(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１に示す繰り返し構造を有するジアリルアミン二酸化硫黄共重合物またはその塩を含む組成物と遺伝子の混合物を細胞に接触させることを特徴とする、遺伝子の細胞内導入方法。
【化１】
0005510333.tif 000006
（ｎは１以上の整数を表す）
【請求項２】
上記ジアリルアミン二酸化硫黄共重合物またはその塩が、該ジアリルアミン二酸化硫黄共重合物の塩である、請求項１に記載の遺伝子の細胞内導入方法。
【請求項３】
塩が、酢酸、リン酸および塩酸から選ばれる一種類以上の酸の塩である、請求項２に記載の遺伝子の細胞内導入方法。
【請求項４】
酸が塩酸である、請求項３に記載の遺伝子の細胞内導入方法。
【請求項５】
上記組成物に、上記ジアリルアミン二酸化硫黄共重合物またはその塩が１ｎｇ／ｍＬから２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子の細胞内導入方法。
【請求項６】
上記混合物がポリエチレングリコールをさらに含む、請求項１に記載の遺伝子の細胞内導入方法。
【請求項７】
遺伝子が、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡまたは一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡである、請求項１に記載の遺伝子の細胞内導入方法。
【請求項８】
前記混合物を細胞に噴霧することにより細胞に接触させる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子の細胞内導入方法。
【請求項９】
式１に示す繰り返し構造を有するジアリルアミン二酸化硫黄共重合物またはその塩を含む、遺伝子の細胞内導入用組成物。
【化２】
0005510333.tif 000007
（ｎは１以上の整数を表す）
【請求項１０】
上記ジアリルアミン二酸化硫黄共重合物またはその塩を１ｎｇ／ｍＬから２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ポリエチレングリコールをさらに含む、請求項９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式１に示すジアリルアミン二酸化硫黄共重合物またはその塩を用いることを特徴とする、遺伝子の細胞内導入方法及びそれに用いる組成物に関する。本発明の遺伝子の細胞内導入方法を用いることによって、遺伝子を簡便かつ経済的に細胞内に導入することが可能になる。ＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子を効率的に細胞内に導入できる方法は、医学、薬学、農学等のバイオ関連分野における研究手段、または遺伝子治療や癌細胞に対するターゲティング療法等の臨床場面で有用な技術的手段となる。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやＲＮＡのような遺伝子を細胞内に導入する方法として多くの提案がなされているが、未だ充分であるとはいえず、導入方法そのものが複雑であり、導入効率も低いという問題点を有している。例えば、ウイルスを利用して遺伝子を細胞内に導入する方法がある（例えば、非特許文献１参照）。しかし、ウイルスを使用する場合には導入遺伝子を煩雑な方法で精製する必要があり、ウイルスであるために意図していない細胞や組織に遺伝子が導入される危険がある。また、ウイルスであるため、バイオハザードの危険性も考慮する必要がある。【０００３】
また、リン酸カルシウム法がある（例えば、非特許文献２参照）。この方法はＤＮＡを含むリン酸カルシウム粒子をつくり、これをエンドサイトーシスで細胞内に取り込ませる方法である。しかし、この方法は操作が煩雑で導入効率が低い欠点がある。これを改良した方法としてカチオン性リポソームやカチオン性ポリマー等の試薬を利用して細胞内に物質を取り込ませる方法が提案されている（例えば、非特許文献３、４参照）。カチオン性リポソームはエンドサイトーシス過程を経て細胞内に取り込まれた後、細胞内のリソソーム等により分解され易いため遺伝子の導入効率が低いという問題があった。また、リポソームに使用する分子種の合成が複雑であるだけではなく、リポソーム化に要する超音波処理等の複雑な製法が必要である。また、遺伝子導入用のカチオン性ポリマーとしてポリエチレンイミンの直鎖構造を有するものが効果的とされている。しかしながら、入手可能な原料からポリエチレンイミンを合成しようとするには、エチレンイミンを用いて開環重合させる必要があるため、１、２、３級のアミンが混じった分岐構造となり、直鎖の分子を作るのは非常に難しい。【０００４】
