(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）１３５ｋＤａの分子量を持ちそしてｂ）ＩｇＧ分子の下部ヒンジ領域において重鎖の１つを単一プロテアーゼ開裂することにより形成されることによって特徴付けられる、単一開裂のＩｇＧプロテアーゼ開裂産物、に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を含む、単離された抗体組成物であって、ｃ）ここで前記抗体が無傷ＩｇＧと反応しない、上記抗体組成物。
【請求項２】
ポリクローナル抗血清を含む、請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項３】
少なくとも１つのモノクローナル抗体を含む、請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項４】
ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−１２、ＨＮＥ、プラスミン、カテプシンＧ、ペプシン、ＩｄｅＳ、又は黄色ブドウ球菌（Staph. aureus.）からのグルタミルエンドペプチダーゼＩよりなる群から選択されたプロテアーゼにより生成されるヒトＩｇＧ１のプロテアーゼ特異性開裂部位に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項５】
開裂産物類似体ペプチドを含むポリペプチドを用いた動物への免疫付与によって生成された抗体、又は抗体ライブラリーのスクリーニングを含む、請求項１に記載の抗体組成物であって、前記開裂産物類似体ペプチドは、
ａ）プロテアーゼによって開裂された抗体の重鎖の残基ペアのＮ末端残基の特定と、
ｂ）プロテアーゼ開裂部位のＮ末端残基が、定義された配列のＣ末端となるプロテアーゼ開裂部位の上流の少なくとも５つの切れ目がなく連続するアミノ酸残基を含むペプチド配列の特定と、
ｃ）免疫付与又はスクリーニングに十分な量のペプチド溶液の作製と、によって準備される、上記抗体組成物。
【請求項６】
アミノ末端側のプロテアーゼ開裂部位から上流のヒトＩｇＧヒンジ領域の配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、又は４から選択される、少なくとも５つの切れ目がなく連続するアミノ酸を含む、ポリペプチドに特異的に結合する、少なくとも１つの抗体を含む、請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、少なくとも残基−Ｔ−Ｃ−Ｐ−Ｐ−Ｃ−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基７〜１１）で定義されるＩｇＧ１のヒンジコアを含む、請求項６に記載の抗体組成物。
【請求項８】
前記ペプチドが、ヒトＩｇＧ１下部ヒンジの１２−ｍｅｒペプチド類似体で、配列ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基７〜１８）を持つＣＨ２領域に隣接する、請求項６に記載の抗体組成物。
【請求項９】
少なくとも５つのアミノ酸から成り、ＩｇＧプロテアーゼ開裂部位のＮ末端側の上流のアミノ酸配列を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５〜１１及びそのＮ末端切断から選択される、アミノ酸配列を持つペプチドを含む開裂産物ペプチド類似体に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５〜１１から選択するアミノ酸配列を持つポリペプチドに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項１１】
（ａ）ＩｇＧ１ＭＭＰ−３開裂部位（ＴＣＰＰＣＰＡＰ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基７〜１４）のアミノ末端側のアミノ酸配列を含むペプチド、（ｂ）又はグルタミルエンドペプチダーゼＩｇＧ１開裂部位（ＴＣＰＰＣＰＡＰＥ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基７〜１５）を含むペプチド、又は（ｃ）ＩｄｅＳ  ＩｇＧ１開裂部位（ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基７〜１８）を含むペプチド、から選択されるアミノ酸配列を持つポリペプチドに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧプロテアーゼ開裂部位ペプチド類似体で免疫を付与されたウサギを使用して、ヒトＩｇＧ親和性マトリックスの事前吸収により抗体が前記動物の血清から精製される、請求項１に記載の抗体組成物の調剤方法。
【請求項１３】
対象からの組織試料の分析により前記対象の疾患過程を検出する方法であって、前記疾患が、関節リウマチであり、前記方法が、ａ）１３５ｋＤａの分子量を持ちそしてｂ）ＩｇＧ分子の下部ヒンジ領域において重鎖の１つを単一プロテアーゼ開裂することにより形成されることによって特徴付けられる、単一開裂のタンパク分解性に開裂したＩｇＧの検出を含む、上記方法。
【請求項１４】
前記試料が滑液である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料が血液又は断片産物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記検知が生体外で実行される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記検知過程が、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的染色、及びウエスタンブロット法よりなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記検知が、血液分画以外の組織試料で実行される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
対象の組織に疾患マーカーを検出するための、単離された抗体組成物を含むキットであって、前記組成物は開裂ＩｇＧに特異的に結合する少なくとも１つの抗体を含み、該抗体は、ａ）１３５ｋＤａの分子量を持ちそしてｂ）ＩｇＧ分子の下部ヒンジ領域において重鎖の１つを単一プロテアーゼ開裂することにより形成されることによって特徴付けられる、単一開裂のＩｇＧ開裂産物を検知することができ、ｃ）ここで前記抗体が無傷ＩｇＧと反応しない、上記キット。
【請求項２０】
ＩｇＧ開裂産物を生産することができるプロテアーゼを放出することによって特徴付けられる病的状態を持つ対象の治療のための医薬としての使用のための請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項２１】
ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−１２、ＨＮＥ、プラスミン、カテプシンＧ、ペプシン、ＩｄｅＳ、又はＳｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ．からのグルタミルエンドペプチダーゼＩのから成るグループから選択されたプロテアーゼによって生成されたヒトＩｇＧ１のプロテアーゼ特異性開裂部位を抗体が認識する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
病的状態の処置に使用される抗体のエフェクター機能を回復するための医薬としての使用のための請求項１に記載の抗体組成物であって、前記病的状態の処置に使用される抗体が１又は複数のプロテアーゼによって開裂を受ける、上記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断及び予後指標、及びその検出のための方法と試薬に関する。本発明は更に、患者の疾患の自然史をモニタリングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
医学の分野で、バイオマーカーは、疾患の進行又は治療効果を測定するために使用することができる生化学的物質、すなわち診断又は予後指標である。疾患の自然史及び疾患管理を効果的に反映するバイオマーカーの１つに、糖尿病患者における血糖管理用のヘモグロビンＡ１ｃがある。血清中のＨｂＡ１ｃは半減期が長いため、理想レベルから離れている血糖の偏り、並びにこのような偏りの持続時間の最新記録としての機能を果たす。現在使用されている全身炎症性疾患のバイオマークは、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）（Ｐｅｐｙｓ  ＭＢら  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１、１８０５〜１８１２、２００３）である。ＣＲＰは、様々な急性炎症性疾患状態に反応して作り出される急性期反応体である。ＣＲＰは、肝臓内で、遠隔炎症部位から移動するＴＮＦ及びＩＬ−６を含むサイトカインシグナルに反応して合成される。血清ＣＲＰの上昇は、感染、脳卒中、血管疾患、心筋梗塞、及びその他の急性炎症性疾患を引き起こす。
【０００３】
免疫グロブリン、及び特にＩｇＧクラスの抗体を循環させるのは、主要血清タンパク質である。ヒトプロテアーゼが炎症疾患、増殖性疾患、転移性疾患、及び感染性疾患と関連していることは既知である。マトリクス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）及び好中球エラスターゼのようなヒトプロテアーゼは、グルタミルエンドペプチダーゼ（黄色ブドウ球菌（Staph.aureus.））又は免疫グロブリンを分解する連鎖球菌（Strep. pyogenes）の酵素のような細菌プロテアーゼと同様に、ＩｇＧｓ重鎖ポリペプチドを、それぞれのプロテアーゼに特有の残基で開裂する。重鎖の開裂部位は、２つの重鎖に鎖間ジスルフィド結合が発生するヒンジ領域と呼ばれる領域に群生する。ヒンジの下の領域は、Ｆｃ領域を構成し、ＩｇＧのエフェクター機能に関与する結合部位を含む。微生物の場合、プロテアーゼ発現は、さもなければ病的細胞を標的化し破壊することにつながる働きを効果的に中和するヒンジの下の開裂によって放出されるＦｃ領域のタンパク質分解において、微生物のオプソニン化（Ｒｏｏｉｊａｋｋｅｒｓら、微生物と感染（Microbes and Infection）７：４７６〜４８４、２００５）を回避させる潜在的な補助的毒性経路である。したがって、特定のプロテアーゼの詳細は、がん、炎症及び感染性疾患を含む無数の疾患状態を代表することができる。
【０００４】
そのＩｇＧ分解は、病理学的生体内環境において、開裂ヒンジ領域に結合する天然ＩｇＧ自己抗体の存在（Ｋｎｉｇｈｔら、１９９５、Ｎａｓｕら、１９８０、Ｐｅｒｓｓｅｌｉｎ及びＳｔｅｖｅｎｓ、１９８５、Ｔｅｒｎｅｓｓら１９９５  Ｊ  Ｉｍｕｎｏｌ．１５４：６４４６〜６４５２）によって増進されることが証明されている。これらの自己抗体はまた、Ｆ（ａｂ’）２分子のＣ末端残基として残存する下部ヒンジ領域への特に強い反応性（Ｔｅｒｎｅｓｓら、１９９５）と共に、複数のプロテイナーゼ（パパイン及びペプシンを含む）によって生成されたＦａｂ断片及びＦ（ａｂ’）2断片を結合する。実際の開裂産物の検出が報告されている（Ｆｉｃｋら、１９８５、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ及びＷｈｉｔｅｈｏｕｓｅ、１９７０、Ｗａｌｔｅｒ、１９７４）が、おそらく様々な断片の迅速除去に起因する血清の低濃度、又は血液及び組織内の多量無傷免疫グロブリンの中に断片を検出する上での技術的問題が原因で、これらの断片がバイオマーカーとして役立つことを可能にするロバスト分析が進展していない。ヒト好中球エラスターゼ開裂Ｆｃ領域の検出には、特定の抗体が準備され（Ｅｃｋｌｅら１９８８．Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２４０：５３１〜５３４）、そのＦｃ領域は、直接に関節リウマチ患者の滑液に中央値濃度の０．６２μｇ／ｍＬでＦｃを検出したが、他の種類の関節疾患患者の滑液には検出しなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、対象の体液又は血液中のＩｇＧ開裂産物（単数又は複数）の種類と量を評価する能力は、特定の疾患活動のバイオマーカーとして利用し得る。このような判定のための特定の試薬及び方法は、診断及び予後の医療分析に役立つ道具を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、プロテアーゼの生産に関連する疾患経過を検出するための試薬及び試薬使用に関し、そのプロテアーゼは疾患病状の兆候、並びに宿主免疫防御を制限する作用因子である。本発明の一態様において、分析における試薬及び試薬の使用は、抗疾患抗体を検出し、その抗体は、疾患病状に関連する対象に対して特異的である。試薬は、このようなタンパク質分解開裂の結果であるＩｇＧ分解産物を評価するように導かれる。
