(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一および第二の融合タンパク質を含む二量体分子複合体であって、該融合タンパク質のそれぞれがＮ末端からＣ末端にかけて以下を含み：
（Ａ）Ｍ２″ＩｇＥスプライスバリアントのＣＨ４二量体化ドメイン；
（Ｂ）ＣＨ４二量体化ドメインに共有結合したアミノ酸リンカー；および
（Ｃ）ＩＩ型膜受容体の細胞外ドメイン、
第一の融合タンパク質のＣ末端Ｍ２″ＩｇＥスプライスバリアントＣＨ４二量体化ドメイン内のシステイン残基と第二の融合タンパク質のＣ末端Ｍ２″ＩｇＥスプライスバリアントＣＨ４二量体化ドメイン内のシステイン残基の間にジスルフィド結合を含む、分子複合体。
【請求項２】
アミノ酸リンカーがグリシンを含む、請求項１に記載の分子複合体。
【請求項３】
ＣＨ４二量体化ドメインのＣ末端Ｍ２″ＩｇＥスプライスバリアントが配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９または配列番号３０から選択される、請求項１に記載の分子複合体。
【請求項４】
ＩＩ型膜受容体が骨髄ＤＡＰ１２会合レクチン１（ＭＤＬ−１）受容体である、請求項１に記載の分子複合体。
【請求項５】
Ｎ末端からＣ末端にかけて以下を含む融合タンパク質：
（Ａ）以下からなる群から選択される生物学的エフェクター部分：
（１）単鎖抗体；
（２）Ｆａｂフラグメント；
（３）Ｉ型膜受容体の細胞外ドメイン；
（４）サイトカイン；
（５）ケモカイン；
（６）酵素；
（７）毒素；および
（８）検出可能マーカー；
（Ｂ）生物学的エフェクター部分に結合したＩｇＧ分子のヒンジ領域；および
（Ｃ）ヒンジ領域に共有結合したＩｇＥ分子のＣＨ４二量体化ドメイン。
【請求項６】
Ｎ末端からＣ末端にかけて以下を含む融合タンパク質：
（Ａ）Ｍ２″ＩｇＥスプライスバリアントＣ末端伸長を有するＣＨ４二量体化ドメイン；
（Ｂ）該ＣＨ４二量体化ドメインと共有結合したアミノ酸リンカー；および
（Ｃ）ＩＩ型膜受容体の細胞外ドメイン。
【請求項７】
請求項５または６に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項８】
発現コンストラクトである、請求項７の核酸分子。
【請求項９】
請求項８の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１に記載の二量体分子複合体および製薬的に許容される媒体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、第一および第二の融合タンパク質を含む二量体分子複合体であって、それぞれの融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端にかけて（ａ）生物学的エフェクター部分、（ｂ）その生物学的エフェクター部分と結合したＩｇＧ分子のヒンジ領域、および（ｃ）そのヒンジ領域と共有結合したＩｇＥ分子のＣＨ４二量体化ドメインを含み、第一の融合タンパク質のヒンジ領域内のシステイン残基と第二の融合タンパク質のヒンジ領域内のシステイン残基の間にジスルフィド結合を含む分子複合体を提供する。
【０００２】
好ましい生物学的エフェクター部分は、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｉ型膜受容体の細胞外ドメイン、サイトカイン、ケモカイン、酵素、毒素または検出可能マーカーである。より好ましい生物学的エフェクター部分は、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、毒素または検出可能マーカーである。
【０００３】
一実施態様において、本発明の二量体分子複合体は２つの融合タンパク質を含み、それぞれが同一の生物学的エフェクター部分を含む。別の実施態様において、その複合体中の２つの融合タンパク質はそれぞれ異なる生物学的エフェクター部分を含む。好ましい実施態様において、それらの生物学的エフェクター部分は、同じまたは異なる結合特異性を有する抗原結合部位である。
【０００４】
それぞれの融合タンパク質は、配列番号２５のアミノ酸残基２２３から２４３を含むヒンジ領域を含み、２４０−２４３位はテトラペプチドＶＦＬＦによって占められている。好ましい実施態様において、テトラペプチドＶＦＬＦは、ＤＳＥＹ、ＫＳＫＹ、ＤＥＥＹおよびＫＲＫＹからなる群から選択されるテトラペプチドにより置換されている。最も好ましい実施態様において、テトラペプチドはＤＳＥＹまたはＫＳＫＹである。
【０００５】
別の局面において、本発明は、第一および第二の融合タンパク質を含む二量体分子複合体であって、それぞれの融合タンパク質がＮ末端からＣ末端にかけて、（ａ）Ｍ２″ＩｇＥスプライスバリアントのＣＨ４二量体化ドメイン、（ｂ）そのＣＨ４二量体化ドメインと共有結合しているアミノ酸リンカーおよび（ｃ）ＩＩ型膜受容体の細胞外ドメインを含み、２つの融合タンパク質それぞれのＣ末端Ｍ２″ＩｇＥスプライスバリアントＣＨ４二量体化ドメイン内のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む分子複合体を提供する。好ましい実施態様において、Ｍ２″ＩｇＥスプライスバリアントは、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９または配列番号３０である。一実施態様において、ＩＩ型膜受容体は骨髄ＤＡＰ１２会合レクチン１（ＭＤＬ−１）受容体である。
【０００６】
別の局面において、本発明は二量体分子複合体を構成する融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。一実施態様において、その核酸分子は配列番号１の融合タンパク質をコードする。
【０００７】
別の局面において、本発明は、本発明の二量体分子複合体を含む医薬組成物を提供する。
【０００８】
別の局面において、本発明は、本発明の二量体分子複合体を用いる処置法に関する。好ましい実施態様において、処置法には、化学療法薬または毒素とコンジュゲートした上記の融合タンパク質により構成される二量体分子複合体を投与することが包含される。好ましい実施態様において、２つの融合タンパク質の少なくとも１つの生物学的エフェクター部分は抗原結合部位を含む。
【０００９】
別の局面において、本発明は、２つの融合タンパク質により構成され、第一の融合タンパク質の生物学的エフェクター部分が抗原結合部位を含み、第二の融合タンパク質の生物学的エフェクター部分が検出可能シグナルを含む本発明の二量体分子複合体を用いて、身体の標的領域をイメージングする方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａ−Ｄは様々な二量体分子複合体の模式図である。各複合体において、ジスルフィド結合は、その複合体を構成する融合タンパク質のヒンジ領域のシステイン間に形成される。図１Ａは、生物学的エフェクター部分が単鎖抗体である二量体分子複合体である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、生物学的エフェクター部分がＦａｂフラグメントである、２つの単一特異性二量体分子複合体である；これらの複合体は互いに、ヒンジ内の「野生型」テトラペプチドＶＦＬＦの置換に用いられた配列が異なっている。
【図１Ｃ】図１Ｃは、生物学的エフェクター部分が２つの異なるＦａｂフラグメントであり、それぞれの融合タンパク質がＣ末端に異なるＭ２″ＩｇＥスプライスバリアント（配列番号２６および２７）をさらに含む、二重特異性二量体分子複合体である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、生物学的エフェクター部分がＩ型膜受容体の細胞外ドメインである、二量体分子複合体である。
【図２】生物学的エフェクター部分がＩＩ型膜受容体の細胞外ドメインである、二量体分子複合体の模式図。
【図３】単鎖抗体１９Ｇ９ｓｃＦｖの作製過程を示す模式図。ＶＨおよびＶＬ領域を、制限部位およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカー（配列番号８）のオーバーラップ伸長部位を導入するプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。１５伸長サイクルを終えた後、ｓｃＦｖを、示した元来の正方向および逆方向プライマーにより３５サイクルかけて増幅し、次いで制限酵素により消化してｐｚ６１３細菌発現ベクターへクローニングした。ＶＨ正方向プライマー、配列番号１５；ＶＨ逆方向プライマー、配列番号１６；ＶＬ正方向プライマー、配列番号１７；ＶＬ逆方向プライマー、配列番号１８。
