(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
0005491364.tif 000006
（式中：
Ｘは、場合により
−Ｏ−；
−Ｓ（Ｏ）0-2；
−Ｎ（Ｒ5）−；
−Ｎ（Ｒ5）−Ｃ（Ｏ）−；
−Ｎ（Ｒ5）−Ｓ（Ｏ2）−；
−Ｎ（Ｒ5）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ5）−；
−Ｎ（Ｒ5）−Ｃ（Ｓ）−Ｎ（Ｒ5）−；および
−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ5）−；
の１つまたはそれ以上によって中断されたアルキレン基であり；
Ｙは、１つの結合であるか、または
−Ｎ（Ｒ5）−；
−Ｎ（Ｒ5）−Ｃ（Ｏ）−；
−Ｎ（Ｒ5）−Ｃ（Ｏ）−シクロヘキシル−；
−Ｎ（Ｒ5）−Ｃ（Ｏ）−フェニレン−；および
−フェニレン−
よりなる群から選択され；
ＺAは、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、
Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、
マレイミド、
ヨードアセチル基、
フェニルアジド、
４−アジドフェニル、
２−ヒドロキシ−４−アジドフェニル、
２−ニトロ−４−アジドフェニル、および
２−ニトロ−３−アジドフェニル
よりなる群から選択され、
Ｒ2は、
−水素；
−アルキル；
−アルケニル；
−アリール；
−置換アリール；
−ヘテロアリール；
−置換ヘテロアリール；
−アルキル−Ｏ−アルキル；
−アルキル−Ｓ−アルキル；
−アルキル−Ｏ−アリール；
−アルキル−Ｓ−アリール；
−アルキル−Ｏ−アルケニル；
−アルキル−Ｓ−アルケニル；および
−アルキルまたはアルケニルであって、
−ＯＨ；
−ハロゲン；
−Ｎ（Ｒ5）2；
−ＣＯ−Ｎ（Ｒ5）2；
−ＣＳ−Ｎ（Ｒ5）2；
−ＳＯ2−Ｎ（Ｒ5）2；
−ＮＲ5−ＣＯ−Ｃ1-10アルキル；
−ＮＲ5−ＣＳ−Ｃ1-10アルキル；
−ＮＲ5−ＳＯ2−Ｃ1-10アルキル；
−ＣＯ−Ｃ1-10アルキル；
−ＣＯ−Ｏ−Ｃ1-10アルキル；
−Ｎ3；
−アリール；
−置換アリール；
−ヘテロアリール
−置換ヘテロアリール；
−ヘテロシクリル；
−置換ヘテロシクリル；
−ＣＯ−アリール；
−ＣＯ−（置換アリール）；
−ＣＯ−ヘテロアリール；および
−ＣＯ−（置換ヘテロアリール）
よりなる群から選択される１つまたはそれ以上の置換基によって置換されたアルキルまたはアルケニルよりなる群から選択され；
Ｒ3およびＲ4は、各々独立して：
−水素；
−ハロゲン；
−アルキル；
−アルケニル；
−Ｏ−アルキル；
−Ｓ−アルキル；および
−Ｎ（Ｒ5）2
であるか、またはＲ3およびＲ4が一緒になった時、場合により
−ハロゲン；
−アルキル；
−アルケニル；
−Ｏ−アルキル；
−Ｓ−アルキル；および
−Ｎ（Ｒ5）2
よりなる群から選択される１つまたはそれ以上の置換基によって置換された融合アリールまたはヘテロアリール基を形成するか、またはＲ3およびＲ4が一緒になった時、場合により１つまたはそれ以上のヘテロ原子を含み、かつ場合により
−ハロゲン；
−アルキル；
−アルケニル；
−Ｏ−アルキル；
−Ｓ−アルキル；および
−Ｎ（Ｒ5）2
よりなる群から選択される１つまたはそれ以上の置換基によって置換された融合５〜７員飽和環を形成し；
各Ｒ5は独立して、水素またはＣ1-10アルキルである）
の化合物、または薬学的に許容しうるその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年８月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／４０３，８４６号の優先権を主張する。
【０００２】
免疫応答修飾因子（「ＩＲＭ」）は、抗ウイルスおよび抗腫瘍活性を包含するがこれらに限定されるわけではない強力な免疫調節活性を有する化合物を含む。あるいくつかのＩＲＭは、サイトカインの産生および分泌を調節する。例えばあるいくつかのＩＲＭ化合物は、サイトカイン、例えばＩ型インターフェロン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＭＩＰ−１、および／またはＭＣＰ−１の産生および分泌を誘発する。もう１つの例として、あるいくつかのＩＲＭ化合物は、あるいくつかのＴＨ−２サイトカイン、例えばＩＬ−４およびＩＬ−５の産生および分泌を阻害しうる。これに加えて、いくつかのＩＲＭ化合物は、ＩＬ−１およびＴＮＦを抑制すると言われている（米国特許第６，５１８，２６５号）。
【背景技術】
【０００３】
あるいくつかのＩＲＭは、小さい有機分子（例えば、大きい生物たんぱく質、ペプチドなどとは対照的に、約１，０００ダルトン未満、あるいくつかの場合は約５００ダルトン未満の分子量）、例えば次の特許に開示されているものである。すなわち、米国特許第４，６８９，３３８号；第４，９２９，６２４号；第４，９８８，８１５号；第５，０３７，９８６号；第５，１７５，２９６号；第５，２３８，９４４号；第５，２６６，５７５号；第５，２６８，３７６号；第５，３４６，９０５号；第５，３５２，７８４号；第５，３６７，０７６号；第５，３８９，６４０号；第５，３９５，９３７号；第５，４４６，１５３号；第５，４８２，９３６号；第５，６９３，８１１号；第５，７４１，９０８号；第５，７５６，７４７号；第５，９３９，０９０号；第６，０３９，９６９号；第６，０８３，５０５号；第６，１１０，９２９号；第６，１９４，４２５号；第６，２４５，７７６号；第６，３３１，５３９号；第６，３７６，６６９号；第６，４５１，８１０号；第６，５２５，０６４号；第６，５４５，０１６号；第６，５４５，０１７号；第６，５５８，９５１号；および第６，５７３，２７３号；欧州特許第０３９４０２６号；米国特許公報第２００２／００５５５１７号；および国際公開第０１／７４３４３号パンフレット；第０２／４６１８８号パンフレット；第０２／４６１８９号パンフレット；第０２／４６１９０号パンフレット；第０２／４６１９１号パンフレット；第０２／４６１９２号パンフレット；第０２／４６１９３号パンフレット；第０２／４６７４９号パンフレット；第０２／１０２３７７号パンフレット；第０３／０２０８８９号パンフレット；第０３／０４３５７２号パンフレット、および第０３／０４５３９１号パンフレットである。
【０００４】
小分子ＩＲＭの他の例には、あるいくつかのプリン誘導体（例えば米国特許第６，３７６，５０１号および第６，０２８，０７６号に記載されているもの）、あるいくつかのイミダゾキノリンアミド誘導体（例えば米国特許第６，０６９，１４９号に記載されているもの）、あるいくつかのベンズイミダゾール誘導体（例えば米国特許第６，３８７，９３８号に記載されているもの）、および５員窒素含有ヘテロ環式環に融合された４−アミノピリミジンのあるいくつかの誘導体（例えば米国特許第６，３７６，５０１号；第６，０２８，０７６号、および第６，３２９，３８１号；および国際公開第０２／０８５９５号パンフレットに記載されているアデニン誘導体）が含まれる。
【０００５】
他のＩＲＭは、大きい生物分子、例えばオリゴヌクレオチド配列を含む。サイトカイン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含有するＩＲＭオリゴヌクレオチド配列もあり、これらは例えば米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６号；第６，２３９，１１６号；第６，３３９，０６８号；および第６，４０６，７０５号に記載されている。合成免疫調節構造モチーフを含んでいることがあるＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドもあり、例えば米国特許第６，４２６，３３４号および第６，４７６，０００号に記載されているものである。ＣｐＧを欠いているＩＲＭヌクレオチド配列もあり、これらは例えば国際公開第００／７５３０４号パンフレットに記載されている。
【０００６】
あるいくつかのＩＲＭは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストとして機能しうる。いくつかの小分子ＩＲＭは、ＴＬＲ２、４、６、７、および８の１つまたはそれ以上を通して作用することもある。ＣｐＧは、ＴＬＲ９を通して作用しうる。
【０００７】
免疫系のあるいくつかの側面を刺激することによって、ならびに他の側面を抑制することによって（例えば米国特許第６，０３９，９６９号および第６，２００，５９２号参照）、ＩＲＭは、多くの疾病を治療するために用いることができる。例えば小分子ＩＲＭイミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）は、ヒトパピローマウイルスによって引起こされた外陰部および肛門周囲のいぼの治療に有用である［例えばトマイ（Ｔｏｍａｉ）ら、「抗ウイルス研究（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２８（３）：２５３−６４（１９９５）参照］。ＩＲＭを用いて治療しうる他の疾病の例には、基底細胞ガン、湿疹、本態性血小板症、Ｂ型肝炎、多発性硬化症、新生物病、乾癬、慢性関節リウマチ、Ｉ型単純ヘルペス、およびＩＩ型単純ヘルペスが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０００８】
ＩＲＭ化合物はまた、Ｂ細胞による抗体産生を刺激することによって、体液性免疫も調節しうる。さらには様々なＩＲＭは、ワクチンアジュバントとして有用であることが証明されている（例えば米国特許第６，０８３，５０５号および第６，４０６，７０５号参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＩＲＭ、特に小分子ＩＲＭ、およびＴＬＲ２、４、６、７、および８のアゴニストが、抗原と化学的または物理的にペアにされて免疫刺激性組成物を形成する時、免疫応答の刺激において驚くほど効果的であることが今や発見された。特定の組成物の免疫刺激性効果は、この組成物中のものと同じ抗原、および同じかまたは匹敵しうるＩＲＭであるが、ペア形成されていない形態で投与されたものの免疫刺激性効果よりも大きくなりうる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、抗原部分とペアにされた免疫応答修飾因子（ＩＲＭ）部分を含む免疫刺激性組成物を提供する。いくつかの実施態様において、このＩＲＭ部分は、Ｔｏｌｌ様受容体２、Ｔｏｌｌ様受容体４、Ｔｏｌｌ様受容体６、Ｔｏｌｌ様受容体７、またはＴｏｌｌ様受容体８のアゴニストであってもよく、またはこれらに由来してもよい。他の実施態様において、このＩＲＭ部分は、イミダゾキノリンアミン；テトラヒドロイミダゾキノリンアミン；イミダゾピリジンアミン；アリールエーテル−置換イミダゾピリジンアミン；１，２−架橋イミダゾキノリンアミン；６，７−融合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン；イミダゾナフチリジンアミン；テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン；オキサゾロキノリンアミン；チアゾロキノリンアミン；オキサゾロピリジンアミン；チアゾロピリジンアミン；オキサゾロナフチリジンアミン；またはチアゾロナフチリジンアミンを含んでいてもよく、またはこれらに由来してもよい。さらに他の実施態様において、このＩＲＭ部分は、約１，０００ダルトン未満の分子量を有する有機部位を含んでいてもよく、またはこれに由来してもよい。この抗原部分は、アミノ酸配列、ヌクレオチド配列、リポ多糖類、プリオン、細菌、ウイルス、または菌類を含んでいてもよい。
