(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生細胞に形質移入するためのＲＣＡ産物の生産方法であって、
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）及びＲＮＡからなる群から選択される１種以上の環状核酸鋳型を、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマーであってその少なくとも一部分が上記環状核酸鋳型の一部分と相補的であるオリゴヌクレオチドプライマーと混合し、
上記オリゴヌクレオチドプライマーを上記環状核酸鋳型にアニールさせ、
アニールしたプライマーと鋳型に、１種以上のポリメラーゼと所定量のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を添加し、
上記環状核酸鋳型をＲＣＡで複製してＲＣＡ産物を得て、
未処理のＲＣＡ産物を形質移入媒体に直接移す
ことを含む方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが３’−５’エキソヌクレアーゼ活性又は鎖置換活性を示す、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、バクテリオファージφ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｓ  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ及びＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡポリメラーゼが３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示さない、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、真核生物ＤＮＡポリメラーゼα、及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性がなくなるように改質されたＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ｄＮＴＰの少なくとも一部分が、ホスホチオエート化ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、ｒＮＴＰ、５−メチルｄＣＴＰ、２−アミノ−ｄＡＴＰ、２−チオ−ｄＴＴＰ、４’−チオ−ｄＴＴＰ、４’−チオ−ｄＣＴＰ及びデアザ−ｄＧＴＰからなる群から選択される修飾ヌクレオチドである、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記環状核酸鋳型が、１以上のプロモーター配列と１以上のターゲット配列と１以上の終結配列とを含んでいる、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記プロモーター配列及び終結配列が真核生物の配列である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ターゲット配列が、宿主生物で免疫応答を誘発することのできる発現産物をコードする、請求項７又は請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記ターゲット配列が、タンパク質、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列、非コードＲＮＡ配列、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）配列、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列及びモノクローナル抗体（ｍＡｂ）鎖の少なくともいずれかをコードする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ターゲット配列が、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物又は非寄生生物のうちの１種以上に由来する、請求項９又は請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記環状ＤＮＡ鋳型が、各々宿主生物で免疫応答を誘発することのできる異なる発現産物をコードする２種以上のターゲット配列を含む、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
インビトロでの細胞の形質移入方法であって、
ホスホチオエート化ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、ｒＮＴＰ、５−メチルｄＣＴＰ、２−アミノ−ｄＡＴＰ、２−チオ−ｄＴＴＰ、４’−チオ−ｄＴＴＰ、４’−チオ−ｄＣＴＰ及びデアザ−ｄＧＴＰからなる群から選択される修飾ヌクレオチドを含む未処理ＲＣＡ産物を得る段階と、
未処理ＲＣＡ産物を１以上の細胞に形質移入する段階と
を含む方法。
【請求項１４】
