(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号６のアミノ酸５２９〜５６６と、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸５２９〜５６６と、（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸４８６〜５２３と、（ｉｖ）配列番号１０のアミノ酸４８６〜５２３と、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸４８６〜５２３と、（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸５４３〜５７６と、（ｖｉｉ）配列番号６のアミノ酸４５４〜５８０と、(ｖｉｉｉ)配列番号１８のアミノ酸４５４〜５８０と、(ｉｘ)配列番号４のアミノ酸４１１〜５３６と、（ｘ）配列番号１０のアミノ酸４１１〜５３６と、（ｘｉ）配列番号１６のアミノ酸４１１〜５３６と、（ｘｉｉ）配列番号２のアミノ酸４６８〜５９５と、（ｘｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸４６８〜５９５と、（ｘｉｖ）（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｉｘ）、（ｘ）または、（ｘｉ）のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、かつ、ボツリヌス神経毒素Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）と結合することができるアミノ酸配列と、からなる群から選択される単離ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが可溶性である、請求項１記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが１２８、１２７、又は１２６個未満のアミノ酸を有する、請求項１記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項５】
ポリヌクレオチド又はその相補体を含む単離核酸であって、
該ポリヌクレオチドが、
（１）請求項１記載のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、
（２）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記第１のポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズする第２のポリヌクレオチドと、
から選択され、かつ、ＢｏＮＴ／Ａと結合することができるポリペプチドをコードし、
核酸が、全長ＳＶ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＳＶ２ポリペプチドの内腔ドメインからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は、一端または両端において非天然フランキングアミノ酸配列によってフランキングされたＳＶ２ポリペプチドの内腔ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まない、単離核酸。
【請求項６】
前記核酸が、（ｉ）配列番号６のアミノ酸５２９〜５６６と、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸５２９〜５６６と、（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸４８６〜５２３と、（ｉｖ）配列番号１０のアミノ酸４８６〜５２３と、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸４８６〜５２３と、（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸５４３〜５８０と、（ｖｉｉ）（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、又は、（ｖ）と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列と、からなる群から選択され、かつ、ボツリヌス神経毒素Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）と結合することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項５記載の単離核酸。
【請求項７】
非天然プロモータと操作可能に結び付く請求項５又は６記載の核酸を含むベクター。
【請求項８】
非天然プロモータと操作可能に結び付く請求項５又は６記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項９】
リガンドとポリペプチドとの複合体であって、
前記リガンドが、ＢｏＮＴ／Ａであり、
該ポリペプチドが、基本的に前記リガンドが結合する成員からなり、
該成員が、（ｉ）配列番号６のアミノ酸５２９〜５６２と、（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸４８６〜５１９と、（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸５４３〜５７６と、（ｉｖ）配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２の断片であって、該断片が配列番号２のアミノ酸５２９〜５６２、配列番号４のアミノ酸４８６〜５１９、又は配列番号６のアミノ酸５４３〜５７６に対応する断片と、（ｖ）配列番号６のアミノ酸４５４〜５４６と、（ｖｉ）配列番号４のアミノ酸４１１〜５０３と、（ｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸４６８〜５６０と、（ｖｉｉｉ）配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８，２０、または、２２の断片であって、該断片が配列番号２のアミノ酸４５４〜５４６、配列番号４のアミノ酸４１１〜５０３、又は配列番号６のアミノ酸４６８〜５６０に対応する断片と、から選択される、リガンドとポリペプチドとの複合体。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが合成ペプチド又は組み換えペプチドである、請求項９記載の複合体。
【請求項１１】
前記ポリペプチドがｉｎ  ｖｉｖｏに位置する、請求項１０記載の複合体。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが組み換えポリペプチドである、請求項１０記載の複合体。
【請求項１３】
非ヒト動物においてＢｏＮＴ／Ａ毒性を低減する方法であって、
前記非ヒト動物に、非ヒト動物においてＢｏＮＴ／ＡとＳＶ２タンパク質との間の結合を低減する薬剤を投与する工程を含み、そして、
前記薬剤が、請求項１に記載のポリペプチド、及び、請求項４に記載の抗体からなる群から選択されるポリペプチドである、方法。
【請求項１４】
前記薬剤がガングリオシドをさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記薬剤が請求項４記載の抗体である、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
ＢｏＮＴ／ＡとＳＶ２タンパク質との間の結合を妨げることができる薬剤を同定する方法であって、  試験薬剤の存在下でＢｏＮＴ／Ａと請求項１記載のポリペプチドとの間の結合を測定する工程と、  前記結合を、同じ条件下ではあるが、前記試験薬剤の非存在下で測定された対照の結合と比較する工程であって、対照の結合より低いことは、該薬剤がＢｏＮＴ／ＡとＳＶ２タンパク質との間の結合を妨げることができることを示す、前記の比較する工程とを含み、そして、前記すべての工程をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが細胞表面上に提供され、該細胞が前記試験薬剤に曝される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ＢｏＮＴ／Ａと前記ポリペプチドとの間の結合が、前記細胞へのＢｏＮＴ／Ａの侵入をモニタリングすることによって間接的に測定される、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
ＳＶ２タンパク質のＢｏＮＴ／Ａ結合配列と結合することができる薬剤を同定する方法であって、
請求項１記載のポリペプチドを試験薬剤に曝す工程と、
前記薬剤が前記ポリペプチドと結合するか否かを求める工程と
を含み、そして、前記すべての工程をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う方法。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが提供され、細胞において試験薬剤に曝される、請求項１９記載の方
法。
【請求項２１】
ＢｏＮＴ／Ａ又はボツリヌス菌を検出する方法であって、該方法が、
ＢｏＮＴ／Ａを含む疑いのあるサンプルを、請求項１記載のポリペプチドに曝す工程と、
任意に、前記サンプルをガングリオシドに曝す工程と、
ＢｏＮＴ／Ａとの前記ポリペプチドの結合を検出する工程と、
を含む、ＢｏＮＴ／Ａ又はボツリヌス菌を検出する方法。
【請求項２２】
ＢｏＮＴ／Ａと結合することができるポリペプチドを同定する方法であって、
ＳＶ２タンパク質のＢｏＮＴ／Ａ結合配列を含むポリペプチドを提供する工程であって、該ポリペプチドが、請求項１記載のポリペプチドである、前記の提供する工程と、
前記ＢｏＮＴ／Ａ結合配列において前記ポリペプチドを修飾する工程と、
前記の修飾されたポリペプチドがＢｏＮＴ／Ａと結合することができるか否かを求める工程と、
を含む、ＢｏＮＴ／Ａと結合することができるポリペプチドを同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００５年１０月１４日に提出された米国特許出願第６０／７２６，８７９号（本明細書でその全体が参照により援用される）の利益を主張する。
【０００２】
［連邦政府による資金提供を受けた研究または開発の記載］
本発明は、国立衛生研究所による助成金番号第ＡＩ０５７１５３号及び同第ＡＩ０５７７４４号に基づき、米国政府の支援によって行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
［発明の背景］
ボツリヌス神経毒素Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）は、嫌気性細菌株ボツリヌス菌によって産生される７つのボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ／Ａ〜Ｇと称される）の１つである（Schiavo  G  et  al.，Physiol．Rev．80：717-766，2000）。ＢｏＮＴは、ＳＮＡＰ−２５と、ｖａｍｐ−２／シナプトブレビン（Ｓｙｂ）と、シンタキシンとから構成された膜融合機構の膜を切断することによって、神経伝達物質の放出を妨げる（Jahn  R  and  Niemann  H，Ann．NY  Acad．Sci．733：245-255，1994、Schiavo  G  et  al.，supra，2000）。運動性神経末端におけるこれらのタンパク質の切断は神経筋接合部（ＮＭＪ）におけるアセチルコリン放出を妨げ、麻痺を引き起こし、呼吸不全により死に至る危険性がある（Schiavo  G．et  al.，supra，2000、Simpson  LL，Ann．Rev．Pharmacol．Toxicol．44：167-193，2004）。強力な潜在能力及び致死性、並びに使用及び輸送が容易であるため、ＢｏＮＴは、６つの最も危険性のある潜在的なバイオテロの脅威（米国の疾病対策センター(Center  for  Disease  Control  of  United  States)で指定された）の１つと考えられている（Arnon  SS  et  al.，JAMA  285：1059-1070，2001）。米国医師会によれば、結晶性毒素はわずか１ｇでも１００万の人々を死滅させるのに十分である。
【０００４】
現在、ＢｏＮＴに対する標準試験は、疾病対策予防センター（ＣＤＣ）で利用可能なマウスのバイオアッセイであり、全国の研究所で選択されている。この試験は、１つのＢｏＮＴを保有する疑いのある臨床サンプルでマウスを処理することを伴う。マウスは、様々なＢｏＮＴに対して免疫付与され、サンプル中に存在する特定のＢｏＮＴに対して免疫付与されたこれらのマウスのみが生き残る。この試験は、わずか０．０３ｎｇのＢｏＮＴを検出することができるという点では高感度であるが、高価であり、終了するまで数日を要する。治療の側面では、ＢｏＮＴに対する抗体を含有するウマの抗毒素は最適治療であり、その有効性は適時の治療によって変わる。しかし、この治療は、アナフィラキシー及び血清病の危険性といったような、ウマの血清産物のあらゆる欠点を有している。この診断試験は治療の効果を待つには日数がかかり過ぎるので、ボツリヌス中毒症が確認される前に、治療を開始することが多い。したがって、代替的な検出及び治療の戦略に対する当該技術分野における必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
