(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファチジルイノシトールを合成する能力を有する改変型ホスホリパーゼＤであって、
配列番号２に示されるアミノ酸配列の１８７位、１９１位、および３８５位のアミノ酸残基が、以下の（１）から（２９）：
（１）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がアルギニン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である；
（２）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がトレオニン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がシステイン残基である；
（３）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がイソロイシン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がトリプトファン残基である；
（４）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がグリシン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である；
（５）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がバリン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がロイシン残基である；
（６）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がバリン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である；
（７）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がトリプトファン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がメチオニン残基である；
（８）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がトリプトファン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がアルギニン残基である；
（９）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がセリン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がグルタミン酸残基である；
（１０）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がセリン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がアルギニン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がメチオニン残基である；
（１１）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がセリン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がメチオニン残基である；
（１２）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である；
（１３）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がロイシン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がアルギニン残基である；
（１４）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がロイシン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である；
（１５）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がバリン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である；
（１６）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がバリン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がグルタミン酸残基である；
（１７）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がグリシン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がロイシン残基である；
（１８）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がバリン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がトリプトファン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がトリプトファン残基である；
（１９）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がアルギニン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がセリン残基である；
（２０）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がアルギニン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である；
（２１）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がアルギニン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基である；
（２２）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がヒスチジン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がメチオニン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がバリン残基である；
（２３）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がアルギニン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がアルギニン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である；
（２４）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がアスパラギン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がアラニン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である；
（２５）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がロイシン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がアラニン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である；
（２６）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がロイシン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がアラニン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基である；
（２７）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がロイシン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がロイシン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である；
（２８）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がトリプトファン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がプロリン残基である；および
（２９）該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がバリン残基であり、該配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ該配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がトリプトファン残基である、
からなる群から選択されるアミノ酸残基である以外は、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対し、該１８７位、１９１位、および３８５位に位置するアミノ酸残基とは異なる位置の少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を有しかつ少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつホスファチジルイノシトールを合成する能力を有するポリペプチド、
である、改変型ホスホリパーゼＤ。
【請求項２】
請求項１に記載の改変型ホスホリパーゼＤをコードする遺伝子。
【請求項３】
ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトールリン酸またはホスファチジルイノシトールグリカンを製造する方法であって、原料リン脂質と、イノシトール、イノシトールリン酸またはイノシトールグリカンと、請求項１に記載の改変型ホスホリパーゼＤとを反応させる工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスファチジルイノシトールを合成する能力を有する新規なホスホリパーゼＤに関する。
【背景技術】
【０００２】
