(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチド主鎖に少なくとも１つのエステル結合を含む非天然タンパク質の製造方法であって、
（ａ）α−ヒドロキシ酸を活性化しうるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素と、
（ｂ）前記アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の存在下において前記α−ヒドロキシ酸と結合可能なサプレッサーｔＲＮＡと、
（ｃ）所望の位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を受けた所望のタンパク質をコードする遺伝子と、
を前記α−ヒドロキシ酸の存在下に細胞内又は細胞抽出液内で発現させることを特徴とし、
前記アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を持つ古細菌又は細菌由来のピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素又はその変異体であり、
前記変異体は、野生型ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素のＣ末端側ドメインにおけるクラス−ＩＩａａＲＳに特徴的な７個のアンチパラレルβ−シートを構成するアミノ酸配列から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置換される変異のみを持つ、
非天然タンパク質の製造方法。
【請求項２】
前記古細菌が、メタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)、メタノサルシナ・バルケリ(Methanosarcina barkeri)、又は、メタノサルシナ・アセチボランス(Methanosarcina acetivorans)、である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、メタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)由来のピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素又はその変異体であり、
前記変異体は、配列番号２に示した野生型ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸配列において３０２位のアラニン、３０６位のチロシン、３０９位のロイシン、３４６位のアスパラギン、３４８位のシステイン、３８４位のチロシン、及び４１７位のトリプトファンから選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置換される変異のみを持つ、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アミノ酸置換が、
３０２位のアラニンからフェニルアラニンへ、
３０６位のチロシンからアラニンへ、
３０９位のロイシンからアラニンへ、
３４６位のアスパラギンからセリンへ、
３４８位のシステインからバリン又はイソロイシンへ、及び
３８４位のチロシンからフェニルアラニンへ
の少なくとも１つのアミノ酸置換を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記α−ヒドロキシ酸が、Ｎ置換６−アミノ−２−ヒドロキシヘキサン酸、又は置換基を有していてもよい３−フェニル乳酸である請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｎ置換６−アミノ−２−ヒドロキシヘキサン酸におけるアミノ基の置換基が、ｔ−ブトキシカルボニル基、又は置換基を有していてもよいフェニル基、ベンジル基、若しくはベンジルオキシカルボニル基である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
大腸菌細胞内で発現させることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物細胞内で発現させることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の記載］
本発明は、日本国特許出願：特願２００７−３０２４５２号（２００７年１１月２２日出願）の優先権主張に基づくものであり、同出願の全記載内容は引用をもって本書に組み込み記載されているものとする。
本発明は、エステル結合を含む非天然タンパク質の製造方法に関し、より詳細には、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素とリボソームにおける翻訳系とを用いて、部位特異的にα−ヒドロキシ酸をタンパク質へ導入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のタンパク質翻訳系に関する技術開発の進展に基づき、非天然アミノ酸を組み込んだ種々のペプチドやタンパク質の合成が可能となっている。これらの非天然構造物は、新規な生理活性物質の開発や工学的な高性能ナノデバイスを作り出す上で重要な技術基盤となる。しかし、細胞内の翻訳系に適合するような非天然の基礎単位が少ないことが、多様な非天然ペプチドや非天然タンパク質を合成する上での一つの障害となっている。【０００３】
タンパク質に新たな機能を付加する上で、ポリペプチド側鎖の構造のみならず、主鎖の構造が重要な役割を果たすことも指摘されている。例えば、膜タンパク質の膜貫通ドメインにおける１つのアミド結合をエステル結合に置換すると、主鎖のペプチド結合に由来する水素結合が破壊されて、当該タンパク質の膜への透過性や受容体活性に大きな影響を与えることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。このような非天然タンパク質を合成するために、部位特異的にポリペプチド主鎖のアミド結合をエステル結合へ置換するいくつかの方法がある。【０００４】
