(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)複数のポリマー分子を含む安定化エンベロープを有するリポソームもしくはガス充填微小胞またはその前駆体を含む第1組成物、ここで、該ポリマーは反復オキシエチレン単位を含む、および
b)ターゲッティングリガンドおよび該ポリマー中の反復オキシエチレン単位の配列と選択的に結合することができる抗体を含む、下記式で示されるターゲッティング構築物を含む第2組成物を含む医薬キット：
(TL)nZ(APA)m
［式中、
TLは、リンカーZと反応するかまたはそれを形成することができる部分により機能化されていることがある上記ターゲッティングリガンドを表す；
APAは、リンカーZと反応するかまたはそれを形成することができる部分により機能化されていることがある上記抗ポリマー抗体を表す；
Zは、共有結合、結合部分、キレーティング部分、結合タンパク質、またはミセル、リポソーム、もしくはナノ粒子から選ばれる超分子ベクターから選ばれる2機能性リンカーまたは多機能性リンカーを表す；
nおよびmは、独立して1〜100,000の整数である。］。
【請求項２】
該ポリマーがメトキシ基で終わる請求項１記載の医薬キット。
【請求項３】
該抗体が、メトキシ基で終わる反復オキシエチレン単位の配列と選択的に結合する請求項２記載の医薬キット。
【請求項４】
該ポリマーが、該安定化エンベロープの成分の総量に対して少なくとも0.05％のモル量で存在する、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬キット。
【請求項５】
該モル量が少なくとも0.2％である請求項４記載の医薬キット。
【請求項６】
該モル量が少なくとも1％である請求項４記載の医薬キット。
【請求項７】
該ガス充填微小胞が50モル％以上のリン脂質を含む請求項１〜６のいずれかに記載の医薬キット。
【請求項８】
該リポソームが治療剤または造影剤を含む請求項１〜７のいずれかに記載の医薬キット。
【請求項９】
該ターゲッティングリガンドが該抗体と非共有結合して該ターゲッティング構築物を形成する請求項１〜８のいずれかに記載の医薬キット。
【請求項１０】
該ターゲッティング構築物がミセルまたはリポソームの形である請求項９記載の医薬キット。
【請求項１１】
a)反復オキシエチレン単位を含むポリエチレングリコールである親水性ポリマー、および
b)下記式で示されるターゲッティング構築物、を含むリポソームもしくはガス充填微小胞、またはその前駆体：
(TL)nZ(APA)m
［式中、
TLは、リンカーZと反応するかまたはそれを形成することができる部分により機能化されていることがあるターゲッティングリガンドを表す；
APAは、リンカーZと反応するかまたはそれを形成することができる部分により機能化されていることがある抗ポリマー抗体を表す；
Zは、共有結合、結合部分、キレーティング部分、結合タンパク質、またはミセル、リポソーム、もしくはナノ粒子から選ばれる超分子ベクターから選ばれる2機能性リンカーまたは多機能性リンカーを表す；
nおよびmは、独立して1〜100,000の整数である；
ここで、該ターゲッティング構築物の該抗体は、該微小胞のポリマー中の反復オキシエチレン単位の配列と選択的に結合する。］。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、(i)ターゲッティングリガンドおよび抗ポリマー抗体を含むターゲッティング構築物、および(ii)該アセンブリと結合または会合することができるポリマー含有リポソームまたはガス充填微小胞を含むアセンブリに関する。さらに、本発明は、また、該アセンブリの製造および投与方法、および該ターゲッティング構築物および該リポソームまたはガス充填微小胞を含むアセンブリに関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の画像診断技術を用いて得ることができる画像を増強することができる画像診断に用いる薬剤(「造影剤」または「画像増強剤」として知られる)は、診断分野において広く受け入れられた技術になってきた。
【０００３】
近年の造影剤の急速な発達は、ヒトや動物の身体の器官や組織の造影に有用な多くの異なる製剤をもたらした。
【０００４】
特に超音波造影法に有用な造影剤のクラスには、水性媒質に分散したナノメートルおよび/またはマイクロメートルサイズの気泡のサスペンジョンが含まれる。気泡が、例えば乳化剤、油、増粘剤、または糖を用いるか、または種々の系中にガスまたはその前駆体を取り込むかまたは封入することにより安定化される製剤が特に興味深い。この安定化された気泡は、一般に当該分野では、例えば「微小胞」、「マイクロスフェア」、「微小泡」、「マイクロカプセル」または「マイクロバルーン」といった種々の用語で呼ばれる。本願明細書および特許請求の範囲において、用語「微小胞」は、上記のあらゆる安定化された気泡を特定するのに用いる。
【０００５】
他の造影剤には、X線造影分析、特にコンピューター断層撮影に広く用いられるヨウ化生成物(例えばイオパミドールまたはイオメプロール)が含まれ、また、常磁性イオンを含む化合物(例えば、ProHance(登録商標)またはMultiHance(登録商標)、Bracco Imaging)はMRI分析に広く用いられる。活性(X線またはMRI)造影剤は、リポソーム構造に好都合に取り込まれる(例えば、参考文献1または2参照)。
【０００６】
ガス充填微小胞は、その製剤中に、例えば免疫原性を減少させ、生体適合性を改善し、網内系(RES)によるレセプター介在取り込みを減少させ、および/または造影剤の血清半減期を増加させるのに有用なことが解っている、ポリマー、特に親水性ポリマー(例えばポリエチレングリコール、PEG)を含みうる。同様の理由により、PEGのようなポリマーも造影剤または治療剤の担体として用いるリポソームの製剤中に含まれる。
【０００７】
より最近になって、ガス充填微小胞は、望ましい器官または組織に該微小胞を選択的に結合させることができる安定な標的特異的成分で修飾されている。
【０００８】
例えば、微小胞またはリポソームを、患者の体内の決定された標的もしくは領域と結合することができる特異的成分(「ターゲッティングリガンド」として知られる)と(例えばその境界エンベロープに包含させることにより)結合させ、該標的または領域の画像を選択的に増強することができる。
【０００９】
ターゲッティングリガンドの例には、例えば、特定の器官または組織、例えば、血管新生性炎症もしくは血栓性組織と結合することができるペプチド、タンパク質、または抗体が含まれる。
【００１０】
例えば、微小胞またはリポソームの構造は、微小胞またはリポソームのエンベロープの形成に用いるのに適した分子とターゲッティングリガンドとの結合により修飾することができる。該ターゲッティング部分は、エンベロープ形成分子と直接または適切なスペーサーを解して結合することができる。すなわち、この方法論では、典型的には目的とするターゲッティング部分に結合するのを可能にするために微小胞またはリポソームエンベロープを形成する成分を修飾する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
今回、本出願人は、該リポソームまたは微小胞中に含まれるポリマー成分を特異的に認識することができる抗体によりターゲッティングリガンドをポリマー含有リポソームまたはガス充填微小胞と結合させる新規方法をみいだした。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
(発明の要約)
本発明のある局面は、以下を含む医薬キットに関する：
a)複数のポリマー分子を含む安定化エンベロープを有するリポソームもしくはガス充填微小胞またはその前駆体を含む第1組成物；および
b)ターゲッティングリガンドおよび該ポリマーと選択的に結合することができる抗体を含むターゲッティング構築物を含む第2組成物。
【００１３】
好ましい態様によれば、該ポリマーは親水性ポリマーである。好ましくは、該ポリマーは反復オキシエチレン単位を含み、より好ましくはメトキシ基で終わる。特に好ましい態様において、該ポリマーはポリエチレングリコールである。好ましくは、該抗体は親水性ポリマーと結合し、より好ましくは、反復オキシエチレン単位を含むポリマーと結合し、さらにより好ましくは、反復オキシエチレン単位を含み、メトキシ基で終わるポリマーと結合する。特に好ましい態様によれば、該抗体はポリエチレングリコールと結合する。
【００１４】
別の好ましい態様によれば、該ポリマーのモル量は、該安定化エンベロープの成分の総量に対して少なくとも0.05％、好ましくは、少なくとも0.2％、さらにより好ましくは少なくとも1％である。
【００１５】
特に好ましい態様によれば、該ポリマーは、両親媒性化合物、好ましくはリン脂質と共有結合する。
【００１６】
さらに好ましい態様によれば、該微小胞は、両親媒性物質、好ましくはリン脂質を含む安定化エンベロープを有し、好ましくは、該両親媒性物質は、安定化エンベロープの総成分の50モル％以上、より好ましくは80％以上、さらにより好ましくは90％以上である。
【００１７】
さらなる局面によれば、本発明は、a)複数のポリマー分子; b)該ポリマーに結合した抗体、およびc)該抗体と結合したターゲッティングリガンドを含むリポソームもしくはガス充填微小胞またはその前駆体に関する。
【００１８】
好ましい抗体およびポリマーは上記の通りである。
【００１９】
本発明のさらなる局面は、患者の身体部分にリポソームまたはガス充填微小胞を投与する方法であって、
a)(i)該身体部分の分子または組織と選択的に結合するターゲッティングリガンドおよび(ii)ポリマー分子と選択的に結合することができる抗体を含むターゲッティング構築物を含む第1組成物を投与し；
b)複数の該ポリマー分子を含む安定化エンベロープを有する該リポソームまたは該ガス充填微小胞を含む第2組成物を投与する
工程を含む方法に関する。
【００２０】
好ましい態様によれば、該リポソームまたはガス充填微小胞は、該ターゲッティング構築物が選択した身体部分に到達するのを可能にするのに充分な時間の後に投与される。
図面
図１〜３は、本発明のターゲッティング構築物の例を示す。
図４は、本発明のターゲッティング構築物を造影剤/治療薬と共に用いる例を示す。
(定義)
【００２１】
用語「〜と結合する」は、特に親水性ポリマーと選択的に結合することができる抗体とターゲッティングリガンドとの結合に言及する場合は、その意味内に該結合に関与する成分間の比較的安定な相互作用を生じることができるあらゆる共有結合または非共有結合を含む。
【００２２】
用語「非共有結合」には、共有結合を含まない2またはそれ以上の分子間の分子間相互作用、例えば、イオン性もしくは静電性相互作用、双極子(ダイポール)-双極子相互作用、水素結合、親水性もしくは疎水性相互作用、ファンデルワールス力、およびそれらの組み合わせが含まれる。非共有結合には、さらに、親和性結合ペアの成分間の相互作用、例えば、アビジンもしくはストレプトアビジンとビオチン間の相互作用；プロテインAまたはG結合、および免疫グロブリンのFc領域、オリゴヌクレオチドおよび相補配列、例えば、ポリデソキシアデニル酸およびポリデソキシチミジル酸、またはポリデソキシグアニル酸およびポリデソキシシチジル酸；Ni-NTA(ニトリロトリ酢酸、ニッケル塩)、およびポリヒスチジン標識リガンドが含まれる。
【００２３】
用語「造影剤」には、その意味内に、患者の目的とする領域を画像化しおよび/または患者の疾患の存在の有無を診断するのを助ける方法に関連して用いることができ、一般に画像診断技術の画像化を増強することができるあらゆる化合物、構築物、組成物、もしくは製剤が含まれる。該診断技術の例には、超音波画像診断、磁気共鳴画像診断、X線画像診断(特にコンピューター断層撮影法)、光学画像診断、核画像診断、または分子画像診断が含まれる。安定な造影剤の例には、例えば、ガス充填微小胞(例えば、超音波画像診断用)、ヨウ化化合物、ヨウ化リポソーム；マグネタイトナノ粒子；常磁性イオンキレート複合体；蛍光染料；過分極原子を含む化合物もしくは放射性医薬品が含まれる。
【００２４】
用語「治療薬(剤)」には、その意味内に、あらゆる治療的適用、例えば、患者の疾患の治療方法に用いることができるあらゆる物質、組成物、製剤、またはドラッグデリバリーシステム、ならびにin vitroおよび/またはin vivoで生物学的効果もしくは生理学的効果をもたらすことができるかまたは該効果をもたらすことに関与するあらゆる物質が含まれる。すなわち、治療薬には、患者のあらゆる病的状態(病気、苦痛、疾患病変、もしくは損傷を含む)の治療(予防、改善、疼痛の軽減、もしくは治癒を含む)に用いることができるあらゆる化合物または物質、例えば薬物、薬剤、生物活性剤、細胞毒性剤、化学療法剤、放射性治療剤、タンパク質、天然もしくは合成ペプチド(オリゴペプチドおよびポリペプチドを含む)、ビタミン、ステロイド、および遺伝子物質(ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびプラスミドを含む)が含まれる。これらの中で薬物または薬剤が好ましい。
【００２５】
治療薬の例には、以下のものが含まれる：抗潰瘍剤、例えばオメプラゾール、ファモチジン、もしくはラニチジン；降圧剤、例えばアムロジピン、バルサルタン、もしくはロサルタン；β遮断薬、例えば、アテノロールもしくはプロプラノロール；カルシウムチャンネルブロッカー、例えばニトレンジピンもしくはベラパミル；ace阻害剤、例えば、エナラプリルもしくはラミプリル；アンギオテンシンII阻害剤、例えばロサルタンカリウム；カリウムチャンネル活性化薬、例えばニコランジル；利尿剤および抗利尿剤、例えばヒドロクロロチアジドもしくはトリアムテレン；抗狭心症薬、例えば、硝酸イソソルビドもしくはジルチアゼム；凝固剤、例えばコンジュゲートメナジオンもしくはヘモコアグラーゼ；抗凝固剤、抗血栓剤、もしくは抗血小板物質、例えば組織プラスミノーゲンアクチベーターもしくはヘパリン；抗不整脈薬、例えばジゾピラミドもしくはアミオダロン；血管拡張剤、例えばジギトキシン、ジゴキシン、もしくはジギタリン；ペニシリン、例えば、ピペラシリンもしくはアモキシリン(所望によりクラブラン酸と組み合わせて)；βラクタム、例えばイミペネムもしくはメロペネム；キノロンもしくはフルオロキノロン、例えばナリジクス酸、レボフロキサシン、もしくはモキシフロキサシン；セファロスポリン、例えばセフジニルもしくはセファクロール；スルホンアミド、例えばフルファメトキサゾール；アミノグリコシド、例えばアジトロマイシンもしくはゲンタマイシン；ポリミキシン、例えばポリミキシンb；テトラサイクリン、例えばドキシサイクリン；マクロライド、例えばエリスロマイシンもしくはクリンダマイシン；オキサゾリジノン、例えばリネゾリド；抗ウイルス剤、例えば、アタザナビル、ジドブジン、エファビレンズ、テノフォビル、アバカビル、テノフォビル、ロピナビル、アシクロビル、バラシクロビル、オゼルタミビル；抗マラリア薬、例えばアルテスネートもしくはメフロキン；抗結核薬、例えばイソニアジド；ストレプトマイシンもしくはピラジナミド；駆虫薬および抗感染症薬(antiinfestives)、例えばピペラジン、ピランテルパモエート、もしくはメベンダゾール(membendazole)；抗ハンセン菌薬、例えば抗原虫薬；抗アメーバ薬、例えばメトロニダゾール；抗真菌薬、例えばカスポフンジン、ボリコナゾール、フルコナゾール；抗アレルギー薬、例えばメモタゾン、フェクソフェナジン、テルフェナジン、もしくはセチリジン；骨格筋弛緩薬、例えばチザニジンもしくはバクロフェン；非ステロイド系抗炎症薬、例えばセレコキシブ、メロキシカム、もしくはイブプロフェン；抗新生物薬、例えばナイトロジェンマスタード化合物(例えばシクロホスファミド)、アジリジン(例えばチオエパ)、N-ニトロソウレア誘導体(例えばロムスチン)、プラチナ化合物(例えばオキサリプラチン)、プロカルバジン、ダカルバジン、メトトレキセート、アドリアマイシン、マイトマイシン、アンサミトシン、シトシン アラビノシド、ベネリスチン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、アミノグルテチミド、ロイプロリドアセテート、ゴセレリン、ビカルタミド、クエン酸タモキシフェン、トリロスタン、アスパラギナーゼ(L-アスパラギナ���ゼ)、エトポシド、インターフェロンα-2a、インターフェロンα-2b、テニポシド(VM-26)、ビンブラスチンサルフェート(VLB)、ビンクリスチンサルフェート、パクリタキセル、ドセタキセル、カンプトテシン、イリノテカン、メトトレキセート、アドリアマイシイ、アラビノシル、ヒドロキシウレア；葉酸拮抗薬、例えばアミノプテリン、メトトレキセート、ペメトレキセド(permetrexed)；ヌクレオシド類似体拮抗薬、例えばゲムシタビン、カペシタビン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルオロウラシル、もしくはシタラビン；チロシンキナーゼ阻害剤、例えばイマチニブ、ソラフェニブ、抗体、例えばリツキシマブ、セツキシマブ、エルロチニブ、トラスツズマブ、もしくはベバシズマブ；アロマターゼ阻害剤、例えばアナストロゾールもしくはレトロゾール；麻酔薬、オピエート、もしくは鎮静剤、例えばクエン酸フェンタニル、塩酸フルラゼパム、ペントバルビタール、テマゼパム、もしくはトリアゾラム；局所もしくは全身麻酔薬、例えばセボフルラン、プロカイン、テトラカイン、もしくはドロペリドール；神経筋遮断薬、例えば、アトラクリムメシレート；ホルモン系の治療薬、例えば、成長ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、エストラジオール、ベクロメタゾンジプロピオネート、ベタメタゾン、コルチゾンアセテート、デキサメタゾン；末端肥大症に対する薬剤、例えばソマトスタチン；アルツハイマー病に対する薬剤、例えばメマンチン、ドネペジル、リバスチグミン；貧血に対する薬剤、例えばエリスロポイエチン；注意欠陥多動性障害に対する薬剤、例えば、メチルフェニダーゼおよびアトモキセチン；良性前立腺過形成に対する薬剤、例えば、タムスロシン、フィナステリド、アルフゾシン；出血に対する薬剤、例えば第VII凝固因子、第VIII凝固因子；糖尿病に対する薬剤、例えばインスリンもしくはグリメピリド；C型肝炎に対する薬剤、例えばペグ化インターフェロンα-2a、ペグ化インターフェロンα-2b、不妊に対する薬剤、例えば、ホリトロピンαおよびホリトロピンβ；多発性硬化症に対する薬剤、例えば、グラチラマー、インターフェロンβ-1aもしくはインターフェロンβ-1b；骨粗鬆症に対する薬剤、例えばアレンドロネート；呼吸器合胞体(RS)ウイルスに対する薬剤、例えばパリビズマブ；リウマチ性関節炎に対する薬剤、例えば、インフリキシマブ、エタネルセプトもしくはアダリムマブ；統合失調症に対する薬剤、例えばリスペリドンもしくはオランザピン；または移植拒絶に対する薬剤、例えばタクロリムス、マイコフェノレート、もしくはシクロスポリン。
