(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サポニン、オリゴ糖またはこれらの混合物を含む化学的成分の薬理学的活性混合物を含有する、選択されたアメリカニンジン（Panax quinquefolium）植物の抽出物から薬理学的活性の再現性を保証する方法であって、
（ａ）前記植物抽出物の第１の試料を得るために抽出を実施する工程と、
（ｂ）前記第１の試料の化学的成分に関する定性的および定量的情報の少なくとも１つを提供する第１の化学的指紋を得るために、前記第１の試料について前記第１の試料の化学的成分の分離および検出を含む化学的分析を実施する工程と、
（ｃ）前記第１の試料の薬理学的活性に関する情報を提供する第１の薬理学的指紋を得るために、前記第１の試料に関する患者の病状の有効な治療と関係することが知られている少なくとも２つの薬理学的試験を行う工程であって、前記薬理学的活性は、免疫系の亢進、抗うつ剤の活性、抗高血圧活性または神経の保護の活性を包含しており、
ここで、前記免疫系の亢進は、脾臓の全リンパ球の産生、脾臓の抗体の産生、血清全抗体産生、および血清免疫グロブリンＧレベルから選択された１または２以上の試験におけるコントロールに対する明確な活性で定義され、
前記抗うつ剤の活性は、インビトロでのモノアミン酸化酵素Ａ阻害活性、インビトロでのモノアミン酸化酵素Ｂ阻害活性、マウスの強制泳動テスト、およびマウスの運動活性テストから選択された１または２以上の試験におけるコントロールに対する明確な活性で定義され、
前記抗高血圧活性は、インビボでの血圧測定、インビボでの血管収縮性試験、およびインビボでの心臓収縮性試験から選択された１または２以上の試験におけるコントロールに対する明確な活性で定義され、
前記神経の保護の活性は、インビトロでのコリン吸収、インビトロでのモノアミン酸化酵素Ａ阻害活性、インビトロでのモノアミン酸化酵素Ｂ阻害活性、およびモリスの水迷路およびスコポラミンにより誘発される記憶喪失試験から選択された１または２以上の試験におけるコントロールに対する明確な活性で定義され、
（ｄ）前記アメリカニンジン植物の抽出物の第２の試料を得るために、工程（ａ）において前記第１の試料を得るために用いた前記抽出を繰り返す工程と、
（ｅ）前記第２の試料について前記工程（ｂ）および工程（ｃ）の試験を反復して、第２の化学的指紋および第２の薬理学的指紋を得る工程と、
（ｆ）前記第１の化学的指紋と前記第２の化学的指紋、および前記第１の薬理学的指紋と前記第２の薬理学的指紋のそれぞれについて比較する工程と、
を有し、
前記第１の試料の化学的成分の量が、前記第２の試料の化学的成分の量に対して、その差において＋１０％または−１０％を越えないで異なっており、
前記第１の試料の薬理学的試験の各々からの結果が、対応する前記第２の試料の薬理学的試験結果に対して、＋１０％または−１０％を越えない場合において、
前記第１の試料および前記第２の試料は、再現性のある薬理学的活性を有することが保証されているとする、
植物抽出物の薬理学的活性の再現性を保証する方法。
【請求項２】
前記工程（ｃ）は、前記第１の薬理学的指紋を得るために、少なくとも２つのインビトロおよび少なくとも２つのインビボの薬理学的試験の実施を含み、
前記２つのインビボの薬理学的試験は、ラットまたはマウスモデルにおいて行う、
請求項１に記載の植物抽出物の薬理学的活性の再現性を保証する方法。
【請求項３】
再現性のある薬理学的活性を持つ選択されたアメリカニンジン（Panax quinquefolium）植物の抽出物を生成する抽出工程を保証する方法であって、
当該アメリカニンジン植物の抽出物は化学的成分の薬理学的活性混合物を含有しており、当該化学的成分の薬理学的活性混合物はサポニン、オリゴ糖またはこれらの混合物を含む化学的成分の薬理学的活性混合物を含有している、再現性のある薬理学的活性を持つ選択されたアメリカニンジン植物の抽出物を生成する方法であって、
当該方法は、
（ａ）前記抽出工程によって生成されている、前記選択されたアメリカニンジン植物抽出物の第１の試料および前記選択されたアメリカニンジン植物抽出物の第２の試料を準備する工程と、
（ｂ）前記第１の試料の化学的成分に関する定性的および定量的情報の少なくとも１つを提供する第１の化学的指紋を得るために、前記第１の試料について前記第１の試料の化学的成分の分離および検出を含む化学的分析を実施する工程と、
（ｃ）前記第１の試料の薬理学的活性に関する情報を提供する第１の薬理学的指紋を得るために、前記第１の試料に関する患者の病状の有効な治療と関係することが知られている少なくとも２つの薬理学的試験を行う工程であって、前記薬理学的活性は、免疫系の亢進、抗うつ剤の活性、抗高血圧活性または神経の保護の活性を包含しており、
ここで、前記免疫系の亢進は、脾臓の全リンパ球の産生、脾臓の抗体の産生、血清全抗体産生、および血清免疫グロブリンＧレベルから選択された１または２以上の試験におけるコントロールに対する明確な活性で定義され、
前記抗うつ剤の活性は、インビトロでのモノアミン酸化酵素Ａ阻害活性、インビトロでのモノアミン酸化酵素Ｂ阻害活性、マウスの強制泳動テスト、およびマウスの運動活性テストから選択された１または２以上の試験におけるコントロールに対する明確な活性で定義され、
前記抗高血圧活性は、インビボでの血圧測定、インビボでの血管収縮性試験、およびインビボでの心臓収縮性試験から選択された１または２以上の試験におけるコントロールに対する明確な活性で定義され、
前記神経の保護の活性は、インビトロでのコリン吸収、インビトロでのモノアミン酸化酵素Ａ阻害活性、インビトロでのモノアミン酸化酵素Ｂ阻害活性、およびモリスの水迷路およびスコポラミンにより誘発される記憶喪失試験から選択された１または２以上の試験におけるコントロールに対する明確な活性で定義され、
（ｄ）前記第２の試料について前記工程（ｂ）および工程（ｃ）の試験を反復して、第２の化学的指紋および第２の薬理学的指紋を得る工程と、
（ｅ）前記第１の化学的指紋と前記第２の化学的指紋、および前記第１の薬理学的指紋と前記第２の薬理学的指紋のそれぞれについて比較する工程と、
を有し、
前記第１の試料の化学的成分の量が、前記第２の試料の化学的成分の量に対して、その差において＋１０％または−１０％を越えないで異なっており、
前記第１の試料の薬理学的試験の各々からの結果が、対応する前記第２の試料の薬理学的試験結果に対して、＋１０％または−１０％を越えない場合において、
前記第１の試料および前記第２の試料を生成する前記抽出工程は、再現性のある薬理学的活性を持つ前記選択された植物抽出物を生成することが保証されているとする、
植物抽出物を生成する抽出工程の再現性を保証する方法。
【請求項４】
前記工程（ｃ）は、前記第１の薬理学的指紋を得るために、少なくとも２つのインビトロおよび少なくとも２つのインビボインビボの薬理学的試験の実施を含み、
前記２つのインビボの薬理学的試験は、ラットまたはマウスモデルにおいて行う、
請求項３に記載の植物抽出物の薬理学的活性の再現性を保証する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は抽出操作の再現性を確実にする方法に向けられている。本発明はまた、生物学的源、特に植物源からの化学組成物の薬理学的に活性な混合物を、高い再現性で抽出する方法に向けられている。さらに本発明は、高い薬理学的活性を有する、生物学的資源から得られる薬理学的に活性な混合物を得る方法に向けられている。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
薬草の料理における一般的な使用に加えて、人間の文化の開始のすぐ後から、薬草は薬草の治療および薬草の薬に用いられてきた。薬草はまた、日常の活動を増強するための食物の添加物として、ある文化において用いられてきた。そのような治療に、および食品添加物として用いられる典型的な薬草は、浸出液あるいは茶として摂取され、または湿布剤として外部から与えられる。そのような投与において、用いられる薬草は典型的にはたくさんの化学組成物の混合物である。一般的には、広く受け入れられている薬草の治療の適切な使用は、患者において有害な副作用の上昇を与えない。薬草治療の有効性は、何世紀もそのような治療を採用してきたそれらの文化においてたしかに確立されているが、西洋科学の記録においてはまだ「承認されて」いない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Takagi K. ら，Japan J. Pharmacol. 22:339(1972)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
