(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タキソール、７-カルボニトリルカンプトテシン（CPT83）または７-ブトキシイミノメチルカンプトテシン（CPT184）の輸送のための、パルミトイルＬ-カルニチンクロライドウンデシルエステル（ST983）を含むリポソーム。
【請求項２】
リポソームがさらにヘルパー脂質を含む、請求項１記載のリポソーム。
【請求項３】
ヘルパー脂質が、コレステロール、１-パルミトイル-２-オレオイルホスファチジルコリンおよびジオレイルホスファチジルコリンから成る群から選択される、請求項２記載のリポソーム。
【請求項４】
タキソール、７-カルボニトリルカンプトテシン（CPT83）または７-ブトキシイミノメチルカンプトテシン（CPT184）の輸送のための、請求項１〜３いずれか一項記載のリポソームを含む組成物。
【請求項５】
経口、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮にて、または鼻腔または口内スプレーの形態で投与することができる、請求項４記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に開示する発明は、一群の新規なＬ-カルニチンおよびアシルＬ-カルニチンのエステルおよび、薬理活性化合物の細胞内送達に適し、その膜貫通輸送を促進するのに、または特定の細胞膜部位（レセプター）との相互作用を促進するのに適したカチオン脂質としての、その使用に関する。
本明細書に記載する発明はさらに、前記の新規化合物と同じ目的に有用なＬ-カルニチンとアシルＬ-カルニチンの公知エステルにも関する。
本明細書中、「細胞内送達」の用語が示すものは、治療活性（遺伝子送達）を有する天然起源の、または改変されたポリヌクレオチドまたはプラスミドによる細胞の感染または、薬物または免疫原性ペプチドの細胞内への導入である。
【背景技術】
【０００２】
例えばポリペプチドおよびタンパク質または薬物のような薬理活性物質の多くは、亜細胞または分子レベルで細胞機能に影響を与えることによりその効力を発揮させるために、細胞へ貫通させる必要がある。これらの分子に対して、細胞膜は選択的不浸透性のバリアを構成する。細胞膜は実際、保護的機能を果たし、毒性がある可能性のある物質の侵入を妨げるが、治療活性を有する化合物の通過も妨げる。細胞膜の複合体組成物には、リン脂質、糖脂質およびタンパク質が含まれ、その機能はＣａ++および他のイオン、ＡＴＰ、微細繊維、微小管、酵素および、Ｃａ++に結合するタンパク質のような細胞質成分により影響を受ける。細胞の構造および細胞質成分と、外からのシグナルに対する応答との間の相互作用が、種々の異なる細胞型により、およびそれらの間で示されている選択性の原因である。膜のバリア作用は、複合体中の物質を、天然由来の膜脂質の脂質製剤と組み合わせることにより克服することができる。これらの脂質は膜と融合することができ、かつ、それらと結合した物質を細胞中に放出することができる。脂質複合体は膜との融合により細胞内輸送を促進することができるだけでなく、膜と細胞中に貫通させなければならない分子の間の電荷の反発を減じることもできる。両親媒性脂質、例えば膜リン脂質は、水系中で脂質ビヒクルまたはリポソームを形成する。
【０００３】
リポソームは、水性容積物を、脂質分子（たいていリン脂質）から成る１またはそれ以上の膜で完全に封入する小胞である。親水性頭部と一対の炭素鎖（疎水性尾部）から成るリン脂質は、生物膜の主要成分である。水溶液中で疎水性尾部が自己会合して水を排除し、一方、親水性頭部は媒質と相互作用して様々な直径を有する小胞群を形成する。脂質は概して、双イオン性、中性またはアニオン性である。これらの小胞は、薬物、小分子、タンパク質、ヌクレオチドおよびプラスミドのキャリアとして用いることができる。
【０００４】
近年、合成脂質から調製される、陽性に荷電した小胞の一クラスであるカチオンリポソームが、遺伝物質の細胞内への輸送にとりわけ用いられている。ＤＮＡの陰性電荷がカチオン脂質の陽性電荷と相互作用して、安定なＤＮＡ-リポソーム複合体を形成することができる。この技術は単純で融通がきくため、リポソームは遺伝子治療において、ヒトの患者に遺伝子を送達するための重要なビヒクルとなっている。現在のところ、遺伝子治療に用いられ、ＮＩＨ・Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ・Ａｄｖｉｓｏｒｙ・Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより認可されているベクターのほとんどはウイルスおよび合成系に含まれる。
【０００５】
ウイルスの感染には、特定の細胞を攻撃し、ＤＮＡを核に輸送することを可能とするための一連の複雑なメカニズムが関与している。遺伝子治療のためのウイルスベクターの使用に関する原理は、ウイルス遺伝子を治療機能をコードする遺伝子に、ウイルス粒子を細胞に感染させる能力を阻害することなく置きかえることができることに基づく。ウイルス治療の限界は、免疫原性、細胞変性性および組換え原性(recombinogenic)の可能性があるウイルス分子を用いて行わなければならないところにある。
【０００６】
遺伝子治療にカチオン脂質を使用することには大きな期待が持たれている。これらのベクターは、生物起源のものと比較して、より安全で毒性が少なく、大きいサイズの遺伝子を導入することができるために、大きな可能性を有する。しかし、生物タイプのベクターと比較して、それらは細胞内遺伝子転写収率が低い。しかし、そのような感染系の使用が研究の初期段階にあることは心にとどめておくべきである。カチオン脂質は、ＤＮＡ-脂質複合体の形成、細胞-複合体相互作用、膜との融合、細胞内へのＤＮＡの放出および転写に非常に重要な役割を果たす。
【０００７】
カチオンリポソームのインビボ適用に関して、重要な例がある。遺伝子治療に関する最初の臨床試験は、ヒトリポソーム複合ＨＬＡ-Ｂ７遺伝子を含む発現ベクターをメラノーマの治療に導入することにより行われた。他の重要な適用は、リポソーム複合発現ベクターＳＶ４０Ｃ-ＦＴＲの、肺経路による、または鼻腔内スプレーとしての投与を用いる肺嚢胞性繊維症の治療に関する。遺伝子治療におけるリポソームの使用に関連する他の臨床試験が、現在進行中である。
【０００８】
４つの構成成分：陽性に荷電したカチオン頭部、スペーサー、アンカー脂質およびリンカー結合が、カチオン脂質の構造中に一般に認められる。
カチオン頭部によって、カチオンリポソームとＤＮＡ、ＤＮＡ-リポソーム複合体と細胞膜および他の細胞成分との間の相互作用が生じる。これは、（電荷数に依存して）様々に置換することができるモノ-またはポリカチオン基から成る。
スペーサーは、カチオン頭部を疎水性尾部から分け、ＤＮＡリン脂質のカチオン頭部と陰性電荷間の最適の接触を確保することに関与する分子の部分である。
【０００９】
アンカー脂質は、該分子の非極性炭化水素部分であり、二重脂質層の物理特性、例えばその硬さおよび膜脂質との交換比等を決定する。
「リンカー結合」が示すものは、炭化水素鎖と分子の残りの部分の間の結合である。この結合によりカチオン脂質の化学的安定性および生物分解性が決定される。
近年、脂質の使用が化粧品分野で確実に増加してきている。この分野でリポソームが成功を収めたのは、これらの化合物が皮膚で非常に良好な耐性を示すという事実のためである。それらは活性成分のためのビヒクルとして、および、活性成分の吸収を促す化合物としての両方として用いられている。
【００１０】
リポソームの調製および使用に関する数多くの化学文献および特許文献があるが、遺伝子送達に有用なカルニチン誘導体の使用を開示する例はほとんどなく、薬物送達に関しては、本明細書に開示する発明によるものとほんの少し類似する化合物の調製に関する公知技術を開示する有用な文献はない。
特許出願ＥＰ０２７９８８７は、カルニチン、即ち、ホスファチジルカルニチンの、他のリン脂質および脂質（コレステロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン）と組み合わせた、リポソームの調製のための使用を開示する。
【００１１】
リポソームの調製に関して提供される例では、抗高血圧、抗アンギナおよび抗不整脈剤として活性であることが知られている薬物、プロプラノルオールと組み合わせたホスファチジルコリンのリポソームが製造されている。ここでは、カルニチン誘導体はカルニチンの顕著な心筋親和性のために用いられている。この親和性により、リポソームが所望の標的部位に達成する前に肝臓で代謝されるのが回避される。
ホスファチジルカルニチンの存在により、リポソームが腸のリパーゼに耐性となるため、リポソームを経口投与することも可能となる。
【００１２】
J. Med. Chem. 1998 Jun 18, 41(13): 2207-15では、遺伝子送達に有用な多くのＬ-カルニチンのエステルが開示されているが、それらは薬物送達に有用な薬剤としては開示あるいは推薦されていない。
ＥＰ５５９６２５Ｂ１は、選択的胃腸管筋肉弛緩活性を有する多くのＬ-カルニチンおよびアシルＬ-カルニチンのエステルを開示する。
近年、分子生物学者は、ヒトの患者で遺伝子疾患を引き起こす、染色体レベルでの多くの欠損を同定した。
現代医薬の重要分野は、遺伝子に基づくこれらの遺伝性疾患を、遺伝子治療プロトコルを用いて治療することに関連している。
すでに記載したように、カチオン脂質は特に、膜貫通輸送を促進し、特定の細胞膜部位（レセプター）とのその相互作用を促す薬理活性化合物の細胞内送達に用いられる。
【００１３】
これらのベクターは生物起源のものと比較して、より安全で毒性が少なく、さらに大きなサイズの遺伝子を導入することができるので、大きな潜在能力を有する。しかし、生物タイプのベクターと比較して、それらは細胞内遺伝子転写収率が低い。
さらに、常套のカチオン脂質が介在する遺伝子輸送には、プラスミドＤＮＡとカチオン脂質が分けられていることが必要であり、遺伝子輸送の直前にそれらが混合される必要がある。
これらのポリヌクレオチド複合体を安定化させる試みは、有望な結果をほとんど生みそうになく、実際、それらはごく短期間しか安定性を保たない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
それゆえ、遺伝子治療または遺伝子送達および薬物送達の分野では、適当な期間後も活性である安定な、再現可能な部位特異的システムの必要性が強く認識されている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
薬理活性化合物の細胞内送達を促進するのに強い活性のあるカチオン脂質の一クラスに、Ｌ-カルニチンおよびアシルＬ-カルニチンの新規エステルが含まれることが、今回見出された。
【００１６】
これらの新規化合物は安定であり、標的器官に到達することに関して部位特異的であるため、高度に選択的である。
この特性により、これら新規化合物が、活性化合物が薬理活性を発揮することができる部位へそれら活性化合物を送達するのに特に有用なものとなる。
【００１７】
以下に記載する本発明による化合物は、一般式（Ｉ）
【化１】
0005420507.tif 000002
（式中、ｎは１〜３の整数；
Ｒは、水素または、直鎖または分枝鎖の、２-６の炭素原子を有するアルカノイル；
下記部分：
0005420507.tif 000003
は、同一または異なっていてよく、３-２０の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖アシル鎖；
Ｘ−は薬理学上許容される酸のアニオンである）
を有する化合物である。
【００１８】
Ｒの例は、アセチル、プロピオニル、ブチリル、バレリルおよびイソバレリルである。
下記部分：
0005420507.tif 000004
の例は、ヘキサノイル、ウンデカノイル、ミリストイル、パルミトイルまたはオレオイルである。
本発明による化合物の好ましい例は、
Ｌ-カルニチンブロマイドと２-ヒドロキシアセチル-１，３-ジパルミトイルグリセロールのエステル（ＳＴ７７０）、
アセチルＬ-カルニチンブロマイドと２-ヒドロキシアセチル-１，３-ジパルミトイルグリセロールのエステル（ＳＴ７７１）、
プロピオニルＬ-カルニチンブロマイドと２-ヒドロキシアセチル-１，３-ジパルミトイルグリセロールのエステル（ＳＴ７７２）、
