(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のａ）〜ｂ）のいずれかを含み、かつ、１つ以上の反すう動物メタン生成菌に特異的な溶解酵素活性を有する、単離されたポリペプチド：
ａ）配列番号６３のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を共有するアミノ酸配列。
【請求項２】
以下のａ）〜ｃ）のいずれかを含む、単離されたポリヌクレオチド：
ａ）配列番号６３のアミノ酸配列をコードする核酸配列、
ｂ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を共有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、１つ以上の反すう動物メタン生成菌に特異的な溶解酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列、
ｃ）前記ａ）〜ｂ）のいずれかと相補的な核酸配列。
【請求項３】
以下のａ）またはｂ）を含むベクター：
ａ）請求項１に記載のポリペプチドをコードするベクター、
ｂ）請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４】
以下のａ）〜ｃ）のいずれかのホスト細胞：
ａ）請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含むように遺伝的に改変されたホスト細胞、
ｂ）請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むように遺伝的に改変されたホスト細胞、
ｃ）請求項３に記載のベクターを含むホスト細胞。
【請求項５】
原核生物またはメタン生成菌である、請求項４に記載のホスト細胞。
【請求項６】
大腸菌（Escherichia coli）、またはメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Methanobrevibacter ruminantium）のＭ１T株（ＤＳＭ１０９３）を含むメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Methanobrevibacter ruminantium）である、請求項５に記載のホスト細胞。
【請求項７】
以下のａ）またはｂ）を含む、抱合体分子または融合体分子：
ａ）請求項１に記載のポリペプチド、
ｂ）請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１に記載のポリペプチドを含む抱合体分子または融合体分子であって、抗メタン生成化合物、シグナル配列、抗体もしくは抗体断片、ペプチド核酸、抗菌ペプチド、または抗生剤をさらに含む、抱合体分子または融合体分子。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチドに結合する、抗体または抗体断片。
【請求項１０】
モノクローナルである、請求項９に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１１】
以下のａ）またはｂ）を含む、単離された組み換えファージ：
ａ）少なくとも１つの請求項１に記載のポリペプチド、
ｂ）少なくとも１つの請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
以下のａ）〜ｄ）のいずれかを含む、医薬組成物：
ａ）請求項１に記載のポリペプチド、
ｂ）請求項２に記載のポリヌクレオチド、
ｃ）請求項３に記載のベクター、
ｄ）請求項１１に記載のファージ。
【請求項１３】
メタン生成菌細胞を抑制する方法であって、
ａ）請求項１に記載のポリペプチドを産生または単離すること、および
ｂ）該細胞を該ポリペプチドに接触させることを含む方法。
【請求項１４】
メタン生成菌細胞を抑制する方法であって、
ａ）請求項７または８に記載の抱合体分子を産生または単離すること、および
ｂ）該細胞を該抱合体分子に接触させることを含む方法。
【請求項１５】
メタン生成菌細胞を抑制する方法であって、
ａ）請求項１１に記載のファージを産生または単離すること、および
ｂ）該細胞を該ファージに接触させることを含む方法。
【請求項１６】
前記細胞が反すう胃のメタン生成菌である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞がメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Methanobrevibacter ruminantium）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞がメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Methanobrevibacter ruminantium）のＭ１T株（ＤＳＭ１０９３）である、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００７年９月２５日に提出した米国特許出願第６０／９７５，１０４号、２００７年１１月２２日に提出した米国特許出願第６０／９８９，８４０号、および２００７年１１月２２日に提出した米国特許出願第６０／９８９，８４１号の利益を主張するものであり、これら全ての出願内容はその全体が参照によりここに取り込まれる。
【０００２】
本発明は、微生物細胞、特にメタン生成菌細胞へ抑制性分子を送達するための組成物および方法に関する。特に本発明は、ファージ誘導、ファージ粒子、ファージゲノム、およびファージポリペプチドも含む、新たに同定されたファージφｍｒｕ、同様にこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、これらのポリペプチドを産生するための発現ベクターおよびホスト細胞にも関する。本発明はさらに、開示されるファージ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター、およびホスト細胞を用いて、微生物細胞、特にメタン生成菌細胞を検出、標的化、および抑制するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ニュージーランドにおいては、農業活動が温室効果ガス排出の大部分を占める。従って農業による温室効果ガス排出を減少させることは、京都議定書によるニュージーランドの義務に応じるため重要である。この議定書は、最初の公約期間（２００８〜２０１２）の終了までに温室効果ガスを１９９０年のレベルにまで減少させることを要求している。このため農業部門集団およびニュージーランド政府は、ニュージーランドの農業温室効果ガス排出を減少させる方法を同定するため、牧畜温室効果ガス研究コンソーシアム（ＰＧＧＲＣ）を設立した。
【０００４】
ＰＧＧＲＣ活動の重要な部分は、ニュージーランドで放牧される反すう動物からのメタン排出減少に対して研究を進めてきた。反すう動物からのメタン排出を軽減することについては、二つの理由から商業的に関心を持たれている。第一は、京都議定書による確約に応じないことは、政府にカーボン・クレジットの購入を強制することであり、現在のところこれは３億５千万ドルになると推定される。第二は、メタン生成は反すう胃において産生される総エネルギーの８〜１２％の損失をもたらすことである。反すう動物の生産性を改善する代わりにこのエネルギーを使用することが可能であるかもしれない。
【０００５】
メタンは、古細菌（Euryarchaeota）界のユリ古細菌（Archaea）門の一部である、メタン生成菌と呼ばれる微生物により反すう胃において産生される。ほとんどのメタン生成菌はＣＯ2およびＨ2を唯一のエネルギー源として生育するが、あるものは生育のために酢酸またはメチル化合物を使用できる。反すう胃には、メタン生成古細菌の幾つかの異なる属が存在するが、メタノブレビバクター（Methanobrevibacter）属の種、特にＭ．ルミナンチウム（M.ruminantium）、およびＭ．スミシー（M.smithii）は、ニュージーランドの反すう動物における主なメタン生成菌であると考えられている。現在のところＭ．ルミナンチウム（M.ruminantium）が、ＰＧＧＲＣより助成金を得ているゲノム配列決定プロジェクトの課題である。このプロジェクトは反すう胃のメタン生成菌の最初のゲノム配列決定であり、メタン形成抑制の標的を発見するためのメタノブレビバクター生物学のより良い理解の確立を目的とする。
【０００６】
反すう胃におけるメタン生成の減少には、メタン生成菌の抑制またはそれらのメタン生成経路の不活性化が要求される。メタン産生の抑制方法は、メタン生成菌細胞内へ特定の抑制性分子を送達することである。これは例えば、メタン生成菌を特異的に標的とする薬剤、例えばバクテリオファージの使用により達成されてよい。非反すう動物メタン生成菌に対する幾つかのファージが特徴付けられているが、ファージが反すう胃メタン生成菌に感染または反すう胃メタン生成菌を溶解できるという公開された報告はない。従って、反すう胃メタン生成菌に感染および／または抑制剤を送達できるファージの同定は非常に有利であろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Altermann E, Klaenhammer TR (2005) PathwayVoyager: pathway mapping using the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database. BMC Genomics 6:60-66.
【非特許文献２】Altermann, E Klaenhammer TR (2003) GAMOLA: a new local solution for sequence annotation and analyzing draft and finished prokaryotic genomes. OMICS: A journal of integrative biology 7, 161-169.
【非特許文献３】Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research 25, 3389-3402.
【非特許文献４】Balch WE, Fox GE, Magrum LJ, Woese CR, Wolfe RS (1979) Methanogens: reevaluation of a unique biological group. Microbiological Reviews 43, 260-296.
【非特許文献５】Baresi, L and Bertani, G. 1984. Isolation of a bacteriophage for a methanogenic bacterium. In Abstracts of the Annual Meeting of the American Society for Microbiology. Washington DC: American Society for Microbiology, p. 133.
【非特許文献６】Bickle, T. A. and D. H. Kruger. 1993. Biology of DNA restriction. Microbiol. Rev. 57:434-450.
【非特許文献７】BuIt CJ, et al. (1996) Complete genome sequence of the methanogenic archaeon, Methanococcus jannaschii. Science 273, 1058-1073.
【非特許文献８】Coutinho PM, Henrissat B (1999) Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. In 'Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering' (Eds HJ Gilbert, G Davies, B Henrissat and B Svensson) pp. 3-12 (The Royal Society of Chemistry, Cambridge) (Carbohydrate Active Enzymes database, http://www.cazy.org/).
【非特許文献９】Delcher AL, Harmon D1 Kasif S, White O, Salzberg SL (1999) Improved microbial gene identification with GLIMMER. Nucleic Acids Research 27, 4636-4641.
【非特許文献１０】Fleischmann, RD, et al. (1995) Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd. Science 269, 496-512.
【非特許文献１１】Fricke WF, Seedorf H, Henne A, Kruer M, Liesegang H, Hedderich R, Gottschalk G, Thauer RK (2006) The genome sequence of Methanosphaera stadtmanae reveals why this human intestinal archaeon is restricted to methanol and H2 for methane formation and ATP synthesis. Journal of Bacteriology 188, 642-658.
【非特許文献１２】Godde JS, Bickerton A (2006) The repetitive DNAe called CRISPRs and their associated genes: evidence of horizontal transfer among prokaryotes. Journal of Molecular Evolution 62, 718-729.
【非特許文献１３】Haft DH, Selengut J, Mongodin EF, Nelson KE (2005) A guild of 45 CRISPR- associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes. PLoS Computational Biology 1 :474-483
【非特許文献１４】Jansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM (2002) Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular Microbiology 43, 1565-1575.
【非特許文献１５】Jansen R, van Embden JD, Gaastra W, Schouls LM (2002) Identification of a novel family of sequence repeats among prokaryotes. OMICS: A journal of integrative biology 6, 23-33.
【非特許文献１６】Jensen LJ, Friis C, Ussery DW (1999) Three views of microbial genomes. Research in Microbiology 150, 773-777.
【非特許文献１７】Joblin KN, Naylor GE, Williams AG (1990) Effect of Methanobrevibacter srhithii on xylanolytic activity of anaerobic ruminal fungi. Applied and Environmental Microbiology 56, 2287-2295.
【非特許文献１８】Kanehisa M, Goto S, Kawashima S, Okuno Y, Hattori M (2004) The KEGG resource for deciphering the genome. Nucleic Acids Research 32, D277-D280.
【非特許文献１９】Kiener, A., Konig, H., Winter, J. and Leisinger, T. 1987. Purification and use of Methanobacteπum wolfeii pseudomurein endopeptidase for lysis of Methanobacterium thermoautotrophicum. J. Bacteriol. 169, 1010-1016.
【非特許文献２０】Knox, M. R. and Harris, J. E. 1986. Isolation and characterisation of a bacteriophage of Methanobrevibacter smithii. In Abstracts of the XIV International Congress on Microbiology. Manchester. International Union of Microbiological Societies.
【非特許文献２１】Kurtz S, Schleiermacher C (1999) REPuter fast computation of maximal repeats in complete genomes. Bioinformatics 15, 426-427.
【非特許文献２２】Lowe TM, Eddy SR (1997) tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Research 25, 955-964.
【非特許文献２３】Loenen, W. and N. Murray. 1986. Modification enhancement by restriction alleviation protein (Ra1) of bacteriophage lambda. J. MoI. Biol. 190:11-22.
【非特許文献２４】Lucchini, S., F. Desiere, and H. Brussow. 1999. Comparative genomics of Streptococcus thermophilus phage species supports a modular evolution theory. J. Virol. 73:8647-8656.
【非特許文献２５】Luo, Y. N., Pfister, P., Leisinger, T. and Wasserfallen, A. 2002. Pseudomurein endoisopeptidases PeiW and PeiP, two moderately related members of a novel family of proteases produced in Methanothermobacter strains. . FEMS Microbiol. Lett. 208, 47- 51.
【非特許文献２６】Makarova, K. S., Aravind, L. and Koonin, E. V. 1999. A superfamily of archaeal, bacterial, and eukaryotic proteins homologous to animal transglutaminases. Protein ScL 8, 1714-1719.
【非特許文献２７】Makarova KS, Grishin NV, Shabalina, SA, Wolf Yl, Koonin EV (2006) A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biology Direct 1:7 -32.
【非特許文献２８】New Zealand Statistics 2005 (www.stats.govt.nz)
【非特許文献２９】New Zealand's Greenhouse Gas Inventory 1990 - 2004. The National Inventory Report and Common Reporting Format. (2006) Ministry for the Environment. http://www.mfe.govt.nz/publications/climate/nir-aprOδ/nir-aprOβ.pdf.
【非特許文献３０】Reeve JN, Nolling J Morgan RM, Smith DR (1997) Methanogenesis: genes, genomes and who's on first? Journal of Bacteriology 179, 5975-5986.
【非特許文献３１】Rawlings, N. D., Morton, F. R. and Barrett, A. J. 2006. MEROPS: the peptidase database. Nucleic Acids Res. 34, D270-D272.
【非特許文献３２】Samuel BS, Hansen EE, Manchester JK, Coutinho PM, Henrissat B, Fulton R, Latreille P, Kim K, Wilson RK, Gordon Jl (2007) Genomic adaptations of Methanobrevibacter smithii to the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 104, 10643-10648.
【非特許文献３３】Smith DR, et al. (1997) Complete genome sequence of Methanobacterium thermoautotrophicum □H: Functional analysis and comparative genomics. Journal of Bacteriology 179, 7135-7155.
【非特許文献３４】Smith PH, Hungate RE (1958) Isolation and characterization of Methanobacterium ruminantium n. sp. Journal of Bacteriology 75, 713-718.
【非特許文献３５】Staden R, Beal KF, Bonfield JK (1998) The Staden Package. Methods in Molecular Biology: Bioinformatics Methods and Protocols 132, 115-130.
【非特許文献３６】Tatusov RL, Natale DA, Garkavtsev IV, Tatusova TA, Shankavaram UT1 Rao BS, Kiryutin B1 Galperin MY, Fedorova ND, Koonin EV (2001) The COG database: new developments in phylogenetic classification of proteins from complete genomes Nucleic Acids Research 29, 22-28.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明はここに詳述するように、全体もしくは部分的に産生されたファージ粒子および／またはファージゲノムを含む単離されたファージφｍｒｕ、同様にファージの単離されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを特徴とする。
【０００９】
本発明はまた、配列番号１〜６９から成る群より選択される少なくとも１つのファージアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを特徴とする。特定の態様によれば、該ポリペプチドは、配列番号２〜５および６２〜６８から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様によれば、該ポリペプチドは、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。別の態様によれば、該ポリペプチドは、例えば配列番号６３の残基３２〜１８６から伸長する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む１断片である。
【００１０】
加えて、本発明は少なくとも１つのファージペプチドに対するコード配列を含む単離されたポリペプチドを特徴とする。一態様によれば、該ポリヌクレオチドは、配列番号１〜６９から成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対するコード配列を含む。特定の態様によれば、該ポリヌクレオチドは、配列番号２〜５および６２〜６８から成る群より選択される配列に対するコード配列を含む。さらなる態様によれば、該ポリヌクレオチドは、配列番号６３に対するコード配列を含む。別の態様によれば、該ポリヌクレオチドはコード配列の断片、例えば配列番号６３の残基３２〜１８６から伸長する最少の１アミノ酸配列を含む。
【００１１】
