(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光合成細菌と乳酸菌と酵母とからなる複合菌を有効成分とする非アルコール性脂肪性肝疾患および／または非アルコール性脂肪肝炎の治療薬であって、
前記光合成細菌は、ロドシュードモナス・パルストリスであり、
前記乳酸菌は、ラクトバシラス  カゼイおよび／またはラクトバシラス  プランタルムであり、
前記酵母はサッカロマイセス  セレビシエである、非アルコール性脂肪性肝疾患および／または非アルコール性脂肪肝炎の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光合成細菌と乳酸菌と酵母とからなる複合菌を有効成分とする非アルコール性脂肪性肝疾患および／または非アルコール性脂肪肝炎の治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
いわゆるメタボリックシンドロームとは、個々の危険因子が重症でない場合でも、重積することにより動脈硬化などの心血管系疾患の発症リスクが顕著に高くなるとの疫学的な知見から、高脂血症、糖尿病および高血圧を危険因子とし、これらを総合的に管理することが効果的な疾患と考えられている。現在、食生活やライフスタイルの変化によりメタボリックシンドロームを発症する個体が増加しており、その多くで肝臓における脂肪蓄積が観察されている。脂肪組織は脂肪蓄積のみならずホルモン、炎症、免疫系などの機能発現と密接に関連している。よって、メタボリック症候群では脂肪細胞の増加に伴って脂肪組織の機能失調が起こり、アディポカインであるアディポネクチンの分泌が減少し、逆に炎症性サイトカインのＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１の産生が増加し、結果として脂肪組織が炎症状態となっている。
【０００３】
現在、成人の２０％に脂肪肝が観察されるようになった。脂肪肝の主な原因は、大量飲酒と過栄養である。飲酒を経ずに肝疾患症状を呈する非アルコール性脂肪性肝疾患（Ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ、以下ＮＡＦＬＤと称する。）は、良性の病気で進行しないと軽視されていたが、肝炎から肝硬変ついには肝臓がんに移行する例が増加し、見逃せない疾患となっている。なお、ＮＡＦＬＤが進行し肝実質への脂肪沈着とともに炎症性細胞の浸潤や肝実質の障害、線維化を介して肝硬変に至る疾患は、非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ  以下ＮＡＳＨと称する。）と称される。脂肪滴の沈着した肝臓に炎症性細胞浸潤、マロリー小体、肝細胞の風船様腫大などの肝細胞変性、肝線維化所見が加わった病態である。ＮＡＳＨは、前記したメタボリックシンドロームの肝臓における表現型と見なされている。高度肥満者の多い米国において急増しているが、日本でも生活スタイルの欧米化に伴いＮＡＳＨ患者が増加すると予想されている。
【０００４】
ＮＡＳＨは、その背景にインスリン抵抗性を有する場合が多く、インスリン抵抗性改善薬であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒγ  以下、ＰＰＡＲγと称する。）アゴニストであるピオグリタゾンが脂肪肝炎の病態を改善するとの報告がある（非特許文献１）。また、インスリン抵抗性改善に関与するＡＭＰキナーゼのアクチベーターの投与によって脂肪肝炎の病態が改善されたとの報告もある（非特許文献２）。また、肥満・インスリン抵抗性に関与するアディポサイトカインのシグナル欠損が、ストレスタンパク質メタロチオネインの発現誘導の抑制を介して脂肪肝炎発症への易感受性を惹起するとの報告もある（非特許文献３）。更に、アディポサイトカインの一種であるＴＮＦαがＴＩＭＰ−１の発現増強を介してＮＡＳＨ病態における肝線維化を促進するとの報告もある（非特許文献４）。
【０００５】
ＮＡＳＨは進行性の疾患であるため、その治療法の確立は急務である。ここに、動物性タンパク質を、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、ロイコノストック属、ラクトコッカス属、ラクトバチルス属、及びペディオコッカス属のいずれかに属する乳酸菌群から選択される少なくとも１種類の乳酸菌を用いて乳酸発酵させることにより得られ、肝臓中の脂質量を低下させる活性を有することを特徴とする動物性タンパク質の乳酸発酵物が開示されている（特許文献１）。乳酸菌で魚肉及び畜肉を発酵させた乳酸発酵物が胆汁酸結合能を有することを見いだしたものである。
【０００６】
また、肝炎の治療剤としてラクトフェリンを有効成分とするＢ型慢性肝炎治療剤もある(特許文献２）。ラクトフェリンにビフィドバクテリウム属に属する微生物、ラクトバチルス属に属する微生物およびストレプトコッカス属に属する微生物などの１種からなるプロバイオティクスとプレバイオティクスとしてオリゴ糖とを含む混合物は、一時的に緩和にアラニンアミノトランスフェラーゼ値が上昇して宿主の免疫賦活化が確認された後、Ｂ型肝炎に対して有効率が高い治療効果が導かれ、かつ治療に対する副作用もないという。
