(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光を試料に照射し、非線形光学効果により前記試料から発せられる非線形物体光を観察する非線形顕微鏡において、
前記試料の観察面において前記励起光を走査する走査手段と、
前記励起光から前記非線形物体光と同じ角振動数の参照光を生成する参照光生成手段と、
前記参照光の位相をシフトする位相シフト手段と、
前記非線形物体光と前記参照光との第１の干渉光を検出する検出手段と、
前記第１の干渉光に基づく第１の画像を生成する画像生成手段と、
前記第１の画像に基づいて前記非線形物体光の複素振幅を計算する計算手段と、
前記非線形物体光の複素振幅の位相を補正する補正手段と
を備え、
前記位相シフト手段は、前記観察面における前記励起光の位置が所定の方向に所定の距離だけ移動する毎に、前記参照光の位相を所定の角度ずつシフトし、
前記走査手段、前記位相シフト手段、および、前記検出手段により、角振動数が前記参照光と同じ照射光を前記試料の前記観察面において走査することにより発せられる線形物体光と、前記参照光との第２の干渉光をさらに検出し、
前記画像生成手段は、前記第２の干渉光に基づく第２の画像をさらに生成し、
前記計算手段は、前記第２の画像に基づいて前記線形物体光の複素振幅をさらに計算し、
前記補正手段は、前記線形物体光の複素振幅の位相に基づいて、前記非線形物体光の複素振幅の位相を補正する
ことを特徴とする非線形顕微鏡。
【請求項２】
前記走査手段は、前記励起光の進行方向を変化させることにより前記観察面において前記励起光を走査し、
前記位相シフト手段は、前記走査手段の動きに同期して前記参照光の位相をシフトする
ことを特徴とする請求項１に記載の非線形顕微鏡。
【請求項３】
前記走査手段は、前記試料が載置されているステージを移動させることにより前記観察面において前記励起光を走査し、
前記位相シフト手段は、前記ステージとともに移動し、前記参照光が入射する位置によって前記検出手段までの前記参照光の光路長を変化させることにより、前記参照光の位相をシフトする
ことを特徴とする請求項１に記載の非線形顕微鏡。
【請求項４】
励起光を試料に照射し、非線形光学効果により前記試料から発せられる非線形物体光を観察する非線形顕微鏡において、
前記試料の観察面において前記励起光を走査する走査手段と、
前記励起光から前記非線形物体光と同じ角振動数の参照光を生成する参照光生成手段と、
前記参照光の位相をシフトする位相シフト手段と、
前記非線形物体光と前記参照光との第１の干渉光を検出する検出手段と、
前記第１の干渉光に基づく第１の画像を生成する画像生成手段と、
前記第１の画像に基づいて前記非線形物体光の複素振幅を計算する計算手段と、
前記非線形物体光の複素振幅の位相を補正する補正手段と
を備え、
前記検出手段は、前記観察面にわたる前記第１の干渉光を、３６０／ｎ度（ｎは３以上の整数）ずつ位相が異なるｎ種類の前記参照光を用いて少なくともｎ回検出し、
前記走査手段、前記位相シフト手段、および、前記検出手段により、角振動数が前記参照光と同じ照射光を前記試料の前記観察面において走査することにより発せられる線形物体光と、前記参照光との第２の干渉光をさらに検出し、
前記画像生成手段は、前記第２の干渉光に基づく第２の画像をさらに生成し、
前記計算手段は、前記第２の画像に基づいて前記線形物体光の複素振幅をさらに計算し、
前記補正手段は、前記線形物体光の複素振幅の位相に基づいて、前記非線形物体光の複素振幅の位相を補正する
ことを特徴とする非線形顕微鏡。
【請求項５】
励起光を試料に照射し、非線形光学効果により前記試料から発せられる非線形物体光を観察する非線形顕微鏡において、
前記試料の観察面において前記励起光を走査する走査手段と、
前記励起光から前記非線形物体光と同じ角振動数の参照光を生成する参照光生成手段と、
前記参照光の位相をシフトする位相シフト手段と、
前記非線形物体光と前記参照光との干渉光を検出する検出手段と
を備え、
前記走査手段は、前記試料が載置されているステージを移動させることにより前記観察面において前記励起光を走査し、
前記位相シフト手段は、前記ステージとともに移動し、前記参照光が入射する位置によって前記検出手段までの前記参照光の光路長を変化させることにより、前記観察面における前記励起光の位置が所定の方向に所定の距離だけ移動する毎に、前記参照光の位相を所定の角度ずつシフトする
ことを特徴とする非線形顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非線形顕微鏡に関し、特に、非線形光学効果により試料から発せられる物体光の位相情報を取得できるようにした非線形顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体試料の３次元画像を得るために共焦点顕微鏡が広く使用されている。また、共焦点顕微鏡は、物質と光の線形現象である蛍光を観察するものであるが、最近この技術を応用して、物質と光の非線形現象を利用する非線形顕微鏡の研究が盛んに行われている。代表的な非線形顕微鏡として、２光子蛍光、第２高調波（SHG）、第３高調波（THG）、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（CARS）などを利用したものがある。
【０００３】
