(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンレベルを減少させることによる哺乳動物におけるＢ細胞調節型自己免疫障害の治療における使用のための併用薬物の製造における、ＢＬｙＳアンタゴニストおよびミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）の使用であって、前記ＢＬｙＳアンタゴニストは、ＴＡＣＩの細胞外ドメインを含むＴＡＣＩ−Ｆｃ−融合タンパク質またはその機能的フラグメントであり、そして前記ＢＬｙＳアンタゴニストおよび前記ＭＭＦは、ＢＬｙＳアンタゴニストとＭＭＦの組み合せが免疫グロブリンレベルを減少するために相乗的に作用する量において投与される、使用。
【請求項２】
減少される免疫グロブリンレベルがＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＡからなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
自己免疫疾患が、若年性関節リウマチ、ヴェグナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性神経障害、重症筋無力症、脈管炎、真性糖尿病、レイノー症候群、糸球体腎炎、自己免疫性肝炎および自己免疫性甲状腺炎からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
自己免疫疾患がループス腎炎である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
自己免疫疾患が全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）である、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
自己免疫疾患がシェーグレン症候群である、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
ＢＬｙＳアンタゴニストが１〜２．５ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与され、ＭＭＦが１〜４ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
ＢＬｙＳアンタゴニストおよびＭＭＦが、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、グルココルチコイド、プレドニゾンおよび疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）からなる群から選択された第２の免疫抑制薬を用いる療法と併用投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
ＴＡＣＩ−Ｆｃ−融合タンパク質が、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３および配列番号２５からなる群から選択されたポリペプチド配列を含み、修飾済み組織プラスミノーゲン活性化シグナル配列（配列番号４１）が前記ポリペプチド配列から除去されている請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
ＴＡＣＩ−Ｆｃ−融合タンパク質が、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３および配列番号２５からなる群から選択された分泌型ポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
ＴＡＣＩ−Ｆｃ−融合タンパク質が、配列番号２のアミノ酸３０〜１１０を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
ＴＡＣＩ−Ｆｃ−融合タンパク質が配列番号２３に示されているポリペプチド配列を含み、修飾済み組織プラスミノーゲン活性化シグナル配列が前記ポリペプチド配列から除去されている、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
ＴＡＣＩ−Ｆｃ−融合タンパク質が配列番号２３に示されている分泌型ポリペプチドを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１５】
ＴＡＣＩ−Ｆｃ−融合タンパク質が配列番号２６のポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１６】
Ｂ細胞調節型自己免疫障害の治療における使用のための、ＢＬｙＳアンタゴニストおよびミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）を含む組成物であって、前記ＢＬｙＳアンタゴニストは、ＴＡＣＩの細胞外ドメインを含むＴＡＣＩ−Ｆｃ−融合タンパク質またはその機能的フラグメントを含み、そして前記ＢＬｙＳアンタゴニストおよび前記ＭＭＦは、ＢＬｙＳアンタゴニストとＭＭＦの組み合せが免疫グロブリンレベルを減少するために相乗的に作用する量において存在する組成物。
【請求項１７】
Ｂ細胞調節型自己免疫障害を治療するための組成物を含む製造品であって、該組成物は、ＢＬｙＳアンタゴニストおよびミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）を含み、前記ＢＬｙＳアンタゴニストは、ＴＡＣＩの細胞外ドメインを含むＴＡＣＩ−Ｆｃ−融合タンパク質またはその機能的フラグメントを含み、そして前記ＢＬｙＳアンタゴニストおよび前記ＭＭＦは、ＢＬｙＳアンタゴニストとＭＭＦの組み合せが免疫グロブリンレベルを減少するために相乗的に作用する量において存在する、製造品。
【請求項１８】
減少する免疫グロブリンレベルがＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡからなる群から選択される、請求項１７に記載の製造品。
【請求項１９】
ＴＡＣＩ−Ｆｃ−融合タンパク質が、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３および配列番号２５からなる群から選択されたポリペプチド配列を含み、修飾済み組織プラスミノーゲン活性化シグナル配列（配列番号４１）が前記ポリペプチド配列から除外されている請求項１７に記載の製造品。
【請求項２０】
ＴＡＣＩ−Ｆｃ−融合タンパク質が、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３および配列番号２５からなる群から選択された分泌型ポリペプチド配列を含む、請求項１７に記載の製造品。
【請求項２１】
ＴＡＣＩ−Ｆｃ−融合タンパク質が配列番号２のアミノ酸３０〜１１０を含む、請求項１７に記載の製造品。
【請求項２２】
ＴＡＣＩ−Ｆｃ−融合タンパク質が配列番号２３に示されているポリペプチド配列を含み、修飾済み組織プラスミノーゲン活性化シグナル配列が前記ポリペプチド配列から除去されている、請求項１７に記載の製造品。
【請求項２３】
ＴＡＣＩ−Ｆｃ−融合タンパク質が、配列番号２３に示されている分泌型ポリペプチドを含む、請求項１７に記載の製造品。
【請求項２４】
ＴＡＣＩ−Ｆｃ−融合タンパク質が配列番号２６のポリペプチド配列を含む、請求項１７に記載の製造品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢＬｙＳまたはＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬ阻害および免疫抑制剤が関与する、自己免疫疾患の治療のための新規の組合せ療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リンパ球は、いくつかある白血球集団の１つである。白血球は外来性抗原を特異的に認識しこれに応答する。リンパ球には主に、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の３つのクラスがある。Ｂリンパ球は、抗体産生を担当する細胞であり、体液性免疫を提供する。Ｂ細胞は骨髄の内部で成熟し、骨髄を離れてその細胞表面上で抗原結合性抗体を発現する。自らの膜結合型抗体が特異性をもつ抗原に天然Ｂ細胞が初めて遭遇した時点で、この細胞は急速に分裂し始め、その後代は記憶Ｂ細胞および形質細胞と呼ばれるエフェクタ細胞に分化する。記憶Ｂ細胞は、比較的長い寿命を有し、原初親細胞と同じ特異性を伴って膜結合抗体を発現し続ける。形質細胞は膜結合抗体を産生しないが、その代り、分泌型抗体を産生する。分泌型抗体は、体液性免疫の主要なエフェクタ分子である。
【０００３】
さまざまな条件下でＢ細胞の表面上に見られる一群の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプタが、免疫系内のＢ細胞機能の細胞調節因子の中にある。特に、膜貫通活性化因子およびＣＡＭＬインタラクタ（ＴＡＣＩ）、ＴＮＦファミリーレセプタに属するＢ細胞活性化因子、およびＢ細胞成熟タンパク質（ＢＣＭＡ）という３つのＴＮＦレセプタが、１つまたは両方のＴＮＦリガンド−Ｂリンパ球刺激因子（ＢＡＦＦとしても知られるＢＬｙＳ、ＴＡＬＬ−１、ｚｔｎｆ４およびＴＨＡＮＫ）および増殖誘発性リガンド（ＡＰＲＩＬ）を結合させるものとして公知である。具体的には、ＴＡＣＩおよびＢＣＭＡはＢＬｙＳおよびＡＰＲＩＬの両方を結合させ、ＢＡＦＦ−ＲはＢＬｙＳのみを結合させるものとして公知である。
【０００４】
Ｂ細胞同時刺激、形質芽球および形質細胞の存続、Ｉｇクラススイッチング、増強型Ｂ−細胞抗原提示細胞機能、悪性Ｂ細胞の存続、Ｂ−１細胞機能の発達ステージＴ−１を超えたＢ細胞の発達、および完全な胚中心の形成を含めた（ただしこれらに限定すべきではない）ＢＬｙＳのさまざまな機能を遮断するために、数多くのＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストが開発されてきた。これらの分子の一部分は同様に、Ｂ細胞および免疫系のその他の構成要素に結合し、これらに対するＡＰＲＩＬの効果を遮断することもできる（Dillonら、(２００６年) Nat. Rev. Drug Dis.第５号、２３５〜２４６頁）。ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬ結合を妨害することによりＢ細胞の機能に影響を及ぼすように開発された分子としては、ＬｙｍｐｈｏＳｔａｔ−ｂ（Belimumab）（Bakerら、（２００３年）Arthritis Rheum, 第４８号、３２５３〜３２６５頁および国際公開第０２／０２６４１号（WO02/02641））などのＢＬｙＳ抗体；レセプタ−細胞外ドメイン／Ｆｃドメイン融合タンパク質例えば、特定の一実施形態としてアタシセプトを含めたＴＡＣＩ−Ｉｇ（米国特許出願第２００６００３４８５２号（U. S. Patent Applicaion.No. 20060034852））、ＢＡＦＦ−Ｒ−Ｆｃ（国際公開第０５／００００３５１号（WO05/0000351)、およびＢＣＭＡ−Ｉｇまたは、レセプタ細胞外ドメインを利用するその他の融合タンパク質が含まれる。さらなるＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストのクラスとしては、ＡＭＧ６２３、レセプタ抗体および国際公開第０３／０３５８４６号（WO03/035846）および国際公開第０２／１６３１２号（WO02/16312）の中で開示されているその他の分子といったような、そのレセプタに対する結合を遮断するためにＢＬｙＳ結合能力に依存しているその他の分子が含まれる。
【０００５】
自己免疫疾患の治療のための現行のアプローチは、望ましくない免疫反応を抑制することにある。例えば、全身性ループス腎炎（ＳＬＥ）を患う患者の腎臓が関与する重症の合併症であるループス腎炎（ＬＮ）の治療においては、いくつかの免疫抑制薬が有益であることが証明された。これらの薬物としては、シクロホスファミド（ＣＹＣ）、アザチオプリン（ＡＺＡ）、シクロスポリンＡ（ＣＳＡ）そしてミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）が含まれる（一般的精査については、Mokら、(２００３年) Ann Rheum Dis 第６２号、７９９〜８０４頁およびIaccarino ら、(２００７年) Autoimmunity Reviews 第６号、１９０〜１９５頁を参照のこと）。これらの薬物は有益ではあるものの、当該技術分野においては、自己免疫疾患を有効に治療するために免疫抑制薬物に対する応答を改善する必要性が今なお存在している。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の１つの態様は、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストおよび免疫抑制薬を投与するステップを含む、哺乳動物の体内の免疫グロブリンレベルを削減させる方法にある。１つの好ましい方法は、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストが、ＴＡＣＩの細胞外ドメインを含むＴＡＣＩ−Ｆｃ−融合タンパク質またはその機能的フラグメント、ＢＡＦＦ−Ｒの細胞外ドメインを含むＢＡＦＦ−Ｒ−Ｆｃ−融合タンパク質またはその機能的フラグメント、およびＢＣＭＡの細胞外ドメインを含むＢＣＭＡ−Ｆｃ−融合タンパク質またはその機能的フラグメントであってよいＦｃ−融合タンパク質である方法である。特に、Ｆｃ−融合タンパク質は、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５または配列番号２６のポリペプチド配列を含む。
【０００７】
別の実施形態においては、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストはＢＬｙＳ抗体、好ましくは配列番号８のアミノ酸１６２〜２７５を含む領域の内部でＢＬｙＳを結合させるＢＬｙＳ抗体、またはＬｙｍｐｈｏＳｔａｔ−ｂとして公知であるＢＬｙＳ抗体である。さらなる実施形態においては、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストは、ＴＡＣＩ抗体、好ましくは配列番号２の７２〜１０７または配列番号２の８２〜２２２を含む領域内部で、ＴＡＣＩを結合させるＴＡＣＩ抗体である。
【０００８】
本発明の方法においては、企図される免疫抑制薬の一部としては、シクロホスファミド（ＣＹＣ）、アザチオプリン（ＡＺＡ）、シクロスポリンＡ（ＣＳＡ）およびミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）が含まれるが、免疫系を抑制するあらゆる薬物が適切であり得る。この方法によって削減される免疫グロブリンレベルは、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥまたはその組合せであり得る。
【０００９】
本発明は同様に、障害を患う患者に対して治療上有効な量の免疫抑制薬およびＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストを投与するステップを含む、Ｂ細胞調節型自己免疫障害を緩和する方法をも包含する。一実施形態においては、自己免疫疾患は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、ループス腎炎（ＬＮ）、ヴェグナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性神経障害、重症筋無力症、脈管炎、真性糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、および糸球体腎炎、からなる群から選択される。この要領で具体的に治療される１つの疾患は、ループス腎炎である。
【００１０】
詳細には、自己免疫障害が関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡またはループス腎炎である場合、１実施形態においては、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストおよび免疫抑制薬は、さらに、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、グルココルチコイド、プレドニゾンおよび疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）などの第２の免疫抑制薬を用いる療法と併用投与される。
【００１１】
本発明の方法は、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストと組合せた形で自己免疫疾患を治療するのに有効であることが示されてきた免疫抑制薬を利用する。本発明の方法において使用するために企図された免疫抑制薬には、シクロホスファミド（ＣＹＣ）、アザチオプリン（ＡＺＡ）、シクロスポリンＡ（ＣＳＡ）およびミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）がある。
【００１２】
患者に対し免疫抑制薬およびＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストが投与される障害の治療または緩和方法のいずれにおいても、免疫抑制薬およびＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストは同時に投与することも逐次的に投与することもできる。具体的実施形態においては、免疫抑制物質は、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストの前に投与される。
【００１３】
免疫抑制物質およびＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストを含む組成物も提供される。
【００１４】
さらに本発明によって提供されているのは、免疫抑制物質、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストおよびラベルを含む製造品において、その組成物がＢ細胞調節型自己免疫障害を治療するためのものであることをラベルが標示している製造品である。
【００１５】
本発明の方法、組成物および製造品の実施形態のいずれにおいても、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストは、抗体である場合、キメラ抗体およびヒト化抗体を含む。
【００１６】
本発明の方法、組成物および製造品の実施形態のいずれにおいても、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストは、一実施形態において、ＢＬｙＳを結合させるレセプタの細胞外ドメインと免疫グロブリンのＦｃドメインの間の融合タンパク質、またはＦｃ−融合タンパク質である。具体的実施形態においては、Ｆｃ−融合タンパク質は、特にアタシセプトであるＴＡＣＩの細胞外ドメインを含むＴＡＣＩＦｃ−融合タンパク質、特にＢＲ３−ＩｇであるＢＡＦＦ−Ｒの細胞外ドメインを含むＢＡＦＦ−ＲＦｃ−融合タンパク質、そしてＢＣＭＡの細胞ドメインを含むＢＣＭＡＦｃ−融合タンパク質からなる群から選択される。その他の実施形態においては、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストはＢＬｙＳ抗体、特に、残基１６２−２７５を含むＢＬｙＳの１領域内でＢＬｙＳを結合させるＢＬｙＳ抗体、特にＬｙｍｐｈｏＳｔａｔ−ｂである。別の実施形態では、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストは、ヒトＢＡＦＦ−Ｒの残基２３−３８を含む領域内で結合させるものを含めたＢＡＦＦ−Ｒ抗体である。別の実施形態においては、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストは、ＴＡＣＩ抗体、ＢＣＭＡ抗体または米国特許出願第２００３−００１２７８３号（U.S.Patent Application No.2003-0012783）で記述されている通りの分子を両方共結合させる抗体である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ビヒクル、ＭＭＦ単独、アタシセプト単独そしてアタシセプトとＭＭＦという４つの治療グループについてのＩｇＧの平均値（±標準偏差）をグラフで表わしている。これらの値の全ての一対比較は、ビヒクル対ＭＭＦ単独以外の対数変換データを用いて、統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５）。
【００１８】
【図２】ビヒクル、ＭＭＦ単独、アクシセプト単独そしてアタシセプトとＭＭＦという４つの治療グループについてのＩｇＭの平均値（±標準偏差）をグラフで表わしている。これらの値の全ての一対比較は、ビヒクル対ＭＭＦ単独以外の対数変換データを用いて、統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５）。
【００１９】
【図３】ビヒクル、ＭＭＦ単独、アクシセプト単独そしてアタシセプトとＭＭＦという４つの治療グループについてのＩｇＡの平均値（±標準偏差）をグラフで表わしている。これらの値の全ての一対比較は、ビヒクル対ＭＭＦ単独以外には対数変換データを用いており、統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
免疫抑制治療は、自己免疫疾患の治療において有用であると思われるが、本明細書中で記述されている実験から、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストと免疫抑制剤の組合せの投与が、自己抗原に向けられた抗体の産生に関与すると考えられるＢ細胞内の多数のシグナル経路を遮断しかくして自己免疫条件を開始させかつ／または永続化させる治療方法である、ということが発見された。このため、かかる治療を受けている哺乳動物の体内では循環する免疫グロブリンが削減される結果となる。かかる循環免疫グロブリンは自己免疫疾患の負の症候を誘発することに少なくとも部分的に関与すると考えられていることから、ＢＬｙＳ経路に対し向けられた療法と免疫抑制薬物の組合せは、Ｂ細胞に基づく自己免疫疾患といったＢ細胞媒介型疾患を治療する新規の方法を提供する。免疫抑制薬物とＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストとの組合せ療法は、例えばループス腎炎などの或る種の疾患のための既存の治療に対するより有効な代替案を提供し得る。
【００２１】
本明細書中「自己免疫疾患」とは、個体自身の（自己）抗原および／または組織に向けて産生される抗体から生じるあらゆる非悪性疾患または障害である。
【００２２】
本明細書で使用される「Ｂ細胞枯渇」とは、薬物または抗体治療後の動物またはヒトの体内のＢ細胞レベルの治療前のレベルに比べた低下を意味する。Ｂ細胞レベルは、例えば、完全血球算定の獲得、公知のＢ細胞マーカーについてのＦＡＣＳ分析染色、および実験例で記述されているような方法による周知の検定を用いて測定可能である。Ｂ細胞枯渇は部分的なものかまたは完全なものであり得る。Ｂ細胞枯渇薬を受ける患者では、Ｂ細胞は一般に、その薬物が患者の体内を循環している時間とＢ細胞が回復する時間の長さだけ枯渇させられる。
【００２３】
「免疫抑制薬」は、免疫系を妨害し、外来性または自己抗原に対するその応答を鈍らせるあらゆる分子である。シクロホスファミド（ＣＹＣ）およびミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）がこの種類の２つの分子である。この用語は、免疫系をダウンレギュレートする上での治療薬として有用なあらゆる薬物または分子を包括するよう意図されている。この方法は特に、自己免疫疾患、例えば関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、ループス腎炎（ＬＮ）、ヴェグナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性神経障害、重症筋無力症、脈管炎、真性糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、および糸球体腎炎を治療するために使用される薬物を企図している。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「ＢＬｙＳ」または「ＢＬｙＳポリペプチド」、「ＴＡＬＬ−１」または「ＴＡＬＬ−１ポリペプチド」または「ＢＡＦＦ」または「ＢＡＦＦポリペプチド」という用語は、「天然配列ＢＬｙＳポリペプチド」および「ＢＬｙＳ変異体」を包含する。「ＢＬｙＳ」は、ヒトＢＬｙＳ配列（配列番号７）またはマウスＢＬｙＳ配列（配列番号９）によってコードされるポリペプチドに与えられた呼称である。ＢＬｙＳ生物活性を示すポリペプチドも同様にこの呼称の中に包含される。例えば、生物学的に活性なＢＬｙＳは、試験管内または生体内で以下の事象のうちのいずれか１つまたは組合せを増強する：Ｂ細胞の存続の増大、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭレベルの上昇、形質細胞数の増加および脾臓Ｂ細胞内でのＮＦ−Ｋｂ２／１００からｐ５２ＮＦ−Ｋｂへのプロセシング（例えばBatten、Mら、(２０００年) J. Exp. Med.第１９２号：１４５３〜１４６５頁；Mooreら、(１９９９年) Science 第２８５号：２６０〜２６３頁;Kayagakiら、(２００２年)第１０号：５１５〜５２４頁）。なかでも国際公開第００／４０７１６号（WO00/40716）で記述されたＢ細胞増殖検定などのＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストをテストするための複数の検定が、当業者にとっては周知である。
【００２５】
簡単に言うと、メーカーの使用説明書に従ってＣＤ１９磁気ビーズおよびVario Macs磁気分離システム（Miltenyi Biotec Auburn, CA）を使用して、末梢血単核細胞からヒトＢ細胞を単離する。精製されたＢ細胞を、可溶性ＢＬｙＳ（２５ｎｇ／ｍｌ）および組換え型ヒトＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ  Pharmingen）と混合し、丸底９６ウェル平板上に１ウェルあたり１×１０5個の細胞の割合で細胞を平板固定する。テストすべきＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストを、約５μｇ／ｍｌから約６ｎｇ／ｍｌまで希釈させ、５日目Ｂ細胞と共にインキュベートし、４日目に１ウェルあたり１μＣｉの3Ｈ−チミジンを用いて一晩パルスで処理することができる。対照として、ＢＬｙＳを含まないＩＬ−４およびＢ細胞と共に、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストをインキュベートすることもできる。平板は、Packard平板収穫装置で収穫され、Packard読取り装置を用いて計数される。
【００２６】
「天然配列」ポリペプチドは、天然に由来する対応するポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。かかる天然配列ポリペプチドは、自然から単離され得、そうでなければ組換え型および／または合成的手段により産生することもできる。「天然配列」という用語は、具体的には、ポリペプチドの天然に発生する切断、可溶性または分泌型形態（例えば細胞外ドメイン配列）、天然に発生する変異体形態（例えば選択的スプライスによる形態）および天然に発生する対立遺伝子変異体を包含する。
【００２７】
