(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列、糖鎖構造、高次構造、及び生理活性が均一な糖タンパク質を製造する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質をフォールディングさせて、複数種類の異なる高次構造を有する、フォールディングされた糖タンパク質を生成させる工程；
（ｂ）前記フォールディングにより生じた前記複数種類の異なる高次構造を有する糖タンパク質を、カラムクロマトグラフィーによって複数の画分に分画する工程；及び
（ｃ）前記複数の画分のうち、前記カラムクロマトグラフィーでの相対吸光度におけるピークの違いに基づいて、所定の活性を有する1つの画分を回収することで、アミノ酸配列、糖鎖構造、高次構造、及び生理活性が均一な、精製された糖タンパク質を得る工程
を含む、
方法であって、
前記アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質は、少なくともその一部が以下の工程（１）〜（６）：
（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基、又は脂溶性保護基でアミノ基が保護された糖鎖付加したアミノ酸のカルボキシル基とをエステル化反応させる工程；
（２）前記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程；
（３）前記遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基、又は脂溶性保護基でアミノ基が保護された糖鎖付加したアミノ酸のカルボキシル基とをアミド化反応させる工程；
（４）前記工程（３）の後、脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程；及び
（５）前記工程（３）及び（４）の工程を１回以上繰り返す工程；および
（６）前記工程（１）で形成されたエステル結合を酸で切断する工程
を含む方法によって製造される、
方法。
【請求項２】
前記工程（ｃ）の後に、
（ｄ）前記工程（ｃ）で回収されなかった画分に含まれる糖タンパク質をアンフォールディングさせる工程；
（ｅ）前記アンフォールディングさせた糖タンパク質を再度フォールディングさせる工程；
（ｆ）前記再度フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって分画し、前記所定の活性を有する画分を回収する工程；及び
（ｇ）必要に応じて（ｄ）から（ｆ）を繰り返す工程
をさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
所定の生理活性を有する、アミノ酸配列、糖鎖構造、高次構造、及び生理活性が均一な糖タンパク質をスクリーニングする方法であって、以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質をフォールディングさせて、複数種類の異なる高次構造を有する、フォールディングされた糖タンパク質を生成させる工程；
（ｉｉ）前記フォールディングにより生じた前記複数種類の異なる高次構造を有する糖タンパク質を、カラムクロマトグラフィーによって複数の画分に分画する工程；及び
（ｉｉｉ）前記複数の画分のうち、前記カラムクロマトグラフィーでの相対吸光度におけるピークの違いに基づいて各画分の活性を測定し、所定の活性を有するか否か判定して、アミノ酸配列、糖鎖構造、高次構造、及び生理活性が均一な、精製された糖タンパク質を得る工程
を含む、
方法であって、
前記アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質は、少なくともその一部が以下の工程（１）〜（６）：
（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基、又は脂溶性保護基でアミノ基が保護された糖鎖付加したアミノ酸のカルボキシル基とをエステル化反応させる工程；
（２）前記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程；
（３）前記遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基、又は脂溶性保護基でアミノ基が保護された糖鎖付加したアミノ酸のカルボキシル基とをアミド化反応させる工程；
（４）前記工程（３）の後、脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程；及び
（５）前記工程（３）及び（４）の工程を１回以上繰り返す工程；および
（６）前記工程（１）で形成されたエステル結合を酸で切断する工程
を含む方法によって製造される、
方法。
【請求項４】
所望の生理活性を有する糖タンパク質混合物を得る方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質をフォールディングさせて、複数種類の異なる高次構造を有する、フォールディングされた糖タンパク質を生成させる工程；
（Ｂ）前記フォールディングにより生じた前記複数種類の異なる高次構造を有する糖タンパク質を、カラムクロマトグラフィーによって複数の画分に分画する工程；
（Ｃ）前記複数の画分のうち、前記カラムクロマトグラフィーでの相対吸光度におけるピークの違いに基づいて、各画分の活性を測定し、所定の活性を有するか否か判定して、アミノ酸配列、糖鎖構造、高次構造、及び生理活性が均一な、精製された糖タンパク質を含む画分を複数得る工程；及び
（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた複数の画分のうち、所望の活性を得るための各画分の混合比率を求め、当該比率に従って各画分を混合する工程
を含む、
方法であって、
前記アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質は、少なくともその一部が以下の工程（１）〜（６）：
（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基、又は脂溶性保護基でアミノ基が保護された糖鎖付加したアミノ酸のカルボキシル基とをエステル化反応させる工程；
（２）前記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程；
（３）前記遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基、又は脂溶性保護基でアミノ基が保護された糖鎖付加したアミノ酸のカルボキシル基とをアミド化反応させる工程；
（４）前記工程（３）の後、脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程；及び
（５）前記工程（３）及び（４）の工程を１回以上繰り返す工程；および
（６）前記工程（１）で形成されたエステル結合を酸で切断する工程
を含む方法によって製造される、
方法。
【請求項５】
前記工程（１）〜（６）によって前記アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質の一部が製造され、当該糖タンパク質が、さらに、以下の工程（７）：
（７）前記工程（６）で得られた糖タンパク質の一部と、他のペプチド又は糖ペプチドとを、ライゲーション法によって連結する工程
を含む方法によって製造される、
請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸配列、糖鎖構造及び高次構造が均一な糖タンパク質を製造する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖タンパク質を様々な医薬として用いる研究が進められている。糖タンパク質の糖鎖部分は、プロテアーゼへの耐性を付加して血中からの代謝を遅延させる機能や、細胞内での小器官への輸送をつかさどるシグナルとしての機能等を有する。従って、適切な糖鎖を付加することによって、糖タンパク質の血中半減期や細胞内での輸送を制御することが可能である。【０００３】
糖鎖が糖タンパク質の生理活性に影響する代表的な例として、エリスロポエチン（ＥＰＯ）が挙げられる。この糖タンパク質は、赤血球系前駆細胞に作用し、その増殖・分化を促進することにより、末梢血中の赤血球数を維持する機能を持った血球分化ホルモンである。ＥＰＯの糖鎖構造と生理活性の相関について研究された結果、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは糖鎖が結合していなくても生理活性を有するが、ｉｎ  ｖｉｖｏでは糖鎖がないとすぐに腎臓から排出されてしまい、十分な生理活性が得られないことが判明した。【０００４】
また、糖タンパク質は糖鎖が不完全な場合や、異なる糖鎖が結合している場合も、血液中のマクロファージ等に認識され、血中から排出されることがある。【０００５】
従って、糖タンパク質を医薬品として用いる場合には、各タンパク質の同じ位置に均一な構造の糖鎖が付加されていることが望ましい。【０００６】
従来、糖タンパク質の製造方法としては、タンパク質に糖を酵素付加する方法が広く用いられているが、この方法では、均一な糖鎖を付加することができず、また、糖鎖を付加した後に修飾やトリミングを均一に施すことも困難である。【０００７】
また、一般に、タンパク質製剤は力価で評価されるが、同一の力価を有する製剤でも、糖鎖構造にばらつきがあるものが含まれる場合があり、血中半減期にばらつきが生じたり、品質管理の点で問題となりうる。【０００８】
本発明者らは、これまでに、脂溶性保護基でアミノ基を保護したアミノ酸と糖鎖アスパラギンを材料とし、均一なアミノ酸配列と糖鎖を有する糖タンパク質を比較的大量に製造できる方法を開発した（例えば特許文献１参照）。さらに、十分な血中濃度を維持できるアミノ化複合型糖鎖誘導体および糖タンパク質を開発した（特許文献２参照）。いずれの糖タンパク質も、医薬品としての有用性が期待される。【０００９】
ところで、医薬品として使用するためには、生理活性にばらつきのない糖タンパク質を製造することが必要であるが、糖タンパク質の機能には、アミノ酸配列と糖鎖構造のみでなく、タンパク質部分の高次構造も密接に関連すると考えられる。【００１０】
タンパク質の高次構造は、アミノ酸残基間の水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、システイン残基間のＳ−Ｓ結合などによって安定化され、多くのタンパク質は、それぞれ固有の高次構造を有する。しかしながら、Ｓ−Ｓ結合以外の結合は、比較的弱い結合であり、比較的温和な加熱や加圧等によって高次構造が壊れ、その生理活性が低下・消失する。これをタンパク質の変性と呼ぶ。また、特にアミノ酸鎖が長い場合、エネルギーの極小点を与える構造が複数生じるため、異常な高次構造（ミスフォールディング）を生じることがある。この場合も、タンパク質の活性が変化または消失することが報告されている。【００１１】
これらの事実から、一般に、タンパク質が機能を発揮するためには正しい高次構造が必須であり、タンパク質をフォールディングさせると、生理活性を有する正しいフォールディングと、生理活性を有しないミスフォールディングに分かれると考えられている。【００１２】
タンパク質の高次構造と生理活性の関係については種々の研究がなされているが、人工的に合成した糖タンパク質において、糖鎖がフォールディングや生理活性にどのような影響を与え得るかについては、これまでに報告がない。【００１３】
本発明者らは、特許文献１に係る方法で糖タンパク質断片を合成し、天然型化学的ライゲーション法（Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ、ＮＣＬ法）で他のペプチド断片と連結することによって、単球走化性タンパク質−３を合成した。合成された単球走化性タンパク質−３をフォールディングさせた後、キモトリプシン処理でジスルフィド結合の位置を確認したところ、約９０％の糖タンパク質はジスルフィド結合が正しい位置に形成されているが、約１０％は通常と異なる位置にジスルフィド結合が形成されていることが判明した（非特許文献１）。【００１４】
しかしながら、同文献では、異なる２種類以上の糖タンパク質をフォールディングした状態では分離していない。キモトリプシン処理時に、ジスルフィド結合が再形成される可能性があることも考慮すると、２種類以上のフォールディングが生じていたのではなく、キモトリプシン処理の結果が２種類以上に分かれただけである可能性も否定できない。従って、当然のことながら、ジスルフィド結合が正しい位置に形成された糖タンパク質と、通常と異なる位置に形成された糖タンパク質との生理活性の違いについても検討されていない。【００１５】
また、比較的よく機能や構造が研究されている糖タンパク質に、卵白に含まれるタンパク質の一種であるオボムコイドタンパク質がある。オボムコイドは分子量約２８，０００のタンパク質であり、分子内に３つのドメインを有し、各ドメインがそれぞれ異なったプロテアーゼに対して阻害活性を有する。特に第３ドメインは、単独でも阻害活性を示すことから詳細に研究されている。これまでに、１００種以上の鳥由来の第３ドメインについて構造が報告され、Ｘ線結晶解析によっても立体構造が明らかにされている。【００１６】
化学的に合成されたオボムコイド第３ドメインの立体構造については、例えば、ＮＣＬ法によって、ペプチド骨格を改変したオボムコイド第３ドメインを合成し、Ｘ線結晶解析を行ったことが報告されている（非特許文献２を参照）。【００１７】
また、オボムコイド第３ドメインを逐次伸長（ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）法とＮＣＬ法によって合成し、フォールディングさせたところ、熱安定性の解析により、正しく折りたたまれたことが強く示唆される結果が得られたとの報告もある（非特許文献３を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】国際公開第２００４／００５３３０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００４／０１１０３６号パンフレット
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００８，１３０，５０１−５１０
【非特許文献２】Ｂａｔｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）３０５，８３９−８４９
【非特許文献３】Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９６，１１８，８５１８−８５２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
しかしながら、上述の先行技術では、合成されたタンパク質に糖鎖が付加されておらず、糖タンパク質において、糖鎖がフォールディングや生理活性にどのように影響するかについては不明であった。【００２１】
そこで、本発明は、血中半減期等の糖鎖に基づく機能に加えて、生理活性も均一である糖タンパク質、即ち、アミノ酸配列、糖鎖構造、及び高次構造が均一な糖タンパク質を製造する方法を提供することを目的とする。【００２２】
また、本発明は、生理活性の強さが異なる複数種類の糖タンパク質から所定の活性を有する糖タンパク質を選択するスクリーニング方法を提供すること、所望の活性を有する糖タンパク質混合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らは、アミノ酸配列と糖鎖構造が均一なオボムコイドタンパク質の第３ドメインを合成してフォールディングさせると、複数種類の高次構造を一定の比率で含む混合物が再現性よく得られることを見出した。そしてこれらを分離して生理活性を測定したところ、従来の理解とは異なり、同一種類の生理活性を比較的高活性と認められるレベルで有する高次構造が複数種類存在すること；比較的高活性であるとはいえ高次構造によって活性に差があること；高次構造の異なる糖タンパク質は、カラムクロマトグラフィーによってそれぞれ分離・精製できること、を確認した。【００２４】
また、所定の活性を有する糖タンパク質以外のものは、アンフォールディングさせた後、再度フォールディングさせると、上記一定の比率で得られる高次構造に変換できること、従って、アンフォールディング／リフォールディング工程を繰り返すことにより、所定の活性を持つ高次構造を有する糖タンパク質を最大限に回収できることを見出した。【００２５】
即ち、本発明は、
アミノ酸配列、糖鎖構造、及び高次構造が均一な糖タンパク質を製造する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質をフォールディングさせる工程；
（ｂ）前記フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって、分画する工程；及び
（ｃ）所定の活性を有する画分を回収する工程
を含む、方法を提供する。【００２６】
上記方法においては、
前記工程（ｃ）の後に、
