(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対応する未変性莢膜糖の単糖単位の内の少なくとも８０％にヒドロキシル基の位置のブロック基を含む修飾莢膜糖であって、該ブロック基が式（Ｉａ）：
−Ｏ−Ｘ−Ｙ  （Ｉａ）
（式中、
Ｘは、Ｃ（Ｏ）であり；
Ｙは、Ｒ３であり；かつ
Ｒ３は、Ｃ１−６アルキル基である）である、修飾莢膜糖であって、
ここで、該修飾莢膜糖の少なくとも４つの単糖単位はブロック基を有する、修飾莢膜糖。
【請求項２】
Ｒ３がＣ１−３アルキル基である、請求項１に記載の修飾莢膜糖。
【請求項３】
Ｒ３がＣ２アルキル基またはＣ３アルキル基である、請求項２に記載の修飾莢膜糖。
【請求項４】
Ｒ３がＣＨ３である、請求項２に記載の修飾莢膜糖。
【請求項５】
前記糖の単糖単位の少なくとも９０％がブロック基を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の修飾莢膜糖。
【請求項６】
前記糖の全ての単糖単位がブロック基を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の修飾莢膜糖。
【請求項７】
前記対応する未変性莢膜糖が、ホスホジエステル結合によって連結される単糖単位を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の修飾莢膜糖。
【請求項８】
前記対応する未変性莢膜糖がＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ糖である、請求項７に記載の修飾莢膜糖。
【請求項９】
前記ブロック基が、前記対応するＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ糖の４位及び／又は３位のいずれかにある、請求項８に記載の修飾莢膜糖。
【請求項１０】
前記ブロック基が、前記対応するＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ糖の４位のいずれかにある、請求項９に記載の修飾莢膜糖。
【請求項１１】
前記修飾莢膜糖がオリゴ糖である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の修飾莢膜糖。
【請求項１２】
前記修飾糖が、末端アノマーヒドロキシル基又は末端アノマーヒドロキシル基から誘導されるアミノ基を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の修飾莢膜糖。
【請求項１３】
前記対応する未変性莢膜糖の２個のビシナルであるヒドロキシル基がブロック基を含有しない、前記修飾莢膜糖の少なくとも１つの単糖単位が存在する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の修飾莢膜糖。
【請求項１４】
式：
【化２０】
0005637689.tif 000041
（式中、
Ｔは式（Ａ）又は（Ｂ）：
【化２１】
0005637689.tif 000042
であり；
ｎは、１から１００までの整数であり；
各Ｚ基は、ＯＨ、ＯＡｃ又は式（Ｉａ）：−Ｏ−Ｘ−Ｙ  （Ｉａ）のブロック基から独立して選択され；及び
各Ｑ基は、ＯＨ、ＯＡｃ又は式（Ｉａ）：−Ｏ−Ｘ−Ｙ  （Ｉａ）のブロック基から独立して選択され；
Ｖは、−ＮＨ２、−ＮＨＥ、−ＮＥ１Ｅ２、Ｗ２又は−Ｏ−Ｄから選択され、ここでＥ、Ｅ１及びＥ２は、同一又は異なっていてよい窒素保護基であり、及びＤは、酸素保護基であり；
Ｗは、−ＯＨ又は式（Ｉａ）：−Ｏ−Ｘ−Ｙ  （Ｉａ）のブロック基から選択され；
Ｗ１は、−ＯＨ又は式（Ｉａ）：−Ｏ−Ｘ−Ｙ  （Ｉａ）のブロック基から選択され；
Ｗ２は、−ＯＨ又は式（Ｉａ）：−Ｏ−Ｘ−Ｙ  （Ｉａ）のブロック基から選択され；
及び、Ｚ基の少なくとも１個及び／又はＱ基の少なくとも１個が、式（Ｉａ）：−Ｏ−Ｘ−Ｙ  （Ｉａ）のブロック基であり、ここで、式（Ｉａ）において、
Ｘは、Ｃ（Ｏ）であり；
Ｙは、Ｒ３であり；かつ
Ｒ３は、Ｃ１−６アルキル基である）の糖であって、該糖の単糖の内の少なくとも８０％が、Ｚ基および／またはＱ基に式（Ｉａ）：−Ｏ−Ｘ−Ｙ  （Ｉａ）のブロック基を含む、糖。
【請求項１５】
Ｚ基の少なくとも１０％がブロック基である、請求項１４に記載の糖。
【請求項１６】
ｎが１５〜２５の整数である、請求項１４又は請求項１５に記載の糖。
【請求項１７】
Ｑ基の少なくとも１％がブロック基である、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の糖。
【請求項１８】
（ａ）単糖単位上に少なくとも１個のヒドロキシル基を有する莢膜糖を提供するステップ；及び
（ｂ）該少なくとも１個のヒドロキシル基を、式（Ｉａ）：−Ｏ−Ｘ−Ｙ  （Ｉａ）のブロック基に変換するステップであって、ここで、式（Ｉａ）において：
Ｘは、Ｃ（Ｏ）であり；
Ｙは、Ｒ３であり；かつ
Ｒ３は、Ｃ１−６アルキル基であり、
該糖の少なくとも４つの単糖単位はブロック基を有し、該糖の単糖単位の少なくとも８０％がブロック基を有する、
ステップ、を含む、莢膜糖を修飾するためのプロセス。
【請求項１９】
ステップ（ｂ）が、
（ｂ１）イミダゾール触媒の存在下で、前記莢膜糖を［Ｒ３Ｃ（Ｏ）］２Ｏと反応させるステップを含む、請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２０】
ステップ（ａ）における前記莢膜糖が莢膜オリゴ糖である、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記莢膜オリゴ糖類が、対応する未変性莢膜多糖の解重合及びサイジングによって取得可能である、請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２２】
ステップ（ａ）における前記莢膜糖類が未変性莢膜多糖であり、前記プロセスが、ステップ（ｂ）の生成物がサイジングされ、それによって修飾莢膜オリゴ糖を提供するステップ（ｃ）を更に含む、請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２３】
（ａ）未変性Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ多糖を提供するステップ；
（ｂ）該多糖の解重合及びサイジングを行ってオリゴ糖を提供するステップ；及び
（ｃ）該オリゴ糖の少なくとも１個のヒドロキシル基を、請求項１８または１９にしたがって、ブロック基に変換するステップ、を含む、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ多糖を修飾するためのプロセス。
【請求項２４】
（ａ）未変性Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ多糖を提供するステップ；
（ｂ）該多糖の少なくとも１個のヒドロキシル基を、請求項１８または１９にしたがって、ブロック基に変換するステップ；
（ｃ）得られた多糖の解重合及びサイジングを行うステップ、を含む、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ多糖を修飾するためのプロセス。
【請求項２５】
２個以上の単糖単位の間にグリコシド結合を形成することを含む全体的な合成プロセスである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の糖を調製するためのプロセス。
【請求項２６】
請求項１８または１９に記載のプロセスによって取得可能な又は得られた修飾莢膜糖。
【請求項２７】
請求項１〜１７および２６のいずれか１項に記載の糖の糖−タンパク質複合体。
【請求項２８】
前記タンパク質が細菌毒素又は細菌トキソイドである、請求項２７に記載の複合体。
【請求項２９】
前記細菌毒素又は細菌トキソイドがジフテリアトキシン又はジフテリアトキソイドである、請求項２８に記載の複合体。
【請求項３０】
前記細菌毒素又は細菌トキソイドがＣＲＭ１９７である、請求項２９に記載の複合体。
【請求項３１】
（ａ）請求項１２に記載の修飾莢膜糖を提供するステップ；
（ｂ）末端アノマーヒドロキシル基又は末端アノマーヒドロキシル基から誘導されるアミノ基を介してタンパク質に該修飾莢膜糖を結合体化するステップ、を含む、糖−タンパク質複合体を作製するためのプロセス。
【請求項３２】
（ａ）請求項１３に記載の修飾莢膜糖を提供するステップ；
（ｂ）酸化開裂によってビシナルであるヒドロキシル基の対の内の少なくとも１つをアルデヒド基に変換するステップ；及び
（ｃ）還元的アミノ化によって該修飾莢膜糖をタンパク質に連結するステップ、を含む、糖−タンパク質複合体を作製するためのプロセス。
【請求項３３】
前記タンパク質が、請求項２８〜３０のいずれか１項で定義される通りである、請求項３１または３２に記載のプロセス。
【請求項３４】
請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のプロセスによって得られた修飾糖の糖−タンパク質複合体。
【請求項３５】
式
【化２２】
0005637689.tif 000043
（式中、
Ｔは式（Ａ）又は（Ｂ）：
【化２３】
0005637689.tif 000044
であり；
ｎは、１から１００までの整数であり；
各Ｚ基は、ＯＨ又は式（Ｉａ）：−Ｏ−Ｘ−Ｙ  （Ｉａ）のブロック基から独立して選択され；
各Ｑ基は、ＯＨ又は式（Ｉａ）：−Ｏ−Ｘ−Ｙ  （Ｉａ）のブロック基から独立して選択され；
Ｗは、ＯＨ又は式（Ｉａ）：−Ｏ−Ｘ−Ｙ  （Ｉａ）のブロック基から選択され；
Ｌは、Ｏ、ＮＨ、ＮＥ、Ｓ又はＳｅであり；
ここでＬの遊離共有結合は、タンパク質担体に結合し；
及び該タンパク質担体は、細菌毒素又は細菌トキソイドであり；
及びＺ基の内の少なくとも１つ及び／又はＱ基の内の少なくとも１つは、式（Ｉａ）：−Ｏ−Ｘ−Ｙ  （Ｉａ）のブロック基であり、ここで、式（Ｉａ）において、
Ｘは、Ｃ（Ｏ）であり；
Ｙは、Ｒ３であり；
Ｒ３は、Ｃ１−６アルキル基である）の糖部分を含む分子であって、該糖の単糖の内の少なくとも８０％が、Ｚ基および／またはＱ基にブロック基を含む、分子。
【請求項３６】
式
【化２４】
0005637689.tif 000045
（式中、
Ｔは、式（Ａ）又は（Ｂ）：
【化２５】
0005637689.tif 000046
であり；
ｎは、１から１００までの整数であり；
各Ｚ基は、ＯＨ、ＯＡｃ又は式（Ｉａ）：−Ｏ−Ｘ−Ｙ  （Ｉａ）のブロック基から独立して選択され；
各Ｑ基は、ＯＨ、ＯＡｃ又は式（Ｉａ）：−Ｏ−Ｘ−Ｙ  （Ｉａ）のブロック基から独立して選択され；
Ｖは、−ＮＨ２、−ＮＨＥ、−ＮＥ１Ｅ２、Ｗ２又は−Ｏ−Ｄから選択され、ここでＥ、Ｅ１及びＥ２は、同一又は異なっていてよい窒素保護基であり、及びＤは、酸素保護基であり；
Ｗは、−ＯＨ又は式（Ｉａ）：−Ｏ−Ｘ−Ｙ  （Ｉａ）のブロック基から選択され；
Ｗ１は、−ＯＨ又は式（Ｉａ）：−Ｏ−Ｘ−Ｙ  （Ｉａ）のブロック基から選択され；ここで、式（Ｉａ）において、
Ｘは、Ｃ（Ｏ）であり；
Ｙは、Ｒ３であり；
Ｒ３は、Ｃ１−６アルキル基であり、
Ｚ基の内の少なくとも１つ及び／又はＱ基の内の少なくとも１つは式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）：
−Ｏ−Ｘ−Ｙ'  （ＩＩａ）      −Ｏ−Ｒ４  （ＩＩｂ）
であり、ここで式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）において、
Ｘは、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）又はＳＯ２であり；
Ｙ’は、ＮＲ２Ｒ４であり；
Ｒ２は、Ｈ又はＣ１−６アルキル基であり；及び
Ｒ４は、−Ｃ１−４アルキレン−ＣＨ（Ｏ）又は−Ｃ１−５アルキレン−ＮＨ−であり、ここで−ＮＨ−基はタンパク質担体の一部であり；
及び該タンパク質担体は、細菌毒素又は細菌トキソイドである）の糖を含む分子であって、該糖の単糖の内の少なくとも８０％が、Ｚ基および／またはＱ基にブロック基を含む、分子。
【請求項３７】
（ａ）請求項１〜１７および２６のいずれか１項に記載の糖と、（ｂ）薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項３８】
髄膜炎菌の血清群Ｃ、Ｗ１３５及びＹの内の１種以上に由来する糖抗原を更に含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
ワクチンアジュバントを更に含む、請求項３７又は請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記アジュバントがリン酸アルミニウムである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
髄膜炎菌に起因する疾患に対するワクチンである、請求項３７または３８に記載の組成物。
【請求項４２】
請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、哺乳類における抗体応答を惹起するための組成物。
【請求項４３】
１種以上の莢膜形成細菌に起因する疾患の予防又は治療のための医薬の製造における、請求項１〜１７又は２６のいずれか１項に記載の糖、又は請求項２７〜３０又は３４のいずれか１項に記載の複合体、又は請求項３５又は３６に記載の分子の使用。
【請求項４４】
前記疾患が細菌性髄膜炎である、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
請求項１〜１７又は２６のいずれか１項に記載の糖、又は請求項２７〜３０又は３４のいずれか１項に記載の複合体、又は請求項３５又は３６に記載の分子を含む、１種以上の莢膜形成細菌に起因する疾患の予防又は治療のための組成物。
【請求項４６】
前記疾患が細菌性髄膜炎である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
髄膜炎菌の血清群Ｃ、Ｗ１３５及びＹの内の１種以上に由来する糖抗原を更に含む、請求項４５または４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記糖抗原がオリゴ糖である、請求項４７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において引用される全ての文献は、その開示内容全体が参考として援用される。
【０００２】
本発明は、多糖類化学の分野におけるものであって、修飾糖類と、それらの調製方法と、結合体化誘導体とに関する。特に、本発明は、水中での安定性が向上した修飾糖類に関する。
【背景技術】
【０００３】
多糖類は、重要な生体分子であり、疾患の予防及び治療のための医薬品工業において広く使用されてきた。例えば、莢膜多糖は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）や、肺炎球菌（肺炎連鎖球菌）、Ｈｉｂ（インフルエンザ菌Ｂ型）等の莢膜形成細菌（ｃａｐｓｕｌａｔｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ）に対するワクチンにおいて長年使用されてきた。
【０００４】
特に小児におけるこれらの多糖類の免疫原性を高めるために、結合体化ワクチンが開発されてきた。これらは、担体タンパク質［例えば参考文献１、２、３（特許文献１、２、３）］に結合体化する莢膜多糖を含む。結合体化によって、Ｔ細胞非依存性抗原は、Ｔ細胞依存性抗原になり得る。
【０００５】
多くの種類の多糖類に関連する課題は、水中における安定性が低いことである。水中における多糖類の安定性は、糖単位を結合するＯ−グリコシド結合の性質に依存し得る。水中における安定性の低下は、Ｏ−グリコシド結合が酸又はグリコシダーゼの存在下で容易に加水分解されることによってもたらされる。血清群Ａ髄膜炎菌の莢膜多糖は、水中で安定性が低い多糖類の一例である。
【０００６】
多糖類の安定性は、結合体化ワクチンの製造における特定の課題である。多糖−タンパク質複合体を調製するためには、多糖がタンパク質と結合し得るように多糖上の化学官能基をマニピュレートする必要がある。これを行うための方法においては、多糖を、化学試薬、特に酸に曝露することによって、グリコシド結合の望ましくない切断と、それに伴う多糖の断片化とが生じる可能性がある。かかる断片化は非常に望ましくないことであり、それによって、多糖−タンパク質複合体の合成における収率の低下が引き起こされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４，７１１，７７９号明細書
【特許文献２】米国特許第４，７６１，２８３号明細書
【特許文献３】米国特許第４，８８２，３１７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように不安定である多糖類は、上記の課題を回避するために、一般的に慎重な試薬と条件との選択を必要とする。しかしながら、これによって、多糖類のマニピュレートに利用可能な試薬が限定され、しかるに多糖と担体タンパク質との間でなされ得る結合の範囲が限定される。更に、これらの多糖類の不安定性は、工業規模でのワクチンの調製に使用され得る確固たる手法の開発が困難であることを意味している。
【０００９】
参考文献４は、対応する未変性莢膜糖の単糖単位の内の少なくとも１つの上のヒドロキシル基の位置のブロック基を含む修飾莢膜糖を開示している。修飾莢膜糖は、加水分解安定性が向上していると言われている。本発明の目的は、加水分解安定性が向上した、別の、又は改善された修飾莢膜糖を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、特定のブロック基を有する莢膜糖類の単糖単位の上のヒドロキシル基の修飾によって安定性が向上するという発見に基づくものである。本発明の方法によって得られる修飾糖類は、それらの未変性の糖対応物よりも加水分解安定性が大きい。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
対応する未変性莢膜糖の単糖単位の内の少なくとも１つにヒドロキシル基の位置のブロック基を含む修飾莢膜糖であって、該ブロック基が式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）：
−Ｏ−Ｘ−Ｙ  （Ｉａ）      −Ｏ−Ｒ１  （Ｉｂ）
（式中、
Ｘは、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）又はＳＯ２であり；
Ｙは、ＮＲ１Ｒ２又はＲ３であり；
Ｒ１は、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基及びアミン基から独立して選択される１、２又は３個の基で置換されるＣ１−６アルキル基であり；
Ｒ２は、Ｈ又はＣ１−６アルキル基であり；
Ｒ３は、Ｃ１−６アルキル基である）である、修飾莢膜糖。
（項目２）
前記ブロック基が式（Ｉａ）である、項目１に記載の修飾莢膜糖。
（項目３）
ＸがＣ（Ｏ）である、項目２に記載の修飾莢膜糖。
（項目４）
ＹがＮＲ１Ｒ２である、項目２又は項目３に記載の修飾莢膜糖。
（項目５）
Ｒ２がＨである、項目４に記載の修飾莢膜糖。
（項目６）
Ｒ１が、１、２又は３個のヒドロキシル基で置換される、項目４又は項目５に記載の修飾莢膜糖。
（項目７）
Ｒ１が単一の基によって置換され、この置換がＣ１−６アルキル鎖の遠位端である、項目４〜６のいずれか１項に記載の修飾莢膜糖。
（項目８）
Ｒ１が２個のビシナルである基によって置換される、項目４〜６のいずれか１項に記載の修飾莢膜糖。
（項目９）
前記糖が、ａ）少なくとも１個のブロック基（ここでＲ１は単一の基によって置換され、この置換はＣ１−６アルキル鎖の遠位端である）；及びｂ）少なくとも１個のブロック基（ここでＲ１は、２個のビシナルである基によって置換される）を含む、項目４〜８のいずれか１項に記載の修飾莢膜糖。
（項目１０）
Ｒ１が単一の基で置換されるブロック基の、Ｒ１が２個のビシナルである基によって置換されるブロック基に対する比が９０：１０である、項目９に記載の修飾莢膜糖。
（項目１１）
ＹがＲ３である、項目２又は項目３に記載の修飾莢膜糖。
（項目１２）
Ｒ３がＣＨ３である、項目１１に記載の修飾莢膜糖。
（項目１３）
前記糖の単糖単位の少なくとも１０％がブロック基を有する、項目１〜１２のいずれか１項に記載の修飾莢膜糖。
（項目１４）
前記糖の全ての単糖単位がブロック基を有する、項目１〜１３のいずれか１項に記載の修飾莢膜糖。
（項目１５）
前記対応する未変性莢膜糖が、ホスホジエステル結合によって連結される単糖単位を含む、項目１〜１４のいずれか１項に記載の修飾莢膜糖。
（項目１６）
前記対応する未変性莢膜糖がＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ糖である、項目１５に記載の修飾莢膜糖。
（項目１７）
前記ブロック基が、前記対応するＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ糖の４位及び／又は３位のいずれかにある、項目１６に記載の修飾莢膜糖。
（項目１８）
前記ブロック基が、前記対応するＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ糖の４位のいずれかにある、項目１７に記載の修飾莢膜糖。
（項目１９）
前記修飾莢膜糖がオリゴ糖である、項目１〜１８のいずれか１項に記載の修飾莢膜糖。
（項目２０）
前記修飾糖が、末端アノマーヒドロキシル基又は末端アノマーヒドロキシル基から誘導されるアミノ基を含む、項目１〜１９のいずれか１項に記載の修飾莢膜糖。
（項目２１）
前記対応する未変性莢膜糖の２個のビシナルであるヒドロキシル基がブロック基を含有しない、前記修飾莢膜糖の少なくとも１つの単糖単位が存在する、項目１〜１９のいずれか１項に記載の修飾莢膜糖。
（項目２２）
前記糖の単糖単位の内の少なくとも１つが、Ｒ１が２個のビシナルであるヒドロキシル基によって置換されるブロック基を含む、項目１〜１９のいずれか１項に記載の修飾莢膜糖。
（項目２３）
式：
【化２０】
0005637689.tif 000002
（式中、
Ｔは式（Ａ）又は（Ｂ）：
【化２１】
0005637689.tif 000003
であり；
ｎは、１から１００までの整数であり；
各Ｚ基は、ＯＨ、ＯＡｃ又は項目１〜８又は１１〜１２で定義される通りのブロック基から独立して選択され；及び
各Ｑ基は、ＯＨ、ＯＡｃ又は項目１〜８又は１１〜１２で定義される通りのブロック基から独立して選択され；
Ｖは、−ＮＨ２、−ＮＨＥ、−ＮＥ１Ｅ２、Ｗ２又は−Ｏ−Ｄから選択され、ここでＥ、Ｅ１及びＥ２は、同一又は異なっていてよい窒素保護基であり、及びＤは、酸素保護基であり；
Ｗは、−ＯＨ又は項目１〜８又は１１〜１２のいずれか１項で定義される通りのブロック基から選択され；
Ｗ１は、−ＯＨ又は項目１〜８又は１１〜１２のいずれか１項で定義される通りのブロック基から選択され；
Ｗ２は、−ＯＨ又は項目１〜８又は１１〜１２のいずれか１項で定義される通りのブロック基から選択され；
及び、Ｚ基の少なくとも１個及び／又はＱ基の少なくとも１個が、項目１〜８又は１１〜１２で定義される通りのブロック基である）の糖。
（項目２４）
Ｚ基の少なくとも１０％がブロック基である、項目２３に記載の糖。
（項目２５）
ｎが１５〜２５の整数である、項目２３又は項目２４に記載の糖。
（項目２６）
Ｑ基の少なくとも１％がブロック基である、項目２３〜２５のいずれか１項に記載の糖。
（項目２７）
（ａ）単糖単位上に少なくとも１個のヒドロキシル基を有する莢膜糖を提供するステップ；及び
（ｂ）該少なくとも１個のヒドロキシル基を、項目１〜８又は１１〜１２で定義される通りのブロック基に変換するステップ、を含む、莢膜糖を修飾するためのプロセス。
（項目２８）
前記ブロック基が−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２であり、ステップ（ｂ）が、
（ｂ１）前記莢膜糖を有機溶媒中の二価性試薬と反応させるステップ；及び
（ｂ２）ステップ（ｂ１）の生成物を式（Ｉ）：
ＨＮＲ１Ｒ２  （Ｉ）
（式中、Ｒ１及びＲ２は、項目１〜８のいずれかで定義される通りである）のアミノ化合物と反応させるステップ、を含む、項目２７に記載のプロセス。
（項目２９）
前記ブロック基が−ＯＣ（Ｏ）Ｒ３であり、ステップ（ｂ）が、
（ｂ１）イミダゾール触媒の存在下で、前記莢膜糖を［（Ｒ３Ｃ（Ｏ）］２Ｏと反応させるステップを含む、項目２７に記載のプロセス。
（項目３０）
ステップ（ａ）における前記莢膜糖が莢膜オリゴ糖である、項目２８又は項目２９に記載のプロセス。
（項目３１）
前記莢膜オリゴ糖類が、該対応する未変性莢膜多糖の解重合及びサイジングによって取得可能である、項目３０に記載のプロセス。
（項目３２）
ステップ（ａ）における前記莢膜糖類が未変性莢膜多糖であり、前記プロセスが、ステップ（ｂ）の生成物がサイジングされ、それによって修飾莢膜オリゴ糖を提供するステップ（ｃ）を更に含む、項目３０に記載のプロセス。
