(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
疼痛を治療及び／又は予防するための医薬の調製のための、少なくとも１つのオピオイド鎮痛薬と組み合わせた、NGFとTrkAとの間の結合を阻害することができる抗TrkA抗体の使用であって、該抗体が、軽鎖の可変領域が配列番号3のアミノ酸 1〜アミノ酸 106の配列を含むヒト化抗体であり、前記ヒト化抗体重鎖の可変領域が、配列番号4のアミノ酸 1〜アミノ酸 123の配列を含み、かつ前記オピオイド鎮痛薬が、モルヒネ又はその医薬として許容し得る塩、又はフェンタニル又はその医薬として許容し得る塩である、前記使用。
【請求項２】
前記抗体がTrkAの生物活性を遮断することができる、請求項1記載の使用。
【請求項３】
前記抗体が単鎖形態であり、かつリンカーによって連結された軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む、請求項1〜2のいずれか1項記載の使用。
【請求項４】
前記抗体が2つの軽鎖及び2つの重鎖を含む、請求項1〜2のいずれか1項記載の使用。
【請求項５】
前記抗体がFab（一価の断片抗原結合）断片である、請求項1〜2のいずれか1項記載の使用。
【請求項６】
前記ヒト化抗体軽鎖が、配列番号3の配列を有する、請求項1〜5のいずれか1項記載の使用。
【請求項７】
前記ヒト化抗体重鎖が、配列番号4、配列番号5、配列番号6から選択される配列を有する、請求項1〜5のいずれか1項記載の使用。
【請求項８】
前記疼痛が慢性痛である、請求項1〜7のいずれか1項記載の使用。
【請求項９】
前記疼痛が急性痛である、先の請求項1〜7のいずれか1項記載の使用。
【請求項１０】
前記疼痛が、膵炎、腎結石、頭痛、月経困難症、筋骨格疼痛、挫傷、内臓痛、卵巣嚢胞、前立腺炎、膀胱炎、間質性膀胱炎、炎症性腸疾患術後疼痛（歯痛を含む）、術後疼痛、片頭痛、三叉神経痛、火傷及び／又は創傷による疼痛、外傷と関連した疼痛（外傷性頭部外傷を含む）、神経障害性疼痛、帯状疱疹後神経痛、筋骨格疾患と関連した疼痛、リウマチ様関節炎、骨関節炎、強直性脊椎炎、関節周囲の病態、腫瘍学的疼痛、（「破綻的疼痛」及び末期癌と関連した疼痛を含む）、骨転移による疼痛、HIVによる疼痛、によって生じる、請求項8又は9記載の使用。
【請求項１１】
前記抗TrkA抗体の量が、前記オピオイド鎮痛薬用量が、それ自体単独で用いるのと同じ鎮痛効果を生じるために必要な量の少なくとも5%まで減少されるような量である、請求項1〜10のいずれか1項記載の使用。
【請求項１２】
医薬として許容し得る用量、かつ有効な用量で、請求項1〜7のいずれか1項に開示したとおりの少なくとも１つの抗TrkA抗体と少なくとも１つのオピオイド鎮痛薬とを含む、鎮痛性医薬品製剤であって、前記オピオイド鎮痛薬が、モルヒネ又はその医薬として許容し得る塩、又はフェンタニル又はその医薬として許容し得る塩である、前記鎮痛性医薬品製剤。
【請求項１３】
前記製剤が単一の医薬組成物に含まれる、請求項12記載の製剤。
【請求項１４】
前記製剤が2つの医薬組成物によって構成され、第1のものは抗TrkA抗体を含み、及び第2のものはオピオイド鎮痛薬を含む、請求項13記載の製剤。
【請求項１５】
請求項1〜7のいずれか1項に開示したとおりの抗TrkA抗体及びオピオイド鎮痛薬を含む組成物を、疼痛の治療及び／又は予防が必要な被験体に対する前記組成物の投与を指示することにより前記被験体の疼痛を治療及び／又は予防するための説明書と共に含む、キットであって、前記オピオイド鎮痛薬が、モルヒネ又はその医薬として許容し得る塩、又はフェンタニル又はその医薬として許容し得る塩である、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（本発明の背景）
本発明は、疼痛に対するオピオイド鎮痛薬効果の増強のためにTrkA活性を遮断することができる分子に関連する。特に、該分子は、モルヒネなどのオピオイドの鎮痛効果の増強を示す抗TrkA抗体である。
【背景技術】
【０００２】
（技術水準）
脊髄に対して求心性の侵害受容性シグナルは、線維Aδ及びCによって運ばれ、その細胞体（一次感受性ニューロン）は、脊髄の背側の神経節（DRG）に位置する。一次感受性ニューロンは、興奮神経伝達物質としてATPと共にグルタミン酸を、並びにサブスタンスP及びCGRP（カルシトニン遺伝子関連ペプチド）などの種々のその他の物質を放出する（Hunt 及び Mantyh の論文, 2001）。これらの興奮神経伝達物質の放出は、カプサイシン（バニロイド受容体、VR1）に感受性のもの、GABAによって活性化されるもの、ATP自体によって活性化されるもの、及びカンナビノイド（CB1）によって活性化されるものを含む、求心性末端に存在する種々のクラスの受容体によって制御される（Sivilotti 及び Nistriの論文, 1991; Hunt 及び Mantyhの論文, 2001; Khakhの論文, 2001; Morisset らの論文, 2001）。慢性疼痛が生じる生理病理学的所見の一つは、異痛症、すなわち通常痛みを伴わない刺激が痛みを伴う感覚に変質することである。この現象には、種々のイオン電流が関与しており、それゆえ、カプサイシン、VR1に対する受容体及びATPに対する向イオン性受容体を含む、「リガンド開口」型の種々のチャンネルが関与している（Khakhの論文, 2001）。脊髄の侵害受容性の介在ニューロン上のVR1に対する受容体、及びATPに対する受容体の同時活性化により、痛みを伴う刺激伝達の補強を伴った興奮性シナプスシグナルのかなりの蓄積が発生する（Nakatsuka らの論文, 2002）。従って、これらの観察から、ATP受容体（特にP2X3クラスに属するもの）は、疼痛経路において基本的役割を果たすことが明らかである（Bumstockの論文、2001）。これらの受容体は、痛覚発生刺激によって活性化される末梢神経終末に、DRGにおけるニューロンの細胞体に、並びに脊髄におけるシナプス前末端に、及びシナプス後末端に存在している（Khakhの論文、2001）。