［発明の簡単な要約］
本発明は、ＢｏＮＴ／Ａ受容体としてのシナプスベッセル(synaptic  vessel)糖タンパク質ＳＶ２の同定及びＳＶ２の様々なＢｏＮＴ／Ａ結合断片のさらなる同定に基づく。本明細書における開示は、ボツリヌス中毒症を診断及び治療する新規のツールを提供する。
【０００６】
本発明のファイルには、カラーで作製された少なくとも１つの図面が含まれる。要請及び必要な手数料の支払いに応じて、特許商標局によってカラーの図面付きの本発明のコピーを準備される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
［発明の詳細な説明］
本発明は、ＢｏＮＴ／Ａ受容体としてのシナプスベッセル糖タンパク質ＳＶ２の同定、及びＳＶ２の様々なＢｏＮＴ／Ａ結合断片の同定に基づく。本明細書における開示は、ＢｏＮＴ／Ａ毒性及びボツリヌス病に対する新規の予防及び治療の戦略を提供する。本明細書における開示は、ＳＶ２−ＢｏＮＴ／Ａ結合、ＢｏＮＴ／Ａ細胞侵入、及びＢｏＮＴ／Ａ毒性を低減することができる薬剤を同定する新規のツールも提供する。
【０００８】
幾つかの種（例えば、ヒト、ラット、及びマウス）において、３つのＳＶ２アイソフォーム、すなわち、ＳＶ２Ａ、ＳＶ２Ｂ及びＳＶ２Ｃが同定されている。例えばラットのＳＶ２を用いて、本発明者らは、３つのアイソフォーム全てが、ＢｏＮＴ／Ａと結合することができ、ＢｏＮＴ／Ａの受容体として有用であることを見出した。ウシ及びシビレエイ（Ｄｉｓｃｏｐｙｇｅ  ｏｍｍａｔｔａ）等の他の種では、今までのところ１つのアイソフォームしか同定されていない。ウシのＳＶ２のｃＤＮＡは、ＳＶ２Ｂ及びＳＶ２ＣよりもＳＶ２Ａに類似しており、シビレエイのＳＶ２のｃＤＮＡは、ＳＶ２Ａ及びＳＶ２ＢよりもＳＶ２Ｃに類似している。ＳＶ２Ａ、ＳＶ２Ｂ及びＳＶ２Ｃの機能及びアミノ酸配列が、動物種（特に哺乳類種）にわたって保存されることが当該技術分野において既知である。タンパク質レベルでは、既知のＳＶ２タンパク質（ヒト、マウス、ラット、ウシ、及びシビレエイ）の間で少なくとも６２％同一性があり、既知のＳＶ２タンパク質の内腔ドメインの間で少なくとも５７％同一性がある。既知のＳＶ２Ａタンパク質及びウシのＳＶタンパク質において、アミノ酸配列の同一性は、全タンパク質に関しては９８％を超え、内腔ドメインに関しては１００％である。既知のＳＶ２Ｂタンパク質において、アミノ酸配列の同一性は、全タンパク質に関しては９４％を超え、内腔ドメインに関しては９６％を超える。既知のＳＶ２Ｃタンパク質及びシビレエイのＳＶタンパク質において、アミノ酸配列の同一性は、全タンパク質に関しては７９％を超え（哺乳類種においては９６％を超え）、内腔ドメインに関しては７６％を超える（哺乳類種においては９７％を超える）。ラットのＳＶ２Ａ、ＳＶ２Ｂ、及びＳＶ２Ｃの内腔ドメインの間のアミノ酸配列同一性は７６％であり、ラットのＳＶ２Ａ、ＳＶ２Ｂ、及びＳＶ２Ｃの内腔ドメインの間のアミノ酸配列同一性は７５％である。本明細書における開示は、ラットのＳＶ２Ａ、ＳＶ２Ｂ、及びＳＶ２Ｃでの発見に基づいているが、全ての哺乳類種を含む全ての動物種に適用される。例えば、或る特定のラットのＳＶ２Ｃ断片がＢｏＮＴ／Ａと結合することができることを示しているが、その一方でラットのＳＶ２Ａ及びラットのＳＶ２Ｂ由来の対応する断片、並びに他のＳＶ２ホモログ由来の対応する断片がＢｏＮＴ／Ａと結合することができると考えられる。全てのＳＶ２タンパク質の間の対応するドメイン及び断片は、当業者に良く知られている任意のアラインメントプログラムを用いて同定することができる。例えば、Accelrys（San  Diego，CA）製のＧＣＧソフトウェアをこの目的に使用することができる（例えば、パラメータが初期値であるＭｅｇａＡｌｉｇｎプログラム）。
【０００９】
典型的に、ＳＶ２タンパク質は１２個の膜貫通ドメインと、７つの細胞質ドメインと、１つの大きな内腔ドメイン（内腔ドメイン４、Ｌ４）とを含有する（Janz  R  and  Sudhof  TC，Neuroscience  94：1279-1290，1999）。ラットのＳＶ２Ａ、ＳＶ２Ｂ、及びＳＶ２Ｃの場合、内腔ドメインはそれぞれ、アミノ酸４６８〜アミノ酸５９５、アミノ酸４１１〜アミノ酸５３６、及びアミノ酸４５４〜アミノ酸５８０にわたっている。本発明者らは、ＢｏＮＴ／Ａが、その内腔ドメインでＳＶ２タンパク質と結合することを見つけ出している。特に、本発明者らは、ラットのＳＶ２Ｃの内腔ドメイン断片のアミノ酸５２９〜５６２及びアミノ酸４５４〜５４６並びに上記の断片を含有する様々な他の断片が、ＢｏＮＴ／Ａと結合することができることを示している。断片のアミノ酸５２９〜５６６は、内腔ドメイン自体とほとんど同じ効率で結合する。アミノ酸５２９〜５６２又は４５４〜５４６にわたる断片よりも短い断片でもＢｏＮＴ／Ａと結合することができる可能性があり、当業者は日常的な切断実験によってこれらの断片を容易に同定することができる。
【００１０】
さらに、上記のＳＶ２タンパク質のＢｏＮＴ／Ａ結合断片のいずれか及び１つ又は複数の保存的置換を有するこのような結合断片のいずれかと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるペプチドが、ＢｏＮＴ／Ａと結合することができると考えられる。同じ保存的群内のアミノ酸は、タンパク質の機能に実質的に影響を与えることなく互いに典型的に置換することができることは当該技術分野で既知である。本発明の目的のために、このような保存的群が共通の特性に基づき、表１に記載されている。
【００１１】
【表１−１】
0005647395.tif 000002
【００１２】
【表１−２】
0005647395.tif 000003
【００１３】
ラットのＳＶ２Ａ（ｃＤＮＡ配列は配列番号１に記載され、アミノ酸配列は配列番号２に記載される）、ＳＶ２Ｂ（ｃＤＮＡ配列は配列番号３に記載され、アミノ酸配列は配列番号４に記載される）、及びＳＶ２Ｃ（ｃＤＮＡ配列は配列番号５に記載され、アミノ酸配列は配列番号６に記載される）に対するｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列はそれぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０５７２１０、Ｌ１０３６２、及びＮＭ＿０３１５９３に見出され得る。マウスのＳＶ２Ａ（ｃＤＮＡ配列は配列番号７に記載され、アミノ酸配列は配列番号８に記載される）、ＳＶ２Ｂ（ｃＤＮＡ配列は配列番号９に記載され、アミノ酸配列は配列番号１０に記載される）、及びＳＶ２Ｃ（ｃＤＮＡ配列は配列番号１１に記載され、アミノ酸配列は配列番号１２に記載される）に対するｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列はそれぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２２０３０、ＮＭ＿１５３５７９、及びＸＭ＿９９１２５７に見出され得る。ヒトのＳＶ２Ａ（ｃＤＮＡ配列は配列番号１３に記載され、アミノ酸配列は配列番号１４に記載される）、ＳＶ２Ｂ（ｃＤＮＡ配列は配列番号１５に記載され、アミノ酸配列は配列番号１６に記載される）、及びＳＶ２Ｃ（ｃＤＮＡ配列は配列番号１７に記載され、アミノ酸配列は配列番号１８に記載される）に対するｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列はそれぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１４８４９、ＢＣ０３００１１、及びＢＣ１００８２７に見出され得る。ウシのＳＶ２に対するｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列（ｃＤＮＡ配列は配列番号１９に記載され、アミノ酸配列は配列番号２０に記載される）は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１７３９６２に見出され得る。シビレエイ（Ｄｉｓｃｏｐｙｇｅ  ｏｍｍａｔｔａ）ＳＶ２に対するｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列（ｃＤＮＡ配列は配列番号２１に記載され、アミノ酸配列は配列番号２２に記載される）は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２３４０３に見出され得る。
【００１４】
ポリペプチド、核酸、ベクター、及び宿主細胞
本明細書中で用いられる「単離ポリペプチド」又は「単離核酸」という用語は、その自然環境から単離されるか、又は当業者にとって既知の方法のような合成方法を用いて調製されたポリペプチド又は核酸を意味する。いずれの場合においても完全な精製は要求されていない。本発明のポリペプチド及び核酸は、精製品においてポリペプチド又は核酸がその精製品の優勢種であるような従来の方法で、通常関連物質から単離精製することができる。精製度は最低限でも、精製品中の異物が、本発明で開示される様式での本発明のポリペプチド又は核酸の使用を妨げない程度のものである。ポリペプチド又は核酸は好ましくは、少なくとも約８５％の純度、より好ましくは少なくとも約９５％の純度、及び最も好ましくは少なくとも約９９％の純度である。
【００１５】
さらに単離核酸は、任意の天然由来の核酸の構造、又は２つ以上の遺伝子にわたる天然由来のゲノム核酸の任意の断片の構造と同一ではない構造を有する。単離核酸としては、これらに限定されないが、（ａ）天然由来のゲノム核酸分子又は染色体外核酸分子の配列を有するが、その自然位置の配列に隣接するコード配列によっては隣接されない核酸、（ｂ）得られる分子が天然由来のベクター又はゲノムＤＮＡのいずれとも同一ではないようなベクター、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムに組み込まれる核酸、（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製される断片、又は制限断片等の分離分子、並びに（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組み換えヌクレオチド配列も挙げられる。クローンの混合物に存在する核酸は、例えばこれらのクローンがｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡのライブラリ等のＤＮＡライブラリで発生するのでこの定義から特に除外される。単離核酸は、完全に若しくは部分的に一本鎖、又は二本鎖、又はたとえ三本鎖であったとしても、修飾若しくは非修飾のＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。核酸は、化学的に又は酵素的に修飾することができ、すなわちイノシン等の非標準塩基を含み得る。
【００１６】
本出願で用いられるように、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列間の「同一率」は「相同率」と同義語であり、これは、Karlin  and  Altschul（Proc．Natl．Acad．Sci．USA  90，5873-5877，1993）によって修正されたKarlin  and  Altschul（Proc．Natl．Acad．ScI  USA  87，2264-2268，1990）のアルゴリズム、又は当業者に良く知られている他の方法を用いて求めることができる。上記のアルゴリズムは、Altschul  et  al.（J．Mol．Biol．215，403-410，1990）のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長＝１２）で実行し、対象のポリヌクレオチドと相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）で実行し、参照ポリペプチドと相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップのあるアラインメントを得るために、ギャップド(Gapped)ＢＬＡＳＴは、Altschul  et  al.（Nucleic  Acids  Res．25，3389-3402，1997）に記載されるように利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラム及びギャップドＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）の初期パラメータを用いることができる。２つのアミノ酸配列をアラインメントする別のプログラムの例（ＭｅｇａＡｌｉｇｎ、ＧＣＧ）は本明細書の上記で与えられる。
【００１７】