イソブチリルＬ-カルニチンブロマイドと２-ヒドロキシアセチル-１，３-ジパルミトイルグリセロールのエステル（ＳＴ７７３）、
イソバレリルＬ-カルニチンブロマイドと２-ヒドロキシアセチル-１，３-ジパルミトイルグリセロールのエステル（ＳＴ７７４）、
Ｌ-カルニチンブロマイドと１，３-ジヘキサノイル-２-ヒドロキシアセチルグリセロールのエステル（ＳＴ８１０）、
アセチルＬ-カルニチンブロマイドと１，３-ジヘキサノイル-２-ヒドロキシアセチルグリセロールのエステル（ＳＴ８０９）、
プロピオニルＬ-カルニチンブロマイドと１，３-ジヘキサノイル-２-ヒドロキシアセチルグリセロールのエステル（ＳＴ８０８）
である。
【００１９】
薬理学上許容される酸のアニオンが意味するものは、有害な毒性または副作用を引き起こさない酸のあらゆるアニオンである。
これらの酸は、薬理学者および、製薬技術の専門家に周知である。
【００２０】
これらのアニオンの例は、掲載するものに限定されないが、クロライド、ブロマイド、ヨーダイド、アスパルテート、酸アスパルテート、シトレート、酸シトレート、タートレート、酸タートレート、ホスフェート、酸ホスフェート、フマレート、酸フマレート、グリセロホスフェート、グルコースホスフェート、ラクテート、マレエート、酸マレエート、ムケート、オロテート、オキサレート、酸オキサレート、スルフェート、酸スルフェート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、メタンスルホネート、パモエートおよび酸パモエートである。
【００２１】
リポソームの形態の式（Ｉ）の化合物は、ワクチンとして有用なペプチドまたはタンパク質をコードしている、遺伝子治療に有用な、天然由来のまたは改変されたプラスミドまたはヌクレオチドの送達と、例えば抗癌剤、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗真菌剤、抗原生動物剤の、心血管系疾患の治療に有用な薬物、または免疫原性ペプチドおよび治療に有用な他の薬物などの薬物の一般的な送達の両方に有用な薬物である。
【００２２】
式（Ｉ）の化合物を含むリポソームは、当業者に周知の常套法を用いて調製される。例えば、Allen T.M. Drugs 56, 747-56 (1998)を参照されたい。本発明によるリポソームは、リポソーム技術の実施において周知の他の化合物を用いても調製することができる。本発明の一態様では、リポソームはヘルパー脂質を含む（この用語は当業者にはよく理解される）。ヘルパー脂質の例としては、コレステロール、１-パルミトイル-２-オレオイルホスファチジルコリンまたはジオレイルホスファチジルコリンが挙げられる。
【００２３】
本発明によるリポソームは、組成物として適切に提供される。薬理活性化合物の送達に関係する態様において、該組成物は、医薬上許容されるビヒクルおよび/または賦形剤を含んでいてよい医薬組成物として理解される。
リポソームの形態の式（Ｉ）の化合物は、リポソームそれ自体を美容活性剤として含む化粧用組成物の調製にも、および、美容活性を有する物質、例えば水和剤、栄養剤、洗顔のための物質、抗皺剤、抗小胞炎剤および抗-伸展線剤の送達のための化粧用組成物の調製にも有用であり得る。
【００２４】
式（Ｉ）の化合物を含むリポソームは、経口または非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮にて、または鼻腔または口内スプレーの形態で投与することができる。
本明細書中に開示する発明はさらに、別の使用がすでに知られている一般式（ＩＩ）を有する更なるカチオン脂質にも関する(前記のＥＰ５５９６２５）。
本発明に従い、式（ＩＩ）の化合物は、薬物送達において強い活性を有し、前記の式（Ｉ）の化合物のものに匹敵するほど、安定で、標的器官に関して選択的であるという特徴を示すリポソームの調製に有用なＬ-カルニチンのエステルである。同じ有利な特性は、化粧品の場合に適用することができる。
【００２５】
これらの化合物は一般式（ＩＩ）：
【化２】
0005420507.tif 000005
（式中、
Ｒ３は飽和または不飽和の、４-２６の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アシル鎖、
Ｒ４は飽和または不飽和の、４-２６の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル鎖、および、
Ｘ−は薬理学上許容される酸のアニオンである）
を有する。
【００２６】
Ｒ３の好ましい例は、ノナノイル、ドデカノイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイルまたはオレオイルである。
Ｒ４の好ましい例は、ノニル、ウンデシル、テトラデシル、ヘキサデシルまたはオレイルである。
【００２７】
本明細書中に記載する発明による式（ＩＩ）の特定化合物の例は、
パルミトイルＬ-カルニチンクロライドウンデシルエステル（ＳＴ９８３）、
ステアロイルＬ-カルニチンクロライドウンデシルエステル（ＳＴ１０５５）、
ステアロイルＬ-カルニチンクロライドテトラデシルエステル（ＳＴ１３５１）、
パルミトイルＬ-カルニチンクロライドテトラデシルエステル（ＳＴ１３７９）、
ミリストイルＬ-カルニチンクロライドテトラデシルエステル（ＳＴ１３８０）、
パルミトイルＬ-カルニチンブロマイドヘキサデシルエステル（ＳＴ１３９０）、
オレイルＬ-カルニチンクロライドオレイルエステル（ＳＴ１３９２）
である。
【００２８】
式（ＩＩ）の多くの化合物、すなわち、ＳＴ１３８０、ＳＴ１３９０およびＳＴ１３９２は公知であり、前記のJ.Med. Chem. 1998 Jun 18; 41(13): 2207-15に、治療活性を有する、細胞感染のためのリポソームの調製に有用な薬剤として開示されているが、薬物送達のためのリポソームの調製に有用な薬剤としては開示されていない。
平均的な経験のある、医薬製剤分野の技術者は、リポソーム-薬物複合体の調製において遭遇する難点をよく知るが、実際、遺伝子送達に有用なリポソームを薬物送達に用いることができるかどうかを演繹的に確認することは、薬物を結合させることができ、かつ治療活性を発揮させなければならない器官に薬物を選択的に送達するリポソームを得るのに克服されなければならない多くの問題のために、不可能である。
【００２９】
リポソームの形態の式（ＩＩ）の化合物は、薬物、例えば抗癌、抗脈管形成、抗ウイルス、抗細菌、抗真菌、抗原生生物剤または、心血管疾患に治療に有用な薬物、または免疫原性ペプチド、および治療に有用な他の薬物の送達に有用な薬剤である。
リポソームの形態の式（ＩＩ）の化合物はさらに、それ自体を美容剤としての化粧用組成物の調製にまたは、美容活性を有する物質、例えば水和剤、栄養剤、洗顔剤および抗皺剤、抗小胞炎剤および抗-伸展線剤の送達のための化粧用組成物の調製に有用である。
該リポソームは、式（ＩＩ）の化合物を含むリポソームの場合のように、ヘルパー脂質を含んでいてよい。
【００３０】
式（ＩＩ）の化合物を含むリポソームは、経口または非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮にてまたは、鼻腔あるいは口内スプレーの形態で投与することができる。
本明細書に開示する発明はさらに、別の使用が既に公知の（前記ＥＰ５５９６２５）、一般式（ＩＩＩ）を有する更なるカチオン脂質に関する。
本発明に従い式（ＩＩＩ）の化合物は、薬物送達を促進する強い活性を有し、かつ、標的器官に到達したとき、前記式（Ｉ）の化合物のものに匹敵する程安定で選択的であるという特徴を示すリポソームの調製に有用な、Ｌ-カルニチンのエステルである。
【００３１】
これらの化合物は、一般式（ＩＩＩ）
【化３】
0005420507.tif 000006
（式中、
Ｒ５は飽和または不飽和の、４-２６の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アシル鎖、
Ｒ６は飽和または不飽和の、４-２６の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル鎖、
Ｘ−は、薬理学上許容される酸のアニオンである。
ただし、Ｒ５がステアロイルのとき、Ｒ６はステアリルではなく、
Ｒ５がオレオイルのとき、Ｒ６はステアリルではなく、
Ｒ５がパルミトイルのとき、Ｒ６はパルミチルではなく、
Ｒ５がミリストイルのとき、Ｒ６はミリスチルではなく、
Ｒ５がラウロイルのとき、Ｒ６はラウリルではなく、
Ｒ５がオレオイルのとき、Ｒ６はオレイルではない。）
を有する。
【００３２】
請求項に記載しなかったリポソーム形態の化合物が、J. Med. Chem. 1988, 41, 2207-2215に、もっぱら遺伝子送達に関して開示されている。
Ｒ５の好ましい例は、ノナノイル、ドデカノイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイルまたはオレオイルである。
Ｒ６の好ましい例は、ノニル、ウンデシル、テトラデシル、ヘキサデシルまたはオレイルである。
【００３３】
本明細書中に記載する本発明による式（ＩＩＩ）の化合物の好ましい例は、
パルミトイルＬ-カルニチンクロライドウンデシルエステル（ＳＴ９８３）；
ステアロイルＬ-カルニチンクロライドウンデシルエステル（ＳＴ１０５５）；
ステアロイルＬ-カルニチンクロライドテトラデシルエステル（ＳＴ１３５１）；
パルミトイルＬ-カルニチンクロライドテトラデシルエステル（ＳＴ１３７９）である。
【００３４】
式（ＩＩＩ）の化合物は、遺伝子治療に有用な天然由来の、あるいは改変されたプラスミドまたはヌクレオチドまたは、ワクチンとして有用なペプチドまたはタンパク質をコードするそれらのプラスミドまたはヌクレオチドの送達に有用な薬剤である。
式（ＩＩＩ）の化合物は、経口または非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮にて、または鼻腔または口内スプレーの形態で投与することができる。
【００３５】
本発明による式（Ｉ）の化合物の調製法を、次の反応図に示すが、この図は一般式（Ｉ）の化合物全てに当てはまると考える。全ての必要な試薬が市場入手可能であり、または文献中に開示されており、反応条件は、本発明の全範囲に一般に適用でき、所望により、いずれの変更も一般的に共通に知られている範囲内で正規になし得るため、当業者は、Ｒ、Ｒ１およびＲ２で示した基のすべてを容易に得ることができる。
【００３６】
【化４】
0005420507.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ヒーラー細胞におけるＳＴ７７２リポソームのプラスミドＤＮＡ感染効率を示す。
【図２】ヒーラー細胞におけるＳＴ７７２リポソームのプラスミドＤＮＡ感染効率を示す。
【図３】リポソームＡおよびＢは共に、ＤＭＳＯ中の遊離ＣＰＴ１８４よりも高いＣＰＴ１８４の蓄積レベルを示した。
【実施例】
【００３８】
前記反応図１を参考に、本発明による式（Ｉ）の化合物の調製法を以下に示す。
実施例１  プロピオニルＬ-カルニチンブロマイドと２-ヒドロキシアセチル１，３ジパルミトイルグリセロールのエステル（ＳＴ７７２）の調製
ａ）１，３-ジヒドロキシプロパン-２-オン１，３-ジパルミテート（１）の調製
ジヒドロアセトン（７ｇ、０．０７８モル）を３００ｍＬの無水クロロホルムに０℃（外部温度）にて無水窒素流下で溶解した。
こうして得られた溶液に、パルミトイルクロライド（４４ｇ、０．１６モル）と無水ピリジン（１５ｍＬ）を滴下した。
生じた混合液を、その温度を室温まで上昇させ、２４時間攪拌下に置いた。
【００３９】
次いで混合液を次の順序で、３００ｍＬの０．５％塩酸水溶液、３００ｍＬの５％重炭酸ナトリウム水溶液および最後に３００ｍＬの水を用いて抽出した。
分離した有機相を無水硫酸ナトリウム上で脱水し、セルロースフィルター上で濾過し、乾燥状態まで濃縮して粗生成物（１）を得た。
純粋な生成物（１）を５００ｍＬのエチルアルコールからの結晶化により得た。
３０．４ｇの生成物（１）を得た。
【００４０】
収率７３％。
ｍ.ｐ.＝８０-８１℃
H1NMR(CDCl3): 0.9(6H, t, CH3CH2-); 1.3(48H, m, (CH2)n=24); 1.55(4H, m, -OCOCH2CH2-); 2.4(4H, t, -OCOCH2-); 4.7(4H, s, -OCCH2-).
