(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
解離定数＜２０ｎＭで配列番号１、配列番号２および配列番号３によるタンパク質に結合することができ、かつ、少なくとも１つの抗原結合部位を含む抗体またはそのフラグメントであって、該抗原結合部位が以下のＣＤＲ：
（ｉ）配列番号１２のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３のＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１４のＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１５のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１６のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１７のＣＤＲ−Ｌ３、
または
（ｉｉ）配列番号１８のＣＤＲ’−Ｈ１、配列番号１９のＣＤＲ’−Ｈ２、配列番号２０のＣＤＲ’−Ｈ３、配列番号２１のＣＤＲ’−Ｌ１、配列番号２２のＣＤＲ’−Ｌ２および配列番号２３のＣＤＲ’−Ｌ３
を順に含むものである、抗体またはそのフラグメント。
【請求項２】
２０ｎＭ未満の濃度で脊髄ミエリンを脱抑制することができる請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項３】
ラット成体脊髄ミエリンの基質上で成長させたラット小脳顆粒細胞の細胞あたりの平均神経突起長を少なくとも２０％まで増加させることができる請求項１または２に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項４】
少なくともａ）
（ｉ）配列番号５を含む可変ドメイン、および
（ｉｉ）ヒト重鎖の定常部分またはそのフラグメント
を含む１つの免疫グロブリン重鎖またはそのフラグメント；ならびに
ｂ）
（ｉ）配列番号４を含む可変ドメイン、および
（ｉｉ）ヒト軽鎖の定常部分またはそのフラグメント
を含む１つの免疫グロブリン軽鎖またはそのフラグメント
を含む、請求項１−３のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項５】
少なくともａ）
（ｉ）配列番号７を含む可変ドメイン、および
（ｉｉ）ヒト重鎖の定常部分またはそのフラグメント
を含む１つの免疫グロブリン重鎖またはそのフラグメント；ならびに
ｂ）
（ｉ）配列番号６を含む可変ドメイン、および
（ｉｉ）ヒト軽鎖の定常部分またはそのフラグメント
を含む１つの免疫グロブリン軽鎖またはそのフラグメント
を含む、請求項１−３のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項６】
ヒト重鎖の定常部分またはそのフラグメントがγ４型のものであり、そしてヒト軽鎖の定常部分またはそのフラグメントがκ型のものである請求項５に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項７】
ヒトまたはキメラまたはヒト化モノクローナル抗体である請求項１−５のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項８】
請求項１−５のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号８および配列番号９からなる群から；または配列番号１０および配列番号１１からなる群から選択されるポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８または９のいずれかに記載の１つまたはそれより多いポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項８または９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターであって、該発現ベクターが適合する宿主細胞中に存在する場合に、請求項１から７のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントを生成することができるものである、発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項１３】
ＣＮＳ傷害の処置のための医薬品の調製における請求項１から７のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントの使用。
【請求項１４】
請求項１から７のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントを少なくとも１つの薬学的に許容される担体または希釈剤と一緒に含む医薬組成物。
【請求項１５】
軸索再生／可塑性の促進に関連する疾患の処置における使用のための医薬の調製における、請求項１から７のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は例えばモノクローナル抗体またはそのＦａｂフラグメントのようなＬＩＮＧＯ結合分子、および中枢神経系に対する傷害を有する患者を処置するためのかかる結合分子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
高等脊椎動物成体の中枢神経系（ＣＮＳ）に対する傷害の後の機能的回復は例外的に限定的であり、四肢の運動および感覚の喪失のような持続的な神経障害を招く。今のところ脊髄傷害（ＳＣＩ）および脳皮質傷害のようなＣＮＳ傷害を有するヒトを処置するための有効な治療は欠如している。成体のＣＮＳニューロンは一般的に軸索切断から生き延びるが、軸索再生は一過性であり、そして限局的な部分にわたってのみ生じ、それ故に機能的に関連するシナプス結合の再形成を遅延させる。さらに成体ＣＮＳの可塑性能力もまた制限され、故に傷害により切断されたものを機能的に補償するための非傷害経路の再編成を妨げる。逆説的に末梢神経系（ＰＮＳ）で軸索切断された軸索は長きにわたって再生し、そして頻繁に機能的に意味のある連結を確立する高い能力を有する（Schwab, Curr Opin Neurobiol １４：１１８−１２４（２００４））。この軸索再生／可塑性における制限はある程度、神経突起伸長の強力な阻害剤であることが示されているいくつかのタンパク質、すなわちＮｏｇｏ−Ａ（Chen et al., Nature ４０３：４３４−４３９（２０００）；GrandPre et al., Nature ４０３：４３９−４４４（２０００）；Prinjha et al., Nature ４０３：３８３−３８４（２０００））、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）およびオリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）（McKerracher et al., Neuron １３：８０５−８１１（１９９４）；Wang et al., Nature ４１７：９４１−９４４（２００２））（図１Ａ）の有髄化オリゴデンドロサイトにおける発現のためである。
【０００３】
Ｎｏｇｏ−Ａはオリゴデンドロサイトの表面に暴露された複数の神経突起伸長阻止ドメインを含有する：二つはアミノ−末端領域（アミノ−Ｎｏｇｏ−Ａ）内に、そして１つはＣ−末端領域（Ｎｏｇｏ−６６）に位置する（Oertle et al., J Neurosci ２３：５３９３−５４０６（２００３））。Ｎｏｇｏ−６６はＮｏｇｏ−６６受容体（ＮｇＲ）として公知のニューロン表面上のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカードロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）含有受容体を介して結合およびシグナル発生する（Fournier et al., Nature ４０９：３４１−３４６（２００１））。構造的には関連しないが、ＭＡＧおよびＯＭｇｐもまたＮｇＲを介して結合およびシグナル発生する（Domeniconi et al., Neuron ３５：２８３−２９０（２００２）；Liu et al., Science ２９７：１１９０−１１９３（２００２）；Wang et al., Nature ４１７：９４１−９４４（２００２））。ＮｇＲを介するシグナル発生は小型ＧＴＰａｓｅ  ＲｈｏＡの活性化に至り、それが今度はＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）を活性化し、アクチン細胞骨格の硬直化および軸索伸長の阻止に至る（Niederoest et al., J Neurosci ２２：１０３６８−１０３７６（２００２）；Schweigreiter et al., Mol Cell Neurosci ２７：１６３−１７４（２００４））。三つのリガンド全てがＮｇＲのＬＲＲ領域内に結合し、そして部分的に重複する結合部位を有する（Fournier et al., J Neurosci ２２：８８７６−８８８３（２００２）；Liu et al. Science ２９７：１１９０−１１９３（２００２）；Wang et al., Nature ４１７：９４１−９４４（２００２）；Barton et al., EMBO J ２２：３２９１−３３０２（２００３））。アミノ−Ｎｏｇｏ−Ａ内の阻止ドメインに関する（複数の）受容体は未知であるが、ＮｇＲとは区別されることが示されている（Schweigreiter et al., Mol Cell Neurosci ２７：１６３−１７４（２００４））。ＭＡＧはＮｇＲ２として公知のＮｇＲの密接した相同体を介してシグナル発生することもまた見出されている（Pignot et al., J Neurochem ８５：７１７−７２８（２００３）；Venkatesh et al., J Neurosci ２５：８０８−８２２（２００５））。
【０００４】
ＮｇＲは細胞質ドメインを欠如するので、それはシグナル伝達のためにいくつかの膜貫通タンパク質、すなわち低親和性ニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ、ＴＲＯＹ（ＴＡＪとも称される）およびＬＩＮＧＯ−１（ＬＲＲおよびＩｇドメイン含有、Ｎｏｇｏ受容体相互作用タンパク質、ＬＲＲＮ６ＡまたはＬＥＲＮ１とも称される）を利用する（Wang et al. Nature ４２０：７４−７８（２００２）；Carim−Todd et al., Eur J Neurosci １８：３１６７−３１８２（２００３）；Mi et al., Nat Neurosci ７：２２１−２２８（２００４）；Park et al., Neuron ４５：３４５−３５１（２００５）；Shao et al., Neuron ４５：３５３−３５９（２００５））。ＴＲＯＹおよびｐ７５ＮＴＲはＮｇＲ受容体複合体において互いに機能的に置き換えることができるが、一方ＬＩＮＧＯ−１の存在は生じるシグナル発生のための絶対的な必要条件である。ＮｇＲ受容体複合体はそれ故にリガンド結合サブユニットとしてＮｇＲ、およびｐ７５ＮＴＲまたはＴＲＯＹのいずれかと協調的に作用する一般的なシグナル伝達サブユニットとしてＬＩＮＧＯ−１を含む三元複合体として認められる。
【０００５】
ＬＩＮＧＯ−１はニューロンおよびオリゴデンドロサイト上で優先的に、ＣＮＳ内で独占的に発現される単一の膜貫通タンパク質である。ＬＩＮＧＯ−１の発現は出生後早期にピークに達し、そして傷害時の成体脊髄において上方調節される。ＬＩＮＧＯ−１の外部ドメインはＮ−およびＣ−末端サブドメイン、続いて塩基性領域およびＩｇドメインによりフランキングされる１２個のタンデムＬＲＲを含有する（図１Ｂ）。ＬＩＮＧＯ−１外部ドメインのＡＰ融合がＮｇＲもしくはｐ７５ＮＴＲまたは双方を発現するＣＯＳ−７細胞に結合し、そして同様に、ＬＩＮＧＯ−１が三つ全てのタンパク質を発現する細胞におけるＮｇＲまたはｐ７５ＮＴＲと共沈する場合、ＬＩＮＧＯ−１は双方と同時に相互作用することによりＮｇＲおよびｐ７５ＮＴＲと三元複合体を形成する可能性が最も高い。
【０００６】
ニューロン上で発現されることに加えて、ＬＩＮＧＯ−１はまた成体ＣＮＳのオリゴデンドロサイトにおいても発現される（Mi et al., Nat Neurosci ８：７４５−７５１（２００５））。ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃでのいずれかの処理によるオリゴデンドロサイト培養物中のＬＩＮＧＯ−１シグナル発生の阻止、ＲＮＡｉでのタンパク質の下方調節、またはＤＮ−ＬＩＮＧＯ−１の過剰発現はＯＰＣの有髄化オリゴデンドロサイトへの分化を増強した。さらに、マウスにおけるＬＩＮＧＯ−１の遺伝手術により成熟オリゴデンドロサイトおよび対応して脊髄における有髄軸索の数が増加する。ＬＩＮＧＯ−１シグナル発生の阻止はＲｈｏＡの活性化を低下させ、そしてＦｙｎキナーゼの作用を増大させ、その双方はオリゴデンドロサイト分化を促進させると報告されているが、ＬＩＮＧＯ−１シグナル発生の活性化に寄与する実際のリガンド／相互作用は未だに例示されていない。これにより、ＬＩＮＧＯ−１がミエリン形成の負のレギュレーターであるという結論に至っている。
【０００７】
多発性硬化症（ＭＳ）は脱髄および軸索変性を特徴とし、多発性神経障害に至るＣＮＳの慢性炎症性疾患である。軸索のミエリン再形成は疾患の早期に生じ、いくつかの時点で、ミエリン再形成は完全に失敗して軸索変性の加速および非可逆的損傷に至る。ミエリン再形成は活動性病変の辺縁部に遊走する成体オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の分化から生じる可能性が最も高い。ＬＩＮＧＯ−１はミエリン形成を負に調節するので、ＬＩＮＧＯ−１の遮断はミエリン再形成を増強し、軸索変性を減弱し、軸索再生を促進し、そして故にＭＳのような脱髄性疾患の進行を減弱、停止または逆転さえし得る。
【０００８】
ＬＩＮＧＯ−１の遮断はまたドーパミン作動性ニューロンの生存性を改善し、そしてパーキンソン病のげっ歯類モデルにおける行動異常を低下させることも示されている（Inoue et al., Proc Natl Acad Sci USA １０４：１４４３０−１４４３５（２００７））。
【発明の概要】
【０００９】
（発明の要旨）
驚くべきことに、ＬＩＮＧＯ−１に対する新規モノクローナルヒト抗体（本明細書後記の抗体４７８４、および抗体４７８５としても公知）がＬＩＮＧＯ−１とＮｇＲとの会合を有意に阻止し、そしてインビトロでｎＭ以下の濃度でラット成体の脊髄ミエリンの神経突起伸長阻止活性を有意に減弱することが見出されている。加えて、該抗体はインビトロで一次オリゴデンドロサイトの分化を有意に増大させ、そして生存細胞における細胞表面ＬＩＮＧＯ−１を有意に下方調節することが示されている。これらの抗体での処理は軸索再生／可塑性を増大させ、そしてＳＣＩおよび脳皮質傷害のような急性ＣＮＳ傷害の後の機能的回復を改善すると予期される。さらに、オリゴデンドログリア細胞における該抗体を用いるＬＩＮＧＯ−１シグナル発生の遮断は、ＭＳのような脱髄性疾患における軸索のミエリン再形成を増強し、疾患進行の減弱に至る可能性がある。一致して、該抗体でのニューロンにおけるＬＩＮＧＯ−１シグナル発生の阻止は軸索再生および神経可塑性を改善し、そして疾患の経過中の神経学的機能喪失の回復を促進すると予期できる。最後に、該抗体でのＬＩＮＧＯ−１の遮断はパーキンソン病の病因を減弱すると予期できる。
【００１０】
さらに本発明はＬＩＮＧＯ−１の特異的エピトープに結合する結合分子を提供する。
抗体はラット、カニクイザルおよびヒトＬＩＮＧＯ−１外部ドメインに対してｎＭ以下のＫＤを有し、ラット成体脊髄ミエリンの神経突起伸長阻止活性をｎＭ以下の濃度で有意に減弱し、そしてインビトロでオリゴデンドロサイト分化を有意に増大させた。さらに今では該抗体と同一の可変領域を有するその他のＬＩＮＧＯ−１結合分子を構築することが可能である。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
したがって、本発明はＬＩＮＧＯ−１の特定の領域またはエピトープに対する結合分子（以後「本発明の結合分子」または単に「結合分子」と称する）を提供する。
本発明の結合分子は解離定数（ＫＤ）＜１０００ｎＭ、さらに好ましくはＫＤ＜１００ｎＭ、最も好ましくはＫＤ＜１０ｎＭでラットＬＩＮＧＯ−１（配列番号１）、カニクイザルＬＩＮＧＯ−１（配列番号２）およびヒトＬＩＮＧＯ−１（配列番号３）の成熟外部ドメイン（残基３４−５５０）に結合する。結合反応を例えば実施例に記載されるＦＡＣＳ法を含む標準的な方法（定性アッセイ）により示すことができる。加えてラット、カニクイザルおよびヒトＬＩＮＧＯ−１に対する結合、ならびに効率もまた以下で記載されるような神経突起伸長アッセイおよびオリゴデンドロサイトアッセイにおいて示すことができる。
【００１２】
故にさらに好ましい実施態様では、結合分子は（１００ｎＭ、好ましくは１０ｎＭ、さらに好ましくは１ｎＭ、なおさらに好ましくは０.１ｎＭの濃度で）ラット成体脊髄ミエリンの基質で成長させたラット小脳顆粒細胞の細胞あたりの平均神経突起長を、ラット、カニクイザルおよびヒトＬＩＮＧＯ−１外部ドメインに結合しない対照抗体で処理されたラット小脳顆粒細胞の細胞あたりの平均神経突起長と比較して、少なくとも２０％、好ましくは５０％、最も好ましくは６０％まで増大させる。
【００１３】