従来の非線形顕微鏡は、試料の観察したい面（以下、観察面と称する）上で励起光を走査しながら、非線形光学効果により試料から発せられる光（以下、非線形物体光と称する）を検出し、検出した非線形物体光の強度を示す電気信号の強度を２次元にマッピングすることにより、２次元の観察画像を得ている。また、観察面を励起光の光軸方向に移動させながら、各観察面において観察画像を取得し、重ね合わせることにより３次元の観察画像を得ることができる。
【０００４】
非線形顕微鏡は、近赤外光を用いて試料を励起するので、可視光では届かなかった試料の深部の情報を取り出すことが可能である。また、非線形顕微鏡は、共焦点顕微鏡とは異なり、観察像の明るさを確保するために検出側のピンホールを開放しても、奥行き分解能を良好に保つことができる。
【０００５】
しかしながら、従来の非線形顕微鏡では、非線形物体光の位相情報を取り出すことはできなかった。しかし、２光子励起のような非線形インコヒーレント現象を利用する非線形顕微鏡は別にして、SHG、THG、CARS等の非線形コヒーレント現象を利用する非線形顕微鏡に対しては、非線形物体光の強度情報だけでなく、位相情報も検出できるようにすることが要望されている。
【０００６】
例えば、CARSを利用した非線形顕微鏡（以下、CARS顕微鏡と称する）について考える。CARS顕微鏡では、角振動数（角速度）がω１およびω２（ただし、ω１＞ω２）の２種類の波長が異なるパルス状の励起光ω１および励起光ω２が用いられる。そして、励起光ω１および励起光ω２が照射された試料において、励起光ω１と励起光ω２の角振動数の差（ω１−ω２）と一致する角振動数の振動モードを有する分子から、共鳴過程による光（以下、CARS光と称する）が発せられ、他の分子から非共鳴過程（４光波混合）による光（以下、非共鳴光と称する）が発せられる。CARS光は、例えば、観察対象となる試料の特定の分子から発せられ、非共鳴光は、例えば、主に試料を浸している水から発せられる。CARS顕微鏡で検出される非線形物体光には、このCARS光と非共鳴光が含まれる。
【０００７】
より具体的には、図１に示されるように、共鳴過程では、分子の状態が、励起光ω１により基底状態から中間状態１に遷移した後、励起光ω２により励起状態に遷移し、さらに励起光ω１により中間状態２に遷移した後、基底状態に戻るときに、角振動数ωｒのCARS光が発せられる。一方、非共鳴過程では、分子の状態が、２つの励起光ω１により中間状態３に遷移し、さらに励起光ω２により基底状態に戻るときに、角振動数ωｒの非共鳴光が発せられる。CARS光と非共鳴光は、角振動数が同じωｒであり、同じ波長となるが、位相が９０度ずれている。
【０００８】
非共鳴光は、背景光となってCARS光の検出を妨げるため、例えば、CARS光と非共鳴光とを分離して観察できるように、CARS光と非共鳴光を含む非線形物体光の位相情報を取得できるようにすることが望まれている。
【０００９】
また、従来、ホモダインCARS顕微鏡が提案されている（例えば、非特許文献１参照）。このホモダインCARS顕微鏡では、非線形物体光（試料の３次非線形感受率χ(3)）の複素振幅の実部に基づく画像、すなわち、CARS光のみに基づく画像を取得することができる。また、このホモダインCARS顕微鏡では、非線形物体光の複素振幅の実部の絶対値と虚部の絶対値を２回に分けて測定することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Eric O. Potma, Conor L. Evans, and X. Sunney Xie, “Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging”, Optics Letters, Vol. 31, No.2, 2006年1月, p. 241-243
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、非特許文献１に記載されているホモダインCARS顕微鏡では、非線形物体光の複素振幅の実部の絶対値と虚部の絶対値を取得することは可能であるが、位相情報を取得することはできない。
【００１２】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、非線形物体光の複素振幅を取得できるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第１の側面の非線形顕微鏡は、励起光を試料に照射し、非線形光学効果により試料から発せられる非線形物体光を観察する非線形顕微鏡であって、試料の観察面において励起光を走査する走査手段と、励起光から非線形物体光と同じ角振動数の参照光を生成する参照光生成手段と、参照光の位相をシフトする位相シフト手段と、非線形物体光と参照光との第１の干渉光を検出する検出手段と、第１の干渉光に基づく第１の画像を生成する画像生成手段と、第１の画像に基づいて非線形物体光の複素振幅を計算する計算手段と、非線形物体光の複素振幅の位相を補正する補正手段とを備え、位相シフト手段は、観察面における励起光の位置が所定の方向に所定の距離だけ移動する毎に、参照光の位相を所定の角度ずつシフトし、走査手段、位相シフト手段、および、検出手段により、角振動数が参照光と同じ照射光を試料の観察面において走査することにより発せられる線形物体光と、参照光との第２の干渉光をさらに検出し、画像生成手段は、第２の干渉光に基づく第２の画像をさらに生成し、計算手段は、第２の画像に基づいて線形物体光の複素振幅をさらに計算し、補正手段は、線形物体光の複素振幅の位相に基づいて、非線形物体光の複素振幅の位相を補正することを特徴とする。