【００４１】
ｂ）１，２，３-トリヒドロキシプロパン-１，３-ジパルミテート（２）の調製
テトラヒドロフラン（１２５ｍＬ）およびトルエン（２５ｍＬ）中に溶解した生成物（１）（５ｇ、９ｍｍｏｌ）に、水（７．５ｍＬ）を攪拌下でゆっくりと添加した。
得られた乳白色の懸濁液の温度を５℃（外部の温度）まで上昇させ、ホウ水素化ナトリウム（５００ｍｇ、１３ｍｍｏｌ）を少しずつ添加した。懸濁液を攪拌下、３０分間５℃に置いた。
氷酢酸を次いでゆっくりと、過剰のホウ水素化ナトリウムの分解により生じる泡立ちが止むまでゆっくりと添加し、最終的に溶液を得た。
クロロホルム（１００ｍＬ）を溶液に添加し、二相系の形成を得た。
ＣＨＣｌ３から成る低い方の有機相を分離し、次の順序で水（２５ｍＬ）、重炭酸ナトリウム（２５ｍＬの１０％水溶液）および水（２５ｍＬ）を用いて抽出した。
【００４２】
（２）を含む有機溶液を硫酸ナトリウム上で脱水し、濾過し、乾燥状態まで濃縮して、ワックス様の生成物を得た。
生成物（２）を、ワックス様粗生成物のアセトン結晶化により得た。
４．８ｇの生成物（２）を得た。
収率９４％。
ｍ.ｐ.＝７１-７２℃。
H1NMR(CDCl3): 0.9(6H, t, CH3CH2-); 1.3(48H, m, (CH2)n=24); 1.55(4H, m, -OCOCH2CH2-); 2.4(4H, t, -OCOCH2-); 4.2(5H, m, -CHCH2O-).
【００４３】
ｃ）１，３-ジパルミトイル-２-ブロモアセチルグリセロール（３）の調製
生成物（２）（２．５ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を無水クロロホルム（５０ｍＬ）に攪拌下、０℃（外部温度）で溶解した。
こうして得られた溶液に、ゆっくりとピリジン（０．４２ｍｌ）を添加し、ブロモアセチルクロライド（０．４３ｍＬ、５．２ｍｍｏｌ）を含む３ｍｌのクロロホルム溶液を滴下した。
反応混合液を３０分間０℃（外部温度）に保ち、かつ、３０分間室温に保った。
【００４４】
反応混合液を次いで次の順序で、１％塩酸水溶液（約５０ｍＬ）、５％重炭酸ナトリウム水溶液（約５０ｍＬ）および水を用いて処理した。
反応混合液を（硫酸ナトリウムで）脱水し、乾燥状態まで濃縮した後、生成物（３）をアセトンの結晶化により精製した。
【００４５】
２．５ｇの生成物（３）を得た。
収率８９％。
ｍ.ｐ.＝４９-４７℃。
H1NMR(CDCl3): 0.9(6H, t, CH3CH2-); 1.3(48H, m, (CH2)n=24); 1.55(4H, m, -OCOCH2CH2-); 2.4(4H, t, -OCOCH2-); 3.9(2H, s, -OCH2COO-) 4.2-4.4(5H, m, -CHCH2O-); 5.25(1H, m, CHCH2O-).
【００４６】
ｄ）Ｌ-プロピオニルカルニチンブロマイドと２-ヒドロキシアセチル-１，３-ジパルミトイルグリセロールのエステル（４）の調製
予め４０℃にて真空乾燥させたＬ-プロピオニルカルニチン分子内塩（０．９５ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（約２０ｍＬ）に懸濁した。
生成物（３）（３ｇ、４．７ｍｍｏｌ）を懸濁液に少しずつ添加した。懸濁液をゆっくりと３８℃まで加熱し、溶液が得られるまでこの条件下に置いた。
１０分後から、溶液を３０分間０℃に保った。沈殿を得、これを濾過し、エチルエーテルで洗浄し、クロロホルム（１００ｍＬ）に溶解した。得られた乳白色溶液（３０ｍＬ）をセライト上で濾過し、濃縮した。この後者の溶液に、ヘキサン（１００ｍＬ）を添加し、得られた生成物（４）の沈殿を濾過し、３５℃にて真空乾燥させた。
３．１９ｇの標題化合物を得た。
収率８０％。
【００４７】
ｍ.ｐ.＝１２７-１２８℃。
[α]２５Ｄ＝−３．９（Ｃ＝１％クロロホルム）。
Ｃ４７Ｈ８８ＢｒＮＯ１０の元素分析
【００４８】
【表１】
0005420507.tif 000008
【００４９】
H1 NMR(CDCl3) :0.9-0.95(6H,t, CH3CH2CH2-); 1.1-1.2(3H,t, CH3CH2CO); 1.2-1.4(24H, m, CH2n=24); 1.5-1.6(4H, m, -OCCH2CH2-); 2.3-2.4(4H, t, -OCCH2CH2-); 2.4-2.45(4H, d.d., -CHCH2O-); 2.95(2H, d, -CH2COOCH2COO-); 3.5(9H, s, N(CH3)3); 4.2(4H, m, -CH2OCOCH2-); 4.35(2H,m, -CH2N-); 4,65(2H,d,d, -OCH2CO-); 5.25(1H,m, -OCH2CHCH2O-); 5.75(1H, m, -CHCH2N-).
【００５０】
実施例２-７
以下の化合物を前記実施例と同じ方法で調製した。
Ｌ-カルニチンブロマイドと２-ヒドロキシアセチル-１，３-ジパルミトイルグリセロールのエステル（ＳＴ７７０）、
アセチルＬ-カルニチンブロマイドと２-ヒドロキシアセチル-１，３ジパルミトイルグリセロールのエステル（ＳＴ７７１）、
イソブチリルＬ-カルニチンブロマイドと２-ヒドロキシアセチル-１，３-ジパルミトイルグリセロールのエステル（ＳＴ７７３）、
イソバレリルＬ-カルニチンブロマイドと２-ヒドロキシアセチル-１，３-ジパルミトイルグリセロールのエステル（ＳＴ７７４）、
Ｌ-カルニチンブロマイドと１，３-ジヘキサノイル-２-ヒドロキシアセチルグリセロールのエステル（ＳＴ８１０）、
アセチルＬ-カルニチンブロマイドと１，３-ジヘキサノイル-２-ヒドロキサセチルグリセロールのエステル（ＳＴ８０９）、
１，３-ジヘキサノイル-２-ヒドロキシアセチルグリセロールとのプロピオニルＬ-カルニチンブロマイドエステル（ＳＴ８０８）。
【００５１】
本明細書中に開示する発明の一つの好ましい態様は、抗癌剤を含むリポソームおよび特に、カンプトテシン（例えばＷＯ９７/３１００３に開示されているもの）のためのビヒクルとして作用するリポソームの調製から成る。より好ましい態様では、本明細書に開示する発明により、一般式（ＩＶ）：
【化５】
0005420507.tif 000009
（式中、Ｒ７は-Ｃ（Ｒ１１）＝Ｎ-Ｏ（ｎ）Ｒ１０基であり、Ｒ１０は水素または、直鎖あるいは分枝鎖のＣ１-Ｃ５アルキルまたはＣ１-Ｃ５アルケニル基、またはＣ３-Ｃ１０シクロアルキル基、または直鎖または分枝鎖の（Ｃ３-Ｃ１０）シクロアルキル-（Ｃ１-Ｃ５）アルキル基、またはＣ６-Ｃ１４アリール、または直鎖または分枝鎖（Ｃ６-Ｃ１４）アリール-（Ｃ１-Ｃ５）アルキル基、または複素環式または直鎖あるいは分枝鎖複素環式-（Ｃ１-Ｃ５）アルキル基であり、該複素環式基は、（Ｃ１-Ｃ５）アルキル基で置換されていてよい窒素、および/または酸素および／または硫黄の原子から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を含み、該アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、アリール-アルキル、複素環式または複素環アルキル基は、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１-Ｃ５アルキル、Ｃ１-Ｃ５アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、-ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２およびＲ１３は同一または異なっていてよく、水素、直鎖または分枝鎖（Ｃ１-Ｃ５）アルキル、-ＣＯＯＨ基またはその医薬上許容されるエステルの一つである）、または-ＣＯＮＲ１４Ｒ１５基（Ｒ１４およびＲ１５は同一または異なっていてよく、水素、直鎖または分枝鎖（Ｃ１-Ｃ５）アルキルである）から選択される他の基で置換されていてよい。または、
Ｒ１０は、ハロゲン、ヒドロキシ、直鎖または分枝鎖Ｃ１-Ｃ５アルキル、直鎖または分枝鎖Ｃ１-Ｃ５アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、-ＮＲ１６Ｒ１７（Ｒ１６およびＲ１７は同一または異なっていてよく、水素、直鎖または分枝鎖Ｃ１-Ｃ５アルキルである）から選択される１またはそれ以上の基で置換されていてよいＣ６-Ｃ１０アロイル基である。
【００５２】
Ｒ１０はポリアミノアルキル基、または、
Ｒ１０はグリコシル基、
ｎは０または１、
Ｒ１１は、水素、直鎖または分枝鎖Ｃ１-Ｃ５アルキル、直鎖または分枝鎖Ｃ１-Ｃ５アルケニル、Ｃ３-Ｃ１０シクロアルキル、直鎖または分枝鎖（Ｃ３-Ｃ１０）シクロアルキル-（Ｃ１-Ｃ５）アルキル、Ｃ６-Ｃ１４アリール、直鎖または分枝鎖（Ｃ６-Ｃ１４）アリール-（Ｃ１-Ｃ５）アルキルである、
