機能性フラグメントを含む。好ましい実施形態において、本発明の変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体は、キメラ抗体である。より好ましい実施態様において、本発明の変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体は、抗体に存在するフレームワーク配列、及び、定常領域配列が、実質的にヒト起源であるヒト化抗体又はヒト抗体である。キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体は、好ましくは、全長抗体又は単鎖抗体である。本発明の変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体が、ヒト治療として使用される場合、Ｆｃ領域は、好ましくは、実質的にヒト起源である。
【００１８】
好ましくは、本発明の変異Ｆｃ領域を含む、或いは、本発明の変異Ｆｃ領域が作動可能な状態で付着されるポリペプチド（つまり、「変異ポリペプチド」）は、母体Ｆｃ領域と比較して、変異Ｆｃ領域における少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、及び、前記変異Ｆｃ領域の母体Ｆｃ領域を含むポリペプチドと比較して改変したエフェクター機能又は血清半減期を呈し、「変異Ｆｃ領域における少なくとも１つのアミノ酸置換」とは、（ｉ）Ｆｃ領域の２７９、３４１、３４３、又は３７３位における任意のアミノ酸置換、又は、（ｉｉ）Ｆｃ領域における、少なくとも１つの以下のアミノ酸置換：２３５Ｇ、２３５Ｒ、２３６Ｆ、２３６Ｒ、２３６Ｙ、２３７Ｋ、２３７Ｎ、２３７Ｒ、２３８Ｅ、２３８Ｇ、２３８Ｈ、２３８Ｉ、２３８Ｌ、２３８Ｖ、２３８Ｗ、２３８Ｙ、２４４Ｌ、２４５Ｒ、２４７Ａ、２４７Ｄ、２４７Ｅ、２４７Ｆ、２４７Ｍ、２４７Ｎ、２４７Ｑ、２４７Ｒ、２４７Ｓ、２４７Ｔ、２４７Ｗ、２４７Ｙ、２４８Ｆ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｗ、２４９Ｌ、２４９Ｍ、２４９Ｎ、２４９Ｐ、２４９Ｙ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｗ、２５４Ｄ、２５４Ｅ、２５４Ｆ、２５４Ｇ、２５４Ｈ、２５４Ｉ、２５４Ｋ、２５４Ｌ、２５４Ｍ、２５４Ｎ、２５４Ｐ、２５４Ｑ、２５４Ｒ、２５４Ｖ、２５４Ｗ、２５４Ｙ、２５５Ｋ、２５５Ｎ、２５６Ｈ、２５６Ｉ、２５６Ｋ、２５６Ｌ、２５６Ｖ、２５６Ｗ、２５６Ｙ、２５７Ａ、２５７Ｉ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｓ、２５８Ｄ、２６０Ｓ、２６２Ｌ、２６４Ｓ、２６５Ｋ、２６５Ｓ、２６７Ｈ、２６７Ｉ、２６７Ｋ、２６８Ｋ、２６９Ｎ、２６９Ｑ、２７１Ｔ、２７２Ｈ、２７２Ｋ、２７２Ｌ、２７２Ｒ、２７９Ａ、２７９Ｄ、２７９Ｆ、２７９Ｇ、２７９Ｈ、２７９Ｉ、２７９Ｋ、２７９Ｌ、２７９Ｍ、２７９Ｎ、２７９Ｑ、２７９Ｒ、２７９Ｓ、２７９Ｔ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、２８０Ｔ、２８３Ｆ、２８３Ｇ、２８３Ｈ、２８３Ｉ、２８３Ｋ、２８３Ｌ、２８３Ｍ、２８３Ｐ、２８３Ｒ、２８３Ｔ、２８３Ｗ、２８３Ｙ、２８５Ｎ、２８６Ｆ、２８８Ｎ、２８８Ｐ、２９２Ｅ、２９２Ｆ、２９２Ｇ、２９２Ｉ、２９２Ｌ、２９３Ｓ、２９３Ｖ、３０１Ｗ、３０４Ｅ、３０７Ｅ、３０７Ｍ、３１２Ｐ、３１５Ｆ、３１５Ｋ、３１５Ｌ、３１５Ｐ、３１５Ｒ、３１６Ｆ、３１６Ｋ、３１７Ｐ、３１７Ｔ、３１８Ｎ、３１８Ｐ、３１８Ｔ、３３２Ｆ、３３２Ｇ、３３２Ｌ、３３２Ｍ、３３２Ｓ、３３２Ｖ、３３２Ｗ、３３９Ｄ、３３９Ｅ、３３９Ｆ、３３９Ｇ、３３９Ｈ、３３９Ｉ、３３９Ｋ、３３９Ｌ、３３９Ｍ、３３９Ｎ、３３９Ｑ、３３９Ｒ、３３９Ｓ、３３９Ｗ、３３９Ｙ、３４１Ｄ、３４１Ｅ、３４１Ｆ、３４１Ｈ、３４１Ｉ、３４１Ｋ、３４１Ｌ、３４１Ｍ、３４１Ｎ、３４１Ｐ、３４１Ｑ、３４１Ｒ、３４１Ｓ、３４１Ｔ、３４１Ｖ、３４１Ｗ、３４１Ｙ、３４３Ａ、３４３Ｄ、３４３Ｅ、３４３Ｆ、３４３Ｇ、３４３Ｈ、３４３Ｉ、３４３Ｋ、３４３Ｌ、３４３Ｍ、３４３Ｎ、３４３Ｑ、３４３Ｒ、３４３Ｓ、３４３Ｔ、３４３Ｖ、３４３Ｗ、３４３Ｙ、３７３Ｄ、３７３Ｅ、３７３Ｆ、３７３Ｇ、３７３Ｈ、３７３Ｉ、３７３Ｋ、３７３Ｌ、３７３Ｍ、３７３Ｎ、３７３Ｑ、３７３Ｒ、３７３Ｓ、３７３Ｔ、３７３Ｖ、３７３Ｗ、３７５Ｒ、３７６Ｅ、３７６Ｆ、３７６Ｇ、３７６Ｈ、３７６Ｉ、３７６Ｌ、３７６Ｍ、３７６Ｎ、３７６Ｐ、３７６Ｑ、３７６Ｒ、３７６Ｓ、３７６Ｔ、３７６Ｖ、３７６Ｗ、３７６Ｙ、３７７Ｇ、３７７Ｋ、３７７Ｐ、３７８Ｎ、３７９Ｎ、３７９Ｑ、３７９Ｓ、３７９Ｔ、３８０Ｄ、３８０Ｎ、３８０Ｓ、３８０Ｔ、３８２Ｄ、３８２Ｆ、３８２Ｈ、３８２Ｉ、３８２Ｋ、３８２Ｌ、３８２Ｍ、３８２Ｎ、３８２Ｐ、３８２Ｑ、３８２Ｒ、３８２Ｓ、３８２Ｔ、３８２Ｖ、３８２Ｗ、３８２Ｙ、３８５Ｅ、３８５Ｐ、３８６Ｋ、４２３Ｎ、４２４Ｈ、４２４Ｍ、４２４Ｖ、４２６Ｄ、４２６Ｌ、４２７Ｎ、４２９Ａ、４２９Ｆ、４２９Ｍ、４３０Ａ、４３０Ｄ、４３０Ｆ、４３０Ｇ、４３０Ｈ、４３０Ｉ、４３０Ｋ、４３０Ｌ、４３０Ｍ、４３０Ｎ、４３０Ｐ、４３０Ｑ、４３０Ｒ、４３０Ｓ、４３０Ｔ、４３０Ｖ、４３０Ｗ、４３０Ｙ、４３１Ｈ、４３１Ｋ、４３１Ｐ、４３２Ｒ、４３２Ｓ、４３８Ｇ、４３８Ｋ、４３８Ｌ、４３８Ｔ、４３８Ｗ、４３９Ｅ、４３９Ｈ、４３９Ｑ、４４０Ｄ、４４０Ｅ、４４０Ｆ、４４０Ｇ、４４０Ｈ、４４０Ｉ、４４０Ｋ、４４０Ｌ、４４０Ｍ、４４０Ｑ、４４０Ｔ、４４０Ｖ、又は４４２Ｋ、或いは、（ｉｉｉ）上記の（ｉ）又は（ｉｉ）に列挙される少なくとも２つのアミノ酸置換、（ｉｖ）上記の（ｉ）又は（ｉｉ）に列挙されていない少なくとも１つのＦｃ領域アミノ酸置換に加えて、上記の（ｉ）又は（ｉｉ）に列挙されている少なくとも１、２、又は３つのアミノ酸置換である。改変したエフェクター機能は、好ましくは、Ｆｃ領域（即ち、母体Ｆｃ領域）においてアミノ酸置換を欠失する前記ポリペプチドに比べて、ＡＤＣＣを増加、ＡＤＣＣを減少、ＣＤＣを増加、ＣＤＣを減少、Ｃ１ｑ結合能を増加、Ｃ１ｑ結合能を減少、ＦｃＲ（好ましくはＦｃＲｎ）結合能を増加、又はＦｃＲ（好ましくはＦｃＲｎ）結合能を減少させる。
【００１９】
本発明は、Ｆｃ領域における以下のアミノ酸置換の少なくとも１つを含む変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体を提供し、変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体は、母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体に比べて増大したＡＤＣＣを呈する。２４７Ａ、２４７Ｆ、２４７Ｍ、２４７Ｔ、２４７Ｖ、２４７Ｙ、２４９Ｅ、２４９Ｙ、２５４Ｆ、２５４Ｍ、２５４Ｙ、２５６Ａ、２５８Ｄ、２７９Ａ、２８３Ａ、２８３Ｉ、２８３Ｋ、２８３Ｍ、２８３Ｒ、２８８Ｎ、２９２Ａ、３１１Ａ、３１１Ｄ、３１１Ｎ、３１１Ｔ、３１１Ｖ、３１１Ｙ、３１５Ｌ、３１８Ｎ、３１８Ｐ、３１８Ｔ、３１８Ｖ、３３２Ｔ、３３２Ｖ、３３９Ｄ、３３９Ｆ、３３９Ｇ、３３９Ｉ、３３９Ｋ、３３９Ｍ、３３９Ｎ、３３９Ｑ、３３９Ｒ、３３９Ｓ、３３９Ｔ、３７６Ａ、３７６Ｖ、３７７Ｇ、３７７Ｋ、３７９Ｎ、３８０Ｎ、３８０Ｓ、３８２Ａ、３８２Ｉ、３８５Ｅ、４２７Ｎ、４２９Ｍ、４３４Ｗ、４３６Ｉ、４４０Ｇ、４４０Ｈ、４４０Ｉ、又は４４０Ｌ、［好ましくは、２４７Ａ、２４７Ｆ、２４７Ｍ、２４７Ｔ、２４７Ｖ、２４７Ｙ、２５４Ｆ、２５４Ｙ、２５８Ｄ、２７９Ａ、２８３Ｍ、２８８Ｎ、２９２Ａ、３１１Ｄ、３１１Ｎ、３１１Ｔ、３１５Ｌ、３１８Ｎ、３１８Ｐ、３１８Ｔ、３１８Ｖ、３３９Ｄ、３３９Ｉ、３３９Ｋ、３３９Ｍ、３３９Ｎ、３３９Ｑ、３３９Ｒ、３３９Ｓ、３７６Ａ、３７６Ｖ、３７７Ｋ、３７９Ｎ、３８０Ｎ、３８２Ａ、４４０Ｉ、又は４４０Ｌ］。
【００２０】
本発明は、Ｆｃ領域における以下のアミノ酸置換の少なくとも１つを含む変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体を提供し、変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体は、母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体に比べて減少したＡＤＣＣ活性を呈する。２３５Ｑ、２３５Ｒ、２３５Ｓ、２３６Ｆ、２３６Ｒ、２３６Ｙ、２３７Ｅ、２３７Ｋ、２３７Ｎ、２３７Ｒ、２３８Ｅ、２３８Ｇ、２３８Ｈ、２３８Ｉ、２３８Ｌ、２３８Ｖ、２３８Ｗ、２３８Ｙ、２４７Ｇ、２４７Ｒ、２４９Ｌ、２４９Ｐ、２５０Ｋ、２５０Ｍ、２５０Ｒ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｗ、２５２Ｙ、２５４Ｌ、２５４Ｐ、２５４Ｑ、２５４Ｔ、２５４Ｖ、２５６Ｖ、２５７Ａ、２５７Ｉ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｓ、２５７Ｖ、２６０Ｓ、２６２Ｌ、２６４Ｓ、２６５Ｈ、２６５Ｋ、２６５Ｓ、２６７Ｇ、２６７Ｈ、２６７Ｉ、２６７Ｋ、２６９Ｎ、２６９Ｑ、２７０Ａ、２７０Ｇ、２７０Ｋ、２７０Ｍ、２７０Ｎ、２７１Ｔ、２７２Ｈ、２７２Ｋ、２７２Ｌ、２７２Ｎ、２７２Ｒ、２７９Ｄ、２７９Ｆ、２７９Ｋ、２７９Ｌ、２７９Ｗ、２８３Ｄ、２８３Ｆ、２８３Ｇ、２８３Ｈ、２８３Ｌ、２８３Ｗ、２８３Ｙ、２８５Ｎ、２８８Ｐ、２９２Ｅ、２９２Ｆ、２９２Ｇ、２９２Ｉ、２９３Ｓ、２９３Ｖ、３０１Ｗ、３０４Ｅ、３０７Ａ、３０７Ｅ、３０７Ｍ、３１１Ｆ、３１１Ｉ、３１１Ｋ、３１１Ｓ、３１２Ｐ、３１４Ｆ、３１４Ｉ、３１４Ｖ、３１４Ｗ、３１５Ｆ、３１５Ｐ、３１６Ｆ、３１７Ｐ、３２７Ｔ、３２８Ｖ、３２９Ｙ、３３２Ｇ、３３２Ｋ、３３２Ｌ、３３２Ｒ、３３２Ｗ、３４１Ｄ、３４１Ｅ、３４１Ｆ、３４１Ｈ、３４１Ｉ、３４１Ｋ、３４１Ｌ、３４１Ｍ、３４１Ｎ、３４１Ｐ、３４１Ｑ、３４１Ｒ、３４１Ｓ、３４１Ｔ、３４１Ｗ、３４１Ｙ、３４３Ａ、３４３Ｄ、３４３Ｅ、３４３Ｆ、３４３Ｇ、３４３Ｈ、３４３Ｌ、３４３Ｍ、３４３Ｎ、３４３Ｑ、３４３Ｒ、３４３Ｓ、３４３Ｔ、３４３Ｖ、３４３Ｗ、３４３Ｙ、３７３Ａ、３７３Ｄ、３７３Ｅ、３７３Ｆ、３７３Ｇ、３７３Ｉ、３７３Ｋ、３７３Ｌ、３７３Ｍ、３７３Ｎ、３７３Ｑ、３７３Ｒ、３７３Ｓ、３７３Ｔ、３７３Ｖ、３７３Ｗ、３７５Ｒ、３７６Ａ、３７６Ｅ、３７６Ｆ、３７６Ｇ、３７６Ｈ、３７６Ｗ、３７６Ｙ、３７９Ｑ、３８２Ｄ、３８２Ｓ、４３０Ｈ、４３０Ｋ、４３０Ｎ、４３０Ｑ、４３０Ｒ、４３０Ｗ、４３２Ｒ、４３２Ｓ、４３４Ｉ、４４０Ｄ、４４０Ｔ、４４０Ｖ、又は４４２Ｋ、［好ましくは、２３５Ｒ、２３６Ｆ、２３６Ｙ、２３７Ｅ、２３７Ｋ、２３７Ｎ、２３７Ｒ、２３８Ｅ、２３８Ｇ、２３８Ｈ、２３８Ｉ、２３８Ｌ、２３８Ｖ、２３８Ｗ、２３８Ｙ、２４７Ｒ、２５０Ｋ、２５１Ｈ、２５４Ｔ、２５７Ｉ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｓ、２５７Ｖ、２６５Ｈ、２６５Ｋ、２６５Ｓ、２６７Ｇ、２６７Ｈ、２６７Ｉ、２６７Ｋ、２６９Ｎ、２６９Ｑ、２７０Ａ、２７０Ｇ、２７０Ｋ、２７０Ｍ、２７０Ｎ、２７１Ｔ、２７２Ｎ、２７２Ｒ、２８８Ｐ、２９２Ｅ、３０１Ｗ、３０４Ｅ、３１６Ｆ、３１７Ｐ、３２７Ｔ、３２８Ｖ、３２９Ｙ、３３２Ｋ、３３２Ｒ、３４１Ｆ、３４１Ｉ、３４１Ｍ、３４１Ｐ、３４１Ｑ、３４１Ｒ、３４１Ｔ、３４１Ｗ、３４１Ｙ、３４３Ｗ、３７３Ａ、３７３Ｅ、３７３Ｇ、３７３Ｓ、３７６Ａ、３７６Ｗ、４３２Ｒ、又は４３２Ｓ］。
【００２１】
本発明は、Ｆｃ領域における以下のアミノ酸置換の少なくとも１つを含む変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体を提供し、変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体は、母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体に比べて増大したＦｃＲｎの結合親和性を呈する。２３８Ｌ、２４４Ｌ、２４５Ｒ、２４９Ｐ、２５２Ｙ、２５６Ｐ、２５７Ａ、２５７Ｉ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｓ、２５７Ｖ、２５８Ｄ、２６０Ｓ、２６２Ｌ、２７０Ｋ、２７２Ｌ、２７２Ｒ、２７９Ａ、２７９Ｄ、２７９Ｇ、２７９Ｈ、２７９Ｍ、２７９Ｎ、２７９Ｑ、２７９Ｒ、２７９Ｓ、２７９Ｔ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、２８３Ａ、２８３Ｄ、２８３Ｆ、２８３Ｇ、２８３Ｈ、２８３Ｉ、２８３Ｋ、２８３Ｌ、２８３Ｎ、２８３Ｐ、２８３Ｑ、２８３Ｒ、２８３Ｓ、２８３Ｔ、２８３Ｗ、２８３Ｙ、２８５Ｎ、２８６Ｆ、２８８Ｎ、２８８Ｐ、２９３Ｖ、３０７Ｅ、３０７Ｍ、３１１Ａ、３１１Ｉ、３１１Ｋ、３１１Ｌ、３１１Ｍ、３１１Ｖ、３１１Ｗ、３１２Ｐ、３１６Ｋ、３１７Ｐ、３１８Ｎ、３１８Ｔ、３３２Ｆ、３３２Ｈ、３３２Ｋ、３３２Ｌ、３３２Ｍ、３３２Ｒ、３３２Ｓ、３３２Ｗ、３３９Ｎ、３３９Ｔ、３３９Ｗ、３４１Ｐ、３４３Ｅ、３４３Ｈ、３４３Ｋ、３４３Ｑ、３４３Ｒ、３４３Ｔ、３４３Ｙ、３７５Ｒ、３７６Ｇ、３７６Ｉ、３７６Ｍ、３７６Ｐ、３７６Ｔ、３７６Ｖ、３７７Ｋ、３７８Ｄ、３７８Ｎ、３８０Ｎ、３８０Ｓ、３８０Ｔ、３８２Ｆ、３８２Ｈ、３８２Ｉ、３８２Ｋ、３８２Ｌ、３８２Ｍ、３８２Ｎ、３８２Ｑ、３８２Ｒ、３８２Ｓ、３８２Ｔ、３８２Ｖ、３８２Ｗ、３８２Ｙ、４２３Ｎ、４２７Ｎ、４３０Ａ、４３０Ｆ、４３０Ｇ、４３０Ｈ、４３０Ｉ、４３０Ｋ、４３０Ｌ、４３０Ｍ、４３０Ｎ、４３０Ｑ、４３０Ｒ、４３０Ｓ、４３０Ｔ、４３０Ｖ、４３０Ｙ、４３１Ｈ、４３１Ｋ、４３４Ｆ、４３４Ｇ、４３４Ｈ、４３４Ｗ、４３４Ｙ、４３６Ｉ、４３６Ｌ、４３６Ｔ、４３８Ｋ、４３８Ｌ、４３８Ｔ、４３８Ｗ、４４０Ｋ、又は４４２Ｋ、［好ましくは、２４５Ｒ、２５２Ｙ、２５６Ｐ、２５７Ａ、２５７Ｉ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｓ、２５７Ｖ、２５８Ｄ、２６０Ｓ、２６２Ｌ、２７９Ａ、２７９Ｄ、２７９Ｇ、２７９Ｈ、２７９Ｎ、２７９Ｑ、２７９Ｓ、２７９Ｔ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、２８３Ｆ、２８３Ｈ、２８３Ｋ、２８３Ｒ、２８５Ｎ、２８６Ｆ、３０７Ｅ、３０７Ｍ、３１１Ｉ、３１１Ｋ、３１１Ｌ、３１１Ｍ、３１２Ｐ、３１８Ｎ、３１８Ｔ、３３２Ｓ、３３９Ｗ、３４３Ｅ、３４３Ｈ、３４３Ｋ、３４３Ｑ、３４３Ｒ、３７５Ｒ、３７７Ｋ、３７８Ｄ、３７８Ｎ、３８０Ｓ、３８０Ｔ、３８２Ｆ、３８２Ｋ、３８２Ｑ、３８２Ｒ、３８２Ｓ、３８２Ｔ、３８２Ｖ、３８２Ｗ、３８２Ｙ、４２３Ｎ、４２７Ｎ、４３０Ａ、４３０Ｆ、４３０Ｈ、４３０Ｉ、４３０Ｌ、４３０Ｍ、４３０Ｎ、４３０Ｑ、４３０Ｒ、４３０Ｓ、４３０Ｖ、４３０Ｙ、４３１Ｈ、４３１Ｋ、４３４Ｆ．  ４３４Ｇ、４３４Ｈ、４３４Ｗ、４３４Ｙ、４３６Ｉ、４３６Ｌ、４３８Ｋ、４３８Ｌ、又は４３８Ｗ］。
【００２２】
本発明は、Ｆｃ領域における以下のアミノ酸置換の少なくとも１つを含む変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体を提供し、変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体は、母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体に比べて減少したＦｃＲｎの結合親和性を呈する。２３５Ｑ、２３６Ｙ、２３７Ｋ、２３７Ｒ、２３８Ｅ、２３８Ｇ、２３８Ｈ、２３８Ｗ、２４７Ａ、２４７Ｄ、２４７Ｅ、２４７Ｆ、２４７Ｇ、２４７Ｈ、２４７Ｉ、２４７Ｌ、２４７Ｍ、２４７Ｎ、２４７Ｑ、２４７Ｒ、２４７Ｓ、２４７Ｗ、２４７Ｙ、２４８Ａ、２４８Ｆ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｗ、２４９Ｅ、２４９Ｌ、２４９Ｍ、２４９Ｙ、２５１Ｆ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｗ、２５４Ｄ、２５４Ｅ、２５４Ｆ、２５４Ｇ、２５４Ｈ、２５４Ｉ、２５４Ｋ、２５４Ｌ、２５４Ｍ、２５４Ｎ、２５４Ｐ、２５４Ｑ、２５４Ｒ、２５４Ｔ、２５４Ｖ、２５４Ｗ、２５４Ｙ、２５５Ｋ、２５５Ｎ、２５６Ｆ、２５６Ｈ、２５６Ｉ、２５６Ｋ、２５６Ｍ、２５６Ｒ、２５６Ｗ、２５６Ｙ、２６４Ｓ、２６５Ｓ、２６５Ｙ、２６７Ｇ、２６７Ｉ、２６８Ｄ、２６８Ｋ、２７０Ａ、２７０Ｍ、２７９Ｉ、２７９Ｋ、２７９Ｌ、２８０Ｔ、２９２Ｅ、２９２Ｆ、２９２Ｇ、２９２Ｉ、２９２Ｌ、３１１Ｄ、３１１Ｅ、３１１Ｆ、３１１Ｇ、３１１Ｎ、３１１Ｒ、３１１Ｙ、３１５Ｆ、３１５Ｋ、３１５Ｐ、３１６Ｆ、３１７Ｔ、３２６Ｗ、３２７Ｔ、３３９Ｅ、３３９Ｇ、３３９Ｌ、３３９Ｒ、３４１Ｄ、３４１Ｅ、３４１Ｆ、３４１Ｉ、３４１Ｋ、３４１Ｌ、３４１Ｍ、３４１Ｎ、３４１Ｑ、３４１Ｒ、３４１Ｓ、３４１Ｔ、３４１Ｖ、３４１Ｗ、３４１Ｙ、３４３Ｍ、３４３Ｖ、３４３Ｗ、３７３Ａ、３７３Ｄ、３７３Ｇ、３７３Ｋ、３７３Ｌ、３７３Ｍ、３７３Ｎ、３７３Ｑ、３７３Ｓ、３７３Ｔ、３７３Ｖ、３７３Ｗ、３７６Ｈ、３７６Ｌ、３７６Ｗ、３７６Ｙ、４２４Ｍ、４２４Ｖ、４２６Ｄ、４２９Ａ、４２９Ｆ、４２９Ｍ、４３０Ｄ、４３０Ｗ、４３１Ｐ、４３２Ｒ、４３２Ｓ、４３９Ｑ、４４０Ａ、４４０Ｄ、４４０Ｅ、４４０Ｆ、又は４４０Ｍ、［好ましくは、２３７Ｒ、２４７Ｄ、２４７Ｅ、２４７Ｆ、２４７Ｈ、２４７Ｉ、２４７Ｌ、２４７Ｍ、２４７Ｎ、２４７Ｑ、２４７Ｗ、２４７Ｙ、２４８Ａ、２４８Ｆ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｗ、２４９Ｌ、２４９Ｍ、２４９Ｙ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｗ、２５４Ｄ、２５４Ｅ、２５４Ｆ、２５４Ｇ、２５４Ｈ、２５４Ｉ、２５４Ｋ、２５４Ｍ、２５４Ｎ、２５４Ｐ、２５４Ｑ、２５４Ｒ、２５４Ｔ、２５４Ｖ、２５４Ｗ、２５４Ｙ、２５５Ｋ、２５５Ｎ、２５６Ｆ、２５６Ｈ、２５６Ｋ、２５６Ｍ、２５６Ｒ、２５６Ｗ、２６５Ｙ、２８０Ｔ、２９２Ｇ、２９２Ｉ、３１１Ｄ、３１１Ｅ、３１１Ｇ、３１１Ｎ、３１５Ｆ、３１５Ｐ、３１６Ｔ、３１７Ｔ、３２７Ｔ、３４１Ｄ、３４１Ｅ、３４１Ｆ、３４１Ｉ、３４１Ｌ、３４１Ｙ、３４３Ｗ、３７３Ａ、３７３Ｇ、３７３Ｍ、３７３Ｑ、３７６Ｗ、３７６Ｙ、４２４Ｍ、４２４Ｖ、４３０Ｄ、４３０Ｗ、４３１Ｐ、又は４３２Ｓ］。
【００２３】
本発明は、Ｆｃ領域における以下のアミノ酸置換の少なくとも１つを含む変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体を提供し、変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体は、母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体に比べて増大したＣＤＣ活性を呈する。２３６Ｙ、２４４Ｌ、２４７Ａ、２４７Ｄ、２４７Ｅ、２４７Ｇ、２４７Ｎ、２４７Ｑ、２４７Ｒ、２４７Ｓ、２４７Ｗ、２４８Ｆ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｗ、２４９Ｅ、２４９Ｌ、２４９Ｍ、２４９Ｎ、２４９Ｐ、２４９Ｙ、２５１Ｆ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｗ、２５４Ａ、２５４Ｆ、２５４Ｋ、２５４Ｌ、２５４Ｍ、２５４Ｒ、２５４Ｙ、２５５Ｋ、２５６Ａ、２５６Ｇ、２５６Ｉ、２５６Ｌ、２５６Ｍ、２５６Ｐ、２５６Ｑ、２５６Ｗ、２５６Ｙ、２６０Ｓ、２６８Ｄ、２７９Ｑ、２７９Ｓ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、２８０Ｋ、２８０Ｔ、２８３Ｆ、２８３Ｇ、２８３Ｈ、２８３Ｉ、２８３Ｋ、２８３Ｌ、２８３Ｍ、２８３Ｎ、２８３Ｐ、２８３Ｒ、２８３Ｓ、２８３Ｗ、２９２Ｌ、３０７Ａ、３０７Ｍ、３１１Ｆ、３１１Ｉ、３１１Ｋ、３１１Ｌ、３１１Ｍ、３１１Ｔ、３１１１Ｖ、３１１Ｗ、３１１Ｙ、３１２Ｐ、３１４Ｆ、３１４Ｉ、３１４Ｖ、３１４Ｗ、３１４Ｙ、３１５Ｆ、３１５Ｋ、３１５Ｌ、３１５Ｐ、３１５Ｒ、３１６Ｋ、３１７Ｐ、３１７Ｔ、３１８Ｎ、３１８Ｔ、３３２Ａ、３３２Ｄ、３３２Ｅ、３３２Ｆ、３３２Ｇ、３３２Ｌ、３３２Ｍ、３３２Ｑ、３３２Ｓ、３３２Ｔ、３３２Ｖ、３３２Ｗ、３３２Ｙ、３３９Ｄ、３３９Ｆ、３３９Ｇ、３３９Ｈ、３３９Ｉ、３３９Ｋ、３３９Ｎ、３３９Ｑ、３３９Ｒ、３３９Ｓ、３３９Ｔ、３３９Ｗ、３３９Ｙ、３４１Ｄ、３４１Ｅ、３４１Ｆ、３４１Ｈ、３４１Ｉ、３４１Ｋ、３４１Ｌ、３４１Ｍ、３４１Ｎ、３４１Ｐ、３４１Ｑ、３４１Ｒ、３４１Ｓ、３４１Ｔ、３４１Ｖ、３４１Ｗ、３４１Ｙ、３４３Ａ、３４３Ｄ、３４３Ｅ、３４３Ｇ、３４３Ｈ、３４３Ｋ、３４３Ｌ、３４３Ｍ、３４３Ｎ、３４３Ｑ、３４３Ｒ、３４３Ｓ、３４３Ｔ、３４３Ｗ、３４３Ｙ、３７３Ｄ、３７３Ｅ、３７３Ｆ、３７３Ｈ、３７３Ｉ、３７３Ｋ、３７３Ｌ、３７３Ｍ、３７３Ｎ、３７３Ｑ、３７３Ｒ、３７３Ｔ、３７３Ｖ、３７３Ｗ、３７５Ｒ、３７６Ａ、３７６Ｆ、３７６Ｇ、３７６Ｈ、３７６Ｌ、３７６Ｎ、３７６Ｐ、３７６Ｑ、３７６Ｒ、３７６Ｓ、３７６Ｔ、３７６Ｖ、３７７Ｐ、３７９Ｎ、３７９Ｑ、３７９Ｓ、３７９Ｔ、３８０Ａ、３８０Ｎ、３８０Ｓ、３８０Ｔ、３８２Ｉ、３８２Ｌ、３８２Ｑ、３８２Ｖ、３８６Ｋ、４２６Ｄ、４２６Ｌ、４２９Ａ、４２９Ｆ、４２９Ｍ、４３０Ａ、４３０Ｄ、４３０Ｆ、４３０Ｇ、４３０Ｈ、４３０Ｉ、４３０Ｋ、４３０Ｌ、４３０Ｍ、４３０Ｎ、４３０Ｐ、４３０Ｒ、４３０Ｓ、４３０Ｔ、４３０Ｖ、４３０Ｗ、４３０Ｙ、４３１Ｈ、４３１Ｐ、４３２Ｒ、４３２Ｓ、４３４Ｗ、４３４Ｙ、４３８Ｌ、４３８Ｗ、４４０Ｑ、又は４４０Ｙ、［好ましくは、２３６Ｙ、２４８Ｆ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｗ、２４９Ｅ、２４９Ｌ、２４９Ｍ、２４９Ｎ、２４９Ｙ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｗ、２５４Ｆ、２５４Ｋ、２５４Ｌ、２５４Ｍ、２５４Ｒ、２５４Ｙ、２５５Ｋ、２５６Ａ、２５６Ｇ、２５６Ｉ、２５６Ｌ、２５６Ｍ、２５６Ｐ、２５６Ｑ、２５６Ｗ、２６０Ｓ、２８０Ｋ、２８３Ｗ、３０７Ｍ、３１１Ｆ、３１１Ｉ、３１１Ｋ、３１１Ｌ、３１１Ｍ、３１１Ｔ、３１１Ｖ、３１１Ｗ、３１１Ｙ、３１４Ｉ、３１４Ｖ、３１４Ｗ、３１４Ｙ、３１５Ｐ、３１７Ｐ、３３２Ｄ、３３２Ｌ、３３２Ｍ、３３２Ｓ、３３２Ｗ、３３９Ｄ、３３９Ｆ、３３９Ｉ、３３９Ｋ、３３９Ｎ、３３９Ｓ、３３９Ｗ、３３９Ｙ、３４１Ｄ、３４１Ｅ、３４１Ｆ、３４１Ｈ、３４１Ｉ、３４１Ｋ、３４１Ｌ、３４１Ｍ、３４１Ｎ、３４１Ｐ、３４１Ｑ、３４１Ｒ、３４１Ｓ、３４１Ｔ、３４１Ｖ、３４１Ｗ、３４１Ｙ、３４３Ｄ、３４３Ｅ、３４３Ｇ、３４３Ｈ、３４３Ｋ、３４３Ｎ、３４３Ｑ、３４３Ｒ、３４３Ｓ、３４３Ｔ、３４３Ｗ、３４３Ｙ、３７３Ｅ、３７３Ｆ、３７３Ｈ、３７３Ｉ、３７３Ｋ、３７３Ｌ、３７３Ｑ、３７３Ｒ、３７３Ｔ、３７３Ｗ、３７６Ａ、３７６Ｇ、３７６Ｎ、３７６Ｐ、３７６Ｑ、３７６Ｒ、３７６Ｓ、３７６Ｔ、３７６Ｖ、３７７Ｐ、３７９Ｎ、３７９Ｑ、３７９Ｔ、３８２Ｉ、３８２Ｌ、３８６Ｋ、４２６Ｄ、４２６Ｌ、４２９Ｆ、４２９Ｍ、４３０Ａ、４３０Ｄ、４３０Ｆ、４３０Ｇ、４３０Ｈ、４３０Ｉ、４３０Ｋ、４３０Ｌ、４３０Ｍ、４３０Ｎ、４３０Ｐ、４３０Ｒ、４３０Ｓ、４３０Ｔ、４３０Ｖ、４３０Ｗ、４３０Ｙ、４３１Ｈ、４３１Ｐ、４３４Ｙ、４３８Ｌ、又は４４０Ｙ］。
【００２４】
本発明は、Ｆｃ領域における以下のアミノ酸置換の少なくとも１つを含む変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体を提供し、変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体は、母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体に比べて減少したＣＤＣ活性を呈する。２３５Ｇ、２３５Ｓ、２３６Ｒ、２３７Ｅ、２３７Ｋ、２３７Ｎ、２３７Ｒ、２３８Ａ、２３８Ｅ、２３８Ｇ、２３８Ｈ、２３８Ｉ、２３８Ｌ、２３８Ｖ、２３８Ｗ、２３８Ｙ、２４５Ｒ、２４７Ｈ、２４７Ｉ、２４７Ｌ、２４７Ｔ、２４７Ｙ、２５０Ｍ、２５２Ｙ、２５４Ｄ、２５４Ｅ、２５４Ｉ、２５４Ｐ、２５４Ｑ、２５４Ｔ、２５４Ｖ、２５５Ｎ、２５７Ａ、２５７Ｉ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｓ、２５７Ｖ、２６２Ｌ、２６４Ｓ、２６５Ｈ、２６５Ｙ、２６７Ｇ、２６７Ｈ、２６７Ｉ、２６７Ｋ、２６８Ｋ、２６９Ｎ、２６９Ｑ、２７０Ｇ、２７０Ｍ、２７０Ｎ、２７１Ｔ、２７２Ｈ、２７２Ｌ、２７２Ｎ、２９２Ａ、２９３Ｓ、３０１Ｗ、３０７Ｅ、３１１Ｅ、３１１Ｓ、３１６Ｆ、３１８Ｐ、３２７Ｔ、３２８Ｖ、３２９Ｙ、３３０Ｋ、３３０Ｒ、３３２Ｅ、３３２Ｍ、３４３Ｉ、３７３Ｓ、３７８Ｄ、３８０Ｄ、３８２Ｄ、３８２Ｆ、３８２Ｎ、３８２Ｐ、３８２Ｒ、３８２Ｓ、３８２Ｗ、３８２Ｙ、３８５Ｅ、３８５Ｐ、４２３Ｎ、４２４Ｈ、４２４Ｍ、又は４２７Ｎ  ［好ましくは、２３５Ｇ、２３５Ｓ、２３６Ｒ、２３７Ｅ、２３７Ｋ、２３７Ｎ、２３７Ｒ、２３８Ａ、２３８Ｅ、２３８Ｇ、２３８Ｈ、２３８Ｉ、２３８Ｌ、２３８Ｖ、２３８Ｗ、２３８Ｙ、２４５Ｒ、２４７Ｉ、２４７Ｌ、２４７Ｔ、２５０Ｍ、２５７Ａ、２５７Ｉ、２５７Ｍ、２６２Ｌ、２６４Ｓ、２６７Ｇ、２６７Ｈ、２６７Ｉ、２６７Ｋ、２６８Ｋ、２６９Ｎ、２６９Ｑ、２７０Ｇ、２７０Ｍ、２７０Ｎ、２７１Ｔ、２７２Ｈ、３０１Ｗ、３１１Ｓ、３２７Ｔ、３２９Ｙ、３３０Ｋ、３７８Ｄ、３８５Ｅ、４２３Ｎ、又は４２４Ｈ］。
【００２５】
更に、本発明は、本発明の変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体を具現化し、前記抗体は、特にヒト標的抗原と結合する。好ましくは、標的抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＴＮＦ（α）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＧＦ（β）、ＶＥＧＦ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、グレリン、又は任意の前駆体、或いは、その機能性フラグメントから選択される。
【００２６】
本発明は、Ｆｃ領域における以下のアミノ酸置換の少なくとも１つを含む変異Ｆｃ領域を含む変異ポリペプチドを提供し、変異ポリペプチドは、母体ポリペプチド（即ち、変異ポリペプチドと同一のポリペプチドであるが、上記に列挙されるアミノ酸置換がない）に比べて増大した血清半減期を呈する。
２３８Ｌ、２４４Ｌ、２４５Ｒ、２４９Ｐ、２５２Ｙ、２５６Ｐ、２５７Ａ、２５７Ｉ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｓ、２５７Ｖ、２５８Ｄ、２６０Ｓ、２６２Ｌ、２７０Ｋ、２７２Ｌ、２７２Ｒ、２７９Ａ、２７９Ｄ、２７９Ｇ、２７９Ｈ、２７９Ｍ、２７９Ｎ、２７９Ｑ、２７９Ｒ、２７９Ｓ、２７９Ｔ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、２８３Ａ、２８３Ｄ、２８３Ｆ、２８３Ｇ、２８３Ｈ、２８３Ｉ、２８３Ｋ、２８３Ｌ、２８３Ｎ、２８３Ｐ、２８３Ｑ、２８３Ｒ、２８３Ｓ、２８３Ｔ、２８３Ｗ、２８３Ｙ、２８５Ｎ、２８６Ｆ、２８８Ｎ、２８８Ｐ、２９３Ｖ、３０７Ｅ、３０７Ｍ、３１１Ａ、３１１Ｉ、３１１Ｋ、３１１Ｌ、３１１Ｍ、３１１Ｖ、３１１Ｗ、３１２Ｐ、３１６Ｋ、３１７Ｐ、３１８Ｎ、３１８Ｔ、３３２Ｆ、３３２Ｈ、３３２Ｋ、３３２Ｌ、３３２Ｍ、３３２Ｒ、３３２Ｓ、３３２Ｗ、３３９Ｎ、３３９Ｔ、３３９Ｗ、３４１Ｐ、３４３Ｅ、３４３Ｈ、３４３Ｋ、３４３Ｑ、３４３Ｒ、３４３Ｔ、３４３Ｙ、３７５Ｒ、３７６Ｇ、３７６Ｉ、３７６Ｍ、３７６Ｐ、３７６Ｔ、３７６Ｖ、３７７Ｋ、３７８Ｄ、３７８Ｎ、３８０Ｎ、３８０Ｓ、３８０Ｔ、３８２Ｆ、３８２Ｈ、３８２Ｉ、３８２Ｋ、３８２Ｌ、３８２Ｍ、３８２Ｎ、３８２Ｑ、３８２Ｒ、３８２Ｓ、３８２Ｔ、３８２Ｖ、３８２Ｗ、３８２Ｙ、４２３Ｎ、４２７Ｎ、４３０Ａ、４３０Ｆ、４３０Ｇ、４３０Ｈ、４３０Ｉ、４３０Ｋ、４３０Ｌ、４３０Ｍ、４３０Ｎ、４３０Ｑ、４３０Ｒ、４３０Ｓ、４３０Ｔ、４３０Ｖ、４３０Ｙ、４３１Ｈ、４３１Ｋ、４３４Ｆ、４３４Ｇ、４３４Ｈ、４３４Ｗ、４３４Ｙ、４３６Ｉ、４３６Ｌ、４３６Ｔ、４３８Ｋ、４３８Ｌ、４３８Ｔ、４３８Ｗ、４４０Ｋ、又は４４２Ｋ，［好ましくは、２４５Ｒ、２５２Ｙ、２５６Ｐ、２５７Ａ、２５７Ｉ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｓ、２５７Ｖ、２５８Ｄ、２６０Ｓ、２６２Ｌ、２７９Ａ、２７９Ｄ、２７９Ｇ、２７９Ｈ、２７９Ｎ、２７９Ｑ、２７９Ｓ、２７９Ｔ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、２８３Ｆ、２８３Ｈ、２８３Ｋ、２８３Ｒ、２８５Ｎ、２８６Ｆ、３０７Ｅ、３０７Ｍ、３１１Ｉ、３１１Ｋ、３１１Ｌ、３１１Ｍ、３１２Ｐ、３１８Ｎ、３１８Ｔ、３３２Ｓ、３３９Ｗ、３４３Ｅ、３４３Ｈ、３４３Ｋ、３４３Ｑ、３４３Ｒ、３７５Ｒ、３７７Ｋ、３７８Ｄ、３７８Ｎ、３８０Ｓ、３８０Ｔ、３８２Ｆ、３８２Ｋ、３８２Ｑ、３８２Ｒ、３８２Ｓ、３８２Ｔ、３８２Ｖ、３８２Ｗ、３８２Ｙ、４２３Ｎ、４２７Ｎ、４３０Ａ、４３０Ｆ、４３０Ｈ、４３０Ｉ、４３０Ｌ、４３０Ｍ、４３０Ｎ、４３０Ｑ、４３０Ｒ、４３０Ｓ、４３０Ｖ、４３０Ｙ、４３１Ｈ、４３１Ｋ、４３４Ｆ、４３４Ｇ、４３４Ｈ、４３４Ｗ、４３４Ｙ、４３６Ｉ、４３６Ｌ、４３８Ｋ、４３８Ｌ、又は４３８Ｗ］。
【００２７】
本発明は、Ｆｃ領域における以下のアミノ酸置換の少なくとも１つを含む変異Ｆｃ領域を含む変異ポリペプチドを提供し、変異ポリペプチドは、母体ポリペプチド（即ち、変異ポリペプチドと同一のポリペプチドであるが、上記に列挙されるアミノ酸置換がない）に比べて減少した血清半減期を呈する。２３５Ｑ、２３６Ｙ、２３７Ｋ、２３７Ｒ、２３８Ｅ、２３８Ｇ、２３８Ｈ、２３８Ｗ、２４７Ａ、２４７Ｄ、２４７Ｅ、２４７Ｆ、２４７Ｇ、２４７Ｈ、２４７Ｉ、２４７Ｌ、２４７Ｍ、２４７Ｎ、２４７Ｑ、２４７Ｒ、２４７Ｓ、２４７Ｗ、２４７Ｙ、２４８Ａ、２４８Ｆ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｗ、２４９Ｅ、２４９Ｌ、２４９Ｍ、２４９Ｙ、２５１Ｆ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｗ、２５４Ｄ、２５４Ｅ、２５４Ｆ、２５４Ｇ、２５４Ｈ、２５４Ｉ、２５４Ｋ、２５４Ｌ、２５４Ｍ、２５４Ｎ、２５４Ｐ、２５４Ｑ、２５４Ｒ、２５４Ｔ、２５４Ｖ、２５４Ｗ、２５４Ｙ、２５５Ｋ、２５５Ｎ、２５６Ｆ、２５６Ｈ、２５６Ｉ、２５６Ｋ、２５６Ｍ、２５６Ｒ、２５６Ｗ、２５６Ｙ、２６４Ｓ、２６５Ｓ、２６５Ｙ、２６７Ｇ、２６７Ｉ、２６８Ｄ、２６８Ｋ、２７０Ａ、２７０Ｍ、２７９Ｉ、２７９Ｋ、２７９Ｌ、２８０Ｔ、２９２Ｅ、２９２Ｆ、２９２Ｇ、２９２Ｉ、２９２Ｌ、３１１Ｄ、３１１Ｅ、３１１Ｆ、３１１Ｇ、３１１Ｎ  ３１１Ｒ、３１１Ｙ、３１５Ｆ、３１５Ｋ、３１５Ｐ、３１６Ｆ、３１７Ｔ、３２６Ｗ、３２７Ｔ、３３９Ｅ、３３９Ｇ、３３９Ｌ、３３９Ｒ、３４１Ｄ、３４１Ｅ、３４１Ｆ、３４１Ｉ、３４１Ｋ、３４１Ｌ、３４１Ｍ、３４１Ｎ、３４１Ｑ、３４１Ｒ、３４１Ｓ、３４１Ｔ、３４１Ｖ、３４１Ｗ、３４１Ｙ、３４３Ｍ、３４３Ｖ、３４３Ｗ、３７３Ａ、３７３Ｄ、３７３Ｇ、３７３Ｋ、３７３Ｌ、３７３Ｍ、３７３Ｎ、３７３Ｑ、３７３Ｓ、３７３Ｔ、３７３Ｖ、３７３Ｗ、３７６Ｈ、３７６Ｌ、３７６Ｗ、３７６Ｙ、４２４Ｍ、４２４Ｖ、４２６Ｄ、４２９Ａ、４２９Ｆ、４２９Ｍ、４３０Ｄ、４３０Ｗ、４３１Ｐ、４３２Ｒ、４３２Ｓ、４３９Ｑ、４４０Ｄ、４４０Ｅ、４４０Ｆ、又は４４０Ｍ  ［好ましくは、２３７Ｒ、２４７Ｄ、２４７Ｅ、２４７Ｆ、２４７Ｈ、２４７Ｌ、２４７Ｍ、２４７Ｎ、２４７Ｑ、２４７Ｗ、２４７Ｙ、２４８Ａ、２４８Ｆ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｗ、２４９Ｌ、２４９Ｍ、２４９Ｙ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｗ、２５４Ｄ、２５４Ｅ、２５４Ｆ、２５４Ｇ、２５４Ｈ、２５４Ｉ、２５４Ｋ、２５４Ｍ、２５４Ｎ、２５４Ｐ、２５４Ｑ、２５４Ｒ、２５４Ｔ、２５４Ｖ、２５４Ｗ、２５４Ｙ、２５５Ｋ、２５５Ｎ、２５６Ｆ、２５６Ｈ、２５６Ｋ、２５６Ｍ、２５６Ｒ、２５６Ｗ、２６５Ｙ、２８０Ｔ、２９２Ｇ、２９２Ｉ、３１１Ｄ、３１１Ｅ、３１１Ｇ、３１１Ｎ、３１５Ｆ、３１５Ｐ、３１６Ｔ、３１７Ｔ、３２７Ｔ、３４１Ｄ、３４１Ｅ、３４１Ｆ、３４１Ｉ、３４１Ｌ、３４１Ｙ、３４３Ｗ、３７３Ａ、３７３Ｇ、３７３Ｍ、３７３Ｑ、３７６Ｗ、３７６Ｙ、４２４Ｍ、４２４Ｖ、４３０Ｄ、４３０Ｗ、４３１Ｐ、又は４３２Ｓ］。
【００２８】
一実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体、好ましくは治療用モノクローナル抗体（又はその機能性フラグメント）のＡＤＣＣ活性を増加させる方法を提供し、少なくとも１つの以下のアミノ酸置換を含む変異Ｆｃ領域をコードする核酸を含む核酸を設計することを含む。２４７Ａ、２４７Ｆ、２４７Ｈ、２４７Ｉ、２４７Ｌ、２４７Ｍ、２４７Ｔ、２４７Ｖ、２４７Ｙ、２４９Ｅ、２４９Ｙ、２５１Ｆ、２５４Ｆ、２５４Ｍ、２５４Ｙ、２５６Ａ、２５６Ｍ、２５８Ｄ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、２７９Ａ、２８０Ａ、２８０Ｋ、２８３Ａ、２８３Ｉ、２８３Ｋ、２８３Ｍ、２８３Ｒ、２８８Ｎ、２９２Ａ、３１１Ａ、３１１Ｄ、３１１Ｎ、３１１Ｔ、３１１Ｖ、３１１Ｙ、３１５Ｌ、３１８Ｎ、３１８Ｐ、３１８Ｔ、３１８Ｖ、３３０Ｋ、３３２Ｔ、３３２Ｖ、３３９Ｄ、３３９Ｆ、３３９Ｇ、３３９Ｉ、３３９Ｋ、３３９Ｍ、３３９Ｎ、３３９Ｑ、３３９Ｒ、３３９Ｓ、３３９Ｔ、３７６Ａ、３７６Ｖ、３７７Ｇ、３７７Ｋ、３７９Ｎ、３８０Ｎ、３８０Ｓ、３８２Ａ、３８２Ｉ、３８５Ｅ、４２７Ｎ、４２９Ｍ、４３４Ｗ、４３６Ｉ、４４０Ｇ、４４０Ｈ、４４０Ｉ、又は４４０Ｌ  ［好ましくは、２４７Ａ、２４７Ｆ、２４７Ｍ、２４７Ｔ、２４７Ｖ、２４７Ｙ、２５４Ｆ、２５４Ｙ、２５８Ｄ、２７９Ａ、２８３Ｍ、２８８Ｎ、２９２Ａ、３１１Ｄ、３１１Ｎ、３１１Ｔ、３１５Ｌ、３１８Ｎ、３１８Ｐ、３１８Ｔ、３１８Ｖ、３３９Ｄ、３３９Ｉ、３３９Ｋ、３３９Ｍ、３３９Ｎ、３３９Ｑ、３３９Ｒ、３３９Ｓ、３７６Ａ、３７６Ｖ、３７７Ｋ、３７９Ｎ、３８０Ｎ、３８２Ａ、４４０Ｉ、又は４４０Ｌ］。この方法によって、変異Ｆｃ領域をコードする核酸分子に、上記の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように（例えば、母体Ｆｃ領域又は天然のＦｃ領域をコードする核酸分子から）設計され、更に、追加的な抗体をコードする核酸（例えば、Ｉｇ重鎖の残部をコードする核酸配列）と作動可能な状態で付着される。また、この方法は、その後、追加的な抗体をコードする核酸に、（即ち、上記に列挙される少なくとも１つのアミノ酸置換の導入後の）変異Ｆｃ領域をコードする核酸に作動可能な状態で付着されることを更に含む。この方法は、変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体の発現及び精製も含む。この方法は、母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体の発現及び精製も含む。この方法は、当該技術で利用される方法、又は本願明細書に記載の方法によって、変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体のＡＤＣＣ活性、及び母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体の活性を測定することも含む。この方法は、母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体より大きい（即ち、好ましくは、５％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％以上大きい）ＡＤＣＣ活性を有する変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体を選択することも含む。本発明は、モノクローナル抗体又はその機能性フラグメントを更に具現化し、その方法によって生成される変異Ｆｃ領域を含む。
【００２９】