（ｄ）前記工程（ｃ）で回収されなかった画分に含まれる糖タンパク質をアンフォールディングさせる工程；
（ｅ）前記アンフォールディングさせた糖タンパク質を再度フォールディングさせる工程；
（ｆ）前記再度フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって分画し、前記所定の活性を有する画分を回収する工程；及び
（ｇ）必要に応じて（ｄ）から（ｆ）を繰り返す工程
をさらに含むことが好ましい。【００２７】
本発明はまた、
所定の生理活性を有する糖タンパク質をスクリーニングする方法であって、以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質をフォールディングさせる工程；
（ｉｉ）前記フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって分画する工程；及び
（ｉｉｉ）各画分の活性を測定し、所定の活性を有するか否か判定する工程
を含む方法を提供する。【００２８】
本発明はまた、
所望の生理活性を有する糖タンパク質混合物を得る方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質をフォールディングさせる工程；
（Ｂ）前記フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって分画する工程；
（Ｃ）各画分の活性を測定する工程；及び
（Ｄ）所望の活性を得るための各画分の混合比率を求め、当該比率に従って各画分を混合する工程
を含む方法を提供する。【００２９】
本発明に係る糖タンパク質の製造方法、糖タンパク質のスクリーニング方法、または所望の生理活性を有する糖タンパク質混合物を得る方法においては、
アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質は、少なくともその一部が以下の工程（１）〜（６）：
（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基、又は脂溶性保護基でアミノ基が保護された糖鎖付加したアミノ酸のカルボキシル基とをエステル化反応させる工程；
（２）前記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程；
（３）前記遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基、又は脂溶性保護基でアミノ基が保護された糖鎖付加したアミノ酸のカルボキシル基とをアミド化反応させる工程；
（４）前記工程（３）の後、脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程；及び
（５）前記工程（３）及び（４）の工程を１回以上繰り返す工程；および
（６）前記工程（１）で形成されたエステル結合を酸で切断する工程
を含む方法によって製造されることが好ましい。【００３０】
また、上記アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質の製造方法においては、
前記工程（１）〜（６）によって前記アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質の一部が製造される場合であって、当該糖タンパク質が、さらに、以下の工程（７）：
（７）前記工程（６）で得られた糖タンパク質の一部と、他のペプチド又は糖ペプチドとを、ライゲーション法によって連結する工程
を含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００３１】
本発明に係る糖タンパク質の製造方法によれば、アミノ酸配列、糖鎖構造に加えて、高次構造も均一な糖タンパク質を得られるので、血中半減期や細胞内での輸送にばらつきがないだけでなく、所定の生理活性を均一に有する糖タンパク質を製造することができる。【００３２】
また、本発明に係る糖タンパク質のスクリーニング方法によれば、高次構造が異なるために生理活性にばらつきが生じている糖タンパク質群から、所定の生理活性を均一に有する糖タンパク質を選択することができる。当該糖タンパク質は、糖鎖構造が均一であることから、血中半減期や、細胞内での輸送といった糖鎖に基づく機能も均一である。【００３３】
また、本発明によれば、糖タンパク質の混合物が所望の活性を有するように制御することが可能となる。【００３４】
本発明によるこれらの効果は、特に糖タンパク質を医薬品として用いる場合に有利である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ｓｉｌｖｅｒ  ｐｈｅａｓａｎｔのオボムコイド第３ドメイン（ＯＭＳＶＰ３）と、その化学合成に用いるフラグメント１〜３のアミノ酸配列を示す。
【図２】ＯＭＳＶＰ３の化学合成に用いるフラグメント１（チオエステル体）を示す。
【図３】糖鎖を有するＯＭＳＶＰ３の化学合成に用いるフラグメント２（チオエステル体）を示す。
【図４】ＯＭＳＶＰ３の化学合成に用いるフラグメント３を示す。
【図５】フラグメント１合成時の各段階における波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。
【図６】フラグメント２合成時の各段階における波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。
【図７】フラグメント３合成時の各段階における波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。
【図８】フラグメント２及びフラグメント３のＮＣＬ法による連結の各段階における波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。
【図９】フラグメント２及び３と、フラグメント１とのＮＣＬ法による連結の各段階における波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。
【図１０】糖鎖を有するＯＭＳＶＰ３をフォールディングさせた後、ＨＰＬＣで分離したときの波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。
【図１１】図１０の画分ＢのＮＭＲスペクトルを示す。
【図１２】図１０の画分ＢのＣＤスペクトルを示す。
【図１３】図１０の各画分のキモトリプシンに対する阻害活性の測定結果を示す。
【図１４】糖鎖を有しないＯＭＳＶＰ３の化学合成に用いるフラグメント２’（チオエステル体）を示す。
【図１５】フラグメント２’合成時の各段階における波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。
【図１６】フラグメント２’及びフラグメント３のＮＣＬ法による連結の各段階における波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。
【図１７】フラグメント２’及び３と、フラグメント１とのＮＣＬ法による連結の各段階における波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。
【図１８】糖鎖を有しないＯＭＳＶＰ３をフォールディングさせた後、ＨＰＬＣで分離したときの波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。
【図１９】図１８の画分ＦのＮＭＲスペクトルを示す。
【図２０】図１８の画分ＦのＣＤスペクトルを示す。
【図２１】図１８の各画分のキモトリプシンに対する阻害活性の測定結果を示す。
【図２２】画分Ｆの検量線を示す。
【図２３】画分Ａ−Ｄのキモトリプシンに対する阻害率を示す。
【図２４】画分Ａ−ＤのＩＣ５０値を示す。
【図２５】画分Ｅ−Ｈのキモトリプシンに対する阻害率を示す。
【図２６】画分Ｅ−ＨのＩＣ５０値を示す。
【図２７】画分Ｂの温度変化によるＣＤスペクトルを示す。
【図２８】画分Ｆの温度変化によるＣＤスペクトルを示す。
【図２９】画分Ｂに対するＴｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ消化における波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。
【図３０】画分Ｂに対するＴｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ消化後のペプチド断片の質量分析結果を示す。
【図３１】画分Ｆに対するＴｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ消化における波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。
【図３２】画分Ｆに対するＴｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ消化後のペプチド断片の質量分析結果を示す。
【図３３】画分Ｂに対するＴｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ消化によるジスルフィド結合の位置決定の結果を示す。
【図３４】画分Ｆに対するＴｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ消化によるジスルフィド結合の位置決定の結果を示す。
【図３５】基質ペプチドの検量線を示す。
【図３６】基質ペプチドのＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ  ｐｌｏｔを示す。
【図３７】基質ペプチドの単位時間当たりの反応速度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
【００３７】
本明細書において、「タンパク質」とは、複数のアミノ酸がアミド結合により結合しているものであれば特に限定されず、公知タンパク質及び新規タンパク質並びにタンパク質改変体を含む。好ましい態様において、本発明の製造方法で得られる糖タンパク質におけるタンパク質部分は、天然型と同じアミド結合（ペプチド結合）で複数のアミノ酸が結合している。本明細書におけるタンパク質は、フォールディングさせることによって所定の高次構造を取り得る長さを有するものである。
【００３８】
本明細書において、「タンパク質改変体」とは、タンパク質を天然又は人工的に改変した化合物であり、そのような改変としては、例えば、タンパク質の１又は複数のアミノ酸残基の、アルキル化、アシル化（例えばアセチル化）、アミド化（例えば、タンパク質のＣ末端のアミド化）、カルボキシル化、エステル形成、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、水酸化、標識成分の結合等が挙げられる。
【００３９】
なお、本明細書において、用語「ペプチド」は、原則としてタンパク質と同義で用いられるが、タンパク質の一部や、高次構造をとらない比較的短いアミノ酸鎖を指すために用いられる場合もある。
【００４０】
本明細書において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸、例えばセリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｒ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）のみならず、アミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えばＬ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体等の化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチン等生体内でタンパク質の構成材料とならないアミノ酸；及び当業者に公知のアミノ酸の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。非天然アミノ酸の例としては、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニン等）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン及びα−メチル−ヒスチジン等）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸等）があげられる。
【００４１】
好ましい態様において、本発明の製造方法で得られる糖タンパク質のタンパク質部分は、全て生体内にタンパク質又は糖タンパク質の構成アミノ酸として存在するアミノ酸からなる。
【００４２】
本明細書において、「糖タンパク質」とは、前記のタンパク質に少なくとも１つの糖鎖が付加された化合物であれば特に限定されず、公知の糖タンパク質及び新規の糖タンパク質を含む。なお、本明細書において、用語「糖ペプチド」は、原則として糖タンパク質と同義で用いられるが、糖タンパク質の一部や、上記ペプチドに糖鎖が結合したものを指す場合もある。
【００４３】
好ましい態様において、本発明の製造方法で得られる糖タンパク質は、Ｎ結合型糖鎖又はＯ結合型糖鎖を有するタンパク質であり、例えば、エリスロポエチン、インターロイキン、インターフェロン−β、抗体、単球走化性因子タンパク質−３（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−３、ＭＣＰ−３）、オボムコイドタンパク質等のペプチドの一部分又は全部が挙げられる。
【００４４】
糖タンパク質において、糖鎖とタンパク質中のアミノ酸残基とは、直接結合していても、リンカーを介して結合していてもよい。糖鎖とアミノ酸との結合部位に特に制限はないが、糖鎖の還元末端にアミノ酸が結合していることが好ましい。
【００４５】
糖鎖が結合するアミノ酸の種類は特に限定されず、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のいずれに結合していてもよい。糖タンパク質が生体内に存在する糖タンパク質と同一又は類似の構造を有するという観点からは、糖鎖は、Ｎ結合型糖鎖のようにＡｓｎに結合していること、又はＯ結合型糖鎖のようにＳｅｒ若しくはＴｈｒに結合していることが好ましい。特に、Ｎ結合型糖鎖の場合、本発明の製造方法により得られる糖タンパク質は、Ａｓｎに糖鎖が結合し、該ＡｓｎのＣ末端側にプロリン以外のアミノ酸（Ｘ）がアミド結合（ペプチド結合）し、さらに該ＸのＣ末端側にＴｈｒ又はＳｅｒがアミド結合（ペプチド結合）した構造（−糖Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ−）を有する糖タンパク質であることが好ましい。  糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとの結合容易性という観点からは、糖鎖が結合するアミノ酸は：アスパラギン酸やグルタミン酸等の分子内に２以上のカルボキシル基を持つアミノ酸；リシン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン等の分子内に２以上のアミノ基を持つアミノ酸；セリン、トレオニン、チロシン等の分子内に水酸基を持つアミノ酸；システイン等の分子内にチオール基を持つアミノ酸；又はアスパラギン、グルタミン等の分子内にアミド基を持つアミノ酸が好ましい。特に、反応性の観点からは、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン又はグルタミンが好ましい。
【００４６】
糖タンパク質において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとしては、当該分野において用いられているものを広く使用することができるが、例えば：
−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ａ−ＣＨ２−
（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）；
Ｃ１−１０ポリメチレン；
−ＣＨ２−Ｒ３−
（ここで、Ｒ３は、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基及び置換された複素環基からなる群より選択される基から水素原子が１つ脱離して生ずる基である）；
等を挙げることができる。
【００４７】
本明細書中において、「糖鎖」とは、単位糖（単糖及び／又はその誘導体）が２つ以上連なってできた化合物の他、１つの単位糖（単糖及び／又はその誘導体）からなる化合物をも含む。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される単糖類及び多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸並びにそれらの複合体及び誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解又は誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。単位糖が２つ以上連なる場合、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。糖鎖は直鎖型であっても分岐鎖型であってもよい。
