(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の５〜８０個のアミノ酸含有ポリペプチドリガンドおよび第２の５〜７個のアミノ酸含有ポリペプチドリガンドを含む、多リガンド捕捉剤であって、
第１のポリペプチドリガンド及び第２のポリペプチドリガンドはトリアゾール結合により互いに結合しており、
単離されている場合に第１のポリペプチドリガンドが標的と結合することができ、
単離されている場合に第２のポリペプチドリガンドが標的と結合することができ、
第１のポリペプチドリガンド及び第２のポリペプチドリガンドは、標的の明確に異なる部分に結合し、
当該多リガンド捕捉剤は標的と特異的に結合することができ、及び
当該多リガンド捕捉剤が標的と結合する場合は第１のポリペプチドリガンドおよび第２のポリペプチドリガンドがどちらも標的と接触する
多リガンド捕捉剤。
【請求項２】
第３の３〜１００個のアミノ酸含有ポリペプチドリガンドをさらに含む請求項１に記載の多リガンド捕捉剤であって、
第３のポリペプチドリガンドは当該多リガンド捕捉剤にトリアゾール結合により結合しており、
多リガンド捕捉剤が標的と結合する場合は第３のポリペプチドリガンドは標的と接触する、
多リガンド捕捉剤。
【請求項３】
第４の３〜１００個のアミノ酸含有ポリペプチドリガンドをさらに含む請求項２に記載の多リガンド捕捉剤であって、
第４のポリペプチドリガンドは当該多リガンド捕捉剤にトリアゾール結合により結合しており、
多リガンド捕捉剤が標的と結合する場合は第４のポリペプチドリガンドは標的と接触する、
多リガンド捕捉剤。
【請求項４】
第１のポリペプチドリガンドは式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６を有し（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６はＤ−アルギニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−リジン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−グルタミン、グリシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−バリン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−チロシン及びＤ−トリプトファンから選択される）、及び
第２のポリペプチドリガンドは式Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２を有する（式中、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１及びＸ１２はＤ−リジン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−イソロイシン、グリシン及びから選択される）
請求項１に記載の多リガンド捕捉剤。
【請求項５】
第１のポリペプチドリガンドもしくは第２のポリペプチドリガンドは、ｋｆｗｌｋｌ、ｋｗｌｗＧｌ及びｒｆｖｉｌｎからなるグループから選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の多リガンド捕捉剤。
【請求項６】
第３のポリペプチドリガンドをさらに含む、請求項１に記載の多リガンド捕捉剤。
【請求項７】
第３のポリペプチドリガンドは、ｋｆｗｌｋｌ、ｋｗｌｗＧｌ及びｒｆｖｉｌｎからなるグループから選択されるアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の多リガンド捕捉剤。
【請求項８】
第３のポリペプチドリガンドは式Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８  を有する（式中、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１７及びＸ１８は、Ｄ−アスパルテート、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トリプトファン、グリシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−バリン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−アスパラギン及びＤ−ロイシンからなるグループから選択される）、請求項６に記載の多リガンド捕捉剤。
【請求項９】
第１のポリペプチドリガンドはｋｆｗｌｋｌのアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の多リガンド捕捉剤。
【請求項１０】
第２のポリペプチドリガンドはｋｗｌｗＧｌのアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の多リガンド捕捉剤。
【請求項１１】
第３のポリペプチドリガンドはｒｆｖｉｌｎのアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の多リガンド捕捉剤。
【請求項１２】
第４のポリペプチドリガンドをさらに含む、請求項７に記載の多リガンド捕捉剤。
【請求項１３】
第４のポリペプチドリガンドは式Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４を有する（式中、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３及びＸ２４は、Ｄ−アルギニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−リジン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−グルタミン、グリシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−バリン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−チロシン及びＤ−トリプトファンから選択される）、請求項１２に記載の多リガンド捕捉剤。
【請求項１４】
少なくとも１個のポリペプチドリガンドは少なくとも１個のＬ−アミノ酸を有する、請求項１に記載の多リガンド捕捉剤。
【請求項１５】
捕捉剤は、所望の化学活性または生物活性を提供する捕捉剤に付着した追加の分子または官能基をさらに含む、請求項１に記載の多リガンド捕捉剤。
【請求項１６】
所望の化学活性または生物活性が溶解度、安定性、生体利用度、免疫原性、検出性、および反応性である、請求項１５に記載の多リガンド。
【請求項１７】
追加の分子または官能基が親水性化合物、疎水性化合物、担体または標識である、請求項１５に記載の多リガンド捕捉剤。
【請求項１８】
標識は放射性同位元素、放射性色素、フルオロフォア、蛍光色素、光学吸収性の色素、化学発光色素、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、色素、金属イオン、ナノ粒子及び金属ゾルからなるグループから選択される、請求項１７に記載の多リガンド捕捉剤。
【請求項１９】
標識はビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはハプテンからなるグループから選択される、請求項１７に記載の多リガンド捕捉剤。
【請求項２０】
複数の候補リガンドから、対応する結合部位で標的と特異的に結合することができる候補リガンドを選択するステップを含み、
結合部位が、それぞれの部位上に結合したそれぞれの、リガンドの互いの間での共有結合を可能にするように配置されている、
多リガンドにおける標的に対する請求項１乃至１９のいずれかに記載の多リガンド捕捉剤の２つ以上のリガンドを提供する方法。
【請求項２１】
選択を、標的と結合した候補リガンド間の共有結合の形成を可能にする時間かつ条件下で複数の候補リガンドを標的と接触させることによって行ない、共有結合の形成が標的によって触媒される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
候補リガンドが、標的またはその一部分と結合できることが当初は知られていない化合物を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
標的と接触させる前または後に所望の特長が導入されるように候補リガンドを修飾する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
リガンド上に提示される官能基によってリガンド間の共有結合が行なわれて、２つの個別のリガンドと標的が結合した際に、官能基が反応して共有結合が形成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
複数の候補リガンドが、第１の複数の候補リガンドおよび第２の複数の候補リガンドを含み、
選択を、
標的を第１の複数の候補リガンドと接触させて、標的と特異的に結合し、標的によって触媒される反応において対応する第２の官能基と特異的に結合することができる第１の官能基を提示するアンカーリガンドを選択するステップと、
アンカーリガンドを標的と接触させ、それによりアンカーリガンド標的複合体を提供するステップと、
アンカーリガンド標的複合体を第２の複数の候補リガンドと接触させるステップと、
アンカーリガンド標的複合体と特異的に結合し、アンカーリガンドと共有結合する第２の複数の候補リガンドの候補リガンドを選択し、それにより多リガンドを提供するステップと
によって行なう、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
アンカーリガンドの選択を、
標的と特異的に結合する候補リガンドを選択するステップと、
標的によって触媒される反応において対応する第２の官能基と特異的に結合することができる第１の官能基が導入されるように選択した候補リガンドを修飾し、それにより前記第１の官能基を提示するアンカーリガンドを提供するステップと
によって行なう、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
第１および第２の複数の候補リガンドが全体でまたは部分的に同一または異なる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
追加のリガンドを多リガンドに付加するために多リガンドをアンカーリガンドとして用いて選択を繰り返す、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
標的に対する高次多リガンド捕捉剤の結合親和性がアンカーリガンドの結合親和性よりも少なくとも１０２高くなるまで選択を繰り返す、請求項２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
標的に対する高次多リガンド捕捉剤の結合親和性がアンカーリガンドの結合親和性よりも少なくとも１０１０高くなるまで選択を繰り返す、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
多リガンド捕捉剤と標的の結合の解離定数が１０−５Ｍ以下となるまで選択を繰り返す、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
多リガンド捕捉剤と標的の結合の解離定数が１０−１６Ｍ以下となるまで選択を繰り返す、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
選択を繰り返し、１回または複数回の選択の反復において同一または異なる複数の候補リガンドを第２の複数の候補リガンドとして用いる、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
選択を繰り返し、１回または複数回の選択の反復において同一または異なる官能基を第１のおよび／または第２の官能基として用いる、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
２つ以上のリガンドがペプチドまたはポリペプチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
多リガンド捕捉剤がポリペプチドによって形成されるタンパク質捕捉剤であり、ポリペプチドを合成するために行なう、請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
修飾したアンカーリガンドを第１の複数の候補リガンドおよび標的と接触させるステップであって、修飾したアンカーリガンドが、標的によって触媒される反応において候補リガンドのうちの１つまたは複数と共有結合しており、それにより１つまたは複数の多リガンド捕捉剤が形成され、多リガンド捕捉剤のそれぞれが、修飾したアンカーリガンドおよび候補リガンドのうちの１つを含むステップを含み、
アンカーリガンドが標的と結合することができ、修飾したアンカーリガンドが第１の官能基を含み、第１の官能基が対応する第２の官能基と特異的に反応することができ、候補リガンドのそれぞれが第２の官能基を含む、
請求項１から１９のいずれかに記載の多リガンド捕捉剤を作製する方法。
【請求項３８】
対応する第４の官能基と特異的に反応することができる第３の官能基を含むように多リガンド捕捉剤のうちの１つを修飾するステップと、
修飾された多リガンド捕捉剤を第２の複数の候補リガンドおよび標的と接触させるステップであって、修飾された多リガンド捕捉剤が標的によって触媒される反応において候補リガンドのうちの１つまたは複数と共有結合し、それにより１つまたは複数の高次多リガンド捕捉剤が形成されるステップと
をさらに含み、
高次多リガンド捕捉剤のそれぞれが、修飾された多リガンド捕捉剤および候補リガンドのうちの１つを含み、
第２の複数の捕捉リガンド中の候補リガンドのそれぞれが第４の官能基を含む、
請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
接触前にはどの候補リガンドが標的と結合できるかが知られていない、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
第１の複数および／または第２の複数の候補リガンドが化合物のコンビナトリアルライブラリを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
化合物のコンビナトリアルライブラリが鎖中で連結されたサブユニットの群の順列を含む化合物を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
鎖が直鎖状、分枝状、環状、または組合せである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
サブユニットの群がアミノ酸、修飾アミノ酸、または組合せを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
サブユニットの群が１つまたは複数の有機小分子をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
サブユニットの群中のアミノ酸がアミノ酸の部分組から本質的になる、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４６】
サブユニットの群中の修飾アミノ酸が修飾アミノ酸の部分組から本質的になる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
多リガンド捕捉剤と標的の結合を可能にして多リガンド捕捉剤標的複合体を形成させる時間かつ条件下で、標的を請求項１から１９のいずれか一項に記載の多リガンド捕捉剤と接触させるステップと、
多リガンド捕捉剤標的複合体を検出するステップと
を含む、標的を検出する方法。
【請求項４８】
標的と多リガンド捕捉剤との接触および多リガンド捕捉剤標的複合体の検出を単パラメータアッセイまたは複数パラメータアッセイに従って行なう、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
多リガンド捕捉剤がタンパク質捕捉剤であり、単パラメータアッセイまたは複数パラメータアッセイが標準のタンパク質アッセイである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
標的が事前に決定した条件に関連するバイオマーカーである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
請求項１から１９のいずれか一項に記載の多リガンド捕捉剤および多リガンド捕捉剤標的複合体の検出を行なうために必要な少なくとも１つの試薬を含む、標的を検出するシステム。
【請求項５２】
少なくとも１つの試薬が標識した分子である、請求項５１に記載のシステム。
【請求項５３】
多リガンド捕捉剤と標的の特異的結合を可能にして多リガンド捕捉剤標的複合体を形成させるための時間かつ条件下で、請求項１から１９のいずれか一項に記載の多リガンド捕捉剤を混合物と接触させるステップと、
タンパク質捕捉剤標的複合体を混合物から分離するステップと
を含む、標的を混合物中の分析物から分離する方法。
【請求項５４】
標的とタンパク質捕捉剤との接触およびタンパク質捕捉剤標的複合体の分離を単パラメータアッセイまたは複数パラメータアッセイに従って行なう、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
請求項１から１９のいずれか一項に記載の多リガンド捕捉剤および混合物から多リガンド捕捉剤標的複合体を分離するために必要な少なくとも１つの試薬を含む、標的を混合物中の分析物から分離するシステム。
【請求項５６】
少なくとも１つの複数の候補リガンド、および
１つまたは複数の官能基を前記候補リガンド上に導入するための試薬
を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の多リガンド捕捉剤を提供するシステム。
【請求項５７】
標識をさらに含む、請求項５６に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示が全体で本明細書中に参考として組み込まれている、題名「多リガンドタンパク質捕捉剤のタンパク質触媒形成（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ
Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉ−ｌｉｇａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ａｇｅｎｔｓ）」、第６１／１３２，４１６号、２００８年６月１８日提出、整理番号ＣＩＴ−５１６４Ｐ号の米国仮出願、および題名「捕捉剤ならびに関連組成物、方法およびシステム（Ｃａｐｔｕｒｅ
Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｏｎｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、第６１／１５５，８９０号、２００９年２月２６日提出、整理番号Ｐ３６７−ＵＳＰ号の米国仮出願の優先権を主張するものである。
【０００２】
政府補助金の記述
「国立衛生研究所によって授与された補助金番号ＣＡ１１９３４７号に準じて、米国政府は本発明の特定の権利を有する」。
【０００３】
技術分野
本開示は、試料中の１つまたは複数の標的を検出および／または分離するための捕捉剤に関する。
【背景技術】
【０００４】
標的および特にバイオマーカーの高感度検出は、生体分子分析の分野において、特に複数の標的の検出および／または特定の寸法もしくは低濃度で試料中に存在する標的の検出を目的とする場合の課題であった。病理学的検査のためであれ、基礎的な生物学的研究のためであれ、いくつかの方法が、様々なクラスの生体材料および生体分子を検出するために一般的に使用されている。
【０００５】
単一の生物学的標的を検出するために実験室で最も一般的に使用されている技術の一部には、ゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、ウエスタンブロット、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。これらの方法により、血清および組織などの生体試料中の１つまたは複数のバイオマーカーを検出する能力が提供され、また、診断目的にも適切である。
【０００６】
続くポリヌクレオチドエンコード手法により以前の技術を超える改善が提供され、特に、標的の感度および選択性の高い多重検出を行なうことが可能となった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本明細書中では、いくつかの実施形態では１つまたは複数の標的を高い親和性および特異性で効率的に検出および／または分離するために使用することができる、捕捉剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様によれば、標的に対する多リガンド捕捉剤を記載する。多リガンド捕捉剤は互いに共有結合した２つ以上のリガンドを含み、２つ以上のリガンドのそれぞれは標的と特異的に結合し、かつ他方と結合的に識別可能であり、２つ以上のリガンドは、多リガンド捕捉剤が標的と結合した際に２つ以上のリガンドのそれぞれが標的と特異的に結合するように、多リガンド捕捉剤中で配置されている。
【０００９】
第２の態様によれば、組成物を記載する。組成物は、本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤と適合性のあるビヒクルとを含む。
【００１０】
第３の態様によれば、多リガンド捕捉剤と標的の結合を可能にして多リガンド捕捉剤標的複合体を形成させるための時間かつ条件下で、標的を本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤と接触させることと、多リガンド捕捉剤標的複合体を検出することとを含む、標的を検出する方法を記載する。
【００１１】
第４の態様によれば、標的を混合物中の別の分析物から分離する方法を記載する。この方法は、本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤を混合物中で、多リガンド捕捉剤と標的の特異的結合を可能にして多リガンド捕捉剤標的複合体を形成させるための時間かつ条件下で加えることと、多リガンド捕捉剤標的複合体を混合物から分離することとを含む。
【００１２】
第５の態様によれば、標的を検出するためのシステムを記載する。このシステムは、本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤と、多リガンド捕捉剤標的複合体の検出を行なうために必要な試薬のうちの少なくとも１つとを含む。
【００１３】
第６の態様によれば、標的を混合物中の別の分析物から分離するためのシステムを記載する。このシステムは、本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤と、混合物から多リガンド捕捉剤標的複合体を分離するために必要な試薬のうちの少なくとも１つとを含む。
【００１４】
第７の態様によれば、多リガンド捕捉剤の２つ以上のリガンドを、多リガンドで提供する方法を提供する。この方法は、標的を提供することと、複数の候補リガンドを提供することと、対応する結合部位で標的と特異的に結合することができる候補リガンドを選択することとを含み、結合部位は、それぞれの部位上に結合したそれぞれのリガンドの、互いの間での共有結合が可能となるように配置されている。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤ならびに関連組成物、方法およびシステムにより、標的に対する親和性剤の必要な事前の知識なしに、事前に決定した標的に特異的な捕捉剤の生成が可能となる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤ならびに関連組成物、方法およびシステムにより、熱ショック、脱水、ｐＨ変動、多くの化学プロセス、および特定の天然に存在する酵素による分解に対して増加した安定性を有する一方で、抗体の感度および選択性に少なくとも匹敵する感度および選択性で標的を検出することが可能となる。
【００１７】
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤ならびに関連組成物、方法およびシステムにより、当分野の特定の抗体に基づいた溶液と比較して、捕捉剤の迅速および／または対費用効果の高い開発が可能となる。
【００１８】
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤ならびに関連組成物、方法およびシステムにより、多様な化学性質のリガンドを有する捕捉剤の形成が可能となる。
【００１９】
また、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤ならびに関連組成物、方法およびシステムにより、事前に決定した標的分子内の部位特異的な標的化が可能となる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤ならびに関連組成物、方法およびシステムにより、単パラメータまたは複数パラメータのアッセイにおける、基質または表面に対する多リガンド捕捉剤の高度に配向された付着が可能となる。
【００２１】
本明細書中に組み込まれており、その一部を構成する添付の図面は、本開示の１つまたは複数の実施形態を例示し、詳細な説明および実施例と共に、本開示の原理および実行を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本明細書中に記載の一部の実施形態による共有結合を示す模式図である。
【図２】図２は、本明細書中に記載の一部の実施形態による共有結合を示す模式図である。
【図３】図３は、本明細書中に記載の一部の実施形態による共有結合を示す模式図である。
【図４】図４は、本明細書中に記載の一部の実施形態による共有結合を示す模式図である。
【図５】図５は、本明細書中に記載の実施形態による二重リガンド捕捉剤を示す図である。特に、１４個の非天然および人工アミノ酸からなる二重リガンド捕捉剤を高純度で合成することができる（単一の親質量を示す）。アンカーリガンドは１°として示し、二次リガンドは２°として示し、１，２，３−トリアゾールリンカー（１°および２°を接続）はＴｚ１として示す。
【図６】図６は、本明細書中に記載の実施形態による三重リガンド捕捉剤を示す図である。特に、アンカーリガンドは濃い灰色の書体によって示し、二次リガンドは中程度の灰色の書体によって示し、三次リガンドは薄い灰色の書体によって示す。リガンド間の接続は１，２，３−トリアゾール（Ｔｚ１およびＴｚ２）によって形成される。
【図７】図７は、本明細書中に記載のいくつかの実施形態による多リガンド捕捉剤を調製する方法を示す模式図である。パネルＡは、ライブラリ中の複数の候補分子を標識した標的と接触させて、一次リガンドまたはアンカーリガンドを同定する、第１のステップを示す。パネルＢは、第１のステップからの一次リガンドを、今ではリンカーが付加されている同じライブラリと接触させて二次リガンドを同定し、第１のステップの一次リガンドおよび二次リガンドによって形成される二重リガンドを得る、第２のステップを示す。パネルＣは、第２のステップから形成された二重リガンドを新しい一次リガンドとして用いることの繰返しにより高次多リガンドの同定を可能にする、第３のステップを示す。
【図８】図８は、本明細書中に記載のいくつかの実施形態による分枝状多リガンド捕捉剤を調製する方法を示す模式図である。パネルＡは、ライブラリを、標識した標的および第１の官能基（図７Ａの方法によって同定）を提示するアンカーリガンドと接触させて、二次リガンドを同定する、第１のステップを示す。この二次リガンドのライブラリは、複数の第２の官能基による置換部位を含有する。そのようなスクリーニングの結果は、内部の分枝点によって接続された二次リガンドからなる二重リガンドである。この分枝状二重リガンドは、官能基でさらに修飾し、分枝状三重リガンドのスクリーニングにおいてアンカーとして利用し得る。パネルＢは、この分枝状二重リガンドアンカーを、今ではリンカーが付加されている包括的なライブラリと接触させて、１つの分枝点を有する多リガンド捕捉剤中の三次リガンドを同定する、第２のステップを示す。パネルＣは、２つの分枝点を有する多リガンド捕捉剤中の三次リガンドを同定するために行なう、同じステップを示す。パネルＡ、パネルＢおよび／またはパネルＣの方法を任意選択で繰り返して、ｎ個の分枝点を有する多リガンド捕捉剤中のｎ個のリガンドが得られ得る。
【図９】図９は、本明細書中に記載の実施形態によるポリヌクレオチド多リガンド捕捉剤を連続してアセンブルする方法を示す模式図である。パネルＡは、複数のポリヌクレオチドを標識した標的と接触させて、一次リガンドまたはアンカーリガンドを同定する、第１のステップを示す。パネルＢは、第１のステップからの一次リガンドを、今ではリンカーが付加されている同じ複数のポリヌクレオチドと接触させて二次リガンドを同定し、第１のステップの一次リガンドおよび二次リガンドによって形成される二重リガンドを得る、第２のステップを示す。パネルＣは、第２のステップから形成された二重リガンドを新しい一次リガンドとして用いることの繰返しにより高次多リガンドの同定を可能にする、第３のステップを示す。
【図１０】図１０は、本明細書中に記載の実施形態による小分子多リガンド捕捉剤を連続してアセンブルする方法を示す模式図である。パネルＡは、複数の小分子を標識した標的と接触させて、一次リガンドまたはアンカーリガンドを同定する、第１のステップを示す。パネルＢは、第１のステップからの一次リガンドを、今ではリンカーが付加されている同じライブラリと接触させて二次リガンドを同定し、第１のステップの一次リガンドおよび二次リガンドによって形成される二重リガンドを得る、第２のステップを示す。パネルＣは、第２のステップから形成された二重リガンドを新しい一次リガンドとして用いることの繰返しにより高次多リガンドの同定を可能にする、第３のステップを示す。
【図１１】図１１は、様々な化学性質のリガンドを連続してアセンブルすることによってキメラ多リガンド捕捉剤を合成する方法を示す模式図である。パネルＡは、ポリヌクレオチドのライブラリを標識した標的と接触させて、一次リガンドまたはアンカーリガンドを同定する、第１のステップを示す。パネルＢは、第１のステップからの一次リガンドを、今ではリンカーが付加されているペプチドライブラリと接触させて二次リガンドを同定し、第１のステップの一次リガンドおよび二次リガンドによって形成される二重リガンドを得る、第２のステップを示す。パネルＣは、パネルＢの同じまたは別のペプチドライブラリを接触させることによって、第２のステップから形成された二重リガンドを新しい一次リガンドとして用いることの繰返しにより高次多リガンドの同定を可能にする、第３のステップを示す。
【図１２】図１２は、本明細書中に記載の実施形態による脱保護した二重リガンドアンカーの構造式を示す図である。特に、図１２の脱保護した二重リガンドアンカーは二重リガンド捕捉剤の元の配列からなり、三重リガンド捕捉剤を構築するための付着部位として役割を果たす１つの追加の官能基を有する。また、図１２の脱保護した二重リガンドアンカーは１５個の非天然および人工アミノ酸も含有し、単一の親質量を示す。
【図１３】図１３は、本明細書中に記載の実施形態による完全に保護した二重リガンドアンカーの構造式を示す図である。図１３の完全に保護した二重リガンドアンカーは二重リガンドアンカー中のアミノ酸側鎖の保護を維持しており、バルク量での多リガンド捕捉剤の合成に使用することができる。また、図１３の完全に保護した二重リガンドアンカーは、１５量体の配列として高純度で合成することもできる。
【図１４】図１４は、本明細書中に記載の実施形態によるビオチン標識した二重リガンドアンカーの構造式を示す図である。特に、示したビオチン標識した二重リガンドアンカーは、図１２に示した脱保護した二重リガンドアンカーの伸長であり、ビオチンにより、生じる修飾された多リガンド捕捉剤に検出性が与えられる。図１４のビオチン標識した二重リガンドアンカーは、ドットブロット実験（図２１を参照）および図２９に模式的に示すアッセイ（実施例１３を参照）の適切な試薬として使用することができる。
【図１５】図１５は、本明細書中に記載の実施形態によるビオチン標識した三重リガンド捕捉剤の構造式を示す図である。特に、図１５のビオチン標識した三重リガンド捕捉剤は、図６に示した三重リガンド捕捉剤の伸長であり、ビオチンにより、生じる修飾された多リガンド捕捉剤に検出性が与えられる。図１４のビオチン標識した二重リガンドアンカーは、実施例１６、２０および２１によって例示されるドットブロット、ウエスタンブロット、およびＥＬＩＳＡ型のアッセイの適切な試薬として使用することができる。
【図１６】図１６は、本明細書中に記載の実施形態による分枝状多リガンド捕捉剤の構造および標的親和性を示す図である。パネルＡは、ｂ（ｈ）ＣＡＩＩの分枝状二重リガンド捕捉剤ｖｋｗ（Ｔｚ１）ｆｗ−ｋｆｗｌｋｌの化学構造を示す。パネルＢは、漸増する濃度の二重リガンド（０から１６５６ｎＭ）を用いて得られたＳＰＲ応答センサーグラムにより、ｂＣＡＩＩ標的に対して５００ｎＭの結合親和性が実証されることを示す。図５の同様に開発した直鎖状二重リガンド捕捉剤の結合親和性と比較した場合、この分枝状構造の親和性は５倍向上していた。