生物への投与に適した１種以上の未処理ＲＣＡ産物を含むワクチンであって、前記ＲＣＡ産物が、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）及びＲＮＡからなる群から選択される１以上の核酸鋳型から少なくとも部分的に生産される、ワクチン。
【請求項１５】
前記未処理ＲＣＡ産物が、ホスホチオエート化ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、ｒＮＴＰ、５−メチルｄＣＴＰ、２−アミノ−ｄＡＴＰ、２−チオ−ｄＴＴＰ、４’−チオ−ｄＴＴＰ、４’−チオ−ｄＣＴＰ及びデアザ−ｄＧＴＰからなる群から選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項１４記載のワクチン。
【請求項１６】
前記未処理ＲＣＡ産物が、生物で免疫応答を誘発することのできる発現産物をコードする１種以上のターゲット配列を含む、請求項１４記載のワクチン。
【請求項１７】
生細胞の形質移入に適した１種以上の未処理ＲＣＡ産物を含む形質移入製品であって、前記ＲＣＡ産物が、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）及びＲＮＡからなる群から選択される１以上の核酸鋳型から少なくとも部分的に生産される、形質移入製品。
【請求項１８】
前記未処理ＲＣＡ産物が、ホスホチオエート化ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、ｒＮＴＰ、５−メチルｄＣＴＰ、２−アミノ−ｄＡＴＰ、２−チオ−ｄＴＴＰ、４’−チオ−ｄＴＴＰ、４’−チオ−ｄＣＴＰ及びデアザ−ｄＧＴＰからなる群から選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項１７記載の形質移入製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、ＤＮＡ複製並びに未処理（非切断、非環化及び非超らせん化）ＲＣＡ産物の用途に関する。かかる用途としては、例えば、ＤＮＡワクチンの生産、生物における免疫応答の誘発及び生細胞の形質移入における使用がある。
【背景技術】
【０００２】
ＲＣＡ（rolling circle amplification）は、以前から環状ＤＮＡ配列の複製に使用されている。ＲＣＡ産物は、ＤＮＡ配列決定、クローニング、ライブラリ構築、プローブ生成及び遺伝子スクリーニングに使用されている。最近、ネイキッドＤＮＡを細胞に投与してＲＮＡ又はタンパク質を産生させる細胞発現並びにネイキッドＤＮＡを生物に投与して免疫応答を生じさせるＤＮＡワクチン接種に、ＲＣＡ産物を使用することが提案されている。ＤＮＡワクチン接種の場合、通常のワクチン接種のように病原体自体（実際の感染の危険性を最小限にするため、一般には死菌又は不活性化された形態の病原体）を投与するのではなく、病原体のゲノムの一部分を投与して、免疫応答を十分に誘発できるようにその生物で複製及び発現せしめる。病原体のゲノムの一部分しか投与しないので、現実的な病原体感染の危険性はほとんど又は全くない。
【０００３】
従前、細胞の形質移入又はＤＮＡワクチンに用いられるＤＮＡは一般にプラスミドＤＮＡを使用して生産されている。しかし、プラスミドＤＮＡの使用には、労力と費用のかかるプラスミドの精製が必要とされ、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小分子のような外来細菌成分又は精製試薬（例えば臭化エチジウム、クロロホルム、フェノールなど）による汚染の危険もある。これらの汚染物質はいずれも望ましくない結果を招きかねない。
【０００４】
近年開発された方法では、かかるプラスミド精製の必要性及び汚染の危険性を回避するため、無細胞ＲＣＡ技術が用いられており、細胞系での発現又は治療用途（ＤＮＡワクチンなど）に適している。しかし、ＤＮＡレシピエントでの十分な取込み及び発現を担保するため、かかる技術では、従前、ＲＣＡ産物の大規模な増幅後処理が必要とされ、ＲＣＡ産物を短いユニット（モノマー、ダイマー、トリマーなど）へと壊してから、環化又は超らせん化する。かかる処理のため、発現又は治療用途での使用に適したＲＣＡ産物の生産にかなりの時間と費用が増す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のものを始めとする当技術分野の短所を解決することが求められている。特に、増幅後処理を必要としない生理的に有効なＲＣＡ産物、並びに該産物の生産及び使用方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の実施形態は、未処理（故意又は意図的に切断、環化及び／又は超らせん化していない）ＲＣＡ産物に関する方法、及びこれらの産物を含む組成物を提供する。本明細書で使用する用語「未処理」は、酵素活性を不可逆的に不活化する熱変性、又はＤＮＡ濃度を変化させ、ＤＮＡを異なる溶液中へ移動させ、ＲＣＡ産物からＲＣＡ反応成分を除去するための精製方法を含まない。
【０００７】