一態様において、本発明は、結合断片の全長にわたるＳＶ２タンパク質のＢｏＮＴ／Ａ結合断片のアミノ酸配列、又は１つ又は複数の保存的置換を有するＳＶ２タンパク質のＢｏＮＴ／Ａ結合断片のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％同一であるアミノ酸配列を含有する単離ポリペプチドに関する。好ましくは、上記単離ポリペプチドはＢｏＮＴ／Ａと結合することができる。全長ＳＶ２タンパク質を含有するポリペプチドは、本発明のポリペプチドから特に除外される。一実施態様では、ＳＶ２内腔ドメインから成るか、又はＳＶ２内腔ドメインを含有する単離ポリペプチドであって、当該ドメインが非天然フランキングアミノ酸配列によって一端又は両端に隣接されるポリペプチドも本発明から除外される。ＳＶ２タンパク質のＢｏＮＴ／Ａ結合断片の例としては、これらに限定されないが、（ｉ）ラットのＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６２と、（ｉｉ）ラットのＳＶ２Ｂのアミノ酸４８６〜５１９と、（ｉｉｉ）ラットのＳＶ２Ａのアミノ酸５４３〜５７６と、（ｉｖ）ラットのＳＶ２Ｃ、ＳＶ２Ｂ、又はＳＶ２Ａのホモログの断片であって、当該断片がそれぞれ、ラットのＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６２、ラットのＳＶ２Ｂのアミノ酸４８６〜５１９、又はラットのＳＶ２Ａのアミノ酸５４３〜５７６に対応する断片である、ホモログの断片（例えば図９を参照されたい）と、（ｖ）ラットのＳＶ２Ｃのアミノ酸４５４〜５４６と、（ｖｉ）ラットのＳＶ２Ｂのアミノ酸４１１〜５０３と、（ｖｉｉ）ラットのＳＶ２Ａのアミノ酸４６８〜５６０と、（ｖｉｉｉ）ラットのＳＶ２Ｃ、ＳＶ２Ｂ、又はＳＶ２Ａのホモログの断片であって、当該断片がそれぞれ、ラットのＳＶ２Ｃのアミノ酸４５４〜５４６、ラットのＳＶ２Ｂのアミノ酸４１１〜５０３、又はラットのＳＶ２Ａのアミノ酸４６８〜５６０に対応する断片（例えば図９を参照されたい）とが挙げられる。
【００１８】
好ましいＳＶ２タンパク質のＢｏＮＴ／Ａ結合断片としては、これらに限定されないが、（ｉ）ラットのＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６６と、（ｉｉ）ラットのＳＶ２Ｂのアミノ酸４８６〜５２３と、（ｉｉｉ）ラットのＳＶ２Ａのアミノ酸５４３〜５８０と、（ｉｖ）ラットのＳＶ２Ｃ、ＳＶ２Ｂ、又はＳＶ２Ａのホモログの断片であって、当該断片がそれぞれ、ラットのＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６６、ラットのＳＶ２Ｂのアミノ酸４８６〜５２３、又はラットのＳＶ２Ａのアミノ酸５４３〜５８０に対応する断片が挙げられる。他の好ましいＢｏＮＴ／Ａ結合断片には、ＳＶ２タンパク質の内腔ドメインが含まれる。
【００１９】
一実施態様において、本発明のポリペプチドは、おおよそＳＶ２内腔ドメインの長さ以下である。例えば、本発明のポリペプチドは、１２９、１２８、１２７、又は１２６アミノ酸長未満であり得る。別の実施態様では、本発明のポリペプチドは、１２５、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、又は４０アミノ酸長未満である。
【００２０】
別の実施態様において、本発明のポリペプチドは水性溶媒（例えば、他の添加剤の有無に関わらず水）に可溶性である。水性溶媒に可溶性であるということは、ポリペプチドが、水性溶媒において少なくとも１０μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも５０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも５００μｇ／ｍｌ、及び最も好ましくは少なくとも１０００μｇ／ｍｌの溶解度を示すことを意味する。ポリペプチドが水溶液に可溶性であるか否かは、そのアミノ酸配列に基づくか、又は日常的な実験によって当業者によって容易に求められ得る。本発明の可溶性ポリペプチドの例としては、ＳＶ２タンパク質の内腔ドメインの全て又は一部を含有するが、隣接膜貫通ドメイン（複数可）の少なくとも一部、好ましくは全てを欠いているポリペプチドが挙げられる。典型的に可溶性ポリペプチドは、静脈内投与に関して不溶性ポリペプチドよりも好適である。
【００２１】
付加的なアミノ酸（複数可）がＢｏＮＴ／Ａ結合機能に実質的に影響を与えなければ、本発明の単離ポリペプチドには、ＳＶ２タンパク質のＢｏＮＴ／Ａ結合配列のＮ末端及びＣ末端のいずれか又は両方に１つ又は複数のアミノ酸が含まれていてもよい。任意の付加的なアミノ酸は必要ではないが、ポリペプチドを精製、検出、又は安定化するのに有利に使用することができる。
【００２２】
ポリペプチドの安定性及び／又は結合性を改善するために、非天然アミノ酸及び／又はアミノ酸間の非天然化学結合の組み込みによって分子を修飾することができる。このような分子はペプチドミミック(peptidomimics)と呼ばれる（H.U.Saragovi  et  al.，Bio/Technology  10：773-778，1992、S.Chen  et  al.，Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA  89：5872-5876，1992）。このような化合物の生成は化学合成に限定されている。本発明のポリペプチドは、その機能を破壊することなくペプチドミミックへと修飾することができることが理解される。これは当業者によって容易に達成することができる。
【００２３】
別の態様において、本発明は、コードポリヌクレオチド又はその相補体を含有する単離核酸であって、当該コードポリヌクレオチドが、上記のように本発明のポリペプチドをコードする一続きの(uninterrupted)コード配列を有する単離核酸に関する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、又は適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、コードポリヌクレオチド又はその相補体とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを含有する核酸は、コードポリペプチドを検出するのに有用であり、したがって本発明の範囲内である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５×ＳＳＣ／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳにおける６８℃でのハイブリダイズ、及び０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ±１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡにおける室温での洗浄と定義され、適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、同じ緩衝液における４２℃での洗浄と定義される。例えば、Sambrook  et  al.著，1989，「分子クローニング、研究所マニュアル(Molecular  Cloning，A  Laboratory  Manual)」，Cold  Spring  Harbor  Press，N.Y.、及びAusubel  et  al.（編），1995,「分子生物学における最新のプロトコル(Current  Protocols  in  Molecular  Biology)」(John  Wiley＆Sons，N.Y.)のＵｎｉｔ  ２．１０によるこのような条件に関する付加的な指針が当該技術分野で容易に利用可能である。コードポリヌクレオチド、又はコードポリヌクレオチドの全長にわたるその相補体と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるポリヌクレオチドを含有する核酸は、コードポリヌクレオチドを検出するプローブとして用いることもでき、したがって本発明の範囲内である。全長ＳＶ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸が本発明から特に除外される。一実施態様では、ＳＶ２内腔ドメインをコードするポリヌクレオチドから成る核酸、及びＳＶ２内腔ドメインを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸であって、当該ドメインが非天然アミノ酸配列によって一端又は両端に隣接される核酸が除外される。
【００２４】
関連の態様において、上記の本発明の任意の核酸が、当業者に既知の様式でベクターにおいて提供され得る。このベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり得る。発現ベクターにおいて、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１つ又は複数の非天然発現制御配列の転写制御下にあり、これにはベクターが適合する宿主細胞に、又は無細胞転写翻訳系に与えられる場合に、コード化ポリペプチドを生成することができるようにポリヌクレオチドに隣接して天然には見出されないプロモータが含まれ得る。このような細胞に基づいた系及び無細胞系は当業者に既知である。本発明の核酸を含有するベクターを含む細胞自体が本発明の範囲内である。非天然部位でそのゲノムに組み込まれた本発明の核酸を有する宿主細胞も本発明の範囲内である。
【００２５】
リガンド−ポリペプチド複合体
別の態様において、本発明は、リガンドとポリペプチドとの複合体であって、当該ポリペプチドが、（ｉ）ラットのＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６２と、（ｉｉ）ラットのＳＶ２Ｂのアミノ酸４８６〜５１９と、（ｉｉｉ）ラットのＳＶ２Ａのアミノ酸５４３〜５７６と、（ｉｖ）ラットのＳＶ２Ｃ、ＳＶ２Ｂ、又はＳＶ２Ａのホモログの断片であって、当該断片がそれぞれ、ラットのＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６２、ラットのＳＶ２Ｂのアミノ酸４８６〜５１９、又はラットのＳＶ２Ａのアミノ酸５４３〜５７６に対応する断片と、（ｖ）ラットのＳＶ２Ｃのアミノ酸４５４〜５４６と、（ｖｉ）ラットのＳＶ２Ｂのアミノ酸４１１〜５０３と、（ｖｉｉ）ラットのＳＶ２Ａのアミノ酸４６８〜５６０と、（ｖｉｉｉ）ラットのＳＶ２Ｃ、ＳＶ２Ｂ、又はＳＶ２Ａのホモログの断片であって、当該断片がそれぞれ、ラットのＳＶ２Ｃのアミノ酸４５４〜５４６、ラットのＳＶ２Ｂのアミノ酸４１１〜５０３、又はラットのＳＶ２Ａのアミノ酸４６８〜５６０に対応する断片と、（ｉｘ）（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の前記アミノ酸配列のいずれかと少なくとも７０％同一であり、ＢｏＮＴ／Ａと結合することができるアミノ酸配列と、（ｘ）保存的置換を有し、ＢｏＮＴ／Ａと結合することができる（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）由来のアミノ酸配列とから選択される、リガンドが結合する部分を含み、ポリペプチドが全長ＳＶ２タンパク質である場合、リガンドがボツリヌス毒素ではない複合体に関する。本明細書に開示される複合体には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで形成されるものの両方が含まれる。
【００２６】
一実施態様において、複合体のポリペプチドは、全長ＳＶ２タンパク質である。
【００２７】
別の実施態様において、複合体のポリペプチドは、「ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞」の項で規定されている本発明のＢｏＮＴ／Ａ結合ポリペプチドの１つである。
【００２８】
好ましい実施態様において、複合体のポリペプチドは、（ｉ）ラットのＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６６と、（ｉｉ）ラットのＳＶ２Ｂのアミノ酸４８６〜５２３と、（ｉｉｉ）ラットのＳＶ２Ａのアミノ酸５４３〜５８０と、（ｉｖ）ラットのＳＶ２Ｃ、ＳＶ２Ｂ、又はＳＶ２Ａのホモログの断片であって、当該断片がそれぞれ、ラットのＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６６、ラットのＳＶ２Ｂのアミノ酸４８６〜５２３、又はラットのＳＶ２Ａのアミノ酸５４３〜５８０に対応するホモログの断片と、（ｖ）ラットのＳＶ２Ｃのアミノ酸４５４〜５４６と、（ｖｉ）ラットのＳＶ２Ｂのアミノ酸４１１〜５０３と、（ｖｉｉ）ラットのＳＶ２Ａのアミノ酸４６８〜５６０と、（ｖｉｉｉ）ラットのＳＶ２Ｃ、ＳＶ２Ｂ、又はＳＶ２Ａのホモログの断片であって、当該断片がそれぞれ、ラットのＳＶ２Ｃのアミノ酸４５４〜５４６、ラットのＳＶ２Ｂのアミノ酸４１１〜５０３、又はラットのＳＶ２Ａのアミノ酸４６８〜５６０に対応するホモログの断片とから選択される成員を含む。
【００２９】
複合体のポリペプチドは、合成ペプチド又は組み換えペプチドであってもよく、アフィニティタグ及び／又はガングリオシド結合部位を含み得る。
【００３０】
一実施態様において、複合体のリガンドは、ポリペプチドに対する抗体又はポリペプチドと結合するＢｏＮＴ／Ａ断片である。このような抗体及びＢｏＮＴ／Ａ断片は、ポリペプチドとＢｏＮＴ／Ａとの間の結合を低減することができる。
【００３１】
ＢｏＮＴ／Ａ神経毒性を低減する方法
別の態様において、本発明はニューロン等の標的細胞でＢｏＮＴ／Ａ細胞毒性を低減する方法に関する。結果として、ボツリヌス病を予防又は治療することができる。一実施態様では、この方法を用いて、ＢｏＮＴ／Ａ毒性を低減することができる薬剤をヒト又は非ヒト動物に投与することによって、ヒト又は非ヒト動物におけるＢｏＮＴ／Ａ毒性を低減させる。
【００３２】