【図１７】図１７は、本明細書中に記載の実施形態による分枝状多リガンド捕捉剤を示す模式図である。パネルＡは直鎖状三重リガンド捕捉剤を示す。パネルＢおよびＣは分枝状三重リガンド捕捉剤を示し、そのような構造中の制限された回転を有する結合をハイライトする。パネルＢおよびＣの制限された回転を有する結合は、同様に開発したが直鎖状である多リガンド捕捉剤（パネルＡ）と比較して、結合力を増加させる潜在性を有する。
【図１８】図１８は、本明細書中に記載のいくつかの実施形態による分枝状三重リガンド捕捉剤の構造を示す図である。アンカーリガンドは１°として示し、二次リガンドは２°として示し、三次リガンドは３°として示し、２つの１，２，３−トリアゾールリンカー（１°および２°ならびに２°および３°を接続）はそれぞれＴｚ１およびＴｚ２として示す。
【図１９】図１９は、本明細書中に記載の一部の実施形態によるアンカーリガンドを同定する方法を示す模式図である。
【図２０】図２０は、本明細書中に記載の一部の実施形態による二次リガンドを同定する方法を示す模式図である。
【図２１】図２１は、本明細書中に記載の実施形態による図１４の二重リガンドおよび図１５の三重リガンドを用いて行なった標的検出の感度を模式的に示す図である。パネルＡは、１０％のブタ血清におけるｂ（ｈ）ＣＡＩＩの検出について図１５の三重リガンドを用いて行なったドットブロット（下部）および関連する図（上部）を示す。パネルＢは、０．１％のブタ血清中で、図１４の二重リガンドを用いて行なったドットブロットを示す。
【図２２】図２２は、本明細書中に記載の一部の実施形態による多リガンド捕捉剤を用いて行なったネイティブウエスタンブロットの結果を示す図である。パネルＡは、全タンパク質含有物を詳しく示す、クマシー染色したネイティブゲルを示す。パネルＢは、一次抗体による特異的タンパク質結合を例示するネイティブウエスタンブロットを示す。パネルＣは、三重リガンド捕捉剤による特異的タンパク質結合を例示するネイティブウエスタンブロットを示す。
【図２３】図２３は、本明細書中に記載の実施形態による多リガンド捕捉剤を用いて行なった、標的分子の検出を示す模式図である。パネルＡは、ｂＣＡＩＩタンパク質を検出するために三重リガンド捕捉剤を用いた、完全にアセンブルしたＥＬＩＳＡ様サンドイッチ吸光度アッセイの構造の模式図を示す。パネルＢは、９６ウェルプレートのウェルで行なった、様々な濃度のｂＣＡＩＩでのＥＬＩＳＡアッセイの実験データを示す。漸増するｂＣＡＩＩ濃度は濃くなっていく灰色として検出される。パネルＣおよびＤは、様々なアッセイ条件を例示する図を示す。パネルＣでは標的が緩衝溶液中で提示される一方で、パネルＤでは、標的が１０％のブタ血清中で提示され、三重リガンド捕捉剤または検出抗体のどちらによっても特異的結合が損なわれなかった。
【図２４】図２４は、本明細書中に記載の一部の実施形態による２種類の二重リガンドのスクリーニングを例示する模式図である。パネルＡには、最初に図２０に詳述した二次（２°）リガンドのｉｎ  ｓｉｔｕスクリーニングを、比較のために再度示す。パネルＢには、パネルＡのスクリーニングが効いていたことを確認するために利用した、二次（２°）リガンドのビーズ上スクリーニングを示す。
【図２５】図２５は、本明細書中に記載の一部の実施形態による多リガンド捕捉剤の一次またはアンカーリガンドを選択する方法の結果を例示する図である。パネルＡは、スクリーニングライブラリＡ（第一世代アンカーリガンドスクリーニング）から単離された５１個のヒット配列の、頻度対Ｄ−アミノ酸をプロットした図を示す。パネルＢは、２つのアンカーリガンドの選択をもたらす、ライブラリＡおよびＢ（第二世代アンカーリガンド）のスクリーニングのヒット率を示す。
【図２６】図２６は、本明細書中に記載の一部の実施形態によるリガンドまたは多リガンド捕捉剤の親和性の検出を例示する図である。特に、図２６の図は、漸増する濃度の標的（０．２μＭから８００μＭ）で滴定したフルオレセイン化アンカーリガンドの蛍光偏光実験の結果を例示しており、この結合相互作用について５００μＭの親和性を示唆している。
【図２７】図２７は、本明細書中に記載の一部の実施形態による多リガンド捕捉剤の二次リガンドの同定を示す図である。パネルＡは、アンカーリガンドおよび標的の存在下でスクリーニングライブラリから単離した二重リガンド捕捉剤の二次リガンド候補の、Ｄ−アミノ酸（ｘ軸）の頻度（ｙ軸）を例示する図を示す。パネルＢは、パネルＡのスクリーニングライブラリから単離した正確な二次リガンド配列の略記のリストを示す。
【図２８】図２８は、漸増する濃度の本明細書中に記載の実施形態による多リガンド捕捉剤を用いた、多リガンド捕捉剤の検出された結合親和性の変動を例示する図である。特に、図２８の図は、２つの二重リガンド捕捉剤のそれぞれとセンサー表面上に固定した標的との相互作用の、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験の結果を例示している。パネルＡは、漸増する濃度の二重リガンドｌｋｌｗｆｋ−Ｔｚ１−ｋｉｗｉＧ（２ｎＭ〜５μＭ）を用いて得られたＳＰＲ応答センサーグラムを示す。パネルＢは、漸増する濃度の二重リガンドｋｗｌｗＧｌ−Ｔｚ１−ｋｆｗｌｋｌ（２ｎＭ〜５μＭ）を用いて得られたＳＰＲ応答センサーグラムを示す。
【図２９】図２９は、本明細書中に記載の一部の実施形態による多リガンド捕捉剤のリガンド間の連結を検出する方法を示す図である。特に、パネルＡは、ビオチン標識した二重リガンドアンカーを用いたビーズ上トリアゾール形成の、ｉｎ  ｓｉｔｕクリックアッセイの模式図を示し、パネルＢは、紫色ビーズ（濃い灰色で示す）をトリアゾール形成の陽性指示薬として示す。
【図３０】図３０は、本明細書中に記載の実施形態による多リガンド捕捉剤を検出する方法を示す模式図である。パネルＡは、三重リガンドの検出を例示的な事例として用いた、ＱＰＣＲによるビーズ上多リガンド検出を検出する方法の模式図を示す。パネルＢは、ＱＰＣＲによって行なった、図２９のビオチン標識した三重リガンドの形成の定量の模式図を例示する。パネルＣは、パネルＢの定量に関するデータを例示する図を示し、約１０：１の対照を超える選択性を示す。
【図３１】図３１は、本明細書中に記載の一部の実施形態による第二世代リガンドのスクリーニングを例示する図である。特に、図３１の図は、３７個の二重リガンドのヒットしたビーズの分析に基づいて位置１〜６に見つかるＤ−アミノ酸の分布を示す。それぞれの位置のアミノ酸残基の頻度は、コンセンサスの指標である。
【図３２】図３２は、本明細書中に記載の一部の実施形態による多リガンド捕捉剤の形成を検証する方法を示す模式図である。特に、アジド含有アミノ酸を有する（パネルＡ）および有さない（パネルＣ）ペプチドの、第一世代三次リガンドスクリーニングを行なって三重リガンドを作製するための、位置依存性のヒストグラムを、（パネルＢ）第一および第二世代のＣｕＡＡＣライブラリのスクリーニングと共に例示する。最終コンセンサス三重リガンド配列を灰色の書体によって示す。
【図３３】図３３は、漸増する濃度の本明細書中に記載の実施形態による多リガンド捕捉剤を用いた、多リガンド捕捉剤の検出された結合親和性の変動を例示する図である。特に、パネルＡおよびＢは、それぞれヒト（Ａ）およびウシ（Ｂ）ＣＡＩＩ標的について測定した、漸増するペプチド濃度（０．１ｎＭから１６２ｎＭ）を用いて得られた図１５の三重リガンド捕捉剤（ｒｆｖｉｌｎ−Ｔｚ２−ｋｗｌｗＧｌ−Ｔｚ１−ｋｆｗｌｋｌ）のＳＰＲ応答センサーグラムを示す。
【図３４】図３４は、本明細書中に記載の実施形態による多リガンド捕捉剤との複合体中の、標的分子の酵素活性を例示する図である。特に、図３４の図は、三重リガンド捕捉剤の存在下（灰色）および非存在下（黒色）、ならびに対照としてｂＣＡＩＩの非存在下（濃い灰色）における、基質４−酢酸ニトロフェニル（４−ＮＰＡ）に対するｂＣＡＩＩの酵素活性を示す。三重リガンド捕捉剤がアッセイ中に存在する場合は、経時的な活性には変化がない。
【図３５】図３５は、本明細書中に記載の実施形態による多リガンド捕捉剤のリガンドを接続する適切なリンカーを同定する方法を示す模式図である。パネルＡは、ｂ（ｈ）ＣＡＩＩに対する三重リガンド捕捉剤中の１，２，３−トリアゾールリンカー（Ｔｚ１およびＴｚ２）を置き換える代替リンカーをスクリーニングするために利用するライブラリを形成する模式図を示す。パネルＢは代表的なヒットを示し、Ｔｚ１またはＴｚ２の適切な置換えであるＤ−アミノ酸を示す。パネルＣは、元の１，２，３−トリアゾールのよりコンパクトな型を表す代替アミドリンカーの適合性の例示を示す。
【図３６】図３６は、１，２，３−トリアゾールリンカー（Ｔｚ１およびＴｚ２）の代わりにアミドリンカーを提示する３つの三重リガンド捕捉剤の分子構造を示す図である。パネルＡはＴｚＲ１と示し、Ｔｚ２＝Ｇｆであり、Ｔｚ１＝ｎｋであり、パネルＢはＴｚＲ３と示し、Ｔｚ２＝ａｌであり、Ｔｚ１＝ｄｋであり、パネルＣはＴｚＲ２と示し、Ｔｚ２＝ｐｓであり、Ｔｚ１＝ｖｖである。
【図３７】図３７は、リガンド間の接続リンカーが１つまたは複数のアミド結合によって置き換えられている三重リガンド捕捉剤の特性を記載する図である。パネルＡは円二色性（ＣＤ）実験の結果を示し、どちらもランダムコイルであるという点において、三重リガンド捕捉剤ＴｚＲ１が元の三重リガンド配列（ｒｆｖｉｌｎ−Ｔｚ２−ｋｗｌｗＧｌ−Ｔｚ１−ｋｆｗｌｋｌ、図６）と類似構造を共有することを例示している。パネルＢは、ＳＰＲによるＴｚＲ１（０〜１５００ｎＭの分析物）とｂ（ｈ）ＣＡＩＩとの間の結合相互作用の結果を示し、平衡解離定数は高いｎＭとして推定された。パネルＣは、１，２，３−トリアゾールの原子配置および電子特性をアミド結合によって模倣し得ることを例示している。
【図３８】図３８は、図６の三重リガンド捕捉剤中のＴｚ２リンカーを置き換えるアミノ酸３個のリンカーを同定するためのスクリーニング手法の例を示す図である。このスクリーニング手法は図２３のＥＬＩＳＡ様サンドイッチアッセイに類似しているが、基質はマイクロウェルではなくビーズであることに注意されたい。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書中では、いくつかの実施形態では１つまたは複数の標的を高い親和性および特異性で効率的に検出および／または分離するために使用できる、捕捉剤を提供する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載する多リガンド捕捉剤を、それだけには限定されないが、本開示を読むことによって当業者が同定可能な標的を検出および／または分離するためのアッセイを含めた、いくつかのアッセイを行なうための他の捕捉剤の代わりに使用することができる。
【００２５】
本明細書中で使用する用語「捕捉剤」とは、標的と特異的に結合することができる化合物を示す。たとえば、開示した捕捉剤は、標的と特異的に結合するように構成することができる。開示した捕捉剤には、それだけには限定されないが、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび当業者が同定可能な他の非ポリマー分子などの有機分子が含まれることができる。本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤は捕捉剤の例である。
【００２６】
第１の分子と第２の分子の結合に関して本明細書中で使用する表現「特異的」、「特異的に」または「特異性」とは、第１の分子と第２の分子との間の認識、接触および安定な複合体の形成ことをいい、それと共に、第１の分子および第２の分子のそれぞれと存在し得る他の分子との間の認識、接触および安定な複合体の形成が実質的により低いまたは存在しないことをいう。例示的な特異的結合は、抗体−抗原の相互作用、細胞受容体−リガンドの相互作用、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション、酵素基質相互作用などである。複合体の分子構成成分に関して本明細書中で使用する用語「特異的」とは、その構成成分と、その構成成分が一部である特定の複合体との固有の会合をいう。ポリヌクレオチドの配列に関して本明細書中で使用する用語「特異的」とは、配列と相補的配列である単一のポリヌクレオチドとの固有の会合をいう。「安定な複合体」とは、検出可能であり、任意の安定性レベルを全く必要としない複合体を意味するが、より高い安定性が一般に好ましい。
【００２７】
本明細書中で使用する用語「標的」とは、目的の分析物を示す。用語「分析物」とは、試料中のその存在または非存在を検出する、物質、化合物、部分、または構成成分をいう。分析物には、それだけには限定されないが、生体分子、特にバイオマーカーが含まれる。本明細書中で使用する用語「生体分子」とは、それだけには限定されないが、糖、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、有機分子、ハプテン、エピトープ、生体細胞、生体細胞の部分、ビタミン、ホルモンなどを含めた、生物学的環境に関連する物質、化合物または構成成分を示す。用語「バイオマーカー」とは、それだけには限定されないが、細胞サイクルの期、健康および病状を含めた、生物学的環境の具体的な状態に関連する生体分子を示す。バイオマーカーの存在、非存在、低下、アップレギュレーションは、特定の状態に関連しており、その指標である。「生物学的環境」とは、たとえば、生態系、目、科、属、種、亜種、生物、組織、細胞、ウイルス、オルガネラ、細胞下部構造、プリオン、および生体由来の試料を含めた、任意の生物学的設定をいう。
【００２８】
当分野で既に知られている例示的な捕捉剤には、抗体、ポリヌクレオチドおよびアプタマーが含まれる。
【００２９】
本明細書中で使用する用語「抗体」とは、抗原による刺激後に活性Ｂ細胞によって産生され、抗原と特異的に結合して生物系において免疫応答を促進することができる種類のタンパク質をいう。完全抗体は、典型的には、２本の重鎖および２本の軽鎖が含まれる４つのサブユニットからなる。用語抗体には、それだけには限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはその断片を含めた、天然および合成の抗体が含まれる。例示的な抗体には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭなどが含まれる。例示的な断片には、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２などが含まれる。モノクローナル抗体とは、「エピトープ」と呼ばれる、別の生体分子の単一の特定の空間的かつ極性の組織と特異的に結合し、したがってそれに相補的であると定義される抗体である。一部の形態では、モノクローナル抗体は同じ構造を有することもできる。ポリクローナル抗体とは、様々なモノクローナル抗体の混合物をいう。一部の形態では、ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体のうちの少なくとも２つが異なる抗原性エピトープと結合する、モノクローナル抗体の混合物であることができる。異なる抗原性エピトープは、同じ標的上、異なる標的上、またはその組合せであることができる。抗体は、宿主の免疫化および血清の収集などの当分野で周知の技術によって（ポリクローナル）、または連続ハイブリドーマ細胞系を調製し、分泌されたタンパク質を収集することによって（モノクローナル）調製することができる。
【００３０】
本明細書中で使用する用語「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド、ヌクレオシドまたはその類似体を含めた２つ以上の単量体からなる有機ポリマーを示す。用語「ヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジン塩基およびリン酸基と結合したリボースまたはデオキシリボース糖からなり、核酸の基本構造単位であるいくつかの化合物のうちの任意のものをいう。用語「ヌクレオシド」とは、デオキシリボースまたはリボースと合わせたプリンまたはピリミジン塩基からなり、特に核酸中に見つかる化合物（グアノシンまたはアデノシンなど）をいう。用語「ヌクレオチド類似体」または「ヌクレオシド類似体」とは、それぞれ、１つまたは複数の個々の原子が異なる原子または異なる官能基で置き換えられた、ヌクレオチドまたはヌクレオシドをいう。したがって、用語「ポリヌクレオチド」には、任意の長さの核酸、特に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、類似体およびその断片が含まれる。また、３個以上のヌクレオチドのポリヌクレオチドは、「ヌクレオチドオリゴマー」または「オリゴヌクレオチド」とも呼ばれる。
【００３１】
本明細書中で使用する用語「アプタマー」とは、特定の標的と結合するオリゴ核酸またはペプチド分子を示す。特に、核酸アプタマーは、たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択の繰返し、または同等にＳＥＬＥＸ（指数関数的富化によるリガンドの系統的な進化）を介して、小分子、タンパク質、核酸などの様々な分子標的、ならびにさらには細胞、組織および生物と結合するように操作された核酸種を含むことができる。アプタマーは抗体に匹敵する分子認識特性を提供するため、生物工学的および治療的用途において有用である。ペプチドアプタマーとは、細胞内のタンパク質−タンパク質の相互作用と特異的に結合してそれを妨害するように設計されたペプチドである。特に、ペプチドアプタマーは、たとえば、酵母二重ハイブリッド（Ｙ２Ｈ）系に由来する選択戦略に従って誘導することができる。特に、この戦略によれば、転写因子結合ドメインと付着した可変ペプチドアプタマーループを、転写因子活性化ドメインと付着した標的タンパク質に対してスクリーニングする。この選択戦略を介したペプチドアプタマーとその標的とのｉｎ  ｖｉｖｏ結合は、下流の酵母マーカー遺伝子の発現として検出される。
【００３２】
本明細書中で使用する用語「多リガンド捕捉剤」とは、薬剤中に含まれる複数のリガンドの特異的結合を介して標的と特異的に結合することができる薬剤を示す。たとえば、多リガンド捕捉剤は、捕捉剤中に含まれる複数のリガンドの特異的結合を介して標的と特異的に結合するように構成された捕捉剤であることができる。多リガンド捕捉剤には、様々な化学性質の分子（たとえば、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／または小分子）が含まれることができ、リガンドによって形成される捕捉剤およびリガンドのうちの少なくとも１つと付着する捕捉剤がどちらも含まれる。
【００３３】
特に、本明細書中に記載する多リガンド捕捉剤は、それぞれ標的と結合することができる２つ以上のリガンドを含むことができる。本明細書中で使用する用語「リガンド」とは、標的と結合する親和性を有する化合物を示す。この親和性は任意の形態をとることができる。たとえば、そのような親和性は、非共有的相互作用、たとえば、特定の基質に特異的かつ検出可能な、酵素中で起こる結合の種類に関連して説明することができる。典型的には、これらの相互作用には、典型的には同時に起こる、疎水性、ファンデルワールス、および水素結合などのいくつかの弱い相互作用が含まれる。例示的なリガンドには、それぞれが特定の標的（たとえばタンパク標的）に対して測定可能な親和性を有する、アミノ酸、非天然アミノ酸、および人工アミノ酸、ならびに有機分子の群から採用される複数のサブユニットからなる分子が含まれる。より詳細には、例示的なリガンドには、ポリペプチドおよびペプチド、１つもしくは複数の官能基が含まれるように修飾できる可能性がある他の分子が含まれる。たとえば、開示したリガンドは、標的に対する親和性を有することができる、標的と結合することができる、標的と特異的に結合することができる、および／または標的との結合において１つもしくは複数の他のリガンドとは結合的に識別可能であることができる。一般に、開示した多リガンド捕捉剤は標的と特異的に結合する。このためには、多リガンド捕捉剤中に含まれる個々のリガンドが個々に標的と特異的に結合できることは必要ではないが、これも企図される。
【００３４】
本明細書中で使用する用語「ポリペプチド」とは、２つ以上のアミノ酸単量体および／またはその類似体からなる、有機の直鎖状、環状、または分枝状のポリマーを示す。用語「ポリペプチド」には、完全長のタンパク質およびペプチドを含めた任意の長さのアミノ酸ポリマー、ならびにその類似体および断片が含まれる。また、３個以上のアミノ酸のポリペプチドは、タンパク質オリゴマー、ペプチドまたはオリゴペプチドとも呼ばれる。特に、用語「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、通常は５０個未満のアミノ酸単量体を有するポリペプチドを示す。本明細書中で使用する用語「アミノ酸」、「アミノ酸単量体」、または「アミノ酸残基」とは、２０種の天然に存在するアミノ酸のうちの任意のもの、非天然アミノ酸、および人工アミノ酸をいい、ＤおよびＬ光学異性体がどちらも含まれる。特に、非天然アミノ酸には、天然に存在するアミノ酸のＤ−立体異性体が含まれる（これらは酵素分解に感受性がないため、これらには有用なリガンド構成単位が含まれる）。用語「人工アミノ酸」とは、標準のアミノ酸カップリング化学を用いて容易に一緒にカップリングすることができるが、天然に存在するアミノ酸とは似ていない分子構造を有する分子を示す。用語「アミノ酸類似体」とは、１つまたは複数の個々の原子が異なる原子、同位体、または異なる官能基のいずれかで置き換えられているが、それ以外は類似体が由来する元のアミノ酸と同一であるアミノ酸をいう。これらのアミノ酸はすべて、標準のアミノ酸カップリング化学を用いてペプチドまたはポリペプチド内に合成によって取り込ませることができる（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら、１９９７）。本明細書中で使用する用語「ポリペプチド」には、１つまたは複数の単量体またはアミノ酸単量体以外の構成単位を含むポリマーが含まれる。用語、単量体、サブユニット、または構成単位とは、適切な条件下で同一または異なる化学性質の別の単量体と化学結合されてポリマーを形成することができる化学物質を示す。用語「ポリペプチド」とは、構成単位のうちの１つまたは複数がアミドまたはペプチド結合以外の化学結合によって互いに共有結合しているポリマーを含むことをさらに意図する。いくつかの実施形態では、２つ以上のリガンドのうちの少なくとも１つのリガンドは１つまたは複数のアミノ酸残基を含み、特に、ポリペプチドによって形成されることができる。特に、いくつかの実施形態では、少なくとも２つのリガンドのうちの少なくとも１つは、３〜１００個の単量体、特に５〜８０個の単量体を含むペプチドである。一部の実施形態では、ペプチドは、３〜１０個の単量体、特に５〜７個の単量体を含むことができる。一部の実施形態では、多リガンド捕捉剤はタンパク質からなることができる。
【００３５】
本明細書中で使用する用語「タンパク質」とは、別の分析物、特に、他のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、代謝物、ホルモン、ケモカイン、および小分子を含めた他の生体分子と相互作用することができる、特定の二次および三次構造を有するポリペプチドを示す。
【００３６】
特に、本明細書中に記載の捕捉剤に含まれるタンパク質は、天然に存在しないタンパク質、すなわち、それ自体で自然に存在せず、人工的な補助なしに存在しないタンパク質であることができる。天然に存在しないタンパク質には、天然に存在するタンパク質の修飾によって誘導することができるタンパク質が含まれる。
【００３７】
より詳細には、いくつかの実施形態では、多リガンド捕捉剤はペプチドリガンドから構築することができ、そのそれぞれは、その一部が天然に存在しない、および／または特定の任務のために固有の化学的機能を有するように設計されている固有のアミノ酸の組から構築する。これらの実施形態の一部では、ペプチドは、事前に決定した実験設計に従って、人工アミノ酸を用いて、および／または天然に存在するペプチドと構造および／もしくは機能が類似もしくは異なる天然に存在しないペプチドがもたらされるように合成する。１つまたは複数のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質リガンドを含む多リガンド捕捉剤は、タンパク質性質の多リガンド捕捉剤と呼ぶことができる。
【００３８】
多リガンド捕捉剤がアミノ酸リガンドを含むいくつかの実施形態では、多リガンド捕捉剤は、アミノ酸構成単位は容易に入手可能であるか、または比較的大量に化学合成することが困難でないため、複数グラム量を低コストで生成することができる。アミノ酸およびペプチドを合成する手順は当業者に知られており、実施例１に例示した手順に例示されている。
【００３９】
他の実施形態では、多リガンド捕捉剤は、アミノ酸以外の化学性質を有するリガンドを含む。特に、一部の例示的な実施形態では、多リガンド捕捉剤は、ポリヌクレオチド（特にオリゴヌクレオチド）、小分子、および生物活性を有する可能性がある様々な他のリガンドによって形成することができる。
【００４０】
本明細書中で使用する用語「小分子」とは、合成または生物学的起源であり、単量体および／または一次代謝物が含まれ得るがポリマーではない有機化合物を示す。特に、小分子は、タンパク質または核酸でなく、内在性（たとえば、標的の阻害もしくは活性化）または外因性（たとえば細胞シグナル伝達）の生物学的役割を果たし、分子生物学のツールとして使用する、または医学における薬物として適切な分子を含むことができる。また、小分子は、天然の生体分子と関係性を有さない場合もある。典型的には、小分子は１ｋｇ・ｍｏｌ−１未満のモル質量を有する。例示的な小分子には、二次代謝物（アクチノマイシン（ａｃｔｉｎｏｍｉｃｙｎ）−Ｄなど）、特定の抗ウイルス薬（アマンタジンおよびリマンタジンなど）、催奇形物質および発癌物質（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテートなど）、天然物（ペニシリン、モルヒネおよびパクリタキセルなど）ならびに本開示を読んだ際に当業者によって同定可能な追加の分子が含まれる。
【００４１】
また、リガンドが非アミノ酸性質の化合物によって形成される実施形態では、リガンドは人工化合物（ヌクレオチドまたはヌクレオシド類似体など）を用いて合成することができ、天然に存在する対応する分子を模倣できる可能性がある非天然リガンドがもたらされる場合がある。リガンドとして適切な非アミノ酸分子を合成する手順は当分野で知られている。たとえば、非ペプチド捕捉剤を含む単量体をアセンブルする手順は、その特定のリガンドのクラスに特異的な反応、たとえば、ポリヌクレオチド捕捉剤の２つのヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合の形成、または小分子捕捉剤の有機合成に一般的な多数の反応のうちの任意のもの（たとえば、アミド結合の形成、Ｃ−Ｃ結合の形成、ＳＮ１、ＳＮ２、Ｅ１、Ｅ２）を含む。分子の合成に適切なさらなる手順は当業者によって同定可能であり、さらに詳述しない。
【００４２】
一部の実施形態では、多リガンド捕捉剤は同じ化学性質のリガンドによって形成することができる。他の実施形態では、本開示を読んだ際に当業者によって理解されるように、多リガンド捕捉剤は異なる化学性質のリガンドによって形成することができる。
【００４３】
特に、いくつかの実施形態では、多リガンド捕捉剤の１つまたは複数のリガンドは、同じ捕捉剤中に含まれる他のリガンドのいずれとも化学性質が異なり得る。生じる多リガンド捕捉剤には、異なる化学性質を有する少なくとも２つの化合物が含まれることができ、本明細書中でキメラ捕捉剤またはキメラ多リガンド捕捉剤としても同定される。例示的なキメラ多リガンド捕捉剤には、それだけには限定されないが、小分子／ペプチド、小分子／ポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチド／ペプチドが含まれる。本開示中にさらに例示するように、リガンドの逐次付加はリガンドの組成物自体によってではなく、リガンドが付随する官能基によって達成されるため、当業者には、多リガンド捕捉剤を構成するリガンドの化学性質は限定されないことが理解されよう。
【００４４】
一部の実施形態では、多リガンド捕捉剤の１つまたは複数のリガンドは、同じ多リガンド捕捉剤中に含まれる少なくとも１つの他のリガンドに非関連および／または標的に非関連である。２つの項目間において本明細書中で使用する用語「非関連」とは、以前に確立された関係性の理由、特に共通祖先による接続または会合を欠くことを示す。
【００４５】
本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤中では、２つ以上の含まれるリガンドのそれぞれは、多リガンド捕捉剤の標的と特異的に結合することができ、かつ他方と結合的に識別可能であることができる。
【００４６】
分子、特にリガンドに関して本明細書中で使用する表現「結合的に識別可能」とは、特定の分子またはその一部分と結合するその能力に基づいて識別可能な分子を示す。したがって、たとえば、第１の分子は、第１の分子が第３の分子と特異的に結合し、第２の分子が第４の分子と特異的に結合し、第４の分子が第３の分子とは明確に異なる場合に、第２の分子とは結合的に識別可能である。第１および第２の分子が同じ第３の分子と特異的に結合する場合は、第１の分子は、第１の分子が第３の分子の第１の部分と特異的に結合し、第２の分子が第３の分子の第２の部分と特異的に結合し、第３の分子の第１の部分が第３の分子の第２の部分とは明確に異なる場合に、第２の分子とは結合的に識別可能である。したがって、たとえば、同じ標的と結合する第１のリガンドおよび第２のリガンドは、第１のリガンドが標的の第１の部分（ｐｏｒｔｉｏｎまたはｍｏｉｅｔｙ）（たとえば標的タンパク質の第１の結合部位）と特異的に結合し、第２のリガンドが標的の第２の部分（たとえば標的タンパク質の第２の結合部位）と特異的に結合し、標的の第１の部分が標的の第２の部分とは明確に異なる場合に、結合的に識別可能である。別の例として、同じ標的と結合する第１のリガンドおよび第２のリガンドは、第１のリガンドが標的の第１の部分（たとえば標的タンパク質の第１の結合部位）と結合し、第２のリガンドが標的の第２の部分（たとえば標的タンパク質の第２の結合部位）と結合し、標的の第１の部分が標的の第２の部分とは明確に異なり、かつ第１のリガンドが第２の部分と結合しない、第２のリガンドが第１の部分と結合しない、またはその両方の場合に、結合的に識別可能である。
【００４７】
特に、たとえば、２つ以上のリガンドは、捕捉剤と標的が結合する際に２つ以上のリガンドのそれぞれが標的と特異的に結合することなどによって標的と結合するように、多リガンド捕捉剤中で配置することができる。特に、たとえば、２つ以上のリガンドは、標的上の隣接する結合部位と結合することができる。これらの実施形態では、２つ以上のリガンドは共有結合によって互いに結合している。
【００４８】
用語「共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｂｏｎｄまたはｃｏｖａｌｅｎｔ  ｌｉｎｋまたはｃｏｖａｌｅｎｔ  ｌｉｎｋａｇｅ）」とは、原子間、または原子と他の共有結合との間で電子対を共有することによって特徴づけられる化学結合の形態を示す。少なくとも２つのリガンドを連結する例示的な共有結合には、それだけには限定されないが、アミドまたはペプチド結合、アジドとトリアリールホスフィンとの間の改変シュタウディンガーライゲーション（図１およびその全体が本明細書中に参考として組み込まれているＥ．Ｓａｘｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）、第２８７巻、２００７−２０１０を参照）、アジドとアセチレンとを共有結合する１，２，３−トリアゾール（図２およびその全体が本明細書中に参考として組み込まれているＶ．Ｄ．Ｂｏｃｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（２００６）、５１−６８を参照）、スルホニルアジドとチオ酸とを共有結合するアシルスルホンアミド（図３およびその全体が本明細書中に参考として組み込まれているＸ．Ｈｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００８）、第１３０巻、１３８２０−１３８２１を参照）、ならびにアルデヒドと第一級アミンとをカップリングさせて過渡的なヘミアミナールまたはイミンを形成し、これを還元して第二級または第三級アミンを得ること（図４およびその全体が本明細書中に参考として組み込まれているＭ．Ｈｏｃｈｇｕｅｒｔｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００２）、第９９巻、３３８２−３３８７，１３０、１３８２０−１３８２１を参照）が含まれる。
【００４９】
一部の実施形態では、多リガンド捕捉剤は複数のリガンドを含み、特に、本開示を読んだ際に当業者によって同定可能な基準による実験設計に応じて、２〜５個のリガンド、またはそれよりも多くのリガンドが含まれる場合がある。長さが増加した多リガンド捕捉剤（たとえば３個以上のリガンド）の特性には、標的と結合した際のエンタルピーの安定性の増強（親和性の増強をもたらす）およびこの結合相互作用における特異性の増加が含まれることができる。たとえば、ペプチドに基づく多リガンド捕捉剤を含む長いポリペプチド鎖は、三次元の折り畳まれた構造をとることができ、それにより、標的との可能な三次相互作用の数が増加する。長さが低下した多リガンド捕捉剤（たとえば３個以下のリガンド）の特性には、標的との結合におけるエントロピー消費の低下および合成負荷の低下が含まれる場合がある。