西洋薬学は一般的に、単独で、またはさらに好ましくは、薬学的に承認された担体内で投与される、単一の組成物または比較的少ない組成物の混合物のいずれか一方として採用されている。薬品としての、これらの単一組成物の研究および開発が、強力な科学的および医学的文書の作成の大部分である。不運なことに、これらの薬品の多くは比較的短い使用の歴史をもち、多くが深刻な副作用を起こすことが示されている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ある程度一般的に、西洋薬学の表現が治療の科学としてみなされるが、一方では伝統的な漢方薬が治療の技術とみなされる場合もある。現代において漢方薬は、西洋においていくらかの容認を得ているが、まだ、いくつかの特定の挑戦に会う。第一に、多くの高度に訓練された医療従事者の主張には、漢方薬は我々の高度に技術的で科学指向の社会において、科学的に支持する十分なデータを欠いているという見方がある。第二に、漢方薬のどの組成物が薬理学的に有効であるかについての心配がある。さらに、漢方薬の薬学的有効成分に存在する濃度または投与量に対する疑問が生じる。つまり、伝統的な医療の従事者は、薬草治療についての質的および量的の両方の基準の欠如を心配している。そのような標準化の欠如は、そのような非伝統的な、または薬草の薬物を処方して投与量を適合させる能力を隠すとみられている。そのような標準化の欠如はまた、制御機関の一部に、さらなる研究やそのような非伝統的な治療の容認に対する躊躇を招いてきた。
【０００６】
西洋伝統医学の基準のいくつかを満たしていないが、そのような薬草組成物は副作用がわずかあるいは皆無であり、様々な病気の治療に実に効果的であることが知られている。ある程度、多くの場合における薬学的な活性は、特定の生物学的活性成分の存在だけでなく、薬草混合物に存在する２またはそれ以上の化学組成物の組み合わせの結果得られる、相乗的な効果に起因し得る。
【０００７】
漢方薬および生物学的に増強する薬草組成物の両方として定義される薬草治療薬は、植物から得られるために、そのような薬草治療薬の化学組成は、少なくとも遺伝子の組成や、植物が生産される生長条件、収穫条件および植物の活性成分の単離と同様の、たくさんの因子に応じて多様となる。したがって、特定の植物の生物学的な多様性は、典型的には、植物に見出される特定の化学組成物の量の顕著な多様性を生じさせることが予測される。そのように、同一の生物学的分類の植物であっても、土壌、湿気および他の生長条件の違いが、植物により生産される特定の化学組成物の量に顕著に影響する可能性がある。
【０００８】
最後に、植物が処理される方法が、植物から単離される特定の化学組成物の相対的な比率および全量に重大な影響を及ぼす可能性がある。そこで、収穫、貯蔵、粒子の大きさの低減、液体組成物の圧搾、および抽出のような工程がすべて、化学組成物の比率および量、したがって、単離された生成物の薬理学的活性
を決定する。
【発明の効果】
【０００９】
薬草組成物の組成および薬学的活性に影響を与える多くの因子を考慮すると、その化学組成物およびそのような化学的な混合物の薬学的活性の両方の観点から、薬物組成物の標準化に基づいた方法を採用することが望ましい。さらに、生育された植物の生長条件を大規模で標準化するのは不可能かもしれないが、標準化された薬草組成物を得るために、処理条件を標準化することが望ましい。さらに、生物学的混合物、特に植物または薬草混合物の組成を精確に決定し、比較することが可能であれば、高い薬理学的活性を得るために処理条件が制御されるようになるであろう。科学の集団で得られるそのような方法によれば、薬草組成物の特定の投与量を自信をもって処方する医者だけでなく、薬草組成物の「製造業者」も、そのような混合物のより高い薬理学的活性、改善された品質制御、および、多様な源からの薬草混合物を区別する能力を達成するであろう。
【００１０】
（発明の開示）
本発明は、高い薬理学的活性をもつ標準化された生物学的組成物を得る方法、および標準化された処理操作を得る方法の両方を提供する。本発明はまた、抽出のような特定の方法により得ることが可能な、高いまたは最も高い薬理学的活性を有する生物学的組成物、特に薬草組成物の単離を可能にする。ここで、「生物学的組成物」とは、生物源から得られる成分の混合物を指す。そのような源は、動物であっても植物であってもよい。本発明は、植物または野菜の源に対して最も広い適用をもつことが期待される。ここで「組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」として用いられる語は、成分の混合物を指す。ここで「成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）」として用いられる語は化合物、そのような化合物の塩、複合体および自然界で見出される他の分子およびイオン種を指す。ここで「薬草の（ｈｅｒｂａｌ）」およびその変形として用いられる語は、食用の野菜または植物の物質または材質を指す。
【００１１】
本発明の、生物学的源、好適には植物から得られる化合物の、生物学的または薬理学的に活性な混合物の標準化に用いられる方法は、まず、同一の生物学的源、好適には植物源からの複数の試料を用いる、複数の生成物を生産するための複数の異なる操作の実施を有する。単離された生成物は、その後、薬理学的試験に供され、その試験において最も高い薬理学的活性を示す生成物が選択される。選択された生成物を生産するのに用いられる特定の操作が、その後、試験生成物を生産するために繰り返される。その後、生成物の（複数の種類の）化学的成分に関する質的な、および多くの場合、量的な情報を提供するために、選択された生成物と試験生成物の両方に物理的および／または化学的試験が行われる。まず複数の生成物に対して行われた薬理学的試験は、その後、試験生成物に繰り返される。質的および量的な情報または時々そのように称される「化学的指紋」、および選択された生成物と試験生成物の薬理学的活性が互いに比較される。試験生成物の化学的成分または（複数の種類の）化学的成分が、選択された生成物の同一の化学的成分の量と、約プラスまたはマイナス１０％以内で異なる量で存在し、試験生成物の薬理学的活性が選択された生成物の対応する薬理学的活性と、プラスまたはマイナス約１０％パーセント以内で違うような場合には、選択された生成物を生産するのに用いられた操作が、薬理学的活性混合物を生産する標準操作として選択される。さらに、最も高い薬理学的な活性が探索されたことを確実とするために、薬理学的試験（または「薬理学的指紋」）により決定された最高の薬理学的活性を有し、物理的および／または化学的試験（または「化学的指紋」）により同定された混合物を、好適な薬理学的活性混合物として選択してもよい。
【００１２】
一般に、検討される操作は同様であるか、一般的には同じである。薬草治療薬または組成物に用いられる混合物のように、例えば、化学的成分の混合物の源が植物源である場合には、典型的な操作は収穫の方法、貯蔵の方法、液体成分を圧搾する方法、および好適には化学的成分、最も好適には、薬理学的な活性に最も関与する化学的成分を抽出する方法を含んでもよい。特定の操作に方法が選択され、複数の方法の生成物を生産するため、可能なときは一度に複数の変数が変更される。抽出の方法において、好適な選択された生成物および試験生成物はそれぞれ、（複数の植物抽出物から得られた）選択された植物抽出物および試験植物抽出物であろう。
【００１３】
操作の生成物、好適には植物抽出物に行われる薬理学的試験は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および／またはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の薬理学的試験の形式であってよい。本発明において、少なくとも２つのインビトロおよび少なくとも２つのインビボの薬理学的試験が用いられることが好ましい。これらの試験は一般に、生体の変化した生物学的な状態と関係する。これは、生体の増強された状態、または、患者の医学的な状態の効果的な処置のどちらの形もとり得る。増強された状態の例は、覚醒された状態、鎮静効果等を起こす刺激剤であり得る。
【００１４】
生成物、薬草材料が検討されている場合には好適には植物抽出物は、最良または最高の薬理学的活性を示すものが選択される。これは、生物学的状態の最も顕著な増強、または患者の最も望ましい医学的な状態を起こすものに対応する。
抽出操作が試験されている時の試験抽出物のような試験生成物を得るには、選択された植物抽出物のような選択された生成物を得るために用いられる同一の条件が再現される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ラット脳シナプトソームによるコリン吸収に対する、様々な投与量のＲｂ1 およびＨＣ３の効果を示す図である。
【図２】Ｄ７９１  １７５（１４．９００）Ｃｍ（１７０：１７９）はクロマトグラム走査番号Ｄ７９１を表し、スペクトラムが操作番号１７５について１４．９００分において中央となっており、１７０から１７９までの走査の組み合わせから得られていることを示す図である。
【図３】多数のイオンカウントイベントについて得られ、ＣＶＴ−Ｅ００１に見出される薬物に特徴的である質量スペクトルを示す図である。
【図４】多数のイオンカウントイベントについて得られ、ＣＶＴ−Ｅ００１に見出される薬物に特徴的である質量スペクトルを示す図である。
【図５】多数のイオンカウントイベントについて得られ、ＣＶＴ−Ｅ００１に見出される薬物に特徴的である質量スペクトルを示す図である。
【図６】多数のイオンカウントイベントについて得られ、ＣＶＴ−Ｅ００１に見出される薬物に特徴的である質量スペクトルを示す図である。