その第一は、試験管内もしくはマイクロインジェクション可能な細胞において、α-ヒドロキシ酸を遺伝暗号に基づいてポリペプチド中に導入する方法である（例えば、非特許文献２及び３参照）。α-ヒドロキシ酸を、酵素的反応ではなく有機化学的反応によって非センスコドン（アンバーコドン、4文字コドンなど）に対応するｔＲＮＡに結合させ、試験管内翻訳系に導入する。それによって、α−ヒドロキシ酸が非センスコドン特異的にリボソームでの翻訳反応でポリペプチドへと導入される。しかし、この方法ではα−ヒドロキシ酸を結合させたｔＲＮＡが一度反応で使用されると再利用されることはない。従って、合成するポリペプチドの分子数以上のα−ヒドロキシ酸を結合させたｔＲＮＡ（２０〜４０μＭ）を有機化学的反応で合成し、試験管内に加えなければならない。その有機化学的な操作が非常に煩雑でありコストもかかる。また、このような系で合成されるα−ヒドロキシ酸を含むポリペプチドの収量は非常に少ない。【０００５】
第二に、試験管内において，リボザイムを用いてα−ヒドロキシ酸を遺伝暗号に基づいてポリペプチド中に導入する方法がある（例えば、非特許文献４参照）。α−ヒドロキシ酸をリボザイムによる酵素的反応によって、非センスコドン（アンバーコドン、４文字コドンなど）に対応するｔＲＮＡに結合させ試験管内翻訳系に導入する。それによってα−ヒドロキシ酸が非センスコドン特異的にリボソームでの翻訳反応でポリペプチドへと導入される。しかし、この方法でも、α−ヒドロキシ酸を結合させたｔＲＮＡが一度反応で使用されると再利用されることはない。従って、操作の煩雑さ及び合成収量の点に関し、上記と同様の問題がある。【０００６】
第三に、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）とｔＲＮＡを用いた生細胞中での非天然型アミノ酸の導入技術が挙げられる。これは、もともと非天然型アミノ酸を認識するか、もしくは認識するように人為的に改変した外来のａａＲＳと、これによって認識され、かつ非センスコドンを認識するサプレッサーｔＲＮＡの遺伝子を大腸菌などの生細胞に導入し発現させる。それにより、酵素的に細胞中で非天然型アミノ酸がサプレッサーｔＲＮＡに結合され、リボソーム上の翻訳反応により部位特異的に非天然型アミノ酸がポリペプチド（タンパク質）へと導入される。ａａＲＳとｔＲＮＡの組み合わせとして、大腸菌内では古細菌型チロシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＴｙｒＲＳ）とアンバーサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒ変異体、リジル−ｔＲＮＡ合成酵素と４文字コドンに対応するｔＲＮＡ、ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）とｔＲＮＡＰｙｌ（例えば、特許文献１参照）が、真核生物では細菌型ＴｙｒＲＳとアンバーサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒ変異体（例えば、非特許文献５参照）、ロイシル−ｔＲＮＡ合成酵素とアンバーサプレッサーｔＲＮＡＬｅｕ変異体、ＰｙｌＲＳとｔＲＮＡＰｙｌが用いられている。しかし、いずれの酵素についてもａａＲＳのもつα−アミノ酸に対する特異性のため、人為的改変によって側鎖の異なるα−アミノ酸の導入には成功しても、これまでα−ヒドロキシ酸の導入に成功した例はない。また、そのように改変することは実際に困難であると考えられている。【０００７】
第四に、大腸菌メチオニル−ｔＲＮＡ合成酵素を用いて、対応するｔＲＮＡに酵素的にメチオニンに対応するα−ヒドロキシ酸を結合させ特殊な試験管内翻訳系でα−ヒドロキシ酸をタンパク質に導入した例が報告されている（非特許文献６参照）。この方法では、ｔＲＮＡは試験管内翻訳系の反応溶液中で何度もα−ヒドロキシ酸を酵素的に結合され、リボソームで用いられるというサイクルを経るため効率はよい。しかし、翻訳系そのものが特殊なアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素とｔＲＮＡの組成をもつものでなければならず、また全てのメチオニンコドンにα−ヒドロキシ酸が導入されるという問題がある。さらに、生細胞では使用することができない。【０００８】
【特許文献１】特開２００７−０３７４４５号公報
【非特許文献１】England PM, Zhang Y, Dougherty DA, Lester HA. “Backbone mutations in transmembrane domains of a ligand-gated ion channel: implications for the mechanism of gating”, Cell 96, 89-98 (1999).
【非特許文献２】Koh JT, Cornish VW, Schultz PG. “An experimental approach to evaluating the role of backbone interactions in proteins using unnatural amino acid mutagenesis”, Biochemistry 36, 11314-11322 (1997)
【非特許文献３】Chapman E, Thorson JS, Schultz PG. “Mutational analysis of backbone hydrogen bonds in staphylococcal nuclease”, J. Am. Chem. Soc. 119, 7151-7152 (1997).
【非特許文献４】Murakami H, Ohta A, Ashigai H, Suga H. “A highly flexible tRNA acylation method for non-natural polypeptide synthesis”, Nat. Methods 3, 357-359 (2006).
【非特許文献５】Wang L, Brock A, Herberich B, Schultz PG. “Expanding the genetic code of Escherichia coli”, Science 292, 498-500 (2001).