一般に、本明細書中で開示されているポリペプチドのいずれかについての「変異体」ポリペプチドには、全長または「天然配列」アミノ酸配列のＮおよび／またはＣ末端においてならびに１つ以上の内部ドメイン内で１つ以上のアミノ酸残基が付加または欠失されている、ポリペプチドが含まれる。レセプタの細胞外ドメインについて論述する場合、天然配列ＢｌｙＳポリペプチドを結合させるフラグメントも同様に企図される。逆に言えば、ＢＬｙＳフラグメントについて論述する場合、３つのＢＬｙＳレセプタのうちのいずれか１つ以上を結合させるフラグメントが企図される。通常は、変異体ポリペプチドは、ポリペプチドまたはその特定のフラグメントと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そしてさらに好ましくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する。一般に、変異体ポリペプチドは、天然ポリペプチド配列を包含しない。通常、変異体ポリペプチドは長さが少なくともアミノ酸約１０個、多くの場合長さが少なくともアミノ酸約２０個、さらに多くの場合長さが少なくともアミノ酸約３０個、さらに多くの場合長さが少なくともアミノ酸約４０個、さらに多くの場合長さが少なくともアミノ酸約５０個、さらに多くの場合長さが少なくともアミノ酸約６０個、さらに多くの場合長さが少なくともアミノ酸約７０個、さらに多くの場合長さが少なくともアミノ酸約８０個、さらに多くの場合長さが少なくともアミノ酸約９０個、さらに多くの場合長さが少なくともアミノ酸約１００個、さらに多くの場合長さが少なくともアミノ酸約１５０個、さらに多くの場合長さが少なくともアミノ酸約２００個、さらに多くの場合長さが少なくともアミノ酸約２５０個、さらに多くの場合長さが少なくともアミノ酸約３００個である。
【００２８】
以上で言及した通り、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストは、試験管内または生体内でＢＬｙＳシグナリングを部分的または完全に遮断、阻害または無力化するため直接的または間接的に機能し得る。例えば、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストは直接ＢＬｙＳを結合させることができる。例えば、直接的結合剤は、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−ＲおよびＢＣＭＡなどのＢＬｙＳレセプタの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含むポリペプチドである。
【００２９】
本発明に関与するＢＬｙＳレセプタは、以下のように記述することができる。本発明のＴＡＣＩポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜２４６を含むかまたはこれらで構成されているＴＡＣＩポリペプチドを含む。一般用語「ＴＡＣＩ」は、国際公開第９８／３９３６１号（WO98/39361）、国際公開第００／４０７１６号（WO00/40716）、国際公開第０１／８５７８２号（WO01/85782）、国際公開第０１／８７９７９号（WO01/87979）、国際公開第０１／８１４１７号（WO01/81417）および国際公開第０２／０９４８５２号（WO02/094852）中で記述されているＴＡＣＩポリペプチドを含む。本発明のＴＡＣＩポリペプチドは、さまざまな供給源、例えばヒト組織型または別の供給源から単離され得、そうでなければ組換え型および／または合成的方法によって調製することもできる。本発明のＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸残基１〜１８４の隣接配列を含むかまたはこれらで構成されているＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドを含む。一般用語「ＢＡＦＦ−Ｒ」は、国際公開第０２／２４９０９号（WO02/24909）、および国際公開第０３／１４２９４号（WO03/14294）の中で記述されているＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドを含む。本発明のＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドは、さまざまな供給源、例えばヒト組織型または別の供給源から単離され得、そうでなければ組換え型および／または合成的方法によって調製することもできる。本発明のＢＣＭＡポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸残基１〜１８４を含むかまたはこれらで構成されているＢＣＭＡポリペプチドを含む。一般用語「ＢＣＭＡ」は、Laabiら、EMBO J.、第１１号：３８９７〜３９０４頁(１９９２年); Laabiら、Nucleic Acids Res.、第２２号：１１４７~１１５４頁(１９９４年); Grasら、Int. Immunology、第７号：１０９３~１１０６頁(１９９５年)；およびMadryら、Int. Immunology、第１０号：１６９３~１７０２頁(１９９８年)中で記述されているＢＣＭＡポリペプチドを含む。本発明のＢＣＭＡポリペプチドは、さまざまな供給源、例えばヒト組織型または別の供給源から単離され得、そうでなければ組換え型および／または合成的方法によって調製することもできる。
【００３０】
ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストとして機能させるためには、これらのレセプタのＥＣＤは、一般にＢＬｙＳを結合させる能力を保持する膜貫通または細胞質ドメインを本質的に含まないポリペプチドである。具体的には、ＴＡＣＩの細胞外ドメインは、ＴＡＣＩポリペプチド配列（配列番号２）のアミノ酸１〜１５４を含むことができる。さらに、ＥＣＤは例えばvon Bulowら、上掲書、国際公開第９８／３９３６１号（WO98/39361）、国際公開第００／４０７１６号（WO00/40716）、国際公開第０１／８５７８２号（WO01/85782）、国際公開第０１／８７９７９号（WO01/87979）および国際公開第０１／８１４１７（WO01/81417）で記述されているようなＴＡＣＩのＥＣＤ形態といったこの配列のフラグメントまたは変異体であってよい。特に、これらのＥＣＤ形態は、配列番号２のアミノ酸１〜１０６、配列番号２のアミノ酸１〜１４２、配列番号２のアミノ酸３０〜１５４、配列番号２のアミノ酸３０〜１０６、配列番号２のアミノ酸３０〜１１０、配列番号２のアミノ酸３０〜１１９、配列番号２のアミノ酸１〜１６６、配列番号２のアミノ酸１〜１６５、配列番号２のアミノ酸１〜１１４、配列番号２のアミノ酸１〜１１９、配列番号２のアミノ酸１〜１２０、および配列番号２のアミノ酸１〜１２６を含むことができる。さらに、ＴＡＣＩ  ＥＣＤは、システイン富有ドメインを１つしか有していない分子を含み得る。
【００３１】
ＢＡＦＦ−ＲのＥＣＤ形態には、ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチド配列（配列番号４）のアミノ酸１〜７１を含むものが含まれる。さらに、ＥＣＤは、例えば国際公開第０２／２４９０９号（WO02/24909）、国際公開第０３／１４２９４（WO03/14294）および国際公開第０２／３８７６６号（WO02/38766）内で記述されている通りのＢＡＦＦ−ＲのＥＣＤ形態といったこの配列のフラグメントまたは変異体であってよい。特に、これらのＥＣＤ形態は、配列番号４のアミノ酸１〜７７、配列番号４のアミノ酸７〜７７、配列番号４のアミノ酸１〜６９、配列番号４のアミノ酸７〜６９、配列番号４のアミノ酸２〜６２、配列番号４のアミノ酸２〜７１、配列番号４のアミノ酸１〜６１、および配列番号４のアミノ酸２〜６３、配列番号４のアミノ酸１〜４５、配列番号４のアミノ酸１〜３９、配列番号４のアミノ酸７〜３９、配列番号４のアミノ酸１〜１７、配列番号４のアミノ酸３９〜６４、配列番号４のアミノ酸１９〜３５、および配列番号４のアミノ酸１７〜４２を含むことができる。さらに、ＢＡＦＦ−Ｒ  ＥＣＤは、システイン富有ドメインを有する分子を含むことができる。
【００３２】
ＢＣＭＡのＥＣＤ形態には、ＢＣＭＡポリペプチド配列（配列番号６）のアミノ酸１〜４８を含むものが含まれる。さらに、ＥＣＤは、例えば国際公開第００／４０７１６号（ＷＯ００／４０７１６）および国際公開第０５／０７５５１１（ＷＯ０５／０７５５１１）内で記述されている通りのＢＡＦＦ−ＲのＥＣＤ形態といったこの配列のフラグメントまたは変異体であってよい。特に、これらのＥＣＤ形態は、配列番号６のアミノ酸１〜１５０、配列番号６のアミノ酸１〜４８、配列番号６のアミノ酸１〜４１、配列番号６のアミノ酸８〜４１、配列番号６のアミノ酸８〜３７、配列番号６のアミノ酸８〜８８、配列番号６のアミノ酸４１〜８８、配列番号６のアミノ酸１〜５４、配列番号６のアミノ酸４〜５５、配列番号６のアミノ酸４〜５１および配列番号６のアミノ酸２１〜５３を含むことができる。さらに、ＢＣＭＡ  ＥＣＤは、部分的システイン富有ドメインを有する分子を含むことができる。
【００３３】
さらなる実施形態においては、ＢＬｙＳレセプタのＢＬｙＳ結合領域（例えばＢＡＦＦ−Ｒ、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩの細胞外ドメインまたはそのフラグメント）は、生体内でのその溶解性を促進するべく免疫グロブリン分子のＦｃ部分に融合され得る。１つの実施形態によると、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストは、１００ｎＭ以下の結合親和力でＢＬｙＳポリペプチドに結合する。別の実施形態によると、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストは、１０ｎＭ以下の結合親和力でＢＬｙＳポリペプチドに結合する。さらに別の実施形態によると、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストは１ｎＭ以下の結合親和力でＢＬｙＳポリペプチドに結合する。
【００３４】
別の例においては、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストは、その天然配列または変異体ではないＢＬｙＳ結合ポリペプチドを含む。かかるポリペプチドのいくつかの例としては、国際公開第０５／０００３５１号（WO05/000351）に記述されている通りの式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩの配列を有するものがある。特に、一部の結合ポリペプチドにはＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）または国際公開第０５／０００３５１号（WO05/000351）の図３２に列挙された配列が含まれる。
【００３５】
代替的には、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストは、天然配列ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−ＲまたはＢＣＭＡの細胞外ドメインをそのＢＬｙＳ結合領域において結合させて、試験管内、原位置または生体内でのＢＬｙＳ結合を部分的または全面的に遮断、阻害または無力化することができる。例えば、このような間接的アンタゴニストは、ＢＬｙＳの結合が立体障害を受けるような形でＴＡＣＩの領域内で結合するＴＡＣＩ抗体である。例えば、アミノ酸７２〜１０９または隣接領域での結合は、ＢＬｙＳ結合を遮断すると考えられている。アミノ酸８２〜２２２の領域内で発生すると考えられているこの分子に対するＡＰＲＩＬ結合を遮断することもまた有利であり得る。もう１つのＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストは、ヒトＢＡＦＦ−ＲのＢＬｙＳに対する結合が立体障害を受けるようにＢＡＦＦ−Ｒの領域内で結合するＢＡＦＦ−Ｒ抗体である。例えば、アミノ酸２３〜３８またはアミノ酸１７〜４２または隣接領域における結合は、ＢＬｙＳ結合を遮断すると考えられている。最後に、さらなる間接的アンタゴニストは、ＢＬｙＳの結合が立体障害を受けるようにＢＣＭＡの１領域内で結合するＢＣＭＡ抗体であると思われる。例えば、アミノ酸５〜４３および隣接領域における結合はＢＬｙＳ（またはＡＰＲＩＬ）結合を遮断するものと考えられている。
【００３６】
一部の実施形態においては、本発明に従ったＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストはＢＬｙＳ抗体を含む。「抗体」という用語に言及する場合、それは最も広い意味で用いられ、具体的には例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ポリエピトープ特異性をもつ抗体、一本鎖抗体、および抗体フラグメントを網羅する。一部の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、抗体が、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−ＲまたはＢＣＭＡに対し結合しそれらに対するＢＬｙＳの結合を阻害できるかまたはＢＬｙＳシグナリングを阻害するような形で可変領域内またはＣＤＲ内で抗体枠組み構造内に融合される。本発明のポリペプチドを含む抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体である。本発明のポリペプチドを含む抗体は、抗体フラグメントであり得る。代替的には、本発明の抗体は本発明のポリペプチドで動物を免疫化することにより産生可能である。本発明のポリペプチドに対し向けられた抗体が企図されている。
【００３７】
特に、ヒトＢＬｙＳの１６２、１６３、２０６、２１１、２３１、２３３、２６４および２６５からなる群から選択されたアミノ酸の残基１６２〜２７５および／または隣接アミノ酸を含むヒトＢＬｙＳ（配列番号８）の領域内部で結合するＢＬｙＳに特異的な抗体が企図されている。抗体の結合は、抗体がそのレセプタのうちの１つ以上のものに対するＢＬｙＳ結合の立体障害を及ぼすようなものである。かかる抗体は、国際公開第０２／０２６４１号（WO02/02641）および国際公開第０３／０５５９７９号（WO03/055979）の中で記述されている。特に好ましい抗体は、Ｌｙｐｈｏｓｔｓｔ−ｂとして記述された抗体である（Bakerら、(２００３年) Arthritis Rheum、第４８号、３２５３〜３２６５頁）。
【００３８】
本明細書で使用されている「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた１抗体を意味する。すなわち、この集団を含む個々の抗体は、少量で存在することが考えられる天然に発生する突然変異を除いて同一である。
【００３９】
モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して向けられており、きわめて特異的である。さらに、異なる決定因子（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を標準的に含んでいる従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に対して向けられている。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、その他の免疫グロブリンにより汚染されない状態でハイブリドーマ培養により合成されるという点で有利である。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られるものとしての抗体の性質を表わし、いずれか特定の方法による抗体の産生を求めるものとしてみなされるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature、第２５６号：４９５頁(１９７５年)によって初めて記述されたハイブリドーマ方法によって作られてよく、そうでなければ組換え型ＤＮＡ方法によって作られてもよい（例えば米国特許第４，８１６，５６７号（U. S. Patent No. 4,816,567）を参照のこと）。「モノクローナル抗体」は同様に、例えばClacksonら、Nature、第３５２号：６２４〜６２８頁(１９９１年)およびMarksら、J. Mol.Biol、第２２２号：５８１〜５９７頁(１９９１年)の中で記述されている技術を用いてファージ抗体ライブラリからも単離可能である。
【００４０】
本明細書中のモノクローナル抗体には具体的には、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種から誘導された抗体または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の中の対応する配列と同一であるかまたは相同であり、一方１つまたは複数の鎖のうち残りのものが、別の種から誘導された抗体または別のクラスまたはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一であるかまたは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに所望の生物活性を示すかぎりにおいてかかる抗体のフラグメントが含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号（U. S. Patent No. 4,816,567）； Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８１号：６８５１〜６８５５頁(１９８４年)）。キメラ抗体の作製方法は、当該技術分野において公知である。
【００４１】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された配列を最小限しか含まないキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはその他の抗体の抗原結合配列）である。
【００４２】
ヒト化抗体はその大部分が、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和力および能力をもつマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部のケースでは、ヒト免疫グロブリンのＦｖ枠組み構造領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体内および移入されたＣＤＲ内または枠組み構造配列内のいずれにも見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらにリファインし最大限にするために行なわれる。一般に、ヒト化抗体は、全てまたは実質的に全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応しかつ全てまたは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである（ただし、ＦＲ領域は結合親和力を改善する１つ以上のアミノ酸配列を含んでいてよい）、少なくとも１つそして標準的には２つの可変領域の実質的に全てを含む。ＦＲ内のこれらのアミノ酸置換の数は、標準的には、Ｈ鎖内で６以下そしてＬ鎖内で３以下である。ヒト化抗体は最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、標準的にはヒト免疫グロブリンのものも同様に含む。さらに詳しくは、Jonesら、Nature、第３２１号： 522〜525 (１９８６年); Reichmannら、Nature、第３３２号：３２３〜３２９頁(１９８８年)；およびPresta、Curr. Op. Struct. Biol、第２号：５９３〜５９６頁(１９９２年)を参照のこと。ヒト化抗体には、関心対象の抗原を有するマカクザルを免疫化することなどによって産生された抗体から抗原結合領域が誘導されている「霊長類化された」抗体が含まれる。ヒト化抗体の作製方法は、当該技術分野において公知である。
【００４３】
ヒト抗体は同様に、ファージディスプレイライブラリを含めた当該技術分野において公知のさまざまな技術を用いて産生させることができる。Hoogenboom および Winter、J. Mol.Biol、第２２７号：３８１頁(１９９１年); Marks ら、J. MoI. Biol、第222号：５８１頁(１９９１年)。ColeらおよびBoernerらの技術も同様に、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である。Cole ら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss、７７頁(１９８５年); Boernerら、J. Immunol、第１４７号(1)：８６〜９５頁(１９９１年)。
【００４４】
本発明の結合抗体の機能的フラグメントは、それらが由来する無傷の完全鎖分子と実質的に同じ親和力を伴うＢＬｙＳ、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−Ｒ、またはＢＣＭＡに対する結合を保持し、本明細書で記述されているもののような試験管内または生体内検定によって測定される通りＢ細胞を枯渇させることができるかもしれないフラグメントである。
【００４５】
抗体「エフェクタ」機能とは、１つの抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因する生物活性を意味し、抗体イソタイプと共に変動する。抗体エフェクタ機能の例としては、Ｃｌｑ結合および補体依存性細胞傷害；Ｆｃレセプタ結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；細胞表面レセプタ（例えばＢ細胞レセプタ）のダウンレギュレーション；およびＢ細胞活性化が含まれる。
【００４６】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」または「ＡＤＣＣ」は、一部の細胞障害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）上に存在するＦｃレセプタ（ＦｃＲｓ）上に結合した分泌型Ｉｇによって、これらの細胞障害性エフェクタ細胞が抗原担持標的細胞に対し特異的に結合しその後サイトトキシンで標的細胞を死滅させることができるようになる１つの細胞障害形態を意味する。抗体は、細胞障害性細胞と「武装し」、このような死滅にとって絶対に必要なものである。ＡＤＣＣを媒介するための一次細胞、ＮＫ細胞はＦｃｙＲＩＩＩのみを発現し、一方単球はＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩおよびＦｃｙＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ravetch and Kinet、Ann. Rev. Immunol 第９号：４５７〜９２頁(１９９１年)の４６４ページの表３中に要約されている。関心対象分子のＡＤＣＣ活性を査定するためには、米国特許第５，５００，３６２号（U. S. Patent No. 5,500,362）および５，８２１，３３７号（U. S. Patent No. 5,821,337）中で記述されているもののような試験管内ＡＤＣＣ検定を実施してもよい。かかる検定のための有用なエフェクタ細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的または付加的には、関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を生体内、例えばClynesら、PNAS (USA)第９５号：６５２〜６５６頁(１９９８年)中で開示されているもののような動物モデル内で査定してもよい。
【００４７】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」とは、補体の存在下での標的細胞の分解を意味する。古典的補体経路の活性化は、その同種抗原に結合させられた（適切なサブクラスの）抗体に対する補体系（Ｃｌｑ）の第１の構成要素の結合によって開始される。補体活性化を査定するためには、例えばGazzano- Santoroら、J. Immunol. Methods 第２０２号：１６３頁(１９９６年)内で記述されているようなＣＤＣ検定を実施してもよい。
【００４８】
「単離された」抗体は、その自然環境の構成要素から同定され分離されかつ／または回収された抗体である。その自然環境の汚染性構成要素は、抗体の診断または治療向け使用を妨害すると思われる材料であり、これらには酵素、ホルモンまたはその他のタンパク性または非タンパク性の溶質が含まれてよい。好ましい実施形態においては、抗体は、（１）Lowryの方法によって決定されるように９５重量％超の抗体、そして最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニングカップシークエネータを用いて少なくとも１５のＮ末端または内部アミノ酸配列残基を得るのに充分な程度まで、または（３）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いて還元または非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質性に至るまで、精製される。
【００４９】
単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しなくなることから、組換え型細胞内の原位置の抗体が含まれる。しかしながら通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製ステップにより調製される。
【００５０】
アミノ酸は、その側鎖の特性の類似性に応じて次のようなグループに分類することが可能である（A. L. Lehninger、in Biochemistry、第２版、７３〜７５頁、Worth Publishers、New York (１９７５年)中）：（１）非極性；Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、（２）非電荷極性；Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、（３）酸性；Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）（４）塩基性Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ−）。代替的には、天然に発生する残基を、共通の側鎖特性に基づいて次のようにグループ分けしてよい：（１）疎水性；ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性；Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性；Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖配向に影響を及ぼす残基；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族；Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００５１】
本発明の中で使用される「保存的」アミノ酸置換という用語は、機能的に同等のアミノ酸を置換するアミノ酸置換を意味するように意図されている。保存的アミノ酸変更は、結果として得られるペプチド内のアミノ酸配列にサイレント変更を生じさせる。例えば、類似の極性をもつ１つ以上のアミノ酸は、機能的等価物として作用し、ペプチドのアミノ酸配列内部でサイレント改変という結果を生じさせる。一般に、一グループ内部での置換は、構造および機能に関して保存的とみなされ得る。しかしながら、当業者であれば、特定の残基の役割は、残基を発生させる分子の三次元構造の内部における状況によって決定される、ということを認識することだろう。例えば、Ｃｙｓ残基は、還元（チオール）形態に比べて極性の低い酸化（ジスルフィド）形態で発生しうる。Ａｒｇ側鎖の長い脂肪族部分は、その構造的または機能的役割の重要な特徴を構成し、これは、別の塩基性残基ではなく非極性残基の置換により最適に保存され得る。同様に、芳香族基（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）を含む側鎖は、イオン−芳香族または「カチオン−パイ」相互作用に参与し得るということが認識される。これらのケースでは、これらの側鎖のうちの１つを酸性または非電荷極性グループの成員で置換することは、構造および機能に関して保存的であり得る。Ｐｒｏ、ＧｌｙおよびＣｙｓ（ジスルフィド形態）といった残基は、主要な鎖コンホメーションに対し直接的効果を与える可能性があり、多くの場合、構造ひずみなく置換され得ない。