【００１４】
本発明の第１の側面においては、試料の観察面において励起光が走査され、励起光から非線形物体光と同じ角振動数の参照光が生成され、参照光の位相が、観察面における励起光の位置が所定の方向に所定の距離だけ移動する毎に、所定の角度ずつシフトされ、非線形物体光と参照光との第１の干渉光が検出され、第１の干渉光に基づく第１の画像が生成され、第１の画像に基づいて非線形物体光の複素振幅が計算され、角振動数が参照光と同じ照射光を試料の観察面において走査することにより発せられる線形物体光と、参照光との第２の干渉光が検出され、第２の干渉光に基づく第２の画像が生成され、第２の画像に基づいて線形物体光の複素振幅が計算され、線形物体光の複素振幅の位相に基づいて、非線形物体光の複素振幅の位相が補正される。
【００１５】
本発明の第２の側面の非線形顕微鏡は、励起光を試料に照射し、非線形光学効果により試料から発せられる非線形物体光を観察する非線形顕微鏡であって、試料の観察面において励起光を走査する走査手段と、励起光から非線形物体光と同じ角振動数の参照光を生成する参照光生成手段と、参照光の位相をシフトする位相シフト手段と、非線形物体光と参照光との第１の干渉光を検出する検出手段と、第１の干渉光に基づく第１の画像を生成する画像生成手段と、第１の画像に基づいて非線形物体光の複素振幅を計算する計算手段と、非線形物体光の複素振幅の位相を補正する補正手段とを備え、検出手段は、観察面にわたる第１の干渉光を、３６０／ｎ度（ｎは３以上の整数）ずつ位相が異なるｎ種類の参照光を用いて少なくともｎ回検出し、走査手段、位相シフト手段、および、検出手段により、角振動数が参照光と同じ照射光を試料の観察面において走査することにより発せられる線形物体光と、参照光との第２の干渉光をさらに検出し、画像生成手段は、第２の干渉光に基づく第２の画像をさらに生成し、計算手段は、第２の画像に基づいて線形物体光の複素振幅をさらに計算し、補正手段は、線形物体光の複素振幅の位相に基づいて、非線形物体光の複素振幅の位相を補正することを特徴とする。
【００１６】
本発明の第２の側面においては、試料の観察面において励起光が走査され、励起光から非線形物体光と同じ角振動数の参照光が生成され、非線形光学効果により試料から発せられる非線形物体光と同じ角振動数の参照光の位相がシフトされ、非線形物体光と参照光との第１の干渉光が検出されるとともに、観察面にわたる第１の干渉光が、３６０／ｎ度（ｎは３以上の整数）ずつ位相が異なるｎ種類の参照光を用いて少なくともｎ回検出され、第１の干渉光に基づく第１の画像が生成され、第１の画像に基づいて非線形物体光の複素振幅が計算され、角振動数が参照光と同じ照射光を試料の観察面において走査することにより発せられる線形物体光と、参照光との第２の干渉光が検出され、第２の干渉光に基づく第２の画像が生成され、第２の画像に基づいて線形物体光の複素振幅が計算され、線形物体光の複素振幅の位相に基づいて、非線形物体光の複素振幅の位相が補正される。
本発明の第３の側面の非線形顕微鏡は、励起光を試料に照射し、非線形光学効果により試料から発せられる非線形物体光を観察する非線形顕微鏡であって、試料の観察面において励起光を走査する走査手段と、励起光から非線形物体光と同じ角振動数の参照光を生成する参照光生成手段と、参照光の位相をシフトする位相シフト手段と、非線形物体光と参照光との第１の干渉光を検出する検出手段とを備え、走査手段は、試料が載置されているステージを移動させることにより観察面において励起光を走査し、位相シフト手段は、ステージとともに移動し、参照光が入射する位置によって検出手段までの参照光の光路長を変化させることにより、観察面における励起光の位置が所定の方向に所定の距離だけ移動する毎に、参照光の位相を所定の角度ずつシフトすることを特徴とする。
本発明の第３の側面の非線形顕微鏡においては、試料が載置されているステージを移動させることにより試料の観察面において励起光が走査され、励起光から非線形物体光と同じ角振動数の参照光が生成され、観察面における励起光の位置が所定の方向に所定の距離だけ移動する毎に、参照光の位相が所定の角度ずつシフトされ、非線形物体光と参照光との干渉光が検出される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の第１の側面乃至第３の側面によれば、非線形光学効果により試料から発せられる物体光の位相情報を取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】共鳴過程（CARS）と非共鳴過程について説明するための図である。
【図２】本発明を適用した非線形顕微鏡の第１の実施の形態を示すブロック図である。
【図３】非線形顕微鏡により実行される観察処理を説明するためのフローチャートである。
【図４】非線形物体光の複素振幅の計算方法について説明するための図である。
【図５】本発明を適用した非線形顕微鏡の第２の実施の形態を示すブロック図である。
【図６】本発明を適用した非線形顕微鏡の第３の実施の形態を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を実施するための形態（以下、実施の形態という）について説明する。なお、説明は以下の順序で行う。
１．第１の実施の形態
２．第２の実施の形態
３．第３の実施の形態
４．変形例
【００２０】
＜１．第１の実施の形態＞
