(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元剤としてクエン酸リチウムのみを用いて硝酸銀を還元することにより、良好な光散乱特性を有する安定な銀コロイド溶液を製造する方法。
【請求項２】
(a)水を加熱する工程；
(b)硝酸銀を前記水に加える工程；
(c)前記(b)の工程で作成された水と硝酸銀との混合物を加熱する工程；
(d)クエン酸リチウム水溶液を前記(c)の工程を経た混合物に加える工程；
(e)前記(d)の工程で作成された混合物を、加熱し、一定の時間維持する工程；及び
(f)前記(e)の工程を経た混合物を冷却する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記(a)〜(f)の工程を、三つ口容器中で実施する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記(a)の工程において、水を４５℃まで加熱することを特徴とする、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記(c)の工程において、前記混合物を９８℃まで加熱することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記(a)の工程において用いられる水が、５００ｍＬの高純度水であることを特徴とする、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記(b)の工程において用いられる硝酸銀が、９０ｍｇの純度９９．９９９９％の硝酸銀であることを特徴とする、請求項２〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記(d)の工程において用いられるクエン酸リチウム水溶液が、１０ｍＬであることを特徴とする、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記クエン酸リチウム水溶液が、２５ｍＬの高純度水中に２２７ｍｇのクエン酸リチウムを含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程(b)〜(f)を通して、混合物を絶えず撹拌する、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記撹拌を、５５０ｒｐｍで回転する撹拌器を用いて実施する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記(e)の工程において維持する時間が９０分であることを特徴とする、請求項２〜１１のいずれに記載の方法。
【請求項１３】
得られた銀コロイドが、狭い粒子サイズ分布を有する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
平均粒子サイズが４ｎｍである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
得られた銀コロイド溶液が、ＳＥＲＳ及びＳＥＲＲＳ分光法において使用するための有機又は無機凝集剤を用いて凝集する、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
還元剤としてクエン酸リチウムのみを用いた硝酸銀の還元により形成された、良好な光散乱特性を有する安定な銀コロイド溶液。
【請求項１７】
良好な光散乱特性を有し、強いＳＥＲＳ及びＳＥＲＲＳスペクトルを生成する、請求項１６に記載の銀コロイド溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定な銀コロイドの製造方法、及び該方法により製造されるコロイドに関する。このコロイドは、ラマン分光法に特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
分析化学者は、ラマン分光法が微量の検体を検出できないので、長い間、ラマン分光法を用いなかった。主にこれは、弱いラマンスペクトルを無力にする試料又は基板のいずれかに由来する蛍光の非常に高いノイズレベルのためである。１９７４年、Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎは、銀電極上のピリジンの電気化学的反応を研究するためにラマン分光を用い、大量の蛍光ノイズを抑制する銀を伴い、ピリジンラマンシグナルの非常に大きな増強があることを発見した。この表面増強は、銀表面が粗面であり、滑面でない場合にのみ達成し得る。
【０００３】
