(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第８リン酸カルシウムとゼラチンとの共沈物の熱脱水架橋体を含む骨再生材料。
【請求項２】
骨再生材料の製造方法であって、
ゼラチンおよびリン酸を含む水溶液に、カルシウム水溶液を滴下または注加して、第８リン酸カルシウムとゼラチンとの共沈物を得る工程、および
該共沈物を加熱して熱脱水架橋体を得る工程
を含む、方法。
【請求項３】
骨再生材料の製造方法であって、
ゼラチンおよびカルシウムを含む水溶液に、リン酸水溶液を滴下または注加して、第８リン酸カルシウムとゼラチンとの共沈物を得る工程、および
該共沈物を加熱して熱脱水架橋体を得る工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨再生材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨腫瘍の手術、唇顎口蓋裂、粉砕骨折などに伴う骨欠損を有する患者に対しては、通常、骨移植が行われる。骨移植は、脳外科、整形外科、歯科などの領域における手術に伴って生じる骨欠損を修復するために行われる場合もある。
【０００３】
骨移植には、自家骨を用いることが好ましい。しかし、自家骨を用いるには量的な制限があり、自家骨を取り出した後に残る障害などの問題もある。このため、骨移植に用いる骨として、自家骨に代わり得る人工骨の開発が行われている。
【０００４】
人工骨材としては、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２：以下、「ＨＡ」と記載する場合がある）セラミックス、β−第３リン酸カルシウム（β−ＴＣＰ）などが提案されている。
【０００５】
ＨＡの前駆体である第８リン酸カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ：以下、「ＯＣＰ」と記載する場合がある）は、ＨＡよりも優れた多くの機能を有する（特許文献１）。例えば、骨伝導能（非特許文献１）、破骨細胞による吸収性（非特許文献２）、用量依存的な骨芽細胞の分化促進（非特許文献３）に優れている。また、ＨＡの前駆体である非晶質リン酸カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２・ｎＨ２Ｏ）（非特許文献４）や第２リン酸カルシウム（第２リン酸カルシウム無水物（ＣａＨＰＯ４）あるいは第２リン酸カルシウム２水和物（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ））（特許文献１および非特許文献５）についてもＯＣＰと同様の性質を有することが報告されている。したがって、人工骨材としては、ＨＡよりはむしろ、ＯＣＰなどのＨＡ前駆体に対する期待が大きい。
【０００６】
しかし、ＯＣＰは人工骨材として用いるには非常に脆く、また賦形性が低い。ＯＣＰの賦形性の低さを補う観点から、ＯＣＰと高分子材料との複合体が検討されている。例えば、ＯＣＰの顆粒とコラーゲンとの複合体（以下、「ＯＣＰ／Ｃｏｌ」と記載する場合がある）が知られている（特許文献２）。ＯＣＰ／Ｃｏｌは、ＯＣＰの優れた骨伝導能を促進するが、人工骨材として用いた場合、人工骨成分が周辺の組織に吸収されて人工骨が消失し、これに置き換わりながら骨が再生する過程において、人工骨の消失速度が骨の再生速度よりも遅くなる。これは、生体内でＯＣＰの顆粒が完全には吸収されにくいために生じる性質である。再生骨が人工骨と十分に置換し、骨の欠損が完全に新生骨で満たされることは、この分野で求められているきわめて重要な課題である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第２７８８７２１号公報
【特許文献２】特開２００６−１６７４４５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Suzuki O.ら、Tohoku J. Eng. Med.、1991年、第164巻、p.37-50
【非特許文献２】Imaizumi H.ら、Calcif. Tissue Int.、2006年、第78巻、p.45-54
【非特許文献３】Anada T.ら、Tissue Eng.、2008年、第14巻、p.965-978
【非特許文献４】Meyer J.L.ら、Calcif. Tissue Int.、1978年、第25巻、p.59-68
