(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．０１から１．０Ｍの酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）及び１から１００ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む溶液中で、酵母細胞を温置する段階、
ベクターＤＮＡ、挿入ＤＮＡ、酵母細胞、０．１から１０Ｍのソルビトール及び０．１から１０ｍＭのＣａＣｌ２又はＭｇＣｌ２を含む縣濁液を提供する段階、および
１０から５０μＦの静電容量で、０．５ｋＶ／ｃｍから１２．５ｋＶ／ｃｍにて縣濁液をエレクトロポレーション処理し、それにより少なくとも１ｘ１０９のライブラリサイズを得る段階、
を含む、酵母細胞のエレクトロポレーションにより酵母ライブラリを調製する方法。
【請求項２】
縣濁液が１Ｍソルビトール及び１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
縣濁液が、１Ｍソルビトール及び１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む、請求項１の方法。
【請求項４】
酵母細胞が、冷０．１Ｍ  ＬｉＡｃ及び１０ｍＭ  ＤＴＴ中で温置される、請求項１の方法。
【請求項５】
縣濁液が、２５μＦの静電容量で、２．５ｋＶ／ｃｍでエレクトロポレーション処理される、請求項１の方法。
【請求項６】
エレクトロポレーション段階が０．２ｃｍギャップキュベット中で行われる、請求項１の方法。
【請求項７】
ベクターＤＮＡ１μｇから８μｇが使用される、請求項１の方法。
【請求項８】
ベクターＤＮＡ４μｇが使用される、請求項１の方法。
【請求項９】
ベクターが線状である、請求項１の方法。
【請求項１０】
縣濁液が１．６ｘ１０９個の酵母細胞／ｍＬの４００μＬを含む、請求項１の方法。
【請求項１１】
ベクターＤＮＡ：挿入ＤＮＡの比が１：０．５から１：１０の範囲である、請求項１の方法。
【請求項１２】
ベクターＤＮＡ：挿入ＤＮＡの比が１：３である、請求項１の方法。
【請求項１３】
１．０から２のＯＤ６００になるまで酵母細胞を培養する段階；
水中で酵母細胞を洗浄する段階；
ソルビトール及びＣａＣｌ２を含む溶液中で酵母細胞を洗浄する段階；
０．０１から１．０Ｍの酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）及び１から１００ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む溶液中で酵母細胞を温置する段階；
ソルビトール及びＣａＣｌ２を含む溶液中で酵母細胞を洗浄する段階；
酵母細胞エレクトロポレーション縣濁液を形成させるために、０．１から１０Ｍのソルビトール及び０．１から１０ｍＭのＣａＣｌ２又はＭｇＣｌ２を含む溶液中で酵母細胞を再縣濁する段階；
酵母細胞−ＤＮＡエレクトロポレーション縣濁液を形成させるために、酵母細胞エレクトロポレーション縣濁液の体積をベクターＤＮＡ及び挿入ＤＮＡに添加する段階；および
０．２ｃｍギャップキュベット中で２．５ｋＶ／ｃｍから１２．５ｋＶ／ｃｍの間の電圧で酵母細胞−ＤＮＡエレクトロポレーション縣濁液をエレクトロポレーション処理する段階、
を含む、酵母ライブラリを調製するためにＤＮＡで酵母を形質転換するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本願は、２００８年３月３日提出の米国特許仮出願第６１／０６７、９１０号に対する優先権及びその利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、酵母形質転換及びそれにより形質転換された酵母細胞及び酵母細胞ライブラリ及びそれ由来の組み換え産物の産生の分野に関する。とりわけ、本発明は、エレクトロポレーションによる酵母の形質転換に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
インビボでの動物免疫付与を用いるか又はインビトロでの組み換え抗体ディスプレイ技術により作製される治療用抗体は、臨床で成果を収めており、それ自体、有効な薬物探索技術としてこれらの技術を実証してきた。一般に動物免疫付与由来のモノクローナル抗体は、治療効果を達成するために十分に高い親和性を有することが予想される一方で、動物免疫付与からの治療用抗体の開発には、非ヒト抗体のヒト化又はヒト抗体を発現するトランスジェニック動物の入手の何れかが必要である。インビトロディスプレイ技術により予め確立された抗体ライブラリからの完全ヒト抗体の直接選択（ファージ、細菌、酵母、哺乳動物細胞及びリボソーム性ディスプレイ）（Ｃｈａｏ、Ｇ．ら（２００６）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１：７５５−６８；Ｇａｉ、Ｓ．Ａ．及びＷｉｔｔｒｕｐ、Ｋ．Ｄ．（２００７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１７：４６７−７３；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、Ａ．Ｄ．ら（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３２４５−６０；Ｈｅ、Ｍ．及びＫｈａｎ、Ｆ．（２００５）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２：４２１−３０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｈ．Ｒ．（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：１−３７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｈ．Ｒ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１０５−１６）によって、有益な同様のアプローチがもたらされており、これは、標的抗原がインビボで生産性の高い免疫反応を誘発できない場合、最良の代替法となり得る。
【０００４】
ヒト抗体ライブラリは、全長抗体又はＦａｂ、ｓｃＦｖ及びｄＡｂなどの様々な抗体断片をディスプレイするために改変されてきた。ライブラリは、一般に、合成的多様性をさらに導入するか又は導入せずに、Ｂ細胞レパートリーからの抗体多様性を捕捉し、ライブラリに移すことによるか（Ｈｏｅｔ、Ｒ．Ｍ．ら（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４４−８）又は限定されたヒト抗体フレームワークにおいてＣＤＲ残基を合成により無作為化することによるか（Ｒｏｔｈｅ、Ｃ．ら（２００８）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３７６：１１８２−２００）の何れかで、構築される。抗体重及び軽鎖は個別に増幅され、ライブラリディスプレイ形式に再設定されるので、ＶＨとＶＬとの間の新しい対形成がこのプロセス中に形成される。このＶＨ−ＶＬシャッフリングにより、新規の抗原結合部位が生成されるようになる一方で、これによってまた、理論的ライブラリ多様性も非常に顕著に向上する。ライブラリを有効にサンプリングするために必要とされる理論的なライブラリ多様性及び実際のライブラリのサイズを低下させることにより、より良好でより生産性の高い抗体ライブラリを操作するためにいくつかのストラテジーが開発されてきた。これらのストラテジーには、知的設計合成又は半合成ライブラリ（Ｒｏｔｈｅ、Ｃ．ら（２００８）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３７６：１１８２−２００）及び、多様性がより低いがより反応性が高い可能性があるＢ細胞レパートリーから作製された、免疫（Ｈｏｅｔ、Ｒ．Ｍ．ら（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４４−８）又は偽免疫（ｐｓｅｕｄｏｉｍｍｕｎｅ）（Ｌｅｅ、Ｈ．Ｗ．ら（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４６：８９６−９０３）ライブラリが含まれる。これらのアプローチは、いくつか又は実に多くのログにより理論的ライブラリ多様性を顕著に低下させることにおいて有効であり得るが、それらの稀少性に関係なく、抗体ヒットを同定する機会を増加させるための大きなライブラリサイズ及びそれらを作製するための方法に対する必要性によって、必ず、ライブラリ設計は完全なものになるであろう。
【０００５】
酵母などの真核系における、核酸ライブラリ及びそれにより産生される組み換え産物（医薬用タンパク質など）の作製のための手段が利用可能であれば、Ｅ．コリなどの原核系の使用と比較して、顕著な長所がもたらされる。酵母は、一般に、細菌よりも高い細胞密度で増殖させることができ、連続発酵処理に容易に適応する。しかし、組み換え産物及びライブラリの生成のための宿主／ベクター系としての酵母種の開発において、形質転換条件及び外来核酸を酵母宿主細胞に安定して導入するための適切な手段に関する知識の欠如が大きな障害となっている。
【０００６】
細胞の電気的形質転換を促進する様々な電気的及び生物学的パラメータの中でも特に挙げられるのは、細胞表面に対するＤＮＡの吸着である。低強度の交流電場もまた、おそらく、ＤＮＡ透過酵素の電気的刺激によって、Ｅ．コリ細菌へのＤＮＡ転移を促進する。高分子電解質ＤＮＡの電気穿孔性遺伝子移動における主要な電気拡散的又は電気泳動的効果に対する証拠が蓄積されてきた。エレクトロポレーションにより促進される電気浸透効果及び膜陥入もまた報告された。
【０００７】
酵母細胞膜を横切る電場の適用の結果、エレクトロポレーションプロセスに対して非常に重要である一時的な孔が生じる。エレクトロポレーターシグナル生成装置は、電極間のギャップ（ｃｍ）を横切って動く電圧（ｋＶ）を与える。この電位差は、Ｅ＝ｋＶ／ｃｍである電場強度と呼ばれるものと定義される。各細胞は、最適のエレクトロポレーションに対するそれ自身の臨界電場強度を有する。これは、細胞の大きさ、膜の構造及び細胞壁それ自身の個々の特徴による。例えば、哺乳動物細胞は、通常、細胞死及び／又はエレクトロポレーションが起こる前、０．５から５．０ｋＶ／ｃｍの間である必要がある。一般に、必要とされる電場強度は、細胞の大きさとは逆に変化する。
【０００８】
形質転換の方法
１．エレクトロポレーションによる形質転換
Ｂｅｃｋｅｒら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９４：１８２−１８７（１９９１））は、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｓ．セレビシエ）の形質転換の方法を開示する。Ｂｅｃｋｅｒはまた、スフェロプラスト形質転換も開示する。
【０００９】
Ｆａｂｅｒら（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２５：３０５−３１０（１９９４））は、メチロトローフ酵母、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の形質転換のための方法を開示する。Ｆａｂｅｒはまた、この方法をピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）にも適用した。
【００１０】
Ｈｅｌｍｕｔｈら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９３：１４９−１５２（２００１））は、ＬｉＡｃ及びＤＴＴ前処理の両方を組み合わせることによる、酵母形質転換効率の向上を開示する。
【００１１】
Ｋａｓｕｔｓｋｅら（Ｙｅａｓｔ  ８：６９１−６９７（１９９２））は、様々な相同ベクタープラスミドによる無傷のカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）細胞のエレクトロパルス形質転換を開示する。
【００１２】
Ｍｅｉｌｈｏｃら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２２３−２２７（１９９０））は、無傷のＳ．セレビシエ酵母細胞及び電場パルスを用いた形質転換系を開示する。
【００１３】
Ｎｅｕｍａｎｎら（１９９６）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．（１９９６）７１：８６８−８７７は、エレクトロポレーション及びカルシウム介在ＤＮＡ吸着による、酵母細胞形質転換の動力学を開示する。