これ以外にもエレクトロポレーションと呼ばれる方法が用いられることが多い（例えば、特許文献１参照）。この方法は遺伝子と細胞の懸濁した溶液に高電圧をパルス状にかけ、溶液中に含まれる遺伝子を細胞内に取り込ませる方法である。この方法は適用範囲が広く遺伝子導入効率が高い方法であるが、遺伝子の導入効率と細胞の致死率との間に比例関係があるため、細胞の致死と無関係に導入することができない。すなわち、パルス条件が不適切であると細胞内に目的とする物質が導入され難いだけではなく、細胞が死んでしまう欠点がある。また、トーイングといわれる溶液内への放電を防ぐため、細胞懸濁溶液の伝導度を下げなければならない。【０００５】
また、試薬、ウイルスを使用して細胞に遺伝子を導入する場合、特定の場所に導入することが難しく、取り分け、培地が存在し導入したい物質が拡散しやすい、シャーレに付着した細胞に対し狙った場所にのみ入れるのは非常に難しい。同様にしてエレクトロポレーションでも付着した細胞にそのまま導入することは難しく、細胞のはがれや細胞融合が生じやすい。【０００６】
このように、従来のウイルスや試薬を使用して細胞に遺伝子を導入する方法の場合、操作そのものが大変煩雑で実施し難いという技術上の問題点を有していた。また、特に培地が存在する場合、導入遺伝子溶液が拡散し、標的細胞が存在する部位を集中的に狙うことが難しく細胞のはがれや細胞融合が生じやすいという問題点を有していた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４９４５０５０号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】D. Yu, T. Shioda, A. Kato, M. K. Hasan, Y. Sakai, Y. Nagai, Genes Cells, 1997 vol.2(7), p457-66
【非特許文献２】F. L. Graham, A. J. Van Der Eb, Virology, 1973, vol. 52, p446-467.
【非特許文献３】P.L. Felgner, T. R. Gadek, M. Holm, R. Roman, H. W. Chan, M. Wenz, J. P. Northrop, G. M. Ringold, M. Danielsen, Proc. Natl. Acad. USA, Vol.84, p7413-7417.
【非特許文献４】D. Goula, J. Remy, P. Erbacher, M. Wasowicz, G. Levi, B. Abdallah, B. Demeneix, Gene Therapy, 1998, vol.5, p712-717.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、遺伝子の細胞内導入を促進する物質を含む組成物を用いた遺伝子の細胞内導入方法を確立し、提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、遺伝子の細胞内への取り込みを促進する物質について鋭意検討し、直鎖状のポリアミン類縁体、中でもジアリルアミン二酸化黄共重合体またはその塩を用いることによって、高い導入効率で、かつ極めて少ない毒性で、細胞内に遺伝子を導入することができることを見出し、本発明を完成するに至った。また、糖やポリエチレングリコールを共存させる、あるいはジェットプリンターなどの噴霧手段を使用することで、特定位置に存在する細胞を狙って遺伝子を細胞内に導入できることを見出し、本発明を完成するに至った、
すなわち、本発明は以下の（１）から（１１）に示す、式１に示すジアリルアミン二酸化硫黄共重合物またはその塩を用いることを特徴とする、遺伝子の細胞内導入方法及びそれに用いる組成物に関する。
（１）式１に示す繰り返し構造を有するジアリルアミン二酸化硫黄共重合物またはその塩を含む組成物と遺伝子の混合物を細胞に接触させることを特徴とする、遺伝子の細胞内導入方法。
【化１】
0005510333.tif 000002
（ｎは１以上の整数を表す）
（２）上記ジアリルアミン二酸化硫黄共重合物またはその塩が、該ジアリルアミン二酸化硫黄共重合物の塩である、（１）に記載の遺伝子の細胞内導入方法。
（３）塩が、酢酸、リン酸および塩酸から選ばれる一種類以上の酸の塩である、（２）に記載の遺伝子の細胞内導入方法。
（４）酸が塩酸である、（３）に記載の遺伝子の細胞内導入方法。