リン脂質は、乳化剤、化粧品の成分、医薬処方物として、およびリポソーム調製のために用いられ得る。天然物由来のリン脂質は、通常、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、スフィンゴミエリンなどの混合物からなる。天然のリン脂質から特定のリン脂質を分画するために、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサン、クロロホルムなどの溶剤による抽出や再結晶などの溶剤分別法、シリカゲル、アルミナ、イオン交換樹脂などの吸着剤を用いたカラムクロマトグラフィー分画法、ＣｄＣｌ２複合体やアセチル化物などの誘導体の利用による分画法が行われている。
【０００３】
天然物（ダイズレシチンなど）からのＰＩの分離および精製は、例えば、特開平５−９７８７３号公報および特開平５−９７８７２号公報に記載されている。特開平５−９７８７３号公報には、ＰＩを含有する脂質を非極性溶媒に溶かし、これを塩基性物質を含有する含水極性溶媒と接触させた後、非極性溶媒層を、塩基性物質を含まない新たな含水極性溶媒と液液分配させ、ＰＩを含水極性溶媒層に抽出する方法が記載されている。特開平５−９７８７２号公報には、ＰＩを含有する混合リン脂質を、水または酢酸水溶液を含む、低級アルコールと非極性溶媒との混合溶媒に溶解させて、高速液体クロマトグラフィーに供する方法が記載されている。このような方法では多量の溶媒が必要であることなどの理由により、得られるＰＩの高純度化は難しく、高純度品はきわめて高価である。
【０００４】
また、有機化学的にＰＩを合成する方法もあるが、保護および脱保護を含む多数の工程からなる複雑な合成経路であるため、効率はあまりよくない。
【０００５】
リン脂質を酵素的に製造する試みもまた従来から行われている。ホスホリパーゼＤ［ＥＣ  ３．１．４．４］（以下、「ＰＬＤ」ともいう）は、グリセロリン脂質のリンジエステル結合を加水分解して、ＰＡおよびアルコール部分の生成を触媒する酵素である。この加水分解活性に加えて、ＰＬＤはまた、リン脂質の極性基の相互変換も触媒する。このプロセスは、「ホスファチジル基転移反応」と呼ばれる。ホスファチジル基転移反応を利用すると、天然には量の少ないリン脂質を天然に豊富なリン脂質から合成することができる。
【０００６】
ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ＰＥ、またはＰＳのようないくつかの天然リン脂質は、ＰＬＤ触媒ホスファチジル基転移反応を用いてレシチンまたはＰＣから合成されている（例えば、特開平６−２６９２８７号公報、特開平５−２９２９８１号公報、特開２００２−５１７９４号公報、および特開２００５−２６１３６２号公報）。特開平６−２６９２８７号公報には、ストレプトマイセス属の微生物を起源とするＰＬＤを用いて、特定の反応条件で塩基交換反応を行って目的のリン脂質を得る方法が記載され、ＰＧ、ＰＥ、ＰＳ、およびホスファチジルプロパノールの生成に成功している。特開平５−２９２９８１号公報では、微生物由来のＰＬＤでの塩基変換反応により目的のリン脂質を得るに当たり、キレート剤を用いる方法が記載され、ＰＧ、ＰＥ、およびＰＳの生成に成功している。ＰＩも生成されているが、塩基変換率は低いようである。特開２００２−５１７９４号公報では、原料となるリン脂質、水酸基を有する受容体、ＰＬＤ、および水を、有機溶媒を用いることなく十分に混合して均質化して、１５〜６５℃にて酵素反応を行う方法が記載され、ＰＳおよびＰＧの生成が成功している。特開２００５−２６１３６２号公報には、ホスファチジル基転移反応を利用したホスファチジルセリンの生成方法が記載されている。
【０００７】
特開平３−８７１９１号公報には、ＰＬＤを用いてＰＩを製造する方法が記載されている。この方法では、ＰＬＤを原料の混合リン脂質に作用させた場合に、ＰＬＤがリン脂質中のＰＩには作用せず、他のリン脂質成分を選択的に加水分解することを利用して、未反応のＰＩを採取する。この方法は、ＰＬＤを添加した後、さらにアルカリまたは酸性ホスファターゼを添加することを必要とする。
【０００８】
ＰＬＤは、これまで、その性質および構造について研究されている（例えば、R. Ulbrich-Hofmannら、Biotechnology Letters, 2005年, 27巻, pp.535-544）。また、ＰＬＤは、その有用性を高めるために種々の改変が行われている（例えば、特開２００４−９７０１１号公報および特開２００５−８０５１９号公報、ならびに西川ら、日本農芸化学会2004年度大会講演要旨，２６８頁）。特開２００４−９７０１１号公報および特開２００５−８０５１９号公報には、有機溶媒や熱に対する安定性が高められた改変型ＰＬＤが記載されている。さらに、西川ら、日本農芸化学会2004年度大会講演要旨，２６８頁には、ナフチル基を有するリン脂質であるホスファチジル−１−ナフトール（Ｐ１ＮＡＰ）に対する分解活性を有する変異ＰＬＤの取得について記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、リン脂質からホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を効率的に製造できる方法を提供することを目的とする。本発明はまた、ＰＩを合成する能力を有する改変型ＰＬＤを提供することも目的とする。さらに、本発明は、グリコール基を有するアシルグリセロリン脂質を合成する能力を有するＰＬＤをスクリーニングする方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ホスファチジルイノシトールを合成する能力を有する改変型ホスホリパーゼＤ（以下、「ＰＩ合成改変型ＰＬＤ」ともいう）を提供する。該ＰＩ合成改変型ＰＬＤは、ホスファチジルイノシトールを合成する能力を有する改変型ホスホリパーゼＤであって、
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１８７位、１９１位、および３８５位のアミノ酸残基の少なくとも１つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列；または
（Ｂ）該（Ａ）のアミノ酸配列において、該１８７位、１９１位、および３８５位に位置するアミノ酸残基とは異なる位置の少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を有し、かつホスファチジルイノシトールを合成する能力を有するポリペプチドのアミノ酸配列、
を含む。
【００１１】
１つの実施形態では、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基は、フェニルアラニン残基、セリン残基、チロシン残基、バリン残基、グリシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン残基、およびロイシン残基からなる群より選択される１つのアミノ酸残基と置換され、かつ／または
上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基は、アルギニン残基、トレオニン残基、イソロイシン残基、グリシン残基、バリン残基、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、アスパラギン酸残基、メチオニン残基、トリプトファン残基、およびアラニン残基からなる群より選択される１つのアミノ酸残基と置換され、かつ／または
上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基は、システイン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基、メチオニン残基、アルギニン残基、グルタミン酸残基、セリン残基、フェニルアラニン残基、バリン残基、およびプロリン残基からなる群より選択される１つのアミノ酸残基と置換されている。
【００１２】
さらなる実施形態では、上記改変型ホスホリパーゼＤは、以下からなる群より選択される：
（１）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がアルギニン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（２）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がトレオニン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がシステイン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（３）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がイソロイシン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がトリプトファン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（４）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がグリシン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（５）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がバリン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がロイシン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（６）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がバリン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（７）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がトリプトファン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がメチオニン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（８）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がトリプトファン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がアルギニン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（９）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がセリン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