【図４Ａ】図４Ａ−Ｂは１９Ｇ９ｓｃＦｖ単鎖抗体を含有する二量体分子複合体の作製に用いるＩｇＥ  ＣＨ４二量体化ドメインコンストラクトの構築過程を示す模式図である。図４Ａは、ＩｇＧ１ヒンジに融合したＩｇＥ  ＣＨ４二量体化ドメインの構築過程である。ＡＴＧ００１プライマー、配列番号９；ＡＴＧ００３プライマー、配列番号１１；ＡＴＧ００４プライマー、配列番号１２；ＡＴＧ００６プライマー、配列番号１３。
【図４Ｂ】図４Ｂは、より親水性のヒンジを創出するために４つのアミノ酸を変異させたＩｇＧヒンジに融合したＩｇＥ  ＣＨ４二量体化ドメインの構築過程（ＡＴＧ０１９プライマー、配列番号１４）である。吹き出し部分は、配列番号１のアミノ酸２５２−２８１のアミノ酸配列とヌクレオチド配列（配列番号２のヌクレオチド７８３−８６９）の両方を含む、変異部位周辺の配列を示す。
【図５Ａ】図５Ａ−Ｂは２つの１９Ｇ９ｓｃＦｖ融合タンパク質の配列である。図５Ａ：「野生型」１９Ｇ９ｓｃＦｖ融合タンパク質のアミノ酸配列（下方）（配列番号３）および核酸配列（上方）（配列番号４）は、ＶＨ（太字の斜字）；ｓｃＦｖリンカー（太字の斜字の下線）；ＶＬおよびＣ末端伸長（太字）；ＩｇＧヒンジ（斜字）と附随する「野生型」テトラペプチド（太字の下線）；ＩｇＥ  ＣＨ４（標準字体）；Ｃ末端エピトープタグ（斜字の下線）の領域を含む。
【図５Ｂ】図５Ｂ：「変異型」１９Ｇ９ｓｃＦｖ融合タンパク質のアミノ酸配列（下方）（配列番号１）および核酸配列（上方）（配列番号２）は、ＶＨ（太字の斜字）；ｓｃＦｖリンカー（太字の斜字の下線）；ＶＬおよびＣ末端伸長（太字）；ＩｇＧヒンジ（斜字）と附随する親水性テトラペプチド置換（太字の下線）；ＩｇＥ  ＣＨ４（標準字体）；Ｃ末端エピトープタグ（斜字の下線）の領域を含む。
【図６Ａ】図６Ａ−Ｂは単鎖抗体を含有する２つの融合タンパク質を含む精製二量体分子複合体、１９Ｇ９ｓｃＦｖ（１９Ｇ９ｓｃＦｖ二量体分子複合体とも称する）の特徴決定を示す。図６Ａは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）特性を示し、純粋タンパク質は主に二量体であることを示している（分子量標準の溶出時間に基づくと約９０ｋＤａ）。
【図６Ｂ】図６Ｂ：非還元１９Ｇ９ｓｃＦｖ融合タンパク質（レーン２および３、それぞれ２μＬおよび５μＬのタンパク質を含有する）および還元１９Ｇ９ｓｃＦｖ融合タンパク質（レーン５および６、それぞれ２μＬおよび５μＬのタンパク質を含有する）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、二量体複合体（８５．４ｋＤａ）および１９Ｇ９ｓｃＦｖ融合タンパク質単量体（４２．７ｋＤａ）の計算分子量と一致している。レーン１および７は分子量マーカーを含有する。
【図７】ＢＨＫ−ＲＧ−１タンパク質と結合している精製１９Ｇ９  ｓｃＦｖ二量体分子複合体（白抜き三角）のＥＬＩＳＡデータを、対応する１９Ｇ９二重特異性抗体の結合（黒い四角）と比較して示すグラフ。１９Ｇ９二重特異性抗体配列の多くは１９Ｇ９  ｓｃＦｖ配列（配列番号１のアミノ酸１−２５１）と類似している。しかしながら、二重特異性抗体のＶＨおよびＶＬドメイン間のリンカーはわずか５アミノ酸長（ＧＧＧＧＳ）である。
【図８】図１Ｂに模式的に示したＦａｂ二量体複合体の発現に用いたベクターｐＰＥＰ  ＭＦ−Ｊ  ＤＳＥＹ２の略図。
【図９】他の型の抗体（１９Ｇ９  ＩｇＧ、１９Ｇ９単量体ｓｃＦｖ単鎖抗体および１９Ｇ９二重特異性抗体）と比較した、１９Ｇ９ｓｃＦｖ二量体分子複合体のイン・ビボ体内分布。Ｙ軸は、４つの組織：血液（Ｂ）、腫瘍（Ｔ）、肝臓（Ｌ）および腎臓（Ｋ）におけるグラム重量あたりの注射用量の比率の平均（平均％ＩＤ／グラム）をプロットしている。値は、動物あたり２μＣｉの１１１Ｉｎ標識抗体を注射してから０．２５、３、６および４８時間後に摘出した組織について示している。４８時間後の腫瘍サンプルについての％ＩＤ／グラムを矢印で示す。腫瘍は１９Ｇ９  ｓｃＦｖ二量体分子複合体および１９Ｇ９  ＩｇＧの両方によって良好に標識されているが、二量体分子複合体とは対照的に、１９Ｇ９  ＩｇＧは４８時間後の血液にも高比率で残存している。ｓｃＦｖおよび二重特異性抗体は腫瘍はあまり標識せず、腎臓に標識が蓄積している。
【図１０】実施例５に示すＪ＿ＤＳＥＹ融合タンパク質の発現に用いたｐＩＥ−Ｊ＿ＤＳＥＹプラスミドの作製過程を示す模式図。
【図１１】抗体ＡＢＪタンパク質に対するビオチン化抗原タンパク質へのＪ＿ＤＳＥＹ二量体分子複合体の結合と、抗体ＡＢＪタンパク質のＦａｂ型の結合との比較。Ｊ＿ＤＳＥＹ二量体分子複合体およびＡＢＪのＦａｂ型は同等の活性を有し、おおよそナノモーラー単位のＥＣ５０である。ＡＢＪの単量体Ｆａｂ型および二量体ＩｇＧ型を同様のアッセイにおいて比較した先の研究は、単量体および二量体抗体が同様の濃度にて結合することを示している。抗体濃度は、二量体分子複合体については１２５ｋＤの分子量、Ｆａｂについては５０ｋＤの分子量、ＩｇＧについては１５０ｋＤの分子量に基づいて計算した。アッセイに用いた二次抗体はＨＲＰ−抗−ヒトＦａｂ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒｃｈ）であった。
【図１２】サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析。Ｊ＿ＤＳＥＹ二量体分子複合体ならびにＪ＿ＤＳＥＹおよびＪ＿ＫＳＫＹのヘテロ発現の両方において、約１２５ｋＤに最大のピークが現れ、このことは二量体複合体の形成を示唆している。Ｊ＿ＫＳＫＹ二量体分子複合体も約１２５ｋＤにピークを示したが、最大のピークではない。
【図１３】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析。Ｊ＿ＤＳＥＹ二分子複合体（０．２６ｍｇ／ｍＬ）を１０ｍｇ／ｍＬシナピン酸ＭＡＬＤＩマトリックス／（５０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ）と１：１から１：５の比率で混合し、１ｐｍｏｌの最小限のタンパク質をスポットごとに標的化した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は、Ｂｒｕｋｅｒのタンパク質標準ＩＩ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ＩＩ）によりリニアモードとして較正したＢｒｕｋｅｒ  ＵＴＴ装置を用いて行った。陽イオンスペクトルを１００レーザーショットについて加速電位２５ｋＶにより記録し、１５イベント分蓄積した。示された１２３，９６２．２  Ｄａという分子量は、インタクトなＪ＿ＤＳＥＹ  Ｆａｂ二量体分子複合体について予測した分子量と一致し、ＳＥＣおよび計算分子量と一致している。
【図１４】両抗体ＡＢ２５に対するビオチン化抗原タンパク質（上記のＡＢＪに対する抗原と同じ）への２５＿ＤＳＥＹ二量体分子複合体の結合と、ＡＢ２５のＦａｂ型およびＡＢ２５のＩｇＧ型の結合との比較。二量体分子複合体（２５＿ＤＳＥＹ）の結合活性は、Ｆａｂの結合活性と比較して改善されており、ＩｇＧ型により観察された結合と等しかった。二量体２５＿ＤＳＥＹ、Ｆａｂ二量体およびＩｇＧについてのＥＣ５０値はどれも、ナノモーラー以下の範囲であった。同様のアッセイにおいてＡＢ２５の単量体Ｆａｂと二量体ＩｇＧ型を比較した先の研究は、二量体ＩｇＧは単量体のＦａｂよりも高い結合活性にて結合したことを示しており、このことは本実験の結果と一致している。二量体分子複合体については１２５ｋＤ、Ｆａｂについては５０ｋＤ、ＩｇＧについては１５０ｋＤの分子量に基づいて抗体濃度を計算した。実施例６に示したものと同じＨＲＰ−抗−ヒトＦａｂ抗体を二次抗体として用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［発明の詳細な説明］