【００１１】
別の側面において、本発明は、患者のＴ細胞の刺激方法を提供する。この方法は、抗原部分とペアにされた免疫応答修飾因子を含む免疫刺激性組成物を供給する工程；この免疫刺激性組成物が抗原提示細胞に結合することを可能にし、これによって抗原提示細胞を活性化する工程；およびこの活性化された抗原提示細胞が患者のＴ細胞を刺激することを可能にする工程を含む。患者のＴ細胞は、生体内または試験管内で刺激されてもよい。
【００１２】
さらにもう１つの側面において、本発明は、抗体産生細胞の刺激方法を提供する。この方法は、抗原部分とペアにされた免疫応答修飾因子部分を含む免疫刺激性組成物を供給する工程；およびこの免疫刺激性組成物が抗体産生細胞と結合することを可能にする工程を含む。これらの抗体産生細胞は、生体内または試験管内で刺激されてもよい。
【００１３】
本発明の様々な他の特徴および利点は、次の詳細な説明、実施例、特許請求の範囲、および添付図面を参照して容易に明らかになるであろう。本明細書全体のいくつかの箇所において、実施例のリストによって指針が与えられている。どの場合も、列挙されたリストは、代表的な群としての役割を果たすだけであり、限定的なリストと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例４に記載されているように、オボアルブミンで免疫化されたマウスによって発生させられた、オボアルブミン特異的活性化ＣＤ８+Ｔ細胞の割合を示している。
【図２】実施例４に記載されているように、ＩＲＭ−オボアルブミン共役体で皮下免疫化されたマウスよって発生させられた、オボアルブミン特異的活性化ＣＤ８+Ｔ細胞の割合を示している。
【図３】実施例４に記載されているように、ＩＲＭ−オボアルブミン共役体で腹膜組織内免疫化されたマウスよって発生させられた、オボアルブミン特異的活性化ＣＤ８+Ｔ細胞の割合を示している。
【図４】実施例５に記載されているように、オボアルブミンで免疫化されたマウスよって誘発されたインターフェロン−γの産生を示している。
【図５】実施例５に記載されているように、ＩＲＭ−オボアルブミン共役体で皮下免疫化されたマウスよって誘発されたインターフェロン−γの産生を示している。
【図６】実施例５に記載されているように、ＩＲＭ−オボアルブミン共役体で腹膜組織内免疫化されたマウスよって誘発されたインターフェロン−γの産生を示している。
【図７】実施例６に記載されているように、ＩＲＭ−オボアルブミン共役体での二次免疫を与えた時の、抗原特異的免疫応答の増加を示している。
【図８】実施例７に記載されているように、腫瘍特異的ＩＲＭ−抗原共役体での免疫化後の腫瘍サイズの減少を示している。
【図９】実施例８に記載されているように、ＩＲＭ−腫瘍抗原共役体での免疫化後の脾臓における活性化腫瘍抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の膨張を示している。
【図１０】実施例８に記載されているように、ＩＲＭ−腫瘍抗原共役体での免疫化後の腫瘍における活性化腫瘍抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の膨張を示している。
【図１１】実施例９に記載されているように、オボアルブミンでの免疫化後にＫb／ＳＩＩＮＦＥＫＬを提示する抗原提示細胞の割合を示している。
【図１２】実施例９に記載されているように、オボアルブミン＋非共役ＩＲＭでの免疫化後にＫb／ＳＩＩＮＦＥＫＬを提示する抗原提示細胞の割合を示している。
【図１３】実施例９に記載されているように、ＩＲＭ−オボアルブミン共役体での免疫化後にＫb／ＳＩＩＮＦＥＫＬを提示する抗原提示細胞の割合を示している。
【図１４】実施例１０に記載されているように、オボアルブミン発現腫瘍細胞での抗原投与後、オボアルブミンまたはＩＲＭ−オボアルブミン共役体で免疫化されたマウスの生存率を示している。
【図１５】実施例１１に記載されているように、オボアルブミンでの免疫化後の抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の膨張を示している。
【図１６】実施例１１に記載されているように、ＩＲＭおよびオボアルブミンのコロイド縣濁液での免疫化後、一人の被検者における抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の膨張を示している。
【図１７】実施例１１に記載されているように、ＩＲＭおよびオボアルブミンのコロイド縣濁液での免疫化後、第二被検者における抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の膨張を示している。
【図１８】２つの異なるＩＲＭを用いたＩＲＭ−抗原共役体での免疫化の結果としての、抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の膨張を示している。
【図１９】様々な免疫刺激性組成物で免疫化されたマウスの、オボアルブミン単独での免疫化を上回る、ＣＤ８+Ｔ細胞の倍膨張を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、免疫刺激性組成物（ＩＳＣ）、免疫刺激性組成物の製造方法、免疫刺激性組成物を用いた免疫応答の惹起方法、およびＩＲＭと別の免疫刺激性成分（例えば抗原）とをペアにすることによる、ＩＲＭの免疫刺激活性の強化方法を提供する。ＩＳＣは、細胞介在免疫応答、体液性免疫応答、またはその両方を惹起するように設計されてもよい。
【００１６】
上記のように、多くのＩＲＭは、ワクチンアジュバントとして用いて、同様にこのワクチンにおいて提示された１つまたはそれ以上の抗原に対して発生させられた免疫応答を増加することができる。驚くべきことに、本発明によるあるいくつかのＩＳＣは、同じかまたは匹敵しうるＩＲＭおよび同じ抗原を含有するが、ペア形成されていない形態のものよりも一層大きい免疫応答を与えることができる。１つの事例では、ＩＳＣは、同じ抗原と匹敵しうるＩＲＭとを含んでいるワクチンによって発生させられた免疫応答の約５倍の大きさの免疫応答を与えた。
【００１７】
本明細書において用いられている「ペアにされた（ｐａｉｒｅｄ）」という用語、およびこれの変形例は、成分が互いから自由に分散可能でないようななんらかの化学的または物理的方法で会合された成分のことを言う。例えば２つの成分は、別々に分散または拡散が不可能であるように互いに対して共有結合されていてもよい。ペア形成は、同様に例えば非共有親和性結合、イオン結合、親水性または疎水性親和性、物理的エントラップメントなどによって達成されてもよい。ペア形成は具体的には、従来のワクチンにおける抗原とアジュバントとの単純混合とは区別される。単純混合物において、これらの成分は、ワクチン接種された環境内で独立して自由に分散しうる。本明細書において用いられる「ペアにされた」という用語、およびこれの変形例は、ペアにされた成分が、免疫化後、化学的または物理的会合を維持するという理解を与える。
【００１８】
免疫応答修飾因子部分は、あらゆる適切なＩＲＭであってもよく、またはこれに由来してもよい。適切なＩＲＭは、小さい有機分子、すなわち約１，０００ダルトン未満の分子量を有する分子を含む。ただし、いくつかの実施態様において、このＩＲＭは約７００ダルトン未満の分子量を有してもよく、いくつかの場合には、ＩＲＭは約５００ダルトン〜約７００ダルトンの分子量を有してもよい。適切なＩＲＭはまた、ＴＬＲ２、４、６、７、８、および９の１つまたはそれ以上のアゴニストも含んでいる。いくつかの実施態様において、適切なＩＲＭは、上記の小分子ＩＲＭ化合物およびこれらの誘導体を含むが、これらに限定されるわけではない。５員窒素含有へテロ環式環に融合された２−アミノピリジンを有する適切な小分子ＩＲＭには、次のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、非限定的にアミド−置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミド−置換イミダゾキノリンアミン、尿素−置換イミダゾキノリンアミン、アリールエーテル−置換イミダゾキノリンアミン、ヘテロ環式エーテル−置換イミダゾキノリンアミン、アミドエーテル−置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエーテル−置換イミダゾキノリンアミン、尿素−置換イミダゾキノリンエーテル、およびチオエーテル−置換イミダゾキノリンアミンを包含するイミダゾキノリンアミン；非限定的にアミド−置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、スルホンアミド−置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、尿素−置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、アリールエーテル−置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、ヘテロ環式エーテル−置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、アミドエーテル−置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエーテル−置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、尿素−置換テトラヒドロイミダゾキノリンエーテル、およびチオエーテル−置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミンを包含するテトラヒドロイミダゾキノリンアミン；非限定的にアミド−置換イミダゾピリジンアミン、スルホンアミド−置換イミダゾピリジンアミン、尿素−置換イミダゾピリジンアミン、アリールエーテル−置換イミダゾピリジンアミン、ヘテロ環式エーテル−置換イミダゾピリジンアミン、アミドエーテル−置換イミダゾピリジンアミン、スルホンアミドエーテル−置換イミダゾピリジンアミン、尿素−置換イミダゾピリジンエーテル、およびチオエーテル−置換イミダゾピリジンアミンを包含するイミダゾピリジンアミン；１，２−架橋イミダゾキノリンアミン；６，７−融合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン；イミダゾナフチリジンアミン；テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン；オキサゾロキノリンアミン；チアゾロキノリンアミン；オキサゾロピリジンアミン；チアゾロピリジンアミン；オキサゾロナフチリジンアミン；およびチアゾロナフチリジンアミンである。
【００１９】
他の適切な小分子ＩＲＭには、あるいくつかのプリン誘導体、あるいくつかのイミダゾキノリンアミド誘導体、あるいくつかのベンズイミダゾール誘導体、および上記の５員窒素含有へテロ環式環（例えばアデニン誘導体）に融合した４−アミノピリミジンのあるいくつかの誘導体が含まれる。
【００２０】
他の適切なＩＲＭには、ＣｐＧ、および上記ＣｐＧを欠いている他のＩＲＭヌクレオチド配列が含まれる。
【００２１】
