(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ２７の分解を抑制することによる作用機作を発揮する大腸癌の治療用の薬剤を製造するための、アルギリンＡ〜Ｆ及びＨ並びにその薬学的に許容可能な塩から選択される少なくとも１つの化合物の使用。
【請求項２】
ｐ２７の分解を抑制することによる作用機作を発揮する乳癌の治療用の薬剤を製造するための、アルギリンＡ及びその薬学的に許容可能な塩から選択される少なくとも１つの化合物の使用。
【請求項３】
対象が哺乳類である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
薬剤が、薬学的に活性のある付加的な抗腫瘍成分をさらに含む、又は薬学的に活性のある付加的な抗腫瘍成分との併用である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
化合物が、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
式１の化合物との対比において、ｐ２７の分解を抑制する能力について抗癌化合物をスクリーニングする方法であって、
ｐ２７の分解を抑制すると推測される化合物と細胞を接触させること、
該細胞の含有物を分析して、ｐ２７の量及び／又は生物活性、及び／又は細胞周期の状態を求める、分析すること、並びに
求めたｐ２７の量及び／又は生物活性、又は細胞周期の状態を、該化合物なしで得られたｐ２７の量及び／又は生物活性、又は細胞周期の状態と比較することを含み、
前記ｐ２７の量及び／又は生物活性、又は細胞周期の状態の変化が、ｐ２７の分解を抑制する化合物の指標となる、方法；
式１
【化１】
0005564267.tif 000007
（式Ｉ）
（式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、水素、非置換か若しくはＯＨで置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、又はＣ１〜Ｃ４アルコキシであり、
Ｒ３は水素、非置換か若しくはＯＨで置換されたＣ１〜Ｃ８アルキル、又はＯＲであり、
ここで、Ｒは水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アリール、又はアセチルから選択され、
Ｒ４は水素、ハロゲン、非置換か若しくはＯＨで置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、又はＣ１〜Ｃ４アルコキシであり
Ｒ５は水素又はハロゲンであり、
Ｒ６は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
ＸはＣ＝ＣＨ２又はＣＨＲ７であり、ここで、Ｒ７は非置換か若しくは−Ｓ−Ｃ１〜Ｃ４アルキルで置換されたＣ１〜Ｃ４アルキルである）の化合物、及びその薬学的に許容可能な塩。
【請求項７】
細胞が、乳癌細胞株、肝細胞癌細胞株、頸癌細胞株、肺癌細胞株、及び／又は大腸癌細胞株から選ばれる腫瘍細胞又は細胞株である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｐ２７  ｍＲＮＡの量、又はｐ２７−ＧＦＰの融合タンパク質の量を求める、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
化合物がｐ２７のプロテアソーム分解に影響を与える、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
アルギリンＡ〜Ｆ及びＨ並びにその薬学的に許容可能な塩から選択される少なくとも１つの化合物を含み、ｐ２７の分解を抑制することによる作用機作を発揮する大腸癌治療剤。
【請求項１１】
アルギリンＡ及びその薬学的に許容可能な塩から選択される少なくとも１つの化合物を含み、ｐ２７の分解を抑制することによる作用機作を発揮する乳癌治療剤。
【請求項１２】
対象が哺乳類である、請求項１０又は１１に記載の癌治療剤。
【請求項１３】
癌治療剤が、薬学的に活性のある付加的な抗腫瘍成分との配合又は併用である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の癌治療剤。
【請求項１４】
患者がヒトである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の癌治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌等の増殖性疾患の治療のための、ｐ２７のプロテアソーム分解の阻害物質である特定の大環状化合物、特にアルギリン及びその誘導体、好ましくはアルギリンＡの使用、並びに該大環状化合物の誘導体化に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞周期の段階間の移行は、サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）群によって触媒される（Nurse, 1990；Hartwell, 1991）。一部の生物では、Ｇ２からＭへの移行を制御する生理学的信号は、有糸分裂ＣｄｋであるＣｄｃ２を活性化する一連の工程を標的とする。Ｃｄｃ２活性化は、トレオニン−１６１のリン酸化により正に調節され（Booher and Beach, 1986；Krek and Nigg, 1991；Gould et al., 1991；Solomon et al., 1990；Solomon et al., 1992）、チロシン−１５のリン酸化により負に調節される（Gould and Nurse, 1989）。不完全なＤＮＡ複製はチロシン−１５の脱リン酸化を遅らせ（Dasso and Newport, 1990；Smythe and Newport, 1992）、チロシン−１５をリン酸化不可能な（nonphosphorylatable）残基へと変換するＣｄｃ２の突然変異は、致死的であり、且つ早期の有糸分裂を引き起こす（Gould and Nurse, 1989）。同様に、チロシン−１５ホスファターゼＣｄｃ２５の過剰発現（Enoch and Nurse, 1990；Kumagai and Dunphy, 1991）、又はチロシン−１５キナーゼの欠損（Ludgren et al., 1991）は、ＤＮＡ複製が有糸分裂が始まる前に完了するという要件を無視する。進行中のＤＮＡ複製に起因する有糸分裂の阻害を十分に説明するには、さらなるレベルの制御が必要とされ得る（Sorger and Murray, 1992；Heald et al., 1993；Stueland et al., 1993）。また、ＤＮＡの損傷によって誘発される細胞周期の停止が、Ｃｄｃ２の不活性化に関連し得るという証拠もあるが（Rowley et al., 1992；Walworth et al., 1993）、この状況下でのチロシンリン酸化の役割は疑問視されている（Barbet and Carr, 1993）。
【０００３】
哺乳類細胞は、酵母のように、Ｇ１期を経てＳ期に入るためにはサイクリン依存性キナーゼを必要とする（D'Urso et al., 1990；Blow and Nurse, 1990；Furukawa et al., 1990；Fang and Newport, 1991；Pagano et al., 1993；Tsai et al., 1993）。Ｄ型サイクリン及びＥ型サイクリンの両方がＧ１からＳへの移行を律速し、その両方が細胞の分裂促進増殖因子の必要性を減らすが、この必要性をなくすものではない（Ohtsubo and Roberts, 1993；Quelle et al., 1993）。
【０００４】
サイクリンキナーゼ阻害物質ｐ２７ｋｉｐ１の細胞レベルの低下は、多くのヒト癌において頻繁に見られ、患者の予後と直接相関している（非特許文献１）。具体的には、ユビキチン依存性プロテアソーム代謝回転が、多くのヒト癌においてｐ２７発現の低下を引き起こすことが示されている（非特許文献２）。
【０００５】
特許文献１は、見かけの分子量が約２７ｋＤであり、且つサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体（ｐ２７と指定される）と結合し、その活性化を抑制することが可能なタンパク質を記載している。さらに、或る薬剤がｐ２７タンパク質のサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を抑制する能力を、特異的に抑制又は向上することが可能か否かを求める方法が記載されている。同様に、特許文献２はｐ２７タンパク質、及びｐ２７を培養細胞において産生させる方法を開示している。ｐ２７の活性に影響を及ぼす薬剤を発見するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイも提供されている。さらに、低増殖性障害を診断及び治療する方法が提供されている。
【０００６】
Porteret al.（非特許文献３）は、細胞周期調節タンパク質ｐ２７（Ｋｉｐ１）（ｐ２７）の異常発現が、乳癌の生存率及び再発と関連する可能性があることを記載している。低いｐ２７発現は、高いｐ２７発現より悪い全生存率及び無病生存率に関連付けられた。低いｐ２７発現は、とりわけステロイド受容体陽性腫瘍を有する患者において、予後不良に関連すると考えられる。
【０００７】
特許文献３の実施例８では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳｋｐ２とｐ２７との相互作用を同定するために使用されているアッセイが記載される。該アッセイは、細胞増殖を抑制する化合物を試験するために有用であると記載されている。アッセイは分子、化合物、ペプチドの存在下又は非存在下で実行することができ、アッセイにより同定された上記分子は、癌及び増殖性障害に対する治療剤として潜在的に有用な薬物であると記載される。同定された特定の分子は記載されていない。
【０００８】
同様に、特許文献４は、ｐ２７のユビキチン依存性分解において重要な役割を果たす、Ｃｋｓ１−Ｓｋｐ２結合の阻害物質を同定する均一時間分解蛍光アッセイを用いた、膨大な化合物ライブラリの迅速なスクリーニングを記載している。
【０００９】
Pohl et al.（非特許文献４）は、高いｐ２７Ｋｉｐ１発現により、併用内分泌療法で治療された患者において高い無再発生存率及び全生存率が独立して予測されたことを記載している。したがって、高いｐ２７Ｋｉｐ１発現は、補助併用内分泌療法について早期ホルモン受容体陽性乳癌の閉経前女性を選択するのに有用であり得る。
【００１０】
特許文献５は、薬学的に活性のある大環状化合物、及び自己免疫疾患の治療、免疫寛容の誘導、又は細菌感染の治療に対するそれぞれの医薬品を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５，６８８，６６５号明細書
【特許文献２】米国特許第６，３５５，７７４号明細書
【特許文献３】国際公開第０２／０５５６６５号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願公開第２００６／３５２８０号明細書
【特許文献５】英国特許出願公開第２,３６７,５５３号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Philipp-Staheli, J., Payne, S.R. and Kemp, C.J. p27(Kip1):regulation and function of a haplo-insufficient tumour suppressor and itsmisregulation in cancer. Exp Cell Res 264, 148-68 (2001)
【非特許文献２】Loda, M. et al. Increased proteasome-dependent degradation of thecyclin dependent kinase inhibitor p27 in aggressive colorectal carcinomas. NatMed 3, 231-4 (1997)
【非特許文献３】Porter PL, Barlow WE, Yeh IT, Lin MG, Yuan XP, Donato E, Sledge GW,Shapiro CL, Ingle JN, Haskell CM, Albain KS, Roberts JM, Livingston RB, HayesDF. p27Kip1 and Cyclin E Expression and Breast Cancer Survival After TreatmentWith Adjuvant Chemotherapy. J Natl Cancer Inst. 2006 Dec 6;98(23):1723-31.