［非線形顕微鏡の構成例］
図２は、本発明の第１の実施の形態である非線形顕微鏡１の構成の例を示すブロック図である。なお、以下、紙面の左右方向をｘ軸方向とし、紙面の上下方向をｚ軸方向とし、紙面に垂直な方向をｙ軸方向とする。
【００２１】
非線形顕微鏡１０１は、コヒーレントな非線形光学効果の一種であるCARS（コヒーレントアンチストークスラマン散乱）により試料１０２から発せられる非線形物体光を観察するための非線形レーザ走査顕微鏡である。
【００２２】
非線形顕微鏡１０１には、角振動数ω１のパルス状の励起光ω１、および、角振動数ω２（＜ω１）のパルス状の励起光ω２が入射される。例えば、図示せぬ光源から射出された角振動数ω１のレーザパルスをOPO（Optical Parametric Oscillator）に入射し、波長を変換して角振動数ω２のレーザパルスを生成した後、角振動数ω１のレーザパルスと角振動数ω２のレーザパルスを、遅延回路等を用いて時間的に合わせて導入することにより、励起光ω１，ω２が非線形顕微鏡１０１に入射される。非線形顕微鏡１０１に入射した励起光ω１，ω２は、同じ光路を進んでビームスプリッタ１１１に入射し、ビームスプリッタ１１１を透過して直進する光と、ビームスプリッタ１１１により反射される光に分かれる。
【００２３】
ビームスプリッタ１１１を透過した励起光ω１，ω２は、非線形結晶１１２に入射し、非線形結晶１１２おいて図１を参照して上述した非共鳴過程（４光波混合）により角振動数ωｒ（＝２ω１−ω２）のコヒーレント光（以下、参照光ωｒと称する）が生成され、射出される。非線形結晶１１２から射出された参照光ωｒは、励起光ω１，ω２を遮光するためのフィルタ１１３を透過し、ミラー１１４により遅延回路１１５の方向に反射され、遅延回路１１５内のミラー１３１およびミラー１３２、並びに、ミラー１１６により、位相シフタ１１７の方向に反射される。さらに、参照光ωｒは、位相シフタ１１７により位相が調整された後、ビームスプリッタ１１８により反射され、ガルバノミラー１１９に入射する。
【００２４】
一方、ビームスプリッタ１１１により反射された励起光ω１，ω２は、ビームスプリッタ１１８を透過した後、参照光ωｒと同じ光路を進み、ガルバノミラー１１９に入射する。
【００２５】
ガルバノミラー１１９に入射した励起光ω１，ω２および参照光ωｒは、ガルバノミラー１１９により進行方向が調整された後、倒立顕微鏡１２０のミラー１４１により対物レンズ１４２の方向に反射され、対物レンズ１４２を介して、試料１０２の所定の面（以下、観察面と称する）において集光する。そして、試料１０２の観察面の励起光ω１，ω２が集光した位置において、図１を参照して上述した共鳴過程および非共鳴過程が発生し、角振動数ωｒのCARS光および非共鳴光を含む非線形物体光が発せられる。一方、参照光ωｒは、その一部が試料１０２をそのまま透過する。
【００２６】
試料１０２から発せられた非線形物体光および試料１０２を透過した参照光ωｒは、レンズ１２１により集光され、互いに干渉して検出器１２２に入射する。検出器１２２は、例えば、PMT（光電子倍増管）などの光検出器、A/D変換器などにより構成され、所定の間隔で入射光の強度を検出し、検出した強度を示すデジタルの電気信号を画像処理部１２４に供給する。なお、A/D変換器を検出器１２２とは別に設け、検出器１２２からはアナログの電気信号を出力し、外部のA/D変換器で所定の間隔で電気信号のサンプリングを行うようにしてもよい。
【００２７】
このとき、励起光ω１，ω２および参照光ωｒは、ガルバノミラー１１９により、試料１０２の観察面において、例えばラスタ順に走査される。そして、検出器１２２は、ガルバノミラー１１９による走査に同期して、試料１０２の観察面における励起光ω１，ω２および参照光ωｒの集光位置がｘ軸方向に所定の距離だけ移動する毎に、および、ｘ軸方向の１ライン分の走査が終わり、集光位置が次のラインの先頭に移動する毎に、非線形物体光と参照光ωｒとの干渉光の強度を検出する。これにより、試料１０２の観察面にわたって、非線形物体光と参照光ωｒとの干渉光の強度が検出器１２２により検出される。
【００２８】
また、位相シフタ１１７は、同期回路１２３の制御の基に、ガルバノミラー１１９の動きに同期して、参照光ωｒの位相を調整する。より具体的には、ガルバノミラー１１９が所定の角度だけ回転し、励起光ω１，ω２および参照光ωｒの集光位置がｘ軸方向に所定の距離だけ移動し、検出器１２２が干渉光の強度を検出する毎に、位相シフタ１１７は、参照光ωｒの位相を９０度ずつ進める（あるいは、遅らせる）。従って、検出器１２２が干渉光の強度を４回検出する毎に、換言すれば、検出器１２２がｘ軸方向の４画素分の干渉光の強度を検出する毎に、参照光ωｒの位相が１波長分シフトする。
【００２９】
画像処理部１２４は、例えば、コンピュータ、あるいは、CPU（Central Processing Unit）などのプロセッサなどからなり、観察画像生成部１５１、計算部１５２、補正部１５３、および、表示画像生成部１５４を含む機能を実現する。
【００３０】
観察画像生成部１５１は、検出器１２２からの電気信号により示される、非線形物体光と参照光ωｒとの干渉光の強度のサンプル値を、励起光ω１，ω２および参照光ωｒの走査順と同じ順序で１画素ずつ並べることにより、試料２の観察面の画像（以下、観察画像と称する）を生成する。上述したように、参照光ωｒの位相は、検出器１２２が干渉光の強度を検出する毎に９０度ずつシフトする。従って、非線形物体光と、非線形物体光の光軸に対してｘ軸方向に所定の角度だけ傾けて照射した参照光ωｒとが干渉し、干渉縞が発生した像と同等の像が、観察画像として得られる。すなわち、デジタルホログラフィの原理に基づいて、非線形物体光と参照光ωｒとの干渉光により得られる像と同等の像が、観察画像として得られる。
