(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−１，３−グルカンを細胞壁の恒常的構成成分として含む植物感染性微生物及び／又は宿主植物との接触に応答してα−１，３−グルカンを含む細胞壁被覆層を形成する植物感染性微生物で、かつＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ属菌、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ属菌、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ属菌、及びＴｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ属菌からなる群から選択される植物感染性微生物の細胞壁におけるα−１，３−グルカンをα−１，３−グルカナーゼにより分解することを特徴とする植物感染性微生物の宿主植物に対する感染を防止又は抑制する方法。
【請求項２】
前記植物が、双子葉類又は単子葉類植物である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記植物がイネ科植物又はナス科植物である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記植物において外来遺伝子によって発現させたα−１，３−グルカナーゼにより、前記植物感染性微生物の細胞壁におけるα−１，３−グルカンを分解する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
α−１，３−グルカナーゼを前記植物に接触させる、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
α−１，３−グルカナーゼ遺伝子を有し、α−１，３−グルカナーゼを細胞外に分泌する微生物を有効成分として含む微生物農薬製剤を前記植物に作用させる、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記微生物におけるα−１，３−グルカナーゼの発現量がその野生型株の通常生育時のその発現量と比較して有意に大である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記微生物にα−１，３−グルカナーゼの発現誘導処理を施す、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記発現誘導処理がα−１，３−グルカンの添加である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記α−１，３−グルカナーゼ遺伝子が内在性遺伝子である、請求項６〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ属菌、及び／又はＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属菌である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
α−１，３−グルカナーゼ遺伝子を有し、α−１，３−グルカナーゼを細胞外に分泌する微生物を有効成分として含む微生物農薬製剤。
【請求項１３】
前記微生物におけるα−１，３−グルカナーゼの発現量がその野生型株の通常生育時のその発現量と比較して有意に大である、請求項１２記載の微生物農薬製剤。
【請求項１４】
前記微生物にα−１，３−グルカナーゼの発現誘導処理を施す、請求項１３記載の微生物農薬製剤。
【請求項１５】
発現誘導処理がα−１，３−グルカンの添加である、請求項１４記載の微生物農薬製剤。
【請求項１６】
前記α−１，３−グルカナーゼ遺伝子が内在性遺伝子である、請求項１２〜１５のいずれか１項記載の微生物農薬製剤。
【請求項１７】
前記微生物が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、及び／又はＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属菌である、請求項１６記載の微生物農薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物に対する植物感染性微生物の感染を防止又は抑制する方法及び微生物感染抵抗性植物の作製方法、及び微生物農薬製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞壁成分は、動植物の真核微生物に対する初期免疫システムにおいて、最初に認識される物質の１つである。動植物細胞は、真核微生物の細胞壁の分解産物を微生物分子パターン（ＭＡＭＰｓ）として認識することにより生体防御反応を引き起こし、菌の感染を阻止する。動物細胞では細胞壁のキチン、β−グルカン、マンナンが、植物細胞ではキチンやβ−グルカンが、ＭＡＭＰｓとして認識されることが知られている（非特許文献３：Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；非特許文献２：Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｇｏｒｄｏｎ，２００５；非特許文献７：Ｒｅｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；非特許文献１：Ａｌｔｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｒｏｂａｔｚｅｋ，２００７）。
植物細胞は、ＭＡＭＰｓを認識すると溶菌酵素（細胞壁分解酵素等）や抗菌物質の生産等の生体防御反応を引き起こし、病原菌の感染を妨害する（非特許文献１：Ａｌｔｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｒｏｂａｔｚｅｋ，２００７）。
細胞の防御反応に対抗するために感染菌が宿主による認識を回避する方法については、一部の病原菌の場合を除き、明らかになっていない。近年、動物病原菌であるＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍでは感染時の細胞壁表面がα−１，３−グルカンで覆われていること、植物感染菌であるＰｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ｆａｂａｅ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａでは感染時の細胞壁表面のキチンがキトサンに変換されていることが明らかになっている。これらの菌は、自身の細胞壁表面を宿主細胞に認識されにくい成分に再構築することで宿主によるＭＡＭＰｓ認識を妨害していると考えられている（非特許文献６：Ｒａｐｐｌｅｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；非特許文献４：Ｅｄｄｉｎｅ  Ｅｌ  Ｇｕｅｄｄａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
いもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）は、主にイネ科穀類に感染する重要な植物病原性糸状菌である。イネは、レセプターを介して菌の細胞壁由来のキチンオリゴマーを認識できることが知られているが（非特許文献５：Ｋａｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、イネによる細胞壁キチン認識に対するいもち病菌側の回避機構のみならず、イネいもち病菌の感染時の細胞壁構成成分に関する知見については全く知られていない。イネゲノム情報（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉａｓ．ｇｏ．ｊｐ）から、イネにはα−１，３−グルカン分解酵素（α−１，３−グルカナーゼ）やキトサン分解酵素がないが、β−１，３−グルカン分解酵素、キチン分解酵素があることが明らかである。すなわち、イネにおいては侵入菌の細胞壁由来のＭＡＭＰｓとして認識されるのはキチンやβ−１，３−グルカンの分解産物であり、侵入した菌の攻撃にはβ−１，３−グルカン分解酵素、キチン分解酵素が用いられていることが強く推測される。
一方、イネいもち病菌の細胞壁には、α結合を有するヘテロ多糖類が存在することは知られていたが（非特許文献８〜１１）、それらが具体的にどのような糖か、どのように局在しているかについては不明であった。
特許文献１（米国特許第５，６７０，７０６号公報）には、細胞内キチナーゼを発現させることにより植物の菌類病耐性を向上させることが記載されている。また、キチナーゼ遺伝子に加えてβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子を導入することも記載されている。しかし、β−１，３−グルカナーゼ遺伝子を単独で発現させることについては言及されていない。さらに、α−１，３−グルカナーゼの利用については全く記載されていない。
特許文献２（再公表公報ＷＯ９８／５８０６５号）及び特許文献３（再公表公報ＷＯ９７／２２２４２号）には、グルカンエリシターレセプターをコードするＤＮＡを、単独で又はグルカナーゼ遺伝子とともに植物に導入することにより、植物をカビに対して抵抗性にすることが記載されている。しかし、ここで使用されたグルカナーゼは、単独で発現させた場合には十分な抵抗性が得られなかったとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第５，６７０，７０６号公報
【特許文献２】再公表公報ＷＯ９８／５８０６５号（発明の名称：カビ抵抗性植物及びその作出方法）
【特許文献３】再公表公報ＷＯ９７／２２２４２号（発明の名称：カビ耐性植物及びその作出方法）
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ａｌｔｅｎｂａｃｈ，Ｄ．，Ｒｏｂａｔｚｅｋ，Ｓ．，２００７．Ｐａｔｔｅｒｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｔｏ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．２０，１０３１−１０３９．
【非特許文献２】Ｂｒｏｗｎ，Ｇ．Ｄ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｓ．，２００５．Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｇａｌ  β−ｇｌｕｃａｎｓ．Ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７，４７１−４７９．
【非特許文献３】Ｈｏｇａｎ，Ｌ．Ｈ．，Ｋｌｅｉｎ，Ｂ．Ｓ．，Ｌｅｖｉｔｚ，Ｓ．Ｍ．，１９９６．Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌｌｙ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｆｕｎｇｉ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．９，４６９−４８８．
【非特許文献４】Ｅｄｄｉｎｅ  Ｅｌ  Ｇｕｅｄｄａｒｉ，Ｎ．，Ｒａｕｃｈｈａｕｓ，Ｕ．，Ｍｏｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ，Ｂ．Ｍ．，Ｄｅｉｓｉｎｇ，Ｈ．Ｂ．，２００２．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｘｐｏｓｅｄ  ｃｈｉｔｉｎ  ｔｏ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｆｕｎｇｉ．Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ．１５６，１０３−１１２．
【非特許文献５】Ｋａｋｕ，Ｈ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｙ．，Ｉｓｈｉｉ−Ｍｉｎａｍｉ，Ｎ．，Ａｋｉｍｏｔｏ−Ｔｏｍｉｙａｍａ，Ｃ．，Ｄｏｈｍａｅ，Ｎ．，Ｔａｋｉｏ，Ｋ．，Ｍｉｎａｍｉ，Ｅ．，Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｎ．，２００６．Ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ｃｈｉｔｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０３，１１０８６−１１０９１．
【非特許文献６】Ｒａｐｐｌｅｙｅ，Ｃ．Ａ．，Ｇｒｏｐｐｅ  Ｅｉｓｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．，Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｗ．Ｅ．，２００７．Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ  α−（１，３）−ｇｌｕｃａｎ  ｂｌｏｃｋｓ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  β−ｇｌｕｃａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０４，１３６６−１３７０．
【非特許文献７】Ｒｅｅｓｅ，Ｔ．Ａ．，Ｌｉａｎｇ，Ｈ．−Ｅ．，Ｔａｇｅｒ，Ａ．Ｍ．，Ｌｕｓｔｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｒｏｏｉｊｅｎ，Ｎ．Ｖ．，Ｖｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｄ．，Ｌｏｃｋｓｌｅｙ，Ｒ．Ｍ．，２００７．Ｃｈｉｔｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｌｌｅｒｇｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４７，９２−９６．
【非特許文献８】中島ら、日本植物病理学会報、第３４巻第５号（昭和４３年（１９６８年）１２月）、３６０頁右欄（１２）
【非特許文献９】田中ら、Ａｎｎ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ、ＸＸＸＶ（２），Ｍａｒｃｈ  １９６９、９５頁左欄（９）
【非特許文献１０】中島ら、Ａｎｎ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ、ＸＸＸＶＩ（３），Ｊｕｎｅ  １９７０、１５９頁左欄（９）
【非特許文献１１】Ｎａｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７７  Ｄｅｃ；８２（６）：１６５７−６２
【非特許文献１２】Ｄ’Ｈａｅｚｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｓｔｅｒｓ．２００４．Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｅｎａｂｌｅｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｏ  ｅｖａｄｅ  ｐｌａｎｔ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：５５５−５６１
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、植物感染性微生物による感染を防止又は抑制し、宿主植物に抵抗性を付与する方法、植物感染性微生物による感染に対して耐性を有する植物の作製方法、及び微生物農薬製剤を提供することを目的とする。
本発明者は、植物感染性微生物の多くがα−１，３−グルカンを細胞壁の恒常的な構成成分として含むこと、また一部の植物感染性微生物では宿主植物への感染時にα−１，３−グルカン層で菌糸及び感染器官が被覆されることに基づき、当該α−１，３−グルカンをα−１，３−グルカナーゼによって分解することで宿主植物に接種した植物感染性微生物の感染力を低減できることを見出した。本発明は、当該知見に基づいて完成されたものであり、以下を提供する。
（１）植物感染性微生物の宿主植物に対する感染を防止又は抑制する方法であって、前記微生物の細胞壁におけるα−１，３−グルカンをα−１，３−グルカナーゼにより分解することを特徴とする方法。
（２）前記植物感染性微生物は、細胞壁における恒常的構成成分としてα−１，３−グルカンを含む、（１）記載の方法。
（３）前記植物感染性微生物は、宿主植物との接触に応答してα−１，３−グルカンを含む細胞壁被覆層を形成する、（１）又は（２）記載の方法。
（４）前記植物感染性微生物が、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ属菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ属菌、Ｐｕｃｃｉｎｉａ属菌、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ属菌、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属菌、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ属菌、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ属菌及びＳｃｌｅｒｏｔｉｕｍ属菌、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ属菌、Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ属菌、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ属菌からなる群から選択される、（２）記載の方法。
（５）前記植物感染性微生物が、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ属菌又はＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ属菌である、（３）記載の方法。
（６）前記植物が、双子葉類又は単子葉類植物である、（１）〜（５）のいずれか記載の方法。
（７）前記植物がイネ科植物又はナス科植物である、（６）記載の方法。
（８）前記植物において外来遺伝子によって発現させたα−１，３−グルカナーゼにより、前記植物感染性微生物の細胞壁におけるα−１，３−グルカンを分解する、（１）〜（７）のいずれか記載の方法。
（９）α−１，３−グルカナーゼを前記植物に接触させる、（１）〜（８）のいずれか記載の方法。
（１０）α−１，３−グルカナーゼ遺伝子を有し、α−１，３−グルカナーゼを細胞外に分泌する微生物を有効成分として含む微生物農薬製剤を前記植物に作用させる、（１）〜（９）のいずれか記載の方法。
（１１）前記微生物におけるα−１，３−グルカナーゼの発現量がその野生型株の通常生育時のその発現量と比較して有意に大である、（１０）記載の方法。
（１２）前記微生物にα−１，３−グルカナーゼの発現誘導処理を施す、（１１）記載の方法。
（１３）前記発現誘導処理がα−１，３−グルカンの添加である、（１２）記載の方法。
（１４）前記α−１，３−グルカナーゼ遺伝子が内在性遺伝子である、（１）〜（１３）のいずれか記載の方法。
（１５）前記微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌及び／又はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属菌である、（１４）記載の方法。
（１６）α−１，３−グルカナーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターで植物を形質転換する工程を含むことを特徴とする、微生物感染抵抗性植物の作製方法。
（１７）（１６）記載の方法に使用するための、α−１，３−グルカナーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクター。
（１８）（１７）記載の発現ベクターを含む植物細胞。
（１９）（１８）記載の植物細胞を含む植物組織。
（２０）（１８）記載の植物細胞又は（１９）記載の植物組織を含む植物体。
（２１）（２０）記載の植物体から得られる種子。
（２２）α−１，３−グルカナーゼ遺伝子を有し、α−１，３−グルカナーゼを細胞外に分泌する微生物を有効成分として含む微生物農薬製剤。
（２３）前記微生物におけるα−１，３−グルカナーゼの発現量がその野生型株の通常生育時のその発現量と比較して有意に大である、（２２）記載の微生物農薬製剤。
（２４）前記微生物にα−１，３−グルカナーゼの発現誘導処理を施す、（２３）記載の微生物農薬製剤。
（２５）発現誘導処理がα−１，３−グルカンの添加である、（２４）記載の微生物農薬製剤。
（２６）前記α−１，３−グルカナーゼ遺伝子が内在性遺伝子である、（２２）〜（２５）のいずれか記載の微生物農薬製剤。
