(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
頭頸部癌の腫瘍マーカーの使用方法であって、被検試料中に頭頸部癌の腫瘍マーカーを検出する検出工程と、前記腫瘍マーカーが陽性か否かを判定する判定工程とを含み、
前記被検試料が、血液試料であり、
前記腫瘍マーカーが、ＣＸＣＬ１３遺伝子、ＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡ、及びＣＸＣＬ１３タンパク質からなる群から選択されるマーカーであり、
前記判定工程は、前記被検試料の前記腫瘍マーカーの測定値が基準値よりも大きい場合に陽性と判定することを含み、
前記腫瘍マーカーの陽性が、前記頭頸部癌の存在を示す、頭頸部癌の腫瘍マーカーの使用方法。
【請求項２】
前記頭頸部癌が頭頸部扁平上皮癌である、請求項１に記載の頭頸部癌の腫瘍マーカーの使用方法。
【請求項３】
前記頭頸部癌が早期癌である、請求項１又は２に記載の頭頸部癌の腫瘍マーカーの使用方法。
【請求項４】
前記腫瘍マーカーが、ＣＸＣＬ１３タンパク質である、請求項１から３のいずれかに記載の頭頸部癌の腫瘍マーカーの使用方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の頭頸部癌腫瘍マーカーの使用方法に用いるためのキットであって、
ＣＸＣＬ１３遺伝子、ＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡ、及びそれらの相補配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件化でハイブリダイズする塩基配列からなるポリヌクレオチを含むプローブ及びプライマー、
前記プローブが配置されたマイクロアレイ、
ＣＸＣＬ１３タンパク質を特異的に認識する抗体、及び、
前記抗体が配置されたプロテインチップ、
からなる群から選択される少なくとも１つの前記腫瘍マーカーを検出するために使用するものを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、頭頸部癌の腫瘍マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍マーカーは一般的に癌の早期発見や治療経過のモニタリングの補助ツールとして広く用いられている。代表的な腫瘍マーカーとして、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＣＹＦＬＡ）、ｃａｒｂｏｈｙｄｏｒａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＡ１９−９）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）などが挙げられる。
【０００３】
一方、頭頸部領域に発生する悪性腫瘍、特に扁平上皮癌の診断補助に広く用いられる腫瘍マーカーは扁平上皮ガン抗原（ＳＣＣ）であるが、感度が低く、特に早期癌では偽陰性となる症例も多い（例えば、非特許文献１〜２）。また、これまでに、頭頸部扁平上皮癌における腫瘍マーカーとして、例えばＣＥＡなどの有用性についても様々な検討がされてきたが、早期癌では十分な感度が得られていないのが現状である（例えば、非特許文献２〜４）。
【非特許文献１】吉田英彦ら、「口腔癌診断に対する血清ＳＣＣ抗原測定の意義．」  癌と化学療法  １１：３５９５−３６０１，１９８９．
【非特許文献２】松友豊伸、「口腔扁平上皮癌におけるＳＣＣ抗原及びＣＥＡの臨床的意義．」  日口外誌  ３９（３）：２０７−２１４，１９９３．
【非特許文献３】小林  裕、「Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−π（ＧＳＴ−π）による口腔扁平上皮癌の診断に関する研究．」  口腔病会誌  ６６（１）：４５−５６，１９９９．
【非特許文献４】Ｒｏｓａｔｉ  Ｇら、「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ．」  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｒｋｅｒｓ  １５（２）：１７９−８３，２０００．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来の頭頸部癌の腫瘍マーカーは感度が低く、例えば、早期癌の診断ツールとして満足できるものではない。頭頸部癌の早期癌に対しても高い感度を有する腫瘍マーカーは、頭頸部癌の診断や予後の向上に極めて有用であり、その必要性は高い。
【０００５】
そこで、本発明は、新規かつ有用な頭頸部癌の腫瘍マーカーを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーは、ＣＸＣＬ１３遺伝子、ＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡ、及びＣＸＣＬ１３タンパク質からなる群から選択される腫瘍マーカーである（以下、本発明の腫瘍マーカーともいう）。
【０００７】