次いで、銀コロイドを用いて、等しいか、又はより高い表面増強効果を達成できることが発見された。コロイドは、溶液中の金属粒子の懸濁液である。最適の効果を達成するため、通常、凝集剤として無機（例えば塩化物又は硝酸塩）、又は有機（例えば、ポリ−Ｌ−リジン又はスペルミン）化合物を用いて、銀コロイド粒子の凝集を制御する必要がある。ほとんどの検体について、コロイド銀粒子は、凝集前に約２０〜５０ｎｍであり、狭い粒度分布を有するべきである。
【０００４】
表面増強効果を用いて達成することのできる感度における非常に大きな増強のため、それ以降、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）分光法、及び表面増強共鳴ラマン散乱（ＳＥＲＲＳ）分光法の分析技術が開発されてきた。これらの技術の利用は指数的に増加しているが、主要な問題は、良好な光散乱特性を有する安定なコロイドを生成し、ノイズの蛍光を消去することである。安定なコロイドのために銀粒子は無制限に懸濁すべきであるが、たびたび、凝集が生じ、銀が溶液から沈殿してしまう。
【０００５】
銀コロイドは、水素化ホウ素ナトリウム又はクエン酸ナトリウムのいずれかを用いた化学的還元によって調製することができる。クエン酸で還元されたコロイドはより安定であり、多くの分析者はＰ．Ｃ．Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｏ．Ｍｅｉｓｅｌ（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，１９８２，８６，３３９１−３３９５）によって公開された方法を用いて、これらを調製してきた。この方法によりバッチ間の再現性を達成することは困難であり、安定性、すなわち、貯蔵安定性は変わりやすい。調製には、非常にきれいなガラス器具の使用、正確に制御された温度、撹拌速度等が必要である。
【０００６】
元の方法（Ｃ．Ｈ．Ｍｕｎｒｏ，Ｗ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｐ．Ｃ．Ｗｈｉｔｅ，Ａｎａｌｙｓｔ  １９９３，Ｖｏｌ．１１８，７３３−７３５）の公開された改良法は、銀コロイドの特性におけるいくつかの改善をもたらしたが、長期安定性は未だに問題である。しかし、市販品については、より大きな安定性が必要であり、研究は、貯蔵容器中で用いられる材料でさえ、銀コロイドのいくつかのバッチに影響を及ぼし得ることを示した。
【０００７】
これらの公知の先行技術による方法により調製された銀コロイドは、表面上に負のクエン酸層を有する銀粒子を生成し、最大表面増強効果のためには、検体は凝集した銀表面に接近しなければならない。カチオン性の検体については、これは、それらが負に帯電した銀表面に引きつけられることによって達成することができる。アニオン性の検体については、銀表面からの反発力のために、非常に弱いＳＥＲ（Ｒ）Ｓ効果のみが達成される。コロイド調製の改良法の著者は、凝集剤としてポリ−Ｌ−リジンを用い、ｐＨを調整し、コロイド表面と検体との間の架橋として作用する凝集剤をプロトン化するためのアスコルビン酸を加えることによって、この問題を解決している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
良好な光散乱特性を有する安定な銀コロイドを達成するための調査において、他の調製方法が出願人によって研究された。これらの研究の結果として、無機材料の化学的特性の知識に基づく新規な方法が、所望の分析特性を有する安定な銀コロイド溶液をもたらした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第一の態様によれば、銀コロイド溶液を製造する方法は、クエン酸リチウムを用いて硝酸銀を還元することを含む。
【００１０】
本発明は、クエン酸リチウムを用いて硝酸銀を還元することにより製造された銀コロイド溶液をも提供する。
【００１１】
前記方法は、好ましくは、（ａ）第一の量の水を、第一の所定の温度に加熱する工程；（ｂ）第二の量の硝酸銀を前記水に加える工程；（ｃ）前記混合物を第二の所定の温度に加熱する工程；（ｄ）第三の量のクエン酸リチウム溶液を前記混合物に加える工程；（ｅ）前記混合物を、第二の所定の温度に、所定の時間、維持する工程；及び（ｆ）前記混合物を冷却する工程を含む。
【００１２】
前記混合工程は、好都合なことには、三つ口容器中で実施される。
【００１３】