【０００７】
一方、光合成細菌を有効成分とする動脈硬化指数低下剤もある(特許文献３）。細胞壁を破砕した光合成細菌の乾燥粉末を有効成分とするもので、動脈硬化の予防および改善に優れた効果を有するという。菌体中の成分がより効果的に作用するため、細胞壁を破砕したものを用いることが好ましいという。実施例では、ウィスター系雄ラットを通常飼料で３日間飼育した後、コレステロールを１％添加した改変飼料、光合成細菌の凍結乾燥粉末を０．２重量％、または２．０重量％添加した群の総コレステロール、ＴＧなどを測定したところ、０．２重量％、２．０重量％の添加で総コレステロール値、ＴＧが低下するという結果を得ている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−１７８３９８号公報
【特許文献２】特許第４０８７２４９号公報
【特許文献３】特表２００８−５６４５０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｓ  Ａｌｃｏｈｏｌ−Iｎｄｕｃｅｄ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  ｉｎ  Ｒａｔｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃ−Ｍｅｔ，  Ｋ  Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１２６，ｐ８７３−８８５，２００４
【非特許文献２】ＡＩＣＡＲ，ａｎ  ＡＭＰＫ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ，Ｈａｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  Ａｌｃｏｈｏｌ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  ｉｎ  Ｒａｔｓ，Ｋ  Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．, Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．１２，ｐｐ２４０ｓ−２４５ｓ，２００５
【非特許文献３】Ｌｅｐｔｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒａｔｓ  ｔｏ  ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ，  Ｋ  Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，ｖｏｌ.２８７  ｐｐＧ１０７８−Ｇ１０８５，２００４
【非特許文献４】Ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  α  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｕｐｆｆｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｐｌａｙｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，Ｋ  Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｔ，ｖｏｌ．５５，ｐｐ４１５−４２４，２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
近年、抗生物質（アンティバイオティクス）の副作用や、抗生物質によって生まれた耐性菌の発生に対する批判から、体内環境を整えるために乳酸菌などの有用菌を食品から摂取することで消化器系のバランスを改善し、病気の発生を未然に抑えることができるプロバイオティクスが、脚光を浴びている。たとえば、微生物の中で人間や動物、作物や自然環境に対して無害で有益な働きを持つ微生物は有用微生物と称され、光合成細菌、乳酸菌、酵母、放線菌、糸状菌、担子菌、枯草菌などが知られている。光合成細菌は、光をエネルギー源として抗酸化物質、アミノ酸、糖類、各種生理活性物質を生成し、乳酸菌が生成する乳酸や酢酸は、抗菌力が強いため有害菌の増殖を抑制することができる。また、酵母は、糖をアルコールに変えるほか他の有用菌の活性を増進させることができる。更に、放線菌は、抗菌物質を生成し、糸状菌は、繊維質など難分解性の炭水化物を分解し、糖化させることができる。このような有用微生物を利用した発酵は、味噌、醤油、その他の発酵食品の生産に必須の工程である。たとえば、光合成細菌は、自然界に広く分布する細菌であり、太陽光をエネルギー源として水素と二酸化炭素を栄養源として光合成を営み、有機物の資化能力に優れアミノ酸やビタミンを豊富に含む利点がある。