がグルタミン酸残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（１０）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がセリン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がアルギニン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がメチオニン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（１１）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がセリン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がメチオニン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（１２）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（１３）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がロイシン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がアルギニン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（１４）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がロイシン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（１５）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がバリン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（１６）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がバリン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がグルタミン酸残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（１７）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がグリシン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がロイシン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（１８）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がバリン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がトリプトファン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がトリプトファン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（１９）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がアルギニン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がセリン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（２０）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がアルギニン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（２１）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がアルギニン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（２２）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がヒスチジン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がメチオニン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がバリン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（２３）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がアルギニン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がアルギニン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（２４）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がアスパラギン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がアラニン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（２５）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がロイシン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がアラニン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（２６）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がロイシン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がアラニン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（２７）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がロイシン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がロイシン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；
（２８）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がトリプトファン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がプロリン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ；および
（２９）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がバリン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がトリプトファン残基である、改変型ホスホリパーゼＤ。
【００１３】
本発明はまた、上記ＰＩ合成改変型ＰＬＤをコードする遺伝子を提供する。
【００１４】
本発明はまた、ホスファチジルイノシトールまたはその誘導体を製造する方法を提供する。該方法は、原料リン脂質と、イノシトールまたはその誘導体と、上記ＰＩ合成改変型ＰＬＤとを反応させる工程を含む。
【００１５】
さらに、本発明は、グリコール基を有するアシルグリセロリン脂質を合成する能力を有するＰＬＤをスクリーニングする方法を提供する。該方法は、
原料リン脂質と、グリコール基を有する化合物と、ＰＬＤとを用いてホスファチジル基転移反応を生じさせ、該グリコール基を有するアシルグリセロリン脂質を生成させる工程；
生成した該グリコール基を有するアシルグリセロリン脂質を酸化してアルデヒドを生成させる工程；および
生成した該アルデヒドを検出する工程を含む。ここで該アルデヒドの生成は、該ＰＬＤが該目的とするアシルグリセロリン脂質を合成する能力を有することの指標である。
【００１６】
１つの実施形態では、上記グリコール基を有する化合物は、イノシトールまたはその誘導体である。
【００１７】
別の実施形態では、上記酸化工程において、過ヨウ素酸またはその塩、四酢酸鉛、およびビスマス酸ナトリウムからなる群から選択される酸化剤が用いられる。
【００１８】
さらに別の実施形態では、上記アルデヒドの検出は、該アルデヒドとヒドラジン化合物とを反応させて生成されるヒドラゾン化合物の検出により行われる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、アシルグリセロリン脂質のホスファチジル基転移反応において、イノシトールのような嵩高い化合物をリン脂質に導入する能力を有するＰＬＤが得られる。このＰＬＤを用いることにより、リン脂質からＰＩを簡便かつ効率的に製造できる。さらに、本発明によれば、グリコール基を有するアシルグリセロリン脂質を合成する能力を有する新規なＰＬＤを迅速にスクリーニングできる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
イノシトール環のような嵩高い極性部分を有するアシルグリセロリン脂質を合成する能力を有するＰＬＤは、未改変型ＰＬＤの酵素触媒部位の特定の位置のアミノ酸残基が置換されて、その立体障害が緩和されていると思われる構造を有するＰＬＤであり得ることが見出された。
【００２１】
本明細書において、「未改変型ＰＬＤ」は、グリコール基を有するアシルグリセロリン脂質（例えば、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ））の合成能を有しないＰＬＤをいう。「未改変型ＰＬＤ」には、生物において天然に生じる天然型ＰＬＤおよび該天然型ＰＬＤをコードする核酸を本来の起源とは異なる生物に導入して発現させることにより得られた組換えＰＬＤが含まれる。また、合成能を獲得するＰＬＤを得ることを目的とした置換を除く変異を有するＰＬＤ（変異型ＰＬＤ）もまた、この用語の範囲内に含まれる。また、人工的に作製されたキメラ型ＰＬＤも含まれる。
【００２２】
本明細書では、グリコール基を有するアシルグリセロリン脂質（例えば、ＰＩ）の合成能を有するＰＬＤは、上記未改変型ＰＬＤにおいて特定の位置のアミノ酸残基が変化しているアミノ酸配列を有するため、便宜上、「改変型ＰＬＤ」ともいう。「改変型ＰＬＤ」は、例えば、未改変型ＰＬＤから、上記合成能を獲得するＰＬＤを得るためのアミノ酸置換がなされているアミノ酸配列を有するＰＬＤである。このアミノ酸置換は、天然に生じた置換および人為的に作製した置換の両方であり得る。