【００３１】
なお、励起光ω１，ω２の代わりに、所定の角振動数ωｘの照射光ωｘのみをビームスプリッタ１１１に入射し、照射光ωｘ、および、位相シフタ１１７により位相が制御された、角振動数ωｘの参照光ωｘを試料１０２に照射するようにして、非線形顕微鏡１０１を、走査型の線形ホログラフィック顕微鏡として使用することも可能である。この場合、試料１０２からは照射光ωｘの強度に比例した物体光（以下、線形物体光と称する）が発せられ、線形物体光と、線形物体光の光軸に対してｘ軸方向に所定の角度だけ傾けて照射した参照光ωｘとが干渉し、干渉縞が発生した像と同等の像が、観察画像として得られる。すなわし、デジタルホログラフィの原理に基づいて、線形物体光と参照光ωｘとの干渉光により得られる像と同等の像が、観察画像として得られる。
【００３２】
なお、以下、非線形物体光と参照光との干渉光による観察画像と、線形物体光と参照光との干渉光による観察画像とを区別する必要がある場合、前者を非線形観察画像と称し、後者を線形観察画像と称する。
【００３３】
計算部１５２は、図３および図４を参照して後述するように、観察画像に基づいて非線形物体光および線形物体光の複素振幅を計算し、計算結果を示す情報を補正部１５３に供給する。
【００３４】
補正部１５３は、図３を参照して後述するように、計算部１５２により計算された非線形物体光の複素振幅の位相を補正し、補正した非線形物体光の複素振幅の計算結果を示す情報を表示画像生成部１５４に供給する。
【００３５】
表示画像生成部１５４は、図３を参照して後述するように、非線形物体光の複素振幅の計算結果に基づいて、ユーザに提示するための表示画像を生成する。
【００３６】
［観察処理の説明］
次に、図３のフローチャートを参照して、非線形顕微鏡１０１により実行される観察処理について説明する。
【００３７】
ステップＳ１において、非線形顕微鏡１０１は、図２を参照して上述したように、励起光ω１，ω２および参照光ωｒを用いて、非線形観察画像を生成する。生成された非線形観察画像は、観察画像生成部１５１から計算部１５２に供給される。
【００３８】
ステップＳ２において、計算部１５２は、非線形観察画像に基づいて、非線形物体光の複素振幅を計算する。ここで、図４を参照しながら、計算方法の具体例を説明する。
【００３９】
図４は、非線形観察画像１７１、および、非線形観察画像１７１を高速フーリエ変換（FFT）することにより得られる画像１７２の例を模式的に示した図である。なお、非線形観察画像１７１内の縦線は、干渉縞を模式的に示したものである。
【００４０】
非線形観察画像１７１をフーリエ変換することにより得られる画像１７２では、非線形観察画像１７１のDC成分による輝点１８１が中央に現れ、輝点１８１の左側に物体スペクトル１８２、右側に共役物体スペクトル１８３が出現する。このうち物体スペクトル１８２のみを抽出し、逆フーリエ変換（FFT-1）することにより、観察画像の各画素における試料１０２の３次非線形感受率χ(3)の複素振幅、すなわち、非線形物体光の複素振幅を得ることができる。
【００４１】
例えば、検出器１２２上での非線形物体光の複素振幅をO(x,y)、参照光ωｒの複素振幅をR・exp[-i2πx・sinθ/λ]とする。なお、λは、CARS光、非共鳴光および参照光ωｒの波長を示し、θは参照光ωｒの位相シフト量を示す。上述したように、参照光ωｒの位相シフト量θは、検出器１２２が干渉光の強度を４回検出する毎に１波長分シフトするように制御されるので、検出器１２２上における非線形物体光と参照光ωｒとの干渉光の複素振幅A(x,y)は、次式（１）により与えられる。
【００４２】
【数１】
0005510712.tif 000002
【００４３】
従って、干渉光の光強度I(x,y)は、次式（２）により求められる。
【００４４】
【数２】
0005510712.tif 000003
【００４５】
そして、式（２）をフーリエ変換することにより次式（３）が得られる。
【００４６】
【数３】
0005510712.tif 000004
【００４７】
なお、~はフーリエ変換を表し、ACはオートコリレーションを表している。
【００４８】
ここで、式（３）の右辺の第２項が、中央の輝点１８１に対応し、第３項が物体スペクトル１８２に対応し、第４項が共役物体スペクトル１８３に対応する。なお、参照光ωｒの強度が、非線形物体光の強度に比べて十分強い場合は、式（３）の右辺の第１項は無視することができる。
【００４９】
そして、式（３）の右辺の第３項を取り出し、逆フーリエ変換することにより、観察画像の各画素における非線形物体光の複素振幅、すなわち、試料１０２の３次非線形感受率χ(3)の複素振幅を得ることができる。
【００５０】
なお、以上の計算方法は、従来のデジタルホログラフィで行われているのと同様の計算方法である。
【００５１】
なお、フーリエ変換した際に、物体スペクトル１８２と共役物体スペクトル１８３が重ならずに、物体スペクトル１８２だけを抽出できるようにするために、検出器１２２により点物体を測定したときの像（点像強度分布）を、数ピクセルにまたがって取得する程度に、集光点の走査間隔を十分細かく取ることが望ましい。
【００５２】