（２７）前記微生物が、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属菌とＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌である、（２６）記載の微生物農薬製剤。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００９−０６２３５０号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１は、いもち病菌の感染器官における細胞壁構成成分の検出を示す図である。図中、パネルＡ１及びＡ２はそれぞれ接種後１６時間及び２４時間の明視野像である。パネルＢ１及びＢ２はα−１，３−グルカン、パネルＣ１及びＣ２はβ−１，３−グルカン、パネルＤ１及びＤ２はキチン、パネルＦ２はキトサン、パネルＨ２はマンナンを、それぞれ染色した像である。パネルＥ２はキトサン染色像（Ｆ２）、パネルＧ２はマンナン染色像（Ｈ２）に対応する明視野像である。上段パネルは接種後１６時間、中段及び下段パネルは接種後２４時間の像である。Ｃ＝胞子、Ｇ＝発芽管、Ａ＝付着器、ＩＦ＝侵入菌糸を表し、各パネルのバーは２０μｍである。
図２は、α−１，３−グルカナーゼ処理後のいもち病菌侵入菌糸での細胞壁成分の検出を示す図である。図中、パネルＡは明視野像であり、パネルＢはα−１，３−グルカン、パネルＣはβ−１，３−グルカン、パネルＤはキチンで、それぞれ染色した像である。  Ａ＝付着器、ＩＦ＝侵入菌糸を表し、各パネルのバーは２０μｍである。
図３Ａは、α‐１，３−グルカン合成遺伝子（ＭｇＡＧＳ１）をマーカー遺伝子であるビアラフォス耐性遺伝子（Ｂａｒ遺伝子）と置換することにより、欠損株を作製するためのストラテジーを示す図である。
図３Ｂは、ＭｇＡＧＳ１のビアラフォス耐性遺伝子（Ｂａｒ遺伝子）による置換をサザンハイブリダイゼーション法により確認した図である。プローブとして、上パネルは「ｐｒｏｂｅ  ＡＧＳ１−ｉｎｔ２」、下パネルは「ｐｒｏｂｅ  Ｂａｒ」を使用した。
図４は、野生株及びΔＭｇＡＧＳ１株の感染器官形成能を示す図である。上パネルは、カバーグラス上での、野生株（左）及びα−１，３−グルカン合成酵素欠損株（ΔＭｇＡＧＳ１株）（右）の感染器官形成を示す像である。下パネルは、熱処理したタマネギ鱗片細胞上での、野生株（左）及びΔＭｇＡＧＳ１株（右）の感染器官形成を示す像である。  Ｃ＝胞子、Ａ＝付着器、ＩＦ＝侵入菌糸を表す。
図５は、ΔＭｇＡＧＳ１株のイネに対する感染力の低下を示す図である。左パネルは野生株、右パネルはΔＭｇＡＧＳ１株をそれぞれ接種した後のイネ葉の図である。
図６は、ΔＭｇＡＧＳ１株のオオムギに対する感染力の低下を示す図である。左パネルは野生株、右パネルはΔＭｇＡＧＳ１株をそれぞれ接種した後のオオムギ葉の図である。
図７は、α−１，３−グルカナーゼの添加によるイネにおけるいもち病菌付着器及び侵入菌糸形成の阻害を示す図である。左パネルは野生株、右パネルは野生株にα−１，３−グルカナーゼを添加したものを、それぞれ接種した４８時間後のイネ細胞の観察像である。右下のバーは２０μｍである。
図８は、α−１，３−グルカナーゼを添加した場合の野生株の感染力の低下を示す図である。左パネルはα−１，３−グルカナーゼ無添加の野生株を、右パネルはα−１，３−グルカナーゼを添加した野生株を、それぞれ接種した後のイネ葉の図である。
図９は、α−１，３−グルカナーゼを添加した場合の野生株の感染力の低下を示す図である。左パネルはα−１，３−グルカナーゼ無添加の野生株を、右パネルはα−１，３−グルカナーゼを添加した野生株を、それぞれ接種した後のオオムギ葉の図である。
図１０は、プラスチック表面上でのいもち病菌細胞壁成分合成酵素遺伝子の転写量を示す図である。パネル（Ａ）は示した時間における胞子の顕微鏡像を示す。右下のバーは２０μｍである。パネル（Ｂ）はα−１，３−グルカン合成酵素（ＭｇＡＧＳ１）遺伝子、パネル（Ｃ）はβ−１，３−グルカン合成酵素（ＭｇＦＫＳ１）遺伝子の転写量を、それぞれアクチン遺伝子の転写量に対する相対値として表したものである。
図１１は、イネにおけるいもち病菌細胞壁成分合成酵素遺伝子の転写量を示す図である。パネル（Ａ）はＭｇＡＧＳ１、パネル（Ｂ）はＭｇＦＫＳ１の転写量を、それぞれアクチン遺伝子の転写量に対する相対値として表したものである。
図１２は、本発明の発現ベクターの一例である。
図１３は、本発明の発現ベクターの一例である。
図１４は、本発明の発現ベクターの一例である。
図１５は、本発明の発現ベクターの一例である。
図１６Ａは、ａｇｌ遺伝子Ｔ０トランスジェニックイネにおけるゲノミックＤＮＡへのａｇｌ遺伝子の組み込みを確認したゲル電気泳動の結果である。
図１６Ｂは、ａｇｌ遺伝子Ｔ０トランスジェニックイネにおけるａｇｌ遺伝子の発現をＲＴ‐ＰＣＲ法により確認した結果である。
図１６Ｃは、ａｇｌ遺伝子Ｔ０トランスジェニックイネ中のＡｇｌタンパク質をウエスタンブロット解析法により確認した結果である。
図１７は、ａｇｌ遺伝子Ｔ０トランスジェニックイネにおける親和性いもち病菌に対する抵抗性を示す。
図１８は、ａｇｌ遺伝子Ｔ０トランスジェニックイネにおける非親和性いもち病菌に対する抵性を示す。
図１９は、ａｇｌ遺伝子Ｔ０トランスジェニックイネにおけるごま葉枯病菌に対する抵抗性を示す。
図２０は、ａｇｌ遺伝子Ｔ１トランスジェニックイネにおけるａｇｌ遺伝子発現を示す。
図２１は、ａｇｌ遺伝子Ｔ１トランスジェニックイネにおけるいもち病菌に対する抵抗性を示す。
図２２は、ａｇｌ遺伝子Ｔ１トランスジェニックイネにおけるごま葉枯病菌に対する抵抗性を示す。
図２３Ａは、ａｇｌ遺伝子Ｔ１トランスジェニックイネにおけるイネ紋枯病菌に対する抵抗性を示す。
図２３Ｂは、ａｇｌ遺伝子Ｔ１トランスジェニックイネにおけるイネ紋枯病菌に対する抵抗性を示す。
図２４Ａは、α−１，３−グルカナーゼ処理した灰色かび病菌のタバコ葉感染阻害を示す。ａは、１，３−グルカナーゼ処理済みの灰色かび病菌胞子を接種したもの、ｂは、１，３−グルカナーゼ無添加のバッファーのみに懸濁した灰色かび病菌胞子を接種したものである。
図２４Ｂは、タバコ葉でのα−１，３−グルカナーゼ一過的発現による灰色かび病菌の感染阻害を示す。ａの破線内は、１，３−グルカナーゼを一過的発現させた部位に灰色カビ菌を接種した箇所、ｂの破線内は、１，３−グルカナーゼを無発現部位に灰色カビ菌を接種した箇所である。
図２５は、α−１，３−グルカナーゼを分泌する枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  ＫＡ３０４株におけるａｇｌ遺伝子の発現を示す。
図２６は、微生物農薬製剤の有効成分の一つであるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  ＫＡ３０４株の接種によるイネのいもち病菌に対する感染防除効果を示す。
図２７は、イネ（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ  Ｎ２）に感染した植物感染性微生物の細胞壁におけるα−１，３−グルカンを示した図である。左パネルのＢＦは、明視野を、右パネルのα‐Ｇは、α−１，３−グルカンの抗体染色図を示す。
図２８は、様々な植物感染性微生物の細胞壁におけるα−１，３−グルカンを示した図である。ＢＦは明視野を、α‐Ｇはα−１，３−グルカンの抗体染色図を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
１．植物感染性微生物の感染防止又は抑制方法
１−１．構成
本発明の第１の実施形態は、植物感染性微生物の宿主植物に対する感染防止又は抑制方法である。本発明の植物感染性微生物の感染防止又は抑制方法は、植物感染性微生物の細胞壁のα−１，３−グルカンをα−１，３−グルカナーゼによって分解することを特徴とする。
本発明において「微生物」とは、肉眼での認識が困難な大きさの生物、たとえば、バクテリア（細菌）や酵母のような単細胞真核微生物、肉眼での認識が困難か又は認識可能な糸状菌（カビを含む）又は担子菌（キノコ等）のような多細胞真核微生物をいう。
「植物感染性微生物」とは、植物に対して感染性を有し、その感染によって宿主植物に何らかの病的症状をもたらす微生物をいう。本発明の対象となる植物感染性微生物は、少なくとも細胞壁にα−１，３−グルカンを有することを要する。細胞壁中のα−１，３−グルカンは、細胞壁の恒常的構成成分であってもよいし、宿主植物との接触に応答して形成される細胞壁被覆層に含まれていてもよい。「宿主植物との接触に応答して」とは、たとえば、植物感染性微生物又はその胞子が宿主植物に接触したときに、宿主植物体表面の堅さや植物表面のワックスを認識し、それらの物質に応答して、という意味である。
以下に、本発明の対象となり得る植物感染性微生物の具体例を列挙する。ただし、以下に記載した病名は、その微生物を原因とする疾病の一病名に過ぎず、たとえば、表１に記載のような様々な別名称を包含するものとする。したがって、本発明の植物感染性微生物の感染防止又は抑制方法は、下記病名で特定される疾病の予防システムと言い換えることができる。
α−１，３−グルカンを細胞壁の恒常的構成成分として有する代表的な植物感染性の糸状菌としては、たとえば、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ属（Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ属）菌（たとえば、灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ））、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ属）菌（たとえば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ（日和見感染：アフラトキシン生産菌））、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ属（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ属）菌（たとえば、イチゴ炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ａｃｕｔａｔｕｍ）、ウリ類炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ））、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ属、Ｈａｅｍａｔｏｎｅｃｔｏｒｉａ属、ｎｅｃｔｏｒｉａ属及びＣａｌｏｎｅｃｔｏｒｉａ属）菌（たとえば、キャベツ萎黄病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ））、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ属菌（たとえば、ナシ黒斑病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ）、トマト輪紋病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ））、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ属（Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ属）菌（たとえば、苗立枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ））、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ属菌（たとえば、白絹病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ））等が挙げられる。
また、担子菌類、いわゆるキノコによる被害は一般的に果樹で問題になっているが、キノコではかなりの属でα−１，３−グルカンを細胞壁にもつと考えられている。具体的には、たとえば、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ属菌（たとえば、菌核病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ））、Ｐｕｃｃｉｎｉａ属（Ａｅｃｉｄｉｕｍ属）菌（たとえば、ネギ類さび病菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ａｌｌｉｉ））がある。
特に、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ属菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ等のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ属菌、Ｐｕｃｃｉｎｉａ属菌、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ属菌、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属菌、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ属菌、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ属菌等は多犯性であり、各種作物に大きな被害を出しており、重要な植物感染菌である。
また、α−１，３−グルカンを宿主植物との接触に応答して形成される細胞壁被覆層に含む代表的な植物感染性の糸状菌としては、たとえば、前記Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ属菌又はＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ属菌が挙げられる。
この他、主な植物感染性微生物（子嚢菌・担子菌・卵菌を含む）としては、Ｔａｐｈｒｉｎａ属菌（たとえば、モモ縮葉病菌（Ｔａｐｈｒｉｎａ  ｄｅｆｏｒｍａｎｓ））、Ｂｌｕｍｅｒｉａ属菌（たとえば、ムギ類うどんこ病菌（Ｂｌｕｍｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）））、Ｃｙｓｔｏｔｈｅｃａ属菌（たとえば、カシ紫かび病菌（Ｃｙｓｔｏｔｈｅｃａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ））、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ属菌（たとえばハナミズキうどんこ病菌（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｐｕｌｃｈｒａ（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒａ  ｐｕｌｃｈｒａ）））、Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ属菌（たとえば、キクうどんこ病菌（Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ）））、Ｐｈｙｌｌａｃｔｉｎｉａ属（Ｏｖｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ属）菌（たとえば、クワ裏うどんこ病菌（Ｐｈｙｌｌａｃｔｉｎｉａ  ｍｏｒｉｃｏｌａ））、Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ属（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ属）菌（たとえば、ウメうどんこ病菌（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｔｒｉｄａｃｔｙｌａ））、Ｓａｗａｄａｅａ属（Ｏｉｄｉｕｍ属）菌（たとえば、カエデうどんこ病菌（Ｓａｗａｄａｅａ  ｐｏｌｙｆｉｄａ））、Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ属菌（たとえば、サツマイモ黒斑病菌（Ｃｅｒａｔｏｓｙｓｔｉｓ  ｆｉｍｂｒｉａｔａ））、Ｍｏｎｏｓｐｏｒａｓｃｕｓ属菌（たとえば、ウリ黒点根腐病菌（Ｍｏｎｏｓｐｏｒａｓｃｕｓ  ｃａｎｎｏｎｂａｌｌｕｓ））、Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ属（Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ属、Ｓｐｈａｅｃｅｌｉａ属）菌（たとえば、イネ稲こうじ病菌（Ｃｌａｖｉｖｅｐｓ  ｖｉｒｅｎｓ（Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ  ｖｉｒｅｎｓ）））、Ｃａｌｏｎｅｃｔｒｉａ属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｌａｄｉｕｍ属）菌（たとえば、ダイズ黒根腐病菌（Ｃａｌｏｎｅｃｔｒｉａ  ｉｌｉｃｉｃｏｌａ（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｌａｄｉｕｍ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｍ）））、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ属菌（たとえば、イネ馬鹿苗病菌（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、ムギ赤かび病菌（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ））、Ｈａｅｍａｔｏｎｅｃｒｉａ属菌（たとえば、エンドウ根腐病菌（Ｈａｅｍａｔｏｎｅｃｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）））、Ｎｅｃｔｒｉａ属菌（たとえば、クリ紅粒がんしゅ病菌（Ｎｅｃｔｒｉａ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎａ（Ｔｕｂｅｒｃｕｌａｒｉａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）））、Ｎｅｏｎｅｃｔｒｉａ属菌（たとえば、ウリカエデがんしゅ病菌（Ｎｅｏｎｅｃｔｒｉａ  ｃａｓｔａｎｅｉｃｏｌａ（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ  ｃａｓｔａｎｅｉｃｏｌａ）））、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ属菌（たとえば、イチゴ炭疽病菌（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｃｉｎｇｕｌａｔａ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）））、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ属菌（たとえば、クリ胴枯病菌（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ（Ｅｎｄｏｔｈｉｅｌｌａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）））、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ属菌（たとえば、リンゴ胴枯病菌（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｔａｎａｋａｅ（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）））、Ｖａｌｓ���属菌（たとえば、セイヨウナシ腐らん病菌（Ｖａｌｓａ  ｃｅｒａｔｏｓｐｅｒｍａ（Ｃｙｔｏｓｐｏｒａ  ｒｏｓａｒｕｍ）））、Ｐｅｓｔａｌｏｓｐｈａｅｒｉａ属菌（たとえば、マツ類ペスタロチア病菌（Ｐｅｓｔａｌｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｇｕｂａｅ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｎｅｇｌｅｃｔａ）））、Ｒｏｓｅｌｌｉｎｉａ属菌（たとえば、ナシ白紋羽病菌（Ｒｏｓｅｌｌｉｎｉａ  ｎｅｃａｔｒｉｘ））、Ｃｉｂｏｒｉｎｉａ属菌（たとえば、サザンカ菌核病菌（Ｃｉｂｏｒｉｎｉａ  ｃａｍｅｌｌｉａｅ））、Ｏｖｕｌｉｎｉａ属菌（たとえば、ツツジ類花腐菌核病菌（Ｏｖｕｌｉｎｉａ  ａｚａｌｅａｅ））、Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ属菌（たとえば、モモ灰星病菌（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ））、Ｄｉｐｌｏｃａｒｐｏｎ属菌（たとえば、バラ黒星病菌（Ｄｉｐｌｏｃａｒｐｏｎ  ｒｏｓａｅ（Ｍａｒｓｓｏｎｉｎａ  ｒｏｓａｅ）））、Ｅｌｓｉｎｏｅ属菌（たとえば、カンキツ類そうか病菌（Ｅｌｓｉｎｏｅ  ｆａｗｃｅｔｔｉ（Ｓｐｈａｃｅｌｏｍａ  ｃｉｔｒｉ）））、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ属菌（たとえば、トウモロコシごま葉枯病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ（．Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｍａｙｄｉｓ））、イネごま葉枯病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｍｉｙａｂｅａｎｕｓ（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｏｒｙｚａｅ）））、Ｄｉｄｙｍｅｌｌａ属菌（たとえば、カボチャつる枯病菌（Ｄｉｄｙｍｅｌｌａ  ｂｒｙｏｎｉａｅ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ  ｃｕｃｕｍｉｓ）））、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ属菌（たとえば、タマネギ葉枯病菌（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ  ｈｅｒｂａｒｕｍ（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ  ｓｐ．）））、Ｖｅｎｔｕｒｉａ属菌（たとえば、ナシ黒星病菌（Ｖｅｎｔｕｒｉａ  ｎａｓｈｉｃｏｌａ））、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ属菌（たとえば、カリン白かび斑点病（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｃｈａｅｎｏｍｅｌｉｓ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ  ｃｈａｅｎｏｍｅｌｉｓ）））、Ｈｅｌｉｃｏｂａｓｉｄｉｕｍ属菌（たとえば、イモ類紫紋羽病菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｍｏｍｐａ））、Ｕｓｔｉｌａｇｏ属菌（たとえば、トウモロコシ黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ））、Ｔｉｌｌｅｔｉａ属菌（たとえば、コムギなまぐさ黒穂病菌（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｃａｒｉｅｓ））、Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ属菌（たとえば、ツツジもち病菌（Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ））、Ｃｏｌｅｏｓｐｏｒｉｕｍ属菌（たとえば、アカマツ葉さび病菌（Ｃｏｌｅｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐｉｎｉ−ａｓｔｅｒｉｓ））、Ｃｒｏｎａｒｔｉｕｍ属菌（たとえば、マツこぶ病菌（Ｃｒｏｎａｒｔｉｕｍ  ｏｒｉｅｎｔａｌｅ））、Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａ属菌（たとえば、ビョウヤナギさび病菌（Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａ  ｈｙｐｅｒｉｃｏｒｕｍ））、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ属菌（たとえば、ブドウさび病菌（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｅｕｖｉｔｉｓ））、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍ属菌（たとえば、ハマナスさび病菌（Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍ  ｍｏｎｔｉｖａｇｕｍ））、Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ属菌（たとえば、カリン赤星病菌（Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ａｓｉａｔｉｃｕｍ））、Ｕｒｏ���ｙｃｅｓ属菌（たとえば、エンドウさび病菌（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｃｉａｅ−ｆａｂａｅ））、Ｂｌａｓｔｏｓｐｏｒａ属菌（たとえば、ウメ変葉病菌（Ｂｌａｓｔｏｓｐｏｒａ  ｓｍｉｌａｃｉｓ））、Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ属菌（たとえば、イネ紋枯病菌（Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ  ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）））、Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ属菌（たとえば、ナシ類ナラタケ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｍｅｌｌｅａ））、Ｅｒｙｔｈｒｉｃｉｕｍ属菌（たとえば、アンズ赤衣病菌（Ｅｒｙｔｈｒｉｃｉｕｍ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ））、Ｐｅｒｅｎｎｉｐｏｒｉａ属菌（たとえば、エンジュべっこうたけ病菌（Ｐｅｒｅｎｎｉｐｏｒｉａ  ｆｒａｘｉｎｅａ））、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ属菌（たとえば、サクラ類こふきたけ病菌（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ａｐｐｌａｎａｔｕｍ））、Ｐｈｏｍａ属菌（たとえば、ダイズ茎枯病菌（Ｐｈｏｍａ  ｅｘｉｇｕａ））、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ属菌（たとえば、トマト褐色根腐病菌（Ｐｕｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ））、Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ属菌（たとえば、アスパラガス茎枯病菌（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ａｓｐａｒａｇｉ））、Ｇｌｏｅｏｄｅｓ属菌（たとえば、リンゴすす斑病菌（Ｇｌｏｅｏｄｅｓ  ｐｏｍｉｇｅｎａ））、Ｔｕｂａｋｉａ属菌（たとえば、クリ斑点病菌（Ｔｕｂａｋｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ））、Ａｓｃｏｃｈｙｔａ属菌（たとえば、デルフィニウム褐色斑点病菌（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ  ａｑｕｉｌｅｇｉａｅ））、Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａ属菌（たとえば、インドゴムノキ枝枯病菌（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａ  ｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ））、Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ属菌（たとえば、ツツジ類ペスタロチア病菌（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｍａｃｕｌａｎｓ））、Ａｔｅｒｏｃｏｎｉｕｍ属菌（たとえば、タブノキ白粉病菌（Ａｓｔｅｒｏｃｏｎｉｕｍ  ｓａｃｃａｒｄｏｉ））、Ｏｉｄｉｏｐｓｉｓ属菌（たとえば、オクラうどんこ病菌（Ｏｉｄｉｏｐｓｉｓ  ｓｉｃｕｌａ））、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ属菌（たとえば、ダイコンバーティシリウム黒点病菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ））、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属菌（たとえば、カンキツ青かび病菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｉｔａｌｉｃｕｍ））、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ属菌（たとえば、ボタンすすかび病菌（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｅｏｎｉａｅ））、Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ属菌（たとえば、キュウリ褐斑病菌（Ｃｏｒｕｎｅｓｐｏｒａ  ｃａｓｓｉｉｃｏｌａ））、Ｆｕｌｖｉａ属菌（たとえば、トマト葉かび病菌（Ｆｕｌｖｉａ  ｆｕｌｖａ））、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ属菌（たとえば、セルリー斑点病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ａｐｉｉ））、Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ属菌（たとえば、ナス褐色円星病菌（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｅｇｅｎｕｌａ（Ｐｒａｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｅｇｅｎｕｌａ）））、Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ属菌（たとえば、カブ根くびれ病菌（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ  ｒａｐｈａｎｉ））、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ属菌（たとえば、チューリップ疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｃｔｏｒｕｍ）、トマト疫��菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ））、Ｐｙｔｈｉｕｍ属菌（たとえば、チューリップ根腐病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ））、Ａｌｂｕｇｏ属菌（たとえば、ダイコン白さび病菌（Ａｌｂｕｇｏ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒｅ））、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ属菌（たとえば、ダイコンべと病菌（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ））、Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ属菌（たとえば、ブドウべと病菌（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ  ｖｉｔｉｃｏｌａ））、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属菌（たとえば、ニチニチソウくもの巣かび病菌（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ））、Ｃｈｏａｎｅｐｈｏｒａ属菌（たとえば、エンドウこうがいかび病菌（Ｃｈｏａｎｅｐｈｏｒａ  ｃｕｃｕｒｂｉｔａｒｕｍ））等が挙げられる。
α−１，３−グルカンを細胞壁の恒常的構成成分として有する主要な植物感染性細菌（バクテリア）としては、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌（たとえば、イネ白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）、ワタ角点病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ  ｐｖ．ｍａｌｖａｃｅａｒｕｍ）、チャかいよう病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｔｈｅｉｃｏｌａ）、カンキツかいよう病（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ  ｐｖ．ｃｉｔｒｉ））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌（たとえば、インゲンマメかさ枯病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｖａｓｔａｎｏｉ  ｐｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ）、ダイズ斑点細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｖａｓｔａｎｏｉ  ｐｖ．ｇｌｙｃｉｎｅａ）、トマト斑葉細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属細菌（たとえば、青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ））、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ属細菌（たとえば、イネ科褐条病菌（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ  ｓｕｂｓｐ．ａｖｅｎａｅ））、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属細菌（たとえば、イネ科もみ枯細菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅ））、Ｅｒｗｉｎｉａ属（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｄｉｃｋｅｙａ属含む）細菌（たとえば、ワサビ軟腐病菌（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ  ｓｕｂｓｐ．ｗａｓａｂｉａｅ）、軟腐病菌（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ（＝ｓｙｎ．Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）））、Ｐａｎｔｏｅａ属細菌（たとえば、パイナップル花樟病菌（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｓ  ｐｖ．ａｎａｎａｓ））、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（Ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒ属含む）細菌（たとえば、メロン毛根病（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ属細菌（たとえば、トマトかいよう病菌（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ））、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌（たとえば、トウガラシかいよう病菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ）、ジャガイモ輪腐病菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ  ｐｖ．ｓｅｐｅｄｏｎｉｃｕｍ））、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属細菌（たとえば、そうか病（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．））、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌（たとえば、イネ赤条斑病菌（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．））、Ｘｙｌｅｌｌａ属細菌（たとえば、ブドウピアース病菌（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ））、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属細菌（たとえば、ジャガイモ粘性腐敗病菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．））等が挙げられる。
【表１】
0005552649.tif 000002
0005552649.tif 000003
0005552649.tif 000004
0005552649.tif 000005
0005552649.tif 000006
前記微生物の宿主となる植物の細胞壁にはα‐１，３−グルカンが存在しない。それ故、α−１，３−グルカナーゼの接触により植物の細胞壁がダメージを受ける等の好ましくない影響は、皆無又はほとんどないと考えられる。したがって、本発明において、植物感染性微生物の感染防止又は抑制の保護対象となる宿主植物（被感染植物）の範囲は極めて広く、コケ類、シダ類、被子植物、裸子植物に及ぶ。ここで、被子植物は、双子葉類又は単子葉類植物のいずれも包含する。代表的なものとしては、農業的又は商業的に重要な植物、たとえば、穀類、花、野菜、果物等の作物植物が挙げられる。
具体的には、単子葉類植物では、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、ハトムギ、キビ、アワ、ヒエ、シコクビエ、トウモロコシ、モロコシ、コウリャン、ソルガム、サトウキビ、タケ、ササ、マコモ、ススキ、ヨシ、シバ、ショウガ、ミョウガ、シバ、エンバク、ライムギ等、また、双子葉類植物では、ナス科植物（タバコ、トマト、ナス、キュウリ、ピーマン、トウガラシ、ペチュニア）、マメ科（インゲンマメ、ダイズ、ピーナッツ、ヒラマメ、エンドウ、ソラマメ、ササゲ、クズ、スイートピー、タマリンド）、バラ科（イチゴ、バラ、ウメ、サクラ、リンゴ、ナシ、モモ、ビワ、アーモンド、スモモ、カリン、サンザシ、ボケ、ヤマブキ）、ウリ科（キュウリ、ウリ、カボチャ、メロン、スイカ、ヘチマ）、ユリ科（ユリ、ネギ、タマネギ）、アブラナ科（レタス、キャベツ、ダイコン、ハクサイ）、ブドウ科（ブドウ）、ミカン科（ミカン、オレンジ、グレープフルーツ、レモン、ユズ）、アオイ科（オクラ）、サクラソウ科（シクラメン）、ツバキ科（チャノキ）、シュウカイドウ科（ベゴニア）、クワ科（イチジク、クワ）、マタタビ科（キウイフルーツ）ウルシ科（ピスタチオ、マンゴー）、コショウ科（コショウ）、ニクズク科（ナツメグ）、ツツジ科（シャクナゲ、サツキ、ツツジ、アザレア）等が挙げられる。
各植物感染性微生物とその宿主植物との関連性、すなわちそれぞれの植物感染性微生物の宿主となり得る植物について表２に列挙した。したがって、本発明の方法は、表２に挙げた各植物感染性微生物が、少なくとも表２に記載のそれぞれの宿主植物に感染する場合において有効である。
【表２】
0005552649.tif 000007
0005552649.tif 000008
0005552649.tif 000009
0005552649.tif 000010
0005552649.tif 000011
0005552649.tif 000012
0005552649.tif 000013
0005552649.tif 000014
0005552649.tif 000015
0005552649.tif 000016
0005552649.tif 000017
0005552649.tif 000018
0005552649.tif 000019
本発明において使用するα−１，３−グルカナーゼは、生物種由来の野生型α‐１，３−グルカナーゼ、その変異体、又はそれらの活性断片を含む。