【００５０】
多リガンド捕捉剤が複数のリガンドを含む実施形態では、使用するリガンドの正確な数は、標的の性質、リガンドの化学性質、および所望する標的との最終的な結合親和性のいずれにも依存する場合がある。
【００５１】
本明細書中で使用する用語「結合親和性」または「親和性」とは、第１の分子と第２の分子の結合に関連する親和性を示す。特に、たとえば、結合親和性は、結合の強度の測度をいう場合がある。たとえば、会合定数、解離定数、会合速度、解離速度、ならびに他の動力学および結合の測度が、結合親和性の測度および／または構成成分となることができる。結合親和性は、水素結合、静電気的相互作用、疎水性相互作用、およびファンデルワールス力などの、２つの分子間の非共有の分子間相互作用によって影響を受ける。会合および解離定数は、典型的にはリガンド（すなわち、他の分子と結合しているとみなされる分子）の濃度に関して表す。内容によって別段に指定しない限りは、親和性および結合親和性への定量的および相対的な言及は、第１の分子と第２の分子の結合の解離定数として表す。解離定数が小さいほど、リガンドがより密に結合している、または２つの分子間の結合親和性がより良好である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、６または７量体ペプチドなどのリガンドには、１０−４〜１０−６Ｍの標的に対するリガンドの結合の解離定数が典型的には達成可能である。１０−６〜１０−７Ｍおよび１０−７〜１０−８Ｍおよび１０−８〜１０−９Ｍの解離定数が、１４量体ペプチドなどの二重リガンド捕捉剤（図５を参照）および２２量体ペプチドなどの三重リガンド捕捉剤（図６を参照）においてそれぞれ典型的には達成可能である。例示的な一事例では、２つの小分子リガンドが標的と特異的に接触し、互いに共有的に反応して、１０−１５Ｍの解離定数を有する阻害剤を形成することが示されている（Ｌｅｗｉｓ，Ｗ．Ｇ．ら、２００２、Ｍａｎｅｔｓｃｈ，Ｒ．ら、２００４、Ｂｏｕｒｎｅ，Ｙ．ら、２００４、Ｋｒａｓｉｎｓｋｉ，Ａ．ら、２００５）。
【００５３】
本明細書中に記載の多様な化学性質のリガンドからなる多リガンド捕捉剤は、長さおよび達成可能な親和性に関して制限を示さない。唯一の要件は、図７〜１１）に例示されており、本開示中にさらに記載されているように、多リガンド捕捉剤のそれぞれのリガンドの化学性質がいくつかの官能基（たとえば、アジドもしくはアセチレン、スルホニルアジドもしくはチオ酸、トリアリールホスフィンもしくはアジド、またはアルデヒドもしくはアミン）のうちの１つの提示を許容し、したがって、ｎ個のリガンドを含む多リガンド捕捉剤の連続的なアセンブルを許容することである。
【００５４】
いくつかの実施形態では、多リガンド捕捉剤は直鎖状捕捉剤である、すなわち、２つ以上のリガンドが鎖様の構造で互いに連結されている捕捉剤である。本開示の例示的な直鎖状多リガンド捕捉剤は実施例７〜２１に記載されており、２つの７量体Ｄ−ペプチドリガンド（１°および２°）からなる二重リガンド捕捉剤（図５、図１２、図１３および図１４を参照）、ならびに３つのＤ−ペプチドリガンド（１°、２°、および３°）からなる三重リガンド捕捉剤（図６および図１５を参照）が含まれる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤は分枝状捕捉剤である、すなわち、少なくとも２つのリガンドのうちの少なくとも１つが、捕捉剤の主部分に位置するまたはそれから伸長する捕捉剤である。特に、分枝状捕捉剤には、２つ以上のリガンドのうちの少なくとも１つを分子の分枝状部分中で提示するように構成された、分枝状ポリペプチドなどの分枝状分子が含まれる。例示的な分枝状多リガンド捕捉剤は実施例１７に記載されており、２つの７量体Ｄ−ペプチドリガンド（１°および２°）からなる分枝状二重リガンド捕捉剤［ただし、１°リガンドは２°リガンド内の非末端残基で２°リガンドと接続しており、同様に対応する直鎖状二重リガンド捕捉剤を超える５倍の親和性の増強を示す］（図１６Ａを図５と比較して参照）、ならびに３つの７量体Ｄ−ペプチドリガンド（１°、２°、および３°）からなる分枝状三重リガンド捕捉剤［ただし、３°リガンドは末端残基で分枝状二重リガンドアンカーと接続している］（図１７Ｂに模式図を示す）（図１８を図６と比較して参照）が含まれる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、多リガンド捕捉剤は、天然で共有結合していない少なくとも２つのリガンドを含む。
【００５７】
特に、一部の実施形態では、同じ天然に存在する分子の一部ではない、特に標的の同じ基質の一部ではない、少なくとも２つのリガンドを含む多リガンド捕捉剤である。
【００５８】
一部の実施形態では、多リガンド捕捉剤は、標的と結合することが知られている化合物から独立して選択された、特に設計された、少なくとも１つのリガンドを含む。特に、一部の実施形態では、多リガンド捕捉剤の少なくとも１つのリガンドは、標的と結合することが知られている化合物をモデルとしていないおよび／またはそれに由来しない。
【００５９】
一部の実施形態では、多リガンド捕捉剤は、単離された標的と結合することができる少なくとも１つのリガンドを含む。これらの実施形態の一部では、１つまたは複数の追加のリガンドが多リガンド捕捉剤中に含まれることができ、１つまたは複数の追加のリガンドは、捕捉剤と標的が特異的結合する際に標的と接触する。
【００６０】
本明細書中に記載するいくつかの多リガンド捕捉剤では、捕捉剤の構造ならびにリガンドの数、化学性質および可能な修飾は、選択した標的の所望の結合親和性および結合特異性の観点から決定することができる。本明細書中で使用する用語「結合特異性」とは、多リガンド捕捉剤と標的の結合親和性および多リガンド捕捉剤と参照分子の結合親和性の間の際の倍数を示す。
【００６１】
一部の実施形態では、参照分子と比較した多リガンド捕捉剤の結合特異性は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、または少なくとも１００である。参照分子とは、多リガンド捕捉剤の結合親和性を多リガンド捕捉剤と標的との結合親和性と比較する、任意の分子である。一部の実施形態では、リガンドまたは多リガンドといくつかの異なる標的との結合を説明する場合、参照分子は、標的のうちのいずれとも異なる分子によって提供することができる。たとえば、標的が血清タンパク質である場合、参照分子は、別の血清タンパク質、細胞質タンパク質、または標的と共通祖先のタンパク質であることができる。これらの実施形態では、参照分子により、たとえば、リガンドまたは多リガンドと標的および標的でない参照分子との間の結合親和性の差異の測定および監視が可能となる。一部の実施形態では、いくつかのリガンドまたは多リガンドと標的との示差的結合を説明する場合、参照分子は標的によって形成されることができる。これらの実施形態では、リガンドまたは多リガンドと単一の標的との相対的結合親和性は、参照分子を使用することによって測定および監視することができる。これらの実施形態では、参照分子により、たとえば、多リガンド捕捉剤を生産および／または同定する開示した方法などにおいて、様々な形態のリガンドまたは多リガンドによる結合親和性の差異の増加を測定および監視することが可能となる。上述のように、標的および参照分子に対する多リガンド捕捉剤の結合親和性の差異は、多リガンド捕捉剤の結合特異性と呼ぶことができる。
【００６２】
一部の実施形態では、標的に対する多リガンド捕捉剤の結合特異性は、標的に関連する参照分子に対する多リガンド捕捉剤の結合特異性に基づくことができる。特に、これらの実施形態の一部では、標的に関連する参照分子は、標的の対立型、標的の相同体および／または標的の修飾型である。
【００６３】
一部の実施形態では、標的に対する多リガンド捕捉剤の結合親和性は、アンカーリガンドの結合親和性よりも、たとえば、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、少なくとも１０１２、または少なくとも１０１３高い場合がある。
【００６４】
一部の実施形態では、多リガンド捕捉剤と標的の結合の解離定数は、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍ以下である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、多リガンド捕捉剤は、捕捉剤中に所望の特長が導入されるように合成または修飾することができる。例示的な所望の特長は、多リガンド捕捉剤中の化学活性または生物活性を可能にするまたは向上させるものである。例示的な化学活性または生物活性には、溶解度、特に水溶性、検出性（特異的環境における検出性が含まれる）、生体利用度（特に、捕捉剤を投与する個体の全身循環を達成する能力）、免疫原性（特に、捕捉剤を投与する個体において液性または細胞媒介性の免疫応答を誘発する、捕捉剤の能力）、ならびに反応性（化合物または物質と反応または結合する、特に、別の目的の化合物もしくは分子および／または表面と結合する能力が含まれる）が含まれる。所望の特長は、典型的には、多リガンド捕捉剤の合成中またはその後に、別の分子または官能基を付加することによって導入することができる。所望の化学活性または生物活性を可能にするまたは向上させる例示的な分子または官能基は、親水性または疎水性の分子または官能基（たとえば、ポリエーテルまたはポリヌクレオチド）、担体（たとえばワクチン担体）、および標識（たとえば、コード分子、たとえばコードポリヌクレオチド、蛍光色素または金ナノ粒子などの捕捉剤の検出を可能にする分子または官能基）を含む。
【００６６】
例示的な修飾された多リガンド捕捉剤には、２つの７量体Ｄ−ペプチドリガンドからなり、Ｎ末端で修飾されて三次リガンドと結合するためのアセチレン官能基を提示する二重リガンド捕捉剤（図１２を参照）、中性および塩基性ｐＨで実行する有機反応のために捕捉剤を安定化させる鎖保護基を有するアミノ酸側の残基で修飾された捕捉剤（図１３の構造を参照）、ドットブロット、ウエスタンブロット、およびＥＬＩＳＡ様アッセイにおける捕捉剤の検出性を可能にするビオチン分子が含まれるようにＮまたはＣ末端が修飾された捕捉剤（図１４および１５を参照）、ならびに、蛍光偏光（実施例６を参照）、免疫細胞化学、および免疫組織化学を含めた生物学的アッセイにおける捕捉剤の検出性を提供する蛍光色素分子が含まれるようにＮ末端が修飾された捕捉剤が含まれる。
【００６７】
一部の実施形態では、多リガンド捕捉剤、特にペプチドリガンドを含む多リガンド捕捉剤は、１つまたは複数の保護基（たとえば、アルコール保護基、アミン保護基、カルボニル保護基など）が含まれるように合成または修飾することができる。たとえば、一部の実施形態では、多リガンド捕捉剤を固相樹脂上で合成し、標準の側鎖保護基を無処置のままにする条件下で放出させることができる。他の例示的な実施形態では、そのような結合が所望される用途において、１つまたは複数の残基の側鎖保護を用いて、多リガンド捕捉剤と他の化合物、特に他のリガンドとの結合を可能にすることができる（たとえばＣｕＡＡＣ、実施例１２を参照）。これらの用途の例には、断片縮合による捕捉剤のバルク合成が含まれる。他の実施形態では、側鎖保護を用いて多リガンドの環化を得ることができる。特に、多リガンド捕捉剤は、捕捉剤の一方の末端を第１の官能基（たとえば−ＳＨ）で官能化し、他方の末端を第２の官能基（たとえば−ＳＨ）で官能化することができる。その後、第１および第２の官能基を互いに反応させて、単一の閉ループ構造（たとえばジスルフィド結合）を生じさせる。この閉ループ構造は、低下したコンホメーションエントロピーを示し、これは、多リガンド捕捉剤と標的の結合相互作用をさらに安定化させることができる。他の実施形態では、側鎖保護を用いて、単パラメータまたは複数パラメータのアッセイにおいて多リガンド捕捉剤と基質または表面との高度に配向された共有結合を達成することができる。これらの実施形態のうちの任意のものにおいて、これら３つのうちの任意のものを利用することによって記載した化学変換が完了した後、側鎖保護を（たとえば酸処理によって）除去することができる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、多リガンド捕捉剤に水溶性を提供することができる化合物が付加されるように多リガンド捕捉剤を合成または修飾することができる。例示的な化合物には、それだけには限定されないが、ポリエーテル（たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはオリゴヌクレオチド）などの親水性分子ならびに非イオン性、無毒性、生体適合性、および高度に親水性の他のポリマーが含まれる。たとえば、ＰＥＧ化捕捉剤は、その増加した水溶性および生体利用度により増強した治療特性を有することができる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、多リガンド捕捉剤は、捕捉剤の存在下における標的の活性の特徴づけおよび／または標的に対する捕捉剤の結合親和性を含めた定量的アッセイを可能にする、安定な非放射性（たとえば、２Ｈ、１５Ｎ、もしくは１３Ｃ）または放射性同位元素（たとえば、３Ｔ、１４Ｃ、３５Ｓ、もしくは３２Ｐ）が含まれるように合成または修飾することができる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、多リガンド捕捉剤は、生化学的または免疫局在性研究のための、捕捉剤に対するポリクローナル抗体を産生させるために、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ＢＳＡ、または卵白アルブミンなどの担体とコンジュゲートしているように修飾することができる。多リガンド捕捉剤と担体の間のコンジュゲーションは、多リガンド捕捉剤のシステイン残基を担体タンパク質にカップリングさせるマレイミド方法によって達成することができる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、多リガンド捕捉剤は、検出性を可能または増強するために、ビオチン分子とコンジュゲートしているように修飾することができる。ビオチンで標識した多リガンド捕捉剤は、捕捉剤とその標的との相互作用の増幅を可能にする、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼなどのストレプトアビジンと連結したタンパク質でさらに標識することができる。別の実施形態では、ストレプトアビジン−Ｃｙ５などのアダプタータンパク質によってビオチン標識をフルオロフォア標識へと変換することができる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、多リガンド捕捉剤は、暗視野および電子顕微鏡観察を含めた方法によって複合体試料（たとえば組織切片）中の捕捉剤と標的の結合の可視化を可能にする、金ナノ粒子標識とコンジュゲートしているように修飾することができる。このコンジュゲーションは、多リガンド捕捉剤の遊離チオール（たとえば−ＳＨ）を金ナノ粒子とカップリングさせるマレイミド方法によって達成することができる。また、このコンジュゲーションは、緩和な条件下（ｐＨ７．５〜８．２）で金ナノ粒子を多リガンド捕捉剤中の第一級アミンと反応させるスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（スルホ−ＮＨＳ）方法によっても達成することができる。遊離チオールおよび第一級アミンは、捕捉剤の既存の構成成分であるか、または当業者によって同定可能な化学によって達成されるルーチン的に設置される修飾のいずれかの官能基の例である。
【００７３】
一部の実施形態では、多リガンド捕捉剤は、多リガンド捕捉剤の標的以外の標的に対して事前に決定した親和性を有する、別のペプチド、小分子、またはタンパク質などの別の目的分子を付加することによって修飾することができる。２つの標的がどちらもタンパク質である実施形態では、修飾された多リガンド捕捉剤を用いてタンパク質間の相互作用を分析することができる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載する多リガンド捕捉剤は多リガンドタンパク質捕捉剤である、すなわち、特定のタンパク質に対して結合親和性を有する少なくとも一部分を含む捕捉剤である。例示的な多リガンドタンパク質捕捉剤には、それだけには限定されないが、タンパク質性質の標的を特異的に認識し、それと接触し、安定な複合体を形成することができる、任意の化学性質の捕捉剤が含まれる。特に、多リガンドタンパク質捕捉剤と標的タンパク質の結合は、タンパク質捕捉剤の１つまたは複数の部分と標的タンパク質の１つまたは複数の結合部位との特異的結合によって行なうことができる。多リガンド捕捉剤が多リガンドタンパク質捕捉剤である実施形態では、２つ以上のリガンドは、標的タンパク質の隣接する結合部位と隣接して結合することができる。
【００７５】
一部の実施形態では、多リガンド捕捉剤は生物学的であるが非タンパク質性質である追加の標的を認識することができる。例示的な多リガンド捕捉剤には、それだけには限定されないが、核酸、炭水化物、ペプチド、小分子、および／または細菌胞子標的を含めた非タンパク質性質の生物学的標的を特異的に認識し、それと接触し、安定な複合体を形成することができる、任意の化学性質の捕捉剤が含まれる。特に、多リガンド捕捉剤と非タンパク質標的の結合は、捕捉剤の１つまたは複数の部分と標的の１つまたは複数の隣接する結合部位との結合によって行なうことができる。特に、ＤＮＡ標的上のポリアミドの二量体化が実証されている（Ｐｏｕｌｉｎ−Ｋｅｒｓｔｉｅｎ，Ａ．Ｔ．およびＰ．Ｂ．Ｄｅｒｖａｎ、２００３）。一部の実施形態では、２つ以上の天然物を含む多リガンドは核酸標的と特異的に結合することができる（Ｔｓｅ，Ｗ．Ｃ．およびＤ．Ｌ．Ｂｏｇｅｒ、２００４）。さらに、２つ以上のペプチドを含む多リガンドは、炭水化物（Ｌａｎｄｏｎ，Ｌ．Ａ．ら、２００４）、蛍光色素（Ｍａｒｋｓ，Ｋ．Ｍ．ら、２００４）、および細菌胞子標的（Ｌｕｓｖａｒｇｈｉ，Ｓ．ら、２００９）と特異的に結合することができる。さらに、２つ以上のポリヌクレオチドを含む多リガンドはペプチド標的と特異的に結合することができる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｋ．Ｐ．ら、１９９７）。
【００７６】
一部の実施形態では、多リガンド捕捉剤は非生物学的性質の標的を認識することもできる。例示的な多リガンド捕捉剤には、それだけには限定されないが、金属および金属イオン、半導体、および伝導性ポリマーを含めた非生物学的標的を特異的に認識し、それと接触し、安定な複合体を形成することができる、任意の化学性質の捕捉剤が含まれる。特に、多リガンド捕捉剤と非生物学的標的との結合は、捕捉剤の１つまたは複数の部分と標的の１つまたは複数の部位との結合、特に特異的結合によって行なうことができる。一部の実施形態では、２つ以上のペプチドを含む多リガンドは、ＡｕもしくはＣｒ（Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．、１９９７）、ガリウムヒ素（Ｗｈａｌｅｙ，Ｓ．Ｒ．ら、２０００）、酸化ケイ素（Ｅｔｅｓｈｏｌａ，Ｅ．ら、２００５）、またはポリピロールポリマー（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ａ．Ｂ．ら、２００５）と特異的に結合することができる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、標的に特異的な多リガンド捕捉剤のリガンドは、生じる多リガンド捕捉剤と同じ標的を用いて同定する。特に、一部の実施形態によれば、多リガンド捕捉剤のリガンドの同定は、それぞれの結合したリガンドと別のリガンドとの間の共有結合が可能となるように配置した標的上の対応する部位で選択標的と非共有付着することができるリガンドを選択することによって、行なうことができる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、リガンドの選択は、候補リガンドから、たとえば、標的によって触媒される、標的と結合した候補リガンド間の共有結合の形成が可能となる時間かつ条件下で候補リガンドを標的と接触させることによって、行なうことができる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、候補リガンドのうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの他の候補リガンドに非関連および／または標的に非関連である。一部の実施形態では、提供するすべての候補リガンドは、互いにおよび／または標的と非関連である。特に、一部の実施形態では、候補リガンドは、当初は標的と結合できることが知られていない化合物を含む。
【００８０】
一部の実施形態では、候補リガンドは、標的またはその一部分と結合できることが当初から知られている化合物を含む。
【００８１】
一部の実施形態では、リガンドの選択は、標的と、ならびにこれらの実施形態の一部では標的上の目的の特異的部位（たとえば、抗体の結合部位および対応するエピトープ）と結合する、候補リガンドの知られている能力に基づいて行なうことができる。また、標的と結合するリガンドの能力に関連する、リガンドのさらなる特長（たとえば、結合親和性および／または特異性）も、選択を行なう際に考慮することができる。
【００８２】
いずれにせよ、一部の実施形態では、リガンドの選択は、リガンド上の所望の特長を選択または導入するためにリガンドおよび／または候補リガンドを設計することによって行なうことができる。
【００８３】
例示的な所望の特長は、リガンドと選択した標的および／または選択した標的内の特異的部位との結合を可能にするまたは向上させるものである。たとえば、一部の実施形態では、２つ以上のリガンドのうちの少なくとも１つは、標的上の特異的部位での結合が得られるように修飾することができる（たとえば、標的上の部位に対するリガンドの親和性および特異性に基づいて）。また、一部の実施形態では、リガンドは、標的、より詳細には標的上の目的の特異的部位によって特異的に認識される分子構造（ヌクレオチド配列など）を模倣するように設計することができる。一部の実施形態では、リガンドは、目的の標的と特異的に結合する能力を得るために、候補リガンド上に１つまたは複数の官能基を挿入することによって修飾することができる。一部の実施形態では、リガンドは、目的の標的またはそれ上の特異的部位と特異的に結合する能力に基づいて候補リガンドの中から事前に選択して、プレスクリーニング手順をもたらすことができる。これらの実施形態すべての一部において、リガンドの選択は、事前に決定した親和性または選択性で標的上の目的部位と結合する能力に基づくこともできる。
【００８４】
他の例示的な所望の特長は実験設計に依存する。たとえば、一部の実施形態では、リガンドまたは候補リガンドは、生じる多リガンド捕捉剤が水溶性を有することが確実となるように設計することができる。特に、これらの実施形態の一部では、リガンドは、ポリ（エチレン）グリコール、アミン、カルボン酸、ヒドロキシル、またはアジド官能基を含有する単量体などの親水性性質のリガンド構成単位が含まれるように設計することができる。他の例示的な実施形態では、リガンドまたは候補リガンドは、プロテアーゼなどの生体分子酵素に対して安定性を示すように設計することができる。これらの実施形態の一部では、生体分子酵素は立体化学、配列、および官能基に対する選択性が高いため、そのような束縛に従って生物学的に耐性のある候補リガンドを設計する。非天然アミノ酸には天然に存在するアミノ酸の任意のＤ光学異性体が含まれ、実施例２のライブラリに例示されている。人工アミノ酸とは、標準のアミノ酸カップリング化学を使用して容易に一緒にカップリングすることができるが、天然に存在するアミノ酸とは似ていない分子構造を有する分子を示す。実施例１のＦｍｏｃ−Ａｚ４−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｚ８−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｄ−Ｐｒａ−ＯＨが例示的な人工アミノ酸である。
【００８５】
リガンドまたは候補リガンド上に選択または導入するさらなる所望の特長は、多リガンド捕捉剤中の他のリガンドと連結するリガンドまたは候補リガンドの能力を可能にするまたは向上させるものである。
【００８６】
特に、本明細書中に記載する多リガンド捕捉剤では、リガンド上に提示される官能基によってリガンド対間の共有結合が行なわれて、２つの個別のリガンドと標的が結合した際にこれらの官能基が反応して共有結合を形成する。
【００８７】
本明細書中で使用する用語「官能基」とは、その構造の特徴的な化学反応を司る、分子構造内の特定の原子群を示す。例示的な官能基には、すべて当業者によって同定可能な、炭化水素、ハロゲン含有基、酸素含基、窒素含有基ならびにリンおよび硫黄含有基が含まれる。特に、本開示の意義での官能基には、カルボン酸、アミン、トリアリールホスフィン、アジド、アセチレン、スルホニルアジド、チオ酸およびアルデヒドが含まれる。特に、たとえば、第１の官能基および第２の官能基は、以下の結合パートナーを含むように選択することができる：カルボン酸基およびアミン基、アジドおよびアセチレン基、アジドおよびトリアリールホスフィン基、スルホニルアジドおよびチオ酸、ならびにアルデヒドおよび第一級アミン。さらなる官能基は本開示を読んだ際に当業者が同定することができる。本明細書中で使用する用語「対応する官能基」とは、別の官能基と反応することができる官能基をいう。したがって、互いに反応することができる官能基を対応する官能基と呼ぶことができる。
【００８８】
化合物または官能基に関して本明細書中で使用する用語「提示する」とは、付着したままで化合物または官能基の化学反応性が維持されるように行なわれる付着を示す。したがって、リガンド上に提示された官能基は、適切な条件下で、官能基を化学的に特徴づける１つまたは複数の化学反応を行なうことができる。
【００８９】
特に、２つ以上のリガンドが改変シュタウディンガーライゲーションによって共有結合している実施形態では、官能基はアジドおよびトリアリールホスフィンによって形成され、反応は、水性環境中でもアジドおよびトリアリールホスフィン基の間でアミド結合を形成することによって安定な共有的付加物を生じる化学選択的ライゲーションである（図１）。２つ以上のリガンドが生体直交型のアミド化反応によって共有結合している実施形態では、官能基はスルホニルアジドおよびチオ酸によって形成され、これらを反応させてアシルスルホンアミドが形成される（図３）。２つ以上のリガンドが過渡的なヘミアミナールおよびイミンの還元によって共有結合している実施形態では、官能基はアルデヒドおよび第一級アミンの間の相互作用によって形成される（図４）。
【００９０】
２つ以上のリガンドが生体直交型の１，３−双極ヒュスゲン付加環化反応によって共有結合している実施形態では、官能基はアジドおよびアセチレンによって形成され、これらを反応させて１，２，３−トリアゾール基が形成される（図２）。
【００９１】
一部の実施形態では、官能基は選択したリガンドまたは候補リガンド中に元々提示されている。一部の実施形態では、リガンドと別のリガンドとを連結させるための官能基の提示は、リガンドまたは候補リガンド中に導入される所望の特長である。特に、これらの実施形態の一部では、候補リガンドと別のリガンドとの間の共有結合を特異的に可能にする官能基が導入されるようにリガンドまたは候補リガンドを修飾することが可能である。
【００９２】
一部の実施形態では、別のリガンドと連結するためにリガンドおよび／または候補リガンド上に提示される官能基は、目的の標的およびそれ上に提示される官能基（たとえば、標的が生物学的標的である場合は、改変シュタウディンガーライゲーションにおいて連結させるアジドおよびトリアリールホスフィンに対して非反応性である（その全体が本明細書中に参考として組み込まれているＥ．Ｓａｘｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）、第２８７巻、２００７−２０１０）。
【００９３】
いくつかの実施形態では、選択されたリガンドは少なくともアンカーまたは一次リガンドおよび少なくとも１つの二次リガンドを含み、これらは、本明細書中に記載の方法を用いて標的に対するその親和性について選択することができる。
【００９４】
特に、候補リガンドを標的と接触させ、標的と特異的に結合して候補リガンド標的複合体を形成する候補一次リガンドを選択することによって、複数の候補一次リガンドから一次リガンドを選択することができる。
【００９５】
その後、二次リガンド一次リガンド標的複合体の形成を可能にする時間かつ条件下で、複数の候補二次リガンドを一次リガンド標的複合体と接触させ、一次リガンド標的複合体と特異的に結合し、かつ一次リガンドと共有結合する二次リガンドを選択することによって、二次リガンドを選択することができる。
【００９６】
特に、一次リガンドを任意選択で修飾して、標的によって触媒される反応において対応する第２の官能基と特異的に結合することができる第１の官能基を導入することができる。その後、修飾された一次リガンドを標的と接触させて、二次リガンドを選択するために使用する修飾された一次リガンド標的複合体を形成することができる。
【００９７】
三次リガンド、四次リガンドなど、実験設計によって所望されるだけの数のリガンドの同定に向けられた同様の手法を用いて、追加のリガンドをさらに選択することができる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、様々な複数の候補リガンド（たとえば、候補一次リガンド、候補二次リガンド、候補三次リガンドなど）のうちの少なくとも２つは、互いに異なる場合がある。特に、複数の候補リガンドを、候補リガンドの以前の選択に由来する情報を用いて選択することができる。たとえば、複数の候補二次リガンドを、複数の第１の候補リガンドに由来する情報を用いて選択して、複数の候補二次リガンドから候補リガンドの親和性を増加させることができる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、複数の候補リガンドのうちの少なくとも１つは基質に付着している。本明細書中で使用する用語「付着」または「付着した」とは、２つ以上の構成成分を一緒に保つための、結合、連結、力または繋がりによる接続または一体化をいい、たとえば、第１の分子が第２の分子もしくは物質と直接結合している、または１つもしくは複数の中間体分子が第１の分子および第２の分子もしくは物質の間に配置されている、直接または間接的な付着のいずれかが包含される。本明細書中で使用する用語「基質」とは、根底にある支持体または基層を示す。例示的な基質には、ガラスプレート、マイクロタイターウェルプレート、磁気ビーズ、ケイ素ウエファーおよび本開示を読んだ際に当業者によって同定可能なさらなる基質または表面などの固体基質が含まれる。
【０１００】
特に、一部の実施形態では、それぞれの複数の候補リガンドは、それぞれの候補リガンドが含まれる複合体を互いに別々に検出することができるように、異なる基質または基質の一部分に付着している。これらの実施形態の一部では、候補リガンドはビーズに付着しており、候補リガンドのそれぞれは、１リガンド−１ビーズの配置で単一のビーズに特異的に付着している。別の実施形態では、候補リガンドは表面上の特定の位置に付着しており、候補リガンドのそれぞれは、１リガンド−１位置の配置で事前に決定された位置に特異的に付着している。
【０１０１】
特に、いくつかの実施形態では、多リガンド捕捉剤のリガンドの選択はライブラリの支援を用いて行なうことができる。たとえば、一次および二次候補リガンドをライブラリ中に提供し、その後、これを標的分子および／または標的分子と選択した一次リガンドとの複合体でスクリーニングすることができる。
【０１０２】
多リガンド捕捉剤中に含めるリガンドがポリペプチド、特にペプチドを含む実施形態では、スクリーニング用に提示された３〜１０単量体ペプチドなどの候補ポリペプチドが含まれるタンパク質ライブラリを用いてリガンドを同定することができる。特に、一部の実施形態では、候補リガンドは、たとえば、それぞれその全体が本明細書中に参考として組み込まれている、Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら、１９９７、Ｆｕｒｋａ，Ａ．ら、１９９１、Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．およびＴ．Ｊ．Ｍａｓｏｎ、１９９３に記載の手法を用いて、１ビーズ−１化合物（ＯＢＯＣ）ペプチドライブラリ上に提示することができる。本開示を読んだ際に当業者によって同定可能なさらなるライブラリを使用することができる。目的標的との接触後のヒットの検出は、実施例セクションにさらに例示する方法が含まれる、当業者が同定可能ないくつかの方法に従って行なうことができる。
【０１０３】
