(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＳＴＮ１（アストロタクチン１）及びＺＮＦ６７１（転写因子ジンクフィンガータンパク質６７１）のメチル化状態を決定することを備える、検体中の肛門性器路の癌又はその前段階を検出することを補助する方法であって、ＡＳＴＮ１及びＺＮＦ６７１が陽性サンプルにおいてメチル化されている方法であり、かつ、肛門性器路の癌が子宮頸癌である方法。
【請求項２】
検体が頸管スミアである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プロモータ領域のメチル化状態が決定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
遺伝子のメチル化状態が、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）により決定される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＭＳＰが定量的ＭＳＰ（ＱＭＳＰ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
定量的ＭＳＰがＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ法に基づく、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
多重方式である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
以下の配列を含むプライマーペアを用いる、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）ＣＧＴＡＡＧＣＧＴＴＧＴＴＡＧＣＧＴＡＧＣ（ＡＳＴＮ１＿Ｆ）  及び
ＣＧＣＧＡＡＡＴＣＧＡＡＡＣＧＡＡＡＡＣＧ（ＡＳＴＮ１＿Ｒ）；  
（ｂ）ＣＧＧＡＧＧＡＣＧＴＡＧＴＡＴＴＴＡＴＴＣＧＣ（ＺＮＦ６７１＿Ｆ）及び
ＣＴＡＣＧＴＣＣＣＣＧＡＴＣＧＡＡＡＣＧ（ＺＮＦ６７１＿Ｒ）。
【請求項９】
プライマーペア又は請求項８で定義されたいくつかのプライマーペア、及び、以下の配列の１つを含む少なくとも一つの追加のプローブを用いる、請求項６又は７に記載の方法：
（ａ）ＧＴＡＡＴＴＣＧＴＴＴＧＴＴＴＣＧＴＡＡＧＴＴＧＴＴＣＧ（ＡＳＴＮ１）；
（ｂ）ＣＧＴＧＧＧＣＧＣＧＧＡＣＡＧＴＴＧＴＣＧＧＧＡＧＣＧ（ＺＮＦ６７１）。
【請求項１０】
更に、ＨＰＶ感染の検出を備える、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＨＰＶの検出がＰＣＲにより行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＣＲにおいて以下の配列を備えるプライマーペアを用いる、請求項１１に記載の方法：
（ａ）ＧＧＴＴＡＴＡＡＴＡＡＴＧＧＴＡＴＴＴＧＴＴＧＧＧ（ＨＰＶ−Ｆ）、及び
（ｂ）ＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＡＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＴＣＣ（ＨＰＶ＿Ｒ）。
【請求項１３】
ＡＳＴＮ１（アストロタクチン１）及びＺＮＦ６７１（転写因子ジンクフィンガータンパク質６７１）のメチル化状態を決定するための、遺伝子特異的プライマー又はプライマーペアを備える、検体中における肛門性器路の癌又はその前段階を検出するためのキットであって、該プライマーは亜硫酸水素塩法で処理後のサンプルＤＮＡのメチル化状態に特異的に結合し、かつ、肛門性器路の癌が子宮頸癌であるキット。
【請求項１４】
請求項８で定義されたプライマー又はプライマーペアを備える、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
請求項９で定義されたプローブを備える、請求項１３又は１４に記載のキット。
【請求項１６】
更に、ＨＰＶ感染を検出するためのプライマーペアを備える、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１７】
プライマーペアが、請求項１２で定義されるプライマーペアである、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
更に、別の容器に収納された少なくとも１つの以下の構成成分を含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のキット：
（ａ）ＤＮＡ単離用試薬；