ペプチドマイクロアレイを使用することにより、本発明の結合分子が結合する特異的エピトープを当分野において周知の方法にしたがって決定する。結果的に別の実施態様では本発明は配列番号４６−５１により定義されるような少なくとも１つのＬＩＮＧＯ−１エピトープに結合する結合分子を提供する。配列番号４６：KIVILLDYMFQD、配列番号４７：AIRDYSFKRLYR、配列番号４８：LKVLEISHWPYL、配列番号４９：NLTAVPYLAVRHLVY、配列番号５０：YFTCRRARIまたは配列番号５１：DVLLPNYFTCRRARI。
【００１４】
別の実施態様では、本発明の結合分子は１つまたはそれより多い以下のＣＤＲ配列、例えばそこで言及された抗体４７８４の全てまたは抗体４７８５配列の全てを含む：
配列番号１２
（抗体４７８４ＣＤＲ−Ｈ１）
SSGVGVG
配列番号１３
（抗体４７８４ＣＤＲ−Ｈ２）
HIGSDDDKYYSTSLKT
配列番号１４
（抗体４７８４ＣＤＲ−Ｈ３）
NQQYGDGYPGYFDY
配列番号１５
（抗体４７８４ＣＤＲ−Ｌ１）
SGDNIGNYYVY
配列番号１６
（抗体４７８４ＣＤＲ−Ｌ２）
EDTNRPS
配列番号１７
（抗体４７８４ＣＤＲ−Ｌ３）
QSYDNLHEQV
配列番号１８
（抗体４７８５ＣＤＲ’−Ｈ１）
DNSAAWS
配列番号１９
（抗体４７８５ＣＤＲ’−Ｈ２）
LIYLRSKWDNDYAVSVKS
配列番号２０
（抗体４７８５ＣＤＲ’−Ｈ３）
TGRADEFDV
配列番号２１
（抗体４７８５ＣＤＲ’−Ｌ１）
SGSSSNIGNNYVS
配列番号２２
（抗体４７８５ＣＤＲ’−Ｌ２）
RNSKRPS
配列番号２３
（抗体４７８５ＣＤＲ’−Ｌ３）
STYDTFSIV
【００１５】
さらに好ましくは、結合分子は配列番号１２、１３、１４、１５、１６および／もしくは１７を有する抗体４７８４に関する；または配列番号１８、１９、２０、２１、２２および／もしくは２３を有する抗体４７８５に関する１つまたはそれより多い前記の配列を含む。
【００１６】
４７８４または４７８５を変化させることができることは当業者には理解され、それを通してそれらはいくつかの、さらに好ましくは１個またはそれより多いアミノ酸、好ましくは３個まで、例えば１または２個の前記のＳＤＲを、特に１個もしくはそれより多い、またはそれらの全て、例えばそれらの１もしくは２個で変化させるか、または生成物の形式の代替えの翻訳後修飾を提供し、同一もしくは実質的に類似する抗Ｌｉｎｇｏ−１結合挙動を実証する治療薬を導く。
別の実施態様では、本発明の結合分子は；配列番号５もしくは配列番号７に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％もしくは少なくとも９９％相同である配列、および；
配列番号４もしくは配列番号６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％もしくは少なくとも９９％相同である配列、またはその直接的な均等物；からなる群から選択される少なくとも１つの抗原結合部位を含む。
【００１７】
１つの実施態様では、結合分子は配列番号５または配列番号７、および；
配列番号４または配列番号６；
からなる群から選択される少なくとも１つの結合部位を含む。
本発明はさらに配列番号５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％もしくは少なくとも９９％相同である第１の配列、および配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％もしくは少なくとも９９％相同である第２の配列、またはその直接的な均等物を含む結合分子を提供する。
【００１８】
本発明はさらに配列番号７に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％もしくは少なくとも９９％相同である第１の配列、および配列番号６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％もしくは少なくとも９９％相同である第２の配列、またはその直接的な均等物を含む結合分子を提供する。
【００１９】
１つの実施態様では、本発明は少なくとも：
ａ）
（ｉ）配列番号５または配列番号７を含む可変ドメイン、および；
（ｉｉ）ヒト重鎖の定常部分またはそのフラグメント；
を含む１つの免疫グロブリン重鎖またはそのフラグメント；ならびに
ｂ）
（ｉ）配列番号４または配列番号６を含む可変ドメイン、および；
（ｉｉ）ヒト軽鎖の定常部分またはそのフラグメント；
を含む１つの免疫グロブリン軽鎖またはそのフラグメント；
またはその直接的な均等物；例えばａ）もしくはｂ）の下で与えられた鎖の各々の２つもしくは３つ；
を含む上記の結合分子を提供する。
【００２０】
配列は配列番号４−７に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％相同でよい。重要な因子は、各々の場合で好ましくは実施例または残りの記載にて記載されるように、かかるバリアントがＬＩＮＧＯ−１に対する結合能力、脱抑制効果（特にラット成体脊髄ミエリンの神経突起伸長阻止活性をｎＭ以下の濃度で減弱する能力）を保持し、そして／またはＳＣＩの機能的回復を改善する（特にラットモデルにおいて）ことである。
【００２１】
１つの実施態様では、本発明は配列番号４−７もしくは配列番号１２−２３による１つもしくはそれより多い配列を含む抗体またはそのフラグメント、またはその直接的な均等物である結合分子を提供する。
さらなる実施態様では、抗体としての結合分子はγ４型のヒト重鎖の定常部分またはそのフラグメントおよびλ型であるヒト軽鎖の定常部分またはそのフラグメントを有する。
【００２２】
さらなる実施態様では、抗体としての結合分子はγ４型のヒト重鎖の定常部分またはそのフラグメントおよびκ型であるヒト軽鎖の定常部分またはそのフラグメントを有する。
さらなる実施態様では、結合分子はヒトまたはキメラまたはヒト化モノクローナル抗体である。
さらなる実施態様では、結合分子はhumaneered抗体である。
本発明はまた前記で定義されたような結合分子をコードするポリヌクレオチドをも提供する。
【００２３】
ポリヌクレオチドを配列番号８および配列番号９からなる群から；または配列番号１０および配列番号１１からなる群から選択できる。
本発明はまた配列番号８−１１による１つまたはそれより多いポリヌクレオチドを含む発現ベクターをも提供する。
さらに本発明は配列番号８−１１によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供し、ここで該発現系またはその部分が適合する宿主細胞中に存在する場合、該発現系またはその部分は前記で示されたような結合分子を生成することができる。本発明はまたはかかる発現系を含む単離された宿主細胞をも提供する。
【００２４】
本発明はまたは医薬品としての前記で示されたような結合分子の使用をも提供する。
本発明はまたはＣＮＳ傷害の処置のための医薬品の調製における前記で示されたような結合分子の使用をも提供する。
本発明はまたは前記で示されたような結合分子を少なくとも１つの薬学的に許容される担体または希釈剤と一緒に含む医薬組成物をも提供する。
【００２５】
さらに本発明は有効量の前記で示されたような結合分子をかかる処置を必要とする対象に投与することを含む、軸索再生／可塑性の促進に関連する疾患の処置の方法を提供する。
本発明はまたは有効量の請求項１から１０のいずれかに記載の結合分子をかかる処置を必要とする対象に投与することを含む、軸索再生／可塑性の促進に関連する疾患の処置の方法をも提供する。
抗原結合部位が第１および第２の双方のドメインを含む場合、これらは同一のポリペプチドに位置してよいか、または好ましくは各ドメインが異なる鎖に位置してよく、第１のドメインは免疫グロブリン重鎖の部分またはそのフラグメントであり、そして第２のドメインは免疫グロブリン軽鎖の部分またはそのフラグメントである。
【００２６】
本発明の結合分子の実例には、ファージディスプレイにより生成されるような抗体およびヒトもしくはキメラヒト化抗体、またはさらにhumaneered抗体、またはその任意のフラグメント、例えばＦ（ａｂ’）２；およびＦａｂフラグメント、ならびに一本鎖または単一ドメイン抗体が含まれる。「抗体」なる用語はかかる結合分子を含むと意図される。
一本鎖抗体は通常１０から３０個のアミノ酸、好ましくは１５から２５個のアミノ酸からなるペプチドリンカーにより共有結合した抗体重および軽鎖の可変ドメインからなる。それ故に、かかる構造は重および軽鎖の定常部分を含まず、そして小型ペプチドスペーサーは定常部分全体よりも抗原性が低いはずであると考えられている。「キメラ抗体」とは重もしくは軽鎖または双方の定常領域がヒト起源であるが、重および軽鎖の双方の可変ドメインが非ヒト（例えばマウス）起源である抗体を意味する。「ヒト化抗体」とは超可変領域（ＣＤＲ）は非ヒト（例えばマウス）起源であるが、免疫グロブリンの全てまたは実質的に全てのその他の部分、例えば定常領域および可変ドメインの高度に保存された部分、すなわちフレームワーク領域はヒト起源である抗体を意味する。しかしながらヒト化抗体は超可変領域に隣接するフレームワーク領域の部分においてネズミ配列の数個のアミノ酸を保持し得る。
【００２７】
超可変領域は任意の種類のフレームワーク領域、好ましくはネズミまたはヒト起源のものに関連し得る。適当なフレームワーク領域は「Sequences of proteins of immunological interest」（Kabat E.A. et al、米国保健社会福祉省国立衛生研究所公衆衛生局、好ましくは、特にフレームワーク領域に関して出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている。好ましくは結合分子のヒト重鎖の定常部分はサブタイプを含むγ４型のものでよく、好ましくはヒト軽鎖の定常部分はκまたはλ型のもの、さらに好ましくはλ型のものでよい。
【００２８】
天然発生「抗体」はジスルフィド結合により相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略する）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのドメインからなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略する）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域を、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるさらに保存されている領域がちりばめられた相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは以下の順でアミノ末端からカルボキシ末端に配列した３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的は補体系の第１の構成要素（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００２９】
抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗原部分」）なる用語は、本明細書で使用される際には、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の全長または１つもしくはそれより多いフラグメント（例えばＬＩＮＧＯ−１および／またはＬＩＮＧＯ−２）を指す。全長抗体のフラグメントにより抗体の抗原結合機能を実施できることが示されている。抗体の「抗原結合部分」なる用語に包含される結合フラグメントの実例には、Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ward et al., Nature ３４１：５４４−５４６（１９８９））；ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。
【００３０】
「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」なる用語は、本明細書で使用される際には、単一分子組成物の抗体分子の調製物（すなわち全て単一の親細胞のクローンである免疫細胞の１つの型により生成されるのでそれらは同一である）を指す。モノクローナル抗体組成物は（本質的に）単一の結合特異性および特定のエピトープに関する親和性を表示する。
【００３１】
「ヒト抗体」なる用語は、本明細書で使用される際には、フレームワークおよびＣＤＲ領域の双方がヒト起源の配列から誘導される可変領域を有する抗体を含むと意図される。さらに抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もまたかかるヒト配列、例えばヒト生殖細胞配列、またはヒト生殖細胞配列の変異したものから誘導される。本発明のヒト抗体はヒト配列によりコードされないアミノ酸残基（例えばインビトロで無作為もしくは部位特異的変異誘発により、またはインビボで体細胞変異により導入された変異）を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」なる用語は、本明細書で使用される際には、マウスのような別の哺乳動物種の生殖細胞系から誘導されたＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むとは意図されない。
【００３２】
「ヒトモノクローナル抗体」なる用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の双方がヒトの配列から誘導される可変領域を有する（本質的に）単一の結合特異性を表示する抗体を指す。１つの実施態様ではヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマにより生成される。
「組換えヒト抗体」なる用語は本明細書で使用される際には、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関して遺伝子導入もしくは染色体導入された動物（例えばマウス）またはそこから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマ（transfectoma）から単離された抗体、組換え体から単離された抗体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーのような組換え手段により調製、発現、創成または単離された全てのヒト抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子の全てまたは一部の、配列をその他のＤＮＡ配列にするスプライシングを伴う任意のその他の手段により調製、発現、創成または単離された抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から誘導される可変領域を有する。しかしながら特定の実施態様では、かかる組換えヒト抗体をインビトロ変異誘発（またはヒトＩｇ配列に関して遺伝子導入された動物を用いる場合、インビボ体細胞変異誘発）に供することができ、そして故に組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ配列から誘導され、そしてそれに関連するが、インビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。
【００３３】
本明細書で使用される際には、「アイソタイプ」とは重鎖定常領域遺伝子により提供される抗体クラス（例えばＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のようなＩｇＧ）を指す。
本明細書で使用される際には、「親和性」なる用語は単一の抗原性部位での抗体と抗原との間の相互作用の強さを指す。各抗原性部位内では、抗体「アーム」の可変領域は弱い非共有結合力を介して多くの部位で抗原と相互作用し；より相互作用すると、親和性がより強くなる。
「ＫＤ」なる用語は、本明細書で使用される際には、Ｋａに対するＫｄの比（解離率に対する会合率）（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られる解離定数を指すと意図され、そしてモル濃度（Ｍ）として表現される。当分野において十分に確立された方法を用いて抗体に関するＫＤ値を決定することができる。抗体のＫＤを決定するための方法は表面プラズモン共鳴法の使用、またはBiacore（登録商標）システムのようなバイオセンサーシステムの使用による。
【００３４】
本発明による結合分子は好ましくは「単離された抗体」であり、それは本明細書で使用される際には、異なる抗原特異性を有するその他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えばＬＩＮＧＯ−１、ＬＩＮＧＯ−２またはＬＩＮＧＯ−１およびＬＩＮＧＯ−２に特異的に結合する単離された抗体は言及されたもの以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら特異的に結合する単離された抗体はその他の種からのＬＩＮＧＯ−１またはＬＩＮＧＯ−２分子のようなその他の抗原に対する交差反応性を有し得る。さらに単離された抗体は好ましくはその他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まない。
本発明はまたは：
ａ）アミノ酸配列（配列番号５）を有する重鎖の可変配列を含む第１ドメイン；
ｂ）アミノ酸配列（配列番号４）を有する軽鎖の可変配列を含む第２ドメイン；
ｃ）第１ドメインのＮ末端および第２ドメインのＣ末端もしくは第１ドメインのＣ末端および第２ドメインのＮ末端のいずれかに結合したペプチドリンカー；
またはその直接的な均等物；
