(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オキアミ由来のタンパク質分解酵素の生成方法であって、
オキアミを水により均質化した上清液を生成または準備した上で、当該上清液をカルシウムイオンの共存下で熱処理するステップを備えていることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ステップは、前記上清液を０．５〜１［ｍＭ］カルシウムイオンの共存下、５０〜５５［℃］の温度範囲で１０〜２０［ｍｉｎ］にわたり熱処理するステップであることを特徴とする請求項１記載のタンパク質分解酵素の生成方法。
【請求項３】
オキアミ由来のタンパク質分解酵素を用いたタンパク質の分解方法であって、
請求項２記載の方法にしたがって熱処理された前記上清液に０．５〜１［ｍＭ］の濃度範囲となるようカルシウムイオンを添加し、５０〜６０［℃］の温度条件で前記タンパク質の分解を行なうことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オキアミ由来のタンパク質分解酵素の生成方法および当該酵素を用いたタンパク質分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オキアミ類（ナンキョクオキアミ、ツノナシオキアミ）は動物プランクトンの一種であり、日本における漁獲量は年間約６万トンである。オキアミ類は現在主に釣り餌（撒き餌）や養殖魚の色出し餌料へ利用されているが、中国および韓国から安い餌料が入手可能であることや釣り餌への需要が低下しているため、より付加価値の高い他の活用法が望まれている。特にオキアミ類の付加価値を上げる活用法の１つに、オキアミ類に含まれるタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）による食品加工助剤、品質改良剤および機能食品への展開を挙げることができる。
【０００３】
しかしながら、オキアミ類を含む甲殻類の水抽出液は冷蔵下で１日放置しただけでも黒変が著しく進行するため、上記利用展開の大きな妨げとなっている。この黒変は内在性のチロシナーゼによりチロシンを含むフェノール類が酸化、さらに自動酸化が進み、黒色のメラニンが生成することで起こる。
【０００４】
ここで、甲殻類の黒変を防ぐ方法として、タンパク質分解酵素阻害物質と亜硫酸ナトリウム、コウジ酸、カテキン類、システイン、グルタチオン、ビタミンＣの一種あるいは二種以上を混合したものを併用する方法のほか（特許文献１参照）、８０〜９０［℃］で加熱処理する方法が提案されている（非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平０６−２４５６９０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「ツノナシオキアミの利用に関する研究」、岩手県水産技術センター年報Vol.1997 Page.111-115 (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
また、オキアミ類の水抽出で得られるタンパク質分解酵素製剤は、３７［℃］の反応温度で長時間安定した分解活性を示すが、５０［℃］の反応温度では徐々に酵素が失活する。タンパク質分解酵素を前記目的に利用するには、分解活性が高い高温領域で長時間安定的に反応を行なえるようにする必要がある。
【０００８】
これまでの黒変防止法はいずれもタンパク質分解酵素の機能を著しく低下させるものであり、タンパク質分解酵素の活用を想定しているものではなかった。タンパク質分解酵素の活性を維持しつつ、黒変を防止する手法の開発が待ち望まれていた。
【０００９】
そこで、本発明は、メラニン発生による黒変を抑制しながら、分解活性が高い高温で安定的な反応を行なうことが可能なオキアミ由来タンパク質分解酵素を生成する方法および当該酵素を用いてタンパク質を分解する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するためのオキアミ由来のタンパク質分解酵素の生成方法は、オキアミを水により均質化した上清液を生成または準備した上で、当該上清液をカルシウムイオンの共存下で熱処理するステップを備えていることを特徴とする。
【００１１】
前記ステップは、前記上清液を０．５〜１［ｍＭ］カルシウムイオンの共存下、５０〜５５［℃］の温度範囲で１０〜２０［ｍｉｎ］にわたり熱処理するステップであることが好ましい。
【００１２】