本発明の第１の態様は、生細胞に形質移入するためのＲＣＡ産物の生産方法であって、１種以上の環状核酸鋳型を、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマーであってその少なくとも一部分が上記環状核酸鋳型の一部分と相補的であるオリゴヌクレオチドプライマーと混合し、上記１種以上のオリゴヌクレオチドプライマーを上記１種以上の環状核酸鋳型にアニールさせ、アニールしたプライマーと鋳型に、１種以上のポリメラーゼと所定量のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を添加し、上記１種以上の環状核酸鋳型をＲＣＡで複製してＲＣＡ産物を得て、ＲＣＡ産物を形質移入媒体に直接移すことを含む方法を提供する。
【０００８】
本発明の第２の態様は、生物で免疫応答を誘発する方法であって、１以上のプロモーター配列と１以上のターゲット配列と１以上の終結配列とを含む環状核酸鋳型であって、上記１以上のターゲット配列が細菌、ウイルス、真菌、寄生生物又は非寄生生物のうちの１種以上に由来し、かつ生物で免疫応答を誘発することのできる発現産物をコードしている、環状核酸鋳型から、ＲＣＡ産物を調製する段階と、有効量の上記ＲＣＡ産物を未処理の形態で上記生物に投与する段階とを含む方法を提供する。
【０００９】
本発明の第３の態様は、細胞の形質移入方法であって、未処理ＲＣＡ産物を得て、その未処理ＲＣＡ産物を１以上の細胞に形質移入することを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明の第４の態様は、生物への投与に適した１種以上の未処理ＲＣＡ産物を含むＤＮＡワクチンを提供する。
【００１１】
本発明の第５の態様は、生細胞の形質移入に適した１種以上の未処理ＲＣＡ産物を含む形質移入製品を提供する。
【００１２】
本発明のこれらの例示的な態様は、本明細書に記載した課題及び本明細書には明示していないが当業者に自明なその他の課題を解決するように設計されている。
【００１３】
本発明の実施形態の上記その他の特徴については、図面と併せて、本発明の様々な態様に関する以下の詳細な説明を参照することによって理解を深めることができるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明での使用に適したＲＣＡ産物の例示的な生産方法の所定の段階の概略流れ図である。
【図２】未処理ＲＣＡ産物の導入効率をプラスミドＲＣＡ産物と対比したグラフである。
【図３】未処理ＲＣＡ産物の導入効率をプラスミドＲＣＡ産物と対比したグラフである。
【図４】未処理ＲＣＡ産物の導入効率をプラスミドＲＣＡ産物と対比したグラフである。
【図５】本発明の一実施形態に従って、未処理ＲＣＡ産物を調製し、生細胞の形質移入に使用する例示的な方法の流れ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
これらの図面は原寸に比例していない。これらの図面は、本発明の典型的な態様だけを示すことが意図されており、これらの図面を、本発明の範囲を限定するものと考えるべきではない。これらの図面では、図面間において同様の符号が同様の要素を表す。
【００１６】
前述の通り、本明細書に開示する主題は一般にＤＮＡの複製に関し、より具体的には、未処理（非切断、非環化及び非超らせん化）ＲＣＡ産物の生成及び使用に関する。本発明の一実施形態は、未処理ＲＣＡ産物の使用に関する。本発明の一態様では、かかる使用が、ＤＮＡワクチン中での未処理ＲＣＡ産物の使用を含む。他の態様では、かかる使用が、生物内において免疫反応を誘発し、及び／又は生細胞に未処理ＲＣＡ産物を形質移入する際の使用を含む。ＲＣＡが形質移入されたこれらの生細胞を、タンパク質発現、細胞療法或いは他の研究又は医療用途に使用することができる。タンパク質発現における例示的な使用には、（例えば細胞療法中に）細胞を追跡する際に有用なある信号の発現（例えば緑色蛍光タンパク質の発現）が挙げられる。これらの例がかかる使用の用途を限定することは意図されておらず、これらの例は単に例示だけが目的である。生細胞中で使用するときには、これらの未処理ＲＣＡ産物を多くの異なる用途に対して適合させることができ、それらの用途は全て本発明の範囲に含まれる。
【００１７】
図１は、本発明での使用に適したＲＣＡ産物の例示的な生産方法の所定の段階の概略流れ図を示す。（Ａ）では、プロモーター配列１０２、ターゲット配列１０４及び終結配列１０６を含む環状ＤＮＡ鋳型１００（一本鎖又は二本鎖とすることができる）を、１以上のオリゴヌクレオチドプライマー２００と混合する。（ここでは、ＤＮＡ鋳型を使用するものとして説明するが、好適な方法は同様にＲＮＡ鋳型を使用することもできる。）ターゲット配列１０４は、複製したい任意のＤＮＡ配列とすることができる。ターゲット配列１０４は一般に、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物又は非寄生生物に由来し、ある生物が細菌、ウイルス、真菌、寄生生物又は非寄生生物にさらされた場合にその生物で免疫応答を誘発することのできる発現産物（例えば表面抗原などのタンパク質）をコードする。一実施形態では、ターゲット配列１０４が、タンパク質、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列、非コードＲＮＡ配列、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）配列、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列又はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）鎖（重鎖又は軽鎖）をコードする。