一実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体、好ましくは治療用モノクローナル抗体（又はその機能性フラグメント）のＡＤＣＣ活性を減少させる方法を提供し、少なくとも１つの以下のアミノ酸置換を含む変異Ｆｃ領域をコードする核酸を含む核酸を設計することを含む。２３５Ｑ、２３５Ｒ、２３５Ｓ、２３６Ｆ、２３６Ｒ、２３６Ｙ、２３７Ｅ、２３７Ｋ、２３７Ｎ、２３７Ｒ、２３８Ｅ、２３８Ｇ、２３８Ｈ、２３８Ｉ、２３８Ｌ、２３８Ｖ、２３８Ｗ、２３８Ｙ、２４７Ｇ、２４７Ｒ、２４９Ｌ、２４９Ｐ、２５０Ｋ、２５０Ｍ、２５０Ｒ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｗ、２５２Ｙ、２５４Ｌ、２５４Ｐ、Ｓ２５４Ｑ、２５４Ｔ、２５４Ｖ、２５６Ｖ、２５７Ａ、２５７Ｉ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｓ、２５７Ｖ、２６０Ｓ、２６２Ｌ、２６４Ｓ、２６５Ｈ、２６５Ｋ、２６５Ｓ、２６７Ｇ、Ｓ２６７Ｈ、２６７Ｉ、２６７Ｋ、２６９Ｎ、２６９Ｑ、２７０Ａ、２７０Ｇ、２７０Ｋ、２７０Ｍ、２７０Ｎ、２７１Ｔ、２７２Ｈ、２７２Ｋ、２７２Ｌ、２７２Ｎ、２７２Ｒ、２７９Ｄ、２７９Ｆ、２７９Ｋ、２７９Ｌ、２７９Ｗ、２８３Ｄ、２８３Ｆ、２８３Ｇ、２８３Ｈ、２８３Ｌ、２８３Ｔ、２８３Ｗ、２８３Ｙ、２８５Ｎ、２８８Ｐ、２９２Ｅ、２９２Ｆ、２９２Ｇ、２９２Ｉ、２９３Ｓ、２９３Ｖ、３０１Ｗ、３０４Ｅ、３０７Ａ、３０７Ｅ、３０７Ｍ、３１１Ｆ、３１１Ｉ、３１１Ｋ、３１１Ｓ、３１２Ｐ、３１４Ｆ、３１４Ｉ、３１４Ｖ、３１４Ｗ、３１５Ｆ、３１５Ｐ、３１６Ｆ、３１７Ｐ、３２７Ｔ、３２８Ｖ、３２９Ｙ、３３２Ｇ、３３２Ｋ、３３２Ｌ、３３２Ｒ、３３２Ｗ、３４１Ｄ、３４１Ｅ、３４１Ｆ、３４１Ｈ、３４１Ｉ、３４１Ｋ、３４１Ｌ、３４１Ｍ、３４１Ｎ、３４１Ｐ、３４１Ｑ、３４１Ｒ、３４１Ｓ、３４１Ｔ、３４１Ｗ、３４１Ｙ、３４３Ａ、３４３Ｄ、３４３Ｅ、３４３Ｆ、３４３Ｇ、３４３Ｈ、３４３Ｌ、３４３Ｍ、３４３Ｎ、３４３Ｑ、３４３Ｒ、３４３Ｓ、３４３Ｔ、３４３Ｖ、３４３Ｗ、３４３Ｙ、３７３Ａ、３７３Ｄ、３７３Ｅ、３７３Ｆ、３７３Ｇ、３７３Ｉ、３７３Ｋ、３７３Ｌ、３７３Ｍ、３７３Ｎ、３７３Ｑ、３７３Ｒ、３７３Ｓ、３７３Ｔ、３７３Ｖ、３７３Ｗ、３７５Ｒ、３７６Ａ、３７６Ｅ、３７６Ｆ、３７６Ｇ、３７６Ｈ、３７６Ｗ、３７６Ｙ、３７９Ｑ、３８２Ｄ、３８２Ｓ、４２９Ａ、４２９Ｆ、４３０Ｈ、４３０Ｋ、４３０Ｎ、４３０Ｑ、４３０Ｒ、４３０Ｗ、４３２Ｒ、４３２Ｓ、４３４Ｉ、４４０Ｄ、４４０Ｔ、４４０Ｖ、又は４４２Ｋ  ［好ましくは、２３５Ｒ、２３６Ｆ、２３６Ｒ、２３６Ｙ、２３７Ｅ、２３７Ｋ、２３７Ｎ、２３７Ｒ、２３８Ｅ、２３８Ｇ、２３８Ｈ、２３８Ｉ、２３８Ｌ、２３８Ｖ、２３８Ｗ、２３８Ｙ、２４７Ｒ、２４９Ｐ、２５０Ｋ、２５１Ｈ、２５４Ｔ、２５７Ｉ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｓ、２５７Ｖ、２６５Ｈ、２６５Ｋ、２６５Ｓ、２６７Ｇ、２６７Ｈ、２６７Ｉ、２６７Ｋ、２６９Ｎ、２６９Ｑ、２７０Ａ、２７０Ｇ、２７０Ｋ、２７０Ｍ、２７０Ｎ、２７１Ｔ、２７２Ｒ、２８８Ｐ、２９２Ｅ、３０１Ｗ、３０４Ｅ、３１６Ｆ、３１７Ｐ、３２７Ｔ、３２９Ｙ、３３２Ｋ、３３２Ｒ、３４１Ｆ、３４１Ｉ、３４１Ｍ、３４１Ｐ、３４１Ｑ、３４１Ｒ、３４１Ｔ、３４１Ｗ、３４���Ｙ、３４３Ｗ、３７３Ａ、３７３Ｅ、３７３Ｇ、３７３Ｓ、３７６Ｗ、４２９Ａ、４３２Ｒ、又は４３２Ｓ］。この方法によって、変異Ｆｃ領域をコードする核酸分子は、上記の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように（例えば、母体Ｆｃ領域又は天然のＦｃ領域をコードする核酸分子から）設計され、更に、追加的な抗体をコードする核酸（例えば、Ｉｇ重鎖の残部をコードする核酸配列）に作動可能な状態で付着される。また、この方法は、その後、追加的な抗体をコードする核酸に、（即ち、上記に列挙される少なくとも１つのアミノ酸置換の導入後の）変異Ｆｃ領域をコードする核酸を作動可能な状態で付着されることを更に含む。この方法は、変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体の発現及び精製も含む。この方法は、当該技術で利用される方法、又は本願明細書に記載の方法によって、変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体のＡＤＣＣ活性、及び母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体の活性を測定することも含む。この方法は、母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体より少ない（即ち、好ましくは、５％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％以上少ない）ＡＤＣＣ活性を有する変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体を選択することを更に含む。本発明はモノクローナル抗体又はその機能性フラグメントを更に具現化し、その方法によって生成される変異Ｆｃ領域を含む。
【００３０】
一実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体、好ましくは治療用モノクローナル抗体（又はその機能性フラグメント）のＦｃＲｎ結合親和性を増加させる方法を提供し、少なくとも１つの以下のアミノ酸置換を含む変異Ｆｃ領域をコードする核酸を含む核酸を設計することを含む。２３８Ｌ、２４４Ｌ、２４５Ｒ、２４９Ｐ、２５２Ｙ、２５６Ｐ、２５７Ａ、２５７Ｉ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｓ、２５７Ｖ、２５８Ｄ、２６０Ｓ、２６２Ｌ、２７０Ｋ、２７２Ｌ、２７２Ｒ、２７９Ａ、２７９Ｄ、２７９Ｇ、２７９Ｈ、２７９Ｍ、２７９Ｎ、２７９Ｑ、２７９Ｒ、２７９Ｓ、２７９Ｔ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、２８３Ａ、２８３Ｄ、２８３Ｆ、２８３Ｇ、２８３Ｈ、２８３Ｉ、２８３Ｋ、２８３Ｌ、２８３Ｎ、２８３Ｐ、２８３Ｑ、２８３Ｒ、２８３Ｓ、２８３Ｔ、２８３Ｗ、２８３Ｙ、２８５Ｎ、２８６Ｆ、２８８Ｎ、２８８Ｐ、２９３Ｖ、３０７Ａ、３０７Ｅ、３０７Ｍ、３１１Ａ、３１１Ｉ、３１１Ｋ、３１１Ｌ、３１１Ｍ、３１１Ｖ、３１１Ｗ、３１２Ｐ、３１６Ｋ、３１７Ｐ、３１８Ｎ、３１８Ｔ、３３２Ｆ、３３２Ｈ、３３２Ｋ、３３２Ｌ、３３２Ｍ、３３２Ｒ、３３２Ｓ、３３２Ｗ、３３９Ｎ、３３９Ｔ、３３９Ｗ、３４１Ｐ、３４３Ｅ、３４３Ｈ、３４３Ｋ、３４３Ｑ、３４３Ｒ、３４３Ｔ、３４３Ｙ、３７５Ｒ、３７６Ｇ、３７６Ｉ、３７６Ｍ、３７６Ｐ、３７６Ｔ、３７６Ｖ、３７７Ｋ、３７８Ｄ、３７８Ｎ、３８０Ｎ、３８０Ｓ、３８０Ｔ、３８２Ｆ、３８２Ｈ、３８２Ｉ、３８２Ｋ、３８２Ｌ、３８２Ｍ、３８２Ｎ、３８２Ｑ、３８２Ｒ、３８２Ｓ、３８２Ｔ、３８２Ｖ、３８２Ｗ、３８２Ｙ、４２３Ｎ、４２７Ｎ、４３０Ａ、４３０Ｆ、４３０Ｇ、４３０Ｈ、４３０Ｉ、４３０Ｋ、４３０Ｌ、４３０Ｍ、４３０Ｎ、４３０Ｑ、４３０Ｒ、４３０Ｓ、４３０Ｔ、４３０Ｖ、４３０Ｙ、４３１Ｈ、４３１Ｋ、４３４Ｆ、４３４Ｇ、４３４Ｈ、４３４Ｗ、４３４Ｙ、４３６Ｉ、４３６Ｌ、４３６Ｔ、４３８Ｋ、４３８Ｌ、４３８Ｔ、４３８Ｗ、４４０Ｋ、又は４４２Ｋ  ［好ましくは、２４５Ｒ、２５２Ｙ、２５６Ｐ、２５７Ａ、２５７Ｉ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｓ、２５７Ｖ、２５８Ｄ、２６２Ｌ、２７９Ａ、２７９Ｄ、２７９Ｇ、２７９Ｈ、２７９Ｎ、２７９Ｑ、２７９Ｓ、２７９Ｔ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、２８３Ｆ、２８３Ｈ、２８３Ｋ、２８３Ｒ、２８５Ｎ、２８６Ｆ、３０７Ａ、３０７Ｅ、３０７Ｍ、３１１Ｉ、３１１Ｋ、３１１Ｌ、３１１Ｍ、３１２Ｐ、３１８Ｎ、３１８Ｔ、３３２Ｓ、３３９Ｗ、３４３Ｅ、３４３Ｈ、３４３Ｋ、３４３Ｑ、３４３Ｒ、３７５Ｒ、３７７Ｋ、３７８Ｄ、３７８Ｎ、３８０Ｓ、３８０Ｔ、３８２Ｆ、３８２Ｋ、３８２Ｑ、３８２Ｒ、３８２Ｓ、３８２Ｔ、３８２Ｖ、３８２Ｗ、３８２Ｙ、４２３Ｎ、４２７Ｎ、４３０Ａ、４３０Ｆ、４３０Ｈ、４３０Ｉ、４３０Ｌ、４３０Ｍ、４３０Ｎ、４３０Ｑ、４３０Ｒ、４３０Ｓ、４３０Ｖ、４３０Ｙ、４３１Ｈ、４３１Ｋ、４３４Ｆ、４３４Ｇ、４３４Ｈ、４３４Ｗ、４３４Ｙ、４３６Ｉ、４３６Ｌ、４３８Ｋ、４３８Ｌ、又は４３８Ｗ］。この方法によって、変異Ｆｃ領域をコードする核酸分子は、上記の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように（例えば、母体Ｆｃ領域又は天然のＦｃ領域をコー���する核酸分子から）設計され、更に、追加的な抗体をコードする核酸（例えば、Ｉｇ重鎖の残部をコードする核酸配列）に作動可能な状態で付着される。また、この方法は、その後、追加的な抗体をコードする核酸に、（即ち、上記に列挙される少なくとも１つのアミノ酸置換の導入後の）変異Ｆｃ領域をコードする核酸を作動可能な状態で付着されることを更に含む。この方法は、変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体の発現及び精製も含む。この方法は、母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体の発現及び精製も含む。方法は、当該技術で利用される方法、又は本願明細書に記載の方法によって、変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体のＦｃＲｎ結合親和性、及び母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体の活性を測定することを更に含む。方法は、母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体より大きい（即ち、好ましくは、５％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％以上大きい）ＦｃＲｎ結合親和性を有する変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体を選択することを更に含む。更なる本発明はモノクローナル抗体又はその機能性フラグメントを具現化し、その方法によって生成される変異Ｆｃ領域を含む。
【００３１】
一実施形態において、本発明は、ポリペプチド（好ましくは治療用ポリペプチド）のインビボ血清半減期を増加させる方法を提供し、以下のアミノ酸置換の少なくとも１つを含む変異Ｆｃ領域をコードする核酸を含む核酸を設計することを含む。２３８Ｌ、２４４Ｌ、２４５Ｒ、２４９Ｐ、２５２Ｙ、２５６Ｐ、２５７Ａ、２５７Ｉ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｓ、２５７Ｖ、２５８Ｄ、２６０Ｓ、２６２Ｌ、２７０Ｋ、２７２Ｌ、２７２Ｒ、２７９Ａ、２７９Ｄ、２７９Ｇ、２７９Ｈ、２７９Ｍ、２７９Ｎ、２７９Ｑ、２７９Ｒ、２７９Ｓ、２７９Ｔ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、２８３Ａ、２８３Ｄ、２８３Ｆ、２８３Ｇ、２８３Ｈ、２８３Ｉ、２８３Ｋ、２８３Ｌ、２８３Ｎ、２８３Ｐ、２８３Ｑ、２８３Ｒ、２８３Ｓ、２８３Ｔ、２８３Ｗ、２８３Ｙ、２８５Ｎ、２８６Ｆ、２８８Ｎ、２８８Ｐ、２９３Ｖ、３０７Ａ、３０７Ｅ、３０７Ｍ、３１１Ａ、３１１Ｉ、３１１Ｋ、３１１Ｌ、３１１Ｍ、３１１Ｖ、３１１Ｗ、３１２Ｐ、３１６Ｋ、３１７Ｐ、３１８Ｎ、３１８Ｔ、３３２Ｆ、３３２Ｈ、３３２Ｋ、３３２Ｌ、３３２Ｍ、３３２Ｒ、３３２Ｓ、３３２Ｗ、３３９Ｎ、３３９Ｔ、３３９Ｗ、３４１Ｐ、３４３Ｅ、３４３Ｈ、３４３Ｋ、３４３Ｑ、３４３Ｒ、３４３Ｔ、３４３Ｙ、３７５Ｒ、３７６Ｇ、３７６Ｉ、３７６Ｍ、３７６Ｐ、３７６Ｔ、３７６Ｖ、３７７Ｋ、３７８Ｄ、３７８Ｎ、３８０Ｎ、３８０Ｓ、３８０Ｔ、３８２Ｆ、３８２Ｈ、３８２Ｉ、３８２Ｋ、３８２Ｌ、３８２Ｍ、３８２Ｎ、３８２Ｑ、３８２Ｒ、３８２Ｓ、３８２Ｔ、３８２Ｖ、３８２Ｗ、３８２Ｙ、４２３Ｎ、４２７Ｎ、４３０Ａ、４３０Ｆ、４３０Ｇ、４３０Ｈ、４３０Ｉ、４３０Ｋ、４３０Ｌ、４３０Ｍ、４３０Ｎ、４３０Ｑ、４３０Ｒ、４３０Ｓ、４３０Ｔ、４３０Ｖ、４３０Ｙ、４３１Ｈ、４３１Ｋ、４３４Ｆ、４３４Ｇ、４３４Ｈ、４３４Ｗ、４３４Ｙ、４３６Ｉ、４３６Ｌ、４３６Ｔ、４３８Ｋ、４３８Ｌ、４３８Ｔ、４３８Ｗ、４４０Ｋ、又は４４２Ｋ、［好ましくは、２４５Ｒ、２５２Ｙ、２５６Ｐ、２５７Ａ、２５７Ｉ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｓ、２５７Ｖ、２５８Ｄ、２６２Ｌ、２７９Ａ、２７９Ｄ、２７９Ｇ、２７９Ｈ、２７９Ｎ、２７９Ｑ、２７９Ｓ、２７９Ｔ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、２８３Ｆ、２８３Ｈ、２８３Ｋ、２８３Ｒ、２８５Ｎ、２８６Ｆ、３０７Ａ、３０７Ｅ、３０７Ｍ、３１１Ｉ、３１１Ｋ、３１１Ｌ、３１１Ｍ、３１２Ｐ、３１８Ｎ、３１８Ｔ、３３２Ｓ、３３９Ｗ、３４３Ｅ、３４３Ｈ、３４３Ｋ、３４３Ｑ、３４３Ｒ、３７５Ｒ、３７７Ｋ、３７８Ｄ、３７８Ｎ、３８０Ｓ、３８０Ｔ、３８２Ｆ、３８２Ｋ、３８２Ｑ、３８２Ｒ、３８２Ｓ、３８２Ｔ、３８２Ｖ、３８２Ｗ、３８２Ｙ、４２３Ｎ、４２７Ｎ、４３０Ａ、４３０Ｆ、４３０Ｈ、４３０Ｉ、４３０Ｌ、４３０Ｍ、４３０Ｎ、４３０Ｑ、４３０Ｒ、４３０Ｓ、４３０Ｖ、４３０Ｙ、４３１Ｈ、４３１Ｋ、４３４Ｆ、４３４Ｇ、４３４Ｈ、４３４Ｗ、４３４Ｙ、４３６Ｉ、４３６Ｌ、４３８Ｋ、４３８Ｌ、又は４３８Ｗ］。変異Ｆｃ領域をコードする核酸分子は、治療用タンパク質をコードする核酸分子に、作動可能な状態で結合される。この方法によって、変異Ｆｃ領域をコードする核酸分子は、上記の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように、（例えば、母体Ｆｃ領域又は天然のＦｃ領域をコードする核酸分子から）設計され、更に、追加的なポリペプチドをコードする核酸（例えば、融合タンパク質の非Ｆｃ領域をコードする核酸配列）に作動可能な状態で付着される。また、この方法は、非Ｆｃ融合パートナーをコードする核酸に上記に列挙される少なくとも１つのアミノ酸置換の導入後の変異Ｆｃ領域をコードする核酸に、その後作動可能な状態で付着されることを更に含む。この方法は、変異Ｆｃ領域を含むポリペプチドの発現及び精製も含む。この方法は、母体Ｆｃ領域を含むポリペプチドの発現及び精製も含む。この方法は、当該技術で利用される方法、又は本願明細書に記載の方法によって、変異Ｆｃ領域を含むポリペプチド、及び母体Ｆｃ領域を含むポリペプチドのインビボ血清半減期を測定することも含む。この方法は、変異Ｆｃ領域を含むポリペプチドを選択することを更に含み、該ポリペプチドが、母体Ｆｃ領域を含むポリペプチドに比べて増加した（即ち、好ましくは、少なくとも５％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％以上増加した）血清半減期を有する。本発明は、方法によって生成される変異Ｆｃ領域を含むポリペプチド（即ち、融合ポリペプチド）を更に具現化する。
【００３２】
一実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体、好ましくは治療用モノクローナル抗体（又はその機能性フラグメント）のＦｃＲｎ結合親和性を減少させる方法を提供し、少なくとも１つの以下のアミノ酸置換を含む変異Ｆｃ領域をコードする核酸を設計することを含む。２３５Ｑ、２３６Ｙ、２３７Ｋ、２３７Ｒ、２３８Ｅ、２３８Ｇ、２３８Ｈ、２３８Ｗ、２４７Ａ、２４７Ｄ、２４７Ｅ、２４７Ｆ、２４７Ｇ、２４７Ｈ、２４７Ｉ、２４７Ｌ、２４７Ｍ、２４７Ｎ、２４７Ｑ、２４７Ｒ、２４７Ｓ、２４７Ｗ、２４７Ｙ、２４８Ａ、２４８Ｆ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｗ、２４９Ｅ、２４９Ｌ、２４９Ｍ、２４９Ｙ、２５１Ｆ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｗ、２５４Ｄ、２５４Ｅ、２５４Ｆ、２５４Ｇ、２５４Ｈ、２５４Ｉ、２５４Ｋ、２５４Ｌ、２５４Ｍ、２５４Ｎ、２５４Ｐ、２５４Ｑ、２５４Ｒ、２５４Ｔ、２５４Ｖ、２５４Ｗ、２５４Ｙ、２５５Ｋ、２５５Ｎ、２５６Ｆ、２５６Ｈ、２５６Ｉ、２５６Ｋ、２５６Ｍ、２５６Ｒ、２５６Ｗ、２５６Ｙ、２６４Ｓ、２６５Ｓ、２６５Ｙ、Ｓ２６７Ｇ、２６７Ｉ、２６８Ｄ、２６８Ｋ、２７０Ａ、２７０Ｍ、２７９Ｉ、２７９Ｋ、２７９Ｌ、２８０Ｔ、２９２Ｅ、２９２Ｆ、２９２Ｇ、２９２Ｉ、２９２Ｌ、３１１Ｄ、３１１Ｅ、３１１Ｆ、３１１Ｇ、３１１Ｎ、３１１Ｒ、３１１Ｙ、３１５Ｆ、３１５Ｋ、３１５Ｐ、３１６Ｆ、３１７Ｔ、３２６Ｗ、３２７Ｔ、３３９Ｅ、３３９Ｇ、３３９Ｌ、３３９Ｒ、３４１Ｄ、３４１Ｅ、３４１Ｆ、３４１Ｉ、３４１Ｋ、３４１Ｌ、３４１Ｍ、３４１Ｎ、３４１Ｑ、３４１Ｒ、３４１Ｓ、３４１Ｔ、３４１Ｖ、３４１Ｗ、３４１Ｙ、３４３Ｍ、３４３Ｖ、３４３Ｗ、３７３Ａ、３７３Ｄ、３７３Ｇ、３７３Ｋ、３７３Ｌ、３７３Ｍ、３７３Ｎ、３７３Ｑ、３７３Ｓ、３７３Ｔ、３７３Ｖ、３７３Ｗ、３７６Ｈ、３７６Ｌ、３７６Ｗ、３７６Ｙ、４２４Ｍ、４２４Ｖ、４２６Ｄ、４２９Ａ、４２９Ｆ、４２９Ｍ、４３０Ｄ、４３０Ｗ、４３１Ｐ、４３２Ｒ、４３２Ｓ、４３４Ｉ、４３９Ｑ、４４０Ａ、４４０Ｄ、４４０Ｅ、４４０Ｆ、又は４４０Ｍ  ［好ましくは、２３７Ｒ、２４７Ｄ、２４７Ｅ、２４７Ｆ、２４７Ｈ、２４７Ｌ、２４７Ｍ、２４７Ｎ、２４７Ｑ、２４７Ｗ、２４７Ｙ、２４８Ａ、２４８Ｆ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｑ、２４９Ｌ、２４９Ｍ、２４９Ｙ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｗ、２５４Ｄ、２５４Ｅ、２５４Ｆ、２５４Ｇ、２５４Ｈ、２５４Ｉ、２５４Ｋ、２５４Ｍ、２５４Ｎ、２５４Ｐ、２５４Ｒ、２５４Ｔ、２５４Ｖ、２５４Ｗ、２５４Ｙ、２５５Ｋ、２５５Ｎ、２５６Ｆ、２５６Ｈ、２５６Ｋ、２５６Ｍ、２５６Ｒ、２５６Ｗ、２６５Ｙ、２８０Ｔ、２９２Ｇ、２９２Ｉ、３１１Ｄ、３１１Ｅ、３１１Ｇ、３１１Ｎ、３１５Ｆ、３１５Ｐ、３１６Ｔ、３１７Ｔ、３２７Ｔ、３４１Ｄ、３４１Ｅ、３４１Ｆ、３４１Ｌ、３４１Ｙ、３４３Ｗ、３７３Ａ、３７３Ｇ、３７３Ｍ、３７３Ｑ、３７６Ｗ、３７６Ｙ、４２４Ｍ、４２４Ｖ、４３０Ｄ、４３０Ｗ、４３１Ｐ、又は４３２Ｓ］。この方法によって、変異Ｆｃ領域をコードする核酸分子は、上記の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように、（例えば、母体Ｆｃ領域又は天然のＦｃ領域をコードする核酸分子から）設計され、変異Ｆ���領域をコードする核酸分子は、追加的な抗体配列をコードする核酸（例えば、Ｉｇ重鎖の残部をコードする核酸配列）に作動可能な状態で付着される。また、この方法は、その後、追加的な抗体をコードする核酸に、上記に列挙される少なくとも１つのアミノ酸置換の導入後の変異Ｆｃ領域をコードする核酸を作動可能な状態で付着されることを更に含む。この方法は、変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体の発現及び精製も含む。この方法は、母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体の発現及び精製も含む。この方法は、当該技術で利用される方法、又は本願明細書に記載の方法によって、変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体のＦｃＲｎ結合親和性、及び母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体の活性を測定することも含む。この方法は、母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体より少ない（即ち、好ましくは、５％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％以上少ない）ＦｃＲｎ結合親和性を有する変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体を選択することを更に含む。本発明は、その方法によって生成される（変異Ｆｃ領域を含む）モノクローナル抗体を更に具現化する。
【００３３】
別の実施形態において、本発明は、ポリペプチド（好ましくは治療用ポリペプチド）のインビボ血清半減期を減少させる方法を提供し、以下のアミノ酸置換の少なくとも１つを含む変異Ｆｃ領域をコードする核酸を設計することを含む。２３５Ｑ、２３６Ｙ、２３７Ｋ、２３７Ｒ、２３８Ｅ、２３８Ｇ、２３８Ｈ、２３８Ｗ、２４７Ａ、２４７Ｄ、２４７Ｅ、２４７Ｆ、２４７Ｇ、２４７Ｈ、２４７Ｉ、２４７Ｌ、２４７Ｍ、２４７Ｎ、２４７Ｑ、２４７Ｒ、２４７Ｓ、２４７Ｗ、２４７Ｙ、２４８Ａ、２４８Ｆ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｗ、２４９Ｅ、２４９Ｌ、２４９Ｍ、２４９Ｙ、２５１Ｆ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｗ、２５４Ｄ、２５４Ｅ、２５４Ｆ、２５４Ｇ、２５４Ｈ、２５４Ｉ、２５４Ｋ、２５４Ｌ、２５４Ｍ、２５４Ｎ、２５４Ｐ、２５４Ｑ、２５４Ｒ、２５４Ｔ、２５４Ｖ、２５４Ｗ、２５４Ｙ、２５５Ｋ、２５５Ｎ、２５６Ｆ、２５６Ｈ、２５６Ｉ、２５６Ｋ、２５６Ｍ、２５６Ｒ、２５６Ｗ、２５６Ｙ、２６４Ｓ、２６５Ｓ、２６５Ｙ、Ｓ２６７Ｇ、２６７Ｉ、２６８Ｄ、２６８Ｋ、２７０Ａ、２７０Ｍ、２７９Ｉ、２７９Ｋ、２７９Ｌ、２８０Ｔ、２９２Ｅ、２９２Ｆ、２９２Ｇ、２９２Ｉ、２９２Ｌ、３１１Ｄ、３１１Ｅ、３１１Ｆ、３１１Ｇ、３１１Ｎ、３１１Ｒ、３１１Ｙ、３１５Ｆ、３１５Ｋ、３１５Ｐ、３１６Ｆ、３１７Ｔ、３２６Ｗ、３２７Ｔ、３３９Ｅ、３３９Ｇ、３３９Ｌ、３３９Ｒ、３４１Ｄ、３４１Ｅ、３４１Ｆ、３４１Ｉ、３４１Ｋ、３４１Ｌ、３４１Ｍ、３４１Ｎ、３４１Ｑ、３４１Ｒ、３４１Ｓ、３４１Ｔ、３４１Ｖ、３４１Ｗ、３４１Ｙ、３４３Ｍ、３４３Ｖ、３４３Ｗ、３７３Ａ、３７３Ｄ、３７３Ｇ、３７３Ｋ、３７３Ｌ、３７３Ｍ、３７３Ｎ、３７３Ｑ、３７３Ｓ、３７３Ｔ、３７３Ｖ、３７３Ｗ、３７６Ｈ、３７６Ｌ、３７６Ｗ、３７６Ｙ、４２４Ｍ、４２４Ｖ、４２６Ｄ、４２９Ａ、４２９Ｆ、４２９Ｍ、４３０Ｄ、４３０Ｗ、４３１Ｐ、４３２Ｒ、４３２Ｓ、４３４Ｉ、４３９Ｑ、４４０Ａ、４４０Ｄ、４４０Ｅ、４４０Ｆ、又は４４０Ｍ  ［好ましくは、２３７Ｒ、２４７Ｄ、２４７Ｅ、２４７Ｆ、２４７Ｈ、２４７Ｌ、２４７Ｍ、２４７Ｎ、２４７Ｑ、２４７Ｗ、２４７Ｙ、２４８Ａ、２４８Ｆ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｑ、２４９Ｌ、２４９Ｍ、２４９Ｙ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｗ、２５４Ｄ、２５４Ｅ、２５４Ｆ、２５４Ｇ、２５４Ｈ、２５４Ｉ、２５４Ｋ、２５４Ｍ、２５４Ｎ、２５４Ｐ、２５４Ｒ、２５４Ｔ、２５４Ｖ、２５４Ｗ、２５４Ｙ、２５５Ｋ、２５５Ｎ、２５６Ｆ、２５６Ｈ、２５６Ｋ、２５６Ｍ、２５６Ｒ、２５６Ｗ、２６５Ｙ、２８０Ｔ、２９２Ｇ、２９２Ｉ、３１１Ｄ、３１１Ｅ、３１１Ｇ、３１１Ｎ、３１５Ｆ、３１５Ｐ、３１６Ｔ、３１７Ｔ、３２７Ｔ、３４１Ｄ、３４１Ｅ、３４１Ｆ、３４１Ｌ、３４１Ｙ、３４３Ｗ、３７３Ａ、３７３Ｇ、３７３Ｍ、３７３Ｑ、３７６Ｗ、３７６Ｙ、４２４Ｍ、４２４Ｖ、４３０Ｄ、４３０Ｗ、４３１Ｐ、又は４３２Ｓ］。Ｆｃ変異体領域をコードする核酸は、治療用タンパク質をコードする核酸に作動可能な状態で結合される。この方法によって、変異Ｆｃ領域をコードする核酸分子は、上記の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように、（例えば、母体Ｆｃ領域又���天然のＦｃ領域をコードする核酸分子から）設計され、核酸分子は、追加的なポリペプチドをコードする核酸（例えば、融合タンパク質の非Ｆｃ領域をコードする核酸配列）に作動可能な状態で付着される。また、この方法は、非Ｆｃ融合パートナーをコードする核酸に上記に列挙される少なくとも１つのアミノ酸置換の導入後の変異Ｆｃ領域をコードする核酸に、その後作動可能な状態で付着されることを更に含む。この方法は、変異Ｆｃ領域を含むポリペプチドの発現及び精製も含む。この方法は、母体Ｆｃ領域を含むポリペプチドの発現及び精製も含む。この方法は、当該技術で利用される方法、又は本願明細書に記載の方法によって、変異Ｆｃ領域を含むポリペプチド、及び母体Ｆｃ領域を含むポリペプチドのインビボ血清半減期を測定することも含む。この方法は、変異Ｆｃ領域を含むポリペプチドを選択することを更に含み、該ポリペプチドが、母体Ｆｃ領域を含むポリペプチドに比べて減少した（即ち、好ましくは、少なくとも５％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％以上減少した）血清半減期を有する。本発明は、方法によって生成される変異Ｆｃ領域を含むポリペプチド（即ち、融合ポリペプチド）を更に具現化する。
【００３４】
別の実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体、好ましくは治療用モノクローナル抗体のＣＤＣ活性を増加させる方法を提供し、以下のアミノ酸置換の少なくとも１つを含むように抗体のＦｃ領域を構築することを含む。２３６Ｙ、２４４Ｌ、２４７Ａ、２４７Ｄ、２４７Ｅ、２４７Ｇ、２４７Ｎ、２４７Ｑ、２４７Ｒ、２４７Ｓ、２４７Ｗ、２４８Ｆ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｗ、２４９Ｅ、２４９Ｌ、２４９Ｍ、２４９Ｎ、２４９Ｐ、２４９Ｙ、２５０Ｋ、２５０Ｒ、２５１Ｆ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｗ、２５４Ａ、２５４Ｆ、２５４Ｋ、２５４Ｌ、２５４Ｍ、２５４Ｒ、２５４Ｙ、２５５Ｋ、２５６Ａ、２５６Ｇ、２５６Ｉ、２５６Ｌ、２５６Ｍ、２５６Ｐ、２５６Ｑ、２５６Ｗ、２５６Ｙ、２６０Ｓ、２６８Ｄ、２７９Ｑ、２７９Ｓ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、２８０Ｋ、２８０Ｔ、２８３Ｆ、２８３Ｇ、２８３Ｈ、２８３Ｉ、２８３Ｋ、２８３Ｌ、２８３Ｍ、２８３Ｎ、２８３Ｐ、２８３Ｒ、２８３Ｓ、２８３Ｗ、２９２Ｌ、３０７Ａ、３０７Ｍ、３１１Ｆ、３１１Ｉ、３１１Ｋ、３１１Ｌ、３１１Ｍ、３１１Ｔ、３１１Ｖ、３１１Ｗ、３１１Ｙ、３１２Ｐ、３１４Ｆ、３１４Ｉ、３１４Ｖ、３１４Ｗ、３１４Ｙ、３１５Ｆ、３１５Ｋ、３１５Ｌ、３１５Ｐ、３１５Ｒ、３１６Ｋ、３１７Ｐ、３１７Ｔ、３１８Ｎ、３１８Ｔ、３３２Ａ、３３２Ｄ、３３２Ｅ、３３２Ｆ、３３２Ｇ、３３２Ｈ、３３２Ｌ、３３２Ｍ、３３２Ｎ、３３２Ｑ、３３２Ｓ、３３２Ｔ、３３２Ｖ、３３２Ｗ、３３２Ｙ、３３９Ｄ、３３９Ｆ、３３９Ｇ、３３９Ｈ、３３９Ｉ、３３９Ｋ、３３９Ｎ、３３９Ｑ、３３９Ｒ、３３９Ｓ、３３９Ｔ、３３９Ｗ、３３９Ｙ、３４１Ｄ、３４１Ｅ、３４１Ｆ、３４１Ｈ、３４１Ｉ、３４１Ｋ、３４１Ｌ、３４１Ｍ、３４１Ｎ、３４１Ｐ、３４１Ｑ、３４１Ｒ、３４１Ｓ、３４１Ｔ、３４１Ｖ、３４１Ｗ、３４１Ｙ、３４３Ａ、３４３Ｄ、３４３Ｅ、３４３Ｇ、３４３Ｈ、３４３Ｋ、３４３Ｌ、３４３Ｍ、３４３Ｎ、３４３Ｑ、３４３Ｒ、３４３Ｓ、３４３Ｔ、３４３Ｗ、３４３Ｙ、３７３Ｄ、３７３Ｅ、３７３Ｆ、３７３Ｈ、３７３Ｉ、３７３Ｋ、３７３Ｌ、３７３Ｍ、３７３Ｎ、３７３Ｑ、３７３Ｒ、３７３Ｔ、３７３Ｖ、３７３Ｗ、３７５Ｒ、３７６Ａ、３７６Ｆ、３７６Ｇ、３７６Ｈ、３７６Ｌ、３７６Ｎ、３７６Ｐ、３７６Ｑ、３７６Ｒ、３７６Ｓ、３７６Ｔ、３７６Ｖ、３７７Ｐ、３７９Ｎ、３７９Ｑ、３７９Ｓ、３７９Ｔ、３８０Ａ、３８０Ｎ、３８０Ｓ、３８０Ｔ、３８２Ｉ、３８２Ｌ、３８２Ｑ、３８２Ｖ、３８６Ｋ、４２６Ｄ、４２６Ｌ、４２９Ａ、４２９Ｆ、４２９Ｍ、４３０Ａ、４３０Ｄ、４３０Ｆ、４３０Ｇ、４３０Ｈ、４３０Ｉ、４３０Ｋ、４３０Ｌ、４３０Ｍ、４３０Ｎ、４３０Ｐ、４３０Ｒ、４３０Ｓ、４３０Ｔ、４３０Ｖ、４３０Ｗ、４３０Ｙ、４３１Ｈ、４３１Ｐ、４３２Ｒ、４３２Ｓ、４３４Ｗ、４３４Ｙ、４３８Ｌ、４３８Ｗ、４４０Ｑ、又は４４０Ｙ  ［好ましくは、２３６Ｙ、２４８Ｆ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｗ、２４９Ｅ、２４９Ｌ、２４９Ｍ、２４９Ｎ、２４９Ｙ、２５０Ｋ、２５０Ｒ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｗ、２５４Ａ、２５４Ｆ、２５４Ｋ、２５４Ｌ、２５４Ｍ、２５４Ｒ、２５４Ｙ、２５５Ｋ、２５６Ａ、２５６Ｇ、２５６���、２５６Ｌ、２５６Ｍ、２５６Ｐ、２５６Ｑ、２５６Ｗ、２６０Ｓ、２８０Ｋ、２８３Ｗ、３０７Ｍ、３１１Ｆ、３１１Ｉ、３１１Ｋ、３１１Ｌ、３１１Ｍ、３１１Ｔ、３１１Ｖ、３１１Ｗ、３１１Ｙ、３１４Ｉ、３１４Ｖ、３１４Ｗ、３１４Ｙ、３１５Ｐ、３１７Ｐ、３３２Ｄ、３３２Ｌ、３３２Ｍ、３３２Ｓ、３３２Ｗ、３３２Ｙ、３３９Ｄ、３３９Ｆ、３３９Ｉ、３３９Ｋ、３３９Ｎ、３３９Ｓ、３３９Ｔ、３３９Ｗ、３３９Ｙ、３４１Ｄ、３４１Ｅ、３４１Ｆ、３４１Ｈ、３４１Ｉ、３４１Ｋ、３４１Ｌ、３４１Ｍ、３４１Ｎ、３４１Ｐ、３４１Ｑ、３４１Ｒ、３４１Ｓ、３４１Ｔ、３４１Ｖ、３４１Ｗ、３４１Ｙ、３４３Ｄ、３４３Ｅ、３４３Ｇ、３４３Ｈ、３４３Ｋ、３４３Ｎ、３４３Ｑ、３４３Ｒ、３４３Ｓ、３４３Ｔ、３４３Ｗ、３４３Ｙ、３７３Ｄ、３７３Ｅ、３７３Ｈ、３７３Ｉ、３７３Ｋ、３７３Ｌ、３７３Ｑ、３７３Ｒ、３７３Ｔ、３７３Ｗ、３７６Ａ、３７６Ｇ、３７６Ｎ、３７６Ｐ、３７６Ｑ、３７６Ｒ、３７６Ｓ、３７６Ｔ、３７６Ｖ、３７７Ｐ、３７９Ｎ、３７９Ｑ、３７９Ｔ、３８２Ｉ、３８２Ｌ、３８６Ｋ、４２６Ｄ、４２６Ｌ、４２９Ｆ、４２９Ｍ、４３０Ａ、４３０Ｄ、４３０Ｆ、４３０Ｇ、４３０Ｈ、４３０Ｉ、４３０Ｋ、４３０Ｌ、４３０Ｍ、４３０Ｎ、４３０Ｐ、４３０Ｒ、４３０Ｓ、４３０Ｔ、４３０Ｖ、４３０Ｗ、４３０Ｙ、４３１Ｈ、４３１Ｐ、４３２Ｒ、４３４Ｙ、４３８Ｌ、又は４４０Ｙ］。この方法によって、変異Ｆｃ領域をコードする核酸分子は、上記の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように、（例えば、母体Ｆｃ領域又は天然のＦｃ領域をコードする核酸分子から）設計され、核酸分子は、追加的な抗体をコードする核酸（例えば、Ｉｇ重鎖の残部をコードする核酸配列）に作動可能な状態で付着される。また、この方法は、その後、追加的な抗体をコードする核酸に、上記に列挙される少なくとも１つのアミノ酸置換の導入後の変異Ｆｃ領域をコードする核酸を作動可能な状態で付着されることを更に含む。この方法は、変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体の発現及び精製も含む。この方法は、母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体の発現及び精製も含む。この方法は、当該技術で利用される方法、又は本願明細書に記載の方法によって、変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体のＣＤＣ活性、及び母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体の活性を測定することも含む。この方法は、母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体より大きい（即ち、好ましくは、５％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％以上大きい）ＣＤＣ活性を有する変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体を選択することを更に含む。本発明は、この方法によって生成される変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体を更に具現化する。
【００３５】
別の実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体、好ましくは治療用モノクローナル抗体のＣＤＣ応答を減少させる方法を提供し、以下のアミノ酸置換の少なくとも１つを含むように抗体のＦｃ領域を構築することを含む。２３５Ｇ、２３５Ｓ、２３６Ｒ、２３７Ｅ、２３７Ｋ、２３７Ｎ、２３７Ｒ、２３８Ａ、２３８Ｅ、２３８Ｇ、２３８Ｈ、２３８Ｉ、２３８Ｌ、２３８Ｖ、２３８Ｗ、２３８Ｙ、２４５Ｒ、２４７Ｈ、２４７Ｉ、２４７Ｌ、２４７Ｔ、２４７Ｙ、２５０Ｍ、２５２Ｙ、２５４Ｄ、２５４Ｅ、２５４Ｉ、２５４Ｐ、２５４Ｑ、２５４Ｔ、２５４Ｖ、２５５Ｎ、２５７Ａ、２５７Ｉ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｓ、２５７Ｖ、２６２Ｌ、２６４Ｓ、２６５Ｈ、２６５Ｙ、２６７Ｇ、２６７Ｈ、２６７Ｉ、２６７Ｋ、２６８Ｋ、２６９Ｎ、２６９Ｑ、２７０Ｇ、２７０Ｍ、２７０Ｎ、２７１Ｔ、２７２Ｈ、２７２Ｌ、２７２Ｎ、２９２Ａ、２９３Ｓ、３０１Ｗ、３０７Ｅ、３１１Ｅ、３１１Ｓ、３１６Ｆ、３１８Ｐ、３２７Ｔ、３２８Ｖ、３２９Ｙ、３３０Ｋ、３３０Ｒ、３３２Ｋ、３３９Ｅ、３３９Ｍ、３４３Ｉ、３７３Ｓ、３７８Ｄ、３８０Ｄ、３８２Ｄ、３８２Ｆ、３８２Ｎ、３８２Ｐ、３８２Ｒ、３８２Ｓ、３８２Ｗ、３８２Ｙ、３８５Ｅ、３８５Ｐ、４２３Ｎ、４２４Ｈ、４２４Ｍ、又は４２７Ｎ  ［好ましくは、２３５Ｇ、２３５Ｓ、２３６Ｒ、２３７Ｅ、２３７Ｋ、２３７Ｎ、２３７Ｒ、２３８Ａ、２３８Ｅ、２３８Ｇ、２３８Ｈ、２３８Ｉ、２３８Ｌ、２３８Ｖ、２３８Ｗ、２３８Ｙ、２４５Ｒ、２４７Ｉ、２４７Ｌ、２４７Ｔ、２５０Ｍ、２５７Ａ、２５７Ｉ、２５７Ｍ、２６２Ｌ、２６４Ｓ、２６７Ｇ、２６７Ｈ、２６７Ｉ、２６７Ｋ、２６８Ｋ、２６９Ｎ、２６９Ｑ、２７０Ｇ、２７０Ｍ、２７０Ｎ、２７１Ｔ、２７２Ｈ、３０１Ｗ、３１１Ｓ、３２７Ｔ、３２９Ｙ、３３０Ｋ、３３０Ｒ、３７８Ｄ、３８５Ｅ、４２３Ｎ、又は４２４Ｈ］。この方法によって、変異Ｆｃ領域をコードする核酸分子は、上記の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように、（例えば、母体Ｆｃ領域又は天然のＦｃ領域をコードする核酸分子から）設計され、核酸分子は、追加的な抗体をコードする核酸（例えば、Ｉｇ重鎖の残部をコードする核酸配列）に作動可能な状態で付着される。また、この方法は、その後、追加的な抗体をコードする核酸に、上記に列挙される少なくとも１つのアミノ酸置換の導入後の変異Ｆｃ領域をコードする核酸を作動可能な状態で付着されることを更に含む。この方法は、変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体の発現及び精製も含む。この方法は、母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体の発現及び精製も含む。この方法は、当該技術で利用される方法、又は本願明細書に記載の方法によって、変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体のＣＤＣ活性、及び母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体の活性を測定することも含む。この方法は、母体Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体より少ない（即ち、好ましくは、５％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％以上少ない）ＣＤＣ活性を有する変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体を選択することを更に含む。本発明は、この方法によって生成される変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体を更に具現化する���
【００３６】
別の実施形態において、本発明は、本発明の変異Ｆｃ領域又はその機能性フラグメントをコードする核酸分子を含む単離核酸分子を提供する。より好ましくは、単離核酸分子は、本発明の変異Ｆｃ領域を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。好ましくは、前記核酸によってコードされる変異Ｆｃ領域ポリペプチドは、変異体の母体Ｆｃ領域と比較して、表１に示すようなアミノ酸置換を有する。好ましくは、ポリペプチドはモノクローナル抗体であり、更に好ましくは、モノクローナル抗体は全長抗体又は単鎖抗体である。モノクローナル抗体は、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、又はヒトモノクローナル抗体である。
【００３７】
別の実施形態において、本発明はベクターを提供し、好ましくは、本発明の変異Ｆｃ領域ポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド、組換え発現ベクター、酵母発現ベクター、又はレトロウイルス発現ベクターを提供する（但し、これらに制限されない）。
【００３８】
別の実施形態において、本発明は、本発明の核酸分子を含む宿主細胞を提供する。好ましくは、本発明の宿主細胞は、本発明の核酸分子を含む１つ以上のベクター又はコンストラクトを含む。本発明の宿主細胞は、本発明のベクターが導入された（例えば、形質転換、形質導入、感染、トランスフェクション、エレクトロポレーションなどによる）細胞であり、前記ベクターは、本発明の変異Ｆｃ領域ポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。任意に、ベクターは、宿主細胞染色体に安定して組み込まれる。宿主細胞タイプは、哺乳類、細菌、植物、及び酵母細胞を含む。好ましくは、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ０細胞、酵母細胞、又はあらゆる好ましい細胞種の誘導体又は子孫である。
【００３９】
別の実施形態において、本発明は、本発明の変異Ｆｃ領域又はその機能性フラグメントを含むポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。好ましくは、ポリペプチドはモノクローナル抗体であり、より好ましくは治療用モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、又はヒトモノクローナル抗体である。あるいは、ポリペプチドは、本発明の変異Ｆｃ領域が作動可能な状態で結合され、及び共発現することによって改変した血清半減期から利益がもたらされる抗体以外のポリペプチドである。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる担体を更に含む。前記医薬組成物において、変異Ｆｃ領域を含むポリペプチドは有効成分である。好ましくは、医薬組成物は、本発明の変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体の相同又は実質的に相同な集団を含む。治療的に使用される医薬組成物は、好ましくは無菌であり、かつ、凍結乾燥される。
【００４０】
本発明は、哺乳類、好ましくはヒトにおけるタンパク質の活性を抑制する方法は、治療的に有効量又は予防的に有効量の（前記哺乳類に本発明の変異Ｆｃ領域を含むポリペプチド（好ましくはモノクローナル抗体）を、それらを必要とする前記哺乳類に投与することを含む。好ましくは、変異Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、抑制されるタンパク質の結合パートナーである。本発明は、抗原エピトープに本発明の変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体が結合して生じる細胞情報伝達の抑制によって、改善する疾患又は障害を治療又は予防する方法を提供し、このような治療又は予防を必要とする患者（例えばヒト）に、治療的又は予防的に有効量の本発明のモノクローナル抗体を投与することを含む。
【００４１】
本発明は、抗原エピトープに本発明の変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体が結合して生じる細胞情報伝達の抑制によって、改善する疾患又は疾患を治療又は予防する方法を提供し、このような治療又は予防を必要とする患者（例えばヒト）に、治療上又は予防上有効量の本発明のモノクローナル抗体を投与することを含む。本発明は包装材料、および該包装材料内に包含された本発明の変異Ｆｃ領域ポリペプチドを含むポリペプチドを含む製品を具現化する。本発明は、本願明細書に記載の変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体及び外因性のポリペプチドを含む組成物、並びに、生理的又は薬学的に許容できる担体又は希釈剤を更に具現化する。