【００２６】
用語「ガス充填微小胞」には、安定化物質のエンベロープまたは層(フィルム形成層を含む)で取り囲まれたミクロンもしくはナノメートルサイズ(例えば、0.1〜10μm、典型的には1〜8μm)の気泡を含むあらゆる構造が含まれる。該用語には、特に当該分野でガス充填リポソーム、微小胞、マイクロスフェア、マイクロバルーン、またはマイクロカプセルとして知られているものが含まれる。安定化物質は、例えば、界面活性剤、脂質、スフィンゴ脂質、オリゴ脂質、糖脂質、リン脂質、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、および合成もしくは天然ポリマー物質を含む当該分野で知られた典型的なあらゆる物質でありうる。好ましいガス充填微小胞は、エンベロープを形成する種々の成分間の相互作用が、典型的には双極子-双極子相互作用、水素結合、親水性もしくは疎水性相互作用、ファンデルワールス力、およびそれらの組み合わせを含む非共有結合形であるもの、特に疎水性相互作用である。典型的には、ガス充填微小胞はCEUS(造影超音波)画像診断に用いられる。さらに、該微小胞は、治療的処置、例えば本明細書中に示すような超音波介在薬剤送達に用いることもできる。
【００２７】
用語「微小胞」には、気泡が、ガスと液体の界面に配置された安定化両親媒性物質を含む非常に薄いエンベロープ(フィルム)(当該分野で「エバネセント」エンベロープと言われることがある)によってガス/液体界面に結合している水性サスペンジョンが含まれる。微小胞サスペンジョンは、適切なその前駆体、例えば粉末両親媒性物質(例えば凍結乾燥し、予め形成されたリポソーム、または凍結乾燥もしくはスプレー乾燥リン脂質溶液)を、空気もしくは他のガス、次いで水性担体と撹拌しながら接触させ、微小胞サスペンジョンを生成することにより製造することができ、次いで、これを好ましくはその製造直後に投与することができる。微小胞の水性サスペンジョン、その前駆体および製造法の例は、例えば、参考文献3、参考文献4、参考文献5、参考文献6、および参考文献7に記載されている(これらの内容は本明細書の一部を構成する。)。
【００２８】
用語「マイクロバルーン」または「マイクロカプセル」は、気泡が、脂質または天然もしくは合成ポリマーの固体物質エンベロープで取り囲まれたサスペンジョンが含まれる。マイクロバルーンおよびその製造法の例は、例えば参考文献8および参考文献9に記載されている。
【００２９】
用語「リポソーム」には、その意味内に、典型的には非共有相互作用している1またはそれ以上の同心二層分子の形の脂質化合物を含む、非晶質化合物の実質的に球状の凝集物が含まれる。
【００３０】
用語「その前駆体」には、水性担体で再構成すると望む分子アセンブリーのサスペンジョンを生成することができるあらゆる組成物が含まれる。特に、ガス充填微小胞の前駆体に言及するときは、該用語には、ガス存在下で水性担体で再構成すると上記ガス充填微小胞のサスペンジョンを生成することができるあらゆる組成物が含まれる。該前駆体組成物は、典型的にはガス存在下でその水性サスペンジョンを振盪するとガス充填微小胞を形成することができる乾燥粉末形(例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥)の上記のあらゆる安定化物質を含む。同様に、リポソームの前駆体には、水性担体で再構成するとリポソームサスペンジョンを形成することができる乾燥粉末形の適切な(両親媒性)物質が含まれる。
【００３１】
用語「エンベロープ形成部分」には、リポソームまたはガス充填微小胞の安定化エンベロープの形成に関与することができるあらゆる部分が含まれる。該部分は、好ましくはリン脂質を含む両親媒性物質であることが好ましい。
【００３２】
用語「MRI造影剤」は、常磁性金属イオンまたはマグネタイト粒子のような磁気共鳴に反応する化合物、組成物、もしくは製剤、ならびに、例えばリポソームまたはミセルのような該化合物を含む超分子構築物を含む造影剤を表す。
【００３３】
用語「X線造影剤」または「CT-造影剤」は、例えば、ヨウ化化合物、特に、非イオン性(例えば、イオパミドールもしくはイオメプロール(Bracco Imaging))、硫酸バリウムもしくは金ナノ粒子を含むコンピューター断層撮影分析のX線の画像化を増強することができる造影剤を表す。
【００３４】
用語「光学画像化剤」は、拡散光断層撮影法(DOT)、光学投影断層撮影法(OPT)、近赤外蛍光画像法(NIR)、または生物発光画像法(BLI)を含む種々の光学画像化技術において画像化を増強することができる化合物または製剤を表す。光学画像化用の造影剤には、有機蛍光色素分子(例えば蛍光タンパク質)および無機蛍光半導体ナノ結晶もしくは量子ドットが含まれる(例えば参考文献10参照)。
【００３５】
用語「核画像化剤」は、陽電子(ポジトロン)放射断層撮影法(PET)および単光子放射断層撮影法(SPECT)を含む核画像化法における画像化を増強することができる化合物または製剤を表す。第1画像技術には、陽電子放射アイソトープ、例えば、11C、13N、15O、18F、68Ca、94mTcを用いる(例えば参考文献11参照)。第2画像化技術には、γ線放射アイソトープ、例えば、133Xe、99mTc、123I、201Tl、111In、および67Caを用いる。これら物質のすべては、担体系(例えばリポソーム)としてナノ粒子を用いて製造することができる(例えば、参考文献12および参考文献13参照)。
【００３６】
用語「ポリマー」は、共有化学結合により結合した、反復構造単位(モノマー)、例えば、5〜1,000,000またはそれ以上のモノマーを含む高分子を表す。ポリマーは、合成、半合成、または天然であり、ホモポリマー(すなわち、同じ反復単位を含む)もしくはコポリマー(すなわち少なくとも2の異なるモノマーを含む)を含むことがある。コポリマーは、断続的コポリマー(例えばモノマーAおよびBがA-B-A-B-B-A-A-A-A-B-B-Bのように反復配列中に並んでいる)またはモノマーAおよびBのランダム配列を有するランダム(またはスタティスティカル)コポリマーでありうる。典型的には、ブロックコポリマーは、共有結合または接合ブロックにより互いに結合した2またはそれ以上のホモポリマーサブユニットを含む。2または3個の異なるブロックを有するブロックコポリマーは、それぞれ、ジ-ブロックコポリマー(AAAAA-BBBBB)およびトリ-ブロックコポリマー(AAAAA-BBBBB-AAAAA)と呼ばれる。ポリマーは、直線状(1本の主鎖を有する)または分枝状(主鎖と結合した1またはそれ以上の側鎖を有する)であり得る。反復単位を含む該ポリマー鎖は、一般に「ポリマー骨格(backbone)」として同定されるが、該鎖の各末端に配置された単位は、一般に「末端基」として同定される。
【００３７】
用語「親水性ポリマー」は、典型的には、その骨格中に極性基、例えば、-O-、-NH-、-SH-、-CO-、またはそのあらゆる組み合わせなどを含む水との親和性を有するポリマーを含む。親水性ポリマーの例には、ポリ(C2-C3)アルキル-オキシド(例えば、PEGまたはPPG)、多糖(例えば、デキストラン)、ポリアミノ酸、半合成ペプチド、およびポリヌクレオチドが含まれる。
抗ポリマー抗体
【００３８】
本明細書において、用語「抗ポリマー抗体」は、その意味内に、特に、ポリマーが本明細書に記載のリポソームもしくはガス充填微小胞のエンベロープに含まれるときに、該ポリマーまたはその部分を抗原として認識し、それと選択的に結合することができるあらゆる抗体を含むことを意図する。
【００３９】
本明細書で用いている用語抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、天然抗体断片、組換え抗体断片、および多特異抗体が含まれる。該用語は、さらに特異結合について抗体と競合するよう設計されたタンパク質の抗原結合断片、例えばアフィボディを含む。
【００４０】
抗ポリマー抗体は、当該分野で知られたあらゆる方法(例えば野生動物もしくはトランスジェニック動物の免疫、ヒト患者血清からの単離、抗原結合断片ライブラリーのスクリーニング)により製造することができる。本明細書に記載の抗体は、あらゆる種およびあらゆるクラス由来(哺乳動物のIgG、M、A、およびEを含む)でありうる。それらは、供給源種の天然抗体配列もしくはそのアミノ酸変異体を伴うことができ、これにはいわゆる「ヒト化」またはPRIMATIZED(登録商標)抗体が含まれる。
【００４１】
抗体は、典型的には当該分野で、病原体の侵入に反応して免疫系によって産生される多量体糖タンパク質のファミリーである免疫グロブリン(Ig)として同定される。抗体は、抗原結合部分(Fab)とエフェクター機能(Fc)からなる。例えば、マウスIgGは、2本の同じ重鎖(H)と2本の軽鎖(L)のY字形のヘテロ四量体である。各軽鎖は、疎水性相互作用およびしばしば共有ジスルフィド結合により重鎖と結合しているが、重鎖間のジスルフィド結合の数は抗体サブクラス間で異なる。各重鎖および軽鎖も、「免疫グロブリンドメイン」と呼ばれる球状ホールディングの安定化に関与する規則的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各鎖のアミノ末端ドメインは、抗体間で配列が大きく異なるため(「定常」ドメインCH1、CH2、CH3、およびCLと対照的に)「可変」(VHおよびVL)と呼ばれ、この多様性が結合特異性の基礎となる。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイン全体に均一に分布していない。可変性は相補性決定領域(CDR)と呼ばれる3つの部分に集中しているが、可変ドメインの最も保存された部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。
【００４２】
用語「ポリクローナル抗体」には、典型的には、同じ抗原の種々の決定基(エピトープ)に対する種々の抗体が含まれる。ポリクローナル抗体の製造は、当業者によく知られており、例えば参考文献14のような多くの参考書に記載されている。
【００４３】
用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体のポピュレーション(すなわち、少量存在するかもしれない、生じうる天然の突然変異以外は同一なポピュレーション)から得られる抗体を表す。モノクローナル抗体は、1個の抗原決定基に対して生じており特異性が高い。モノクローナル抗体は、しばしば「完全」モノクローナル抗体として確認され、用語「完全」は、抗体がすべてのその天然部分(抗原結合およびエフェクター)を含むことを意味し、それが、ハイブリドーマ法(例えば参考文献15参照)、組換えDNA技術(例えば、参考文献16参照)、種々のアミノ酸鎖の直接クローニング(例えば、参考文献17参照)、B細胞の不死化(例えば、参考文献18参照)または抗体ライブラリーのスクリーニング(例えば、参考文献19参照)によって生成されているかに関わらず、その天然形である(例えば、IgGでは単量体二価、IgAでは二量体四価、IgMでは五量体10価)。
【００４４】
用語「天然抗体断片」は、抗体の部分、好ましくは抗原結合領域を含む、抗原と選択的に結合する能力を保持している化合物を表す。用語「天然」は、それが完全抗体の酵素的または化学的開裂により得られることを規定する。天然抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２が含まれる。
【００４５】
用語「Fab」は、抗体分子の一価抗原結合断片を含む断片を表す。Fab断片は、全抗体を酵素パパインで消化して完全軽鎖と1重鎖の部分を生じることにより生成することができる。
【００４６】
用語「Fab′」(または「Fabプライム」)は、全抗体をペプシンで処理し、次いで還元して完全軽鎖と重鎖の部分を生じることにより得ることができる。1抗体分子あたり2本のFab'断片が得られる。Fab′断片は、抗体ヒンジ領域由来の1またはそれ以上のシステインを含む重鎖CH1のカルボキシル末端に少数の残基が付加することがFab断片と異なる。
【００４７】
用語「(Fab′)2」は、全抗体を酵素ペプシンで処理し、さらに還元することなく得ることができる抗体の断片を表す。(Fab′)2は、2つのジスルフィド結合により結合した2本のFab′断片の二量体である。
【００４８】
抗体断片の製造方法は当該分野でよく知られている。該方法は例えば参考文献14に記載されている。
【００４９】
「組換え抗体断片」は、小抗体部分としてin vitroで直接合成される。遺伝子操作された抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲペプチド、ミニボディ、マルチボディ、ＶｈＨ、ならびにＶ−ＮＡＲが含まれる。
【００５０】
可変断片「Fv」は、1本の重鎖および1本の軽鎖可変ドメインが強く非共有結合した二量体(VH-VLダイマー)からなる。Fvは、完全な抗体認識および結合部位を含む最小抗体断片である。Fvでは、この構造内で、各可変ドメインの3個のCDRが、VH-VL二量体の表面の抗原結合部位を決定するように相互作用する。あるいはまた、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合により結合するか、化学薬品、例えばグルタルアルデヒドにより架橋することができる。
【００５１】
「scFv」は、一本鎖可変断片であり、互いに適切なポリペプチドリンカーで結合した軽鎖の可変領域(VL)と重鎖の可変領域(VH)を含む遺伝子操作した分子、例えば遺伝子融合一本鎖分子である。ドメイン間のポリペプチドリンカーは、scFvが抗原を結合するための望ましい構造を形成するのを可能にする(例えば、参考文献20参照)。
【００５２】
「Fdは」は、2本のアミノ末端ドメイン(VHおよびCH1)からなる免疫グロブリン重鎖の部分である。Fdは、例えば参考文献21に記載のように組換えFabを生成するために軽鎖と共にin vitro発現系により生成することができる。
【００５３】
6個のCDR(各可変領域につき3個)がまとまって、抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、1個の可変ドメイン(または抗原特異的な3個のCDRのみを含むFvの半分)でも、完全な結合部位より親和性は低いものの、抗原を認識し、結合する能力を有する。それらは単独で、露出した疎水性残基により非常に低い可溶性を示す。
【００５４】
用語「CDRペプチド」には、単一相補性決定領域をコードする最少認識単位が含まれる。CDRペプチドは、目的とする抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することにより得ることができる。そのような遺伝子は、例えば抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成するポリメラーゼ連鎖反応を用いて製造される。あるいはまた、CDRペプチドは、ファージディスプレーまたはリボソームディスプレーライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる(例えば参考文献22参照)。
【００５５】
用語「ミニボディ」は、一本鎖中に全抗体の必須エレメントをコードする全抗体の小バージョンを表す。ミニボディは、ヒンジ領域に融合した天然抗体のVLおよびVHドメイン、およびCH3ドメインを含む。それらはミニボディ遺伝子で形質転換された宿主細胞により発現される(例えば、参考文献23または参考文献24参照)。
【００５６】
用語「マルチボディ」は、抗体由来の種々の抗原結合部位を有する多価構築物、例えば、ディアボディ、ビス-scFV、トリアボディ、テトラボディを表す。例えば、「ディアボディ」は、同じポリペプチド鎖(VH-VL)内に軽鎖可変ドメイン(VL)と結合した重鎖可変ドメイン(VH)を含む、2抗原結合部位を有する小抗体断片である。同じ鎖上の2つのドメインを対合させるには短すぎるリンカーを用いることにより、該ドメインは、強制的に別の鎖の相補性ドメインと対合し、2抗原結合部位を形成する。ディアボディは、例えば参考文献25または参考文献26に詳述されている。ビス-scFvは、4個の可変ドメインを含む1つのポリペプチドのみからなる以外はディアボディと似た全体構造を持っている(例えば、参考文献25参照)。
【００５７】
用語「VhH」および「V-NAR」は、それぞれカメリドおよびサメIgの一本の高親和性V様ドメインを表す(例えば、参考文献27)。齧歯類もしくは霊長類VHドメインと異なり、それらは可溶性断片であるが、ラマVhHドメインは免疫原性がほんのわずかのようである。
【００５８】
組換え抗体断片の総説は、例えば参考文献27に記載されているが、そのような組換え抗体断片の製造方法は、例えば参考文献28または参考文献29に記載されている。
【００５９】
抗ポリマー抗体は、実質的にあらゆるタイプのポリマー抗原に対して生成することができる。例えば、例えば参考文献30に記載の抗ヘマグルチニン、抗HIVgp120、抗ホスホタンパク質、抗DNA、抗ガラクタン、抗デキストラン、抗ポリリジン、抗ポリアルギニン、抗ポリアクリルアミド、抗ポリビニルピロリドン、および抗ポリエチレングリコール抗体のような、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、多くの天然、合成、および半合成ポリマーに対して産生される。
【００６０】
