(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
方法が次の工程：
（ａ）対象から採取された脂肪組織から間質血管分画（ＳＶＦ）を単離すること；
（ｂ）ＳＶＦを間質培地で培養すること；
（ｃ）ＳＶＦを、成長因子としてＥＧＦ又はｂＦＧＦを１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で含む増殖培地で培養して、脂肪由来間質幹細胞を培養すること；及び
（ｄ）脂肪由来間質幹細胞を少なくとも１継代培養すること；
を含有してなる、脂肪由来間質幹細胞を含む脂肪幹細胞組成物を製造する方法。
【請求項２】
脂肪組織を同種異系の対象から採取する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１継代培養して得た脂肪由来間質幹細胞の免疫調節活性を確認して、優れた免疫抑制活性を有する同種異系の脂肪由来間質幹細胞を選択する工程をさらに含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法によって製造された、脂肪由来間質幹細胞を含む脂肪幹細胞組成物。
【請求項５】
前記脂肪幹細胞組成物の少なくとも５０％が、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＯｃｔ４に対して陽性であるが、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１０４、ＣＤ１０６及びＳｔｒｏ−１には陰性である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記脂肪幹細胞組成物の少なくとも８０％が、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＯｃｔ４に対して陽性であるが、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１０４、ＣＤ１０６及びＳｔｒｏ-１には陰性である、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の脂肪幹細胞組成物を有効成分として含むことを特徴とする、瘻孔治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は瘻孔を治療するためにヒト脂肪組織由来の間質幹細胞(stromal stem cell)の臨床的有効量を製造する方法及びこれによって製造される組成物に係り、この間質幹細胞は自家及び同種異系の脂肪組織から得られる。
【背景技術】
【０００２】
再生医療は損傷したり機能が低下した組織及び／又は器官を治療するための方法であって、通常は多分化能幹細胞を用いる細胞に基づく治療法（cell-based therapy）に関連している。再生医療に用いられる成体幹細胞の主な種類の一つである、骨髓由来幹細胞はインビトロで増殖が可能であり、例えば、筋肉細胞、心筋細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神経細胞などを含む多様な細胞へ分化が可能である。また、骨髄由来幹細胞は、免疫調節活性を有するので、同種異系の骨髓移植に適用可能であり、また自家免疫疾患に免疫抑制剤として使用可能である。
【０００３】
脂肪組織も幹細胞を多量に含んでおり、脂肪幹細胞を移植材料として利用しようとする広範囲にわたる研究が近年行われている。脂肪組織は他の組織型と比較してかなり大量の幹細胞を有していて(すなわち、脂肪組織と同量の骨髓から単離された幹細胞より約１,０００倍多い量)、この脂肪由来幹細胞は骨髓由来幹細胞と同様に、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、筋細胞などに分化する多分化能を有している。また、脂肪由来間質幹細胞は骨髓由来幹細胞と同様に細胞表面マーカーの発現を示し、そして自家または同種異系の免疫応答に対するインビボ並びにインビトロの免役調節活性を有している。
【０００４】
瘻孔(fistula)は体内に異常形成された管状の穴(channel)であって、色々の原因によって体の多部位に発生する場合がある。最も頻繁に発生する瘻孔は肛門と直腸を含む腸管系に主に存在している。痔瘻は通常、肛門腺にできた炎症が皮膚の外側に広がって行きながら膿のような分泌物がにじみ出る、炎症障害に起因していて、痔疾患の約２０％を占める。
【０００５】
痔瘻は実質上、直腸管と肛門周辺の皮膚の間の異常な管状の穴を示し、肛門ではなく開口部を介する異常な大便排出をもたらす。これが肛門直腸膿瘍(anorectal abscess)の発生、それに続く排膿瘻孔形成の主な原因である。このように形成された瘻孔を痔瘻(fistula in ano)と称する。すなわち、痔瘻は、肛門直腸膿瘍が破れたときに直腸や肛門管の内側から肛門周辺の皮膚まで形成された長い孔である。痔瘻は肛門機能に重要な役割を果たす外肛門括約筋との関係によって次の４種類に分類される。
【０００６】
（１）内肛門括約筋と外肛門括約筋との間に形成された瘻管を有している括約筋間タイプの痔瘻(inter-sphincteric type); 
（２）外肛門括約筋を貫通して形成された瘻管を有している括約筋貫通タイプの痔瘻(trans-sphincteric type);
（３）外肛門括約筋の上部に形成された瘻管を有している括約筋上部タイプの痔瘻(supra-sphincteric type);及び
（４）肛門腺窩に形成されず、直腸上部付近に形成された１次瘻孔を有している括約筋外部タイプの痔瘻(extra-sphincteric type)。
【０００７】
痔瘻の主な原因は肛門周囲腺の感染であること、更に、痔瘻が結核、クローン病、癌、白血病、白血球減少症などによって発生する場合もあるということが知られている。クローン病は腸の慢性且つ再発性炎症によって特徴付けられて、希少・難治性疾患に指定されている。クローン病による瘻孔は痔瘻だけではなく、膣と連結する直腸膣瘻、腸管付近に形成される腸管瘻などがある。