【００１４】
Ｐｉｒｅｄｄａら（Ｙｅａｓｔ  １０：１６０１−１６１２（１９９４））は、酵母、ヤマダザイマ（ピキア）オーメリ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ（Ｐｉｃｈｉａ）ｏｈｍｅｒｉ）に対する形質転換系を開示する。
【００１５】
Ｓｃｏｒｅｒら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：１８１−１８４（１９９４））は、エレクトロポレーション及びスフェロプラスト形質転換系の両方を用いた、ピキア・パストリスでの発現のための稀少な高コピー数形質転換体の迅速なＧ４１８選択を可能にするＰ．パストリスベクターを開示する。
【００１６】
Ｓｈｅｒｍａｎら（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ｐ．９１  １０２、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８６））は、酵母突然変異体ＬＥＵ２及びＨＩＳ３の形質転換を開示する。
【００１７】
Ｓｕｇａ及びＨａｔａｋｅｙａｍａ（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．４３：２０６−２１１（２００３））は、カルシウムの添加によるエレクトロポレーション前にコンピーテント細胞を作製するための凍結法を開示する。
【００１８】
Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（Ｙｅａｓｔ  １４：５６５−５７１（１９９８））は、エレクトロポレーションによる形質転換のための、Ｓ．セレビシエ及びカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）などの酵母細胞の調製を開示する。
【００１９】
Ｙａｎｇら（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６０（１２）：４２４５−４２５４（１９９４））は、そのＵＲＡ３遺伝子及び相同自己複製配列ＡＲＳ２に基づく、ピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）のエレクトロポレーションを開示する。
【００２０】
Ｒａｙｍｏｎｄに対する米国特許第５，７１６，８０８号は、エレクトロポレーションを用いた外来ＤＮＡコンストラクトを含有するピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞を調製するための方法及びピキア・メタノリカ細胞において外来ペプチドを産生させるための方法を開示する。
【００２１】
Ａｂｂａｓに対する米国特許第７，００９，０４５号は、エレクトロポレーションによる及びスフェロプラスト形質転換による、フラビン生成酵母、ピキア・ギリエルモンディ（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）及びカンジダ・ファマータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆａｍａｔａ）の形質転換を開示する。
【００２２】
２．スフェロプラスト形成による形質転換
Ｂｅｃｋｅｒら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９４：１８２−１８７（１９９１））は、酵母Ｓ．セレビシエならびにスフェロプラスト形質転換の形質転換の方法を開示する。
【００２３】
Ｓｃｏｒｅｒら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：１８１−１８４（１９９４））は、エレクトロポレーション及びスフェロプラスト形質転換系の両方を用いた、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）での発現のための稀少な高コピー数形質転換体のＧ４１８選択を可能にするＰ．パストリスベクターを開示する。
【００２４】
Ｓｔｒｏｍａｎらに対する米国特許第４，８０８，５３７号は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）からのメタノール誘導性遺伝子及び、スフェロプラスト形質転換を用いた異種遺伝子のメタノール制御発現に有用な制御領域を、単離しクローニングするための方法を開示する。
【００２５】
Ｃｒｅｇｇに対する米国特許第４，８３７，１４８号は、ピキアの宿主株において染色体外エレメントとしてプラスミドを維持することが可能な自己複製配列を開示する。この特許は、ＤＮＡ配列を含むコンストラクトならびにスフェロプラスト形成により生成される形質転換生物をさらに開示し、本発明のＤＮＡ配列及びコンストラクトを作製するためのプロセスならびに何らかの源から配列を単離するための方法を提供する。
【００２６】
Ｓｔｒｏｍａｎらに対する米国特許第４，８５５，２３１号は、メタノールの存在、異化代謝産物非抑制性炭素源及び炭素源欠乏に反応性があるＤＮＡ配列を開示する。'２３１特許は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のスフェロプラスト形質転換を明らかにする。
【００２７】
Ｓｔｒｏｍａｎらに対する米国特許第４，８７９，２３１号は、ピキア・パストリスなどの酵母に対するスフェロプラスト形質転換法を開示する。
【００２８】
Ｃｒｅｇｇらに対する米国特許第４，８８２，２７９号は、ピキア属の酵母、例えばピキア・パストリスに対するスフェロプラスト形質転換技術を開示する。
【００２９】
Ｃｒｅｇｇに対する米国特許第５，１３５，８６８号は、ピキア属の酵母の部位特異的ゲノム修飾のための方法に関する。'８６８特許は、スフェロプラスト形質転換法を使用する。
【００３０】
Ｂｕｃｋｈｏｌｚに対する米国特許第５，２６８，２７３号は、ピキア・パストリスのスフェロプラスト形質転換の方法に関する。
【００３１】
Ｒａｙｍｏｎｄに対する米国特許第５，７３６，３８３号は、ピキア属の酵母株、特にピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の形質転換の方法に関する。'３８３特許は、ピキア属の酵母のスフェロプラスト形質転換の方法ならびにエレクトロポレーションによる形質転換の方法にさらに関する。
【００３２】
３．その他の形質転換系
Ｋｕｎｚｅら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９（３）：２０５−２０９（１９８５））は、プラスミドｐＹｅ（ＡＲＧ４）４１１を用いた、Ｓ．セレビシエ、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）及びピキア・ギリエルモンディ（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）Ｇ２６６の形質転換の方法を開示し、これは、ｐＢＲ３２２に挿入されたＳ．セレビシエＡＲＧ４遺伝子を含有する。Ｋｕｎｚｅは、形質転換の方法においてＣａＣｌ２を使用した。
【００３３】
Ｋｕｎｚｅら（Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５（２）：１４１−１４４（１９８５））は、ＣａＣｌ２を用いた、産業的に重要な酵母カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）及びピキア・ギリエルモンディ（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）Ｇ２６６の形質転換の方法を開示する。
【００３４】
Ｋｕｎｚｅら（Ａｃｔａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６（１）：２８（１９８６））は、産業的に重要な酵母カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）及びピキア・ギリエルモンディ（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）の形質転換を開示する。
【００３５】
Ｎｅｉｓｔａｔら（Ｍｏｌ．Ｇｅ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．Ｖｉｒｕｓｏｌ．１２：１９−２３（１９８６））（要約のみ）は、Ｓ．セレビシエのＡＤＥ２遺伝子を担うプラスミドによる、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・ギリエルモンディ（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、ウィリオプシス・サツルヌス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ  ｓａｔｕｒｎｕｓ）酵母の形質転換を開示する。形質転換の方法は開示されていない。
【００３６】
Ｃｒｅｇｇらに対する米国特許第４，９２９，５５５号は、ＤＮＡによる形質転換に対して妥当であるピキア属のメチロトロフィー種の全細胞を作製するための方法及びこのような種、特にピキア・パストリスの全細胞をＤＮＡで形質転換するための方法を開示する。
【００３７】
Ｈｅｅｆｎｅｒらに対する米国特許第５，２３１，００７号は、６日間に対して１Ｌあたり約７．０から７．５ｇのリボフラビン量を産生するカンジダ・ファマータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆａｍａｔａ）の高フラビン生成株の作製及び単離の方法を開示する。この方法は、親株及びスクリーニングプロトコールに従い各段階後に選択される子孫株において行われる反復突然変異誘発段階及びプロトプラスト融合段階の組み合わせを含む。
【００３８】
４．ベクター、ＡＲＳエレメント及び遺伝子ライブラリ
Ｃｌｙｎｅ、Ｒ．Ｋ．ら（ＥＭＢＯ  Ｊ．１４（２４）：６３４８−６３５７（１９９５））は、ＡＲＳ１、分裂酵母、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）のＡＲＳエレメントの微小構造分析に関する。一連のネスト化欠失突然変異の特徴から、重要なＡＲＳ活性を保持した６５０ｂｐ以下の断片はなかったので、ＡＲＳ１を包含するＤＮＡの最小断片が大きいことが示される。
【００３９】
Ｌｉａｕｔａ−Ｔｅｇｌｉｖｅｔｓ、Ｏ．ら（Ｙｅａｓｔ  １１（１０）：９４５−９５２（１９９５））は、ピキア・ギリエルモンディ（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）ゲノムライブラリからのリボフラビン生合成に含まれるＧＴＰ−シクロヒドロラーゼの構造遺伝子のクローニングを開示する。
【００４０】
Ｃａｎｎｏｎ、Ｒ．Ｄ．ら（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２１（２）：２１０−２１８（１９９０））は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）及びＳ．セレビシエで機能的である自己複製配列（ＡＲＳ）エレメントの単離及びヌクレオチド配列を開示する。
【００４１】
Ｔａｋａｇｉ、Ｍ．ら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６７（２）：５５１−５５５（１９８６））は、そのゲノムから単離されたＡＲＳ部位を使用することによる、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）における宿主−ベクター系の構築を開示する。
【００４２】
Ｐｌａ、Ｊ．ら（Ｇｅｎｅ  １６５（１）：１１５−１２０（１９９５））は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）及びＳ．セレビシエの両方の非組み込み型（ｎｏｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）遺伝子形質転換を促進することが示されている、自己複製活性のあるＡＲＳ２及びＡＲＳ３カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）ＤＮＡ断片に関する。
【００４３】
Ｆｏｕｒｎｉｅｒらに対する米国特許第５，２１２，０８７号は、ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において有効であるＡＲＳ配列ならびにこれらの配列を担うプラスミドを開示する。
【００４４】