【非特許文献４】Pohl G, Rudas M, Dietze O, Lax S, Markis E, Pirker R, Zielinski CC,Hausmaninger H, Kubista E, Samonigg H, Jakesz R, Filipits M. High p27Kip1expression predicts superior relapse-free and overall survival forpremenopausal women with early-stage breast cancer receiving adjuvant treatmentwith tamoxifen plus goserelin. J Clin Oncol. 2003 Oct 1;21(19):3594-600.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ｐ２７を安定化させるため、増殖性疾患、特に癌性疾患の治療のための治療剤として使用するために、使用することのできる化合物及び遂行することのできる戦略を提供することが本発明の一目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の第１の態様によると、対象における癌の治療用の薬剤を製造するための、一般式Ｉ：
【００１５】
【化１】
0005564267.tif 000002
（式Ｉ）
【００１６】
（式中、Ｒ１及びＲ２は水素、非置換か若しくはＯＨで置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、又はＣ１〜Ｃ４アルコキシであり、
Ｒ３は水素、非置換か若しくはＯＨで置換されたＣ１〜Ｃ８アルキル、又はＯＲであり、ここで、Ｒは水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アリール、又はアセチルから選択され、
Ｒ４は水素、ハロゲン、非置換か若しくはＯＨで置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、又はＣ１〜Ｃ４アルコキシであり
Ｒ５は水素又はハロゲンであり、
Ｒ６は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
ＸはＣ＝ＣＨ２又はＣＨＲ７であり、ここで、Ｒ７は非置換か若しくは−Ｓ−Ｃ１〜Ｃ４アルキルで置換されたＣ１〜Ｃ４アルキルである）の化合物、及びその薬学的に許容可能な塩を使用することによって、この目的は解決される。
【００１７】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が独立して、水素、非置換か若しくはＯＨで置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、又はＣ１〜Ｃ４アルコキシであり、
Ｒ４が水素、ハロゲン、非置換か若しくはＯＨで置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、又はＣ１〜Ｃ４アルコキシであり、
Ｒ５が水素又はハロゲンであり、
Ｒ６が水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルであり、且つ
ＸがＣ＝ＣＨ２又はＣＨＲ７であり、ここで、Ｒ７は非置換か若しくは−Ｓ−Ｃ１〜Ｃ４アルキルで置換されたＣ１〜Ｃ４アルキルである、対象における癌の治療用の薬剤を製造するための本発明による化合物、及びその薬学的に許容可能な塩の使用が好ましい。
【００１８】
上に定義した化合物が、その構造内に置換基を有し得ること、例えば適当なアミノ部分置換基を有し得ることが理解されよう。
【００１９】
式Ｉの化合物のアルキル基及びアルキル部分は分岐鎖であっても、又は直鎖であってもよい。アルキル基は直鎖であるのが適切である。
【００２０】
Ｒ１が水素、又はメチル等の非置換Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、
Ｒ２が水素、又はメチル等の非置換Ｃ１〜Ｃ４アルキルか、若しくはヒドロキシメチル等のＯＨで置換されたＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
Ｒ３が水素、又はメトキシ等のＣ１〜Ｃ４アルコキシであり、
Ｒ４が水素、又はメチル等の非置換Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、
Ｒ５が水素又はブロモであり、
Ｒ６が水素又はメチルであり、且つ
ＸがＣ＝ＣＨ２又はＣＨＲ７であり、ここで、Ｒ７は非置換か若しくは−Ｓ−エチルで置換されたメチルである、本発明による化合物、及びその薬学的に許容可能な塩の使用がさらに好ましい。
【００２１】
Ｒ１が水素又はメチルであり、
Ｒ２がメチル又はヒドロキシメチルであり、
Ｒ３が水素又はメトキシであり、
Ｒ４が水素又はメチルであり、
Ｒ５が水素であり、
Ｒ６がメチルであり、且つ
ＸがＣ＝ＣＨ２である、本発明による化合物、及びその薬学的に許容可能な塩の使用がまたさらに好ましい。
【００２２】
アルギリンＡ及びその薬学的に許容可能な塩を、それを必要とする患者に与えることを含む本発明による方法が好ましい。アルギリンＢ：
【００２３】
【化２】
0005564267.tif 000003
【００２４】
又は特にアルギリンＦ、及びその薬学的に許容可能な塩がさらに特に好ましい。
【００２５】
アルギリンに対して、以下の定義を適用する（Ｒ５はＨであり、Ｒ６はＭｅである）。
【００２６】
【表１】
0005564267.tif 000004
【００２７】
対象が哺乳類、特にヒトである本発明による方法が好ましい。
【００２８】
Sasse F et al.（Sasse F, Steinmetz H, Schupp T, Petersen F, Memmert K, Hofmann H,Heusser C, Brinkmann V, von Matt P, Hofle G, Reichenbach H. Argyrins, immunosuppressive cyclic peptides from myxobacteria. I. Production, isolation, physico-chemical and biological properties. J Antibiot (Tokyo). 2002 Jun;55(6):543-51.）は、アルギリンと呼ばれる環状ペプチド群の生成、並びにその生物学的特性の一部を記載している。癌は言及されていない。Vollbrecht et al.（Vollbrecht L, Steinmetz H, Hofle G, Oberer, L, Rihs G, Bovermann G, and von Matt P. Argyrins, immunosuppressive cyclic peptides from myxobacteria. II.Structure elucidation and stereochemistry. J Antibiot (Tokyo). 2002 Aug;55(8):715-721.）は、上記環状ペプチドの構造を記載している。
【００２９】
同様に、Ley et al.（Ley SV, Priour A, Heusser C. Total synthesis of the cyclic heptapeptide Argyrin B: a new potent inhibitor of T-cell independent antibody formation. Org Lett. 2002 Mar 7;4(5):711-4.）は、アルギリンＢの合成、及び抗体形成の阻害物質としてのその機能を記載している。同様に癌は言及されていない。
【００３０】
増殖性障害及び／又は癌の治療が、腫瘍細胞増殖の阻害、既存の腫瘍血管系の阻害及び／又は破壊、乳癌の治療、肝細胞癌の治療、頸癌の治療、肺癌の治療、多発性骨髄腫の治療、及び／又は大腸癌の治療、及び乾癬の治療を含む、本発明による方法がより好ましい。
【００３１】
また、本発明の別の態様は、薬剤がパクリタキセル等の薬学的に活性のある付加的な抗腫瘍成分をさらに含む、本発明による使用に関する。
【００３２】
本発明者らが実施したマウス予備実験は、アルギリンが０．０３ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で既に活性を有することを示す。したがって、本発明の別の態様は、例えばアルギリンＡ又はアルギリンＦ等の化合物が、最適には１日当たり、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇの用量で、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量で、最も好ましくは０．０２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、本発明による使用に関する。別の例では、０．１５ｍｇ／ｋｇ体重のアルギリンが３日毎に腹腔内注射される。
【００３３】
本発明の或る特定の実施の形態では、投与は幾らかの期間、例えば数時間、数日、数週間、数ヶ月、又は数年にわたる化合物への順次曝露をもたらすように設計され得る。これは、化合物の反復投与、例えば上記の方法の１つによって、又は代替的には、化合物を対象に反復投与せずに長期にわたって送達する放出制御送達システムによって達成することができる。放出制御送達システムとは、化合物の全放出が投与の直後ではなく、幾らかの時間遅れて起こることを意味する。放出は一気に起こり得るか、又は徐々に且つ継続的に起こり得る。このようなシステムの投与は、例えば長時間作用型経口投薬形態、ボーラス注入、経皮貼布、又は皮下埋め込みによるものであり得る。放出が一気に起こるシステムの例としては、例えば化合物がポリマーマトリクス中に封入されたリポソームに捕捉され、該リポソームが特定の刺激、例えば温度、ｐＨ、光、磁場、又は分解酵素に対して感受性が高いシステム、及び化合物がマイクロカプセルコア分解酵素でイオンコーティングしたマイクロカプセルにより封入されるシステムが挙げられる。化合物の放出が徐々に且つ継続的に起こるシステムの例としては、例えば化合物がマトリクス内にある形態である浸食システム、及び化合物が制御速度で、例えばポリマーを介して浸透する拡散システムが挙げられる。かかる持続放出システムは、例えば丸薬又はカプセルの形態であり得る。