「野生型α−１，３−グルカナーゼ」は、α−１，３−グルカンを加水分解する活性を有する公知のα−１，３−グルカナーゼであれば、いずれの生物種由来のものであってもよい。このような公知の野生型α−１，３−グルカナーゼのアミノ酸配列又は野生型α‐１，３−グルカナーゼ遺伝子の塩基配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ等の検索によって入手することができる。たとえば、表３に記載のＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮｏ．で示される各種生物のα−１，３−グルカナーゼとして登録されているタンパク質、又はＢｌａｓｔＸの結果、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉのα−１，３−グルカナーゼとアミノ酸レベルで領域カバー率＞８０％、ｅ−ｖａｌｕｅ＞ｅ−１００のα−１，３−グルカナーゼと推測されるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。ここで、アミノ酸レベルで領域カバー率＞８０％、ｅ−ｖａｌｕｅ＞ｅ−１００のタンパク質をα−１，３−グルカナーゼとした理由は、α−１，３−グルカナーゼとして既に同定されている各種生物のα−１，３−グルカナーゼ間においても、そのほとんどにおいてアミノ酸レベルで領域カバー率＞８０％、ｅ−ｖａｌｕｅ＞ｅ−１００である点に基づく。あるいは、表４に記載のアクセッションＮｏ．で示されるＢｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ）において公開されているＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌のα−１，３−グルカナーゼ遺伝子の塩基配列も利用することができる。一具体例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  ＫＡ３０４（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）に由来する配列番号２３で示される塩基配列からなるα−１，３−グルカナーゼ遺伝子及び配列番号３１で示されるアミノ酸配列を有するそのα−１，３−グルカナーゼ、又はいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）に由来するＧｅｎｂａｎｋ  受託番号ＸＰ００１４１０３１７  又はＢｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＭＧＧ  １２６７８（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｇｅｎｏｍｅ／ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ＿ｇｒｉｓｅａ／ＭｕｌｔｉＨｏｍｅ．ｈｔｍｌ                                                        ；
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｇｅｎｏｍｅ／ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ＿ｇｒｉｓｅａ／ＧｅｎｅＤｅｔａｉｌｓ．ｈｔｍｌ？ｓｐ＝Ｓ７０００００２１６８１３８３２１）に記載のα−１，３−グルカナーゼ遺伝子が挙げられる。
【表３】
0005552649.tif 000020
0005552649.tif 000021
0005552649.tif 000022
0005552649.tif 000023
0005552649.tif 000024
【表４】
0005552649.tif 000025
0005552649.tif 000026
0005552649.tif 000027
ただし、通常、野生型α−１，３−グルカナーゼの全長アミノ酸配列においてみられるシグナルペプチド領域は、α−１，３−グルカナーゼ活性に必須の領域ではない。したがって、公知の各野生型全長α−１，３−グルカナーゼからシグナルペプチドを除いたポリペプチド、又は、さらにそのポリペプチドのＮ末端にメチオニンを付加したポリペプチドも本発明においては野生型α−１，３−グルカナーゼに含むものとする。具体的には、たとえば、前述の配列番号３１で示されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  ＫＡ３０４のα−１，３−グルカナーゼの場合であれば、シグナルペプチド領域に相当するＮ末端側の「ＭＲＴＫＹＶＡＷＳＬ  ＩＡＡＬＬＩＴＴＬＦ  ＱＳＶＧＰＧＥＰＶＥ  ＡＡＧＧ」からなる３４アミノ酸を除去し、除去後のＮ末端にメチオニンを付加した配列番号３２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  ＫＡ３０４の野生型α−１，３−グルカナーゼに包含される。また、それをコードする配列番号３３で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドもＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  ＫＡ３０４の野生型α−１，３−グルカナーゼ遺伝子とみなす。
本発明において「α−１，３−グルカナーゼの変異体」とは、前記野生型のα‐１，３−グルカナーゼを構成するアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたもの、又はそのアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するもので、かつα−１，３−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで「同一性」とは、二つのアミノ酸配列にギャップを導入して、又は導入しないで最も高い一致度となるように整列（アラインメント）させたときに、前記ギャップの数を含めた、一方のアミノ酸配列の全アミノ酸残基数に対する他方のアミノ酸配列の同一アミノ酸残基数の割合（％）をいう。また、「数個」とは、２〜１０の整数、例えば、２〜７、２〜５、２〜４、２〜３の整数をいう。上記α−１，３−グルカナーゼ変異体の具体例としては、たとえば、ＳＮＰ（一塩基多型）等の多型に基づく変異体やスプライス変異体のような天然型の変異体の他、変異剤による突然変異誘導処理の結果得られるα−１，３−グルカナーゼ活性を有する人為的な変異体等が挙げられる。なお、前記置換は、保存的アミノ酸置換であることが好ましい。保存的アミノ酸置換であれば、野生型α−１，３−グルカナーゼと実質的に同等な構造又は性質を有しうるからである。保存的アミノ酸とは、互いに、非極性アミノ酸（グリシン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、トリプトファン）及び極性アミノ酸（非極性アミノ酸以外のアミノ酸）、荷電アミノ酸（酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）及び塩基性アミノ酸（アルギニン、ヒスチジン、リジン））及び非荷電アミノ酸（荷電アミノ酸以外のアミノ酸）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、分岐状アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン）、ならびに脂肪族アミノ酸（グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン）などが挙げられる。
本発明において「それらの活性断片」とは、α−１，３−グルカナーゼ活性を保持する野生型α−１，３−グルカナーゼ又は前記α‐１，３−グルカナーゼ変異体の一部を含むポリペプチドをいう。本活性断片を構成するポリペプチドのアミノ酸の長さは、α−１，３−グルカナーゼ活性を保持するポリペプチドであればその長さは、特に制限はしない。
本発明で使用するα−１，３−グルカナーゼは、任意の（ポリ）ペプチドを含むことができる。たとえば、細胞外分泌シグナルペプチド、標識（タグ）ペプチドが挙げられる。また、前記生物種は、内在性α−１，３−グルカナーゼ遺伝子（ａｇｌ遺伝子）を有する種であればいずれであってもよい。バクテリアであれば、たとえば、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ属菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．等）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属菌が挙げられる。また、糸状菌であれば、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ  ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ  ａｎｓｅｒｉｎｅ、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｇｌｏｂｏｓｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍａｒｎｅｆｆｅｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｌｉｘｉｉ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）等が挙げられる。利用可能性が高い菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属菌、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属菌、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属菌である。このうち特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属菌とＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌は、微生物農薬として利用可能性が大きい。組み換え作物に利用する遺伝子としては、食品微生物であるＢａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌（特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属菌（特にＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）がより好ましい。
１−２．方法
本発明における植物感染性微生物の感染を防止又は抑制方法としては、（１）α−１，３−グルカナーゼを宿主植物に接触させる方法、（２）宿主植物細胞内で外来α−１，３−グルカナーゼ遺伝子を発現させる方法、（３）α−１，３−グルカナーゼ遺伝子を有し、α−１，３−グルカナーゼを細胞外に分泌する微生物を有効成分として含む微生物農薬製剤を宿主植物に作用させる方法、及びそれらを組合わせた方法が挙げられる。以下（１）〜（３）の方法について具体的に説明をする。
（１）α−１，３−グルカナーゼを宿主植物に接触させる方法
本方法は、前述のα−１，３−グルカナーゼを有効成分とする農薬製剤を、保護対象となる宿主植物に接触させる方法である。
本方法で使用する農薬製剤のα−１，３−グルカナーゼは、前述の内在性α−１，３−グルカナーゼ遺伝子を有する生物種から、又はα−１，３−グルカナーゼ遺伝子を導入した形質転換生物種から、当該分野で公知の方法によって精製又は調製することができる。そのような方法は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載の方法を参照すればよい。
本方法で使用する農薬製剤は、α−１，３−グルカナーゼを宿主植物に接触させた後にその酵素活性を保持し得る状態であれば、いかなる状態であってもよく、たとえば、α−１，３−グルカナーゼを適当な溶液に懸濁した液体状態であってもよいし、固体状態（粉末状態を含む）であってもよい。
液体状態の場合、α−１，３−グルカナーゼを懸濁する溶液としては、たとえば、水溶液、好ましくはバッファーが挙げられる。α−１，３−グルカナーゼの至適ｐＨ付近のｐＨ（３．５〜７．５）及び至適塩濃度付近の塩濃度（５０ｍＭ〜２００ｍＭＮａＣｌ）を有するバッファーが好ましい。また、前記懸濁溶液は、農薬製剤上許容可能な担体をα−１，３−グルカナーゼ活性を害しない濃度で添加することもできる。前記溶液におけるα−１，３−グルカナーゼの濃度は、宿主植物に接触させる際に５０ｎｇ／ｍｌ以上１００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ以上５０・ｇ／ｍｌ以下、または３００ｎｇ／ｍｌ以上５μｇ／ｍｌ以下であればよい。
固体状態の場合、α−１，３−グルカナーゼは凍結乾燥によって調製されたものが好ましい。固体状態のα−１，３−グルカナーゼは、その酵素活性を阻害又は抑制しない範囲において農薬製剤上許容可能な担体との混合物した組成物であってもよい。
前記「農薬製剤上許容可能な担体」には、たとえば、賦形剤、安定剤、結合剤、及び／又は崩壊剤が挙げられる。
賦形剤としては、たとえば、糖（グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム）、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。安定剤としては、たとえば、グリセロールが挙げられる。結合剤としては、たとえば、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としては、たとえば、前記デンプンや、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム又はそれらの塩が挙げられる。また、上記物質以外にも必要であれば、希釈剤、吸着剤、乳化剤、可溶化剤、保湿剤、防腐剤、抗酸化剤、緩衝剤等を添加することもできる。
このような担体は、α−１，３−グルカナーゼの活性を安定的に保持すると共に、宿主植物への接触を容易し、また風雨等によって容易に宿主植物からα−１，３−グルカナーゼが除かれないようにするためのものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。
α−１，３−グルカナーゼの宿主植物への接触方法は、α−１，３−グルカナーゼが宿主植物の植物体、特にその表面において酵素活性を発揮し得る方法であれば、特に制限はしない。たとえば、噴霧、散布、塗布、浸漬等の方法が挙げられる。宿主植物との接触場所は、植物体の一部又は全体のいずれであってもよいが、防除対象となる植物感染性微生物が宿主植物に感染する経路で最も多く見られる部位に接触させることが好ましい。たとえば、いもち病菌を防除対象とする場合、α−１，３−グルカナーゼを葉及び茎に接触させればよい。
（２）宿主植物細胞内で外来α−１，３−グルカナーゼ遺伝子を発現させる方法
本方法は、宿主植物にα−１，３−グルカナーゼ遺伝子を導入したトランスジェニック植物を作製し、その外来α−１，３−グルカナーゼ遺伝子を発現させて、形質転換した宿主植物自身が分泌するα−１，３−グルカナーゼによって植物感染性微生物の感染を防止又は抑制する方法である。
本方法は、宿主植物を、その都度α−１，３−グルカナーゼで処理することなく、持続的な感染防止効果を得られる点で有利である。また、本方法は、トランスジェニック植物由来の植物組織もしくは植物細胞を含む植物体、又はその種子もしくは後代を利用することもできる。
宿主植物の形質転換に用いるα−１，３−グルカナーゼ遺伝子は、上述したα−１，３−グルカナーゼ、すなわち、野生型α‐１，３−グルカナーゼ、その変異体、又はそれらの活性断片をコードするポリヌクレオチドである。したがって、必ずしも野生型の全長からなるポリヌクレオチドである必要はない。このようなα−１，３−グルカナーゼ遺伝子は、前述のようにＧｅｎｂａｎｋで入手可能な各種生物種の野生型α−１，３−グルカナーゼ遺伝子の配列に基づいて公知の方法によりクローニングするか、化学合成によって得ることができる。α−１，３−グルカナーゼ遺伝子のクローニング方法は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載の方法を参照すればよい。
本発明の発現ベクターは、たとえば、宿主植物に導入した後、α−１，３−グルカナーゼ遺伝子がその植物体内で発現されるような発現プロモーターを含む。一般に、このプロモーターの下流にはα−１，３−グルカナーゼ遺伝子が位置し、さらにこの遺伝子の下流にはターミネーターが位置する。この目的に用いられるベクターは、植物への導入方法や植物の種類に応じて、当業者によって適宜選択される。上記プロモーターとしては、たとえば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来の３５Ｓプロモーターや、トウモロコシのユビキチンプロモーター、ＥＮ４プロモーター等を挙げることができる。発現効率を上げるために、ＴＭΩ配列等を含むプロモーター、たとえば、Ｅｌ２Ωプロモーター等を利用することもできる。また、上記ターミネーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーターや、ノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を挙げることができる。しかし、宿主植物細胞中で機能するプロモーターやターミネーターであれば、これらに限定されない。
また、α−１，３−グルカナーゼ遺伝子を導入された形質転換植物細胞を効率的に選択するために、上記発現ベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子カセットを含むか、あるいは、選抜マーカー遺伝子カセットを含むＤＮＡと共に植物細胞へ導入するのが好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子としては、たとえば、抗生物質ハイグロマイシン耐性をもたらすハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシン耐性をもたらすネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。
α−１，３−グルカナーゼ遺伝子ＤＮＡ断片あるいはα−１，３−グルカナーゼ遺伝子を含む発現ベクターの宿主植物細胞への導入は、当業者においては公知の方法、たとえば、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法等により実施することができる。また、α−１，３−グルカナーゼ遺伝子を導入した植物細胞は、導入された選抜マーカー遺伝子の種類にしたがって適当な条件で培養することによって効率的に選択される。
α−１，３−グルカナーゼ遺伝子を導入した形質転換細胞から、植物体を再生することができる。植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、また、用いた遺伝子導入法に応じて当業者に公知の方法で行うことができる。たとえば、アグロバクテリウム法でカルスに遺伝子を導入した場合は、カルスから植物体を再生させる方法（Ｔｏｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，４７，９６９−９７６，２００６）、エレクトロポレーション法を用いた場合は、プロトプラストから植物体を再生させる方法（Ｔｏｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１００，１５０３−１５０７，１９９２）等を用いることができる。一旦、ゲノム中にα−１，３−グルカナーゼ遺伝子が導入された形質転換植物細胞や種子が得られれば、それを用いてこの植物培養組織や植物体を量産することも可能である。
得られたトランスジェニック植物における微生物感染性植物に対する感染抵抗性の有無は、防除対象の微生物が感染しやすい条件下でその微生物（たとえば、胞子や菌糸）をトランスジェニック植物に接触させ、感染するかどうかを調べること等によって確認することができる。接触させる方法としては、たとえば、防除対象の微生物を懸濁させた液を植物体に噴霧し、培養後に観察する方法（噴霧接種ともいう）、植物体にパンチャーで傷をつけ、傷上に防除対象の微生物をつけたアガロース片等をのせ、培養後に観察するような方法（有傷接種ともいう）、防除対象の微生物を懸濁させた液を針先に付けて、植物体に針傷を付ける方法（針接種ともいう）等が挙げられる。
（３）α−１，３−グルカナーゼ遺伝子を有し、α−１，３−グルカナーゼを細胞外に分泌する微生物を有効成分として含む微生物農薬製剤を宿主植物に作用させる方法
本方法は、α−１，３−グルカナーゼを生合成できる微生物を有効成分とする微生物農薬製剤を宿主植物に接触させ、当該微生物が細胞外に分泌したα−１，３−グルカナーゼの作用により、植物感染性微生物の感染を防止又は抑制する方法である。
効果の持続性が酵素を接触させる方法よりも長く、形質転換植物の作製を要さず、簡便である点で有利である。
本方法で使用する微生物農薬製剤は、後述する実施形態２に記載の微生物農薬製剤を用いればよい。
微生物農薬製剤を宿主植物に作用させる方法は、本方法で使用する微生物農薬製剤の有効成分である微生物が野生型株の通常生育時と比較して有意に大となるようにα−１，３−グルカナーゼを発現し、かつそのα−１，３−グルカナーゼを細胞外に分泌することによって、本発明の効果を奏し得ることができれば、特に限定はしない。
ここでいう「有意」とは、前記有効成分である微生物におけるα−１，３−グルカナーゼの発現量と、その微生物の野生型株を通常生育時、すなわち、その微生物にとって適切な栄養状態、生育温度、ｐＨ及び密度等の至適条件下で生育したときのα−１，３−グルカナーゼの発現量の量的差異を統計学的に処理したときに、両者間に有意差があることをいう。具体的には、例えば、危険率（有意水準）が５％、１％又は０．１％より小さい場合が挙げられる。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントｔ検定法、多重比較検定法を用いることができる。また、「有意に大」とは、前記有効成分である微生物のα−１，３−グルカナーゼの発現量が野生型株と比較して有意に大きいこと、具体的には、例えば、野生株の平常状態時のα−１，３−グルカナーゼの発現量の１．５倍以上、好ましくは２倍以上又は３倍以上あることをいう。