多リガンド捕捉剤中に含めるリガンドがポリヌクレオチド、特にオリゴヌクレオチドを含む実施形態では（図９を参照）、たとえば、ポリスチレンビーズ上の標準のホスホルアミダイトおよびチオホスホルアミダイト化学を用いた１ビーズ１オリゴヌクレオチド（Ｓ−ＯＤＮまたはＳ２−ＯＤＮ）方法を使用して、オリゴヌクレオチドリガンドのライブラリを合成してリガンドを同定することができる（Ｙａｎｇ，Ｘ．ら、２００２）。特に、これらの実施形態では、ポリヌクレオチド捕捉剤のそれぞれのリガンドは、典型的には２０〜３０個のヌクレオチドの長さを含むことができる。標的との接触後のヒットの検出は、それだけには限定されないが、配列決定前の下流ＰＣＲ増幅を可能にする、オリゴヌクレオチドリガンドのコンビナトリアルライブラリセグメントに隣接する５’および３’固定プライマー配列の取り込みによって可能となるヒットの配列決定が含まれる、配列を用いて行なうことができる。ビーズに基づいたＳ−ＯＤＮライブラリの多様性要素は、標準の単量体（たとえば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｕ）から増加させて１つまたは複数の官能基を提示する非天然単量体を含めることができ、これには、アセチレン保有ピリミジン三リン酸（Ｇｒａｍｌｉｃｈ，Ｐ．Ｍ．Ｅ．ら、２００８）および５’−ブロモヘキシルホスホルアミダイト（これらはアジ化ナトリウムで処理することによってビーズ上で５’−アジドヘキシル修飾単量体に迅速に変換される）が含まれることができる。非天然修飾はこれらの捕捉剤のヌクレアーゼ安定性を増加させ、また、個々の一次リガンドから多リガンドを構築するための官能基も提供する。二次リガンドは、複数の候補リガンド（第２の官能基で修飾）を一次リガンド／標的の複合体と接触させて、２つのリガンド間の特異的結合および共有的反応を可能にすることによって選択される。これらの官能基はアジドおよびアセチレンであることができるが（図９に示す）、図１または図３に示すものなどの官能基も含まれることができる。三次、四次などのリガンドは同様の方法によって同定される。
【０１０４】
多リガンド捕捉剤中に含めるリガンドが小分子を含む実施形態では、標準の固相有機合成（ＳＰＯＳ）および１ビーズ１分子方法によって小分子のライブラリを調製することができる。小分子捕捉剤のそれぞれのリガンドは、１つ（図１０に示す）または複数の分子構成単位を含むことができる。ライブラリは、典型的には数十個の構成単位を含有して１０２〜１０３個のリガンドをもたらす。ヒットの解読は、単一ビーズの内容物を光切断可能（たとえば２−ニトロフェニル）またはＣＮＢｒ切断可能（たとえばメチオニン）なリンカーによって放出させ、続いて質量分析を行なうことによって可能となる。代替的に、それぞれのコンビナトリアルステップ後に分子タグによってエンコードすることで、間接的手段によるヒット解読が可能となる（Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｊ．ら、１９９５）。小分子捕捉剤のそれぞれの一次リガンドは、官能基を提示するように合成される。二次リガンドは、複数の候補リガンド（第２の官能基で修飾）を一次リガンド／標的の複合体と接触させて、２つのリガンド間の特異的結合および共有的反応を可能にすることによって選択される。これらの官能基はアジドおよびアセチレンであることができるが（図１０に示す）、図１または図３または図４に示すものなどの官能基も含まれることができる。三次、四次などのリガンドは同様の方法によって同定される。一部の事例では、官能基は、標的と特異的に結合し、捕捉剤の複合的な部分となることができる。小分子捕捉剤は薬物としての有効性を有することができる。
【０１０５】
多リガンド捕捉剤が小分子／ペプチド、小分子／ポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチド／ペプチドなどのキメラ捕捉剤によって形成される実施形態では（１つのスキームにはたとえば図１１を参照）、関連するリガンドは、上述のものなどの所望の化学性質のリガンドの同定に関連する特定のステップを組み合わせる方法によって同定する（また、ポリヌクレオチドには図９、小分子には図１０、ならびにペプチドには図７および８を参照）。これらの実施形態では、リガンドを同定し、場合によっては捕捉剤を生成するための全体的な方法は、多リガンドの連続アセンブルが、標的を、相補的官能基を表示するように合成した２つの個別のリガンドと接触させ、それらの間の反応を促進することによって起こるという点で、他の捕捉剤で使用するものと類似である。オリゴヌクレオチドへの効率的なペプチドカップリングは以前に示されており（Ｈａｌｐｉｎ，Ｄ．Ｒ．ら、２００４）、これはバルク量でのキメラ多リガンド捕捉剤の合成が実行可能であることを実証している。官能基が１つまたは複数のリガンドの内部部位で提示される場合は、キメラ多リガンド捕捉剤のうちの任意のものが分枝状組成物を有することができる。キメラ捕捉剤は、２つの結合ポケットを含有するタンパク質（たとえば、ＤＮＡ結合のために１つのポケットおよび他のタンパク質と結合するための第２のポケット）などの、多様な化学性質の複数のエピトープを有するタンパク質と効率的に相互作用することができる。
【０１０６】
多リガンド捕捉剤が分枝状捕捉剤である実施形態では、分枝状構造は、捕捉剤を構成する１つまたは複数のリガンドの内部部位で、リガンドの化学性質に依存せずに官能基を提示することによって得ることができる。多リガンド捕捉剤が直鎖状捕捉剤である実施形態では、その代わりに官能基をリガンドの末端のうちの一方で提示することができる。
【０１０７】
リガンドがアジドとアセチレンの間の生体直交型の１，３−双極ヒュスゲン付加環化反応で連結されている実施形態では、大きなライブラリ（図７に例示するものなど）を、標的との特異的相互作用についてスクリーニングする。最良結合リガンドをアセチレン官能基で修飾し、「アンカーリガンド」とする。第２のスクリーニングでは、アセチレンで修飾したアンカーリガンドを、アジド官能基を付随させた二次リガンドの包括的なビーズライブラリの存在下でインキュベーションする。このスクリーニングの結果は、標的と接触する２つのリガンド間の共有的１，２，３−トリアゾール結合によって形成される「二重リガンド」である。この二重リガンドが（アセチレン修飾して）新しいアンカーリガンドとして役割を果たすことができ、同じビーズライブラリを用いて三重リガンド捕捉剤の三次リガンドを同定し、以降も同様である。逆に、アンカーリガンドがアジド官能基を含有する場合は、二次、三次などのリガンド候補はアセチレン官能基を含有することができる。本明細書中で使用する用語「アンカーリガンド」とは、第２のリガンドをカップリングさせるリガンドをいう。一般に、開示した方法のコンテキストでは、第２のリガンドは、標的に触媒される反応においてアンカーリガンドと共有結合する。
【０１０８】
リガンドが改変シュタウディンガーライゲーションで連結されている実施形態では、多リガンド捕捉剤を合成するためのライブラリは、図７に例示するものに類似の手法に従って構築することができるが、例外として、１°および２°スクリーニングのアンカーリガンドは、アセチレン基ではなくトリアリールホスフィンで官能化する。
【０１０９】
リガンドがアミド化反応で連結されている実施形態では、多リガンド捕捉剤を合成するためのライブラリは、図７に例示するものに類似の手法に従って構築することができるが、例外として、１°および２°スクリーニングのアンカーリガンドはアセチレン基ではなくチオ酸で官能化し、ビーズライブラリはスルホニルアジド官能基で修飾する。代替的に、極性を逆転させ、アンカーリガンドをスルホニルアジド官能基に付着させ、ビーズライブラリをチオ酸に付着させることができる。
【０１１０】
リガンドが還元性アミノ化によって連結されている実施形態では、多リガンド捕捉剤を合成するためのライブラリは、図７に例示するものに類似の手法に従って構築することができるが、例外として、１°および２°スクリーニングのアンカーリガンドはアセチレン基ではなくアルデヒドで官能化し、ビーズライブラリはアミン官能基で修飾する（たとえばペプチドリガンドのＮ末端）。代替的に、極性を逆転させ、アンカーリガンドをアミン官能基に付着させ、ビーズライブラリをアルデヒドに付着させることができる。
【０１１１】
一部の実施形態では、標的に対する多リガンド捕捉剤の２つ以上のリガンドは、対応する結合部位で標的と特異的に結合することができる候補リガンドを選択することを含むことができる本明細書中に記載の方法を用いて、多リガンドで提供することができ、結合部位は、それぞれの部位上に結合しているそれぞれのリガンド間の互いの共有結合が可能となるように標的上に配置されている。いくつかの実施形態では、候補リガンドのうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの他の候補リガンドに非関連および／または標的に非関連である。本明細書中で使用する用語「対応する結合部位」とは、別の分子上の分子結合部位をいう。したがって、所定のリガンドが結合する標的上の部位は、リガンドの対応する結合部位であると言うことができる。
【０１１２】
特に、一部の実施形態では、候補リガンドは第１の複数の候補リガンドおよび第２の複数の候補リガンドを含み、そのそれぞれには、複数の候補リガンドのうちの少なくとも１つの他のリガンドに非関連および／または標的に非関連である少なくとも１つのリガンドが、場合によっては含まれる。これらの実施形態では、リガンドの選択は、標的を第１の複数の候補リガンドと接触させて、標的と特異的に結合し、かつ標的によって触媒される反応において対応する第２の官能基と特異的に結合することができる第１の官能基を提示するアンカーリガンドを選択することによって行なうことができる。その後、そのようにして提供されたアンカーリガンドを標的と接触させてアンカーリガンド標的複合体を提供し、その後、これを第２の複数の候補リガンドと接触させて第２の官能基を提示する。その後、アンカーリガンド標的複合体と特異的に結合し、アンカーリガンドと共有結合し、したがって多リガンドを提供する、第２の複数の候補リガンドの候補リガンドを選択する。追加のリガンドを多リガンドに付加するためのアンカーリガンドとして多リガンドを使用して、候補リガンドの選択を任意選択で繰り返すことができる。
【０１１３】
特に、一部の実施形態では、アンカーリガンドの選択は、標的と特異的に結合する候補リガンドを選択することと、標的によって触媒される反応において対応する第２の官能基と特異的に結合することができる第１の官能基を導入する選択した候補リガンドを修飾し、したがって第１の官能基を提示するアンカーリガンドを提供することとによって行なうことができる。
【０１１４】
一部の実施形態では、多リガンドをアンカーとして用いて候補リガンドの選択を２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、６回以上、または７回以上繰り返して、追加のリガンドを多リガンドに付加する。
【０１１５】
一部の実施形態では、標的に対する高次多リガンド捕捉剤の結合親和性が、アンカーリガンドの結合親和性よりも少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、少なくとも１０１２、または少なくとも１０１３高くなるまで、多リガンドをアンカーとして用いて候補リガンドの選択を繰り返す。本明細書中で使用する、高次多リガンド捕捉剤とは、３個以上のリガンドを有する多リガンド捕捉剤をいう。多リガンド捕捉剤を同定および生成する開示した方法の一部の実施形態では、第３、第４、第５、第６、第７などのリガンドを二重リガンド捕捉剤に付加することができる。これは、たとえば、多リガンド捕捉剤をアンカーリガンドとして用いた標的に触媒される付加ステップを繰り返すことによって達成することができる。生じる多リガンド捕捉剤は高次多リガンド捕捉剤である。２、３、４、５、６、および７個のリガンドを有する多リガンド捕捉剤は、それぞれ二重リガンド、三重リガンド、四重リガンド、五重リガンド、六重リガンド、および七重リガンドと呼ぶことができる。
【０１１６】
一部の実施形態では、多リガンド捕捉剤と標的の結合の解離定数が１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍ以下となるまで候補リガンドの選択を繰り返す。
【０１１７】
一部の実施形態では、第１および第２の複数の候補リガンドは、全体としてまたは部分的に同一または異なる。
【０１１８】
一部の実施形態では、候補リガンドの選択の反復うちの１回または複数回、場合によっては毎回において、同一または異なる複数の候補リガンドを第２の複数の候補リガンドとして使用し、アンカーリガンドの選択は、標的と特異的に結合する候補リガンドを選択することと、第１の官能基を導入するために選択した候補リガンドを修飾することとによって行なう。
【０１１９】
一部の実施形態では、候補リガンドの選択の反復のうちの１回または複数回、場合によっては毎回において、同一または異なる官能基を第１のおよび／または第２の官能基として使用し、アンカーリガンドの選択は、標的と特異的に結合する候補リガンドを選択することと、第１の官能基を導入するために選択した候補リガンドを修飾することとによって行なう。
【０１２０】
２つ以上のリガンドがペプチドまたはポリペプチドによって形成される一部の実施形態では、多リガンド捕捉剤はタンパク質性質の多リガンド捕捉剤を形成することができ、上記方法を用いてタンパク質性質の多リガンド捕捉剤を合成することができる。
【０１２１】
一部の実施形態では、ペプチドリガンド、タンパク質標的およびトリアゾール結合を参照して実施例セクションに例示されている手順を行なうことができる。このプロセスは必要な変更を加えて他のリガンド、標的分子および共有結合で行なうことができることが、当業者には理解されよう。
【０１２２】
この手順によれば、ペプチドアンカーリガンドは、当業者に知られている手順に従って合成したペプチドを用いて調製できる第１の大きなペプチドライブラリを用いて同定することができる。特に、スクリーニング方法を用いて、ペプチドアンカーリガンドを、第１のライブラリのペプチドから、目的タンパク質に対する事前に決定した親和性を有することについて選択する。特に、ペプチドアンカーリガンドの選択手順には、ペプチドアンカーリガンドの所望の親和性および／または選択性を達成するための配列選択が含まれることができる。
【０１２３】
その後、第１のライブラリと同じ（または異なるものでもよい）種類のアミノ酸構成単位から調製できる第２の大きなペプチドライブラリを用いることによって、二次リガンド同定することができる。ペプチドアンカーリガンドが１つまたは複数のアジドで官能化されたアミノ酸を有する場合は、第２のライブラリからのペプチドは、少なくとも１つまたは複数のアセチレンで官能化された人工アミノ酸を含有する。同じタンパク質に対する第２のペプチドライブラリを含む第２のスクリーニングを実施するが、ただし、過剰量のペプチドアンカーリガンドの存在下で実施する。正しい配向でタンパク質表面およびペプチドアンカーリガンドと接触させることができる二次リガンドのみが反応して１，２，３−トリアゾール結合を形成する。したがって、タンパク質表面は、アンカーリガンドおよび二次リガンドを互いに対しておよびタンパク質表面に対して正しく配向することによって、このプロセスの触媒を提供する。
【０１２４】
本明細書中に記載の一部の実施形態によるペプチドアンカーリガンドを同定する方法を図１９に模式的に例示する。特に、図１９の図中では、蛍光標識した目的タンパク質（１１）をペプチドのライブラリ（１２）に対してスクリーニングする。
【０１２５】
そのライブラリは、１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）手法を用いてビーズ上に構築することができる（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら、１９９７、Ｆｕｒｋａ，Ａ．ら、１９９１、Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．およびＴ．Ｊ．Ｍａｓｏｎ、１９９３）。このようにして、それぞれのビーズは固有のペプチド（１３）を含有し、そのペプチドは、天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸（Ｄ−立体異性体）、または人工アミノ酸（アジドもしくはアセチレン官能基を含有することができる）であるアミノ酸からなる。
【０１２６】
ライブラリ自体は標準のカップリング化学を用いてアセンブルする（Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｌ．Ａ．ら、１９９４）。タンパク質（１１）およびライブラリ（１２）を一定時間、特定のタンパク質濃度でインキュベーションし、「ヒット」したビーズ（１４）をその蛍光によって同定する。典型的には、ビーズのうちの０．１％以下がヒットしたビーズとして同定され、ヒットしなかったビーズ（１５）から分離する。標準の化学を用いてタンパク質をビーズから除去し、エドマン分解（Ｌａｕｒｓｅｎ，Ｒ．Ａ．、１９７１）または質量分析（Ｗａｎｇ，Ｘ．ら、２００５、Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．Ｋ．ら、２０００）などの方法を用いてビーズ上のペプチドを配列決定する。
【０１２７】
ペプチド配列（１６）が同定された後、アミノ酸頻度対アミノ酸同一性を相関させるヒストグラム（１７）を調製する。その後、最も共通して同定されたアミノ酸を使用する第２のより集中したライブラリ（１８）を調製し、タンパク質（１１）に対して再度スクリーニングし、ヒットしたビーズをそのペプチド配列（１６）によって再度同定することができる。この第２のライブラリはわずかに長いペプチドを含有する場合があり、スクリーニングプロセスはより低濃度のタンパク質（１１）を含む場合がある。所望の親和性の１つまたは複数のペプチドアンカーリガンド（１９）が達成されるまでこのプロセスを繰り返すことができる。その後、これらのペプチドを、二重リガンド捕捉剤を同定するスクリーニングプロセスの第２の段階のためにバルク量で調製する。それぞれ利点および不利点を有する、アンカーリガンドを同定する他の方法を使用することができる。たとえば、ファージディスプレイ方法を用いてペプチドを同定することができ（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．およびＶ．Ａ．Ｐｅｔｒｅｎｋｏ、１９９７）、その後、そのペプチドをアジドまたはアセチレン含有人工アミノ酸で修飾して、集中したライブラリを生成することができ、その後、これを目的タンパク質に対してスクリーニングする。他の手法を同等に適用可能である。ペプチドアンカーリガンドの親和性は、他の要因の中でとりわけ、ペプチド中のアミノ酸の数、およびそれに対してスクリーニングするタンパク質に依存する。いくつかの実施形態では、６または７量体ペプチドなどの捕捉剤では、１０−４〜１０−６Ｍの桁の親和性が典型的には達成可能であり、これは、当分野の特定の捕捉剤と少なくとも見合っている。
【０１２８】
その後、二次リガンドの同定および二重リガンド捕捉剤の形成を、本明細書中に記載の一部の実施形態による手法を例示する図２０に模式的に例示する方法に従って行なうことができる。上述のスクリーニング手順からのペプチドアンカーリガンド（１９）のうちの１つを、目的タンパク質（１１）をペプチドアンカー分子の結合親和性に依存する濃度で含有する溶液に加える。典型的には、１０−６Ｍの結合親和性には、数〜１０マイクロモーラーの濃度が十分である。
【０１２９】
その後、ペプチドアンカーリガンド／タンパク質の溶液を候補二次リガンド（２１）のライブラリに対してスクリーニングする。このライブラリは、ペプチドアンカーリガンド（１２）の候補ライブラリと同様に構築されているが、例外として、アジドで官能化されたペプチドアンカーリガンドの事例では人工アミノ酸構成成分（２２）の一部がアセチレン官能基を含有する。逆に、ペプチドアンカーリガンドがアセチレンで官能化されたアミノ酸構成成分を含有する場合は、二次リガンド候補はアジドで官能化されたアミノ酸構成成分を含有する。以前に記載したスクリーニングと同様に、ヒットしたビーズ（２３）をその蛍光によって同定し、ヒットしなかったビーズ（１５）から分離する。ヒットしたビーズは、ビーズと結合したペプチドとペプチドアンカーリガンドとのタンパク質に触媒されるカップリングによって形成される二重リガンド捕捉剤を特定の量で含有することができるが、ヒットしたビーズ（２３）上のペプチドの大多数は反応しなかった二次リガンドである可能性が高い。標準の化学手順を用いてタンパク質および任意の反応しなかったペプチドアンカーリガンドをビーズから除去し、標準の方法を用いてビーズ上のペプチド（２４）を配列決定し、アミノ酸頻度対アミノ酸同一性を相関させるヒストグラム（２５）を調製する。その後、最も共通して同定されたアミノ酸を使用する第２のより集中したライブラリ（２６）を調製し、タンパク質（１１）に対して再度スクリーニングし、ヒットしたビーズをそのペプチド配列（２４）によって再度同定する。この二次リガンドの第２のライブラリはわずかに長いペプチドを含有する場合があり、スクリーニングプロセスはより低濃度のタンパク質（１１）を含む場合がある。
【０１３０】
二次リガンドのスクリーニングから二重リガンドが形成されたかどうかを決定することは、いくつかの方法に従って行なうことができる。１つの可能性のある方法は、二次リガンドペプチド配列に由来する情報の検出に基づく。配列相同性、特にペプチド内の人工アミノ酸の同定および位置に関する配列相同性が手掛かりを提供する場合がある。別の可能性のある方法は、二次リガンドのバルク合成、続いてペプチドアンカーリガンドおよびタンパク質と合わせたｉｎ  ｓｉｔｕクリック実験に基づく。さらに、図１９に記載したものと類似であるが、二重リガンド全体をビーズ上で合成するさらなるスクリーニングを、場合によっては一部の配列変動、対照の追加などを伴って行なうことができる。最後に、同定した候補二重リガンド捕捉剤（２７）をバルク量で合成することができ、タンパク質に対するその測定した結合親和性をペプチドアンカーリガンド（１９）に対して比較する。１０〜１００（すなわち、１０−６Ｍ〜１０−７Ｍまたは１０−８Ｍ以下の親和性の増加）以上の結合親和性の増加を、二重リガンド捕捉剤対ペプチドアンカーリガンドについて得ることができる。
【０１３１】
所望の親和性および／または選択性が達成されない場合、および／または実験設計に従ってより長い捕捉剤が所望される場合、二重リガンド自体をアンカーリガンドとして利用することができ、必要に応じて図２０に記載のプロセスを繰り返して三重リガンドを調製することができる。
【０１３２】
三重リガンドを提供する方法の模式図を示す図７を参照されたい。一次（１°）スクリーニングでは、包括的なＯＢＯＣライブラリを標識した標的と共にインキュベーションする。実施例３〜５、７、および１１に詳述するように、ヒットは標識の直接または間接検出のどちらかによって同定する。１°スクリーニングからのヒットを第１の官能基で修飾し、その後、標識した標的および第２の官能基で修飾した二次（２°）リガンドからなる第２のＯＢＯＣライブラリに対するスクリーニングにおいてアンカーリガンドとして用いる。特定の条件下では、アンカーリガンドおよび二次リガンドは、互いに共有結合した標的および官能基と同時に結合する。実施例７に詳述するように、生じる捕捉剤は二重リガンドである。三次（３°）スクリーニングでは、プロセスを繰り返すが、ここでは２°スクリーニング（図１２を参照）からの二重リガンドを新しいアンカー単位として用い、三重リガンド捕捉剤の迅速な同定が可能となる（実施例１１も参照）。
【０１３３】
追加のリガンドは、選択された一次リガンドを選択された二次リガンドと共有結合させることによって得られたｎ重リガンドを使用し、その後、さらなるｎ次リガンドを選択するためにこの構築体をアンカーリガンドとして用いることによって、付加することができる。３個のリガンドからなる三重リガンド捕捉剤を同定した例示的な事例を実施例１１に示す。この三重リガンドを１つの官能基でさらに修飾し、第２の官能基で修飾した四次（４°）リガンドからなるＯＢＯＣライブラリに対してスクリーニングできることに注意されたい。（ｎ−１）重捕捉剤を１つの官能基で修飾し、この構築体を第２の官能基で修飾したｎ重リガンドからなるＯＢＯＣライブラリに対してスクリーニングするプロセスは、所望の物理的、化学的、および／または生物学的特性が達成されるだけの回数まで繰り返すことができる。たとえば、１０個までのリガンド、特に７個までのリガンドまたは２〜５個のリガンドを付加することができるが、これは限定することを意図しない。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、多リガンド捕捉剤を構成するリガンドの数が増加するにつれて、目的の標的分子に対するその捕捉剤の親和性が劇的に増加する。これらの実施形態の一部では、この効果は、タンパク質に対して１０−６Ｍの親和性を示す２つのリガンドが、二重リガンドとして形成される場合に１０−１２Ｍの親和性を示すことができるという程度まで、非常に大きい。特に、ｎ重リガンドの親和性は、個々のリガンド構成成分の親和性の積ほどに高い場合がある。いくつかの実施形態では、追加のリガンドあたり１０２〜１０３の親和性の積の増加が達成される（実施例１０、１４、および１７を参照）。
【０１３５】
一部の実施形態では、多リガンド捕捉剤を構成するリガンドの数が増加するにつれて、目的タンパク質に対するその捕捉剤の選択性も増加する。限定することを意図せず、指導目的としてのみ本明細書中に提供する可能性のある説明は、捕捉剤を構成するリガンドがタンパク質表面のより大きな領域をサンプリングしており、タンパク質表面がタンパク質の固有のフィンガープリントであることである。多リガンド捕捉剤中に含まれるリガンドの数が増加するにつれて、そのようなリガンドと標的の間の接触の数が一般に増加する。これらの接触には、ファンデルワールス、水素結合、静電気、および疎水性相互作用が含まれる場合がある。特異的接触の数の増加は、一般に、標的に対する捕捉剤の選択性の増加を促進する。
【０１３６】
ペプチドの二次リガンド内の非末端アミノ酸から分枝するように多リガンド捕捉剤のリガンドのうちの任意のものが別のものと連結している一部の実施形態では、分枝状多リガンド捕捉剤を生成することができる。分枝状三重リガンド捕捉剤を提供する方法の模式図を示す図８を参照されたい。分枝状二重リガンドを選択する方法（図８の２°スクリーニングによる）は図７とほぼ同一である。図８に示すように、図７によって同定し、第１の官能基を提示する同じアンカーリガンドを、標識した標的および第２の官能基で修飾した二次（２°）リガンドからなる第２のＯＢＯＣライブラリに対するスクリーニングにおけるアンカーリガンドとして使用するが、この第２の官能基を提示する人工アミノ酸は、二次（２°）リガンドのライブラリの非末端位置に位置することに注意されたい。特定の条件下では、アンカーリガンドおよび二次リガンドは、互いに共有結合した標的および官能基と同時に結合する。
【０１３７】
実施例１７および図１６Ａに詳述するように、生じる捕捉剤は分枝状二重リガンドである。三次（３°）スクリーニングでは、プロセスを繰り返すが、ここでは２°スクリーニングからの分枝状二重リガンドを新しいアンカー単位として用い、三重リガンド捕捉剤の迅速な同定が可能となる（図１８を参照）。この図８の３°スクリーニングでは、三次（３°）リガンドのＯＢＯＣライブラリは、官能基を末端位置で提示して単一の分枝点を有する三重リガンド捕捉剤をもたらすか（図１８を参照）、または非末端位置で提示して２つの分枝点を有する三重リガンド捕捉剤をもたらすことができる。ｎ個のリガンドの多リガンドおよびｎ個の分枝点が得られるまでこのプロセスを繰り返すことができる。この多リガンド捕捉剤のクラスは、比較的低い分子量を維持する一方で、折り畳まれた免疫グロブリン（抗体）内の可変領域の効果に匹敵する場合がある。図１７Ｂ（１つの分枝点）および図１７Ｃ（２つの分枝点）は、分枝状三重リガンド捕捉剤の代表的な構造を示す。分枝状多リガンド中の分枝点は、直鎖状多リガンドと比較しておよび分枝状捕捉剤のクラス内で異なるコンホメーション動力学を与えることができる。一部の実施形態では、分枝状多リガンド構造中の結合の制限された回転は、同様に開発したが直鎖状である多リガンド捕捉剤と比較して結合力を増加させることができる。
【０１３８】
大きなペプチドライブラリを合成およびスクリーニングするための代替手法は、本開示を読んだ際に当業者が同定することができる。特に、ＯＢＯＣ手法以外のさらなる手法は、ペプチドマイクロアレイを使用することによって提供することができる（Ｒ．Ｃ．Ｐａｎｉｃｋｅｒら、コンビナトリアル化学および高スループットスクリーニング（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）（２００４）、第７巻、５４７−５５６を参照）。特に、一部の実施形態では、非共有的吸着（「スポッティング」）または共有的固定によってペプチドをガラス基質上に付着させることができる。非共有的吸着方法では、ペプチドを静電気的相互作用によって表面に接着させ、ランダムに配向させる。共有的固定方法では、ペプチドおよび基質を化学結合によって一緒にし、この付着は、典型的には部位特異的な様式で達成される（たとえば、マレイミドで官能化された基質とチオール化ペプチドとの間のマイケル付加）。ペプチドマイクロアレイは、スライドガラス上の空間的なエンコードの内因性の利点を唯一持っており、個々のペプチドまたはペプチド組成物はその位置によって同定される。ペプチドライブラリを慣用の固相ペプチド合成によって作製し、その後、アレイに固定することができる（非共有的または共有的に）。しかし、これらの実施形態では、ペプチドのライブラリを最初に作製し（たとえばビーズ上で）、構成成分を精製した後にアレイを作製する。また、ペプチドを基質自体の上でｉｎ  ｓｉｔｕ方法によって合成することもできる（フォトリソグラフィーなど、Ｓ．Ｌｉら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２００５）、５８１−５８３およびＳ．Ｌｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００４）、第１２６巻、４０８８−４０８９を参照）。
【０１３９】
一部の実施形態では、多リガンド捕捉剤の組成は、その親和性および選択性は折り畳まれた構造に依存しないため、標的の結合能力が変性によって影響を受けないものである。１つの例示的な事例は、３つのリガンドからなる構造化されていない直鎖状捕捉剤である図１５の多リガンド捕捉剤であり、ドットブロット（実施例１６）、ネイティブウエスタンブロット（実施例２０）、およびＥＬＩＳＡ様アッセイ（実施例２１）において有効であることが示された。特に、いくつかの実施形態では、多リガンド捕捉剤は、短い長さのリガンドならびに非天然および人工単量体からなり、これは典型的には高い度合の折り畳まれた三次構造をとらない。これらの実施形態は、配列が約３０倍長く、天然単量体からなり、高い度合の折り畳まれた三次構造（変性に対して潜在的に不安定な場合があるジスルフィド結合が含まれる）を促進する、抗体などの当分野の特定の捕捉剤とは異なる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、所望の特性は、リガンド選択プロセスの前、その間またはその後に捕捉剤内に構築することができる。例示的な特性は、水溶性、または多リガンド捕捉剤を特異的な所望の配向で表面に付着させる能力、および当業者によって同定可能なさらなる特性を含む。一部の実施形態では、所望の特性に関連する特定の反応に活用することができる官能基などの関連する所望の特長を導入することによって、所望の特性を多リガンド捕捉剤上に導入することができる。
【０１４１】
たとえば、多リガンド捕捉剤のリガンド選択の前、その間またはその後に、単パラメータまたは複数パラメータのアッセイにおいて多リガンド捕捉剤と基質または表面との特異的な高度に配向された付着を可能にする捕捉剤を、官能基および他の分子タグ内に構築することができる。特に、これらの実施形態の一部では、基質上に提示される第２の官能基と結合することができる官能基を導入することができる。結合パートナーとして使用することができる例示的な官能基には、カルボン酸基およびアミン基、アジドおよびアセチレン、ならびにアルデヒドおよびアミンが含まれる。たとえば、アミノ化表面は、ガラスまたはケイ素をシラン処理剤で処理することによって調製することができ、この表面を、カルボン酸を提示する捕捉剤とさらに共有的カップリングさせることができる（ＭｃＡｌｐｉｎｅ，Ｍ．Ｃ．ら、２００８）。第２の例では、アセチレン（Ｒｏｈｄｅ，Ｒ．Ｄ．ら、２００６）またはアジド（Ｃａｏ，Ｐ．ら、２００８）で修飾したケイ素表面を調製し、銅（Ｉ）触媒性アジド−アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）によって、それぞれアジドまたはアセチレンのどちらかで修飾された捕捉剤と共有的にカップリングさせることができる。また、多リガンド捕捉剤を修飾してそれを表面上への配向に特異的な固定のために調製することには、捕捉剤が、その相補鎖とのハイブリダイゼーションによって核酸アレイ上に固定されることを可能にする、短いポリヌクレオチド配列などの共有タグも含まれる場合がある（たとえば、Ｆａｎ，Ｒ．ら、２００８の方法による）。これらすべての例において、表面の配向に特異的な固定は容易に達成され、これは標的と表面との特異的結合を測定するアッセイ間の均一性を促進する。
【０１４２】
２つ以上のリガンドを同定した後、リガンドの化学性質に依存する当業者によって同定可能な方法を用いて多リガンド捕捉剤を合成することができる。特に、２つ以上のリガンドがペプチドである実施形態では、ペプチドを同定した後、当業者によって同定可能なアミノ酸単量体を重合させる方法を用いてタンパク質多リガンド捕捉剤を合成することができる。