【０００７】
本発明の他の実施形態において、本発明の方法は、ＩｇＧ開裂産物の検出に導向けられ、ＩｇＧ開裂産物は、１）生理学的条件下での分子量が無傷哺乳類ＩｇＧに相当することと、２）変性だが非還元条件下で、抗原結合断片及び３２ｋＤａ断片を含む２つの断片に分離可能であることと、３）インビトロ分析でＡＤＣＣ活動を示さないことと、によって特徴付けられる。本発明のＩｇＧ開裂産物の検出方法の一態様において、開裂産物を検出することができる特定の試薬が提供され、その試薬は前記開裂産物に結合することができる少なくとも１つの抗体である。
【０００８】
本発明の他の実施形態において、ＩｇＧ開裂産物の検出に役立つ試薬生産の配列が提供され、それは抗体付与、パンニング、及び本発明の抗ＩｇＧ開裂産物の試薬選択に役立つ。一態様において、配列は、プロテアーゼ開裂部位のアミノ末端側のヒトＩｇＧヒンジ領域の配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１、２、３、又は４から選択される少なくとも５つの連続するアミノ酸からなる群から選択される。一実施形態において、配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．５〜１１及びそのＮ末端切断の中から選択される。他の態様において、ヒトＩｇＧ分子のタンパク質分解開裂部位に基づいたペプチド免疫原のデザイン方法が提供される。
【０００９】
本発明の他の実施形態において、核酸配列、ベクトル、及び抗ＩｇＧ開裂産物抗体の組み換え生産のための宿主細胞を含めた、本発明の抗ＩｇＧ開裂産物抗体の生成方法が提供される。抗ＩｇＧ開裂産物抗体の生産方法における他の態様において、免疫宿主動物から提供される本発明の抗体の源となる動物の血清から、記述された方法又は当該技術分野において既知の方法によって試薬が調剤される。
【００１０】
本発明の他の実施形態において、本発明の抗ＩｇＧ開裂産物抗体を含む抗ＩｇＧ開裂産物の検出キットが提供される。
【００１１】
本発明の更なる実施形態は、ＩｇＧ開裂産物にエフェクター機能を回復するために、抗ＩｇＧ開裂に特定した抗体を患者の治療に投与する方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】典型的な哺乳類のＩｇＧクラス抗体の様々な領域を、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、及びＦｃとして定義される、ヒンジとの、及びペプシンとパパイン開裂産物との関係を示しながら例示。
【図２】ヒトＩｇＧ１κ抗体、Ｍａｂ１、１％ｗ／ｗヒトＭＭＰ−３（Ａ）、連鎖球菌ＩｄｅＳ（Ｂ）、ブドウ球菌グルタミルエンドペプチダーゼＩ（Ｃ）、及び３７℃でのヒト好中球エラスターゼ（Ｄ）それぞれのプロテイナーゼ分解中の４つの個別のアジレント社（Agilent）のＢｉｏｓｉｚｉｎｇ微小毛細血管の電気泳動分析をゲル画像として示す。それぞれのゲル（レーン１）の基準は、無傷ヒト／マウスキメラＩｇＧ１及び既知の開裂片に対応。
【図３】ヒンジ領域の周辺のヒトＩｇＧ１重鎖配列を例示し、主なタンパク質分解開裂の位置は矢印によって示されている。
【図４】傷からの滲出液による経時的なビオチン化マウス／ヒトＩｇＧ分解を示すウエスタンブロット法。
【図５】３つの異なるプロテアーゼからのＦ（ａｂ’）2分解生産物を共役したものに免疫を有するウサギによって生成された抗血清の相対的特異性。ＭＭＰ−３、Ｖ８、及びＩｄｅＳ  ＴＣＰＰＣＰＡＰ、ＭＭＰ−３開裂部位、ＴＣＰＰＣＰＡＰＥに一致するＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１の残基７〜１４、グルタミルエンドペプチダーゼ部位、及びＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧに一致するＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１の残基７〜１５、ＩｄｅＳ部位に一致するＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１の残基７〜１８を示すグラフである。Ｍａｂ３ＩｇＧ１κのＦ（ａｂ’）2断片κを用いる３つの個別のウサギポリクローナル抗ヒンジペプチド抗体調製のＥＬＩＳＡ反応性。Ｆ（ａｂ’）2断片は、ヒト組み換えＭＭＰ−３、ブドウ球菌グルタミルエンドペプチダーゼＩ、及びＳｔｒｅｐ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからの組み換えＩｄｅＳを用いて作り出された。ウサギ抗体調製の混合プールは、Ｍａｂ３Ｆ（ａｂ’）2断片のそれぞれとほとんど同等の反応性を証明した。バーは、３つの複製ウェルの平均値±の標準偏差に一致。
【図６】抗体消化物を用いたウサギポリクローナル抗体調製のウェスタンブロット反応性。無傷又は部分的にＭＭＰ−３で分解されたＭａｂ３ヒトＩｇＧ１、グルタミルエンドペプチダーゼ（Ｖ８）又はＩｄｅＳは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の免疫ブロットによって分離された。（Ａ）抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）［レーン１〜４］又は抗．．．ＬＬＧウサギポリクローナル［レーン６〜１０］でブロットした。（Ｂ）抗．．．ＰＡＰ［レーン２〜５］又は抗．．．ＡＰＥ［レーン７〜１０］でブロットした。ブロットは、個別の抗血清を用いての検出ができるように、パネルＡのレーン５及びパネルＢのレーン６を介して抗体との培養前に切り取られた。
【図７】ＲＡ患者５人の滑液中のＩｇＧ分解分析からの試料上にＲＡＨ−１試薬を使用して展開され、ＭＭＰ−３、グルタミルエンドペプチダーゼ（Ｖ８）及びＩｄｅＳを用いたモノクローナルＩｇＧ１のインビトロタンパク質分解消化物からの試料と比較されたウェスタンブロット像。
【図８】特定の精製断片をヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を用いて測定したマウスに注射した後の、様々なタンパク質分解開裂片、無傷ＩｇＧ、ｓｃＩｇＧ、及びＦ（ａｂ’）2の経時的な血清濃度。
【図９】表示されたように疾患と診断された患者からのヒト血清試料内の試薬ＲＡＨ−１によって検出されたｓｃＩｇＧの個別値を、正常ヒト血清試料の群のそれと比較したドットプロットであり、線はそれぞれの群の平均値。
【図１０】リウマチ様関節炎（ＲＡ）患者１０人の希釈血清中、及びＥＬＩＳＡの改善されたバージョンを用いてＲＡＨ−１試薬によって検出された同数の健常対照中のｓｃＩｇＧ濃度を示し、ＲＡ群の「（２）」は、個別の２患者において同一値が得られたことを示す。
【図１１】ペプチド類似体としてのヒトＩｇＧ１ヒンジから特定した残基で終結する抗体断片まで（図３参照）の開裂片を対象とする、ウサギモノクローナル抗体の相対反応性。
【図１２】補体依存性の細胞溶解（ＣＤＣ）をＩｇＧ１を分解することによって作成されたＩｄｅＳを有するＦ（ａｂ’）2に回復させる上で、ヒトＩｇＧ１ヒンジの開裂片を対象とする３つの異なるウサギモノクローナル抗体の濃度依存性を、ペプチド類似体の開裂（ｒｂポリ）に準備されたウサギポリクローナルと比較して表示。
【００１３】
【表１】
0005530356.tif 000002
【発明を実施するための形態】
【００１４】
略語
Ａｂｓ＝抗体類、ＡＤＣＣ＝抗体依存性細胞傷害、ＣＤＣ＝補体依存性細胞傷害、ＨＮＥ＝ヒト好中球エラスターゼ、ＩｄｅＳ＝Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓの免疫グロブリン分解酵素、Ｉｇ＝免疫グロブリン、Ｍａｂ＝モノクローナル抗体、ＭＭＰ＝マトリックスメタロプロテアーゼ、ｓｃＩｇＧ＝単一ＩｇＧ開裂、ＳＡ＝ストレプトアビジン、Ｖ８＝黄色ブドウ球菌（Staph. aureus.）からのグルタミルエンドペプチダーゼＩ。
【００１５】
定義
抗体断片、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、及びＦｃは、重鎖間のジスルフィド結合の還元（コアヒンジ領域）によって更に解離している可能性のあるＩｇＧ抗体のタンパク質分解開裂産物を説明する用語である。典型的なタンパク質分解的に生成された抗体断片は以下を含み、鎖間結合を形成するシステイン残基間のジスルフィド結合を還元が除去する（図１参照）：Ｆａｂ（例：パパイン消化による）、Ｆａｂ’（例：ペプシン消化及び部分的還元）及びＦ（ａｂ’）2（例：ペプシン消化による）、ｆａｃｂ（例：プラスミン消化による）、ｐＦｃ’（例：ペプシン又はプラスミン消化による）、Ｆｄ（例：ペプシン消化、部分的還元、及び再集合による）。Ｆｃ断片は、ヒトＩｇＧ１をヒンジのＮ末端である残基２２４（ＥＵ番号）で開裂するパパイン開裂断片であると述べたように、Ｆｃ断片はヒンジ及び重鎖間のジスルフィド結合を保持すると考えられているが、抗体のＣＨ２−ＣＨ３重鎖二量体間の高い会合度により、二量体構造はジスルフィド（ヒンジ）結合がない場合でも保持される。したがって、本発明で使用するとき、「Ｆｃ」は、共有結合性を問わず、重鎖ＣＨ２−ＣＨ３部分の会合により形成された二量体構造を指す。洗剤のような変性剤の存在下でＣＨ２−ＣＨ３モノマーへの解離を起こすその能力によって、ジスルフィド結合Ｆｃは非共有で会合されたＦｃと区別されることが理解されよう。
【００１６】
「タンパク質分解」、「タンパク質分解開裂」、「プロテアーゼ」、及び「タンパク質分解酵素」という用語は、ほとんど同じ意味で用いられ、酵素が作用する標準温度下、生理条件下、又は生理学的互換条件下で、酵素のような、ポリペプチド鎖を開裂し２以上の断片を生成することができる化学物質を意味する。生理条件は、健常か疾患かを問わず、生きている哺乳動物の体内に自然に発見される任意の温度、緩衝材、カチオン、アニオン、基質、触媒、ｐＨ、補助因子等を含む。しかしながら、プロテアーゼは、いかなる生命体でもあり得る病原体のような非哺乳類源から得ることができる。
【００１７】
「ｓｃＩｇＧ」又は「単一ＩｇＧ開裂」は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含み、重鎖のうち１つが単一重鎖のタンパク質分解開裂を受け、２番目の重鎖が原型を保つヘテロ二量体性構造を有する全ての免疫グロブリンＧ分子を意味する。
【００１８】
「上流」は、アミノ酸配列に対してＮ末端残基からＣ末端残基まで記述された所定の残基からＮ末端へ向かう配列の残基を意味する。反対に、「下流」は、アミノ酸配列に対して所定の残基からＣ末端方向へ向かう配列の残基を意味する。
【００１９】
部分構造による抗体作用
一般に、免疫グロブリン、抗体は、約１００の特徴的に折りたたまれた球状ドメインを示し、構造の異なる要素を表すアミノ酸を含む連続ポリペプチド鎖の領域からなる。１００のアミノ酸領域はそれぞれ、約１０〜１１ｋＤａの球状ドメインを表す。免疫ガンマグロブリン（ＩｇＧｓ）については、これらの領域は部分別にグループ化され、Ｆａｂ部分は、軽鎖定常領域に単鎖でジスルフィド結合を介して重鎖可変領域に近接する重鎖の第一定常領域（ＣＨ１）に連結する軽鎖可変を含み、Ｆｃは、ヒンジ領域の２つ又は３つのジスルフィド結合を介して隣接する２つの重鎖可変領域（ＣＨ２及びＣＨ３）を含む。研究によって、パパイン及びペプシンのようなプロテアーゼは、部分間のような部位で優先的に抗体を開裂することが報告されてきた。２つの同一Ｆａｂ部分は、ヒンジ領域を介して１つのＦｃ部分に接続されており、したがって１５０ｋＤａ構造（図１参照）のＹ字構造を形成する。パパインを用いて生成したＦａｂ部分は典型的には４６ｋＤａの分子量、非還元性Ｆ（ａｂ’）2は典型的には９０〜１００ｋＤａの分子量、及び非グリコシル化、非還元性Ｆｃは約５０〜６０ｋＤａの見掛けの分子量を有する。しかしながら、それぞれの抗体種、及びそれぞれの抗体種内のそれぞれの抗体サブクラスはわずかに異なり、開裂又は開裂産物の厳密な性質及び位置は異なる。