を含む抗体４７８４の抗原結合部位（特に抗体４７８４に関して前記されたＣＤＲを伴う）を含む一本鎖結合分子から選択できる本発明の結合分子を提供する。
本発明の結合分子を
ａ）アミノ酸配列（配列番号７）を有する重鎖の可変配列を含む第１ドメイン；
ｂ）アミノ酸配列（配列番号６）を有する軽鎖の可変配列を含む第２ドメイン；
ｃ）第１ドメインのＮ末端および第２ドメインのＣ末端もしくは第１ドメインのＣ末端および第２ドメインのＮ末端のいずれかに結合したペプチドリンカー；
またはその直接的な均等物；
を含む抗体４７８５の抗原結合部位（特に抗体４７８５に関して前記されたＣＤＲを伴う）を含む一本鎖結合分子から選択できる。
周知のように、１つまたはいくつかのアミノ酸の欠失、付加または置換のようなアミノ酸配列におけるわずかな変化は、実質的に同一の特性を有する元来のタンパク質のアレル形態に至り得る。故に「その直接的な均等物」なる用語は：
（ｉ）結合分子の可変領域（例えば配列番号４、５、６または７）は、配列番号４および配列番号５の各々の直接的な均等物を含む軽および重鎖または配列番号６および配列番号７の各々の直接的な均等物を含む軽および重鎖の均等な可変領域に対して少なくとも５０または８０％相同、好ましくは少なくとも９０％相同、さらに好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８、９９％相同であり；
（ｉｉ）ラットＬＩＮＧＯ−１（配列番号１）、カニクイザルＬＩＮＧＯ−１（配列番号２）およびヒトＬＩＮＧＯ−１（配列番号３）の外部ドメイン（残基３４−５５０）に、好ましくは解離定数（ＫＤ）＜１０００ｎＭ、さらに好ましくはＫＤ＜１００ｎＭ、最も好ましくはＫＤ＜１０ｎＭで結合できる；
本発明のいずれかの任意の単一ドメイン結合分子（分子Ｘ）、または結合部位あたり少なくとも２つのドメインを有する本発明の任意の結合分子（分子Ｘ’）を意味する。
【００３５】
故に本発明のさらなる実施態様は例えば解離定数＜１０００ｎＭでラット、カニクイザルおよび／またはヒトＬＩＮＧＯ−１の外部ドメインに結合でき、そして少なくとも１つの抗原結合部位を含み、該抗原結合部位は配列に４７８４の軽および重鎖（各々配列番号４および配列番号５）または４７８５の軽および重鎖（各々配列番号６および配列番号７）の均等な可変領域に少なくとも５０％、好ましくは８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９％相同である可変領域を含む。
【００３６】
別の実施態様では、結合分子は配列番号１２−２３からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列、またはこれらの配列に対して少なくとも５０％、好ましくは８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９％相同である配列を含む。
この解離定数を例えば実施例で記載されるＦＡＣＳ法を含む種々のアッセイにおいて都合よく試験できる。加えて結合分子の結合および機能的影響をバイオアッセイ、例えば以下に記載されるような神経突起伸長アッセイにおいて示すことができる。
【００３７】
ヒト重鎖の定常部分はγ１；γ２；γ３；γ４；α１；α２；δまたはε型、好ましくはγ型、さらに好ましくはγ４型のものでよいが、一方ヒト軽鎖の定常部分はκまたはλ型（それはλ１；λ２；およびλ３サブタイプを含む）でよいが、好ましくはλ型のものである。これらの全ての定常部分のアミノ酸配列はKabat et al（Supra）で与えられる。
本発明の結合分子の抱合体、例えば酵素または毒素または放射性同位体抱合体もまた本発明の範囲内に含まれる。
【００３８】
「ポリペプチド」には、本明細書にて特記しない場合、ペプチド結合により互いに結合したアミノ酸を含み、Ｎ末端で始まり、そしてＣ末端で終わるアミノ酸配列を有する任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。好ましくは本発明のペプチドはモノクローナル抗体であり、さらに好ましくはキメラ（Ｖグラフティングとも称される）またはヒト化（ＣＤＲグラフティングとも称される）モノクローナル抗体である。ヒト化（ＣＤＲグラフティング）モノクローナル抗体はアクセプター抗体のフレームワーク（ＦＲ）配列に導入されたさらなる変異を含んでも含まなくてもよい。
【００３９】
ポリペプチドの機能的誘導体は本明細書で使用される際には、質的に本発明のポリペプチドに共通した生物学的活性を有する、すなわちラット、カニクイザルおよびヒトＬＩＮＧＯ−１の外部ドメインに結合する能力を有する分子が含まれる。
機能的誘導体には本発明によるポリペプチドのフラグメントおよびペプチド類似体が含まれる。それはまた「直接的な誘導体」をも含む。
【００４０】
フラグメントは本発明による、例えば特定された配列のポリペプチドの配列内の領域を含む。結合分子の、特に抗体のフラグメントは機能的なフラグメントである、すなわちそれらはＬＩＮＧＯ−１および／またはＬＩＮＧＯ−２に、特に配列番号４６、４７、４８、４９、５０および５１により与えられる少なくとも１つのエピトープに、好ましくは、前記でまたは実施例で特に好ましいとして言及された結合親和性（ＫＤ）で結合できる少なくとも１つの部分を含む。
「誘導体」なる用語は本発明による、例えば特定された配列のポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、および共有結合性修飾を定義するために用いられる。本発明による、例えば特定された配列のポリペプチドの例えば軽および重鎖の超可変領域の機能的誘導体は好ましくは、本発明による、例えば特定された配列のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約６５％、さらに好ましくは少なくとも約７５％、なおさらに好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９５、９６、９７、９８、９９％の配列全体にわたる相同性を有し、そしてラット、カニクイザルおよびヒトＬＩＮＧＯ−１（および場合によっては加えてＬＩＮＧＯ−２）の外部ドメインに結合する能力を実質的に保持している。
【００４１】
「共有結合性修飾」なる用語には、本発明による、例えば特定された配列のポリペプチド；またはそのフラグメントの有機タンパク質性または非タンパク質性誘導体化剤での修飾、異種性ポリペプチドへの融合および翻訳後修飾が含まれる。例えば特定された配列の共有結合性修飾されたポリペプチドは依然ラット、カニクイザルおよびヒトＬＩＮＧＯ−１の外部ドメインに結合する能力を有する。共有結合性修飾は伝統的には標的化されたアミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応できる有機誘導体化剤と反応させることにより、または選択された組換え宿主細胞において機能する翻訳後修飾のメカニズムを利用することにより導入される。特定の翻訳後修飾は発現されたポリペプチドにおける組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に頻繁に翻訳後脱アミド化される。これに代えて、これらの残基は穏やかな酸性条件下で脱アミノ化される、その他の翻訳後修飾にはプロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル、チロシンまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化が含まれる（例えばT. E. Creighton, Proteins：Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. ７９−８６（１９８３）参照）。共有結合性修飾には、例えばイムノアドヘシンのような、例えば本発明による、例えば特定された配列のポリペプチド含む融合タンパク質およびそのアミノ酸バリアントを、ならびに異種性シグナル配列に対するＮ末端融合が含まれる。
【００４２】
自然のポリペプチドおよびその機能的誘導体に関する「相同性」（または「同一性」）は本明細書では、必要により最大相同性パーセントを達成するために配列をアラインし、そしてギャップを誘導した後、対応する自然のポリペプチドの残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義され、そして任意の保存置換を配列同一性の一部ではないと考える。ＮもしくはＣ末端伸長も挿入も同一性または相同性を低下させるものではないと解釈しなければならない。アラインメントのための方法およびコンピュータープログラムは周知である。
【００４３】
好ましくは本明細書で使用される際には、２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列間の相同性パーセントは２つの配列間の同一性パーセントと均等である。２つの配列間の同一性パーセントは配列により共有される同一の位置の数の関数であり（すなわち相同性％＝同一の位置の数／位置の全数×１００）、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定を、以下の非限定例で記載されるような数学的アルゴリズムを用いて達成することができる：
【００４４】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、ALIGNプログラム（バージョン２.０）に組み入れられているE. MeyersおよびW. Millerのアルゴリズム（Comput. Appl. Biosci., ４：１１−１７（１９８８））を用いて、ＰＡＭ１２０残基重み付け表（weight residue table）、ギャップ長ペナルティー１２およびギャップペナルティー４を用いて決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（http://www.gcg.comで利用可能）に組み入れられているNeedlemanおよびWunsch（J. Mol, Biol. ４８：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを用いて、Blossom ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、ならびにギャップ重み付け１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ重み付け１、２、３、４、５または６を用いて決定することができる。
【００４５】
加えてまたはこれに代えて、本発明のタンパク質配列をさらに「クエリー配列」として用いて公開されたデータベースに対して検索を実施し、例えば関係する配列を同定することができる。Altschul, et al., J.Mol. Biol. ２１５：４０３−１０（１９９０）のXBLASTプログラム（バージョン２.０）を用いてかかる検索を実施することができる。BLASTタンパク質検索をXBLASTプログラム、スコア＝５０、語長＝３で実施して、本発明の抗体分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップの入ったアラインメントを得るために、Altschul et al., Nucleic Acids Res. ２５（１７）：３３８９−３４０２（１９９７）に記載されるようなGapped BLASTを利用することができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、各プログラムのデフォルトパラメーター（例えばXBLASTおよびNBLAST）を用いることができる。http:www.ncbi.nhn.nih.govを参照のこと。
「（複数の）アミノ酸」は全ての天然発生の例えばＬ−α−アミノ酸を指し、そしてＤ−アミノ酸を含む。アミノ酸は周知の一文字表記または三文字表記のいずれかにより同定される。
【００４６】
「アミノ酸配列バリアント」なる用語は、本発明による、例えば特定された配列のポリペプチドと比較してそのアミノ酸配列においていくつかの差異を有する分子を指す。本発明による、例えば特定された配列のポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは依然ラット、カニクイザルおよびヒトＬＩＮＧＯ−１の外部ドメインに対する結合能力を有する。置換バリアントは、本発明による、例えば特定された配列のポリペプチドにおいて少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、そして同一位置でその場所に異なるアミノ酸が挿入されたものである。これらの置換は単一でよく、その場合分子の１個のアミノ酸のみが置換されているか、またはそれらは複数でよく、その場合２個またはそれより多い、例えば１から１０個。好ましくは１から５個、さらに好ましくは１から３個のアミノ酸が同一分子内で置換されている。挿入バリアントは、１つまたはそれより多い、例えば１から１０個のような１から１００個のアミノ酸が、本発明による、例えば特定された配列のポリペプチドにおける特定の位置のアミノ酸に直ぐ隣接して挿入されたものである。アミノ酸に直ぐ隣接してとは、アミノ酸のα−カルボキシまたはα−アミノ官能基のいずれかに連結されていることを意味する。欠失バリアントは本発明による、例えば特定された配列のポリペプチドにおいて１個またはそれより多い、例えば１から１０個または１から５個のような１から１００個のアミノ酸が除去されているものである。通常欠失バリアントは分子の特定の領域において１または２個のアミノ酸が欠失されている。
【００４７】
本発明の結合分子を組換えＤＮＡ技術により生成できる。これに鑑みて、結合分子をコードする１つまたはそれより多いＤＮＡ分子は構築され、適切な制御配列下に置かれ、そして発現のために適当な宿主生物に移されなければならない。
【００４８】
したがって非常に一般的な様式では：
（ｉ）本発明の単一ドメイン結合分子、本発明の一本鎖結合分子、本発明の結合分子の重もしくは軽鎖またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ分子；および
（ｉｉ）組換え手段による本発明の結合分子の生成のための本発明のＤＮＡ分子の使用；
が提供される。
【００４９】
当分野の現状では、当業者は本明細書にて提供される情報、すなわち超可変領域のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列を考慮して、本発明のＤＮＡ分子を合成できる。可変ドメイン遺伝子を構築する方法は例えば欧州特許第２３９４００号（好ましくは特に可変ドメイン遺伝子を構築するための方法に関して、出典明示により本明細書の一部とする）に記載されており、そして以下のように簡単に要約できる：どのような特異性のものでもモノクローナル抗体の可変ドメインをコードする遺伝子はクローン化される。フレームワークおよび超可変領域をコードするＤＮＡセグメントを決定し、そして超可変領域をコードするＤＮＡセグメントを除去し、フレームワーク領域をコードするＤＮＡセグメントを接合部で適当な制限部位と一緒に融合する。標準的な手順によりＤＮＡ分子の変異誘発により適切な位置で制限部位を作成することができる。前記の配列にしたがってＤＮＡ合成により二本鎖合成可変領域カセットを調製する。免疫グロブリン可変ドメインをコードするＤＮＡ分子を達成するための標準的なプロトコールにより、これらのカセットに付着末端が提供され、それらを接合部でフレームワークにライゲートできるようになる。
【００５０】
さらに本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ構築物を得るために、生成ハイブリドーマ細胞系からｍＲＮＡを入手する必要はない。故にＰＣＴ出願第ＷＯ９０／０７８６１号（好ましくは特にモノクローナル抗体の生成に関して、出典明示により本明細書の一部とする）により、遺伝子のヌクレオチド配列に関して記載された情報のみを考慮して組換えＤＮＡ技術によりモノクローナル抗体を生成するための全ての指示が与えられる。
その方法は多数のオリゴヌクレオチドの合成、ＰＣＲ法によるその増幅および望ましいＤＮＡ配列を与えるためのそのスプライシングを含む。
【００５１】
適当なプロモーターまたは重および軽鎖定常部分をコードする遺伝子を含む発現ベクターは公的に入手可能である。故に一度本発明のＤＮＡ分子が調製されると、それを適切な発現ベクターに都合よく移すことができる。
一本鎖抗体をコードするＤＮＡ分子を標準的な方法により、例えば第ＷＯ８８／１６４９号（好ましくは特に一本鎖抗体をコードするＤＮＡ分子に関して、出典明示により本明細書の一部とする）に記載されるように調製することもできる。
本発明の特定の実施態様では、本発明の結合分子のいくつかの生成のための組換え手段には、以下に記載されるような第１および第２のＤＮＡ構築物が含まれる：
【００５２】
第１のＤＮＡ構築物は重鎖またはそのフラグメントをコードし、そして：
ａ）抗体４７８４、ＤＮＡ−４７８４ＶＨ（配列番号８）、または抗体４７８５、ＤＮＡ−４７８５ＶＨ（配列番号９）のいずれかの重鎖の可変ドメインをコードする第１の部分；この第１の部分は可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンで始まり、そして可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる；および
ｂ）重鎖の定常部分の最初のアミノ酸をコードするコドンで始まり、そして定常部分またはそのフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わり、ナンセンスコドンが続く重鎖定常部分またはそのフラグメントをコードする第２の部分；
を含む。