【００１１】
ＮＡＳＨは、ＮＡＦＬＤが重篤化した疾患であり、ＮＡＦＬＤの改善はＮＡＳＨの予防を意味する。ＮＡＦＬＤの多くは生活習慣病に由来し、長期投与を考慮すれば安全性に優れる微生物製剤によってＮＡＳＨを予防し治療できることが好ましい。しかしながら、いまだ微生物を使用しＮＡＳＨ治療などに有効なプロバイオティクスは存在しない。
【００１２】
たとえば、上記特許文献１で使用する乳酸発酵物は、乳酸菌の菌体を含まない状態で胆汁酸結合能を有すると共に、ラット等において、肝臓中の中性脂肪及びコレステロールの量を低減させる作用、並びに肝臓中の脂肪細胞等における中性脂肪及びコレステロール含有量を低下させる作用を有する。しかしながら、肝炎の治療効果に関する記載は存在しない。
【００１３】
また、特許文献２は、ラクトフェリンと共にラクトフェリンにビフィドバクテリウム・ロンガム菌末を内服するものである。しかしながら、ラクトフェリン単独投与に対してビフィドバクテリウム・ロンガム菌末を併用することで免疫賦活化を観察するものであり、ビフィドバクテリウム・ロンガム菌末自体の肝炎治癒効果を観察するものではない。
【００１４】
更に、特許文献３は、光合成細菌の凍結乾燥品を経口摂取して光合成細菌投与群で総コレステロール値、ＴＧの低下を観察しているが、健常マウスに飼料を自由摂取させたものである。光合成細菌投与群では、摂餌量および摂餌効率が低下しており、光合成細菌による肝機能への直接の効果は不明である。
【００１５】
上記現状に鑑み、本発明は、光合成細菌と乳酸菌と酵母とからなる複合菌を有効成分とするＮＡＦＬＤおよび／またはＮＡＳＨの治療薬を提供することを目的とする。
【００１６】
本発明は、液剤、ゲル状剤、またはカプセルの形態にある、ＮＡＦＬＤおよび／またはＮＡＳＨの治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、光合成細菌と乳酸菌と酵母とからなる複合菌について詳細に検討したところ、メチオニン・コリン欠乏食を与えた肥満糖尿病ラットに光合成細菌からなる治療薬を投与すると催炎因子が低下して肝炎の改善効果があることを見出し、本発明を完成させた。また、肥満を伴う糖尿病モデル動物であるｄｂ／ｄｂマウスに上記治療薬を投与すると、糖新生阻害効果が確認された。
【００１８】
すなわち本発明は、光合成細菌と乳酸菌と酵母とからなる複合菌を有効成分とするＮＡＦＬＤおよび／またはＮＡＳＨの治療薬であって、前記光合成細菌は、ロドシュードモナス・パルストリスであり、前記乳酸菌は、ラクトバシラス  カゼイおよび／またはラクトバシラス  プランタルムであり、前記酵母はサッカロマイセス  セレビシエである、ＮＡＦＬＤおよび／またはＮＡＳＨの治療薬を提供するものである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、光合成細菌と乳酸菌と酵母とからなる複合菌を有効成分とするＮＡＦＬＤおよび／またはＮＡＳＨの治療薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】（Ａ）は、実施例１の血清ＡＳＴの、（Ｂ）は血清ＡＬＴの結果を示す図である。
【図２】（Ａ）は実施例１の肝ＴＧの、（Ｂ）は対照群のＨＥ染色像の、（Ｃ）は製造例１の治療薬のＨＥ染色像の結果を示す図である。
【図３】（Ａ）は実施例１の肝ＰＡＩ−１の、（Ｂ）は肝ＴＮＦαの結果を示す図である。
【図４】（Ａ）は、実施例２の空腹時血糖の、（Ｂ）はインスリン濃度の結果を示す図である。
【図５】（Ａ）は、実施例２の総コレステロール値の、（Ｂ）は血清ＴＧの結果を示す図である。
【図６】（Ａ）は、実施例２の血清ＡＳＴの、（Ｂ）は血清ＡＬＴの結果を示す図である。
【図７】（Ａ）は、実施例２の肝ピルベートカルボキシラーゼの、（Ｂ）はグルコース６−フォスファターゼの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の第一は、光合成細菌と乳酸菌と酵母とからなる複合菌を有効成分とするＮＡＦＬＤおよび／またはＮＡＳＨの治療薬であって、前記光合成細菌は、ロドシュードモナス・パルストリスであり、前記乳酸菌は、ラクトバシラス  カゼイおよび／またはラクトバシラス  プランタルムであり、前記酵母はサッカロマイセス  セレビシエであるＮＡＦＬＤおよび／またはＮＡＳＨの治療薬である。メタボリックシンドロームの多くは脂肪肝であり、ＮＡＦＬＤやＮＡＳＨが脂肪肝であることと共通する。また、メタボリックシンドロームの多くが肥満に起因するインスリン抵抗性を有する点でもＮＡＦＬＤやＮＡＳＨと共通し、ゆえに、ＮＡＳＨはメタボリックシンドロームの肝臓における表現型と見なされている。したがって、ＮＡＦＬＤやＮＡＳＨを予防し治療しうる薬剤は、メタボリックシンドロームの予防および治療剤であることを意味する。本発明では、メチオニン・コリン欠乏食に給餌によりＮＡＳＨ様病態を誘発したマウスに光合成細菌を含む複合菌を投与すると肝炎の治癒効果が観察され、これは非アルコール性脂肪性肝疾患および／または非アルコール性脂肪肝炎の治療薬として有用であることを意味する。
