(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
醗酵ブロスから塩基性アミノ酸を分離する方法であって、該方法は、
（ａ）発酵ブロスと、模倣移動ベッドクロマトグラフィー分離装置としての操作のために構成された多数の強酸性陽イオン交換樹脂を含むカラムとを接触させる工程であって、該樹脂が、８％未満が架橋されている、工程；および
（ｂ）該塩基性アミノ酸が該醗酵ブロスから分離されるように、該交換樹脂から該アミノ酸を溶出する工程、
を包含し、
ここで、前記模倣移動ベッドクロマトグラフィー分離装置が、前記多数の強酸性陽イオン交換樹脂にわたる複数のゾーンを設けるように構成されており、
前記複数のゾーンが吸着ゾーン、富化ゾーン、および溶出ゾーンを含んでなり、
前記吸着ゾーンが前記装置の供給物入り口ポートと排出物出口ポートとの間に位置しており、
前記富化ゾーンが前記供給物入り口ポートと前記装置の生成物出口ポートとの間に位置しており、かつ
前記溶出ゾーンが前記装置の溶出剤入り口ポートと前記生成物出口ポートとの間に位置している、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記強酸性陽イオン交換樹脂が、２％〜７％が架橋されている、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記溶出工程が、３ベッド容積未満の溶出容積を用いる工程を包含する、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記溶出工程が、１ベッド容積〜２ベッド容積の溶出容積を用いる工程を包含する、方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法であって、前記溶出工程が、１．２ベッド容積の溶出容積を用いる工程を包含する、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記溶出工程が、１％〜７％のＮＨ４ＯＨを用いる工程を包含する、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記溶出工程が、２％〜５％のＮＨ４ＯＨを用いる工程を包含する、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記塩基性アミノ酸が、８５％を超える純度で前記醗酵ブロスから分離される、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記塩基性アミノ酸が、９０％を超える純度で前記醗酵ブロスから分離される、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記塩基性アミノ酸が、０．８〜２．０の濃度比で前記醗酵ブロスから分離される、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記塩基性アミノ酸が、１．０〜１．８の濃度比で前記醗酵ブロスから分離される、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記塩基性アミノ酸が、天然塩基性アミノ酸、合成塩基性アミノ酸、および改変塩基性アミノ酸からなる群より選択される、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、前記塩基性アミノ酸が、リジン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群より選択される、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記アミノ酸がリジンである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、醗酵ブロスから塩基性アミノ酸を分離するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術）