【００１８】
本発明の一実施形態では、環状ＤＮＡ鋳型１００が、複数のプロモーター配列、ターゲット配列及び終結配列を含むことができる。そのような場合には、同じ細菌、ウイルスなどの異なる株に対するターゲット配列を宿主細胞又は宿主生物に移入することができる。或いは、全く関係のないターゲット配列を、同じ未処理ＲＣＡ産物に移すこともできる。かかる実施形態は、複数の株及び／又は病気に対するワクチン接種を単一のワクチンで可能にするＤＮＡワクチン中で未処理ＲＣＡ産物を使用する場合に特に有用であることがある。
【００１９】
本発明の一実施形態では、環状ＤＮＡ鋳型が、ターゲット配列に加えて、宿主細菌細胞内での複製及び選択に必要な配列を含む発現プラスミドである。この配列は、ＲＣＡによる調製された又は大量のＤＮＡに対する鋳型として後で使用することができる組換えＤＮＡ環状構成体の初期の生成を可能にする点で有用でありえる。
【００２０】
オリゴヌクレオチドプライマー２００の配列の少なくとも一部分は、環状ＤＮＡ鋳型１００の配列の一部分に対して相補的である。一実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマー配列の相補部分がプライマーの３’末端に位置し、オリゴヌクレオチドプライマー配列の非相補部分が５’末端に位置する。後でより詳細に説明するが、かかるプライマーは、ＲＣＡ中のプライマーの置換（displacement）を促進することがある。ＲＣＡ反応にはプライマーが必要であること、及びＲＣＡ反応は、加えられたオリゴヌクレオチドプライマー又はＲＣＡ反応において合成されたプライマーによって開始させることができることが理解される。かかる合成プライマーは、ＲＣＡ反応においてプライマーゼを使用することによって生成することができる。
【００２１】
（Ｂ）には、環状ＤＮＡ鋳型１００にアニールした単一のオリゴヌクレオチドプライマー２００が示されている。かかるアニーリングは、各プライマーが環状ＤＮＡ鋳型１００の単一の部分だけに相補的な同じ配列を有する単一のプライマー「種」を使用する場合に典型的である。或いは、（Ｃ）に示すように、環状ＤＮＡ鋳型１００の２以上の部分に相補的な配列を含む複数のプライマー「種」を使用することもできる。（Ｃ）では、それぞれが環状ＤＮＡ鋳型１００の異なる部分に相補的な配列を有する４つのプライマー２００が使用されている。複数のプライマー「種」を使用する場合には、かかるプライマーを、環状ＤＮＡ鋳型１００の一部分に相補的な配列を含むように特異的に設計することができ、又は、かかるプライマーがランダムなＤＮＡ配列を含むこともできる。マルチプライムド（multi-primed）ＲＣＡは、Ｌａｓｋｅｎ他の米国特許第６３２３００９号に記載されている。本発明の態様の実施には、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から販売されているＴｅｍｐｌｉＰｈｉ（商標）  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔなどの市販の増幅キットを使用することもできる。
【００２２】
いずれにせよ、環状ＤＮＡ鋳型１００の複製は、ＤＮＡポリメラーゼが、環状ＤＮＡ鋳型１００から新たに複製された一本鎖ＤＮＡを置換することによって進行する。その結果は、環状ＤＮＡ鋳型１００の配列の直鎖状コンカテマーである。プライマーは、置換された一本鎖ＤＮＡに結合し、二本鎖ＲＣＡ産物を完成させる。
【００２３】
ＲＣＡでは、多数のポリメラーゼを使用することができる。より一般的に使用されているＤＮＡポリメラーゼには、例えばバクテリオファージφ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｓ  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２  ＤＮＡポリメラーゼ、細菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｐｏｌ  Ｉ）、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、細菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、及びＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼＩなど、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示すＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。これらの中で、本発明の一実施形態では、バクテリオファージφ２９  ＤＮＡポリメラーゼが特に好ましい。例えばＴａｑポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、真核生物ＤＮＡポリメラーゼα、及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性がなくなるように改質されたＤＮＡポリメラーゼを含む、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示さないポリメラーゼを使用することもできる。