計算部１５２は、以上の計算を行った後、非線形物体光の複素振幅の計算結果を示す情報を補正部１５３に供給する。
【００５３】
ステップＳ３において、非線形顕微鏡１０１は、照射光ωｒおよび参照光ωｒを用いて、線形観察画像を生成する。すなわち、非線形顕微鏡１０１は、上述したように、励起光ω１，ω２の代わりに、参照光ωｒと同じ角振動数ωｒの照射光ωｒのみをビームスプリッタ１１１に入射するようにして、照射光ωｒにより試料１０２から発せられる線形物体光と参照光ωｒとの干渉光による線形観察画像を生成する。生成された線形観察画像は、観察画像生成部１５１から計算部１５２に供給される。
【００５４】
ステップＳ４において、計算部１５２は、ステップＳ２と同様の処理により、線形観察画像に基づいて、線形物体光の複素振幅を計算する。計算部１５２は、線形物体光の複素振幅の計算結果を示す情報を補正部１５３に供給する。
【００５５】
ステップＳ５において、補正部１５３は、非線形物体光の複素振幅の位相を補正する。具体的には、ステップＳ２の処理で計算された非線形物体光の複素振幅の位相には、非線形物体光に含まれるCARS光と非共鳴光との位相差に加えて、試料１０２の屈折率や厚みの分布などにより生じる位相差が反映されている。一方、線形物体光の複素振幅の位相には、CARS光と非共鳴光との位相差以外の、試料１０２の屈折率や厚みの分布などにより生じる位相差が反映されている。従って、非線形物体光の複素振幅の位相から、線形物体光の複素振幅の位相を差し引くことにより、CARS光と非共鳴光との位相差のみに基づいた非線形物体光の複素振幅の位相を得ることができる。補正部１５３は、このようにして非線形物体光の複素振幅の位相を補正し、位相を補正した非線形物体光の複素振幅の計算結果を示す情報を表示画像生成部１５４に供給する。
【００５６】
ステップＳ６において、画像処理部１２４は、全ての観察面の処理が終了したか否かを判定する。画像処理部１２４は、予め設定されている試料１０２の奥行き方向（ｚ軸方向）の複数の観察面のうち、まだステップＳ１乃至Ｓ６の処理を行ってない観察面が残っている場合、まだ全ての観察面の処理が終了していないと判定し、処理はステップＳ７に進む。
【００５７】
ステップＳ７において、非線形顕微鏡１０１は、観察面をシフトする。すなわち、非線形顕微鏡１０１は、図示せぬ制御部の制御の基に、例えば、試料１０２が載置されているステージ(不図示)または対物レンズ１４２をｚ軸方向に移動させて、励起光ω１，ω２および参照光ωｒの集光位置をｚ軸方向にシフトすることにより、観察面をｚ軸方向にシフトする。
【００５８】
その後、処理はステップＳ１に戻り、ステップＳ６において、全ての観察面の処理が終了したと判定されるまで、ステップＳ１乃至Ｓ７の処理が繰返し実行される。これにより、表示画像生成部１５４は、各観察面における非線形物体光の複素振幅の計算結果を取得し、蓄積する。
【００５９】
一方、ステップＳ６において、全ての観察面の処理が終了したと判定された場合、処理はステップＳ７に進む。
【００６０】
ステップＳ７において、表示画像生成部１５４は、表示画像を生成する。例えば、表示画像生成部１５４は、非線形物体光の複素振幅の位相情報に基づいて、CARS光と非共鳴光とを分離し、それぞれを画像化する。あるいは、例えば、表示画像生成部１５４は、非線形物体光の強度分布を画像化したり、非線形物体光の位相分布を画像化したりする。さらに、例えば、表示画像生成部１５４は、試料１０２の奥行き方向（ｚ軸方向）の各観察面に対して上記の画像が得られるので、得られた画像を重ね合わせて、３次元の画像を生成する。表示画像生成部１５４は、例えば、生成した表示画像を図示せぬ表示手段に供給し表示させたり、図示せぬ記憶手段に供給し、記憶させたりする。
【００６１】
その後、観察処理は終了する。
【００６２】
このようにして、試料１０２の観察面において励起光ω１，ω２および参照光を１回走査するだけで、当該観察面における非線形物体光の強度だけでなく、位相情報も簡単に取得することができる。また、非線形物体光の位相情報を利用して、CARS光のみの画像、非線形物体光の位相分布の画像など、種々の画像を得ることができる。
【００６３】
＜２．第２の実施の形態＞
［非線形顕微鏡の構成例］
図５は、本発明の第２の実施の形態である非線形顕微鏡２０１の構成の例を示すブロック図である。なお、図中、図２と対応する部分には、同じ符合を付してあり、その説明は適宜省略する。
【００６４】
非線形顕微鏡２０１は、図２の非線形顕微鏡１０１と比較して、ミラー１１６、位相シフタ１１７、ビームスプリッタ１１８、ガルバノミラー１１９、検出器１２２が設けられておらず、ミラー２１１、ステージ２１２、ミラー２１３、レンズ２１４、ミラー２１５、レンズ２１６、ビームスプリッタ２１７、ピンホール２１８、および、検出器２１９が設けられている点が異なる。
【００６５】
非線形顕微鏡２０１に入射した励起光ω１，ω２は、同じ光路を進んでビームスプリッタ１１１に入射し、ビームスプリッタ１１１を透過して直進する光と、ビームスプリッタ１１１により反射される光に分かれる。
【００６６】