【００２３】
（ホスファチジルイノシトールを合成する能力を有する改変型ＰＬＤ）
本発明は、ホスファチジルイノシトールを合成する能力を有する改変型ホスホリパーゼＤ（ＰＩ合成改変型ＰＬＤ）を提供する。上記ＰＩ合成改変型ＰＬＤは、未改変型ＰＬＤの酵素触媒部位の特定の位置のアミノ酸残基が置換されて、その立体障害が緩和されていると思われる構造を有する。なお、現在までにＰＩ合成能力を有するＰＬＤは知られていない。
【００２４】
本発明のＰＩ合成改変型ＰＬＤは、（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１８７位、１９１位、および３８５位のアミノ酸残基の少なくとも１つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列；または（Ｂ）該（Ａ）のアミノ酸配列において、該１８７位、１９１位、および３８５位に位置するアミノ酸残基とは異なる位置の少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を有し、かつホスファチジルイノシトールを合成する能力を有するポリペプチドのアミノ酸配列、を含む。
【００２５】
本発明において、置換、欠失、挿入、および／または付加され得るアミノ酸残基の数は、所望の酵素活性を有する酵素となる限り、任意の数である。例えば、下記で説明する配列同一性を有する配列となるような任意の数であり得る。通常２５０以下、例えば１５０以下、１００以下、あるいは５０以下、好ましくは３０以下、より好ましくは２０以下、さらに好ましくは１６以下、さらにより好ましくは５以下、さらにより好ましくは０〜３アミノ酸残基である。当業者であれば、例えば、部位特異的変異導入法などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより、タンパク質の構造を改変することができる。また、アミノ酸の変異は自然界において生じることもあるので、人工的にアミノ酸を変異した酵素のみならず、自然界においてアミノ酸が変異した酵素も、所望の酵素活性を有する限り、意図されるＰＬＤに含まれる。所望の酵素活性の有無を決定する方法および手段は、当業者に周知であり、例えば、以下に説明する方法に基づいて実施され得る。
【００２６】
１つの実施形態では、本発明のＰＩ合成改変型ＰＬＤは、
配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基が、フェニルアラニン残基、セリン残基、チロシン残基、バリン残基、グリシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン残基、およびロイシン残基からなる群より選択される１つのアミノ酸残基と置換され、かつ／または
配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基が、アルギニン残基、トレオニン残基、イソロイシン残基、グリシン残基、バリン残基、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、アスパラギン酸残基、メチオニン残基、トリプトファン残基、およびアラニン残基からなる群より選択される１つのアミノ酸残基と置換され、かつ／または
配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基が、システイン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基、メチオニン残基、アルギニン残基、グルタミン酸残基、セリン残基、フェニルアラニン残基、バリン残基、およびプロリン残基からなる群より選択される１つのアミノ酸残基と置換されている。
【００２７】
本発明のＰＩ合成改変型ＰＬＤとしては、より具体的には、以下の改変型ＰＬＤが挙げられる：
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がアルギニン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ＰＬＤ；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がトレオニン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がシステイン残基である、改変型ＰＬＤ；
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がイソロイシン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がトリプトファン残基である、改変型ＰＬＤ；
（４）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がグリシン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ＰＬＤ；
（５）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がバリン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がロイシン残基である、改変型ＰＬＤ；
（６）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がバリン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ＰＬＤ；
（７）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がトリプトファン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がメチオニン残基である、改変型ＰＬＤ；
（８）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がトリプトファン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がアルギニン残基である、改変型ＰＬＤ；
（９）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がセリン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がグルタミン酸残基である、改変型ＰＬＤ；
（１０）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がセリン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がアルギニン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がメチオニン残基である、改変型ＰＬＤ；
（１１）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がセリン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がメチオニン残基である、改変型ＰＬＤ；
（１２）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ＰＬＤ；
（１３）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がロイシン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がアルギニン残基である、改変型ＰＬＤ；
（１４）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がロイシン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ＰＬＤ；
（１５）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がバリン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ＰＬＤ；
（１６）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がバリン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がグルタミン酸残基である、改変型ＰＬＤ；
（１７）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がグリシン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がロイシン残基である、改変型ＰＬＤ；
（１８）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がバリン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がトリプトファン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がトリプトファン残基である、改変型ＰＬＤ；
（１９）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がアルギニン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がセリン残基である、改変型ＰＬＤ；
（２０）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がアルギニン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ＰＬＤ；
（２１）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がアルギニン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基である、改変型ＰＬＤ；
（２２）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がヒスチジン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がメチオニン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がバリン残基である、改変型ＰＬＤ；
（２３）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がアルギニン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がアルギニン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ＰＬＤ；