リジンおよび他の塩基性アミノ酸は、動物飼料添加物（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）として広範に用いられる。代表的には、リジンは、デキストロースの醗酵により生成される。リジンに加えて、醗酵ブロスは、種々の不純物（例えば、色素体、残りの糖類、塩類、および他の副産物）を含む。醗酵ブロスからリジンを精製することにおける主な工程は、イオン交換クロマトグラフィーである（Ｔａｎａｋａら、米国特許第４，７１４，７６７号（１９８５）を参照のこと）。クロマトグラフィーでの分離は、固定ベッドまたは模倣移動ベッド技術（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  ｍｏｖｉｎｇ  ｂｅｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｖａｎ  Ｗａｌｓｅｒｎ，Ｈ．Ｊ．およびＴｈｏｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５９：１２７−１３２（１９９７））を用いたバッチ様式または連続様式において操作され得る。代表的には、高い架橋程度を有する強酸性陽イオン交換樹脂が用いられる。
【０００３】
模倣移動ベッド（ＳＭＢ）技術は、醗酵ブロスのクロマトグラフィーによる分離の簡便かつ効率的な方法である（Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ，Ｄ．Ｂ．，米国特許第２，９８５，５８９号（１９６１））。高い架橋程度を有する伝統的な強酸性陽イオン交換樹脂をＳＭＢ操作において用いる場合、得られるリジンの純度は、８０〜８５％に過ぎない（収量は約８５〜９０％）。高い架橋程度を有する伝統的な強酸性陽イオン交換樹脂で得られた分離が低レベルであることは、工業規模の生産には満足行くものではない。従って、醗酵ブロスを精製する間のリジンの純度および収量を改善する必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、模倣移動ベッド技術を用いて、醗酵ブロスから塩基性アミノ酸を分離するための方法に関し、この方法は、醗酵ブロスと、低い架橋程度を有する強酸性陽イオン交換樹脂とを接触させる工程、およびこのアミノ酸をこの交換樹脂から溶出する工程を包含する。例えば、本発明は以下を提供する：
（項目１）  醗酵ブロスから塩基性アミノ酸を分離する方法であって、該方法は、
（ａ）模倣移動ベッド装置において、醗酵ブロスと、強酸性陽イオン交換樹脂とを接触させる工程であって、該樹脂が低い架橋程度を有する、工程；および
（ｂ）該塩基性アミノ酸が該醗酵ブロスから分離されるように、該交換樹脂から該アミノ酸を溶出する工程、
を包含する、方法。
（項目２）  項目１に記載の方法であって、前記強酸性陽イオン交換樹脂が、約８％未満が架橋されている、方法。
（項目３）  項目２に記載の方法であって、前記強酸性陽イオン交換樹脂が、約２％〜約７％が架橋されている、方法。
（項目４）  項目１に記載の方法であって、前記溶出工程が、約３ベッド容積未満の溶出容積を用いる工程を包含する、方法。
（項目５）  項目４に記載の方法であって、前記溶出工程が、約１ベッド容積〜約２ベッド容積の溶出容積を用いる工程を包含する、方法。
（項目６）  項目４に記載の方法であって、前記溶出工程が、約１．２ベッド容積の溶出容積を用いる工程を包含する、方法。
（項目７）  項目１に記載の方法であって、前記溶出工程が、約１％〜約７％のＮＨ４ＯＨを用いる工程を包含する、方法。
（項目８）  項目７に記載の方法であって、前記溶出工程が、約２％〜約５％のＮＨ４ＯＨを用いる工程を包含する、方法。
（項目９）  項目１に記載の方法であって、前記塩基性アミノ酸が、約８５％を超える純度で前記醗酵ブロスから分離される、方法。
（項目１０）  項目９に記載の方法であって、前記塩基性アミノ酸が、約９０％を超える純度で前記醗酵ブロスから分離される、方法。
（項目１１）  項目１に記載の方法であって、前記塩基性アミノ酸が、約０．８〜約２．０の濃度比で前記醗酵ブロスから分離される、方法。
（項目１２）  項目１１に記載の方法であって、前記塩基性アミノ酸が、約１．０〜約１．８の濃度比で前記醗酵ブロスから分離される、方法。
（項目１３）  項目１に記載の方法であって、前記塩基性アミノ酸が、天然塩基性アミノ酸、合成塩基性アミノ酸、および改変塩基性アミノ酸からなる群より選択される、方法。
（項目１４）  項目１に記載の方法であって、前記塩基性アミノ酸が、リジン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群より選択される、方法。
（項目１５）  項目１４に記載の方法であって、前記アミノ酸がリジンである、方法。
（項目１６）  項目１に記載の方法により精製された、塩基性アミノ酸。