Ｈａｇｅｎｓｏｎらに対する米国特許第５，６６５，６００号は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）線状プラスミド及びＡＲＳ配列を含有するそのＤＮＡ断片を開示する。'６００特許は、米国特許第４，９２９，５５５号のＣｒｅｇｇらに記載のようなスフェロプラスト形質転換系を使用した。
【００４５】
Ｃｒｅｇｇらに対する米国特許第４，８３７，１４８号は、ピキアの宿主株において染色体外エレメントとしてプラスミドを維持することが可能な自己複製配列を開示する。'１４８特許は、このＤＮＡ配列を含むコンストラクトならびにそれにより形質転換された生物にさらに関する。この特許は、本発明のＤＮＡ配列及びコンストラクトを作製するためのプロセスならびに何らかの源からその配列を単離するための方法をさらに提供する。
【００４６】
Ｃｈａｏら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１（２）：７５５−７６８（２００６））は、エレクトロポレーションにより酵母細胞を形質転換し、５μｇ挿入物及び１μｇベクターＤＮＡにより最大５ｘ１０７ライブラリサイズを達成するためのプロトコールを開示する。
【００４７】
上記方法及び開示は、次第により高い形質転換効率を達成してはいるが、以前として困難であり、１０６から１０７サイズ範囲の複数の小さなライブラリから１０８から１０９サイズ範囲のより大きな複合したライブラリサイズを蓄積するために、長い時間を要し、繰り返し実行することが必要である。
【００４８】
酵母ライブラリは、ファージライブラリにより達成されているサイズ又は効率を達成していない。２００５年にＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２３（９）：１１０５−１１１６）により概説されているように、典型的な最大ファージライブラリのサイズは１０１０から１０１１であり、一方、典型的な酵母ライブラリは１０７のサイズであるが（その他のディスプレイ技術（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｈ．Ｒ．（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：１−３７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｈ．Ｒ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１０５−１６により達成されるものよりも顕著に小さい。）、１０９の範囲のライブラリサイズが既に報告されている（Ｈｏｅｔ、Ｒ．Ｍ．ら（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４４−８；Ｌｉｐｏｖｓｅｋ、Ｄ．ら（２００７）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３６８：１０２４−４１；Ｓｅｇａｌ、Ｌ．ら（２００７）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３：１４４０−９）。Ｆｅｌｄｈａｕｓら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２１：１６３−１７０（２００３）は、努力を要して形質転換を繰り返し、次いで形質転換されたライブラリを組み合わせることによって、１．５ｘ１０９ライブラリを構築できることを示した。エレクトロポレーションプロトコールにおける最近の進展（Ｃｈａｏ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １（２）：７５５−７６８（２００６）参照）により、１回の形質転換で最大５ｘ１０７酵母ライブラリサイズを達成可能になったが、発明者らは、Ｃｈａｏのプロトコールが酵母を形質転換する形質転換効率が、一般に、顕著により低いことを見出した。今まで達成された酵母ライブラリサイズが、依然として、１０１０から１０１１サイズのファージディスプレイライブラリにより日常的に達成可能であるものよりも顕著に低いことは今なお相違ない。
【００４９】
磁性ビーズ及び蛍光標示式細胞分類の両方を用いた酵母ディスプレイライブラリ選択により、特に蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）とのその適合性によって、標的抗原に対する特異的結合物を濃縮するための有効で感度の高い方法が得られる。しかし、酵母細胞の形質転換効率が低いために、典型的な酵母ディスプレイライブラリのサイズに限界があることによって、この選択能力の長所が損なわれる。酵母ディスプレイ選択技術が、ファージディスプレイ（約１０１０の大きさ）に対して作製されるものと同様の大きな抗体ライブラリと組み合わせられ得る場合、酵母ディスプレイ技術により、非常に有効な抗体探索ツールがもたらされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００５０】
【特許文献１】米国特許第５，７１６，８０８号明細書
【特許文献２】米国特許第７，００９，０４５号明細書
【特許文献３】米国特許第４，８０８，５３７号明細書
【特許文献４】米国特許第４，８３７，１４８号明細書
【特許文献５】米国特許第４，８５５，２３１号明細書
【特許文献６】米国特許第４，８７９，２３１号明細書
【特許文献７】米国特許第４，８８２，２７９号明細書
【特許文献８】米国特許第５，１３５，８６８号明細書
【特許文献９】米国特許第５，２６８，２７３号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，７３６，３８３号明細書
【特許文献１１】米国特許第４，９２９，５５５号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，２３１，００７号明細書
【特許文献１３】米国特許第５，２１２，０８７号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，６６５，６００号明細書
【非特許文献】
【００５１】
【非特許文献１】Ｃｈａｏ、Ｇ．他、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１、２００６年、ｐ．７５５−７６８
【非特許文献２】Ｇａｉ、Ｓ．Ａ．及びＷｉｔｔｒｕｐ、Ｋ．Ｄ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１７、２００７年、ｐ．４６７−７３
【非特許文献３】Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、Ａ．Ｄ．他、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３、１９９４年、ｐ．３２４５−３２６０
【非特許文献４】Ｈｅ、Ｍ．及びＫｈａｎ、Ｆ．、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２、２００５年、ｐ．４２１−４３０
【非特許文献５】Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｈ．Ｒ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８、２００２年、ｐ．１−３７
【非特許文献６】Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｈ．Ｒ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３、２００５年、ｐ．１１０５−１１１６
【非特許文献７】Ｈｏｅｔ、Ｒ．Ｍ．他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３、２００５年、ｐ．３４４−３４８
【非特許文献８】Ｒｏｔｈｅ、Ｃ．他、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３７６、２００８年、ｐ．１１８２−１２００
【非特許文献９】Ｌｅｅ、Ｈ．Ｗ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４６、２００６年、ｐ．８９６−９０３
【非特許文献１０】Ｂｅｃｋｅｒ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９４、１９９１年、ｐ．１８２−１８７
【非特許文献１１】Ｆａｂｅｒ他、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２５、１９９４年、ｐ．３０５−３１０
【非特許文献１２】Ｈｅｌｍｕｔｈ他、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９３、２００１年、ｐ．１４９−１５２
【非特許文献１３】Ｋａｓｕｔｓｋｅ他、Ｙｅａｓｔ  ８、１９９２年、ｐ．６９１−６９７
【非特許文献１４】Ｍｅｉｌｈｏｃ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８、１９９０年、ｐ．２２３−２２７
【非特許文献１５】Ｎｅｕｍａｎｎ他、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７１、１９９６年、ｐ．８６８−８７７
【非特許文献１６】Ｐｉｒｅｄｄａ他、Ｙｅａｓｔ  １０、１９９４年、ｐ．１６０１−１６１２
【非特許文献１７】Ｓｃｏｒｅｒ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２、１９９４年、ｐ．１８１−１８４
【非特許文献１８】Ｓｈｅｒｍａｎ他、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９８６年、ｐ．９１  １０２、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
【非特許文献１９】Ｓｕｇａ及びＨａｔａｋｅｙａｍａ、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．４３、２００３年、ｐ．２０６−２１１
【非特許文献２０】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他、Ｙｅａｓｔ  １４、１９９８年、ｐ．５６５−５７１
【非特許文献２１】Ｙａｎｇ他、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６０（１２）、１９９４年、ｐ．４２４５−４２５４
【非特許文献２２】Ｂｅｃｋｅｒ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９４、１９９１年、ｐ．１８２−１８７
【非特許文献２３】Ｋｕｎｚｅ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９（３）、１９８５年、ｐ．２０５−２０９
【非特許文献２４】Ｋｕｎｚｅ他、Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５（２）、１９８５年、ｐ．１４１−１４４
【非特許文献２５】Ｋｕｎｚｅ他、Ａｃｔａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６（１）、１９８６年、ｐ．２８
【非特許文献２６】Ｎｅｉｓｔａｔ他、Ｍｏｌ．Ｇｅ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．Ｖｉｒｕｓｏｌ．１２、１９８６年、ｐ．１９−２３
【非特許文献２７】Ｃｌｙｎｅ、Ｒ．Ｋ．他、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４（２４）、１９９５年、ｐ．６３４８−６３５７
【非特許文献２８】Ｌｉａｕｔａ−Ｔｅｇｌｉｖｅｔｓ、Ｏ．他、Ｙｅａｓｔ  １１（１０）、１９９５年、ｐ．９４５−９５２
【非特許文献２９】Ｃａｎｎｏｎ、Ｒ．Ｄ．他、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２１（２）、１９９０年、ｐ．２１０−２１８
【非特許文献３０】Ｔａｋａｇｉ、Ｍ．他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６７（２）、１９８６年、ｐ．５５１−５５５
【非特許文献３１】Ｐｌａ、Ｊ．他、Ｇｅｎｅ  １６５（１）、１９９５年、ｐ．１１５−１２０
【非特許文献３２】Ｌｉｐｏｖｓｅｋ、Ｄ．他、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３６８、２００７年、ｐ．１０２４−１０４１