本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカー検出用プローブは、ＣＸＣＬ１３遺伝子、ＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡ、及びそれらの相補配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件化でハイブリダイズする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含み、本発明の腫瘍マーカーの検出に使用するプローブである（以下、本発明のプローブともいう）。
【０００８】
本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカー検出用プライマーは、ＣＸＣＬ１３遺伝子、ＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡ、及びそれらの相補配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件化でハイブリダイズする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含み、本発明の腫瘍マーカーの検出に使用するプライマーである（以下、本発明のプライマーともいう）。
【０００９】
本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカー検出用マイクロアレイは、本発明のプローブが配置され、本発明の腫瘍マーカーの検出に使用するマイクロアレイである（以下、本発明のマイクロアレイともいう）。
【００１０】
本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカー検出用抗体は、ＣＸＣＬ１３タンパク質を特異的に認識し、本発明の腫瘍マーカーの検出に使用する抗体である（以下、本発明の抗体ともいう）。
【００１１】
本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカー検出用プロテインチップは、本発明の抗体が配置され、本発明の腫瘍マーカーの検出に使用するプロテインチップである（以下、本発明のプロテインチップともいう）。
【００１２】
本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカー検出用キットは、本発明のプローブ、プライマー、マイクロアレイ、抗体、及びプロテインチップからなる群から選択される少なくとも一つを含み、本発明の腫瘍マーカーの検出に使用するキットである（以下、本発明のキットともいう）。
【００１３】
本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーの使用方法は、被検試料を準備する準備工程、前記試料中における本発明の腫瘍マーカーを検出する検出工程、及び前記検出結果に基づいて腫瘍マーカーの陽性を判定する判定工程を含む（以下、本発明の使用方法ともいう）。
【００１４】
本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーの発現を抑制する物質のスクリーニング方法は、被検物質と本発明の腫瘍マーカーを発現している細胞とを接触させる工程、及び前記腫瘍マーカーの発現量を減少させる被検物質を選択する工程を含む（以下、本発明のスクリーニング方法ともいう）。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、例えば、頭頸部癌の診断及びその予後の向上に大きく貢献でき、好ましくは、頭頸部扁平上皮癌の診断、より好ましくは、頭頸部癌の早期癌の診断の感度及び／又は精度を向上できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明者らは、頭頸部癌の腫瘍マーカーについて鋭意研究を重ね、ＣＸＣＬ１３が頭頸部癌の腫瘍マーカーとなり得ることを見出し、この発明に到達した。具体的には、本発明者らは、まず、正常組織と頭頸部癌の腫瘍組織において、マイクロアレイによる網羅的な遺伝子解析を行なった結果、頭頸部癌である扁平上皮癌においてのみ共通して３倍以上の発現亢進を示す遺伝子を２７８種類同定した。そして、それらのうち、ＣＸＣＬ１３（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ  １３）を新規の腫瘍マーカーとして同定した。ＣＸＣＬ１３は、Ｂ細胞に特異的に細胞走化活性を示すケモカインとして１９９８年に同定され、リンパ濾胞やリンパ節形成に重要な役割を果たしていることが報告されている。しかし、固形腫瘍とりわけ頭頸部癌との関連については報告されておらず、頭頸部扁平上皮癌との関連も不明である。本発明は、頭頸部癌における新規な腫瘍マーカーとしてＣＸＣＬ１３を見出したことに基づくものであって、本発明によれば、頭頸部癌の診断及びその予後の向上に大きく貢献できる。
【００１７】