主な種類の「持続的」疼痛の根底にある分子過程において、神経成長因子（NGF）及びその高親和性受容体TrkAの関与を示すかなりの証拠があり（Levi-Montalciniの論文、1987；Levi-Montalcini らの論文, 1996；Frade 及び Bardeの論文（1998）；Kaplanの論文, 1998）、NGF／TrkA系を遮断する抗体（Levineの論文、1998）のための主要な治療領域（特に「持続」型に関連した疼痛のもの）を示している。感受性のある侵害受容性ニューロンの発達は、NGFに非常に依存しており、成人侵害受容体の反応も同じ因子によって調整される（Julius 及び Basbaumの論文, 2001）。特に、NGFは、カプサイシン痛覚発生刺激に対して急性感作を発揮する（Shu 及び Mendellの論文, 1999）。基本的観点から、侵害受容性ニューロンは、慢性炎症に続いて、これらの活動電位の頻度及び期間に変化を起こす。これらの現象は、内因性NGFを遮断することによって退行し、慢性疼痛状態の典型である過剰興奮の有意な減弱を引き起こす（Djouhri らの論文, 2001）。成人侵害受容体において疼痛閾値を定義するNGF作用は、TrkA受容体によって媒介され、侵害受容性末端に存在するVR1受容体によって媒介される反応の調整も介する。VR1反応のTrkA依存的増強は、ホスホリパーゼCγ（PLCγ、Chuang らの論文, 2001）の細胞内伝達経路を介して生じると考えられている。この迅速な、TrkAを媒介した侵害受容器シグナリング及び機能の増強により、急性及び慢性疼痛状況にて疼痛効果を有することができた。末梢NGFレベルは、炎症過程で増加するが、一方で、外来性NGFの投与は、ラットにおいて痛覚過敏効果を有し、ヒトでは筋肉痛を生じさせる。更に、NGFは、一般的にヒト及び哺乳類において熱刺激に対する過敏化を生じさせる。NGFは、炎症性過程が生じる末梢部位において、肥満細胞、線維芽細胞及びその他の細胞タイプによって放出される。特に、肥満細胞は、基本的役割を果たすようである（Woolf らの論文, 1996）。これらは、NGFを産生し、それと同時にこれらの表面上に機能的なTrkA受容体を発現するので（Nilsson らの論文, 1997）、これらはリゾホスファチジルセリンの存在下において、NGF自体に反応することができる（Horigome らの論文, 1993；Kawamoto らの論文, 2002）。その結果、NGF／TrkA系は、自己分泌ポジティブ・フィードバック機構を介して肥満細胞活性化を媒介し、痛覚発生炎症性シグナルの局部的増幅を可能にするようである。
【０００３】
高レベルのNGFはニューロンにおいても見いだされ、そこでこのニューロトロフィンは疼痛と関連した神経線維の修飾の役割を担っている（Harpf らの論文, 2002）。ある形態の癌において、過剰のNGFは、腫瘍による疼痛の誘導と共に神経線維の成長及び浸潤を容易にする（Zhu らの論文, 1999）。最近の実験研究では、NGFを遮断することにより、障害を受けたニューロンの細胞体に損傷を与えることなく、どのようにして神経障害性の疼痛の原因である神経腫の形成を有意に減少させることができるかを証明している（Kryger らの論文, 2001）。これらの結果により、急性及び持続的疼痛の治療のためのNGF効果の減少に基づいた治療アプローチに、かなりの興味が生じた（Saragovi 及び Gehringの論文, 2000）。近年、疼痛伝達の分子過程におけるNGF／TrkA系の関与が、遺伝学的にも証明された。特に、TrkA遺伝子（染色体1q21-q22に局在する）の突然変異は、再発性の偶発性発熱、無汗症、侵害受容性刺激に対する無反応、精神遅滞及び自傷傾向によって特徴づけられるCIPA（「先天性無痛無汗症」）として公知の遺伝性の常染色体劣性症候群の原因となる（Indo らの論文, 1996；Saragovi 及び Gehringの論文, 2000）；Indoの論文, 2001；Indo らの論文, 2001）。侵害反応におけるNGFの関与の更なる確認は、抗NGFトランスジェニックマウス表現型（AD11）の特徴づけにより、発明者によって最近得られた。これらの動物では、抗NGF抗体αDl1の局所的な発現により、成人年齢におけるNGFの機能的遮断が生じる。このような遮断は、一貫して有害な熱刺激に対する反応の潜時の増大へと換えられる（Capsoni らの論文, 2000；Ruberti らの論文, 2000）。多数の証拠により、疼痛療法のための可能性ある標的としての、神経成長因子（NGF）及びその高親和性受容体TrkAによって構成される系が示されている。このため、TrkA受容体を遮断することによってNGF／TrkA系の生物活性を中和することができる抗体は、疼痛療法のための、重要な資源を表すであろう。
【０００４】
本発明の著者は、TrkAによって媒介されるNGFの生物学的効果を遮断することができる（TrkA受容体に向けられた）抗体を利用する。試薬MNAC13は、特に興味深い。
MNAC13抗体は、ヒトTrkA受容体に対して向けられたマウスモノクローナル抗体であり（Cattaneo らの論文, 1999；Pesavento らの論文, 2000）、特にインビトロ及びインビボの両方で、NGFによるTrkAの活性化及びその下流の生物学的機能の阻害におけるマウスモノクローナル抗体である（Cattaneo らの論文, 1999；Pesavento らの論文, 2000）。NGFによるTrkAの機能的活性化を防げるアンタゴニスト活性を有するMNAC13抗体を含む抗TrkA抗体は、EP 1.181.318に開示されている。また、このような抗体の誘導体は、W02005／061540に開示されている。しかし、そのような分子によるオピオイド鎮痛効果の増強は、開示されていない。
該抗体は、構造の観点から詳細に特徴づけられ（Covaceuszach らの論文, 2001）、及びTrkA受容体との分子相互作用についても同様に特徴付けられた（Covaceuszach らの論文, 2005）。このような詳細な構造的知識に基づいて、革新的な方法によって、元の抗体と同じ抗原結合特性を有するMNAC13のヒト化型（Hu-MNAC13）が産生された（特許出願WO2005／061540）。
【０００５】