【図７】多数のイオンカウントイベントについて得られ、ＣＶＴ−Ｅ００１に見出される薬物に特徴的である質量スペクトルを示す図である。
【図８】多数のイオンカウントイベントについて得られ、ＣＶＴ−Ｅ００１に見出される薬物に特徴的である質量スペクトルを示す図である。
【図９】多数のイオンカウントイベントについて得られ、ＣＶＴ−Ｅ００１に見出される薬物に特徴的である質量スペクトルを示す図である。
【図１０】多数のイオンカウントイベントについて得られ、ＣＶＴ−Ｅ００１に見出される薬物に特徴的である質量スペクトルを示す図である。
【図１１】多数のイオンカウントイベントについて得られ、ＣＶＴ−Ｅ００１に見出される薬物に特徴的である質量スペクトルを示す図である。
【図１２】多数のイオンカウントイベントについて得られ、ＣＶＴ−Ｅ００１に見出される薬物に特徴的である質量スペクトルを示す図である。
【図１３】純粋なジンセノシド  Ｒｂ１の質量スペクトルを示す図である。
【図１４】純粋なジンセノシド  Ｒｇ１の質量スペクトルを示す図である。
【図１５】１日当たり水（０．５ｍｌ）またはＣＶＴ−Ｅ００１（２００ｍｇ／ｋｇを０．５ｍｌ中）のいずれか一方を給餌された（８−１３日）ラットの学習曲線を示す図であり、ラットはプールの中央で隠されたプラットフォームの位置を学習することを、５日を超える間、要求された。ラットはそれぞれの日に４回の試行を受けた。値は、３５または３６回の試行に基づく、平均±平均の標準誤差である。処置の明らかな効果は示されなかった。
【図１６】ラットが、隠されたプラットフォームの最初の新しい場所を学習する、反応時間（１４日）示す図であり、ラットは我々のグループに分類された。グループ１（Ｃ／Ｓｃｏｐ）は食餌の栄養として水のみを受け、試験の１５分前にスコポラミン（２ｍｇ／ｋｇ）を注射された。グループ２（ＨＴ／Ｓｃｏｐ）は食餌の栄養としてＣＶＴ−Ｅ００１（２００ｍｇ／ｋｇ／日）を受け、試験の１５分前にスコポラミン（２ｍｇ／ｋｇ）を注射された。グループ３（Ｃ／Ｓａｌ）は食餌の栄養として水を受け、試験の１５分前に食塩水（０．２ｍｌ）を注射された。グループ４（ＨＴ／Ｓａｌ）は食餌の栄養としてＣＶＴ−Ｅ００１を受け、試験の１５分前に食塩水（０．２ｍｌ）を注射された。＊はＣ／Ｓｃｏｐとｐ＜０．０５で明らかに異なる。
【図１７】ラットが、隠されたプラットフォームの最初の新しい場所を学習する反応時間（１４日）の３回の試行の組み合わされたデータ示す図であり、処理は図１６におけるのと同じである。値は、３３または３６回の試行に基づく、平均±平均の標準誤差である。明らかな違いは示されなかった。
【図１８】ラットが、隠されたプラットフォームの最初の新しい場所を思い出す反応時間（１５日）示す図であり、処理は図１６におけるのと同じである。値は、１１または１２回の試行に基づく、平均±平均の標準誤差である。 *はＣ／Ｓｃｏｐとｐ＜０．０５で明らかに異なる。**はＣ／Ｓｃｏｐとｐ＜０．０１で明らかに異なる。
【図１９】ラットが、隠されたプラットフォームの最初の新しい場所を思い出す反応時間の、３回の試行の組み合わされたデータ（１５日）示す図であり、処理は図１６におけるのと同じである。値は、３３または３６回の試行に基づく、平均±平均の標準誤差であり、 *はＣ／Ｓｃｏｐとｐ＜０．０５で明らかに異なる。**はＣ／Ｓｃｏｐとｐ＜０．０１で明らかに異なる。 ***はＣ／Ｓｃｏｐとｐ＜０．０１で、ＨＴ／Ｓｃｏｐとｐ＜０．０５で明らかに異なる。
【図２０】ラットが、隠されたプラットフォームの２番目の新しい場所を学習する反応時間（１６日）示す図であり、処理は図１６におけるのと同じである。値は、１１または１２回の試行に基づく、平均±平均の標準誤差である。 *はＣ／ＳｃｏｐおよびＨＴ／Ｓｃｏｐとｐ＜０．０１で明らかに異なる。
【図２１】ラットが、隠されたプラットフォームの２番目の新しい場所を学習する反応時間の３回の試行の組み合わされたデータ（１６日）示す図であり、処理は図１６におけるのと同じである。値は、３３または３６回の試行に基づく、平均±平均の標準誤差である。明らかな違いは示されなかった。
【図２２】ラットが、隠されたプラットフォームの２番目の新しい場所を思い出す反応時間（１７日）示す図であり、処理は図１６におけるのと同じである。値は１１または１２回の試行に基づく、平均±標準誤差または平均である。 *はＣ／Ｓｃｏｐとｐ＜０．０５で明らかに異なる。
【図２３】ラットが、隠されたプラットフォームの２番目の新しい場所を思い出す反応時間の３回の試行の組み合わされたデータ（１７日）示す図であり、処理は図１６におけるのと同じである。値は３３または３６回の試行に基づく、平均±平均の標準誤差である。 *はＣ／Ｓｃｏｐとｐ＜０．０１で明らかに異なる。
【図２４Ａ】ロット３に対する紫外吸収特性（ｕｖ  ＡＮＯＬＯＧ）を示す図である。
【図２４Ｂ】ロット３に対する全イオン数（ＴＩＣ）を示す図である。
【図２５Ａ】ロット４に対する紫外吸収特性（ｕｖ  ＡＮＯＬＯＧ）を示す図である。
【図２５Ｂ】ロット４に対する全イオン数（ＴＩＣ）を示す図である。
【図２６】ＰＣ１２細胞におけるＮＧＦによるニューライトの成長の亢進を示す図である。
【図２７】ＰＣ１２細胞におけるＣＶＴ−Ｅ００１によるニューライトの成長亢進を示す図である。
【図２８】ＮｌＥ−１１５におけるニューロン成長に対するＣＶＴ−Ｅ００１の効果を示す図である。
【図２９】コントロール細胞の原物の写真を示す図である。
【図３０】処理された細胞の原物の写真を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（発明の実施の形態）
本発明の方法は、薬草処理技術、特に植物源からの薬理学的活性混合物の抽出の差別化、再現性の改善および達成、または標準化、および高い薬理学的活性の植物抽出物を得ることにおいて、最も広い適用を有すると期待される。発明の再現性および標準化の手順は、単離された、典型的には抽出操作で得られた生成物の薬理学的および化学的指紋分析の組み合わせの使用を含む。
【００１７】
化学的指紋分析
化学的指紋分析は、存在する（複数の種類の）化合物に特徴的である質的な、および多くの場合には量的な情報を得るために、１つの化合物または化合物の混合物、例えば薬草の薬学的混合物が試験される過程である。これらの特徴的な成分の認識可能で特徴的な量での存在は、（複数の種類の）成分の薬学的性質と関係する可能性のある化学的な特徴を提供する。化学的指紋分析の準備または集積は、試料、植物ソースから得られる材料に指紋分析が適用されるときにはしばしば抽出物を、クロマトグラフィーまたは電気泳動法、および続いて行われる、分離方法において溶出される化学的成分の分析を含む分離操作に供する。溶出された化学的成分の実際の化学的指紋の形成において、たくさんの検出方法が採用されてよい。薬草の薬学的組成物から得られる化学的成分を分離する最も適切な方法は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）であり、溶出された薬物の特性分析は、紫外吸収測定および続いて行われるエレクトロスプレー質量分析による。この分析方法は、薬草の薬学的調製において見出されるような、化学的成分の複雑な混合物の最も明確な特性分析を提供する。このような指紋から得られるデータは、薬草の薬学的調製物の化学的成分の化学的な特徴に関する情報だけでなく、提供された試料の信頼性、純度、および組成の一致に関する情報も提供する。
【００１８】
薬草の薬学的生成物のような複雑な化学的混合物の化学的指紋は、薬草の薬学的生成物の可溶な抽出物の調製をしばしば含む、化学的混合物の成分の可溶化を含む。溶液または抽出物はその後、混合物を成分のグループ、または好適には個々の成分に分類する分離操作に供される。そのような分離操作は、化学的分析方法と組み合わされたときに、生成物に通常見出され、生成物に特徴的である重要な化学的構成物の、しばしば正確な同定を可能にする。
【００１９】
採用される分離操作は好適には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、電気泳動（ゲルまたはキャピラリー）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）およびガスクロマトグラフィー（ＧＣ）のようなクロマトグラフィー操作である。引き続き薬学的な評価を行うことができる試料を得るために、ＨＰＬＣが好適な方法である。ＨＰＬＣの場合に好適な検出系は、吸収および蛍光分光法、屈折率、電気化学的方法、蒸発光散乱、エレクトロスプレー質量分析、またはこれらの組み合わせを含む。ＧＣの場合は、電子捕獲、ナトリウム−リンまたは質量分析計がしばしば用いられる。ＴＬＣおよび電気泳動の分離方法が採用されるとき、様々な熱量の、および／または質量分析の検出方法が採用される。薬草の薬学的生成物の場合には、紫外吸収検出およびエレクトロスプレー質量分析と組み合わせたＨＰＬＣの使用が、吸収の指紋を提供し、吸収成分の多くに分子質量を帰属させる。カラムからの溶出プロフィールと吸収特性と分子質量特性との組み合わせは、質的および量的の両方で薬草の生成物の個々の化学的構成物の同定を提供する。
【００２０】