抗原部分は、細胞介在免疫応答、体液性免疫応答、またはこれらの両方を上昇させるあらゆる物質を含んでいてもよい。適切な抗原物質には、次のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、ペプチド；ポリペプチド；脂質；糖脂質；多糖類；炭水化物；ポリヌクレオチド；プリオン；生きている細菌または不活性化細菌、ウイルスまたは菌類；および細菌、ウイルス、真菌類、原生動物、腫瘍由来、または生物由来イムノゲン、毒素、またはトキソイドである。
【００２２】
本発明の免疫刺激性組成物を治療薬として用いることができる疾病には、次のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
（ａ）ウイルス病、例えば陰部ゆうぜい、尋常性ゆうぜい、足底いぼ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、単純ヘルペスウイルスＩ型およびＩＩ型、伝染性軟属腫、痘瘡、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＶＺＶ、ライノウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、インフルエンザ、パラインフルエンザ；
（ｂ）細菌性疾患、例えば結核、マイコバクテリウム・アビウム、ハンセン氏病；
（ｃ）その他の感染病、例えば真菌病、クラミジア、カンジダ、アスペルギルス、クリプトコックス髄膜炎、ニューモシスティス・カリニ、クリプトスポリジウム症、ヒストプラスマ症、トキソプラズマ症、トリパノゾーマ感染、リーシュマニア症；
（ｄ）新生物病、例えば表皮内腫瘍形成、子宮頚部形成異常、光線性角化症、基底細胞ガン、扁平上皮ガン、ヘアリー細胞白血病、カポジ肉腫、黒色腫、腎細胞ガン、骨髄性白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、およびその他のガン；
（ｅ）ＴＨ−２介在性、アトピー、および自己免疫疾患、例えばアトピー性皮膚炎または湿疹、好酸球増加症、喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、全身性エリテマトーデス、本態性血小板血症、多発性硬化症、オメン（Ｏｍｍｅｎ）症候群、円板状狼瘡、円形脱毛症、ケロイド形成およびその他の型の瘢痕化の阻害、および慢性創傷を含む創傷治癒の強化；および
（ｆ）体液性および／または細胞介在性のどちらかの免疫応答を上昇させるあらゆる物質、例えば生きているウイルスおよび細菌イムノゲンおよび不活性化ウイルス、腫瘍由来、原生動物、生物由来、真菌類、および細菌イムノゲン、トキソイド、毒素、多糖類、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、細胞ワクチン、ＤＮＡワクチン、組み換えタンパク質、糖タンパク質、およびペプチドなどとともに使用するためのワクチンアジュバントとして、例えばＢＣＧ、コレラ、ペスト、腸チフス、Ａ、Ｂ、およびＣ型肝炎、ＡおよびＢ型インフルエンザ、パラインフルエンザ、ポリオ、狂犬病、麻疹、おたふく風邪、風疹、黄熱病、破傷風、ジフテリア、ｂ型ヘモフィルスインフルエンザ、結核、髄膜炎および肺炎ワクチン、アデノウイルス、ＨＩＶ、水痘、サイトメガロウイルス、デング熱、ネコ白血病、家禽ペスト、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２、豚コレラ、日本脳炎、呼吸器合胞体ウイルス、ロタウイルス、パピローマウイルス、および黄熱病に関連して用いるためのもの。
【００２３】
本発明の免疫刺激性組成物は、免疫応答修飾因子部分および抗原部分の両方の生物活性の有効量を含んでいる。免疫応答部分の生物活性（「ＩＲＭ活性」）の有効量は、次のものの１つまたはそれ以上を包含する。すなわち、Ｔ細胞によるサイトカイン産生の増加、抗原に特異的なＴ細胞の活性化、および樹状細胞の活性化である。抗原部分の生物活性（「抗原活性」）の有効量は、次のものの１つまたはそれ以上を包含する。すなわち、Ｂ細胞による抗原に特異的な抗体の発生、および抗原を提示する抗原提示細胞の発生である。本発明の免疫刺激性組成物は、製薬組成物を形成するために、製薬的に許容しうるキャリヤー、１つまたはそれ以上の賦形剤、または前記のもののなんらかの組合わせと組合わされてもよい。
【００２４】
本発明の製薬組成物に用いられる活性化合物の正確な量は、当業者に知られている要因、例えば免疫刺激性組成物の物理的および化学的性質、キャリヤーの性質、被検者の免疫系の性質（例えば抑制性、妥協性、刺激性）、および意図されている投薬計画にしたがって変わるであろうが、本発明の製薬組成物は、被検者へＩＲＭ約１００ｎｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの用量を供給するのに十分な免疫応答修飾因子部分を含むと予想される。
【００２５】
多様な投薬形態が用いられてもよい。例えば、タブレット、トローチ剤、カプセル、非経口配合物、シロップ、クリーム、軟膏、エアゾール配合物、経皮パッチ、経粘膜パッチなどである。
【００２６】
本発明の製薬組成物は、１つの治療方式において単一治療薬として投与することができる。またはこの製薬組成物は、別の製薬組成物または他の活性剤と組合わせて投与されてもよい。これには、追加の免疫応答修飾因子、抗ウイルス剤、抗生物質、抗体、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチドなどが含まれる。
【００２７】
いくつかの実施態様において、免疫刺激性免疫応答修飾因子部分は、抗原部分に共有結合されて、免疫刺激性共役体が形成されてもよい。本明細書において用いられている「共有結合された（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ）」とは、もっぱら共有結合のみを通した２つの成分の直接的および間接的共役のことを言う。直接的共有結合は、免疫応答修飾因子部分の原子と抗原部分の原子との間の直接的共有結合を包含しうる。あるいはまた、この共有結合は、ＩＲＭ部分、抗原部分、またはその両方に共有接着された連結基を通して発生することもあり、これは、ＩＲＭ部分および抗原部分の共有結合を容易にする。間接的共有結合は、第三成分、例えば免疫応答修飾因子部分および抗原部分が別々に共有接着された固体支持体を含んでいることもある。同様に、「共有結合された」および「共有接着された」は、互換的に用いられる。
【００２８】
免疫刺激性共役体は、ＩＲＭ部分として免疫応答修飾因子部位（ｍｏｉｅｔｙ）、および抗原部分として抗原含有部位を含んでいてもよい。免疫刺激性共役体を合成する時、免疫応答修飾因子部位、連結基、および抗原含有部位の各々は、結果として生じる免疫刺激性共役体が、ＩＲＭ活性の有効量および抗原活性の有効量を有するように選択されうる。
【００２９】
この連結基は、ＩＲＭ活性および抗原活性の有効量を保持しつつ、抗原含有部位が免疫応答修飾因子部位に共有結合されるのを可能にするあらゆる適切な有機連結基であってもよい。いくつかの実施態様において、連結基は、抗原含有部位が、結果として例えばサイトカイン産生などのＩＲＭ活性を生じる、活性コアとＴ細胞との間の生物学的に有効な相互作用を妨害しないのに十分なほどの空間を、免疫応答修飾因子部位と抗原含有部位との間に生じるように選択されてもよい。
【００３０】
この連結基は、抗原と反応して共有結合を形成しうる反応性基を含んでいる。適切な反応性基には、ハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、Ｇ（１９９６）、「生物共役体技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、アカデミック・プレス」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、第二章、「反応性官能基の化学（Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐｓ）」、１３７−１６６において考察されているものが含まれる。例えばこの連結基は、第一アミン（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルまたはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル）と反応しうる；これは、スルフヒドリル基（例えばマレイミドまたはヨードアセチル）と反応することがあり、またはこれは光反応性基（例えば４−アジドフェニル、２−ヒドロキシ−４−アジドフェニル、２−ニトロ−４−アジドフェニル、および２−ニトロ−３−アジドフェニルを包含するフェニルアジド）であってもよい。
【００３１】
連結基に共有結合するために利用しやすい化学的活性基には、１つまたは複数の連結基に直接共有結合するために用いることができる基が含まれる。これらは、連結基に共有結合するために利用可能になるように修飾することができる。例えば適切な化学的活性基には、第一アミンおよびスルフヒドリル基が含まれるが、これらに限定されるわけではない。あるいくつかの抗原含有部位、例えばタンパク質および他のペプチドは、複数の化学的活性基を含んでいることがあるので、本発明によるあるいくつかのＩＳＣは、特定の抗原含有部位に共役された複数のＩＲＭ部位を含んでいることがある。
【００３２】
免疫刺激性共役体の作製方法
本発明による免疫刺激性共役体は一般に、免疫応答修飾因子とクロスリンカーとを反応させ、ついでその結果として生じた中間体と抗原とを反応させることによって調製することができる。生物共役体の調製に適した多くのクロスリンカーが知られており、多くは商品として入手しうる。例えばハーマンソン、Ｇ．（１９９６）「生物共役体技術」、アカデミック・プレス参照。
【００３３】
本発明による免疫刺激性共役体はまた、例えば反応スキームＩに示されている方法にしたがって調製されてもよく、このスキームでは抗原含有部位が、ＲIを通してＩＲＭ部位に連結されている。反応スキームＩの工程（１）において、式ＩＩＩの化合物を、式ＩＶのヘテロ二官能性クロスリンカーと反応させて、ＩＩの化合物を生じる。ＲAおよびＲBは各々、他方と反応するように選択された官能基を含有する。例えばＲAが第一アミンを含有するならば、その場合には、ＲBがアミン反応性官能基、例えばＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステルを含有するヘテロ二官能性クロスリンカーが選択されてもよい。ＲAおよびＲBは、これらが反応してこの共役体中に所望のリンカー基を生じるように選択されてもよい。
【００３４】
式ＩＩＩ（式中、ＲAは官能基を含有する）の化合物の調製方法が知られている。例えば次の特許参照。すなわち、米国特許第４，６８９，３３８号；第４，９２９，６２４号；米国特許第５，２６８，３７６号；第５，３８９，６４０号；第５，３５２，７８４号；第５，４９４，９１６号；第４，９８８，８１５号；第５，３６７，０７６号；第５，１７５，２９６号；第５，３９５，９３７号；第５，７４１，９０８号；第５，６９３，８１１号；第６，０６９，１４９号；第６，１９４，４２５号；および米国特許第６，３３１，５３９号、および国際公開第００／７６５０５号パンフレット；第００／７６５１８号パンフレット；第０２／４６１８８号パンフレット；第０２／４６１８９号パンフレット；第０２／４６１９０号パンフレット；第０２／４６１９１号パンフレット；第０２／４６１９２号パンフレット；第０２／４６１９３号パンフレット；および第０２／４６１９４号パンフレットである。
【００３５】