【非特許文献３３】Ｓｅｇａｌ、Ｌ．他、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３、２００７年、ｐ．１４４０−１４４９
【非特許文献３４】Ｆｅｌｄｈａｕｓ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２１、２００３年、ｐ．１６３−１７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００５２】
従って、酵母を用いた、例えば抗体ライブラリなどのタンパク質ライブラリを作製するための有効な方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００５３】
（発明の要旨）
本発明は、例えば最大２ｘ１０１０のサイズの酵母細胞ライブラリの作製のための、酵母細胞を形質転換する高効率で迅速な方法を提供する。本発明の方法により、ファージライブラリの規模の収率を達成することが可能になる。本発明の方法は、以前に未探索のより大きい抗体多様性スペースに到達するための実際的なツールとして、酵母ディスプレイ技術を適用する際の重大な問題を排除し、このライブラリサイズは、現在、実験室で増殖させ得る酵母培養物のサイズによってのみ制限される。
【００５４】
最良の組み合わせを明らかにするために、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、スクロース、ソルビトール、酢酸リチウム、ジチオスレイトール、エレクトロポレーション電圧、ＤＮＡ投入量及び細胞体積の使用を含む複数の成分及び条件を試験するか又は滴定した。この新しく開発されたプロトコールを適用することによって、１−１．５ｘ１０８個の形質転換体／ｍｇベクターＤＮＡの典型的な形質転換効率で、基本的に１日でヒト脾臓ＲＮＡから、２ｘ１０１０抗体ライブラリを構築した。配列分析により、この非免疫ヒト脾臓抗体ライブラリ内の抗体生殖細胞系列配列の多様な表示が確認された。試験的なライブラリ選択を行うことによって、発明者らは、低ナノモル親和性のＴＮＦ−α及びＩＬ−１８に対するヒト抗体を同定し、このことから、このライブラリの生産性が明らかになった。
【００５５】
ある態様において、本発明は、（ａ）核酸ベクター、酵母細胞、ソルビトール及びＣａＣｌ２を含む縣濁液を提供し、（ｂ）約１０から約５０μＦの静電容量で、０．５ｋＶ／ｃｍから１２．５ｋＶ／ｃｍ超で縣濁液をエレクトロポレーション処理する段階を含む、酵母細胞のエレクトロポレーションにより酵母ライブラリを調製する方法を提供する。ある実施形態において、本発明は、（ａ）約１．０から約２のＯＤ６００になるまで酵母細胞を培養し；（ｂ）冷水の体積中で酵母細胞を洗浄し；（ｃ）冷１Ｍソルビトール／１ｍＭＣａＣｌ２の体積中で酵母細胞を洗浄し；（ｄ）３０℃の０．１Ｍ  ＬｉＡｃ／１０ｍＭ  ＤＴＴの体積中で酵母細胞を温置し；（ｅ）第二の多量の冷１Ｍソルビトール／１ｍＭ  ＣａＣｌ２の体積中で酵母細胞を洗浄し；（ｆ）酵母細胞エレクトロポレーション縣濁液を形成させるために、第三の冷１Ｍソルビトール／１ｍＭ  ＣａＣｌ２の体積中で酵母細胞を再縣濁し；（ｇ）酵母細胞−ＤＮＡエレクトロポレーション縣濁液を形成させるために、エレクトロポレーション細胞縣濁液の体積をベクターＤＮＡ及び挿入ＤＮＡに添加し；（ｈ）０．２ｃｍギャップキュベット中で約２．５ｋＶ／ｃｍから約１２．５ｋＶ／ｃｍの間の電圧で酵母細胞−ＤＮＡエレクトロポレーション縣濁液をエレクトロポレーション処理する段階を含む、ライブラリを調製するためにＤＮＡで酵母を形質転換するための方法を提供する。
【００５６】
ベクターＤＮＡ：挿入ＤＮＡの比は、約１：０．５から約１：１０、例えば、１：０．５、１：１；１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９又は１：１０の範囲である。ある実施形態において、ベクターＤＮＡ約１μｇ及び挿入ＤＮＡ約１μｇを反応に使用する。別の実施形態において、ベクターＤＮＡ約１μｇ及び挿入ＤＮＡ約２μｇを沈殿させる。別の実施形態において、ベクターＤＮＡ約１μｇ及び挿入ＤＮＡ約３μｇを沈殿させる。さらに別の実施形態において、ベクターＤＮＡ約１μｇ及び挿入ＤＮＡ約４μｇを沈殿させる。さらに別の実施形態において、ベクターＤＮＡ約１μｇ及び挿入ＤＮＡ約５μｇを沈殿させる。
【００５７】
ある実施形態において、細胞縣濁液は、酵母細胞約５０から約４００μＬ、例えば、酵母細胞約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００μＬを含む。
【００５８】
ある実施形態において、酵母細胞縣濁液は、約１から約１０ｘ１０９個の酵母細胞／ｍＬ、例えば、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９又は約１０ｘ１０９個の酵母細胞／ｍＬである。
【００５９】
ある実施形態において、酵母細胞をエレクトロポレーション処理するために使用される電場強度は、約０．５ｋＶ／ｃｍから約１２．５ｋＶ／ｃｍ、例えば、約０．５、約１．０、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５、約１０．０、約１０．５、約１１．０、約１１．５、約１２．０、約１２．５、約１３．０、約１３．５、約１４．０、約１４．５、又は約１５．０ｋＶ／ｃｍであった。
【００６０】
ある実施形態において、酵母細胞は、約１０から約５０μＦ、例えば、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５又は約５０の静電容量でエレクトロポレーション処理される。
【００６１】
ある実施形態において、酵母細胞は、約０．１から約１０Ｍソルビトール及び約０．１から約１０ｍＭ  ＣａＣｌ２もしくはＭｇＣｌ２、例えば、約０．１、約０．２５、約０．５、約０．７５、約１．０、約２．０、約３．０、約４．０、約５．０、約６．０、約７．０、約８．０、約９．０もしくは約１０．０Ｍソルビトール又は例えば、約０．１、約０．２５、約０．５、約０．７５、約１．０、約２．０、約３．０、約４．０、約５．０、約６．０、約７．０、約８．０、約９．０もしくは約１０．０ｍＭ  ＣａＣｌ２又はＭｇＣｌ２中で縣濁している。
【００６２】
ある実施形態において、酵母細胞は、約０．０１から約１．０Ｍ  ＬｉＡｃ、例えば、約０．０１、約０．０２、約０．０３、約０．０４、約０．０５、約０．０６、約０．０７、約０．０８、約０．０９、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９又は約１．０Ｍ  ＬｉＡｃ及び／又は約１から約１００ｍＭ  ＤＴＴ、例えば、約１、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０又は約１００ｍＭ  ＤＴＴ中で温置する。
【００６３】
特定の実施形態において、本発明は、（ａ）約１．０から約２のＯＤ６００になるまで酵母細胞を一晩培養し；（ｂ）水中で酵母細胞を洗浄し；（ｃ）ソルビトール及びＣａＣｌ２を含む溶液中で酵母細胞を洗浄し；（ｄ）ＬｉＡｃ及びＤＴＴを含む溶液中で酵母細胞を温置し；（ｅ）ソルビトール及びＣａＣｌ２を含む溶液中で酵母細胞を洗浄し；（ｆ）酵母細胞エレクトロポレーション縣濁液を形成させるために、ソルビトール及びＣａＣｌ２を含む溶液の体積中で酵母細胞を再縣濁し；（ｇ）酵母細胞−ＤＮＡエレクトロポレーション縣濁液を形成させるために、エレクトロポレーション細胞縣濁液の体積をベクターＤＮＡ及び挿入ＤＮＡに添加し；（ｈ）０．２ｃｍギャップキュベット中で約２．５ｋＶ／ｃｍから約１２．５ｋＶ／ｃｍの間の電圧で酵母細胞−ＤＮＡエレクトロポレーション縣濁液をエレクトロポレーション処理する段階の２以上を含む、ライブラリを作製するためにＤＮＡで酵母を形質転換するための方法を提供する。
【００６４】
別の特定の実施形態において、本発明は、（ａ）ＤＮＡをペレットになるように沈殿させ、続いて最小体積中で再懸濁することにより、約１：０．５から約１：１０の比のベクター及び挿入ＤＮＡの体積を最小化し；（ｂ）（ｉ）培養プレートからの酵母コロニー入りの培地の第一の体積又は増殖中の酵母培養物の一部を接種し；（ｉｉ）３０℃で一晩酵母細胞を増殖させ；（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）からの細胞入りの培地の第二の体積を接種し、約１．３から約１．６のＯＤ６００に到達するまで細胞を３０℃で増殖させることによって、適切な増殖状態になるまでコロニーからの酵母細胞を培養し；（ｃ）遠心によって酵母細胞をペレット化し；（ｄ）冷水で酵母細胞を洗浄し；（ｅ）冷１Ｍソルビトール／１ｍＭＣａＣｌ２で酵母細胞を洗浄し；（ｆ）０．１Ｍ  ＬｉＡｃ／１０ｍＭ  ＤＴＴ中で酵母細胞を再懸濁し；（ｇ）３０℃にて２５０ｒｐｍで３０分間、酵母細胞を温置し；（ｈ）１Ｍソルビトール／１ｍＭ  ＣａＣｌ２で酵母細胞を洗浄し；（ｉ）酵母細胞エレクトロポレーション縣濁液を形成させるために、１Ｍソルビトール／１ｍＭ  ＣａＣｌ２中で酵母細胞を再縣濁し；（ｊ）酵母細胞−ＤＮＡエレクトロポレーション縣濁液を形成させるために、酵母細胞エレクトロポレーション細胞縣濁液の一部をＤＮＡペレットに添加し；（ｋ）約０．５ｋＶから約２．５ｋＶの範囲及び２５μＦの静電容量で、酵母細胞−ＤＮＡエレクトロポレーション縣濁液をエレクトロポレーション処理し、（ｌ）エレクトロポレーション処理される酵母細胞−ＤＮＡエレクトロポレーション縣濁液に１Ｍソルビトール／ＹＰＤ（最終濃度：０．５Ｍソルビトール、０．５ｘＹＰＤ）の１：１混合物を添加し、３０℃で１時間温置し；（ｍ）酵母細胞をペレット化し、１０ｍＬ  １Ｍソルビトール中で再懸濁する段階の２以上を含む、ＤＮＡで酵母を形質転換するための方法を提供する。
【００６５】
添付の図面とともに読む場合、好ましい実施形態の次の記述から、本発明の前述及びその他の目的、特性及び長所ならびに本発明そのものがより詳細に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、ベクター：挿入物及び電圧２．５ｋＶ／ｃｍから１２．５ｋＶ／ｃｍの関数としてのコロニー数を示す、表１のデータのグラフ表示を示す。
【図２】図２は、ベクター：挿入物及び電圧２．５ｋＶ／ｃｍから１２．５ｋＶ／ｃｍの関数としてのコロニー数を示す、表３のデータのグラフ表示を示す。
【図３】図３は、キュベットあたりの体積を増加させることによって、エレクトロポレーション効率が顕著に向上することを示す。
【図４】図４は、（ベクター：挿入物比ではなく）ＤＮＡ投入量増加及び高電圧が最大形質転換効率に重要であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
（発明の詳細な記述）
いくつかの既に明らかにされた条件を試験し、組み合わせることによって、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対する高効率エレクトロポレーションプロトコールが確立された（Ｃｈａｏ、Ｇ．ら（２００６）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１：７５５−６８；Ｂｅｃｋｅｒ、Ｄ．Ｍ．及びＧｕａｒｅｎｔｅ、Ｌ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：１８２−７；Ｈｅｌｍｕｔｈ、Ｍ．ら（２００１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９３：１４９−５２；Ｎｅｕｍａｎｎ、Ｅ．ら（１９９６）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７１：８６８−７７；Ｓｉｍｏｎ、Ｊ．Ｒ．（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：４７８−８３；Ｓｕｇａ、Ｍ．及びＨａｔａｋｅｙａｍａ、Ｔ．（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．４３：２０６−１１；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｊ．Ｒ．ら（１９９８）Ｙｅａｓｔ  １４：５６５−７１）。これらには、エレクトロポレーション緩衝液中での、細胞調節剤としての酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）の組み合わせ（これらの両者とも酵母形質転換の頻度を促進するために使用されてきた。）（Ｈｅｌｍｕｔｈ、Ｍ．ら（２００１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９３：１４９−５２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｊ．Ｒ．ら（１９９８）Ｙｅａｓｔ  １４：５６５−７１；Ｇｉｅｔｚ、Ｒ．Ｄ．ら（１９９５）Ｙｅａｓｔ  １１：３５５−６０）及びソルビトール及び塩化カルシウムの包含（Ｂｅｃｋｅｒ、Ｄ．Ｍ．及びＧｕａｒｅｎｔｅ、Ｌ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：１８２−７；Ｈｅｌｍｕｔｈ、Ｍ．ら（２００１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９３：１４９−５２；Ｎｅｕｍａｎｎ、Ｅ．ら（１９９６）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７１：８６８−７７）が含まれる。