好ましくは第２の部分はヒト重鎖の定常部分、さらに好ましくはヒトγ４鎖の定常部分をコードする。この第２の部分はゲノム起源のＤＮＡフラグメント（イントロンを含む）またはｃＤＮＡフラグメント（イントロンを含まない）でよい。
【００５３】
第２のＤＮＡ構築物は軽鎖またはそのフラグメントをコードし、そして：
ａ）抗体４７８４、ＤＮＡ−４７８４ＶＬ（配列番号１０）、または抗体４７８５、ＤＮＡ−４７８５ＶＬ（配列番号１１）のいずれかの軽鎖の可変ドメインをコードする第１の部分；この第１の部分は可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンで始まり、そして可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる；および
ｂ）軽鎖の定常部分の最初のアミノ酸をコードするコドンで始まり、そして定常部分またはそのフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わり、ナンセンスコドンが続く軽鎖定常部分またはそのフラグメントをコードする第２の部分；
を含む。
好ましくは第２の部分はヒト軽鎖の定常部分、さらに好ましくはヒトκ鎖の定常部分をコードする。
【００５４】
ＤＮＡ構築物の各々を適当な制御配列の制御下に、とりわけ適当なプロモーターの制御下に置く。ＤＮＡ構築物を発現のために移す宿主生物に適合するならば、任意の種類のプロモーターを使用できる。しかしながら哺乳動物細胞において発現を行うことになっている場合、免疫グロブリン遺伝子のプロモーターを使用するのがとりわけ好ましい。
【００５５】
細胞培養またはトランスジェニック動物において望ましい抗体を生成できる。適当な制御配列の下に置かれた第１および第２のＤＮＡ構築物を卵にマイクロインジェクトし、そのように調製された卵を適切な偽妊娠の雌に移し、そして望ましい抗体を発現する子孫を選択することを含む標準的な方法により、適当なトランスジェニック動物を得ることができる。
抗体鎖が細胞培養中に生成されなければならない場合、ＤＮＡ構築物を単一の発現ベクターまたは２つの別個であるが適合する発現ベクターのいずれかに最初に挿入すべきであり、恐らく後者が好ましい。
【００５６】
したがって本発明はまた前記で記載されたＤＮＡ構築物の少なくとも１つを含む原核細胞系または真核細胞系において複製できる発現ベクターをも提供する。
次いでＤＮＡ構築物を含有する各発現ベクターを適当な宿主生物に移す。ＤＮＡ構築物を２つの発現ベクターに別個に挿入する場合、それらを別個に、すなわち細胞あたり１つの型のベクターに移すか、または同時に移すことができ、恐らくこの後者が好ましい。適当な宿主生物は細菌、酵母または哺乳動物細胞系でよく、この後者が好ましい。さらに好ましくは、哺乳動物細胞系はリンパ系起源、例えば骨髄腫、ハイブリドーマまたは通常の不死化Ｂ細胞であるが、内因性抗体重または軽鎖を全く発現しない。
【００５７】
宿主生物が細胞あたりに多数のベクターのコピーを含有するのも好ましい。宿主生物が哺乳動物細胞系である場合、標準的な方法にしたがってコピーの数を増幅することにより望ましい目標に到達することができる。増幅方法は通常薬物に対して高められた抵抗性に関して選択することからなり、該抵抗性は発現ベクターによりコードされる。
本発明の別の態様では、本発明の多鎖結合分子を生成するための方法が提供され、それは（ｉ）本発明の第１および第２の構築物で形質転換された生物を培養すること；ならびに（ｉｉ）培養物から本発明の活性な結合分子を回収すること；を含む。
【００５８】
これに代えて重および軽鎖を別個に回収し、そしてインビトロでリフォールディングした後、活性な結合分子に再構成することができる。再構成の方法は当分野において周知である；方法の実例はとりわけ欧州特許第１２０６７４号または欧州特許第１２５０２３号にて提供される。
それ故に方法はまた：
（ｉ）本発明の第１のＤＮＡ構築物で形質転換された第１の生物を培養し、そして培養物から該重鎖またはそのフラグメントを回収すること；ならびに
（ｉｉ）本発明の第２のＤＮＡ構築物で形質転換された第２の生物を培養し、そして培養物から該軽鎖またはそのフラグメントを回収すること；ならびに
（ｉｉｉ）（ｉ）で得られた重鎖またはそのフラグメントおよび（ｉｉ）で得られた軽鎖またはそのフラグメントから本発明の活性な結合分子をインビトロで再構成すること；
をも含む。
【００５９】
類似の様式で、
（ｉ）本発明の一本鎖または単一ドメイン結合分子を各々コードするＤＮＡ構築物で形質転換された生物を培養すること；および
（ｉｉ）培養物から該分子を回収すること；
を含む本発明の一本鎖または単一ドメイン結合分子を生成するための方法もまた提供される。
【００６０】
本発明の結合分子は以下に例示されるようにＬＩＮＧＯ−１のＮｇＲに対する結合を有意に阻止し、ラット成体脊髄ミエリンの神経突起伸長阻止活性をｎＭ以下の濃度で有意に減弱し、そしてオリゴデンドロサイト分化をインビトロで有意に増大させる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ＮｇＲ：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対するＡＰ−ＬＩＮＧＯ−１結合に及ぼすＦａｂ４７８４および４７８５の影響：２μＭの指示された抗ＬＩＮＧＯ−１Ｆａｂまたは抗ニワトリリゾチームＦａｂ３２０７の不在下または存在下で懸濁液中のＮｇＲ：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を１ｎＭ  ＡＰまたはＡＰ−ＬＩＮＧＯ−１のいずれかと共にインキュベートする。１−ＳｔｅｐＴＭ  ＰＮＰＰと共に３０分間インキュベートした後、細胞における結合ＡＰ活性を４０５ｎｍでの吸光度として測定する。ＡＰ−ＬＩＮＧＯ−１の特異的結合をＡＰ−ＬＩＮＧＯ−１結合の全量とＡＰ単独との結合の量との間の差異として計算する。特異的結合の平均阻止パーセンテージ（ｎ＝３、±ＳＴＤ）をＦａｂ３２０７の存在下および抗ＬＩＮＧＯ−１  Ｆａｂの存在下のＡＰ−ＬＩＮＧＯ−１の特異的結合の量の間の差異パーセンタイルとして計算する。
【００６２】
【図２】抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４抗体４７８４および４７８５による脊髄ミエリンの脱抑制：Ａ）脊髄ミエリンを伴わずにコーティングされたウェル（ＳＣなし、白色棒）または脊髄ミエリンでコーティングされたウェル上で抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４抗体、対照抗リゾチームＩｇＧ４抗体３２０７（緑色棒）もしくは１μｍ  ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２（黄色棒）の不在下（ＳＣ、赤色棒）または存在下、Ｐ７  ＣＧＮ細胞を１６時間インキュベートする。ＲＯＣＫは全てではないが、たいていの、ＮｇＲ受容体複合体を介してシグナル発生しないものを含むミエリン関連神経突起伸長阻害剤のシグナル発生経路における２次メッセンジャーであり、それでＹ２７６３２処理が脊髄ミエリンの神経突起伸長阻止活性の減弱のための陽性対照として用いられる（図１）。プレート毎にＳＣを伴う、およびＳＣを伴わない条件で３つの９６ウェルプレートで実験を実施し、そのプレート上の抗体の影響を比較し、そしてニューロンあたりの平均神経突起長（μｍ）を１０回反復でウェルあたり５００ニューロンに関して計算する。阻止パーセンテージ（白色文字）を、ＳＣを伴って、および伴わずにコーティングされたウェル上に置かれた細胞間の平均神経突起長／ニューロンにおける差異パーセンタイルとして計算する。脱抑制パーセンテージ（黒色斜字体文字）を、抗ＬＩＮＧＯ−１抗体の存在下および不在下でＳＣ上に置かれた細胞間の平均神経突起長における差異として、ＳＣを伴って、および伴わずにコーティングされたウェル上に置かれた細胞間における差異パーセンタイルとして計算する。＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１（一元配置分散分析、抗体不在下で脊髄ミエリン上に置かれた細胞に関する平均神経突起長／ニューロンに対するHolm−Sidak比較）。Ｂ）脊髄ミエリンを伴わずに（ＳＣなし）コーティングされたウェル上で、および脊髄ミエリンを伴って（ＳＣ）コーティングされたウェル上で、１ｎＭ  対照ＩｇＧ４  ３２０７もしくは抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４  ４７８４の不在下（ＳＣ）または存在下でインキュベートされた細胞の代表的な視野の蛍光画像。４７８４の存在下の脊髄ミエリン上で成長させた細胞は、抗体の不在下または対照抗体３２０７の存在下で成長させた細胞よりも細胞あたりの神経突起が可視的により長く、そしてより多い。
【００６３】
【図３】抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４抗体ＩＩによる脊髄ミエリンの脱抑制  Ａ）脊髄ミエリンを伴わずにコーティングされたウェル（ＳＣなし、白色棒）または脊髄ミエリンでコーティングされたウェル上で抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４抗体もしくは対照抗リゾチームＩｇＧ４抗体３２０７の不在下（ＳＣ、赤色棒）または存在下、Ｐ７  ＣＧＮ細胞を８時間インキュベートする。プレート毎にＳＣを伴う、およびＳＣを伴わない条件で３つの９６ウェルプレートで実験を実施し、そのプレート上の抗体の影響を比較し、そしてニューロンあたりの平均神経突起長（μｍ）を１０回反復でウェルあたり５００ニューロンに関して計算する。阻止パーセンテージ（白色文字）および脱抑制パーセンテージ（黒色斜字体文字）を前記のように計算する。＊＊ｐ＜０.０１（一元配置分散分析、抗体不在下で脊髄ミエリン上に置かれた細胞に関する平均神経突起長／ニューロンに対するHolm−Sidak比較）。
【００６４】
【図４】抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４抗体ＩＩＩによる脊髄ミエリンの脱抑制：Ａ）脊髄ミエリンを伴わずにコーティングされたウェル（ＳＣなし）または脊髄ミエリンでコーティングされたウェル上で指示された濃度の抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４抗体４７８４もしくは４７８５、対照抗リゾチームＩｇＧ４抗体３２０７もしくは１μＭ  Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ）の不在下（ＳＣ）または存在下、Ｐ７  ＣＧＮ細胞を８時間インキュベートする。プレート毎にＳＣを伴う、およびＳＣを伴わない条件で３つの９６ウェルプレートで実験を実施し、そのプレート上の抗体の影響を比較し、そしてニューロンあたりの平均神経突起長（μｍ）を１０回反復でウェルあたり５００ニューロンに関して計算する。阻止パーセンテージ（白色文字）および脱抑制パーセンテージ（黒色斜字体文字）を前記のように計算する。＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１（一元配置分散分析、抗体不在下で脊髄ミエリン上に置かれた細胞に関する平均神経突起長／ニューロンに対するHolm−Sidak比較）。
【００６５】
【図５】抗ＬＩＮＧＯ−１抗体は未成熟オリゴデンドロサイトの分化を有意に増大させる：Ａ）新たに単離されたＯＰＣをＤＭＥＭ／ＣＮＴＦ／Ｔ３培地中１００ｎＭ  ４７８４、４７８５または対照ＩｇＧ４  ３２０７で３日間処理し、続いて抗Ｏ４抗体で染色して未成熟および成熟オリゴデンドロサイト（より大きければ、標識がより拡散される）を可視化し、そして核酸色素ＤＡＰＩ（４’,６−ジアミジン−２’−フェニル−インドール二塩酸塩）で細胞核（より小さい円形ドット）を可視化する。高度に樹状化し、そして伸長した突起およびミエリンシート状構造を担持するオリゴデンドロサイトは成熟形態を有していると考えられ、そして白色矢印で示される。抗ＬＩＮＧＯ−１抗体処理の結果、成熟形態を有するＯ４陽性細胞の比率の増大を招くが、一方対照ＩｇＧ４  ３２０７での処理には影響がない。Ｂ）全（左グラフ）および成熟（右グラフ）オリゴデンドロサイトの比率を３つの独立した実験（１、２、３）で定量する。左の棒グラフはＯ４染色に関連するＤＡＰＩ染色された核のパーセンテージを表し、そして右の棒グラフは成熟形態を有するＯ４陽性細胞のパーセンテージを表す（３検体の平均＋ＳＴＤ）。各棒グラフでは、最左の棒は処理なしのものであり、左から２番目の棒は対照ＩｇＧでの対照、次は４７８４での処理、そして最右は４７８５での処理を表す。抗ＬＩＮＧＯ−１抗体はオリゴデンドロサイトである細胞の比率に影響しないが、成熟形態を有するオリゴデンドロサイトの比率を有意に増大させる。＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１、対照ＩｇＧ４  ３２０７の存在下の成熟オリゴデンドロサイトの比率に対するHolm−Sidak比較を伴う一元配置分散分析。
【００６６】
【図６】抗ＬＩＮＧＯ−１抗体は細胞表面ＬＩＮＧＯ−１を下方調節する：Ａ）トランスフェクトされていないＣＨＯ−Ｋ１またはＣＨＯ−Ｋ１−ｈＬＩＮＧＯ−１細胞を１００ｎＭ  ４７８４、４７８５および３２０７と共に３７℃で２４時間インキュベートし、そして抗Ｖ５抗体と共に室温で３０分間さらにインキュベートすることにより細胞表面でＬＩＮＧＯ−１を検出する。細胞を４％ＰＦＡで固定し、ＢＳＡで遮断し、そして結合抗Ｖ５抗体を抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）−ＰＯＤ抱合体を用いて検出し、それをその後１−Step（商標）Turbo ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡキットを用いて展開する。４５０ｎｍでの吸光度は細胞表面でのＬＩＮＧＯ−１の量の測定値と考えられる（３検体の平均＋ＳＴＤ）。トランスフェクトされていないＣＨＯ−Ｋ１細胞に対して非常に低レベルのＶ５抗体結合が観察される。ＣＨＯ−Ｋ１−ｈＬＩＮＧＯ−１細胞を、抗ＬＩＮＧＯ−１抗体を伴うが、対照ＩｇＧ４  ３２０７を伴わないでインキュベートすることにより、結果的に細胞表面でのＬＩＮＧＯ−１の量の有意な低下を招く。＊＊ｐ＜０.０１、対照ＩｇＧ４  ３２０７とのインキュベーションの後の吸光度に対するHolm−Sidak比較を伴う一元配置分散分析。Ｂ）トランスフェクトされていないＣＨＯ−Ｋ１またはＣＨＯ−Ｋ１−ｈＬＩＮＧＯ−１細胞上の細胞表面タンパク質を４℃でビオチン化し、そして細胞を１００ｎＭ  ４７８４、４７８５および３２０７を伴って、または伴わずに３７℃で指示された時間、インキュベートする。インキュベーション期間の終わりに、アガロースビーズに結合させた抗Ｖ５抗体を用いて細胞ライゼートからＬＩＮＧＯ−１を沈殿させ、そしてビオチン化（細胞表面）ＬＩＮＧＯ−１をウェスタンブロット分析により抗ビオチン抗体を用いて検出する。トランスフェクトされていないＣＨＯ−Ｋ１細胞ではビオチン化ＬＩＮＧＯ−１に関するシグナルは検出されない。ＣＨＯ−Ｋ１−ｈＬＩＮＧＯ−１細胞を抗ＬＩＮＧＯ−１抗体と共にインキュベートすることにより、細胞表面のＬＩＮＧＯ−１の分解離率が増大する。
【００６７】
【図７】ＥＬＳＩＡによる抗ＬＩＮＧＯ−１  Ｆａｂの特徴付け：ＥＬＩＳＡ分析に関する値を相対蛍光単位（ＲＦＵ）の平均値として与える。これらのクローンの結合親和性はＦＡＣＳ飽和アッセイにより特徴付けされる。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
本発明はまた哺乳動物神経系、とりわけヒト神経系の軸索再生／可塑性の促進における本発明の結合分子の使用をも提供する。
本発明はまた有効量の本発明の結合分子をかかる処置を必要とする患者に投与することを含む、哺乳動物神経系、とりわけヒト神経系の軸索再生／可塑性を促進する方法をも提供する。
本発明はまた本発明の結合分子および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、哺乳動物神経系、とりわけヒト神経系の軸索再生／可塑性を促進するための医薬組成物をも提供する。
【００６９】
とりわけ本発明の結合分子は、ＣＮＳ傷害の軸索再生および可塑性を促進するのに有用である（傷害なる用語は本出願では、特に機械的もしくは化学的影響により引き起こされるか、または例えばニューロンの変性に至る疾患もしくは障害による傷害、特に例えばアルツハイマー病もしくはパーキンソン病のような神経学的疾患または以下に言及されるような障害もしくは疾患におけるその構造または形態を指す）。故に本発明の分子はとりわけヒト対象のために広い有用性を有する。例えば本発明の結合分子は末梢（ＰＮＳ）および中枢（ＣＮＳ）神経系の種々の疾患の処置において、すなわちさらにとりわけアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、レビー様病理またはその他の一般的な認知症、頭蓋、大脳または脊髄外傷後の疾患および脳卒中のような神経変性疾患において有用である。さらにＬＩＮＧＯ−１がミエリン形成の負のレギュレーターであることを考慮すると、本発明の結合分子は、限定するものではないが多発性硬化症、単相性脱髄、脳脊髄炎、多巣性白質脳症、全脳炎、マルキアファーヴァ・ビニャミ病、橋ミエリン崩壊、副腎白質ジストロフィー、ペリツェウス・メルツバッハー病、海綿状変性、アレキサンダー病、カナヴァン病、異染性白質ジストロフィーおよびクラッベ病を含む脱髄性疾患における軸索再生／可塑性の促進と協調してミエリン再形成を促進するのに有用である。一例では、本発明の結合分子を発現する細胞を脊髄傷害部位に移植して、傷害を受けた部位全体にわたって軸索成長を促すことができる。かかる移植細胞は傷害または外傷後の脊髄機能を回復するための手段を提供するであろう。かかる細胞は嗅神経鞘細胞および胎児神経または組織移植片の様々な系列の幹細胞を含み得る。
