(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシル基がキトサンのアミン基と共有結合するポリアルギニン、ポリヒスチジン、またはポリライシンを含むことを特徴とするキトサン基材陽イオン性高分子接合体。
【請求項２】
カルボキシル基がキトサンのアミン基に共有結合するポリアルギニンを含むことを特徴とする請求項１に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体。
【請求項３】
カルボキシル基がキトサンのアミン基に共有結合するポリヒスチジンを含むことを特徴とする請求項１に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体。
【請求項４】
カルボキシル基がキトサンのアミン基に共有結合するポリライシンを含むことを特徴とする請求項１に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体。
【請求項５】
キトサンに共有結合されたポリエチレングリコールを更に含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体。
【請求項６】
前記ポリエチレングリコールが、キトサンのアミン基またはハイドロキシ基に結合されることを特徴とする請求項５に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体。
【請求項７】
前記ポリエチレングリコールが糖成分（sugar moiety）により修飾されたものであることを特徴とする請求項５に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体。
【請求項８】
請求項５に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体及び核酸素材医薬を含むことを特徴とする核酸素材医薬の生体内または細胞内伝達用輸送体組成物。
【請求項９】
前記核酸素材医薬は、低分子干渉ＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡであることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記細胞は、粘膜部位または粘膜組織を構成する細胞であることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１乃至４に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体及び核酸素材医薬を含むことを特徴とする核酸素材医薬の血中滞留増加用輸送体組成物。
【請求項１２】
前記核酸素材医薬は、低分子干渉ＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡであることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
水溶液内カルボキシル基カップリング化剤の存在下にキトサン及びポリアルギニン、ポリヒスチジン、またはポリライシンを混合及び撹拌するステップを含む請求項１に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体の製造方法。
【請求項１４】
キトサン：ポリアミンのモル比が１：１乃至１：１０で結合されることを特徴とする請求項１３に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体の製造方法。
【請求項１５】
キトサンとポリアミンとの混合前に活性化されたポリエチレングリコールをキトサンと混合及び撹拌するか、またはキトサンとポリアミンとの混合及び撹拌後に生成されたキトサン−ポリアミン共有結合接合体に活性化されたポリエチレングリコールを混合及び撹拌するステップを更に含むことを特徴とする請求項１３に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体の製造方法。
【請求項１６】
キトサン：ポリエチレングリコールのモル比が１：１乃至１：５０で結合されることを特徴とする請求項１５に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体の製造方法。
【請求項１７】
前記活性化されたポリエチレングリコールは、糖成分（sugar moiety）により修飾されたものであることを特徴とする請求項１５に記載のキトサン基材陽イオン性高分子接合体の製造方法。
【請求項１８】
（１）カルボキシル基カップリング化剤の存在下にキトサン及びポリアミンを混合及び撹拌してキトサンのアミン基にポリアルギニン、ポリヒスチジン、またはポリライシンが共有結合されたキトサン基材陽イオン性高分子を生産するステップと、
（２）ステップ（１）で生産されたキトサン基材陽イオン性高分子接合体を核酸素材医薬と混合するステップと、
を含むことを特徴とする請求項８に記載の核酸素材医薬の生体内または細胞内伝達用輸送体組成物の製造方法。
【請求項１９】
前記キトサン基材陽イオン性高分子接合体がキトサンに共有結合されたポリエチレングリコールを更に含むものであって、前記製造方法は、前記ステップ（１）でキトサンとポリアミンとの混合前に活性化されたポリエチレングリコールをキトサンと混合及び撹拌するか、またはキトサンとポリアミンの混合及び撹拌後に生成されたキトサン−ポリアミン共有結合接合体に活性化されたポリエチレングリコールを混合及び撹拌するステップを更に含んで製造されることを特徴とする請求項１８に記載の核酸素材医薬の生体内または細胞内伝達用輸送体組成物の製造方法。
【請求項２０】
前記核酸素材医薬は、低分子干渉ＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡであることを特徴とする請求項１８に記載の核酸素材医薬の生体内または細胞内伝達用輸送体組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小さな干渉リボ核酸（small interfering
RNA）、プラスミドデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）等、核酸素材医薬（gene medicine）の生体投与及び細胞内の伝達のためのキトサン接合体、及びその製造方法に関し、より詳しくは、多様な分子量のキトサン（chitosan）を主型にして、ポリアルギニン（poly-L-arginine）と結合させた二重接合体、またはこれら接合体にポリエチレングリコール（poly ethylene glycol；ＰＥＧ）が追加された三重接合体、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、核酸素材医薬（gene medicine）は、その構造的特徴により陰イオンを帯びており、したがって陽電荷を保有したポリエチレンイミン、ポリライシンなどの陽イオン性高分子や陽電荷地質を使用した燐脂質ナノ粒子が、小さな干渉リボ核酸やプラスミドデオキシリボ核酸の陰イオン性荷電と複合体（complex）を形成して生体内に伝達する伝達体として研究されて来た。
【０００３】
陽イオン性燐脂質ナノ粒子の場合、燐脂質組成に陽電荷を帯びる地質を一定の割合で混合して陽イオン性リポソーム（cationic liposome）のような粒子を製造し、この粒子を遺伝子と混合して陽電荷燐脂質粒子及び遺伝子の接合体を細胞株に処理して遺伝子の発現を増強させる方法が公開されたことがある（米国特許ＵＳ５，８５８，７８４号、米国特許ＵＳ２００６０００８９１０Ａ１）。陽イオン性高分子の場合、ＤＥＡＥデキストラン、ライシンアミノ酸が反復される構造のポリライシン、エチレンイミンが反復される構造のポリエチレンイミン、ポリアミドアミン（polyamidoamine）（米国特許第６，０２０，４５７号）、ポリアミンエステル（poly-amino-ester）（米国特許ＵＳ２００４００７１６５４Ａ１）、生分解性陽イオン共重合体（米国特許ＵＳ２００６００９３６７４Ａ１）などが遺伝子の輸送体として研究されて来た。
【０００４】
合成高分子を用いた遺伝子伝達方法は、レンチウイルス、アデノウイルス、またはレトロウイルスベクターなどを使用したウイルス性遺伝子輸送体に比べて製造方法が簡便であり、伝達しようとする遺伝子のサイズ制限を受けず、ウイルスベクターの表面たんぱく質の免疫原性により誘発される反復投与時の免疫副作用が少なく、ウイルス自体が所有する遺伝子による体内安全性問題が提起されず、製造費用及び工程ステップにおいても商業的に非常に有利な長所がある。しかしながら、これら陽イオン性高分子を用いた輸送体は、細胞の表面の受容体を通じて細胞の内部に効果的に輸送されるウイルス性輸送体に比べて、体内細胞内への輸送効率が低いし、細胞内への遺伝子伝達過程で誘発できる細胞に対する毒性などに問題点が指摘されて来た（J.
Control. Release（２００６）１１４、１００−１０９）。また、生体内で複合体を形成して伝えられた遺伝子の血中半減期を大きく延長させられない短所がある（Gene Ther.（２００１）８、１８５７−１５９２）。
【０００５】
陽イオン性高分子のうち、キトサンは他の高分子に比べて経済性が高くて、産業的利用性が高く、生体内の適合性が優れる長所があるが、遺伝子伝達体として研究が遂行されたことがあるが、キトサンの溶解度問題、細胞内への低い伝達効率などが当分野で解決すべき問題点として残っている。キトサンの溶解度、細胞内の透過度などを改善するために、キトサンにポリエチレングリコールを結合させた高分子接合体が粘膜投与用遺伝子伝達体として知られたことがある（米国特許６，７３０，７４２、２００４年）。しかしながら、単純なポリエチレングリコールの添加だけでは細胞内への核酸医薬伝達を格段に増加させることに制限があった。
【０００６】
したがって、本発明者は、キトサン素材で核酸医薬を生体内へ伝達する効率及び血中安定性を増強させるために努力した結果、キトサンに陽イオン性高分子であるポリアミンを結合させた２重接合体、またはこれら接合体に生体適合性高分子であるポリエチレングリコールが追加された３重接合体を使用する場合、細胞毒性が減少し、核酸医薬の細胞内の伝達効率や生体内の血中滞留を格段に増強させることができることを発見して、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許ＵＳ５，８５８，７８４号
【特許文献２】米国特許ＵＳ２００６０００８９１０Ａ１
【特許文献３】米国特許第６，０２０，４５７号
【特許文献４】米国特許ＵＳ２００４００７１６５４Ａ１
【特許文献５】米国特許ＵＳ２００６００９３６７４Ａ１
【特許文献６】米国特許６，７３０，７４２、２００４年
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J. Control. Release（２００６）１１４、１００−１０９
【非特許文献２】Gene Ther. （２００１）８、１８５７−１５９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、細胞で毒性を減少させ、細胞内へ目的する小さな干渉リボ核酸やプラスミドデオキシリボ核酸など、核酸素材医薬の細胞及び体内伝達効能を増強させるだけでなく、細胞毒性が減少された、キトサン及びポリアミンが共有結合により連結されたキトサン素材高分子接合体、またはこれら接合体に追加的にポリエチレングリコールが連結されたキトサン基材陽イオン性高分子接合体を提供することにある。
【００１０】
また、本発明の他の目的は、上記キトサン基材陽イオン性高分子接合体を含む核酸素材医薬の生体内、または細胞内の伝達用輸送体組成物を提供することにある。
【００１１】
また、本発明の更に他の目的は、上記キトサン基材陽イオン性高分子接合体を製造する方法を提供することにある。
【００１２】
また、本発明の更なる他の目的は、上記キトサン基材陽イオン性高分子接合体を使用して、核酸素材医薬の血中滞留を増強させるための伝達体として使用する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するための本発明の一様態は、キトサンのアミン基に共有結合されたポリアミンを含む陽イオン性高分子接合体を提供する。
【００１４】
キトサンは、ポリ−［１、４］−β−Ｄ−グルコサミンの通常的に使われる名称であり、無脊椎の甲殻類を始めとして昆虫類の外皮成分、菌類の細胞壁等にたくさん存在する天然高分子であるキチンを高濃度のアルカリで処理することによって、Ｎ−脱アセチル化して製造される塩基性多糖類である。本発明で使われるキトサンは、キチンから化学的に誘導されるか、真菌類の細胞壁、昆虫の皮、及び特に甲殻類から誘導される等、広く入手可能な素材から低廉に誘導でき、また市販品でも購入可能である。
【００１５】
本発明で使われるキトサンは、多様な分子量を有するキトサンが使われることができ、好ましくは５，０００乃至２，０００，０００の分子量を有する。本発明の具体的な一実施形態として、本発明者は低分子量（Low molecular weight）−キトサン（ＬＭＷ−キトサン；ｆｗ
５００００〜１５００００、Ｆｌｕｋａ、スイス）、中間分子量−キトサン（ＭＭＷ−キトサン；Ａｌｄｒｉｃｈ、１９０，０００−３１０，０００）及び高分子量−キトサン（ＨＭＷ−キトサン；Ａｌｄｒｉｃｈ、３１０，０００−３７５，０００、または平均分子量６００，０００
Ｆｌｕｋａ、スイス）を使用して本発明のキトサン素材陽イオン性高分子を製造した。
【００１６】
本発明で使われるポリアミンには、分子内に２以上のアミノ基を有するものであればどのものでも関係ないし、当該技術分野に広く知られた方法により製造するか、市販品を使用することができる。具体的な様態として、本発明で使われるポリアミンは陽電荷を帯びる性質を有し、好ましくは陽電荷を帯びるポリアミノ酸、より好ましくはポリアルギニン、ポリヒスチジン、またはポリライシンである。
【００１７】
また、本発明で使われるポリアミンは、５００乃至３００，０００の分子量を有し、上記使われるポリアミンの分子量はポリアミンの種類などによって変わることができる。
【００１８】
具体的な一実施形態として、本発明者は、分子量１５０００乃至７００００、または７００００以上のポリ−Ｌ−アルギニン（シグマ、米国）、分子量５０００のポリ−Ｌ−ヒスチジン（シグマ、米国）、または分子量９２００のポリ−Ｌ−ライシン（シグマ、米国）を使用して本発明の接合体を製造した。
【００１９】
キトサンとポリアミンの結合反応時、キトサン：ポリアミン反応モル比の範囲は１：１乃至１：１０、好ましくは１：１乃至１：２である。また、キトサン、ポリアミン、ポリエチレングリコール結合反応でのキトサンとポリエチレングリコール反応モル％比の範囲は１：１乃至１：５０であり、好ましくは１：５乃至１：２５である。
【００２０】
好ましい一様態として、本発明のキトサン素材陽イオン性高分子接合体には追加的にポリエチレングリコールが結合できる（即ち、キトサン、ポリアミン、及びポリエチレングリコール３重接合体）。
【００２１】
本発明で使われるポリエチレングリコールは、キトサンと結合するために活性化されなければならない。ポリエチレングリコールのような生体適合性高分子の活性化は、生体適合性高分子の末端基のうちの１つを反応性作用基（group）、または残基（moiety）に転換させて達成する。このような転換による生成物を“活性化された生体適合性高分子”という。例えば、ポリ（アルキレンオキサイド）を薬物に結合させるために、ヒドロキシル末端基のうちの１つをカーボネートのような反応性作用基に転換させることができ、これによって得られた生成物は活性化されたポリ（アルキレンオキサイド）となる。
【００２２】
多数の溶媒に容易に溶解でき、実質的に非抗原性を表す高分子鎖としてのポリエチレングリコールの数平均分子量は約３００ダルトン乃至約１００，０００ダルトンが好ましくて、より好ましくは約１，０００ダルトン乃至約２０，０００ダルトンである。本発明のポリエチレングリコールは、二次または三次分枝化するために鎖になっているものでありうる。また、二作用性及びヘテロ−二作用性活性ポリエチレングリコールのエステルが使われることができる。
【００２３】
また、好ましい一様態として、本発明で使われるポリエチレングリコールは、キトサンのアミノ基、またはハイドロキシ基と結合できる。本発明において、上記ポリエチレングリコールをキトサンの特定機能基に結合させるために、キトサンのアミノ基またはハイドロキシ基を、例えばフタリック無水物のような保護物質で保護した後、ポリエチレングリコールを結合させることができる。
【００２４】
また、本発明の好ましい一様態として、本発明の接合体が標的臓器に一層特異的に到達できるように、本発明のキトサン基材陽イオン性高分子接合体には追加的に糖成分（sugar moiety）が修飾できる。修飾できる糖成分には、マンノーズ、ガラクトーズ、及びグルコーズなどがあリ、これに制限されない。具体的な一実施形態として、本発明者はポリエチレングリコールにマンノーズ（mannose）を結合させたキトサン素材陽イオン性高分子を製造した。
【００２５】
本発明の他の好ましい一様態として、本発明のキトサン基材陽イオン性高分子接合体は、追加的に生体または細胞内に投与して伝達しようとする１つ以上の核酸素材医薬と複合体を形成することができる。好ましくは、上記核酸素材医薬は、プラスミドDNAまたは小さな干渉ＲＮＡである。具体的な一実施形態として、本発明者はネズミのサバイビン（survivin）遺伝子のたんぱく質の発現を阻害するサバイビン特異的な小さな干渉リボ核酸序列をキトサン−ポリアルギニン、及びポリエチレングリコール−キトサン−ポリアルギニン接合体と複合体を形成するようにしたのであり、これを細胞内に伝達させた場合、高い細胞内伝達効率を表すだけでなく、細胞毒性も格段に減少させることによって、多様な細胞を対象に、目的する小さな干渉リボ核酸遺伝子を効果的に細胞内へ輸送し発現させた。
【００２６】
したがって、本発明のキトサン基材高分子接合体は、プラスミド DNA、または小さな干渉ＲＮＡのような陰電荷を帯びる核酸素材医薬と荷電度による接合体を形成して目的する核酸医薬を細胞内へ輸送する効率を上げることができるだけでなく、細胞毒性を減少させることによって、核酸素材医薬を生体または細胞内に投与する場合、伝達体として有用に使われることができる。
【００２７】
また、本発明の更に他の様態として、本発明は上記キトサン基材陽イオン性高分子を含む、核酸素材医薬の生体内または細胞内伝達用輸送体組成物、または核酸素材医薬の血中滞留増加用輸送体組成物に関するものである。
【００２８】
本発明の組成物は、本発明のキトサン基材陽イオン性高分子接合体、及び追加的に生体または細胞内に投与して伝達しようとする１つ以上の核酸素材医薬を含むことができる。好ましくは、上記核酸素材医薬はプラスミド DNAまたは小さな干渉ＲＮＡである。
【００２９】
本発明において、“投与”は如何なる適切な方法により患者に所定の物質を導入することを意味し、上記組成物の投与経路は薬物が目的組織に到達できる限り、如何なる一般的な経路を通じて投与できる。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与などになることができるが、これに制限されるのではない。また、本発明の組成物は活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置により投与できる。
【００３０】
本発明の組成物は、薬剤学的に許容可能な担体を含むことができる。薬剤学的に許される担体は、経口投与時には、結合剤、滑澤剤、崩解剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の組成物の剤形は前述したような薬剤学的に許される担体と混合して多様に製造できる。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリクサー、サスペンション、シロップ、ウエハーなどの形態に製造でき、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬形態に製造できる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放型製剤などに剤型化することができる。
【００３１】