本発明の方法によれば、詳細は後述するが、黒変を抑制しつつカルシウムイオンによる熱安定化によりタンパク質分解酵素の比活性を増加させることができる。また、熱処理後の上清溶液を酵素試料とし、カルシウムイオンを反応系に０．５〜１［ｍＭ］となるように添加し、５０［℃］の反応温度でタンパク質の分解を行なうと、従来よりも長時間にわたり高い分解活性を保持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】１［ｍＭ］カルシウムイオン存在・非存在下，粗酵素抽出液を各温度、２０［ｍｉｎ］で熱処理して得られる上清溶液のアゾカゼイン分解活性（比活性の相対値）、および同上清液を４［℃］、１日放置したときのメラニン生成量（相対値）の説明図。
【図２】１［ｍＭ］のカルシウムイオン存在下、粗酵素抽出液を５５［℃］、各時間で熱処理して得られる上清溶液のアゾカゼイン分解活性（比活性の相対値）、および同上清液を４［℃］、１日放置したときのメラニン生成量（相対値）の説明図。
【図３】各カルシウムイオン濃度，反応温度５０［℃］におけるアゾカゼイン分解量の経時変化の実験結果説明図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のオキアミ由来のタンパク質分解酵素の生成方法および当該酵素を用いたタンパク質分解方法の実施形態について説明する。
【００１５】
（実施例１）
（粗酵素抽出液の調製）
−８０℃で凍結保存していたオキアミ４０［ｇ］をたとえば２倍量（８０［ｍｌ］）の冷水とともにHSIANGTAI製ホモジナイザー（本体：ＨＧ-２００、シャフトジェネレーター：Ｋ３０）を用いて氷冷下でホモジナイズした。このホモジネートを遠心分離（１０、０００×［ｇ］、１０［ｍｉｎ］、４［℃］）し、上清液（粗酵素抽出液）を得た。
【００１６】
（加熱処理）
上清液２．７［ｍｌ］に１０［ｍＭ］の塩化カルシウム０．３［ｍｌ］（＋Caイオン：最終濃度１［ｍＭ］）または水０．３［ｍｌ］（−Caイオン）を加え混合した試料について、３７、４５、５０、５５、６０および７０［℃］のそれぞれの温度で２０［ｍｉｎ］にわたり熱処理を行なった。熱処理後、遠心分離（１０、０００×［ｇ］、１０［ｍｉｎ］、４［℃］）し、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）を含有する上清液について、メラニン生成量、タンパク質の定量、タンパク質分解活性の測定を行なった。
【００１７】
（メラニン生成量の測定）
前記で得られた各条件の上清液の一部（約１．５［ｍｌ］）を試験管にとり、４［℃］で２４［ｈｒ］にわたり放置した。この溶液を蒸留水で5倍希釈し、遠心分離後の上清液を等量の１Ｍ水酸化ナトリウムで可溶化した溶液について、４０５［ｎｍ］の吸光度を測定することで、黒変の程度（メラニン生成量）を数値化した。なお、メラニン生成量は熱処理なしを１００［％］とした相対値で示した。
【００１８】
（タンパク質の定量）
前記手順により得られたそれぞれの上清液中のタンパク質濃度を、ミクロビウレット法（Itzhaki, R. F. and Gill, D. M. (1964) Anal. Biochem. 9 401-410参照）にしたがって測定した。なお、標準タンパク質はウシ血清アルブミンを用いた。
【００１９】
（タンパク質分解活性の測定）
アゾカゼインを基質とし、基質の分解によって生じた遊離チロシン量を３３５［ｎｍ］の吸光度で測定する方法でタンパク質分解活性を測定した。
【００２０】
具体的には、１００［ｍＭ］リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）で溶解した１［％］（ｗ/ｖ）アゾカゼイン７００［μｌ］に１５０［μｌ］の水を加え、これにタンパク質濃度０．５［ｍｇ／ｍｌ］となるように調製した各条件の上清液を１５０［μｌ］加えて、３７［℃］で１［ｈｒ］にわたり加水分解反応を行なった。
【００２１】
１０［％］（ｖ/ｖ）トリクロロ酢酸２［ｍｌ］を加えることで反応を停止させ、遠心分離後の上清液の３３５［ｎｍ］における吸光度を測定した。なお、９５［℃］で１０［ｍｉｎ］にわたり酵素失活させた各条件の上清液について、上記と同様の処理を施したものをブランクに用いた。前記加熱処理を行なわなかった粗酵素抽出液の活性を１００［％］としたときの相対活性として結果をまとめた。
【００２２】
カルシウムイオン存在・非存在下，粗酵素抽出液を各温度で所定時間熱処理して得られる上清溶液のアゾカゼイン分解活性（相対値）、およびメラニン生成量（相対値）の結果を図１に示す。黒変すなわちメラニン生成量について、４５［℃］までは強い黒変が観察されたが、５０［℃］以降からメラニン生成量が熱処理前の５０［％］以下となり明確な黒変の抑止効果がみられた。なお、この黒変の程度に関して、カルシウムイオンの存在・非存在下間での差異は認められなかった。