【００３４】
化合物は、疾患の症状が発現する前、又は発現に続いて投与され得る。或る特定の実施の形態では、化合物は、疾患の家族歴のある患者、又は疾患、例えば乳癌の素因を示し得る表現型を有する患者、又は疾患が患者に生じやすくなる遺伝子型を有すると診断された患者、又は他の危険因子を有する患者に投与される。
【００３５】
本発明による化合物は、対象に治療的に有効な量で投与される。治療的に有効な量とは、疾患を少なくとも部分的に予防するか、又は回復させることが可能な量を意味する。治療的に有効な量は個別的に、且つ対象の種、対象のサイズ、対象の年齢、使用される特定の化合物の有効性、使用される特定の化合物の寿命、使用される送達システムの型、疾患の症状の発症に対する投与の時間、および、単回、複数回、又は放出制御の投与計画のいずれが採用されるかを考慮して、これらの考慮に少なくとも一部基づき、決定することができる。当業者は、かかる因子を用い、単なる日常実験を使用して治療的に有効な量を求めることができる。
【００３６】
或る特定の好ましい実施の形態では、化合物の濃度は、１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０００ｍｇ／ｋｇ体重の用量、より好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量、最も好ましくは０．０２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの用量である。好ましくは、投薬形態は、対象に実質的に悪影響を及ぼさないようなものである。
【００３７】
また、本発明の化合物は任意の従来の経路、特に経腸的に、例えば経口的に、例えば錠剤若しくはカプセルの形態で、非経口的に、例えば注射剤若しくは懸濁剤の形態で、局所的に、例えばローション剤、ジェル、軟膏、若しくはクリームの形態で、又は鼻腔内に、又は坐薬の形態で全身投与若しくは局所投与され得る。
【００３８】
式Ｉの化合物の誘導体は、ペプチド化学の当業者に既知の方法、例えば適切なオリゴペプチドの環形成を含むプロセスによって合成的に調製してもよく、代替的には、適切な微生物の培養ブロスから単離してもよい。調製は、付加的な修飾工程、例えば環外二重結合の水和、添加反応工程、又はハロゲン化工程を含んでいてもよい。適切な微生物は、例えば粘液細菌群から選択される、様々な異なる微生物を培養し、得られた培養ブロスを式Ｉの化合物、特にＲ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が独立して水素、非置換か若しくはＯＨで置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、又はＣ１〜Ｃ４アルコキシであり、Ｒ５が水素であり、且つＸがＣ＝ＣＨ２である式Ｉの化合物の存在についてスクリーニングすることにより同定され得る。
【００３９】
単離は、当業者に一般に知られている方法に従ってもよい。適切なアプローチは、例えば、微生物を固相、例えば樹脂、例えばアンバーライトの存在下で培養すること、式Ｉの化合物を吸着させること、及び式Ｉの化合物を固相から溶出させることを含み得る。
【００４０】
また、本発明の別の態様は、ｐ２７の分解を抑制する能力について化合物をスクリーニングする方法であって、ｐ２７の分解を抑制すると思われる化合物と細胞を接触させること、細胞の含有物を分析して、ｐ２７の量及び／又は生物活性、及び／又は細胞周期の状態を求めること、並びに求めたｐ２７の量及び／又は生物活性、又は細胞周期の状態を、化合物なしで得られたｐ２７の量及び／又は生物活性、又は細胞周期の状態と比較することを含み、該ｐ２７の量及び／又は生物活性、又は細胞周期の状態の変化が、ｐ２７の分解を抑制する化合物の指標となる、方法に関する。
【００４１】
ｐ２７の量及び／又は生物活性、及び／又は細胞周期の状態を求めるために、スクリーニングされる化合物と接触させた細胞の含有物を分析する方法は、当業者に既知であり、ｐ２７についてのウエスタンブロット、（例えばｒｔＰＣＲによる）ｐ２７の発現分析、及び例えばｐ２７−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）等の融合タンパク質の分析、並びに細胞周期マーカーの分析を含む。ｐ２７−ＧＦＰの量を求める、本発明による方法が好ましい。
【００４２】
スクリーニングした化合物が、ｐ２７−ＧＦＰ等の融合タンパク質の量により求められるｐ２７のプロテアソーム分解に影響を与える、本発明による方法が好ましい。
【００４３】
調べられるアッセイ細胞が乳癌細胞株、肝細胞癌細胞株、頸癌細胞株、肺癌細胞株、及び／又は大腸癌細胞株等の腫瘍細胞若しくは細胞株である、本発明による方法が好ましい。
【００４４】
方法が、同定した化合物の化学修飾をさらに含む、本発明による方法がより好ましい。この場合、スクリーニングされる化合物は、さらに化学修飾を受ける、いわゆる「リード構造」として機能するが、これを次に上記のような１つ又は複数のその後のスクリーニング方法において、ｐ２７の量及び／又は生物活性を増大する有効性についてスクリーニングする。
【００４５】
修飾は当該技術分野で既知の様々な方法により達成することができ、該方法としては、新規の側鎖の導入又は官能基の交換、例えばハロゲン、特にＦ、Ｃｌ、又はＢｒの導入、好ましくは１個〜５個の炭素原子を有する低級アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、若しくはイソペンチル基）、好ましくは２個〜５個の炭素原子を有する低級アルケニル基、好ましくは２個〜５個の炭素原子を有する低級アルキニル基の導入、又は、例えばＮＨ２基、ＮＯ２基、ＯＨ基、ＳＨ基、ＮＨ基、ＣＮ基、アリール基、ヘテロアリール基、ＣＯＨ基、又はＣＯＯＨ基から成る群から選択される基の導入が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、単一アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド等の付加的なペプチド基を分子に付加することができる。
【００４６】
必要に応じて、化合物を選択する工程、化合物を修飾する工程、及び修飾化合物のタンパク質への影響を測定する工程は、３回又は任意の所与の必要な回数で反復することができる。上記の方法は、修飾及び選択を含む多数の工程を伴い、これにより有効な化合物が、その能力を特定の特性、すなわちｐ２７の安定化に関して最適化する「進化的」プロセスにおいて選択されるため、「指向進化」とも称される。
【００４７】
上記の式Ｉ（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、水素、非置換か若しくはＯＨで置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、又はＣ１〜Ｃ４アルコキシであり、Ｒ４は水素、ハロゲン、非置換か若しくはＯＨで置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、又はＣ１〜Ｃ４アルコキシであり、Ｒ５は水素又はハロゲンであり、Ｒ６は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルであり、ＸはＣ＝ＣＨ２又はＣＨＲ７であり、ここで、Ｒ７は非置換か若しくは−Ｓ−Ｃ１〜Ｃ４アルキルで置換されたＣ１〜Ｃ４アルキルである）による化合物、及びその薬学的に許容可能な塩が化学修飾される、すなわち「指向進化」のリード構造として使用される、本発明による方法が好ましい。
【００４８】
本発明のさらに別の態様は、本発明によるスクリーニング方法（複数可）、並びにスクリーニングした化合物を、薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤と共に製剤することを含む、医薬組成物を製造する方法を対象とする。例えば任意の従来の経路、特に経腸的に、例えば経口的に、例えば錠剤若しくはカプセルの形態で、非経口的に、例えば注射剤若しくは懸濁剤の形態で、局所的に、例えばローション剤、ジェル、軟膏、若しくはクリームの形態で、又は鼻腔内に、又は坐薬の形態で全身投与若しくは局所投与される医薬組成物を製剤するための担体、賦形剤、及び戦略は、当業者に既知であり、それぞれの文献内に記載される。
【００４９】
薬剤、例えば化合物の投与は、薬剤を標的細胞に到達させる任意の方法により達成することができる。これらの方法には、例えば注射、付着（deposition）、注入、座薬、経口摂取、吸入、局所投与、又は薬剤の標的細胞への接近が達成される任意の他の投与方法が含まれる。注射は、例えば静脈注射、皮内注射、皮下注射、筋肉注射、又は腹腔内注射であり得る。注入には、挿入植え込み型薬物送達システム、例えば、ミクロスフェア、ヒドロゲル、ポリマーリザーバ、コレステロールマトリクス、ポリマーシステム、例えば、マトリクス侵食及び／又は拡散システム、及び非ポリマーシステム、例えば、圧縮、融合、又は部分融合した丸薬が含まれる。座薬はグリセリン座薬を含む。経口摂取用量は腸溶コーティングすることができる。吸入は、吸入器内のエアロゾルを用いて薬剤を、単独か、又は吸収されることができる担体に結合させて投与することを含む。薬剤は、例えば溶解形態又はコロイド形態で液体中に懸濁することができる。液体は溶剤、不完全溶剤、又は非溶剤であり得る。多くの場合、水又は有機液体を使用することができる。