【００４８】
また、本明細書中において、「糖鎖」には糖鎖の誘導体も含まれ、糖鎖の誘導体としては、例えば、糖鎖を構成する糖が、カルボキシル基を有する糖（例えば、Ｃ−１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルクロン酸））、アミノ基又はアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなど）、アミノ基及びカルボキシル基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ−アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２−デオキシ−Ｄ−リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などである糖鎖が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４９】
本発明の糖鎖は、好ましくは、生体内で複合糖質（糖タンパク質（又は糖ペプチド）、プロテオグリカン、糖脂質等）として存在する糖鎖であり、好ましくは、生体内で糖タンパク質（又は糖ペプチド）としてタンパク質（又はペプチド）に結合している糖鎖であるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖等である。Ｏ−結合型糖鎖が結合している糖タンパク質においては、ペプチドのＳｅｒ又はＴｈｒにＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、キシロース、フコース等がＯ−グリコシド結合で結合し、これにさらに糖鎖が付加する。Ｎ結合型糖鎖としては、例えば、高マンノース（ハイマンノース）型、複合（コンプレックス）型、混成（ハイブリッド）型を挙げることができ、複合型が好ましい。
【００５０】
本発明において、好ましい糖鎖としては、例えば、下記式（４）で表される糖鎖である。
【化１】
0005530358.tif 000002
［式中、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、水素原子、又は、式（５）〜（８）で示される基である。］
【００５１】
【化２】
0005530358.tif 000003
【００５２】
【化３】
0005530358.tif 000004
【００５３】
【化４】
0005530358.tif 000005
【００５４】
【化５】
0005530358.tif 000006
【００５５】
本発明の糖タンパク質の製造方法を、医薬品等の製造の分野に適用することを考慮した場合に抗原性等の問題を回避し得るという観点からは、好ましい糖鎖としては、例えば、ヒト体内において、タンパク質と結合した糖タンパク質として存在する糖鎖（例えば、ＦＥＢＳ  ＬＥＴＴＥＲＳ  Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．３，Ｆｅｂ．１９７５に記載の糖鎖）と、同一の構造を有する糖鎖（構成糖の種類及びそれらの結合様式が同一の糖鎖）又はこれの非還元末端から１又は複数の糖を失った糖鎖を挙げることができる。
【００５６】
糖タンパク質における、糖鎖の付加数は、１鎖以上であれば特に限定されないが、生体内に存在する糖タンパク質と類似した構造の糖タンパク質を提供するという観点からは、体内に存在する糖タンパク質と同程度の付加数であれば、より好ましいであろう。
【００５７】
本発明に係る糖タンパク質の製造方法では、アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質が用いられる。本発明において、糖タンパク質における糖鎖の構造が均一であるとは、糖タンパク質間で比較した場合に、ペプチド中の糖鎖付加部位、糖鎖を構成する各糖の種類、結合順序、及び糖間の結合様式が、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の糖鎖において同一であることをいう。
【００５８】
また、本発明において、糖タンパク質におけるアミノ酸配列が均一であるとは、糖タンパク質間で比較した場合に、タンパク質中のアミノ酸の種類、結合順序、及びアミノ酸間の結合様式が同一であることをいう。ただし、糖タンパク質をフォールディングさせたときに所定の活性を有する限り、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の糖タンパク質において同一であればよい。
【００５９】
本発明に用いられる、アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質は、固相合成、液相合成、細胞による合成、天然に存在するものを分離抽出する方法等、当業者に公知のペプチド製造方法に、糖鎖付加工程を組み込むことで製造することができる。糖鎖付加工程で用いる糖鎖の製造方法に関しては、例えば、国際公開番号ＷＯ０３／００８４３１、ＷＯ２００４／０５８９８４、ＷＯ２００４／００８４３１、ＷＯ２００４／０５８８２４、ＷＯ２００４／０７００４６、ＷＯ２００７／０１１０５５等を参照することができる。
【００６０】
本発明の好ましい態様においては、アミノ酸及び糖鎖が均一な糖タンパク質は、少なくともその一部が、以下に示す方法によって製造される。以下に示す方法においては、ＷＯ２００４／００５３３０パンフレットも参照することができる。
【００６１】
まず、（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基、又は脂溶性保護基でアミノ基が保護された糖鎖付加したアミノ酸のカルボキシル基とをエステル化反応させる。この場合アミノ酸のアミノ基を脂溶性保護基で保護しているので、アミノ酸同士の自己縮合は防止され、レジンの水酸基とアミノ酸のカルボキシル基との間でエステル化反応が起こる。
【００６２】
次に、（２）工程（１）で得られたエステルの脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（３）上記遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基、又は脂溶性保護基でアミノ基が保護された糖鎖付加したアミノ酸のカルボキシル基とをアミド化反応させ、
（４）工程（３）の後、脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ
（５）工程（３）及び（４）の工程を必要に応じて繰り返すことにより、所望の数のアミノ酸が連結し、所望の位置に１つ以上の糖鎖が付加した糖タンパク質を得ることができる。なお、糖鎖付加したアミノ酸としては、例えば、アスパラギン側鎖のアミド基の窒素に糖鎖がＮ−グリコシド結合した糖鎖アスパラギン、セリン又はトレオニン側鎖の水酸基に糖鎖がＯ−グリコシド結合した糖鎖セリン又は糖鎖トレオニンが挙げられる。
【００６３】
工程（５）で得られる糖タンパク質は、一端がレジンに結合し、もう一端に遊離アミノ基を有する。そこで、（６）工程（１）で形成されたエステル結合を酸で切断することにより、所望の糖タンパク質を製造することができる。
【００６４】
固相樹脂（レジン）としては、通常、固相合成で使用する樹脂（レジン）であればよく、例えば、Ａｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）、Ｗａｎｇレジン（メルク社製）、ＨＭＰＡ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）、Ｔｒｔ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅレジン（メルク社製）等を用いることができる。
【００６５】
また、Ａｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（樹脂）とアミノ酸との間にリンカーを存在させてもよく、このようなリンカーとして、例えば、４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸（ＨＭＰＡ）、４−（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ）−ブチル酢酸（ＨＭＰＢ）等を挙げることができる。
【００６６】
脂溶性保護基としては、例えば、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）基等のカルボニル含有基、アセチル（Ａｃ）基等のアシル基、アリル基、ベンジル基等の保護基を挙げることができるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００６７】
脂溶性保護基を導入するには、例えばＦｍｏｃ基を導入する場合には９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミジルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１〜５時間程度行うのが良い。
【００６８】
脂溶性保護基で保護したアミノ酸としては、既出のアミノ酸を上記の方法で保護したものを用いることができる。また、市販のものも使用することができる。例えば、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏを挙げることができる。
【００６９】
エステル化触媒として、例えば１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。アミノ酸と脱水縮合剤との使用割合は、前者１重量部に対して、後者が、通常１〜１０重量部、好ましくは２〜５重量部である。
【００７０】
エステル化反応は、例えば、固相カラムにレジンを入れ、このレジンを溶剤で洗浄し、その後アミノ酸の溶液を加えることにより行うのが好ましい。洗浄用溶剤としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２−プロパノール、塩化メチレン等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。エステル化反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０分〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。
【００７１】
この時固相上の未反応の官能基を、無水酢酸等を用いてアセチル化してキャッピングすることも好ましい。
【００７２】
脂溶性保護基の脱離は、例えば塩基で処理することにより行うことができる。塩基としては、例えばピペリジン、モルホリン等を挙げることができる。その際、溶媒の存在下行うのが好ましい。溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール等を挙げることができる。
【００７３】
遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とのアミド化反応は、活性化剤及び溶媒の存在下行うのが好ましい。
【００７４】
活性化剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ／ＨＣｌ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ）、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、３−ジエトキシホスホリルオキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−５−アザベンゾ−１，２，３−トリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ヒドロキシフタルイミド（ＨＯＰｈｔ）、ペンタフルオロフェノール（Ｐｆｐ−ＯＨ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスホネート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）等を挙げることができる。
【００７５】
活性化剤の使用量は、脂溶性の保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、１〜２０当量、好ましくは１〜１０当量、さらに好ましくは、１〜５当量とするのが好ましい。
【００７６】
上記活性化剤のみでも反応は進行するが、補助剤としてアミンを併用することが好ましい。アミンとしては、例えば、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、Ｎ−エチルモルホリン（ＮＥＭ）、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）、Ｎ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）等を用いることができる。補助剤の使用量は、脂溶性の保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、１〜２０当量、好ましくは１〜１０当量、さらに好ましくは、１〜５当量とするのが好ましい。
【００７７】
溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０分〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。この際にも固相上の未反応のアミノ基を無水酢酸等を用いてアセチル化しキャッピングするのが好ましい。脂溶性保護基の脱離は、上記と同様に行うことができる。
【００７８】
レジン（樹脂）からペプチド鎖を切断するには酸で処理するのが好ましい。酸としては、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、弗化水素（ＨＦ）等を挙げることができる。その際、アミノ酸に使用していた脂溶性保護基およびレジン（樹脂）上のリンカーから、反応性の高いカチオン種が生成する場合があるため、このものを捕獲するため求核性試薬を添加することが好ましい。求核性試薬としてはトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、フェノール、チオアニソール、エタンジチオール（ＥＤＴ）等を挙げることができる。
【００７９】
アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質は、いくつかのペプチドブロック又は糖ペプチドブロックに分け、それぞれを工程（１）〜（６）によって合成した後、ライゲーション法によって連結して製造することもできる。
【００８０】
本明細書において「ライゲーション法」とは、国際公開第９６／３４８７８号パンフレットに記載された天然型化学的ライゲーション法（Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ、ＮＣＬ法）をはじめとし、非天然アミノ酸やアミノ酸誘導体を含むペプチドについて、天然型化学的ライゲーション法を応用する場合も含む。ライゲーション法によれば、連結部位に天然アミド結合（ペプチド結合）を有するタンパク質を製造することができる。
【００８１】
ライゲーションを用いた連結は、ペプチド−ペプチド間、ペプチド−糖ペプチド間、糖ペプチド−糖ペプチド間のいずれにおいても行うことができるが、連結される２つのペプチド又は糖ペプチドの一方がＮ末端にシステイン残基を有し、他方がＣ末端にαカルボキシチオエステル部分を有していることが必要である。
【００８２】
各ペプチド又は糖ペプチドブロックが、Ｎ末端にシステイン残基を有するようにするためには、例えば、各ペプチド又は糖ペプチドブロックを設計する際に、最終的に製造する糖タンパク質に含まれるシステイン残基のＮ末端側で分割すればよい。
【００８３】
Ｃ末端にαカルボキシチオエステル部分を有するようにしたペプチド又は糖ペプチドブロックは、国際公開番号ＷＯ９６／３４８７８の記載された方法等、当業者に公知の手法を用いて製造することができる。
【００８４】
例えば、後述の実施例に記載のように、固相合成法によって、アミノ酸側鎖とＮ末端のアミノ基が保護された保護ペプチド（又は糖ペプチド）を得て、このＣ末端側のカルボキシル基を、液相中において縮合剤にＰｙＢＯＰ（Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ−ｏｘｙ−ｔｒｉｓ−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）／ＤＩＰＥＡを用いてベンジルメルカプタンと縮合させ、その後、９５％ＴＦＡ溶液を用いて脱保護することで、Ｃ末端にα−カルボキシチオエステル部分を有するようにしたペプチド（又は糖ペプチド）を得ることができる。