【００２３】
一方、タンパク質分解活性については、カルシウムイオンの添加の有無に関わらず４５〜６０［℃］の熱処理により活性の増加が認められた。これは海水やオキアミに含まれる内在性カルシウムイオンによる熱安定化の寄与があるためと推察されるが、１［ｍＭ］のカルシウムイオンが追加されると比活性がさらに増加する。
５０〜６０［℃］の温度域がメラニン生成を熱処理前の５０［％］以下に抑えつつ、タンパク質分解の比活性も熱処理前より１０［％］以上増加する好ましい条件である。特に、５５［℃］の熱処理ではメラニン生成を熱処理前の３５［％］以下に抑制し、かつタンパク質分解酵素の比活性を２０［％］以上増加することができる最も好ましい条件である。
なお、カルシウムイオンの濃度を変化させた場合、例えば０．５［ｍＭ］において、タンパク質分解活性は１［ｍＭ］と同等のレベルを有していたが、３［ｍＭ］においてはタンパク質分解活性の増加が熱処理前の１０［％］程度に留まることから、０．５〜１［ｍＭ］のカルシウムイオンが本発明を実施する上での最適濃度であることが判明している。
【００２４】
（実施例２）
実施例１により黒変を防止しつつタンパク質分解活性も増加する好ましい条件であった１［ｍＭ］カルシウムイオンの存在下、５５［℃］の熱処理について、最適処理時間を検討した。
【００２５】
（加熱処理）
粗酵素抽出液２．７［ｍｌ］に１０［ｍＭ］の塩化カルシウム０．３［ｍｌ］（最終濃度１［ｍＭ］）を加え混合した試料について、５５［℃］、２、５、１０、２０、４０、６０［ｍｉｎ］の条件で熱処理を行なった。熱処理後、遠心分離（１０、０００×［ｇ］、１０［ｍｉｎ］、４［℃］）し、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）を含有する上清液について、実施例１と同様メラニン生成量、タンパク質の定量、タンパク質分解活性の測定を行なった。
【００２６】
カルシウムイオン存在下，粗酵素抽出液を５５［℃］で各所定時間熱処理して得られる上清溶液中のアゾカゼイン分解活性（相対値）、およびメラニン生成量（相対値）の結果を図２に示す。黒変について、１０［ｍｉｎ］以上の熱処理でメラニン生成量が熱処理前より５０［％］以下となり明確な黒変防止効果が認められた。タンパク質分解活性については、５〜２０［ｍｉｎ］の間２０［％］以上の増加が認められた。よって、５５［℃］の熱処理の場合、１０〜２０［ｍｉｎ］の処理時間が黒変を防止しつつ、タンパク質分解活性を増加させる条件であることが判明した。
【００２７】
以上、加熱処理とカルシウムイオンの添加を組み合わせる簡便かつ安価な方法により、酵素製剤化の大きな障害となる黒変を抑制しつつ、タンパク質分解酵素の比活性の増加、つまり粗精製も同時に行なうことが可能になる。
【００２８】
（実施例３）
実施例２により黒変を防止しつつタンパク質分解活性も増加する最も好ましい条件であった１［ｍＭ］カルシウムイオンの存在下、５５［℃］で２０［ｍｉｎ］にわたる熱処理により得られた上清液を試料に用いた。本実施例では高温（５０［℃］）で失活を抑制できる最適なカルシウム添加量について検討した。
【００２９】
（タンパク質分解活性の測定）
カルシウムイオン存在下（最終濃度：０．５〜１、５及び１０［ｍＭ］）または非存在下、５０［℃］の温度条件で０、５、１０および２５［ｈｒ］のそれぞれにわたって時間反応させた以外は、実施例１と同様の操作で活性を測定した。
【００３０】
本実施例の結果を図３に示す。５０［℃］の反応温度において、カルシウムイオン無添加では徐々に増加率が減少し、失活が進行する。これに対し、反応系に０．５〜１［ｍＭ］のカルシウムイオンが加わると、分解酵素の耐熱性が増し、失活の進行を最も抑えることができる。反応時間２５［ｈｒ］後においてカルシウム無添加の約１．７倍の活性で反応を進めることができる。
【００３１】
一方、反応系に５［ｍＭ］のカルシウムイオンが加わると、０．５〜１［ｍＭ］ほど耐熱性の効果は得られないが、反応時間２５［ｈｒ］後においてカルシウム無添加の約１．５倍の活性で反応を進めることができる。さらに反応系に１０［ｍＭ］のカルシウムイオンが加わると、耐熱効果がほとんど得られず、カルシウムイオン無添加と同レベルの活性となった。
【００３２】
以上、反応系に０．５〜１［ｍＭ］のカルシウムイオンが添加されると、オキアミに含まれるタンパク質分解酵素の耐熱性が増し、活性の高い５０［℃］の高温域で安定的にタンパク質分解を行なうことが可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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