さらなる態様によれば、本発明は、配列番号７４〜１４２から成る群より選択されるファージ核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを特徴とする。特定の態様によれば、該ポリヌクレオチドは、配列番号７５〜７８および１３５〜１４１から成る群、または特に配列番号１３６より選択される核酸配列を含む。別の態様によれば、該ポリヌクレオチドは、例えば配列番号１３６のヌクレオチド９４〜５５８から伸長する核酸配列を含む断片またはオリゴヌクレオチドである。さらに本発明は、配列番号７４〜１４２のいずれか１つの核酸配列とハイブリダイズする、単離されたポリヌクレオチドまたはその断片を包含する。本発明はさらに、いずれか１つの核酸配列の相補体、逆相補体、逆配列、またはその断片を含む単離されたポリヌクレオチドを包含する。
【００１２】
本発明は、少なくとも１つののファージポリペプチドに対するコード配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを特徴とする。一態様によれば、該発現ベクターは、配列番号１〜６９から成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対するコード配列を含む。特定の態様によれば、該発現ベクターは、配列番号２〜５および６２〜６８の少なくとも１つのアミノ酸配列に対するコード配列を含む。さらなる態様によれば、該発現ベクターは、配列番号６３の少なくとも１つのアミノ酸配列に対するコード配列を含む。別の態様によれば、該発現ベクターは、配列番号６３の残基３２〜１８６から伸長する少なくとも１つのアミノ酸配列に対するコード配列を含む。
【００１３】
特定の態様として、本発明はここに詳述されるように、ファージφｍｒｕを全体または部分的に産生する発現ベクターを特徴とする。特に該発現ベクターは、そのいずれの変化、誘導体、変異体、または断片を含む、ファージ粒子、ファージゲノム、または改変ファージを産生してよい。
【００１４】
本発明はまた、ホスト細胞、例えば少なくとも１つの発現ベクターを含む微生物ホスト細胞も特徴とする。
【００１５】
本発明は特に、ここに開示されるポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して産生された抗体を特徴とする。特定の態様によれば、該抗体は配列番号１〜６９から成る群より選択される少なくとも１つのポリペプチド配列、またはその改変された配列に向けられる。代替の態様によれば、該抗体は配列番号７４〜１４２から成る群より選択されるポリヌクレオチドの少なくとも１つの断片、またはその相補体、またはその改変された配列に対して産生される。別の態様によれば、ここに詳述されるように該抗体は、少なくとも１種の細胞抑制剤、例えば抗メタン生成化合物（例えばブロモエタンスルホン酸）、抗体および抗体断片、溶解酵素、ペプチド核酸、抗菌ペプチド、およびその他の抗生剤との１つ以上の融合体または抱合体を含む。
【００１６】
加えて本発明は、例えばここに述べられる生物学的に活性のある変化、断片、変異体、および誘導体を含む、配列番号１〜６９のうち少なくとも１つの、改変されたファージポリペプチドを特徴とする。加えて本発明は、例えばここに述べられる生物学的に活性のある変化、断片、変異体、および誘導体を含む、配列番号１〜６９のうち少なくとも１つに向けられる、改変された抗体を特徴とする。これらの改変されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、同様に開示されるポリヌクレオチドの変化、断片、変異体、および誘導体、これらのポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ならびにこれらのベクターを含むホスト細胞もまた特徴とする。特定の態様によれば、本発明の組成物および方法はこれらの改変されたポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または対応する発現ベクターもしくはホスト細胞を用いる。
【００１７】
加えて本発明は、例えば配列番号１〜６９のうち少なくとも１つ、またはその改変された配列であるファージポリペプチドを特徴とし、これは少なくとも１種の細胞抑制剤、例えば抗メタン生成化合物（例えばブロモエタンスルホン酸）、抗体および抗体断片、溶解酵素、ペプチド核酸、抗菌ペプチド、およびその他の抗生剤との融合体または抱合体を含む。
【００１８】
本発明は単離されたポリペプチド、例えば配列番号１〜６９の少なくとも１つ、またはその改変された配列を含む組成物を特徴とする。加えて本発明は、例えば配列番号１〜６９の少なくとも１つ、またはその改変された配列に向けた抗体を含む組成物を特徴とする。単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号７４〜１４２の少なくとも１つ、またはその相補体または改変された配列を含む組成物もまた特徴とする。さらに、本発明に従う、発現ベクターまたは発現ベクターを含むホスト細胞を含む組成物も特徴とする。該組成物はここに述べられる生物学的に活性のある変化、断片、変異体、および誘導体のいずれか１つを含んでよい。該組成物は少なくとも１種の細胞抑制剤（例えば融合体または抱合体として）を含んでよく、かつ例えば医薬組成物または食物サプリメント、特に反すう動物の飼料構成成分として処方されてよい。
【００１９】
本発明はまた、開示される方法に従い、微生物細胞、特にメタン生成菌細胞を標的化および／または抑制するためのキットの一部としての本発明の組成物も特徴とする。該キットは、ａ）ここに提示される組成物の少なくとも１種；およびｂ）選択的に、例えば細胞の標的化、あるいはメタン生成菌またはその他の微生物の細胞生育または複製の抑制における使用のための説明書を含む。
【００２０】
本発明は、ファージを産生するための方法を特徴とし、該方法は、ａ）少なくともファージゲノムの一部を含む発現ベクターまたは発現ベクターを含むホスト細胞を、ファージの産生に適切な条件下で培養すること；およびｂ）該培養からファージを回収することを含む。特定の態様によれば該ファージは、配列番号１〜６９から成る群より選択される少なくとも１つのポリペプチド、またはその改変された配列を含む。さらなる態様によれば該ファージは、配列番号７４〜１４２から成る群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド、またはその改変された配列を含む。
【００２１】
本発明は、ファージポリペプチドを産生するための方法も特徴とし、該方法は、ａ）少なくとも１つのファージポリペプチドのコード配列の少なくとも一部を含む発現ベクターまたは発現ベクターを含むホスト細胞を、該ポリペプチドの発現に適切な条件下で培養すること；およびｂ）該培養からポリペプチドを回収することを含む。特定の態様によれば該ポリペプチドは、配列番号１〜６９から成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列、またはその改変された配列を含む。
【００２２】
加えて本発明は、少なくとも１種の細胞抑制剤、例えばここに詳述される抗メタン生成化合物（例えばブロモエタンスルホン酸）、抗体および抗体断片、溶解酵素、ペプチド核酸、抗菌ペプチド、およびその他の抗生剤との融合体または抱合体を含む、例えば配列番号１〜６９の少なくとも１つのファージポリペプチドを産生するための方法を特徴とする。このような方法は、ａ）少なくとも１つのファージポリペプチドのコード配列を含む発現ベクターまたは発現ベクターを含むホスト細胞を、該ポリペプチドの発現に適切な条件下で培養すること；ｂ）ファージ融合体または抱合体を形成すること（例えば、融合配列の発現または細胞抑制剤に対する化学的抱合により）；およびｃ）該融合体または抱合体を回収することを含む。特定の態様によれば該ポリペプチドは、配列番号１〜６９から成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列、またはその改変された配列を含む。
【００２３】
加えて、本発明は微生物細胞、特にメタン生成菌細胞の抑制（例えば生育または複製の抑制）方法を特徴とし、該方法はａ）選択的に、少なくとも１つのファージポリペプチドを産生または単離すること；およびｂ）該細胞を該ファージポリペプチドに接触させることを含む。特定の態様によれば該ポリペプチドは、配列番号１〜６９から成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列、またはその改変された配列を含む。
【００２４】
さらなる特徴として、本発明は微生物細胞、特にメタン生成菌細胞の抑制（例えば生育または複製の抑制）方法を包含し、該方法はａ）選択的に、少なくとも１つの細胞抑制剤をさらに含む少なくとも１つのファージポリペプチドを産生または単離すること；およびｂ）該細胞を該ファージポリペプチドに接触させることを含む。特定の態様によれば該ポリペプチドは、配列番号１〜６９から成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列、またはその改変された配列を含む。
【００２５】
本発明はまた、ファージまたは対応するファージポリペプチドもしくはポリヌクレオチドのレベルを検出および／または測定するための方法も特徴とし、該方法は、１）被験体由来のサンプルをファージポリペプチド（例えば、配列番号１〜６９のいずれか１つ、またはその改変配列）、または対応するポリヌクレオチドに対して産生された抗体と接触させること；および２）サンプル中でポリペプチド、またはポリヌクレオチドと形成された抗体複合体の存在またはレベルを決定することを含む。このような方法はまた、微生物細胞、特にメタン生成菌細胞のレベルを検出および／または測定するためにも使用できる。
【００２６】
本発明は同様に、ファージまたは対応するファージポリヌクレオチド（例えばファージコード配列）のレベルを検出および／または測定するための方法を特徴とし、該方法は、１）被験体由来のサンプルを相補的ポリペプチド（例えば、配列番号７４〜１４２のいずれか１つに相補的な配列、またはその改変配列）と接触させること；および２）サンプル中でファージポリヌクレオチドと形成されたハイブリダイゼーション複合体の存在またはレベルを決定することを含む。このような方法はまた、微生物細胞、特にメタン生成菌細胞のレベルを検出および／または測定するためにも使用できる。
【００２７】
特定の態様によれば、本発明の方法はｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現構成成分を利用する。その他の態様によれば、該方法は、組み換え、合成、または半合成の方法により産生されるポリペプチド、または内在性の方法により産生されるポリペプチドを用いる。
【００２８】
本発明のその他の態様および実施形態を以下に述べる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
本発明をその特定の実施形態への参照および図面への参照と共に記述する。
【００３０】
【図１Ａ】推定される組み込み部位配列であるａｔｔＬおよびａｔｔＲを示すＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージφｍｒｕを示した図である。
【図１Ｂ】予測されるファージ機能的モジュールおよび遺伝子構造を示した図である。
【図１Ｃ】無菌気体（酸素圧力）を用いたファージ誘導を示した図である。
【図１Ｄ】マイトマイシンＣを用いた初回ファージ誘導を示した図である。
【図１Ｅ】誘導（酸素曝露）および未誘導Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）のＰＣＲ単位複製配列のアガロース電気泳動を示した図である。レーン２および４：Invitrogenの１ｋｂＤＮＡマーカーラダー。レーン１および３はそれぞれ、誘導および未誘導Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）の培養物から分離したＤＮＡについての、プライマーペアＲ１Ｆ−Ｌ２Ｒを用いたＰＣＲを示す。
【図２】ファージφｍｒｕ翻訳領域アノテーションおよびコメントを示した図である。
【図３−１】ファージφｍｒｕ翻訳領域アノテーション、予測される機能、およびコメントを示した図である。
【図３−２】ファージφｍｒｕ翻訳領域アノテーション、予測される機能、およびコメントを示した図である。
【図３−３】ファージφｍｒｕ翻訳領域アノテーション、予測される機能、およびコメントを示した図である。
【図３−４】ファージφｍｒｕ翻訳領域アノテーション、予測される機能、およびコメントを示した図である。
【図４Ａ−１】ファージφｍｒｕのコード配列を含む、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージφｍｒｕの配列情報を示した図である。
【図４Ａ−２】ファージφｍｒｕのコード配列を含む、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージφｍｒｕの配列情報を示した図である。
【図４Ａ−３】ファージφｍｒｕのコード配列を含む、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージφｍｒｕの配列情報を示した図である。
【図４Ａ−４】ファージφｍｒｕのコード配列を含む、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージφｍｒｕの配列情報を示した図である。
【図４Ａ−５】ファージφｍｒｕのコード配列を含む、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージφｍｒｕの配列情報を示した図である。
【図４Ａ−６】ファージφｍｒｕのコード配列を含む、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージφｍｒｕの配列情報を示した図である。
【図４Ａ−７】ファージφｍｒｕのコード配列を含む、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージφｍｒｕの配列情報を示した図である。
【図４Ａ−８】ファージφｍｒｕのコード配列を含む、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージφｍｒｕの配列情報を示した図である。
【図４Ａ−９】ファージφｍｒｕのコード配列を含む、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージφｍｒｕの配列情報を示した図である。
【図４Ａ−１０】ファージφｍｒｕのコード配列を含む、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージφｍｒｕの配列情報を示した図である。
【図４Ａ−１１】ファージφｍｒｕのコード配列を含む、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージφｍｒｕの配列情報を示した図である。
【図４Ａ−１２】ファージφｍｒｕのコード配列を含む、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージφｍｒｕの配列情報を示した図である。
【図４Ｂ−１】ファージφｍｒｕのアミノ酸配列を含む、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージφｍｒｕの配列情報を示した図である。
【図４Ｂ−２】ファージφｍｒｕのアミノ酸配列を含む、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージφｍｒｕの配列情報を示した図である。
【図４Ｂ−３】ファージφｍｒｕのアミノ酸配列を含む、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージφｍｒｕの配列情報を示した図である。
【図４Ｂ−４】ファージφｍｒｕのアミノ酸配列を含む、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージφｍｒｕの配列情報を示した図である。
【図４Ｂ−５】ファージφｍｒｕのアミノ酸配列を含む、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージφｍｒｕの配列情報を示した図である。
【図４Ｂ−６】ファージφｍｒｕのアミノ酸配列を含む、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージφｍｒｕの配列情報を示した図である。
【図４Ｂ−７】ファージφｍｒｕのアミノ酸配列を含む、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージφｍｒｕの配列情報を示した図である。
【図５】M. marburgensis由来のＰｅｉＰ、およびM. wolfeii由来のＰｅｉＷによるファージφｍｒｕ  ＯＲＦ２０５８の配列アラインメントを示した図である。
【図６】コアコンセンサスシグナルを示す、LogoBarを用いて作られたＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）由来のシグナルペプチド配列のタンパク質配列ロゴを示した図である。
【図７】Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）休止細胞における、ＯＲＦ２０５８の抑制効果を示した図である。
【図８】Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）細胞の生育およびメタン産生における、ＯＲＦ２０５８の抑制効果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
定義
ここで用いられる、ファージポリペプチドをコードする「変化した」核酸配列は、好ましくは同じかまたは機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをもたらす、異なるヌクレオチドの欠失、挿入、または置換による核酸配列を含む。コードされるポリペプチドまたは抗体もまた「変化」してよく、サイレント変化を生じて機能的に同等なポリペプチドをもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を含む。意図されたアミノ酸置換が、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性性質の類似性に基づき、生物学的活性（例えば細胞結合、細胞透過性、もしくは細胞融解）もしくはポリペプチドの免疫学的活性（例えば１つ以上の抗体結合部位）を保持する限りにおいて行なわれてよい。例えば陰性荷電アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含んでよく；陽性荷電アミノ酸はリジンおよびアルギニンを含んでよく；類似の親水性値を有する非荷電の極性頭部基をもつアミノ酸はロイシン、イソロイシン、およびバリン、グリシンおよびアラニン、アスパラギンおよびグルタミン、セリンおよびスレオニン、ならびにフェニルアラニンおよびチロシンを含んでよい。
【００３２】
ここで用いられる「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質配列、およびそれらのいずれの断片を意味し、かつ天然発生、組み換え、合成、もしくは半合成分子を意味する。本発明の配列は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０アミノ酸、好ましくは少なくとも５から１０、１０から２０、２０から３０、３０から４０、４０から５０、５０から１００、１００から１５０、１５０から２００、または２００から２５０、または２５０から４０００アミノ酸を含み、かつ好ましくは本来の配列の生物学的活性（例えば細胞結合、細胞透過性、もしくは細胞融解）または免疫学的活性（１つ以上の抗体結合部位）を保持する。ここに列挙される「アミノ酸配列」が、天然発生ポリペプチド分子のアミノ酸配列、アミノ酸配列、および類似語を意味するとき、これはアミノ酸配列を完全長分子に付随する完全な本来のアミノ酸配列に限定することを意味するものではない。
【００３３】
ここで用いられる「増幅」は、核酸配列の追加コピーの産生を意味し、一般には公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて行われる（Dieffenbach, C. W. and G. S.
Dveksler (1995) PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY）。
【００３４】
「抗体」という用語は可能な意味の最も広い範囲において理解されなければならず、かつ未変化のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含むことが意図される。抗体の断片および誘導体もまた、それらが望まれる生物学的活性を示す限りにおいて網羅されることが意図される。抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性部位、すなわち抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を包含する。限定はされないが、これらはポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦａｂ2断片、ならびにＦａｂ発現ライブラリーを含む。
【００３５】
抗体分子は、分子内に存在する重鎖の性質によって互いに異なる、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤのクラスのいずれかに関連する。同様に、これらはサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびその他を含む。軽鎖はカッパ鎖またはラムダ鎖であってよい。ここでの抗体への参照は、全てのクラス、サブクラス、および型への参照を含む。例えば、１種以上の源、例えばマウス、ヒト、もしくは反すう動物の配列のうち１つ以上に対して特異的であるモノクローナル抗体またはその断片であるキメラ抗体もまた含まれる。さらに、カメリド抗体またはナノボディーも含まれる。ここで、「抗体」またはいずれの類似語へのそれぞれの参照は、未変化の抗体、同様に断片、変化、誘導体、またはそれらの変異体のいずれも含むことが理解されるであろう。
【００３６】
ここで用いられる「生物学的に活性のある」または「機能的」という用語は、天然発生配列の構造的、免疫学的、もしくは生化学的機能（例えば細胞結合、細胞透過性、もしくは細胞融解）の１以上を保持するポリペプチドを意味する。
【００３７】
ここで用いられる「細胞抑制剤」または「抑制剤」という用語は、微生物細胞、特にメタン生成菌細胞の生育もしくは複製を減少または遮断する薬剤を意味する。細胞抑制剤は、例えば細胞分裂を減少または遮断するために作用できる。抑制剤は、例えばＤＮＡ合成、ＲＮＡ合成、タンパク質合成、もしくは翻訳後修飾を減少または遮断できる。抑制剤はまた、メタン生成経路に関与する酵素の活性を減少または遮断することもできる。抑制剤はまた、免疫システム構成成分による認識のために細胞を標的化することもできる。細胞の抑制はまた、例えば溶解、アポトーシス、壊死などによる細胞の死滅および細胞死も含む。有用な抑制剤は、ここに詳述されるように抗メタン生成化合物（例えばブロモエタンスルホン酸）、抗体および抗体断片、溶解酵素、ペプチド核酸、抗菌ペプチド、およびその他の抗生剤を含むが、これらに限定されない。
【００３８】
ここで用いられる「相補的な」または「相補性」という用語は、許容される塩および温度条件下での塩基対によるポリヌクレオチドの自然結合を意味する。配列Ａ−Ｇ−Ｔに対する相補的配列はＴ−Ｃ−Ａ、逆相補体はＡ−Ｃ−Ｔ、および逆配列はＴ−Ｇ−Ａである。二つの単鎖分子の間での相補性は、幾つかの核酸のみの結合においては部分的であってよく、また二つの単鎖分子の間に全て相補性が存在するときには完全であってよい。核酸鎖の間での相補性の程度は、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強度に有意な効果をもつ。これは、核酸鎖間の結合に依存する増幅反応ならびにＰＮＡ分子の設計および使用において特に重要である。
【００３９】
ここで用いられる「誘導体」という用語は、ファージポリペプチドをコードする核酸、またはそれらに相補的な核酸の化学的修飾を意味する。このような修飾は例えば、水素のアルキル、アシル、またはアミノ基による置換を含む。好ましい態様によれば核酸誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を保持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドはグリコシル化、ペグ化により、あるいはそれが由来する配列の生物学的活性（例えば細胞結合、細胞透過性、もしくは細胞融解）の１以上、または免疫学的機能を保持する同様の過程により修飾されたものである。
【００４０】