【００７０】
加えて本発明の結合分子は一般的な虚血性網膜症、前眼部虚血性視神経症、視神経炎の全形態、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、網膜色素変性症、スタルガルト病、ベスト病の卵黄様網膜変性、レーベル先天黒内障およびその他の遺伝性網膜変性、病的近視、未熟児網膜症、およびレーベル遺伝性視神経症、角膜移植または屈折矯正角膜手術の後遺症、ならびにヘルペス角膜炎を含む網膜または角膜の変性を直接的または間接的に伴い得る眼変性傷害の処置に有用である。
さらに本発明の結合分子は精神医学的症状、とりわけ統合失調症および抑うつの処置に有用である。
【００７１】
これらの適応症のための適切な投薬量はもちろん例えば用いられることになっている本発明の特定の分子、投与の様式ならびに処置される症状の性質および重篤度に依存して異なるであろう。一般的には、投薬量は好ましくは１μｇ／ｋｇ／日から１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であろう。本発明の結合分子は治療薬として病変部またはその近くに都合よくポンプにより投与されるかまたは注射され、例えばそれらをＣＮＳに頭蓋内に、または脊椎に髄腔内に直接病変部に投与できる。しかしながら全身投与はここでは排除されない。本発明の結合分子を単独で、またはその他の薬剤との組み合わせで、または逐次的組み合わせで提供することができる。例えば本発明の結合分子を、限定するものではないが脳卒中または脊髄傷害後のさらなるニューロン損傷および軸索再生の阻止を遮断するための手段としてのコルチコステロイド、ＮＧＦ、ＢＤＮＦのような神経栄養因子またはExelon（商標）もしくはレボドパのような神経変性疾患のためのその他の薬物のような、抗Ｎｏｇｏ−Ａ抗体または抗炎症薬との組み合わせで投与することができる。脳卒中の処置のためのその他の適当な組み合わせパートナーはアルテプラーゼおよびデスモテプラーゼ（ＤＳＰＡ、例えば第ＷＯ９０／０９４３８号に開示される）である。１つの実施態様では本発明は、本発明の結合分子およびデスモテプラーゼを含む組み合わせをとりわけ脳卒中の処置のために、および該組み合わせを含む医薬組成物として提供する。本明細書で使用される際には、２つの薬剤が同時に投与されるか、または薬剤が同時に作用するような様式で独立して投与される場合、２つの薬剤は組み合わせで投与されると考えられる。
【００７２】
コード番号、一般名または商品名により同定される活性成分の構造を標準的な事典「The Merck Index」の最新版から、またはデータベース、例えばPatents International（例えばIMS World Publications）もしくはIMS Healthにより提供されるその他のデータベースから取ることができる。その対応する内容を出典明示により本明細書の一部とする。任意の当業者が活性成分を同定することは十分に可能であり、そしてこれらの参照文献に基づいて、同様にインビトロおよびインビボの双方で標準的な試験モデルにおいて医薬的適応および特性を製造および試験することが可能である。
【００７３】
都合のよい様式で本発明の医薬組成物を製造できる。例えば本発明の分子を含む本発明による組成物は好ましくは凍結乾燥形態で提供される。即時的投与のために、それを適当な水性担体、例えば注射用滅菌水または滅菌緩衝生理学的食塩水に溶解する。
適当な組成物を作り上げるのを助けるために、本発明の結合分子および場合によっては本発明の結合分子の影響を増強する第２の薬物を、混合または併用投与のための説明書と共に同一容器内に別個に包装することができる。最適な第２の薬物候補は前記で提供した。
【００７４】
本発明の結合分子およびＮＧＦのような成長因子の組み合わせの相乗効果をインビボで脊髄傷害モデルにより実証できる。
以下の実施例を参照して本発明はさらに十分に理解されよう。しかしながらそれらは本発明の範囲を限定するとは解釈されるべきではない。
実施例において注目を集めるモノクローナル抗体は抗体４７８４に関して軽鎖の可変部分（配列番号４）および重鎖の可変部分（配列番号５）を含有し、そして４７８５に関して軽鎖の可変部分（配列番号６）および重鎖の可変部分（配列番号７）を含む本発明による結合分子である。
【００７５】
以下の略語を用いる：
ＡＰ                  ヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ
ＣＤＲ                相補性決定領域
ｃＤＮＡ              相補的ＤＮＡ
ＥＬＩＳＡ            酵素結合免疫吸着アッセイ
ＦＡＣＳ              蛍光活性化セルソーティング
ＦＢＳ                ウシ胎仔血清
ＨＣＭＶ              ヒトサイトメガロウイルスプロモーター
ＩｇＧ                免疫グロブリンアイソタイプＧ
ＰＢＳ                リン酸塩緩衝生理食塩水
ＰＣＲ                ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＦＡ                パラホルムアルデヒド
ＰＮＰＰ              リン酸パラニトロフェニル
【実施例１】
【００７６】
全長ラット、カニクイザルまたはヒトＬＩＮＧＯ−１およびヒトＬＩＮＧＯ−２を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞の作成
無作為およびオリゴｄＴプライマーを用いてユニバーサルヒト参照ＲＮＡ（Stratagene）のＲＴ−ＰＣＲによりヒトｃＤＮＡライブラリーを作成する。無作為およびオリゴｄＴプライマーを用いて凍結カニクイザル脳から単離されたポリＡ  ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより、カニクイザル脳ｃＤＮＡライブラリーを作成する。Marathon−readyラット脳ｃＤＮＡライブラリーをClontechから入手する。５’−ＸｂａＩおよび３’−ＸｈｏＩ部位によりフランキングされたヒトＬＩＮＧＯ−１（配列番号２７）、カニクイザルＬＩＮＧＯ−１（配列番号２８）およびラットＬＩＮＧＯ−１（配列番号２９）の成熟配列をコードするｃＤＮＡ（残基３４−６１４）を正方向プライマーＤＭ１４、５’−CTACGTCTAGAACGGGCTGCCCGCCCCGCT−３’（配列番号３０）および逆方向プライマーＤＭ１５、５’−GGTTTCTCGAGTCATATCATCTTCATGTTGAACTTGCGG−３’（配列番号３１）を用いて各々のライブラリーからＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ生成物をＸｂａＩおよびＸｈｏＩで切断し、そしてベクターｐＳｅｃＴａｇ２−Ｖ５（配列番号３２）の各々の部位に挿入して、各々ｈＬＩＮＧＯ−１−ｐＳｅｃＴａｇ２−Ｖ５、ｃｍＬＩＮＧＯ−１−ｐＳｅｃＴａｇ２−Ｖ５およびｒＬＩＮＧＯ−１−ｐＳｅｃＴａｇ２−Ｖ５を作成する。予測されるタンパク質生成物はＮ末端で２アミノ酸残基リンカーを介して１４アミノ酸残基Ｖ５エピトープタグに融合されたＬＩＮＧＯ−１の成熟配列である。５’−ＸｂａＩおよび３’−ＸｈｏＩ部位によりフランキングされたヒトＬＩＮＧＯ−２（配列番号３３）の成熟配列をコードするｃＤＮＡ（残基２６−６０６）を正方向プライマーＤＭ１６、５’−CTACGTCTAGAATTGGCTGCCCCGCTCGCT−３’（配列番号３４）および逆方向プライマーＤＭ１７、５’−GGTTTCTCGAGTCAAATCATTTTCATGTTGAACCTCCTG−３’（配列番号３５）を用いてMarathon−readyヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（Clontech）からＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ生成物をＸｂａＩおよびＸｈｏＩで切断し、そしてベクターｐＳｅｃＴａｇ２−Ｖ５の各々の部位に挿入して、ｈＬＩＮＧＯ−２−ｐＳｅｃＴａｇ２−Ｖ５を作成する。予測されるタンパク質生成物はＮ末端で２アミノ酸残基リンカーを介して１４アミノ酸残基Ｖ５エピトープタグに融合されたＬＩＮＧＯ−２の成熟配列である。lipofectamine−２０００（Invitrogen）を用いて製造者の説明書にしたがって、ｈＬＩＮＧＯ−１−ｐＳｅｃＴａｇ２−Ｖ５、ｃｍＬＩＮＧＯ−１−ｐＳｅｃＴａｇ２−Ｖ５、ｒＬＩＮＧＯ−１−ｐＳｅｃＴａｇ２−Ｖ５およびｈＬＩＮＧＯ−２−ｐＳｅｃＴａｇ２−Ｖ５で各々細胞をトランスフェクトすることにより、ヒトＬＩＮＧＯ−１（ＣＨＯ−Ｋ１−ｈＬＩＮＧＯ−１）、カニクイザルＬＩＮＧＯ−１（ＣＨＯ−Ｋ１−ｃｍＬＩＮＧＯ−１）、ラットＬＩＮＧＯ−１（ＣＨＯ−Ｋ１−ｒＬＩＮＧＯ−１）およびヒトＬＩＮＧＯ−２（ＣＨＯ−Ｋ１−ｈＬＩＮＧＯ−２）を安定して発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を作成する。安定して発現するトランスフェクト体を１ｍｇ／ｍｌゼオシン（Invivogen）で選択し、そして９６ウェルプレートへの連続希釈か、またはクローンリング（clonal rings）の使用かのいずれかにより単一のクローンを単離する。細胞表面での構築物の発現を、抗Ｖ５抗体を用いる免疫蛍光分析により確認する（InvitroGen）。
【実施例２】
【００７７】
ヒトＬＩＮＧＯ−１−ＦｃおよびヒトＬＩＮＧＯ−１ΔＬＲＲ−Ｆｃの作成および発現
ヒトＬＩＮＧＯ−１をコードするＭＧＣ  ｍＲＮＡ（クローンＭＧＣ：１７４２２  ＩＭＡＧＥ：４２１４３４３）をＰＣＲ増幅のための鋳型として使用する。Ｐｗｏ１ポリメラーゼ（Roche Diagnostics）ならびに標的配列の５’末端でＨｉｎｄＩＩＩ制限部位およびKozakコンセンサス配列および３’末端で標的配列の最後のコドンの直後にＸｈｏＩ制限部位を加えられたプライマーで、ヒトＬＩＮＧＯ−１の天然のシグナル配列により先行される細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ａａ１−５５０）をＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲ生成物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、ゲル精製し、そして以前に同一の酵素で消化されたプラスミドｐＲＳ５ａ−ＩｇＧ（配列番号３６）に挿入する。得られた発現クローン（天然リーダー（natleader）−ｈｓＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ／ｐＲＳ５ａ、配列番号３７）における挿入された配列、完全なＦｃおよびフランキング領域の正確さをＤＮＡシークエンシングにより確認する。
【００７８】
同一のＭＧＣクローンをＬＲＲドメインを欠くヒトＬＩＮＧＯ−１（ａａ３４−６５＋ａａ３５４−５５０）に関する発現プラスミドの遺伝子ＳＯＥによる構築のための鋳型として提供する。成熟ＬＩＮＧＯ−１に融合した異種性分泌シグナルをコードする部分配列で５’末端を伸長し、そして３’末端でＣ末端フラグメントの最初の７個のアミノ酸をコードする配列を加えたプライマーでヒトＥＣＤ  ＬＩＮＧＯ−１のＮ末端領域（ａａ３４−６５）をＰＣＲにより増幅する。Ｎ末端フラグメントの最後の７個のアミノ酸をコードする配列で５’末端を伸長し、そして３’末端で標的配列の最後のコドンの直後にＸｈｏＩ部位を加えたプライマーでヒトＥＣＤ  ＬＩＮＧＯ−１のＣ末端領域（ａａ３５４−５５０）をＰＣＲにより増幅する。２つのＰＣＲ生成物をゲル精製し、混合し、そして５’末端でＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、Kozakコンセンサス配列を加え、そして異種性分泌シグナル配列を完成するプライマー、および３’末端で以前にＣ末端フラグメントを増幅するために用いられた外部プライマーを用いる第２のＰＣＲ増幅のための鋳型として提供する。ＰＣＲ生成物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、ゲル精製し、そして以前に同一酵素で消化されたプラスミドｐＲＳ５ａ−ＩｇＧに挿入する。得られた発現クローン（Ｉｇリーダー−ｈｓＬＩＮＧＯ−１−ΔＬＲＲ−Ｆｃ／ｐＲＳ５ａ、配列番号３８）における挿入された配列、完全なＦｃおよびフランキング領域の正確さをＤＮＡシークエンシングにより確認する。
【００７９】
最初の発現評価として双方の構築物を小規模な実験で試験する。ＨＥＫ.ＥＢＮＡ細胞（Invitrogen、以前のカタログ番号Ｒ６２０−０７）をアタッチモード（attached mode）で組織培養フラスコで、２５ｍＭ  Hepes（Gibco／Life Technologies カタログ番号４２４３０−０２５）で緩衝され、そしてさらに１０％ウシ胎仔血清でさらに富化されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中培養し；培養物を加湿雰囲気下３７℃および５％ＣＯ２で維持する。小規模なトランスフェクション実験のために、トランスフェクションの１日前に４×１０５セルをポリ−Ｄ−リジンコーティングした６ウェル（プレート）に播種する。ウェルあたりプラスミドＤＮＡ３μｇおよびLipofectamine２０００試薬（Invitrogenカタログ番号１１６６８−０１９）６μｌを用いて本質的には製造供給元により記載されるようにトランスフェクションを実施する。トランスフェクション後３日に、細胞上澄を収集し、そして細胞不含上澄をタンパク質分析、すなわちプロテインＧカラムの免疫親和性ＨＰＬＣ分析に供する。構築物天然リーダー−ｈｓＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ／ｐＲＳ５ａに関して８ｍｇ／ｌと構築物Ｉｇリーダー−ｈｓＬＩＮＧＯ−１−ΔＬＲＲ−Ｆｃ／ｐＲＳ５ａに関して４０ｍｇ／ｌとの間の範囲で力価を決定する。その後に双方のプラスミドに関して、ＨＥＫ.ＥＢＮＡ懸濁培養物中で大容量規模での一過性のトランスフェクションを可能にするために大規模プラスミド調製物準備する。
規模を拡大した天然リーダー−ｈｓＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃの生成のために、１.４×１０６セル／ｍｌの密度のＨＥＫ.ＥＢＮＡ細胞培養物２.９ｌをＤＮＡ：ＰＥＩ溶液（ＤＮＡ  １μｇ：ＰＥＩ  ２μｇ／ｍｌ）１.１ｌと混合する。４時間インキュベートした後、培養物にＥｘＣｅｌｌ  ＶＰＲＯ培地（ＳＡＦＣ、以前はＪＲＨ、Lenexa, ＫＳ）４ｌを供給する。培養の６日後に細胞培養上澄を収集し、そして１０ｋＤａカットオフの使い捨てHemoflow Ｆ１０ＨＰＳフィルター（Fresenius Medical Care, Germany）を用いてダイアフィルトレーションにより１ｌまで濃縮する。Ｉｇリーダー−ｈｓＬＩＮＧＯ−１−ΔＬＲＲ−Ｆｃタンパク質を作成するために行う第２の関連するタンパク質生成を類似の様式で行う。大規模トランスフェクションに関する詳細、ＤＮＡ：ＰＥＩ比率、細胞密度、供給および収集は前記されたものと全く同一である。
【００８０】
ａ）天然リーダー−ｈｓＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ
濃縮物１ｌ（培養上澄８ｌから）を２０ｍｌプロテインＡセファロースのクロマトグラフィーにより分析する。１００ｍＭ  ＮａＰｉ、ｐＨ７.３のベースライン洗浄の後、結合材料を５０ｍＭクエン酸、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ２.７で溶出し、中和し、そして滅菌ろ過する。溶出された分画さらに濃縮し、そしてＰＢＳ中Superdex ７５でゲルろ過し、１.２ｍｇ／ｍｌの濃度の生成物８.２ｍｇを生じる。
ｂ）Ｉｇリーダー−ｈｓＬＩＮＧＯ−１−ΔＬＲＲ−Ｆｃ
濃縮物１ｌ（培養上澄８ｌから）を２０ｍｌプロテインＡセファロースのクロマトグラフィーにより分析する。１００ｍＭ  ＮａＰｉ、ｐＨ７.３のベースライン洗浄の後、結合材料を５０ｍＭクエン酸、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ２.７で溶出し、中和し、そして滅菌ろ過して、１.５ｍｇ／ｍｌの濃度の生成物５２.５ｍｇを生じる。
精製されたタンパク質を還元／アルキル化およびトリプシン消化の後、Ｎ末端シークエンシングおよびＭＡＬＤＩペプチド質量分析により詳しく特徴付けする。
【実施例３】
【００８１】
ＡＰ−ＬＩＮＧＯ−１結合アッセイ
ＬＩＮＧＯ−１のＮｇＲに対する結合の遮断は神経突起伸長の３つのミエリン関連阻害剤、すなわちＮｏｇｏ−６６、ＭＡＧおよびＯＭｇｐのシグナル発生を防御し、そしてしたがってＣＮＳミエリンの神経突起伸長阻止活性を減弱し、故に軸索再生／可塑性の増大および急性ＣＮＳ傷害後の機能的回復の改善に至ると予期される。抗ＬＩＮＧＯ−１抗体がＬＩＮＧＯ−１のＮｇＲに対する結合を遮断することを実証するために、ヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）−タグ化ラットＬＩＮＧＯ−１外部ドメイン（ＡＰ−ＬＩＮＧＯ−１）の、ＮｇＲを安定して発現するＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ＮｇＲ−ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、Walmsley et. al., J Cell Sci １１７：４５９１−４６０２（２００４））への結合を測定するアッセイを用いることができる。
