(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
近位端および遠位端を有する光ファイバー部と、
前記光ファイバー部の遠位端上に形成される第１および第２反射面であって、透明光学要素を介して離隔されて、前記光ファイバー部の近位端に入射した光が該第１および第２反射面で反射して干渉シグナルを生じるように配置された前記第１および第２反射面と、
前記第１反射面上に形成される、検体結合分子の堆積であって、当該検体結合分子の堆積に対する検体分子の結合が干渉シグナルの変化を生じさせるものと、
前記光ファイバー部に固定されるコネクタ構造と、
を備えた検出チップであって、
前記コネクタ構造は、この検出チップの取り付け先である光学的結合アセンブリのチップコネクタに対して取り外し自在に取り付けられるものであり、この取り付けは、前記光ファイバー部の前記近位端が前記チップコネクタ内に収容された１つ以上の光ファイバに光学的に結合されるようになされ、該コネクタ構造は、前記光ファイバー部の近位端と前記チップコネクタ内に収容された前記１つ以上の光ファイバとの間に空隙を維持するように構成されており、
前記チップコネクタがフェルールを含み、該フェルールが前記１つ以上の光ファイバを収容しており、この検出チップが前記チップコネクタに取り外し可能に取り付けられるとき前記コネクタ構造が前記フェルールと直接的に係合し、
前記光ファイバー部は、前記コネクタ構造内で支えられた部分と前記コネクタ構造内で支えられていない部分とを有し、該支えられた部分を介して前記コネクタ構造によって支えられていて、該支えられていない部分に剛性を持たせるように短くなっており、
前記コネクタ構造が、その中に前記光ファイバー部が取り付けられる中心孔と、可撓性の把持アームとを備え、前記可撓性の把持アームは前記フェルール上をスライドし、前記チップコネクタの前記１つ以上の光ファイバに対する位置に前記光ファイバー部を保持するための摩擦力を前記フェルール上で維持するように構成されており、かつ、前記可撓性の把持アームの係合端が面取りされていて、前記コネクタ構造へ前記フェルールを挿入できるようなっており、
前記コネクタ構造を手で把持してスライドさせることにより前記チップコネクタに対して脱着可能であることを特徴とする使い捨て可能な検出チップ。
【請求項２】
前記検体結合分子の堆積は、前記光ファイバー部の遠位端のチップに形成された検体結合分子の層であり、これにより、前記光ファイバー部の遠位端を溶液に浸すと前記検体結合分子の層が前記溶液にさらされる、ことを特徴とする請求項１に記載の使い捨て可能な検出チップ。
【請求項３】
前記検体結合分子の堆積が、前記光ファイバー部の遠位端のチップに形成された検体結合分子の層であり、前記第1反射面は前記検体結合分子の層を含み、これにより、前記光ファイバー部の遠位端を溶液に浸すと前記検体結合分子の層が前記溶液にさらされる、ことを特徴とする請求項１に記載の使い捨て可能な検出チップ。
【請求項４】
前記第１および第２反射面が少なくとも５０ｎｍ離間する、ことを特徴とする請求項１に記載の使い捨て可能な検出チップ。
【請求項５】
前記空隙が１００ｎｍ未満である、ことを特徴とする請求項１に記載の使い捨て可能な検出チップ。
【請求項６】
前記空隙が２μｍと５ｍｍの間である、ことを特徴とする請求項１に記載の使い捨て可能な検出チップ。
【請求項７】
前記空隙によって、前記光ファイバー部の近位端と前記チップコネクタに収容される光ファイバとの横方向ミスアライメントに対する光学的結合の感度が低下する、ことを特徴とする請求項１に記載の使い捨て可能な検出チップ。
【請求項８】
前記フェルールがＳＭＡフェルールである、ことを特徴とする請求項１に記載の使い捨て可能な検出チップ。
【請求項９】
前記コネクタ構造が平坦な係合面を含み、前記平坦な係合面が前記光ファイバー部の近位端と略面一であり、前記平坦な係合面と前記フェルールとが接触することによって前記光ファイバー部の近位端と前記チップコネクタに収容される光ファイバとの間に空隙を維持する、ことを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の使い捨て可能な検出チップ。
【請求項１０】
前記コネクタ構造が一体構造である、ことを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の使い捨て可能な検出チップ。
【請求項１１】
前記チップコネクタに収容される前記１つ以上の光ファイバが、１つ以上の入力側光ファイバと１つ以上の出力側光ファイバとを備え、前記１つ以上の入力側光ファイバおよび前記１つ以上の出力側光ファイバが中心軸周りに対称に配置される、ことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の使い捨て可能な検出チップ。
【請求項１２】
前記チップコネクタに収容される前記１つ以上の光ファイバが、
１つの入力側光ファイバと、
２つ以上の出力側光ファイバと
を備え、前記出力側光ファイバが、前記入力側光ファイバを中心にしたパターンで配置される、ことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の使い捨て可能な検出チップ。
【請求項１３】
前記光ファイバー部が多重モードのファイバを備える、ことを特徴とする請求項１乃至１２のいずれかに記載の使い捨て可能な検出チップ。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれかに記載の前記使い捨て可能な検出チップを使用して検体を検出するための装置であって、光学的結合アセンブリを具備し、
該光学的結合アセンブリが、
光源に光学的に結合するための光源用コネクタアセンブリと、
１つ以上の前記使い捨て可能な検出チップを取り外し可能に取り付けるためのチップコネクタアセンブリと、
前記光源用コネクタアセンブリを前記チップコネクタアセンブリへ光学的に結合するための、１つ以上の光源用光ファイバを含む光源用ファイバーアセンブリと、
干渉シグナルを分析する検出ユニットへ光学的に結合するための検出器コネクタアセンブリと、
前記チップコネクタアセンブリを前記検出器コネクタアセンブリへ光学的に結合するための、１つ以上の検出用光ファイバを含む検出用ファイバーアセンブリと、
を有し、前記チップコネクタアセンブリが前記１つ以上の光源用光ファイバの一端と前記１つ以上の検出用光ファイバの一端とを収容したチップコネクタを含み、該光源用光ファイバの該一端と該検出用光ファイバの該一端が前記検出チップの前記光ファイバ部に空隙を介して結合されている、
ことを特徴とする装置。
【請求項１５】
前記光源用コネクタアセンブリが、前記光源用ファイバーアセンブリに収容される前記１つ以上の光源用光ファイバの他端を収容する１つ以上のフェルールを含み、、
前記チップコネクタアセンブリが、前記１つ以上の光源用光ファイバの一端と、前記１つ以上の検出用光ファイバの一端の両方を収容する１つ以上のフェルールを含み、
前記検出器コネクタアセンブリが、前記１つ以上の検出用光ファイバの他端を収容する１つ以上のフェルールを含む、
ことを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記チップコネクタアセンブリがＮ個（ただしＮ＞１）のフェルールを含み、各フェルールが、１個の検出チップと係合し、かつ、１つ以上の光源用光ファイバと１つ以上の検出用光ファイバとを含む、ことを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【請求項１７】