ここで用いられる「相同性」という用語は、相補性の程度を意味する。部分的相同性（すなわち、Ｉ同一性）、または完全相同性（すなわち１００％同一性）があってよい。標的核酸へのハイブリダイズから、同一配列を少なくとも部分的に抑制する部分的相補配列には、機能的用語である「実質的に相同」の使用が適用される。標的配列への完全に相補的な配列のハイブリダイゼーションの抑制は、低ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションアッセイ（サザンもしくはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を用いて試験されてよい。実質的に相同な配列もしくはハイブリダイゼーションプローブは、低ストリンジェンシー条件下における完全相同配列の標的配列への結合に競合、および該結合を抑制し得る。これは低ストリンジェンシー条件が非特異結合を許容するということ；低ストリンジェンシー条件は二つの配列の互いの結合が特異的（すなわち選択的）相互作用であることを要求すると述べるものではない。
【００４１】
ここで用いられる「ハイブリダイゼーション」という用語は、核酸の鎖が塩基対を通して相補鎖に結合することによるいずれの過程も意味する。
【００４２】
ここで用いられる「挿入」または「付加」という用語は、天然発生分子に比較したアミノ酸残基またはヌクレオチドのそれぞれ１つ以上の追加をもたらす、アミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を意味する。
【００４３】
ここで用いられる「メタン生成菌」は、メタンガスを産生する微生物を意味し、メタノブレビバクター、メタノサーモバクター、メタノミクロビウム、メタノバクテリウム、およびメタノサルシナを含む。特定のメタン生成菌は、メタノブレビバクター・ルミナンチウム（Methanobrevibacter ruminantium）、メタノブレビバクター・スミシー（Methanobrevibacter smithii）、メタノブレビバクター・アシディデュランス（Methanobrevibacter acididurans）、メタノブレビバクター・アシディデュランス（Methanobrevibacter acididurans）、メタノブレビバクテリウム・ブライアンティイ（Methanobacterium bryantii）、メタノブレビバクテリウム・フォルミシカム（Methanobacterium formicicum）、メタノサーモバクター・マーブルゲンシス（Methanothermobacter marburgensis）、メタノサーモバクター・ウォルフェイイ（Methanothermobacter wolfeii）、メタノスファエラ・スタッドマナエ（Methanosphaera stadtmanae）、メタノミクロビウム・モービレ（Methanomicrobium mobile）、メタノサルシナ・バーケリ（Methanosarcina barkeri）、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）、メタノコッコイデス・ブルトニイ（Methanococcoides burtonii）、およびメタノロブス・テイロリイ（Methanolobus taylorii）を含むがこれらに限定されない。全てのメタン生成菌の属および種はこの用語により包含される。
【００４４】
ここで用いられる「微生物」細胞は、天然発生または遺伝的に改変された微生物細胞を意味し、メタン生成菌、好塩菌、および好熱好酸菌のような古細菌、ならびにシアノバクテリア、スピロヘータ、プロテオバクテリア、同様にグラム陽性およびグラム陰性菌のような真正細菌を含む。
【００４５】
「改変された」という用語は、ここに述べられるような、変化した配列、および配列断片、変異体、ならびに誘導体を意味する。
【００４６】
ここで用いられる「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、もしくはそれらの断片の配列、ならびに単鎖もしくは二重鎖であってよい天然、組み換え、合成、もしくは半合成起源の、センス鎖もしくはアンチセンス鎖および翻訳領域もしくは非翻訳領域を表してよい、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。本発明の配列は、好ましくは少なくとも１２、１５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５、１２０、１３５、１５０、３００、４５０、６００、７５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５から３０、３０から６０、６０から９０、９０から１２０、１２０から１５０、１５０から３００、３００から４５０、４５０から６００、もしくは６００から７５０ヌクレオチド、または少なくとも１０００ヌクレオチド、または少なくとも１５００ヌクレオチドを含む。ここで「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」への各参照は、本来の完全長配列、同様にそのいずれの相補体、断片、変化、誘導体、もしくは変異体も含み得ることが理解されるであろう。
【００４７】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＰＣＲ増幅、配列決定、またはハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用できる、少なくとも６、８、１０、１２、１５、１８、２１、２５、２７、３０、もしくは３６ヌクレオチド、または少なくとも１２から３６ヌクレオチド、または少なくとも１５から３０ヌクレオチドの核酸配列を意味する。ここで用いられるオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において一般に定義される「アンプライマー」、「プライマー」、「オリゴマー」、および「プローブ」の語に実質的に同等である。
【００４８】
ここで用いられる「ポリペプチド」は、天然、合成、半合成、もしくは組み換えを問わないいずれの源由来の、いずれの種、好ましくは微生物から得られた、本発明の単離されたポリペプチドを意味する。特にファージペプチドは、メタン生成菌細胞、例えばメタノブレビバクター細胞、特にＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）、またはＭ．スミシー（M. smithii）細胞から得ることができる。組み換え産生のためには、本発明のポリペプチドは微生物または真核細胞、例えばEscherichia、Streptomyces、Bacillus、Salmonella、酵母、ショウジョウバエのような昆虫細胞、ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞のような動物細胞、または植物細胞から得ることができる。ここで「ポリペプチド」への各参照は、本来の完全長配列、同様にそのいずれの断片、変化、誘導体、もしくは変異体も含み得ることが理解されるであろう。
【００４９】
「ポリヌクレオチド」という用語が単数もしくは複数で用いられるとき、一般にいずれの核酸配列、例えば、未改変のＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、いずれのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをも意味する。これは単鎖および二重鎖ＤＮＡ、単鎖および二重鎖領域を含むＤＮＡ、単鎖および二重鎖ＲＮＡ、ならびに単鎖および二重鎖領域を含むＲＮＡ、単鎖もしくはより典型的には二重鎖、または単鎖および二重鎖領域を含んでよいＤＮＡならびにＲＮＡを含むハイブリッド分子を含むが、これらに限定されない。ＲＮＡもしくはＤＮＡ，またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三重鎖領域もまた含まれる。特にｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくはゲノムＤＮＡ、およびそれらのいずれの断片も含まれる。この用語は１つ以上の改変された塩基、例えばトリチウム標識された塩基、またはイノシンのような独特な塩基を含む、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。本発明のポリヌクレオチドはコード配列もしくは非コード配列、またはセンスもしくはアンチセンス配列、またはｓｉＲＮＡのようなｉＲＮＡを包含できる。ここで「ポリヌクレオチド」または類似語への各参照は、完全長配列、同様にそのいずれの相補体、断片、変化、誘導体、もしくは変異体も含み得ることが理解されるであろう。
【００５０】
ここで用いられる「ペプチド核酸」または「ＰＭＡ」は、ペプチド骨格を通して連結する塩基を含むアンチセンス分子または抗遺伝子薬剤を意味する。
【００５１】
ここで用いられる「反すう動物」という用語は、特別な型の消化器官として反すう胃をもつ動物を意味する。反すう動物はウシ、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、ヘラジカ、アンテロープ、カリブー、およびシカを含むがこれらに限定されない。
【００５２】
ここで用いられる「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェンシー」という用語は、核酸、塩、および温度によって規定されるハイブリダイゼーションの条件を意味する。これらの条件は当該技術分野において公知であり、同一または関連ポリヌクレオチド配列を同定または検出するために変更されてよい。例えば、Sambrook, J. et al. (1989)
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, および Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY. を参照のこと。低または高ストリンジェンシーのいずれかを含む多数の同等な条件は、配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）の長さおよび性質、標的（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）の性質、環境（溶液中または固体基質上での不動化）、塩およびその他の構成成分（例えばホルムアミド、硫酸デキストランおよび／またはポリエチレングリコール）の濃度、ならびに反応温度（プローブの融解温度より約５℃低い温度から、融解温度より約２０℃から２５℃低い温度の範囲内）のような因子に依存する。上に列挙した条件とは異なるが同等である、低または高ストリンジェンシーのいずれかの条件を作り出すため、１つ以上の因子が変化させられてよい。
【００５３】
「被験体」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は鳥類および哺乳類、例えば反すう動物、ならびに特にマウス、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、牝ウシ、およびウマを含むがこれらに限定されない。
【００５４】
ここで用いられる「実質的に精製された」または「単離された」という用語は、細胞、組み換え、もしくは合成環境から取り除かれ、かつ細胞、組み換え、もしくは合成環境において付随していたその他の構成成分を少なくとも６０％含まない、好ましくは７５％含まない、最も好ましくは少なくとも９０％含まないかまたは少なくとも９９％含まない、核酸またはアミノ酸配列を意味する。
【００５５】
ここで定義される「形質転換」は、外来性ＤＮＡが進入してレシピエント細胞を変化させることによる過程を表す。これは当該技術分野において公知の様々な方法を用い、自然もしくは人工的条件下で起こってよい。形質転換は、原核または真核細胞内に外来核酸配列を挿入するため、いずれの公知の方法にも依存してよい。方法は形質転換されるホスト細胞の型に基づいて選択され、ウィルス感染、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、および微粒子銃を含んでよいがこれらに限定されない。このような「形質転換された」細胞は、挿入されたＤＮＡが自己複製プラスミドまたはホスト染色体の一部のいずれかとして複製できる、安定的に形質転換された細胞を含む。これらはまた、挿入されたＤＮＡまたはＲＮＡを限られた期間に一過性に発現する細胞も含む。
【００５６】
ここで用いられるポリペプチドの「変異体」は、１つ以上のアミノ酸により変化させられたアミノ酸配列を意味する。変異体ポリヌクレオチドは１つ以上のヌクレオチドにより変化させられる。変異体は、例えばロイシンのイソロイシンによる置換のような、置換されたアミノ酸が類似の構造もしくは化学特性を有する「保存的な」変化をもたらしてよい。さらにまれには、変異体は、例えばグリシンのトリプトファンによる置換のような「非保存的な」変化をもたらしてよい。類似の小さな変異体はアミノ酸欠失もしくは挿入、またはその両方もまた含んでよい。生物学的または免疫学的活性を無効にすることなく、どのアミノ酸残基が置換、挿入、もしくは欠失され得るかを決定するためのガイダンスは、当該技術分野において公知のコンピュータープログラム、例えばLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて見出されてよい。
【００５７】
本発明はまた、少なくとも１つの生物学的活性（例えば細胞結合、細胞透過性、もしくは細胞融解）またはポリペプチドの免疫学的活性を保持する変異体も包含する。好ましい変異体は、実質的に同じであるかまたは機能的に同等な配列を有する、例えば開示される配列に対して少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するものである。最も好ましい変異体は、ここに開示される配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するものである。パーセンテージ同一性は、以下に述べるように二つの配列を比較するため整列させること、整列された部分における同一な残基の数を決定すること、この数を発明の（クエリー）配列内の全残基数で割ること、および結果に１００を掛けることにより決定される。有用なアラインメントプログラムはAlignX（Vector NTI）である。
【００５８】
発明の説明
メタンは反すう動物の前腸内で、反すう胃システムにおける炭素の最終還元作用を行うメタン生成菌により産生される。多段階メタン生成経路は、主に非反すう胃メタン生成菌の研究によって十分に解明されているが、反すう胃においてメタン生成菌の生育および存続を可能にするための適応はよく理解されていない。Methanobrevibacter ruminantiumは、ニュージーランドの反すう動物における有名なメタン生成菌である。ここに述べるように、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）のゲノムが配列決定され、約３．０Ｍｂのサイズにおける３３．６８％のＧＣ含有量が示された。予想外の発見として、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）のゲノムは、ファージ組み込み、ＤＮＡ複製およびパッケージング、カプシドタンパク質、溶解、ならびに溶原性変換機能をコードする異なる機能モジュールを持つプロファージ配列（φｍｒｕと命名された）を含むことが見出された。
【００５９】
Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）ファージはハイスループット配列決定の間に、ゲノムの３０ないし４０ｋｂ領域が配列決定されたクローンにおいて過剰に出現しているときに同定された。これはゲノムの一部が通常よりも高コピー数で存在し、かつ常在のファージの複製に起因し得ることを示唆した。過剰出現領域は研究され、存在する予測翻訳領域の詳細なバイオインフォマティック分析はこれがファージ様遺伝子を含むことを示した。ファージ配列の遠位末端に見出される低ＧＣ領域（溶原性変換）は、ホストもしくは外来性ＤＮＡのさらなる修飾をもたらし得る、硫黄（ｄｎｄ）による予測されるＤＮＡ修飾システムを持つことが示されてきた。ここに、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージ配列を詳細に記述する。本発明の様々な態様によれば、プロファージポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、反すう胃におけるメタン生成菌および／またはメタン生成を抑制し、かつメタン生成におけるＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）の役割をさらに解明するための方法として使用できる。
【００６０】
従って本発明は、配列番号１〜６９の少なくとも１つ、ならびにその断片、変異体、および誘導体を含む、ファージポリペプチドを包含する。本発明はまた、微生物細胞、特にメタン生成菌細胞の標的化および抑制のためのこれらのポリペプチドの使用も包含する。本発明はさらに、これらの細胞の生育または複製を抑制するためのポリペプチドの使用を包含する。本発明のポリペプチドは、その生物学的活性を決定するため発現されてよく、かつ様々なアッセイにおいて使用されてよい。該ポリペプチドは大量合成および単離手順、例えば商業的産生のために使用されてよい。このようなポリペプチドは、対応するアミノ酸配列を単離し、かつ該アミノ酸配列のレベルを定量的に決定するための抗体の産生に使用されてよい。本発明のポリペプチドはまた、組成物、例えば医薬組成物、および食物サプリメント、例えば反すう動物の飼料構成成分としても使用されてよい。本発明のポリペプチドはまた、健康上の効用も有する。健康関連の態様によれば、メタン生成菌の抑制剤は、通常はメタンとして失われるエネルギーを被験体へ還元するために使用できる。特定の態様によれば、徐放反すう胃装置が、本発明のポリペプチドおよび組成物（例えば医薬組成物および食物サプリメント）と共に使用できる。
【００６１】
本発明のポリペプチドは、（ａ）配列番号１〜６９から成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列、またはその断片、変異体、もしくは誘導体を含むポリペプチド；（ｂ）配列番号１〜６９から成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列の機能的ドメイン、ならびにその断片および変異体を含むポリペプチド；および（ｃ）配列番号１〜６９から成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列の少なくとも１つの特定された数の近接残基、またはその変異体もしくは誘導体を含むポリペプチドから成る群より選択される少なくとも１つの配列を含む。一実施形態によれば、本発明は配列番号１〜６９のうち少なくとも１つのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを包含する。これらの配列の全ては、ここに本発明のポリペプチドとして総称される。
【００６２】
本発明はまた、配列番号１〜６９を含む少なくとも１つのファージポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびそれらの断片、変異体、または誘導体も包含する。本発明はまた、微生物細胞、特にメタン生成菌細胞を標的化、および抑制するための発現ベクターおよびホスト細胞の調製のためのこれらのポリヌクレオチドの使用も包含する。本発明はさらに、これらの細胞の生育または複製を抑制するためのポリヌクレオチドの使用を包含する。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ゲノムマッピング、物理的マッピング、および多かれ少なかれ関連するファージの遺伝子のクローニングにおいても有用である。本発明のポリヌクレオチドを用いて設計されるプローブは、スロットブロット技術またはマイクロアレイ分析のような当該技術分野における公知の技術を用いて、十分に相同的なＤＮＡおよびＲＮＡ配列を細胞内に有するいずれの生物の遺伝子の存在を検出、および発現パターンを試験するために用いられてよい。本発明のポリヌクレオチドを用いて設計されるプライマーは、配列決定およびＰＣＲ増幅に用いられてよい。本発明のポリヌクレオチドはまた、組成物、例えば医薬組成物、および食物サプリメント、例えば反すう動物の飼料構成成分としても使用されてよい。本発明のポリヌクレオチドはまた、健康上の効用も有する。このような効用のため、該ポリヌクレオチドは発現ベクターまたは発現ベクターを含むホスト細胞として提示できる。特定の態様によれば、徐放反すう胃装置が、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ホスト細胞、および組成物（例えば医薬組成物および食物サプリメント）と共に使用できる。
【００６３】
本発明のポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１〜６９から成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列のコード配列を含む配列、またはその断片もしくは変異体；（ｂ）配列番号１〜６９から成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列のコード配列の相補体、逆配列、逆相補体、ならびにその断片および変異体；および（ｃ）配列番号１〜６９から成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列のコード配列に含まれる翻訳領域、ならびにその断片および変異体；（ｄ）配列番号１〜６９から成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列のコード配列の機能的ドメイン、ならびにその断片および変異体；および（ｅ）配列番号１〜６９から成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列のコード配列の少なくとも１つの特定された数の近接残基を含む配列、またはその変異体を含む配列から成る群より選択される配列の少なくとも１つを含む。一実施形態によれば、本発明は、配列番号１〜６９から成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列のコード配列を含む単離されたポリヌクレオチドを包含する。
【００６４】
本発明のポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号７４〜１４２から成る群より選択される少なくとも１つの核酸配列を含む配列、またはその断片もしくは変異体；（ｂ）配列番号７４〜１４２から成る群より選択される少なくとも１つの核酸配列のコード配列の相補体、逆配列、逆相補体、またはその断片もしくは変異体；および（ｃ）配列番号７４〜１４２から成る群より選択される核酸配列に含まれる翻訳領域、ならびにその断片および変異体；（ｄ）配列番号７４〜１４２から成る群より選択される少なくとも１つの核酸配列のコード配列の機能的ドメイン、ならびにその断片および変異体；および（ｅ）配列番号７４〜１４２から成る群より選択される少なくとも１つの核酸配列の少なくとも１つの特定された数の近接残基を含む配列、またはその変異体、を含む配列から成る群より選択される配列の少なくとも１つを含む。オリゴヌクレオチドおよびプライマー、ならびにいずれの開示される配列から得られるその変異体もまた提供される。これらのポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの全ては、ここに本発明のポリヌクレオチドとして総称される。
【００６５】
当業者は、遺伝コードの縮重の結果として、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の多数、いずれの既知および天然発生遺伝子のヌクレオチド配列に最小の相同性を有する幾つか、が産生されてよいことが認識されるであろう。従って本発明は、可能なコドン選択に基づく組み合わせの選択によって作り出されてよいヌクレオチド配列の、可能な変動のそれぞれおよび全てを意図する。これらの組み合わせは、天然発生アミノ酸配列に適用される標準的な三つ組の遺伝コードに従って作られ、かつこれら全ての変異体は具体的に開示されたものとみなされる。
【００６６】
ファージポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体は、適切に選択されたストリンジェンシーの条件下で天然発生配列のヌクレオチド配列に好ましくハイブリダイズできる。しかしながら、実質的に異なるコドン用法を有する、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはその断片もしくは誘導体を産生することは有利であろう。コドンは、ホストによる特定のコドンの使用頻度に従い、特定の原核または真核ホストにおけるポリペプチドの発現率を増大させるように選択されてよい。例えば公知の方法に従い、コドンはE coliにおける発現のために最適化できる。コードされるアミノ酸配列を変化させることなく、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびその誘導体を実質的に変化させるその他の理由は、より望ましい特性、例えば天然発生配列から産生された転写物よりも長い半減期を有するＲＮＡ転写物の産生を含む。
【００６７】