本発明はＩｇＥ  ＣＨ４ドメインの自己二量化特性を活用して、生物学的エフェクター部分を含む二量体分子複合体を提供する。「生物学的エフェクター部分」は、分子、例えば抗体、Ｉ型およびＩＩ型膜受容体、サイトカイン、酵素などの生物学的に活性な部分を含むポリペプチドである。有用な生物学的エフェクター部分には、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｉ型またはＩＩ型膜受容体の細胞外ドメイン、サイトカイン（ケモカインを含む）、酵素の活性部位ドメイン、タンパク質ホルモンおよびペプチドエフェクター分子などがある。
【００１２】
二量体分子複合体を構成する２つの融合タンパク質のそれぞれの生物学的エフェクター部分は、同一であってもよく、または２つの異なる機能を有する部分（例えば抗原結合部位と毒素）であってもよい。有用な治療的または組織特異的標的機能を有する生物学的エフェクター部分は特に有用である。
【００１３】
二量体分子複合体はイン・ビボにおいて安定であり、生物学的エフェクター部分が由来するネイティブ分子と同様の親和性にて目的の標的へと結合する。
【００１４】
本発明の二量体分子複合体は２つの融合タンパク質を含む。いくつかの実施態様において、それぞれの融合タンパク質はＮ末端からＣ末端にかけて以下の部分を含む：（ａ）生物学的エフェクター部分、（ｂ）その生物学的エフェクター部分と結合したＩｇＧ分子のヒンジ領域；および（ｃ）そのヒンジ領域と共有結合したＩｇＥ  ＣＨ４二量体化ドメイン。第一および第二の融合タンパク質のＣＨ４二量体化ドメインの二量体化は、それぞれの融合タンパク質のヒンジ領域内のシステイン間にジスルフィド結合が形成されることにより起こる。図１Ａ−Ｄを参照のこと。
【００１５】
エフェクター分子はＩｇＧ１ヒンジのネイティブ配列に直接共有結合し得る。他の実施態様において、アミノ酸リンカーを採用してもよい。そのような実施態様において、エフェクター分子はリンカーと共有結合し、そのリンカーはＩｇＧ１ヒンジと共有結合する。ＩｇＧヒンジは好ましくはＩｇＧ１ヒンジであり、好ましくはヒトＩｇＧ１由来のものであるが、他種（例えば、マウス、ウサギなど）からのＩｇＧ１ヒンジ領域を用いることもできる。他の実施態様において、他のＩｇＧ類（例えば、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）からのヒンジ領域を用いてもよい。
【００１６】
本明細書において用いる場合、ＩｇＧ１ヒンジは、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインの第一のベータストランド内からのアミノ酸残基２２３から２４３を含み、ここで番号付けはＥｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９６９）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ，  ６３，  ｐｐ．７８−８５に記載されているＥｕ  ＩｇＧ１重鎖（配列番号２５）の配列に基づいている。この配列は２４０−２４３位に疎水性テトラペプチドであるＶＦＬＦを含有する（配列番号３の２７７−２８０位に対応）。好ましい実施態様において、この疎水性テトラペプチドは、溶解性を増大させるために、親水性アミノ酸のテトラペプチド、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、ＧｌｕおよびＴｙｒ（ＤＳＥＹ）（配列番号１のアミノ酸残基２７７−２８０）により置換されている。ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のヒンジおよびＮ末端ＣＨ２配列もＶＦＬＦテトラペプチドを含有するので、これらのイムノグロブリン分子からのヒンジ領域もこれらの位置における置換を同じく行うことができる。
【００１７】
別の実施態様において、様々な分子が本発明の二量体分子複合体へコンジュゲートする可能性を増大させるために、ヒンジ領域に修飾を施すことができる。二量体に既に存在しているリシン残基をコンジュゲートに用いることができるが、ＤＳＥＹへ置換した（結果として配列番号１となる）同じ疎水性テトラペプチド（すなわち配列番号３の２７７−２８０位のＶＦＬＦ）を、例えばテトラペプチドＫＳＫＹへ改変させることにより、さらなるコンジュゲート部位を提供することができる。この置換により得られたさらなるリシン残基を用いて、二量体化した分子へポリグリコール（例えば、ＰＥＧ、ＰＯＧ）を加え、クリアランスを改善することができる。あるいは、分子、例えば毒素、検出可能標識、放射性分子などを、これらのリシン残基を介して二量体分子複合体の融合タンパク質とコンジュゲートさせてもよい。コンジュゲートの方法は当分野においてよく知られている。
【００１８】
生物学的エフェクター部分として抗体を用いる二量体分子複合体
ｓｃＦｖおよびＦａｂ二量体
本発明の二量体分子複合体は、生物学的エフェクター部分として抗体を含む融合タンパク質を用いて形成することができる。いくつかの実施態様において、それぞれの融合タンパク質の生物学的エフェクター部分は抗原結合部位により構成される。抗原結合部位としては、例えば単鎖抗体（ｓｃＦｖ）またはＦａｂフラグメントを用いることができる。得られた二量体分子複合体は、同じまたは異なる特異性の２つの抗原結合部位を含み得る（すなわち、それぞれ単一特異性または二重特異性二量体分子複合体を形成している）。
【００１９】
両方の融合タンパク質上の生物学的エフェクター部分が単鎖抗体である単一特異性の二量体分子複合体を図１Ａに模式的に示す。図１Ｂは、それぞれの融合タンパク質上の生物学的エフェクター部分がＦａｂフラグメントである単一特異性の二量体分子複合体（すなわち「Ｆａｂ二量体」）の模式図である。図１Ｃは、融合タンパク質上の生物学的エフェクター部分が異なる特異性のＦａｂフラグメントである二重特異性の二量体分子複合体の模式図である。
【００２０】
本発明の抗体関連二量体分子複合体は、単量体の単鎖抗体、二重特異性抗体または完全サイズの二量体ＩｇＧ類と比較して優れた薬物動力学的および体内分布特性を有する。完全なＩｇＧ抗体と比較すると、本発明の分子複合体は、イン・ビボ投与した後、より早い時点に血液における濃度に対する腫瘍における濃度の比がより高くなり、これは腫瘍内へより良好に浸透することを示している。このような複合体はまた、単量体の単鎖抗体または二重特異性抗体の両方と比較して、腫瘍においてより高濃度の蓄積を、腎臓においてより低濃度の蓄積を示す（図９を参照のこと）。
【００２１】
本発明の抗体関連二量体分子複合体は、診断および治療に用いることができる。例えば、二量体分子複合体は、イン・ビボにおけるイメージング、例えばＰＥＴイメージング、またはイン・ビトロにおける診断に用いることができる。治療用分子とコンジュゲートさせると、二量体分子複合体を用いてその治療用分子を特定の標的へ標的化することができる。
【００２２】
好ましい実施態様において、二量体複合体における２つの融合タンパク質はそれぞれ、ヒンジ領域およびヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインの第一のβシートの部分を含むＮ末端アミノ酸を介してＩｇＥ  ＣＨ４ドメインと連結した単鎖抗体を含む。この連結の利点は、２つの融合タンパク質間のジスルフィド結合が二量体分子複合体の中央に位置し、これにより複合体が安定化することである。このような二量体分子複合体は典型的には５０ｋＤから１５０ｋＤの分子量を有する。
【００２３】
本発明の二量体複合体に用いられるｓｃＦｖ含有融合タンパク質の一例は、配列番号１（図５Ｂ）であり、この例は単鎖抗体１９Ｇ９ｓｃＦｖを含有している。
【００２４】
この融合タンパク質のヒンジ領域、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＤＳＥＹ（配列番号５；配列番号１のアミノ酸残基２６０−２８０）は、アミノ酸残基２７７−２８０に、「野生型」テトラペプチド「ＶＦＬＦ」（配列番号３のアミノ酸残基２７７−２８０）の代わりに、親水性テトラペプチド「ＤＳＥＹ」を含有している。
【００２５】
この融合タンパク質は可溶性であり、親のイムノグロブリンと同様の親和性にて抗原と結合する。
【００２６】
１９Ｇ９ｓｃＦｖ融合タンパク質分子のＶＨとＶＬドメイン間のリンカーは、配列番号１のアミノ酸残基１２５−１４４：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８）からなる。
【００２７】