【００４２】
ある実施形態において、本発明は、ｉ）天然のヒトフレームワーク領域（「ＦＲ」）（例えば、自然発生のヒトフレームワークに対して改変されていない）、及び、ｉｉ）変異Ｆｃ領域を含むポリペプチドを提供する。ある実施形態において、前記未修飾のヒトフレームワークは、ヒト生殖細胞系フレームワークである。他の実施形態において、本発明は、ポリペプチドを含む組成物を提供し、ポリペプチドは、ｉ）少なくとも１つのランダム化ＣＤＲ配列、及び、ｉｉ）本発明の変異Ｆｃ領域を含む。他の実施形態において、本発明は、ポリペプチドを含む組成物を提供し、ポリペプチドは、ｉ）未修飾のヒトフレームワーク（例えば、ヒト生殖細胞系フレームワーク）、ｉｉ）少なくとも１つのランダム化ＣＤＲ配列、及び、ｉｉｉ）本発明の変異Ｆｃ領域を含む。
【００４３】
本発明は、本発明の変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体外因性のポリペプチドの治療及び診断的な使用を意図し、本願明細書において開示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本願明細書及び本願請求の範囲全体において、免疫グロブリン中の重鎖（Ｆｃ領域）のアミノ酸残基に対する番号づけは、Ｋａｂａｔ他，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）により、ＥＵインデックスによる。「ＫａｂａｔによるＥＵインデックスフォーマット」とは、ヒトＩｇＧ抗体における残基の番号づけを意味し、本願明細書の図２に示される。例えば、４３８位において、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及びマウスＩｇＧ３の全ては、Ｑアミノ酸を有し、マウスＩｇＧ１はＩアミノ酸を有し、マウスＩｇＧ２ａはＴアミノ酸を有し、及び、マウスＩｇＧ２ＢはＫアミノ酸を有する。更に、本願明細書において、置換は、置換が生じたアミノ酸位置番号、その後に母体Ｆｃ領域の同位置にあったアミノ酸に代替するアミノ酸が続いて指定される（例えば、２４９Ｇは、母体Ｆｃ領域の２４９位において置換されるグリシン残基を示す）。番号は、母体Ｆｃ領域がヒトＩｇＧ１であるか否かに関わらずヒトＩｇＧ１の位置に言及する。母体Ｆｃ領域がヒトＩｇＧ１でなく、ある位置でヒトＩｇＧと共に整列する場合、番号は母体Ｆｃ領域における相同性の位置に言及する。
【００４５】
本願明細書で使用される場合において、「被験者」及び「患者」という用語は、本発明の変異Ｆｃ領域を含むポリペプチドが治療的に使用される任意の動物に言及し、このような治療によって利益を享受するヒトのみならず他の哺乳類（例えば、ペット用動物（イヌ、ネコ等）、スポーツ用の動物（例えばウマ）、及び家畜動物（ウシ、ブタ、及びヒツジ）を含む。
【００４６】
本願明細書で使用される場合において、「治療又は予防」という用語は、異常なレベルのタンパク質と関連し、タンパク質の活性又はレベルを改変することによって利益が得られる疾患又は障害に言及する。
【００４７】
「単離された」という用語は、天然環境において回収された、少なくとも１つの混入核酸と同定及びその核酸から単離された核酸に関連して使用される。単離された核酸は天然において見られるのとは異なる型及び環境に存在する。したがって、単離核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。単離核酸分子は、通常、例えば、核酸分子がプラスミド又は染色体中の天然細胞とは異なる位置でポリペプチドを発現する、細胞中に含まれる核酸分子を含む。単離された核酸は、一本鎖又は二本鎖の状態で存在する。単離核酸分子がタンパク質を発現するために使用されるとき、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは最低限センス鎖又はコード鎖を含むが、センス鎖及びアンチセンス鎖（即ち、二本鎖である）を含んでもよい。
【００４８】
核酸は、他の核酸分子と機能的な関係におかれた場合に、「作動可能に結合」又は「作動可能に付着」される。例えば、プロモーター又はエンハンサーがコード配列の転写に作用する場合、核酸のコード配列に作動可能な状態で結合されるか、又は、リボソーム結合部位が翻訳を容易にするために配置される場合、核酸のコード配列に作動可能な状態で結合される。変異Ｆｃ領域をコードする核酸分子は、発現した融合タンパク質が、変異Ｆｃ領域ポリペプチドに上流又は下流で付着する外因性のタンパク質又はその機能性フラグメントを含むように配置される場合、外因性のタンパク質（即ち、自然界に存在するようにＦｃ領域を含まないタンパク質又はその機能性フラグメント）をコードする核酸分子に作動可能な状態で結合され、外因性のタンパク質は、変異Ｆｃ領域ポリペプチドにすぐに付着されるか、或いは、あらゆる長さ及び組成のリンカー配列によって分離される。同様に、ポリペプチドが別のポリペプチドとの機能的な関係に配置されるとき、ポリペプチド（本願明細書において「タンパク質」と同義的に使用される）分子は、「作動可能に結合」又は「作動可能に付着」される。
【００４９】
本願明細書で使用される場合において、「機能性フラグメント」という用語は、ポリペプチド又はタンパク質（例えば、変異Ｆｃ領域又はモノクローナル抗体）に関して使用される場合、全長ポリペプチドの少なくとも１つの機能において保持するタンパク質のフラグメントに関連する。フラグメントは、６つのアミノ酸から全長ポリペプチドの全アミノ酸配列から１つのアミノ酸を除く大きさにおいて様々である。本願明細書において定義されるように、本発明の変異Ｆｃ領域ポリペプチドの機能性フラグメントは少なくとも１つの「アミノ酸置換」を保持する。変異Ｆｃ領域ポリペプチドの機能性フラグメントは、Ｆｃ領域に関連する公知の少なくとも１つの機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体への結合、Ｃ１ｑへの結合、細胞表面レセプターの下方制御は、例えば、Ｆｃ領域が作動可能に付着されるポリペプチドのインビボ又はインビトロでの半減期を増加させる）を保持する。
【００５０】
「精製された」又は「精製する」という用語は、サンプルから少なくとも１つの混入物の実質的な除去を意味する。例えば、抗原特異的な抗体は、少なくとも１つの混入する非免疫グロブリンタンパク質を完全又は実質的に（少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％以上、好ましくは、９６％、９７％、９８％、又は９９％）除去することにより精製することができ、また、それらは同一の抗原に結合しない免疫グロブリンを除去することにより精製することができる。非免疫グロブリンタンパク質及び／又は特定の抗原に結合しない免疫グロブリンを除去することにより、サンプル中の抗原特異的な免疫グロブリンの割合が増大する。他の例では、ポリペプチド（例えば免疫グロブリン）を細菌の宿主細胞中で発現させ、宿主細胞のタンパク質を完全又は実質的に除去して精製することにより、サンプル中のポリペプチドの割合が増大する。
【００５１】
用語「天然」という用語は、ポリペプチド（例えばＦｃ領域）に言及し、自然又は自然に発生する多型現象において共通に発生するポリペプチドのアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を、ポリペプチドが有するということを示すために本願明細書において使用する。天然ポリペプチド（例えば天然のＦｃ領域）は、組換え手段によって生成されるか、又は自然発生源から単離される。
【００５２】
本願明細書で使用される場合において、「発現ベクター」という用語は、所望のコード配列及び特定の宿主生体で作動可能に結合されたコード配列の発現に必要な適当な核酸配列を含む組み換えＤＮＡ分子を意味する。
【００５３】
本願明細書で使用される場合において、「宿主細胞」という用語は、インビトロ又はインビボのいずれかに存在する、任意の真核細胞及び原核細胞（例えば、大腸菌等の細菌、ＣＨＯ細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞、及び昆虫細胞）を意味する。例えば、宿主細胞はトランスジュニック動物中に存在するものでもよい。
【００５４】
本願明細書で使用される場合において、「母体ポリペプチド」とは、変異体（変異ポリペプチド）を生成するために変更又は改変（例えばアミノ酸置換）されてもよいアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。好ましい実施形態において、母体ポリペプチドは、天然又は非天然のＦｃ領域、つまり、自然発生するＦｃ領域又は少なくとも一部又はアミノ酸配列の修飾を伴うＦｃ領域を含む。ある実施形態において、母体ポリペプチドよりも長い、あるいは短い変異体が特に意図される。特に好ましい実施形態において、母体ポリペプチドは、変異体と比べ機能（例えば、増大又は減少したエフェクター機能、レセプター結合等）の点で相違する。
【００５５】
本願明細書で使用されている場合において、「母体ポリペプチドの変異体」という用語は、少なくとも１つのアミノ酸置換により、母体ポリペプチドと異なるアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。ある実施形態において、変異体はＦｃ領域の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％、或いは最も好ましくは少なくとも９５％、９７％、又は９９％（つまり、Ｆｃ領域の「一部」）を含む。好ましい実施例において、母体ポリペプチドの変異Ｆｃ領域は母体ポリペプチドからの少なくとも１つのアミノ酸置換、Ｆｃ領域において行なわれる置換を含む。母体ポリペプチドは、天然ポリペプチドであってもなくてもよい。
【００５６】
本願明細書で使用される場合において、「Ｆｃ領域」という用語は、（例えば図１に示したような）免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を意味する。「Ｆｃ領域」は、Ｆｃ領域の天然配列であってもよく、又は変異Ｆｃ領域であってもよい。広く受け入れられている免疫グロブリン重鎖におけるＦｃ領域の境界は変動しうるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常２２６位のＣｙｓ又は２３０位のＰｒｏから、カルボキシル末端まで及ぶと定義されている。ある実施形態において、変異体はＦｃ領域の一部のみを含み、カルボキシル末端は含んでも含まなくてもよい。免疫グロブリンのＦｃ領域は、例えば、図１に示すように通常２つの定常領域、ＣＨ２及びＣＨ３を含んでいる。ある実施形態において、１又は複数の定常領域を含む変異体が意図されている。他の実施形態において、そのような定常領域を含まない（又はそのような定常領域の一部しか含まない）変異体が意図されている。
【００５７】
ヒトＩｇＧのＦｃ領域の「ＣＨ２領域」（「Ｃγ２」領域とも呼ばれる）は、通常２３１位付近のアミノ酸から３４０位付近のアミノ酸に至る。ＣＨ２領域は、他の領域と緊密に対形成していない点で際立っている。２つのＮ結合性分岐糖鎖が、正常なＩｇＧ分子の２つのＣＨ２領域の間に介在する。
【００５８】
ヒトＩｇＧのＦｃ領域の「ＣＨ３領域」（「Ｃγ３」領域とも呼ばれる）は、一般にＦｃ領域の３４１位付近のアミノ酸残基から４４７位付近のアミノ酸残基に至る、Ｆｃ領域のＣ末端からＣＨ２領域までの残基の範囲である。
【００５９】
「機能的なＦｃ領域」は、天然の配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を保有する。本発明の変異Ｆｃ領域を含むポリペプチドの少なくとも１つのエフェクター機能は、天然のＦｃ領域又は変異体の母体Ｆｃ領域を含むポリペプチドに関して増加又は減少する。エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑへの結合、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体依存細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター、ＢＣＲ）の下方制御等が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなエフェクター効果は、Ｆｃ領域が結合領域（例えば抗体の可変領域）に作動可能に結合されることを必要とする場合もあり、種々のアッセイ（例えば、Ｆｃ結合アッセイ、ＡＤＣＣアッセイ、ＣＤＣアッセイ、全血又は部分血サンプルからの標的細胞の消失等）により評価することができる。
【００６０】
「天然配列Ｆｃ領域」又は「野生型Ｆｃ領域」は、広く天然において見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を意味する。天然配列ヒトＦｃ領域の例を図２に示すが、これらには、天然配列ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（ｆ及びａ，ｚアロタイプ、つまり非Ａアロタイプ及びＡアロタイプ）、天然配列ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域、及び天然配列ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域並びに天然に存在するこれらの変異体が含まれる。天然配列マウスＦｃ領域も図２に示す。
【００６１】
「変異Ｆｃ領域」は、本願明細書で定義されるように、少なくとも１つの「アミノ酸置換」により天然配列Ｆｃ領域（又はそのフラグメント）と異なるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態において、変異Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域又は母体ポリペプチドのＦｃ領域において、１、２、３、４、又は５のアミノ酸置換、好ましくは約１〜約５のアミノ酸置換を有する。他の実施形態において、変異Ｆｃ領域は、本願明細書に開示される方法に従って生成され、この変異Ｆｃ領域は選択した外因性のポリペプチド、例えば、レセプター又はリガンドの結合ドメインなどの抗体可変ドメイン又は非抗体ポリペプチドに融合することができる。
【００６２】
本願明細書で使用される場合、ポリペプチドにおける「誘導体」という用語は、それを含むポリペプチド、及び、アミノ酸残基置換の導入によって改変したアミノ酸配列に言及する。本願明細書において使用する場合、「誘導体」という用語は、あらゆる種類の分子がポリペプチドへの共有結合することによって修飾されるポリペプチドに言及する。例えば、抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸エステル化、アミド化、公知の保護基／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンド又は他のタンパク質に対する結合などによって修飾されるが、これらに制限されない。ポリペプチド誘導体は、特定の化学開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むがこれには限定されない当業者にとって公知の技術を使用し、化学修飾によって生成される。更に、ポリペプチド誘導体は、誘導元のポリペプチドと同様又は同一の機能を有する。本発明の変異Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、本願明細書で定義されるように誘導体であると理解され、好ましくは、誘導体化はＦｃ領域において発生する。
【００６３】
ポリペプチド（例えばＦｃ領域又はモノクローナル抗体）に関連して本願明細書で使用される場合、「実質的にヒト由来」は、ポリペプチドは、天然のヒトアミノポリペプチドと少なくとも８０％、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又はそれ以上、より好ましくは、少なくとも９５％、９５％、９７％、９８％、又は９９％相同であるアミノ酸配列を有することを示す。
【００６４】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」という用語は、Ｆｃ領域（例えば抗体のＦｃ領域）に結合するレセプターを意味する。好ましいＦｃＲは、天然の配列ＦｃＲである。更に、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体と結合し（γレセプター）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩサブクラスのレセプターを含み、このレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的にスプライスされた形態を含む。ＦｃγＲＩＩレセプターは、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）、及びＦｃγＲＩＩＢ（「抑制化レセプター）を含み、その細胞質ドメインにおいて主に異なる同様のアミノ酸配列を有する。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔによって研究されている。Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９：４５７−９２  （１９９１）；  Ｃａｐｅｌ，他，  Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４  （１９９４）；  ａｎｄ  ｄｅ  Ｈａａｓ他，  Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．  １２６：３３０−４１  （１９９５）。別の好ましいＦｃＲは、母体のＩｇＧの胎児への移動に関与する新生児レセプター（ＦｃＲｎ）を含む（Ｇｕｙｅｒ他，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１７：５８７  （１９７６）ａｎｄ  Ｋｉｍ他，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：２４９  （１９９４））。将来、特定されるＦｃＲを含む他のＦｃＲは、本願明細書において用語「ＦｃＲ」に包含される。
【００６５】
本願明細書で使用される場合において、「抗体依存細胞媒介性細胞毒性」及び「ＡＤＣＣ」という語句は、非特異的なＦｃＲを発現した（例えば非特異的な）細胞障害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、標的細胞の溶解を起こす細胞に媒介された反応を意味する。ＡＤＣＣを媒介する細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。
【００６６】
本願明細書で使用される場合において、「エフェクター細胞」という語句は、１種又は複種のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を果たす白血球（好ましくはヒト）を意味する。好ましくは、エフェクター細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介する白血球の例としては、ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が挙げられる。エフェクター細胞は、天然供給源から（例えば血液又はＰＢＭＣから）単離されてもよい。
【００６７】
「改変した」ＦｃＲｎ結合親和性を有する変異ポリペプチドは、ｐＨ６．０のとき、その変異体の母体ポリペプチド又は天然配列Ｆｃ領域を有するポリペプチドと比べてＦｃＲ結合親和性は、強化（増大）又は減退（減少）してよい。ＦｃＲｎに対し増大した結合又は結合性を示す変異ポリペプチドは、ＦｃＲと母体ポリペプチドよりも高い親和性で結合する。ＦｃＲｎに対し減少した結合又は結合性を示す変異ポリペプチドは、ＦｃＲと母体ポリペプチドよりも低い親和性で結合する。ＦｃＲｎに対し減少した結合性を示す変異体は、結合性をほとんど又は全く検知できず、例えば、母体ポリペプチドに比べ、０〜２０％の結合性を有する。ＦｃＲｎに対し「高い親和性」で結合する変異ポリペプチドは、母体ポリペプチドと比較して、結合アッセイにおいて変異ポリペプチドと母体ポリペプチドの量がほぼ同一で、その他の条件も同一な場合、１種のＦｃＲｎと母体抗体よりも高い結合親和性で結合する。例えば、高いＦｃＲｎ結合親和性を有する変異ポリペプチドは、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＦｃＲｎ結合親和性が、母体ポリペプチドと比べ、約１．１０倍〜１００倍（より典型的には約１．２倍〜約５０倍）増加することを示す。
【００６８】
本願明細書で使用される場合において、「アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸配列中に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を、他の「代替」アミノ酸残基に置き換えることを意味する。代替残基は、「天然に存在する（遺伝子によりコードされた）アミノ酸残基」であり、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びバリン（Ｖａｌ）から選択されてもよい。１又は複数の天然に存在しないアミノ酸残基による置換も、本願明細書におけるアミノ酸置換の定義に包含される。「天然に存在しないアミノ酸残基」とは、上に挙げた天然に存在するアミノ酸残基以外の残基を意味し、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基と共有結合することができる。天然に存在しないアミノ酸の例としては、ノルロイシン、オミシン、ノルバリン、ホモセリン、及び本願明細書に参照として組み込まれるＥｌｌｍａｎ他，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１）に記載のもの等の他のアミノ酸残基アナローグが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
「アッセイシグナル」という用語は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出する任意の方法からの出力を意味し、比色アッセイからの吸光度、蛍光強度、又は１分あたりの分解速度が含まれるが、これらに限定されない。アッセイのフォーマットとして、ＥＬＩＳＡ、ｆａｃｓ、又は他の方法を含んでいてもよい。「アッセイシグナル」の変化は、細胞の生存率及び／又は解離速度、結合速度、若しくは両者の変化を反映させることができる。「高いアッセイシグナル」とは、測定された出力の値が他の値よりも高いこと（例えば、変異体は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、母体ポリペプチドに比べて高い（大きい）値を示すことがある）を意味する。「より低い」アッセイシグナルとは、測定された出力の値が他の値よりも低いこと（例えば、変異体は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、母体ポリペプチドに比べてより低い（小さい）値を示すことがある）を意味する。
【００７０】
「結合親和性」という用語は、個々のＦｃレセプター−Ｆｃ結合相互作用に関する解離平衡定数（濃度の単位で示される）を意味する。結合親和性は、解離速度（通常、秒−１等の時間の逆数の単位で示される）を結合速度（通常、モル／秒等の単位、濃度／単位時間の単位で示される）で割った比に直接関係する。一般に、解離平衡定数の変化が、結合速度、解離速度、又は両者の変化によるものであるかについては、それらの値を（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ又はＳＡＰＩＤＹＮＥ測定によって）実験的に測定しないと、明確にすることはできない。
【００７１】
本願明細書で使用される場合において、「ヒンジ領域」という用語は、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２ｌ６（２１６）からＰｒｏ２３０にわたる、ヒトＩｇＧ１における一連のアミノ酸を意味する。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ−Ｓ結合を同じ位置で形成する最初と最後のシステイン残基の位置を決定することにより、ＩｇＧ１配列について整列することができる。
【００７２】
「Ｃｌｑ（Ｃ１ｑ）」とは、免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合部位を含むポリペプチドを意味する。Ｃｌｑ（Ｃ１ｑ）と２つのセリンプロテアーゼＣｌｒ及びＣｌｓは、共に、ＣＤＣ経路の第１成分である複合体Ｃｌを形成する。
【００７３】
本願明細書で使用される場合において、「抗体」という用語は、「免疫グロブリン」又は「Ｉｇ」と同義であり、そして、最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異的（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）（例えば二特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、及び所望の生物学的活性又は機能的活性を示す任意の抗体のフラグメントを包含する。単鎖抗体、及びキメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、又は霊長類化抗体（ＣＤＲを移植された）、更に、キメラ抗体又はＣＤＲを移植した単鎖抗体は、異なる種に由来する部分を含み、本発明及び「抗体」という用語に包含される。これらの抗体の部分は、従来の技術によって、合成的に、化学的に結合することができ、また、遺伝子工学技術を使用して連続したタンパク質として調製することができる。例えば、キメラ抗体又はヒト化抗体の鎖をコードする核酸は、連続したタンパク質を生成するために発現させることができる。米国特許第４，８１６，５６７号明細書；欧州特許第０１２５０２３  Ｂ１号明細書；米国特許第４，８１６，３９７号明細書；欧州特許第０１２０６９４  Ｂ１号明細書；国際公開第８６／０１５３３号明細書；欧州特許第０１９４２７６  Ｂ１号明細書；米国特許第５，２２５、５３９号明細書；欧州特許第０２３９４００  Ｂ１号明細書、及び米国特許第５，５８５，０８９号明細書、及び、米国特許第５，６９８，７６２号明細書を参照。また、単鎖抗体に関する、Ｎｅｗｍａｎ，  Ｒ．他  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １０：１４５５−１４６０，  １９９３，  ｒｅｇａｒｄｉｎｇ  ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、及びＬａｄｎｅｒ他、米国特許第４，９４６，７７８号明細書、及び、Ｂｉｒｄ，  Ｒ．Ｅ．他，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４２：４２３−４２６，  １９８８も参照。Ｆｃ領域（又はその部分）を含む抗体の全ての形態は、「抗体」という用語で本願明細書において包含されると理解される。更にまた、抗体は、固相に固定され、及び／又は、公知技術の方法に従って異種化合物（例えば、エンザイム又は毒素）によって結合して検出可能な標識で標識化される。
【００７４】
本願明細書で使用される場合において、「抗体のフラグメント」という用語は、完全な抗体の一部を意味する。抗体のフラグメントの例としては、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、Ｆｃ又はＦｃ’ペプチド、Ｆａｂ及びＦａｂフラグメント、及び抗体のフラグメントから形成される多特異的（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗体のフラグメントは、好ましくはヒンジ領域の少なくとも一部及び必要に応じてＩｇＧ重鎖のＣＨ１領域を保持する。他の好ましい実施形態において、抗体のフラグメントはＣＨ２領域の少なくとも一部又はＣＨ２領域全体を含む。
【００７５】
本願明細書で使用される場合において、「機能性フラグメント」という用語は、モノクローナル抗体に関して使用される場合、機能的活性を保持するモノクローナル抗体の一部を意味することが意図される。機能的活性は、例えば、抗原結合活性又は特異性、レセプター結合活性又は特異性、エフェクター機能活性などである。モノクローナル抗体の機能性フラグメントとしては、重鎖又は軽鎖単独及び、ＶＬ、ＦＨ及びＦｄ等のそれらのフラグメント、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦａｂ’等の一価フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２等の二価フラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、及びＦｃフラグメント等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの用語は、例えば、Ｈａｒｌｏｗｅ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ａ．（ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｉｎｃ．）；Ｈｕｓｔｏｎ他，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２２：１８９−２２４（１９９３）；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１７８：４９７−５１５（１９８９）及び、Ｄａｙ，Ｅ．Ｄ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９０）に記載される。機能性フラグメントという用語は、例えば、プロテアーゼによるモノクローナル抗体の消化又は短縮、及び公知の組み換えＤＮＡ法により生成されたフラグメントを含むことが意図される。
【００７６】
本願明細書で使用される場合、「フラグメント」という用語は、別のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５、１５、２０、２５、４０、５０、７０、９０、１００以上連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドに言及する。好ましい実施形態において、ポリペプチドのフラグメントは、全長ポリペプチドの少なくとも１つの機能を保持する。
【００７７】
本願明細書で使用される場合、用語「キメラ抗体」は、１価、２価、又は多価の免疫グロブリンを含む。１価のキメラ抗体は、キメラ軽鎖とジスルフィド架橋を介して結合するキメラ重鎖によって形成される二量体である。２価のキメラ抗体は、少なくとも１つのジスルフィド架橋で結合される２つの重鎖−軽鎖二量体によって形成される四量体である。ヒトに用いられる抗体のキメラ重鎖は、非ヒト抗体の重鎖に由来する抗原結合性領域を含み、少なくとも一部のヒト重鎖定常領域（例えばＣＨ１又はＣＨ２）に結合される。ヒトに用いられる抗体のキメラ軽鎖は、非ヒト抗体の軽鎖に由来する抗原結合領域を含み、少なくとも一部のヒト軽鎖定常領域（ＣＬ）に結合される。また、抗体、同一又は異なる可変領域結合特性のキメラ重鎖、及び、キメラ軽鎖を有するフラグメント又は誘導体は、公知の方法に従って、個々のポリペプチド鎖の適切な結合によって調製することができる。本方法において、キメラ重鎖を発現する宿主は、キメラ軽鎖を発現する宿主から別々培養され、そして、免疫グロブリン鎖は、別々に回収及び結合される。あるいは、宿主は共培養され、培養液において自然に結合させることができ、その後、組み立てられた免疫グロブリン又はフラグメント又は両方が回収され、重鎖及び軽鎖が同一の宿主細胞において発現される。キメラ抗体を生成する方法は、公知技術である（米国特許第６，２８４，４７１号明細書；米国特許第５，８０７，７１５号明細書；米国特許第４，８１６，５６７号明細書；及び米国特許第４，８１６，３９７号明細書を参照）。
【００７８】
本願明細書で使用される場合において、非ヒト（マウス等）抗体がヒト化した状態（つまり、ヒト化抗体）とは、非ヒト免疫グロブリンから誘導される最小限の配列を含む、あるいは全く含まない抗体を意味する。大部分は、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエント由来の超可変領域が、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類等の非ヒト種由来の、所望の特異性、親和性及び能力を有する超可変領域由来の残基（ドナー抗体）で置換される。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト由来の残基で置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体において見出されない残基を含んでもよい。これらの改変は、一般に抗体の特性を更に改善するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常は２つの可変領域のほぼ全体を含んでおり、超可変ループ（ＣＤＲ）の全体又はほぼ全体は、非ヒト免疫グロブリンの同一部位に対応しており、ＦＲの全体又はほぼ全体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト化抗体はまた、通常、ヒト免疫グロブリン由来のイニムノグロブリン（ｉｎｉｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）の定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。ヒト化抗体を生成するために使用される例示的な方法は、米国特許第５，２２５，５３９号明細書に記載される。
【００７９】
本願明細書で使用される場合において、「イムノアドヘシン」という用語は、外因性の「アドヘシン」タンパク質（例えば、レセプター、リガンド又は酵素）の結合領域を、免疫グロブリンの定常領域に結合させた抗体類似の分子を表す。構造的に、イムノアドヘシンは、所望の結合特性を有し、抗体の抗原認識及び結合部位（抗原結合部位）とは異なる（「外因性の」）アドヘシンのアミノ酸配列と免疫グロブリン定常領域配列が融合した構造を含む。
【００８０】
本願明細書で使用される場合において、「リガンド結合ドメイン」という用語は、任意の天然レセプター又は少なくとも対応する天然レセプターの定性的なリガンド結合能を保持したその誘導体を意味する。ある実施形態において、レセプターは、免疫グロブリンの超遺伝子族のメンバーと相同な細胞外ドメインを有する細胞表面ポリペプチドに由来する。特にこの定義に含まれる、免疫グロブリン超遺伝子族に属しない他のレセプターとして、特にチロシンキナーゼ活性を有するサイトカインレセプター（チロシンキナーゼレセプター）、ヘマトポイエチン及び神経成長因子スーパーファミリー、及び細胞接合分子（例えば、Ｅ−、Ｌ−、及びＰ−セレクチン）がある。
【００８１】
本願明細書で使用される場合において、「レセプター結合ドメイン」という用語は、任意のレセプターに対する天然のリガンドを意味し、細胞接合分子、又は、対応する天然のリガンドの少なくとも定性的な結合能を保持した天然のリガンドの任意の領域又は誘導体を意味する。
【００８２】
本願明細書で使用される場合において、「抗体−イムノアドヘシンキメラ」という用語は、抗体の少なくとも１つの結合ドメインに少なくとも１つのイムノアドヘシンで結合する分子を含む。例としては、Ｂｅｒｇ他，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：４７２３−４７２７（１９９１）及びＣｈａｒｎｏｗ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５３：４２６８（１９９４）に記載の二特異性ＣＤ４−ＩｇＧキメラを含むが、これらに限定されない。
【００８３】
本願明細書で使用される場合において、「単離した」ポリペプチドとは、同定及び単離され、かつ／又はその天然環境（ｅｎｖｉｒｏｍｎｅｎｔ）下での成分から回収されたものである。天然環境での混入成分は、ポリペプチドの診断又は治療用途への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質、又は非タンパク質性の溶質が含まれる。ある実施形態において、単離したポリペプチドは、（１）Ｌｏｗｒｙ法により決定された場合にポリペプチドの９５重量％、好ましくは９９重量％を上回るまで、（２）スピニングカップシークエネーターを用いて、少なくとも１５のＮ末端又は内部（ｉｎｔｅｍａｌ）のアミノ酸配列を得るのに適当な程度に、又は（３）還元又は非還元条件下で、クマシーブルー又は銀染色を用いたＳＤＳ−ｐａｇｅで単一性を示すまで精製される。単離したポリペプチドは、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１つの成分を含まないため、そのままでは組み換え細胞内のポリペプチドを含んでいる。しかし、通常単離したポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程を経て調製される。
【００８４】
本願明細書で使用される場合において、「治療」という用語は、治療的な処置及び予防又は防止の方法を意味する。治療を必要とする人には、すでに疾患を発症している人及び疾患を予防する必要がある人が含まれる。
【００８５】
本願明細書で使用される場合において、「障害」及び「疾患」という用語は、同義的に使用され、変異ポリペプチド（本発明の変異体Ｆｃを含むポリペプチド）を用いた治療により利益を享受することができる任意の状態を意味し、慢性及び急性の障害又は疾患（例えば、患者が特定の疾患にかかりやすくなるような病的状態）を含む。ある実施形態において、病気はガンである。ある実施形態において、「自己免疫疾患」という用語は、「自己免疫不全」という用語と同義的に使用され、被験者の細胞、組織及び／又は器官との被検者自身の免疫反応によって引き起こされる細胞損傷、組織損傷及び／又は臓器損傷を特徴とした被検者の症状に言及する。用語「炎症性疾患」は、用語「炎症性疾患」によって同義的に使用され、炎症を特徴とする被検者の症状に言及する。自己免疫不全は、炎症と関連していてもいなくてもよい。更に、炎症は、自己免疫不全によって引き起こされてもなくてもよい。特定の疾患は、自己免疫疾患及び炎症性疾患の両方を特徴とする。