本発明はまた、ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体をコードする、ＤＮＡ配列またはその断片の、完全な合成化学による産生も包含する。産生後、該合成配列は当該技術分野において公知の試薬を用いて、多数の利用可能な発現ベクターおよび細胞システムのいずれにも挿入されてよい。さらに合成化学は、ポリペプチドをコードする配列、またはそのいずれの変異体もしくは断片に変異を導入するために使用されてよい。本発明はまた、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152:399-407) および Kimmel, A. R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511) に説明されるようなストリンジェンシーの様々な条件下において、特許請求されるヌクレオチド配列、特に配列番号７４〜１４９に示されるもの、もしくはそれらの相補体にハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列もまた包含する。
【００６８】
当該技術分野において公知かつ一般的に入手可能なＤＮＡ配列決定法は、本発明の実施形態のいずれの実践にも使用されてよい。該方法は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、SEQUENASE (U.S. Biochemical Corp、クリーブランド、オハイオ州)、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、熱安定型Ｔ７ポリメラーゼAmersham Pharmacia Biotech(ピスカタウェイ、ニュージャージー州)のような酵素、またはLife Technologies（ゲイサーズバーグ、メリーランド州）により市販されているELONGASE Amplification Systemに見出されるような、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼの組み合わせを用いてよい。好ましくは、この過程はHamilton Micro Lab 2200（ハミルトン、リノ、ネバダ州）、Peltier Thermal Cycler（PTC200; MJ Research、ウォータータウン、マサチューセッツ州）、ABI Catalyst および 373 および 377 DNA Sequencers（Perkin Elmer）、またはGenome Sequencer 20（商標）（Roche Diagnostics）のような装置を用いて自動化される。
【００６９】
ポリペプチドをコードする核酸配列は、部分的ヌクレオチド配列を用いて、かつプロモーターおよび調節性エレメントのような上流の配列を検出するための当該技術分野において公知の様々な方法を用いることにより伸長されてよい。例えば、用いられてよい一方法である「制限酵素部位」ＰＣＲは、既知の遺伝子座に隣接する未知の配列を取得するために普遍的なプライマーを使用する（Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322）。特にゲノムＤＮＡは、リンカー配列に対するプライマーおよび既知領域に特異的なプライマーの存在下で最初に増幅される。増幅された配列は、次に同じリンカープライマーおよび最初のプライマーの内部に特異的な別のプライマーによる２回目のＰＣＲに供される。ＰＣＲの各回の産物は適切なＲＮＡポリメラーゼによって転写され、逆転写酵素を用いて配列決定される。
【００７０】
有用な別の方法は、ＩＰＣＲとも称される逆ＰＣＲである（例えば、Ochman H, Gerber
AS, . Hartl, DL. Genetics. 1988 Nov; 120(3):621-3を参照）。逆ＰＣＲは、標的ＤＮＡの内部配列のみが既知である場合に用いることができる。逆ＰＣＲ法は、ＤＮＡを制限酵素で切断することによる、一連の消化および自己ライゲーションを含む。この切断は、未知の配列のいずれかの末端において既知の配列をもたらす。この方法に従い、標的ＤＮＡは制限酵素消化によって数キロベースの小さめの断片に容易に切断される。続いて自己ライゲーションは、リン酸骨格の再編成をもたらし、かつ環状ＤＮＡライゲーション産物を産生する低濃度において誘導される。標的ＤＮＡは次に既知の制限酵素により制限消化される。これは、既知の末端配列を有する直線状産物を生じる、既知の内部配列内の切断を生じる。この産物は次に、既知の内部配列に相補的なプライマーを用いて行われる標準ＰＣＲのために使用できる。
【００７１】
サイズの解析または配列決定法もしくはＰＣＲ産物のヌクレオチド配列の確認のため、市販されているキャピラリー電気泳動システムが使用されてよい。特にキャピラリー配列決定法は、電気泳動による分離のための流動性ポリマー、レーザーにより活性化される４種の異なる蛍光色素（各ヌクレオチドに対して１種）、および放射された波長の電荷結合素子カメラによる検出を用いてよい。出力／光強度は適切なソフトウェア（例えばGENOTYPER および Sequence NAVIGATOR、Perkin Elmer）を用いて電気的シグナルに変換されてよく、サンプルの負荷からコンピューター解析までの全体の過程および電気的データ表示は、コンピューターにより制御されてよい。キャピラリー電気泳動は、特定のサンプル中に限られた量で存在し得るＤＮＡ小片の配列決定に特に好ましい。
【００７２】
最近、ピロシーケンスが有用な配列決定方法論として現れた。Ronaghi, M. et al. 1996 Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release. Anal. Biochem. 242: 84-89; Ronaghi, M. et al. 1998. A sequencing method based on real-time pyrophosphate. Science 281: 363-365; Ronaghi, M. et al. 1999. Analyses of secondary structures in DNA by pyrosequencing. Anal. Biochem. 267: 6571; Ronaghi 2001. Genome -Res. Vol. 11, Issue 1, 3-11; Nyren The history of pyrosequencing. Methods Mol Biol. 2007;373:1-14.を参照のこと。ピロシーケンスは正確さ、柔軟性、並行処理の利点を有し、かつ容易に自動化できる。さらに、技術が標識プライマー、標識ヌクレオチド、およびゲル電気泳動の必要に応じて施行される。この方法に従い、ポリメラーゼはヌクレオチドの核酸への取り込みを触媒する。取り込みの結果としてピロリン酸分子が遊離し、続いてスルフリラーゼによりＡＴＰに変換される。ルシフェリン分子が酸化されるルシフェラーゼ反応の間に光が産生される。各ヌクレオチド付加の後、洗浄工程が行なわれ、反復性付加が可能になる。ヌクレオチド分解酵素によりヌクレオチドは連続的に分解され、続くヌクレオチドの付加が可能になる。ピロシーケンスは、ゲノムおよびメタゲノム分析を含む大量配列決定のプラットフォームとして成功裏に応用されてきた（例えば454 Life Sciences/Roche からのThe Genome Sequencer FLX（商標）を参照）。
【００７３】
SOLiD（商標）システムもまた、配列決定のために開発された（例えば、Applied Biosystems. Application Fact Sheet for the SOLiDTM System.フォスターシティー、カリフォルニア州を参照）。この方法論は色素標識オリゴヌクレオチドのクローン的に増幅されたＤＮＡ断片との連続ライゲーションに基づく。この方法によれば、ＤＮＡ配列は連続ライゲーションを基準にして生じる。ライゲーション反応は連続付加ではなくプローブ認識に基づき、それ故にエラーの蓄積が少ない傾向にある。化学的性質は実質的に偽挿入もしくは欠失の可能性を排除する。ライゲーション工程およびライゲーションされていないプローブのホスファターゼ処理はdephasingを防ぐ。加えて、７サイクルのライゲーションの後、本来のプライマーは鋳型から取り除かれ、ｎ−１位置における照合を開始するために新たなプライマーがハイブリダイズされる。この「リセット」段階の使用は、システムノイズを減少し、かつより長い長さの読み取りを可能にする。加えて、２塩基コーディングが、真の多型性とそれに反する測定エラーとを識別するために使用される。単一の位置における変化はランダムエラーと同定され、データ分析のソフトウェアにより除くことができる。分析プラットフォームとして、SOLiD（商標）システムは、大量配列決定、デジタル遺伝子発現、ＣｈＩＰおよびメチル化研究における応用を有し、ゲノムの変動を検出するために特に有用である。
【００７４】
本発明の別の実施形態によれば、適切なホスト細胞内でポリペプチド、またはその断片もしくは変異体の発現を導く組み換えＤＮＡ分子内で、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片が使用されてよい。遺伝子コードに固有の縮重により、実質的に同じかまたは機能的に同等なアミノ酸配列をコードするその他のＤＮＡ配列が産生され得り、これらの配列はクローニングおよびポリペプチドの発現のために使用されてよい。本発明のヌクレオチド配列は、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を修飾する変化を含むがこれらに限定されない様々な理由によりアミノ酸をコードする配列を変化させるため、当該技術分野において一般に公知の方法を用いて操作することができる。ヌクレオチド配列の操作のため、ランダム断片化および遺伝子断片のＰＣＲ再構築によるＤＮＡシャッフリング、ならびに合成オリゴヌクレオチドが使用されてよい。例えば新しい制限酵素部位の挿入、グリコシル化パターンの変化、コドン優先度の変更、変異の導入などのために部位特異的変異誘発が使用されてよい。
【００７５】
本発明の別の実施形態によれば、ポリペプチドをコードする天然、改変、または組み換え核酸配列が、融合タンパク質をコードするために異種性配列に連結されてよい。これは例えば、市販の抗体により認識できるキメラ配列をコードするために有用であろう。融合タンパク質はまた、本発明のポリペプチドと異種性タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように操作されてもよく、これによりポリペプチドは異種性部分から切断され精製され得る。
【００７６】
別の実施形態によれば、ポリペプチドをコードする配列は、当該技術分野において公知の化学的方法を用い、全体または一部が合成されてよい（Caruthers, M. H. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232を参照）。あるいは、該ポリペプチドそれ自体は、アミノ酸配列またはその断片を合成する化学的方法を用いて産生されてよい。例えば、ポリペプチド合成は様々な固相技術を用いて行うことができ（Roberge, J. Y. et al. (1995) Science 269:202-204; Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154）、かつ例えばABI 431Aペプチドシンセサイザー（Perkin Elmer）を用いた自動合成が達成されてよい。ポリペプチドの様々な断片は別々に化学合成され、完全長分子を産生するための化学的方法を用いて組み合わせられてよい。
【００７７】
新たに合成されたポリペプチドは調製用の高速液体クロマトグラフィー（例えば、Creighton, T. (1983) Proteins Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, NY）により単離されてよい。合成ポリペプチドの組成物は、アミノ酸分析または配列決定により確認されてよい（例えば、エドマン分解法；Creighton、上記）。加えて、ポリペプチドのアミノ酸配列またはそのいずれの一部は、変異分子を産生するため、直接合成の間に変化させられてよく、かつ／または化学的方法を用いてその他のタンパク質由来の配列またはそのいずれの一部と組み合わせられてよい。
【００７８】
生物学的に活性のあるポリペプチドを発現させるため、該ポリペプチドまたは機能的同等物をコードするヌクレオチド配列が、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクターへ挿入されてよい。ポリペプチドをコードする配列ならびに適切な転写および翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築するため、当業者に公知の方法が用いられてよい。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝的組み換えを含む。このような技術は、Sambrook, J. et al. (2001) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, および Ausubel, F. M. et al. (2007) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NYに記載されている。
【００７９】
本発明のポリペプチドをコードする配列を含み、かつ発現するために、様々な発現ベクター／ホストシステムが利用されてよい。これらは、組み換えファージ、プラスミド、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌のような微生物；酵母発現ベクターにより形質転換された酵母；ウィルス発現ベクター（例えばバキュロウィルス）に感染した昆虫細胞システム；ウィルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウィルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウィルス、ＴＭＶ）もしくは細菌発現ベクター（例えばTiもしくはpBR322プラスミド）により形質転換された植物細胞システム；または動物細胞システムを含むがこれらに限定されない。細菌のために有用なプラスミドは、Invitrogenにより市販されているｐＥＴ、ｐＲＳＥＴ、ｐＴｒｃＨｉｓ２、およびｐＢＡＤプラスミド、Novagenにより市販されているｐＥＴおよびｐＣＤＦプラスミド、ならびにSigma-Aldrichにより市販されているDirector（商標）プラスミドを含む。メタン生成菌のために有用なプラスミドは、ｐＭＥ２００１、ｐＭＶ１５、およびｐＭＰ１を含むがこれらに限定されない。本発明は、用いられる発現ベクターまたはホスト細胞により限定されない。
【００８０】
「制御エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するためにホスト細胞タンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域−エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域−である。このようなエレメントはその強度および特異性において異なり得る。ベクターシステムおよび利用するホストに依存して、恒常的および誘導的プロモーターを含む、適切な転写および翻訳エレメントが幾つでも使用されてよい。例えば細菌システムにおけるクローニングのとき、BLUESCRIPTファージミド（Stratagene、ラホヤ、カリフォルニア州）のハイブリッドｌａｃＺプロモーター、またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Life Technologies）などのような誘導性プロモーターが使用されてよい。昆虫細胞においては、バキュロウィルスのポリヘドリンプロモーターが使用されてよい。植物細胞ゲノム由来（例えば熱ショック、RUBISCO、および貯蔵タンパク質遺伝子）または植物ウィルス由来（例えばウィルス性プロモーターもしくはリーダー配列）のプロモーターまたはエンハンサーがベクター内へクローン化されてよい。
【００８１】
細菌システムにおいては、幾つかの発現ベクターがポリペプチドに対する意図された使用に依存して選択されてよい。例えば大量のポリペプチドが必要なとき、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を導くベクターが使用されてよい。このようなベクターは、ハイブリッドタンパク質を産生できるように、ポリペプチドをコードする配列がベクター内でβ−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよびそれに続く７残基の配列とインフレームで連結し得るBLUESCRIPT（Stratagene）のような多機能大腸菌（E. coli）クローニングおよび発現ベクター；pINベクター（Van Heeke, G. and S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509）などを含むが、これらに限定されない。
【００８２】
ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために、ｐＧＥＸベクター（Promega、マディソン、ウィスコンシン州）もまた使用されてよい。一般にこのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズへの吸着とそれに続く遊離グルタチオン存在下での溶出により、溶解した細胞から容易に精製できる。このようなシステムで作られるタンパク質は、クローン化された目的のポリペプチドがＧＳＴ成分から選択的に遊離できるよう、ヘパリン、トロンビン、もしくは因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を含むように設計されてよい。酵母、Saccharomyces cerevisiaeでは、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨのような恒常的もしくは誘導的プロモーターを含む幾つかのベクターが使用されてよい。概説として、Ausubel et al.（上記）およびGrant et al. (1987) Methods Enzymol. 153:516-544を参照のこと。
【００８３】
本発明のポリペプチドをコードする配列のさらに効率的な翻訳を達成するため、特定の開始シグナルもまた用いられてよい。このようなシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。ポリペプチドをコードする配列の場合には、その開始コドンおよび上流配列は適切な発現ベクターへ挿入されており、追加の転写もしくは翻訳制御シグナルは必要ではないであろう。しかしながら、コード配列もしくはその断片のみが挿入される場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳制御シグナルが供給されなければならない。さらに、挿入物全体の翻訳を確実にするため、開始コドンは正確な読み枠でなければならない。外来性の翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然および合成両方による、様々な起源であってよい。発現の効率は、文献（Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162）に記載されているような、使用される特定の細胞システムに適切なエンハンサーを含むことにより増大し得る。
【００８４】
加えて、ホスト細胞の系統が、その挿入配列の発現を調節する能力または発現されるポリペプチドを望まれる様式で処理する能力について選択されてよい。このような配列の修飾は、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化を含むがこれらに限定されない。ポリペプチドの「プレプロ」型を切断する後翻訳プロセシングもまた、正確な挿入、フォールディング、および／または機能を促進するために用いられてよい。後翻訳活性に対する特定の細胞機構および特徴的な機序を有する異なるホスト細胞が、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ；ベセスダ、メリーランド州）から入手可能であり、配列の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選択されてよい。特定のホスト細胞は、メタノブレビバクター細胞、特にＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）もしくはＭ．スミシー（M. smithii）細胞のようなメタン生成菌細胞を含むがこれらに限定されない。目的のホスト細胞は、例えばロドトルラ属（Rhodotorula）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、スポロボロミセス属（Sporobolomyces）、シュードモナス属（Pseudomonas）、エルウィニア属（Erwinia）およびフラボバクテリウム属（Flavobacterium）；またはエシェリヒア属（Escherichia）、乳酸桿菌属（Lactobacillus）、バチルス属（Bacillus）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）のようなその他の生物などを含む。本発明の特定のホスト細胞は、本発明の使用に特に適している大腸菌（Escherichia coli）を含み、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）などを含む。
【００８５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養されている真核細胞内へ核酸を導入するための幾つかの方法が存在する。これらは化学的方法（Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:7413
7417 (1987); Bothwell et al., Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Eds., Jones and Bartlett Publishers Inc., Boston, Mass. (1990), Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, NY (1992);およびFarhood, Annal. NY Acad. Sci., 716:23 34 (1994)）、プロトプラスト（Bothwell、上記）または電気的パルス（Vatteroni et al., Mutn. Res., 291:163 169 (1993); Sabelnikov, Prog. Biophys. Mol. Biol., 62: 119 152 (1994); Bothwell et al.、上記;および Ausubel et al.、上記）の使用、弱毒化ウィルスの使用（Davis et al., J. Virol. 1996, 70(6), 3781 3787; Brinster et al. J. Gen. Virol. 2002, 83(Pt 2), 369 381; Moss, Dev. Biol. Stan., 82:55 63 (1994); および Bothwell et al.、上記）、同様に物理的方法（Fynan et al., 上記、 Johnston et al., Meth Cell Biol., 43(Pt A): 353 365 (1994); Bothwell et al.、上記; および Ausubel et al.、上記）を含む。
【００８６】
動物組織への核酸の良好な送達は、陽イオン性リポソーム（Watanabe et al., Mol. Reprod. Dev., 38:268 274 (1994)）、動物筋肉組織（Robinson et al., Vacc, 11:957 960 (1993); Hoffman et al., Vacc. 12:1529 1533; (1994); Xiang et al., Virol., 199:132 140 (1994); Webster et al., Vacc., 12:1495 1498 (1994); Davis et al., Vacc., 12:1503 1509 (1994); Davis et al., Hum. Molec Gen., 2:1847 1851 (1993); Dalemans et al. Ann NY Acad. Sci. 1995, 772, 255 256. Conry, et al. Cancer Res. 1995, 55(7), 1397-1400）および胚（Naito et al., Mol. Reprod. Dev., 39:153 161 (1994);およびBurdon et al., Mol. Reprod. Dev., 33:436 442 (1992)）へのネイキッドＤＮＡもしくはＲＮＡの直接注入、自己複製ＲＮＡワクチンの筋肉内注入（Davis et al., J Virol 1996, 70(6), 3781 3787; Balasuriya et al. Vaccine 2002, 20(11 12), 1609 1617）、または「遺伝子銃」技術を用いるＤＮＡの皮内注入（Johnston et al.、上記）により達成できる。
【００８７】
