(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１０からなるアミノ酸配列の相補性決定領域Ｈｃ−ＣＤＲ１、Ｈｃ−ＣＤＲ２及びＨｃ−ＣＤＲ３に該当する部分のアミノ酸配列と、  配列番号９からなるアミノ酸配列の相補性決定領域Ｌｃ−ＣＤＲ１  Ｌｃ−ＣＤＲ２及びＬｃ−ＣＤＲ３に該当する部分のアミノ酸配列と、を有する単離された抗ＣＤ１４７抗体。
【請求項２】
配列番号１２からなるアミノ酸配列の相補性決定領域Ｈｃ−ＣＤＲ１、Ｈｃ−ＣＤＲ２及びＨｃ−ＣＤＲ３に該当する部分のアミノ酸配列と、  配列番号１１からなるアミノ酸配列の相補性決定領域Ｌｃ−ＣＤＲ１  Ｌｃ−ＣＤＲ２及びＬｃ−ＣＤＲ３に該当する部分のアミノ酸配列と、を有する単離された抗ＣＤ１４７抗体。
【請求項３】
配列番号１４からなるアミノ酸配列の相補性決定領域Ｈｃ−ＣＤＲ１、Ｈｃ−ＣＤＲ２及びＨｃ−ＣＤＲ３に該当する部分のアミノ酸配列と、  配列番号１３からなるアミノ酸配列の相補性決定領域Ｌｃ−ＣＤＲ１  Ｌｃ−ＣＤＲ２及びＬｃ−ＣＤＲ３に該当する部分のアミノ酸配列と、を有する単離された抗ＣＤ１４７抗体。
【請求項４】
配列番号１６からなるアミノ酸配列の相補性決定領域Ｈｃ−ＣＤＲ１、Ｈｃ−ＣＤＲ２及びＨｃ−ＣＤＲ３に該当する部分のアミノ酸配列と、  配列番号１５からなるアミノ酸配列の相補性決定領域Ｌｃ−ＣＤＲ１  Ｌｃ−ＣＤＲ２及びＬｃ−ＣＤＲ３に該当する部分のアミノ酸配列と、を有する単離された抗ＣＤ１４７抗体。
【請求項５】
ヒト化重鎖及びヒト化軽鎖を含むヒト化抗体であって、
ａ）前記ヒト化重鎖可変領域が、マウスモノクロナール抗体４Ａ５重鎖の配列番号１２に示されるアミノ酸配列からの３つの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）と、ヒトアクセプター抗体重鎖からのフレームワークと、を含み、
ｂ）前記ヒト化軽鎖可変領域が、マウスモノクロナール抗体４Ａ５軽鎖の配列番号１１に示されるアミノ酸配列からの３つの相補性決定領域と、ヒトアクセプター抗体軽鎖からのフレームワークと、を含み、
ｃ）前記ヒト化抗体が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞表面上のＣＤ１４７抗原と特異的に結合する、ヒト化抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００８年９月２９日出願の米国特許出願第６１／１００，８４８号の優先権を主張するものであり、出願の全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、抗ＣＤ１４７抗体及び治療薬としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ１４７は、様々な組織内の大多数の異なる細胞上に発現される免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである。これは元々ヒトＢａｓｉｇｉｎと命名され（基本的な免疫グロブリンスーパーファミリーに関して）、１９９１年頃に最初にクローン化された。（Ｍｉｙａｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１０：７７０〜７７４（１９９１）；Ｋａｎｅｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｓｔｒｕｃｔ  Ｆｕｎｃｔ  １６：２３〜３０（１９９１）；Ｍｉｙａｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１０：７７０〜７７４（１９９１））。ＥＭＭＰＲＩＮ（細胞外マトリックス金属タンパク質誘導因子」）アイソフォームＩＩ（ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿９４０９９１）としても知られるｂｓｇ遺伝子産物、ＣＤ１４７は、２２又は２４アミノ酸長のシグナルペプチド、１８３アミノ酸の細胞外ドメイン、残基２０８〜２２８の膜貫通ドメイン、及び残基２２９〜２６９th残基の細胞内ドメインを有する２６９アミノ酸長のプロポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、図１）である。管理された（curated）ＮＣＢＩ記録によれば、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は２つの免疫グロブリン様ドメイン：残基２２〜１０３のＣ２型ドメインと、残基１０５〜１９９のＶ様ドメインとを含む（図１）。多数のスプライス変異体が報告されている。
【０００４】
ＣＤ１４７は、胎児発生、網膜機能、及びＴ細胞成熟に役割を有する多面的分子である。ＣＤ１４７は、シクロフィリンの細胞表面受容体であることが示されている。ＣＤ１４７は、組織リモデリングの範囲：腫瘍、子宮内膜、胎盤、皮膚及び血管新生を受けている領域内で発現され（Ｉａｃｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｅｘｐ  Ｍｏｌ．Ｐａｔｈ  ８３：２８３〜２９５参照）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及びＶＥＧＦ産生を刺激する。ＣＤ１４７は単球分化により誘導され、ヒトアテローム内で発現される（Ｍａｊｏｒ  ＴＣ，Ｌｉａｎｇ  Ｌ，Ｌｕ  Ｘ，Ｒｏｓｅｂｕｒｙ  Ｗ，Ｂｏｃａｎ  ＴＭ．２００２．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２２：１２００〜１２０７）。ＣＤ１４７は、腫瘍周囲の間質細胞によるＭＭＰ及びウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子系の誘導を介して、異なる腫瘍型の浸潤及び転移を促進することが示されている。ＣＤ１４７はまた、血管新生、アノイキス耐性、乳酸放出、多剤耐性、及び癌細胞における細胞増殖にも関与している。ＣＤ１４７の過剰発現及び／又は機能は、炎症反応、肺線維症、関節リウマチ、エリテマトーデス、心不全、アルツハイマー病、並びにリンパ球内でのヒト免疫不全ウイルス及びコロナウイルスの感染性サイクルなどの他の病理過程に関連している（Ｒｕｉｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８３，（９），５５５４〜５５６６，２００８参照）。加えて、ＣＤ１４７の切断及びＣＤ１４７断片の脱落は、ＣＤ１４７調節又は活性破片の放出に関与し得る（Ｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１（４９）：３７５７６〜８５）。
【０００５】
抗ＣＤ１４７抗体が報告されている。マウス抗体ＩｇＭ  Ｍａｂ、ＣＢＬ１（Ｂｉｌｌｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １：３０３〜３１１，１９８２、米国特許第５３３０８９６号及び同第５６４３７４０号）がステロイド抵抗性急性移植片対宿主病にて試験された（Ｈｅｓｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３４６：８０５〜８０６；Ｄｅｅｇ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｂｌｏｏｄ  ９８：２０５２〜８）。ＥＣＤの膜貫通ドメインの付近の、ＣＢＬ１（ａｋａ  ＡＢＸ−ＣＢＬ）のエピトープと重複するエピトープに結合するヒト等価Ｍａｂも開発された（米国特許第２００７０４８３０５Ａ１号）。Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｔｅｒｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１（５）７７７〜７８６，１９９９）は、Ｔ及びＢ細胞活性化に関連したＣＤ１４７エピトープをマッピングし、ＣＤ１４７に形成される抗体グループの最も高い親和性を有するモノクローナル抗体（ＭＥＭ−Ｍ６／６）のみが、ＭＡＢによるＣＤ３、ＯＫＴ３に対抗するヒトＴ細胞活性化及び増殖の防止に有効であることを報告した。腫瘍細胞由来のヒトＣＤ１４７に対するマウス抗体、ＥＩＩＦ４（Ｅｌｌｉｓ，１９８９  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４９：３３８５〜９１；Ｂｉｓｗａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５，４３４〜４３９，１９９５）は、ヒト線維芽細胞からの肺癌ＣＤ１４７誘導によるコラゲナーゼ（マトリックスメタロプロテイナーゼ−１、即ちＭＭＰ−１）の活性を遮断する能力を示した。ＣＤ１４７に対するＥＩＩＦ４抗体の結合は、Ｎ−末端Ｉｇドメインが欠損した突然変異体ＥＣＤが調製された際に無効になることが示された（Ｂｉｓｗａｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５，４３４〜４３９，１９９５）。Ｋｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃａｎ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６５（５）４３５〜４４３，２００７）は、切断ＣＤ１４７配列を使用することによって、ＣＤ１４７関連のＭＭＰ軸の阻害性として記載されたＭＡＢを同定し、ＣＤ１４７  ＭＭＰ誘導活性のためのＮ−末端（22Ａ〜50Ｖ）におけるキー残基を同定した。
【０００６】
このように、ＣＤ１４７の所定の抗体及び他のアンタゴニストは既知であるが、２つの免疫グロブリンドメインを含むタンパク質の複雑な性質が、種々の生物学的活性にどのように影響を与えるかは完全には解明されていない。ドメイン特異的なアンタゴニストは、ＣＤ１４７表示及び／又は様々な組織上での活性化に関連した様々な病変の処置に有用な治療的候補であると証明され得る。例えば、ＣＤ１４７により誘導されるＭＭＰ産生又はＶＥＧＦ活性を遮断可能な治療薬は、癌治療に有利であり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ＣＤ１４７−依存性疾患の症候を軽減又は除去するための治療に使用するためのヒトＣＤ１４７に特異的なヒト抗体、並びに既知の抗体又はその断片に対する改良を供給する必要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、血管新生、ＶＥＧＦ産生、マトリックスメタロプロテイナーゼ産生（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、及びＭＭＰ−９）を含むが、これらに限定されないＣＤ１４７に関連した１つ以上の生物活性を遮断可能であり、ヒトＣＤ１４７上に特異的結合部位を有する、抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体を提供する。
【０００９】
本発明の一態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１１、１３及び１５に示されるような軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のアミノ酸配列と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、１２、１４及び１６に示されるような重鎖ＣＤＲｓのアミノ酸配列とを有する、モノクローナル抗体の抗原結合能力を有する、ヒトＣＤ１４７タンパク質と反応する単離された抗体である。
【００１０】
本発明の別の態様は、ＣＤ１４７タンパク質のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基６５〜７５に位置するＣＤ１４７タンパク質エピトープと反応する単離された抗体である。
【００１１】
本発明の別の態様は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、１２及び１４に示される配列から選択される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（Ｈｃ−ＣＤＲ１、Ｈｃ−ＣＤＲ２及びＨｃ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列と、式（Ｉ）：
Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｘａａ1  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｘａａ2  Ｐｒｏ  Ｘａａ3Ｔｈｒ
（Ｉ）
（式中、Ｘａａ1は、Ｔｙｒ又はＡｓｐであり；Ｘａａ2は、Ｔｙｒ又はＳｅｒであり；Ｘａａ3は、Ｐｈｅ又はＴｙｒ又は非存在であり；Ｘａａ4は、Ｔｈｒ又はＰｈｅである）に示されるような軽鎖ＣＤＲ３（Ｌｃ−ＣＤＲ３）；並びにそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９及び１１に示されるような配列から選択される軽鎖ＣＤＲ１（Ｌｃ−ＣＤＲ１）及び軽鎖ＣＤＲ２（Ｌｃ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列と、を有する、単離された抗体である。
【００１２】
本発明の別の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示されるＨｃ−ＣＤＲ１、Ｈｃ−ＣＤＲ２及びＨｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示されるようなＬｃ−ＣＤＲ１  Ｌｃ−ＣＤＲ２及びＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と、を有する単離された抗体である。
【００１３】
本発明の別の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示されるＨｃ−ＣＤＲ１、Ｈｃ−ＣＤＲ２及びＨｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示されるようなＬｃ−ＣＤＲ１  Ｌｃ−ＣＤＲ２及びＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と、を有する単離された抗体である。
【００１４】
本発明の別の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示されるＨｃ−ＣＤＲ１、Ｈｃ−ＣＤＲ２及びＨｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示されるようなＬｃ−ＣＤＲ１  Ｌｃ−ＣＤＲ２、及びＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と、を有する単離された抗体である。
【００１５】
本発明の別の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示されるＨｃ−ＣＤＲ１、Ｈｃ−ＣＤＲ２及びＨｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示されるようなＬｃ−ＣＤＲ１  Ｌｃ−ＣＤＲ２、及びＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と、を有する単離された抗体である。
【００１６】
本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチドである。
【００１７】
別の態様において、本発明は、抗体４Ａ５及び５Ｆ６により規定される共通エピトープに結合する、及び／又はＣＤ１４７に対する結合に関して抗体４Ａ５若しくは５Ｆ６と競合する、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基６５〜７４におけるＤ２交換に対する保護などの、抗体４Ａ５及び５Ｆ６により示される他の機能的結合特性を有する、抗体に関する。そのような抗体には、例えば抗体４Ａ５又は５Ｆ６と競合し、１０-7Ｍ未満の、例えば１０-8Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、１０-10Ｍ未満、又はそれ未満（例えば、１０-11Ｍ未満）などの解離定数（ＫD）でＣＤ１４７に結合するものが挙げられる。
【００１８】
本発明は、本明細書に定義されるヒトＣＤ１４７に結合可能な典型的な抗体配列に由来し、血管新生、ＶＥＧＦ産生及びマトリックスメタロプロテイナーゼ産生（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２及び／又はＭＭＰ−９産生）を含むがこれらに限定されない、ＣＤ１４７に関連した１つ以上の生物活性に関連した活性を遮断する、特異的結合ドメインを提供する。特異的結合ドメインは、可変領域として特定されるドメインであり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９〜１６にて特定されるＣＤＲ残基である。本発明は更に、ＫＤ  １０-7Ｍ未満の親和性でヒトＣＤ１４７に免疫特異的に結合する能力を維持し、ＣＤ１４７に対する結合に関して抗体２Ｈ３、４Ａ５又は５Ｆ６と競合し、ＣＤ１４７の生物活性を遮断する、ヒト化若しくは再構築された抗体などのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９〜１６に由来する抗体、又は抗体結合ドメインを含む。
【００１９】
したがって、本発明の一態様は、ヒト化重鎖及びヒト化軽鎖を含むヒト化抗体に関し、
（１）ヒト化重鎖可変領域は、マウス２Ｈ３、４Ａ５、５Ｆ６又は２Ｃ８重鎖からの３つの相補性決定領域（ＣＤＲＳ）と、場合により１つ以上のヒトフレームワーク残基置換を有する、ヒトアクセプター抗体重鎖からのフレームワークと、を含み、
（２）ヒト化軽鎖可変領域は、マウス２Ｈ３、４Ａ５、５Ｆ６又は２Ｃ８軽鎖からの３つの相補性決定領域と、場合により１つ以上のヒトフレームワーク残基置換を有する、ヒトアクセプター抗体軽鎖からのフレームワークと、を含み、ヒト化抗体は、ヒトＣＤ１４７に特異的に結合する。
【００２０】
更なる実施形態において、ヒト化抗体は、更に１つ以上の置換又は削除により操作された１つ以上のＣＤＲs、例えば、２Ｈ３、４Ａ５、５Ｆ６又は２Ｃ８の１つ以上のＣＤＲｓと９０％、９５％、９８％又は９９．５％同一のものから構成されてもよい。
【００２１】