「ＢｏＮＴ／Ａ細胞毒性を低減させる」という用語は、ＢｏＮＴ／Ａ毒性におけるあらゆるレベルの低減を包含する。標的細胞のＳＶ２タンパク質のレベルを低減すること、標的細胞のＳＶ２タンパク質のＢｏＮＴ／Ａ関連の細胞機能を阻害すること、又はＢｏＮＴ／Ａと標的細胞の細胞表面上に位置するＳＶ２タンパク質との間の結合を低減することによって、ＢｏＮＴ／Ａ毒性を低減することができる。ＢｏＮＴ／ＡとＳＶ２タンパク質との間の結合は、直接結合を妨げること、又は結合に利用可能なＳＶ２タンパク質の量を減少させることのいずれかによって低減することができる。
【００３３】
ＳＶ２タンパク質のレベル等の細胞タンパク質のレベルを低減することができる方法が多く存在する。本発明は、これに関して特定の方法に限定されない。例として、ＳＶ２タンパク質の細胞レベルは、アンチセンス技術を用いることによって低減することができる。例えば、ＳＶ２のｍＲＮＡの５’末端に向かって２０〜２５ｍｅｒのアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成することができる。ホスホロチオエート誘導体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端及び５’末端における最後の３塩基対に利用し、その半減期及び安定性を高めることができる。カチオン性リポソーム等のキャリアを利用して、アンチセンスオリゴヌクレオチドを輸送することができる。これに関して、オリゴヌクレオチドは、クロロホルム１ｍｌ中５：２の比で１−αジオレイルファチジルセルタノールアミンを臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウムと混合することによって調製されたカチオン性リポソームと混合する。溶媒は蒸発させ、脂質を生理食塩水１０ｍｌ中での超音波処理によって再懸濁させた。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる別の方法は、ベクターがＳＶ２のｍＲＮＡの翻訳を妨げるアンチセンスｃＲＮＡを生成することができるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドをベクターに組み込むことである。同様に、今まで哺乳類系に適用されているＲＮＡｉ技法も、ＳＶ２タンパク質の発現を阻害するのに適している（Zamore，Nat．Struct．Biol．8：746-750，2001を参照されたい（その全体が記載されるように参照により本明細書に援用される））。
【００３４】
ドミナントネガティブＳＶ２
別の態様において、本発明は、対応する野生型ＳＶ２を発現する細胞におけるＢｏＮＴ／Ａの影響を打ち消すことができるドミナントネガティブＳＶ２を同定することに関する。ドミナントネガティブＳＶ２は、突然変異を野生型ＳＶ２遺伝子に導入すること、同じ宿主細胞において突然変異型ＳＶ２及び野生型ＳＶ２を発現させること、及びＢｏＮＴ／Ａ毒性に関するパラメータ（これには、宿主細胞のＢｏＮＴ／Ａに対する感受性、新たに形成されたＳＶ２の宿主細胞膜への融合、ＢｏＮＴ／Ａとの野生型ＳＶ２の結合、及び細胞へのＢｏＮＴ／Ａの取り込みが含まれるが、これらに限定されない）に対する突然変異型ＳＶ２の影響を求めることによって同定することができる。宿主細胞で発現した野生型ＳＶ２は、内因性ＳＶ２又は宿主細胞に導入されたＳＶ２であり得る。同定された任意のドミナントネガティブＳＶ２が本発明の範囲内である。同定されたドミナントネガティブＳＶ２を用いて、ＢｏＮＴ／Ａの影響を打ち消すことができる。
【００３５】
ＢｏＮＴ／ＡとＳＶ２との間の結合を妨げること
ＢｏＮＴ／Ａ受容体としてのＳＶ２、及びＳＶ２におけるＢｏＮＴ／Ａ結合配列の同定は、当業者が、当該技術分野で利用可能な多くの戦略によって、ＢｏＮＴ／Ａとその受容体との間の結合を妨げることを可能にする。１つの戦略は、ＳＶ２におけるＢｏＮＴ／Ａ結合配列に特異的なモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の使用を伴う。このようなモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を生成することは十分に当業者の能力の範囲内である。このようにして生成された抗体は本発明の範囲内である。
【００３６】
別の戦略は、ＢｏＮＴ／Ａ結合に対する受容体と競合するＢｏＮＴ／Ａ結合ポリペプチド、好ましくは可溶性ＢｏＮＴ／Ａ結合ポリペプチドの使用を伴う。例えば、「ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞」の項で上記の本発明のＢｏＮＴ／Ａ結合ポリペプヂトは、この目的に利用することができる。利用することができる他のポリペプチドとしては、全長ＳＶ２タンパク質を含むポリペプチドと、ＳＶ２内腔ドメインから成るポリペプチドと、ＳＶ２内腔ドメインを含むポリペプチドであって、当該ドメインが非天然フランキングアミノ酸配列によって一端又は両端に隣接されるポリペプチドとが挙げられる。
【００３７】
動物（ヒト又は非ヒト）におけるＢｏＮＴ／Ａとその受容体との間の結合を妨げるために、同じ種及び異なる種の両方に由来のＢｏＮＴ／Ａ結合ポリペプチドを用いることができる。ポリペプチドは、ポリペプチドを直接投与すること又は動物においてポリペプチドを発現することができるベクターを投与することによって動物に導入することができる。
【００３８】
当業者は、置換、挿入及び欠失等の突然変異がＢｏＮＴ／Ａ結合活性を破壊することなく、ＳＶ２タンパク質のＢｏＮＴ／Ａ結合配列に導入することができることを理解している。幾つかの突然変異は結合活性さえも高めることができる。このような突然変異を含有するポリペプチドは、本発明の方法に用いることができる。このようなポリペプチドは、下記のスクリーニング方法を用いることによって同定することができる。
【００３９】
さらに、ガングリオシドが安定性のあるＢｏＮＴ／Ａ−ＳＶ２複合体の形成を促進し得るので、ＢｏＮＴ／ＡとＳＶ２タンパク質との間の結合は、ガングリオシドとＳＶ２タンパク質との間の結合を低減することによって、又はＳＶ２タンパク質との結合に利用可能なガングリオシドの量を減少させることによって低減し得る。関連の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ結合ポリペプチドが、ＢｏＮＴ／Ａとの複合体を形成することによってＢｏＮＴ／Ａ毒性を低減するのに用いられる場合、複合体の形成を容易にさせるガングリオシドが含まれ得る。
【００４０】
ＢｏＮＴ／ＡとＳＶ２との間の結合を妨げることができる薬剤の同定
ＢｏＮＴ／Ａ、及びＢｏＮＴ／Ａがポリペプチドと結合するのに好適な条件下でＳＶ２タンパク質のＢｏＮＴ／Ａ結合配列を含有するポリペプチドを利用することによって、ＢｏＮＴ／ＡとＳＶ２との間の結合を妨げることができる薬剤をスクリーニングすることができる。ガングリオシドは任意で反応混合物に含まれる。ＢｏＮＴ／Ａとポリペプチドとの間の結合は、試験薬剤の存在下で測定し、試験薬剤に曝されない対照の結合と比較することができる。試験群において対照よりも低い結合は、試験薬剤がＢｏＮＴ／ＡとＳＶ２タンパク質との間の結合を妨げることができることを示す。この方法で利用することができる他のＢｏＮＴ／Ａ結合ポリペプチドとしては、「ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞」の項で上記の本発明のポリペプチドが挙げられる。
【００４１】
当業者には、ＢｏＮＴ／ＡとＢｏＮＴ／Ａ結合ポリペプチドとの間の結合を評価する多くの系が良く知られている。これらの系のいずれもスクリーニング方法に用いることができる。実験条件の詳細は、当業者によって容易に決定することができる。例えば、上記のＢｏＮＴ／Ａとポリペプチドとの間の結合は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（無細胞系）で測定することができる。ＳＶ２タンパク質が発現し、細胞膜上で転座される細胞培養系も用いることができる。細胞培養系に関しては、ＢｏＮＴ／ＡとＳＶ２タンパク質との間の結合に加えて、ＢｏＮＴ／Ａの細胞侵入及び他のパラメータの値も、ＢｏＮＴ／ＡとＳＶ２との間の結合の指標として用いることができる。
【００４２】
タンパク質−タンパク質相互作用を測定する当業者に既知の任意の方法を用いて、ＢｏＮＴ／ＡとＢｏＮＴ／Ａ結合ポリペプチドとの間の結合を測定することができる。免疫共沈降及びアフィニティカラム単離の２つが一般的に用いられる方法である。
【００４３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は別の一般的に用いられる方法である。ＳＰＲは屈折率の変化を用いて、マイクロフローセル内の薄金チップ上に共有結合したリガンドとの高分子の結合及び解離を定量化する。この技法を用いて、多くの系におけるタンパク質−タンパク質相互作用（これには、ＰＡ６３のＥＦ及びＬＦとの相互作用（Elliott，J.L．et  al.，Biochemistry  39：6706-6713，2000）が含まれる）を研究している。この技法によって、高感度及び高い正確性、並びにリアルタイムで結合及び放出を観察する能力が与えられる。平衡解離定数（Ｋｄ）に加えて、結合速度定数及び解離速度定数(on-  and  off-rate  constants)（ｋａ及びｋｄ）も得ることができる。典型的に、研究されるタンパク質は、金チップと結合したカルボキシメチルデキストランマトリクスと共有結合的に連結される。固定化タンパク質とのタンパク質リガンドの結合がデキストラン／タンパク質層の屈折率の変化をもたらし、これはＳＰＲによって定量化される。ＢＩＡｃｏｒｅ２０００機器（Pharmacia  Biotech）をこれらの測定に用いることができる。
【００４４】
細胞培養系に関して、ＢｏＮＴ／Ａ結合ポリペプチドとのＢｏＮＴ／Ａの結合は、細胞を染色することによって評価することができ、この例は、以下の実施例の項で記載される。
【００４５】
ＳＶ２のＢｏＮＴ／Ａ結合配列と結合することができる薬剤の同定
ＳＶ２タンパク質のＢｏＮＴ／Ａ結合配列と結合することができる薬剤を用いて、ＢｏＮＴ／ＡとＳＶ２タンパク質との結合を妨げることができる。このような薬剤は、ＳＶ２タンパク質のＢｏＮＴ／Ａ結合配列を含有するポリペプチドを試験薬剤に与えること、及びこの薬剤がＢｏＮＴ／Ａ結合配列と結合するか否か求めることによって同定することができる。この方法に利用することができる他のＢｏＮＴ／Ａ結合ポリペプチドとしては、「ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞」の項で上記の本発明のポリペプチドが挙げられる。この方法によって同定された任意の薬剤は、細胞へのＢｏＮＴ／Ａ侵入を妨げる能力又はＢｏＮＴ／Ａ毒性を中和する能力に関してさらに試験することができる。当業者は、さらに試験するのに用いることができる好適な系を良く知っている。このような系の例は以下の実施例の項で与えられる。
【００４６】
当業者は、ポリペプチドと薬剤との間の結合を評価する当該技術分野における多くの系を良く知っている。これらの系のいずれかを本発明の方法に使用することができる。実験条件の詳細は当業者によって容易に決定することができる。例えば、ＳＶ２タンパク質のＢｏＮＴ／Ａ結合配列を含有するポリペプチドは好適な基質で与えられ、試験薬剤に曝すことができる。抗体と結合するポリペプチドの能力の喪失、又は薬剤が放射性標識、蛍光標識、又はそうでなければ他の方法で標識される場合のポリペプチドの標識化のいずれかによって、ポリペプチドとの薬剤の結合を検出することができる。別の例では、ＳＶ２タンパク質のＢｏＮＴ／Ａ結合配列を含有するポリペプチドは宿主細胞で発現することができ、それからこの細胞が試験薬剤に曝される。次に、例えば、免疫沈降又は電気泳動によってポリペプチドを単離することができ、ポリペプチドと薬剤との間の結合を測定することができる。上記のように、ポリペプチドと薬剤との間の結合を測定する１つの方法は、薬剤と結合するポリペプチドが結合時に標識されるように薬剤を標識することである。試験薬剤がポリペプチドである場合、上記のタンパク質／タンパク質結合を評価するのに特有の技法例も用いることができる。なお、スクリーニングアッセイに用いられるＳＶ２タンパク質のＢｏＮＴ／Ａ結合配列がフランキング配列を有する場合、薬剤がフランキング配列よりもむしろＢｏＮＴ／Ａ結合配列と結合することを確認する必要があり、これは当業者によって容易に達成することができる。
【００４７】
スクリーニングできる薬剤
上記のスクリーニング方法でスクリーニングされる薬剤は、例えばポリペプチド（例えば、ＳＶ２タンパク質の修飾ＢｏＮＴ／Ａ結合配列を含有するポリペプチド、又はＳＶ２タンパク質のＢｏＮＴ／Ａ結合配列に対するモノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体が含まれる）等の高分子量分子、多糖、脂質、核酸、低分子量の有機分子、又は低分子量の無機分子等であり得る。
【００４８】
スクリーニング用の薬剤のバッテリは、ペプチドライブラリを含む様々な化学ライブラリの形態で市販されている。このようなライブラリの例としては、ASINEX製のライブラリ（すなわち、２４０００個の自動的に合成された有機分子のＣｏｍｂｉｎｅｄ  Ｗｉｓｄｏｍライブラリ）及びCHEMBRIDGE  CORPORATION製のライブラリ（すなわち、５００００個の自動的に合成された化合物のＤＩＶＥＲＳｅｔ（商標）ライブラリ、２４０００個の自動的に合成された化合物のＳＣＲＥＥＮ−Ｓｅｔ（商標）ライブラリ、１１０００個の化合物のＣＮＳ−Ｓｅｔ（商標）ライブラリ、最大３０００００個の化合物のＣｈｅｒｒｙ−Ｐｉｃｋ（商標）ライブラリ）及び直鎖ライブラリ、多量体ライブラリ及び環状ライブラリ（Tecnogen（Italy））が挙げられる。所望の活性を有する薬剤が同定されたら、この薬剤の誘導体のライブラリは、より良好な分子に関してスクリーニングすることができる。ファージ提示法は、ＢｏＮＴ／ＡとＳＶ２との相互作用の新規の阻害因子の発見に好適なアプローチでもある。