【非特許文献６】Hartman MC, Josephson K, Lin CW, Szostak JW. “An expanded set of amino Acid analogs for the ribosomal translation of unnatural peptides”, PLoS ONE 2, e972 (2007).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上の特許文献１及び非特許文献１〜６の全開示内容は、本書に引用をもって繰り込み記載されているものとする。以下に本発明による関連技術の分析を与える。
上述したように、生体内での翻訳反応系ではａａＲＳの基質特異性の観点から、連結させることのできる基礎単位はアミノ酸又はその誘導体のみであった。しかし、リボソームにおける生体内翻訳系を用いて、タンパク質を構成する主鎖のペプチド結合を効率的にエステル結合に置換することができれば、多様な非天然タンパク質を合成する上で有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ａａＲＳの構造と機能を研究する中で、一部の古細菌及び細菌のもつアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素であるピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）が、大腸菌や哺乳動物細胞内においてα−ヒドロキシ酸を認識し、これをｍＲＮＡの終止コドンに特異的に導入しうることを見出した。そして、このような反応系を用いて、ポリペプチド主鎖の所望の位置にエステル結合を含む非天然タンパク質を生細胞内で酵素的に合成することに初めて成功した。【００１１】
すなわち、本発明にかかる非天然タンパク質の製造方法は、
（ａ）α−ヒドロキシ酸を活性化しうるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素と、
（ｂ）前記アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の存在下において前記α−ヒドロキシ酸と結合可能なサプレッサーｔＲＮＡと、
（ｃ）所望の位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を受けた所望のタンパク質をコードする遺伝子と、
を前記α−ヒドロキシ酸の存在下に細胞内又は細胞抽出液内で発現させることを特徴とする。【００１２】
前記アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、古細菌由来のピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）又はその変異体であることが好ましい。さらに、前記変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素が、配列番号２に示した野生型ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸配列において３０２位のアラニン、３０６位のチロシン、３０９位のロイシン、３４６位のアスパラギン、３４８位のシステイン、３８４位のチロシン、及び４１７位のトリプトファンから選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置換されることが好ましい。【００１３】
本発明の好ましい実施形態において、前記変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸置換は、３０２位のアラニンからフェニルアラニンへ、３０６位のチロシンからアラニンへ、３０９位のロイシンからアラニンへ、３４６位のアスパラギンからセリンへ、３４８位のシステインからバリン又はイソロイシンへ、及び３８４位のチロシンからフェニルアラニンへの少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。１つの実施形態において、本発明にかかる変異体酵素は、ＰｙｌＲＳ（Ｙ３８４Ｆ）、ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ａ）、ＰｙｌＲＳ（Ｌ３０９Ａ，Ｃ３４８Ｖ）、及びＰｙｌＲＳ（Ａ３０２Ｆ、Ｙ３０６Ａ、Ｎ３４６Ｓ、Ｃ３４８Ｉ、Ｙ３８４Ｆ）である。【００１４】
他の好ましい実施形態において、前記α−ヒドロキシ酸は、Ｎ置換６−アミノ−２−ヒドロキシヘキサン酸、又は置換基を有していてもよい３−フェニル乳酸である。前記Ｎ置換６−アミノ−２−ヒドロキシヘキサン酸におけるアミノ基の置換基が、ｔ−ブトキシカルボニル基、又は置換基を有していてもよいフェニル基、ベンジル基、若しくはベンジルオキシカルボニル基であることがさらに好ましい。１つの実施形態において、本発明にかかるα−ヒドロキシ酸は、６−アミノ−Ｎ−Ｂｏｃ−２−ヒドロキシヘキサン酸、６−アミノ−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−２−ヒドロキシヘキサン酸、３−フェニル−乳酸である。
【発明の効果】
【００１５】
α−ヒドロキシ酸はポリペプチド内に導入されるときに、通常のアミド結合とは異なるエステル結合で結合する。エステル結合はアミド結合に比べ、酸やアルカリによって容易に切断することができる。そのため、タンパク質の所望の位置で、ｐＨ依存的に切断されるタグの調製等に応用することができる。またタンパク質の立体構造をアミド結合では達成できない新しい構造へと改変することが可能である。遺伝情報に基づいてエステル結合を導入することができるため、遺伝的スクリーニング法により、特定の活性をもつエステル結合導入ポリペプチドを選択することができる。そのようなポリペプチドの中には、これまでのアミノ酸のみのポリマーにはなかった新しい有用な機能を持つものがあると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】野生型ＰｙｌＲＳによって認識される基質アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸の構造を示す。
【図２】実施例１で合成されたタンパク質のアルカリ加水分解をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示す。