多くのヘテロ二官能性クロスリンカーが知られており、多くが商品として入手可能である。例えばハーマンソン、Ｇ．（１９９６）、「生物共役体技術」、アカデミック・プレス、第五章「ヘテロ二官能性クロスリンカー（Ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｅｒｓ）」、２２９−２８５参照。この反応は一般に、適切な溶媒、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の式ＩＩＩの化合物の溶液と、適切な溶媒、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の式ＩＶのヘテロ二官能性クロスリンカーの溶液とを組合わせることによって実施することができる。この反応は、周囲温度で実施されてもよい。ついで式ＩＩの生成物は、従来の技術を用いて単離されてもよい。
【００３６】
反応スキームＩの工程（２）において、反応性基ＺAを含有する式ＩＩの化合物と抗原とを反応させ、式Ｉの免疫刺激性共役体を生じる。この反応は一般に、適切な溶媒、例えばジメチルスルホキシド中の式ＩＩの化合物の溶液と、適切な緩衝液、例えばＰＢＳ中の抗原の溶液とを組合わせることによって実施することができる。この反応は、周囲温度で、または低い温度（約４℃）で実施されてもよい。ＺAが、光反応性基、例えばフェニルアジドであるならば、その場合にはこの反応混合物は、架橋を実施するのに適した時間の長さ（例えば１０〜２０分）の間、長波ＵＶ光に暴露されるであろう。１抗原部位あたりの免疫応答修飾因子部位の平均数は、この反応に用いられる式ＩＩの化合物の量を調節することによって制御されてもよい。式Ｉの免疫応答共役体は、従来技術を用いて単離され、精製されてもよい。
【００３７】
反応スキームＩ
【化１】
0005491364.tif 000002
【００３８】
あるいはまた、式ＩＩの化合物は、ヘテロ二官能性クロスリンカーを用いずに合成されてもよい。式ＩＩの化合物が反応性基ＺAを含有するかぎり、これを上記工程（２）の方法を用いて抗原と反応させて、免疫刺激性共役体を生じてもよい。
【００３９】
本明細書において用いられている「アルキル」、「アルケニル」という用語、および接頭辞「アルク（ａｌｋ）−」は、直鎖、分枝鎖、および環式基、すなわちシクロアルキルおよびシクロアルケニルを包含する。ほかに特定されていなければ、これらの基は、１〜２０個の炭素原子を含有し、アルケニル基は、２〜２０個の炭素原子を含有する。好ましい基は、全部で１０個までの炭素原子を有する。環式基は、単環式または多環式であってもよく、好ましくは３〜１０環炭素原子を有する。環式基の例には、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロプロピルメチル、およびアダマンチルが含まれる。
【００４０】
「ハロアルキル」という用語は、１つまたはそれ以上のハロゲン原子によって置換された基を包含し、これには過フッ素化基が含まれる。このことはまた、接頭辞「ハロ−」を含む基にも当てはまる。適切なハロアルキル基の例は、クロロメチル、トリフルオロメチルなどである。
【００４１】
本明細書において用いられている「アリール」という用語には、炭素環式芳香族環または環系が含まれる。アリール基の例には、フェニル、ナフチル、ビフェニル、フルオレニル、およびインデニルが含まれる。「ヘテロアリール」という用語には、少なくとも１つの環へテロ原子（例えばＯ、Ｓ、Ｎ）を含有する芳香族環または環系が含まれる。適切なヘテロアリール基には、フリル、チエニル、ピリジル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、イソインドリル、トリアゾリル、ピロリル、テトラゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、カルバゾリル、ベンゾキサゾリル、ピリミジニル、ベンズイミダゾリル、キノキサリニル、ベンゾチアゾリル、ナフチリジニル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、プリニル、キナゾリニルなどが含まれる。
【００４２】
「ヘテロシクリル」には、少なくとも１つの環へテロ原子（例えばＯ、Ｓ、Ｎ）を含有する非芳香族環または環系が含まれ、上記ヘテロアリール基の完全飽和および一部不飽和誘導体のすべてが含まれる。ヘテロ環式基の例には、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、およびイミダゾリジニルが含まれる。
【００４３】
アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリル基は、非置換であってもよく、または独立して、次のものよりなる群から選択される１つまたはそれ以上の置換基によって置換されていてもよい。すなわち、アルキル、アルコキシ、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、アルキルチオ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ハロアルキルチオ、ハロゲン、ニトロ、ヒドロキシ、メルカプト、シアノ、カルボキシ、ホルミル、アリール、アリールオキシ、アリールチオ、アリールアルコキシ、アリールアルキルチオ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、ヘテロアリールアルコキシ、ヘテロアリールアルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロアルキル、アルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルコキシカルボニル、ハロアルキルカルボニル、ハロアルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、アリールチオカルボニル、ヘテロアリールチオカルボニル、アルカノイルオキシ、アルカノイルチオ、アルカノイルアミノ、アリールカルボニルオキシ、アリールカルボニルチオ、アルキルアミノスルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アリールジアジニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、アリールアルキルスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アルケニルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、アリールアルキルカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールアルキルカルボニルアミノ、アルキルスルホニルアミノ、アルケニルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、アリールアルキルスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールアルキルスルホニルアミノ、アルキルアミノカルボニルアミノ、アルケニルアミノカルボニルアミノ、アリールアミノカルボニルアミノ、アリールアルキルアミノカルボニルアミノ、ヘテロアリールアミノカルボニルアミノ、ヘテロアリールアルキルアミノカルボニルアミノ、およびヘテロシクリルの場合オキソである。他の基が「置換されている」または「場合により置換されている」として記載されているならば、その場合にはこれらの基もまた、上に列挙されている置換基の１つまたはそれ以上によって置換されていてもよい。
【００４４】
いくつかの置換基が一般に好ましい。例えば好ましいＲ2基には、水素、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基（すなわちメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、第二ブチル、イソブチル、第三ブチル、およびシクロプロピルメチル）、およびアルコキシアルキル基（例えばメトキシエチルおよびエトキシエチル）が含まれる。好ましくはＲ3およびＲ4は独立して、水素またはメチルであり、あるいはＲ3とＲ4とは互いに接合して、ベンゼン環、ピリジン環、６−員飽和環、または窒素原子を含有する６−員飽和環を形成する。これらの好ましい置換基の１つまたはそれ以上は、存在するとすれば、本発明の化合物中にあらゆる組合わせで存在してもよい。
【００４５】
いくつかの実施態様において、免疫刺激性共役体は、抗原部分およびＩＲＭ部分の両方が接着されている固体支持構造を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、ＩＲＭ部分、抗原部分、またはその両方が、連結基、例えば上記のものを用いて、固体支持体に共有接着されていてもよい。固体支持体には、例えばアガロースビーズ、金粒子などを含めることができる。ついで固体支持体は、適切な標的細胞集団へ、接着されたＩＲＭ部分および抗原部分を同時到達するために用いられてもよい。生物分子を固体支持体に接着させる方法は、当業界において知られている。固体支持体上に生物分子を固定化するためのプロトコルは、当業界においてよく知られており、適切な試薬が、商業的供給源から入手しうる。
【００４６】
本発明による免疫刺激性組成物は、ＩＲＭ部分と抗原部分との間の共有結合以外の化学的会合を含有してもよい。例えばＩＳＣは、抗原部分とＩＲＭ部分との間の親和性相互作用を含んでいてもよい。アビジン−ビオチン親和性は、抗原部分とＩＲＭ部分とをペアにするために利用することができる非共有相互作用の一例を表わす。ビオチン分子は、例えばタンパク質抗原（例えば第一アミンまたはスルフヒドリル基）中のアミノ酸上に存在するいくつかの官能基の１つを介して抗原に化学接着されてもよい。ＩＲＭ部分は、同様な化学的手段によってアビジン分子に共役されてもよい。ＩＲＭ部分と抗原部分とは、その場合アビジン−ビオチン親和性相互作用によってペアにされてもよい。タンパク質のビオチニル化方法およびアビジンへの化学基の連結方法は、当業者によく知られている。ＩＳＣの製造のために有用になりうる代替親和性相互作用には、例えば抗原／抗体相互作用、糖たんぱく質／レクチン相互作用が含まれる。
【００４７】
免疫刺激性組成物はまた、ＩＲＭ部分と抗原部分との間のイオン相互作用によって形成されてもよい。例えばＩＲＭ部分、抗原部分、またはこれらの両方は、反対の電荷成分を含有するように化学修飾されてもよい。反対の電荷のＩＲＭ部分と抗原部分とはついで、これら２つの物質（ｅｎｔｉｔｉｅｓ）間のイオン相互作用を可能にするためにともにインキュベーションされてもよい。その結果生じたＩＳＣはついで、被検者または細胞集団に投与されてもよく、その結果、標的細胞へのＩＲＭおよび抗原の両方の同時送達を生じる。
【００４８】
共有連結されたＩＳＣの場合のように、ＩＲＭ部分と抗原部分とが非共有的にペアにされているＩＳＣは、固体支持体を含んでいてもよい。
【００４９】
免疫刺激性共役体を用いた免疫応答の惹起方法
本発明による免疫刺激性組成物は、試験管内または生体内で免疫系の細胞から免疫応答を惹起するために用いられてもよい。したがって、本発明によるＩＳＣは、ワクチンの成分として、またはＴ細胞またはＢ細胞の試験管内細胞培養に用いられる免疫刺激性因子として有用になりうる。実際、ＩＲＭは、ペア形成されていないワクチンアジュバントとして送達された時と比較して、本発明によるＩＳＣの一部として送達された時、より強力な免疫刺激性因子になりうる。試験管内で免疫応答を惹起するために用いられた時、試験管内で活性化された免疫細胞は、患者に再導入されてもよい。あるいはまた、活性化免疫細胞、例えば抗体、サイトカインなどによって分泌された因子は、検査、診断、および／または治療用途のために収集されてもよい。