前記方法においては、好ましくは、前記第一の所定の温度は４５℃であり、前記第二の所定の温度は９８℃であり、前記第一の量は、５００ｍＬの高純度水であり、前記第二の量は、９０ｍｇの、純度９９．９９９９％の前記硝酸銀であり、前記第三の量は、１０ｍＬの前記クエン酸リチウム水溶液であり、前記クエン酸リチウム水溶液は、２５ｍＬの高純度水中に２２７ｍｇのクエン酸リチウムを含み、工程（ａ）〜（ｆ）を通して、前記水及び前記混合物は絶えず撹拌される。前記所定の時間は好ましくは９０分である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
先行技術にあるように、硝酸銀を還元してコロイドを生成する、ナトリウム（クエン酸ナトリウムの形態で用いられている）の化学的特性を考慮し、ナトリウムのイオン的性質が、コロイド粒子の生成を困難にし、そのことが、コロイド粒子の不安定化を導くと信じられていた。
【００１５】
リチウムは１属の原子であり、ナトリウムとは非常に異なるいくつかの性質を示す。その小さい原子半径の結果として、リチウムは陽性物質であり、高い帯電を有し、それ故高い溶媒和エネルギーを有する。更に、リチウム化合物は、イオン結合と対照的に共有結合を形成する傾向にあり、更に、リチウムは水和した時にナトリウムに比べて非常に大きくなる。従って、これらの特性が、より小さい粒子サイズの銀コロイドをもたらし、従来において困難であった、種々の材料で製造されている容器中で良好な安定性をもたらし得ることが、本出願人によって検討された。
【００１６】
銀コロイド生成における以前の試みは期待を裏切るものであり、硝酸銀中のナトリウムのイオン的性質（前述した）が、十分に長い貯蔵期間／安定性を持つ銀コロイドを得ることにおける試みの失敗の原因であるという認識された知識に反対するための奨励はほとんどなかった。
【００１７】
しかし、今や、出願人によって、従来のナトリウムをリチウムに置換することができることが発見された。硝酸銀を還元するためのクエン酸リチウムを用いた初期の実験は前途有望であることがわかった。これらの材料を用いて生成されたコロイドのバッチは、優れた散乱特性（さらに強いラマンシグナル、これは、より小さい粒子サイズ及び良好な粒子サイズ分布を示す）を有し、検体からの蛍光のノイズをかなり減少し（蛍光消光のレベルの向上を示す）、良好な安定性を有することがわかった。
【００１８】
コロイドのこれらのバッチは安定なままであり、すなわち、銀粒子は長期間、懸濁したままである。最近の試験により、粒子が分散したままであることが確認された。クエン酸ナトリウムの更に最近の試料と比較した場合、古いクエン酸リチウム銀コロイド試料は、優れた光散乱特性、すなわち、還元剤としてクエン酸ナトリウムを用いた先行技術に従って製造された銀コロイドと比較し、更に強いＳＥＲＲＳスペクトルを示し続けた。
【００１９】
また、有機凝集剤を用いてほとんどが機能していない状態で、無機凝集剤を用いた場合にのみ、クエン酸ナトリウムを用いて製造された多くの銀コロイドを用いることができることが証明された。しかし、クエン酸リチウムコロイドを用いて、有機又は無機凝集剤のいずれかを用いて制御された凝集を得ることができた。この最後の観察は、改良された安定性と共に、銀コロイド粒子の化学的性質を制御する際に大きな役割を果たすのがリチウムの使用であることを明確に示す。
【００２０】
これらのクエン酸リチウム−還元コロイド溶液の製造方法を以下に説明する。
【００２１】
安定な銀コロイド溶液の製造方法
高純度水（５００ｍＬ、ＢＤＨ；１８ｍΩ）を、１リットルの三つ口の丸底フラスコに入れた。ガラスの撹拌棒を、中央の口を通して、５５０ｒｐｍの撹拌速度に設定されているオーバーヘッド撹拌器に取り付けた。フラスコの側面の口の１つに、温度計（０〜１１０℃の温度幅）を取り付けた。撹拌しながら、水温を４５℃にまで上昇し、硝酸銀（９０ｍｇ−９９．９９９９％；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を、フラスコの第三の口から加えた。フラスコ内容物の温度を急速に９８℃に上昇させ、１０ｍＬのクエン酸リチウム溶液（２５ｍＬのＢＤＨ高純度水中、２２７ｍｇ）を反応混合物に加えた。
【００２２】
更に９０分間、この温度で撹拌を維持し、次いで、熱を取り除いた。コロイド溶液を室温に冷却し、この間撹拌を続けた。
【００２３】
得られた銀コロイド溶液は、狭いサイズ分布を示し、ガラス、及び広い範囲の他の重合体容器材料中で非常に安定である。更に、得られた銀コロイド溶液は、高い光散乱特性、特に、非常に低い蛍光ノイズレベルで、強いＳＥＲＳ及びＳＥＲＲＳスペクトルを示す。この銀コロイド溶液は、ラマン分光法において用いられる種類の有機又は無機試薬のいずれかを用いても凝集し得る。中でも、銀コロイド溶液は、信じられないほど安定であり、長い貯蔵期間を有している。