この特定の融合タンパク質はまた、配列番号１のアミノ酸残基３９１−４０５にＣ末端エピトープタグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲＡＡ（配列番号２３））を含む。このようなエピトープタグは発現した分子の精製を助けるためにしばしば用いられる。本発明の他の実施態様において、本発明の二量体分子複合体は、エピトープタグを含有しない融合タンパク質、または異なるエピトープタグ（例えばＥＳＳＥＥＧＧＣ（配列番号２４））を有する融合タンパク質を用いて産生される。
【００２８】
本発明の二量体分子複合体は、二量体複合体を構成する融合タンパク質内の生物学的エフェクター分子として、単鎖抗体の代わりにＦａｂ重鎖フラグメントを用いて作製することもできる（実施例５−８を参照のこと）。Ｆａｂフラグメントを含む二量体分子複合体を作製する場合、正常なイムノグロブリン分子におけるように重鎖のＣＨ１ドメインをヒンジ領域と直接連結させ、分子内の外来免疫原性配列の量をさらに減少させることができる。Ｆａｂ軽鎖をＦａｂ重鎖の二量体分子複合体と結合させると、Ｆａｂ二量体分子複合体が形成される。
【００２９】
ＩｇＧと同じ親和性を有するが分子量がより小さいＦａｂ二量体はＦｃ領域を除去することにより構築することができる。このような二量体は分子量がより低いために、腫瘍への浸透が増大し得る。さらに、このようなＦａｂ二量体は細胞のＦｃ受容体（ＦｃＲ）と結合しないであろうから、不必要なＦｃＲ関連相互作用が減少するであろう。例えば、このようなＦａｂ二量体を用いる二量体分子複合体は、ＦｃγＲまたは新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を有する細胞に結合しない毒素コンジュゲートの作製に用いることができる。図８は、このようなＦａｂ含有二量体分子複合体を創出するために用いるベクターを示しており、軽鎖（配列番号１９および２１、それぞれアミノ酸および核酸配列）および重鎖およびＩｇＥドメイン（配列番号２０および２２、それぞれアミノ酸および核酸配列）を含んでいる。このような複合体は、Ｆａｂの軽鎖と重鎖間の内部ジスルフィド結合、ならびに２つの融合タンパク質のヒンジ領域間のジスルフィド結合を有している。この分子はイン・ビボにおいて、いかなるＦｃ受容体またはＣ１ｑ媒介性活性も誘発しないであろう。
【００３０】
Ｆｃ結合ドメインがＦｃ融合タンパク質に含まれる場合、創出された二量体分子複合体はＦｃ受容体のみならず他のタンパク質（例えば、ＦｃγＩＩＩａ、ＦｃγＩＩｂ、Ｃ１ｑなど）にも結合し得、これらの分子のエフェクター機能の引き金となり得る。Ｆｃ受容体へ結合することにより、抗体毒素コンジュゲートをＦｃ受容体を発現する細胞へ向かわせることができる。Ｆｃ受容体相互作用により媒介され得る抗体のイン・ビボ特性には、抗原依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用、補体依存性細胞毒性、増大した血清半減期、および減少したクリアランスなどが含まれる。「Ｆｃ融合タンパク質」または「Ｆｃ融合」なる用語は、ＩｇＧヒンジおよびＣＨ２およびＣＨ３ドメインを用いてタンパク質の二量化を行うことを言うために広く用いられる。このような「Ｆｃ融合体」はＦｃ受容体への結合能を保持している。
【００３１】
Ｆａｂ含有二量体分子複合体の好ましい実施態様は、ヒンジ領域内の「野生型」テトラペプチド「ＶＦＬＦ」がより親水性の「変異型」テトラペプチドＤＳＥＹによって、またはコンジュゲートのためのさらなるリシンを提供するテトラペプチド「ＫＳＫＹ」によって（それぞれ配列番号５および７を参照）置換されているヒンジ領域を含む。
【００３２】
ｓｃＦｖまたはＦａｂ含有二量体分子複合体の他の実施態様において、融合タンパク質の「野生型」二量体化ドメインに存在する疎水性テトラペプチドＶＦＬＦ（配列番号３のアミノ酸残基２７７−２８０）を置換するために、上記の２配列以外のテトラペプチド配列を用いることができる。二量体コンストラクトを構成する第一および第二の融合タンパク質において、このテトラペプチドを異なるテトラペプチドによって置換することは、ヘテロ二量体形成の促進を助けるのに特に有用である。好ましい実施態様において、置換には、一方の融合タンパク質上のＳＥＳＥまたはＳＤＳＤの、第二の融合タンパク質上のＳＫＳＫまたはＳＲＳＲによる置換などがある。この方法によるヘテロ二量体形成の促進に用いることができる、疎水性テトラペプチドのさらなる配列置換には、以下が含まれる：ＳＥＳＹもしくはＳＤＳＹの、ＳＫＳＹもしくはＳＲＳＹによる置換；またはＤＥＥＹ、ＤＤＤＹ、ＤＤＥＹ、ＤＥＤＹ、ＥＥＥＹ、ＥＤＤＹ、ＥＤＥＹもしくはＥＥＤＹの、ＲＲＲＹ、ＲＫＲＹ、ＲＲＫＹ、ＲＫＫＹ、ＫＫＫＹ、ＫＲＲＹ、ＫＲＫＹもしくはＫＫＲＹによる置換。ヒトＩｇＧ１構造において、Ｖａｌ２４０位から始まる疎水性テトラペプチド（Ｖ２４０ＦＬＦ）の２つのＰｈｅ残基は内向きであり、ＩｇＧ１二量体のもう一方の重鎖の対応するＰｈｅ残基へ向かっている。これらのＰｈｅ残基は、ＣＨ２に結合した炭水化物構造へと伸び、２つのＣＨ２ドメインの間に位置している（Ｓａｐｈｉｒｅ  （２００２）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３１９、ｐｐ．  ９−１８）。ＶＦＬＦテトラペプチドのＶａｌおよびＬｅｕ残基は外向きであり、上記の炭水化物から離れ、ＣＨ２のアミノ酸残基へ向かっている。ＶＦＬＦテトラペプチド内の残基を疎水性がより低い残基（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＣｙｓまたはＡｌａ）により置換することは、露出した疎水性側鎖の数を減少させ、これにより二量体分子複合体の溶解性が改善される。ＬｙｓまたはＣｙｓによる置換は、化学修飾のための部位も提供することとなる。ヘテロ二量体形成を促進するために、二量体分子複合体の１つの融合タンパク質内の１つまたは両方のＰｈｅ残基を、二量体分子複合体の第二の融合タンパク質に存在するものと反対の電荷を持つ残基により置換する。ヘテロ二量体を構成するそれぞれの融合タンパク質から互いに向かい合う位置に反対電荷の残基を配置することにより、ヘテロ二量体形成を促進する電荷相互作用が起こり得る。一般に、Ｘが非疎水性のいずれかのアミノ酸であるとすると、以下の配列の組み合わせをヘテロ二量体の２つの分子内のＶＦＬＦテトラペプチドを置換するのに用いてヘテロ二量体を形成することができる：１）ＸＥＸＹもしくはＸＤＸＹの、ＸＫＸＹもしくはＸＲＸＹによる置換；２）ＸＥＸＥ、ＸＥＸＤ、ＸＤＸＥもしくはＸＤＸＤの、ＸＲＸＲ、ＸＲＸＫ、ＸＫＸＲもしくはＸＫＸＫによる置換；または３）ＸＲＸＥ、ＸＲＸＤ、ＸＫＸＥもしくはＸＫＸＤの、ＸＥＸＲ、ＸＥＸＫ、ＸＤＸＫもしくはＸＤＸＲによる置換。
【００３３】
他の実施態様において、野生型疎水性テトラペプチド配列「ＶＦＬＦ」および隣接するプロリン残基（配列番号３のアミノ酸残基２７７−２８１）は、ヒトＩｇＥ配列（配列番号４５）においてＣＨ３およびＣＨ４を連結するループからのアミノ酸配列により置換されてもよい。５アミノ酸のこのストレッチ（ＶＦＬＦＰ）はＬｙｓＴｈｒＳｅｒＧｌｙ（配列番号４５のアミノ酸残基３１５から３１８）またはＴｈｒＬｙｓＴｈｒＳｅｒＧｌｙ（配列番号４５のアミノ酸残基３１４から３１８）により置換されてもよい。同様に、配列番号１の残基２７７から２８１（ＤＳＥＹＰ）または配列番号２０のアミノ酸残基２６３から２６７（ＤＳＥＹＰ）を、ヒトＩｇＧまたはＩｇＥからのネイティブ配列から完全に構成される二量体分子複合体を創出するために、これらのＩｇＥ由来配列により置換することもできる。
【００３４】
典型的には、ＩｇＥ  ＣＨ４ドメインを本発明の融合タンパク質を二量体化するために用いる。しかしながら、ヘテロ二量体をさらに安定化するために、Ｍ２″ＩｇＥ  ＣＨ４スプライスバリアントを二量体分子複合体を構成する融合タンパク質のＣ末端に付加してもよい。１つの融合タンパク質において、酸性型のＭ２″ＩｇＥ  ＣＨ４スプライスバリアント（ＥＳＳＥＥＧＧＣ（配列番号２６））をＣ末端に付加し、一方、第二の融合タンパク質においては塩基性アミノ酸を含有するＭ２″ＩｇＥ  ＣＨ４スプライスバリアント（ＥＳＳＲＲＧＧＣ（配列番号２７）を付加する。図１Ｃを参照のこと。
【００３５】
他の生物学的エフェクター部分を用いた二量体分子複合体