（５）上記組成物に、上記ジアリルアミン二酸化硫黄共重合物またはその塩が１ｎｇ／ｍＬから２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれる、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の遺伝子の細胞内導入方法。
（６）上記混合物がポリエチレングリコールをさらに含む、（１）に記載の遺伝子の細胞内導入方法。
（７）遺伝子が、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡまたは一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡである、（１）に記載の遺伝子の細胞内導入方法。
（８）前記混合物を細胞に噴霧することにより細胞に接触させる、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の遺伝子の細胞内導入方法。
（９）式１に示す繰り返し構造を有するジアリルアミン二酸化硫黄共重合物またはその塩を含む、遺伝子の細胞内導入用組成物。
【化２】
0005510333.tif 000003
（ｎは１以上の整数を表す）
（１０）上記ジアリルアミン二酸化硫黄共重合物またはその塩を１ｎｇ／ｍＬから２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む、（９）に記載の組成物。
（１１）ポリエチレングリコールをさらに含む、（９）に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の遺伝子導入能を有するカチオン性ポリマーとしてジアリルアミン二酸化硫黄共重合体を使用することによって、負電荷を有するＤＮＡ、ＲＮＡと複合体を形成し、この複合体により、高い遺伝子導入率で、しかも特定部位の細胞に導入することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】GFP遺伝子導入されたCHO細胞の蛍光顕微鏡写真
【図２】エレクトロスプレー実験装置図
【図３】エレクトロスプレー装置より全体に均一にスプレーされたCHO細胞の蛍光顕微鏡写真
【図４】エレクトロスプレー装置より直線状に遺伝子が導入されたCHO細胞の蛍光顕微鏡写真
【図５】FITC化されたジアリルアミン二酸化硫黄共重合物を使用しGFP遺伝子導入されたCHO細胞の蛍光顕微鏡写真
【図６】GFP遺伝子導入された浮遊細胞Jurkatでの蛍光顕微鏡写真
【図７】ジアリルアミン二酸化硫黄共重合物とプラスミドDNAを混合した電気泳動写真
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は細胞、特に動物細胞に負電荷を持つ物質を導入するのに使用するもので、式１に示すジアリルアミン二酸化硫黄共重合体またはその塩を含む組成物を用いる方法である。
【００１４】
本発明の方法は遺伝子であるＤＮＡ、ＲＮＡを対象とする細胞内への導入方法であり、式１の物質と遺伝子の混合物を細胞に接触させることによって細胞内に遺伝子を導入する方法である。なお、遺伝子の他に負電荷を有するものであれば、本発明の方法を有効に用いることが可能である。本発明でＤＮＡ、ＲＮＡは一本鎖または二本鎖の状態にあるものを使用することができる。これらのＤＮＡ、ＲＮＡは環状、直鎖どちらでも良く、合成、生物由来どちらでもかまわない。具体的にはプラスミド、ＰＣＲ産物、ウイルス由来ＤＮＡまたはＲＮＡ、核酸合成機由来のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノム分解物等が挙げられる。これらは蛋白質の発現やＲＮＡ干渉のような作用機能を起こすことが可能である。ＤＮＡ、ＲＮＡの分子量に関しては特に制限がないが、一般に小さいものの方が細胞に導入しやすいことは容易に予想できる。
本発明で使用する式１で示されるジアリルアミン二酸化硫黄共重合体の分子量について特に制限を設けていないが、入手のし易さ等から分子量３００から２０００００のものが好ましく、分子量１０００から１００００のものがより好ましい。
【００１５】
式１に記載される物質は塩として提供されることが多い。使用する塩は溶解性、導入性、細胞に対する毒性を考慮して使用すればよい。酸根を有しないジアリルアミン二酸化硫黄共重合体はアルカリ性で溶解性が低くなることから、pH調整と溶解性向上のために塩として使用するのが好ましい。本発明で使用する酸根は鉱酸、有機酸のいずれでも良く、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、臭化水素酸、フッ酸、ヨウ化水素酸、リン酸、ジリン酸、トリリン酸、ポリリン酸、酢酸、乳酸、クエン酸、炭酸、酒石酸、シュウ酸、ホウ酸等が挙げられる。これらのうち、溶解性や導入性が優れていることから塩酸、リン酸、酢酸が好ましく、特に一価の鉱酸である塩酸は溶解性が良いことから調合性、導入性に優れていることから好ましい。