【００５２】
本明細書中で同定されたリガンドまたはレセプタポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性百分率（％）」とは、必要な場合に最大配列同一性百分率を達成するため配列を整列させギャップを挿入した後の、保存的置換のいずれも配列同一性の一部とみなさない、本明細書中で同定されたこのようなリガンドまたはレセプタ配列の中でアミノ酸配列と同一である候補配列内のアミノ酸残基の百分率と定義づけされる。アミノ酸配列同一性百分率を決定することを目的としたアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアといったような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて、当該技術分野の技術的範囲内に入るさまざまな要領で達成可能である。当業者であれば、比較されている配列の全長にわたる最大のアライメントを達成するために必要とされるあらゆるアルゴリズムを含めて、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書の目的のためには、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって以下で記述する通りにアミノ酸配列同一性百分率の値が得られ、下表中にＡＬＩＧＮ−２プログラムのための完全なソースコードが提供されている。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Genentech Incが制作したものであり、下表に示すソースコードは、米国著作権局（ワシントンＤ．Ｃ．２０５５９）においてユーザー文書と共に保管され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登記されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、カリフォルニア州サウスサンフランシスコのGenentech Inc.,を通して公に入手可能であるか、そうでなければ、下表に提供されているソースコードからコンパイル可能である。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄ上で使用するためにコンパイルすべきである。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定可能であり、変動しない。
【００５３】
突然変異誘発のための好ましい場所であるタンパク質中の一部の残基または領域を同定するために有用な方法は、「アラニン走査突然変異誘発」と呼ばれ、Cunningham and Wells Science、第２４４号：１０８１〜１０８５頁(１９８９年)により記述されている。１つの残基または標的残基群が同定され（例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕなどの電荷残基）、結合標的とアミノ酸の相互作用に影響を及ぼすべく中性または負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）で置き換えられる。このとき、置換に対する機能的感度を実証するこれらのアミノ酸位置は、置換部位におけるまたは置換部位のためのさらなるまたはその他の変異体を導入することによってリファインされる。かくして、アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め定められているものの、突然変異の性質自体は予め定められている必要はない。例えば、所与の部位における１つの突然変異の性能を分析するためには、標的コドンまたは領域においてａｌａ走査またはランダム突然変異誘発が行なわれ、発現された変異体は、所望の活性についてスクリーニングされる。
【００５４】
「二面角」という用語は、１つの結合を中心とする回転を意味する。例えばCreighton、T. E.、(１９９３年) Protein: Structures and Molecular Properties、第２版、W. H. Freeman and Company、New York、NY.を参照のこと。「ファイ（ｐｈｉ）」という用語は、１つのアミノ酸のＮ−Ｃ結合を中心とする回転を表わす二面角である。例えばCreighton、T. E.、(１９９３年) Protein: Structures and Molecular Properties、第２版、W. H. Freeman and Company、New York、NY.を参照のこと。Ｉ型ベータ回旋は、Hutchinson、E. G. & Thornton、J. M. (１９９４年) A revised set of potentials for beta turn formation in proteins. Protein Science 第３号、２２０７〜２２１６頁の中で記述されている。
【００５５】
「融合タンパク質」および「融合ポリペプチド」は、共有結合により連結された２つの部分を有するポリペプチドを意味し、ここで各々の部分は異なる特性をもつポリペプチドである。この特性は、試験管内または生体内での活性といったような生物学的特性であってよい。この特性は同様に、単純な化学的または物理的特性、例えば標的分子に対する結合、反応の触媒作用などであってもよい。２つの部分は、単一のペプチド結合によってかまたは１つ以上のアミノ酸残基を含有するペプチドリンカーを通して直接連結されていてもよい。一般に、２つの部分およびリンカーは互いに読取り枠内にある。
【００５６】
「抱合体」は、融合タンパク質ならびにアミノ酸またはタンパク質部分および非タンパク質部分の両方を含有する分子を含めた、あらゆるハイブリッド分子を意味する。抱合体は、例えば組換え型ＤＮＡ技術、固相合成、溶液相合成、有機化学合成技術またはこれらの技術の組合せを含めた当該技術分野において公知のさまざまな技術によって合成可能である。合成の選択は、生成すべき特定の分子によって左右される。例えば、本来は完全に「タンパク質」でないハイブリッド分子を、組換え型技術と溶液相技術の組合せにより合成してもよい。
【００５７】
本明細書中で使用される「Ｆｃ−融合タンパク質」という用語は、非相同タンパク質の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクタ機能を組合わせた抗体様の分子を表わす。構造的には、Ｆｃ−融合タンパク質は、１つの抗体の抗原認識および結合部位以外の（すなわちそれとは「非相同」である）所望の結合特異性をもつアミノ酸配列と免疫グロブリン定常ドメイン配列の融合を含む。Ｆｃ−融合タンパク質分子は標準的には、レセプタまたはリガンドの結合部位を少なくとも含む隣接するアミノ酸配列を含んでいる。Ｆｃ−融合タンパク質内の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、あらゆる免疫グロブリン、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３またはＩｇＧ−４亜型、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得ることができる。例えば、本発明に従った有用なＦｃ−融合タンパク質は、ＢＬｙＳレセプタの膜貫通または細胞質配列の無いＢＬｙＳレセプタのＢＬｙＳ結合タンパク質を含むポリペプチドである。１つの実施形態においては、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＴＡＣＩまたはＢＣＭＡの細胞外ドメインは、免疫グロブリン配列の定常ドメインに融合される。
「哺乳動物」という用語は、ヒト、家畜、および動物園、スポーツ用またはペット用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含めた哺乳動物として分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは、本明細書中の哺乳動物はヒトである。
【００５８】
「治療上有効な量」という用語は、対象または哺乳動物における疾患または障害を「緩和する」または「治療する」のに有効な抗体またはアンタゴニストの量を意味する。癌の場合、薬物の治療上有効な量は、癌細胞の数を減少させ；腫瘍のサイズを縮小し；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害し（すなわち或る程度緩慢にし好ましくは停止させ）；腫瘍の転移を阻害し（すなわち或る程度緩慢にし好ましくは停止させ）；腫瘍の成長を或る程度阻害し；かつ／または癌に付随する症候のうち１つ以上を或る程度軽減する可能性がある。以下の「治療される」という用語の定義を参照のこと。薬物が既存の癌細胞の成長を予防しかつ／またはこれらの細胞を死滅させ得る限り、それは細胞増殖抑制性および／または細胞障害性であり得る。
【００５９】
本発明のＢＬｙＳまたはＢＬｙＳレセプタ抗体は、ＣＨＯ細胞といったような過渡的なまたは安定したトランスフェクション真核生物宿主細胞が産生できる。
本明細書で使用される「担体」には、それに曝露されている細胞または哺乳動物にとって、利用される投薬量および濃度では無毒性である薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤が含まれる。多くの場合、生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理学的に許容される担体の例としては、例えばリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液およびその他の有機酸緩衝液；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性重合体例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン；単糖類、二糖類および、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含むその他の炭水化物；キレート剤例えばＥＤＴＡ；糖アルコール例えばマンニトールまたはソルビトール；塩形成対イオン例えばナトリウム；および／または非イオン界面活性剤例えばＴＷＥＥＮポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭが含まれる。
【００６０】
ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞
本明細書中で開示されている一定数の実施形態によると、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストは、特定の宿主細胞を用いて特定のベクター内で特定のポリヌクレオチドを使用して産生される特定のポリペプチドを含むことができる。本発明のさまざまなタイプのポリペプチドは広義に記述することが可能であり、これらは、レセプタベースの配列、抗体ベースの配列そして人工的（すなわち非天然）結合配列からなる群から選択される。レセプタベースの配列の例は、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−ＲまたはＢＣＭＡといった、生体内でＢＬｙＳを結合させるレセプタのドメインから単離されたかまたは誘導されたＢＬｙＳを結合させる配列である。抗体ベースの配列は、抗体開発技術を用いて産生され抗体分子の一般的構造を維持する配列である。抗体ベースの配列の例は、ＬｙｍｐｈｏＳｔａｔ−ｂ、またはＢＬｙＳのレセプタに対する抗体である。人工的結合配列の例としては、本明細書中で記述されている１７ｍｅｒペプチド、１つ以上の１７ｍｅｒペプチドをコア領域として内含するポリペプチドそして１７ｍｅｒペプチドおよびポリペプチドの共有結合によって修飾された形態（例えばＦｃ−融合タンパク質、標識されたポリペプチド、保護されたポリペプチド、抱合されたポリペプチド、融合タンパク質など）が含まれる。これらのポリペプチド形態を作るために利用されるさまざまな技術が本明細書中に記述されている。ポリペプチドを標識し分子をポリペプチドに抱合させる方法は、当該技術分野において公知である。
【００６１】
本発明の組成物は、当該技術分野において公知の組換え型技術を用いて調製可能である。
【００６２】
以下の記述は、コーディング核酸を含有するベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を培養し、細胞培養からポリペプチドを回収することによってかかる特異的ポリペプチドを産生させる方法に関する。（例えばSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press、１９８９年); Dieffenbachら、PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、１９９５年)を参照のこと）。
【００６３】
所望のポリペプチドをコードする核酸（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のため、複製可能なベクターの中に挿入され得る。さまざまなベクターが公に入手可能である。ベクター構成要素には一般に、各々以下で記述されているシグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサ要素、プロモータ、および転写終結配列のうちの１つ以上が含まれるがこれらに限定されるわけではない。利用し得る任意のシグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子、エンハンサ要素および転写ターミネータ配列は当該技術分野において公知であり、国際公開第９７／２５４２８号（WO77/25428）中でさらに詳述されている。
【００６４】
発現およびクローニングベクターは通常、宿主生体により認識されコーディング核酸配列に作動的に連結されたプロモータを含有する。プロモータは、それらが作動的に連結されている特定の核酸配列の転写および翻訳を制御する構造遺伝子（一般に約１００〜１０００ｂｐ以内）の開始コドンの上流側（５’）にある未翻訳の配列である。かかるプロモータは標準的に、誘導性と構成性という２つのクラスに分類される。誘導性プロモータは、例えば栄養素の有無または温度変化などの培養条件の幾分かの変化に応えて、その制御下にあるＤＮＡからの転写レベルの上昇を開始させるプロモータである。現時点で、さまざまな潜在的宿主細胞により認識される数多くのプロモータが周知である。これらのプロモータは、制限酵素消化によりソースＤＮＡからプロモータを除去し単離されたプロモータ配列をベクター内に挿入することにより、コーディングＤＮＡに対し作動的に連結される。
【００６５】
以上に列挙した構成要素のうちの１つ以上のものを含有する適切なベクターの構築には、標準的なライゲーション技術が用いられる。単離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグメントは、求められているプラスミドを生成するために所望の形態に、分割、調整しかつ再ライゲートされる。構築されたプラスミド内の正しい配列を確認するための分析のためには、ライゲーション混合物を使用して大腸菌Ｋ１２の菌株２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）を形質転換でき、成功した形質転換体を適宜アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選択することができる。形質転換体からのプラスミドは、当該技術分野において公知の標準的技術を用いて調製され、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析されかつ／または配列決定される［例えばMessingら、Nucleic Acids Res.、第９号：３０９頁(１９８１年); Maxamら、Methods in Enzymology、第６５号：４９９頁(１９８０年)を参照のこと］。
【００６６】
哺乳動物細胞内においてコーディングＤＮＡの一過性発現を提供する発現ベクターを利用してよい。一般的には、一過性発現には、宿主細胞が発現ベクターの数多くのコピーを蓄積し、順に発現ベクターによってコードされる所望のポリペプチドを高レベルで合成するような形で、宿主細胞内で効率良く複製することのできる発現ベクターの使用が関与する［Sambrookら、上掲書］。適切な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一過性発現系は、クローニングされたＤＮＡによってコードされるポリペプチドの便利で確実な同定ならびに所望の生物学的または生理学的特性についてのかかるポリペプチドの高速スクリーニングを可能にする。
【００６７】
組換え型脊椎動物細胞培養中での所望のポリペプチドの合成に適合させるのに適したその他の方法、ベクターおよび宿主細胞は、Gethingら、Nature、第２９３号：６２０〜６２５頁(１９８１年); Manteiら、Nature、第２８１号：４０〜４６頁(１９７９年);欧州特許第１１７，０６０号（EP 117,060）；および欧州特許第１１７，０５８号（EP117,058）に記述されている。
【００６８】
本明細書中のベクター内でＤＮＡをクローニングまたは発現させるのに適した宿主細胞としては、原核生物、酵母または高等真核細胞が含まれる。この目的に適した原核生物には、真正細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物、例えば腸内細菌科例えばエシェリキア属、例えば大腸菌、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシェラ属、プロテウス属、サルモネラ属例えばネズミチフス菌、セラシア属例えばサラチア・マルセッセンスおよび赤痢菌、ならびにバシラス属例えば枯草菌およびリケニアホルミス菌（例えば１９８９年４月１２日に公開された東独特許第２６６，７１０号（DD266,710）中で開示されているB. licheniformis 41P）、シュードモナス科、例えば緑膿菌およびストレプトミセスが含まれるが、これらに限定されるわけではない。好ましくは、宿主細胞は最少量のタンパク質分解酵素しか分泌すべきでない。
【００６９】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母といったような真核微生物も、ベクターのための適切なクローニングまたは発現宿主である。グリコシル化ポリペプチドの発現のための適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。かかる宿主細胞全ての例が、国際公開第９７／２５４２８号（WO97/25428）の中でさらに記述されている。
【００７０】
宿主細胞はトランスフェクトされ、好ましくは上述の発現またはクローニングベクターで形質転換され、プロモータの誘発、形質転換体の選択または所望の配列をコードする遺伝子の増殖のため適宜修飾された栄養培地内で培養される。
【００７１】
トランスフェクションというのは、何らかのコーディング配列が実際に発現されるか否かに関わらず宿主細胞による発現ベクターの取込みを意味する。当業者には、例えばＣａＰ０４および電気穿孔といった数多くのトランスフェクション方法が公知である。トランスフェクションの成功は、このベクターの操作の何らかの標示が宿主細胞内で発生した場合に一般に認識される。
【００７２】
形質転換とは、染色体外要素としてかまたは染色体組込体によってＤＮＡが複製可能となるように生体内にＤＮＡを導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換は、かかる細胞に適した標準技術を用いて行なわれる。Sambrookらの前掲書に記述されているように塩化カルシウムを利用するカルシウム処理または電気穿孔は一般に、実質的な細胞壁障壁を含む原核細胞またはその他の細胞のために使用される。Shaw ら、Gene、第２３：３１５頁(１９８３年)および１９８９年６月２９日に公開された国際公開第８９／０５８５９号（WO89/05859）により記述されているように、或る種の植物細胞の形質転換のためには、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（根頭癌腫病菌）による感染が使用される。さらに、１９９１年１月１０日に公開された国際公開第９１／００３５８号（WO91/00358）の中で記述されている通りの超音波処理を用いて植物をトランスフェクトしてもよい。
【００７３】
かかる細胞壁をもたない哺乳動物細胞のためには、Grahamおよびvan der Eb、Virology、第５２号：４５６〜４５７頁(１９７８年)のリン酸カルシウム沈降方法を利用してよい。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的態様は、米国特許第４，３９９，２１６号（U. S. Patent No. 4,399,216）中で記述された。酵母への形質転換は、標準的に、Van Solingenら、J. Bact.、第１３０号：９４６頁(１９７７年)およびHsiaoら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)、第７６号：３８２９頁(１９７９年)の方法に従って実施される。しかしながら、核マイクロインジェクション、電気穿孔、無傷細胞またはポリブレン、ポリオルニチンといったポリカチオンとの細菌プロトプラスト融合などによる、細胞内にＤＮＡを導入するためのその他の方法も使用してよい。哺乳動物細胞を形質転換するためのさまざまな技術については、Keownら、Methods in Enzymology、第１８５号：５２７〜５３７頁(１９９０年)およびMansourら、Nature、第３３６号：３４８〜３５２頁(１９８８年)を参照のこと。
【００７４】
原核細胞を、Sambrookらの前掲書中で一般的に記述されている通りに適切な培地の中で培養することができる。市販の培地の例としては、ハムＦ１０（Sigma）、最小必須培地（「ＭＥＭ」、Sigma）、ＲＰＭＩ−１６４０（Sigma）、およびダルベッコ修正イーグル培地（「ＤＭＥＭ」、Sigma）が含まれる。かかる培地のいずれも、必要に応じ、ホルモンおよび／またはその他の成長因子（例えばインシュリン、トランスフェリン、または上皮成長因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えばゲンタマイシン）、微量元素（マイクロモル範囲内の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源で補足してよい。当業者にとって公知であると思われる適切な濃度で、その他の任意の補足物質を含み入れてもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
【００７５】
一般に、哺乳動物細胞培養の生産性を最大限にするための原則、プロトコルおよび実践技術は、Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach、M. Butler、ed. (IRL Press、１９９１年)の中に見出すことができる。
【００７６】
発現されたポリペプチドは、分泌ポリペプチドとして培地から回収され得るが、分泌シグナル無しで直接産生される場合、宿主細胞溶解物から回収されてもよい。ポリペプチドが膜結合されている場合、それは、適切な洗浄剤溶液（例えばTriton-X100）を用いて膜から放出させることができ、そうでなければ酵素分割によりその細胞外領域を放出させてもよい。
【００７７】
ポリペプチドが、ヒト由来のもの以外の組換え型細胞内で産生される場合、それは、ヒト由来のタンパク質またはポリペプチドを含まない。しかしながら、通常、実質的に均一な調製物を得るためには、組換え型細胞タンパク質またはポリペプチドからポリペプチドを回収または精製することが必要である。第１のステップとして、培地または溶解物を遠心分離して微粒子細胞残屑を除去してよい。以下に記すのは、適切な精製手順を例示する手順である。すなわち、イオン交換カラム上での分留によるもの；エタノール沈降；逆相ＨＰＬＣ；シリカ上またはＤＥＡＥといったカチオン交換樹脂上のクロマトグラフィ；クロマト分画；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈降；例えばセファデックスＧ−７５を用いたゲルろ過；およびＩｇＧなどの汚染物質を除去するためのプロテインＡセファロースカラム。
【００７８】
ファージディスプレイ
一部の実施形態によると、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）および国際公開第０５／０００３５１号（WO05/000351）の図３２中に列挙されている配列からなる群から選択された本発明のポリペプチドを、ファージディスプレイにおいて使用してよい。
【００７９】
ファージディスプレイ技術を使用することで、高親和力で標的分子に結合する配列について急速に選別され得るタンパク質変異体の大きなライブラリを生成することが可能になる。変異体ポリペプチドをコードする核酸が、遺伝子ＩＩＩタンパク質または遺伝子ＶＩＩＩタンパク質などのウイルス外皮タンパク質をコードする核酸配列に融合される。タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列が遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部分をコードする核酸配列に融合されている一価のファージディスプレイシステムが開発された（Bass S.、Proteins、第８号：３０９頁(１９９０年); LowmanおよびWells、Methods: A Companion to Methods in Enzymology、第３号：２０５頁(１９９１年)）。一価のファージディスプレイシステムにおいては、遺伝子融合は低レベルで発現され、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も同様に発現されて、粒子の感染力が保持されるようになっている。ペプチドライブラリを生成しこれらのライブラリをスクリーニングする方法が数多くの特許において開示されてきた（例えば、米国特許第５，７２３，２８６号（U. S. Patent No. 5,723,286）；米国特許第５，４３２，０１８号（U. S. Patent No. 5,432,018）；米国特許第５，５８０，７１７号（U. S. Patent No. 5,580,717）；米国特許第５，４２７，９０８号（U. S. Patent No. 5,427,908）；および米国特許第５，４９８，５３０号（U. S. Patent No. 5,498,530））。
【００８０】
一部の実施形態においては、式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩは、ファージ上のペプチドライブラリとして発現される。このとき式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩのポリペプチドライブラリを発現するファージは、ＢＬｙＳ結合に基づく選択に付される。一部の実施形態では、選択プロセスには、ニュートラアビジン平板に後で結合させられるビオチニル化ＢＬｙＳに一部のファージが結合できるようにすることが関与する。ＢＬｙＳ−ビオチン−ニュートラアビジン結合を通して平板に結合したファージは回収され増殖させられる。一部の実施形態においては、ファージは、いくつかの選択ラウンドに付される。一部の実施形態においては、ファージはＢＬｙＳ−ビオチンと共にインキュベートされ、その後競合的結合剤として非ビオチニル化ＢＬｙＳが添加される。
【００８１】
本発明に関連したファージディスプレイの使用についての付加的な指針は、実施例の中で提供されている。
【００８２】
非相同ポリペプチドに融合または抱合されたポリペプチド。
本発明のポリペプチドを含むＦｃ−融合タンパク質分子が、本明細書中の方法において使用するためにさらに企図されている。一部の実施形態では、分子は、本発明のポリペプチドと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域の融合を含む。Ｆｃ−融合タンパク質の２価形態については、かかる融合は有用なことに、ＩｇＧ分子のＦｃ領域を含む。さらなる実施形態においては、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１分子由来のものである。一部の実施形態においては、免疫グロブリン融合は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３またはヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。