【００８５】
ライゲーション法は、特許文献１に記載のような当業者に公知の手法を用いて、また、後述の実施例の記載を参照して実施することができる。例えば、Ｃ末端に−Ｃ（＝Ｏ）−ＳＲにより表されるα−カルボキシチオエステル部分を有するようにした第１のペプチドと、Ｎ末端に−ＳＨ基を有するアミノ酸残基を有する第２のペプチドとを上述の記載を参照して用意する。なお、第１のペプチドにおいて、Ｒはチオール交換反応を阻害せず、カルボニル炭素への求核置換反応において脱離基となる基であれば特に限定されないが、好ましくはベンジルメルカプタン等のベンジル型、チオフェノール、４−（カルボキシメチル）−チオフェノール等のアリール型、２−メルカプトエタンスルホン酸塩、３−メルカプトプロピオン酸アミド等のアルキル型等から選択することができる。また、第２のペプチドのＮ末端の−ＳＨ基は、所望により保護基により保護されていてもよいが、この保護基は以下のライゲーション反応までの所望の時点で脱保護し、Ｎ末端に−ＳＨ基を有する第２のペプチドが、第１のペプチドと反応する。例えばジスルフィド基等、ライゲーションが起こる条件において自然に脱保護される保護基であれば、保護基により保護した第２のペプチドをそのまま以下のライゲーション反応に用いることもできる。
【００８６】
これらの２つのペプチドを、必要に応じ、４−メルカプトフェニル酢酸、ベンジルメルカプタン、チオフェノール等の触媒チオールの存在下、１００ｍＭリン酸緩衝溶液等の溶液中で混合する。好ましくは、第１のペプチド１当量に対し第２のペプチドを０．５〜２当量及び触媒チオールを５当量程度の割合で反応を行う。反応はｐＨ６．５〜７．５程度、２０〜４０℃程度の条件下、約１〜３０時間程度行うのが望ましい。反応の進行は、ＨＰＬＣ、ＭＳ等を組み合わせた公知の手法を用いて確認することができる。
【００８７】
これに、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス２−カルボキシエチルホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）のような還元剤を加えて副反応を抑制し、所望により精製することで、第１のペプチドと第２のペプチドとを連結することができる。
【００８８】
なお、Ｃ末端にカルボキシチオエステル部分（−Ｃ＝Ｏ−ＳＲ）を有するようにしたペプチドにおいて、Ｒ基の異なるペプチドが存在する場合、ライゲーション反応の順序を操作することが可能であり（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７），１６：２０５６−２０６４等参照）、複数回のライゲーションを行う場合にはこれを考慮することができる。例えば、Ｒとしてアリール基、ベンジル基及びアルキル基が存在する場合には、一般に、この順に、連結反応が進行する。
【００８９】
本明細書において、タンパク質の「高次構造」とは、αへリックスやβシート構造などの２次構造、またはランダムコイル等の構造、２次構造が水素結合、ジスルフィド結合、イオン結合、疎水性相互作用などにより空間的に折りたたまれて、安定なコンフォメーションを形成した３次構造、複数のポリペプチド鎖がサブユニットとして集合して形成される４次構造を含む、タンパク質の立体構造をいう。タンパク質の高次構造は、タンパク質が生体内で機能を発揮するために必要な構造であることが好ましい。タンパク質の高次構造は、Ｘ線結晶構造解析やＮＭＲ等により解析することができる。
【００９０】
本明細書において、糖タンパク質の高次構造が均一とは、糖タンパク質のタンパク質部分の高次構造を、糖タンパク質間で比較した場合に、実質的に同一であることをいう。高次構造が実質的に同一であるとは、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の構造が均一であることを言う。高次構造が均一の糖タンパク質は、品質が一定であり、特に医薬品の製造や、アッセイなどの分野において好ましい。ある画分に含まれる糖タンパク質の高次構造が均一であるか否かは、例えば、ＮＭＲ解析、ＣＤ測定、ジスルフィドマッピング等によって確認することができる。
【００９１】
本明細書において「フォールディング」とは、糖タンパク質のタンパク質部分が特定の高次構造に折りたたまれることをいう。糖タンパク質のフォールディングは、公知の方法またはそれに順ずる方法に従って当業者は適宜行うことができるが、例えば、透析法と希釈法、失活法等が挙げられる。透析法は、予めタンパク質変性剤（アンフォールディング剤）を加えておき、これを透析によって徐々に希釈して緩衝液等に置き換えることにより、ペプチドを所定の高次構造にフォールディングさせる方法である。アンフォールディング剤としては、塩酸グアニジン、尿素等が挙げられる。また、希釈法は、タンパク質変性剤を加えた後、緩衝液などで段階的あるいは一度に希釈することでペプチドを高次構造にフォールディングさせる方法である。失活法とは、タンパク質変性剤を加えた後、段階的あるいは一度にこの変性剤を失活させる第２の剤を加えることでペプチドを高次構造にフォールディングさせる方法である。
【００９２】
本発明において「所定の生理活性」とは、フォールディングさせたときに、一定の比率で再現性よく得られる高次構造を有する糖タンパク質の生理活性の中から選択することができる。かかる生理活性は、予め対象とする糖タンパク質を、後述する工程（ａ）及び工程（ｂ）と同様の方法でフォールディングさせ、カラムクロマトグラフィーによって分画し、主なピークに対応する流出液を回収し、その画分に含まれる糖タンパク質の生理活性を測定することによって求めることができる。ここで、主なピークとは、工程（ａ）及び工程（ｂ）を繰り返し行った場合に、再現性よく得られるピークを意味する。生理活性の測定は、対象となる糖タンパク質に応じて、当業者に公知の方法で行うことができる。
【００９３】
本発明に係る「アミノ酸配列、糖鎖構造、及び高次構造が均一な糖タンパク質の製造方法」では、まず工程（ａ）において、アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質をフォールディングさせる。フォールディング後の糖タンパク質を含む溶液には、高次構造の異なる糖タンパク質が混在し、所定の活性を有するものと有しないものが含まれる。
【００９４】
次に、工程（ｂ）において、フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって分画する。カラムクロマトグラフィーは、高次構造の異なる糖タンパク質を分離できるものである限り特に限定されないが、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。カラムクロマトグラフィーの固定相、移動相の種類、流出速度等の条件は、分離する糖タンパク質に応じて、当業者が適宜選択することができるが、例えば、ＯＤＳタイプの逆相クロマトグラフィー、順相系カラム、アフィニティーカラム、ゲルろ過カラム、イオン交換カラム等を用いることができる。
【００９５】
工程（ｃ）において、カラムクロマトグラフィーの溶出液の各画分に含まれる糖タンパク質の活性を測定し、所定の活性を有する画分を回収することによって、アミノ酸配列、糖鎖構造、及び高次構造が均一な糖タンパク質を得ることができる。
【００９６】
本発明に係る糖タンパク質製造方法では、工程（ｃ）の後、（ｄ）前記工程（ｃ）で回収されなかった画分に含まれる糖タンパク質をアンフォールディングさせ、
（ｅ）前記アンフォールディングさせた糖タンパク質を再度フォールディングさせ、
（ｆ）前記再度フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって分画し、前記所望の活性を有する画分を回収し、
（ｇ）必要に応じて（ｄ）から（ｆ）を繰り返すことも好ましい。
【００９７】
工程（ｄ）でアンフォールディングされる糖タンパク質が含まれる画分には、所定の活性を有しない高次構造も含まれる。また、所定の活性を有する糖タンパク質が２以上混在している画分も、所定の活性値を示さないため、アンフォールディングされる画分に含まれる。
【００９８】
糖タンパク質のアンフォールディングは、当業者に公知の方法を用いて行うことができるが、例えば、塩酸グアニジン、尿素等のアンフォールディング剤（タンパク質変性剤）を添加する方法、また、これらに加えてジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール等の還元剤を添加する手法も挙げられる。
【００９９】
工程（ｅ）及び工程（ｆ）は、上記工程（ａ）乃至工程（ｃ）と同様の方法で行うことができる。
【０１００】
このように工程（ｄ）から工程（ｆ）を行うことによって、所定の活性を有しない画分に含まれる糖タンパク質が、いったん巻き戻され、再度折りたたまれることによって、一定の比率で所定の活性を有する高次構造に変換されうる。こうして、所定の活性を有する高次構造をとる糖タンパク質を、最大限回収することができる。
【０１０１】
本発明に係る「糖タンパク質のスクリーニング方法」は、（ｉ）アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質をフォールディングさせ、
（ｉｉ）前記フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって分画し、
（ｉｉｉ）各画分の活性を測定し、所定の活性を有するか否か判定する。
【０１０２】
工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）は、上記工程（ａ）及び工程（ｂ）と同様に行うことができる。上述のとおり、アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質をフォールディングした後の糖タンパク質溶液には、複数の高次構造をとる糖タンパク質が混在している。従って、カラムクロマトグラフィーによって分画した後、各画分の活性を測定し、所定の活性を有するか否か判定することによって、所定の生理活性を有する均一な高次構造を有する糖タンパク質のみを選択し精製することができる。
【０１０３】
さらに、本発明は、所望の生理活性を有する糖タンパク質混合物を得る方法を提供する。同方法は、（Ａ）アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質をフォールディングさせ、
（Ｂ）前記フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって分画し、
（Ｃ）各画分の活性を測定し、
（Ｄ）所望の活性を得られる各画分の混合比率を求め、当該比率に従って各画分を混合することを含む。
【０１０４】
工程（Ａ）及び工程（Ｂ）は、上記工程（ａ）及び工程（ｂ）と同様に行うことができる。工程（Ａ）及び工程（Ｂ）によって、アミノ酸配列、糖鎖構造、及び高次構造が均一で、所定の活性を有する糖タンパク質を得ることができる。従って、これらを所定の比率で混合することによって、所望の生理活性を有する糖タンパク質混合物を得ることが可能である。
【０１０５】
なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、  例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
【０１０６】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【０１０７】
<実施例１>  ｓｉｌｖｅｒ  ｐｈｅａｓａｎｔのオボムコイド第３ドメイン（以下、「ＯＭＳＶＰ３」と記載することもある。）の化学合成【０１０８】
１．アミノ酸配列及び糖鎖が均一なｓｉｌｖｅｒ  ｐｈｅａｓａｎｔのオボムコイド第３ドメインの化学合成
図１に示される３つのフラグメントをそれぞれ合成した後、ＮＣＬ法によってライゲーションを行って、アミノ酸配列及び糖鎖が均一なｓｉｌｖｅｒ  ｐｈｅａｓａｎｔのオボムコイド第３ドメインを合成した。フラグメント１〜３を図２〜４に示す。【０１０９】
［使用した装置］
１Ｈ−ＮＭＲはＢｒｕｋｅｒのＡＶＡＮＣＥ  ６００（６００ＭＨｚと表記）で測定した。ＥＳＩマススペクトル測定には、Ｂｒｕｃｋｅｒ  ＤａｌｔｏｎｉｃｓのＥｓｑｕｉｒｅ３０００ｐｌｕｓ．を用いた。
ＣＤスペクトル測定には、ＪＡＳＣＯのＪ−８２０、Ｊ−８０５を用いた。
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析装置はＷａｔｅｒｓ社製のものを、ＵＶ検出器はＷａｔｅｒｓ製のＷａｔｅｒｓ４８６とｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ  ａｒｒａｙ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｗａｔｅｒｓ  ２９９６）とＷａｔｅｒｓ２４８７を、カラムはＣａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｉｍｔａｋｔ  Ｃｏｒｐ．，３μｍ，４．６×７５ｍｍ）とＶｙｄａｃＣ−１８（５μｍ，４．６×２５０ｍｍ，１０×２５０ｍｍ），ＶｙｄａｃＣ−８（５μｍ，１０×２５０ｍｍ），ＶｙｄａｃＣ−４（５μｍ，４．６×２５０ｍｍ）を使用した。【０１１０】
［フラグメント１の合成］
固相合成用カラムに２−Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ  ｒｅｓｉｎ（１４３ｍｇ、２００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、で十分に洗浄した。別途、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ（２１２．１ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（２７２．１μＬ、１．６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．２ｍＬ）に溶解させたものを、樹脂の入った固相合成用カラムに入れ、室温で２時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＤＩＰＥＡ＝１７：２：１、ＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。次いで、Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、Ｋａｉｓｅｒ  Ｔｅｓｔにより反応を確認し、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１１１】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（１３５．１ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（１５３．９μＬ、１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解させ１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れ、室温で１時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。アミノ基を保護したアミノ酸には、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、を用い、最後のアミノ酸は保護基が酸で除去できるＢｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ・Ｈ２Ｏ（２４９．３ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を用いた。固相樹脂上に、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｌｅｕの保護基を有する２３残基ペプチド（配列番号１）を得た。このものに、ＡｃＯＨ：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝５：４：１を（２ｍＬ）を加え、室温で３時間攪拌した。攪拌後、樹脂をろ過して除き、さらにＭｅＯＨにて樹脂の洗浄を行った。ろ液を別途用意したヘキサン中に加え、晶析を行った。ろ過後の結晶を過剰量のベンゼンで３回共沸した後、凍結乾燥を行った（図５上段。ただし脱保護して測定した。）。【０１１２】