【図３】Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−ＨＡを１０９位に含むＧＳＴのアルカリ加水分解前（上）と加水分解後（下）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる質量スペクトルである。
【図４】実施例２で合成されたタンパク質のアルカリ加水分解をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示す。なお、ＨＡ＋／−はヒドロキシ酸添加の有無を、ＮＨ３＋／−はアンモニア処理の有無を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
［アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）］
本発明の方法に用いることができるａａＲＳは、α−ヒドロキシ酸を活性化することができ、かつサプレッサーｔＲＮＡを認識してこれに前記α−ヒドロキシ酸を結合させることができるａａＲＳである。このようなａａＲＳであれば天然に存在するか、又は変異体酵素であるかは限定されないが、好ましくは、古細菌、特に、メタン生成古細菌から取得しうるピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）である。本発明者らは、野生型ＰｙｌＲＳ若しくはアミノ酸の側鎖部分を認識するポケット領域の残基を改変したＰｙｌＲＳが、それぞれの認識可能なα−アミノ酸だけではなく、それらと同一の側鎖をもつα−ヒドロキシ酸を認識することを発見した。【００１８】
野生型ＰｙｌＲＳとしては、例えば、メタン生成古細菌であるメタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)、メタノサルシナ・バルケリ(Methanosarcina barkeri)、及びメタノサルシナ・アセチボランス(Methanosarcina acetivorans)等から取得することできるがこれらに限定されない。これらの古細菌を含む多くの細菌ゲノム塩基配列及びこれに基づくアミノ酸配列は公知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋ等の公共データベースから塩基配列やアミノ酸配列の相同性検索を行って、他の相同なＰｙｌＲＳを取得することも可能である。典型的な例として、メタノサルシナ・マゼイ由来のＰｙｌＲＳは、アクセッションＮｏ．ＡＡＭ３１１４１として、メタノサルシナ・バルケリ由来のＰｙｌＲＳは、アクセッションＮｏ．ＡＡＬ４０８６７として、及びメタノサルシナ・アセチボランス由来のＰｙｌＲＳは、アクセッションＮｏ．ＡＡＭ０３６０８として登録されている。特に好ましくは、上記メタノサルシナ・マゼイ由来のＰｙｌＲＳであり、その遺伝子の塩基配列を配列番号１に、タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示した。これらメタノサルシナ属のＰｙｌＲＳ相同体の配列はよく保存されており、例えば、アミノ酸配列の相同性は、凡そ７０％以上である。これらの野生型ＰｙｌＲＳは、基質であるピロリジン側鎖を認識するが、その基質結合部位に変異を導入することによって、所望の側鎖構造を認識する変異体ＰｙｌＲＳが作成できると考えられる。【００１９】
［変異体ａａＲＳの作製］
本発明にかかる変異体ａａＲＳは、所望のα−ヒドロキシ酸を認識できるようにその基質結合部位を改変することにより作製することができる。種々のａａＲＳの立体構造がすでに明らかにされているが、中でも古細菌由来のＰｙｌＲＳを用いることが好ましい。メタノサルシナ・マゼイ由来のＰｙｌＲＳの触媒活性ドメインの結晶化及びＸ線構造解析方法については、すでに本発明者らにより報告されている（Yanagisawa, T. et al., Acta Cryst. (2006) F62, 1031-1033）。また、ＰｙｌＲＳの立体構造に基づいて作製された種々の変異体酵素についても本出願人により特願２００７−２４３５７４号として２００７年９月２０日にすでに出願されている。それらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。【００２０】
ＰｙｌＲＳのアミノ酸基質認識はリジンのεアミノ基に結合するカルボニル、及びその先に付加された疎水性官能基の存在が重要である。疎水性官能基が、ピロール環のようなある程度の大きさと嵩高さを持っていれば、野生型ＰｙｌＲＳはそのリジン誘導体を活性化することができる。しかし野生型ＰｙｌＲＳが活性化できるリジン誘導体の大きさには限界があり、例えばＮε−ベンジルオキシカルボニル−リジン（Ｚ−Ｌｙｓ）のように大きな官能基を持つリジン誘導体は効率的に認識することができない。【００２１】
そこで、様々な側鎖構造を有するα−ヒドロキシ酸を認識するために、ＰｙｌＲＳの基質結合部位に変異を導入して所望の変異体酵素を取得することができる。メタノサルシナ・マゼイのＰｙｌＲＳは４５４個のアミノ酸残基を有し、主に２つのドメインからなる。約２５０アミノ酸残基のＣ末端側ドメインは、クラス−ＩＩａａＲＳに特徴的な７個のアンチパラレルβ−シートを有し、その表面にピロリジン分子を結合する。ピロリジンの嵩高い４−メチル−ピロリン環は、配列番号２に示すアミノ酸配列のＡｌａ−３０２、Ｌｅｕ−３０５、Ｔｙｒ−３０６、Ｌｅｕ−３０９、Ｃｙｓ−３４８、Ｖａｌ−４０１、Ｌｅｕ−４０７、Ｉｌｅ−４１３及びＴｒｐ−４１７を含む主として疎水性の残基によって形成されるトンネルに収容されている。従って、これらのアミノ酸残基の何れか若しくはその複数を別のアミノ酸に置換することによって、基質特異性の異なる種々の変異体ＰｙｌＲＳを作製することができる。【００２２】
本発明者らはすでに野生型ＰｙｌＲＳの３８４位のチロシンをフェニルアラニンに置換した変異体ＰｙｌＲＳ（Ｙ３８４Ｆ）がＢｏｃ−Ｌｙｓに対する活性が向上し、３０６位のチロシンをアラニンに置換した変異体ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ａ）がＺ−Ｌｙｓ誘導体に対する活性が向上することを見出している。また、３０９位のロイシンをアラニンに、３４８位のシステインをバリンに置換した二重変異体ＰｙｌＲＳ（Ｌ３０９Ａ、Ｃ３４８Ｖ）はＺ−Ｌｙｓに対する活性が向上する。さらに、３０２位のアラニンをフェニルアラニンへ、３０６位のチロシンをアラニンへ、３４６位アスパラギンをセリンへ、３４８位のシステインをイソロイシンへ、及び３８４位のチロシンをフェニルアラニンへ置換した五重変異体ＰｙｌＲＳ（Ａ３０２Ｆ、Ｙ３０６Ａ、Ｎ３４６Ｓ、Ｃ３４８Ｉ、Ｙ３８４Ｆ）が、基質としてフェニルアラニンを認識することも見出した。従って、これらの変異体ＰｙｌＲＳを用いて、対応するα−ヒドロキシ酸を導入することができると考えられる。【００２３】