【００８３】
免疫グロブリン融合の産生については、米国特許第５，４２８，１３０号（US Patent No. 5,428,130）、米国特許第５，８４３，７２５号（US Patent No. 5,843,725）、米国特許第６，０１８，０２６号（U.S. Patent No. 6,018,026）、およびChamowら、TIBTECH、第１４号：５２〜６０頁(１９９６年)も参照のこと。
【００８４】
最も簡単で最も直接的なＦｃ−融合タンパク質設計は、多くの場合、本発明のアンタゴニストポリペプチドの１つまたは複数の結合ドメイン、好ましくは天然配列を免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域と組合せる。別の実施形態においては、ポリペプチドは人工的なもの、例えば、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩの配列、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号１３）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号１６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号１７）を含むポリペプチドであり得、そうでなければ図３２で列挙された配列を免疫グロブリンのＦｃ部分に共有結合により連結させることができる。さらに、これらのポリペプチドのうちの１つ以上を互いに連結させることができ、かつ免疫グロブリンのＦｃ部分に連結させることができる。
【００８５】
通常は、本発明のＦｃ−融合タンパク質を調製する場合、結合ドメインをコードする核酸が免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸に対してＣ末端で融合されるが、Ｎ末端融合も同じく可能である。
【００８６】
典型的には、かかる融合においては、コードされたキメラポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを保持する。融合は同様に、定常領域のＦｃ部分のＣ末端に対して、または重鎖のＣＨ１または軽鎖の対応する領域に対してＮ末端で直接行なってもよい。融合が行なわれる精確な部位は重要ではない；特定の部位は周知であり、Ｆｃ−融合タンパク質の生物活性、分泌または結合特性を最適化するように選択してもよい。
【００８７】
好ましい実施形態においては、結合ドメイン配列は、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃ領域のＮ末端に融合される。結合ドメイン配列に対して重鎖定常領域全体を融合させることが可能である。しかしながら、より好ましくは、化学的にＩｇＧＦｃを定義するパパイン分割部位（すなわち、重鎖定常領域の第１の残基が１１４となるものとして、残基２１６）またはその他の免疫グロブリンの類似の部位のすぐ上流側のヒンジ領域内で始まる配列が、融合内で使用される。特に好ましい実施形態においては、結合ドメインアミノ酸配列は、ＩｇＧ重鎖の（ａ）ヒンジ領域およびＣＨ２およびＣＨ３、または（ｂ）ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合させられる。
【００８８】
２重特異性Ｆｃ−融合タンパク質については、Ｆｃ−融合タンパク質は、多量体として、特にヘテロ二量体またはヘテロ四量体として結集される。一般に、これらの結集された免疫グロブリンは、公知の単位構造を有する。基本的な４鎖構造単位は、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＥが存在する形態である。４鎖単位は、より高い分子量の免疫グロブリンの中で反復される；ＩｇＭは一般に、ジスルフィド結合によりまとめられた４つの基本単位の五量体として存在する。ＩｇＡグロブリンそして場合によってはＩｇＧグロブリンは同様に血清中に多量体形態でも存在し得る。多量体の場合、４つの単位の各々は同じであっても異なるものであってもよい。
【００８９】
本明細書の範囲内のさまざまな例示的な結集Ｆｃ−融合タンパク質が、以下に概略的に示されている：ＡＣＬ−ＡＣＬ；（ｂ）ＡＣＨ−（ＡＣＨ、ＡＣＬ−ＡＣＨ、ＡＣＬ−ＶＨＣＨ、またはＶＬＣＬ−ＡＣＨ）；（ｃ）ＡＣＬ−ＡＣＨ−（ＡＣＬ−ＡＣＨ、ＡＣＬ−ＶＨＣＨ、ＶＬＣＬ−ＡＣＨ、またはＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ）；（ｄ）ＡＣＬ−ＶＨＣＨ−（ＡＣＨ、またはＡＣＬ−ＶＨＣＨ、またはＶＬＣＬ−ＡＣＨ）；（ｅ）ＶＬＣＬ−ＡＣＨ−（ＡＣＬ−ＶＨＣＨ、またはＶＬＣＬ−ＡＣＨ）；および（ｆ）（Ａ−Ｙ）ｎ−（ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ）２、なおここで各Ａは、ＢＬｙＳレセプタドメインから誘導された配列、ＢＬｙＳに対するまたはＢＬｙＳに対するレセプタに対する抗体から誘導された配列または式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩといった人工的配列、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号７）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号８）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号９）または図３２に列挙されている配列またはそれらの組合せのアミノ酸配列を含む同一のまたは異なるポリペプチドを表わしている。
【００９０】
ＶＬは、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；ｎは１より大きい整数であり；Ｙは共有結合架橋剤の残基を表わす。
【００９１】
簡潔さを期して、以上の構造は、主要な特長しか示していない；これらの構造は、免疫グロブリンの接合（Ｊ）またはその他のドメインを標示せず、ジスルフィド結合も示されていない。しかしながら、かかるドメインは、結合活性のために必要とされる場合、それらが免疫グロブリン分子内で占める通常の場所に存在するように構築されるものとする。
【００９２】
代替的には、Ｆｃ配列を免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列の間に挿入して、キメラ重鎖を含む免疫グロブリンが得られるようにすることもできる。この実施形態では、Ｆｃ配列はヒンジとＣＨ２ドメインの間またはＣＨ２およびＣＨ３ドメインの間のいずれかにおいて免疫グロブリンの各アーム内の免疫グロブリン重鎖の３’末端に対し融合される。類似の構成体が、Hoogenboomら、MoI. Immunol、第２８：１０２７〜１０３７頁(１９９１年)によって報告されている。
【００９３】
本発明のＦｃ−融合タンパク質内では、免疫グロブリン軽鎖の存在は必要とされないが、免疫グロブリン軽鎖は結合ドメイン−免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに対して共有結合により会合させられた状態かまたは結合ドメインに直接融合させられた状態で存在するかもしれない。前者の場合においては、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは標準的には、結合ドメイン−免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと同時発現される。分泌時点で、ハイブリッド重鎖および軽鎖は共有結合により会合させられて、２つのジスルフィド連結された免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を含む免疫グロブリン様構造を提供する。かかる構造の調製に適した方法は、例えば、１９８９年３月２８日付けの米国特許第４，８１６，５６７号（U. S. Patent No. 4,816,567）の中で開示されている。
【００９４】
Ｆｃ−融合タンパク質は、結合ドメイン部分をコードするｃＤＮＡ配列を免疫グロブリンｃＤＮＡ配列に枠内で融合させることによって、最適に構築される。しかしながら、ゲノミック免疫グロブリンフラグメントに対する融合も用いることができる（例えばAruffoら、Cell、第６１号：１３０３〜１３１３頁(１９９０年)；およびStamenkovicら、Cell、第66号：１１３３〜１１４４頁(１９９１年)を参照のこと）。後者の融合タイプには、発現のためのＩｇ調節配列の存在が必要となる。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ重合反応（ＰＣＲ）技術により、脾臓または末梢血リンパ球から誘導されたｃＤＮＡライブラリに由来する公開済み配列に基づいて単離され得る。Ｆｃ−融合タンパク質の免疫グロブリン部分および結合ドメインをコードするｃＤＮＡは、選択された宿主細胞内で効率の良い発現を導くプラスミドベクター内に縦列で挿入される。
【００９５】
本発明において使用するためのＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストＦｃ融合分子などの融合分子を作り上げるのに有用なＦｃ配列を産生するために、特別な修飾が行なわれてきた。具体的には、Ｆｃ−融合タンパク質を作り上げるために修飾されたヒトＩｇＧ１Ｆｃの６つのバージョンが生成され、Ｆｃ−４８８ならびにＦｃ４、Ｆｃ５、Ｆｃ６、Ｆｃ７およびＦｃ８と命名されている。Ｆｃ−４８８（配列番号３９）は、ヒトγ１Ｆｃ領域を含有する融合タンパク質をクローニングする上で便利なように設計され、鋳型として野生型ヒト免疫グロブリンγ１定常領域を用いて構築された。不対システイン残基に起因する潜在的な有害効果に関する懸念から、通常免疫グロブリン軽鎖定常領域とジスルフィド結合するシステインをセリン残基で置き換える決定が下されるに至った。将来のＤＮＡ操作を容易にするためにＢｇｌＩＩ制限酵素認識部位を導入するべく、ＥＵインデックス位置２１８をコードするコドンにおいて、付加的な変更が導入された。これらの変更は、ＰＣＲプライマ上でコードされたＰＣＲ産物内に導入される。ＢｇｌＩＩ部位の場所に起因して、Ｆｃヒンジ領域を補完する目的で、ＥＵインデックス位置２１６および２１７のためのコドンが、融合タンパク質パートナー配列内に取込まれた。
【００９６】
Ｆｃ４、Ｆｃ５およびＦｃ６は、ＦｃγＲＩ結合および補体Ｃ１ｑ結合を削減することを通して、Ｆｃにより媒介されるエフェクタ機能を低減するための突然変異を含有する。Ｆｃ４は、Ｆｃ−４８８内に導入されたものと同じアミノ酸置換を含む。潜在的なＦｃ媒介型エフェクタ機能を削減するため、付加的なアミノ酸置換が導入された。具体的には、ＦｃγＲＩ結合を削減するために、３つのアミノ酸置換が導入された。これらは、ＥＵインデックス位置２３４、２３５および２３７における置換である。これらの位置における置換は、ＦｃγＲＩに対する結合を削減することが示された（Duncanら、Nature第３３２号：５６３頁(１９８８年)）。これらのアミノ酸置換は、ＦｃγＲＩＩａ結合ならびにＦｃγＲＩＩＩ結合をも削減し得る（Sondermannら、Nature第４０６号：２６７頁(２０００年)；Winesら、J. Immunol. 第１６４号：５３１３頁(２０００年)）。
【００９７】
複数のグループが、補体Ｃ１ｑ結合および後続する補体固定におけるＥＵインデックス位置３３０および３３１（配列番号６のアミノ酸残基１３４および１３５）の関連性について記述してきた（Canfield and Morrison、J. Exp. Med.第１７３号：１４８３頁(１９９１年)；Tao ら、J. Exp. Med.第１７８号：６６１頁(１９９３年)）。これらの位置におけるアミノ酸置換がＦｃ４内に導入され、補体固定を削減した。Ｆｃ４のＣH3ドメインは、クローニングされたＤＮＡが大腸菌のｄａｍプラス株内で成長させられた場合に潜在的ｄａｍメチル化部位を削除するべく、ＴＧＡからＴＡＡに変更された停止コドンを除き、対応する野生型ポリペプチド内に見られるものと同一である。
【００９８】
Ｆｃ５内では、ＥＵインデックス位置２１８におけるアルギニン残基は、この特殊なＦｃを含む融合タンパク質内でＢｇｌＩＩクローニングスキームが使用されなかったため、リジンに戻るように突然変異を受けた。Ｆｃ５配列の残りの部分はＦｃ４についての以上の記述と整合する。
【００９９】
Ｆｃ６は、カルボキシ末端リジンコドンが削除されたという点を除いて、Ｆｃ５と同一である。成熟免疫グロブリンのＣ末端リジンは、多くの場合、Ｂ細胞からの分泌に先立って翻訳後に成熟免疫グロブリンから除去されるか、または血清循環中に除去される。その結果、Ｃ末端リジン残基は標準的には、循環する抗体上に見られない。以上のＦｃ４およびＦｃ５の場合のように、Ｆｃ６配列内の停止コドンはＴＡＡに変更された。
【０１００】
Ｆｃ７は、ＣH2ドメイン内にあるＥＵインデックス位置２９７におけるアミノ酸配列を除いて、野生型γ１Ｆｃと同一である。ＥＵインデックス位置Ａｓｎ−２９７は、Ｎ結合型炭水化物付着の部位である。Ｎ結合型炭水化物は、炭水化物構造の潜在的なバッチ毎の変動に起因して、組換え発現されたタンパク質に潜在的変動源を導入する。この潜在的変動性を除去しようとして、Ａｓｎ−２９７は、その残基位置におけるＮ結合型炭水化物の付着を防止するべくグルタミン残基へと突然変異させられた。残基２９７にある炭水化物は同様に、ＦｃＲＩＩＩに対するＦｃ結合に関与している（Sondermannら、Nature 第４０６号：２６７頁(２０００年)）。従って、炭水化物の除去は、融合タンパク質を含有する組換え型Ｆｃ７のＦｃγＲｓ全般に対する結合を減少させるはずである。以上のものと同様、Ｆｃ７配列中の停止コドンはＴＡＡへと突然変異された。
【０１０１】
ＥＵ標識位置２２０におけるシステイン残基がセリン残基で置き換えられたという点を除き、Ｆｃ８は、配列番号６に示された野生型免疫グロブリンγ１領域と同一である。この突然変異は、通常免疫グロブリン軽鎖定常領域とジスルフィド結合するシステイン残基を除去した。ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストの形成のためのこれらの特異的Ｆｃドメインのいずれかの使用は、本発明の範囲内にある。
【０１０２】
これらの分子のロイシンジッパー形態も同様に、本発明により企図されている。「ロイシンジッパー」とは、その融合パートナー（例えばロイシンジッパーが融合または連結される配列または分子）の２量体化または３量体化を増強、促進または駆動するロイシン富有配列を意味するように使用される当該技術分野の用語である。当該技術分野においては、さまざまなロイシンジッパーポリペプチドが記述されてきた。例えばLandschulzら、Science、第２４０号：１７５９頁(１９８８年); 米国特許第５，７１６，８０５号（US Patent 5,716,805）；国際公開第９４/１０３０８（WO 94/10308）；Hoppeら、FEBS Letters、第３４４号：１９９１頁(１９９４年)；Maniatisら、Nature、第３４１号：２４頁(１９８９年)を参照のこと。当業者であれば、ロイシンジッパー配列を本発明のポリペプチドの５’または３’末端のいずれかで融合させてよいということがわかるだろう。
【０１０３】
本発明のポリペプチドを、別の非相同ポリペプチドまたはアミノ酸配列にこのポリペプチドを融合させることによりキメラ分子を形成させるような形で修飾することも可能である。
【０１０４】
一部の実施形態によると、かかる非相同ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、キメラ分子をオリゴマー化するように作用するものである。一部の実施形態においては、かかるキメラ分子は、タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとポリペプチドの融合を含む。エピトープタグは、一般に、ポリペプチドのアミノまたはカルボキシル末端に置かれる。
【０１０５】
ポリペプチドのこのようなエピトープタグ付き形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出され得る。同様に、エピトープタグを提供することで、タグ抗体またはエピトープタグに対して結合する別のタイプの親和力マトリクスを用いた親和力精製によりポリペプチドを容易に精製することが可能となる。
【０１０６】
当該技術分野においてはさまざまなタグポリペプチドおよびそのそれぞれの抗体が周知である。例としてはポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ［Fieldら、Mol. Cell. Biol.、第８号：２１５９〜２１６５頁(１９８８年)］；ｃ−ｍｙｃタグおよびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Evanら、Molecular and Cellular Biology、第５号：３６１０〜３６１６頁(１９８５年)］；および単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Paborskyら、Protein Engineering、第３号(6)：５４７〜５５３頁(１９９０年)］がある。その他のタグポリペプチドには、フラグ−ペプチド［Hoppら、BioTechnology、第６号：１２０４〜１２１０頁(１９８８年)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martinら、Science、第２５５号：１９２〜１９４頁(１９９２年)］；抗チューブリンエピトープペプチド［Skinner ら、J. Biol. Chem.、第２６６号：１５１６３〜１５１６６頁(１９９１年)］；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuthら、Proc. Natl. Acad.Sci ：USA、第８７号：６３９３〜６３９７頁(１９９０年)］が含まれる。
【０１０７】
ペプチド−重合体抱合体の構築
一部の実施形態においては、合成ペプチドの重合体の抱合（例えばＰＥＧ化）のための戦略は、互いに対して反応性をもつ特別な官能基を各々担持するペプチドとＰＥＧ部分を、溶液中での抱合体連結によって形成することを通して組合せることから成る。ペプチドは、従来の固相合成を用いて容易に調製できる。ペプチドは、特異的部位で適切な官能基を用いて「予備活性化」される。前駆体は精製され、ＰＥＧ部分と反応させる前に完全に特徴づけされる。ＰＥＧでのペプチドのライゲーションは通常、水相中で行なわれ、逆相分析ＨＰＬＣによって容易に監視され得る。ＰＥＧ化されたペプチドは、分取ＨＰＬＣにより容易に精製され、分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸分析およびレーザー脱着質量分析によって特徴づけされ得る。
【０１０８】
一部の実施形態においては、ペプチドは、主に反応条件、重合体の分子量などに応じて、重合体上の末端反応基に対し、ペプチドのアミノ酸残基のうちの１つ以上を介して共有結合させられる。１つまたは複数の反応基をもつ重合体をここでは活性化された重合体と呼ぶ。反応基は、ペプチド上の遊離アミノまたはその他の反応基と選択的に反応する。潜在的反応部位としては、Ｎ末端アミノ基、リジン残基上のイプシロンアミノ基ならびにその他のアミノ、イミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、ヒドロキシルおよびその他の親水基が含まれる。しかしながら、最適な結果を得るために選択される反応基のタイプおよび量、ならびに利用される重合体のタイプは、ペプチド上の過度に多い特に活性の高い基と反応基を反応させることを回避するために利用される特定のペプチドによって左右される、ということがわかるだろう。一部の実施形態においては、抱合に適した位置で、反応性残基（例えばリジン（Ｋ）、修飾された非天然アミノ酸またはその他の小分子）を置換してよい。
【０１０９】
一部の実施形態では、ペプチドは、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩの配列、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号７）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号８）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号９）を含み、そうでなければ国際公開第０５／０００３５１号（WO05/000351）の図３２に列挙されている配列は末端反応基を有する。
【０１１０】
一部の実施形態では、ペプチドは、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩの配列、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（配列番号５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（配列番号６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（配列番号７）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（配列番号８）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（配列番号９）または国際公開第０５／０００３５１号（WO05/000351）の図３２に列挙されている配列を含むポリペプチドのうちの少なくとも１つ以上、そしてより好ましくは２つ以上を含む。合わせて連結されているポリペプチドは同じ配列を有しているかまたは異なる配列および末端反応基を有することができる。一部の実施形態では、これらのポリペプチドは、任意にはリンカーを用いて互いに接合され得る。
【０１１１】
抱合は一部の実施形態においてポリペプチド上の任意の反応性アミノ酸で発生してよいが、この反応性アミノ酸は、その遊離イプシロン−アミノ基を通して活性化重合体の反応基に連結されているリジンか、またはアミド結合を通して重合体に連結されているグルタミン酸またはアスパラギン酸である。一部の実施形態では、ペプチドの反応性アミノ酸は、位置Ｘ２およびＸｌｚにおけるシステイン残基ではない。
【０１１２】
各ペプチドでの重合体抱合度は、ペプチド上の反応性部位の数、重合体の分子量、親水性およびその他の特性、そして選択された特定のペプチド誘導体化部位に応じて変動する。一部の実施形態においては、抱合体は、ペプチド分子１個あたり１〜１０個の重合体分子という最終モル比を有するが、本発明のペプチドにより多くの重合体分子が付着されることも企図されている。一部の実施形態においては、各抱合体は１つの重合体分子を含有する。所望の量の誘導体化は、時間、温度およびその他の反応条件が置換度を変化させるように変動させられる実験用マトリクスを用いて容易に達成され、その後、抱合体の重合体置換レベルは、サイズ排除クロマトグラフィまたは当該技術分野で公知のその他の手段によって決定される。
【０１１３】
一部の実施形態においては、重合体は、反応性である単一基のみを含有する。これが、タンパク質分子の架橋を回避する一助となる。しかしながら、架橋を削減するべく反応条件を最大限にすること、または実質的に均一な誘導体を回収するべくゲルろ過またはイオン交換クロマトグラフィを通して反応生成物を精製することは、本明細書の範囲内に入る。その他の実施形態においては、重合体は、重合体主鎖に対し多数のペプチドを連結させる目的で２つ以上の反応基を含有する。
【０１１４】
ここでもまた、実質的に均一な形態で所望の誘導体を回収するために、ゲルろ過またはイオン交換クロマトグラフィを使用することができる。一部の実施形態においては、重合体は、多機能（通常は２機能）架橋剤を使用することなくペプチドに直接共有結合させられる。一部の実施形態においては、１：１のモル比のＰＥＧ鎖対ペプチドが存在する。
【０１１５】
共有結合による修飾反応は、ペプチド上の反応基がリジン基である場合に好ましくは約ｐＨ５〜９、より好ましくは７〜９で不活性重合体と生物活性材料を反応させるために一般に用いられるあらゆる適切な方法によって、発生してよい。一般的に、このプロセスには、活性化重合体（この重合体は標準的に、活性化すべき少なくとも１つの末端ヒドロキシル基を有する）を調製するステップ、この重合体から活性基質を調製するステップ、そしてその後活性基質とペプチドを反応させて処方物に適したペプチドを産生させるステップが関与する。上述の修飾反応は、１つ以上のステップが関与してよい複数の方法により実施され得る。１ステップ反応内で活性化重合体を産生させるのに使用可能である修飾剤の例としては、シアヌル酸塩化物（２，４，６−トリクロロ−Ｓ−トリアジン）およびシアヌル酸フッ化物が含まれる。
【０１１６】
一部の実施形態においては、修飾反応は２段階で発生し、重合体をまず無水コハク酸またはグルタル酸無水物といった酸無水物と反応させてカルボン酸を形成させ、次にこのカルボン酸をカルボン酸と反応できる化合物と反応させて、ペプチドと反応できる反応性エステル基をもつ活性化重合体を形成させる。かかる化合物の例としてはＮ−ヒドロキシスクシンイミド、４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンスルホン酸などが含まれ、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドまたは４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンスルホン酸が使用される。例えばモノメチル置換ＰＥＧを高温で、好ましくは１００〜１１０℃で４時間、グルタル酸無水物と反応させてよい。このように産生されたモノメチルＰＥＧ−グルタル酸を次に、ジシクロヘキシルまたはイソプロピルカルボジイミドといったカルボジイミド試薬の存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて、活性化重合体、メトキシポリエチレングリコール−Ｎ−スクシニミジルグルタレートを生成させ、次にこれをＧＨと反応させることができる。この方法は、Abuchowskiら、Cancer Biochem. Biophys.、第７号：１７５〜１８６頁(１９８４年)中で詳述されている。別の例では、モノメチル置換ＰＥＧを、グルタル酸無水物と反応させ、それに続いてジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンスルホン酸（ＨＮＳＡ）と反応させて活性化重合体を生成してよい。ＨＮＳＡについては、Bhatnagarら、Peptides: Synthesis-Structure -Function. Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium、Richら、(eds.) (Pierce Chemical Co.、RockfordllL、１９８１年)、９７〜１００頁、およびNitecki ら、High-Technology Route to Virus Vaccines (American Society for Microbiology：１９８６年) 標題「Novel Agent for Coupling Synthetic Peptides to Carriers and Its Applications」の中で記述されている。
【０１１７】