（ｂ）ＤＮＡ増幅用酵素；
（ｃ）亜硫酸水素ナトリウム；
（ｄ）１又はそれ以上の緩衝液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肛門性器路の癌、好ましくは、子宮頸癌及びその前段階の早期診断方法に関する。本方法は、ＡＳＴＮ１（アストロタクチン１）及びＺＮＦ６７１（転写因子であるジンクフィンガータンパク質６７１）の遺伝子領域のセグメントのメチル化状態を決定することに基づくものである。これらの遺伝子の少なくとも１つ又は両方の遺伝子のプロモータ領域及び／又は５’領域内のグアニン／シトシンが豊富な領域（いわゆるＣｐＧアイランド）におけるＤＮＡメチル化は、肛門性器路の癌又は当該癌の前段階に特徴的である。対応するように修飾されたＤＮＡの検出は、診断に利用される。本発明はまた、本発明の診断方法の実施を可能にするキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸部の癌（子宮頸癌）は、世界中の女性において２番目に最も頻度の高い悪性の癌疾患である。この癌は、いわゆる高リスクのヒトパピローマウイルス（ｈｒ−ＨＰＶ）による感染の過程で、子宮頸部上皮内癌（ＣＩＮ）と呼ばれる前段階を経て発症する。ＣＩＮ１：（軽度異形成）は、上皮の基底から多くて３分の１の高さに及ぶ；ＣＩＮ２：（中等度異形成）は、最大３分の２の上皮に及ぶ；ＣＩＮ３：（高度異形成）は、上皮のほぼ全体に達する。ＣＩＮ２及びＣＩＮ３は、重度の異形成と呼ばれる。後者の異形成に関しては、それらが子宮頸癌に変化するリスクが高い。本願において、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３及び子宮頸癌は、ＣＩＮ２＋という名称で包含される。ｈｒ−ＨＰＶ感染に加えて、さらなる因子も子宮頸部の発癌に関与する。
【０００３】
子宮頸癌及びその前段階（ＣＩＮ）を検出するための既存の予防的な試験は、細胞形態学的な方法（パップテスト）に基づく。このパップテストは、顕微鏡を用いて、癌又はＣＩＮと疑われるいくつかの細胞を何千個もの正常細胞のバックグラウンドにおいて認識しなければならないので、非常に誤りがおきやすい。さらに、細胞の形態の評価は、きわめて主観的である。これらの欠点の結果として、パップテストの感度は、ＣＩＮ２＋の検出について５３％であり、その特異度は、９６．３％である（Ｃｕｚｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，１１９：１０９５−１１０１）。
【０００４】
この癌検査は、分子試験法によって、かなり改善することができた。いくつかの例外は別として、すべての子宮頸癌及びそれらの前段階は、ｈｒ−ＨＰＶのＤＮＡを含み、ＨＰＶ−ＤＮＡは、癌検査のためのモデルマーカーであるとみられる。公開された様々な研究において、ＨＰＶ−ＤＮＡ試験（ＰＣＲ法）が、ＣＩＮ２＋の検出について９６．１％の感度及び９０．７％の特異度を有すると示すことができた。しかしながら、多くの女性は、単にＨＰＶに感染しているだけで癌の前段階ではないので、たった２０．３％という、ＣＩＮ２＋に対するＨＰＶ−ＤＮＡ試験の陽性予測値は予想どおり悪い（Ｃｕｚｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，１１９：１０９５−１１０１）。したがって、肛門性器路の癌腫、特に、子宮頸癌の改善された診断法が必要とされる。
【０００５】
したがって、子宮頸癌などの肛門性器路の癌腫及び上記のそれらのすべての前段階の信頼できる早期診断をもたらす方法を提供することが、本発明の目的である。
【０００６】
本発明によれば、これは、請求項における主題によって達成される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｕｚｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １１９：１０９５−１１０１
【非特許文献２】Ｅｓｔｅｌｌｅｒ，２００７，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１６：Ｒ５０−Ｒ５９
【非特許文献３】Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｒｃｏｂｉｏｌ  ３３：９０１−９０５
【非特許文献４】Ｓｈａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２５１：１８７−９８
【非特許文献５】Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３：７２９６−７３０４
【非特許文献６】Ｗｅｎｔｚｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １１２，２９３−２９９
【非特許文献７】Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ♯５０，９９ｔｈ  ＡＡＣＲ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｐｒｉｌ  １２−１６，２００８，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、下でより詳細に記載される、ある特定の遺伝子のメチル化状態と肛門性器路の癌腫の発症との相関に関する本出願人の知見に基づく。癌腫及びその前段階では、遺伝子の上流、プロモータ及びプロモータ付近のエキソン領域におけるシトシン／グアニンが豊富なＣｐＧアイランドが、対応する正常組織と比べて頻繁にメチル化される。この遺伝子のメチル化は、任意ではなく、それぞれの腫瘍の存在に依存する（Ｅｓｔｅｌｌｅｒ，２００７，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１６：Ｒ５０−Ｒ５９）。したがって、本発明に基づくと、メチル化についての解析は、組織病理学的にＣＩＮ３と確認された女性患者及び子宮頸癌を有する女性患者の頸管スミアのＤＮＡにおいてメチル化されていることが特に多い遺伝子を同定する目的で行われた。さらに、細胞学的に注意を引かないがｈｒ−ＨＰＶ陽性の女性の子宮頸部の頸管スミアのＤＮＡにおけるそれらの遺伝子は、非常に稀にしかメチル化されていないか又は全くメチル化されていないはずである。本明細書中に列挙される解析は、遺伝子ＡＳＴＮ１及び／又はＺＮＦ６７１のある特定の領域のメチル化が、サンプル中の肛門性器路の癌腫（好ましくは：ＣＩＮ２＋）を検出するための価値あるマーカーであることを初めて示す（図２を参照のこと）。したがって、本発明は、サンプル（例えば、子宮頸部の細胞頸管スミア、子宮頸部洗浄液）中の子宮頸癌及びその重篤な前段階（ＣＩＮ２＋）を解析するための改善された方法を提供する。本発明者らによって示されるように、上で述べた２つの遺伝子のメチル化状態の判定が、すでに高度に有意であるにもかかわらず、１つ以上のさらなる遺伝子（例えば、ＤＬＸ１（転写因子である遠位欠失ホメオボックス１）、ＥＤＩＬ３（ＥＧＦ様リピート及びジスコイジンＩ様ドメイン３）、ＩＴＧＡ４（α４−インテグリン）及び／又はＲＸＦＰ３（レラキシン／インスリン様ファミリーペプチド受容体３））のメチル化状態を判定することも、医学的に例外な場合における診断を保護するために役立つことがある。
【０００９】
本発明は、ＡＳＴＮ１及びＺＮＦ６７１のメチル化状態の（直接的又は間接的な）検出に基づく。好ましくは、遺伝子ＡＳＴＮ１及びＺＮＦ６７１のプロモータ領域が過剰メチル化されているか否かが検出される。メチル化は、通常、遺伝子のプロモータ領域に起こるので、関連性のある遺伝子のメチル化を検出するための方法は、通常、これらの領域に焦点が当てられる。しかしながら、ＧＣが豊富なＣｐＧアイランドは、そこだけに見られるわけではないので、遺伝子は、プロモータ領域以外の領域でもメチル化され得る。そのようなさらなる領域におけるメチル化の検出も、診断上有用である可能性があり、ゆえにそれも本発明の主題である。
【００１０】
本発明において、遺伝子ＡＳＴＮ１及びＺＮＦ６７１のメチル化状態は、好ましくは、プロモータ領域において検出される。これに関連して、ある特定のシトシンが、修飾される（すなわちメチル化される）ことにより５−メチルシトシンになっているか否かが調べられる。検出可能な臨床上の変化がなくｈｒ−ＨＰＶに感染している女性に由来するサンプルからのＤＮＡでは、メチル化は、そのＤＮＡの対応する位置においてほとんど検出可能でないか、又は全く検出可能でない。しかしながら、ＣＩＮ２＋である女性では、選択されたシトシン残基におけるメチル化の確率は高い。
【００１１】
したがって、正常組織と比べて発癌中に生じている遺伝子のメチル化の特異的な検出は、パップテストに取って代わるように、ＨＰＶ−ＤＮＡ検出を補完することができる。ＣＩＮ２＋を検出するためのＨＰＶ試験の特異度は、平行して行われるメチル化解析によって、かなり改善され得る（図１及び２を参照のこと）。パップテスト及びＨＰＶ検出のために以前使用された試験される人由来の頸管スミア材料と同じ頸管スミア材料が、ＤＮＡメチル化を検出するための出発物質として役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】様々な頸管スミアにおけるＤＮＡメチル化を示す。ＨＰＶ陰性、目立つ程度ではない女性患者（ｎ＝７７）、ＨＰＶ陽性、組織病理学的に目立つ程度ではない女性患者（ｎ＝９０）、組織病理学的にＣＩＮ３と確認された女性患者（ｎ＝４８）、及び子宮頸癌を有する女性患者（ｎ＝６５）の頸管スミアから得られたＤＮＡにおける、ＡＳＴＮ１遺伝子、ＤＬＸ１遺伝子、ＥＤＩＬ３遺伝子、ＩＴＧＡ４遺伝子、ＲＸＦＰ３遺伝子及びＺＮＦ６７１遺伝子のメチル化頻度、並びにこれらの遺伝子の少なくとも１つの遺伝子のメチル化の頻度を示すグラフである。