【００８６】
本願明細書で使用される場合において、「ガン」及び「ガン性の」という用語は、典型的には、無秩序な細胞成長によって特徴づけられる哺乳類の生理学的状態を意味し、記述する。ガンの例としては、上皮性悪性腫瘍、リンパ腫、芽細胞種、肉腫、及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、それらのガンとしては、扁平上皮ガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、肺腺ガン、肺扁平上皮ガン、腹膜ガン、肝細胞ガン、胃ガン、膵臓ガン、グリア芽腫、子宮頸ガン、卵巣ガン、肝ガン、膀胱ガン、肝ガン、乳ガン、大腸ガン、結腸直腸ガン、子宮内膜又は子宮ガン、唾液腺ガン、腎臓ガン、肝臓ガン、前立腺ガン、外陰部ガン、甲状腺ガン、肝腫瘍、及び数種の頭部及び頸部ガンが挙げられる。本願明細書で使用される場合において、「標識」という用語は、ポリペプチドと直接又は間接的に結合する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身が検出可能なもの（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）であってもよく、酵素標識の場合には、検出可能な基質又は組成物の化学変化を触媒するものであってもよい。
【００８７】
本願明細書で使用される場合において、「レセプター」という用語は、少なくとも１つのリガンドに結合することが可能なポリペプチドを意味する。好ましいレセプターは、細胞外リガンド結合ドメイン、及び、必要に応じて、他のドメイン（例えば、膜貫通ドメイン、細胞間ドメイン及び／又は膜アンカー）を有する細胞表面又は可溶性のレセプターである。本願明細書に記載のアッセイにより評価されるレセプターは、完全なレセプターでもよく、そのフラグメント又は誘導体（例えば、１又は複数の外因性ポリペプチドに融合した、レセプターの結合ドメインを有する融合タンパク質）でもよい。更に、結合能が評価されるレセプターは、細胞内にあってもよく、又は単離され、必要に応じてアッセイプレート又は他の固相に塗布されていてもよく、又は直接標識されプローブとして使用されてもよい。
【００８８】
本願明細書で使用される場合において、「抗体応答性疾患」という用語は、抗体療法により少なくとも部分的に治療が可能であることが示される任意の疾患又は病状を意味する。そのような疾患又は病状の例としては、リンパ腫（ＲＩＴＵＸＡＮにより治療可能であることが示されている）、感染症（ＳＹＮＡＧＩＳで治療可能であることが示されている呼吸器シンシチウムウイルス）、腎臓移植（ＺＥＮＡＰＡＸが有効であることが示されている）、クローン病及び関節リウマチ（ＲＥＭＩＣＡＤＥで治療可能であることが示されている）、乳ガン（ＨＥＲＣＡＰＴＩＮにより治療可能であることが示されている）、及び大腸ガン（ＥＤＲＥＣＯＬＯＭＡＢにより治療可能であることが示されている）が挙げられるが、これらに限定されない。本願明細書で使用される場合において、「イムノアドヘシン応答性疾患」という用語は、アドヘシン療法により少なくとも部分的に治療が可能であることが示される任意の疾患又は病状を意味する。
【００８９】
本願明細書で使用される場合において、母体ポリペプチドよりも「ヒトエフェクター細胞の存在下で抗体依存細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を効率的に媒介する」変異ポリペプチドとは、インビトロ又はインビボにおいて、アッセイに用いた変異ポリペプチド及び母体抗体の量がほぼ同じである場合に、ＡＤＣＣの媒介が顕著に有効なポリペプチドである。例えば、そのような変異体は、同一のＡＤＣＣアッセイにおいて、母体ポリペプチドよりもあるＡＤＣＣアッセイにおいてより多くの標的細胞の溶解を起こす。そのような変異体は、例えばＡＤＣＣアッセイにより同定することができるが、ＡＤＣＣ活性を決定する他のアッセイ又は方法（例えば動物モデル）を用いてもよい。好ましい実施形態において、変異ポリペプチドは、母体ポリペプチドよりも、ＡＤＣＣの媒介において約１．２倍、１．５倍、５０倍、１００倍、約５００倍、又は約１０００倍以上有効である。
【００９０】
「抗体又はイムノアドヘシン応答性疾患の症状」という用語は、通常、特定の疾患に関連するそれらの症状を意味する。例えば、症状は通常クローン病に関連する症状であり、腹痛、下痢、直腸出血、体重の減少、発熱、食欲の減退、脱水、貧血、膨張、線維症、腸管の炎症、及び栄養失調を含む。「症状が軽減するような条件下で」という語句は、任意の抗体又はイムノアドヘシン応答性疾患の検知可能な症状における、任意の定性的又は定量的な減少を意味し、疾患からの回復速度における検出可能な影響（例えば体重の増加）、又は、通常特定の疾患に関連する少なくとも１つの疾患の軽減（例えば、抗体又はイムノアドヘシン応答性疾患がクローン病の場合には、腹痛、下痢、直腸出血、体重の減少、発熱、食欲の減退、脱水、貧血、膨張、線維症、腸管の炎症、及び栄養失調の少なくとも１つの軽減）の症状を含むが、それらに限定されない。
【００９１】
モノクローナル抗体及びレセプター
天然に存在する全長抗体（「免疫グロブリン」又は「Ｉｇ」）は、４つのペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互接続する２つの重（Ｈ）鎖（完全長では約５０−７０ｋＤａ）及び２つの軽（Ｌ）鎖（完全長では約２５ｋＤａ）からなる免疫グロブリン分子である。各鎖のアミノ末端は、抗原認識に主に関与する約１００−１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のＣ末端部は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を定義する。
【００９２】
軽鎖は、κ又はλとして分類され、特定の定常領域を特徴とする。重鎖は、γ、μ、α、δ又はεとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥとして定義する。各重鎖タイプは、特定の定常領域を特徴とする。
【００９３】
各重鎖は、重鎖可変領域（本願明細書では「ＨＣＶＲ」）、及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、及び、ＩｇＡに関する３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）、及び４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本願明細書「ＬＣＶＲ」）、及び、軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に再分割され、そして、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保護領域が点在する。各ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなり、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端を構成する。各ドメインに対するアミノ酸の帰属は、周知の規則に従う［Ｋａｂａｔ，  ”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  （１９９１）］。特定の抗原と結合する抗体の機能的な能力は、集合的に６つのＣＤＲで決定される。しかしながら、完全なＦａｂより低い親和性であるにもかかわらず、抗原に関する特定の３つのＣＤＲだけを含む単一の可変ドメインですら抗原を認識及び結合する能力を有する。
【００９４】
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、公知技術のハイブリドーマ技術のみならず、組み換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術又はこのような容易な公知の技術の組合せを使用して生成することができる。本願明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、制限されないが、ハイブリドーマ技術で生成される抗体である。「モノクローナル抗体」は、例えば、あらゆる成熟核、原核生物、又はファージクローンを含む単一のコピー又はクローンに由来する抗体に言及し、かつ、その抗体が生成される方法に言及しない。「モノクローナル抗体」は完全（ｉｎｔａｃｔ）（完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）又は全長）な抗体、実質的に完全な抗体、抗体の機能性フラグメントであり、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体であってよい。
【００９５】
「モノクローナル抗体」の集団は、相同又は実質的に相同な（又は純粋な）抗体集団に言及し、つまり、集団における抗体の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、又はそれ以上、より好ましくは、少なくとも約９７％又は９８％、最も好ましくは少なくとも９９％が同一であり、同じ抗原又はエピトープに対してＥＬＩＳＡ分析において拮抗する。
【００９６】
本願明細書において使用する場合、「特異的に結合する」又は「選択的に結合する」という用語は、特異結合の対の片方は、その特異結合パートナー以外の分子に、有意に結合しない状態に言及する。また、この用語は、例えば、本発明の抗体の抗原結合性ドメインは、多くの抗原によって担持される特定のエピトープに特異的であり、抗原結合性ドメインを担持する特異抗体が、エピトープを担持する様々な抗原に結合する場合に適用できる。
【００９７】
Ｆｃ領域は、酵素パパインでの消化によって生成される完全抗体（例えばＩｇＧ）の部分に言及する（図１を参照）。Ｆｃ領域は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン同様ヒンジ領域の部分からなる各鎖を有するホモ二量体である。Ｆｃ領域は、ＣＨ３ドメイン間のヒンジ領域間及び複数の非共有結合間で形成される鎖間ジスルフィド架橋による二量体である。ＩｇＧは、身体の最も多い種類のＩｇであって、総免疫グロブリンのほぼ７５％を構成し、血管内プール及び血管外プールの中に均等に分布する。ＩｇＧは、抗原に一次応答の初期のステージにおいてほとんど生成されないが、二次応答において生成される抗体の主な形状である。
【００９８】
上述したように、抗体には主としてＣＨ２及びＣＨ３領域が存在し、非抗原性の結合機能に関与する。また、これらの領域及びリンカーの部分は、通常、Ｆｃ領域として知られており、エフェクター分子の結合により媒介されるいくつかのエフェクター効果を有する。
【００９９】
抗体のＦｃ領域に媒介されるエフェクター機能は、（１）抗体が抗原に結合した後に作用するエフェクター効果（これらの効果は、例えば、補体カスケード又はＦｃレセプター（ＦｃＲ）を有する細胞に関与する）、及び（２）抗原への結合とは無関係に作用するエフェクター効果（これらの効果は、循環し続けること及びトランスサイトーシスにより細胞間障壁を越えて輸送される能力によりもたらされる）の２つのカテゴリーに分類することができる。例えば、補体のＣｌｑ（Ｃ１ｑ）成分の抗体への結合により補体系が活性化される。オプソニン化に続く、補体の活性化が細胞病原体の溶解にとって重要である。補体の活性化はまた、炎症応答を刺激し、自己免疫過敏にも関与する場合がある。更に、抗体はＦｃ領域を介して、抗体のＦｃ領域上のＦｃレセプター結合部位で、細胞上のＦｃＲに結合することにより細胞に結合する。ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びＩｇＭを含む種々の抗体には、特異的な多くのＦｃＲが存在する。本発明は、いずれかの特定のメカニズムに限定されないが、細胞表面におけるＦｃＲへの抗体の結合は、抗体に覆われた粒子の呑食及び破壊、免疫複合体の除去、キラー細胞による抗体で覆われた標的細胞の溶解（ＡＤＣＣ）、炎症性メディエータ、胎盤通過及び免疫グロブリンの産生の制御を含む多くの重要で多様な生物学的応答を引き起こす。
【０１００】
いくつかの抗体のエフェクター機能は、抗体のＦｃ領域に結合するＦｃＲに媒介される。ＦｃＲは、免疫グロブリンのアイソタイプに対する特異性によって定義され、ＩｇＧ抗体に対するＦｃレセプターはＦｃγＲ、ＩｇＥに対するものはＦｃεＲ、ＩｇＡに対するものはＦｃαＲ等と呼ばれる。ＦｃγＲの３つのサブクラス、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）が同定されている。
【０１０１】
ＦｃγＲのそれぞれのサブクラスは２つ又は３つの遺伝子によりコードされており、選択的ＲＮＡスプライシングにより多重転写が起こり、ＦｃγＲアイソフォームの幅広い多様性が存在する。ＦｃγＲＩサブクラスをコードする３つの遺伝子（ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ及びＦｃγＲＩＣ）は、第１染色体長腕の１ｑ２１．１領域に一団となって存在しており、ＦｃγＲＩＩサブクラスをコードする３つの遺伝子（ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＣ）及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスをコードする２つの遺伝子（ＦｃγＲＩＩＩＡ、及びＦｃγＲＩＩＩＢ）は全て領域１ｑ２２に一団となって存在する。これらの異なるＦｃＲサブタイプは、異なる細胞種において発現する（例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１））。例えば、ヒトにおいて、ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球のみにおいて見られるが、ＦｃγＲＩＩＩＡはマクロファージ、単球、ＮＫ細胞、及びＴ細胞の亜集団において見られる。特に、ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＡＤＣＣに関与する細胞種の一つであるＮＫ細胞に存在する。
【０１０２】
ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）レセプターは、細胞外ドメインの１５８位に、この位置にフェニルアラニン又はバリンをコードする共通の多型を有する。ＦｃγＲＩＩＩのＶ型対立遺伝子は、ヒトＩｇＧ１に対しＦ型対立遺伝子よりも高い親和性を有する。Ｖ１５８対立遺伝子はまた、ＡＤＣＣを効率的に媒介する。臨床データは、ＲＩＴＵＸＡＮによる治療を行っている患者におけるＦｃγＲＩＩＩＡの遺伝子型と、処置及び治療に対する応答との間に相関を示した。臨床及び分子レベルでの応答並びに進行時間は、ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖ遺伝子型（人口の約２０％）と同型の患者が優れていることが示された。それに対して、異型又はより親和性の低いＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆ遺伝子型（人口の約８０％）の患者の応答は鈍くなる。これらのデータは、ＡＤＣＣを促進する１５８ＦのＦｃ変異キャリアはガンの抗体治療の臨床での有効性を高める可能性があることを示唆する。遺伝子多型は、ヒトＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）レセプターの、細胞外ドメインの１３１位にも存在し、ヒスチジン（Ｈ）又はアルギニン（Ｒ）のいずれかをコードする。１３１位における多型は、ヒトＩｇＧに対する結合に影響を与えることが見出されている。最近のデータによれば、ＦｃγＲＩＩＩＡの１３１位における多型とＲＩＴＵＸＡＮに対する臨床応答との間に相関が存在することが示されている。
【０１０３】
Ｈ１３１対立遺伝子と同型である患者は、他の２つの群よりも優位に高い応答速度を有する。ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩは、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）レセプターであり、ＦｃγＲＩは細胞外ドメインに３つのＩｇＳＦドメインを有する一方、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩは、細胞外ドメインに２つのＩｇＳＦドメインしか有しない。他のタイプのＦｃレセプターは新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）である。ＦｃＲｎは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と構造的に同一であり、β２−マイクログロブリンと非共有結合したα鎖を含む。
【０１０４】
変異Ｆｃ領域
本発明は、変異ポリペプチド、変異ポリペプチドをコードする核酸配列、及び、変異ポリペプチドを生成する方法を提供する。好ましくは、本発明の変異ポリペプチドは、母体ポリペプチドと少なくとも１つのアミノ酸の修飾、好ましくはアミノ酸置換を有する点で異なる。「母体」、「野生型」、「出発物質となる」又は「非変異体」ポリペプチドは、好ましくは抗体Ｆｃ領域の少なくとも一部を含み、変異体ポリペプチドはＦｃ領域の中で発生する。Ｆｃ領域を含む母体ポリペプチドは、Ｆｃ領域またはその部分を含むポリペプチドを生成する当該技術分野で用いられる手法を用いて調製することができる。好ましい実施形態において、母体ポリペプチドは抗体である。しかし、母体ポリペプチドは、少なくともＦｃ領域の一部を含む他のポリペプチド（例えばイムノアドヘシン）であってもよい。母体ポリペプチドのＦｃ領域の部分は天然配列又は非天然配列のものであり、好ましくは、ヒト起源の天然配列である。ある実施形態において、変異Ｆｃ領域は（例えば、本願明細書に記載の方法によって）生成することができ、抗体の可変領域又はレセプター若しくはリガンド、或いは治療用ポリペプチドの結合ドメイン等の選択された外因性のポリペプチドに融合させてもよい。
【０１０５】
好ましい実施形態において、母体ポリペプチドは、Ｆｃ領域又はその機能部位を含む。一般的に、母体ポリペプチドのＦｃ領域は天然配列Ｆｃ領域、及び好ましくはヒト天然配列Ｆｃ領域を含む。しかし、母体ポリペプチドのＦｃ領域は、１又は複数のすでに存在する天然配列Ｆｃ領域からのアミノ酸配列の変更又は修飾（例えばアミノ酸置換）を有していてもよい。例えば、Ｆｃ領域のＣｌｑ（Ｃ１ｑ）結合活性がすでに変更させられていてもよく、またＦｃ領域のＦｃγＲ結合親和性が変更されてもよい。関連する変異Ｆｃ領域をコードする所望の変異Ｆｃ領域又は核酸は構築してから、変異Ｆｃ領域（例えば、抗体可変領域、外因性のタンパク質）の所望の融合パートナーに作動可能に付着されるように設計される。さらなる実施形態において、母体ポリペプチドのＦｃ領域は仮想的（例えば、思考上のもの又はコンピューター若しくは紙面上に可視的に表現されたもの）であり、それは物理的に存在しないが、抗体技術者は所望の変異Ｆｃ領域のアミノ酸配列を決定し、その配列又は所望の変異Ｆｃ領域のアミノ酸配列のＤＮＡコーディングを含むポリペプチドを生成することができる。しかし、好ましい実施形態において、母体ポリペプチドのＦｃ領域をコードする核酸配列を得ることができ、この核酸配列を変更して変異Ｆｃ領域をコードする変異性核酸配列を生成することができる。
【０１０６】
母体ポリペプチド（又は単に変異Ｆｃ領域）の変異体をコードする核酸は、具体的な配列についての本願明細書の教示を用いて、公知の方法により調製することができる。これらの方法には、ポリペプチドをコードするすでに調製された核酸への部位特異的（又はオリゴヌクレオチド媒介性）突然変異誘発法、ＰＣＲ突然変異誘発法（ｅ．ｇ．，  Ｖａｌｌｅｔｔｅ他，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７：７２３−７３３  （１９８９）、及びカセット式突然変異誘発法（ｅ．ｇ．，  Ｗｅｌｌｓ他，  Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３  （１９８５）が含まれるが、それらに限定されない。部位特異的突然変異誘発法は、変異体を調製するための好ましい方法である。この手法は当該技術において公知である（例えば、Ｃａｒｔｅｒ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３（１９８５）及びＫｕｎｋｅｌ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８（１９８７）を参照）。
【０１０７】
あるいは、又は更に、変異ポリペプチドをコードする所望のアミノ酸配列を決定することができ、このような変異ポリペプチド（即ち、本願明細書に記載されるように、アミノ酸置換からなる変異Ｆｃ領域を含むポリペプチド）のアミノ酸配列を合成的に生成することができる。これは、母体Ｆｃ領域が変異Ｆｃ領域の分子前駆体ではないが、代わりに、所望のアミノ酸置換の非存在下の母体に存在するＦｃ領域のアミノ酸配列であった場合であるにもかかわらず、母体Ｆｃ領域の変異Ｆｃ領域であると未だに考慮される。
【０１０８】
母体ポリペプチドのアミノ酸配列は、インビトロ及び／又はインビボで変更された結合親和性又は活性を有し、かつ／又はインビトロ及び／又はインビボで変更されたＡＤＣＣを有する変異Ｆｃ領域を生成するために修飾されてもよい。また、母体ポリペプチドのアミノ酸配列は、変更された補体結合特性及び／又は循環半減期を有する変異Ｆｃ領域を生成するために修飾されてもよい。
【０１０９】
Ｆｃ領域の生物学的性質の実質的な改変は、（ａ）例えば、シート又はヘリックスコンホメーションの置換された領域のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子、又は側鎖全体における電荷又は疎水性、（ｄ）糖質との相互作用、又は（ｅ）ドメインの運動柔軟性を変化させる効果の点で有意に異なるアミノ酸置換を選択することにより達成される。天然に存在するアミノ酸残基は、共通の側鎖の性質に基づき、下記のように分類される。
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ
（２）中性かつ親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ
（５）配向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
【０１１０】
非保存的置換により、これらの分類の１つに属するアミノ酸は他の分類に属するアミノ酸に交換される。保存的置換により、これらの分類の１つに属するアミノ酸は同一の分類に属するアミノ酸に交換される。
【０１１１】
以下の実施例で示されるように、改変した活性（エフェクター機能及び薬物動態）を有する変異Ｆｃ領域を設計することができる。例えば、Ｆｃ領域の１又は複数のアミノ酸残基を、ＡＤＣＣ活性又はＣＤＤ活性或いはＦｃＲｎ結合親和性を改変（例えば、増大又は減少）するために修飾することができる。好ましい実施例において、修飾は、本願明細書の表１のリストに記載される置換である。一般的に、ＡＤＣＣ活性に影響することを本願明細書で確認したＦｃ領域の残基について、そのような変異Ｆｃ領域を生成するために１又は複数のアミノ酸置換を行う。好ましい実施形態において、１〜約１０以下のＦｃ領域の残基を置換する。ここで、１又は複数のアミノ酸置換を有するＦｃ領域は、好ましくは、母体Ｆｃ領域又は天然ヒトＦｃの配列の少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％を保持する。
【０１１２】
母体Ｆｃ領域に適当なアミノ酸配列の修飾を導入することにより、（母体Ｆｃ領域と比較して）（ａ）ＡＤＣＣをヒトエフェクター細胞の存在下で効率的又は非効率に媒介し、かつ／又は、（ｂ）ＣＤＣをヒトエフェクター細胞の存在下で効率的又は非効率に媒介し、かつ／又は、（ｃ）Ｃ１ｑに、所望の親和性で結合し、かつ／又は、（ｄ）Ｆｃγレセプター（ＦｃγＲ）又は新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）に所望の親和性で結合することができる変異Ｆｃ領域を生成することができる。そのような変異Ｆｃ領域は、通常少なくとも１つのアミノ酸の修飾をＦｃ領域に含む。好ましくは、修飾は、アミノ酸置換（より好ましくは、本願明細書の表１〜９に列挙されるようなアミノ酸置換）である。
【０１１３】
好ましい実施形態において、母体ポリペプチドのＦｃ領域は、ヒトＦｃ領域又はその機能性フラグメント、例えば、天然ヒトＦｃ領域ＩｇＧ１（ｆ及びａ，ｚアロタイプ）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及び任意の種について知られている又は発見された全てのアロタイプである。そのような領域は図２（配列番号１〜８）及び図３（配列番号９〜１２）に示した配列を有する。
【０１１４】
ある実施形態において、増大したＡＤＣＣ活性を有する変異Ｆｃ領域を生成するために、母体ポリペプチドは、ＡＤＣＣをすでに有するもの（例えば、母体ポリペプチドはヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ３のＦｃ領域を含む）であることが好ましい。ある実施形態において、変異体は、母体ポリペプチドに比べて増大したＡＤＣＣ活性（例えば、本願明細書に記載されるＡＤＣＣ分析に従って母体に比べて大きなレベル）を有する。即ち、変異Ｆｃ領域から成っているモノクローナル抗体は、母体Ｆｃ領域或いは天然ＩｇＧ１又はＩｇＧ３のＦｃ領域配列からなるモノクローナル抗体に対して同一の環境、又は、変異Ｆｃ領域からなるモノクローナル抗体と同一の下で比較して増大したＡＤＣＣ活性を有する。
【０１１５】
好ましい実施形態において、アミノ酸置換はＦｃ領域のＣＨ２及び／又はＣＨ３領域に導入される。好ましい実施形態において、これらの変異体を生成するためのテンプレートとして用いた母体ポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む。
【０１１６】
ある実施形態において、増大したＣＤＣ活性を有する変異Ｆｃ領域を生成するために、母体ポリペプチドは、ＣＤＣをすでに有していることが好ましい。ある実施形態において、変異体は、母体ポリペプチドに比べて増大したＣＤＣ活性（例えば、本願明細書に記載されるＣＤＣ分析に従って母体に比べて大きなレベル）を有する。即ち、変異Ｆｃ領域から成っているモノクローナル抗体は、母体Ｆｃ領域或いは天然ＩｇＧ１又はＩｇＧ３のＦｃ領域配列からなるモノクローナル抗体に対して同一の環境、又は、変異Ｆｃ領域からなるモノクローナル抗体と同一の下で比較して増大したＣＤＣ活性を有する。
【０１１７】
上述の変異ポリペプチドには、望ましい又は意図されるポリペプチドの使用に応じて更に修飾を行ってもよい。そのような修飾には、例えば、アミノ酸配列のさらなる変更（アミノ酸配列の置換、挿入及び／又は欠失）、糖質の改変、外因性ポリペプチドとの融合及び／又は共有結合による修飾が含まれる。そのようなさらなる改変は、Ｆｃレセプターとの結合及び／又はＡＤＣＣ活性の変更をもたらす、本願明細書に開示したアミノ酸の修飾の前、同時、又は後に行うことができる。
【０１１８】
あるいは、又は更に、アミノ酸の修飾をＣｌｑ（Ｃ１ｑ）との結合及び／又はＦｃ領域のＣＤＣ機能を改変させる１又は複数のさらなるアミノ酸の修飾と組み合わせることが有用な場合がある。例えば、出発物質となったポリペプチドは、Ｃｌｑ（Ｃ１ｑ）に結合することができず、かつ／又はＣＤＣを媒介できないが、本願明細書の教示に従い、これらのさらなるエフェクター機能を獲得するように改変することができる。更に、すでにＣｌｑ（Ｃ１ｑ）結合能を有し、必要に応じてＣＤＣ媒介能をも更に有するポリペプチドを、これらの活性の一方又は両方を増大（或いは、減少）させるように改変することもできる。Ｃｌｑ（Ｃ１ｑ）結合を変化させ、かつ／又はＣＤＣ活性を改変する特定のＦｃ領域アミノ酸の修飾については、本願明細書（表２、７、８、及び１０を参照）又は、国際公開第００／４２０７２号パンフレットに記載される。
【０１１９】
上に開示したように、Ｆｃ領域又はその一部を、例えば、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性を改変することにより、エフェクター機能を変化させるようにデザインすることができる。例えば、改善したＣＤＣ活性及びＡＤＣＣ活性を有する変異Ｆｃ領域を生成することができる。あるいは、エフェクター機能を減少させ、あるいは除去したい場合には、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性が減少した変異Ｆｃ領域を設計することができる。他の実施形態において、これらの活性の一方を増大させ、必要に応じて他方の活性を減少させ、例えば、増大したＡＤＣＣ活性を有するがＣＤＣ活性が減少したＦｃ領域変異体、及びその逆の変異Ｆｃ領域を生成することができる。更に、ＦｃＲｎ、プロテインＡ、及び／又は他のＦｃ結合性タンパク質に対する結合親和性が改変した変異Ｆｃ領域を設計することができる。
【０１２０】
ある実施形態において、本発明は、母体ポリペプチドの変異体を含む組成物を提供し、前記変異体はＦｃ領域を有し、Ｆｃ領域の中において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する（例えば、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０：２３６１−７０，  Ａｐｒｉｌ  １９８１，  及びＷ０００４２０７２を参照）。他の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域を有する母体ポリペプチドの変異体を含む組成物を提供し、該変異体はＦｃ領域において少なくとも１つの非表面残基のアミノ酸の修飾を含む。さらなる実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域を有する母体ポリペプチドの変異体を含む組成物を提供し、該変異体は、Ｆｃ領域において、少なくとも１つの表面残基のアミノ酸の修飾及び少なくとも１つの非表面残基のアミノ酸の修飾の両方を含む。
【０１２１】
複合変異体
ある実施形態において、本発明の変異Ｆｃ領域は、２つ以上アミノ酸の修飾（例えば置換）からなる。このような複合変異体は、例えば、上記で詳述される（例えば、表１を参照）アミノ酸置換、又は当該技術分野において公知の置換に加えて表１に列挙されるような１つ以上のアミノ酸置換の２つ以上を選択して生成される。
【０１２２】
表１０に示した複合変異体及び他の複合変異体（国際公開第００／４２０７２号パンフレットに開示され、本願明細書において開示される組合せで使用する）は、所定の活性（例えば、ＦｃＲｎ結合活性、ＡＤＣＣ活性、及びＣＤＣ活性）について、種々のアッセイ（下記の実施例を参照）によりテストすることができる。こうして、有用な複合変異体を同定することができる。
【０１２３】
ある好ましい実施形態において、複数のアミノ酸置換はＡＤＣＣ活性を増大させる１つのアミノ酸置換、及び変異Ｆｃ領域を含むポリペプチドの新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）への結合親和性（例えば、ｐＨ６．０における）を増大させる１つのアミノ酸の修飾を有する本発明の変性Ｆｃ領域において存在する。他の実施形態において、本発明の複合変異体は、本発明の少なくとも変異Ｆｃ領域の１つの表面残基のアミノ酸の修飾及び少なくとも１つの非表面残基のアミノ酸の修飾を含む。本発明の変異Ｆｃ領域のさらなる複合変異体は、本願明細書に記載の２又はそれ以上のアミノ酸置換、又は本願明細書に記載の少なくとも１つのアミノ酸の修飾、及び世界公開第００／４２０７２号パンフレットに記載のアミノ酸の修飾を組み合わせることにより生成することができる。
【０１２４】
変異ポリペプチドのアッセイ
本発明は、Ｆｃ領域変異体又は本発明の変異Ｆｃ領域を含むポリペプチドをスクリーニングする種々のアッセイを提供する。スクリーニングアッセイを、有用な変異体の発見及び検証のために用いることができる。例えば、複合変異体（表１０参照）をスクリーニングし、ＦｃＲへの結合が変化した、かつ／又はＡＤＣＣ活性が変化した、かつ／又はＣＤＣ活性が変化した（例えば、ＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性が増大又は減少した）、かつ／又は全血からの標的細胞（例えばＢ細胞）の除去能が改変を受けた変異体を見出すことができる。また、以下に述べるように、本発明のアッセイを用いて、（例えば、抗体又はイムノアドヘシン応答性疾患の症状を有するヒト等の）被験者に対する有用な治療効果を有する変異体を発見し検証することができる。種々のアッセイのタイプを用いて、変異体における母体ポリペプチドに対する任意の変更を評価することができる（国際公開第００／４２０７２号パンフレットに記載のスクリーニングアッセイを参照）。他のアッセイの例は以下に示す。
【０１２５】
好ましい実施形態において、変異ポリペプチド、（つまり、本発明の変異Ｆｃ領域を含むポリペプチド）は、母体プリペプチドと比べ（つまり、例えば、結合能は、好ましくは非変異ポリペプチドの約２０分の１、１０分の１、７分の１、５分の１より小さい）特異抗原（未改変の抗原結合領域又は改変を受けた抗原結合領域を介した）の結合能をほぼ保持するモノクローナル抗体である。変異ポリペプチドの抗原への結合能は、ＥＬＩＳＡ、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析、又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）等の手法により決定することができ、例えば、ＦｃＲ結合アッセイは、本発明の変異体を評価するために使用される。例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃＲｎ等のＦｃレセプターへの結合は、変異ポリペプチドを滴定し、結合した変異ポリペプチドを、ＥＬＩＳＡのフォーマット（下記の実施例を参照）において特異的に変異ポリペプチドに結合する抗体を用いて測定することにより決定することができる。例えば、抗体を含む変異体について標準的なＥＬＩＳＡアッセイによりスクリーニングを行い、ｐＨ６．０及びｐＨ７．０又は７．４におけるＦｃＲｎを決定する。ストレプトアビジン又はニュートラアビジンを塗布した固体表面を用いてビオチン標識したＦｃＲｎを、マウス又はヒト等の他の種から捕捉することができる。ブロッキングを行った後、変異ポリペプチド（例えば抗体）で捕捉したレセプターをバッファー中ｐＨ６．０又はｐＨ７．０で希釈し、インキュベートすることができる。次の工程において、ヒト抗体に特異的な分子（例えば、ヤギ（Ｆａｂ’）２抗ヒトＦａｂ抗体と酵素のコンジュゲート）を加える。その後、基質を加え、ｐＨ６．０又はｐＨ７．０又は０Ｈ７．４において固定化したＦｃＲｎへの変異ポリペプチドの結合量を決定する。本アッセイの結果を母体（非変異体）ポリペプチドの同一のＦｃＲへの結合能と比較することができる。他の好ましい実施形態において、（例えば、ＦｃＲｎとの）ＥＬＩＳＡを行い変異体のスクリーニングを行うための成分は、キットとして（例えば取扱説明書と共に）パッケージ化されている。
【０１２６】
また、ＡＤＣＣアッセイは、本発明の変異体をスクリーニングするために使用される。ＡＤＣＣアッセイはインビトロ及び／又はインビボで行うことができる。変異ポリペプチドのＡＤＣＣ活性の評価を行うために、ＡＤＣＣアッセイを種々のエフェクター：標的比で行って（ｐｅｒｆｏｎｎｅｄ）もよい。例示的なＡＤＣＣアッセイにおいて、次の標的抗原：ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ６３、ＥＧＦレセプター、ｈｅｒ−２レセプター、前立腺特異的膜抗原、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ糖質、ＧＤ２及びＧＤ３ガングリオシド、ｌａｍｐ−ｉ、ＣＯ−０２９、Ｌ６、及びｅｐｈＡ２のいずれかが発現した標的細胞系を用いることができる。エフェクター細胞は健康なドナーから（例えば、実験当日に）得ることができ、ＰＢＭＣは、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて精製することができる。その後、標的細胞を本発明の変異Ｆｃ領域を含むＩｇＧ変異体と、エフェクター細胞と、例えば、４０：１、２０：１、及び１０：１のエフェクター：標的比で混合する前に、例えば０．１〜１０００ｎｇ／ｍｌで３０分間プレインキュベートする。その後、ＡＤＣＣ活性を、損傷を受けた細胞の細胞質から上澄み中に放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性の測定に基づき、細胞の死及び溶解の定量を行うためのＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を用いて、比色定量法により測定する。ＡＤＣＣ活性は、クロムを導入した標的細胞のアッセイにより、細胞の死又は溶解の結果放出されたクロムを測定することによっても測定することができる。抗体非依存性細胞毒性は、抗体の非存在下で標的細胞及びエフェクター細胞由来のＬＤＨ活性を測定することにより決定することができる。全放出量は、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを標的細胞及びエフェクター細胞に添加した後で測定することができる。標的細胞及びエフェクター細胞のインキュベーションは、最適化された時間（０．５４〜１８時間）、３７℃、５．０％ＣＯ２中で行い、次いでアッセイプレートの遠心分離を行うことにより行う（ｐｅｒｆｏｎｎｅｄ）ことができる。その後上澄みを９６ウェルプレートに移し、ＬＤＨ検出試薬を加え、３０分間２５℃でインキュベートする。資料の吸光度は、４９０ｎｍでマイクロプレートリーダーを用いて測定することができる。細胞毒性の割合は、下式により計算することができる。
細胞毒性の割合（％））＝｛（実験値−低対照値）／（高対照値−低対照値）｝×１００
抗ＣＤ−２０及び変異体における細胞毒性の割合は、同量のＲＩＴＵＸＡＮと直接比較することができ、相対有効性の測定値が得られる。例示的なＡＤＣＣアッセイにおいては、ＣＤ２０抗原を過剰発現したＳＫＷ６．４細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）を、標的細胞源として用いることができる。このアッセイの多くの変形が知られている（例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ他，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９７８；７（１）：１−２６を参照）。