【００２４】
（Ｄ）には、（Ｂ）と同じように単一のプライマー「種」のアニーリングによって得ることができる二本鎖直鎖状ＲＣＡ産物３００が示されている。直鎖状ＲＣＡ産物３００は、プライマー配列２００と、環状ＤＮＡ鋳型１００の配列の直鎖状コピーである複数のモノマー（すなわちプロモーター配列３０２、ターゲット配列３０４及び終結配列３０６の反復単位）とを含む。したがって、直鎖状ＲＣＡ産物３００は、ｍＲＮＡに転写され、適宜タンパク質に翻訳された後でターゲット配列３０４の複数のコピーを発現させるための鋳型の役目を果たすことができる。
【００２５】
（Ｅ）の枝分れＲＣＡ産物４００は、（Ｃ）に示すマルチプライムドＲＣＡの結果である。１次枝４１０は、プライマー配列２００と、プロモーター配列３０２、ターゲット配列３０４及び終結配列３０６の複数の反復モノマーとを含む直鎖状ＲＣＡ産物３００と同種のものである。２次枝４２０は、環状ＤＮＡ鋳型１００の複製中に、新たに複製された一本鎖１次枝４１０にプライマーがアニールした結果である。比較的に単純な枝分れ構造として示されているが、マルチプライムドＲＣＡによって生成されるＲＣＡ産物は実際には、（Ｅ）に示すものよりもはるかに複雑である可能性が高く、枝分れはｄＮＴＰが使い尽くされるまで続くことを理解すべきである。枝分れＲＣＡ産物４００を示したのは単に、例示のため及び直鎖状ＲＣＡ産物と対比させるためである。
【００２６】
ＲＣＡ産物を処理して、導入効率及び／又は形質移入したターゲット配列の宿主生物における発現を向上させることができる。一般に、かかる処理は、ＲＣＡ産物をそのモノマーサブユニットに分割し、続いてそのサブユニットを環化又は超らせん化することを含む。次いで、適切な形質移入媒体と混合して接種することにより、この処理されたＲＣＡ産物を宿主生物に投与することができる。
【００２７】
未処理ＲＣＡ産物の形質移入は、細胞への形質移入に最も一般的に使用されているＤＮＡの形態である超らせんプラスミドＤＮＡの導入効率に匹敵する導入効率を与える。したがって、本明細書で使用するとき、用語「未処理」は、故意又は意図的に切断、環化及び／又は超らせん化していないことを意味する。
【００２８】
例えば、図２は、初期超らせんプラスミドＤＮＡ（ｐＨｙｇ−ＥＧＦＰ）１．０ナノグラム及び１．０ピコグラムを増幅してＲＣＡ産物とした等量のＤＮＡ（それぞれ１００００倍及び１０００００００倍増幅）を使用した導入効率、並びに等量の超らせんプラスミド（ｐＨｙｇ−ＥＧＦＰ）の導入効率を示す。ＲＣＡは、Ｗ＋Ｗ＋Ｎ*Ｎ*Ｓプライマーを使用して３０℃で４時間実施した（＋はロックド核酸（ＬＮＡ：locked nucleic acid）主鎖を示し、*は、ホスホチオエート主鎖を示す）。次いで、プラスミド又は未処理ＲＣＡ産物１００ｎｇを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）  ２０００を使用した３００００個のＨＥＫ２９３細胞のリバーストランスフェクションに使用した。形質移入から２日後にフローサイトメトリーによって細胞を分析し、ＧＦＰ陽性細胞の割合を求めた。
【００２９】
１００００倍に増幅したＲＣＡ産物の効率（「ｎｇ未処理」、約５４％）と１０００００００倍に増幅したＲＣＡ産物の効率（「ｐｇ未処理」、約５２％）はいずれも超らせんプラスミドの効率（「プラスミド」、約５３％）と同等である。８つの独立した試験において一致した結果が得られた。「対照」と記された結果は、非形質移入細胞を示す。
【００３０】
図３は、増幅すべき環状プラスミドを含むｐＨｙｇ−ＥＧＦＰ形質転換細菌コロニーから直接に増幅したＤＮＡから調製した未処理ＲＣＡ産物、精製した環状ＤＮＡ鋳型から調製した未処理ＲＣＡ産物、及び超らせんプラスミドＤＮＡの導入効率を示す。形質転換細菌コロニーは、ルリア培地１０μｌに再懸濁させた。次いで、ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（商標）試料緩衝液９．５μｌに０．５μｌを添加し、９５℃に２分間加熱し、氷上で４℃に冷却した。２×反応緩衝液９μｌ及びｐｈｉ２９酵素混合物１μｌを添加し、３０℃で９０分間インキュベートし、その後、６５℃で１０分間熱不活化した。次いで、前述と同様に、プラスミド又は未処理ＲＣＡ  ＤＮＡ  １００ｎｇを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）  ２０００を使用した３００００個のＨＥＫ２９３細胞のリバーストランスフェクションに使用し、２日後、ＧＦＰ陽性細胞の割合をフローサイトメトリーによって求めた。
【００３１】
未処理ＲＣＡ産物及び超らせんプラスミドＲＣＡ産物は、同様の導入効率を与えた（それぞれ約７０％、約７２％）。形質移入前の全てのプラスミドＤＮＡ精製段階を排除することができる細菌コロニーＤＮＡから調製した未処理ＲＣＡ産物でさえも、約４８％の導入効率を与えた。
【００３２】