Ｎ＝８である、ことを特徴とする請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
Ｎ＝９６である、ことを特徴とする請求項１６に記載の装置。
【請求項１９】
前記光源用コネクタアセンブリがＮ個のフェルールを含み、前記検出器コネクタアセンブリがＮ個未満のフェルールを含む、ことを特徴とする請求項１６に記載の装置。
【請求項２０】
前記Ｎ個の各フェルールごとに、前記１つ以上の光源用光ファイバおよび前記１つ以上の検出器用光ファイバが中心軸周りで対称的に配置される、ことを特徴とする請求項１６に記載の装置。
【請求項２１】
前記Ｎ個の各フェルールごとに、前記１つ以上の光源用光ファイバが正確に１つの光源用光ファイバを含み、前記１つ以上の検出器用光ファイバが、前記光源用光ファイバを中心にしたパターンで配置された２つ以上の検出器用光ファイバを含む、ことを特徴とする請求項１６に記載の装置。
【請求項２２】
前記Ｎ個のフェルールごとに、前記１つ以上の光源用光ファイバの数が前記１つ以上の検出器用光ファイバの数とは異なる、ことを特徴とする請求項１６に記載の装置。
【請求項２３】
前記チップコネクタアセンブリが、１よりも多いＮ個の使い捨て可能な検出チップを取り外し可能に取り付け、
前記光源からの光を前記Ｎ個の使い捨て可能な検出チップのいずれかに向けるためのシャッターをさらに備える、ことを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【請求項２４】
前記光源用ファイバーアセンブリがＮ個の光源用光ファイバを含み、前記Ｎ個の光源用光ファイバは前記光源からのＮ個より多い光ファイバに光学的に結合される、ことを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【請求項２５】
前記光源用ファイバーアセンブリが多重モードのファイバのみを含み、前記検出用ファイバーアセンブリが多重モードのファイバのみを含む、ことを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中の１種以上の検体の有無、量、または結合の速度を検出するための装置および方法に関し、詳細には光ファイバ干渉法による装置および方法に関する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本願は、（ａ）２００３年１１月６日出願の米国仮出願番号第６０／５１８，０６８号および２００４年３月３１日出願の米国仮出願番号第６０／５５８，３８１号の特典を請求した、２００４年１１月４日出願の米国特許出願第１０／９８１，９０１号の一部継続出願であり、（ｂ）２００５年６月３日出願の米国仮出願６０／６９０，３２４号および２００６年６月１２日出願の米国特許出願第１１／４２３，６７１号の特典を請求する。ここに、上記すべての開示内容は、目的を問わず、その全体を参照して組み込まれる。
（連邦支援の研究または開発に関する記載）
適用なし
【背景技術】
【０００３】
検体−抗検体結合対の両メンバー間の結合イベントに基づく診断試験は、医学上、獣医学上、農学上の各用途および研究用途に広く使われている。典型的には、この方法を利用してサンプル中の検体の有無もしくは量、および／または検体が抗検体に結合する速度を算出する。典型的な検体と抗検体との結合対としては、核酸の相補鎖、抗原−抗体対、およびレセプタ−レセプタ結合剤が挙げられ、検体はこれらの対のいずれか一方のメンバーであり、抗検体分子はその相手側のメンバーである。
【０００４】
この種の診断方法は、抗検体分子が固定された固体表面を使用することが多く、この固体表面に、サンプルの検体分子が所定検出領域で特異的に、しかも高いアフィニティで結合する。この種の固相アッセイとして知られるアッセイ（分析）では、固体表面は、固定された抗検体分子への検体の結合を促進する条件下でサンプルに暴露される。この結合イベントは、例えば質量、反射率、厚み、色、または結合イベントの指標となる他の特性の変化によって直接に検出できる。検体が、例えば発色団または蛍光標識または放射性標識で予め標識化されている場合、結合イベントは、検出領域にこの検出可能な標識が存在するか、および／またはどのくらいの量が存在するかによって検出される。代替として、例えば、二次的な蛍光標識化された抗検体抗体を用いて検体を検出領域に結合させた後で検体を標識化することもできる。
【０００５】
参照してここに組み込まれた共有の米国特許第５，８０４，４５３号（'４５３特許）には、光ファイバの末端表面への検体結合を検出するように設計された光ファイバ干渉計アッセイ（分析）デバイスが開示されている。検体は、検体分子が光ファイバの末端表面に結合することによるこの表面での厚さ変化によって検出され、検体の量が多いと干渉シグナルがこの厚さに関連して大きく変化する。干渉シグナルの変化は、’４５３特許の図７ａおよび７ｂで詳細に示されるように、ファイバ末端で反射した光と、ファイバ末端に担持された結合層で反射した光との位相シフトによるものである。
【０００６】
理想的には、干渉計アッセイデバイスは、使用が簡単であるとともに経済的であり、基本的には同じデバイスで異なる種類の検体を検出できる柔軟性があり、規模による利点もある。本発明は、これらの利点のいくつかまたは全てを提供する。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、一態様において、サンプル中の検体を検出するための装置を含み、検体の有無、検体の量、または検体が検体結合分子と会合および／または分離する速度を検出する。この装置は、光源と、検出ユニットと、１つ以上の使い捨て検出チップとを含む。また、この装置は、光源から検出チップにへの光を結合し、検出チップから検出ユニットへの反射光を結合する、光学的結合アセンブリも含む。
【０００８】
この検出チップは、少なくとも５０ｎｍ離れた２つの反射面を含む。光源からの光がこの２つの反射面に向かい、この２つの反射面で反射する。反射した干渉ビームは検出ユニットに向かう。検出チップは検体結合分子の堆積も含み、この検体結合分子の堆積は、検体が検体結合分子に結合するにつれて反射ビーム間の干渉が変化するように配置されている。
【０００９】
一態様では、光学的結合アセンブリは、光源へ光学的に結合するための光源用コネクタアセンブリと、検出ユニットへ光学的に結合するための検出器コネクタアセンブリと、検出チップへ光学的に結合するためのチップコネクタアセンブリとを含む。この使い捨て検出チップは、チップコネクタアセンブリへ取り外し自在に取り付けることができ、容易に、使用チップを迅速に交換して別のタイプのチップを使用できる。光源用ファイバーアセンブリは、光源用コネクタアセンブリをチップコネクタアセンブリに光学的に結合し、検出用ファイバーアセンブリは、チップコネクタアセンブリを検出器コネクタアセンブリに光学的に結合する。
【００１０】
光学的結合アセンブリは、好ましくは標準部品で構成される。例えば、コネクタアセンブリは、好ましくは、標準的な光ファイバと、ＳＭＡフェルール等のファイバーフェルールとで構成される。一設計例では、チップコネクタアセンブリは複数のフェルールを含む。各フェルールは検出チップに光学的に結合し、光源用ファイバーアセンブリと検出用ファイバーアセンブリの両方からの光ファイバを収容する。特定の設計例では、光源用ファイバおよび検出器用ファイバはそれぞれ中心軸周りにそれぞれ対称に配置される。例えば、１つの光源用ファイバと複数の検出器用ファイバとを、光源用ファイバを中心にしたパターンで配置してもよい。