【０００８】
大部分の瘻孔は外科手術によって治療されている。直腸肛門の周辺に発生した瘻孔治療の最も重要な目的は肛門括約筋の正常機能を維持させつつ、完全に治癒することである。しかし、瘻孔は外科手術後にも再発しやすく、例えば、肛門の機能障害による大便失禁などが発生する。従って、現在の手術法は満足な治療効果をもたらさない。
【０００９】
瘻孔の手術法としては、例えば、瘻孔切開術、セトン(seton)法、高機能移植片(advanced flap)の使用、筋肉充填術(muscle filling procedure)、フィブリン糊(fibrin glue)の使用などがある。このうち、フィブリン糊はフィブリノゲンとトロンビンとを混ぜ合わせて纖維素塊(fibrin clot)を作って、一般的な外科における外科用充填剤として使用されている。痔瘻では、フィブリン糊を外開口部を通じて瘻孔内に注射して、痔瘻の瘻孔と内開口部を満たしている。
【００１０】
最近、幹細胞に関して広範な研究が実施されるにつれ、幹細胞を瘻孔部位に移植して痔瘻を治療する方法が行われてきた。例えば、Mizuno et al.(Plast.Reconstr.Surg.2002,109:199-209)は脂肪組織から分離した成体幹細胞が筋肉細胞に分化するということを立証し、一方、Damian et al.(Dis Colon Rectum 2005,48:1416-1423)は第１相臨床試験において脂肪組織由来幹細胞がクローン病患者の痔瘻を治療するのに安全に使用できることを示した。また、クローン病患者に直腸瘻を治療するために成体幹細胞を移植した結果、幹細胞移植後３ヶ月経過した後にも大便失禁がなかったことが報告された。
【００１１】
脂肪由来間質幹細胞はインビトロの培養が容易であることが知られている。しかし、臨床的に有効な細胞数を得るためには、通常比較的多量の脂肪組織及び長期間の細胞培養時間が必要である。特に、クローン病のように慢性的かつ/又は再発性の疾患を患っている患者の瘻孔の治療には多量の細胞、さらに改善された細胞培養法が必要である。また、同種異系の脂肪由来間質細胞を使用することが可能ならば、、これらは臨床的に極めて有用であろう。
【００１２】
国際公開第2006/136244号(2006年12月28日) には、脂肪由来間質幹細胞を用いる瘻孔の治療及びその使用が開示されている。しかし、治療に用いられる脂肪由来幹細胞は患者自身から得るので、患者が十分な脂肪組織を有していない場合、脂肪組織に含まれる幹細胞の量が著しく少ない場合、或いは患者自身の幹細胞を培養するのに失敗した場合は、臨床的に適した治療を提供することができない。特に、クローン病によって瘻孔ができた患者の場合、患者の体重減少及び低い肥満度指数をもたらす、深刻な腸管炎症を引き起こしている。このような患者に対しては、十分な量の脂肪由来間質細胞の確保が困難である。また、疾患が長期間持続し、患者に多数個の瘻孔が発生するまで悪化して、瘻孔のサイズも相当に大きくなるので、これら患者の治療のためには多量の幹細胞が必要である。
【００１３】
一方、脂肪由来間質細胞のインビトロの培養に関して、既存の特許文献(国際公開第2007/011797号、米国特許第6,777,231号明細書など)や刊行文書(Tissue Engineering 7(2), 211-228, 2001)などに開示された標準的細胞培養法を使用する場合、インビトロの細胞培養に長時間を要し、臨床的に有効な細胞数が得難くなる。従って、臨床適用における実際効率が低下してしまう。未だ明確な原因は明らかに究明されていないが、脂肪幹細胞の増殖率は個人差があって、インビトロ培養中の脂肪間質細胞の増殖が活発に行われずに、細胞培養に失敗する場合があり得る。さらに、例えば、多分化能、免疫調節活性等を含む、脂肪幹細胞の生物学的機能はそのドナーによって異なる場合がある。従って、臨床的に有効な特性を有する同種異系の脂肪幹細胞を利用することによって、瘻孔の治療効果を改善することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第2006/136244号
【特許文献２】国際公開第2007/011797号
【特許文献３】米国特許第6,777,231号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Plast. Reconstr. Surg. 2002, 109:199-209
【非特許文献２】Dis Colon Rectum 2005, 48:1416-1423
【非特許文献３】Tissue Engineering 7(2), 211-228, 2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、ヒトの脂肪組織から分離した間質幹細胞を瘻孔の治療に利用することに関連して、本発明の１つの目的は、臨床的に有効な数の間質幹細胞を製造するためのさらに改善された方法、及びこの方法により製造された脂肪幹細胞組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
前述した目的を達成するために本発明では、同種異系の脂肪組織由来間質幹細胞を含む、瘻孔治療のための脂肪幹細胞組成物を提供する。
【００１８】
前述した他の目的を達成するために本発明では、次の工程を含む、脂肪由来間質幹細胞を含む脂肪幹細胞組成物の製造方法を提供する。
(a) 対象から脂肪組織を採取すること；
(b) 脂肪組織から間質血管分画(stromal vascular fraction、SVF)を単離すること；
(c) ＳＶＦを間質培地で培養すること；
(d) ＳＶＦを成長因子であるＥＧＦまたはｂＦＧＦを含む増殖培地で培養して、脂肪由来間質幹細胞を培養すること；及び
(e) 脂肪由来間質幹細胞を少なくとも１継代培養すること。
【００１９】
本発明により、前記方法に基づき製造された脂肪幹細胞組成物、及び前記組成物を患者の瘻孔に投与する工程を含む瘻孔の治療方法もさらに提供される。