好ましい抗体は、例えば、その基本骨格にオキシエチレン反復単位を含むポリマーまたはコポリマーを含む親水性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール(PEG。当該分野では「ポリエチレンオキシド」-PEO、または「ポリオキシエチレン」-POEとも呼ばれる。)およびその誘導体、オキシプロピレン反復単位を含むポリマーまたはコポリマー、例えば、ポリプロピレングリコール(PPG、当該分野では「ポリプロピレンオキシド」-PPOまたは「ポリオキシプロピレン」-POPとも呼ばれる。)およびその誘導体、多糖(例えば、デキストラン)、ポリアミノ酸(例えば、ポリリジン)、ポリ-もしくはオリゴ-ヌクレオチド、または半合成ペプチドを認識し、それと特異的に結合するものである。より好ましい抗体は、その基本骨格に反復オキシエチレン単位を含むポリマーまたはコポリマー、例えば、PEG、またはエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー(例えば、PEGおよびPPGのブロックコポリマー)を認識し、それと特異的に結合することができるものである。反復オキシエチレン単位(例えば、PEG)を含み、メトキシ基で終わるポリマー(例えばmPEG、すなわちメトキシで終わるPEG)を認識し、それと結合する該抗体が特に好ましい。
【００６１】
例えば、mPEGと特異的に結合することができる抗体は、非メトキシル化PEGポリマー(例えば、末端にメトキシ基を持たないPEGは、しばしば、ガス充填微小胞またはリポソームの凍結乾燥前駆体の製造において抗凍結剤物質として用いられる)も含有する製剤中に含まれ得る該mPEGを含む超分子アセンブリに特異的に結合させるのに用いることができるので特に好都合である。
【００６２】
抗PEG抗体は当該分野でよく知られており、例えば、参考文献31または参考文献32に記載されている(これらの内容は本明細書の一部を構成する)。PEG基本骨格(すなわち、該ポリマーの基本骨格中の反復オキシエチレン単位の配列)と特異的に結合する市販の抗PEG抗体はAGP3およびE11(Institute of Biomedical Sciences、Academia Sinica、Taipei、Taiwan)として利用可能であるが、メトキシ基で終わるPEGポリマーと特異的に結合する抗体は抗体PEG-B-47(Epitomics Inc. USA)として利用可能である。
ターゲッティングリガンド
【００６３】
該ポリマーを含有するリポソームまたはガス充填微小胞と目的とする身体領域または組織との効果的な結合を可能にするために、抗ポリマー抗体を該特定の身体領域または組織と結合することができる適切な成分と結合させる。すなわち、該成分は、該特定の身体領域または組織上の対応する標的、例えば、該特定の身体領域または組織に発現するレセプターと結合することができるターゲッティング部分を含む。本明細書で用いている用語「ターゲッティングリガンド」には、in vivoで組織および/またはレセプターに対するターゲッティング活性を有するか、該活性を増強することができるあらゆる化合物、部分、もしくは残基が含まれる。ターゲッティングリガンドが結合することができる標的には、組織、例えば、心筋組織(心筋細胞(myocardial cellおよびcardiomyocyte)を含む)、膜様組織(内皮および上皮を含む)、ラミナ(薄層)、結合組織(腸組織を含む)または腫瘍；血栓；およびレセプター、例えば、ペプチドホルモンの細胞表面レセプター、神経伝達物質、抗原、補体断片、免疫グロブリン、およびステロイドホルモンの細胞質レセプターが含まれる。その平均サイズのため、リポソームおよびガス充填微小胞は、一般に血管内コンパートメント内に留まる傾向があり、該ターゲッティング部位は、管腔内に位置するのが最も好ましい。したがって、分子標的は、血管内膜の内皮細胞と結合するのが好ましい。これらの標的は、内皮細胞の表面にあるか、または内皮細胞膜内に統合され得る。
【００６４】
適切なターゲッティングリガンドの例には、例えば、タンパク質(抗体、抗体断片、レセプター分子、レセプター結合分子、糖タンパク質、およびレクチンを含む)；ペプチド(オリゴペプチドおよびポリペプチドを含む)；ペプチド模倣物；糖類(単糖および多糖を含む)；ビタミン；ステロイド、ステロイド類似体、ホルモン、補助因子、生物活性物質(置換小分子を含む)および遺伝子物質(ヌクレオシド、ヌクレオチド、およびポリヌクレオチド、およびその模倣物、例えばペプチド核酸を含む)が含まれる。
【００６５】
適切な標的およびターゲッティングリガンドの例は、例えば参考文献33に記載されている(この内容は本明細書の一部を構成する)。
【００６６】
本発明の標的化微小胞が向けられる適切な特異的標的の例には、例えばフィブリンおよび活性化血漿板上のGPIIbIIIa レセプターがある。フィブリンおよび血小板は、一般に「血栓」、すなわち血流中で形成され、血管閉塞を生じることがある凝血中に存在する。さらに、フィブリンは、種々の腫瘍プロセスに関連することもある。フィブリンターゲッティングに特異的な好ましい結合ペプチドは例えば参考文献34に記載されている(この内容は本明細書の一部を構成する)。フィブリンターゲッティングに特異的なさらに好ましい結合ペプチドは例えば参考文献35および参考文献36に記載されている(これらの内容も本明細書の一部を構成する)。
【００６７】
重要な標的の他の例には、不安定プラーク中のレセプターおよび腫瘍特異的レセプター、例えばキナーゼ挿入ドメインレセプター(KDR)、およびVEGF(血管内皮成長因子)/KDR複合体が含まれる。ターゲッティングKDRまたはVEGF/KDR複合体のターゲッティングに適した結合ペプチドの例は、例えば、参考文献37、参考文献38、参考文献39、および参考文献40に記載されている(これらの内容は本明細書の一部を構成する)。腫瘍特異的リガンドの他の例には、例えばトランスフェリン、葉酸、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸配列(RGD)、NRG配列(新たに形成された血管上に発現したアミノペプチダーゼをターゲッティングするための)もしくはGA3ペプチド配列(腫瘍の血管新生に関与する標的Tie2レセプター)、Tuftsin様配列(参考文献41に記載のターゲッティングNRP-1レセプター)がある。
【００６８】
本発明の態様によれば、ターゲッティングリガンドは抗体であり、該抗体には、上記のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、天然抗体断片、組換え抗体断片、および多特異抗体、ならびにその抗原結合断片(例えば、アフィボディ)が含まれる。適切な抗体および利用可能なそのそれぞれの潜在的標的を下記表に示す。
【表１】
0005491511.tif 000002
抗ポリマー抗体とターゲッティングリガンドの結合
【００６９】
本発明に用いるのに有用なターゲッティング構築物は、下記一般式で表すことができる：(TL)nZ(APA)m
［式中、
TLは、リンカーZと反応するかまたはそれを形成することができる部分で機能化されることがある上記ターゲッティングリガンドを表す；
APAは、リンカーZと反応するかまたはそれを形成することができる部分で機能化されることがある上記抗ポリマー抗体を表す；
Zは、共有結合、結合部分、キレーティング部分、結合タンパク質(例えば、アビジンもしくはストレプトアビジン)、または超分子ベクター、例えばミセル、リポソーム、またはナノ粒子から選ばれる2機能性リンカーまたは多機能性リンカーを表す；
nおよびmは、独立して1〜100,000の整数である。]。
【００７０】
例えば、Zが共有結合(すなわち、2機能性リンカー)である場合は、TLおよびAPAは、互いに反応するよう適切に修飾され(すなわち、リンカーZは共有結合として形成される)、mおよびnは共に1である。
【００７１】
Zがストレプトアビジン(4機能性リンカー)である場合は、TLおよびAPAは、適切にリンカーと相互作用するよう修飾され(特に、ビオチン部分がTLおよびAPAの各構造中に導入される)、それぞれ、mは1、2、または3であり、nは3、2、または1である(m＋nの合計が4になる)。
【００７２】
Zが多機能性リンカー、例えばミセルまたはリポソームである場合は、TLおよびAPAは、該リンカーと相互作用するように修飾され(例えば、それらはミセルまたはリポソームを形成する分子と結合することができる)、nおよびmは共に、リンカーの組成とそのサイズに応じて1〜100,000で変化しうる。
【００７３】
抗ポリマー抗体を、種々の手順および方法論に従ってターゲッティングリガンドと結合させ、目的とするターゲッティング構築物を得ることができる。
【００７４】
第1の態様において、該抗ポリマー抗体はターゲッティングリガンドと共有結合している。この場合において、APAおよびTLは、ディアボディまたは二特異性ビス-scFvのような組換え融合タンパク質として生じることが好ましい。二機能性抗体は、2つのハイブリドーマを融合させるか(ハイブリッドハイブリドーマ)またはジスルフィド結合を介して2つの還元抗体断片を結合することにより製造することもできる。あるいはまた、二機能性抗体は、ヘテロ二機能性リンカーまたはホモ二機能性リンカー、多価機能化ポリマー、例えば4アームPEG-マレイミド(CreativePegWorks、USA)を用いて2つの異なる抗体を化学的にカップリングするか、または指向性カップリング基、例えば「Bioconjugate toolkit reagents(バイオコンジュゲートツールキット試薬)」(Pierce、Switzerland)において利用可能なものを導入することにより生成することができる。例えば、APAは、例えば、該成分をスクシニミジル4-ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラジンと反応させることによりその構造内にヒドラジン部分を導入することにより修飾することができる。別個に、TL(例えば、ターゲッティング抗体またはその断片)を、例えば、スクシニミジル4-ホルミルベンゾエートと反応させることにより修飾し、その構造内にアルデヒド基が導入されるよう修飾する。次に、そうして修飾した化合物を室温で数時間、等モル比で反応させ、共有結合した二機能性コンジュゲートを形成する。所望により、ゲル濾過クロマトグラフィによりヘテロダイマーを非反応化合物および/またはマルチマーから分離することができる。もちろん、同様に、上記手順は、ヒドラジン基をターゲッティングリガンド(例えば、ターゲッティング抗体またはその断片)に導入し、抗ポリマー抗体の構造内にアルデヒド基を導入することにより実施することができる。同様に、ディアボディの代わりに、二機能性APAおよびTLを、2つのAPAが2つのTLと結合したテトラボディを生成するよう修飾することができる。
【００７５】
好ましい態様において、抗ポリマー抗体は、ターゲッティングリガンド(例えば、超分子アセンブリ、例えば、ミセル、ナノ粒子、またはリポソームの形の)と非共有結合する。
【００７６】
例えば、該抗体および該ターゲッティングリガンドは、図1に示すようにミセルの形で非共有結合することができる。このために、両親媒性化合物101(例えばリン脂質)は抗ポリマー抗体102と共有結合するが、別の(または同じ)両親媒性化合物を望ましいターゲッティングリガンド103と結合させる。次に、それぞれさらなる成分を含む2つの両親媒性化合物を水性担体と混合し、ミセルアセンブリの形のターゲッティング構築物を得る。
【００７７】
あるいはまた、該抗体および該ターゲッティングリガンドを、図2に示すようにリポソームの形に非共有結合させることができる。例えば、上記手順と同様に、APAおよびTL(それぞれ202および203で示す)は、それぞれ両親媒性化合物201と共有結合することができ、次いで、これはリポソームのエンベロープ204内に含まれる(例えば、同じおよび/または異なる両親媒性化合物により形成される)。好都合には、ミセル構造、特にリポソームの使用は、特に目的の領域中のターゲッティング部位の量が比較的低い場合に、該ポリマーを含むリポソームまたは微小胞に対する結合部位の量の増強を可能にする。
【００７８】
あるいはまた、該非共有結合は、図3に示す生物学的特異的親和性相互作用(例えばストレプトアビジン-ビオチン結合)に基づくことができる。例えば、ターゲッティングリガンド303は、その構造内にビオチン部分301を導入することにより(例えば、反応性ビオチン含有溶液の存在下でターゲッティング抗体のリン酸緩衝液サスペンジョンをインキュベーションすることにより)修飾することができる。同様に、抗ポリマー抗体302も同様の方法で修飾し、ビオチン化抗ポリマー抗体を得ることができる。次に、2ビオチン化抗体の混合物をストレプトアビジン304(4つのビオチン部分と結合することができる)含有サスペンジョンと反応させて、図3に示す目的とする2特異性構築物を得る。所望により、該ターゲッティングリガンドおよびAPAを含む構築物は好都合には治療剤も含む。例えば、該治療剤はリポソーム組成物内に含まれうる。
【００７９】
別の態様において、該抗ポリマー抗体と結合した種々のターゲッティングリガンドを含む種々の(すなわち、2またはそれ以上)ターゲッティング構築物の混合物を製造することもできる。
【００８０】
例えば、これは上記のごとく製造したターゲッティング構築物の2またはそれ以上の異なる調製物(該抗体とターゲッティングリガンドが共有結合または非共有結合している)を単に混合することにより得ることができる。あるいはまた、該混合物は、上記手順に従って、2またはそれ以上のターゲッティングリガンド(抗ポリマー抗体と混合した)を用いて超分子ベクター(例えばミセル、リポソーム)を製造するか、または2またはそれ以上の異なるビオチン化ターゲッティングリガンド(ビオチン化抗ポリマー抗体と混合した)を用いてビオチン-ストレプトアビジンターゲッティング構築物を製造することにより得ることができる。
ガス充填微小胞
【００８１】
本発明のガス充填微小胞は、ガス充填微小気泡、マイクロカプセル、およびマイクロバルーンを含む当該分野で知られたあらゆる微小胞であり得る。
【００８２】
好ましい微小胞は、ガス充填微小気泡、すなわち、一般的に1またはそれ以上の両親媒性成分により安定化された微小胞である。微小気泡の安定化エンベロープを形成するための適切な両親媒性成分は、例えば、リン脂質；リゾリン脂質；脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、もしくはオレイン酸；キチン、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドン、もしくはポリエチレングリコール(PEG)のようなポリマーを保持する脂質(ペグ化脂質ともいう)；硫酸化単糖、二糖、オリゴ糖、または多糖保持脂質；コレステロール、コレステロール硫酸もしくはコレステロールヘミスクシネート；トコフェロールヘミスクシネート；エーテルもしくはエステル結合脂肪酸含有脂質；重合脂質；ジアセチルホスフェート；ジセチルホスフェート；セラミド；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸ステアレート）、ポリオキシエチレン脂肪アルコール、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエステル、ポリオキシエチル化ソルビタン脂肪酸エステル、グリセロールポリエチレングリコールリシノレート、エトキシル化ダイズステロール、エトキシル化ヒマシ油もしくはエチレンオキシド（ＥＯ）、およびプロピレンオキシド（ＰＯ）ブロックコポリマー；ステロール脂肪酸エステル（コレステロールブチレート、コレステロールイソブチレート、コレステロールパルミテート、コレステロールステアレート、ラノステロールアセテート、エルゴステロールパルテート、もしくはフィトステロールｎ−ブチレートを含む）；糖酸のステロールエステル（コレステロールグルクロニド、ラノステロールグルコロニド、７−デヒドロコレステロールグルコロニド、エルゴステロールグルコロニド、コレステロールグルコネート、ラノステロールグルコネート、またはエルゴステロールグルコネートを含む）；糖酸およびアルコールのエステル（ラウリルグルコロニド、ステアロイルグルコロニド、ミリストイルグルコロニド、ラウリルグルコネート、ミリストイルグルコネート、またはステアロイルグルコネートを含む）；糖と脂肪酸のエステル（ラウリン酸スクロース、ラウリン酸フルクトース、パルミチン酸スクロース、ステアリン酸スクロース、グルクロン酸、グルコン酸、もしくはポリウロン酸を含む）；サポニン（サルササポゲニン、スミラゲニン、ヘデラゲニン、オレアノール酸、またはジギトキシゲニンを含む）；グリセロールもしくはグリセロールエステル（グリセロールトリパルミテート、グリセロールジステアレート、グリセロールトリステアレート、グリセロールジミリステート、グリセロールトリミリステート、グリセロールジラウレート、グリセロールトリラウレート、グリセロールジパルミテートを含む）；長鎖アルコール（ｎ−デシルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、またはｎ−オクタデシルアルコールを含む）；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；ジガラクトシルジグリセリド；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシル−１−チオ−β−Ｄ−マンノピラノシド；１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）オクタデカン酸；Ｎ−［１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）オクタデカノイル］−２−アミノパルミチン酸；Ｎ−スクシニルジオレイルホスファチジルエタノールアミン；１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロール；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール；１，３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール；１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロホスホエタノールアミン、またはパルミトイルホモシステイン；少なくとも１の（Ｃ１０−Ｃ２０）、好ましくは（Ｃ１４−Ｃ１８）アルキル鎖を含むアルキルアミンまたはアルキルアンモニウム塩、例えば、Ｎ−ステアリールアミン、Ｎ，Ｎ’−ジステアリールアミン、Ｎ−ヘキサデシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジヘキサデシルアミン、Ｎ−ステアリール塩化アンモニウム、Ｎ，Ｎ’−ジステアリール塩化アンモニウム、Ｎ−ヘキサデシル塩化アンモニウム、Ｎ，Ｎ’−ジヘキサデシル塩化アンモニウム、ジメチルジオクタデシル臭化アンモニウム（ＤＤＡＢ）、ヘキサデシルトリメチル臭化アンモニウム（ＣＴＡＢ）；（Ｃ３−Ｃ６）アルキレン架橋によりＮ原子と結合した１または好ましくは２の（Ｃ１０−Ｃ２０）、好ましくは（Ｃ１４−Ｃ１８）アシル鎖を含む第３または第４アンモニウム塩、例えば、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＰＴＡＰ）、１，２−オレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアロイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＤＡＰ）；およびそれらの混合物または組み合わせを含む。