【００１１】
別の態様では、使い捨て検出チップは光ファイバー部とコネクタ構造とを含む。光ファイバー部は近位端と遠位端とを有し、検知要素は遠位端上に形成されている（すなわち、支えられている）。近位端は、チップコネクタアセンブリへ光学的に結合する。コネクタ構造は、光ファイバー部に固定され、チップコネクタに取り外し可能に取り付けることができる。例えば、コネクタ構造は、チップコネクタのフェルールを上をスライドし、そこからスライドして外すこともできる。この様式では、ファイバー部の近位端は、チップコネクタに含まれる１つ以上の光ファイバへ光学的に結合できる。
【００１２】
特定の一設計例では、コネクタ構造は中心孔を備えており、この中心孔に光ファイバー部が取り付けられる。また、コネクタ構造には可撓性の把持アームも含まれており、この可撓性の把持アームはチップコネクタのフェルール（例えばＳＭＡフェルール）をスライドする。可撓性の把持アームは、フェルールとの十分な摩擦力を維持してフェルールを光ファイバに対して適切な位置に光ファイバー部を保持する。コネクタ構造は、ファイバー部の近位端とフェルールの光ファイバ面との間に空隙を維持する。コネクタ構造は平坦な係合面を備えており、この平坦な係合面が光ファイバー部の近位端と略面一である。平坦な係合面がフェルール端と接触することによって、光ファイバー部の近位端とチップコネクタに含まれた光ファイバとの間に空隙を維持する。
【００１３】
本発明の上記の特徴ならびに他の特徴、態様および利点は、以下の記載および添付図面を参照してさらによく理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（定義）
特許請求の範囲および明細書中で使用される用語は、当業者が理解しているような通常の意味に従って解釈され、それ以外は以下に記載するように定義される。特許請求の範囲および明細書中で引用される数値範囲は、引用した範囲の境界値を含むと解釈する。
【００１５】
用語「インビボ」は、生体中で起こるプロセスを指す。
【００１６】
「検体結合」分子は、検体分子との特定の結合反応に関与可能な任意の分子を指す。特定の結合反応の例としては、限定されないが、例えば、抗体−抗原結合反応および核酸ハイブリダイゼーソン反応が含まれる。
【００１７】
「特定の結合反応」は、飽和可能（通常は可逆性）で、１つ以上の過剰な反応物と競合する結合反応を指す。特定の結合反応は、特定の結合反応の関与物質の、形状、電荷および他の結合決定因子、の相補性によって特徴付けられる。
【００１８】
「抗体」は、当該技術分野で任意の方法または最近開発された方法で調製された２つの重鎖と２つの軽鎖とを有する免疫グロブリン分子を指し、ポリクローナル抗体（例えば、哺乳動物（例えば、ヤギ、マウス、ウサギなど）に免疫源を接種することによって産生されるもの）、および周知のＫｏｈｌｅｒ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎハイブリドーマ融合技術を用いて産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。この用語には、遺伝子操作方法（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を用いて再構築されたＳＣＩＤマウスを使用する方法）によって産生された抗体、および当該技術分野で既知の表面再建技術を用いてヒト化された抗体も含まれる。
【００１９】
「抗体フラグメント」は、化学的開裂技術または遺伝子操作技術によって生成する抗体分子のフラグメント、および一本鎖抗体（ＳＣＦｖ）、例えば、遺伝子ライブラリとファージディスプレイ技術とを組み合わせて産生したものを指す。本発明に従って使用される抗体フラグメントは、通常は同種の抗原に結合する能力を保持しており、可変配列と抗原結合部位とを有する。
【００２０】
「低分子」は、約５００ダルトン未満の分子量を有する有機化合物を指す。低分子は、従来の医薬品化学、新規薬物の構造活性に関連する研究で最適化することができる薬物リード化合物を同定するスクリーニングのために有用な出発物質である。低分子薬物化合物は、通常は経口摂取可能であるという利点を有する。低分子の例としては、以下のデータベースに列挙された化合物が挙げられる：ＭＤＬ／ＡＣＤ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｄｌｉ．ｃｏｍ／）、ＭＤＬ／ＭＤＤＲ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｄｌｉ．ｃｏｍ／）、ＳＰＥＣＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｐｅｃｓ．ｎｅｔ／）、ｔｈｅ  Ｃｈｉｎａ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＮＰＤ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｏｔｒｉｄｅｎｔ．ｃｏｍ／）およびｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇの化合物サンプルデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｒｅｅｎ．ｏｒｇ．ｃｎ／）。
【００２１】
本明細書中で使用される略語としては、以下のものが挙げられる：「ｓｓ」は一本鎖を指し、「ＳＮＰ」は一本鎖ヌクレオチド多形を指し、「ＰＢＳ」はリン酸緩衝化食塩水（０．０１Ｍリン酸干渉液、０．００２７Ｍ塩化カリウムおよび０．１３７Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）を指し、「ＮＨＳ」はＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを指し、「ＭＷ」は分子量を指す。「スルホ−ＳＭＣＣ」は、スルホコハク酸イミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシ速度を指す。
【００２２】
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形をあらわす「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他の内容を明確に示していない限り、複数形のものも含むことを注記しておかねばならない。
（利点および有用性）
【００２３】
本発明の利点および有用性を、以下に詳細に説明する図面および実施例を参照して述べる。本発明の利点および有用性には、標識を使用せずに、費用および潜在的毒性を低下させて、リアルタイムで検体結合反応をモニタリングする能力が含まれる。更なる利点としては、可視波長の光源を用いた方法を実施できる。更なる他の利点は、非常に小さい体積のサンプル中で、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」空間中も含め、結合反応をモニタリングできるようにし、そして結合反応の高度な多重分析を行うためにファイバを束ねることを可能にする検出チップの光ファイバの性質によって提供される。