【非特許文献５】Eidelman N.ら、Calcif. Tissue Int.、1987年、第41巻、p.18-26
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、欠損する前の骨の形状と同じ形状を有し、新生骨と十分に置換し得る骨再生材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＯＣＰの粒径を可能な限り小さくすることが重要であり、このために化学的に析出し、合成条件下で規定される最小の結晶径を有する化学析出ＯＣＰとゼラチンとの共沈物（以下、「ＯＣＰ／Ｇｅｌ」と記載する場合がある）が有効であることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
本発明は、第８リン酸カルシウムとゼラチンとの共沈物の熱脱水架橋体を含む骨再生材料を提供する。
【００１２】
本発明はまた、骨再生材料の製造方法を提供し、該方法は、ゼラチンおよびリン酸を含む水溶液に、カルシウム水溶液を滴下または注加して、第８リン酸カルシウムとゼラチンとの共沈物を得る工程、および該共沈物を加熱して熱脱水架橋体を得る工程を含む。
【００１３】
本発明はさらに、骨再生材料の製造方法を提供し、該方法は、ゼラチンおよびカルシウムを含む水溶液に、リン酸水溶液を滴下または注加して、第８リン酸カルシウムとゼラチンとの共沈物を得る工程、および該共沈物を加熱して熱脱水架橋体を得る工程を含む。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、良好な物理的強度を有し、かつ欠損する前の骨の形状と同じ形状を有し、新生骨と十分に置換し得る骨再生材料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１におけるラットの再生した頭蓋骨の断面を示すヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色の写真である。
【図２】比較例１におけるラットの再生した頭蓋骨の断面を示すヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の骨再生材料は、第８リン酸カルシウム（ＯＣＰ）とゼラチンとの共沈物（ＯＣＰ／Ｇｅｌ）の熱脱水架橋体を含む。
【００１７】
ＯＣＰ／Ｇｅｌは、変性コラーゲンであるゼラチンに、ＯＣＰの結晶を直接析出させた複合体であり、ＯＣＰの結晶が均一に分散していると考えられる。
【００１８】
ＯＣＰ／Ｇｅｌは共沈法によって得られる。例えば、ゼラチンおよびリン酸を含む水溶液にカルシウム水溶液を滴下または注加する方法、ゼラチンおよびカルシウムを含む水溶液にリン酸水溶液を滴下または注加する方法によって得られる。
【００１９】
ゼラチンとしては、特に限定されない。通常、コラーゲンを熱処理して得られる。市販のゼラチンであってもよい。
【００２０】
コラーゲンとしては、特に限定されない。例えば、豚、牛の皮膚、骨、腱に由来するコラーゲンが挙げられる。好ましくは、蛋白分解酵素（例えば、ペプシン、プロナーゼ）により可溶化され、テロペプチドが除去された酵素可溶化コラーゲンである。コラーゲンのタイプとしては、例えば、タイプＩ、タイプＩ＋タイプＩＩＩが好ましい。コラーゲンは生体由来成分であるので、安全性が高く、特に酵素可溶化コラーゲンがアレルゲン性も低く好ましい。市販のコラーゲンであってもよい。
【００２１】
リン酸としては、水溶液中でＰＯ４３−を生じる化合物であれば、特に限定されない。このような化合物としては、例えば、リン酸水素ナトリウム、リン酸アンモニウムおよび正リン酸が挙げられる。
【００２２】
カルシウムとしては、水溶液中でＣａ２＋を生じる化合物であれば、特に限定されない。このような化合物としては、例えば、酢酸カルシウム、塩化カルシウムおよび硝酸カルシウムが挙げられる。
【００２３】
リン酸とカルシウムとの割合は、特に限定されないが、好ましくは、モル比で、カルシウム１に対してリン酸が０．７１〜１．１０、より好ましくは０．７３〜１．００である。
【００２４】
ＯＣＰとゼラチンとの割合は、特に限定されないが、好ましくは、質量比で、ゼラチン１に対してＯＣＰが０．１〜９、より好ましくは０．６７〜４である。ゼラチン１に対してＯＣＰが０．１未満であると、得られる骨再生材料の骨再生能が劣り、９を超えると、形状付与性が低下する。