（項目３３）
（ａ）未変性Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ多糖を提供するステップ；
（ｂ）該多糖の解重合及びサイジングを行ってオリゴ糖を提供するステップ；及び
（ｃ）該オリゴ糖の少なくとも１個のヒドロキシル基を、項目２７〜２９のいずれか１項に記載のブロック基に変換するステップ、を含む、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ多糖を修飾するためのプロセス。
（項目３４）
（ａ）未変性Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ多糖を提供するステップ；
（ｂ）該多糖の少なくとも１個のヒドロキシル基を、項目２７〜２９のいずれか１項に記載のブロック基に変換するステップ；
（ｃ）得られた多糖の解重合及びサイジングを行うステップ、を含む、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ多糖を修飾するためのプロセス。
（項目３５）
２個以上の単糖単位の間にグリコシド結合を形成することを含む全体的な合成プロセスである、項目１〜２６に記載の修飾莢膜糖を調製するためのプロセス。
（項目３６）
項目２７〜３５のいずれかに記載のプロセスによって取得可能な又は得られた修飾莢膜糖。
（項目３７）
項目１〜２６又は３６のいずれか１項に記載の修飾糖の糖−タンパク質複合体。
（項目３８）
前記タンパク質が細菌毒素又は細菌トキソイドである、項目３７に記載の複合体。
（項目３９）
前記細菌毒素又は細菌トキソイドがジフテリアトキシン又はジフテリアトキソイドである、項目３８に記載の複合体。
（項目４０）
前記細菌毒素又は細菌トキソイドがＣＲＭ１９７である、項目３９に記載の複合体。
（項目４１）
（ｃ）項目２０に記載の修飾莢膜糖を提供するステップ；
（ｄ）末端アノマーヒドロキシル基又は末端アノマーヒドロキシル基から誘導されるアミノ基を介してタンパク質に該修飾莢膜糖を結合体化するステップ、を含む、糖−タンパク質複合体を作製するためのプロセス。
（項目４２）
（ａ）項目２１に記載の修飾莢膜糖を提供するステップ；
（ｂ）酸化開裂によってビシナルであるヒドロキシル基の対の内の少なくとも１つをアルデヒド基に変換するステップ；及び
（ｃ）還元的アミノ化によって該修飾莢膜糖をタンパク質に連結するステップ、を含む、糖−タンパク質複合体を作製するためのプロセス。
（項目４３）
（ａ）項目２２に記載の修飾莢膜糖を提供するステップ；
（ｂ）酸化開裂によってビシナルであるヒドロキシル基の対の内の少なくとも１つをアルデヒド基に変換するステップ；及び
（ｃ）還元的アミノ化によって該修飾莢膜糖をタンパク質に連結するステップ、を含む、糖−タンパク質複合体を作製するためのプロセス。
（項目４４）
前記ブロック基内に存在するビシナルであるヒドロキシル基の全てがステップ（ｂ）においてアルデヒド基に変換される、項目４３に記載のプロセス。
（項目４５）
酸化開裂のための条件が、ステップ（ｂ）においてブロック基内に存在するある比率のビシナルであるヒドロキシル基だけがアルデヒド基に変換されるように選択される、項目４３に記載のプロセス。
（項目４６）
前記タンパク質が、項目３８〜４０のいずれか１項で定義される通りである、項目４１〜４５のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目４７）
項目４１〜４６のいずれかに記載のプロセスによって取得可能な又は得られた修飾糖の糖−タンパク質複合体。
（項目４８）
式
【化２２】
0005637689.tif 000004
（式中、
Ｔは式（Ａ）又は（Ｂ）：
【化２３】
0005637689.tif 000005
であり；
ｎは、１から１００までの整数であり；
各Ｚ基は、ＯＨ又は項目１〜８又は１１〜１２で定義される通りのブロック基から独立して選択され；及び
各Ｑ基は、ＯＨ又は項目１〜８又は１１〜１２で定義される通りのブロック基から独立して選択され；
Ｗは、ＯＨ又は項目１〜８又は１１〜１２で定義される通りのブロック基から選択され；
Ｌは、Ｏ、ＮＨ、ＮＥ、Ｓ又はＳｅであり；
ここでＬの遊離共有結合は、タンパク質担体に結合し；
及び該タンパク質担体は、項目３８〜４０のいずれか１項に定義される通りであり；
及びＺ基の内の少なくとも１つ及び／又はＱ基の内の少なくとも１つは、項目１〜８又は１１〜１２で定義される通りのブロック基である）の糖部分を含む分子。
（項目４９）
式
【化２４】
0005637689.tif 000006
（式中、
Ｔは、式（Ａ）又は（Ｂ）：
【化２５】
0005637689.tif 000007
であり；
ｎ、Ｚ、Ｑ、Ｗ、Ｗ１及びＶは、項目２３で定義される通りであり、Ｚ基の内の少なくとも１つ及び／又はＱ基の内の少なくとも１つは式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）：
−Ｏ−Ｘ−Ｙ'  （ＩＩａ）      −Ｏ−Ｒ４  （ＩＩｂ）
であり、
ここで
Ｘは、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）又はＳＯ２であり；
Ｙ’は、ＮＲ２Ｒ４であり；
Ｒ２は、Ｈ又はＣ１−６アルキル基であり；及び
Ｒ４は、−Ｃ１−４アルキレン−ＣＨ（Ｏ）又は−Ｃ１−５アルキレン−ＮＨ−であり、ここで−ＮＨ−基はタンパク質担体の一部であり；
及び該タンパク質担体は、項目３８〜４０のいずれか１項で定義されるタンパク質である）の糖を含む分子。
（項目５０）
（ａ）項目１〜２６又は３６のいずれか１項に記載の修飾糖及び／又は項目３７〜４０又は４７のいずれか１項に記載の糖−タンパク質複合体及び／又は項目４８又は４９に記載の分子と、（ｂ）薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
（項目５１）
髄膜炎菌の血清群Ｃ、Ｗ１３５及びＹの内の１種以上に由来する糖抗原を更に含み、該糖が、場合によりオリゴ糖であり、場合により担体タンパク質に結合体化する、項目５０に記載の組成物。
（項目５２）
ワクチンアジュバントを更に含む、項目５０又は項目５１に記載の組成物。
（項目５３）
前記アジュバントがリン酸アルミニウムである、項目５２に記載の組成物。
（項目５４）
髄膜炎菌に起因する疾患に対するワクチンである、項目５０〜５３のいずれか１項に記載の組成物。
（項目５５）
哺乳類に対して項目５０〜５４のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、該哺乳類における抗体応答を惹起するための方法。
（項目５６）
医薬として使用するための、項目１〜２６又は３６のいずれか１項に記載の修飾糖；項目３７〜４０又は４７のいずれか１項に記載の複合体；又は項目４８又は４９に記載の分子。
（項目５７）
１種以上の莢膜形成細菌に起因する疾患の予防又は治療のための医薬の製造における、項目１〜２６又は３６のいずれか１項に記載の修飾多糖、又は項目３７〜４０又は４７のいずれか１項に記載の複合体、又は項目４８又は４９に記載の分子の使用。
（項目５８）
前記疾患が細菌性髄膜炎である、項目５７に記載の使用。
【００１１】
故に、本発明は、対応する未変性莢膜糖の単糖単位の内の少なくとも１つの上のヒドロキシル基の位置のブロック基を含む修飾莢膜糖を提供するものである。ブロック基については、以下で定義される。本発明の修飾莢膜糖は、その未変性の糖対応物よりも加水分解安定性が大きい。好ましくは、本発明の修飾莢膜糖は、その未変性の糖対応物との免疫学的交差反応性を保持する。
【００１２】
また、本発明は、ブロック基を有する莢膜糖の修飾方法と、該修飾莢膜糖を含む糖−タンパク質複合体と、糖−タンパク質複合体の作製方法と、該修飾莢膜糖及び／又は糖−タンパク質複合体を含む医薬組成物と、その方法及び使用とを提供するものである。
【００１３】
本発明の修飾糖類
本発明は、対応する未変性莢膜糖の単糖単位の内の少なくとも１つの上のヒドロキシル基の位置のブロック基を含む修飾莢膜糖を提供するものである。該ブロック基は、式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）
−Ｏ−Ｘ−Ｙ  （Ｉａ）      −Ｏ−Ｒ１  （Ｉｂ）
（式中、
Ｘは、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）又はＳＯ２であり；
Ｙは、ＮＲ１Ｒ２又はＲ３であり；
Ｒ１は、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基及びアミン基から独立して選択される１、２又は３個の基で置換されるＣ１−６アルキル基であり；
Ｒ２は、Ｈ又はＣ１−６アルキル基であり；及び
Ｒ３は、Ｃ１−６アルキル基である）である。
【００１４】
好ましくは、該ブロック基は、式（Ｉａ）である。本実施形態においては、ＸがＣ（Ｏ）であることが好ましい。かかるカルバメート及びエステルブロック基は、グリコシド結合に対する安定効果を有しており、軽度の条件下で調製され得る。以下、カルバメート及びエステルブロック基を提供するために糖をマニピュレートする方法の例について説明する。しかしながら、本発明は、本明細書において例証される方法によって調製される修飾糖類に限定されるものではなく、本発明の修飾糖類を調製するための他の方法は、当業者に直ちに明らかであろう。
【００１５】
好ましくは、Ｒ２はＨである。
【００１６】
Ｒ１のＣ１−６アルキル基は、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基及びアミン基から独立して選択される１、２又は３個の基によって置換される。Ｃ１−６アルキル基が２又は３個の基で置換される場合、該置換は、同一の基又は異なる基によるものであってよいが、典型的には同一の基によるものである。好ましくは、Ｒ１のＣ１−６アルキル基は、１、２又は３個のヒドロキシル基で置換される。
【００１７】
Ｒ１は、Ｃ１−６アルキル鎖のいずれかの位置で置換され得る。好ましくは、少なくとも１つの置換は、Ｃ１−６アルキル鎖の末端に存在する。Ｃ１−６アルキル鎖が直鎖アルキル基である場合、このことは、Ｃ１−６アルキル基がＣｘで置換されることを意味し、ここでｘは、Ｃ１−６アルキル鎖中の炭素原子の総数である。同様に、Ｃ１−６アルキル鎖が分枝鎖アルキル基である場合、このことは、Ｃ１−６アルキル基が、分枝の内の１つ（典型的には最長の分枝）の末端で置換されることを意味する。
【００１８】
好ましい実施形態においては、Ｒ１は単一の基で置換されるが、この置換は、上記のようにＣ１−６アルキル鎖の末端で生じる。かかる基は、加水分解安定性の向上を得ることに特に有効である。好ましくは、該単一の基はヒドロキシル基である。故に、好ましい基としては、ヒドロキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル基、５−ヒドロキシペンチル基、６−ヒドロキシヘキシル基が挙げられる。特に好ましい基は、２−ヒドロキシエチル基である。
【００１９】
他の好ましい実施形態において、Ｒ１は、２個のビシナルである基（即ち、Ｃ１−６アルキル鎖に沿って隣接する位置の２個の基）によって置換される。かかる基は、加水分解安定性の向上を得ることに特に有効である。好ましくは、２個のビシナルである基は、Ｃ１−６アルキル鎖の末端にある。Ｃ１−６アルキル鎖が直鎖アルキル基である場合、このことは、２個のビシナルである基がＣｘ及びＣｘ−１であることを意味し、ここでｘは、Ｃ１−６アルキル鎖中の炭素原子の総数である。同様に、Ｃ１−６アルキル鎖が分枝鎖アルキル基である場合、このことは、２個のビシナルである基が、分枝の内の１つ（典型的には最長の分枝）の末端で置換されることを意味する。好ましくは、２個のビシナルである基はヒドロキシル基である。後述するように、かかる基は、担体分子への結合体化のための結合手を提供する。故に、好ましい基としては、１，２−ジヒドロキシエチル；１，２−ジヒドロキシプロピル及び２，３−ジヒドロキシプロピル；１，２−ジヒドロキシブチル、２，３−ジヒドロキシブチル及び３，４−ジヒドロキシブチル；１，２−ジヒドロキシペンチル、２，３−ジヒドロキシペンチル、３，４−ジヒドロキシペンチル及び４，５−ジヒドロキシペンチル；１，２−ジヒドロキシヘキシル、２，３−ジヒドロキシヘキシル、３，４−ジヒドロキシヘキシル、４，５−ジヒドロキシヘキシル及び５，６−ジヒドロキシヘキシルが挙げられる。上記したように、２個のビシナルである基がＣ１−６アルキル鎖の末端にあることが好ましい。故に、特に好ましい基としては、１，２−ジヒドロキシエチル、２，３−ジヒドロキシプロピル；３，４−ジヒドロキシブチル、４，５−ジヒドロキシペンチル及び５，６−ジヒドロキシヘキシルが挙げられる。特に好ましい基は、４，５−ジヒドロキシペンチルである。
【００２０】
幾つかの実施形態において、修飾莢膜糖は、（上記の通り）少なくとも２種のブロック基を含む。例えば、該糖は、ａ）少なくとも１個のブロック基（ここでＲ１は単一の基によって置換され、この置換は、（上記のように）Ｃ１−６アルキル鎖の末端で生じる）；及びｂ）少なくとも１個のブロック基（ここでＲ１は、（上記のように）２個のビシナルである基によって置換される）を含むことが好ましい。かかる混合ブロック基は、加水分解安定性の向上を得ることに特に有効である。更に、後述するように、Ｒ１が２個のビシナルであるヒドロキシル基によって置換される少なくとも１個のブロック基を含むことによって、担体分子への結合体化のための結合手が提供される。
【００２１】
好ましくは、Ｒ３はＣ１−Ｃ３アルキル基である。最も好ましくは、Ｒ３はＣ１アルキル基（ＣＨ３）であるが、Ｃ２アルキル基及びＣ３アルキル基もまた好ましい。
【００２２】
式：−Ｏ−Ｘ−Ｙ又は−Ｏ−Ｒ１のブロック基は、ハロゲン化アシル、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化スルホニル等とのヒドロキシル基の反応等の標準的な誘導体化手法によって、（例えば未変性分子内に見出される通りの）ヒドロキシル基から調製され得る。したがって、−Ｏ−Ｘ−Ｙの中の酸素原子は、好ましくはヒドロキシル基の酸素原子であるが、−Ｏ−Ｘ−Ｙの中の−Ｘ−Ｙ基は、好ましくはヒドロキシル基の水素原子と置換する。或いは、該ブロック基は、光延型置換等の置換反応を介して利用可能となり得る。ヒドロキシル基からブロック基を調製するこれらの及び他の方法は、よく知られている。
【００２３】
典型的には、本発明の修飾糖類はオリゴ糖類である。オリゴ糖類は、本明細書に記載の解重合方法及びサイジング方法のいずれかによって多糖類から得ることが可能である。
【００２４】
本発明の修飾莢膜糖類は、未変性の莢膜糖類から得ることができる。しかしながら、本発明は、未変性の莢膜糖類から得られる修飾糖類に限定されない。本発明の修飾莢膜糖類は、全合成や部分合成等の他の方法によって得ることが可能である（例えば、参考文献５参照）。
【００２５】
本発明の修飾莢膜糖類においては、ブロック基を有する単糖単位の数は変化し得る。好ましくは、修飾莢膜糖の単糖単位の全て又は実質的に全ては、ブロック基を有してよい。或いは、修飾莢膜糖の単糖単位の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％は、ブロック基を有してよい。修飾莢膜糖の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個の単糖単位は、ブロック基を有してよい。
【００２６】
修飾莢膜糖が少なくとも２種のブロック基を含む場合、各種のブロック基を有する単糖単位の数もまた変化し得る。例えば、あるタイプのブロック基が構成するブロック基の総数の、別のタイプのブロック基に対する比率は、変化し得る。特に、２種のブロック基が存在する場合、あるタイプのブロック基の、他のタイプのブロック基に対する比は、１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２及び１：１から選択され得る。特に上記の実施形態においては、該糖が、ａ）少なくとも１個のブロック基（ここでＲ１は単一の基で置換され、この置換はＣ１−６アルキル鎖の末端で生じる）；及び、ｂ）少なくとも１個のブロック基（ここでＲ１は２個のビシナルである基によって置換される）を含む場合、前者のタイプのブロック基の、後者のタイプのブロック基に対する比は、９９：１、９８：２、９７：３、９６：４、９５：５、９４：６、９３：７、９２：８、９１：９、９０：１０、８９：１１、８８：１２、８７：１３、８６：１４、８５：１５、８４：１６、８３：１７、８２：１８、８１：１９及び８０：２０から選択されることが好ましい。これらの比の中で、９５：５、９４：６、９３：７、９２：８、９１：９、９０：１０、８９：１１、８８：１２、８７：１３、８６：１４及び８５：１５が特に好ましい。これらの中では、９０：１０が好ましい。
【００２７】
同様に、単糖単位上のブロック基の数は、変化し得る。例えば、単糖単位上のブロック基の数は、１、２、３、４、５又は６個であり得、好ましくは１〜４個、より好ましくは１又は２個、最も好ましくは１個である。
【００２８】
一実施形態において、ブロック基を有する少なくとも１個の単糖単位は、非末端単糖単位を含む。「非末端単糖単位」という用語は、オリゴ糖／多糖鎖の末端単糖単位の内の１つではない単糖単位を意味する。
【００２９】
本発明は、末端単糖単位及び非末端単糖単位の全てのヒドロキシル基位置がブロック基を有する修飾莢膜糖類を包含する。しかしながら、幾つかの好ましい実施形態においては、本発明の修飾莢膜糖類の中に少なくとも１個の遊離ヒドロキシル基又はアミノ基がある。後述するように、遊離ヒドロキシル基又はアミノ基は、修飾莢膜糖の更なる反応のための、例えば担体分子への結合体化のための結合手を提供するので、有利である。該修飾糖は、遊離ヒドロキシル基を含む場合、アノマーヒドロキシル基、特に末端アノマーヒドロキシル基であってよい。該修飾糖は、アミノ基を含有する場合、アノマーヒドロキシル基から誘導され得る。アミノ基は、（例えば、ＮａＢＨ３ＣＮ／ＮＨ４Ｃｌを使用して）還元的アミノ化によってアノマーヒドロキシル基から容易に利用可能である。同様に、他の好ましい実施形態においては、修飾莢膜糖の少なくとも１個の単糖単位が、対応する未変性莢膜糖の２個のビシナルであるヒドロキシル基がブロック基を含まない場合に存在する。好ましくは、このようにして、単糖単位の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％が２個のビシナルであるヒドロキシル基を有する。例えば、このようにして、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個の単糖単位が２個のビシナルであるヒドロキシル基を有する。好ましくは、単糖単位の５〜１５％の間、最も好ましくは１０％が、このようにして、２個のビシナルであるヒドロキシル基を有する。後述するように、単糖単位の中の２個のビシナルであるヒドロキシル基は、担体分子への結合体化のための結合手を提供するので、有利である。
【００３０】
或いは、幾つかの好ましい実施形態においては、上記の通り、修飾莢膜糖の単糖単位の内の少なくとも１個或いは少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％がブロック基を有し、ここでＲ１は２個のビシナルであるヒドロキシル基によって置換される。例えば、修飾莢膜糖の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個の単糖単位は、かかるブロック基を有することができる。好ましくは、修飾莢膜糖の単糖単位の５〜１５％の間、最も好ましくは１０％がブロック基を有し、ここでＲ１は２個のビシナルであるヒドロキシル基によって置換される。再度、後述するように、単糖単位の中の２個のビシナルであるヒドロキシル基は、担体分子への結合体化のための結合手を提供するので有利である。
【００３１】
有効なブロック基が電子吸引性基であることは、参考文献４において示唆されている。理論に束縛されるものではないが、グリコシド結合は、グリコシド結合上の糖ヒドロキシル基の分子内求核攻撃からの助力によって（即ち環状中間体の形成によって）加水分解に不安定であると考えられる。ヒドロキシル基の求核性がより大きいほど、分子内求核攻撃の傾向がより大きくなる。電子吸引性ブロック基は、酸素の非共有電子対を非局在化し、それによって酸素求核性を低下させ、分子内求核攻撃の傾向を低下させる効果を有する。意外にも、ブロック基の中の求核性のヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はアミン基の存在にもかかわらず、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基及びアミン基から独立して選択される１、２又は３個の基によって置換されたＣ１−６アルキル基を含む基が有効なブロック基である可能性があるということが見出されている。更に、これらのヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はアミン基で置換された基は、担体分子への修飾莢膜糖のより効果的な結合体化を可能にするため、有利である。理論に束縛されるものではないが、この効果は、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基及びアミン基から独立して選択される１、２又は３個の基によって置換されたＣ１−６アルキル基を含む基の相対的親水性に起因すると考えられる。更に、該ブロック基が、２個のビシナルであるヒドロキシル基によって置換されたＣ１−６アルキル基を含む場合、該ブロック基自体は、担体分子への結合体化のための結合手を提供する。
【００３２】
上記の全ての実施形態において、該修飾莢膜糖は、好ましくはリン酸ジエステル結合を有する修飾莢膜糖である。より好ましくは、該修飾莢膜糖は、修飾Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ糖である。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ糖は、特に加水分解に不安定である。
【００３３】
該修飾莢膜糖が修飾Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ糖である場合、該ブロック基は、好ましくは対応するＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ糖の４位及び／又は３位、より好ましくは４位にある。４位及び／又は３位のＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ糖におけるブロック基が特に加水分解に対する安定性の向上に有効であることを示した。
【００３４】
エステルブロック基による実施形態において（即ち、ブロック基が式（Ｉａ）であり、ＸがＣ（Ｏ）であり、及びＹがＲ３である場合）、本発明者らは、修飾Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ糖の安定性が、ブロック基を有する４位及び／又は３位の比率に影響されることを明らかにした。例えば、ブロック基を有する４位の比率は、約０％、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は約１００％であってよく、少なくとも３０％及び約１００％であることが好ましい。同様に、ブロック基を有する３位の比率は、約０％、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は約１００％であってよく、少なくとも９５％及び約１００％であることが好ましい。典型的には、ブロック基を有する４位及び３位の比率は各位置でほぼ同じである。換言すれば、ブロック基を有する３位に対するブロック基を有する４位の比は、約１：１である。しかしながら、幾つかの実施形態においては、ブロック基を有する３位に対するブロック基を有する４位の比率は変化し得る。例えば、ブロック基を有する３位に対するブロック基を有する４位の比は、１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３又は１：２であってよい。同様に、ブロック基を有する４位に対するブロック基を有する３位の比は、１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３又は１：２であってよい。
【００３５】
本発明はまた、式：
【００３６】
【化１】
0005637689.tif 000008
（式中、
Ｔは式（Ａ）又は（Ｂ）：
【００３７】
【化２】
0005637689.tif 000009
であり；
ｎは、１から１００までの整数であり；
各Ｚ基は、−ＯＨ、ＯＡｃ又は上記記載の通りのブロック基から独立して選択され；
各Ｑ基は、−ＯＨ、ＯＡｃ又は上記記載の通りのブロック基から独立して選択され；