一部の実施形態においては、アミノ基に対する共有結合は、塩化シアヌル、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応基（ＰＥＧアルコキシドとブロモアセトアルデヒドジエチルアセタール；ＰＥＧとＤＭＳＯおよび無水酢酸、またはＰＥＧ塩化物と４−ヒドロキシベンズアルデヒドフェノキシド、活性化スクシンイミジルエステル、活性化ジチオカルボネートＰＥＧ、２，４，５−トリクロロフェニルクロロホルメートまたはＰ−ニトロフェニルクロロホルメート活性化ＰＥＧに基づく公知の化学反応によって達成される。カルボジイミドを用いてＰＥＧ−アミンをカップリングすることにより、カルボキシ基が誘導化される。スルフヒドリル基は、１９９７年３月２７日付けで公開された国際公開第９７／１０８４７号（WO97/10847）中で記述されている通りのマレイミド置換ＰＥＧ（例えばアルコキシ−ＰＥＧアミンとスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、またはNektar Technologies, San Carlos, CA（旧Shearwater Polymers, Inc.）から市販されているＰＥＧ−マレイミドにカップリングさせることによって誘導体化される。代替的には、ペプチド上の遊離アミノ基（例えば、リジン残基上のイプシロンアミノ基）をＮ−ヒドロキシスクシミニジル置換ＰＥＧ（Nektar Technologiesより入手可能なＰＥＧ−ＮＨＳ）にカップリングさせてよく、そうでなければ、Pedleyら、Br. J. Cancer、第７０号：１１２６〜１１３０頁(１９９４年)で記述されているように、これを２−イミノ−チオラン（トラウト試薬）でチオール化させ、次にこれをＰＥＧのマレイミド含有誘導体にカップリングさせることができる。
【０１１８】
ＰＥＧを含めた（ただしこれに限定されない）数多くの不活性重合体が、調合薬中で使用するのに適している。例えはDavisら、Biomedical Polymers: Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use、４４１〜４５１頁(１９８０年)を参照のこと。本発明の一部の実施形態においては、非タンパク性重合体が使用される。非タンパク性重合体は標準的に親水性合成重合体であり、別途天然には見られない重合体である。しかしながら、天然供給源から単離される重合体のように自然の中に存在し組換え型または試験管内方法で産生される重合体も同様に有用である。親水性ポリビニル重合体例えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンは、本発明の範囲内に入る。特に有用であるのは、ポリアルキレンエーテル例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリオキシアルキレン例えばポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロック共重合体（Pluronics）；ポリメタクリレート；カルボマー；単糖類単量体、Ｄ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトシダーゼ、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えばポリマンヌロン酸またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコースおよび、ホモ多糖類およびヘテロ多糖類、例えばラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、または酸ムコ多糖類の多糖類サブユニット、例えばヒアルロン酸を含むノイラミン酸を含む分岐または未分岐多糖類；糖アルコールの重合体たとえばポリソルビトールおよびポリマンにトール；ヘパリンまたヘパロンである。
抱合前の重合体は、水溶性である必要はないものの好ましくは水溶性であり、最終的抱合体は好ましくは水溶性である。好ましくは、抱合体は、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌ、そしてなお一層好ましくは少なくとも約１ｍｇ／ｍｌの水溶性を示す。
【０１１９】
さらに、重合体は、抱合体形態において高い免疫原性を有していてはならず、また抱合体が静脈内輸液、注射または吸入といった経路により投与されるよう意図されている場合、かかる経路と相容れない粘度を有していてはならない。
【０１２０】
重合体の分子量は、最高約１００，０００Ｄまでの範囲であり得、好ましくは少なくとも約５００Ｄまたは少なくとも約１０００Ｄまたは少なくとも約５０００Ｄである。一部の実施形態においては、ＰＥＧまたはその他の重合体は５０００〜２０，０００Ｄの範囲内の分子量を有する。選択される分子量は、達成すべき抱合体の有効サイズ、重合体の性質（例えば線状または分岐といった構造）および誘導体化度、すなわちペプチド１個あたりの重合体分子の数およびペプチド上の１つまたは複数の重合体付着部位により左右され得る。一部の実施形態においては、ペプチドの有効サイズの大幅な増大を誘発するために、分岐ＰＥＧを使用してよい。半減期を増大させ、溶解度を増大させ、タンパク質分解性攻撃に対し安定化させ、かつ免疫原性を削減するために、ＰＥＧまたはその他の重合体抱合体を利用してよい。
【０１２１】
本発明のペプチドを修飾するための機能化されたＰＥＧ重合体は、Nektar Technologies of San Carlos、CA （旧Shearwater Polymers、Inc.）から入手可能である。このような市販のＰＥＧ誘導体としては、アミノ−ＰＥＧ、ＰＥＧアミノ酸エステル類、ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド化学（ＮＨＳ）、ＰＥＧ−ヒドラジド、ＰＥＧ−チオール、ＰＥＧ−スクシネート、カルボキシメチル化ＰＥＧ、ＰＥＧ−プロピオン酸、ＰＥＧアミノ酸類、ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート、ＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシンイミジルエステル、ＰＥＧのスクシンイミジルカルボネート、アミノ酸ＰＥＧのスクシンイミジルエステル類、ＰＥＧ−キシカルボニルイミダゾール、ＰＥＧ−ニトロフェニルカルボネート、ＰＥＧトレシレート、ＰＥＧ−グリシジルエーテル、ＰＥＧ−アルデヒド、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−オルトピリジル−ジスルフィド、ヘテロ官能性ＰＥＧ類、ＰＥＧビニル誘導体類、ＰＥＧシラン類、およびＰＥＧホスファミド類が含まれるが、これらに限定されるわけではない。これらのＰＥＧ誘導体をカップリングするための反応条件は、タンパク質、所望のＰＥＧ化度および使用されるＰＥＧ誘導体に応じて変動する。ＰＥＧ誘導体の選択に関与するいくつかの因子としては、所望の付着点（例えばリジンまたはシステインＲ基）、誘導体の加水分解安定性および反応性、結合の安定性、毒性および抗原性、分析に対する適合性などか含まれる。任意の特定の誘導体を使用するにあたって具体的指示事項はメーカーから入手可能である。
【０１２２】
抱合体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲルろ過、ＮＭＲ、トリプシンマッピング、液体クロマトグラフィ質量光度法および試験管内生物学的検定によって特徴づけされ得る。例えば、ＰＥＧ抱合の程度はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルろ過によって示され、その後、ＰＥＧのメチレン水素についての特異的共鳴ピークを有するＮＭＲによって分析され得る。各分子上のＰＥＧ基の数は、ＮＭＲスペクトルまたは質量分析法から計算できる。１０％のＳＤＳ中のポリアクリルアミドゲル電気泳動は、溶出緩衝液としての１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ８．０の中で適切に実施される。どの残基がＰＥＧ化されているかを実証するために、トリプシンマッピングを実施することができる。かくして、ＰＥＧ化されたペプチドは、１００ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭの塩化カルシウムｐＨ８．３中において４時間３７℃でｍｇベースで１００対１のタンパク質／酵素比でトリプシンを用いて消化され、４未満のｐＨで酸性化されて消化を中止し、その後ＨＰＬＣＮｕｃｌｅｓｉｌＣ−１８（４．６ｍｍ、時間、１５０ｍｍ、５．ｍｕ、１００Ａ）上で分離される。クロマトグラムは、非ＰＥＧ化出発物質のものと比較される。次に各ピークを質量分析法により分析してピーク内のフラグメントのサイズを確認する。ＰＥＧ基を担持していた１つまたは複数のフラグメントは、通常、注入後ＨＰＬＣカラム上に保持されず、クロマトグラフから消滅する。クロマトグラフからのこのような消滅は、少なくとも１つのリジン残基を含有するはずであるその特定のフラグメント上でのＰＥＧ化の標示である。ＰＥＧ化ペプチドは次に従来の方法によって、ＢＬｙＳに対する結合能力について検定され得る。
【０１２３】
一部の実施形態においては、抱合体はイオン交換クロマトグラフィ（例えばイオン交換ＨＰＬＣ）によって精製される。親電子的に活性化されたＰＥＧのうち多くのものの化学反応の結果として、ＰＥＧ化された生成物のアミノ基電荷が減ることになる。かくして、高分解能イオン交換クロマトグラフィを用いて、遊離および抱合タンパク質を分離し、異なるＰＥＧ化レベルをもつ種を分解することが可能である。
【０１２４】
実際、未反応アミノ酸のイオン特性の差異に起因して、異なる種（例えば１つまたは２つのＰＥＧ残基を含有するもの）の分解が同様に可能である。一実施形態においては、異なるＰＥＧ化レベルを有する種が、国際公開第９６／３４０１５号（WO96/34015）（１９９６年１０月３１日公開の国際ＰＣＴ出願第９６／０５５５０号（PCT/US96/05550））に記述されている方法にしたがって分解される。抱合体の非相同種は、同じ要領で相互に精製される。
【０１２５】
一部の実施形態においては、ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨＳ）は、一級アミン（例えばリジンおよびＮ末端）と反応する。一部の実施形態においては、ＰＥＧ−ＮＨＳは、ポリペプチドのＣ末端リジン（Ｋ）と反応する。一部の実施形態においては、リジン残基は、１７−ｍｅｒポリペプチドのＣ末端に付加され、一方その他の実施形態においてはＸｉはリジンで置換される。一部の実施形態においては、重合体はＮ末端と反応する。好ましい実施形態においては、抱合体は、以下の実施例の中で記述されている誘導体化および精製方法を利用することによって生成される。
【０１２６】
１つの態様においては、本発明は、抱合体の共有結合分子構造内にいかなる外来の物質も無く、１つ以上の重合体分子に共有結合によって付着されたその構成要素部分すなわち１つ以上のペプチドによって形成された上述の抱合体のいずれかを提供する。
【０１２７】
本発明の方法および製造品は、ＢＬｙＳまたはその３つのレセプタのうちの１つ以上に結合する抗体を使用するかまたは取込んでいる。したがって、かかる抗体を生成するための方法を以下で記述する。
【０１２８】
抗体の産生またはそのスクリーニングのために使用すべきＢＬｙＳまたはＢＬｙＳレセプタは、例えば、所望のエピトープを含むその抗体のまたはその一部分の可溶形態であってよい。上述の通り、ＢＬｙＳ配列およびＢＬｙＳレセプタの配列は、これらのポリペプチドのさまざまなドメインの境界であるものとして知られている。細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のペプチドフラグメントを免疫原として使用することができる。これらの公知の配列およびドメインの描写に基づいて、当業者は、抗体を産生させる上で使用するためのＢＬｙＳまたはＢＬｙＳレセプタポリペプチドおよびそのフラグメントを表現することができる。
【０１２９】
ＢＬｙＳまたはそのレセプタに対する抗体を生成するため、長さが残基６個以上の全長ポリペプチドまたはペプチドフラグメントを、マウス、ハムスター、およびラットを含めたげっ歯類、ウサギ、ヤギまたはその他の適切な動物において抗体を発生させるための免疫原として使用することができる。可溶性ＢＬｙＳまたはＢＬｙＳレセプタポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントは、細菌または真核細胞といった適切な宿主細胞内で発現され得る。一実施形態においては、大腸菌内でヒトおよびマウスの洗浄剤可溶化全長ＢＬｙＳが産生され、ＢＬｙＳ抗体を産生するハイブリドーマを免疫化しそれについてスクリーニングするために使用される。
【０１３０】
代替的にまたは付加的には、抗体を生成しかつ／またはそれについてスクリーニングするために、その細胞表面でＢＬｙＳまたはＢＬｙＳレセプタを発現するＢ細胞またはＢ細胞系列を使用することができる。抗体を生成するために有用なＢＬｙＳのその他の形態も当業者には明らかであり、ＢＬｙＳ結合抗体を産生させるためにはファージディスプレイ法なども使用可能である。ＢＬｙＳまたはＢＬｙＳレセプタを結合させる抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体であり得る。かかる抗体およびそれらの生成方法について以下でさらに詳述する。
【０１３１】
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原およびアジュバントの多数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注入により動物の体内で発生させられる。例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンまたはダイズトリプシン阻害物質などの免疫化すべき種の中で免疫原性であるタンパク質に対し、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を通した抱合）、Ｎ−ヒドロキシスクシイミド（リジン残基を通したもの）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣ１２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（なお式中ＲおよびＲ’は異なるアルキル基である）などの二機能性または誘導体化剤を用いて、関連する抗原を抱合させることが有用であるかもしれない。
【０１３２】
３体積の完全フロインドアジュバントと例えば１００ｗｕまたは５ｇのタンパク質または抱合体（それぞれウサギまたはマウス用）を組合せ、多数の部位で皮内に溶液を注入することによって、抗原、免疫原性抱合体または誘導体に対して動物を免疫化する。１カ月後に、多数の部位での皮下注射により完全フロインドアジュバント中の当初の量のペプチドまたは抱合体の１／５〜１／１０で動物に追加免疫する。７〜１４日後に、動物を出血させ、抗体力価について血清を検定する。力価が水平状態に達するまで動物を追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原の抱合体ではあるものの異なるタンパク質に対しかつ／または異なる架橋試薬を通して抱合された抱合体で追加免疫される。抱合体は同様に、タンパク質融合として組換え型細胞培養内で作ることもできる。同様に、ミョウバンといったような凝集剤を適切に用いて免疫応答を増強させる。
【０１３３】
モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られる。すなわち、この集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる考えられる天然に発生する突然変異を除いて、同一である。かくして、「モノクローナル」という修飾語は、個別の抗体の混合物ではないものとしての抗体の性質を表わしている。
【０１３４】
例えば、モノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature、第２５６号：４９５頁(１９７５年)が最初に記述したハイブリドーマ方法を用いて作られてもよいし、または、組換え型ＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６７号（U. S. Patent No.4,816,567））によって作られてもよい。ハイブリドーマ方法においては、マウスまたはハムスターなどのその他の適切な宿主動物が、上述のように免疫化されて、免疫化に用いられたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するまたは産生する能力をもつリンパ球を惹起する。代替的には、リンパ球は、試験管内で免疫化されてよい。その後、リンパ球は、例えばポリエチレングリコールといったような適切な融合剤を用いて、骨髄腫細胞と融合されてハイブリドーマ細胞を形成する（Goding、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice、５９〜１０３頁(Academic Press、1986)）。
【０１３５】
かくして調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは未融合の親骨髄腫細胞の成長または存続を阻害する１つ以上の物質を含有する適切な培地の中に播種され成長させられる。例えば、親骨髄腫細胞に酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）が欠如している場合、ハイブリドーマのための培地は、標準的には、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ培地）を含有し、これらの物質がＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止する。
【０１３６】
好ましい骨髄腫細胞は、効率良く融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの産生を支援し、ＨＡＴ培地といったような培地に対する感応性をもつ。
【０１３７】
これらの中でも、好ましい骨髄腫細胞系列は、マウス骨髄腫系列例えば、Salk Institute Cell Distribution Center、San Diego、California USAから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍およびAmerican Type Culture Collection、Rockville、Maryland USA.から入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来するものである。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系列も同様に、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記述されている（Kozbor、J.Immunol.、第１３３号：３００１頁(１９８４年); Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、５１〜６３頁(Marcel Dekker、Inc.、New York、１９８７年)）。
【０１３８】
ハイブリドーマ細胞を中で成長させている培地が、抗原に対し向けられたモノクローナル抗体の産生について検定される。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によってかまたは試験管内結合検査、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。モノクローナル抗体の結合親和力は例えば、Munsonら、Anal. Biochem.、第１０７号：２２０頁(１９８０年)のスキャチャード解析によって決定され得る。
【０１３９】
所望の特異性、親和力および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、希釈手順を制限することでクローンをサブクローニングし標準的方法により成長させてもよい（Goding、Monoclonal Antibodies Principles and Practice、５９〜１０３頁(Academic Press、１９８６年)）。この目的のための適切な培地としては、例えばＤ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、動物の体内で腹水腫瘍として、ハイブリドーマ細胞を成長させてもよい。
【０１４０】
サブクローンにより分泌型モノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアルパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析または親和性クロマトグラフィといった従来の免疫グロブリン精製手順により、培地、腹水または血清から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えばマウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力をもつオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。ひとたび単離されると、ＤＮＡは、発現ベクター内に入れられてよく、次にこの発現ベクターは、それ以外の形では免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞といった宿主細胞内にトランスフェクトされて、組換え型宿主細胞内でのモノクローナル抗体の合成を提供する。抗体をコードするＤＮＡの細菌内での組換え発現についての総論としては、Skerraら、Curr. Opinion in Immunol.、第５号：２５６〜２６２頁(１９９３年)およびPluckthun、Immunol Revs.、第１３０号：１５１〜１８８頁(１９９２年)がある。
【０１４１】
さらなる実施形態においては、抗体または抗体フラグメントを、McCaffertyら、Nature、第３４８号：５５２〜５５４頁(１９９０年).の中で記述された技術を用いて生成された抗体ファージライブラリから単離することができる。
【０１４２】
Clacksonら、Nature、第３５２号：６２４〜６２８頁(１９９１年) およびMarksら、J. MoI. Biol、第２２２号：５８１〜５９７頁(１９９１年)は、それぞれ、ファージライブラリを用いたマウスおよびヒト抗体の単離について記述している。その後の刊行物は、チェーンシャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Marksら、BiolZ'echraology、第１０号：７７９〜７８３頁(１９９２年)）ならびに非常に大きなファージライブラリを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染および生体内組換え（Waterhouseら、Nuc. acids. Res.、第２１号：２２６５〜２２６６頁(１９９３年)）について記述している。かくして、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的モノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替案である。
【０１４３】
ＤＮＡは同様に、例えば相同性マウス配列の代りにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのためのコーディング配列を置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号（U. S. Patent No. 4,816,567）；Morrisonら、Proc. Natl Acad. Sci. USA、第８１号：６８５１頁(１９８４年)）、または非免疫グロブリンポリペプチドのためのコーディング配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコーディング配列に共有結合により接合することによって修飾されてもよい。
【０１４４】
標準的には、かかる非免疫グロブリンポリペプチドは抗体の定常ドメインに置換させられるかまたは、抗体の１つの抗原組合せ部位の可変ドメインに置換させられて、抗原に対する特異性をもつ１つの抗原組合せ部位および異なる抗原に対する特異性をもつ別の抗原組合せ部位を含むキメラ２価抗体を作り上げる。
【０１４５】
非ヒト抗体をヒト化するための方法が当該技術分野において記述されてきた。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒト供給源からその内部に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「移入」残基と呼ばれ、これらは標準的に「移入」可変ドメインから取られる。ヒト化は基本的に、Winterと共同研究者の方法 (Jonesら、Nature、第３２１号：５２２〜５２５頁(１９８６年)；Riechmannら、Nature、第３３２号：３２３〜３２７頁(１９８８年); Verhoeyenら、Science、第２３９号：１５３４〜１５３６頁(１９８８年)に従い、超可変領域配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって実施可能である。従って、かかる「ヒト化」抗体は、実質的に１つ未満の無傷ヒト可変ドメインが非ヒト種からの対応する配列により置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は標準的に、一部の超可変領域残基そして場合によっては一部のＦＲ残基がげっ歯類抗体内の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１４６】
ヒト化抗体を作るのに用いるべき軽鎖および重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を削減するためにきわめて重要である。いわゆる「最良適合」方法によると、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングされる。このときげっ歯類の配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のためのヒト枠組み構造領域（ＦＲ）として受入れられる（Simsら、J. Immunol.、第１５１号：２２９６頁(１９９３年); Chothia ら、J. MoI. Biol、第１９６号：９０１頁(１９８７年)）。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導された特定の枠組み構造領域が使用される。複数の異なるヒト化抗体のために同じ枠組み構造を使用してもよい（Carterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８９号：４２８５頁(１９９２年); Presta ら、J. Immunol、第１５−１号：２６２３頁(１９９３年)）。
【０１４７】
抗原およびその他の有利な生物学的特性に対する高い親和力を保持しながら抗体をヒト化することがさらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法に従うと、ヒト化抗体は、親およびヒト化配列の３次元モデルを用いる親配列およびさまざまな概念的ヒト化産物の分析プロセスにより調製される。
【０１４８】
３次元免疫グロブリンモデルは一般的に利用可能であり、当業者にとっては珍らしいものではない。選択された候補免疫グロブリン配列の確率の高い３次元コンホメーション構造を例証しディスプレイするコンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレイを調べることで、免疫グロブリン配列候補の機能において可能性ある残基の役割を分析すること、すなわち候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基を分析することが可能となる。このようにして、１つまたは複数の標的抗原に対する親和力の増加といったような所望の抗体特性を達成するような形で、レシピエントおよび移入配列からＦＲ残基を選択し組合せることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接的にかつ最も実質的に関与している。
【０１４９】