【００８３】
好ましい態様によれば、微小気泡のエンベロープを形成する化合物の少なくとも1は、その他のあらゆる上記物質と混合されることがあるリン脂質である。本明細書によれば、用語リン脂質は、分子が、最終微小気泡サスペンジョン中のガス-水境界界面に物質の安定化膜(典型的には単分子層の形の)を形成することができるあらゆる両親媒性リン脂質化合物を含むことを意図する。したがって、これら物質も当該分野では「フィルム形成リン脂質」という。
【００８４】
両親媒性リン脂質化合物は、典型的には、少なくとも1のリン酸基、および少なくとも1の、好ましくは2の脂溶性長鎖炭化水素基を含む。
【００８５】
適切なリン脂質の例には、脂肪酸の1もしくは好ましくは2(等しいかまたは異なる)残基およびリン酸を有するグリセロールのエステルを含み、その結果、リン酸残基は親水性基、例えば、コリン(ホスファチジルコリン-PC)、セリン(ホスファチジルセリン-PS)、グリセロール(ホスファチジルグリセロール-PG)、エタノールアミン(ホスファチジルエタノールアミン-PE)、イノシトール(ホスファチジルイノシトール)などと結合する。脂肪酸を1残基のみ有するリン脂質のエステルは、一般に、当該分野ではリン脂質の「リゾ」形、もしくは「リゾリン脂質」という。該リン脂質中に存在する脂肪酸残基は、一般的には、典型的には炭素数12〜24の、好ましくは14〜22の長鎖脂肪族鎖であり、該脂肪族鎖は、1またはそれ以上の不飽和を含むか、または好ましくは完全に飽和されていてよい。該リン脂質中に含まれる適切な脂肪酸の例には、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸がある。好ましくは、飽和脂肪酸、例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、およびアラキドン酸を用いる。
【００８６】
リン脂質のさらなる例には、ホスファチジン酸、すなわち、グリセロール-リン酸と脂肪酸のジエステル；スフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴミエリン、すなわち、脂肪酸を有するグリセロールジエステルの残基がセラミド鎖で置換しているそれらのホスファチジルコリン類似体；カルジリピン、すなわち、1,3-ジホスファチジルグリセロールと脂肪酸のエステル；糖脂質、例えば、ガングリオシドGM1(またはGM2)またはセレブロシド；糖脂質；スルファチドおよび糖スフィンゴ脂質がある。
【００８７】
本明細書で用いている、用語リン脂質には、単独でまたは混合物として用いることができる天然、半合成、または合成生成物が含まれる。
【００８８】
天然リン脂質の例には、天然レシチン(ホスファチジルコリン(PC)誘導体)、例えば、典型的にはダイズもしくは卵黄レシチンがある。
【００８９】
半合成リン脂質の例には、天然レシチンの部分もしくは完全水素化誘導体がある。好ましいリン脂質には、ホスファチジルコリン、エチルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、またはスフィンゴミエリンの脂肪酸ジエステルがある。
【００９０】
好ましいリン脂質の例には、例えば、ジラウロイル-ホスファチジルコリン(DLPC)、ジミリストイル-ホスファチジルコリン(DMPC)、ジパルミトイル-ホスファチジルコリン(DPPC)、ジアラキドイル-ホスファチジルコリン(DAPC)、ジステアロイル-ホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイル-ホスファチジルコリン(DOPC)、1,2ジステアロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(エチル-DSPC)、ジペンタデカノイル-ホスファチジルコリン(DPDPC)、1-ミリストイル-2-パルミトイル-ホスファチジルコリン(MPPC)、1-パルミトイル-2-ミリストイル-ホスファチジルコリン(PMPC)、1-パルミトイル-2-ステアロイル-ホスファチジルコリン(PSPC)、1-ステアロイル-2-パルミトイル-ホスファチジルコリン(SPPC)、1-パルミトイル-2-オレイルホスファチジルコリン(POPC)、1-オレイル-2-パルミトイル-ホスファチジルコリン(OPPC)、ジラウロイル-ホスファチジルグリセロール(DLPG)およびそのアルカリ金属塩、ジアラキドイルホスファチジル-グリセロール(DAPG)およびそのアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)およびそのアルカリ金属塩、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)およびそのアルカリ金属塩、ジステアロイルホスファチジルグリセロール(DSPG)およびそのアルカリ金属塩、ジオレオイル-ホスファチジルグリセロール(DOPG)およびそのアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジン酸(DMPA)およびそのアルカリ金属塩、ジパルミトイルホスファチジン酸(DPPA)およびそのアルカリ金属塩、ジステアロイルホスファチジン酸(DSPA)、ジアラキドイルホスファチジン酸(DAPA)およびそのアルカリ金属塩、ジミリストイル-ホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジステアロイルホスファチジル-エタノールアミン(DSPE)、ジオレイルホスファチジル-エタノールアミン(DOPE)、ジアラキドイルホスファチジルエタノールアミン(DAPE)、ジリノレイルホスファチジルエタノールアミン(DLPE)、ジミリストイルホスファチジルセリン(DMPS)、ジアラキドイルホスファチジルセリン(DAPS)、ジパルミトイルホスファチジルセリン(DPPS)、ジステアロイルホスファチジルセリン(DSPS)、ジオレオイルホスファチジルセリン(DOPS)、ジパルミトイルスフィンゴミエリン(DPSP)、およびジステアロイルスフィンゴミエリン(DSSP)、ジラウロイル-ホスファチジルイノシトール(DLPI)、ジアラキドイルホスファチジルイノシトール(DAPI)、ジミリストイルホスファチジルイノシトール(DMPI)、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール(DPPI)、ジステアロイルホスファチジルイノシトール(DSPI)、ジオレオイル-ホスファチジルイノシトール(DOPI)がある。
【００９１】
特に好ましいリン脂質は、DAPC、DSPC、DPPC、DMPA、DPPA、DSPA、DMPG、DPPG、DSPG、DMPS、DPPS、DSPS、およびエチル-DSPCである。DPPG、DPPS、およびDSPCが最も好ましい。
【００９２】
リン脂質の混合物、例えば、DPPE、DPPC、DSPCおよび/またはDAPCと、DSPS、DPPS、DSPA、DPPA、DSPG、DPPG、エチル-DSPCおよび/またはエチル-DPPCの混合物も用いることができる。
【００９３】
好ましい態様において、該リン脂質は、微小気泡の安定化エンベロープの主成分であり、その量は、ガス充填微小気泡のエンベロープ形成成分の総量の少なくとも50％(w/w)である。ある好ましい態様において、エンベロープの実質的に全体(すなわち少なくとも90％)をリン脂質で形成することができる。
【００９４】
該リン脂質は、好都合には、上記のあらゆる両親媒性化合物と組み合わせて用いることができる。すなわち、例えば、脂質、例えば、コレステロール、エルゴステロール、フィトステロール、シトステロール、ラノステロール、トコフェロール、没食子酸プロピルもしくはアスコルビルパルミテート、脂肪酸、例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸およびその誘導体、またはブチル化ヒドロキシトルエン、および/または他の非リン脂質化合物を、所望により、1またはそれ以上の前記リン脂質に0〜50重量％、好ましくは25％以下の範囲の割合で加えることができる。特に、パルミチン酸が好ましい。
【００９５】
抗ポリマー抗体と適切に相互作用するために、次に微小気泡の安定化エンベロープはポリマー、好ましくは親水性ポリマーを含むべきである。適切な親水性ポリマーの例には、例えば、その基本骨格中にオキシエチレン反復単位を含むポリマーまたはコポリマー(例えば、PEG)およびその誘導体、オキシプロピレン反復単位を含むポリマーまたはコポリマー、例えば、PPGおよびその誘導体、多糖(例えば、デキストラン)、ポリアミノ酸(例えば、ポリリジン)、ポリ-またはオリゴ-ヌクレオチド、または半合成ペプチドが含まれる。これらポリマーの中で合成または半合成ポリマーが好ましく、特に、その基本骨格中に反復オキシエチレン単位を含むポリマーまたはコポリマー、例えば、PEG、またはエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー(例えば、PEGおよびPPGのブロックコポリマー)が好ましい。好ましい態様によれば、反復オキシエチレン単位を含む該ポリマーはメトキシ基で終了する。すなわち、
-(O-CH2-CH2)n-O-CH3
[式中、遊離結合は、該ポリマーと微小胞のエンベロープ(またはその成分)との結合を示し、nは、該ポリマーの反復オキシエチレン単位の数を示す整数であり、約10〜約2,000、好ましくは約10〜約200、より好ましくは約40〜160で変化しうる。特に、好ましいポリマーは、メトキシが末端にあるPEG(mPEG)である。
【００９６】
該ポリマーの分子量は、約500〜約100,000ダルトン、好ましくは約1,000〜約10,000ダルトンで変化しうる。特に、分子量約2,000〜約8,000ダルトンのmPEGが好ましく、約5,000ダルトンのmPEGがより好ましい。
【００９７】
該ポリマーは、典型的には、微小気泡の安定化エンベロープの成分と適合性の化合物、好ましくは(エンベロープを形成する他の安定化化合物と疎水性に相互作用するように)その中に少なくとも疎水性部分を含む化合物、好ましくは、両親媒性化合物、例えばリン脂質などと共有結合している。親水性ポリマーを含有するリン脂質の好ましい例には、PEGで修飾したホスファチジルエタノールアミン(PE)(「PE-PEG」と略す)、すなわち、親水性エタノールアミン部分が種々の分子量のPEG分子と結合しているホスファチジルエタノールアミン、例えば、DPPE-PEG(またはDSPE-、DMPE-、DOPE-、DAPE、もしくはDLPE-PEG)、すなわち、それと結合したPEGポリマーを有するDPPE(または、DSPE、DMPE、DOPE、DAPE、もしくはDLPE)がある。例えば、DPPE-PEG5000は、平均分子量約5,000のPEGポリマーと結合したDPPEを表す。あるいはまた、該ポリマーは、他の両親媒性脂質成分、例えば、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)、ジアシルグリセロール、ジアルキルオキシプロピル、セラミド、またはコレステロールと結合し、対応するペグ化脂質誘導体を形成することができる。親水性ポリマーを含む他の可能な成分には、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンビス(イミダゾリルカルボニル)、ポリオキシエチレン脂肪エーテル(例えば、市販品のBrij(登録商標))、ポロキサマー(すなわち、ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドのブロックコポリマー、例えば、市販品のTween(登録商標)またはPluronic(登録商標))、ポリソルベート(すなわち、脂肪酸と反応させたペグ化ソルビタンの誘導体、例えば、市販品のTriton(登録商標))、ポリエチレングリコールステレート、またはポリオキシエチレンステアレート(例えば、市販品のMyrj)が含まれる。
【００９８】
本出願人は、ガス充填微小胞と抗ポリマー抗体を含むターゲッティング構築物との効果的な結合を可能にするには、微小胞の安定化エンベロープ中の重合化合物のモル量は、該エンベロープを形成する成分の総モル量に対して、好ましくは少なくとも0.05％、より好ましくは少なくとも0.2％、さらにより好ましくは少なくとも1％であることをみいだした。微小胞の表面上の複数のポリマー分子の存在は、微小胞の種々のAPAとの多価結合を可能にし、より高い親和性によって結合を改善する。
【００９９】
他方、本出願人は、過剰量の重合化合物は、必ずしも微小胞の結合効率をそれに対応して増強しないことをみいだした。したがって、重合化合物のモル量は、一般的には、約15％以下、好ましくは約12％以下、より好ましくは約10％以下である。ある好ましい態様において、特に血管系においてリポソームまたはガス充填微小胞が多くの(時間)循環をするのが望ましくない場合に、重合化合物のモル量は、4％より高くない、より好ましくは2％より高くないことが好ましい。
【０１００】
本発明の組成物の微小気泡は、当該分野で知られたあらゆる方法に従って製造することができる。典型的には、該製造方法は、上記両親媒性物質(ポリマー保持両親媒性物質を含む)を含む乾燥粉末物質の、好ましくは該物質を含む水性もしくは有機サスペンジョンの凍結乾燥による製造を含む。
【０１０１】
例えば、参考文献3に記載のごとく、フィルム形成両親媒性化合物は、最初に、リポソームの形成に用いるあらゆる方法により層形に変換することができる。そのために、フィルム形成脂質および所望により他の添加物(例えば、増粘剤、非フィルム形成界面活性剤、電解質など)を含む水性溶液を、高速機械式ホモゲナイゼーション、または音響周波数もしくは超音波周波数下のソニケーションにかけ、次いで凍結乾燥して自由流動性粉末を形成し、次いでガス存在下で保存することができる。所望により凍結乾燥前に洗浄工程を実施することができる。
【０１０２】
別の態様(例えば参考文献6に記載の)にしたがって、フィルム形成化合物および親水性安定化剤(例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、グリコール酸、リンゴ酸、またはマルトール)を有機溶媒(例えば、第3ブタノール、2-メチル-2-ブタノール、またはC2Cl4F2)に溶解し、次いで該溶液を凍結乾燥し乾燥粉末を形成することができる。
【０１０３】
好ましくは、例えば参考文献7に記載のごとく、リン脂質(ポリマー保持リン脂質を含む上記から選ばれる)および凍結保護剤(例えば、上記のもの、特に、炭水化物、糖アルコール、ポリグリコール、ポリオキシアルキレングリコール、およびその混合物)を、水と水非混和性有機溶媒(例えば、分枝状もしくは直線状アルカン、アルケン、シクロアルカン、芳香族炭化水素、アルキルエーテル、ケトン、ハロゲン化炭化水素、過フッ化炭化水素、またはその混合物)のエマルジョンに撹拌下で分散することができる。該エマルジョンは、少なくとも1のリン脂質の存在下で水性媒質と該溶媒を当該分野で知られた適切なエマルジョン生成技術、例えば、ソニケーション、振盪、高圧ホモゲナイゼーション、微小混合、膜乳化法、高速撹拌、もしくは高剪断混合にかけることにより得ることができる。例えば、ロータ-ステータ(rotor-stator)ホモゲナイザー、例えばPolytron(登録商標)PT3000を用いることができる。ロータ-ステータホモゲナイザーの撹拌速度は、該エマルジョンの成分、該エマルジョンの容量、有機溶媒の相対容量、該エマルジョンを含有する容器の直径、および該エマルジョン中の溶媒の微小滴の目的とする最終直径に応じて選択することができる。あるいはまた、微小混合技術を用いて、例えば、ミキサー中に有機溶媒を第1注入口から導入し(例えば0.05〜5mL/minの流速で)、水性相を第2注入口から導入する(例えば2〜100mL/minの流速で)ことにより混合物をエマルジョンにすることができる。エマルジョン技術に応じて、有機溶媒をエマルジョン化工程中徐々に、またはエマルジョン化工程の開始前に一度に導入することができる。あるいはまた、水性媒質を水非混和性溶媒にエマルジョン化工程中徐々に、またはエマルジョン化工程の開始前に一度に加えることができる。好ましくは、リン脂質を水性媒質に分散し、次いで、これを有機溶媒と混合する。あるいはまた、リン脂質は、有機溶媒に分散するか、またはエマルジョン化工程の前または該工程中に水性-有機混合物に別個に加えることができる。次に、そのようにして得られた、リン脂質物質(および所望により他の両親媒性フィルム形成化合物および/または添加物)により取り囲まれ、安定化された溶媒の微小滴を含むミクロエマルジョンを、常套的技術により凍結乾燥して凍結乾燥物質を得、これを(例えば適切なガス存在下のバイアル中に)保存し、水性担体で再構成して、最終的に、微小気泡の大きさとサイズ分布が微小滴のサスペンジョンの大きさとサイズ分布と実質的に同程度であるガス充填微小気泡サスペンジョンを得ることができる。
【０１０４】
ガス充填微小気泡の製造方法には、さらに、リン脂質(および所望により他の両親媒性フィルム形成化合物および/または添加物)を含む水性媒質を、望ましいガスの存在下で制御された高撹拌エネルギー(例えばロータ-スタータミキサーによる)にかけてガス微小気泡ディスパージョンを生成し、次いで得られたディスパージョンを凍結乾燥して再構成可能な乾燥生成物を得ることが含まれる。この方法の例は、例えば参考文献42に記載されている(この内容は本明細書の一部を構成する)。