【００２４】
図１は、記載された方法により調製された銀コロイドのＵＶ／可視スペクトルのグラフを示す。ＵＶ／可視分光法は、銀コロイドの特徴付けの方法を提供する。ピークの高さの半分におけるバンドの幅は、コロイド粒子の粒子サイズ分布の指標を与え、より均一な粒子サイズは、より狭いバンド幅をもたらす。クエン酸ナトリウムで還元したコロイドについては、通常、６０〜７０ｎｍの値が得られ、これらはほどよいＳＥＲＲＳ特性を与えるが、クエン酸リチウムで還元したコロイドについては、６０ｎｍ未満の値が得られる。記載された実施例のバンド幅は４６ｎｍである。
【００２５】
λｍａｘ値は、コロイドの粒子サイズ分布及び散乱特性に関係する。３９０〜４００ｎｍの値を有するコロイドが、最良のＳＥＲＲＳ特性を与え、クエン酸ナトリウムで還元したコロイドについては、４００ｎｍ未満を達成することは困難であることが多く、通常の範囲は４００〜４１０ｎｍである。記載された実施例のλｍａｘ値は３９９ｎｍである。
【００２６】
ほとんどのクエン酸ナトリウムで還元したコロイドは、コロイドのλｍａｘにおいて０．２５〜０．３０の吸光度を示し、これは、貯蔵において３〜６ヶ月で急速に減少する。吸光度は銀粒子の濃度の指標であり、吸光度が高いほど、ＳＥＲＲＳシグナルの強度が高い。クエン酸リチウムで還元したコロイドについては、吸光度０．３０を超える吸光度が得られる。記載された実施例の吸光度は０．３６である。
【００２７】
また、図１は、５ヶ月間、分光光度的特性においてほとんど変化がなく、従って、本発明によって製造された銀コロイドの安定性を示す。これらのコロイドのバッチが、ガラス、及び高及び低密度ポリエチレン、ポリプロピレン、及びポリエチレンテレフタレートを含む重合体材料から製造された容器中で長期間安定であることを示した。
【００２８】
図２に示すように、本発明によって製造された銀コロイドの粒子サイズ解析は、先行技術に開示された方法によって製造された銀コロイドと比較し、前者は、同様な平均粒子サイズを有し（４．５ｎｍと比較４ｎｍ）、粒子の分布はより狭いが、１１ｎｍを超える粒子は有意な数は存在しない。しかし、クエン酸ナトリウム銀コロイドは、１８〜２３ｎｍの範囲に粒子の他の分布を示す。ここで観察される相違は、クエン酸リチウム銀コロイドの可視スペクトルにおいて観察される高い吸光度、小さいバンド幅及び低いλｍａｘ値を説明し、すなわち、より均一な粒子サイズを有する、多くの小さいコロイド銀粒子が生成される。これらは、更に強い表面散乱効果、従ってより強いＳＥＲＲＳシグナルを引き起こす、凝集上の銀コロイドの性質である。更に、本発明により生成されたコロイドを用いた、クエン酸ナトリウム銀コロイドを超える、優れた安定性は、粒子サイズ及び分布の均一性によるものであり得る。
【００２９】
前述したように、本発明によって生成された銀コロイド溶液は、強いＳＥＲＳ及びＳＥＲＲＳスペクトルを生成する。コロイドのＳＥＲＲＳ活性を評価するために通常に用いられる色素標準である、ローダミン６Ｇを用いて、塩化ナトリウム等の無機、又はポリ−Ｌ−リジン等の有機のいずれかの凝集剤を用いることにより、コロイドは、１０−９Ｍの色素溶液からの強いＳＥＲＲＳスペクトルを生成することができる。これらの基準は本発明の方法により生成された銀コロイドに合致し、図３は、０．０１２５Ｍの最適濃度において凝集剤として塩化ナトリウムを用いて得られる色素のＳＥＲＲＳスペクトル（下側のトレース）を提供する。図３の上側のトレースは、同一の最適分析条件下でクエン酸ナトリウム銀コロイドを用いて得られたＳＥＲＲＳスペクトルを示す。結果は、本発明に開示された方法によって生成された銀コロイドを用いて達成することのできる、ノイズの蛍光における有意な減少、及び感度の増加を示した。これらのスペクトルから正確にノイズを引いたデータを用いて、１６５０ｃｍ−１における最も強いバンドについてほとんど７０％の強度の増加を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
本発明の好ましい実施態様を、添付する図面を参照して説明する。
【図１】本発明の方法により製造された銀コロイドの安定性を示すＵＶ／可視スペクトルである。
【図２】クエン酸リチウム及びナトリウム銀コロイドの粒子サイズ分析を示すグラフである。
【図３】ローダミン６ＧのＳＥＲＲＳ分析のために用いられるクエン酸リチウム及びクエン酸ナトリウムを比較する波数に対するラマン強度のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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