【０１２７】
このようなアッセイに有用な細胞としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、及び他の末ＰＢＭＣが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、又は更には、本発明の変異ポリペプチドのＡＤＣＣ活性は、インビボで、Ｃｌｙｎｅｓ他，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されたような動物モデル等を用いて評価することができる。
【０１２８】
本発明の変異体は、補体の活性化によってもスクリーニングすることができる。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３（１９９６））を参照。）例えば、種々の濃度の変異ポリペプチド及びヒト補体をバッファーで希釈してもよい。変異ポリペプチドが結合する抗原が発現した細胞を、１×１０６個／ｍｌの密度まで希釈することができる。変異ポリペプチド、希釈されたヒト補体、及び抗原を発現した細胞の混合物を、平底の組織培養用９６ウェルプレートに加え、２時間、３７℃、５％ＣＯ２中でインキュベートし、補体依存性細胞溶解を促進する。その後、５０μｌのアラマーブルー（Ａｃｃｕｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）をそれぞれのウェルに加え、３７℃で州やインキュベートする。９６ウェル蛍光光度計を用いて、励起波長５３０ｎｍ、発光波長５９０ｎｍで吸光度の測定を行うことができる。結果は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）によって表される。サンプルの濃度は標準曲線により計算することができ、非変異ポリペプチドと比較した活性の割合を、対象となる変異ポリペプチドについて求めることができる。
【０１２９】
ある実施形態において、本発明の変異体は補体を活性化しない、又は、十分に活性しない。例えば、変異ポリペプチドは、本アッセイにおいて、変異を有しないＩｇＧ１  Ｆｃ領域を有する対照抗体と比べ約０〜１０％のＣＤＣ活性を示す。好ましくは、変異体は上述のＣＤＣアッセイにおいて全くＣＤＣ活性（例えば、バックグラウンドレベル以上の）を示さないように見える。他の実施形態において、本発明の変異体は、母体ポリペプチドと比べ増大したＣＤＣを示す（例えば、好ましくは、ＩＣ５０値の比較において、インビトロ又はインビボで約１．１、１．５、１．７、又は２〜約１００倍（又はそれ以上）に増大したＣＤＣ活性を示す）ことが見出される。
【０１３０】
本発明の変異ポリペプチドは、全血サンプルにおける標的細胞の消失によってもスクリーニングすることができる。例えば、種々の濃度のＣＤ２０標的特異性を有する変異ポリペプチドを、全血サンプルにおけるＢ細胞の消失についてｆａｃｓを用いてスクリーニングすることができる（Ｖｕｇｍｅｙｓｔｅｒ他，２００３  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ５２Ａ，１０１−１０９）。新たに採取した血液を種々の濃度の変異ポリペプチドと３７℃、５％ＣＯ２中で４時間（時間は変化させてもよい）インキュベートする。インキュベート後、赤血球を製造者の説明書に従い、塩化アンモニウム試薬（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号５５５８９９）により溶解し、蛍光標識を有するＢ細胞特異的な抗体（抗ＣＤ１９抗体等）を用いて、ｆａｃｓ法によりＢ細胞を検出する。結果は、未処理のサンプル又は無関係な（非消失性の）抗体とインキュベートしたサンプルのいずれかに対するＢ細胞の消失率（％）として表される。
【０１３１】
好ましい実施形態において、変異体はＢ細胞を母体ポリペプチドよりも効率的に消失させることができる。変異ポリペプチドは、Ｂ細胞を、例えば、母体プリペプチドより約２倍以上、好ましくは約５倍以上消失させることができる。また、変異体は、Ｂ細胞の消失について高い能力を示すことができる。例えば、変異体は、母体ポリペプチドと同じ割合のＢ細胞を消失させるが、約１／５、好ましくは約１／１０の抗体しか用いる必要がない。変異体に媒介される標的細胞の消失は、母体ポリペプチドと比べ、約２倍、３倍、５倍〜約１０００倍以上、好ましくは、約５倍〜約１０００倍に増大する。
【０１３２】
本発明の変異体は、インビボでもスクリーニングすることができる。任意のタイプのインビボアッセイを用いることができる。１つのタイプのアッセイの具体例について以下に示す。本例に示したアッセイにより、Ｆｃ変異体のインビボでの臨床前評価が可能になる。テストされる変異体は、何らかの活性を有することが知られている特定の抗体のＦｃ領域に取り込まれてもよい。例えば、変異体を抗ＣＤ２０  ＩｇＧのＦｃ領域に、変異誘発法により組み込むことができる。これにより、母体ＩｇＧ及びＦｃ変異性ＩｇＧをＲＩＴＵＸＡＮ（腫瘍の縮小を促進することが知られている）と直接比較することが可能になる。臨床前評価は、２つのフェーズ（薬物動態フェーズ及び薬力学フェーズ）により行うことができる。第１フェーズの薬物動態試験の目標は、Ｆｃ領域変異性ＩｇＧ及びインビボ活性が既知の抗体（例えばＲＩＴＵＸＡＮ）との間で、排出速度が相違するか否かを決定することである。排出速度が異なると、血清中のＩｇＧの定常状態レベルが異なる。かくして、定常状態濃度の相違が検出された場合には、正確な比較が可能なように規格化しなければならない。第２フェーズの薬力学試験の目標は、Ｆｃ変異体の、この場合には腫瘍の成長に及ぼす効果を決定することである。ＲＩＴＵＸＡＮを用いた過去の試験では、単回投与が用いられ腫瘍の成長を完全に阻害した。この試験では定量的な違いを測定できないため、容量範囲を用いる必要がある。
【０１３３】
第１フェーズでのＦｃ変異体、野生型の母体Ｆｃ、及びＲＩＴＵＸＡＮの薬物動態の比較は、例えば、次の方法により行われる。まず、動物１頭あたり４０μｇ（試験用に他の用量）を静脈注射し、ＩｇＧの血漿中濃度を、０、０．２５、０．５、１、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８、及び３３６時間後に定量する。データを、例えば、ゼロ遅延２−コンパートメント薬物動態モデル薬物動態プログラム（ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ）によりフィッティングし、排出速度を用いることができる。排出速度を用いて、次の式により定常状態での血漿内濃度を定義することができる。
Ｃ＝（投与量）／（排出速度×τ）
ここで、τは投与間隔、Ｃは定常状態での血漿内濃度を表す。薬物動態実験は、腫瘍を有しないマウスを、例えば、１つの時間ポイントあたり少なくとも５頭のマウスを用いて行うことができる。
【０１３４】
次のフェーズのために、下記の方法により例示的な動物モデルを用いることができる。ＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスの右脇腹の皮下に、１０６個のＲａｊｉ細胞を埋め込む。Ｆｃ変異体、野生型Ｆｃ、及びＲＩＴＵＸＡＮの静脈注入を、埋め込み後すぐに開始し、腫瘍のサイズが直径２ｃｍを超えるまで続行する。毎週月、水、金曜日に、腫瘍の長さ、幅、及び高さをノギスで測定することにより、腫瘍の体積を決定する（腫瘍の体積＝Ｗ×Ｌ×Ｄ）。腫瘍の体積−時間プロットより、腫瘍成長速度が得られ、薬力学計算が行なわれる。群毎に、少なくとも約１０頭の動物を用いる必要がある。
【０１３５】
第２フェーズでの変異性Ｆｃ抗体、野生型の母体Ｆｃ、及びＲＩＴＵＸＡＮの薬力学の比較は、次の方法により行われる。文献値に基づき、毎週１０μｇ／ｇのＲＩＴＵＸＡＮは、インビボで完全に腫瘍の成長を阻害する（Ｃｌｙｎｅｓ他，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ６：４４３−６，  ２０００）。したがって、週当たりの用量範囲１０μｇ／ｇ、５μｇ／ｇ、１μｇ／ｇ、０．５μｇ／ｇ、及び０μｇ／ｇについてテストすることができる。腫瘍の成長を５０％阻害する定常状態での血漿中濃度を、定常状態での血漿中濃度及び効果の関係からグラフを用いて決定する。定常状態での血漿中濃度を、上述のように計算することができる。必要ならば、τをそれぞれの変異性Ｆｃ抗体及び野生株Ｆｃ抗体について、薬物動態特性に応じて調節し、ＲＩＴＵＸＡＮと同程度の定常状態での血漿中濃度を達成することができる。母体ポリペプチド（例えばＦｃ野生株）と比較して、Ｆｃ変異体及びＲＩＴＵＸＡＮの薬力学値が統計的に改善し、一般的に変異性Ｆｃ抗体の活性がインビボにおいて改善することを示す。
【０１３６】
変異性Ｆｃ抗体、野生型Ｆｃ、及びＲＩＴＵＸＡＮのさらなる薬力学的比較は、カニクイザルを用いて文献記載の方法（Ｒｅｆｆ他，Ｂｌｏｏｄ，８３，４３５−４４５，１９９４）により行うことができる。末梢Ｂ細胞及びリンパ節Ｂ細胞の消失における用量反応を用いて、静脈投与及び／又は皮下投与されたＦｃ変異体と、野生型Ｆｃ及びＲＩＴＵＸＡＮの相対効果を比較することができる。母体ポリペプチド（例えばＦｃ野生株）と比較して、Ｆｃ変異体及びＲＩＴＵＸＡＮの薬力学値が統計的に改善し、一般的に変異性Ｆｃ抗体の活性がインビボにおいて改善することを示す。
【０１３７】
さらなる実施形態において、本発明の変異体（本発明の変異Ｆｃ領域を含むポリペプチド又はその機能的な部分）はスクリーニングされ、少なくとも２種類の種に対して治療的に有用な変異体が同定される。そのような変異体は、本願明細書で「複数種の改善した変異体」と呼ばれ、特にヒトに対する治療効果を有する変異体の同定に有用であり、動物モデルにおいても有効性を示す（又は有効性を示す傾向がある）。この点で、本発明は、動物モデルのデータが政府の監督官庁（例えば米国食品医薬品局）に提出した全てのヒトに対する試験結果を強く支持するため、ヒトに対する臨床試験で承認される見通しの高い変異体を同定する方法を提供する。
【０１３８】
ある実施形態において、複数種の改善した変異体は、まずヒトエフェクター細胞を用いたＡＤＣＣアッセイを行い、改善した変異体を見出し、次いでマウス、ラット又は非ヒト霊長類エフェクター細胞を用いた第２のＡＤＣＣアッセイを行い、複数種の改善した変異体である改善した変異体のサブセットを見出すことにより同定される。ある実施形態において、本発明は、ａ）ｉ）標的細胞、ｉｉ）少なくともＦｃ領域の一部を有する母体ポリペプチドの候補変異体で、候補変異体は、Ｆｃ領域において少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、候補変異体は、標的細胞に対する細胞毒性を、第１の種（例えばヒト）のエフェクター細胞の存在下で母体ポリペプチドよりも効率的に媒介する候補変異体、及びｉｉｉ）第２の種（例えば、マウス、ラット又は非ヒト霊長類）のエフェクター細胞を提供すること、かつ、ｂ）組成物を候補変異体が標的細胞と結合することにより標的細胞に結合した候補変異体を生成させる条件下で標的細胞とインキュベートすること、ｃ）第２の種のエフェクター細胞を、候補変異体が結合した標的細胞と混合すること、並びに、ｄ）候補変異体に媒介された標的細胞に対する細胞毒性を測定することを含む、複数種の改善した変異体を同定する方法を提供する。
【０１３９】
ある実施形態において、該方法は、工程ｅ）候補変異体が第２の種のエフェクター細胞の存在下で、母体ポリペプチドよりも効率的に標的細胞に対する細胞毒性を媒介するか否かを決定することを更に含む。ある実施形態において、該方法は、工程ｆ）候補変異体を、第２の種のエフェクター細胞の存在下で、母体ポリペプチドよりも効率的に標的細胞に対する細胞毒性を媒介する複数種の改善した変異体として同定することを更に含む。好ましい実施形態において、同定された複数種の改善した変異体は、その後１又は複数種での動物アッセイによりスクリーニングされる。
【０１４０】
ある実施形態において、複数種の改善した変異体は、まずヒトの血液を用いた全血アッセイを行い、改善した変異体を見出し、次いでマウス、ラット又は非ヒト血液を用いた第２の全血アッセイを行い、複数種の改善した変異体である改善した変異体のサブセットを見出すことにより同定される。ある実施形態において、本発明は、ａ）ｉ）標的細胞、ｉｉ）少なくともＦｃ領域の一部を有する母体ポリペプチドの候補変異体で、候補変異体は、Ｆｃ領域において少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、標的細胞の消失を、第１の種（例えばヒト）のエフェクター細胞の存在下で母体ポリペプチドよりも効率的に媒介し、及びｉｉｉ）第２の種（例えばマウス、ネズミ又は非人間的な霊長類）の血液、かつ、ｂ）組成物を候補変異体が標的細胞と結合することにより標的細胞に結合した候補変異体を生成させる条件下で標的細胞とインキュベートすること、ｃ）第２の種のエフェクター細胞を、候補変異体が結合した標的細胞と混合すること、並びに、ｄ）候補変異体に媒介された標的細胞の消失を測定することを含む、複数種の改善した変異体を同定する方法を提供する。ある実施形態において、該方法は、工程ｅ）候補変異体が第２の種のエフェクター細胞の存在下で、母体ポリペプチドよりも効率的に標的細胞の消失を媒介するか否かを決定することを更に含む。ある実施形態において、該方法は、工程ｆ）候補変異体を、第２の種のエフェクター細胞の存在下で、母体ポリペプチドよりも効率的に標的細胞の消失を媒介する複数種の改善した変異体として同定することを更に含む。好ましい実施形態において、同定された複数種の改善した変異体は、その後１又は複数種での動物アッセイによりスクリーニングされる。
【０１４１】
ある実施形態において、複数種の改善した変異体は、ヒトの成分（例えば、ヒト細胞、ヒトＦｃＲ）を用いた上述のいずれかのアッセイを行うことにより同定され、改善した変異体を同定し、その後、ヒト以外の成分（例えば、マウス細胞、マウスＦｃＲ）を用いた同様のアッセイ（あるいは異なるアッセイ）を行う。このようにして、ヒトに基づくアッセイ及び第２の種に基づくアッセイの両者において、上記の基準によく従い機能する変異体のサブセットを同定することができる。
【０１４２】
複数種の改善した変異体を同定するための方法の例は下記のとおりである。まず、ＩｇＧのＦｃ領域の少なくとも一部をコードする核酸配列を、発現したアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸が変化するように変異させ、それにより変異体を生成する。次に、この発現したＩｇＧ変異体は、ヒトＰＢＭＣ又はサブセット（例えば、ＮＫ細胞又はマクロファージ）を用いたＡＤＣＣアッセイにより評価される。増大したＡＤＣＣ活性が観測されると、変異体は、マウス又はラットＰＢＭＣを用いた第２のＡＤＣＣアッセイによりスクリーニングされる。あるいは、又は更に、クローニングされたげっ歯類レセプター又は細胞系に結合する変異体を用いてアッセイを行うことができる。最後に、変異体について、複数種の改善した変異体であることを特徴づける、第２のアッセイにおける改善が観測された場合、変異体はマウス又はラットにおいてインビボでスクリーニングされる。
【０１４３】
変異Ｆｃ領域を含む分子の例
本発明の変異Ｆｃ領域は、大きな分子の一部であってもよい。大きな分子は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二特異性抗体、イムノアドヘシン等であってもよい。更に、本発明の変異Ｆｃ領域は、改変した（増加又は減少した）半減期を示す非抗体ポリペプチドに作動可能に付着される。このように、本発明の変異Ｆｃ領域は、広汎な用途を有することは明らかである。
【０１４４】
抗体を含む変異Ｆｃ領域
好ましい実施形態において、変異Ｆｃ領域を含む分子（例えばポリペプチド）は抗体である。抗体を生成する手法は、以下に述べるとおりである。
【０１４５】
（１）抗原の選択及び調製
通常、変異Ｆｃ領域を含む分子が抗体である場合、抗体は、対象となる抗原に対する。好ましくは、抗原はポリペプチドであり、抗原分子の量又は活性の減少から利益がもたらされる疾患又は障害にかかっている哺乳類への抗体の投与は、該哺乳類に対して治療の利益をもたらす。しかし、非ポリペプチド抗原（ガンに関連する糖脂質抗原等；米国特許第５，０９１，１７８号明細書を参照）に対する抗体を用いることもできる。
【０１４６】
抗原の例としては、レニン、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン等の成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リポタンパク質、α−ｉ−アンチトリプシン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子（ＴＦ）、及びフォンウィレブラント等の凝固因子、タンパク質Ｃ等の抗凝固因子、心房性ナトリウム利尿因子、肺サーファクタント、ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活性化因子等（ｔ−ＰＡ）のプラスミノーゲン活性化因子、ボンベシン、トロンビン、造血成長因子、腫瘍壊死因子−α及び−β、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−α）、ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン、ミュラー管抑制物質、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、プロリラキシン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、β−ラクタマーゼ等の微生物タンパク質、ＤＮａｓｅ、ＩｇＥ、ＣＴＬＡ−４等の細胞毒性Ｔ−リンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ホルモン又は成長因子のレセプター、タンパク質Ａ又はＤ、リウマチ因子、骨誘導性神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニュートロフィン−３、−４、−５、又は−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６）、又は神経成長因子等の神経栄養因子、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、αＦＧＦ及びβＦＧＦ等の繊維芽細胞増殖因子、内皮成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦ−１、ＴＧＦ−２、ＴＧＦ−３、ＴＧＦ−４、又はＴＧＦ−５等のＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β、等の形質転換成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子−Ｉ及び−Ｉ１（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９及びＣＤ２０等のＣＤタンパク質、エリスロポイエチン、骨誘導因子、イムノトキシン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、成長分化因子（例えばＧＤＦ８）インターフェロン−α、−β、及び−γ等のインターフェロン、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ等のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＩＬ−ＩからＩＬ−２５までのインターロイキン（ＩＬ）、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ２５−細胞レセプター、表面膜タンパク質、分解促進因子、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部等のウイルス性抗原、輸送タンパク質、ホーミングレセプター、アドレシン、調節タンパク質、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ４及びＶＣＡＭ等のインテグリン、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター等のガン関連抗原、グレリン、アポトーシス経路の構成分子、及び上述のポリペプチドのフラグメント又は前駆体等の分子を含むがこれらに限定されない。
【０１４７】
好ましい抗原としては、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３４及び等のＣＤタンパク質、ＥＧＦレセプター、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター等のＥｒｂＢレセプターファミリー、ＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、ａ４／ｐ７インテグリン、及びａ５又はサブユニットの一方（例えば、抗ＣＤＩＩａ、抗ＣＤ１８、又は抗ＣＤＩｌｂ抗体）を含むＸｖ／ｐ３インテグリン等の細胞接着分子、ＶＥＧＦ等の成長因子、組織因子（ＴＦ）、αインターフェロン（α−ＩＦＮ）、ＧＤＦ−８等の成長分化因子、ＩＬ−８等のインターロイキン、ＩｇＥ、血液型抗原、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター、肥満（ＯＢ）レセプター、ｍｐｌレセプター、ＣＴＬＡ−４、タンパク質Ｃ、及びグレリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
必要に応じて他の分子と結合した可溶性の抗原又はそのフラグメントを、抗体を形成するための抗原として用いることができる。レセプター、それらのフラグメント（例えば、レセプターの膜貫通領域）等の膜貫通分子を免疫抗原（ｉｒｎｍｕｎｏｇｅｎ）として用いることができる。あるいは、膜貫通分子を発現している細胞を抗原として用いることができる。そのような細胞は、天然の供給源（例えばガン細胞系）から誘導することであってもよく、又は組み換え手法により膜貫通タンパク質を発現させてもよい。抗体を調製するのに有用な他の抗原及びその型は、当業者にとって明らかである。
【０１４９】
（ｉｉ）ポリクローナル抗体
本発明は、変異Ｆｃ領域を有するポリクローナル抗体を提供する。例えば、改変したＧ１定常領域を含むヒト免疫グロブリンレパートリーを、免疫グロブリンを不活性化されたマウスに移植し、改変したＦｃ領域を含むＩｇＧレパートリーを発現したマウスを得ることができる（例えば、Ｍｅｎｄｅｚ，ＭＪ他，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６（１９９７）を参照）。ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原及びアジュバントの頻回皮下注射（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射により動物内で発現する。関連抗原を、免疫する種に対する免疫原性を有するタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビター）に、二官能性又は誘導化剤（例えば、システイン残基で結合させる場合のマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル、リジン残基で結合させる場合のＮ−ヒドロキシスクシンイミド、グルタルアルデヒド、スクシニルアルデヒド、ＳＯＣ１２、又はＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ１は異なるアルキル基を表す））を用いて結合させることは有用である。
【０１５０】
一般的なウサギ又はマウスに対する免疫のプロトコルは、以下のとおりである。動物を抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して、例えば、１００μｇ又は５μｇ（それぞれ、ウサギ及びマウスに対する量）のタンパク質又はコンジュゲートを３倍容の完全フロインドアジュバントと混合し、腹腔内の複数個所に注射することにより免疫する。１ヵ月後、動物を、元の量の１／５又は１／１０の完全フロインドアジュバント中のタンパク質又はコンジュゲートを腹腔内の複数個所に注射し免疫性を高める。７〜１４日後に動物から採血し、血清を抗体力価によりアッセイする。力価が一定値に達するまで動物の免疫性を高める。好ましくは、動物は同一の抗原のコンジュゲートであるが、異なるタンパク質及び／又は異なるクロスリンク試薬により結合させたコンジュゲートにより抗原性を高められる。コンジュゲートは、組み換え細胞の培養により、融合タンパク質として製造することもできる。更に、ミョウバン等の凝集剤を、免疫応答を高めるために好適に用いることができる。
【０１５１】
（ｉｉｉ）モノクローナル抗体
本発明は、変異Ｆｃ領域を有するモノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ他，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５に記載の方法）又は組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照）を含む種々（ｎｕｎｂｅｒ）の方法により製造することができる。
【０１５２】
ハイブリドーマ法では、マウス又はハムスター又はマカクザル等の適当な宿主動物を免疫し、免疫に用いるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する又は産生能を有するリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫してもよい。その後リンパ球を、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する。このようにして調製したハイブリドーマ細胞を接種し、好ましくは未融合の母体骨髄腫細胞の生存を阻害する１又は複数の物質を含む適当な培地で培養する。例えば、母体骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合には、ハイブリドーマの培地には通常ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害する。
【０１５３】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、抗体産生細胞を選択することにより、安定した高レベルの抗体の産生を支え、ＨＡＴ培地等の培地に感受性を有する。これらの中で、好ましい骨髄腫細胞系は、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１Ｉマウス、の腫瘍から誘導されたもの、及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞等のマウス骨髄腫系である。ヒト骨髄腫細胞及びマウス−ヒトへテロミエローマ細胞系も、ヒトモノクローナル抗体の製造について記載されている（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４））。
【０１５４】
ハイブリドーマ細胞を培養する培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の産生のためにアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法、又は、ＲＩＡ若しくは酵素共役免疫結合アッセイＥＬＩＳＡ等のインビトロ結合アッセイによって決定される。ハイブリドーマ細胞が、所望の特異性、親和性及び／又は活性を有する抗体を産生することが同定されると、クローンは、限界希釈法によりサブクローンし、標準培地で培養することができる。この目的に好適な培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地である。更に、ハイブリドーマ細胞は、インビボで、動物の腹水ガン細胞として培養することができる。サブクローンから分泌されるモノクローナル抗体は、培地、腹水、又は血清から、例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製法により好適に単離される。
【０１５５】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来法（例えば、モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブの使用）により容易に単離及び配列決定することができる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源としての機能を果たす。一旦単離されると、ＤＮＡを発現ベクターに組み込むことができ、その後、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞等の、他の免疫グロブリンを産生しない宿主細胞にトランスフェクトし、組み換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成物を得る。組み換え法による抗体の産生については、以下により詳細に説明する。
【０１５６】
ある実施形態において、抗体又は抗体のフラグメントは、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ他，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載の手法を用いて生成された抗体ファージライブラリーから単離される。Ｃｌａｃｋｓｏｎ他，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）には、それぞれ、マウス及びヒト抗体のファージライブラリーを用いた単離について記載されている。下記の文献には、チェーンシャフリング（Ｍａｒｋｓ他，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））、また、組み合わせ感染及びインビボ組み換えを、非常に大きいファージライブラリーを構築するための戦略として用いた高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ他，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））について記載されている。このように、これらの手法及び同様の手法は、モノクローナル抗体の単離のための当該技術分野において公知の抗体ハイブリドーマ法の、実行可能な代替技術である。また、ＤＮＡは、例えば、相同なマウスの配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常領域をコードする配列を用いること（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書及びＭｏｒｒｉｓｏｎ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４）、又は免疫グロブリンをコードする配列に、非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列の全部又は一部を共有結合させることにより修飾することができる。
【０１５７】
通常、そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常領域の代わりに用いられ、又は、それらは、抗体の１つの抗原結合部位の可変領域の代わりに用いられ、キメラ抗原及び異なる抗原に対する特異性を有する他の抗原結合部位に対する特異性を有する１つの抗原結合部位を含む二価抗体が生成される。
【０１５８】
ｉｖ）ヒト化抗体及びヒト抗体
本発明は、本発明の変異Ｆｃ領域を有するヒト化抗体及びヒト抗体を提供する。好ましい実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列と共にヒト抗体由来でないアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ヒト化抗体中のヒト配列はフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、ヒト配列由来でない配列又は残基は、１又は複数のＣＤＲを含む。ＦＲ及びＣＤＲは、重鎖及びＶＬ領域におけるアミノ酸残基の番号づけに基づいて定義可能であることは注目すべきである。ＣＤＲという用語は、重鎖及び軽鎖の両者のポリペプチドの可変領域においてみられる非連続な抗原結合部位を意味する。これらの領域は、Ｋａｂａｔら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６（１９７７）及びＫａｂａｔ他，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９９１）；以下「Ｋａｂａｔ」という）、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；以下「Ｃｈｏｔｈｉａ」という）、及びＭａｃＣａｌｌｕｍら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）；以下「ＭａｃＣａｌｌｕｍ」という）により定義され、これらの定義を互いに比較すると、重複やアミノ酸残基のサブセットが含まれる。それでもなお、これらの全ての定義を、単独で（例えば、Ｋａｂａｔの定義を）、あるいは組み合わせて（あくまで例示であるが、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせ）用いることにより、抗体（ヒト化抗体を含む）のＣＤＲを定義することは、本願明細書での用語の定義及び使用の範囲内に含まれる。
【０１５９】
また、「フレームワーク」という用語は、抗体可変領域について使用される場合、抗体可変領域内に含まれるがＣＤＲの外にある全てのアミノ酸残基を意味する。したがって、可変領域フレームワークは、約１００〜１２０アミノ酸の長さを有するが、ＣＤＲの外に存在するアミノ酸のみを指す。「フレームワーク領域」という用語は、ＣＤＲにより隔てられたそれぞれのフレームワークのドメインを意味する。したがって、Ｋａｂａｔの定義によるＶＨ領域及びＣＤＲの具体例として、フレームワーク領域１（ＦＲＩ）は、アミノ酸１〜３０を含む可変領域のドメインに相当し、フレームワーク領域２（ＦＲ２）は、アミノ酸３６〜４９を含む可変領域のドメインに相当し、フレームワーク領域３（ＦＲ３）は、アミノ酸６６〜９４を含む可変領域のドメインに相当し、フレームワーク領域４（ＦＲ４）は、アミノ酸１０３から可変領域のＣ末端までを含む可変領域のドメインに相当する。軽鎖可変領域におけるＦＲも、同じようにそれぞれの軽鎖可変領域のＣＤＲによって隔てられている。同様に、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＭａｃＣａｌｌｕｍによるＣＤＲの定義又はそれらのＣＤＲの定義の任意の組み合わせを用いて、フレームワークの境界はＣＤＲによって上述のようにして区分される。ＣＤＲについて複数の定義が存在するが、Ｋａｂａｔの定義によりＣＤＲを定義するのが好ましい。
【０１６０】
ヒト化抗体中のヒト抗体に由来しない残基は、他の種（マウスが含まれるが、これに限定されない）から導入された、又は派生したものであってよく、あるいは、これらの配列は（例えば、ランダム化された核酸配列から生成された）ランダムアミノ酸配列であってもよく、これらは、ヒト化抗体配列に挿入される。上述したように、ヒト化抗体中のヒトアミノ酸配列は、好ましくは、ＦＲであり、ヒト抗体由来でない残基は、（他の種から誘導されたものであれ、ランダムアミノ酸配列であれ）好ましくは、ＣＤＲに相当する。しかし、ある実施形態において、１又は複数のＦＲは、１又は複数の非ヒト由来アミノ酸配列を含んでいてもよい。他のヒトフレームワークへの改変又は修飾（例えば、非ヒト由来残基の導入）の場合、改変又は修飾されたＦＲを、他の種由来の修飾されたＣＤＲ又はランダムＣＤＲ配列に隣接させることが可能であるが、他の実施形態において、改変したＦＲは、他の種由来の改変したＣＤＲ配列又はランダムＣＤＲ配列に隣接しない。ある実施形態において、ヒト化抗体のフレームワーク配列は、完全にヒト由来（ヒトフレームワークに対するフレームワークの変更は行われない）である。好ましい実施形態において、ヒト化抗体のフレームワーク配列は、完全にヒト生殖細胞系由来（ヒト生殖細胞系フレームワークに対するフレームワークの変更は行われない）である。
【０１６１】
他の種由来の非ヒトアミノ酸残基、又はランダム配列は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、通常「インポート」可変領域から取り込まれる。ヒト化は、基本的にＷｉｎｔｅｒらの方法（例えば、Ｊｏｎｅｓ他，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従い、ヒト抗体の対応するＣＤＣ配列を、げっ歯類（又は他の哺乳類）のＣＤＲ又はＣＲＣ配列に置換することにより行われる。また、完全なヒト可変領域よりもはるかに短い部分は、非ヒト種由来の対応する配列によって置換された抗体を生成することもできる（例えば米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。実際に、ヒト化抗体は、通常、いくつかのＣＤＲ残基及び可能ならばいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体の対応する部位によって置換され、又は、上述のように、ＣＤＲ配列がランダム配列によって置換されたヒト抗体である。非限定的な例示に過ぎないが、ドナーＣＤＲの抗体アクセプター可変領域フレームワークへの結合親和性を比較する方法が、国際公開第０１／２７１６０号パンフレット、及び米国特許出願第０９／４３４，８７０号明細書及び米国特許出願第０９／９８２，４６４号明細書に記載されている。
【０１６２】
ヒト可変領域（重鎖及び軽鎖）を、ヒト化抗体の作成のために選択することは、免疫原性の減少のために重要である。いわゆる「ベストフィット」法によると、ヒト化するげっ歯類抗体の可変領域の配列は、既知のヒト可変領域配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。げっ歯類配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として採用する（例えば、Ｓｉｍｓ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３），及びＣｈｏｔｈｉａ他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。他の方法においては、特定の軽鎖及び重鎖のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導された特定のフレームワークを用いる。同一のフレームワーク法を、いくつかの異なるヒト化抗体に用いることができる（例えば、Ｃａｒｔｅｒ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