【００２０】
抗原は、それぞれの対の軽鎖と重鎖の可変領域で抗原結合部位を介して抗体に結合する（図１）。エフェクター分子又は細胞として知られるその他の分子は、例えば抗原結合部位以外のような分子残部のその他の部位に結合し、この抗体部分は更なる免疫グロブリン不変配列を含み、抗体の「普遍部分」のような部位は、特に軽鎖の末端を越えて広がる重鎖の部分で構成されるＦｃ領域に位置する。
【００２１】
抗体は、エフェクター分子の結合を介して様々なエフェクター機能を有する。例えば、Ｃ１補体成分の抗体への結合は、補体系を活性化する。補体の活性化は、オプソニン化及び病原体細胞の溶解（補体媒介性細胞障害又はＣＤＣと呼ばれる過程）において重要である。補体の活性化は、炎症反応を刺激し、自己免疫過敏症にも関係する可能性がある。更に、抗体は、抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体部位を細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した状態で、Ｆｃ領域を介して細胞と結合する。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（エータ受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）及びＩｇＭ（ミュー受容体）を含めて、異なるクラスの抗体に特異的な多数のＦｃ受容体が存在する。細胞表面のＦｃ受容体と抗体との結合は、例えば抗体被覆粒子の貪食及び破壊、免疫複合体の除去、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、又はＡＤＣＣと呼ぶ）、炎症性メディエーターの放出、免疫グロブリン生成の胎盤通過及び制御を含む、多数の重要な及び多様な生物学的応答を誘発する。
【００２２】
ヒンジ領域周辺の配列は、通常、ＩｇＧアイソタイプ間（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４）及び哺乳類種間で保存される。ＩｇＧ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及びＩｇＧ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）アイソタイプは、Ｆｃγ受容体結合（単数又は複数）及びＦｃエフェクター機能の構造モチーフであるロイシン−ロイシンのペアを含む。典型的には少なくとも２つの非システイン残基で分離されたシステインを含む「ヒンジコア」の下流のその他の残基もまた保存される。
【００２３】
本出願人らは、ヒトＩｇＧ１の開裂産物、ｓｃＩｇＧは、ＩｇＧを含む２つの重鎖ポリペプチドのうち１つにタンパク質分解が起こる際に、ヘテロ二量体分子の全体組成を分裂させることなしに、ヒト及び細菌プロテアーゼによって生成されることを発見した。次に、本出願人らは、ｇＧ分子を含むヒト重鎖定常領域におけるタンパク質分解攻撃の動態解析を介して、ｓｃＩｇＧは生体中のタンパク質分解の豊富な生産物であり得ることを決定した。ＩｇＧのタンパク質分解中のｓｃｌｇＧのＦ（ａｂ’）2につながるタンパク質分解中間体としての存在については、ＭＭＰ−３酵素に関して前述された（Ｇｅａｒｉｎｇ  ＡＪＨら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．８１：４１〜４８、２０００）。連鎖球菌プロテアーゼ、ＩｄｅＳによるＩｇＧ開裂はまた、サイズ排除クロマトグラフィーによって無傷ＩｇＧに類似の物質を生成すると述べられている（Ｖｉｎｃｅｎｔｓ  Ｂら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１５５４０〜１５５４９、２００４）。しかしながら、この中間体の機能的特性化、又は提供された生物学的試料中のＳｃＩｇＧを検出する方法はどちらも報告されなかった。
【００２４】
本出願人らは更に、生体内、ｓｃＩｇＧは、数日間から数ヶ月間の疾患活動の評価と互換性のある血清半減期を提示し、したがってｓｃＩｇＧを潜在的な又は抑制された疾患経過のマーカーとして使用すること、又は最近の自然史及び反応、若しくは疾患からの回復を理解するために使用することが可能であることを示している。
【００２５】
簡単に述べると、本出願人らは、生理学的条件下でのタンパク質分解切断の動態が、Ｆ（ａｂ’）2のような乗加開裂事象の生成物である種よりも、より多くのｓｃＩｇＧ構造にあるタンパク質分解的に切断されたＩｇＧの部分につながるのを発見した。（図１参照）。数多くのプロテアーゼを検査する過程において、無傷ＩｇＧ内の重鎖定常領域の第１開裂は、第２開裂に比べてより急速に進行することが決定され、この順序は単一開裂種の一時的蓄積をもたらす。この単一開裂種のＩｇＧ分子は、その未変化の親と多くの点で区別ができない（例：分子の大きさ、抗原結合、タンパク質Ａ／Ｇによって認識される能力）。
【００２６】
本発明に従って、本出願人らは、Ｆ（ａｂ’）2及びｓｃＩｇＧを含むタンパク質分解切断産物の検出に適する試薬を作成した。本発明の試薬は、本発明の開裂部位類似体ペプチドを使用して作成され、ヒトＩｇＧ１開裂産物を認識するが、無傷ＩｇＧは認識しない。
【００２７】
本出願人らは、更に、抗原結合特異性を保持するＩｇＧ開裂産物を認識する抗体は、ＣＤＣ及びＡＤＣＣのようなエフェクター機能を開裂ＩｇＧに回復することができることを証明した。
【００２８】
タンパク質分解酵素と疾患関連性
本出願人らは、インビトロ酵素パネルで作成されたものと同等の大きさのｓｃＩｇＧｓを含む抗体開裂産物は、リウマチ性関節炎患者の滑液のような炎症性滲出液に検出可能であることを証明する。更にｓｃＩｇＧは、局部的タンパク質分解活動が既知の病理特性である数多くの疾患を有する患者の血清中に検出可能である。これらの疾患状態のｓｃＩｇＧは、健常ボランティアと比較して高濃度にあり、比較的軽度の炎症疾患患者の血清と比較しても高度である。
【００２９】
ｓｃＩｇＧの検出は、ヒンジジスルフィドの又はその周辺の開裂重鎖の新たに露出したエピトープに特異的に結合したアフィニティー精製ポリクローナル抗体（ウサギ）の生成によって可能になった。血清中のｓｃＩｇＧ検出の確証は、無傷ＩｇＧと同様の持続性循環寿命である。ｓｃＩｇＧを疾患患者の体液又は血液中に検出する能力は、新規バイオマーカー戦略となる可能性がある。ウサギ以外の他の種の抗体（マウス、ラット、及びラクダ等）が使用されてもよく、例えばポリクローナル及びモノクローナル抗体がヒトＩｇＧ１開裂産物を結合する能力を保持するが、無傷ＩｇＧは本発明の試薬として包括されていることを認識しない特定の抗体結合配列領域の抗体遺伝子コードをクローン化することにより、モノクローナル抗体が生産される可能性があることが理解されよう。その他の抗体生産方法は、例えば抗体ドメインライブラリーからの選択により、当該技術分野における技術者に周知であって、本発明の抗体の原料として使用することができる。
【００３０】
抗体試薬
本発明の抗体は、本出願人らによって設計された評価基準及び免疫原を用いて、本発明の実施に際して役立つ抗体を作製又は選択するために、当該技術分野において既知のいくつかの方法で作成することができる。
【００３１】
一態様では、抗体は、動物に観察した開裂片又はそれに由来する開裂部位類似体ペプチドで免疫を与えることにより作製されたハイブリドーマから容易に入手することができる。したがって、抗体は、Ｆ（ａｂ’）2及びｓｃＩｇＧを含む抗体開裂片、又はＮ末端切断、若しくは構造類似によって動物に免疫を与えること又は抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。一実施態様において、抗体を作製するために用いられるペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５〜１１に示すＩｇＧ１の１４−ｍｅｒペプチド片から選択され、ここでポリペプチド又はペプチドのＣ末端残基が、残基開裂ペアの表１に示されるように、開裂部位の残基上流（Ｎ末端側）を示す。ＩｇＧ１の−Ｔ−Ｃ−Ｐ−Ｐ−Ｃ−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基７〜１１）のようなヒンジモチーフを含む断片は、システイン残基（Ｃ）が例えばアラニン（Ａ）残基と交換されていない限り、ジスルフィド結合形成によって多重結合となる。
【００３２】
特定の実施形態において、抗体は、ＭＭＰ−３開裂部位のアミノ末端側のアミノ酸配列に対応する（ＴＣＰＰＣＰＡＰ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基７〜１４）８−ｍｅｒペプチドを用いて、又はグルタミルエンドペプチダーゼ部位（ＴＣＰＰＣＰＡＰＥ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基７〜１５）に対応する伸張ペプチド、又はＩｄｅＳ部位（ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基７〜１８）を用いて生成される。免疫原として使用されるとき、ペプチドは、容易に共有結合によってキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にＮ末端を介して、又は追加したリンカー残基若しくはペプチドを通して付着させることができる。
【００３３】
したがって抗体は、当該技術分野において周知のハイブリドーマ技術いずれによっても取得することができる。Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄ．、「分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons、 Inc.）、ニューヨーク、ニューヨーク（１９８７〜２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第２編、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク（１９８９）；「ハーローとレーン、抗体、実験マニュアル（Harlow and Lane、antibodies、 a Laboratory Manual）」、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク（１９８９）、Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、「免疫学の最新プロトコル（Current Protocols in Immunology）」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons、 Inc.）、ニューヨーク（１９９４〜２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、「タンパク質科学の最新プロトコル（Current Protocols in Protein Science）」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons）、ニューヨーク、ニューヨーク、（１９９７〜２００１）を参照のこと。これらはそれぞれ本明細書に参照として組み込まれる。本発明の抗体は、例えばヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、霊長類、又はこれらのいかなる組み合せ、及び単離ヒト、霊長類、げっ歯類、哺乳類、キメラ、ヒト化及び／又はＣＤＲグラフト化抗インテグリン抗体、免疫グロブリン、開裂産物、及びその他の特定したその部分と変異であるがこれに限らない、いかなる哺乳類をも含む又はいかなる哺乳類からでも得ることができる。
【００３４】
ファージディスプレイシステムを用いた抗体ライブラリーはまた、ｓｃＩｇＧ及びその他の抗体断片の希望する特異性をもって、新規結合領域を特定するために使用することができる。