【００６８】
定義：
「発現ベクター」という用語は、自己増殖部位（ＡＲＳ）、転写開始部位及び、宿主生物中で発現させようとするタンパク質をコードする少なくとも１つの構造遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトを意味する。複製部位（ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）又は複製起点は、クローニング及び発現ベクターの複製を調節する何らかのＤＮＡ配列である。発現ベクターはまた、通常、宿主酵母におけるタンパク質の発現を調節する、１以上のエンハンサー及び／又はプロモーター、サプレッサー及び／又はサイレンサー及び終結因子などの適切な調節領域も含有する。本発明による発現ベクターはまた、本明細書中に記載のような必須遺伝子を含む選択マーカーも含有し得る。本発現ベクターはまた、場合によっては、広く利用可能であり、当業者にとって周知であるその他の選択可能マーカーも含有する。発現ベクターは、ベクターの一種である。ベクターは、場合によっては、１以上の酵母株由来の１以上のＡＲＳ配列（エレメント）を含み得る。
【００６９】
「操作可能に連結される」という用語は、ＤＮＡセグメントがその意図する目的に呼応して機能するように、ＤＮＡセグメントが配置されることを意味する（例えば、転写がプロモーターで開始し、コードセグメントを通じて転写終結因子まで進行する。）。
【００７０】
「形質転換」という用語は、遺伝子型を変化させるレシピエント酵母宿主細胞へのＤＮＡ又はその他の核酸の導入を意味する。
【００７１】
「形質転換体」又は「形質転換（された）細胞」という用語は、形質転換を受けた、レシピエント酵母宿主細胞及びその子孫を意味する。
【００７２】
本発明のエレクトロポレーション法に有用なベクターには、ｐＹＤベクター、酵母細胞により増殖させられ得る、何らかのその他のベクター及びそれらの派生コンストラクト又は一般に核酸が含まれる。本発明の発現ベクターは、そのベクターが宿主酵母細胞を形質転換するか、それに遺伝子移入するか又は形質導入し得る限り、ベクターのあらゆる型に基づき得る。好ましい実施形態において、本発現ベクターは、酵母プラスミド、特にＳ．セレビシエ由来のものに基づく。酵母細胞の形質転換後、ライブラリ配列をコードする外来性ＤＮＡがその細胞により取り込まれ、次に形質転換された細胞により発現される。
【００７３】
より好ましくは、本発現ベクターは、Ｅ．コリ又は酵母の何れかにおいて増殖させられ得る酵母−細菌シャトルベクターであり得る（Ｓｔｒｕｈｌら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：１０３５−１０３９）。ｐＢＲ３２２などのＥ．コリプラスミドＤＮＡ配列の包含により、Ｅ．コリでのベクターＤＮＡの定量的調製が容易になり、従って酵母の効率的な形質転換が容易になる。
【００７４】
シャトルとして作用し得る酵母プラスミドベクターの型は、複製ベクター又は統合ベクターであり得る。複製ベクターは、機能的なＤＮＡ複製起点の存在に基づいて、酵母の染色体ＤＮＡとは独立して、それ自身の維持を媒介可能な酵母ベクターである。統合ベクターは、複製及び従って宿主細胞での組み換えＤＮＡの継続的な維持を容易にするための、染色体ＤＮＡでの組み換えに依存する。複製ベクターは、ＤＮＡ複製起点が内在性の２ミクロンプラスミド酵母由来である、２ミクロンベースのプラスミドベクターであり得る。あるいは、この複製ベクターは、自己複製（ＡＲＳ）ベクターであり得、この場合、「見かけの」複製起点は、酵母の染色体ＤＮＡ由来である。場合によっては、複製ベクターは、上記のＤＮＡ複製起点の１つに加えて、セントロメアを有することが知られている酵母染色体ＤＮＡの配列を有する、セントロメア（ＣＥＮ）プラスミドであり得る。
【００７５】
本ベクターは、閉環型又は線状形態で酵母細胞に形質転換され得る。ベクターを組み込むことによる酵母の形質転換は、遺伝性の安定性があるにもかかわらず、ベクターが閉環形態である場合、効率的でない可能性がある（例えば、収率が僅か約１−１０個の形質転換体／μｇＤＮＡ）。酵母染色体ＤＮＡと相同であるＤＮＡ配列に自由端がある線状化ベクターは、高効率で酵母を形質転換し（１００−１０００倍）、この形質転換ＤＮＡは、一般に切断部位と相同な配列に組み込まれることが分かっている。従って、適切な制限エンドヌクレアーゼでベクターＤＮＡを切断することによって、形質転換効率を上昇させ、染色体組み込みの部位を標的化することが可能である。統合的な形質転換は、形質転換の効率が十分に高く、組み込みに対する標的ＤＮＡ配列が、宿主細胞の代謝に必須の遺伝子を破壊しない領域内であるならば、醸造酵母の遺伝子組み換えに適用可能であり得る。
【００７６】
高コピー数（およそ２０−５０コピー／細胞）を有するＡＲＳプラスミドは、最も不安定である傾向があり、世代あたり１０％を超える頻度で失われる。しかし、ＡＲＳプラスミドの安定性は、セントロメアの接着により向上させることができ；セントロメアプラスミドは、細胞１個あたり１又は２コピー存在し、１世代あたりの喪失は僅かおよそ１％である。関心のある何らかの遺伝子を含む本発明のエレクトロポレーション法を用いた酵母宿主細胞による発現のためのタンパク質の非限定例には、抗体及び抗体断片、ホルモン、サイトカイン及びリンホカイン、受容体、接着分子及び酵素が含まれる。
【００７７】
本発明のエレクトロポレーション法により形質転換され得る酵母株には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス属及びシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｐｏｍｂｅ）などのシゾサッカロミセス属の酵母種が含まれる。ある実施形態において、本酵母細胞は２倍体酵母細胞である。あるいは、本酵母細胞は、酵母半数体細胞の「ａ」及び「α」株などの半数体細胞である。
【００７８】
本発明は、１以上の核酸コンストラクトとともに酵母を含有する細胞縣濁液をエレクトロポレーション処理することを含む、酵母細胞の形質転換のための方法を提供する。酵母細胞の形質転換の結果、単一クローンから、（ａ）酵母表面タンパク質に連結されるか又は、酵母細胞表面タンパク質もしくはその他の成分との特異的な共有結合もしくは非共有結合の相互作用を介した会合により酵母細胞の表面で提示される、ペプチド又はタンパク質；（ｂ）細胞内で発現されるペプチド又はタンパク質；又は（ｃ）培地などの細胞外空間に分泌されるか又は固体表面に沈積するペプチド又はタンパク質に対してスクリーニングを行うために使用することができる酵母細胞集団（即ち、酵母ライブラリ又はライブラリ）まで、得ることができる。このような酵母ライブラリは、都合よく、複数回の適用、酵母細胞中に導入され得るかもしくは外来性に添加され得る、別のタンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその他の化学物質に対する、ペプチドもしくはタンパク質間の相互作用について、スクリーニング又は特性分析を行いやすい可能性がある。具体例は、酵母ディスプレイ、酵母２ハイブリッド、酵母３ハイブリッドなどで見られるものである。
【００７９】
本発明は、酵母細胞を形質転換することに十分である、抵抗、電場強度及びパルス持続時間の１以上を用いて、１以上の制御配列及び１以上の遺伝子又は遺伝子セグメントを含む１以上の核酸コンストラクトとともに酵母を含有する細胞縣濁液をエレクトロポレーション処理することを含む、酵母細胞の形質転換に対する方法を提供する。
【００８０】
ある実施形態において、電場強度は、約２．５ｋＶ／ｃｍから約１２．５ｋＶ／ｃｍである。ある種の実施形態において、電場強度は、約０．５ｋＶ／ｃｍ、約１．０ｋＶ／ｃｍ、約１．５ｋＶ／ｃｍ、約２．０ｋＶ／ｃｍ又は約２．５ｋＶ／ｃｍである。これらの値は、エレクトロポレーションキュベットが０．２ｃｍのギャップを有することを考慮している。より高い電場強度が可能であるが、しかしそれらの実用性は、より強いパルスを送ることができる装置の開発に大きく依存する。
【００８１】
ある実施形態において、パルス持続時間は、約３ミリ秒から約１０ミリ秒である。特定の実施形態において、パルス持続時間は約４．８ミリ秒である。
【００８２】
本発明のエレクトロポレーション法による細胞の処理は、電極対の間で酵母細胞縣濁液に電場をかけることにより行われる。この電場強度は、細胞のエレクトロポレーションが、細胞に対して損傷なく又は最小限の損傷で行われるように、合理的に、的確に調整しなければならない。電極間の距離を測定することができ、式Ｅ＝Ｖ／ｄに従う適切な電圧を電極にかけることができる（Ｅ＝電場強度（Ｖ／ｃｍ；Ｖ＝電圧（ボルト）及びｄ＝距離（ｃｍ））。
【００８３】
本明細書中に記載の手順を行うためのパルス発生装置は、長年にわたり市販されてきた。ある適切なシグナル発生装置は、Ｇｅｎｅ  ＰｕｌｓｅｒＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）である。典型的な設定は、静電容量エクスペンダープラス（ｅｘｐｅｎｄｅｒ  ｐｌｕｓ）及びパルスコントローラープラスモジュール（ｐｕｌｓｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ  ｐｌｕｓｅ  ｍｏｄｕｌｅ）に連結されるＧｅｎｅ  ＰｕｌｓｅｒＩＩからなる。
【００８４】
市販されているさらなるエレクトロポレーションモデルには、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＭＸｃｅｌｌシステム又はＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘ  ｃｅｌｌ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｃｅｌｌｊｅｃｔ  Ｐｒｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ及びその他のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｒ）エレクトロポレーションシステム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ）、ＥＣＭエレクトロポレーションジェネレーター及びＢＴＸ（Ｒ）ＨＴ９６ウェルエレクトロポレーションシステム（ＢＴＸ、Ｈａｒｖａｒｄ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）が含まれ、これらは全て、本明細書中で開示される条件を用いて酵母細胞をエレクトロポレーション処理するのに適切な装置である。
【００８５】
酵母細胞へのＤＮＡの導入を促進するために、本発明内でエレクトロポレーションを使用する。エレクトロポレーションは、細胞膜を一過性に透過性にして、細胞内にＤＮＡなどの巨大分子を通すことができるようにするための、パルス状電場を使用するプロセスである。しかし、ＤＮＡが細胞に移される実際の機構はよく理解されていない。カンジダ・ファマータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆａｍａｔａ）の形質転換に対して、例えば、約１０から約１３ｋＶ／ｃｍの電場強度及び約Ｒ５（１２９オーム）の抵抗値及び約４５ｍｓの時定数を有する実験的減衰パルス状電場に細胞が曝露される場合、驚くべきことにエレクトロポレーションが有効である。通常、抵抗及び静電容量は、選択されたエレクトロポレーション装置に依存して、既存であるか又は使用者により選択され得るかの何れかである。何れにしても、この装置は、必要に応じて電場強度及び減衰パラメータを与えるために、製造者の説明書に従い、設定される。
【００８６】