化学的指紋は一般に、吸収およびエレクトロスプレー質量分析検出と組み合わされたＨＰＬＣを用いて行われる。以下の説明は、ＣＶＴ−Ｅ００１の指紋分析に関係する。
【００２１】
簡潔には、対象となる薬草の生成物は適切な溶媒、しばしば水、アルコール、アセトニトリル、エチルアセテート、またはこれらの溶媒の組み合わせ（アルコール溶液はしばしば、さらに処理されずに分析される）に抽出される。抽出物はその後、粒子を除去するために濾過され、干渉する溶媒を除去するために乾燥される。抽出物は分析まで冷凍されて保存されてもよい。分析が行われるとき、抽出物は適切な溶媒に溶解される。典型的には０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する２０％アセトニトリルを用いることができるが、これは分析される抽出物の溶解度に応じて変更することができる。既知の量の抽出物はその後、ＨＰＬＣ装置に添加される（典型的には１００ｍｌの溶媒中で１ｍｇ以下が分析される）。ＨＰＬＣ装置は、１分間に０．０１ｍｌから５ｍｌの範囲またはそれ以上の流速を有し、無勾配の系も用いることができるが、溶媒の勾配を提供する能力を有する、たくさんの入手可能な型のいずれでもよい。典型的には薬草の生成物の化学的構成物の分離は、水、アセトニトリルおよびＴＦＡの勾配溶出を用いることにより達成される。溶媒Ａは水、または少量のアセトニトリル（２％−５％）および０．０５％ＴＦＡを含有する水からなる。溶媒Ｂは０．０５％ＴＦＡを含む高濃度のアセトニトリル（７０％−９５％）からなる。流速は通常１分間に１ｍｌ（１分間に０．５ｍｌ−１．５ｍｌまたはそれ以外の流速が用いられてもよい）である。少量の溶媒Ａから多量の溶媒Ｂへ移行する勾配が用いられる。この勾配は、選択された化学的成分を単離するために変更可能である。勾配の一例は以下を含むことができる：溶媒Ａ（５％アセトニトリル，０．０５％ＴＦＡ）、溶媒Ｂ（７０％アセトニトリル，０．０５％ＴＦＡ）；流速１ｍｌ／分；時間＝０において移動相は１００％溶媒Ａである。時間＝３０分において移動相は１００％溶媒Ｂである。０と３０分の間で勾配の変化は直線的である。３０と３５分の間で移動相は１００％溶媒Ｂである。３５と４０分の間で溶媒は１００％溶媒Ａに戻され、分離系は次の試料の分析の前に再び平衡化される。
【００２２】
ＨＰＬＣが化学的指紋分析に好適な試験である一方、技術分野の者に明らかであるように、タンパク質の定量、炭化水素の定量、有機抽出または化学分析の他の方法にＴＬＣを用いることも可能である。
【００２３】
分離は、分析用高速液体クロマトグラフィーカラム（通常、４．６ｍｍの内径×長さ２５ｃｍ）において達成されるが、他の大きさが用いられてもよい（例えば１ｍｍ×２５ｃｍ）。カラムは、薬物の分離に用いられる、たくさんの充填材料（逆相材料、シリカ、親水性相互作用材料等）のうちのいずれを含んでもよい。典型的には、Ｃ8 逆相材料を含む逆相カラムが用いられる。
【００２４】
対象となる薬物の検出は、前述した適用可能な検出器の使用を含む。典型的には紫外吸収とエレクトロスプレー質量分析の組み合わせが用いられる。ＨＰＬＣカラムからの溶出直後に、対象となる化合物を含む溶媒が紫外吸収検出器を通過して吸収が記録され、これにより、典型的な吸収プロフィールが提供される（対象となる薬物の吸収特性に応じて、たくさんの波長が測定される）。紫外吸収検出器の通過の直後に、対象となる薬物を含む溶媒は、エレクトロスプレー質量分析計に続く。分析用カラムの場合には、エレクトロスプレー装置が少ない流量の溶媒（最高で５０−１００ｍｌ／分）にしか適用されないため、一定量の流れる溶媒が分離される。より小さいカラムの場合には、移動相のすべてがエレクトロスプレー装置に入ることが可能かもしれない。分析用カラムの場合には、分離は典型的には１０％以下の流れをエレクトロスプレー装置に入れ、一方、残りの９０％以上の流れは特定の薬物を含有する分画として、後の薬理学的評価のために集められてもよい。エレクトロスプレー質量分析計に入る薬物は、それらがプロトンをとる場合（例えばある種のアミン類、ステロイド類またはフラボン類）には、陽性モード分析のためにプラスに荷電したイオンを提供する。そのような薬物は、それらの正確な化学的質量に関する情報を提供することができるであろうし、また、それらのフラグメント化のパターンによって化学的な同定をさらに提供するかもしれない。荷電せず、むしろ塩基性環境においてプロトンを失う薬物（糖類、ある種のフェノール類およびカルボン酸）は、少し異なる方法で調べられなければならない。荷電しない薬物の場合は、個々の分画はカラムからの溶出後に集められ、適切な検出器（例えば紫外吸収または屈折率計）を通過する。その後、各分画は乾燥されてから、適当な溶媒（例えば、１０％水酸化アンモニウムが混合された水中に５０％アセトニトリル）に再構成され、陰性モードで動作しているエレクトロスプレー装置に直接、投入される。再び、正確な化学的質量、さらに、それらのフラグメント化のパターンによって化学的同定に関する情報が提供される。
【００２５】
したがって、溶出パターンの組み合わせ、紫外吸収特性および化学的質量およびフラグメント化のパターンは、薬草の生成物に見出される個々の特徴のある薬物の同定に関する広範囲な情報を提供する。この情報は、特徴的な化学的性質により、試料が信頼性があるかどうかを研究者に伝え、また、既知の量の選択された薬物を含有する標準と比較されたときに、選択された薬物の存在量の、量的な予測を提供することができる。外部からの薬物が分析において現れれば、可能性のある不純物に関する情報が提供され得る。提供された情報は研究者に、材料が望ましい物質を含有するかどうか、およびどの程度の量で（すなわち品質制御）、および可能ならば不純物が存在するかどうかを知らせるだろう。これにより、原料の情報が知らされた購入が可能になるであろうし、生産され消費者に販売される物質の品質の一致の証拠を提供する。
【００２６】
薬草抽出物に対する化学的指紋分析の応用例
ＣＶＴ−Ｅ００１はＡｍｅｒｉｃａｎ  ｇｉｎｓｅｎｇ（Ｐａｎａｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ  Ｌ．）の特定の抽出物である。それは、たくさんの特徴的なサポニン類および脂肪酸が豊富であることが知られている。表１は、Ｐａｎａｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍおよび他のＰａｎａｘ種に特徴的なたくさんのサポニン類を挙げている。ＣＶＴ−Ｅ００１は、コリンの取り込みを亢進させ、動物モデルにおいて学習および記憶を増強する能力を含む性質を有するといわれている。ＣＶＴ−Ｅ００１の２つのロットが調べられ、紫外吸収検出およびエレクトロスプレー質量分析と組み合わされた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることにより化学的指紋が形成された。
【００２７】
Ｐａｎａｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍおよび他のＰａｎａｘ種に特徴的なサポニン類
【００２８】
【表１】
0005491114.tif 000002
ＣＶＴ−Ｅ００１生成物のロット３と４のそれぞれ１０ｍｇが、別々のバイアルに、０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する水に含有された５％アセトニトリルの１．０ｍｌに溶解された。
【００２９】
原料の１ｍｇに相当するこれらの貯蔵物の１００ｍｌが、ＨＰＬＣ装置にそれぞれ添加された。クロマトグラフィーシステムは、自動導入器および紫外吸収検出器を有するＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  １０５０グラジエントＨＰＬＣシステムとした。カラムはＺｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−Ｃ８逆相カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）とした。
【００３０】
分離は水、アセトニトリルおよびＴＦＡからなる勾配溶出を用いることにより達成された。移動相Ａはカウンターイオンとして０．０５％トリフルオロ酢酸を含む水に５％のアセトニトリルであった。移動相Ｂは、カウンターイオンとして０．０５％トリフルオロ酢酸を含む水に７０％のアセトニトリルであった。流速は１．０ｍｌ／分とした。時間＝０分において移動相は１００％Ａとした。３０分において移動相は１００％Ｂであり、０と３０分の間では勾配の変化は直線的であった。３０と３５分の間では、移動相は１００％Ｂであった。３５と４０分の間では、移動相は１００％Ｂから１００％Ａに戻った。１００％Ａにおける最小限１０分の洗浄時間が、もう１つの導入の前に行われた。紫外吸収は２０３ｎｍにおいて監視された。
【００３１】
エレクトロスプレー質量分析はＦｉｓｏｎｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＶＧ  Ｑｕａｔｒｏ装置を用いて行われた。紫外吸収検出器からの溶出後、ＨＰＬＣ装置からの流れは分岐され、２％（２０ｍｌ／分）がエレクトロスプレー装置に送られた。ＨＰＬＣ装置から溶出された薬物は、分子量２００から１２００の間の質量を陽性モードで監視された。たくさんの薬物が、この生成物に特徴的な質量スペクトルを提供した。