【００２０】
本発明は実質的に、瘻孔を治療するために、ヒト脂肪組織由来間質幹細胞の臨床的有効量を製造する方法、及び当該方法により製造した組成物に関する。移植に使用する脂肪由来間質細胞は自家及び/または同種異系の脂肪組織から単離できる。より特定には、本発明に係る同種異系の脂肪由来間質細胞は対象患者から脂肪組織を単離せずに治療に利用でき、より優れた治療効果を有する同種異系脂肪幹細胞を選択して治療に利用できるので、臨床適合性を有している。
【００２１】
また、自家または同種異系の脂肪組織から単離した間質血管分画（以降、しばしば「ＳＶＦ」と呼す）の培養に関して、本発明は、培養を行うために間質培地及び増殖培地を適宜使用することによって、臨床的に有効な数の間質幹細胞を短期間に効果的に製造できる。より詳細には、本発明は、塩基性線維芽細胞成長因子（以降、しばしばｂＦＧＦと呼す）または上皮細胞増殖因子（以降、しばしばＥＧＦと呼す）のような特異的成長因子を含む増殖培地を利用することによって、幹細胞の培養時間を画期的に短縮することができ、個体差によって変化するそれらの増殖率を容易に制御することができる。さらに、本発明の方法によって製造された脂肪幹細胞は、従来の細胞培養法で製造された細胞に比べて、優れた分化速度と免疫調節活性を示す。
【００２２】
脂肪吸引術によって患者から十分な脂肪組織が提供される場合は、脂肪由来幹細胞を精製して使用できる。しかし、殆どの場合、移植に十分な量の脂肪由来幹細胞を得るためには、増殖過程が必要である。すなわち、脂肪吸引術で得た脂肪組織の量、脂肪組織から単離した脂肪組織由来間質幹細胞の数、及び移植に必要な幹細胞数を計算した後、臨床的に有効な数の幹細胞を得るために、細胞培養及び継代培養を施すべきである。同種異系移植のために、免疫細胞、線維芽細胞など免疫応答を誘発しうる細胞群を十分に除去して、間質幹細胞の均質集団(homogenous population)を生成するために継代培養を施すことが望ましい。継代培養は少なくとも１継代施すのが望ましい。
【００２３】
本明細書において「間質培地」は、ＳＶＦを培養するための培地を示し、ＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２などの適宜な細胞培養培地に１０％ＦＢＳ及び１％抗生剤を加えて調製できる。一方、「増殖培地」は、脂肪由来幹細胞の増殖のために使われる培地を示し、間質培地にｂＦＧＦまたはＥＧＦをさらに含むことができる。
【００２４】
本発明に係る培養方法によれば、脂肪由来幹細胞の平均倍加時間(doubling time)は約４８時間であって、約７２〜１２０時間の平均倍加時間を必要とする従来の培養方法(国際公開第2007/011797号)に比べて、著しく増強された効果を奏する。図１に示したように、各継代における平均培養期間は本発明による所定条件下で４日であり、これに対して、従来の方法による各継代についての平均期間は７日であることから、本発明は、細胞産生日数、すなわち、十分な数の細胞を産生するのに必要な期間、を画期的に短縮することができる。例えば、供与された吸引脂肪組織５０ｍｌを用いて１×１０8個の脂肪幹細胞を得るためには、既存の培養法では少なくとも３０日を必要とする。これに対して、典型的な間質培地にｂＦＧＦまたはＥＧＦを含有する本発明の増殖培地中で供与された吸引脂肪組織を培養する場合は、約１５日で所望の産物が得られる。他の実施例によれば、、供与された吸引脂肪組織の量が５０ｍｌ未満の場合、既存の培養法では臨床的に有効な数の脂肪幹細胞を産生することが難しいが、本発明はこのような難点を克服するための改善された培養法を提供する。
【００２５】
間質幹細胞の培養には、脂肪組織のドナーによって倍加時間がかなり変わるが、本発明は、ドナー間の個人差による培養時間の差異を最小化することができる。従って、本発明に係る細胞培養方法は瘻孔治療のための臨床的に有効な細胞数を確保するのに適している。
【００２６】
一般的に、インビトロ培養によって継代数が増えるほど、幹細胞の多分化能は減少することが知られている。よって、幹細胞の所望の多分化能を維持できる培養法が必要である。本発明に係る培養方法を用いる場合、幹細胞は、既存の培養法に比べて、筋細胞、骨細胞などに分化する優れた多分化能を示す。また、本発明に係る培養方法で得られた脂肪由来間質幹細胞は固有の免疫調節活性を有利に維持しているのみならず、一層優れた効果を示す。すなわち、本発明に従って、ｂＦＧＦまたはＥＧＦを含む増殖培地で培養する場合、幹細胞の固有な性質である多分化能および免疫調節活性がよりよく維持されるので、臨床的に優れた効果を達成する。
【００２７】
脂肪由来間質幹細胞は同種異系の細胞に対して免疫応答を引き起こさず、かえって誘導された免疫応答を阻害する免疫調節機能があることが知られている。本発明は瘻孔治療のために同種異系の脂肪幹細胞を使用できることを提示している。一例として、クローン病患者の抹消血単核球細胞を活性化させる条件下で脂肪幹細胞を添加する場合、免疫応答を抑制（又は制御）することができる。この場合、同種異系の幹細胞は自家幹細胞と同等であるか、またはより優れた機能を有する。従って、同種異系の脂肪幹細胞はクローン病による瘻孔又はその他のタイプの瘻孔の治療のために効果的に使用できる。
【００２８】
本発明において移植に用いられる間質幹細胞は１〜１０継代培養を通じて得られ、望ましくは少なくとも５０％、さらに望ましくは少なくとも８０％のそのような幹細胞がＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＯｃｔ４に対して陽性であり、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１０４、ＣＤ１０６、及びＳｔｒｏ-１には陰性である。
【００２９】
以下の詳細な説明から、本発明の詳細がより明確になるだろう。
【００３０】