Ｖは、−ＮＨ２、−ＮＨＥ、−ＮＥ１Ｅ２、Ｗ２又は−Ｏ−Ｄから選択され、ここでＥ、Ｅ１及びＥ２は、同一又は異なっていてよい窒素保護基であり、及びＤは、酸素保護基であり；
Ｗは、−ＯＨ又は上記記載の通りのブロック基であり；
Ｗ１は、−ＯＨ又は上記記載の通りのブロック基であり；
Ｗ２は、−ＯＨ又は上記記載の通りのブロック基であり；
及び、Ｚ基の少なくとも１個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個）及び／又はＱ基の少なくとも１個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個）は、上記記載の通りのブロック基である）の糖を提供するものである。
【００３８】
好ましくは、ｎは１５から２５までの整数である。
【００３９】
ｎ＋２個のＺ基の各々は、それぞれ同一又は異なっていてよい。同様に、ｎ＋２個のＱ基は、それぞれ同一又は異なっていてよい。
【００４０】
Ｖは、好ましくは−ＮＨ２又は−ＮＨＥである。
【００４１】
適切な窒素保護基としては、シリル基（例えば、ＴＭＳ、ＴＥＳ、ＴＢＳ、ＴＩＰＳ等）、アシル誘導体（例えば、トリフルオロアセトアミド、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ又はＣｂｚ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）等）、スルホニル誘導体（例えば、β−トリメチルシリルエタンスルホニル（ＳＥＳ）等）、スルフェニル誘導体、Ｃ１−１２アルキル基、ベンジル基、ベンズヒドリル基、トリチル基、アリル基、９−フェニルフルオレニル基等がある。好ましい窒素保護基は、Ｆｍｏｃである。
【００４２】
Ｅ１Ｅ２として使用され得る二価の窒素保護基としては、
環状イミド誘導体（例えば、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−ジチアスクシンイミド、Ｎ−２，３−ジフェニルマレイミド等）、イミン誘導体（例えば、Ｎ−１，１−ジメチルチオメチレンアミン、Ｎ−ベンジリデンアミン、Ｎ−ｐ−メトキシベンジリデンアミン、Ｎ−ジフェニルメチレンアミン等）、エナミン誘導体（例えば、Ｎ−（５，５−ジメチル−３−オキソ−１−シクロヘキセニル）アミン等）等が挙げられる。好ましい二価の窒素保護基は、Ｎ−フタルイミジルである。
【００４３】
適切な酸素保護基としては、エステル、エーテル（例えば、シリルエーテルやアルキルエーテル）、アセタールが挙げられる。具体例としては、アリル、アセチル、Ａｌｏｃ、ベンジル、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、ｔ−ブチル、トリチル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、パラメトキシベンジル（ＰＭＢ）、ＭＥＭ、メトキシメチル（ＭＯＭ）、ＭＴＭ、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）が挙げられる。
【００４４】
全てのＺ基は、ＯＨ（ブロック基であるＺ基の内の少なくとも１つ及び／又はＱ基の内の少なくとも１つの影響を受けやすい）であってよい。ＯＨである全てのＺ基に代えて、Ｚ基の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％は、ＯＡｃであってよい。好ましくは、Ｚ基の約６０〜９０％がＯＡｃであり、Ｚ基の残部がＯＨ又は上記記載の通りのブロック基である。好ましくは、Ｚ基の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％又は４０％がブロック基であり、６０〜９０％がＯＡｃであり、残部がＯＨである。好ましくは、Ｚ基の約１０〜４０％がブロック基であり、６０〜９０％がＯＡｃであり、残部がＯＨである。或いは、Ｚ基の約０％、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は約１００％がブロック基であり、少なくとも９５％及び約１００％であることが好ましい。
【００４５】
全てのＱ基は、ＯＨ（ブロック基であるＺ基及び／又はＱ基の内の少なくとも１つの影響を受けやすい）であってよい。或いは、Ｑ基の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％又は２０％は、ＯＡｃであってよい。好ましくは、Ｑ基の約１〜２０％がＯＡｃであり、残部がＯＨ又は上記記載の通りのブロック基である。好ましくは、Ｑ基の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％で、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％がブロック基であり、１〜２０％がＯＡｃであり、残部がＯＨである。好ましくは、Ｑ基の約８０〜９９％がブロック基であり、１〜２０％がＯＡｃであり、残部がＯＨである。或いは、Ｑ基の約０％、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は約１００％がブロック基であり、少なくとも３０％及び約１００％であることが好ましい。
【００４６】
また、本発明は、式
【００４７】
【化３】
0005637689.tif 000010
（式中、
Ｔは、式（Ａ）又は（Ｂ）：
【００４８】
【化４】
0005637689.tif 000011
であり；
ｎ、Ｚ、Ｑ及びＷは、上記で定義された通りであり；Ｚ基の内の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０）及び／又はＱ基の内の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０）がブロック基であり；及びＬは、Ｏ、ＮＨ、ＮＥ、Ｓ又はＳｅである）の糖部分を含む分子を提供するものである。
【００４９】
Ｌの遊離（ｆｒｅｅ）共有結合は、任意の適切な部分、例えば、−Ｈ−Ｅ、リンカー、タンパク質担体等に結合し得る。Ｌは、好ましくはＮ又はＯである。また、ＬはＮであることが可能でり、二価のリンカー、二価の保護基又は二価のタンパク質担体に結合する。
【００５０】
ｎ、Ｚ、Ｑ及びＷ基の好ましい本性は、上に記載される。
【００５１】
また、本発明は、式
【００５２】
【化５】
0005637689.tif 000012
（式中、
Ｔは、式（Ａ）又は（Ｂ）：
【００５３】
【化６】
0005637689.tif 000013
であり；
ｎ、Ｚ、Ｑ、Ｗ、Ｗ１及びＶは、上記で定義された通りであり、Ｚ基の内の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０）及び／又はＱ基の内の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０）が式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）：
−Ｏ−Ｘ−Ｙ'  （ＩＩａ）      −Ｏ−Ｒ４  （ＩＩｂ）
（式中、
Ｘは、上記で定義された通りであり；
Ｙ’は、ＮＲ２Ｒ４であり；
Ｒ２は、上記で定義された通りであり；及び
Ｒ４は、−Ｃ１−４アルキレン−ＣＨ（Ｏ）又は−Ｃ１−５アルキレン−ＮＨ−であり、ここで−ＮＨ−基はタンパク質担体の一部である）である）の糖を含む分子を提供するものである。
【００５４】
好ましくは、該少なくとも１個のＺ基及び／又はＱ基は、式（ＩＩａ）である。本実施形態においては、ＸがＣ（Ｏ）であることが好ましい。
【００５５】
好ましいＲ２基については、式（Ｉａ）に関して、上で記載される。
【００５６】
好ましいＲ４基としては、−Ｃ１アルキレン−ＣＨ（Ｏ）、−Ｃ２アルキレン−ＣＨ（Ｏ）、−Ｃ３アルキレン−ＣＨ（Ｏ）、−Ｃ４アルキレン−ＣＨ（Ｏ）が挙げられる。特に好ましいＲ４基は、−Ｃ３アルキレン−ＣＨ（Ｏ）である。
【００５７】
他の好ましいＲ４基としては、−Ｃ１アルキレン−ＮＨ−、−Ｃ２アルキレン−ＮＨ−；−Ｃ３アルキレン−ＮＨ−、−Ｃ４アルキレン−ＮＨ−、−Ｃ５アルキレン−ＮＨ−が挙げられる。特に好ましいＲ４基は、−Ｃ４アルキレン−ＮＨ−である。
ｎ、Ｚ、Ｑ、Ｗ、Ｗ１及びＶ基の好ましい本性は、上で記載される。
【００５８】
修飾糖の製造方法。
【００５９】
本発明は、
（ａ）単糖単位上に少なくとも１個のヒドロキシル基を有する莢膜糖を提供するステップ；及び
（ｂ）該少なくとも１個のヒドロキシル基をブロック基に変換するステップ、を含む、莢膜糖の修飾方法を提供する。
【００６０】
該ブロック基は、上で定義されたブロック基のいずれかである。
【００６１】
該莢膜糖は、未変性の莢膜糖（オリゴ糖又は多糖）であってよい。代わりとして、該莢膜糖は、例えば、脱−Ｏ−アセチル化莢膜糖及び／又は末端アミノ基を有する莢膜糖（例えば、還元的アミノ化によって得られるもの）。
【００６２】
ブロック基が−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２である糖を修飾するための好ましい方法は、ステップ（ｂ）が、
（ｂ１）莢膜糖類を有機溶媒中の二価性試薬と反応させるステップ；及び
（ｂ２）ステップ（ｂ１）の生成物を式（ＩＩＩ）：
ＨＮＲ１Ｒ２  （ＩＩＩ）
（式中、Ｒ１及びＲ２は上記記載の通りである）のアミノ化合物と反応させるステップ、を含む場合である。
【００６３】
「二価性試薬」という用語は、（ｉ）ステップ（ｂ１）において、該糖上のヒドロキシル基との結合のための第１の求電子性炭素原子を提供する；及び（ｉｉ）ステップ（ｂ２）において使用されるアミノ基との結合のための第２の求電子性炭素原子を提供する、という二重機能を行うことができる任意の試薬を意味する。一般的に、第２の求電子性炭素原子は、ステップ（ｂ）の間に第１の求電子性炭素原子から再生成される。該二価性試薬によって、多糖とアミノ化合物との間に−Ｃ（Ｏ）−結合が形成される。
【００６４】
本発明に使用される二価性試薬としては、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、カルボニルジ−１，２，４−トリアゾール（ＣＤＴ）、カルボニルジ−１，２，３−ベンゾトリアゾール（ＣＤＢ）、ジフェニルカーボネート、臭化シアン、ホスゲン、トリホスゲンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。当業者は、これらと同じ機能を行うことが可能な他の二価性試薬を知っているであろう。
【００６５】
好ましい二価性試薬は、ＣＤＩである。ＣＤＩには、例えばホスゲンや臭化シアンよりも穏やかな試薬であるという長所がある。特に、ＣＤＩを使用するカップリング反応によって、ＨＣｌやＨＢｒ等のハロゲン化水素酸ガスは生成されない。ＨＣｌガスやＨＢｒガスの生成は、これらの気体によって、大気中へのそれらのガスの漏出を回避するために反応室排出口の洗浄が必要となるので、望ましくない。更に、ＨＣｌガス又はＨＢｒガスの生成は、該糖上の感受性が高い官能基に影響を及ぼす可能性があり、それによって、糖の分解又は断片化による収率の低下が生じる。
【００６６】
ステップ（ｂ１）で使用する有機溶媒は、好ましくは非プロトン性溶媒である。非プロトン性溶媒は、当業者によく知られており、いかなるイオン化水素原子も含むものではない。これらの溶媒は、ヒドロキシル基の求核性を高めることによって、二価性試薬との糖上のヒドロキシル基の反応を容易にするため、有利である。適切な非プロトン性溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ホルムアミド、ヘキサメチルリン酸トリアミド（ＨＭＰＴ）、１，３ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＤＭＳＯが好ましい。
【００６７】
本発明の方法のステップ（ｂ２）において、ステップ（ｂ１）の生成物は、アミノ化合物と反応して修飾多糖を形成する。上記記載の通り、本発明の方法において使用されるアミノ化合物は、式（ＩＩＩ）である。
【００６８】
本発明で使用され得る適切なアミノ化合物は、Ｒ１とＲ２によって決まる。上記のように、他の好ましい実施形態において、Ｒ１は単一のヒドロキシル基によって置換され（この置換はＣ１−６アルキル鎖の末端で生じる）、Ｒ２はＨである。故に、本発明で使用され得る好ましいアミノ化合物としては、アミノメタノール、２−アミノエタノール、３−アミノプロパン−１−オール、４−アミノブタン−１−オール、５−アミノペンタン−１−オール、６−アミノヘキシル−１−オールが挙げられる。特に好ましいアミノ化合物は、２−アミノエタノールである。他の好ましい実施形態においては、Ｒ１は２個のビシナルであるヒドロキシル基によって置換され、且つ、Ｒ２はＨである。故に、本発明で使用され得る好ましいアミノ化合物としては、１−アミノエタン−１，２−ジオール；１−アミノプロパン−１，２−ジオール及び３−アミノプロパン−１，２−ジオール；１−アミノブタン−１，２−ジオール、１−アミノブタン−２，３−ジオール及び４−アミノブタン−１，２−ジオール；１−アミノペンタン−１，２−ジオール、１−アミノペンタン−２，３−ジオール、５−アミノペンタン−２，３−ジオール及び５−アミノペンタン−１，２−ジオール；１−アミノヘキサン−１，２−ジオール、１−アミノヘキサン−２，３−ジオール、５−アミノヘキサン−３，４−ジオール、６−アミノヘキサン−２，３−ジオール及び６−アミノヘキサン−１，２−ジオールが挙げられる。特に好ましい実施形態において、Ｒ１は、Ｃ１−６アルキル鎖の末端で、２個のビシナルであるヒドロキシル基によって置換される。故に、本発明で使用され得る好ましいアミノ化合物としては、３−アミノプロパン−１，２−ジオール、４−アミノブタン−１，２−ジオール、５−アミノペンタン−１，２−ジオール、６−アミノヘキサン−１，２−ジオールが挙げられる。特に好ましいアミノ化合物は、５−アミノペンタン−１，２−ジオールである。これらは、塩の形態（例えば塩酸塩）で使用され得る。
【００６９】
本発明の好ましい方法は、下記の模式図１において例示される。
【００７０】
【化７】
0005637689.tif 000014
この模式図において、糖（例えば、ＭｅｎＡ多糖やオリゴ糖）は、まず、ＤＭＳＯ溶媒内のＣＤＩを使用して、単糖単位上のそのヒドロキシル基の内の少なくとも１つによって活性化される。それによって生じるイミダゾールカルバメート中間体は、アミンＲ１Ｒ２ＮＨ（例えば２−アミノエタノール）によって捕捉されて、修飾糖が得られる。
【００７１】
或いは、修飾糖は、莢膜糖上の一個以上のヒドロキシル基を式：ＸＣ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２（式中、Ｘは脱離基であり、且つ、Ｒ１及びＲ２は、上で定義された通りである）の試薬と反応させることによって一段階過程において調製され得る。適切な脱離基としては、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＣＦ３、−ＯＣ６Ｆ５、−ＣＣｌ３が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７２】
ブロック基が−ＯＣ（Ｏ）Ｒ３である糖を修飾するための好ましい方法は、ステップ（ｂ）が、
（ｂ１）イミダゾール触媒の存在下で［（Ｒ３Ｃ（Ｏ）］２Ｏと莢膜糖を反応させるステップ、を含む場合である。
【００７３】
この方法は、ブロック基が−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３である糖を修飾することに特に適切である。本実施形態において、ステップ（ｂ）は、
（ｂ１）イミダゾール触媒の存在下で莢膜糖を［（ＣＨ３Ｃ（Ｏ）］２Ｏ（無水酢酸）と反応させるステップ、を含む。
【００７４】
或いは、本発明の修飾莢膜糖類は、例えば適切な単糖単位から、合成手段によって調製され得る。典型的には、修飾莢膜糖の全合成は、適切な単糖単位の間にグリコシド結合（例えばリン酸ジエステル結合）を形成することと、次いで得られた糖を上記記載の任意の方法で修飾することとを含む。或いは、同一の修飾莢膜糖を得るために、単糖単位は、グリコシド結合を形成する前に修飾され得る。
【００７５】
本発明の修飾莢膜糖類は、好ましくはオリゴ糖類である。未変性の莢膜多糖類から開始する場合、修飾莢膜オリゴ糖類は、２つの方法：
（１）莢膜多糖を修飾し、その後修飾多糖の解重合及びサイジングを行って修飾オリゴ糖を形成すること；又は（２）莢膜多糖の解重合及びサイジングを行って、その後得られたオリゴ糖を修飾して修飾オリゴ糖を形成すること、のいずれかによって得ることが可能である。両方法は、本発明の中に包含される。しかしながら、第１の方法は、この方法によって、タンパク質等の担体分子への修飾オリゴ糖の結合体化を引き続いて行うために末端のヒドロキシル基を利用し得ることが確実にされることから、特定の実施形態において好ましい。
【００７６】
また、本発明は、
（ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ多糖を提供するステップ；
（ｂ）該多糖の解重合及びサイジングを行ってオリゴ糖を提供するステップ；及び
（ｃ）該オリゴ糖の少なくとも１個のヒドロキシル基を上記の通りのブロック基に変換するステップ、を含む、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ多糖の修飾方法を提供するものである。
【００７７】
この方法のステップ（ｂ）の後、ステップ（ｃ）の前に既知の誘導体化ステップを任意に行ってよい。既知の誘導体化ステップとしては、例えば、還元的アミノ化を行い、その後、生じた−ＮＨ２基の保護及び／又は脱−Ｏ−アセチル化を行うことが挙げられる。
【００７８】
また、本発明は、
（ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ多糖を提供するステップ；
（ｂ）該多糖の少なくとも１個のヒドロキシル基を上記の通りのブロック基に変換するステップ；
（ｃ）それによって生じた多糖の解重合及びサイジングを行ってオリゴ糖を提供するステップ、を含む、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ多糖の修飾方法を提供するものである。
【００７９】
この方法のステップ（ｃ）の後、既知の誘導体化ステップを任意に行ってよい。既知の誘導体化ステップとしては、例えば、還元的アミノ化を行い、その後、生じた−ＮＨ２基の保護及び／又は脱−Ｏ−アセチル化を行うことが挙げられる。
【００８０】
上記の方法の内のいずれかを行った後、混入物（例えば低分子量混入物）を除去するステップを行ってよい。
【００８１】
莢膜糖出発材料
本発明の修飾莢膜糖類は、未変性莢膜糖類から得ることが可能である。「未変性莢膜糖」という用語は、髄膜炎菌、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌等の細菌（グラム陽性及びグラム陰性の両方）の莢膜内に見出され得る糖含有ポリマー（例えば、糖類や、糖酸、アミノ糖、多価アルコール、糖アルコール、糖リン酸のポリマー等）を意味する。更に、「未変性莢膜糖」は、多糖類及びオリゴ糖類の両方を包含する。未変性莢膜オリゴ糖類は、未変性多糖類の解重合及びサイジングによって得ることが可能である。
【００８２】
未変性莢膜糖の「ヒドロキシル基の位置」とは、ヒドロキシル基を有する未変性莢膜糖上の位置である。しかしながら、それは、ヒドロキシル基（例えば、ヒドロキシル基の位置を占めないリン酸塩結合の一部であるヒドロキシル基）を有するグリコシド結合又はその残基における位置を含まない。また、それは、未変性莢膜糖上にアセトキシ基（ＡｃＯ）が存在する位置も含まず、ヒドロキシル基の位置でもない。
【００８３】
未変性莢膜糖は、ホスホジエステル結合によって連結される糖単位を含むことができる。ホスホジエステル結合を含む糖は、加水分解に不安定であってよい。
【００８４】
未変性莢膜糖及び本発明の修飾莢膜糖は、哺乳類（例えばヒト）において、好ましくは免疫原性である。該哺乳類は、ヒト成人又は子供であってよい。
【００８５】
未変性莢膜糖は、好ましくは、髄膜炎菌（血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙ等）、肺炎連鎖球菌（血清タイプ１、４、５、６Ｂ、９Ｖ、１４，１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ等）、インフルエンザ菌Ｂ型、ナイセリアゴノロエエ、ストレプトコッカス−アガラクティエ、大腸菌、チフス菌、ストレプトコッカス−ミュータンス、クリプトコックス・ネオフォルマンス、モラクセラカタラーリス、肺炎桿菌、黄色ブドウ球菌及び／又は緑膿菌に由来する多糖（又はそのオリゴ糖断片）である。
【００８６】
本発明は、髄膜炎菌の任意の血清群に適用され得るが、血清群Ａ（「ＭｅｎＡ」）に由来する莢膜糖を使用することが好ましい。ＭｅｎＡ莢膜糖は、特に水溶液中で不安定であるが、このことは、この分子上における化学的マニピュレート（例えば、担体タンパク質への結合体化）を行うために特殊な手法を使用する必要があることを意味する。しかしながら、本発明に従って修飾されたＭｅｎＡ糖は、有利には水溶液中で安定であることが分かる。
【００８７】
ＭｅｎＡ莢膜多糖｛→６）−Ｄ−ＭａｎｐＮＡｃ（３／４ＯＡｃ）−α−（１→ＯＰＯ３→｝は、以下に示される反復単位を有するα１−６ホスホジエステル結合によって共に連結されるＮ−アセチルマンノサミン残基から構成される。
【００８８】
【化８】
0005637689.tif 000015
上記の定義によれば、４位の約８０〜９９％はヒドロキシル基位置であり、３位の約１０〜４０％はヒドロキシル基位置である。また、末端１−ヒドロキシ基は、ヒドロキシル基位置を占める。末端１−ヒドロキシ基は、末端アノマーヒドロキシル基である。−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−基の一部であるヒドロキシル基は、ヒドロキシル基位置ではない。
【００８９】
糖−タンパク質複合体
本発明の修飾糖類は、糖類に適用される任意の通常の下流の処理（例えば、誘導体化、結合体化、断片化等）に供され得る。免疫原性を高めるために、本発明の修飾糖類は、好ましくは担体タンパク質に結合体化される。担体タンパク質への結合体化は、特に小児科ワクチンに有用であり［６］、よく知られた技法である［例えば、参考文献７〜１５等において概説される］。多糖はタンパク質に直接連結され得るか［２、１６］、若しくはリンカー基を介して連結され得る。多くの異なるタイプのリンカー基は、多糖類をタンパク質に連結するために提案されてきたものである［例えば、３、１７］。
【００９０】
しかるに、本発明は、タンパク質と本発明の修飾糖との複合体を提供するものである。タンパク質は直接糖に結合体化され得るか、若しくはリンカーが使用され得る。任意の適切なリンカー化学が使用され得る。修飾多糖の安定性を向上することによって、有利には広範囲にわたる結合が使用され得る。
【００９１】
上記の通り、幾つかの実施形態において、修飾莢膜糖は、担体タンパク質への次の結合のための結合手として使用され得る少なくとも１個の遊離ヒドロキシル基又はアミノ基を有することが好ましい。
【００９２】
遊離ヒドロキシル基を有する修飾莢膜糖は、莢膜糖上のヒドロキシル基を選択的にブロックすることによってか、若しくは全てのヒドロキシル基がブロックされる修飾莢膜糖を選択的に非ブロック化することによって得られ得る。或いは、遊離ヒドロキシル基は、修飾莢膜糖の解重合及びサイジングによって出現する。好ましくは、該少なくとも１個の遊離ヒドロキシル基は、末端アノマーヒドロキシル基である。末端アノマーヒドロキシル基は、修飾莢膜糖の解重合及びサイジングによって出現し得るため、末端アノマーヒドロキシル基は、遊離ヒドロキシル基として好ましい。
【００９３】
遊離アミノ基を有する修飾莢膜糖は、末端アノマーヒドロキシル基の還元的アミノ化を行い、その後、得られた−ＮＨ２基を任意に保護することによって得られ得る。還元的アミノ化反応は、本発明の修飾ステップの前又は後に行われ得る。好ましくは、還元的アミノ化は、得られた−ＮＨ２基がヒドロキシル基／ブロック基の存在下で選択的に保護／脱保護され得ることから、本発明の修飾ステップの前に行われる。
【００９４】
例えば、本発明は、
（ａ）本発明の修飾莢膜糖を提供するステップであって、該修飾糖が、末端アノマーヒドロキシル基又は末端アノマーヒドロキシル基から誘導されるアミノ基を含む、ステップ；及び
（ｂ）末端アノマーヒドロキシル基又は末端アノマーヒドロキシル基から誘導されるアミノ基を介してタンパク質に修飾莢膜糖類を連結するステップ、を含む、糖−タンパク質複合体の作製方法を提供するものである。
【００９５】
該タンパク質は、好ましくは細菌毒素又は細菌トキソイド、特にジフテリアトキシン又はジフテリアトキソイドである。例えば、タンパク質は、好ましくはＣＲＭ１９７である。
【００９６】