【００３５】
本発明に役立つ抗体又はその他のバインダーを作製又は選択する上で、この目的に使用された特定の試薬は、本発明の更なる態様である。この目的のために開発された特定の免疫原又は試験試薬は、図３に例示するように、残基ＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰ  ＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰ  ＳＶＦＬＦＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含むがこれに限らない、ＩｇＧ１のヒンジコア周囲の残基を含むことを特徴とする。タンパク質分解酵素に触れると抗体断片を作製するその他のヒトアイソタイプ抗体のヒンジ領域はまた、抗体又はその他の酵素開裂産物に結合するその他の分子の作製、選択、又は検査を目的として類似体の源としての機能を果たすことができる。ヒトＩｇＧ４重鎖の類似した領域は、それぞれ残基ＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮ  ＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫ  ＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡ  ＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦ  ＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３及び４に示すＩｇＧ２とＩｇＧ３用を含む。それぞれの場合において、ペプチドは、プロテアーゼ開裂部位のアミノ末端側のヒトＩｇＧヒンジ領域配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、又は４から選択される少なくとも５つの切れ目がなく連続するアミノ酸から成る。一態様では、抗体作製に使用される特定の免疫原又はペプチドは、残基−Ｔ−Ｃ−Ｐ−Ｐ−Ｃ−として定義される、ＩｇＧ１の少なくともヒンジコアを含む。特定の実施形態において、ペプチドは、ヒトＩｇＧ１下方ヒンジの１２−ｍｅｒペプチド類似体で、配列ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基７〜１８）を有する隣接するＣＨ２領域である。
【００３６】
抗体又はその他の酵素開裂産物に結合するその他の分子の作製、選択、又は検査をする上で役立つペプチド断片を作製する一般的な方法は、ａ）実施例１及び表１の特定のプロテアーゼによって例示されたプロテーゼで開裂された抗体重鎖残基対のＮ末端残基を特定し、ｂ）Ｎ末端残基が定義された配列のＣ末端になる開裂部位からの５〜１４又はそれ以上の上流残基から定義され、ｃ）希望する目的（単数又は複数）に十分な量のペプチドを作製する。詳述したようなペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５〜１１、又はそのＮ末端切断から選択されるものである。ペプチドは、標識され、接合され、架橋化され、他のものと混合して、又は結合を検査するためのアジュバント、免疫原として、例えばファージディスプレイライブラリーから結合を選択するためのパニング対象として使用することができる。
【００３７】
本発明は更に、一態様において、少なくとも１つの特定の配列、ドメイン、部分又はその変異体を含む、前記の特定のペプチド又はその抗体をコードするポリヌクレオチドを含むか、これに対し相補的か、又はこれに対しハイブリッド形成する単離核酸分子を提供している。本発明は、ここで説明されるように、ｓｃＩｇＧ特異性を有する少なくとも１つの単離モノクローナル抗体をコードする単離核酸及び単離核酸を含む核酸ベクトル、及び／又は単離核酸を含む原核又は真核宿主細胞を包含する。宿主細胞は、Ｅから任意的に選択される少なくとも１つのものであり得る。Ｃｏｌｉ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ  Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、Ｈｅｌａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫又は植物細胞、全ての誘導体、不死化又はその形質転換細胞。同様に提供されているのは、ペプチド及び抗体が検出可能な又は回収可能な量で発現されるようにインビトロ、生体内又はその場で核酸をコードする抗体を翻訳する工程を含む、少なくとも１つの本発明の抗体の生産方法である。
【００３８】
使用方法
本発明の試薬は、疾患経過がタンパク質分解活動及びタンパク質分解酵素、プロテアーゼを発生、その結果、それを引き起こす、又はさもなければそれと関連する時、疾患病状の検出に役立つ。このような疾患と経過は、感染、ストローク、血管疾患、心筋梗塞、及び数多くのその他の即時的及び長期にわたる炎症性疾患の増悪及び悪化、それらによって生じる、又はそれらに起因するものを含む。本出願人らは、特に役立つタンパク質分解活動の１つのバイオマーカーは、いくつかの前述した疾患において増量したレベルで検出されるｓｃＩｇＧであることを立証した。ｓｃＩｇＧは、病変の又は病理過程の又は病理感染の部位で通常局所的に生成され、ｓｃＩｇＧは、特異及び特定の疾患部位の特異組織又は細胞型の関与評価のような過程のマーカーを提供する。
【００３９】
本発明の方法の一実施形態において、プロテアーゼ上昇を特徴とする疾患がある、疾患があった、又は疾患の治療を受けたという疑いのある対象から試料が収集される。試料を、疾患刺激プロテアーゼと血清ＩｇＧ群との接触に起因することが既知のＩｇＧ開裂片に対して特異性を持つ、抗体調製等の結合剤と接触させる。
【００４０】
本発明方法は、疾患又は症状の診断を過去に受けた患者が進行疾患（例：がん転移、侵襲性腫瘍増殖、持続感染等）のリスクを持つか否かの評価に利用できる。
【００４１】
ある場合は、例えばがん患者の場合、ｓｃＩｇＧの検出は、タンパク質分解酵素、特にＭＭＰｓの生産に関連することが既知である転移拡散を含む進行疾患経過の指摘に役立つ可能性がある。ある態様において、腫瘍性疾患は、通常、炎症過程、組織修復、及び治癒（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ、Ｌ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｗｅｒｂ、Ｚ．  ２００２．  Ｎａｔｕｒｅ  ４２０（１９）：８６０−８６７）とこれらの機構を共有する。その他の研究によると、例えば、脂質低下は、例えば血栓症のような心臓と血管事象のリスク低下、及びＭＭＰ−２とＭＭＰ−９のようなＭＭＰｓの低下の両方と相互に関連があり、これらの酵素は動脈硬化プラークによって生産されることが示された。（Ｄｅｇｕｃｈｉ、Ｊ、Ｍａａｎｏｒｉ、Ａ．、Ｃｈｉｎｇ−Ｈｓｕａｎ、Ｔ．ら、２００６  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１４：５５２〜６２）。したがって、本発明方法は、重度の関節炎症候群（ＲＡ、強直性脊椎炎）を持つ患者、特定のがん（特に炎症性乳がん）、重度の冠状動脈異常状態（心筋梗塞及びうっ血性心不全）及び喘息のようなその他の疾患を持つ患者に特に適用するがこれらに限定されない。本発明方法は、病態生理学がＩｇＧに作用することが可能なプロテアーゼを伴う及び誘発するこれらの疾患及び症状を、分泌プロテアーゼ上昇の増進を特徴としない又はプロテアーゼがＩｇＧを開裂しないその他の病理学から区別するために使用することができる。
【００４２】
したがって、ここで説明した試薬の使用方法は、開裂片の検出に特異的である一方で、開裂片の更なる特異的な分析は、開裂抗体の様々な領域における結合特異性の分析を含むことができる。例えば、抗原結合選択度と抗体断片検出を合わせた固相分析は、対象において特定の抗原及びプロテアーゼが共局在化され、したがってタンパク質分解活動部位での組織、疾患、又は病理学的性質についての情報を提供しているかどうかを決定するために使用することができる。
【００４３】
採血は、最も頻繁に実行される健康な又は病気の対象、ヒト、又は動物からの組織標本採取の実施形態である。ｓｃＩｇＧは全身において体系的に発見され、形成部位、すなわちプロテアーゼ活動部位に限定されず、特定の部分で局在化する可能性のある疾患活動のレポーターマーカーである。このような部分の１つは、滑液である。したがって、血液又は血清採取は、本発明が提供する試薬及び方法を使用して、初期疾患を検出するための容易で実行可能な供給源を提供する。別の方法としては、ＲＡ滑液、肺滲出液、生検等の局所設定の標本採取も、診断を含むどの時期の患者にも、又は進行疾患を持つ患者にも適用することができる。抗体開裂片は、直接染色法（免疫組織化学法）を適用したこのような組織内に、又は試料から得られる断片試料中に検出されることがある。
【００４４】
血液を含む組織試料は、プロテアーゼ活性物質の残留物を阻害するように扱われなければならない。金属のキレート化（例：ＥＤＴＡ）は効果的にＭＭＰｓを抑制する。ヨードアセトアミドは、システインプロテアーゼ（例：ＩｄｅＳ）をブロックし、セリンプロテアーゼは、ＤＥＰ及び類似合成物によってブロックされ得る。活性プロテアーゼは、滑液に存在し、それに応じて処理されるべきである。試料は、分析時まで冷凍管理してもよい。試料が適切に処理された時点で、本発明のｓｃＩｇＧ特異試薬は、ＥＬＩＳＡ、ビーズに基づく形式、ＲＩＡｓ、当業者には周知である又はまだ開発されていない、いかなる抗体に基づいた技術に用いられてもよい。
【００４５】
本発明の抗ＩｇＧタンパク質分解開裂片試薬は、研究又は診断用途として、又は緩衝液のような他の試薬及び測定と共に無傷ヒトＩｇＧ及び既知重量のＩｇＧ開裂のような標準物質及び、必要に応じて、対象から得た組織試料のＩｇＧタンパク質分解切断片の定量化と共に販売用途としてのキットにパッケージ化されてもよい。
【００４６】
ヒンジペプチド開裂断片に免疫特異的な本発明の抗体は、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＩｇＧのような抗原結合領域を保持する酵素開裂ＩｇＧの残留を結合することができ、したがって無傷のＦｃ領域を提供することで、Ｆｃに関連する結合特性を回復し、エフェクター機能を付随する。したがって、ここで指導された方法で作製された、又は生体内の酵素的に生成された抗体断片の結合特性を持つ抗体は、治療用分子として役立つ可能性がある。本発明の抗ＩｇＧ開裂断片抗体は、疾患によるＩｇＧのタンパク質分解開裂を特徴とする疾患を持つ患者を治療するために使用することができる。一態様において、抗ＩｇＧ開裂断片抗体は、標的特異性の結合能力を保持する抗体断片にエフェクター機能を回復する。
【００４７】
本発明は一般的な用語で説明したが、本発明の実施形態は、以下の実施例において更に開示される。
【実施例】
【００４８】
実施例１：ヒトＩｇＧ重鎖の切断解析
マトリックスメタロプロテイナーゼ、カテプシン、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、及びブドウ球菌グルタミルエンドペプチダーゼ（Ｖ８プロテアーゼ）のような選択病原体酵素、及び連鎖球菌の免疫グロブリン分解性酵素（ＩｄｅＳ）によるヒトＩｇＧ重鎖のタンパク質分解が研究された。
【００４９】
ヒトＩｇＧ重鎖を含む精製モノクローナル抗体を、上述したプロテアーゼと接触させ、接触の様々な期間に渡って標本採取を行った。試料中の断片は、インビトロｂｉｏｓｉｚｉｎｇ用のアジレント社（Agilent）顕微溶液の「チップ上のラボ」技術を用いて評価された（Ｇｏｅｔｚ  Ｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６０；２８１〜２９３、２００４）。
【００５０】
抗体基質．モノクローナル抗体は、ヒト定常領域及びヒンジ領域ＩｇＧ１カッパクラス／サブクラス及び種を有する、完全なヒト、組み換えヒト化マウス、あるいはヒト／マウスキメラ抗体であった。Ｍａｂ１は、病原体を結合するヒトＩｇＧ１、Ｍａｂ２（抗サイトカイン）は、ヒト定常領域とヒンジ領域を処理するヒト／マウスキメラＩｇＧ１抗体、及びＭａｂ３は、ＣＤＲグラフト化ヒト化ＩｇＧ１。全ての抗体は、カッパ軽鎖を含む。