本明細書において、「間質血管分画」(stromal vascular fraction；ＳＶＦ)とは、脂肪組織から単離された細胞を示し、脂肪組織をコラゲナーゼで処理及び遠心分離処理によって、殆どの成熟脂肪細胞を除去した後に残っている細胞群を意味する。
【００３１】
「脂肪由来間質幹細胞」(adipose-derived stromal stem cells)は、ＳＶＦから得られる中間葉幹細胞を意味して、脂肪由来幹細胞(adipose-derived stem cells；ＡＳＣ）、脂肪由来成体幹細胞(adipose-derived adult stem cells；ＡＤＡＳ)、脂肪幹細胞等とも表される。
【００３２】
本発明で用いられる「瘻孔」は体内にできた異常な管状の穴(channel)を示す。瘻孔の例としては、痔瘻、肛門直腸瘻、直腸膣瘻、膀胱瘻、腸管瘻、糞瘻などを含み、これに特に限定されない。
【００３３】
「同種異系移植」は同一種の他からのまたは他の個体からの特定組織、臓器、又は細胞の移植、特に自己組織、臓器、又は細胞が使用できない場合の、他人や他の動物からの特定の組織、臓器又は細胞の移植を意味する。
【００３４】
本発明は、主として、自家又は同種異系の脂肪組織からＳＶＦを採取すること、及びＳＶＦから脂肪由来間質幹細胞を培養することを含み、これに関連する方法は既に報告されている。本発明は、米国特許第6,777,231号明細書に開示されている従来の方法を改善することによる、瘻孔治療のため臨床的に有効な数の細胞の製造方法を提示する。より具体的には、米国特許第6,777,231号明細書は、脂肪吸引術によって得られた脂肪組織を処理してＳＶＦを調製するためにコラゲナーゼを用いること、得られた細胞群、すなわち、ＳＶＦを１０％ウシ血清を含有するＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２（Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Broth）で構成される間質培地で培養すること、及び細胞が（培養容器の）８０-９０％をカバーする程生育したら、少なくとも一継代、培養した細胞を培養することを包含している方法を開示している。一方、本発明は、ＳＶＦを間質培地で２４時間培養して、次いでｂＦＧＦまたはＥＧＦを含有している間質培地である増殖培地に培養した細胞を付加することを包含している。本発明によれば、増殖培地は、０.１〜１００ｎｇ／ｍｌ、そして望ましくは１〜１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ又はＥＧＦを間質培地に添加することによって調製でき、それによって多分化能及び免疫調節活性を維持しつつ細胞増殖率を増大する。従って、本発明は改善された細胞製造方法を提供する。
【００３５】
本発明における脂肪由来間質幹細胞は、ヒトの皮下脂肪組織から脂肪吸引術又は外科的切除手術によって得られるが、これに特に限定されない。
【００３６】
本発明における移植に使用するための自家及び／又は同種異系の脂肪由来間質幹細胞は次の方法によって得られるが、細胞培養に使われる基本培地は以下の記載に特に限定されない。
【００３７】
(１) 脂肪吸引術により得られた脂肪組織からのＳＶＦの分離
脂肪組織をＫＲＢ溶液で洗浄して、コラゲナーゼで処理した後、遠心分離を行う。脂肪の上層を除去し、下層に生理学的に適した食塩水溶液（すなわち、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ)を加えて懸濁液を形成する。続いて、遠心分離によってＳＶＦを含有している下層を回収する。
【００３８】
(２) ＳＶＦの間質培地での培養
ＳＶＦを間質培地に懸濁させた後、懸濁液を１０,０００〜４０,０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度で培養容器に接種して、そこで培養する。間質培地は１０％ウシ胎仔血清を含んでいるＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２（Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Broth）を含有する培地であって、、ＳＶＦを約２４時間培養するために用いる。
【００３９】
(３) 増殖培地での培養
間質培地を除去した後、増殖培地を加えて接着（又は付着）細胞を増殖する。増殖培地は１０％ウシ胎仔血清、及び０.１〜１００ｎｇ／ｍｌ濃度のＥＧＦ又は０.１〜１００ｎｇ／ｍｌ濃度のｂＦＧＦを含むＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２であって、脂肪由来の（接着性又は付着性）間質幹細胞を迅速に増殖させて、それによって細胞の数を短期間に大幅に増加させるように機能する。
【００４０】
(４) 継代培養
細胞が培養容器の底部の８０〜９０％を満たしたら、増殖培地を除去して、トリプシン処理を行って、細胞を培養容器から採取する。継代培養のために、細胞を１：３〜１：４の比で希釈し、次いで新たな培養容器において増殖培地を用いて培養する。上記と同様の方法により、さらに継代培養を実施できる。
【００４１】
(５) 免疫調節活性の確認
同種異系の脂肪由来間質幹細胞はそのタイプ(個体)によって異なった免疫調節活性を有しているので、少なくとも１継代の継代培養後に得られた脂肪由来間質幹細胞の免疫調節活性を観察して確認した後、優れた免疫抑制能を有する同種異系の脂肪由来間質幹細胞を選択して使用することができ、それによって自家細胞を越える優れた臨床効果が実現する。
【発明の効果】
【００４２】
以上説明したように本発明によれば、既存の標準培養法を改善したもので、臨床的に有效な数の脂肪組織由来間質幹細胞を短期間に効率よく製造できる。また、本発明に係る方法により得られる脂肪組織由来間質幹細胞を含む脂肪幹細胞組成物は、従来の方法により製造された細胞組成物に比べて分化能と免疫調節活性に優れて、瘻孔治療にさらに適している。特に、同種異系の脂肪由来幹細胞は臨床的用途において優れている。