【００２４】
図１は模式図であり、本発明に従って構成される干渉計装置２０を示す。この装置は、その最も基本的な要素である、光源２２と、検知要素または検出チップとして機能する光学アセンブリ２６と、光学アセンブリ２６で反射した光波を干渉させて生じる干渉シグナルを検出する検出ユニット２８とを含む。光学アセンブリ２６は、図２、４、５を参照して以下詳細に説明する。
【００２５】
光源２２からの光は光学アセンブリ２６上に向けられて反射し、点線で示す光学的結合アセンブリ３０を通って検出器に入る。好ましい実施の形態において、この結合アセンブリは、光源から光学アセンブリ２６へ光を搬送する第１ファイバーアセンブリ３２（便宜上「光源用ファイバーアセンブリ」と称する）と、光学アセンブリ２６から検出器へ反射光を搬送する第２ファイバーアセンブリ３４（検出用ファイバーアセンブリ）とを含む。オプションとして、光学的結合器３６を使用してファイバーアセンブリ３２、３４を光学アセンブリ２６へ光学的に結合してもよい。
【００２６】
装置の光源は、白色光源、例えば４００ｎｍ以下から７００ｎｍ以上までの広い範囲のスペクトルにわたって、典型的には少なくとも１００ｎｍのスペクトルレンジにわたって光を発生する発光ダイオード（ＬＥＤ）等でよい。代替として、光源は、それぞれ異なる特性の波長を有する複数の光源、例えば可視光レンジ内の異なる選択波長で発光するように設計されたＬＥＤ、であってもよい。光学アセンブリへ異なる選択波長の光を向けるのに適するフィルタを用いて、一つの光源、例えば白色光源、によって同じ機能を達成することもできる。
【００２７】
検出器は、好ましくは、光学アセンブリで反射した干渉光のスペクトルを記録可能な分光計、例えば電荷結合素子（ＣＣＤ）である。代替として、光源が光学アセンブリ上へ異なる選択波長を光を向ける場合、検出器は、異なる照射波長ごとに光度を記録する単純な光検出器であってもよい。さらに別の実施の形態では、検出器は、例えば白色光源からの光度を、干渉反射波の複数の選択波長ごとに検出できるようにする複数のフィルタを含んでいてもよい。
【００２８】
図２は、本発明の一実施の形態に従って構成した光学アセンブリ２６の光学的機能部分を示す。光学アセンブリ２６は短い長さの光ファイバ２９を含み、光ファイバ２９の上に光学アセンブリの残り部分が形成されている。光ファイバ２９の他端は、ファイバーアセンブリ３２および３４のそれぞれに光学的に結合している。図から分かるように、アセンブリ２６は、透明な光学要素３８を含み、この透明な光学要素３８は第1反射面４２および第２反射面４０を有す。本発明の重要な特徴によれば、２つの反射面間の光学要素の厚さｄは少なくとも５０ｎｍ、好ましくは少なくとも１００ｎｍである。例示の厚さは、約１００〜５，０００ｎｍ、好ましくは４００〜１，０００ｎｍである。第1反射面４２は、検体結合分子、例えば分子４４、の層で形成されており、検体分子４６を特異的に高いアフィニティで結合するのに有効である。つまり、検体分子と抗検体分子とは、上記タイプの結合対の相対するものであり、このような例としては、限定されないが、抗原−抗体対、相補的な核酸、およびレセプタ結合薬剤対が挙げられる。
【００２９】
光学要素の屈折率は、好ましくは第1反射面と同じであるので光学アセンブリの下側遠位端での反射は、光学要素と検体結合分子との界面ではなく、検体結合分子が形成する層で優先的に生ずる。同様に、検体分子が光学アセンブリの下層に結合しているので、アセンブリの下端での光の反射は、光学要素と検体結合分子との界面ではなく、検体結合分子および結合された検体が形成する層で優先的に生ずる。光学要素を形成する材料の一例はＳｉＯ2であり、例えば、屈折率が約１．４〜１．５の高級な高品質ガラスである。光学要素は、透明ポリマー、例えば、好ましくは屈折率が１．３〜１．８のポリスチレンまたはポリエチレンで形成してもよい。
【００３０】
光学アセンブリに光学要素よりも実質的に高い屈折率を持つ透明材料の層として形成される第２反射面は、光学アセンブリに向けた光の一部を反射する機能を有する。好ましくは、この第２の層の屈折率は１．８より大きい。第２の層に用いる材料の一例はＴａ2Ｏ5であり、屈折率は２．１である。この層は、典型的には、従来の蒸着コーティングまたは層化プロセスによって光学要素上に形成され、その層厚は５０ｎｍ未満であり、典型的には５と３０ｎｍの間である。
【００３１】
第１の（検体結合）層の厚さは、特定のハードウェアおよび光学構成要素に基づいて総合感度が最適化されるように設計される。従来の固定化用化学物質を用いて、光学要素の下側面に検体結合分子の層を、例えば共有結合で化学的に結合させる。例えば、ＳｉＯ2との化学的結合のためのシロキサン基と；ヒドロキシル基、アミン基、カルボキシル基、または、抗原や抗体等のタンパク質または核酸などの生体分子に結合するための他の反応基と；を含有する種々の二官能試薬である。ガラス表面をエッチング等で処理を行うことにより、検体結合分子を結合させることができるヒドロキシル基の密度を高めることはよく知られている。光学要素がポリマー（例えばポリスチレン）で形成されている場合、種々の方法を利用して化学的に活性な基（例えば、アミン基、ヒドロキシル基、およびカルボキシル基）を表面に露出させることができる。
【００３２】
検体結合層は、好ましくは、光学要素の遠位面が緻密にコーティングされる条件下で形成される。それにより、検体分子はこの層に充填されるのではなくて、検体分子がこの層へ結合することにより層厚が変わるように形成される。検体結合層は、単層であっても、複層マトリックスであってもよい。
【００３３】
検体の有無、濃度、および／または検体の光学アセンブリへのに結合速度は、光学アセンブリ中の２つの反射面からの反射光線の干渉によって測定できる。詳細には、検体分子がこの表面から脱着する場合、第1反射層の平均厚さはそれによって変化する。これ以外の層の厚さは同じままであるため、２つの表面から反射した光波によって形成される干渉波はこの厚さ変化に従って位相シフトされる。
【００３４】
２つの反射ビームがあると仮定すると、第1ビームは第1表面で反射し、この第1表面は、検体結合分子および結合した検体と、周囲の媒体との間の遠位端の界面であり、第２のビームは第２表面で反射し、この第２表面は、光学要素（第１の層）と、高屈折率層（第２の層）との近位の界面である。干渉波の最終的な波長依存強度は：
【数１】
0005420897.tif 000002
式中、Ｉは強度、Ｉ1およびＩ2は２つの干渉ビームの強度、Δは光路差、λは波長である。
【００３５】
（２πΔ／λ）＝Ｎπであるとき、Ｎが整数０、１、２・・・の場合に曲線は山または谷を有する形状となる。第１の層の厚さｄ＝Δ／２ｎである。従って、山または谷でλ＝４ｎｄ／Ｎである（極値）。Ｎの最初のいくつかの値（すなわち、０、１、２、・・・７）で、ｄが７７０ｎｍであるとすると、以下の式が得られる：
Ｎ＝０：λ＝∞（山）
Ｎ＝１：λ＝４ｎｄ＝４，４９６．８０ｎｍ（谷）
Ｎ＝２：λ＝２ｎｄ＝２，２４８．４０ｎｍ（山）
Ｎ＝３：λ＝４ｎｄ／３＝１，４９８．９ｎｍ（谷）
Ｎ＝４：λ＝ｎｄ＝１，１２４．２０ｎｍ（山）
Ｎ＝５：λ＝４ｎｄ／５＝８９９．３６ｎｍ（谷）
Ｎ＝６：λ＝２ｎｄ／３＝７４９．４７ｎｍ（山）
Ｎ＝７：λ＝４ｎｄ／７＝６４２ｎｍ（谷）
Ｎ＝８：λ＝ｎｄ／２＝５６２ｎｍ（山）
Ｎ＝９：λ＝４ｎｄ／９＝４９９．６４ｎｍ（谷）