【図２】様々な頸管スミアにおけるＤＮＡメチル化を示す。ＨＰＶ陰性、目立つ程度ではない女性患者（ｎ＝７７）、ＨＰＶ陽性、組織病理学的に目立つ程度ではない女性患者（ｎ＝９０）、組織病理学的にＣＩＮ３と確認された女性患者（ｎ＝４８）及び子宮頸癌を有する女性患者（ｎ＝６５）の頸管スミアから得られたＤＮＡにおける、ＡＳＴＮ１遺伝子及びＺＮＦ６７１遺伝子のメチル化頻度、並びにこれらの遺伝子の少なくとも１つの遺伝子のメチル化の頻度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
したがって、本発明は、サンプル中の肛門生殖器癌又はその前段階を検出するための方法に関し、その方法は、ＡＳＴＮ１（アストロタクチン１）及びＺＮＦ６７１（ジンクフィンガータンパク質６７１）のメチル化状態の判定を包含し、ここで、一方又は両方の遺伝子の検出可能なメチル化は、肛門生殖器癌又はその前段階を示唆する。
【００１４】
所見が不確定の場合は、遺伝子ＤＬＸ１（転写因子である遠位欠失ホメオボックス１）、ＥＤＩ１３（ＥＧＦ様リピート及びジスコイジンＩ様ドメイン３）、ＩＴＧＡ４（α４−インテグリン）又はＲＸＦＰ３（レラキシン／インスリン様ファミリーペプチド受容体３）のうちの１つ以上のメチル化状態を追加で判定することも必要に応じて可能である。
【００１５】
ＡＳＴＮ１（アストロタクチン１；アクセッション番号ＮＭ＿００４３１９．１、ＮＭ＿２０７１０８、ＮＣ＿０００００１．９に含まれる）は、神経細胞の遊走において重要な役割を果たす接着タンパク質である。ＺＮＦ６７１（アクセッション番号ＮＭ＿０２４８８３、ＮＣ＿００００１９．９に含まれる）は、典型的なジンクフィンガーモチーフを有する転写因子である。ＤＬＸ１（遠位欠失ホメオボックス１；アクセッション番号ＮＭ＿１７８１２０、ＮＭ＿００１０３８４９３、ＮＣ＿０００００２．１１に含まれる）は、転写因子であり、細胞分化に影響する。ＥＤＩＬ３（ＥＧＦ様リピート及びジスコイジンＩ様ドメイン３；アクセッション番号ＮＭ＿００５７１１、ＮＣ＿０００００５．８に含まれる）は、インテグリンリガンドであり、血管新生において重要な役割を果たす。それは、血管壁の再構築及び発生にとって重要であり得る。さらに、ＥＤＩＬ３は、内皮細胞の接着を促進する。ＩＴＧＡ４（α−４インテグリン；アクセッション番号ＮＭ＿０００８８５、ＮＣ＿０００００２．１０に含まれる）は、１つのβ−インテグリンとともに内在性膜タンパク質として存在するα−インテグリンのファミリーに属する。それらは、フィブロネクチンに対する受容体として役立ち、ゆえに細胞接着において重要な役割を果たす。ＲＸＦＰ３（レラキシン／インスリン様ファミリーペプチド受容体３；アクセッション番号ＮＭ＿０１６５６８、ＮＣ＿０００００５．８に含まれる）は、レラキシン３に対するＧタンパク質共役型受容体として役立つ。
【００１６】
本明細書中で使用される表現「肛門生殖器癌」は、肛門性器路の癌のタイプ、すなわち、生殖器、会陰、肛門及び肛門周囲の領域における癌のタイプのすべてを包含する。これらのタイプは、好ましくは、子宮頸癌、外陰癌、卵巣癌及び子宮内膜癌である。
【００１７】
本明細書中で使用される表現「前段階」は、重篤な前段階のことを指し、それには、ＣＩＮ２及びＣＩＮ３が含まれる。
【００１８】
本明細書中で使用される用語「サンプル」は、ＤＮＡメチル化を検出することができる任意の身体サンプルを包含する。そのような身体サンプルの例は、血液、頸管スミア、痰、尿、便、体液、胆汁、胃腸管分泌物、リンパ液、骨髄、器官吸引液及び生検材料である。特に、頸管スミア及び生検材料は、肛門生殖器の癌腫、例えば、子宮頸癌の検出が関係するときに有用である。当業者は、検体採取に適した方法及び補助剤を承知している。当業者はまた、サンプルからのＤＮＡ単離、例えば、フェノール／クロロホルムを用いるか又は市販のキットを用いた抽出の方法及び試薬も承知している。
【００１９】
本明細書中で使用される表現「メチル化状態」は、対応する遺伝子のプライマー結合部位の領域、好ましくは、５’−領域及びプロモータ領域におけるＧＣが豊富なＣｐＧアイランドにおけるゲノムＤＮＡの過剰メチル化のことを指す。
【００２０】