Ｒ８およびＲ９は同一または異なっていてよく、水素、ヒドロキシ、直鎖または分枝鎖Ｃ１-Ｃ５アルコキシである）
を有するカンプトテシン、そのＮ１-オキシド、単一異性体、特に、-Ｃ（Ｒ１１）＝Ｎ-Ｏ（ｎ）Ｒ１０基のシンおよびアンチ異性体、その可能なエナンチオマー、ジアステレオ異性体および関連混合物、その医薬上許容される塩およびその活性代謝物を送達するためのリポソームが提供される。
【００５３】
式（ＩＶ）の化合物は、１９９９年３月９日出願のヨーロッパ特許出願Ｎｏ．９９８３０１２４．６に開示されている。
ｎが１であり、Ｒ１０がアロイルを除いて前に定義するものである式（ＩＶ）の化合物に関して、これらの化合物は、カンプトテシン７-アルデヒド（式ＩＶａ、Ｒ１１は水素）またはカンプトテシン７-ケト（式ＩＶａ、Ｒ１１は水素以外である）から出発して調製することができる。
【００５４】
【化６】
0005420507.tif 000010
（式中、Ｒ７は、-（ＣＲ１１）＝Ｏ基であり、および、Ｒ１１は式（ＩＶ）で定義するものであり、Ｒ８およびＲ９は式（ＩＶ）で定義するものである。）式（ＩＶａ）の化合物を式（Ｖａ）の化合物Ｒ１０Ｏ-ＮＨ２（Ｒ１０は前記のものである）と反応させ、式（Ｉ）（式中、Ｒ７は-Ｃ（Ｒ１１）＝Ｎ-Ｏ-Ｒ１０基であり、Ｒ１０はアロイルを除いて式（ＩＶ）で定義するものである）の化合物を得る。
【００５５】
反応は、オキシムの通常の形成を含む方法である、当業者に公知の常套法を用いて行うことができる。好ましくは、カンプトテシン７-アルデヒドまたは７-ケトのヒドロキシルアミンに対するモル比は、１：３〜３：１の範囲内にあるべきである。関連するヒドロキシルアミン塩を用いることもできる。反応は塩基（例えば、炭酸カリウムのような無機塩基）または有機塩基（トリエチルアミンまたはジアザビシクロノナンなど）の存在下、極性溶媒、好ましくはメタノールまたはエタノールを用いて行い、該反応は、室温から溶媒の沸点の範囲の温度で、任意に脱水剤（例えば硫酸ナトリウムまたはマグネシウム、モレキュラーシーブ）の存在下で行う。所望の場合、反応は触媒、例えばルイス酸の存在下で行うこともできる。
【００５６】
別に、前記化合物は、（Sawada et al Chem. Pharm. Bull. 39, 2574(1991)に開示されるようにして得られた）カンプトテシン７-アルデヒドまたは７-ケトのオキシムから、または対応する７-アシルカンプトテシンから、Ｒ１０-Ｘハロゲン化物（Ｘは好ましくはヨウ素である）を極性溶媒（例えばテトラヒドロフランまたはアルコール）中、塩基（例えば水素化ナトリウムまたは炭酸カリウム）の存在下で用いる反応により調製することができる。
【００５７】
ｎが１であり、Ｒ１０が式（ＩＶ）に定義するアロイルである式（ＩＶ）の化合物に関し、これらの化合物は、カンプトテシン７-オキシム（この調製に関しては前の段落に記載してある）から出発して、Ｒ１０-ＣＯＣｌアシルクロライドを極性溶媒中、塩基（好ましくはピリジン）の存在下で、またはそれを直接ピリジン中で用いて調製することができる（Cho et al. J. Org. Chem. 62, 2230(1997)に開示されている）。
【００５８】
ｎが０であり、Ｒ１０がアロイル基を除いて前に定義するものである式（ＩＶ）の化合物に関し、該化合物はカンプトテシン７-アルデヒド（式ＩＶａ、Ｒ１１は水素である）またはカンプトテシン７-ケト（式ＩＶａ、Ｒ１１は水素以外である）から出発して調製することができる。
【００５９】
【化７】
0005420507.tif 000011
（式中、Ｒ７は-Ｃ（Ｒ１１）＝Ｏ基であり、Ｒ１１は式（ＩＶ）で定義するものであり、Ｒ８およびＲ９は式（ＩＶ）で定義するものである）。式（ＩＶａ）の化合物を式（Ｖｂ）の化合物Ｒ１０-ＮＨ２（Ｒ１０は前に定義したものである）と反応させて、式（ＩＶ）（式中Ｒ７は-Ｃ（Ｒ１１）＝Ｎ-Ｒ１０基であり、Ｒ１０はアロイルを除いて式（ＩＶ）で定義するものである）の化合物を得る。反応は、製薬技術の専門家に公知の常套法（当該工程はイミンの通常の形成から成る）を用いて行うことができる。好ましくは、カンプトテシン７-アルデヒドまたは７-ケトのイミンに対するモル比は１：３〜３：１の範囲内であるべきである。関連するアミンの塩を用いることもできる。反応は塩基、例えば無機塩基（炭酸カリウムなど）または有機塩基（トリエチルアミンまたはジアザビシクロノナンなど）の存在下で、極性溶媒（好ましくはメタノールまたはエタノール）を用いて行い、当該反応は、室温から溶媒の沸点の範囲の温度で、任意に脱水剤（例えば硫酸ナトリウムまたはマグネシウム、モレキュラーシーブ）の存在下で行う。所望の場合、反応は触媒、例えばMoretti and Torre, Synthesis, 1970, 141;または、Kobayashi et al, Synlett, 1977, 115に開示されているようなルイス酸などの存在下で行うこともできる。
【００６０】
カンプトテシン７-アルデヒドおよびカンプトテシン７-オキシムは、ヨーロッパ特許出願ＥＰ００５６６９２および、Sawada et al, Chem. Pharm. Bull. 39, 2574(1991)による前に引用した文献に開示されている。
式（ＩＶ）の化合物のＮ１-オキシドは、公知の複素環式芳香族窒素酸化法に従い、好ましくは酢酸またはトリフルオロ酢酸および過酸化水素を用いる酸化または有機ペルオキシ酸を用いる反応(A. Albini and S. Pietra, Heterocyclic N-oxides, CRC, 1991)により調製する。
【００６１】
異なる式Ｖの反応物に存在するＲ１０の種々の意義に関して、これらの反応物は市場入手可能であり、または、当該分野の専門家が、当該事項に関する彼ら自身の知識を補充するものとして信頼することができる文献から知ることができる方法に従い調製することができる。
医薬上許容される塩は当該文献に開示される常套法を用いて得られ、更なる開示は必要でない。
【００６２】
実施例８  ７-ベンジルオキシイミノメチルカンプトテシン（ＣＰＴ１７２）
５００ｍｇ（１．３３ｍｍｏｌ）の７-ホルミルカンプトテシンを１００ｍｌのエタノールに溶解する。１５ｍｌのピリジンおよび６３８ｍｇ（４ｍｍｏｌ）のＯ-ベンジルヒドロキシルアミンヒドロクロライドを添加する。溶液を５時間還流する。溶媒を真空蒸発させ、こうして得られた残存物をシリカゲル上、ヘキサン/酢酸エチルの４：６混合物を溶離剤として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。
収率；６５％。
ｍ．ｐ．：２００−２０５℃ｄｅｃ。
【００６３】
得られた生成物は、２つのシンおよびアンチ異性体のおよそ８：２の混合物から成る（異性体Ａ：Ｒｆ０．３２；異性体Ｂ、Ｒｆ０．１９、メルク６０Ｆ２５４シリカゲル上；溶離剤：ヘキサン：酢酸エチル３：７）。
ＨＰＬＣ：分析はローダインインジェクター（２０μｌ白金匙）を有する４つ組ポンプ（ＨＰ１０５０）とＨＰＬＣ-ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎプログラムで操作するダイオードアレイ検出器（ＨＰ１０５０）を備えた装置上で行った。スペクトル取得は２００〜６００ｎｍで行い、クロマトグラムは３６０と４００ｎｍで記録した。
【００６４】
Ｃ１８逆相カラム（ＲａｉｎｉｎＣ１８：２５×０．４ｃｍ、Ｖａｒｉａｎ）を、ＲＰ１８プレカラムと共に用いた。分析は、アセトニトリル：水３０：７０から出発してアセトニトリル１００％までの、２０分間、１ｍｌ／分の流速での線形溶離勾配を用いて行った。保持時間は異性体Ｂに関しては１２．５１分、異性体Ａに関しては１４．４８分であった。
1H-NMR (300 MHz; DMSO-d6): δ: 0.88 (t, H3-18A+H3-18B), 1.87 8m, (H2-19A+H2-19B), 5.18 (s, H2-5B), 5.21 (8s, H2-Ph B), 5.30 (H2-Ph A), 5.40 (s, H2-5A), 5.45 (s, H2-17A+H2-17B), 6.53 (s, -OH A+-OH B), 7.3-7,6 (m, Ar A+ Ar B+H-14A+ H-14B), 7.75 (m, H-11A+H-11B), 7.85-7-95 (m, H10A+H-10B), 7.98 (dd, H-12B), 8.18-8.27 (m, H-12A+H9-B), 8.45 (s, CH=N B), 8.59 (dd, H-9A), 9.38 (s, CH=N A).
Mass m/z 481 (M+ 100) 374 (30)330(70)300(30)273(20)243(20)91(34).