一方、製剤化に適した担体、賦形剤、及び希釈剤の例には、ラクトーズ、デキストローズ、スクローズ、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフエート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルハイドロキシベンゾエート、プロピルハイドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート、または鉱物油などが使われることができる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、防腐剤などを更に含むことができる。
【００３２】
本発明の組成物は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、及び疾患の重等度などのいろいろな関連因子と共に、活性成分である薬物の種類によって決定される。本発明の組成物は、生体内の持続性及び役価が優れるので、本発明の薬剤学的製剤の投与回数及び頻度を格段に減少させることができる。好ましい一様態として、本発明の組成物はｓｉＲＮＡを生体内に単位体重グラム当たり０．１−５００ｐｍｏｌｅの容量範囲に全身または局所投与することに使用することができ、プラスミド DNAを単位グラム当たり０．１−１０００マイクログラム（microgram）の容量範囲に全身または局所投与することに使用することができる。
【００３３】
また、本発明の更に他の一様態として、本発明は本発明のキトサン基材高分子接合体を製造する方法を提供する。
【００３４】
具体的に、本発明の製造方法は、キトサン及びポリアミンを混合して結合させるステップを含む。好ましくは、上記の結合は混合物を撹拌するステップを含んでなされることができる。キトサン及びポリアミンを容易に混合及び結合させるために、適切な溶媒を使用してこれらを溶解させることもでき、そのような溶媒はキトサン及びポリアミンを溶解させることができる性質を有するものであれば制限がない。上記溶媒は当業者がその用途によって適切に選択することができる。また、撹拌などにより両物質を容易に混合及び結合するようにすることもできる。
【００３５】
また、本発明ではキトサンとポリアミンとを容易に結合させるために、キトサンまたはポリアミンの末端基のうちのカルボキシルグループをカップリング化させる製剤を使用することができる。このような試薬の例には、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カーボジイミド（ＥＤＡＣ）、１、３−ジイソプロピルカーボジイミド（ＤＩＣ）、ジサイクロヘキシルカーボジイミド（ＤＣＣ）、及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カーボジイミド（ＥＤＣ）などを含む。好ましいカルボキシル基のカップリング化剤はＥＤＡＣである。
【００３６】
好ましくは、上記カルボキシル基カップリング化剤と共に活性反応補助剤を使用することができる。上記活性反応補助剤の好ましい例には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、３、４−ジヒドロ
−３−ヒドロキシ−４−ヨウ素−１、２、３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）などがあるが、これに制限されるのではない。
【００３７】
カルボキシル基カップリング化剤と活性反応補助剤の添加量は、これらの活性度、濃度など、いろいろな要因により決定できる。具体的な一実施形態として、本発明者は、ＨＣｌ溶液にキトサンを溶解させた後、緩衝溶液で希望する濃度にキトサン溶液を希釈した後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カーボジイミド（ＥＤＡＣ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）、及びポリアミンを混合して２４時間撹拌して反応させた。
【００３８】
好ましい一様態として、本発明の製造方法は、追加的にポリエチレングリコールをキトサンに結合させるステップを含むことができる。本発明で結合されるポリエチレングリコールは、上記キトサン基材陽イオン性高分子接合体のように、キトサンと結合するために活性化されなければならない。ポリエチレングリコールのような生体適合性高分子の活性化は、生体適合性高分子の末端基のうちの１つを反応性作用基（group）または残基（moiety）に転換させて達成する。ポリエチレングリコールはキトサンとポリアミンとの結合の前に、先にキトサンと結合されることもでき、キトサンとポリアミンとの結合後に結合されることもできる。
【００３９】
好ましい更に他の一様態として、本発明の製造方法は、追加的に生産されたキトサン基材陽イオン性高分子に糖成分を追加的に修飾するステップを含むことができる。
【００４０】
更に他の好ましい一様態として、本発明の製造方法は、上記のように生産されたキトサン素材陽イオン性高分子に追加的に生体内または細胞内投与を希望する核酸素材医薬と複合体を形成させるステップを更に含む。複合体を形成させようとする核酸素材医薬は、市販品を購入するか、当該技術分野で広く知られた方法により製造可能である。より好ましくは、上記核酸素材医薬は小さな干渉ＲＮＡまたはプラスミド DNAである。複合体を形成させる方法は、当業者が当該技術分野で広く知られた方法により可能であり、本発明のキトサン素材陽イオン性高分子と核酸素材医薬は各々異なる電荷を帯びているので、撹拌などの簡単な処理により複合体を形成することができる。
【００４１】
具体的な一実施形態として、本発明者は、ネズミのサバイビン遺伝子のたんぱく質発現を阻害するサバイビン特異的な小さな干渉ＲＮＡ序列をｓｉＲＮＡ鎖デザインプログラムを用いて決定して注文製作したのであり、このような小さな干渉リボ核酸をキトサン−ポリアルギニン、またはキトサン−ポリアルギニン−ポリエチレングリコール溶液と混合した後、３７℃で３０分間放置して複合体を形成させた。
【００４２】
本発明に従う製造方法の各反応ステップでの生成物は、当業界に公知された通常の方法により反応系から分離及び／又は精製できる。分離及び精製方法の例には、蒸留（大気圧下蒸留、及び減圧蒸留を含み）、再結晶、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、箔層クロマトグラフィー、相分離、溶媒抽出、透析、洗浄などを挙げることができる。精製は各反応ステップ毎に、または一連の反応ステップの以後に遂行することができる。
【００４３】
本発明の製造方法により生産されたキトサン基材陽イオン性高分子重合体は、前述から分かるように、遺伝子または小さな干渉ＲＮＡのような陰電荷を帯びる核酸素材医薬を細胞内へ輸送する効率を上げることができ、細胞毒性を減少させることによって、核酸素材医薬を生体または細胞内に投与する場合、伝達体として有用に使われることができる。だけでなく、生体内の血中滞留性を格段に増強させることができる。
【００４４】
したがって、更に他の一様態として、本発明は、本発明のキトサン基材陽イオン性高分子接合体を使用して、核酸素材医薬の血中滞留を増強させるための伝達体として使用する方法を提供する。本発明の接合体をこのような伝達体として使用するために、本発明の接合体を単独または薬剤学的に許容可能な担体などが含まれた組成物の形態で投与することができ、その投与方法及び投与量は上記本発明の組成物での説明と同一である。
【発明の効果】
【００４５】
本発明のキトサン素材陽イオン性高分子接合体は、小さな干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）などの核酸素材医薬物質と荷電による複合体（complex）を形成して、細胞内にこれら核酸素材物質を効率的に伝達するだけでなく、細胞毒性も格段に減少させることによって、多様な細胞を対象にして目的する小さな干渉リボ核酸遺伝子を効果的に細胞内に輸送し発現させることに有用に使われることができる。また、本発明のキトサン素材陽イオン性高分子接合体は、生体内で核酸医薬の滞留時間を増加させることに有用に使われることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】キトサン−ポリアルギニン接合体の１Ｈ ＮＭＲ結果を示すものである。
【図２】フタリック酸で反応基が保護されたフタロイルキトサンの１Ｈ ＮＭＲ結果である。
【図３】５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−フタロイル−キトサン接合体の１ＨＮＭＲ結果である。
【図４】フタリック酸のデプロテクティング（deprotecting）後の５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−キトサン接合体の１ＨＮＭＲ結果である。
【図５】５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−キトサン−ポリアルギニン接合体の１Ｈ ＮＭＲ結果である。
【図６】キトサン、ポリアルギニン、キトサン−ポリアルギニンと小さな干渉リボ核酸複合体の電気泳動上の特徴を示すものである。
【図７】各種陽イオン性高分子伝達体の肝がん細胞株（ｈｅｐａ１−６）へのリボ核酸伝達効率を蛍光標識リボ核酸を用いて蛍光顕微鏡で比較評価したものである。
【図８】各種陽イオン性高分子伝達体の粘膜上皮細胞株（ＶＫ２ｃｅｌｌ）への小さな干渉リボ核酸伝達効率を蛍光標識リボ核酸を用いて蛍光顕微鏡で比較評価したものである。
【図９】キトサン高分子接合体の小さな干渉リボ核酸細胞伝達効率を細胞内の標的たんぱく質の発現干渉効能を指標にして評価したものである。
【図１０】キトサン高分子接合体と小さな干渉リボ核酸複合体の肝がん細胞株（Ｈｅｐａ １−６ｃｅｌｌ）での細胞毒性を評価したものである。
【図１１】キトサン高分子接合体と小さな干渉リボ核酸複合体の上皮細胞株（ＶＫ２ ｃｅｌｌ）での細胞毒性を評価したものである。
【図１２】キトサン高分子接合体と複合体形態で投与された小さな干渉リボ核酸の血中滞留性を他の陽イオン性高分子伝達体を使用して投与した場合と比較評価したものである。
【図１３】肝繊維化（Liver Fibrosis）ネズミに対するｓｉＲＮＡ投与による治療効果を表す写真であって、一番上の写真は陰性対照群で肝繊維化の誘発後、何らの処理もしていない肝組織写真であり、中間の写真はｓｉＲＮＡ単独注射した場合の写真であり、一番下の写真は本発明に係るポリエチレングリコール−キトサン−ポリアルギニンとｓｉＲＮＡの複合体を注射した場合の肝組織の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
以下、本発明を実施形態により詳細に説明する。
【００４８】
但し、下記の実施形態は本発明を例示するだけであり、本発明の内容が下記の実施形態に限定されるのではない。
【００４９】
比較例１
キトサン−ポリエチレングリコール接合体製造
ＬＭＷ（低分子量、low molecular weight−キトサン（ｆｗ
５００００〜１５００００））を０．１Ｍ ＨＣｌ溶液に２０ｍｇ／ｍｌ濃度に溶解させた後、ＰＢＳ ｐＨ７．４緩衝溶液で２ｍｇ／ｍｌ濃度に希釈する。
【００５０】
上記で用意したキトサン溶液５ｍｌ（ｆｗ ５００００〜１５００００、１０ｍｇ、６．２Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とｍＰＥＧ５Ｋ−ＳＣ（ｍＰＥＧ５Ｋ−サクシニルカーボネート、ｆｗ ５０００、２４．８４ｍｇ、４．９６×１０−６ｍｏｌ、８ｍｏｌ％、ＩＤＢ、韓国）を混合した後、室温で２４時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機（centrifugal filter；ＭＷＣＯ ３０ｋ）を使用して精製した後、凍結乾燥してｍＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＷ−キトサン接合体を（ＤＰ
８ｍｏｌ％；ＤＰ：the degree of PEGylation）製造する。
【００５１】
比較例２
ポリアルギニン−ポリエチレングリコール接合体製造
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０緩衝溶液２ｍｌにポリ−Ｌ−アルギニン（ＰＬＲ；ｆｗ １５０００〜７００００、１０ｍｇ、２．８５Ｘ１０−７ｍｏｌ、シグマ、米国）とｍＰＥＧ５Ｋ−ＳＣ（ｆｗ ５０００、７．１４ｍｇ、１．４２Ｘ１０−６ｍｏｌ）を混合した後、室温で２時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機（centrifugal filter；ＭＷＣＯ ３０ｋ）を使用して精製した後、凍結乾燥してＰＥＧ−ポリ−Ｌ−アルギニン接合体を製造する。
【００５２】
１．キトサン−ポリアミン高分子２重接合体の製造方法
【００５３】
実施形態１
ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体製造
１−１．Low molecular weight キトサン（ＬＭＷ−キトサン；ｆｗ
５００００〜１５００００、Ｆｌｕｋａ、スイス）を０．１Ｍ ＨＣｌ溶液に２０ｍｇ／ｍｌ濃度に溶解させた後、５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ４．０緩衝溶液で２ｍｇ／ｍｌ濃度に希釈する。
【００５４】
１−２．実施形態１−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（ｆｗ ５００００〜１５００００、２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）にポリ−Ｌ−アルギニン（ＰＬＲ；ｆｗ １５０００〜７００００、０．７ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ、シグマ、米国）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カーボジイミド（ＥＤＡＣ
ｆｗ １９１．７、３８３．４ｕｇ、０．２Ｘ１０−５ｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ；ｆｗ ２１７．１４、４３４．２８ｕｇ、０．２Ｘ１０−５ｍｏｌ）を混合して室温で２４時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機（centrifugal filter；ＭＷＣＯ ３０ｋ、サトリアス、ドイツ）を使用して精製した後、凍結乾燥してＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
１５０００〜７００００）接合体を製造する。
【００５５】
１−３．実施形態１−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（ｆｗ ５００００〜１５００００、２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）にＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００、１．４ｍｇ、０．４Ｘ１０−７ｍｏｌ）、ＥＤＡＣ（ｆｗ １９１．７、７６６．８ｕｇ、０．４Ｘ１０−５ｍｏｌ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（ｆｗ
２１７．１４、８６９ｕｇ、０．４Ｘ１０−５ｍｏｌ）を混合して室温で２４時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機（centrifugal filter、ＭＷＣＯ  ３０ｋ）を使用して精製した後、凍結乾燥してＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
１５０００〜７００００）接合剤を製造する。
【００５６】
１−４．実施形態１−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（ｆｗ ５００００〜１５００００、２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）にＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００、３．５ｍｇ、１Ｘ１０−７ｍｏｌ）、ＥＤＡＣ（ｆｗ １９１．７、１．９１７ｍｇ、１Ｘ１０−５ｍｏｌ）、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（ｆｗ
２１７．１４、２．１７ｍｇ、１Ｘ１０−５ｍｏｌ）を混合して室温で２４時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機（centrifugal filter；ＭＷＣＯ ３０ｋ）を使用して精製した後、凍結乾燥してＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
１５０００〜７００００）接合剤を製造する。
【００５７】
実施形態２
ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体製造
２−１．ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりにＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ、シグマ、米国）を使用して実施形態１−２と同一な方法によりＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体を製造する。
【００５８】
２−２．ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりに、ＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、２．８ｍｇ、０．４Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−３と同一な方法によりＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造する。
【００５９】
２−３．ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりに、ＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、７ｍｇ、１Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−４と同一な方法によりＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造する。
【００６０】
実施形態３
ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体製造
３−１．ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりに、ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ＰＬＨ；ｆｗ
５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ、シグマ、米国）を使用して実施形態１−２と同一な方法によりＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体を製造する。
【００６１】
３−２．ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりに、ＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．２ｍｇ、０．４Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−３と同一な方法によりＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体を製造する。
【００６２】