【００３２】
図２４および２５は、ロット３および４それぞれに対する紫外吸収特性（ｕｖ  ＡＮＯＬＯＧ）および全イオン数（ＴＩＣ）を提供する。
【００３３】
両方のロットが１３．７−１３．９分の明らかなピーク、１７．６から１９．４分の間の５個の別々のピーク、３１．７分の明確なピーク、および３３．６分のもう１つの明確なピークが存在する明らかな特徴を有する、ほとんど同一の紫外吸収クロマトグラムを提供する。たくさんのより弱いピークもまた識別可能である。７つの最も主要なピークが１から７まで設定された。
【００３４】
移動相が１つの検出装置から他に流れることにより、紫外吸収信号の記録と質量スペクトルの信号との間に約１分の遅れがある。結果的に、全イオン数の１４．９０分における発生は、紫外吸収の１３．７１分における発生に対応する。以下の図（図３−１３）は、たくさんのイオンカウントイベントについて得られ、ＣＶＴ−Ｅ００１に見出される薬物に特徴的である質量スペクトルを表す。それぞれのイオンイベントは、スペクトルの左上の角部の数字により同定される。例えば図２に現れているように、Ｄ７９１  １７５（１４．９００）Ｃｍ（１７０：１７９）はクロマトグラム走査番号Ｄ７９１を表し、スペクトラムが操作番号１７５について１４．９００分において中央となっており、１７０から１７９までの走査の組み合わせから得られていることを表す。
【００３５】
以下は、７つの明らかなピークのそれぞれに関係した質量、およびこれらのピークの可能な同定を挙げたものである。Ｍ＋Ｈは、分子量プラス１つのプロトンを表す。
ピーク１  Ｍ＋Ｈ  ８０１，フラグメント４２３，４４０，５８７，７６７．ジンセノシド  Ｒｇ１と同定されるＭＷ＝８００．ジンセノシド  Ｒｅ  Ｍ＋Ｈ
９４８  ＭＷ＝９４７も存在する．これらの化合物は同時に分離され、組み合わされたスペクトルを提供する．
ピーク２  Ｍ＋Ｈ  １１１０，フラグメント７６７，４８６，６６７，９４７．ジンセノシド  Ｒｂ１と同定されるＭＷ＝１１０９
ピーク３  Ｍ＋Ｈ  １１８０，フラグメント８９９，４５６，６３７．ジンセノシド  Ｒｃと同定されるＭＷ＝１０７９
ピーク４  信号として解像されない質量が、他の成分によって覆い隠されている
ピーク５  信号として解像されない質量が、他の成分によって覆い隠されている
ピーク６  Ｍ＋Ｈ  １１５１，フラグメント７６７，４２４，５２９，３２３．キンケノシド  Ｒ１と同定される．これは、Ｐａｎａｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍに見出されるＲｂ１のアセチル化された形であり、他のＰａｎａｘ種では報告されていない．その構造を以下に示す．
【００３６】
Ｐａｎａｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍの抽出物に特徴的であるキンケノシド  Ｒ１の化学構造．
0005491114.tif 000003
ピーク７  Ｍ＋Ｈ  ２６６．同定不明．
３３．６分における小さいピークはリノール酸に同定されている。
純粋なジンセノシド  Ｒｂ１およびＲｇ１のスペクトルはまた、ＣＶＴ−Ｅ００１試料（図１４および１５）から得られたものとの比較のためにそれぞれ提供される。
【００３７】
ＣＶＴ−Ｅ００１のロット３および４はそれぞれ、記載された方法で分離されたときに、特徴的な紫外吸収クロマトグラムを生産する。エレクトロスプレー質量分析は、ＨＰＬＣ法により分離されたたくさんの薬物の明確な同定、およびＣＶＴ−Ｅ００１の特徴を提供する。２つの試料がＰａｎａｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍから正確に得られ、化学的に比較される。
【００３８】
薬理学的指紋分析
薬理学的指紋分析は、材料に基本的に薬理学的活性があるかどうかを決定するための、化合物または複数の種類の化合物の試料の試験を含む。試料の薬理学的性質または薬理学的活性は、採用される特定の生物学的または薬理学的モデルに依存する。そのようなモデルは、個人の生物学的な状態の生物学的な増強、または、患者の医学的な状態の効果的な処置を、適切に試験しなければならない。そのような患者は好適には人間であるが、例えば犬、猫、馬などの他の動物であってもよい。したがって、そのような薬理学的試験または指紋分析は、インビボおよび／またはインビトロの生物学的モデルを含む。典型的には、試験される試料は、適切な薬学的担体および／または溶媒中において、純粋な（複数の種類の）化合物として存在する。本発明の好適な実施態様において、試料は薬草抽出物または薬草抽出物のクロマトグラフィーの分画である。
【００３９】
本発明において用いられる好適な薬理学的指紋分析は、本来の抽出物と、化学的指紋分析において記載されたクロマトグラフィー操作により得られ、単離された対象となる（複数の種類の）化合物を含む、選択されたクロマトグラフィーの分画との両方の採取と、これらの分画に見出される（複数の種類の）化合物を標準化された薬理学的評価へ供することを含む。たくさんの異なる薬理学的評価が行われ得るが、一般的には、評価は（複数の種類の）評価される化学的成分または薬草の物質の意図された効果を支持する処理を示唆するものに制限される。本発明において、試料または抽出物の生物学的活性を決定するために、少なくともインビボで２つ、インビトロで２つの生物学的モデルが評価されることが最も好適である。インビトロでの実験のそれぞれにおいて、抽出物の少なくとも３つの投与量と、１つの溶媒のコントロール（対照）群が含まれることも、また好適である。少なくとも２つのモデルにおいて、試料溶液または抽出物がコントロール群と明らかに異なる薬理学的活性を示すことも、また好適である。
【００４０】
採用される生物学的または薬理学的モデルは、抽出物の成分に大きく依存する。例えば、オリゴ糖を含有するヤクヨウニンジン抽出物の分画は、免疫系を亢進するそれらの能力を評価され得た。２つのインビトロでのモデルは、マウスまたはラット脾臓を用いた全リンパ球の産生および抗体の産生を含んでもよい。２つのインビボでのモデルは、血清全抗体および免疫グロブリンＧレベルを含んでもよい。抗うつ剤の活性をもつように作られた生成物が、インビトロでのモノアミン酸化酵素ＡおよびＢ阻害能力、およびマウスの強制泳動テストおよび運動活性テストのような受け入れられている行動テストにおける抗うつ剤の活性を評価され得た。抗高血圧モデルは、対象となっている抽出物を給餌または静脈投与されたラットのインビボでの血圧測定や、インビボでの血管および心臓収縮性試験等により評価されてもよく、また、神経の保護はインビトロおよびインビボで酸化的な負荷に関与する酵素および基質、および神経保護試験により評価されてもよく、および、抗うつ剤はモノアミン酸化酵素阻害活性、ノルアドレナリンおよびセロトニンの脳内レベルの上昇、５−水酸化インドール酢酸の脳内レベルの低下、泳動、および黒および白箱試験を強制されたマウスにおける抗うつ様および抗不安薬様の効果の程度により評価されてもよい。
【００４１】
いくつかのモデルにおいて抽出物の活性は、抽出物から得られた１つまたはそれ以上の純粋な化合物と比較される。その結果は、抽出物中の混合された化合物の相乗効果を示すために分析される。これは、増加した潜在能力および副作用の可能な減少に関して、１つの単一の化合物を超える抽出物の使用を要求することの優位性を提供する。
薬草抽出物ＣＶＴ−Ｅ００１に対する薬理学的指紋分析の適用例
【００４２】
化学的に標準化され、前述した化学的指紋の特徴を有する薬草抽出物ＣＶＴ−Ｅ００１が、記憶力を改善する薬理学的性質について評価された。生物学的モデルが以下の知見に基づいて選択された：（ａ）中枢神経系におけるコリン作動系の欠陥がアルツハイマー病（ＡＤ）において明白である。（ｂ）老ラットおよび痴呆症患者等における、モノアミン酸化酵素Ｂ（ＭＡＯ−Ｂ）活性の増加が報告されている。以下の生物学的モデルにおける実験が実施され、その結果はＣＶＴ−Ｅ００１の薬学的指紋を形成する。それぞれの実験において見られた陽性の結果は、ＣＶＴ−Ｅ００１がアルツハイマー病のような認識および記憶の障害状態の治療に有用であることを示す。
【００４３】
（１）単離されたラット脳シナプトソームのコリン吸収に対するＣＶＴ−Ｅ００１の効果
原理
ジンセノシド  Ｒｂ1 はコリン吸収を増加することが示されている（Ｂｅｎｉｓｈｉｎ，１９９２）。神経伝達物質アセチルコリンの産生の低下は、記憶の消失およびアルツハイマー病に関係する。Ｒｂ1 はニューロンへのコリン吸収を増加させることが示されており、これはおそらくアセチルコリン産生を増大させ、次に、記憶障害を軽減する。ＣＶＴ−Ｅ００１が記憶の損失を緩和する性質を有することを適切に断定するためには、ＣＶＴ−Ｅ００１が神経組織調製物においてコリン吸収を増加させることが示されなければならない。