【００５１】
タンパク質分解酵素と試験方法．ヒトプロＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７及びプロＭＭＰ−９は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Temecula、 CA）より入手され、使用前に１ｍＭ  ｐ−アミノフェニル酢酸第二水銀アセテート（APMA、 CalBiochem、 San Diego、 CA）で１６時間３７℃で培養し、活性化された（Ｍａｒｃｈら、１９９１）。組み換えヒト活性ＭＭＰ−１２は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。組み換えＭＭＰ−１は、Ｄｒ．Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｎａｇａｓｅからの寛大な贈り物であった。ヒトプロＭＭＰ−３は、ヒンジ及びヘモペキシン領域の代わりにヒスチジンタグ付きＨＥＫ細胞に一時的に発現した。プロＭＭＰ−３変異型は、記載されたように、２５分間５５℃で培養し、活性化された（Ｋｏｋｌｉｔｉｓら、１９９１）。カテプシンＢ、Ｄ、Ｇ、Ｓ、及びプロテイナーゼ３は、Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Athens、 GA）より入手した。凝固酵素トロンビン、Ｆ．Ｘａ、Ｆ．ｌＸａ、Ｆ．Ｘｌｌａ、及びカリクレイン、並びにプラスミン及びプラスミノーゲン、はＥｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（South Bend、 IN）から購入した。組織プラスミノーゲンアクチベーター（アクチバーゼ）は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（South San Francisco、 CA）の製品であった。ストレプトキナーゼ及び活性化したタンパク質Ｃは、Ｓｉｇｍａ（St.Louis、 MO）より入手した。スタフィロキナーゼは、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ（Golden、 CO）より入手した。黄色ブドウ球菌（Staph. aureus.）Ｖ８グルタミルエンドペプチダーゼＩは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Rockville、 IL）より入手した。化膿連鎖球菌（IdeS）の組み換え免疫グロブリン分解酵素は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｕｎｄ（Lund、 Sweden）のＤｒ．Ｌａｒｓ  Ｂｊｏｒｃｋより提供された。
【００５２】
精製ＩｇＧｓのプロテイナーゼ消化は、ｐＨ７．５でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、又はメタロプロテイナーゼは、３７℃のトリス緩衝食塩水で実施された。塩化カルシウムは、メタロプロテイナーゼ反応に含まれ、ＭＭＰ−１２には１ｍＭで、ＭＭＰ−３には１０ｍＭで、さもなければ添加剤は使用されなかった。抗体濃度は、典型的には１又は２ｍｇ／ｍＬ及び反応は、ＩｇＧに対する１％（ｗ／ｗ）の割合で酵素添加によって引き起こされた。アリコット（１０〜２０μＬ）は、表示した時間に取り除かれ、２０ｍＭＥＤＴＡ（メタロプロテイナーゼ培養）又は１ｍＭヨードアセトアミド（システインプロテイナーゼ）へ調製することにより、又は急速凍結により反応を停止した。
【００５３】
ＩｇＧ１ヒンジの主要なタンパク質分解切断位置は、酵素生成断片に対して、精製Ｆｃ断片（ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−１２）及び／又は精製Ｆａｂ（好中球エラスターゼ、プラスミン）及びＦ（ａｂ’）2（カテプシンＧ、グルタミルエンドペプチダーゼ、及びＩｄｅＳ）断片の高分解能質量分光分析のＮ末端配列によって特定された。断片は、アジレント社（Agilent）顕微溶液の「チップ上のラボ」技術を用いて評価された。
【００５４】
結果．検査したプロテイナーゼのリスト及びヒトＩｇＧ１のタンパク質分解開裂の一次産物の分析結果は、表１に表示されている。いくつかの酵素は、使用された条件下でＩｇＧ１を破砕しなかった。活性プロテイナーゼの中で、説明した条件下での比較的特異的な活動は次の通りである：ＩｄｅＳ＞ＭＭＰ−１２＞ＭＭＰ−３、グルタミルエンドペプチダーゼ＞好中球エラスターゼ＞カテプシンＧ、プラスミン＞ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９＞ＭＭＰ−７。
【００５５】
図２は、タンパク質分解酵素処置前と処置中のＩｇＧのｂｉｏｓｉｚｉｇ分析を示す。ＭＭＰ−３、グルタミルエンドペプチダーゼＩ及びＩｄｅＳはそれぞれ、ＩｇＧ１を段階的に開裂するために観察された（それぞれ図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃ）。それぞれにおいて、約１３５，０００Ｄａの初期中間体が生成され、続いて約１００，０００Ｄａの種に変換された。これらの反応の間、Ｆｃモノマーと思われる約３５ｋＤａの断片が形成される。ゲル移動によって測定される分子量（３５ｋＤａ）は、重鎖断片アミノ酸配列による予想される２１１〜２１５残基（重鎖のＣ末端の残基２３２と２３７の間から４４７番目）よりも大きいが、ＣＨ２領域のグリコシル化部位を含む断片と一致する。無傷ＩｇＧ（１６０，０００Ｄａ）の消滅は、これらの条件下で、ＭＭＰ−３及びグルタミルエンドペプチダーゼＩとは数時間にわたって、ＩｄｅＳとは１分以内又はそれよりも早く生じた。全ての消化は、記載されているように同等の条件下で実施された。
【００５６】
１３５ｋＤａ中間体は、下部ヒンジ領域の重鎖の１つにおいて単一タンパク質分解開裂に起因することが発見された。非変性状態下で、中間体は、サイズ排除クロマトグラフィーの拡散移動のような特定の物理的特性の無傷ＩｇＧから区別することができない（データは示されず）。しかしながら、ＳＤＳゲル及び現在の微小毛細血管電気泳動システムの中で、Ｆｃ領域の開裂断片（重鎖のＣＨ２−ＣＨ３領域）は、サイズが縮小した中間体（１３５ｋＤａ）を示すために、残りの構造から分離する。この種のサイズは、Ｇｅａｒｉｎｇによって報告されたように（２００２  ｓｕｐｒａ）、単一開裂ＩｇＧと一致する．３つの酵素を用いたＩｇＧ１の延長培養は、ｓｃＩｇＧ中間体をＦ（ａｂ’）2断片及びＦｃに変換する結果となる。
【００５７】
検査済みの異なるモノクローナルＩｇＧ１ベース基質のＩｇＧ１を開裂する能力を提示する酵素の中で、単一開裂中間体への第一開裂が比較的速く、Ｆ（ａｂ’）2への第二開裂には長い時間を要したことが、一貫性のある結果である。また、図２Ｄは、Ｍａｂ１にヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）を付加した概要である。ＨＮＥは、上記の３つの酵素において、Ｆａｂ断片及び一致するジスルフィド結合Ｆｃ二量体を生産するためにＩｇＧを上部ヒンジで開裂した点で異なった。
【００５８】
ＩｇＧ１ヒンジの主要なタンパク質分解開裂位置は、精製Ｆｃ断片（ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−１２）及び／又は精製Ｆａｂ（好中球エラスターゼ、プラスミン）及びＦ（ａｂ’）2（カテプシンＧ、グルタミルエンドペプチダーゼ、及びＩｄｅＳ）断片の高分解能質量分光分析のために特定された。ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸配列は、酵素的開列の特定位置を示して図３に提示されている。上部ヒンジで開裂したプロテイナーゼを用いた延長消化は、２つのＦａｂ断片を生産し、下部ヒンジで開裂した酵素（コアヒンジジスルフィド結合の下）は、Ｆ（ａｂ’）2Sを生産した。
【００５９】
ヒトＭＭＰ−３及び−１２、ヒトカテプシンＧ、ヒトＨＮＥ、ブドウ球菌グルタミルエンドペプチダーゼＩ、及びＦ（ａｂ’）2又はＦｃ断片それぞれのカルボキシ末端残基及びアミノ末端残基両方の分析に基づいた連鎖球菌ＩｄｅＳを含む酵素それぞれについて、酵素開裂の優性部位が特定又は確認された（表１）。次に、開裂部位はある場合は延長培養中に（例：カテプシンＧ及びＨＮＥ）観察され、これらが指示されるプロテイナーゼの別の開裂部位であるか又はこれらの酵素調合物中の少量のプロテイナーゼ混入物質が原因であるかは不確実だった。ＩｇＧのＭＭＰ−１２及びＨＮＥ開裂部位は、過去に報告されていない。その他のプロテイナーゼについては、特定された腫瘍ＩｇＧ開裂位置は既に報告されている結果と一致した（Ｃｈｕｂａ、１９９４；Ｄｉｅｍｅｌら、２００５；Ｇｅａｒｉｎｇら、２００２；Ｖｉｎｃｅｎｔｓら、２００４；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、１９９５）。
【００６０】
酵素の中で、開裂位置はわずかに異なった。ＭＭＰ−３、Ｖ８及びＩｄｅＳについて、タンパク質分解は、それぞれプロライン−２４５に続いて、グルタミン酸−２４６、グリシン−２４９の順で起こった。マイクロキャピラリー電気泳動ｂｉｏｓｉｚｉｎｇシステム（Agilent Technologies）を使用して、感知可能な開列位置におけるこれらの相違点は、分子量に影響を与えない。ＭＭＰ−３、Ｖ８及びＩｄｅＳとの長い培養時間は、Ｆ（ａｂ’）2への完全的な変換を可能にする。ＨＮＥによるＩｇＧ１の消化は、Ｆａｂ生産物及びジスフィルド結合Ｆｃ（図２Ｄを参照）を生産するために（図２Ｄを参照）ヒスチジン２３６のコアヒンジジスフィルドの前で開裂するため（システイン２３８及び２４１）その他のプロテアーゼから異なる。
【００６１】
開裂部位は、ＥＵ番号に基づき、図３及びヒトＩｇＧ１クラス抗体のＳｅｒ219−Ｐｈｅ243を包括するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示した残基に関連する。いくつかのプロテイナーゼは、ヒンジ領域下でＩｇＧ１を開裂し、わずかに長さが異なる（全長Ａｌａ231−Ｇｌｙ237）Ｆ（ａｂ’）2断片を生産した。本発明に特異の多くのＩｇＧ分解プロテイナーゼは、腫瘍又は創傷治癒環境の（ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、プラスミン）炎症部位（ＨＮＥ、カテプシンＧ、ＭＭＰ−１２）、及び感染部位で（グルタミルエンドペプチダーゼ、ＩｄｅＳ）発現される又は遺棄されることが報告されている（Ｄｏｌｌｅｒｙら、２００３；Ｋｉｌｉａｎら、１９９６；Ｒｏｏｉｊａｋｋｅｒｓら、２００５；Ｓｈｏｎｂｅｃｋら、１９９９；Ｓｈａｐｉｒｏ、１９９９；Ｓｕｋｈｏｖａら、１９９８；ｖａｎ  Ｋｅｍｐｅｎら、２００６；Ｖｉｎｃｅｎｔｓら、２００４））。多くの場合、特定のプロテイナーゼの細胞外発現が主として宿主ＩｇＧに向けて導かれることはまれであり、むしろその生成は、疾患の生理学（例：腫瘍環境のマトリックスメタロプロテイナーゼ）と関連する。それにもかかわらず、これらのインビトロ精製酵素／モノクローナル抗体の分解研究は、ヒトＩｇＧｓはヒト疾患と潜在的関連性を持つ数多くのプロテイナーゼに耐性が無いことを示唆した。
【００６２】
ＩｇＧ１をＦ（ａｂ’）2（大多数）に変換した酵素にとって、開裂は非常に特異的で自己限定的（Ｆｃ領域を小さなペプチドに減少させるペプシン消化とは異なる）であった。ＩｄｅＳを除いて、これらの細胞外プロテイナーゼの多くとのＩｇＧ１開裂の割合は、適条件下のペプシンとで見られたそれと比べて概して遅かった（例：ｐＨ４．０）。Ｆ（ａｂ’）2に対するタンパク質分解断片化は、単一開裂中間体を介した２段階過程で進行した。ＩｇＧ１の単一開裂中間体は、過去にＭＭＰ−３を用いた（Ｇｅａｒｉｎｇら、２００２）、及びＩｄｅＳを用いた（Ｖｅｎｃｅｎｔｓら、２００４）ＩｇＧｓの消化中に可能な中間体として提案された。現在の研究において、Ｆ（ａｂ’）2を生産する２番目の遅い開裂に比べて、単一開裂中間体への最初の開列は比較的速く発生したことが常に観察された。ここで報告する研究は、ＩｇＧ１はヒト循環においてＩｇＧの優性アイソタイプであるため、焦点を当てた。ＭＭＰ−３及びＩｄｅＳに対する相対的感受性を究明するために、限定された数のその他のヒトアイソタイプ実験が行われた。これらの中で、ＩｇＧ４は感受性においてＩｇＧ１に匹敵することが観察され、ここでＩｇＧ２及びＩｇＧ３はこれらの条件下で耐性を増した（データは示されず）。ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ分解に関する類似の調査はなされていない。