別の実施形態は、治療的又は予防的に有効な量の本発明の１つの抗体、又は本発明の複数の抗体の混合物を、処置を必要とする対象に投与することによる、ＣＤ１４７生物活性に関連した病態の処置又は予防に関する。
【００２２】
更なる実施形態では、ワクチンの成分としての抗原エピトープが提供される。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１残基６５〜７４、又は本発明の抗体により尚認識されるその保存的変更を含む上述したエピトープは、宿主を能動的に免疫化して、ＣＤ１４７生物活性に関連した病態と戦い又は病態を予防することができる、ＣＤ１４７に対抗する抗体の産生を誘発するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ヒトＣＤ１４７アイソフォーム２のドメインマップ及び一文字アミノ酸コードでのプロペプチドの配列。
【図２】Ｆｃ−コンストラクトとしてのＣＤ１４７  ＥＣＤ及びサブドメイン（Ｎ−ドメインは残基１９〜１１７であり、Ｃ−ドメインは残基９５〜２０４である）の、ＮＨＬＦ内での濃度依存性刺激ＭＭＰ−１産生における相対的な活性を示すグラフ。
【図３】Ｆｃ−コンストラクトとしてのＣＤ１４７  ＥＣＤ及びサブドメイン（Ｎ−ドメインは残基１９〜１１７であり、Ｃ−ドメインは残基９５〜２０４である）の、ＮＨＬＦ内での濃度依存性刺激ＶＥＧＦ産生における相対的な活性を示すグラフ。
【図４】ＶＥＧＦ又は（Ｂ）ＭＭＰ−１の分泌を刺激するのに使用されたＣＤ１４７  ＥＣＤ又はサブドメインＦｃ−コンストラクト（Ａ）に対するＡｋｔ−ｖ、Ａｋｔ依存性シグナル伝達経路阻害剤の効果。
【図５】生きたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（Ａ）に結合する（ｍＩｇＧ１）が、ＮＨＬＦ細胞（Ｂ）に結合しないマウス抗体（１０ｕｇ／ｍＬ）の棒グラフ。
【図６】選択された精製マウス抗体（ｍＩｇＧ１）が、ＮＨＬＦ内でＣＤ１４７（ＣＤ１４７）刺激ＭＭＰ−１産生を遮断する相対的な能力を示すグラフ。
【図７】ヒト腫瘍及びヒト神経芽細胞の共培養物中でのＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９産生を遮断する選択されたマウス抗体（ｍＩｇＧ１）の相対的な能力を示す酵素電気泳動像。
【図８】組み換え抗ＣＤ１４７抗体２Ｈ３（ｍＩｇＧ２ａ）及び５Ｆ６（ｈＩｇＧ１）により減弱された、ヒト腫瘍及びヒト神経芽細胞の共培養物中でのＭＭＰ−２放出を示す酵素電気泳動像。
【図９】抗ＣＤ１４７抗体２Ｈ３（ｍＩｇＧ２ａ）及び５Ｆ６（ｈＩｇＧ１）が、ＮＨＬＦからのＣＤ１４７誘導によるＶＥＧＦを阻害することを示す棒グラフ。
【図１０】１日目及び４日目に１０ｍｇ／ｋｇ  Ｍａｂのｉ．ｐ．注射を受容した後のヌードマウスから採取した、ＰＡＮＣ−１（ヒト膵臓腫瘍細胞）と共に移植された８日目のマトリゲルプラグ内のヘモグロビン（Ｈｂ）含有量の棒グラフ。
【図１１】エフェクター陽性アイソタイプ（Ｅ＋）又はＰＢＳである、組み換え抗ＣＤ１４７抗体、２Ｈ３（ｍＩｇＧ２ａ）及び５Ｆ６（ｈＩｇＧ１）を受容しているマウスにおける、ある時間に亘る腫瘍容積変化。
【図１２】４Ａ５（上）又は５Ｆ６（下）結合領域のいずれかと複合されたＡｓｐ１９−Ａｓｎ１１７コンストラクトの簡略化Ｈ／Ｄ交換マップ。
【図１３】ＥＬＩＳＡフォーマットにおけるＡｓｐ１９−Ｇｌｕ  １９２−Ｆｃコンストラクトの結合に関して４Ａ５又は５Ｆ６と競合する２Ｈ３  Ｍａｂの競合的結合アッセイを示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
【表１】
0005564049.tif 000002
【００２５】
略語
ＣＤＲ−相補性決定領域、ＨＣ−重鎖、ＧｖＨＤ移植片対宿主病、ＬＣ−軽鎖、ＩＦＮ−インターフェロン（ａ、α；ｂ、β）、Ｉｇ−免疫グロブリン、Ｍａｂ−モノクローナル抗体、ＭＭＰ−マトリックスメタロプロテイナーゼ、ＮＨＬＦ−正常ヒト肺線維芽細胞、ＮＨＤＦ−正常ヒト皮膚線維芽細胞線、ＶＥＧＦ−血管内皮増殖因子、ＶＬ−可変部軽鎖、ＶＨ−可変部重鎖
【００２６】
定義
本明細書で使用されるとき、「抗体」は、抗体全体、及びその任意の抗原結合断片又は短鎖を含む。したがって、抗体は、本発明の抗体の中に取り込むことのできる、少なくとも１つの重鎖若しくは軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）若しくはそのリガンド結合部、重鎖若しくは軽鎖可変領域、重鎖若しくは軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域若しくはその任意の部分、又は結合タンパク質の少なくとも一部分などであるが、これらに限定されない免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む、任意のタンパク質又はペプチド含有分子を含む。用語「抗体」は、更に、抗体、その消化断片、特定部分及び変異体を包含することを意図し、これには抗体模倣薬が挙げられ、又は抗体の構造及び／若しくは機能を模倣する抗体の部分若しくはその特定断片若しくは一部を含み、単鎖抗体及びその断片が挙げられる。機能的断片は、予め選択された標的に対する抗原結合断片を含む。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例は、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ、ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域にてジスルフィド架橋により結合された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ、ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単腕（single arm）のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６）；並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によりコードされているが、それらは組み換え方法を使用して、合成リンカーにより連結されることができ、前記合成リンカーは、ＶＬ及びＶＨ領域が組み合わされて一価分子を形成している単一タンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として既知、例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６、及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３参照）として作製されることを可能にする。そのような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることを意図する。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来の技術を使用して得られ、これらの断片はインタクト抗体と同一の方法で、有用性に関してスクリーニングされる。逆に、ｓｃＦｖコンストラクトのライブラリを使用して抗原結合能力に関してスクリーニングした後、従来の技術を使用して、ヒト生殖系列遺伝子配列をコードする他のＤＮＡにスプライスしてもよい。そのようなライブラリの１つの例は、「ＨｕＣＡＬ：ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリ」（Ｋｎａｐｐｉｋ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２０００）２９６（１）：５７〜８６）である。
【００２７】
用語「ＣＤＲ」は、抗原結合に関与する、抗体の相補性決定領域又は高頻度可変領域アミノ酸残基を指す。抗体のヒトＩｇＧサブタイプの高頻度可変領域、即ち「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）］に記載されているように、軽鎖可変部ドメイン内の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）と、重鎖可変部ドメイン内の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）とからのアミノ酸残基、並びに／又は高頻度可変ループ（即ち、［Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７）］により記載されているように、軽鎖可変部ドメイン内の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）及び９１〜９６（Ｌ３）と、重鎖可変部ドメイン内の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）及び９６〜１０１（Ｈ３））からの残基を含む。フレームワーク又はＦＲ１〜４残基は、高頻度可変領域以外の、一括する可変部ドメイン残基である。より最近になって、普遍的な付番システム（universal numbering system）、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（登録商標）（ＩＭＧＴ）（ＬａＦｒａｎｃ，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：Ｄ５９３〜Ｄ５９７）が開発され、広く採用されている。本明細書において、ＣＤＲは、アミノ酸配列と、軽鎖又は重鎖における位置との両方の観点において意味される。免疫グロブリン可変部ドメインの構造内のＣＤＲの「位置」は、種の間で保存され、ループと称される構造で存在するため、可変部ドメイン配列を構造的特徴に従って整合する付番システムを使用することにより、ＣＤＲ及びフレームワーク残基は容易に特定される。この情報は、１つの種の免疫グロブリンからのＣＤＲ残基を、典型的にはヒト抗体からのアクセプターフレームワーク内に移植及び置き換えるのに使用される。
【００２８】
用語「ＥＭＭＰＲＩＮ」は、本明細書にて「細胞外マトリックス金属タンパク質誘導因子」、ＣＤ１４７、ヒトｂａｓｉｇｉｎ（ＢＳＧ）遺伝子の産物、ヒト白血球活性化抗原Ｍ６、ラットＯＸ−４７の種ホモログ、マウスｂａｓｉｇｉｎ、及びニワトリＨＴ７分子、腫瘍細胞由来コラゲナーゼ刺激因子、ニューロセリン（neurothelin）を意味するよう使用され、ＣＤ１４７の全ての変異体、アイソフォーム及び種ホモログを含む。したがって、本発明の抗体は、所定の場合では、ヒト以外の種からのＣＤ１４７と交差反応することができる。他の場合では、抗体は、ヒトＣＤ１４７に対して完全に特異的であってもよく、種の又は他のタイプの交差反応性を示さない。
【００２９】
「エピトープ」という用語は、抗体に対する特異的結合が可能なタンパク質決定因子を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの化学的に活性な分子表面基で構成されており、通常、特定の３次元構造特性並びに特定の電荷特性を有する。構造的及び非構造的エピトープは、後者ではなく前者に対する結合が、変性溶媒の存在下で損失するという点で区別される。
【００３０】
「ヒト化」（再構築又はＣＤＲ移植とも称される）は、異種源（通常、げっ歯類）からのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の免疫原性を低減し、親和性又はエフェクター機能（ＡＤＣＣ、補体活性化、Ｃ１ｑ結合）を向上させる確立された技術を含む。操作されたｍＡｂは、ファージ表示された無作為化配列を用いて分子生物学の技術により生成され、又はデノボで合成されることができる。例えば、非ヒト種からのＣＤＲ領域を組み込んだヒト化抗体を構築するために、デザインは、ＣＤＲの残基内の保存的アミノ酸置換、及び非ヒトｍＡｂからの残基のヒトフレームワーク領域内への逆置換（逆突然変異）などのバリエーションを含み得る。位置は、配列比較方法、コンセンサス配列分析、又は可変領域の３Ｄ構造の構造的分析により識別又は同定することができる。選択された候補の免疫グロブリン配列について、可能性の高い３次元立体構造を図示及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレイを調べることにより、候補の免疫グロブリン配列の機能における残基の役割として可能性の高いものの分析、即ち候補の免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。この方法で又は単純な配列アラインメントアルゴリズム（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）により、ＦＲ（フレームワーク）残基を、公にアクセス可能なＶＢＡＳＥ又はＫａｂａｔのようなデータベース内に見出される既知の抗体配列から選択することができ、また標的抗原（１つ以上）に対する親和性などの所望の抗体特性が達成されるようコンセンサス配列が最適化される。抗体構造に関する既知のパラメータのデータセットが増加するにつれて、これらの技術が洗練及び精密化される。ヒト化の他の手法は、ヒトｍＡｂに見出される最も通常の残基によってげっ歯類配列の表面残基のみを修飾することであり、「表面再構成（resurfacing）」又は「化粧張り（veneering）」と称されている。現在、多数のヒト及び非ヒトＩｇ配列の両方が既知であり、自由に入手することができ、例えば、ＬｅＦｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌにより開発され、ＩＭＧＴの名称で見出されるデータベース及びツール；Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（ＮＣＢＩ）により管理されるウェブサイトが当業者により使用され、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３）も目下非常に拡張され、オンラインで入手可能であり、これらはそれぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明の抗体のヒト化又は操作は、既知の任意の方法、又はヒト免疫グロブリン配列情報を用いて開発された方法により行うことができる。そのような方法は、例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第６９８２３６１号、及びＢｏｗｄｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．の国際公開第０３／０２５０１９号に教示され、それらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、ＫDは、解離定数、詳細には既定の抗原についての抗体の解離定数ＫDを意味し、特異的標的に対する抗体の親和性の尺度である。高親和性抗体は、既定の抗原について、有するＫDが１０-8Ｍ以下、より好ましくは１０-9Ｍ以下、更に好ましくは１０-10Ｍ以下である。ＫDの逆数は、ＫA、会合定数である。本明細書で使用されるとき、用語「ｋdis」又は「ｋ2」又は「ｋd」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を意味するよう意図されている。「ＫD」は、会合速度（ｋ1）又は「オン速度（ｋon）」に対する、「オフ速度（ｋoff）」とも呼ばれる解離速度（ｋ2）の比である。よってＫDはｋ2／ｋ1又はｋoff／ｋonに等しく、モル濃度（Ｍ）で表わされる。ＫDが小さくなるほど、結合は強いということになる。よって、ＫDが１０-6Ｍ（又は１マイクロＭ）とは、１０-9Ｍ（又は１ｎＭ）に比べ、弱い結合を表わす。
【００３２】
本明細書で使用されるところの「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成物からなる抗体分子の製剤を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定エピトープの単一の結合特異性及び親和性を示す。この用語はまた、「組み換え抗体」及び「組み換えモノクローナル抗体」も含み、（ａ）動物、又は抗体分泌動物細胞と融合パートナーとの融合により調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するよう形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組み換えの、ヒト又は他の種のコンビナトリアル抗体ライブラリから単離された抗体、並びに（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライスすることを含む任意の他の手段により調製、発現、作製又は単離された抗体、などの全ての抗体は、組み換え手段により調製、発現、作製又は単離される。本明細書で使用されるとき、「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に有さない抗体を指すことが意図される。しかしながら、ヒトＣＤ１４７のエピトープ、アイソフォーム又は変異体に特異的に結合する、単離された抗体は、他の関連した抗原、例えば他の種（例えば、ＣＤ１４７種ホモログ）由来の抗原に対して交差反応性を有する場合がある。また、単離された抗体は、他の細胞材料及び／又は化学薬品を有さない場合がある。本発明の一実施形態では、異なる特異性を有する「単離された」モノクローナル抗体の組み合わせを、明確に規定された組成物中で混ぜ合わせる。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、「特異的な結合」、「免疫特異的な結合」及び「免疫特異的に結合する」は、所定の抗原に結合する抗体を指す。典型的に、抗体は、解離定数（ＫD）が１０-7Ｍ以下で結合し、既定の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン、又はその他任意の特定ポリペプチド）に結合するためのＫDに比べ、少なくとも２分の１のＫDで、既定の抗原に結合する。「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という表現は、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と同義的に使用される。本明細書で使用されるとき、「高度に特異的な」結合は、特定の標的エピトープに対する抗体の相対的なＫDが、他のリガンドに対する抗体の結合に関するＫDの少なくとも１０倍小さいことを意味する。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ）を指す。いくつかの抗体クラスは更にサブクラスを包含し、サブクラスも重鎖定常領域によりコードされ、更に定常領域ドメイン（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）内の特定の残基においてオリゴ糖により装飾され、抗体に生物学的機能が更に付与されている。例えば、ヒト抗体アイソタイプにおいて、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、及び現存するより少数のＩｇＧ２は、マウスＩｇＧ２ａ抗体と同様、エフェクター機能を示す。