得られたペプチド（保護基を有する配列番号１に記載の２３残基ペプチド）（３９ｍｇ、１０μｍｏｌ）とＭＳ４Ａ、ベンジルメルカプタン（３５．５μＬ、０．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ溶媒中（１．３５ｍＬ）、アルゴン気流下−２０℃で１時間攪拌した後、ＰｙＢＯＰ（２６ｍｇ、５０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（８．５μＬ、５０μｍｏｌ）を加え、２時間攪拌した。攪拌後、反応溶液に過剰量のジエチルエーテルを加え化合物を沈殿させ、ろ過した。その後に沈殿物をＤＭＦで溶解した。溶液を減圧下に濃縮した後、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＰＳ、２．５％Ｈ２Ｏ溶液（１ｍＬ）を加え室温で２時間攪拌した（図５中段）。反応溶液を減圧濃縮後、ＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ  ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）  １５分  流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製し、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＳＢｎのＣ末端がベンジルチオエステルである２３残基のペプチド（配列番号２）を得た（図５下段）。【０１１３】
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１１８Ｈ１８１Ｎ２７Ｏ３４Ｓ４：［Ｍ＋２Ｈ］２＋１３２６．０，Ｆｏｕｎｄ．１３２５．８【０１１４】
［フラグメント２の合成］
次いで、別の固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１ｇ、５０μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．１２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．１２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．１２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で２時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、Ｋａｉｓｅｒ  Ｔｅｓｔで反応を確認した。Ｋａｉｓｅｒ  Ｔｅｓｔ陰性（−）であることを確認し、樹脂をＤＣＭで１時間膨潤させた。ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、これを固相合成用の固相担体として用いた。【０１１５】
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（９６．９ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（７４ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（１４．９μｌ、０．１８８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１ｍＬ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、室温で２時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍＬ）で２０分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、Ｋａｉｓｅｒ  Ｔｅｓｔにより反応を確認し、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１１６】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（３３．８ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（３８．５μＬ、０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させ１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れ、室温で１時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍＬ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。アミノ基を保護したアミノ酸には、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、を用い、固相樹脂上に、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−Ｐｈｅの保護基を有する９残基ペプチド（配列番号３）を得た。この固相樹脂上の９残基ペプチド３μｍｏｌ相当を別の固相合成用カラムにとりＦｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍＬ）を用いて脱保護した。ＤＭＦにて十分洗浄を行った後、樹脂をエッペンチューブに移した。次いで、下記式（１）で表される糖鎖アスパラギン（１２ｍｇ、６μｍｏｌ）とＤＥＰＢＴ（３ｍｇ、１０μｍｏｌ）をＤＭＦ：ＤＭＳＯ＝４：１、０．２０ｍＬに溶解させ、エッペンチューブに入れ、ＤＩＰＥＡ（１．０２μＬ、６μｍｏｌ）を加えて室温で２０時間攪拌した。【０１１７】
【化６】
0005530358.tif 000007
攪拌後、樹脂を固相合成用カラムに移し、ＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍＬ）で２０分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後の糖ペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（２ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（２．３μＬ、０．０１５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．３７５ｍＬ）に溶解させ１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れ、室温で２時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍＬ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。アミノ基を保護したアミノ酸には、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）を用い、固相樹脂上にＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）―Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−Ｐｈｅの保護基を有する１４残基糖鎖付加ペプチド（配列番号４）を得た。このものに、酢酸：トリフルオロエタノール（＝１：１）１ｍＬを加え、室温で２０時間撹拌を行った。樹脂をろ過して除き、さらにＭｅＯＨで洗浄した後、ろ液を減圧下に濃縮後、ベンゼンを用いて共沸を３回行った。この残渣を溶解後、凍結乾燥を行った（図６上段。ただし脱保護して測定した。）。【０１１８】
得られたペプチド（保護基を有する配列番号４に記載の１４残基糖鎖付加ペプチド）（１１．７ｍｇ、３μｍｏｌ）とＭＳ４Ａ（１０ｍｇ）、ベンジルメルカプタン（１０．６μＬ、０．０９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ溶媒中（０．４１ｍＬ）、アルゴン気流下−２０℃で１時間攪拌した後、ＰｙＢＯＰ（７．８ｍｇ、１５μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（２．６μＬ、１５μｍｏｌ）を加え、２時間攪拌した。攪拌後、反応溶液に過剰量のジエチルエーテルを加え化合物を沈殿させ、ろ過後に沈殿物をＤＭＦで溶解した。溶液を減圧下に濃縮した後、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＰＳ、２．５％Ｈ２Ｏ溶液（１ｍＬ）を加え室温で２時間攪拌した（図６中段）。反応溶液を減圧下に濃縮後、ＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ  ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、  ７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分  流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製し、Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−ＳＢｎのＣ末端がベンジルチオエステルである保護基を有する１４残基糖鎖付加ペプチド（配列番号５）を得た（図６下段）。【０１１９】
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１３３Ｈ２０３Ｎ２３Ｏ６７Ｓ３：［Ｍ＋２Ｈ］２＋１６４７．１，Ｆｏｕｎｄ．１６４６．６【０１２０】
［フラグメント３の合成］
次いで、固相合成用カラムに２−Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ  ｒｅｓｉｎ（２００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、で十分に洗浄した。別途、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）（３５１．４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（２７２．１μＬ、１．６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．２ｍＬ）に溶解させたものを、樹脂の入った固相合成用カラムに入れ、室温で２時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＤＩＰＥＡ＝１７：２：１、ＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。次いで、Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、Ｋａｉｓｅｒ  Ｔｅｓｔにより反応を確認し、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１２１】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（１３５．１ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（１５３．９μＬ、１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解させ１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れ、室温で１時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。アミノ基を保護したアミノ酸には、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂上に、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）の保護基を有する１９残基ペプチド（配列番号６）を得た。このものに９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＰＳ、２．５％Ｈ２Ｏ溶液（３ｍＬ）を加え室温で２時間攪拌した後、樹脂をろ過して除き、ろ液を減圧下に濃縮した（図７上段）。これをＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ  ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分  流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製し、Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓの１９残基ペプチド（配列番号７）を得た（図７下段）。【０１２２】
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ８３Ｈ１３４Ｎ２４Ｏ２８Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋９９１．１，Ｆｏｕｎｄ．９９１．０【０１２３】
［フラグメント２とフラグメント３のＮＣＬ法によるライゲーション］
フラグメント３（配列番号７に記載の１９残基ペプチド）１．９ｍｇ（１μｍｏｌ）とフラグメント２（配列番号５に記載のＣ末端がベンジルチオエステルである保護基を有する１４残基の糖鎖付加ペプチド）３．２ｍｇ（１μｍｏｌ）との二種類を同じエッペンチューブにいれ、０．１％りん酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、６Ｍ  グアニジン塩酸塩含有）４８５μＬに溶解させた後、２５℃にてチオフェノール（１５μＬ）を加え、室温で反応を行った（図８の０ｈ）。２４時間後、反応終了をＨＰＬＣで確認した後（図８の２４ｈ）、反応溶液をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ  ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）  １５分  流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した（図８の精製後）。その後凍結乾燥を行い、Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓの保護基を有する３３残基糖鎖付加ペプチド（配列番号８）を得た。【０１２４】
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２０９Ｈ３２９Ｎ４７Ｏ９５Ｓ４：［Ｍ＋４Ｈ］４＋１２８７．２８，Ｆｏｕｎｄ．１２８７．６【０１２５】
得られたペプチド（配列番号８に記載の保護基を有する３３残基糖鎖付加ペプチド）を、０．２Ｍメトキシアミン水溶液（ｐＨ＝４．０）に溶解させた。４時間後、反応の終了をＨＰＬＣにて確認した後、ＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ  ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分  流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した（図８のチアゾリン脱保護）。その後凍結乾燥を行い、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓの３３残基糖鎖付加ペプチド（配列番号９）を得た。【０１２６】
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２０８Ｈ３２９Ｎ４７Ｏ９５Ｓ４：［Ｍ＋４Ｈ］４＋１２８４．２８，Ｆｏｕｎｄ．１２８４．５【０１２７】
なお、以下の条件でも同様に配列番号９に記載の３３残基糖鎖付加ペプチドが得られた。
フラグメント３（配列番号７に記載の１９残基ペプチド）１．９ｍｇ（１μｍｏｌ）とフラグメント２（配列番号５に記載のＣ末端がベンジルチオエステルである保護基を有する１４残基の糖鎖付加ペプチド）３．２ｍｇ（１μｍｏｌ）との二種類をそれぞれエッペンチューブにいれ、０．１％りん酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、６Ｍ  グアニジン塩酸塩含有）２４７．５μＬに溶解させた後、ひとつのエッペンチューブに合わせた。２５℃にて１％チオフェノール（５μＬ）を加え、室温で反応を行った。反応をＨＰＬＣと質量分析で追跡し、７時間後にＨＰＬＣでフラグメント３の消失を確認した。その後０．２Ｍのメトキシアミン水溶液を系中がｐＨ４付近になるまで加えてＮ末端のＣｙｓを脱保護した。６時間後反応の終了を質量分析で確認し、反応溶液をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ  ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）  １５分  流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した。その後凍結乾燥を行い、配列番号９の３３残基糖鎖付加ペプチドを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２０８Ｈ３２９Ｎ４７Ｏ９５Ｓ４：［Ｍ＋４Ｈ］４＋１２８４．２８，Ｆｏｕｎｄ．１２８４．５【０１２８】