図４は、一般的な２つの形質移入技術（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）を使用したリポフェクション及びエレクトロポレーション）を使用した未処理ＲＣＡ産物及びプラスミドＤＮＡ産物の導入効率を示す。リポフェクションは前述の通りに実施した。エレクトロポレーションは、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）エレクトロポレーター（緩衝液Ｖ、プログラムＱ０１）を使用して実施し、未処理ＲＣＡ  ＤＮＡ又は超らせんプラスミド３００ｎｇを１０6個の細胞内へエレクトロポレーションにより導入した。ＲＣＡ  ＤＮＡは、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ（商標）反応緩衝液に入れてエレクトロポレーションに付し、低導電率緩衝液への緩衝液の交換は実施しなかった。形質移入から２日後、ＧＦＰ陽性細胞の割合をフローサイトメトリーによって求めた。両技術とも、非常によく似た効率を与え、未処理ＲＣＡ産物とプラスミドＤＮＡ産物の両方で、リポフェクションの方がより良好な結果を与えた。
【００３３】
図５は、未処理ＲＣＡ  ＤＮＡ産物を調製し、使用する、本発明の一実施形態に基づく例示的な方法の流れ図を示す。核酸鋳型（ここではＤＮＡ）がまだ環化されていない場合には、Ａで、核酸鋳型を環化する。ＤＮＡ鋳型は、標準分子生物学技術によって作製したプラスミド構成体とすることができ、合成によって作製し、或いは、環状構成体を形成するために連結され、又は一緒に環化された精製成分から作製することができる。Ｂで、環状ＤＮＡ鋳型に、１種以上のプライマー種、１種以上のポリメラーゼ及びデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を加える。ＤＮＡ鋳型、プライマー、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰが予め混合された形態で提供される場合には、かかる追加が不要なことがある。
【００３４】
一実施形態では、修飾ヌクレオチド（例えば、ヌクレオチドの塩基、リン酸又は糖のうちの１つ以上が修飾されている非天然ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体）を使用することができ、それらの修飾ヌクレオチドの一部が、結果として生じるＤＮＡ又はＲＮＡに、ヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を与えるものであってもよい。かかる非天然ヌクレオチドには例えば、ホスホチオエート化ヌクレオチド、ＬＮＡ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、ｒＮＴＰ、５−メチルｄＣＴＰ、２−アミノ−ｄＡＴＰ、２−チオ−ｄＴＴＰ、４’−チオ−ｄＴＴＰ、４’−チオ−ｄＣＴＰ及びデアザ−ｄＧＴＰなどが挙げられる。ホスホチオエート化ヌクレオチドが特に好ましい。
【００３５】
ＲＣＡ産物自体の処理は一般に、ＲＣＡ産物を使用する前にヌクレアーゼを使用してＲＣＡ産物をモノマーサブユニットに分割することを利用するため、知られているＲＣＡ法では、オリゴヌクレオチドプライマーだけが、かかる修飾ヌクレオチドを含むことがある。しかし、ＲＣＡ産物を未処理の形態で使用するときには、かかる制限はない。したがって、ヌクレアーゼ抵抗性ＲＣＡ産物の生成は、産物の全体的な安定性及び有効性を向上させ、このことは、未処理ＲＣＡ産物をＤＮＡワクチン中で使用する場合に特に重要なことがある。
【００３６】
修飾ヌクレオチドを使用して、非修飾ｄＮＴＰから生成したＲＣＡ産物に比べて、ＲＣＡ産物の特性を変化させることもできる。ある種のヌクレオチド類似体は、インビボでより良好な結果を与えることがある。例えば、修飾ヌクレオチドは、インビボでよく転写されるが、ＤＮＡ組換え系が鋳型として使用しないＲＣＡ産物を形成することがある。このことは、細胞ゲノム内へのＲＣＡ産物の再組換えを防ぐのに有益であることがあり、これによって、ＲＣＡ産物を一過性の細胞外要素として保持することができる。
【００３７】
Ｃで、ＲＣＡによって環状核酸鋳型を複製して、未処理ＲＣＡ産物４００を産生する。Ｄで、未処理ＲＣＡ産物４００を、適切な形質移入媒体に直接に（故意又は意図的な切断、環化及び／又は超らせん化のようなＲＣＡ産物の一般的処理を行わずに）移す。理解されるように、選択する形質移入法及び形質移入すべき細胞によって、使用する形質移入媒体は異なる。例えば、形質移入媒体を、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨｅＢＳ）などの緩衝液とすることができる。形質移入媒体を、ＤＥＡＥデキストラン、ポリエチレンイミンなどの陽イオンポリマーとすることもできる。或いは、形質移入媒体を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、ＨｉｌｙＭａｘ、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）、ｊｅｔＰＥＩ（商標）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）など、多数の市販産物のうちの１つ以上とすることもできる。未処理ＲＣＡ産物をＤＮＡワクチンとして使用する場合には、未処理ＲＣＡ産物を移す先の媒体が生理的に許容されるものでなければならないが、ワクチンを接種した生物の免疫応答を増強するために１種以上のアジュバントを含むこともできる。