本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーは、ＣＸＣＬ１３遺伝子、ＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡ、及びＣＸＣＬ１３タンパク質からなる群から選択される腫瘍マーカーであり、好ましくは、頭頸部扁平上皮癌、より好ましくは、頭頸部癌の早期癌の腫瘍マーカーである。
【００１８】
本発明において「頭頸部癌」とは、脳と眼を除いた首から上にできる癌をいい、一般的に、口腔癌、鼻副鼻腔癌、口唇癌、咽頭癌、喉頭癌、頭部腫瘍、耳の癌を含む。本発明において「腫瘍マーカー」とは、癌細胞の目印（マーカー）となる物質であって、癌の診断や治療の判断基準として役立つ物質の総称をいう。
【００１９】
本発明において「ＣＸＣＬ１３」は、Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ  ）ｌｉｇａｎｄ  １３というケモカインであり、ＢＬＣ（Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ）又はＢＣＡ−１（Ｂ  ｃｅｌｌ−ａｔｒａｃｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  １）ともいう。本発明において「ＣＸＣＬ１３遺伝子」とは分泌性可溶性タンパク質であるＣＸＣＬ１３タンパク質をコードする遺伝子であり、「ＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡ」とは前記ＣＸＣＬ１３遺伝子の転写産物であり、「ＣＸＣＬ１３タンパク質」とは前記ＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡの翻訳産物である。前記ＣＸＣＬ１３遺伝子は、ＣＸＣＬ１３タンパク質をコードするＤＮＡ及びその断片などを含み、例えば、クローニング、化学合成技術又はそれらを組み合わせて得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが挙げられる。前記ＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩの遺伝子データ−ベースにおいてＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００６４１９（２００７年７月１０日付）として登録されており、具体的には、配列表の配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。前記ＣＸＣＬ１３タンパク質は、ＮＣＢＩのタンパク質データ−ベースにおいてＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＰ＿００６４１０として登録されており、具体的には、配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。前記塩基配列において、例えば、突然変異や遺伝子多型などに起因して１から数個の塩基の置換・欠失・付加などの相違があっても、本発明の腫瘍マーカーに含まれる。同じく、前記アミノ酸配列において、例えば、突然変異や遺伝子多型などに起因して１から数個のアミノ酸残基の置換・欠失・付加などの相違があっても本発明の腫瘍マーカーに含まれる。また、前記ＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡ及びＣＸＣＬ１３タンパク質の一部分、及び修飾されたＣＸＣＬ１３タンパク質、例えば、リン酸化ＣＸＣＬ１３なども本発明の腫瘍マーカーに含まれる。
【００２０】
本発明の腫瘍マーカーは、特に限定されないが、好ましくは頭頸部扁平上皮癌、さらに好ましくは頭頸部癌の早期癌の診断などに使用できる。
【００２１】
本発明のプローブ及びプライマーは、ＣＸＣＬ１３遺伝子、ＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡ、及びそれらの相補配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件化でハイブリダイズする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む。前記ポリヌクレオチドは、特に限定されないが、例えば、ＣＸＣＬ１３遺伝子又はＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡの塩基配列の全体配列、部分配列、及びそれらの相補配列からなるポリヌクレオチド、並びに、前記ポリヌクレオチドにおいて１から数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドなどが挙げられる。（以下、本発明のプローブ用又はプライマー用ポリヌクレオチドという）。なお、前記ストリンジェントな条件は、特に限定されないが、例えば、０．３％ＳＤＳを含む５ＸＳＳＣ緩衝液中で熱変性し、６５℃で４〜１６時間ハイブリダイゼーションし、常温で０．１％ＳＤＳを含む２ＸＳＳＣ緩衝液及び２ＸＳＳＣ緩衝液で、それぞれ５分間洗浄し、０．０５ＸＳＳＣでリンスすることなどが挙げられる。本発明のプローブ及びプライマーは、特に限定されないが、例えば、後述のとおり、本発明の腫瘍マーカーの検出に使用できる。