本発明は、何らかの１以上の所望の内在性（即ちその酵母細胞内に天然に存在する）又は異種遺伝子の高レベル発現を可能にする、酵母の形質転換の高効率法にさらに関する。本発明の方法は、例えば抗体又はキメラ又はその断片を発現するライブラリを調製するための方法にさらに関する。
【００８７】
ある場合において、関心のある遺伝子を担う発現ベクターは、単一クローン又は、細胞内タンパク質（例えば、核又は細胞質タンパク質）、膜タンパク質（例えば、膜貫通タンパク質又は膜結合タンパク質）又は分泌タンパク質を発現する多くの形質転換細胞からなるライブラリを作製するために、エレクトロポレーションにより酵母宿主細胞に形質転換され得る。タンパク質を精製し、タンパク質機能を調べ、タンパク質−タンパク質相互作用を同定するために又は新規タンパク質結合物もしくは相互作用パートナーを同定するために、形質転換細胞又はライブラリを使用することができる。抗体及び抗体断片を提示するか又は発現する非常に大きな酵母ライブラリを作製する能力は重要な点である。選択抗原に結合する抗体を同定するために、このライブラリを標的抗原による選択に供することができる。
【００８８】
形質転換酵母は、人工的に構築されたプラスミドを喪失する傾向があるので、それらにおいて正の選択圧を与えるように培地を使用することは有利である。その株が主要代謝産物に対して栄養要求性変異株である場合及び使用されるベクタープラスミドが株原栄養性を回復することができるマーカー遺伝子を含む場合（例えば上述のＬＥＵ２遺伝子）、培地からの代謝産物を除外することによってこの選択圧が働き得る。同じ結果を得るためにその他の手段が存在し、本発明を実施するためにも使用され得る。
【００８９】
関心のある構造遺伝子の性質に依存して、産物又は発現産物は、酵母宿主細胞の細胞質に留まり得るか又は分泌され得る。細胞中に留まるタンパク質だけでなく、分泌されるタンパク質も可溶性であることが分かっている。産物又は発現産物が酵母宿主細胞中に留まるべきものである場合、これは、形質転換体が高密度に到達するまで、所望産物の発現又は産生が殆ど又は全くないように、誘導性転写開始領域を有することが一般には望ましいものであり得る。産物又は発現産物が発現されるのに十分な時間後、従来の手段、例えば遠心、溶解及び関心のある産物の単離によって、その細胞を単離し得る。産物の性質及び使用に依存して、溶解物を、クロマトグラフィー、電気泳動、溶媒抽出、結晶化、透析、限外ろ過などの様々な精製法に供し得る。クロマトグラフィーの方法には、以下に限定されないが、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び当業者にとって公知のクロマトグラフィーのその他の方法が含まれる。精製度は、約５０％から９０％以上、好ましくは約１００％まで、変動し得る。
【００９０】
あるいは、関心のある発現産物又は産物は、培地中に分泌され得、継続的に産生され、培地を一部採取した場合、所望の産物を例えばカラム又はアフィニティークロマトグラフィー、限外ろ過、沈殿などにより抽出し、使用した培地を廃棄するか又は必須成分を戻すことにより再循環させる。限外ろ過からの産物を含有する透過液は、さらなる蒸発により、さらに濃縮に供され、続いて結晶化又はアルコール及び／又はｐＨ調整を用いた沈殿に供され得る。当業者は、多くのプロセスの選択肢を知っている。産物が分泌されるべきものである場合、非構成領域が使用され得るが、通常、構成的転写開始領域が使用される。
【００９１】
別段の断りがない限り、本明細書中で新しく記載される全てのヌクレオチド配列は、自動ＤＮＡ配列決定装置（例えば、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．からのモデル３７７など）を用いて決定した。従って、当技術分野で公知のように、この自動化法により決定された何らかのＤＮＡ配列に対して、本明細書中で決定された何れのヌクレオチド配列もある程度のエラーを含有し得る。自動化法により決定されたヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列と、通常、少なくとも約９０％同一、より一般的には少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当技術分野で周知の手動式ＤＮＡ配列決定法を含むその他の方法によって、より正確に決定され得る。
【００９２】
例示
【実施例１】
【００９３】
ベクターＤＮＡの調製
ｓｃＦｖ＋３００ｂｐ  ＤＮＡ断片での組み換えでの使用に対して、制限酵素ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩによりｐＹＤｓＴｅｖベクターを消化した。効率を向上させ、非切断ベクターが形質転換されないようにするために、ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ消化ベクターをＢｇｌＩＩ及びＨｐａＩ（両者ともスタッファー内で切断）でさらに消化した。
【００９４】
Ｂｉｏｌｉｎｅ（Ｒａｎｄｏｌｐｈ、ＭＡ）からのＳｕｒｅｃｌｅａｎを用いて、消化ＤＮＡを精製した。簡潔に述べると、Ｓｕｒｅｃｌｅａｎの等体積と制限消化物を混合した。試料を室温で１０分間、温置した。次に、１３．２ｋ  ｒｐｍで１５分間、試料を遠心した。上清を廃棄し、７０％エタノール２．５ｘ試料体積でペレットを洗浄した。次に、１３．２ｋ  ｒｐｍで１５分間、試料を遠心した。上清を除去し、ペレットを風乾した。５−１０μＬ  ＴＥ  ｐＨ８中でペレットを再懸濁した。
【実施例２】
【００９５】
挿入ＤＮＡの調製
相同組み換えを効率的に行うために、挿入物に十分なベクター配列５’及び３’（例えば約３００塩基対）を付加して関心のある挿入物を増幅するためにＰＣＲを用いて、挿入ＤＮＡを調製する。
【００９６】
ファーストストランド（１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡ合成のために免疫グロブリンのＩｇＭ及びＩｇＧ（ＩｇＭ／Ｇ  ｃＤＮＡに対して）又はＩｇＫ（ＩｇＫ  ｃＤＮＡ）とハイブリッド形成する免疫グロブリン定常領域プライマーを消化した（表２）。具体的には、ＩｇＭ／Ｇ  ｃＤＮＡに対して、プライマーＦｃｇＲｅｖ１、２及び３及びＦｃｍＲｅｖ１、２及び３を使用した。ＩｇＫファーストストランド（１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡ合成に対して、ＣｋＲｅｖ１、２及び３を使用した。
【００９７】
上記のプライマーを使用し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １ｓｔＳｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキットを用いて、ｃＤＮＡ合成反応を行った。
【００９８】
【表１】
0005647009.tif 000002
【００９９】
【表２】
0005647009.tif 000003
【０１００】
合成の段階２：
マスターミックス４５μＬ（８０μＬ  ＲＴ緩衝液（１０ｘ）、１６０μＬ  ＭｇＣｌ２、８０μＬ  ０．１Ｍ  ＤＴＴ、４０μＬ  ＲＮＡｓｅ  Ｏｕｔを含む調製済み保存液）を各冷５０μＬ反応液に添加し、試験管を４２℃で２分間置いた。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩリバーストランスクリプターゼ５μＬを各反応試験管に添加し、４２℃で５０分間温置し、７０℃に１５分間移し、次いで４℃に移した。ＲＮＡｓｅＨ５μＬを各反応に添加し、次いで３７℃で２０分間温置した。４回のＩｇＧ／Ｍ反応を貯え、２回のＩｇＫ反応物を貯えた。
【実施例３】
【０１０１】
ヒト脾臓ＩｇＧ／Ｍ  ＶＨ及びＩｇＫ  ＶＬ  ＤＮＡの作製
Ｓｂｌａｔｔｅｒｏ及びＢｒａｄｂｕｒｙ（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：２７１−２７８により定められたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ヒトＶＨ及びＶＫ免疫グロブリンの様々な種類を増幅した。
【０１０２】
８ｘ１００μＬ試料ＶＨ反応液
８０μＬ  １０ｘＰＣＲ反応緩衝液
８μＬ  ｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）
３２μＬ  ＭｇＳＯ４（５０ｍＭ）
８μＬ  ＶＨバックプライマー（２０μＭ）
８μＬ  （各５μＭ／２０μＭ  ３’プライマートータル）に対する、ＶＨ１／２、ＶＨ４／５、ＶＨ３及びＶＨ６の当モル混合液
１６μＬ  ＩｇＭ／Ｇ  ｃＤＮＡ
８μＬ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＨｉＦｉ
６４０μＬ  ｄｄ水
１００μＬ／ｒｘｎ
８ｘ１００μＬ試料ＶＫ反応液
８０μＬ  １０ｘＰＣＲ反応緩衝液
８μＬ  ｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）
３２μＬ  ＭｇＳＯ４（５０ｍＭ）
８μＬ  ＶＫバックプライマー（２０μＭ）
８μＬ  ＶＫ１、ＶＫ２／４、ＶＫ３及びＶＫ５の当モル混合液（各５μＭ／２０μＭ  ３’プライマートータル）
１６μＬ  ＩｇＫ  ｃＤＮＡ
８μＬ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＨｉＦｉ
６４０μＬ  ｄｄ水
１００μＬ／ｒｘｎ
ＰＣＲプログラム
１．９４℃で２分間
２．９４℃で３０秒間
３．５５℃で３０秒間
４．６８℃で３０秒間
５．段階２に戻って３９回繰り返し
６．６８℃５分間
７．４℃で維持。
【０１０３】
１％ＧＴＧアガロースゲル上で反応物を精製した。Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて、適切なサイズ、約４００ｂｐのバンドを精製した。スピンカラム１本あたりアガロースを含有するＤＮＡ０．４ｍｇを使用した。５５℃に予め温めたＥＢ５０μＬで試料を溶出した。類似試料を貯え、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｄｅｌａｗａｒｅ）を用いてＡ２６０／２８Oを測定した。
【実施例４】
【０１０４】
ＶＨ／ＶＫ  ｓｃＦｖの作製
重複伸長（ＳＯＥ）ＰＣＲにより重ね継ぐことによって、ＶＨ／ＶＫ  ｓｃＦｖを作製した。ＶＨ  Ｆｏｒ及びＶＫ  Ｂａｃｋプライマーは、ｓｃＦｖ分子を作製するためにＶＨ及びＶＬ領域を連結する（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを生成させる相同性を有している。反応を次のように設定した。
【０１０５】
１００μＬ／ｒｘｎ（例としてＶＨ１０／ＶＫアセンブリ）で２４ｒｘｎ
２４０μＬ  １０ｘＰｌａｔ  Ｔａｑ  ＨｉＦｉ緩衝液
２４μＬ  ｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）
９６μＬ  ＭｇＳＯ４（５０ｍＭ）
２４μＬ  ｓｃＦｖ  Ｒｅｖ（２０μＭ）
２４μＬ  ｓｃＦｖ  Ｆｏｒ（２０μＭ）
１４１μＬ  ＶＨ１０バック（ＶＨ  ２４ｐｍｏｌ／１００μＬ  ｒｘｎあたり１ｐｍｏｌ）
７２μＬ  当モル混合液ＶＫ１、２、９及び１２ＤＮＡ（２４ｐｍｏｌトータル／１００μＬ  ｒｘｎあたり、各０．２５ｐｍｏｌ  ＶＫ）
２４μＬ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＨｉＦｉ
１７５５μＬ  ｄｄ水
１００μＬ／ｒｘｎ
ＰＣＲプログラム
１．９４℃で２分間
２．９４℃で３０秒間
３．５５℃で３０秒間
４．６８℃で１分間
５．段階２に戻り３９ｘ
６．６８℃で５分間
７．４℃で維持。
【０１０６】
ＶＨ又はＶＫゲル断片に対して、上述したように、ｓｃＦｖバンド（約８００ｂｐ）をゲル精製した。
【０１０７】
ｐＹＤ５’３００ｂｐ断片とのＳＯＥ  ＰＣＲでの使用のために、同様の試料を溜めた。
【０１０８】
形質転換効率を確実に向上させるために、発明者らは、ｐＹＤベクターにおけるｓｃＦｖ挿入部位（ＳｆｉＩ）の相同５’の約３００ｂｐを有する挿入ＤＮＡ断片を操作した。ヒト脾臓ｓｃＦｖにこのホモロジーを付加するために、ｐＹＤ１ｓＴｅｖ  ＳｆｉＩ部位のすぐ上流の領域に相補的であるプライマーを設計した（ｐＹＤ５ｐｒｅｖ）。ＳＯＥ  ＰＣＲにより既存の脾臓ｓｃＦｖへ添加しようとする約３００ｂｐ断片を作製するために、ｐＹＤ１  ５’プライマー（５１０７）と組み合わせてこのプライマーを使用した。
【０１０９】
５１０７／ｐＹＤ５ｐｒｅｖ  ＰＣＲ
１μＬ  ｐＹＤｓＴｅｖ（１０ｎｇ／μＬ）