【００３８】
ウイルスを使用して、未処理ＲＣＡ産物を、宿主細胞又は宿主生物に送達することもできる。したがって、本明細書で使用するとき、用語「形質移入」は、未処理ＲＣＡ産物を送達する際にウイルスを使用することを含む。
【００３９】
最後に、Ｅで、１以上の細胞に未処理ＲＣＡ産物を形質移入する。ＤＮＡワクチンの場合、この形質移入が、未処理ＲＣＡ産物の筋肉内注射を含むことがある。追加の方法を使用して、取込み効率を増大させることができる。かかる方法には例えば、皮膚アブレージョン（dermal abrasion）、エレクトロポレーション、超音波及び粒子媒介プロジェクティル形質移入（particle-mediated projectile transfection）が挙げられる。組織培養細胞の形質移入の場合には、これが、懸濁液中の組織培養細胞又はマトリックスに付着した組織培養細胞を含むことがある。
【実施例】
【００４０】
以下の実施例では、未処理ＲＣＡ産物の好適な生産及び使用方法を例示する。かかる方法は、本発明の様々な態様及び実施形態で使用するのに適した唯一の方法ではなく、かかる方法を本発明の範囲を限定するものとみなすべきではない。
【００４１】
実施例１  −  未処理ＲＣＡ  ＤＮＡ産物の生成
濃度１００ｎｇ／μｌ（ＴＥ緩衝液）の超らせんＤＮＡプラスミドｐＨｙｇＧＦＰを標準法によって調製する。２×Ｒ緩衝液（Ｔｒｉｓ：ＨＣｌ  １００ｍＭ、ｐＨ＝８．２；ＫＣｌ  １５０ｍＭ；ＭｇＣｌ2  ２０ｍＭ、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０  ０．０２％、ＤＴＴ  ２ｍＭ、ｄＮＴＰ  ２  ｍＭ）２．５ｍｌ、Ｐ緩衝液（Ｔｒｉｓ：ＨＣｌ  １０ｍＭ、ｐＨ＝８．２；ＥＤＴＡ  ０．５ｍＭ；ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０  ０．０１％、２つのホスホロチオエート結合を３’末端に含むランダムヘキサマー０．０８ｍＭ）２．５ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ  φ２９  ＤＮＡポリメラーゼ０．１ｍｌ、及び超らせんｐＨｙｇＧＦＰプラスミド２５０ｎｇを使用して、ＲＣＡ反応を組み立てる。このＲＣＡ反応混合物を３０℃で１６時間インキュベートして等温ＤＮＡ増幅を引き起こし、次いで６５℃で２０分間加熱して、ＤＮＡポリメラーゼを不活化する。
【００４２】
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）染料結合をメーカーの説明書に従って使用して、この反応を評価することができる。一般的な濃度は約０．６ｍｇ／ｍｌであり、これは１００００倍超の増大（すなわち２５０ｎｇから３ｍｇ）を表す。
【００４３】
実施例２  −  未処理ＲＣＡ  ＤＮＡ産物の生成
実施例１と同様の未処理ＲＣＡ  ＤＮＡ産物を生成する代替法を使用することができる。ここでは、反応混合物が、
２×Ｒ緩衝液２．５ｍｌ；
チオエート化ランダムヘキサマー２．５ｍｌ（ＴＥ緩衝液中）（最終濃度は４０μＭプライマーである）；
１００ｍＭ  ｄＮＴＰ  ２０μｌ；
１Ｍ  ＤＴＴ  ５μｌ；
１Ｍ  ＭｇＣｌ2  ５０μｌ；
１ｍｇ／ｍｌ  φ２９ＤＮＡポリメラーゼ  １００μｌ；及び
ｐＨｙｇＧＦＰ超らせんプラスミド  ２５０ｎｇ
を含む。
【００４４】
この反応を３０℃で１７時間インキュベートし、次いで６５℃で２０分間加熱して、酵素を不活化する。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）染料結合をメーカーの説明書に従って使用して、この反応を評価することができる。
【００４５】
実施例３  −  超らせんプラスミドＤＮＡの調製
実施例１又は２の超らせんプラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ社から販売されているＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｇｉｇａ  Ｋｉｔを使用して以下のように調製することができる。
【００４６】
ｐＨｙｇＧＦＰプラスミドを担持した形質変換ＤＨ５α細菌を、３７℃の発酵槽内のＴＢ培地中で一晩増殖させる。６０００×ｇ、１５分、４℃の遠心分離法によって細菌細胞を採集する。この細菌ペレットを、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｐ１  １２５ｍｌに再懸濁させる。Ｂｕｆｆｅｒ  Ｐ２  １２５ｍｌを添加し、勢いよく４〜６回反転させることによって十分に混合し、室温で５分間インキュベートする。冷蔵Ｂｕｆｆｅｒ  Ｐ３  １２５ｍｌを添加し、勢いよく４〜６回反転させることによって十分に混合する。白い綿毛状の物質が形成され、溶解物の粘性がなくなるまで混合を続ける。溶解物を、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｇｉｇａカートリッジに注ぎ入れ、室温で１０分間インキュベートする。