Ｎ＝１０：λ＝４ｎｄ／１０＝４４９．６ｎｍ（山）
上の式と図３Ａおよび３Ｂに更に示されるように、少なくとも３つの山／谷（Ｎ＝７〜９）が可視スペクトル範囲にある。
【００３６】
Ｎ＝７の谷を利用して分子層の厚さ変化を算出する場合、分子層が第１の層に結合すると０ｎｍ〜１０ｎｍ厚くなり、Ｎ＝７の谷は６５０．７４ｎｍへシフトする。従って、Ｎ＝７の谷の実際の位相シフトと厚さ変化との比は、（６５０．７４−６４２．４０）／１０＝０．８３４である。
【００３７】
対照的に、２つの反射層間にある初期の空間が、ファイバの末端上で全体に検体結合分子でできている場合、この層の厚さが２５ｎｍであるとすると、Ｎ＝１の山は１４６ｎｍで生じ、可視スペクトル範囲からは明らかに外れているため、このデバイスではＮ＝０の谷とＮ＝１の山との間の領域の一部分しか判別することができないばかりか、他のピークを判別することもできず、干渉波のスペクトル特性のシフトから正確に測定することは困難である。
【００３８】
反射層の全体的な厚さが約１００ｎｍ付近にならないと、Ｎ＝１の山が可視スペクトル内に現れてこない。厚さ変化が全体で５０ｎｍまでと仮定すると、光学要素の厚さは５０ｎｍであるが、好ましくは、数１００ｎｍになれば、Ｎが高次の山または谷、例えばＮ＝３〜１０、のスペクトル位置のシフトによって、干渉波の位相シフトまたは周期性変化を容易に測定できる。
【００３９】
実際の厚さと測定した位相シフトとの比は、測定感度の重要な因子であると考えられている。光学要素の厚さと光学要素の屈折率とを調整して、感度を高め、最適化して電子機器を組み合わせて最適設計する方法を理解できるであろう。
【００４０】
図４Ａは、アッセイ装置（分析装置つまり干渉計装置）２０の実装例４２０を示す。この実施例で、光学要素２６は、使い捨てチップ４２６（図４では装置の残りの部分から取り外した状態を示す）として実装されており、この装置は、使い捨てチップ４２６を一度に８個まで使用できる設計になっている。光学的結合アセンブリ３０は、ファイバーアセンブリとコネクタとの集合体４３０として実装されている。集合体４３０は、光源２２と、検出チップ４２６と、検出ユニット２８とへ着脱自在である。このモジュラ型実装により、異なる種類の光学的結合アセンブリ４３０で同じ光源２２および／または検出ユニット２８を使用でき、異なる種類の検出チップ４２６を同一光学的結合アセンブリ４３０で使用することもできる。検出ユニット２８によって対応ソフトウェアを変え、これらの変化に対応させてもよい。
【００４１】
この実施例では、光源２２から検出ユニット２８までは、５６本のファイバ４１２が、標準のＳＭＡファイバーコネクタ４１１を介して光源２２に結合されている。５６本のファイバを７本ずつ８個の束にわけて整列させる。この束はそれぞれファイバーコネクタ４１３につながっており、この束は別のファイバーコネクタ４３１と光学的に結合されている。便宜上、ファイバーコネクタ４３１は、光源２２を検出チップ４２６へ光学的に結合されているので、光源用コネクタ４３１（または集合的に光源用コネクタアセンブリ）と称する。各光源用コネクタ４３１から対応する検出チップまでのファイバ束は１本のファイバを含む。従って、各ファイバ接続４１３〜４３１は、コネクタ４１３に７本のファイバを結合し、コネクタ４３１に１本のファイバを結合する。接続全体では、５６本のファイバをコネクタアセンブリ４１３に結合し、８本のファイバを光源用コネクタアセンブリ４３１に結合する。シャッター４３５が、２つのコネクタアセンブリ４１３〜４３１間に配置される。
【００４２】
各コネクタ４１３毎に７本のファイバを束にして使用するのは、光源２２からの光の均一性を高めるためである。１本の束に７本のファイバを用いると、全部で５６本のファイバが光源２２からの光を受ける。この５６本のファイバは、光源用コネクタ４３１の１本のファイバに結合される光をより均一にするように配置できる。以下に記載するように、シャッター４３５は、検出チップ４２６へ一度に照射するために開閉して使用する。
【００４３】
光学的結合アセンブリ４３０では、光源用コネクタ４３１は、ファイバーアセンブリ４３２（光源用ファイバーアセンブリと称す）によってコネクタ４３６（チップコネクタまたは集合的にチップコネクタアセンブリと称す）に結合され、コネクタ４３６は使い捨て検出チップ４２６に結合する。光源用ファイバーアセンブリ４３２は、それぞれ１本のファイバを有する８本の束を収容する。各束の１本のファイバは別のチップコネクタ４３６で終端を成す。チップコネクタ４３６は、検出ユニット２８に結合するファイバ束４３４も含む。この実施例では、チップコネクタ４３６と検出ユニットに対するコネクタ（検出器コネクタアセンブリ４３３）との間にあるファイバーアセンブリ４３４は、それぞれ７本のファイバを有する８個の束を含む。従って、各チップコネクタ４３６は、光源用ファイバーアセンブリ４３２からの１本のファイバと、検出用ファイバーアセンブリ４３４からの７本のファイバとを含む。
【００４４】
これらのファイバは図４Ｂのように配置される。検出器用ファイバ４３４は、光源用ファイバ４３２を中心にしたパターンで配置される。この配置パターンを使用すると、ファイバ４３２、４３４と、検出チップ２６のファイバー部２９との間のミスアライメントに対する感度が低下する（図２を参照）。光源用ファイバ４３２からの光は、検出チップのファイバー部２９に結合し、干渉構造へ伝播し、反射して検出器用ファイバ４３４で集められる。図５に示すように、この実施例での光学的結合は、小さな空隙を通る直接的なファイバ間結合である。ファイバの横方向ミスアライメントにより、結合が低下してしまうが、ファイバを対称に編成すると横方向アライメントに対する感度が低下する。
【００４５】
再び図４Ａを参照すると、チップコネクタ４３６からの８本のファイバ束４３４は１個の検出器コネクタ４３３で終端を成し、干渉シグナルを分析することが可能な検出ユニット２８と光学的に結合している。
【００４６】
光学的結合アセンブリ４３０では、コネクタ４１１、４１３、４３１、４３６および４３３は、好ましくは標準のコネクタに基づいており、典型的にはＳＭＡコネクタである。全体的なコネクタ構造が使用されない場合でも、コネクタは、好ましくは、関連するファイバ束に接続する少なくとも標準フェルール（例えばＳＭＡフェルール）を使用する。光学的結合アセンブリ４３０で使用されるファイバは、この実施例では全て多重モードのファイバである。
【００４７】
図５Ａ〜５Ｃは、チップコネクタ４３６および使い捨て検出チップ４２６をさらに詳細に示す。図５Ａは、検出チップ４２６に挿入されたチップコネクタ４３６を示す斜視図である。図５Ｂは、検出チップ４２６に挿入されたチップコネクタ４３６の断面図である。図５Ｃは、チップコネクタ４３６と検出チップ４２６との光学的結合の詳細図である。
【００４８】
図５Ｂを先ず参照すると、使い捨て検出チップ４２６は光ファイバー部５２０とコネクタ構造５３０とを含む。ファイバー部５２０は近位端５２２と遠位端５２４とを有している。近位端５２２は、チップコネクタ４３６のファイバに光学的に結合している。検知構造は遠位端５２４上に形成されている。検知構造（図５Ｂには詳しく示されていない）は、典型的には２つの反射面を含む、この２つの反射面は、ファイバー部の近位端５２２で結合された光が干渉シグナルを生じるように反射する位置に配置される。検知構造は、検体結合分子の堆積も含む。検体分子がこの堆積に結合することにより干渉シグナルが変化する。検知構造の一例を図２に示す。