このような変異体を作製する方法としては、当業者に公知の種々の方法を用いることができ、例えば、目的のアミノ酸の位置をコードする塩基配列を改変すべきアミノ酸をコードする塩基配列に置換したプライマーを用いて、改変すべきアミノ酸をコードする塩基配列に置換したＤＮＡをＰＣＲにより増幅させて全長の変異体ＰｙｌＲＳをコードするＤＮＡを取得し、これを大腸菌等の宿主細胞を用いて発現させることができる。あるいは、Ｋｕｎｋｅｌ法又はギャップ二重鎖(Gapped duplex)法等の公知の部位特異的突然変異導入方法によって行うことができ、これらの手法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−ＫやＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ）等）を利用することができる。【００２４】
［α−ヒドロキシ酸］
本発明に用いられるα−ヒドロキシ酸としては、上述したａａＲＳによって認識されるものであれば特に限定されないが、好ましくは、野生型ＰｙｌＲＳ及び変異体ＰｙｌＲＳによって認識されるα−ヒドロキシ酸である。野生型ＰｙｌＲＳは、図１に示すように、ピロリジン（Ｐｙｌ）の側鎖の構造と良く似たＮε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジン（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ）や、これに対応するα−ヒドロキシ酸である６−アミノ−Ｎ−Ｂｏｃ−２−ヒドロキシヘキサン酸（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−ＨＡ）を認識することができる。この他、野生型ＰｙｌＲＳは、アリルオキシカルボニル−リジン（Ａｌｏｃ−Ｌｙｓ）、Ｎε−アセチル−Ｌ−リジン（Ａｃ−Ｌｙｓ）、Ｎε−ニコチニル−Ｌ−リジン（Ｎｉｃ−Ｌｙｓ）、Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（Ｚ−Ｌｙｓ）及び蛍光アミノ酸であるＮε−（Ｎ−メチル−アントラニロイル）−Ｌ−リジン（Ｎｍａ−Ｌｙｓ）等のＮε−修飾リジン誘導体でｔＲＮＡＰｙｌをエステル化することが分かっており、これらに対応するα−ヒドロキシ酸を用いることができる。【００２５】
本発明の好ましい態様において用いることのできるα−ヒドロキシ酸は、Ｎ置換６−アミノ−２−ヒドロキシヘキサン酸、又は３置換乳酸である。前記Ｎ置換６−アミノ−２−ヒドロキシヘキサン酸におけるアミノ基の置換基は、ｔ−ブトキシカルボニル基、又は置換基を有していてもよいフェニル基、ベンジル基、若しくはベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基である。Ｚ基の置換基としては、例えば、オルト位にクロスリンカー（アジド、ジアジリン）や、反応性官能基（アルキン）等を含む。具体的には、Ｎε−オルト−ヨード−ベンジルオキシカルボニル−２−ヒドロキシヘキサン酸、Ｎε−オルト−エチニル−ベンジルオキシカルボニル−２−ヒドロキシヘキサン酸、Ｎε−オルト−アジド−ベンジルオキシカルボニル−２−ヒドロキシヘキサン酸、及びＮε−オルト−ジアジリル−ベンジルオキシカルボニル−２−ヒドロキシヘキサン酸等が挙げられる。【００２６】
また、前記３置換乳酸における３位の置換基は、置換基を有していてもよいフェニル基であり、具体的には３−（３−ヨードフェニル）乳酸、３−（３−ブロモフェニル）乳酸、３−（４−アセチルフェニル）乳酸、３−（４−ベンゾイルフェニル）乳酸、３−（４−アジドフェニル）乳酸、３−（３−メチル−４−ヒドロキシフェニル）乳酸等が挙げられる。【００２７】
［サプレッサーｔＲＮＡ］
上記ａａＲＳと組み合わせて使用されるｔＲＮＡは、通常２０種類のアミノ酸に割り当てられたコドンではないナンセンスコドンに割り当てられ、かつ、上記ａａＲＳにのみ認識され、宿主の通常のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素には認識されない(orthogonal tRNA)という要件を備え、かつ真正細菌内又は哺乳動物細胞内で発現しなければならない。このようなｔＲＮＡとしては、古細菌由来のサプレッサーｔＲＮＡが挙げられる。【００２８】
ここで、ナンセンスコドンとしては、ＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）、ＵＧＡ（オパール）が挙げられるが、ＵＡＧ（アンバー）又はＵＧＡ（オパール）コドンを用いることが好ましい。また、ナンセンスコドンに代えて、４塩基以上（好ましくは４若しくは５塩基）の塩基からなるコドン（以下「フレームシフトコドン」という。）を用いることもできる。【００２９】
このようなｔＲＮＡは、例えば、上記古細菌ゲノムからｔＲＮＡＰｙｌに対応する遺伝子を取得し、これをそのまま、又は所望の変異を導入してインビトロ又はインビボで発現させて調製することができる。一例として、メタノサルシナ・マゼイ由来の野生型ｔＲＮＡは以下に示す塩基配列を有する。
ｔＲＮＡｐｙｌ：5'-GGAAACCUGAUCAUGUAGAUCGAAUGGACUCUAAAUCCGUUCAGCCGGGUUAGAUUCCCGGGGUUUCCGCCA-3'（配列番号３）【００３０】
［非天然タンパク質の製造］
α−ヒドロキシ酸を活性化しうるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、古細菌又は真核生物のサプレッサーｔＲＮＡと組み合わせて、インビトロ又はインビボでのα−ヒドロキシ酸組み込みタンパク質の製造に用いることができる。すなわち、（ａ）α−ヒドロキシ酸を活性化しうるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素と、（ｂ）前記アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の存在下において前記α−ヒドロキシ酸と結合可能なサプレッサーｔＲＮＡと、（ｃ）所望の位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を受けた所望のタンパク質をコードする遺伝子と、をα−ヒドロキシ酸の存在下に細胞内又は細胞抽出液内で発現させる。ここで、本発明にかかるａａＲＳやサプレッサーｔＲＮＡの合成系としては特に制限されることはなく、任意の発現系を用いることができる。例えば、無細胞タンパク質合成系や真正細菌細胞内におけるタンパク質合成系、或いは、真核細胞、好ましくは動物細胞、特に好ましくは哺乳動物細胞である。【００３１】