１０μＬ  １０ｘＰｌａｔ  Ｔａｑ  ＨｉＦｉ緩衝液
４μＬ  ＭｇＳＯ４（５０ｍＭ）
１μＬ  ｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）
１μＬ  ５１０７（２０μＭ）
１μＬ  ｐＹＤ５ｐｒｅｖ（２０μＭ）
１μＬ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＨｉＦｉ
８０μＬ  ｄｄ水
１００μＬ／ｒｘｎ
ＰＣＲプログラム
１．９４℃で２分間
２．９４℃で３０秒間
３．５５℃で３０秒間
４．６８℃で３０秒間
５．段階２に戻り３９ｘ
６．６８℃で５分間
７．４℃で維持。
【０１１０】
ＶＨ又はＶＫゲル断片に対して、上述したように、５１０７／ｐＹＤ５ｐｒｅｖバンド（約３００ｂｐ）をゲル精製した。脾臓ｓｃＦｖとのＳＯＥ  ＰＣＲでの使用のために、同様の試料を貯えた。
【０１１１】
ｓｃＦｖ＋３００ＰＣＲ（１６ｘ１００μＬ  ｒｘｎ混合液）
１６２μＬ  １０ｘＰｌａｔ  Ｔａｑ  ＨｉＦｉ緩衝液
１６．２μＬ  ｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）
６４．８μＬ  ＭｇＳＯ４（５０ｍＭ）
１６．２μＬ  ５１０７（２０μＭ）
１６．２μＬ  ｓｃＦｖ  Ｆｏｒ（２０μＭ）
３２．４μＬ  ＶＨ／ＶＫ  ｓｃＦｖ  ＤＮＡ
１６．２μＬ  ５１０７／ｐＹＤｐｒｅｖ５  ＤＮＡ
１６．２μＬ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＨｉＦｉ
１２７９．８μＬ  ｄｄ水
１００μＬ／ｒｘｎ
【０１１２】
上記のｓｃＦｖ反応に対するものと同様にＰＣＲ反応を行った。ＶＨ又はＶＫゲル断片に対して上記で述べたように、ＳｃＦｖ＋３００ｂｐ（約１１００ｂｐ）をゲル精製した。エレクトロポレーション反応での使用のために、同様の試料を貯えた。
【実施例５】
【０１１３】
先行技術の酵母ライブラリ形質転換プロトコール
次のものは、先行技術の酵母形質転換プロトコールである。５ｍＬ  ＹＰＤ培地にＥＢＹ１００コロニーを接種し（ＹＰＤプレート上に新たに画線接種）、３０℃で一晩増殖させる。一晩培養物を用いて、６００ｎｍで０．１の吸収まで５０ｍＬ培養物をＹＰＤ培地中に接種し、３０℃で、６００ｎｍで約１．３から１．５の吸収になるまで約６時間、増殖させた。細胞は対数増殖期の初期から中期でなければならない。後期の対数又は静止期の細胞を用いると、形質転換効率が実質的に低下する。細胞が増殖している間、製造者のプロトコールに従い、ＰｅｌｌｅｔＰａｉｎｔを用いて形質転換のためのＤＮＡを沈殿させる。通常、約５ｘ１０７個のライブラリを作製するために、挿入物５ｍｇ及びカットベクター１ｍｇをそれぞれ含む、４個のエレクトロポレーションキュベットに入れるべきＤＮＡを使用する。骨格のみの対照もまた調製する。ＤＮＡはペレット形態のままにしておく。挿入物：骨格比は、キュベット１個あたり少なくとも１ｍｇを用いて、５：１から１：１で変動し得る。
【０１１４】
６００ｎｍで約１．３−１．５の吸収に細胞が到達したら、５００μＬ  Ｔｒｉｓ−ＤＴＴ緩衝液を培養物に添加し、３０℃で１５分間振盪器で温置する。形質転換効率は、１０−２０分のＤＴＴ温置時間に対して比較的一定であるが、２０分を超える温置の場合はかなり低下する。４℃にて２５００ｇで３分間、細胞をペレット化し、２５ｍＬ氷冷Ｅ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、２７０ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で洗浄する（例えば、すすぎ、再びペレット化し、上清を吸引）。１ｍＬ氷冷Ｅ緩衝液で細胞を再び洗浄し、３００μＬの総体積になるようにしてＥ緩衝液中で再懸濁する。細胞縣濁液（キュベット１個あたり５０μＬ）の適切な体積中でＤＮＡ対照ペレットを再懸濁する。細胞を氷上で維持する。再懸濁細胞−ＤＮＡ混合物５０μＬを予め冷却したエレクトロポレーションキュベットに対して等分し、パルスをかけるまで、エレクトロポレーションキュベットを氷上に置いておく。
【０１１５】
キュベットをジーンパルサーに搭載し、パルスコントローラーなしで０．５４ｋＶ及び２５μＦでエレクトロポレーション処理する。温（３０℃）ＹＰＤ培地１ｍＬをすぐにキュベットに添加する。エレクトロポレーションに対する典型的な時定数は、形質転換効率に大きな影響を与えず、約１５ｍｓから４０ｍｓの範囲である。
【０１１６】
パルスを受けたキュベットから１５ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎチューブに細胞を移す。キュベットから残存細胞を回収するために、各キュベットをさらなるＹＰＤ培地１ｍＬで洗浄する。３０℃で１時間細胞を振盪する。２５００ｇで５分間、細胞をペレット化し、上清を除去し、１０ｍＬ  ＳＤＣＡＡ培地で再懸濁する。形質転換効率を調べるために、連続希釈液をＳＤＣＡＡプレート上にプレーティングする。骨格のみの対照は、骨格＋挿入物形質転換の１％未満の効率であるはずである。細胞縣濁液を１００−１０００ｍＬ  ＳＤＣＡＡ培地＋ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ（１：１００希釈）入りのフラスコに移し、３０℃で２４から４８時間、温置する。８ｘ１０７ライブラリを作製するためにこの方法を使用し、この方法は、表３に記載の処理７に相当し、本発明の最適化プロトコール（実施例６参照）と比較して、０．４％の効率である。
【実施例６】
【０１１７】
本発明の方法２の酵母ライブラリ形質転換プロトコール
本発明は、例えば最大で２ｘ１０１０のサイズの酵母細胞ライブラリ作製のための、酵母細胞を形質転換する、高効率で及び迅速な方法を提供する。最適な条件を同定するために、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、スクロース、ソルビトール、酢酸リチウム、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の使用、エレクトロポレーション電圧、ＤＮＡ投入量及び細胞体積を含む複数成分及び条件を試験し、滴定した。
【０１１８】
本発明のエレクトロポレーションプロトコールは、Ｓｕｇａ及びＨａｔａｋｅｙａｍａ（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．４３：２０６−２１１；Ｎｅｕｍａｎｎら（１９９６）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．（１９９６）７１：８６８−８７７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９８）Ｙｅａｓｔ  １４：５６５−５７１；Ｂｅｃｋｅｒ及びＧｕａｒｅｎｔｅ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４、１８２−１８７；Ｍｅｌｉｈｏｎら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２２３−２２７；Ｈｅｌｍｕｔｈら（２００１）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９３：１４９−１５２のプロトコール；及び実施例５で提供されるプロトコールにおける改法である。
【０１１９】
酵母細胞の調製：静止期までＳ．セレビシエを一晩増殖させた。約０．３のＯＤ６００に到達するまで、培養物のアリコートをＹＰＤ培地１００ｍＬに接種した。遠心により回収する前に、ＯＤ６００が約１．６に到達するまで細胞を増殖させた。細胞をペレット化し、冷水で２回、５０ｍＬエレクトロポレーション緩衝液（１Ｍソルビトール／１ｍＭ  ＣａＣｌ２）で１回洗浄し、３０℃にて３０分間、０．１Ｍ  ＬｉＡｃ／１０ｍＭ  ＤＴＴ  ２０ｍＬ中で温置した。５０ｍＬエレクトロポレーション緩衝液で再び細胞を洗浄し、次いで１ｍＬ体積に到達するまでエレクトロポレーション緩衝液１００−２００μＬ中で縣濁した。これは、およそ１から１０ｘ１０９個の細胞／ｍＬに相当する。
【０１２０】
エレクトロポレーション：細胞縣濁液１００、２００、３００又は４００μＬを１個のキュベットあたりのエレクトロポレーション処理に対して使用し、対応する３、６、９又は１２μｇＤＮＡ挿入物とともに１、２、３又は４μｇの線状化ベクター（ベクター：挿入物比＝１：３）を使用した。ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒキュベット（０．２ｃｍ電極ギャップ）中、２．５ｋＶ及び２５μＦで細胞をエレクトロポレーション処理した。典型的なエレクトロポレーション時定数は、３．０から４．５ミリ秒の範囲であった。エレクトロポレーション後、１Ｍソルビトール：ＹＰＤ培地の１：１混合液１０ｍＬ中で細胞を縣濁し、３０℃で１時間温置した。次に、細胞を回収し、２０ｇ／Ｌグルコース、６．７ｇ／Ｌ酵母窒素塩基（アミノ酸なし）、５．４ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、８．６ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ及び５ｇ／Ｌカザミノ酸を含有したＳＤ−ＵＴ培地（−ｕｒａ、−ｔｒｐ）中で培養した。選択ＳＤ−ＵＴプレート上に形質転換細胞の１０倍連続希釈物をプレーティングすることによって形質転換体の数を調べた。図３を参照して、７２時間後、コロニーを計数し、形質転換効率（Ａ）を形質転換体の数／μｇベクターＤＮＡの平均±標準偏差として表し；収率（Ｂ）は、キュベット１個あたりの形質転換体の総数の平均±標準偏差として表した。
【０１２１】
ＬｉＡｃ、ＤＴＴ、ＣａＣｌ２及びソルビトールの組み合わせの結果、常に、形質転換効率は、１．６ｘ１０個の細胞／ｍＬの密度で、１μｇベクターＤＮＡ及び１００μＬ酵母細胞から、３±１ｘ１０７個の形質転換体／μｇ（ベクターＤＮＡ）（６００ｎｍの光学密度により決定される場合、１ＯＤ＝１０７個の細胞と仮定）となった（図３）。このことから、酵母細胞のおおよそ２％が首尾よく形質転換され、１個のエレクトロポレーションキュベットから３±１ｘ１０７個のライブラリサイズが予想され得ることが示唆された。さらにより大きいライブラリを作製するために、個々のキュベットあたりの最適細胞体積を評価した。驚くべきことに、キュベット１個あたり１００μＬから２００μＬに細胞体積を増加させた場合、形質転換効率が、１ｘ１０８個の形質転換体／μｇベクターＤＮＡへと顕著に向上した。０．２ｃｍギャップキュベット中の最大４００μＬ細胞体積で、同じ密度及び細胞対ＤＮＡ比を用いて、１個のキュベットから、５ｘ１０８という規模のライブラリサイズを容易に作製することができた（図３）。
【０１２２】
このエレクトロポレーション法は、様々な操作者によって及び２種類の異なるエレクトロポレーター（ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  ＰｕｌｓｅｒＴＭモデル＃１６５２０７６及びＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（Ｒ）ＩＩモデル＃１６５２１０８）において、同様の形質転換効率が得られたので、再現性が高い。
【実施例７】
【０１２３】
ＬｉＡｃ、ＤＴＴ、ソルビトール及びＣａＣｌ２の使用を比較することによる、Ｓ．セレビシエのエレクトロポレーション効率の上昇
表３は、実施例７の方法ならびにその方法における改法に対する、エレクトロポレーション効率、キュベット１個あたりの収率、％効率及び最大ライブラリサイズを示す。
【０１２４】
【表３】
0005647009.tif 000004
【０１２５】
組み合わせプロトコールは、ベクター４μｇ及びＤＮＡ挿入物１２μｇとの酵母縣濁液（１．６ｘ１０９／ｍＬ）４００μＬのエレクトロポレーションの、実施例７に記載のものである。その他の処理に対して、組み合わせプロトコールは、次の変更点を除き、実施例７に従った：（２）ＤＴＴのみで細胞を前処理し、（３）ＬｉＡｃのみで細胞を前処理し、（４）ＣａＣｌ２の代わりにＭｇＣｌ２を使用した。（５）エレクトロポレーション緩衝液からＣａＣｌ２を除き、（６）１Ｍソルビトールの代わりに２７０ｍＭスクロースを使用し、（７）エレクトロポレーション緩衝液として２７０ｍＭスクロース／１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を使用した。
【０１２６】