タンパク質に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを用いて、本発明のポリペプチドの発現を検出および測定するための様々な手順が当該技術分野において公知である。例として、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、および蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）が含まれる。ポリペプチド上の２種の非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる、２部位のモノクローナルに基づく免疫アッセイが使用できるが、競合的結合アッセイもまた使用できる。これらおよびその他のアッセイは、特にHampton, R. et al. (1990; Serological Methods, a laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN) および Maddox, D. E. et al. (1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216)に記載されている。
【００８８】
広く様々な標識および抱合技術が当業者に公知であり、様々な核酸およびアミノ酸アッセイに用いられてよい。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識ハイブリダイゼーションもしくはＰＣＲプローブを産生するための方法は、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識、または標識ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅を含む。あるいは、ポリペプチドをコードする配列、またはそのいずれの断片もしくは変異体は、ｍＲＮＡプローブを産生するためのベクター内へクローン化されてよい。このようなベクターは当該技術分野において公知かつ市販されており、Ｔ７、Ｔ３、もしくはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドの添加によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いられてよい。これらの方法は、Amersham Pharmacia
Biotech、Promega、およびUS Biochemicalの様々な市販キットを用いて行われてよい。検出を容易にするために用いられてよい適切なレポーター分子または標識は、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または発色薬剤、同様に基質、補因子、抑制剤、磁性粒子などを含む。
【００８９】
発現ベクターまたは発現ベクターにより形質転換されるホスト細胞は、ポリペプチドの発現および培養からの回収に適した条件下で複製されてよい。培養はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの発現のための構成成分を含んでよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現の構成成分は、ウサギ網状赤血球ライセート、大腸菌（E. coli）ライセート、およびコムギ胚芽抽出物のためのもの、例えばInvitrogenから市販されているExpressway（商標）またはRiPs system、iNtRON Biotechnologyから市販されているGenelator（商標）system、Novagenから市販されているEcoPro（商標）またはSTP3（商標）system、Promegaから市販されているTNT（登録商標）Quick Coupled system、およびQIAGENから市販されているEasyXpress systemを含む。培養から産生されるポリペプチドは、配列および／または使用されるベクターに依存して、分泌されるかまたは細胞内に含まれてよい。特定の態様によれば、ポリペプチドをコードする発現ベクターは、原核または真核細胞の膜を通してポリペプチドの分泌を導くシグナル配列を含むように設計できる。
【００９０】
その他の構成は、ポリペプチドの精製を促進し得るアミノ酸ドメインを含んでよい。このようなドメインは、固定化された金属における精製を可能にするヒスチジン−トリプトファン（例えば６Ｘ−ＨＩＳ（配列番号１５０））モジュールのような金属キレート化ペプチド、固定化された免疫グロブリンにおける精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびFLAG（登録商標）extension/affinity purification system（Immunex Corp.、シアトル、ワシントン州）において利用されるドメインを含むが、これらに限定されない。有用なエピトープタグは、3XFLAG（登録商標）、ＨＡ、ＶＳＶ−Ｇ、Ｖ５、ＨＳＶ、ＧＳＴ、ＧＦＰ、ＭＢＰ、ＧＡＬ４、およびβ−ガラクトシダーゼを含む。有用なプラスミドは、ビオチンタグ（例えばPromegaから市販されているPinPoint（商標）プラスミド）、カルモジュリン結合タンパク質（例えばStratageneから市販されているpCALプラスミド）、ストレプトアビジン結合ペプチド（例えばStratageneから市販されているInterPlay（商標）プラスミド）、ｃ−ｍｙｃもしくはFLAG（登録商標）タグ（例えばSigma-Aldrichから市販されている免疫沈降プラスミド）、またはヒスチジンタグ（例えばQIAGENから市販されているQIAExpressプラスミド）を含むものを、含む。
【００９１】
精製を促進するために発現ベクターは、例えば因子Ｘａまたはエンテロキナーゼに特異的である切断可能なリンカー配列（Invitrogen、サンディエゴ、カリフォルニア州）を含んでよい。例えば、ベクターは精製ドメインとポリペプチドの間に１つ以上のリンカーを含んでよい。このような発現ベクターの一つは、本発明のポリペプチド、およびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位に先立つ６ヒスチジン残基をコードする核酸を含む融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基はＩＭＡＣ（Porath, J. et al. (1992) Prot. Exp. Purif. 3: 263-281に記載される、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）における精製を促進するが、エンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質からポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターについての考察はKroll, D. J. et al. (1993; DNA Cell Biol. 12:441-453)により提供される。
【００９２】
本発明の抗体は、例えば精製または診断技術における使用のために、当該技術分野において一般に公知の方法を用いて産生されてよい。特に、一般的に公知の手順に従って抗体を産生するため、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドが使用されてよい。このような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、および単鎖抗体、Ｆａｂ断片、ならびにＦａｂ発現ライブラリーにより産生された断片を含んでよいがこれらに限定されない。中和抗体（すなわち機能を抑制するもの）は、本発明との併用に特に好ましい。
【００９３】
抗体産生のため、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトおよびその他を含む様々なホストが、免疫原性を有するポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはそれらのいずれの断片の注入により免疫されてよい。免疫反応を増大させるため、様々なアジュバントがホストの種に依存して使用されてよい。このようなアジュバントは、水酸化アルミニウムのようなフロイントミネラルゲル、ならびにリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールのような表面活性物質を含むがこれらに限定されない。ヒトにおいて使用されるアジュバントのうち、ＢＣＧ（bacilli Calmette-Guerin）およびコリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）は特に好ましい。
【００９４】
抗体を誘導するために使用されるポリペプチド、または断片は、少なくとも５アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１０アミノ酸を含むアミノ酸配列を有することが好ましい。これらは天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることもまた好ましく、かつ小さな天然発生分子の全体のアミノ酸配列を含んでよい。アミノ酸の短い伸展は、キーホールリンペットヘモシアニンおよびキメラ分子に対して産生された抗体のような別のタンパク質のものと融合されてもよい。
【００９５】
モノクローナル抗体は、培養における継続的な細胞株による抗体分子の産生を提供するいずれの技術を用いて調製されてもよい。これらは、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Kohler, G. et al. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. et al. (1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote, R. J. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030; Cole, S. P. et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120）を含むがこれらに限定されない。抗体はまた、リンパ球集団内でのｉｎ  ｖｉｖｏ産生の誘導、または文献（Orlandi, R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837; Winter, G. et al. (1991) Nature 349:293-299）に開示されるような、免疫グロブリンライブラリーまたはは高度に特異的な結合試薬のパネルのスクリーニングにより産生されてもよい。
【００９６】
加えて「キメラ抗体」、例えば適切な抗原特異性および生物学的活性をもつ分子を得るための、抗体遺伝子の組み合わせを産生するために技術が使用できる（Morrison, S. L. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M.S. et al. (1984)
Nature 312:604-608; Takeda, S. et al. (1985) Nature 314:452-454）。あるいは、特異的な単鎖抗体を産生するために、単鎖抗体の産生のために記述された技術が当該技術分野において公知の方法を用いて適応されてよい。ランダムコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーからの鎖のシャッフリングにより、明確なイディオタイプ構成成分ではないが関連した特異性を有する抗体が作られてよい（Burton D. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-3）。
【００９７】
本発明が関連する技術分野の当業者は、「ダイアボディ（diabody）」および「トリアボディ（triabody)」という用語を理解し得る。これらは同鎖上の二つのドメインを対合させるには短すぎる短ペプチドリンカーにより、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む分子である。これは１つ以上のその他の鎖の相補的ドメインとの対合を促進し、２つ以上の機能的抗原結合部位をもつ二量体または三量体分子の形成を助長する。得られた抗体分子は単一特異性または多特異性であり得る（例えばダイアボディの場合、二特異性）。このような抗体分子は、本発明が関連する技術分野において標準的な方法論を用いて、例えばTodorovska et al. (Design and application of diabodies, triabodies and tetrabodies for cancer targeting. J. Immunol. Methods. 2001 Feb 1;248(1-2):47-66)によって記載されるように、２種以上の抗体から作られる。
【００９８】
特異的結合部位を含む抗体断片もまた作られてよい。例えばこのような断片は、抗体分子のペプシン消化により産生できるＦ（ａｂ’）2断片、およびＦ（ａｂ’）2断片のジスルフィド橋を還元することにより作られるＦａｂ断片を含むがこれらに限定されない。あるいは、望まれる特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能にするために、Ｆａｂ発現ライブラリーが構築されてよい（Huse, W. D. et al. (1989) Science 254:1275-1281）。
【００９９】
結合特異性を有する抗体を同定するスクリーニングのために、様々な免疫アッセイが用いられてよい。確立された特異性をもつポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを用いる、競合的結合または免疫放射線測定法のための多数の手順が当該技術分野において公知である。このような免疫アッセイは典型的に、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとそれに特異的な抗体との間の複合体形成の測定に関与する。２種の非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する、２部位のモノクローナルに基づく免疫アッセイが好ましいが、競合的結合アッセイもまた用いられてよい（Maddox、上記）。
【０１００】
ここに述べられるファージポリペプチドは細胞を標的化、透過処理、および／または抑制する能力を有し、さらなる抑制分子の微生物細胞への送達の担体分子としても有用である。化合物をアミノ酸へ共役させるための化学はよく開発されており、幾つかの異なる分子の型がポリペプチドへ連結され得る。最も一般的な共役法は、遊離アミノ（アルファアミノもしくはＬｙｓ）、スルフヒドリル（Ｃｙｓ）、またはカルボン酸基（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、もしくはアルファカルボキシル）の存在に依存する。共役法は、カルボキシまたはアミノ末端残基を通してポリペプチドを細胞抑制剤へ連結するために使用できる。幾つかの場合、配列は、選択された化学に反応してよい複数の残基を含む。これは、１種を超える細胞抑制剤を含む多量体の産生のために用いることができる。あるいは、ポリペプチドは、反応残基が配列のアミノまたはカルボキシル末端のいずれかに局在するように短くできるかまたは選択できる。
【０１０１】
例えば、フルオレセインのようなレポーター分子は、ポリペプチド合成の間にＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｎε−１−（４，４−ジメチル−２，６ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン−３−メチルブチル）−Ｌ−リジンを用いて、リジン残基に特異的に取り込むことができる（Ono et al., 1997）。合成に続き、ヒドラジン処理によって４，４−ジメチル−２，６ジオキソシクロヘキサ−１−イリデンが除去された後、５−および６−カルボキシフルオレセインサクシニミジルエステルを共役できる。従って、ファージポリペプチドへの抑制分子の共役は、ポリペプチド配列へのリジン残基の包含、続いて適切に誘導体化された細胞抑制剤との反応により達成できる。
【０１０２】
ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）またはカルボジイミド共役法もまた使用できる。カルボジイミドは、アスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖カルボン酸基、同様にカルボキシル末端基を、一級アミンとの共役の反応部位とするために活性化できる。活性化されたポリペプチドは、最終抱合体を産生するために細胞抑制剤と混合される。細胞抑制剤が最初に活性化される場合には、ＥＤＣ法はＮ−末端アルファアミンを通して、かつそれが配列中に存在する場合にはおそらくＬｙｓの側鎖内のアミンを通して、細胞抑制剤を共役し得る。
【０１０３】
ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ＭＢＳ）は、システインを通してポリペプチドを細胞抑制剤へ連結するために使用できる、ヘテロ二機能性試薬である。共役はシステイン残基のチオール基により起こる。選択された配列がＣｙｓを含まない場合、ポリペプチドの細胞抑制剤への高度に制御された連結を得るため、Ｎ−もしくはＣ−末端にＣｙｓ残基を配置することは一般的である。合成の目的のため、ポリペプチドのＮ−末端にシステインが配置されることは役に立つであろう。ＭＢＳは本発明の使用に特に適している。
【０１０４】
グルタルアルデヒドは、二つの化合物をそれらのアミノ基を通して連結する、二機能性の共役試薬として使用できる。グルタルアルデヒドは好ましい提示のため、ポリペプチドと細胞抑制剤の間に高度に柔軟性のあるスペーサーを提供する。グルタルアルデヒドは非常に反応性のある化合物であり、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、およびＨｉｓとは限られた程度に反応し得る。グルタルアルデヒド共役法は、ポリペプチドがそのアミノ末端に単一の遊離アミノ基のみを含む時に特に有用である。ポリペプチドが１を超える遊離アミノ基を含む場合、大きな多量体複合体が形成できる。
【０１０５】
一態様によれば、本発明のポリペプチドは、抗菌剤のような細胞抑制剤へ融合（例えばインフレームクローニングにより）または連結（例えば化学共役により）できる。これらに含まれるものは抗菌ペプチド、例えば殺菌性／透過性増大タンパク質、陽イオン性抗菌タンパク質、リゾチーム、ラクトフェリン、およびカテリシジンである（例えば好中球由来の；例えば、Hancock and Chapple, 1999, Antimicrob. Agents Chemother.43:1317-1323; Ganz and Lehrer, 1997, Curr. Opin. Hematol. 4:53-58; Hancock et al., 1995, Adv. Microb. Physiol. 37:135-175を参照）。抗菌ペプチドはさらにデフェンシン（例えば上皮細胞または好中球由来の）および血小板殺微生物性タンパク質（例えば、Hancock and Chapple, 1999, Antimicrob. Agents Chemother.43:1317-1323を参照）を含む。さらなる抗菌ペプチドはグラミシジンＳ、バシトラシン、ポリミキシンＢ、タキプレシン、バクテネシン（例えばウシバクテネシン）、ラナレキシン、セクロピンＡ、インドリシジン（例えばウシインドリシジン）およびナイシン（例えば細菌性ナイシン）を含むがこれらに限定されない。
【０１０６】
細胞膜のような脂質バリアを横断して、イオン（例えばナトリウム）の透過を促進するイオノフォアもまた抗菌剤として含まれる。RUMENSIN（商標）（Eli Lilly）およびLasalocid（Hoffman LaRoche）の二つのイオノフォア化合物が、本発明に特に適する。その他のイオノフォアは、サリノマイシン、アボパルシン、アリドシン（aridcin）、およびアクタプラニンを含むがこれらに限定されない。その他の抗菌剤は、Monensin（商標）およびアジスロマイシン、メトロニダゾール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ならびにペニシリン、同様に、一般的にβ−ラクタム、アミノグリコシド、マクロライド、クロラムフェニコール、ノボビオシン、リファンピン、およびフルオロキノロンを含む（例えば、Horn et al., 2003, Applied Environ. Microbiol. 69:74-83; Eckburg et al., 2003, Infection Immunity 71 :591-596; Gijzen et al., 1991, Applied Environ. Microbiol. 57:1630-1634; Bonelo et al., 1984, FEMS Microbiol. Lett. 21:341-345; Huser et al., 1982, Arch. Microbiol. 132:1-9; Hilpert et al., 1981, Zentbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1 Abt Orig. C 2:21-31を参照）。
【０１０７】
特に有用な抑制剤は、ブロモエタンスルホン酸、例えば２−ブロモエタンスルホン酸またはその塩、例えばナトリウム塩を含む、メタン生成を遮断または妨げる化合物である。モリブデン酸ナトリウム（Ｍｏ）は硫酸還元抑制剤であり、ブロモエタンスルホン酸と共に使用できる。その他の抗メタン生成化合物は、硝酸、ギ酸、フッ化メチル、クロロホルム、抱水クロラール、亜硫酸ナトリウム、エチレン、およびアセチレンのような不飽和炭化水素、リノール酸、シスオレイン酸のような脂肪酸、ベヘン酸およびステアリン酸のような飽和脂肪酸、ならびにルマジン（例えば、２，４−プテリジンジオン）もまた含むがこれらに限定されない。さらなる化合物は、３−ブロモプロパンスルホン酸塩（ＢＰＳ）、プロピン酸および２−ブチン酸エチルを含む。
【０１０８】
抗菌剤としてさらに、ファージリゾチーム、エンドリシン、リゾチーム、溶解素、ファージ溶解素、muralysin、ムラミダーゼ、およびビロリシンを含む溶解酵素が含まれる。有用な酵素は、細菌細胞壁の特異的結合の加水分解能を示す。特定の溶解酵素は、ペプチドグリカンのアミノ糖（例えばＮ−アセチルムラミン酸、およびＮ−アセチルグルコサミン）間のグリコシド結合を加水分解するグルコサミニダーゼ、グリカン鎖および架橋結合ペプチド間のＮ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミド結合を切断するアミダーゼ、ならびに内部ペプチド結合を加水分解するエンドペプチダーゼ（例えばシステインエンドペプチダーゼ）、およびメタノバクテリウム科（Methanobacteriacaea）ファミリー由来のメタン生成菌のシュードムレインを攻撃するエンドイソペプチダーゼを含むがこれらに限定されない。
【０１０９】
ここおよび以下に詳述される、ＯＲＦ２０５８もしくはＯＲＦ２０５５によりコードされるポリペプチドは、反すう動物メタン生成菌特異的溶解酵素として有用である。天然の酵素はφｍｒｕにより新たに溶解されたＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）細胞から調製できる。あるいは、ＯＲＦ２０５８もしくはＯＲＦ２０５５は発現ベクター内にクローン化でき、Escherichia coliのような異種性のホスト内で発現できる。これは以前にＰｅｉＰおよびＰｅｉＷにより達成されており、組み換えタンパク質が還元条件下でメタノサーモバクター細胞壁に対して活性であることが示された（Luo et al., 2002）。ＯＲＦ２０５８もしくはＯＲＦ２０５５溶解酵素、またはいずれのその他の溶解酵素は、組成物中に、例えば反すう動物のための食品添加物として使用できるか、または反すう胃内の長期にわたる送達のための徐放カプセルもしくはボーラス装置に取り込むことができる。溶解酵素は、ホストメタン生成菌の適応、または酵素への抵抗性を回避するため、その他のメタン生成菌抑制剤と併用もしくは順次使用できる。酵素のランダムおよび／または標的化された変異もまた、適応を回避するために使用できる。溶解／溶原性スイッチ構成成分（例えばＯＲＦ１９８１およびＯＲＦ１９８３−ＯＲＦ１９８６）は溶解酵素と同様の様式により使用できる。
【０１１０】
加えて、抗菌剤としてＰＮＡが含まれる。ＰＮＡは、リン酸骨格がＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位から作られるアキラルかつ中性の骨格により置換された、ペプチド−核酸ハイブリッドである（例えば、Eurekah Bioscience Collection. PNA and Oligonucleotide Inhibitors of Human Telomerase. G. Gavory and S. Balasubramanian, Landes Bioscience, 2003を参照）。Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃの塩基が、骨格上のアミノ窒素にメチレンカルボニル結合を通して付着する（P. E. Nielsen et al., Science 1991. 254: 1497-1500; M. Egholm et al., Nature 1993. 365: 566-568）。ＰＮＡは相補配列に、高い特異性、および類似ＤＮＡまたはＲＮＡに比較してより高いアフィニティーで結合する（M. Egholm et al.、上記）。ＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ／ＲＮＡハイブリッドもまた、対応するＤＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖に比較してより高い熱安定性を示す（M. Egholm et al.、上記）。ＰＮＡはまた、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼによって認識されない非天然のアミド骨格のために、高い化学的および生物学的安定性も有する（V. Demidov et al., Biochem Pharmacol 1994. 48: 1310-1313）。典型的には、ＰＮＡは少なくとも５塩基の長さであり、末端リジンを含む。ＰＮＡは、その寿命をさらに延長するためにペグ化されてよい（Nielsen, P. E. et al. (1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63）。