【０１６３】
他の実施形態において、特定のヒト抗体フレームワークを「予備選択」する必要はない（最も相同性が高いヒトフレームワーク又はヒト化される所定の候補抗体と配列の同一性を有する配列を選択する必要がない）。これらの実施形態において、共通又は万能ヒトフレームワークを、１又は複数の非ヒトＣＤＲを受容するために用いることができる。好ましい実施形態において、１つの普遍的完全ヒトフレームワークを、候補抗体のフレームワーク配列との相同性に関わりなく、ヒト化される全ての抗体のフレームワークとして用いられる。このように、フレームワーク領域に改変を施さずにヒト化抗体を生成させることができる。この普遍的完全ヒトフレームワークは、１又は複数のＣＤＲ配列を受容することができる。１つの実施形態において、１又は複数のＣＤＲ配列は、他の種に由来する完全な抗体中の対応するＣＤＲと比べ修飾されている他の種（例えば、マウス又はネコ）に由来する抗体のＣＤＲ配列である（ＣＤＲの導入及び普遍的ヒトフレームワーク（ｆｒａｎｅｗｏｒｋ）に導入されたＣＤＲの修飾が同時である）。１又は複数のアミノ酸に対応する修飾は、他の種に由来する完全な抗体中の対応するＣＤＲと比べて（修飾されたＣＤＲにおいて）変化する。１つの実施形態において、ＣＤＲ中の全てのアミノ酸残基はライブラリーに含まれるが、他の実施形態においては、ＣＤＲのアミノ酸残基の全てがライブラリーに含まれるわけではない。他の実施形態において、１又は複数のＣＤＲ配列は、ＣＤＲ配列を置換するランダム配列である。
【０１６４】
好ましい実施形態において、抗体は、抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的性質を保持したままヒト化される。ある実施形態において、ヒト化抗体の抗原に対する親和性は、対応する非ヒト化抗体、完全抗体又はそれらのフラグメント又は一部（例えばげっ歯類候補抗体）の親和性よりも高い。この点において、ある実施形態において、ヒト化抗体は母体配列の分析の過程で、母体配列及びヒト化配列の３次元モデルを用いた種々の仮想的なヒト化抗体により調製される。３次元免疫グロブリンモデルは広く入手可能であり、当業者によく知られている。可能性のある候補免疫グロブリン配列のコンホメーションの３次元構造を図示し表示するコンピュータープログラムが入手可能である。これらの表示を検討することにより、候補免疫グロブリン配列の機能において残基が果たす可能性のある役割の解析、例えば、候補免疫グロブリンが抗原に結合する能力に影響を与える残基の解析が可能になる。このようにして、ＦＲ残基をレシピエントから選択して組み合わせることができ、標的に対する増大した親和性等の所望の抗体特性インポート配列が得られる。一般的に、ＣＤＲ残基は直接的及び最も実質的に、抗原への結合に関与する。
【０１６５】
当業者によく知られた種々の具体的な方法を用いて、抗体ＣＤＲ（又は抗体ＣＤＲの代わりにランダム配列）を抗体フレームワークに導入することができる（例えば、米国特許出願第０９／４３４，８７９号明細書及び米国特許出願第０９／９８２，４６４号明細書参照）。ある実施形態において、重複オリゴヌクレオチドを抗体遺伝子又はその一部（例えば、ヒト化抗体をコードする遺伝子）の合成に用いることができる。他の実施形態において、抗体テンプレートの変異発現は、Ｋｕｎｋｅｌらの方法（上掲）により、例えば、修飾ＣＤＲ又はランダム配列をＣＤＲの代わりに用いることにより行うことができる。ある実施形態において、軽鎖及び重鎖可変領域を別個にヒト化し、その後ヒト化可変領域として共発現させる。他の実施形態において、ヒト化可変領域は、完全抗体の可変領域を形成する。ある実施形態において、ヒト化可変領域を含む完全抗体のＦｃ領域は修飾を受けている（例えば、少なくとも１つのアミノ酸の修飾をＦｃ領域において受けている）。例えば、ランダム化ＣＤＲによってヒト化され、フレームワークについて改変を受けていない抗体は、Ｆｃ領域において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を含んでいてもよい。
【０１６６】
他の実施形態において、内在性の免疫グロブリン産生能を有しておらず、免疫するとヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（マウス等）を用いる。例えば、キメラマウス又は生殖細胞系変異マウスにおいて、抗体の重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子の同型欠失により、内在性抗体の産生は完全に阻害されることが記述されている。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイをそのような生殖細胞系変異マウスに導入すると、抗原の攻撃に対しヒト抗体を産生する（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３），及びＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ他，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３））。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーからも誘導することができる（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１），及びＶａｕｇｈａｎ他，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：３０９（１９９６））。
【０１６７】
本発明は、本願明細書で列挙されるような少なくとも１つのアミノ酸置換を（アミノ酸置換のないＦｃ領域を有する母体ポリペプチドと比べて）Ｆｃ領域に含むヒト化抗体（及び抗体のフラグメント）を産生する方法を提供する。そのようなヒト化抗体を生成する他の方法について以下に述べる。本発明はまた、これらの方法により生成された抗体及び抗体のフラグメント組成物を提供する。以下に述べるヒト化方法、及び（例えば上述の）他のヒト化方法を本発明の変異Ｆｃ領域と組み合わせることができることは重要である。こうして、改変した独自のＦｃ領域を有するヒト化抗体が、本発明にしたがって構築される。
【０１６８】
ある実施形態において、改変したＶＨ領域をコードする核酸の集団を構築する方法が提供され、ａ）該方法は、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、該第１の参照配列はドナーのＶＨ領域の配列を含み、該ドナーの可変領域は、ｉ）ＦＲ及び、ｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つのＣＤＲを含み、第２の参照配列は、ＦＲを含むアクセプターのＶＨ領域の配列を含み、ｂ）該方法は、アクセプターのＶＨ領域中のＦＲの一部分をコードする第１のオリゴヌクレオチドを合成する方法を含み、該ＦＲの一部は、第２の参照配列と比べて修飾を受けておらず、第２のオリゴヌクレオチドの集団は、ｉ）修飾された第１のＣＤＲの少なくとも一部をコードし、該第１のＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３からなる群から選択され、該修飾された第１のＣＤＲは、第１の参照配列中の対応するドナーのＣＤＲと比べて、１又は複数の位置において異なるアミノ酸を含み、かつ、ｉｉ）修飾を受けていない、第１のオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズすることができるＦＲの１又は複数の部分をコードし、ｃ）該方法は、第１のオリゴヌクレオチドを第２のオリゴヌクレオチドの集団と混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させることを含み、並びに、ｄ）該方法は、改変したＶＨ領域をコードする核酸の集団が構築される条件下において重複オリゴヌクレオチドを処理することを含み、該改変したＶＨ領域をコードする核酸にコードされたＦＲは、第２の参照配列に対して修飾を受けていない方法である。
【０１６９】
別の実施形態において、改変したＶＬ領域をコードする核酸の集団を構築する方法が提供され、ａ）該方法は、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、該第１の参照配列はドナーのＶＬ領域の配列を含み、該ドナーの可変領域は、ｉ）ＦＲ及び、ｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つのＣＤＲを含み、第２の参照配列は、ＦＲを含むアクセプターのＶＬ領域の配列を含み、ｂ）該方法は、アクセプターのＶＬ領域中のＦＲの一部分をコードする第１のオリゴヌクレオチドを合成する方法を含み、該ＦＲの一部は、第２の参照配列と比べて修飾を受けておらず、第２のオリゴヌクレオチドの集団は、ｉ）修飾された第１のＣＤＲの少なくとも一部をコードし、該第１のＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３からなる群から選択され、該修飾された第１のＣＤＲは、第１の参照配列中の対応するドナーのＣＤＲと比べて、１又は複数の位置において異なるアミノ酸を含み、かつ、ｉｉ）修飾を受けていない、第１のオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズすることができるＦＲの１又は複数の部分をコードし、ｃ）該方法は、第１のオリゴヌクレオチドを第２のオリゴヌクレオチドの集団と混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させることを含み、並びに、ｄ）該方法は、改変したＶＬ領域をコードする核酸の集団が構築される条件下において重複オリゴヌクレオチドを処理することを含み、該改変したＶＬ領域をコードする核酸にコードされたＦＲは、第２の参照配列に対して修飾を受けていない方法である。
【０１７０】
ある実施形態において、改変したＶＨ領域をコードする核酸の集団を構築する方法が意図され、
Ａ）該方法は、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、該第１の参照配列はドナーのＶＨ領域の配列を含み、該ドナーの可変領域は、ｉ）ＦＲ及び、ｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つのＣＤＲを含み、第２の参照配列は、ＦＲを含むアクセプターのＶＨ領域の配列を含み、Ｂ）該方法は、第１のオリゴヌクレオチドの集団を合成することを含み、ＨＣＤＲＩ（１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３からなる群から選択される第１のＣＤＲの少なくとも一部をそれぞれコードし、第１の参照配列の対応するドナーのＣＤＲと比べて、修飾された第１のＣＤＲは、１又は複数の位置において異なるアミノ酸を含み、かつ、第２のオリゴヌクレオチドは、ｉ）アクセプターのＶＨ領域中のＦＲの一部分をコードし、該ＦＲの一部は、参照配列と比べて修飾を受けておらず、かつ、ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドの集団にハリブリダイズすることができるＣＤＲの１又は複数の部分をコードし、Ｃ）該方法は、第１のオリゴヌクレオチドの集団を第２のオリゴヌクレオチドと混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させること、並びに、Ｄ）該方法は、改変したＶＨ領域をコードする核酸の集団が構築される条件下において重複オリゴヌクレオチドを処理することを含み、該改変したＶＨ領域をコードする核酸にコードされたＦＲは、第２の参照配列に対して修飾を受けていない方法である。
【０１７１】
別の実施形態において、改変したＶＬ領域をコードする核酸の集団を構築する方法が提供され、Ａ）該方法は、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、該第１の参照配列はドナーのＶＬ領域の配列を含み、該ドナーの可変領域は、ｉ）ＦＲ及び、ｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つのＣＤＲを含み、第２の参照配列は、ＦＲを含むアクセプターのＶＬ領域の配列を含み、Ｂ）該方法は、ａ）第１のオリゴヌクレオチドの集団を合成することを含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３からなる群から選択される第１のＣＤＲの少なくとも一部をそれぞれコードし、第１の参照配列の対応するドナーのＣＤＲと比べて、修飾された第１のＣＤＲは、１又は複数の位置において異なるアミノ酸を含み、かつ、ｂ）第２のオリゴヌクレオチドを合成することを含み、該２のオリゴヌクレオチドは、ｉ）アクセプターのＶＬ領域中のＦＲの一部分をコードし、該ＦＲの一部は、参照配列と比べて修飾を受けておらず、かつ、ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドの集団にハリブリダイズすることができるＣＤＲの１又は複数の部分をコードし、Ｃ）第１のオリゴヌクレオチドの集団を第２のオリゴヌクレオチドと混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させること、並びに、Ｄ）該方法は、改変したＶＬ領域をコードする核酸の集団が構築される条件下において重複オリゴヌクレオチドを処理することを含み、該改変したＶＬ領域をコードする核酸にコードされたＦＲは、第２の参照配列に対して修飾を受けていない方法である。
【０１７２】
ある実施形態において、第１及び第２の参照配列の表現は、電子的な形態をとる。ある実施形態において、該方法は、改変したＶＬ領域をコードする核酸の集団を、ＶＨ領域をコードする核酸と共発現させ、改変したヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生する工程（ｅ）を更に含む。ある実施形態において、合成は化学合成を含む。ある実施形態において、アクセプターはヒトである。ある実施形態において、アクセプターはヒトである。ある実施形態において、工程（ｄ）の処理は、ポリメラーゼで伸長することを含む。
【０１７３】
別の実施形態において、改変したＶＨ領域をコードする核酸の集団を構築する方法が意図され、ａ）該方法は、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、該第１の参照配列はドナーのＶＨ領域の配列を含み、該ドナーの可変領域は、ｉ）ＦＲ及び、ｉｉ）３つのＣＤＲを含み、第２の参照配列はＶＨ領域を含み、ｂ）該方法は、改変したＶＨ領域抗体の遺伝子配列の集団を合成する方法を含み、該改変したＶＨ領域のＦＲは、第２の参照配列のＦＲと同一であり、改変した抗体の可変領域の少なくとも第１のＣＤＲは修飾され、修飾された該第１のＣＤＲは、第１の参照配列の対応するドナーＣＤＲと比べて、１又は複数の部位において異なるアミノ酸を含む方法である。
【０１７４】
ある実施形態において、改変したＶＬ領域をコードする核酸の集団を構築する方法が意図され、ａ）該方法は、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、該第１の参照配列はドナーのＶＬ領域の配列を含み、該ドナーの可変領域は、ｉ）ＦＲ及び、ｉｉ）３つのＣＤＲを含み、第２の参照配列はＦＲを含むアクセプターのＶＬ領域の配列を含み、ｂ）該方法は、改変したＶＬ領域抗体の遺伝子配列の集団を合成する方法を含み、該改変したＶＬ領域のＦＲは、第２の参照配列のＦＲと同一であり、改変した抗体のＶＬ領域の少なくとも第１のＣＤＲは修飾され、修飾された該第１のＣＤＲは、第１の参照配列の対応するドナーＣＤＲと比べて、１又は複数の部位において異なるアミノ酸を含む方法である。
【０１７５】
ある実施形態において、第１及び第２の参照配列の表現は、電子的な形態をとる。ある実施形態において、該方法は、更に改変したＶＬ領域をコードする核酸の集団を、ＶＨ領域をコードする核酸と共発現させ、改変したヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生する工程を更に含む。ある実施形態において、アクセプターはヒトである。ある実施形態において、合成は重複オリゴヌクレオチドを使用することを含む。
【０１７６】
更に別の実施形態において、改変したＶＨ領域をコードする核酸の集団を構築する方法が意図され、ａ）該方法は、参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、参照配列は、ＦＲを含むアクセプターのＶＨ領域を含み、ｂ）該方法は、改変したＶＨ領域の抗体遺伝子配列の集団を合成することを含み、改変したＶＨ領域のＦＲは、参照配列のＦＲと同一であり、改変した抗体の可変領域の少なくとも第１のＣＤＲは、ランダムアミノ酸配列を含む方法である。
【０１７７】
別の実施形態において、改変したＶＬ領域をコードする核酸の集団を構築する方法が意図され、ａ）該方法は、参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、参照配列は、ＦＲを含むアクセプターのＶＬ領域を含み、ｂ）該方法は、改変したＶＬ領域の抗体遺伝子配列の集団を合成することを含み、改変したＶＬ領域のＦＲは、参照配列のＦＲと同一であり、改変した抗体のＶＬ領域の少なくとも第１のＣＤＲは、ランダムアミノ酸配列を含む方法である。
【０１７８】
更に別の実施形態において、改変したＶＨ領域をコードする核酸の集団を構築する方法が意図され、
ａ）該方法は、参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、参照配列は、ＦＲを含むヒトのアクセプターのＶＨ領域を含み、
ｂ）該方法は、改変したＶＨ領域の抗体遺伝子配列の集団を合成することを含み、改変したＶＨ領域のＦＲは、参照配列のＦＲと同一であり、改変した抗体の可変領域の少なくとも第１のＣＤＲは、ランダムアミノ酸配列を含む方法である。
ある実施形態において、参照配列の表現は、電子的な形態をとる。
【０１７９】
別の実施形態において、改変したＶＬ領域をコードする核酸の集団を構築する方法が意図され、ａ）該方法は、参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、参照配列は、ＦＲを含むヒトのアクセプターのＶＬ領域を含み、ｂ）該方法は、改変したＶＬ領域の抗体遺伝子配列の集団を合成することを含み、改変したＶＬ領域のＦＲは、参照配列のＦＲと同一であり、改変した抗体のＶＬ領域の少なくとも第１のＣＤＲは、ランダムアミノ酸配列を含む方法である。
【０１８０】
ある実施形態において、参照配列の表現は、電子的な形態をとる。ある実施形態において、該方法は、更に改変したＶＬ領域をコードする核酸の集団を、ＶＨ領域をコードする核酸と共発現させ、改変したヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生する工程を更に含む。ある実施形態において、アクセプターはヒトである。ある実施形態において、合成において重複オリゴヌクレオチドを使用することを含む。ある実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義により定義される。
【０１８１】
ある実施形態において、１又は複数のＦＲは、１又は複数の修飾されたＣＤＲの導入と同時に修飾されている。他の実施形態において、修飾されたフレームワークは修飾されたＣＤＲに隣接する。
【０１８２】
ある実施形態において、本発明は、改変したＶＨ領域をコードする核酸の集団を構築する方法を提供し、ａ）該方法は、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、該第１の参照配列はドナーのＶＨ領域の配列を含み、該ドナーの可変領域は、ｉ）ＦＲ及び、ｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つのＣＤＲを含み、第２の参照配列は、ＦＲを含むアクセプターのＶＨ領域の配列を含み、ｂ）該方法は、ａ）修飾されたＶＨ領域中のＦＲ又はその一部分をコードする第１のオリゴヌクレオチドの集団を合成することを含み、該ＶＨ領域のＦＲ又はその一部分は、アクセプターのフレームワーク領域の参照配列の位置と比べて１又は複数の位置において複数の変更されたアミノ酸を含み、変更されたフレームワークの位置は、第１の参照配列におけるドナーのフレームワークの位置と比べて、対応する位置で異なっている第２の参照配列におけるアクセプターにおけるフレームワークの位置から選択され、かつ、ｂ）第２のオリゴヌクレオチドの集団を合成し、該第２のオリゴヌクレオチドは、ｉ）少なくとも１つ改変したＣＤＲをコードし、該改変したＣＤＲ又はその一部は、対応するドナーのＣＤＲのアミノ酸参照配列と比べて１又は複数の部位において異なるアミノ酸を含み、及び、ｉｉ）オリゴヌクレオチドの第１の集団にハイブリダイズすることができる隣接したＦＲの１又は複数の部分をコードし、ｃ）該方法は、第１及び第２のオリゴヌクレオチドの集団を混合して、重複オリゴヌクレオチドを生成させることを含み、並びに、ｄ）該方法は、改変したＶＨ領域をコードする核酸の集団が構築される条件下で重複オリゴヌクレオチドを処理することを含む方法である。ある実施形態において、第１及び第２の参照配列の表現は、電子的な形態をとる。別の実施形態において、該方法は、更に改変したＶＨ領域をコードする核酸の集団を、ＶＬ領域をコードする核酸と共発現させ、改変したヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生する工程（ｅ）を更に含む。さらなる実施形態において、合成は化学合成を含む。ある実施形態において、アクセプターはヒトである。好ましい実施形態において、１又は複数の改変したヘテロメリックな可変領域の多様な集団は、Ｆｃ領域を含む抗体の一部であり、該Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域を有する母体ポリペプチドと比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１８３】
別の実施形態において、本発明は、改変したＶＬ領域をコードする核酸の集団を構築する方法を提供し、ａ）該方法は、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、該第１の参照配列はドナーのＶＬ領域の配列を含み、該ドナーの可変領域は、ｉ）ＦＲ及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つのＣＤＲを含み、第２の参照配列は、ＦＲを含むアクセプターのＶＬ領域の配列を含み、ｂ）該方法は、ａ）修飾されたＶＬ領域中のＦＲ又はその一部分をコードする第１のオリゴヌクレオチドの集団を合成することを含み、該ＶＬ領域のＦＲ又はその一部分は、アクセプターのフレームワーク領域の参照配列の位置と比べて１又は複数の位置において複数の変更されたアミノ酸を含み、変更されたフレームワークの位置は、第１の参照配列におけるドナーのフレームワークの位置と比べて、対応する位置で異なっている第２の参照配列におけるアクセプターにおけるフレームワークの位置から選択され、かつ、ｂ）第２のオリゴヌクレオチドの集団を合成し、該第２のオリゴヌクレオチドは、ｉ）少なくとも１つ改変したＣＤＲをコードし、該改変したＣＤＲ又はその一部は、対応するドナーのＣＤＲのアミノ酸参照配列と比べて１又は複数の部位において異なるアミノ酸を含み、及び、ｉｉ）オリゴヌクレオチドの第１の集団にハイブリダイズすることができる隣接したＦＲの１又は複数の部分をコードし、ｃ）該方法は、第１及び第２のオリゴヌクレオチドの集団を混合して、重複オリゴヌクレオチドを生成させることを含み、並びに、ｄ）該方法は、改変したＶＬ領域をコードする核酸の集団が構築される条件下で重複オリゴヌクレオチドを処理することを含む方法である。他の実施形態において、第１及び第２の参照配列の表現は、電子的な形態をとる。更なる実施形態において、該方法は、更に改変したＶＬ領域をコードする核酸の集団を、ＶＨ領域をコードする核酸と共発現させ、改変したヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生する工程（ｅ）を更に含む。
【０１８４】
ある実施形態において、該方法は、ａ）該方法は、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、該第１の参照配列はドナーのＶＨ領域の配列を含み、該ドナーの可変領域は、ｉ）ＦＲ及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つのＣＤＲを含み、第２の参照配列は、ＦＲを含むアクセプターのＶＨ領域の配列を含み、ｂ）該方法は、ａ）修飾されたＶＨ領域中のフレームワーク領域又はその一部分をコードする第１のオリゴヌクレオチドの集団を合成することを含み、該ＶＨ領域のＦＲ又はその一部分は、アクセプターのフレームワークの位置と比べて１又は複数の位置において複数の変更されたアミノ酸を含み、変更されたフレームワークの位置は、第１の参照配列におけるドナーのフレームワークの位置と比べて、対応する位置で異なっている第２の参照配列におけるアクセプターにおけるフレームワークの位置から選択され、かつ、ｂ）第２のオリゴヌクレオチドの集団を合成し、該第２のオリゴヌクレオチドは、ｉ）少なくとも１つ改変したＣＤＲをコードし、該改変したＣＤＲ又はその一部は、対応するドナーのＣＤＲのアミノ酸参照配列と比べて１又は複数の部位において異なるアミノ酸を含み、及び、ｉｉ）オリゴヌクレオチドの第１の集団にハイブリダイズすることができる隣接したＦＲの１又は複数の部分をコードし、ｃ）該方法は、第１及び第２のオリゴヌクレオチドの集団を混合して、重複オリゴヌクレオチドを生成させることを含み、並びに、ｄ）該方法は、改変したＶＨ領域をコードする核酸の集団が構築される条件下でＤＮＡポリメラーゼを有する重複オリゴヌクレオチドを伸長することを含む方法である。
【０１８５】
更に別の実施形態において、本発明は、改変したＶＬ領域をコードする核酸の集団を構築する方法を提供し、ａ）該方法は、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、該第１の参照配列はドナーのＶＬ領域の配列を含み、該ドナーの可変領域は、ｉ）ＦＲ及び、ｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つのＣＤＲを含み、第２の参照配列は、ＦＲを含むアクセプターのＶＬ領域の配列を含み、ｂ）該方法は、ａ）修飾されたＶＬ領域中のＦＲ又はその一部分をコードする第１のオリゴヌクレオチドの集団を合成することを含み、該ＶＬ領域のＦＲ又はその一部分は、アクセプターのＦＲの参照配列の位置と比べて１又は複数の位置において複数の変更されたアミノ酸を含み、変更されたフレームワークの位置は、第１の参照配列におけるドナーのフレームワークの位置と比べて、対応する位置で異なっている第２の参照配列におけるアクセプターにおけるフレームワークの位置から選択され、かつ、ｂ）第２のオリゴヌクレオチドの集団を合成し、該第２のオリゴヌクレオチドは、ｉ）少なくとも１つ改変したＣＤＲをコードし、該改変したＣＤＲ又はその一部は、対応するドナーのＣＤＲのアミノ酸参照配列と比べて１又は複数の部位において異なるアミノ酸を含み、及び、ｉｉ）オリゴヌクレオチドの第１の集団にハイブリダイズすることができる隣接したＦＲの１又は複数の部分をコードし、ｃ）該方法は、第１及び第２のオリゴヌクレオチドの集団を混合して、重複オリゴヌクレオチドを生成させることを含み、並びに、ｄ）該方法は、改変したＶＬ領域をコードする核酸の集団が構築される条件下でＤＮＡポリメラーゼを有する重複オリゴヌクレオチドを伸長することを含む方法である。
【０１８６】
ある実施形態において、１又は複数のフレームワーク領域は、１又は複数の修飾されたＣＤＲの導入と同時に修飾されている。修飾されたＣＤＲは、参照配列中の対応するＣＤＲと比べ１又は複数のアミノ酸の修飾を含んでいてよい。ある実施形態において、改変したＶＨ領域をコードする核酸の集団を構築する方法を提供し、ａ）該方法は、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、該第１の参照配列はドナーのＶＨ領域の配列を含み、該ドナーの可変領域は、ｉ）ＦＲ及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つのＣＤＲを含み、第２の参照配列は、ＦＲを含むアクセプターのＶＨ領域の配列を含み、ｂ）該方法は、ｉ）オリゴヌクレオチドの第１の集団を合成することを含み、少なくとも１つの修飾されたＣＤＲをコードし、該修飾されたＣＤＲは、対応するドナーのＣＤＲのアミノ酸配列と比べて、１又は複数の位置において異なるアミノ酸を含み、かつ、ｉｉ）第２のオリゴヌクレオチドの集団を合成することを含み、ＶＨフレームワークの修飾された部分をコードするオリゴヌクレオチドを含み、修飾を受けた部分は、アクセプターのフレームワーク領域の参照配列と比べて１又は複数の位置において複数の変更されたアミノ酸を含み、変更されたフレームワークの位置は、第１の参照配列におけるドナーのフレームワークと比べて、対応する位置で異なっている第２の参照配列におけるアクセプターにおけるフレームワークの位置から選択され、ｃ）該方法は、第１及び第２のオリゴヌクレオチドの集団を、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部がハイブリダイズするような条件下で混合して、重複オリゴヌクレオチドを生成させることを含み、並びに、ｄ）該方法は、改変したＶＨ領域をコードする核酸の集団が構築される条件下で重複オリゴヌクレオチドを処理することを含む方法である。ある実施形態において、第１及び第２の参照配列の表現は、電子的な形態をとる。更なる実施形態において、該方法は、更に改変したＶＨ領域をコードする核酸の集団を、ＶＬ領域をコードする核酸と共発現させ、改変したヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生する工程（ｅ）を更に含む。さらなる実施形態において、アクセプターはヒトである。
【０１８７】
別の実施形態において、本発明は、改変したＶＬ領域の集団をコードする核酸を構築する方法を提供し、ａ）該方法は、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、該第１の参照配列はドナーのＶＬ領域の配列を含み、該ドナーの可変領域は、ｉ）ＦＲ及び、ｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つのＣＤＲを含み、第２の参照配列は、ＦＲを含むアクセプターのＶＬ領域の配列を含み、ｂ）該方法は、ｉ）オリゴヌクレオチドの第１の集団を合成することを含み、少なくとも１つの修飾されたＣＤＲをコードし、該修飾されたＣＤＲは、対応するドナーのＣＤＲのアミノ酸配列と比べて、１又は複数の位置において異なるアミノ酸を含み、ｉｉ）第２のオリゴヌクレオチドの集団を合成することを含み、ＶＬフレームワークの修飾された部分をコードするオリゴヌクレオチドを含み、修飾を受けた部分は、アクセプターのＦＲの参照配列と比べ１又は複数の位置において複数の変更されたアミノ酸を含み、変更されたフレームワークの位置は、第１の参照配列におけるドナーのフレームワークと比べて、対応する位置で異なっている第２の参照配列におけるアクセプターにおけるフレームワークの位置から選択され、ｃ）該方法は、第１及び第２のオリゴヌクレオチドの集団を、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部がハイブリダイズするような条件下で混合して、重複オリゴヌクレオチドを生成させることを含み、並びに、ｄ）該方法は、改変したＶＬ領域をコードする核酸の集団が構築される条件下で重複オリゴヌクレオチドを処理することを含む方法である。
【０１８８】
ある実施形態において、Ｆｃ変異体及び改変した変異領域を含む抗体又は抗体のフラグメントを生成することができる。例えば、ある実施形態において、本発明は、改変したＶＨ領域をコードする核酸の集団を構築する方法を提供し、ａ）該方法は、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、該第１の参照配列はドナーのＶＨ領域の配列を含み、該ドナーの可変領域は、ｉ）ＦＲ及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つのＣＤＲを含み、第２の参照配列は、ＦＲを含むアクセプターのＶＨ領域の配列を含み、ｂ）該方法は、Ａ）アクセプターのＶＨ領域中のＦＲの一部分をコードする第１のオリゴヌクレオチドを合成することを含み、該ＦＲの一部は、第２の参照配列と比べて修飾されず、かつ、Ｂ）第２のオリゴヌクレオチドの集団を合成することを含み、第１又は第２のオリゴヌクレオチドはそれぞれ、ｉ）修飾された第１のＣＤＲの少なくとも一部をコードし、該第１のＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３からなる群から選択され、該修飾された第１のＣＤＲは、第１の参照配列中の対応するドナーのＣＤＲと比べて、１又は複数の位置において異なるアミノ酸を含み、かつ、ｉｉ）修飾を受けていない、第１のオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズすることができるＦＲの１又は複数の部分をコードし、ｃ）該方法は、第１のオリゴヌクレオチドを第２のオリゴヌクレオチドの集団と混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させることを含み、並びに、ｄ）該方法は、改変したＶＨ領域をコードする核酸の集団が構築される条件下において重複オリゴヌクレオチドを処理することを含み、該改変したＶＨ領域をコードする核酸にコードされたＦＲは、第２の参照配列に対して修飾を受けていない方法である。ある実施形態において、該方法は、更に改変したＶＨ領域をコードする核酸の集団を、ＶＬ領域をコードする核酸と共発現させ、改変したヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生する工程を更に含む。
【０１８９】
別の実施形態において、本発明は、改変したＶＬ領域をコードする核酸の集団を構築する方法を提供し、ａ）該方法は、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、該第１の参照配列はドナーのＶＬ領域の配列を含み、該ドナーの可変領域は、ｉ）ＦＲ及び、ｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つのＣＤＲを含み、第２の参照配列は、ＦＲを含むアクセプターのＶＬ領域の配列を含み、ｂ）該方法は、ａ）アクセプターのＶＬ領域中のＦＲの一部分をコードする第１のオリゴヌクレオチドを合成することを含み、該ＦＲの一部は、第２の参照配列と比べて修飾されず、かつ、ｂ）第２のオリゴヌクレオチドの集団を合成することを含み、第１又は第２のオリゴヌクレオチドはそれぞれ、ｉ）修飾された第１のＣＤＲの少なくとも一部をコードし、該第１のＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３からなる群から選択され、該修飾された第１のＣＤＲは、第１の参照配列中の対応するドナーのＣＤＲと比べて、１又は複数の位置において異なるアミノ酸を含み、かつ、ｉｉ）修飾を受けていない、第１のオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズすることができるＦＲの１又は複数の部分をコードし、ｃ）該方法は、第１のオリゴヌクレオチドを第２のオリゴヌクレオチドの集団と混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させることを含み、並びに、ｄ）該方法は、改変したＶＬ領域をコードする核酸の集団が構築される条件下において重複オリゴヌクレオチドを処理することを含み、該改変したＶＬ領域をコードする核酸にコードされたＦＲは、第２の参照配列に対して修飾を受けていない方法である。
【０１９０】
別の実施形態において、本発明は、改変したＶＨ領域の集団をコードする核酸を構築する方法を提供し、Ａ）該方法は、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、該第１の参照配列はドナーのＶＨ領域の配列を含み、該ドナーの可変領域は、ｉ）ＦＲ及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つのＣＤＲを含み、第２の参照配列は、ＦＲを含むアクセプターのＶＨ領域の配列を含み、Ｂ）該方法は、ａ）第１のオリゴヌクレオチドの集団を合成することを含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３からなる群から選択される第１のＣＤＲの少なくとも一部をそれぞれコードし、第１の参照配列の対応するドナーのＣＤＲと比べて、修飾された第１のＣＤＲは、１又は複数の位置において異なるアミノ酸を含み、かつ、ｂ）第２のオリゴヌクレオチドを合成することを含み、該２のオリゴヌクレオチドは、ｉ）アクセプターのＶＨ領域中のＦＲの一部分をコードし、該ＦＲの一部は、参照配列と比べて修飾を受けておらず、かつ、ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドの集団にハリブリダイズすることができるＣＤＲの１又は複数の部分をコードし、Ｃ）該方法は、第１のオリゴヌクレオチドの集団を第２のオリゴヌクレオチドと混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させることを含み、並びに、Ｄ）該方法は、改変したＶＨ領域をコードする核酸の集団が構築される条件下において重複オリゴヌクレオチドを処理することを含み、該改変したＶＨ領域をコードする核酸にコードされたＦＲは、第２の参照配列に対して修飾を受けていない方法である。
【０１９１】
ある実施形態において、該方法は、更に改変したＶＨ領域をコードする核酸の集団を、ＶＬ領域をコードする核酸と共発現させ、改変したヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生する工程を更に含む。