【０１４３】
合成した多リガンド捕捉剤のさらなる修飾を行なうことができる。たとえば、一部の実施形態では、細胞透過ペプチド配列が導入されるように多リガンド捕捉剤を修飾することができ、これにより、捕捉剤がｉｎ  ｖｉｖｏ標的化またはイメージングに特化したものとなる。また、多リガンド捕捉剤を脂質分子で修飾することもでき、これにより、細胞膜との会合が促進され、その後、細胞−細胞の認識のプローブとして使用することができる。
【０１４４】
一部の実施形態では、多リガンド捕捉剤は、修飾したアンカーリガンドを第１の複数の候補リガンドおよび標的と接触させるステップであって、修飾したアンカーリガンドが、標的によって触媒される反応において候補リガンドのうちの１つまたは複数と共有結合しており、それにより１つまたは複数の多リガンド捕捉剤が形成されるステップを含む、多リガンド捕捉剤を作製する方法によって提供することができる。多リガンド捕捉剤のそれぞれは、修飾したアンカーリガンドおよび候補リガンドのうちの１つを含み、アンカーリガンドは標的と結合することができ、修飾したアンカーリガンドは第１の官能基を含み、第１の官能基は対応する第２の官能基と特異的に反応することができ、候補リガンドのそれぞれは第２の官能基を含む。
【０１４５】
この方法は、（ｉ）対応する第４の官能基と特異的に反応することができる第３の官能基を含むように多リガンド捕捉剤のうちの１つを修飾するステップと、（ｉｉ）修飾された多リガンド捕捉剤を第２の複数の候補リガンドおよび標的と接触させるステップであって、修飾された多リガンド捕捉剤が標的によって触媒される反応において候補リガンドのうちの１つまたは複数と共有結合し、それにより１つまたは複数の高次多リガンド捕捉剤が形成されるステップとをさらに含むことができる。高次多リガンド捕捉剤のそれぞれは、修飾された多リガンド捕捉剤および候補リガンドのうちの１つを含むことができ、第２の複数の捕捉リガンド中の候補リガンドのそれぞれは第４の官能基を含むことができる。
【０１４６】
この方法は、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）を１回または複数回繰り返すことをさらに含むことができ、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）のそれぞれの繰り返しについて、ステップ（ｉｉ）の最後の反復で形成される高次多リガンド捕捉剤のうちの１つを、ステップ（ｉ）の次の反復で修飾する多リガンド捕捉剤として使用する。ステップ（ｉ）および（ｉｉ）を２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、６回以上、または７回以上繰り返すことができる。標的に対する高次多リガンド捕捉剤の結合親和性がアンカーリガンドの結合親和性よりも少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、少なくとも１０１２、または少なくとも１０１３高くなるまで、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すことができる。標的に対する多リガンド捕捉剤の結合親和性が、多リガンドと標的との結合の解離定数が１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍ以下となるまで、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すことができる。
【０１４７】
第２の複数の候補リガンドは、第１の複数の候補リガンドと同一であることができる。第２の複数の候補リガンドは、第１の複数の候補リガンドとは異なることができる。第２の複数の候補リガンド中の候補リガンドの一部は、第１の複数の候補リガンド中の候補リガンドの一部と同一であることができる。第２の複数の候補リガンド中の候補リガンドの一部は、第１の複数の候補リガンド中の候補リガンドの一部とは異なることができる。第２の複数の候補リガンド中の候補リガンドの一部は、第１の複数の候補リガンド中の候補リガンドの一部と同一であることができ、第２の複数の候補リガンド中の候補リガンドの一部は、第１の複数の候補リガンド中の候補リガンドの一部とは異なることができる。
【０１４８】
異なる複数の候補リガンドを、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）の反復のうちの１つまたは複数において第２の複数の候補リガンドとして使用することができる。異なる複数の候補リガンドを、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）のすべての反復において第２の複数の候補リガンドとして使用することができる。同じ複数の候補リガンドを、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）の反復のうちの１つまたは複数において第２の複数の候補リガンドとして使用することができる。同じ複数の候補リガンドを、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）のすべての反復において第２の複数の候補リガンドとして使用することができる。複数の異なる複数の候補リガンドを、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）の反復において第２の複数の候補リガンドとして使用することができる。
【０１４９】
第３の官能基は、第１の官能基と同一であることができる。第４の官能基は、第２の官能基と同一であることができる。第３の官能基は、第２の官能基と同一であることができる。第４の官能基は、第１の官能基と同一であることができる。第３の官能基は、第１の官能基とは異なることができる。第３の官能基は、第２の官能基とは異なることができる。第４の官能基は、第１の官能基とは異なることができる。第４の官能基は、第２の官能基とは異なることができる。
【０１５０】
この方法の一部の形態では、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）のそれぞれの繰り返しについて、同一の第３の官能基を使用することができる。この方法の一部の形態では、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）のそれぞれの繰り返しについて、同一の第４の官能基を使用することができる。この方法の一部の形態では、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）のそれぞれの繰り返しについて、異なる第３の官能基を使用することができる。この方法の一部の形態では、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）の一部の繰り返しについて、異なる第４の官能基を使用することができる。この方法の一部の形態では、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）の一部の繰り返しについて、同一の第３の官能基を使用することができる。この方法の一部の形態では、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）の一部の繰り返しについて、同一の第４の官能基を使用することができる。この方法の一部の形態では、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）の一部の繰り返しについて、異なる第４の官能基を使用することができる。
【０１５１】
本方法は、修飾したアンカーリガンドを第１の複数の候補リガンドおよび標的と接触させるステップの前に、標的を第３の複数の候補リガンドと接触させ、標的と結合する候補リガンドを同定し、同定される候補リガンドのうちの１つをアンカーリガンドとして使用することをさらに含むことができる。
【０１５２】
本方法は、修飾したアンカーリガンドを第１の複数の候補リガンドおよび標的と接触させるステップの前に、修飾したアンカーリガンドを調製することをさらに含むことができる。
【０１５３】
修飾したアンカーリガンドは、第１の官能基を含むアンカーリガンドの形態を合成することによって調製することができる。修飾したアンカーリガンドは、部分的に合成したアンカーリガンドの合成を完了することによって調製することができ、第１の官能基は、合成の完了中にアンカーリガンドに付加する。修飾したアンカーリガンドは、第１の官能基をアンカーリガンドに付加することによって調製することができる。高次多リガンド捕捉剤は本方法によって作製した多リガンド捕捉剤であることができる。ステップ（ｉｉ）の最後の反復で形成される高次多リガンド捕捉剤は、本方法によって作製した多リガンド捕捉剤であることができる。修飾したアンカーリガンドは、第１の官能基および第２の官能基の間の反応によって候補リガンドのうちの１つまたは複数と共有結合させることができる。多リガンド捕捉剤は標的と結合することができる。
【０１５４】
この方法の一部の形態では、接触前にはどの候補リガンドが標的と結合できるかは知られていない。
【０１５５】
複数の候補リガンドは化合物のコンビナトリアルライブラリを含むことができる。化合物のコンビナトリアルライブラリは、鎖中で連結されたサブユニットの群の順列を含む化合物を含むことができる。鎖は、直鎖状、分枝状、環状、または組合せであることができる。サブユニットの群は、アミノ酸、修飾アミノ酸、または組合せを含むことができる。サブユニットの群は、１つまたは複数の有機小分子をさらに含むことができる。サブユニットの群中のアミノ酸は、アミノ酸の部分組から本質的になることができる。サブユニットの群中の修飾アミノ酸は、修飾アミノ酸の部分組から本質的になることができる。サブユニットの群は、アミノ酸から本質的になることができる。サブユニットの群は、アミノ酸の部分組から本質的になることができる。
【０１５６】
参照分子と比較した多リガンド捕捉剤の結合特異性は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、または少なくとも１００であることができる。多リガンド捕捉剤と参照分子との結合は、参照アッセイで検出不可能な場合がある。参照分子は標的に関連する分子であることができる。参照分子は標的であることができる。参照標的は標的の対立型であることができる。参照標的は標的の相同体であることができる。参照分子は参照試料であることができる。参照試料は、標的を検出する試料と同じ種類の標的を欠く試料であることができる。参照試料は、標的を検出する試料と同じ供給源の標的を欠く試料であることができる。
【０１５７】
標的に対する多リガンド捕捉剤の結合親和性は、アンカーリガンドの結合親和性よりも少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、少なくとも１０１２、または少なくとも１０１３高い場合がある。多リガンド捕捉剤と標的の結合の解離定数は、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍ以下であることができる。
【０１５８】
一部の形態では、修飾したアンカーリガンドは標的の天然基質ではない。一部の形態では、修飾したアンカーリガンドは標的の基質ではない。一部の形態では、第１の複数の候補リガンドは標的の天然基質を含まない。一部の形態では、第１の複数の候補リガンドは標的の基質を含まない。一部の形態では、第１の複数の候補リガンドは、標的と結合することが知られている化合物をモデルとしている化合物を含まない。一部の形態では、第１の複数の候補リガンドは、標的と結合することが知られている化合物に由来する化合物を含まない。一部の形態では、第１の複数の候補リガンドは、標的と結合することが知られている化合物をどれも含まない。一部の形態では、第１の複数の候補リガンドは、標的と結合すると同定された化合物をどれも含まない。一部の形態では、第１の複数の候補リガンドは、修飾したアンカーリガンド、第１の複数の候補リガンド、および標的を接触させるステップの前に、標的と結合することが知られている化合物をモデルとしている化合物を含まない。一部の形態では、第１の複数の候補リガンドは、修飾したアンカーリガンド、第１の複数の候補リガンド、および標的を接触させるステップの前に、標的と結合することが知られている化合物に由来する化合物を含まない。一部の形態では、第１の複数の候補リガンドは、修飾したアンカーリガンド、第１の複数の候補リガンド、および標的を接触させるステップの前に、標的と結合することが知られている化合物をどれも含まない。一部の形態では、第１の複数の候補リガンドは、修飾したアンカーリガンド、第１の複数の候補リガンド、および標的を接触させるステップの前に、標的と結合６ると同定された化合物をどれも含まない。
【０１５９】
また、開示した方法のうちの任意のものによって作製した多リガンド捕捉剤も記載する。また、開示した方法のうちの任意のものによって作製した多リガンド捕捉剤の修飾型を含む多リガンド捕捉剤も記載する。多リガンド捕捉剤の１つまたは複数の官能基部分を修飾することができる。多リガンド捕捉剤の官能基部分は、官能基部分をリンカーで置き換えることによって修飾することができる。多リガンド捕捉剤の官能基部分は、官能基部分をサブユニットで置き換えることによって修飾することができる。サブユニットは、アミノ酸または修飾アミノ酸を含むことができる。サブユニットは、有機小分子を含むことができる。多リガンド捕捉剤は、鎖中で連結された２つ以上のサブユニットを含むことができ、サブユニットのうちの１つまたは複数は修飾されている。サブユニットは、サブユニットを異なるサブユニットで置き換えることによって修飾することができる。サブユニットは、アミノ酸または修飾アミノ酸を含むことができる。サブユニットは、有機小分子を含むことができる。
【０１６０】
また、第１のリガンドおよび第２のリガンドを含む多リガンド捕捉剤も開示されており、第１のリガンドおよび第２のリガンドは共有結合しており、第１のリガンドは単離されている場合に標的と結合することができ、第２のリガンドは単離されている場合に標的と結合することができ、第１のリガンドおよび第２のリガンドは、標的とのその結合において結合的に識別可能であり、多リガンド捕捉剤は標的と特異的に結合することができ、多リガンド捕捉剤が標的と結合する場合は第１のリガンドおよび第２のリガンドはどちらも標的と接触する。一部の形態では、第１のリガンドおよび第２のリガンドは天然で共有結合していない。一部の形態では、第１のリガンドおよび第２のリガンドは同じ天然分子の一部分ではない。一部の形態では、第１のリガンドおよび第２のリガンドは標的の同じ基質の一部分ではない。一部の形態では、第１のリガンドは、標的と結合することが知られている化合物をモデルとしていない。一部の形態では、第１のリガンドは、標的と結合することが知られている化合物に由来しない。一部の形態では、第２のリガンドは、標的と結合することが知られている化合物をモデルとしていない。一部の形態では、第２のリガンドは、標的と結合することが知られている化合物に由来しない。
【０１６１】
一部の形態では、第２のリガンドは、修飾したアンカーリガンドを複数の候補リガンドおよび標的と接触させることによって同定することができ、修飾したアンカーリガンドは、標的によって触媒される反応において候補リガンドのうちの１つと共有結合し、第２のリガンドは、修飾したアンカーリガンドと共有結合した候補リガンドであり、修飾したアンカーリガンドは第１の官能基を含んでおり、第１の官能基は対応する第２の官能基と特異的に反応することができ、候補リガンドのそれぞれは第２の官能基を含んでいた。アンカーリガンドは第１のリガンドを含んでいた可能性がある。
【０１６２】
多リガンド捕捉剤は第３のリガンドを含むことができ、第３のリガンドは第１および第２のリガンドと共有結合しており、多リガンド捕捉剤が標的と結合する場合は第３のリガンドは標的と接触する。一部の形態では、単離されている場合に第３のリガンドは標的と結合することができる。第１のリガンドおよび第３のリガンドは、標的とのその結合において結合的に識別可能であることができる。第２のリガンドおよび第３のリガンドは、標的とのその結合において結合的に識別可能であることができる。第３のリガンドは第１のリガンドと直接連結することができる。第３のリガンドは第２のリガンドと直接連結することができる。第３のリガンドは、第１のリガンドを介して第２のリガンドと連結することができる。第３のリガンドは、第２のリガンドを介して第１のリガンドと連結することができる。一部の形態では、第１のリガンドおよび第３のリガンドは天然で共有結合していない。一部の形態では、第１のリガンドおよび第３のリガンドは同じ天然分子の一部分ではない。一部の形態では、第１のリガンドおよび第３のリガンドは標的の同じ基質の一部分ではない。一部の形態では、第２のリガンドおよび第３のリガンドは天然で共有結合していない。一部の形態では、第２のリガンドおよび第３のリガンドは同じ天然分子の一部分ではない。一部の形態では、第２のリガンドおよび第３のリガンドは標的の同じ基質の一部分ではない。一部の形態では、第３のリガンドは、標的と結合することが知られている化合物をモデルとしていない。一部の形態では、第３のリガンドは、標的と結合することが知られている化合物に由来しない。
【０１６３】
第３のリガンドは、修飾したアンカーリガンドを複数の候補リガンドおよび標的と接触させることによって同定することができ、修飾したアンカーリガンドは、標的によって触媒される反応において候補リガンドのうちの１つと共有結合し、第３のリガンドは、修飾したアンカーリガンドと共有結合した候補リガンドであり、修飾したアンカーリガンドは第１の官能基を含んでおり、第１の官能基は対応する第２の官能基と特異的に反応することができ、候補リガンドのそれぞれは第２の官能基を含んでいた。アンカーリガンドは第１のリガンドを含んでいた可能性がある。アンカーリガンドは第２のリガンドを含んでいた可能性がある。
【０１６４】
多リガンド捕捉剤は第４のリガンドを含むことができ、第４のリガンドは第１、第２、および第３のリガンドと共有結合しており、多リガンド捕捉剤が標的と結合する場合は第４のリガンドは標的と接触する。一部の形態では、単離されている場合に第４のリガンドは標的と結合することができる。第１のリガンドおよび第４のリガンドは、標的とのその結合において結合的に識別可能であることができる。第２のリガンドおよび第４のリガンドは、標的とのその結合において結合的に識別可能であることができる。第３のリガンドおよび第４のリガンドは、標的とのその結合において結合的に識別可能であることができる。第４のリガンドは第１のリガンドと直接連結することができる。第４のリガンドは第２のリガンドと直接連結することができる。第４のリガンドは第３のリガンドと直接連結することができる。第４のリガンドは、第１のリガンドを介して第２のリガンドと連結することができる。第４のリガンドは、第３のリガンドを介して第２のリガンドと連結することができる。第４のリガンドは、第２のリガンドを介して第１のリガンドと連結することができる。第４のリガンドは、第３のリガンドを介して第１のリガンドと連結することができる。第４のリガンドは、第１のリガンドを介して第３のリガンドと連結することができる。第４のリガンドは、第２のリガンドを介して第３のリガンドと連結することができる。一部の形態では、第１のリガンドおよび第４のリガンドは天然で共有結合していない。一部の形態では、第１のリガンドおよび第４のリガンドは同じ天然分子の一部分ではない。一部の形態では、第１のリガンドおよび第４のリガンドは標的の同じ基質の一部分ではない。一部の形態では、第２のリガンドおよび第４のリガンドは天然で共有結合していない。一部の形態では、第２のリガンドおよび第４のリガンドは同じ天然分子の一部分ではない。一部の形態では、第２のリガンドおよび第４のリガンドは標的の同じ基質の一部分ではない。一部の形態では、第３のリガンドおよび第４のリガンドは天然で共有結合していない。一部の形態では、第３のリガンドおよび第４のリガンドは同じ天然分子の一部分ではない。一部の形態では、第３のリガンドおよび第４のリガンドは標的の同じ基質の一部分ではない。一部の形態では、第４のリガンドは、標的と結合することが知られている化合物をモデルとしていない。一部の形態では、第４のリガンドは、標的と結合することが知られている化合物に由来しない。
【０１６５】
第４のリガンドは、修飾したアンカーリガンドを複数の候補リガンドおよび標的と接触させることによって同定することができ、修飾したアンカーリガンドは、標的によって触媒される反応において候補リガンドのうちの１つと共有結合し、第４のリガンドは、修飾したアンカーリガンドと共有結合した候補リガンドであり、修飾したアンカーリガンドは第１の官能基を含んでおり、第１の官能基は対応する第２の官能基と特異的に反応することができ、候補リガンドのそれぞれは第２の官能基を含んでいた。アンカーリガンドは第１のリガンドを含んでいた可能性がある。アンカーリガンドは第２のリガンドを含んでいた可能性がある。アンカーリガンドは第３のリガンドを含んでいた可能性がある。
【０１６６】
一部の実施形態では、本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤は、適切なビヒクルと一緒に組成物中に含まれる。本明細書中で使用する用語「ビヒクル」とは、組成物中に活性成分として含まれる多リガンド捕捉剤の、通常は溶媒、担体、結合剤または希釈剤として作用する様々な媒体のうちの任意のものを示す。特に、多リガンド捕捉剤が含まれる組成物は、本明細書中に記載の方法または系のうちの１つで使用することができる。
【０１６７】
本明細書中に記載する多リガンド捕捉剤は、試料中の１つまたは複数の標的を検出および／または分離するための方法および系で使用することができる。
【０１６８】
本明細書中で使用する用語「検出する」または「検出」とは、それだけには限定されないが、試料、反応混合物、分子複合体および基質を含めた、限定された空間部分における標的の存在（ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ、ｐｒｅｓｅｎｃｅ）または事実の決定を示す。本明細書中で使用する「検出する」または「検出」は、それだけには限定されないが、他の化合物と相互作用する、特に結合する能力、別の化合物を活性化する能力、および本開示を読んだ際に当業者によって同定可能なさらなる特性を含めた、標的の化学的および／または生物学的特性の決定を含むことができる。検出は定量的または定性的であることができる。検出は、標的またはシグナルの量（ｑｕａｎｔｉｔｙもしくはａｍｏｕｎｔ）の測定をいう、それに関連する、またはそれを含む場合に「定量的」であり（定量化とも呼ぶ）、それだけには限定されないが、標的またはシグナルの量または割合を決定するために設計された任意の分析が含まれる。検出は、定量しない別の標的またはシグナルの相対的存在量に関して標的またはシグナルの品質または種類の同定をいう、それに関する、またはそれを含む場合に「定性的」である。
【０１６９】
本明細書中で使用する用語「分離する」とは、１つの項目と別の項目の間、特に標的と目的でない別の分析物との間を設定、離して保つまたは区別することを示し、複数の目的の標的を分別することが含まれる。本明細書中で使用する用語「分別する」とは、任意の共通特長に基づいて設定された群を設定することを示す。特に、本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤を用いて、標的を分離するおよび／または試料中の複数の標的を分別することができる。
【０１７０】
本明細書中で使用する用語「試料」とは、それだけには限定されないが、生物学的環境由来の流体、検体、培養物、組織、市販の組換えタンパク質、合成化合物またはその一部分を含めた、限定された量のある物を示し、これは、より大量のその物の指標となる。
【０１７１】
特に、本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤は、すべて多重アッセイとして行なうことができる単パラメータアッセイおよび複数パラメータアッセイを含めた、標的を検出するアッセイを行なうための方法および系において使用することができる。
【０１７２】
本明細書中で使用する用語「単パラメータアッセイ」とは、１つの標的の存在、非存在、または量を決定するために行なう分析をいう。用語「複数パラメータアッセイ」とは、複数の標的の存在、非存在、または量を決定するために行なう分析をいう。用語「多重」または「多重」アッセイとは、複数のアッセイ反応、たとえば複数の分析物の同時アッセイを、単一の反応チャンバ内で実施する、および／または単一の分離および検出様式で分析するアッセイをいう。
【０１７３】
本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤を用いて行なうことができる単パラメータアッセイには、それだけには限定されないが、血清中の単一のマーカーを検出するための任意のアッセイ、生体試料中の単一のタンパク質の検出、１つの表面マーカーに従った細胞分取、および、本開示を読んだ際に当業者によって同定可能な、捕捉剤を用いて行なうことができるさらなるアッセイが含まれる。検出に有用な多くの分析物および標的が当業者に知られており、開示した多リガンド捕捉剤および方法を用いて検出および／または捕捉することができる。多くの様々なアッセイ様式を含めた多くのアッセイおよび検出方法が当業者に知られており、開示した多リガンド捕捉剤において使用に適応させることができる。特に、抗体を利用する任意のアッセイまたは検出方法を、開示した多リガンド捕捉剤のうちの１つまたは複数を、アッセイまたは方法中で使用する任意の抗体に加えて、またはそれの代わりとして、使用に適応させることができる。
【０１７４】
本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤を用いて行なうことができる複数パラメータアッセイには、それだけには限定されないが、任意のプロテオミクス分析、組織分析、血清診断学、バイオマーカー、血清プロファイリング、複数パラメータ細胞分取、単一細胞研究、および本開示を読んだ際に当業者によって同定可能なさらなるアッセイが含まれる。
【０１７５】
一部の実施形態では、本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤を有利に用いて診断的アッセイを行なうことができ、検出する標的は、事前に決定した条件に関連する事前に決定したバイオマーカーである。２つの項目に関して本明細書中で使用する表現「関連する」とは、第１の項目の発生が第２の項目の発生によって伴われるような、２つの項目間の関係性を示し、それだけには限定されないが、因果関係および兆候／症状−疾患の関係性が含まれる。例示的なバイオマーカーには、臨床的に情報価値のあるバイオマーカーおよび診断的バイオマーカーが含まれる。
【０１７６】
これらの実施形態は、様々なクラスの生体材料および生体分子を、典型的には異種の組織試料の異なる領域からそれぞれ測定することで定量が困難な不可避なノイズ源が導入される、診断的手法において特に有利である。
【０１７７】
本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤を用いて行なうことができる例示的なアッセイには、それだけには限定されないが、血清診断学、免疫組織化学、細胞分取、単一細胞研究、ドットブロット、ウエスタンブロット、親和性精製および他の分離、ならびに実施例１６、２０、および２１の図２１、図２２、および図２３に例示する酵素結合免疫吸着アッセイが含まれる。
【０１７８】
さらなる実施形態では、本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤を用いて、マイクロフルイディクスに基づいたアッセイを行なうことができる。本明細書中で使用する用語「マイクロフルイディクス」とは、マイクロフルイディクスの特長、たとえば、一般にミクロンまたはサブミクロンのスケールで製作されるチャネルおよび／またはチャンバを有する構成成分または系をいう。たとえば、典型的なチャネルまたはチャンバは、約０．１ミクロン〜約１５００ミクロンの範囲、より典型的には約０．２ミクロン〜約１０００ミクロンの範囲、さらにより典型的には約０．４ミクロン〜約５００ミクロンの範囲の、少なくとも１つの横断寸法を有する。個々のマイクロフルイディクスの特長は、典型的にはたとえば約１０ナノリットル〜約５ミリリットル、より典型的には約１００ナノリットル〜約２ミリリットル、さらにより典型的には約２００ナノリットル〜約５００マイクロリットル、またはさらにより典型的には約５００ナノリットル〜約２００マイクロリットルの、非常に少量の流体を保有する。
【０１７９】
本明細書中に記載の方法および系により、多重複数パラメータの検出、目的バイオマーカーの分別および関連する診断的分析が可能となる。
【０１８０】
本明細書中に開示するように、本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤は、本明細書中に記載のアッセイのうちの任意のものを含めた任意のアッセイを行なうための系の一部として提供することができる。系は、有用なアレイまたはキットの形態で提供することができる。場合によっては「マイクロアレイ」とも呼ばれるアレイには、その領域に関連する特定の分子を保有する、任意の一次元、二次元または三次元のアドレス可能な領域配置が含まれることができる。通常は、特徴的な特長の大きさはマイクロメートルである。
【０１８１】
有用なキットでは、アッセイ行なうための多リガンド捕捉剤および他の試薬が独立してキットに含まれることができる。多リガンド捕捉剤を１つまたは複数の組成物中に含めることができ、それぞれ捕捉剤は適切なビヒクルと共に組成物中に一緒に存在することができる。
【０１８２】
追加の構成成分には、標識した分子、特に、標識したポリヌクレオチド、標識した抗体、標識、マイクロフルイディクスチップ、参照標準、および本開示を読んだ際に当業者によって同定可能な追加の構成成分が含まれることができる。複合体または分子の構成成分として本明細書中で使用する用語「標識」および「標識した分子」とは、それだけには限定されないが、放射性同位元素、フルオロフォア、化学発光色素、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、色素、金属イオン、ナノ粒子、金属ゾル、リガンド（ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはハプテン等）などを含めた、検出が可能な分子をいう。用語「フルオロフォア」とは、検出可能な画像において蛍光を示すことができる物質またはその一部分をいう。その結果、本明細書中で使用する表現「標識シグナル」とは、それだけには限定されないが、放射活性、蛍光、化学発光、酵素反応の結果としての化合物の産生などを含めた、標識の検出を可能にする、標識から放出されるシグナルを示す。
【０１８３】
一部の実施形態では、多リガンド捕捉剤の検出は、標識した抗体を、網羅的ではないが小分子色素、タンパク質発色団、量子ドット、および金ナノ粒子が含まれるフルオロフォアで標識する、蛍光に基づいた読取りによって実施することができる。さらなる技術は本開示を読んだ際に当業者によって同定可能であり、さらに詳述しない。
【０１８４】
特に、キットの構成成分は、本明細書中に記載の方法を行なうために、適切な指示および他の必要な試薬と共に提供することができる。キットは通常、組成物を別々の容器内に含有する。アッセイを実施するための指示、たとえば、紙またはテープもしくはＣＤ−ＲＯＭなどの電子支持体上の書面または音声の指示が通常キット内に含められる。また、使用する特定の方法に応じて、キットは他の梱包試薬および物質（すなわち洗浄バッファーなど）も含有することができる。
【０１８５】
一部の実施形態では、本明細書中に記載の多リガンド捕捉剤は、賦形剤または希釈剤と一緒に薬剤組成物中に含めることができる。特に、一部の実施形態では、本明細書中に記載の少なくとも１つの多リガンド捕捉剤を、１つまたは複数の適合性のあるかつ製薬上許容されるビヒクル、特に製薬上許容される希釈剤または賦形剤と組み合わせて含有する薬剤組成物が開示されている。これらの薬剤組成物では、多リガンド捕捉剤は、個体において状態を処置または予防するための活性成分として投与することができる。
【０１８６】
本明細書中で使用する用語「治療」とは、状態の医療の一部であるまたはそれに医学的にもしくは外科的に対処する、任意の活動を示す。
【０１８７】
本明細書中で使用する用語「予防」とは、個体における状態から死亡率または罹患率の負荷を低下させる任意の活動を示す。これは一次、二次および三次の予防レベルで起こり、ａ）一次予防は疾患の発生を回避し、ｂ）二次予防活動は初期疾患処置を目的としており、したがって、疾患の進行および症状の出現を予防するための介入機会を増加させ、ｃ）三次予防は、機能を回復し、疾患関連の合併症を低下させることによって、既に確立された疾患の悪影響を低下させる。
【０１８８】
本明細書中で使用する用語「状態」とは、個体の完全な物理的、精神的および社会的な健全性の状態に関連する標準の身体状態とは一致しない、個体の身体（全体としてまたはその部分の１つもしくは複数として）の身体状態を示す。本明細書中に記載の状態には、それだけには限定されないが、障害および疾患が含まれ、用語「障害」とは、身体またはその任意の部分の機能異常に関連する生きた個体の状態を示し、用語「疾患」とは、身体またはその任意の部分の正常機能を損なう生きた個体の状態を示し、典型的には識別可能な兆候および症状によって明らかとなる。