【００１６】
式１に示す構造を繰り返し単位として有していれば遺伝子導入に有効であり、必要に応じて修飾することも可能である。修飾の方法としてはアミノ基に置換基を導入するのが容易であり、例えば、ポリエチレングリコール基のような膜親和性を変えるような置換基、蛍光を持つ置換基、またはビオチンを結合させた置換基が有用である。置換基の導入割合は全アミノ基の０．１％から３０％以下が好ましく、より好ましくは０．２％から１０％である。置換基を多く入れると細胞への物質導入能が減少することが予想され、その能力を勘案して置換基を入れなければならない。導入する置換基としては、蛋白質やペプチドのアミノ基標識に使用されている標識試薬を使用することで導入することが出来る。具体的には4-fluoro-7-nitrobenzofurazan、fluoresein-4-isothiocyanate、N-ethyl-N’-[5-(N”-succinimidyloxycarbonyl)pentyl]-3,3,3’,3’-tetramethy-2,2’-indodicarbocyanine chloride, HiLyte Fluor 555 labeling kit (同仁化学製)、HiLyte Fluor 647 labeling kit (同仁化学製)、Biotin Labeling kit(同仁化学製)、polyethyleneglycol iodide 等である。
【００１７】
ジアリルアミン二酸化硫黄共重合体は、通常、適当な濃度に希釈した溶液の形態で使用され、この溶液が、本発明の遺伝子の細胞内導入用組成物に相当する。ただし、本発明の遺伝子の細胞内導入用組成物は、下記に記載するように、ジアリルアミン二酸化硫黄共重合体以外に、糖やポリエチレングリコールなどの他の成分を含有してもよい。該溶液中のジアリルアミン二酸化硫黄共重合体の濃度は、１ｎｇ／ｍＬから２００ｍｇ／ｍＬがよく、特に１０ｎｇ／ｍＬから１０ｍｇ／ｍＬがよい。本発明の方法では、まず、負電荷を有する物質としてＤＮＡ、ＲＮＡ類と式１の物質を混合することにより、両者の複合体を形成させる。複合体は、遺伝子であるＤＮＡ、ＲＮＡの1塩基当たり本発明の化合物の１つのアミノ基が対応し形成すると考えている。このような混合比が理想的であろうと考えられるが、培地、細胞の状態によって変化させることが可能である。すなわち（使用するＤＮＡ、ＲＮＡの塩基）／（式1の物質のアミノ基）が０．００１から１０００で使用することが好ましく、０．０１から１００で使用するのがより好ましい。
【００１８】
このようにして形成された遺伝子とジアリルアミン二酸化硫黄共重合体との複合体を細胞と接触させることによって、該複合体を細胞に取り込ませることが可能になる。すなわち、本発明者は実施例に示す結果等から導入の機構を以下のように予測している。ＤＮＡ、ＲＮＡは一つのリン酸基当たり、ジアリルアミン二酸化硫黄共重合体の一つのアミノ基と塩形成を行い、全体としての電荷が負から正へと変化する。その際、二重螺旋構造のような構造をとっていてもそれは維持されたまま、電荷の変化は生じる。電荷が変化した複合体は細胞に付着しやすく、エンドサイトーシスで取り込まれ易くなり、また細胞内で複合体は解離して転写可能になると考えている。
【００１９】
細胞に添加する際、血清入り培地、無血清培地、バッファー、生理食塩水等の細胞に悪影響の少ない環境で行うのが良い。より好ましくは血清の入っていない環境で行うのが良い。通常、細胞培養培地として緩衝能を有するものを用いることが多いため、使用する式1の物質溶液のｐＨに特に制限はないが、より厳密には、好ましくはｐＨ２から１１、より好ましくはｐＨ５から９のものを用いることが望ましい。
【００２０】
本発明の対象となる細胞は、付着性または浮遊性の細胞の何れでもよく、特に制限はないがなく、例えば、植物細胞のような細胞壁を有する細胞では、導入遺伝子との複合体と接触させる前に、セルラーゼ等で処理することにより、細胞内への導入効率を上げることも可能である。
【００２１】