MNAC13抗体の、並びにヒト化MNAC13抗体型（huMNAC13）の作用は、持続的炎症性疼痛の古典的モデル、すなわちマウスホルマリン試験において調査された（Porro 及び Cavazzutiの論文, 1993）。動物がこの試験を受けるとき、疼痛反応に関して、2つの行動段階を区別することができる。該2つの段階は、痛みに富んだ刺激に対する反応が軽度又は無い数分の間隔で分けられる。第1段階は侵害受容性末端の直接刺激（ホルマリンによる）によって決定され、一方、第2段階はその後の炎症による。MNAC13抗体の作用を、オピオイド種に属する従来の強力な鎮痛薬であり、主に軽度から重篤な疼痛を治療するために使用されるモルヒネ（Przewlocki 及び Przewlockaの論文, 2001）及び抗NGF抗体αD11の作用と比較した。オピオイド鎮痛薬には、モルヒネと同様の作用を有する天然又は合成の全ての有効成分を含む。合成又は半合成の成分は、5つの化学物質種（フェナントレン、フェニルエチルアミン、フェニルピペリジン、モルフィナン及びベンゾモルフィナン）の誘導体である。薬理学的観点から、これらは、異なる活性を有し：これらは、強力なオピオイド受容体アゴニスト（モルヒネ様）、同受容体の中程度又は弱いアゴニスト（コデイン様）、アンタゴニスト／アゴニスト活性が混合された化合物（ナルブフィン様）又は部分的アゴニスト（ナロルフィン様）でもよい。全てのこれらの化合物のうち、モルヒネは、最も幅広く使用され続けている。しかし、その治療特性にもかかわらず、モルヒネは、いくつかの副作用（鎮静効果、悪心、嘔吐、その他）を有する。更に、モルヒネ及びこの鎮痛種に属する化合物は、寛容性及び身体嗜癖を発症するという基本的に不利な特徴を示す。従って、可能な限り低用量のこの種の鎮痛剤を使用した治療を開発して、副作用の発生並びに寛容性及び/又は嗜癖を発症する可能性を減少させることが急務である。
【０００６】
この目的のために、オピオイドの鎮痛効果の増強を、NGF／TrkA系を遮断する抗体を用いて調査した。
特許出願WO2004／096122は、NGFアンタゴニスト及びオピオイド鎮痛薬の投与を含む疼痛の治療又は予防のための方法を記述する。該出願は、特に、抗NGF抗体に言及しており、その受容体であるTrkAのアンタゴニストには言及してはいない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、疼痛に対するオピオイド鎮痛薬効果の増強のための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明の著者は、TrkA生物活性を遮断することができる分子の少量（これらの有効性閾値以下）が、オピオイドの鎮痛効果を増強することができることを見いだした。このような併用療法により、オピオイド量を減量して使用して、より高いオピオイド用量を単独で投与した場合に達成されるであろう疼痛寛解と同じレベルを得ることができる。
【０００９】
本発明の目的は、疼痛の治療及び/又は予防の医薬の製剤のための、少なくとも一つのオピオイド鎮痛薬と組み合わせた、NGFとTrkAとの間の結合を阻害することができる抗TrkA抗体の使用である。適切には、抗体は、TrkAの生物活性を遮断する、すなわちアンタゴニスト抗体である。
【００１０】
TrkAの生物活性を遮断する分子は、TrkA受容体に対するNGF結合に関して、アンタゴニストとして作用する分子をいい、これは、
i）TrkAに対して結合し；かつ、
ii）生細胞の表面上に発現された「ネイティブな」TrkA受容体に対するNGFの結合を阻害し；かつ、
iii）同じTrkA受容体に対するNGF結合に由来する生物活性を遮断する、
合成分子若しくはモノクローナル抗体又はその生物学的／合成誘導体として定義され得る。
【００１１】
「生物活性を遮断する」という用語は、受容体自体の「活性な」状態への変換過程を遮断することとして定義される、受容体の活性化を遮断することを単に意味するだけでなく、活性化過程の下流の生物学的結果：二次メッセンジャー、新たな遺伝子発現、細胞及び系レベルの両方での表現型の修飾並びに機能的修飾の機能的中和；も意味する。本発明の分子は、古典的なインビトロ試験（PC12細胞における神経突起伸長の試験）においてTrkAを遮断することができるだけでなく、インビボでも遮断できる（前脳基底核のコリン作動性ニューロンの機能的遮断及び古典的な「熱板」試験における痛覚の遮断）。
上記の如く、アンタゴニスト作用をもつTrkA抗体は、EP 1181318及びWO2005/061540に開示されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の態様において、抗体軽鎖の可変領域は、配列番号1のアミノ酸 24〜アミノ酸 33；配列番号1のアミノ酸 49〜アミノ酸 55；配列番号1のアミノ酸 88〜アミノ酸 96；から選択される配列を有する相補性決定領域（CDR）の少なくとも1つ、より好ましくは上記CDRのうち2つを含み、最も好ましくは上記のCDRのうちの3つを含む。抗体軽鎖の可変領域は、例えば本質的に配列番号1の配列を含んでいてもよい。
【００１３】
【化１】
0005419448.tif 000002
。
【００１４】
本発明の態様において、抗体重鎖の可変領域は、配列番号2のアミノ酸 26〜アミノ酸 35；配列番号2のアミノ酸 50〜アミノ酸 66；配列番号2のアミノ酸 99〜アミノ酸 112；から選択される配列を有する相補性決定領域（CDR）の少なくとも1つ、より好ましくは上記CDRのうち2つ、最も好ましくは上記のCDRのうちの3つを含む。抗体軽鎖の可変領域は、例えば本質的に配列番号2の配列を含んでいてもよい。
【００１５】
【化２】
0005419448.tif 000003
。
【００１６】
抗体は、単鎖の形態であってよく、リンカーによって連結された軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む。
或いは、抗体は、2つの軽鎖及び2つの重鎖を含んでいてもよい。
或いは、抗体は、Fab断片（一価の抗原結合断片）であってもよい。Fab断片は、初めから組換え法によって調製してもよく、又は抗体全体の酵素（例えばパパイン）によるタンパク質分解によって調製してもよい。