（２４）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がアスパラギン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がアラニン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ＰＬＤ；
（２５）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がロイシン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がアラニン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ＰＬＤ；
（２６）配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がロイシン残基であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がアラニン残基であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基である、改変型ＰＬＤ；
（２７）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がロイシン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がロイシン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がチロシン残基である、改変型ＰＬＤ；
（２８）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がトリプトファン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がプロリン残基である、改変型ＰＬＤ；および
（２９）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のアミノ酸残基がバリン残基であり、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における１９１位のアミノ酸残基がチロシン残基であり、かつ上記配列番号２に示されるアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸残基がトリプトファン残基である、改変型ＰＬＤ。
【００２８】
本発明のＰＩ合成改変型ＰＬＤは、例えば、当業者が通常用いる部位特異的変異導入方法を用いて、未改変型ＰＬＤから製造することができる。より詳細には、未改変型ＰＬＤのアミノ酸配列を含有するＰＬＤをコードする核酸において、上述の置換を生じさせるための変異導入を行ない、核酸構築物を得る工程；得られた核酸構築物を宿主に導入し、形質転換体を得る工程；および得られた形質転換体を培養して、核酸構築物の発現産物として上記ＰＩ合成改変型ＰＬＤを得る工程を含む手順により製造され得る。
【００２９】
未改変型ＰＬＤとして、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列を含有するＰＬＤが挙げられる。このアミノ酸配列は、ストレプトマイセス・アンチビオティカス（Streptomyces antibioticus）株由来ＰＬＤのアミノ酸配列である。また、本発明においては、ＰＬＤ活性を呈するものである限り、配列番号２に示されるアミノ酸配列と異なる配列を有し得る。上記異なる配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１８７位のトリプトファン残基、１９１位のチロシン残基、および３８５位のチロシン残基以外のアミノ酸残基が異なる配列であり得る。例えば、上記未改変型ＰＬＤは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、かつＰＬＤ活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列を含有するポリペプチドであり得る。上記未改変型ＰＬＤは、配列番号２に示されるアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を有し（但し、合成能を獲得するＰＬＤを得ることを目的とした置換を除く）、かつＰＬＤ活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列を含有するポリペプチドでもあり得る。
【００３０】
本明細書では、アミノ酸配列における「配列同一性」は、ＢＬＡＳＴのｂｌａｓｔｐプログラム、ＧＥＮＥＴＹＸなどのプログラムを使用して算出される。その際の条件、例えば、期待値、Ｗｏｒｄｓｉｚｅ、Ｇａｐなどの設定は、当該技術分野で一般的な手法で行われ得る。本発明においては、上記配列同一性は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７９％、さらに好ましくは少なくとも９０％、よりさらに好ましくは少なくとも９５％である。
【００３１】
ＰＬＤの活性は、加水分解活性および／またはホスファチジル基転移活性により評価され得る。上記加水分解活性は、例えば、９５％卵黄製ホスファチジルコリンを基質とし、基質濃度０．１６％の０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む）を３７℃にて反応させた時に、１分間あたりのコリンの生成量を算出することにより評価され得る。ここで、ＰＬＤの加水分解活性の１単位は、１分間に１μｍｏｌのコリンを遊離する酵素量である。上記転移活性は、例えば、９５％卵黄製ホスファチジルコリンおよびエタノールを基質とし、基質濃度０．１６％の０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む）を３７℃にて反応させた時に、１分間あたりのコリンの生成量を算出することにより評価され得る。ここで、ＰＬＤの転移活性の１単位は、１分間に１μｍｏｌのコリンを遊離する酵素量である。また、上記転移活性は、ホスファチジルパラニトロフェノールおよびエタノールを用いて転移反応を行い、遊離するパラニトロフェノールを測定することによっても評価できる（例えば、Hagishiutaら、Anal. Biochem.，1999年，276巻(2)号，pp.161-165）。
【００３２】
上記未改変型ＰＬＤとしては、放線菌、特に、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、ストレプトベルチシリウム（Streptoverticillium）属、ミクロモノスポーラ（Micromonospora）属、ノカルディア（Nocardia）属、ノカルディオプシス（Nocardiopsis）属、アクチノマデューラ（Actinomadura）属などに属する微生物に由来するＰＬＤが好ましく用いられる。より具体的には、ストレプトマイセス・アンチビオティカス（Streptomyces antibioticus）、ストレプトマイセス・アシドマイセティカス（Streptomyces acidomyceticus）、ストレプトマイセス・ＡＡ５８６種（Streptomyces sp. AA586）、ストレプトマイセス・ＰＭＦ種（Streptomyces sp. PMF）、ストレプトベルチシリウム・シンナモネウム（Streptoverticillium cinnamoneum）、ストレプトマイセス・シンナモネウム（Streptomyces cinnamoneum IFO 12852）、ミクロモノスポラ・チヤルセア（Micromonospora chalcea ATCC 12452）、ノカルディア・メディテラーネイ（Nocardia mediterranei IFO 13142）、ノカルディオプシス・ダソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei IFO 13908）、アクチノマデューラ・リバノチカ（Actinomadura libanotica IFO 14095）などに由来するＰＬＤが挙げられる。
【００３３】
変異導入は、例えば、当業者が通常用いる部位特異的変異導入方法、具体的には、ギャップド・デュプレックス（ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ）法、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）法、ＰＣＲによる変異導入法などにより行われ得る。なお、アミノ酸残基の置換に用いられる核酸は、ＰＩ合成改変型ＰＬＤを発現させるための宿主のコドン使用頻度に合わせ、設計され得る。
【００３４】
上記核酸構築物の作製には、使用する宿主に応じて、慣用のベクターを用い得る。ベクターとしては、例えば、宿主が、大腸菌の場合、ｐＵＣ１８およびその誘導体、ｐＢＲ３２２及びその誘導体、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩおよびその誘導体、ｐＧＥＭおよびその誘導体などのプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１等のファージベクターが挙げられ、宿主が、酵母の場合、ｐＹＡＣ誘導体などが挙げられる。核酸構築物は、誘導可能なプロモーター、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を含有してもよい。また、核酸構築物は、発現対象のポリペプチドの単離精製が容易になるように、発現対象のポリペプチドが、ＨｉｓタグポリペプチドまたはＧＳＴ融合ポリペプチドとして発現され得る配列を含有してもよい。
【００３５】
アミノ酸の置換の位置および置換されるべきアミノ酸残基の種類は、上述の通りである。
【００３６】
宿主への核酸構築物の導入は、当業者が通常用いる形質転換法、例えば、特に限定されないが、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などが用いられ得る。
【００３７】
上記宿主としては、特に限定されないが、例えば、大腸菌、酵母、枯草菌、緑濃菌、サルモネラ菌、Ｌ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ｓｆ９細胞などが挙げられる。大腸菌としては、具体的には、ＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株などが挙げられる。なかでも、発現制御の観点から、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株が好適である。
【００３８】