抗体関連分子以外の様々な生物学的エフェクター部分を、本発明の二量体分子複合体を構成する融合タンパク質に用いることができる。このようなタンパク質において、生物学的エフェクター部分とヒンジ領域間にアミノ酸リンカーを用いることも用いないこともできる。アミノ酸リンカーを含める場合、アミノ酸リンカーは好ましくは１から１０またはそれ以上のアミノ酸のポリＧｌｙリンカーであり、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｓｐなどの他のアミノ酸を含んでもよい。目的とする用途に応じて、二量体分子複合体は２つの生物学的エフェクター部分が同じまたは異なる融合タンパク質から構成され得る（すなわち、それぞれホモ二量体またはヘテロ二量体）。ヘテロ二量体は上記と同様の方法により安定化される。
【００３６】
Ａ．Ｉ型膜受容体の細胞外ドメイン
生物学的エフェクター部分がＩ型膜受容体の細胞外ドメインである融合タンパク質により構成される二量体分子複合体を図１Ｄに模式的に示す。このような複合体は、生物学的エフェクターとして、またはリガンドと結合するために有用である。本発明において有用なＩ型膜受容体には、ＴＮＦ受容体、エフリン、Ｅｐｈ、ＶＥＧＦ受容体、ＩＧＦ受容体、トロンボスポンジン、トロンボモジュリン、ＰＤＧＦ受容体、ＩＬ−２Ｒ、ＴＣＲ複合体成分、ＥＧＦ受容体、ＴＧＦ受容体、組織因子、増殖因子受容体、ＨＧＨ受容体、ＩＦＮ受容体、ＨＥＲ２、インスリン受容体などがある。
【００３７】
Ｂ．サイトカイン
いくつかの実施態様において、生物学的エフェクター部分は、細胞の生物学的反応を調節するのに有用なサイトカインである。本発明において有用なサイトカインには、リンホカイン、例えばマクロファージ活性化因子（ＭＡＦ）、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＭＩＦ）、白血球遊走阻止因子（ＭＣＦ）、白血球遊走阻止因子（ＬＭＩＦ）、ヒスタミン放出因子（ＨＲＦ）またはトランスファー因子（ＴＦ）が含まれる。腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ−α（カケクチン）およびＴＮＦ−β（リンホトキシン）は、生物学的エフェクター部分であり得る。インターロイキン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４およびＩＬ−１５、ＩＬ−１７は生物学的エフェクター部分であり得る。インターフェロン、例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−ωおよびＩＦ−τは生物学的エフェクター部分であり得る。
【００３８】
他の有用なサイトカインには、コロニー刺激因子、ケモカインおよびストレスタンパク質などがある。コロニー刺激因子の例には、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）およびマルチＣＳＦ（ＩＬ−３）などがある。
【００３９】
α−ケモカインの例には、ＩＬ−８、ＮＡＰ−２（好中球活性化タンパク質２）、ＰＦ−４（血小板第４因子）およびβＴＧ（β−トロンボグロブリン）などがある。β−ケモカインにはＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質１）、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α（マクロファージ炎症性タンパク質１α）、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳ（「活性化により制御され、正常Ｔ細胞から発現されおそらく分泌されるケモカイン（「Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｐｒｅｓｕｍａｂｌｙ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）」）などがある。他の有用なケモカインには、例えば、ＣＣＬケモカイン；ＣＸＣ（ＳＣＹＢ）ケモカインまたはＣＸ３Ｃケモカイン；ＸＣケモカイン；およびＣＣケモカイン、例えばＣＣＬ２、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ３およびＣＣＬ４などがある。
【００４０】
ストレスタンパク質には、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、グルコース制御タンパク質（ＧＲＰ）、ユビキチンおよびスーパーオキシドジスムターゼなどがある。
【００４１】
Ｃ．酵素
他の実施態様において、生物学的エフェクター部分は酵素、例えば、タンパク質分解酵素（アミノペプチダーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、システイニルプロテアーゼ、ペプシン、トリプシン、トロンビン、リゾチーム、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、第ＩＸ因子）である。他の酵素、例えばグリコシダーゼ、エステラーゼ、ヒドロラーゼ、ヌクレアーゼ、シンターゼ（ｓｙｎｔｈｅａｓｅ）、イソメラーゼ、ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、リダクターゼ（酸化還元酵素を含む）、トランスフェラーゼ、リガーゼ、制限酵素、アミダーゼ、ＡＴＰアーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、デヒドロゲナーゼおよびオキシダーゼも用いることができる。
【００４２】
Ｄ．毒素
治療上有用な毒素も、本発明の二量体分子複合体を構成する融合タンパク質の生物学的エフェクター部分として用いることができる。多くのこのような毒素の例が当業者によく知られており、例えば細菌毒素のシュードモナス外毒素Ａおよびジフテリア毒素、ならびに植物毒素のリシン、アブリン、モデシン、サポリンおよびゲロニンなどがある。
【００４３】
Ｅ．ＩＩ型膜受容体の細胞外ドメイン
生物学的エフェクター部分がＩＩ型膜受容体の細胞外ドメインである二量体分子複合体も構築することができる。しかしながら、この場合、２つの融合タンパク質のそれぞれはＮ末端からＣ末端にかけて以下を含む：（ａ）Ｍ２″ＩｇＥ  ＣＨ４スプライスバリアント（ＥＳＳＲＲＧＧＣ（配列番号２７））により構成されるＣ末端伸長を有するＣＨ４二量体化ドメイン、（ｂ）そのＣＨ４二量体化ドメインと共有結合するアミノ酸リンカー（好ましくは３−１０残基長）、および（ｃ）ＩＩ型膜受容体の細胞外ドメイン。図２を参照のこと。いくつかの実施態様において、Ｍ２″ＩｇＥスプライスバリアントの配列を修飾し、化学修飾のためのさらなる部位を提供することができる（例えばＥＳＳＫＫＧＧＣ（配列番号２８）、ＥＳＳＣＲＧＧＣ（配列番号２９）またはＥＳＳＲＣＧＧＣ（配列番号３０））。
【００４４】
ＩＩ型膜受容体は膜貫通タンパク質類の〜５％を占めるのみであるが、重要な生物学的エフェクター機能を有するメンバー、例えばヘプシンプロテアーゼ、エクトジスプラシン、コラーゲン性膜タンパク質、マクロファージスカベンジャー受容体、ＭＡＲＣＯタンパク質、ＴＮＦリガンド様タンパク質、アシアロ糖タンパク質受容体、リンパ球ＩｇＥ受容体、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞受容体、ＮＫＧ２、ＮＫＲ−Ｐ１、Ｌｙ−４９、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＬｙＢ−２、コレクチン、ＣＬＥＣ５Ａなどを含む。
【００４５】
二量体分子複合体の産生
本発明の二量体分子複合体における融合タンパク質は、組換え技術により、または合成的に、あるいはその２つの方法を組み合わせて用いて産生することができる。組換え体の産生において、本発明は本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する（以下を参照のこと）。
【００４６】
本発明の融合タンパク質は、その融合タンパク質のアミノ酸配列を合成する化学的手法を用いて産生することが可能である。その方法には固相法を用いた直接的なペプチド合成が含まれる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５，  ２１４９−２１５４，  １９６３；Ｒｏｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９，  ２０２−２０４，  １９９５）。タンパク質合成は、手動法を用いて、または自動的に行うことができる。自動合成は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて行うことができる。要すれば、融合タンパク質のフラグメントを個別に合成し、化学的手法を用いて結合させ完全長融合タンパク質を産生することができる。国際公開第２００１／０９８３４０号パンフレットを参照のこと。