【００８２】
５’−Ｘｈｏ  Ｉおよび３’−Ｘｂａ  Ｉ部位によりフランキングされたラットＬＩＮＧＯ−１外部ドメイン（残基３４−５３２）の大部分をコードするｃＤＮＡを、正方向プライマーＤＭ２２、５’−GGTTATCTCGAGACCGGCTGCCCGCCCC−３’（配列番号２４）、および逆方向プライマーＤＭ２３、５’−GGCCCTTCTAGATCACTCGCCTGGCTGGTTGGAGATG−３’（配列番号２５）を用いてｒＬＩＮＧＯ−１−ｐＳｅｃＴａｇ２−Ｖ５からＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ生成物をＸｈｏＩおよびＸｂａＩで切断し、そしてベクターＡＰｔａｇ−５−ＮＨＩＳ（配列番号２６）の各々の部位に挿入して、ＡＰｔａｇ−５−ＮＨＩＳ−ｓｏｌｒＬＩＮＧＯ−１を作成する。予測されるタンパク質生成物はＮ末端で３アミノ酸残基リンカーを介してヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼの残基２３−５１１に融合したラットＬＩＮＧＯ−１外部ドメインの大部分である。lipofectamine２０００を用いて製造者の説明書にしたがって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＡＰｔａｇ−５−ＮＨＩＳ−ｓｏｌｒＬＩＮＧＯ−１でトランスフェクトする。トランスフェクションの４時間後にトランスフェクション培地を除去し、そしてフェノールレッド（Invitrogen）を含まないＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉで置き換える。２４時間後に培地を収集し、置き換え、そしてさらに２４時間後に再度収集する。１３０００×ｇで５分間遠心することにより培地を清澄化し、そしてCentriprepフィルター装置（Millipore）を用いて製造者の説明書にしたがって上澄をほぼ１５倍に濃縮する。濃縮された上澄のＡＰ活性を１−Step（商標）ＰＮＰＰ（Pierce）を用いて４０５ｎｍでの経時的な吸光度の変化として測定し、そして以下の等式を用いて濃度に変換する（２００μｌ  ＰＮＰＰ／セルで９６ウェル形式に適用）：
【数１】
0005647414.tif 000002
【００８３】
濃縮された上澄を記載されるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動およびウェスタンブロットに供する（Walmsley et. al., J Cell Sci １１７：４５９１−４６０２（２００４））。ＥＣＬ（商標）システム（GE Healthcare）を用いて０.１％（容量／容量）抗ペンタヒスチジン抗体（Qiagen）、続いて０.０２％（容量／容量）ペルオキシダーゼ抱合抗マウスＩｇＧ抗体（Sigma）でＡＰ−ＬＩＮＧＯ−１を検出する。ＡＰ−ＬＩＮＧＯ−１をおよそ１１０ｋＤａのバンドとして可視化し、その予測される分子量、１１２ｋＤａに類似する。Ｎ末端分解生成物は観察されない。
【００８４】
ＮｇＲ：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を周密度５０％で酵素不含解離バッファー（Invitrogen）で収集してＮｇＲのような細胞表面タンパク質を保存する。１ｎＭ  ＡＰ、１ｎＭ  ＡＰ−ＬＩＮＧＯ−１、または２μＭ抗ＬＩＮＧＯ−１Ｆａｂもしくはニワトリ卵白リゾチームに対する対照Ｆａｂ３２０７の存在下の１ｎＭ  ＡＰ−ＬＩＮＧＯ−１をＯｐｔｉＭＥＭ（Invitrogen）中３０分間プレインキュベートし、そしてその後懸濁液中ＮｇＲ：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞と共に一定の攪拌を行いながら１.５時間インキュベートする。細胞をＨＢＨ（Hanks緩衝生理食塩水中２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７.４／１％ウシ血清アルブミン）で６回洗浄し、そしてＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／５％スクロース中で１５分間固定する。Hanks緩衝生理食塩水中２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７.４中、６５℃で１時間インキュベートすることによる内因性ＡＰ活性の不活化に続いて、１−Step（商標）ＰＮＰＰ（Pierce）と共に製造者の説明書にしたがって３０分間インキュベートした後、細胞結合性ＡＰ活性を４０５ｎｍでの吸光度として定量する。
【００８５】
Ｆａｂを２μＭの濃度で使用してＡＰ−ＬＩＮＧＯ−１を結合性Ｆａｂで飽和し、そしてしたがって結合を阻止するその能力に関して、その親和性の影響を最小にする。このための理由は、その結合部位の位置よりもむしろその低親和性のために結合を阻止し損ねたＦａｂを時期尚早にさらなる実験から破棄する可能性を排除するためであるが、かかるＦａｂの親和性が親和性成熟化およびＩｇＧ４転換により後の段階で増大し得るためである。１ｎＭ  ＡＰ−ＬＩＮＧＯ−１を対照Ｆａｂ３２０７または抗ＬＩＮＧＯ−１  Ｆａｂ４７８４および４７８５のいずれかとともにプレインキュベートし、そして次に懸濁液中Ｆａｂの存在下、ＮｇＲ：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞への結合を可能にする（図１）。抗ＬＩＮＧＯ−１  Ｆａｂの存在下、特異的ＡＰ−ＬＩＮＧＯ−１結合の阻止パーセンテージをＦａｂ３２０７に関して正規化する。４７８４および４７８５は、細胞に対するＡＰ−ＬＩＮＧＯ−１結合を有意に阻止する（p＜０.０１、一元配置分散分析、対照Ｆａｂ３２０７の存在下、ＡＰ−ＬＩＮＧＯ−１の特異的結合に対するHolm−Sidak比較）。
【００８６】
ＮｇＲに対するＬＩＮＧＯ−１の結合の遮断は、ミエリン関連阻害剤Ｎｏｇｏ−６６、ＭＡＧおよびＯＭｇｐのシグナル発生を防御してＣＮＳミエリンの神経突起伸長阻止活性の低下に至ると予測される。その点で、４７８４および４７８５Ｆａｂは最終的なＩｇＧ４形式（実施例８参照）に転換され、そしてラット成体脊髄ミエリン上で成長させた出生後７日のラット小脳顆粒ニューロンからの神経突起伸長の阻止を減弱するその能力に関して評価される。
【実施例４】
【００８７】
神経突起伸長阻止アッセイ
インビボ軸索再生／可塑性に及ぼす抗ＬＩＮＧＯ−１抗体の影響を予測する最も関連性のあるインビトロアッセイは、ＣＮＳミエリンの神経突起伸長阻止活性を減弱するその能力である。このアッセイでは、成体ラットから抽出された全脊髄ミエリンでコーティングされたウェル中で出生後７日のラット小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）を成長させ、そして神経突起伸長を自動ArrayScan（登録商標）ＨＣＳリーダー（Cellomics）により定量する。
抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４抗体４７８４および４７８５の脱抑制活性を該神経突起伸長アッセイにおいて評価する（図２）。
【００８８】
ラット成体からの新たなラット脊髄組織を３容量（重量／容量）抽出バッファー（６０ｍＭ  Chaps、２０ｍＭ  Tris  ｐＨ８.０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤カクテル）中でホモジナイズし、４℃で３０分間インキュベートし、そして１７００００×ｇで、４℃で３０分間遠心することにより清澄化する。９６ウェルプレートの各ウェルをＭｅＯＨ中ニトロセルロース５μｌ（ＭｅＯＨ１２ｍｌ中５ｃｍ２ニトロセルロース）でコーティングし、空気乾燥し、そして５μｇ／ｍｌポリ−Ｄ−リジン１００μｌで、３７℃で４時間インキュベートすることによりコーティングする。水で３回洗浄した後、プレートを１時間空気乾燥し、そして次に３７℃で一晩インキュベートすることにより、６０μｇ／ｃｍ２脊髄抽出物でコーティングする。以前に記載されたように（Schweigreiter et al., ２００４）出生後７日のラット小脳組織のトリプシン分離物からＣＧＮ細胞を新たに精製する。ＬＩＮＧＯ−１を検出するために、２μｇ／ｍｌ（または１３.３ｎＭ）抗ＬＩＮＧＯ−１ポリクローナル抗体（Upstate）、続いて０.０２％（容量／容量）ペルオキシダーゼ抱合抗ウサギＩｇＧ抗体（Sigma）を用いてＶ５−タグ化ラットＬＩＮＧＯ−１を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞またはＰ７  ＣＧＮ細胞からのライゼートに関してウェスタンブロット分析を実施する。脊髄ミエリンでコーティングされていないかまたはコーティングされたウェル上で、ＣＧＮ細胞（３５０００セル／ウェル）を３７℃で３０分間インキュベートした後、０−１００ｎＭ抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４抗体または対照３２０７  ＩｇＧ４抗体のいずれかを添加する。３７℃で８−１６時間インキュベートした後、細胞を４％ＰＦＡで固定し、そして核の可視化のためにHoechst ３３４２（Invitrogen）、および抗β−チューブリンＩＩＩ抗体（R&D Systems）、続いてAlexa Fluor ５４６抱合抗マウスＩｇＧ抗体（Invitrogen）で染色してニューロンを特異的に可視化する。神経突起伸長のパラメーターをArrayScan（登録商標）ＨＣＳリーダー（Cellomics）を用いて決定する。ArrayScan（登録商標）ＩＩは９６ウェルマイクロタイタープレート内の細胞のフィールドを自動的に位置決定し、焦点を合わせ、そして暴露する。ArrayScan（登録商標）は高解像度光学系、対応したシングルバンド励起フィルターを伴う多帯域発光フィルター（ＸＦ１００）、フレーム取り込み装置を有するＣＣＤカメラ、および専用アプリケーションソフトウェアからなる。このアッセイではExtended Neurite Outgrowth Bioapplicationを用いる。励起フィルターホイールおよび多帯域発光フィルターを用いることにより、同一細胞における２つのフルオロフォアからの蛍光の多チャンネル撮像が可能になる。Hoechst ３３３４２標識された核の帯域画像を獲得して別々の細胞を同定し、そして次にAlexa Fluor ４８８の帯域画像を獲得して抗チューブリン抗体で標識された細胞の広がりを同定する（Alexa Fluor ４８８に二次抱合されたものを用いる）。細胞内の不適切な物体を分析から自動的に排除して、Hoechstおよびベータ−チューブリンを重複する細胞体のみを分析する。プレートの各ウェルで５個の別々の３５０μｍ２フィールドに関して二重発光画像を獲得する。１０倍対物を用いて、これにより結果的にウェルあたり４００−５００セルが分析される。次いでExtended Neurite Outgrowth Bioapplicationにより細胞あたりの神経突起の神経突起長数、細胞体面積、ならびに分岐および交差点を含む単一の細胞に関するニューロン形態のいくつかの定量的測定が報告される。ニューロンあたりの平均神経突起長（μｍ）を１０回反復でウェルあたり５００ニューロンに関して計算する。
【００８９】
前記の神経突起伸長アッセイでは、抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４抗体４７８４および４７８５は１および１０ｎＭで脱抑制性であるが、一方リゾチームに対する対照ＩｇＧ４抗体は双方の濃度で脱抑制を示さない（図２）。双方の濃度での４７８４および４７８５存在下で脊髄ミエリン上のニューロンあたりの神経突起の平均の長さは抗体不在下のものよりも統計的に長い。抗ＬＩＮＧＯ−１抗体４７８４および４７８５と比較して、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２でより大きなレベルの脱抑制が達成されることが予期されるが、この化合物がＮｇＲ受容体複合体を介してシグナル発生するもの以外のさらなるミエリン関連神経突起伸長阻害剤のシグナル発生経路を阻止するためである。
【００９０】
前記の結果を確認するために、神経突起伸長アッセイを繰り返す（図３）。再度抗ＬＩＮＧＯ−１抗体４７８４および４７８５が１ｎＭおよび１０ｎＭで脱抑性であるが、一方リゾチームに対する対照ＩｇＧ４抗体は双方の濃度で脱抑制を示さない。双方の濃度で４７８４および４７８５存在下で脊髄ミエリン上のニューロンあたりの神経突起の平均の長さは抗体不在下のものよりも統計的に長い。
【００９１】
抗ＬＩＮＧＯ−１抗体４７８４および４７８５の効力をさらに確立するために、ｎＭ以下の濃度の抗体の神経突起伸長阻止に及ぼす影響を評価する（図４）。４７８４および４７８５により０.１ｎＭほどの低濃度で脊髄ミエリンの有意な脱抑制（各々３８−５１％および５１−５７％）が示されるが、一方対照抗リゾチーム抗体は影響を及ぼさない。予期されるように、再度ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２により、抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４抗体よりも高度な脱抑制（６５−７４％）が示される。
【実施例５】
【００９２】
一次オリゴデンドロサイト分化アッセイ
遺伝的手段による、または受容体アンタゴニストでの処理によるＬＩＮＧＯ−１機能の遮断により、精製されたＯＰＣ培養物から生じる成熟オリゴデンドロサイトの比率が増大することが報告されている（Mi et al., Nat Neurosci ８：７４５−７５１（２００５））。抗ＬＩＮＧＯ−１抗体がＯＰＣ培養物におけるＬＩＮＧＯ−１機能を遮断し、そしてオリゴデンドロサイト成熟化を促進する能力を評価するために、新たに単離されたラットＯＰＣをＤＭＥＭ／ＣＮＴＦ／Ｔ３培地中４７８４、４７８５または対照ＩｇＧ４  ３２０７と共に３日間インキュベートし、続いて抗Ｏ４抗体で染色して未成熟および成熟双方のオリゴデンドロサイトを標識する（図５）。オリゴデンドロサイト成熟の程度を、成熟形態を呈するＯ４陽性細胞の比率として測定する。
【００９３】
ＯＰＣの富化集団をＯＦＡ  Ｐ３ラットから単離する。簡単には、脳を切開し、そして終脳を０.１５％ＭｇＳＯ４含有氷冷Hankバッファー生理食塩水（ＨＢＳＳ、Invitrogen）中に置く。組織を１：１  ＨＢＢＳ／トリプシン−ＥＤＴＡ（Invitrogen）および１００μｇ／ｍｌ  ＤＮＡｓｅ  Ｉ（Roche）と共に３７℃で１０分間インキュベートし、そしてＦＣＳ（Invitrogen）を最終濃度１０％で添加してトリプシンを不活化する。組織懸濁液を８９０ｒｐｍで１０分間遠心し、そしてペレットを１０％ウマ血清（Invitrogen）を含むBasal Medium Eagle（BME、Invitrogen）に再懸濁する。懸濁液を、４０μｍセルストレーナー（BD Falcon）を通してろ過し、そして細胞をポリ−Ｄ−リジンプレコーティングされた８０ｃｍ２組織培養フラスコ（BD Falcon）にフラスコあたり脳１個で置く。細胞をＢＭＥ／１０％ウマ血清中３７℃で１１日間培養する。５ｍＭ  Ｌ−ロイシン−メチルエステルを添加することにより小グリア細胞を死滅させ、そしてフラスコを１４０ｒｐｍで２時間振盪することにより攪拌する。フラスコを２００ｒｐｍで、３７℃で一晩振盪することによりＯＰＣを収集し、そして１０ｃｍ細菌培養皿上で３７℃で２時間予め付着させることにより、上澄に残る任意のアストロサイトをＯＰＣからさらに分離する。非接着細胞を集め、８９０ｒｐｍで１０分間遠心し、そしておよそ３×１０４セル／ウェルでポリ−Ｄ−リジンコーティングされた８ウェルチャンバースライド（BD Falcon）に置く。１０ｎｇ／ｍｌ  Ciliary Neurotrophic Factor（R&D Systems）および１５ｎＭ  トリヨードチロニン（Sigma）を含有するＤＭＥＭ（Invitrogen）からなるＤＭＥＭ／Ｔ３／ＣＮＴＦ培地中、または１０μｇ／ｍｌ  トランスフェリン（Sigma）、１０μｇ／ｍｌインスリン（Sigma）、１００μＭプトレシン（Sigma）、２００ｎＭプロゲステロン（Sigma）、５２０ｎＭチロキシン（Sigma）、５００ｐＭトリヨードチロニン（Sigma）、２２０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム（Sigma）、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Sigma）および１％ＨＳ（Invitrogen）を含有するＤＭＥＭ（Invitrogen）からなるＳＡＴＯ培地中のいずれかで３日間培養物を維持する。オリゴデンドロサイト系列に関して培養物の純度を評価するために、抗Ｏ４抗体で染色された細胞のパーセンテージをＳＡＴＯ培地中７日の培養の後に定量する。典型的には細胞の８０−９５％が抗Ｏ４抗体で染色され、それは培養物中の細胞の大部分がオリゴデンドロサイト系列であることを実証している。
【００９４】
オリゴデンドロサイト形態に基づいてオリゴデンドロサイト成熟化を評価するために、新たに単離されたＯＰＣ培養物をＤＭＥＭ／Ｔ３／ＣＮＴＦ培地中、１００ｎＭ  ４７８４、４７８５または対照ＩｇＧ４  ３２０７の不在下または存在下で３日間インキュベートし、続いて抗Ｏ４抗体で染色して未成熟および成熟の双方のオリゴデンドロサイトを標識し、そしてＤＡＰＩで細胞核を標識する。明確に定義された短い突起を有するＯ４陽性細胞は未成熟オリゴデンドロサイトを表すが、一方ミエリンシート様構造を伴い、伸長し、そして高度に分枝した突起を担持するＯ４陽性細胞は成熟オリゴデンドロサイトを表すと考えられる。成熟形態を有するＯ４陽性細胞の比率を処理あたり３検体ずつ、ほぼ３００−１３００セルに関して定量し、そして対照ＩｇＧ４  ３２０７の存在下の成熟オリゴデンドロサイトの比率に対するHolm−Sidak比較を伴う一元配置分散分析を用いて有意性を決定する。培養物中の全（未成熟および成熟）オリゴデンドロサイトの比率に及ぼす抗体処理の影響を評価するために、Ｏ４染色に関連するＤＡＰＩ核の比率を定量する。