無細胞タンパク質合成系とは、タンパク質の翻訳に必要なタンパク質因子を細胞抽出液として取り出し、試験管内でこの反応を再構成することで目的とするタンパク質を合成させる系である。様々な生物種に由来する抽出液を利用して無細胞系を構成することができ、例えば、大腸菌や好熱性細菌等の細菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞及び出芽酵母等の、高いタンパク質合成活性の状態の真核細胞、及び原核細胞の抽出液を用いることができる(Clemens, M.J., Transcription and Translation - A Practical Approach, (1984), pp. 231-270, Henes, B.D. et al. eds., IRL Press, Oxford〈参考文献１〉)。なお、参考文献１の記載内容は、引用をもって本書に組み込まれる。【００３２】
大腸菌の抽出液としては、ズベイら(Zubay et al., Ann. Rev. Genet. Vol.7, pp.267-287 (1973) 〈参考文献２〉)又はプラットら(Pratt, J.M. et al., Transcription and Translation - A Practical Approach, (1984), pp. 179-209, Henes, B.D. et al. eds., IRL Press, Oxford〈参考文献３〉)に記載された方法により調製されたＳ３０抽出液を用いることができる。大腸菌Ｓ３０抽出液は、転写及び翻訳に必要な大腸菌の全ての酵素と因子を含んでいる。更に補充的な混合液を添加することができる。具体的な調製方法としては、最初に大腸菌を培養し、菌体を遠心分離等により回収する。回収された菌体は、洗浄後、緩衝液に再懸濁し、フレンチプレスやガラスビーズ、ワーリングブレンダー等を用いて破砕する。破砕された大腸菌の不溶物質を遠心分離で除去し、プレインキュベーション混合液と混合してインキュベーションする。この操作によって内在性のＤＮＡ、ＲＮＡが分解されるが、更に、カルシウム塩やマイクロコッカスのヌクレアーゼ等を添加して内在性の核酸を分解させてもよい。続いて、透析により内在性のアミノ酸、核酸、ヌクレオシド等を除き、適量ずつ分注して液体窒素又は−８０℃にて保存する。なお、前掲参考文献２及び３の記載内容は、引用をもって本書に組み込まれる。【００３３】
α−ヒドロキシ酸組み込みタンパク質の合成反応を行う際には、上記細胞抽出液に転写／翻訳鋳型となる所望の位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を受けた所望のタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、α−ヒドロキシ酸を含むアミノ酸、本発明の変異体ＰｙｌＲＳ、前記変異体ＰｙｌＲＳの存在下でα−ヒドロキシ酸と結合可能なサプレッサーｔＲＮＡ、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、ＡＴＰ再生系、核酸分解酵素阻害剤、ｔＲＮＡ、還元剤、ポリエチレングリコール、ｃＡＭＰ、葉酸類、抗菌剤、また鋳型としてＤＮＡを用いる場合にはＲＮＡ合成の基質、及びＲＮＡポリメラーゼ等を含むことができる。これらは目的タンパク質や、用いるタンパク質合成系の種類によって適宜選択して調製される。例えば、大腸菌のＳ３０抽出液の場合は、Ｔｒｉｓ−酢酸、ＤＴＴ、ＮＴＰｓ（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びＵＴＰ）、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、アミノ酸（天然の２０種類のアミノ酸に加えてホスホセリンを添加する。）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、葉酸、ｃＡＭＰ、ｔＲＮＡ、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、グルタミン酸カリウム、及び至適濃度の酢酸マグネシウム等の一部あるいは全部を添加する。【００３４】
本発明にかかるａａＲＳを哺乳動物細胞内で発現させるためには、ａａＲＳ遺伝子をＰＣＲ法によって増幅し、これを市販のｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社）等の発現ベクターのＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに組み込んで構築したプラスミドを哺乳動物細胞に導入すればよい。細胞へのベクターの導入方法としては、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。【００３５】
一方、サプレッサーｔＲＮＡの発現方法としては、特に限定されることなく当業者に公知の方法に従って、大腸菌等の真正細菌内で、又は哺乳動物細胞等の真核細胞内で発現させることができる。例えば、大腸菌内における発現は、サプレッサーｔＲＮＡをコードするＤＮＡの５’末端にプロモーター配列を、３’末端にターミネーター配列を夫々連結する。真核細胞内でｔＲＮＡを転写するタイプＩＩプロモーターは、ｔＲＮＡコーディング配列内の２つの領域から成り立つ内部プロモーターであり、そのコンセンサス配列は、ボックスＡ、ボックスＢとして知られている。ボックスＡのコンセンサス配列は、８位〜１９位のＴＲＧＣＮＮＡＧＹＮＧＧ（配列番号４）であり、ボックスＢのコンセンサス配列は、５２位〜６２位のＧＧＴＴＣＧＡＮＴＣＣ（配列番号５）である。従って、例えば、バチルス・ステアロサーモフィラスのサプレッサーチロシンｔＲＮＡのように、そのコーディング配列内にボックスＡとボックスＢが存在している場合は、なんら改変を加えなくても動物細胞内で発現させることができる。しかし、内部プロモーターを持たないサプレッサーｔＲＮＡの場合は、外部プロモーターを用いて真核細胞内で発現させることもできる。例えば、サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子の５’末端に、真核生物のｔＲＮＡ核酸配列やＵ１又はＵ６ｓｎＲＮＡ遺伝子のプロモーター配列を結合させることによって動物細胞内で効果的に発現させうる。さらに、異なる実施形態として、Ｔ７ファージ由来のＴ７プロモーターを連結し、動物細胞内でＴ７ＲＮＡポリメラーゼと同時に発現させてもよい。【００３６】