（項目１７）  項目１に記載の方法を利用することにより精製された塩基性アミノ酸を含む、動物飼料添加物。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、模倣移動ベッド操作におけるアミノ酸分離のカラム構成を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、醗酵ブロスから塩基性アミノ酸を分離する方法および装置に関する。具体的には、本発明は、模倣移動ベッド技術を用いて、醗酵ブロスから塩基性アミノ酸を分離する工程に関し、この工程は、以下の工程を包含する：（ａ）醗酵ブロスと、低い架橋程度を有する強酸性陽イオン交換樹脂とを接触させる工程；および（ｂ）上記塩基性アミノ酸が元の醗酵ブロスから分離されるように、上記交換樹脂から上記塩基性アミノ酸を溶出する工程。
【０００７】
本発明の方法は、模倣移動ベッド（ＳＭＢ）装置を利用する。ＳＭＢ装置は、イオン交換樹脂を含む複数のカラムを備え、図１に示されるように、直列に接続されている。好ましくは、供給および溶出のための入り口ポートの位置、ならびに生成物およびラフィネートのための出口ポートは、流体に関して樹脂の向流運動を模倣するために、流体流の方向において周期的に変更される。好ましくは、生成物ストリームの一部は、生成物出口ポートの隣にあるポートにおいてこの装置に戻されて再循環される（富化ストリームとして公知）。このポートは、この装置を複数のゾーンに分ける。好ましくは、この装置は、３つのゾーン、すなわち、吸着ゾーン、富化ゾーン、および溶出ゾーンからなる。吸着ゾーンは、供給物入り口ポートとラフィネート出口ポートとの間にカラムを備える。溶出ゾーンは、溶出物入り口ポートと生成物出口ポートとの間のカラムからなる。富化物入り口ポートと供給物入り口ポートとの間のカラムは、富化ゾーンを構成する。４番目のゾーン（再ロードゾーンとしても知られる）は、溶媒の使用を最小限にするためにしばしば用いられる。数タイプのＳＭＢ装置が市販されている。これらの装置は、２つの分類、すなわち、移動ポートシステムおよび移動カラムシステムに分けられ得る（Ｂａｋｅｒ，Ｐ．Ｅ．およびＤｅｅｂｌｅ，Ｒ．Ｅ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ  ８：６７−６９（１９７５））。ＵＯＰ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｏｉｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．）により開発されたＳＯＲＢＥＸシステムは、移動ポートシステムの例である。移動カラムシステムの例は、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  Ｗａｔｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（ＩＷＴ）によって開発されたＡＤＳＥＰシステム（Ｍｏｒｇａｒｔ，Ｊ．Ｒ．およびＧｒａａｓｋａｍｐ，Ｊ．Ｍ．，「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｐａｐｅｒ  Ｎｏ．２３０，Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡ（１９８８年２月２２日））、およびＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ＡＳＴ）により開発されたＩＳＥＰシステム（Ｒｏｓｓｉｔｅｒ，Ｇ．Ｊ．，「ＩＳＥＰ，Ａ  Ｍｏｖｉｎｇ  Ｂｅｄ  Ｃｏｎｔｒａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ」，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ＨＰＬＣ，Ｓａｌｚｂｕｒｇ，Ａｕｓｔｒｉａ（１９９３年３月２８日））である。
【０００８】
本発明の好ましい実施形態は、醗酵ブロスから塩基性アミノ酸を分離するための方法を提供する。醗酵ブロスの例としては、リカー、テンサイ糖蜜、サトウキビ糖蜜に由来するブロス、またはデンプンもしくは大豆タンパク質の加水分解物が挙げられるが、これらに限定されない。任意の醗酵ブロスは、濾過されてもよいし、濾過されなくてもよい。
【０００９】