【０１０５】
噴霧乾燥技術(例えば参考文献43に記載されている)を用いて、生物学的水性担体と接触させて再構成しガス充填微小気泡を得ることができる乾燥粉末を得ることもできる。
【０１０６】
あらゆる上記技術を用いて得られる乾燥または凍結乾燥生成物は、一般に粉末もしくはケーキの形であり、望ましいガスと接触させて(例えばバイアル中)微小胞前駆体として保存することができる。該生成物は、典型的には注射可能な適切な生理学的に許容される水性液体担体を用いて容易に再構成することができ、次いで、このサスペンジョンを静かに撹拌するとガス充填微小気泡が形成される。適切な生理学的に許容される液体担体は、無菌水、水性溶液、例えば生理食塩水(これは注射用の最終生成物が低張でないように好都合に平衡化することができる)、または1またはそれ以上の張性調節剤、例えば塩もしくは糖、糖アルコール、グリコール、もしくは他の非イオン性ポリオール物質(例えば、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど)の溶液である。
【０１０７】
別の態様では、本発明のガス充填微小胞はマイクロカプセルでありうる。マイクロカプセルの好ましい例には、所望により生分解性ポリマーと混合したポリマー、好ましくは、生分解性ポリマー、または生分解性水不溶性脂質(例えば、トリパルミチン)を含む安定化エンベロープを有するものがある。適切なマイクロカプセルおよびその製造の例は、例えば参考文献8および参考文献9に記載されている(これらの内容は本明細書の一部を構成する)。タンパク質性エンベロープ(すなわち天然タンパク質(アルブミン、ヘモグロビン)でできた)を有するマイクロカプセル、例えば、参考文献44または参考文献45(これらの内容は本明細書の一部を構成する)に記載のものも用いることができる。また、この場合において、APAにより認識されやすい該ポリマー(例えば、PEGまたはmPEG)は、好ましくは、マイクロカプセルの各エンベロープを形成する成分、例えば、ポリマー(例えば、ポリメタクリレート、ポリスチレン、またはポリ(L-ラクチド))、上記両親媒性脂質、またはタンパク質(例えば、アルブミンまたはラクトアルブミン)と適合性の化合物と、先に記載したのと同じモル量で結合している。あらゆる生体適合性ガス、ガス前駆体、またはその混合物を用いて上記微小胞を満たすことができる(以後、「微小胞形成ガス」ともいう)。
【０１０８】
該ガスは、例えば空気、窒素、酸素、二酸化炭素、水素、亜酸化窒素、希もしくは不活性ガス(例えば、ヘリウム、アルゴン、キセノン、またはクリプトン)、放射性ガス(例えばXe133またはKr81)、過分極希ガス(例えば、過分極ヘリウム、過分極キセノン、または過分極ネオン)、低分子量炭化水素(例えば、7個以下の炭素原子を含む)(例えば、アルカン(例えば、メタン、エタン、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタン、もしくはイソペンタン)、シクロアルカン(例えば、シクロブタンもしくはシクロペンタン)、アルケン(例えばプロペン、ブテン、またはイソブテン、またはアルキン(例えば、アセチレン))、エーテル、ケトン、エステル、ハロゲン化ガス(好ましくはフッ化ガス)またはハロゲン化、フッ化、もしくは過フッ化(prefluorinated)低分子量炭化水素(例えば、7個までの炭素原子を含む)、あるいは前記のあらゆる混合物が含まれうる。ハロゲン化炭化水素を用いる場合は、該化合物中のハロゲン原子の好ましくは少なくともいくらか、より好ましくはすべてがフッ素原子である。
【０１０９】
特に超音波画像診断の分野では、フッ化ガス、特に過フッ化ガスが好ましい。フッ化ガスには、少なくとも1のフッ素原子を含む物質、例えばフッ化炭化水素(1またはそれ以上の炭素原子およびフッ素を含む有機化合物)、六フッ化硫黄、フッ化、好ましくは過フッ化ケトン(例えばパーフルオロアセトン)、およびフッ化、好ましくは過フッ化エーテル(例えば、パーフルオロジエチルエーテル)が含まれる。好ましい化合物は、過フッ化ガス、例えば、SF6もしくはパーフルオロカーボン(過フッ化炭化水素)、すなわち、例えば参考文献4に記載の特に安定な微小気泡サスペンジョンを形成することが知られているすべての水素原子がフッ素原子で置換している炭化水素である。
【０１１０】
用語パーフルオロカーボンには、飽和、不飽和、および環式パーフルオロカーボンが含まれる。生体適合性の生理学的に許容されるパーフルオロカーボンの例には、パーフルオロアルカン、例えば、パーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン(例えば、所望により他の異性体、例えばパーフルオロ-イソブタンと混合しているパーフルオロ-n-ブタン)、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘキサン、もしくはパーフルオロヘプタン；パーフルオロアルケン、例えば、パーフルオロプロペン、パーフルオロブテン(例えば、パーフルオロブタ-2エン)、もしくはパーフルオロブタジエン；パーフルオロアルキン(例えば、パーフルオロブタ-2-イン)；およびパーフルオロシクロアルカン(例えば、パーフルオロシクロブタン、パーフルオロメチルシクロブタン、パーフルオロジメチルシクロブタン、パーフルオロトリメチルシクロブタン、パーフルオロシクロペンタン、パーフルオロメチルシクロペンタン、パーフルオロジメチルシクロペンタン、パーフルオロシクロヘキサン、パーフルオロメチルシクロヘキサン、およびパーフルオロシクロヘプタン)がある。好ましい飽和パーフルオロカーボンには、例えば、CF4、C2F6、C3F8、C4F8、C4F10、C5F12、およびC6F14が含まれる。
【０１１１】
あらゆる比のあらゆる上記ガスの混合物を用いることも好都合かもしれない。例えば、該混合物は、常套的ガス、例えば窒素、空気、または二酸化炭素、および安定な微小気泡サスペンジョンを形成するガス、例えば上記六フッ化硫黄もしくはパーフルオロカーボンを含み得る。適切なガス混合物の例は、例えば参考文献46に見ることができる(この内容は本明細書の一部を構成する)。以下の組み合わせが特に好ましい：ガス(A)および(B)の混合物であり、ここで、ガス(B)は、上記から選ばれるフッ化ガス(その混合物を含む)であり、(A)は、空気、酸素、窒素、二酸化炭素、もしくはそれらの混合物から選ばれる。ガス(B)の量は、総混合物の約0.5％〜約95％v/v、好ましくは約5％〜80％でありうる。
【０１１２】
特に好ましいガスは、所望により空気、酸素、窒素、二酸化炭素、またはそれらの混合物と混合しているSF6、C3F8、C4F10、またはそれらの混合物である。
【０１１３】
ある状況では、ガス状物質の前駆体(すなわち、in vivoでガスに変換されることができる物質)を含むことが望ましいことがある。該ガス状前駆体およびそれ由来のガスは生理学的に許容されることが好ましい。該ガス状前駆体は、pH活性化、光活性化、温度活性化などされる。例えば、あるパーフルオロカーボンを温度活性化ガス状前駆体として用いることができる。該パーフルオロカーボン、例えばパーフルオロペンタンもしくはパーフルオロヘキサンは、室温(すなわち、該物質が産生および/または保存される温度)以上、体温以下の液相/ガス相遷移温度を有し、液相/ガス相遷移を受けてヒト体内でガスに変換される。
【０１１４】
MRIに用いるために、微小胞は、過分極希ガス、例えば、過分極ネオン、過分極ヘリウム、過分極キセノン、またはその混合物を、所望により空気、二酸化炭素、酸素、窒素、ヘリウム、キセノン、またはあらゆる上記ハロゲン化炭化水素と混合して含むことが好ましい。
【０１１５】
シンチグラフィに用いるために、微小胞は、放射性ガス、例えば、Xe133もしくはKr81またはその混合物を、所望により空気、二酸化炭素、酸素、窒素、ヘリウム、クリプトン、またはあらゆる上記ハロゲン化炭化水素と混合して含むことが好ましい。
【０１１６】
診断薬として用いるのに加え、ガス充填微小胞は、例えば参考文献47、参考文献48、または参考文献49に記載の治療薬を送達するために用いることもできる(これらの内容は本明細書の一部を構成する)。典型的には、該ガス充填微小胞は、望ましい治療薬と(混合または結合して)共に投与され、微小胞および治療薬が患者内の目的とする領域に達すると、ガス充填微小胞を破壊することができる制御された音響パワーを適用して該領域中に治療薬を(超音波を介して)放出させる。
リポソーム
【０１１７】
リポソームは、あらゆる前記造影剤、特に、MRI、またはX線造影剤、または上記治療薬の担体として好都合に用いることができる。
【０１１８】
リポソームを製造するための好ましい物質には、所望により他の両親媒性化合物(例えば前記のもの)と混合したリン脂質(例えば前記のもの)がある。本発明に用いるためのリポソームは、さらに、安定化エンベロープ中に含まれる化合物、特にリン脂質と共有結合させることによりリポソーム構造内に好都合に挿入された親水性ポリマー(例えば前記のもの、特にPEGまたはmPEGが好ましい)を含む。親水性ポリマーの好ましいモル量は、ガス充填微小胞の製剤について前記した通りである。
【０１１９】
リポソームサスペンジョンを製造するには当該分野で知られた常套的技術を用いることができる。該製造技術は、典型的にはリポソームを形成する化合物(例えば、リン脂質)を有機溶媒に溶解し、真空下で有機溶媒を蒸発させてリポソーム形成化合物のフィルムを得、最終的に該フィルムを水和することを含む。典型的には、リポソーム形成化合物がリン脂質である場合は、リン脂質遷移温度以上の温度で水和を行う。好ましくは、そうして得られたリポソームを、次いで、例えば好都合に段階づけられた濾過膜を通して押し出して、粒子サイズ分布を適切な限度内に狭めることにより望むサイズに較正する。望む造影剤または治療薬(「活性化合物」)をリポソームの内部部分に、例えば活性化合物の水性溶液もしくはサスペンジョンとして封入するための好ましい方法には、活性化合物の溶液もしくはサスペンジョンを用いて該脂質を脂質遷移温度またはそれ以上で水和し、次いで得られたリポソームを洗浄して(例えば透析による)、過剰の非封入溶液もしくはサスペンジョンを除去することが含まれる。あるいはまた、該脂質を最初にアンロードした水性担体で水和し、次いで活性化合物をリポソームの内部に、膜透過ローディング、得られたリポソームの活性化合物の濃縮溶液の存在下でのインキュベーションにより導入し、次いで該リポソームを洗浄する。
【０１２０】
リポソームの望ましいサイズ減少は、最初のリポソームサスペンジョンのソニケーション、押し出し(エクストルージョン)、または微流動化を含む常套的技術に従って得られる。したがって、上記のごとく得られた水和リポソームを超音波放射に暴露し、リポソームの大きさを適切に減少させることができる。あるいはまた、水和リポソームをポアサイズが減少する(例えば、2.0、1.0、0.8、0.6、0.4、および0.2μm)複数の膜(例えばポリカーボネートの)を通して押し出し、リポソームのサイズを望む最終的な大きさに減少させることができる。さらなる代替法として、大きな粒子を、微粒化装置(例えば、Microfluidics Corporationの)で高圧でホモゲナイゼーションし、微粒化装置中のリポソームの再循環量に応じてリポソームのサイズを望むサイズに徐々に減少させることができる。
【０１２１】
好ましくは、サイズ減少後の該小胞の約80％は0.2〜1.0μmから選ばれるあらゆる名目値から±10％である。しかしながら、前記限界内のあらゆる他のより広いまたはより狭い分布が許容される。サイズ減少処理後、該サスペンジョンを検査し、リポソームサスペンジョン中の脂質濃度が適切であることを保証することが好ましく、所望により、これを目的とする適用に適合するように調整する。調整は、脂質濃度が望ましい限界を超える場合は多量の担体液で希釈するように行うことができ、他方、通常の手段、例えば、該小胞は保持されるが担体液に対して浸透性である適切な多孔性を有する膜を用いて精密濾過もしくは限外濾過することにより該濃度を増加させることができる。APAにより認識されやすいポリマーの挿入は、好ましくは、リポソームのエンベロープを形成する成分と適合性の化合物、好ましくは上記両親媒性脂質化合物(例えば、リン脂質)と結合させることによりなされる。
【０１２２】
リポソームとその製造方法に関する総説は、参考書、例えば参考文献51でも見ることができる。
【０１２３】
望ましい造影剤(好ましくは、MRI反応剤)または治療剤は、リポソームの内部に該化合物を含ませるか、またはリポソーム膜(リン脂質二重層)もしくはリポソーム表面に結合させることにより、リポソーム内に挿入することができる。例えば、マグネタイトナノ粒子または治療剤をリポソームの内部液に懸濁することができる。あるいはまた、キレート化常磁性イオンをリポソームのエンベロープを形成する成分と適合性の化合物、好ましくは上記両親媒性脂質化合物(例えばリン脂質)と結合させることができる。好ましい態様によれば、(例えば参考文献52に記載のような(この内容は本明細書の一部を構成する))MRI造影剤を含有するミセルを(例えば静電気的相互作用により)リポソームの表面と結合させることができる。好都合には、リポソームの使用は、その構造中への治療薬および/または診断薬の比較的高いロードを可能にする。
【０１２４】
好ましい常磁性金属イオンは、原子番号21〜29、42、44、または57〜83であり、少なくとも1の、より好ましくは5またはそれ以上の不対電子を有する、磁気モーメントが少なくとも1.7 Bohrマグネトロンの遷移金属もしくはランタニド種のイオンを含んでいる。好ましい常磁性金属には、限定されるものではないが、クロム(III)、マンガン(II)、マンガン(III)、鉄(II)、鉄(III)、コバルト(II)、ニッケル(II)、銅(II)、プラセオジニウム(III)、ネオジミウム(III)、サマリウム(III)、ガドリニウム(III)、テルビウム(III)、ジスプロシウム(III)、ホルミウム(III)、エルビウム(III)、ユーロピウム(III)、およびイッテルビウム(III)が含まれる。好ましい常磁性イオンはガドリニウムである。常磁性イオンは、好ましくは、キレート化部分もしくはキレート剤でキレートする。当該分野で知られた適切なキレート剤には、メチレンホスホン酸基、メチレンカルボヒドロキサミン酸基、カルボキシエチリデン基、またはカルボキシメチレン基を有する酸、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(DOTA)、1,4,7,-トリカルボキシメチル 1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン三酢酸(DO3A)、例えば、1,4,7,10-テトラアザシクロ-ドデカン-1-(2-ヒドロキシプロピル)-4,7,10-三酢酸(HP-DO3A)、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、および1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,8,11-四酢酸(TETA)などが含まれる。あらゆるこれらのキレート常磁性イオンを上記の適切な両親媒性脂質(例えば、ホスファチジルエタノールアミン)と結合させ、次いで、得られた構築物を既知の技術に従ってリポソームエンベロープの他の成分と混合することができる。
【０１２５】
リポソームに組み込むことができるさらなる造影剤の例には、例えば、ヨウ化化合物、例えば、イオメプロールまたはイオパミドール(Bracco Imagingから市販されている)；過分極原子、例えば、13C、15N、19F、23Na、31P、または35.5Clを含む化合物(例えば、[13C]ウレア(例えば、参考文献54参照)もしくはビス-1,1-ヒドロキシメチル-1-13C-シクロプロパン-D8(例えば、参考文献55参照)を含む)；放射性医薬品、例えば、テクネチウム(99mTc)、ガリウム(67Ga、または68Ga)、インジウム(111In)、またはタリウム(201Tl)の複合体、または上記の光学的もしくは核画像化剤が含まれる。
リポソーム/微小胞およびターゲッティング構築物
【０１２６】
造影/治療方法論の多くの種々の工程で多くの種々の方法を用いて、ターゲッティング構築物をリポソームまたはガス充填微小胞と結合させることができる。
【０１２７】
ある態様によれば、該ターゲッティング構築物は、上記のあらゆる製造手順のあらゆる適切な段階で超分子アセンブリを形成する成分と混合することができる。例えば、参考文献7に記載の方法の場合は、該ターゲッティング構築物を最初の混合物の成分と混合し、エマルジョンおよび凍結乾燥工程を行うことができる。あるいはまた、該構築物を含むサスペンジョンを別々に製造し、次いで、好ましくは加熱下で、すでに形成されたエマルジョン(他のフィルム形成成分を含む)に加えることができる。あるいはまた、該ターゲッティング構築物を超分子アセンブリのサスペンジョンと(例えばサスペンジョンとして)混合し、得られた該アセンブリと結合したターゲッティング構築物を含む混合物を投与に用いるか、またはさらに凍結乾燥し、次いで最終的に再構成して使用することができる。
【０１２８】
好ましい態様によれば、該ターゲッティング構築物を患者に別々に投与し、次いで造影剤(例えば、ガス充填微小胞)を投与する。(例えば、目的とする領域中への該ターゲッティング構築物の有効な蓄積を可能にする)予め決定した時間後、該造影剤を投与する。すなわち、該造影剤は、患者の体内、特に、該構築物のターゲッティングリガンドが対応する標的部位と結合する目的とする領域中でターゲッティング構築物と結合する。
医薬キット、投与、および画像化
【０１２９】
本発明のリポソームまたはガス充填微小胞、およびターゲッティング構築物を含む医薬キットは、リポソームまたは微小胞がターゲッティング構築物と結合する方法に応じて種々の形で存在しうる。
【０１３０】
好ましい態様によれば、該医薬キットは、少なくとも2成分、第1成分がリポソームまたはガス充填微小胞(またはその前駆体)であり、第2成分がターゲッティング構築物である少なくとも2つの成分を含む。所望により、1またはそれ以上のさらなる異なるターゲッティング構築物(例えば、同じ抗ポリマー抗体を有するが、ターゲッティングリガンドが異なる)をキットに含むことができる。典型的には、各成分は、それぞれ分離した容器中に含まれる。あるいはまた、異なるターゲッティング構築物の混合物を単一容器に含むことができる。