式１の物質とＤＮＡ、ＲＮＡ複合体を浸透圧、細胞保護のために糖やポリエチレングリコールと共存して使用できる。糖の具体的例としてはショ糖、グリセリンアルデヒド、トレオース、アラビノース、キシロース、リボース、リブロース、キシルロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、タガトース、アロース、アルトース、グロース、イドース、タロース、ソルボース、プシコース、果糖、トレハロース、トレイトール、エリトリトール、アドニトール、アラビトール、キシリトール、タリトール、ソルビトール、マンニトール、イジトール、ズルシトール、イノシトール、水あめ、還元水あめ、パラチニット、寒天、カルボキシメチルセルロース、カラギーナン、でんぷん加水分解オリゴ糖等が挙げられる。特にポリエチレングリコールは粘度を上げることで液の拡散希釈を抑制することができるため、特定の場所の細胞に集中的に遺伝子を導入することが可能になる。ポリエチレングリコールは細胞毒性が低いためにこのような使用を行うことができる。これらは浸透圧、粘度で適切になるような濃度に添加されれば良い。好ましくは０．０１％から９９％が添加成分で残りを式1の物質と導入物質や水で構成するのが良い。より好ましくは１から９０％である。添加方法はＤＮＡ、ＲＮＡと式１の化合物を混合した後にこれにポリエチレングリコールを混合して細胞に添加する。または、ＤＮＡ、ＲＮＡと式１の化合物を混合したものをポリエチレングリコールと混合された細胞に添加すればよい。
【００２２】
また、本発明の組成物を使用し、かつジェットプリンターなどの噴霧手段により上記複合体を細胞に対して噴霧することで狙った場所に導入することができる。ジェットプリンターは低価格で高精度に噴霧できる手段として広く採用されている。これを細胞へのＤＮＡ、ＲＮＡの導入に使用することで、細胞の情報伝達の仕組みを解明する研究に使用することや細胞の発生、分化、機能解析に使用する重要な技術的ツールとして、安価かつ簡単な操作で使用することが可能になる。ジェットプリンターの液を飛ばす噴射機構については特に断りがない。特にエレクトロスプレーを利用した方法は温度をかけることなく行うことができ好ましい。また、エレクトロスプレーを使用することでジェットプリンターの走査間隔を密にしなくても均一に噴射付着させることができる。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例および比較例をもって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例にのみ限定されるわけではない。
実施例１
１．細胞導入剤溶液の調製
式１に示す細胞導入剤を含む組成物として、ジアリルアミン二酸化硫黄共重合体（以下、PDASと略記することがある）塩酸塩の20wt%水溶液（PAS-92、分子量5,000日東紡製）を用い、以下の（ａ）から（ｅ）に示す細胞導入剤溶液を調製した。
（ａ）中和水溶液（濃度2mg/mL、pH6.5）：PDAS塩酸塩の20wt%水溶液を10wt%水酸化ナトリウム水溶液と水を用いて中和希釈し、2mg/mL濃度のPDAS中和水溶液（pH6.5）を調製した。
（ｂ）塩酸酸性水溶液（濃度2mg/mL、pH2）：PDAS塩酸塩の20wt%水溶液を水で希釈し、2mg/mL濃度のPDAS塩酸酸性水溶液（pH2）を調製した。
（ｃ）アルカリ性水溶液（濃度2mg/mL、pH12）：PDAS塩酸塩の20wt%水溶液50μLに10wt%水酸化ナトリウム水溶液100μLを加え、生成した遊離体の白色沈殿物を遠心分離した後、水を加えることによって再溶解し、2mg/mL濃度のPDASアルカリ性水溶液（pH12）を調製した。
（ｄ）リン酸酸性水溶液（濃度2mg/mL、pH5）：PDAS塩酸塩の20wt%水溶液50μLに10wt%水酸化ナトリウム水溶液100μLを加え、生成した遊離体の白色結晶を遠心分離した後、85wt%リン酸水溶液10μLと水を加えることによって再溶解し、2mg/mL濃度のPDASリン酸塩水溶液（pH5）を調製した。
（ｅ）硫酸塩水溶液（濃度2mg/mL、pH1）、同（濃度5mg/mL、pH1）：PDAS塩酸塩の20wt%水溶液50μLに10wt%水酸化ナトリウム水溶液100μLを加え、生成した遊離体の白色結晶を遠心分離した後、濃硫酸10μLと水を加えることによって再溶解し、2mg/mL濃度のPDAS硫酸塩水溶液（pH1）を調製した。また、最終的に加える水の量を変えて、濃度5mg/mLのPDAS硫酸塩水溶液(pH1）を調整した。
（ｆ）酢酸塩水溶液（濃度2mg/mL、pH6）：PDAS塩酸塩の20wt%水溶液50μLに10wt%水酸化ナトリウム水溶液100μLを加え、生成した遊離体の白色結晶を遠心分離した後、酢酸10μLと水を加えることによって再溶解し、2mg/mL濃度のPDAS酢酸塩水溶液（pH6）を調製した。