【００２５】
ゼラチンおよびリン酸を含む水溶液ならびにゼラチンおよびカルシウムを含む水溶液は、好ましくはｐＨが４．５〜７．５である。カルシウム水溶液またはリン酸水溶液を混合することによってｐＨを変動させないために、緩衝成分を含んでもよい。
【００２６】
ゼラチンおよびリン酸を含む水溶液へのカルシウム水溶液の滴下または注加、あるいはゼラチンおよびカルシウムを含む水溶液へのリン酸水溶液の滴下または注加は、好ましくは５０℃〜８０℃、より好ましくは約６０℃〜７５℃で行われる。５０℃未満または８０℃を超えると、ＯＣＰが生成しにくい。
【００２７】
ここで、「滴下」とは、一方の溶液の液滴を他方の溶液に加えることをいい、「注加」とは、チューブなどの中空管を用いて、一方の溶液を他方の溶液に加えることをいう。
【００２８】
滴下または注加は、ゼラチンおよびリン酸を含む水溶液、あるいはゼラチンおよびカルシウムを含む水溶液を攪拌しながら行う。攪拌しないと、均一な粒径のＯＣＰ／Ｇｅｌが得られない。
【００２９】
滴下または注加の速度（ｍＬ／分）は、好ましくは３０〜１２０、より好ましくは３５〜８２である。３０未満または１２０を超えると、ＯＣＰが生成しにくい。
【００３０】
熱脱水架橋体は、ＯＣＰ／Ｇｅｌを形成するゼラチン分子同士が脱水縮合反応により架橋した構造体である。熱脱水架橋体は、架橋構造を有するため、物理的強度が高い。
【００３１】
熱脱水架橋体は、ＯＣＰ／Ｇｅｌを加熱することにより得られる。この加熱処理は、５０℃〜２００℃、好ましくは１００℃〜１５０℃の温度で、３時間〜２４０時間、好ましくは２４時間〜１００時間行われる。
【００３２】
熱脱水架橋体は、好ましくは、ＯＣＰ／Ｇｅｌを減圧下で加熱することにより得られる。減圧条件としては、特に限定されないが、例えば、２００Ｐａ以下、好ましくは１３３Ｐａ以下である。
【００３３】
熱脱水架橋体は、より好ましくは、ＯＣＰ／Ｇｅｌを乾燥した後、減圧下で加熱することにより得られる。乾燥方法としては、特に限定されないが、例えば、凍結乾燥法および自然乾燥法（風乾）が挙げられる。乾燥前に、ＯＣＰ／Ｇｅｌを静置し、次いで上清を除去するなどして、適宜水分を少なくすることにより、乾燥工程を効率的にしてもよい。
【００３４】
本発明の骨再生材料は、本発明の効果が阻害されない範囲内で、一般的に骨再生材料に含まれる成分を含んでいてもよい。このような成分としては、例えば、生体吸収性高分子（ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリエチレングリコール共重合体など）、生体吸収性リン酸カルシウム（β−ＴＣＰなど）、生体非吸収性材料（ＨＡセラミックスなど）が挙げられる。
【００３５】
本発明の骨再生材料は、骨欠損部の形状に応じて適宜成形され、電子線照射、高圧蒸気滅菌などにより滅菌処理後、骨欠損部に埋入される。ただし、高圧蒸気滅菌は、ＯＣＰの結晶相に影響を及ぼすので、その場合は骨欠損の適用部位を考慮する。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３７】
（実施例１）
（ＯＣＰ／Ｇｅｌの熱脱水架橋体の調製）
ゼラチン（シグマ社製、Ｔｙｐｅ  Ａ  Ｇｅｌａｔｉｎ（ブタ皮膚由来））をリン酸緩衝液（リン酸２水素ナトリウム）に溶解して、１％（w/v）のゼラチンを含む水溶液を調製した。このゼラチン溶液５００ｍＬを攪拌しながら７０℃に維持した。この溶液に、０．０８モル／Ｌの酢酸カルシウム水溶液５００ｍＬを７．５分間かけて滴下して混合した。滴下終了後、混合液をさらに７０℃にて数分間静置することにより、沈殿（共沈物）を形成させた。上清を除去し、沈殿の懸濁液をポリプロピレン製の容器に移し、凍結乾燥を行った。凍結乾燥物を１３３Ｐａ以下の減圧下、１５０℃にて２４時間維持することにより、ＯＣＰ／Ｇｅｌの熱脱水架橋体を得た。得られたＯＣＰ／Ｇｅｌ中のＯＣＰ含有量は、化学分析の結果、約４０質量％であった。
【００３８】
（骨形成の検証）
ジエチルエーテルおよびネンブタールを用いて、ラット（Ｗｉｓｔａｒ、１２週齢、雄性）に全身麻酔を施した。次いで、ラットの頭蓋部皮膚を剃毛し、露出した皮膚およびその下の骨膜をメスで切開した。頭蓋骨正中部に直径９ｍｍの骨欠損部を形成した。次いで、電子線照射（５ｋＧｙ）により滅菌したＯＣＰ／Ｇｅｌの熱脱水架橋体を、ディスク状に成形し（直径９ｍｍ、厚さ１ｍｍ）、骨欠損部に埋入して骨膜および皮膚を縫合した。