【００５０】
本発明のさらに別の態様は、上記方法により製造される医薬組成物を対象とする。
【００５１】
本発明の別の態様は、対象における癌を治療する方法であって、本発明による医薬品の有効量を、該治療を必要とする対象に投与することを含む、方法に関する。好ましくは、該癌は乳癌、肝細胞癌、頸癌、肺癌、及び大腸癌、又は上記増殖性障害から選択される。好ましくは、上記対象はヒトである。治療するとは、例えば疾患若しくは病気の症状を予防、治療、軽減すること、又は疾患若しくは病気を治癒することを含むことを意味する。
【００５２】
本発明はまた、上記疾患の危険がある対象を治療する方法であって、治療的に有効な量の上記化合物を与える、方法を含む。疾患の危険がある状態は、例えば疾患の家族歴、疾患が生じやすくなる遺伝子型、又は疾患が生じやすくなる表現型症状に起因し得る。
【００５３】
本発明の別の態様は、薬剤が乳癌、肝細胞癌、頸癌、肺癌、及び大腸癌等の癌を調節する、薬学的に活性のある付加的成分、又は他の増殖性疾患を調節する薬剤、例えば抗乾癬薬剤をさらに含む、上記使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】アルギリンＡが２０Ｓプロテアソームの阻害によりｐ２７安定化を誘導することを示す図である。ａ）指定の細胞株をアルギリンＡで処理し、Ｇ１画分及びｓｕｂ−Ｇ１画分を、ヨウ化プロピジウム染色細胞のフローサイトメトリー分析により求めた。ＩＣ５０値を、種々の濃度のアルギリンＡを用いてＭＴＴ細胞増殖アッセイで求めた。ＩＣ５０値は、アルギリンＡが効果を発揮する最大半減濃度として算出した。ｂ）ＳＷ４８０細胞、ＨＣＴ１１６細胞、及びＨｅＬａ細胞を、アルギリンＡで処理した後、ｐ２７ｋｉｐ１の発現レベルをウエスタンブロットにより求めるために、細胞を指定の時点で溶解した。ｃ）ＳＷ４８０細胞及びＨｅＬａ細胞を１２時間アルギリンＡで処理するか、又は未処理のままにした後、シクロヘキシミドを２５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。ｐ２７ｋｉｐ１の発現レベルを、指定の時点でウエスタンブロットにより求め、内部対照として使用したアクチン発現に対して正規化した。グラフは、３つの独立実験の定量化を示す。ｄ）精製ヒト赤血球由来２０Ｓプロテアソームを、指定の量のアルギリンＡ又はボルテゾミブとインキュベートし、カスパーゼ、キモトリプシン及びトリプシン様プロテアソーム活性を、種々の触媒活性に特異的な蛍光発生ペプチド基質を用いて測定した。ｅ）ＳＷ４８０細胞株及びＨＣＴ１１６細胞株をアルギリンＡとインキュベートした。指定の時点で細胞を溶解し、ｐ５３、ｐ２１、Ｂａｘ、ＮｆκＢ、及びアクチンの発現レベルをウエスタンブロットにより分析した。
【図２】プロテアソーム阻害によって誘発されるアポトーシスが、ｐ２７ｋｉｐ１の発現に依存することを示す図である。ａ）アルギリンＡによるアポトーシス細胞死の誘導がｐ２７ｋｉｐ１の発現に依存するか否かを求めるために、野生型（ＷＴ）又はｐ２７ノックアウトマウス（ＫＯ）に由来するマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を、アルギリンＡで処理した。アポトーシスを起こした細胞の数は、ｓｕｂ−Ｇ１画分をヨウ化プロピジウム染色細胞を用いてフローサイトメトリーで測定することにより求めた。６つの独立実験の平均の数を結果として示す。ｂ＋ｄ）野生型ＭＥＦ（ｂ）及びｐ２７ノックアウトＭＥＦ（ｄ）をアルギリンＡで処理するか、又はプロテアソームのβ１、β２若しくはβ５サブユニットに特異的なｓｉＲＮＡで２４時間トランスフェクトした。グラフは、未処理対照（ｎ＝３）と比較した、アルギリンＡ又はｓｉＲＮＡで処理した後の種々のプロテアソームサブユニットの残存触媒活性を示す。ウエスタンブロットは、代表的実験に関するｓｉＲＮＡで処理した後の増殖性細胞におけるプロテアソームのβ１、β２若しくはβ５サブユニットの発現を示す。ｃ＋ｅ）野生型ＭＥＦ（ｃ）又はｐ２７ノックアウトＭＥＦ（ｅ）において、アルギリンＡ又はｓｉＲＮＡで処理した後に、アポトーシスを起こした細胞（ｓｕｂ−Ｇ１画分）の数のフローサイトメトリー測定結果。ｆ）ＨｅＬａ細胞を、アルギリンＡ、ｐ２７に対するｓｉＲＮＡ、又はアルギリンＡ及びｐ２７に対するｓｉＲＮＡで、２４時間又は４８時間処理した。ウエスタンブロットは、種々の処理に応じたｐ２７の発現レベルを示す。ｇ）ヒートマップは、アルギリンＡ又はボルテゾミブで指定の時間処理したＭＣＦ７乳癌細胞の全ゲノム遺伝子発現プロファイルの相関分析を示す。対応する相関値行列は図６ｄに示す。
【図３】アルギリンＡがヒト大腸癌異種移植片においてｉｎ  ｖｉｖｏでアポトーシスを誘導することを示す図である。ａ）マウスにアルギリンＡ（０．０３ｍｇ／ｋｇ体重）又はボルテゾミブ（１ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射した。指定の時点で２０Ｓプロテアソームを末梢血細胞から単離し、種々のプロテアソームサブユニットの活性を記載のように（図１ｄ）求めた。ｂ）マトリゲルと混合したＳＷ４８０大腸癌細胞株を、ｎｕ／ｎｕマウスに皮下注射し、異種移植腫瘍を形成させた。アルギリンＡ又はボルテゾミブでの処理は、これらの腫瘍の体積が２００ｍｍ３に達した時点で開始した。グラフは、１００に設定した開始サイズと比較した、指定の時点での腫瘍体積の定量化を示す（ｎ＝８  アルギリンＡ（０．１５ｍｇ／ｋｇ体重）、ｎ＝４  ボルテゾミブ（０．６ｍｇ／ｋｇ体重）、ｎ＝１０  ＰＢＳ／ＥｔＯＨ対照）。ｃ）全てのマウスを実験の全期間にわたって秤量した。グラフは、アルギリンＡ又はボルテゾミブで処理したマウスに関する体重の変化を示す。ｄ）ボルテゾミブ及びアルギリンＡでの処理後の腫瘍組織におけるプロテアソーム活性の決定。それぞれの化合物を１回注射した後、腫瘍を指定の時点で外植し、プロテアソームを腫瘍組織から抽出した。それぞれのプロテアソームサブユニットの活性を前述のように（図１ｄ）求めた。ｅ）アルギリンＡ処理後の腫瘍組織におけるｐ２７ｋｉｐ１陽性細胞の数の決定。写真は、１０日間のアルギリンＡでの処理後の腫瘍組織における、ｐ２７についての免疫組織化学的染色の代表的な試料を示す。ｆ）アルギリンＡ又はボルテゾミブでの処理後の異種移植腫瘍におけるアポトーシスを起こした細胞の、腫瘍組織のＴＵＮＥＬ染色による検出。アポトーシスを起こした細胞の数を定量化するために、少なくとも２００個の細胞を５つの独立した切片上で計数した。
【図４】アルギリンＡが既存の腫瘍血管を損傷し、ｐ２７ｋｉｐ１依存的に血管新生を妨げることをを示す図である。ａ）マトリゲルと混合したＨＣＴ１１６大腸癌細胞株をｎｕ／ｎｕマウスに皮下注射し、異種移植腫瘍を形成させた。アルギリンＡ又はボルテゾミブでの処理は、これらの腫瘍の体積が２００ｍｍ３に達した時点で開始した。グラフは、１００に設定した開始サイズと比較した、指定の時点での腫瘍体積の定量化を示す（ｎ＝８  アルギリンＡ、ｎ＝８  ボルテゾミブ、ｎ＝６  ＰＢＳ／ＥｔＯＨ）。ｂ）写真は、１０日間のアルギリンＡ処理後の異種移植腫瘍の肉眼的外観を示す。外植腫瘍の大きな壊死中心に留意されたい。ｃ）アルギリンＡ（０．１５ｍｇ／ｋｇ体重）又はボルテゾミブ（１．０ｍｇ／ｋｇ体重）の単回注射の後、腫瘍を指定の時点で外植し、腫瘍組織中の血管をＣＤ３１及びｐ２７について共染色した（代表的な免疫蛍光染色については図７Ａも参照のこと）。グラフはデータの定量化を示す。ｄ）アルギリンＡ（右及び中央の写真）又はボルテゾミブ（左の写真）のそれぞれを注射した後、微小血管の超微細構造を分析した。９０分間のアルギリンＡ処理後の、赤血球による内皮細胞の腫大（「Ｅ」）及び内腔の閉塞（「Ｌ」）に留意されたい。矢印は、４８時間のアルギリンＡ処理後の内皮細胞の分離を指す。左パネルは、ボルテゾミブ処理後にアポトーシスを起こした内皮細胞を示す。ｅ＋ｆ）ＨＵＶＥＣ細胞を、増殖因子を補充した２％ＦＣＳを含有する内皮細胞基礎培地において２４時間増殖させ、アルギリンＡ（１μＭ）、ボルテゾミブ（１０ｎＭ）、ｐ２７に対するｓｉＲＮＡ、アルギリンＡ及びｓｉＲＮＡ、又は、ボルテゾミブ及びｓｉＲＮＡで処理した。管長（ｆ）及び２３箇所の血管様構造を、ＨＵＶＥＣ培地の写真を用いて決定した。顕微鏡写真は、指定の条件下のＨＵＶＥＣ培地の代表的な例を示す。
【図５】ａ）アルギリンＡの化学構造を示す図である。ｂ）ヒストン結合ＤＮＡ断片ＥＬＩＳＡにより求めた、アルギリンＡでの処理後にアポトーシスを起こしたＳＷ４８０細胞（％）の定量化を示すグラフである。カンプトセシン処理Ｕ９３７細胞を陽性対照として使用した。
【図６】ａ）アルギリンＡ又はボルテゾミブでの処理後の、野生型及びｐ２７ノックアウト細胞のフローサイトメトリー測定結果の代表的な例を示すグラフである。ｂ）ｐ２７野生型又はノックアウトＭＥＦをアルギリンＡとインキュベートし、ｐ２１、ｐ５３、Ｂａｘ、及びアクチンの発現レベルを指定の時点で求めた。ｃ）ＭＣＦ７乳癌細胞をアルギリンＡ又はボルテゾミブと２４時間インキュベートするか、又は未処理のままにし、カスパーゼ、キモトリプシン及びトリプシン様プロテアソーム活性を、種々の触媒活性に特異的な蛍光発生ペプチド基質を用いて測定した。ｄ）図２ｇの相関値を示す図である。
【図７】ＣＤ３１及びｐ２７に対するヒト大腸癌異種移植腫瘍の内皮細胞の代表的な免疫蛍光共染色を示す図である。