【００４９】
ＢｏＮＴ／Ａ又はボツリヌス菌を検出する方法
別の態様において、本発明は、ＢｏＮＴ／Ａ又はボツリヌス菌を検出する方法に関する。この方法は、ＳＶ２タンパク質のＢｏＮＴ／Ａ結合配列を有するポリペプチドを含有する薬剤に、ＢｏＮＴ／Ａを含有する疑いのあるサンプルを曝すこと、及びＢｏＮＴ／Ａとのポリペプチドの結合を検出することを伴う。この方法に利用することができる他のＢｏＮＴ／Ａ結合ポリペプチドとしては、「ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞」の項で上記の本発明のポリペプチドが挙げられる。
【００５０】
ＢｏＮＴ／Ａと結合することができるポリペプチドを同定する方法
別の態様において、本発明は、ＢｏＮＴ／Ａと結合することができるポリペプチドを同定する方法に関する。この方法は、ＳＶ２タンパク質のＢｏＮＴ／Ａ結合配列を含むポリペプチドを提供すること、ＢｏＮＴ／Ａ結合配列においてポリペプチドを修飾すること、及び修飾ポリペプチドがＢｏＮＴ／Ａと結合することができるか否かを求めることを伴う。
【００５１】
キット
本明細書に記載の本発明の任意の製品は、当業者の理解に合わせて、キットの形態（例えば、診断キット、予防キット、又は治療キット）で１つ又は複数の他の試薬又は緩衝液等と組み合わせてもよい。
【００５２】
本発明は、以下の非限定的な例を考慮してより完全に理解される。
【実施例】
【００５３】
本実施例において、本発明者らは、ＢｏＮＴ／Ａが３つのＳＶ２アイソフォーム（ＳＶ２Ａ、ＳＶ２Ｂ、及びＳＶ２Ｃ）全てと結合することを示している。ラットのＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６２、５２９〜５６６、及び４５４〜５４６等の特定の結合断片も同定された。組み換えＳＶ２断片が、海馬ニューロン及び運動性神経末端とのＢｏＮＴ／Ａ結合を阻害する。重要なことに、海馬ニューロンとのＢｏＮＴ／Ａ結合は、ＳＶ２Ａ／Ｂノックアウトマウスで破壊され、ＳＶ２をニューロンにトランスフェクトすることによって元に戻すことができる。常に、ＳＶ２ノックアウトマウスの横隔膜の運動性神経末端においてＢｏＮＴ／Ａ結合は低減され、ＳＶ２Ｂノックアウトマウスは、ＢｏＮＴ／Ａに対する感受性の低減を示した。これらのデータによって、ＢｏＮＴ／Ａに対するタンパク質受容体としてＳＶ２が確定し、これはシナプス小胞の再生によって毒素侵入を介在する。
【００５４】
材料及び方法
材料、抗体及びＳＶ２ノックアウトマウス株：Ａｌｅｘａ４８８結合α−ＢＴＸはMolecular  Probes，Inc.（OR）から購入した。ＢｏＮＴ／Ａで切断させた後にＳＮＡＰ−２５を認識するｍＡｂ（抗ＳＮＡＰ−２５−Ｃ）は、Research＆Diagnostic  Antibodies，Inc.（CA）から購入した。ＳＶ２（汎ＳＶ２（pan-SV2））、Ｓｙｐ（Ｃｌ  ７．２）、Ｓｙｂ  ＩＩ（Ｃｌ  ６９．１）及びＳｙｔ  Ｉ（Ｓｙｔ  ＩN  Ａｂ、Ｃｌ  ６０４．４）に対するｍＡｂがR．Jahn（マックスプランク生物物理化学研究所(Max-Planck-Institute  for  Biophysical  Chemistry)，Gottingen，Germany）で広く与えられた。ＢｏＮＴ／Ａに対するヒトの抗体（ＲＡＺ−１）は、J．Marks（カルフォルニア大学サンフランシスコ校(University  of  California  -  San  Francisco)，CA）で広く与えられた。Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５４６及びＡｌｅｘａ６４７と結合した二次抗体は、Jackson  Laboratories（ME）及びMolecular  Probes，Incから購入した。ウサギの抗ＢｏＮＴ／Ａ、抗ＢｏＮＴ／Ｂ及び抗ＢｏＮＴ／Ｅポリクローナル抗体並びに抗ＳＶ２Ａ、抗ＳＶ２Ｂ及び抗ＳＶ２Ｃ抗体がDong  M  et  al.，J．Cell．Biol．162：1293-1303，2003、及びJanz  R  and  Sudhof  TC，Neuroscience  94：1279-1290，1999（両方がその全体において参照により本明細書に援用される）で記載されていた。ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ及びＢｏＮＴ／Ｅは、Malizio  CG，Methods  and  Protocols，O．Holst，ed．(Humana  Press)，pp.27-39，2000（その全体において参照により援用される）で記載されるように精製した。ウシの脳のガングリオシド混合物は、Matreya  LLC（PA）から購入した。この研究で用いられたＳＶ２ノックアウトマウス株は、Janz  R  et  al.，Neuron  24：1003-1016，1999（その全体において参照により援用される）で記載されていた。マウスは、Janz  R  et  al.，supra，1999で記載されるようにＰＣＲで遺伝子型を決定した。
【００５５】
ｃＤＮＡ、構築及びトランスフェクション：ラットのＳＶ２Ａ、ＳＶ２Ｂ及びＳＶ２ＣのｃＤＮＡは、Bajjalieh  SM  et  al．Science  257：1271-3，1992、Feany  MB  et  al．Cell  70：861-7，1992、Bajjalieh  SM  et  al．Proc  Natl  Acad  Sci  USA  90：2150-4，1993、及びJanz  R＆Sudhof  TC  Neuroscience  94：1279-90，1999（全てその全体において参照により本明細書に援用される）に記載されていた。様々なＳＶ２内腔ドメイン断片がＰＣＲによって生成され、ｐＧＥＸ−２Ｔにサブクローニングされ、ＧＳＴ融合タンパク質として精製された（Lewis  JL  et  al．J  Biol  Chem  276：15458-65，2001）。また、ＧＳＴ及びＧＳＴで標識したＳＶ２Ｃ−Ｌ４タンパク質は、製造業者のプロトコル（Promega，WI）に従って磁性ＧＳＴビーズを用いて精製し、４０ｍＭのグルタチオン（Sigma）で溶出し、その後透析し、高濃度の可溶性タンパク質を生成した。
【００５６】
ＳＶ２アイソフォームを海馬ニューロンにトランスフェクトするために、全長ＳＶ２Ａ、ＳＶ２Ｂ及びＳＶ２ＣをＬｏｘ−Ｓｙｎ−Ｓｙｎレンチウイルスベクターにサブクローニングした（P．Scheiffele，Columbia  University，NYにより与えられる）。このベクターは、ｐＦＵＧＷの修正版であり（Lois  C  et  al.，Science  295：868-872，2002）、別個のニューロン特異的な（シナプシン）プロモータを含有する。１つのプロモータがＢａｍＨＩ部位とＮｏｔＩ部位との間に挿入されるＳＶ２アイソフォームの発現を制御し、他のプロモータがＥＧＦＰの発現を制御し、トランスフェクト細胞を検出する。Dean  C  et  al.，Nat．Neurosci．6：708-716，2003（その全体において参照により援用される）に記載のようにリポフェクタミン２０００（Invitrogen）を用いて７〜１０ＤＩＶのニューロンでトランスフェクトを行い、４８時間後に分析した。備考：ＳＶ２Ｃ配列内のＢａｍＨＩ部位は、単純にサブクローニングするのに突然変異している（アミノ酸配列を保存するＧＧＡＴＣＣからＧＧＡＴＡＣへの突然変異）。
【００５７】
ニューロン細胞培養、ＢｏＮＴ取り込み、免疫細胞化学：海馬ニューロンの培養物は、Ｅ１８〜Ｅ１９のラットから調製され、ＳＶ２ノックアウトマウスのニューロン培養物がＰ１マウスから調製された。ニューロンは、５００００／ｃｍ2の密度でポリ−Ｄ−リジンでコートされたカバーガラス片（１２ｍｍ）上で平板培養され、Ｂ−２７（２％）及びＧｌｕｔａｍａｘ（２ｍＭ）で添加されたニューロベイサル（Neurobasal）培地で培養した。実験は１０〜１４日齢のニューロンで行った。
【００５８】
異なる条件下でＢｏＮＴ／Ａの取り込みに関して評価するために（図１ｂ）、海馬ニューロンを１分間、ＢｏＮＴ／Ａ（１０ｎＭ）及びＳｙｔ  ＩN  Ａｂ（６０４．４、１：４０）を含有する以下のアッセイ緩衝液の１つ（２００μｌ）でインキュベートした。これらの緩衝液は、対照緩衝液（ＰＢＳ：１４０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、８ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１ｍＭのＣａＣｌ2、０．５ｍＭのＭｇＣｌ2）、高Ｋ+緩衝液（対照緩衝液と同じだが、５６ｍＭのＫＣｌ及び８７ｍＭのＮａＣｌに調整する）、及び高Ｋ+／無Ｃａ2+緩衝液（高Ｋ+緩衝液と同じだが、ＣａＣｌ2を欠いている）である。それからニューロンをＰＢＳで洗浄し（３×５００μｌ）、４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。０．３％トリトンＸ−１００での浸透後、ニューロンは、１０％ヤギ血清で遮断され、室温で１時間、抗ＢｏＮＴ／Ａポリクローナル抗体（１：２００）で染色した。二次抗体は、Ｃｙ２結合ヤギ抗マウス及びＣｙ３結合ヤギ抗ウサギであった。共焦点顕微鏡（Olympus  ＦＶ１０００、６０Ｘ浸水対物レンズ）を用いて、免疫蛍光画像が得られた。同一のゲイン（Identical  gain）及びレーザーの設定は、図で直接比較した画像に用いた。図１ｂ後の海馬ニューロンを用いる全ての実験に関して、毒素侵入量を増加させるために、ニューロンを１０分間高Ｋ+緩衝液でインキュベートした。
【００５９】
ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ及びＳＶ２の三重染色に関して（図４ｂ）、ＢｏＮＴ／Ｂをウサギのポリクローナル抗体（１：２００）及びＣｙ２結合二次抗体で検出し、ＢｏＮＴ／Ａをヒトの抗体（ＲＡＺ−１、１：３００）及びＡｌｅｘａ−５４６結合二次抗体で検出して、ＳＶ２発現をマウスのモノクローナル抗体（汎ＳＶ２  Ａｂ、１：４００）及びＡｌｅｘａ−６４７結合二次抗体で検出した。
【００６０】
ＢｏＮＴ／Ａで切断しているＳＮＡＰ−２５を検出するために（図３ｂ）、ニューロンをＢｏＮＴ／Ａに曝した後３回洗浄し、６時間培養培地でさらにインキュベートした。それから細胞を固定し、浸透させ、抗ＳＮＡＰ−２５−Ｃモノクローナル抗体（１：５０）及びウサギの抗ＢｏＮＴ／Ａ抗体で染色した。
【００６１】
ＩｍａｇｅＪソフトウェア（NIH）を用いて、図４に示される蛍光強度を定量化した。要するに、初めにそれぞれのチャネル（ＢｏＮＴ／Ｂ及びＢｏＮＴ／Ａ）に関して固定した閾値が選択され、ニューロンを欠いている領域からバックグラウンドシグナルを排除して、装飾ニューロン由来の蛍光シグナルの平均強度を測定した。ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂに曝されなかったニューロンを固定し、同じ抗体で同時に染色した。毒素で処理したサンプルからこれらの画像の平均強度を差し引いた。両側ｔ検定を用いて、統計的有意性を求めた。
【００６２】
免疫共沈降及びプルダウンアッセイ：ラット又はマウスの脳の界面活性剤抽出物は、Lewis  JL  et  al.，J．Biol．Chem．276：15458-15465，2001（その全体において参照により援用される）で記載されるように構成された。４℃で１時間、脳の抽出物（４００μｌ、３〜６ｍｇ／ｍｌ）と予混合した後、抗体（５μｌ）を加え、それから１時間さらにインキュベートした。プロテインＧ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗビーズ（４０μｌ、Amersham  Biosciences）を加え、１時間インキュベートした。０．５％トリトンＸ−１００に加えて、ＴＢＳ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４））中で３回ビーズを洗浄した。結合物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析にかけた。
【００６３】
組み換えＧＳＴ融合タンパク質を精製し、グルタチオン−セファロースビースで固定化した。０．５％トリトンＸ−１００に加えて、ＴＢＳ１００μｌ中で固定化タンパク質８μｇ及び１００ｎＭの毒素を用いて、Dong  M  et  al.（supra，2003）に記載のようにプルダウンアッセイを行った。結合物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析にかけた。
【００６４】
マウスの片側横隔膜実験：マウスの片側横隔膜を対照緩衝液（図１ａ、哺乳類のリンガー液（ｍＭ）：ＮａＣｌ  １３８．８、ＫＣｌ  ４、ＮａＨＣＯ3  １２、ＫＨ2ＰＯ4  １、ＭｇＣｌ2  ２２、ＣａＣｌ2  ２、及びグルコース  １１）、又は高Ｋ+緩衝液（対照緩衝液と同じだが、９８ｍＭのＮａＣｌ及び４５ｍＭのＫＣｌに調整する）で維持し、３７℃まで温め、９５％Ｏ2／５％ＣＯ2に空気調節した(gased)。片側横隔膜を室温で１時間、指示されたＢｏＮＴ（２５ｎＭ）とインキュベートした（備考：１０ｎＭのＢｏＮＴ／Ａを用い、図３ｃで３０分間だけインキュベートした）。インキュベート後に、横隔膜を洗浄し、室温で３０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定して、浸透させ、０．５％トリトンＸ−１００に加えて、５％ヤギ血清において遮断した。４℃で一晩、横隔膜をＡｌｅｘａ−４８８結合α−ＢＴＸ（１：２５０）及びウサギ抗ＢｏＮＴ／Ａ抗体又は抗ＢｏＮＴ／Ｂ抗体（１：１０００）とインキュベートした。Ｃｙ３結合抗ウサギ二次抗体を１：８００の希釈で用いた。ＮＭＪにおいてＳＶ２Ａ、ＳＶ２Ｂ又はＳＶ２Ｃを染色するために（図８）、片側横隔膜を切除し、直ぐに固定した。１：１０００の希釈の特異的なウサギ抗ＳＶ２Ａ、抗ＳＶ２Ｂ又は抗ＳＶ２Ｃ抗体を用いた。共焦点顕微鏡（Olympus  ＦＶ１０００、６０Ｘ浸水対物レンズ）を用いて、全ての画像を収集した。