ヒト化に対する代替案として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、今や、免疫化の時点で、内因性免疫グロブリン産生が無い状態でヒト抗体の完全なレパートリを産生する能力をもつ遺伝子導入動物（例えばマウス）を生産することが可能である。例えば、キメラおよび生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合体欠失の結果として内因性抗体産生の完全な阻害が生じる、ということが記述された。
【０１５０】
このような生殖系列突然変異体マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの転移により、抗原チャレンジの時点でヒト抗体が産生される結果となった。例えば、Jakobovitsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第９０号：２５５１頁(１９９３年); Jakobovitsら、Nature、第３６２号：２５５〜２５８頁(１９９３年); Bruggermannら、Year in Immuno.、第７号：３３頁(１９９３年)；および米国特許第５，５９１，６６９号（US Patent Nos. 5,591、669）、第５，５８９，３６９号（5,589,369）および第５，５４５，８０７号（5,545,807）を参照のこと。
【０１５１】
代替的には、免疫化されていないドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリから、試験管内でヒト抗体および抗体フラグメントを産生するために、ファージディスプレイ技術（McCaffertyら、Nature第３４８号：５５２〜５５３頁(１９９０年)）を使用することができる。この技術に従うと、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３またはｆｄなどの糸状バクテリオファージの主要または微量外皮タンパク質遺伝子のいずれかの中に枠内でクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能的抗体フラグメントとしてディスプレイされる。糸状粒子はファージゲノムの１本鎖ＤＮＡコピーを含むことから、抗体の機能的特性に基づく選択によって、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が同様に得られる結果となる。かくして、ファージはＢ細胞の特性の一部を模倣する。
【０１５２】
ファージディスプレイは、さまざまな形式で実施可能である。その精査のためには、例えばJohnson、Kevin S. および Chiswell、David J.、Current Opinion in Structural Biology 第３号：５６４〜５７１頁(１９９３年)を参照のこと。ファージディスプレイのためには、Ｖ−遺伝子セグメントの複数の供給源を使用できる。Clacksonら、Nature、第３５２号：６２４〜６２８頁（１９９１年）は、免疫化されたマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリから、さまざまな抗−オキサゾロン抗体のアレイを単離した。基本的にMarksら、J. MoI. Biol.第２２２号：５８１〜５９７頁(１９９１年)、またはGriffithら、EMBO J. 第１２号：７２５〜７３４頁(１９９３年)によって記述されている技術に従って、免疫化されていないヒトドナー由来のＶ遺伝子レパートリを構築することができかつ（自己抗原を含む）さまざまな抗原アレイに対する抗体を単離することができる。同様に、米国特許第５，５６５．３３２号（US Patent-Nos. 5,565,332）および第５，５７３，９０５号（5,573,905）も参照のこと。ヒト抗体は同様に、試験管内で活性化されたＢ細胞によって生成されてもよい（米国特許第５，５６７，６１０号（US Patents 5,567,610）および第５，２２９，２７５号（5,229,275）を参照のこと）。
【０１５３】
抗体フラグメントの産生のためのさまざまな技術が開発されてきた。従来、これらのフラグメントは、無傷抗体のタンパク質分解消化を介して誘導された（例えばMorimotoら、Journal of Biochemical and Biophysical Methods 第２４号：１０７〜１１７頁(１９９２年) およびBrennanら、Science、第２２９号：８１頁(１９８５年)を参照のこと）。しかしながら、これらのフラグメントは今や、組換え型宿主細胞によって直接産生可能である。例えば、抗体フラグメントは、以上で論述されている抗体ファージライブラリから単離可能である。代替的には、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを大腸菌から直接回収し化学的にカップリングさせてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Carterら、Bio/Technology 第１０号：１６３〜１６７頁(１９９２年)）。別のアプローチによると、組換え型宿主細胞培養から直接、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを単離することができる。抗体フラグメントの産生のためのその他の技術は、当業者には明らかである。その他の実施形態では、選択される抗体は、一本鎖Ｆｖ（ＦＧ）（ｓｃＦｖ）である。国際公開第９３/１６１８５号（WO 93/16185）；米国特許第５，５７１，８９４号（US Patent No. 5,571,894）；および米国特許第５，５８７，４５８号（US Patent No. 5,587,458）を参照のこと。抗体フラグメントは同様に、例えば米国特許第５，６４１，８７０号（US Patent 5,641,870）で記述されているような「線状抗体」であってよい。かかる線状抗体フラグメントは、単一特異性であるかまたは二重特異性であってよい。
【０１５４】
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的二重特異性抗体は、Ｂ細胞表面マーカーの２つの異なるエピトープに対し結合し得る。その他のこのような抗体は、第１のＢ細胞マーカーを結合させかつさらに第２のＢ細胞表面マーカーを結合させ得る。代替的には、抗Ｂ細胞マーカー結合アームは、細胞防御機序をＢ細胞に集中させるべく、白血球上の引き金分子例えばＴ細胞レセプタ分子（例えばＣＤ２またはＣＤ３）またはＩｇＧ（ＦｃｙＲ）用Ｆｃレセプタ例えばＦｃｙＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃｙＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃｙＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合するアームと組合されてよい。二重特異性抗体は同様に、Ｂ細胞に細胞傷害薬を局在化させるためにも使用可能である。
【０１５５】
これらの抗体は、Ｂ細胞マーカー結合アームおよび細胞傷害薬（例えばサポリン、抗−インタフェロン−、ビンカ・アルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセートまたは放射性同位元素ハプテン）を結合させるアームを有する。
【０１５６】
二重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製可能である。二重特異性抗体を作るための方法は、当該技術分野において公知である。全長二重特異性抗体の従来の産生は、２つの鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいている（Millsteinら、Nature、第３０５号：５３７〜５３９頁(１９８３年)）。
【０１５７】
免疫グロブリン重鎖および軽鎖がランダムに選別されていることから、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、異なる１０個の抗体分子の潜在的混合物を産生し、そのうちの１つだけが正しい二重特異性構造を有する。通常親和性クロマトグラフィステップにより行なわれる正しい分子の精製は、かなりわずらわしいものであり、産物収量は低い。類似の手順が、国際公開第９３／０８８２９号（WO93/08829）およびTrauneckerら、EMBO J.、第１０号：３６５５〜３６５９頁(１９９１年)の中で開示されている。
【０１５８】
異なるアプローチによると、所望の結合特異性をもつ抗体可変ドメイン（抗体−抗原組合せ部位）が免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。融合は好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部分を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。融合のうちの少なくとも１つの中に存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合および望ましい場合には免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが、別々の発現ベクター内に挿入され、適切な宿主生物内に同時トランスフェクトされる。こうして、構築に用いられる３つのポリペプチド鎖の不等な比率が最適な収量を提供する場合、実施形態の中で３つのポリペプチドフラグメントの相互の割合を調整する上での大きな融通性が得られる。しかしながら、等しい比率での少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらす場合、または比率が特に意義をもたない場合、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のためのコーディング配列を１つの発現ベクター内に挿入することが可能である。
【０１５９】
このアプローチの好ましい１実施形態においては、二重特異性抗体は、１つのアーム内の第１の結合特異性をもつハイブリッド免疫グロブリン重鎖およびもう一方のアーム内の（第２の結合特異性を提供する）ハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対で構成されている。二重特異性分子の一半分の中のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することで分離が容易になるため、この非対称構造により、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せから所望の二重特異性化合物を容易に分離することができる。このアプローチは、国際公開第９４／０４６９０号（WO94/04690）の中で開示されている。二重特異性抗体の生成のさらなる詳細については、Suresh ら、Methods in Enzymology、第１２１号：２１０頁(１９８６年)を参照のこと。米国特許第５，７３１，１６８号（U. S. Patent No.5,731,168）で記述されている別のアプローチによると、組換え型細胞培養から回収されるヘテロ二量体の百分率を最大限にするように抗体分子対間の界面を工学処理することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも１つを含む。この方法においては、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小アミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）で置き換えられる。１つまたは複数の大側鎖と同一のまたは類似のサイズの代償性「キャビティ」が、大アミノ酸側鎖をより小さな側鎖（例えばアラニンまたはトレオニン）で置換えることにより第２の抗体分子の界面上に作り上げられる。こうして、ホモ二量体などその他の望ましくない最終産物に比べてヘテロ二量体の収量を増大させるための機序が得られる。
【０１６０】
二重特異性抗体には、架橋または「ヘテロ抱合体」抗体が含まれる。例えば、ヘテロ抱合体内の抗体の一方は、アビジンにカップリングされ得、もう一方はビオチンにカップリングされ得る。かかる抗体は、例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的化するため（米国特許第４，６７６，９８０号）およびＨＩＶ感染の治療のため（国際公開第９１／００３６０号（WO 91/00360）、国際公開第９２/２００３７３号（WO 92/200373）および欧州特許第０３０８９号（EP 03089））に提案されてきた。ヘテロ抱合体抗体は、適切な任意の架橋方法を用いて作ることができる。適切な架橋剤は、当該技術分野において周知であり、数多くの架橋技術と共に米国特許第４，６７６，９８０号で開示されている。
【０１６１】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成するための技術も同様に、文献中で記述されてきた。例えば、二重特異性抗体は化学的連結を用いて調製可能である。Brennanら、Science、第２２９号：８１頁(１９８５年)は、無傷抗体をタンパク質分解により分解してＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成する１つの手順について記述している。これらのフラグメントは、隣接ジオチールを安定化させ分子間ジスルフィド形成を妨げるべくジオチール錯化剤ヒ酸ソーダの存在下で還元される。生成されたＦａｂ’フラグメントは次にチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体へと転換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つは、次にメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに再度転換され、等モル量のその他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて二重特異性抗体を形成する。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための作用物質として使用可能である。
【０１６２】
近年の進歩により、化学的にカップリングさせて二重特異性抗体を形成させることのできる大腸菌由来のＦａｂ’−ＳＨフラグメントの直接的回収が容易になった。Shalabyら、J. Exp. Med.、第１７５号：２１７〜２２５頁(１９９２年)は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生について記述している。各Ｆａｂ’フラグメントは、大腸菌から別々に分泌され試験管内での定方向化学カップリングに付され、二重特異性抗体を形成した。このように形成させられた二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２レセプタを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合でき、かつヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害リンパ球の溶解活性を引き起こすことができた。
【０１６３】
組換え型細胞培養から直接二重特異性抗体フラグメントを作り単離するためのさまざまな技術も、記述されてきた。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを用いて産生された。Kostelnyら、J. Immunol.、第１４８号（５）：１５４７〜１５５３頁(１９９２年)。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。
【０１６４】
抗体ホモ二量体は、ヒンジ領域において還元されて、単量体を形成し、次に再酸化させられて抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は同様に、抗体ホモ二量体の産生のためにも利用可能である。
【０１６５】
Hollingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第９０号：６４４４〜６４４８頁(１９９３年)によって記述された「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作るための代替的機序を提供した。フラグメントは、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能にするには短すぎるリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは、もう１つのフラグメントの相補的ＶＬおよびＬＨドメインと強制的に対合させられ、かくして２つの抗原結合部位を形成する。１本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用することにより二重特異性抗体フラグメントを作るための別の戦略も報告された。Gruberら、J. ImmunoL、第１５２号：５３６８頁(１９９４年)を参照のこと。
【０１６６】
２つ以上の原子価を有する抗体が企図されている。例えば三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら、J. Immunol.第１４７号：６０頁(１９９１年)。
【０１６７】
本明細書中で記述されているタンパク質またはペプチドアンタゴニストおよび抗体のアミノ酸配列の１つまたは複数の修飾が企図されている。例えば、ＢＬＹＳ結合抗体またはアンタゴニストの結合親和力および／またはその他の生物学的特性を改善することが望ましいかもしれない。アンタゴニストのアミノ酸配列変異体は、アンタゴニスト核酸内に適切なヌクレオチド変化を導入することによってかまたはペプチド合成によって調製される。かかる修飾には、例えばアンタゴニストのアミノ酸配列内部の残基からの欠失および／またはその中への挿入および／またはその置換が含まれる。最終構成体が所望の特性を有することを条件として、最終構成体に到達するべく、欠失、挿入および置換のあらゆる組合せが行なわれる。アミノ酸の変更もまたアンタゴニストの翻訳後プロセスを改変する可能性があり、例えばグリコシル化部位の数または位置を変更させる。
【０１６８】
突然変異誘発にとって好ましい場所であるアンタゴニストの或る種の残基または領域を同定するのに有用な１つの方法は、Cunningham and Wells Science、第２４４号：１０８１〜１０８５頁(１９８９年)によって記述されている通り「アラニン走査突然変異誘発」と呼ばれる。ここでは、標的残基の１残基または一群（例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕといったような荷電残基）が同定され、アミノ酸と抗原の相互作用に影響を及ぼすべく中性または負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられる。このとき、置換に対する機能的感応性を示すこれらのアミノ酸の場所は、置換部位においてまたは置換部位のためにさらなるまたはその他の変異体を導入することによりリファインされる。かくして、アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め定められているものの、突然変異自体の性質を予め定める必要はない。例えば、所与の部位における突然変異の性能を分析するためには、標的コドンまたは領域においてｔａｌａ走査（tala scanning）またはランダム突然変異誘発が行なわれ、所望の活性について、発現されたアゴニスト変異体がスクリーニングされる。
【０１６９】
アミノ酸配列の挿入には、長さが１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの範囲にあるアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または多数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を伴うアンタゴニストまたは細胞傷害ポリペプチドに融合されたアンタゴニストが含まれる。アンタゴニスト分子のその他の挿入変異体には、アンタゴニストの血清半減期を増大させるポリペプチドまたは酵素のアンタゴニストＮまたはＣ末端への融合が含まれる。
【０１７０】
別のタイプの変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基に置き換えられたアンタゴニスト分子内のアミノ酸残基を少なくとも１つ有する。抗体アンタゴニストの置換突然変異誘発のために最も有利な部位としては超可変領域があるが、ＦＲ改変も企図されている。保存的置換が、「好ましい置換」という見出しの下で表１に示されている。かかる置換が生物活性の変化をもたらす場合には、表１の中で「例示的置換」と命名されているかまたはアミノ酸のクラスに関して以下でさらに記述される通り、より多くの実質的変化を導入し、産物をスクリーニングしてよい。
【０１７１】
アンタゴニストの生物学的特性の実質的修飾は、（ａ）例えばシートまたはらせんコンホメーションとしての置換の部域内のポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性または（ｃ）側鎖のバルク、の維持に対する効果が有意に異なっている置換を選択することによって達成される。天然に発生する残基は、共通の側鎖特性に基づいて次のグループに分けられる：すなわち、（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；そして（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。非保存的置換には、これらのクラスのうちの１クラスの成員と別のクラスとの交換が必要である。
【０１７２】
アンタゴニストの適正なコンホメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基を、一般的にはセリンと置換させて、分子の酸化安定性を改善し異常な架橋を防止することもできる。換言すると、１つまたは複数のシステイン結合をアンタゴニストに加えてその安定性を改善してもよい（特にアンタゴニストがＦｖフラグメントといった抗体フラグメントである場合）。
【０１７３】
置換変異体の特に好ましいタイプには、親抗体の１つ以上の超可変領域残基の置換が関与する。一般に、さらに開発するために選択される結果として得られた１つまたは複数の変異体は、それらを生成した親抗体に比べ改善した生物学的特性を有する。このような置換変異体を生成するための便利な方法は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟である。簡単に言うと、各部位において考えられる全てのアミノ置換を生成するために複数の超可変領域部位（例えば６〜７部位）が突然変異させられる。このように生成された抗体変異体は、各粒子内部で凝縮されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物に対する融合として、繊維状ファージ粒子から一価の形でディスプレイされる。ファージディスプレイされた変異体は次に、本明細書中で開示される通りのそれらの生物活性（例えば結合親和力）についてスクリーニングされる。修飾のための超可変領域部位候補を同定するためには、抗原結合に有意な形で寄与する超可変領域残基を同定するためのアラニン走査突然変異誘発を実施することができる。代替的または付加的に、抗体と抗原の間の接点を同定するために抗原−抗体錯体の結晶構造を分析することが有益であり得る。かかる接触残基および隣接残基は、本明細書中で詳述されている技術に従った置換のための候補である。かかる変異体がひとたび生成されたならば、一群の変異体を本明細書で記述されている通りにスクリーニングに付し、１つ以上の関連する検定において比較的優れた特性をもつ抗体をさらなる開発のために選択することができる。
【０１７４】
アンタゴニストの別のタイプのアミノ酸変異体が、アンタゴニストの原初のグリコシル化パターンを改変する。改変とは、アンタゴニスト中に見出される１つ以上の炭水化物部分を欠失させることおよび／またはアンタゴニスト中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を追加することを意味する。
【０１７５】
ポリペプチドのグリコシル化は、標準的にＮ結合型かＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型というのは、アスパラギン残基の側鎖に対する炭水化物部分の付着を意味する。Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であるものとして、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニンというトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖に対する炭水化物部分の酵素的付着についての認識配列である。したがってこれらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド内に存在する場合、潜在的なグリコシル化部位が作り出されることになる。Ｏ結合型グリコシル化とは、最も一般的にはセリンまたはトレオニンであるヒドロキシアミノ酸に対する糖Ｄ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの１つの付着を意味するが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも同様に使用できる。
【０１７６】
アンタゴニストに対するグリコシル化部位の追加は、（Ｎ結合型グリコシル化部位のために）上述のトリペプチド配列のうちの１つ以上を含むような形でアミノ酸配列を改変することによって適宜達成される。改変は同様に、（Ｏ結合型グリコシル化部位のために）原初のアンタゴニストの配列に対して１つ以上のセリンまたはトレオニン残基を添加するかまたはそれを置換させることによっても行なうことができる。
【０１７７】
アンタゴニストのアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術分野において公知のさまざまな方法によって調製される。これらの方法には、天然供給源からの単離（天然に発生するアミノ酸配列変異体の場合）またはオリゴヌクレオチド媒介型（または部位特異的）突然変異誘発による調製、ＰＣＲ突然変異誘発、およびアンタゴニストの早期調製済み変異体または非変異体バージョンのカセット突然変異誘発が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１７８】
例えばアンタゴニストの抗原依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強させる目的で、エフェクタ機能に関して本発明のアンタゴニストを修飾することが望ましいかもしれない。これは、抗体アンタゴニストのＦｃ領域内に１つ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成可能である。代替的または付加的には、１つまたは複数のシステイン残基をＦｃ領域内に導入し、かくしてこの領域内の鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。
【０１７９】
このようにして生成されたホモ二量体抗体は、改善された内在化能力および／または増大した補体媒介性細胞死滅化および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有し得る。Caronら、J. Exp Med.第１７６号：１１９１〜１１９５頁(１９９２年)およびShopes、B.J. Immunol.第１４８号：２９１８〜２９２２頁(１９９２年)を参照のこと。増強された抗腫瘍活性をもつホモ二量体抗体は同様に、Wolffら、Cancer Research 第５３号：２５６０〜２５６５頁(１９９３年)において記述されているようなヘテロ２機能架橋剤を用いて調製することもできる。代替的には、２重Ｆｃ領域を有する抗体を工学処理することができ、これはかくして増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有し得る。Stevensonら、Anti-Cancer Drug Design 第３号：２１９〜２３０頁(１９８９年)を参照のこと。