本発明は、以下の実施例によりさらに詳細に説明されるが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
［実施例１］大腸菌細胞を用いたα−ヒドロキシ酸組み込み非天然タンパク質の合成
（１）α−ヒドロキシ酸Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−ＨＡの合成
Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ）を原料として、文献（Organic Letters 6, 497-500 (2004)）に基づく方法により有機合成した。【００３８】
（２）プラスミド
（２．１）ＰｙｌＲＳ・ｔＲＮＡＰｙｌ発現系
完全長のＰｙｌＲＳ遺伝子は、プラスミドｐＴＫ２−１において大腸菌ｔｒｐＳプロモーターの制御下で発現させた。このプラスミドｐＴＫ２−１は、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４の誘導体であって、カナマイシン耐性遺伝子と大腸菌ｌｐｐプロモーターの制御下で１コピーのｔＲＮＡＰｙｌ遺伝子を発現する。
（２．２）エステル結合を組み込むグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）発現系
ｐＥＴ２１ｂ（アンピシリン耐性）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトの間に、Ｎ末端から１０９番目のシステインコドンがアンバーコドン（ＴＡＧ）に変異したグルタチオンＳ−トラスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子をクローン化し、そのＮ末端にＴ７タグ、及びＣ末端にヒスチジンタグを付加した以下のタンパク質が合成されるような発現ベクターを構築した。そのアミノ酸配列は次のとおりである。【００３９】
MASMTGGQQMGRDPGANSGVTKNSYSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEHHHHHH（配列番号６）【００４０】
最初の下線（ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ）はＴ７タグ、最後の下線はヒスチジンタグを含むｐＥＴ２１ｂ由来の領域である。中央部の下線で示したＣｙｓ１０９に対するコドンをアンバーコドンに対応する配列（ＴＡＧ）に置換している。【００４１】
（３）エステル結合を含むタンパク質の発現および精製
（３．１）ＢＬ２１（ＤＥ３）に一般の形質転換法により、上記二つのプラスミドを導入した。
（３．２）１００μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地で一晩培養した。培養は全て３７℃で行ったが、発現させるタンパク質によって任意に上下させることもできる。
（３．３）得られた培養液より遠心により菌体を分離し、１ｍＭのＢｏｃＬｙｓ−ＨＡ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＧＭＭＬ培地（１×Ｍ９（Sigma-Aldrich M-6030）、１ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、８．５ｍＭのＮａＣｌ、５μＭのＦｅ２ＳＯ４、１％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．３ｍＭのｌｅｕｃｉｎｅ）に植えた。
（３．４）波長６００ｎｍにおける濁度が０．３から０．４になった時点で，終濃度１ｍＭでＩＰＴＧを加えた。
（３．５）６時間培養し、遠心により集菌した。
（３．６）タンパク質精製はグルタチオンセファロース４ファーストフロー（ＧＥヘルスケア）を用いて付属のプロトコルどおりに行った。【００４２】
（４）エステル結合が導入されていることの検証
（４．１）得られたタンパク質について、水を加えた試料（−ＯＨ）、終濃度１４％でアンモニア水を加えた試料（＋ＯＨ）を調製し、それぞれ２時間室温において反応させた。
（４．２）それぞれを１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で分離し、SimplyBlue Safe Stain (Invitrogen)で染色した。図２に示すように、ＢｏｃＬｙｓ−ＨＡを培地に加えたときに限り全長のＧＳＴが発現し、またアンモニア水によって特異的に１箇所で切れ、２本のポリペプチドが見られることから、１箇所にエステル結合が含まれることが示される。タンパク質の収率は、ＧＭＭＬ培地ではおよそ１ｍｇ／Ｌ培養である。
（４．３）（４．２）と同様に泳動したゲルより、ウェスタンブロット法によりＴ７タグ（Ｎ末端）を含むポリペプチドおよびヒスチジンタグ（Ｃ末端）を含むポリペプチドを、それぞれに対して特異的な抗体で検出した。図２のように、予想された通りのバンドがそれぞれのタグを含むことが示された。レーン５は、非天然型の基質を培地に加えずにＧＳＴを発現させ、精製したものを泳動している。アンバーコドンのサプレッションが起こらないためにバンドが見られない。一方，Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−ＨＡおよびＢｏｃ−Ｌｙｓを加えた際には、全長のＧＳＴが生成している（レーン１、３）。アルカリ分解を行うと、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−ＨＡが導入され、内部にエステル結合を持つ場合に限り、特定位置で切断が起こる（レーン２）。Ｂｏｃ−Ｌｙｓでは、通常のアミド結合しか持たないため切断は起こらない（レーン４）。完全に加水分解反応が進行していない状態で泳動したため、レーン２では全長のＧＳＴが残っている。【００４３】