【００４３】
本発明の上記及びその他の目的、特徴及びその他の利点は、添付した図面を併用して、以下の詳細な説明からより明確に理解できるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、間質培地または増殖培地で培養した脂肪幹細胞の累積集団倍加レベル（Cumulative Population Doubling Level:ＣＰＤＬ）を示したグラフである。
【図２】図２は、間質培地または増殖培地で２０日間培養した脂肪幹細胞の収量を示したグラフである。
【図３】図３は、間質培地または増殖培地で培養した脂肪幹細胞の筋細胞分化を示す写真である(Ｘ４０)。
【図４】図４は、間質培地または増殖培地で培養した脂肪幹細胞の骨細胞分化を示す写真(Ｘ４０)である。
【図５】図５は、脂肪幹細胞の免疫原性を示す図である。
【図６】図６は、ＭＬＲにおいて脂肪幹細胞の免疫抑制活性を示す図である。
【図７】図７は、ＰＨＡで刺激された免疫応答に対する自家及び同種異系の脂肪幹細胞のＩＦＮ−γ分泌抑制活性を示す図である。
【図８】図８は、ＰＨＡで刺激された免疫応答に対する自家及び同種異系の脂肪幹細胞のＴＮＦ−α分泌抑制活性を示す図である。
【図９】図９は、ＰＨＡで刺激された免疫応答に対する間質培地及び増殖培地で培養した脂肪幹細胞のＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α分泌抑制活性（ｎ＝９）を示す図である。
【図１０】図１０は、脂肪幹細胞の細胞外マトリクスタンパク質の分泌活性を示す写真(Ｘ４０)である。
【図１１】図１１は、脂肪幹細胞移植前及び後の痔瘻を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
以下、本発明の好ましい実施態様及び実施例をさらに詳述する。但し、これらの実施例は本発明の例示に過ぎず、本発明を限定することを意図していない。
【実施例】
【００４６】
実施例１：  ヒト脂肪由来間質幹細胞の培養方法
脂肪組織は通常脂肪吸引術により得られるが、これに特に限定されない。
【００４７】
脂肪吸引物から次のようにして脂肪由来間質細胞を単離した：脂肪組織から血液を除去するために、得られた脂肪組織を等容量のＫＲＢ溶液を用いて３〜４回洗浄した。等容量のコラゲナーゼ溶液を脂肪組織に加えて、３７℃水浴中で反応させた。反応生成物を遠心分離用チューブに移し入れて、２０℃、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄液である脂肪層を除去した後、下層として残留するコラゲナーゼ溶液を撹拌せず徐々に分離した。間質培地をコラゲナーゼ溶液に加えて懸濁液を調製した後、２０℃、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この際、下に沈むものが間質血管分画、すなわち、ＳＶＦであって、上澄液を除去した。
【００４８】
ＳＶＦを間質培地に懸濁して、培養容器に接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで２４時間培養した。培養培地を除去し、ＳＶＦをリン酸緩衝生理食塩水（以後、ＰＢＳ）で洗浄した後、ＳＶＦを、間質培地、１ｎｇ／ｍｌ濃度のｂＦＧＦを含有している間質培地、又は５ｎｇ／ｍｌ濃度のＥＧＦを含有している間質培地中で増殖した。脂肪由来間質幹細胞が培養容器の８０〜９０％をカバーするまでに生育したら、細胞をトリプシン処理して単離し、単一タイプの細胞を得た。得られた単一細胞を増殖培地を用いて１:３〜１:４の比で希釈して継代培養を行った。
【００４９】
図１は間質培地又は増殖培地で培養した脂肪幹細胞のＣＰＤＬを示したグラフであり、図２は間質培地又は増殖培地で２０日間培養した脂肪幹細胞の収量を示したグラフである。これらの図に示したように、脂肪幹細胞を間質培地にｂＦＧＦ又はＥＧＦを添加した増殖培地で培養する場合は、細胞の成長速度が標準培地即ち間質培地のみを用いた場合より約３倍速いことが分かった。１.５×１０６個の細胞を前述のそれぞれの培地で２０日間培養すると、平均細胞収量は間質培地では９.７×１０６個、増殖培地では１.９×１０８個であった。従って、増殖培地においては、間質培地におけるよりも約２０倍多い細胞を採取できることが分かる。
次の表１は培養培地による倍加時間（doubling time）及び細胞収量を示す。
【００５０】
【表１】
0005647230.tif 000002
【００５１】
脂肪幹細胞は１０又はそれ以上の継代まで増殖率及び表現型(phenotype)の変化なしで継代培養が可能であると知られている。間質培地を用いる標準培養法で１×１０６個の脂肪幹細胞を継代培養すると、得られる細胞数は約３.８×１０9個である。一方、本発明による増殖培地を用いると、約１.５×１０１３個の細胞が得られ、これは前記の間質培地を用いて得られた細胞数の約４０００倍である。
【００５２】
脂肪吸引術によって得られた脂肪組織５０ｍｌ及び１００ｍｌをそれぞれの培地を用いて培養する場合に、１×１０８個の細胞を産生するのに必要な培養時間は下記の表２の通りである。
【００５３】
【表２】
0005647230.tif 000003
【００５４】
未だその正確な原因及び／または理由は明らかにされていないが、脂肪幹細胞の増殖率は個体により異なり、インビトロ培養において脂肪由来間質細胞の増殖が活発に行われないので、細胞培養に失敗する場合がありうる。
【００５５】
下記の表３は、５０ｍＬの脂肪組織を相異なる７名のドナーから得て、脂肪幹細胞をその脂肪組織から調製して及びそれぞれの培地で培養した、脂肪幹細胞の培養結果を示す。本発明に係る増殖培地を用いて培養した場合、１×１０８個の細胞を得るのに必要な培養時間は１３〜１８日の範囲であった。一方、標準培養法による間質培地を用いると、培養時間は４つのロットで約２５〜３５日であった。更に、３つのロットでは、細胞増殖が十分でなかったので、細胞の産生が不可能であった。
【００５６】
【表３】