好ましい実施形態において、本発明に係る診断方法は、子宮頸部の癌（子宮頸癌）及びその前段階（ＣＩＮ２＋を含む）の診断に使用される。
【００２１】
本発明に係る方法は、遺伝子ＡＳＴＮ１及びＺＮＦ６７１のメチル化を判定する。本明細書中で使用される用語「メチル化」は、分子生物学において通常の用語「過剰メチル化」と同義である。これは、一般にグアニン及びシトシン、ならびに特にＣＧ−ジヌクレオチドが豊富なＤＮＡセグメント（いわゆるＣｐＧアイランド）内の通常の状態とは異なるメチル化のことを指す。
【００２２】
本発明に係る方法のために使用されるサンプルは、好ましくは、非常に信頼できる結果を提供する子宮頸部の頸管スミアである。
【００２３】
ある遺伝子のプロモータ領域ならびに５’−エキソン領域及びプロモータ付近のエキソン領域のメチル化状態は、本発明に係る方法の別の好ましい実施形態において判定される。これらの領域は、特に情報価値がある。
【００２４】
ＤＮＡのメチル化は、好ましくは、好適なプライマー対を使用したメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）と呼ばれるものを用いる亜硫酸水素塩法によって、メチル化されていないシトシンを先に修飾した後に検出される。亜硫酸水素塩法では、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換し、メチル化されているシトシン（５−メチルシトシン）をこの変換から保護する。ウラシルは、通常、シトシンとは異なる対形成特性を有し、すなわち、ウラシルは、チミンのように振舞う。ＭＳＰは、ＤＮＡメチル化を検出するための確立された手法である。ＭＳＰは、メチル化されているＤＮＡとメチル化されていないＤＮＡとの区別を可能にするプライマー及び場合によりプローブに基づき、すなわち、増幅産物の形成が、陽性の所見に対応するメチル化を示す。
【００２５】
メチル化状態を検出するためのプライマーの設計は、ＡＳＴＮ１及びＺＮＦ６７１のメチル化領域の所在及び配列に依存し、ならびにＤＬＸ１、ＥＤＩＬ３、ＩＴＧＡ４及び／又はＲＸＦＰ３のメチル化状態が必要に応じて判定される場合は、これらの遺伝子のメチル化領域にも依存する。
【００２６】
本発明において使用可能なＡＳＴＮ１及びＺＮＦ６７１に対するメチル化特異的プライマーは、試験方法中に、プライマー結合部位内のある特定のシトシンがメチル化されている場合に亜硫酸水素塩で改変されたサンプルＤＮＡだけに結合する。亜硫酸水素塩処理の前にこれらの領域がメチル化されていない場合、プライマーは結合せず、反応産物も形成されない。例えば、反応産物の存在は、特定の遺伝子のＤＮＡ領域のメチル化を指し、子宮頸部の頸管スミアのＤＮＡの場合、例えば、ＣＩＮ２＋の存在の可能性を指す。
【００２７】
メチル化の定性的な検出だけでなく、メチル化されたＤＮＡセグメントの定量も可能にする、リアルタイムＰＣＲ法（ＱＭＳＰ）が特に好ましい。このＭＳＰは、蛍光に基づいたリアルタイム法において行うことができ、ここで、メチル化特異的産物の形成は、蛍光色素、例えば、ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎの取り込みによって追跡される。マーカー遺伝子のメチル化は、メチル化されていないＤＮＡが多いバックグラウンドにおいてこれらの２つの方法（ＭＳ及びＱＭＳＰ）によって検出され得る（Ｓｈａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２５１：１８７−９８）。ＰＣＲに基づいた方法は、ハイスループット法においても使用することができるので、これも癌検査に特に適している。
【００２８】
「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ」法に基づくＱＭＳＰがなおもより好ましく、メチル化について試験されるそれぞれの遺伝子セグメントに対して蛍光プローブが使用される。そのプローブは、５’末端に蛍光色素を有し、３’末端にクエンチャーを有する。そのプローブは、２つの特異的プライマーの間のＰＣＲ反応産物に結合する。そのプローブは、標的配列に結合した後、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’−エキソヌクレアーゼ活性によって分解されるとすぐに、蛍光色素が放出される。測定される蛍光は、形成された産物の量を反映する。行われる反応の数は、いくつかのオリゴヌクレオチド及びプローブを使用することによってこの方法において調べられるサンプルに対応して減少し得る（Ｓｈａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２５１：１８７−９８）。好適な蛍光色素及びクエンチャー（例えば、フルオロフォアとしてＦＡＭ、ＨＥＸＴＭ、ＮＥＤＴＭ、ＲＯＸＴＭ、Ｔｅｘａｓ  ＲｅｄＴＭなど、及びクエンチャーとしてＴＡＭＲＡ又はＢＨＱ）は、当業者に公知である。