【００４９】
干渉の変化によって、異なる物理現象が生じる。例えば、検体が結合することにより、光路長、または２つの反射面間の物理的距離が変化する。あるいは、検体が結合することにより、反射面間に配置された材料の指数が変化するか、または光吸収率が変化する。検体が結合することにより、検体結合分子の層が膨潤し、その結果、干渉が変化する場合もある。
【００５０】
コネクタ構造５３０は、ファイバー部５２０を支えるとともに、チップコネクタ４３６に取り外し自在に取付可能である。この特定なケースでは、チップコネクタ４３６のファイバ５２５は、フェルール５２７（具体的にはＳＭＡフェルール）内に保持される。コネクタ構造５３０は、フェルール５２７がコネクタ構造５３０内にスライドして入り、摩擦力によってその位置を維持し、ファイバー部５２０とフェルール５２７内のファイバ５２５との間で光学的に結合するように設計されている。コネクタ構造５３０は、好ましくは、手でフェルール５２７と脱着できるように設計されている。
【００５１】
図５Ｂに示されるコネクタ構造は中心孔５４１を含み、その中に光ファイバー部５２０が固定されている。コネクタ構造は、可撓性把持アーム５４３も含み、この可撓性把持アーム５４３はフェルール５２７上をスライドし、フェルール５２７内の光ファイバ５２５に対する位置に光ファイバー部５２０を保持するのに十分な摩擦力をフェルール上に維持する。可撓性把持アームの端部５２３はフェルールと係合し、フェルールを容易にコネクタ構造内に挿入できるように面取りされている。
【００５２】
この特定の設計では、戻り止めは使用されておらず、フェルール５２７およびコネクタ構造５３０の設計によって適切な軸空間が達成されている。図５Ｃに詳細に示すように、コネクタ構造５３０は、平坦な係合面５４７を含み、この係合面５４７はファイバー部５２０の近位表面５２２と略面一であり、公差は±１ｍｍ未満である。挿入されると、フェルール５２７が係合面５４７に接触する。接触すると、ファイバはフェルールおよびコネクタ構造５３０内に位置決めされ、ファイバは軸上の位置に正しく配置される。
【００５３】
特に、空隙５５３は、ファイバー部５２０とフェルールのファイバ５２５との間に維持される。空隙によって、（ファイバを互いに直接接続した場合と比較して）横方向ミスアライメントに対する感度が低下し、フェルール内にファイバが同心配置される（図４Ｂ参照）ことによって、横方向ミスアライメントに対する感度は更に低下する。空隙によって、２つのファイバ−空気界面からの望ましくない反射および干渉が減る。空隙は、好ましくは１００ｎｍ未満、または２μｍ〜５ｍｍである。
【００５４】
この特定の実装では、コネクタ構造５３０は一体構造である。従って、検出チップ４２６はファイバー部５２０および一体コネクタ構造５３０の２つだけを有する（チップ上の結合化学物質を除く）。さらに、検知構造を有する支えられていない部分が剛性を持つように、ファイバー部５２０は十分に短く、コネクタ構造５３０によって十分に支えられている。検知構造の配置をより容易に予測できるので、このことは操作の自動化を容易にする。
【００５５】
図４および図５の装置は、以下のように自動化された様式で操作されてもよい。検出チップコネクタ４３６および検出チップ４２６の設計により、チップコネクタ４３６を検出チップ４２６に挿入するように、ロボット装置をプログラミングすることができる。次いで、検出チップ４２６を分析対象溶液に浸す。異なるチップを各チップコネクタに接続することができ、各チップを異なる溶液に浸すことができる。シャッター４３５を操作して一度に検出チップ４２６を照射する。８個のチャネルが標識化されたＡ−Ｈである場合、時間ｔ１にシャッター４３５Ａを開け、シャッター４３５Ｂ−Ｈを閉じる。これにより、検出チップ４２６Ａに照射し、干渉シグナルを生成し、このシグナルを検出ユニット２８によって分析する。時間ｔ２にシャッター４３５Ａを閉じ、シャッター４３５Ｂを開け、検出チップ４２６Ｂを照射するなどのやり方がある。他の種類のマルチプレクサを使用することもできる。照射順序をプログラミングすることもでき、好ましくは、検出ユニット４２８によって同時に分析が行なわれる。ロボット装置を使用済のチップから新しいチップに交換し、さらなる分析サイクルを繰り返す。他の実装例では異なる数（例えば、現在利用可能なアレイに適合する９６個）の検出チップを使用できる。
【００５６】
本発明に記載の装置は、さらに特定的には以下の用途に使用できる。
（ｉ）多量の抗体を発現する細胞株についてハイブリドーマ発現株をスクリーニングするための、チップ上で行なわれる抗種抗体を用いる用途。
（ｉｉ）抗原に対して高いアフィニティを有する抗体の特性決定をするための、チップ上で行なわれる抗原を用いる用途。
（ｉｉｉ）タンパク質に対する結合パートナ（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、有機分子）を同定し、特性決定するための、チップ上で行なわれるタンパク質を用いる用途。
（ｉｖ）炭水化物に対する結合パートナ（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、有機分子）を同定し、特性決定するための、チップ上で行なわれる炭水化物またはグリコシル部分を用いる用途。
（ｖ）結合成分を特性決定し、および／または複合体形成の反応速度論を特性決定するための、チップ上で行なわれる複数のタンパク質複合体が関与すると考えられるタンパク質を用いる用途。
（ｖｉ）低分子タンパク質結合分子に対するタンパク質を同定し、特性決定するための、チップ上で行なわれる低分子タンパク質結合分子を用いる用途。
（ｖｉｉ）検体標準のセットを用いて検体に対する較正曲線を作るための、チップ上で行なわれる抗体を有する用途。この較正曲線を用いて、未知の溶液（細胞培養上澄み液、生体サンプル、プロセス混合物等）の検体濃度を産出できる。
（ｖｉｉｉ）核酸に特異的に結合する分子を同定するための、一本鎖核酸（例えば、ｓｓＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いる用途。
【００５７】
温度制御ブロックを用いて、この装置および方法を使用してＳＮＰ分析を行うために溶液中のオリゴヌクレオチドに対する固定化したｓｓＤＮＡの結合をモニタリングし、特性決定することもできる。
【００５８】
以下の実施例には本発明の種々の方法および用途を示すが、いずれもいかなる様式であっても本発明の範囲を限定するものではない。
（実施例）
【００５９】
以下に本発明を実施するための特定の実施の形態の実施例を示す。これらの実施例は単に説明用であり、いかなる様式であっても本発明の範囲を限定するものではない。使用する数値（例えば量、温度等）の精度を確保する努力はされているものの、いくらかの実験誤差および偏差はもちろん許容されるべきである。
【００６０】
本発明の実施に際し、他に言及のない限り、当該技術の常識の範囲内にあるタンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術および薬理学の従来の方法を使用できる。この種の技術は、文献で完全に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３rd  Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ（１９９２）を参照。
【実施例１】
【００６１】