リンカー基を介した結合は、任意の既知の手法、例えば、参考文献３及び１７に記載の手法を使用して形成され得る。好ましいタイプの結合はカルボニルリンカーであり、それは、修飾糖の遊離ヒドロキシル基をＣＤＩ［１８、１９］と反応させ、その後タンパク質と反応させてカルバメート結合を形成することによって形成され得る。別の好ましいタイプの結合はアジピン酸リンカーであり、それは、（例えば、ジイミド活性化を使用して）修飾糖上の遊離−ＮＨ２基をアジピン酸と結合し、次いで得られた糖−アジピン酸中間体にタンパク質を結合することによって得られ得る［１１、２０、２１］。他のリンカーとしては、Ｂ−プロピオンアミド［２２］、ニトロフェニル−エチルアミン、［２３］、ハロアシルハライド［２４］、グリコシド結合［２５］、６−アミノカプロン酸［２６］、ＡＤＨ［２７］、Ｃ４〜Ｃ１２部分［２８］等が挙げられる。
【００９７】
結合体化は、１次ヒドロキシル基へのアノマー末端の還元、１次ヒドロキシル基の任意の保護／脱保護；ＣＤＩカルバメート中間体を形成するためのＣＤＩとの１次ヒドロキシル基の反応；及びタンパク質上のアミノ基へのＣＤＩカルバメート中間体の結合を含む。
【００９８】
模式図２は、本発明において、いかにして莢膜糖が担体タンパク質に結合体化され得るのかについての２つの異なる例を示す。第１の例において、タンパク質は、末端ヒドロキシル基を介して結合体化される。第２の例において、タンパク質は、末端アミノ基を介して連結される。
【００９９】
【化９】
0005637689.tif 000016
例えば参考文献２及び１６に記載されるように、タンパク質への直接結合は、多糖を酸化し、その後タンパク質と還元的アミノ化を行うことを含む。例えば、実施形態において、対応する未変性莢膜糖の２個のビシナルであるヒドロキシル基がブロック基を含まない修飾莢膜糖の少なくとも１個の単糖単位が存在する場合、ビシナルであるヒドロキシル基の１個以上の対は、酸化開裂によってアルデヒド基に変換され得る（例えば、ＮａＩＯ４、Ｐｂ（ＯＡｃ）４等）。次いで、修飾莢膜糖は、還元的アミノ化によってタンパク質に連結され得る。
【０１００】
例えば、本発明は、
（ａ）本発明の修飾莢膜糖を提供するステップであって、対応する未変性莢膜糖の２個のビシナルであるヒドロキシル基がブロック基を含まない該修飾莢膜糖の少なくとも１個の単糖単位が存在する、ステップ；
（ｂ）酸化開裂によってビシナルであるヒドロキシル基の対の内の少なくとも１つをアルデヒド基に変換するステップ；及び
（ｃ）還元的アミノ化によって該修飾莢膜糖をタンパク質に連結するステップ、を含む、糖−タンパク質複合体の作製方法を提供する。
【０１０１】
タンパク質は、好ましくは細菌性毒素又は細菌性トキソイド、特にジフテリアトキシン又はジフテリアトキソイドである。例えば、タンパク質は、好ましくはＣＲＭ１９７である。
【０１０２】
上記のように、幾つかの実施形態においては、修飾莢膜糖の単糖単位の内の少なくとも１つがブロック基を含むことが好ましく、ここでＲ１は、２個のビシナルであるヒドロキシル基によって置換される。２個のビシナルであるヒドロキシル基は、担体タンパク質への次の結合のための結合手として使用され得る。例えば、ビシナルであるヒドロキシル基の１個以上の対は、酸化開裂によって、アルデヒド基に変換され得る（例えば、ＮａＩＯ４、Ｐｂ（ＯＡｃ）４等）。次いで、修飾莢膜糖は、還元的アミノ化によってタンパク質に連結され得る。
【０１０３】
例えば、本発明は、
（ａ）単糖単位の内の少なくとも１つがブロック基を含む本発明の修飾莢膜糖を提供するステップであって、ここでＲ１が２個のビシナルであるヒドロキシル基によって置換される、ステップ；
（ｂ）酸化開裂によってビシナルであるヒドロキシル基の対の内の少なくとも１つをアルデヒド基に変換するステップ；及び
（ｃ）還元的アミノ化によって該修飾莢膜糖をタンパク質に連結するステップ、を含む、糖−タンパク質複合体の作製方法を提供する。
【０１０４】
タンパク質は、好ましくは細菌性毒素又は細菌性トキソイド、特にジフテリアトキシン又はジフテリアトキソイドである。例えば、タンパク質は、好ましくはＣＲＭ１９７である。
【０１０５】
この方法の幾つかの実施形態において、ブロック基内に存在するビシナルであるヒドロキシル基の全ては、ステップ（ｂ）においてアルデヒド基に変換される。これらの実施形態において、生じるアルデヒド基の数は、ブロック基の総数によって決まり、ここでＲ１は、修飾莢膜糖に存在する２個のビシナルであるヒドロキシル基によって置換される。他の実施形態において、酸化開裂のための条件は、ブロック基内に存在するある比率のビシナルであるヒドロキシル基だけがアルデヒド基に変換されるように選択される。これらの実施形態において、生じるアルデヒド基の数は、Ｒ１が修飾莢膜糖内に存在する２個のビシナルであるヒドロキシル基によって置換されるブロック基の総数と、選択される条件によって決まる。かかる実施形態において、修飾莢膜糖の単糖単位の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％が、アルデヒド基に変換されるブロック基を有することが好ましい。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個の単糖単位が、アルデヒド基に変換されるブロック基を有する。好ましくは、単糖単位の５〜１５％の間、最も好ましくは１０％が、アルデヒド基に変換されるブロック基を有する。
【０１０６】
模式図３は、本発明において、いかにして莢膜糖が担体タンパク質に結合体化され得るのかについての２つの更なる例を示す。第１の例（左側）において、ブロック基の全ては、２個のビシナルであるヒドロキシル基によって置換されるＲ１基を有する。ある比率（例えば１０％）のこれらのビシナルであるヒドロキシル基は、タンパク質への結合体化のためのアルデヒド基に変換される。第２の例（右側）において、２つのタイプのブロック基が存在する。これらの比率（例えば１０％）は、２個のビシナルであるヒドロキシル基によって置換されるＲ１を有する。これらのビシナルであるヒドロキシル基の全ては、タンパク質への結合体化のためのアルデヒド基に変換される。
【０１０７】
【化１０】
0005637689.tif 000017
好ましい担体タンパク質は、細菌毒素又は細菌トキソイド（例えば、ジフテリアトキソイドや破傷風トキソイド等）である。これらは、結合体化ワクチンにおいて一般的に用いられる。ＣＲＭ１９７ジフテリアトキソイドは、特に好ましい［２９］。他の適切な担体タンパク質としては、髄膜炎菌外膜タンパク質［３０］、合成ペプチド［３１、３２］、熱ショックタンパク質［３３、３４］、百日咳タンパク質［３５、３６］、インフルエンザ菌由来のタンパク質Ｄ［３７］、サイトカイン［３８］、リンホカイン［３８］、ホルモン類［３８］、成長因子［３８］、クロストリジウム・ディフィシレ由来の毒素Ａ又はＢ［３９］、鉄取り込みタンパク質［４０］等が挙げられる。担体タンパク質の混合物を使用することが可能である。
【０１０８】
結合体化後、遊離糖類と結合体化糖類とが分離され得る。疎水性クロマトグラフィ、接線限外濾過、ダイアフィルトレーション等を含む多くの適切な方法がある［また、参考文献４１、４２等を参照］。
【０１０９】
単一の担体タンパク質は、多くの異なる糖類を担持することができる［４３］。
【０１１０】
医薬組成物及び方法
本発明の方法を用いて作製される組成物は、薬学的に許容される。それらは、修飾糖及び／又は複合体の他の成分を含むことが可能であり、例えば、それらは、１種以上の医薬担体を典型的に含むことになる。かかる成分についての綿密な考察は、参考文献４４において得ることが可能である。しかるに、本発明は、（ａ）本発明の修飾糖及び／又は本発明の複合体と、（ｂ）薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供するものである。該組成物は、好ましくは免疫原性組成物（例えばワクチン）である。糖類又は糖タンパク質複合体に基づくワクチンは、当該技術分野でよく知られている。
【０１１１】
組成物は、１種以上の緩衝液を含むことができる。典型的な緩衝液としては、リン酸緩衝液；トリス緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液；又はクエン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液は、典型的には５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。
【０１１２】
張性を制御するために、ナトリウム塩等の生理的塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、１〜２０ｍｇ／ｍＬで存在し得る。存在してよい他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩酸カルシウム等が挙げられる。
【０１１３】
組成物は、重量オスモル濃度が、一般的に２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、より好ましくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲にある。重量オスモル濃度は、接種に起因する疼痛に対する衝撃を有さないことが既に報告されている［４５］が、それでも、この範囲に重量オスモル濃度を維持することが好ましい。
【０１１４】
組成物のｐＨは、一般的に５．０〜８０であり、より典型的には５．５〜６．５であり、例えば６．５〜７．５である。故に、本発明の方法は、包装前にバルクワクチンのｐＨを調整するステップを含むことができる。
【０１１５】
該組成物は、好ましくは無菌である。該組成物は、好ましくは非発熱原性であり、例えば１回の投与につき１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準測定値）未満であり、好ましくは１回の投与につき０．１ＥＵ未満である。該組成物は、好ましくはグルテンを含まない。
【０１１６】
該組成物は、チオメルサールや２−フェノキシエタノール等の保存剤を含むことができる。しかしながら、ワクチンは、水銀材料を実質的に含まない（即ち、５μｇ／ｍＬ未満）、例えば、チオメルサールを含まないことが好ましい。水銀を含有しないワクチンは、より好ましい。
【０１１７】
組成物は、単回免疫化のための材料を含むことができるか、若しくは多回免疫化のための材料（即ち「多回投与」キット）を含むことができる。保存剤の混在物は、多回投与の配置において好ましい。
【０１１８】
ワクチンは、典型的には約０．５ｍＬの投与量で投与される。
【０１１９】
組成物は、好ましくは２℃〜８℃の間で保存される。それらは、凍結していてはならない。それらは、理想的には直接光を当ててはならない。
【０１２０】
組成物が複合体を含む場合、次いでそれは非結合体化型担体タンパク質を含むこともできるが、非結合体化型担体の量は、その担体の総量に対して５％未満であることが好ましい。
【０１２１】
本発明の組成物は、ヒト患者への投与に適切であり、本発明は、かかる組成物を該患者に投与するステップを含む、患者における免疫応答を高める方法を提供するものである。本発明はまた、医薬として使用するための本発明の組成物を提供する。また、本発明は、患者の免疫応答を高めるための医薬の製造における修飾糖及び／又は本発明の複合体の使用を提供する。これらの方法及び使用によって高まる免疫応答は、一般的に抗体応答、好ましくは髄膜炎菌感染に対する防御抗体応答を含む。ナイセリアに起因する疾患としては、髄膜炎、敗血症、淋疾が挙げられる。細菌性髄膜炎の予防及び／又は治療が好ましい。
【０１２２】
該組成物は、各種方法で投与され得る。最も好ましい免疫化経路は、筋肉内注射（例えば腕や脚の中）によるものであるが、他に利用し得る経路としては、皮下注射、鼻腔内［４６〜４８］、経口［４９］、皮内［５０、５１］、経皮的、経皮性［５２］等が挙げられる。
【０１２３】
本発明によって調製される組成物は、小児と成体との両方を治療するために使用され得る。患者は、１歳未満、１〜５歳未満、５〜１５歳、１５〜５５歳、又は少なくとも５５歳であってよい。該患者は、高齢者（例えば、５０歳以上、好ましくは６５歳以上）、若者（例えば５歳以下）、入院患者、医療従事者、軍部や軍隊の人、妊婦、慢性的疾患患者、免疫不全患者、及び海外旅行をしている人々であってよい。しかしながら、該組成物は、単にこれらの群についてのみ適切であるわけではなく、個体群においてより一般的に使用され得る。
【０１２４】
治療は、単回投与スケジュール又は多回投与スケジュールによることができる。多回投与は、一次免疫化スケジュール及び／又は追加免疫化スケジュールにおいて使用され得る。多回投与スケジュールにおいて、各種投与は、同一又は異なる経路、例えば、非経口初回抗原刺激と粘膜追加免疫、粘膜初回抗原刺激と非経口追加免疫等によって与えられ得る。１回超の投与量（典型的には２回投与量）の投与は、免疫学的に無感作の患者において特に有用である。多回投与は、典型的には、少なくとも１週間隔（例えば約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１２週間、約１６週間等）で投与される。
【０１２５】
本発明の組成物は、他の組成物と実質的に同時（例えば同じ医療相談や医療専門家への来院の間）、特に他のワクチンと同時に、患者に投与され得る。
【０１２６】
免疫原性組成物は、免疫学的有効量の糖抗原、並びに場合により他の特定の成分のいずれか他のものを含む。「免疫学的有効量」によって、単回投与において又は連続投与の一部としてのいずれかにおける個体へのその量の投与は、治療又は予防に有効であることが意味される。この量は、治療される個体の健康及び身体の状態、年齢、治療される個体の分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類等）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望の保護度、ワクチンの製剤化、医学的状態の治療医師の評価、及び他の関連因子に応じて変化する。その量は、ルーチン試験で決定され得る相対的に広い範囲にあるものと考えられる。用量処置は、単回投与スケジュール又は多回投与スケジュール（例えば、追加抗原投与量等を含む）であってよい。
【０１２７】
本発明によるワクチンは、予防的（即ち、感染の予防）又は治療的（即ち、感染後の疾患の治療）のいずれかであってよいが、典型的には予防的である。
【０１２８】
アジュバント
本発明の組成物は、有利には、該組成物の投与を受ける患者において誘発される免疫応答を高める働きをし得るアジュバントを含むことができる。本発明と共に使用され得るアジュバントとしては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる。
【０１２９】
・カルシウム塩及びアルミニウム塩（又はそれらの混合物）を含む無機質含有組成物。カルシウム塩としては、リン酸カルシウム（例えば、参考文献５３において開示される「ＣＡＰ」粒子)が挙げられる。アルミニウム塩としては、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶質、非晶質等）をとる塩と共に、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩等が挙げられる。これらの塩に対する吸着は、好ましい。また、無機質含有組成物は、金属塩の粒子として製剤化され得る［５４］。アルミニウム塩アジュバントについては、以下で更に詳細に記載される。
【０１３０】
・以下で更に詳細に記載される水中油形乳剤。
【０１３１】
・免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によってグアノシンに連結される非メチル化シトシンを含有するジヌクレオチド配列）、ＴｐＧモチーフ［５５］、二本鎖ＲＮＡ、パリンドローム配列を含有するオリゴヌクレオチド、ポリ（ｄＧ）配列を含有するオリゴヌクレオチドを含有するもの等）。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド修飾体／類似体（例えば、ホスホロチオエート修飾体）を含むことが可能であり、二本鎖又は（ＲＮＡを除いて）一本鎖であり得る。参考文献５６〜５８は、類似体置換（例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンとのグアノシンの置換）の可能性を開示する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果については、参考文献５９〜６４において更に考察されている。ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９に指向され得る（例えば、モチーフＧＴＣＧＴＴやＴＴＣＧＴＴ）［６５］。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘発に特異的であってよく（例えば、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド））、Ｂ細胞応答の誘発により特異的であってよい（例えば、ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮ）。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ及びＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮについては、参考文献６６〜６８において考察される。好ましくは、ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識に利用可能であるように構築される。場合により、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を、それらの３’末端で結合して、「イムノマー」を形成し得る。例えば、参考文献６５及び６９〜７１を参照。有用なＣｐＧアジュバントは、ＣｐＧ７９０９（別名ＰｒｏＭｕｎｅ（登録商標））（Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）である。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも２０個のヌクレオチドを含むものである。それらは、１００個未満のヌクレオチドを含むことができる。
【０１３２】
・３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（「３ｄＭＰＬ」（別名「ＭＰＬ（登録商標）」））［７２〜７５］。３ｄＭＰＬは、サルモネラ・ミネソタのヘプトース欠損変異体から調製されたものであって、リピドＡと化学的に類似しているが、酸に不安定なホスホリル基と塩基に不安定なアシル基とが欠失している。３ｄＭＰＬの調製については、元々参考文献７６に記載された。３ｄＭＰＬは、関連分子の混合物という形態をとることが可能であり、その形態は、その分子のアシル化によって変化する（例えば、異なる長さであり得る３、４、５又は６個のアシル鎖を有する）。２個のグルコサミン（別名２−デオキシ−２−アミノグルコース）単糖は、それらの２位の炭素（即ち、２位及び２’位）でＮ−アシル化され、３’位ではＯ−アシル化も生じる。
【０１３３】
・イミダゾキノリン化合物（例えば、イミキモッド（「Ｒ−８３７」）［７７、７８］）、レジキモド（「Ｒ−８４８」）［７９］、それらの類似体）；及びその塩（例えば塩酸塩）。免疫刺激性イミダゾキノリンに関する更なる詳細については、参考文献８０〜８４に見出され得る。
【０１３４】
・チオセミカルバゾン化合物（例えば、参考文献８５において開示されるもの等）。活性化合物のための調製、製造及びスクリーニングの方法は、参考文献８５にも記載される。また、活性化合物のための調製、製造及びスクリーニングの方法は、参考文献８５に記載される。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−α等のサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激において特に有効である。
【０１３５】
・トリプタントリン化合物（例えば参考文献８６において開示されるもの等）。また、活性化合物のための調製、製造及びスクリーニングの方法は、参考文献８６に記載される。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−α等のサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激において特に有効である。
【０１３６】
・ヌクレオシド類似体（例えば：（ａ）イサトラビン（Ｉｓａｔｏｒａｂｉｎｅ）（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：
【０１３７】
【化１１】
0005637689.tif 000018
及びそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献８７〜８９に開示される化合物；（ｆ）式：
【０１３８】
【化１２】
0005637689.tif 000019
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立してＨ、ハロ、−ＮＲａＲｂ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、Ｃ１−６アルキル又は置換Ｃ１−６アルキルであり；
Ｒ３は、存在しないか、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、ヘテロシクリル又は置換ヘテロシクリルであり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立してＨ、ハロ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、又は共に結合してＲ４−５：
【０１３９】
【化１３−１】
0005637689.tif 000020
における通りの５員環を形成し、該結合は、
【０１４０】
【化１３−２】
0005637689.tif 000021
で示される結合で達成され、
Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立してＮ、Ｃ、Ｏ又はＳであり；
Ｒ８は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、−ＯＨ、−ＮＲａＲｂ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｒｃ、−Ｏ−（Ｃ１−６アルキル）、−Ｓ（Ｏ）ｐＲｅ又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄであり；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル又はＲ９ａであり、
ここでＲ９ａは、
【０１４１】
【化１４−１】
0005637689.tif 000022
であり、該結合は
【０１４２】
【化１４−２】
0005637689.tif 000023
で示される結合で達成され、
Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立してＨ、ハロ、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲａＲｂ、又は−ＯＨであり；
各Ｒａ及びＲｂは、独立してＨ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、Ｃ６−１０アリールであり；
各Ｒｃは、独立してＨ、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、Ｃ１−６アルキル又は置換されたＣ１−６アルキルであり；
各Ｒｄは、独立してＨ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、−ＮＨ（置換Ｃ１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｎ（置換Ｃ１−６アルキル）２、Ｃ６−１０アリール又はヘテロシクリルであり；
各Ｒｅは、独立してＨ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、ヘテロシクリル又は置換ヘテロシクリルであり；
各Ｒｆは、独立してＨ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、ホスフェート、ジホスフェート又はトリホスフェートであり；
各ｎは、独立して０、１、２又は３であり；
各ｐは、独立して０、１又は２である）を有する化合物；
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの薬学的に許容される塩、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの互変異性体、又は互変異性体の薬学的に許容される塩等）。