【００２９】
特に好ましい実施形態において、本発明の方法は、多重実験として行われる。そのような多重実験は、サンプル１つあたり１つのアッセイにおいて、例えばＣＩＮ２＋の存在と相関すると知られているいくつかの遺伝子のメチル化状態の解析によって、ＣＩＮ２＋の検出を可能にする。試験される遺伝子セットのメチル化状態は、サンプル１つあたり１つ又は２つの反応において判定することができるので、その多重方法はいくつかの利点を提供する。これにより、かなりの時間、サンプル材料及び材料コストが節約される。この多重実験では、試験される最大５つの遺伝子に対して、メチル化特異的プライマーが使用される。さらに、プローブと呼ばれる、１つのさらなる特異的なオリゴヌクレオチドの各々が、すべての遺伝子に対して使用される。このプローブは、一方の末端に蛍光色素を有し、そのプローブが実験中に形成される反応産物に特異的に結合するまで蛍光が生じないように修飾されている。それらのプローブは、異なる蛍光基を有するので、すべてを同時に検出することができる。本発明に係る方法は、「マイクロアレイ」技術を用いても行うことができる。
【００３０】
当業者は、メチル化状態を判定するためのさらなる方法、例えば、蛍光による特異的産物の量の直接的な測定に基づく方法を承知している。例えば、分子ビーコン技術を、本発明に係る診断方法のために使用することもできる。分子ビーコンは、レポーターフルオロフォアとクエンチャーの両方に連結されたオリゴヌクレオチドである。そのプローブの５’末端におけるヌクレオチドは、分子ビーコンに特有である二次構造を形成するように、３’末端におけるヌクレオチドと相補的である。ヘアピン構造と呼ばれるこの状態では、レポーターは、それがクエンチャーとの距離が近いので、蛍光を示さない。クエンチャーとレポーターとの距離は、ＰＣＲサイクル中にプライマー間の相補ＤＮＡ配列にループ領域が結合した結果として長くなる。かくして、そのレポーターの蛍光を観察することができる。
【００３１】
本発明に係る方法を行うために適した別の手法は、「スコーピオン」技術である。スコーピオンプローブは、１つの分子（一スコーピオン）又は２つの分子（二スコーピオン）においてリアルタイムＰＣＲプローブの特性とＰＣＲプライマーの特性とが組み合わされた複合的なオリゴヌクレオチドである。それらは、分子ビーコンと同様に、末端がレポーターフルオロフォア及びクエンチャーで修飾された自己相補的なシャフト領域を有する特徴的な二次構造を含む。さらに、これらのプローブは、３’末端にＰＣＲプライマーを有する。ＰＣＲサイクル中、相補ＤＮＡ配列にループ領域が結合し、そしてＤＮＡ濃度が上昇するときにクエンチャー及びレポーターとの距離が長くなることによって、レポーター蛍光が観察され得る。種々のプローブの結合を検出するためには、後者が蛍光色素分子と結合される。
【００３２】
さらに、本発明に係る方法が行われるとき、ポジディブコントロール遺伝子及び／又はネガティブコントロール遺伝子、例えば、メチル化されていないコントロール遺伝子が、同時に増幅され得る。
【００３３】
遺伝子のメチル化は、転写が阻止されること、ひいては翻訳されないことと関連があることが多いと知られている。したがって、本発明に係る方法は、対応するＲＮＡ及び／又はタンパク質の濃度を測定することによる、メチル化状態の間接的な判定も包含する。その検出は、通常の方法、例えば（ＲＮＡの場合）ノーザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲなど、及び（タンパク質の場合）抗体に基づく方法又はタンパク質の生物学的活性の測定に基づく方法によって、行うことができる。
【００３４】
本発明に係る方法は、以下の工程に基づき得、例えば：
（ａ）試験される人の細胞頸管スミアから、標準的な方法に従って、例えば、ＱｉａＡｍｐ  ＤＮＡ−Ｍｉｎｉキットを製造者（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の指示書に従って、ＤＮＡを単離する；