【００２２】
本発明のプローブ用又はプライマー用ポリヌクレオチドは、特に限定されないが、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は、従来公知のこれらの誘導体や類縁体を使用できる。また、欠失、置換若しくは付加が可能な塩基数としては、特に限定されないが、例えば１〜１０個以上であり、好ましくは１〜３個であり、より好ましくは１又は２個である。本発明のプローブ又はプライマー用ポリヌクレオチドの製造方法としては、特に限定されないが、従来公知の製造方法、例えば、化学合成や酵素合成などが挙げられる。本発明のプローブ又はプライマー用ポリヌクレオチドは、特に限定されないが、例えば、酵素標識、放射標識、及び蛍光標識などの従来公知の標識方法で標識されてもよい。
【００２３】
本発明のプローブの使用方法は、特に限定されないが、例えば、後述するマイクロアレイのプローブ、又は、リアルタイムＰＣＲのプローブとして使用することなどが挙げられる。マイクロアレイのプローブとして使用する場合、その長さとしては、特に限定されないが、例えば、１０〜２００ヌクレオチドであって、２０〜１００ヌクレオチドが好ましく、４０〜８０ヌクレオチドがより好ましい。また、マイクロアレイのプローブとして使用する場合は、マイクロアレイの基板に固定するための修飾がされていてもよい。前記修飾は、使用するマイクロアレイの基板の種類に応じて従来公知のものを選択できるが、例えば、プローブのポリヌクレオチドの５’又は３’側のＣ（３〜７）アミン化などが挙げられる。また、リアルタイムＰＣＲのプローブとして使用する場合、本発明のプローブは、例えば、蛍光物質及びクエンチャーを結合してもよい。
【００２４】
本発明のプライマーは、ＣＸＣＬ１３遺伝子やＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡを特異的に増幅するためのプライマーである。本発明のプライマーを用いることにより、ＰＣＲなどの公知の方法に基づいて目的のＣＸＣＬ１３遺伝子やＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡを増幅できる。プライマーの設計は、特に制限されないが、従来公知の方法、例えば、プライマー設計用アルゴリズムやソフトウエアなどを利用して行なうことができる。プライマーの長さとしては、特に限定されないが、例えば、１５〜３０ヌクレオチドである。また、本発明のプライマーは、特に限定されないが、前述のとおり適当な標識によりラベル化されてもよく、ビオチン、リン酸、アミンなどにより修飾されてもよい。
【００２５】
本発明のマイクロアレイは、本発明のプローブが基板上に配置されたマイクロアレイである。前記マイクロアレイにおいて、配置される前記本発明のプローブの種類と数は特に限定されない。前記マイクロアレイの製造方法としては、特に制限されないが、例えば、基板表面で直接プローブのポリヌクレオチドを合成する方法（オンチップ法）や、予め調製したプローブを基板表面に固定する方法などの従来公知の方法などが挙げられる。前記オンチップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術及び固相合成技術とを組み合わせて、微小なマトリックスの所定の領域で選択的に合成を行なう方法などが挙げられる。また、前記予め調製したプローブを用いる方法としては、プローブ溶解液をインクジェット法により基板に微小滴下して、化学的又は物理的に固定する方法などが挙げられる。前記基板としては、特に制限されないが、例えば、ガラス、金属、プラスチックなどが挙げられる。本発明のマイクロアレイは、特に限定されないが、例えば、後述のとおり、本発明の腫瘍マーカーの検出に使用できる。
【００２６】
本発明の抗体は、ＣＸＣＬ１３タンパク質を特異的に認識する抗体である。ＣＸＣＬ１３タンパク質のアミノ酸配列は、前述のとおり、例えば、ＮＣＢＩのタンパク質データ−ベースにおいて、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＰ＿００６４１０により入手できる。抗体の製造方法は、従来公知の方法により製造できる。例えば、抗体がポリクローナル抗体の場合は、従来公知の方法により大腸菌などで発現し精製されたＣＸＣＬ１３タンパク質を用いて、又は、従来公知の方法によりＣＸＣＬ１３タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、ウサギなどの非人動物に免疫し、該免疫動物の血清から通常の方法により製造することができる。一方、モノクローナル抗体の場合は、従来公知の方法により大腸菌などで発現し精製されたＣＸＣＬ１３タンパク質を用いて、又は、従来公知の方法によりＣＸＣＬ１３タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成し、マウスなどの非人動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄細胞とを融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から作製することができる。