【０１８０】
アンタゴニストの血清半減期を延長させるために、例えば米国特許第５，７３９，２７７号（U. S. Patent No.5,739,277）の中で記述されているようにアンタゴニスト（特に抗体フラグメント）内にサルベージレセプタ結合エピトープを取込んでもよい。本明細書で使用される「サルベージレセプタ結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子の生体内血清半減期を延長させるのに関与するＩｇＧ分子（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを意味する。
【０１８１】
検定
末梢Ｂ−細胞濃度を、ＣＤ３−／ＣＤ４０＋細胞を計数するＦＡＣＳ方法により決定する。
【０１８２】
試料中の全リンパ球のうちのＣＤ３−ＣＤ４０＋Ｂ細胞の百分率は、以下のゲーティング戦略により得ることができる。リンパ球集団を前方散乱／側方散乱散布図上にマーキングして、領域１（Ｒｉ）を画定する。ＲＩ中の事象を用いて、ＣＤ４０およびＣＤ３マーカーについて蛍光強度ドットプロットを表示する。蛍光標識づけしたイソタイプ対照を用いて、ＣＤ４０およびＣＤ３の正値性についてのそれぞれのカットオフポイントを決定する。
【０１８３】
ＦＡＣＳ分析
５０万個の細胞を洗浄し、５μｌの染色または対照抗体を含有する１％のＢＳＡを伴うリン酸緩衝生理食塩水である１００ｌのＦＡＣＳ緩衝液の中に再懸濁させる。イソタイプ対照を含め全ての染色抗体は、PharMingen, San Diego, CAから得られる。ＦＩＴＣ抱合抗ヒトＩｇＧ１二次抗体と共にRituxan&commat;で染色することにより、ヒトＢＬＹＳ発現を査定する。
【０１８４】
FACScanおよびCellQuest（Becton Dickinson Immunocytometry Systems、San Jose、CA）を用いてＦＡＣＳ分析を行なう。全てのリンパ球は前方および側方光散乱で定義され、一方全てのＢリンパ球は、細胞表面上のＢ２２０の発現を用いて定義される。
【０１８５】
Ｂ細胞の枯渇および回復は、注射後最初の一週間は毎日そしてその後は週毎のベースで、末梢Ｂ細胞計数を分析し、脾臓、リンパ節および骨髄においてＦＡＣＳによりｈＢＬＹＳ＋Ｂ細胞を分析することによって査定される。注射された２Ｈ７変異体抗体の血清レベルが監視される。
【０１８６】
製剤処方
本発明にしたがって使用されるＢＬｙＳ結合抗体といったようなＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストの治療用処方物は、凍結乾燥された処方物または水溶液の形で、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤（Remitgtorz's Phamamaceutical Science 第１６版、Osol、A. Ed. (１９８０年)）と所望の純度をもつ抗体とを混合することによって貯蔵用として調製される。許容される担体、賦形剤または安定剤は、用いられた投薬量および濃度でレシピエントにとって無毒性であり、緩衝液例えばリン酸塩、クエン酸塩およびその他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼエトニウムクロリド；フェノル、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（残基約１０個未満）ポリペプチド；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性重合体例えばオリビニルピロリドン；アミノ酸例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；単糖、二糖類およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含めたその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン界面活性剤例えばＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【０１８７】
本明細書中の処方物は、治療対象となっている特定の適応性に必要であるような２つ以上の化合物、好ましくは互いに有害な影響を及ぼさない相補的活性をもつ化合物を含んでいてよい。例えば、細胞傷害薬、化学療法薬、サイトカインまたは免疫抑制剤（例えばＴ細胞に作用するもの、例えばシクロスポリンまたはＴ細胞を結合させるもの、例えばＬＦＡ−１を結合させるもの）をさらに提供することが望ましいかもしれない。かかるその他の作用物質の有効量は、処方物中に存在する抗体の量、疾病または障害または治療のタイプそして上述のその他の要因によって左右される。これらは一般に本明細書に記述されている通りの同じ投薬量および投与経路で使用される。
【０１８８】
活性成分は、例えば、それぞれコロイド薬物送出系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中またはマクロエマルジョン中のヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルなどの、例えば液滴形成技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセルの中に封入されてもよい。かかる技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (１９８０年)中で開示されている。
【０１８９】
持続放出型調製物を調製してもよい。持続放出型調製物の適切な例としては、例えばフィルムまたはマイクロカプセルなどの造形品の形をした、アンタゴニストを含む固形疎水性重合体の半透性マトリクスが含まれる。持続放出型マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号（U. S. Patent No.3,773,919））、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドから成る注射用ミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸が含まれる。
【０１９０】
生体内投与のために使用されるべき処方物は、無菌でなくてはならない。これは、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成可能である。
【０１９１】
疾病治療
疾病
本発明の免疫抑制薬およびＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストは、Ｂ細胞調節型自己免疫障害を治療するために有用である。Ｂ細胞調節型自己免疫障害には、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎）、乾癬、アトピー性皮膚炎を含む皮膚炎；慢性自己免疫性じんま疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、中毒性表皮剥離症、全身性強皮症および硬化症、炎症性大腸炎（ＩＢＤ）に付随する応答、（クローン病、潰瘍性大腸炎）、呼吸窮迫症候群、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、骨髄炎、アレルギー性鼻炎、脳炎、ブドウ膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、アレルギー性身体条件、湿疹、ぜんそく、Ｔ細胞の浸潤および慢性炎症性応答が関与する身体条件、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、（腎炎、非腎臓、円板状、脱毛症を含めた）ループス、若年発症糖尿病、多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、サイトカインおよびＴ−リンパ球が媒介する急性および遅延型過敏症に付随する免疫応答、結核症、サルコイドーシス、ヴェグナー肉芽腫症を含めた肉芽腫症、無顆粒球症、（ＡＮＣＡを含めた）脈管炎、再生不良性貧血、クームズ試験陽性貧血、ダイヤモンドブラックファン貧血、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含めた免疫性溶血性貧血、悪性貧血、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球漏出が関与する疾病、ＣＮＡ炎症性障害、多臓器損傷症候群、重症筋無力症、抗原−抗体複合体媒介型疾患、抗糸球体基低膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、ランバート・イートン筋無力症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、（高パネル反応性抗体力価、組織内ＩｇＡ被着などについての予備治療を含めた）固形臓器移植片拒絶反応、移植片対宿主拒絶反応（ＧＶＨＤ）、水疱性類天疱瘡、天疱瘡（尋常性、葉性を含めた全て）、自己免疫性多腺性内分泌障害、ライター病、スティフマン症候群、巨細胞関節炎、免疫複合体性腎炎、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性神経障害またはＩｇＭ媒介型神経障害、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性精巣炎および卵巣炎を含めた睾丸および卵巣の自己免疫性疾患、原発性甲状腺機能低下症；自己免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、亜急性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下症、アジソン病、甲状腺機能亢進症、自己免疫性多腺症候群（または多腺性内分泌障害症候群）、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）とも呼ばれるＩ型糖尿病およびシーハン症候群を含めた自己免疫性内分泌疾患；自己免疫性肝炎、リンパ球様間質性肺炎（ＨＩＶ）、閉塞性細気管支炎（非移植片）対ＮＳＩＰ、ギラン−バレー症候群、（リウマチ性多発性筋痛および巨細胞性（高安）動脈炎を含めた）大血管炎、（川崎病および結節炎多発性動脈炎を含めた）中血管炎、強直性脊椎炎、ベルガー病（ＩｇＡ腎症）、急速進行性腎炎、原発性胆汁性肝硬変、セリアック病（グルテン性腸症）、クリオグロブリン血症、ＡＬＳ、冠動脈疾患、が含まれる。
【０１９２】
所望のＢ細胞枯渇レベルは疾病により左右される。好ましくは、Ｂ細胞枯渇は、少なくとも２ヵ月、より好ましくは３ヵ月、さらに一層好ましくは４ヵ月、より好ましくは５ヵ月、さらに一層好ましくは６ヵ月以上にわたり疾病の進行を防止するのに充分なものである。さらに一層好ましい実施形態においては、Ｂ細胞枯渇は、少なくとも６ヵ月、より好ましくは９ヵ月、より好ましくは１年、より好ましくは２年、より好ましくは３年、さらに一層好ましくは５年以上寛解期を延長するのに充分なものである。最も好ましい実施形態においては、Ｂ細胞枯渇は、疾病の治癒に充分なものである。好ましい実施形態においては、自己免疫性患者におけるＢ細胞枯渇は、少なくとも過渡的に治療前のベースラインレベルの約７５％そしてより好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、９９％さらには１００％である。
【０１９３】
自己免疫性疾患の治療のためには、免疫抑制薬またはＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストの投薬量を調整することにより、個々の患者において疾病および／または身体条件の重症度に応じてＢ細胞枯渇の程度を変調させることが望ましいかもしれない。したがって、Ｂ細胞枯渇は完全であってよいが、完全である必要はない。或いは、初期治療においてはＢ細胞の完全枯渇が望ましいかもしれないが、後続する治療においては、部分枯渇のみ達成するべく投薬量を調整してもよい。１つの実施形態においては、Ｂ細胞枯渇は少なくとも２０％である、すなわち治療前のベースラインレベルに比べ８０％以下のＢ細胞が残っている。その他の実施形態においては、Ｂ細胞枯渇は２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％以上である。
【０１９４】
好ましくは、Ｂ細胞枯渇は、疾病の進行を停止させるため、より好ましくは治療中の特定の疾病の兆候および症候を緩和するため、さらに一層好ましくは疾病を治癒するために充分なものである。
【０１９５】
治療的応用のためには、本発明の免疫抑制薬およびＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニスト組成物は、ＤＭＡＲＤＳおよびその他の生物製剤を含めた抗炎症性薬物といったような付加的薬物との組合せ療法において使用可能である。前述の治療方法は、自己免疫性疾患のための従来の療法のその他の形態と併用して従来の療法に連続して、その前または後に投与することができる。
【０１９６】
治療前と比べ本発明の組成物の投与後に、症候の測定可能な改善かまたはその他の適用可能な基準が存在する場合、本発明の当該方法により患者のＢ細胞調節型自己免疫疾患が緩和したまたはその治療に成功したことになる。治療の効果は、本発明の組成物の投与から３〜１０週以内に明らかとなるかもしれない。各疾患について適用可能な基準は、該当する技術分野に熟練した医師にとっては周知である。例えば、医師は、疾病の血清学的マーカー、Ｂ細胞計数を含む完全血球算定および血清免疫グロブリンレベルといったような疾病の臨床的または血清学的証拠について治療対象患者を監視することができる。アタシセプトなどのＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストによる治療を受けているマウスにおいては、ＩｇＧおよびＩｇＭの血清レベルは低下している。アタシセプト治療に応答するヒトの患者も同様に、血清ＩｇＧおよびＩｇＭレベルの低下を示す。
【０１９７】
自己免疫または自己免疫関連疾患の治療の効能または成功を査定するためのパラメータは、該当する疾病を熟知する医師にとっては周知である。一般に、熟練した医師は、特定の疾病の兆候および症候の削減を模索する。以下に示すのは、一例である。
【０１９８】
関節リウマチ（ＲＡ）は、原因不明の自己免疫障害である。大部分のＲＡ患者は、療法を用いた場合でも、漸進的関節破壊、変形、身体障害そしてさらには早期の死をもたらすことのある慢性的な疾患経過をたどる。ＲＡ療法の最終目的は、関節の損傷を予防または制御し、機能喪失を予防し疼痛を低減させることにある。ＲＡの初期療法には通常、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、グルココルチコイド（関節注射を介するもの）、および低用量プレドニゾンといった薬物のうちの１つ以上の投与が関与する。"Guidelines for the management of rheumatoid arthritis” Arthritis & Rhemmatism 第４６号（２）：３２８〜３４６頁(２００２年２月)を参照のこと。新たにＲＡと診断された患者の大部分に、診断から３ヵ月以内に疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）療法が開始される。
【０１９９】
ＲＡにおいて一般に使用されるＤＭＡＲＤは、ヒドロキシクロロキシ、スルファサラジン、メトトレキセート、レフルノミド、エタネルセプト、インフリキシマブ（さらに経口および皮下メトトレキセート）、アザチオプリン、Ｄ−ペニシラミン、（経口）金製剤、（筋内）金製剤、ミノサイクリン、シクロスポリン、ブドウ球菌プロテインＡ免疫吸着である。
【０２００】
ＲＡの間に体が腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）を産生することから、この疾病の療法としてＴＮＦａ阻害物質が使用された。エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ）は、活性ＲＡの療法として米国で承認された注射用薬物である。エタネルセプトはＴＮＦａに結合し、関節および血液から大部分のＴＮＦａを除去するのに役立ち、かくしてＴＮＦａが炎症および関節リウマチのその他の症候を促進するのを妨げる。
【０２０１】
エタネルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたヒト７５ｋＤ（ｐ７５）腫瘍壊死因子レセプタ（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部分から成る「Ｆｃ融合タンパク質」融合タンパク質である。
【０２０２】
ＲＥＭＩＣＡＤＥという商標名で販売されているインフリキシマブは、ＲＡおよびクローン病を治療するために処方される免疫抑制薬物である。インフリキシマブは、ＴＮＦに結合し、炎症を生成するＴＮＦαを標的化しこれに結合することによって体内の炎症を低減させるキメラモノクローナル抗体である。
【０２０３】
従来Ｄ２Ｅ７として知られていたアダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡＴＭ、Abbott Laboratories）は、ＴＮＦａに結合し、１つ以上の従来の疾患修飾性ＤＭＡＲＤに対する応答が不充分であった中度乃至重度の活性ＲＡを患う成人において兆候および症候を削減し構造的損傷の進行を阻害するために承認されているヒトモノクローナル抗体である。
【０２０４】
免疫抑制薬およびＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストを投与することによる関節リウマチの治療は、ＲＡ用の上述の薬物の１つ以上を用いた療法と併用して実施できる。例えば関節リウマチについては、治療の進捗測定値としては、腫張および圧痛関節数および朝のこわばりの長さが含まれる。Ｓｈａｒｐスコアとして知られている評定システムおよびＸ線を用いることによって手足の関節がどれほど侵食されているかについて、患者を検査することができる。別の評定システムは、療法に対する応答を査定するための米国リウマチ学会基準に基づいている。
【０２０５】
ＲＡの治療効能を評価する１つの方法は、特に圧痛および腫脹関節の改善百分率を測定する米国リウマチ学会（ＡＣＲ）基準に基づいている。ＲＡ患者は、例えば、抗体治療無しの場合（例えば治療前のベースライン）またはプラセボでの治療の場合と比べたＡＣＲ２０（２０パーセントの改善）で評定され得る。抗体治療の効能を評価するその他の方法としては、骨侵食および関節空間狭窄といったような構造的損傷を評定するために用いられるＳｈａｒｐＸ線スコアなどのＸ線評定が含まれる。同様に、治療中または治療後の時限における健康調査質問票［ＨＡＱ］スコア、ＡＩＭＳスコア、ＳＦ−３６に基づき身体障害の予防または改善について患者を評価することも可能である。ＡＣＲ２０基準には、圧痛（有痛）関節計数および腫脹関節計数の両方における２０％の改善に加えて、以下の５つの付加的尺度のうちの少なくとも３つにおける２０％の改善が含まれ得る：
１．  視覚アナログ尺度（ＶＡＳ）による患者の疼痛査定、
２．  疾患活性（ＶＡＳ）による患者の包括的査定、
３．  疾患活性（ＶＡＳ）による医師の包括的査定、
４．  健康調査質問票により測定される、患者が自己査定した身体障害、および
５．  急性反応物質、ＣＲＰまたはＥＳＲ。
【０２０６】
ＡＣＲ５０および７０は、類似の要領で定義される。好ましくは、患者には、少なくともＡＣＲ２０、好ましくは少なくともＡＣＲ３０、より好ましくは少なくともＡＣＲ５０、さらにより好ましくは少なくともＡＣＲ７０、最も好ましくは少なくともＡＣＲ７５以上のスコアを達成するのに有効な量の本発明のＢＬＹＳ結合抗体が投与される。
【０２０７】
乾癬性関節炎は、独特の全く異なるＸ線像の特徴を有する。乾癬性関節炎については、同様に関節侵食および関節空間狭窄をＳｈａｒｐスコアによって評価することができる。本明細書で開示されているヒト化ＢＬＹＳ結合抗体は、関節損傷を防止するためならびに障害の疾患兆候および症候を低減させるために使用可能である。
【０２０８】
本発明のさらに別の態様は、本発明の免疫抑制薬と組合せた治療上有効な量のＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストを、ＳＬＥ患者に対して投与することによって、狼瘡つまりＳＬＥを治療する方法にある。ＳＬＥＤＡＩスコアは、疾病活性の数値的定量を提供する。ＳＬＥＤＡＩは、０〜１０３の数値範囲を伴う、疾病活性と相関関係をもつものとして知られる２４の臨床および実験室パラメータの加重指数である。Bryan Gescuk & John Davis, "Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus" in Current Opinion in Rheumatology ２００２年、第１４号：５１５〜５２１頁を参照のこと。２本鎖ＤＮＡに対する抗体は、腎性発赤および狼瘡のその他の徴候をひき起こすものと考えられている。抗体治療を受けている患者は、血清クレアチニン、尿中タンパクまたは尿中血の有意かつ再現可能な増加として定義づけされる腎性発赤までの時間について監視され得る。代替的または付加的には、抗核抗体および２本鎖ＤＮＡに対する抗体のレベルについて、患者を監視することができる。ＳＬＥの治療には、高用量のコルチコステロイドおよび／またはシクロホスファミド（ＨＤＣＣ）が含まれる。全身性紅斑性狼瘡の場合、抗核抗体および２本鎖ＤＮＡに対する抗体のレベルについて、患者を監視することができる。
【０２０９】
本発明の特定の一態様は、免疫抑制薬とＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニスト、例えばアタシセプトの組合せによる、ループス腎炎の治療である。
【０２１０】
脊椎関節症は、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎およびクローン病を含めた一群の関節障害である。治療の成功は、患者および医師による包括的査定の有効な測定用手段によって決定され得る。
【０２１１】
本発明の方法を用いて治療可能なさらなる自己免疫性疾患は、乾癬である。乾癬を治療するためにさまざまな投薬療法が現在使用されている。治療は疾病の重症度に直接関係して異なる。比較的軽度の形態の乾癬を患う患者は標準的に、疾病に対処するべく局所ステロイド、アントラリン、カルシポトリエン、クロベタゾールおよびタザロテンといったような局所的治療を利用し、一方中度および重度の乾癬を患う患者は全身的（メトトレキセート、レチノイド、シクロスポリン、ＰＬＴＶＡおよびＵＶＢ）療法を利用する確率がさらに高くなる。タールも同様に用いられる。これらの療法には、安全性に関する懸念、時間のかかる投薬計画、または不便な治療プロセスの組合せが存在する。さらに、診察室環境内に専用の空間および高価な設備を必要とするものもある。全身的投薬療法は、高血圧症、高脂血症、骨髄抑制、肝臓疾患、腎臓疾患および胃腸障害を含む重大な副作用を発生させる可能性がある。同様に、光線療法の使用は皮膚癌の発生率を増大させ得る。局所療法の使用に付随する不都合および不快感に加えて、光線療法および全身的療法では、患者を治療状態と非治療状態の間で循環させること、そしてそれらの副作用のため生涯にわたり被曝を監視することが必要となる。
【０２１２】
乾癬治療の効能は、ベースライン条件に対比させて、医師用グローバルアセスメント（ＰＧＡ）変化および乾癬部域・重症度指数（ＰＡＳＩ）スコア、乾癬症候群アセスメント（ＰＳＡ）を含めた疾病の臨床的兆候および症候の変化を監視することにより査定される。特定の時点に経験したそう痒度を標示するのに用いられるビジュアル・アナログスケール上で、治療全体を通して定期的に患者を測定することができる。
【０２１３】
自己免疫因果関係を有するさまざまなその他の炎症性疾患が同様に、この治療方法の範囲内に入る。特定的に企図されている疾病の中には、自己免疫性肝炎および自己免疫性甲状腺炎がある。自己免疫性肝炎には、患者自身の免疫系による自己攻撃に起因する肝臓の炎症が関与する。同様にして、甲状腺の自己攻撃およびその結果としての炎症は、自己免疫性甲状腺炎の生物学的原因である。このような疾病は、ＭＭＦといったような免疫抑制薬とＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストの組合せを用いて緩和されるものと予想されている。
【０２１４】
用量決定
治療すべき適応症およびこの分野に熟練した医師が熟知している用量決定に関連する要因に応じて、本発明のＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストおよび免疫抑制薬は、毒性および副作用を最小限におさえながらその適応症の治療にとって有効な投薬量で投与される。一般に、本発明のＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストは、体重１ｋｇあたり約０．２５ｍｇ〜約２５ｍｇ、好ましくは約１ｍｇ〜約１０ｍｇの投薬量範囲でヒトの患者に投与される。換言すると、ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストのための好ましい投薬量範囲は一用量あたり約７５〜約１９０ｍｇである。好ましい実施形態においては、投薬量はＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストについて一用量あたり約１５０ｍｇである。
【０２１５】
本発明の治療方法には、（共に本明細書において治療部分と呼ばれている）免疫抑制薬およびＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストを同時におよび逐次的に投与することの組合せが含まれる。逐次的投与においては、治療部分を、まずは免疫抑制薬そして続いてＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストといったいずれかの順序で投与できる。患者を１つの薬物で治療し、その１つの薬物での治療前に効能について監視できる。例えば、免疫抑制薬が部分的応答を生成する場合、完全応答を達成するために治療をＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストで続けることができ、その逆もある。代替的には、患者に当初両方の薬物を投与し、後続する投薬はいずれか一方の薬物で行なうこともできる。
【０２１６】
薬物に耐容し、かつ／または治療用化合物の初期および後続投与から発生する輸液関連症候といった有害効果の発生を削減するように患者を条件づけするために、それを必要としている哺乳動物には、一方のまたは両方の薬物の初回または初期条件づけ用量を投与し、その後一方または両方の薬物の少なくとも１回の第２の治療有効な用量を投与することができ、ここで第２のおよびあらゆる後続する用量は初回用量よりも高い。初回用量は、より高い第２の治療用用量に耐容するように哺乳動物を条件づけするのに役立つ。このようにして、哺乳動物は、当初投与され得るよりも高い用量の治療用化合物に耐容することができる。「条件づけ用量」とは、治療用化合物の投与に付随する初回用量有害副作用を減衰させるかまたはその頻度または重症度を低減させる用量である。条件づけ用量は、治療用量、非治療用量、徴候用量または非徴候用量であり得る。治療用量とは、患者に対する治療的効果を示す用量であり、非治療用量は、治療対象患者に対し治療的効果を示さない用量である。徴候用量は、投与時点で少なくとも１つの有害効果を誘発する用量であり、非徴候用量は有害効果を誘発しない用量である。一部の有害効果としては、発熱、頭痛、悪心、おう吐、呼吸困難、筋痛症および悪寒がある。
【０２１７】