【００２３】
本発明では、光合成細菌を使用する点に特徴がある。光合成細菌は安価に入手でき、前記特許文献３に示すように、血清ＴＧを低下させることができ、かつ安全性に優れるからである。ただし、特許文献３は、光合成細菌の細胞壁を破砕した乾燥粉末を使用するものであり、光合成細菌を完全な形態でプロバイオティクスとして使用した例や、ＮＡＳＨの治療剤として使用した例は存在しない。
【００２４】
本発明の治療剤で使用する光合成細菌とは、広くは光合成を行う真正細菌の総称であり、紅色細菌や紅色非硫黄細菌などを含む。光合成を行うのはシアノバクテリア、紅色細菌、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、ヘリオバクテリアであり、紅色細菌は栄養的分類から紅色硫黄細菌と紅色非硫黄細菌に分けられる。紅色細菌は、光合成細菌のうち酸素を発生せず、カロテノイドの蓄積により赤色ないし褐色を呈する。本発明では、紅色非硫黄細菌を好適に使用することができる。好ましくはロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）である。より好ましくは、本発明で使用する光合成細菌としては、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターの受託証（通知年月日２０１１年１２月５日、通知番号１１−３０９）に記載の通り、２０１１年１１月２４日付で寄託した受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−１１６６に基づく受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１１６６として寄託されたＲｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  ＴＰＲ００１株(以下、単にＮＩＴＥ  Ｐ−１１６６と称する。）である。通性嫌気性であるため、嫌気条件、好気条件で生育しうるからである。なお、光合成色素や光合成に関与するタンパク質の合成は好気条件下では行われず、生育環境が嫌気的になって初めて合成が開始される。
【００２５】
本発明の治療薬に配合しうる乳酸菌としては、ラクトバシラス属、ビフィドバクテリウム属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、リューコノストック属、ストレプトコッカス属などがあり、いずれも好適である。本発明では特にラクトバシラス属、ストレプトコッカス属、リューコノストック属などの乳酸菌は、糖類を資化できるため好ましい。
【００２６】
ラクトバシラス属の乳酸菌としては、ラクトバシラス  カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバシラス  プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバシラス  ラクティス（Lactobacillus lactis）、ラクトバシラス  アミロフィルス（Lactobacillus amylophilus）、ラクトバシラス  サシドフィルス（Lactobacillu sacidophilus）、ラクトバシラス  ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバシラス  サンフランシスコ（Lactobacillus sanfrancisco）、ラクトバシラス  フェルメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバシラス  ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバシラス  ラムノズス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバシラス  パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）などがある。
またストレプトコッカス属の乳酸菌としては、ストレプトコッカス  ファエカリス（Streptococcus faecalis）、ストレプトコッカス  ファエシウム（Streptococcus faecium）などがある。
またリューコノストック属の乳酸菌としては、リューコノストック  マエセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、リューコノストック  ラクティス（Leuconostoc lactis）などがある。
【００２７】