【００６５】
実施例９  ７-ブトキシイミノメチルカンプトテシン（ＣＰＴ１８４）
４００ｍｇ（１．０６ｍｍｏｌ）の７-ホルミルカンプトテシンを８０ｍｌのエタノールに溶解する。１２ｍｌのピリジンおよび４００ｍｇ（３．１８ｍｍｏｌ）のＯ-ｔ-ブチルヒドロキシルアミンヒドロクロライドを添加する。溶液を４時間還流する。溶媒を真空蒸発させ、こうして得られた残存物をシリカゲル上、ヘキサン/酢酸エチルの４：６混合物を溶離剤として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。
３２２ｍｇ（０．７２ｍｍｏｌ）の黄色固体を得る。
収率６８％。
ｍ．ｐ．２５０℃ｄｅｃ。
【００６６】
得られた生成物は、２つのシンおよびアンチ異性体の約８：２の混合物（異性体Ａ：Ｒｆ０．３１、異性体Ｂ、Ｒｆ０．２４、メルク６０Ｆ２５４シリカゲル；溶離剤：ヘキサン：酢酸エチル３：７）から成る。
ＨＰＬＣ：分析は、ローダインインジェクター（２０μｌ白金匙）を有する４つ組ポンプ（ＨＰ１０５０）とＨＰＬＣ-ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎプログラムで操作するダイオードアレイ検出器（ＨＰ１０５０）を備えた装置上で行った。スペクトル取得は２００〜６００ｎｍで行い、クロマトグラムは３６０と４００ｎｍで記録した。
【００６７】
Ｃ１８逆相カラム（ＲａｉｎｉｎＣ１８；２５×０．４ｃｍ、Ｖａｒｉａｎ）をＲＰ１８プレカラムと共に用いた。分析はアセトニトリル：水３０：７０から出発してアセトニトリル１００％まで、２０分間、１ｍｌ／分の流速で用いる線形溶離勾配を用いて行った。保持時間は異性体Ｂに関しては１２．９２分および、異性体Ａに関しては１４．６１分であった。
【００６８】
1H-NMR (300 MHz; DMSO-d6): δ: 0.88 (t, H3-18A+H3-18B), 1.30 (s, t-but.B), 1.47 (s, t-but.A) 1.87 (m, H2-19A+H2-19B) 5.18 (s, H2-5 B), 5.37 (H2-5 A), 5.42 (s, H2-17A+H2-17B), 6.54 (s, -OH A+-OH B), 7.35 (s H-14A), 7.36 (s, H-14B) 7.69-7.83 (m, H-11A+H-11B), 7.85-7.98 (m, H-10A+H-10B), 8.07 (dd, H-9B), 8.16-8.27 (m, H-9A+H-12B) 8.40 (s, CH B), 8.62 (dd, H-12A), 9.31 (s, CH A).
Mass m/z 448 (M+ 28) 391 (40)374(100)362(40)330(34)57(17).
【００６９】
リポソームの調製
本発明による化合物は、多層リポソーム（ＭＬＶ）および単層リポソーム（ＳＵＶ）を、共に乾燥粉末形態で、および水溶液中の懸濁物として調製するのに用いることができる。
実施例１-７に開示するように調製した本発明による化合物を、以下の方法に従いリポソームを調製するのに用いる。適量の化合物をクロロホルム中に溶解し、該溶液を乾燥状態までロータリーエバポレーター中で、脂質層が得られるまで真空濃縮する。脂質層を、最終的に残っている微量の溶媒が除去されるまで高真空下で乾燥させ、次いでｔｅｒｔ-ブチルアルコールまたは水で溶解する。こうして得られた溶液を凍結乾燥し、軟質の乾燥粉末を得た。
【００７０】
粉末を適量の水溶液で水和し、使用する化合物から成るリポソームを得、これを次いでポリヌクレオチドまたは所望の薬物と結合させる。
リポソームの調製の別の方法は、本発明による化合物から成る脂質層を溶媒中で、適当な不活性支持体（例えばソルビトール、マンニトールまたは他の薬理学上許容される炭水化物など）の上に吸着させることから成る。混合物を真空乾燥させ、固体を得、これは使用前に容易かつ非常に迅速に水和できる。
乾燥粉末の形態の調製物は、長期間安定であり、使用しやすいという利点を示す。
【００７１】
さらに、本発明による化合物を以下の方法に従い、ＤＮＡまたは所望の薬物を結合させた、乾燥粉末形態のリポソームを調製するのに用いることができる。本発明による化合物をｔｅｒｔ-ブチルアルコール中に、または水で溶解し、こうして得られた溶液をＤＮＡまたは所望の薬物を混合し、当該混合物を凍結乾燥し、プロリポソーム-ＤＮＡまたはプロリポソーム-薬物として定義することができる複合物を軟質の乾燥粉末形態で得る。
【００７２】
こうして得られた粉末（プロリポソーム）を、エアゾルにより投与することができる、または、別に、水または適当なバッファー溶液で復元した場合に非経口または経口投与することができる医薬組成物の調製に用いることができる。
ＤＮＡまたは薬物と結合させた固体形態のリポソームは、ソルビトール、マンニトールまたは他の炭水化物のような不活性支持体上に、前記の方法を用いる脂質層を吸着させる方法を用いても得ることができる。
【００７３】
リポソームの形成に関する試験
リポソームの形成を、以下の方法に従い、水溶性色素を用いる比色法を用いて試験した。水溶性色素ＡｒｓｅｎａｚｏＩＩＩの水溶液を得た（ｍ．ｗ．＝７７６．３７；２．３ｍｇ／ｍＬ）。
この溶液を水の代わりに用いて前記の調製から生じる脂質層を水和した。
色素を内包するリポソームを含む懸濁液の一部を水で１００倍に希釈した。
【００７４】
２ｍＬのリポソーム懸濁液を用いて６６０ｎｍでの第一光学濃度示数を得た。この示数はブランクとして定義した等量のサンプルに対して得た。２００μｌのＣａＣｌ２溶液（１５ｍｇ／ｍＬ；１００ｍＭ）を第一サンプルに添加し、光学濃度を、２００μｌの水を添加したブランクに対して６６０ｎｍで測定した。得られた吸収値は示数２として示された。サンプルには１００μｌのトライトンＸ−１００（５％ｖ／ｖ；０．２６％終濃度）溶液を、ブランクには２００μｌの水を添加し、６６０ｎｍでの光学濃度示数は、示数３と定義される光学濃度値であった。内包される色素の割合を算出するために、以下の式を用いた。
【００７５】
【化８】
0005420507.tif 000012
【００７６】
内包される色素の割合により、リポソーム形成の基準が提供され、平均は約４０％である。リポソームサイズの検査をレーザー光スキャニングを用いて行い、ポジティブな結果を得た。
【００７７】
リポソームの調製に関する実施例
以下の形態でのパルミトイルＬ−カルニチンクロライドウンデシルエステル（ＳＴ９８３）の調製
ａ）凍結乾燥粉末
６５ｍｇ、０.１１ｍｍｏｌのパルミトイルＬ−カルニチンクロライドウンデシルエステルを２０ｍＬのクロロホルムに、１００ｍＬのフラスコ中で溶解した。
該溶液を、脂質層が得られるまで蒸発させ、これを３時間真空乾燥させた。こうして得られた生成物をｔｅｒｔ−ブチルアルコールに溶解し、この溶液を迅速に−７０℃まで液体窒素を用いて冷却し、２４時間凍結乾燥させた。
スポンジ状の軟質白色固体を得た。
【００７８】
ｂ）吸着粉末
１４３ｍｇ、０．２３１ｍｍｏｌのパルミトイルＬ−カルニチンクロライドウンデシルエステルを１０ｍＬのクロロホルムに溶解した。こうして得られた溶液を少量ずつ、７５０ｍｇのソルビトールを含む１００ｍＬのフラスコに注いだ。クロロホルム溶液を何回もに分けて添加した添加の終わりに、クロロホルムを迅速に蒸発させた。
こうして得られた溶液を３時間真空乾燥させた。
８９３ｍｇの固体の白色生成物を得た。
使用前に当該生成物を迅速に適容量の水で水和し、等張性溶液を得た。
【００７９】
ｃ）ＭＬＶ懸濁液
６５ｍｇ、０.１１ｍｍｏｌのパルミトイルＬ−カルニチンクロライドウンデシルエステルを２０ｍＬのクロロホルムに、１００ｍＬのフラスコ中で溶解した。  こうして得られた溶液を、脂質層が得られるまで蒸発させ、次いでこれを３時間真空乾燥させた。
脂質層を１０ｍＬの水で、３０℃にて３時間水和し、ＭＬＶ懸濁液を得た。
適当に希釈したＭＬＶ懸濁液をポリヌクレオチドまたは薬物と結合させ、生物アッセイに用いた。
【００８０】
ｅ）ＳＵＶ懸濁液
６５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌのパルミトイルＬ−カルニチンクロライドウンデシルエステルを２０ｍＬのクロロホルムに、１００ｍＬのフラスコ中で溶解した。
こうして得られた溶液を、脂質層が得られるまで蒸発させ、これを次いで３時間真空乾燥させた。
脂質層を１０ｍＬの水で、３０℃にて３時間水和し、ＭＬＶ懸濁液を得た。
ＭＬＶ懸濁液を１０回、２００ｎｍのサイズの穴を有するポリカルボネートフィルターに通した。こうして得られた単層リポソーム懸濁液をポリヌクレオチドまたは薬物と結合させ、生物アッセイに用いた。
【００８１】
ｆ）リポソームの物理的安定性に関する試験
リポソーム懸濁液の物理的安定性を３０日間濁度計を用いて試験した。
６００ｎｍにて所定の間隔で、各被検懸濁液に関して吸光度測定を行った。０時間にて測定した平均吸光値は、試験した全製剤に関して一定であった。
考慮した分子は考慮した時間中、妥当な値を示した。
【００８２】
ＭＬＶおよびＳＵＶリポソーム懸濁液は、本発明による化合物をヘルパー脂質（例えば、コレステロール、１-パルミトイル-２-オレイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）またはジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＥ）など）と結合させて調製することができる。
化合物は、安定な膜を有するリポソームを得るために、ヘルパー脂質と結合させる。これ以下、リポソームの調製を開示するセクションに、調製に関する例を示すが、そこでは本発明による化合物は、コレステロールまたはＰＯＰＣのようなヘルパー脂質と結合させる。
【００８３】
薬物送達のためのリポソームの調製に関する実施例
実施例１０  タキソール-ＳＴ９８３ＭＬＶリポソーム（１：４０）の調製
２０ｍｇ、０．０２３４ｍｍｏｌのタキソールおよび５５６ｍｇ、０．９４１７ｍｍｏｌのＳＴ９８３を２０ｍＬのクロロホルムに溶解した。
溶液を、脂質層がガラスフラスコの表面上に得られるまで濃縮した。最終的に残った微量のクロロホルムを真空ポンプを用いて除去した後、２０ｍＬのｔｅｒｔ-ブチルアルコールを脂質層に添加し、こうして得られた溶液を１９のフラクションに細別し、これをすぐ、液体窒素で−７０℃で凍結させ、２４時間凍結乾燥させた。固体の各フラクションはタキソール（１．０５ｍｇ）およびＳＴ９８３（２９．２ｍｇ）を含んでいた。