（ｂ）第２の工程では、好ましくは、解析されるサンプルがｈｒ−ＨＰＶ−ＤＮＡを含むか否かを調べる。この検出は、ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲ  ＥＩＡ法（Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３３：９０１−９０５）などのすでに確立されている方法を用いて行われる。すべてのｈｒ−ＨＰＶタイプ（ＨＰＶ１６、１８、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５３、５６、５８、５９、６６、６８、７３、８２）が網羅されるべきである。ハウスキーピング遺伝子、例えば、β−グロビン又はβ−アクチンの検出によって、増幅され得る十分な品質の十分な量のＤＮＡが、そのサンプル中で利用可能であることが保証される；
（ｃ）ＨＰＶ陰性サンプルでは、ＣＩＮ２＋の存在は、ほぼ１００％排除される（Ｃｕｚｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１１９：１０９５−１１０１）。それゆえ、これらのサンプルは、さらに調べられる必要はない。次いで、ＣＩＮ２＋であるか又はそうでないｈｒ−ＨＰＶ陽性の所見を有する女性の区別を、遺伝子ＡＳＴＮ１及びＺＮＦ６７１のメチル化状態の判定によって行う；
（ｄ）この目的のために、ｈｒ−ＨＰＶ陽性サンプルのＤＮＡを、亜硫酸水素塩法に従って、例えば、市販のキット（例えば、Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｇｏｌｄ  Ｋｉｔ，Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、化学的に変換する。ここでは、ＤＮＡサンプルのメチル化されていないシトシンのすべてが、重亜硫酸ナトリウムでの処理及びそれに続くアルカリ加水分解によって、ウラシルに変換される；
（ｅ）関連するＤＮＡを、それぞれのゲノムセグメントのメチル化された形態に対する特異的プライマーを用いたＰＣＲによって増幅し、解析する；
（ｆ）メチル化特異的ＰＣＲ又はＱＭＳＰにおいて遺伝子ＡＳＴＮ１及びＺＮＦ６７１のメチル化を検出するために、以下のメチル化特異的プライマーを使用することができる：
【００３５】
【表１】
0005491631.tif 000002
【００３６】
しかしながら、本発明に係る診断方法は、遺伝子ＡＳＴＮ１及びＺＮＦ６７１のメチル化を検出するためにこれらのプライマーを使用することに限定されない。本発明はまた、両方の遺伝子のメチル化を検出するために役立ち得る他の配列のプライマーも含む。
（ｇ）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ解析法によって遺伝子ＡＳＴＮ１及びＺＮＦ６７１のメチル化を検出するために、上に記載されたプライマーに加えて蛍光プローブを使用する：
【００３７】
【表２】
0005491631.tif 000003
【００３８】
適用法に応じて、上記プローブは、対応する蛍光色素に結合される。しかしながら、本発明は、遺伝子ＡＳＴＮ１及びＺＮＦ６７１のメチル化を検出するためにこれらのプローブを使用することに限定されない。本発明はまた、両方の遺伝子のメチル化を検出するために役立ち得る他の配列を有するプローブも含む。
【００３９】
マーカー遺伝子のメチル化の定量は、必須ではない。決定的に重要なことは、例えば、ＭＳＰ又はＱＭＳＰによって、マーカー遺伝子がメチル化されている少なくとも１つの細胞を、マーカー遺伝子がメチル化されていない１０００個の細胞のバックグラウンドにおいて検出することができることである。
【００４０】
本発明に係る方法のさらに特に好ましい実施形態において、サンプル中のＨＰＶ−ＤＮＡがさらに定量される。これにより、亜硫酸水素塩修飾に対応するように適合されたｈｒ−ＨＰＶ特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって、亜硫酸水素塩処理によって修飾されたＤＮＡにおいてＨＰＶ陽性細胞の数を査定することができる。それらのプライマーは、好ましくは、ＨＰＶゲノムの保存されたＬ１領域の増幅を可能にするものであり、例えば以下の配列を含み得る：
【００４１】
【表３】
0005491631.tif 000004
【００４２】
さらに好ましい実施形態において、遺伝子ＤＬＸ１、ＥＤＩＬ３、ＩＴＧＡ４及び／又はＲＸＦＰ３の１つ以上のメチル化が調べられる。この目的のために使用可能なプライマーは、以下のものである：
【００４３】
【表４】
0005491631.tif 000005
【００４４】
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ解析法によって遺伝子ＤＬＸ１、ＥＤＩＬ３、ＩＴＧＡ４及びＲＸＦＰ３のメチル化を検出するために、上に記載されたプライマーに加えて蛍光プローブが使用される：
【００４５】
【表５】
0005491631.tif 000006
【００４６】
適用法に応じて、上記プローブは、対応する蛍光色素に結合される。