したがって、微生物農薬製剤を宿主植物に作用させる場合には、野生型株の通常生育時と比較してα−１，３−グルカナーゼの発現量が有意に大となるように、有効成分である微生物が有するα−１，３−グルカナーゼ遺伝子の状態を勘案して適宜定めればよい。たとえば、前記有効成分である微生物が、α−１，３−グルカナーゼ遺伝子を恒常的に発現できる発現ベクターをその細胞内に有する場合には、その微生物を含む微生物農薬製剤を宿主植物に接触させればよい。また、前記微生物が、誘導性プロモーターに連結されたα−１，３−グルカナーゼ遺伝子を含む場合（たとえば、多くの内在性のα−１，３−グルカナーゼ遺伝子や、ｌａｃプロモーター等に発現可能な状態で連結された外来性α−１，３−グルカナーゼ遺伝子等が該当する）であれば、微生物農薬製剤を宿主植物に接触させる前、接触後に、その微生物のα−１，３−グルカナーゼ遺伝子の発現を誘導・促進させる処理を行なえばよい。具体的には、発現を誘導・促進可能な物質（発現誘導剤）を微生物農薬製剤中に直接添加するか、微生物農薬製剤を宿主植物に接触させた後、別途添加する方法が挙げられる。発現誘導剤は、プロモーターの種類に応じて適宜定めればよいが、内在性のα−１，３−グルカナーゼ遺伝子のプロモーターの場合であれば、当該酵素の基質であるα−１，３−グルカンが利用できる。したがって、この場合、α−１，３−グルカンそのものの（たとえば、精製及び／又は未精製α−１，３−グルカン）のみならず、α−１，３−グルカンを含み、α−１，３−グルカナーゼの活性を害さない物質を添加すればよい。また、ｌａｃプロモーターに連結されたα−１，３−グルカナーゼ遺伝子を有する場合には、ラクトース又はラクトースを含みα−１，３−グルカナーゼの活性を害さない物質が利用できる。
微生物農薬製剤の宿主植物への具体的な作用方法は、接触又は根部から吸収させる方法等が挙げられる。一般的には、接触方法が好ましい。この方法は、前述の（１）α−１，３−グルカナーゼを宿主植物に接触させる方法で述べた接触方法に準じて行なうことができる。
１−３．効果
本発明によれば、宿主植物の表面又は組織内にα−１，３−グルカナーゼを予め存在させることにより、いもち病菌をはじめとする、細胞壁にα−１，３−グルカンを有する植物感染性糸状菌等の微生物が宿主植物に感染する際に、侵入菌糸等の菌体の細胞壁のα−１，３−グルカンが分解される。α−１，３−グルカンが分解されれば、覆われていたキチン、β−１，３−グルカンが露出し、宿主植物はこれらを認識することができる。それらを認識することによって、宿主植物における生体防御反応が惹起されるため、菌の感染を抑制できる。
したがって、本発明の感染防止又は抑制方法は、β−１，３−グルカナーゼやキチナーゼの遺伝子又はタンパク質を導入することにより菌糸を直接攻撃するタイプの従来の感染防止方法とは、根本的に概念が異なっている。すなわち、従来の方法がこれらの酵素で菌糸自体を攻撃するのに対し、本発明の方法では、β−１，３−グルカナーゼやキチナーゼがあまり有効に作用しない植物感染性微生物、たとえば、α−１，３−グルカンの「覆い」を被った当該微生物に対して、植物自身が本来持っている生体防御反応を促進するというものであり、まったく新規な発想に基づくものである。
２．微生物農薬製剤
２−１．構成
本発明の第２の実施形態は、植物感染性微生物に対する感染を防止又は抑制する微生物農薬製剤である。本発明の微生物農薬製剤は、α−１，３−グルカナーゼ遺伝子を有し、α−１，３−グルカナーゼを細胞外に分泌する微生物を有効成分として含むことを特徴とする。
本発明の有効成分である微生物は、α−１，３−グルカナーゼ遺伝子を有し、発現したα−１，３−グルカナーゼを細胞外に分泌できる微生物であれば、特に限定はしない。たとえば、感染性微生物又は非感染性微生物が挙げられる。
ここでいう「感染性微生物」とは、他生物に対して病原性及び感染性を有する微生物、たとえば、バクテリア、酵母、糸状菌（カビを含む）又は担子菌（キノコ等）をいう。本発明で感染性微生物を使用する場合、保護対象とする植物及び／又は哺乳動物に対する安全性の観点から、その病原性を欠失したもの又は前記生物に対して有害性のない程度に病原性を弱められたものを使用することが望ましい。一方、アブラムシ、カイガラムシ、ウンカ、ヨコバイ、グンバイ、バッタ、蛾（ヨトウガ等の幼虫）、ダニ等の害虫に対する有害性、感染性は保持していても構わない。そのような性質は、害虫に対する農薬製剤の有効成分として有用だからである。
また、前記「非感染性微生物」とは、少なくとも本発明の保護対象となる植物に対して病原性、感染性のない微生物、また当該植物を食品として使用する場合には、ヒトをはじめとする哺乳動物に対して感染性のない微生物、たとえば、バクテリア、酵母、糸状菌（カビを含む）又は担子菌（キノコ等）をいう。好適には、後述するようにα−１，３−グルカナーゼ遺伝子を内在性遺伝子として有する微生物である。たとえば、バクテリアであれば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．等）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属菌等、特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）が挙げられる。また、糸状菌であれば、たとえば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ  ａｎｓｅｒｉｎｅ、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｇｌｏｂｏｓｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｌｉｘｉｉ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）が挙げられる。特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属菌、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属菌、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属菌は好ましい。
本発明の微生物農薬製剤の有効成分である微生物は、内在性のα−１，３−グルカナーゼ遺伝子を有していてもよいし、外来性のα−１，３−グルカナーゼ遺伝子を有していてもよいし、その両方であってもよい。圃場に散布することを鑑みれば、内在性遺伝子を有する微生物であることが好ましい。
本発明において、「α−１，３−グルカナーゼ遺伝子」とは、第１の実施形態で説明したα−１，３−グルカナーゼをコードする核酸、たとえば、配列番号２３又は受託番号ＸＰ００１４１０３１７で示される核酸をいう。
本発明の「α−１，３−グルカナーゼ」は、「細胞外分泌型」である。ここでいう細胞外分泌型」とは、微生物の細胞内で生合成されたα−１，３−グルカナーゼが最終的に細胞外に分泌されることを意味し、細胞外に分泌されるのであれば、その手段は問わない。たとえば、α−１，３−グルカナーゼが細胞外シグナルペプチドを有していてもよいし、他の細胞外輸送因子を介して細胞外に分泌されてもよい。
本発明の有効成分である微生物は、その野生株の通常生育時と比較して有意に大となるようにα−１，３−グルカナーゼを発現できることが望ましい。そのためには、前記微生物において、α−１，３−グルカナーゼ遺伝子が、恒常的（構成的）プロモーター又は誘導性プロモーター下流に発現可能な状態で連結されていることが好ましい。恒常的プロモーターには、たとえば、Ｓ１０プロモーターが、誘導性プロモーターには、たとえば、ｌａｃ、ｔｒｐプロモーター又は内在性α−１，３−グルカナーゼ遺伝子本来のプロモーターが挙げられる。
本発明の微生物農薬製剤において、有効成分である微生物は、宿主植物に作用させる際に、α−１，３−グルカナーゼを発現済みであってもよいし、未発現状態であってもよい。有効成分である微生物がα−１，３−グルカナーゼを恒常的に発現しているか、誘導処理によって発現が誘導、促進されたα−１，３−グルカナーゼ発現済みの場合、α−１，３−グルカナーゼが安定に保持される状態にあれば、微生物農薬製剤中の有効成分である微生物の生死は問わない。一方、未発現の場合には、微生物農薬製剤を宿主植物に接触後、前述のように発現誘導処理を行なうようにする。したがって、この場合、有効成分である微生物は宿主植物に作用するまでの間、生存状態にある必要がある。  本発明の「微生物農薬製剤」は、液体状態、固体状態（半固体状態を含む）又はその組み合わせのいずれであってもよい。
液体状態の場合、有効成分である微生物を適切な溶液に懸濁したものであればよい。適切な溶液としては、たとえば、バッファー、その微生物用の培地が挙げられる。当該微生物を懸濁した溶液は、農薬製剤上許容可能な担体をα−１，３−グルカナーゼ活性を阻害しない濃度で添加することもできる。農薬製剤上許容可能な担体は、第１実施形態の１−２．方法の章、（１）α−１，３−グルカナーゼを宿主植物に接触させる方法に記載のものを使用すればよい。
前記溶液には、必要に応じてα−１，３−グルカナーゼの発現に有効な適当な発現誘導剤を添加することができる。発現誘導剤は、第１実施形態の１−２．方法の章、（３）α−１，３−グルカナーゼ遺伝子を有し、α−１，３−グルカナーゼを細胞外に分泌する微生物を有効成分として含む微生物農薬製剤を宿主植物に作用させる方法に記載のように、有効成分である微生物が有するα−１，３−グルカナーゼ遺伝子のプロモーターの性質に応じて、適宜定めればよい。たとえば、プロモーターが内在性α−１，３−グルカナーゼ遺伝子本来のプロモーターであれば、基質であるα−１，３−グルカンが適当であり、また、ｌａｃプロモーターであれば、基質であるラクトースが適当である。これらの発現誘導剤を適宜発現誘導に応じて適切な容量で添加すればよい。
固体状態の場合、有効成分である微生物、より具体的にはその微生物によって合成されたα−１，３−グルカナーゼが、宿主植物に作用し得る状態であれば、特に制限はしない。たとえば、顆粒状態、粉末状態、ゲルのような半固体状態が挙げられる。接触等により宿主植物に付着し、作用することを鑑みれば、粉末状（特に接着性を有する粉末状）、ゲル状であることが好ましい。
２−２．効果
本発明の微生物農薬製剤によれば、α−１，３−グルカンをもつ植物感染微生物の感染防除に広く有効である。さらに、本発明の微生物農薬製剤は、比較的安価に製造することが可能で、内在性α−１，３−グルカナーゼ遺伝子を有する非感染性微生物を有効成分として使用する場合には、特定の遺伝子発現を強化した自然界に存在する微生物を使用することから、環境に対する影響が低く、安全性が高い。
【実施例】
【０００８】
＜実施例１．感染器官における細胞壁構成成分の検出＞
いもち病菌野生株Ｇｕｙ１１に対して感受性であるイネ品種ＬＴＨの第４葉の葉鞘細胞に、いもち病菌胞子懸濁液（滅菌水１ｍｌあたり１×１０６分生子数）５０μｌをシリンジで注入し、室温で静置した。接種後、発芽した分生子から、およそ１６時間で付着器の形成、２４時間以降に侵入菌糸の形成が見られた。
菌を感染させたイネ葉鞘を、接種後１６時間及び２４時間のそれぞれの時点で、３％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド／９０％（ｖ／ｖ）エタノール浸漬にて固定し、その後、葉組織を取り出して、ＰＢＳバッファー（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で十分にリンスをした。固定した葉鞘サンプルを、１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳバッファー中；「ＰＢＳ−Ｔ」ということがある）に浸漬した後に、それぞれの細胞壁成分を特異的に染色できる試薬を１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳバッファー中）に添加し、以下のＡ〜Ｄに示すとおりに染色を行った：
Ａ．  α−１，３−グルカン染色
０．１ｍｇ／ｍｌのα−１，３グルコース特異的マウスＩｇＭ抗体（商品名「Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＭλ（ＭＯＰＣ１０４ｅ），α−１→３グルコース特異的」（Ｓｉｇｍａ））を２０μｌ添加し、一晩インキュベートした。続いて、０．１ｍｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識抗マウスＩｇＭ抗体（商品名「Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＭ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を２０μｌ添加し、遮光して一晩インキュベートした。
Ｂ．  β−１，３−グルカン染色
０．１ｍｇ／ｍｌのβ−１，３−グルカン特異的マウスモノクローナル抗体（商品名「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  （１→３）−β−ｇｌｕｃａｎ  （Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｋａｐｐａ  Ｌｉｇｈｔ）」、Ｂｉｏｓｕｐｐｌｉｅｓ）を２０μｌ添加し、一晩インキュベートした。続いて、０．１５ｍｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４標識抗マウスＩｇＧ抗体（商品名「Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ａｎｔｉｂｏｄｙ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を２０μｌ添加し、遮光して一晩インキュベートした。
Ｃ．  キチン染色
１０μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０標識ＷＧＡ（商品名「ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を２０μｌ添加し、遮光して一晩インキュベートした。
Ｄ．  キトサン染色
０．０５％（ｗ／ｖ）のエオシン（商品名「Ｅｏｓｉｎ  Ｙ」（Ｓｉｇｍａ））を２０μｌ添加し、遮光して一晩インキュベートした。
Ｅ．  マンナン染色
０．１ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識コンカナバリンＡ（商品名「ＦＩＴＣ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ」（Ｓｉｇｍａ））を２０μｌ添加し、遮光して一晩インキュベートした。
インキュベート後のサンプルに残存する過剰な染色試薬を、ＰＢＳを用いてリンスすることにより十分に取り除き、蛍光顕微鏡観察に供した。顕微鏡観察には、ライカ社（ドイツ）製「Ｌｅｉｃａ  ＤＲ  システム」を用いた。
α−１，３−グルカン及びマンナンの蛍光観察にはＧＦＰフィルターキューブ（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ  ＢＰ  ４７０／４０ｎｍ，５００ｎｍ  ｄｉｃｈｒｏｍａｔｉｃ  ｍｉｒｒｏｒ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ  ＢＰ  ５２５／５０ｎｍ）、β−１，３−グルカン染色サンプル及びキトサン染色サンプルにはＹ３フィルターキューブ（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ  ＢＰ  ５４５／３０ｎｍ，５６５ｎｍ  ｄｉｃｈｒｏｍａｔｉｃ  ｍｉｒｒｏｒ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ  ＢＰ６１０／７５ｎｍ）、キチン染色サンプルにはＡ４フィルターキューブ（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ  ＢＰ  ３６０／４０ｎｍ，４００ｎｍ  ｄｉｃｈｒｏｍａｔｉｃ  ｍｉｒｒｏｒ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ  ＢＰ  ４７０／４０ｎｍ）を、蛍光フィルターとしてそれぞれ用いた。
結果を図１に示す。図中、Ｃ＝胞子、Ｇ＝発芽管、Ａ＝付着器、ＩＦ＝侵入菌糸を表し、各パネルのバーは２０μｍである。
α−１，３−グルカンは、いもち病菌の植物細胞への接種後１６時間では発芽管及び未熟な付着器で検出され（パネルＢ１）、接種後２４時間では侵入菌糸で検出された（パネルＢ２）。β−１，３−グルカンは、接種後１６時間では未熟な付着器でわずかに検出されたが（パネルＣ１）、２４時間後には菌体のどの器官でも検出されなかった（パネルＣ２）。キチンは、接種後１６時間で発芽管及び未熟な付着器で検出されたが（パネルＤ１）、接種後２４時間では菌体のどの器官でも検出されなかった（パネルＤ２）。キトサンは、接種後２４時間では付着器、侵入菌糸の両方で検出されていた（パネルＦ２）。マンナンは、胞子、発芽管、付着器で検出された（パネルＨ２）。
このことから、いもち病菌の侵入菌糸では、α−１，３−グルカン、β−１，３−グルカン、マンナン、キチン及びキトサンといった細胞壁成分のうち、α−１，３−グルカンとキトサンが主に検出され、β−１，３−グルカン、キチンが器官特異的に検出されなくなることが明らかになった。
＜実施例２．α−１，３−グルカナーゼ処理後の侵入菌糸での細胞壁成分の検出＞
上記と同様の方法で、イネ品種ＬＴＨの葉鞘細胞にいもち病菌を感染させ、接種後２４時間に、菌を感染させたイネ葉鞘を固定した。固定後、浸漬に用いるＰＢＳバッファーにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来の精製α−１，３−グルカナーゼ溶液（５μｇ／ｍｌ）を３０μｌ添加し、室温で６時間インキュベートした。その後、ＰＢＳバッファーで十分洗浄し、上記と同様の方法で細胞壁成分の染色を行った。
結果を図２に示す。α−１，３−グルカナーゼ処理を施した侵入菌糸では、α−１，３−グルカンは、α−１，３−グルカナーゼによって分解され、検出されなくなっていた（パネルＢ）。逆に、酵素処理前は検出されなかったβ−１，３−グルカン及びキチンが、侵入菌糸で検出されるようになった（パネルＣ及びＤ）。
このことから、いもち病菌の侵入菌糸には、β−１，３−グルカン及びキチンが細胞壁成分として存在しているが、これらはα−１，３−グルカンによって覆われていることが明らかになった。
＜実施例３．α−１，３−グルカン合成酵素欠損いもち病菌株（ΔＭｇＡＧＳ１株）の感染性＞
いもち病菌のα−１，３−グルカン合成酵素遺伝子（ＭｇＡＧＳ１）を含むゲノム断片をクローニングし、ＭｇＡＧＳ１のコード領域を薬剤耐性マーカー（ビアラフォス耐性遺伝子（Ｂａｒ遺伝子））と置換後、野生型いもち病菌に導入することにより、ＭｇＡＧＳ１遺伝子破壊株（ΔＭｇＡＧＳ１）を作出した（図３Ａ）。
具体的には、ＭｇＡＧＳ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＸＰ  ３６４７９４）の上流約１．５ｋｂ（配列番号１）及び下流約１．５ｋｂ（配列番号２）をそれぞれクローニングし（プライマーとして、配列番号３〜６を使用した）、上流領域、Ｂａｒ遺伝子（マーカー）（配列番号７）、下流領域をこの順番でＰＣＲ法によって連結し、融合ＤＮＡを作製した。この融合ＤＮＡを更にＰＣＲで増幅させ（プライマーとして、配列番号４及び５を使用した）、増幅断片ＤＮＡを野生型いもち病菌にプロトプラストＰＥＧ法で形質転換した。いもち病菌への形質転換は以下の方法で行った。いもち病菌菌糸を３０μｇ／ｍｌの溶菌酵素（Ｓｉｇｍａ社  Ｌｙｓｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）を含む１．２Ｍ  ソルビトールに浸透しプロトプラスト化した後、上記で増幅したＤＮＡ断片をＰＥＧバッファー（４０％（Ｗ／Ｖ）  ＰＥＧ８０００、２０％（Ｗ／Ｖ）  ショ糖、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０）と共に添加し、遺伝子導入を行った。その後、ビアラフォス（９０μｇ／ｍｌ）を含む生育培地で生育させ、形質転換体を選択した。サザンハイブリダイゼーション法及びＰＣＲ法（プライマーとして配列番号１０〜１３に示すものを使用した）、シークエンシングでＭｇＡＧＳ１が欠損していることを確認した形質転換体をΔＭｇＡＧＳ１株とした（図３Ｂ）。なお、遺伝子欠損の確認に際しては、ＭｇＡＧＳ１の指標としてｐｒｏｂｅ  ＡＧＳ１−ｉｎｔ２配列（配列番号１５）を、Ｂａｒ遺伝子の指標としてｐｒｏｂｅ  Ｂａｒ配列（配列番号１４）を使用した。図３Ｂにおいて、上パネルは、ｐｒｏｂｅ  ＡＧＳ１−ｉｎｔ２によって、野生株ではＭｇＡＧＳ１が検出されるが、ΔＭｇＡＧＳ１株では検出されないことを示している。下パネルは、ｐｒｏｂｅ  Ｂａｒによって、野生株ではＢａｒ遺伝子が検出されないが、ΔＭｇＡＧＳ１株は検出されることを示している。
Ａ．ΔＭｇＡＧＳ１株の感染器官形成能
いもち病菌の野生株及びΔＭｇＡＧＳ１株の胞子懸濁液（滅菌水１ｍｌあたり１×１０５分生子数）３０μｌをカバーグラス（マツナミ社、大阪）に滴下し、室温で２４時間静置し、２４時間後に形成されている付着器の観察を行った。
カバーグラスの代わりに電子レンジで煮沸したタマネギ鱗片細胞を用いたことを除き、上記と同様にして、２４時間静置後に形成されている侵入菌糸の観察を行った。