【００３５】
「エフェクター」機能又は「エフェクターポジティブ（effector positive）」は、抗体が抗原特異的結合ドメインから区別されるドメインを含み、ドメインは、受容体、又は補体などの他の血液成分と相互作用して、例えばマクロファージの動員、及び抗体の抗原結合ドメインに結合された細胞の破壊をもたらす事象を引き起こすことができる。抗体は、エフェクター分子の結合により仲介される数種のエフェクター機能を有する。例えば、抗体に対する補体のＣ１成分の結合は、補体系を活性化させる。補体の活性化は、オプソニン作用と、細胞の病原体の溶解に重要である。補体の活性化は、炎症性応答を刺激し、また自己免疫過敏症にも関与し得る。更に、抗体は、Ｆｃ領域を介して細胞に結合し、抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体部位が細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）と結合する。ＩｇＧ（γ受容体）、ＩｇＥ（η受容体）、ＩｇＡ（α受容体）及びＩｇＭ（μ受容体）を含む、抗体の異なるクラスに特異的な多数のＦｃ受容体が存在する。細胞表面上のＦｃ受容体に対する抗体の結合は、多数の重要で多様な生物学的応答を誘発し、生物学的応答には、抗体被覆粒子の貪食及び破壊、免疫複合体の排除、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞介在性細胞傷害、又はＡＤＣＣと称される）、炎症性メディエーターの放出、胎盤通過、並びに免疫グロブリン産生の制御が含まれる。
【００３６】
本発明の抗体
本発明のＣＤ１４７抗体は、インビトロ、インサイチュ及び／又はインビボで、少なくとも１つのＣＤ１４７の活性若しくは結合、又はＣＤ１４７の活性若しくは結合を、阻害し、又は遮断し、又は妨害する抗体である。好適な抗ＣＤ１４７抗体、特異的部分、又は変異体はまた、場合により、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はタンパク質合成、タンパク質放出、ＣＤ１４７受容体シグナル伝達、ＣＤ１４７切断、ＣＤ１４７活性、ＣＤ１４７生成及び／又は合成などであるがこれらに限定されない、少なくとも１つのＣＤ１４７活性又は機能に影響を及ぼすことができる。
【００３７】
一実施形態において、抗ヒトＣＤ１４７抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９〜１６に示すようなアミノ酸配列を有する軽鎖可変（ＶＬ）又は重鎖可変（ＶＨ）領域を含む結合領域を有し、抗体又はその結合部分は、ＣＤ１４７に免疫特異的に結合する。本発明の別の実施形態では、抗体又はその抗原結合部分はＣＤ１４７タンパク質に結合し、加えて抗体は、本発明の抗体の特定の機能的特性を所有し、特性は、例えば
ＥＬＩＳＡにおいてヒトＣＤ１４７に結合し、
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞に対するヒトＣＤ１４７の結合を阻害し、
ＮＨＬＦからのヒトＣＤ１４７媒介性のＭＭＰ−１放出を、Ｆａｂ  ５Ｆ６のＩＣ５０以下のＩＣ５０で阻害し、
ヒト線維芽細胞からの腫瘍細胞媒介性のＭＭＰ−２の放出を阻害し、
ヒトＣＤ１４７媒介性のＶＥＧＦ放出刺激を阻害し、
１００ｎＭ（１０-7Ｍ）未満のＫｄでヒトＣＤ１４７に結合し、
１００ｎＭ未満の、より好ましくは１０ｎＭ未満のＫDでカニクイザルＣＤ１４７に結合し、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基６４〜７５（ＤＡＬＰＧＱＫＴＥＦ）により包含されるヒトＣＤ１４７アイソフォーム２上のエピトープに結合する。
【００３８】
本発明の別の態様では、２Ｈ３、５Ｆ６、又は４Ａ５結合ドメインの構造的特徴が使用されて、ＣＤ１４７に対する結合などの、本発明の抗体の少なくとも１つの機能的特性を維持する、構造的に関連したヒト抗ＣＤ１４７抗体を作製する。より詳細には、２Ｈ３、５Ｆ６、又は４Ａ５の１つ以上のＣＤＲ領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９〜１４の特定の残基）を既知のヒトフレームワーク領域及びＣＤＲと組み換えにより組み合わせて、組み換えにより操作された本発明の更なるヒト抗ＣＤ１４７抗体を作製することができる。
【００３９】
抗体重鎖及び軽鎖ＣＤＲドメインは、抗原に対する抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たすことが周知であるため、上述したように調製される本発明の組み換え抗体は、２Ｈ３の軽鎖及び重鎖ＣＤＲ３（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９及び１０）を含むことが好ましい。抗体は、更に２Ｈ３のＣＤＲ２を含んでもよい。抗体は、更に２Ｈ３のＣＤＲ１を含んでもよい。したがって、本発明は更に、（１）ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖ＣＤＲ１領域、ヒト重鎖ＣＤＲ２領域、及びヒト重鎖ＣＤＲ３領域（ヒト重鎖ＣＤＲ３領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示すような２Ｈ３のＣＤＲ３から選択される）と、（２）ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ１領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ２領域、及びヒト軽鎖ＣＤＲ３領域（ヒト軽鎖ＣＤＲ３領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示すような２Ｈ３のＣＤＲ３から選択される）と、を含む抗ＣＤ１４７抗体を提供し、抗体はＣＤ１４７に結合する。抗体は、２Ｈ３の重鎖ＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ２を更に含んでもよい。抗体は、２Ｈ３の重鎖ＣＤＲ１及び／又は軽鎖ＣＤＲ１を更に含んでもよい。
【００４０】
非限定的な例として、抗体又は抗原結合部分又は変異体は、本明細書に記載され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、１２、１４、又は１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、並びに／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１１、１３、及び１５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、の少なくとも１つを含んでもよい。特定の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、本明細書に記載され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、１２、１４、又は１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ（即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）の少なくとも一部分を含む抗原結合領域を有することができる。別の特定の実施形態において、抗体又は抗原結合部分又は変異体は、本明細書に記載され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１１、１３、及び１５からなる群より選択される対抗するＣＤＲ１、２及び／又は３のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ（即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）の少なくとも一部分を含む抗原結合領域を有することができる。好ましい実施形態では、抗体又は抗原結合断片の３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲは、本明細書に記載のような、ｍＡｂ  ２Ｈ３、５Ｆ６、４Ａ５、及び２Ｃ８のうちの少なくとも１つの対応するＣＤＲのアミノ酸配列を有する。かかる抗体は、組み換えＤＮＡ技術の従来技術を使用して抗体をコードする（即ち、１つ以上の）核酸分子を調製する及び発現させることによって、又は任意の他の適切な方法を使用することによって、従来技術を使用して、抗体の様々な部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク部分）を一緒に化学的に連結させることにより調製できる。
【００４１】
一実施形態において、操作された本発明の抗体は、２Ｈ３、５Ｆ６、４Ａ５、及び２Ｃ８の正確な配列、ＣＤＲ１、２及び／又は３を有する。ＣＤＲが、例えばヒトフレームワーク内に移植されている操作された抗体に加えて、当業者は、抗体が有効にＣＤ１４７に結合する能力を維持したまま、元のマウス抗体の正確なＣＤＲ配列から幾分かの逸脱が可能であり（例えば、保存的置換）、又は望ましい場合があることを理解するであろう。したがって、別の実施形態において、抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９〜１６に特定する可変領域の１つ以上のＣＤＲと例えば９０％、９５％、９８％、又は９９．５％同一である１つ以上のＣＤＲから構成されてもよい。上述したような操作された抗体は、ＣＤ１４７を単に結合することに加えて、インビボでの腫瘍細胞の増殖阻害をもたらす血管新生を阻害する能力などの、本発明の抗体の他の機能的特性を維持するよう選択されてもよい。
【００４２】
ＣＤ１４７に対する本発明のヒトモノクローナル抗体の結合は、例えば標準的なＥＬＩＳＡにより試験することができる。
【００４３】
別の実施形態では、本発明の抗体により結合されたエピトープ、より詳細にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の６４〜７５（ＤＡＬＰＧＱＫＴＥＦ）、又はその核酸コード配列を使用して対象を免疫化して宿主内で本発明の抗体を直接生成し、ＣＤ１４７の産生に関連した疾病の症候を処置し、予防し、又は寛解させることができる。
【００４４】
抗ＣＤ１４７抗体の生成
本発明の抗ＣＤ１４７抗体は、場合により、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術（ハイブリドーマ法）を含む、多様な技術により生成されてもよい。ハイブリドーマ法では、マウス、又はハムスター若しくはマカクザルなどの他の適切な宿主動物を本明細書に記載するように免疫化して、免疫化に使用したタンパク質に特異的に結合する抗体を生成する又は生成できるリンパ球を誘発する。代替的に、リンパ球はインビトロで免疫化されてもよい。次いで、リンパ球をポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９〜１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【００４５】
抗ＣＤ１４７抗体はまた、所望により、本明細書に記載及び／又は当該技術分野において既知であるように、ヒト抗体のレパートリーを生成することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、非ヒト霊長類など）の免疫化により生じる場合もある。ヒト抗ＣＤ１４７抗体を生成する細胞を、このような動物から単離し、本明細書に記載の方法のような、好適な方法を用いて不死化してもよい。代替的に、本明細書に教示されたかつ当該技術分野で既知の方法により、抗体コード配列を好適なベクター内にクローン化して導入し、これを宿主細胞のトランスフェクションに使用して抗体を発現させ、単離してもよい。
【００４６】
ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）ｌｏｃｉを保有するトランスジェニックマウスを、その生殖系列構造（configuration）に使用することにより、正常なヒト免疫系が耐性を有するヒト自己抗原を含む多様な目標に対して指向された高親和性の完全ヒトモノクローナル抗
体の単離が提供される（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ５５６９８２５，ＵＳ６３００１２９  ａｎｄ  １９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜９；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３〜２１；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．＆  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，１９９８，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３〜９５；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．，１９９５，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，ｅｔ  ａｌ．ＵＳ６７１３６１０；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１３２３〜１３２６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５〜８５１；Ｍｅｎｄｅｚ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６〜１５６；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１〜２３；Ｙａｎｇ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：１２３６〜１２４３；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｔａｕｓｓｉｇ，Ｍ  Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５〜４５８，１９９７；Ｔｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．ＷＯ０２０４３４７８）。このようなマウスの内因性免疫グロブリン遺伝子座を分断又は欠失させ、内因性遺伝子によりコードされた、抗体を産生する動物の能力を除去することができる。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）及びＭｅｄａｒｅｘ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）などの会社は、上述したような技術を使用して、選択された抗原に対して指向されるヒト抗体を提供するよう従事し得る。
【００４７】
別の実施形態では、ヒト抗体はファージライブラリから選択され、そのファージはヒト免疫グロブリン遺伝子を含み、ライブラリは、例えば単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂなど、又は対の若しくは対でない抗体可変領域を示すいくつかの他のコンストラクトなどのヒト抗体結合ドメインを発現する（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ｌｏ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０９〜３１４（１９９６）：Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＩＴＡＳ（ＵＳＡ）９５：６１５７〜６１６２（１９９８））；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））。本発明のヒトモノクローナル抗体は、ファージディスプレイ法を用いて、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングして調製することもできる。ヒト抗体単離のためのそのようなファージディスプレイ法は、当技術分野にて確立されている。例えば、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号及び同第５，５７１，６９８号、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，４２７，９０８号及び同第５，５８０，７１７号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，９６９，１０８号及び同第６，１７２，１９７号、並びにＧｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，８８５，７９３号、同第６，５２１，４０４号、同第６，５４４，７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５８２，９１５号及び同第６，５９３，０８１号を参照されたい。
【００４８】
免疫原性抗原の調製、及びモノクローナル抗体の生成は、組み換えタンパク質生成などの任意の好適な技術を用いて行うことができる。免疫原性抗原は、精製タンパク質、又は全細胞若しくは細胞若しくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形態で動物に投与されてもよく、又は抗原は、動物の身体内で、前記抗原又はその一部をコードする核酸から新規に形成されてもよい。
【００４９】