【０１４３】
・ロキソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）［９０］。
【０１４４】
・参考文献９１において開示される化合物（アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドロイソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンゾイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［９２、９３］、ヒドラフタルアミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソオキサゾール化合物、ステロール化合物、キナゾリノン化合物、ピロール化合物［９４］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラゾロピリミジン化合物、ベンザゾール化合物、［９５］等）。
【０１４５】
・参考文献９６において開示される化合物（３，４−ジ（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、スタウロスポリン類似体、誘導体化ピリダジン、クロマン−４−オン、インドリノン、キナゾリン、ヌクレオシド類似体等）。
【０１４６】
・アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えばＲＣ−５２９［９７、９８］）。
【０１４７】
・ホスファゼン（例えば参考文献９９及び１００に記載される通りのポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」））。
【０１４８】
・小分子免疫賦活薬（ＳＭＩＰ）（例えば：
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−エチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−ペンチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロプ−２−エニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−２−［（フェニルメチル）チオ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
１−（２−メチルプロピル）−２−（プロピルチオ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エタノール
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］酢酸エチル
４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−｛４−アミノ−２−［メチル（プロピル）アミノ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル｝−２−メチルプロパン−２−オール
１−［４−アミノ−２−（プロピルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール
Ｎ４，Ｎ４−ジベンジル−１−（２−メトキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン等）。
【０１４９】
・広範囲にわたる植物種の樹皮、葉、茎、根や花においてさえ見出されるステロール・グリコシド及びトリテルペノイドグリコシドの非相同基であるサポニン［参考文献１３１の第２２章］。キラヤの木の樹皮に由来するサポニンは、アジュバントとして広く研究されてきた。サポニンは、スミラックス・オルナタ（サルサパリラ）、シュッコンカスミソウ（ブライダル・ベール）及びサポナリア・オフィシナリス（ソープ・ルート）から商業的に得ることが可能である。サポニンアジュバント製剤は、精製製剤（例えばＱＳ２１）並びに脂質製剤（例えばＩＳＣＯＭ）を包含する。ＱＳ２１は、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）として販売されている。サポニン成分は、ＨＰＬＣ及びＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製されてきた。これらの技法を使用した特定の精製画分が同定されたが、それらとして、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ及びＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の製造方法は、参考文献１０１において開示される。また、サポニン製剤は、コレステロール等のステロールを含んでよい［１０２］。サポニン及びコレステロールの組み合わせを使用して、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼称される固有の粒子を形成することができる［参考文献１３１の第２３章］。また、ＩＳＣＯＭは、典型的には、リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミンやホスファチジルコリン）を含む。いかなる既知のサポニンも、ＩＳＣＯＭにおいて使用され得る。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡ及びＱＨＣの内の１種以上を含む。ＩＳＣＯＭは、参考文献１０２〜１０４に更に記載されている。場合により、ＩＳＣＯＭＳは、更なる界面活性剤を含まなくてよい［１０５］。サポニンに基づくアジュバントの開発の概要については、参考文献１０６及び１０７に記載されている。
【０１５０】
・細菌性ＡＤＰ−リボシル化毒素（例えば、大腸菌易熱性腸毒素「ＬＴ」コレラ毒素「ＣＴ」又は百日咳毒素「ＰＴ」）及びその無毒化された誘導体（例えば、ＬＴ−Ｋ６３及びＬＴ−Ｒ７２として知られている変異体毒素）［１０８］。粘膜アジュバントとしての無毒化されたＡＤＰ−リボシル化毒素の使用については、参考文献１０９に記載されており、非経口アジュバントとしての使用については、参考文献１１０に記載されている。
【０１５１】
・生体接着剤及び粘膜接着剤（例えば、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア［１１１］やキトサン及びその誘導体［１１２］）。
【０１５２】
・生分解性及び非毒性の材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトン等）から、好ましく、場合により負に荷電する表面（例えばＳＤＳによる）又は正に荷電する表面（例えば、陽イオン界面活性剤（例えばＣＴＡＢ）によって）を有するように処理されるポリ（ラクチド−コ−グリコリド）によって形成される微小粒子（即ち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍの粒子、より好ましくは、直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、又は直径約５００ｎｍ〜約１０μｍ）。
【０１５３】
・リポソーム（参考文献１３１の第１３及び１４章）。アジュバントとしての使用のために適切なリポソーム製剤の例は、参考文献１１３〜１１５に記載されている。
【０１５４】
・ポリオキシエチレンエーテル及びポリオキシエチレンエステル［１１６］。かかる製剤は、更に、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［１１７］、並びにオクトキシノール等の少なくとも１種の更なる非イオン性活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル又はエステル界面活性剤［１１８］を含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１５５】
・ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（「ｔｈｒ−ＭＤＰ」）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニン−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−ｉｓｏｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（「ＤＴＰ−ＤＰＰ」又は「Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（登録商標）」）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（「ＭＴＰ−ＰＥ」）。
【０１５６】
・第２のグラム陰性菌に由来するリポサッカライド（ＬＰＳ）製剤と組み合わせて第１のグラム陰性菌から調製される外膜タンパク質プロテオソーム製剤（該外膜タンパク質プロテオソーム及びＬＰＳ製剤は、安定性のある非共有結合性アジュバント複合体を形成する）。かかる複合体としては、「ＩＶＸ−９０８」（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜及びＬＰＳをから構成される複合体）が挙げられる。
【０１５７】
・メチルイノシン５’−一リン酸（「ＭＩＭＰ」）［１１９］。
【０１５８】
・ポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物［１２０］（例えば、式：
【０１５９】
【化１５】
0005637689.tif 000024
（式中、Ｒは、水素、直鎖又は分岐鎖、非置換又は置換、飽和又は不飽和のアシル基、アルキル基（例えば、シクロアルキル基）、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基を含む群から選択される）を有するもの）、或いはその薬学的に許容される塩又はその誘導体。例としては、カスアリン、カスアリン−６−α−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１６０】
・γイヌリン［１２１］又はその誘導体（例えばアルガムリン）。
【０１６１】
・参考文献１２２において定義される通りの
式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ
【０１６２】
【化１６】
0005637689.tif 000025
の化合物或いはその塩（例えば、「ＥＲ  ８０３０５８」、「ＥＲ  ８０３７３２」、「ＥＲ  ８０４０５３」、「ＥＲ  ８０４０５８」、「ＥＲ  ８０４０５９」、「ＥＲ  ８０４４４２」、「ＥＲ  ８０４６８０」、「ＥＲ  ８０４７６４」、「ＥＲ  ８０３０２２」又は「ＥＲ  ８０４０５７」、例えば
【０１６３】
【化１７】
0005637689.tif 000026
【０１６４】
【化１８】
0005637689.tif 000027
）。
【０１６５】
・大腸菌（例えばＯＭ−１７４）由来のリピドＡの誘導体（参考文献１２３及び１２４に記載）。
【０１６６】
・カチオン脂質の製剤及び（通常は中性の）共脂質（例えば、アミノプロピル−ジメチル−ミリストレイルオキシ−プロパンアミニウムブロミド−ジフィタノイルホスファチジル−エタノールアミン（「Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標）」）やアミノプロピル−ジメチル−ビス−ドデシルオキシ−プロパンアミニウムブロミド−ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（「ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ」）。（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ｓｙｎ−９−テトラデセンイルオキシ）−１−プロパンアミニウム塩を含有する製剤が好ましい［１２５］。
【０１６７】
・ホスフェート含有非環式骨格鎖（例えば、ＴＬＲ４拮抗剤Ｅ５５６４［１２６、１２７］）：
【０１６８】
【化１９−１】
0005637689.tif 000028
に連結する脂質を含有する化合物。
【０１６９】
これら及び他のアジュバント活性物質は、参考文献１３１及び１３２において更に詳細に考察される。
【０１７０】
組成物は、該アジュバントの内の２種個以上を含んでよい。
【０１７１】
組成物中の抗原及びアジュバントは、典型的には混合物の中にある。
【０１７２】
水中油形乳剤アジュバント
水中油乳剤は、特にアジュバントとして有用である。各種のそのような乳剤は、知られており、典型的には少なくとも１種の油と少なくとも１種の界面活性剤とを含んでおり、該油及び界面活性剤は、生分解性（代謝可能）且つ生体適合性である。乳剤における油滴は、一般的に直径５μｍ未満であり、サブミクロンの直径を有してもよく、これらの小さなサイズは、マイクロフリューダイザによって達成されて、安定した乳剤が提供される。２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴が好ましいが、それは、それらが濾過殺菌に供せられ得るからである。
【０１７３】
本発明は、動物（例えば魚）や植物の原料に由来するもの等の油と共に使用され得る。植物油についての原料としては、ナッツ、種子、穀粒が挙げられる。最も一般的に利用され得る落花生油、大豆油、椰子油及びオリーブ油によって、ナッツ油が例示される。ホホバ油が、例えばホホバ豆から得られ、使用され得る。種子油としては、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油等が挙げられる。穀粒の群において、トウモロコシ油は、最も容易に利用可能であるが、他の穀物粒（例えば、小麦、オート麦、ライ麦、米、テフ、ライ小麦等）の油もまた使用され得る。グリセロール及び１，２−プロパンジオールの炭素数６〜１０個の脂肪酸エステルは、種子油中に天然には生じないが、ナッツ及び種子油をはじめとする適切な材料の加水分解、分離及びエステル化によって調製され得る。哺乳類の乳に由来する油脂は、代謝可能であり、故に本発明の実施において使用され得る。動物原料から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化及び他の手段のための手法は、当該技術分野で周知である。大部分の魚は、容易に回収され得る代謝可能な油を含む。例えば、鱈肝油、鮫肝油、鯨油（例えば鯨蝋）によって、本明細書に使用され得る魚油の内の幾つかが例示される。多くの分枝鎖油は、炭素数５個のイソプレン単位において生化学的に合成され、一般的にテルペノイドと呼ばれる。鮫肝油は、特に本明細書において好ましいスクアレンとして既知の分岐鎖、不飽和のテルペノイド（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）を含有する。また、スクアラン（スクアレンに対する飽和類似体）も好ましい油である。スクアレン及びスクアランを含む魚油は、市販の原料から容易に入手可能である、若しくは当該技術分野で周知の方法によって得られる。他の好ましい油としては、トコフェロール（下記参照）がある。油の混合物を使用することが可能である。
【０１７４】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類され得る。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、界面活性剤と共に使用され得るが、その界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０及びポリソルベート８０；ＤＯＷＦＡＸ（登録商標）の下で販売されているエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）及び／又はブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（例えば、直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー）；反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変化し得るオクトキシノール（特に興味深いのは、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、又はｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール））；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン（レシチン））；ラウリル、セチル、ステアリル及びオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られる）（例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）；ソルビタンエステル（一般的に、ＳＰＡＮとして知られる）（例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５）及びソルビタンモノラウレートが挙げられるが、これらに限定されるものではない。乳剤中に含むための好ましい界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチン及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００がある。界面活性剤の混合物（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０／Ｓｐａｎ  ８５の混合物）を、使用することが可能である。
【０１７５】
本発明と共に有用な特定の水中油形乳剤アジュバントとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１７６】
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ  ８０及びＳｐａｎ  ８５のサブミクロンの乳剤。乳剤の組成物は、容量％で、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０及び約０．５％のＳｐａｎ  ８５であり得る。重量の観点において、これらの比は、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０及び０．４８％のＳｐａｎ  ８５となる。このアジュバントは、参考文献１３１の第１０章及び参考文献１３２の第１２章においてより詳細に記載されるように、「ＭＦ５９」［１２８〜１３０］として知られている。ＭＦ５９乳剤は、有利にはクエン酸イオン（例えば、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液）を含む。
【０１７７】
・スクアレン、トコフェロール及びＴｗｅｅｎ  ８０の乳剤。該乳剤は、リン酸緩衝生理食塩水を含んでよい。また、それは、Ｓｐａｎ  ８５（例えば１％で）及び／又はレシチンを含んでよい。これらの乳剤は、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロール、及び０．３〜３％のＴｗｅｅｎ  ８０を有することが可能であり、スクアレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは１以下であり、それは、これによってより安定的な乳剤が提供されるからである。そのようなある種の乳剤は、Ｔｗｅｅｎ  ８０をＰＢＳに溶解して２％溶液を得て、次いで９０ｍＬのこの溶液を混合物（５ｇのＤＬ−α−トコフェロール及び５ｍＬのスクアレン）と混合し、次いでその混合物をマイクロフリューダイズすることによって作製され得る。得られた乳剤は、例えば平均直径が１００〜２５０ｎｍの間の、好ましくは約１８０ｎｍの、サブミクロンの油滴を有し得る。
【０１７８】
・スクアレン、トコフェロール及びトリトン界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の乳剤。
【０１７９】
・スクアラン、ポリソルベート８０及びポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ１２１」）の乳剤。該乳剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）において製剤化され得る。この乳剤は、ムラミルジペプチドのための有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバント［１３３］（０．０５〜１％Ｔｈｒ  ＭＤＰ、５％スクアラン、２．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１及び０．２％ポリソルベート８０）におけるスレオニルＭＤＰと共に使用される。また、それは、Ｔｈｒ−ＭＤＰなしで、「ＡＦ」アジュバント［１３４］（５％スクアラン、１．２５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１及び０．２％ポリソルベート８０）における通りに使用され得る。マイクロフリューダイズが好ましい。
【０１８０】
・０．５〜５０％の油と、０．１〜１０％のリン脂質と、０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤とを有する乳剤。参考文献１３５において記載され通り、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン及びカルジオリピンである。サブミクロンの液滴直径が有利である。
【０１８１】
・非代謝性油（例えば軽油）のサブミクロン水中油型乳剤及び少なくとも１種の界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｓｐａｎ  ８０）。添加剤（例えば、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン親油性複合体（例えば、グルクロン酸のカルボキシル基を介してデアシルサポニンに脂肪族アミンを付加することによって作製される、参考文献１３６に記載のＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド及び／又はＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン）が含まれ得る。
【０１８２】
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡやＱＳ２１）及びステロール（例えばコレステロール）が螺旋状のミセルとして会合する乳剤［１３７］。
【０１８３】
乳剤は、送達時に即座に抗原と混合され得る。しかるに、アジュバント及び抗原は、使用時の最終的な製剤化の準備を整えた、包装又は分注されたワクチンの中に別々に保持され得る。抗原は、ワクチンが混合二液体によって最終的に調製されるように、一般的に水性の形態においてある。混合のための二液体の体積比は、変化し得る（例えば、５：１〜１：５の間）が、一般的に約１：１である。
【０１８４】
アルミニウム塩アジュバント
水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムとして知られているアジュバントを使用可能である。これらの名前は、従来のものであるが、便宜上使われるだけであって、存在する実際の化学化合物の厳密な記述ではない（例えば、参考文献１３１の第９章参照）。本発明は、アジュバントとして一般的に使用される「水酸化物」又は「ホスフェート」アジュバントのいずれかを使用できる。
【０１８５】
「水酸化アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的にはアルミニウムオキシ水酸化物塩であり、それは通常、少なくとも部分的に結晶質である。式：ＡｌＯ（ＯＨ）によって示され得るアルミニウムオキシ水酸化物は、赤外（ＩＲ）分光法によって、特に１０７０ｃｍ−１の吸着帯及び３０９０〜３１００ｃｍ−１の強い肩部の存在によって、他のアルミニウム化合物（例えば水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３）と区別され得る［参考文献１３１の第９章］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度は、より小さい微結晶サイズのためより大きな線幅拡大を示す十分に結晶質でない粒子によって、半分の高さ（ＷＨＨ）で回折バンドの幅で表される。ＷＨＨが増加するにつれて表面積は増大し、より高いＷＨＨ値を有するアジュバントは、抗原吸着の能力がより大きいことが示された。（例えば透過電子顕微鏡組織において認められる通りの）線維形態は、水酸化アルミニウムアジュバントについて典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、典型的には約１１であり、即ち、アジュバントそのものは、生理学的ｐＨで正の表面電荷を有する。水酸化アルミニウムアジュバントについては、ｐＨ７．４でＡｌ＋＋＋1ｍｇ当たり１．８〜２．６ｍｇの間のタンパク質の吸着容量が報告された。