【００６５】
蛍光シグナルを定量化するために、α−ＢＴＸチャネルは偽着色した緑色であり、ＢｏＮＴ／Ａ（又はＢｏＮＴ／Ｂ）チャネルは偽着色した赤色であった。組み合わせた緑色画像及び赤色画像をＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（Improvision）に導入した。α−ＢＴＸ緑色チャネルを閾値化することによって、ＮＭＪをマーキングする対象の領域（ＲＯＩ）を求めた。横隔膜実験を通して同じ閾値を用いた。ＲＯＩ内の緑色チャネル及び赤色チャネルの平均強度を測定し、それらの間の比を用いて、毒素結合のレベルを求めた。両側ｔ検定を用いて、対となるデータセット間の統計的有意性を求めた。
【００６６】
マウスにおける迅速なＢｏＮＴ毒素アッセイ：Boroff  DA  and  Fleck  U，J．Bacteriol．92：1580-1581，1966（その全体において参照により援用される）、Dong  M  et  al.，supra，2003、及びMalizio  CG，supra，2000に記載された点適法を用いて、マウスにおいてＢｏＮＴ／Ａの効果的な毒素を推測した。要するに、Ｈａｌｌ株から単離されたＢｏＮＴ／Ａ（Ａ１型）を３０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（０．２％ゼラチンを加えてｐＨ６．３）において１０μｇ／ｍｌに希釈した。０．１ｍｌの希釈毒素をそれぞれのマウスに静脈注射し（外側尾静脈）、その時間対致死を記録した。Malizio  CG，supra，2000に記載された標準曲線を用いて、時間対致死の値を腹腔内のＬＤ50／ｍｌに変換した。これらの実験で用いたＳＶ２Ｂノックアウトマウスは、Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊのマウスと６世代にわたって交雑されている。
【００６７】
結果
ＢｏＮＴ／Ａ受容体がシナプス小胞上に存在する：ＢｏＮＴ／Ａに対する生理学的標的は末梢運動性神経末端である（Dolly  JO  et  al.，Nature  307：457-460，1984）。ニューロンの活動の刺激（すなわち、神経伝達物質放出）がＢｏＮＴ／Ａによって引き起こされる麻痺の速度を加速させる可能性がある（Hughes  RW，J．Physiol（Lond.）160：221-233，1962）。しかし、シナプス小胞のエキソサイトーシスがＢｏＮＴ／Ａ結合及びニューロンへの侵入を直接増大させるか否かは知られていない。この問題に対処するために、本発明者らはマウスの横隔膜標本における運動性神経末端とのＢｏＮＴ／Ａ結合を視覚化させた。この組織の神経筋接合部（ＮＭＪ）を、シナプス後アセチルコリン受容体と結合するα−ブンガロトキシン（α−ＢＴＸ）で標識した（Astrow  SH  et  al.，J．Neurosci．12：1602-1615，1992）。図１ａで示されるように、シナプス小胞のエキソサイトーシスを誘起する高Ｋ+溶液（４５ｍＭのＫＣｌ）が、対照条件と比べて約６倍までＮＭＪとのＢｏＮＴ／Ａ結合を増大させ、このことはシナプス小胞のエキソサイトーシスがＢｏＮＴ／Ａ受容体を曝すことを示していた。
【００６８】
ＢｏＮＴ／Ａ受容体がシナプス小胞上にあるか否かをさらに分析するために、本発明者らは、モデル系として培養したラットの海馬ニューロンを用いた。シナプス小胞の再生は、豊富なシナプス小胞膜タンパク質であるシナプトタグミンＩ（Ｓｙｔ  ＩN  Ａｂ）の内腔ドメインを認識する抗体の取り込みによってモニタリングされた（Dong  M  et  al.，J．Cell．Biol．162：1293-1303，2003）。図１ｂで示されるように、Ｓｙｔ  ＩN  Ａｂの取り込みは、高Ｋ+による短い刺激（５６ｍＭのＫＣｌ、１分）で大きく増大し、細胞外Ｃａ2+の減少によって阻害された。興味深いことに、ＢｏＮＴ／Ａの同じニューロンへの取り込みは、Ｓｙｔ  ＩN  Ａｂの挙動を模倣しており、Ｓｙｔ  ＩN  Ａｂシグナルと広く共局在化する（図１ｂ）。さらにこの所見を確認するために、本発明者らは、エキソサイトーシスに必要なシナプス小胞膜タンパク質であるＳｙｂ  ＩＩを切断することによって、シナプス小胞のエキソサイトーシスを特異的に妨げるＢｏＮＴ／Ｂでこれらのニューロンを前処理した（Schiavo  G  et  al.，Nature  359：832-835，1992）。図１ｃで示されるように、ＢｏＮＴ／Ｂ処理は、刺激条件下でＢｏＮＴ／Ａの取り込みを止め、このことはＢｏＮＴ／Ａ受容体が、ニューロンでＳｙｂ  ＩＩを含有する小胞に存在することを示していた。同時に、これらの証拠によって、ＢｏＮＴ／Ａに対する受容体がシナプス小胞に存在することが示唆されている。
【００６９】
ＢｏＮＴ／ＡがＳＶ２の内腔ドメインに結合する：シナプス小胞は十分に研究された細胞小器官であり、全てではないがほとんどの内在性シナプス小胞タンパク質が同定されている（Fernandez-Chacon  R  and  Sudhof  TC  Ann．Rev．Physiol．61：753-776，1999）。本発明者らは、これらの特異的な抗体を用いてラットの脳の界面活性剤抽出物由来のＢｏＮＴ／Ａを免疫共沈降することによって、ＢｏＮＴ／Ａ相互作用に対する既知のシナプス小胞膜タンパク質をスクリーニングした。図２ａで示されるように、ＳＶ２モノクローナル抗体（汎ＳＶ２）がＢｏＮＴ／Ａを免疫沈降することができた。別の豊富な小胞タンパク質であるシナプトフィジン（Ｓｙｐ）に対する抗体が相当量のＢｏＮＴ／Ａを削減することはできないので、この相互作用は特異的である（図２ａ）。
【００７０】
次に本発明者らは、ＢｏＮＴ／Ａ−ＳＶ２相互作用がガングリオシドの影響を受けるか否かを評価した。本発明者らは、外因性ガングリオシドを加えることによって、脳の界面活性剤抽出物においてガングリオシド濃度を増大させた。様々なＢｏＮＴ／Ａ濃度で免疫沈降を行った。図２ｂで示されるように、外因性ガングリオシドを加えることによって、ＢｏＮＴ／Ａの免疫共沈降のレベルが増大した。この効果は高いＢｏＮＴ／Ａ濃度（１００ｎＭ）では有意ではなかったが、低い毒素濃度（例えば、２０ｎＭ）ではより明らかになり、このことはガングリオシドが低い毒素濃度で安定したＢｏＮＴ／Ａ−ＳＶ２複合体の形成を促進し得ることを示していた。
【００７１】
ＳＶ２は、脊椎動物におけるシナプス小胞及び内分泌小胞上で保存された膜タンパク質である（Buckley  K  and  Kelly  RB，J．Cell．Biol．100：1284-1294，1985、Lowe  AW  et  al.，J  Cell．Biol．106：51-59，1988）。ＳＶ２Ａ、ＳＶ２Ｂ及びＳＶ２Ｃと呼ばれる３つの相同性の高いアイソフォームが同定されている（Bajjalieh  SM  et  al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA  90：2150-2154，1993、Bajjalieh  SM  et  al.，Science  257：1271-1273，1992、Feany  MB  et  al.，Cell  70：861-867，1992、Janz  R  and  Sudhof  TC，Neuroscience  94：1279-1290，1999）。ＳＶ２Ａ及びＳＶ２Ｂは脳全体で広く発現されるが、ＳＶ２Ｃの発現は進化的に古い脳領域であればあるほどより制限される（Bajjalieh  SM  et  al.，J．Neurosci．14：5223-5235，1994、Janz  R  and  Sudhof  TC，supra，1999）。図２ａで用いた抗体は、３つのアイソフォーム全てを認識する（Lowe  AW  et  al.，supra，1988）。図２ｄで示されるように、ＳＶ２アイソフォームは同様のトポロジーを共有し、１２個の推定膜貫通ドメインとわずか１つの比較的大きな内腔ドメイン（内腔ドメイン４、Ｌ４)とを含有する（Janz  R  and  Sudhof  TC，supra，1999）。ＳＶ２の内腔ドメインだけが、小胞のエキソサイトーシス後に細胞の外側に曝された領域であるので、初めに本発明者らはＢｏＮＴ／Ａ結合がＳＶ２内腔ドメインで介在されるか否かを試験した。ＳＶ２Ａ、ＳＶ２Ｂ及びＳＶ２Ｃの主な内腔ドメイン（Ｌ４）をＧＳＴ融合タンパク質として精製し、ビーズ上で固定化して、溶液からＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ及びＢｏＮＴ／Ｅを取り除くこれらの能力を試験した。図２ｃで示されるように、本発明者らは、ＢｏＮＴ／Ｂ又はＢｏＮＴ／Ｅではなく、ＢｏＮＴ／Ａの全てのＳＶ２アイソフォームとの直接結合を観察した。ＳＶ２Ｃは、最も堅固な結合を示し、ＳＶ２Ｂは、最小量のＢｏＮＴ／Ａしか削減しなかった。
【００７２】
有意な（critical）ＢｏＮＴ／Ａ結合領域を決定するために、本発明者らはＳＶ２Ｃ−Ｌ４領域内で一連の切断変異体を作製した。図２ｅで示されるように、短い断片（アミノ酸５２９〜５６６）は、全Ｌ４領域に対するＢｏＮＴ／Ａレベルを同程度まで削減することができた。配列アラインメントは、図２ｄにおいて矢印で示されるこの領域がＳＶ２アイソフォーム間で比較的保存され、２つの推定Ｎ−グリコシル化部位を含むことを示していた。より短い断片（アミノ酸５２９〜５６２）も、５２９〜５６６断片ほど効果的ではないが、ＢｏＮＴ／Ａを削減することができることがさらに観察された。さらに、アミノ酸４５４〜５４６を含有する様々な断片もＢｏＮＴ／Ａを削減することができた。
【００７３】
ＳＶ２Ｃ内腔断片がニューロンとのＢｏＮＴ／Ａ結合を阻害する：３つのＳＶ２アイソフォーム間で、ＳＶ２Ｃではなく、ＳＶ２Ａ及びＳＶ２Ｂを発現する海馬ニューロンが発見された（Bajjalieh  SM  et  al.，supra，1994、Janz  R  and  Sudhof  TC，supra，1999）。ＳＶ２がこれらのニューロンにおいてＢｏＮＴ／Ａ結合を介在するか否かを求めるために、本発明者らは、ＢｏＮＴ／Ａに対して明らかに最も高いアフィニティを示した可溶性組み換えＳＶ２Ｃ−Ｌ４断片を用い、内因性ＳＶ２Ａ／Ｂと競合させることによって、ニューロンとのＢｏＮＴ／Ａ結合を阻害した。ニューロンは、過剰量の対照タンパク質（ＧＳＴ）又はＧＳＴ標識ＳＶ２Ｃ−Ｌ４断片のいずれかの存在下で１０分間、ＢｏＮＴ／Ａ及びＳｙｔ  ＩN  Ａｂに曝された。図３ａで示されるように、ＳＶ２Ｃ−Ｌ４が、ＧＳＴに比べて、ニューロンとのＢｏＮＴ／Ａ結合を低減した。両方の条件でのニューロンは、同程度のレベルのＳｙｔ  ＩN  Ａｂの取り込みを示し、このことによって、ＢｏＮＴ／Ａ結合の低減がシナプス小胞の再生の非特異的な変化によるものではないことが示された。
【００７４】
この阻害の特異性をさらに実証するために、本発明者らは平行して、別のＢｏＮＴであるＢｏＮＴ／Ｂを試験し、シナプス小胞タンパク質シナプトタグミンＩ／ＩＩを細胞に侵入するのに用いることが示された（Dong  M  et  al.，supra，2003、Nishiki  T  et  al.，J．Biol．Chem．269：10498-10503，1994、Nishiki  T  et  al.，Biochim．Biophys．Acta  1158：333-338，1993）。ＢｏＮＴ／Ｂは、ＢｏＮＴ／Ａと同様の構造及び大きさを有しており、同じ侵入経路を用いるので理想的な対照である。図３ａ（右側のパネル）で示されるように、ＳＶ２Ｃ−Ｌ４は、ニューロンとのＢｏＮＴ／Ｂ結合に影響を与えなかった。さらに、ＢｏＮＴ／Ｂの結合は、その受容体、シナプトタグミンＩＩ（Ｓｙｔ  ＩＩ）に由来するペプチド（Ｐ２１）を加えることによって阻害することができ（Dong  M  et  al.，supra，2003）、このペプチドの添加は、ＢｏＮＴ／Ａ結合に影響を与えなかった（図７ａ及び図７ｂ）。興味深いことに、ＳＶ２Ｃ−Ｌ４は、別の主なＢｏＮＴであるＢｏＮＴ／Ｅの結合にも影響を与えず、このことによって、ＢｏＮＴ／Ｅはニューロンに侵入するのにＳＶ２を用いないことが示唆された（図７ｃ）。
【００７５】
本発明者らは、ＳＶ２Ｃ−Ｌ４の添加によるＢｏＮＴ／Ａ結合の低減が、内因性ＳＮＡＰ−２５の防御に相関があるか否かをさらに評価した。分化した抗体である、ＢｏＮＴ／Ａで切断されたＳＮＡＰ−２５断片のみを認識する抗ＳＮＡＰ−２５−Ｃ（図３ｂ）を利用して、本発明者らは免疫染色によって、断片の切断レベルをモニタリングした。初めにＧＳＴ又はＳＶ２Ｃ−Ｌ４のいずれかの存在下で１０分間、ニューロンをＢｏＮＴ／Ａで処理した。これらのニューロンを洗浄し、６時間さらにインキュベートして、固定させ、切断されたＳＮＡＰ−２５断片に関して免疫染色を行った。図３ｂで示されるように、ＳＶ２Ｃ−Ｌ４の添加によるＢｏＮＴ／Ａ結合の低減によって、ＳＮＡＰ−２５の切断レベルが低減し、このことは、ＳＶ２Ｃ−Ｌ４がＢｏＮＴ／Ａのニューロンへの機能的な侵入を抑えたことを示していた。