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【００５７】
実施例２：  ヒト脂肪由来間質幹細胞の細胞表面マーカー
前記実施例１と同様な方法で取得した脂肪由来間質細胞を１.５ｍｌの遠心分離用チューブに移し入れた。ＦＡＣＳ染色溶液(１％ウシ胎仔血清を含むＰＢＳ)１ｍｌをそこに加えて、均一になるまでよく混ぜ合わせて、１０,０００ｒｐｍで５秒間遠心分離した。上澄液を除去した後、残留する生成物をＦＡＣＳ染色溶液１ｍｌに懸濁して、１０,０００ｒｐｍで５秒間遠心分離した。上澄液を除去した後、残留する生成物をＦＡＣＳ染色溶液３００μｌに再懸濁した。サンプルの数を考慮して、得られたサンプルをそれぞれの遠心分離用チューブに約０.５〜１.０×１０６個の細胞が含まれるように、新たな遠心分離用チューブに分注した。そこに抗体を添加した後、チューブの内容物を４℃で３０分間反応させた。次いで、反応生成物をＦＡＣＳ染色溶液１ｍｌに再懸濁して、１０,０００ｒｐｍで５秒間遠心分離した後、上澄液を除去した。そこにＦＡＣＳ固定液４００〜５００μｌを添加して残留生成物を再懸濁した。得られた懸濁液をフローサイトメータを用いる分析に付した。
【００５８】
その分析の結果、下記の表４に示したように、本発明によって増殖させた脂肪幹細胞の少なくとも９５％がＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＯｃｔ４に対して陽性応答を示し、ＳＴＲＯ−１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１０４及びＣＤ１０６に陰性応答を示した。ただし、ＣＤ３４では、所定の脂肪組織ロットによって、ｐ０において約５〜１０％の脂肪幹細胞が陽性反応を示す場合もあった。培養条件による差異は観察されなかった。
【００５９】
【表４】
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【００６０】
実施例３：  ヒト脂肪由来間質幹細胞の分化能
実施例２と同様な方法で培養した脂肪由来間質幹細胞が、培養容器の８０〜９０％に生育したときに、培養した細胞をトリプシン処理して単離し、単一細胞を取得した。
【００６１】
それぞれ異なる培養培地を用いて培養した脂肪由来間質幹細胞の筋細胞分化能を確認するために、４つのウェルに各ウェルが約５,０００細胞／ｃｍ２を含有するように細胞を接種した。接種した細胞が培養容器の８０％を満たすまで培地を交換しつつ培養した。脂肪由来間質幹細胞が培養容器の１００％を満たしたとき、用いた培地を排出してプロモセル社製の筋細胞分化培地と交換し、２週間幹細胞の筋細胞への分化を誘導した。筋細胞への分化率を測定するために、次の方法によって免疫蛍光染色を行った：ＰＢＳを用いて幹細胞を３回洗浄し、４％のフォルムアルデヒドを含むＰＢＳを３０分間用いて固定した。次いで、固定した細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、５％正常山羊血清（normal goat serum）と０.１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳを３０分間用いて、洗浄した生成物を透化処理及びブロッキングした。筋細胞に特異的なデスミンとミオシンの１次抗体を含むＰＢＳを細胞に添加した後、これらを３７℃で１時間反応させて、反応生成物をＰＢＳで３回洗浄し、２次抗体を用いて３０分間反応させた。生成物をＰＢＳを用いて再び３回洗浄した後、それにマウント溶液を適用して、蛍光顕微鏡で観察した。
【００６２】
図３は間質培地又は増殖培地で培養した脂肪幹細胞の筋細胞分化を示す写真である(Ｘ４０)。 図３に示したように、間質培地で培養したものより、間質培地にｂＦＧＦを添加した増殖培地で培養した脂肪由来間質幹細胞でデスミンとミオシンに陽性である細胞がさらに多く観察された。すなわち、本発明によって間質培地にｂＦＧＦを添加して調製した培地で脂肪由来間質幹細胞を培養した時、筋細胞への分化率が向上されたことを確かめることができた。
【００６３】
相異なる培養培地で培養した脂肪由来間質幹細胞の骨細胞分化能を確認するため、１２のウェルに各ウェルが約２０,０００細胞／ｃｍ２を含有するように細胞を接種した。接種した細胞が培養容器の約１００％を満たすまで培地を交換しながら培養した。脂肪由来間質幹細胞が培養容器の１００％を満たしたら、用いた培地を排出して、１００μｇ／ｍｌアスコルビン酸、１０ｎＭグリセロリン酸塩、１００ｎＭデキサメタソン及び１０ｎＭビタミンＤ３が含まれた骨細胞分化培地と交換して、４週間幹細胞の骨細胞への分化を誘導した。骨細胞への分化率を測定するために、以下の方法によってｖｏｎ−Ｋｏｓｓａ染色を行った：ＰＢＳを用いて、幹細胞を３回洗浄し、４％のフォルムアルデヒドを含むＰＢＳを２０分間用いて固定した。次いで固定した細胞を蒸留水で３回洗浄した後、５％硝酸銀溶液をこれに添加して、ＵＶ照射に１時間露出した。蒸留水を用いて暴露した物質を３回洗浄して、５％チオ硫酸ナトリウム溶液をそこに添加した後、２分間反応させた。蒸留水を用いて反応生成物を３回洗浄し、マウント液をそこに適用して、顕微鏡を用いて細胞を観察した。
【００６４】
図４は間質培地又は増殖培地で培養した脂肪幹細胞の骨細胞分化を示す写真である(Ｘ４０)。図４に示したように、間質培地で培養したものより、ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含有している増殖培地で培養した脂肪由来間質幹細胞が大幅に増大したｖｏｎ−Ｋｏｓｓａ染色を示した。すなわち、本発明によると、間質培地にｂＦＧＦ又はＥＧＦを添加して調製した増殖培地で脂肪由来間質幹細胞を培養した時、幹細胞の分化が向上したことが分かる。
【００６５】
実施例４：  ヒト脂肪由来間質細胞の免疫調節活性