３−３．ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりに、ＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．５ｍｇ、１Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−４と同一な方法によりＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体を製造する。
【００６３】
実施形態４
ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体製造
４−１．ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりに、ポリ−Ｌ−ライシン（ＰＬＫ；ｆｗ ９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ、シグマ、米国）を使用して、実施形態１−２と同一な方法によりＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体を製造する。
【００６４】
４−２．ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりに、ＰＬＫ（ｆｗ ９２００、０．３６８ｍｇ、０．４Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−３と同一な方法によりＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体を製造する。
【００６５】
４−３．ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりに、ＰＬＫ（ｆｗ ９２００、０．９２ｍｇ、１Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−４と同一な方法によりＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体を製造する。
【００６６】
実施形態５
ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体製造
５−１．Medium molecular weight−キトサン（ＭＭＷ−キトサン、アルドリチ、米国）を使用して、実施形態１−１と同一な方法によりキトサン溶液を用意する。
【００６７】
５−２．実施形態５−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）を使用して実施形態１−２と同一な方法によりＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体を製造する。
【００６８】
５−３．実施形態５−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）を使用して、実施形態１−３と同一な方法によりＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体を製造する。
【００６９】
５−４．実施形態５−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）を使用して、実施形態１−４と同一な方法によりＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体を製造する。
【００７０】
実施形態６
ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体製造
６−１．実施形態５−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−２と同一な方法によりＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造する。
【００７１】
６−２実施形態５−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、２．８ｍｇ、０．４Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−３と同一な方法によりＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造する。
【００７２】
６−３．実施形態５−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、７ｍｇ、１Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−４と同一な方法によりＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造する。
【００７３】
実施形態７
ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体製造
７−１．実施形態５−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−２と同一な方法によりＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体を製造する。
【００７４】
７−２．実施形態５−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．２ｍｇ、０．４Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−３と同一な方法によりＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体を製造する。
【００７５】
７−３．実施形態５−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．５ｍｇ、１Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−４と同一な方法によりＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体を製造する。
【００７６】
実施形態８
ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体製造
８−１．実施形態５−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＫ（ｆｗ ９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−２と同一な方法によりＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体を製造する。
【００７７】
８−２．実施形態５−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＫ（ｆｗ ９２００、０．３６８ｍｇ、０．４Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−３と同一な方法によりＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体を製造する。
【００７８】
８−３．実施形態５−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＫ（ｆｗ ９２００、０．９２ｍｇ、１Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−４と同一な方法によりＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体を製造する。
【００７９】
実施形態９
ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体製造
９−１．High molecular weight−キトサン（ＨＭＷ−キトサン；ｆｗ
〜６０００００、Ｆｌｕｋａ、スイス）を使用して、実施形態１−１と同一な方法によりキトサン溶液を用意する。
【００８０】
９−２．実施形態９−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（ｆｗ 〜６０００００、２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）を使用して、実施形態１−２と同一な方法によりＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体を製造する。
【００８１】
９−３．実施形態９−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（ｆｗ 〜６０００００、２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）を使用して、実施形態１−３と同一な方法によりＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体を製造する。
【００８２】
９−４．実施形態９−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（ｆｗ 〜６０００００、２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）を使用して、実施形態１−４と同一な方法によりＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体を製造する。
【００８３】
実施形態１０
ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体製造
１０−１．実施形態９−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（ｆｗ 〜６０００００、２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−２と同一な方法によりＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造する。
【００８４】
１０−２．実施形態９−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（ｆｗ 〜６０００００、２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、２．８ｍｇ、０．４Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−３と同一な方法によりＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造する。
【００８５】
１０−３．実施形態９−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（ｆｗ 〜６０００００、２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、７ｍｇ、１Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−４と同一な方法によりＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造する。
【００８６】
実施形態１１
ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体製造
１１−１．実施形態９−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（ｆｗ 〜６０００００、２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−２と同一な方法によりＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体を製造する。
【００８７】
１１−２．実施形態９−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（ｆｗ 〜６０００００、２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．２ｍｇ、０．４Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−３と同一な方法によりＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体を製造する。
【００８８】
１１−３．実施形態９−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（ｆｗ 〜６０００００、２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．５ｍｇ、１Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−４と同一な方法によりＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体を製造する。
【００８９】
実施形態１２
ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体製造
１２−１．実施形態９−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（ｆｗ 〜６０００００、２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＫ（ｆｗ ９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−２と同一な方法によりＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体を製造する。
【００９０】
１２−２．実施形態９−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（ｆｗ 〜６０００００、２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＫ（ｆｗ ９２００、０．３６８ｍｇ、０．４Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−３と同一な方法によりＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体を製造する。
【００９１】
１２−３．実施形態９−１で用意したキトサン溶液１ｍｌ（ｆｗ 〜６０００００、２ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＫ（ｆｗ ９２００、０．９２ｍｇ、１Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１−４と同一な方法によりＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体を製造する。
【００９２】
２．ポリエチレングリコール−キトサン−ポリアルギニン３重接合体の製造方法
実施形態１３
ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体製造
１３−１．ＬＭＷ−キトサン（ｆｗ ５００００〜１５００００）を０．１Ｍ ＨＣｌ溶液に２０ｍｇ／ｍｌ濃度に溶解させた後、ＰＢＳ
ｐＨ７．４緩衝溶液で２ｍｇ／ｍｌ濃度に希釈する。
【００９３】
１３−２．１０％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体
実施形態１３−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（ｆｗ ５００００〜１５００００、２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とｍＰＥＧ２ｋ−ＳＧ（ｍＰＥＧ２ｋ−サクシミジルグルタレート、ｆｗ ２０００，２４．８ｍｇ、１．２４Ｘ１０−５ｍｏｌ、１０ｍｏｌ％、ＩＤＢ、韓国）を混合した後、室温で２４時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機（centrifugal filter、ＭＷＣＯ ３０ｋ）を使用して精製した後、凍結乾燥してｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン（ｆｗ
５００００〜１５００００）接合体（ＤＰ １０ｍｏｌ％；ＤＰ：the degree of PEGylation）を製造する。製造されたｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン（ｆｗ
５００００〜１５００００）接合体２ｍｇを１ｍｌの５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ４．０緩衝溶液に溶かした後（ｆｗ １５０００〜７００００、ＰＬＲ ０．７ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）、ＥＤＡＣ（ｆｗ
１９１．７、３８３．４ｕｇ、０．２Ｘ１０−５ｍｏｌ）、ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（ｆｗ ２１７．１４、４３４．２８ｕｇ、０．２Ｘ１０−５ｍｏｌ）を混合して、室温で２４時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機（centrifugal filter；ＭＷＣＯ ３０ｋ）を使用して精製した後、凍結乾燥してｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
１５０００〜７００００）接合体（ＤＰ １０ｍｏｌ％）を製造する。
【００９４】
１３−３．１５％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体
実施形態１３−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（ｆｗ ５００００〜１５００００、２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とｍＰＥＧ２ｋ−ＳＧ（ｆｗ ２０００、３７．２６ｍｇ、１．８６３Ｘ１０−５ｍｏｌ、１５ｍｏｌ％）を混合した後、室温で２４時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機（centrifugal filter、ＭＷＣＯ ３０ｋ）を使用して精製した後、凍結乾燥してｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン（ｆｗ ５００００〜１５００００）接合体（ＤＰ
１５ｍｏｌ％）を製造する。製造されたｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン（ｆｗ ５００００〜１５００００）接合体２ｍｇを１ｍｌの５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ４．０緩衝溶液に溶かした後、ＰＬＲ（ｆｗ
１５０００〜７００００、０．７ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）、ＥＤＡＣ（ｆｗ １９１．７、３８３．４ｕｇ、０．２Ｘ１０−５ｍｏｌ）、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（ｆｗ
２１７．１４、４３４．２８ｕｇ、０．２Ｘ１０−５ｍｏｌ）を混合して室温で２４時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機（centrifugal filter；ＭＷＣＯ ３０ｋ）を使用して精製した後、凍結乾燥してｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
１５０００〜７００００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【００９５】
実施形態１４
ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００）接合体製造