【０１１１】
特定の一態様によれば、本発明のポリペプチドは細胞抑制剤、例えば抗体またはその断片へ融合（例えばインフレームクローニングにより）または連結（例えば化学共役により）できる。抗体または抗体断片は、微生物細胞もしくは特にメタン生成菌細胞、または１つ以上の細胞構成成分へ向けられてよい。例えば、細胞外レセプターのような細胞表面タンパク質が標的にされ得る。免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性部位、すなわち抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子が含まれる。
【０１１２】
本発明のポリペプチドには、微生物細胞、特にメタン生成菌細胞の標的化における特定の使用が見出される。特定の態様によれば、ポリペプチドは、細胞壁もしくは膜への付随または結合、細胞の透過処理、および／または細胞の生育もしくは複製の抑制のために使用できる。このように、ポリペプチドは、細胞への一過性もしくは延長された付着、または細胞壁もしくは膜の透過、および／または細胞内環境における蓄積のために使用できる。本発明のファージポリペプチド、同様に対応するポリヌクレオチド、発現ベクター、ホスト細胞、および抗体は、様々な微生物、例えば反すう動物における主要なメタン生成菌であるメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Methanobrevibacter ruminantium）、およびヒトにおける主要なメタン生成菌であるメタノブレビバクター・スミシー（Methanobrevibacter smithii）を標的化するために使用できることが理解される。標的化を達成するため、微生物細胞はここに詳述されるように、１種以上の天然源から単離された、または発現ベクターおよび／もしくはホスト細胞、または合成もしくは半合成化学により産生されたファージポリペプチドに接触させることができる。増大した透過性のため、該ポリペプチドは１つ以上のシグナル配列に融合もしくは連結できる（［ＭＬ］ＫＫＫＫ［Ｋ］｛０，１｝Ｘ｛０，９）［ＩＬ］［ＩＦＬ］［ＩＬ］［ＩＬ］［ＩＳ］［ＬＩＡ］Ｘ｛０，４｝［ＬＩＶＦ］［ＬＩＡＶ］［ＬＩ］［ＩＬＶ］［ＬＡＩＶ］［ＩＬＦＶ］［ＬＩＶＦ］［ＳＡＬ］［ＩＬＶ］［ＧＳＡ］［ＡＳ］［ＶＡＩ］［ＳＡ］Ａ、図６を参照）。Perez-Bercoff, A., Koch, J. and Burglin, T.R. (2006) LogoBar: bar graph visualization of protein logos with gaps. Bioinformatics 22, 112-114も参照のこと。特定の態様によれば、ペプチドもしくはポリペプチドはここに詳述される組成物として、例えば反すう動物のための徐放装置の使用を通して被験体へ送達される。
【０１１３】
特定の実施形態によればポリペプチドは、細胞抑制剤、例えば抗メタン生成化合物（例えばブロモエタンスルホン酸）、抗体もしくは抗体断片、溶解酵素、ペプチド核酸、抗菌ペプチド、またはその他の抗生剤に融合または連結される。ポリペプチド抑制剤は、微生物細胞、特にメタン生成菌細胞の生育および／または複製を抑制するための組成物として被験体へ送達される。組成物は例えば、ａ）単離されたファージ、ファージ粒子、ファージゲノム、またはその変化、断片、変異体、もしくは誘導体；ｂ）単離されたファージポリペプチド、またはその変化、断片、変異体、もしくは誘導体；ｃ）単離されたポリヌクレオチド、またはその変化、断片、変異体、もしくは誘導体；ｄ）このポリヌクレオチドを含む発現ベクター；またはｅ）この発現ベクターを含むホスト細胞を含む。本発明の組成物は、開示される方法に従い、微生物細胞、特にメタン生成菌細胞を標的化、透過処理、および／または抑制するためのキットの一部として特に包装できる。該キットは、ここに提示される組成物の少なくとも１種、および細胞の標的化もしくは透過処理、あるいはメタン生成菌もしくはその他の微生物の細胞生育または複製の抑制における使用のための説明書を含む。
【０１１４】
さらなる実施形態として、本発明は上で考察されたいずれの方法の使用のための、薬理学的に許容される担体との組み合わせにおける医薬組成物に関する。このような医薬組成物は、ファージポリペプチドを細胞抑制剤と組み合わせて含んでよい。あるいは該医薬組成物は、ここに詳述されるように、発現ベクター、もしくはホスト細胞を含んでよい。該組成物は単独で投与されてよいか、または生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水を含むがこれらに限定されない無菌、生体適合性のいずれの薬理学的担体中で投与されてよい、安定化化合物のような少なくとも１種のその他の薬剤との組み合わせにより投与されてよい。該組成物は被験体へ単独で、またはその他の薬剤、薬物（例えば抗菌薬物）、もしくはホルモンと組み合わせて投与されてよい。
【０１１５】
有効成分に加え、これらの医薬組成物は、薬理学的に使用できる製剤中への有効化合物の加工を促進する賦形剤および助剤を含む、適切な薬理学的に許容される担体を含んでよい。製剤および投与のための技術におけるさらなる詳細は、Remington's Pharmaceutical
Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA)の最新版に見出されるであろう。本発明で利用される医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、延髄内、包膜内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、経腸、外用、舌下、または直腸の手段を含むがこれらに限定されないいずれの数の経路により投与されてよい。
【０１１６】
経口投与のための医薬組成物は、当該技術分野において公知の薬理学的に許容される担体を経口投与に適した用量で用いることにより処方できる。被験体の摂取のため、このような担体は医薬組成物の錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などへの処方を可能にする。経口投与のための医薬製剤は、有効成分と固体賦形剤との混合物を通して得ることができ、得られた混合物は選択的に粉砕され、錠剤もしくは糖衣コアを得るために必要な場合には適切な助剤を加えた後、顆粒混合物が加工される。適切な賦形剤は炭水化物またはタンパク質増量剤であり、例えば、ラクトース、ショ糖、マンニトール、もしくはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、もしくはその他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、もしくはカルボキシメチルセルローススナトリウムのようなセルロース；アラビアの、もしくはトラガントを含むゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質である。必要な場合には崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩が添加されてよい。
【０１１７】
経口的に使用される医薬製剤は、ゼラチンで作られた押し込み型カプセル、同様にゼラチン、およびグリセロールもしくはソルビトールのようなコーティングにより作られたソフトな密封カプセルを含む。押し込み型カプセルは、ラクトースもしくはデンプンのような増量剤または結合剤、タルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および選択的に安定剤と混合された有効成分を含んでよい。ソフトカプセル内で有効化合物は、安定剤を含むかまたは含まない、脂肪油、液体、もしくは液体ポリエチレングリコールのような適切な液体中に溶解または懸濁されてよい。糖衣コアが濃縮糖液のような適切なコーティングと組み合わせて使用されてよく、これはまた、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポール（carbopol）ゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒もしくは溶媒混合物も含んでよい。製品の識別、または有効化合物の量すなわち用量を特徴付けるため、染料または顔料が錠剤または糖衣錠コーティングに添加されてよい。
【０１１８】
非経口投与に適切な医薬製剤は、水性溶液中、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理緩衝食塩水のような生理的適合性緩衝液中に処方されてよい。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのような、懸濁液の粘性を増大させる物質を含んでよい。加えて、有効化合物の懸濁液は適切な油性注射用懸濁液として調製されてよい。適切な親油性の溶媒もしくはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。非脂質のポリカチオン性アミノポリマーもまた、送達のために用いられてよい。懸濁液は選択的に、適切な安定剤、または高度に濃縮された溶液の調製を可能にするための化合物の溶解度を増大させる薬剤もまた含んでよい。外用または鼻内投与のため、透過すべき特定のバリア適した浸透剤が製剤中に使用される。このような浸透剤は一般に当該技術分野において公知である。
【０１１９】
本発明の医薬組成物は当該技術分野において公知の様式において、例えば従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、粉末化、乳化、被包、封入、または凍結乾燥過程の手段によって製造されてよい。該医薬組成物は塩として供給されてよく、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、コハク酸などを含むがこれらに限定されない多数の酸により形成できる。塩は、相当する遊離塩基型に比較して、水性またはその他のプロトン性溶媒にさらに可溶性となる傾向がある。その他の場合の好ましい製剤は、使用前に緩衝液と組み合わせた４．５ないし５．５のｐＨ範囲において、１〜５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％ショ糖、および２〜７％マンニトールのいずれかまたは全てを含んでよい、凍結乾燥粉末であってよい。医薬組成物の調製後、これらは適切な容器に配置でき、表示される状態の治療のために標識される。本発明の組成物の投与のため、このような標識は投与の量、頻度、および方法を含んでよい。
【０１２０】
本発明における使用に適切な医薬組成物は、意図される目的を達成するため、有効成分が有効量含まれる組成物を含む。いずれの化合物についても、治療的に有効な量は最初に、例えば微生物細胞、もしくは特にメタン生成菌細胞、または通常マウス、ウサギ、イヌ、もしくはブタ等の動物モデル、またはヒツジ、ウシ、シカ、およびヤギのような反すう動物種のいずれかにおける細胞アッセイにおいて推定できる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路の決定のためにも用いられてよい。このような情報は次に、被験体における投与のために有用な用量および経路の決定のために使用できる。投与経路に依存して、通常の投与量は０．１ないし１００，０００マイクログラム、全用量が約１ｇまでに変動してよい。送達の特定の用量および方法のガイダンスは文献により提供され、当業者に一般的に利用可能である。当業者はポリヌクレオチドに対し、ポリペプチドとは異なる製剤を用いるであろう。同様に、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの送達は、特定の細胞、状態、部位などに対して特異的であり得る。
【０１２１】
ファージに基づく治療学は公知であり、このような組成物の製造は当該技術分野において公開されている。ファージ治療学は、例えば、Staphylococcus（例えばS. aureus）、Pseudomonas（例えばP. aeruginosa）、Escherichia（例えばE. coli）、Klebsiella（例えばK ozaenae, K. rhinoscleromatis scleromatis およびK. pneumonia）、Proteus、Salmonella、Shigellaの標的化について記載されている（例えばCarlton, R.M. (1999). Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 47: 267-274; Liu,. J. et al. (2004). Nat. Biotechnol. 22, 185-191;. Projan, S. (2004). Nat. Biotechnol. 22, 167-168; Sulakvelidze, A., Alavidze, Z. and Morris, J. G. (2001). Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45 (3): 649-659; Weber-Dabrowska, Mulczyk, M. and Gorski, A. (2000). Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 48: 547-551を参照）。ファージ療法は、ファージが高度に特異的であり、人体の正常ミクロフローラに影響しないこと；ファージは真核細胞に感染せず、既知の重篤な副作用がないこと；ファージは感染部位に局在できること；およびファージは指数関数的に増加できることから、治療には少量のみが必要とされ、かつ一般的に低価格であり、伝統的な抗菌剤を超える固有の利点を有する。現在の概説については、Fischetti VA, Nelson. D, Schuch R. Reinventing phage therapy: are the parts greater than the sum? Nat Biotechnol. 2006 Dec;24(12):1508-11を参照のこと。
【０１２２】
ペプチドおよびポリペプチドに基づく治療学についてもまた、例えば、デニロイキンジフチトクス、オクトレオチド、バプレオチド、ランレオチド、ＲＣ−３９４０シリーズペプチド、デカペプチル、リュープロン、ゾラデックス、セトロレリクスについて（例えば、Lu et al.,. 2006, AAPS J 8:E466-472を参照）、hemocidins、staphopainsについて（例えば、Dubin et al., 2005, Acta Biochemica Polonica, 52:633-638を参照）、同様にインドリシジン、デフェンシン、lantibiotics、microcidin B17、ヒスタチン、およびmaganinについて（例えば、Yeaman and Yount, 2003, Pharmacol Rev 55:27-55を参照）記載されている。ペプチドおよびポリペプチドの治療学の一般的なガイダンスはまた、Degim et al., 2007, Curr Pharm Des 13:99-117 および Shai et al., 2006, Curr Prot Pept Sci, 7:479-486にも見出される。最近承認されたペプチドに基づく薬物は、Hematide1（商標）（合成ペプチドに基づく赤血球形成刺激剤、Affymax, Inc.）、エクセナチド（合成エキセンディン−４、Amylin/Eli Lilly）、ナトレコール（ネシリチド、ナトリウム利尿ペプチド、Scios)、プレナキシス（アバレリックス、Praecis Pharmaceuticals）、およびセクレフロー（セクレチン、Repligen）を含む。
【０１２３】
正確な用量は、治療を必要とする被験体に関する因子に鑑みて、実行者により決定され得る。用量および投与は、有効薬剤を十分な濃度で供給するため、または望まれる効果を維持するために調整される。考慮され得る因子は、疾病状態の重症度、被験体の一般的健康、被験体の年齢、体重、および性別、食事、時間、および投与頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、ならびに治療に対する耐性／反応性を含む。長時間作用型の医薬組成物は、特定製剤の半減期およびクリアランス率に依存して、３ないし４日毎、週１回、または２週間に１回投与されてよい。
【０１２４】
徐放処方または機序は、本発明の組成物（特に医薬組成物）に特に有用である。例えば反すう胃内装置は、国際公開第９５／１９７６３号およびニュージーランド特許第２７８９７７号に開示される、最初にAg Research Ltd.、ニュージーランドで開発され、Agri-Feeds Ltd.、ニュージーランドにより市販されるTime Capsule（商標）Bolus range、ならびにオーストラリア特許第３５９０８１７８号、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８１／１０００８２号、およびLaby et al., 1984, Can. J. Anim. Sci 64 (Suppl.), 337-8に開示される、Nufarm Ltd.、オークランド、ニュージーランドの一部門であるNufarm Health & Sciencesにより市販されるCAPTECを含むがこれらに限定されず、これら全ては参照によりここに取り込まれる。特定の例によれば、該装置は、注射外筒末端の穴へ組成物を推し進めるバネおよびプランジャーを含んでよい。
【０１２５】
さらなる実施形態として、本発明は上で考察されたいずれの方法の使用のための、水サプリメント、例えば水薬組成物、または食物サプリメント、例えば反すう動物の飼料構成成分のための組成物に関する。特定の態様によれば、食物サプリメントは少なくとも１種の食用野菜材料、および本発明のペプチドもしくはポリペプチドを含む。あるいは、食物サプリメントは少なくとも１種の食用野菜材料、およびポリペプチドまたはペプチド、または例えば発現ベクターもしくは該発現ベクターを含むホスト細胞として、ここに開示されるペプチドもしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。特に該組成物
は、得られる配列に融合または連結される細胞抑制剤をさらに含む。好ましい野菜材料は、乾草、草、穀粒、もしくは穀粉、例えば豆乾草、草乾草、トウモロコシサイレージ、草サイレージ、豆サイレージ、トウモロコシ粒子、カラスムギ、オオムギ、蒸留かす、ビールかす、大豆穀粉、および綿実穀粉のいずれか１種を含む。特に、反すう動物の食物組成物として草サイレージが有用である。植物材料は、本発明の構成成分の１種以上、例えばポリペプチドもしくはペプチド、ポリヌクレオチド、またはベクターのうち１種以上を含むように遺伝的に改変できる。
【０１２６】
別の実施形態によれば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して産生された抗体が、微生物、特にメタン生成菌の存在を決定するため、またはこのような微生物のレベルをモニターするアッセイにおいて使用されてよい。診断目的に有用な抗体が、上記に同じ様式で調製されてよい。診断アッセイは、ヒト体液または細胞もしくは組織の抽出液中のポリペプチドを検出するための、抗体および標識を利用する方法を含む。該抗体は改変してまたは改変なしで使用されてよく、かつ共有結合もしくは非共有結合のいずれかによるレポーター分子との結合により標識されてよい。当該技術分野において公知の広く様々なレポーター分子が用いられてよく、その幾つかは上述である。
【０１２７】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルを測定するための様々な手順は当該技術分野において公知であり（例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、およびブロット、例えばサザン、ノーザン、ウェスタンブロット）、微生物、特にメタン生成菌の存在またはレベルを決定するための基礎を提供する。正常または標準レベルは、正常被験体、例えば正常のヒトまたは反すう動物から得られた体液または細胞抽出液を複合体形成に適した条件下で抗体と組み合わせることによって確立される。標準的複合体形成の量は様々な方法により定量されてよいが、側光手段によることが好ましい。被験体、コントロール、および処理サンプル（例えば処置された被験体からのサンプル）に発現するポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの量は標準的な値と比較される。標準値と被験体の値との間の偏差は、微生物の存在またはレベルを決定するためのパラメーターを確立する。
【０１２８】
本発明の特定の実施形態によれば、ポリヌクレオチドは特定のハイブリダイゼーションおよび／または増幅技術を用いる診断目的で使用されてよい。使用されてよいポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド、相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ分子、ならびにＰＮＡを含む。ポリヌクレオチドは、発現が微生物の存在またはレベルと関連し得る、サンプル中の遺伝子発現を検出または定量するために使用されてよい。診断アッセイは、不在、存在と微生物レベルの変化の間を区別するため、および治療介入中のレベルをモニターするために使用されてよい。
【０１２９】
一態様によれば、ＰＣＲプローブとのハイブリダイゼーションは、核酸配列、特に本発明のポリペプチドをコードするゲノム配列を同定するために用いられてよい。プローブの、それが高度に特異的な領域、例えば５’調節性領域の１０の独特なヌクレオチドから作られたか、または特異性のより少ない領域、例えば３’翻訳領域から作られたかという特異性、およびハイブリダイゼーションもしくは増幅のストリンジェンシー（最大、高、中、もしくは低）は、プローブが天然発生の配列、対立遺伝子のみを同定するか、または関連配列を同定するかを決定し得る。プローブはまた、関連配列の検出にも使用されてよく、好ましくはいずれのコード配列からのヌクレオチドの少なくとも５０％を含む必要がある。対象発明のハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、配列番号７４〜１４２、または相補体、もしくはその改変配列のヌクレオチド配列由来、または天然発生配列のプロモーターおよびエンハンサーエレメント、ならびにイントロンを含むゲノム配列由来であってよい。
【０１３０】
ＤＮＡに対する特異的なハイブリダイゼーションプローブを産生するための手段は、ｍＲＮＡプローブ産生のためのベクターへの核酸配列のクローン化を含む。このようなベクターは当該技術分野において公知かつ市販されており、適切なＲＮＡポリメラーゼおよび適切な標識ヌクレオチドの添加によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡプローブ合成に使用されてよい。ハイブリダイゼーションプローブは様々なレポーター群、例えば32Ｐもしくは35Ｓのような放射性核種、またはアビジン／ビオチン共役システムを通してプローブに共役されたアルカリホスファターゼのような酵素ラベルなどにより標識されてよい。ポリヌクレオチドは、サザンもしくはノーザン分析、ドットブロット、またはその他の膜に基づく技術；ＰＣＲ技術；あるいは試験紙、ピン、ＥＬＩＳＡアッセイ、または微生物の存在もしくはレベルを検出するために、被験体生検由来の液体もしくは組織を利用するマイクロアレイにおいて使用されてよい。このような定性または定量法は当該技術分野において公知である。
【０１３１】
特定の態様によれば核酸配列は、標準法により標識される様々なアッセイにおいて有用である可能性があり、ハイブリダイゼーションおよび／または増幅に適した条件下で被験体由来の液体もしくは組織サンプルに加えられる。適切なインキュベーション期間の後、サンプルは洗浄され、シグナルが定量されて標準値と比較される。試験サンプル中のシグナル量が、比較されるコントロールサンプルのそれよりも著しく変化している場合、サンプル中のヌクレオチド配列の変化したレベルの存在は、微生物の存在またはレベルを示す。このようなアッセイはまた、動物実験、臨床試験、または被験体の治療のモニターにおいて特定の処置の有効性を評価するためにも用いられてよい。
【０１３２】
微生物の存在またはレベルの診断の基礎を提供するため、発現特性の正常または標準プロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーションおよび／または増幅に適した条件下で、正常被験体由来の体液または細胞抽出物をポリヌクレオチドまたはその断片と組み合わせることにより達成され得る。標準レベルは、正常被験体から得られた値を、実質的に精製されたポリヌクレオチドの既知の量を使用した実験から得られた値と比較することにより定量されてよい。正常サンプルから得られた標準値は、微生物の生育に対して治療された被験体のサンプルから得られた値と比較されてよい。標準値と被験体の値との間の偏差は、微生物の存在またはレベルを確立するために使用される。