【００４７】
真空源を作動させ、全ての液体を吸引した後、真空源を停止させる。ＱＩＡｆｉｌｔｅｒカートリッジは取り付けられたままにしておく。ＱＩＡｆｉｌｔｅｒカートリッジにＢｕｆｆｅｒ  ＦＷＢ２  ５０ｍｌを添加し、無菌へらを使用して沈殿物を静かに撹拌する。液体が完全に吸引されるまで、真空源を作動させる。
【００４８】
濾過された溶解物に、Ｂｕｆｆｅｒ  ＥＲ  ３０ｍｌを添加し、ボトルを約１０回反転させることによって混合し、氷上で３０分間インキュベートする。Ｂｕｆｆｅｒ  ＱＢＴ  ７５ｍｌを添加し、重力流によってカラムを空にすることによって、ＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ  １００００を平衡状態にする。濾過された溶解物をＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐに加え、重力流によってこの樹脂の中へ入るようにする。Ｂｕｆｆｅｒ  ＱＣを合計６００ｍｌ使用してＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐを洗浄する。
【００４９】
Ｂｕｆｆｅｒ  ＱＮ  １００ｍｌを用いてＤＮＡを溶出させ、室温のイソプロパノール７０ｍｌ（０．７容量）を添加して沈殿させる。この溶液を混合し、直ぐに≧１５０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離する。上清を慎重にデカントし、エンドトキシンを含まない室温の７０％エタノール（キットと一緒に供給されるエンドトキシンを含まない水に９６〜１００％エタノール４０ｍｌを加えたもの）１０ｍｌを用いてＤＮＡペレットを洗浄し、≧１５０００×ｇで、１０分間遠心分離する。ペレットを撹乱しないように上清を慎重にデカントし、ペレットを１０〜２０分風乾する。次いで、エンドトキシンを含まない適量のＢｕｆｆｅｒ  ＴＥにＤＮＡを再溶解する。
【００５０】
ＵＶ吸収及びＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）をメーカーの説明書に従って使用して、この反応生成物を定量することができる。
【００５１】
実施例４  −  未処理ＲＣＡ  ＤＮＡ産物のポリエチレンイミン形質移入
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、プラスミドＤＮＡを濃縮して、細胞の陰イオン性表面と相互作用する正荷電粒子にする。エンドサイトーシスによって細胞に入った後、このポリマーの高い電荷密度はリソソームを破裂させ、細胞質ゾル内へＤＮＡを放出し、核内への移動を可能にする。
【００５２】
実施例１に従って調製した未処理ＲＣＡ産物などの未処理ＲＣＡ産物を、増幅後又はＤＮＡの沈殿及び適切な緩衝液での再懸濁の後で直接に使用することができる。
【００５３】
形質移入すべき細胞（例えばＨＥＫ２９３）を、標準プロトコルに従って、最高約３．５×１０6細胞／ｍｌ、好ましくは約５×１０5細胞／ｍｌから約１×１０6細胞／ｍｌの濃度に増殖させる。好ましくは、増殖期中に細胞に形質移入する。
【００５４】
細胞は、ターゲット体積の半分の体積に、約１×１０6細胞／ｍｌから約２×１０6細胞／ｍｌ濃度で接種する。後述するようにして完全な体積にすると、密度は、約０．５×１０6細胞／ｍｌから約１×１０6細胞／ｍｌになる。
【００５５】
培養１ｍｌ当たりＤＮＡ  ２．５μｇを使用して、ＤＮＡ複合体を調製する。比１：３（ｗ／ｗ）のＤＮＡとＰＥＩを１５０ｍＭ  ＮａＣｌに混合して、培養体積の約５％に等しい体積になるようにする。細胞培養混合物１００ｍｌに対する一般的なＤＮＡ複合体は例えば、０．５ｍｇ／ｍｌ（ＴＥ）  ＤＮＡ  ０．５ｍｌ、４５０ｍＭ（ＴＥ）  ＮａＣｌ  １．１７ｍｌ及びＰＥＩ  ３．３３ｍｌである。この複合体を１０分間インキュベートし、接種から約１時間後、細胞培養に加える。混合した培養を４時間インキュベートし、次いで、等量の培地を加えることによって完全な体積にする。
【００５６】
形質移入から４〜７日後、培養又は培地を採集する。実施例１の場合のように、未処理ＲＣＡ  ＤＮＡ産物がＧＦＰ遺伝子を含む場合には、細胞をリアルタイムで監視してＧＦＰの産生を評価することができる。或いは、採集した培地からタンパク質を精製することもできる。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析を実行することもできる。
【００５７】
本明細書では、本発明を開示するとともに、開示した組成物の生産・使用及び開示した方法の実施を始め、本発明を当業者が実施できるようにするため、例を用いて説明してきた。本発明の特許性を有する範囲は、特許請求の範囲によって規定され、当業者に自明な他の例も包含する。かかる他の例は、特許請求の範囲の文言上の差のない構成要素を有しているか、或いは特許請求の範囲の文言と実質的な差のない均等な構成要素を有していれば、特許請求の範囲に記載された技術的範囲に属する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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