また、本発明の抗体は、特に限定されないが、例えば、酵素標識、放射標識、及び蛍光標識などの従来公知の標識方法で標識してもよく、ビオチンなどにより適宜に修飾されてもよい。本発明の抗体の作製に免疫抗原として使用されるＣＸＣＬ１３タンパク質は、例えば、ＣＸＣＬ１３遺伝子の配列情報に基づいて、ＤＮＡのクローニング、プラスミドへの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養及び培養物からのタンパク質の回収などの操作により作製できる。本発明の抗体は、特に限定されないが、例えば、後述のとおり、本発明の腫瘍マーカーの検出に使用できる。
【００２７】
本発明のプロテインチップは、本発明の抗体が基板上に配置されたプロテインチップである。前記プロテインチップにおいて、配置される前記本発明の抗体の種類と数は特に限定されない。前記抗体の基板上の配置は、特に限定されないが、公知の方法、例えば、光架橋剤を用いる方法やレーザーアブレーションによる方法などにより行なうことができる。また、本発明のプロテインチップは、特に限定されないが、公知の方法、例えば、インクジェット方式など、マイクロアレイの作製と同様の方法により作製できる。また、前記基板としては、前記マイクロアレイの基板と同様のものを使用できる。本発明のプロテインチップは、特に限定されないが、例えば、後述のとおり、本発明の腫瘍マーカーの検出に使用できる。
【００２８】
本発明の腫瘍マーカーの検出用キットは、特に限定されないが、後述のとおり、本発明の腫瘍マーカーの検出に使用できる。本発明のキットは、特に限定されないが、前述のとおり作製した本発明のプローブ、プライマー、マイクロアレイ、抗体、及びプロテインチップからなる群から選択される少なくとも一つを含ませることにより作製できる。また、本発明のキットは、取り扱い説明書を含んでもよい。さらに、本発明のキットは、例えば、その利用目的によって、酵素、緩衝液、試薬などを含むことができる。
【００２９】
本発明のキットの第１の態様として、本発明のプローブを含むキットが挙げられる。前記キットは、例えば、リアルタイムＰＣＲ法により本発明の腫瘍マーカーを検出する場合や、本発明のマイクロアレイを作製する場合などに使用できる。本発明のキットの第２の態様として、本発明のマイクロアレイを含むキットが挙げられる。前記キットは、さらに、被検試料からトータルＲＮＡを調製するためのプライマーや試薬、ターゲットを調製するための標識化された本発明のプライマーや試薬などを含んでもよい。前記試薬としては、特に限定されないが、従来公知の試薬が利用でき、例えば、ポリメラーゼ、標識化合物、及び緩衝液などが挙げられる。本発明のキットの第３の態様として、本発明の抗体を含むキットが挙げられる。前記キットは、さらに、前記抗体に対する標識化された二次抗体を含んでもよい。前記キットは、例えば、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法等により本発明の腫瘍マーカーを免疫学的に検出する場合や本発明のプロテインチップを作成する場合などに使用できる。本発明のキットの第４の態様として、本発明のプロテインチップを含むキットが挙げられる。前記キットは、さらに、酵素標識化された前記抗体に対する二次抗体や、発色試薬などを含んでもよい。
【００３０】
本発明の腫瘍マーカーの使用方法は、特に限定されないが、従来公知の腫瘍マーカーの使用方法と同様の方法でよい。例えば、被検試料を準備する準備工程、前記試料中における腫瘍マーカーを検出する検出工程、及び前記検出結果に基づいて腫瘍マーカーの陽性を判定する判定工程を含む使用方法などが挙げられる。
【００３１】
まず、準備工程として、特に限定されないが、例えば、被験者の組織や細胞などの生体試料や、血清などの血液試料を被検試料として準備する。
【００３２】
次に、検出工程において、本発明の腫瘍マーカーの検出及び／又は定量を行う。ＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡを検出／定量する場合は、前記の被検試料から通常の方法によりＲＮＡを調製し、又は、該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを調製し、下記の方法などで検出／定量する。前記ＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡの定量は、絶対量として又は相対量として測定してもよい。測定操作の簡便性や正確性などの点から、内部標準や外部標準などを利用した相対量として測定することが好ましい。前記内部標準としては、βアクチン遺伝子やＧＡＰＤＨ遺伝子などが挙げられる。特定のｍＲＮＡを検出／定量する方法は、特に制限されないが、例えば、ノーザンブロッティング、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ＰＣＲ法，リアルタイムＰＣＲ法、マイクロアレイ法、及びｍＲＮＡを直接測定する方法などが挙げられる。ＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡの検出／定量には、本発明のプローブ、プライマー、マイクロアレイ、及びそれらを含むキットなどを適宜利用することができる。前記リアルタイムＰＣＲ法としては、例えば、前記被検試料からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに逆転写し、そのｃＤＮＡを鋳型に目的領域をＰＣＲで増幅し、リアルタイムモニタリング用試薬を用いて増幅産物の生成過程をリアルタイムでモニタリングして解析する方法などが挙げられる。前記マイクロアレイ法としては、例えば、本発明の腫瘍マーカーに対応するプローブが配置されたマイクロアレイを準備し、前記マイクロアレイに、前記被検試料中の本発明の腫瘍マーカーを鋳型として調製した標識化ターゲットをハイブリダイズさせ、前記プローブに結合した前記ターゲットの標識シグナルを測定して解析する方法などが挙げられる。前記ｍＲＮＡを直接測定する方法としては、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標：Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）ＲＮＡアッセイなどが挙げられる。
【００３３】
なお、検出工程において、ＣＸＣＬ１３タンパク質を検出／定量する場合は、前記の被検試料から通常の方法によりタンパク質を調製し、下記の方法などで検出／定量する。特定のタンパク質を検出／定量する方法は、特に限定されないが、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プロテインチップ法などが挙げられる。また、ＣＸＣＬ１３タンパク質の検出／定量には、本発明の抗体、プロテインチップ、及びそれらを含むキットなどを適宜使用することができる。なお、ＣＸＣＬ１３タンパク質は、特に限定されないが、例えば、被検試料中のタンパク質の濃度として検出／定量することができる。前記ＥＬＩＳＡ法としては、例えば、前記被検試料から調製したＣＸＣＬ１３タンパク質を含む溶液をマイクロプレートのウェルの固相表面に吸着させた後、ＣＸＣＬ１３タンパク質に特異的な抗体を加え、酵素反応により検出／定量する方法などが挙げられる。前記プロテインチップ法としては、例えば、ＣＸＣＬ１３タンパク質に特異的な抗体を配置したプロテインチップに、前記被検試料から調製したＣＸＣＬ１３タンパク質を加え、抗体抗原反応をさせた後、標的タンパク質のシグナルを検出し、解析する方法などが挙げられる。
【００３４】
最後に、判定工程において、前記検出工程の検出結果に基づいて本発明の腫瘍マーカーが陽性か否かを判定する。本発明において、腫瘍マーカーが陽性であるとは、被験者の腫瘍マーカーの測定値が基準値より大きい場合をいう。
【００３５】
前記の検出工程においてＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡを定量した場合の基準値は、特に限定されないが、当該技術分野の当業者であれば、健常者や頭頸部癌症例などにおける前記ＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡの測定値を統計学的に処理した値に基づいて定めることができる。前記基準値としては、例えば、健常者における前記ＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡの測定値の平均の２倍、３倍、４倍、５倍、及びそれ以上の値などが挙げられ、被験者のＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡの測定値が基準値以上である場合は、陽性と判断される。なお、前記ＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡの測定値は、上述のとおり、絶対量として又は相対量としての測定値のいずれであってもよい。
【００３６】
前記検出工程において、ＣＸＣＬ１３タンパク質を定量した場合の基準値は、特に限定されないが、当該技術分野の当業者であれば、健常者や頭頸部癌症例などにおけるＣＸＣＬ１３タンパク質の測定値を統計学的に処理した値に基づいて定めることができる。前記基準値としては、例えば、ＲＯＣ（Ｒｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｃｕｒｖｅ）曲線で決定するカットオフ値などが挙げられ、好ましくは、正診率が最大になる場合のカットオフ値などが挙げられる。
【００３７】
本発明のスクリーニング方法は、特に限定されないが、従来公知の方法と同様の方法でよい。例えば、被検物質と本発明の腫瘍マーカーを発現している細胞とを接触させる工程、及び前記腫瘍マーカーの発現量を減少させる被検物質を選択する工程を含むスクリーニング方法などが挙げられる。前記スクリーニング方法は、さらに、被検物質と接触させた細胞における前記腫瘍マーカーの発現量を測定する工程、被検物質と接触させていない対照細胞における前記腫瘍マーカーの発現量を測定する工程、前記測定結果を比較する工程を含んでもよく、その場合、前記の比較結果に基づいて、前記腫瘍マーカーの発現量を減少させる被検物質を選択することができる。前記腫瘍マーカーの発現量は、具体的には、ＣＸＣＬ１３ｍＲＮＡ又はＣＸＣＬ１３タンパク質を定量することにより測定することができる。