本発明の単離核酸は、当該技術分野において周知であるように、（ａ）組み換え方法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、又はこれらの組み合わせを使用して形成することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、当技術分野にて既知の方法を用いて容易に単離及び配列決定される（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽差をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）。ハイブリドーマが生成される場合、そのような細胞はそれらのＤＮＡの供給源として機能することができる。代替的に、ファージ又はリボソームディスプレイライブラリのような、コード配列と翻訳産物とが関連されているディスプレイ技術を使用することにより、バインダと核酸の選択が簡素化される。ファージの選択後、ファージからの抗体コード領域が単離され、ヒト抗体、又は任意の他の所望の抗原結合断片を含む抗体全体の生成に使用され、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌を含む任意の所望の宿主内で発現される。
【００５０】
ヒト化抗体
本発明は更に、ヒトＣＤ１４７に結合するヒト化免疫グロブリン（又は抗体）を提供する。免疫グロブリンのヒト化形態は、実質的にヒト免疫グロブリンからの可変フレームワーク領域（１つ以上）（アクセプター免疫グロブリンと呼ばれる）と、実質的にＣＤ１４７に特異的に結合する非ヒトＭａｂからのＣＤＲと、を有する。存在する場合、定常領域（１つ以上）も、実質的にヒト免疫グロブリンからである。ヒト化抗体は、少なくとも約１０＾−６Ｍ（１マイクロＭ）、約１０＾−７Ｍ（１００ｎＭ）又はそれ未満のＣＤ１４７に対するＫDを示す。ヒト化抗体の結合親和性は、そのヒト化抗体が由来するマウス抗体の結合親和性を上回り、又は下回り得る。ＣＤ１４７に対するヒト化抗体の親和性を変化させ、また親和性を改善するために、ＣＤＲ残基又はヒト残基のいずれかに置換を行ってもよい。
【００５１】
ＣＤ１４７に結合するヒト化抗体の生成源は、その生成、単離及び特徴付けが本明細書の実施例に記載される２Ｈ３、４Ａ５、５Ｆ６又は２Ｃ８マウス抗体が好ましいが、ＣＤ１４７に対する結合に関して２Ｈ３、４Ａ５、５Ｆ６又は２Ｃ８マウス抗体と競合する他のマウス抗体も使用することができる。それ故、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９〜１６の同定されたＣＤＲは、ヒト化プロセスの出発点である。
【００５２】
ヒト可変部ドメインフレームワークが、ＣＤＲの起源であるマウス可変フレームワークと同一又は同様の立体構造（conformation）をとる場合、マウスＣＤＲをヒト可変部ドメインフレームワークに置換することにより、その正確な空間配向が維持される可能性が最も高い。これは、そのフレームワーク配列が、ＣＤＲが由来するマウス可変フレームワークドメインと高い程度の配列同一性を示すヒト抗体からヒト可変部ドメインを得ることによって達成される。重鎖及び軽鎖可変フレームワーク領域は、同一又は異なるヒト抗体配列に由来することができる。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であってもよく、又はヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来してもよく、又は数種のヒト抗体及び／若しくは生殖系列配列のコンセンサス配列であってもよい。
【００５３】
好適なヒト抗体配列は、マウス可変領域のアミノ酸配列と、既知のヒト抗体の配列とのコンピュータ比較により同定される。比較は重鎖と軽鎖とで別々に行われるが、原理はそれぞれに関して類似している。
【００５４】
１つの例では、抗ＣＤ１４７  ｍＡｂのアミノ酸配列を使用して、抗体配列データベースから蓄積したヒト抗体データベースに問い合わせる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、１２、１４、又は１６の重鎖可変領域を使用して、最も高い配列同一性を有するヒト可変領域を見つけることができる。同様に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１１、１３、又は１５の軽鎖の可変領域を使用して、最も高い配列同一性を有するヒト可変領域を見つけることができる。マウスＭａｂドナーからの重鎖可変領域の１つのＣＤＲをコードする領域が、選択されたヒト重鎖可変配列内に移動され、ヒト可変領域のＣＤＲを置き換えるＤＮＡコンストラクトは、各マウス可変領域について調製される。
【００５５】
ヒト可変フレームワーク領域を有するマウスＣＤＲ領域の不自然な並置により、不自然な配座拘束を生じる場合があり、この拘束は所定のアミノ酸残基の置換により修正されない限り結合親和性の損失をもたらす。前記したように、本発明のヒト化抗体は、実質的にヒト免疫グロブリンからの可変フレームワーク領域（１つ以上）と、実質的にマウス免疫グロブリンからのＣＤＲ（例えば、２Ｈ３、４Ａ５、５Ｆ６又は２Ｃ８マウス抗体）と、を含む。マウス抗体のＣＤＲ及び適切なヒトアクセプター免疫グロブリン配列を同定した後、次の工程は、もし存在する場合、これらの成分のどの残基を置換して、結果として得られるヒト化抗体の特性を最適化するべきかを決定することである。一般に、マウスによるヒトアミノ酸残基の置換は、マウス残基の導入がヒトにおいて抗体によるＨＡＭＡ応答の誘発の危険性を増大させるため、最小限にする必要がある。置換されるアミノ酸は、ＣＤＲ立体構造及び／又は抗原への結合に対する可能な影響に基づいて選択される。そのような可能な影響は、モデリング、特定の位置におけるアミノ酸の特性の検査、又は特定のアミノ酸の置換若しくは変異誘発の効果の経験的観察結果により検討することができる。経験的方法に関しては、所望の活性、結合親和性又は特異性をスクリーニングし得る変異体配列のライブラリを形成することが特に簡便であることが見出されている。そのような変異体のライブラリを形成するための１つのフォーマットは、ファージディスプレイベクターである。代替的に、変異体は、可変部ドメイン内の標的残基をコードする核酸配列を変動（varigation）させる他の方法を用いて生成することができる。
【００５６】
更なる置換が必要であるか否かを決定する他の方法と、置換されるアミノ酸残基の選択とは、コンピュータモデリングを用いて達成することができる。免疫グロブリン分子の３次元画像を生成するコンピュータハードウェア及びソフトウェアは広く入手可能である。一般に、分子モデルは、免疫グロブリン鎖又はそのドメインに関する解明された構造から出発して生成される。モデリングされる鎖のアミノ酸配列の、解明された３次元構造の鎖又はドメインとの類似性が比較され、最大の配列類似性を示す鎖又はドメインが分子モデル構成の出発点として選択される。解明された出発構造は、モデリングされている免疫グロブリン鎖又はドメイン内の実際のアミノ酸と、出発構造内のアミノ酸との間の差異を許容するよう変更される。次いで、変更された構造は、複合体免疫グロブリンに組み立てられる。最終的に、モデルは、エネルギー最小化し、また全部の原子が互いから適切な距離内に存在し、結合の長さと角度とが化学的に許容し得る限界内にあることを検証することにより精密化される。
【００５７】
通常、ヒト化抗体内のＣＤＲ領域は実質的に同一であり、より通常には、ＣＤＲ領域が由来するマウス抗体内の対応するＣＤＲ領域と同一である。通常所望されないが、時には、結果として得られるヒト化免疫グロブリンの結合親和性に相当な影響を与えることなく、ＣＤＲ残基の１つ以上の保存的アミノ酸置換を行うことが可能である。時折、ＣＤＲ領域の置換は、結合親和性を高めることができる。
【００５８】
上述した特定のアミノ酸置換に関する以外に、ヒト化免疫グロブリンのフレームワーク領域は通常、実質的に同一であり、通常以上には、フレームワーク領域が由来するヒト抗体のフレームワーク領域と同一である。勿論、フレームワーク領域内のアミノ酸のうちの多数は、抗体の特異性又は親和性にほとんど又は全く直接寄与しない。したがって、フレームワーク残基の多数の個々の保存的置換は、結果として得られるヒト化免疫グロブリンの特異性又は親和性の相当の変化を起こすことなく許容され得る。
【００５９】
コードの縮重により、多様な核酸配列が各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードするであろう。所望の核酸配列は、デノボ（de nova）固相ＤＮＡ合成、又は所望のポリヌクレオチドの早期に調製された変異体のＰＣＲ変異誘発により生成され得る。本願に記載される抗体をコードする全ての核酸は、本発明に明白に含まれる。
【００６０】
上述したように生成されたヒト化抗体の可変セグメントは、典型的には、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部に結合される。抗体は、軽鎖及び重鎖定常領域の両方を含むであろう。重鎖定常領域は、通常、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及び時折ＣＨ４ドメインを含む。
【００６１】
ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含む任意のクラスの抗体からの任意の種類の定常ドメインを含んでもよく、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む任意のサブクラス（アイソタイプ）を含んでもよい。ヒト化抗体が細胞傷害活性を示すことが所望される場合、定常ドメインは通常、補体結合性定常ドメインであり、クラスは一般にＩｇＧ1である。そのような細胞傷害活性が所望されない場合、定常ドメインはＩｇＧ2クラスのものであってもよい。ヒト化抗体は、２つ以上のクラス又はアイソタイプからの配列を含んでもよい。
【００６２】
場合により定常領域に結合されたヒト化軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸は、発現ベクター内に挿入される。軽鎖及び重鎖は、同一又は異なる発現ベクター内にクローン化されてもよい。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター（１つ以上）内の制御配列に操作可能に結合される。そのような制御配列は、シグナル配列、プロモーター、エンハンサー、及び転写終結配列を含む（その全体が全目的のために参照により本明細書に組み込まれるＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１００２９（１９８９）；ＷＯ  ９０／０７８６１；Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１１４９（１９９２）参照）。
【００６３】
抗体の使用方法
以下に詳細に記載するように、本発明者らは、単離されたモノクローナル抗体の３つ（２Ｈ３、４Ａ５、５Ｆ６）がＣＤ１４７上の重複エピトープに結合し、インビトロ及び／又はインビボでのＣＤ１４７阻害活性を有する。有意には、ＭＡｂの反応性は、ＭＭＰ及びＶＥＧＦの産生を低下させ、血管新生を阻害する能力を含む。
【００６４】
本発明に記載したようなモノクローナル抗体の特性を考慮すると、抗体又はその抗原結合断片は、ヒト及び動物におけるＣＤ１４７関連の状態を処置又は予防するための治療及び予防剤の両方として好適である。
【００６５】
一般に、使用は、有効量の１つ以上の本発明モノクローナル抗体又は抗原結合断片を、感受性の対象に、又はＣＤ１４７活性が腫瘍増殖及び転移などの病理学的続発症を有することが知られる状態を示している対象に、治療的又は予防的に投与することを含むであろう。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片を含む、抗体の任意の活性型を投与することができる。
【００６６】
使用される抗体は、Ｍａｂに対する免疫応答が容認しがたいほど短い循環半減期をもたらさず、又はＭＡｂに対する免疫応答を対象内で誘導しないように、レシピエント種に対して適合性を有することが好ましい。投与されるＭＡｂは、対象のＦｃ受容体に対する結合、及びＡＤＣＣ機構の活性化などのいくつかの二次的機能を示すことが好ましい。
【００６７】
個人の処置は、治療的有効量の本発明の抗体を投与することを含んでもよい。抗体は、上述したようなキットで提供されてもよい。抗体は、例えば等量の混合物として投与されてもよく、又は個別に連続して提供されても、又は一度に投与されてもよい。レシピエント患者内でＣＤ１４７に結合可能な抗体若しくはその断片、又はＣＤ１４７に対して保護できる抗体を患者に提供する際、投与される薬剤の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身の健康状態、全身の医学的状態、既往歴などの因子に応じて変動するであろう。
【００６８】
一般に、全身性用量の抗体を投与する場合、約１ｎｇ／ｋｇ〜１００ｎｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ〜５００ｎｇ／ｋｇ、５００ｎｇ／ｋｇ〜１ｕｇ／ｋｇ、１ｕｇ／ｋｇ〜１００ｕｇ／ｋｇ、１００ｕｇ／ｋｇ〜５００ｕｇ／ｋｇ、５００ｕｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ（レシピエントの体重）の範囲内の用量の抗体をレシピエントに提供することが望ましが、より少ない又は多い用量が投与されてもよい。約１．０ｍｇ／ｋｇのような少ない用量が、幾分かの有効性を示すことが期待され得る。好ましくは約５ｍｇ／ｋｇが許容できる用量であるが、約５０ｍｇ／ｋｇ迄の用量レベルも特に治療的使用においては好ましい。あるいは、１ｕｇ〜１００ｕｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇ、又は１ｇｍ〜１００ｇｍの範囲内の量のような、患者の体重に基づかない特定の量の抗体が投与されてもよい。例えば、部位特異的投与は、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮手段などの身体区画また腔に対するものであり得る。
【００６９】
ＣＤ１４７抗体組成物を、特に液体溶液又は懸濁液の形での非経口（皮下、筋肉、若しくは静脈内）又はその他のあらゆる投与に使用するため；クリーム又は座薬といった（ただしこれらに限定されない）特に半固体形態での膣内又は直腸内投与で使用するため；錠剤又はカプセルの形での（ただしこれらに限定されない）口腔内又は舌下投与のため；粉末、点鼻薬、若しくはエアロゾル、又は一部の作用物質の形で（ただしこれらに限定されない）鼻腔内で；皮膚構造を修飾するか又は経皮パッチ内の薬物濃度を増大させるためジメチルスルホキンドといったような化学的エンハンサーを伴った（Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．「Ｄｒｕｇ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ」；Ｈｓｉｅｈ，Ｄ．Ｓ．，Ｅｄｓ．，ｐｐ．５９〜９０（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９４、参照により全体が本明細書に組み込まれる）又は皮膚上へのタンパク質及びペプチドを含有する処方の塗布（ＷＯ  ９８／５３８４７）又は電気穿孔といった過渡的輸送経路を作り出すか又はイオントフォレシスなどの皮膚を通して荷電薬物の易動性を増大させるための電界の適用、又はソノフォレシスなどの超音波の適用（米国特許第４，３０９，９８９号及び同第４，７６７，４０２号）を可能にする酸化剤を伴うゲル、軟こう、ローション、懸濁液又はパッチ送達系といった（ただしこれらに限定されない）ように経皮的に投与するために、調製することができる（上述の刊行物及び特許は参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【００７０】
同様の手法で、本発明のモノクローナル抗体の他の治療的使用は、本モノクローナル抗体のうちの１つに対して上昇された抗イディオタイプ抗体を使用する、患者の能動免疫化である。エピトープの構造を模倣した抗イディオタイプによる免疫化は、能動的な抗ＣＤ１４７応答を誘発し得る（Ｌｉｎｔｈｉｃｕｍ，Ｄ．Ｓ．ａｎｄ  Ｆａｒｉｄ，Ｎ．Ｒ．，Ａｎｔｉ−Ｉｄｉｏｔｙｐｅｓ，Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｍｉｃｒｙ（１９８８），ｐｐ  １〜５  ａｎｄ  ２８５〜３００）。
【００７１】
同様に、能動免疫化は、ワクチンの成分として１つ以上の抗原性及び／又は免疫原性エピトープを投与することにより誘導することができる。ワクチン接種は、レシピエントが、この生物学的に機能的な領域に予防的又は治療的に対抗する保護抗体を生成できるのに十分な量で、経口又は非経口的に行うことができる。宿主は、純粋な形態の抗原性／免疫原性ペプチド、ペプチドの断片、又はペプチドの修飾形態により能動免疫化され得る。元のタンパク質配列に一致しない１つ以上のアミノ酸を元のペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に加えてもよく、又はペプチドの切断型に加えてもよい。そのような余分のアミノ酸は、ペプチドを他のペプチド、又は大きい担体タンパク質、又は支持体に結合するのに有用である。これらの目的に有用なアミノ酸には、チロシン、リシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン及びこれらの誘導体が挙げられる。代替的なタンパク質修飾技術、例えばＮＨ２−アセチル化又はＣＯＯＨ−末端アミド化を用いて、ペプチドを他のタンパク質若しくはペプチド分子又は支持体に結合又は融合する更なる手段を提供してもよい。
【００７２】
ＣＤ１４７生物活性に対する保護が可能な抗体は、ＣＤ１４７関連の症候又は病理の軽減、回復又は寛解を達成するのに十分な量でレシピエント対象に提供されることが意図される。量は、薬剤の用量、投与経路などが、そのような応答に影響を与えるのに十分な場合、症候の軽減を達成するのに十分な、又は治療的に有効な量であるものと考えられる。抗体投与に対する応答は、イメージング技術又は組織試料のエクスビボ分析により、対象の患部組織、器官又は細胞を分析して測定され得る。薬剤は、その薬剤の存在が、レシピエント患者の生理機能に検出可能な変化をもたらした場合、生理学的に有意である。
【００７３】