全脳および海馬から得られたシナプトソーム調製物におけるコリン吸収が、Ｒｂ1 、ＣＶＴ−Ｅ００１およびＨＣ３の存在下で調べられている。Ｒｂ1 はシナプトソームへのコリン吸収を増加させることがすでに示されている陽性のコントロール（対照）であり、一方、ＨＣ３はコリン吸収を阻害することが知られている陰性のコントロールである。
【００４４】
図１は、ラット脳シナプトソームによるコリン吸収に対する、様々な投与量のＲｂ1 およびＨＣ３の効果を示す。この最初の研究は、我々のシナプトソーム調製物が使用可能であることを示し、Ｒｂ1 はコリン吸収を亢進し、ＨＣ３はコリン吸収を阻害する。これらの効果の規模は以前の研究と一致する。
【００４５】
Ｒｂ１とＣＶＴ−Ｅ００１の両方を用いた実験は、両方の物質が、ラット海馬から得られたシナプトソームへのコリン吸収を増加させることを示す（表２）。約１×１０-6Ｍの濃度のサポニン（分子量は９００に確立された）のＣＶＴ−Ｅ００１が、コリン吸収の亢進に常に有効であった。より高い投与量（１×１０-5Ｍ）は必ずしも有効ではなかった。この観察は、たくさんの薬学的化合物が至適投与量範囲を有し、より多いまたはより少ない物質はより少ない生物学的活性を招くことから、予想外ではない。
【００４６】
Ｒｂ１およびＣＶＴ−Ｅ００１の、ラット海馬から調製されたシナプトソームへのコリン吸収に対する効果
【００４７】
【表２】
0005491114.tif 000004
値は放射活性コリン吸収の増加の平均パーセントである
*はコントロールｐ＜０．０５から明らかである（ＡＮＯＶＡ，Ｓｔｕｄｅｎｔ／Ｎｅｗｍａｎ／Ｋｕｅｌｓ）
【００４８】
表３は、ラット脳シナプトソームにおけるコリン吸収に対するＣＶＴ−Ｅ００１および全ジンセノシド（ＴＳ）およびＲｂ1 を示す。ＣＶＴ−Ｅ００１は８．１％Ｒｂ1 、３２．４％ＴＳのみ含有するため、ＣＶＴ−Ｅ００１の効果は明らかにＲｂ1 またはＴＳのいずれよりも高い。
【００４９】
【表３】
0005491114.tif 000005
【００５０】
ラット脳シナプトソームにおけるコリン吸収に対するＲｂ１、全ジンセノシド（サポニン、ＴＳ）の１００％およびＣＶＴ−Ｅ００１の比較（％コントロール）。
Ｒｂ１：アメリカニンジンから単離されたジンセノシドの１つ。＞９８％純度。
Ｒｂ１−５２、Ｒｂ１−５３およびＲｂ１−５４はＲｂ１の３つのバッチを示す。
ＴＳ：アメリカニンジンから単離された、２５％Ｒｂ１、１９．４％Ｒｃ１および２１．６％Ｒｇ１＋Ｒｅを含有する全ジンセノシド抽出物。
ＣＶＴ−Ｅ００１：アメリカニンジンから単離された、８．１％Ｒｂ１、３２．４％全ジンセノシドを含有する抽出物
【００５１】
値は平均±ＳＥを表す。ｎ＝４、 *Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１  スチューデントＴ検定、コントロールと比較された
効能：ＣＶＴ−Ｅ００１＞ＴＳ＞Ｒｂ１
【００５２】
結果は、ＣＶＴ−Ｅ００１とＲｂ1 の両方がコリン吸収を明らかに亢進することを示す。しかしながら、ＣＶＴ−Ｅ００１はＲｂ1 を８．１％しか含有しないものの、同様な重量濃度において同等またはそれ以上の効能を示す。これは、ＣＶＴ−Ｅ００１におけるＲｂ１以外の物質の相乗効果を示唆する。
【００５３】
（２）３つのバッチのＣＶＴ−Ｅ００１の、インビトロでのラット脳におけるＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂ活性に対する効果。
【００５４】
いくつかのニンジン抽出物のインビトロでのモノアミン酸化酵素Ａ（ＭＡＯ−Ａ）およびモノアミン酸化酵素Ｂ（ＭＡＯ−Ｂ）活性に対する効果
【００５５】
【表４】
0005491114.tif 000006
値は５（ＭＡＯ−Ａ）および４（ＭＡＯ−Ｂ）の定量に基づく平均±標準誤差。すべての場合に、明らかな投与量依存性の効果が定量された。
ＧＬＰ＝全精油、ＨＰＬＣ−ＵＶ吸収の２４から３５分の間の物質を含むＣＶＴ−Ｅ００１の一部。
【００５６】
（３）モリスの水迷路およびスコポラミンにより誘発される記憶喪失モデルを用いた、ＣＶＴ−Ｅ００１の学習に対する効果。
原理
Ｒｂ1 およびＲｇ1 を含むジンセノシドは、学習および記憶を増強することが示されている。ＣＶＴ−Ｅ００１はジンセノシドの混合物であるため、純粋なサポニンと同じ性質をもたないかもしれない。ＣＶＴ−Ｅ００１が学習および記憶を増強できることを断言するためには、この生成物が科学的に受容された学習パラダイムにおいて、課題の習得および／または記憶の測定可能な増加を提供し得ることが示されなければならない。モリスの水迷路は空間的学習および記憶を試験できる、科学的に示された方法である。ラットは、真っ暗な水泳用プールにおいて、隠されたプラットフォームの位置を学習することを要求される。もし、ＣＶＴ−Ｅ００１で処置されたラットが、ＣＶＴ−Ｅ００１で処置されていないラットよりも速く、隠されたプラットフォームの位置を学習すれば、ＣＶＴ−Ｅ００１が学習を増強することが示される。ＣＶＴ−Ｅ００１の記憶に対する効果は、スコポラミン誘発記憶喪失（スコポラミンはコリン作動性の神経伝達系を阻害し、学習および記憶を阻害する）においても調べることができる。もしＣＶＴ−Ｅ００１が学習および／または記憶を増強すれば、ＣＶＴ−Ｅ００１はスコポラミンで処置された動物における課題の習得および／または記憶の消失に対する保護を促進するはずである。
【００５７】
実験の設計
ＣＶＴ−Ｅ００１を試験化合物とする空間的学習および記憶の研究は、モリス水迷路およびスコポラミン誘発記憶喪失を用いて設計された。実験の特定の目的は、ＣＶＴ−Ｅ００１がスコポラミン誘発記憶喪失の存在下で新しい課題の習得および／または記憶に作用するかどうかを試験することであった。ラット（Ｓ／Ｄ系オス、２００−２５０ｇ、約８週齢）がまず２つのグループに分けられ、水（０．５ｍｌ）またはＣＶＴ−Ｅ００１（０．５ｍｌの水で胃管により２００ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれか一方を実験の期間、与えられる。ＣＶＴ−Ｅ００１の投与開始の８日後、ラットは真っ暗な水のプールの中の隠されたプラットフォームの位置を学習する課題を与えられる。ラットはプールに１日４回５日間置かれ、プラットフォームを見つけるのに要求される時間が記録される（最大時間５分）。この時間は、ラットが課題を学習するにつれて短くなる。１４日に、ラットの２つのグループが４つのグループにさらに細分化される。最初の２つのグループのそれぞれからの６匹のラットは食塩水の注射を受け、一方、最初のグループのそれぞれからの残りの６匹のラットは、新しい場所に移動されたプラットフォームを見つけることを要求されるのに先立って、スコポラミン（２ｍｇ／ｋｇ）を受ける（３回の試験、食塩水またはスコポラミンの注射の一方を受けて３０分以内に、最大時間３分。１５日に、プラットフォームを１４日に設定された位置に留まらせて配置させて、１４日の操作が繰り返された。１６日に、プラットフォームがプールの反対側の場所に移動されたことを除き、１４日からの操作が再び行われた。１７日に、プラットフォームが１６日に設定された位置に留まることを除き、１４日に行われた操作が繰り返された。それぞれの場合に、プラットフォームに位置する時間が記録される。
【００５８】
この実験は２４匹のラットを各回に用いて２回繰り返された。２つの実験からのデータが組み合わされた。１匹のＣＶＴ−Ｅ００１処置されたラットは、ＣＶＴ−Ｅ００１の肺への事故的な投与により死亡した。１匹のコントロールラットは、学習曲線の最後の５回の試行で、プラットフォームを見つけられなかった。このデータは結果に顕著に影響しないが、除外された。１匹のＣＶＴ−Ｅ００１を与えられ、スコポラミン注射されたラットは最終日にプラットフォームを見つけられず、異常値として除外された。
【００５９】
統計的な分析は、対数に変換されたデータの分散解析によった。明確さの帰納的試験は、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験を用いて行われた。
個別の試験と、別々の日の組み合わされた材料の両方からのデータが表されている。
【００６０】
結果および考察
ラットは課題を、最初の試験での約２００秒から２０回の試験での約８秒に急激に下降するプラットフォームへの時間で、容易に学習した（図１５）。すべての動物が課題を学習したときの１４回目の試行で、曲線は横ばいとなる。５、９および１３回目の試行（２、３および４日の最初の操作）で、保持された情報の夜の間のいくらかの損失を示す、わずかな逆戻りの効果がある。
【００６１】
ラットがスコポラミンおよびＣＶＴ−Ｅ００１の存在下または非存在下で、新しいプラットフォームの位置を学習することを要求されたとき（図１６）、最初、すべての処置のものがプラットフォームに位置するのに同じ長さの時間がかかった（図１６、最初の２回の試行）。これは、違いが見られなかった新しい経験である。３回目の試行で、ＣＶＴ−Ｅ００１および食塩水を受けた動物のみが、スコポラミンを受けたがＣＶＴ−Ｅ００１を受けなかった動物よりも優れていた動物であった。この日のデータが組み合わされるとき、処置の効果の証拠はない（図１７）。これは、これらの状況においては（スコポラミンによる記憶の並の障害を伴う、最初の短い期間の習得）ＣＶＴ−Ｅ００１は情報の習得に効果がないことを示唆する。