［フラグメント１と、フラグメント２及び３とのＮＣＬ法によるライゲーション］
フラグメント２とフラグメント３をライゲーションすることによって調製した３３残基糖鎖付加ペプチド（配列番号９）１．３ｍｇ（０．２５μｍｏｌ）とフラグメント１（配列番号２に記載のＣ末端がベンジルチオエステルである２３残基ペプチド）１．３ｍｇ（０．５０μｍｏｌ）との二種類を同じエッペンチューブにいれ、０．１％りん酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、８Ｍ  グアニジン塩酸塩含有）４８５μＬに溶解させた後、２５℃にてチオフェノール（１５μＬ）を加え、室温で反応を行った（図９の０ｈ）。５４時間後、反応終了をＨＰＬＣで確認した後（図９の５４ｈ）。反応溶液をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ  ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分  流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した（図９下段）。その後凍結乾燥を行い、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓの５６残基糖鎖付加ペプチド（配列番号１０）を得た。【０１２９】
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３１９Ｈ５０２Ｎ７４Ｏ１２９Ｓ７：［Ｍ＋５Ｈ］５＋１５３２．４６，Ｆｏｕｎｄ．１５３２．７【０１３０】
なお、以下の条件でも同様に、５６残基糖鎖付加ペプチド（配列番号１０）を得ることができた。
配列番号９に記載の３３残基糖鎖付加ペプチド１．３ｍｇ（０．２５μｍｏｌ）とフラグメント１（配列番号２に記載のＣ末端がベンジルチオエステルである２３残基ペプチド）１．３ｍｇ（０．５０μｍｏｌ）との二種類をそれぞれエッペンチューブに入れ、０．１％りん酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、８Ｍ  グアニジン塩酸塩含有）２４７．５μＬに溶解させた後、ひとつのエッペンチューブに合わせた。反応をＨＰＬＣと質量分析で追跡し、３０時間後に、反応溶液をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ  ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分  流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した。【０１３１】
［糖タンパク質のフォールディング］
このようにして調製した５６残基糖鎖付加ペプチド（配列番号１０）０．５ｍｇ（６５．２ｎｍｏｌ）をエッペンチューブに取り、０．６Ｍトリス緩衝液（ｐＨ＝８．７、０．６Ｍグアニジン塩酸塩、６ｍＭ  ＥＤＴＡ含有）１００μＬに溶解した。蒸留水５００μＬを加え希釈して、糖鎖を有するオボムコイド第３ドメインをフォールディングさせた。【０１３２】
［ＨＰＬＣによる分画］
３６時間後、反応の進行をＨＰＬＣと質量分析にて確認した後、ＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ  ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分  流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した。高次構造を有したＬｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓの５６残基糖鎖付加ペプチド（配列番号１０）が含まれる４つの画分Ａ〜Ｄを得た（図１０）。【０１３３】
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３１９Ｈ５０２Ｎ７４Ｏ１２９Ｓ７：［Ｍ＋５Ｈ］５＋１５３２．２，［Ｍ＋４Ｈ］４＋１９１５．０，［Ｍ＋３Ｈ］３＋２５５３．０，
Ａ；Ｆｏｕｎｄ．１５３２．５，１９１５．２，２５５３．２
Ｂ；Ｆｏｕｎｄ．１５３２．５，１９１５．２，２５５３．２
Ｃ；Ｆｏｕｎｄ．１５３２．６，１９１５．３，２５５３．２
Ｄ；Ｆｏｕｎｄ．１５３２．７，１９１５．４，２５５３．３
図９下段から図１０へのピークの変化、および、質量の減少は、上述のフォールディング工程により、ジスルフィド結合が形成されたことを示す。【０１３４】
なお、反応をＨＰＬＣと質量分析で追跡し、質量分析で分子量変化とＨＰＬＣでピークのリテンションタイムが変化したことを確認することにより、反応時間を適宜変更（例えば、２４時間）することができる。【０１３５】
画分ＢのＮＭＲ測定：凍結乾燥後の画分Ｂを５％Ｄ２Ｏ／Ｈ２Ｏ（３００μｌ）に溶かし２５℃、６０ｍｓ、６００ＭＨｚで２Ｄ  ＴＯＣＳＹを測定した。ＮＭＲスペクトルを図１１に示す。
画分ＢのＣＤ測定：凍結乾燥後の画分Ｂを蒸留水に溶かしＣＤ測定を行った。装置はＪＡＳＣＯのＪ−８２０を用いた。測定領域は１８０ｎｍ〜２６０ｎｍの範囲で行った。ＣＤスペクトルを図１２に示す。
図１１より、ＨＰＬＣによる分離のみで、同一の高次構造を有する糖ペプチドが高度に精製されることが確認された。【０１３６】
２．糖鎖を有しないｓｉｌｖｅｒ  ｐｈｅａｓａｎｔのオボムコイド第３ドメインの化学合成
実施例と同様に、３つのフラグメントをそれぞれ合成した後、ＮＣＬ法によるライゲーションを行って、糖鎖を有しないｓｉｌｖｅｒ  ｐｈｅａｓａｎｔのオボムコイド第３ドメインを合成した。フラグメント１及びフラグメント３は、実施例と同様に合成した。比較例で、実施例のフラグメント２に対応するフラグメント（以下「フラグメント２’」という。）は、図１４に示すとおり糖鎖を有しない。【０１３７】
［フラグメント２’の合成］
固相合成用カラムに２−Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ  ｒｅｓｉｎ（１４３ｍｇ、２００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、で十分に洗浄した。別途、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（２３２．４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（２７２．１μＬ、１．６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．２ｍＬ）に溶解させたものを、樹脂の入った固相合成用カラムに入れ、室温で２時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＤＩＰＥＡ＝１７：２：１、ＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。次いで、Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、Ｋａｉｓｅｒ  Ｔｅｓｔにより反応を確認し、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１３８】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（１３５．１ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（１５３．９μＬ、１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．４ｍＬ）に溶解させ１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れ、室温で１時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍＬ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。アミノ基を保護したアミノ酸には、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、を用い、最後のアミノ酸は保護基が酸で除去できるＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）−ＯＨ（２３３．３ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を用いた。固相樹脂上に、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−Ｐｈｅの保護基を有する１４残基ペプチド（配列番号１１）を得た。このものに、ＡｃＯＨ：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝５：４：１を（２ｍＬ）を加え、室温で３時間攪拌した。攪拌後、樹脂をろ過して除き、さらにＭｅＯＨにて樹脂の洗浄を行った。ろ液を減圧下に濃縮し、過剰量のベンゼンで３回共沸して凍結乾燥を行った（図１５上段。ただし脱保護して測定した。）。【０１３９】
得られたペプチド（配列番号１１に記載の保護基を有する１４残基ペプチド）１１０ｍｇ（５０μｍｏｌ）とＭＳ４Ａ（１０ｍｇ）、ベンジルメルカプタン（１７７．４μＬ、１．５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ溶媒中（６．８ｍＬ）、アルゴン気流下−２０℃で１時間攪拌した後、ＰｙＢＯＰ（１３０ｍｇ、２５０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（４２．５μＬ、２５０μｍｏｌ）を加え、２時間攪拌した。攪拌後、反応溶液に過剰量のジエチルエーテルを加え化合物を沈殿させ、ろ過後に沈殿物をＤＭＦで溶解した。溶液を減圧下に濃縮した後、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＰＳ、２．５％Ｈ２Ｏ溶液（５ｍＬ）を加え室温で２時間攪拌した（図１５中段）。反応溶液を減圧下に濃縮後、ＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ  ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、  ７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：９％→２７％）１５分  流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製し、Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−ＳＢｎのＣ末端がベンジルチオエステルである保護基を有する１４残基ペプチド（配列番号１２）を２６９．６ｍｇ得た（図１５下段）。【０１４０】
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ７１Ｈ１０１Ｎ１９Ｏ２２Ｓ３：［Ｍ＋２Ｈ］２＋８３４．８，  Ｆｏｕｎｄ．８３４．７【０１４１】
［フラグメント２’とフラグメント３のＮＣＬ法によるライゲーション］
このようにして調製したフラグメント２’（配列番号１２に記載のＣ末端がベンジルチオエステルである保護基を有する１４残基ペプチド）１．６ｍｇ（０．９６μｍｏｌ）と、実施例にて合成したフラグメント３  １．９ｍｇ（０．９６μｍｏｌ）との二種類を同じエッペンチューブにいれ、０．１％りん酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、６Ｍ  グアニジン塩酸塩含有）４９５μＬに溶解させた後、チオフェノール（５μＬ）を加え、室温で反応を行った（図１６の０ｈ）。１８時間後、反応終了をＨＰＬＣで確認した後（図１６の１８ｈ）、反応溶液をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ  ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、  ７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分  流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した（図１６の精製後）。その後凍結乾燥を行い、Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓの保護基を有する３３残基ペプチド（配列番号１３）を得た。【０１４２】
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１４７Ｈ２２７Ｎ４３Ｏ５０Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３＋１１７５．９，Ｆｏｕｎｄ．１１７５．４【０１４３】
得られた保護基を有する３３残基ペプチド（配列番号１３）を、０．２Ｍメトキシアミン水溶液（ｐＨ＝４．０）に溶解させた。４時間後、反応の終了をＨＰＬＣにて確認した後、ＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ  ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分  流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した（図１６のチアゾリン脱保護）。その後凍結乾燥を行い、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓの３３残基ペプチド（配列番号１４）を得た。【０１４４】
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１４６Ｈ２２７Ｎ４３Ｏ５０Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３
＋１１７１．９、Ｆｏｕｎｄ．１１７１．５【０１４５】
なお、以下の条件でも同様に配列番号１４に記載の３３残基糖鎖付加ペプチドが得られた。
フラグメント２’（配列番号１２に記載のＣ末端がベンジルチオエステルである保護基を有する１４残基ペプチド）１．６ｍｇ（０．９６μｍｏｌ）と、実施例にて合成したフラグメント３  １．９ｍｇ（０．９６μｍｏｌ）との二種類をそれぞれエッペンチューブにいれ、０．１％りん酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、６Ｍ  グアニジン塩酸塩含有）２４７．５μＬに溶解させた後、ひとつのエッペンチューブに合わせた。１％チオフェノール（５μＬ）を加え、室温で反応を行った。反応をＨＰＬＣと質量分析で追跡し、６時間後にＨＰＬＣでフラグメント３の消失を確認した。その後０．２Ｍのメトキシアミン水溶液を系中がｐＨ４付近になるまで加えてＮ末端のＣｙｓを脱保護した。６時間後反応の終了を質量分析で確認し、反応溶液をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ  ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分  流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１４６Ｈ２２７Ｎ４３Ｏ５０Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３＋１１７１．９、Ｆｏｕｎｄ．１１７１．５【０１４６】
［フラグメント１と、フラグメント２’及び３とのＮＣＬ法によるライゲーション］
このようにして調製した３３残基ペプチド（配列番号１４）０．６ｍｇ（０．１７μｍｏｌ）と実施例で合成したフラグメント１（配列番号２に記載のＣ末端がベンジルチオエステルである２３残基ペプチド）１．１ｍｇ（０．４１μｍｏｌ）との二種類を同じエッペンチューブにいれ、０．１％りん酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、８Ｍ  グアニジン塩酸塩含有）４８５μＬに溶解させた後、チオフェノール（１５μＬ）を加え、室温で反応を行った（図１７の０ｈ）。４５時間後、反応終了をＨＰＬＣで確認した後（図１７の４５ｈ）、反応溶液をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ  ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、  ７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分  流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した。その後凍結乾燥を行い、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓの５６残基ペプチド（配列番号１５）を得た（図１７下段）。【０１４７】