【０１３１】
好ましくは、第1容器は、微小胞形成ガスと接触する乾燥粉末形のガス充填微小胞前駆体を含む。
【０１３２】
第2成分は、乾燥固体形で、または生理学的に許容される水性担体中のサスペンジョンとして容器中に存在しうる。
【０１３３】
上記キットは、所望により注射前に乾燥成分を再構成するための生理学的に許容される水性担体(分離した容器または二腔容器中)を含むことができる。
【０１３４】
該成分の再構成は、選択した投与方法に依存し、例えば、ターゲッティング構築物および造影剤/治療薬を別々に投与する場合は、2成分は、各担体で別々に再構成される。あるいはまた、リポソームまたはガス充填微小胞をターゲッティング構築物と併用投与するために予め組み立てることが予測される場合は、該2組成物を同じ容器で連続的に再構成してよい。
【０１３５】
あるいはまた、凍結乾燥組成物がすでにターゲッティング構築物と混合した微小胞の前駆体を含む場合は、該キットは、選択した微小胞形成ガス(前記)と接触する凍結乾燥組成物を含む第1容器と生理学的に許容される水性担体を含む第2容器を含み得る。
【０１３６】
本発明のアセンブリは、特に超音波画像診断を含む種々のin vivoおよびin vitro造影法に用いることができる。造影法には、身体部分または組織のあらゆる造影法、並びにあらゆる他の診断技術もしくは方法、例えば定量診断技術(例えば血圧、血流、および/または血液灌流評価を含む)が含まれる。
【０１３７】
典型的には、患者に有効量の該アセンブリを分離した成分としてまたはすでに形成されたアセンブリとして投与し(例えば注射により)、画像化もしくは治療すべき身体部分もしくは組織(「目的領域」)を望ましい画像診断法にかける。用語患者には、診断/治療目的、または実験目的で該アセンブリの投与(例えば、実験的治療的処置を追跡するために実験動物に造影剤を使用することを含む)を受けるあらゆる対象(ヒトまたは動物)が含まれる。
【０１３８】
好ましい態様によれば、図4に模式的に示すように、有効量のターゲッティング構築物(例えば、構築物のタイプおよび/またはターゲッティングリガンドのタイプに応じて、例えば約1nmol/kg〜500nmol/kg、好ましくは5nmol/kg〜50nmol/kg、より好ましくは10nmol/kg〜30nmol/kgの濃度で)を、最初に、典型的にはそのサスペンジョンを注射することにより患者に投与する。次に、該組成物は、図4aに示すように、ターゲッティング構築物401が目的領域404(すなわち、該構築物のターゲッティングリガンド403に対する各標的またはレセプター405を発現するかまたは含むと思われる領域)に到達し、各ターゲッティングリガンド403を通してそれと結合するのに充分な時間、患者の血管系中を循環するのを可能にする。明確にするために、二特異性ターゲッティング構築物401を、ただ1つのターゲッティングリガンド403と1つの抗ポリマー抗体402を含むものとして図4に示したが、この模式図には先に記載のあらゆるターゲッティング構築物が含まれると理解される。次に、親水性ポリマー407を含む望ましい造影剤/治療薬406(例えば、この場合はガスを満たした微小胞)のサスペンジョンを患者に注射し、目的領域を、適切な画像化技術で画像化し、および/または望む治療的処置(例えば治療薬の超音波介在放出)に付す。ターゲッティング構築物と造影剤の投与間隔は、例えば、患者(例えば、タイプ、年齢、体重)、ターゲッティング構築物の種類と特性(例えば、血中半減期および/または標的組織/領域中の蓄積)、画像診断方法および/または処置の種類、および目的領域の位置に応じ、一般的医療行為に基づいて施術者が容易に決定することができる。例えば、ガス充填微小胞を用いる超音波画像診断法の場合は、2つの投与間隔は、例えば約5分間〜約48時間、典型的には約30分間〜約24時間で変化し得る。目的領域の画像診断は、図4bに示す目的領域404に固定化されたターゲッティング構築物401の1またはそれ以上の抗ポリマー抗体402に、エンベロープに含まれるポリマー407の最終部分408を介して結合した微小胞406の存在により増強される。
【０１３９】
種々の画像診断技術を、例えば、基礎的高調波Bモード画像診断、パルスもしくは相変換画像診断、および基礎的高調波ドップラー画像診断を含む超音波適用に用いることができ、所望により、三次元画像診断技術に用いることができる。さらに、ガス充填微小胞の破壊(例えば、高音圧の超音波による)を伴う診断技術は、例えば、血液灌流の評価方法にも期待される。
【０１４０】
本発明の微小胞は、典型的には、例えば、そのそれぞれの組成物、画像化する組織もしくは器官、および/または選択した画像診断技術に応じて、患者の体重1kgあたり約0.01〜約5.0μlのガス濃度で投与することができる。もちろん、この一般的濃度範囲は、カラードップラーやパワーパルス変換などで非常に低い用量で信号を観察することができる場合などの具体的な画像診断適用に応じて変更することができる。可能な他の画像診断適用には、シンチグラフィ、光画像診断、およびX線画像診断(X線位相差画像診断を含む)が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】本発明のターゲッティング構築物の例を示す。
【図２】本発明のターゲッティング構築物の例を示す。
【図３】本発明のターゲッティング構築物の例を示す。
【図４ａ】本発明のターゲッティング構築物を造影剤/治療薬と共に用いる例を示す。
【図４ｂ】本発明のターゲッティング構築物を造影剤/治療薬と共に用いる例を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１４２】
以下の非限定的実施例は本発明をよりわかりやすく示すことを意図する。実施例1〜9、11、および14〜21は実際の実施例であるが、実施例10、12，13，および22〜30は予測的実施例である。
【０１４３】
以下の略号および物質を以下の実施例に使用する。
【表２】
0005491511.tif 000003
【実施例１】
【０１４４】
ビオチン化抗マウスP-セレクチン抗体の製造
1mgのChromalinkビオチン354S(参考文献# B-1001-110、Solulink、USA)を室温でDMF(100μL)に溶解し、12.3mM溶液を得た。該溶液(10mol当量)を1mg/mLの抗体をリン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)に溶解して調製したラット抗マウスP-セレクチン抗体(クローンRB40.34、参考文献#553741、BD Biosciences、USA)の溶液に加えた。反応混合物を室温で2時間インキュベーションし、次いで、PBSで平衡化したZebaスピンカラム(2min 1,000g、Pierce、USA)でゲル濾過して精製した。得られたビオチン化抗体は、製造業者の推奨に従って光度定量すると2.0ビオチン残基/抗体分子を含んでいた。
【実施例２】
【０１４５】
ビオチン化抗mPEG抗体の製造
実施例1を、抗マウスP-セレクチン抗体をウサギ抗mPEG抗体(クローンPEG-B-47、参考文献2061-1、Epitomics、USA)に置き換えて繰り返した。得られたビオチン化抗体は1.9ビオチン残基/抗体分子を含んでいた。
【実施例３】
【０１４６】
(比較)
ビオチン化ラットアイソタイプ抗体(コントロール)の製造
実施例1を、抗マウスP-セレクチン抗体をラットアイソタイプコントロール抗体(アフィニティ精製ラットIgG1アイソタイプコントロール、eBioscience、ref# 14-4301)で置き換えて繰り返した。得られたビオチン化抗体は1.9ビオチン残基/抗体分子を含んでいた。
【実施例４】
【０１４７】
二特異性標的化ストレプトアビジン(抗マウスP-セレクチン抗体および抗mPEG抗体)の製造
実施例1に従って製造したビオチン-抗マウスP-セレクチン抗体10μgおよび実施例2に従って製造したビオチン-抗mPEG抗体10μgを800μLのリン酸緩衝生理食塩水pH 7.4に溶解した。次に、抗体混合物を撹拌下でストレプトアビジン(IBA、参考文献#2-0203-100)を蒸留水に溶解して製造したストレプトアビジン溶液(1 mg/mL)28.3μLに加えた。該溶液を25℃で30分間混合した。
【実施例５】
【０１４８】
(比較)
二特異性コントロールストレプトアビジン(コントロール)の製造
実施例4を、ビオチン-抗マウスP-セレクチン抗体を実施例3に従って製造したビオチンラットアイソタイプコントロール抗体に置き換えて繰り返した。
【実施例６】
【０１４９】
mPEG含有ガス充填微小胞の製造
27 mgのDSPCおよび2.2 mgのパルミチン酸を3.9 gのシクロオクタンに60℃で熔解した。得られた溶液を室温に冷却し、5.5 gのPEG4000(Fluka)および19 mgのDPPE-mPEG5000を含む蒸留水50 mLに高速ホモゲナイザー(Polytron T3000)を用いて8000 rpmで1分間分散させた。得られるエマルジョンを撹拌下80℃で1時間加熱し、次いで室温に冷却した。得られるエマルジョンを10％のPEG4000を含む蒸留水で5倍に希釈し、次いでDIN8Rバイアルに充填した(0.75 mL/バイアル)。バイアルを-50℃で2時間凍結し(Christ Epsilon凍結乾燥機)、次いで-20℃、0.5mBarで12時間凍結乾燥し、さらに30℃、0.2mBarで6時間最終乾燥工程を実施した。
【０１５０】
次に、凍結乾燥生成物を35％パーフルオロ-n-ブタンおよび65％窒素を含む雰囲気に暴露し、次いでバイアルを密封した。
【０１５１】
最終的に、標記mPEG含有ガス充填微小胞を、バイアル(凍結乾燥ケーキ＋ガス)を2 mLの生理食塩水溶液(0.9％ NaCl)で静かに手で振りながら再構成して得た。
【実施例７】
【０１５２】
二特異性ストレプトアビジン(抗マウスP-セレクチン抗体および抗mPEG抗体)およびmPEG含有ガス充填微小胞とのin vitro二段階結合
a. マウスFc-P-セレクチンでコートしたガラスカバースリップの調製
簡単には、マウスFc P-セレクチンの乾燥粉末(50μg、R&D System、参考文献# 737-PS-050)をグラスバイアル中の100μLのPBS pH 7.4に溶解し、次いで12.4 mLのPBS中に移し、マウスFc P-セレクチンの4μg/mL溶液を得た。マウスFc P-セレクチン溶液(4μg/mLを400μL)を40mmガラスカバースリップ上に置き、4℃で一夜インキュベーションした。次に、過剰のマウスFc P-セレクチン溶液を捨て、室温で2時間、ブロッキング溶液(1％(w/v)BSA含有PBS、500μL)に置換した。カバースリップを洗浄溶液(0.05％ Tween含有PBS、3 mL)で洗浄し、次いで-20℃で保存した。使用前に、マウスFc P-セレクチンでコートしたカバースリップを室温で平衡化する。
b.結合試験
【０１５３】
上記のごとく作製したガラスカバースリップを、実施例4で作製した二特異性ストレプトアビジンサスペンジョン400μLで30分間インキュベーションした。次に、該カバースリップをフローチャンバー(FCS2、Bioptech、USA)にマウントした。実施例6に従って作製したmPEG含有ガス充填微小胞をフローチャンバーを介して引き込み(drawn through)、そのカバースリップのコーティング層への付着をPBS中の50％ヒト血漿(v:v、Biomeda(クエン酸塩を用いて回収)、参考文献ES1020P、Stehelin & Cie AG)の存在下、流速1.0 mL/min(剪断速度114s-1)で10分間評価した。微小胞蓄積の定量分析は、画像処理プログラムAnalysis FIVE(SIS、Germany)を用い、総10分間の注入にわたり2分間隔で観察した領域中に付着する微小胞の数を計測することにより行った。10分間後、無作為に5枚の写真を撮って平均化し、次いで10で割ると、得られた数は微小胞蓄積速度/分(RMA/min)を示す。各観察領域は、183 x 137μmであった(ステージマイクロメーターにより測定)。画像化は、チャンバーの中間と出口の間で行った。平均測定値は4.5RMA/minであり、二特異性標的化ストレプトアビジンの抗mPEG抗体に対する微小胞の良好な結合を示し、次いで、これがコートしたカバースリップ表面に抗マウスP-セレクチン抗体を介して結合する。
【実施例８】
【０１５４】
(比較)
二特異性ストレプトアビジン(アイソタイプコントロール抗体および抗mPEG抗体)およびmPEG含有微小胞とのin vitro二段階結合
マウスFc P-セレクチンでコートしたガラスカバースリップを、比較実施例5に従って作製した非結合二特異性ストレプトアビジン400μLと30分間インキュベーションすることにより、実施例7を繰り返した。平均測定値は0.02RMA/minであり、カバースリップの表面への微小胞の結合が実質的に無いことを示す。
【実施例９】
【０１５５】
チオール化CD62P抗体の製造
精製抗Ｐ−セレクチン抗体クローンＲＢ４０．３４の溶液を、８０μＬの５０ｍＭリン酸緩衝液  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ  ７．４中の２０μＬの１０ｍＭスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ溶液（（スルホスクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］−ヘキサノエート）、Ｐｉｅｒｃｅ、＃２１６５０）と反応させた。該溶液を、リン酸緩衝液５ｍＭ  ｐＨ７．４中で平衡化した２ｍＬスピンカラムで１０００ｇ（Ｚｅｂａスピンカラム、Ｐｉｅｒｃｅ、＃８９８８９）にてスピンさせた。次に、機能化抗体を１ｍＭ  ＴＣＥＰ、５０ｍＭトリスＨＣｌ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ６．８にて室温で１０分間還元させた。次に、還元抗体を２ｍＬスピンカラムで１０００ｇにてスピンさせ、チオール化抗体のサスペンジョンを得た。
【実施例１０】
【０１５６】
チオール化抗PEG抗体の製造
実施例9を、抗マウスモノクローナル抗体を抗mPEGウサギモノクローナル抗体(Epitomics #2061-1)に置き換えて繰り返し、抗mPEG抗体を得た。
【実施例１１】
【０１５７】
マレイミド機能化ミセルの製造
2mg(0.69μmol)のDSPE-PEG2000-マレイミドを40℃でエタノールに溶解した。該溶媒をN2下、40℃で除去して脂質フィルムを得た。該脂質フィルムを真空(0.2mBar)下、25℃で一夜乾燥させた。乾燥フィルムを60℃で0.5 mLのリン酸緩衝液(50mM pH=6.5)で水和し、DSPE-PEG2000-マレイミドミセルの透明なサスペンジョンを得た。
【実施例１２】
【０１５８】
二特異性標的化ミセルの製造
実施例9に従って製造したチオール化抗P-セレクチン抗体クローンRB40.34、325μLおよび実施例10に従って製造したチオール化抗mPEG抗体のサスペンジョン325μLを混合し、実施例11に従って製造したミセルサスペンジョン250μLに加えた。混合物を25℃で3時間混合する。次に、残存するマレイミド基をブロックするため、該溶液にシステイン(0.69μmol)を加える。
【実施例１３】
【０１５９】
共有結合二特異性抗体の製造
ウサギモノクローナルIgG抗mPEG(クローンPEG-B-47、Epitomix、USA)および抗P-セレクチン抗体クローンRB40.34を、修飾緩衝液(100mMリン酸塩、150 mM塩化ナトリウム、pH 7.2 - BupH(登録商標)PBS、Pierce、Switzerland)で1.5 mg/mL(すなわち、10μM)に希釈する。
【０１６０】
スクシンイミジル4-ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン(SANH、Pierce、Switzerland)をDMSO(10 mM)で2.9 mg/mLに希釈する。スクシンイミジル4-ホルミルベンゾエート(SFB、Pierce、Switzerland)をDMSOで2.47 mg/mL(すなわち、10 mM)に希釈する。
【０１６１】
該抗体(100μg)の1つを室温で1時間、希釈したSANHと反応させて5倍モル過剰の修飾試薬を得る。同量の他の抗体を室温で1時間、希釈SFBと反応させて5〜20倍モル過剰の修飾試薬を得る。両抗体をコンジュゲーション緩衝液(100 mM MES、150 mM NaCl pH 4.7 - BupH(登録商標)MES、Pierce、Switzerland)に対して透析し、次いで一緒に混合して室温で2時間インキュベーションする。
【０１６２】
Sephacryl(登録商標)S300カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィによりヘテロダイマーコンジュゲートを単離する。
【実施例１４】
【０１６３】
二特異性標的化リポソームの製造
30.2mgのコレステロール、73.2mgのDSPC、23.0mgのDPPG.Na、および3.6mgのDIOを65℃で20mLのクロロホルムに溶解し、次いで31μLの3Hコレステリルヘキサデシルエーテルを加えた。溶媒を蒸発させ、成分の混合物を真空下で2時間乾燥した。残渣を10 mg/mLの濃度まで蒸留水に再懸濁し、リポソームのサスペンジョンを得た。次に、該サスペンジョンを1 um、0.6 um、および0.4 umのフィルターを用いて押し出し、リポソームのサイズを減少させた。リポソームサスペンジョンをリン酸緩衝グルコース溶液に対して透析した。次に、10.5mgのDSPE-PEG2000-マレイミドを0.5 mLのリン酸緩衝グルコース溶液に溶解した。この溶液をリポソームサスペンジョンに加えた。該サスペンジョンを65℃で1時間維持し、リポソームの構造へのマレイミド誘導体の挿入を可能にする。次に、472μLのストレプトアビジンの10 mg/mL溶液を実施例9に記載の手順に従って処理し、対応するチオール化ストレプトアビジンを得た。チオール化ストレプトアビジンをリポソームサスペンジョンに加え、室温で2.5時間反応させた。リポソームサスペンジョンを遠心分離(30000gで30分間)して精製し、次いでトリス緩衝グルコース溶液に再懸濁した。
【０１６４】