条件づけ用量の投薬計画の他にも、本発明の疾病緩和を達成するために追従できる数多くのその他の投薬計画が存在する。このようなアプローチの１つが、１つの免疫抑制薬の短期治療とそれに続く逓減、それに続く別の免疫抑制薬とＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストの組合せでの治療である。例えば、コルチコステロイド１０００〜１５００ｍｇを４週間一日２回投与し、その後一週間に５ｍｇずつ逓減させて１０週の治療単位にわたり一日１０ｍｇまでひき下げることができる。一旦ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストの開始時になれば、負荷用量投薬計画が適切であるかもしれない。特に、アタシセプトを一週２回、４週間投与し、その後４８週といった長期にわたり週一回投与することができる。これとは対照的に、免疫抑制薬は、上昇用量式投薬計画で投与される傾向にある。例えばＭＭＦは、一日２回５００ｍｇの用量で投与でき、２週間後に一日２回７５０ｍｇまで増量することができる。投薬量は、患者の白血球計数が許容可能なレベル（すなわち３．０×１０9／Ｌまたは３０００／ｍｍ2超）にとどまる場合、一日３回１０００ｍｇという最大用量まで週毎に増量することができる。特に、ＭＭＦの最大投与範囲は一日患者一人あたり２０００〜３０００ｍｇとなると予想される。
【０２１８】
投与経路
ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストおよび免疫抑制薬は、公知の方法に従って、例えばボーラスとしてかまたは一時限にわたる連続輸液によってなどの静脈内投与により、または、皮下、筋内、腹腔内、脳脊髄内、関節内、滑液嚢内、髄腔内または吸入経路により、ヒトの患者に対し投与される。適切な処方を有する免疫抑制薬を経口または局所的に投与してもよい。ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストおよび一部の免疫抑制薬は一般に静脈内または皮下投与によって投与される。同じまたは異なる経路により異なる治療部分を投与することが可能である。
【０２１９】
製造品およびキット
本発明の別の実施形態は、以上で開示されている通りのＢ細胞調節型自己免疫障害を治療するためのＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストおよび免疫抑制薬を含む製造品である。具体的な一実施形態においては、製造品はループス腎炎の治療のためのＭＭＦおよびアクタシセプトを含有する。
【０２２０】
製造品は、少なくとも１つのコンテナおよびコンテナ上またはコンテナに付随するラベルまたは添付文書を含む。適切なコンテナには、例えばボトル、バイアル、シリンジなどが含まれる。コンテナは、ガラスまたはプラスチックといったようなさまざまな材料から形成されていてよい。コンテナは、身体条件を治療するために有効である本発明の組成物を保持し、無菌アクセスポートを有していてよい（例えば、コンテナは皮下注射針により穿孔可能なストッパを有する静脈内溶液袋またはバイアルであり得る）。ラベルまたは添付文書は、組成物が特定の身体条件例えばループス腎炎または関節リウマチの治療のために用いられるということを標示する。ラベルまたは添付文書はさらに、患者に対し組成物を投与するための指示事項を含む。さらに、製造品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液が入った第２のコンテナを含んでいてよい。これはさらに、その他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針およびシリンジを含めた、商業的観点およびユーザーの観点から望ましいその他の資料を含んでいてよい。
【０２２１】
例えばＢ細胞死滅化検定といったさまざまな目的のために有用なキットも提供される。製造品の場合と同様、キットは、コンテナおよびコンテナ上のまたはコンテナに付随するラベルまたは添付文書を含む。コンテナは、本発明の少なくとも１つの免疫抑制薬および１つのＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストを含む組成物を保持する。例えば希釈剤および緩衝液、対照抗体の入った付加的なコンテナが含まれていてよい。ラベルまたは添付文書は、組成物の説明ならびに意図された試験管内または診断用途のための指示事項を提供し得る。
【実施例】
【０２２２】
実施例１
ＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストの産生
ＴＡＣＩ−Ｆｃの４つのアミノ末端切断バージョンを生成した。これら４つは全て、配列番号４のアミノ酸残基番号３０に融合された国際公開第０２／０９４８５２号（WO02/094852）（配列番号４１）の中で開示されている通りの修飾型ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子シグナル配列を有する。しかしながら、４つのタンパク質は、Ｆｃ５が配列番号２のＴＡＣＩアミノ酸配列に融合された地点の場所が異なっていた。表１は、４つの融合タンパク質の構造を概略的に示している。
【表１】
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【０２２３】
タンパク質コーディング発現カセットは、標準的技術を用いて、オーバーラップＰＣＲによって生成された（例えばHortonら、Gene、第７７号：６１頁(１９８９年)を参照）。ＰＣＲ鋳型としては、ＴＡＣＩをコードする核酸分子およびＦｃ５をコードする核酸分子を使用した。オリゴヌクレオチドプライマは表２および３に特定されている。
【表２】
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【表３】
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【０２２４】
ＰＣＲ増幅の第１ラウンドは、４つのアミノ末端切断バージョンの各々についての２つの反応で構成されていた。２つの反応は、各バージョンについて、１つの反応では５’および３’のＴＡＣＩオリゴヌクレオチドを用いて別々に実施され、もう１つの反応においては５’および３’のＦｃ５オリゴヌクレオチドを用いて実施された。第１ラウンドのＰＣＲ増幅の条件は、以下の通りであった。２５μｌの最終体積に対して、約２００ｎｇの鋳型ＤＮＡ、２．５μｌの１０倍Ｐｆｕ反応緩衝液（Stratagene）、２μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰｓ、各々０．５μｌずつの２０μＭの５’オリゴヌクレオチドおよび３’オリゴヌクレオチド、そして０．５μｌのＰｆｕポリメラーゼ（２．５単位、Stratagene）を加えた。増幅温度プロフィールは、３分間９４℃、次に１５秒間９４℃、１５秒間５０℃、２分間７２℃で３５サイクル、それに続く７２℃での２分間の延長で構成されていた。反応生成物を、アガロースゲル電気泳動法により分画させ、予測されたサイズに対応するバンドをゲルから切除し、メーカーの指示事項に従いＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡＱＵＩＣＫゲル抽出キット（Qiagen）を用いて回収した。
【０２２５】
ＰＣＲ増幅の第２ラウンド、またはオーバーラップＰＣＲ増幅反応は、ＤＮＡ鋳型として第１ラウンドのＰＣＲからのゲル精製済みフラグメントを用いて実施した。第２ラウンドのＰＣＲ増幅の条件は以下のとおりであった。２５μｌの最終体積に対し、ＴＡＣＩフラグメントおよびＦｃ５フラグメントの各々約１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、２．５μｌの１０倍Ｐｆｕ反応緩衝液（Stratagene）、２μｌの２．５ｍＭのｄＮＴＰ、各０．５μｌずつの２０μＭのＺＣ２４，９０３（配列番号２７）およびＺＣ２４，９４６（配列番号３０）および０．５μｌのＰｆｕポリメラーゼ（２．５単位、Stratagene）を添加した。増幅温度プロフィールは、１分間９４℃、次に１５秒間９４℃、１５秒間５５℃、２分間７２℃で３５サイクル、それに続く７２℃での２分の延長で構成されていた。反応生成物を、アガロースゲル電気泳動法により分画させ、予測されたサイズに対応するバンドをゲルから切除し、メーカーの指示事項に従いＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡＱＵＩＣＫゲル抽出キット（Qiagen）を用いて回収した。
【０２２６】
アミノ末端切断ＴＡＣＩ−ＦｃＰＣＲ産物の４つのバージョンの各々を、メーカーの推奨プロトコルに従ってInvitrogenのＺＥＲＯＢＬＵＮＴ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキットを用いて別々にクローニングした。表４は、これらのＴＡＣＩ−Ｆｃ構成体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を特定している。
【表４】
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【０２２７】
ヌクレオチド配列を確認した後、アミノ末端切断ＴＡＣＩ−Ｆｃ融合の４つのバージョンの各々を含むプラスミドをＦｓｅＩおよびＡｓｃＩで消化させ、アミノ酸コーディングセグメントを放出させた。ＦｓｅＩ−ＡｓｃＩフラグメントを、ＣＭＶプロモータおよびＳＶ４０ポリＡセグメントを含有する哺乳動物発現ベクター内にライゲートさせた。発現ベクターを、以下に記述されている通りにチャイニーズハムスター卵巣細胞内に導入した。
【０２２８】
実施例２
チャイニーズハムスター卵巣細胞によるＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質の産生
動物タンパク質を含まない培地内で成長させた懸濁適応型チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＤＧ４４細胞を電気穿孔法を介してトランスフェクトするために、ＴＡＣＩ−Ｆｃ発現構成体を使用したUrlaubら、Som. Cell. Molec. Genet. 第１２号：５５５頁(１９８６年)。ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞には、両方のジヒドロ葉酸還元酵素染色体位置での欠失に起因して、機能的ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子が欠如している。増大した濃度のメトトレキセートの存在下での細胞の成長の結果として、ジヒドロ葉酸還元酵素が増幅され、発現構成体上に、組換え型タンパク質によりコードされた連結された遺伝子がもたらされる。
【０２２９】
ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を、ＰＦＣＨＯ培地（JRH Biosciences, Lenexa KS）、４ｍＭのＬ−グルタミン（JRH Biosciences）および１倍のハイポタンキシン−チミジンサプリメント（Life Technologies）の中で継代させ、コーニング振とうフラスコに入れて３７℃、５％ＣＯ2で１２０ＲＰＭの回転振とう器プラットフォーム上において細胞をインキュベートした。細胞を、線状化発現プラスミドと共に別々にトランスフェクトした。無菌性を確保するために、エッペンドルフ型管の中で２００μｇのプラスミドＤＮＡを２０μｌのせん断したサケ精子担体ＤＮＡ（5’−>3’ Inc. Boulder, CO、１０ｍｇ／ｍｌ）、２２μｌの３ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）そして４８４μｌの１００％エタノール（Gold Shield Chemical Co., Hayward）と組合せることにより、２５分間氷上で単一のエタノール沈降ステップを実施した。インキュベーションの後、管を、４℃の冷温室内に置いたミクロフュージ内で１４，０００ＲＰＭで遠心分離し、上清を除去し、ペレットを０．５ｍｌの７０％エタノールで二回洗浄し、空気乾燥させた。
【０２３０】
２５ｍｌ入り円錐形遠心分離管内で１０6個の合計細胞（１６．５ｍｌ）を５分間９００ＲＰＭで遠心分離することによって、ＤＮＡペレットが乾燥している間に、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を調製した。ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を合計体積３００μｌのＰＦＣＨＯ成長培地中に再懸濁させ、０．４ｃｍの電極ギャップを有するGene-Pulser Cuvette(Bio-Rad)の中に入れた。約５０分の乾燥時間の後、ＤＮＡを５００μｌのＰＦＣＨＯ成長培地内に再懸濁させ、合計体積が８００μｌを超えないような形でキュベット中の細胞に添加し、５分間室温に放置して気泡形成を減少させた。０．２９６ｋＶ（キロボルト）および０．９５０ＨＣ（高キャパシタンス）に設定したBio Rad Gene Pulser IIユニットの中にキュベットを入れ、直ちに電気穿孔した。
【０２３１】
細胞を室温で５分間インキュベートした後に、Co Star T-75フラスコ内の合計体積２０ｍｌのＰＦＣＨＯ培地内に入れた。フラスコを３７℃で５％ＣＯ2に４８時間置き、その後トリパンブルー排除試験を用いて血球計により細胞を計数し、ハイポタンキシン（hypothanxine）−チミジンサプリメントを含まず２００ｍＭのメトトレキセートを含むＰＦＣＨＯ選択培地（Cal Biochem）の中に入れた。
【０２３２】
メトトレキセート選択プロセスの回復時点で、分泌型ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質を含有する馴化培地をウェスタンブロット分析によって検査した。
【０２３３】
実施例３
マウスにおけるアタシセプトおよびＭＭＦの組合せ
ＣＤ−１マウスにおいて２８日研究の中でアタシセプトおよびＭＭＦ（Cell Cept）の同時投与をテストした。１５０匹の動物を４つの治療グループに分割した。グループ１には、各々のテスト製品について用いたのと同じ経路および投薬計画を使用して、アタシセプトとＭＭＦの両方に使用したビヒクル対照製品を投与した。グループ２には、毎日の経口強制飼養を介してＭＭＦ（３５１ｍｇ／ｋｇ）を投与した。グループ３には、皮下注射を介して一週三回アタシセプト（２０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。グループ４には、アタシセプト（２０ｍｇ／ｋｇ、３回／週、ＳＣ（皮下））およびＭＭＦ（３５１ｍｇ／ｋｇ、毎日、経口）を標準的に３０分以内で交互に投与した。投与するＭＭＦの用量は、マウスにおいて実行可能な最大用量として選択され、ヒト用量をマウスにスケーリングするべく体の表面積を用いて肝移植患者のために用いられる２９ｍｇ／ｋｇという体重７０ｋｇのヒトについてのヒト等価用量（およそ２ｇ／日）を模倣していた。
【０２３４】
動物をベースライン（１日目）、および１４日目、２８日目（治療最終日）、４２日目、５６日目および１１２日目に屠殺した。死亡率、異常および疼痛または苦痛の兆候について毎日マウスを点検した。研究第一日目、それ以降は一週間に一回、そして屠殺の前に体重を測定し記録した。包括的な血液学および血清化学分析、リンパ球亜型のおよび合計血清ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ濃度フローサイトメトリ分析のため、屠殺した動物から血液を収集した。臓器重量変化、肉眼的病理および組織病理の評価のために屠殺した動物について行なわれた包括的剖検を用いて、合計血清ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡを測定した。
【０２３５】
ELISA Starter Accessary Package（カタログ番号E101, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX）と組合せたマウスＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ定量キット（カタログ番号E90-131, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX）を用いて合計ＩｇＧレベルを評価した。全ての液体の取扱いは、一体型Freedom Evo 150液体取扱いシステムおよびColumbus Washer（TECAN,Denmark）を用いて実施した。マイクロタイターウェルを、親和力精製したヤギ抗マウスＩｇＧでコーティングし、１時間室温でインキュベートした。ウェルを吸引し、洗浄溶液で洗浄し、次に３０分間、ブロッキング溶液で遮断した。ブロッキング溶液を除去し、平板を洗浄し、試料／標準をデュプリケートで添加した。１時間後に、試料／標準を吸引し、ウェルを洗浄溶液で洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧを添加し、ウェルを一時間室温でインキュベートした。未結合の抱合抗体を洗浄によって除去し、ウェル内に残っている抱合体の量を１０分間ＴＭＢ基質（Bethyl Laboratories, Montgomery, TX）とのインキュベーションによって測定した。呈色反応を２ＭのＨ2ＳＯ4の添加で停止させ、結合としての吸光度（ＯＤ−４５０）をSpectramax 190マイクロプレート読取り装置上で読取った。
【０２３６】
合計ＩｇＧについてのデータ計算を以下のように実施した。すなわち、各々の試料および標準から、平均ゼロ標準（平板ブランク）ＯＤ−４５０値を減算し、デュプリケート読取り値を平均した。各標準についての平均ＯＤと濃度の関係を、４パラメータロジスティック曲線適合を用いてプロットすることで標準曲線にした。標準曲線からの補間により試料濃度を得た。希釈係を平均試料濃度に乗じた。Soft Max（登録商標） Proソフトウェアを用いて分析されたデータには、ＯＤ値、１つまたは複数の標準曲線、標準偏差および複製間のＣＶ％、および１つまたは複数の未知数の補間値が含まれていた。
【０２３７】
ELISA Starter Accessary Package（カタログ番号E101, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX）と組合せたマウスＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ定量キット（カタログ番号E90-101, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX）を用いて合計ＩｇＭレベルを評価した。全ての液体の取扱いは、一体型Freedom Evo 150液体取扱いシステムおよびColumbus Washer（TECAN,Denmark）を用いて実施した。マイクロタイターウェルを、親和力精製したヤギ抗マウスＩｇＭでコーティングし、１時間室温でインキュベートした。ウェルを吸引し、洗浄溶液で洗浄し、次に３０分間、ブロッキング溶液で遮断した。ブロッキング溶液を除去し、平板を洗浄し、試料／標準をデュプリケートで添加した。１時間後に、試料／標準を吸引し、ウェルを洗浄溶液で洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウスＩｇＭを添加し、ウェルを一時間室温でインキュベートした。未結合の抱合抗体を洗浄によって除去し、ウェル内に残っている抱合体の量を１０分間ＴＭＢ基質（Bethyl Laboratories, Montgomery, TX）とのインキュベーションによって測定した。呈色反応を２ＭのＨ2ＳＯ4の添加で停止させ、結合としての吸光度（ＯＤ−４５０）をSpectramax 190マイクロプレート読取り装置上で読取った。
【０２３８】
合計ＩｇＭについてのデータ計算を以下のように実施した。すなわち、各々の試料および標準から、平均ゼロ標準（平板ブランク）ＯＤ−４５０値を減算し、デュプリケート読取り値を平均した。各標準についての平均ＯＤと濃度の関係を、４パラメータロジスティック曲線適合を用いてプロットすることで標準曲線にした。標準曲線からの補間により試料濃度を得た。希釈係を平均試料濃度に乗じた。Soft Max（登録商標） Proソフトウェアを用いて分析されたデータには、ＯＤ値、１つまたは複数の標準曲線、標準偏差および複製間のＣＶ％、および１つまたは複数の未知数の補間値が含まれていた。
【０２３９】
ELISA Starter Accessary Package（カタログ番号E101, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX）と組合せたマウスＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ定量キット（カタログ番号E90-103, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX）を用いて合計ＩｇＡレベルを評価した。全ての液体の取扱いは、一体型Freedom Evo 150液体取扱いシステムおよびColumbus Washer（TECAN,Denmark）を用いて実施した。マイクロタイターウェルを、親和力精製したヤギ抗マウスＩｇＡでコーティングし、１時間室温でインキュベートした。ウェルを吸引し、洗浄溶液で洗浄し、次に３０分間、ブロッキング溶液で遮断した。ブロッキング溶液を除去し、平板を洗浄し、試料／標準をデュプリケートで添加した。１時間後に、試料／標準を吸引し、ウェルを洗浄溶液で洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウスＩｇＭを添加し、ウェルを一時間室温でインキュベートした。未結合の抱合抗体を洗浄によって除去し、ウェル内に残っている抱合体の量を１０分間ＴＭＢ基質（Bethyl Laboratories, Montgomery, TX）とのインキュベーションによって測定した。呈色反応を２ＭのＨ2ＳＯ4の添加で停止させ、結合としての吸光度（ＯＤ−４５０）をSpectramax 190マイクロプレート読取り装置上で読取った。
【０２４０】
合計ＩｇＡについてのデータ計算を以下のように実施した。すなわち、各々の試料および標準から、平均ゼロ標準（平板ブランク）ＯＤ−４５０値を減算し、デュプリケート読取り値を平均した。各標準についての平均ＯＤと濃度の関係を、４パラメータロジスティック曲線適合を用いてプロットすることで標準曲線にした。標準曲線からの補間により試料濃度を得た。希釈係を平均試料濃度に乗じた。Soft Max（登録商標） Proソフトウェアを用いて分析されたデータには、ＯＤ値、１つまたは複数の標準曲線、標準偏差および複製間のＣＶ％、および１つまたは複数の未知数の補間値が含まれていた。
【０２４１】
免疫グロブリン測定値の変化の平均結果は下表５に記録され、図１、２および３中にグラフ表示されている。
【表５】
0005426531.tif 000006
【０２４２】
これらの計算から見るとわかるように、組合せは、３つのタイプ全てについて免疫グロブリンの削減に対する相乗効果を有している（すなわち、組合せた状態でのビヒクルからの平均変化（△３）は、ビヒクルからＭＭＦ単独への平均変化（△１）とビヒクルからアタシセプト単独への平均変化（△２）とを加算したものより大きい（つまり数学的に、△３＞△１＋△２））。
【０２４３】
結論
本明細書中の実験は、ＭＭＦおよびアタシセプトといったような免疫抑制薬とＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストの組合せが、免疫抑制薬およびＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニスト単独での削減レベルに比べてＩｇレベルを相乗的に枯渇させるという点で意外な結果を示した。
【０２４４】
実施例４
アタシセプトおよびＭＭＦの組合せ実験の反復および延長
実施例３に記述されている手順に類似した手順および９１日目までの投薬を用いて、実施例３の結果を複製し、３５日目、９１日目、１２６日目および１８２日目まで時間的に延長した。この実験の結果は、各々の時点における３つのタイプの免疫グロブリンのうちの少なくとも１つのタイプについて、平均免疫グロブリンレベルに対するアタシセプトおよびＭＭＦの相乗効果を確認した。相乗的結果は、下表６に要約されている。
【表６】
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【０２４５】
選択された免疫グロブリン亜型が最大抑制に到達した時点で、相乗効果を観察する能力が、絶対数の少なさゆえに隠されてしまうという点に留意すべきである。この「マスキング」効果はより遅い時点で３つの免疫グロブリン亜型を横断して一貫して相乗作用が少ない理由を説明している。要するに、これらの結果は、実施例３の中に見られる標示された免疫グロブリンタイプのレベルの数値平均に対するアタシセプトおよびＭＭＦの組合せの相乗効果を確認し、かつこの結論を３５、９１、１２６および１８２日からの経時変化全体にわたり拡張している。
【０２４６】
完全性を期して、以下では、この反復および延長実験において使用された実験グループ、用量、投与体積および濃度について記述する：
【表７】
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【０２４７】
投与計画
アタシセプト：一日おき、一週３日、皮下経路、
ＭＭＦ：毎日、経口
グループ１は、治療対象グループと同じ治療頻度で、アタシセプト用ビヒクルとCellCept用ビヒクルの両方を受けた。グループ２は、唯一アタシセプトのみで治療された。
【０２４８】
グループ３は、CellCeptのみを受けた。グループ４は、およそ３０分の時間内にCellCeptの経口強制飼養とそれに続くアタシセプトの皮下注射を受けた。最初の治療日を研究第１日目とみなした。研究期間全体を通して、臨床的観察、血液学的および血液化学検査、トキシコキネティクスおよび付加的な調査を実施した。
【０２４９】
合計ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡの判定／サテライトグループ９、１０、１１および１２
合計免疫グロブリンの判定および抗体の判定のために付加的な動物サテライトグループを使用した。これらは、主研究と同じ手順に従って治療し計量した。
【表８】
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動物を１ケージ１性別あたり３匹のマウスの割合で収容した。
【０２５０】
以下の時点でＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡの血清レベルを判定するため（漸進的番号順で）１グループ１性別あたり３匹の動物から血液試料を収集した：
対照グループ（グループ９）の動物：Pre-dose（投薬前）
グループ９、１０、１１および１２の動物から：
−  ５週間の治療期間の第３４日目、
−  １３週間の治療期間の第９０日目、
−  ５週間の回復期間の第３４日目、
−  １３週間の回復期間の第９０日目
【０２５１】
ジエチルエーテルで完全に麻酔した後マウスの腹大動脈から屠殺時に血液（少なくとも０．８〜１ｍＬ）を収集した。
【０２５２】
抗凝血剤が一切入っていない管の中に試料を収集し、室温で約１時間凝固させた。凝血塊を１５分間＋４℃で３０００ｒｐｍで遠心分離により遠沈させた。血液細胞を捨て、血清を１００μＬのアリコート中で傾斜させ（各々の単回分析について４つのアリコート）、分析まで−８０℃で貯蔵した。合計ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡレベルを、有効ＥＬＩＳＡ方法によって決定した。
【０２５３】
屠殺を、１グループ１性別あたり４匹の動物（番号順で最初のもの）については５週間の治療期間の終了時点で；１グループ１性別あたり８匹の動物（番号順で２番目のもの）については１３週間の治療期間の終了時点で；１グループ１性別あたり４匹の動物（番号順で最初に回復した動物）については５週間の回復期間の終了時点で；そして１グループ１性別あたり４匹の動物（残りの動物）については１３週間の回復期間の終了時点で実施された。
【０２５４】
結論
本明細書中で報告した延長実験は、ＭＭＦおよびアタシセプトといったような免疫抑制薬およびＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニストの組合せが、免疫抑制薬およびＢＬｙＳおよび／またはＡＰＲＩＬアンタゴニスト単独での削減レベルに比べてＩｇレベルを相乗的に枯渇させる結果となったということが意外にも示された実施例３の結果を裏づけている。
【０２５５】
参考文献
特許、公開出願およびその他の刊行物を含め、本出願内で引用されている参考文献は、本明細書に参照により援用されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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