【００６２】
ラットが翌日に同じ課題を行うことを要求された（すなわち、それらが前日からの課題を覚えたかどうかを見るための試験をされた）とき、ラットはすべての試験でスコポラミンを受けＣＶＴ−Ｅ００１を受けていない（図１８）。試行２で、すべての処置のグループが、スコポラミンを受けＣＶＴ−Ｅ００１を受けない動物よりも優れていた。この日のすべての試験が組み合わされたとき（図１９）、ＣＶＴ−Ｅ００１を除きスコポラミンを受けた動物は、他のグループよりも明らかに大きい遅れがあり、スコポラミンの存在がＣＶＴ−Ｅ００１の存在により相殺された記憶の障害を引き起こしたことを示す。この試験は前日からの記憶の想起に関与する要素をもつために、ＣＶＴ−Ｅ００１が短期間の情報の習得よりもむしろ長期間の記憶の集積における欠損を阻害するかもしれないことを示す。
【００６３】
ラットが新しいプラットフォームの位置を学習することを再び要求されたとき、処理グループの間で最初の違いはなかった（図２０、試行１）。しかしながら、試行３によれば、スコポラミン処理された動物はスコポラミン誘発学習障害を示した。データ、この日のすべての試行のデータが組み合わされたとき、処理グループの間で明らかな違いはなかった（図２１）ことから、ＣＶＴ−Ｅ００１および適度なスコポラミンが誘発した記憶喪失は短期間ではほとんど効果がないことが再び示される。
【００６４】
ラットがその後、実験の最終日にプラットフォームの最後の位置を覚えることを要求されたとき、スコポラミン誘発欠損はただちに明白となった（図２２）。最初の試験で、スコポラミンを受けてＣＶＴ−Ｅ００１を受けていない動物は明らかに劣っていて、長期間の記憶の損失を示した。この記憶喪失はＣＶＴ−Ｅ００１とスコポラミンの両方を受けた動物においては全く存在せず、これらの動物はスコポラミンを受けなかった動物と同様に課題を実行した。この日のすべての試行のデータが組み合わされたとき（図２３）、ＣＶＴ−Ｅ００１による予備処置なしにスコポラミンを受ける動物は、学習障害を示す。ＣＶＴ−Ｅ００１およびスコポラミンを受けた動物は、コントロールと違いがなかったことから、ＣＶＴ−Ｅ００１はスコポラミンにより誘発された学習障害を完全に無効にしたことが示される。ＣＶＴ−Ｅ００１を受けスコポラミンを受けなかった動物は、スコポラミンまたはＣＶＴ−Ｅ００１のいずれも受けない動物と比較されたとき、何も利点を見せない。
【００６５】
ＣＶＴ−Ｅ００１は、食餌の補足剤としてラットに提供されたとき、スコポラミンが誘発する記憶障害を阻害するジンセノシドの混合物である。ＣＶＴ−Ｅ００１は、記憶障害をもたない動物における学習および記憶を改善しないように見えることから、その効果は記憶障害の動物においてのみ見られる。最大の効果は動物が課題の学習の２４時間後にそれらを思い出すことを要求されるときに示されることから、ＣＶＴ−Ｅ００１の効果は情報の習得および短期間の記憶には関与せず、むしろ長期間の記憶の集積に関与するように見える。スコポラミンはコリン作動系を妨害することが知られているため、この仕事は、コリン作動系が損傷することが知られていて、空間的記憶の障害が起こるアルツハイマー病のような状況に対してＣＶＴ−Ｅ００１が有利となり得ることを示唆する。
【００６６】
（４）ヒト個体におけるＣＶＴ−Ｅ００１（リメンバー−ＦＸ）の記憶試験
方法：
記憶因子測定表が用いられた。５つの試験があった。
Ａ：指示された記憶：２４個の単語を告げた後、被験者は、例えば野菜といった種類ごとに分けられた単語を繰り返すことを要求された。
Ｂ：対になった関連の記憶：１２組の単語を被験者に告げ、対になった単語のそれぞれ最初の単語を繰り返した後、被験者は対になった単語の他方を言うことを要求された。いくつかの組は例えば上−下や太陽−月などのように関係があった。いくつかは馬−ランプ等のように全く関係がなかった。
Ｃ：絵の自由な想起：１５枚の絵を見せた後、被験者は、彼または彼女が何の絵を見たか思い出すことを要求された。
Ｄ：意味のない図形の認識：２０個の意味のない曲線の図形が最初に被験者に見せられ、次に、それらの半分はすでに見せられたものである別の２０個が見せられた。被験者はその後、どの図形が彼または彼女が前に見たものかを指摘することを要求された。
Ｅ：肖像画の関係の想起：それぞれ姓、職業および趣味が付けられた６枚の肖像画が被験者に見せられた：例えば姓がチャン、先生、趣味はテレビを見ること。しばらくしてから、肖像画が別の順で再び見せられた。被験者は、それぞれの肖像画を思い出すことを要求された。
【００６７】
各テストは点数がつけられ、各被験者の合計が記憶因子に計算された。各被験者は、リメンバー−ＦＸまたはコントロール（対照）食を摂る前および後に、２回試験された。各被験者は、リメンバー−ＦＸまたはコントロール食を摂る前に１回、摂った後に１回、身体検査に供された。身体検査は、リメンバー−ＦＸを摂ることに副作用がないことを確実とするためのものであった。
【００６８】
若いグループ：５人が女性、５人が男性で２０から２４歳の１０人の大学生が、リメンバー−ＦＸを１日２カプセル（２００ｍｇ／カプセル）１３日間摂取した。若いコントロール（対照）グループは１２人（９人が男性で３人が女性）から構成された。４６から６４歳の老年のグループは、リメンバー−ＦＸを１日２カプセル１４日間摂取した。老年のコントロールグループは４０から６５歳の５人（３人が男性で２人が女性）から構成された。
【００６９】
統計：
集団Ｔ検定が、コントロール群と実験群との間の比較に用いられた。
結果：
各試験は点数が記録され、各被験者の点数の合計がＭＱ（記憶因子）に計算された。各被験者はコントロール食またはリメンバー−ＦＸの前に１回、後に１回の２回試験された。
【００７０】
若年および老年のリメンバー−ＦＸ摂取前後のＭＱＳ
【００７１】
【表５】
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ＭＱは点数から式により計算され、７段階に分類される。ＭＱ＞１３０は１級−より優れている；１２９−１２０は２級−優れている；１１９−１１０は良；１０９−９０は中間；８９−８０はやや悪い；７９−７０はよくない；６９−６０は悪い。
【００７２】
若い人々のＭＱの違い
【００７３】
【表６】
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平均ＳＤ；コントロールとの比較において *Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１。
試験Ａ−Ｅにおける値は、リメンバー−ＦＸの摂取前後の点数の違いを表す。
【００７４】
老年グループのＭＱの違い
【００７５】
【表７】
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平均ＳＤ；コントロールとの比較において *Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１。
試験Ａ−Ｅにおける値は、リメンバー−ＦＸの摂取前後の点数の違いを表す。
【００７６】
結論：
（１）表５１は、９人の若い被験者は２番目の１人を除きＭＱが増加したことを示す。５番目の１人は２段階増加した。老年のグループにおいて、５人（３、４、７、８および９）は段階の増加を示した。それらの１人（８番目）は２段階増加した。１段階低下した人が１人（１０番目）いたが、他の４人（１、２、５および６）は同じ段階に留まった（少しばらつきがあったが）。
【００７７】
（２）表６および表７は、２つのグループのＭＱＳは、対応するコントロールとの間で明らかな違いがあったことを示した。若い年齢のグループでは試験Ｄに違いがあり、老年のグループでは試験Ｂと試験Ｄに違いがあった。試験Ｂは、大脳の左半分によって支配される言語能力についての試験であり、一方、試験Ｄは、大脳の右半分によって支配される非言語的な描画試験である。この結果は、リメンバー−ＦＸが大脳の左半分に支配的に作用するかもしれず、一方、老人のグループにおいては全体の脳に作用することを示した。
試験ＡとＢは大脳の言語的な（左の）半球を試験し、一方、試験Ｄは右の非言語的な半球を試験した。試験ＣおよびＥは両方の半球を試験した。
【００７８】
ＰＣ１２および神経芽細胞腫ＮｌＥ−１１５細胞系のインビトロでの培養における、ＨＴ−１００１によるニューライトの成長の亢進。序論：
我々はＨＴ−１００１の作用の新しい機構をすでに発見しており、それはＰＣ１２（褐色細胞腫）細胞系における神経芽細胞腫の成長の亢進である。この結果は、ＨＴ−１００１が症状を緩和するように作用するだけでなく、神経の変性の病気の進行を変えることを示す。ＨＴ−１００１の有利な効果（阻害／治療）は、老人性痴呆症、パーキンソン病、多発脳梗塞性痴呆などのような変性の病気に適用してもよい。
【００７９】
ジンセノシドは中枢神経系に対するたくさんの作用をもつことが報告されている。これらはＣＮＳの亢進または抑制、鎮痙性、抗精神病性、鎮痛性、抗疲労および抗ストレス性、および様々な記憶の課題における改善された成果を含む、（Takagi K. ら，Japan J. Pharmacol. 22:339(1972)，Satio H.およびNabata H.