本発明の治療薬では、複数の乳酸菌を併用することができる。使用する乳酸菌数は、光合成細菌１細胞に対し０．５〜１０００倍の乳酸菌、より好ましくは１〜１００倍の乳酸菌である。この範囲でＮＡＦＬＤやＮＡＳＨの治癒効果に優れるからである。
【００２８】
本発明の治療薬に配合しうる酵母としては、サッカロマイセス属、カンジダ属、トルロプシス属、ジゴサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、デバリオマイセス属、ゲオトリクム属、ウィッケルハミア属、フェロマイセス属などがある。本発明では、出芽酵母であるサッカロマイセス属、や分裂酵母であるシゾサッカロマイセス属、カンジダ属などを好適に使用することができる。好ましくは、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。酵母は、タンパク分解酵素を含み、タンパク質をペプチドやアミノ酸に分解することができ、また、酵母が体内で摂取した糖から、ビタミンやアミノ酸などを生産することができる。
本発明の治療薬では、光合成細菌１細胞に対し０．０１〜１００倍の酵母、より好ましくは０．１〜１０倍の酵母が配合される。
【００２９】
本発明の治療薬には、更に本発明の効果を損なわない範囲で麹菌、枯草菌、糸状菌などを含むものであってもよい。
【００３０】
本発明の治療薬は、上記菌を生菌状態で使用するものである。上記した菌は、いずれも市販されているため、これを混合して本発明で使用する複合菌を調製することができる。たとえば、乳製品、黒蜜、酵母エキスなどを含む培養液や、ＹＭ培地、ＭＲＳ培地に上記した光合成細菌、乳酸菌、酵母をそれぞれ別個に前培養し、培養液中の菌濃度を測定する。光合成細菌に対して、上記範囲となるように乳酸菌と酵母とを混合して複合菌液を調製する。この複合菌液を必要に応じて遠心やろ過などにより濃縮し、１ｍｌあたりの菌数が１×１０７〜１×１０１２の濃縮複合菌液に調整する。
この複合菌液や濃縮複合菌液は、そのままＮＡＦＬＤやＮＡＳＨの治療薬として使用することができるが、他の分散媒その他を添加し、製剤化してもよい。なお、上記した前培養液や濃縮複合菌は、冷凍や凍結乾燥などで保存することができる。
【００３１】
本発明の治療薬は、使用する複合菌が生菌であれば乾燥物であってもよい。したがって、上記複合菌液や濃縮複合菌液を凍結乾燥してなる粉末物を本発明の治療剤として使用することができる。このような粉末物には、本発明の効果を損なわない範囲で矯味、矯臭剤などを添加することができる。このような粉末物に更に澱粉や乳糖などの賦形剤を添加し、粉末状の散剤としたり、打錠して錠剤としたり、または顆粒に造粒して顆粒剤とすることができる。更に、上記粉末をカプセルに充填してカプセル剤とすることができる。
【００３２】
上記複合菌液や濃縮複合菌液に矯味、矯臭剤を添加してシロップ剤やゼリー剤とすることができる。幼児や嚥下が困難な老人にも好適に服用することができる。
【００３３】
本発明の治療薬は、消化器官内に投与できればよく、経口投与のほか経管により胃、腸などの消化器官に導入するものであってもよい。投与量は、上記複合菌の組成によって適宜選択できるが、本発明の治療薬に含まれる光合成細菌が１×１０５〜１×１０１５個／日、より好ましくは１×１０６〜１×１０１２個／日となるように投与する。
【００３４】
本発明の治療剤は、ＮＡＦＬＤやＮＡＳＨの治療のみならずこれらの予防薬としても使用することができる。
【実施例】
【００３５】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
【００３６】
（製造例１）
光合成細菌（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ：ＮＩＴＥ  Ｐ−１１６６）を、ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス２ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｇ、蒸留水１リットルを含む培地にて、５０００ルクスの蛍光灯照射下、２７℃、２週間、静置嫌気条件で前培養した。
また、乳酸菌として、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ：  ＩＦＯ（ＮＢＲＣ）  １５８８３）と乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ：ＡＴＣＣ  ８０１４）とを、それぞれ別個にＭＲＳ培地にて３７℃、３日間、静置嫌気条件にて前培養した。
また、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：ＡＴＣＣ番号  １１９０９）をＹＭ培地にて３３０℃、３日間、静置嫌気条件で前培養した。
上記のように前培養したそれぞれの菌を、マイクロチューブに全量を１．２ｍｌ、２００μＬあたり表１の菌数になるように混合した。