顕微鏡観察にはライカ社（ドイツ）製「Ｌｅｉｃａ  ＤＲ  システム」を用いた。
結果を図４に示す。カバーグラス上では、ΔＭｇＡＧＳ１株は、野生株同様に静置後２４時間までに分生子が発芽し、付着器を形成していた（上パネル）。タマネギ鱗片細胞上でも、野生株同様に付着器を形成し、細胞内に侵入菌糸を形成していた（下パネル）。したがって、ΔＭｇＡＧＳ１株は、野生株と同等の付着器形成及び侵入菌糸形成能を維持していた。
Ｂ．イネへの接種実験
いもち病菌野生株及びΔＭｇＡＧＳ１株のいもち病菌胞子懸濁液（滅菌水１ｍｌあたり１×１０６分生子数）１０ｍｌを、イネ品種ＬＴＨ（第４葉目展開したイネを使用）の切り葉に噴霧接種し、接種葉を継続光下２５℃でインキュベートした。接種５日後、切り葉に生じた病斑を観察した。
結果を図５に示す。野生株ではイネ葉に進展型の病斑が形成されていたが（左パネル）、ΔＭｇＡＧＳ１株ではほとんど病斑が形成されず、イネの抵抗応答時に見られる褐点型病斑となっていた（右パネル）。したがって、ΔＭｇＡＧＳ１株は、イネに対する感染力が低下していることが判明した。
Ｃ．オオムギへの接種実験
いもち病菌野生株及びΔＭｇＡＧＳ１株のいもち病菌胞子懸濁液（滅菌水１ｍｌあたり１×１０６分生子数）１０ｍｌを、オオムギ品種ゴールデンプロミス（第４葉目展開したオオムギを使用）の切り葉に噴霧接種し、接種葉を継続光下２５℃でインキュベートした。接種５日後、切り葉に生じた病斑を観察した。
結果を図６に示す。野生株ではオオムギ葉に進展型の病斑が形成されていたが（左パネル）、ΔＭｇＡＧＳ１株では病斑が顕著に少なくなっていた（右パネル）。したがって、ΔＭｇＡＧＳ１株は、オオムギに対する感染力が低下していることが判明した。
＜実施例４．いもち病菌における、α−１，３−グルカナーゼの添加による植物への侵入菌糸形成の阻害＞
Ａ．イネへの接種実験（顕微鏡観察）
いもち病菌野生株胞子懸濁液（滅菌水１ｍｌあたり１×１０６分生子数）５０μｌに精製α−１，３−グルカナーゼ溶液（５μｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを加え、イネ品種ＬＴＨの第４葉の葉鞘に接種を行い、室温で静置した。対照として、α−１，３−グルカナーゼ溶液の代わりに滅菌水０．５ｍｌを胞子懸濁液に加えたものも同様に接種し、静置した。
接種４８時間後、菌を感染させたイネ葉鞘を、上記と同様の方法で３％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド／９０％（ｖ／ｖ）エタノールを用いて固定し、顕微鏡観察を行った。
結果を、図７に示す。α−１，３−グルカナーゼを加えていない野生株胞子懸濁液を葉鞘に接種した場合には、接種後４８時間で付着器及び侵入菌糸の形成が観察された（左パネル）。しかし、α−１，３−グルカナーゼを加えた野生株胞子懸濁液を接種した場合には、イネ細胞に付着している付着器は少なく、またそれらは侵入菌糸も形成していなかった（右パネル）。
以上の結果から、α−１，３−グルカン合成酵素欠損株（ΔＭｇＡＧＳ１株）は、カバーグラスや植物死細胞上では野生株同様に付着器及び侵入菌糸を形成するが、生きた植物上では、野生株と比較して明らかに感染力の低下が見られた。また、野生株に対して外来のα−１，３−グルカナーゼで処理することにより、その感染を顕著に抑制できることが示された。
Ｂ．イネへの接種実験（肉眼観察）
精製α−１，３−グルカナーゼ溶液（５μｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを加えた野生株胞子懸濁液１０ｍｌを、イネ品種ＬＴＨ（第４葉目展開したイネを使用）の切り葉に噴霧接種し、接種葉を継続光下２５℃でインキュベートした。対照として、α−１，３−グルカナーゼ溶液の代わりに滅菌水０．５ｍｌを胞子懸濁液に加えたものも同様に接種及びインキュベートした。接種５日後、切り葉に生じた病斑を観察した。
結果を、図８に示す。α−１，３−グルカナーゼ無添加の野生株では進展型の病斑が形成されていたが（左パネル）、α−１，３−グルカナーゼを添加した野生株では病斑が顕著に少なくなっていた（右パネル）。したがって、いもち病菌細胞壁のα−１，３−グルカンを分解することにより、いもち病菌の感染力を低下させることができることが示された。
Ｃ．オオムギへの接種実験（肉眼観察）
精製α−１，３−グルカナーゼ溶液（５μｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを加えた野生株胞子懸濁液１０ｍｌを、オオムギ品種ゴールデンプロミス（第４葉目展開したオオムギを使用）の切り葉に噴霧接種し、接種葉を継続光下２５℃でインキュベートした。対照として、α−１，３−グルカナーゼ溶液の代わりに滅菌水０．５ｍｌを胞子懸濁液に加えたものも同様に接種及びインキュベートした。接種５日後、切り葉に生じた病斑を観察した。
結果を、図９に示す。α−１，３−グルカナーゼ無添加の野生株では進展型の病斑が形成されていたが（左パネル）、α−１，３−グルカナーゼを添加した野生株では病斑が顕著に少なくなっていた（右パネル）。したがって、いもち病菌細胞壁のα−１，３−グルカンを分解することにより、いもち病菌の感染力を低下させることができることが示された。
＜実施例５．  プラスチック表面上での付着器形成中の細胞壁多糖類合成遺伝子の発現＞
付着器形成中のα−１，３−グルカン合成酵素遺伝子（ＭｇＡＧＳ１）及びβ−１，３−グルカン合成酵素遺伝子（ＭｇＦＫＳ１）の転写レベルを、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析によって調べた。
総ＲＮＡを、「ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｅａｓｙ  ｋｉｔ」（商品名；Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、発芽中の胞子又はＧｅｌＢｏｎｄフィルム（商品名；タカラ）の疎水性表面で付着器から発生中の胞子から単離した。ＧｅｌＢｏｎｄ表面で発生中の菌体は、シリコンスクレイパー（Ｔｏｒａｙ）を用いて集め、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商品名；Ａｍｂｉｏｎ）中に再懸濁した。菌胞子を接種したイネ葉鞘由来の総ＲＮＡは、「ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｅａｓｙ  ｋｉｔ」（商品名；Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。「ＥｘＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ」（商品名；タカラ）及びオリゴｄＴプライマーを用いて総ＲＮＡサンプルからｃＤＮＡを合成し、ｑＲＴ−ＰＣＲのための鋳型として用いた。「ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥｘＴａｑ  ｋｉｔ」（商品名；タカラ）を、ｑＲＴ−ＰＣＲのための鋳型ｃＤＮＡの標識及び増幅に用いた。ｑＲＴ−ＰＣＲのために、相当する遺伝子の約３００ｂｐのユニーク配列を増幅するように遺伝子特異的プライマーを設計した（表５、配列番号１６〜２１）。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、「ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＭｘ３００ｐ」システム（商品名；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて製造業者の指示にしたがって行った。これらの遺伝子の転写レベルの定量は、デルタ−Ｃｔ法（Ｌｉｖａｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，２００１）によって計算した。
【表５】
0005552649.tif 000028
結果を図１０に示す。
プラスチック表面上で、胞子の発芽は培養開始２時間以内に観察され、発芽管は４時間以内、小さい初期付着器は約７時間後、付着器は１０時間以内に、それぞれ形成された（図１０、パネル（Ａ））。付着器は、培養開始から２４時間後に十分に成熟しメラニン化した（データは示していない）。ＭｇＡＧＳ１の発現レベルは、培養開始７〜１０時間後に一時的に上昇し、２４時間後には２時間後の発現レベルまで低下した（図１０、パネル（Ｂ））。これに対し、ＭｇＦＫＳ１の発現レベルは、付着器形成の間を通じてほとんど一定であった（図１０、パネル（Ｃ））。
したがって、α−１，３−グルカン合成酵素遺伝子（ＭｇＡＧＳ１）の発現は、付着器形成の初期に特異的に誘導されることがわかった。
＜実施例６．  イネ細胞における感染中の細胞壁多糖類合成遺伝子の発現＞
植物体内での感染性生育中のα−１，３−グルカン合成酵素遺伝子（ＭｇＡＧＳ１）及びβ−１，３−グルカン合成酵素遺伝子（ＭｇＦＫＳ１）の転写レベルを、上記と同様にｑＲＴ−ＰＣＲ分析によって調べた。
ｑＲＴ−ＰＣＲ分析のための総ＲＮＡは、いもち病菌胞子の接種２４又は４８時間後のイネ鞘細胞から抽出した。感染性菌糸はイネ鞘細胞中で接種後２４時間には発生し、４８時間後には著しく成長していた（データは示していない）。ＭｇＡＧＳ１の発現レベルは、２４時間後よりも４８時間後の時点で有意に高く、ＭｇＡＧＳ１の発現が感染性生育中に増大したことが示された（図１１、パネル（Ａ））。これに対し、ＭｇＦＫＳ１の転写レベルは、４８時間後では２４時間後より顕著に低く、ＭｇＦＫＳ１の発現が経時的に急激に低減したことが示された（図１１、パネル（Ｂ））。
これらの菌類遺伝子の転写は、未接種のイネ鞘細胞から抽出した総ＲＮＡにおいては検出されなかった（図１１、パネル（Ａ）、（Ｂ）の０時間）。
したがって、イネへの感染が進むにつれて、α−１，３−グルカン合成酵素遺伝子の転写量は増大するが、β−１，３−グルカン合成酵素遺伝子の転写量は低減することがわかった。
＜実施例７．  α−１，３−グルカナーゼ発現ベクターの作製＞
Ａ．プラスミドｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ａｇｌの構築
図１２に示す構造のプラスミドｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ａｇｌを構築した。
使用したｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ＲＣＣ２（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，９９，３８３−３９０，１９９９）は、バイナリーベクターｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＴ−ＤＮＡ領域内に、選抜マーカーカセットとして、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター：：ハイグロマイシンリン酸転移酵素（ＨＰＴ）：：ＣａＭＶターミネーターを持ち、さらに、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターのエンハンサー領域を４反復させた人工プロモーターＥＮ４（独立行政法人農業生物資源研究所  廣近洋彦博士より譲渡；配列番号２２）と、その下流に、ＲＣＣ２（イネキチナーゼ遺伝子Ｃｈｔ−２；アクセッション番号：Ｘ５６７８７）及びノパリン合成酵素のターミネーター（ＮＯＳ３’）とを持つ。このｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ＲＣＣ２を、ＳｐｅＩ及びＳａｃＩで切断することによってＲＣＣ２を除き、そこに先にクローン化したα−１，３−グルカナーゼをコードするａｇｌ（配列番号２３）のＳｐｅＩ−ＳａｃＩ断片を連結し、ｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ａｇｌを完成させた。
Ｂ．プラスミドｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ＲＣＣ２ＳＳ／ａｇｌの構築
上記で作製したｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ａｇｌに、細胞外分泌シグナル（ＲＣＣ２ＳＳ）のＸｈｏＩ−ＳａｃＩ断片を連結して、図１３に示すプラスミドｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ＲＣＣ２ＳＳ／ａｇｌを構築した。
Ｃ．プラスミドｐＴＮ２／Ｅｌ２Ω−ＲＣＣ２ＳＳ／ａｇｌの構築
植物内強発現プロモーターであるＥｌ２Ωプロモーター（Ω配列についてはＰｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４０（８）：８０８−８１７（１９９９）を、Ｅｌ２ΩプロモーターについてはＰｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７（１）：４９−５９（１９９６）を参照）を使用し、ＲＣＣ２ＳＳ配列の下流にａｇｌ遺伝子を有する、図１４に示すプラスミドｐＴＮ２／Ｅｌ２Ω−ＲＣＣ２ＳＳ／ａｇｌを作製した。
このプラスミドは、植物内マーカー遺伝子としてｎｐｔＩＩ、ｎｐｔＩＩを発現させるプロモーターとしてＰＮＣＲ、ターミネーターとしてＴｔｍｌ配列を有する（Ｆｕｋｕｏｋａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１９：８１５−８２０）。
Ｄ．プラスミドｐＭＬＨ７１３３−Ｓｐ／ａｇｌの構築
使用したｐＭＬＨ７１３３（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｉａ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ  ｅｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔａ  ９３：１７３−１７８（１９９９））は、バイナリーベクターｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＴ−ＤＮＡ領域内に、選抜マーカーカセットとして、ノパリン合成酵素のプロモーター（Ｐｎｏｓ）：：カナマイシンリン酸転移酵素遺伝子（ｎｐｔＩＩ）：：ノパリン合成酵素のターミネーター（Ｔｎｏｓ）及び、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター（Ｐ３５Ｓ）：：ハイグロマイシンリン酸転移酵素遺伝子（ＨＰＴ）：：ＣａＭＶの３５Ｓターミネーター（Ｔ３５Ｓ）を持ち、さらに、イントロン配列を含む植物内強発現プロモーター（Ｅ７：：Ｐ３５Ｓ：：Ω：：Ｉ  （Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７（１）：４９−５９（１９９６）を参照。））を持つ。このイントロン配列を含む植物内強発現プロモーターの下流に、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）ＰＲ１ａ遺伝子の転写開始領域及び分泌シグナルペプチド領域（Ｓｐ配列；配列番号２４）とａｇｌ遺伝子を有する、図１５に示すプラスミドｐＭＬＨ７１３３−Ｓｐ／ａｇｌを作製した。
＜実施例８．トランスジェニック植物の作製＞
（１）アグロバクテリウムへのａｇｌ遺伝子導入法
Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７，３２５，１９９０）にしたがってα−１，３−グルカナーゼ（ａｇｌ）遺伝子を導入したバイナリーベクターｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ａｇｌを、それぞれエレクトロポーレーション法によりＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ  ｓ（ＥＨＡ１０５株又はＬＢＡ４４０４株）に導入する。その後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン又は５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含むＬＢ培地（０．５％  ＮａＣｌ、１％  Ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎ、１％  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）上で２８℃で２日間培養することによって形質転換アグロバクテリウムを得る。
（２）ａｇｌ遺伝子導入
（２−１：イネへの遺伝子導入法）
イネの形質転換は、超迅速形質転換法（特許第３１４１０８４号公報、又は、Ｔｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，４７，９６９−９７６，２００６）にしたがって行った。ただし、アグロバクテリウムの除菌にはメロペン（大日本住友製薬）を用いた。具体的には以下のようにして行った。
上記（１）で調製した形質転換されたアグロバクテリウムの懸濁液と、超迅速形質転換法にしたがって前培養したイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ品種：日本晴（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ））の種子を、２Ｎ６−ＡＳ培地（３０ｇ／Ｌ  ショ糖、１０ｇ／Ｌ  グルコース、０．３ｇ／Ｌ  カザミノ酸、２ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、１０ｍｇ／Ｌ  アセトシリンゴン、４ｇ／Ｌ  ゲルライト、ｐＨ５．２）上で、暗黒下で３日間、２８℃で共存培養した。その後、２５ｍｇ／Ｌのメロペンを含有する滅菌水を用いて種子からアグロバクテリウムを洗浄後、種子を１２．５ｍｇ／Ｌのメロペン及び選抜マーカーとして５０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシン、さらに４ｇ／Ｌゲルライトを加えたＮ６培地（選抜培地）に置床して、２８℃、暗所で約１０日間培養し、ハイグロマイシン耐性細胞を増殖し、カルスを得た。
選抜されたハイグロマイシン耐性カルスを再分化培地〔ＭＳ無機塩類及びＭＳビタミン（Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ，１５，４７３−４９７（１９６２））、６．２５ｍｇ／Ｌ  メロペン、５０ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシン、３０ｇ／Ｌ  ショ糖、３０ｇ／Ｌ  ソルビトール、２ｇ／Ｌ  カザミノ酸、２ｍｇ／Ｌ  カイネチン、０．００２ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ（ナフタレン酢酸）、４ｇ／Ｌ  ゲルライト、ｐＨ５．８〕に移植して、再分化するまで、２８℃、明所で培養を続けた。
再分化個体を、発根培地（６．２５ｍｇ／Ｌ  メロペン及び２５ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシンを補充した、ホルモンを含まないＭＳ培地（６．２５ｍｇ／Ｌ  メロペン、５０ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシン、３０ｇ／Ｌ  ショ糖、３０ｇ／Ｌ  ソルビトール、２ｇ／Ｌ  カザミノ酸、４ｇ／Ｌ  ゲルライト、ｐＨ５．８）に置床した。約１０日後、新しい発根培地に移植し、さらに約１週間後、形質転換植物が大きくなったところで、２〜３日の馴化を経て「呉羽粒培土−Ｄ」（商品名；呉羽化学）を詰めたポットに移植し、温室内で生育させた。
（２−２：ゲノミックＤＮＡへの組み込みの確認）
ａｇｌ遺伝子を導入したイネのうち、ゲノミックＤＮＡにａｇｌ遺伝子が組み込まれた真の組換え体イネをＰＣＲ法により確認した。
ゲノミックＤＮＡを「ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ」（商品名；ＱＩＡＧＥＮ）を用いてイネ葉から単離した。これを鋳型ＤＮＡとして、ａｇｌ遺伝子の部分配列及び内部コントロールで、恒常的に発現するＯｓＵｂｑ１遺伝子の部分配列をＰＣＲ法により増幅させて、電気泳動法により増幅断片を確認した。相当する遺伝子の約３００ｂｐのユニーク配列を増幅するように遺伝子特異的プライマーを設計した（配列番号２５／２６：ａｇｌ用フォワード／リバースプライマー、配列番号２７／２８：ＯｓＵｂｑ１用フォワード／リバースプライマー）。
結果を図１６Ａに示す。ＧＭ  ＃４−８及びＧＭ  ＃５−２は、それぞれトランスジェニックイネ（Ｔ０世代）であり、Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ  Ｎ２は非組換え体イネである。上パネルは、ａｇｌ遺伝子特異的な増幅バンドを観察したもので、組換え体イネであるＧＭ  ＃４−８及びＧＭ  ＃５−２においてバンドが観察される。下パネルは、ＯｓＵｂｑ１遺伝子の増幅バンドを観察したもので、全てのイネで観察される。
したがって、組換え体イネＧＭ  ＃４−８及びＧＭ  ＃５−２においてゲノム中にａｇｌ遺伝子が組み込まれていることが確認された。
（２−３：ａｇｌ  ｍＲＮＡの発現確認）