【００５０】
他の記載がなければ、宿主は、皮下または腹膜組織内免疫化されてもよい。宿主がＩＳＣへの免疫応答を発生させうるのに十分な時間の後、免疫部位に適切な免疫細胞が採集される。例えばリンパ節は、皮下免疫化された宿主から採集されてもよい。脾臓細胞は、腹膜免疫化された宿主から採集されてもよい。いくつかの宿主の場合、細胞採集は、宿主を犠牲にすることを含むことがある。また別の場合には、細胞採集が、適切な組織の生検または外科的除去を含むこともある。
【００５１】
１つの実施態様において、ＩＳＣは、抗原特異的Ｔ細胞の増殖を誘発するために用いられてもよい。宿主（例えばマウス）は、特定の抗原を含むＩＳＣで免疫化されてもよい。宿主における十分なインキュベーションの後、あるいくつかのＴ細胞（例えばＣＤ８+Ｔ細胞）は、免疫化に応答して抗原特異的なＴ細胞に成熟するであろう。抗原のみで免疫化された宿主と比較して、Ｔ細胞のより大きい割合が、ＩＳＣで免疫化された宿主において抗原特異的であろう（図１〜３）。ＩＳＣは、ＩＲＭ部分と抗原部分とを共有結合させることによって（図１〜３）、あるいはまた非共有ペア形成、例えばコロイド縣濁液によって（図１５〜１７）ペア形成されてもよい。
【００５２】
抗原がタンパク質（例えばオボアルブミン）であるならば、ＩＳＣが全タンパク質を含む必要はないかもしれない。例えばタンパク質からの免疫優性ペプチドが、完全なタンパク質抗原に特異的なＴ細胞の発育を誘発するのに必要とされるすべてでありうる。さらには、例えば最初の免疫化の１５日後の追加抗原免疫化は、抗原特異的Ｔ細胞の誘発を増加させうる（図７）。
【００５３】
ＩＳＣでの宿主の免疫化は、ＣＤ８+細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）における抗原特異的応答を惹起するために用いることができる。このような応答は、腫瘍およびウイルス感染した細胞集団を包含するがこれらに限定されるわけではない多くの状態に対して向けることができる。ＩＳＣはまた、将来の腫瘍またはウイルス感染に対して向けられた保護的ＣＴＬ免疫を宿主に備えさせるために、予防的に投与することもできる。
【００５４】
もう１つの実施態様において、ＩＳＣは、試験管内で抗原特異的Ｔ細胞によってサイトカイン産生を誘発するために用いることができる。免疫化された宿主からの適切な組織が、収集され、抗原とともに試験管内で培養され、これによって１つまたはそれ以上のサイトカインの産生を誘発することができる（例えばＩＦＮ−γ、図４−６参照）。ここでもまた、抗原がタンパク質である場合、抗原タンパク質からの免疫優性ペプチドが、細胞培養物中に抗原特異的Ｔ細胞を誘発して、サイトカインを産生および分泌させるのに必要とされるすべてでありうる。
【００５５】
別の実施態様において、ＩＳＣは、生体内で腫瘍成長を阻害するために用いることができる。特定の抗原を発現する腫瘍細胞を有する宿主は、抗原を含有するＩＳＣで免疫化されうる。いくつかの実施態様において、最初の免疫化は、二次免疫化で高めることができる。抗原を含有するＩＳＣで免疫化された宿主から採集された腫瘍は、抗原のみで免疫化された宿主から採集された腫瘍よりも一般に小さかった（図８）。さらにはこれらの腫瘍の分析は、ＩＳＣで免疫化された宿主から採集された腫瘍が、抗原のみで免疫化された宿主から採集された腫瘍よりも高い割合の抗原特異的Ｔ細胞を含有していた（図１０）。
【００５６】
さらにもう１つの実施態様において、ＩＳＣは、抗原提示細胞（ＡＰＣ、例えば樹状細胞）を誘発させて、これらの細胞表面においてＭＨＣ類（ｃｌａｓｓ）Ｉ錯体内の抗原からペプチドを提示させるために用いることができる。宿主は、この型の応答を誘発するために、静脈内で免疫化されてもよい。この応答は、ＡＰＣ提示抗原／ＭＨＣ類Ｉ錯体について脾臓細胞を収集して分析することによって検証することができる（図１１−１３）。
【００５７】
代替実施態様において、ＩＳＣは、試験管内で抗原特異的Ｔ細胞を発育させるために用いることができる。例えば骨髄細胞は、特定の抗原を発現する腫瘍を有する患者から採集することができる。これらの採集された細胞は、腫瘍によって発現された抗原を含有するＩＳＣとともに試験管内で培養することができる。ここでもまた、抗原がタンパク質であるならば、ＩＳＣは、タンパク質の免疫優性ペプチドを含む必要があるだけであろう。ＩＳＣでのインキュベーションに応答して試験管内で発育する抗原特異的Ｔ細胞は、患者に再導入することができる。
【００５８】
さらにもう１つの代替実施態様において、ＩＳＣは、腫瘍を有する被検者が、生存の可能性、生存期間、またはその両方を増すために投与することができる。黒色腫細胞で抗原投与された（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）マウスに投与された腫瘍特異的抗原部分を含んでいるＩＳＣは、腫瘍抗原のみで免疫化されたマウスと比較して、増加した生存率を生じた（図１４）。
【実施例】
【００５９】
次の実施例は、本発明の特徴、利点、およびその他の詳細をさらに例証するためにのみ選択されている。しかしながらこれらの実施例は、この目的のために用いられるが、使用された特定の材料および量、ならびにその他の条件および詳細は、本発明の範囲を不当に制限するように解釈されるべきではないと理解すべきであることは明らかである。
【００６０】
ＩＲＭ化合物の調製
ＩＲＭ化合物１（ＩＲＭ１）：Ｎ−［６−（｛２−［４−アミノ−２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチル｝アミノ）−６−オキソヘキシル］−４−アジド−２−ヒドロキシベンズアミド
【化２】
0005491364.tif 000003
【００６１】
パートＡ
Ｎ2下、２００ｍＬの無水ＣＨ2Ｃｌ2中の４−クロロ−３−ニトロキノリン（１７．３ｇ、８３．２ミリモル）の攪拌溶液を、トリエチルアミン（２３．２ｍＬ、１６６．４ミリモル）および１，２−ジアミノ−２−メチルプロパン（９．５７ｍＬ、９１．５ミリモル）で処理した。一晩攪拌した後、この反応混合物を、８００ｍＬのＣＨＣｌ3で希釈し、Ｈ2Ｏ（３×３００ｍＬ）およびブライン（３００ｍＬ）で洗浄した。有機部分をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、濃縮すると、２−メチル−Ｎ1−（３−ニトロキノリン−４−イル）プロパン−１，２−ジアミン（２１．０ｇ）を明るい黄色の固体として生じた。
【００６２】
パートＢ
Ｎ2下、５０ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中の２−メチル−Ｎ1−（３−ニトロキノリン−４−イル）プロパン−１，２−ジアミン（２．６０ｇ、１０．０ミリモル）の溶液を０℃に冷却し、１０ｍＬの１Ｎ  ＮａＯＨ溶液で処理した。ついでジ−第三ブチルジカーボネート（２．１８ｇ、１０．０ミリモル）を、急速に攪拌された溶液に添加した。ついで反応混合物を、周囲温度に温めておき、一晩攪拌した。追加の４００ｍｇのジ−第三ブチルジカーボネートを添加し、攪拌を３日間続行した。ついで反応物をエチルアセテート（２００ｍＬ）で処理し、Ｈ2Ｏ（２×）およびブラインで洗浄した。有機部分をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、濃縮すると、黄色の固体を生じた。これを１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで摩砕した。この固体を濾過によって単離し、真空下一晩乾燥すると、第三ブチル１，１−ジメチル−２−［（３−ニトロキノリン−４−イル）アミノ］エチルカルバメート（２．８０ｇ）を黄色い粉末として生じた。
【００６３】
パートＣ
１５０ｍＬのトルエン中の第三ブチル１，１−ジメチル−２−［（３−ニトロキノリン−４−イル）アミノ］エチルカルバメート（３．５０ｇ、９．７２ミリモル）の溶液を、炭素上０．３ｇの５％Ｐｔで処理し、Ｈ2下（３気圧、３Ｋｇ／ｃｍ2）６時間振とうした。ついでこの溶液を、セライトパッドを通して濾過し、濃縮すると、３．０４ｇの粗第三ブチル−２−［（３−アミノキノリン−４−イル）−１，１−ジメチルエチルカルバメートを薄いオレンジ色の泡として生じた。
【００６４】
パートＤ
５０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中の第三ブチル−２−［［３−アミノキノリン−４−イル］−１，１−ジメチルエチルカルバメート（３．０４ｇ、９．２１ミリモル）の溶液を０℃に冷却し、トリエチルアミン（１．４１ｍＬ、１０．１３ミリモル）および塩化エトキシアセチル（１．０２ｍＬ、１０．１７ミリモル）で処理した。２時間後、反応混合物を減圧下に濃縮した。その結果生じたシロップを、１００ｍＬのＥｔＯＨ中に取り、４．５ｍＬのトリエチルアミンで処理した。この溶液を、一晩還流に至るまで加熱した。反応混合物を濃縮し、１００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中に取り、Ｈ2Ｏ（２×）、およびブラインで洗浄した。有機部分をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、濃縮した。その結果として生じたシロップを、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、８０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製すると、第三ブチル−２−［２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチルカルバメート（１．５７ｇ）をピーチカラーの泡として生じた。
【００６５】
パートＥ
３０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中の第三ブチル−２−［２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチルカルバメート（１．５７ｇ、３．９４ミリモル）の溶液を、３−クロロペルオキシ安息香酸（７７％、１．０１ｇ、４．５７ミリモル）で処理した。２時間の攪拌後、反応混合物を、３０ｍＬの追加のＣＨ2Ｃｌ2で処理し、１％Ｎａ2ＣＯ3溶液（２×３０ｍＬ）、Ｈ2Ｏ、およびブラインで洗浄した。ついで有機部分をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、濃縮すると、第三ブチル−２−［２−（２−（エトキシメチル）−５−オキシド−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチルカルバメート（１．５８ｇ）を薄い褐色の泡として生じた。
【００６６】
パートＦ
