(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質と、前記基質上のコーティングと、ショ糖を含むブロッキング剤と、を含む細胞培養用生成物であって、下記方法：
細胞外マトリックスタンパク質の混合物および水性溶媒を含むコーティング溶液を、基質の表面に塗布するステップであって、前記コーティング溶液中の総タンパク質濃度は、１０μｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌであるステップと、
前記基質表面上で前記コーティング溶液をインキュベートして、基質表面にコーティングを付着させるステップと、
前記インキュベートされたコーティング溶液を前記基質から除去するステップと、
前記除去ステップの後に、前記基質を洗浄するステップと、
前記洗浄された基質を乾燥させるステップと、を含み、
前記除去ステップの後で、かつ前記洗浄するステップの前または該ステップ中に、ショ糖を含む少なくとも１つのブロッキング剤および水性媒体を含むブロッキング組成物で、前記基質表面をブロッキングするステップをさらに含む方法
によって製造されたものである、細胞培養用生成物。
【請求項２】
前記ショ糖は０．１から５．０％ｗ／ｖの量で前記ブロッキング組成物中に存在していることを特徴とする請求項１記載の細胞培養用生成物。
【請求項３】
前記細胞外マトリックスタンパク質の混合物はラミニンの混合物を含むことを特徴とする請求項１記載の細胞培養用生成物。
【請求項４】
前記細胞外マトリックスタンパク質の混合物はラミニンおよびエンタクチンの混合物を含むことを特徴とする請求項１記載の細胞培養用生成物。
【請求項５】
前記細胞外マトリックスタンパク質の混合物はラミニンおよびＩＶ型コラーゲンの混合物を含むことを特徴とする請求項１記載の細胞培養用生成物。
【請求項６】
細胞外マトリックスコーティング溶液を基質の表面に塗布するステップであって、前記コーティング溶液中の総タンパク質濃度は１０μｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌであるステップと、
前記基質表面上で前記コーティング溶液をインキュベートするステップと、
前記インキュベートされたコーティング溶液を前記基質から除去するステップと、
前記除去ステップの後に、前記基質を洗浄するステップと、
前記洗浄された基質を乾燥させるステップと、を含み、
前記除去ステップの後で、かつ前記洗浄するステップの前または該ステップ中に、ショ糖を含む少なくとも１つのブロッキング剤および水性媒体を含むブロッキング組成物で、前記基質表面をブロッキングするステップをさらに含むことを特徴とする、安定ですぐに使用できる細胞培養システムを調製する方法。
【請求項７】
ショ糖が、０．１から５．０％ｗ／ｖの量で前記ブロッキング組成物中に存在していることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記乾燥基質を滅菌するステップをさらに含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記滅菌された乾燥基質を耐湿性容器の中に包装するステップをさらに含むことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞外マトリックスタンパク質の混合物はラミニンおよびエンタクチンの混合物から本質的に成ることを特徴とする請求項１記載の細胞培養用生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して細胞培養分野に関する。より詳細には、本発明は、胚幹細胞を培養するのに適した細胞外マトリックス組成物でコーティングされた基質に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚幹細胞は、高いテロメラーゼ活性、無制限な自己複製能力、および多分化能（外胚葉、内胚葉、および中胚葉という３種類の胚葉に表されるいかなる細胞型にも分化する能力）を有する細胞として特徴付けられている。その結果、遺伝子／細胞治療および再生医療の分野では、ヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞の適用の可能性に多大な期待が持たれている。
【０００３】
ヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞導出の最初の成功が１９９８年に報告されている（例えば、非特許文献１参照）。この研究では、ｈＥＳ細胞を胚盤胞の内部細胞塊から単離し、有糸分裂を不活性化されたマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の支持細胞上に播種した。初期のｈＥＳ細胞導出および培養は、主としてマウスＥＳ（ｍＥＳ）細胞用に過去２５年間にわたって開発された培養の実践から生み出されたものであった。ＭＥＦ支持細胞は、ｈＥＳ細胞を長期培養する際の確固とした表面であることが判明しているが、この方法にはいくつかの制限がある。第１に、ｈＥＳ細胞に伝搬するかもしれない潜在的な動物病原体に関する危惧があり、そのため、それらは臨床上の適用に不適当なものとなっている。第２に、２種類の細胞型を増殖させ、維持するのが、不都合であり、かつやっかいである。さらに、支持細胞上に密集したｈＥＳ細胞コロニーに形質移入し、それらを遺伝学的に操作するのが困難である。これらの理由すべてから、ｈＥＳ細胞を培養するための、支持細胞を含まない条件を開発する試みが開始された。
【０００４】
マウスＥＳ細胞の研究は、ｈＥＳ細胞の自己複製を調節するメカニズムを我々がさらに理解するための基礎として役立ってきた。特定のシグナル伝達調節因子を操作することによって、支持細胞の非存在下における、未分化なｈＥＳ細胞を増殖させるのに必要な条件の開発が促進された。近年の研究は、ｈＥＳ細胞を適切な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）上に播種し、支持細胞で条件付けされた培地または可溶性因子で補足された培地中でそれらを培養する限り、支持細胞の非存在下でもｈＥＳ細胞を培養できることを明確に示している。