【００６３】
表１において全情報は要約されており、そこで「凝固プロテイナーゼ」はＦ．ＸＩＩａ、ＦＩＸａ、Ｆ．Ｘａ、トロンビン及び活性化タンパク質Ｃを含み、プラスミンはプラスミノーゲンをプラスミノーゲン活性剤と共培養したもの、ｔＰＡ、ストレプトキナーゼ及びスタフィロキナーゼ、「プラスミノーゲン活性剤のみ」は、プラスミノーゲンがないこと、ＭＭＰｓは材料に詳述するように組み換えプロテイナーゼ活性型として又はプロ酵素として入手したもの、及び「なし」は２４時間以内に検出可能な開裂を示す。別途記載されている場合を除いて全ての酵素はヒト酵素であった。残基番号は、ＩｇＧ１抗体重鎖用のＥＵ番号付けシステムで、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２５残基は、完全成熟重鎖の残基２１９〜２４３と一致する。
【００６４】
【表２】
0005530356.tif 000003
（１）Ｂａｒｒｅｔｔ  Ａ．Ｊ．、Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．及びＢａｒｒｅｔｔＡ．Ｊ．、Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．及びＷｏｅｓｓｎｅｒ  Ｊ．Ｆ．（Ｅｄｓ．）、「タンパク質分解酵素のハンドブック第１巻（Handbook of Proteolytic Enzymes Vol.1）」、エルザビア（Elsevier）、アムステルダム、２００４。
（２）Ｂａｒｒｅｔｔ  Ａ．Ｊ．、Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．ａｎｄ  Ｗｏｅｓｓｎｅｒ  Ｊ．Ｆ．（Ｅｄｓ．）、「タンパク質分解酵素のハンドブック第２巻（Handbook of Proteolytic Enzymes Vol.2）」、エルザビア（Elsevier）、アムステルダム、２００４。
（３）Ｐｏｗｅｒｓ、ＪＣ．．「タンパク質分解酵素と疾患治療（Proteolytic Enzymes and Disease Treatment）」１９８２．Ｉｎ：フィーニーとウィタカー（Feeney and Whitaker）（ｅｄｓ）。「タンパク質の修飾：食物的、栄養的及び薬理学的観点（Modification of Proteins:Food,Nutritional, and Pharmacological Aspects）」。「化学の進歩シリーズ１９８（Advances in Chemistry Series 198）」。ＡＣＳ、ワシントンＤ．Ｃ．、１９８２  ｐｐ３４７〜３６７。
（４）Ｔｃｈｅｔｖｅｒｉｋｏｖ  Ｉ．、Ｒｏｎｄａｙ  Ｈ．Ｋ．、ｖａｎ  ＥＩＢ．、Ｋｉｅｒｓ  Ｇ．Ｈ．、Ｖｅｒｚｉｊｌ  Ｎ．，ＴｅＫｏｐｐｅｌｅ  Ｊ．Ｍ．、Ｈｕｉｚｉｎｇａ  Ｔ．Ｗ．Ｊ．、ＤｅＧｒｏｏｔ  Ｊ．及びＨａｎｎｅｍａａｉｊｅｒ  Ｒ．、２００４。「リウマチ性関節炎患者の血清と滑液の一組の試料におけるＭＭＰプロファイル（MMP Profile in paired serum and synovial fluid samples of patients with rheumatoid arthritis.）」Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６３、８８１〜８８３。
（５）Ｖｉｎｃｅｎｔｓ  Ｂ．、ｖｏｎ  Ｐａｗｅｌ−Ｒａｍｍｉｎｇｅｎ  Ｕ．、Ｂｊｏｒｃｋ  Ｌ．及びＡｂｒａｈａｍｓｏｎ  Ｍ．、２００４．  「（連鎖球菌エンドペプチダーゼ、ＩｄｅＳの酵素的特性解析は、エキソサイト結合によるＩｇＧ開裂に対して厳密特異性を持つシステインプロテアーゼであることを示す。（Enzymatic characterization of the streptococcal endopeptidase、IdeS、reveals that it is a cysteine protease with strict specificity for IgG cleavage due to exosite binding．）」。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３、１５５４０〜１５５４９。
（６）Ｓｕｎ  Ｈ．、Ｒｉｎｇｄａｈｌ  Ｕ．、Ｈｏｍｅｉｓｔｅｒ  Ｊ．Ｗ．、Ｆａｙ  Ｗ．Ｐ．、Ｅｎｇｌｅｂｅｒｇ  Ｎ．Ｃ．、Ｙａｎｇ  Ａ．Ｙ．、Ｒｏｚｅｋ  Ｌ．Ｓ．、Ｗａｎｇ  Ｘ．、Ｓｊｏｂｒｉｎｇ  Ｕ．、Ｇｉｎｓｂｕｒｇ  Ｄ．、２００４。「プラスミノーゲンはＡ群連鎖球菌感染の必須宿主病原性因子である。（Plasminogen is a critical host pathogenicity factor for group A streptococcal infection.）」Ｓｃｉｅｎｃｅ．３０５、１２８３〜１２８６。
【００６５】
実施例２：炎症性滲出物中のＩＧＧの開裂
炎症性滲出物及びその他のそのような液体は、炎症及び創傷治癒に関連するタンパク質分解酵素を所有するはずである。この目的のために、創傷液の試料をＥｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．より入手した。
【００６６】
最初に、ヒト重鎖定常領域を含む抗体基質を無作為にビオチン化した。１０マイクロリットルのビオチン化基質抗体を１９０μＬの創傷液に加え、３７℃で８〜２４時間培養した。特定の時間に、試料を取り出した。出発ＩｇＧ及び様々な時間での試料が、別々のウェルで４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルに適用され、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を受ける。別々のバンドは、ニトロセルロース膜に移動し、０．１％ツイーン２０及び１０％ブロッキンググレードの牛乳（「ブロット」）を含む０．１Ｍトリス緩衝食塩水でブロッキングし、ＡＶＩＤＩＮ−Ｄ西洋ワサビペルオキシダーゼ試薬に続いてＴＭＢ（膜）基質を用いてブロットを展開させた。
【００６７】
図４に示すゲル画像から明らかであるように、無傷ＩｇＧが８時間で消失し、Ｆ（ａｂ’）２及びＦａｂ標準のサイズに類似したバンドが出現した。この実験結果は、炎症性液体における酵素によるＩｇＧのタンパク質分解は、数時間にわたって起こり、精製酵素を用いたインビトロタンパク質分解によって作製される断片に一致する断片を生産することを示唆した。
【００６８】
実施例３：試薬の調製
内因性プロテアーゼによって作製される宿主（患者）抗体断片の存在の確認は、開裂ＩｇＧに選択的に結合するが無傷ＩｇＧには結合しない試薬を必要とする。開裂成分の認識及び正常集団と比較した疾患患者からの試料の断片量間の定量的差はどちらも、試薬を用いて評価できるはずである。
【００６９】
比較的高濃度の無傷ＩｇＧを含む未知だが恐らく少量のＩｇＧと思われる断片を液体中に検出することは難しい。ｓｃＩｇＧはＩｇＧ開裂断片（Gearing 2002 supra）の可能性があると記載されているが、ヒト試料の定量化は過去に行われていない。このため、必要な特異性を持つ試薬が、開裂ＩｇＧに高い特異性を持つが、無傷ＩｇＧには持たないウサギに作製された。
【００７０】
ヒトＩｇＧ１ヒンジの３つの結合、及び徐々に長くなる単一鎖ペプチド類似体が免疫付与に用いられた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにおいて）。ＭＭＰ−３開裂部位のアミノ末端側のアミノ酸配列に対応する８−ｍｅｒペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にＮ−末端（ＴＣＰＰＣＰＡＰ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基７〜１４）を介して共有結合された。グルタミルエンドペプチダーゼ部位（ＴＣＰＰＣＰＡＰＥ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基７〜１５）及びＩｄｅＳ部位（ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基７〜１８）に対応する延長ペプチドは、免疫原として別々に準備された。ニュージーランドウサギ（１免疫原につき２匹）は、完全フロインドアジュバントの０．２ｍｇ共役ペプチドの皮下注射により免疫を与えられ、フロイント不完全アジュバントの０．１ｍｇ抗原で更に３回、１４日、４２日、及び５６日に追加免疫を与えられた。４週間、８週間及び１０週間で血清が収集され、免疫原毎に抗体精製のためにプールした。免疫タイターは、固相抗原ペプチドに基づくＥＬＩＳＡによってモニターされた。
【００７１】
抗体の親和性精製は、活性化支持体で固定化したそれぞれのペプチド抗原を利用した。同一抗原で免疫付与された２匹のウサギからの抗血清は、プールされ、抗原カラムを完全に洗浄した後で抗原カラムを通された。特定の抗体は、それぞれ３Ｍ  ＫＳＣＮ及び０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．５を使用して低親和性及び高親和性プールとして溶出された。２つのプールは、区別のできない結合特性を生み出し、交互に用いられた又は／及びプールされた。３つの結合抗体の溶解プールは、次に、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（Ｍａｂ３）から成る無傷抗体を含むカラム上の２番目の親和性吸着段階の対象となった。２番目の親和性色層分析段階の意図は無傷ＩｇＧを認識し得る望ましくない抗体を除去することであった。しかしながら、ＩｇＧカラムが吸収したウサギ抗体はほとんど又は全くなく、抗体群は、カルボキシ基末端が露出した「開裂した」配列とのみ反作用を示すことを示唆した。
【００７２】
個々のアフィニティー精製したウサギ抗ペプチド抗体は、ヒトＩｇＧの酵素的生成断片並びにＥＬＩＳＡによる無傷ＩｇＧへの結合能力を検査された（図５）。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基７〜１４（ＭＭＰ−３部位類似体）に共役するＫＬＨに免疫を持つウサギからの精製抗体は、無傷ＩｇＧに結合せず、ＭＭＰ−３を用いたＩｇＧの消化によって生成されたｓｃＩｇＧ及びＦ（ａｂ’）2への特異性が高かった。この抗体調製は、Ｖ８プロテアーゼ及びＩｄｅＳで製作されたｓｃＩｇＧ及びＦ（ａｂ’）2に対して最小の反作用を示した。対照的に、Ｖ８開裂部位ヒンジペプチド類似体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基７〜１５）及びＩｄｅＳ開裂部位ヒンジペプチド類似体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基７〜１８）に免疫を持つウサギから得られた抗体は、これら２つの酵素のうちいずれかで生成されたｓｃＩｇＧｓ及びＦ（ａｂ’）2に対して交差反応性結合プロファイルを示した。しかしながら、これらの調製は、ＭＭＰ−３消化産物に対して最小の反応性を示した。抗体調製で無傷ＩｇＧと結合するものは無く、抗体調製で図６に示されるように、３つの異なる酵素で生成されたＦ（ａｂ’）2及びｓｃＩｇＧを含む断片と同等の反作用を示すものは無かった。
【００７３】
抗ヒンジ試薬の使用目的は、複雑な生体内設定で疾患特異的な組織に存在する酵素によって、又は例えば浸潤性マクロファージ又は好中球のような、疾患特異的な細胞型若しくは細胞集団によって生成されたｓｃＩｇＧｓ及びＦ（ａｂ’）2（及びその他の潜在的断片）の検出である。潜在的ＩｇＧ断片の最適包括域に関して、開裂部位認識のプロファイルは出来る限り広いことが望ましいと考えられた。このため、後に続くウエスタンブロット法及び血清ベースのＥＬＩＳＡ検査での使用のために、３匹のウサギ抗体プールを混合したものが、それぞれの成分の０．３３ｍｇ／ｍＬで調製され（合計＝１ｍｇ／ｍＬ）。この試薬プールは、ＲＡＨ−１と呼ばれる。