２０ｍＬの１，２−ジクロロエタン中の第三ブチル−２−［２−（２−（エトキシメチル）−５−オキシド−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチルカルバメート（１．５７ｇ、３．７９ミリモル）の溶液を、７０℃に加熱し、２ｍＬの濃縮ＮＨ4ＯＨ溶液で処理した。急速攪拌溶液に、固体ｐ−トルエンスルホニルクロライド（７９５ｍｇ、４．１７ミリモル）を添加した。ついで反応混合物を圧力容器において密封し、加熱を２時間続行した。ついで反応混合物を冷却し、５０ｍＬのＣＨＣｌ3で処理した。ついで反応混合物を、Ｈ2Ｏ、１％Ｎａ2ＣＯ3溶液（３×）、およびブラインで洗浄した。有機部分をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、濃縮すると、生成物を薄い褐色の油として生じた。その結果生じた油を、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、２−５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3）によって精製すると、第三ブチル−２−［４−アミノ−２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチルカルバメート（１．２６ｇ）を薄黄色の泡として生じた。
【００６７】
パートＧ
第三ブチル−２−［４−アミノ−２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチルカルバメート（１．２６ｇ、３．０５ミリモル）を、１０ｍＬのＥｔＯＨ中に溶解し、ＥｔＯＨ中の１０ｍＬの２Ｍ  ＨＣｌで処理した。２時間還流加熱後、反応混合物を冷却し、減圧下濃縮した。その結果生じた黄色い固体を、５０ｍＬのＨ2Ｏ中に溶解し、ＣＨＣｌ3（２０ｍＬ）で抽出した。有機相を捨て、水性部分を、濃縮ＮＨ4ＯＨ溶液の添加によって塩基性（ｐＨ約１２）にした。ついでこれを、ＣＨＣｌ3（４×２０ｍＬ）で抽出し、組合わされた有機部分を、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、濃縮すると、１−（２−アミノ−２−メチルプロピル）−２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（８０８ｍｇ）を薄い褐色の粉末として生じた。融点１６１．０−１６２．０℃。
ＭＳｍ／ｚ３１４（Ｍ＋Ｈ）；
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）δ８．３０（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｄｄ，Ｊ＝１．２，８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．４０（ｄｄｄ，Ｊ＝１．０，７．２，８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２１（ｄｄｄ，Ｊ＝１．２，７．０，８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．５７（ｓ，２Ｈ），４．９４（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），４．６１（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．５２（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．６１（ｓ，２Ｈ），１．３１（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），１．０７（ｓ，６Ｈ）；
13Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）δ１５２．４，１５１．１，１４５．７，１３４．３，１２６．８，１２６．７，１２１．７，１２０．８，１１５．７，６５．６，６５．２，５５．８，５２．５，２９．２，１５．４．
分析。Ｃ17Ｈ23Ｎ5Ｏについての計算値：％Ｃ，６５．１５；％Ｈ，７．４０；％Ｎ，２２．３５；実測値：％Ｃ，６５．０４；％Ｈ，７．５２；％Ｎ，２２．０７。
【００６８】
パートＨ
窒素雰囲気下、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドＤＭＦ（２〜４ｍＬ）中のＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル（アジドサリチルアミド）ヘキサノエート（米国イリノイ州ロックフォードのピアス・バイオテクノロジー社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）からのスルホ−ＬＣ−ＮＨＳ−ＡＳＡ、１００ｍｇ、０．２０４ミリモル）の溶液を、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の１−（２−アミノ−２−メチルプロピル）−２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（６３ｍｇ、０．２０１ミリモル）の溶液に添加した。反応混合物を、ホイルでラップされた容器において窒素下攪拌した。２日後、追加の５０ｍｇのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル（アジドサリチルアミド）ヘキサノエートを添加した。約１週間後、反応混合物を、減圧下５５℃で濃縮した。残渣を、少量のメタノールを含有するジクロロメタンと水との間で分けた。有機相を分離し、減圧下に濃縮した。残渣を、フラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム中６％メタノールで溶離する２×１５ｃｍＳｉＯ2）によって精製すると、５３ｍｇの生成物を無色ガラスとして生じた。このガラスを、ジクロロメタンを用いて円錐フラスコに移しかえ、ついで濃縮すると、泡が生じた。この泡を、高真空下に一晩乾燥すると、白い結晶固体４８ｍｇを生じた。ＮＭＲによる分析は、ジクロロメタンの存在を示しており、したがってこの物質を高真空下に一晩、ついで真空オブンにおいて５０℃で５時間乾燥した。ＨＰＬＣによる分析は、＞９３％の純度を示した。
【００６９】
ＩＲＭ化合物２（ＩＲＭ２）：Ｎ−｛６−［（２−｛２−［４−アミノ−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］エトキシ｝エチル）アミノ］−６−オキソヘキシル｝−４−アジド−２−ヒドロキシベンズアミド
【化３】
0005491364.tif 000004
【００７０】
パートＡ
Ｎ2下、１８０ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中の２−（２−アミノエトキシ）エタノール（２９．０ｇ、０．２７６モル）の溶液を０℃に冷却し、１４０ｍＬの２Ｎ  ＮａＯＨ溶液で処理した。ついで１８０ｍＬのＴＨＦ中のジ−第三ブチルジカーボネート（６０．２ｇ、０．２７６モル）の溶液を、急速攪拌溶液に１時間にわたって一滴ずつ添加した。ついで反応溶液を、室温に温めておき、さらに１８時間攪拌した。ついでＴＨＦを減圧下に除去し、残りの水性スラリーを、１５０ｍＬの１Ｍ  Ｈ2ＳＯ4溶液の添加によってｐＨ３にした。ついでこれを酢酸エチル（３００ｍＬ、１００ｍＬ）で抽出し、組合わされた有機相を、Ｈ2Ｏ（２×）およびブラインで洗浄した。有機部分をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、濃縮すると、第三ブチル２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルカルバメートを無色油（４７．１ｇ）として生じた。
【００７１】
パートＢ
１Ｌの無水ＣＨ2Ｃｌ2中の第三ブチル２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルカルバメート（４７．１ｇ、０．２３０モル）の急速攪拌溶液を、Ｎ2下、０℃に冷却し、トリエチルアミン（４８．０ｍＬ、０．３４５モル）で処理した。ついで塩化メタンスルホニル（１９．６ｍＬ、０．２５３モル）を、３０分にわたって一滴ずつ添加した。ついで反応混合物を室温に温めておき、さらに２２時間攪拌した。反応物を、５００ｍＬ飽和ＮａＨＣＯ3溶液の添加によって急冷し、有機相を分離した。ついでこの有機相を、Ｈ2Ｏ（３×５００ｍＬ）およびブラインで洗浄した。有機部分をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、濃縮すると、２−｛２−［（第三ブトキシカルボニル）アミノ］エトキシ｝エチルメタンスルホネートを褐色油（６３．５ｇ）として生じた。
【００７２】
パートＣ
４００ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２−｛２−［（第三ブトキシカルボニル）アミノ］エトキシ｝エチルメタンスルホネート（６３．５ｇ、０．２２４モル）の攪拌溶液を、ＮａＮ3（１６．１ｇ、０．２４７モル）で処理し、反応混合物を、Ｎ2下、９０℃に加熱した。５時間後、この溶液を室温に冷却し、５００ｍＬの冷たいＨ2Ｏで処理した。ついでこの反応混合物を、Ｅｔ2Ｏ（３×３００ｍＬ）で抽出した。組合わされた有機抽出物を、Ｈ2Ｏ（４×１００ｍＬ）およびブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機部分をＭｇＳＯ4上で乾燥し、濃縮すると、５２．０ｇの第三ブチル２−（２−アジドエトキシ）エチルカルバメートを薄い褐色油として生じた。
【００７３】
パートＤ
ＭｅＯＨ中の第三ブチル２−（２−アジドエトキシ）エチルカルバメート（４７．０ｇ、０．２０４モル）の溶液を、炭素上４ｇの１０％Ｐｄで処理し、Ｈ2（３Ｋｇ／ｃｍ2）下、２４時間振とうした。ついでこの溶液を、セライトパッドを通して濾過し、濃縮すると、３５．３ｇの粗第三ブチル２−（２−アミノエトキシ）エチルカルバメートを無色液体として生じ、これを、それ以上精製することなく用いた。
【００７４】
パートＥ
Ｎ2下、５００ｍＬの無水ＣＨ2Ｃｌ2中の４−クロロ−３−ニトロキノリン（３１．４ｇ、０．１５１モル）の攪拌溶液を、トリエチルアミン（４３ｍＬ、０．３０８モル）および第三−ブチル２−（２−アミノエトキシ）エチルカルバメート（０．１５１モル）で処理した。一晩攪拌した後、反応混合物を、Ｈ2Ｏ（２×３００ｍＬ）およびブライン（３００ｍＬ）で洗浄した。有機部分をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、濃縮すると、明るい黄色の固体を生じた。酢酸エチル／ヘキサンからの再結晶化によって、４３．６ｇの第三ブチル２−｛２−［（３−ニトロキノリン−４−イル）アミノ］エトキシ｝エチルカルバメートを明るい黄色の結晶として生じた。
【００７５】
パートＦ
トルエン中の第三ブチル２−｛２−［（３−ニトロキノリン−４−イル）アミノ］エトキシ｝エチルカルバメート（７．５２ｇ、２０．０ミリモル）の溶液を、炭素上の１．５ｇの５％Ｐｔで処理し、Ｈ2（３Ｋｇ／ｃｍ2）下、２４時間振とうした。ついでこの溶液を、セライトパッドを通して濾過し、濃縮すると、６．９２ｇの粗第三ブチル２−｛２−［（３−アミノキノリン−４−イル）アミノ］エトキシ｝エチルカルバメートを黄色いシロップとして生じた。
【００７６】
パートＧ