形質転換体の培養条件は、使用する宿主、ベクターなどに応じて、適宜設定できる。培養に用いられる培地としては、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地、ＳＯＣ培地、Ｌ培地などが挙げられる。上記培養条件としては、具体的には、宿主として大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用い、ベクターとしてｐＥＴＫｍＳ１を用いる場合、下述の実施例２に記載の培地を用いて、形質転換体を３０℃で８時間培養し、その後、イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）（１ｍＭ）を培地に添加し、３０℃で１６時間培養する条件が挙げられる。
【００３９】
核酸構築物の発現産物として得られるＰＩ合成改変型ＰＬＤは、形質転換体の培養物から、一般的な精製方法によって単離精製され得る。精製方法としては、塩析、超遠心分離、イオン交換カラムクロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００４０】
上記の精製方法を、適宜組み合わせて、ＰＩ合成改変型ＰＬＤを精製し、各精製段階において、上記加水分解活性および／または転移活性の評価法によりＰＬＤ活性を測定し、かつ慣用のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法および未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により精製物の精製度を評価することにより、発現産物を得ることができる。得られた発現産物は、転移活性評価法（例えば、上記のホスファチジル基転移活性評価法）において基質としてイノシトールを用いてＰＬＤ活性を測定することにより、所望のＰＩ合成能を有するＰＬＤであると確認することができる。
【００４１】
当業者は、本願明細書に記載の情報に基づいて、ＰＩ合成改変型ＰＬＤをコードする遺伝子を得ることができる。ＰＩ合成改変型ＰＬＤをコードする遺伝子もまた、本発明に含まれる。本発明の遺伝子は、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの天然のポリヌクレオチドに加え、人工的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であり得る。また本発明の遺伝子は、ＤＮＡ−ＲＮＡのキメラ分子であり得る。この遺伝子を用いて、例えば、上記で説明されるような組換え技術を用いて、ＰＩ合成改変型ＰＬＤを製造することができる。
【００４２】
本発明のＰＩ合成改変型ＰＬＤは、アシルグリセロリン脂質のホスファチジル基転移反応において、未改変型ＰＬＤでは導入が困難であった嵩高い化合物であるイノシトールをリン脂質に導入できる。したがって、本発明のＰＩ合成改変型ＰＬＤを用いて、原料リン脂質からＰＩを効率的に製造できる。
【００４３】
（ホスファチジルイノシトールの製造方法）
本発明はまた、ホスファチジルイノシトールまたはその誘導体を製造する方法を提供する。この方法は、原料リン脂質と、イノシトールまたはその誘導体と、ＰＩ合成改変型ＰＬＤとを反応させる工程を含む。
【００４４】
本発明の方法において使用するＰＩ合成改変型ＰＬＤは、上記のいずれかのＰＩ合成改変型ＰＬＤである。これは、上述のように、ＰＬＤを発現する微生物から調製され得る。
【００４５】
本発明の方法で用いられるＰＩ合成改変型ＰＬＤの使用量は、原料リン脂質１ｇに対し、１０〜２００単位の範囲で選択することができる。なお、酵素活性の１単位は、大豆レシチンを基質とし、基質濃度１％の０．０１Ｍ  Tris-maleate-NaOH緩衝液（ｐＨ５．５）を３７℃にて反応させた時、１分間に１μｍｏｌのコリンを遊離する酵素量である。
【００４６】
本発明の方法での原料リン脂質としては、ＰＬＤの基質となり得るものであれば、天然から抽出したもの、抽出後精製したもの、または合成したもののいずれでも使用できる。また、市販のもの、または公知の方法で調製したものを使用してもよい。例えば、大豆レシチン、脱脂大豆レシチン、菜種レシチン、ひまわりレシチンなどの植物由来のレシチン；卵黄レシチン、ヒツジ、ウシ由来レシチンなどの動物由来のレシチン；イカ、マグロのような水産物由来レシチン；酵母などの微生物由来のレシチンなどがあり得る。これらのレシチンの組成成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、リゾレシチン、ホスファチジン酸などの単品またはそれらの混合物などが挙げられる。
【００４７】
本発明の方法において、イノシトールまたはその誘導体がホスファチジル基転移反応の受容体として用いられる。受容体として用いられるイノシトールまたはその誘導体としては、イノシトール、イノシトールリン酸（例えば、一リン酸、ビスリン酸、またはポリリン酸）、イノシトールグリカン（例えば、イノシトールマンノシド）などが挙げられる。
【００４８】
原料リン脂質と受容体のイノシトールまたはその誘導体とのモル比は、原料リン脂質の種類により適宜選択する必要がある。一般にＰＣ１モルに対し、５〜５０倍モルの受容体を用いるのが適切である。
【００４９】
本発明の方法においてホスファチジル基転移反応に使用される反応溶媒は、水系溶媒と有機溶媒との混合溶媒を用いても、水系溶媒を単独で用いてもよい。有機溶媒としては、ｎ−ヘプタン、ｎ−ヘキサン、石油エーテル等の脂肪族炭化水素；シクロペンタン、シクロヘキサン等の環状脂肪族炭化水素；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；四塩化炭素、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類を挙げることができる。水系溶媒とは、水および水性の緩衝液をいう。水としては、イオン交換水、精製水、または蒸留水を用いることが好ましく、水道水も使用できる。水性の緩衝液としては、例えば、ｐＨ４〜６の酢酸緩衝液、ｐＨ７〜８のリン酸緩衝液などが好ましく用いられる。
【００５０】
本発明の方法で使用する反応溶媒が水系溶媒と有機溶媒との混合溶媒である場合、反応溶媒中の水系溶媒と有機溶媒との混合比は、使用する有機溶媒の種類に応じて適宜選択することができる。一般的には、水系溶媒：有機溶媒を容量比率で１：０．６５〜１：１００の範囲で混合して用いることができる。副反応である原料リン脂質のホスファチジル基の加水分解反応を抑制し、目的のホスファチジル基転移反応を効率的に行うためには、反応系内の水系溶媒の含量を１０容量％以下で行うことが好ましい。また、有機溶媒の選択および混合比は任意に選択することができる。
【００５１】
上記酵素反応に使用する反応溶媒中の有機溶媒の量は、原料として用いるリン脂質の重量の５〜５００容量倍が好ましく、さらに好ましくは、１０〜１００容量倍である。有機溶媒量が５容量倍未満では、原料基質を溶解した溶液の粘度が高くなって反応効率の低下を招く。逆に５００容量倍を超えるとホスファチジル基転移反応効率が悪くなる。
【００５２】
本発明の方法においてホスファチジル基転移反応の温度は、１０〜６０℃が好ましく、２５〜４５℃がより好ましい。反応の所要時間は、酵素量や反応温度により変動するが、概ね０．５〜４８時間である。本発明の方法で使用する反応溶媒が水系溶媒と有機溶媒との混合溶媒である場合は２相系となるので、水層と有機溶媒層とを十分に混合させるために、反応中に適宜撹拌、振とうなどの処理を施すことが好ましい。
【００５３】
上記反応後、例えば、加熱などの処理でＰＬＤを失活させ、静置処理、遠心分離法などにより水層を除去して有機溶媒層を得、有機溶媒を減圧下で除去することによって、目的のアシルグリセロリン脂質（例えば、ホスファチジルイノシトール）を得ることができる。さらに、得られたアシルグリセロリン脂質を、溶剤分別、シリカゲル分画、高速液体クロマトグラフィーなどの処理に供して高純度に精製することも可能である。
【００５４】
あるいは、上記反応後、静置処理や遠心分離法などにより、水層と有機溶媒層とを分別し、必要に応じて、水層にＰＬＤや各種受容体アルコールを追加し、新たに原料リン脂質を溶解した有機溶媒に混合することによって、水層を繰り返してこの反応に使用することもできる。反応後分別された有機溶媒層から、上記と同様にして目的のアシルグリセロリン脂質（例えば、ホスファチジルイノシトール）を得ることができる。
【００５５】
（グリコール基を有するアシルグリセロリン脂質を合成する能力を有するＰＬＤのスクリーニング方法）
本発明はまた、グリコール基を有するアシルグリセロリン脂質を合成する能力を有するＰＬＤをスクリーニングする方法を提供する。
【００５６】
グリコール基を有するアシルグリセロリン脂質を合成する能力を有するＰＬＤを得るためのスクリーニングの対象となるＰＬＤは特に限定されないが、例えば、未改変型ＰＬＤのアミノ酸配列とは少数（例えば、１〜数個（例えば、２または３まで））のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド（改変したＰＬＤ）であり得る。このようなポリペプチドは、人為的に作製されたポリペプチドであり得る。これは、当業者が通常用いる部位特異的変異導入方法、具体的には、ギャップド・デュプレックス（ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ）法、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）法、ＰＣＲによる変異導入法（例えば、オーバーラッピングＰＣＲ）などを用いて作製され得る。このようなポリペプチドは、天然に生じた変異により得られるポリペプチドでもあり得る。スクリーニングに供されるＰＬＤは、グリコール基を有するアシルグリセロリン脂質を合成する能力を有するか否かが不明であるＰＬＤを天然に生成し得る生物から単離されたポリペプチドでもあり得る。
【００５７】
スクリーニングの対象となる改変したＰＬＤは、例えば、以下のような手順により得られ得る。未改変型ＰＬＤ（特に、天然型ＰＬＤ）のアミノ酸配列とは少数（例えば、１〜数個（例えば、２または３まで））の特定または無作為の位置でアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する種々のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を生成する。これらのＤＮＡ断片を発現ベクターに連結して核酸構築物を得る。得られた核酸構築物を宿主に導入し、形質転換体を得る。得られた形質転換体を培養して、核酸構築物の発現産物として元のＰＬＤとは多種類の改変したＰＬＤが生成されたプラスミドライブラリーを得る。核酸構築物の作製、宿主への導入、形質転換体の培養については、上述の通りである。プラスミドライブラリーにより発現される改変したＰＬＤについて、スクリーニングが行われ得る。
【００５８】