【０１８６】
「リン酸アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的にはヒドロキシリン酸アルミニウムであり、それはまた、多くの場合、少量の硫酸塩（即ち、ヒドロキシリン酸アルミニウムスルフェート）を含有する。それらは、沈殿によって得ることが可能であり、沈殿の間の反応条件及び濃度は、該塩中のヒドロキシルに対するリン酸塩の置換度に影響する。ヒドロキシリン酸塩は、一般的に０．３〜１．２の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシリン酸塩は、ヒドロキシル基の存在によって狭義のＡｌＰＯ４から区別され得る。例えば、３１６４ｃｍ−１（例えば、２００℃に加熱される場合）のＩＲスペクトル帯は、構造的ヒドロキシルの存在を示す［参考文献１３１の第９章］。
【０１８７】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般的に０．３〜１．２の間、好ましくは０．８〜１．２の間、より好ましくは０．９５±０．１である。特にヒドロキシリン酸塩について、リン酸アルミニウムは、一般的に非晶質である。典型的なアジュバントは、０．６ｍｇ  Ａｌ３＋／ｍＬで含まれる、ＰＯ４／Ａｌモル比が０．８４〜０．９２の間の非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムである。リン酸アルミニウムは、一般的に微粒子（例えば、透過電子顕微鏡組織で認められるように板状形態）である。いかなる抗原吸着の後においても、該粒子の典型的な直径は、０．５〜２０μｍ（例えば、約５〜１０μｍ）の範囲である。リン酸アルミニウムアジュバントについては、ｐＨ７．４のＡｌ＋＋＋１ｍｇ当たり０．７〜１．５ｍｇの間のタンパク質の吸着容量が報告された。
【０１８８】
リン酸アルミニウムのゼロ電荷点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルに対するリン酸塩の置換度に反比例の関係があり、この置換度は、沈殿によって塩を調製するために使用される反応物の反応条件及び濃度に応じて変化し得る。また、ＰＺＣは、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変えることによって変化し得るか（より多くのリン酸塩は、より酸性のＰＺＣと関連している）、若しくは緩衝液（例えばヒスチジン緩衝液）を添加することによって変化し得る（ＰＺＣをより塩基性にする）。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、一般的に４．０〜７．０の間の、より好ましくは５．０〜６．５の間の、例えば約５．７のＰＺＣを有する。
【０１８９】
本発明の組成物を調製するために使用されるアルミニウム塩の懸濁液は、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液やヒスチジン緩衝液やトリス緩衝液）を含むことが可能であるが、これは、必ずしも必要ではない。懸濁液は、好ましくは無菌であり且つ発熱物質を含まない。懸濁液は、（例えば、１．０〜２０ｍＭの間の、好ましくは５〜１５ｍＭの間の、より好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する）遊離水溶性リン酸イオンを含んでよい。また、該懸濁液は、塩化ナトリウムを含むこともできる。
【０１９０】
本発明は、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムの両方の混合物を使用することができる。この場合、水酸化物よりもリン酸アルミニウムのほうが多く存在してよい（例えば、重量比が少なくとも２：１、例えば５：１以上、６：１以上、７：１以上、８：１以上、９：１以上等）。
【０１９１】
患者への投与のための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ未満、例えば５ｍｇ／ｍＬ以下、４ｍｇ／ｍＬ以下、３ｍｇ／ｍＬ以下、２ｍｇ／ｍＬ以下、１ｍｇ／ｍＬ以下等である。好ましい範囲は、０．３〜１ｍｇ／ｍＬの間である。
【０１９２】
更なる抗原
該組成物は、修飾糖類及び／又は複合体だけでなく、更なる抗原成分も含むことができる。例えば、該組成物は、１種以上の更なる糖類（本発明に従って修飾されたものであろうとなかろうと）を含むことができる。例えば、該組成物は、髄膜炎菌の血清群Ｃ、Ｗ１３５及びＹに由来する糖類を（例えば、修飾ＭｅｎＡ糖に加えて）含むことができる。これらは、担体タンパク質に典型的に結合体化するものであって、髄膜炎菌の異なる血清群に由来する糖類は、同一又は異なる担体タンパク質に結合体化することができる。混合物が血清群Ａ及びＣの両方に由来する莢膜糖類を含む場合、ＭｅｎＡ糖：ＭｅｎＣ糖の比（ｗ／ｗ）が１超（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１以上）であることが好ましい。ＭｅｎＡ成分の免疫原性の向上は、それがＭｅｎＣ成分に対して過度（質量／投与量）に存在する場合に認められた［１３８］。
【０１９３】
該組成物はまた、タンパク質抗原を含むこともできる。
【０１９４】
本発明の組成物中に含まれ得る抗原としては、以下のものが挙げられる。
【０１９５】
−髄膜炎菌血清群Ｂ由来のタンパク質抗原（下記参照）。
【０１９６】
−参考文献１３９、１４０、１４１、１４２等に開示される髄膜炎菌由来の外膜小胞（ＯＭＶ）製剤。
【０１９７】
−ＣａｇＡ［１４３〜１４６］、ＶａｃＡ［１４７、１４８］、ＮＡＰ［１４９、１５０、１５１］、ＨｏｐＸ［例えば、１５２］、ＨｏｐＹ［例えば、１５２］及び／又はウレアーゼ等、ピロリ菌由来の抗原。
【０１９８】
−肺炎連鎖球菌由来の糖抗原［例えば、１５３、１５４、１５５］。
【０１９９】
−非活化ウイルス等のＡ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、１５６、１５７］。
【０２００】
−Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、表面抗原及び／又はコア抗原［例えば、１５７、１５８］。
【０２０１】
−Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、１５９］。
【０２０２】
−百日咳菌由来の無細胞抗原（例えば、百日咳菌由来の百日咳ホロトキシン（ＰＴ）や糸状の赤血球凝集素（ＦＨＡ）、場合によりペルタクチン及び／又は凝集原２及び３とも組み合わされる［例えば、参考文献１６０及び１６１］。
【０２０３】
−細胞性百日咳菌抗原。
【０２０４】
−ジフテリア抗原（例えば、ジフテリアトキソイド）［例えば、参考文献１６２の第３章］例えば、ＣＲＭ１９７変異体［例えば、１６３］。
【０２０５】
−ポリオ抗原［例えば、１６４、１６５］（例えば、不活性化ポリオウイルス（ＩＰＶ））。
【０２０６】
−破傷風抗原（例えば、破傷風トキソイド）［例えば、参考文献１６２の第４章］。
【０２０７】
−インフルエンザ菌Ｂ型由来の糖抗原［例えば、参考文献１６６〜１７４］。
【０２０８】
−麻疹抗原、耳下腺炎抗原及び／又は風疹抗原［例えば、参考文献１６２の第９、１０及び１１章］。
【０２０９】
−淋菌由来の抗原。
【０２１０】
−クラミジア・ニューモニエ由来の抗原［例えば、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１］。
【０２１１】
−トラコーマクラミジアに由来する抗原［例えば、１８２］。
【０２１２】
−ポルフィロモナス・ジンジバリスに由来する抗原［例えば、１８３］。
【０２１３】
−狂犬病抗原［例えば、１８４］（例えば、凍結乾燥非活化ウイルス［例えば、ＲａｂＡｖｅｒｔ（登録商標）］）。
【０２１４】
−インフルエンザ抗原［例えば、参考文献１６２の第１９章］（例えば、赤血球凝集素及び／又はノイラミニダーゼ表面タンパク質）。
【０２１５】
−モラクセラカタラーリス由来の抗原［例えば、１８６］。
【０２１６】
−ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｂ群連鎖球菌）由来の抗原［例えば、１８７、１８８］。
【０２１７】
−ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｂ群連鎖球菌）由来の糖抗原。
【０２１８】
−化膿連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌）由来の抗原［例えば、１８８、１８９、１９０］。
【０２１９】
−黄色ブドウ球菌由来の抗原［例えば、１９１］。
【０２２０】
−バシラスアンスラシス由来の抗原［例えば、１９２、１９３、１９４］。
【０２２１】
−単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）抗原。本発明に使用するための好ましいＨＳＶ抗原は、膜糖タンパク質ｇＤである。ＨＳＶ−２株（「ｇＤ２」抗原）由来のｇＤを使用することが好ましい。該組成物は、Ｃ末端膜アンカー領域が欠失したｇＤ［１９５］（例えば、Ｃ末端でのアスパラギン及びグルタミンの付加を伴う天然タンパク質のアミノ酸１〜３０６を含むトランケーションされたｇＤ）の形態を使用することができる。この形態のタンパク質は、切断されて成熟２８３アミノ酸タンパク質を産生するシグナルペプチドを含む。アンカーの欠失によって、タンパク質は可溶形態に調製され得る。
【０２２２】
−ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原。本発明に使用するための好ましいＨＰＶ抗原は、Ｌ１キャプシドタンパク質であり、それは組み立てされてウイルス様粒子（ＶＬＰ）として知られている構造を形成する。ＶＬＰは、イースト細胞における（例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエにおける）又は昆虫細胞における（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ等のスポドプテラ細胞における、或いはドロソフィラ細胞における）Ｌ１の組換え発現によって産生され得る。イースト細胞については、プラスミドベクターが、Ｌ１遺伝子を担持することが可能であり；昆虫細胞については、バキュロウイルスベクターが、Ｌ１遺伝子を担持することが可能である。より好ましくは、該組成物は、ＨＰＶ−１６株及びＨＰＶ−１８株の両方に由来するＬ１  ＶＬＰを含む。この二価の組み合わせは非常に有効であることが示されている［１９６］。ＨＰＶ−１６株及びＨＰＶ−１８株に加えて、ＨＰＶ−６株及びＨＰＶ−１１株に由来するＬ１  ＶＬＰを含むことも可能である。腫瘍原性ＨＰＶ株の使用も可能である。ワクチンは、１つのＨＰＶ株につき２０〜６０μｇ／ｍＬの間（例えば、約４０μｇ／ｍＬ）のＬ１を含むことができる。
【０２２３】
−フラビウイルス科（フラビウイルス属）のウイルス由来の（例えば、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルスの４種の血清タイプ、ダニ媒介性脳炎ウイルス、西ナイルウイルス由来の）抗原。
【０２２４】
−ペスチウイルス抗原（例えば、ブタコレラウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス及び／又はボーダー病ウイルスに由来するもの等）。
【０２２５】
−例えばパルボウィルスＢ１９に由来するパルボウィルス抗原。
【０２２６】
−プリオンタンパク質（例えば、ＣＪＤプリオンタンパク質）。
【０２２７】
−アミロイドタンパク質（例えば、ベータペプチド）［１９７］。
【０２２８】
−癌抗原（例えば、参考文献１９８の表１又は参考文献１９９の表３及び４に記載されるもの）。
【０２２９】
該組成物は、これらの更なる抗原の内の１種以上を含み得る。
【０２３０】
毒性タンパク質抗原は、必要な場合、無毒化され得る（例えば、化学的手段及び／又は遺伝学的手段による百日咳毒素の解毒［１６１］）。
【０２３１】
ジフテリア抗原が該組成物中に含まれる場合、破傷風抗原及び百日咳抗原をも含むことが好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原及び百日咳抗原をも含むことが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原及び破傷風抗原をも含むことが好ましい。
【０２３２】
抗原は、アルミニウム塩に吸着され得る。
【０２３３】
組成物中の抗原は、典型的には各々少なくとも１μｇ／ｍＬの濃度で存在する。一般的に、任意の所与の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を誘発するために十分なものである。
【０２３４】
本発明の組成物中のタンパク質抗原の使用に代わるものとして、抗原をコードする核酸が使用され得る［例えば、参考文献２００〜２０８］。しかるに、本発明の組成物のタンパク質成分は、タンパク質をコードする核酸（好ましくはＤＮＡ（例えば、プラスミドの形態））で置換され得る。
【０２３５】
非糖髄膜炎菌抗原
髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５及びＹの内の莢膜糖類を使用して防御免疫を生じさせることができるが、同じ方法は、血清群Ｂについては機能しなかった。しかるに、本発明の修飾糖類及び複合体は、莢膜糖類に基づかない髄膜炎菌抗原（例えば、タンパク質抗原、リポ多糖、膜小胞）と共に（例えば、別々に又は混合して）使用され得る。
【０２３６】
髄膜炎菌血清群Ａ［２０９］及びＢ［２１０、２１１］についてゲノム配列が報告されており、適切なタンパク質抗原は、コードされたポリペプチドから選択され得る［例えば、参考文献２１２〜２１７］。候補抗原が、非相同発現を向上させるためにマニピュレートされた［参考文献２１８〜２２０］。
【０２３７】
１つの好ましい組成物は、Ｔｂｐタンパク質とＨｓｆタンパク質とを含む［２２１］。Ｈｓｆは、オートトランスポータータンパク質［２２２〜２２４］（別名、ｎｈｈＡ［２２４］、ＧＮＡ０９９２［２１２］又はＮＭＢ０９９２［２１０］）である。Ｔｂｐは、トランスフェリン結合タンパク質であり［２２５〜２２８］、ＴｂｐＡ及びＴｂｐＢの両方並びに高分子量及び低分子量の形態のＴｂｐＡ及びＴｂｐＢを包含する。Ｔｂｐは、上記の個々のタンパク質と、該タンパク質の複合体と、トランスフェリンと結合し得る他のタンパク質又はそれらの複合体とを包含する。Ｔｂｐは、高分子形態又は低分子形態のいずれかのＴｂｐＡ又はＴｂｐＢを意味し得るが、高分子量形態及び低分子量形態のＴｂｐＡ及び／又はＴｂｐＢが存在することが好ましい。高分子量及び低分子量のＴｂｐＡが存在することが最も好ましい。
【０２３８】
別の好ましい組成物は、ナイセリアの中の異なる機能を有する少なくとも２種の異なるカテゴリーのタンパク質の各々から選択される少なくとも１種の抗原を含む。かかるカテゴリーのタンパク質の例としては、付着因子、オートトランスポータータンパク質、毒素、内在性外膜タンパク質、鉄獲得タンパク質がある。これらの抗原は、参考文献２２９の命名法を用いて以下の通りに選択され得る：ＦｈａＢ、ＮｓｐＡ  ＰｉｌＣ、Ｈｓｆ、Ｈａｐ、ＭａｆＡ、ＭａｆＢ、Ｏｍｐ２６、ＮＭＢ０３１５、ＮＭＢ０９９５、ＮＭＢ１１１９及びＮａｄＡからなる群から選択される少なくとも１種のナイセリア付着因子；Ｈｓｆ、Ｈａｐ、ＩｇＡプロテアーゼ、ＡｓｐＡ及びＮａｄＡからなる群から選択される少なくとも１種のナイセリアオートトランスポーター；ＦｒｐＡ、ＦｒｐＣ、ＦｒｐＡ／Ｃ、ＶａｐＤ、ＮＭ−ＡＤＰＲＴ（ＮＭＢ１３４３）並びにＬＰＳ免疫型Ｌ２とＬＰＳ免疫型Ｌ３の一方又は両方からなる群から選択される少なくとも１種のナイセリア毒素；ＴｂｐＡ、ＴｂｐＢ、ＬｂｐＡ、ＬｂｐＢ、ＨｐｕＡ、ＨｐｕＢ、Ｌｉｐｏ２８（ＧＮＡ２１３２）Ｓｉｂｐ、ＮＭＢ０９６４、ＮＭＢ０２９３、ＦｂｐＡ、Ｂｃｐ、ＢｆｒＡ、ＢｆｒＢ及びＰ２０８６（ＸｔｈＡ）からなる群から選択される少なくとも１種のナイセリアＦｅ獲得タンパク質；ＰｉｌＱ、ＯＭＰ８５、ＦｈａＣ、ＮｓｐＡ、ＴｂｐＡ、ＬｂｐＡ、ＴｓｐＡ、ＴｓｐＢ、ＴｄｆＨ、ＰｏｒＢ、ＭＩｔＡ、ＨｐｕＢ、ＨｉｍＤ、ＨｉｓＤ、ＧＮＡ１８７０、ＯｓｔＡ、ＨｌｐＡ（ＧＮＡ１９４６）、ＮＭＢ１１２４、ＮＭＢ１１６２、ＮＭＢ１２２０、ＮＭＢ１３１３、ＮＭＢ１９５３、ＨｔｒＡ及びＰＬＤＡ（ＯＭＰＬＡ）からなる群から選択される少なくとも１種のナイセリア膜関連タンパク質、好ましくは外膜タンパク質、特に内在性外膜タンパク質。ナイセリア抗原のこれらの組み合わせによって、ナイセリア感染に対するワクチンの有効性が驚異的に高まると言われている［２２９］。
【０２３９】
特に好ましい組成物は、以下の５種の抗原の内の１種以上を含む［２３０］：（１）「ＮａｄＡ」タンパク質（好ましくはオリゴマー形態（例えば、三量体形態）のもの）；（２）「７４１」タンパク質；（３）「９３６の」タンパク質；（４）「９５３」タンパク質；及び（５）「２８７」タンパク質。
【０２４０】
ＭｅｎＢ由来の「ＮａｄＡ」（ナイセリア付着因子Ａ）は、参考文献２１５にタンパク質「９６１」（配列番号：２９４３及び２９４４）として、及び参考文献２１０に「ＮＭＢ１９９４」として（また、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＧＩ：１１３５２９０４及び７２２７２５６も参照）開示されている。該タンパク質の詳細な研究については、参考文献２３１に見出すことが可能である。ＮａｄＡは、本発明に従って使用される場合、各種の形態をとり得る。好ましい形態のＮａｄＡは、野生型配列のトランケーション変異体又は欠失変異体（例えば、参考文献２１８〜２２０において開示されるもの等）である。特に、そのＣ末端膜アンカーを有さないＮａｄＡが好ましい（例えば、２９９６株については残基３５１〜４０５の欠失）。
【０２４１】
ＭｅｎＢ由来の「７４１」タンパク質は、参考文献２１５に開示され（配列番号：２５３５及び２５３６）、及び「ＮＭＢ１８７０」としては参考文献２１０に開示されている（また、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＧＩ：７２２７１２８も参照）。血清群Ａ株［２０９］の対応するタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号７３７９３２２を有する。７４１は、天然におけるリポタンパク質である。７４１タンパク質は、本発明に従って使用される場合、各種形態をとることができる。好ましい形態の７４１は、野生型配列のトランケーション変異体又は欠失変異体（例えば、参考文献２１８〜２２０において開示されるもの等）である。特に、７４１のＮ末端は、そのポリグリシン配列までそれを含んで欠失され得（即ち、株ＭＣ５８について残基１〜７２の欠失）、これは、「ΔＧ」プレフィックスを使用して本明細書において区別され得る場合がある。この欠失によって、発現が高められ得る。また、該欠失によって、７４１の脂質化部位が除去される。各種７４１配列は、参考文献２２０の配列番号：１〜２２において、参考文献２３２の配列番号：１〜２３において、及び参考文献２３３の配列番号：１〜２９９において見出され得る。
【０２４２】
血清群Ｂ由来の「９３６」タンパク質は、参考文献２１５に開示され（配列番号：２８８３及び２８８４）、及び「ＮＭＢ２０９１」としては参考文献２１０に開示されている（また、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＧＩ：７２２７３５３も参照）。血清群Ａにおける対応する遺伝子［２０９］は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号７３７９０９３を有する。９３６タンパク質は、本発明に従って使用される場合、各種形態をとることができる。好ましい形態の９３６は、野生型配列のトランケーション変異体又は欠失変異体（例えば、参考文献２１８〜２２０において開示されるもの等）である。特に、９３６のＮ末端リーダーペプチドは、欠失され得る（例えば、株ＭＣ５８について残基１〜２３の欠失（９３６（ＮＬ）が得られる））。
【０２４３】
血清群Ｂ由来の「９５３」タンパク質は、参考文献２１５に開示され（配列番号：２９１７及び２９１８）、及び「ＮＭＢ１０３０」としては参考文献２１０に開示されている（また、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＧＩ：７２２６２６９も参照）。血清群Ａにおける対応するタンパク質［２０９］は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号７３８０１０８を有する。９５３タンパク質は、本発明に従って使用される場合、各種形態をとることができる。好ましい形態の９５３は、野生型配列のトランケーション変異体又は欠失変異体（例えば、参考文献２１８〜２２０において開示されるもの等）である。特に、９５３のＮ末端リーダーペプチドは、欠失され得る（例えば、株ＭＣ５８について残基１〜１９の欠失）。
【０２４４】
血清群Ｂ由来の「２８７」タンパク質は、参考文献２１５に開示され（配列番号：３１０３及び３１０４）、及び「ＮＭＢ２１３２」としては参考文献２１０に開示され、「ＧＮＡ２１３２」としては参考文献２１２に開示されている（また、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＧＩ：７２２７３８８も参照）。血清群Ａにおける対応するタンパク質［２０９］は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号７３７９０５７を有する。２８７タンパク質は、本発明に従って使用される場合、各種形態をとることができる。好ましい形態の２８７は、野生型配列のトランケーション変異体又は欠失変異体（例えば、参考文献２１８〜２２０において開示されるもの等）である。特に、２８７のＮ末端は、そのポリグリシン配列までそれを含んで欠失され得る（即ち、株ＭＣ５８について残基１〜２４の欠失（ΔＧ２８７が得られる））。
【０２４５】
タンパク質２８７は、好ましくは株２９９６由来であり、或いはより好ましくは株３９４／９８由来である。タンパク質７４１は、好ましくは血清群Ｂ株ＭＣ５８、２９９６、３９４／９８又は９５Ｎ４７７に由来し、又は血清群Ｃ株９０／１８３１１に由来する。株ＭＣ５８がより好ましい。タンパク質９３６、９５３及びＮａｄＡは、好ましくは株２９９６に由来する。組成物が特定のタンパク質抗原（例えば、７４１又は２８７）を含む場合、該組成物は、１種超の異型におけるその抗原（例えば、同一のタンパク質であるが、１種超の株に由来するもの）を含むことができる。これらのタンパク質は、タンデム又は別々のタンパク質として含まれ得る。
【０２４６】
本発明の組成物中に含まれ得る他のＭｅｎＢポリペプチド抗原としては、以下のアミノ酸配列：参考文献２１３由来の配列番号：６５０；参考文献２１３由来の配列番号：８７８；参考文献２１３由来の配列番号：８８４；参考文献２１４由来の配列番号：４；参考文献２１５由来の配列番号：５９８；参考文献２１５由来の配列番号：８１８；参考文献２１５由来の配列番号：８６４；参考文献２１５由来の配列番号：８６６；参考文献２１５由来の配列番号：１１９６；参考文献２１５由来の配列番号：１２７２；参考文献２１５由来の配列番号：１２７４；参考文献２１５由来の配列番号：１６４０；参考文献２１５由来の配列番号：１７８８；参考文献２１５由来の配列番号：２２８８；参考文献２１５由来の配列番号：２４６６；参考文献２１５由来の配列番号：２５５４；参考文献２１５由来の配列番号：２５７６；参考文献２１５由来の配列番号：２６０６；参考文献２１５由来の配列番号：２６０８；参考文献２１５由来の配列番号：２６１６；参考文献２１５由来の配列番号：２６６８；参考文献２１５由来の配列番号：２７８０；参考文献２１５由来の配列番号：２９３２；参考文献２１５由来の配列番号：２９５８；参考文献２１５由来の配列番号：２９７０；参考文献２１５由来の配列番号：２９８８の内の１種を含むものや、（ａ）該配列に対して５０％以上の同一性（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）を有する；及び／又は（ｂ）該配列から少なくともｎ個の連続するアミノ酸の断片（ここでｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上））を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。（ｂ）についての好ましい断片は、関連配列に由来するエピトープを含む。これらのポリペプチドの内の２種以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４種以上）が含まれ得る。