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２５７Ｈ４００Ｎ７０Ｏ８４Ｓ７：［Ｍ＋４Ｈ］４＋１５１０．７，Ｆｏｕｎｄ．１５１０．６【０１４８】
なお、以下の条件でも同様に配列番号１５に記載の５６残基糖鎖付加ペプチドが得られた。
配列番号１４に記載の３３残基ペプチド０．６ｍｇ（０．１７μｍｏｌ）とフラグメント１（配列番号２に記載のＣ末端がベンジルチオエステルである２３残基ペプチド）１．１ｍｇ（０．４１μｍｏｌ）との二種類をそれぞれエッペンチューブにいれ、０．１％りん酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、８Ｍ  グアニジン塩酸塩含有）２４７．５μＬに溶解させた後、ひとつのエッペンチューブに合わせた。１％チオフェノール（５μＬ）を加え、室温で反応を行った。反応をＨＰＬＣと質量分析で追跡し、３０時間後に、反応溶液をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ  ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分  流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した。その後凍結乾燥を行い、配列番号１５に記載の５６残基糖鎖付加ペプチドを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２５７Ｈ４００Ｎ７０Ｏ８４Ｓ７：［Ｍ＋４Ｈ］４＋１５１０．７，Ｆｏｕｎｄ．１５１０．６【０１４９】
［タンパク質のフォールディング］
このようにして調製した５６残基ペプチド（配列番号１５）０．４ｍｇ（６６．２ｎｍｏｌ）をエッペンチューブに取り、０．６Ｍトリス緩衝液（ｐＨ＝８．７、０．６Ｍグアニジン塩酸塩、６ｍＭ  ＥＤＴＡ含有）１００μＬに溶解した。蒸留水５００μＬを加え希釈し、糖鎖のないオボムコイド第３ドメインをフォールディングさせた。【０１５０】
［ＨＰＬＣによる分画］
３６時間後、反応の進行をＨＰＬＣと質量分析にて確認した後、ＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ  ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分  流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製し、高次構造を有したＬｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓの５６残基ペプチド（配列番号１５）が含まれる４つの画分Ｅ〜Ｈを得た（図１８）。【０１５１】
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２５７Ｈ３９４Ｎ７０Ｏ８４Ｓ７：［Ｍ＋５Ｈ］５＋１２０７．５，［Ｍ＋４Ｈ］４＋１５０９．１，［Ｍ＋３Ｈ］３＋２０１１．９，
Ｅ；Ｆｏｕｎｄ．１２０７．７、１５０９．３、２０１２．０
Ｆ；Ｆｏｕｎｄ．１２０７．６、１５０９．３、２０１２．０
Ｇ；Ｆｏｕｎｄ．１２０７．７、１５０９．３、２０１２．０
Ｈ；Ｆｏｕｎｄ．１２０７．８、１５０９．３、２０１２．０
図１７下段から図１８へのピークの変化、および、質量の減少は、上述のフォールディング工程により、ジスルフィド結合が形成されたことを示す。【０１５２】
なお、反応をＨＰＬＣと質量分析で追跡し、質量分析で分子量変化とＨＰＬＣでピークのリテンションタイムが変化したことを確認することにより、反応時間を適宜変更（例えば、２４時間）することができる。【０１５３】
画分ＦのＮＭＲ測定：凍結乾燥後の画分Ｆを５％Ｄ２Ｏ／Ｈ２Ｏ（３００μｌ）に溶かし２５℃、８０ｍｓ、６００ＭＨｚで２Ｄ  ＴＯＣＳＹを測定した。ＮＭＲスペクトルを図１９に示す。
画分ＦのＣＤ測定：凍結乾燥後の画分Ｆを蒸留水に溶かしＣＤ測定を行った。装置はＪＡＳＣＯのＪ−８２０を使用した。測定領域は１８０ｎｍ〜２６０ｎｍの範囲で行った。ＣＤスペクトルを図２０に示す。
図１９より、ＨＰＬＣによる分離のみで、同一の高次構造を有する糖ペプチドが高度に精製されることが確認された。【０１５４】
［画分Ｆの検量線の作成］
画分Ｆ（１ｍｇ）をＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含むｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸バッファー（１ｍｌ）に溶かし、この溶液を希釈して１６５μＭ、８２．５μＭ、４１．３μＭ、２０．６μＭの濃度の画分Ｆを調製した。各濃度の溶液のＯＤ２８０をそれぞれ３回ずつ測定し、平均値化したものを表１および図２２に示した。【０１５５】
【表１】
0005530358.tif 000008
【０１５６】
<実施例２>生理活性の測定
［糖鎖付加ＯＭＳＶＰ３（画分Ａ〜Ｄ）の生理活性の測定］
０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ＝８．０、０．０１％α−キモトリプシン、０．０１％牛血清アルブミン含有）の酵素溶液、及び、０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ＝８．０、５１７μＭの参考例１（後述）で合成した保護基を有する１４残基ペプチド（配列番号１６）、０．０１％牛血清アルブミン含有）の基質溶液を調製し、各々２０μＬをエッペンチューブに加えた。この溶液に、実施例１で得られた画分Ａ〜Ｄそれぞれを凍結乾燥した後、０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ＝８．０、０．０１％牛血清アルブミン含有）に溶解させ、各溶液のＯＤ２８０を測定し、溶液中に含まれるタンパク質濃度を一定としたサンプル液２０μＬを加え、阻害活性を測定した。この際の、最終的な反応濃度は、サンプル濃度２．５μＭ、酵素濃度０．３３μｇ／ｍＬ、基質濃度１７２μＭである。この反応液を、３７℃で１０分間インキュベートした後、４Ｎ塩酸を５μＬ加え反応を停止した。同様の操作を３回繰り返し、それぞれ分解率の平均値及び標準偏差を算出した。結果を図１３に示す。【０１５７】
［糖鎖のないＯＭＳＶＰ３（画分Ｅ〜Ｈ）の生理活性の測定］
０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ＝８．０、０．０１％α−キモトリプシン、０．０１％牛血清アルブミン含有）の酵素溶液、及び、０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ＝８．０、５１７μＭの参考例１（後述）で合成した保護基を有する１４残基ペプチド（配列番号１６）、０．０１％牛血清アルブミン含有）の基質溶液を調製し、各々２０μＬをエッペンチューブに加えた。この溶液に、実施例１で得られた画分Ｅ〜Ｈそれぞれを凍結乾燥した後、０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ＝８．０、０．０１％牛血清アルブミン含有）に溶解させ、各溶液のＯＤ２８０を測定し、溶液中に含まれるタンパク質濃度を一定としたサンプル液２０μＬを加え、阻害活性を測定した。この際の、最終的な反応濃度は、サンプル濃度２．５μＭ、酵素濃度０．３３μｇ／ｍＬ、基質濃度１７２μＭである。この反応液を、３７℃で１０分間インキュベートした後、４Ｎ塩酸を５μＬ加え反応を停止した。同様の操作を３回繰り返し、それぞれ分解率の平均値及び標準偏差を算出した。結果を図２１に示す。【０１５８】
<実施例３>生理活性の測定（ＩＣ５０の導出）
［糖鎖付加ＯＭＳＶＰ３（画分Ａ〜Ｄ）のＩＣ５０の導出］
参考例１（後述）で合成した保護基を有する１４残基ペプチド（配列番号１６）（１．５ｍｇ）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ含有）１ｍＬに溶解させ、１ｍＭの溶液を調製した。吸光度計を用いて０．３４ｍＭになるように希釈した（溶液１）。キモトリプシン（１ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ含有）１ｍＬに溶解させ、この溶液を１０倍希釈し、さらにその溶液を１０倍希釈することを繰り返して０．２μｇ／ｍＬになるよう調製した（溶液２）。画分Ｂを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ含有）１００μＬに溶解させ、吸光度計を用いて６５ｎＭになるように希釈した。これを希釈して５８．５ｎＭ，５２ｎＭ，４５．５ｎＭ，３９ｎＭ，３２．５ｎＭ，２６ｎＭ，１９．５ｎＭ，１３ｎＭ，６．５ｎＭの溶液を作った（溶液３）。氷上で十分に冷やした溶液１を８０μＬ、溶液２，３を４０μｌずつ同じエッペンチューブに移し、３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、１Ｎの塩酸を１６μＬ加えることで反応を停止させた。反応液２０μＬを、バッファー８０μＬと混合させ計１００μＬとし、ＨＰＬＣによる測定に用いた。反応生成物のＨＰＬＣ上のピーク面積から単位時間当たりの分解率（単位時間当たりの反応速度）を計算した。図２３は各阻害剤濃度に対する阻害率をプロットしたグラフを示す。同様に画分Ａ，ＣおよびＤに対しても阻害剤の濃度が酵素の活性を５０％阻害する濃度を挟むようにプロットした。その結果のグラフを示す（図２３）。このグラフを元に算出した糖鎖付加ＯＭＳＶＰ３（画分Ａ〜Ｄ）のＩＣ５０値をグラフに示す（図２４）。【０１５９】
［糖鎖のないＯＭＳＶＰ３（画分Ｅ〜Ｈ）のＩＣ５０の導出］
参考例１（後述）で合成した保護基を有する１４残基ペプチド（配列番号１６）（１．５ｍｇ）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ含有）１ｍＬに溶解させ、１ｍＭの溶液を調製した。吸光度計を用いて０．３４ｍＭになるように希釈した（溶液１）。キモトリプシン（１ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ含有）１ｍＬに溶解させ、この溶液を１０倍希釈し、さらにその溶液を１０倍希釈することを繰り返して０．２μｇ／ｍＬになるよう調製した（溶液２）。画分Ｆを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ含有）１００μＬに溶解させ、吸光度計を用いて６５ｎＭになるように希釈した。これを希釈して５８．５ｎＭ，５２ｎＭ，４５．５ｎＭ，３９ｎＭ，３２．５ｎＭ，２６ｎＭ，１９．５ｎＭ，１３ｎＭ，６．５ｎＭの溶液を作った（溶液３）。氷上で十分に冷やした溶液１を８０μＬ、溶液２，３を４０μＬずつ同じエッペンチューブに移し、３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、１Ｎの塩酸を１６μＬ加えることで反応を停止させた。反応液２０μＬを、バッファー８０μＬと混合させ計１００μＬとし、ＨＰＬＣによる測定に用いた。反応生成物のＨＰＬＣ上のピーク面積から単位時間当たりの分解率（単位時間当たりの反応速度）を計算した。図２５は各阻害剤濃度に対する阻害率をプロットしたグラフを示す。同様に画分Ｅ，ＧおよびＨに対しても阻害剤の濃度が酵素の活性を５０％阻害する濃度を挟むようにプロットした。その結果のグラフを示す（図２５）。このグラフを元に算出した糖鎖のないＯＭＳＶＰ３（画分Ｅ〜Ｆ）のＩＣ５０値をグラフに示す（図２６）。【０１６０】
<実施例４>熱安定性の測定
ＣＤ測定用のセルを蒸留水で満たし、室温のまま測定した。この測定値をブランクとして以降の測定値は全てこのブランクの数値を差し引いて計算した。
［糖鎖付加ＯＭＳＶＰ３（画分Ｂ）の熱安定性］
画分Ｂを蒸留水３００μＬに溶解し室温で測定した。測定終了後、試料をセルに満たしたままセルごと恒温槽に浸し温度可変実験を行った。はじめに５０℃の恒温槽に１０分間浸しておいたセルを１０分間室温に静置し測定を行った。以降９０℃まで同様の操作をしてＣＤスペクトルを測定した。結果を図２７に示す。【０１６１】
［糖鎖のないＯＭＳＶＰ３（画分Ｆ）の熱安定性］
画分Ｆを蒸留水３００μｌに溶解し室温で測定した。測定終了後、試料をセルに満たしたままセルごと恒温槽に浸し温度可変実験を行った。はじめに５０℃の恒温槽に１０分間浸しておいたセルを１０分間室温に静置し測定を行った。以降９０℃まで同様の操作をしてＣＤスペクトルを測定した。結果を図２８に示す。【０１６２】
<実施例５>オボムコイド第３ドメインのジスルフィドマッピング
合成したＯＭＳＶＰ３は３本のジスルフィド結合を有している。ジスルフィド結合はタンパク質のフォールディングの際に形成され、その形成過程は平衡反応である。そのため天然型タンパク質とは異なる位置でのジスルフィド結合形成も生じると考えられる。
今回合成したＯＭＳＶＰ３（画分Ｂ）はＮＭＲおよび阻害活性評価の結果から単一化合物であり、天然型タンパク質と同じ位置でジスルフィド結合を形成していると予想された。そこで画分Ｂが確かに天然と同じ位置でジスルフィド結合を形成しているか確認するために以下の検討を行った。【０１６３】
［アミノ酸配列及び糖鎖が均一なＯＭＳＶＰ３（画分Ｂ）のジスルフィドマッピング］
実施例１で得られた画分Ｂ（０．４ｍｇ）に対して臭化シアン（１ｍｇ／ｍＬ）を、４０％アセトニトリル、２％ＴＦＡ水溶液中、３７℃、遮光条件化で一晩反応させた。これを凍結乾燥させＨＰＬＣ（ＶｙＤＡＣ  ｃｏｌｕｍｎ  Ｃ４（Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｃ．）、３μｍ、４．５×２５０ｍｍ展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）３０分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製して画分Ｉを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３１８Ｈ４９４Ｎ７４Ｏ１３０Ｓ６：［Ｍ＋４Ｈ］４＋，１９０７．５，Ｆｏｕｎｄ．１９０７．４【０１６４】
次に、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を溶解させた５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２含有）に、画分Ｉ（０．１ｍｇ）を溶解させ、３７℃でインキュベートした。３時間後にＨＰＬＣ（ＶｙＤＡＣ  ｃｏｌｕｍｎ  Ｃ４（Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｃ．）、３μｍ、４．５×２５０ｍｍ  展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝９５：５→５０：５０（アセトニトリル  グラジエント：４．５％→４５％）１５分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製して画分ＩＩからＶＩを得た（図２９、３０）。
ＥＳＩ−ＭＳ：
画分ＩＩ；Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３５Ｈ５４Ｎ１０Ｏ１３Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋，４４４．８，Ｆｏｕｎｄ  ４４４．７
画分ＩＩＩ；Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２５Ｈ３７Ｎ７Ｏ８：［Ｍ＋Ｈ］＋，５６４．４，Ｆｏｕｎｄ  ５６４．４
画分ＩＶ；Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１１４Ｈ１８７Ｎ１９Ｏ６４Ｓ２：［Ｍ＋３Ｈ］３＋，９７１．６，Ｆｏｕｎｄ  ９７１．５
画分Ｖ；Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１２３Ｈ１９６Ｎ２０Ｏ６６Ｓ２：［Ｍ＋３Ｈ］３＋，１０２６．０，Ｆｏｕｎｄ  １０２５．９
画分ＶＩ；Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ６４Ｈ９３Ｎ１５Ｏ２２Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋，７４４．８，Ｆｏｕｎｄ  ７４５．０【０１６５】
［糖鎖を有しないＯＭＳＶＰ３（画分Ｆ）のジスルフィドマッピング］
実施例１で得られた画分Ｆ（０．４ｍｇ）に対して臭化シアン（１ｍｇ／ｍＬ）を、４０％アセトニトリル、２％ＴＦＡ水溶液中、３７℃、遮光条件化で一晩反応させた。これを凍結乾燥させＨＰＬＣ（ＶｙＤＡＣ  ｃｏｌｕｍｎ  Ｃ４（Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｃ．）、３μｍ、４．５×２５０ｍｍ  展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）３０分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製して画分ＶＩＩを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２５６Ｈ３９２Ｎ７０Ｏ８５Ｓ６：［Ｍ＋４Ｈ］４＋，１５０１．６，Ｆｏｕｎｄ．１５０１．５【０１６６】