(低分子−タンパク質結合反応）
この実施例は、センサーチップに固定された低分子へのタンパク質の結合と、それに続く複数の抗体の結合とを検出する能力を示す。この試験では光ファイバのチップ上の二層構成を使用する。第１のＴａ2Ｏ5層の厚さは２５ｎｍであり、第２のＳｉＯ2層の厚さは７７０ｎｍである。このファイバはＯｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ（Ｄｕｎｅｄｉｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ）から購入した。ファイバを手で４０ｍｍ長に切断した。これらセグメントの両端を標準鏡面品質になるように研磨した。使用した研磨方法は、光学レンズおよびミラーを研磨する方法と同じであった。これらのファイバーセグメントの一面へのＴａ2Ｏ5層およびＳｉＯ2層の光学コーティングは業者に外注した。この業者は、Ｌｅｙｂｏｌｄ製イオンビームによる物理蒸着（ＩＡＰＶＤ）装置を使用した。ＩＡＰＶＤは、反射防止および光学フィルタのために一般的に使用されるコーティング技術である。実験ステップには、以下のステップが含まれる（全ステップとも他に注釈のない限り、室温で行なう）。
【００６２】
ファイバーチップをビオチンで誘導体化したポリマー単一層でコーティングした。ポリマー単一層をビオチン化脂質（特注）を用いて調製した。この脂質を使用して、水溶液表面に脂質単一層を形成した。この単一層にＵＶ光を１５分間照射して架橋した。ついで、清浄な乾燥ファイバを浮かせた薄層に接触させ、ビオチンポリマーをファイバーチップに吸着させた。次いで、ファイバを６０℃で１時間乾燥した。次いで、ファイバを周囲条件下で保存した。
【００６３】
バイオセンサーチップをＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；カタログ番号１４１９００７８）中のストレプトアビジンストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ，カタログ番号２１１２２）５０μｇ／ｍｌに９分間浸漬し、ＰＢＳで簡単にすすいだ。
【００６４】
同じチップをウサギ−抗−ストレプトアビジン（ＡｂＣａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ；カタログ番号ａｂ６６７６−１０００）のＰＢＳ溶液１０μｇ／ｍｌに３６分間浸漬し、ＰＢＳで簡単にすすいだ。
【００６５】
最後に、このチップをロバ−抗−ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ；カタログ番号７１１−００５−１５２）のＰＢＳ溶液５０μｇ／ｍＬに２５分間浸漬した。最後にＰＢＳ溶液で１０分間すすいだ。
【００６６】
図６は、この連続的な結合試験のリアルタイム応答曲線を示す。縦軸は、Ｎ＝７の谷の位相シフトをｎｍで示す。チップに固定したビオチンにストレプトアビジンが結合し、その後にストレプトアビジンに抗−ストレプトアビジン抗体が結合し、この第１の抗体に第２の抗体が結合していることを明示している。９００秒で、ストレプトアビジン層がチップから分離していることが分かる（光学的厚さが少し減っている）。
【実施例２】
【００６７】
（生体分子相互作用の反応速度論分析および生体分子相互作用のアフィニティ分析）
この実施例は、生体分子相互作用の反応速度論およびアフィニティを測定する生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）を実施するための本発明の使用を示す。実施例１と同じチップ構造を使用した。実験ステップには、以下のステップが含まれる（全ステップとも他に注釈のない限り、室温で行なわれる）。
【００６８】
メルカプトシランでコーティングされたチップを以下の手順を用いて調製した。清浄な乾燥ファイバをトルエン：ヘキサン酸：メルカプトプロピルトリオキシシラン（体積比１０：２：１）の混合物中、室温で２４時間インキュベートした。このファイバをトルエン１０ｍＬで５分間のすすぎを２回行った。次いで、このファイバをエタノール１０ｍＬで１回すすぎ、アルゴン流で乾燥し、周囲条件下に保存した。
【００６９】
最初に、バイオセンサーチップをＰＢＳ中のウサギ−ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ；カタログ番号３０９−００５−００３）１０μｇ／ｍｌに１時間浸漬するによって誘導体化した。
【００７０】
コーティングしたチップをＰＢＳ中のヤギ−抗−ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ；カタログ番号１１１−００５−００３）１０μｇ／ｍｌに浸漬し、放置した。
【００７１】
チップを取り出しＰＢＳで洗浄した。第１の抗体から第２の抗体を分離しやすくするために、ＰＢＳを手動で２０分間攪拌した。
【００７２】
次いで、ウサギ−ＩｇＧに対するヤギ−抗−ウサギの再生可能な結合を示すために、チップを同じヤギ−抗−ウサギ抗体溶液に再び浸漬した。
【００７３】
図７は、ウサギ−ＩｇＧおよびヤギ−抗−ウサギの抗体の結合および分離から生じるオン曲線およびオフ曲線を示す。縦軸は、ここでも、Ｎ＝７の谷の位相シフトをｎｍで示す。位相シフトは平均厚さと直接的に関連があり、比は０．８３４である。オン曲線およびオフ曲線を正確に検出する能力は、反応速度論およびアフィニティを測定するのに必須である。
【実施例３】
【００７４】
（抗体−抗原結合および関連する曲線からアフィニティ定数を算出）
この実施例は、２つの抗体およびこれらの抗体のオン曲線およびオフ曲線を測定することによるアフィニティ定数の計算を示す。特許品である抗体をＡｂ−ＩおよびＡｂ−２として標識化した。抗原の分子量は約３０キロダルトンであった。実施例１の記載と同じチップ構造を使用した。実施例２の記載と同じメルカプトシランファイバ調製物を使用した。実験ステップには、以下のステップが含まれる（全ステップとも他に注釈のない限り、室温で行なう）。
【００７５】
抗原と共有結合させるためにファイバーチップを活性化した。スルホ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＴＬ；カタログ番号２２３２２）のＤＭＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；カタログ番号４９４４８８）５０ｍｇ／ｍＬ溶液５０μＬに２時間センサーチップを浸漬することによって、メルカプトシランでコーティングしたファイバを活性化した。センサーチップをＤＭＦで簡単にすすいで乾燥した。
【００７６】
この活性化したチップを抗原のＰＢＳ溶液２０μｇ／ｍｌに２０分間浸漬することによって、活性化したファイバに抗原を共有結合させた。このチップをＰＢＳで２分間すすいだ。ＰＳＢですすいだ後、チップをｐＨ８．５のエタノールアミン１００μＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；カタログ番号Ｅ９５０８）水溶液で５分間クエンチし、ＰＢＳで２分間再びすすいだ。
【００７７】
同じチップを結合試験のために抗体に浸漬し、リアルタイム結合データを９〜１５分間記録した（抗体の属性および濃度に依存する）。データを記録してから、チップを再びＰＢＳに浸漬し、攪拌してオフ曲線（すなわち、固定した抗原と結合した抗体との分離）を９〜１５分間測定した。異なる濃度（２５ｎＭ、１５０ｎＭおよび４３０ｎＭ）の抗体と、Ａｂ−ＩおよびＡｂ−２として同定される２つの異なる抗体を用いて、結合（オン曲線）および分離（オフ曲線）の測定を繰り返した。