１４−１．１０％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりに、ＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１３−２と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体（ＤＰ １０ｍｏｌ％）を製造する。
【００９６】
１４−２．１５％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりに、ＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１３−３と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ＰＬＲ（ｆｗ
＞７００００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【００９７】
実施形態１５
ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体製造
１５−１．１０％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりに、ＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１３−２と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体（ＤＰ １０ｍｏｌ％）を製造する。
【００９８】
１５−２．１５％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりに、ＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１３−３と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【００９９】
実施形態１６
ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体製造
１６−１．１０％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりに、ＰＬＫ（ｆｗ ９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１３−２と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体（ＤＰ １０ｍｏｌ％）を製造する。
【０１００】
１６−２．１５％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりに、ＰＬＫ（ｆｗ ９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１３−３と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１０１】
実施形態１７
ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）
１７−１．ＭＭＷ−キトサンを使用して、実施形態１３−１と同一な方法によりキトサン溶液を用意する。
【０１０２】
１７−２．１０％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体
１７−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）を使用して、実施形態１３−２と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体（ＤＰ
１０ｍｏｌ％）を製造する。
【０１０３】
１７−３．１５％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体
１７−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）を使用して、実施形態１３−３と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体（ＤＰ
１５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１０４】
実施形態１８
ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体製造
１８−１．１０％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体製造
実施形態１７−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１３−２と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ＰＬＲ（ｆｗ
＞７００００）接合体（ＤＰ １０ｍｏｌ％）を製造する。
【０１０５】
１８−２．１５％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体製造
実施形態１７−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１３−３と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１０６】
実施形態１９
ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体製造
１９−１．１０％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体
実施形態１７−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１３−２と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体（ＤＰ １０ｍｏｌ％）を製造する。
【０１０７】
１９−２．１５％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体
実施形態１７−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１３−３と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１０８】
実施形態２０
ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体製造
２０−１．１０％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体
実施形態１７−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＫ（ｆｗ ５０００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１３−２と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体（ＤＰ １０ｍｏｌ％）を製造する。
【０１０９】
２０−２．１５％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体
実施形態１７−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＫ（ｆｗ ５０００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１３−３と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１１０】
実施形態２１
ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体製造
２１−１．ＨＭＷ−キトサン（ｆｗ 〜６０００００）を使用して、実施形態１３−１と同一な方法によりキトサン溶液を用意する。
【０１１１】
２１−２．１０％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体
実施形態２１−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）を使用して、実施形態１３−２と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体（ＤＰ
１０ｍｏｌ％）を製造する。
【０１１２】
２１−３．１５％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体
実施形態２１−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）を使用して、実施形態１３−３と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体（ＤＰ
１５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１１３】
実施形態２２
ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体製造
２２−１．１０％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体
実施形態２１−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１３−２と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体（ＤＰ １０ｍｏｌ％）を製造する。
【０１１４】
２２−２．１５％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体
実施形態２１−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１３−３と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造する。
【０１１５】
実施形態２３
ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体製造
２３−１．１０％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体製造
実施形態２１−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１３−２と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体（ＤＰ １０ｍｏｌ％）を製造する。
【０１１６】
２３−２．１５％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体
実施形態２１−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１３−３と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１１７】
実施形態２４
ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサンポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体製造
２４−１．１０％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体
実施形態２１−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＫ（ｆｗ ５０００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１３−２と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体（ＤＰ １０ｍｏｌ％）を製造する。
【０１１８】
２４−２．１５％ ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体
実施形態２１−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＫ（ｆｗ ５０００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態１３−３と同一な方法によりｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１１９】
実施形態２５
ｍＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体製造
２５−１．５％ ｍＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体
実施形態１３−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（ｆｗ ５００００〜１５００００、２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とｍＰＥＧ５ｋ−ＳＣ（ｆｗ ５０００、３１．０５ｍｇ、６．２１Ｘ１０−６ｍｏｌ、５ｍｏｌ％、ＩＤＢ、韓国）を混合した後、室温で２４時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機（centrifugal filter；ＭＷＣＯ ３０ｋ）を使用して精製した後、凍結乾燥してｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン（ｆｗ
５００００〜１５００００）接合体（ＤＰ ５ｍｏｌ％）を製造する。製造されたｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン（ｆｗ ５００００〜１５００００）接合体２ｍｇを１ｍｌの５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ４．０緩衝溶液に溶かした後、ＰＬＲ（ｆｗ
１５０００〜７００００、０．７ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）、ＥＤＡＣ（ｆｗ １９１．７、３８６．４ｕｇ、０．２Ｘ１０−５ｍｏｌ）、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（ｆｗ
２１７．１４、４３４．２８ｕｇ、０．２Ｘ１０−５ｍｏｌ）を混合して、室温で２４時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機（centrifugal filter、ＭＷＣＯ ３０ｋ）を使用して精製した後、凍結乾燥してｍＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
１５０００〜７００００）接合体（ＤＰ ５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１２０】
２５−２．１５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体
実施形態１３−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（ｆｗ ５００００〜１５００００、２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とｍＰＥＧ５ｋ−ＳＣ（ｆｗ ５０００、４６．５８ｍｇ、９．３１６Ｘ１０−６ｍｏｌ、１５ｍｏｌ％）を混合した後、室温で２４時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機（centrifugal filter、ＭＷＣＯ  ３０ｋ）を使用して精製した後、凍結乾燥してｍＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＷ−キトサン（ｆｗ ５００００〜１５００００）接合体（ＤＰ
１５ｍｏｌ％）を製造する。製造されたｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン（ｆｗ ５００００〜１５００００）接合体２ｍｇを１ｍｌの５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ４．０緩衝溶液に溶かした後、ＰＬＲ（ｆｗ
１５０００〜７００００、０．７ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）、ＥＤＡＣ（ｆｗ １９１．７、３８６．４ｕｇ、０．２Ｘ１０−５ｍｏｌ）、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（ｆｗ
２１７．１４、４３４．２８ｕｇ．０．４Ｘ１０−５ｍｏｌ）を混合して、室温で２４時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機（centrifugal filter、ＭＷＣＯ ３０ｋ）を使用して精製した後、凍結乾燥してｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
１５０００〜７００００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１２１】
実施形態２６
ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００）接合体製造
２６−１．５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００）接合体
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりに、ＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態２５−１と同一な方法によりｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体（ＤＰ ５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１２２】
２６−２．１５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００）接合体
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりに、ＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態２５−２と同一な方法によりｍＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１２３】
実施形態２７
ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体製造
２７−１．５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりに、ＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態２５−１と同一な方法によりｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体（ＤＰ ５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１２４】
２７−２．１５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりに、ＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態２５−２と同一な方法によりｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１２５】
実施形態２８
ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体製造