ａｇｌ遺伝子トランスジェニックイネ（Ｔ０世代）におけるａｇｌ遺伝子の発現を逆転ＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。
前記トランスジェニックイネＧＭ  ＃４−８及びＧＭ  ＃５−２並びに非組換え体イネのＮｉｐｐｏｎｂａｒｅ  Ｎ２のそれぞれの葉から総ＲＮＡを「ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ」（商品名；ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出し、「ＥｘＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ」（商品名；タカラ）及びオリゴｄＴプライマーにより合成したｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ用の鋳型として、前記２−２と同様のプライマーセットを用いてＰＣＲ法により得られた増幅断片をゲル電気泳動法によって確認した。内部コントロールには、前記２−２と同様にＯｓＵｂｑ１遺伝子のプライマーセットを用いた。
結果を図１６Ｂに示す。上パネルは、ａｇｌ遺伝子の増幅バンドを観察したもので、トランスジェニックイネであるＧＭ  ＃４−８及びＧＭ  ＃５−２でのみバンドが観察される。下パネルは、ＯｓＵｂｑ１遺伝子特異的な増幅バンドを観察したもので、全てのイネで観察される。
したがって、トランスジェニックイネＧＭ  ＃４−８及びＧＭ  ＃５−２においてａｇｌ遺伝子が恒常的に発現していることが確認された。
（２−４：Ａｇｌタンパク質の確認）
ａｇｌ遺伝子トランスジェニックイネ（Ｔ０世代）の全タンパク質中にＡｇｌタンパク質が含まれているかをウエスタンブロット解析法により確認した。
イネから全タンパク質を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によりタンパク質を分離した後、Ａｇｌタンパク特異的なウサギ抗血清を一次抗体、洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギＩｇＧを二次抗体としてウエスタンブロットを行い発光基質を加えてＸ線フィルムに感光させＡｇｌタンパク質（分子量約１３５ｋＤ）の存在を確認した。Ａｇｌタンパク質抗血清は、Ａｇｌタンパク質を免疫したウサギより精製した（注：バイオツールズ株式会社、東京都港区高輪２−１５−２４）。抗原として用いたＡｇｌタンパク質は、Ｙａｎｏら（２００３）による方法によって発現、精製を行った〔Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７，１９７６−１９８２〕。
結果を図１６Ｃに示す。トランスジェニックイネであるＧＭ  ＃４−８及びＧＭ  ＃５−２においてのみＡｇｌタンパク質特異的なバンド（分子量：約１３５ｋＤ）が観察された。
したがって、トランスジェニックイネＧＭ  ＃４−８及びＧＭ  ＃５−２においてＡｇｌタンパク質が恒常的に発現されていることが確認された。
（３）タバコへの遺伝子導入法
タバコの形質転換は、Ｈｏｒｓｃｈら（１９８５）によるリーフディスク法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２２９−１２３１（１９８５）〕に基づいて行う。ただし、アグロバクテリウムの除菌にはカルベニシリンを用いる。具体的には以下のようにして行う。
約１ヶ月齢のタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．サムソンＮＮ）の葉から切り出したリーフディスクを、α−１，３−グルカナーゼを保持するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ  ｓ  ＬＢＡ４４０４菌液（本実施例の（１）に記載の方法で培養選抜した後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン又は５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含むＬＢ液体培地で２昼夜培養したものを滅菌蒸留水で希釈再懸濁したもの）に浸し、シュート誘導培地〔０．１ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ、１ｍｇ／Ｌ  ＢＡ（ベンジルアデニン）、ＭＳ無機塩類及びＭＳビタミン類（本実施例の（２−１）に記載）、３０ｇ／Ｌ  ショ糖、８ｇ／Ｌ  寒天、ｐＨ５．７〕上で２日培養する。その後、５０ｍｇ  カナマイシン及び２５０ｍｇ／Ｌ  カルベニシリンを含むシュート誘導培地に移し、２８℃、明所にて２〜４週間培養して再分化させる。
再分化個体を、トランスジェニックイネを作製するときと同様にして発根培地〔ＭＳ無機塩類及びＭＳビタミン、３０ｇ／Ｌ  ショ糖、５０ｍｇ／Ｌ  カナマイシン、８ｇ／Ｌ  寒天、２５０ｍｇ／Ｌ  カルベニシリン、ｐＨ５．７〕に移植し、馴化を経て自殖種子を得る。
（４）トマトへの遺伝子導入法
トマトの形質転換は、Ｈｏｒｓｃｈら（１９８５）によるリーフディスク法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２２９−１２３１（１９８５）〕に基づいて行う。ただし、アグロバクテリウムの除菌にはカルベニシリンを用いる。具体的には以下のようにして行う。
トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）を、播種用培地〔ＭＳ無機塩類及びＭＳビタミン類（本実施例（２−１）に記載）、１５ｇ／Ｌ  ショ糖、３ｇ／Ｌ  ゲルライト、ｐＨ５．８〕に無菌播種し、得られた子葉を切り出して葉片とする。このリーフディスクを、α−１，３−グルカナーゼを保持したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ  ｓ  ＬＢＡ４４０４菌液（本実施例の（１）に記載の方法で選抜した後５０μｇ／ｍＬのカナマイシン又は５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含むＬＢ液体培地で２昼夜培養したものを、１００μＭアセトシリンゴン、１０μＭメルカプトエタノールを添加したＭＳ培地で希釈再懸濁したもの）に１０分間浸したのち、共存培地〔ＭＳ無機塩類及びＭＳビタミン類（本実施例（２−１）に記載）、３０ｇ／Ｌ  ショ糖、３ｇ／Ｌゲルライト、１．５ｍｇ／Ｌ  ゼアチン、４μＭ  アセトシリンゴン、ｐＨ５．８〕の上にのせ、暗黒下、２５℃で３日間共存培養する。
共存培養後のリーフディスクを、カルス誘導培地〔ＭＳ無機塩類及びＭＳビタミン類（本実施例（２−１）に記載）、３０ｇ／Ｌ  ショ糖、３ｇ／Ｌ  ゲルライト、１．５ｍｇ／Ｌ  ゼアチン、１００ｍｇ／Ｌ  カナマイシン、２５０ｍｇ／Ｌ  カルベニシリン、ｐＨ５．８〕に移し、２５℃、１６時間日長で培養する。リーフディスクからカルスが形成され、そのカルスからシュートが見えるようになったところで、リーフディスクを切り落とす。シュート及びカルスは、シュートの生長を早めるため、シュート誘導培地〔ＭＳ無機塩類及びＭＳビタミン類（本実施例（２−１）に記載）、３０ｇ／Ｌ  ショ糖、３ｇ／Ｌ  ゲルライト、１．０ｍｇ／Ｌ  ゼアチン、１００ｍｇ／Ｌ  カナマイシン、３７５ｍｇ／Ｌ  オーグメンチン、ｐＨ５．８〕上に移し、２５℃、１６時間日長でさらに培養する。
シュートが１〜２ｃｍの長さに生長したところで根元から切り取って発根培地〔ＭＳ無機塩類（本実施例（２−１）に記載の０．５倍濃度にしたもの）、１５ｇ／Ｌ  ショ糖、３ｇ／Ｌ  ゲルライト、５０ｍｇ／Ｌ  カナマイシン、２５０ｍｇ／Ｌ  カルベニシリン、ｐＨ５．８〕上に移植し、発根した個体を選抜する。選抜後の個体を馴化し自殖種子を得る。
＜実施例９．ａｇｌ遺伝子トランスジェニックイネのいもち病菌抵抗性の確認＞
（１）親和性いもち病菌抵抗性：１
上記実施例８で作製したａｇｌ遺伝子トランスジェニックイネの葉に、親和性（病原性）いもち病菌（Ｉｎａ８６−１３７株）の胞子懸濁液（滅菌水１ｍｌあたり１×１０６分生子数）３０μｌを針接種し、接種葉を継続光下２５℃でインキュベートした。コントロールには、非組換え体イネＮｉｐｐｏｎｂａｒｅ  Ｎ２を用いた。上述したように、いもち病菌は、宿主植物への感染時に自身の細胞壁表面にα−１，３−グルカン層を形成し、宿主植物の免疫機構を回避することが知られている。接種５日後、病斑の形成の有無及び程度について接種葉を観察した。
結果を図１７に示す。非組換え体イネＮｉｐｐｏｎｂａｒｅ  Ｎ２の葉では、菌侵入初期に見られる典型的ないもち病斑が確認された（白矢印）。一方、実施例８でＮｉｐｐｏｎｂａｒｅ  Ｎ２から作出したトランスジェニックイネＧＭ  ＃４−８の葉では、いもち病菌抵抗反応様の褐点が確認された（白矢頭）。
本結果からａｇｌ遺伝子トランスジェニックイネ（Ｔ０世代）は、外来性のａｇｌ遺伝子の発現により、いもち病菌抵抗性を有することが明らかとなった。
（２）非親和性いもち病菌抵抗性：２
上記実施例８で作製したａｇｌ遺伝子トランスジェニックイネＧＭ  ＃４−８の葉に、非親和性いもち病菌（Ｋｙｕ８９−２４６株）の胞子懸濁液（滅菌水１ｍｌあたり１×１０６分生子数）３０μｌを針接種し、接種葉を継続光下２５℃でインキュベートした。コントロールには、非組換え体イネ  Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ  Ｎ２を用いた。非親和性いもち病菌Ｋｙｕ８９−２４６株は、Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ  Ｎ２に対して非感染性を示すことが知られている。
結果を図１８に示す。Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ  Ｎ２では、Ｋｙｕ８９−２４６株の非親和性が確認された（白矢頭）。一方、Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ  Ｎ２から作出したＧＭ  ＃４−８においても非感染性は維持されていた（白矢頭）。
＜実施例１０．ａｇｌ遺伝子トランスジェニックイネのごま葉枯病菌抵抗性の確認＞
上記実施例８で作製したａｇｌ遺伝子トランスジェニックイネＧＭ  ＃４−８の葉に、イネごま葉枯病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｍｉｙａｂｅａｎｕｓ＝無世代名  Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＭＡＦＦ３０５４２５）野生株胞子懸濁液（滅菌水１ｍｌあたり１ｘ１０６分生子数）３０μｌを針接種し、接種葉を継続光下２５℃でインキュベートした。イネごま葉枯病菌は、細胞壁の恒常的な構成成分としてα−１，３−グルカンを含むが、いもち病菌のように宿主植物感染時に菌糸表面にα−１，３−グルカン層を形成することはない。コントロールには、非組換え体イネ  Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ  Ｎ２を用いた。接種５日後、病斑の形成の有無及び程度について接種葉を観察した。
結果を図１９に示す。非組換え体イネＮｉｐｐｏｎｂａｒｅ  Ｎ２の葉では、典型的なごま葉枯病斑が確認された。ＧＭ  ＃４−８の葉では抵抗反応様の褐点が確認された。
本結果からａｇｌ遺伝子トランスジェニックイネ（Ｔ０世代）は、ごま葉枯病菌抵抗性を有することが明らかとなった。
＜実施例１１．トランスジェニックイネ（Ｔ１世代）の確認＞
（１）Ｔ１世代の作製
上記トランスジェニックイネ（Ｔ０世代）を温室内で生育させて、次世代の自殖種子（Ｔ１世代若しくはＲ１世代と呼ぶ）を得た。この種子を、ホルモンを含まない１／４ＭＳ培地（１／４希釈したＭＳ無機塩類、１００ｍｇ／ｌ  アンピシリン、５０〜１００ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシン、４ｇ／Ｌ  ゲランガム）に置床した。２８℃で１〜２日暗黒下にインキュベートした後、継続光下で約１０日間培養した。発芽したハイグロマイシン耐性を有するトランスジェニックイネをその後、「ボンソル１号」（商品名；住友化学）を詰めたポットに移植し、温室内で生育させた。
（２）Ｔ１世代におけるａｇｌ遺伝子発現の確認
ａｇｌ遺伝子を導入したＴ０トランスジェニックイネから得られたＴ１世代のイネがａｇｌ遺伝子を発現しているかをＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。コントロールには、Ｔ０トランスジェニックイネの作製に用いた非組換えイネＮｉｐｐｏｎｂａｒｅ  Ｎ２を使用した。具体的な方法については、前記実施例８（２−３）と同様の方法に準じた。
結果を図２０に示す。Ｔ１  ｌｉｎｅ＃２０１−Ａ２及び０＃３１０−２は、いずれもａｇｌ遺伝子の発現を確認済みのＴ０世代トランスジェニックイネの自殖種子から得られたＴ１世代のトランスジェニックイネである。＃２０１−Ａ２及び＃３１０−２では、ａｇｌ増幅バンドが観察されたが、コントロールである非組換えイネＮｉｐｐｏｎｂａｒｅ  Ｎ２では確認できなかった。ＯｓＵｂｑ１遺伝子は、全てのイネで観察された。
したがって、Ｔ１トランスジェニックイネＴ１  ｌｉｎｅ＃２０１−Ａ２及び＃３１０−２でもａｇｌ遺伝子が恒常的に発現していることが確認された。
（３）Ｔ１トランスジェニックイネにおけるいもち病菌抵抗性の確認
Ｔ１トランスジェニックイネ＃２０１−Ａ２及び０＃３１０−２に親和性いもち病菌（Ｉｎａ８６−１３７株）の胞子懸濁液（滅菌水１ｍｌあたり１×１０６分生子数）１０ｍｌを噴霧接種し、接種５日後のイネの反応を観察した。具体的な方法については、実施例９（１）に準じた。
結果を図２１に示す。実施例９のＴ０世代と同様に、Ｔ１トランスジェニックイネ＃２０１−Ａ２及び＃３１０−２においても、その葉でいもち病菌抵抗反応様の褐点が確認された。
したがって、ａｇｌ遺伝子のＴ１世代トランスジェニックイネもいもち病菌に対して抵抗性を維持していることが確認された。
（４）Ｔ１世代トランスジェニックイネにおけるごま葉枯病菌抵抗性の確認
Ｔ１トランスジェニックイネにごま葉枯病菌の胞子懸濁液（滅菌水１ｍｌあたり１×１０６分生子数）１０ｍｌを噴霧接種し、イネの反応を観察した。具体的な方法については、実施例９（２）に準じた。
結果を図２２に示す。Ｔ１トランスジェニックイネ＃２０１−Ａ２及びＴ１  ｌｉｎｅ＃３１０−２の葉では抵抗反応様の褐点が確認された。一方、非組換え体イネ  Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅでは典型的なごま葉枯病斑が確認された。
したがって、ａｇｌ遺伝子のＴ１トランスジェニックイネもＴ０世代と同様のごま葉枯病菌に対する抵抗性を維持していることが確認された。
（５）Ｔ１トランスジェニックイネにおけるイネ紋枯病菌抵抗性の確認
ａｇｌ遺伝子のＴ１トランスジェニックイネのイネ紋枯病菌に対する抵抗性を調べた。
（５−１）葉面接種
イネ紋枯病菌（Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ  ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ  ＝ｓｙｎ．Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ  ＭＡＦＦ３０５２１９）野生株をＭａｒｕｔｈａｓａｌａｍら（２００７）の方法〔Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，２６，７９１−８０４．〕を参考にしてＴ１トランスジェニックイネ＃２７−２の葉面に接種した。イネ紋枯病菌を生育させたＰＤＡ培地（２４ｇ／Ｌ  ＤＩＦＣＯ  ｐｏｔａｔｏ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ｂｒｏｔｈ，１．５（ｗ／ｖ）％寒天）をコルクボーラーでくり抜き、菌叢面を葉面に合わせるように静置し、継続光下、３０℃でインキュベートした。接種６日後の病斑の形成の有無及び程度について接種葉を観察した。イネ紋枯病菌もごま葉枯菌と同様に、α−１，３−グルカンを細胞壁の恒常的な構成成分として含む。
なお、Ｔ１  ｌｉｎｅ＃２０１−Ａ２及び＃３１０−２と同様に、Ｔ１  ｌｉｎｅ＃２７−２もＮｉｐｐｏｎｂａｒｅ  Ｎ２より作出したＴ０世代より得られたＴ１世代のａｇｌ遺伝子のトランスジェニックイネで、ａｇｌ遺伝子の発現を確認している（データ示さず）。
結果を図２３Ａに示す。Ｔ１トランスジェニックイネ＃２７−２の葉ではイネ紋枯病菌による葉の枯死が抑制されていた。一方、Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ  Ｎ２では、典型的なイネ紋枯病菌による葉の枯死が生じていた。
以上より、ａｇｌ遺伝子のＴ１トランスジェニックイネは、イネ紋枯病菌に対しても感染抵抗性を有することが明らかとなった。
（５−２）葉鞘接種
イネ紋枯病菌野生株の菌糸を爪楊枝先端で絡めとり、Ｔ１トランスジェニックイネ＃２７−２及びＮｉｐｐｏｎｂａｒｅ  Ｎ２の葉鞘切断面に擦り付け、継続光下、３０℃でインキュベートした。接種６日後の病斑の形成の有無及び程度について接種葉を観察した。
結果を図２４Ｂに示す。＃２７−２の葉鞘では紋枯病菌による枯死が抑制されていたが、Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅでは紋枯病菌による葉鞘の枯死が激しかった。
以上より、ａｇｌ遺伝子のＴ１トランスジェニックイネは、葉のみならず、葉鞘においてもイネ紋枯病菌に対しても感染抵抗性を示すことが明らかとなった。
＜実施例１２．灰色かび病菌のタバコ葉感染阻害＞
灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）は、α−１，３−グルカンを細胞壁の恒常的な構成成分として含む。そこで、予めα−１，３−グルカナーゼで処理した灰色かび病菌胞子の宿主植物感染性が阻害されるか否かについて検証した。
（１）α−１，３−グルカナーゼ処理した灰色かび病菌のタバコ葉感染阻害
灰色かび病菌野生株胞子の懸濁液（滅菌水１ｍｌあたり５ｘ１０４分生子）に精製α−１，３−グルカナーゼ５μｇを加え、１００μｌをタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）サムソンＮＮ株の葉に接種した。対照として精製α−１，３−グルカナーゼに代えてＰＢＳバッファーを同一葉に接種した。その後、接種葉を２５℃でインキュベートし、接種３週間後、病斑の形成の有無及び程度について観察した。
結果を図２４Ａに示す。破線円内は接種箇所を示す。ａは、１，３−グルカナーゼ処理済みの灰色かび病菌胞子を接種したもの、ｂは、１，３−グルカナーゼ無添加のバッファのみに懸濁した灰色かび病菌胞子を接種したものである。１，３−グルカナーゼ処理した灰色かび病菌胞子では著しく感染力が抑制されていることがわかる。
本結果は、１，３−グルカナーゼを宿主植物表面に塗布又は噴霧等によって直接付着させた場合であっても、植物感染性微生物の感染を予防できることを示唆している。
（２）タバコ葉でのα−１，３−グルカナーゼー過的発現による灰色かび病菌の感染阻害
実施例８（１）の方法に準じてα−１，３−グルカナーゼ遺伝子を保持するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４菌液及びコントロールとしてα−１，３−グルカナーゼ遺伝子を保持しないＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４菌液を、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）サムソンＮＮ株に注入接種し、２４時間インキュベートした。その後、灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）野生株の胞子懸濁液（滅菌水１ｍｌあたり５ｘ１０４分生子）１００μｌをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを接種したタバコ葉部位に接種した。接種葉を２５℃でインキュベートし、１週間後、病斑の形成の有無及び程度について観察した。
結果を図２４Ｂに示す。ａの破線内は、１，３−グルカナーゼを一過的発現させた部位に灰色カビ菌を接種した箇所、ｂの破線内は、１，３−グルカナーゼを無発現部位に灰色カビ菌を接種した箇所を示す。
本結果が示すように、１，３−グルカナーゼを一過的にタバコ内で発現させた場合にも灰色カビ菌に対する感染抵抗性が示された。
＜実施例１３．α−１，３−グルカナーゼを分泌する微生物接種によるいもち病菌防除効果＞
本発明の微生物農薬製剤の有効性を、内在性ａｇｌ遺伝子を有する枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＡ３０４株を用いて検証した。
（１）枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  ＫＡ３０４株におけるａｇｌ遺伝子の発現の確認