【０１３３】
一旦微生物が同定され、処置手順が開始されると、被験体における発現レベルが正常被験体において観察されるそれに比べて減少し始めるか否かを評価するため、ハイブリダイゼーションおよび／または増幅アッセイが定期的に反復されてよい。連続的なアッセイから得られた結果は、数日から数ヶ月の範囲の期間にわたって処置の有効性を示すために用いられてよい。
【０１３４】
核酸配列から設計されたオリゴヌクレオチドの特定の診断的使用は、ＰＣＲの使用に関連してよい。このようなオリゴマーは化学的に合成、酵素的に産生、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されてよい。オリゴマーは好ましくは二つのヌクレオチド配列から成る可能性があり、特定のヌクレオチド配列または状態を同定するための最適化された状態の下で用いられる、一つはセンス方向（５’．→．３’）およびもう一つはアンチセンス方向（３’．→．５’）である。同一の二つのオリゴマー、オリゴマーの入れ子状態のセット、またはオリゴマーの縮重プールでさえも、密接に関連するＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の検出および／または定量のための少ないストリンジェント状態の下で用いられてよい。
【０１３５】
発現の定量のために用いてよい方法はまた、放射標識もしくはビオチン化ヌクレオチド、コントロール核酸の共増幅、および実験結果が補間された検量線も含む（Melby, P. C. et al. (1993) J. Immunol. Methods, 159:235-244; Duplaa, C. et al. (1993) Anal. Biochem. 229-236）。複数のサンプルを定量する速度は、目的のオリゴマーが様々な希釈で存在し、かつ分光光度的もしくは比色反応が迅速な定量を生ずるＥＬＩＳＡ形式におけるアッセイを行うことによって促進され得る。
【０１３６】
さらなる実施形態によれば、ここに記載されるいずれかのポリヌクレオチド由来のオリゴヌクレオチドもしくは長めの断片は、マイクロアレイにおける標的として使用されてよい。マイクロアレイは多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニターし（転写像を作り出すため）、かつ遺伝的変異体、変異および多型性を同定するために使用できる。この情報は、遺伝子機能の決定、疾病の遺伝的基礎の理解、疾病の診断、および治療薬活性の開発およびモニターのために使用されてよい。一実施形態によればマイクロアレイは、ＰＣＴ出願国際公開第９５／１１９９５号（Chee et al.）、Lockhart, D. J. et al. (1996; Nat. Biotech. 14: 1675-1680) および Schena, M. et al. (1996; Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619)に記載されるのような当該技術分野において公知の方法に従って準備、および使用される。
【０１３７】
一態様によればオリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ出願国際公開第９５／２５１１１６号（Baldeschweiler et al.）に記載されるような化学共役手順およびインクジェット適用装置を用い、マイクロアレイの表面で合成されてよい。別の態様によれば、ドットまたはスロットブロットに対する「格子」アレイ類似物（HYBRIDOT器具、Life Technologies）が、真空システム、熱、ＵＶ、機械的または化学的結合手順を用いて、基質の表面にｃＤＮＡ断片またはオリゴヌクレオチドを整列および連結するために用いられてよい。さらに別の態様によれば、アレイは用手で、または利用可能な装置、材料、および機械（マルチチャンネルピペッターまたはロボット機器；Brinkmann、ウェストベリー、ニューヨーク州、を含む）を用いて産生され、かつ例えば２４、４８、９６、３８４、１０２４、１５３６、もしくは６１４４スポットまたはウェル（例えばマルチウェルプレートとして）、またはそれを超えて、またはそれ自体が市販の機器使用を効率的にする、その他のいずれの２ないし１，０００，０００の複数を含んでよい。
【０１３８】
マイクロアレイを用いるサンプル分析を行うため、生物学的サンプルからポリヌクレオチドが抽出される。生物学的サンプルはいずれの体液（血液、尿、唾液、痰、胃液など）、培養細胞、生検、またはその他の組織標本から得られてよい。プローブの産生のため、サンプルから抽出されたポリヌクレオチドを用いてマイクロアレイの核酸に相補的な核酸配列が産生される。マイクロアレイがｃＤＮＡから成る場合、適切なプローブはアンチセンスＲＮＡである。従って一態様によれば、次々に蛍光ヌクレオチドの存在下で断片またはアンチセンスＲＮＡプローブを産生するために用いられる、ｃＤＮＡを産生するためにｍＲＮＡが用いられる。これらの蛍光標識されたプローブはマイクロアレイと共にインキュベートされ、プローブ配列はマイクロアレイのｃＤＮＡオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。別の態様によれば、プローブとして用いられる核酸配列は、ハイブリダイゼーション技術の分野において公知の制限酵素、ＰＣＲ技術、およびオリゴ標識キット（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて産生される、ポリヌクレオチド、断片、および相補またはアンチセンス配列を含んでよい。
【０１３９】
本発明の別の実施形態によれば、本発明のポリペプチド、またはその機能性もしくは免疫原性断片またはそのオリゴペプチドは、様々な薬物スクリーニング技術のいずれにおいても、化合物ライブラリーのスクリーニングのために使用できる。このようなスクリーニングに用いられる断片は、溶液中で遊離型であるか、固体支持体へ固定されるか、細胞表面上にあるか、または細胞内に位置し得る。ポリペプチドと、試験される薬剤の間での結合複合体の形成が測定されてよい。
【０１４０】
使用されてよい薬物スクリーニングの一技術は、公開されたＰＣＴ出願国際公開第８４／０３５６４号に記載されるように、目的のポリペプチドへの適切な結合アフィニティーを有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供する。この方法によれば、多数の異なる小さな試験化合物が、プラスチックピン、またはその他の幾つかの表面のような固体基質上で合成される。試験化合物は、ポリペプチド、またはその断片と反応し、洗浄される。結合したポリペプチドは、次に当該技術分野において公知の方法により検出される。精製されたポリペプチドはまた、上述の薬物スクリーニング技術における使用のため、プレート上に直接コートもできる。あるいは非中和抗体が、ペプチドの捕獲および固体支持体上への不動化のために使用できる。
【０１４１】
別の技術によれば、ポリペプチドを結合できる中和抗体が、ポリペプチドへの結合に対して試験化合物と特異的に競合する、競合薬物スクリーニングアッセイが使用されてよい。この様式によれば該抗体は、１つ以上の抗原結合部位を該抗体と共有する試験化合物の存在を検出するために使用できる。
【実施例】
【０１４２】
ここに記載される実施例は、本発明の実施形態を例証する目的のためにある。その他の実施形態、方法、および分析の型は分子診断技術における当業者の範囲内であり、ここに詳述する必要はない。当該技術分野の範囲内のその他の実施形態は、本発明の一部とみなされる。
【０１４３】
実施例１：ゲノムサイズの推定
メタノブレビバクター・ルミナンチウム（Methanobrevibacter ruminantium）のＭ１T株（ＤＳＭ１０９３）は、［ｇ／ｌ］ＮａＣｌ（１）、ＫＨ2ＰＯ4（０．５）、（ＮＨ4）2ＳＯ4（０．２５）、ＣａＣＬ2．２Ｈ2Ｏ（０．１３）、ＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ（０．２）、Ｋ2ＨＰＯ4（１）、浄化した反すう胃液（３００ｍｌ）ｄＨ2Ｏ（３６０ｍｌ）、ＮａＨＣＯ3（５）、レザズリン（０．２ｍｌ）Ｌ−システイン−ＨＣｌ（０．５）、酵母抽出物（２）、ならびに、（ｇ／ｌ）ニトリロ三酢酸（１．５）、ＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ（３）、ＭｎＳＯ4．Ｈ2Ｏ（０．５）、ＮａＣｌ（１）、ＦｅＳＯ4．７Ｈ2Ｏ（０．１）、ＣｏＣｌ2．６Ｈ2Ｏ（０．１）、ＣａＣｌ2（０．１）、ＺｎＳＯ4．７Ｈ2Ｏ（０．１）、ＣｕＳＯ4．５Ｈ2Ｏ（０．０１）、ＡｌＫ（ＳＯ4）2．１２Ｈ2Ｏ（０．０１）、Ｈ3ＢＯ3（０．０１）、Ｎａ2ＭｏＯ4．２Ｈ2Ｏ（０．０１）、ＮｉＳＯ4．６Ｈ2Ｏ（０．０３）、Ｎａ2ＳｅＯ3（０．０２)、およびＮａ2Ｗo4．２Ｈ2Ｏ（０．０２）から成るBalchの微量元素溶液（１０ｍｌ）（微量元素の添加；Balch et al., 1979）、から成るＢＹ＋培地（基本培地、Joblin et al., 1990）中で生育した。凍結粉砕法を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。細胞を遠心によって回収し、細胞ペレットを予め冷却した乳鉢内に配置し、液体窒素により凍結し、かつ予め冷却した滅菌乳鉢および乳棒を用いて穏やかに粉砕して微粉にした。ゲノムＤＮＡの物理的せん断を減少させるため、細胞ホモジネートをアガロースプラグ上に包埋し、続く操作をプラグ内で行った。制限酵素により消化を行い、ＤＮＡ断片をパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を用いて分離した。
【０１４４】
実施例２：ＤＮＡクローニングおよび配列決定
Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）ゲノムのＤＮＡは、Agencourt Biosciences Corporation（マサチューセッツ州、米国）によりランダムショットガンクローニングアプローチ（Fleischmann et al., 1995）を用いて、およびMacrogen Corporation（ロックビル、メリーランド州、米国）によりピロシーケンスを用いて配列決定された。簡単に述べると、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）のＤＮＡのライブラリーを、ゲノムＤＮＡのランダムな物理的破壊およびゲル電気泳動による断片の分離により、Escherichia coli内へ構築した。４０ｋｂ範囲の大きな断片をゲルから回収し、大インサートのフォスミドライブラリーを作製するために使用した。２ないし４ｋｂ範囲のＤＮＡ断片を回収し、小インサートのプラスミドライブラリーを作製するために使用した。大および小インサートライブラリーの両方からもたらされたクローンを生育させ、それらのフォスミドまたはプラスミドＤＮＡを回収し、ハイスループット配列決定技術を用いて配列決定した。Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）ゲノムの理論的な８倍のカバー率を生ずるために十分な数のクローンを配列決定した。１０倍の最終理論的なカバー率を得るため、ランダムにせん断されたゲノムＤＮＡ断片についてピロシーケンスを行った。
【０１４５】
実施例３：配列構築およびアノテーション
配列の重複を見出すためにＤＮＡ配列を整列し、Paracel Genome Assembler（Paracel Inc、カリフォルニア州、米国）およびStadenパッケージ（Staden et al., 1998）を用い、標準および逆ＰＣＲの両方から得られた配列を組み合わせて、近接する（コンティグ）配列へ構築した。コンティグは翻訳領域（ＯＲＦ）ファインダーＧＬＩＭＭＥＲ（Ｇｅｎｅ  Ｌｏｃａｔｏｒ  Ｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｅｄ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌ  ＥＲ、Delcher et al., 1999）を用いて分析し、各ＯＲＦは、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）の非重複性ヌクレオチドおよびタンパク質データベースに対するギャップ付きＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（Altschul et al., 1997））により分析した。８倍のドラフト段階の配列からのコンティグを、「偽分子」を産生するために配列の人工連結によってランダムに連結し、自動アノテーションのためThe Institute for Genomic Research（TIGR、ワシントンＤＣ、米国）へ提出した。１０倍のピロシーケンスから構築されたコンティグはGLIMMERを用いて再分析し、ＯＲＦはGAMOLA（Global Annotation of Multiplexed On-site Blasted DNA sequences; Altermann and Klaenhammer, 2003）を用いて自動アノテートした。ＯＲＦはオルソログタンパク質（ＣＯＧ）データベース（閾値１ｅ−０２）（Tatusov et al., 2001）のクラスターを用いる関数により分類した。
【０１４６】
タンパク質モチーフは、広範囲および局所性のアラインメント（hypertext transfer protocol://pfam.wustl.edu）ならびに標準および断片モードTIGRFAM HMMモデル（hypertext transfer protocol://world wide web.tigr.org/TIGRFAMs）それぞれと共に、PFAM HMMならびにTIGRFAMライブラリーを用いたHMMER（hypertext transfer protocol://hmmer.wustl.edu）により決定した（閾値１ｅ−０２）。ｔＲＮＡはTRNASCAN-SE（Lowe and Eddy, 1997）を用いて同定し、ヌクレオチド反復はKODONソフトウェアパッケージ（Applied Maths、オースティン、デキサス州、米国）およびREPUTER（Kurtz and Schleiermacher, 1999）を用いて同定した。自動アノテーションは、次に手動で確認した。ゲノムアトラス描出はGENEWIZ （Jensen et al., 1999）を用いて構築し、基礎となるデータ構造はカスタマイズされた社内開発のアルゴリズムによって作られた。予測されるＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）のＯＲＦｅｏｍｅからの経路再構築は、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Kanehisa et al., 2004）オンラインデータベースを併用し、社内開発のソフトウェア（PathwayVoyager; Altermann and Klaenhammer, 2005）を用いて行った。
【０１４７】
実施例４：配列決定結果および分析
ゲノムＤＮＡの制限酵素消化およびＰＦＧＥによる断片のサイズ決定によるＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）ゲノムのサイズ推定は、約２．５〜２．９Ｍｂの単一染色体を示した。大および小インサートクローン（６倍ドラフトカバー率）の最初の配列決定および配列のコンティグへの構築は、ゲノムの４０ｋｂ範囲が、特に小インサートライブラリー内で高度に過剰表現（＞２０倍）されていることを示した。これは高コピー数のプラスミド（染色体外ＤＮＡは同定されていないが）、またはＤＮＡ抽出のために使用した培養物の生育の間に複製した溶原性バクテリオファージによる可能性がある。この大きな配列バイアスのため、さらなる配列決定（２倍の理論的ゲノムカバー率）を、サンガー配列決定法により最終の８倍のカバー率をもたらす小インサートクローンのみについて行った。８倍のドラフト段階の配列を、１０５のスキャフォールドを通して連結した７５６のコンティグへ構築した。さらなる〜１０倍のカバー率に対してさらなるピロシーケンスを行い、これらの配列の構築への取り込みはコンティグの数を２７に低下させた。これに続く逆および長距離ＰＣＲ技術を用いるギャップ閉鎖は、コンティグの数を１４に減少させ、１の誤構築が残った。
【０１４８】
ハイスループット配列決定段階の間、低Ｇ＋Ｃ領域（〜１２ｋｂ）に直接に隣接する著しく高いＧ＋Ｃ量の領域（〜５０ｋｂ）へ向かって配列カバー率のバイアスが観察された。GAMOLAおよびGeneWizによるゲノム配列分析は、大きな低ＧＣスパイクに直接に隣接する顕著な高ＧＣの発見をもたらした。高Ｇ＋Ｃ領域の詳細な解析はファージ関連インテグラーゼ、ファージターミナーゼの大サブユニット、ファージポータルタンパク質、ファージカプシドタンパク質、およびファージ溶解素として作用すると予測されるタンパク質に類似性を持つ遺伝子産物の存在を明らかにした。これらの遺伝子産物は、φｍｒｕと名付けられた予測されるＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）プロファージの全体構造に対するアンカー点として用いた。ＤＮＡ二次構造の分析に基づき、ファージ組み込み部位の可能性があるａｔｔＬおよびａｔｔＲが同定された（図１Ａ）。ａｔｔ部位におけるファージ組み込みは、ＯＲＦ１９８０および２０６９によりコードされる推定膜タンパク質を破壊すると考えられ、この遺伝子はφｍｒｕファージゲノムであるａｔｔＢの本来の組み込み部位を含む可能性がある。
【０１４９】
φｍｒｕの一般的構造（図１Ｂ）およびＤＮＡ配列（図４Ａ）は、一般に認識されるファージゲノムのモジュラー構造と、配列類似性および機能的データベースとの組み合わせに基づいて決定した。例えば、Altermann E, Klein JR, Henrich B. Primary structure and features of the genome of the Lactobacillus gasseri temperate bacteriophage (phi)adh. Gene. 1999 Aug 20;236(2):333-46; Desiere F, Lucchini S, Canchaya C, Ventura M, BrUssow H. Antonie Van Leeuwenhoek: Comparative genomics of phages and prophages in lactic acid bacteria. 2002 Aug;82(14):73-91を参照のこと。予測されるφｍｒｕファージＯＲＦｏｍｅは、ファージ組み込み、ＤＮＡ複製およびパッケージング、ファージ構造タンパク質、および溶解カセットをコードするモジュールへ成功裏に分類され、ファージＯＲＦの約４０％が機能的に特徴付けられた。多数の直接および間接反復に隣接し、ＤＮＡ複製モジュール内にあると決定された大きな非コード配列（２４４ｂｐ）内の転写終結区様構造は、ＤＮＡ複製の推定起点として特徴付けられた。ファージゲノム配列内の幾つかの遺伝子は、アンチセンス鎖および低ＧＣ領域と一致する所に予測された。これらの遺伝子がファージ機能を不活性化するか、またはファージゲノム内の誤構築を示すかについて決定される必要がある。
【０１５０】
予測されるファージ溶解素とａｔｔＲの間の低ＧＣ領域は、タイプＩＩ制限ｍ６アデニンＤＮＡメチル転移酵素およびｄｎｄシステムに特異的であると考えられる転写調節因子を含む、ＤＮＡ硫黄修飾システムであるｄｎｄ（電気泳動の間の分解）を有することが見出された。さらに、非翻訳ＲＮＡ構造がファージゲノムの内側および隣接部位の両方に同定された。推定されるＤＮＡ複製モジュールの内側で、ｒｂｃＬが同定された。ｒｂｃＬはChlamydomonas reinhardtii由来の５’ＵＴＲ  ＲＮＡ安定化エレメントを表す。リブロース−１，５−カルボキシラーゼ二リン酸の大サブユニットをコードするｒｂｃＬの安定化において、ファミリーが関与すると考えられる。このファミリー内の変異は、転写物の分解において５０倍の促進をもたらし得る。
【０１５１】
ファージゲノムに隣接して、三つのグループＩイントロン構造が同定された。グループＩ触媒性イントロンは大きな自己スプライシングリボザイムである。これらは、広範囲の生物におけるｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡ前駆体からの自身の切除を触媒する。コア二次構造は９対の領域から成る（Ｐ１−Ｐ９）。これらは基本的な２ドメイン、Ｐ４−Ｐ６ドメイン（Ｐ５、Ｐ４、Ｐ６およびＰ６ａらせん体の積み重ねから形成される）およびＰ３−Ｐ９ドメイン（Ｐ８、Ｐ３、Ｐ７およびＰ９らせん体から形成される）へ折り畳まれる。このファミリーのための二次構造の印付けは、この保存されたコアのみを表す。グループＩ触媒性イントロンは、しばしばループ領域に挿入された長いＯＲＦを有する。これらの非翻訳ＲＮＡ構造は、ＯＲＦ１９８０（配列番号７４）の上流、ＯＲＦ２０６５（配列番号１４１）の下流、およびａｔｔＲと、ＯＲＦ２０６９（配列番号１４２）の上流の間の非翻訳領域に位置する。
【０１５２】
実施例５Ａ：ファージ遺伝子
Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）ゲノム配列内のプロファージ配列の発見は予想外であった。これまでにメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Methanobrevibacter ruminantium）系統Ｍ１（ＤＳＭ１０９３）が溶解または溶原性ファージに感受性であるという報告はないが、その他のメタノブレビバクター種において同定されたファージについては報告されている（Baresi and Bertani, 1984; Knox and Harris, 1986）。φｍｒｕプロファージの配列は、周囲のＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）ゲノムよりも著しく高いＧ＋Ｃ含量であり、これが別の生物に由来することが示唆される。観察されるレベルでの相同性はそれが由来する明らかなホストを示唆せず、φｍｒｕはこれまでに遭遇したいずれのその他のファージとも異なることが示される。
【０１５３】
φｍｒｕＤＮＡ配列はＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）の予想される膜タンパク質内に挿入され、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ部位に一致する二次構造をもつＤＮＡ配列に隣接する。他の既知のタンパク質との高い相同性がないにもかかわらず、ファージの全ての機能的モジュールの特性はφｍｒｕの配列内に同定され得る。配列の興味ある特徴は、ＤＮＡ硫黄修飾（ｄｎｄ）システムに関連するタンパク質に対する相同性を示す、３’末端の低Ｇ＋Ｃ領域である。これらの遺伝子はφｍｒｕのａｔｔＲ付着部位の上流に位置し、そのためファージ組み込みの間にＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）ゲノム内へ運ばれると考えられる。該領域は幾つかのｄｎｄ付随ＯＲＦ（ｄｎｄ１、２、および３）、および推定される転写調節因子と共にタイプＩＩメチラーゼサブユニットをコードする。
【０１５４】
ｄｎｄ表現型は、電気泳動の間にそのＤＮＡを分解に対して感受性にする。各ｄｎｄＯＲＦ機能の分析は、硫黄または硫黄を含む物質のホストゲノムへの取り込みを示唆した。Ｄｎｄ表現型はまた、様々な起源および多様な生息地の広範な細菌種のＤＮＡ内に存在することも発見された。同様に、異なる属を代表する幾つかの細菌ゲノム内、および海洋生物のｅＤＮＡ内に系統的な遺伝子クラスターが見出され、このような修飾が広範な現象であることを示す。Ｄｎｄ表現型と硫黄によるＤＮＡ修飾の間の一致が幾つかの代表的な細菌ゲノムに起こることが、ｉｎ  ｖｉｖｏ（３５）Ｓ−標識により示された（Zhou X, He
X, Liang J, Li A, Xu T, Kieser T, Helmann JD, Deng Z. A novel DNA modification by sulphur. Mol Microbiol. 2005 Sep;57(5):1428-38）。
【０１５５】
タイプＩＩ  Ｒ＼Ｍシステムは最もシンプルかつ最も普及している。複合体としての作用に代わり、メチル転移酵素および制限酵素は２つの異なるタンパク質としてコードされ、独立して作用する。タンパク質の特異性は存在しない。両タンパク質は同じ認識部位を認識し、そのために活性は競合する。メチル転移酵素単量体として作用し、一度に二本鎖の一ストランドをメチル化する。制限酵素はホモ二量体として作用し、両ストランドの切断を促進する。切断は認識配列の内部またはそれに近い、限定された部位に起こる。この点において、予測される機能性がどのようにｄｎｄシステムと共に作用するかについては明らかでない。しかし、ファージが送達担体としての有用性を持つことは明らかである。特に溶原性変換領域は、遺伝子置換の座位として使用できる。
【０１５６】
ｄｎｄシステムはファージによってＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）へ輸送されたと考えられる。φｍｒｕ  ｄｎｄシステムそれ自体としての、Ｍ．ルミナンチウム（M.