【００８４】
目的のリポソーム懸濁液を得るために、使用時に水（４５０μｌ）または他の塩水溶液で凍結乾燥生成物を水和し、１０分間攪拌し、３０分間静置して、膨張（水和）工程を完了させた。
ＭＬＶリポソームを得た。
【００８５】
調製物の物理的安定性に関する試験
調製物の物理的安定性を、ＴＤＣ（時間駆動曲線）を８００ｎｍ、２０℃にて２０時間記録する濁度計を用いて試験した。
調製物の安定性を示す一定の濁度傾向が記録され、沈殿現象はなかった。
【００８６】
調製物中のタキソールの化学的安定性に関する試験
タキソールの化学的安定性をＨＰＬＣにより試験した。
クロマトグラフィー条件は以下のようであった。
カラム：μＢｏｎｄａｐａｃｋ・Ｃ-１８
溶離剤：アセトニトリル：水７０：３０
検出器ＵＶ-ＶＩＳ：２２７ｎｍ
流速：１ｍＬ/分
保持時間：４．５分
スタンダードに対して測定したタキソール濃度は２．１３ｍｇ／ｍＬであった。
内包されるタキソールの割合は９８％であった。
【００８７】
実施例１１  ＳＴ９８３ＳＵＶリポソームの調製
２０ｍｇ、０．０２３４ｍｍｏｌのタキソールと５５６ｍｇ、０．９４１７ｍｍｏｌのＳＴ９８３を２０ｍＬのクロロホルムに溶解した。
該溶液を、脂質層がガラスフラスコの表面上に得られるまで濃縮した。
最終的に残る微量のクロロホルムを高真空ポンプを用いて除去した後、２０ｍＬのｔｅｒｔ-ブチルアルコールを脂質層に添加し、こうして得られた溶液を１９のフラクションに細分し、これらをすぐに液体窒素で−７０℃にて凍結し、２４時間凍結乾燥した。固体の各フラクションはタキソール（１．０５ｍｇ）とＳＴ９８３（２９．２ｍｇ）を含んでいた。
最終目的のＳＵＶリポソーム懸濁液を得るために、ＰＢＳ溶液（１ｍＬ）で水和した凍結乾燥生成物を２０分間０℃で超音波処理した。
４００ｎｍの濾紙上で濾過を次いで行い、ソニケータープローブにより放出された微量のチタンを除いた。
【００８８】
調製物の物理的安定性に関する試験
調製物の物理的安定性を、ＴＤＣ（時間駆動曲線）を８００ｎｍで、２０℃にて２０時間記録する濁度計を用いて試験した。
調製物の安定性の指標である一定の濁度傾向が記録され、沈殿現象は認められなかった。
【００８９】
調製物中のタキソールの化学的安定性に関する試験
タキソールの化学的安定性を、ＨＰＬＣにより試験した。
クロマトグラフィー条件は以下のようであった。
カラム：μＢｏｎｄａｐａｃｋ・Ｃ−１８
溶離剤：アセトニトリル：水７０：３０
検出器ＵＶ-ＶＩＳ：２２７ｎｍ
流速：１ｍＬ／分
保持時間：４．５分
ＳＵＶリポソーム懸濁液のＨＰＬＣ分析は、対応するＭＬＶリポソーム懸濁液と同じ結果を生じ、この場合にも、内包されるタキソールの割合は９８％であった。
２４時間後に繰り返したＨＰＬＣ分析により、タキソール以外の新たなピークは明らかにされず、該活性成分の安定性が示唆される。
【００９０】
実施例１２  タキソール-ＳＴ８９３コレステロールリポソーム（１：１５）の調製
このタイプのリポソームを、もっと安定な膜を有する複合体を得るために調製した。
６ｍｇ、０．０１０１ｍｍｏｌのタキソール、６２．２ｍｇ、０．１０５ｍｍｏｌのＳＴ９８３および４０ｍｇのコレステロールを１０ｍＬのクロロホルムに溶解した。
こうして得られた溶液を、脂質層がガラスフラスコの表面上に得られるまで濃縮した。
【００９１】
最終的に残る微量のクロロホルムを高真空ポンプで除去した後、６．３ｍＬのｔｅｒｔ-ブチルアルコールを脂質層に添加し、こうして得られた溶液を５フラクションに細分し、これをすぐに‐７０℃にて液体窒素で凍結し、２４時間凍結乾燥させた。固体の各フラクションはタキソール（１．２ｍｇ）、ＳＴ９８３（１２．４４ｍｇ）およびコレステロール（８ｍｇ）を含んでいた。
最終目的のリポソーム懸濁液を得るために、凍結乾燥した生成物を使用時に水（１０００ｍＬ）または他の塩水溶液で水和し、１０分間攪拌し、３０分間静置して、膨張（水和）工程を完遂した。
ＭＬＶリポソームを得た。
【００９２】
調製物の物理的安定性に関する試験
調製物の物理的安定性を、ＴＤＣ（時間駆動曲線）を８００ｎｍ、２０℃にて６時間記録する濁度計を用いて試験した。
調製物の安定性の指標である一定の濁度傾向が記録され、沈殿現象は見られなかった。
【００９３】
実施例１３  タキソール‐ＳＴ７７２ＳＵＶリポソーム（１：７０）の調製
２０ｍｇ、０．０２３４ｍｍｏｌのタキソールと１４８５ｍｇ、１．６３８ｍｍｏｌのＳＴ７７２を２０ｍＬのクロロホルムに溶解した。
該溶液を脂質層がガラスフラスコの表面上に得られるまで濃縮した。
最終的に残る微量のクロロホルムを高真空ポンプで除去した後、２０ｍＬのｔｅｒｔ-ブチルアルコールを脂質層に添加した。透明の溶液を得るために、６０℃まで加熱しなければならなかった。該溶液を即座に液体窒素で-７０℃にて凍結し、２４時間凍結乾燥した。
最終目的であるＳＵＶリポソーム懸濁液を得るために、ＰＢＳ溶液（２０ｍＬ）で水和した凍結乾燥生成物を２０分間０℃で超音波処理した。
濾過を次いで４００ｎｍフィルター上で行い、ソニケータープローブにより放出された微量のチタンを除去した。
【００９４】
調製物の物理的安定性に関する試験
調製物の物理的安定性を、ＴＤＣ（時間駆動曲線）を８００ｎｍ、２０℃にて６時間記録する濁度計を用いて試験した。
調製物の安定性の指標である一定の濁度傾向が記録され、沈殿現象はなかった。
【００９５】
実施例１４  ＣＰＴ８３-ＳＴ９８３ＭＬＶリポソーム（１：４０）の調製
６．３ｍｇ、０．０１６８ｍｍｏｌのＣＰＴ８３（ＷＯ９７／３１００３に開示される７-カルボニトリルカンプトテシン）および４００ｍｇ、０．０６６７ｍｍｏｌのＳＴ９８３を２０ｍＬのクロロホルムに溶解した。
該溶液を、脂質層がガラスフラスコの表面上に得られるまで濃縮した。
最終的に残っている微量のクロロホルムを真空ポンプを用いて除去した後、２６ｍＬのｔｅｒｔ-ブチルアルコールを脂質層に添加し、こうして得られた溶液を１２のフラクションに細分し、これを即座に液体窒素で‐７０℃にて凍結し、２４時間凍結乾燥した。固体の各フラクションはＣＰＴ８３（０．５２５ｍｇ）およびＳＴ９８３（３３．３３ｍｇ）を含んでいた。
【００９６】
最終目的であるリポソーム懸濁液を得るために、凍結乾燥生成物を使用時に水（１０００μＬ）または他の塩水溶液で水和し、１０分間攪拌した。
ＭＬＶリポソームを得た。
【００９７】
調製物の物理的安定性に関する試験
調製物の物理的安定性を、ＴＤＣ（時間駆動曲線）を８００ｎｍにて、２０℃にて２０時間記録する濁度計を用いて試験した。
調製物の安定性の指標である一定の濁度傾向が記録され、沈殿現象は見られなかった。
【００９８】
調製物中のＣＰＴ８３の化学安定性に関する試験
ＣＰＴ８３の化学的安定性をＨＰＬＣにより試験した。
クロマトグラフィー条件は以下のようであった。
カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ・ＬＣ-ＡＢＺ
溶離剤：リン酸バッファー２０ｍＭ：メタノール４０：６０、ｐＨ＝７．３
検出器ＵＶ-ＶＩＳ：３６０ｎｍ
流速：１ｍＬ／分
保持時間：４.０３３分
標準に対して決定したＣＰＴ８３濃度は０．５０２ｍｇ／ｍＬであった。
内包されるＣＰＴ８３の割合は９９％であった。
【００９９】
実施例１５  ＣＰＴ８３-ＳＴ９８３ＳＵＶリポソーム（１：４０）の調製
６．３ｍｇ、０．０１６８ｍｍｏｌのＣＰＴ８３および４００ｍｇ、０．６６７ｍｍｏｌのＳＴ９８３を２０ｍＬのクロロホルムに溶解した。
脂質層がガラスフラスコの表面上に得られるまで該溶液を濃縮した。
最終的に残る微量のクロロホルムを高真空ポンプで除去した後、２６ｍＬのｔｅｒｔ-ブチルアルコールを脂質層に添加し、こうして得られた溶液を１２のフラクションに細分し、これを即座に液体窒素で‐７０℃にて凍結し、２４時間凍結乾燥した。固体の各フラクションはＣＰＴ８３（０．５２５ｍｇ）およびＳＴ９８３（３３．３３ｍｇ）を含んでいた。
最終目的であるＳＵＶリポソーム懸濁液を得るために、水（１０００μＬ）で水和した凍結乾燥生成物を４０分間０℃にて超音波処理した。
次いで濾過を４００ｎｍのフィルター上で行い、ソニケータープローブにより放出された微量のチタンを除去した。
【０１００】
調製物中のＣＰＴ８３の化学的安定性に関する試験
ＨＰＬＣにより、ＣＰＴ８３の化学的安定性を試験した。
クロマトグラフィー条件は以下のようであった。
カラム：ＳｕｐｅｌｃｏｓｉｌＬＣ-ＡＢＺ
溶離剤：リン酸バッファー２０ｍＭ：メタノール４０：６０、ｐＨ＝７．３
ディテクターＵＶ-ＶＩＳ：３６０ｎｍ
流速：１ｍｌ/分
保持時間：４．０３３分
基準に対して決定したＣＰＴ８３濃度は０．３ｍｇ/ｍＬであった。
内包されるＣＰＴ８３の割合は５９％であった。
２４時間後に反復したＨＰＬＣ分析でＣＰＴ８３のピーク以外の新規なピークは現れず、該化合物の安定性が示唆される。
【０１０１】
調製物の物理的安定性に関する試験
調製物の物理的安定性を、ＴＤＣ（時間駆動曲線）を６００ｎｍで、２０度で２０時間記録する濁度計を用いて試験した。
調製物の物理的安定性の指標である一定の濁度傾向が記録され、沈殿現象は見られなかった。
【０１０２】
実施例１６  ＣＰＴ１８４-ＳＴ９８３ＭＬＶリポソーム（１：４０）の調製
７．２９ｍｇ、０．０１６８ｍｍｏｌのＣＰＴ１８４および４００ｍｇ、０．６７７ｍｍｏｌのＳＴ９８３を２０ｍＬのクロロホルムに溶解した。
脂質層がガラスフラスコの表面上に得られるまで該溶液を濃縮した。
最終的に残る微量のクロロホルムを真空ポンプを用いて除去した後、２６ｍＬのｔｅｒｔ-ブチルアルコールを脂質層に添加し、こうして得られた溶液を１２のフラクションに細分し、これを即座に液体窒素で-７０℃にて凍結し、２４時間凍結乾燥した。固体の各フラクションはＣＰＴ１８４（０．６０７ｍｇ）とＳＴ９８３（３３．３３ｍｇ）を含んでいた。
最終目的のリポソーム懸濁液を得るために凍結乾燥生成物を使用時に水（１０００μｌ）または他の塩水溶液で水和し、１０分間攪拌した。
ＭＬＶリポソームを得た。
【０１０３】
調製物の物理的安定性に関する試験
調製物の物理的安定性を、ＴＤＣ（時間駆動曲線）を６００ｎｍにて、２０℃で２０時間記録する濁度計を用いて試験した。