２．（ａ）中和水溶液を用いての遺伝子細胞内導入試験
細胞内導入物質として緑色蛍光蛋白遺伝子組み込みプラスミドDNA（4.7kbp）、導入細胞としてチャイニーズハムスターの卵巣から生検樹立された繊維芽細胞（CHO細胞）を、細胞導入剤溶液として（ａ）の中和水溶液を用いて遺伝子の細胞内導入効率に対する影響を検討した。
直径3.5cmのポリスチレン製シャーレにCHO細胞をまき、α-MEM培地＋10%牛胎児血清（FBS）の培地で、CO2インキュベーター中37℃で培養したものを使用した。濃度100μｇ/mLのプラスミドDNA水溶液（pH7）50μLを、（ａ）の中和水溶液（2mg/mL、pH6.5）10μLに加えて混合した後、10分間、室温でインキュベートした。これを前記の培地2mLの入った細胞濃度150×104cell/dishのシャーレに加えた。一夜培養後、NIKON製顕微鏡TE-2000Sを使用し、高圧水銀ランプを光源として蛍光フィルターNIKON製GFPブロックを使用して対物レンズ10倍でプラスミドDNAの細胞内導入率の程度を観察した。その結果、27%の細胞が蛍光を発しており、遺伝子の導入が確認された。その蛍光顕微鏡写真を図1に示す。【００２４】
実施例２〜７、および比較例１、２
実施例1で調製した各細胞導入剤溶液を用いて実施例と同様にしてプラスミドDNAの細胞内導入試験を行った。その結果を表1に示す。実施例1で作成した試薬は遺伝子の細胞内導入を促進する作用を有しており、中でも導入試薬のｐHが中性付近の場合において、より高い遺伝子導入効率が認められた。それに対して、本細胞導入剤を使用しない場合や一般的に販売されているポリエチレンイミンでは導入されなかった。【００２５】
【表１】
0005510333.tif 000004
【００２６】
実施例８から１３
前記プラスミドDNA（濃度100μg/mL）50μLと実施例1で調整したジアリルアミン二酸化硫黄共重合物塩酸塩(2mg/mL,pH6.5) 10μLを混合し30分以上室温でおいた。これに添加物を加え混合した。シャーレから培地を抜き、リン酸バッファー（本発明のリン酸バッファー(PBS)はKH2PO40.21g/L, NaCl 9.0g/L, Na2HPO4・7H2O 0.726g/L の混合水溶液(pH7.2)を全ての実施例で使用した）で2回洗浄し、さらにPBS100μL加えた状態で上記混合液を加えた。2分後培地を加えた。実施例2と同様に評価した。その結果を表２に示す。【００２７】
【表２】
0005510333.tif 000005
【００２８】
実施例１４
前記の実施例8と同様にしてプラスミドDNA（濃度100μg/mL）50μLと実施例1で調整したジアリルアミン二酸化硫黄共重合物塩酸塩(2mg/mL,pH6.5) 10μLを混合し30分以上室温でおいた。これにポリエチレングリコール分子量5000を0.07g添加して混合した。シャーレから培地を抜き、リン酸バッファーで洗浄し、このリン酸バッファー100μL加えた。シャーレの右半分にこの混合液を加え、2分間置いた。培地を加え一晩培養した。
その結果、右半分の遺伝子導入効率は6%であったが、左半分の遺伝子導入効率は0.5%以下であった。このように添加した位置にだけ遺伝子導入が生じ、そのほかの部分では極端に抑制された。【００２９】
実施例１５
図２に示す構造を持つ静電噴霧型のプリンターを使用した。武蔵エンジニアリング製3軸制御ディスペンサロボット（SHOTmini SL）1に高圧電源2を接続することで静電噴霧型のプリンターを作製した。金属製チューブ3はPEEK製チューブ(内径0.25mm, 外径1/16インチ、長さ3cm)4に接続している。この部分はディスペンサロボットにより移動することが出来る。金属性チューブ3はシリンジポンプ5にテフロン（登録商標）チューブで接続している。高圧電源2からの高電圧は高電圧ケーブルで金属製チューブ3に伝えられ、PEEK製チューブ4の先端から静電噴霧される。ディスペンサロボットのステンレス天板6は高圧電源1のアースラインと接続している。この上に細胞の入ったポリスチレン製シャーレ7があり、天板とシャーレ内部は同電位になるようにステンレスリボンで電気的につながっている。この装置を使用して遺伝子導入の実験を行った。
前記プラスミドDNA(100μg/mL) 2mLとジアリルアミン二酸化硫黄共重合物塩酸塩(2mg/mL, pH6.5) 400μLを混合し、水1600μLを加えた。これをポンプで供給する溶液とした。CHO細胞を3日間培養し、細胞濃度20×104cell/dishにした。培地を抜き、リン酸バッファーで2回洗った。リン酸バッファー100μL加え、スプレー開始から3分後に培地を加えた。