表２で示されるように、ＤＴＴ又はＬｉＡｃ前処理を除外した結果、それぞれ９３．３％及び８５．７％、効率が低下した。同様に、ソルビトールを除外するか又はこれをスクロースで置き換えることにより、９６％を超える効率低下が起こった（表２及びデータを示さず。）。これは、浸透圧を安定させ、エレクトロポレーション後の酵母膜の完全性を支えるソルビトールの能力が、少なくとも部分的に、高形質転換効率を達成することに関与するという以前の知見と矛盾しない（Ｂｅｃｋｅｒ、Ｄ．Ｍ．及びＧｕａｒｅｎｔｅ、Ｌ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：１８２−７；Ｗｅａｖｅｒ、Ｊ．Ｃ．ら（１９８８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２２９：３０−４）。おそらく細胞膜へのＤＮＡの結合を促進するために、エレクトロポレーション中にＣａＣｌ２が存在すること（Ｎｅｕｍａｎｎ、Ｅ．ら（１９９６）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７１：８６８−７７）は、それを除外した場合に形質転換効率が３０％とあまり低下せず、ＭｇＣｌ２でそれを置き換えても１１％しか低下しなかったので、あまり重要なパラメーターではないと思われる。
【実施例８】
【０１２７】
エレクトロポレーション効率における電圧の影響
エレクトロポレーション効率における電圧の影響を調べるために及び最良のベクター：挿入物比を決定するために、実験を行った。実験を２回行った。０．２ｃｍギャップキュベット中で、０．５−２．５ｋＶの範囲のいくつかの電圧を使用し、１：１から１：１０（ｗ／ｗ）の範囲のいくつかのベクター：挿入物比（ベクターＤＮＡ量は１μｇに一定に維持した。）で、実施例２のプロトコールを行った。上述のように、全ての反応物を濃縮し、ＳｕｒｅＣｌｅａｎを用いて沈殿させ、ｄｄ水中でＤＮＡペレットを再懸濁し、その後、細胞縣濁液を添加した。
【０１２８】
各実験において、上述のように酵母細胞を調製した。５回の反応に対して、ベクター／挿入物の体積を１１．６μＬに固定した。
【０１２９】
実験＃１
【０１３０】
【表４】
0005647009.tif 000005
【０１３１】
【表５】
0005647009.tif 000006
【０１３２】
結果：１．５から２．５の電圧範囲で１：１のベクター：挿入物比；１．０から２．５の電圧範囲で１：２のベクター：挿入物比；１．０から２．５の電圧範囲で１：３のベクター：挿入物比；０．５から２．５の電圧範囲で１：４のベクター：挿入物比；１．０から２．５の電圧範囲で１：５のベクター：挿入物比；及び１．０から２．５の電圧範囲で１：１０のベクター：挿入物比で、形質転換を検出した。全てのベクター：挿入物比に対して、２．０ｋＶの電圧を用いて、ピークコロニー数が達成された。最適条件は、１：４のベクター：挿入物比及び２．０ｋＶの電圧であると考えられる（３．６２ｘ１０８の遺伝子移入効率が達成された。）。
【０１３３】
実験＃２
【０１３４】
【表６】
0005647009.tif 000007
【０１３５】
【表７】
0005647009.tif 000008
【０１３６】
結果：１．０から２．５の電圧範囲で１：１のベクター：挿入物比；１．５から２．５の電圧範囲で１：２のベクター：挿入物比；１．０から２．５の電圧範囲で１：３のベクター：挿入物比；０．５から２．５の電圧範囲で１：４のベクター：挿入物比；１．０から２．５の電圧範囲で１：５のベクター：挿入物比；及び１．０から２．５の電圧範囲で１：１０挿入物比で、形質転換を検出した（１．５ｋＶではコロニーなし）。ベクター：挿入物比１：１に対して、２．０ｋＶの電圧を用いてピークコロニー数が達成された。全てのその他のベクター：挿入物比に対して、２．５ｋＶ電圧が最適であった。最適条件は、１：１０のベクター：挿入物比及び２．５ｋＶの電圧であると考えられる。この実験の結果から、最適電圧は２−２．５ｋＶであり、ベクターに対する挿入物の量を増加させても、１：２の比を凌ぐ顕著な利点は得られないことが示される。
【０１３７】
実験＃３：ＤＮＡ投入量増加及び高電圧は最大形質転換効率に重要である（しかし、ベクター：挿入物比は重要ではない。）。
【０１３８】
同じ１：３のベクター：挿入物比に維持しながら、ベクターＤＮＡ１、２、３、４又は８μｇとともに４００μＬ酵母縣濁液をエレクトロポレーション処理することによって、形質転換効率におけるＤＮＡ量の影響を調べた。実施例７に記載のようにＳ．セレビシエを処理した。１キュベットあたり１、２、３又は４μｇベクターを用いて、４００μＬ酵母細胞縣濁液（１．６ｘ１０９個の細胞／ｍＬ）をエレクトロポレーション処理した（ベクター：挿入物比＝１：３に維持）。図４を参照して、７２時間後、コロニー数を調べ、（Ａ）形質転換効率（ベクターＤＮＡ１μｇあたりの平均形質転換体±標準偏差）及び（Ｂ）形質転換収率（１個のキュベットあたりの形質転換体の総数±標準偏差）として表した。さらに、（Ｃ）２又は２．５ｋＶ及び様々なベクター：挿入ＤＮＡ比で４００μＬ酵母縣濁液をエレクトロポレーション処理した。ベクターＤＮＡ１μｇあたりの平均形質転換体として形質転換効率を表す。
【０１３９】
興味深いことに、各形質転換に対して４μｇベクターＤＮＡ以下を使用した場合、形質転換効率は顕著に変化せず、８μｇベクターＤＮＡ投入量では僅かに低下した（図４Ａ）。予想されるように、形質転換ライブラリサイズの収率は、ＤＮＡ投入量の増加に対応して向上した（図４Ｂ）。全体として、４μｇ線状化ベクターの使用は、最も都合よく効率的な条件であることが分かった。（１：３のベクター：挿入物比を達成するための）１２μｇＤＮＡ挿入物を減少させることができるか否かを調べるために、様々なベクター：挿入物比を試験した。結果から、形質転換効率に悪影響を与えることなく、この比を１：１．５という低い値にすることができることが示される（図４Ｃ）。しかし、ベクター：挿入物比が１：１より小さいか又は１：５より大きい場合、形質転換効率の低下が観察された（データ示さず。）。さらに、エレクトロポレーション電圧設定は、２．５ｋＶから２ｋＶ以下にエレクトロポレーション電圧を低下させると形質転換効率が顕著に低下するので、重要であることが分かった（図４Ｃ及びデータ示さず。）。
【実施例９】
【０１４０】
ナイーブヒト脾臓抗体ライブラリの多様性及び生産性
大きなヒト抗体ライブラリを作製するために、本発明のエレクトロポレーションプロトコールを使用した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び既に報告されているプライマー（Ｓｂｌａｔｔｅｒｏ、Ｄ．及びＢｒａｄｂｕｒｙ、Ａ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：２７１−８）を使用して、市販の脾臓ポリＡＲＮＡからヒトＶＨ及びＶκ  ｃＤＮＡ断片を個別に増幅した。各生殖細胞系列ファミリーがライブラリにおいて等しく示されるように、Ｖκ断片を均等に一緒に貯えた。重複ＰＣＲにより、ＶＨ及び貯えたＶκ断片からＳｃＦｖ断片を個別に調製した。線状ベクターＤＮＡと混合されたこれらのｓｃＦｖ断片から、エレクトロポレーションにより複数の酵母ライブラリを作製し、全てのＶＨ生殖細胞系列配列の均等な表示を維持するために、均等に一緒に貯えた。ｓｃＦｖ生殖細胞系列組成物を分析するために、多数の酵母コロニーの配列決定を行い、その結果から多様性が高いことが確認された。稀少なＶＨ７生殖細胞系列遺伝子を除き、全てのその他の生殖細胞系列遺伝子ファミリーが同定され、それらの表示は、発明者らのライブラリでのそれらの生殖細胞系列遺伝子数とおおよそ比例していた（表８参照）。同一のＶＨ配列は同定されなかったので、ライブラリ多様性は、Ｖκに対しては１０４の最大理論的多様性及びＶＨに対しては１０８の最大理論的多様性（約１０８個のドナーＢ細胞）と仮定すれば、１０１２の規模である可能性は９５％であると推定される（これはライブラリサイズによってのみ制限される。）。この高効率酵母エレクトロポレーションプロトコールを用いることにより、典型的なファージライブラリのサイズに匹敵するサイズの酵母ライブラリを構築することが現在可能である（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｈ．Ｒ．（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：１−３７；Ｓｂｌａｔｔｅｒｏ、Ｄ．及びＢｒａｄｂｕｒｙ、Ａ．（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：７５−８０）。実際に、単純に２０個のキュベットにエレクトロポレーションの規模を大きくすることにより、２ｘ１０１０酵母ライブラリを作製ために要する時間は僅か１日となり、１０９酵母ライブラリは現在、親和性成熟又はその他の最適化目的のために日常的に作製されている。
【０１４１】
【表８】
0005647009.tif 000009
【０１４２】
構築されたライブラリが適度に優れた親和性を有する抗体を産生することを明らかにするために、最初にライブラリサイズを約１０７個細胞に縮小するために磁気活性化細胞ソーティングを行い、次いで基本的に既に記載のようにＦＡＣＳを複数回行うことにより、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に対してヒト脾臓抗体ライブラリを選択した（Ｃｈａｏ、Ｇ．ら（２００６）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１：７５５−６８；Ｆｅｌｄｈａｕｓ、Ｍ．Ｊ．ら（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１６３−７０）。ＴＮＦαに対する複数の結合物が同定され、それらのＶＨは、ＶＨ１、ＶＨ３及びＶＨ４由来であり、ＶκはＶκ１及びＶκ２ヒト生殖細胞系列配列由来であり、このことから、このライブラリは、実際に、多様な抗体プールから抗原結合物を生み出したことが示される。ｓｃＦｖのうち１つは、ＴＮＦαに対して、４ｎＭの親和性を示し、別のものは４０ｎＭの親和性を示した。ＩｇＧ転換時に、４ｎＭ結合物は同様の結合親和性を維持し（ＥＬＩＳＡにより１．５ｎＭ）、一方、４０ｎＭ結合物は親和性の顕著な向上を示した（ＥＬＩＳＡにより０．３ｎＭ）。この見かけの親和性の上昇は、同じホモ三量体ＴＮＦαタンパク質で２つのＴＮＦαと相互作用する変換ＩｇＧの親和力によるものであり得る。さらなるライブラリ選択により、このライブラリからヒトＩＬ−１８に対する低ナノモル親和性抗体も同定された（データは示さず。）。
【０１４３】
最適のエレクトロポレーション条件を使用することによって、日常的に１ｘ１０８酵母形質転換体／μｇベクターＤＮＡの酵母形質転換効率を達成することができる。この形質転換効率は最小の細胞体積（１００μＬ）で達成されるので、自動及びマルチウェルエレクトロポレーション装置に非常に受け入れられ易い。例えば、９６−ウェルエレクトロポレーションプレートにおいてエレクトロポレーションを設定することによって、９．６ｘ１０９のライブラリサイズを達成することができることを構想し得る。このマルチウェルエレクトロポレーションが手動又は自動操作により１０から１１回繰り返される場合、１日で１０１１個の形質転換体より大きい酵母ライブラリを容易に構築することができる。構築されたライブラリのこの効率及び可能なサイズは、典型的なファージライブラリにほぼ等しく、酵母抗体ディスプレイ及び酵母ツーハイブリッド相互作用スクリーニングなど、本ライブラリに適用し得る様々な適用に対して、構築された酵母ライブラリの使用の成功率を最大化することにおいて非常に望ましい。
【０１４４】
【表９】
0005647009.tif 000010
【０１４５】
参照による組み込み
本願を通して引用され得る、全ての引用参照物（参考文献、特許、特許出願及びウェブサイトを含む。）の内容は、本明細書により、参照により明確に組み込まれる。本発明の実施は、別段の断りがない限り、当技術分野で周知である、細胞エレクトロポレーション及び酵母細胞生物学の従来技術を使用する。
【０１４６】
同等性
本発明は、本発明の精神又は不可欠な特徴から逸脱することなく、その他の具体的な形態で実施され得る。従って、先行する実施形態は、全ての点で、本明細書中に記載される本発明の制限ではなく、例示的なものであるとみなされるものである。このように、本発明の範囲は、先行する記述ではなく添付の特許請求の範囲により示され、従って、本特許請求の範囲の同等性の意義及び範囲内で行われる変更は全て、本発明に包含されるものとする。
【図１】
0005647009.tif 000011
【図２】
0005647009.tif 000012
【図３】
0005647009.tif 000013
【図４】
0005647009.tif 000014
【配列表】
0005647009000001.app