【００７４】
実施例４：単鎖開裂免疫グロブリン分析
捕獲試薬として、開裂ヒトＩｇＧを結合可能だが、無傷ヒトＩｇＧは結合できないＲＡＨ−１を使用する血清にｓｃＩｇＧを検出するために用いられた新しい分析は以下で詳細に説明される。
【００７５】
化学ルミネッセンスＥＬＩＳＡを使用して、Ｎｕｎｃ社化学ルミネッセンス９６ウェルプレートの領域が、ＰＢＳで１０ｍｇ／ｍＬのＲＡＨ−１でコーティングされた。残りのプレートはコーティングせずにそのままの状態であった（１Ｘ  ＰＢＳのみ）。プレートを、４℃で一晩培養した。プレートを洗浄し、２００ｍＬ／ウェルのＣｈｅｍｉｃｏｎ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのＣｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲ（Ｃ＃２１６０）をプレートに添加し、３７℃で３０分間培養した。ブロッキング緩衝液は、ウェルから吸引され、標準と試料がプレートに加えられた。標準のＭａｂ３、Ｖ８で消化されたｓｃＩｇＧは、１％カゼイン及び３％ＢＳＡを含むＰＢＳで５０ｍｇ／ｍＬで開始し、４倍連続希釈法を用いて複製に添加された。疾患血清試料は、１：５０希釈で同じ緩衝液に添加された。プレートを洗浄し、ウサギを含む様々な動物に対して最小限の交差反応を持つ１：６０００希釈Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  ＲｅｓｅａｒｃｈのＨＲＰ共役ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ’）2Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｄｏｎｋｅｙ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）が全ウェルに添加された。これは、１％カゼイン及び３％ＢＳＡを含むＰＢＳ希釈に添加され、３７℃で１時間培養した。プレートを十分に洗浄し、発光リーダーでプレートを読み取った数秒後に、１００ｍＬ／ウェルのＨＲＰ基質（Ｒｏｃｈｅ’ｓ  ＢＭ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ＰＯＤ、５８２  ９５０）を加えた。
【００７６】
ＲＡＨ−１コートにさらされた全てのウェルから、スタンダード曲線の０ｎｇ／ｍＬ  ｓｃＩｇＧウェルからの平均発光値を差し引いた。差し引くことで、ＲＡＨ−１との２次抗体の非特異性反応が制御される。次に、前もって調整したＲＡＨコーティングウェルの値から、非ＲＡＨコーティングウェルのそれぞれのドナーの値を差し引いた。これは、プレートへの血清の非特異性反応を説明する。
【００７７】
実施例５：疾患に関連するタンパク質分解活動を検出するための試薬の使用
ＲＡＨ−１試薬は、ＩｇＧ断片を他の炎症液体、関節リウマチ（ＲＡ）患者の滑液内に検出するその能力を検査された。
【００７８】
ＲＡ患者からの滑液試料の収集は、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎから購入した。試料は、ＬＤＳ試料緩衝液で１：５に希釈され、それぞれの試料の１０ｍｃｉｒｏＬを４〜１２％のビス−トリスゲルに載せた。ＲＡＨ−１反応性のコントロールとして、無傷ＩｇＧ（Ｍａｂ３）、プロテアーゼ消化ＩｇＧ（ＭＭＰ−３でのＭａｂ３の部分消化、グルタミルエンドペプチダーゼ及びＩｄｅＳ）もまたゲルに載せた。ＳＤＳ  ＰＡＧＥに続いて、ゲルをニトロセルロース膜に移動し、Ｂｌｏｔｔｏでブロックした。次に膜をｂｌｏｔｔｏのＲＡＨ−１の１：２，５００希釈で培養し、０．１％ツイーン２０を含むｐＨ７．５の０．１Ｍトリス緩衝食塩水で洗浄し、１：５，０００希釈のヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）西洋ワサビペルオキシダーゼ共役で培養した。次にＴＭＢ膜を使用してブロットを展開した。図７に示すように、ＲＡＨ−１調製は無傷ＩｇＧと反応しなかったが、３つのプロテアーゼ全てからｓｃＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）2恐らくＦａｂ’を検出した。５つのＲＡ患者の滑液試料全てにおいて、ｓｃＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）2及びＦａｂ’とおよそ同じサイズのバンドが検出され、３つのタンパク質分解断片はそれぞれのＲＡ患者の滑液に存在したことを示唆した。
【００７９】
実施例６：疾患をモニターするための試薬の使用
血漿及び血清は、バイオマーカー検査において、滑液のような生体液又は組織抽出物よりも便宜性が高い。しかしながら、滑液の利点は、内蔵型であることと、プロテアーゼを活性化し、実施例２で述べたようにＩｇＧ断片が蓄積することが期待される局所環境であることである。それにもかかわらず、検査用血清の容易さと普及が、ＩｇＧ分解産物を含むバイオマーカー用試料組織としての可能性をかなり高めている。
【００８０】
異なる種と血清源のＩｇＧ断片の検査を初期化する前に、任意のタンパク分解ＩｇＧ断片が、その蓄積及び数量化を可能にするために十分な期間中循環するかを定めることが好ましい。これに応答して、比較薬物動態学的研究が計画された。以下のマウスにおけるＰＫ実験は、ヒトＩｇＧｓが一般に１０〜２０日の終末半減期を示した過去のいくつかの同様な研究報告をモデルとした。
【００８１】
断片化したタンパク質分解産物、ＭＭＰ−３によって生成されたＭａｂ２  ＩｇＧ１、ｓｃＩｇＧ及びＦ（ａｂ’）2は、以下のように調製された。２０ミリグラム量のＭａｂ２  ＩｇＧは、実施例１で述べたように、加熱によって活性化するＭＭＰ−３で分解された。酵素を１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ７．５、３７℃のトリス緩衝食塩水を含むＭａｂ２の４ｍｇ／ｍＬ溶液に添加することにより、消化が開始した。ＥＤＴＡを２０ｍＭの最終濃度に４８時間目で添加することにより反応を終了した。無傷ＩｇＧ残留物は無く、アジレント社のｂｉｏ−ｓｉｚｉｎｇ解析に基づいた（８８２６−６７）ｓｃＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）2及びＦｃの割合はそれぞれ、２４％、４１％、３６％であった。終了した消化は、Ｆｃ断片を除去し、精製ｓｃＩｇＧ及びＦ（ａｂ）2を分離するために２段階精製を受けた。第１段階では、消化はタンパク質Ａセファロースを用いた色層分析を受けた。カラムからの非結合材料は、Ｆ（ａｂ）2断片を含み、検出可能な無傷ＩｇＧ又はｓｃＩｇＧ含まなかった。ｐＨ３．５の０．１Ｍクエン酸ナトリウムでのカラムの処置は、Ｆｃを含む成分、Ｆｃ断片、及びｓｃＩｇＧの混合物の溶出をもたらした。断片は、体積の１／１０の２Ｍトリス、ｐＨ７．０を加えることにより直ちにｐＨ７に中和された。中和された物質は、約１ｍＬに濃縮され、ｐＨ７．５のリン酸緩衝生理食塩水に透析された。Ｆｃ断片は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（カラム体積＝１００ｍＬ）のサイズ排除クロマトグラフィーによってｓｃＩｇＧから分離された。１３５ｋＤａとして前述したアジレント社（Agilent）のｂｉｏｓｉｚｉｎｇ技術を使用して後に認識された、カラムから溶出した２つのピークは、ゲルバンド位置及び約３５ｋＤａのＦｃモノマー断片によって確認されたより低い分子量のピークと一致した。マウスにおける許容静脈内注射（＜４０ＥＵ／ｋｇ）のＡＡＬＡＣ特異性に対する内毒素を低減するために、精製ｓｃＩｇＧ及びＦ（ａｂ）2の成分は、アクティクリーン・イートックス（ActiCleanEtox）（それぞれの５ｍＬのプロテイン溶液につき０．５ｍＬのゲル）と接触した。
【００８２】
この研究のために、無傷マウス−ヒトキメラモノクローナル抗体の等価ミリグラム量（１．９ｍｇ／ｋｇ）、Ｍａｂ２  ＩｇＧ１、ＭＭＰ−３によって生成されたｓｃＩｇＧ及びＦ（ａｂ’）２は、下記のように検査された。
【００８３】
２１匹のメスＢａｌｂ／ｃマウス群（エース・アニマルズ（Ace Animals））がｐＫ研究に使用された。終末血は、心穿刺を介して実験前に無作為に対象基準として選択されたマウス３匹から採集された。残りの１８匹のメスＢａｌｂ／ｃマウスは、秤量され、同等の６つのグループに配置された。２つのグループには無傷Ｍａｂ２  ＩｇＧ１、２つのグループにはＭＭＰ−３で生成したＭａｂ２  ｓｃＩｇＧ１、２つのグループにはＭＭＰ−３で生成したＭａｂ２  Ｆ（ａｂ’）２が注射された。全ての注射は、それぞれの動物の体重０．１９ｍｇ／ｍＬに基づいた、一定投与量１０ｍＬ／ｋｇでの腹腔内投与であった。したがって、それぞれの動物は、第０日に１．９ｍｇ／ｋｇの投与量を与えられた。約８０μＬの血液が２つのグループのうち最初のグループから１時間、２４時間、７日、２１日、３５日、２番目のグループからは５時間、４８時間、１４日、２８日に採血された。血清試料は、検査時まで２０℃で保管された。
【００８４】
採集した血清のＩｇＧ及びＩｇＧ断片濃度は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって定量化された。Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−ｒｅｓｅａｒｃｈのＰＢＳの０．５μｇ／ｍＬ稀釈：ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異性（ウシ、ウマ、及びマウス血清タンパク質に対する最小交差反応）を用いてＣｏｓｔａｒ  ３３６９プレートをコーティングした。プレートは、ＰＢＳ／カゼイン／ＢＳＡでブロックされた。ブロッキングに続いて、標準と試料をＰＢＳ／１％カゼイン／３％ＢＳＡに加えた。標準は、以下の連続希釈を含んだ：マウス／ヒトＩｇＧ１、マウス／ヒトｓｃＩｇＧ１  ＭＭＰ−３又はマウス／ヒト１０００ｎｇ／ｍＬから開始するヒトＦ（ａｂ’）２  ＭＭＰ−３。それぞれの時点での試料はＰＢＳの１：１０から１：１６３，８４０まで連続的に希釈された／１％カゼイン／３％ＢＳＡ。抗ヒト捕獲抗体でコーティングされたプレートに結合したヒトＩｇＧｓは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−ｒｅｓｅａｒｃｈの：ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ウシ、ウマ、及びマウス血清タンパク質に対する最小交差反応、１０９−０３５−０８３）５０μＬ／ｗｅｌｌと検出され、ＲＴで１時間培養された。プレートを十分に洗浄し、５０μＬ／ｗｅｌｌ  Ｏ−フェニレンジアミン基質に約１０分さらし、５０μＬ／ｗｅｌｌ３Ｍ  ＨＣＬで終了し、４９０〜６５０ｎｍで読み取った。結果を図８に示す。
【００８５】
マウスＰＫの実験結果は、ｓｃＩｇＧは延長した循環生存期間を持つが、Ｆ（ａｂ’）2は持たないことを示した。マウスにおけるＦ（ａｂ’）2の非常に急速な排除は、ヒトにおけるこの断片の急速な消失と一致する（Ｒｏｓｋｏｓ  ＬＫら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．６１：１０８〜１２０、２００４）。これらの結果は、バイオマークとしての目的には、ｓｃＩｇＧが最も豊富な、生存期間の長い、実用的なＩｇＧのタンパク質分解成分であることを示した。
【００８６】
実施例７：疾患におけるタンパク質分解酵素
ｓｃＩｇＧが実用的な疾患バイオマークとなるためには、定義された疾患分類から入手された試料における健常者と比較した差分量を示さなければならない。
【００８７】
疾患個人からの血清の商業的供給源は、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ（現Ｓｅｒａ  Ｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）と特定した。異なる１０人８疾患からの少量（３００μＬ）の血清が購入された。疾患分類は、関節リウマチ、変形性関節症、ぜんそく、１型糖尿病、乳がん、肺がん、心筋梗塞、及びうっ血性心不全であった。更に、血清年齢適合及び性別適合の２８人の健常者ボランティアからの血清をこの業者から対照群として入手した。