２８−１．５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりに、ＰＬＫ（ｆｗ ９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態２５−１と同一な方法によりｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体（ＤＰ ５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１２６】
２８−２．１５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりに、ＰＬＫ（ｆｗ ９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態２５−２と同一な方法によりｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１２７】
実施形態２９
ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体製造
２９−１．５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体
実施形態１７−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）を使用して、実施形態２５−１と同一な方法によりｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体（ＤＰ
５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１２８】
２９−２．１５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体
実施形態１７−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）を使用して、実施形態２５−２と同一な方法によりｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体（ＤＰ
１５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１２９】
実施形態３０
ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体製造
３０−１．５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体
実施形態１７−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態２５−１と同一な方法によりｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体（ＤＰ ５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１３０】
３０−２．１５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体
実施形態１７−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態２５−２と同一な方法によりｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１３１】
実施形態３１
ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体製造
３１−１．５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体
実施形態１７−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態２５−１と同一な方法によりｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体（ＤＰ ５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１３２】
３１−２．１５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体
実施形態１７−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態２５−２と同一な方法によりｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１３３】
実施形態３３
ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体製造
３３−１．５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体
実施形態１７−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＫ（ｆｗ ９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態２５−１と同一な方法によりｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体（ＤＰ ５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１３４】
３３−２．１５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体
実施形態１７−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＫ（ｆｗ ９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態２５−２と同一な方法によりｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１３５】
実施形態３３
ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体製造
３３−１．５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体
実施形態２１−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）を使用して、実施形態２５−１と同一な方法によりｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体（ＤＰ
５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１３６】
３３−２．１５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体
実施形態２１−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）を使用して、実施形態２５−２と同一な方法によりｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体（ＤＰ
１５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１３７】
実施形態３４ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００）接合体製造
３４−１．５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００）接合体
実施形態２１−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態２５−１と同一な方法によりｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体（ＤＰ ５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１３８】
３４−２．１５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００）接合体
実施形態２１−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態２５−２と同一な方法によりｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ（ｆｗ
＞７００００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１３９】
実施形態３５
ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体製造
３５−１．５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体
実施形態２１−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態２５−１と同一な方法によりｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体（ＤＰ ５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１４０】
３５−２．１５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体
実施形態２１−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態２５−２と同一な方法によりｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１４１】
実施形態３６
ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体製造
３６−１．５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体
実施形態２１−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＫ（ｆｗ ９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態２５−１と同一な方法によりｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体（ＤＰ ５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１４２】
３６−２．１５％ ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体
実施形態２１−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＫ（ｆｗ ９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態２５−２と同一な方法によりｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【０１４３】
実施形態３７
５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体製造
３７−１．ｍＰＥＧ２Ｋ−ＣＯＣＨ（ＣＨ３）Ｃｌ製造
ｍＰＥＧ２Ｋ−ＯＨ（０．５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ；９１．６ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ；０．０７０ｍｌ、０．５ｍｍｏｌ）を１２ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶かした溶液を０℃、窒素ガス下で２−クロロプロピオニルクロライド（2-chloropropionyl chloride；０．１２ｍｌ、１．２５ｍｍｏｌ）を３ｍｌのＤＣＭに溶かした溶液を徐々に加えた後、反応温度を０℃から室温に上げて、２４時間の間撹拌する。ＴＬＣで反応過程確認後、反応混合物を減圧濃縮してジエチルエテル（diethyl ether）に注いで沈殿させて濾過精製し、エタノール（ethanol）に溶かして再結晶させ、濾過精製する。この化合物の構造確認は５００ＭＨｚ
１Ｈ−ＮＭＲで確認した。
【０１４４】
３７−２．Phthaloyl
LMW Chitosan（ｐｈｔｈ−ＬＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ）製造
ＬＭＷ−キトサン（ＬＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ  Ｆｌｕｋａ、５００ｍｇ、３．１ｍｍｏｌ）、フタリック無水物（Phthalic anhydride
１．３８ｇ、９．３２ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かした溶液を窒素ガス下で１３０℃位加熱して、７時間の間撹拌する。反応物を室温に冷却し、氷水に注いで沈殿物を水で洗ってあげながら濾過する。得られた固形物はソックスレー抽出（soxhlet extraction）を通じてエタノール（ethanol）で洗ってあげる。得られた固形物は５０℃で真空乾燥させてキトサン（chitosan）のアミン基を保護したｐｈｔｈ−ＬＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎを得た。
【０１４５】
３７−３．１５ｍｏｌ％  PEGylationされた５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＬＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ製造
実施形態３７−２で製造したｐｈｔｈ−ＬＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ（７０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を１ｍｌのピリジン（Pyridine）に溶かした溶液に実施形態３７−１で合成したｍＰＥＧ２Ｋ−ＣＯＣＨ（ＣＨ３）Ｃｌ（７２．２ｍｇ、３６．１μｍｏｌ）を２ｍｌのＤＭＦに溶液を加えて、窒素ガス下で１００℃位に加熱して２４時間の間撹拌する。この反応物を室温で冷却し、エタノールに注いで沈殿させて、エタノールとエーテルで洗ってあげながら濾過して、キトサン５`ＣのハイドロキシにＰＥＧを接合させた固形物５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−キトサン（ｐｈｔｈ）を真空乾燥させる。この化合物５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−キトサン（ｐｈｔｈ）５０ｍｇを１０ｍｌのヒドラジン水化物（hydrazine monohydrate（Ｈ２ＮＮＨ２・Ｈ２Ｏ））に溶かした溶液を窒素ガス下で１３０℃で還流させ、２４時間の間撹拌する。この反応物を室温で冷却させ、沈殿物を精製して１０ｍｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨ（ａｑ）に混合して室温で１６時間の間撹拌する。この混合物のｐＨを５０ｍＭ
ＨＣｌ（ａｑ）で１０程度に下げて透析させ、真空乾燥して化合物５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＬＭＷ−キトサンを得る。この化合物は５００ＭＨｚ
１Ｈ−ＮＭＲで確認した。
【０１４６】
３７−４．１０ｍｏｌ％ PEGylationされた５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＬＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ製造
ｍＰＥＧ２Ｋ−ＣＯＣＨ（ＣＨ３）Ｃｌ（４８．１ｍｇ、２４．０μｍｏｌ）を使用して、実施形態３７−３と同一な方法により製造した。
【０１４７】
３７−５．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）
実施形態３７−３で製造した５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＬＭＷ−キトサン２ｍｇを５０ｍＭ
ＭＥＳ ｐＨ４．０緩衝溶液１ｍｌに溶かした後、ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００、０．７ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）、ＥＤＡＣ（ｆｗ
１９１．７、３８３．４ｕｇ、０．２Ｘ１０−５ｍｏｌ）、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（ｆｗ ２１７．１４、４３４．２８ｕｇ、０．２Ｘ１０−５ｍｏｌ）を混合して室温で２４時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機（centrifugal filter、ＭＷＣＯ ３０ｋ）を使用して精製した後、凍結乾燥して５`−ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
１５０００〜７００００）接合体を製造する。
【０１４８】
３７−６．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）
実施形態３７−４で製造した５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＬＭＷ−キトサン２ｍｇを５０ｍＭ
ＭＥＳ ｐＨ４．０緩衝溶液１ｍｌに溶かした後、ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００、０．７ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）、ＥＤＡＣ（ｆｗ
１９１．７、３８３．４ｕｇ、０．２Ｘ１０−５ｍｏｌ）、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（ｆｗ ２１７．１４、４３４．２８ｕｇ、０．２Ｘ１０−５ｍｏｌ）を混合して室温で２４時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機（centrifugal filter、ＭＷＣＯ ３０ｋ）を使用して精製した後、凍結乾燥して５`−ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
１５０００〜７００００）接合体を製造する。
【０１４９】
実施形態３８
５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体製造
３８−１．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜１５００００）の代わりに、ＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態３７−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造する。
【０１５０】
３８−２．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜１５００００）の代わりに、ＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態３７−６と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造する。
【０１５１】
実施形態３９
５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体製造
３９−１．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜１５００００）の代わりに、ＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態３７−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体を製造する。