【０２４７】
しかしながら、幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、同一のタンパク質であるが１種超の株に由来するものを含む。この方法は、７４１タンパク質において有効であることが分かった。このタンパク質は、抗髄膜炎菌抗体応答を誘発するための極めて有効な抗原であり、全ての髄膜炎菌血清群に亘って発現する。系統発生学的解析によって、タンパク質が２個の基に分割し、これらの内の１つは再度分割して全体で３個の変異体が得られることが示され［２３４］、所与の変異体に対して増加される血清は、同一の変異体群の中で殺菌性であるが、他の２種の変異体の内の１種を発現する株に対しては活性でない（即ち、変異体内干渉効果があるが、変異体間干渉効果がない）［２３２，２３４］。故に、クロス株有効性が最大になるためには、組成物が、タンパク質７４１の１種超の変異体を含むことが好ましい。
【０２４８】
本発明の組成物は、少数の精製血清群Ｂタンパク質（例えば、ｔ個未満の抗原（ここでｔは、１０、９、８、７、６、５、４又は３である））を含む。該タンパク質は、好ましくは非相同の宿主内で組換え発現し、次いで精製される。ｔ個のＭｅｎＢ抗原を含む組成物については、ｔ個の別々のポリペプチドがあるが、複雑度は更に低下しており、該抗原の内の少なくとも２つが単一のポリペプチド鎖として発現すること（「ハイブリッド」タンパク質［参考文献２１８〜２２０］）、即ちｔ個の抗原がｔ個未満のポリペプチドを形成するように発現することが好ましい。ハイブリッドタンパク質は、２つの主要な利点を提供する。それは即ち、第１には、不安定又はそれ自体で不十分に発現したタンパク質は、課題を克服する適切なハイブリッドパートナーを付加することによって助力を受け得ること；第２には、２種の別々に有用なタンパク質を産生するために用いられる必要がある発現及び精製が１回だけなので、商業生産が単純化されること、である。本発明の組成物中に含まれるハイブリッドは、上記の５種のタンパク質の２種以上（即ち、２、３、４又は５種）を含むことができる。５種のタンパク質の内の２種からなるハイブリッドが好ましい。
【０２４９】
別の好ましい組成物は、血清群Ｂリポオリゴ糖（ＬＯＳ）を含む［２３５］。ＬＯＳは、血清群Ｂポリペプチドに加えて使用され得るか、若しくはそれ／それらの代わりに使用され得る。
【０２５０】
膜小胞もまた、該組成物において使用され得る。これらの小胞は、髄膜炎菌外膜を崩壊させて外膜のタンパク質成分を含む外膜の小胞を形成することによって得られるいずれかのプロテオリポソーム小胞であり得る。「ＯＭＶ」は、（例えば、界面活性剤処理によって）細菌から人工的に調製され、しかるに微細小胞（ＭＶ［２３６］）及び「未変性ＯＭＶ」（「ＮＯＭＶ」［２３７］）（その両方は、細菌増殖中に自然に形成し、培養培地に放出される天然由来の膜小胞である）から区別される。ＭＶは、ナイセリアをブロス培養培地中で培養し、ブロス培養培地中のより小さなブレブから細胞全体を分離し、次いで細胞欠失培地からＭＶを回収することによって得ることが可能である。ＭＶの製造に用いられる株は、培養において産生するＭＶの量に基づいて一般的に選択することが可能であり、例えば、参考文献２３８及び２３９においては、ＭＶ産生が高いナイセリアについて記載されている。また、小胞は、ｍｌｔＡノックアウト株から得ることも可能である［２４０］。
【０２５１】
発熱活性を低下させるために、該細菌は、エンドトキシン（ＬＰＳ）レベルが低いことが好ましい。適切な変異細菌が知られており、例えば、変異ナイセリア［２４１］や変異ヘリコバクター［２４２］が知られている。グラム陰性菌からＬＰＳ欠失外膜を調製するためのプロセスは、参考文献２４３に開示されている。
【０２５２】
該細菌は、野生型細菌であってよく、又は組換え細菌であってよい。好ましい組換え細菌は、（対応する野生株と比較して）イムノゲン（例えば、ＮｓｐＡ、タンパク質２８７［２４４］、タンパク質７４１［２４４］、ＴｂｐＡ、ＴｂｐＢ、スーパーオキシドジスムターゼ［２４５］等）を過剰発現する。該細菌は、１種超のＰｏｒＡクラスＩ外膜タンパク質（例えば、ＰｏｒＡサブタイプ：Ｐ１．７，１６；Ｐ１．５，２；Ｐ１．１９，１５；Ｐ１．５ｃ，１０；Ｐ１．１２，１３；及びＰ１．７ｈ，４の内の２、３、４、５又は６種）を発現することができる［例えば、参考文献２４６及び２４７］。
【０２５３】
本発明で使用され得る他の組換え細菌は、特定の遺伝子産物の発現を低下する（又は、好ましくはノックアウトする）ために、１つ以上の変異を有する（例えば、参考文献２４８及び２４９）。ダウンレギュレーション及び／又はノックアウトのための好ましい遺伝子としては：（ａ）Ｃｐｓ、ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＣ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＧａｌＥ、ＨｔｒＢ／ＭｓｂＢ、ＬｂｐＡ、ＬｂｐＢ、ＬｐｘＫ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡ及び／又はＴｂｐＢ［２４８］；（ｂ）ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＣ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＧａｌＥ、ＨｔｒＢ／ＭｓｂＢ、ＬｂｐＡ、ＬｂｐＢ、ＬｐｘＫ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｈｏＰ、ＰｉｌＣ、ＰｍｒＥ、ＰｍｒＦ、ＰｏｒＡ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡ及び／又はＴｂｐＢ［２４９］；（ｃ）溶解トランスグリコシラーゼＮＭＢ００３３［２５０］；（ｄ）ＥｘｂＢ、ＥｘｂＤ、ｒｍｐＭ、ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＤ、ＧａｌＥ、ＬｂｐＡ、ＬｐｂＢ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡ及び／又はＴｂｐＢ［２５１］；及び（ｅ）ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＯｐＡ、ＯｐＣ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＤ、ＳｙｎＡ、ＳｙｎＢ及び／又はＳｙｎＣ［２５２］が挙げられる。
【０２５４】
これらの非糖抗原のための原料としての血清群Ｂの中の好ましい株は、ＭＣ５８、２９９６、Ｈ４４／７６、３９４／９８及びニュージーランド株９８／２５４である。しかしながら、使用する最良の血清タイプ及び株は、特定の地理的位置における一般的な株によって決まる。例えば、髄膜炎菌は、任意の血清サブタイプ（Ｐ１．２；Ｐ１．４；Ｐ１．５；Ｐ１．５，２；Ｐ１．７，１６；Ｐ１．７，１６ｂ；Ｐ１．９；Ｐ１．９，１５；Ｐ１．１２，１３；Ｐ１．１３；Ｐ１．１４；Ｐ１．１５；Ｐ１．２１，１６；Ｐ１．２２，１４；等）及び任意の免疫型（例えば、Ｌ１；Ｌ３，３，７；Ｌ１０；等）の任意の血清タイプ（例えば、１、２ａ、２ｂ、４、１４、１５、１６等）のものであり得、好ましい株としては：（ａ）Ｂ：４：Ｐ１．４；（ｂ）Ｂ：４：Ｐ１．１５；（ｃ）Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６；及び（ｄ）Ｂ：４：Ｐ１．７ｂ，４が挙げられる。髄膜炎菌は、超侵襲性及び超毒性系統等、任意の適切な系統（例えば、以下の７種の超有毒性系統のいずれか：亜群Ｉ；亜群ＩＩＩ；亜群ＩＶ−１；ＥＴ−５複合体；ＥＴ−３７複合体；Ａ４クラスター；系統３）に由来するものであってよい。これらの系統は、多遺伝子座酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）によって明らかにされるが、髄膜炎菌を分類するために多座配列タイピング（ＭＬＳＴ）も使用されてきた［参考文献２５３］（例えば、ＥＴ−３７複合体は、ＭＬＳＴによるＳＴ−１１複合体であり、ＥＴ−５複合体は、ＳＴ−３２（ＥＴ−５）であり、系統３は、ＳＴ−４１／４４等である）。
【０２５５】
ＭｅｎＢ超毒性系統Ａ４、ＥＴ−５及び系統３の内の２種又は３種に対して有効である血清殺菌性抗体応答を誘発するために、非糖抗原を使用することができる。それらは、超毒性系統の亜群Ｉ、亜群ＩＩＩ、亜群ＩＶ−１又はＥＴ−３７複合体の内の１種以上に対する、及び他の系統（例えば、超侵襲性系統）に対する殺菌性抗体応答を更に誘発することができる。これらの抗体応答は、マウスにおいて都合よく測定され、ワクチン有効性の標準的指標である［例えば、参考文献２１２の巻末の注１４を参照］。血清殺菌性活性（ＳＢＡ）は、補体によって媒介される殺菌について評価するものであって、ヒト又は乳児ウサギの補体を使用してアッセイされ得る。ＷＨＯの基準は、ワクチンによって、９０％超のレシピエントにおけるＳＢＡの少なくとも４倍の増大が誘発されることを義務づけている。
【０２５６】
該組成物は、これらの超毒性系統の中のどのＭｅｎＢ株に対しても殺菌性抗体を誘発する必要はなく；むしろ、特定の超毒性系統の中の血清群Ｂ髄膜炎菌のより多くの株の内の４種の任意の所与の群については、該組成物によって誘発される抗体は、該群の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％以上）に対して殺菌性である。株の好ましい群は、以下の国の内の少なくとも４カ国において単離された株を含む：ＧＢ、ＡＵ、ＣＡ、ＮＯ、ＩＴ、ＵＳ、ＮＺ、ＮＬ、ＢＲ及びＣＵ。血清は、好ましくは、殺菌性力価が少なくとも１０２４（例えば、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８以上、好ましくは少なくとも２１４）であって、即ち、参考文献２１２に記載されるように、血清は、１／１０２４に希釈される場合、特定の株の少なくとも５０％の試験細菌を死滅させることが可能である。
【０２５７】
好ましい組成物は、血清群Ｂ髄膜炎菌の以下の株に対する殺菌性応答を誘発することが可能である：（ｉ）クラスターＡ４由来の、株９６１〜５９４５（Ｂ：２ｂ：Ｐ１．２１，１６）及び／又は株Ｇ２１３６（Ｂ：−）；（ｉｉ）ＥＴ−５複合体由来の、株ＭＣ５８（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６ｂ）及び／又は株４４／７６（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６）；（ｉｉｉ）系統３由来の、株３９４／９８（Ｂ：４：Ｐ１．４）及び／又は株ＢＺ１９８（Ｂ：ＮＴ：−）。より好ましい組成物は、株９６１〜５９４５、４４／７６及び３９４／９８に対する殺菌性応答を誘発することができる。株９６１〜５９４５及びＧ２１３６は、両ナイセリアＭＬＳＴ参考株である［参考文献２５４におけるｉｄ６３８及び１００２］。株ＭＣ５８は、広く利用可能であり（例えば、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−３３５）、参考文献２１０において配列化された株であった。株４４／７６は、広く使用され、特徴が記述されてきており（例えば、参考文献２５５）、ナイセリアＭＬＳＴ参考株の内の１種である［参考文献２５４のｉｄ２３７；参考文献２５６の表２の３２行目］。株３９４／９８は、元々１９９８年にニュージーランドで単離されたものであって、この株を使用した研究が幾つか公表されている（例えば、参考文献２５７及び２５８）。株ＢＺ１９８は、別のＭＬＳＴ参考株である［参考文献２５４のｉｄ４０９；参考文献２５６の表２の４１行目］。該組成物は、ＥＴ−３７複合体由来の血清群Ｗ１３５株ＬＮＰ１７５９２（Ｗ１３５：２ａ：Ｐ１．５，２）に対する殺菌性応答を更に誘発することができる。
【０２５８】
一般
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」並びに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘだけからなることができるか、又は更なる何か（例えば、Ｘ＋Ｙ）を含むことができる。
【０２５９】
「実質的に」という語は、「完全に」を除外するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要な場合、「実質的に」という語は、本発明の定義から省略され得る。
【０２６０】
数値ｘに関する「約」という用語は、例えばｘ±１０％を意味する。
【０２６１】
「アルキル」という用語は、直鎖及び分岐鎖の形態のアルキル基を意味するために本明細書において使用される。しかしながら、「アルキル」という用語は、通常直鎖形態のアルキル基を意味する。アルキル基は、−Ｏ−、−ＮＨ−又は−Ｓから選択される１、２又は３個のヘテロ原子によって割込まれ得る。アルキル基は、１、２又は３個の二重結合及び／又は三重結合によって割込まれ得る。しかしながら、「アルキル」という用語は、ヘテロ原子割込み或いは二重結合割込み又は三重結合割込みを有さないアルキル基を通常意味する。Ｃ１−６アルキル基に対する参照がなされる場合、アルキル基が、１〜６個の間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６）を含有し得ることが意味される。
【０２６２】
「アルキレン」という用語は、上記記載の通り、二価のアルキル基を意味するために本明細書において使用される。Ｃ１−５アルキレン基に対する参照がなされる場合、アルキレン基が、１〜５個の間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５）を含有し得ることが意味される。同様に、Ｃ１−４アルキレン基に対する参照がなされる場合、アルキレン基が、１〜４個の間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４）を含有し得ることが意味される。
【０２６３】
「アミノ基」という用語は、式：−ＮＨ２又は−ＮＨ−Ｅ（ここでＥは窒素保護基である）の基を含む。典型的な窒素保護基の例は、上で記載される。
【０２６４】
「アミン」という用語は、特に他に文脈によって示されない限り、式：−ＮＨ２の基を意味する。
【０２６５】
「修飾莢膜糖」という用語は、適切な修飾によって未変性莢膜糖から得ることができる糖を意味する。故に、未変性莢膜糖における反復単糖単位の塩基性配列は、本発明の修飾莢膜糖類において保持される。
【０２６６】
「糖」という用語は、オリゴ糖類（例えば、２〜３９個の単糖単位を含有）及び多糖類（例えば、４０個以上の単糖単位を含有）の両方を包含する。細菌において天然に見出されるように、未変性莢膜糖類は、一般的に多糖類の形態をとる。多糖類をマニピュレートして、より短いオリゴ糖類を得ることができる。オリゴ糖類は、未変性多糖類の精製及び／又は解重合の後、サイジングによって（例えば、緩酸における加水分解によって、加熱によって、サイジングクロマトグラフィーによって、等）、得ることが可能である。
【０２６７】
動物（及び特にウシ）の材料が細胞の培養に使用される場合、それらは、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない原料から得られなければならない。全体として、動物由来材料が全体的に存在しない細胞を培養することが好ましい。
【０２６８】
イオン化可能な基は、本明細書における式に示される中性形態の中に存在し得る、或いは、例えばｐＨに応じて、荷電性形態の中に存在し得るということはいうまでもない。しかるに、リン酸基は−Ｐ−Ｏ−（ＯＨ）２として示すことが可能であり、この式は、中性リン酸基の単なる代表であって、他の荷電性形態は本発明に包含される。同様に、
カチオン性基及びアニオン性基に対する本明細書における参照は、例えばアミン−ＮＨ２がプロトン化されてカチオン性−ＮＨ３＋基が得られる（このプロトン化は、生理学的ｐＨで生じるものである）生理学的条件の下でその基上に存在する電荷を意味するためになされなければならない。更に、カルボキシル−ＣＯＯＨが脱プロトン化されてアニオン性−ＣＯＯ−基が得られる（このプロトン化は、生理学的ｐＨで生じ得るものである）。その上、本発明は、本発明の分子の荷電性形態の塩を包含する。糖環は、開いた形態及び閉じた形態で存在することが可能であり、閉じた形態が本明細書において構造式に示されると共に、開いた形態も本発明に包含される。同様に、本発明は、互変異性体（例えば、イミン／エナミン互変異性体）、配座異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体等を含む、本発明の分子の異性体形態を包含するものである。
【０２６９】
血清群の後、髄膜炎菌分類は、血清タイプ、血清サブタイプ、次いで免疫型を含み、標準的命名法は、血清群、血清タイプ、血清サブタイプ及び免疫型を記載し、各々は、コロン（例えば、Ｂ：４：Ｐ１．１５：Ｌ３，７，９）で区切られる。血清群Ｂの中で、幾つかの系統は、多くの場合（超侵襲性の）疾患を生じさせ、幾つかの系統は、他の（超毒性）疾患よりも重度の形態の疾患を生じさせ、他は、めったに疾患を生じさせない。７種の超毒性系統（即ち、亜群Ｉ、ＩＩＩ及びＩＶ−１、ＥＴ−５複合体、ＥＴ−３７複合体、Ａ４クラスター及び系統３）が認められる。これらは、多遺伝子座酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）によって定義されてきたが、多遺伝子座配列タイピング（ＭＬＳＴ）もまた、髄膜炎菌を分類するために使用されてきた［参考文献２５６］。
【図面の簡単な説明】
【０２７０】
【図１】ＣＲＭ１９７−ＭｅｎＡ複合体の化学合成についての模式図を提供する。「ＭｅｎＡ１０／９０」（約１０％の単糖単位上に４，５−ジヒドロキシペンチルカルバメートブロック基と、約９０％の単糖単位上に２−ヒドロキシエチルカルバメートブロック基とを含むＭｅｎＡオリゴ糖）及び「ＭｅｎＡ１０／０」（約１０％の単糖単位上に４，５−ジヒドロキシペンチルカルバメートブロック基を含むＭｅｎＡオリゴ糖）の一般的構造が示される。
【図２】（パネルＡ）サイジングの前で且つ（パネルＢ）サイジングの後のＭｅｎＡオリゴ糖類が２１４ｎｍでの陰イオン交換解析的なプロファイルを提供する。
【図３】化学修飾なしのＭｅｎＡオリゴ糖（パネルＡ）、ＭｅｎＡ１０／９０オリゴ糖（パネルＢ）及びＭｅｎＡ１０／０オリゴ糖（パネルＣ）の２５℃での６００ＭＨｚ  １Ｈ  ＮＭＲスペクトルを提供する。
【図４】化学修飾なしのＭｅｎＡオリゴ糖、ＭｅｎＡ１０／９０オリゴ糖及びＭｅｎＡ１０／０オリゴ糖による３７℃での保存中に発現するホスホモノエステルのパーセンテージを比較する。
【図５】ＭｅｎＡオリゴ糖の３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルを提供する。
【図６】化学修飾なしのＭｅｎＡオリゴ糖、ＭｅｎＡ１０／９０オリゴ糖及びＭｅｎＡ１０／０オリゴ糖の３７℃での保存中の３１Ｐ  ＮＭＲで測定された重合（ＤＰ）の程度を比較する。
【図７】ＣＲＭ−ＭｅｎＡオリゴ糖複合体：Ｌａｎｅ  Ｍ−Ｍｗ  Ｍａｒｋｅｒｓ；Ｌａｎｅ  １−ＣＲＭ；Ｌａｎｅ  ２−ＣＲＭ−ＭｅｎＡ１０／９０；及びＬａｎｅ  ３−ＣＲＭ−ＭｅｎＡ１０／０のＳＤＳ−Ｐａｇｅプロファイルを提供する。
【図８】ＣＲＭ−ＭｅｎＡ１０／９０オリゴ糖複合体及びＣＲＭ−ＭｅｎＡ１０／０オリゴ糖複合体から３７℃での保存中に放出される遊離糖（ＦＳ）を比較する。
【図９】ＣＲＭ−ＭｅｎＡ１０／９０オリゴ糖複合体及びＣＲＭ−ＭｅｎＡ１０／０オリゴ糖複合体によって３７℃で保存中に発現するホスホモノエステルのパーセンテージを比較する。
【発明を実施するための形態】
【０２７１】
実施例１
Ｍｅｎ  Ａオリゴ糖の修飾
ＭｅｎＡ  多糖の加水分解の制御
ＭｅｎＡ多糖溶液の化学的加水分解によって、ＭｅｎＡオリゴ糖類を生成した。概略説明すると、終濃度が１０ｍｇ／ｍＬでＭｅｎＡ多糖を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．７５）に可溶化した。約１０の重合度（ＤＰ）に達するまで、前記溶液を７３℃で加熱した。以下の式：ＤＰ＝１／｛０．５８１７［１−（αｔ／αｍ）］｝（ここで、αｍは、溶液の温度が５０℃の場合の６つの試料の旋光能の平均値であり、αｔは、時間ｔにおける旋光能である）に従って、時間と共に溶液の光学活性（α  Ｈｇ  ３６５ｎｍ）の変化をモニタすることによって、前記加水分解を制御した。ＤＰが１０である場合に対応するα値に達した時、加水分解を停止した。加水分解反応終了時、室温及び約６．５に調製されたｐＨで前記溶液を冷却した。
【０２７２】
ＭｅｎＡオリゴ糖のサイズ分画
ＭｅｎＡ多糖の酸性加水分解を制御することによって、目標平均ＤＰを有する多分散度が得られる。複合体調製のために、オリゴ糖多分散度は、二段階サイズ分画を使用して更に限定され得る。これらのサイジングステップは、全リン（Ｐｔ）の値と末端モノエステルリン酸塩（Ｐｍ）の値との間のモル比で測定する場合、典型的には約１０の値から１５〜２０間の値までＭｅｎＡオリゴ糖類のＤＰを変化させる。参考文献２５９に記載される方法に従ってＰｔ濃度を決定し、ジャガイモ酸性ホスファターゼとの酵素反応によって放出される無機リン酸塩を測定することによってＰｍを決定した［２６０］。
【０２７３】
概略説明すると、高分子量種を除去するために、まず、３０ＫＤａ接線流膜によってＭｅｎＡ加水分解物を限外濾過した。この手法の間、生成物を１０倍に濃縮し、次いで体積が１３の５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対してダイアフィルターする。所望のオリゴ糖類を含有する透過物を、濃縮水を廃棄すると共に回収する。
【０２７４】
第２ステップにおいては、アニオン性交換カラムクロマトグラフィーによって透過物を分画する。このステップは、免疫原性が不十分であり得る６未満のＤＰを特徴とする低Ｍｗ種を除去するようにデザインされる［２６１］。既に５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．５）で平衡させたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗをパックしたカラム上に、３０ＫＤａ限外濾過から得られるオリゴ糖類混合物をロードした。オリゴ糖／パック体積の比は、パック樹脂１７ｍｇ／ｍＬであった。次いで、５カラム体積（ｃｖ）の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した。次いで、１０ｃｖの５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液／１２５ｍＭＮａＣｌの洗浄液（ｐＨ６．５）をカラムに加えて、ＤＰが６以下のオリゴ糖類を溶出した。次いで、５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液／５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．５）による溶出によって、所望のオリゴ糖類分画物を回収した。５ｃｖの２Ｍ  ＮａＣｌによるストリッピングと、１Ｍ  ＮａＯＨによる浄化によって、この手法を完了した。
【０２７５】
分画の前後でオリゴ糖多分散度を測定するために、解析的陰イオン交換クロマトグラフィを用いた。概略説明すると、Ｍｏｎｏ−Ｑ  ＨＲ  ５／５カラムを使用してＨＰＬＣによってＭｅｎＡオリゴ糖の多分散度を解析した。水による平衡化の後、約１ｍｇの糖を含有する１ｍＬの試料をカラム上にロードし、次いでそれを、０．５ｍＬの流量で、直線濃度勾配が０〜６０％のＮａＣｌ（１Ｍ）で発現させた。２１４ｎｍでクロマトグラムをモニタした。テストされた多分散試料において６未満のＤＰを有するオリゴ糖類の存在又は除去を同定するために、質量分析及び１Ｈ  ＮＭＲによって証明されたように、それぞれ５及び６の定義されたＤＰを有する単分散ＭｅｎＡオリゴ糖の標準製剤を使用した。図２は、サイジングされたＭｅｎＡオリゴ糖類（パネルＢ）と比較した加水分解物（パネルＡ）の解析的プロファイルを示す。
【０２７６】
対イオン交換
非水溶媒中のオリゴ糖に溶解度を与えるナトリウム対イオンのテトラブチルアンモニウムとの交換のため、３ＫＤａ膜上で、二段階サイズ分画手法からのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液を限外濾過した。概略説明すると、体積４の１０ｍＭテトラブチルアンモニウムブロミドに対して、その後体積１０の水に対して、ＭｅｎＡオリゴ糖溶液をダイアフィルターした。所望の生成物を含有する残留物を回収し、透過物を廃棄した。回転蒸発によって、残留物から水を除去した。
【０２７７】
ＭｅｎＡオリゴ糖の化学修飾