或いは、抗体は、Fab2断片であってもよい。Fab2断片は、初めから組換え法によって調製してもよく、又は抗体全体の酵素（例えばパパイン）によるタンパク質分解によって調製してもよい。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様において、抗TrkA抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体である。当業者であれば、抗体をデザインするために適当なヒト化法を選択するはずであり、好ましい方法は、WO2005/061540に開示された方法である。例示的なヒト化抗体は、配列番号1（マウス起源配列）のヒト化誘導体である軽鎖可変領域を含む。例示的なヒト化抗体は、配列番号2（マウス起源の配列）のヒト化誘導体である重鎖可変領域を含む。
【００１８】
本発明の好ましい実施態様において、ヒト化抗体軽鎖の可変領域は、配列番号3のアミノ酸 1〜アミノ酸 106の配列を本質的に含む。
より好ましい実施態様において、ヒト化抗体軽鎖は、本質的に配列番号3の配列を有する。
【００１９】
【化３】
0005419448.tif 000004
。
【００２０】
本発明の好ましい実施態様において、ヒト化抗体重鎖の可変領域は、配列番号4のアミノ酸 1〜アミノ酸 123の配列を本質的に含む。
より好ましい実施態様において、ヒト化抗体重鎖は、本質的に配列番号4、配列番号5、配列番号6から選択される配列を有する。
【００２１】
【化４】
0005419448.tif 000005
。
【００２２】
【化５】
0005419448.tif 000006
。
【００２３】
【化６】
0005419448.tif 000007
。
【００２４】
イタリック：可変領域、太字：ヒト化過程におけるマウス配列の突然変異、下線：CDR。
なおさらなる本発明の目的は、急性及び慢性疼痛、炎症性成分による任意の疼痛、並びにオピオイド鎮痛薬が通常処方される任意の疼痛を含むが、これらに限定されない任意の病因の疼痛治療の治療薬を調製するための、少なくとも一つのオピオイド鎮痛薬と組み合わせた、NGFとTrkAとの間の結合を阻害することができる抗TrkA抗体の使用である。より好ましくは、疼痛は、膵炎、腎結石、頭痛、月経困難症、筋骨格疼痛、挫傷、内臓痛、卵巣嚢胞、前立腺炎、膀胱炎、間質性膀胱炎、炎症性腸疾患術後疼痛（歯痛を含む）、術後疼痛、片頭痛、三叉神経痛、火傷及び／又は傷からの疼痛、外傷と関連した疼痛（外傷性頭部外傷を含む）、神経障害性疼痛、帯状疱疹後神経痛、筋骨格の疾患と関連した疼痛、リウマチ様関節炎、骨関節炎、強直性脊椎炎、関節周囲の病態、腫瘍学的疼痛（「破綻的疼痛」及び末期癌と関連した疼痛を含む）、骨転移による疼痛、HIVによる疼痛、心筋梗塞による疼痛、によって生じる。
【００２５】
疼痛研究の国際協会（IASP, www.iasp-pain.org ＜http：//www.iasp-pain.org/＞）によると、疼痛は、「実際の、若しくは潜在的組織損傷と関連するか、又はこのような損傷若しくは両方に関して記述された、不快な感覚及び感情的経験」として一般に定義される。全ての形態の疼痛に必須の要素は、生体に対して潜在的組織損傷を警告するための特殊化した高閾値受容体及び神経線維の活性化である。炎症細胞及び炎症過程の関与は、多くの疼痛状態における共通の要素である。「急性疼痛」という用語は、切断、圧挫、火傷などの傷害によって、又は化学的刺激によってもたらされる即座の、一般に高閾値の疼痛を意味する。本明細書で使用される「慢性疼痛」という用語は、急性疼痛以外の疼痛を意味する。慢性疼痛は、例えば何月も又は何年もの比較的長い期間であり、連続的又は断続的であり得ることが理解される。
【００２６】
本発明の一つの詳細な実施態様において、治療される疼痛は、持続型疼痛、例えば腫瘍学的疼痛、神経障害性疼痛又はリウマチの疼痛である。
本発明の抗TrkA抗体は、適切には全身投与される。全身投与は、注射、例えば連続静脈内注入、大量瞬時静脈内注入、皮下又は筋肉内注入によって行うことができる。或いは、その他の投与形態（例えば、経口、粘膜、吸入法を介して、舌下など）を使用してもよい。抗体の局部的送達は、局所投与、例えば患部組織の近くの関節内投与又は皮下、筋肉内の注射によって行うことができる。
【００２７】
抗TrkA抗体は、意図された投与経路に適した医薬組成物と共に適切に製剤化される。注射のための溶液には、適切な緩衝液及びモル濃度変更剤、例えばリン酸、塩及び／又はデキストロースを適切なように含む水性媒体（例えば、注射用水）中に溶解又は分散している抗体を適切に含む。
治療計画、すなわち用量、時期及び反復は、選ばれた投与経路により、製品の一回又は繰り返しの投与（例えば、注射）によって表すことができる。用量投与の間隔は、臨床効果の範囲及び期間、並びに特定の個体及び個体の臨床歴に応じて変更させることができる。
【００２８】
併用投与には、両方の同時投与及び／又は異なる時間での投与を含む。TrkAアンタゴニスト及びオピオイド鎮痛薬は、異なる頻度及び用量で投与してもよい、すなわちTrkA抗体は、0,01〜500mg/kg（例えば0.1〜50mg/kg）の範囲の単一用量にて、1週につき1〜3回又は1月につき1〜3回投与してもよく、一方で、オピオイド鎮痛薬は、このカテゴリーの鎮痛薬について通常使用される用量より以下の用量で、より多くの頻度で投与してもよい。例えば、モルヒネ（塩酸モルヒネとして）の適切な用量は、0,05〜5mg/kgの範囲であろう。例えば、フェンタニル（クエン酸フェンタニールとして）の適切な用量は、0,0005〜0,05の範囲であろう。TrkA抗体及びオピオイド鎮痛薬は、異なる方法で投与してもよく、用量は、治療に対する患者の反応に従って投与の間に変更してもよい。可能な適切な投与経路（該組み合わせの1つ及び／又はその他の成分）は、以下の通りである：経口、静脈内、舌下腺、皮下、動脈内、筋肉内、直腸、脊髄内、内胸、腹腔内、心室内、経皮、吸入法による。投与経路は、全身性であってもよく（静脈内投与の場合のように）、又は局在型であってもよい。疼痛の発症前の予防的投与も考慮されるであろう。
【００２９】
適切には、抗TrkA抗体は、長い作用期間を有する。特に、投与後に及ぶ抗体の臨床効果は、動物試験から決定すると21日間程度の長さであろう。更に、予備的データは、抗TrkA抗体が、その投与後に血清又は血漿などの関連した生体マトリックスにおいて検出することができる期間よりも長い期間の臨床的利益を明示し得ることを暗示する。
【００３０】