本発明は、低い架橋程度を有する強酸性陽イオン交換樹脂を用いて、醗酵ブロスから塩基性アミノ酸を分離するための方法に関する。好ましくは、本発明は、約８％未満で架橋された強酸性陽イオン交換樹脂に関する。より好ましくは、本発明の方法は、約２〜７％が架橋された強酸性陽イオン交換樹脂を用いる。最も好ましくは、本発明の方法は、約４〜６．５％、好ましくは、約４％または約６．５％が架橋された強酸性陽イオン交換樹脂を用いる。低い架橋程度を有する強酸性陽イオン交換樹脂の例としては、ＳＫ１０４（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）（４％架橋）およびＧＣ４８０（Ｆｉｎｅｘ）（６．５％架橋）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１０】
本発明は、模倣移動ベッド装置を用いて醗酵ブロスから塩基性アミノ酸を分離するための方法を提供し、この方法は、醗酵ブロスと、低い架橋程度を有する強酸性陽イオン交換樹脂とを接触させる工程、および溶出工程を包含する。好ましくは、本発明の溶出工程は、約１〜７％  ＮＨ４ＯＨ、より好ましくは、約２〜５．１％  ＮＨ４ＯＨ、最も好ましくは、約２．２％  ＮＨ４ＯＨを使用することを包含する。本発明の好ましい実施形態は、約３ベッド容積未満の溶出容積を含む溶出工程を提供する。より好ましくは、本発明の溶出工程は、約１〜２ベッド容積の溶出容積を含む。最も好ましくは、本発明の溶出工程は、約１．２ベッド容積を含む。模倣移動ベッド装置において低い架橋程度を有する強酸性陽イオン交換樹脂を用いる本発明の方法は、高架橋樹脂と比較して、塩基性アミノ酸の溶出時間を増大させない。
【００１１】
本発明の別の好ましい実施形態は、醗酵ブロスから塩基性アミノ酸を分離するための方法を提供する。本明細書中で用いられる場合、用語塩基性アミノ酸は、中性ｐＨで正荷電を有する任意のアミノ酸（天然、合成または改変）を意味するために用いられる。好ましくは、醗酵ブロスから分離された本発明の塩基性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンを含む群から選択される。より好ましくは、本発明は、醗酵ブロスからリジンを分離することを提供する。
【００１２】
ＳＭＢ技術と関連して利用される場合、低い架橋程度を有する強酸性陽イオン交換樹脂は、高架橋の従来の塩基性アミノ酸分離樹脂よりも、より高い動的能力、より速い交換反応速度、およびより高いピーク分離という有利な特性を有する。低い架橋程度を有する強酸性陽イオン交換樹脂の独特な特性の組み合わせ効果は、これらの樹脂により、醗酵ブロスからより効率的に塩基性アミノ酸（具体的には、リジン）が分離できるようになる。低い架橋程度を有する強酸性陽イオン交換樹脂を利用する模倣移動ベッド装置を用いた操作は、より高い架橋程度を有する樹脂を用いた操作と比較して、より高いスループットおよびより高い濃度比を生じる。さらに、低い架橋程度を有する強酸性陽イオン交換樹脂を利用する模倣移動ベッド装置を用いた操作は、明らかに、より高い架橋程度を有する樹脂を用いた実験と比較して、より高い収量およびより高い純度を伴う改善された分離を示す。本発明の好ましい実施形態は、約８５％以上純粋な塩基性アミノ酸を生じる、醗酵ブロスからリジンを分離するための方法を提供する。より好ましくは、この分離方法の塩基性アミノ酸の純度は、約８６〜１００％、最も好ましくは、約８５％、９３％または９５％である。本発明の好ましい実施形態は、約９４％以上の塩基性アミノ酸の生成物収量を生じる、醗酵ブロスからリジンを分離するための方法を提供する。より好ましくは、この塩基性アミノ酸生成物収量は、約９８％以上、最も好ましくは約９８％または１００％である。
【００１３】
低い架橋程度を有する強酸性陽イオン交換樹脂を用いる模倣移動ベッド装置を使用した実験は、明らかに、より高い架橋程度を有する樹脂を用いた実験と比較して、改善された濃度比を示す。本発明の好ましい実施形態は、約０．８〜２．０の塩基性アミノ酸の濃度比を生じる、醗酵ブロスから塩基性アミノ酸を分離するための方法を提供する。より好ましくは、塩基性アミノ酸の濃度比は、約１．０〜１．８である。本明細書中で用いられる場合、用語濃度比は、生成物の塩基性アミノ酸の濃度÷供給物中の塩基性アミノ酸の濃度と規定される。
【００１４】