【００９５】
３つの独立した実験では、抗ＬＩＮＧＯ−１抗体４７８４および４７８５での処理は、広い面積にわたって伸長する高度に分枝した突起およびミエリンシート様構造を担持する細胞により表されるような成熟形態のオリゴデンドロサイトの比率を有意に増大させる（図５）。対照ＩｇＧ４抗体３２０７での処理は培養物中の成熟オリゴデンドロサイトの比率に影響を及ぼさない。Ｏ４染色に関連するＤＡＰＩ染色された核の比率は全処理に関して類似し、抗ＬＩＮＧＯ−１抗体が未成熟および成熟の双方のオリゴデンドロサイトに対応する細胞の比率に影響を及ぼさないことが実証される。
【００９６】
抗ＬＩＮＧＯ−１抗体処理は全オリゴデンドロサイトの比率に影響を及ぼさないが、成熟オリゴデンドロサイトの比率の増大は、ＯＰＣの未成熟オリゴデンドロサイトへの分化の率における増大よりもむしろ未成熟オリゴデンドロサイトの成熟オリゴデンドロサイトへの分化の率の増大のために生じる可能性が最も高い。
【実施例６】
【００９７】
細胞表面ＬＩＮＧＯ−１の抗ＬＩＮＧＯ−１抗体媒介の下方調節
多価抗体の細胞表面標的に対する結合は抗体：標的複合体の内部移行およびその後のエンドサイトーシス経路内での標的の分解に至り得る（Weinmann et al., Mol Cell Neurosci ３２：１６１−１７３（２００６））。
抗ＬＩＮＧＯ−１抗体の細胞表面ＬＩＮＧＯ−１の量に及ぼす影響を決定するために、トランスフェクトされていないＣＨＯ−Ｋ１またはＣＨＯ−Ｋ１−ｈＬＩＮＧＯ−１細胞（実施例１参照）を１００ｎＭ  ４７８４、４７８５または３２０７と共に３７℃で２４時間インキュベートし、そしてその後細胞表面ＬＩＮＧＯ−１を抗Ｖ５抗体、続いて１−Step（商標）Turbo ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡキット（Pierce）で展開される抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）−ＰＯＤ抱合体で検出する（図６Ａ）。
【００９８】
ＣＨＯ−Ｋ１−ｈＬＩＮＧＯ−１細胞における細胞表面ＬＩＮＧＯ−１の量は、抗ＬＩＮＧＯ−１抗体４７８４および４７８５を伴う２４時間のインキュベーションの後に有意に低下するが、一方対照ＩｇＧ４  ３２０７を伴うインキュベーションは影響を及ぼさない。加えて４７８５でのインキュベーションにより細胞表面ＬＩＮＧＯ−１は４７８４よりも大きい程度まで低下する。
【００９９】
抗ＬＩＮＧＯ−１抗体の細胞表面ＬＩＮＧＯ−１の分解に及ぼす影響を評価するために、トランスフェクトされていないＣＨＯ−Ｋ１またはＣＨＯ−Ｋ１−ｈＬＩＮＧＯ−１細胞上の細胞表面タンパク質を記載されるように４℃でビオチン化し（Walmsley et al., J Cell Sci １１７：４５９１−４６０２（２００４））、そして細胞を３７℃で１８０分の期間にわたって種々の時間に１００ｎＭ  ４７８４、４７８５または３２０７を伴って、または伴わずにインキュベートする（図６Ｂ）。インキュベーション期間の終わりにアガロースビーズに結合させた抗Ｖ５抗体を用いて細胞ライゼートからＬＩＮＧＯ−１を免疫沈殿し、そして沈殿物中のビオチン化ＬＩＮＧＯ−１をウェスタンブロット分析により抗ビオチン抗体（Sigma）を用いて検出する。
【０１００】
ビオチン化（およびしたがって細胞表面）ＬＩＮＧＯ−１に対応するバンドの強度は、抗体を伴わずに、または対照ＩｇＧ４  ３２０７と共にインキュベートされた細胞においてよりも、抗ＬＩＮＧＯ−１抗体４７８４および４７８５と共にインキュベートされたＣＨＯ−Ｋ１−ｈＬＩＮＧＯ−１細胞において、より急速に減少する。加えて４７８５とのインキュベーションにより細胞表面ＬＩＮＧＯ−１の分解の率は４７８４よりも大きい程度まで増大する。
【０１０１】
これらの結果により累積的に、抗ＬＩＮＧＯ−１抗体４７８４および４７８５が、最も可能性が高いのは内部移行およびタンパク質の分解を増強することにより、細胞表面でＬＩＮＧＯ−１を有意に下方調節することが示される。この特性はＬＩＮＧＯ−１機能の遮断におけるこれらの抗体の効率に寄与すると予期される。
【実施例７】
【０１０２】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびＦＡＣＳ技術
ヒト組換えＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ融合タンパク質を、直接固定されたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体を介するＦｃ部分の捕捉により間接的にMaxisorpプレート９６または３８４ウェルに室温で１時間固定する（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌでコーティングされた１００μｌまたは２０μｌ）。
ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの抗原２０μｌのコーティングの後、ウェルをＰＢＳ／０.０５％Tween（ＰＢＳ−Ｔ）／５％粉乳で、室温で１時間遮断する。ウェルをＰＢＳ−Ｔ  ＢＥＬ抽出物で洗浄した後、精製されたＦａｂまたは対照ＩｇＧをＰＢＳで希釈し、ウェルに加え、そして室温で１時間インキュベートする。一次抗体を検出するために、以下の二次抗体を適用する：アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）抱合AffiniPureヤギＦ（ａｂ’）２フラグメント抗ヒトＩｇＧまたは抗マウスＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch）。ＡＰ抱合体の検出のためにAttoPhos（Roche）のような蛍光発生基質を製造者の説明書にしたがって使用する。全インキュベーション工程の間に、マイクロタイタープレートのウェルをＰＢＳ−Ｔで５回、および二次抗体との最終インキュベーションの後に５回洗浄する。TECAN Spectrafluorプレートリーダーで蛍光を測定する。
【０１０３】
トランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞表面上に発現されたＬＩＮＧＯ−１に結合する抗体のＦＡＣＳ分析
丸底９６ウェルマイクロタイタープレート（NUNC（商標）、Wiesbaden, Germany）中ウェルあたり２×１０５セルで全染色を実施する。各々の細胞系の細胞をＰＢＳ／３％ＦＣＳ／０.０２％ＮａＮ３（ＦＡＣＳバッファー）に再懸濁し、そしてａ）周辺質抽出物もしくはＢＥＬライゼートからの抗体またはｂ）精製されたＦａｂフラグメントまたはｃ）ＦＡＣＳバッファーで希釈された、精製されたＩｇＧと混合し、そして４℃で３０−６０分間インキュベートする。次いで細胞をＦＡＣＳバッファー／ウェル１５０μｌで１回洗浄し、そしてＦＡＣＳバッファー中１：２００で希釈されている、フィコエリスリン標識された二次抗体（Ｒ−ＰＥ抱合されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch）１００μｌに取る。４℃で３０−６０分間インキュベートした後、細胞をＦＡＣＳバッファーで１回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー１００μｌに再懸濁し、そしてＬＩＮＧＯ−１特異的抗体の結合をＦＡＣＳCalibur（商標）またはFACSArray（商標）（Becton Dickinson）においてＦＬ２蛍光強度により測定する。
【０１０４】
ＬＩＮＧＯ−１特異的抗体の同定のために、ＣＨＯ−Ｋ１−ｃｍＬＩＮＧＯ−１またはＣＨＯ−Ｋ１−ｒＬＩＮＧＯ−１を用いて並行して染色を行う。トランスフェクトされていないＣＨＯ−Ｋ１細胞をさらなる対照として提供する。カニクイザルおよびラットＬＩＮＧＯ−１発現細胞は、これらの種オルソログがヒトＬＩＮＧＯ−１タンパク質と数個のアミノ酸しか異ならないので、スクリーニングのために選択される。これらのクローンのみが、トランスフェクトされていないＣＨＯ−Ｋ１細胞において陰性であり、そしてＬＩＮＧＯ−１発現細胞系においてバックグラウンドを超えて≧５倍であるＬＩＮＧＯ−１特異的であると判断される。ヒトＬＩＮＧＯ−１およびその他のオルソログ（カニクイザルＬＩＮＧＯ−１、ラットＬＩＮＧＯ−１）に対する、およびヒトＬＩＮＧＯ−２パラログに対する交差反応性を逐次的に試験する。
【０１０５】
配列分析の後、ＦＡＣＳ分析で細胞表面に発現されたヒトＬＩＮＧＯ−１に対して強力な結合を示す３１個の独特なクローンが同定される。１２個の結合剤はＥＬＩＳＡにおいて捕捉されたヒトＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃに対する強力な結合を示し（シグナル：ノイズ比は１０：１より大きい）、そして７個はＥＬＩＳＡにおいて中程度の結合を示す（シグナル：ノイズ比は５：１より大きい）。結合剤の４個はＥＬＩＳＡにおいて捕捉されたヒトＮｇＲ−Ｆｃ融合タンパク質（R&D Systems）に対する強力な結合を示し、そして中断される。結合剤の別の３個はＬＩＮＧＯ−１の３つの種の全てと交差反応せず、そして中断される。ヒト／カニクイザル／ラットＬＩＮＧＯ−１と交差反応するが、ヒトＮｇＲ−Ｆｃとは交差反応しない残りの２４個のクローンを発現させ、精製し、そしてＬＩＮＧＯ−１のＮｇＲに対する結合を有意に阻止する能力に関して試験し（図１参照）、そしてインビトロで脊髄ミエリンの神経突起伸長阻止活性を脱抑制し（図２−４参照）、さらなる分析のためにＦａｂ４７８４および４７８５の選択に至る。ＥＬＩＳＡでは、４７８４および４７８５は捕捉されたヒトＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃに結合するが、無関係のＦｃ対照と比較して、ヒトＬＩＮＧＯ−１−ΔＬＲＲ−ＦｃまたはヒトＮｇＲ−Ｆｃに対する結合は観察されない（表１および図７参照）。これは４７８４および４７８５がＬＩＮＧＯ−１のＬＲＲ領域（残基６６−３５３）内にあるエピトープを有することを示している。
【０１０６】
表１：ＥＬＩＳＡによる抗ＬＩＮＧＯ−１  Ｆａｂの特徴付け
【表１】
0005647414.tif 000003
ＥＬＩＳＡ分析に関する値は相対蛍光単位の平均値として与えられる。
【０１０７】
ＦＡＣＳ飽和分析を用いる選択された抗ＬＩＮＧＯ−１  Ｆａｂの親和性決定
抗ＬＩＮＧＯ−１特異的抗体の細胞基盤の親和性をＦＡＣＳ飽和結合実験により決定する。染色するために試料中に存在する抗原の濃度は見かけのＫＤ値に影響するので、ＦＡＣＳ飽和結合実験における抗原濃度を低下させるために２×１０５セル／ウェルと対比して１.２５×１０４セル／ウェルのみを用いる。その他の点は前記されたＦＡＣＳ染色手順と同一に染色手順を行う。
【０１０８】
詳細には、ＣＨＯ−Ｋ１−ｈＬＩＮＧＯ−１、ＣＨＯ−Ｋ１−ｃｍＬＩＮＧＯ−１またはＣＨＯ−Ｋ１−ｒＬＩＮＧＯ−１をベルセンにより培養フラスコから剥がし、ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、そしてＦＡＣＳバッファーに再懸濁する。精製された抗ＬＩＮＧＯ−１  ＦａｂをＦＡＣＳバッファーで連続希釈し、そして丸底９６ウェルマイクロタイタープレート（NUNC（商標）、Wiesbaden, Germany）に広げる。各濃度に関して、２検体ずつのウェルを１.２５×１０４セルと共に全容量１００μｌで、氷上で３０−６０分間インキュベートする。ＦＡＣＳバッファー１５０μｌを適用し、そして４００×ｇで５分間遠心することによる洗浄工程の後、細胞ペレットをフィコエリスリン標識二次抗体（Ｒ−ＰＥ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch）１００μｌに再懸濁し、それをＦＡＣＳバッファーで１：２００に希釈する。４℃で３０−６０分間インキュベートした後、細胞をＦＡＣＳバッファーで１回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー１００μｌに再懸濁し、そしてＬＩＮＧＯ−１特異的抗体の結合をFACSArray（商標）（Becton Dickinson）において細胞のＦＬ２蛍光強度により測定する。見かけのＫＤ値／ＥＣ５０値をGraphPad Prism ｖ３.０３ソフトウェアまたはGraphPad Prism ｖ４.０３を用いて飽和結合曲線から決定し、非線形回帰曲線フィットに適用する。
【０１０９】
このアッセイを用いて以下の見かけのＫＤ値を決定することができる（表２）。Ｆａｂ形式では、クローン４７８４はヒトＬＩＮＧＯ−１、カニクイザルＬＩＮＧＯ−１およびラットＬＩＮＧＯ−１に対してかなり弱い親和性を有する（各々１４.０７ｎＭ、２７.１１および２４.０３ｎＭ）。しかしながらクローン４７８４はＦａｂ形式でヒトＬＩＮＧＯ−２に結合しない。Ｆａｂ形式では、クローン４７８５はヒトＬＩＮＧＯ−１、カニクイザルＬＩＮＧＯ−１およびラットＬＩＮＧＯ−１に対してナノモル以下の結合親和性（すなわち見かけのＫＤ値は１×１０−９Ｍ未満である）を示す。クローン４７８５はＦａｂ形式で低ナノモルからナノモル以下の親和性でヒトＬＩＮＧＯ−２に対して交差反応性を示す。ＬＩＮＧＯ−２機能および分布は依然未知であるので、ＬＩＮＧＯ−２に対する交差反応性の結果は記載している時点で評価できない。しかしながら有利な影響は排除できない。
【０１１０】
表２：ＣＨＯ−Ｋ１細胞により発現されたＬＩＮＧＯ−１またはＬＩＮＧＯ−２抗ＬＩＮＧＯ−１  Ｆａｂに対する見かけのＫＤ値
【表２】
0005647414.tif 000004
与えられた値は見かけのＫＤ値の平均値（ｎＭ）である。ｎｂは結合しない。
【実施例８】
【０１１１】
HuCAL（登録商標）のＩｇＧ４クローニング、発現および精製
ＩｇＧ形式への転換
全長免疫グロブリン（Ｉｇ）を発現するために、重（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインフラグメントをpMORPH（登録商標）Ｘ９  ＭＨ（配列番号３９）Ｆａｂ発現ベクターからヒトＩｇＧ４のためのpMORPH（登録商標）  ｈ  Ｉｇ（配列番号４０−４２）またはpMORPH（登録商標）２  ｈ  Ｉｇ（配列番号４３−４５）ベクターシリーズのいずれかにサブクローニングする。
【０１１２】
制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＭｆｅＩおよびＢｌｐＩを用いてＶＨドメインフラグメントのpMORPH（登録商標）  ｈ  ＩｇＧ４（配列番号４０）にサブクローニングする：ＥｃｏＲＩ／ＢｌｐＩ消化および６４００ｂｐフラグメントの抽出によりベクター骨格を作成するが、一方ＭｆｅＩおよびＢｌｐＩでの消化およびその後の精製によりＶＨフラグメント（３５０ｂｐ）を生成する。ベクターおよびインサートを、各々ＥｃｏＲＩおよびＭｆｅＩ消化により作成された適合するオーバーハングを介して、およびＢｌｐＩ部位を介してライゲートする。それによりＥｃｏＲＩおよびＭｆｅＩ制限部位の双方が破壊される。
【０１１３】
制限酵素ＭｆｅＩおよびＢｌｐＩを用いて、ＶＨドメインフラグメントをpMORPH（登録商標）２  ｈ  ＩｇＧ４（配列番号４３）にサブクローニングする。このＩｇＧベクターの新たな作成では、その他の修飾時にＥｃｏＲＩ部位（それは適合するオーバーハングを介するサブクローニングのみを可能にする）はＭｆｅＩ部位により置き換えられ、故にベクターおよびインサートの双方のＭｆｅＩ／ＢｌｐＩ消化が可能になる。
ＶＬドメインフラグメントのpMORPH（登録商標）  h  Ｉｇκ（配列番号４２）およびpMORPH（登録商標）２  ｈ  Ｉｇκ（配列番号４５）へのサブクローニングをＥｃｏＲＶおよびＢｓｉＷＩ部位を介して実施するが、一方pMORPH（登録商標）  ｈ  Ｉｇλ（配列番号４１）およびpMORPH（登録商標）２  ｈ  Ｉｇλ２（配列番号４３）へのサブクローニングをＥｃｏＲＶおよびＨｐａＩを用いて行う。
【０１１４】
ヒトＩｇＧの一過性の発現および精製
ＨＥＫ２９３細胞を等モル量のＩｇＧ重および軽鎖発現ベクターでトランスフェクトする。トランスフェクション後４または５日に、細胞培養上澄を収集する。上澄のｐＨを８.０に調整し、そして滅菌ろ過した後、溶液を標準的なプロテインＡカラムクロマトグラフィー（Poros ２０Ａ、PE Biosystems）に供する。
【実施例９】
【０１１５】
ＦＡＣＳ飽和分析を用いる選択された抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４の親和性決定
抗ＬＩＮＧＯ−１特異的抗体の細胞基盤の親和性をＦＡＣＳ飽和結合実験により決定する。見かけのＫＤ値の決定は、抗ＬＩＮＧＯ−１Ｆａｂ抗体を用いて前記された手順と同一に実施する。