【０１５２】
３９−２．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜１５００００）の代わりに、ＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態３７−６と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体を製造する。
【０１５３】
実施形態４０
５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体製造
４０−１．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体製造
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜１５００００）の代わりに、ＰＬＫ（ｆｗ ９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態３７−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体を製造する。
【０１５４】
４０−２．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体製造
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜１５００００）の代わりに、ＰＬＫ（ｆｗ ９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態３７−６と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体を製造する。
【０１５５】
実施形態４１
５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）
４１−１．Ｐｈｔｈ−ＭＭＷ−キトサン製造
ＭＭＷ−キトサン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して実施形態３７−２のような方法により製造した。
【０１５６】
４１−２．１５ｍｏｌ％ＰＥＧ化された５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＭＭＷ−キトサン製造
ｐｈｔｈ−ＭＭＷ−キトサンを使用して実施形態３７−３と同一な方法により製造した。
【０１５７】
４１−３．１０ｍｏｌ％フェギル化された５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＭＭＷ−キトサン製造
ｐｈｔｈ−ＭＭＷ−キトサンを使用して実施形態３７−４と同一な方法により製造した。
【０１５８】
４１−４．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）
実施形態４１−２で製造した５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＭＭＷ−キトサン２ｍｇを使用して、実施形態３７−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
１５０００〜７００００）接合体を製造する。
【０１５９】
４１−５．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）
実施形態４１−３で製造した５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＭＭＷ−キトサン２ｍｇを使用して実施形態３７−６と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
１５０００〜７００００）接合体を製造する。
【０１６０】
実施形態４２
５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体製造
４２−１．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）
実施形態４１−２で製造した５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＭＭＷ−キトサン２ｍｇとＰＬＲ（ｆｗ
＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態３７−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造した。
【０１６１】
４２−２．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）
実施形態４１−３で製造した５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＭＭＷ−キトサン２ｍｇとＰＬＲ（ｆｗ
＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態３７−６と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造した。
【０１６２】
実施形態４３
５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体製造
４３−１．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）
実施形態４１−２で製造した５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＭＭＷ−キトサン２ｍｇとＰＬＨ（ｆｗ
５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態３７−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体を製造した。
【０１６３】
４３−２．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）
実施形態４１−３で製造した５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＭＭＷ−キトサン２ｍｇとＰＬＨ（ｆｗ
５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態３７−６と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体を製造した。
【０１６４】
実施形態４４
５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体製造
４４−１．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体
実施形態４１−２で製造した５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＭＭＷ−キトサン２ｍｇとＰＬＫ（ｆｗ
９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態３７−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体を製造した。
【０１６５】
４４−２．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体
実施形態４１−３で製造した５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＭＭＷ−キトサン２ｍｇとＰＬＫ（ｆｗ
９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態３７−６と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体を製造した。
【０１６６】
実施形態４５
５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体製造
４５−１．Ｐｈｔｈ−ＨＭＷ−キトサン製造
ＨＭＷ−キトサン（Ｆｌｕｋａ）を使用して実施形態３７−２のような方法により製造した。
【０１６７】
４５−２．１５ｍｏｌ％ PEGylationされた５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＨＭＷ−キトサン製造
ｐｈｔｈ−ＨＭＷ−キトサンを使用して実施形態３７−３と同一な方法により製造した。
【０１６８】
４５−３．１０ｍｏｌ％ PEGylationされた５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＨＭＷ−キトサン製造
ｐｈｔｈ−ＨＭＷ−キトサンを使用して実施形態３７−４と同一な方法により製造した。
【０１６９】
４５−４．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体
実施形態４５−２で製造した５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＨＭＷ−キトサン２ｍｇを使用して、実施形態３７−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
１５０００〜７００００）接合体を製造する。
【０１７０】
４５−５．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体
実施形態４５−３で製造した５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＨＭＷ−キトサン２ｍｇを使用して、実施形態３７−６と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
１５０００〜７００００）接合体を製造する。
【０１７１】
実施形態４６
５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体製造
４６−１．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）
実施形態４５−２で製造した５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＨＭＷ−キトサン２ｍｇとＰＬＲ（ｆｗ
＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態３７−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造した。
【０１７２】
４６−２．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）
実施形態４５−３で製造した５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＨＭＷ−キトサン２ｍｇとＰＬＲ（ｆｗ
＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態３７−６と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造した。
【０１７３】
実施形態４７
５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体製造
４７−１．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体
実施形態４５−２で製造した５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＨＭＷ−キトサン２ｍｇとＰＬＨ（ｆｗ
５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態３７−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体を製造した。
【０１７４】
４７−２．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体
実施形態４５−３で製造した５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＨＭＷ−キトサン２ｍｇとＰＬＨ（ｆｗ
５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態３７−６と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体を製造した。
【０１７５】
実施形態４８
５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体製造
４８−１．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体製造
実施形態４５−２で製造した５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＨＭＷ−キトサン２ｍｇとＰＬＫ（ｆｗ
９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態３７−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体を製造した。
【０１７６】
４８−２．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体製造
実施形態４５−３で製造した５`−ｍＰＥＧ２Ｋ−ＨＭＷ−キトサン２ｍｇとＰＬＫ（ｆｗ
９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態３７−６と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体を製造した。
【０１７７】
実施形態４９
５｀−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ１５００〜７００００）
４９−１．ｍＰＥＧ５Ｋ−ＣＯＣＨ（ＣＨ３）Ｃｌ製造
ｍＰＥＧ２Ｋ−ＯＨ（１．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ；７３．３ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ；０．０５６ｍｌ、０．４ｍｍｏｌ）と２−クロロプロピオニルクロライド（2-chloropropionyl chloride；０．０９７ｍｌ、１．０ｍｍｏｌ）を使用して、実施形態３７−１のような方法により製造した。
【０１７８】
４９−２．１５ｍｏｌ％ PEGylationされた５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ製造
実施形態４９−１で製造したｍＰＥＧ５Ｋ−ＣＯＣＨ（ＣＨ３）Ｃｌ（１８０ｍｇ、３６．１μｍｏｌ）と実施形態３７−２で製造したキトサンを使用して、実施形態３７−３と同一な方法により製造した。
【０１７９】
４９−３．１０ｍｏｌ％PEGylationされた５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ製造
実施形態４９−１で製造したｍＰＥＧ５Ｋ−ＣＯＣＨ（ＣＨ３）Ｃｌ（１２０ｍｇ、２４．０μｍｏｌ）と実施形態３７−２で製造したキトサンを使用して実施形態３７−４のような方法により製造した。
【０１８０】
４９−４．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）
実施形態４９−２で製造した５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＷ−キトサン２ｍｇを５０ｍＭ
ＭＥＳ ｐＨ４．０緩衝溶液１ｍｌに溶かした後、ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００、０．７ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）、ＥＤＡＣ（ｆｗ
１９１．７、３８３．４ｕｇ、０．２Ｘ１０−５ｍｏｌ）、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（ｆｗ ２１７．１４、４３４．２８ｕｇ、０．２Ｘ１０−５ｍｏｌ）を混合して、室温で２４時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機（centrifugal filter；ＭＷＣＯ ３０ｋ）を使用して精製した後、凍結乾燥して５｀−ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
１５０００〜７００００）接合体を製造する。
【０１８１】
４９−５．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）
実施形態４９−３で製造した５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＷ−キトサン２ｍｇを５０ｍＭ
ＭＥＳ ｐＨ４．０緩衝溶液１ｍｌに溶かした後、ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００、０．７ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）、ＥＤＡＣ（ｆｗ
１９１．７、３８３．４ｕｇ、０．２Ｘ１０−５ｍｏｌ）、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（ｆｗ ２１７．１４、４３４．２８ｕｇ、０．２Ｘ１０−５ｍｏｌ）を混合して、室温で２４時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機（centrifugal filter、ＭＷＣＯ ３０ｋ）を使用して精製した後、凍結乾燥して５｀ −ｍＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
１５０００〜７００００）接合体を製造する。
【０１８２】
実施形態５０
５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体製造
５０−１．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜１５００００）の代わりに、ＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態４９−４と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造する。
【０１８３】
５０−２．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜１５００００）の代わりに、ＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態４９−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造する。
【０１８４】
実施形態５１
５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体製造
５１−１．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜１５００００）の代わりに、ＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態４９−４と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体を製造する。
【０１８５】
５１−２．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜１５００００）の代わりに、ＰＬＨ（ｆｗ ５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態４９−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体を製造する。
【０１８６】
実施形態５２