本発明の化合物は、薬剤的に有用な組成物を調製する既知の方法に従って処方することができ、それによってこれらの材料又はそれらの機能的誘導体が、混和物中で薬剤的に許容できる担体ビヒクルと組み合わされる。好適なビヒクル、及び他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含むそれらの処方物は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１６ｔｈ  ｅｄ．，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．（１９８０））に記載されている。効果的な投与に好適な、薬剤的に許容できる組成物を形成するために、それらの組成物は、有効量の上述した化合物を、好適な量の担体ビヒクルと共に含有するであろう。追加の薬剤的方法を使用して、作用の持続時間を制御してもよい。制御放出製剤は、ポリマー類を使用して、化合物を複合させること又は吸収することにより達成され得る。制御放出製剤による作用の持続時間を制御する他の可能な方法は、本発明の化合物を、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）又はエチレンビニルアセテートコポリマーなどのポリマー材料の粒子中に組み込むことである。あるいは、これらの薬剤をポリマー粒子中に組み込む代わりに、これらの材料をマイクロカプセル内、例えば界面重合により調製された、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）−マイクロカプセル、又はコロイド状薬物送達システム内、例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル、又はマクロエマルション内に封入することができる。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）に開示されている。
【００７４】
処置は単回投与計画、又は好ましくは複数回投与計画で付与されてもよく、複数回投与計画では、一次処置過程が１〜１０回の別個の投与と、応答を維持し及び又は強化するのに必要な続く時間間隔で他の投与とを行い、例えば第２の投与が１〜４ヶ月後、また必要であれば、続く投与（１回以上）を数ヶ月後に行う。好適な処置スケジュールの例は、（ｉ）０、１ヶ月及び６ヶ月、（ｉｉ）０、７日及び１ヶ月、（ｉｉｉ）０及び１ヶ月、（ｉｖ）０及び６ヶ月、又は疾病の症候を軽減し、若しくは疾病の重篤さを軽減することが期待される、所望の応答を誘発するのに十分な他のスケジュールを含む。
【００７５】
本発明は、本発明を実行するのに有用なキットも提供する。本発明のキットは、上述した抗体を収容し、又は上述した抗体と関連して包装された第１の容器を含む。キットは、本発明を実行するのに必要な又は簡便な溶液を収容し、又は溶液と関連して包装された他の容器を含んでもよい。容器は、ガラス、プラスチック又はホイルから形成されてもよく、またバイアル、ボトル、パウチ、チューブ、バッグなどであってもよい。キットは、本発明を実行するための手順、又は第１の容器手段内に収容されている試薬の量などの分析的情報などの文書情報も含み得る。容器は文書情報と共に他の容器器具、例えば箱又はバッグ内に存在してもよい。
【００７６】
本発明の更なる別の態様は、生物学的試料中のＣＤ１４７を検出するためのキットである。このキットは、ＣＤ１４７に結合して免疫複合体を形成し、この免疫複合体の形成を検出することによって免疫複合体の存在又は不在を試料中のＣＤ１４７の存在又は不在と相関させることを目的として、ＣＤ１４７のエピトープに結合する１つ以上の抗体を保持する容器と、抗体の使用のための指示書とを含む。容器の例には、多数の試料中のＣＤ１４７を同時に検出できるマルチウェルプレートが挙げられる。
【００７７】
治療適用
本発明の抗ＣＤ１４７抗体、抗原結合断片、又はその特定の変異体を使用して、細胞、組織、器官又は動物（哺乳動物及びヒトを含む）内で測定し又は効果をもたらして、ＣＤ１４７により仲介、影響又は調節される状態の発生を診断し、監視し、調節し、処置し、軽減し、発生の予防を補助し、又は状態の症候を軽減することができる。そのような状態は、例えば組織再増殖、新生物疾病、転移性疾病、及び線維化状態におけるような細胞遊走及び組織リモデリングにより仲介される疾病又は状態から選択されるが、これらに限定されない。そのような疾病又は状態には、特に悪性及び神経系の疾患若しくは疾病、又は他の既知の若しくは特定のＣＤ１４７関連の状態が挙げられ、ＣＤ１４７関連の状態には、炎症性又は自己免疫疾患若しくは疾病、心血管疾患若しくは疾病、又は感染症が不随し得る。特に、抗体は、血管形成が関与する疾病、例えば眼疾患及び腫瘍性疾患、再狭窄などの組織再形成及びある種の細胞型の増殖、特に上皮及び扁平上皮細胞癌の治療に有用である。特定の適応症としては、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、癌転移、関節リウマチ、糖尿病性網膜症及び黄斑変性症の治療における使用が含まれる。本発明の中和抗体は更に、例えば骨粗鬆症において見られる、又は一部の腫瘍によるＰＴＨｒＰ過剰発現の結果生じる、望ましくない骨吸収又は骨分解の予防又は治療にも有用である。抗体はまた、特発性肺線維症、糖尿病性腎症、肝炎、及び肝硬変といったさまざまな線維症の治療においても有用であり得る。
【００７８】
よって、本発明は、当該技術分野において既知のように、又は本明細書に記載されているように、本発明の少なくとも１つのＣＤ１４７抗体を用いて、細胞、組織、器官、動物、又は患者における少なくとも１つのＣＤ１４７関連疾患を調節又は処置するための方法を提供する。特別な指摘については以下に論述する：
【００７９】
肺疾患
本発明は更に、肺炎；肺膿瘍；粉塵、ガス又は飛沫の形をした作用物質を原因とする職業性肺疾患；喘息、閉塞性繊維性細気管支炎、呼吸不全、過敏性肺炎（外因性アレルギー性肺胞炎）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、及び薬物反応を含む肺の過敏性疾患；成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、グッドパスチャー症候群、慢性閉塞性気道疾患（ＣＯＰＤ）、特発性間質性肺疾患、例えば特発性肺線維症及びサルコイドーシス、剥離性間質性肺炎、急性間質性肺炎、呼吸細気管支炎関連間質性肺疾患、気質性肺炎を伴う特発性閉塞性細気管支炎、リンパ球性間質性肺炎、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、特発性肺ヘモジデリン沈着症；急性気管支炎、肺胞タンパク症、気管支拡張症、胸膜疾患、無気肺、嚢胞性線維症、肺腫瘍、及び肺栓塞症のうちの少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物、又は患者における肺又は胸膜疾病を調節又は治療するための方法をも提供している。
【００８０】
悪性疾患
本発明はまた、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞又はＦＡＢ  ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、原疾患又は転移性疾患のような固形腫瘍、カポジ肉腫、直腸結腸癌、膵臓癌、腎細胞癌、中皮腫を含む肺癌、乳癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、悪性の腫瘍随伴症候群／高カルシウム血症、腺癌、扁平上皮細胞癌、肉腫、悪性黒色腫、特に転移性黒色腫、血管腫、転移性疾患、癌関連骨吸収、及び癌関連骨痛などのうちの少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物、又は患者における悪性疾患を調節又は治療するための方法をも提供している。
【００８１】
免疫関連疾患
本発明は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎（ankylosing spondilitis）、胃潰瘍、血清反応陰性関節症、変形性関節症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質症候群、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、突発性肺線維症、全身性血管炎／ウェゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、精巣炎／精管復元術（vasectomy reversal procedure）、アレルギー性／アトピー性疾患、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、アレルギー性接触性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏性肺炎、移植片、器官移植拒絶、移植片対宿主病、全身性炎症性応答症候群、敗血症症候群、グラム陽性菌敗血症、グラム陰性菌敗血症、培養陰性敗血症、真菌性敗血症、好中球減少性発熱、尿路性敗血症、髄膜炎菌血症、外傷／出血、やけど、電離放射線暴露、急性膵炎、成人呼吸窮迫症候群、関節リウマチ、アルコール性肝炎、慢性炎症性病態、サルコイドーシス、クローン病（Crohn’s pathology）、鎌状赤血球貧血、糖尿病、ネフローゼ、アトピー性疾患、過敏反応、アレルギー性鼻炎、花粉症（hay fever）、通年性鼻炎、結膜炎、子宮内膜症、喘息、蕁麻疹、全身アナフィラキシー、皮膚炎、悪性貧血、溶血性疾患、血小板減少症、任意の器官又は組織の移植片拒絶、腎臓移植拒絶、心臓移植拒絶、肝臓移植拒絶、膵臓移植拒絶、肺移植拒絶、骨髄移植（ＢＭＴ）拒絶、移植皮膚拒絶、軟骨移植拒絶、骨移植片拒絶、小腸移植拒絶、胎児胸腺移植拒絶、副甲状腺移植拒絶、任意の器官又は組織の異種移植拒絶、同種移植片拒絶、抗受容体過敏反応、グレーブス病、レイノー病、Ｂ型インスリン抵抗性糖尿病、喘息、重症筋無力症、抗体介在細胞毒性、ＩＩＩ型過敏反応、全身性エリテマトーデス、ＰＯＥＭＳ症候群（多発ニューロパチー、臓器肥大、内分泌疾患、単クローン性γグロブリン血症、及び皮膚変化症候群）、抗リン脂質症候群、天疱瘡、強皮症、混合性結合組織病、特発性アジソン病、真性糖尿病、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変（primary billiary cirrhosis）、白斑、血管炎、ＭＩ心臓切開術後症候群（post-MI cardiotomy syndrome）、ＩＶ型過敏症、接触性皮膚炎、過敏性肺炎、同種移植片拒絶、細胞内微生物による肉芽腫、薬物感受性、代謝性／突発性、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス（hemachromatosis）、α−１−抗トリプシン欠乏症、糖尿病性網膜症、橋本甲状腺炎、骨粗鬆症、視床下部−下垂体−副腎軸評価（hypothalamic-pituitary-adrenal axis evaluation）、原発性胆汁性肝硬変、甲状腺炎、脳脊髄炎、悪液質、嚢胞性線維症、新生児慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、家族性食血細胞性リンパ組織球症（familial hematophagocytic lymphohistiocytosis）、皮膚科学的状態、乾癬、脱毛症、ネフローゼ症候群、腎炎、糸球体腎炎、急性腎不全、血液透析、尿毒症、毒性、子癇前症、ＯＫＴ３療法、抗ＣＤ３療法、サイトカイン療法、化学療法、放射線療法（例えば喘息、貧血、悪液質などを含むがこれらに限定されない）、慢性サリチル酸塩中毒などのうちの少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物、又は患者における免疫関連の疾病を調節又は処置するための方法も提供する。例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ，１２ｔｈ〜１７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ���Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ（１９７２，１９７７，１９８２，１９８７，１９９２，１９９９），Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．編、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．（１９９８，２０００）を参照し、それぞれ参照によりその全体が組み込まれる。
【００８２】
心血管疾患
本発明は、心機能不全症候群（cardiac stun syndrome）、心筋梗塞、うっ血性心不全、卒中、虚血発作、出血、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病性動脈硬化性疾患（diabetic ateriosclerotic disease）、高血圧、動脈性高血圧、腎血管性高血圧、失神、ショック、心血管系の梅毒、心不全、肺性心、原発性肺高血圧、不整脈、心房異所性拍動、心房粗動、心房細動（持続性又は発作性）、還流後症候群、心肺バイパス炎症応答、無秩序型又は多源性心房頻脈、規則的狭ＱＲＳ頻脈（regular narrow QRS tachycardia）、固有不整脈（specific arrythmias）、心室細動、ヒス束不整脈（His bundle arrythmias）、房室ブロック、脚ブロック、心筋虚血性疾患、冠動脈疾病、狭心症、心筋梗塞、心筋症、拡張型うっ血性心筋症、拘束型心筋症、心臓弁膜症、心内膜炎、心膜疾患、心臓腫瘍、大動脈瘤又は末梢動脈瘤、大動脈切開、大動脈の炎症、腹部大動脈及びその分岐の閉塞、末梢血管疾患、閉塞性動脈疾患、末梢アテローム硬化性疾患、閉塞性血栓性血管炎、機能性末梢動脈疾患、レイノー現象及び疾患、先端チアノーゼ、紅痛症、静脈性疾患、静脈血栓症、静脈瘤、動静脈瘻、リンパ浮腫（lymphederma）、脂肪性浮腫、不安定狭心症、再灌流傷害、ポンプ後症候群（post pump syndrome）、虚血再灌流障害などのうちの少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物、又は患者における心血管疾病の調節又は処置のための方法も提供する。
【００８３】
神経系疾患
本発明は、神経変性疾患、多発性硬化症、片頭痛、ＡＩＤＳ認知症症候群、多発性硬化症及び急性横断性脊髄炎（acute transverse myelitis）などの脱髄性疾患；皮質脊髄系の病変などの錐体外路及び小脳の疾患；基底核の疾患又は小脳疾患；ハンチントン舞踏病及び老人性舞踏病などの運動過剰障害；ＣＮＳドーパミン受容体を遮断する薬物により誘導されるものなどの薬剤性運動異常症；パーキンソン病などの運動低下障害；進行性核上性麻痺；小脳の器質的病変；脊髄性運動失調、フリードライヒ失調症、脊髄小脳変性症、多系統変性症（multiple systems degenerations）（Ｍｅｎｃｅｌ、Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ、Ｓｈｉ−Ｄｒａｇｅｒ，ａｎｄ  Ｍａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ）などの脊髄小脳変性症；全身疾患（レフサム病、無βリポタンパク質血症、運動失調、毛細血管拡張症及びミトコンドリア多系疾患（mitochondrial multi． system disorder））；多発性硬化症、急性横断性脊髄炎などの脱髄コア疾患（demyelinating core disorders）；神経性筋萎縮（筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症及び若年性脊髄性筋萎縮症などの前角細胞変性）などの運動単位の疾患；アルツハイマー病；中年におけるダウン症候群；びまん性レビー小体病；レビー小体型の老年認知症；ウェルニッケ・コルサコフ症候群；慢性アルコール症；クロイツフェルト・ヤコブ病；亜急性硬化性全脳炎、ハレルフォルデン−スパッツ病（Hallerrorden-Spatz disease）；並びに拳闘家認知症などのうちの少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物、又は患者における心血管疾病の調節又は処置のための方法も提供する。所望により、少なくとも１つのＴＮＦ抗体又は特定部分又は変異体を含む有効量の組成物又は医薬組成物を、このような調節、治療又は療法を必要としている細胞、組織、器官、動物、又は患者に対し投与する工程を含むことができる。例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ，１６th  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ（１９９２）を参照のこと。
【００８４】
抗ＣＤ１４７抗体の他の治療的使用
上述の疾患及び疾病に加えて、本発明はまた、肝臓線維症（アルコール性肝硬変、ウイルス性肝硬変、自己免疫性肝炎を含むがこれらに限定されない）；肺線維症（強皮症、特発性肺線維症を含むがこれらに限定されない）；腎臓線維症（強皮症、糖尿病性腎炎、糸球体腎炎、ループス腎炎を含むがこれらに限定されない）；皮膚線維症（強皮症、肥厚性及びケロイド瘢痕、火傷を含むがこれらに限定されない）；骨髄線維症；神経線維腫症；線維腫；腸線維症；及び外科手術の結果としての線維化付着といったようなさまざまな病因の線維性疾患を調節又は処置するための方法をも提供している。
【００８５】
本発明は、急性又は慢性細菌感染、細菌、ウイルス、及び菌感染を含む急性及び慢性寄生又は感染プロセス、ＨＩＶ感染／ＨＩＶ神経障害、髄膜炎、肝炎（Ａ、Ｂ又はＣなど）、敗血症性関節炎、腹膜炎、肺炎、喉頭蓋炎、大腸菌、溶血性尿毒症症候群、マラリア、デング出血熱、リーシュマニア症、ハンセン病、中毒性ショック症候群、連鎖球菌筋炎、ガス壊疽、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、ニューモシスティス・カリニ肺炎、骨盤感染症、精巣炎／精巣上体炎、レジオネラ、ライム病、Ａ型インフルエンザ、エプスタイン・バーウイルス、ウイルス関連血球貪食症候群、ウイルス性脳炎／無菌性髄膜炎などのうちの少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物、又は患者における心血管疾病の調節又は処置のための方法も提供する。
【００８６】