好ましい態様において、オピオイド鎮痛薬は、以下の一覧から選択される化合物又は1つ若しくは複数の化合物の組み合わせである：モルヒネ、コデイン、ジヒドロコデイン、ジアセチルモルヒネ、ヒドロコドン、ヒドロモルフォン、レボルファン、オキシモルフォン、アルフェンタニル、ブプレノルフィン、ブトルファノール、フェンタニル、スフェンタニル、メペリジン、メサドン、ナブルフィナ、プロポキシフェン、ペンタゾシン；及びその医薬として許容し得る塩誘導体。一つの実施態様において、オピオイド鎮痛薬は、モルヒネ又はその医薬として許容し得るその塩である。別の実施態様において、オピオイド鎮痛薬は、フェンタニル又はその医薬として許容し得るその塩である。
【００３１】
適切には、抗TrkA抗体の量は、オピオイド用量がそれ自体によるのと同じ鎮痛効果を生じるために必要な量の少なくとも5%、例えば少なくとも20%、例えば少なくとも50%まで減少されるような量である。
適切には、オピオイド鎮痛薬の量は、TrkA抗体用量が、それ自体によるのと同じ鎮痛効果を生じるために必要な量の少なくとも5%、例えば少なくとも20%、例えば少なくとも50%まで減少されるような量である。
【００３２】
別の本発明の目的は、医薬として許容し得る用量、かつ有効な用量で、少なくとも１つの抗TrkA抗体と少なくとも１つの鎮痛性オピオイドとを含む鎮痛性医薬品製剤である。好ましくは、該製剤は、単一の医薬組成物に含まれる。より好ましくは、該製剤は、2つの医薬組成物によって構成され、第1のものは抗TrkA抗体を含み、及び第2のものは鎮痛性オピオイドを含む。
本発明の更なる目的は、疼痛の治療のために鎮痛性オピオイドと組み合わせて使用するための、本発明の抗TrkA抗体である。
【００３３】
別の目的は、被験体の疼痛の治療及び／又は予防の方法であって、被験体の疼痛を治療及び／又は予防するために、抗TrkA抗体の有効量と鎮痛性オピオイドの有効量とを被験体に投与することを含む、前記方法である。
また、抗TrkA抗体及び鎮痛性オピオイドを含む組成物を、疼痛の治療及び／又は予防が必要な被験体に対する前記組成物の投与を指示することにより前記被験体の疼痛を治療及び／又は予防するための説明書と共に含むキットも提供する。
【実施例】
【００３４】
（方法）
（モノクローナル抗体の産生）
モノクローナル抗体MNAC13及びαD11を、先に開示した標準的方法（Galfre及びMilstein, 1981；Cattaneo らの論文, 1988；Cattaneo らの論文, 1999）に従って、ハイブリドーマ上清から産生した。それぞれの抗体を含む上清を、沈澱（29%の硫酸アンモニウム）、続いて1倍濃度のPBSに対する透析（Spectra-Por 12／14K膜、Spectrum社）及びセファロースプロテインGカラム（4-Fast Flow、Amersham Biosciences社）によるアフィニティークロマトグラフィーに供した。溶出を低pH（5 mM HC1）溶液によって行い、これを回収時に中和した。最終的な溶出液を濃縮して、1〜5 mg／mlの間の濃度の精製抗体の標品を得た（Amicon Ultra-15, 50K, Millipore社）。
【００３５】
αD11及びMNAC13抗体のFab（一価の抗原結合断片）型を、前述したように産生した（特許出願WO05/061540、Covaceuszach らの論文, 2004）。
簡潔には、Fab断片を相当するモノクローナル抗体全体から、パパインによるタンパク質分解、続いてイオン交換クロマトグラフィー精製工程及び素通り中に回収されたFab断片の濃縮によって得た。なおも存在する極めて少量の未切断IgGとFab断片とを分離するために、Superdex G75カラム（Pharmacia社）によるサイズ排除クロマトグラフィーを、FPLCシステム（Pharmacia社）を使用して行い、続いて最終の濃縮工程を行った。
【００３６】
2つの抗体のヒト化型の抗体（Hu-αD11及びHu-MNAC13）が濃縮される限り、それぞれの抗体の重鎖（pVH／CMVexpress）及び軽鎖（pVL／CMVexpress）の安定的共形質移入体である、安定に形質移入されたCHO細胞株の上清から開始して、先に開示したとおりに該２つの抗体を更に精製した。使用したベクターは、以前に開示されていた（特許出願WO05/061540）。安定的共形質移入体クローンは、G418及びミコフェノール酸による二重選別を介して得られた。pVH／CMV発現ベクターはヒトIgG1の定常部分を含むので、Hu-αD11のIgG4変異体を産生するために、ヒトIgG1の定常部分をIgG4に相当するFc領域（ヒトリンパ球RNAからRT-PCRによってクローニングした）に置換した。IgG1*変異体（Bolt らの論文, 1993により記述された、N297A突然変異をもつIgG1）を部位特異的変異によって作製した。
【００３７】
（動物）
およそ35gの重さの雄のCD1マウス（Charles River Lab、Como、Italia）を使用した。研究室に到着した後（実験の少なくとも2週前に）、これらを標準的な透明プラスチックケージ（1ケージあたり4匹）内に、恒温（22±1℃）及び相対湿度（60%）にて、光／暗闇サイクル則（光07：00〜19：00）で、水又は食物を制限することなく収容した。実験は、09：00〜14：00の間に行った。動物は、研究目的のための動物の使用におけるIASP倫理委員会（疼痛研究の国際協会）指針及びイタリア国内法令（DL116/92、欧州方針86/609/EECの適用）を遵守して処理し、かつ扱った。動物の苦しみを最少にするために、及び信頼できる科学的データを産生するために必要な動物の最少量を使用するために、あらゆる必要な努力がなされた。
【００３８】
（ホルマリン試験）
ホルマリンに対するマウスの刺激反応を試験した。それぞれの実験群には、10匹の動物を含んだ（特に明記しない限り）。マウスを実験群に無作為割付けし、試験の30分前に、試験する動物を透明プラスチックケージ（30×12×13 cm）に配置し、そこではあらゆる方向に自由に動かせた。ケージの下に配置した鏡及び反対側に配置したビデオカメラにより、観察期間の間に後足の完全な観察を可能にした。それぞれのマウスをNGF（αD11）又はTrkA（MNAC13又はhuMNAC13）を遮断する抗体で、例えば無関係な抗体（マウスIgG）又は生理食塩水で、右の後足の背側部分の皮下注射（s.c）を介して処理した（同じ足へのホルマリン（5%、生理食塩水溶液）の注射（s.c）の1〜18時間前に行った）。26の直径針を有するHamilton微量注射器を注射のために使用した（20 μlに等しい注射体積）。いくつかの実験において、抗体（MNAC13又はHu-MNAC13）注射は、試験の18時間前に腹腔内（i.p）に行った。