次に、65.5 pmoLのラットIgG1 抗マウスCD62P(実施例1に記載のごとく製造した)および65.5 pmoLのウサギ抗PEG抗体(実施例2に記載のごとく製造した)を1090μLのPBS中で混合した。次に、該混合物を上記のリポソームサスペンジョン19μLに加え、目的とする二特異性リポソームを得た。
【実施例１５】
【０１６５】
比較(抗PEG結合ではない)標的化リポソームの製造
リポソームサスペンジョンを、ウサギ抗PEG抗体をビオチン化ウサギ非特異的IgGで置き換えた以外は、実施例14に記載のごとく製造した。
【実施例１６】
【０１６６】
比較(抗P-セレクチン特異的ではない)標的化リポソームの製造
リポソームサスペンジョンを、抗P-セレクチン抗体クローンRB40.34をラット非特異的IgG1で置き換えた以外は実施例14に記載のごとく製造した。
【実施例１７】
【０１６７】
二特異性リポソーム(抗P-セレクチン抗体および抗mPEG抗体)およびmPEG含有ガス充填微小胞とのin vitro二段階結合
Thermanox(登録商標)ディスクを実施例7に記載の方法論に従ってマウス-Fc-P-セレクチンでコートした。コートしたディスクを24ウェルプレートのウェルに置いた。
【０１６８】
次に、実施例14に従って製造したリポソームサスペンジョンをThermanoxディスク上で4時間(各ウェルに500μL)インキュベーションした。
【０１６９】
次に該ディスクをPBS(各ウェルおよび各洗浄につき1mL)で洗浄し(5回)、非結合リポソームを除去した。
【０１７０】
次に、実施例6に従って製造した微小胞のサスペンジョン600μLを各ウェルに加えた。1時間後、該ディスクをPBSで2回洗浄し、光学顕微鏡(Leica DC300S DMR、Q-Win画像分析ソフトウエアを用いる)で検査して微小胞によって有効に被われた平均割合を測定した。
【０１７１】
測定された平均表面被覆率は60.8％であった。
【０１７２】
該手順を、実施例14のリポソーム調製物をそれぞれ実施例15および16の比較調製物に置き換えて繰り返した。得られた平均表面被覆率はそれぞれ0.8％および1.3％であった。
【実施例１８】
【０１７３】
mPEG含有リポソームの製造
30.2mgのコレステロール、73.2mgのDSPC、23.0mgのDPPG.Na、および3.6mgのDIOを65℃で20 mLのクロロホルムに溶解し、次いで31μLの放射性マーカー3Hコレステリルヘキサデシルエーテルを加えた。溶媒を蒸発させ、成分の混合物を真空下で2時間乾燥した。残渣を蒸留水に濃度10 mg/mLまで再懸濁し、リポソームのサスペンジョンを得た。次に、該サスペンジョンを1 um、0.6 um、および0.4 umのフィルターで押し出した。リポソームサスペンジョンをリン酸緩衝グルコース溶液に対して透析した。次に、10.5mgのDSPE-mPEG2000を0.5 mLのリン酸緩衝グルコース溶液に溶解した。この溶液をリポソームサスペンジョンに加えた。該サスペンジョンを65℃で1時間維持し、リポソームの構造中にマレイミド誘導体の挿入を可能にした。リポソームサスペンジョンを遠心分離(30000gで30分間)して精製し、次いでトリス緩衝グルコース溶液に再懸濁した。
【実施例１９】
【０１７４】
二特異性ストレプトアビジン(抗マウスP-セレクチン抗体および抗mPEG抗体)およびmPEG含有リポソーム(19a)を用いるin vitro二段階結合
Thermanox(登録商標)ディスクを実施例7に記載の方法論に従ってマウス-Fc-P-セレクチンでコートした。コートしたディスクを24ウェルプレートのウェルに置いた。次に、実施例4に従って作製した二特異性ストレプトアビジン溶液を、Thermanoxディスク上で1時間インキュベーションした(各ウェル中400μL)。
【０１７５】
次に、ディスクをPBS(各ウェルおよび各洗浄につき1mL)で洗浄し(3回)、非結合二特異性ストレプトアビジンを除去した。
【０１７６】
次に、実施例18に従って製造したリポソームのサスペンジョン400μLを各ウェルに加えた。4時間後、ディスクをPBSで4回洗浄し、液体シンチレーション分析機(2200CA-Tri-Carb、Packard)により放射能を計測して(dpm(崩壊/分)として表示)結合リポソームの量を測定した。
【０１７７】
同様の実験を、実施例5(19b)に従って製造した二特異性ストレプトアビジン溶液を用いて繰り返した。
【０１７８】
第3実験(19c)を、実施例4に記載の二特異性ストレプトアビジン溶液を用い、ビオチン-抗mPEG抗体の代わりにビオチンラットアイソタイプコントロール抗体を用いて繰り返した。結果を下記表に示す。比較実験はディスクに対するリポソーム結合が実質的に生じないことを示す。
0005491511.tif 000004
【実施例２０】
【０１７９】
イオメプロールをロードしたペグ化リポソームの製造
70.3mgのDSPC、22.1mgのDPPG.Na、および29.1mgのコレステロールを20 mLのクロロホルムに溶解した。該溶液を丸底フラスコ中で60℃に加熱し、クロロホルムを減圧下で蒸発させ、次いで、残存する溶媒を、真空オーブン中最大真空下で3時間完全に除去した。次に、該脂質を、775m/mLgのイオメプロールを含有するイオメプロール(Bracco Imaging)溶液で再水和し、イオメプロールをロードしたリポソームを形成した。次に、リポソームのサスペンジョンを、選択したポアサイズのフィルターを通して押しだし、0.2μmに減少させた。次に、得られた較正リポソームを5％グルコース溶液に対して透析した。DSPE-PEG2000の溶液をpH7.4のTween 20mMに溶解し、1mLのこの溶液を、10mLのリポソームサスペンジョンに加えた。この混合物を撹拌し、65℃で1時間インキュベーションした。X線造影剤としてさらに使用可能な、イオメプロールをロードしたペグ化リポソームを得た。
【実施例２１】
【０１８０】
二特異性標的化ストレプトアビジン(マウス抗ヒトフィブリン抗体および抗mPEG抗体)の製造
実施例1を、抗P-セレクチン抗体クローンRB40.34をビオチン-マウス抗ヒトフィブリン抗体で置き換えて繰り返した。10μgのフィブリン抗体および10μgのビオチン-抗mPEG抗体(実施例2に従って製造した)を800μLのリン酸緩衝生理食塩水pH 7.4に溶解する。次に、該抗体混合物を、撹拌下で28.3μLのストレプトアビジンの溶液(1 mg/mL)に加え、ストレプトアビジン(IBA、参考文献#2-0203-100)を蒸留水に溶解し、次いで該溶液を25℃で30分間混合した。
【実施例２２】
【０１８１】
イオメプロールをロードしたリポソームのin vivo標的化投与
ヒトの血餅をラットの左頸動脈に挿入する。次に、実施例21に従って製造した二特異性構築物をラットに静脈内注射する。2時間後、実施例21に従って製造したイオメプロール含有リポソームをイオメプロール用量0.5mg/kgでラットに静脈内注射する。次に、造影された血栓の画像をラットのコンピュータ断層撮影により得る。イオメプロール溶液の注射後に得られた画像に比較して、血栓のコントラストが増強する。
【実施例２３】
【０１８２】
PEG鎖の基本骨格と特異的に結合する抗PEG構築物を用いるin vitro結合
a. 二特異性ストレプトアビジン構築物(抗マウスP-セレクチン抗体および抗PEG抗体E11)の製造
実施例4を、ビオチン化抗mPEG抗体をビオチン化抗PEG抗体E11で置き換えて実施した(参考文献30参照)。
b. コポリマーPEG-ポリリジンでコートしたガス微小気泡の製造
【０１８３】
DPPS(10mg)を水(2mL)中の5％プロピレングリコール-グリセロールと混合する。次に、ディスパージョンを65℃で5分間加熱し、次いで室温に冷却した。1.5mLのディスパージョンをバイアル2mLに移し、C4F10でフラッシュし、次いで60秒間振盪させた。得られた微小気泡を水で洗浄し、次いで5mg/mLのPEG-ポリリジン(メトキシ-ポリ(エチレングリコール)-ブロック-ポリ(L-リジン)塩酸(Alamanda Polymer, Inc.)を含む溶液でインキュベーションした。微小気泡のPEG-ポリリジンによる表面コーディングは、ゼータ電位測定により確認することができる。
c. フローチャンバー中のP-セレクチンコートしたカバースリップに対するin vitro結合
【０１８４】
実施例7を、微小気泡および二特異性ストレプトアビジン抗体(抗マウスP-セレクチンおよび抗mPEG B47)をそれぞれ上記工程aおよびbで製造したPEG-ポリリジンコートした微小気泡および二特異性ストレプトアビジン抗体(抗マウスP-セレクチンおよび抗PEG E11)に置き換えて繰り返す。PEG-ポリリジンコートした微小気泡のP-セレクチンコートした表面に対する良好な結合が得られる。
【実施例２４】
【０１８５】
抗PEGターゲッティング構築物およびPEG含有微小胞を用いる超音波介在遺伝子送達
a. 二特異性ターゲッティング構築物の製造
実施例4を、ビオチン化IgG 抗P-セレクチンを、LNCaP細胞上に過剰発現したヘプシンレセプターと特異的に結合するファージディスプレースクリーニングにより選択したビオチン-ペプチド配列(IPLVVPLGGSC-ビオチン)に置き換えて繰り返す(参考文献56参照)。
b. in vitro遺伝子送達実験
【０１８６】
参考文献49に記載の遺伝子送達のためのプロトコールを用いる。簡単には、LNCaP前立腺腫瘍細胞を、225cm2組織培養フラスコ中、10％v/v加熱不活化ウシ胎児血清(FCS)および1％v/v抗生物質添加 Glutamax-I(Life Technologie、Switzerland)含有Mac Coyの5A培地中で、37℃、5％CO2雰囲気下でインキュベーションする。遺伝子送達アッセイは、濃度10μg/mLのプラスミド(GFP)および微小気泡/mL細胞比30を用いて行う。チューブを回転暴露系に取り付け、37℃の水浴に漬ける。トランスデューサーとチューブの距離は7.6 cmである。チューブを2.25MHz(エア-バック)のトランスデューサーを用いて10秒間超音波照射する。
【０１８７】
細胞を、最初に上記工程(a)に従って製造したターゲッティング構築物(10μg/mL)とインキュベーションする。1時間後、細胞を培地で洗浄し、mPEG含有微小気泡(実施例6参照)と再度インキュベーションし、超音波照射に暴露する。次に、細胞を、FACS Calibur(Becton Dickinson AG、Switzerland)を用いて分析し、GFP陽性細胞のパーセンテージおよび明確にトランスフェクトされた細胞の平均蛍光強度を測定した。高いトランスフェクション率と蛍光強度がみられる。
【実施例２５】
【０１８８】
抗mPEGターゲッティング構築物およびmPEG含有微小気泡を組み合わせた超音波画像診断法
a. 抗PEGターゲッティング構築物の製造
実施例4を、ビオチン化IgG 抗P-セレクチンを、腫瘍の新生血管の内皮細胞に過剰発現したKDRのレセプターに特異的に結合するビオチン-ペプチド配列で置き換えて繰り返す(例えば、参考文献39参照)。
b. in vivo超音波画像診断試験
【０１８９】
1x106個のMATBIII腫瘍細胞を、麻酔した雌Fisher 344ラットの乳腺脂肪体内に注射する。ラットを(i)mPEG含有微小気泡のみ、および(ii)ターゲッティング構築物およびmPEG含有微小気泡の二群に分けて造影について試験する。造影超音波画像診断を、腫瘍誘発後第5〜7日(腫瘍サイズ：0.5〜1cm)に、7MHzおよびCPS造影モードで操作するプローブを取り付けた超音波スキャナーを用いて行う。
【０１９０】
ラット群(i)には、0.4mLのmPEG含小気泡(実施例6)をラット内に注射し、mPEG含有小気泡注射後10分間超音波処理を行う。
【０１９１】
ラット群(ii)には、二機能性ターゲッティング構築物(抗mPEG B-47およびビオチン化ペプチドKDRを含む)を、最初にMATBIII腫瘍を有するラットの尾部に注射する。ターゲッティング構築物注射の6時間後に、0.4 mLのmPEG含有小気泡(実施例6)をラットに注射し、超音波画像化を、mPEG含有小気泡注射の10分後に行う。
【０１９２】
結果は、認められる造影効果(LPO：ビデオ輝度で表現された後期混濁(late phase opacification))が(ii)群のラットでとても強いことを示す。
【実施例２６】
【０１９３】
抗PEGターゲッティング構築物およびデュアル画像診断(光学および超音波)を用いる治療に対する癌の反応の評価
a. 二特異性ターゲッティング構築物(抗PEG B-47およびペプチドHVGGSSV)の製造
抗PEGターゲッティング構築物を、Cy7標識ストレプトアビジン、ビオチン化抗mPEG B-47(実施例2)、およびビオチン化ペプチド配列 HVGGSSV(1:1:2)を用いて製造する。このペプチドを、ファージディスプレイ(T7ファージベースのランダムペプチドライブラリー)により選択し、該ペプチドは放射線療法で治療される腫瘍に対する特異的結合を示す(参考文献57参照)。
b. 反応する腫瘍と反応しない腫瘍を区別するためのin vivo画像診断
【０１９４】
1x106個のBxpC3(ヒト膵臓癌細胞、ATCC)をヌードマウスの右および左後肢に接種し、腫瘍サイズが直径0.5cmに達するときに処置した。治療は、チロシンキナーゼ阻害剤(Sorafenib(登録商標)、30mg/kg)の使用およびγ線照射(マウスの1肢のみ3Gy)からなる。
【０１９５】
2つの画像診断技術(コントラスト光学および超音波)を用いて放射線療法に対する腫瘍の反応を評価した。光学的画像診断では、NIR(近赤外蛍光)画像をIVIS画像診断装置(Xenogen)を用いて得る。超音波造影では、Siemens Sequoia超音波スキャナー(15L8プローブ、CPSモード)、およびペグ化微小気泡を用いる(実施例6)。
【０１９６】
ペグ化微小気泡を注射する2時間前に、ターゲッティング構築物(ビオチン化抗mPEGおよびビオチン化ペプチド配列HVGGSSV、およびCy7-ストレプトアビジン)をマウスに注射する。光学画像診断および超音波造影を実施する(治療的処置の24時間後)。
【０１９７】
結果は、1日治療(24時間)後、照射肢においてNIRと超音波画像の両方で造影画像は増強されるが、照射処理しなかった肢では造影効果はごくわずかであることを示す。これらの結果は、抗PEG ターゲッティング構築物を癌療法の追跡調査に用いることができることを示唆する。光学画像診断は、PEGポリマーでコートした量子ドットおよび抗PEGターゲッティング構築物を用いて行うこともできる。
【実施例２７】
【０１９８】
Liposomal Doxorubicin(リポソームドキソルビシン)(Doxil(登録商標))を用いる腫瘍ターゲッティング
a. 二特異性抗体(抗マウスVEGFR2および抗mPEG)の製造
実施例13を、IgG抗P-セレクチンを抗VEGFR2(CD101、参考文献56参照)に置き換えて繰り返す。
b. in vivo投与
【０１９９】
U-87 MG腫瘍細胞を、ヌードマウスの右大脳半球内に注射し、頭蓋内腫瘍を樹立する。腫瘍が数ミリメートルのサイズに成長したら、二機能性抗体(抗マウス抗VEGFR2および抗mPEG)をマウスに20μg/マウスの用量で注射する。ドキソルビシンをロードした長循環mPEG含有リポソームの市販調製品であるDoxil(登録商標)(Alza Corporation)を、抗体投与の6時間後に3mg/kgの用量でマウスに投与する。二機能性抗体およびDoxil(登録商標)で処置した担腫瘍マウスの生存延長が、同用量のDoxil(登録商標)のみで処置したマウスの生存に比べて予期される。
【実施例２８】
【０２００】
抗PEG ターゲッティング構築物およびPEG含有微小胞を用いる超音波介在遺伝子送達
a. 二特異性ターゲッティング構築物の製造
実施例4を、ビオチン化IgG 抗P-セレクチンを、LNCaP細胞上に過剰発現したヘプシンレセプターと特異的に結合するファージディスプレースクリーニングにより選択したビオチン-ペプチド配列(IPLVVPLGGSC-ビオチン)に置き換えて繰り返す(参考文献57参照)。
b. in vitro遺伝子送達実験
【０２０１】
参考文献49に記載の遺伝子送達のためのプロトコールを用いる。簡単には、LNCaP前立腺腫瘍細胞を、225cm2組織培養フラスコ中、10％v/v加熱不活化ウシ胎児血清(FCS)および1％v/v抗生物質添加 Glutamax-I(Life Technologie、Switzerland)含有Mac Coyの5A培地中で、37℃、5％CO2雰囲気下でインキュベーションする。遺伝子送達アッセイは、濃度10μg/mLのプラスミド(GFP)および微小気泡/mL細胞比30を用いて行う。チューブを回転暴露系に取り付け、37℃の水浴に漬ける。トランスデューサーとチューブの距離は7.6 cmである。チューブを2.25MHz(エア-バック)のトランスデューサーを用いて10秒間超音波照射する。
【０２０２】
細胞を、最初に上記工程(a)に従って製造したターゲッティング構築物(10μg/mL)とインキュベーションする。1時間後、細胞を培地で洗浄し、mPEG含有微小気泡(実施例6参照)と再度インキュベーションし、超音波照射に暴露する。次に、細胞を、FACS Calibur(Becton Dickinson AG、Switzerland)を用いて分析し、GFP陽性細胞のパーセンテージおよび明確にトランスフェクトされた細胞の平均蛍光強度を測定した。高いトランスフェクション率と蛍光強度がみられる。
【実施例２９】
【０２０３】
抗mPEG ターゲッティング構築物およびmPEG含有微小胞を組み合わせた超音波画像診断法 
a. 抗PEG ターゲッティング構築物の製造
実施例4を、ビオチン化IgG 抗P-セレクチンを、腫瘍の新生血管の内皮細胞に過剰発現したKDRのレセプターに特異的に結合するビオチン-ペプチド配列で置き換えて繰り返す(例えば、参考文献39参照)。
b. in vivo超音波画像診断試験
【０２０４】
1x106個のMATBIII腫瘍細胞を、麻酔した雌Fisher 344ラットの乳腺脂肪体内に注射する。ラットを(i)mPEG含有微小気泡のみ、および(ii)ターゲッティング構築物およびmPEG含有微小気泡の二群に分けて造影について試験する。造影超音波画像診断を、腫瘍誘発後第5〜7日(腫瘍サイズ：0.5〜1cm)に、7MHzおよびCPS造影モードで操作するプローブを取り付けた超音波スキャナーを用いて行う。
【０２０５】