詳細には、ＣＨＯ−Ｋ１−ｈＬＩＮＧＯ−１、ＣＨＯ−Ｋ１−ｃｍＬＩＮＧＯ−１またはＣＨＯ−Ｋ１−ｒＬＩＮＧＯ−１をベルセンにより培養フラスコから剥がし、ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、そしてＦＡＣＳバッファーに再懸濁する。精製された抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４をＦＡＣＳバッファーで連続希釈し、そして丸底９６ウェルマイクロタイタープレート（NUNC（商標）、Wiesbaden, Germany）に広げる。各濃度に関して、２検体ずつのウェルを１.２５×１０４セルと共に全容量１００μｌで、氷上で３０−６０分間インキュベートする。ＦＡＣＳバッファー１５０μｌを適用し、そして４００×ｇで５分間遠心することによる洗浄工程の後、細胞ペレットをフィコエリスリン標識二次抗体（Ｒ−ＰＥ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch）１００μｌに再懸濁し、それをＦＡＣＳバッファーで１：２００に希釈する。４℃で３０−６０分間インキュベートした後、細胞をＦＡＣＳバッファーで１回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー１００μｌに再懸濁し、そしてＬＩＮＧＯ−１特異的抗体の結合をFACSArray（商標）（Becton Dickinson）において細胞のＦＬ２蛍光強度により測定する。見かけのＫＤ値／ＥＣ５０値をGraphPad Prism ｖ３.０３ソフトウェアまたはGraphPad Prism ｖ４.０３を用いて飽和結合曲線から決定し、非線形回帰曲線フィットに適用する。このアッセイを用いて以下の見かけのＫＤ値を決定することができる（表３）。
【０１１６】
pMORPH（登録商標）２  ｈ  Ｉｇベクターシリーズを用いて生成された４７８４および４７８５  ＩｇＧ４抗体の親和性を表３に示す。ＩｇＧ４形式の４７８４および４７８５はヒト、カニクイザルおよびラットＬＩＮＧＯ−１に対して明らかに１ｎＭを下まわる見かけのＫＤ値を有する。４７８４は４７８５よりもヒトＬＩＮＧＯ−２に対してはるかに低い交差反応を有する。
【０１１７】
表３：ＣＨＯ−Ｋ１細胞により発現されたＬＩＮＧＯ−１またはＬＩＮＧＯ−２に対する抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４の見かけのＫＤ値
【表３】
0005647414.tif 000005
与えられた値は見かけのＫＤ値の平均値（ｎＭ）である。
【実施例１０】
【０１１８】
ＦＡＣＳ分析を用いる選択された抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４のヒトＬＩＮＧＯ−１に対する結合に及ぼすヒト脳脊髄液の影響
抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４のヒトＬＩＮＧＯ−１に対する結合に及ぼすヒト脳脊髄液の影響をＦＡＣＳ飽和結合実験により試験する。４７８４および４７８５の連続希釈物を調製する。ＣＨＯ−Ｋ１−ｈＬＩＮＧＯ−１に対する結合を５０％ヒト脳脊髄液の存在下で試験する。前記されたＦＡＣＳ染色にしたがって細胞をヒトＣＳＦの存在下、これらのＩｇＧ４抗体で染色する。
【０１１９】
詳細には、ＣＨＯ−Ｋ１−ｈＬＩＮＧＯ−１をベルセンにより培養フラスコから剥がし、ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、そしてＦＡＣＳバッファーに再懸濁する。精製された抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４をＦＡＣＳバッファー＋５０％ヒト血清で連続希釈し、そして４℃で６０分間インキュベートする。対照としてＩｇＧ４形式の候補結合剤の連続希釈物をＦＡＣＳバッファー中、ヒト脳脊髄液のタンパク質含量に類似する２.６％ＢＳＡと共に４℃で６０分間インキュベートする。インキュベーションの後、連続希釈物を丸底９６ウェルマイクロタイタープレート（NUNC（商標）、Wiesbaden, Germany）に広げる。各濃度に関して、２検体ずつのウェルを１.２５×１０４セルと共に全容量１００μｌで、氷上で３０−６０分間インキュベートする。ＦＡＣＳバッファー１５０μｌを適用し、そして４００×ｇで５分間遠心することによる３回の洗浄工程の後、細胞ペレットをフィコエリスリン標識二次抗体（Ｒ−ＰＥ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch）１００μｌに再懸濁し、それをＦＡＣＳバッファーで１：２００に希釈する。４℃で３０−６０分間インキュベートした後、細胞をＦＡＣＳバッファーで１回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー１００μｌに再懸濁し、そしてＬＩＮＧＯ−１特異的抗体の結合をFACSArray（商標）（Becton Dickinson）において細胞のＦＬ２蛍光強度により測定する。見かけのＫＤ値／ＥＣ５０値をGraphPad Prism ｖ３.０３ソフトウェアまたはGraphPad Prism ｖ４.０３を用いて飽和結合曲線から決定し、非線形回帰曲線フィットに適用する。
【０１２０】
このアッセイを用いて５０％ヒト脳脊髄液の影響を対照と比較することができる（表４）。５０％ヒト脳脊髄液中でのインキュベーションは差次的に影響する全ての結合剤との結合親和性の低下に至る。ヒト脳脊髄液の存在により結合親和性に及ぼす最強の影響力が４７８４に関して認められ、それは０.４３ｎＭから１.５７ｎＭの、７３％までの親和性の低下を示す。
【０１２１】
表４：ＣＨＯ−Ｋ１細胞により発現されたＬＩＮＧＯ−１に対する抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４の見かけのＫＤ値に及ぼすヒト脳脊髄液の影響
【表４】
0005647414.tif 000006
与えられた値は見かけのＫＤ値の平均値（ｎＭ）である。
【実施例１１】
【０１２２】
ＦＡＣＳ分析を用いる選択された抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４のヒトＬＩＮＧＯ−１に対する結合に及ぼすヒト血清の影響
抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４のヒトＬＩＮＧＯ−１に対する結合に及ぼすヒト血清の影響をＦＡＣＳ飽和結合実験により試験する。４７８４および４７８５の連続希釈物を５０容量／容量％ヒト血清の存在下で調製する。細胞を６０分間インキュベートした後、前記されたＦＡＣＳ染色にしたがってこれらのプレインキュベートされたＩｇＧ４抗体で細胞を染色する。
【０１２３】
詳細には、ＣＨＯ−Ｋ１−ｈＬＩＮＧＯ−１をベルセンにより培養フラスコから剥がし、ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、そしてＦＡＣＳバッファーに再懸濁する。精製された抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４をＦＡＣＳバッファー＋５０％ヒト血清で連続希釈し、そして４℃で６０分間インキュベートする。対照としてＩｇＧ４形式の候補結合剤の連続希釈物をＦＡＣＳバッファー＋２.６％ＢＳＡ（ヒト血清のタンパク質含量に類似する）中でインキュベートするか、またはＦＡＣＳバッファー単独中、４℃で６０分間インキュベートする。インキュベーションの後、連続希釈物を丸底９６ウェルマイクロタイタープレート（NUNC（商標）、Wiesbaden, Germany）に広げる。各濃度に関して、２検体ずつのウェルを１.２５×１０４セルと共に全容量１００μｌで、氷上で３０−６０分間インキュベートする。ＦＡＣＳバッファー１５０μｌを適用し、そして４００×ｇで５分間遠心することによる３回の洗浄工程の後、細胞ペレットをフィコエリスリン標識二次抗体（Ｒ−ＰＥ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch）１００μｌに再懸濁し、それをＦＡＣＳバッファーで１：２００に希釈する。４℃で３０−６０分間インキュベートした後、細胞をＦＡＣＳバッファーで１回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー１００μｌに再懸濁し、そしてＬＩＮＧＯ−１特異的抗体の結合をFACSArray（商標）（Becton Dickinson）において細胞のＦＬ２蛍光強度により測定する。見かけのＫＤ値／ＥＣ５０値をGraphPad Prism ｖ３.０３ソフトウェアまたはGraphPad Prism ｖ４.０３を用いて飽和結合曲線から決定し、非線形回帰曲線フィットに適用する。
【０１２４】
このアッセイを用いて５０％ヒト血清中でのプレインキュベーションの影響を対照と比較することができる（表５）。ヒト血清の存在下での１時間のインキュベーションは４７８４および４７８５のＫＤ値に影響しない。したがってこれらの抗体はこの時間にわたって血清中で安定であり、さらにそのＫＤは変化しないので、血清構成要素とは交差反応しないと思われる。
【０１２５】
表５：ＣＨＯ−Ｋ１細胞により発現されたＬＩＮＧＯ−１に対する抗ＬＩＮＧＯ−１  ＩｇＧ４の見かけのＫＤ値に及ぼすヒト血清の影響
【表５】
0005647414.tif 000007
与えられた値は見かけのＫＤ値の平均値（ｎＭ）である。
【０１２６】
配列表と簡単な説明
配列番号１
ラット成熟ＬＩＮＧＯ−１外部ドメイン（残基３４−５５０）
【化１】
0005647414.tif 000008
【０１２７】
配列番号２
カニクイザル成熟ＬＩＮＧＯ−１外部ドメイン（残基３４−５５０）
【化２】
0005647414.tif 000009
【０１２８】
配列番号３
ヒト成熟ＬＩＮＧＯ−１外部ドメイン（残基３４−５５０）
【化３】
0005647414.tif 000010
【０１２９】
配列番号４
４７８４ＶＬ
【化４】
0005647414.tif 000011
【０１３０】
配列番号５
４７８４ＶＨ
【化５】
0005647414.tif 000012
【０１３１】
配列番号６
４７８５ＶＬ
【化６】
0005647414.tif 000013
【０１３２】
配列番号７
４７８５ＶＨ
【化７】
0005647414.tif 000014
【０１３３】
配列番号８
ＤＮＡ−４７８４ＶＨ
【化８】
0005647414.tif 000015
【０１３４】
配列番号９
ＤＮＡ−４７８５ＶＨ
【化９】
0005647414.tif 000016
【０１３５】
配列番号１０
ＤＮＡ−４７８４ＶＬ
【化１０】
0005647414.tif 000017
【０１３６】
配列番号１１
ＤＮＡ−４７８５ＶＬ
【化１１】
0005647414.tif 000018
【０１３７】
配列番号１２
抗体４７８４ＣＤＲ−Ｈ１
【化１２】
0005647414.tif 000019
【０１３８】
配列番号１３
抗体４７８４ＣＤＲ−Ｈ２
【化１３】
0005647414.tif 000020
【０１３９】
配列番号１４
抗体４７８４ＣＤＲ−Ｈ３
【化１４】
0005647414.tif 000021
【０１４０】
配列番号１５
抗体４７８４ＣＤＲ−Ｌ１
【化１５】
0005647414.tif 000022
【０１４１】
配列番号１６
抗体４７８４ＣＤＲ−Ｌ２
【化１６】
0005647414.tif 000023
【０１４２】
配列番号１７
抗体４７８４ＣＤＲ−Ｌ３
【化１７】
0005647414.tif 000024
【０１４３】
配列番号１８
抗体４７８５ＣＤＲ’−Ｈ１
【化１８】
0005647414.tif 000025
【０１４４】
配列番号１９
抗体４７８５ＣＤＲ’−Ｈ２
【化１９】
0005647414.tif 000026
【０１４５】
配列番号２０
抗体４７８５ＣＤＲ’−Ｈ３
【化２０】
0005647414.tif 000027
【０１４６】
配列番号２１
抗体４７８５ＣＤＲ’−Ｌ１
【化２１】
0005647414.tif 000028
【０１４７】
配列番号２２
抗体４７８５ＣＤＲ’−Ｌ２
【化２２】
0005647414.tif 000029
【０１４８】
配列番号２３
抗体４７８５ＣＤＲ’−Ｌ３
【化２３】
0005647414.tif 000030
【０１４９】
配列番号２４
正方向プライマーＤＭ２２
【化２４】
0005647414.tif 000031
【０１５０】
配列番号２５
逆方向プライマーＤＭ２３
【化２５】
0005647414.tif 000032
【０１５１】
配列番号２６
ＡＰタグ−５−ＮＨＩＳベクター
【化２６】
0005647414.tif 000033
【化２７】
0005647414.tif 000034
【０１５２】
配列番号２７
ヒトＬＩＮＧＯ−１成熟ＤＮＡ配列
【化２８】
0005647414.tif 000035
【０１５３】
配列番号２８
カニクイザルＬＩＮＧＯ−１成熟ＤＮＡ配列
【化２９】
0005647414.tif 000036
【０１５４】
配列番号２９
ラットＬＩＮＧＯ−１成熟ＤＮＡ配列
【化３０】
0005647414.tif 000037
【０１５５】
配列番号３０
正方向プライマーＤＭ１４
【化３１】
0005647414.tif 000038
【０１５６】
配列番号３１
逆方向プライマーＤＭ１５
【化３２】
0005647414.tif 000039
【０１５７】
配列番号３２
ｐＳｅｃＴａｇ２−Ｖ５ベクター
【化３３】
0005647414.tif 000040
【化３４】
0005647414.tif 000041
【０１５８】
配列番号３３
ヒトＬＩＮＧＯ−２成熟ＤＮＡ配列
【化３５】
0005647414.tif 000042
【０１５９】
配列番号３４
正方向プライマーＤＭ１６
【化３６】
0005647414.tif 000043
【０１６０】
配列番号３５
逆方向プライマーＤＭ１７
【化３７】
0005647414.tif 000044
【０１６１】
配列番号３６
ｐＲＳ５ａ−ＩｇＧ
【化３８】
0005647414.tif 000045
【化３９】
0005647414.tif 000046
【化４０】
0005647414.tif 000047
【０１６２】
配列番号３７
天然リーダー（natleader）−ｈｓＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ／ｐＲＳ５ａ
【化４１】
0005647414.tif 000048
【化４２】
0005647414.tif 000049
【化４３】
0005647414.tif 000050
【化４４】
0005647414.tif 000051
【０１６３】
配列番号３８
Ｉｇリーダー−ｈｓＬＩＮＧＯ−１−ΔＬＲＲ−Ｆｃ／ｐＲＳ５ａ
【化４５】
0005647414.tif 000052
【化４６】
0005647414.tif 000053
【化４７】
0005647414.tif 000054
【化４８】
0005647414.tif 000055
【０１６４】
配列番号３９
Ｆａｂ発現ベクターpMORPH（登録商標）Ｘ９  ＭＨ
【化４９】
0005647414.tif 000056
【化５０】
0005647414.tif 000057
【化５１】
0005647414.tif 000058
【化５２】
0005647414.tif 000059
【０１６５】
配列番号４０
ＩｇＧ４発現ベクターpMORPH（登録商標）ｈ  Ｉｇγ４
【化５３】
0005647414.tif 000060
【化５４】
0005647414.tif 000061
【化５５】
0005647414.tif 000062
【化５６】
0005647414.tif 000063
【化５７】
0005647414.tif 000064
【０１６６】
配列番号４１
ＩｇＧラムダ鎖発現ベクターpMORPH（登録商標）ｈ  Ｉｇ  ラムダ
【化５８】
0005647414.tif 000065
【化５９】
0005647414.tif 000066
【化６０】
0005647414.tif 000067
【化６１】
0005647414.tif 000068
【０１６７】
配列番号４２
ＩｇＧカッパ鎖発現ベクターpMORPH（登録商標）ｈ  Ｉｇ  カッパ
【化６２】
0005647414.tif 000069
【化６３】
0005647414.tif 000070
【化６４】
0005647414.tif 000071
【化６５】
0005647414.tif 000072
【０１６８】
配列番号４３
ＩｇＧ４発現ベクターpMORPH２（登録商標）  ｈ  Ｉｇγ４
【化６６】
0005647414.tif 000073
【化６７】
0005647414.tif 000074
【化６８】
0005647414.tif 000075
【化６９】
0005647414.tif 000076
【化７０】
0005647414.tif 000077
【化７１】
0005647414.tif 000078
【０１６９】
配列番号４４
ＩｇＧラムダ鎖発現ベクターpMORPH（登録商標）２  ｈ  Ｉｇ  ラムダ２
【化７２】
0005647414.tif 000079
【化７３】
0005647414.tif 000080
【化７４】
0005647414.tif 000081
【化７５】
0005647414.tif 000082
【化７６】
0005647414.tif 000083
【０１７０】
配列番号４５
ＩｇＧカッパ鎖発現ベクターpMORPH（登録商標）２  ｈＩｇ  カッパ
【化７７】
0005647414.tif 000084
【化７８】
0005647414.tif 000085
【化７９】
0005647414.tif 000086
【化８０】
0005647414.tif 000087
【化８１】
0005647414.tif 000088
【図１】
0005647414.tif 000089
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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