本願全体で引用した全ての引用参考文献（論文参考文献、交付済み特許、公開された特許出願、及び同時係属の特許出願を含む）の内容は、参照により本明細書に明白に組み込まれる。
【００８７】
本発明の他の特徴は、本発明の説明のために提供され、本発明を限定することを意図しない以下の例示的な実施形態の記載の過程にて明らかとなるであろう。
【実施例】
【００８８】
実施例１：ＣＤ１４７試薬及び方法
抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体を生成及び試験するために、ＣＤ１４７の細胞外ドメインの全部又は一部を表す所定のタンパク質コンストラクトを生成した。ＣＤ１４７ポリペプチドと、ＣＤ１４７の変異型、切断型若しくは削除型、又は融合タンパク質は、様々な使用のために調製することができ、その使用には、抗体の生成、診断アッセイにおける試薬として、例えばＨＩＶ−１感染症、ＡＩＤＳ、ＲＡ及び癌の処置又は予防に使用できる治療的化合物のスクリーニングのためのアッセイにおける試薬として、例えばＨＩＶ−１感染症、ＡＩＤＳ及びＡＩＤＳ関連の疾患、ＲＡ及び癌の処置に有用な薬剤的試薬として、が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
ＣＤ１４７アイソフォームＩＩ（ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿９４０９９１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）として既知のｂｓｇ遺伝子は、シグナル配列、細胞外、膜貫通、及び細胞内ドメインを含む２６９アミノ酸長のプロポリペプチドである。
【００９０】
図１は、ＣＤ１４７の、Ｎ−末端Ｉｇドメイン（Ｎ−末端ドメイン、残基２２〜１０３からのＣ２型領域）とＣ−末端Ｉｇドメイン（Ｃ−末端ドメイン、残基１０５〜１９９からのＶ様領域）とを含む細胞外（ＥＣＤ又はＥＣＤ−ＦＬ）、膜貫通（ＴＭ）及び細胞内（ＩＣＤ）ドメインを概略的に示す。１つ以上の他の領域又はドメインが削除されている、１つ以上のこれらのＣＤ１４７のドメインに対応するペプチド、及び完全長ＥＣＤ又は一方若しくは他方のＩｇ様領域が、無関係タンパク質（例えば、ＧＳＴ、ＦＬＡＧ、ｈｅｘ−ＨＩＳ、及びＦｃ−融合物）に融合されている融合タンパク質が、当技術分野にて既知の組み換え法により構成され、哺乳動物細胞培養物から発現及び精製された。それらのヒトＣＤ１４７−Ｆｃキメラは、同様にＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されている、ヒトＩｇＧ１のカルボキシ−末端ｈｅｘａ−ＨｉｓタグＦｃ領域に融合された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基２４〜２０５を含む。
【００９１】
ヒトＣＤ１４７アイソフォーム２をコードするｃＤＮＡをＡＴＣＣ  ＩＭＡＧＥクローン３８６７３５２又はＭＧＣ−１７７００（ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＣ００９０４０、１６２２ｂｐ、完全ｃｄｓ）から獲得し、このクローンをテンプレートとして使用して３つの発現コンストラクトを生成した。
【００９２】
ｉ）コンストラクト＃  ３３６４：ヒトＣＤ１４７  ＥＣＤ1〜192
発現ベクター３３６４を生成するために、内因性シグナルペプチド及びヒトＣＤ１４７の細胞外ドメイン（ＥＣＤ1〜192）を含む、アミノ酸１〜１９２をコードするヌクレオチド配列を、Ｃ−末端にＦＬＡＧ−タグ付けされた（３３６４）バージョンとして発現ベクターｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４（Ｓｉｇｍａ）内にサブクローン化した。ポリペプチドモノマーは、Ｃ−末端ＦＬＡＧ−タグ付けタンパク質としてヒトＣＤ１４７  ＥＣＤ、ＦＬＡＧペプチドに融合したアミノ酸Ｍｅｔ１〜Ｇｌｙ  １９２を含むであろう（Ｂｒｉｚｚａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１９９４  Ａｐｒ；１６（４）：７３０〜５）。
【００９３】
ｉｉ）コンストラクト＃  ３１２８：ヒトＣＤ１４７  Ｎ−ドメイン
発現ベクター３１２８ヌクレオチド配列を生成するために、内因性シグナルペプチド及びヒトＣＤ１４７の第１  Ｉｇ様領域（Ｎ−ドメイン）を含む、アミノ酸１〜１１７をコードするヌクレオチド配列を、Ｉｇ１．ＦＣ．ｆｏｒ、５’ＴＣＧＡＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）及び
Ｉｇ１．ＦＣ．ｒｅｖ、５’ＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＴＴＧＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＡＣＧ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
を使用して、Ｃ−末端Ｆｃ−融合物（３１２８）として、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）内にサブクローン化した。ＥＲ内で成熟され分泌された際、Ｎ−末端はＡｓｐ  １９として見出され、これはＡをコードするリーダーコドン内の突然変異を表す。Ｆｃ−融合コンストラクトＡｓｐ１９−Ａｓｎ１１７−ＩｇＧ1−Ｆｃに加えて、ＣＤ１４７  Ｎ−ドメインＡｓｐ１９−Ａｓｎ１１９は、更にタグ付け及びＡｓｐ１９−Ａｓｎ１１７−ｈｅｘａｈｉｓ種を構築するのに使用された。
【００９４】
ｉｉｉ）コンストラクト＃  ３１２９：ヒトＣＤ１４７  Ｃ−ドメイン
発現ベクター３１２９を生成するために、ヒト成長ホルモンシグナルペプチドと、ヒトＣＤ１４７の第２Ｉｇ様領域（Ｃ−ドメイン）を含むアミノ酸９５〜２０３とをコードするヌクレオチド配列を、５’ＣＡＡＧＡＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＧＣＡＣＧＧＣＣ  ３’；Ｉｇ２．ＦＣ．（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）をフォワードプライマーとして、５’ＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＣＧＣＡＣＧＣＧＧ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）をリバースプライマーとして使用して、Ｃ−末端Ｆｃ−融合物Ｉｇ２．ＦＣ．としてｐｃＤＮＡ３．１（＋）内にサブクローン化した。哺乳動物宿主細胞内で発現され、ＥＲ内で成熟され分泌された際、分泌されたタンパク質は、アミノ酸残基ｇｌｙ  ９５〜ｓｅｒ２０４融合ヒトＦｃ−足場（ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）を表すホモ二量体を形成するであろう（コンストラクト＃  ３１２９）。Ｆｃ−融合コンストラクトに加えて、ｇｌｙ  ９５〜ｓｅｒ２０４を更に使用して、タグ付け及びｈｅｘａｈｉｓ種を構築した。
【００９５】
これらの３つのコンストラクトを、カチオン性脂質試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるトランスフェクション後、血清フリー条件下（ＳＦＭＩＩ）でＨＥＫ  ２９３細胞内で一時的に発現させた。トランスフェクションから４日後、細胞上清を回収し、抗ＦＬＡＧ（ＥＣＤ−ＦＬＡＧ）又はタンパク質−Ａ樹脂（Ｎ  ＆  ＣドメインＦｃ融合物）のいずれか上で精製した。純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥのより及びＮ−末端ａａ配列決定により調べた。
【００９６】
同様にして、ＥＣＤ−ＦＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡｓｐ１９〜１９２を有する）、Ｎ−末端Ｉｇ−ドメイン（Ａｓｐ１９〜Ａｓｐ  １１７）及びＣ−末端Ｉｇ−ドメイン（Ｇｌｕ９５〜Ｓｅｒ２０４）を表すＨｅｘａ−Ｈｉｓタグ試薬を構築し、発現させ、精製した。
【００９７】
実施例２：ＣＤ１４７由来のコンストラクトの生物学的アッセイ及び特徴付け
ＣＤ１４７  ＥＣＤ又はサブドメインに対する直接結合
酵素−免疫アッセイ（ＥＩＡｓ）を用いて、抗ヒトＣＤ１４７  Ｍａｂの存在についてハイブリドーマ細胞上清を試験した。簡略的には、プレート（Ｎｕｎｃ−Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬのヒトＣＤ１４７（ＥＣＤ、Ｎ  ＆  Ｃ−ドメインタンパク質）で一晩被覆した。０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有する０．１５Ｍ生理食塩水で洗浄した後、ウェルをＰＢＳ中の１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にて３７℃で１時間ブロックした。未希釈ハイブリドーマ上清を、被覆プレート上にて３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ中で１：１０，０００に希釈したＨＲＰ−標識ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ特異的（Ｓｉｇｍａ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。プレートを再度洗浄した後、１００ｍＬ／ウェルのクエン酸−リン酸基質液（０．１Ｍクエン酸及び０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．０１％過酸化水素、並びに１ｍｇ／ｍＬ  Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）と共にＲＴで１５分間インキュベートした。４Ｎ硫酸を２５ｍＬ／ウェルにて加えて基質展開を停止し、自動化プレート分光光度計により４９０ｎｍで吸収を測定した。
【００９８】
生細胞結合アッセイ
試験全体においてヒト乳癌細胞ラインＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２６）をＣＤ１４７陽性細胞として使用した。簡略的には、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を９６ウェルプレート上にウェル当たり５０，０００で蒔いた。一晩増殖後、細胞を２００μｌの氷冷ＤＭＥＭで穏やかに３回洗浄し、２００μｌの１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを用いて室温で３０分間インキュベートしてブロックした。プレートを洗浄した後、１００μｌの未希釈抗体上清を加え、室温で１時間インキュベートし、プレートを再度洗浄した。二次的なＨＲＰコンジュゲート抗体を１：５０００希釈にて加えた後、室温で１時間インキュベートし、洗浄し、５０μｌ／ウェルの展開バッファを室温で１５分間で加えた。４Ｎ硫酸を２５μｌ／ウェルにて加えて基質展開を停止し、自動化プレート分光光度計により４９０ｎｍで吸収を測定した。
【００９９】
線維芽細胞内のＭＭＰ−１産生
ヒト線維芽細胞が、ヒトＣＤ１４７タンパク質との接触により様々なマトリックス型のメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を分泌することは十分確立されている（Ｋａｔａｏｋａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９３  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３，３１５４〜３１５８；Ｓａｍｅｓｈｉｍａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  １５７，１７７〜１８４；Ｇｕｏ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２，２４〜２７）。実施例１で生成した組み換えヒトＣＤ１４７コンストラクト：ヒトＣＤ１４７のＥＣＤ、Ｎ−ドメイン及びＣ−ドメインを使用してヒト線維芽細胞を刺激した。異なる量の組み換えＣＤ１４７タンパク質で処理した線維芽細胞によりコンディショニングした血清フリー培地中のＭＭＰ−１活性を、ＭＭＰ−１活性アッセイを用いて、製品マニュアルに従って定量的に測定した（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。実施の際、アッセイは、１５０μｌの標準物質又は試料中に含まれるＭＭＰ−１を測定した。ＭＭＰ−１をアッセイウェルの底部に不動化した抗ＭＭＰ−１抗体により捕捉した。続いて、捕捉したＭＭＰ−１を４−アミノフェニル水銀アセテート（ＡＰＭＡ）により活性化した。各ウェル内に加えられたＭＭＰ基質は活性化ＭＭＰ−１により切断され、得られた蛍光をＳｐｅｃｔｒａＦｌｕｏｒ  Ｐｌｕｓ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＴＥＣＡＮ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ）を使用して、３２０ｎｍでの励起及び４０５ｎｍでの発光を用いて測定した。
【０１００】
結果（図２）は、ＥＣＤ−ＦｃコンストラクトがＭＭＰ発現の誘導の最も高い活性レベルを維持し、活性の高い割合がＮ−ドメイン内に存在することを示す。Ｃ−ドメインコンストラクトは、培養線維芽細胞からのＭＭＰの発現の誘導が比較的乏しかった。
【０１０１】
腫瘍−線維芽細胞共培養物ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９放出アッセイ
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０％  ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中にて、１０％  ＣＯ２で補充した加湿細胞培養インキュベーター内で培養した。ＮＨＤＦ細胞を、供給者により推奨される条件下で培養した。簡略的には、１ｕｇ／ｍＬのｈＦＧＦ、５μｇ／ｍＬのインスリン、０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、及び５０μｇ／ｍＬのアンホテリシンを含有する線維芽細胞増殖培地中で細胞を培養した。サブコンフルエンスにおいて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びＮＨＤＦ細胞を別々にトリプシン処理し、新しい培養培地（１０％  ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ）中に懸濁させた。１００，０００のＮＨＤＦ細胞を１００，０００のＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞と共に、６ウェルプレート内で２４時間共培養した。細胞共培養物をＰＢＳで穏やかに濯ぎ、増殖培地を新鮮な血清フリーＤＭＥＭ培地で置き換え、１００μｌの試験抗体上清を加えた。３日後、培養培地を１．５ｍＬの血清フリーＤＭＥＭ培地と、同一量の抗体上清とで再度置き換えた。２日後、条件培地を収集して、活性を分析した。ＳＤＳ基質酵素電気泳動を、以前に記載された方法に基づいて、変更を加えて行った（Ｔａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２，７３〜８０，２００４；Ｔａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５，３１９３〜３１９９，２００５）。２０ｍｇのタンパク質を含有する条件培地の試料を、非還元ＳＤＳ試料バッファと混合し、０．１％ゼラチンを含有する１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。電気泳動後、ゲルを２．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で３０分間洗浄した。基質消化は、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＺｎＣｌ２、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び０．０２％ＮａＮ３を含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）中でゲルを３７℃で２４時間インキュベートして行った。ゲルを０．１％クマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色し、ゼラチン分解活性の位置を、均一な青色染色の背景内の明瞭なバンドとして検出した。ＭＭＰ標準物質を使用して、ゼラチナーゼ活性を有するバンドの位置を同定した。
【０１０２】
ＶＥＧＦ分泌の促進
ＶＥＧＦ産生を経芽細胞内で組み換えＣＤ１４７により刺激した。組み換えＣＤ１４７が神経芽細胞内でＶＥＧＦ産生を刺激できることは以前に確立された（Ｔａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６  ４：３７１〜３７７）。実施例１の３つの異なるＣＤ１４７−コンストラクト（ＣＤ１４７のＮ−若しくはＣ−末端ドメイン、又は完全長ＥＣＤ）により刺激されるＶＥＧＦ分泌を比較した。
【０１０３】
Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキットを使用して、条件培地中のヒトＶＥＧＦ濃度の定量化を行った。２００μｌの標準物質又は試料中に含まれるＶＥＦＧを、アッセイウェルの底部上に不動化した抗−ＶＥＧＦ抗体により捕捉し、コンジュゲートした２nd抗体により検出した。ＥＬＩＳＡデータは、ＶｅｒｓａＭａｘ  Ｔｕｎａｂｌｅ  ＭｉｃｏＰｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒを使用して４５０ｎｍで獲得した。Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ  ３．１ソフトウェアを使用してデータを解析した。結果（図３）は、ＥＣＤコンストラクトがＶＥＧＦ発現の最も強力な誘導因子であり、活性のほとんどはＮ−ドメイン内に存在することを示す。ＶＥＧＦ誘導に対するＣ−ドメインの寄与は比較的少ない。
【０１０４】
ＣＤ１４７シグナル伝達