【００７６】
本発明者らは、この研究を、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＢｏＮＴ／Ａの生理学的標的である末梢運動性神経末端にまで広げた。ＳＶ２アイソフォームに特異的な抗体を用いて、本発明者らは、横隔膜中のＮＭＪにおける運動性神経末端が３つのＳＶ２アイソフォーム全てを発現することを見出した（図８）。ＢｏＮＴ／Ａの高濃度のＳＶ２Ｃ−Ｌ４断片（３０μＭ）との前インキュベーションが、ＮＭＪとのＢｏＮＴ／Ａ結合を有意に低減させた（対照と比べて６５％の低減、Ｐ＜０.０００１、ｔ検定）（図３ｃ及び図３ｄ）。ＳＶ２Ｃ−Ｌ４はＢｏＮＴ／Ｂ結合に影響を与えなかったので、この低減はＢｏＮＴ／Ａに特異的である（図３ｃ及び図３ｄ）。これらのデータは、運動性神経末端とのＢｏＮＴ／Ａの結合が、ＳＶ２内腔ドメインとの直接的な相互作用によって介在されることを示唆している。
【００７７】
ＢｏＮＴ／Ａ結合は、ＳＶ２Ａ／Ｂノックアウトニューロンにおいて破壊される：ＳＶ２がＢｏＮＴ／Ａに対する受容体であるか否かを確実に求めるために、本発明者らは、利用可能なＳＶ２Ａシングルノックアウトマウス及びＳＶ２Ｂシングルノックアウトマウス並びにＳＶ２Ａ／Ｂダブルノックアウトマウスに注目した（Janz  R  et  al.，Ann．NY  Acad．Sci．733：345-255，1999）。ＳＶ２Ａを欠いている（ＳＶ２Ａシングルノックアウト及びＳＶ２Ａ／Ｂダブルノックアウト）マウスは重大な発作を示し、生後２〜３週間で死に至るが、ＳＶ２Ｂシングルノックアウトマウスは正常である。これらの現象は、ＳＶ２ＡがＳＶ２Ｂよりも広く分布し、これらの２つのアイソフォームが機能的に不必要なものであるために起こり得る（Janz  R  et  al.，supra，1999）。ＳＶ２Ａ／Ｂノックアウトマウス由来の培養された海馬ニューロンは通常のシナプス構造を発達させ、神経伝達物質を放出することができる（Janz  R  et  al.，supra，1999）。これらのニューロンはＳＶ２Ａ及びＳＶ２Ｂを発現するだけであるので、ＳＶ２Ａ／Ｂダブルノックアウトマウス由来のニューロンは、ＢｏＮＴ／Ａ結合に対するＳＶ２の役割を研究するのに理想的な機能消失モデルとなる。
【００７８】
初めに本発明者らは、ＳＶ２Ｂノックアウトウ（ＳＶ２Ｂ（−／−））マウス及び野生型同腹子対照（ＷＴ）由来のニューロンとのＢｏＮＴ／Ａ結合を比較することによって、ＳＶ２Ｂの機能を試験した。高Ｋ+緩衝液で１０分間、ニューロンをＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂに同時に曝し、洗浄して固定させた。ニューロンとのＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂの結合は、免疫蛍光強度を測定することによって定量化した（詳細に関しては方法を参照のこと）。正規化した平均強度（％ＷＴ）は図４ａで示されている。ＳＶ２ＢノックアウトニューロンがＢｏＮＴ／Ａ結合の有意な低減（ＷＴに比べて２８％の低減、Ｐ＜０．０００１、ｔ検定）を示したが、ＢｏＮＴ／Ｂ結合は同じままであった。これらのデータは、ＳＶ２Ｂの消失が毒素侵入経路、すなわちシナプス小胞の再生よりもむしろ、一般的にはＢｏＮＴ／Ａが結合する表面結合部位の特異的な低減に影響を与えるということを支持している。
【００７９】
ＳＶ２Ｂ（−／−）ニューロンはＳＶ２Ａを発現するままであるので、本発明者らは、ＢｏＮＴ／Ａの結合の維持がＳＶ２Ａによって介在されるか否かを調べた。ＳＶ２Ａ（＋／−）ＳＶ２Ｂ（−／−）マウスを交雑することによって、本発明者らは、ＳＶ２Ｂを有しないが、野生型レベルのＳＶ２Ａを有する同腹子（ＳＶ２Ａ（＋／＋）ＳＶ２Ｂ（−／−））、ＳＶ２Ｂを有さず、半分のレベルのＳＶ２Ａを有する同腹子（ＳＶ２Ａ（＋／−）ＳＶ２Ｂ（−／−））、及びＳＶ２Ａ／Ｂダブルノックアウト同腹子（ＳＶ２Ａ（−／−）ＳＶ２Ｂ（−／−））を発生させた（図４ｂ）。これらの同腹子から培養したニューロンをＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂに曝し、洗浄して固定させた。ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ及びＳＶ２の三重の免疫染色を行い、それぞれの遺伝子型の代表的な画像を図４ｂに示す。免疫蛍光強度の定量によって、ＳＶ２Ａ（＋／−）ＳＶ２Ｂ（−／−）ニューロンとのＢｏＮＴ／Ａ結合が、ＳＶ２Ａ（＋／＋）ＳＶ２Ｂ（−／−）ニューロンのわずか４７％であることが示された（図４ｃ）。興味深いことに、ＳＶ２Ａ（＋／−）ＳＶ２Ｂ（−／−）ニューロンにおけるＢｏＮＴ／Ａ結合の大部分がＳＶ２Ａ発現と共局在化していた（図４ｂの真ん中のフレーム）。顕著なことに、ＳＶ２Ａ／ＢダブルノックアウトニューロンとのＢｏＮＴ／Ａの結合は実質的に全くない（図４ｂ及び図４ｃ）。それぞれの遺伝子型に対するＢｏＮＴ／Ｂ結合が同じままであったので、結合におけるこれらの変化はＢｏＮＴ／Ａに特異的である（図４ｂ及び図４ｃ）。このことによって、ＳＶＡ／Ｂノックアウトが、他の侵入経路の障害を引き起こす代わりに、ＢｏＮＴ／Ａ認識部位を特異的に破壊したことが示される。ＳＶ２Ｃ内腔断片がＢｏＮＴ／Ａ結合を阻害することができたという事実と共に、本発明者らは、海馬ニューロンとのＢｏＮＴ／Ａ結合がＳＶ２Ａ及びＳＶ２Ｂとの直接的な相互作用によって介在されることを実証している。
【００８０】
ＳＶ２の発現は、ＳＶ２Ａ／ＢノックアウトニューロンとのＢｏＮＴ／Ａ結合を元に戻す：ＳＶ２Ａ／Ｂダブルノックアウトマウス由来の海馬ニューロンを用いて、本発明者らは補助研究（rescue  studies）を行い、ＳＶ２Ａ、ＳＶ２Ｂ又はＳＶ２Ｃの発現がＢｏＮＴ／Ａ結合を元に戻すことができるか否かを求めた。ラットのＳＶ２Ａ、ＳＶ２Ｂ又はＳＶ２Ｃは、別々のニューロン特異的プロモータ（シナプスプロモータ、方法で詳述される）下でＳＶ２及びＧＦＰを同時に発現することができるレンチウイルスベクターを用いて、これらのニューロンにトランスフェクトした。トランスフェクトの４８時間後、ニューロンを１０分間ＢｏＮＴ／Ａに曝し、洗浄して、ＢｏＮＴ／Ａの結合を免疫染色で評価した。トランスフェクトニューロンをＧＦＰ蛍光シグナルで同定し、これらのニューロンにおけるＳＶ２の発現を免疫染色で確認した。図５で示されるように、ＢｏＮＴ／Ａ結合は、ＳＶ２Ａ、ＳＶ２Ｂ又はＳＶ２Ｃをトランスフェクトしたニューロンで観察されただけであったが、同じ領域において他のニューロンは結合を示さなかった。ＳＶ２とＢｏＮＴ／Ａシグナルとの間の拡大したオーバーレイ画像が、シナプスにおける高度な共局在化を示していた（図５、オーバーレイ）。細胞体における高レベルのＳＶ２発現は、野生型のニューロンにおける外因性ＳＶ２の免疫染色で見出されないことから、外因性タンパク質の過剰発現のためであると考えられる。同じウイルスベクターを用いる、別のシナプス小胞タンパク質であるシナプトタグミンＩの過剰発現では、検出可能なＢｏＮＴ／Ａ蛍光シグナルが生じず、これによって補助効果の特異性が確認された。ＳＶ２Ａ、ＳＶ２Ｂ又はＳＶ２Ｃ全てがＢｏＮＴ／Ａ結合を補助し、これによって、３つのアイソフォーム全てが一度発現すれば、ニューロンとのＢｏＮＴ／Ａ結合を介在することができることが示された。
【００８１】
運動性末端とのＢｏＮＴ／Ａ結合が、ＳＶ２Ａ／Ｂノックアウトマウスで低減する：ＳＶ２がその生理学的標的におけるＢｏＮＴ／Ａに対する受容体として機能するか否かを求めるために、本発明者らは、ＳＶ２ノックアウトマウス由来の横隔膜の神経末端とのＢｏＮＴ／Ａ結合を試験した。通常、これらの神経は３つのＳＶ２アイソフォーム全てを発現し（図８）、本発明者らは、これらの神経全てが運動性末端のＢｏＮＴ／Ａ認識に寄与すると考えている。ＳＶ２Ａノックアウトマウス及びＳＶ２Ａ／Ｂダブルノックアウトマウスは成体まで生存せず、ＳＶ２Ｃノックアウトマウスは利用することができないので、本発明者らは、最小量のＳＶ２発現を有する利用可能な成体ノックアウトマウス由来の横隔膜調製物（ＳＶ２Ａ（＋／−）ＳＶ２Ｂ（−／−））を野生型（ＷＴ）と比較した。図６ａ及び図６ｂに示されるように、ＳＶ２Ａ（＋／−）ＳＶ２Ｂ（−／−）マウス由来のＮＭＪとのＢｏＮＴ／Ａ結合は、ＷＴと比べて有意に低減するが（７２％の低減、Ｐ＜０.００１、ｔ検定）、ＢｏＮＴ／Ｂ結合のレベルは同じままであり（Ｐ＞０．０５、ｔ検定）、このことによって、ＳＶ２Ａ及びＳＶ２Ｂが運動性神経末端とのＢｏＮＴ／Ａ結合に重要であることが示唆される。これらのマウスで変わることなく、ＳＶ２Ａにおいてはレベルが低減したままである、ＳＶ２Ａ（＋／−）ＳＶ２Ｂ（−／−）ＮＭＪにおけるＢｏＮＴ／Ａ結合のレベルの維持はＳＶ２Ｃによって介在されると考えられる。
【００８２】
ＳＶ２ＢノックアウトマウスはＢｏＮＴ／Ａに対する感受性が低減している：これらの所見の生理学的意味をさらに明らかにするために、本発明者らは動物全体に広げて研究（studied）を行った。利用可能なＳＶ２ノックアウトマウス株の間で、ＳＶ２Ａノックアウトマウス及びＳＶ２Ａ／Ｂダブルノックアウトマウスの両方が生後数週間以内に死滅し、このことによって、ＳＶ２Ａが通常のシナプス伝達を維持するのに必須であることが示唆される。対して、ＳＶ２Ｂシングルノックアウトマウス（ＳＶ２Ｂ（−／−））は野生型（ＷＴ）マウスとの明らかな違いはない。シナプス伝達に対するｉｎ  ｖｉｖｏでの潜在的異常を最小限にするために、本発明者らは、ＳＶ２ＢノックアウトマウスのＢｏＮＴ／Ａ感受性と、ＷＴ同腹子のＢｏＮＴ／Ａ感受性とを比較することを選択した。大量の毒素を静脈内注射し、注射後の生存時間（時間対致死）を記録した従来の迅速なアッセイ（Boroff  DA  and  Fleck  U，J．Bacteriol，92：1580-1581，1966、Dong  M  et  al.，supra，2003、Malizio  CG，Methods  and  Protocols  O．Holst，ed．(Humana  Press)，pp.27-39，2000）を用いて、ＢｏＮＴ／Ａに対する感受性を評価した。この生存時間は、以前に設定された標準曲線から見かけの毒性に変換することができる（Malizio  CG，supra，2000）。
【００８３】
同量のＢｏＮＴ／Ａ（１０4〜１０6ＬＤ50／ｍｌ）をＳＶ２Ｂ（−／−）マウス及びＷＴマウスに注射して、その生存時間を図６ｃに示す。ＳＶ２Ｂノックアウトマウスは、野生型同腹子より有意に長期間生存した（４３．７±１．９分対３２．６±４．６分）。ＷＴマウスの生存時間から推定した効果的な毒素濃度は、ＳＶ２Ｂ（−／−）マウスの約２．５倍であった（８．４±２．９×１０5ＬＤ50／ｍｌ対３．４±０．５×１０5ＬＤ50／ｍｌ、図６ｃ）。効果的な毒素の差は、ＳＶ２ＢノックアウトマウスのＬＤ50値の移行に反映され、すなわちこれらのマウスが、これらのＷＴ同腹子よりも致死用量に関して約２．５倍多いＢｏＮＴ／Ａを必要としている。ＳＶ２Ｂ（−／−）マウスにおける残りの毒性は、これらの運動性神経末端においてＳＶ２Ａ及びＳＶ２Ｃによって介在されると考えられている。これらの結果は、ＳＶ２がｉｎ  ｖｉｖｏでのＢｏＮＴ／Ａに対する生理学的な受容体であるという機能的証明を与える。
【００８４】
本発明は、上記の実施例に対する限定を意図せず、むしろ添付の特許請求の範囲内に近づくように、このような変更及び修正を全て包含するように意図される。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】シナプス小胞のエキソサイトーシスを刺激することによって、横隔膜の運動性神経末端及び培養された海馬ニューロンとのＢｏＮＴ／Ａ結合が増大することを示す図である。パネルａ：マウスの片側横隔膜調製物を、静止条件（対照緩衝液）又は刺激条件（高Ｋ+緩衝液：４５ｍＭのＫＣｌ）のいずれかにおいてＢｏＮＴ／Ａ（２５ｎＭ）に曝した。組織を固定し、浸透させた。神経筋接合部（ＮＭＪ）をＡｌｅｘａ−４８８結合α−ＢＴＸで標識した。ＢｏＮＴ／ＡをＢｏＮＴ／Ａポリクローナル抗体及びＣｙ３結合二次抗体を用いて検出した。長方形で示される領域のオーバーレイは、ＢｏＮＴ／Ａ染色が個々のＮＭＪにおけるα−ＢＴＸ染色を反映することを示すために拡大表示した。右側のパネル：ＮＭＪとのＢｏＮＴ／Ａ結合を定量化した。ＮＭＪ領域（対象の領域、ＲＯＩ）をα−ＢＴＸシグナルで定義した。ＢｏＮＴ／Ａ染色の強度をα−ＢＴＸシグナルに対して正規化し、その比をＹ軸上にプロットした。高Ｋ+緩衝液による刺激によって、ＢｏＮＴ／Ａ強度が約６倍増大した。誤差バーはＳＥＭ（ｎ＝２７〜２８画像数）を表す。パネルｂ：３つの異なる緩衝液条件：（１）標準緩衝液（ＰＢＳ）、（２）高Ｋ+（５６ｍＭのＫＣｌ）、及び（３）高Ｋ+／無Ｃａ2+（Ｃａ2+なし）で１分間、培養したラットの海馬ニューロンを、ＢｏＮＴ／Ａ（１０ｎＭ）及びシナプトタグミンＩ（Ｓｙｔ  ＩN  Ａｂ、ＣＩ６０４．４、１：４０）の内腔ドメインに対する抗体に曝した。高Ｋ+でニューロンを刺激することによって、Ｓｙｔ  ＩN  Ａｂ免疫蛍光シグナルが増大した。この増大は、細胞外Ｃａ2+なしでは見られなかった。ＢｏＮＴ／Ａシグナルは、Ｓｙｔ  ＩN  Ａｂシグナルと広く共局在化する。右側３列目の画像は、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡から得られた画像を示す。パネルｃ：ＢｏＮＴ／Ｂ（３０ｎＭ、２４時間）で前処理したラットの海馬ニューロンを高Ｋ+緩衝液で１０分間、ＢｏＮＴ／Ａ（１０ｎＭ）に曝した。細胞を固定し、Ｓｙｂ  ＩＩ及びＢｏＮＴ／Ａに対して免疫染色した。ＢｏＮＴ／Ａ結合は、ＢｏＮＴ／Ｂ処理によって破壊され、ニューロンにおけるＳｙｂ  ＩＩを切断する。ＢｏＮＴ／Ｂで処理しなかったニューロンは対照とする。右側３列目の画像はＤＩＣ顕微鏡から得られた画像を示す。