【００３９】
モルヒネ（塩酸モルヒネ、Guieu）を1 mg/kg〜5 mg/kg（生理食塩水溶液）の間の終濃度にてホルマリン試験の15分前に腹腔内（i.p）に注射した。
クエン酸フェンタニル（Hameln pharmaceuticals GmbH、使用した用量：0.01 又は0.005 mg/kg）を試験の20分前に動物の皮下に投与した（背側の注射）。試験されるフェンタニル用量の選択は、公開されたプロトコルに基づいた（Seguin らの論文, 1995；Meert 及び Vermeirschの論文, 2005）。
【００４０】
「舐める」行動、すなわち動物が注射された足を舐め、及び／又は噛むのに費やされる合計時間を連続的に40分間記録した（5分の観察時間間隔に分けた）。試験のそれぞれのセッションの間に、「舐めること」と同様に、一般的行動及び「自己毛繕い」行動（顔の毛繕いと解釈され）も記録した。一般的行動は、慣習的に、動物が垂直位又は傾いたときの瞬間を含む、動物が水平に移動する行動及び探索行動に費やす時間と解釈される。
【００４１】
抗体投与に関して、試験した用量を以下の表に要約してある：
【表１】
0005419448.tif 000008
【００４２】
いくつかの実験において、MNAC13（15 μg、概算的に0.4 mg／kgに相当）、Hu-MNAC13（15 μg、概算的に0.4 mg／kgに相当）及びマウス／ヒト対照免疫グロブリン（15 μg、概算的に0.4 mg／kgに相当）も、ip投与経路を介して与えた。
【００４３】
（統計分析）
ホルマリン試験は、二重盲検様式で行った。ホルマリン疼痛反応を初期段階（0〜15分まで）及び後期段階（15〜40分まで）に分けた。二元ANOVA（治療及び投与経路因子）を行った図5Aに要約した実験を除き、該2段階を、一元分散分析試験（ANOVA）を使用して別々に解析した。同じタイプの統計分析を一般的行動及び毛繕い行動について行った。適切な場合、すでに示したように、フィッシャー PLSD又はTukey／Kramer試験のいずれかを使用して、事後の比較を引き出した。
図5Bの結果を解析するために、単純なスチューデントｔ検定を使用した（ipで与えられたHu-MNAC13対ヒトIgGの単一用量の効果）。
【００４４】
（結果）
ホルマリンにより、ホルマリン注射の15分後に開始する「舐める」行動の第一段階及び疼痛に対する強度の反応の第二段階の典型的な二段階の反応を生じた。無関係なマウス免疫グロブリン（IgG）又はこれらの一価型（Fab）の皮下投与は、疼痛に対する反応に効果を有さなかった。IgGで処理した動物の反応は、生理食塩水で治療される動物の反応と一致していた。加えて、一般的な行動及び「毛繕い」は、処理群と対照群との間の両方で見分けがつかず、処理の薬理効果の特異的な特色が証明された。
【００４５】
（単一用量研究）
最初の一連の実験では、ホルマリン注射によって誘導される疼痛に対する反応におけるモルヒネの3つの異なる用量（1 mg/kg；2.5 mg/kg；5 mg/kg）の鎮痛効果を評価した。グラフ（図1）は、60分の観察期間（5分間隔に分けた）に関し、実際の試験時間（最初の40分）及びそれに引き続く20分間を含んでいる。
最初の40分を考える場合、第一段階（0〜15分）及び第二段階（15〜40分、図1A）の両段階において、最も高いモルヒネ用量が疼痛応答を強く減少させることができ（図1C）、中間用量では舐める時間を50%まで減少させるが（図1B）、最も低用量（1mg/kg）では全く効果がないことが判明した。
【００４６】
抗NGF及び抗TrkA抗体を使用したとき、疼痛反応（「舐める」時間として測定される）は、抗体の形式に応じて異なる影響を受けた（免疫グロブリン全体= Mab；一価の抗原結合断片= Fab）。
最初の単一用量研究では、MNAC13及びαD11抗体をMab形式（図2A）又はFab形式（図2B）での試験の1時間前に投与した。分散分析では、初期段階（F2.28：1.217；p = 0.3114）及び後期段階（F2.28：1.393；p=0.2650）の両方において、Mab形式の抗体の有意な鎮痛効果は全く強調されなかった。これに反して、Fab形式の抗体の投与（αD11 Fab：12.5 μg/20 μl；MNAC13 Fab：60 μg/20 μl）では、試験の後期段階において疼痛反応の有意な減少が示されたが（F2.26：8.340 p＜0.01）、一方で、初期段階において統計学的に有意な変化は観察されなかった（F2.26：1.608；p=0.2195）。
【００４７】
ホルマリン試験の18時間前に抗体が投与されたときは（同じ単一用量）（図3A及び3B）、抗NGF（αD11）抗体及び抗TrkA（MNAC13）抗体は、試験の1時間前に投与されたときに観察されたのとは異なる舐める反応に対する効果を示した。無関係なマウス免疫グロブリン（IgG）と比較したときには、どちらの抗体も、初期段階において有意な効果を示さなかった（F2.24：1.226；p=0.3112）；しかし、後期段階に関しては、MNAC13が疼痛反応の有意な減少を生じた一方で（F2.24：5.129；p＜0.01）、αD11の効果は、統計学的に有意ではなかった（図3A）。この結果は、NGFリガンド及びTrkA受容体によって表される2つの分子標的が同等ではないことを示した。持続的炎症性疼痛の周知のモデル（ホルマリン試験）において、（MNAC13遮断抗体による）受容体の機能的遮断は鎮痛効果を生じたが、それは、（αD11遮断抗体により）リガンドを遮断することによって（少なくとも同じ投与プロトコルで）検出できなかった。
図3Bに示したように、Fab形式での試験の18時間前に投与した場合、どちらの抗体も、初期段階（F2.23：0.468；p=0.6318）及び後期段階（F2.23：0.074；p=0.9293）において有意な鎮痛効果両方を生じることができなかった。
【００４８】
（MNAC13の用量反応試験）