【００４７】
本発明のさらなる主題は、本発明に係る方法を行うためのキットである。そのようなキットは、ＡＳＴＮ１（アストロタクチン１）及びＺＮＦ６７１（転写因子であるジンクフィンガータンパク質）のメチル化状態を判定するための遺伝子特異的プライマー又はプライマー対、好ましくは、上でより詳細に定義されたプライマー及び／又はプライマー対を備える。さらなる実施形態において、そのキットはさらに、ＤＬＸ１（遠位欠失ホメオボックス１）、ＥＤＩＬ３（ＥＧＦ様リピート及びジスコイジンＩ様ドメイン３）、ＩＴＧＡ４（α４−インテグリン）及び／又はＲＸＦＰ３（レラキシン／インスリン様ファミリーペプチド受容体３）のメチル化状態を判定する遺伝子特異的プライマー又はプライマー対、好ましくは、上でより詳細に定義されたプライマー及び／又はプライマー対を備え得る。
【００４８】
本キットはさらに、上でより詳細に記載されたようなプローブ、及び／又はＨＰＶ感染を検出するためのプライマー対も備え得る。
【００４９】
最後に、本キットはさらに、別個の容器において、以下の構成物のうちの少なくとも１つを備え得る：
（ａ）ＤＮＡ単離用試薬；
（ｂ）ＤＮＡ増幅用酵素；
（ｃ）亜硫酸水素ナトリウム；
（ｄ）１又はそれ以上の緩衝液。
【００５０】
本キットの個別の構成要素の１つ以上の類似物が、入手可能であり得る。
【００５１】
したがって、本発明を用いて、肛門性器路の癌腫、特に子宮頸癌を初期の段階で診断することが可能である。特に、これらの癌腫の前段階を早期に検出することができる。臨床上関連性のある組織の改変、例えば、ＣＩＮ２＋であるか又はそうでないｈｒ−ＨＰＶ陽性の女性の識別を行うことができることが指摘されなければならない。別の特徴的な因子は、本発明に係る方法によって得られる結果が主観評価に供されず、それゆえ例えばパップテストの偽陰性又は偽陽性の結果を回避することができる点である。さらに、本発明に係る診断方法は、迅速かつ簡便な操作によって区別するので、大規模なスクリーニング測定、特に、第三世界諸国において適している。したがって、本発明は、肛門生殖器の癌、特に子宮頸癌又はそれらの前段階の現用の診断法に対して重要な寄与をもたらす。
【００５２】
この点において、ＡＳＴＮ１及びＺＮＦ６７１のメチル化状態を判定する本発明の組み合わせの結果として、ＣＩＮ２＋病変の検出に関する優れた確定診断を達成することができ、それは他の遺伝子の個別の判定を上回るものであることに注目されるべきである。例えば、ＲＸＦＰ３（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）は、ＡＳＴＮ１及びＺＮＦ６７１よりも１０％超劣るマーカーである（図１を参照のこと）。したがって、上で述べられたさらなるマーカー遺伝子のメチル化状態の追加の判定は、例外的な場合にのみ必要であり、診断を確認するためだけに本発明に従って使用される。
【００５３】
本発明は、以下の実施例によって説明される。
【実施例】
【００５４】
実施例１  頸管スミアにおけるＤＮＡメチル化
【００５５】
（１）７７人のＨＰＶ陰性女性の頸管スミア、（２）組織変化の徴候が（組織病理学的に）なかった９０人のｈｒ−ＨＰＶ陽性女性の頸管スミア；（３）組織病理学的にＣＩＮ３と確認された４８人のｈｒ−ＨＰＶ陽性女性の頸管スミア、及び（４）組織病理学的に子宮頸癌と確認された６５人のｈｒ−ＨＰＶ陽性女性の頸管スミアを調べた。
【００５６】
結果を図２に示す。図２は、個別の群における遺伝子ＡＳＴＮ１及びＺＮＦ６７１のメチル化頻度を示している。これらの遺伝子の少なくとも１つのメチル化は、ＣＩＮ３サンプルの８７％及び子宮頸癌サンプルの９０％に起きていたが、ｈｒ−ＨＰＶ陰性の３％及び組織変化のないｈｒ−ＨＰＶ陽性の女性の５％でしか起きていなかった。したがって、これらの２つの遺伝子を組み合わせた結果として、ほぼ１００％の確定診断を得ることが可能である。これは、本発明に係る方法の信頼性を示している。
【００５７】
ＨＰＶ感染の検出とメチル化された遺伝子の検出の両方のためのＰＣＲは、非常に感度が高い。本実施例は、ＨＰＶ状態及びマーカー遺伝子のメチル化状態のそれぞれの定性的な測定に基づく。ＨＰＶ  ＤＮＡの定量的な測定によって、サンプル中のＨＰＶ陽性細胞の最小数に対応する限界値を定義することができる。結果として、メチル化特異的ＰＣＲの特異度は、ＣＩＮ２＋の検出に対してさらに高められ得る。
【図１】
0005491631.tif 000007
【図２】
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【配列表】
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