，Japan J. Pharmacol. 22:245(1972)，Saito H.ら，Japan J. Pharmacol. 23:43(1973) ，Takagiら，Japan J. Pharmacol. 24:41(1974) ，Saito ら，Japan J. Pharmacol. 24:119(1974)，Saito H.，Japan J. Pharmacol. 27:509(1977)，Hong S.A. ，Korean J. Pharmacol. 10:1(1974) ）。純粋なジンセノシドＲｂ１およびＲｇ１は、実験動物において記憶を改善できることが知られており（Saito
H.，Advances in Chinese Medical Materials Research Chang H.M. ら編集，World Sci. Publ. Singapore，1985, p.509 ，Saito H.  Recent Advances in Ginsent Studies, Shibata S.編集，Hirokawa Publ. Col, Tokyo 1990, p.99，Benishin C.G. ら，Pharmacology 42:223(1991) ）、脳におけるコリン作動性神経伝達に対するその作用機構は、よく説明されている。Ｒｂ／Ｒｇ１について記述されている行動の効果に加えて、ジンセノシドＲｂ１およびＲｄ（他の１つのジンセノシド）は神経成長因子（ＮＧＦ）により、脊髄神経節および交感神経節のニューライトの成長を増強することが見いだされているが（Saito H.，Advances in Chinese Medical Materials Research Chang H.M. ら編集，World Sci. Publ. Singapore，1985, p.509 ）、それ自身では効果がなかった。現在まで、この増強の細胞の機構について、とてもわずかな情報が現れている。現在まで、ニューライト成長に対するＲｂ１または他のジンセノシドの作用についての研究は何も出版されていない。最近の報告は、ニンジンの“親油性の”抽出物もまた、神経親和性の活性を有することを示している（Mohri T.ら，Planta Med. 58:321(1992)）が、この抽出物の活性成分は解明されるべき状態のままである。
【００８０】
ＮＧＦは１９５０年代に最初に発見され、典型的な神経栄養である。ＮＧＦは神経経路の発生および維持と関係する、たくさんの作用をもつ。さらに、生物学的作用が概説されている（Levi-Montalcini R. Science 237:1154(1987) ，Levi A. およびAlema S.，Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 31:205(1991)）。末梢のＮＧＦはアドレナリン作動性の交感神経、および、発達における第１段階の感覚ニューロンの生存に必須である。それは、成長および体性感覚繊維のニューロンの回路に発達の間（Hefti F.ら，Neurobiol. Aging 10:75(1989)）、および成人において外傷の後（Raivich G.およびKreutzberg G.W. ，Int. J. Devel. Neurosci. 11:311, 1993)）、影響を及ぼす。脳内でＮＧＦは、基底の前脳のコリン作動性ニューロンの生存を促進し（Martinら，J. Cell Biol. 106:829(1988) 。Mobley W.C. ら，Mol. Brain Res. 1:53(1986)）、これらの同じニューロンの外傷後の損失を阻害する（Hagg T. ら，Brain Res. 505:29(1989))，Tuszynski M.H.ら，Ann Neurol. 30:625(1991)）。ＮＧＦはまた、ニューロンの前駆体細胞の分化を亢進することが報告されている（Hartikka J. およびHefti F.J.，Neurosci. Res. 21:352(1988) ）。ＰＣ１２細胞は他の性質と同様に、ＮＧＦ処理に対して、ニューライトの成長および電気的興奮性により応答する（Green L.A.ら，Adv. Cell. Neurobiol. 3:373(1982) ）。現在、様々な変性の病気の治療のための神経栄養の因子の設計と開発が、活発に行われている（Hefti F.J.，Neurobiol. 25:1418(1994)，Tonnaer JADMおよびDekker AJAM ，Anti-Dementia Agents Academic Press 1994, p.139 ）。
【００８１】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、基底前脳から皮質および海馬への投射路を含むコリン作動性神経路の変性と関係する。ＰＣ１２細胞系（Greene L.A. およびTischler A.S. ，Adv. Cell. Neurol., 3:373(1982) ）は、これらの神経路の機能の研究のためのモデルの１つである。この細胞系は表現型ではクロム親和性細胞系であるが、アドレナリン作動性の表現を誘起され得る（Greene L.A. およびTischler A.S. ，Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 73:2424(1976) ，Aloe LおよびLevi-Montalicini R, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 76:1246(1979) ）し、コリン作動性のマーカーも同様である（Greene L.A. およびRelin G.，Brain Res. 138:521(1977)，Ritchie A.K.，J. Physiol. (Lond.) 286:541(1979) ，Schubert D. ら，Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 74:2579(1977) ，Jumblatt J.E. およびTischler A.S. ，Nature 297:152(1982)）。このモデルは以下の利点を有し（Shibata S.ら，Economic and Medicinal Plant Res. 1:217(1985) ）、その利点は、不朽化された細胞系であること、（Saito H. Advances in Chinese Medicinal Materials Research, Chang H.M. ら編集，World Sci. Publ., Singapore, 1985, p.509）ＮＧＦに対する感受性があるが、生存はＮＧＦに依存しないこと、および（Saito H. Recent Advances in Ginseng Studies, Shibata S. 編集，Hirokawa Publ. Co., Tokyo 1990, p.99）基底前脳の中枢のコリン作動性ニューロンと共通なたくさんの性質をもつことである。ＰＣ１２細胞は、中枢のコリン作動性ニューロンが応答する栄養因子のすべてに対して感受性がないが、一方、中枢のコリン作動性ニューロンは、ＰＣ１２細胞が応答するすべての栄養因子に応答することが指摘されている。この理由として、ＰＣ１２細胞系は間違った陽性の結果を与えなさそうな理想的なモデル系として見なされ得るが、間違った陰性の結果を与えるかもしれない、すなわち、中枢のコリン作動性ニューロンに対して作用する栄養因子を欠いているかもしれない。
【００８２】
ＰＣ１２細胞は、たくさんの方法でＮＧＦに応答することが報告されており、その方法は以下を含むが限定はされない：膜の興奮性、合成、集合の発達および細胞骨格構造の安定化、細胞接着の増加、肥大、および同化作用の増加、ＤＮＡ合成の減少、および細胞の増殖（Werrback-Perez K. ら，Prog. Brain Res. 86:183(1990) ；抗酸化剤（例えばカタラーゼ）およびエネルギー代謝酵素の選択的誘導（Perez-Polo J.R. およびWerback-Perez K. Recent Achievements in Restorative Neurology 30:321(1985)，Perez-Polo J.R. およびWerback-Perez K. Neural Development and Regeneration, Sringer-Verlag, Heidelberg, p.339(1987) ，Perez-Polo J.R. およびWerbach-Perez K ，Nervous System regeneration, Alan Liss, New York, p.201(1988) ；コリン作動性神経伝達物質の代謝の亢進（例えばＣＨＡＴ活性、（Greene L.A. およびRein G. ，Brain Res. 138:521(1977)，Ritchie A.K.，J. Physiol. (Lond.) 286:541(1979) ，Schubert D. ら，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74:2579(1977) ，Jumblatt J.E. およびTischier A.S. ，Nature 297:152(1982)；遺伝子発現の変化（Szebereni J.およびErhardt P.，Biochim. Biophys. Acta 1222:187(1994) ；ニューライトの成長の増加（Greene L.A. およびTischler A.S. ，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73:2424(1976) ，表面の膜レセプターの発現の増加（Greene LA およびTischler AS ，Adv. Cell Neurol 3:373(1982)；ＡＰＰ−６９５（アルツハイマー病の病因学に関して重要である、の発現の増加（Schubert D. ら，Neuron 3:689(1989)）；オメガ−ＣｇＴｘ感受性Ｃａ２＋チャネルの発現の増加（Usowicz M.M.ら，J. Physiol.
(Lond.) 426:95(1990)）；ゼータ−ＰＫＣの発現の増加、およびニューライトの成長の増強を起こすＰＫＣの他の異性形のダウンレギュレーション（Coleman E.S.およびWooten M.W. ，J. Mol. Neurosci. 5:39(1994)。ＰＣ１２細胞は様々な記述された応答でＮＧＦに応答することから、それらは他の物質のＮＧＦ様の性質を研究するための候補と考えられる。これらの細胞は基底前脳の中枢のコリン作動性ニューロンの良好なモデルであるという指摘に対する支持がある。
神経芽細胞腫ＮｌＥ−１１５は分化していないマウスの神経芽細胞腫であり、神経栄養活性の研究に有用とされてきた。
【００８３】
材料および方法：
ＰＣ１２細胞は播種され、１００ｃｍ2 の組織培養皿に３７℃で、１％抗生物質、１０％加熱されて不活性化されたウマ血清および５％ウシ胎児血清を含むＲＲＭＩ１６４０中で、９５％空気および５％ＣＯ2 の水が飽和された雰囲気で維持された。ＮｌＥ−１１５細胞はフラスコに、１０％ＦＢＳおよび抗生物質ＰＮＳ（ペニシリン、ネオマイシン、ストレプトマイシン）を含む９０％ＤＭＥＭ（ダルベッコの改良イーグル培地，Gibco,グランドアイランド，ＮＹ，ＵＳＡ）中で維持された。培養皿は９５％部屋の空気と５％ＣＯ2 からなる、温度制御され（３７℃）、湿気のある雰囲気で維持された。細胞は実験のため、パスツールピペットを介した培地の強制的な吸引によって機械的に剥離され、全部で２．０ｍｌの完全培地を含む、３５ｍｍのコラーゲンコートされた組織培養皿の中に１×１０4 細胞／ｍｌの濃度で播かれた。培地は１週間に３回変えられた。
【００８４】
神経成長因子（ＮＧＦ）および試料に対する細胞の応答は、ＰＣ１２細胞における処理を含有する細胞の数を数えることにより、定量された。細胞の写真が処理の７および１４日後に撮られた。フィルムが現像され焼き付けられる前に、各皿において、２つの視野が選択された。
【００８５】
細胞およびニューライトは以下のように数えられた。
円状または球状の形の細胞およびニューライトの成長のないものは、０として数えられた（Ｓ０）；
伸びた、または短いニューライトの成長を示した細胞はＳ１として数えられた；
細胞体に２つ以上の小さいニューライトがある細胞はＳ２として数えられた；
細胞体の直径の少なくとも２倍の長さを有する、１つまたは２つのニューライトがある細胞はＳ３として数えられた；
２つ以上の長いニューライトがある細胞はＳ４として数えられた。
ニューライト指数は以下のように計算された：
ニューライト指数（Ｉｎ）＝全ニューライトスコア（ΣＳ）／全細胞数ΣＮ）
ΣＳ＝Ｓ１＊Ｎ＋Ｓ２＊Ｎ＋Ｓ３＊Ｎ＋Ｓ４＊Ｎ；Ｎは各細胞視野の細胞数。
【００８６】
実験の結果：
１．ＮＧＦはＰＣ１２におけるニューライトの成長を、処理の７日後に量依存的に増加させた（図２６）。
２．ＨＴ−１００１はＰＣ１２におけるニューライトの成長を、処理の７日後に量依存的に増加させた（図２７）。
３．ＨＴ−１００１はＮｌＥ−１１５におけるニューライトの成長を、処理の７日後に量依存的に増加させた（図２８）。図２９および図３０は、コントロールおよび処理された細胞の原物の写真をそれぞれ示す。わずかなまたは全くないニューライトの成長がコントロール群において観察され、一方、処理された細胞においては明らかなニューライトが見られた。
【００８７】
結論：
ＨＴ−１００１は、ＰＣ１２とＮｌＥ−１１５細胞系の両方において、ニューライトの成長を亢進するＮＧＦ様の効果を起こした。これは、神経変性の病気の治療および予防における有益な効果に寄与するかもしれない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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