ヒト白血球抗原（Human Leukocyte Antigen；ＨＬＡ）の分析結果に従って、ＨＬＡタイプＩ及びＩＩの多様な組み合わせを有する７種類のヒト抹消血単核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell; ＰＢＭＣ)と脂肪由来間質幹細胞を選択し、次いで混合リンパ球反応(Mixture Lymphocyte Reaction; ＭＬＲ)を行った。Ｕ底９６ウェルプレートの各ウェルに、キラー細胞（responder cell）として、各ロットのＰＢＭＣを２×１０５細胞/ウェルになるように添加した。次いで刺激細胞（stimulator）として、各ロットの脂肪由来間質幹細胞を各ウェルに２×１０4 細胞の量で添加した。陽性対照として、ＰＢＭＣ２×１０4個をマイトマイシンＣを用いて処理してウェルに添加した。反応後３日目に、上澄液を収集して、分泌されたＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
【００６６】
図５は脂肪幹細胞の免疫原性を示す。この図に示したように、陽性対照であるＰＢＭＣの場合、これらは同種異系のＰＢＭＣと反応して多量のＩＦＮ−γを分泌をもたらした。一方、実施例１に従って培養した脂肪由来間質幹細胞と反応した前記ＰＢＭＣはＩＦＮ−γの分泌を示さないか、自家のＰＢＭＣと実質的に同程度のＩＦＮ−γを示した。すなわち、脂肪由来間質幹細胞は同種異系のＰＢＭＣに対して免疫応多分化能答を誘発しないことが分かる。
【００６７】
他の実施態様によると、相異なるＰＢＭＣを含む２つのロットをＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに２×１０5細胞/ウェルの量で接種して免疫応答を誘発して、次いで実施例１に従って培養した同種異系の脂肪由来間質幹細胞をそれぞれ５,０００、１０,０００、及び２０,０００個でウェルに添加した。７２時間培養した後、それぞれのウェルから上澄液を採取して、ＩＦＮ−γ分泌量を測定した。
【００６８】
図６はＭＬＲにおける脂肪幹細胞の免疫抑制活性を示す。この図に示したように、実施例１に従って培養した脂肪由来間質幹細胞をウェルに添加した時、添加した細胞数に比例して免疫応答が抑制（または制御）されることが分かる。すなわち、脂肪由来間質幹細胞は同種異系のＴ細胞による免疫応答を誘発せず、免疫応答の発生時に免疫細胞によって多量分泌されて免疫活性を増加させるＩＦＮ−γの分泌を著しく減少させるので、免疫抑制活性を有する。
【００６９】
実施例５：  同種異系のヒト脂肪由来間質細胞の免疫調節活性
同種異系及び自家の脂肪由来間質幹細胞の免疫抑制活性を確認するため、相異なる４名のドナーから得たＰＢＭＣを植物性血球凝集素（ＰＨＡ）で活性化して、ＩＦＮ−γ又はＴＮＦ−α分泌の量を測定した。９６ウェルプレートのそれぞれに自家又は同種異系の脂肪由来間質幹細胞を１０,０００細胞の量で接種した後、１×１０5細胞/ウェルのＰＢＭＣをウェルに添加して、次いでＰＨＡを用いて免疫応答を誘発した。７２時間後に、上澄液を採取して、ＩＦＮ−γ又はＴＮＦ−α分泌の量を測定した。
【００７０】
図７はＰＨＡで刺激された免疫応答に対する自家及び同種異系の脂肪幹細胞のＩＦＮ−γ分泌抑制活性を示し、図８はＰＨＡで刺激された免疫応答に対する自家及び同種異系の脂肪幹細胞のＴＮＦ−α分泌抑制活性を示す。図７及び図８に示したように、実施例１に従って培養した脂肪由来間質幹細胞をウェルに添加した時、自家及び同種異系の脂肪由来間質幹細胞の両方でＩＦＮ−γ又はＴＮＦ−α分泌の量が著しく減少した。特に、同種異系の脂肪由来間質幹細胞はそのタイプ（個体）によって実質的に異なる免疫調節活性を示すので、優れた免疫抑制活性を有する脂肪由来間質細胞をスクリーニングして使用する場合、自家間質細胞に比べて、臨床的に優れて効果的である。
【００７１】
すなわち、同種異系の脂肪由来幹細胞は免疫細胞を活性化するマイトゲン（mitogen）により誘発される免疫応答を制御できるので、免疫抑制活性を有し、このような活性は自家脂肪由来幹細胞のそれと実質的に同等であるか、あるいはそれより優れている増殖。
【００７２】
実施例６：  間質培地又は増殖培地で産生したヒト脂肪由来間質細胞の免疫調節活性
間質培地または増殖培地で産生したヒト脂肪由来間質幹細胞の免疫調節活性を比較するために、相異なる３名のドナーから得た脂肪幹細胞をそれぞれに間質培地または本発明で開示した増殖培地で培養した。３名の別々のドナーから得たＰＢＭＣをＰＨＡを用いて活性化した後、前記の脂肪幹細胞を活性化したＰＢＭＣに添加して、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの分泌量を測定した。９６ウェルプレートの各ウェルに脂肪由来間質幹細胞を１０,０００細胞の量で接種した後、１×１０5細胞/ウェルのＰＢＭＣ（抹消血単核球）をウェルに添加して、次いでＰＨＡを用いて免疫応答を誘発した。７２時間後に、上澄液を採取して、ＩＦＮ−γ又はＴＮＦ−αの分泌量を測定した。
【００７３】
図９はＰＨＡで刺激した免疫応答に対する、間質培地及び増殖培地で培養した脂肪幹細胞のＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの両方の分泌抑制活性（ｎ＝９）を示す。図９に示したように、実施例１に従って増殖培地で培養した脂肪由来間質幹細胞を添加した時、間質培地を用いて産生した幹細胞に比べて、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α分泌抑制活性が著しく増加したことが分る。すなわち、本発明に従って産生された脂肪由来幹細胞は既存の標準培養法に比べて、マイトゲンによって誘発された免疫応答を一層効率よく抑制（又は制御）した。
【００７４】
実施例７：  ヒト脂肪由来間質幹細胞のＥＣＭタンパク質の分泌活性