【００８６】
【図２】ＢｏＮＴ／ＡがＳＶ２内腔ドメインと直接結合することを示す図である。パネルａ：シナプス小胞タンパク質シナプトフィジン（Ｓｙｐ、ＣＩ７．２）及びＳＶ２（汎ＳＶ２）に対するモノクローナル抗体を用いて、ラットの脳の界面活性剤抽出物由来のＢｏＮＴ／Ａ（１００ｎＭ）を免疫共沈降した。平行して、抗体を有しない対照サンプル（無Ａｂ）に免疫共沈降を行った。免疫沈降した毒素及び小胞タンパク質をウエスタンブロットで検出した。ＢｏＮＴ／ＡをＳｙｐではなく、ＳＶ２で免疫共沈降した。パネルｂ：指示されたＢｏＮＴ／Ａ濃度で外因性ガングリオシド（ウシの脳のガングリオシド混合物、０．６ｍｇ／ｍｌ）あり又はなしで、汎ＳＶ２抗体を用いてマウスの脳の界面活性剤抽出物からのＢｏＮＴ／Ａの免疫共沈降を行った。ガングリオシドを加えることによって、ＳＶ２抗体によって免疫共沈降されたＢｏＮＴ／Ａの量が増加した。パネルｃ：３つのＳＶ２アイソフォーム全ての第４の内腔ドメイン（ＳＶ２トポロジーに関してはパネルｄを参照されたい）は、ＧＳＴ標識タンパク質として精製し、グルタチオン−セファロースビーズにおいて固定化した。固定化タンパク質８μｇ及び１００ｎＭの毒素（ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ又はＢｏＮＴ／Ｅ）を用いてプルダウンアッセイを行った。抗ＢｏＮＴ／Ａ抗体、抗ＢｏＮＴ／Ｂ抗体、抗ＢｏＮＴ／Ｅ抗体によるウエスタンブロットによって、結合した物質を分析した。ＢｏＮＴ／Ａは、明らかに最も高いアフィニティを示すＳＶ２Ｃの内腔ドメインを有する全てのＳＶ２アイソフォームと直接結合する。パネルｄ：推定ＳＶ２トポロジーの概略図。それぞれの丸は残基を表す。黒丸は全てのＳＶ２Ａ、ＳＶ２Ｂ及びＳＶ２Ｃアイソフォームにおいて保存された残基を示し、灰色の丸は２つのＳＶ２アイソフォームにおいて保存された残基であり、白丸は保存されない残基を表す。ＳＶ２は、Ｎ末端及びＣ末端が細胞質側にある１２個の膜貫通ドメインを含む。第４の内腔ドメイン（Ｌ４）は小胞内に存在し、示された３つの推定Ｎ−グリコシル化部位を含む。ＢｏＮＴ／Ａ結合に関するＳＶ２Ｃにおける重要領域（critical  region：有意域）を矢印で示す（詳細に関してはパネルｅを参照されたい）。パネルｅ：ＳＶ２Ｃ−Ｌ４内の一連の切断突然変異がＧＳＴ融合タンパク質として生じ、ＢｏＮＴ／Ａ結合に関して試験した。結合アッセイをパネルｂで記載されたように行い、ウエスタンブロットで分析した。ＢｏＮＴ／Ａ結合に関する重要領域が、単独でＢｏＮＴ／Ａと結合する能力を維持する短い断片（ＳＶ２Ｃにおける残基５２９〜５６６）にマップされた。Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓ染色によって固定化されたＧＳＴ融合タンパク質が示され、当量の固定化タンパク質がこのアッセイで用いられることを確実にした。アスタリスクで示された推定Ｎ−グリコシル化部位で、この領域のタンパク質配列をＳＶ２Ａ及びＳＶ２Ｂの領域（全てがラットの配列である）とアラインメントする。
【００８７】
【図３】ＢｏＮＴ／Ａ結合の遮断及びＳＶ２Ｃ内腔断片による海馬ニューロン及び運動性神経末端への侵入を示す図である。パネルａの左側のパネル：海馬ニューロンは、対照タンパク質（可溶性ＧＳＴ、１０μＭ）又はＳＶ２Ｃ−Ｌ４（可溶性ＧＳＴ標識ＳＶ２Ｃ−Ｌ４断片、１０μＭ）のいずれかの存在下で高Ｋ+緩衝液において１０分間、ＢｏＮＴ／Ａ（１０ｎＭ）及びＳｙｔ  ＩN  Ａｂに曝された。細胞を洗浄し、固定した。Ｓｙｔ  ＩN  Ａｂ及びＢｏＮＴ／Ａの結合及び取り込みを続く免疫染色で分析した。ＳＶ２Ｃ−Ｌ４は、ニューロンへのＳｙｔ  ＩN  Ａｂの取り込みには影響を与えないが、同じニューロンとのＢｏＮＴ／Ａ結合が低減された。パネルａの右側のパネル：ＢｏＮＴ／Ａの代わりにＢｏＮＴ／Ｂを用いることを除いて上記のように実験を行った。ＳＶ２Ｃ−Ｌ４はニューロンとのＢｏＮＴ／Ｂ結合に影響を与えなかった。パネルｂ：高Ｋ+緩衝液において１０分間、ＧＳＴタンパク質又はＳＶ２Ｃ−Ｌ４のいずれかの存在下で、海馬ニューロンをＢｏＮＴ／Ａ（１０ｎＭ）とインキュベートした。細胞を３回洗浄し、培養培地で６時間さらにインキュベートした。それから細胞を固定し、浸透させた。（未処理の（intact）全長ＳＮＡＰ−２５ではなく）切断ＳＮＡＰ−２５のみを認識するモノクローナル抗体（抗ＳＮＡＰ−２５−Ｃ）を用いて、ＳＮＡＰ−２５の切断を検出した。ＳＶ２Ｃ−Ｌ４は、ＢｏＮＴ／Ａによる未処理のＳＮＡＰ−２５の切断を防いだ。右側３列目の画像は、ＤＩＣ顕微鏡から得られた画像を示す。パネルｃ：高Ｋ+緩衝液において３０分間、ＧＳＴタンパク質又はＳＶ２Ｃ−Ｌ４のいずれかの存在下でマウスの片側横隔膜調製物をＢｏＮＴ／Ａ（１０ｎＭ）又はＢｏＮＴ／Ｂ（１０ｎＭ）に曝した。組織を洗浄し、固定して浸透させた。ＮＭＪをα−ＢＴＸで標識した。ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂをそれぞれ、これらのポリクローナル抗体で検出した。ＳＶ２Ｃ−Ｌ４は、ＮＭＪとのＢｏＮＴ／Ａの結合を特異的に低減させたが、ＢｏＮＴ／Ｂ結合には効果がなかった。パネルｄ：パネルｃで回収した画像に基づき、ＮＭＪとのＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂの結合を図１ａに記載されたように定量化した。ＳＶ２Ｃ−Ｌ４は、ＢｏＮＴ／Ａ結合を特異的に低減させるが（対照に比べて６５％の低減、Ｐ＜０．０００１、ｔ検定、ｎ＝７６〜９０画像数）、ＢｏＮＴ／Ｂ結合には影響を与えなかった（Ｐ＞０．０５、ｔ検定、ｎ＝４９〜５５画像数）。誤差バーはＳＥＭを表す。
【００８８】
【図４】ＢｏＮＴ／Ａ結合がＳＶ２Ａ及びＳＶ２Ｂノックアウト海馬ニューロンで破壊されることを示す図である。パネルａ：ＳＶ２Ｂノックアウト（ＳＶ２Ｂ（−／−））マウス及び野生型（ＷＴ）同腹子対照由来の海馬ニューロンを培養した。１０分間、高Ｋ+において、ニューロンをＢｏＮＴ／Ａ（１５ｎＭ）及びＢｏＮＴ／Ｂ（７．５ｎＭ）に曝した。これらのニューロンを３回洗浄し、表面結合毒素を減らし、固定して浸透させた。ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂに対する免疫蛍光シグナルを検出し定量化して、正規化した強度比としてプロットした（％ＷＴシグナル）。ＳＶ２Ｂ（−／−）ニューロンによって、ＢｏＮＴ／Ａの取り込みの有意な低減が示された（ＷＴに比べて２８％の低減、Ｐ＜０.０００１、ｔ検定、ｎ＝１８画像数）。ＢｏＮＴ／Ｂの取り込みレベルは、ＳＶ２Ｂ（−／−）ニューロンとＷＴニューロンとで同程度に維持された（Ｐ＞０．０５、ｔ検定、ｎ＝２２画像数）。誤差バーはＳＤを表す。パネルｂ：以下の遺伝子型：ＳＶ２Ａ（＋／＋）ＳＶ２Ｂ（−／−）、ＳＶ２Ａ（＋／＋）ＳＶ２Ｂ（−／−）を有する同腹子由来の海馬ニューロン、及びダブルノックアウトＳＶ２Ａ（−／−）ＳＶ２Ｂ（−／−）ニューロンを培養した。培養物を１０分間同時にＢｏＮＴ／Ａ（１０ｎＭ）及びＢｏＮＴ／Ｂ（７．５ｎＭ）に曝した。細胞を３回洗浄し、固定して浸透させた。三重の免疫染色を行った（ＢｏＮＴ／Ｂ：ウサギの抗ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ａ：ヒトの抗ＢｏＮＴ／Ａ、ＳＶ２：マウスの汎ＳＶ２）。ニューロンとのＢｏＮＴ／Ｂの結合は、異なる遺伝子型の間で変わらなかった。ＳＶ２Ｂノックアウト及びＳＶ２Ａ異型の接合体（ＳＶ２Ａ（＋／−）ＳＶ２Ｂ（−／−））は、ＢｏＮＴ／Ａ結合の低減を示した。ＳＶ２Ａ／Ｂダブルノックアウトは、ＢｏＮＴ／Ａの結合を示さなかった。パネルｃ：パネルｂで回収した画像は閾値であり、ニューロンのみを含んでいた。平均強度（バックグラウンドが差し引かれたもの）を正規化データとしてプロットした（ＳＶ２Ａ（＋／＋）の％）。ＳＶ２Ａ（＋／−）ＳＶ２Ｂ（−／−）ニューロンは、ＳＶ２Ａ（＋／＋）ＳＶ２Ｂ（−／−）と比べて５３％の低減を示し、ＳＶ２Ａ／ＢダブルノックアウトはＢｏＮＴ／Ａの結合を示さなかった。ＢｏＮＴ／Ｂの結合は、全ての遺伝子型で同程度を維持した（Ｐ＞０．０５、ｔ検定、ｎ＝１１画像数）。
【００８９】
【図５】ＳＶ２Ａ／ＢダブルノックアウトニューロンにおいてＳＶ２Ａ、ＳＶ２Ｂ又はＳＶ２Ｃを導入することがＢｏＮＴ／Ａ結合を補助することを示す図である。ニューロン特異的なシナプシンプロモータの制御下でラットのＳＶ２Ａ、ＳＶ２Ｂ及びＳＶ２Ｃをレンチウイルスベクターにサブクローニングし、ＳＶ２Ａ／Ｂダブルノックアウトマウス由来の海馬ニューロンをトランスフェクトするのに用いた。トランスフェクトの４８時間後に、ニューロンを１０分間、ＢｏＮＴ／Ａ（１０ｎＭ）に曝した。細胞を３回洗浄し、固定して浸透させた。図４ｂに記載されるようにＳＶ２及びＢｏＮＴ／Ａに対する免疫染色を行った。ベクターにおいて個々のシナプシンプロモータの制御下でトランスフェクトしたニューロンをＧＦＰ発現によって同定した。外因性非標識ＳＶ２アイソフォームの発現をＳＶ２染色によって確認し、ＢｏＮＴ／Ａはトランスフェクト細胞と選択的に結合した。白色の長方形で示された領域のオーバーレイ画像を拡大し、ＳＶ２発現とＢｏＮＴ／Ａシグナルとの間の高度な共局在化が示された。
【００９０】
【図６】ＳＶ２ノックアウトマウスは、横隔膜の運動性神経末端においてＢｏＮＴ／Ａ結合が低減され、ＢｏＮＴ／Ａに対してより耐性であることを示す図である。パネルａ：野生型（ＷＴ）マウス及びＳＶ２Ａ（＋／−）ＳＶ２Ｂ（−／−）マウスからマウスの横隔膜を調製した。１時間、刺激条件下で横隔膜の半分をＢｏＮＴ／Ａ（２５ｎＭ）に曝した。組織を固定し、図１ａに記載されたように、α−ＢＴＸ及びＢｏＮＴ／Ａ抗体で免疫染色した。横隔膜の残りの半分をＢｏＮＴ／Ｂ（２５ｎＭ）に曝し、平行して免疫染色した。代表的な画像が示される。パネルｂ：パネルａで回収した画像を図１ａで示されたように定量化した。ＳＶ２Ａ（＋／−）ＳＶ２Ｂ（−／−）マウスは、ＷＴに比べてＢｏＮＴ／Ａ結合が有意に低減したことを示したが（７２％の低減、Ｐ＜０．００１、ｔ検定、ｎ＝４７画像数）、ＢｏＮＴ／Ｂ結合は同程度である（Ｐ＞０．０５、ｔ検定、ｎ＝２０画像数）。パネルｃ：ＳＶ２Ｂ（−／−）マウス及びこれらのＷＴ同腹子のＢｏＮＴ／Ａに対する感受性を迅速な時間対致死アッセイで求めた。同量のＢｏＮＴ／Ａをそれぞれのマウスに注射し、その生存時間（時間対致死）を記録した。標準曲線を用いて、時間対致死から平均の効果的毒性（ＬＤ50／ｍｌ）を推測した。ＳＶ２Ｂ（−／−）マウスはＷＴマウスより有意に長期間生存する（４３分対３３分、Ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定）。ＷＴマウスで注射したＢｏＮＴ／Ａの効果的な毒性は、ＳＶ２Ｂノックアウトマウスより約２．５倍大きい。
【００９１】
【図７】ＢｏＮＴ／Ｂ結合部位を含有するペプチドが、海馬ニューロンと結合するＢｏＮＴ／Ａではなく、ＢｏＮＴ／Ｂを特異的に阻害し、ＳＶ２Ｃ−Ｌ４はＢｏＮＴ／Ｅ結合に影響を与えないことを示す図である。パネルａ：ペプチドＰ２１はシナプトタグミンＩＩ内腔ドメインに由来する（Dong  M  et  al.，J．Cell．Biol．162：1293-1303，2003）。Ｐ２１Ｓは対照となるＰ２１のスクランブル版である（Dong  M  et  al.，supra，2003）。Ｐ２１（３０μＭ）又はＰ２１Ｓの存在下で、１０分間高Ｋ+緩衝液において、培養した海馬ニューロンをＢｏＮＴ／Ｂ（１０ｎＭ）及びＳｙｔ  ＩN  Ａｂに曝した。細胞を洗浄し固定した。Ｓｙｔ  ＩN  Ａｂ及びＢｏＮＴ／Ｂの結合及び取り込みを図３ａに記載されたように、続く免疫染色で分析した。Ｐ２１はニューロンとのＢｏＮＴ／Ｂ結合を阻害したが、Ｓｙｔ  ＩN  Ａｂの取り込みには影響を与えていない。パネルｂ：ＢｏＮＴ／Ｂの代わりにＢｏＮＴ／Ａを用いて、パネルａに記載されたように実験を行った。Ｐ２１ペプチドは海馬ニューロンとのＢｏＮＴ／Ａ結合に影響を与えなかった。パネルｃ：ＧＳＴ（１０μＭ）又はＳＶ２Ｃ−Ｌ４（１０μＭ）の存在下で１０分間、高Ｋ+緩衝液において、海馬ニューロンをＢｏＮＴ／Ｅ（１０ｎＭ）及びＳｙｔ  ＩN  Ａｂに曝した。ＢｏＮＴ／Ｅの結合を抗ＢｏＮＴ／Ｅポリクローナル抗体で検出した。ＳＶ２Ｃ−Ｌ４はニューロンとのＢｏＮＴ／Ｅ結合に影響を与えなかった。
【００９２】
【図８】マウスの横隔膜における運動性神経末端はＳＶ２Ａ、ＳＶ２Ｂ及びＳＶ２Ｃを発現することを示す図である。マウスの片側横隔膜を切除し、直ぐに４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定して、浸透させ、遮断した。ＳＶ２Ａ、ＳＶ２Ｂ又はＳＶ２Ｃの発現をこれらの特異的なポリクローナル抗体（１：１０００）によって検出した。ＮＭＪをα−ＢＴＸで標識した。全てのＳＶ２アイソフォームがＮＭＪ、おそらくはシナプス前神経末端で観察された。
【００９３】
【図９】ラットのＳＶ２Ｃ（配列番号６）、ヒトのＳＶ２Ａ（配列番号１４）、ヒトのＳＶ２Ｂ（配列番号１６）、ヒトのＳＶ２Ｃ（配列番号１８）、マウスのＳＶ２Ａ（配列番号８）、マウスのＳＶ２Ｂ（配列番号１０）、及びマウスのＳＶ２Ｃ（配列番号１２）の部分配列のアラインメントを示す図である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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