ＣＤ１４７はＰＩ−３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達経路を介してＭＭＰ−１及びＶＥＧＦの産生を刺激し得る。線維芽細胞内のＡｋｔリン酸化を、ＣＤ１４７シグナル伝達測定の基礎として使用した。Ａｋｔはタンパク質キナーゼＢとしても既知のキナーゼである。Ａｋｔによりリン酸化されたタンパク質は、一般に細胞生存を促進する。組み換えＣＤ１４７は、線維芽細胞内でＡｋｔリン酸化を刺激し得る（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４（２００６），ｐｐ．３７１〜３７７）。完全長ＥＣＤ（ＥＣＤ−ＦＬ）の代わりに切断型ＥＣＤドメイン、Ｎ−ドメイン又はＣ−ドメインを使用した実験は、活性のほとんどがＮ−ドメインが使用された場合に生じ、Ｃ−ドメイン含有試薬タンパク質のみの存在下では比較的少ないシグナル伝達が行われたことを示した。
【０１０５】
このシグナル伝達経路を更に理解し、異なるドメインタンパク質の役割を区別するために、ＮＨＬＦ細胞内でＣＤ１４７刺激によるＭＭＰ−１及びＶＥＧＦの産生に対する特異的Ａｋｔ阻害剤、Ａｋｔ  Ｖの効果を試験した（図４）。結果は、Ａｋｔ  Ｖが、ＣＤ１４７ドメインタンパク質により誘導されるＶＥＧＦ発現を阻害する（図４Ａ）が、ＭＭＰ−１は阻害しない（図４Ｂ）ことを示す。
【０１０６】
ＮＦ−κbもＶＥＧＦ発現を調節し、Ａｋｔシグナル伝達経路の下流標的であることが報告されている。ＮＦ−ｋｂシグナル伝達が、ＣＤ１４７ドメインタンパク質により誘導されるＭＭＰ及びＶＥＧＦの産生に関わることを試験するために、異なるＣＤ１４７タンパク質（図示せず）でＮＨＬＦ細胞を刺激した後、ＮＦ−ｋｂ阻害剤、Ｂａｙ１１−７０８２で処理した。Ｂａｙ１１−７０８２がＣＤ１４７  ＥＣＤにより誘導されるＶＥＧＦ発現を阻害するがＭＭＰ−１発現を阻害せず、Ｃ−ドメインではなくＮ−ドメインがほとんどの活性ＶＥＧＦ誘導活性を示す限りにおいて、Ａｋｔ阻害剤に関するものと同様であった。
【０１０７】
実施例３：抗ＣＤ１４７抗体の生成
Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ法により、マウス抗ヒトＣＤ１４７を生成した。加えて、マウスＣＤ１４７に対する代替抗体も生成した。
【０１０８】
３匹の１２〜１４週齢のＢａｌｂ／ｃマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。マウスのうちの２匹のそれぞれが、０日目に、７５ｍＬ  ＰＢＳ中で、等量のフロイントの完全アジュバント中で乳化した２５ｍｇの組み換えヒトＣＤ１４７  ＥＣＤ25〜205−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の１２．５ｍｇ／部位での皮内及び腹腔内注射の組み合わせを受容した。１４、２８及び５１日目に、７５ｍＬ  ＰＢＳ中で、等量のフロイントの完全アジュバント中で乳化した２５ｍｇＥＣＤをこれらのマウスに注射した。第３のマウスは、１００ｍＬ  ＰＢＳ中の２５ｍｇのヒトＥＣＤ＋０．３３×１０５ＵマウスＩＦＮａ＋０．３３×１０5  ＵマウスＩＦＮｂ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を尾の基部にて皮下（ｓｃ）投与された最初の注射を受容した。２及び３日目に、マウスは、１００ｍＬ  ＰＢＳ中の０．３３×１０5  Ｕ  ＩＦＮａ＋０．３３×１０5  Ｕ  ＩＦＮｂを尾の基部にてｓｃ投与された更なる注射を受容した。数週間後、マウスを尾の基部にて２５ｍｇ  ＣＤ１４７をｓｃ投与してブーストした。免疫化スケジュール全体において様々な時点でマウスから出血させた。後眼窩穿刺により血液収集を行い、血清を収集して固相ＥＩＡにより力価測定した。力価プラトーを得た後、マウスはそれらの最終的なブースターであるＰＢＳ中の２５ｍｇのＥＣＤを所定の静脈内（ＩＶ）に受容した。３日後、マウスをＣＯ２窒息により安楽死させ、脾臓を無菌的に除去し、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び０．２５ｍｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ（ＰＢＳ／ＰＳＡ）を含有する、１０ｍＬの冷ＰＢＳ中に浸漬した。リンパ球を、冷ＰＢＳ／ＰＳＡ中に浸漬したワイヤーメッシュスクリーンを介して細胞を無菌的に通過させることにより回収した。細胞を冷ＰＳＡ／ＰＢＳ中で１回洗浄し、トリパンブルー染料排除を用いて計数し、１０ｍＬ  ＰＢＳ中に再懸濁した。非分泌マウス骨髄腫融合パートナー細胞ラインＦＯを、融合まで、対数期培養物中に維持した。融合前に、ＦＯ細胞をＰＢＳ中で洗浄し、計数し、トリパンブルー染料排除を介して生存率を測定した（＞９５％）。合計３つの融合を行った。脾細胞を１：１比でＦＯ細胞と融合した。簡略的には、脾細胞と骨髄腫細胞とを一緒に混合し、ペレット化し、５０ｍＬのＰＢＳ中で２回洗浄した。ペレットを２ｍＬの融合溶液（５ｍＬ  ＰＥＧ分子量３０００、５ｍＬ  Ｈ２Ｏ（ｐＨ  ７．０）、０．５ｍＬ  ＤＭＳＯ）中にて３７℃で１分間再懸濁した。次に、細胞／融合混合物を、３７℃の水浴内に、穏やかに撹拌しながらおよそ９０秒間浸漬した。３７℃のＰＢＳを、最初の３０秒間を１ｍＬ、次の３０秒間を３ｍＬ、次の６０秒間を１６ｍＬでゆっくりとした増分にて加えることにより融合反応を停止した。次に、融合した細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞を融合培地中に再懸濁し、２０個の９６−ウェル平底プレート内に２００ｍＬ／ウェルで蒔いた。次に、融合プレートを６％  ＣＯ2を含む３７℃の加湿インキュベーター内に配置し、７〜１０日間平静に放置した。
【０１０９】
マウスＣＤ１４７に対する中和モノクローナル抗体を、マウスＣＤ１４７の細胞外ドメインを用いてラットを免疫化することにより生成した。免疫化及び融合の後、ハイブリドーマをマウスＣＤ１４７に対する結合に関してスクリーニングし、次にインビトロでの活性を評価した。Ｃ９４７と指定された抗体はヒトＣＤ１４７と交差反応せず、外来性マウスＣＤ１４７を加えることなく、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス線維芽細胞）によるマウスＣＤ０１４７誘導によるＭＭＰ−１産生の発現を阻害し、ＮＩＨ３Ｔ３  ＆  ＭＩＳＡ（マウス腫瘍細胞ライン）細胞の共培養物中のＭＭＰ−２を阻害した。Ｃ９４７ハイブリドーマのＶ−領域クローン化は、組み換えにより発現された際にＣ９４７の元の活性を所有する単一の重鎖及び軽鎖配列をもたらした。
【０１１０】
実施例４：抗ＣＤ１４７  ＭＡＢの特徴付け
ハイブリドーマ上清を、固相（ＥＩＡ）アッセイフォーマットにおいて、ＣＤ１４７に対する結合に関してスクリーニングした。このスクリーニングにより、５２の陽性クローンを得た。
【０１１１】
生細胞結合アッセイを用いて、５２のクローンを更にスクリーニングした。このスクリーニングにより、１３の陽性クローンを得た。
【０１１２】
１３の陽性クローンを、ＭＭＰ−１アッセイで更に試験した。ＭＭＰ−１アッセイによるスクリーニング後、１０の陽性クローンを同定した。
【０１１３】
最終的に、１０のクローンの活性は、共培養アッセイで特徴付けた。このスクリーニングにより７つの陽性クローンを得、クローンからＭａｂを精製して更なる特徴付けを行い、２Ｈ３、５Ｆ６、２Ｃ８、４Ｄ１２、４Ｇ１、５Ａ９  ＆  ４Ａ５を指定した。
【０１１４】
実施例５：ＭＡＢの生物活性
実施例２に記載したスクリーニングにより同定した７つのＭＡＢを、ＣＤ１４７の細胞外ドメイン内での結合特異性及び親和性に関して分析した。Ｎ−ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡｓｐ１９〜Ａｓｐ１１７）又はＣ−ドメイン（Ｇｌｕ９５〜Ｓｅｒ２０４）のいずれかをコードするタンパク質を使用したデータは、７つの全部がＮ−ドメインに特異的に結合するが、Ｃ−ドメインに結合しないことを示した。
【０１１５】
７つのＭａｂを、ＣＤ１４７−陽性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞、及びＣＤ１４７−陰性ＮＨＬＦに対する生細胞結合に関して再びスクリーニングした（図５）。７つの抗体の全部が、腫瘍細胞表面上に天然ＣＤ１４７抗原を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を認識した。対照的に、これらの抗体のいずれも、ＣＤ１４７発現に陰性のヒト神経芽細胞に対する検出可能な結合を全く有さなかった。
【０１１６】
Ｍａｂの結合親和性を固相結合アッセイにより推定した。４つの中和抗体、２Ｃ８（ｍＩｇＧ１）、２Ｈ３（ｍＩｇＧ１）、５Ｆ６（ｍＩｇＧ１）及び４Ｄ１２（ｍＩｇＧ１）は、試験した７つのＭａｂのＲＤＩ−ＣＤ１４７と比較して、組み換えＣＤ１４７に対する最も高い親和性を示した。
【０１１７】
ＭａｂがＭＭＰ−１産生を遮断する能力を評価するために、ＮＨＬＦを１μｇ／ｍＬの組み換えＥＣＤ−Ｆｌａｇコンストラクトで処理した。ＭＭＰ−１活性アッセイを用いて、ＣＤ１４７刺激に対するＭＭＰ−１産生を測定した。７つの精製抗ＣＤ１４７抗体全部をアッセイに含めて、それらの阻害活性を評価した。４つのｍＡｂｓは、ＭＭＰ−１産生の有意な阻害を示した。２Ｈ３（ｍＩｇＧ１）、２Ｃ８（ｍＩｇＧ１）及び５Ｆ６（ｍＩｇＧ１）ｍＡｂが最も強力であり、４０μｇ／ｍＬで使用された際に、ＭＭＰ−１産生を最小レベルに阻害した（図６）。
【０１１８】
共培養物中で、ＣＤ１４７誘導によるＭＭＰ−２又はＭＭＰ−９産生を阻害する能力について抗体をスクリーニングした。このアッセイでスクリーニングされた７つのうち３つ、ｍＡｂ  ２Ｈ３（ｍＩｇＧ１）、２Ｃ８（ｍＩｇＧ１）、５Ｆ６（ｍＩｇＧ１））が、共培養物中でＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９産生を阻害した（図７）。４Ｄ１２（ｍＩｇＧ１）は、このアッセイでは実質的に阻害活性を示さなかった。５Ａ９（ｍＩｇＧ１）は阻害性だと思われたが、その阻害活性は用量依存的ではなかった（図７）。
【０１１９】
またＣＤ１４７  ＥＣＤに対する親和性を、表面プラズモン共鳴法（Ｂｉａｃｏｒｅ）により測定した。ＢＩＡＣＯＲＥ  ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）器具を使用して２５℃で動力学的試験を行った。ヤギ抗マウスＦｃｙ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｐｒｏｄ  ＃  １１５−００５−０７１）をカルボキシメチルデキストラン被覆金表面（ＣＭ−５Ｃｈｉｐ，Ｂｉａｃｏｒｅ）に共有結合させた。デキストランのカルボキシメチル基をＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させた。Ａｂは、１０ｍＭ酢酸ナトリウム中にてｐＨ  ４．５で結合された。表面上の残りの任意の反応部位は、エタノールアミンを用いた反応により遮断された。
【０１２０】
動力学的結合測定のために、抗マウスＦｃｙ特異的抗体を用いて抗ＣＤ１４７  ｍＡｂを流速３０μＬ／分で捕捉した。Ａｂ捕捉の後、ＣＤ１４７−ＦＬ−ＥＣＤ又はＮ−若しくはＣ−ドメイン断片（実施例１に記載したような）を濃度７５〜３００ｎＭにて６０μＬ／分で注入した。会合データを２分間収集した後、解離データを１０分間収集した。表面を１５μＬの１００ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４で再生した後、１５μＬの５０ｍＭ  ＮａＯＨにて３０μＬ／分で再生した。全試料は、３ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．００５％の表面活性剤Ｐ２０を含有するＤ−ＰＢＳ中で調製された。データは、捕捉抗体を含む流動細胞と、捕捉抗体を含まない参照細胞との間のＳＰＲシグナルの差異を報告した。基準−除算シグナル（reference-subtracted signal）からブランク注入のデータを除算することによって、シグナルに対する器具の追加の寄与を除去した。ＢＩＡ評価ソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して、全濃度において会合及び解離相を適合することによりデータを解析した。
【０１２１】
データは３つのｍＡｂ  ２Ｈ３（ｍＩｇＧ１）、５Ｆ６（ｍＩｇＧ１）及び２Ｃ８（ｍＩｇＧ１）がＣＤ１４７に対するｎＭ親和性を有し、Ｎ−ドメインに結合するがＣ−ドメインに結合しないことを示した。
【０１２２】
これらのＭａｂの活性の概略を表１（下記）に示し、表中の共培養阻害は、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９産生に関するアッセイを指す。
【０１２３】
【表２】
0005564049.tif 000003
【０１２４】
ＥＣＤのＮ−末端ドメインに関する最も高い結合親和性（最も小さい結合Ｋｄ）と特異性とを有するクローン２Ｈ３、４Ａ５、及び５Ｆ６に基づいて、これらのクローンを更なる試験のためのクローン化及びより大量の発現のために選択した。
【０１２５】
実施例６：抗ＣＤ１４７  ＭＡＢのクローン化
２Ｈ３、２Ｃ８、５Ｆ６及び４Ａ５の重鎖及び軽鎖に関するＶ−領域核酸配列をハイブリドーマからクローン化した。アミノ酸配列を下記に示し、ＣＤＲを注解する。
【０１２６】
マウス抗体鎖をハイブリドーマクローンＣ１１６４Ａ（２Ｈ３）、Ｃ１１７０（２Ｃ８）、Ｃ１１７１Ａ（５Ｆ６）、Ｃ１１７１Ａ（４Ａ５）からクローン化するために、全ＲＮＡ（３μｇ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコルに従ってＴｒｉｚｏｌを使用して単離）を５’ＲＡＣＥに使用し、オリゴｄＴにより逆転写をプライミングした（ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。得られた各ｃＤＮＡを２つの別個のＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用して（１μｌ／反応）、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を増幅した。ＨＣの可変領域を増幅するために、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ５’プライマーをＰＣＲ増幅のためのラットＨＣ１（＃６４１）プライマーと共に使用した。重鎖ＰＣＲ産物は、約７００ｂｐの単一のバンドであった。プラチナＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼハイフィデリティ（Platinum TAQ DNA polymerase High Fidelity）をＰＣＲに使用し、ＰＣＲ増幅のアニーリング温度は６５℃（９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で１分間）であった。ＬＣの可変領域を増幅するために、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ５’プライマーをラットＬＣ１（＃６４４）プライマーと共に使用した後、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ５’ネステッドプライマー及びラットＬＣ２（＃６４５）プライマーを使用してネステッドＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は上述した通りであり、軽鎖ＰＣＲ産物はおよそ６００ｂｐのバンドを提供した。６００ｂｐバンドを、ＬＣ  ＰＣＲ産物としてアガロースゲルから精製した。Ｖ−領域配列産物を得るために、ＰＣＲ産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローン化した。Ｍ１３フォワード又はリバースオリゴ（３０ｎｇ）を使用して、配列反応を刺激した。１つの抗体のために、配列決定により５Ｆ６、１つのＨＣ及び２つのＬＣｓ  Ｖ−領域配列を同定した。リガーゼ非依存性クローン化方法（ligase-independent cloning method）を用いて、ＨＣ及びＬＣｓを様々な発現ベクター内にクローン化した。ＰＣＲプライマーを以下に規定する。
【０１２７】
【表３】
0005564049.tif 000004
【０１２８】
各抗体重鎖及び軽鎖に関するクローン化Ｖ−領域の翻訳産物を以下に示す。
【０１２９】
【化１】
0005564049.tif 000005
【０１３０】
実施例７：組み換えＭＡＢの生物活性
マウス抗体からの結合ドメインが、新生物組織増殖及び転移拡散などの病理に関連したＣＤ１４７の所定の生物活性を遮断する能力を、マウスｍＡｂ（ｍＩｇＧ１）として発現された完全抗体、又は、インビボでのアッセイにて抗体エフェクター機能に寄与するヒトＩｇＧ１若しくはマウスＩｇＧ２ａ定常領域のいずれかを有するＶ−領域キメラのいずれかを用いて評価した。そのようなキメラの構築方法は、当該技術分野において周知である。いくつかのアッセイでは、市販のＣＤ１４７中和抗体、ＲＤＩ−ＣＤ１４７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を比較器として使用した。
【０１３１】
単一培養ＮＨＬＦにおけるＣＤ１４７誘導によるＭＭＰ−１放出の阻害
アッセイは、実施例４に記載のように実施した。抗ＣＤ１４７抗体の阻害活性を測定するために、細胞を組み換えＣＤ１４７（ＥＣＤ１９−２０５−Ｆｃコンストラクト）で１５分間刺激した後、細胞培養物にＭａｂ  ２Ｈ３（ｍＩｇＧ２ａ）及び５Ｆ６（ｈＩｇＧ１）を１、５、１０及び２０ｕｇ／ｍＬにて加えた。データ（表３）は、神経芽細胞によるＣＤ１４７刺激ＭＭＰ−１産生が、組み換え抗ＣＤ１４７  Ｍａｂ  ２Ｈ３（ｍＩｇＧ２ａ）及び５Ｆ６（ｈＩｇＧ１）により用量依存的に阻害されたことを示した。
【０１３２】
【表４】
0005564049.tif 000006
【０１３３】
共培養物中のＭＭＰ−２産生の阻害
実施例４に記載したように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＮＨＤＦの共培養アッセイを用いて、２つの組み換え抗ＣＤ１４７抗体：５Ｆ６（ｈＩｇＧ１）及び４Ａ５（ｍＩｇＧ２ａ）の存在下及び不在下でアッセイを行った。両方の抗体が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＮＨＤＦによるＭＭＰ−２産生を用量依存的に阻害した（図８）。
【０１３４】