【０１８９】
処置のコンテキストにおいて本明細書中で使用する用語「個体」には、それだけには限定されないが、動物、特に高等動物、特に脊椎動物、たとえば哺乳動物、特に人間を含めた、単一の生物が含まれる。
【０１９０】
本明細書中で使用する用語「賦形剤」とは、医薬品の活性成分の担体として使用する不活性物質を示す。本明細書中に記載の薬剤組成物の適切な賦形剤には、個体の身体が多リガンド捕捉剤またはその組合せを吸収する能力を増強させる任意の物質が含まれる。また、適切な賦形剤には、好都合かつ正確な用量を可能にするために、ペプチドまたはその組合せを有する配合物を増大させるために使用できる任意の物質も含まれる。単一用量でのその使用に加えて、賦形剤は、関係するペプチドまたはその組合せの取扱いを支援するために、製造プロセス中に使用することができる。投与経路および医薬品の形態に応じて、様々な賦形剤を使用することができる。例示的な賦形剤には、それだけには限定されないが、抗接着剤、結合剤、コーティング、崩壊剤、充填剤、香料（甘味料など）および着色料、流動促進剤、潤滑剤、保存料、吸着剤が含まれる。
【０１９１】
本明細書中で使用する用語「希釈剤」とは、組成物の活性成分を希釈または運ぶための希釈用剤を示す。適切な希釈剤には、医薬調製物の粘度を減少させることができる任意の物質が含まれる。
【０１９２】
以降、本開示のさらなる利点および特徴は、実験セクションを参照することで、例示目的のみとして以下の詳細な開示からより明らかになろう。
【実施例】
【０１９３】
本明細書中に記載の捕捉剤、方法および系を、例示目的として提供し、限定することを意図しない以下の実施例にさらに例示する。特に、以下の実施例では、リガンドがポリペプチドによって形成されるタンパク質性質の多リガンド捕捉剤を参照して、本開示の多リガンド捕捉剤ならびに関連する方法および系のさらなる説明を提供する。当業者には、アミノ酸化学性質のリガンドによって形成された捕捉剤について詳述した特長の、別の化学性質のリガンドによって全体または一部が形成された捕捉剤への適用性が理解されよう。特に、本開示を読んだ当業者は、ペプチド性化学性質の多リガンド捕捉剤は捕捉剤の１つの例のみであり、多リガンド捕捉剤にはオリゴおよびポリヌクレオチド、小分子、ならびに他の生物活性のあるリガンドが含まれうることを理解されよう。
【０１９４】
特に、現在の標準である抗体を置き換えることができる、多リガンド捕捉タンパク質剤およびタンパク質性質の多リガンド捕捉剤を含めた多リガンド捕捉剤を開発する方法を記載し、リガンドがペプチド様分子によって提供される例示的な実施形態を参照して実証した。特に、それぞれのリガンドは、天然、人工、または非天然のアミノ酸および他の有機分子構成単位からなるペプチド様分子である。それぞれの多リガンドは２つ以上のリガンドからなり、それぞれのリガンドは複数の構成単位（アミノ酸など）からなる。多リガンドを構成するリガンドの数が増加するにつれて、目的タンパク質に対する多リガンドの選択性および親和性が迅速に増加する。標的タンパク質自体を、それ自体の多リガンド捕捉剤をアセンブルするための触媒として利用する。個々のリガンド自体（およびその構成成分のアミノ酸）は、この触媒プロセスのために特異的に設計されている。化学的および生化学的な安定性、水溶性、熱安定性、ならびに他の所望の特徴を多リガンド中に設計することができる。さらに、多リガンドは、慣用の化学方法を用いてグラムのスケールの量で生成することができる。
【０１９５】
また、以下の実施例では、標準のタンパク質アッセイにおける、タンパク質に触媒される多リガンド捕捉剤の使用も例示する。実験室または臨床設定のいずれかにおいて使用されているいくつかの標準のタンパク質アッセイが存在する。標準のアッセイは、試料分析物の直接標識によって行なうアッセイおよび無標識アッセイの２つのクラスに分類される。これらの標準のアッセイには、最も一般的なタンパク質捕捉剤は抗体である。
【０１９６】
無標識アッセイとは、少なくとも１つの抗体を利用してその同族タンパク質を検出するものである。これらには、ウエスタンブロットおよびドットブロット、ならびに酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等のサンドイッチアッセイなどのアッセイが含まれる。
【０１９７】
実施例１：官能化した人工アミノ酸の合成および特徴づけ
アジド含有人工アミノ酸の合成には、すべての化学薬品はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）から購入し、受け取ったままの状態で使用した。Ｆｍｏｃ−Ｄ−プロパルギルグリシン（Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｒａ−ＯＨ）は商業販売業者（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、イリノイ州Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ）から獲得し、アンカーリガンドおよび二重リガンドを構築するためのアセチレンハンドルとして使用した。
【０１９８】
スキーム１は、１ビーズ１化合物のペプチドライブラリに取り込ませた、アジド含有人工アミノ酸Ｆｍｏｃ−Ａｚ４−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ａｚ８−ＯＨの合成を記載する。Ｆｍｏｃ−Ａｚ４−ＯＨの詳細な合成プロトコルおよび分光学的な特徴づけを提供する。Ｆｍｏｃ−Ａｚ８−ＯＨでは、分光学的な特徴づけのみを提供する。
【０１９９】
【化１】
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【０２００】
アジドブチルブロマイド（１ａ）。１，４−ジブロモブタン（１２３ｍｍｏｌ）の溶液に、アジ化ナトリウム（６１．５ｍｍｏｌ）を加え、終夜、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、５０℃で撹拌した。反応を酢酸エチルで希釈し、有機層を水、その後ブラインで洗浄し、その後、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（１００％のヘキサン）によって精製して、生成物（８０％）が透明な油状物として得られた。1H  NMR  (300  MHz、CDCl3)：δ  3.44  (2H、t、J  =  6.3  Hz)、3.34  (2H、t、J  =  6.6  Hz)、1.93-1.98  (2H、m)、1.74-1.79  (2H、m)。
【０２０１】
アジドオクチルブロマイド（１ｂ）。１，８−ジブロモブタンを出発物質として使用した以外は、上述のように合成を実施した。1H  NMR  (300  MHz、CDCl3)：δ  3.41  (2H、t、J  =  6.9  Hz)、3.26  (2H、t、J  =  6.6  Hz)、1.86  (2H、p、J  =  6.9  Hz)、1.60  (2H、p、J=8.7  Hz)、1.34-1.55  (4H、m)。
【０２０２】
ジエチル２−アセトアミド−２−（４−アジドブチル）マロネート（２ａ）。以前に公開されている手順に従って、２５ｍｌの無水ＥｔＯＨ中の０．５９８ｇ（０．０２６ｍｏｌ）の金属ナトリウムの溶液に、５．６５ｇのジエチルアセトアミドマロネート（０．０２６ｍｏｌ）を加えた（Ｃｈｅｎａｕｌｔ，Ｈ．Ｋ．ら、１９８９）。混合物を３０分間、室温で撹拌した。滴下によってアジドブチルブロマイド１ａ（４．８２ｇ、０．０２７ｍｏｌ）を撹拌しながら加えた。反応混合物を２時間、室温で撹拌し、６時間８０℃で還流した。終夜冷却した後、反応混合物を濃縮乾固し、残渣をジエチルエーテルで抽出した。合わせたエーテル抽出物を水、飽和ＮａＨＣＯ３、水、およびブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、その後、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ＝１：１）により、生成物（６３％）が透明な粘稠油状物として得られた。1H  NMR  (300  MHz、CDCl3)：δ  6.77  (1H、s)、4.24  (4H、q、J=6.9  Hz)、3.26  (2H、t、J=6.9  Hz)、2.31-2.37  (2H、m)、2.04  (3H、s)、1.59  (2H、p、J=7.5  Hz)、1.26  (6H、t、J=6  Hz)、1.16-1.27  (2H、m)。ESI-MS  m/e  315。
【０２０３】
ジエチル２−アセトアミド−２−（４−アジドオクチル）マロネート（２ｂ）。アジドオクチルブロマイド１ｂが出発物質として役割を果たした以外は、２ａと同様の合成プロトコルを採用した。1H  NMR  (300  MHz、CDCl3)：δ  6.76  (1H、s)、4.24  (4H、q、J=7.2  Hz)、3.24  (2H、t、J=6.9  Hz)、2.27-2.33  (2H、m)、2.04  (3H、s)、1.56  (2H、p、J=7.5  Hz)、1.25  (6H、t、J=7.2  Hz)、1.06-1.16、1.2-1.4  (10H、m)。ESI-MS  m/e  371。
【０２０４】
２−アジドブチルアミノ酸（３ａ）。標準の方法に従って、２５ｍｌの１０％のＮａＯＨ溶液中のジエステル２ａ（２．８ｍｍｏｌ）を４時間加熱還流した（ｖａｎ  Ｈｅｓｔ，Ｊ．Ｃ．Ｍ．ら、２０００）。その後、溶液を濃ＨＣｌで中和し、蒸発させた。残渣を２５ｍｌの１ＭのＨＣｌに溶かし、３時間加熱還流した。溶媒を還元し、ＭｅＯＨで抽出して、アミノ酸３ａが塩酸塩として得られた（８５％）。1H  NMR  (300  MHz、CD3OD):δ  3.98  (1H、t、J=6.3  Hz)、3.35  (2H、t、J=7.8  Hz)、1.45-1.7、1.85-2.05  (6H、m)。MALDI-MS  m/e  173。
【０２０５】
２−アジドオクチルアミノ酸（３ｂ）。ジエステル２ｂを出発物質として使用して、上述のように合成を実施した。1H  NMR  (300  MHz、CD3OD):δ  3.94  (1H、t、J=6.3  Hz)、3.27  (2H、t、J=6.9  Hz)、1.3-1.52、1.52-1.62、1.8-1.98  (14H、m)。ESI-MS  m/e  229。
【０２０６】
Ｆｍｏｃ−２−アジドブチルアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ａｚ４−ＯＨ）。公開されている方法に従って、アミノ酸３ａ（２６．３ｍｍｏｌ）を０．４５：０．５５のＨ２Ｏ：ＴＨＦ（１５０ｍｌ）に溶かし、ＮａＨＣＯ３（２２．１ｇ、２６３ｍｍｏｌ）を加えた（Ｌｅｅ，Ｈ．−Ｓ．ら、２００３）。混合物を０℃まで冷却した後、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（９．７ｇ、２８．９ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴下した。反応混合物を室温にし、終夜撹拌した。ＴＨＦの蒸発を真空下で完了し、水性残渣をジエチルエーテルで洗浄した（２×２００ｍｌ）。その後、水層を収集し、濃ＨＣｌでｐＨ２まで酸性化した後、酢酸エチル（４×１００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。有機残渣をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中に２％のＭｅＯＨ）によって精製して、白色粉末が得られた（４８％の収率）。1H  NMR  (300  MHz、CDCl3):δ  7.76  (2H、d、J=7.5  Hz)、7.59  (2H、d、J=6.9  Hz)、7.40  (2H、t、J=7.5  Hz)、7.31  (2H、t、J=7.5  Hz)、5.34  (1H、d、J=7.8  Hz)、4.49-4.59  (1H、m)、4.43  (2H、d、J=6.6  Hz)、4.22  (1H、t、J=6.6  Hz)、3.27  (2H、t、J=6.6  Hz)、1.3-2.0  (6H、m)。ESI-MS  m/e  395。
【０２０７】
Ｆｍｏｃ−２−アジドオクチルアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ａｚ８−ＯＨ）。上述のようにアミノ酸３ｂをＦｍｏｃ保護で処理した。1H  NMR  (300  MHz、CDCl3):δ  7.75  (2H、d、J=7.5  Hz)、7.57-7.61  (2H、m)、7.39  (2H、t、J=7.5  Hz)、7.30  (2H、t、J=7.2  Hz)、5.40  (1H、d、J=8.1  Hz)、4.42-4.52  (1H、m)、4.40  (2H、d、J=7.2  Hz)、4.21  (1H、t、J=7.2  Hz)、3.23  (2H、t、J=6.9  Hz)、1.18-1.98  (14H、m)。ESI-MS  m/e  450。
【０２０８】
実施例２：１ビーズ−１化合物のペプチドライブラリの構築
材料。Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ（Ｆｍｏｃ、フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（Ｐｂｆ、ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｔｒｔ、トリチル）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（ｔＢｕ、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（Ｂｏｃ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｄ−Ｖａｌ−ＯＨをＡｎａｓｐｅｃ（カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）から購入し、受け取ったままの状態で使用した。ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ−ＮＨ２樹脂（９０μｍ、０．３１ｍｍｏｌ／ｇ）をＡｎａｓｐｅｃ（カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）から得て、ＯＢＯＣライブラリの構築に利用した。Ｆｍｏｃ−ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（５０μｍ、０．６７ｍｍｏｌ／ｇ）をＡｎａｓｐｅｃ（カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）から得て、ヒットしたペプチド配列のバルク合成に利用した。アミノ酸カップリング反応を、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ、９９％）中で、ＨＡＴＵ（２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアンモニウムヘキサフルオロホスフェート、ＣｈｅｍＰｅｐ、フロリダ州Ｍｉａｍｉ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（９９％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を用いて行なった。Ｎα−Ｆｍｏｃ保護基の除去には、ＮＭＰ中の２０％のピペリジンの溶液を使用した。ペプチドライブラリの最終脱保護には、トリフルオロ酢酸（９８％の最小滴定）およびトリエチルシラン（ＴＥＳ）を使用した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）。
【０２０９】
ペプチドライブラリの構築。１ビーズ−１化合物（ＯＢＯＣ）のコンビナトリアルライブラリ方法を用いて、５〜７個のペプチドのランダム化されたライブラリを合成し、ペプチドライブラリは、以前の報告されている分割混合手法によって合成した（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら、１９９７、Ｆｕｒｋａ，Ａ．ら、１９９１、Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．およびＴ．Ｊ．Ｍａｓｏｎ、１９９３）。
【０２１０】
特に、５〜７個のペプチドのランダム化されたＯＢＯＣライブラリを、９０μＭのポリエチレングリコール移植ポリスチレンビーズ（ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ−ＮＨ２、０．３１ｍｍｏｌ／ｇ、２．８６×１０６個のビーズ／ｇ）上の標準の分割混合固相ペプチド合成方法によって、手動で合成した（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら、１９９７、Ｆｕｒｋａ，Ａ．ら、１９９１、Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．およびＴ．Ｊ．Ｍａｓｏｎ、１９９３）。非天然Ｄ−立体異性体（小文字の一文字のアミノ酸コードで示す）をペプチド配列中の可能なすべての位置で使用した。それぞれのライブラリ要素の十分な表示を保証するために、少なくとも５倍過剰のビーズをそれぞれのライブラリ合成で利用した。Ｆｍｏｃ化学を用いた標準の固相ペプチド合成方法を使用した（Ｃｏｉｎ，Ｉ．ら、２００７）。すべての洗浄、脱保護、およびカップリングのステップは、樹脂の１８０度振盪によって促進した。プラスチックフリット反応器内で樹脂をＮＭＰで事前に膨潤させ、複数のアリコートに分けた。それぞれのアリコートを２倍モル濃度過剰量（樹脂に対して）の単一のＮα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸と反応させた。アミドカップリングは、２倍モル濃度過剰量のＨＡＴＵおよび６倍モル濃度過剰量のＤＩＥＡを加えることによって開始した（Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｌ．Ａ．ら、１９９４）。カップリング反応は１５分間実行した。別の２当量のＮα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸、２当量のＨＡＴＵ、および６当量のＤＩＥＡを加え、１５分間反応させた（「二重カップリング」）。一部の事例では、第３の組のカップリング試薬およびＮα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸を用いた「三重カップリング」を行なった（表１、ライブラリＤ、Ｅ、Ｆ、およびＧ）。カップリング後、アリコートを十分に洗浄し（５×ＮＭＰ）、単一の容器内で一緒に混合し、ＮＭＰ中の２０％のピペリジンで脱保護した（３０分間）。樹脂を十分に洗浄し（５×ＮＭＰ）、乾燥させ（５×ＤＣＭ）、次のカップリングサイクルのために複数の等質量のアリコートへと再度分割した。所望の長さのペプチドが得られるまで手順を繰り返した。
【０２１１】
その後、トリフルオロ酢酸（９５％）、水（５％）、およびトリエチルシラン（保護した側鎖あたり２倍モル濃度過剰量）中、２時間、２５℃でインキュベーションすることによってアミノ酸側鎖保護基を除去した。その後、ライブラリ樹脂をＤＭＦで中和し、ＤＭＦ（５×）、水（５×）、メタノール（ＭｅＯＨ、５×）、および塩化メチレン（ＤＣＭ、５×）で十分に洗浄し（Ｄｉｘｏｎ，Ｓ．Ｍ．ら、２００６）、その後、真空下で乾燥させ、リン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ（ｐＨ７．４）］＋０．０５％のＮａＮ３中、２５℃で保管した。
【０２１２】
表１に、直鎖状および分枝状の二重リガンドならびに三重リガンド捕捉剤の開発に利用したライブラリを記載する。
【０２１３】
【表１】
0005647113.tif 000003
＋ランダム化された位置は、ｘ（Ｄ−アミノ酸）およびＡｚｎ（アジド含有人工アミノ酸）で示す。
【０２１４】
実施例３：一般スクリーニング手順
タンパク質標的の提供。炭酸脱水酵素ＩＩ（ｂＣＡＩＩ）が多リガンドタンパク質捕捉剤の概念証明開発の標的として役割を果たした。ｂＣＡＩＩ（Ｃ２５２２）、ウシ赤血球由来、凍結乾燥粉末、≧３，０００のＷ−Ａ単位／ｍｇのタンパク質をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）から得て、受け取ったままの状態で使用した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７マイクロスケールタンパク質標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を用いて製造者の低度標識（ＤＯＬ）のプロトコルに従ってタンパク質を色素標識した。手短に述べると、１００μｇのタンパク質を、６ｍｏｌ当量のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７  ＮＨＳエステルと共に１５分間、２５℃でインキュベーションした。ＢｉｏＧｅｌ  Ｐ−６サイズ排除樹脂によって過剰の色素を除去した。標識したタンパク質（ｂＣＡＩＩ−Ａｌｅｘａ６４７）をＵＶ−Ｖｉｓおよび質量分析によって特徴づけた。
【０２１５】
リガンドのスクリーニングに適切なスクリーニング手順は以下のように要約される。典型的なペプチドアンカーリガンドのスクリーニングは、非特異的なタンパク質結合を遮断するために、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０＋０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋０．０５％のＮａＮ３（ＰＢＳＴＢＮａＮ３）中、１時間、振盪しながらライブラリをインキュベーションすることに始まる（Ｌｅｈｍａｎ，Ａ．ら、２００６）。その後、ライブラリを３×５ｍＬのＰＢＳＴＢＮａＮ３で洗浄した。ビーズ上多リガンドスクリーニングは適切なｂＣＡＩＩ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７の希釈率で実行し（表２および図２４のスキームを参照）、その後、３×５ｍＬのＰＢＳＴＢＮａＮ３、３×５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０、最後に６×５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。すべてのｉｎ  ｓｉｔｕ多リガンドスクリーニングは、ｂＣＡＩＩ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７とペプチドアンカーリガンド（典型的にはタンパク質に対して≧２０００当量）とのさらに２時間のプレインキュベーションを含有し、その後、ビーズライブラリをこの混合物に加え、スクリーニングを続けた（表２および図２４のスキームを参照）。Ｉｎ  ｓｉｔｕの多リガンドのスクリーニング後、ビーズを３×５ｍＬのＰＢＳＴＢＮａＮ３、３×５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０、その後６×５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。
【０２１６】
実施例２のライブラリＡ〜Ｊに使用するスクリーニング条件の要約を以下の表２に報告する。
【０２１７】
【表２】
0005647113.tif 000004
【０２１８】
スクリーニングしたビーズをガラス製顕微鏡スライド上に移し、ＧｅｎｅＰｉｘ４２００アレイスキャナ（λｅｘ＝６３５ｎｍ）を用いて蛍光についてすぐにイメージングした。ヒットしたビーズをガラスマイクロピペットによって手動で選択した。結合したタンパク質を除去するために、それぞれのヒットしたビーズを７．５Ｍの塩酸グアニジン（ｐＨ２．０）中で１時間インキュベーションし、続いて水で１０回すすいだ。
【０２１９】
単一のヒットしたビーズをエドマン分解によって配列決定した。特に、エドマン配列決定は、モデル４９４  Ｐｒｏｃｉｓｅ  ｃＬＣ配列決定システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）で実施した。反復Ｎ末端化学分解サイクルにより、直接の位置的なアミノ酸情報が得られる。それぞれの分解サイクルにより１個のＰＴＨ−アミノ酸（ＰＴＨ＝フェニルチオヒダントイン）産物が生じ、これをＨＰＬＣによって分析し、ＰＴＨ−アミノ酸標準と比較した保持時間によって同定した。この方法による人工アジド含有アミノ酸の分割を可能にするために習慣のエドマン分解方法を利用し、これには延長した勾配およびフラスコサイクルが含まれる。
【０２２０】
Ａｚ２、Ａｚ４、Ａｚ６およびＡｚ８の溶出に対応するエドマン追跡により、アジドアルキル側鎖に２個のメチレン単位が付加されるごとに６分の保持時間の増加が実証された。Ｆｍｏｃ−Ａｚ２−ＯＨは文献プロトコルに従って合成し（Ｒｏｉｃｅ，Ｍ．ら、２００４）、一方で、Ｆｍｏｃ−Ａｚ６−ＯＨは上記実施例１のスキーム１に従って合成した。
【０２２１】
実施例４：スクリーニング手法：第一世代アンカーリガンド
アンカーリガンドのスクリーニング。特に、第一世代スクリーニングは、上記実施例２に記載し、図１９に例示したように調製した五量体のライブラリＡ（４ｇ、約２，５００，０００個のビーズ）を用いて実行した。特に、ライブラリＡをポリプロピレンフリット管へ１０ｍｇ部分で分けた。その後、１ｍＬのＰＢＳ［２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）］中に１００ｎＭの希釈率のｂＣＡＩＩ−Ａｌｅｘａ６４７を、それぞれのライブラリ部分と共に１時間、２５℃で振盪しながらインキュベーションした。スクリーニングしたビーズを３×５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）および７×５ｍＬの水で洗浄した。ビーズを必要最低限量の水中でガラス製顕微鏡スライド上に移し、ＧｅｎｅＰｉｘ４２００アレイスキャナを用いて蛍光についてすぐにイメージングした。ヒットをガラスマイクロピペットによって手動で選択した。結合したタンパク質を除去するために、それぞれのヒットしたビーズを７．５Ｍの塩酸グアニジン（ｐＨ２．０）中で１時間インキュベーションし、続いて水で１０回すすいだ。
【０２２２】
その後、ヒット配列をエドマン分解によって解読した。ヒストグラム分析を用いて、アミノ酸頻度のヒット配列および試料間の位置的な配列相同性について分析した。第一世代アンカーリガンド分析の例を図２５に提示する。
【０２２３】
特に、図２５の図では、スクリーニングＡｎ１から単離した５１個のヒット配列の頻度対Ｄ−アミノ酸をパネルＡに示す。スクリーニングＡｎ２ａおよびＡｎ３ｂのヒット率を図２５のパネルＢに示し、これにより２つのペプチドアンカーリガンドの選択がもたらされる。
【０２２４】
これから、塩基性／帯電残基（ｋ、ｒ）および芳香族残基（ｙ、ｆ、ｗ）がｂＣＡＩＩのアンカーリガンド中の重要なアミノ酸であることが決定され、これらのアミノ酸を用いて、以下の実施例５に例示した手順に従って集中したライブラリＢを構築した。
【０２２５】
実施例５：スクリーニング手法：第二世代アンカーリガンド
実施例２に例示した手順に従って集中したライブラリＢを構築して、実施例４に例示した手順に従って同定した発生頻度の高いアミノ酸を反映した。
【０２２６】
具体的には、アミノ酸ｋ、ｒ、ｙ、ｆ、ｗ、ｈ、およびｌを含ませて、ペプチドの長さを六量体まで増加した。構成成分のアミノ酸のより密な分布および増加したペプチドの長さは、第二世代スクリーニングを濃縮して、さらにより特異的なアンカーリガンドが選択されることが示された。
【０２２７】
その後、上記実施例３に例示したスクリーニングＡｎ１と同様のプロトコルに従って、１個のコピーのライブラリＢ（４０ｍｇ、約１２０，０００個のビーズ）を使用して第二世代アンカーリガンドスクリーニングを実行した。ここでは、４ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の８〜５０ｎＭのｂＣＡＩＩ−Ａｌｅｘａ６４７の希釈率をライブラリと共に、１〜２４時間、２５℃で振盪しながらインキュベーションした。
【０２２８】
第二世代スクリーニングＡｎ２ａおよびＡｎ２ｂの結果を例示する図２５Ｂを参照されたい（図１９も参照）。ここでは、ヒットはさらに低いタンパク質濃度およびより低い頻度で単離された。
【０２２９】
最もストリンジェントなスクリーニングにより、２つのヒット、ｈｌｙｆｌｒおよびｌｋｌｗｆｋが得られ、これらは２つの選択されたアンカーリガンドを表す。
【０２３０】
実施例６：アンカーリガンドの合成および親和性測定。
【０２３１】
ペプチド合成。スクリーニングＡｎ２ｂからのヒットを、その末端に適切な人工アミノ酸（アジド／アセチレン）リンカーを含有するように再合成して、これらをクリックケミストリーに適切なものとした。ヒットしたペプチド配列のバルク合成は、Ｆｍｏｃ−ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ（５０μｍ、０．６７ｍｍｏｌ／ｇ）または塩化２−クロロトリチル（１．５ｍｍｏｌ／ｇ）樹脂（Ａｎａｓｐｅｃ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）のいずれか上で、０．３ｇ／配列の典型的な樹脂スケールで行なった。粗ペプチドをエーテルで沈殿させ、その後、ＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ１２６溶媒モジュールおよび１６８検出器、カリフォルニア州Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）によって、Ｃ１８逆相半調製用カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  １０μｍ、２５０×１０ｍｍ）上で＞９８％まで精製した。純粋なペプチドを親和性測定、スクリーニング、および結合アッセイに使用した。ヒットしたペプチド配列を同様の樹脂スケールでＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ−ＮＨ２上でも再合成し、ビーズ上結合アッセイに使用した。
【０２３２】
蛍光偏光によるＫＤの決定。公開されているプロトコルに従って、アンカーリガンドのＮ末端をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した（Ｙｉｎ，Ｈ．ら、２００６）。樹脂の切断後、粗フルオレセイン化アンカーリガンドをエーテルで沈殿させ、その後、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣによって＞９８％まで精製した。
【０２３３】
発光スペクトルは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅレーザー資源センター（Ｌａｓｅｒ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）（カリフォルニア州Ｐａｓａｄｅｎａ）のＦｌｕｏｒｏｌｏｇ２分光蛍光光度計（Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ、フランスＬｏｎｇｊｕｍｅａｕ）によって記録した。すべての試料は、６μＭのフルオレセイン化アンカーリガンドおよび様々な濃度のｂＣＡＩＩ（０．２μＭから８００μＭ）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋３％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ中に含有していた。ストックタンパク質およびアンカーリガンドの濃度は、ＵＶ−Ｖｉｓによって、フルオレセイン化アンカーリガンドにはε２８０（ｂＣＡＩＩ）＝５７，０００Ｍ−１ｃｍ−１またはε４９４（ＦＩＴＣ、０．１ＮのＮａＯＨ）＝６８，０００Ｍ−１ｃｍ−１を用いて検証した。試料を４８８ｎｍ（２ｎｍの帯域通過）で励起し、発光スペクトルを５００ｎｍ〜７００ｎｍ（４ｎｍの帯域通過）で得た。すべての測定値は２ｎｍ間隔、０．５秒の積分時間、２５℃で採った。すべての発光スペクトルはバックグラウンド減算に供した。
【０２３４】
系の垂直および水平の平面偏光の感受性（Ｇ）の比は、ペプチドのみの試料から得られたＩＨＨおよびＩＨＶ発光スペクトルを用いて、方程式Ｇ＝ＩＨＨ／ＩＨＶによって計算した。発光スペクトルＩＶＶおよびＩＶＨを積分し、蛍光偏光値（Ｐ）は方程式１を適用することによって得られた。
【０２３５】
【数１】
0005647113.tif 000005
【０２３６】
Ｏｒｉｇｉｎ６．１（マサチューセッツ州Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ）を用いて分極値をＳ字型用量応答曲線に当てはめた。
【０２３７】
この方法によって、ｂＣＡＩＩに対する５００μＭの親和性がフルオレセイン化アンカーリガンドｌｋｌｗｆｋ−（Ｄ−Ｐｒａ）で測定された。フルオレセイン化アンカーリガンドを漸増する濃度の標的（０．２μＭから８００μＭ）で滴定し、この結合相互作用について５００μＭの親和性が示唆された（図２６）。
【０２３８】
実施例７：二次リガンドの同定：二重リガンドのスクリーニング