ruminantium）または外来性ＤＮＡの保護または修飾における役割は明らかではない。φｍｒｕ配列の別の興味ある特徴は、アンチセンス鎖上にコードされる幾つかのＯＲＦである。これらのＯＲＦは低ＧＣ領域に相当し、様々な生物由来のタンパク質に対して弱いBLASTマッチを有する。このことは、これらの遺伝子がＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）への組み込み以来、φｍｒｕゲノム内に蓄積していることを示唆し得る。これらのＯＲＦが、最終的にファージの不活性化および順化をもたらし得る挿入の進行中の蓄積を表すか、またはφｍｒｕが完全に活性であるかについては明らかではない。
【０１５７】
メタン緩和のために特に興味ある一つのφｍｒｕ遺伝子は、溶解カセット内に位置するＯＲＦ２０５８である。ＯＲＦ２０５８は、ペプチダーゼとしてアノテートされ、ペプチダーゼＣ３９ファミリータンパク質に対するタンパク質ファミリー（Ｐｆａｍ）マッチ（スコア：−１３．７、Ｅ値：０．０００５４）を有する。これらのタンパク質はシステインプロテアーゼであり、MEROPSペプチダーゼデータベース（Rawlings et al., 2006）により定義されたＣＡペプチダーゼのより大きな一族の一部である。Ｃ３９ペプチダーゼファミリーは通常ＡＢＣトランスポーターに付随し、バクテリオシンの搬出およびプロセシングの間に成熟プロテアーゼとして機能する。ＣＡペプチダーゼ一族はまた、ウィルス性システインエンドペプチダーゼ、例えば古細菌の細胞壁の架橋されたペプチドを切断するＣ７１古細菌ファージイソペプチダーゼも含む。メタノバクテリウム目ファミリーに属するメタン生成古細菌の細胞壁は、ペプチドにより架橋されたN-acetyl-L-talosaminurinic acidの重合体である、偽ムレインの平行鎖を含む。Ｃ７１偽ムレインエンドイソペプチダーゼは、古細菌の細胞壁ペプチド架橋を切断し、細胞を溶解できる。
【０１５８】
メタノサーモバクター・マーブルゲンシス（Methanothermobacter marburgensis）ファージであるΨＭ２（図３）由来の偽ムレインエンドイソペプチダーゼの位置およびシンテニーに基づき、ＯＲＦ２０５８は、ファージ産物の放出に先立つ細胞溶解に関わる溶解酵素をコードするメタン生成菌溶解素遺伝子としての役割を有し得る。ＯＲＦ２０５８と、M. marburgensis由来のＰｅｉＰおよびM. wolfeii由来のＰｅｉＷとのアラインメント（図５）は、タンパク質間の低い全体的相同性を示す。しかしながら、エンドイソペプチダーゼ触媒性の三つ組に関与するヒスチジンおよびアスパラギン酸残基の保存が存在し、かつＯＲＦ２０５８内のシステイン残基がＰｅｉＰおよびＰｅｉＷの保存されたシステインの近傍に位置することによって、触媒性の三つ組の第三の保存された部位が作られる（Makarova et al., 1999, Luo et al., 2002）。さらに、ＰｅｉＰおよびＰｅｉＷの触媒性Ｈｉｓ残基を囲むＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒモチーフもまた、ＯＲＦ２０５８内に見出される。これらの観察は、ＯＲＦ２０５８が、ファージ溶解サイクルの間にＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）細胞の溶解に対して機能するφｍｒｕ溶解素遺伝子であることを示唆する。ＯＲＦ２０５８とＰｅｉＰおよびＰｅｉＷの間に観察される相違は、古細菌細胞壁のペプチド架橋の相違、ならびにそれ故のペプチダーゼ基質の特異性を反映する可能性がある。
【０１５９】
実施例５Ｂ：ファージの誘導
メタノブレビバクター・ルミナンチウム（Methanobrevibacter ruminantium）のＭ１T株（ＤＳＭ１０９３）は、［ｇ／ｌ］ＮａＣｌ（１）、ＫＨ2ＰＯ4（０．５）、（ＮＨ4）2ＳＯ4（０．２５）、ＣａＣＬ2．２Ｈ2Ｏ（０．１３）、ＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ（０．２）、Ｋ2ＨＰＯ4（１）、浄化した反すう胃液（３００ｍｌ）ｄＨ2Ｏ（３６０ｍｌ）、ＮａＨＣＯ3（５）、レザズリン（０．２ｍｌ）Ｌ−システイン−ＨＣｌ（０．５）、酵母抽出物（２）、ならびに、（ｇ／ｌ）ニトリロ三酢酸（１．５）、ＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ（３）、ＭｎＳＯ4．Ｈ2Ｏ（０．５）、ＮａＣｌ（１）、ＦｅＳＯ4．７Ｈ2Ｏ（０．１）、ＣｏＣｌ2．６Ｈ2Ｏ（０．１）、ＣａＣｌ2（０．１）、ＺｎＳＯ4．７Ｈ2Ｏ（０．１）、ＣｕＳＯ4．５Ｈ2Ｏ（０．０１）、ＡｌＫ（ＳＯ4）2．１２Ｈ2Ｏ（０．０１）、Ｈ3ＢＯ3（０．０１）、Ｎａ2ＭｏＯ4．２Ｈ2Ｏ（０．０１）、ＮｉＳＯ4．６Ｈ2Ｏ（０．０３）、Ｎａ2ＳｅＯ3（０．０２、およびＮａ2ＷＯ4．２Ｈ2Ｏ（０．０２）から成るBalchの微量元素溶液（１０ｍｌ）（微量元素の添加；Balch et al., 1979）、から成るＢＹ＋培地（基本培地、Joblin et al., 1990）中で生育した。
【０１６０】
波長６００（ＯＤ600）で測定した吸光度（ＯＤ）の０．１０と０．１４の間において、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）をそれぞれ１ｍｌおよび２ｍｌの無菌気体（〜１６０ないし３２０μｌ酸素）（図１Ｃ）ならびに２μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣに曝露した。気体曝露の潜伏時間〜９０分により、両暴露において典型的な溶解曲線が観察され得る。マイトマイシンＣ曝露の最初の結果は、非常に短い潜伏期間を示す。ファージのホストゲノムからの除去を確認するため、両ファージ付着部位に面する二つのオリゴヌクレオチドをそれぞれ設計した（Ｒ１Ｆ：ｃａａａｇａｇａｇａｔｔａａａｇａａｇｃａｇａｃｇ；配列番号１４６およびＬ２Ｒ  ａｇｔａｇｔｇｔｔｇｇａａｔｃａｇｔｇａａａａｇｇ；配列番号１４７）。このプライマーペアは、除去に従ってファージゲノムが再環状化したときにのみ単位複製配列を産生する。
【０１６１】
図１Ｅは、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）を気体に曝露したときの最初の除去実験を表す。誘導に伴い予想されるサイズの明らかな、不明瞭ではない単位複製配列が見出され、成功裏の除去および再環状化が示された。同様に、バンドが未誘導Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）細胞にも弱くはあるが見出され、φｍｒｕは正常の未曝露での生育の間に自発的な除去能をもつことが示された。
【０１６２】
実施例５Ｃ：溶解酵素バイオアッセイ
ＯＲＦ２０５８によりコードされるポリペプチドは、反すう胃メタン生成菌特異的な溶解酵素として有用であり、組み換えタンパク質の産生のため大腸菌（E. coli）発現ベクターにサブクローン化されている。ＯＲＦ２０５８は、プライマーＭｂｂｒｕｍ１１ｆｏｒ２２（１１２２Ｆｏｒ，ｃａｃ  ｃａｔ  ｇｇｔ  ｔａｇ  ａｆｔ  ｃａｇ  ｃａｇ  ａｇｅ  ｃ；配列番号１４８）およびＭｂｂｒｅｖ１１ｒｅｖ２２（１１２２Ｒｅｖ，ｔｃａ  ｔｇｃ  ａｇｇ  ａｃｅ  ｇａｃ  ａａｃ  ａｔａ  ｇｔａ  ｇ；配列番号１４９）を用い、１２１．５ｎｇ  Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）系統Ｍ１ゲノムＤＮＡ；０．２ｐＭ  １１２２Ｆｏｒおよび１１２２Ｒｅｖプライマー；１５ｐＬ  Accuprime Pfx緩衝液（ｄＮＴＰと共に、InVitrogen）；２．４ｐＬ  Accuprime Pfx（InVitrogen）を含む１５０μＬ反応量中でＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ条件は、９５℃、２分間の最初の変性に続き、９５℃、１５秒間、５５℃、３０秒間、および６８℃、４０秒間の３５サイクルであった。最終伸長は行わなかった。ＰＣＲ産物を精製し、Nanodrop（Thermo Scientific、ジョージア州、米国）を用いて定量した。
【０１６３】
ＯＲＦ２０５８クローニング：ＰＣＲ増幅したＯＲＦ２０５８を、pET 100またはpET 151-Dトポベクター（InVitrogen）のいずれかへ製造者の推奨に従ってクローン化し、化学的にコンピテントなTOP 10細胞（InVitrogen）を形質転換した。形質転換体をコロニーＰＣＲにより分析し、プラスミドＤＮＡを精製および配列決定した。ＯＲＦ２０５８のそれに一致するＤＮＡ配列を持つクローンを選択した。
【０１６４】
ＯＲＦ２０５８の発現：確認されたＯＲＦ２０５８のインサートを含むクローンからのプラスミドＤＮＡで、エレクトロポレーションにより電気的にコンピテントなBL21*またはRosetta 2細胞を形質転換した。可溶性ＯＲＦ２０５８タンパク質の発現に最も適した生育条件は、ＬＢ培地中で、６００ｎｍでの吸光度０．４８〜０．６の間でのＩＰＴＧを用いた誘導、および３０℃における約６時間の継続生育により見出された。次に遠心によって細胞を回収し、−２０℃において凍結した。
【０１６５】
細胞融解：細胞ペレットを解凍し、以下の緩衝液（ｐＨ７．５）：３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2に再懸濁した。リゾチームを最終濃度１ｍｇ／ｍｌにて加え、続いて氷上で穏やかに攪拌しながら３０分間インキュベーションした。ＤＮａｓｅＩおよびＲＮａｓｅＩをそれぞれ最終濃度５ｐｇ／ｍｌにて加え、続いて氷上で穏やかに攪拌しながら３０分間インキュベーションした。細胞ライセートを１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、未加工のライセートは０．８μｍフィルターを通して濾過した。
【０１６６】
ニッケルアフィニティークロマトグラフィー：細胞溶解手順により濾過した上清を８０ｍＬニッケルアフィニティーカラムに加え、以下の緩衝液（ｐＨ７．５）：３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、および２０％グリセロール中の、２０ｍＭないし２５０ｍＭイミダゾール勾配を用いて溶出した。発現したＯＲＦ２０５８タンパク質を含むカラムから溶出された画分を、１０，０００ｋＤａ分子量カットオフ膜によるMillipore ultra filtration cellを用いて濃縮した。E.coli BL21*細胞に発現するpET100内のＯＲＦ２０５８コンストラクトを、以下の溶出緩衝液、ｐＨ８．２（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５０  ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ｂ−メルカプトエタノール、１０％グリセロール）を用いてニッケルカラムから溶出し、かつ酵素は、追加のグリセロールおよびジチオスレイトールを最終濃度が４０％グリセロール、１ｍＭジチオスレイトールになるように加えた緩衝液、ｐＨ８．２中で保管した。
【０１６７】
脱塩：Rosetta 2細胞内のpET 151コンストラクトにより発現される濃縮されたタンパク質の脱塩を、２５０ｍＬ  BioGel P6 DG（BioRad、カリフォルニア州、米国）カラムを以下の緩衝液（ｐＨ７．０）：２０ｍＭ  ＭＯＰＳ、１ｍＭ  ＤＴＴ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、および２０％グリセロール、と共に用いて行った。カラムからの画分を上記のように濃縮し、最終サンプルを濾過して、−２０℃での保管に先立ち液体窒素中でスナップ凍結した。
【０１６８】
Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）休止細胞の溶解：５ｍｌのＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）Ｍ１（ＤＳＭ１０９３）培養物を、Hungateチューブ内のＢＹ＋培地で後期対数期まで生育させ、Hungateチューブを５，０００ｘｇ、室温にて３０分間遠心することにより細胞を回収した。該チューブを嫌気性チャンバー（９５％ＣＯ2−５％Ｈ2雰囲気、Coy Laboratory Products、ミシガン州、米国）内へ移し、ここで上清を廃棄して、１０ｍｌ培養物からの細胞を１ｍｌＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ６．８（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール）に再懸濁した。ＭＯＰＳ緩衝液を添加する希釈により、細胞懸濁液を〜０．１２のＯＤ（６００ｎｍ）に調整した。
【０１６９】
標準化した細胞懸濁液（５０μｌ）をマイクロタイタープレートへ分注し、様々な濃度のＯＲＦ２０５８溶解酵素（pET 100コンストラクトから調製された）を加え、緩衝液で反応全量を２５０ｍｌにした。細胞およびタンパク質混合物を３７℃でインキュベートし、ＯＤの読み取りを記録した。Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）休止細胞における酵素添加の効果（１アッセイあたりに添加した酵素のμｇ）を図７に示す。酵素添加は、懸濁細胞のＯＤ６００ｎｍの読み取りを、酵素を添加しないコントロール細胞に比較して量依存的に減少した。これはＯＲＦ２０５８溶解酵素が、嫌気性条件下でＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）休止細胞を攻撃および溶解できることを示す。
【０１７０】
生育中のＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）細胞の溶解：Ｍ．ルミナンチウム（M.
ruminantium）はＲＭ０２培地中で生育した。ＲＭ０２培地は以下の成分（ｇ／Ｌ）：ＫＨ2ＰＯ4（１．４）、（ＮＨ4）2ＳＯ4（０．６）、ＫＣｌ（１．５、）微量元素溶液  ＳＬ１０（１ｍｌ）、亜セレン酸塩／タングステン酸塩溶液（１ｍｌ）、０．１％（ｗ／ｖ）レザズリン溶液（４滴）から構成される。構成成分を混合し、Ｏ2を含まない１００％ＣＯ2下で沸騰させ、１００％ＣＯ2により泡立てながら氷浴中で冷却した。冷却後、ＮａＨＣＯ3（４．２ｇ）およびＬ−システインＨＣｌ・Ｈ2Ｏ（０．５ｇ）を加え、９．５ｍｌの培地をHungateチューブに分注する一方、チューブに１００％ＣＯ2を供給した。チューブはオートクレーブし、使用前２４時間暗所に保管した。接種に先立ち、NoSubRFV（１チューブあたり０．５ｍｌ、基質、酵母抽出液、ビタミンを含む）を加えた。接種チューブに８０％ＣＯ2／２０％Ｈ2を２５ｌｂ／ｉｎ2で供給した後、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）を中期対数期（ＯＤ６００ｎｍ〜０．１）まで生育させ、この点で様々な濃度のＯＲＦ２０５８溶解酵素（pET 151Dトポクローンから調製された）を培養物へ加えた。培養物のインキュベーションを続け、ＯＤ読み取りを記録した。Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）生育およびメタン形成における酵素添加の効果（無添加に比較した％メタン産生；２１７時間生育後のコントロールを角括弧内に示す）を図８に示す。結果はＯＲＦ２０５８溶解酵素が、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）の生育に量依存的に劇的に影響したことを示し、添加２時間以内に生育中の培養物のＯＤ６００ｎｍを減少させた。二つの最も高い酵素添加濃度もまたメタン形成を、クロロホルム添加（１００μｌ／１０ｍｌ培養物添加）と同程度まで減少させた。
【０１７１】
実施例６：概観
Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）ゲノム配列決定からの予想外の発見はプロファージ配列の存在であった。ゲノム配列の分析は幾つかのファージ関連遺伝子を含む異常に高いＧＣ含有領域を同定した。予測されるプロファージの全体構造はさらなるバイオインフォティック分析により同定され、φｍｒｕと名付けられた。約４０％のファージ遺伝子が、ファージ組み込み、ＤＮＡ複製およびパッケージング、ファージ構造タンパク質ならびに溶解を含む機能的グループを分離するために割り当てられた。ファージゲノムに隣接するＤＮＡ配列は、ファージ組み込みの潜在的部位を表すことが見出された（ａｔｔＬおよびａｔｔＲ）。ファージは、φｍｒｕファージゲノムであるａｔｔＢの本来のメタン生成菌組み込み部位を有すると思われる、Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）の予測される膜タンパク質へそれ自体で組み込まれると考えられる。さらに、ＤＮＡ複製モジュール内に見出された転写終結区様構造は、ファージＤＮＡ複製の起点を表すと考えられる。ファージゲノムの３’末端の低ＧＣ領域は、ｄｎｄシステムの発現を制御すると思われる遺伝子を含む、硫黄によるＤＮＡ修飾システムであると考えられる領域を有する。これらの遺伝子はおそらくファージ組み込みの間にＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）ゲノム内に運ばれたと考えられ、そのファージ、ホストまたは外来性ＤＮＡについての役割は解明されていない。Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）によるｄｎｄシステムの保持は、それがホストに利益を与えることを示唆する。しかしながら、φｍｒｕ  ｄｎｄシステムのＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）または外来性ＤＮＡの修飾における役割は、なお研究途上である。
【０１７２】
φｍｒｕ配列の別の興味ある特徴は、低ＧＣ領域に相当し、かつ様々な生物由来のタンパク質に弱い一致を有する、アンチセンス鎖上にコードされる幾つかの遺伝子である。このことは、これらの遺伝子がＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）への組み込み以来、φｍｒｕゲノム内に蓄積していることを示唆し、かつこれらの遺伝子が、最終的にファージの不活性化および順化をもたらし得る挿入の進行中の発達を表す可能性がある。Ｍ．ルミナンチウム（M. ruminantium）ゲノムに比較したφｍｒｕファージ配列の高ＧＣ量は、それが別の生物由来であることを示唆する。しかしながら、φｍｒｕタンパク質はこれまでに遭遇したその他のファージと比較していくらか独特であることから、以前のホストは明らかではない。
【０１７３】
メタン緩和に関して著しく興味あるφｍｒｕの遺伝子は、溶解カセットの内部に位置する。特に一遺伝子は、ファミリーＣ３９ペプチダーゼに類似のタンパク質をコードする。このペプチダーゼファミリーは、中でもMethanobrevibacterの細胞壁を作る偽ムレインのペプチド架橋を切断するＣ７１古細菌ファージエンドイソペプチダーゼのような、ウィルスシステインエンドペプチダーゼを含む。他の非反すう胃メタン生成菌ファージゲノム由来の偽ムレインエンドイソペプチダーゼの、ファージゲノム内の位置およびシンテニーに基づき、この遺伝子はファージ産物の放出に先立つ細胞溶解に関わる溶解酵素をコードする溶解素遺伝子としての役割を有し得る。この遺伝子およびそれがコードする酵素はＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）および同様の細胞壁を持つその他の反すう胃メタン生成菌の、可能な制御機構として明らかな興味が持たれる。
【０１７４】
ホスト細胞の溶解に関わる反すう動物ファージおよびその酵素は、反すう胃内のメタン生成菌集団およびその他の群集メンバー（細菌、原核生物および真菌）の両方を制御する重要な機会を表す。加えて、ファージのライフサイクルの理解を通してファージによる抑制に感受性のある、鍵となるホスト酵素標的の同定が可能になる。本発明はウシ、ヒツジ、およびシカにおける反すう胃ファージの組成物を調査し、それらが数および型において一時的な変動を表すことを示した。ファージにより影響されたニュージーランドのメタン生成菌の分離株もまた同定されている。メタン生成菌の純粋培養が、ファージ溶解酵素を評価するために使用されており、培養およびＰＣＲに基づく技術が、新規のファージをスクリーンするために開発されてきた。反すう胃サンプル由来の純化されたファージが、ファージ酵素の発見を可能にするためのランダムＤＮＡ配列分析に受け入れられることが示された。
【０１７５】
ファージまたはその酵素を、メタン放出を減少させる緩和技術において使用することには幾つかの利点がある。ファージは反すう胃の微生物群集の天然メンバーであり、従って抗生物質治療の対象とはされない（かつ、より容易にいずれの調節的制約を克服し得る）。ファージは通常、メタン生成菌の選択された標的化を潜在的に可能にする、狭い範囲のホストに特異的である。ファージ療法は現在、抗生物質抵抗性生物の治療法として認識され、一般的に安全であると認識される。一旦産生されると、ファージは通常比較的安定である。メタン生成菌系統の、ファージに感受性のある反すう胃への導入は、特に接種が若年（例えば若い子ヒツジ、および子ウシ）において行われたとき、長期にわたる有益な効果を有し得る。メタノブレビバクター・スミシー（Methanobrevibacter smithii）（系統ＰＳ）、メタノブレビバクテリウム・ブライアンティイ（Methanobacterium bryantii）およびMethanobrevibacter系統ＭＦ−１を含む特定のメタン生成菌は、ファージゲノムを含んで溶解性ファージに感受性になるか、または自己溶解（溶解酵素と示唆される）を行う。農業的に問題のある生物を抑制するために使用されているファージの一つの注目すべき例は、ファージの、Escherichia coli. O157:H7を標的化するための使用である。
【０１７６】
メタノブレビバクター・ルミナンチウム（Methanobrevibacter ruminantium）は、様々な食餌条件下（栽培および分子検出データに基づく）での反すう胃におけるその普及、培養の利用可能性、そのルチンに対する快適さ、研究室内での生育、およびこの生物についての比較的多数の以前の研究および背景文献の入手可能性から、ゲノム配列決定のために選択された。本発明はＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）ゲノムに関する重要なデータを提供し、反すう胃内でのファージの詳細な実態を構築する。φｍｒｕプロファージ配列はＭ．ルミナンチウム（M. ruminantium）の抑制のため、および遺伝子機能の決定を補助する遺伝的操作のための特異的試薬を提供する。ファージは、反すう胃内でのメタン形成を予防または減少させるため、メタン生成菌の間で保存された機能／構成成分の遮断に使用できる。
【図１Ａ】
0005552053.tif 000002
【図１Ｂ】
0005552053.tif 000003
【図１Ｃ】
0005552053.tif 000004
【図１Ｄ】
0005552053.tif 000005
【図１Ｅ】
0005552053.tif 000006
【図２】
0005552053.tif 000007
【図３−１】
0005552053.tif 000008
【図３−２】
0005552053.tif 000009
【図３−３】
0005552053.tif 000010
【図３−４】
0005552053.tif 000011
【図４Ａ−１】
0005552053.tif 000012
【図４Ａ−２】
0005552053.tif 000013
【図４Ａ−３】
0005552053.tif 000014
【図４Ａ−４】
0005552053.tif 000015
【図４Ａ−５】
0005552053.tif 000016
【図４Ａ−６】
0005552053.tif 000017
【図４Ａ−７】
0005552053.tif 000018
【図４Ａ−８】
0005552053.tif 000019
【図４Ａ−９】
0005552053.tif 000020
【図４Ａ−１０】
0005552053.tif 000021
【図４Ａ−１１】
0005552053.tif 000022
【図４Ａ−１２】
0005552053.tif 000023
【図４Ｂ−１】
0005552053.tif 000024
【図４Ｂ−２】
0005552053.tif 000025
【図４Ｂ−３】
0005552053.tif 000026
【図４Ｂ−４】
0005552053.tif 000027
【図４Ｂ−５】
0005552053.tif 000028
【図４Ｂ−６】
0005552053.tif 000029
【図４Ｂ−７】
0005552053.tif 000030
【図５】
0005552053.tif 000031
【図６】
0005552053.tif 000032
【図７】
0005552053.tif 000033
【図８】
0005552053.tif 000034
【配列表】
0005552053000001.app