高さ2cmで＋10kV電圧を印加した。ノズルの移動は6mm間隔のラインを描くように移動し、3mL/hrの液供給スピードでおよそ1分間スプレーした。図3に蛍光顕微鏡写真を示す。シャーレ全体均一に導入されており、66%の導入効率であった。【００３０】
実施例１６
実施例15と同様に実験を行った。ただし、電圧-10kVに変え、液の供給スピードを6mL/hrで行った。その結果、71%の効率であった。【００３１】
実施例１７
実施例15と同様に実験を行った。ただし、電圧+10kVに変え、液の供給スピードを0.3mL/hrで行った。その結果を図4に示す。スプレーした場所に導入されており、位置特異的であった。【００３２】
実施例１８
蛍光標識化
ジアリルアミン二酸化硫黄共重合体塩酸塩(分子量5000)20%品を水で希釈しpHをNaOHで7に調整し、20mg/mLの濃度にした（PAS-92 20mg/mL）。また、同仁化学製Fluorescein-4-isothiocyanate (FITC)をジメチルスルホキシドに溶解し、１０mg/mLの濃度にした。上記PAS-92 (20mg/mL) 1mLにFITC (１０mg/mL)160μL（ジアリルアミン二酸化硫黄共重合体塩酸塩(分子量5000)の分子1個当たり1個の蛍光基に相当する量）を加え混合した。37℃で1.5時間処理した。これに水を加え、PAS-92として2mg/mLにした（FITC-PAS）。培地を抜いた後、CHO細胞をリン酸バッファーで洗浄してリン酸バッファー100μL加えた。ここにFITC-PAS10μLと前記プラスミドDNA100μLを混合したものを加えた。一晩培養後、培地を入れ替え、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図5に示すように蛍光を発した細胞が得られた。【００３３】
実施例１９
浮遊性細胞での例
ヒトリンパ球培養細胞Jurkatを使用して実験を行った。培地はRPMI1640（GIBCO製）に10%FBSを使用した。CO2インキュベーターで培養し、遠心分離して培地を捨て、リン酸バッファーで懸濁した細胞（360×104cell/mL）100μLを3.5cmシャーレに加えた。前記プラスミドDNA(100μg/mL)50μLとジアリルアミン二酸化硫黄共重合物塩酸塩(2mg/mL, pH6.5) 10μLを混合して10分以上置いたものを細胞に混合した。15分室温で置いた後、培地を加え、翌日蛍光顕微鏡観察した。図6に蛍光顕微鏡写真を示す。
浮遊性細胞でも本発明は有効であった。【００３４】
比較例３
実施例19と同様にJurkatを使用した。PDASを使用せず、前記プラスミドDNAのみを細胞に添加して15分間室温に置いた。同様に評価を行ったが蛍光を発する細胞は見られず、遺伝子の導入は確認できなかった。【００３５】
実施例２０
電気泳動とUVスペクトル
前記プラスミドDNA（100μg/mL）100μLにジアリルアミン二酸化硫黄共重合物塩酸塩(2mg/mL,pH6.5)を1/10に希釈した溶液を混合した。PDASのアミノ基/ DNAのリン酸基が0, 0.5, 1, 2, 4の混合比で行い、その混合液から10μLをインビトロジェン社製ローディングバッファー1μLと混合してから１％アガロースゲルにのせた。
アガロースゲルで電気泳動し、エチジュウムブロマイドで染色した。これを以下の図7に示す。ジアリルアミン二ｓ酸化硫黄共重合物塩酸塩のアミノ基とDNAの塩基1対1で対応しており、DNAのリン酸基とPDASのアミノ基が塩を形成していると考えられる。さらに鮭精子由来のDNAにジアリルアミン二酸化硫黄共重合物塩酸塩を過剰に混合し、紫外可視スペクトルを測定したが吸光度、最大吸収波長に変化はなかった。ジアリルアミン二酸化硫黄共重合物は二重螺旋構造を維持したまま、遺伝子の電荷を変化させていた。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明の遺伝子の細胞内導入方法は、遺伝子を簡便かつ経済的に細胞内に導入することを可能とし、ＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子を効率的に細胞内に導入でき、医学、薬学、農学等のバイオ関連分野における研究手段、または遺伝子治療や癌細胞に対するターゲティング療法等の臨床場面で有用な技術的手段として利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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