単一用量研究（試験の18時間前に投与）において得られた有意な結果に基づいて、用量反応試験（マウスにおけるホルマリン試験）をMNAC13抗TrkA抗体で行った。疼痛に対する反応（「舐めている」時間）の分析では、最も低いもの（0.9 μg/20 μlの注射用量、約25 μg/kgに相当）を除いて、試験した全ての用量について、試験の後期段階の間に有意な鎮痛効果を示した（F7,71：4,134；p＜0.001）（図4）。MNAC13の3つの有効用量（1.875 μg；3.75 μg；7.5 μg）が、単一用量研究に使用されたαD11の用量（12.5 μg）よりも少なかったことは、注目すべきである。このことは、この投与プロトコルを使用したホルマリン試験において抗NGFと抗TrkA抗体との間の鎮痛有効性の基本的な相違を確証させる。
【００４９】
15 μg（約0.4mg/kgに相当）よりも高用量のMNAC13は、試験の後期段階における平均の鎮痛有効性において、何ら増大を示さなかった：疼痛反応の減少の最大効果（対照の約52%）は、15 μgですでに得ることができた。またこれは、小さいが統計学的に有意な効果がホルマリン試験の初期段階において観察された唯一の用量である（図4）。
【００５０】
図5Aは、15 μg用量の鎮痛特性が、投与経路とは無関係であることを示している。実際、抗体が皮下又は腹腔に注射された時に、舐める行動に対して同様の効果が観察された。
Hu-MNAC13を15 μgの用量にて同種の実験において腹腔に投与したときに、元のMNAC13の相当する用量と比較して、同様の鎮痛効果が観察された（図5A）。
【００５１】
（抗TrkA抗体MNAC13とオピオイドの相乗効果）
ホルマリン試験を行うことにより、MNAC13（及びそのヒト化対応物）が、オピオイドと相乗的に作用し得ることを示すこともできた。前述した投与プロトコルを使用して（試験の18時間前に）、動物を、無効な用量のモルヒネ（1 mg/kg）又はフェンタニル（0.005m g/kg）を腹腔内投与した後に無効な用量のMNAC13（25 μg/kg）で処理した。併用治療の結果は、（MNAC13が無関係な免疫グロブリンによって置き換えられ、一方でオピオイド鎮痛剤が食塩水によって置き換えられた、全ての関連したクロスチェックと比較して）驚くべき、並びに有意な増強効果を示した（図6）。無効な用量のMNAC13及びモルヒネの共投与では、疼痛反応（「舐めている時間」）の有意な減少を生じ、これは、試験の後期段階においてより明らかであった。
【００５２】
モルヒネとMNAC13との併用投与に関しては（図6A）、第2段階において、舐めている時間が、それぞれのIgG + Sal対照群と比較して40%まで減少した。ホルマリン試験の両段階において、2つの標準以下の閾値用量のMNAC13（25 μg/kg）とモルヒネ（1 mg/kg）との併用投与により、（それ自体有効な）2.5 mg/kgのモルヒネの用量と同等な鎮痛効果を生じた。
【００５３】
別のオピオイド（フェンタニル）をMNAC13と組み合わせて与えたときにも、同様の結果が得られ（図6B）、オピオイドで誘導される鎮痛の増強が、使用されるオピオイドとは無関係に得られたことを示している。ホルマリン試験の両段階について、2つの標準以下の閾値用量のMNAC13（25 μg/kg）とフェンタニル（0.005 mg/kg）との併用投与により、（それ自体有効な）0.01 mg/kgのフェンタニルの用量と同等な鎮痛効果を生じた。
【００５４】
図7に示したように、MNAC13をそのヒト化変異体（Hu-MNAC13）によって置き換えたときに、同様の結果が得られた。
TrkA受容体を遮断する抗体によるオピオイドで誘導される鎮痛増強は、治療的観点から注目すべき結果を示す。MNAC13の（又は、そのヒト化型の、並びに元の抗体の遮断特性を維持するその他の任意の誘導体の）共投与により、通常無効なより低い用量のモルヒネの使用が可能になり、その結果、副作用の発生及び薬物耐性又は嗜癖を発症する確率を減少させる。
【００５５】
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【図面の簡単な説明】
【００５６】
本発明の非制限的実施例を提供し、特に以下の図を提示することで、本発明を記載する。
【図１】マウスホルマリン試験におけるモルヒネ（A）1 mg/kg、（B）2.5 mg/kg、（C）5 mg/kgの効果（それぞれの実験群についてn=10）。モルヒネを、試験を始める15分前に腹腔内に注射し、合計「舐めている」時間（疼痛に対する反応）を秒単位で測定した。生理食塩水（Sal）をネガティブ対照に注射した。5分の時間間隔を考慮した。それぞれの時間間隔は、一元分散分析試験（ANOVA）によって分析した。最初の8間隔（=合計時間40分）は、試験時間に対応する。また、動物を試験直後の20分間、観察した。（A）1 mg/kgのモルヒネでは、完全に効果がない；（B）2.5 mg/kgのモルヒネでは、有意な鎮痛効果を有する；（C）5 mg/kgのモルヒネでは、一貫してホルマリンに対する反応を遮断する。
【００５７】
【図２】マウスにおけるホルマリン試験：方法の節に示したように、抗体を試験の1時間前に注射した場合の疼痛反応（舐めている）における抗NGF αD11及び抗TrkA MNAC13モノクローナル抗体の効果。（A）抗NGFαD11モノクローナル抗体（Mab形式：12.5 μg/20 μl）及び抗TrkA MNAC13モノクローナル抗体（Mab形式：60 μg/20 μl）；（B）αD11抗体のFab（一価の抗原結合断片）（12.5 μg/20 μl）及びのMNAC13抗体のFab（60 μg/20 μl）。無関係なマウス免疫グロブリン（IgG、60 μg/20 μl）及びマウスの無関係なFab（Fab、60 μg/20 μl）を対照として使用した。合計の舐めている時間は、第１段階（初期段階= 0〜15分）及び第２段階（後期段階= 15〜40分）に分けられる。  実験群：（A）IgG（n=11）、αD11（n=10）、MNAC13（n=10）；（B）Fab（n=9）、αD11 Fab（n=10）、MNAC13 Fab（n=10）。** p＜0.01対  対照群（フィッシャーPLSD試験）。2つの抗体のFabは、鎮痛特性を示す（第２段階に限定される）。
【００５８】