ＰＬＤは、例えば、以下のようにして、スクリーニングに供され得る。該ＰＬＤをコードする遺伝子を含むプラスミドライブラリーを宿主に導入し、形質転換体を得る。この形質転換体を培養し、得られたコロニーを膜（例えば、ニトロセルロース膜）に転写させる。ここで、該培地はマスタープレートとして保存されるべきである。膜上でコロニーを生育させ、ＩＰＴＧ含有培地にて該ＰＬＤを発現および分泌させる。これにより、発現されたＰＬＤは、該膜上に吸着する。
【００５９】
本発明のスクリーニング方法においては、アシルグリセロリン脂質に導入される受容体として、グリコール基を含有する化合物が用いられ得る。このような化合物としては、糖類（好ましくは、オリゴ糖類（例えば、１〜１０糖で構成される糖類）、イノシトールまたはその誘導体（例えば、イノシトールリン酸（例えば、一リン酸、ビスリン酸、またはポリリン酸））が挙げられる。好ましくは、イノシトールまたはその誘導体が用いられる。
【００６０】
本発明のスクリーニング方法において用いられる原料リン脂質もまた、上述したとおり、ＰＬＤの基質となり得るリン脂質であれば、いずれでもよい。
【００６１】
原料リン脂質、受容体、およびＰＬＤを用いてホスファチジル基転移反応を行う。反応温度は、１０〜６０℃が好ましく、２５〜４０℃がより好ましい。反応の所要時間は、反応温度により変動するが、概ね０．５〜４８時間である。目的のＰＬＤが存在する場合、この反応により、目的とするアシルグリセロリン脂質が生じる。
【００６２】
上記ホスファチジル基転移反応は、例えば、上記のＰＬＤ吸着膜を、原料リン脂質および受容体を含む反応水溶液に浸漬することにより実施され得る。この反応水溶液に、カルシウム塩を含有させることが好ましい。上記ホスファチジル基転移反応により目的とするアシルグリセロリン脂質が生成すると、水溶液中に共存するカルシウムイオンと水不溶性の塩を形成し、膜上で酵素反応が生じた場所に沈着する。この場所は、目的とするＰＬＤを発現するコロニーが存在していた場所を意味する。
【００６３】
ホスファチジル基転移反応により生じたアシルグリセロリン脂質のグリコール部分は酸化により開裂され、アルデヒドへと誘導され得る。酸化は、酸化剤を用いて行われるが、この酸化剤は、グリコール部分を開裂してアルデヒドに誘導し得るものであれば、いずれの酸化剤も使用できる。このような酸化剤としては、好ましくは、過ヨウ素酸またはその塩、四酢酸鉛、およびビスマス酸ナトリウムが用いられ得る。過ヨウ素酸またはその塩としては、例えば、メタ過ヨウ素酸、メタ過ヨウ素酸カリウム、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、およびオルト過ヨウ素酸ナトリウムが挙げられる。この酸化反応の温度は、１０〜６０℃が好ましく、２０〜４０℃がより好ましい。反応の所要時間は、反応温度により変動するが、概ね５〜６０分間である。
【００６４】
上記アルデヒドは、当業者が通常用いる手法により検出され得る。アルデヒドの検出のための手法として、例えば、上記アルデヒドをヒドラジン化合物（例えば、ジニトロフェニルヒドラジン、７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ）−ヒドラジンなど）とカップリングさせることにより、該ヒドラジンがヒドラゾンとなる反応を利用することができるが、該反応に限定されない。銀鏡反応およびフェーリング反応を利用することもできる。例えば、ＮＢＤヒドラジンを上記アルデヒドと反応させると、ＮＢＤヒドラジンがＮＢＤヒドラゾンとなり、強い蛍光を呈する。この蛍光を測定することにより、アルデヒドの存在が検出できる。
【００６５】
アルデヒドの存在の決定により、アルデヒドを生成したグリコール部分を含有するアシルグリセロリン脂質の存在、そしてさらには、ホスファチジル基転移反応により、グリコール部分を含有するアシルグリセロリン脂質を合成する能力を有するＰＬＤの存在が認定できる。
【００６６】
上記ＰＬＤ吸着膜を用いてこれらの一連の反応を行った場合、その膜上でアルデヒドの存在を検出できる。したがって、膜における検出の有無により、目的とする合成能を有するＰＬＤを獲得したか否かが認定できる。さらに、この膜に対応するマスタープレートにこの合成能を有するＰＬＤを発現する形質転換体が存在するため、合成能を有するＰＬＤの遺伝子を保有する形質転換体を得ることができる。さらに、合成能を有するＰＬＤの遺伝子の塩基配列の解析により、目的とする合成能を有するＰＬＤを同定することができる。
【実施例】
【００６７】
以下に、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されることはない。
【００６８】
なお本実施例において、組換えベクターの構築、形質転換体の作製、形質転換細胞またはクローンからのプラスミドの調製などは、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野の当業者が通常用いる方法に準じて行った。
【００６９】
（実施例１：ライブラリーの作成）
ｐＰＥＬＢ−ＰＬＤ１（Y. Iwasakiら、J. Ferment. Bioeng.，1995年，79巻，pp.417-421の記載に基づいて調製）を制限酵素ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで消化し、リボゾーム結合部位、pET22b（Novagen）由来のpelBシグナルおよびストレプトマイセス・アンチビオティカス由来ＰＬＤ遺伝子の全長（１５３０ｂｐ；塩基配列は配列表の配列番号１に示す通りである）を含む断片を回収し、予めＸｂａＩおよびＸｈｏＩで消化しておいたpBluescriptII KS+（東洋紡製）に挿入し、pPELB-PLD-KSを作成した。これを制限酵素ＡｐａＩで消化し、該ＰＬＤ遺伝子の終止コドン周囲の断片とともに該ＰＬＤ遺伝子の下流の逆向き繰り返し配列を除去した。一方、ｐＳＡ１（Y. Iwasakiら、Appl. Microbiol. Biotechnol.，1994年，42巻，pp.290-299の記載に基づいて調製）を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、該ＰＬＤ遺伝子の後半部分を含む断片を切り出し、予めＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化しておいたpBluescript II SK+（東洋紡製）に挿入し、pSA1-BSを得た。pSA1-BSを制限酵素ＡｐａＩで消化し、該ＰＬＤ遺伝子の終止コドン周囲の断片を切り出した。この切り出された断片と、ＡｐａＩ消化したpPELB-PLD-KSとを連結し、次いでＫｐｎＩおよびＸｂａＩで切断し、pelBシグナルおよびＰＬＤ遺伝子の全長（１５３０ｂｐ）を含む断片を得た。この断片を、予めＳａｌＩおよびＸｂａＩで切断しておいたpBluescript II KS+プラスミド（東洋紡製）と連結し、プラスミドpPELB-PLD-KS IIを得た。
【００７０】
ｃａｔ遺伝子を含むプラスミドpHSG399（宝酒造製）をプライマーCAT-F1（配列番号３）およびCAT-R1（配列番号４）を用いてＰＣＲ｛反応液組成（各濃度は終濃度）：10×LA Taqポリメラーゼ用緩衝液（宝酒造製、1/10容）、MgCl2（2.5mM）、dATP（0.2mM）、dGTP（0.2mM）、dCTP（0.2mM）、dTTP（0.2mM）、プラスミドpHSG399（10ng/μL）、プライマーCAT-F1（0.5μM）、プライマーCAT-R1（0.5μM）、LA TaqDNAポリメラーゼ（宝酒造製、0.025Units/μL）／温度プログラム：９４℃１分の後、９４℃１０秒−５０℃１０秒−７２℃４０秒を３０サイクル、続いて７２℃７分、４℃∞｝により増幅し、ＢｇｌＩＩで消化し、ｃａｔを含む断片を得た。pETKmS1（Mishima N.ら、Biotechnol. Prog.，1997年，13巻，pp.864-868の記載に基づいて調製）をＢｇｌＩＩで切断し、ｃａｔ遺伝子断片を逆方向に連結し、プラスミドpETKmS1-CATを得た。次いで、このプラスミドをＳａｃＩおよびＸｂａＩで切断して、ｃａｔ逆方向配列およびT7-lacプロモーターを含む断片を切り出した。この断片を、予めＳａｃＩおよびＸｂａＩで切断しておいたpPELB-PLD-KS IIに連結し、プラスミドpPELB-PLD-KS II-CAT（５５８１ｂｐ）を得た。このプラスミドpPELB-PLD-KS II-CATを、部位特異的ランダムアミノ酸置換導入のためのオーバーラッピングＰＣＲの鋳型として使用した。
【００７１】
pPELB-PLD-KS II-CATを鋳型にして、プライマーPL-F1（配列番号５）およびOL-R1（配列番号６）を用いてＰＣＲ｛反応液組成（各濃度は終濃度）：10×LA Taqポリメラーゼ用緩衝液（宝酒造製、1/10容）、MgCl2（2.5mM）、dATP（0.2mM）、dGTP（0.2mM）、dCTP（0.2mM）、dTTP（0.2mM）、pPELB-PLD-KSII-CAT（10ng/μL）、プライマーPL-F1（0.5μM）、プライマーOL-R1（0.5μM）、LA TaqDNAポリメラーゼ（宝酒造製、0.025Units/μL）／温度プログラム：９４℃２分の後、９５℃１０秒−６０℃１０秒−７２℃１分１０秒を３０サイクル、７２℃１０分、４℃∞分｝により増幅し、この鋳型プラスミドのｃａｔ遺伝子、T7-lacプロモータ、リボゾーム結合部位、pelBシグナル配列および成熟ＰＬＤの一部を含む増幅断片（フラグメント１）を得た。
【００７２】
ストレプトマイセス・アンチビオティカス由来ＰＬＤの成熟タンパク質の全アミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示す通りである。このストレプトマイセス・アンチビオティカス由来ＰＬＤの成熟アミノ酸のＮ末端から１８７番目のトリプトファン残基および１９１番目のチロシン残基が置換されるように、pPELB-PLD-KSII-CATを鋳型にして、プライマーOL-F1（配列番号７）およびOL-R2（配列番号８）を用いてＰＣＲ｛反応液組成（各濃度は終濃度）：10×LA Taqポリメラーゼ用緩衝液（宝酒造製、1/10容）、MgCl2（2.5mM）、dATP（0.2mM）、dGTP（0.2mM）、dCTP（0.2mM）、dTTP（0.2mM）、pPELB-PLD-KSII-CAT（10ng/μL）、プライマーOL-F1（0.5μM）、プライマーOL-R2（0.5μM）、LA TaqDNAポリメラーゼ（宝酒造製、0.025Units/μL）／温度プログラム：９４℃２分の後、９５℃１０秒−６７℃１０秒−７２℃３０秒を２５サイクル、続いて７２℃７分、４℃∞｝により増幅し、２つのアミノ酸変異箇所で種々の塩基配列を有する断片（フラグメント２）を得た。
【００７３】