【０１９２】
別の実施形態において、本発明は、改変したＶＬ領域をコードする核酸の集団を構築する方法を提供し、Ａ）該方法は、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、該第１の参照配列はドナーのＶＬ領域の配列を含み、該ドナーの可変領域は、ｉ）ＦＲ及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つのＣＤＲを含み、第２の参照配列は、ＦＲを含むアクセプターのＶＬ領域の配列を含み、Ｂ）該方法は、ａ）第１のオリゴヌクレオチドの集団を合成することを含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３からなる群から選択される第１のＣＤＲの少なくとも一部をそれぞれコードし、第１の参照配列の対応するドナーのＣＤＲと比べて、修飾された第１のＣＤＲは、１又は複数の位置において異なるアミノ酸を含み、かつ、ｂ）第２のオリゴヌクレオチドを合成することを含み、該２のオリゴヌクレオチドは、ｉ）アクセプターのＶＬ領域中のＦＲの一部分をコードし、該ＦＲの一部は、参照配列と比べて修飾を受けておらず、かつ、ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドの集団にハリブリダイズすることができるＣＤＲの１又は複数の部分をコードし、Ｃ）該方法は、第１のオリゴヌクレオチドの集団を第２のオリゴヌクレオチドと混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させることを含み、並びに、Ｄ）該方法は、改変したＶＬ領域をコードする核酸の集団が構築される条件下において重複オリゴヌクレオチドを処理することを含み、該改変したＶＬ領域をコードする核酸にコードされたＦＲは、第２の参照配列に対して修飾を受けていない方法である。
【０１９３】
他の実施形態において、本発明は、変異を有するヒト化抗体可変領域の結合親和性を向上させる方法を提供し、ａ）該方法は、第１の変異を有するヒト化抗体の可変領域をコードする核酸配列を提供することを含み、該変異可変領域は、（ｉ）野生型ヒト抗体フレームワーク、（ｉｉ）３つの非ヒト重鎖ＣＤＲ、及び、（ｉｉｉ）３つ非ヒト軽鎖ＣＤＲを含み、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの組合せによって定義され、少なくとも１つの該軽鎖ＣＤＲは、少なくとも１つの位置で少なくとも１つの異なるアミノ酸を有する変異を有する軽鎖ＣＤＲであり、第１の変異を有するヒト化抗体の可変領域は、対応する変異を有さない抗体の可変領域より高い結合能を有し、ｂ）該方法は、第１の変異を有する抗体可変領域コードする核酸配列を、第２の変異を有するヒト化抗体可変領域がコードされるような条件下で変異させることを含み、第２の変異を有するヒト化抗体可変領域は、少なくとも更に１つの異なるアミノ酸を、変異を含むＣＤＲの少なくとも１つの位置に含み、さらなる変異は、最初の変異と共に、高い結合親和性をもたらす方法である。ある実施形態において、第１の変異を有するヒト化抗体の可変領域の変異を有する軽鎖ＣＤＲは、ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）である。
【０１９４】
他の実施形態において、第１の変異を有するヒト化抗体可変領域における少なくとも１つの非ヒト重鎖ＣＤＲは、異なるアミノ酸が、対応する野生型非ヒトＣＤＲと比べ少なくとも１つの位置でコードされているような変異を含む。更なる実施形態において、重鎖ＣＤＲ変異は、ＨＣＤＲ３において行なわれる。
【０１９５】
ある実施形態において、本発明は、改変したＶＨ領域核酸をコードする核酸の集団を構築すると共に、少なくとも１つのＣＤＲと少なくとも１つのＦＲを同時に修飾する方法を提供し、
ａ）該方法は、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、該第１の参照配列はドナーのＶＨ領域の配列を含み、該ドナーの可変領域は、ｉ）４つのＦＲ及びｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａを組み合わせて定義される３つのＣＤＲを含み、第２の参照アミノ酸配列は、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａを組み合わせて定義されるように、４つのＦＲを含むアクセプターのＶＨの領域の配列を含み、ｂ）該方法は、ｉ）修飾される各ＦＲために、オリゴヌクレオチドの集団を合成することを含み、各オリゴヌクレオチドは、修飾されたＦＲ又はその部分をコードし、該修飾されたＦＲ又はその部分は、アクセプターのＶＨ領域の参照配列において対応するフレームワーク領域に比べて、１又は複数の位置において複数の変更されたアミノ酸を含み、変更される該ＦＲ位置は、第１の参照配列のドナーのフレームワーク領域の位置と比べて、対応する位置において異なる第２の参照配列のアクセプターのフレームワーク位置の中から選択され、ｉｉ）修飾される各ＣＤＲのために、オリゴヌクレオチドの集団を合成することを含み、各オリゴヌクレオチドは、修飾したＣＤＲ又はその部分をコードし、該修飾したＣＤＲは、対応するドナーのＣＤＲのアミノ酸配列と比べて１又は複数の位置において異なるアミノ酸を含み、ｉｉｉ）天然及び修飾を受けていない各ＦＲのために、ＦＲをコードするオリゴヌクレオチド又はその部分を合成することを含み、ＦＲ又はその部分は、第２の参照アクセプター配列の対応するＦＲと同一の配列を有し、ｉｖ）天然及び修飾を受けていない各ＣＤＲのために、ＣＤＲをコードするオリゴヌクレオチド又はその部分を合成することを含み、ＣＤＲ又はその部分は、第１の参照ドナー配列の対応するＣＤＲと同一の配列を有し、ＶＨ領域の隣接部分をコードする（ｉ）〜（ｉｖ）から、各オリゴヌクレオチドは、それらの末端において重複配列を有し、ｃ）該方法は、重複ヌクレオチドを精製するように、各オリゴヌクレオチドの重複配列のハイブリダイズを行なうという条件下において、各工程ｂ）で合成されるオリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドの集団を混合させることを含み、ｄ）該方法は、改変したＶＨ領域の集団をコードするヌクレオチドが形成される条件下で、重複オリゴヌクレオチドを処理することを含む方法である。ある実施形態（ｅｍ  ｂｏｄｉｍｅｎｔ）において、参照配列の表現は、電子的な形態をとる。さらなる実施形態において、修飾を受けるフレームワーク領域は、ＨＦＲ１、ＨＦＲ２及びＨＦＲ３からなる群より選択される。他の実施態様において、修飾されるＣＤＲは、ＨＣＤＲ３である。他の実施形態において、該方法は、更にＶＨ領域をコードする核酸の集団を、ＶＬ領域をコードする核酸と共発現させ、改変したヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生する工程（ｅ）を更に含む。異なる実施形態において、該方法は、更にＶＨ領域をコードする核酸の集団を、ＶＬ領域をコードする核酸と共発現させ、改変したヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生する工程（ｅ）を更に含む。
【０１９６】
他の実施形態において、改変したＶＬ領域をコードする核酸の集団を構築すると共に、少なくとも１つのＣＤＲと少なくとも１つのＦＲを同時に修飾する方法を提供し、該方法は、ａ）該方法は、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供することを含み、該第１の参照配列はドナーのＶＬ領域の配列を含み、該ドナーの可変領域は、ｉ）４つのＦＲ及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａを組み合わせて定義される３つのＣＤＲを含み、第２の参照アミノ酸配列は、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａを組み合わせて定義されるように、４つのＦＲを含むアクセプターのＶＬの領域の配列を含み、ｂ）該方法は、ｉ）修飾される各ＦＲために、オリゴヌクレオチドの集団を合成することを含み、各オリゴヌクレオチドは、修飾されたＦＲ又はその部分をコードし、該修飾されたＦＲ又はその部分は、アクセプターのＶＬ領域の参照配列において対応するフレームワーク領域に比べて、１又は複数の位置において複数の変更されたアミノ酸を含み、変更される該ＦＲ位置は、第１の参照配列のドナーのＦＲ位置と比べて、対応する位置において異なる第２の参照配列のアクセプターのＦＲ位置の中から選択され、かつ、ｉｉ）修飾される各ＣＤＲのために、オリゴヌクレオチドの集団を合成することを含み、各オリゴヌクレオチドは、修飾したＣＤＲ又はその部分をコードし、該修飾したＣＤＲは、対応するドナーのＣＤＲのアミノ酸配列と比べて１又は複数の位置において異なるアミノ酸を含み、ｉｉｉ）天然及び修飾を受けていない各ＦＲのために、ＦＲをコードするオリゴヌクレオチド又はその部分を合成することを含み、ＦＲ又はその部分は、第２の参照アクセプター配列の対応するＦＲと同一の配列を有し、ｉｖ）天然及び修飾を受けていない各ＣＤＲのために、ＣＤＲをコードするオリゴヌクレオチド又はその部分を合成することを含み、ＣＤＲ又はその部分は、第１の参照ドナー配列の対応するＣＤＲと同一の配列を有し、（ｉ）〜（ｉｖ）のＶＬ領域の隣接部分をコードする各オリゴヌクレオチドは、それらの末端において重複配列を有し、ｃ）該方法は、重複ヌクレオチドを精製するように、各オリゴヌクレオチドの重複配列のハイブリダイズを行なうという条件下において、各工程ｂ）で合成されるオリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドの集団を混合させることを含み、ｄ）該方法は、改変したＶＬ領域の集団をコードするヌクレオチドが形成される条件下で、重複オリゴヌクレオチドを処理することを含む方法である。ある実施形態において、該方法は、更にＶＬ領域をコードする核酸の集団を、ＶＨ領域をコードする核酸と共発現させ、改変したヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生する工程を更に含む。
【０１９７】
（ｖ）多特異性抗体
本発明は、変異Ｆｃ領域を含む多特異性抗体を提供する。多特異性抗体は、少なくとも２種類の異なる抗原に対し結合特異性を有する。そのような分子は通常２種類の抗原にしか結合しないが（二特異性抗原、ＢｓＡｂ）、三特異性抗原等のさらなる特異性を有する抗体も、本願明細書で使用される場合においてこの表現に包含される。ＢｓＡｂの例としては、一方の腕がガン細胞抗原を対象とし、他方の腕が細胞毒性誘発分子を対象とする、抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／ＦｃｙＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、抗ＣＤ３／抗悪性Ｂ−細胞（１Ｄ１０）、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５ＨＥＲ２、抗ＣＤ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎細胞ガン、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ−３、抗ＣＤ３／Ｌ−ＤＩ（Ｌ−Ｄ１）（抗大腸ガン）、抗ＣＤ３／抗メラニン細胞刺激ホルモン（ｈｏｒｎｏｎｅ）アナローグ、抗ＥＧＦレセプター／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡＩ（ＣＡＭＡ１）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）／抗ＣＤ３、抗葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）／抗ＣＤ３、抗腫瘍関連抗原（ＡＭＯＣ−３１）／抗ＣＤ３；腫瘍抗原に特異的に結合する１本の腕と毒素に特異的に結合する１本の腕を有する抗サポリン／抗ｉｄ−１等のＢｓＡｂｓ、抗ＣＤ２２／抗サポリン、抗ＣＤ７／抗サポリン、抗ＣＤ３８／抗サポリン、抗ＣＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）／抗ハイブリドーマイデオタイプ、抗ＣＥＡ／抗ビンカアルカロイド酵素により活性化されたプロドラッグを変換するための抗ＣＤ３０／抗アルカリホスファターゼ（リン酸マイトマイシンプロドラッグのマイトマイシンアルコールへの変換を触媒する）等のＢｓＡｂ；線維素溶解剤として使用可能な抗フィブリン／抗組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）等のＢｓＡｂ、抗フィブリン／抗ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）；細胞表面レセプターに対する免疫複合体を標的にする抗低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）／抗Ｆｃレセプター（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ又はＦｃγＲＩＩＩ）等のＢｓＡｂ；感染症の治療に用いられる抗ＣＤ３／抗単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）、抗Ｔ−細胞レセプター：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃｙＲ／抗ＨＩＶ等のＢｓＡｂ；インビトロ又はインビボでの腫瘍の検出のための抗ＣＥＡ／抗ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／抗ハプテン等のＢｓＡｂ；ワクチンのアジュバントとして用いられるＢｓＡｂ；及び治療のツールとして用いられる抗ウサギＩｇＧ／抗フェリチン、抗西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／抗物質Ｐ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗ｐ−ガラクトシダーゼ等のＢｓＡｂが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９８】
三特異性抗体の例としては、抗ＣＤ３／抗ＣＤ４／抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗ＣＤ３７及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ８／抗ＣＤ３７が挙げられるが、これらに限定されない。二特異性抗体は、全長抗体又は抗体のフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二特異性抗体）として調製することができる。二特異性抗体を作成する方法は公知である。従来法による全長二特異性抗体の製造は、２つの分子鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現によるものである（例えば、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ他，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の配列の任意の組み合せにより、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の可能な異なる抗体分子の混合物を生成し、そのうち１つだけが正しい二特異性構造を有する。正しい分子の精製はアフィニティークロマトグラフィー工程により行うことができる。同様の方法は、国際公開第９３／０８８２９号パンフレット及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ他，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）。
【０１９９】
他のアプローチにおいて、所望の結合特異性を有する抗体の可変領域（抗体−抗原結合部位）を、免疫グロブリンの定常領域配列に融合させる。融合体は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも一部分を含む免疫グロブリンの重鎖定常領域を有する。軽鎖との結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を、融合体の少なくとも１つに有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、及び、所望に応じて、免疫グロブリンの軽鎖をコードするＤＮＡは、別個の発現ベクター中に挿入され、適当な宿主生物中に共にトランスフェクションされる。このことにより、構築の際に３つのポリペプチドの割合が等しくない場合に最適の収率が得られる実施形態において、３つのポリペプチドの相互の割合を調節する上で多大な柔軟性がもたらされる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の同じ割合での発現の結果高い収率が得られる場合、又は発言の割合が顕著な影響を及ぼさない場合には、２つ又は３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに導入することができる。このアプローチの好ましい実施形態において、二特異性抗体は、一方の腕に存在する第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び他方の腕に存在するハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性をもたらす）からなる（例えば、国際公開第９４／０４６９０号パンフレット参照）。国際公開第９６／２７０１１号パンフレットに記載の他のアプローチによると、一対の抗体分子の間のインターフェースを、組み換え培養細胞から回収されるヘテロダイマーの割合を最大化するように設計することができる。二特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体はまた、架橋又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一方はアビジンに、他方はビオチンに結合していてもよい。
【０２００】
Ｂ．イムノアドヘシン分子
本発明はまた、変異Ｆｃ領域を含むイムノアドヘシン分子を提供する。イムノアドヘシンをデザインする１つの方法は、アドヘシンの結合領域（例えば、レセプターの細胞外ドメイン（ＥＣＤ））を免疫グロブリンの重鎖のＦｃ領域（例えば変異Ｆｃ領域）と結合させることである。通常、本発明のイムノアドヘシンを調製する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸は、Ｃ末端で免疫グロブリンの定常領域配列のＮ末端をコードする核酸と融合するが、Ｎ末端側での融合も可能である。
【０２０１】
通常、そのような融合体において、コードされたキメラポリペプチドは、少なくとも免疫グロブリンの重鎖定常領域中の機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を保持する。融合は、定常領域中のＦｃ領域のＣ末端部分、又は重鎖ＣＨ１領域のＮ末端付近若しくは軽鎖の対応する領域において行うこともできる。融合が行われた正確な位置は決定的に重要ではないが、イムノアドヘシンの生物学的活性、分泌、又は結合特性を最適化することができる特定の位置はよく知られており、その位置を選択することができる。
【０２０２】
ある実施形態において、アドヘシン配列は、免疫グロブリンＧ１の変異Ｆｃ領域のＮ末端に融合する。重鎖定常領域の全体がアドヘシン配列に融合することが可能である。しかし、好ましい実施形態において、ＩｇＧのＦｃ領域を化学的に定義するパパイン切断部位（重鎖定常領域の最初の残基を１１４位とした場合における２１６位の残基）の丁度上流側であるヒンジ領域から開始される配列、又は他の免疫グロブリンの相同な部位が、融合において用いられる。ある好ましい実施形態において、アドヘシンアミノ酸配列は、ＩｇＧ重鎖の、（ａ）ヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３、又は（ｂ）ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域に融合する。ある実施形態において、イムノアドヘシンは二特異性である。あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含む免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖配列の間に挿入されていてもよい。そのような実施形態において、アドヘシン配列は、免疫グロブリンの各腕において、ヒンジ領域及びＣＨ２領域の間、又はＣＨ２及びＣＨ３領域の間のいずれかで、免疫グロブリン重鎖の３’末端に融合していてもよい（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ他，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１０２７−１０３７（１９９１）参照）。
【０２０３】
本発明のイムノアドヘシンにおいて、免疫グロブリンの軽鎖の存在は必要とされていないが、免疫グロブリン軽鎖は、アドヘシン−免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合していてもよく、又は直接アドヘシンに融合していてもよい。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、通常アドヘシン−免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと共発現される。分泌されると、ハイブリッド重鎖及び軽鎖は共有結合し、２つのジスルフィド結合を有する免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を含む免疫グロブリン様構造を提供する。このような構造の調製に適した方法は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に開示されている。
【０２０４】
好ましい実施形態において、イムノアドヘシンは、アドヘシンの一部分をインフレームにコードするｃＤＮＡ配列を免疫グロブリンｃＤＮＡ配列に融合させることにより構築される。しかし、ゲノムの免疫グロブリンフラグメントへの融合も用いることができる。一般に、後者のタイプの融合体は、発現のためにＩｇ制御配列を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、脾臓又は末梢血リンパ球から誘導されたｃＤＮＡライブラリーより公開された配列に基づいて、ハイブリダイゼーション又はＰＣＲ手法により単離することができる。イムノアドヘシンの「アドヘシン」及び免疫グロブリン部位をコードするｃＤＮＡは、選択された宿主細胞において有効な発現を目的とするプラスミドベクターに連続的に挿入することができる。
【０２０５】
異性体ポリペプチドの改変した半減期
新生児Ｆｃレセプター「ＦｃＲｎ」は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の相同体であり、妊娠中に、母子間でＩｇＧを移行させるだけでなく、ＩｇＧの血清半減期の制御にも関係する。最近のＦｃＲｎの研究においては、Ｇｈｅｔｉｅ，  Ｖ  ａｎｄ  Ｅ．Ｓ．  Ｗａｒｄ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８：７３９−７６６，  ２０００を参照。ＦｃＲｎは、ｐＨ依存でＩｇＧに結合し、この結合は、弱酸性のｐＨにおいて発生し、ｐＨ７．４では発生しない。ＩｇＧは、ＦｃＲｎを発現する細胞及びによって回収され、酸性のエンドソームが入ることによってＦｃＲｎ−ＩｇＧ相互作用が発生すると仮定される。次に、ＩｇＧは、細胞表面に輸送されると、中性に近いｐＨで放出される。細胞での摂取後、ＦｃＲｎに結合しないＩｇＧは、リソソームコンパートメントに運ばれ、分解する。この形式によって一致するのは、増大した親和性を有するＦｃＲｎに結合する変異Ｆｃ領域は、少ない親和性を有するＦｃＲｎに結合する変異Ｆｃ領域より長い血清半減期を有するという仮説である。
【０２０６】
ＩｇＧ輸送体としてのＦｃＲｎの役割は、ＦｃＲｎに対して改変した親和性を有する変異Ｆｃ領域は、モノクローナル抗体内において、又は外因性のタンパク質、即ち、非抗体に作動可能に付着されるときに、治療上の有用性も有することを示す。被検者又は患者から急激に除去されることによって、又は胎盤膜全体に輸送されないことによって利益をもたらす治療用ポリペプチド、例えば、放射性標識されたポリペプチドは、減少したＦｃＲｎ結合能を示すＦｃ領域が作動可能に付着されることによって利益をもたらす。また、長い血清半減期を有することによってより投与回数を減らすだけでよく、又は、胎盤膜を通して輸送することによって利益をもたらすポリペプチドは、増大されたＦｃＲｎ結合能を示すＦｃ領域（表２、５、及び６を参照）に、選択的に作動可能に付着される。Ｆｃの特性の多数の組合せが意図される、例えば、増大されたＦｃＲｎ結合能を有するＦｃ領域は、ＣＤＣ又はＡＤＣＣがほとんど又は全くない場合、増大したＦｃＲｎ結合能を有するＦｃ領域は、表２に列挙されるＦｃＲｎ結合能を増大する１又は複数のＦｃアミノ酸置換をＣＤＣ及びＡＣＤＤ活性を減少させるアミノ酸置換との組合せにおいてＩｇＧ１の母体Ｆｃ領域に組み込むことによって生成される。
【０２０７】
母体ポリペプチドと比べて増大したＦｃＲｎ結合能を示す本発明の変異Ｆｃ領域が作動可能に付着されることによって増大した血清半減期から利益を享受する好ましいポリペプチドは、例えば、レニン；成長ホルモン；ヒト成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；グレリン；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポ蛋白質；インシュリンＡ鎖；インシュリンＢ鎖；α１−抗トリプシン；ＰＡＩ−１；プロインスリン；トロンボポエチン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、及びフォンウィルブラント因子などの凝血因子；タンパク質Ｃなどの抗−凝血因子；心房性ナトリウム（ｎａｔｕｒｉｅｔｉｃ）利尿因子；肺表面活性物質；ウロキナーゼ又は人尿又は組織型プラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲン（ｐｌａｍｉｎｏｇｅｎ）アクチベーター活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；ＩＬ−１〜ＩＬ−１０、ＩＬ−２０などのインターロイキン；腫瘍壊死因子−α及び−β；エンケファリナーゼ；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；リラキシンＡ鎖；リラキシン軽鎖；プロリラキシン；マウスの性腺刺激ホルモン関連ペプチド；β‐ラクタマーゼなどの微生物タンパク；Ｄｎａｓｅ；インヒビン；アクチビン；血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン類又は成長因子のためのレセプター；インテグリン；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５又は−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、ＮＴ−６）又はＮＧＦ−βなどの神経成長因子（カーディオトロフィン−１（ＣＴ−１）などのカーディオトロフィン（心筋細胞肥大因子））などの神経栄養因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＲ）；（例えばａＦＧＦ、及び、ｂＦＧＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）又はそのレセプター）などの線維芽細胞成長因子；例えば、ＴＧＦ−α、及び、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、又はＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）（ＩＧＦ結合蛋白質）；ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、及びＣＤ−１９などのＣＤタンパク質；エリスロポイエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成医薬品（成長分化因子（例えばＧＤＦ−８））；インターフェロン−α、−β、及び−γのようなインターフェロン；コロニー形成刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ；ＧＭ−ＣＳＦ、及び、Ｇ−ＣＳＦ；ＩｇＧの天然のＦｃ領域を有さない抗−ＨＥＲ−２抗体；ＩｇＧの天然のＦｃ領域を有さない抗−ニワトリ肉腫ウイルス抗体；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表層膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＨＩＶ−１エンベロプタンパク質（ｐｒｏｔｉｏｎ）；輸送蛋白質；ホーミングレセプター；アドレシン；収縮調節蛋白；ＩｇＧの天然のＦｃ領域を有さない抗体などの分子を含む哺乳類の治療用ポリペプチド、及び、上記のポリペプチドのいずれのフラグメント又は前駆体である。
【０２０８】
作動可能に付着されるポリペプチドにおいて改変した血清半減期（即ち、増大したＦｃＲｎ結合能を）を示す本発明のアミノ酸置換からなる変異Ｆｃ領域は、好ましくは関連するポリペプチドのカルボキシ末端又はアミノ末端に作動可能に付着され、これにより融合タンパク質を生成する。
【０２０９】
変異Ｆｃ領域をコードする核酸配列
本発明はまた、変異Ｆｃ領域をコードする核酸配列と同様、Ｆｃ領域変異体をコードする核酸配列を含む組成物、ベクター、及び宿主細胞を提供する。本発明はまた、変異Ｆｃ領域を生成するための組み換え方法を提供する。
【０２１０】
一般に、組み換え法による変異体の生成のためには、変異体をコードする核酸配列を単離し、ベクターに挿入する。宿主細胞に、ベクターを用いてトランスフェクトすることができ、それにより核酸配列を増幅させ、かつ／又は変異体ペプチドを製造させることができる。本発明のペプチド変異体をコードする核酸配列を、従来法（例えば、変異体をコードする配列に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブの使用）により単離し、整列することができる。一般に、変異体をコードする核酸配列は、シグナル配列（例えば分泌性シグナル配列）、複製起点、少なくとも１つのマーカー遺伝子、エンハンサー、プロモーター、又は転写ターミネーター等の他の要素に作動可能に結合される。ある実施形態において、宿主細胞は変異体をコードする核酸により安定にトランスフェクトされ、特定の変異体を発現する細胞系を生成する。好ましい実施形態において、変異体は、ＣＨＯ，ＮＳＯ、Ｓｐ２／０、ＰＥＲ．Ｃ６、又はＨＥＫ２９３細胞内で発現される。組み換え方法は、周知の技術である。
【０２１１】
核酸配列は、変異Ｆｃ領域が生成されるように変異をしていてもよい。例えば、母体Ｆｃ領域をコードする核酸配列（例えば配列番号１〜１２）は、核酸配列が発現した場合に少なくとも１つのアミノ酸の改変が生じるように変異していてもよい。また、母体Ｆｃ領域の少なくとも一部分をコードする核酸配列は、少なくとも変異Ｆｃ領域の一部分を含むアミノ酸配列を産生するように変異していてもよい。
【０２１２】
ある実施形態において、コドンを用いた合成を用いて変異を有する配列を生成する。コドンを用いた合成の例としては、例えば、米国特許第５，２６４，５６３号明細書、米国特許第５，５２３，３８８号明細書及び米国特許第５，８０８，０２２号明細書に記載の方法が挙げられる。要約すると、コドンを用いた合成は、別個の担体の上でモノマーを順次カップリングさせ、少なくとも２つの異なる連続配列（ｔｕｐｌｅｔ）を生成する。カップリングは、別個の反応容器中で行うことができ、その後反応容器から担体を混合し、混合した担体を２つ以上の別個の反応容器に分別し、カップリング、混合及び分別工程を反応容器中で１又は複数回反復し、混合又は分別工程で修了する。更に、オリゴヌクレオチドを、担体から切り離すことができる。
【０２１３】
治療への使用及び製剤
ある実施形態において、本発明は変異体を含む治療用の製剤を提供する。本発明は、治療用組成物の特定の性質に限定されるものではない。例えば、そのような組成物は変異ポリペプチド（又はその一部分）を含むことができ、生理学的に許容される液体、ゲル、固体担体、希釈剤、アジュバント及び賦型剤、並びにこれらの組み合わせと共に提供される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）を参照）。
【０２１４】
更に、変異ポリペプチドは、サリチル酸塩、ステロイド、免疫抑制剤、抗体又は抗生物質を含むがこれらに限定されない他の治療剤と同時、前、又は後に用いることができる。本発明の変異体と共に用いることができる具体的な治療剤としては、アゾベンゼン化合物（米国特許第４，３１２，８０６号明細書）、ベンジル置換ローダミン誘導体（米国特許第５，２１６，００２号明細書）、Ｌ−カルノシン亜鉛塩（米国特許第５，２３８，９３１号明細書）、３−フェニル−５−カルボキシピラゾール及びイソチアゾール（米国特許第５，２９４，６３０号明細書）、ＩＬ−１０（米国特許第５，３６８，８５４号明細書）、キノリンロイコトリエン合成阻害剤（米国特許第５，３９１，５５５号明細書）、２’−ハロ−２’−デオキシアデノシン（米国特許第５，５０６，２１３号明細書）、フェノール及びベンズアミド化合物（米国特許第５，５４２，４３９号明細書）、トリブチリン（米国特許第５，５６９，６８０号明細書）、ある種のペプチド（米国特許第５，７５６，４４９号明細書）、ω−３ポリ不飽和酸（米国特許第５，７９２，７９５号明細書）、ＶＬＡ−４ブロッカー（米国特許第５，９３２，２１４号明細書）、メタスルホ安息香酸プレドニソロン（米国特許第５，８３４，０２１号明細書）、サイトカイン抑制剤（米国特許第５，８８８，９６９号明細書）、及びニコチン（米国特許第５，８８９，０２８号明細書）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２１５】
変異ポリペプチドは、細胞の生存率又は増殖能力を減少させる薬剤と共に用いることができる。細胞の生存率又は増殖能力を減少させる薬剤は、例えば、ＤＮＡ合成の阻害、細胞分裂の阻害、アポトーシスの誘導、又は非アポトーシス誘導性の細胞の殺傷等の種々の経路により機能を果たすものであってもよい。細胞毒性薬及び細胞増殖抑制剤の具体例としては、ヨウシュヤマゴボウ抗菌タンパク質、アブリン、リシン、及びそれらのＡ鎖、ドキソルビシン、シスプラチン、ヨウ素１３１、イットリウム９０、レニウム１８８、ビスマス２１２、タキソール、５−フルオロウラシル、ＶＰ−１６、ブレオマイシン、メトトレキセート、ビンデシン、アドリアマイシン、ビンクリスチン、ＢＣＮＵ、マイトマイシン、及びシクロホスファミド、及び、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β等のある種のサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。このように、細胞毒性薬及び細胞増殖抑制剤は、例えば、放射性元素、化学療法剤、タンパク質、及びレクチンを含んでいてもよい。
【０２１６】
治療用の組成物は、例えば、バインダー、充填剤、担体、保存料、安定化剤、乳化剤、緩衝剤、及び賦型剤等として、例えば、医薬品グレードのマニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の通常用いられる添加物を含んでいてもよい。これらの組成物は、通常、１〜９５％の有効成分、好ましくは、２〜７０％の有効成分を含む。
【０２１７】
本発明の変異ポリペプチドはまた、適用可能で生理学的に許容される希釈剤又は賦型剤と混合することもできる。好適な希釈剤又は賦型剤は、例えば、水、生理的食塩水、デキストロース、グリセロール等、及びこれらの組み合わせである。更に、所望により、組成物は保湿剤又は乳化剤、安定化剤又はｐＨ調整剤等の微量の補助剤を含んでいてもよい。
【０２１８】
ある実施形態において、本発明の治療用組成物は、液体状の溶液又は懸濁液として、スプレーとして、又は固形剤のいずれかとして調製される。経口製剤は、通常、例えば、バインダー、充填剤、担体、保存料、安定化剤、乳化剤、緩衝剤、及び賦型剤等として、例えば、医薬品グレードのマニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の通常用いられる添加物を含む。これらの組成物生物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放剤、又は粉末の形態をとり、通常、１〜９５％の有効成分、好ましくは、２〜７０％の有効成分を含む。本発明の治療用の組成物を投与するのに有用な経口用組成物の一例は、米国特許第５，６４３，６０２号明細書に記載されている。
【０２１９】
局所投与等の他の形態での投与に適した他の製剤としては、軟膏、チンキ剤、クリーム、ローション、経皮パッチ、及び座薬が挙げられる。軟膏及びクリームには、従来のバインダー、担体及び賦型剤は、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドを含んでいてもよい。全身投与法の一例は、米国特許第５，８３４，０１６号明細書に記載されている。他のリポソームを用いた投与法（例えば、米国特許第５，８５１，５４８号明細書及び米国特許第５，７１１，９６４号明細書を参照）を用いてもよい。
【０２２０】
製剤はまた、特定の治療への適応に対する、必要に応じて２種以上の活性化合物を含んでいてもよく、好ましくは、それらは相補的な活性を有しており互いに悪影響を及ぼさない。そのような分子は、意図した目的に有効な量で好適に共存する。
【０２２１】