【００４７】
核酸分子
本発明の核酸分子は、所望の融合タンパク質をコードするあらゆるヌクレオチド配列を含み得る。本発明の核酸分子は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）ならびにｍＲＮＡを含む。融合タンパク質を構築するための多くのキットが、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ；Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）およびＱｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａ；１−８８８−ＤＮＡ−ＫＩＴＳ）などの企業から入手可能である。
【００４８】
当業者によく知られている方法を用いて本発明の核酸分子を構築することができる。これらの方法はイン・ビトロ組換えＤＮＡ技術および合成技術を含む。このような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、「ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（分子生物学の最新プロトコル）」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８９に記載されている。
【００４９】
いくつかの実施態様において、本発明の核酸分子は、融合タンパク質をコードする挿入コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有する発現コンストラクトである。Ｆａｂ二量体発現コンストラクトはＣ末端システインを有する軽鎖のコード配列を含み得る。発現コンストラクトは、本発明の融合タンパク質を細胞へ導入するのに適したベクター内に存在してもよい。
【００５０】
本発明の融合タンパク質は、様々な宿主細胞において組換え技術により発現させることができる。これらの宿主には、限定されないが、微生物、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌；酵母発現ベクターにより形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワー・モザイク・ウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたははｐＢＲ３２２プラスミド）により形質転換された植物細胞系、または動物細胞系、特に哺乳類系（ヒト系を含む）が含まれる。国際公開第２００１／０９８３４０号パンフレットを参照のこと（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ベクター成分および適切な宿主細胞の選択は、十分に当業者の実施可能な範囲である。
【００５１】
本発明のいくつかの実施態様において、二量体分子複合体の両融合タンパク質は、同じ細胞において、好ましくは同じプラスミドから、例えば２シストロン性オペロンとして発現される（Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ４、９７１、１９９１）。シグナル配列を含ませて、融合タンパク質を所望の細胞の位置に方向付けることができる。二量体分子複合体の２つの融合タンパク質を同じプラスミドから発現させると、同量の各構成要素が細胞において産生されるので、形成される二重特異性二量体の量が増加する。
【００５２】
要すれば、融合タンパク質は、検出または精製タグとして用いられる部分、例えば少なくとも５つのヒスチジン残基を含むペプチド、または一般に用いられるｃ−ｍｙｃおよびＦＬＡＧタグを含むことができる。
【００５３】
診断方法
本発明の二量体分子複合体は診断目的にも有用であり得る。例えば、複合体は２つの融合タンパク質を含むことができ、一方のタンパク質は関心の分析物に結合するよう設計された生物学的エフェクター部分を含み、他方のタンパク質は、容易に定量化できる検出可能標識、例えば酵素、蛍光タンパク質、放射性核種などであるかまたはそれらに結合する生物学的エフェクター分子を含む。
【００５４】
治療方法
本発明の二量体分子複合体は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与するための医薬組成物として提供することができる。抗体フラグメント（単一または二重特異性）により構成された複合体は、腫瘍の治療に特に有用である。例えば、複合体の一方の融合タンパク質は腫瘍マーカーに結合する分子を含むことができ、他方の融合タンパク質は、Ｔ細胞エピトープ、毒素または放射性核種結合ペプチドもしくはタンパク質と結合し腫瘍細胞に接近して殺す機能をもたらす分子を含むことができる。
【００５５】
本発明の二量体分子複合体を含む適切な医薬組成物を調製するにあたり、当業者は既知の注射可能な生理学的に許容される滅菌溶液を用いることができる。非経口の注射または注入用の使用準備済溶液を調製するために、等張水溶液、例えば生理食塩水または対応する血漿タンパク質溶液を容易に利用することができる。医薬組成物は、滅菌条件下において使用直前に既知の注射可能溶液によってもどすことができる凍結乾燥物または乾燥調製物としておいてもよい。医薬組成物に既知の担体物質および／または添加物（例えば、血清アルブミン、デキストロース、亜硫酸水素ナトリウム、ＥＤＴＡなど）を補足してもよい。
【００５６】
本発明の医薬組成物は、当業者に既知の種々の投与経路により、特に静脈内注射または標的組織への直接注射により投与することができる。全身投与において、静脈内、脈管内、筋肉内、動脈内、腹腔内、経口またはくも膜下腔内経路を用いることができる。より局所的な投与は、皮下に、皮内に、心臓内に、肺葉内に（ｉｎｔｒａｌｏｂａｌｌｙ）、髄内に、肺内にまたは処置すべき組織（結合組織、骨組織、筋肉組織、神経組織、上皮組織）内または近傍に直接的に、行うことができる。処置の望ましい持続時間および実効性に応じて、組成物は、数日間、数週間または数ヶ月間に、１回または数回、また断続的に、例えば毎日、様々な用量にて投与してもよい。
【００５７】
用量は、患者の年齢、症状、性別および疾患の程度に依拠し、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ／用量で変化してもよく、毎日１回以上、１日から数日間投与してもよい。
【００５８】
本明細書に引用したあらゆる特許、特許出願および参考文献は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これまでの記載は本発明を一般的に説明している。より完全な理解は下記の具体的な実施例を参照することにより得ることができ、それらは単に説明を目的として記載したものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【実施例１】
【００５９】
ｓｃＦｖ二量体分子複合体の産生
この実施例は図１Ａに示す構造を有する２つの二量体分子複合体の産生を示す。２つのコンストラクトを調製した。両方のコンストラクトにおいて、ポリＧｌｙリンカーを野生型ＩｇＧ１ヒンジ領域のＮ末端に加えた。「野生型」コンストラクトにおいては、この後にヒトＩｇＧ１のＣＨ２の第一ベータストランドのいくつかのネイティブ配列が附随した。「変異型」コンストラクトには、「野生型」ベータストランドに存在する、溶媒に曝されると溶解性を妨げる可能性がある疎水性残基を除去するための変異を導入した。ＩｇＧ１の重鎖定常領域（配列番号２５）内の２つの疎水性残基、Ｖａｌ２４０およびＬｅｕ２４２は、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインとの疎水性相互作用を有し、２つのフェニルアラニン、Ｐｈｅ２４１およびＰｈｅ２４３は炭水化物基と相互作用する。配列番号２５の２４０−２４３位のこれらの疎水性アミノ酸、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、ＬｅｕおよびＰｈｅを、それぞれ親水性残基、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、ＧｌｕおよびＴｙｒにより置換した。ヒンジ領域の２つのシステイン基は、ＣＨ４領域の二量化の際にそれぞれの融合タンパク質間で共有結合を生じる。