【００７８】
図８は、異なる濃度での結合および分離の曲線を示す。２５ｎＭのＡｂ−２試験は、この濃度では結合が非常に遅かったため完結しなかった。これらの図示された曲線は、生データをプロットしたものである。
【００７９】
生データを一次対数関数に合わせ、これらの曲線からＫon、ＫoffおよびＫDを誘導した。２セットのデータの平均を取り、反応速度係数およびアフィニティ係数を以下のように得た。
【表１】
0005420897.tif 000003
【実施例４】
【００８０】
（ＮＨＳ−エステルで活性化したチップ）
実施例１の記載と同じチップ構造を使用した。実施例２の記載と同じメルカプトシランファイバ調製物を使用した。スルホ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＴＬ；カタログ番号２２３２２）のＤＭＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；カタログ番号４９４４８８）５０ｍｇ／ｍＬ溶液５０μＬに２時間センサーチップを浸漬することによって、メルカプトシランでコーティングしたファイバを活性化した。センサーチップをＤＭＦで簡単にすすいで、乾燥した。
【００８１】
この表面に安定なアミド結合を形成させることによりアミンを含有する分子を共有結合させることができる。遊離アミンを含有しない分子はＮＨＳ部分を介して固定されないが、これらの分子は非特異的結合でこの表面に結合する可能性がある。この非特異的結合は複数層になることもあるが、ＮＨＳエステルを介する共有結合はＮＨＳエステルの利用可能性および接近可能性で制御された単一層である。
【００８２】
このセットの実験では、ビスアミノＰＥＧ（ＭＷ３３００）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）を試験化合物として使用し、活性化した表面に共有結合させた。ＰＥＧ（ＭＷ８０００）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；カタログ番号０４１６２）は遊離アミノ基を含有しておらず、このＰＥＧをネガティブコントロールとして用いた。このネガティブコントロールを使用して、この表面でＰＥＧポリマーに固有の任意の非特異的結合または複数層の結合について調べる。
【００８３】
図９は、活性化したメルカプトシランチップを試験分子で処理した経時経過を示す。活性化したチップは、ＰＢＳ中のビスアミノＰＥＧ（ＭＷ３３００）０．１ｍｇ／ｍＬに接触させると光学的厚さが明らかに増加することが示された。この増加は、ビスアミノＰＥＧ溶液をＰＢＳ緩衝液に変えると起こらなかった。活性化したチップを、アミンを含有していないＰＢＳ中のＰＥＧ（ＭＷ８０００）０．１ｍｇ／ｍＬに接触させると、光学的厚さが初期に少しだけ増加したが、すぐに平坦になった。このことから、ＰＥＧポリマーは固有の非特異的結合を有しておらず、ビスアミノＰＥＧで見られる結合はアミン基の特異的共有結合による固定によるものであることを結論付けることができる。
【実施例５】
【００８４】
（ＮＨＳ−エステル化化学を用いて誘導体化した抗体）
この実施例は、固定した高分子量分子への低分子量分子の結合を示す。実施例４で記載された同じＮＨＳエステルを末端に有する表面および実施例１に記載の同じチップ構造を用いて、抗−ビオチン抗体を３本のファイバに固定した。この活性化したファイバをマウス抗−ビオチン抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｓａｃｏ  ＭＮ；カタログ番号Ｈ６１５０４Ｍ）のＰＢＳ溶液２０μｇ／ｍＬに室温で１時間浸漬することによって抗体を固定化した。このチップをＰＢＳで２分間すすいだ。ＰＢＳですすいだ後、チップをｐＨ８．５のエタノールアミン１００μＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；カタログ番号Ｅ９５０８）水溶液で５分間クエンチし、ＰＢＳで２分間再びすすいだ。
【００８５】
第１のファイバをビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ；カタログ番号２９１２９）のＰＢＳ溶液２００μｇ／ｍＬと接触させた。ショ糖（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；カタログ番号Ｓ８５０１）（２ｍｇ／ｍＬ）およびＰＢＳの溶液を用いて第２および第３のファイバでコントロール試験を実施し、ベースラインノイズを決定した。これらの試験から得たデータを図１０に示す。ビオチン結合は、光学的厚さが増加していることによって確認され、ショ糖と接触させてもベースライン（ＰＢＳ）からの増加は検出されていない。
【００８６】
無関係の抗体（抗−Ｌｅｗｉｓ  Ｙ抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ；カタログ番号４３４６３６））を上述の抗−ビオチン抗体と同じ様式で固定し、別のネガティブコントロール試験を行った。この固定した抗体を２００μｇ／ｍＬビオチン溶液に接触させた。この抗体にビオチンが結合しないことは、抗−ビオチン抗体へのビオチンの結合が特異的な相互作用の結果であって、非特異的結合の結果ではないことを示す。
【００８７】
本発明は好ましい実施の形態および種々の代替の実施の形態を参照して特定的に示され、記載されるが、種々の形態および細部の変更は、本発明の精神および範囲を逸脱することなくなされることが当業者は理解できる。
【００８８】
本明細書中で引用された全ての引用文献、特許および特許出願は、目的を問わず、その内容全体が本明細書中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】バイオプローブおよびその装置のための基本システムのセットアップを示す。
【図２】本発明の一実施の形態に従って形成された光学アセンブリを示す。
【図３Ａ】７つの山および谷が順に並んだ、干渉波の一部を示す。
【図３Ｂ】図３Ａのスペクトルの可視部分を示す。
【図４Ａ】本発明による構造の光学的結合アセンブリを示す。
【図４Ｂ】図４Ａの光学的結合アセンブリのチップコネクタ中のファイバの配置を示す。
【図５Ａ】図４のチップコネクタおよび検出チップの斜視図である。
【図５Ｂ】検出チップに挿入されたチップコネクタの断面図である。
【図５Ｃ】チップコネクタと検出チップとの間の光学的結合の詳細な図である。
【図６】３分子の連続的な結合を示す。
【図７】抗体の会合および分離からのオン曲線およびオフ曲線を示す。
【図８】異なる濃度で抗原に結合する２種の抗体の曲線を示す。
【図９】アミド結合形成を介した、ビスアミノＰＥＧ（ＭＷ３３００）の特異的な固定化を示し、ＰＥＧポリマーの非特異的な結合を観察するためにＰＥＧ（ＭＷ８０００）をネガティブコントロールとして使用している。
【図１０】高分子への低分子の結合、ネガティブコントロール、およびベースライン測定値を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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