【図８】マウスの体重により示されるように、アルギリンＡ処理が非常に良好な耐容性を示すことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明者らは近年、遺伝子改変マウスにおける安定化型ｐ２７ｋｉｐ１（ｐ２７ｋｉｐ１Ｔ１８７Ａ）の発現が、浸潤癌に進行した腸管腺腫性ポリープの数を有意に低減することを実証した（Timmerbeul, I. et al. Testing the importance of p27 degradation bythe SCFskp2 pathway in murine models of lung and colon cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 14009-14 (2006)）。この研究に基づいて、本発明者らは、癌組織におけるｐ２７の再発現をもたらす化合物の同定に着手した。この研究では、本発明者らは、ｐ２７ｋｉｐ１発現の強力な誘発剤として、粘液細菌アーキアンギウム・ゲファイラ（archangiumgephyra）に由来する化合物であるアルギリンＡを同定した。アルギリンＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト癌細胞株及び腫瘍異種移植片においてアポトーシスを誘導する。重要なことには、ｐ２７ｋｉｐ１を誘導することにより、アルギリンＡは既存の腫瘍血管系をも標的とし、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍組織の破壊をもたらす。アルギリンＡの機能は、この化合物に応答してｐ２７ｋｉｐ１を発現しない腫瘍細胞としてでも、内皮細胞としてでもないｐ２７ｋｉｐ１の発現に厳密に依存する。驚くべきことに、アルギリンＡがそのｐ２７依存性生物学的機能を発揮する分子機構は、２０Ｓプロテアソームの強力な阻害による。
【００５６】
ｐ２７ｋｉｐ１の発現レベルの増大をもたらす物質を同定するために、本発明者らは、細胞に基づいたハイスループットアッセイシステムを作成した（詳細は材料及び方法を参照のこと）。蛍光において最も強い増大を示した物質の１つをアルギリンＡとして同定したが、これは粘液細菌アーキアンギウム・ゲファイラに由来する代謝産物として最初に同定された環状ペプチドである（Sasse, F. et al. Argyrins, immunosuppressive cyclic peptides from myxobacteria. I. Production, isolation, physicochemical and biologicalproperties. J Antibiot (Tokyo) 55, 543-51 (2002) Figure 5A）。フローサイトメトリーにより示されるように、アルギリンＡはＩＣ５０の範囲で２つの異なる細胞表現型を示した。初代ヒト線維芽細胞、Ａ５４９（肺癌）及びＨＣＴ１１６（大腸癌）細胞は増殖を停止したが、ｓｕｂ−Ｇ１段階画分の劇的な増加により示されるように、大腸癌細胞株ＳＷ４８０、ＣａＣｏ、並びにＭＣＦ７（乳癌）及びＨｅＬａ（頸癌）細胞はアポトーシスを遂げた。アルギリンＡのアポトーシス誘導活性は、ヒストン断片化ＥＬＩＳＡを用いてＤＮＡ断片化を測定することにより確認した（図５ｂ）。
【００５７】
図１ｂに示す経時的実験により、アルギリンＡがＳＷ４８０及びＨＣＴ１１６大腸癌、並びにＨｅＬａ細胞においてｐ２７ｋｉｐ１細胞内レベルの増大を誘導したことが示される。アルギリンＡが誘導したｐ２７ｋｉｐ１発現レベルにおける変化が、その安定性の増大によるものか否かを判定するために、本発明者らは、アルギリンＡの存在下及び非存在下でのＨｅＬａ細胞及びＳＷ４８０細胞におけるｐ２７ｋｉｐ１の半減期を測定した。図１ｃは、アルギリンＡとインキュベートしたか、又は未処理のままにしたシクロヘキシミド処理細胞における、アクチンと比較したｐ２７ｋｉｐ１発現レベルの定量化を示す。アルギリンＡ処理は、これらの細胞においてｐ２７代謝の完全な阻害を引き起こす。全ての既知のｐ２７代謝機構が、２０Ｓプロテアソームによるタンパク質のタンパク質破壊を伴うため、本発明者らは次に、漸増量のアルギリンＡとインキュベートした後の精製ヒトプロテアソームの活性を測定した。図１ｄは、精製ヒト２０ＳプロテアソームをアルギリンＡとインキュベートすることでカスパーゼ、トリプシン及びキモトリプシン様プロテアソーム活性の用量依存的阻害がもたらされることを示す。重要なことには、アルギリンＡによるプロテアソーム阻害の程度は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで臨床的に使用されるプロテアソーム阻害物質であるボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）を用いて測定したものと同程度である。アルギリンＡのプロテアソームを抑制する能力に従って、本発明者らは、他の既知のプロテアソーム基質、すなわちｐ５３、ｐ２１、ＢＡＸ、及びＮｆκＢもアルギリンＡ処理に反応して蓄積したことを見出した（図１ｅ）。したがって、本発明者らは、アルギリンＡはｉｎ  ｖｉｖｏでのプロテアソーム阻害活性によりｐ２７の分解を予防し、様々な異なる腫瘍細胞株においてアポトーシス又はＧ１停止を誘導すると結論付ける。
【００５８】
次に本発明者らは、ｐ２７の安定化がアルギリンＡのアポトーシス誘導機能に実際に必要であったか、又は単にプロテアソーム阻害の結果であったかを試験した。このために、本発明者らは、ｐ２７ｋｉｐ１野生型又はノックアウトマウスからの不死化マウス胎児線維芽細胞を、アルギリンＡ又はプロテアソーム阻害物質ボルテゾミブで処理し、フローサイトメトリーにより細胞周期分布及びアポトーシスを分析した。ボルテゾミブ処理は、ｐ２７ｋｉｐ１状態に関係なく、両方の細胞株において２４時間後にアポトーシスを誘導した。図２ａは、ｐ２７野生型及びノックアウトＭＥＦにおけるｓｕｂ−Ｇ１画分の定量化を示す（図６ａも参照のこと）。ＭＧ１３２処理と同じ反応が観察された。非常に対照的に、アルギリンＡ処理はｐ２７ｋｉｐ１を発現した細胞でしかアポトーシスを誘導しなかったが、６０時間の処理後でアポトーシス細胞死を遂げたｐ２７ｋｉｐ１ノックアウト線維芽細胞はわずか１０％であった。アルギリンＡ処理に応じるこれらの感度の差は、ｐ２７野生型及びノックアウト細胞における他のプロテアソーム基質の蓄積差によるものではないが、これは両方の細胞株においてｐ５３及びｐ２１レベルがアルギリンＡに反応して増大したためである（図６ｂ）。この見解をヒト癌細胞に広げるために、本発明者らは、ｐ２７ｋｉｐ１特異的ｓｉＲＮＡを用いてＨｅＬａ細胞におけるｐ２７ｋｉｐ１レベルを低減した。図２ｆに示されるように、ｐ２７ｋｉｐ１を発現するＨｅＬａ細胞はアルギリンＡに反応してアポトーシスを遂げたが、ｐ２７ｓｉＲＮＡでの処理は、この化合物のアポトーシス誘導機能を完全に阻害した。
【００５９】
本発明者らの分析は、プロテアソーム阻害物質であるアルギリンＡ及びボルテゾミブの両方が、プロテアソーム活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害可能であるが、アルギリンＡのみ細胞死を誘導するためにｐ２７ｋｉｐ１発現を必要とすることを示す。したがって、本発明者らは、プロテアソーム阻害の細胞効果自体がｐ２７ｋｉｐ１発現に影響を受ける程度を直接試験することを決意した。このため、本発明者らは、マウス２０Ｓプロテアソームのβ１（カスパーゼ様活性）、β２（トリプシン様活性）及びβ５（キモトリプシン様活性）サブユニットを標的とする特異的ｓｉＲＮＡ分子を設計した。本発明者らは次に、野生型又はｐ２７ｋｉｐ１ノックアウト細胞に由来する胎児線維芽細胞における、これらのサブユニットの発現を低減し、プロテアソーム活性及び細胞周期分布を測定した。図２ｂ及び図２ｄは、β１、β２及びβ５サブユニットに対してアルギリンＡ又はｓｉＲＮＡの組み合わせで処理した後の、プロテアソームのカスパーゼ、キモトリプシン及びトリプシン様活性の活性測定結果を示す。プロテアソームサブユニット発現のレベルは、対応するウエスタンブロットにおいて示される。プロテアソームサブユニットのｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンにより本発明者らが到達した阻害度は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのアルギリンＡ又はボルテゾミブ処理により発揮される効果と同程度であった（図３ａ）。プロテアソームサブユニット発現のレベルは対応するウエスタンブロットにより示される。
【００６０】
野生型線維芽細胞におけるプロテアソーム活性の喪失は、２４時間後に全細胞の３８％（アルギリンＡ）又は４５％（ｓｉＲＮＡ）においてアポトーシスの誘導をもたらした（図２ｃ）。重要なことには、ｐ２７ノックアウトマウスに由来する全線維芽細胞の５％（アルギリンＡ）又は６％（ｓｉＲＮＡ）しか、同程度のプロテアソーム阻害レベルでアポトーシスを遂げなかったが（図２ｅ）、ボルテゾミブでのｐ２７野生型又はノックアウト細胞の処理は、ｐ２７の状態と独立して広範なアポトーシスを誘導した（図２ａ）。これらの結果は、プロテアソーム阻害に応じたアポトーシス細胞死の重要な調節因子としてのｐ２７ｋｉｐ１の未知の役割を指摘する。
【００６１】