（４．４）（４．１）で得られた試料を、一晩おいて完全に切断反応を進行させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置により解析した。図３に示したように、主なピークはそれぞれのバンドに対応して１本であり、１０９位に別のアミノ酸が導入されている可能性は排除された。また、それぞれの質量は、１０９位にＢｏｃＬｙｓ−ＨＡが導入されていること、またそれによるエステル結合のみがアンモニア水による加水分解で分解されていることを示す。１０９位がＢｏｃ−Ｌｙｓの場合では、アルカリの有無に関わらずＧＳＴ全長のピークのみが得られる。【００４４】
［実施例２］ＨＥＫ２９３ｃ−１８株におけるタンパク質へのＢｏｃ−Ｌｙｓ−ＨＡの導入
（１）用いた細胞
ＨＥＫ２９３  ｃ−１８株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１０８５２）【００４５】
（２）プラスミド
ヒトのｇｒｂ２の１１１位のロイシンコドンを、Quick Change site-directed mutagenesis kit（ストラタジーン社）を用いて、アンバーコドンに変換した（ｇｒｂ２（Ａｍ１１１））。次いで、Ｃ末端にＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）が付加するように構築した遺伝子（配列番号７）を、ｐＯｒｉＰベクターのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトに組み込み、サプレッション検出用のプラスミドとした。Ｇｒｂ２は、細胞内で、上皮成長因子受容体と相互作用する、細胞の癌化に関わるタンパク質である。【００４６】
ＰｙｌＲＳ発現プラスミドの構築は、メタノサルシーナ・マゼイ由来の野生型ＰｙｌＲＳ遺伝子ＤＮＡ配列（配列番号１）を、ＰＣＲ法を用いて増幅した。これを、ｐＯｒｉＰベクターのＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに組み込んで、プラスミドを構築した。【００４７】
ｔＲＮＡＰｙｌ遺伝子の発現ベクターは、ヒトＵ６プロモーターの下流にメタノサルシナ・マゼイ由来の野生型ピロリジンｔＲＮＡ遺伝子及びターミネーターを連結し、これを一方向に９コピー並べたものをｐＯｒｉＰベクターのＮｒｕＩ−ＰｖｕＩＩサイトに組み込んだ。なお、ｐＯｒｉＰは、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ間の配列を詰めてなくし、ＭｕｎＩサイトに、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＭｕｎＩ消化断片を挿入したもので、ＥＢＮＡ−１タンパク質を発現するＨＥＫ２９３ｃ−１８株などの細胞において、トランスフェクション効率を上昇させる。【００４８】
（３）トランスフェクション方法
上記で作製した３種類のプラスミドを５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭに溶解した。２μｌのリポフェクタミン２０００を別の５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合し、室温で５分間インキュベートした。これらの溶液を混合し、室温にて２０分間インキュベートした後、９０〜９５％コンフルエントに培養したＨＥＫ２９３細胞に添加し、３７℃、４時間、炭酸ガスインキュベーターにて培養した。４時間経過後、培地を１０ｍＭのＢｏｃ−Ｌｙｓ−ＨＡを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２に交換し、さらに３７℃で４０時間培養した。【００４９】
（４）アッセイ法
上記トランスフェクションによりＨＥＫ２９３ｃ−１８株にＧｒｂ２（１１１Ａｍｂ）、ＰｙｌＲＳ、ｔ−ＲＮＡＰｙｌ全ての遺伝子を導入し、一方のウェルには何も加えず、もう一方のウェルにはＢｏｃ−Ｌｙｓ−ＨＡを加えた。細胞を回収し、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降し、精製したタンパク質をアンモニア溶液あるいは水と混ぜ、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してウェスタンブロッティングを行なった後、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫染色した。なお、上記アンモニア処理の条件は、精製タンパク質１μｌに、１０％ＳＤＳ溶液を５μｌ、アンモニア水７．５μｌを加え、室温で２時間反応させた。その後、バキュームしながら遠心してアンモニアを飛ばした。アンモニア処理を行わない場合、アンモニアの代わりに水５μｌを加え、室温で２時間放置した。【００５０】
（５）結果
以上の実験結果を図４に示す。図４より、Ｇｒｂ２（１１１Ａｍｂ）のアンバーコドンにヒドロキシ酸が導入されＧｒｂ２＿ＦＬＡＧの全長２２５残基が発現し、アンモニア処理をした場合に、Ｇｒｂ２が半分に切断され、Ｃ末端側の１１５残基が検出される（Ｃ末ＦＬＡＧタグが染まる）。したがって、ヒドロキシ酸がタンパク質へ導入されていることが証明された。【００５１】
なお、図４においてヒドロキシ酸を添加しないで合成したサンプルについてもＧｒｂ２＿ＦＬＡＧの全長が検出されるが、これは、本実験においては大量の精製タンパク質をアプライしているため、内在性のサプレッション活性が検出されているものと思われる。
なお、前述の特許文献等の各開示を、本書に引用をもって繰り込むものとする。本発明の全開示（請求の範囲を含む）の枠内において、さらにその基本的技術思想に基づいて、実施形態ないし実施例の変更・調整が可能である。また、本発明の請求の範囲の枠内において種々の開示要素の多様な組み合わせないし選択が可能である。すなわち、本発明は、請求の範囲を含む全開示、技術的思想にしたがって当業者であればなし得るであろう各種変形、修正を含むことは勿論である。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【図４】
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【配列表】
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