内在性ａｇｌ遺伝子を有することが知られている枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  ＫＡ３０４株（Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：１７５４−１７６３）を発現誘導剤として０．５（ｗ／ｖ）％α−１，３−グルカンを添加したａｇｌ発現誘導用の、又はそれを添加しない非発現誘導用の、Ｂａｃｉｌｌｕｓ増殖用培地（０．５（ｗ／ｖ）％ポリペプトン、０．５（ｗ／ｖ）％酵母エキス、０．１（ｗ／ｖ）％  Ｋ２ＨＰＯ４、０．０３（ｗ／ｖ）％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に添加し、一晩培養した。コントロールとして、内在性の本酵素遺伝子を有さない枯草菌Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株を用いた。培養後、それぞれの培養液の菌体から総ＲＮＡを「ＲＮＡｉｓｏ」（商品名；タカラ）を用いて単離した。その後、総ＲＮＡをＤＮａｓｅ（商品名；ニッポンジーン）処理し、「ＥｘＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ」（商品名；タカラ）及びランダムヘキサマープライマーを用いて総ＲＮＡサンプルからｃＤＮＡを合成した。各ｃＤＮＡの濃度を一定にしてＲＴ−ＰＣＲ用の鋳型として、相当する遺伝子の約３００ｂｐのユニーク配列を増幅するように設計した遺伝子特異的プライマー（ａｇｌ増幅用フォワード／リバースプライマー：配列番号２５／２６，１６Ｓ  ｒＲＮＡ増幅用フォワード／リバースプライマー：配列番号２９／３０）によりＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は、９６℃４分間、続いて（９６℃１５秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒）を２５〜３５サイクル、最後に７２℃で７分間である。
結果を図２５に示す。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株ではａｇｌ遺伝子をもたないため、いずれの培養条件でもａｇｌ遺伝子の発現は見られない。一方、内在性のａｇｌ遺伝子をもつＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  ＫＡ３０４株ではａｇｌ遺伝子の発現が確認された。更にＢ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  ＫＡ３０４株では、発現誘導剤であるα−１，３−グルカンを添加した培養時の方が無添加の培養時に比べてａｇｌ遺伝子の転写量が増加していた。
以上より、ａｇｌ遺伝子を有する微生物では、発現誘導処理を行うことによりα−１，３−グルカナーゼを高発現することが判明した。
（２）枯草菌を接種したイネのいもち病菌に対する感染抵抗性
本実施例の（１）に記載の方法で、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  ＫＡ３０４株及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株を培養した。培養後、各培養液の吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）を０．５に合わせ、１０ｍｌの細菌懸濁液を調製した。この懸濁液をイネ品種ＬＴＨ（第４葉目展開したイネを使用）の切り葉に噴霧接種し、接種葉を継続光下２５℃でインキュベートした。対照として、細菌懸濁液に代えて滅菌水を用いた。３時間後にいもち病菌野生株（Ｇｕｙ１１株）胞子懸濁液（滅菌水１ｍｌあたり１×１０６分生子数）１０ｍｌを切り葉に噴霧接種し、接種葉を継続光下２５℃でインキュベートした。接種４日後、切り葉に生じた病斑を観察した。
結果を、図２６に示す。細菌無処理でいもち病菌を接種したイネでは進展型の病斑が多数形成されていた（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。一方、α−１，３−グルカナーゼを発現しないＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株を接種したイネでは培養時のα−１，３−グルカン添加の有無に関わらず、わずかに病斑が少なくなっていた。これは、枯草菌が分泌する他の抗菌物質によるものと思われる。対して、α−１，３−グルカナーゼを発現し、分泌するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  ＫＡ３０４株を接種したイネでは、発現誘導剤のα−１，３−グルカン無添加培養時は、病斑がＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株と同程度であったが、α−１，３−グルカン添加培養時では病斑が顕著に少なくなっていた。
したがって、α−１，３−グルカン添加培養により、すなわち発現誘導処理によりα−１，３−グルカナーゼを高発現させたＢ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓをイネに噴霧することで、いもち病菌の感染が抑制されることが示された。すなわち、本発明の微生物農薬製剤が有効に機能し得ることが立証された。
＜実施例１４．イネに感染した植物感染性微生物の細胞壁におけるα−１，３−グルカン＞
（１）イネに感染したイネごま葉枯病菌の細胞壁におけるα−１，３−グルカンの検出
イネ品種Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅの第４葉の葉鞘細胞に、イネごま葉枯病菌胞子懸濁液（滅菌水１ｍｌあたり１ｘ１０６分生子数）５０μｌをシリンジで注入し、室温で静置し、２４時間以降に侵入菌糸の形成が見られた。接種後４８時間の葉鞘をα−１，３−グルカン検出の試料とした。前記実施例１の方法に従ってイネごま葉枯病菌細胞壁のα−１，３−グルカンの検出を行った。
結果を図２７Ａに示す。ＢＦは、明視野（Ｂｒｉｇｈｔ  Ｆｉｅｌｄ）における接種画像であり、α−Ｇは、α−１，３−グルカンを緑色蛍光色素を用いて抗体検出した画像である。イネごま葉枯病菌の侵入菌糸（ＢＦ図矢印）でα−１，３−グルカン（α−Ｇ）が検出された。
（２）イネに感染したイネ紋枯病菌の細胞壁におけるα−１，３−グルカンの検出
イネ品種Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅの第４葉の葉鞘細胞に、イネ紋枯病菌の菌糸懸濁液５０μｌをシリンジで注入し、室温で静置した。接種後４８時間の葉鞘をα−１，３−グルカン検出の試料とした。前記実施例１の方法に従ってイネ紋枯病菌細胞壁のα−１，３−グルカンの検出を行った。
結果を図２７Ｂ、Ｃに示す。図２７Ｂは、イネ紋枯病菌ＭＡＦＦ３０５２１９株を、図２７Ｃは、イネ紋枯病菌ＭＡＦＦ３０５２３１株を接種した画像である。左パネルは明視野を、右パネルはα−Ｇをそれぞれ示す。イネ紋枯病菌の菌糸でも、α−１，３−グルカンが検出された。
＜実施例１５．様々な植物感染性微生物の細胞壁におけるα−１，３−グルカンの検出＞
上記発明の詳細な説明において列挙した植物感染性微生物の細胞壁にα−１，３−グルカンが構成成分として存在することを確認した。
それぞれ植物感染性微生物を植物ワックスを含まないＰＤＡ培地（２４ｇ／Ｌ  ＤＩＦＣＯ  ｐｏｔａｔｏ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ｂｒｏｔｈ，１．５（ｗ／ｖ）％寒天）でシャーレ全面に広がる程度生育させた。胞子を形成するものは胞子を集め、胞子を形成しないものは菌糸を集め、滅菌水で懸濁液を作成した。ただし、タバコうどんこ病菌は絶対寄生菌であるため、タバコ葉上で形成された分生子および子嚢胞子を水に懸濁したものを用いた。また、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ａｃｕｔａｔｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍについては、発芽もしくは感染器官分化の促進のためｐｏｔａｔｏ−ｃａｒｒｏｔ  ｂｒｏｔｈ（ジャガイモ（２０ｇ／ｌ）・ニンジン（２０ｇ／ｌ）煮沸浸出液）１（ｖ／ｖ）％を胞子懸濁液に添加した。その後、懸濁液３０μｌをカバーグラスに滴下し、室温で一晩インキュベートした後、３％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド（ＰＢＳバッファーに溶解）５０μｌを重層し、６５℃で３０分インキュベートした。これをＰＢＳバッファーで十分にリンスした後、前記実施例１の方法に従ってα−１，３−グルカンの検出を行った。
結果を図２８Ａ〜ＡＫに示す。いずれの図も左パネル（ＢＦ）は、明視野における写真であり、右パネル（α−Ｇ）は、α−１，３−グルカンを緑色蛍光色素で抗体検出した写真である。
検出に用いた植物感染性微生物名を以下に示す。Ａはトウモロコシごま葉枯病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ＝Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｍａｙｄｉｓ）ＭＡＦＦ３０５０６０株、Ｂは黄麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＲＩＢ４０株、Ｃは野菜類萎凋病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＭＡＦＦ２３６４２９株、Ｄは灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）ＭＡＦＦ３０５９２９株、Ｅは灰色かび病菌ＭＡＦＦ３０６６５８株、Ｆはムギ類麦角病菌（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）ＭＡＦＦ２３７６５６株、Ｇはリンゴ胴枯病菌（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｔａｎａｋａｅ）ＭＡＦＦ６２５０３７株、Ｈはトマト葉かび病菌（Ｐａｓｓａｌｏｒａ  ｆｕｌｖａ＝Ｆｌｕｖｉａ  ｆｌｕｖａ，Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｌｕｖｕｍ）ＭＡＦＦ７２６６２１株、Ｉはさび病菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｒｅｃｏｎｄｉｔａ）ＭＡＦＦ１０２０１２株、Ｊは白絹病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ）ＭＡＦＦ３２８２３０株、Ｋは白絹病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ）ＭＡＦＦ３２８２４２株、Ｌは菌核病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｉｏｒｕｍ）ＭＡＦＦ７２６００１株、Ｍは菌核病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）ＭＡＦＦ３０５９５５株、Ｎはモモ縮葉病菌（Ｔａｐｈｒｉｎａ  ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）ＭＡＦＦ３０５６１４株、Ｏはトマト萎凋病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）ＭＡＦＦ１０３０３６株、Ｐはトマト萎凋病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）ＭＡＦＦ１０３０３８株、Ｑはタバコ葉より単離されたタバコうどんこ病菌（Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ＝Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ）子嚢及び子嚢胞子、Ｒはリンゴ斑点落葉病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ）ＭＡＦＦ２３５９９８株、Ｓはトマト炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｏｃｃｏｄｅｓ）ＭＡＦＦ２３７４５９株、Ｔはｐｏｔａｔｏ−ｃａｒｒｏｔ  ｂｒｏｔｈ（ジャガイモ（２０ｇ／ｌ）・ニンジン（２０ｇ／ｌ）煮沸浸出液）１（ｖ／ｖ）％を胞子懸濁液に添加させた時のイチゴ炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ａｃｕｔａｔｕｍ）、Ｕはリンゴ胴枯病菌（Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｂｅｒｅｎｇｅｒｉａｎａ）ＭＡＦＦ６４５００１株、Ｖはコムギ赤カビ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ＝Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）ＭＡＦＦ２３９９４２株、Ｗはジャガイモ疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）ＭＡＦＦ２３５８８４株、Ｘはイネ馬鹿苗病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ＝Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）ＭＡＦＦ２３５９４９株Ｙはピシウム性イネ苗立枯病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）ＭＡＦＦ２３８４３２株、Ｚはピシウム性イネ苗立枯病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）ＭＡＦＦ２３８４３３株、ＡＡはｐｏｔａｔｏ−ｃａｒｒｏｔ  ｂｒｏｔｈ（ジャガイモ（２０ｇ／ｌ）・ニンジン（２０ｇ／ｌ）煮沸浸��液）１（ｖ／ｖ）％を胞子懸濁液に添加させた時のクロカビ病菌（黒麹菌）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＭＡＦＦ２３８８８３株、ＡＢはｐｏｔａｔｏ−ｃａｒｒｏｔ  ｂｒｏｔｈ（ジャガイモ（２０ｇ／ｌ）・ニンジン（２０ｇ／ｌ）煮沸浸出液）１（ｖ／ｖ）％を胞子懸濁液に添加させた時のトリコデルマ菌（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）ＭＡＦＦ２４０２６１株、ＡＣはリンゴ腐らん病菌（Ｖａｌｓａ  ｃｅｒａｔｏｓｐｅｒｍａ）ＭＡＦＦ６４５００８株、ＡＤは紫紋羽病菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｍｏｍｐａ）ＭＡＦＦ３２８０２４株、ＡＥは白紋羽病菌（Ｒｏｓｅｌｌｉｎｉａ  ｎｅｃａｔｒｉｘ）ＭＡＦＦ３２８１５０株、ＡＦはバーティシリウム病菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ）ＭＡＦＦ２３５６１２株、ＡＧはトウモロコシ黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）ＭＡＦＦ５１１４５４株、ＡＨはチャ輪斑病菌（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｌｏｎｇｉｓｅｔａ）ＭＡＦＦ２３７３３２株、ＡＩはリンゴ黒星病菌（Ｖｅｎｔｕｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）ＭＡＦＦ２３７３０５株、ＡＪはバラ黒星病菌（Ｍａｒｓｓｏｎｉｎａ  ｒｏｓａｅ＝Ｄｉｐｌｏｃａｒｐｏｎ  ｒｏｓａｅ）ＭＡＦＦ４１０２１５株、ＡＫはナラタケ菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｍｅｌｌｅａ）ＭＡＦＦ４２５２８５株を検証した画像である。いずれの細胞壁でもα−１，３−グルカンが検出された。
以上の結果から、多くの植物感染性微生物でα−１，３−グルカンが細胞壁の恒常的な構成成分として存在していることが明らかとなった。したがって、ａｇｌ遺伝子を導入したトランスジェニック植物又は本発明の微生物農薬製剤は、α−１，３−グルカンを細胞壁に有するこれらの多くの植物感染性微生物の細胞壁を分解することにより、当該微生物の感染を防止又は抑制することができると、考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明の植物感染性微生物の感染防止又は抑制方法によれば、細胞壁にα−１，３−グルカンを含む植物感染性微生物の宿主植物への感染を防止又は抑制することができる。
本発明の微生物農薬製剤によれば、宿主・品種間の特異性を問わず、細胞壁にα−１，３−グルカンを含む植物感染性微生物の感染防止又は抑制に有効な製剤を提供することができる。
また、本発明の植物感染性微生物の感染防止又は抑制方法及び微生物農薬製剤は、微生物の感染に必須な細胞壁成分をターゲットとするため、耐性微生物が出現しにくい利点を有する。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
0005552649.tif 000029
0005552649.tif 000030
0005552649.tif 000031
0005552649.tif 000032
0005552649.tif 000033
0005552649.tif 000034
0005552649.tif 000035
0005552649.tif 000036
0005552649.tif 000037
0005552649.tif 000038
0005552649.tif 000039
0005552649.tif 000040
0005552649.tif 000041
0005552649.tif 000042
0005552649.tif 000043
0005552649.tif 000044
0005552649.tif 000045
0005552649.tif 000046
0005552649.tif 000047
0005552649.tif 000048
0005552649.tif 000049
0005552649.tif 000050
0005552649.tif 000051
0005552649.tif 000052
0005552649.tif 000053
0005552649.tif 000054
0005552649.tif 000055
0005552649.tif 000056
0005552649.tif 000057
0005552649.tif 000058
0005552649.tif 000059
0005552649.tif 000060
0005552649.tif 000061
0005552649.tif 000062
【図３Ａ】
0005552649.tif 000063
【図３Ｂ】
0005552649.tif 000064
【図１２】
0005552649.tif 000065
【図１３】
0005552649.tif 000066
【図１４】
0005552649.tif 000067
【図１５】
0005552649.tif 000068
【図１】
0005552649.tif 000069
【図２】
0005552649.tif 000070
【図４】
0005552649.tif 000071
【図５】
0005552649.tif 000072
【図６】
0005552649.tif 000073
【図７】
0005552649.tif 000074
【図８】
0005552649.tif 000075
【図９】
0005552649.tif 000076
【図１０】
0005552649.tif 000077
【図１１】
0005552649.tif 000078
【図１６Ａ】
0005552649.tif 000079
【図１６Ｂ】
0005552649.tif 000080
【図１６Ｃ】
0005552649.tif 000081
【図１７】
0005552649.tif 000082
【図１８】
0005552649.tif 000083
【図１９】
0005552649.tif 000084
【図２０】
0005552649.tif 000085
【図２１】
0005552649.tif 000086
【図２２】
0005552649.tif 000087
【図２３Ａ】
0005552649.tif 000088
【図２３Ｂ】
0005552649.tif 000089
【図２４Ａ】
0005552649.tif 000090
【図２４Ｂ】
0005552649.tif 000091
【図２５】
0005552649.tif 000092
【図２６】
0005552649.tif 000093
【図２７】
0005552649.tif 000094
【図２８Ａ−Ｃ】
0005552649.tif 000095
【図２８Ｄ−Ｆ】
0005552649.tif 000096
【図２８Ｇ−Ｉ】
0005552649.tif 000097
【図２８Ｊ−Ｌ】
0005552649.tif 000098
【図２８Ｍ−Ｎ】
0005552649.tif 000099
【図２８Ｏ−Ｑ】
0005552649.tif 000100
【図２８Ｒ−Ｔ】
0005552649.tif 000101
【図２８Ｕ−Ｘ】
0005552649.tif 000102
【図２８Ｙ−ＡＡ】
0005552649.tif 000103
【図２８ＡＢ−ＡＤ】
0005552649.tif 000104
【図２８ＡＥ−ＡＧ】
0005552649.tif 000105
【図２８ＡＨ−ＡＪ】
0005552649.tif 000106
【図２８ＡＫ】
0005552649.tif 000107