ＶＥＧＦ産生の阻害
抗ＣＤ１４７抗体の阻害活性を測定するために、抗体をＮＨＬＦ細胞培養物に加え、細胞を組み換えＣＤ１４７で１５分間刺激した。条件培地を４８時間後に収集した。データ（図９）は、２Ｈ３（ｍＩｇＧ２ａ）及び５Ｆ６（ｈＩｇＧ１）Ｍａｂｓの両方が、１０μｇ／ｍＬの組み換えＣＤ１４７で４８時間刺激された正常なヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）によるＶＥＧＦ産生を阻害できたことを示す。
【０１３５】
腫瘍細胞上のＣＤ１４７発現が腫瘍細胞と線維芽細胞との共培養物中でのＶＥＧＦ発現に影響を与えたため、組み換え抗ＣＤ１４７  ｍａｂ、２Ｈ３（ｍＩｇＧ２ａ）及び５Ｆ６（ｈＩｇＧ１）の、ＣＤ１４７媒介性の腫瘍間質ＶＥＧＦ産生を抑制する能力を試験した。このアッセイは、以下の変更を加えて実施例４に記載したように行った。試験したｍＡｂは、共培養物に加えられた。３日後、培養培地を再度、１．０ｍＬの血清フリーＤＭＥＭ培地及びｍＡｂで置き換えた。２日後、条件培地を収集して、ＶＥＧＦ濃度を分析した。データは、２０μｇ／ｍＬの組み換え抗ＣＤ１４７  Ｍａｂ  ２Ｈ３（ｍＩｇＧ２ａ）及び５Ｆ６（ｈＩｇＧ１）の両方が、腫瘍細胞と神経芽細胞との共培養物中で、４０％を越えるＶＥＧＦ産生を阻害したことを示した。
【０１３６】
実施例８：インビボでの活性
血管新生の阻害
マトリゲル（商標）は、細胞マトリックスタンパク質に富んだ腫瘍であるＥｎｇｅｌ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出した、可溶化基底膜調製品である。主な成分はラミニンであるが、マトリゲルは、微量の線維芽細胞増殖因子、ＴＧＦ−β、組織プラスミノーゲン活性化因子、及びＥＨＳ腫瘍内に天然に存在する他の増殖因子も含有する。マトリゲルは、数種の腫瘍細胞浸潤アッセイの基礎であり、血管新生の試験に必要な基質を提供する。マトリゲルは、マウス又はラットに皮下注射された際に柔らかいゲルプラグを形成し、血管新生因子を補充された際に強力な血管応答を支持する。
【０１３７】
実験１
マトリゲルプラグアッセイを用いて、ハイブリドーマ上清から精製された抗ＣＤ１４７抗体組み換え２Ｈ３、５Ｆ６、及び４Ｄ１２、並びにラット抗マウスＣＤ１４７抗体（Ｃ９４７）の抗血管新生効果を評価した。試験１日目、５０匹のヌードマウスを、以下に示すように１０個のグループ（ｎ＝５／グループ）に無作為化した。マウスを秤量し、ケタミン／キシラジン（９０／１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔した。マウスの２つの部位に、各側につき０．５ｍＬのマトリゲル（０．５０万細胞／ｍＬマトリゲルで）を注射した。試験物質はｉ．ｐ．で１日目及び４日目に治療当たり１０ｍｇ／ｋｇで注射された。１日目に治療薬を、下記の表４に規定したように、マトリゲルプラグの移植から３時間前に注射した。抗ＣＤ１４７抗体２Ｈ３（ｍＩｇＧ２ａ）、５Ｆ６（ｈＩｇＧ１）、４Ｄ１２（ｍＩｇＧ１）、Ｃ９４７（ラットＩｇＧ１）及びｃＶａｍ（対照として使用した非特異性Ｍａｂ）を適切な濃度に希釈して、体重２０ｇｍ当たり総容積０．５ｍＬの各ｍＡｂのＩ．Ｐ．投与を可能にした。示した薬剤は、注射前に互いに混合（１：１）された。
【０１３８】
【表５】
0005564049.tif 000007
【０１３９】
８日目に、全部のマウスをＣＯ２窒息により安楽死させた。プラグを外科的に除去し、盲検方式で秤量した。１つのプラグ／動物（右側）のヘモグロビン含有量をアッセイし、これを血管新生応答の直接指標として使用した。他方のプラグを全体像解析（gross image analysis）のために加工した。
【０１４０】
データ（図１０）は、組み換え抗ＣＤ１４７  Ｍａｂ、２Ｈ３（ｍＩｇＧ２ａ）及び５Ｆ６（ｈＩｇＧ１）が、単独又は抗マウスＣＤ１４７（ｃ９４７）Ｍａｂとの組み合わせのいずれかで、インビボで血管新生を有意に阻害することを示した。
【０１４１】
実験２
ＰＡＮＣ−１癌細胞由来のＣＤ１４７により刺激された血管新生に対する抗ＣＤ１４７Ｍａｂ（４Ａ５、５Ｆ６）の阻害効果を評価及び比較するために、雌のＳＣＩＤマウス内のマトリゲルプラグにＰＡＮＣ−１癌細胞を埋め込んだ。
【０１４２】
マトリゲルをＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｉｎｃ．から購入し、１１．１ｍｇ／ｍＬで使用した。ＰＡＮＣ−１ヒト膵臓腫瘍細胞を血清フリーＤＭＥＭ中に供給した。
【０１４３】
エフェクター機能陽性アイソタイプ（Ｅ＋ｍＩｇＧ２ａ）及びエフェクター陰性アイソタイプ（Ｅ−ｍＩｇＧ１）の両方が可変部ドメインの各対に表れるように、マウス定常領域により抗体を調製した。
【０１４４】
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ（Ｒａｌｅｉｇｈ，Ｎ．Ｃ．）から得た４２匹の雌ＳＣＩＤマウス（６週齢）をフィルタートッププラスチックケージ内にグループで収容し（７匹／ケージ）、自由選択で、オートクレーブした食物及び水を供給した。試験の０日目、４２匹のＳＣＩＤマウスを剪毛し、６つのグループに無作為化した（ｎ＝７／グループ）。１日目に、マトリゲルプラグを移植する３時間前に試験物質を体重２０ｇ当たり０．２ｍＬ（１０ｍｇ／ｋｇ）でｉ．ｐ．注射し、次に５日目に再度注射した。
【０１４５】
マウスを秤量し、ケタミン／キシラジン（９０／１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔した。１グループを除き、マウスは２つの部位に０．５ｍＬのマトリゲルを注射された。
【０１４６】
９日目に、全部のマウスを安楽死させ、プラグを外科的に除去し、盲検方式で秤量した。プラグのヘモグロビン含有量を血管新生応答の間接的指標としてアッセイした。
【０１４７】
ヘモグロビンレベルの分析を、各マウスの２つの測定値の平均を用いて行った。
【０１４８】
【表６】
0005564049.tif 000008
【０１４９】
上記のデータ表（表５）は、ヘモグロビンに関するグループ別の推定平均及び標準誤差、並びに信頼区間を示す。Ｐａｎｃ−１細胞を有する未処理マトリゲルを含むプラグは、最も高いヘモグロビンレベル２５．１０±１５．０６ｍｇ／ｇｍを有した。Ｅ＋５Ｆ６（ＣＮＴＯ  ７６０３）グループは、最も低いヘモグロビンレベル０．２６±０．２１ｍｇ／ｇｍを有した。
【０１５０】
全体的Ｆ検定のＰ値は、＜０．００１である。グループ間に、有意な統計的差異の証拠が存在した。グループ間で、対による比較の全部を行った。細胞を有さないプラグ、ＰＢＳ−処理グループは、Ｐａｎｃ−１細胞を有する未処理（ＰＢＳ）グループ、Ｅ−４２５（ＣＮＴＯ７７０９）グループ及びＥ−５Ｆ６（ＣＮＴＯ  ８２６１）グループ（それぞれ、ｐ値＜０．００１、＜０．００１及び０．００２）よりも有意に小さかった。細胞グループを有さないＰＢＳ−処理プラグと、Ｅ＋グループ、Ｅ＋４Ａ５（ＣＮＴＯ８２６１）及びＥ＋５Ｆ６（ＣＮＴＯ７６０３）との間で、差異は統計的に検出されなかった。
【０１５１】
Ｅ＋Ｍａｂで処理した細胞を有するマトリゲルからのグループを、細胞を有するＰＢＳと比較した際にヘモグロビンレベルの有意な低下が検出された。Ｅ＋４Ａ５（ＣＮＴＯ  ９６３３）は、細胞を含むマトリゲルを有するＰＢＳよりも９７％±３％小さく（ｐ値＜０．００１）、Ｅ＋５Ｆ６（ＣＮＴＯ７６０３）は、細胞を含むマトリゲルを有するＰＢＳよりも９９％±１％小さかった（ｐ値＜０．００１）。細胞を含むマトリゲルを有するＰＢＳと、Ｅ−５Ｆ６（ＣＮＴＯ８２６１）処理との間のヘモグロビンの差異は、統計的有意性から僅かに外れた（ｐ値＝０．０７２）。細胞を含むマトリゲルを有するＰＢＳとＥ−４Ａ５（ＣＮＴＯ７７０９）グループとの間では、２３％±６６％のみの差異（ｐ値＝０．７５３）が検出された。
【０１５２】
２つの４Ａ５グループを比較すると、Ｅ＋（ＣＮＴＯ９６３３）はＥ−（ＣＮＴＯ７７０９）ヘモグロビンレベルよりも有意に小さい。推定差は、９９％±３％（ｐ値＜０．００１）である。２つの５Ｆ６グループを比較すると、Ｅ＋（ＣＮＴＯ７６０３）はＥ−（ＣＮＴＯ８２６１）ヘモグロビンレベルよりも有意に小さい。推定差は、９５％±５％（ｐ値＝０．００４）である。
【０１５３】
２つのＥ＋（ＣＮＴＯ９６３３対ＣＮＴＯ７６０３）グループ又は２つのＥ−グループ（ＣＮＴＯ７７０９対ＣＮＴＯ８２６１）の間で、有意な差異は検出されなかった。２つの４Ａ５グループを比較すると、Ｅ＋４Ａ５はＥ−４Ａ５ヘモグロビンレベルよりも有意に小さい。５Ｆ６グループを比較すると、Ｅ＋５Ｆ６はＥ−５Ｆ６ヘモグロビンレベルよりも有意に小さい。Ｅ＋グループの間、又は２つのＥ−グループの間で、有意な差異は検出されなかった。データは、Ｅ−ではなくＥ＋の５Ｆ６及び４Ａ５が、Ｐａｎｃ−１マトリゲルプラグモデルにおいて腫瘍血管新生を阻害することを示した。
【０１５４】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１同所性腫瘍異種移植モデルにおける腫瘍増殖の阻害
腫瘍進行に対する抗ＣＤ１４７機能遮断抗体の抗癌効果を測定するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を移植したＳＣＩＤベージュマウスをＥ＋４Ａ５（ＭｕＩｇＧ２ａ）又はＥ＋５Ｆ６（ＭｕＩｇＧ２ａ）で処理した。
【０１５５】
０日目、４０匹の雌ＳＣＩＤベージュマウスをケタミン／キシラジン（９０／１０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）で麻酔した。動物は、右腋窩部第２又は第３乳房脂肪体内に、０．０５ｍＬ（２．５×１０6細胞）のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞懸濁液を同所性に移植された。
【０１５６】
動物全部を試験開始持に秤量し、試験の全過程において週１回秤量した。平均腫瘍容積が６０〜７０ｍｍ３となったときに、動物をグループ当たり８匹で、以下の３つのグループのうちの１つに層別化した。ＰＢＳのみ、Ｅ＋５Ａ６又はＥ＋４Ａ５。これらは試験の残りにおいて週２回、１ｍｇ／Ｋｇにて投与された（全部で５０日間）。腫瘍増殖を週毎に、ノギスを用いて２次元（長さ及び幅）にてミリメートル（ｍｍ）で測定し、腫瘍容積（ｍｍ３）を式［長さ×幅×幅］／２に基づいて計算した。
【０１５７】
実験の終了時点で、ＣＯ２窒息によりマウスを安楽死させた。一次腫瘍を切除し、デジタル天秤上で秤量した。肺を除去し、秤量し、肺転移にインディアインクを散布し、Ｆｅｋｅｔｅ溶液中に配置して盲検方式にて転移を数え上げた。
【０１５８】
結果
腫瘍体積に関しては、反復測定モデルを、一次自己相関共分散構造を仮定したデータに適合させた。時間プロファイルにおける傾向の曲率をモデリングするために、自然スプラインを使用した。各時間点でグループ間における一対比較を行った。計算は、Ｒソフトウェア環境を用いて実施した。
【０１５９】
古典的、及び耐性かつロバストなＡＮＯＶＡ（resistant and robust ANOVA）の両方を肺転移計数に適用し、２つの方法からの結果を比較した。両方の分析からの結論は同一であるが、耐性かつロバストな分析に関しては、グループ間の等しい分散と、正規分布からの標本抽出との前提が、より合理的に適合される。
【０１６０】
一次腫瘍増殖曲線を示す（図１１）。処理開始から７日後に開始して、Ｅ＋４Ａ５（ｍｕＩｇＧ２ａ）及びＥ＋５Ｆ６（ｍｕＩｇＧ２ａ）グループの腫瘍増殖は、ＰＢＳ対照グループと比較して有意に阻害された（全部の対比較においてｐ＜０．００１、統計の詳細に関するＡｐｐｅｎｄｉｘ  １を参照）。この差異は、日数が増加するにつれ増大する。Ｅ＋４Ａ５（ｍｕＩｇＧ２ａ）による処理は、７〜２８日目に、Ｅ＋５Ｆ６（ｍｕＩｇＧ２ａ）と比較して有意に小さい腫瘍容積をもたらした。
【０１６１】
Ｅ＋５Ｆ６（ｍｕＩｇＧ２ａ）及びＥ＋４Ａ５（ｍｕＩｇＧ２ａ）の両方は、ＰＢＳグループ（両方のｐ値＝＜０．００１）に対して、腫瘍容積が１５００ｍｍ3に到達した時間迄の平均時間を有意に延長した（即ち遅延させた）。Ｅ＋４Ａ５（ｍｕＩｇＧ２ａ）も、Ｅ＋５Ｆ６（ｍｕＩｇＧ２ａ）と比較して、１５００ｍｍ3閾値に到達する迄の日数を有意に増大させた（１８％±６％；ｐ値＝０．００４）。
【０１６２】
このデータは、Ｅ＋抗−ＥＭＭＰＲＩＮ抗体がこの用量で一次腫瘍増殖を阻害できることを示す。
【０１６３】
ＰＢＳグループのマウスからの肺の全部が多数の肺転移を含んでいた（平均値±標準偏差＝１２２±１４．０）一方、Ｅ＋４Ａ５（ｍｕＩｇＧ２ａ）及びＥ＋５Ｆ６（ｍｕＩｇＧ２ａ）抗体処理グループの肺における転移性病変の数は有意に低減され（それぞれ１７．８±１２．１及び１７．５±１３．７）、全体のＰ値は＜０．００１であった。Ｅ＋５Ｆ６（ｍｕＩｇＧ２ａ）とＥ＋４Ａ５（ｍｕＩｇＧ２ａ）処理の間で肺転移の数に関する有意な差異は検出されなかった（ｐ値＝０．９７０）。Ｅ＋５Ｆ６（ｍｕＩｇＧ２ａ）及びＥ＋４Ａ５（ｍｕＩｇＧ２ａ）処理グループの両方において、明らかに肺転移を有さないマウスが存在した（各グループにて１匹のマウス）。これらの結果は、ＥＭＭＰＲＩＮの中和が一次ＭＤＡ−ＭＢ−２３１同所性腫瘍からの肺転移の形成を阻害し又は増殖を遅延させ得ることを示唆する。
【０１６４】
実施例９：エピトープマッピング
ヒトＣＤ１４７上の４Ａ５及び５Ｆ６  ＭＡＢに関する結合部位は、抗体競合的結合アッセイ、Ｈ／Ｄ交換、及び単一点変異誘発の組み合わせにより規定され、ヒトＥＭＭＰＲＩＮ断片の公表かつ内部的に生成された構造の状況から解釈された。結果は、抗体がＣＤ１４７の細胞外ドメイン内の類似したエピトープに結合することを示す。
【０１６５】
Ｈ／Ｄ交換のために、組み換えＣＤ１４７  ＥＣＤ  Ｎ−ドメイン（Ａｓｐ１９〜Ａｓｎ１１７−ｈｅｘａｈｉｓ）を重水溶液中で所定時間インキュベートし、交換可能な水素原子において重水素を組み込んだ。重水素化ＥＭＭＰＲＩＮを、不動化した４Ａ５  Ｆａｂ（大腸菌から発現、Ｃ−末端Ｈｉｓ−タグを有する）又は５Ｆ６  ｍＡｂを含むカラム上に捕捉した後、水性バッファで洗浄した。逆交換（back-exchanged）したＣＤ１４７ドメインタンパク質をカラムから溶出し、重水素含有断片の局在性を、プロテアーゼ消化及び質量分析により決定した。抗体に結合した領域は比較的交換から保護される部位であり、それ故、抗体と複合しないＣＤ１４７よりも高い割合の重水素を含むと推測された。Ａｓｐ１９〜Ａｓｎ１１７−ｈｅｘａｈｉｓのＨ／Ｄ交換パータベーション（H/D exchange perturbation）を図１２に示す。
【０１６６】
４Ａ５に関するＨ／Ｄ交換データは、２つのセグメント（Ｌｅｕ９０〜Ａｓｎ９８＞Ａｓｐ６５〜Ｐｈｅ７４）を関係させる。しかしながら、これら２つのセグメントは、Ｎ−ドメイン試薬の３次元配座の２つの対向側に存在するため、抗体が両方に結合する見込みはない。残基９０〜９８は関連して二量体構造を形成することが観察された。この領域内で抗体の間で観察されたＨ／Ｄ差異は、４Ａ５結合による構造的（アロステリック）安定性の結果である可能性がある。したがって、Ｌｅｕ９０〜Ａｓｎ９８は除外され、Ａｓｐ６５〜Ｐｈｅ７４がエピトープ領域である可能性がある。５Ｆ６抗体結合を用いたＨ／Ｄ交換試験は、Ａｓｐ６５〜Ｐｈｅ７４ペプチドに対する結合を示し、おそらく領域Ｖａｌ３０〜Ｔｈｒ４０に対する結合を示す。これら２つのセグメントは、構造的に接近しており、それ故、両方ともエピトープの一部であることが可能である。
【０１６７】
４Ａ５抗体のエピトープのマッピングのための独立した第２の方法として、ヒトＣＤ１４７のＮ−末端ドメインの単一点変異誘発を、Ｐｒｏｇｅｎｏｓｉｓ，Ｌｉeｇｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ（Ｃｈｅｖｉｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．３０：８１〜９３）からの二機能性ハイブリッドタンパク質（ＢＨＰ）表示技術を用いて行った。３つの単一点突然変異体、Ｄ４５、Ｇ６９及びＱ７０は、４Ａ５  ｍＡｂに対する結合を実質的に低下させた。これらの残基のうちの２つ、Ｇ６９及びＱ７０は、Ｈ／Ｄ交換により同定されたＡｓｐ６５〜Ｐｈｅ７４セグメント内に存在する。第３の残基、Ｄ４５は、６９ＧＱ７０に隣接する可撓性ループ内に存在する。このことは、結合領域のそれぞれがどのように標的ＣＤ１４７タンパク質に係合し、エピトープがペプチド65ＤＡＬＰＧＱＫＴＥＦ74内に存在するかの類似性を示唆したが、領域30ＶＥＤＬＧＳＫＩＬＬＴ40もまたＦ６結合エピトープに寄与し得る。
【０１６８】
ＣＤ１４７  Ａｓｐ１９〜Ａｓｎ１１７−Ｆｃ融合タンパク質で被覆したマイクロタイタープレート上での競合ＥＬＩＳＡを行って、２Ｈ３、４Ａ４及び５Ｆ６  ｍＡｂに関する結合特異性を評価した。標識した２Ｈ３  ｍＡｂを異なる濃度のＭａｂと共に室温で３０分間プレインキュベートした。次いで、これらの混合物を抗原被覆マイクロウェルに加えた。３７℃での２時間のインキュベーション後、マイクロタイタープレートを徹底的に洗浄し、結合した２Ｈ３を検出した。結果は、４Ａ５及び５Ｆ６の両方が２Ｈ３ｍＡと競合することを示す（図１３）。データは、２Ｃ８が２Ｈ３及び５Ｆ６の両方に対して非常にうまく競合するが（ＩＣ５０〜３０ｎＭ）、２Ｈ３及び５Ｆ６は互いに対してあまり競合しないことを示唆した（ＩＣ５０〜１μＭ）。これらのデータは、２Ｈ３及び５Ｆ６が異なるエピトープを有し、両方が非常に接近すること又は２Ｃ８結合部位と重複することを示す。
【０１６９】
総じて、これらの結果は、４Ａ５のエピトープを領域Ａｓｐ６５〜Ｐｈｅ７４内に配置し、ループ領域（４０〜５０）をＡｓｐ４５の付近にて中央に配置した。５Ｆ６  ｍＡｂに関する結合部位も、Ｖａｌ３０〜Ｔｈｒ４０と共にＡｓｐ６５〜Ｐｈｅ７４にマッピングした。
【図１】
0005564049.tif 000009
【図２】
0005564049.tif 000010
【図３】
0005564049.tif 000011
【図４】
0005564049.tif 000012
【図５Ａ】
0005564049.tif 000013
【図５Ｂ】
0005564049.tif 000014
【図６】
0005564049.tif 000015
【図７】
0005564049.tif 000016
【図８】
0005564049.tif 000017
【図９】
0005564049.tif 000018
【図１０】
0005564049.tif 000019
【図１１】
0005564049.tif 000020
【図１２】
0005564049.tif 000021
【図１３】
0005564049.tif 000022
【配列表】
0005564049000001.app