本発明者らは、アルギリンＡ又はボルテゾミブで直接処理した細胞の細胞反応を比較することを決意した。この目的で、本発明者らは、アルギリンＡ又はボルテゾミブに応じたＭＣＦ７細胞の遺伝子発現の特徴を求め、得られた遺伝子発現プロファイルを比較した。図６ｃは、これらの実験で未処理のＭＣＦ７細胞、アルギリンＡ又はボルテゾミブで処理したＭＣＦ７細胞を用いて本発明者らが得た遺伝子発現データの相関プロットを示す。図６ｄは相関値を示す。図２ｇに示されるように、ボルテゾミブ又はアルギリンＡで処理したＭＣＦ７細胞の遺伝子発現プロファイルは劇的に異なる。ボルテゾミブ処理は１０９００個を超える遺伝子の発現において変化をもたらしたが、アルギリンＡ処理に応じて変化した遺伝子はわずか約５００個であった。これらの遺伝子のうち、３１１個がボルテゾミブ及びアルギリンＡの両方によりそれぞれ影響を受けた。対応する遺伝子オントロジー用語に基づく機能遺伝子クラスタリングは、アルギリンＡ及びボルテゾミブが共に２０Ｓプロテアソームを抑制するが、これらは細胞レベルの非常に異なる変動を引き起こすことを示唆する。このデータから、本発明者らは、ボルテゾミブ処理が細胞のさらなる標的に影響を及ぼし、これにより多様な細胞反応が活性化し、ｐ２７ｋｉｐ１発現と独立してボルテゾミブ誘導細胞死が起こると結論付ける。
【００６２】
本発明者らは近年、ｐ２７ｋｉｐ１安定化が腺腫性ポリープからの浸潤性腸癌への進行を予防することを実証した。したがって、本発明者らはアルギリンＡ誘導ｐ２７ｋｉｐ１安定化が、ヒト大腸癌細胞由来腫瘍異種移植片の治療において有益であるか否かを試験した。これを分析するために、本発明者らはまず、ｉｎ  ｖｉｖｏ適用後にアルギリンＡが活性を有するか否かを試験した。アルギリンＡの腹腔内注射後、２０Ｓプロテアソームを注射後の異なる時点で末梢血リンパ球から単離した。図３ａに示されるように、アルギリンＡは、腹腔内適用後に全てのプロテアソーム活性を阻害した。注射後４８時間で最大阻害活性に到達し、全ての活性は注射後７２時間で基準レベルまで戻った。この所見に基づいて、本発明者らは腫瘍担持マウスを３日毎に０．１５ｍｇ／ｋｇ体重のアルギリンの腹腔内注射で処理した。
【００６３】
図３ｂに示されるように、アルギリンＡは、これらの実験において使用した異種移植腫瘍のサイズの有意な低下をもたらした。腫瘍退縮の程度及び動態は、ボルテゾミブ処理動物において観察されたものと同程度であるか、又はさらに顕著であった。しかし、重要なことには、本発明者らはボルテゾミブ処理動物と比較して、アルギリンＡにおける不快症状、体重減少（図３ｃ）、又は疾患の任意の兆候は観察しなかった。
【００６４】
初代腫瘍組織におけるプロテアソーム阻害、ｐ２７ｋｉｐ１誘導、及びアポトーシス細胞死の発生の程度を分析するために、本発明者らは、腫瘍担持マウスをアルギリンＡ又はボルテゾミブの単回投与により処理し、その後腫瘍を指定の時点で外植した。図３ｄに示されるように、ボルテゾミブ処理及びアルギリンＡ処理は共に、初代腫瘍組織においてプロテアソーム活性の有意な低下をもたらした。
【００６５】
重要なことには、アルギリンＡ処理は全腫瘍細胞の６０％超で、ｐ２７ｋｉｐ１の誘導及びアポトーシス細胞死をもたらした（図３ｅ、図３ｆ）。この結果は、ＳＷ４８０細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでアルギリンＡ処理に対して感受性が高いことから、予期していなかったことではない。したがって、本発明者らは、これらの細胞株がｉｎ  ｖｉｔｒｏでアポトーシスを遂げないが、代わりにＧ１段階に停止したため、アルギリンＡがＨＣＴ１１６由来腫瘍異種移植片に対して効果を示すか否かを試験することを決意した。これらの実験の結果は図４ａに示す。腫瘍サイズの低下は、ＳＷ４８０由来異種移植片ほど顕著ではなかったにもかかわらず、本発明者らはアルギリンＡ処理後の腫瘍体積において有意な低下を認めた。興味深いことに、ＳＷ４８０又はＨＣＴ１１６由来腫瘍を外植すると、これらは一様に、血液及び壊死腫瘍組織で満たされた腫瘍の中心に大きな壊死領域を示した（図４ｂ）。この表現型は多くの場合、血管形成を妨げる薬物又は既存の腫瘍血管を直接損傷する化合物により観察される。したがって、本発明者らは、アルギリンＡの単一注射を受けたマウスからの腫瘍組織（ＳＷ４８０又はＨＣＴ１１６）において、微小血管密度を求めた。図４ｃは、アルギリンＡが、早ければ注射の９０分後に始まるＣＤ３１陽性内皮細胞数の有意な低下をもたらし、注射の７２時間後では約１０％のＣＤ３１陽性細胞しか残存しないことを示す（代表的な染色については補足の図３ａを参照のこと）。腫瘍血管系のこの低下は、ＣＤ３１陽性内皮細胞におけるｐ２７ｋｉｐ１発現の誘導と並行した（図７ａ）。この表現型をより詳細に理解するために、本発明者らは、初代腫瘍材料を電子顕微鏡検査法により分析した。早ければ注射の９０分後に、本発明者らは、腫瘍血管系において内皮細胞の腫大、続いて基底膜付着及び細胞間接触の喪失を観察した（図４ｄ）。アルギリンＡ処理後の細胞及び基底膜付着の明らかな喪失の結果、観察した腫瘍血管の多くが内皮細胞又は赤血球により閉塞した。アルギリンＡ処理後に本発明者らが観察した腫瘍中心部の破壊は、したがって罹患血管の血栓性閉塞の結果であり得る。対照的に、ＣＤ３１陽性細胞におけるボルテゾミブ誘導低下は、壊死内皮細胞の発現と相関する（図４ｄ）。
【００６６】
本発明者らは次に、化合物の血管新生を妨げる能力を試験するために頻繁に使用したアッセイで、アルギリンＡがＨＵＶＥＣによりマトリゲル上に形成される毛細血管様管構造の形成を同様に妨げることが可能か否かを求めた。図４ｅは、ＶＥＧＦで刺激した際にＨＵＶＥＣにより形成された毛細血管の相対長の定量化を示す。アルギリンＡの添加は、このアッセイにおいて管形成の４０％の低下をもたらした。重要なことには、ｐ２７に対するｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、内皮細胞をアルギリンＡの阻害活性から保護した。このアッセイにおいてボルテゾミブが発揮した効果はより小さく、ｐ２７の欠損によって奪回されない。管長に加えて、本発明者らは、アルギリンＡ又はボルテゾミブでの処理の後、ＨＵＶＥＣにより形成された血管様構造の数も定量化した（図４ｆ）。両処理は血管様構造において有意な低減をもたらした。しかしながら、ｐ２７の欠損は、アルギリンＡ誘導表現型に対してしか有意な効果を有さず、アルギリンＡがその生物学的機能をｐ２７ｋｉｐ１発現の増大により発揮するという結論を強固にする。
【００６７】
この研究では、本発明者らは、ｐ２７ｋｉｐ１の細胞内代謝を阻害することにより生物学的機能を発揮する化合物として、粘液細菌由来環状ペプチドアルギリンＡを同定する。ｐ２７ｋｉｐ１の安定化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで種々のヒト腫瘍細胞においてＧ１停止又はアポトーシスをもたらした。ヒト大腸癌細胞株に由来する異種移植腫瘍を処理することにより、本発明者らはさらに、アルギリンＡも腫瘍血管系に影響を及ぼすことを示す。その抗血管形成活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管新生の阻害を包含するが、より顕著にはｉｎ  ｖｉｖｏでの確立した腫瘍血管の破壊を包含する。本発明者らは、腫瘍中心部の破壊が内皮細胞の基底膜からの分離、及び細胞間接触の喪失を伴うことを示す。同様に、ＨＵＶＥＣ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで、アルギリンＡでの処理の後、局所接着及びストレス線維の形成の低減を示すが、これはＲｈｏＡ活性の低減と相関する。同じ状況において、腫瘍細胞におけるｐ２７ｋｉｐ１発現の喪失又は抑制は、アルギリンＡのアポトーシス誘導活性への耐性をもたらす。これらの見解は共に、アルギリンＡ抗腫瘍活性がｐ２７ｋｉｐ１安定化により媒介されるという結論を支持する。
【００６８】
アルギリンＡがｐ２７ｋｉｐ１を安定化する分子機構は、２０Ｓプロテアソームの阻害による。この結論は、アルギリンＡがｉｎ  ｖｉｔｒｏ、並びに末梢血細胞及び腫瘍組織ではｉｎ  ｖｉｖｏで精製２０Ｓプロテアソームの全てのプロテアソーム活性を抑制可能であるという見解に基づく。重要なサブユニットを対象とするｓｉＲＮＡを用いてプロテアソーム活性を阻害することにより、本発明者らは驚くことに、ｐ２７ｋｉｐ１が実際にプロテアソーム阻害のアポトーシス誘導機能自体に必要であることを見出した。したがって、ｐ２７ｋｉｐ１の発現の喪失又は低減は、通常はプロテアソームにより分解されるタンパク質の蓄積を引き起こすプロセスに対する腫瘍細胞の耐性の増大をもたらす。本発明者らはアルギリンＡ、及び本明細書中に記載される他のアルギリン、例えば特にアルギリンＦによるｐ２７ｋｉｐ１安定化が、ヒト悪性腫瘍の治療に有益な新規の戦略であることを示唆する。
【００６９】
また、本発明の別の態様は、薬剤が薬学的に活性のある付加的抗腫瘍成分、例えばパクリタキセル及び／又はボルテゾミブをさらに含む、本発明による方法に関する。
【００７０】
本発明の別の態様は、対象における癌を治療する方法であって、本発明による医薬品の有効量を、該治療を必要とする対象に投与することを含む、方法に関する。好ましくは、該癌は乳癌、肝細胞癌、頸癌、肺癌、及び大腸癌から選択される。好ましくは、該対象はヒトである。治療するとは、例えば疾患若しくは病気の症状を予防、治療、軽減すること、又は疾患若しくは病気を治癒することを含むことを意味する。
【００７１】
本発明はまた、上記疾患の危険がある対象を治療する方法であって、治療的に有効な量の上記化合物を与える、方法を含む。疾患の危険がある状態は、例えば疾患の家族歴、疾患が生じやすくなる遺伝子型、又は疾患が生じやすくなる表現型症状に起因し得る。
【００７２】
以下の図面、配列、及び実施例は、単に本発明を説明するために用いられ、本発明の範囲を実施例に記載される本発明の特定の実施の形態に限定すると解釈されるべきではない。本発明において、本明細書中に引用される全ての参照文献は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【００７３】
配列番号１〜配列番号１４は、本発明において使用するｓｉＲＮＡ分子の配列を示す。
【実施例】
【００７４】
材料及び方法：