５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体製造
５２−１．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜１５００００）の代わりに、ＰＬＫ（ｆｗ ９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態４９−４と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体を製造する。
【０１８７】
５２−２．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体製造
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜１５００００）の代わりに、ＰＬＫ（ｆｗ ９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態４９−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体を製造する。
【０１８８】
実施形態５３
５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５００〜７００００）接合体製造
５３−１．１５ｍｏｌ％ PEGylationされた５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＭＭＷ−キトサン製造
実施形態４９−１で製造したｍＰＥＧ５Ｋ−ＣＯＣＨ（ＣＨ３）Ｃｌと実施形態４１−１で製造したキトサンを使用して、実施形態４９−２のような方法により製造した。
【０１８９】
５３−２．１０ｍｏｌ％ PEGylationされた５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＭＭＷ−キトサン製造
実施形態４９−１で製造したｍＰＥＧ５Ｋ−ＣＯＣＨ（ＣＨ３）Ｃｌと実施形態４１−１で製造したキトサンを使用して、実施形態４９−３と同一な方法により製造した。
【０１９０】
５３−３．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）
実施形態５３−１で製造した５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＭＭＷ−キトサン２ｍｇを使用して、実施形態４９−４と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
１５０００〜７００００）接合体を製造する。
【０１９１】
５３−４．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）
実施形態５３−２で製造した５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＭＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ２ｍｇを使用して、実施形態４９−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
１５０００〜７００００）接合体を製造する。
【０１９２】
実施形態５４
５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）
５４−１．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）
実施形態５３−１で製造した５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＭＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ２ｍｇとＰＬＲ（ｆｗ
＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態４９−４と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造した。
【０１９３】
５４−２．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）
実施形態５３−２で製造した５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＭＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ２ｍｇとＰＬＲ（ｆｗ
＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態４９−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造した。
【０１９４】
実施形態５５
５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体製造
５５−１．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）
実施形態５３−１で製造した５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＭＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ２ｍｇとＰＬＨ（ｆｗ
５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態４９−４と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体を製造した。
【０１９５】
５５−２．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）
実施形態５３−２で製造した５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＭＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ２ｍｇとＰＬＨ（ｆｗ
５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態４９−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体を製造した。
【０１９６】
実施形態５６
５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体製造
５６−１．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体
実施形態５３−１で製造した５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＭＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ２ｍｇとＰＬＫ（ｆｗ
９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態４９−４と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体を製造した。
【０１９７】
５６−２．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体
実施形態５３−２で製造した５`−ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ２ｍｇとＰＬＫ（ｆｗ
９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して実施形態４９−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体を製造した。
【０１９８】
実施形態５７
５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５００〜７００００）
５７−１．１５ｍｏｌ％ PEGylationされた５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＨＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ製造
実施形態４９−１で製造したｍＰＥＧ５Ｋ−ＣＯＣＨ（ＣＨ３）Ｃｌと実施形態４５−１で製造したキトサンを使用して、実施形態４９−２のような方法により製造した。
【０１９９】
５７−２．１０ｍｏｌ％PEGylationされた５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＨＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ製造
実施形態４９−１で製造したｍＰＥＧ５Ｋ−ＣＯＣＨ（ＣＨ３）Ｃｌと実施形態４５−１で製造したキトサンを使用して実施形態４９−３と同一な方法により製造した。
【０２００】
５７−３．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体
実施形態５７−１で製造した５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＨＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ２ｍｇを使用して実施形態４９−４と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
１５０００〜７００００）接合体を製造する。
【０２０１】
５７−４．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体
実施形態５７−２で製造した５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＨＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ２ｍｇを使用して、実施形態４９−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
１５０００〜７００００）接合体を製造する。
【０２０２】
実施形態５８
５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）
５８−１．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）
実施形態５７−１で製造した５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＨＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ２ｍｇとＰＬＲ（ｆｗ
＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態４９−４と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造した。
【０２０３】
５８−２．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）
実施形態５７−２で製造した５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＨＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ２ｍｇとＰＬＲ（ｆｗ
＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態４９−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造した。
【０２０４】
実施形態５９
５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体製造
５９−１．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体
実施形態５７−１で製造した５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＨＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ２ｍｇとＰＬＨ（ｆｗ
５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態４９−４と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体を製造した。
【０２０５】
５９−２．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ ５０００）接合体
実施形態５７−２で製造した５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＨＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ２ｍｇとＰＬＨ（ｆｗ
５０００、０．１ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態４９−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ｆｗ
５０００）接合体を製造した。
【０２０６】
実施形態６０
５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体製造
６０−１．１５％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体
実施形態５７−１で製造した５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＨＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ２ｍｇとＰＬＫ（ｆｗ
９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態４９−４と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体を製造した。
【０２０７】
６０−２．１０％ ５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ ９２００）接合体
実施形態５７−２で製造した５`−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＨＭＷ−ｃｈｉｔｏｓａｎ２ｍｇとＰＬＫ（ｆｗ
９２００、０．１８４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態４９−５と同一な方法により５｀−ｍＰＥＧ５ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−ライシン（ｆｗ
９２００）接合体を製造した。
【０２０８】
実施形態６１
Ｍａｎ−ＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００−７００００）接合体製造
６１−１．Ｍａｎ−ＰＥＧ２Ｋ−ＮＨＳ製造
ＰＥＧ２Ｋ−ｄｉａｍｉｎｅ（０．５ｇ、２５μｍｏｌ）を２５ｍｌのＤＣＭに溶かし、０℃でＦｍｏｃ−ＯＳｕ（１２．６ｍｇ、３７．５μｍｏｌ）を添加し、ＴＬＣで確認してＰＥＧ−ｄｉａｍｉｎｅが消耗されるまで撹拌する。減圧蒸留装置によりＤＣＭを除去する。少量のＤＣＭを使用して溶かし、エーテル（ether）に沈殿させて精製して（Ｆｍｏｃ）２−ＰＥＧを含むＦｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨ２を得る。このＰＥＧ−化合物Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨ２はＴＬＣにより反応モニタリングした。製造したＦｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨ２（０．４６ｇ、２３μｍｏｌ）を２３ｍｌのＤＣＭに溶かし、スクシニック無水物（succinic anhydride；２３．０ｍｇ、２３０μｍｏｌ）とピリジン（２２．３μｌ、２７６μｍｏｌ）を入れて、窒素ガス下で４０−６０℃位で還流させ、一晩中撹拌する。室温に低めて、ＤＣＭで抽出し、飽和されたＮＨ４Ｃｌ（ａｑ）で洗ってあげる。ＤＣＭ層は、ＭｇＳＯ４で水分を除去し、減圧蒸留装置でＤＣＭを除去する。少量のＤＣＭに溶かして過量のエーテル（ether）に注いで沈殿させて精製して反応に関与せず、残った（Ｆｍｏｃ）２−ＰＥＧを含むＦｍｏｃ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨを得る。化合物Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨはＴＬＣで反応モニタリングし、Ｄ２Ｏに溶かして５００ＭＨｚ１Ｈ
ＮＭＲで確認した。この化合物Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（０．４５ｇ、２２．５μｍｏｌ）を５０％ピペリジン／ＤＭＦに溶かし、１．５時間位撹拌してFmoc deprotection反応をする。過量のエーテルに注いで沈殿させ、エーテル（ether）で十分に洗いながら濾過し精製して、ＰＥＧ−ｄｉａｍｉｎｅを含むＨ２Ｎ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨを得る。得られた化合物Ｈ２Ｎ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（０．４ｇ、２０μｍｏｌ）とマンノーズ（mannose；１０．８ｍｇ、６０μｍｏｌ）、イミダゾール（imidazole；８．２ｍｇ、１２０μｍｏｌ）を２ｍｌのＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）に溶かし、６０℃位に加熱して２０ｈｒ位撹拌する。室温に低めて、ＤＣＭで抽出し、飽和されたＮＨ４Ｃｌ（ａｑ）で洗ってあげる。ＤＣＭ層はＭｇＳＯ４で水分を除去し、減圧蒸留装置でＤＣＭを除去する。シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製し、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨでＰＥＧを回収した後、減圧蒸留装置で溶媒を除去する。少量のＤＣＭに溶かして過量のエーテルに注いで沈殿させて精製して、（Ｍａｎ）２−ＰＥＧを含むＭａｎ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨを得る。マンノーズの確認はＭａｎ−ＰＥＧ−ＮＨＳ化合物でＮＭＲで確認した。
【０２０９】
化合物Ｍａｎ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（１２５ｍｇ、６．２５μｍｏｌ）とＮＨＳ（７．２ｍｇ、６２．５μｍｏｌ）を１．５ｍｌのＤＣＭに溶かした溶液に窒素ガス下に０℃以下でＤＣＣ（１２．９ｍｇ、６２．５μｍｏｌ）を０．３ｍｌのＤＣＭに溶かした溶液をｄｒｏｐで１時間位に亘って加え、低温維持して１０−１２時間の間撹拌する。濾過して生成された固形物（urea類）を除去し、エーテル（ether）で沈殿精製する。ＥＡ（エチルアセテート）で再結晶させて精製して、Ｍａｎ−ＰＥＧ−ＮＨＳを得る。化合物Ｍａｎ−ＰＥＧ−ＮＨＳのマンノーズ確認は、Ｄ２Ｏに溶かし，ＮＨＳはＣＤＣｌ３に溶かして５００ＭＨｚ１Ｈ
ＮＭＲで確認した。
【０２１０】
６１−２．１５％ Ｍａｎ−ＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００−７００００）接合体