【００３８】
本発明のスクリーニングに用いられる細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＸＣＬ１３遺伝子を発現する培養細胞全般が挙げられる。前記培養細胞としては、特に限定されないが、例えば癌患者より単離、調製した生体組織や血球由来の細胞、又はＣＸＣＬ１３遺伝子を導入した細胞などが挙げられる。また、培養細胞における前記ＣＸＣＬ１３遺伝子の発現の有無は、公知の方法、例えば、ウエスタンブロット法などにより容易に確認することができる。前記細胞と被検物質とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死滅せずかつ本発明の腫瘍マーカー遺伝子を発現できる培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）が好ましい。前記スクリーニング方法は、例えば、ＣＸＣＬ１３遺伝子の発現量を低下させる物質を探索することによって頭頸部癌を抑制する候補物質を提供する。
【００３９】
本発明は、例えば頭頸部癌、好ましくは頭頸部扁平上皮癌、さらに好ましくは頭頸部癌の早期癌の診断及び治療における本発明の腫瘍マーカーの使用を含む。前記本発明の腫瘍マーカーの使用は、特に限定されないが、例えば、頭頸部癌の早期発見や治療過程のモニタリングの補助ツールとしての使用などが挙げられる。さらに、本発明は、本発明の腫瘍マーカーを使用又は検出することを含む、例えば頭頸部癌、好ましくは頭頸部扁平上皮癌、さらに好ましくは頭頸部癌の早期癌の診断方法及び治療方法を含む。具体的には、本発明は、本発明の腫瘍マーカー、プローブ、プライマー、抗体、マイクロアレイ、プロテインチップ、キット、使用方法、及びスクリーニング方法などによる、例えば頭頸部癌、好ましくは頭頸部扁平上皮癌、さらに好ましくは頭頸部癌の早期癌の診断、治療、診断方法及び治療方法を含む。
【００４０】
以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明は、これに限定されない。
【実施例１】
【００４１】
（頭頸部癌の腫瘍マーカーの同定）
頭頸部扁平上皮癌４５症例を対象とし、比較対照例として正常粘膜組織３例を用いた。前記各症例の原発腫瘍及び正常粘膜組織を機械的にホモジナイズした後、Ｉｓｏｇｅｎ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出し、精製した。前記トータルＲＮＡ１μｇをケミルミネッセントＲＴ−ＩＶＴラベリングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて増幅し、ジゴキシゲニン（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）標識ｃＲＮＡを合成した。前記合成ｃＲＮＡをヒトゲノムサーベイマイクロアレイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にハイブリダイゼーションさせた。その後、ケミルミネッセントディテクションキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて洗浄、発色させ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｙｔｅｍｓ  １７００マイクロアレイアナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて２９９０８個のヒト全遺伝子の発現量を定量した。各症例及び対照例の遺伝子発現量の比較は、ソフトウエアＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（Ｓｉｋｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）を用いて解析した。
【００４２】
（結果）
まず、正常粘膜組織と比較して、頭頸部扁平上皮癌の腫瘍組織においてのみ共通して３倍以上の発現亢進を認める遺伝子を２７８種類同定し、その中より、分泌型の可溶性タンパク質であるＣＸＣＬ１３を新規腫瘍マーカーとして同定した。
【実施例２】
【００４３】
本実験は愛媛大学医学部附属病院臨床研究倫理審査委員会での承認を受け、人権保護への配慮などを明記した同意書をもとに説明の上、同意の得られた患者及び健常者を被験者として行われた。前記被験者から血液を採取し室温で１時間放置した後、４℃で３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し血清を抽出した。
【００４４】
（ＣＸＣＬ１３の頭頸部癌の腫瘍マーカーとしての有用性）