ラット群(i)には、0.4mLのmPEG含小気泡(実施例6)をラット内に注射し、mPEG含有小気泡注射後10分間超音波処理を行う。
【０２０６】
ラット群(ii)には、二機能性ターゲッティング構築物(抗mPEG B-47およびビオチン化ペプチドKDRを含む)を、最初にMATBIII腫瘍を有するラットの尾部に注射する。ターゲッティング構築物注射の6時間後に、0.4 mLのmPEG含有小気泡(実施例6)をラットに注射し、超音波画像化を、mPEG含有小気泡注射の10分後に行う。
【０２０７】
結果は、認められる造影効果(LPO：ビデオ輝度で表現された後期混濁(late phase opacification))が(ii)群のラットでとても強いことを示す。
【実施例３０】
【０２０８】
抗PEGターゲッティング構築物およびデュアル画像診断(光学および超音波)を用いる治療に対する癌の反応の評価
a. 二特異性ターゲッティング構築物(抗PEG B-47およびペプチドHVGGSSV)の製造
抗PEGターゲッティング構築物を、Cy7標識ストレプトアビジン、ビオチン化抗mPEG B-47(実施例2)、およびビオチン化ペプチド配列 HVGGSSV(1:1:2)を用いて製造する。このペプチドを、ファージディスプレイ(T7ファージベースのランダムペプチドライブラリー)により選択し、該ペプチドは放射線療法で治療される腫瘍に対する特異的結合を示す(参考文献58参照)。
b. 反応する腫瘍と反応しない腫瘍を区別するためのin vivo造影
【０２０９】
1x106個のBxpC3(ヒト膵臓癌細胞、ATCC)をヌードマウスの右および左後肢に接種し、腫瘍サイズが直径0.5cmに達するときに処置した。治療は、チロシンキナーゼ阻害剤(Sorafenib(登録商標)、30mg/kg)の使用およびγ線照射(マウスの1肢のみ3Gy)からなる。
【０２１０】
2つの画像診断技術(コントラスト光学および超音波)を用いて放射線療法に対する腫瘍の反応を評価した。光学的画像診断では、NIR(近赤外蛍光)画像をIVIS画像診断装置(Xenogen)を用いて得る。超音波造影では、Siemens Sequoia超音波スキャナー(15L8プローブ、CPSモード)、およびペグ化微小気泡を用いる(実施例6)。
【０２１１】
ペグ化微小気泡を注射する2時間前に、ターゲッティング構築物(ビオチン化抗mPEGおよびビオチン化ペプチド配列HVGGSSV、およびCy7-ストレプトアビジン)をマウスに注射する。光学画像診断および超音波造影を実施する(治療的処置の24時間後)。
【０２１２】
結果は、1日治療(24時間)後、照射肢においてNIRと超音波画像の両方で造影画像は増強されるが、照射処理しなかった肢では造影効果はごくわずかであることを示す。これらの結果は、抗PEG ターゲッティング構築物を癌療法の追跡調査に用いることができることを示唆する。光学画像診断は、PEGポリマーでコートした量子ドットおよび抗PEGターゲッティング構築物を用いて行うこともできる。
参考文献
【０２１３】
1.  米国特許No.6,217,849 (BRACCO RESEARCH S.A.)
2.  米国特許No.5,387,410 (Mallinckrodt Inc.)
3.  米国特許No.5,271,928 (BRACCO INTERNATIONAL B.V.)
4.  米国特許No.5,413,774 (BRACCO INTERNATIONAL B.V.)
5.  米国特許No.5,827,504 (BRACCO RESEARCH S.A.)
6.  米国特許No.5,597,549 (BRACCO INTERNATIONAL B.V.)
7.  国際出願公開公報WO 04/069284 (BRACCO INTERNATIONAL B.V.)
8.  米国特許No.5,711,933  (BRACCO INTERNATIONAL B.V.)
9.  米国特許No.6,333,021 (BRACCO RESEARCH S.A.)
10.  Cassidy, P. J.; Radda, G. K.  "Molecular imaging perspectives", J.R.Soc.Interface, 2005, 2(3), 133-144.
11.  Sharma, V.; Luker, G. D.; Piwnica-Worms, D.  "Molecular imaging of gene expression and protein function in vivo with PET and SPECT", J.Magn Reson.Imaging, 2002, 16(4), 336-351.
12.  Goins, B. A.; Phillips, W. T.  "The use of scintigraphic imaging as a tool in the development of liposome formulations", Prog.Lipid Res., 2001, 40(1-2), 95-123.
13.  Torchilin, V. P.  "Targeted pharmaceutical nanocarriers for cancer therapy and imaging", AAPS.J., 2007, 9(2), E128-E147.
14.  Making and using antibodies: A practical handbook, CRC press: 2007; Chapter 4, 5 and 9.
15.  Kohler, G.; Milstein, C.  "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity", Nature, 1975, 256(5517), 495-7.
16.  米国特許No.4,816,567 (Genentech Inc.)
17.  Babcook, J. S.; Leslie, K. B.; Olsen, O. A.; Salmon, R. A.; Schrader, J. W.  "A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities", Proc Natl Acad Sci U S A, 1996, 93(15), 7843-8.
18.  Pasqualini, R.; Arap, W.  "Hybridoma-free generation of monoclonal antibodies", Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101(1), 257-9.
19.  米国特許No.5,969,108 (Medical Research Council)
20.  Okamoto, T.; Mukai, Y.; Yoshioka, Y.; Shibata, H.; Kawamura, M.; Yamamoto, Y.; Nakagawa, S.; Kamada, H.; Hayakawa, T.; Mayumi, T.; Tsutsumi, Y.  "Optimal construction of non-immune scFv phage display libraries from mouse bone marrow and spleen established to select specific scFvs efficiently binding to antigen", Biochem Biophys Res Commun, 2004, 323(2), 583-91.
21.  Wu, B. P.; Xiao, B.; Wan, T. M.; Zhang, Y. L.; Zhang, Z. S.; Zhou, D. Y.; Lai, Z. S.; Gao, C. F.  "Construction and selection of the natural immune Fab antibody phage display library from patients with colorectal cancer", World J Gastroenterol, 2001, 7(6), 811-5.
22.  Yau, K. Y.; Dubuc, G.; Li, S.; Hirama, T.; Mackenzie, C. R.; Jermutus, L.; Hall, J. C.; Tanha, J.  "Affinity maturation of a V(H)H by mutational hotspot randomization", J Immunol Methods, 2005, 297(1-2), 213-24.
23.  米国特許No.5,837,821 (City of Hope)
24.  Quiocho, F. A.  "Protein engineering. Making of the minibody", Nature, 1993, 362(6418), 293-4.
25.  Pat. Appl. Publ. No. EP 404 097 (Genentech Inc.)
26.  Holliger, P.; Prospero, T.; Winter, G.  ""Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments", Proc Natl Acad Sci U S A, 1993, 90(14), 6444-8.
27.  Holliger, P.; Hudson, P. J.  "Engineered antibody fragments and the rise of single domains", 2005, 23(9), 1126-1136.
28.  Bird, R. E.; Hardman, K. D.; Jacobson, J. W.; Johnson, S.; Kaufman, B. M.; Lee, S. M.; Lee, T.; Pope, S. H.; Riordan, G. S.; Whitlow, M.  "Single-chain antigen-binding proteins", Science, 1988, 242(4877), 423-6.
29.  米国特許No.4,946,778 (Genex Corp)
30.  Cheng, T. L.; Cheng, C. M.; Chen, B. M.; Tsao, D. A.; Chuang, K. H.; Hsiao, S. W.; Lin, Y. H.; Roffler, S. R.  "Monoclonal antibody-based quantitation of poly(ethylene glycol)-derivatized proteins, liposomes, and nanoparticles", Bioconjug.Chem., 2005, 16(5), 1225-1231.
31.  Pat. Appl. Publ. No. US 2001/028881  (Academia Sinica)
32.  国際出願公開公報WO 02/094853 (Shearwater Corp.)
33.  国際出願公開公報WO 98/18501 (Nycomed Imaging AS)
34.  Int. Pat. Appl. Publ. No WO 2008/073458 (BRACCO IMAGING SpA)
35.  Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 01/09188 (EPIX Medical Inc.)
36.  Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 02/55544 (DYAX CORP.)
37.  Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 03/74005 (DYAX CORP. and BRACCO INTERNATIONAL B.V.)
38.  Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 03/84574 (BRACCO INTERNATIONAL B.V. and DYAX CORP.)
39.  国際出願公開公報WO 2006/031885 (DYAX CORP. and BRACCO INTERNATIONAL B.V.)
40.  国際出願公開公報WO 2007/109475 (BRACCO IMAGING SpA)
41.  von Wronski, M. A.; Raju, N.; Pillai, R.; Bogdan, N. J.; Marinelli, E. R.; Nanjappan, P.; Ramalingam, K.; Arunachalam, T.; Eaton, S.; Linder, K. E.; Yan, F.; Pochon, S.; Tweedle, M. F.; Nunn, A. D.  "Tuftsin binds neuropilin-1 through a sequence similar to that encoded by exon 8 of vascular endothelial growth factor", J.Biol.Chem., 2006, 281(9), 5702-5710.
42.  国際出願公開公報WO 97/29782 (Nycomed Imaging AS)
43.  米国特許No.5605673 (Alliance Pharmaceutical Corp.)
44.  米国特許No.4,276,885 (Rasor Associates Inc.)
45.  Pat. Appl. Publ. No. EP 324 938 (Molecular Biosystems Inc.)
46.  Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 94/09829 (BRACCO INTERNATIONAL B.V.)
47.  Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 99/39738 (BRACCO RESEARCH S.A.)
48.  Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 2005/063305 (BRACCO RESEARCH S.A.)
49.  Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 2006/111490 (BRACCO RESEARCH S.A.)
50.  Int. Pat. Appl. No. WO 92/10166 (SINTETICA S.A.)
51.  M.Malmsten  in Surfactants and Polymers in Drug Delivery, Marcel Dekker Inc., editor; 2002; Chapter 4, pp. 87-113.
52.  国際出願公開公報WO 05/117832 (BRACCO RESEARCH, S. A.)
53.  米国特許No.5,545,395 (BRACCO RESEARCH S.A.)
54.  Golman, K.; Ardenkjaer-Larsen, J. H.; Petersson, J. S.; Mansson, S.; Leunbach, I.  "Molecular imaging with endogenous substances", Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 2003, 100(18), 10435-10439.
55.  Johansson, E.; Olsson, L. E.; Mansson, S.; Petersson, J. S.; Golman, K.; Stahlberg, F.; Wirestam, R.  "Perfusion assessment with bolus differentiation: a technique applicable to hyperpolarized tracers", Magn Reson.Med., 2004, 52(5), 1043-1051.
56.  Sweeney, P.; Karashima, T.; Kim, S. J.; Kedar, D.; Mian, B.; Huang, S.; Baker, C.; Fan, Z.; Hicklin, D. J.; Pettaway, C. A.; Dinney, C. P.  "Anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody reduces tumorigenicity and metastasis in orthotopic prostate cancer xenografts via induction of endothelial cell apoptosis and reduction of endothelial cell matrix metalloproteinase type 9 production", Clin.Cancer Res., 2002, 8(8), 2714-2724.
57.  Kelly, K. A.; Setlur, S. R.; Ross, R.; Anbazhagan, R.; Waterman, P.; Rubin, M. A.; Weissleder, R.  "Detection of early prostate cancer using a hepsin-targeted imaging agent", Cancer Res., 2008, 68(7), 2286-2291.
58.  Han, Z.; Fu, A.; Wang, H.; Diaz, R.; Geng, L.; Onishko, H.; Hallahan, D. E.  "Noninvasive assessment of cancer response to therapy", Nat.Med., 2008, 14(3), 343-349.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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