調製物の安定性の指標である一定の濁度傾向が記録され、沈殿現象は見られなかった。
【０１０４】
調製物中のＣＰＴ１８４の化学的安定性に関する試験
ＣＰＴ１８４の化学的安定性をＨＰＬＣにより試験した。
クロマトグラフィー条件は以下のようであった。
カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ・ＬＣ-ＡＢＺ
溶離剤：リン酸バッファー２０ｍＭ：メタノール４０：６０、ｐＨ＝７．３
ディテクターＵＶ-ＶＩＳ：３６０ｎｍ
流速：１ｍＬ／分
保持時間：２５．５分
基準に対して決定したＣＰＴ１８４濃度は０．６００ｍｇ／ｍＬであった。
内包されるＣＰＴ１８４の割合は９９％であった。
【０１０５】
実施例１７  ＣＰＴ１８４-ＳＴ９８３ＳＵＶリポソーム（１：４０）の調製
７．２９ｍｇ、０．０１６８ｍｍｏｌのＣＰＴ１８４および４００ｍｇ、０．６６７ｍｍｏｌのＳＴ９８３を２０ｍＬのクロロホルムに溶解した。
該溶液を、脂質層がガラスフラスコの表面上に得られるまで濃縮した。
最終的に残っている微量のクロロホルムを高真空ポンプを用いて除去した後、２６ｍＬのｔｅｒｔ−ブチルアルコールを脂質層に添加し、こうして得られた溶液を１２のフラクションに細分し、これらを即座に液体窒素で‐７０℃にて凍結し、２４時間凍結乾燥させた。固体の各フラクションはＣＰＴ１８４（０．６０７ｍｇ）およびＳＴ９８３（３３．３３ｍｇ）を含んでいた。
最終目的であるＳＵＶリポソーム懸濁液を得るために、水（１０００μＬ）で水和した凍結乾燥生成物を４０分間０℃で超音波処理した。
濾過を次いで４００ｎｍの濾紙上で行い、ソニケータープローブにより放出された微量のチタンを除去した。
【０１０６】
調製物中のＣＰＴ１８４の化学的安定性に関する試験
ＣＰＴ１８４の化学的安定性をＨＰＬＣにより試験した。
クロマトグラフィー条件は以下のようであった。
カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ・ＬＣ−ＡＢＺ
溶離剤：リン酸バッファー２０ｍＭ：メタノール４０：６０、ｐＨ＝７．３
ディテクターＵＶ−ＶＩＳ：３６０ｎｍ
流速：１ｍＬ／分
保持時間：２５．５分
基準に対して測定したＣＰＴ１８４濃度は０．３６ｍｇ／ｍＬであった。
内包されるＣＰＴ１８４の割合は７０％であった。
２４時間後に反復したＨＰＬＣ分析ではＣＰＴ１８４のピーク以外の新規なピークは現れず、活性成分の安定性が示唆される。
【０１０７】
調製物の物理的安定性に関する試験
調製物の物理的安定性を、ＴＤＣ（時間駆動曲線）を６００ｎｍで、２０℃にて２０時間記録する濁度計を用いて試験した。
調製物の安定性の指標である一定の濁度傾向が記録され、沈殿現象は見られなかった。
以下の実施例で、リポソームをヘルパー脂質および／または凍結防止剤を用いて調製した。
【０１０８】
実施例１８  ＣＰＴ１８４-ＳＴ９８３リポソームの調製
２ｌフラスコ中、１００ｍｌのメチルクロロホルムを２０ｍｇのＣＰＴ１８４および６００ｍｇのＳＴ９８３に添加し、混合液を溶解が完遂するまで少しだけ温めた。得られた溶液を脂質層が得られるまでロータベイパー中で濃縮し、これをさらに２時間高真空ポンプにて乾燥させた。脂質層をラクトース溶液（６ｇ／３００ｍｌ水）で４５℃にて水和し、ロータベイパー中２時間攪拌下に置いた。懸濁液を次いで２時間超音波処理し、各サイクルを１時間半続けた。次いで生成物を２００ｎｍフィルターで濾過し、凍結乾燥した。
【０１０９】
調製物中のＣＰＴ１８４の化学安定性に関する試験
ＣＰＴ１８４の化学的安定性をＨＰＬＣで確認した。
生成物は２４時間の試験中、安定していた。
【０１１０】
調製物の物理的安定性に関する試験
調製物の物理的安定性を、濁度計を用いて試験した。生成物は２４時間の試験中安定であった。粒子のサイズも安定していた（１００ｎｍの平均値）。
【０１１１】
実施例１９  ＣＰＴ１８４-ＳＴ９８３リポソームの調製
１ｍｌのリポソーム製剤（ＰＯＰＣ-１-パルミトイル-２-オレオイルホスファチジルコリン５ｍＭ；ＳＴ９８３  １．２５ｍＭ；ＣＰＴ１８４  ０．２５およびトレハロース１５０ｍＭ）のために、以下の方法を用いた。
０．１１ｍｇ、０．２５μモルのＣＰＴ１８４を２５０μＬの酢酸エチルに溶解し、３．７９ｍｇ、４.８９μモルのＰＯＰＣを１００μＬのエタノールに溶解し、０．７４ｍｇ、１．２５μモルのＳＴ９８３を１００μＬのエタノールに溶解した。３溶液を混合し、かき混ぜた。溶媒をローターベイパーを室温で８０ｍバールで用いて蒸発させた。脂質膜を２時間暗中で乾燥させた。脂質層を１ｍｌの１５０ｍＭのＤ（+）-トレハロース二水和物（Ｆｌｕｋａ、ＨＰＬＣ９９％）溶液中に懸濁し、０．２２ｎｍフィルターを通して滅菌し、２分間かき混ぜた。懸濁液を２００ｎｍのポリカルボネートフィルターに２１回通した。通過させたリポソーム懸濁液を液体窒素中で凍結し、二晩凍結乾燥させた。白色固体を得た。
【０１１２】
実施例２０  ＣＰＴ１８４-ＳＴ９８３リポソームの調製
トレハロース５００ｍＭを用いる以外は実施例１９と同じ方法を用いた。
ＳＴ９８３リポソーム-抗癌剤複合体の抗癌活性
これ以下に見られるように、ＳＴ９８３リポソームは肺レベルで際立った蓄積を示した。この部位特異的な特徴は、肺癌のネズミモデルにおける使用に適している。
この実験で用いた抗癌剤はタキソールであった。
【０１１３】
腫瘍をインビボで誘導するために、非麻酔Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０．１ｍｌのＲＰＭＩ-１６４０（シグマ）中３×１０５細胞のネズミ肺癌Ｍ１０９の注射を、右後ろ足の大腿骨四等筋に施した。
腫瘍の移植１０日後、リポソーム‐タキソール複合体をリン酸緩衝塩水溶液（ＰＢＳ、ＳＩＧＭＡ、Ｐ-４４１７）で希釈し、ＳＴ９８３２．５ｍｇ/ｍＬおよび、タキソール７５μｇ／ｍＬの濃度で静脈注射した。
コントロールとして用いたタキソール(paclitaxel INDENA)はクレモフォアビヒクルＥＬ（ＢＡＳＦ）に２０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、＋４℃にてその後の２４時間、光を遮断して貯蔵した。使用時にリン酸緩衝塩水溶液（ＰＢＳ、ＳＩＧＭＡ）で希釈し、ＳＴ９８３リポソームで輸送されるタキソールに関して記載したものと同じ体積および濃度条件で静脈注射した。
【０１１４】
クレモフォアは、エチルアルコールで１：１に希釈することにより調製した。
腫瘍の接種後１０日から始め、７日間連続投与した。接種後１７日まで動物を観察下に起き、頚部脱臼により屠殺し、その肺を腫瘍転移数を測定するために取り出した。腫瘍の転移を検出するための肺の染色を、肺を１０日間、７１％飽和ピクリン酸溶液、４.８％の氷酢酸（メルク）および２４％１０％ホルムアルデヒド（フルカ）から成る５ｍｌのＢｏｕｉｎの溶液中でインキュベートすることにより行った。Ｂｏｕｉｎの溶液中でのインキュベーション期間の終了時、腫瘍転移数を計測した。
非処置のコントロールマウスと比較して、クレモフォア輸送性タキソールにより、肺の腫瘍転移数を減じる効果は示されなかった（後者は非処置のコントロールのものよりも腫瘍は小さかった。）が、一方、ＳＴ９８３リポソームと結合させたタキソールは、肺の腫瘍転移数とそのサイズの両方に関して有意な低下を示した。
肺の腫瘍転移数に関するデータの統計学的分析を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ非パラメトリック試験を非対データに関して用いて行った。
得られた結果を以下の表１に示す。
【０１１５】
【表２】
0005420507.tif 000013
【０１１６】
インビトロ細胞毒性試験
毒性アッセイを、９６ウェルのプレート中のヒーラーおよびＭ１０９細胞に関して行った。培養後１日目に、細胞を被検分子でその後の４８時間処置した。細胞を次いでＰＢＳで洗浄し、通常の生育条件下に４８時間置いた。生育培地の除去後、細胞を１６％のＴＣＡと共に氷上でインキュベートし、３回Ｈ２Ｏ中で洗浄し、３０分間１％酢酸中のスルホールホダミンＢ（ＳＲＢ）で処置し、３回１％酢酸のみで洗浄し、２０分間ＴＲＩＳ１０ｍＭ、ｐＨ１０．５中でインキュベートし、最後に５４０ｎｍで記録を行った。
【０１１７】
ＣＰＴ８３を用いる細胞毒性試験
リポソームと結合させた抗癌剤の細胞毒性を有効活性の予備的指標として評価するために、ＣＰＴ８３を用いるインビトロ細胞毒性試験を行った。
ＣＰＴ８３を輸送するリポソームの能力をインビトロで評価するために、Ｍ１０９細胞において、前記のスルホールホダミンＢ試験を用いた。
加えて、ジメチル‐スルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解したＣＰＴ８３の細胞毒性も、ＳＴ９８３リポソームと結合させた同じ分子の細胞毒性と比較して評価した。
リポソーム-ＣＰＴ８３複合体を細胞毒性アッセイにおいて、以下の表２．１、２．２および３．３に示す濃度で、ＳＵＶおよびＭＬＶ形態の両方で用いた。用いたリポソーム：ＣＰＴ８３のモル比は４０：１であった。
以下の表２．１、２．２および２．３に示す、両ＳＵＶおよびＭＬＶ形態のＳＴ９８３-ＣＰＴ８３複合体の平均細胞毒性値は、ＳＴ９８３リポソームがＤＭＳＯとほとんど同じ様式でＣＰＴ８３を輸送することができ、同じ大きさのオーダーの細胞毒性レベルを示すことを示唆する。
【０１１８】
【表３】
0005420507.tif 000014
表に示す値は５４０ｎｍでの光学濃度示数を示す。
【０１１９】
【表４】
0005420507.tif 000015
表に示す値は５４０ｎｍでの光学濃度示数を示す。
【０１２０】
【表５】
0005420507.tif 000016
表に示す値は５４０ｎｍでの光学濃度示数を示す。
【０１２１】
ＳＴ９８３リポソーム-ＣＰＴ１８４複合体の生物活性
実施例１８のリポソーム（以下、リポソームＡと呼ぶ）および実施例２０のリポソーム（以下、リポソームＢと呼ぶ）の生物活性を試験した。
【０１２２】
健康なマウスにおける細胞毒性
遊離ＣＰＴ１８４との比較において、リポソームＡおよびＢを、１．２ｍｇ／ｋｇの投与量でｑ４ｄｘ４スキームにより、経口、静脈内投与した。２つのリポソームは、体、肺、脾臓および腎臓の重量にさほど影響しなかった。リポソームＢの静脈内、リポソームＡの経口投与は、遊離ＣＰＴ１８４と同様に胸腺の重量に影響を及ぼした。リポソームＡの静脈内投与はわずかしか影響しなかった。血液分析学的パラメータは２４時間後、両リポソームに関して有意な変動を示さなかった。ｑｄ５スキームに従い静脈投与したリポソームＡは遊離ＣＰＴ１８４に匹敵する毒性を示した。