実施例１において培養した脂肪由来間質細胞を４ウェルプレートの各ウェルに接種して培養容器に入れた。細胞をＰＢＳで３回洗浄して、４％のフォルムアルデヒドを含むＰＢＳを３０分間用いて固定した。次いで、固定した細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、洗浄した生成物を５％正常山羊血清及び０.１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳを３０分間用いて透化処理及びブロッキングした。処理した物質に１次抗体を含むＰＢＳを添加して３７℃で１時間反応させた後、反応生成物をＰＢＳで３回洗浄し、２次抗体で３０分間反応させた。生成物をＰＢＳ（リン酸塩緩衝溶液）で再度３回洗浄した後、洗浄した生成物はマウント溶液をそれに適用してマウントし、蛍光顕微鏡で観察した。
【００７５】
図１０は脂肪幹細胞の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）蛋白質分泌活性を示す写真(Ｘ４０)である。写真に示したように、本発明に従って培養した脂肪幹細胞はコラーゲンタイプＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ、タイプＶ、フィブロネクチン及びラミニンに陽性応答を示した。すなわち、本発明に従って培養した脂肪由来間質細胞はコラーゲンタイプＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ、タイプＶ、フイブロネクチン及びラミニンなど多種のＥＣＭを発現できるので、体内に前記細胞を移植した時、細胞の生着及び／または新たな組織の形成を容易にすることができる。
【００７６】
実施例８：  脂肪由来間質細胞を用いるクローン性瘻孔治療例
実施例１に記載と同様の方法により培養した脂肪由来間質細胞の臨床的適用のため、クローン性瘻孔患者を対象にして臨床試験を施した。調製した細胞を１〜３継代培養した。１〜２×１０7細胞/ｍｌ濃度の細胞を瘻孔のサイズによって４〜１４ｍｌ容量で瘻孔壁に沿って移植した。細胞移植後に、瘻孔をフィブリン糊で充填した。
【００７７】
（移植例１）
本患者は２４歳の女性患者であって、１０年前にクローン病の診断を受け、２年前に瘻孔切除術を受けた。しかし、術後１年６ヶ月に、患者は疾患の再発により、外科的切除手術を受けた。アザチオプリン（Azathioprine）、レミケード（Remicade）などを投与されたが、病状は改善しなかった。痔瘻の継続的な再発とその炎症によって、対象である痔瘻サイズが５.５ｃｍ（深さ）×２ｃｍ（直径）で、膿瘍の排出が多く、相当に悪化していた（図１１のＡを参照されたい）。患者の腹部から約５０ｍｌの脂肪組織を採取し、脂肪組織を３継代まで培養して、総数２.８×１０8個の細胞を得た。総産生期間は２１日であった。細胞移植前に、掻爬を施して炎症組織を除去して、２×１０７細胞/ｍｌ濃度で細胞を瘻孔管の最深部から瘻孔管に沿って移植した。移植後に、フィブリン糊を利用して瘻孔管を充填した。細胞移植後２週間の追跡観察から、瘻孔管が殆ど閉鎖して、外部開口の殆どに上皮化が起こったことが分かった。８週間追跡観察の結果、痔瘻部位が完全に閉鎖して、外部開口が完全に上皮化されたことが観察された（上皮化した部分を少し擦って内部瘻孔管が完全に閉鎖したことを確認した)。
【００７８】
（移植例２）
本患者は２４歳の男性患者であって、１０年前にクローン病と診断されて、過去３年の間に３回瘻孔切除術を受けた。しかし、病気の継続的な再発と外科的切除手術を繰り返した。ステロイド、レミケードなどを投与されたが、病状は改善しなかった。痔瘻の継続的な再発とその炎症によって、対象である痔瘻は肛門から１ｃｍの距離の１０時の方向に位置し、サイズが７ｃｍ（深さ）×１ｃｍ（直径）で、膿瘍の排出が多く、相当に悪化していた(図１１のＢを参照されたい)。患者の腹部から約７０ｍｌの脂肪組織を採取し、脂肪組織を３継代まで培養して、総数３×１０8個の細胞を得た。総培養期間は２０日であった。細胞移植の前に、掻爬を施して炎症組織を除去し、２×１０７細胞/ｍｌ濃度で細胞を瘻孔管の最深部から瘻孔管に沿って移植した。移植後に、フィブリン糊を利用して瘻孔管を充填した。細胞移植後、２週間の追跡観察から、細胞移植前に元々約７ｃｍの深さであった瘻孔管の少なくとも半分が閉鎖して、約３ｃｍの深さになっていた。８週間の追跡観察の結果、痔瘻部位が完全に閉鎖し、その外部開口が完全に上皮化されたことが観察された(上皮化した部分を少し擦って内部瘻孔管が完全に閉鎖したことを確認した)。
図１１は脂肪幹細胞移植の前及び後の痔瘻を示す写真である。
【００７９】
以上の臨床例が示すように、薬物に応答せず、継続的に再発して、従来の方法では治療し難かった痔瘻を、本発明の方法に従って培養した脂肪幹細胞を用いて効率よく治療できることが分る。特に、移植例１及び２に記載のように、重篤な痔瘻、例えば、１ｃｍ以上の直径及び／又は５ｃｍ以上の深さを有する大きいサイズの瘻孔管を治療する方法は今まで開示されていなかった。痔瘻に移植する細胞の製造のため、実施例１に提示する改善された培養方法を適用して、多量の脂肪幹細胞を培養することができた。本発明の培養方法は、国際公開第２００６／１３６２４４号（２００６年１２月２８日）に開示されている従来方法に比べて、２〜３継代の培養により１０倍以上の脂肪組織由来間質細胞の供給を可能にした。さらに、治療結果も優れて、向上した臨床効果を達成する。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明による培養方法は、従来の標準的な培養方法を改善することにより、臨床的に有效な数の脂肪組織由来間質幹細胞を短期間に効率よく製造できる。
【００８１】
本発明の方法で得られる脂肪組織由来間質幹細胞を含有している脂肪幹細胞組成物は、従来の方法で製造された細胞組成物と比べて、優れた多分化能及び免疫調節活性を示すので、瘻孔の治療により適している。特に、臨床適用を考慮すると同種異系の脂肪由来幹細胞は優れている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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