頭頸部扁平上皮癌におけるＣＸＣＬ１３の腫瘍マーカーとしての有用性を検討した。対象は未治療の頭頸部扁平上皮癌患者５３名、健常者２５名とした。ＣＸＣＬ１３は、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  ＣＸＣＬ１３／ＢＬＣ／ＢＣＡ−１  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、血清１００μｌにおけるＣＸＣＬ１３タンパク質を測定した。その結果について、図１に示した。
【００４５】
（結果）
図１に示したとおり、血清のＣＸＣＬ１３タンパク質の濃度は、担癌患者で  ９０．０±９５．０  ｐｇ／ｍｌであり、健常者では３６．２±２２．０  ｐｇ／ｍｌであり、担癌患者では健常者と比較して有意に高値（Ｐ値は０．０００１７１９４９である）を示した（図１）。以上の結果から、血清のＣＸＣＬ１３は、腫瘍マーカーとりわけ頭頸部癌の腫瘍マーカーとして有用であることが分った。
【００４６】
（病期分類別比較検討）
担癌患者をＵＩＣＣ（Ｕｎｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｉｓ  Ｃｏｎｔｒａ  Ｃａｎｃｒｕｍ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ）の分類に従った病期分類別に分類し、血清のＣＸＣＬ１３タンパク質の濃度の検討を行なった。その結果を図２に示す。また、既存の腫瘍マーカーであるＳＣＣについても、アーキテクト・ＳＣＣ（アボットジャパン社製）を用いて、血清１５０μｌにおけるそのタンパク質を測定し、口腔扁平上皮癌の診断を受けた患者１３２名及び健常者３３名との比較検討を行った。その結果を図３に示す。
【００４７】
（結果）
図２に示すとおり、血清のＣＸＣＬ１３タンパク質の濃度は、早期癌（ステージＩ、ステージＩＩ）では７２．４±５２．５ｐｇ／ｍｌであり、進行癌（ステージＩＩＩ、ステージＩＶ）では１０４．７±１１８．４ｐｇ／ｍｌであった。血清のＣＸＣＬ１３タンパク質の濃度は、早期癌と進行癌で共に健常者よりも有意に（Ｐ値は、それぞれ、０．００３８５９６８と０．００４６５３２８である）高値を示した（図２）。また、図３に示したとおり、血清のＳＣＣタンパク質の濃度は、早期癌では１．１２±０．５１ｎｇ／ｍｌであり、進行癌では１．９２±１．７８ｎｇ／ｍｌであり、健常者では１．２±０．５５ｎｇ／ｍｌであった。血清のＳＣＣタンパク質の濃度については、進行癌では健常者との有意差を認めるものの（Ｐ値は０．００６７５０４９である）、早期癌では有意差を認めることはできなかった。以上の結果により、血清のＣＸＣＬ１３は、腫瘍マーカーとりわけ頭頸部癌、特に、早期癌の腫瘍マーカーとして、極めて有用であることが分った。
【００４８】
（頭頸部癌の腫瘍マーカーを用いた腫瘍の診断の比較検討）
腫瘍の診断とりわけ頭頸部癌の診断を行なう場合の、腫瘍マーカーとしてのＣＸＣＬ１３とＳＣＣについて比較検討を行なった。具体的には、図４のとおり、まず、ＣＸＣＬ１３のカットオフ値を決定するために縦軸に感度、横軸に１−特異度（偽陽性率）をとり、ＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｃｕｒｖｅ）曲線を設定した。次に、Ｙｏｕｄｅｎ指数（感度＋特異度−１）が最大、すなわち正診率が最大となるようにＣＸＣＬ１３のカットオフ値を設定した結果、カットオフ値は５０ｐｇ／ｍｌとなった。ＣＸＣＬ１３を腫瘍マーカーとして、前記カットオフ値に基づいて頭頸部癌の腫瘍の陽性を判断した場合、感度は７１％、特異度は８０％、正診率は７４．３％であった。なお、ＳＣＣについては、通常の臨床診断に用いるのと同様に１．５ｎｇ／ｍｌをカットオフ値とし、それ以上を陽性とした。この場合、ＳＣＣの頭頸部扁平上皮癌早期癌に対する感度は７％、特異度は８７．９％、正診率は３６．７％であり、進行癌に対する感度は３４．７％、正診率は５４．９％となった。以上の結果から、ＣＸＣＬ１３を腫瘍マーカーとした場合、頭頸部癌とりわけ頭頸部扁平上皮癌に対する感度、特異度、及び正診率のすべてにおいて優れており、特に、早期癌に対しては、感度、特異度、及び正診率が共に非常に優れていることが分った。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は、頭頸部癌の腫瘍マーカーとして利用でき、例えば、頭頸部癌頭の診断及び治療の分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】頭頸部扁平上皮癌患者と健常者における血清のＣＸＣＬ１３タンパク質の濃度を比較した結果を示す図である。
【図２】頭頸部扁平上皮癌の早期癌患者、進行癌患者、及び健常者における血清のＣＸＣＬ１３タンパク質の濃度を比較した結果を示す図である。
【図３】頭頸部扁平上皮癌の早期癌患者、進行癌患者、及び健常者における血清のＳＣＣタンパク質の濃度を比較した結果を示す図である。
【図４】血清のＣＸＣＬ１３タンパク質濃度のＲＯＣ曲線を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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