ビームスプリッタ１１１を透過した励起光ω１，ω２は、非線形結晶１１２に入射し、非線形結晶１１２おいて参照光ωｒが生成され、射出される。非線形結晶１１２から射出された参照光ωｒは、フィルタ１１３を透過し、ミラー１１４、遅延回路１１５内のミラー１３１およびミラー１３２、並びに、ミラー２１１により、試料１０２が載置されているステージ２１２に設けられているミラー２１３に入射する。さらに、参照光ωｒは、ミラー２１３によりレンズ２１４の方向に反射され、レンズ２１４を透過し、ミラー２１５により反射され、レンズ２１６を透過し、ビームスプリッタ２１７により反射され、ピンホール２１８を通過して、PMT（光電子倍増管）などの光検出器、A/D変換器などから構成される検出器２１９に入射する。
【００６７】
一方、ビームスプリッタ１１１により反射された励起光ω１，ω２は、倒立顕微鏡１２０のミラー１４１により対物レンズ１４２の方向に反射され、対物レンズ１４２を介して、試料１０２の観察面において集光する。そして、試料１０２の観察面の励起光ω１，ω２が集光した位置において、図１を参照して上述した共鳴過程および非共鳴過程が起こり、角振動数ωｒのCARS光および非共鳴光を含む非線形物体光が発せられる。試料１０２から発せられた非線形物体光は、レンズ１２１により集光され、ピンホール２１８を通過し、検出器２１９に入射する。
【００６８】
検出器２１９は、所定の間隔で入射光の強度を検出し、検出した強度を示すデジタルの電気信号を画像処理部１２４に供給する。
【００６９】
このとき、図示せぬ制御部の制御の基に、ステージ２１２がｘ軸およびｙ軸方向に移動することにより、励起光ω１，ω２が、試料１０２の観察面上において、例えばラスタ順に走査される。そして、検出器１２２は、ステージ２１２がｘ軸方向に所定の距離だけ移動し、励起光ω１，ω２の集光位置がｘ軸方向に所定の距離だけ移動する毎に、および、ｘ軸方向の１ライン分の走査が終わり、集光位置が次のラインの先頭に移動する毎に、非線形物体光と参照光ωｒとの干渉光の強度を検出する。これにより、試料１０２の観察面にわたって、非線形物体光と参照光ωｒとの干渉光の強度が検出器２１９により検出される。
【００７０】
また、ステージ２１２がｘ軸およびｙ軸方向に移動するのに合わせて、ステージ２１２に設けられているミラー２１３も移動する。さらに、ミラー２１３の反射面は、ステージ２１２の面に対してｙ軸回りに角度θだけ傾けて設置されている。従って、ステージ２１２のｘ軸方向の位置により、参照光ωｒのミラー２１３へのｘ軸およびｚ軸方向の入射位置が異なり、その結果、ミラー２１１から検出器２１９までの参照光ωｒの光路長が変化する。
【００７１】
例えば、検出器２１９が干渉光を検出してから次に検出するまでの間にステージ２１２およびミラー２１３がｘ軸方向に移動する距離をΔｘとすると、ステージ２１２のｘ軸方向の位置がＸのときに干渉光が検出され、次にステージ２１２が位置Ｘ＋Δｘのときに干渉光が検出された場合、この２点間における参照光ωｒの光路長の差は、Δｘ・sin2θとなる。そして、この光路長の差により、検出器２１９における参照光ωｒの位相が９０度ずれ、非線形顕微鏡１０１と同様に、検出器２１９が干渉光の強度を４回検出する毎に参照光ωｒの位相が１波長分シフトするように、角度θが調整される。
【００７２】
これにより、位相シフタ１１７を用いずに、観察画像生成部１５１において、非線形顕微鏡１０１で得られた観察画像とほぼ同等の観察画像を得ることができる。
【００７３】
また、非線形顕微鏡２０１は、非線形顕微鏡１０１と同様に、参照光と同じ角振動数の照射光を試料１０２に照射するようにして、走査型の線形ホログラフィック顕微鏡として使用することも可能である。
【００７４】
なお、画像処理部１２４の処理は、非線形顕微鏡１０１の場合と同様であり、その説明は繰返しになるので省略する。
【００７５】
＜３．第３の実施の形態＞
［非線形顕微鏡の構成例］
図６は、本発明の第３の実施の形態である非線形顕微鏡３０１の構成の例を示すブロック図である。なお、図中、図５と対応する部分には、同じ符合を付してあり、その説明は適宜省略する。
【００７６】
非線形顕微鏡３０１は、図５の非線形顕微鏡２０１と比較して、遅延回路１１５、ミラー２１１、ステージ２１２、ミラー２１３、レンズ２１４、ミラー２１５、レンズ２１６、および、画像処理部１２４が設けられておらず、遅延回路３１１、ミラー３１２、ステージ３１３、および、画像処理部３１４が設けられている点が異なる。また、画像処理部３１４と、図５の画像処理部１２４とは、計算部１５２の代わりに計算部３５１が設けられている点が異なる。
【００７７】
非線形顕微鏡３０１において、励起光ω１，ω２、および、励起光ω１，ω２により試料１０２から発せられる非線形物体光は、非線形顕微鏡２０１と同じ光路を進む。一方、参照光ωｒは、非線形結晶１１２で生成された後、フィルタ１１３を透過し、遅延回路３１１内のミラー３３１およびミラー３３２、並びに、ミラー３１２により、ビームスプリッタ２１７の方向に反射される。さらに、参照光ωｒは、ビームスプリッタ２１７により反射され、ピンホール２１８を通過し、検出器２１９に入射する。
【００７８】
また、非線形顕微鏡３０１では、非線形顕微鏡２０１と同様に、図示せぬ制御部の制御の基に、ステージ３１３がｘ軸およびｙ軸方向に移動することにより、励起光ω１，ω２が、試料１０２の観察面上において、例えばラスタ順に走査される。
【００７９】
さらに、非線形顕微鏡３０１では、非線形顕微鏡１０１および非線形顕微鏡２０１と観察画像の生成方法（図３のステップＳ１およびステップＳ３の処理）、および、物体光の複素振幅の計算方法（図３のステップＳ２およびステップＳ４の処理）が異なる。
【００８０】