二次リガンドを２つの相補的な手法、１）ｉｎ  ｓｉｔｕ二重リガンドスクリーニング、２）ビーズ上二重リガンドスクリーニングによって同定した。（図２４を参照）
【０２３９】
Ｉｎ  ｓｉｔｕ二重リガンドスクリーニング：第１の手法では（図２０および図２４Ａを参照）、ペプチドアンカーリガンドおよびタンパク質は溶液中にあり、二次リガンドの同族ライブラリはビーズ上にある。タンパク質は、ビーズ上での二重リガンドのｉｎ  ｓｉｔｕアセンブリの触媒として作用する。
【０２４０】
スクリーニングＢｉ１では、５０ｎＭのｂＣＡＩＩ−Ａｌｅｘａ６４７の溶液を、ペプチドアンカーリガンド（ｌｋｌｗｆｋ−（Ｄ−Ｐｒａ）、タンパク質に対して２０００×）と、２時間、３７℃でプレインキュベーションした。ポリプロピレンフリット管あたり６０ｍｇ部分に分けたアジド七量体ライブラリＣ（４ｇ、約２，２５０，０００個のビーズ）を用いてスクリーニングを実行した。アンカーリガンド／タンパク質の溶液をビーズライブラリに加え、４８時間、３７℃で振盪しながらインキュベーションした。スクリーニングしたビーズを３×５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）および７×５ｍＬの水で洗浄した。実施例３に概要を示したプロトコルを用いてビーズを蛍光についてイメージングした。Ｉｎ  ｓｉｔｕ二重リガンドを表すヒットをマイクロピペットによって手動で選択した。その後、選択されたビーズを加工して、結合したタンパク質を除去し［７．５Ｍの塩酸グアニジン（ｐＨ２．０）］、二次リガンドの配列がエドマン分解によって得られた。
【０２４１】
図２７は、この第一世代ｉｎ  ｓｉｔｕ二重リガンドスクリーニングＢｉ１の結果を例示する。この第一世代ｉｎ  ｓｉｔｕ二重リガンドスクリーニングＢｉ１におけるヒットした二次リガンドのヒストグラム分析および生分析から、そのモチーフがいくつかのヒットした試料にわたって繰り返されていた二次リガンド候補が出現した（Ａｚ４−ｋｉｗｉＧ）。特に、図８Ａ２７Ａは、１００μＭのアンカーリガンド（ｌｋｌｗｆｋ−（Ｄ−Ｐｒａ））の存在下でスクリーニングライブラリＣから単離した二次リガンド候補の頻度対Ｄ−アミノ酸のヒストグラムを示す。図２７Ｂは、５０ｎＭのｂＣＡＩＩ−Ａｌｅｘａ６４７に対するスクリーニングライブラリＣから単離したヒット配列の略記のリストを示す。
【０２４２】
Ｉｎ  ｓｉｔｕ二重リガンドアセンブリによって二次リガンドをスクリーニングする方法は、対でのスクリーニングによって妥当性確認することができる。特に、アンカーリガンドおよび二次リガンドの対を、タンパク質標的の存在下で、溶液中で合わせる。タンパク質に触媒される二重リガンド捕捉剤のアセンブリをＭａｎｅｔｓｃｈ、Ｋｒａｓｉｎｓｋｉら、２００４およびＫｒａｓｉｎｓｋｉ、Ｒａｄｉｃら、２００５によって記載されているものなどの分析方法によって監視する。
【０２４３】
対でのスクリーニング。二次リガンド（アジド、Ａｚ４−ｋｉｗｉＧ、１３．１ｍＭ）およびアンカーリガンド（アセチレン、ｌｋｌｗｆｋ−（Ｄ−Ｐｒａ）、２．１ｍＭ）のストック溶液をＤＭＳＯ中で調製した。ｂＣＡＩＩおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のストック溶液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で調製した。それぞれの反応は、１００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋６％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）中に３９４μＭのアジド、６５μＭのアルキン、および３６μＭのタンパク質を含有していた。反応を４８時間、３７℃で、続いて５日間、２５℃で進行させた。反応を１００μＬの７．５Ｍの塩酸グアニジン（ｐＨ２．０）で反応停止させ、続いて遠心濾過（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）によってタンパク質を除去した。
【０２４４】
Ｉｎ  ｓｉｔｕ二重リガンドの形成はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって同定した。対照実験は、アジドおよびアルキンの間のクリック反応がｂＣＡＩＩタンパク質標的に特異的であることを検証するために、（１）ｂＣＡＩＩの非存在下で、および（２）ｂＣＡＩＩをＢＳＡで置き換えて実行した。タンパク質の非存在下で行なった第３の対照は、アジドおよびアルキンの溶液の間の、ゆっくりの熱駆動される反応を表す。
【０２４５】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳでは、タンパク質ｂＣＡＩＩがｉｎ  ｓｉｔｕ二重リガンドの代謝回転を触媒した、対でのスクリーニングの結果を図２８に例示する。ＢＳＡによって触媒されるバックグラウンド反応または熱クリック反応は低く、二重リガンドの代謝回転のほとんどがｂＣＡＩＩに起因する可能性があることを提供している。特定の実施形態では、対でのスクリーニングの生成物の増幅は、実施例１３の図２９および図３０に例示するように行なうことができる。
【０２４６】
ビーズ上二重リガンドスクリーニング：二次リガンドを同定する第２の手法では（図２４Ｂを参照）、銅（Ｉ）に触媒されるアジド−アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）によってペプチドアンカーリガンドを二次リガンドのビーズ上ライブラリに共有的カップリングさせる。特に、この事前にアセンブルした二重リガンドのライブラリをタンパク質標的に対してスクリーニングして、二次リガンド候補が得られる。この手法ではタンパク質標的は触媒ではなく、このスクリーニングは、ｉｎ  ｓｉｔｕ捕捉剤スクリーニングに対する比較の妥当性確認ツールとして用いた。
【０２４７】
上記実施例３に従って、ライブラリＤ（４０ｍｇ、約１２０，０００個のビーズ）を用いてポリプロピレンフリット管中でスクリーニングＢｉ２ａおよびＢｉ２ｂを実行した。非特異的なタンパク質結合を遮断するために、ライブラリを最初にＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０＋０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋０．０５％のＮａＮ３（ＰＢＳＴＢＮａＮ３）中で１時間、振盪しながらインキュベーションした（Ｌｅｈｍａｎ，Ａ．ら、２００６）。この事前遮断ステップの後、ライブラリを３×５ｍＬのＰＢＳＴＢＮａＮ３で洗浄した。４ｍＬのＰＢＳＴＢＮａＮ３中に１０〜５０ｎＭの希釈率のｂＣＡＩＩ−Ａｌｅｘａ６４７を、ライブラリと共に１７時間、２５℃で振盪しながらインキュベーションした。スクリーニングしたビーズを３×５ｍＬのＰＢＳＴＢＮａＮ３、その後、３×５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄し、最後に６×５ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄した。ビーズを蛍光についてイメージングし、マイクロピペットによってヒットを選択した。ヒットを洗浄して結合したタンパク質を除去した後［７．５Ｍの塩酸グアニジン（ｐＨ２．０）］、上記実施例３に従ってその配列をエドマン分解によって決定した。
【０２４８】
スクリーニングＢｉ２ａおよびＢｉ２ｂによって得られたすべての二次リガンド配列は、特筆すべき配列相同性を示す。ｋｗｌｗＧｌおよびｋｗｉｗＧｗを含めたいくつかの配列は複数回繰り返されていた。
【０２４９】
すべての二次リガンドヒットの残基ごとのヒストグラム分析（図３１）は、二重リガンド捕捉剤の二次リガンド構成成分中でそれぞれの残基１（ｋ）、２（ｗ）、４（ｗ）、および５（Ｇ）で、１個のみのアミノ酸の強力な優先性が見つかることを例示している。特に、３７個の二重リガンドヒットしたビーズの分析に基づいて位置１〜６に見つかった、図３１に例示されているＤ−アミノ酸の分布により、コンセンサス配列ｋ−ｗ−ｘ３−ｗ−ｇ（式中、ｘ３＝疎水性アミノ酸）が示唆されている。
【０２５０】
実施例８：より長い多リガンド捕捉剤のアンカーリガンドとしての二重リガンドの利用
二重リガンドを同定した後、その二重リガンドは図７のアンカーリガンドとして役割を果たすことができ、同じＯＢＯＣライブラリを用いて三重リガンドを同定し、以降も同様である。
【０２５１】
図７の図に示すように、多リガンド捕捉剤を調製するための逐次のｉｎ  ｓｉｔｕクリックケミストリースクリーニングの表示。１°）ＴｅｎｔａＧｅｌ（ＴＧ）ビーズ上の包括的なＯＢＯＣペプチドライブラリ（ｘｉ＝可変領域）を、蛍光標識したタンパク質標的と共にインキュベーションする。実施例４および５に詳述するように、ヒットをその蛍光強度によって同定する。２°）１°スクリーニングからのヒットしたペプチドをアンカーリガンドとして用い、今ではアジドリンカー（ｎ＝４、８）が付随しているＯＢＯＣペプチドライブラリの存在下でインキュベーションする。実施例７に詳述するように二重リガンドを選択する。３°）プロセスを繰り返すが、ここでは２°スクリーニングからの二重リガンドを新しいアンカー単位として用い、高次多リガンドの迅速な同定が可能となる。
【０２５２】
リガンドを捕捉剤に付加するごとに、その捕捉剤の、その同族タンパク質に対する親和性および選択性が迅速に増加する。実施例２〜７に例示した手順に従って、図７のスクリーニングを用いてｌｋｌｗｆｋ−（Ｄ−Ｐｒａ）をアンカーリガンドとして同定し、（Ｄ−Ｐｒａ）−ｋｗｌｗＧｌ−Ｔｚ１−ｋｆｗｌｋｌを二重リガンドとして同定し、最終的には（Ｄ−Ｐｒａ）−ｋｗｌｗＧｌ−Ｔｚ１−ｋｆｗｌｋｌを、ｂＣＡＩＩに対する三重リガンドを同定するためのアンカーリガンドとして示唆した。
【０２５３】
以下の実施例９に例示するように、ｂＣＡＩＩに対する二重リガンドｋｗｌｗＧｌ−Ｔｚ１−ｋｆｗｌｋｌは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定して、ｂＣＡＩＩに対して３μＭの結合親和性を示した（ＳＰＲ手順には実施例１０も参照）。この二重リガンドの測定された解離定数は、標的と相互作用するアンカーリガンドｌｋｌｗｆｋ−（Ｄ−Ｐｒａ）で測定されたものよりも１５０倍良好である。
【０２５４】
実施例９：ビーズ上クリック反応を用いた二重リガンドの合成。
【０２５５】
ｂＣＡＩＩに対する特異的な二重リガンドの同定および親和性測定を、以下に記載するように行なった。
【０２５６】
材料。ペプチド二重リガンド合成には、アセチル化試薬（無水酢酸、２，６−ルチジン、およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ））をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）から購入した。ビーズ上のＣｕ（Ｉ）に触媒されるクリック反応には、ヨウ化銅（Ｉ）、Ｌ−アスコルビン酸、およびジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）から購入した。
【０２５７】
ビーズ上での二重リガンド合成。二重リガンドの合成は４つのステップ、すなわち、以前の実施例中に例示した手順に従った（１）アンカーリガンドの合成、（２）アセチル化、（３）クリック反応、および（４）二次リガンド配列の付加で完了した。スキーム２はアセチル化およびクリック反応を例示する。アセチル化には、完全に保護したＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ−ＮＨ２ビーズと結合した配列（０．４２０ｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を、触媒量の２，６−ルチジンを含有するＤＭＦ中の無水酢酸（１ｍｍｏｌ）の溶液によってキャップした。
【０２５８】
アセチル化したペプチドを、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｒａ−ＯＨ（０．２１８ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）と、ヨウ化銅（Ｉ）（０．１２４ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）、Ｌ−アスコルビン酸（０．１１４ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＦ／ピペリジン（８／２）の存在下、２５℃で６時間反応させた（Ｚｈａｎｇ，Ｚ．およびＥ．Ｆａｎ、２００６）。反応溶液を樹脂から排出し、樹脂を、ＤＭＦ中の１％のＤＩＥＡ（ｖ／ｖ）を含有する５×５ｍＬのジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物（Ｅｔ２ＮＣＳＳＮａ・３Ｈ２Ｏ、１％ｗ／ｖ）で洗浄して、クリック反応後の過剰の配位した銅を除去した（Ｗｅｔｅｒｉｎｇｓ，Ｊ．Ｊ．ら、２００６）。
【０２５９】
特に、スキーム２を用いて、二重リガンドアンカー（Ｄ−Ｐｒａ）−ｋｗｌｗＧｌ−Ｔｚ１−ｋｆｗｌｋｌを塩化２−クロロトリチル（１．６ｍｍｏｌ／ｇ）樹脂（Ａｎａｓｐｅｃ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）上で合成した。二重リガンドアンカーは、９５：５のＴＦＡ：水（側鎖保護基あたり＋２ｍｏｌ当量のトリエチルシラン捕捉剤）を用いた切断によって完全に脱保護されたペプチドとして、または９９：１のＤＣＭ：ＴＦＡを用いた切断によって完全に保護されたペプチドとして放出された（Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．ら、２００７）。ビーズ上クリック反応を容易にするために、１°リガンドをここではＡｚ４−ｋｆｗｌｋｌ（Ｎ末端Ａｚｎ修飾を示す）として合成し、この配列にＤ−Ｐｒａおよび２°リガンドをカップリングさせて直鎖状二重リガンドを生成したことに注意されたい。
【０２６０】
スキーム２は、アンカーリガンドを二重リガンドまたはより長い多リガンドの二次リガンドと結合させるために１，２，３−トリアゾールを設置する方法を例示する。
【０２６１】
【化２】
0005647113.tif 000006
【０２６２】
実施例１０：二重リガンドの親和性測定
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＫＤの決定。固定および二重リガンド感受性実験をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  ＳＰＲ（カリフォルニア大学タンパク質発現センター（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ）、カリフォルニア州Ｐａｓａｄｅｎａ）によって行なった。標準の手順に従って、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）緩衝液中で調製した０．２５ｍｇ／ｍＬのｂＣＡＩＩならびに０．１ｍＭのＮＨＳおよび０．４ｍＭのＥＤＣの１：１溶液を使用して、バイオセンサー表面（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５）の１つのフローセルにｂＣＡＩＩを固定した（Ｐａｐａｌｉａ，Ｇ．Ａ．ら、２００６）。同様に、標準の手順に従って、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）緩衝液中で調製した０．２５ｍｇ／ｍＬのｈＣＡＩＩを使用して、第２のフローセルにｈＣＡＩＩを固定した（Ｓｖｅｄｈｅｍ，Ｓ．ら、２００１）。１００μＬ／分の流速を用いて４２０秒間かけて約４０００ＲＵの固定レベルが達成された。バルク屈折率の変化を補正し、非特異的結合を評価するために、残りの２つのフローセルは誘導体化しないままにした。ランニング緩衝液は１０ｍＭのＨＥＰＥＳ＋１５０ｍＭのＮａＣｌ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０＋３％のＤＭＳＯを含有するように調製し、この緩衝液をすべての実験で使用した。ペプチド分析物の実験の前に、ベースラインの安定化を確立するために８回の緩衝液単独でのサイクルを完了した。二重リガンド試料を、４つのフローセルにわたって１００μＬ／分の流速で、１２０〜１８０秒間、一連の濃度（５μＭから２ｎＭ）で注入した。バックグラウンド減算の後、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて分析物の応答データを１：１の結合親和性に当てはめた。
【０２６３】
結合応答（図２８）により、ｂＣＡＩＩに対する２つの二重リガンドが１０−６Ｍの親和性であることが明らかとなった。これは、選択された二重リガンドを図２８Ａに示すｉｎ  ｓｉｔｕ二重リガンドスクリーニング、および選択された二重リガンドを図２８Ｂに示すビーズ上二重リガンドライブラリのスクリーニングが、同様の親和性を有する同様の二重リガンド配列に収束することを証明している。
【０２６４】
特に、図２８Ａは、ｉｎ  ｓｉｔｕスクリーニングＢｉ１から選択された二重リガンドのＳＰＲデータ組を示し、ライブラリＣがＫＤ＝１１μＭを示すことを示唆している。図２８Ｂは、ビーズ上スクリーニングＢｉ２ｂから選択された二重リガンドのＳＰＲデータ組を示し、ライブラリＤがＫＤ＝３μＭを示すことを示唆している。これらの平衡解離定数は、アンカーリガンドと標的の間の相互作用と比較して１５０倍の親和性の増強を表している図２６）。
【０２６５】
上記に鑑みて、二重リガンドアンカー（Ｄ−Ｐｒａ）−ｋｗｌｗＧｌ−Ｔｚ１−ｋｆｗｌｋｌを合成した（分子量：１９９３．４９）。
【０２６６】
実施例１１：三重リガンド捕捉剤の同定
二重リガンド（Ｄ−Ｐｒａ）−ｋｗｌｗＧｌ−Ｔｚ１−ｋｆｗｌｋｌが新しいアンカー単位として役割を果たし、図７のスクリーニングをライブラリＣで繰り返して（実施例２、３、および７を参照）、ＳＰＲによってｂＣＡＩＩおよびｈＣＡＩＩに対してそれぞれ６０ｎＭおよび４５ｎＭの結合親和性を示した、三重リガンドｒｆｖｉｌｎ−Ｔｚ２−ｋｗｌｗＧｌ−Ｔｚ１−ｋｆｗｌｋｌを同定した（図６）。
【０２６７】
Ｉｎ  ｓｉｔｕ三重リガンドスクリーニングのそれぞれの事例において、図７を用いて、ヒットしたビーズ中で観察されたアミノ酸の位置依存性の頻度の示すヒストグラムを作成した（図３２）。コンセンサス三次リガンドはＡｚ４−ｎｌｉｖｆｒであった。
【０２６８】
図３２は、三重リガンドを作製するためのアジド含有アミノ酸を（ａ）有するおよび（ｃ）有さないペプチドの第一世代ｉｎ  ｓｉｔｕクリックスクリーニングの位置依存性のヒストグラムを示す。（ａ）Ｉｎ  ｓｉｔｕスクリーニング（Ｔｒｉ１）には、ビーズの１／３がｘ１またはｘ７の位置にアジドを有さなかったが、すべてのヒットしたビーズはアジドを含有していた。（ｂ）ＣｕＡＡＣ（Ｔｚ２、図３２）を介して３°リガンドの可変領域を二重リガンドとカップリングさせた、第一および第二世代のＣｕＡＡＣライブラリスクリーニング（Ｔｒｉ２およびＴｒｉ４）により、ｉｎ  ｓｉｔｕ結果の独立した妥当性確認が得られた。最終的なコンセンサス三重リガンド配列を灰色の書体によって示す。このビーズ上の三重リガンドのスクリーニングおよびｉｎ  ｓｉｔｕスクリーニングのどちらでも同じコンセンサス配列が得られ、２種類のスクリーニングが等価であることが確認された。（ｃ）アジドの非存在下では、三重リガンド捕捉剤の形成が禁止されたため、ｉｎ  ｓｉｔｕ三重リガンドスクリーニングにより、完全に異なり、はるかに相同性の低いヒット配列が得られた（対照スクリーニングＴｒｉＸを実施）。この結果は、標的の表面上で相互作用して多リガンド捕捉剤を形成するアジドおよびアセチレンなどの官能基の重要性を例示している。試料の大きさ：ｉｎ  ｓｉｔｕ＝２５個のヒット、ｉｎ  ｓｉｔｕのアジドなし＝２４個のヒット、ＣｕＡＡＣライブラリ＝２１個のヒット。
【０２６９】
第二世代ｉｎ  ｓｉｔｕスクリーニングＴｒｉ３によって得られたコンセンサス三次リガンドは、第一世代スクリーニング（Ｔｒｉ１）によって単離された三次リガンドとほとんど正確に似ている。そのような配列相同性は、標的に導かれた選択を示すｉｎ  ｓｉｔｕスクリーニングに固有である。
【０２７０】
実施例１２：ビーズ上クリック反応を用いた三重リガンドの合成
個々の６量体からなる三重リガンドは、バルク量で標準の固相合成によって調製し、その後、個々のセグメントをＣｕ（Ｉ）に触媒されるアジド−アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）によってライゲーションすることができる［ＴｏｒｎｏｅおよびＭｅｌｄａｌ、「ペプチドトリアゾール：固相上の銅（Ｉ）に触媒される１，３−双極環付加（Ｐｅｐｔｉｄｏｔｒｉａｚｏｌｅｓ：Ｃｏｐｐｅｒ（Ｉ）−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  １，３−Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ）」、ペプチド：未来の波（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｔｈｅ  Ｗａｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ）（ＬｅｂｅｌおよびＨｏｕｇｈｔｅｎ編、２００１）、２６３ページ、Ｔｏｒｎｏｅら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、６７（９）：３０５７−３０６４（２００２）、Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ，Ｖ．Ｖ．ら、２００２］。
【０２７１】
あるいは、三重リガンド合成をビーズ上で行なうことができる。Ｃｕ（Ｉ）に触媒されるクリック化学反応は、４つの一般的なステップ、すなわち、以前の実施例９に例示した手順に従った（１）アンカーリガンドの合成、（２）アセチル化、（３）クリック反応、および（４）２°リガンド配列の付加を用いて、ビーズ上で実施した。特に、三重リガンドは、完全に保護した二重リガンドアンカー（Ｄ−Ｐｒａ）−ｋｗｌｗＧｌ−Ｔｚ１−ｋｆｗｌｋｌ（０．２７４ｇ、０．１ｍｍｏｌ、＞９８％のＨＰＬＣ）およびビーズと結合した３°リガンドＡｚ４−ｎｌｉｖｆｒ（０．１ｇ、０．０３ｍｍｏｌ）の間のクリック反応によって、ＤＭＦ／ピペリジン（８／２）中のヨウ化銅（０．０２１ｇ、０．１ｍｍｏｌ）およびＬ−アスコルビン酸（０．０２０ｇ、０．１ｍｍｏｌ）を使用して、２５℃、終夜で合成した。
【０２７２】
上記手順は、ライブラリＤ、Ｅ、およびＧの調製（実施例２の表１を参照）、ならびに三重リガンド候補のバルク合成のために使用した。
【０２７３】
実施例１３：タンパク質に触媒されるｉｎ  ｓｉｔｕ多リガンド形成の妥当性確認
タンパク質に触媒される多リガンド捕捉剤を、三重リガンド捕捉剤の生成を例示する図７のスキームに従って調製する。
【０２７４】
特に、図７の図では、タンパク質に触媒される多リガンド捕捉剤を開発するスキームを示す。多リガンドを含む個々のペプチドリガンドの間を架橋するトリアゾール結合の２つの潜在的な構造が可能であることに注意されたい。２つの可能な構造のうちの一方のみを示す。
【０２７５】
Ｉｎ  ｓｉｔｕ多リガンドスクリーニングを図７に従って実施する場合、ビーズ上ｎ次リガンドの非常に小さな画分のみがタンパク質によって溶液相のアンカーリガンドと共有的カップリングしている。標準の方法を用いたビーズ上のｎ次リガンドの分析により、大部分はｎ次リガンド自体の配列に関する情報が得られ、これは、これらが含む分子の＞９９％がビーズと結合しており、完全な多リガンドではないためである。以前に公開されているｉｎ  ｓｉｔｕクリックケミストリースクリーニングでは、クロマトグラフィー分離、続いて質量分析を用いてトリアゾール生成物を同定した［Ｌｅｗｉｓ，Ｗ．Ｇ．ら、２００２、Ｍａｎｅｔｓｃｈ，Ｒ．ら、２００４、Ｂｏｕｒｎｅ，Ｙ．ら、２００４、Ｍｏｃｈａｒｌａ，Ｖ．Ｐ．ら、２００５、Ｗｈｉｔｉｎｇ，Ｍ．ら、２００６］。Ｉｎ  ｓｉｔｕの図７を用いた二重リガンドスクリーニングの事例では、実施例７の対でのスクリーニングを適用した。これは幅広く適用可能な方法ではなかったが、１つの例示的な事例において有効性を示した（図２８）。したがって、代替戦略はタンパク質に触媒される多リガンド捕捉剤の化学が成功であったことを実証するために有用である。
【０２７６】
２つの代替戦略には、配列相同性分析、および１つまたは複数の標識したリガンドの増幅を含むアッセイが含まれる。
【０２７７】
配列相同性：第一世代の二重リガンドおよび三重リガンドのスクリーニングのどちらでも、特筆すべき結果は、ヒットしたビーズで観察された非常に高い配列相同性であった。たとえば、スクリーニングＢｉ１から配列決定した最初の１７個のヒットしたビーズでは２個のペプチドが同一であり、第３のペプチドは単一のアミノ酸のみが変化していた。スクリーニングＴｒｉ１（同じライブラリに対する）では、位置によって最も共通して観察されるアミノ酸（図３２）は、第二世代（集中）スクリーニングＴｒｉ３で同定したコンセンサス配列をほぼ正確に反映している。そのような配列相同性はｉｎ  ｓｉｔｕスクリーニングに固有であり、これらのスクリーニングが選択的の高いヒットを生じるとことがわかった。
【０２７８】
ｉｎ  ｓｉｔｕの図７を用いた三重リガンドスクリーニングの事例では、ヒットしたビーズで観察されたアミノ酸の位置依存性頻度を示すヒストグラムを作成した（図３２Ａ）。そのヒストグラムに基づいて２つの集中したＯＢＯＣライブラリを構築した。第１のライブラリは３°リガンド可変領域のみを含有しており、ｉｎ  ｓｉｔｕスクリーニングＴｒｉ３に使用した。第２のライブラリ（ライブラリＧ）は同じ３°リガンド可変領域を含有しており、ＣｕＡＡＣを介して（Ｔｚ２、図６）二重リガンドとカップリングしていた。このビーズ上の三重リガンドのスクリーニングＴｒｉ４およびｉｎ  ｓｉｔｕスクリーニングＴｒｉ３のどちらでも同じコンセンサス配列が得られた。この２種類のスクリーニングが等価であることが確認された。さらに、第３のｉｎ  ｓｉｔｕスクリーニングＴｒｉＸを実施したが、Ａｚｎ（アジド含有）アミノ酸はＯＢＯＣライブラリに含めず、したがってトリアゾール結合の形成が禁止された。そのスクリーニングにより、非常に異なり、はるかに相同性の低いヒット配列の組が作製された（図３２）。この結果により、多リガンドの提供におけるトリアゾール結合の重要性が確認された。
【０２７９】
標識したリガンドを用いたアッセイ：ビーズ上のタンパク質鋳型の多リガンドを検出するために酵素連結の比色アッセイを開発した（図２９）。この手法は、ビオチンなどの小分子を、スクリーニングで使用する溶液相アンカーリガンドに付随させることに依存する。スクリーニングが完了した後、タンパク質に触媒される多リガンドを含有するビーズのみがその小分子も含有する。その後、その分子は、ある程度の検出可能なシグナルを生じることができる化学構築体を構築するためのハンドルを提供する。最も成功する手法は増幅できるシグナルに依存する。たとえば、酵素を小分子に付随させ、その後、その酵素を利用して何らかの化学的プロセスを触媒する場合は、化学プロセス自体がビーズ上のタンパク質に触媒される多リガンドの増幅したサインを表す。酵素反応によって生成された生成分子は、固有の色、蛍光であるか、または検出することができる何らかの他の珍しい化学的もしくは物理額的特性を有することができ、立ち代ってこれはビーズ上多リガンド生成物の形成の証拠を提供する。図７の３°リガンドスクリーニングの生成物として示す、三重リガンドのビーズ上形成を検出するために利用するそのようなアッセイの結果を図２９に表す。
【０２８０】
特に、図２９Ａの図は、ビオチン標識した二重リガンドアンカー［ビオチン−（ＥＧ）５−（Ｄ−Ｐｒａ）−ｋｗｌｗＧｌ−Ｔｚ１−ｋｆｗｌｋｌ］を用いた、ビーズ上トリアゾール形成のｉｎ  ｓｉｔｕクリックアッセイの模式図を示す。標的の解離後、図２９Ｂは、アルカリホスファターゼ−ストレプトアビジン（ＡＰ−ＳＡ）、その後、ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェート、Ｌｉｕ，Ｇ．およびＫ．Ｓ．Ｌａｍ、２０００に従う）で処理することで、紫色ビーズ（濃い灰色で示す）が多リガンド形成の陽性指示薬として得られることを示す。Ｉｎ  ｓｉｔｕ三重リガンドはｂ（ｈ）ＣＡＩＩタンパク質の存在下のみで形成され、タンパク質がヒトトランスフェリン（Ｔｆ）、ＢＳＡ、または非存在の場合は形成されなかった。また、二重リガンドアンカー配列が不正確な場合も三重リガンドは観察されなかった。
【０２８１】
ビーズ上のタンパク質に触媒される多リガンドタンパク質捕捉剤の形成を検出および定量するためのＰＣＲアッセイ。このアッセイは図２１に示す。ＰＣＲに基づくアッセイは酵素アッセイの変形であり、ＡＰ−ＳＡを小鋳型オリゴヌクレオチド（５’・・・ＮＨ２−（ＣＨ２）６−ＧＧＧＡＣＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＣＴＣＡＣＧＴＧＧＴＡＣＧＡＧＴＴＣＧＴＣＴＣＣＣＡＧＧ・・・３’−配列番号１）とコンジュゲートしたストレプトアビジンで置き換えた。この試薬とビオチン標識した三重リガンドとの結合により鋳型オリゴヌクレオチドがビーズ表面に動員され、ここでＰＣＲによって増幅することができる。増幅の程度はビーズ表面でのオリゴヌクレオチドの量に正比例し、アセンブルされた三重リガンドの定量的な読取値が提供される。
【０２８２】
ストレプトアビジンオリゴ試薬を以下に記載のように調製した。ＳＡＣの発現は以前に公開されているプロトコルに従って行なった（Ｓａｎｏ，Ｔ．およびＣ．Ｒ．Ｃａｎｔｏｒ、１９９０）。
【０２８３】
使用前に、脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、ストックＳＡＣ（ストレプトアビジン−システイン）を、５ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を含有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）に緩衝液交換した。ＤＭＦ中のＭＨＰＨ（塩酸３−Ｎ−マレイミド−６−ヒドラジニウムピリジン、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）をＳＡＣに３００：１のモル濃度過剰量で加えた。平行して、ＤＭＦ中のＳＦＢ（スクシンイミジル４−ホルミルベンゾエート、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を４０：１モル濃度過剰量で５’アミノ化オリゴに加えた。混合物を室温で３〜４時間反応させた。過剰のＭＨＰＨおよびＳＦＢを除去し、試料を、ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、クエン酸緩衝液（５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）に緩衝液交換した。その後、ＳＦＢで標識したオリゴを２０：１モル濃度過剰量で誘導体化したＳＡＣと合わせ、２〜３時間、室温で反応させた後、終夜、４℃でのインキュベーションに移した。０．５ｍｌ／分のＰＢＳの均一濃度流のＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲル濾過カラムを用いて反応していないオリゴを除去した。１０Ｋ  ｍｗｃｏ濃縮フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＳＡＣ−オリゴコンジュゲートを含有する画分を濃縮した。ＳＡＣ−オリゴ構築体の合成は、非還元の８％のトリス−ＨＣｌ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検証した。
【０２８４】
三重リガンド含有ビーズを上述のように調製した（図２９Ａを参照）。標的の解離後、０．５ｍｇのビーズを水で１０回洗浄し、遮断緩衝液（０．１５％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、１５０μｇ／ｍＬの剪断サケ精子ＤＮＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．４）に再懸濁させた。ビーズを１００μＬの遮断緩衝液で３回洗浄し、１時間、２５℃で、１００μＬの遮断緩衝液中でインキュベーションした。その後、ビーズを濾過し、１００μＬの遮断緩衝液でさらに２回洗浄した。１００μＬのストレプトアビジン−オリゴ（遮断緩衝液中に１７０ｎｇ／ｍＬ）を加え、ビーズを１時間、２５℃でインキュベーションした。ビーズを２５０μＬの遮断緩衝液で５回洗浄し、続いて２５０μＬのＰＢＳで３回洗浄した。ビーズをｄＨ２Ｏに再懸濁させ、スライドガラス上にスポットした。蒸発後、ビーズを手動で選び取り、薄壁ＰＣＲ管内に入れた。
【０２８５】