２つの異なる標的構造を得るために、１，１’カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）活性化と、その後の１−アミノ−４，５−ペンタンジオール（ＡＰＤ）単独か、ＡＰＤ及び２−アミノエタノール（ＥＴＡ）のいずれかとの反応とを用いて、ＭｅｎＡオリゴ糖を修飾した（図１）：
ｉ）約１０％の単糖単位上における４，５−ジヒドロキシペンチルカルバメートブロック基と約９０％の単糖単位上における２−ヒドロキシエチルカルバメートブロック基とを含むＭｅｎＡオリゴ糖（ＭｅｎＡ１０／９０）；及び
ｉｉ）約１０％の単糖単位上における４，５−ジヒドロキシペンチルカルバメートブロック基を含むＭｅｎＡオリゴ糖（ＭｅｎＡ１０／０）。
【０２７８】
概略説明すると、上記の３ＫＤａ膜限外濾過から誘導されるＭｅｎＡオリゴ糖を、約１０ｍｇ／ｍＬの終濃度にＤＭＳＯ中で可溶化した。この溶液に、（ＭｅｎＡ単糖単位のモル数と比較して）２０倍のモル過剰のＣＤＩを添加して、その溶液を室温で２時間撹拌した。次いで、体積が９の低温（−２０℃）酢酸エチルに活性化オリゴ糖溶液を添加し、その後、ＭｅｎＡ単糖単位と等モルの終濃度にＣａＣｌ２の２Ｍ溶液を添加した。混合物を３０分間撹拌し、オリゴ糖の沈降後、ほとんどの上清を吸入によって除去し、ペレットを、遠心分離によって回収し、酢酸エチルで３回洗浄し、真空下で乾燥した。
【０２７９】
ブロック基の付加のために、活性化オリゴ糖を１０ｍｇ／ｍＬの終濃度にＤＭＳＯ中で可溶化した。「ＭｅｎＡ１０／０」オリゴ糖を得るために、（ＭｅｎＡ単糖単位のモル数と比較して）０．１倍のモル過剰のＡＰＤを添加し、反応液を室温で２時間撹拌した。この時以後、体積が１９の０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を撹拌下で添加した。この操作の間、形成されるいかなる蛋白石濁も、０．２μｍ膜による濾過によって除去した。「ＭｅｎＡ１０／９０」オリゴ糖を得るために、０．６倍のモル過剰のトリエチルアミン及び０．１倍モル過剰のＡＰＤを添加して、反応液を室温で２時間撹拌した。その後、（ＭｅｎＡ単糖単位のモル数と比較して）５０倍のモル過剰のＥＴＡを添加し、反応液を更に２時間撹拌することを続けた。再度、この時以後、体積が１９の０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を撹拌下で添加し、０．２μｍの膜による濾過によっていかなる蛋白石濁も除去した。
【０２８０】
３ＫＤａ膜上の限外濾過によって、過剰の低分子量試薬から誘導体化オリゴ糖の粗溶液を精製した。まず、前記溶液を約２０倍に濃縮し、次いで体積が１０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に対してダイアフィルターを行い、その後、体積が１０の蒸留水に対して行った。残留物から精製生成物を回収し、透過物を廃棄した。
【０２８１】
１Ｈ  ＮＭＲによる化学修飾の確認
所望の化学修飾が生じたことを確認するためのＮＭＲによって、化学修飾ＭｅｎＡオリゴ糖の特性を評価した。
【０２８２】
未変性ＭｅｎＡオリゴ糖類の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、図３（パネルＡ）に示される。スペクトルは、公表された文献［２６２、２６３］と一致している。純粋ＡＰＤ及びＥＴＡにおいて行われた１Ｈ  ＮＭＲによって、以下のシグナルが得られた：ＡＰＤシグナル：ＨＯＣＨ２ＡＣＨＢ（ＯＨ）ＣＨ２ＣＣＨ２ＤＣＨ２ＥＮＨ２（３．６ｐｐｍでＨＡ、３．７ｐｐｍでＨＢ、１．５ｐｐｍでＨＣ、１．６ｐｐｍでＨＤ、２．７ｐｐｍでＨＥ）；ＥＴＡシグナル：ＨＯＣＨ２ＦＣＨ２ＧＮＨ２（４．４ｐｐｍでＨＦ、３．６ｐｐｍでＨＧ）。これらの割当をガイドとして使用して、誘導体化オリゴ糖類のスペクトルにおけるＡＰＤ及びＥＴＡシグナルを同定した。ＭｅｎＡ１０／９０オリゴ糖の１Ｈ  ＮＭＲスペクトは、図３（パネルＢ）において報告される。ＭｅｎＡ１０／０オリゴ糖の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、図３（パネルＣ）において報告される。ＥＴＡ基又はＡＰＤ基と、Ｎ−アセチル−マンノサミンの４位及び／又は３位において導入されるカルボニル基との間の共有結合を、ＨＳＱＣスペクトルにおいて検出される（１Ｈ，１３Ｃ）異種核相関によって確認した。カルボニル基と、ＥＴＡのＨＧ又はＡＰＤのＨＥとの間の長距離相関ピークを検出した。同様に、カルボニル基によって、Ｎ−アセチル−マンノサミンの３／４位のジェミナルプロトンとの長距離相関が得られた。化学的処理によって導入されるＡＰＤ基のパーセンテージを、ＡＰＤ及びＭｅｎＡからの選択シグナルの積分によって推定した。１．５ｐｐｍ（ＡＰＤ基）でのＨＤ＋ＨＣ重なりシグナルを、４．６ｐｐｍ（ＭｅｎＡオリゴ糖）でのＨ２ピークに対して積分した。異なる実験において、６％〜１４％のＭｅｎＡ単糖単位が、ＡＰＤ基と置換された。同一の方法に従って、ＥＴＡ基を、４．６ｐｐｍ（ＭｅｎＡオリゴ糖）でのＨ２ピークに対する３．６ｐｐｍ（ＥＴＡ基）でのＨＦ重なりシグナルの比によって推定した。ＡＰＤシグナルとの部分的重なり（３．６ｐｐｍでのＨＡ及び３．７ｐｐｍでのＨＢ）のため、ＨＦの積分を、ＨＤ＋ＨＣ値の３／４減算した。異なる実験において、６６％〜８５％のＭｅｎＡ単糖単位が、ＥＴＡ基と置換された。期待されたように、図３において、ＥＴＡ基に関連したパネルＣシグナルは存在せず、それによって、提唱された構造と、構造解析及び同一性評価のためのツールとしてのＮＭＲの適合性とが確認された。図３（パネルＡ）は、血清群Ａ髄膜炎菌多糖の酸性加水分解の後、Ｏ−アセチル化が保存されることを示しており、カルバメート基によって、局所磁場が変化し、割当がより複雑になるが、Ｏ−アセチル化状態は、化学修飾の後において維持されると思われる（図３、パネルＢ及びＣ）。
【０２８３】
ＭｅｎＡオリゴ糖類の安定性
ホスホジエステル結合における加水分解の帰結であるＭｅｎＡオリゴ糖類の分解によって、ホスホモノエステル基が新しく形成される。ＭｅｎＡ１０／９０オリゴ糖及びＭｅｎＡ１０／０オリゴ糖の安定性を、未変性オリゴ糖類の安定性と比較した。
【０２８４】
概略説明すると、１．４〜３ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のＭｅｎＡオリゴ糖類の溶液のインキュベーションを、１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ７．２）において３７℃で行った。４２日間に亘る異なる時点において、保存中に生成するホスホモノエステルの量について、オリゴ糖類を解析した。
【０２８５】
図４は、前述の３種のオリゴ糖について、３７℃での保存中におけるホスホモノエステル基の増加を示す。ホスホモノエステルのパーセンテージを、［Ｐｍ（ｔ）―Ｐｍ（０）］×１００／［（Ｐｔ（０）−Ｐｍ（０）］（ここで、Ｐｍ（ｔ）及びＰｔ（ｔ）は、時間ｔにおけるホスホモノエステル基の濃度及び全リンであり；Ｐｍ（０）及びＰｔ（０）は、時間０のホスホモノエステル基の濃度及び全リンである）として算出した。参考文献２５９に記載された方法に従って全リン（Ｐｔ）濃度を決定し、そしてジャガイモ酸性ホスファターゼとの酵素反応によって放出された無機リン酸塩を測定することによって末端モノエステルリン酸塩（Ｐｍ）を決定した［２６０］。
【０２８６】
ＭｅｎＡ１０／９０オリゴ糖及びＭｅｎＡ１０／０オリゴ糖は、時間に亘ってホスホモノエステル基を放出する傾向が低減することによって証明されるように、未変性オリゴ糖と比較して安定性が向上した。これらの結果は、本発明によるブロック基でＮ−アセチルマンノサミンの４位及び３位のヒドロキシル基をブロック化することによって、ＭｅｎＡオリゴ糖の安定性が高まり得ることを示す。
【０２８７】
同様に、３１Ｐ  ＮＭＲ解析［２６４］を用いて、１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ７．２）において、３７℃で４２日間、未変性のオリゴ糖類と比較して修飾ＭｅｎＡオリゴ糖類の安定性を評価した。概略説明すると、解重合度の平均（ａｖＤＰ）を、連鎖基（Ｐｉｎ  ｃｈａｉｎ）のホスホジエステルとホスホモノエステル非還元末端基（Ｐｎｏｎ−ｒｅｄ  ｅｎｄ）との間のモル比によって決定した（図５）。
ａｖＤＰ＝［Ｐｉｎ  ｃｈａｉｎ＋１］／Ｐｎｏｎ−ｒｅｄ  ｅｎｄ
再度、ＭｅｎＡ１０／９０オリゴ糖及びＭｅｎＡ１０／０オリゴ糖は、全ての時点で重合度がより大きいことによって証明されるように、未変性オリゴ糖と比較して安定性が向上した（図６）。
【０２８８】
【表１】
0005637689.tif 000029
ＣＲＭ１９７―ＭｅｎＡ複合体
過ヨウ素酸酸化の制御による反応性アルデヒド基の生成
ＭｅｎＡ１０／９０オリゴ糖及びＭｅｎＡ１０／０オリゴ糖におけるＡＰＤから誘導された４，５−ジヒドロキシペンチルカルバメートブロック基のビシナルであるヒドロキシル基を、限定された過ヨウ素酸ナトリウム処理によって酸化して、反応性アルデヒド基を生成した。概略説明すると、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）におけるＭｅｎＡ１０／９０オリゴ糖及びＭｅｎＡ１０／０オリゴ糖の溶液を、ＭｅｎＡ単糖単位１モル当たり０．１モルのＮａＩＯ４と反応させた。前記反応を、撹拌しながら暗所で行い、２２５ｎｍにおいて分光測光法でモニタした。約２時間後、２２５ｎｍの吸光度がプラトーに達した。前記反応によって生成するアルデヒド基の量を、酸化中に放出されるホルムアルデヒドの等モル量を解析することによって決定した［２６５］。ＮａＩＯ４と等モルの終濃度にエチレングリコールを添加することによって、前記反応を停止させた。
【０２８９】
アルデヒド基の生成は、４，５−ジヒドロキシペンチルカルバメートブロック基の最初の数と比較してほぼ定量的だった。
【０２９０】
酸化オリゴ糖の精製
酸化オリゴ糖類を、３ＫＤａ膜上における限外濾過によって精製した。溶液を２倍に濃縮し、体積が１０の０．５Ｍ  ＮａＣｌに対して、その後体積が１０の蒸留水に対してダイアフィルターした。所望の生成物を含有する残留物を回収し、透過物を廃棄した。回転蒸発によって残留物から水を除去した。
【０２９１】
ＣＲＭ１９７への結合体化
還元的アミノ化を介してＣＲＭ１９７（ジフテリアトキシンの無毒性変異体［２６６］）に酸化ＭｅｎＡオリゴ糖類を結合体化させ、それぞれＣＲＭ−ＭｅｎＡ１０／９０及びＣＲＭ−ＭｅｎＡ１０／０を得た（図１）。
【０２９２】
概略説明すると、タンパク質１モル当たりアルデヒド基が１３モルの比で、ＣＲＭ１９７の５０ｍｇ／ｍＬ溶液において酸化ＭｅｎＡオリゴ糖類を可溶化した。１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を添加して、３０ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得た。次いで、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）におけるＮａＢＨ３ＣＮの２Ｍ溶液を添加して、アルデヒド基に対して７０倍のモル過剰のＮａＢＨ３ＣＮを得た。反応は、３７℃で３日間行った。次いで、体積が１４の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を添加し、その後、（アルデヒド基のモル数と比較して）２５倍のモル過剰のＮａＢＨ４を添加した。いかなる残存するアルデヒド基も消滅させるために、ｐＨを８．５に制御して、混合物を室温で２時間撹拌した。消滅ステップの終了時、ｐＨを再度７．２に調整し、０．２μｍ細孔膜によって溶液を濾過した。
【０２９３】
複合体の精製
３０ＫＤａ膜上の限外濾過によって、過剰の試薬及び残存する未反応オリゴ糖類から、複合体を精製した。体積が１００の０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に対して、その後体積が５０の１０ｍＭヒスチジン（ｐＨ７．２）に対して、反応混合物のダイアフィルターを行った。次いで、精製複合体を含有する溶液を、０．２μｍ細孔膜によって濾過し、２〜８℃で保存した。
【０２９４】
ＣＲＭ１９７への結合体化の確認
ＣＲＭ１９７へのＭｅｎＡオリゴ糖類の結合体化について、ＳＤＳ−Ｐａｇｅによって示した（図７）。濃縮ゲル用７．５％アクリルアミド及び分離ゲル用７．５％アクリルアミドを使用して、参考文献２６７に従ってＳＤＳ−Ｐａｇｅを行った。電気泳動の前に、試料を、試料緩衝液によって１：４に処理し、１０分間沸騰させた。２００Ｖの定常電圧で約４０分間電気泳動を行った。ゲルを、クーマシー染色液によって約２０分間作製し、約４時間酢酸／ＥｔＯＨ溶液（７／４０％）において脱染色した。
【０２９５】
図７における複合体のプロファイルは、ＣＲＭ１９７と比較して、より高分子量の方へシフトしており、ＣＲＭ１９７とは著しく異なる。ＳＤＳ−Ｐａｇｅ解析はまた、高分子量材料の存在を示す。この材料は、結合体化結合反応の間に形成され得るが、このことによって、オリゴ糖分子１個当たりＣＲＭ１９７の付着点が多くなり得る。
【０２９６】
また、糖及びタンパク含有量についての複合体の解析も行った。０．２０〜０．３２の範囲の糖／タンパク質比（ｗｔ／ｗｔ）が観察された。
【０２９７】
ＣＲＭ１９７−ＭｅｎＡ複合体の安定性
ホスホジエステル結合の加水分解から生じる、時間に亘る非結合体化糖の放出を測定することによって、ＣＲＭ１９７−ＭｅｎＡ複合体の安定性を決定した。
【０２９８】
Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０装置（２ｍＬ容量）を、１ｍｌの蒸留水で洗浄し、２回転させた。約０．３ｍｇ／ｍＬの糖を含有する９４０μＬ試料（ＣＲＭ−ＭｅｎＡ１０／９０又はＣＲＭ−ＭｅｎＡ１０／０）に、６０μＬ生理食塩水を添加した。全リン含有量を、前記装置に混合物を添加する前に上記の通りに測定した。１００〜２００μＬの溶液が残留物チャンバに残るまで、前記装置を１９４２ｇで回転させ、次いで２×１ｍＬ生理食塩水で洗浄し、再度回転を行った。透過物チャンバ内の溶液を回収し、生理食塩水で試料体積を３ｍＬに調整した。各試料から誘導された透過物を、上記の通りに全リン含有量について解析した。
【０２９９】
（Ｐ２／Ｐ１）×１００（Ｐ１は、セントリコン処理の前の全リンであり、Ｐ２は、セントリコン処理の後の全リンである）の値は、遊離糖のパーセンテージを示す。９４０μＬの試料又は生理食塩水に６０μＬの約２ｍｇ／ｍＬオリゴ糖を添加し、次いで上記記載の分離手法を適用することによって、膜による遊離オリゴ糖の回収を示すためのスパイキング実験を行った。回収率は、一貫して８０％を越えた。
【０３００】
図８は、複合体ＣＲＭ−ＭｅｎＡ１０／９０が、ＣＲＭ−ＭｅｎＡ１０／０と比較して、遊離糖を放出する傾向の低下を示したことを示している。ＦＳ（遊離糖）は、ＦＳ％（ｔ）−ＦＳ％（０）（ここで、ＦＳ％（ｔ）及びＦＳ％（０）は、それぞれ時間ｔ及び０における遊離糖のパーセンテージである）として算出される。
【０３０１】
ＣＲＭ１９７−ＭｅｎＡ複合体の安定性を、保存中のホスホモノエステル生成を測定することによって決定した。概略説明すると、複合体の溶液のインキュベーションを、１５７〜２５３μｇ／ｍＬの濃度範囲で、１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ７．２）において３７℃で行った。４２日間に亘る異なる時点において、保存中に生成したホスホモノエステルの量について、前記複合体を解析した。
【０３０２】
図９は、前述の２種の複合体について、３７℃で保存中のホスホモノエステル基の増加を示している。ホスホモノエステルのパーセンテージを、上記の通りに算出した。複合体ＣＲＭ−ＭｅｎＡ１０／９０が示すホスホモノエステルを生成する傾向は、ＣＲＭ−ＭｅｎＡ１０／０と比較して低かった。
【０３０３】
ＣＲＭ−ＭｅｎＡ複合体の免疫原性
未変性ＭｅｎＡ莢膜多糖を認識する抗体を誘発するＭｅｎＡ複合体の能力を評価するために、マウスにおいて免疫原性実験を行った。
【０３０４】
ワクチン製剤
ＣＲＭ−ＭｅｎＡ１０／９０及びＣＲＭ  ＭｅｎＡ１０／０複合体を、リン酸ナトリウム緩衝液及びＡｌＰＯ４懸濁液と混合して、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）において終濃度が２０μｇ／ｍＬの糖及び０．６ｍｇ／ｍＬのＡｌ３＋を得た。非アジュバント製剤のために、ＡｌＰＯ４懸濁液を、リン酸ナトリウム緩衝液と交換した。得られたワクチンを、免疫化前に１：５に生理食塩水で希釈した。
【０３０５】
マウスの免疫化
８匹のＢａｌｂ／ｃマウスの群（６〜８週齢の雌）を、２μｇの糖を含有する０．５ｍＬの結合体化ワクチンによって、皮下で２回又は３回免疫した。２回注射スケジュールの場合、１回目と２回目の投与の間の間隔は、４週間であった。免疫化の前、及び２回目の投与の２週間後に、ブリーディングを行った。３回投与スケジュールの場合、０、１４及び２８日目にワクチンを与え、ゼロ時、３回目の免疫化の１日前（２回の血清投与後）及び３回目の免疫化の１４日後（３回の血清投与後）にブリーディングを行った。
【０３０６】
免疫原性
特異的抗ＭｅｎＡ莢膜多糖総ＩｇＧ抗体について、及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａに対する補体媒介血清殺菌活性（ＳＢＡ）について、免疫マウス由来の血清を解析した。
【０３０７】
動物血清分析に適合させた参考文献２６８の方法に従って、特異的抗ＭｅｎＡ莢膜多糖総ＩｇＧ抗体を本質的に決定した。個別のマウス血清を、滴定曲線によって重複して解析した。抗ＭｅｎＡ多糖力価を、Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌｉｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄに基づくソフトウェアを使用して、Ｍｏｕｓｅ  Ｅｌｉｓａ  Ｕｎｉｔ（ＭＥＵ）／ｍＬとして算出した。幾何平均力価（ＧＭＴ）を、各免疫化群について算出した。
【０３０８】
ＳＢＡを、各免疫化群について、ｐｏｓｔ  ＩＩ及びｐｏｓｔ  ＩＩＩ（場合により）血清プールにおいて測定した。標準的ＳＢＡプロトコールは、０．２５％グルコースを添加したＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  Ｂｒｏｔｈにおける試験菌株（ＭｅｎＡ  Ｆ８２３８）の接種材料に基づくものであった。細菌培養物のインキュベーションを、５％ＣＯ２の存在下で３７℃で行い、細菌が指数増殖期の初期に達した時（約０．２２０〜０．２４０  ＯＤ６００）、増殖を停止させた。次いで、ＧＢＢＳ緩衝液における１％ＢＳＡで細菌を１０−４に希釈し、熱不活性血清プール（５６℃で３０分間）と補体の原料としての２５％乳児ウサギ血清との存在下で、５％ＣＯ２で３７℃で１時間インキュベートした。次いで,
反応混合物を、Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎアガー上で平板培養し、３７℃で終夜インキュベートした。殺菌力価を、細菌の５０％の死滅を生じさせる相互血清希釈物として表した。
【０３０９】
表ＩＩは、ＥＬＩＳＡで測定される通りのＧＭＴ（±９５信頼限界）として表される抗ＭｅｎＡ莢膜多糖総ＩｇＧ力価と、ＣＲＭ−ＭｅｎＡ１０／９０及びＣＲＭ−ＭｅｎＡ１０／０によって誘導されるＳＢＡ力価とを示す。両複合体は、殺菌機能活性を有するマウス特異的抗ＭｅｎＡ多糖抗体における誘導が可能であった。
【０３１０】
【表２】
0005637689.tif 000030
第２の実験において、ＣＲＭ−ＭｅｎＡ１０／９０のマウスにおける免疫原性を、ＡｌＰＯ４のある場合とない場合でテストした。ＣＲＭ−ＭｅｎＡ１０／９０の免疫原性は、表ＩＩＩにおいて確認され、その表は、２回及び３回の免疫化後に誘導される特異的抗ＭｅｎＡ  ＩｇＧ抗体力価と、これらの抗体の補体媒介殺菌活性とを示している。前免疫化力価は、陰性（ＳＢＡ＜４）であることが分かった。これらのデータは、アジュバントの存在によって抗体応答が高まることを示唆している。ＭｅｎＡオリゴ糖、ＣＲＭ１９７及びＡｌＰＯ４の物理的混合物が免疫原性ではなかったため、複合体において観察される免疫原性は、明らかにタンパク質担体へのオリゴ糖の化学的結合体化の帰結である。
【０３１１】
【表３】
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実施例２
Ｍｅｎ  Ａ多糖の修飾
ＭｅｎＡ多糖の化学修飾
２０ｍｇの未変性ＭｅｎＡ莢膜多糖（０．０７２ｍｍｏｌ）を、１７０ｍｇ（２．５ｍｍｏｌ）のイミダゾール及び１ｍＬのＣＨ３ＣＮに添加した。磁気バーで撹拌しながら、１６３μＬ（１．５９ｍｍｏｌ）の無水酢酸を添加し、反応液を２１時間５５℃でインキュベートした。イミダゾール：無水酢酸のモル比は、２：４であった。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（１：７ｖｏｌ／ｖｏｌ）に対してＣｅｎｔｒｉｃｏｎセルロース膜（１ｋＤａ分画分子量）を使用したダイアフィルトレーションステップを用いて、反応生成物を精製した。材料を、最終的に真空下で乾燥した（ＳｐｅｅｄＶａｃ）。
【０３１２】
１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲによる化学修飾の確認
アセチル化度を定めるために、修飾ＭｅｎＡ莢膜多糖の完全な構造的特性評価を、１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ分光法によって行った。
【０３１３】
糖鎖のＯ−アセチル化のレベルを定量するために、定量的ＮＭＲ解析を使用した。Ｈ１（Ｎ−アセチル−マンノサミン残基の位置Ｃ−１のプロトン）と比較して、Ｈ２３ＯＡｃピーク（Ｃ−３でＯ−アセチル化されたＮ−アセチル−マンノサミン残基の位置Ｃ−２のプロトン）、Ｈ２４ＯＡｃピーク（Ｃ−４でＯ−アセチル化されたＮ−アセチル−マンノサミン残基の位置Ｃ−２のプロトン）及びＨ２ｄｅＯＡｃピーク（Ｏ−アセチル化されないＮ−アセチルマンノサミン残基の位置Ｃ−２のプロトン）の積分によって、Ｏ−アセチル化のパーセンテージを推定した。Ｈ２３ＯＡｃピーク積分及びＨ２４ＯＡｃピーク積分の合計によって総Ｏ−アセチル化レベルを得た。
【０３１４】
％Ｏ−アセチル化＝［Ｈ２３ＯＡｃ＋Ｈ２４ＯＡｃ］／［Ｈ１ＯＡｃ＋Ｈ１ｄｅＯＡｃ］
更に、Ｈ１（Ｎ−アセチル−マンノサミン残基の位置Ｃ−１のプロトン）と比較して、Ｈ２３ＯＡｃ／Ｈ２４ＯＡｃピーク（Ｃ−３でＯ−アセチル化されたＮ−アセチル−マンノサミン残基の位置Ｃ−３のプロトン及びＣ−４でＯ−アセチル化されたＮ−アセチル−マンノサミン残基の位置Ｃ−４のプロトン）の積分によって、Ｏ−アセチル化パーセンテージを推定した。
【０３１５】
％Ｏ−アセチル化＝［Ｈ２３ＯＡｃ／Ｈ２４ＯＡｃ］／［Ｈ１ＯＡｃ＋Ｈ１ｄｅＯＡｃ］
ＭｅｎＡ多糖類の安定性
上記のように、１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ７．２）において、３７℃で４２日間、未変性多糖及び対応するオリゴ糖と比較して、完全にアセチル化された修飾ＭｅｎＡ莢膜多糖の安定性を評価するために、３１Ｐ  ＮＭＲ解析を使用した。
【０３１６】
完全にＯ−アセチル化された修飾ＭｅｎＡ多糖類は、未変性莢膜多糖及び対応するオリゴ糖よりもはるかに安定的であった。
【０３１７】
【表４】
0005637689.tif 000032
これらの結果から、本発明によるブロック基によってＮ−アセチルマンノサミンの４位及び３位でヒドロキシル基をブロック化することによって、ＭｅｎＡオリゴ糖の安定性を高めることができることが確認される。
【０３１８】
本発明を単なる例によって記載したが、本発明の適用範囲内及び趣旨の範囲内にとどまる限り、変更をなすことが可能であるということが理解されよう。
【０３１９】
参考文献（これらの内容は、参考として本明細書に援用される）
【０３２０】
【化１９−２】
0005637689.tif 000033
【０３２１】
【化１９−３】
0005637689.tif 000034
【０３２２】
【化１９−４】
0005637689.tif 000035
【０３２３】
【化１９−５】
0005637689.tif 000036
【０３２４】
【化１９−６】
0005637689.tif 000037
【０３２５】
【化１９−７】
0005637689.tif 000038
【０３２６】
【化１９−８】
0005637689.tif 000039
【０３２７】
【化１９−９】
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【図１】
0005637689.tif 000047
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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