徐放調剤を調製することも可能である。徐放調剤の好適な例としては、変異ポリペプチドを含む固体の疎水性ポリマーからなる半透性マトリックスが挙げられ、マトリックスは、例えばフィルム、マイクロカプセル等の成型体の構造をとる。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−グルタミン酸エチルのコポリマー、非分解性のエチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なマイクロスフェア）生分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられるが、これらに限定されない。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール（．ｇｌｙｃｏｌｉｃ）酸等のポリマーは、１００日以上にわたり分子の放出を行うことを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短期間しか放出することができない。
【０２２２】
本発明の変異ポリペプチドは、被検者を治療するために使用される。そのような治療剤は、疾患にかかった被験者に投与してもよく、被験者（例えば、疾患にかかりやすい被験者）に予防的に投与してもよい。治療することができる健康状態の例としては、ガン（変異ポリペプチドが、例えば、ＨＥＲ２レセプター、ＣＤ２０、又は血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合する）、喘息等のアレルギー症状（抗ＩｇＥ抗体に結合する）、及びＬＦＡ−１媒介性の病気（変異ポリペプチドは、例えば、抗ＬＦＡ−Ｉ又は抗ＩＣＡＭ−Ｉ抗体である）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２３】
好ましい実施形態において、被験者の治療に用いられるポリペプチド変異体は、抗体又はイムノアドヘシンを含む。また、好ましい実施形態において治療される疾患は、抗体又はイムノアドヘシンに応答する疾患である。抗体に応答する疾患及び病状の例としては、リンパ腫（抗ＣＤ２０抗体であるＲＩＴＵＸＡＮにより治療可能であることが示されている）、感染症（呼吸器合胞体ウイルスのＦタンパク質を対象とする抗体であるＳＹＮＡＧＩＳにより治療可能であることが示されている）、腎移植（抗ＩＬ−２レセプター抗体であるＺＥＮＡＰＡＸが有効であることが示されている）、クローン病及び関節リウマチ（抗ＴＮＦα抗体であるＲＥＭＩＣＡＤＥにより治療可能であることが示されている）、乳ガン（抗ＨＥＲ２抗体であるＨＥＲＣＥＰＴＩＮにより治療可能であることが示されている）、及び大腸ガン（抗１７−１Ａ（ＩＡ）抗体であるＥＤＲＥＣＯＬＯＭＡＢにより治療可能であることが示されている）が挙げられるが、これらに限定されない。ガンを治療するために使用される変異ポリペプチドは、好ましくは、本発明のＦｃ領域アミノ酸置換からなり、該ポリペプチドに増大したＡＤＣＣ活性及び又は増大したＣＤＣ活性を付与する。
【０２２４】
ある実施形態において、改善したＡＤＣＣ活性を有する変異ポリペプチドは、組織又は外来微生物の破壊又は除去が望ましい疾患又は障害の治療に用いられる。例えば、変異体はガン、炎症性疾患、感染（例えば、細菌、ウイルス、真菌又はイーストの感染）、及び組織の除去が望ましい他の健康状態（甲状腺腫等）の治療に用いることができる。他の実施形態において、変異ポリペプチドは、ＡＤＣＣ活性が減退する。そのような変異体は、長い半減期を有するＦｃ領域を含むポリペプチドが望ましいが、ポリペプチドが望ましくないエフェクター機能を有しない方が好ましい場合において疾患又は障害の治療に用いることができる。例えば、Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、抗組織因子（ＴＦ）抗体、抗ＩｇＥ抗体、及び抗インテグリン抗体（例えば抗ａ（α）４３７抗体）であってもよい。そのようなＦｃ領域を含むポリペプチドの望ましい作用機構は、リガンド−レセプター結合対をブロックすることであってもよい。更に、ＡＤＣＣ活性が減退したＦｃ領域を含むポリペプチドは、アゴニスト抗体であってもよい。
【０２２５】
ガンを治療するために使用される変異ポリペプチドは、好ましくは、本発明のＦｃ領域アミノ酸置換（例えば、本願明細書の表２を参照）からなり、該ポリペプチドに増大したＡＤＣＣ活性及び又は増大したＣＤＣ活性を付与する。
【０２２６】
本発明の変異ポリペプチドは、非経口、皮下、局所、腹膜内、肺内、及び鼻腔内、並びに病巣内投与（例えば、局所免疫抑制治療のため）等の任意の適当な方法により投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、及び皮下投与が含まれる。更に、ポリペプチド変異体は、特に、変異ポリペプチドの用量を減少させる場合にはパルス注入により好適に投与される。好ましくは、投与は注射により行われ、最も好ましくは、部位や投与が短期化長期化に応じて静脈又は皮下注射により行われる。
【０２２７】
疾患の予防又は治療のためのポリペプチド変異体の適切な用量は、疾患のタイプ、重篤度及び経過、変異ポリペプチドの投与が予防目的か治療目的か、これまでの治療、患者の病歴及びポリペプチド変異体に対する応答、並びに担当する医師の判断に依存する。変異ポリペプチドは、患者に対し、１度だけ又は一連の治療期間を通して適切に投与される。
【０２２８】
例えば、疾患のタイプ及び重篤度にもよるが、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１２０ｍｇ／ｋｇ）の変異ポリペプチドが、患者に対し、例えば、１回又は複数回に分けて、又は連続注入によって投与される初期試験用量である。通常の１日用量は、上述の条件にもよるが、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲内である。数日間又はそれ以上にわたる反復投与については、病状にもよるが、治療は症状が充分減少するか消失するまで継続される。この治療の進展は、従来の手法及びアッセイにより簡単にモニターすることができ、治療効果を達成するための用量の調節に利用することができる。
【０２２９】
変異ポリペプチドのこれらの提案された量は、多くの治療的な裁量による。適切な投与量及び投与計画は、得られた結果となる。この内容において考慮される要因は、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、病因、抗体の送達部位、特定の種類の抗体、投与方法、投与計画、及び医師にとって公知の他の要因である。
【０２３０】
治療上有効な変異ポリペプチドの投与量は、患者が治療を受けている疾患の症状を軽減させるために必要とされる用量レベルである。更に、治療上有効量は、遅延するか又は、疾患の発症、例えば、ガンの進行を遅延させるか、最小化するか、予防するのに十分な量の治療薬の量に言及する。治療上有効量は、治療薬（例えば変異ポリペプチド）の量に言及し、また、被検者の疾患の治療（ｔｒａｔｍｅｎｔ）又は管理において治療的な利点を提供する治療薬の量に言及する。更に、本発明の治療薬に関する治療上の有効量は、治療薬単独の量、又は他の治療との組合せに言及し、治療又は被検者の疾患の管理において治療的な利点を提供する。変異ポリペプチドは、必ずしも必要ではないが、対象となる病気の治療に近年使用されている１又は複数の薬剤と共に必要に応じて調剤される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する変異ポリペプチドの量、病気又は治療のタイプ、及び上述の他の因子に依存する。第１の予防薬又は治療薬（例えば本発明又はその機能性フラグメントの変異Ｆｃ領域からなる変異ポリペプチド又はポリペプチド）は、障害を持つ被験者に第２の予防約又は治療薬を投与する前、同時、後に投与することができる。
【０２３１】
本発明の治療薬は、使用前に貯蔵用に凍結、凍結乾燥され、及び、適切な無菌の担体において再構成される。凍結乾燥及び再構成は、抗体活性損失の変化させる程度に行なうことができる。投薬量は、調製して補正する必要がある。通常、ｐＨ６〜８が好ましい。
【０２３２】
モノクローナル抗体が結合する抗原は、有害である又はどの抗原の減少したレベルから利点を享受する、前記疾患の少なくとも１つ（例えばガン）を治療又は予防するための、本発明の変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体の使用は、本願明細書において意図される。前記疾患の少なくとも１つの治療用医薬の製造において使用される、本発明の変異Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体の使用は、本願明細書において意図される。
【０２３３】
本願明細書で使用される場合、用語「治療」、「治療する」などの用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得るということに言及する。その効果は、その疾患又は症状を完全に又は部分的に予防する観点から予防的であり、及び／又は、疾患及び／又は疾患に対する有害作用を部分的又は完全な治療の観点から治療的である。本願明細書において使用される場合、「治療」は、哺乳類、特にヒトにおいて疾患又は症状を治療する、本発明の化合物を投与することを含み、かつ、（ａ）それを有するように、疾患の素因を持つが、まだ罹患したと診断されていない被験者において、その疾患が発症するのを予防することと、（ｂ）疾患を抑制、つまり、発現を抑制することと、（ｃ）疾患又は障害の退行を引き起こすか、又は症状又はその症状の複雑化を緩和することを含む。薬剤投与計画を提供し、最適所望の反応（例えば治療反応又は予防反応）を調整する。例えば、１回の注入によって投与してもよく、数回に分けて時間ごとに投与してもよく、又は、投与量は治療的な状況の緊急性によって示されるように比例して増減させてもよい。
【０２３４】
抗ＣＤ２０抗体
本発明の変異Ｆｃ領域から成っている抗ＣＤ２０抗体は、本発明の範囲内において意図される（本願明細書における実施例４及び図４を参照）。一実施形態において、抗ＣＤ２０抗体は、本発明の変異Ｆｃ領域又はその一部を含み、本願明細書の表１〜１０に列挙されるアミノ酸置換を含み、更に、配列番号１３、１４、１５、又は１６で表される配列を有するペプチドを含む。一実施形態において、抗ＣＤ２０抗体は、本発明の変異Ｆｃ領域又はその一部を含み、本願明細書の表１〜１０に列挙されるアミノ酸置換を含み、更に、
ａ）配列番号１３及び配列番号１４；
ｂ）配列番号１５及び配列番号１６；
ｃ）配列番号１７、１８、１９、２０、２１、及び２２；又は
ｄ）配列番号２３、２４、２５、２６、２７、及び２８で表される配列を有するペプチドを含む。
【０２３５】
更に好ましくは、抗ＣＤ２０抗体は、本発明の変異Ｆｃ領域又はその一部を含み、
ａ）２４７Ｉ及び３３９Ｄ；
ｂ）２４７Ｉ及び３３９Ｑ、及び、
ｃ）３７８Ｄからなる群から選択されるアミノ酸置換を含み、
及び、
ａ）配列番号１３及び配列番号１４；
ｂ）配列番号１５及び配列番号１６；
ｃ）配列番号１７、１８、１９、２０、２１、及び２２、かつ、
ｄ）配列番号２３、２４、２５、２６、２７、及び２８からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。
【０２３６】
変異Ｆｃ領域の他の利用
本発明の変異体、及び変異体をコードする核酸配列は、多くの方法で使用することができる。例えば、本発明の変異体を薬剤のスクリーニングアッセイに使用することができる。例えば、候補化合物を、変異体を候補化合物と接触させ、候補化合物の変異体に対する結合能を決定することにより、Ｆｃ領域のエフェクター機能を改変又は阻害する能力を評価することができる。変異体は、ＧＳＴ−変異体融合タンパク質を、グルタチオンを含むポリマービーズの表面に結合させる等の周知の方法により固定化することができる。ＧＳＴ融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡは、対象となる変異体をコードするＤＮＡをＧＳＴのカルボキシル末端をコードするＤＮＡに融合させることにより構築される（例えば、Ｓｍｉｔｈ他，Ｇｅｎｅ，６７：３１（１９８８））。融合コンストラクトは、その後、ＧＳＴ融合タンパク質の発現がイソプロピル−ｆ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＴＰＧ）により誘導される適当な発現系（例えば大腸菌ＸＡ９０）に移される。ＩＴＰＧによる誘導により、融合タンパク質が可溶性の細胞性タンパク質の主成分として得られる。融合タンパク質は、グルタチオンアフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法により精製することができる。候補化合物の変異体への結合は、該化合物が１又は複数のエフェクター機能を阻害する能力と相関する。
【０２３７】
他のスクリーニング方法において、変異体又は選択されたＦｃＲのいずれかが、プラスチック製マイクロタイタープレート上への吸着又はＧＳＴ融合タンパク質のグルタチオンを含むポリマービーズ上への特異的な結合等の公知の方法により固定化される。例えば、ＧＳＴ−変異体は、グルタチオン−セファロースビーズ上に結合する。固定化した変異体を、その後ＦｃＲ及び候補化合物と接触させる。結合していないペプチドを除去し、複合体を可溶化して分析し、結合した標識ペプチドの量を決定する。結合量の減少は、候補化合物が変異体とＦｃＲとの相互作用を阻害することを意味する。このスクリーニング方法は、増大した量の本発明の変異体を用いると特に有用である。この方法の変形法は、先に形成した変異体／Ｆｃレセプター複合体を分解することが可能な化合物のスクリーニングを可能にする。例えば、ある実施形態において、ＦｃＲに結合した変異体を含む複合体を上述のように固定化し、候補化合物と接触させる。候補化合物による複合体の分解は、化合物がテストする変異体とＦｃＲとの相互作用を破壊又は阻害する能力と相関する。このようにして、（例えば、ヒトに対する）治療能力を有する化合物（例えば、自己免疫疾患等のヒトの疾患を治療するのに有用な化合物）を同定することができる。
【０２３８】
薬剤をスクリーニングするための他の手法は、変異体ペプチドに対する好適な結合親和性を有する化合物に対する高スループットのスクリーニング方法を提供し、国際公開第８４／０３５６４号パンフレットに詳細に記載されている。要約すると、多くの異なる小ペプチド供試化合物を、プラスチックのピン又は他の表面等の固体担体上で合成する。ペプチド供試化合物を変異体ペプチドと反応させ、洗浄する。結合したペプチドを、その後周知の方法により検出する。
【０２３９】
他の手法では、変異体ペプチドを対象とする抗体を用いる。変異体ペプチドに特異的に結合することができる抗体は、ある変異体との結合について供試化合物と拮抗する。このようにして、変異体ペプチドと１又は複数の抗原性決定基を共有する任意のペプチドの存在を、抗体を用いて検出することができる。
【０２４０】
本発明は、化合物をスクリーニングする他の多くの方法を意図する。上述の実施例は、単に用いることが可能な手法の範囲を説明するために示される。当業者にとって、多くの他のスクリーニング方法を用いることができることは認識される。
【０２４１】
特に、本発明は、少なくとも１つの変異Ｆｃ領域をコードする核酸がトランスフェクトされた細胞系の化合物の活性をスクリーニングするための使用を意図し、特に、高スループットの化合物の組み合わせライブラリー（例えば、１０４以上の化合物を含むライブラリー）からのスクリーニングを意図する。本発明の細胞系は、多くのスクリーニング方法において使用することができる。
【０２４２】
本発明の変異体は、アフィニティー精製剤として使用することができる。例えば、変異体をセファデックス又はろ紙等の固相上に、公知の方法を用いて固定することができる。固定化した変異体を、精製しようとする抗原を含むサンプルと接触させ、その後、サンプル中に含まれる、固定化したポリペプチド変異体に結合した精製しようとする抗原以外のほぼ全ての物質を除去する適当な溶媒で担体を洗浄する。最後に、担体を、ｐＨ５．０のグリシンバッファー等の他の適当な溶媒で洗浄すると、変異ポリペプチドから抗原が切り離される。
【０２４３】
変異ポリペプチドはまた、診断アッセイ（例えば、細胞、組織、又は血清における、対象となる抗原の発現の検出）にも有用である。診断に応用するためには、変異体は通常検出可能な残基で標識されている（そのような標識は、上述のＦｃ領域のアッセイにおいても有用である）。放射性同位体（例えば、３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、希土類キレート（ユーロピウムキレート）又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ、フィコエリスリン、並びにテキサスレッド）、及び種々の酵素−基質標識（例えば、米国特許第４，２７５，１４９号明細書参照）、及びルシフェラーゼ、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸脱水素酵素、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、３−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素）、ヘテロ環オキシダーゼ（ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ等）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ等）を含むがこれらに限定されない多くの標識が利用可能である。酵素−基質の組み合わせとしては、例えば、（ｉ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と基質としての過酸化水素（染料の前駆体（例えば、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する）；（ｉｉ）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と、発色性基質としてリン酸ｐ−ニトロフェニル；及び（ｉｉｉ）−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｒ−Ｄ−Ｇａｉ）と、発色性基質又は蛍光性基質が挙げられる。
【０２４４】
本発明の変異体は、インビボでの診断アッセイにも使用することができる。例えば、変異ポリペプチドは、抗原又は抗原を発現している細胞の位置を、免疫シンチグラフィーで特定できるように放射性元素で標識される。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【表３】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【表５】
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【表６】
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【表７−１】
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【表７−２】
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【表８】
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【実施例】
【０２４５】
以下の実施例は、本発明の一つの好ましい実施形態及び側面を示し、より詳しく説明するためのものであり、これらの範囲を限定するものではない。
【０２４６】
ＡＤＣＣアッセイにおける変異Ｆｃ領域のスクリーニング
本実施例では、ＡＤＣＣアッセイにおいて、どのように抗体（例えば抗ＣＤ２０）に関連する変異Ｆｃ領域をスクリーニングするかについて述べる。
【０２４７】
ｉ．抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離
約５０ｍＬの抹消血を健康なドナーから採取し、ｐＨ７．０リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１：２に希釈する。チューブを穏やかに回転させることにより溶液を混合する。約１２ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ社カタログ番号１０７７−１）を希釈血液サンプルの下に注意深く加えて層状にした後、Ｓｏｒｖｏｌｌ社製ＲＴ６０００Ｂ遠心器中で、バケットローターを、ブレーキをオフにして１０００ｒｐｍで１０分間回転させ遠心分離する。グラジエントの上相を吸引して廃棄し、白色のＰＢＭＣを含む界面相を回収し、Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｉｂｃｏ社カタログ番号１４０２５−０９２）で３回洗浄する。洗浄した細胞ペレットを約２０ｍＬの、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社カタログ番号ＦＢ−０１）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させる。再懸濁させたＰＢＭＣを２つのＴ−１７５培養フラスコに分注し、３０ｍＬの、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩをそれぞれに加え、３７℃において５％ＣＯ２インキュベーター中で終夜インキュベートする。翌日、非接着性のＰＢＭＣを５０ｍＬファルコンチューブ中に回収後、上記と同様に遠心分離し、１％ＦＢＳを含むフェノールレッド欠損ＲＰＭＩ中に再懸濁させる。少量の再懸濁細胞を１０倍に希釈し、血球計でカウントする。残りのＰＢＭＣは、必要となるまでインキュベーターに保存する。
【０２４８】
ｉｉ．標的細胞系（抗ＣＤ２０ＡＤＣＣアッセイに特有）
ＣＤ２０を発現した、Ｗｉｌ．２及びＳＫＷ６．４  Ｂ細胞系は、ＡＴＣＣより入手し、推奨される条件で培養した。使用する１日前に細胞を２等分する。翌日、細胞数を４×１０５個／ｍＬに調節し、５０μＬずつ９６ウェル組織培養プレートに加える。
【０２４９】
ｉｉｉ．ＩｇＧ希釈液
スクリーニングの前に、本発明のＦｃ変異体を含むＩｇＧを発現させ、生成し、標準的なＥＬＩＳＡを用いて定量する。一点法によるＡＤＣＣ一次スクリーニングのために、ＩｇＧ変異体を、１％ＰＢＳを含むフェノールレッド欠損ＲＰＭＩ培地中で４０ｍｇ／ｍＬに希釈する。アッセイに用いられるＩｇＧの最終濃度を４倍に希釈する（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）。５０μＬのＩｇＧ希釈液を標的細胞に加え、１５分間３７℃でインキュベートした後、オプソニン化された標的細胞にエフェクター細胞を加える。
【０２５０】
ＩｇＧの滴定を行うと、ＩｇＧ濃度は、約０．００１〜１μｇ／ｍＬの範囲で変化する。ＩｇＧ希釈液を、９６ウェルマイクロタイタープレート中で、１％ＰＢＳを含むフェノールレッド欠損ＲＰＭＩ中のサンプルを希釈することにより調製する。希釈したＩｇＧサンプルを、標的細胞を含むアッセイプレートに加える。
【０２５１】
ｉｖ．エフェクター細胞
ＰＢＭＣの濃度を、エフェクター細胞：標的細胞比が、１０〜２０：１（２〜４×１０６個／ｍＬ）の範囲内となるよう調節する。１００μＬの再懸濁したＰＢＭＣをそれぞれのウェルのオプソニン化された標的細胞に加える。プレートを、５％ＣＯ２の存在下３７℃で３〜４時間インキュベートする。
【０２５２】
ｖ．乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出の検出
標的細胞の溶解を、損傷を受けた細胞の細胞質から上澄みへのＬＤＨ酵素の放出を検出することにより測定する。オプソニン化した標的細胞をエフェクター細胞とインキュベートした後、アッセイプレートを２０００ｒｐｍで５分間遠心する。ペレット化した細胞及び破砕物を避けつつ、約７５μＬの細胞培養液の上澄みを注意深く取り去る。この上澄みを直接マイクロタイタープレートに加え、これに７５μＬのＬＤＨ検出試薬（Ｒｏｃｈｅ社カタログ番号１６４４７９３）を加える。その後、プレートを約１５〜３０分間インキュベートし、４９０ｎｍにおける吸光度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｖｍａｘ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒにより読み取る。
【０２５３】
ｖｉ．データの解析
ＡＤＣＣスクリーニングアッセイは、全て２回行った。それぞれのアッセイプレートは、自然溶解、ＩｇＧ非存在下でのエフェクター細胞及び標的細胞の溶解、及び標的細胞の完全溶解のコントロール群を含む。標的細胞の完全溶解は、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を標的細胞に加えることにより達成される。野生型コントロール群をそれぞれのアッセイプレートに含めておき、得られるＡＤＣＣシグナルを平均する。自然分解コントロール群から得られるバックグラウンド値を、それぞれのサンプルから差し引く。希釈ＩｇＧ液から得られるバックグラウンド値をそれぞれのサンプルから差し引く。データを、吸光度から、自然溶解及び完全溶解に対する特異的溶解の割合に変換する。特異的溶解の割合は、次の式により計算される。
（％特異的溶解）＝（測定値Ａ４９０−バックグラウンドＡ４９０）／（最大Ａ４９０−バックグラウンドＡ４９０）×１００
ここで、バックグラウンドＡ４９０は、ＩｇＧ非存在下でのエフェクター及び標的細胞、及び粗製ＩｇＧ上澄み中に存在するＬＤＨ混入物によるＩｇＧバックグラウンドの和（ｓｕｐｅｍａｔａｎｔ）である。Ｆｃ変異体の活性の割合は、野生型コントロールの平均値に対して規格化される。２度のアッセイについての規格化された活性の割合は平均され、個々のサンプルについてそれぞれのアッセイプレート間の標準偏差を計算する。
【０２５４】
ｖｉｉ．結果
相対ＡＤＣＣ特異性活性を表９（一置換）及び表１０（組合せ置換）に示す。この表に示したＣＤＣの値は、本願明細書の実施例９の記載に従い得られたものであり、表９に示したＦｃＲｎ結合アッセイの値は、本願明細書の実施例３の記載に従い得られたものである。更に、結果は、上記の表１及び２に示される。一置換単独より高いＡＤＣＣを得た組合せ置換は、２４７Ｆ，３３９Ｄ；２４７Ｉ，３３９Ｄ；２４７Ｌ，３３９Ｄ；２４７Ｌ，３３９Ｔ；及び２４７Ｉ，３３９Ｑである。単独でテストした場合に野生型ＡＤＣＣより高いＡＤＣＣを有するにも関わらず、野生型ＡＤＣＣの８０％以下のＡＤＣＣであった組合せ置換は、２４７Ａ，３３９Ｄ；２４７Ｙ，３３９Ｈ；２４７Ｉ，３３９Ｉ；２４７Ｔ，３３９Ｉ；２４７Ｌ，３３９Ｎ；２４７Ａ，３３９Ｑ；及び２４７Ａ，３３９Ｒである。単独でテストした場合に野生型ＡＤＣＣより高いＡＤＣＣを有するにも関わらず、野生型ＡＤＣＣの１０％以下のＡＤＣＣであった組合せ置換は、２４７Ｉ，３３９Ｉ；２４７Ｔ，３３９Ｉ；及び２４７Ｌ，３３９Ｎである。
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【表９−５】
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【表９−６】
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【表９−７】
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【表９−８】
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【表９−９】
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【表９−１０】
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【表９−１１】
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【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【０２５５】
実施例２−変異体のＣＤＣ活性の評価
本実施例では、どのようにして種々の変異Ｆｃ領域のＣＤＣ活性を決定したかについて述べる。
【０２５６】
本アッセイは、Ｒａｍｏｓ（ＲＡ＃１）細胞（ＡＴＣＣ社カタログ番号ＣＲＬ−１５９６）上のヒト補体（Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ．，カタログ番号Ａ１１３）を用いて行う。Ｒａｍｏｓ細胞を、１０％ＦＢＳを含むＧｉｂｃｏ社製ＲＰＭＩ１６４０培地中３７℃、５％ＣＯ２中で培養した。アッセイの前日に、Ｔ１７５フラスコ中に細胞を１×１０６個接種する。翌日、細胞を、１％ＦＢＳを含むフェノールレッド欠損ＲＰＭ１１６４０中に、３．５７×１０５個／ｍｌとなるよう再懸濁する。Ｃｏｓｔｅｒ社製３９１７平底プレート中に、７０μｌ／ウェルずつ細胞を分注した。滴定曲線を得るために、変異Ｆｃ領域を有するＩｇＧをＲＰＭＩ１６４０培地中３倍連続希釈法により調製する。一点法ライブラリースクリーニングアッセイを行うために、一時的に培地の上澄み中で発現させたＩｇＧ変異体を、ｍｏｃｋ培地で１μｇ／ｍｌに規格化する。３０μｌの変異性ＩｇＧ（最終濃度２００ｎｇ／ｍｌ）及び、ＲＭＰＩ１６４０＋１％ＦＢＳで１：５に希釈したヒト補体（Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ．，カタログ番号Ａ１１３）５０μｌを、標的細胞に加え、穏やかにピペッティングすることにより混合する。プレートを、５％ＣＯ２の存在下３７℃で１．５時間インキュベートする。１５μｌ／ウェルのアラマーブルー（Ｓｅｒｏｔｅｃ社カタログ番号ＢＵＦ０１２Ｂ）を加えた後、インキュベーションを終夜継続する。次に、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＥｎＶｉｓｉｏｎ２１００多標識リーダーを用いて、励起波長５６０ｎｍ、発光波長５９０ｎｍにおいて蛍光シグナルを測定する。
【０２５７】
ｉｉ．データの解析
一点法によるアッセイは、全て２回行う。それぞれのアッセイプレートは、ＩｇＧ非存在下でのヒト補体による標的細胞の自然溶解、及び１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００存在下での標的細胞の完全溶解のコントロール群を含む。３つの野生型コントロール群をそれぞれのアッセイプレートに含めておき、得られるＣＤＣシグナルを平均する。自然分解コントロール群から得られるバックグラウンド値を、それぞれのサンプルから差し引く。データを、蛍光シグナルから、自然溶解及び完全溶解コントロール群に対する特異的溶解の割合に変換する。特異的溶解の割合は、次の式により計算される。
（％特異的溶解）＝（蛍光シグナルの測定値−自然分解シグナル）／（最大分解シグナル−自然分解シグナル）×１００
３つの野生型コントロール群の平均値に対するＦｃ変異体の活性の割合を計算する。野生型コントロール群の平均値に対する２つのアッセイプレートについての活性の割合を平均し、それぞれのアッセイプレート間の標準偏差を計算する。
【０２５８】
実施例３−ＦｃＲｎの結合の評価
本実施例では、Ｆｃ新生児レセプター（ＦｃＲｎ）への変異Ｆｃ領域を有するＩｇＧの結合に対するアッセイについて述べる。
【０２５９】
丸底９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、５０μｌ／ウェルの２μｇ／ｍｌニュートラビジン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社カタログ番号３１０００）５０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９．３）溶液を用いて、４℃で終夜コートした。結合していないニュートラビジンを除去し、プレートをＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄する。ビオチン標識した可溶性ＦｃＲｎの２．５μｇ／ｍｌＰＢＳ溶液を、５０μｌ／ウェルずつ加え、室温で１時間インキュベートする。その後、７５μｌのカゼインブロッキングバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社カタログ番号３７５２８）をプレートに１時間加える。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで洗浄し、５０μｌ／ウェルの変異性ＩｇＧでインキュベートする。滴定曲線を得るために、テストされるＩｇＧをＦｃＲｎ結合バッファー（１００ｍＭ  ＮａＰＯ４、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、種々のｐＨ（６．０〜７．４））中で３倍連続希釈法により調製する。一点法スクリーニングを行うために、一時的に培地の上澄み中で発現させた変異性ＩｇＧを、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌに規格化し、ｐＨを、ＦｃＲｎ結合バッファーを用いて６．０に調整する。以下のステップにおいて、同様のｐＨのＦｃＲｎ結合バッファーを用いてプレートの洗浄及び試薬の希釈を行なう。結合反応を室温で１時間行う。３回洗浄後、結合したＩｇＧを、ヤギ（Ｆａｂ’）２抗ヒトＦａｂ−ＨＲＰコンジュゲートを用いて１時間で検出する。ＨＲＰ活性は、Ｐｉｅｒｃｅ社のＨＲＰ基質（Ｔｕｒｂｏ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、カタログ番号３４０２２）を用いて、５〜３０分で明らかにする。５０μｌの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させ、４５０ｎｍにおける吸光度を、ＶＭＡＸマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定する。
【０２６０】
実施例  ４−抗ＣＤ２０−Ｉ３３２Ｅ  Ｆｃ変異体によるヒトの治療
インビトロでの研究及びマウス腫瘍モデル（Ｃｌｙｎｅｓ  ＲＡ他，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．６：４４３（２０００））より、ＡＤＣＣが、ＲＩＴＵＸＡＮ等の抗ＣＤ２０抗体の抗ガン効果において役割を果たす証拠を得る。ヒト患者を、抗ＣＤ２０−Ｉ３３２ＥＦｃ変異体抗体、又はＲＩＴＵＸＡＮを用いて、Ｃａｒｔｏｏｎ他，Ｂｌｏｏｄ  ９９：７５４（２００２）に開示された方法と同様の方法により治療してもよい。例えば、Ａｎｎ−Ａｒｂｏｒの分類でステージＩＩ〜ＩＶの疾患を発症しており、少なくとも１つの測定可能な病巣を有し、ＧＥＬＦの基準による全身腫瘍組織量の低い患者には、４回の総用量が約３７５ｍｇ／ｍ２の、抗ＣＤ２０−Ｆｃ変異体又はＲＩＴＵＸＡＮを、静脈内注射により投与（１日、８日、１５日、及び２２日間）することができる。一次有効性エンドポイントは、客観的奏功率、即ち、国際専門化委員会により最近提案された基準による完全寛解（ＣＲ）、未確認完全寛解（Ｃｒｕ）、又は部分寛解（ＰＲ）に至った患者の割合である。臨床反応は、２月目（Ｍ２）に評価することができる。患者の経過について１年経過時（ＭＩ２）において評価してもよい。
【０２６１】
Ｉ３３２Ｅ変異体によりもたらされる増大されたＡＤＣＣを定量できるように、効果Ｍ２及びＭ１２における、ＲＩＴＵＸＡＮ又は抗ＣＤ２０−Ｆｃ変異体で治療される患者の客観的奏功率を比較してもよい。同様の実施例を、他の抗ＣＤ２０変異体（例えば、表１〜１０に示した組み合わせ）について繰り返すこともできる。
【０２６２】
更に、変異体の向上した能力により、他の投与経路、注射の回数の減少、及び／又は少容量の投与が可能になる。上記の明細書において言及される全ての出版物、及び、特許に記載された本発明の方法及びシステムの種々の改変及び変形は、当業者にとって、本発明の範囲及び精神から逸脱することのない明白なものであろう。本発明について特に好ましい実施形態と関連づけて記載したが、特許請求の範囲に記載の発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきものではない。実際、記載された本発明の実施形式に対する、化学、及び分子生物学又は関連する分野の当業者にとって明白な改変は、特許請求の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２６３】
【図１】種々の領域及び区分を表示したＩｇＧ分子の略図を示す図である。
【図２】ヒトＩｇＧ１（非ａ型及びアロタイプを示す配列番号１）、ヒトＩｇＧ２（配列番号２）、ヒトＩｇＧ３（配列番号３）、ヒトＩｇＧ４（配列番号４）、マウスＩｇＧ１（配列番号５）、マウスＩｇＧ２Ａ（配列番号６）、マウスＩｇＧ２Ｂ（配列番号７）、マウスＩｇＧ３（配列番号８）を含む、母体Ｆｃアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図３】ヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域（配列番号９）、及びＣＨ３領域（配列番号１０）、同じくｆアロタイプ（配列番号１１）、及びａ、ｚアロタイプ（配列番号１２）の配列を含む、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を含むヒトＩｇＧ１の種々のアミノ酸配列を示す図である。
【図４】（ａ）抗ＣＤ２０抗体の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）（ｉ）（配列番号１３）；（ｂ）抗ＣＤ２０抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）（ｉ）（配列番号１４）；（ｃ）抗ＣＤ２０抗体のＬＣＶＲ（ｉｉ）（配列番号１５）；（ｄ）抗ＣＤ２０抗体のＨＣＶＲ（ｉｉ）（配列番号１６）内に含まれる様々なアミノ酸配列；（ｅ）抗ＣＤ２０抗体の可変領域内に含まれるアミノ酸配列を示す（２００３年５月２０日に出願された米国特許仮出願第６０／４７１，９５８号明細書、及び、米国特許第５，８４３，４３９号明細書を参照。これらは本願明細書に組み込まれる）図である。
【図５】（ａ）抗ＣＤ２０抗体ＡＭＥ１３３に関する全長軽鎖アミノ酸配列；（ｂ）ＡＭＥ１３３に関する全長軽鎖核酸配列を示す図である。
【図６】抗ＣＤ２０抗体ＡＭＥ１３３の３つの好ましい変異体の全長重鎖のアミノ酸配列及び核酸配列を示す図である。具体的には、（ａ）２４７Ｉ／３３９Ｑ変異体の全長重鎖のアミノ酸配列；（ｂ）２４７Ｉ／３３９Ｑ変異体の全長重鎖の核酸配列；（ｃ）２４７Ｉ／３３９Ｄ変異体の全長重鎖のアミノ酸配列；（ｄ）２４７Ｉ／３３９Ｄ変異体の全長重鎖の核酸配列；（ｅ）３７８Ｄ変異体の全長重鎖のアミノ酸配列；（ｆ）３７８Ｄ変異体の全長重鎖の核酸配列を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【配列表】
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