次に、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を溶解させた５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２含有）に、画分ＶＩＩ（０．１ｍｇ）を溶解させ、３７℃でインキュベートした。４時間後にＨＰＬＣ（ＶｙＤＡＣ  ｃｏｌｕｍｎ  Ｃ４（Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｃ．）、３μｍ、４．５×２５０ｍｍ  展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝９５：５→５０：５０（アセトニトリル  グラジエント：４．５％→４５％）  １５分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製して画分ＶＩＩＩからＸＩを得た（図３１、３２）。
ＥＳＩ−ＭＳ：
画分ＶＩＩＩ；Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３５Ｈ５４Ｎ１０Ｏ１３Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋，４４４．８，Ｆｏｕｎｄ  ４４４．７
画分ＩＸ；Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２５Ｈ３７Ｎ７Ｏ８：［Ｍ＋Ｈ］＋，５６４．４，Ｆｏｕｎｄ  ５６４．４
画分Ｘ；Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ５２Ｈ８５Ｎ１５Ｏ１９Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋，６４４．８，Ｆｏｕｎｄ  ６４４．９
画分ＸＩＩ；Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ６４Ｈ９３Ｎ１５Ｏ２２Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋，７４４．８，Ｆｏｕｎｄ  ７４４．９【０１６７】
ＣＮＢｒ処理を用いて糖鎖を有するＯＭＳＶＰ３（画分Ｂ）配列中のメチオニン部位で特異的にペプチド鎖を切断し（画分Ｉ）、続いてＴｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ消化を行った結果、ジスルフィド結合でつながったペプチド断片が得られた（図２９）。それぞれのペプチドフラグメントを精製後、ＥＳＩ−ｍａｓｓによりその質量を測定した。そして、得られた質量が、ＯＭＳＶＰ３のどのフラグメントに相当するかを解析した。その結果得られた推定構造を図３３の下図に示した。同様の方法を用いて糖鎖を有しないＯＭＳＶＰ３（画分Ｆ）についても、同様の方法を用いて解析し（図３１、３４参照）、その結果得られた推定構造を図３４の下図に示した。天然のＯＭＳＶＰ３と同じ位置でジスルフィド結合が形成していることを確認した（図３１、３４）。これらのジスルフィドマッピングから推定された画分Ｂおよび画分Ｆにおけるジスルフィド結合位置は、すでに解析されている天然のＯＭＳＶＰ３のジスルフィド結合位置と一致するものであった。
これらのことから、本発明のフォールディング工程、分画工程、及び、回収工程によって、アミノ酸配列、糖鎖構造、及び、高次構造が均一な糖タンパク質を製造することができることが示された。また、ＯＭＳＶＰ３の場合において、本発明の分画工程において最大ピークとして得られた画分は、天然と同じジスルフィド結合を有し、かつ、高活性の画分であり、所望の構造及び所望の活性を有する糖タンパク質を効率よく製造することができた。なお、このことは、他の糖タンパク質を製造する場合において、最大ピークの画分が所望の活性ないし所望の構造でないものであったとしても、所望の活性を有するその他の画分を適宜回収することにより、やはり、所定の活性を有する、アミノ酸配列、糖鎖構造、及び、高次構造が均一な糖タンパク質を製造することができるものであり、本発明が実施可能であることをなんら妨げるものではない。【０１６８】
本発明の実施例において、糖タンパク質を有するオボムコイド第３ドメインをフォールディングさせ、ＨＰＬＣで分画したパターン（図１０）と、糖鎖を有しない第３ドメインをフォールディングさせ、ＨＰＬＣで分画したパターン（図１８）は、４つのピークを有する比較的類似したものであった。また、活性の強さもそれぞれ、実施例２においては、画分Ａ>画分Ｂ>画分Ｄ>画分Ｃ、画分Ｆ>画分Ｅ>画分Ｈ>画分Ｇ（図１３と図２１）、実施例３においては、画分Ａ>画分Ｂ>画分Ｃ>画分Ｄ、画分Ｅ>画分Ｆ>画分Ｇ>画分Ｈ（図２３〜２６）と類似していたことから、同一の高次構造を有するものが、同じ順序で溶出したように見えた。中でも最大ピークとして得られる、高活性を有する画分Ｂと画分Ｆについて、ジスルフィド結合位置が同一であったことも、これと整合する結果であった。
しかしながら、画分Ｂと画分ＦのＣＤスペクトルは一致せず、両者の高次構造が異なることが示された（図１２と図２０）。このことは、糖鎖付加が、糖鎖を有しないタンパク質のフォールディングに対して歪みを与えることなどによって、タンパク質の高次構造に変化をもたらしうることを示す。
タンパク質のこのような高次構造の変化は、基質との結合のしやすさ等にも影響する点で、生理活性に影響を与えうることが予想され、また、糸球ろ過体の通過しやすさ等にも影響する点で、血中半減期にも影響を与えうることが予想される。このことから、糖タンパク質を医薬品として用いる際には、タンパク質に糖鎖を付加した状態で高次構造が一定のもののみを精製分離することにより、生理活性及び血中半減期を一定とする医薬を製造することが重要であるところ、本発明の方法はこれを可能にするものである。【０１６９】
<参考例１  阻害活性試験用基質の合成>
［基質ペプチドの合成］
固相合成用カラムに２−Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ  ｒｅｓｉｎ（１４３ｍｇ、２００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、で十分に洗浄した。別途、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（２３２．４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（２７２．１μＬ、１．６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．２ｍＬ）に溶解させたものを、樹脂の入った固相合成用カラムに入れ、室温で２時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＤＩＰＥＡ＝１７：２：１、ＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。次いで、Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、Ｋａｉｓｅｒ  Ｔｅｓｔにより反応を確認し、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１７０】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（１３５．１ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（１５３．９μＬ、１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．４ｍＬ）に溶解させ１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れ、室温で１時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍＬ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。アミノ基を保護したアミノ酸には、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、を用い、最後のアミノ酸はＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）−ＯＨ  （２３３．３ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を用いた。固相樹脂上に、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−Ｐｈｅの保護基を有する１４残基ペプチド（配列番号１１）を得た。このものに９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＰＳ、２．５％Ｈ２Ｏ溶液（３ｍＬ）を加え室温で２時間攪拌した後、樹脂をろ過して除き、ろ液を減圧下に濃縮した。これをＨＰＬＣ（ＶｙＤＡＣ  ｃｏｌｕｍｎ  Ｃ４（Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｃ．）、３μｍ、４．５×２５０ｍｍ  展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝９５：５→５０：５０（アセトニトリル  グラジエント：４．５％→４５％）１５分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）にて精製した後、凍結乾燥を行い、Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅの保護基を有する１４残基ペプチド（配列番号１６）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ６４Ｈ９５Ｎ１９Ｏ２３Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋，７８２．３４，Ｆｏｕｎｄ．７８２．２【０１７１】
［基質ペプチドの検量線の作成］
合成した１４残基ペプチド（配列番号１６）１．５ｍｇを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、ＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ）含有）１ｍＬに溶解し、この溶液を希釈して０．６ｍＭ、０．４ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭの基質濃度の溶液を調製した。各濃度の溶液のＯＤ２８０をそれぞれ３回ずつ測定し、平均値化したものを表２および図３５に示した。【０１７２】
【表２】
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【０１７３】
［基質ペプチドのＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ  ｐｌｏｔの導出］
合成した１４残基ペプチド（配列番号１６）３．１ｍｇを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、ＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ）含有）１ｍＬに溶解し、２ｍＭの溶液を調製した。これを希釈して１．６ｍＭ、１．２ｍＭ、０．８ｍＭ、０．４ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０５ｍＭの濃度の基質溶液を調製した。またキモトリプシン（１ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、ＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ）含有）１ｍＬに溶解し、この溶液を１０倍希釈し、さらにその溶液を１０倍希釈することを繰り返して０．１μｇ／ｍＬになるよう調製した。氷上で十分に冷やした各濃度の基質溶液を５０μＬ、酵素溶液を５０μＬずつ同じエッペンチューブに移し、３７℃で３０分インキュベートした。３０分後、１Ｎの塩酸を１０μＬ加えることで反応を停止させた。反応液２０μＬを、緩衝液８０μＬと混合させ計１００μＬとし、ＨＰＬＣによる測定に用いた。反応生成物のＨＰＬＣ上のピーク面積から単位時間当たりの分解率（単位時間当たりの反応速度）を計算した（図３６）。表３に各基質濃度に対する反応速度を示す。【０１７４】
【表３】
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【０１７５】
［基質ペプチドのＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ  ｐｌｏｔの導出］
合成した１４残基ペプチド（配列番号１６）１．５ｍｇを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、ＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ）含有）１ｍＬに溶解し、１ｍＭの溶液を調製した。これを希釈して１ｍＭ、５００μＭ、３３３μＭ、２５０μＭ、２００μＭの濃度の基質溶液を調製した。またキモトリプシン（１ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、ＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ）含有）１ｍＬに溶解し、この溶液を１０倍希釈し、さらにその溶液を１０倍希釈することを繰り返して０．１μｇ／ｍＬになるよう調製した。氷上で十分に冷やした各濃度の基質溶液を５０μＬ、酵素溶液を５０μｌずつ同じエッペンチューブに移し、３７℃で３０分インキュベートした。３０分後、１Ｎの塩酸を１０μＬ加えることで反応を停止させた。反応液２０μＬを、バッファー８０μＬと混合させ計１００μＬとし、ＨＰＬＣによる測定に用いた。反応生成物のＨＰＬＣ上のピーク面積から単位時間当たりの分解率（単位時間当たりの反応速度）を計算した（図３７）。表４に各基質濃度の逆数に対する反応速度の逆数を示す。【０１７６】
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【０１７７】
本発明の製造方法によって、アミノ酸配列、糖鎖構造に加えて、高次構造も均一な糖タンパク質を得ることが可能となった。本発明の製造方法により得られる糖タンパク質は、高次構造が均一であることから、血中半減期や細胞内での輸送にばらつきがないだけでなく、所定の生理活性を均一に有する。また、本発明によれば、糖タンパク質の混合物が所望の活性を有するように制御することが可能となる。したがって、本発明の製造方法は、特に糖タンパク質を利用した医薬品の開発に利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０１７８】
配列番号１は、フラグメント１の、保護基を有するアミノ酸配列である。【０１７９】
配列番号２は、フラグメント１の、ベンジルチオエステル基を有するアミノ酸配列である。【０１８０】
配列番号３は、フラグメント２の、保護基を有するアミノ酸配列である。【０１８１】
配列番号４は、フラグメント２の、糖鎖が付加された、保護基を有するアミノ酸配列である。【０１８２】
配列番号５は、フラグメント２の、糖鎖が付加された、ベンジルチオエステル基及び保護基を有するアミノ酸配列である。【０１８３】
配列番号６は、フラグメント３の、保護基を有するアミノ酸配列である。【０１８４】
配列番号７は、フラグメント３のアミノ酸配列である。【０１８５】
配列番号８は、糖鎖が付加された、保護基を有するアミノ酸配列である。【０１８６】
配列番号９は、糖鎖が付加された、アミノ酸配列である。【０１８７】
配列番号１０は、糖鎖付加ＯＭＳＶＰ３の、糖鎖が付加された、アミノ酸配列である。【０１８８】
配列番号１１は、フラグメント２’の、保護基を有するアミノ酸配列である。【０１８９】
配列番号１２は、フラグメント２’の、ベンジルチオエステル基及び保護基を有するアミノ酸配列である。【０１９０】
配列番号１３は、保護基を有するアミノ酸配列である。【０１９１】
配列番号１４は、アミノ酸配列である。【０１９２】
配列番号１５は、糖鎖付加されていないＯＭＳＶＰ３の、アミノ酸配列である。【０１９３】
配列番号１６は、キモトリプシンの基質である、保護基を有するアミノ酸配列である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図１】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【配列表】
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