【０１２３】
リポソームの肺親和性
リポソームＡとＢは肺レベルで懸著な蓄積が示された。リポソームは１．２ｍｇ／ｋｇで静脈投与した。遊離ＣＰＴ１８４は、ＤＭＳＯ中１．２ｍｇ／ｋｇで経口投与した。動物、健康なマウスを最終投与の２４時間後に屠殺した。それらの群から肺を摘出し、液体窒素中に凍結した。一度溶解し、肺をプールし、０．１％酢酸／アセトニトリル１：５中でホモジェナイズした。ホモジェネートを３等分し、その２つにＣＰＴ１８４を、回収率算定のために添加した。３サンプルを１６，０００ｇにて５分間遠心分離した。上清を集め、ジクロロメタンで抽出した。有機相をスピードバックを用いて乾燥させ、残存物を、ＨＰＬＣにローディングするための５０μｌ中に一匹の動物に対応する量を含むように、アセトニトリル中に再溶解した。ＨＰＬＣをＷａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８  ３．５μｍ（４．６×７．５ｍｍ）において行った。メルク蛍光計は３７０ｎｍの励起および５１０ｎｍの放出の検出器であった。溶離剤は、水／アセトニトリル６０：４０、イソクラティックであった。サンプルの体積は５０μｌであった。ＣＰＴ１８４の回収率は約７０％であった。図３に示すように、リポソームＡおよびＢは共に、ＤＭＳＯ中の遊離ＣＰＴ１８４よりも高いＣＰＴ１８４の蓄積レベルを示した。
【０１２４】
遺伝子送達
リポソーム‐ＤＮＡ複合体の調製
リポソームおよびプラスミドＤＮＡを適当に別々にＰＢＳに希釈した。ＤＮＡを次いでリポソームに添加し、リポソーム‐ＤＮＡ複合体を約３０分間、４℃に置き、安定なリポソーム‐ＤＮＡ相互作用の形成を促した。
インビトロ実験において、１，２−ジオレオイルオキシ‐３-トリメチル‐アンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を参考カチオン脂質として用いた。２．５μｇのプラスミドＤＮＡを２×１０５ヒーラー細胞につき使用し、リポソーム濃度は９μＭであった。
【０１２５】
インビトロ実験において、ＤＯＴＡＰおよび[２，３−（ジオレオイル）プロピル]トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）の両方を参考カチオン脂質として使用した。
結果中に示すモル比は、ＤＮＡ１ｍｇあたりのそれぞれのカチオン脂質のｎｍｏｌ濃度を意味する。
インビボ感染実験で、２５μｇのプラスミドＤＮＡを動物一匹当たりに用いた。
これらの実験で使用したプラスミドｐＣＭＶｌｕｃは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの転写コントロール下のルシフェラーゼ遺伝子のｃＤＮＡを含んでいた。
【０１２６】
ルシフェラーゼ活性の定量測定
タンパク質ルシフェラーゼの細胞および組織内での活性を、ベーリンガー・マンハイムキット（ｃａｔ  ｎｏ．１６６９８９３）を用いて測定した。
細胞を３回ＰＢＳ中で洗浄し、次いで溶解バッファー（１００ｍＭのリン酸カリウムｐＨ７．８。１ｍＭのジチオトレイトール‐ＤＴＴ）中でスクレーパーを用いてプレートからはがし、凍結と溶解の３連続サイクルに供した。１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ中で遠心分離した後、上清をタンパク質の抽出後５時間以内に発光試験に使用した。発光放出測定を、発光計を５６２ｎｍで用いて行った。液体窒素中でまず凍結させた後、粉末を得るために細かく粉砕し、組織を溶解バッファーに再懸濁し、１０-１５分間氷中でインキュベートした。
サンプルを次いで２ｍｌのエッペンドルフチューブ中で遠心分離し、上清をルシフェラーゼ活性に関して試験した。
【０１２７】
ドットブロット分析
細胞のＤＮＡを、Sanbrook, Fritsch and ManiatisによりMolecular Cloning, 1989に記載されているアルカリ溶解法に従い抽出した。
細胞から抽出した５μｇのＤＮＡをナイロンフィルター(ベーリンガー）に、バイオラッドドット-ブロット器具を用いて予め吸着させた。フィルターを次いで４時間６５度で、０．５Ｍのピロリンサンナトリウム（ＮａＰｉ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、７％のＳＤＳを含む溶液でプレハイブリダイゼーションした。３２Ｐ（アルファ）でラベルしたプローブを、プラスミドｐＣＭＶｌｕｃ・ＤＮＡを鋳型としておよび、ランダムプライムしたアマシャムのキットを用いて調製した。フィルターを同じプレハイブリダイゼーションバッファー中で１２時間４２℃で１×１０６ＣＰＭ／ｍｌを用いてハイブリダイゼーションした。フィルターを次いで３１０分、６５℃にて、４０ｍＭのＮａＰｉ、１％のＳＤＳを含むバッファー中で洗浄した。オートラジオグラフィー分析を、ベータ放射線（これは、電子増倍管システムを用いて読み、かつ定量する）で活性化させた蛍光スクリーンを用いる蛍光画像を画像分析プログラムと組み合わせてを用いて行った。ドットブロットに関して行った濃度測定は、ＩＰ-ＬａｂＧｅｌ画像分析プログラムを用いて行った。
【０１２８】
プラスミドＤＮＡ感染試験
多くのプラスミドＤＮＡ感染試験を、インビトロとインビボの両方で行った。
その感染力がAbkenet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 6518に特徴づけられ、および開示されているＤＯＴＡＰとＤＯＴＭＡの両方を、参考となるカチオン脂質として用いた。インビボ試験では、プラスミドＤＮＡに対するカチオン脂質の種々の異なるモル比を、カチオン脂質の活性と遺伝子輸送に最も有効な個々の濃度を決定するために分析した。種々のリポソームの感染力を、ｐＣＭＶｌｕｃプラスミド中に含まれるルシフェラーゼ遺伝子トランスポーター（定量を容易にするために相対蛍光単位（前に記載した）に関して活性化させたもの）を用いて、インビボとインビトロの両方で評価した。
別法として、感染させた細胞から抽出し、ニトロセルロースフィルター上に予め吸着させ（ドットブロット）、３２Ｐ-標識プラスミドＤＮＡマーカーでハイブリダイゼーションさせたＤＮＡサンプルの濃度分析（蛍光画像）を用いて、多くのカチオンリポソームの感染力を前記のように評価した。
【０１２９】
インビトロ感染試験
この実験では、肝臓、肺および心臓の感染効率の、ＳＴ９８３リポソーム：プラスミドＤＮＡのモル比への依存性を評価した。次の、ＤＮＡ１μｇ当たりのリポソームのｎｍｏｌ比を試験した；１２：１、２４：１、３６：１および４８：１。
各群６匹の約２０ｇの体重のＢａｌｂ／ｃマウスへ、２００μｌ容積のＰＢＳ中、前記の量のリポソーム‐ＤＮＡ複合体を静脈投与し、複合体の投与の２４時間後に屠殺した。
肺、心臓および肝臓組織から抽出されたルシフェラーゼの活性により、分析した全モル比でルシフェラーゼが肺に際立って分布していることが明らかになった。実際、３つの組織から抽出されたトータルのルシフェラーゼの約９９％が肺に位置していた。１２：１のリポソーム:ＤＮＡモル比が最良であることが分かった。得られた結果を以下の表３に示す。
【０１３０】
【表６】
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【０１３１】
インビボ感染効率の、ＳＲＴ９８３リポソーム調製物間の違いへの依存性
１２：１のリポソーム：ＤＮＡモル比で異なるＳＴ９８３リポソーム調製物を静脈処置したＢａｌｂ／ｃマウスの肺から抽出したルシフェラーゼ活性の値を、相対蛍光単位（ＲＬＵ）として表４に示す。
得られたデータは、ＳＴ９８３リポソームがプラスミドＤＮＡＩをインビボで、ＤＯＴＭＡよりも高いおよび／またはそれに匹敵する効率で輸送することができることを示していることに加え、さらに、異なるＳＴ９８３調製物間の変動の程度をも示している。これは、多くの物理化学的特徴、例えばリポソーム小胞のサイズ、異なるＳＴ９８３調製物の単層（ＳＵＶ）または多層構造に関する小胞の相対的割合などによるものであり得る。実際に、前記物理化学的パラメータは、最適のインビボおよびインビトロ感染効率を得ることに関する決定要因として、R.I. Mahato et al., Human Gene Therapy 9. 1998: 2083に詳細に記載されている。
【０１３２】
【表７】
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【０１３３】
インビボ感染力の、ＳＴ９８３-ＤＮＡリポソーム複合体プレインキュベーション時間への依存性
表５は、プラスミドＤＮＡと共に投与前３０分間、または３時間プレインキュベーションしたＳＴ９８３リポソームを用いて静脈処置したマウスの肝臓、肺および心臓から抽出した相対蛍光単位を示す。ＤＮＡと共に３時間プレインキュベーションしたＳＴ９８３で処置した動物は、肺および心臓におけるルシフェラーゼ活性に関し、３０分間プレインキュベーションした同じリポソームを用いて処置したものと比較して約５倍の増加を示している。この結果は、安定なリポソームＤＮＡ複合体の形成が時間に依存する現象であり、インビボ感染力の決定要因として決定的な役割を果たしていることを示唆する。
【０１３４】
【表８】
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【０１３５】
ＳＴ７７２リポソームを用いた、ヒーラー細胞におけるプラスミドＤＮＡの感染
図１および図２は、ヒーラー細胞におけるＳＴ７７２リポソームのプラスミドＤＮＡ感染効率を示す。この目的のために、ＳＴ２７２および、参考カチオン脂質としてＤＯＴＡＰを用いて感染させた細胞から抽出したＤＮＡの濃度分析を行った。ブロット分析の結果は、ＤＯＴＡＰを用いて得られるものと同じ大きさのオーダーのプラスミドＤＮＡの量を明らかにしている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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