その後、７０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ遠心分離を行い、上清０．９ｍｌを除去後、除去した液体培地と同量の分散媒（森永脱脂粉乳２０％  ｗ／ｖ）を加え、１．２ｍｌとした。これを治療剤とした。
【００３７】
【表１】
0005525511.tif 000002
【００３８】
(実施例１）
８週令Ｃ５７ＢＬ６／Ｎ  雄性マウスを２群に分け、メチオニン・コリン欠乏食と分散媒（森永乳業株式会社製、森永脱脂粉乳  ２０％（ｗ/ｖ））、メチオニン・コリン欠乏食と製造例１の治療剤とをそれぞれ１２週間に亘り、摂取させた。
投与後、肝臓を採取し、肝ＴＧを測定した。肝臓組織の一部は、４％パラホルムアルデヒド固定し、パラフィン切片を作成した。ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、肝臓組織像を評価した。血清および組織サンプルは、−８０℃で保存し、血清ＡＳＴ、血清ＡＬＴ、血清ＴＧ、肝臓組織免疫組織化学染色を行った。血清ＡＳＴおよび血清ＡＬＴの結果を図１に示す。また、肝ＴＧおよびＨＥ染色像の結果を図２に示す。更に、肝臓細胞からＲＮＡ、タンパク質を抽出し、リアルタイムＰＣＲ法を用いてアディポサイトカインおよびサイトカインなどの各種パラメータの変化を定量的に評価した。肝ＰＡＩ−１、肝ＴＮＦαの結果をそれぞれ図３に示す。
【００３９】
（結果）
図１（Ａ）、図１（Ｂ）に示すように、メチオニン・コリン欠乏食が給餌されてＮＡＳＨ様病態が誘導されたマウス群に製造例１の治療剤を投与すると、血清ＡＳＴおよび血清ＡＬＴがやや低減し、肝機能が改善した。
【００４０】
図２（Ａ）に示すように、肝ＴＧ量は、メチオニン・コリン欠乏食が給餌されてＮＡＳＨ様病態が誘導されたマウス群では１１５  ＩＵ／Ｌであるが、ＮＡＳＨ様病態を誘導したマウスに製造例１の治療剤を投与した群は約９０  ＩＵ／Ｌであった。本発明の治療薬投与により肝ＴＧを７８％に低減させることができ、中性脂肪含有量の減少傾向が観察された。
【００４１】
さらに、図２（Ｂ）、図２（Ｃ）に示すように、肝臓組織像の検討においても、肝臓病態の改善傾向が認められた。すなわち、図２（Ｂ）に示すＨＥ染色の結果から、メチオニン・コリン欠乏食が給餌されてＮＡＳＨ様病態が誘導されたマウスでは、脂肪細胞が散在したが、製造例１の治療剤を投与すると、図２（Ｃ）に示すようにＮＡＳＨ様病態が誘導されたマウス群でも脂肪細胞数および脂肪細胞のサイズが縮小した。
【００４２】
図３（Ａ）、図３（Ｂ）に示すように、炎症性サイトカインである肝ＰＡＩ−１および肝ＴＮＦαは、ＮＡＳＨ様病態が誘導されたマウス群より、製造例１の治療剤を投与した群で有意差をもって低減した。製造例１の治療剤の投与により、肝臓のＰＡＩ−１、ＴＮＦαなどの催炎症性サイトカインの産生が抑制されこれにより、肝臓保護作用が発揮されたことが示唆される。
【００４３】
（実施例２）
７週令の雌性、レプチンレセプター欠損マウス（ｄｂ／ｄｂ）を２群に分け、一方に分散媒（森永乳業株式会社製、森永脱脂粉乳  ２０％（ｗ/ｖ））を、他方に製造例１の治療剤を４週間投与した。
投与後、一晩絶食の後採血および肝臓を採取した。血清および組織サンプルは、−８０℃で保存し、空腹時血糖、インスリン濃度、総コレステロール値、血清ＴＧ、血清ＡＳＴ、血清ＡＬＴを行った。空腹時血糖およびインスリン濃度の結果を図４に示す。また、総コレステロール値、血清ＴＧの結果を図５に示す。また、血清ＡＳＴおよび血清ＡＬＴの結果を図６に示す。更に、肝臓細胞からＲＮＡ、タンパク質を抽出し、リアルタイムＰＣＲ法、ウェスタンブロッド法、免疫沈降法を用いてアディポサイトカインおよびサイトカインなどの各種パラメータの変化を定量的に評価した。肝ピルベートカルボキシラーゼおよびグルコース６−フォスファターゼの結果を図７に示す。
【００４４】
(結果）
図４（Ａ）に示すように、製造例１の治療剤を投与しても、空腹時血糖値に変化はなかった。しかしながら、図４（Ｂ）に示すように血清インスリン値は低減し、インスリン抵抗性の改善が示唆された。なお、図５（Ａ）、図５（Ｂ）に示すように総コレステロール値およびＴＧ値は変動がないが、図６（Ａ）、図６（Ｂ）に示すように、血清ＡＳＴ値およびＡＬＴ値はやや低減している。更に、図７（Ａ）、図７（Ｂ）に示すように、糖新生に関する酵素である肝ピルベートカルボキシラーゼおよびグルコース６−フォスファターゼの発現量が低減している。本発明の治療薬の作用機序は明確ではないが、糖新生に関わる酵素の発現量の低減も関与すると推察される。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明は、光合成細菌や乳酸菌、酵母をプロバイオティクスとして使用し、ＮＡＦＬＤやＮＡＳＨの治療薬として使用するもものであり、有用である。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図２】
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