また、この成熟アミノ酸のＮ末端から３８５番目のチロシン残基が置換されるように、pPELB-PLD-KSII-CATを鋳型にして、プライマー対OL-F2（配列番号９）およびPL-R1（配列番号１０）を用いてＰＣＲ｛反応液組成（各濃度は終濃度）：10×LA Taqポリメラーゼ用緩衝液（宝酒造製、1/10容）、MgCl2（2.5mM）、dATP（0.2mM）、dGTP（0.2mM）、dCTP（0.2mM）、dTTP（0.2mM）、pPELB-PLD-KSII-CAT（10ng/μL）、プライマーOL-F2（0.5μM）、プライマーPL-R1（0.5μM）、LA TaqDNAポリメラーゼ（宝酒造製、0.025Units/μL）／温度プログラム：９４℃２分の後、９５℃１０秒−６２℃１０秒−７２℃３０秒を２５サイクル、続いて７２℃１０分、４℃∞｝により増幅し、１つのアミノ酸変異箇所で種々の塩基配列を有する断片（フラグメント３）を得た。
【００７４】
次にフラグメント２とフラグメント３とを、それらのオーバーラップ部分を利用してハイブリダイズさせ、さらにプライマーOL-F1（配列番号７）およびPL-R1（配列番号１０）を用いてＰＣＲ｛反応液組成（各濃度は終濃度）：10×LA Taqポリメラーゼ用緩衝液（宝酒造製、1/10容）、MgCl2（2.5mM）、dATP（0.2mM）、dGTP（0.2mM）、dCTP（0.2mM）、dTTP（0.2mM）、フラグメント２（10ng/μL）、フラグメント３（10ng/μL）、プライマーOL-F1（0.5μM）、プライマーPL-R1（0.5μM）、LA TaqDNAポリメラーゼ（宝酒造製、0.025Units/μL）／温度プログラム：９４℃２分の後、９５℃１０秒−６２℃１０秒−７２℃４５秒を２５サイクル、続いて７２℃１０分、４℃∞｝を行い、増幅断片（フラグメント４）を得た。
【００７５】
続いてフラグメント１とフラグメント４とを、それらのオーバーラップ部分を利用してハイブリダイズさせ、プライマーを加えずにオーバーラップエクステンション反応｛反応液組成（各濃度は終濃度）：10×LA Taqポリメラーゼ用緩衝液（宝酒造製、1/10容）、MgCl2（2.5mM）、dATP（0.2mM）、dGTP（0.2mM）、dCTP（0.2mM）、dTTP（0.2mM）、フラグメント１（0.2ng/μL）、フラグメント４（0.2ng/μL）、LA TaqDNAポリメラーゼ（宝酒造製、0.05Units/μL）／温度プログラム：９４℃５分の後、９８℃１０秒−５９℃１０秒−７２℃２分を２０サイクル、続いて４℃∞｝を行った。続いてこのオーバーラップエクステンション反応後の反応液を鋳型とし、プライマーPL-F1（配列番号５）およびPL-R1（配列番号１０）を用いてＰＣＲ｛反応液組成（各濃度は終濃度）：オーバーラップエクステンション反応後の反応液1/2容、10×LA Taqポリメラーゼ用緩衝液（宝酒造製、1/20容）、MgCl2（2.5mM）、dATP（0.2mM）、dGTP（0.2mM）、dCTP（0.2mM）、dTTP（0.2mM）、フラグメント１（10ng/μL）、フラグメント４（10ng/μL）、プライマーPL-F1（0.5μM）、プライマーPL-R1（0.5μM）、LA TaqDNAポリメラーゼ（宝酒造製、0.025Units/μL）／温度プログラム：９４℃３分の後、９８℃１０秒−５９℃１０秒−７２℃２分を３０サイクル、続いて７２℃１０分、４℃∞｝を行い、増幅断片を得た。このようにして、３つのアミノ酸変異箇所で種々の塩基配列を有する増幅断片を得た。
【００７６】
この増幅断片を制限酵素ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩで切断し、予め制限酵素ＳｐｅＩおよびＳａｌＩで切断しておいたpETKmS1-Termにライゲーションし、発現ベクターを得た。pETKmS1-Termは、上記pETKmS1-CATをBamHIで切断し、自己連結することにより作成した。この発現ベクターで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αを形質転換した。この形質転換した大腸菌ＤＨ５αをＬＢ寒天培地（50μg/mlカナマイシンおよび30μg/mlクロラムフェニコールを含む；10g/Lトリプトン（ディフコ製）、5g/L酵母エキス（ディフコ製）、10g/L  NaCl、15g/L寒天（和光純薬製））に撒いて生育させ、コロニーを形成させた。寒天培地上のコロニーにＬＢ液体培地（10g/Lトリプトン（ディフコ製）、5g/L酵母エキス（ディフコ製）、10g/L  NaCl）をかけて、コロニーを掻き取った。得られた細胞からプラスミドを調製し、変異ＰＬＤ遺伝子を含む混合物をプラスミドライブラリーとして得た。
【００７７】
（実施例２：プラスミドライブラリーの発現）
上記のプラスミド混合物を発現用宿主である大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、実施例１に記載と同じ組成のＬＢ寒天培地上で３７℃にて１６時間生育させた。得られたコロニー上にニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｃ；アマシャム製）を置き、コロニーを転写した。次いで、合成培地（組成は以下の通り（１Ｌあたりの質量を示す）：ＫＨ２ＰＯ４  ５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ５ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４  ４．４ｇ、（ＮＨ２）２ＳＯ４  ３ｇ、グルコース５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ３ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ４０ｍｇ、ＣａＣｌ２  ４０ｍｇ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ２．９ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ３ｍｇ、Ｎａ２ＭｏＯ・２Ｈ２Ｏ  ０．３６ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  １０ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０ｍｇに１．５％の寒天を添加したもの）上に膜を移して、３０℃で８時間保温して膜上でコロニーを生育させた。ＬＢ寒天培地上のコロニーはマスタープレートとして、冷蔵庫に保管した。１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加した上記合成培地上に膜を移し、３０℃で１６時間保温して、膜上でＰＬＤの発現を誘導した。この発現系では、発現したＰＬＤは細胞の外に放出され、膜上に吸着する。超音波洗浄機を用いて、この膜から菌体の残渣を洗い流した。
【００７８】
（実施例３：ＰＩ合成改変型ＰＬＤの発現に関するクローンのスクリーニング）
上記の膜を基質液（１０％大豆レシチン（ＳＬＰ−ＰＣ７０  ツルーレシチン工業製）、２０％イノシトール、２％塩化カルシウム、および５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．６）中に３０℃で１４時間浸漬し、膜上で酵素反応を行った。この酵素反応により酸性リン脂質であるホスファチジルイノシトール（ＰＩ）が生成すると、これらは、共存するカルシウムイオンと水不溶性の塩を形成し、反応が生じた場所に沈着する。反応後、過剰の基質液を水で洗い流し、膜を１０％過ヨウ素酸ナトリウム水溶液中に室温で１０分間浸漬した。この過ヨウ素酸ナトリウム処理により、沈着しているＰＩのグリコール部分が酸化開裂し、アルデヒドに誘導される。過剰の過ヨウ素酸ナトリウム溶液を水で洗い流し、膜にＮＢＤ−ヒドラジン水溶液（０．０５％ＮＢＤ−Ｈ、１０％ＤＭＳＯ）を塗布した。ＮＢＤ−Ｈはアルデヒドと反応してＮＢＤ−ヒドラゾンとなり、強い蛍光を呈する。この蛍光を紫外線（３６５ｎｍ）照射下で観察し、明るいスポットを識別した。このスポットは、膜上のＰＩが存在していた場所に相当する。このスポットと一致するコロニーをマスタープレートから単離し、陽性クローンを得た。これにより、４９個の陽性クローンが得られた（表１）。
【００７９】
（実施例４：陽性クローンの配列決定）
実施例３で得られた陽性クローンからプラスミドを調製し、ＰＬＤ遺伝子の変異内容をダイデオキシ法により決定した。結果を表１に示す。
【００８０】
【表１】
0005420016.tif 000002
【００８１】
（実施例５：改変型ＰＬＤによるＰＩの合成）
表１中の全ての番号のクローンを、実施例２に記載と同じ組成の合成培地（但し、寒天は含まない）中で３０℃にて液体培養した。約８時間後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるように加え、ＰＬＤの発現を誘導した。誘導から１６時間後に遠心分離により除菌して得られた上清を硫安分画してＰＬＤ粗酵素品を調製した。
【００８２】
ジパルミトイルホスファチジルコリン５ｍｇ、ｍｙｏ−イノシトール４０ｍｇ、塩化カルシウム４ｍｇ、５０ｍＭ酢酸緩衝液１８０μＬおよび上記ＰＬＤ粗酵素品２０μＬ（約１単位）を３０℃にて攪拌しながら１４時間反応させた。
【００８３】
リン脂質の定性分析は、下記の条件の薄層クロマトグラフ法（ＴＬＣ法）にて行った：
ＴＬＣプレート・・・シリカゲル６０プレート（メルク社製）
展開溶媒・・・クロロホルム：メタノール：石油エーテル：酢酸＝４：２：３：１（V/V/V/V）
展開時間・・・約２０分
検出・・・展開後０．１％２，７−ジクロロフルオレッセインのエタノール溶液を噴霧後、３６５ｎｍの紫外線照射下で観察するか、ディトマー試薬を噴霧し放置することで、リン脂質のスポットを検出した。その結果、いずれのクローンから調製したＰＬＤにおいても、イノシトールを基質として用いた場合に、ジパルミトイルＰＩに相当する新たなスポットが検出された。
【００８４】
また質量分析によっても分析した。質量分析は、飛行時間型二次イオン質量分析計（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ、商品名PHITRIFT III、アルバックファイ社製）によるバルク測定、負イオンモードで行った。その結果、いずれのクローンから調製したＰＬＤにおいても、イノシトールを基質として用いた場合、ジパルミトイルＰＩに相当するイオンが検出された。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明の新規なＰＬＤは、アシルグリセロリン脂質のホスファチジル基転移反応において、イノシトールのような嵩高い化合物をリン脂質に導入できるので、このＰＬＤを用いて安価で入手可能なリン脂質（例えば、レシチン）からＰＩを簡便かつ効率的に製造できる。さらに、本発明によれば、グリコール基を有するアシルグリセロリン脂質を合成する能力を有する新規なＰＬＤを簡便かつ迅速にスクリーニングする方法も提供される。
【配列表】
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