２５０ｍＬの無水ＣＨ2Ｃｌ2中の第三ブチル２−｛２−［（３−アミノキノリン−４−イル）アミノ］エトキシ｝エチルカルバメート（１０．２ｇ、２９．５ミリモル）の溶液を０℃に冷却し、トリエチルアミン（４．１８ｍＬ、３０．０ミリモル）で処理した。ついで塩化メトキシプロピオニル（３．３０ｍＬ、３０．３ミリモル）を、５分にわたって一滴ずつ添加した。ついで反応物を室温に温め、攪拌を１時間続行した。ついで反応混合物を減圧下に濃縮すると、オレンジ色の固体を生じた。これを２５０ｍＬのＥｔＯＨ中に溶解し、１２．５ｍＬのトリエチルアミンを添加した。この混合物を還流に至るまで加熱し、Ｎ2下、一晩攪拌した。ついでこの反応物を、減圧下に乾燥に至るまで濃縮し、３００ｍＬのＥｔ2Ｏで処理した。ついでこの混合物を濾過し、この濾過物を減圧下に濃縮すると、褐色固体を生じた。この固体を２００ｍＬのホットメタノール中に溶解し、活性炭で処理した。この熱い溶液を濾過し、濃縮すると、１１．１ｇの第三ブチル２−｛２−［２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］エトキシ｝エチルカルバメートを黄色いシロップとして生じた。
【００７７】
パートＨ
２５０ｍＬのＣＨＣｌ3中の第三ブチル２−｛２−［２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］エトキシ｝エチルカルバメート（１０．２２ｇ、２４．７ミリモル）の溶液を、３−クロロ過安息香酸（７７％、９．１２ｇ、４０．８ミリモル）で処理した。３０分の攪拌後、反応混合物を、１％Ｎａ2ＣＯ3溶液（２×７５ｍＬ）およびブラインで洗浄した。有機相を、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、濃縮すると、１０．６ｇの第三ブチル２−｛２−［２−（２−メトキシエチル）−５−オキシド−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］エトキシ｝エチルカルバメートをオレンジ色の泡として生じ、これを、それ以上精製することなく用いた。
【００７８】
パートＩ
１００ｍＬの１，２−ジクロロエタン中の第三ブチル２−｛２−［２−（２−メトキシエチル）−５−オキシド−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］エトキシ｝エチルカルバメート（１０．６ｇ、２４．６ミリモル）の溶液を、６０℃に加熱し、１０ｍＬの濃縮ＮＨ4ＯＨ溶液で処理した。急速攪拌溶液に、固体ｐ−トルエンスルホニルクロライド（７．０５ｇ、３７．０ミリモル）を１０分間にわたって添加した。反応混合物を、追加の１ｍＬ濃縮ＮＨ4ＯＨ溶液で処理し、ついで圧力容器において密封し、加熱を２時間続行した。ついで反応混合物を冷却し、１００ｍＬのＣＨＣｌ3で処理した。ついで反応混合物を、Ｈ2Ｏ、１％Ｎａ2ＣＯ3溶液（２×）、およびブラインで洗浄した。有機部分をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、濃縮すると、１０．６ｇの第三ブチル２−｛２−［４−アミノ−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］エトキシ｝エチルカルバメートを褐色の泡として生じた。
【００７９】
パートＪ
第三ブチル２−｛２−［４−アミノ−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］エトキシ｝エチルカルバメート（１０．６ｇ、２４．６ミリモル）を、エタノール中の７５ｍＬの２Ｍ  ＨＣｌで処理し、この混合物を攪拌しつつ還流に至るまで加熱した。１．５時間後、反応混合物を冷却し、濾過すると、ガム状の固体を生じた。この固体をエタノールおよびＥｔ2Ｏで洗浄し、真空下に乾燥すると、塩酸塩を薄い褐色固体として生じた。５０ｍＬのＨ2Ｏ中にこの塩酸塩を溶解し、１０％ＮａＯＨ溶液で処理することによって、遊離塩基を作製した。ついでこの水性縣濁液を、乾燥に至るまで濃縮し、残渣をＣＨＣｌ3で処理した。その結果生じた塩を、濾過によって除去し、この濾過物を濃縮すると、３．８２ｇの１−［２−（２−アミノエトキシ）エチル］−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンを黄褐色粉末として生じた。
ＭＳ３３０（Ｍ＋Ｈ）+；
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ８．１０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）；７．４０（ｍ，１Ｈ）；７．２５（ｍ，１Ｈ）；６．８８（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）；４．７８（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ）；３．８９（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ）；３．８４（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ）；３．５４（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ）；３．３１（ｓ，３Ｈ）；３．２３（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ）；２．８８（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ）．
【００８０】
パートＫ
窒素雰囲気下、ＤＭＦ（２〜４ｍＬ）中のＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル（アジドサリチルアミド）ヘキサノエート（米国イリノイ州ロックフォードのピアス・バイオテクノロジー社からのスルホ−ＬＣ−ＮＨＳ−ＡＳＡ、１００ｍｇ、０．２０４ミリモル）の溶液を、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の１−［２−（２−アミノエトキシ）エチル］−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（６６ｍｇ、０．２０１ミリモル）の溶液に添加した。３．５時間後、ＨＰＬＣによる分析は、出発物質が存在していないことを示した。反応混合物を一晩攪拌し、ついで減圧下濃縮した。残渣を、フラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム中８％メタノールで溶離する２×１５ｃｍＳｉＯ2）によって精製すると、５５ｍｇの生成物を無色ガラスとして生じた。このガラスを、ジクロロメタンを用いて円錐フラスコに移しかえ、ついで濃縮すると、泡が生じた。この泡を、高真空下に一晩、ついで真空オブンにおいて５０℃で５時間乾燥すると、４５ｍｇの生成物を白色のフワフワした（ｆｌｕｆｆｙ）固体として生じた。ＨＰＬＣによる分析は、＞９５％の純度を示した。
【００８１】
ＩＲＭ化合物３（ＩＲＭ３）：Ｎ−（２−｛２−［４−アミノ−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］エトキシ｝エチル）ヘキサデカンアミド
【化４】
0005491364.tif 000005
【００８２】
窒素雰囲気下、ジクロロメタン（３．５ｍＬ）とトリエチルアミン（１５０μＬ、１．０７ミリモル）との混合物中の１−［２−（２−アミノエトキシ）エチル］−２−（２−メトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（１４０．５ｍｇ、０．４２８モリモル）の縣濁液を、０℃に冷却した。塩化パルミトイル（１３０μＬ、０．４２８ミリモル）をゆっくりと添加した。反応混合物を０℃で２時間攪拌させておき、この時の薄層クロマトグラフィーによる分析は、出発物質が残っていないことを示した。反応混合物を、ジクロロメタン（３０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２×５ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、ついで減圧下に濃縮した。その結果生じた残渣を、カラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中２％メタノールで溶離された１２ｇのシリカゲル）によって精製すると、１８３ｍｇのＮ−（２−｛２−［４−アミノ−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］エトキシ｝エチル）ヘキサデカンアミドを白色粉末として生じた。
分析。Ｃ33Ｈ53Ｎ5Ｏ3についての計算値：％Ｃ，６９．８０；％Ｈ，９．４１；％Ｎ，１２．３３；実測値：％Ｃ，６９．６０；％Ｈ，９．２８；％Ｎ，１１．９９。
【００８３】
実施例１：オボアルブミンへの免疫応答修飾因子の架橋
ＩＲＭ１を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に１０ｍｇ／ｍｌまで縣濁した。オボアルブミンを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に１０ｍｇ／ｍｌまで縣濁し、ｐＨを、ＮａＯＨの添加によって＞１０．０に調節した。５００μｌのオボアルブミン溶液（５ｍｇのオボアルブミン）を、１２−ウエル組織培養プレートの単一ウエルにおいて１００μｌのＩＲＭ１（１ｍｇのＩＲＭ１）と混合した。このプレートを氷上に置き、長波ＵＶ光源を、プレート上に直接、できるだけＩＲＭ１／オボアルブミン混合物の入っているウエルの近くに置いた。この混合物を１５分間照射した。その結果生じた共役体をこのウエルから除去し、５ｍｇ／ｍｌオボアルブミン、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＩＲＭ１の最終濃度までＰＢＳ中に再縣濁して、ＰＢＳに対して透析し、あらゆる非共役ＩＲＭを除去した。
【００８４】
実施例２：免疫化
Ｃ５７ＢＬ／６のマウスを、２００μｌ  ＰＢＳ中の共役体（実施例１において調製された、１ｍｇオボアルブミンおよび２００μｇＩＲＭ１）で皮下または腹膜組織内免疫化した。対照マウスを、２００μｌ  ＰＢＳ中の１ｍｇオボアルブミンで免疫化した。一次応答の分析のために、免疫化の５〜７日後にマウスを犠牲にした。二次応答の分析のために、最初の免疫化の７〜１５日後にマウスに追加免疫を与え（ｂｏｏｓｔ）、５〜７日後にマウスを犠牲にした。ほかに示されていなければ、リンパ節を、皮下的に免疫化されたマウスから分析のために採集し、脾臓細胞を、腹膜組織内免疫化されたマウスから分析のために採集した。
【００８５】
実施例３：試薬
マウスＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、およびＣＤ４４に対して特異的なフルオロクロム標識抗体を、ファーミンゲン（Ｐｈｅｒｍｉｎｇｅｎ）（カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））から入手した。モノクローナル抗体２５Ｄ１．１６（ロン・ジャーメイン博士（Ｄｒ．Ｒｏｎ  Ｇｅｒｍａｉｎ）、ＮＩＨ）は、ＭＨＣ類Ｉ分子Ｈ−２Ｋbに結合された優性オボアルブミンペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に対して特異的である。ポーガドー（Ｐｏｒｇａｄｏｒ）ら、「免疫（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」６：７１５−２６。オボアルブミンは、シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から入手した。優性オボアルブミンペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬに結合されたＭＨＣ類Ｉ分子Ｈ−２Ｋbのテトラマーを、ケドル（Ｋｅｄｌ）ら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、１９２：１１０５−１３（２０００）に記載されているように生成した。オボアルブミン−発現黒色腫細胞株Ｂ１６ｏｖａは、プラスミドエンコード全長オボアルブミンでのＢ１６−Ｆ１０細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−６４７５）のリポフェクションによって作製した。ケドルら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８：１０８１１−６参照。サイトカイン捕獲および検出試薬は、ミルティエニ・バイオテック（Ｍｉｌｔｙｅｎｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（カリフォルニア州オーバーン（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ））からのものであった。
【００８６】
実施例４
実験用マウスを、実施例１において調製された共役体で、実施例２に記載されているように皮下または腹膜組織内のどちらかによって免疫化した。対照マウスを、実施例２に記載されているようにオボアルブミンで免疫化した。７日後、リンパ節または脾臓を除去し、これらの細胞を、ＣＤ８、ＣＤ４４、およびＨ−２Ｋb／ＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマーに対して特異的な抗体で染色し、フロー・サイトメトリーによって分析した。これらの結果は図１〜３に示されている。３つのマーカーすべてについて染色がプラスの細胞は、免疫化の結果として発育した、活性化されたオボアルブミン特異的ＣＤ８+Ｔ細胞を同定する。
【００８７】
図１〜３の各々は、活性化オボアルブミン特異的ＣＤ８+Ｔ細胞として同定された、すべての調べられたＣＤ８+Ｔ細胞の割合を含む。対照マウスにおいて、０．０７％のＣＤ８+Ｔ細胞は、活性化オボアルブミン特異的ＣＤ８+Ｔ細胞であった。共役体での皮下免疫化は、０．５２％の活性化オボアルブミン特異的ＣＤ８+Ｔ細胞を発生させた。共役体での腹膜組織内免疫化は、０．９２％の活性化オボアルブミン特異的ＣＤ８+Ｔ細胞を発生させた。
【００８８】
ＩＲＭ１（２００μｇのＩＲＭ１に架橋された１００μｇのペプチド）に共役された優性オボアルブミンペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）での免疫化も、オボアルブミン特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の活性化を誘発した。
【００８９】
実施例５
対照マウスを、実施例２に記載されているようにオボアルブミンで免疫化した。実験用マウスを、実施例１において調製された共役体で、実施例２に記載されているように皮下または腹膜組織内のどちらかによって免疫化した。適切な免疫細胞を、免疫化の７日後に採集し、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドで４時間試験管内でインキュベーションした。インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）産生ＣＤ８+Ｔ細胞は、フロー・サイトメトリーと組合わされたＩＦＮ−γ捕獲および検出アッセイを用いて同定した。ＩＲＭ１−オボアルブミン共役体での免疫化によって発生させられたＣＤ８+Ｔ細胞は、その後の抗原刺激に応答してＩＦＮ−γを産生した（図４〜６）。
【００９０】
実施例６
マウスを、実施例１において調製された共役体で、実施例２に記載されているように免疫化し、ついで１５日目に等量の共役体で追加免疫を与えた。これらの追加免疫が与えられた動物からの脾臓およびリンパ節細胞を、追加免疫の７日後に分析した。分析は、一次免疫化のみを受けたマウスからのものよりも増加した割合の活性化オボアルブミン特異的ＣＤ８+Ｔ細胞を示した（図７）。
【００９１】
実施例７
マウスに、オボアルブミン−発現黒色腫細胞株Ｂ１６ｏｖａ（１×１０5細胞）を皮内注射した。７日目に、マウスに、１ｍｇのオボアルブミン（対照）、または実施例１において調製された共役体のどちらかを皮下注射した。１４日目に、これらのマウスに、７日目のようにオボアルブミンまたは共役体で皮下的に追加免疫を与えた。２０日目に、腫瘍サイズを、キャリパーで二次元測定した。共役体での免疫化の結果、対照と比較して減少した腫瘍サイズを生じた（図８）。
【００９２】
実施例８
マウスに、オボアルブミン−発現黒色腫細胞株Ｂ１６ｏｖａ（１×１０5細胞）を皮内注射した。７日および１４日後、これらのマウスに、１ｍｇのオボアルブミン（対照）、または実施例１において調製された共役体のどちらかを腹膜組織内注射した。黒色腫細胞株での抗原投与の２０日後、脾臓および腫瘍を除去し、各源からの細胞を、ＣＤ８およびＣＤ４４、ならびにＨ−２Ｋb／ＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマーに対して特異的な抗体で染色した。フロー・サイトメトリック分析は、脾臓（図９）および腫瘍（図１０）内の両方において、活性化オボアルブミン特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の有意な膨張を明らかにした。
【００９３】
実施例９
マウスを、オボアルブミン、オボアルブミンとペア形成されていないＩＲＭ１：１−（２−アミノ−２−メチルプロピル）−２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（リンカー基の接着前のＩＲＭ１−ＩＲＭ１の合成のパートＧの生成物）、または実施例１において調製された共役体で静脈内免疫化した。１４時間後、脾臓を除去し、コラゲナーゼ処理し、これらの細胞を、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、および抗体２５Ｄ１．１６に対して特異的な抗体で染色した。これは、ＭＨＣ類ＩＨ−２Ｋb分子と錯体化されたオボアルブミンペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬに対して特異的である。フロー・サイトメトリック分析は、ＩＲＭ１−オボアルブミン共役体（図１３）でのマウスの免疫化が、オボアルブミン単独（図１１）、またはペア形成されていないオボアルブミンとＩＲＭ１との混合物（図１２）でのマウスの免疫化よりも大きい割合の、Ｋb／ＳＩＩＮＦＥＫＬを提示するＣＤ１１ｃ+、ＣＤ８+樹状細胞を発生させたことを示した。
【００９４】
実施例１０
マウスに、オボアルブミン（対照）、または実施例１において調製されたＩＲＭ１共役体で、実施例２に記載されているように０日目に皮下免疫化した。これらのマウスは、１４日目に追加免疫化を受けた。ついでこれらのマウスに、２８日目にオボアルブミン−発現黒色腫細胞株Ｂ１６ｏｖａ（１×１０5細胞）を皮内抗原投与し、腫瘍成長について監視した。７５日目に、共役体で免疫化されたマウスの８０％は生存し、健康であるように見えたが、一方で、オボアルブミンだけで免疫化されたマウスはすべて死んだ（図１４）。
【００９５】
実施例１１
ＩＲＭ３の保存溶液を、ＩＲＭ３をＤＭＳＯ中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度まで溶解して調製した。オボアルブミンを、ＰＢＳ中に５０ｍｇ／ｍｌの濃度まで溶解した。５０μｌのＩＲＭ３保存溶液を、１５０μｌのＰＢＳに添加し、ついで渦巻き攪拌によって混合した。５０μｌのオボアルブミンを、ＩＲＭ３溶液に添加し、渦巻き攪拌によって混合した。ＩＲＭ３およびオボアルブミンの濁ったコロイド縣濁液が、結果として生じた。
【００９６】
マウスに、（ａ）オボアルブミン単独、または（ｂ）アルブミンとＩＲＭ３とのコロイド縣濁液５０μｌのいずれかで、実施例２に記載されているように０日目に皮下免疫化した。６日目に、排液（ｄｒａｉｎｉｎｇ）リンパ節を除去し、均質化し、Ｈ−２Ｋb／ＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマーで染色し、オボアルブミン特異的Ｔ細胞を同定した。図１５は、オボアルブミン単独で免疫化された対照マウスからのフロー・サイトメトリーデータを示している。図１６および１７は、コロイド縣濁液で免疫化された２匹の異なるマウスからのデータを示している。
【００９７】
実施例１２
ＩＲＭ２とオボアルブミンとの共役体を、実施例１に記載されているように調製した。ただし、ＩＲＭ１の代わりにＩＲＭ２を用いた。
【００９８】
２４匹のマウスを、３匹ずつの８つのグループに分けた。３匹のマウスの４つのグループに、０日目に実施例２に記載されているように皮下免疫化した。各グループは、ＩＲＭ１−オボアルブミンの漸増量を受けた。残りの４つのグループを、０日目にＩＲＭ２−オボアルブミン共役体で同様に免疫化した。６日目に、マウスを犠牲にし、排液リンパ節を除去し、Ｈ−２Ｋb／ＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマーで染色し、オボアルブミン特異的Ｔ細胞を同定した。オボアルブミン特異的Ｔ細胞の割合を、各マウスについて計算した。図１８は、これらの結果を要約する。
【００９９】
実施例１３
マウスに、約２×１０6ＯＴ１オボアルブミン特異的トランスジェニックＴ細胞（メイン州バー・ハーバー、ザ・ジャクソン・ラボラトリー（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ））で養子免疫伝達した。マウスに、（ａ）１００μｇオボアルブミン、（ｂ）１００μｇオボアルブミン＋５０μｇＣｐＧ（Ｏｖａ＋ＣｐＧ）、（ｃ）１００μｇオボアルブミン＋５０μｇのペア形成されていないＩＲＭ１（Ｏｖａ＋ＩＲＭ）、または（ｄ）５０μｇのＩＲＭ１に共役された１００μｇオボアルブミン（Ｏｖａ×ＩＲＭ）のいずれかで、０日目に実施例２に記載されているように皮下免疫化した。５日目に、排液リンパ節を除去し、これらの細胞を、Ｈ−２Ｋb／ＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマーで染色し、オボアルブミン特異的Ｔ細胞を同定した。図１９は、オボアルブミン単独で免疫化されたマウスを上回る、Ｏｖａ＋ＣｐＧ、Ｏｖａ＋ＩＲＭ、およびＯｖａ×ＩＲＭグループにおけるオボアルブミン特異的Ｔ細胞の倍膨張（ｆｏｌｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を示している。
【０１００】
これらの特許、特許文献、および本明細書において引用されている出版物の完全な開示は、それぞれが個別に援用されているかのように、これらの全体が援用される。紛争の場合には、定義を含め、本明細書が支配することになる。
【０１０１】
この発明への様々な修正および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかになるであろう。例証的な実施態様および実施例は、単なる例として示されているだけであり、本発明の範囲を限定するためのものではない。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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