【００６０】
単鎖抗体の作製
単鎖抗体１９Ｇ９ｓｃＦｖを、ＶＨおよびＶＬ鎖から、制限部位および１６アミノ酸リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５）のオーバーラップ伸長のための部位を導入するプライマーを用いてＰＣＲにより増幅して作製した。１５伸長サイクル後、ｓｃＦｖを元来の正方向および逆方向プライマーにより増幅し、制限酵素により消化して細菌発現ベクターｐｚ６１３へクローニングした。図３を参照のこと。
ＶＨ正方向プライマー：ＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣ（配列番号１５）；
ＶＨ逆方向プライマー：ＣＣＡＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＡＡＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣ（配列番号１６）；
ＶＬ正方向プライマー：ＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＡＧＴＣ
（配列番号１７）；
ＶＬ逆方向プライマー：ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣ（配列番号１８）。
【００６１】
ＣＨ４二量体化ドメインの作製
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入したｍＲＮＡ（クローン２１３２５８１）から、ＰＣＲプライマー「ＡＴＧ００１」（ＩｇＥＣＨ４＿ｂｋ＿ａ）：ＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴ  ＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣ  ＣＣＣＧＣＧＴＧＣＴ  ＧＣＣＣＣＧＧＡＡＧ（配列番号９）および「ＡＴＧ００３」（ＩｇＥＣＨ４＿ｆｏｒ＿ａ）：ＣＧＧＡＴＡＣＧＧＣ  ＡＣＣＧＧＣＧＣＡＣ  ＣＴＴＴＡＣＣＧＧＧ  ＡＴＴＴＡＣＡＧＡＣ（配列番号１１）を用いてＩｇＥのＣＨ４ドメインをクローニングした。ＩｇＧ１ヒンジ領域およびＩｇＧ１  ＣＨ２の第一ベータストランドを、プライマー「ＡＴＧ００２」：ＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣ  ＣＣＣＣＧＣＧＴＧＣ  ＴＧＣＣＣＣＧＧＡＡ  Ｇ（配列番号１０）を用いてＰＣＲにより導入した。Ｎｏｔ１およびＳｇｒＡ１部位をそれぞれプライマーＡＴＧ００１およびＡＴＧ００３により導入した。これらの部位によって制限消化することによりＩｇＧ１ヒンジ−ＩｇＥ  ＣＨ４領域融合体を単鎖ベクター（「１９Ｇ９」）へ直接クローニングすることが可能となった。図４を参照のこと。
【００６２】
「野生型」１９Ｇ９ｓｃＦｖ融合タンパク質（１９Ｇ９Ｍ１とも称する）のアミノ酸配列（配列番号３）を図５Ａに示す。二量体化ドメインのアミノ酸残基２７７−２８０に配列ＤＳＥＹを含有する「変異型」融合タンパク質１９Ｇ９Ｍ２のアミノ酸配列（配列番号１）を図５Ｂに示す。
【実施例２】
【００６３】
ｓｃＦｖ二量体分子複合体の発現、精製および機能
実施例１に記載の「変異型」１９Ｇ９ｓｃＦｖ二量体分子複合体コンストラクト（１９Ｇ９Ｍ２；配列番号１）を哺乳類発現ベクターｐＰＥＰ１ｐｏｌｙへクローニングし、ＣＨＯ細胞において発現させた。精製  はエピトープ−タグアフィニティークロマトグラフィーを用いて行い、その精製複合体を、結合、抗原特異性および親和性についてＥＬＩＳＡを用いて試験した。図６Ａを参照のこと。精製複合体の分子量（還元または非還元）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ系において解析した。４％−１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用い、ＭＥＳ  ＳＤＳランニングバッファー、１２０ｍＡ、２００Ｖにより４０分行った。図６Ｂを参照のこと。
【００６４】
図７は、１９Ｇ９Ｍ２二量体分子複合体のＢＨＫ−ＲＧ−１タンパク質への結合を、対応する二重特異性抗体（短くした５アミノ酸リンカーにより連結した１９Ｇ９  ＶＨおよびＶＬから作製した二量体の単鎖抗体）の結合と比較した結果を示す。二重特異性抗体および１９Ｇ９のＩｇＧは同等の活性を有している。ＥＣ５０は大まかにナノモーラー単位である。二量体分子複合体については分子量８０ｋＤに、二重特異性抗体については５０ｋＤに基づいて抗体濃度を計算した。アッセイに用いた二次抗体はＨＲＰ−抗−Ｅタグ抗体であった。
【実施例３】
【００６５】
ヒンジ領域におけるジスルフィド結合形成の実証
図６Ｂはクーマシーブルー染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルであり、実施例１および２に記載の二量体分子複合体調製物が主にジスルフィド二量体を含み（レーン２および３）、単量体の混入は少量のみであることを示している。還元により、全てのジスルフィド二量体が崩壊し単量体となっている（レーン５および６）。この結果は、ＩｇＧ１からのヒンジ領域が適切に機能していること、およびＩｇＥ  ＣＨ４ドメインが二量化した後にヒンジにおいてジスルフィド結合が形成されていることを実証している。レーンは左から右へ向けて以下の通りである：１、１０μＬマーカー；２、２μＬ  １９Ｇ９  Ｍ２；３、５μＬ  １９Ｇ９  Ｍ２；４、ブランク；５、２μＬ還元型１９Ｇ９  Ｍ２；６、５μＬ還元型１９Ｇ９  Ｍ２；７、１０μＬマーカー。
【実施例４】
【００６６】
１９Ｇ９二量体分子複合体のイン・ビボ体内分布
放射標識およびキレーター付加の方法はＮｉｋｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２、３８７−３９０に準じた。精製１９Ｇ９ｓｃＦｖ二量体分子複合体、１９Ｇ９  ＩｇＧ、１９Ｇ９ｓｃＦｖおよび１９Ｇ９二重特異性抗体は使用する前にＳＥＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特徴決定した。１０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液により繰り返しリンスし、濾過する前にＣｈｅｌｅｘ処理を行うことにより金属を含まない状態にしたバッファーおよび装置において、１１１Ｉｎを用いて標識化を行った。キレーターｐ−ＳＣＮ−ＣＨＸ−Ａ″−ＤＰＴＡはＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ  Ｉｎｃから購入した。コンジュゲートに用いたバッファーは、５０ｍＭ炭酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有し、ｐＨ  ６．５であった。放射標識は５０ｍＭ  ＮａＡｃ、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌを含有する、ｐＨ  ６．５のバッファーにおいて行った。
【００６７】
上記４つの抗体グループの１１１Ｉｎ−放射標識抗体溶液（ＰＢＳ）を、各グループにつき８匹のＬＮＣａＰ腫瘍を有するマウスに注射した（２μＣｉ／動物）。標識抗体の注射から１５分、３時間、６時間および４８時間後に１グループにつき２匹の動物の体重を測定し、屠殺し、組織を収集した。腫瘍、組織または血液サンプルの重量を測定し、総放射活性を測定した。サンプルのグラムあたりのｍＣｉを動物体重あたりの総ｍＣｉと比較し、組織のグラムあたりの注射用量の比率（％）および各グループおよび時点について計算した平均値を決定した（平均％ＩＤ／グラム）。結果を図９に示す。
【実施例５】
【００６８】
Ｆａｂ融合タンパク質の産生およびＦａｂ二量体分子複合体の発現
この実施例は、図１Ｂに示す構造を有するＦａｂ二量体分子複合体（すなわち生物学的エフェクター部分がＦａｂフラグメントである単一特異性二量体分子複合体）の産生を示す。このコンストラクトはＦａｂのＣＨ１ドメインのＣ末端とＩｇＧ１ヒンジ領域のＮ末端の間にリンカー配列を有さず、この領域の配列はＩｇＧと同じである。