【００８８】
実施例４に詳述したように分析を用いて、試料が分析され、その結果は図９に示されている。ＲＡＨ−１試薬の選択性に基づく分析は、既知の特定のプロテアーゼによって生成されたものと同等であるＩｇＧ開裂産物は、明らかに検出可能で、炎症性自己免疫疾患、関節リウマチに関して健常ドナーではレベルを超えて維持されたことを証明した。対照的に、変形性関節症患者のレベルは、健常者の試料と同様のレベル及び健常者のレベルの範囲内を示した。
【００８９】
実施例８：修飾単鎖開裂ＩＧＧ分析
血清中のｓｃＩｇＧ検出のために試薬ＲＡＨ−１を用いる固相分析、ＥＬＩＳＡについては、実施例４において詳述した。ｓｃＩｇＧ濃度血清試料の検出範囲を最大化するために、特定の変更を加えた。
【００９０】
使用されたプレートは、プレートを封着し１時間室温で培養することにより、濃度５μｇ／ｍＬのＰＢＳｐＨ７．２（ウェルにつき１００μＬ）ウサギポリクローナル抗体（ＲＡＨ−１）でコーティングされたＩｍｍｕｌｏｎ  ４ＨＢＸプレート（ＶＷＲ）。次に、プレートをＰＢＳ、０．０５％ツイーン（Ｓｉｇｍａ社）で３回自動プレート洗浄器で洗浄した。全ての試料と標準は、１％ＢＳＡ、０．０５％ツイーンを含むＰＢＳで希釈された。抗ＩｇＧ  Ｆｃ−ビオチン（US Blologicals、 Swampscott、 MA）は、血清希釈のｓｃＩｇＧ標準及びｓｃＩｇＧ不明検出の方法である。
【００９１】
プレートを、２００μＬのＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Pierce）を使用してブロックし、１５分間室温（ＲＴ）で振盪し、その後プレートをＰＢＳ、０．０５％ツイーンで３回自動プレート洗浄器で洗浄した。
【００９２】
標準材料、Ｍａｂ１プロテアーゼ消化産物は、複製ウェルに６００ｎｇ／ｍＬから開始して添加された（ウェルにつき１００μＬ、３倍数希釈）。血清試料は、１：１００、１：２００、１：４００等で必要に応じて希釈された）。試料は、複製に同時に添加され、振とう器にて室温で１時間培養し、続いてＰＢＳ、０．０５％ツイーンで３回自動プレート洗浄器で洗浄した。
【００９３】
１：２０，０００のＩｇＧＦｃビオチン希釈（分析緩衝液で希釈された）をすべてのウェルに加え（ウェルにつき１００μＬ、振とう器にて室温で１時間培養し、続いてＰＢＳ、０．０５％ツイーンで３回自動プレート洗浄器で洗浄した）。
【００９４】
ＳＡ−ＨＲＰ（ＰＢＳ、０．０５％ツイーン、１％ＢＳＡで１：３０，０００に希釈して使用した西洋ワサビペルオキシダーゼ、Ｓｉｇｍａ、と共役なストレプトアビジン）がすべてのウェルに添加された（ウェルにつき１００μＬ、振とう器にて室温で１時間培養し、続いてＰＢＳ、０．０５％ツイーンで３回自動プレート洗浄器で洗浄した。
【００９５】
最後に、業者（Ｓｉｇｍａ）によって提供されたままの１００μＬのＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ペルオキシダーゼ基質）をそれぞれのウェルに加え、色反応のため約１０分間培養した。反応は、７５μＬの１Ｎ  Ｈ2Ｓ０４で終了させ、プレートを４５０ｎｍで読んだ。
【００９６】
上記のＥＬＩＳＡ形式を用いて、分析は、健常血清におけるｓｃＩｇＧの大幅に改善された直線性及びスパイク回復を立証した。分析の稀釈の直線性は、２つの血清プールにおいて決定され、１：１００に希釈され、濃度１５０ｎｇ／ｍＬ及び３００ｎｇ／ｍＬのＭａｂ１が添加され、更に濃度０、２５、７５、及び１００％の血清に希釈された。試料希釈のそれぞれは、３重で分析され、中間分析物回復が算出された。直線性は、それぞれの試料プールの観察値（ｙ軸）対分析物回復結果の期待値（ｘ軸）の関係を示す図からのＲ２相関係数を計算して評価された。Ｒ２値は：試料１低０．９９８３、試料１高０．９９１３、試料２低０．９８５２、試料２高０．９７３、及び稀釈の直線性は全ての希釈において１００％であった。
【００９７】
実施例９：血清における単鎖開裂ＩＧＧの検出
ＲＡ患者からの血清は、この患者のグループからのいくつかの血清試料が対照と比べて著しく高いｓｃＩｇＧを示した実施例４の結果を更に研究するために排他的に使用された。
【００９８】
関節リウマチ（ＲＡ）を持つ対象１０人及び年齢及び性別適合の健常者１０人からの血清試料をＧｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ社より入手した。実施例８で述べた修正分析を使用して、試料を分析し、その結果を図１０に示す。結果は、ＲＡを持つ対象１０人のうち４人が血清ｓｃＩｇＧの濃度＞６０μｇ／ｍＬを明示した。健常な対照群では、ｓｃＩｇＧ濃度は、＜８．２μｇ／ｍＬ〜５２．７μｇ／ｍＬに及んだ。この比較のための試料は、疾患過程、治療計画等に厳密に選択されなかった。したがって、健常及び疾患に関連する血清ｓｃＩｇＧの更なる弁別が、よくコントロールされ、前向きにデザインされた臨床試験の患者の縦断的解析において起こり得ることが期待できる。しかしながら、現在のこれらの商業試料の分析は、上昇したｓｃＩｇＧ濃度が疾患患者に検出されることを示唆した。
【００９９】
実施例１０：抗ヒンジＩＧＧモノクローナル抗体の調製
製造及びヒト患者における潜在的使用のために、開裂ＩｇＧを結合し、無傷ＩｇＧを結合しないクローナル抗体のような、定義された分子を生産することが理想的である。以下の手順は、このような分子生産の方法を示す。
【０１００】
ヒトＩｇＧ１下部ヒンジの１２−ｍｅｒペプチド類似体及び隣接するＣＨ２領域は、免疫原である：ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基７〜１８）。自然発生的なシステインは、変異型ＴＡＰＰＡＰＡＰＥＬＬＧを与えるためにアラニンによって置き換えられた。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）への結合を可能にするため、遊離スルフヒドリルに対する反応の標準化学手法によって、Ｎ末端システインを追加した。最終免疫原は、ＫＬＨ−ＣＴＡＰＰＡＰＡＰＥＬＬＧである。
【０１０１】
ニュージーランドシロウサギ（３）に頻回皮下部位（５）を使用して完全フロインドアジュバントの０．５ｍｇＫＬＨペプチドで免疫付与した。動物は、フロイント不完全アジュバントの０．２５ｍｇ免疫原で３週間毎、計４回の追加免疫を与えられた。
【０１０２】
同一ペプチドのＢＳＡ−結合異型の血清抗体滴定濃度は、標準ＥＬＩＳＡ法によって、免疫付与の過程においてモニターされた。動物（２）は、滴定濃度データに基づき、脾臓摘出に選ばれた。ウサギハイブリドーマは、ウサギ溶融パートナー細胞と融合した脾臓誘導のリンパ球から生成された（Spieker-Polet、 1995 PNAS USA 92:9348-9352）。複数のプレートでの溶融２〜３週間後、細胞増殖を観察した。
【０１０３】
陽性ハイブリドーマをＢＳＡ免疫原ペプチド結合でコーティングされたプレート上のＥＬＩＳＡを介してスクリーニングした。それぞれの溶融から複数の陽性クローンが確認された。更なるスクリーニングには、無傷ＩｇＧ１及びＩｇＧ１の様々な酵素生成Ｆ（ａｂ’）２断片への結合を含んだ。これらのスクリーニング又はカウンタースクリーニング策には、免疫原ペプチドへの及び免疫原ペプチドの末端又は近くの末端、及び無傷ＩｇＧ１との最小結合を持つＦ（ａｂ’）２断片への結合の強い選択性に基づいて、３つのクローンが選択された。陽性ハイブリドーマは、サブクローンされ、拡大された。
【０１０４】
ウサギＩｇＧは、固定化タンパク質Ａの色層分析を含む標準方法によって個別セル浮遊物から精製された。精製されたウサギＩｇＧｓのヒトＩｇＧ１ヒンジのペプチド類似体への結合の特異性、並びにＩｄｅＳ及びＭＭＰ−３酵素を使用した単一又は二重開裂Ｍａｂｓを使用して形成された無傷ＩｇＧと精製ＩｇＧＦ（ａｂ’）２断片は、標準ＥＬＩＳＡ手順で検査された。簡単には、標準ペプチド化学によって合成され、Ｎ末端ビオチン化したペプチドは、ストレプトアビジンでコーティングされたウェルに捕捉された。ＩｇＧ及び断片は、直接１０μｇ／ｍＬでコーティングされた。ウサギｍＡｂｓの結合は、よく特徴づけられたヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃ−西洋ワサビペルオキシダーゼ及びＯＰＤ基質システムによって検出された。
【０１０５】
ウサギｍＡｂ  ９１〜２のＥＬＩＳＡ結果は、図１１に示されている。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１６〜２２（Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｖ−Ｆ）で終結する下部ヒンジペプチドへの明らかな結合選択性があった。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の３〜１６（Ｄ−Ｋ−Ｔ−Ｈ−Ｔ−Ｃ−Ｐ−Ｐ−Ｃ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｌ−）に包括される上部ヒンジ、コアヒンジ、又は初期下部ヒンジのこれらの部位に一致する上流残基への結合はほとんどなし又はなしであった。ＭＭＰ−３に生成されたＦ（ａｂ’）２断片及びｓｃＩｇＧ断片へのごくわずかな結合があった（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１４と１５（Ｐ−Ａ−Ｐ*Ｅ−Ｌ−Ｌ）との間のＭＭＰ−３開裂部位でのペプチド類似体への結合不足と一致する）。対照的に、ＩｄｅＳによって生成されたＦ（ａｂ’）２断片及びｓｃＩｇＧへのかなりの結合が見られた。したがって、ウサギｍＡｂ結合特異性は、それを引き起こした免疫原によく適合した。直接コーティングされたｒｂ（ウサギ）ＩｇＧは、陽性対照であった。
【０１０６】
補体測定
ＷＩＬ２−Ｓ細胞、ＣＤ２０（ＡＴＣＣ）を抽出するリンパ芽球様Ｂ細胞株は、ＣＤＣ分析の標的細胞として使用された。５０μＬの細胞が、９６ウェルプレートのウェルに添加され、ＲＰＭＩ、５％加熱不活性化したＦＢＳ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（５００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（５００Ｕ／ｍＬ）、２ｍＭＬグルタミンのウェルにつき最終濃度８×１０4の細胞を得た。様々な濃度の抗体と共に又は抗体なしで付加的５０μＬをウェルに添加し、プレートを、室温で２時間培養した。５０μＬの１０％ウサギ補体（Invitrogen）をウェルに添加し、プレートを２０分、３７℃で培養した。全ての試料は、３重で実行された。プレートは、２００ｇで３分間遠心分離され、プレートを分離するために、５０μＬの上澄みを除き、ＣＤＣをＬＤＨ細胞毒性探知キット（Roche）を使用して測定した。吸収度をＳｐｅｃｔｒａ  ｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４（PerkinElmer）を使用して測定した。データを、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Sigma Aldrich）及び細胞と補体のみを含む最小コントロールで最高細胞毒性に正規化した。
【０１０７】
図１２は、３つのウサギ抗ヒンジｍＡｂｓがＣＤ２０を結合する抗体のＦ（ａｂ’）２断片の固定濃度の存在下で滴定される時に、補体依存細胞溶解を標的細胞に回復させることができたことを示す。ウサギｍＡｂｓは、ポリクローナルウサギ抗ヒンジｍＡｂ調製（上記で述べた同一の血清ｓｃＩｇＧ検出システムの成分）よりも低い濃度でより効果的であった。ＣＤ２０の無傷抗体は予想したとおり活性であったが、そのＦ（ａｂ’）２断片及びｓｃＩｇＧ種類のみは、活性ではなかった。ウサギ抗ヒンジｍＡｂｓは、細胞を結合するＦ（ａｂ’）２断片が無いときは細胞溶解を誘導することができなかった。これらの結果は、モノクローナル抗ヒンジ抗体は、補体媒介エフェクター機能をさもなければ不活性のタンパク質分解開裂産物ＩｇＧ１に再構築することが可能であることを実証した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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