【図３】マウスにおけるホルマリン試験：方法の節に示したように、抗体を試験の18時間前に注射した場合の疼痛反応（舐めている）における抗NGF αD11及び抗TrkA MNAC13モノクローナル抗体の効果。（A）抗NGFαD11モノクローナル抗体（Mab形式：20 μlの合計注射体積中に12.5 μg）及び抗TrkA MNAC13モノクローナル抗体（Mab形式：20 μlの合計注射体積中に60 μg）；（B）αD11抗体のFab（一価の抗原結合断片）（20 μlの合計注射体積中に12.5 μg）及びのMNAC13抗体のFab（20 μlの合計注射体積中に60 μg）。無関係なマウス免疫グロブリン（IgG、20 μlの合計注射体積中に60 μg）及びマウスの無関係なFab（Fab、20 μlの合計注射体積中に60 μg）を対照として使用した。合計の舐めている時間は、第１段階（初期段階= 0〜15分）及び第２段階（後期段階= 15〜40分）に分けられる。実験群：（A）IgG（n=10）、αD11（n=8）、MNAC13（n=9）；（B）Fab（n=10）、αD11 Fab（n=8）、MNAC13 Fab（n=8）。** p＜0.01対  対照群（フィッシャーPLSD試験）。MNAC13（Mab）は、有意な鎮痛効果を生じる（第２段階に限定される）。
【００５９】
【図４】初期段階（第1段階= 0〜15分）について、及び後期段階（第2段階= 15〜40分）についての両段階のホルマリン試験（マウス）における抗TrkA MNAC13抗体の用量反応試験。方法の節に示したように、試験の18時間前に抗体を投与した。MNAC13の単一用量の実験群：0.9 μg：n=8；1.875 μg：n=10；3.75 μg：n=10；7.5 μg：n=10；15 μg：n=10；30 μg：n=10；60 μg：n=9。マウス免疫グロブリン（IgG、60 μg：n = 12）を対照として注射した。* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001対  対照IgG群（フィッシャーPLSD試験）。最低用量（0.9 μg、およそ25 μg/kgに等しい）のみが鎮痛特性を全く示さなかった。15 μg（およそ0.4 mg/kgに等しい）の中間用量では、観察される最大の効果をすぐに生じることができ（第２段階における舐めている時間のおよそ52%まで減少）、試験の第１段階において統計学的に有意な効果を示す唯一の用量である。
【００６０】
【図５】ホルマリン試験（マウス）における抗TrkA MNAC13モノクローナル抗体及びそのヒト化対応物（Hu-MNAC13）の効果。（A）15 μgのMNAC13を試験の18時間前にsc（皮下）又はip（腹腔内）のどちらかでマウスに与えた。無関係なマウス免疫グロブリン（IgG）を対照として使用した。実験群：IgG（ip、n= 10）；IgG（sc、n=9）；MNAC13（ip、n=9）；MNAC13（sc、n=8）。初期段階及び後期段階の結果の統計解析（2元分散分析）では、有意な治療の効果を示したが（初期段階でF13,66-P＜0.0008；後期段階でF21,657-P＜0.0001）、投与経路及び相互作用の有意性は、示さなかった（治療*投与経路）。事後の比較（Tukey／Kramer）により、初期及び後期の両段階で、MNAC13とIgG処理群との間の有意差（** p＜0.01）が明らかとなった。MNAC13は、ホルマリン試験において、投与経路とは独立して無痛を誘導する。（B）15 μg用量のHu-MNAC13（IgG4）を試験の18時間前にマウス腹腔内に与えた。無関係なヒト免疫グロブリン（IgG）を対照として使用した。実験群：ヒトIgG（n=6）；Hu-MNAC13（n=9）。スチューデントT検定* p＜0.05、** p＜0.005。結果は、マウスMNAC13 抗体（パネルA）で得られたものと同等であった。
【００６１】
【図６】オピオイドで誘導される鎮痛におけるMNAC13（抗TrkA）の増強効果（マウスにおけるホルマリン試験：A、モルヒネ；B、フェンタニル）。方法の節に示したように、それぞれのマウスを異なる実験群の一つに無作為割付けして、試験の18時間前に抗TrkA（マウスMNAC13、動物あたり0.9 μg、およそ25 μg/kgに等しい、本質的には無効な用量）又は無関係なマウスIgG（抗体用量：動物あたり25 μg/kg）を皮下に（sc）注射した。（A）塩酸モルヒネを試験の15分前に腹腔内に注射した。（B）フェンタニルを試験の20分前に皮下に注射した。実験群：生理食塩水（Sal）及びIgG（n=10）；）IgG及びモルヒネ、1 mg/kg（Mo1）（n=9）；）IgG及びモルヒネ、2.5 mg/kg（Mo2.5）（n=9）；MNAC13（マウス）及び生理食塩水（n=11）；MNAC13（マウス）及びモルヒネ、1 mg/kg（Mo1）（n=11）；IgG及びフェンタニル、0.005 mg/kg（FEN 0.005）（n=8）；IgG及びフェンタニル、0.01 mg/kg（FEN 0.01）（n=7）；MNAC13及びフェンタニル、0.01 mg/kg（FEN 0.01）（n=8）。一元分散分析、続いて事後の比較（Tukey／Kramer）。* p＜0.05、** p＜0.005対  対照群。
【００６２】
【図７】モルヒネで誘導される鎮痛（マウスにおけるホルマリン試験）におけるヒト化MNAC13（Hu-MNAC13）の増強効果。  方法の節に示したように、それぞれのマウスを異なる実験群の一つに無作為割付けして、試験の18時間前に抗TrkA抗体（Hu-MNAC13；抗体用量：25 μg/kg、本質的には無効）又は無関係なヒトIgG（抗体用量：25 μg/kg）を皮下（sc）に注射した。塩酸モルヒネ（1mg/kg= Mo-1、本質的に無効な用量）を試験の15分前に腹腔内に注射した。モルヒネのネガティブ対照には、生理食塩水（Sal）を注射した。実験群：Sal及びIgG（n=8）；IgG及びMo-1（n=6）；Sal及びHu-MNAC13（n=8）；Hu-MNAC13及びMo-1（n=8）。一元分散分析、続いて事後の比較（Tukey／Kramer）：** p＜0.001対 対照群。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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