【００６９】
ＩｇＧ１ヒンジ領域において、溶解が困難になる可能性を避けるため、ヒンジ領域のＣ末端に位置する４つの疎水性アミノ酸、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、ＬｅｕおよびＰｈｅを、それぞれ親水性残基Ａｓｐ、Ｓｅｒ、ＧｌｕおよびＴｙｒにより置換した（配列番号２０のアミノ酸残基２６３−２６６）。ヒンジ領域に存在する２つのシステイン基は、ＣＨ４領域の二量体化によりそれぞれの融合タンパク質間に共有結合を生じる。ＣＨ１およびＣＬの両方のＣ末端にも別のシステインが位置し、これらのドメインがジスルフィド共有結合によって連結できるようになっている。
【００７０】
（ａ）ＩｇＧ１ヒンジ領域およびＩｇＥ  ＣＨ４ドメインのＩｇＧ１発現ベクターへの挿入
ＩｇＧ１ヒンジ領域およびＩｇＥ  ＣＨ４ドメインをコードするＤＮＡを、ＰｃｉＩおよびＦｓｅＩ制限部位を導入するプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、次いでこの領域を制限酵素による消化によってクローニングベクターｐＣＲ２．１＿ＴＯＰＯへクローニングして、Ｊ＿ＤＳＥＹ二量体分子複合体のＦａｂ融合タンパク質の重鎖を創出するためのｐＣＲ２．１＿ｈｉｎｇｅ＿ＩｇＥ  ＣＨ４を産生した。
ＡＴＧ４７正方向プライマー：ＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣ（配列番号３１）；
ＡＴＧ４６逆方向プライマー：ＴＧＴＧＧＣＣＧＧＣＣＣＴＡＴＴＴＡＣＣＧＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＣＴ（配列番号３２）；
【００７１】
Ｆａｂ抗体（ＡＢＪ）のＶＨおよびＣＨドメインをＰｃｉＩ制限部位を導入するプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、制限酵素（ＥｃｏＲＶおよびＰｃｉＩ）による消化によってｐＣＲ２．１＿ｈｉｎｇｅ＿ＩｇＥ  ＣＨ４へクローニングした。
ＡＴＧ５１正方向プライマー：ＧＴＴＧＡＡＡＴＴＡＡＡＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号３３）；
ＡＴＧ５６逆方向プライマー：ＧＡＣＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＴＡＴＣＧＣＡＧＣＴＴＴＴＣＧＧＴＴＣＣＡＣＴＴＴＴＴＴＡＴＣＣ（配列番号３４）；
【００７２】
完全な重鎖複合体をＸｍａ制限部位を導入するプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、次いで制限酵素（ＢｌｐＩおよびＸｍａＩ）による消化によってＩｇＧ１発現ベクターｐＩＥ＿ＡＢＪへクローニングし、ベクターｐＩＥ−Ｊ＿ＤＳＥＹを産生した。図１０を参照のこと。
ＡＴＧ７５正方向プライマー：ＣＡＧＧＴＧＣＡＡＴＴＧＧＴＴＣＡＧＡＧＣＧ（配列番号３５）；
ＡＴＧ７６逆方向プライマー：ＣＧＡＣＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＣＣＧＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＣＡＣ（配列番号３６）。
【００７３】
（ｂ）第二の重鎖Ｆａｂ融合タンパク質の産生
異なる（より塩基性の）ＩｇＧ１ヒンジドメインを有する第二のＦａｂ二量体分子コンストラクトを、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔおよび適切なプライマーセットを用いて、Ｊ＿ＤＳＥＹ二量体重鎖およびＩｇＥ  ＣＨ４ドメイン（配列番号２０）から、配列番号２０の２６３から２６６位のアミノ酸Ａｓｐ、Ｓｅｒ、ＧｌｕおよびＴｙｒを、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＬｙｓおよびＴｙｒ（ＫＳＫＹ）により置換して作製した。
ＡＴＧ８５正方向プライマー：ＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＴＡＣＣＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣ（配列番号３７）；
ＡＴＧ８６逆方向プライマー：ＧＣＡＣＧＣＧＧＣＧＧＧＴＡＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＧＡＣＧＧＴＣＣＣＣＣ（配列番号３８）；
によりベクターｐＩＥ−Ｊ＿ＫＳＫＹが産生される。
【実施例６】
【００７４】
Ｊ＿ＤＳＥＹおよびＪ＿ＫＳＫＹ  Ｆａｂ二量体分子複合体の発現および精製
実施例５に記載のＪ＿ＤＳＥＹおよびＪ＿ＫＳＫＹ  Ｆａｂ重鎖融合タンパク質コンストラクトをそれぞれ哺乳類発現ベクターｐＩＥ−ＡＢＫにクローニングし、ＣＨＯ−Ｋ１細胞において発現させた。それぞれの発現産物の精製はタンパク質Ｌアフィニティークロマトグラフィーを用いて行い、精製された複合体を、結合、抗原特異性および親和性についてＥＬＩＳＡを用いて試験した。精製複合体の分子量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ系において還元条件下にて分析したところ（４％−１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ランニングバッファーＭＯＰＳ  ＳＤＳ、１２０ｍＡ、２００Ｖにて６０分）、予想した分子量を有することが示された。
【実施例７】
【００７５】
別の重鎖Ｆａｂ融合タンパク質の産生
同じ抗原に対する抗体（ＡＢ２５）を用いて別のＦａｂ二量体分子複合体を産生した。
【００７６】
ＡＢ２５の重鎖可変領域（配列番号４２）をＭｆｅＩ制限部位を導入するプライマーを用いてＰＣＲによりクローニングし、制限酵素（ＮｏｔＩおよびＢｌｐＩ）による消化によってｐＩＥ−Ｊ＿ＤＳＥＹ発現ベクターへ挿入した。
ＡＴＧ  １０５正方向プライマー：
ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＡＴＴＧＧＴＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧ  （配列番号３９）；
ＡＴＧ  １０６逆方向プライマー：ＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＴ（配列番号４０）；
【００７７】
ＡＢ２５の軽鎖可変領域（配列番号４４）を制限酵素（ＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩ）による消化によってｐＩＥ−Ｊ＿ＤＳＥＹ発現ベクターへ挿入した。
【実施例８】
【００７８】
２５＿ＤＳＥＹ  Ｆａｂ二量体分子複合体の発現および精製
実施例７に記載の２５＿ＤＳＥＹ  Ｆａｂ二量体分子複合体コンストラクトをＣＨＯ−Ｋ１細胞において発現させた。精製はタンパク質Ｌアフィニティークロマトグラフィーを用いて行い、精製複合体を、結合、抗原特異性および親和性についてＥＬＩＳＡを用いて試験した。精製複合体の分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ系において還元条件下にて分析したところ、予想した分子量を有することが示された。予測したように、二量体分子複合体（２５＿ＤＳＥＹ）の結合活性は、Ｆａｂの結合活性と比較して改善されており、ＩｇＧ型において観察された結合と同等であった。二量体の２５＿ＤＳＥＹ  Ｆａｂ二量体およびＩｇＧについてのＥＣ５０は両方ともナノモーラー以下の範囲であった。ＡＢ２５の単量体のＦａｂと二量体のＩｇＧ型を同様のアッセイにおいて比較した先の研究は、二量体のＩｇＧが単量体のＦａｂよりもより高い結合活性にて結合したことを示しており、本実施例の結果と一致している。図１４を参照のこと。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
0005600758.tif 000003
【図１Ｃ】
0005600758.tif 000004
【図１Ｄ】
0005600758.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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