定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）をＢｉｏ−ＲａｄリアルタイムＰＣＲシステム上で実施した。１〜５個の個別のビーズを含有するそれぞれの管に、１２．５μＬのｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、１１．５μＬのｄＨ２Ｏ、１００ｎＭの順方向プライマー（５’・・・ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＡＣＡ・・・３’−配列番号２）、および１００ｎＭの逆方向プライマー（５’・・・ＡＣＣＧＣＴＧＣＣＡＧＡＣＣＣＣＧＡＴＴＴＧＧＣＣＴＧＧＧＡＧＡＣＧＡＡＣＴＣＧ・・・３’、配列番号３）を加えた。リアルタイムＰＣＲは、以下の熱プロフィールを用いて３０サイクル実施した：９４℃、３０秒間、５０℃、４５秒間、７２℃、６０秒間。０．０１ｎＭ〜０．０１ｐＭの範囲の既知の鋳型濃度を用いて検量線を作成した。既知の濃度のそれぞれの計数値を鋳型濃度の対数に対してプロットして直線検量線を作成し、その後、これを使用してそれぞれの試料管中のオリゴの濃度を決定した。これを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定したストレプトアビジン四量体あたりの存在するオリゴヌクレオチド鋳型の数に基づいて調節した。
【０２８６】
実施例１４：三重リガンドの親和性測定
実施例１０に例示した方法を用いて、三重リガンド捕捉剤およびｂ（ｈ）ＣＡＩＩの間の特異的相互作用を説明する結合親和性測定を行なった。その後、４つのフローセルにわたって１００μＬ／分の流速、１２０〜１８０秒間の接触時間、および３００秒間の解離相で、様々な濃度にわたって三重リガンド（図３３）分析物の応答データを収集した。バックグラウンド減算の後、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて分析物の応答データを１：１の結合親和性に当てはめた。図３３に代表的な結果を示す（図３３Ａおよび図３３Ｂ）。
【０２８７】
特に、図３３Ａの図は、漸増する濃度の三重リガンドｒｆｖｉｌｎ−Ｔｚ２−ｋｗｌｗＧｌ−Ｔｚ１−ｋｆｗｌｋｌ（０．１ｎＭから１６２ｎＭ）を用いて得られたＳＰＲ応答センサーグラムを示し、ヒト（図３３Ａ）およびウシ（図３３Ｂ）のＣＡ  ＩＩでそれぞれ４５ｎＭおよび６４ｎＭの親和性が実証された。これらの平衡解離定数は、二重リガンドと標的の間の相互作用と比較して５０倍の親和性の増強を表している（図２８も参照）。
【０２８８】
実施例１５：三重リガンドの存在下における酵素活性アッセイ
基質４−酢酸ニトロフェニルに対するｂＣＡＩＩの酵素活性（４−ＮＰＡ、Ｐｏｃｋｅｒ，Ｙ．およびＪ．Ｔ．Ｓｔｏｎｅ、１９６７）を、三重リガンド捕捉剤の存在および非存在下、ならびに対照としてｂＣＡＩＩの非存在下で測定した。三重リガンド捕捉剤がアッセイ中に存在する場合は経時的なエステラーゼ活性に変化がなかった。
【０２８９】
実験結果を図３４に表す。三重リガンドはｂＣＡＩＩの酵素活性を妨害しないことが観察され、活性部位の正常な触媒作用から離れて結合する、または少なくともそれを妨害しないように見えた。そのような、オフサイトであるが高度に選択的な結合は、タンパク質に対して産生した天然抗体に一般的であり、目前の技術の範囲を良好に予示している。
【０２９０】
実施例１６：血清中のドットブロット選択性／感度アッセイ
ドットブロットは、タンパク質を検出する一般的な方法である。複合体環境における多リガンド（二重リガンドおよび三重リガンド）捕捉剤のｂ（ｈ）ＣＡＩＩに対する感度および選択性を、１０％のブタ血清中のドットブロット実験を使用することによって実証した。ドットブロットには、目的タンパク質を含有する溶液を単純に吸収膜材料（典型的にはニトロセルロース）上にドットする。捕捉剤（典型的には抗体）をビオチン分子で標識し、同じスポットに施用する。スポットをすすぎ、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識したストレプトアビジンを加え、タンパク質と結合したビオチンと結合させる。典型的には光学的方法を利用してこの結合を検出する。
【０２９１】
これらの試験では、ビオチン−ＰＥＧ−ＮｏｖａＴａｇ樹脂（０．４８ｍｍｏｌ／ｇ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）をＣ末端ビオチン標識多リガンドのバルク合成に利用する。樹脂の切断後、粗ビオチン標識した多リガンドをエーテルで沈殿させ、その後、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣによって＞９８％まで精製した。
【０２９２】
ドットブロットアッセイでは、手順は以下のとおりであった：ｂ（ｈ）ＣＡＩＩ抗原をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１ｍｇ／ｍＬのストックとして調製した。抗原の希釈系列を、典型的には２μｇ〜０．５ｎｇ／スポットの範囲でニトロセルロース膜に施用した。膜を４℃、終夜、トリス−緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）［２５ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ（ｐＨ８．０）］中の５％の乳で遮断した。その後、膜をＴＢＳで洗浄した。ビオチン標識した多リガンドを１μＭのＴＢＳ＋０．１％のＤＭＳＯ中の１０％のブタ血清で調製し、膜上で終夜、４℃でインキュベーションした。ＴＢＳで１時間洗浄した後、０．５％の乳／ＴＢＳ中で調製した１：３０００のストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）を膜に加え、１時間インキュベーションした。ＴＢＳで１時間洗浄した後、膜を化学発光試薬で処理し（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光エンハンサーおよび基質溶液、Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、その後、すぐにフィルム上で現像した。
【０２９３】
ｈＣＡＩＩおよびｂＣＡＩＩをブタ血清から検出するために二重リガンド（図１４）および三重リガンド（図１５）を使用するドットブロットアッセイの結果を図２１に示す。ｂＣＡＩＩおよびｈＣＡＩＩは、配列が＞８０％同一であることに注意されたい（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＣＡ２、１Ｖ９Ｅ）。
【０２９４】
特に、図２１Ａは、１０％のブタ血清における三重リガンドによるｂ（ｈ）ＣＡＩＩの検出限界を例示するドットブロットを示す。この検出限界は２０ｎｇのタンパク質である。図２１Ｂは、０．１％の血清中で二重リガンドアンカー（Ｄ−Ｐｒａ）−ｋｗｌｗＧｌ−Ｔｚ１−ｋｆｗｌｋｌを捕捉剤として使用する場合、感度が＞１０倍低下することを示している。
【０２９５】
実施例１７：分枝状多リガンド捕捉剤
直鎖状ポリペプチド鎖は、折り畳まれた構造を採用することによって潜在的なタンパク質標的といくつかの可能な三次相互作用を示す場合がある。分枝状オリゴペプチドはそのような折り畳まれた構造を真似ることができるが、はるかに小さなフットプリントを有する（したがって作製がはるかに安価である）という主要な利点を持つ。また、図８に例示した方法によって調製した分枝状多リガンド捕捉剤も、多数の所望の化学的、物理的、および生化学的な特性、すなわち、抗体および天然のポリペプチドが安定でない様々な環境における安定性を示すことができる。
【０２９６】
低分子量ペプチドとの捕捉剤の結合力の向上には、分枝状および直鎖状の多リガンド捕捉剤の比較結合動力学および熱力学が関係している。図１７はこの効果を模式的に例示している。
【０２９７】
特に、図１７の図は、直鎖状と分枝状の三重リガンド捕捉剤を模式的に比較する。図１７Ａは、単一のペプチド鎖である直鎖状三重リガンド捕捉剤を示す。図１７Ｂ（１つの分枝点）および図１７Ｃ（２つの分枝点）は、分枝状三重リガンド捕捉剤の代表的な構造を示す。分枝状多リガンド中の分枝点は、直鎖状多リガンドと比較しておよび分枝状捕捉剤のクラス内で異なるコンホメーション動力学を与える。分枝状多リガンド構造におけるこれらの結合の周りの制限された回転は、同様に開発したが直鎖状である多リガンド捕捉剤と比較して結合力を増加させる潜在性を有する。
【０２９８】
図８に例示した方法を用いて、ｂ（ｈ）ＣＡＩＩタンパク質に対する分枝状多リガンド捕捉剤が開発されている。直鎖状の事例（図７）と同様、アンカーリガンドｌｋｌｗｆｋ−（Ｄ−Ｐｒａ）を２世代のｉｎ  ｓｉｔｕ二重リガンドスクリーニングで利用した。第一世代スクリーニングＢｒＢｉ１により、分枝を許容する二次（２°）リガンドのライブラリ（ライブラリＨ）内の位置を同定した。スクリーニングＢｒＢｉ１では、５０ｎＭのｂＣＡＩＩ−Ａｌｅｘａ６４７の溶液を、ペプチドアンカーリガンド（ｌｋｌｗｆｋ−（Ｄ−Ｐｒａ）、タンパク質に対して２０００×）と共に、２時間、３７℃で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０＋０．１％のＢＳＡ＋０．０５％のＮａＮ３＋１％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）中でプレインキュベーションした。アンカーリガンド／タンパク質の溶液をライブラリＨに加え、１８時間、３７℃で振盪しながらインキュベーションした。スクリーニングしたビーズを６×５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０＋０．１％のＢＳＡ＋０．０５％のＮａＮ３、２×５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０、および４×５ｍＬのＰＢＳで洗浄した。実施例３に概要を示したプロトコルを用いてビーズを蛍光についてイメージングした。ヒット（ｉｎ  ｓｉｔｕ二重リガンドを表す）をマイクロピペットによって選び取り、７．５Ｍの塩酸グアニジン（ｐＨ２．０）で加工して、結合したタンパク質を除去し、その後、エドマン分解によって分析して二次リガンド配列を解読した。
【０２９９】
スクリーニングＢｒＢｉ１の結果を表３に示す。選択した二次リガンド中の４個目の残基としてのＡｚ４の高度な保存は、本発明者らの図８の方法が分枝点の選択に成功したことを示している。
【０３００】
【表３】
0005647113.tif 000007
【０３０１】
二次（２°）リガンドの集中したライブラリ（ライブラリＩ）を用いた第二世代スクリーニングＢｒＢｉ２により、ｖｋｗ（Ａｚ４）ｆｗおよびｗｋｖ（Ａｚ４）ｌｗが２つの最適化された二次リガンド候補として同定された。スクリーニングＢｒＢｉ２では、１０ｎＭ〜５００ｐＭの範囲のｂＣＡＩＩ−Ａｌｅｘａ６４７の溶液を、ペプチドアンカーリガンド（ｌｋｌｗｆｋ−（Ｄ−Ｐｒａ）、４０μＭ）と共に、２時間、２５℃で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０＋０．１％のＢＳＡ＋０．０５％のＮａＮ３＋１％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）中でプレインキュベーションした。アンカーリガンド／タンパク質の溶液をライブラリＩに加え、１５時間、２５°で振盪しながらインキュベーションした。スクリーニングしたビーズを洗浄し、蛍光についてイメージングし、実施例３に概要を示したプロトコルを用いて選び取った。７．５Ｍの塩酸グアニジン（ｐＨ２．０）で処理して、結合したタンパク質を除去した後、エドマン分解による分析により最適化された二次リガンド配列のリストが得られ、これを実施例７に記載のヒストグラム分析に供した。ヒストグラム分析により、スクリーニングＢｒＢｉ２からのすべてのヒットが単一のコンセンサス配列、ｘ１−ｋ−ｘ３−Ａｚ４−ｘ５−ｗを含有していることが例示された。２つの分枝状二重リガンド捕捉剤候補、ｖｋｗ（Ｔｚ１）ｆｗ−ｋｆｗｌｋｌおよびｗｋｖ（Ｔｚ１）ｌｗ−ｋｆｗｌｋｌ（前者は図１６Ａの分子構造によって示される）は、同じスクリーニング中に２回観察され、試験した最低タンパク質濃度（すなわち≦１ｎＭの標的）での唯一のヒットとして単離されたことから、優勢であると考えられた。
【０３０２】
ビーズ上クリック反応を用いた分枝状二重リガンドの合成。分枝状二重リガンドの合成を、直鎖状二重リガンドの合成（実施例９のスキーム２）の改変によって、スキーム４に示すように行なった。最初に、Ｎα−Ｆｍｏｃ保護戦略を用いて二次（２°）リガンドをＦｍｏｃ−ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（０．６７ｍｍｏｌ／ｇ）上に合成した。末端アミノ酸（たとえば、スキーム４に示すＤ−Ｖａｌ）をＮα−Ｂｏｃの保護された型として設置し、これはこのセグメント上にさらなる合成をかぶせた。次に、２５℃、終夜のＤＭＦ／ピペリジン（８／２）中のヨウ化銅（０．１５ｍｍｏｌ）およびＬ−アスコルビン酸（０．１５ｍｍｏｌ）を用いたＣｕＡＡＣによって、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｒａ−ＯＨ（０．１５ｍｍｏｌ）を、ビーズと結合した二次リガンド（０．０３ｍｍｏｌ）と共有結合させた。さらなるペプチド合成のための末端アミンを現すこの分枝点に、アンカーリガンド配列（ｌｋｌｗｆｋ）の残りの部分を、標準のＮα−Ｆｍｏｃ保護戦略によってカップリングさせた。９５：５のＴＦＡ：トリエチルシラン（ＴＥＳ）捕捉剤で処理した後、この分枝状二重リガンドをＨＰＬＣによって＞９５％まで精製した。
【０３０３】
【化３】
0005647113.tif 000008
【０３０４】
図１６Ａは、ｂＣＡＩＩに対する分枝状二重リガンド捕捉剤ｖｋｗ（Ｔｚ１）ｆｗ−ｋｆｗｌｋｌの化学構造を示す。分枝状二重リガンド捕捉剤とｂＣＡＩＩの間の特異的相互作用を説明する結合親和性測定を、実施例１０に詳述したＳＰＲ方法を用いて行なった。図１６Ｂは、漸増する濃度の二重リガンド（０から１６５６ｎＭ）を用いて得られたＳＰＲ応答センサーグラムを示し、ｂＣＡＩＩに対する５００ｎＭの二重リガンド親和性が実証された。同様に開発した直鎖状二重リガンド捕捉剤の結合親和性と比較した場合（図２８も参照）、この分枝状の実態の親和性は５倍良好であった。したがって、分枝状三重リガンドはこの同じ親和性増強を順守することができ、ｐＭの親和性を示すはずである。
【０３０５】
より長い分枝状多リガンド捕捉剤のアンカーリガンドとしての分枝状二重リガンドの利用。
【０３０６】
分枝状二重リガンドが同定された後、その分枝状二重リガンドが図８のアンカーリガンドとして役割を果たすことができ、分枝状三重リガンドを三次（３°）スクリーニングで選択することができる。さらにより集中した二次（２°）リガンドのライブラリ（ライブラリＪ）を用いた第三世代スクリーニングＢｒＢｉ３により、Ｄ−Ｌｙｓが位置ｘ０に新しい分枝点を設置するための適切なアミノ酸であることが同定された。スクリーニングＢｒＢｉ３では、１０ｎＭのｂＣＡＩＩ−Ａｌｅｘａ６４７の溶液を、ペプチドアンカーリガンド（ｌｋｌｗｆｋ−（Ｄ−Ｐｒａ）、４０μＭ）と共に、２時間、２５℃で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０＋０．１％のＢＳＡ＋０．０５％のＮａＮ３＋１％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）中でプレインキュベーションした。アンカーリガンド／タンパク質の溶液をライブラリＪに加え、１５時間、２５℃で振盪しながらインキュベーションした。スクリーニングしたビーズを洗浄し、蛍光についてイメージングし、実施例３に概要を示したプロトコルを用いて選び取った。７．５Ｍの塩酸グアニジン（ｐＨ２．０）で処理して、結合したタンパク質を除去した後、エドマン分解による分析により、表４に示す配列が得られた。表４の分析により、第２の分枝点がｘ０に設置されたｋｗｋｖ（Ａｚ４）ｌｗが、分枝状二重リガンドアンカーの構築に適切であるという判断がもたらされた。
【０３０７】
【表４】
0005647113.tif 000009
【０３０８】
ｎ次分枝状多リガンド捕捉剤を選択するためのｎ次アンカー中の新しい分枝点位置を同定するために、三重リガンド、四重リガンドなどを用いてＢｒＢｉ３スクリーニングの方法を繰り返すことができる。
【０３０９】
分枝状二重リガンドアンカーの合成を、スキーム４の軽微な改変によってスキーム５に示すように行なった。最初に、標準のＮα−Ｆｍｏｃ保護戦略を用いて二次（２°）リガンドをＦｍｏｃ−ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（０．６７ｍｍｏｌ／ｇ）上に合成した。この二次（２°）リガンドのＮ末端位置は、Ｄ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）（ｉｖＤｄｅ＝１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）−３−メチルブチル）の取り込みによって第２の分枝点を提示するように合成し、これにより、後の段階での選択的脱保護およびＤ−Ｌｙｓ側鎖との反応が可能となった。Ｄ−ＬｙｓはスクリーニングＢｒＢｉ３によって選択されたｘ０残基であることに注意されたい。このＤ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）カップリングおよび無水酢酸を用いたキャッピング後（実施例９を参照）、修飾された二次リガンドＡｃ−ｋ（ｉｖＤｄｅ）ｗｋｖ（Ａｚ４）ｌｗが生じた。次に、２５℃、終夜のＤＭＦ／ピペリジン（８／２）中のヨウ化銅（０．１５ｍｍｏｌ）およびＬ−アスコルビン酸（０．１５ｍｍｏｌ）を用いたＣｕＡＡＣによって、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｒａ−ＯＨ（０．１５ｍｍｏｌ）を、ビーズと結合した修飾した二次リガンド（０．０３ｍｍｏｌ）と共有結合させた。さらなるペプチド合成のための末端アミンを現すこの分枝点に、アンカーリガンド配列（ｌｋｌｗｆｋ）の残りの部分を、標準のＮα−Ｆｍｏｃ保護戦略によってカップリングさせた。最後に、ＤＭＦ中の２％のヒドラジンを用いた処理によるｉｖＤｄｅ保護基の選択的除去により第一級アミンが現れ、これにＦｍｏｃ−Ｄ−Ｐｒａ−ＯＨを標準のアミドカップリング化学によってカップリングさせる。
【０３１０】
【化４】
0005647113.tif 000010
【０３１１】
分枝状三重リガンド捕捉剤の同定。分枝状三重リガンド捕捉剤を同定するために、スキーム５の分枝状二重リガンドアンカー（Ｄ−Ｐｒａ）−ｋｗｋｖ（Ｔｚ１）ｌｗ−ｋｆｗｌｋｌを用いて、図８に示した方法に従ってｂＣＡＩＩおよびライブラリＣに対する三次（３°）スクリーニングを行なった。スクリーニングＢｒＴｒｉ１では、５０ｎＭのｂＣＡＩＩ−Ａｌｅｘａ６４７の溶液を、１００μＭの分枝状二重リガンドアンカーと共に、２時間、２５℃で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０＋０．１％のＢＳＡ＋０．０５％のＮａＮ３＋１％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）中でプレインキュベーションした。アンカーリガンド／タンパク質の溶液をライブラリＣに加え、１６時間、２５℃で振盪しながらインキュベーションした。スクリーニングしたビーズを洗浄し、蛍光についてイメージングした、実施例３のプロトコルを用いて選び取った。７．５Ｍの塩酸グアニジン（ｐＨ２．０）で処理して、結合したタンパク質を除去した後、エドマン分解による分析により三次（３°）リガンド配列が得られた。実施例１１の方法に従った三次リガンド配列のヒストグラム分析により、図１７Ｂの模式図および図１８の分子構造によって示されるものなどの、分枝状三重リガンド捕捉剤が得られた。
【０３１２】
実施例１８：多リガンド捕捉剤の合成方法
アジドおよびアセチレンなどの官能基は（図２）、実施例５および実施例１７に例示したように、多リガンド捕捉剤のタンパク質に触媒されるアセンブリを可能にする。官能基は単なるスクリーニングツールであり、診断学アッセイ、分離などに実装する捕捉剤中に必ずしも所望されるものではない。そのようなアッセイのために多リガンド捕捉剤をバルク量で合成する手順は、アジド−アルキン１，２，３−トリアゾールリンカーを２−アミノ酸リンカーによって置き換えることを含む（図３５を参照）。この代替リンカーは、現在の自動ペプチド合成装置を改変することなしに、捕捉剤の高スループット生産を可能にする。図３５Ａは、ｂＣＡＩＩに対する三重リガンド捕捉剤中の１，２，３−トリアゾールリンカー（Ｔｚ１およびＴｚ２）を置き換える代替リンカーをスクリーニングするために利用する１つのＯＢＯＣライブラリの形成を示す。上記実施例３に従ってこのライブラリを用いてスクリーニングを実行した。
【０３１３】
図３５Ｂは代表的なヒットを示し、どのＤ−アミノ酸がＴｚ１およびＴｚ２の適切な置換えとなるかを示す。これらのヒットのいくつかの分子構造を図３６に示す。図３６ＡはＴｚＲ１と示し、Ｔｚ２＝Ｇｆであり、Ｔｚ１＝ｎｋであり、図３６ＢはＴｚＲ３と示し、Ｔｚ２＝ａｌであり、Ｔｚ１＝ｄｋであり、図３６ＣはＴｚＲ２と示し、Ｔｚ２＝ｐｓであり、Ｔｚ１＝ｖｖである。
【０３１４】
１，２，３−トリアゾール自体の新しい代理は、図３７Ｃに示すように１つの主鎖アミド結合であることに注意されたい（Ｂｏｃｋ，Ｖ．Ｄ．ら、２００６から再現）。アミド結合は、１，２，３−トリアゾールの原子配置および電子特性を模倣することができる強固な連結単位として機能する（Ｋｏｌｂ，Ｈ．Ｃ．およびＫ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ、２００３、Ｂｏｃｋ，Ｖ．Ｄ．ら、２００６）。しかし、Ｔｚ１およびＴｚ２リンカーはアジドブチルおよびプロパルギルの側鎖基間の１，２，３−トリアゾールの共有的合成を表し（図６を参照）、したがって、理想的には２〜５個のアミド結合がリンカー全体の原子配置および電子特性を模倣することができる。図３５Ｃは、選択したアミドリンカーが元のＴｚ１およびＴｚ２リンカーよりもコンパクトであることができることを示す図である。アミドリンカーの模倣体を、本実施例１６、２０、および２１に記載のタンパク質アッセイ（たとえば、ウエスタンブロット、ドットブロット、およびＥＬＩＳＡ様アッセイ）における捕捉剤の特性を変化させる手段として活用することができる。
【０３１５】
代理アミド結合を有する三重リガンド捕捉剤の特性を図３７に例示する。円二色性（ＣＤ）実験によって、三重リガンド捕捉剤ＴｚＲ１は元の三重リガンド配列（ｒｆｖｉｌｎ−Ｔｚ２−ｋｗｌｗＧｌ−Ｔｚ１−ｋｆｗｌｋｌ、図６）と類似構造を共有することが見いだされ、これらはどちらもランダムコイルである（図３７Ａ）。対照的に、ＴｚＲ２およびＴｚＲ３は、図６の三重リガンドとは異なるその強力なα−ヘリックス特徴に基づいて、適切な候補から除外された。ＴｚＲ１とｂ（ｈ）ＣＡＩＩの間の結合相互作用をＳＰＲによって測定した際、平衡解離定数は高いｎＭとして推定された（図３３Ｂ）。ランダムコイル構造およびより長い３〜５個のアミノ酸リンカーの長さに集中する、代理アミド結合を有する三重リガンドの第二世代スクリーニングにより、ＫＤが４５〜６４ｎＭまたは元の三重リガンドよりも良好な代理三重リガンドを得ることができる。
【０３１６】
Ｔｚ２リンカーを置き換えるアミノ酸３個のリンカーを同定するスクリーニング手法の例を図３８に示す。このスクリーニング手法はＥＬＩＳＡ様サンドイッチアッセイであるが（実施例２１を参照）、基質がマイクロウェルではなくビーズであることに注意されたい。この手法では、最初に、合計５８３２個の配列の、アミノ酸３個のリンカーの包括的なライブラリ（Ｘｉ＝Ｄ−ＭｅｔおよびＤ−Ｃｙｓ以外の任意のＤ−立体異性体）を、終夜、２５℃で、遮断緩衝液（２５ｍＭのトリス−Ｃｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１４ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５））中で遮断する。遮断後、包括的なライブラリを標的（たとえば１０ｎＭ〜１μＭのｂＣＡＩＩ）と接触させる。１時間、２５℃で接触させた後、ライブラリ／標的の複合体を５×１ｍＬの遮断緩衝液で洗浄して過剰の標的を除去し、その後、一次抗体（たとえば、ウサギポリクローナル抗ｂＣＡＩＩ、１：５０００の希釈率）と共に１時間インキュベーションした。ビーズを遮断緩衝液で洗浄して過剰の一次抗体を除去し、その後、遮断緩衝液中の二次抗体（たとえば、抗ウサギＩｇＧ、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート、１：２０００の希釈率）と共に、３０分間、振盪しながらインキュベーションした。５×１ｍＬの洗浄１緩衝液（２５ｍＭのトリス−Ｃｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、７００ｍＭのＮａＣｌ、１４ｍＭの２−メルカプトエタノール、ｐＨ７．５）、続いて５×１ｍＬの洗浄２緩衝液（２５ｍＭのトリス−Ｃｌ、１４ｍＭの２−メルカプトエタノール、ｐＨ７．５）でビーズを洗浄することによって、過剰の二次抗体を除去した。ビーズを発色基質ＢＣＩＰ中で２０分間展開させた。最も濃い紫色ビーズをヒットとして選択し、塩酸グアニジン（ｐＨ２．０）で洗浄して結合したタンパク質を除去し、その後、実施例３に記載のようにエドマン分解によって配列決定してＸ１、Ｘ２、およびＸ３を同定した。
【０３１７】
実施例１９：二重リガンドおよび三重リガンド捕捉剤−構造的な考察。
【０３１８】
タンパク質に触媒される二重リガンド捕捉剤およびタンパク質に触媒される三重リガンド捕捉剤の構造をそれぞれ図５および図６に示す。これらの捕捉剤は、実施例４〜１２の方法に従って作製した。
【０３１９】
非天然アミノ酸（Ｄ−立体異性体）および人工アミノ酸からなる１°ペプチドリガンドから開始して、図５および図６に示す捕捉剤を逐次的にアセンブルした。１°ペプチドリガンド、タンパク質ｂＣＡＩＩ、および大きな１ビーズ−１化合物のライブラリからなる、タンパク質に触媒されるスクリーニングを利用して二重リガンド（１°＋２°）を同定した。三重リガンド（１°＋２°＋３°）を同様に調製したが、ただし、二重リガンドおよびタンパク質ｂＣＡＩＩを大きな１ビーズ１化合物のライブラリに対してスクリーニングした。
【０３２０】
図１４および図１５に示すように、これらの捕捉剤は、ビオチン分子をリガンド構成成分のうちの１つの末端に付加することによって修飾することができる。アンカーリガンド（図２６）および二重リガンドは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、他のフルオロフォア、他の小分子標識、オリゴヌクレオチド、および捕捉剤と部位特異的にカップリングさせることができるタンパク質で修飾することができる。
【０３２１】
実施例２０：多リガンド捕捉剤を用いて行なうウエスタンブロット。
【０３２２】
ウエスタンブロットは、タンパク質を検出するための２番目に一般的な方法である。ネイティブウエスタンブロットおよびウエスタンブロット手順の違いは、標準のウエスタンブロットでは検出するタンパク質が変性していることである。
【０３２３】
タンパク質を検出するためのネイティブウエスタンブロット方法では、試料中のタンパク質を非変性ゲル電気泳動に供し、吸収膜に移す。それだけには限定されないが抗体または多リガンドが含まれる捕捉剤を用いて膜上のタンパク質を調べる。捕捉剤と標的との特異的結合の後、捕捉剤と特異的に結合させるために二次検出剤を加える。二次検出剤（たとえばストレプトアビジン−ＨＲＰ）は、多くの場合、結果の可視化を可能にする化学発光を示す。
【０３２４】
三重リガンドおよび市販の抗体の間の直接比較を伴う、１０％の血清からのｂＣＡＩＩを検出するためのネイティブウエスタンブロットの例示を図２２に示す。
【０３２５】
図２２Ａは、全タンパク質含有物を詳しく示す、クマシー染色したネイティブゲルを示す。一次抗体（図２２Ｂ）または三重リガンド捕捉剤（図２２Ｃ）でプローブするネイティブウエスタンブロットは、血清の存在下でもｂＣＡＩＩに対する強力な選択性を例示し、三重リガンドが市販の抗体とほぼ同等に感受性があることを示している。
【０３２６】
実施例２１：多リガンド捕捉剤を用いて実行するＥＬＩＳＡ様サンドイッチアッセイ。
【０３２７】
サンドイッチアッセイは、タンパク質を検出するための３番目に一般的な方法である。サンドイッチアッセイは、目的の標的（タンパク質）を検出するために２つの抗体、すなわち一次捕捉抗体（１°）および標識した検出抗体（２°抗体）に依存する。１°抗体は、典型的には、９６ウェルプレート内のウェルの表面などの表面上にコーティングする。タンパク質を含有する血清などの溶液をウェルに加え、タンパク質を表面まで拡散させ、ここでこれが１°抗体によって捕捉される。その後、２°抗体を同じウェルに加える。この抗体は、検出するタンパク質の異なる結合部位またはエピトープと結合するように設計されており、この２°抗体は、タンパク質＋抗体の複合体全体が光学的手段または何らかの他の手段によって検出されることを可能にするように、標識することができる。光学的検出には、標識は、多くの場合、光学吸収性の色素分子または蛍光色素分子であり、その標識は、多くの場合、最初にビオチンを２°抗体にコンジュゲートさせ、その後、標識したタンパク質（たとえばストレプトアビジン）をビオチンと結合させることを用いることによって、２°抗体に付着させる。他の方法、たとえば、蛍光標識を２°抗体に直接付着させること、または蛍光もしくは光学吸収性の色素分子の代わりに金ナノ粒子を標識として利用すること、または放射性分子を標識として使用することなどが可能であり、この場合、最終検出はシンチレーションカウンターまたは適切に感光性にしたフィルムを用いて行なう。
【０３２８】
典型的なＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイでは、一次捕捉抗体（１°）を表面（たとえば９６ウェルプレート内のウェル）上にコーティングし、その後、標的分子を含有する溶液を表面まで拡散させて特異的に結合させる。標識した（たとえばビオチン）検出抗体（２°）が、標的分子上の直交性部位と特異的に結合することによって「サンドイッチ」を完成する。その後、標識を蛍光または何らかの他の光学的方法によって検出し、シグナル強度はアッセイにおいて捕捉された標的分子の量に比例する。
【０３２９】
市販の抗体（２°捕捉剤）および三重リガンド（１°捕捉剤として）の組合せを使用した、ｂＣＡＩＩを検出するためのストレプトアビジンで官能化されたマイクロタイタープレート上におけるサンドイッチ型ＥＬＩＳＡアッセイの例示を図２３に示す。
【０３３０】
図２３  ２４は、ｂＣＡＩＩタンパク質を検出するために三重リガンドを用いたＥＬＩＳＡ様サンドイッチ吸光度アッセイを示す。特に、図２３Ａは、完全にアセンブルしたアッセイの構造を示す。図２３Ｂは、９６ウェルプレートのウェルで行なった、様々な濃度のｂＣＡＩＩでのＥＬＩＳＡアッセイの実験データを示す。漸増するｂＣＡＩＩ濃度は濃くなっていく灰色として検出される。図２３Ｃ〜２３Ｄは２つの典型的なアッセイ条件を示す。図２３Ｃは、ｂＣＡＩＩを緩衝溶液中に提示して行なったアッセイであり、一方、図２３Ｄは１０％のブタ血清中で行なったアッセイであり、三重リガンド捕捉剤または検出抗体のどちらによっても特異的結合は損なわれなかった。
【０３３１】
要約すると、いくつかの実施形態では、２つ以上のリガンドを含む多リガンド捕捉剤、ならびに関連組成物、方法および系が記載されている。
【０３３２】
上述の実施例は、本開示の装置、系および方法の実施形態をどのように作製および使用するかの完全な開示および説明を当業者に与えるために提供し、本発明者らがその開示とみなす範囲を限定することを意図しない。本開示中に言及するすべての特許および出版物は、本開示が関連する分野の技術者の技術レベルの指標である。本開示中に引用したすべての参考文献は、それぞれの参考文献を個別にその全体で参考として組み込んだ場合と同じ程度に、参考として組み込まれている。
【０３３３】
引用したそれぞれの文書（特許、特許出願、雑誌論文、要旨、実験室の手引き、本、または他の開示が含まれる）の開示は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている。
【０３３４】
さらに、本出願と共に提出した配列表の印刷物および対応するコンピュータ読取可能な形態は、どちらもその全体で本明細書中に参考として組み込まれている。
【０３３５】
本開示は特定の組成物または生物系に限定されず、これらはもちろん変動することができることを理解されたい。また、本明細書中で使用する用語は特定の実施形態を説明する目的のためのみであり、限定することを意図しないことも理解されたい。本明細書および付随する特許請求の範囲中で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、内容により明らかにそうでないと指示される場合以外は、複数形の指示対象が含まれる。用語「複数（ｍｕｌｔｉｐｌｅおよびｐｌｕｒａｌｉｔｙ）」には、内容により明らかにそうでないと指示される場合以外は、２つ以上の指示対象が含まれる。別段に定義しない限りは、本明細書中で使用するすべての技術用語および科学用語は、本開示が関連する分野の技術者に一般的に理解されるものと同じ意味をもつ。
【０３３６】
本開示のいくつかの実施形態を記載した。とはいえ、本開示の精神および範囲から逸脱せずに様々な改変を行ない得ることを理解されたい。特に、当業者に明らかな上述の発明を実施するための形態の改変は、本開示の範囲内にあることを意図する。したがって、他の実施形態が以下の特許請求の範囲内にある。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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