以下の実施例は例示に過ぎず、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定するとは意図されない。種々の改変およびバリエーションが、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく本発明の方法において行われ得ることは当業者に明らかである。従って、本発明は、本発明の改変およびバリエーションが添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物内に入る限り、本発明の改変およびバリエーションを包含することが意図される。
【００１５】
本明細書中で参照される全ての特許および刊行物は、明らかに参考として援用される。
【実施例】
【００１６】
（実施例）
この研究において用いた樹脂を、架橋の程度に基づいて、２つの分類に分けた。第１の分類には、ＨＸ（高架橋）樹脂といわれる架橋８％以上のレベルを有する樹脂が含まれる。これらの樹脂は、従来のリジン分離プロセスにおいて伝統的に用いられる。ＨＸ樹脂の例は、Ｃ１００／１６３３（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ）およびＴ３１１（Ｔｈｅｒｍａｘ）である。第２の分類には、ＬＸ（低架橋）樹脂といわれる８％未満の架橋レベルを有する樹脂が含まれる。ＬＸ樹脂の例は、ＳＫ１０４（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）およびＧＣ４８０（Ｆｉｎｅｘ）である。
【００１７】
模倣移動ベッド操作。模倣移動ベッド（ＳＭＢ）実験を、３００ｍｌの強酸性陽イオン交換樹脂を充填した１２のカラムで行い、そして図１に示す構成で直列で配置した。水および１４．５％のＮＨ４ＯＨの流速は、それぞれ、６ｃｃ／分および３３ｃｃ／分であった。従って、ＮＨ４ＯＨ溶液の濃度は、吸着したリジンを溶出するために２．２％であった。３３．３ｍｌ／分の樹脂流速に等価な９分の工程を、全ての実験に用いた。この操作を周囲温度で行った。濾過した醗酵ブロス（約１２０ｇ／Ｌ  リジン−ＨＣｌを含む）を、供給物質として用いた。供給ストリームおよび生成物ストリームの流速を操作して、所望の分離を達成した。
【００１８】
結果。ＨＸおよびＬＸ樹脂を、処理能力の２つのレベルでＳＭＢシステムで評価した。高レベル（ＨＬ）の処理とは、８．０〜８．４ｇａｌ／日の供給をいう。低レベル（ＬＬ）の処理とは、５．４〜６．１ｇａｌ／日の供給をいう。表１は、ＳＭＢをＨＬレベルで操作した場合に醗酵ブロスからリジンを分離することにおけるＨＸおよびＬＸ樹脂の効果を比較する。
【００１９】
【表１】
0005530389.tif 000002
表Ｉは、ＬＸ樹脂がＨＸ樹脂より有意に高い収量を生じたことを示す。ＬＸ樹脂で達成された濃度比はまた、ＨＸ樹脂で達成された濃度比より高く、そしてＬＸ樹脂から得られた生成物中のリジン濃度は、供給ストリームより高かった。これは、引き続くエバポレーションの費用を低減させるので、重要な利益である。
【００２０】
ＳＭＢを、ＬＸ樹脂を用いてＬＬレベルで操作した場合、生成物ストリームの一部を再循環させ、１：２の容積比で新たな供給物と混合した。再循環速度は２．７〜３．０ｇａｌ／日であったのに対して、新たな供給物の速度は、５．４〜６．１ｇａｌ／日であった。従って、この構成を用いて、ＬＸおよびＨＸの両方の樹脂とともに、同量の新たな供給物をＳＭＢシステムに添加した。表ＩＩは、ＳＭＢをＬＬレベルで操作した場合に、醗酵ブロスからリジンを分離することにおけるＨＸおよびＬＸ樹脂の効率を比較する。
【００２１】
【表２】
0005530389.tif 000003
表ＩＩは、ＬＸ樹脂が、ＨＸ樹脂と比較して、より高収量およびより高純度のリジン生成物を生じたことを示す。最も重要なことには、ＬＸ樹脂で達成された濃度比の値は、ＨＸ樹脂で達成された値よりかなり高かった。伝統的なＳＭＢプロセスは、常に、生成物ストリームにおいてリジン濃度の減少を生じるが、低い架橋程度を有する樹脂を用いると、濃度比は生成物ストリーム中で増大する。以前のように、動的能力が高くなり、かつＬＸ樹脂の取り込み速度が速くなると、ＳＭＢシステムの吸着ゾーンにおけるより速い流体速度が可能になり、排出物ストリーム中のリジンの喪失が最小になる。また、ＬＸ樹脂の場合、新たな供給物に添加した比較的純粋な再循環ストリームは、混合した供給物の不純物レベル全体を低下させた。これらの因子全ては、リジン生成物のより高い収量および純度に関して、ともに醗酵ブロスからリジンを分離することにおける有意な改善に寄与した。
【図１】
0005530389.tif 000004