実施形態１３−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（ｆｗ ５００００〜１５００００、２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）と実施形態６１−１で製造したＭａｎ−ＰＥＧ２Ｋ−ＮＨＳ（ｆｗ ２０００，３７．２６ｍｇ、１．８６３Ｘ１０−５ｍｏｌ、１５ｍｏｌ％）を混合した後、室温で２４時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機（centrifugal filter；ＭＷＣＯ ３０ｋ）を使用して精製した後、凍結乾燥してＭａｎ−ＰＥＧ２Ｋ−ＬＭＷ−キトサン（ｆｗ ５００００〜１５００００）接合体（ＤＰ
１５ｍｏｌ％）を製造する。製造されたＭａｎ−ＰＥＧ２Ｋ−ＬＭＷ−キトサン（ｆｗ ５００００〜１５００００）接合体２ｍｇを１ｍｌの５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ４．０緩衝溶液に溶かした後、ＰＬＲ（ｆｗ
１５０００〜７００００、０．７ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）、ＥＤＡＣ（ｆｗ １９１．７、３８３．４ｕｇ、０．２Ｘ１０−５ｍｏｌ）、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（ｆｗ
２１７．１４、４３４．２８ｕｇ、０．２Ｘ１０−５ｍｏｌ）を混合して、室温で２４時間の間撹拌反応する。この混合物を遠心分離用濾過機（centrifugal filter、ＭＷＣＯ  ３０ｋ）を使用して精製した後、凍結乾燥してＭａｎ−ＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
１５０００−７００００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【０２１１】
実施形態６２
１５％ Ｍａｎ−ＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体製造
ＰＬＲ（ｆｗ １５０００〜７００００）の代わりに、ＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して実施形態６１−２と同一な方法によりＭａｎ−ＰＥＧ２ｋ−ＬＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【０２１２】
実施形態６３
１５％ Ｍａｎ−ＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）
１７−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）を使用して、実施形態６１−２と同一な方法によりＭａｎ−ＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体を製造する。
【０２１３】
実施形態６４
１５％ Ｍａｎ−ＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体製造
実施形態１７−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態６１−２と同一な方法によりＭａｎ−ＰＥＧ２ｋ−ＭＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体（ＤＰ １５ｍｏｌ％）を製造する。
【０２１４】
実施形態６５
１５％ Ｍａｎ−ＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体製造
実施形態２１−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）を使用して、実施形態６１−２と同一な方法によりＭａｎ−ＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ １５０００〜７００００）接合体（ＤＰ
１５ｍｏｌ％）を製造する。
【０２１５】
実施形態６６
１５％ Ｍａｎ−ＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ ＞７００００）接合体製造
実施形態２１−１で用意したキトサン溶液１０ｍｌ（２０ｍｇ、１．２４Ｘ１０−４ｍｏｌ
ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ｕｎｉｔｓ）とＰＬＲ（ｆｗ ＞７００００、１．４ｍｇ、０．２Ｘ１０−７ｍｏｌ）を使用して、実施形態６１−２と同一な方法によりＭａｎ−ＰＥＧ２ｋ−ＨＭＷ−キトサン−ポリ−Ｌ−アルギニン（ｆｗ
＞７００００）接合体を製造する。
【０２１６】
実施形態６７
キトサン素材接合体と小さな干渉リボ核酸の複合体（complex）製造
６７−１．陽イオン性高分子伝達体と小さな干渉リボ核酸の複合体製造
ネズミ（Mus musculus）のサバイビン（survivin、mouse由来、NCBI accession
number NM_001168）遺伝子のたんぱく質発現を阻害するサバイビン特異的な小さな干渉リボ核酸序列は、ｓｉＲＮＡ鎖デザインプログラムを用いて決定したし、三千里製薬（ソウル、韓国）から注文製作した。陽イオン性高分子伝達体は、キトサン（Sigma、米国）、ポリアルギニン（Sigma、米国）、比較例１、２及び上記実施形態に記載されたキトサン−ポリアルギニン、及びキトサン−ポリアルギニン−ポリエチレングリコールを全て水溶液状態で製造して使用した。
【０２１７】
６７−２．小さな干渉リボ核酸と陽イオン性高分子の複合体形成確認評価
小さな干渉リボ核酸と陽イオン性高分子の複合体を製造するために、キトサン、ポリアルギニン、比較例１、比較例２、実施形態６−２で製造されたキトサン−ポリアルギニン、または実施形態４５−５で製造されたキトサン−ポリアルギニン−ポリエチレングリコール溶液とサバイビンに対する小さな干渉リボ核酸を多様な割合で加え、混合した後、３７℃で３０分間放置させた後、アガロースゼルに電気泳動して複合体の形成を確認した。
【０２１８】
本実験遂行結果、図６に表れるようにキトサン−ポリアルギニン（実施形態６−２）の量が増加するほど、複合体を形成したサバイビン小さな干渉リボ核酸の量が増加して、複合体を形成しない状態で存在して、電気泳動時、移動性を表す小さな干渉リボ核酸の量が減少する結果を確認することができた。また、キトサン−ポリアルギニン−ポリエチレングリコール（実施形態４５−４）の量が増加するほど、複合体を形成したサバイビン小さな干渉リボ核酸の量が増加して、複合体を形成しなくて電気泳動上で移動性を表す小さな干渉リボ核酸の量が減少する結果を確認することができた。
【０２１９】
実施形態６８
蛍光標識リボ核酸物質を用いたキトサン高分子接合体の細胞内伝達効率評価
蛍光印字により標識されたリボ核酸（Flu-dsRNA、Invitrogen、米国）とキトサン、キトサンとポリエチレングリコール接合体（比較例１）、ポリアルギニン、ポリアルギニンとポリエチレングリコールの２重接合体（比較例２）、キトサンとポリアルギニンの２重接合体（実施形態２−３）、キトサンとポリアルギニン及びポリエチレングリコールの３重接合体（実施形態１４−１）を各々混合した後、３７℃で３０分間放置させた後、肝がん細胞株であるＨｅｐａ １−６細胞株（American Tissue Culture Collection、米国）（図７参照）と上皮細胞株であるＶＫ２細胞株（American Tissue Culture
Collection、米国）（図８参照）に各々処理し、２４時間が経過した後、 蛍光顕微鏡下で細胞内に伝えられた蛍光標識リボ核酸の量を比較した。図７に表れるように、キトサン自体を伝達体として使用した場合やキトサンとポリエチレングリコールのみの２重接合体（比較例１）の場合、細胞内伝達効率が比較群のうち、最も低かったし、ポリアルギニンのみを処理した場合、キトサンのみを使用した場合よりは細胞内伝達効率が高かったが、キトサンとポリアルギニンが接合体を形成した場合（実施形態２−３）、細胞内伝達効率が増加した。また、キトサンとポリアルギニン及びポリエチレングリコールの３重接合体（実施形態１４−１）は、ポリアルギニンとポリエチレングリコールのみの２重接合体（比較例２）に比較する時は、細胞内伝達効率で高い効率を表した。図７と他の細胞株を対象にして伝達効率を評価した図８の場合にも、実施形態２−２及び実施形態１７−２は、キトサン、ポリアルギニン、及び比較例１、２に比べて高い伝達効率を表した。
【０２２０】
実施形態６９
キトサン高分子接合体の小さな干渉リボ核酸細胞内伝達効率評価：標的たんぱく質の発現低下度による細胞内伝達度評価
実施形態６８において、蛍光標識リボ核酸を使用して、いろいろな比較群のうち、キトサン−ポリアルギニン、キトサン−ポリアルギニン−ポリエチレングリコールの接合体が細胞内伝達程度が高いものと評価されたが、これに追加的に、細胞内に伝えられた小さな干渉リボ核酸物質が細胞内で所期の生物学的機能を達成するかを特定の小さな干渉リボ核酸が細胞内で標的たんぱく質の発現を低下させるか否かにより評価した。細胞内伝達対象には、サバイビンたんぱく質に特異的な小さな干渉リボ核酸を使用したし、細胞株としては肝がん細胞株であるＨｅｐａ １−６細胞を使用した。伝達体としては、キトサン、キトサンとポリエチレングリコールとの接合体（比較例１）、ポリアルギニン、ポリアルギニンとポリエチレングリコールとの接合体（比較例２）、キトサンとポリアルギニンとの２重接合体（実施形態５−３）、キトサンとポリアルギニン及びポリエチレングリコールの３重接合体（実施形態４２−２）を各々使用した。
【０２２１】
肝がん細胞株であるＨｅｐａ １−６細胞は、ＤＭＥＭ（Dulbecco's
modified eagles medium）に牛血清が１０％添加された培地を製造して培養した。Ｈｅｐａ
１−６細胞株に陽イオン性高分子キトサン誘導体とｓｉＲＮＡの複合体を製造して加え、２４時間の間培養した後に水洗し、トリゾール（TRIzolTM、インビトロジェン社（Invitrogen）、米国）を使用して、細胞内で転写遺伝子（ｍＲＮＡ）を分離精製した後、サバイビンに対する転写遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現減少率をサバイビンに対する特定プライマー及び比較遺伝子であるglyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（ＧＡＰＤＨ）に対するプライマーを用いて逆転写連鎖酵素重合反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を通じ定量的に確認した。
【０２２２】
逆転写連鎖酵素重合反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、まず１ｕｇの分離精製されたＲＮＡをバイオニア社で購入したＲＴ−ＰｒｅＭｉｘに添加して相補的ＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）を製造したし、上記のように製造されたｃＤＮＡのうちの一部（１００ｎｇ）を１０ｐｍｏｌｅのセンス（sense）及びアンチセンス（antisense）プライマーを各々１ｕｌずつ、Ｔａｑポリマラーゼ（Taq Polymerase）（５Ｕ／ｕｌ、バイオニア社、韓国）０．１ｕｌ、ｄＮＴＰｓ、１０Ｘ反応緩衝液を混合して連鎖重合反応を遂行した。逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の産物は１％アガローズゼル上で電気泳動した後、連鎖反応産物のバンド密度（gel
density）をイメージ分析器を使用して定量化して比較評価した。
【０２２３】
図９に示すように、キトサンやキトサンとポリエチレングリコールとの接合体（比較例１）、及びポリアルギニンとポリエチレングリコールとの接合体（比較例２）の場合、サバイビン転写遺伝子の発現を抑制する機能が殆どなかったし、ポリアルギニンのみを処理した場合、キトサンのみを使用した場合よりは転写遺伝子発現抑制機能がある程度増強されたが、キトサンとポリアルギニンとの接合体（実施形態５−３）を形成した場合やキトサンとポリアルギニン及びポリエチレングリコールの３重接合体（実施形態４２−２）の場合、他の対照群より転写遺伝子発現抑制機能が格段に増加された。
【０２２４】
実施形態７０
腫瘍細胞株における細胞毒性評価
小さな干渉リボ核酸と遺伝子を含む陽イオン性高分子キトサン誘導体からなる複合体の細胞毒性に関する評価をするために、下記のような過程で実験を遂行した。Ｈｅｐａ １−６肝がん細胞株とＶＫ２上皮細胞株を対象にして陽イオン性高分子キトサン誘導体とｓｉＲＮＡ遺伝子の複合体を製造し、細胞毒性を評価した。
【０２２５】
毒性評価方法には、3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl
tetrazolium bromide（ＭＴＴ）試薬を用いた方法を使用した。細胞を１ウェル（well）当たり１×１０５細胞になるように分株（seeding）し培養した後、陽イオン性高分子キトサン誘導体（各々１５ｕｇ）とｓｉＲＮＡ（１００ｐｍｏｌｅ）遺伝子の複合体、またはｓｉＲＮＡ遺伝子自体の形態で各々添加した。複合体を処理し、２４時間経過後、各々のＭＴＴ溶液を培地の１０％になるように加え、４時間更に培養した後、上層液を除去し、０．０４Ｎ塩酸イソプロパノール溶液を添加した後、ＥＬＩＳＡリーダー（ELISA reader、Tecan社、米国）を用いて５９０ｎｍでその吸光度を測定した。対照群には、小さな干渉リボ核酸を処理していない細胞が使われたし、細胞の生存率（cell viability）は下記のような数式で計算された。
【０２２６】
（数１）
細胞の生存率（％）＝（実験群のＯＤ／対照群のＯＤ）×１００
【０２２７】
図１０に示すように、キトサン−ポリアルギニン（実施形態１−４）やキトサン−ポリエチレングリコール（実施形態４１−５）処理群の場合、増強された細胞内伝達効率にもかかわらず、他の陽イオン性伝達体に比べて細胞毒性が大きくないことが分かる。また、図１１でもキトサン−ポリアルギニン（実施形態１−２、１−３）やキトサン−ポリエチレングリコール（実施形態１４−１、１８−１）処理群の場合、既存の商業的に商用化されて使われるリポフェクタミン処理群に比べて細胞毒性が減少したことが分かる。
【０２２８】
実施形態７１
動物モデルにおけるキトサン高分子接合体による小さな干渉リボ核酸の血中滞留性評価
実験用マウス（ICR mice）を対象にして２重鎖の５｀方向ニュクレオタイドの５番目の炭素に連結された燐酸化グループに各々バイオチン（biotin）とジナイトロフェノール
（dinitrophenol；ＤＮＰ）を結合させたｓｉＲＮＡと輸送体としてキトサン−ポリエチレングリコール（比較例１）、ポリアルギニン−ポリエチレングリコール（比較例２）、キトサン−ポリアルギニンの接合体（実施形態２−１）を各々使用して複合体（complex）を形成させた後、尾静脈に静脈注射し、一定時間の後に血液を取って免疫活性測定法によりｓｉＲＮＡを定量した。詳細な実験過程としては、比較例１、比較例２、実施形態２−１の高分子と小さな干渉リボ核酸を２０分間常温で結合させ、対照群に何にも処理せず、血液のみを取ったグループと、キトサン誘導体を使用せず、小さな干渉リボ核酸のみをインスリン注射器を用いて注射したグループを利用した。３０秒、２分、５分にネズミの尾から血液を取ってヘパリンを添加した後、ストレプタビジン（streptavidin）がコーティングされたプレートに入れた後、３７℃で１時間反応させた。プレートを３回水洗した後、１次抗体（monoclonal
mouse anti-DNP IgE；Sigma、Saint Louis、MO、USA）を５０００対１に希釈して１００μｌ処理し、３７℃で１時間放置した。ジエチルピロカーボネート及び０．１％ツイン２０を含有した燐酸緩衝液で３回水洗した後、２次抗体（goat anti-mouse IgE conjugate HRP；Serotec、Oxford、UK）を１０００対１に希釈して１００μｌ入れて、３７℃で１時間放置した後、ジエチルピロカーボネート及び０．１％ツイン２０を含有した燐酸緩衝液で水洗し、horseradish peroxidase酵素基質である３、３'、５、５｀‐tetramethyl benzidine（Turbo TMBTM、Pierce、Rockford、USA）溶液１００μｌを入れて、１５分間発色させた後、同一量の１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４１００μｌを入れて反応を中止させた。図１２に示すように、キトサンとポリアルギニンとの接合体（実施形態２−１）と複合体形態で生体内に注入された小さな干渉リボ核酸は、複合体を形成しないで投与された小さな干渉リボ核酸やキトサンとポリエチレングリコールとの接合体（比較例１）、ポリアルギニンとポリエチレングリコールとの接合体（比較例２）を輸送体として使用した場合に比べて血中濃度が高い状態に持続されることが観察された。
【０２２９】
実施形態７２
陽イオン性高分子ポリエチレングリコール−キトサン−ポリアルギニンと目的ｓｉＲＮＡの複合体製造を用いたネズミの肝繊維化（Liver fibrosis）治療実験
ネズミ（Mus  musculus）のＴＧＦ−β１（mouse由来、NCBI accession
number NM_011577）遺伝子に対する小さな干渉リボ核酸序列は、文献を通じて知られたｓｉＲＮＡ鎖を用いて決定したし、三千里製薬から注文製作した。ｓｉＲＮＡ鎖の序列情報は次の通りである。５｀末端−AACUGUAUUCCGUCUCCUUGG−３'末端と、５｀末端−AACCAAGGAGACGGAAUACAG−３'末端から構成された。実施形態３７−６の方法により製造されたポリエチレングリコール−キトサン−ポリアルギニンは、１０ｍｇ／ｍｌの溶液になるように製造して使用したし、上記ｓｉＲＮＡは、１ｍｇ／ｍｌの溶液になるように製造して使用した。
【０２３０】
ネズミの肝繊維化を誘導するために、ＣＣｌ４（Carbon Tetrachloride、ネズミ個体重量当たり１．５μｌ）ととうもろこし油（corn oil、ネズミ個体重量当たり４．５μｌ）を１対３の割合で混合して腹腔に注射したし、肝繊維化の判別はコラゲン染色を通じて確認した。６週齢の雌ネズミ（平均個体重量、２０グラム）を用いて１４日間実験を進行したし、この期間の間肝繊維化誘導薬物を４回腹腔投与したし、上記ポリエチレングリコール−キトサン−ポリアルギニンと目的ｓｉＲＮＡの複合体を製造（上記ポリエチレングリコール−キトサン−ポリアルギニン溶液５μｌ（即ち、ポリエチレングリコール−キトサン−ポリアルギニン固形分５０μｇ）と上記ｓｉＲＮＡ １０μｌ（即ち、ｓｉＲＮＡ固形分１０μｇ）を３７℃
ＰＢＳ溶液で２０分間複合体を形成する）して８回血管注射した。一方、対照群として本発明に従うポリエチレングリコール−キトサン−ポリアルギニン無しでｓｉＲＮＡ単独注射した場合も実験した。
【０２３１】
１４日間の実験後、ネズミの肝を摘出して固定した後、パラピンで肝組織試料を製造し、薄片器（microtome）を用いてネズミの肝組織を５〜７μｍ厚みの切片に製作した後、コラーゲン染色を実施して肝繊維化程度を評価した。図１３は、上記実験後の結果、肝組織を撮影した写真であって、一番上の写真は陰性対照群であって、何らの処理もしていない肝組織写真であり、中間写真はｓｉＲＮＡ単独注射した場合の写真であり、一番下の写真は本発明に従うポリエチレングリコール−キトサン−ポリアルギニンとｓｉＲＮＡの複合体を注射した場合の肝組織の写真である。上記の図面から分かるように、治療効果を持つことと期待される目的ｓｉＲＮＡを単独処理する場合、その治療効能が微小な反面、本発明に従うキトサン基材陽イオン性高分子と複合体を形成して投与される場合、優れる治療効果が達成できることを確認した。
【図１】
0005600846.tif 000002
【図２】
0005600846.tif 000003
【図３】
0005600846.tif 000004
【図４】
0005600846.tif 000005
【図５】
0005600846.tif 000006
【図６】
0005600846.tif 000007
【図７】
0005600846.tif 000008
【図８】
0005600846.tif 000009
【図９】
0005600846.tif 000010
【図１０】
0005600846.tif 000011
【図１１】
0005600846.tif 000012
【図１２】
0005600846.tif 000013
【図１３】
0005600846.tif 000014