【００３９】
埋入から８週間後、ラットから摘出した頭蓋骨の脱灰標本を用いて、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色により組織学的分析を行った。結果を図１に示す。
【００４０】
図１から明らかなように、ＯＣＰ／Ｇｅｌの熱脱水架橋体を埋入したラットでは、再生骨は、骨欠損部を形成する前の頭蓋骨と類似の形状を有し、かつ母床骨に近い組成構造を呈した。
【００４１】
ＨＥ染色の結果から、組織形態計測により、骨形成量および残存ＯＣＰ量を定量し、骨形成率＝骨形成量／残存ＯＣＰ量を算出した。ＯＣＰ／Ｇｅｌの熱脱水架橋体を埋入したラットでは、８週間の骨形成率は６６％という比較的高い値を示した。
【００４２】
（比較例１）
（ＯＣＰ／Ｃｏｌの熱脱水架橋体の調製）
ブタ皮膚由来ペプシン可溶化コラーゲン凍結乾燥粉末（タイプＩ＋タイプＩＩＩ、中性、架橋あり：ＮＭＰコラーゲンＰＳ；日本ハム株式会社製）を酸性溶液に溶解して、１％（w/v）のコラーゲンを含む水溶液を調製した。このコラーゲン溶液に、O.Suzukiら、Tohoku J. Exp. Med.、1991年、第164巻、p.37に記載の手順で製造したＯＣＰ顆粒を、ＯＣＰとコラーゲンとの質量比が７７：２３（ＯＣＰ７７質量％）となるように分散させた。この分散液をポリプロピレン製の容器に移し、凍結乾燥を行った。凍結乾燥物を１３３Ｐａ以下の減圧下、１５０℃にて２４時間維持することにより、ＯＣＰ／Ｃｏｌの熱脱水架橋体を得た。
【００４３】
（骨形成の検証）
実施例１と同様にして、骨欠損部を形成した。次いで、電子線照射（５ｋＧｙ）により滅菌したＯＣＰ／Ｃｏｌの熱脱水架橋体を、ディスク状に成形し（直径９ｍｍ、厚さ１ｍｍ）、骨欠損部に埋入して骨膜および皮膚を縫合した。
【００４４】
埋入から１２週間後、ラットから摘出した頭蓋骨について、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色により組織学的分析を行った。結果を図２に示す。
【００４５】
図２から明らかなように、ＯＣＰ／Ｃｏｌの熱脱水架橋体を埋入したラットでは、再生骨は、ＯＣＰ／Ｇｅｌによる再生骨と比べ、母床骨よりも膨隆し、ＯＣＰ／Ｃｏｌ中のＯＣＰ顆粒が残存し、またＯＣＰの顆粒形状に依存した骨組織構造を呈した。
【００４６】
このように、実施例１のＯＣＰ／Ｇｅｌの熱脱水架橋体は、比較例１のＯＣＰ／Ｃｏｌの熱脱水架橋体と比べて、生体への吸収速度と新生骨の置換速度とのバランスがよいことがわかる。
【００４７】
ＨＥ染色の結果から、組織形態計測により、骨形成量および残存ＯＣＰ量を定量し、骨形成率＝骨形成量／残存ＯＣＰ量を算出した。ＯＣＰ／Ｃｏｌの熱脱水架橋体を埋入したラットでは、１２週間の骨形成率は５３％であった。ＯＣＰの用量が大きいほど、骨芽細胞の賦活化能（Anada T.ら、Tissue Eng. Part A、2008年、第14巻、p.965-978）またはＯＣＰ／Ｃｏｌの骨形成能（Kawai T.ら、Tissue Eng. Part A、2009年、第15巻、p.23-32）が高いことがわかっている。このことから、ＯＣＰ／Ｇｅｌ（ＯＣＰ４０質量％）の８週間で６６％という骨再生能と、ＯＣＰ／Ｃｏｌ（ＯＣＰ７７質量％）の１２週間で５３％という骨再生能とを比較した場合、ＯＣＰ／Ｇｅｌの格段に優れた骨再生能が伺える。
【００４８】
このように、実施例１のＯＣＰ／Ｇｅｌの熱脱水架橋体は、比較例１のＯＣＰ／Ｃｏｌの熱脱水架橋体と比べて、埋入期間が４週間も短かったにもかかわらず、高い骨形成率を示した。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の骨再生材料は、良好な物理的強度を有し、かつ欠損する前の骨の形状と同じ形状を有し、新生骨と十分に置換し得る。したがって、本発明の骨再生材料は、機能障害を伴う骨欠損への適応のみならず、機能障害が顕在化せず看過されることが多かった手術に伴って形成される骨欠損の修復（脳外科、整形外科、歯科領域など）、骨吸収を伴う歯周病、義歯の保持を不安定化させる顎堤の低下などの障害にも適用され得、患者の生活の質（ＱＯＬ）の向上に寄与し得る。
【図１】
0005647432.tif 000002
【図２】
0005647432.tif 000003