ｐ２７安定化物質に関するハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）
ｐ２７安定化化合物に関するハイスループット細胞スクリーニングは、ＨｅＬａ細胞におけるｐ２７ｋｉｐ１−ＧＦＰ融合タンパク質の発現を可能にする、ＤＮＡプラスミド（ＥＧＦＰ−Ｎ１、Clontech）を安定に導入することにより確立した。ｐ２７−ＧＦＰ発現細胞をネオマイシンを用いて選択し、幾つかの独立クローンを継代培養した。ＨｅＬａ  ｐ２７−ＧＦＰ細胞を、３８４ウェルプレート（Corning）に播種し、一連の多様な天然産物（ヘルムホルツ感染研究センターの粘液細菌代謝産物コレクションの一部）と７０ｎＭ濃度でインキュベートした。ＧＦＰ発光を処理開始の３時間後、２４時間後、４８時間後、及び６０時間後にＶｉｃｔｏｒ  １４２０マルチラベルカウンター（Perkin Elmer）を用いて蛍光分析測定により求めた。プロテアソーム阻害物質ＭＧ１３２を陽性対照として使用した。
【００７５】
細胞及び組織培養
初代ヒト線維芽細胞（ＨＫＩ）；ＨＣＴ１１６（大腸癌）、ＭＣＦ７（乳癌）、ＣａＣｏ（大腸癌）、Ａ５４９（肺癌）、ＨｅＬａ（頸癌）、及び不死化ＭＥＦは、５％ＦＣＳ及び２ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で培養した。ＳＷ４８０細胞（大腸癌）は、５％ＦＣＳ及び２ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを補充したマッコイ培地中で培養した。
【００７６】
抗体、ウエスタンブロット、免疫蛍光、免疫組織化学
マウス腫瘍組織の免疫組織化学的染色、ウエスタンブロット、及び免疫蛍光の実験は、以前に記載されているように（Timmerbeul, I. et al. Testing the importance of p27 degradation by the SCFskp2 pathway in murine models of lung and colon cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 14009-14 (2006). Kossatz, U. et al. C-terminal phosphorylation controls the stability and function of p27kipl. Embo J 25, 5159-70(2006).）行なった。以下の抗体を使用した：ｐ２７（カタログ番号Ｋ２５０２０−１５０；Transduction Labs）、ｐ２１（Ｎ２０；SantaCruz）、ｐ５３（ＦＬ−３９３；Santa Cruz）、ＮｆκＢ（Ｃ−２０；Santa Cruz）、Ｂａｘ（Ｐ−１９；Santa Cruz）、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８（＃Ａ１１００１；Invitrogen）、２０Ｓプロテアソームサブユニットβ２（Ｚ）（ＰＷ９３００；Biomol、ヒト細胞用）、２０Ｓプロテアソームサブユニットβ２（Ｚ）（ＰＷ８１４５；BIOTREND、マウス細胞用）；２０Ｓプロテアソームサブユニットβ１（Ｙ）（ＰＷ８１４０；BIO TREND）、２０Ｓプロテアソームサブユニットβ５（ＰＷ８８９５；BIO TREND）；ＰＥＣＡＭ抗体クローンＭＥＣ  １３．３（＃５５０２７４；BD Pharmingen）。
【００７７】
ＭＴＴアッセイ、アポトーシス、フローサイトメトリー
ＭＴＴアッセイは、以前に記載されているように（Sasse, F. et al. Argyrins, immunosuppressive cyclic peptides from myxobacteria. I. Production, isolation, physico-chemical and biological properties. J Antibiot (Tokyo) 55, 543-51 (2002)）行なった。組織切片のＴＵＮＥＬ染色は、脱パラフィンし（deparafinised）、製造業者により推奨されるように処理した（Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ；ROCHE、カタログ番号１１  ６８４  ７９５  ９１０）１０μｍの切片上で実施した。培養細胞のフローサイトメトリー分析は、Becton Dickinsonの蛍光フローサイトメーターを用いて、以前に記載されているように（Malek, N.P. et al. A mouse knock-inmodel exposes sequential proteolytic pathways that regulate p27Kip1 in G1 and S phase. Nature 413,323-7 (2001)）行なった。細胞周期における細胞の分布及びｓｕｂ−Ｇ１画分の分析は、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて行なった。ヒストン結合ＤＮＡ断片ＥＬＩＳＡを使用して、製造業者の指定に従って（Roche；＃１１  ７７４４２５００１）アポトーシスを起こした細胞の数を求めた。
【００７８】
ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡノックダウンは、トランスフェクション試薬ＦｕＧｅｎｅ６（登録商標）、又はＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬を用いて実施した。トランスフェクションは、ｓｉＲＮＡをＰｓｍｂ１、Ｐｓｍｂ２、ＰＳＭＢ１、ＰＳＭＢ２、及びＣＤＫＮ１Ｂについては０．２ｎＭの濃度で、Ｐｓｍｂ５及びＰＳＭＢ５については０．４ｎＭの濃度で用いて行なった。ｓｉＲＮＡは全て、Ambionから購入した。
【００７９】
ｐ２７：ＩＤ：１１８７１４：
ｐ２７  フォワード：５’−ＣＧＵＡＡＡＣＡＧＣＵＣＧＡＡＵＵＡＡｔｔ−３’（配列番号１）
バックワード：５’−ＵＵＡＡＵＵＣＧＡＧＣＵＧＵＵＵＡＣＧｔｔ−３’（配列番号２）
【００８０】
Ｐｓｍｂ１：ＩＤ：６８８７８：
Ｐｓｍｂ１  フォワード：５’−ＧＧＡＵＵＵＵＣＡＡＵＵＣＡＵＡＣＣＣｔｔ−３’（配列番号３）
バックワード：５’−ＧＧＧＵＡＵＧＡＡＵＵＧＡＡＡＡＵＣＣｔｔ−３’（配列番号４）
【００８１】
Ｐｓｍｂ２：ＩＤ：７０４８０：
Ｐｓｍｂ２  フォワード：５’−ＧＧＡＣＧＡＵＣＡＵＧＡＣＡＡＧＡＵＧｔｔ−３’（配列番号５）
バックワード：５’−ＣＡＵＣＵＵＧＵＣＡＵＧＡＵＣＧＵＣＣｔｔ−３’（配列番号６）
【００８２】
Ｐｓｍｂ５：ＩＤ：６８７８３：
Ｐｓｍｂ５  フォワード：５’−ＧＧＵＧＣＵＵＡＵＡＵＵＧＣＵＵＣＣＣｔｔ−３’（配列番号７）
バックワード：５’−ＧＧＧＡＡＧＣＡＡＵＡＵＡＡＧＣＡＣＣｔｇ−３’（配列番号８）
【００８３】
ＰＳＭＢ１：ＩＤ：１０５６１２：
ＰＳＭＢ１  フォワード：５’−ＧＡＣＵＧＵＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＣＡＡｔｔ−３’（配列番号９）
バックワード：５’−ＵＵＧＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧＡＣＡＧＵＣｔｃ−３’（配列番号１０）
【００８４】
ＰＳＭＢ２：ＩＤ：１０５６１４：
ＰＳＭＢ２  フォワード：５’−ＧＡＵＡＵＵＡＣＵＣＣＵＧＵＧＵＧＵＵｔｔ−３’（配列番号１１）
バックワード：５’−ＡＡＣＡＣＡＣＡＧＧＡＧＵＡＡＵＡＵＣｔｔ−３’（配列番号１２）
【００８５】
ＰＳＭＢ５：ＩＤ：１０５６２２：
ＰＳＭＢ５  フォワード：５’−ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＵＣＧＡＡＡｔｔ−３’（配列番号１３）
バックワード：５’−ＵＵＵＣＧＡＵＵＣＣＵＧＧＣＣＵＵＣｔｇ−３’（配列番号１４）
【００８６】
プロテアソーム精製、プロテアソームアッセイ
精製２０Ｓプロテアソームによるプロテアソームアッセイは、以前に記載されているように（Lightcap, E. S. et al. Proteasome inhibition measurements: clinical application. Clin Chem 46, 673-83 (2000)）、赤血球由来２０Ｓプロテアソーム（Biomol International、＃ＬＰ  ＰＷ８７２０）及び蛍光基質Ｓｕｃｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ、ＢＺ−ＶＧＲ−ＡＭＣ、及びＺ−Ｌｌｅ−ＡＭＣ（Biomol International、ＬＰ  ＰＷ９９０５）をプローブとして用いて、製造業者の指定に従って実施した。細胞及び腫瘍切片からのプロテアソーム抽出は、以前に記載されているように（Crawford,L.J. et al. Comparative selectivity and specificity of the proteasome inhibitors BzLLLCOCHO, PS-341, and MG-132. Cancer Res 66, 6379-86 (2006)）行なった。簡潔に言うと、細胞（ＭＥＦ又はＭＣＦ−７）又は組織試料ホモジネート（腫瘍切片）を、１ｍＬのＡＴＰ／ＤＴＴ溶解緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、５ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、０．５ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＴ、５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２）に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートし、続いて１５秒間超音波処理した。溶解物を４００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、得られたプロテアソームを含有する上清を、２０％グリセロールを添加して−８０℃で少なくとも１ヶ月間固定した（stable）。試料のタンパク質濃度を、クマシータンパク質アッセイ（Pierce、Rockford、IL）を用いて測定した。