具体的には、非線形顕微鏡３０１は、参照光ωｒの位相を固定したまま、観察面にわたって、非線形物体光と参照光ωｒとの干渉光を検出器２１９により検出し、非線形観察画像を生成する。また、非線形顕微鏡３０１は、１つの観察面につき、遅延回路３１１により参照光ωｒの位相を９０度ずつ４回変化させて、位相が異なる４種類の参照光ωｒを用いて、観察面にわたる非線形物体光と参照光ωｒとの干渉光を検出し、４種類の非線形観察画像を生成する。
【００８１】
そして、計算部３５１は、得られた４種類の観察画像に基づいて、以下の方法で非線形物体光の複素振幅を計算する。
【００８２】
例えば、検出器２１９上での非線形物体光の複素振幅U(x,y)＝A(x,y)exp[iφ(x,y)]、参照光ωｒの複素振幅をUR(φ)＝ARexp(iφR)とすると、非線形物体光と参照光ωｒとの干渉光の光強度I(x,y;φR)は、次式（４）で与えられる。
【００８３】
【数４】
0005510712.tif 000005
【００８４】
例えば、上述したように、１つの観察面に対して、参照光ωｒの位相を９０度（π／２ラジアン）ずつ変化させ、４種類の非線形観察画像を取得したとすると、非線形物体光の位相φ(x,y)は、次式（５）により計算される。
【００８５】
【数５】
0005510712.tif 000006
【００８６】
一方、非線形物体光の複素振幅の絶対値｜A(x,y)｜は、参照光ωｒをブロックすることにより得られる。従って、非線形物体光の複素振幅を得ることができる。
【００８７】
なお、線形物体光の複素振幅についても、同様の処理に得ることができる。
【００８８】
なお、以上の計算方法も、従来のデジタルホログラフィで行われているのと同様の計算方法である。
【００８９】
このように、非線形顕微鏡３０１では、励起光ω１，ω２の走査に同期して、参照光ωｒの位相をシフトする制御を行わずに、非線形物体光および線形物体光の複素振幅を得ることができる。そして、非線形顕微鏡１０１および非線形顕微鏡２０１と同様の表示画像を得ることができる。
【００９０】
＜４．変形例＞
なお、以上の説明では、透過型の照明を用いる例を示したが、本発明は、落射型の照明を用いる場合にも適用できる。
【００９１】
また、図３のステップＳ３乃至Ｓ５の処理は必ずしも行う必要はなく、省略することが可能である。さらに、３次元の表示画像を取得する必要がない場合は、図３のステップＳ６およびステップＳ７の処理を省略することが可能である。
【００９２】
さらに、以上の説明では、CARSを利用する顕微鏡の例を示したが、本発明は、例えば、SHG、THG、4光波混合、和周波発生などのコヒーレントな非線形光学効果を利用する顕微鏡に適用することができる。
【００９３】
また、以上の説明では、非線形顕微鏡１０１および非線形顕微鏡２０１において、参照光ωｒの位相シフト量を９０度に設定する例を示したが、提示した例に限定されるものではない。ただし、９０度前後が望ましい。例えば、９０度±３０度の範囲である。なお、観察画像において干渉縞が明確に現れるように、位相シフト量を小さくしすぎないようにすることが望ましい。
【００９４】
さらに、以上の説明では、非線形顕微鏡３０１において、参照光ωｒの位相シフト量を９０度に設定する例を示したが、提示した例に限定されるものではなく、３６０／ｎ（ｎは３以上の整数）度に設定することが可能である。なお、スキャン回数を減らし、処理時間を短縮するために、ｎの値を大きくしすぎないようにすることが望ましい。
【００９５】
また、非線形顕微鏡２０１において、ミラー２１３の代わりに、ステージ２１２とともに移動し、参照光ωｒの入射位置によって検出器２１９までの光路長を変化させる部材を設けるようにしてもよい。
【００９６】
さらに、画像処理部１２４または画像処理部３１４を、非線形顕微鏡とは別に設けるようにしてもよい。
【００９７】
また、本明細書において、フローチャートに記述されたステップは、記載された順序に沿って時系列的に行われる場合はもちろん、必ずしも時系列的に処理されなくとも、並列に、あるいは呼び出しが行われたとき等の必要なタイミングで実行されてもよい。
【００９８】
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明
の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００９９】
１０１  非線形顕微鏡，  １０２  試料，  １１１  ビームスプリッタ，  １１２  非線形結晶，  １１７  位相シフタ，  １１８  ビームスプリッタ，  １１９  ガルバノミラー，  １２０  倒立顕微鏡，  １２１  レンズ，  １２２  検出器，  １２３  同期回路，  １２４  画像処理部，  １４２  対物レンズ，  １５１  観察画像生成部，  １５２  計算部，  １５３  補正部，  １５４  表示画像生成部，  ２０１  非線形顕微鏡，  ２１２  ステージ，  ２１３  ミラー，  ２１４，２１６  レンズ，  ２１７  ビームスプリッタ，  ２１８  ピンホール，  ２１９  検出器，  ３０１  非線形顕微鏡，  ３１１  遅延回路，  ３１３  ステージ，  ３１４  画像処理部，  ３５１計算部
【図１】
0005510712.tif 000007
【図２】
0005510712.tif 000008
【図３】
0005510712.tif 000009
【図４】
0005510712.tif 000010
【図５】
0005510712.tif 000011
【図６】
0005510712.tif 000012