【００８７】
全血からのプロテアソーム抽出については、凍結全血細胞ペレットを解凍し、２〜３ペレット容量の冷溶解緩衝液（５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に溶解した。溶解物を４℃で遠沈し、上清を新しい試験管に移した。クマシータンパク質アッセイ（Pierce、Rockford、IL）を用いてタンパク質濃度を求めるために、５μｌを取った。
【００８８】
細胞又は組織から精製したプロテアソームを用いたプロテアソームアッセイを、２０μｇのプロテアソーム抽出物、５０ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、及び６０μｍｏｌ／Ｌの蛍光発生基質（キモトリプシン様（ＣＴ−Ｌ）、トリプシン様（Ｔ−Ｌ）、又はカスパーゼ様（Ｃ−Ｌ））を含有するＡＴＰ／ＤＴＴ溶解緩衝液（反応容量１００μＬ）中、３７℃で実行した。アッセイ緩衝液に、キモトリプシン様活性及びカスパーゼ様活性の評価のために最終濃度０．０５％のＳＤＳを補充した。蛍光発生ペプチド基質の開裂速度は、Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０マルチラベルカウンター（Wallac）を用いて、励起波長３９５ｎｍ及び放射波長４６０ｎｍで６０分間にわたって、放出されたアミノメチルクマリンの蛍光をモニタリングすることにより求めた。
【００８９】
ＨＭＶＥＣ培養、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ毛細血管様管構造形成アッセイ、及び免疫蛍光
初代微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）をヒト包皮から単離した。細胞を基礎培地（ＥＢＭ−２）、ＦＢＳ、ヒドロコルチゾン、ｈＦＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ、Ｒ３−ＩＧＦ、アスコルビン酸、ｈＥＧＦ、ゲンタマイシン、及びアムホテリシンを含むＥＧＭ−２  ＭＶ（Cambrex）において、３７℃及び１０％ＣＯ２で維持した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管形成に対するアルギリンＡ又はボルテゾミブの影響を、マトリゲル毛細血管様管構造形成アッセイにより求めた。種々の化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管形成への影響を調べるために、マトリゲル（BDBiosciences、＃３５４２４８）でプレコートした９６ウェル培養プレートにＨＭＶＥＣを播種し、アルギリンＡ又はボルテゾミブに曝露した。無作為に選択した３つの領域からの管構造の閉鎖ネットワークを、顕微鏡（Leica、Cambridge、United Kingdom）下でスコアリングした。Ａｘｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎ  ３．１  Ｚｅｉｓｓカメラを用いて写真を撮り、管長及び閉鎖血管様構造の形成を求めることによりスコアリングした。
【００９０】
異種移植研究
１×１０７個のＳＷ４８０細胞又はＨＣＴ１１６細胞（１００μｌのＤＭＥＭ培地及び１００μｌのマトリゲル中）を、ＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍を適当なサイズ（２００ｍｍ３）に達するまで、およそ１８日間増殖させた。腫瘍のサイズをデジタルノギスで測定し、以下の式：（長さ×幅２）×π／６を用いて算出した。実験は全て検討後に、Lower Saxony、Germanyの動物権利保護機関に従って行なった。
【００９１】
ＥＭ
腫瘍の小試験片を、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．３）中２．５％グルタルアルデヒド（Polysciences、Warrington、PA、USA）中で固定し、同じ緩衝液中２％四酸化オスミウム（Polysciences）で後固定した。段階的（graded）アルコール中で脱水した後、Ｅｐｏｎ（Serva、Heidelberg、Germany）に包埋した。酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した薄片を、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＥＭ  ３０１電子顕微鏡において観察した。電子顕微鏡写真を選択し、デジタル化し、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ６．０を用いて処理した。
【００９２】
ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション及び分析
単離した全ＲＮＡの品質及び完全性を、全試料をＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Agilent Technologies；Waldbronn、Germany）にかけることにより調整した。３μｇの全ＲＮＡから始めるビオチン標識標的合成に関しては、反応を製造業者（Affymetrix；SantaClara、CA）により提供された標準プロトコルを用いて行なった。いずれの場合にも、１０μｇの標識ｃＲＮＡを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ  ＨＧ−Ｕ１３３  ２．０の同一ロットに４５℃で１６時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、ＧｅｎｅＣｈｉｐを洗浄し、ＳＡ−ＰＥで染色し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ流体装置及びスキャナーを用いて読み取った。
【００９３】
データ分析
マイクロアレイデータの分析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＣＯＳ  １．２ソフトウェアを用いて実施した。正規化のために、全アレイ実験を標的強度１５０に合わせるか（scaled）、そうでなければＧＣＯＳ  １．２のデフォルト値を用いた。完全データセットは、ＭＩＡＭＥ対応フォーマットのＧＥＯ公開データベースサーバーに寄託されており、アクセッション番号ＧＳＥ８５６５で入手可能である。アレイ一組の相関係数は：
【００９４】
【数１】
0005564267.tif 000005
【００９５】
（式中、ａｉはアレイａにおけるシグナルであり、ｂｉはアレイβにおけるシグナルであり、μ及びσはそれぞれ平均及び標準偏差であり、ｎは各アレイにおける項目数である）として定義した。遺伝子オントロジー用語に基づく機能クラスタリングを、Ａｒｒａｙ  Ａｓｓｉｓｔ  ５．１（Stratagene、La Jolla、CA）を用いて実施した。
【００９６】
統計分析
統計分析は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌソフトウェアを用いて実行した。特に指定のない限り、全てのデータは平均＋／−ＳＤ（エラーバーは全ての図においてＳＤを表す）として表す。群間比較は両側スチューデントｔ検定により実施した。ｐ＜０．０５の確率値は、統計的有意性を示すものと解釈した。
【００９７】
レポーター構築物としてのｐ２７−ＧＦＰ細胞株の生成
（プラスミドベクターＣＳ２＋の）ヒトｐ２７ｃＤＮＡをＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１で消化し、得られた断片をゲル精製後、同じ制限酵素で切断したベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Clontech）にライゲーションした。このようにして、ｐＥＧＦＰベクターに含有されるＧＦＰとのリーディングフレームシフト融合を生成した。次に、プラスミドをＨｅｌａ細胞にトランスフェクトし、続いてカナマイシンで細胞選択し、プラスミドがその染色体に安定に組込まれた細胞性クローンを単離した。ｐ２７ＥＧＦＰタンパク質の発現を、ウエスタンブロット並びにｐ２７及びＧＦＰの両方に対する免疫沈降を用いて確認した。
【００９８】
種々のアルギリン誘導体の効果
２つの癌細胞株、Ｈ１５（頸癌）及びＳＷ４８０（大腸癌）に対するアルギリン誘導体Ａ〜Ｈの効果を、以下の表に要約する。有効性を試験するために、ｐ２７−ＧＦＰクローンを使用した。
【００９９】
【表２】
0005564267.tif 000006
【図８】
0005564267.tif 000008
【図１】
0005564267.tif 000009
【図２】
0005564267.tif 000010
【図３】
0005564267.tif 000011
【図４】
0005564267.tif 000012
【図５】
0005564267.tif 000013
【図６】
0005564267.tif 000014
【図７】
0005564267.tif 000015
【配列表】
0005564267000001.app