【０００５】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、様々な組成の三次元分子複合体であり、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、および他の糖タンパク質、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、ならびにエラスチンなどの構成成分を含むことができる。市販されている細胞外マトリックスの例には、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のＥＣＭゲル、またはＢｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ社のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリックスが含まれる。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリックスは、マウスのＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）腫瘍から単離された再構成基底膜である。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリックスは、主としてラミニン、コラーゲンＩＶ、エンタクチン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカンで構成されている。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリックスは、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦなど、多数の成長因子も含有する。
【０００６】
本発明の前には、様々なタイプの支持細胞から得られた条件培地を用いることによって、ＥＣＭの表面で、ｈＥＳ細胞を未分化状態のまま増殖できることが知られていた。ｈＥＳ細胞を培養するための、支持細胞を含まない基質としてＥＣＭを用いることは多くの利点を有する。例えば、ＥＣＭの表面では、支持細胞由来の汚染の可能性がないため、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質の単離がより容易になる。加えて、ｈＥＳ細胞の遺伝子操作を行うには、効率的な形質移入能力が必要である。Ｍａｔｒｉｇｅｌの表面で培養されたｈＥＳ細胞の形質移入効率は、支持細胞上で培養されたものに比べ改善されている。ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリックス上で培養された場合、ｈＥＳ細胞は「単層培養の様な」コロニーを形成し、それによって、個々の細胞はＤＮＡまたはＳｉＲＮＡで、より貫通されやすい状態になることが以前に示されている。支持細胞を含まない培養は他のＥＣＭタンパク質を使用しても成功しているが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）と同程度な成績を得るには、ＥＣＭタンパク質を組み合わせる必要があると、以前に行われたいくつかの研究が示唆している。さらに、精製されたタンパク質は、通常、より高価であり、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ほど、長期的な成績に関してよく試験されていない。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４８２９０００号明細書
【非特許文献１】Thomson, J. A. et al., Science (1998) 282:1145-1147
【非特許文献２】Kleinman et al., J. Biometer. Sci. Polymer Edn., 5: 1-11, (1993)
【非特許文献３】Xu, et al. (2004) Stem Cells, 22: 972-980
【非特許文献４】Stojkovic, et al. (2005) Stem Cells, 23:306-314
【非特許文献５】Sjogren-Jansson, et al. (2005) Developmental Dynamics, 233: 1304-1314
【非特許文献６】Ludwig, et al. (2006) Nature Biotechnology, Brief Communications, January 2006
【非特許文献７】Robinson, Meth. Mol. Biol. 75:173, 1997 at page 177
【非特許文献８】Sporn and Roberts, Peptide Growth Factors and Their Receptors I, Springer-Verlag, New York (1990)
【非特許文献９】Xu et al. (2001) Nature Biotechnology 9: 971-974
【非特許文献１０】Carpenter et al. (2004) Developmental Dynamics 229: 243-258
【非特許文献１１】Greenlee et al. (2005) Toxicology In Vitro 19: 389-397
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、長期間ｈＥＳ細胞を培養するための、支持細胞を含まない実用的な基質として広く承認されているが、それには重要な制限が１つある。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）はＥＨＳ腫瘍から得られるので、本来的に、タンパク質の濃度および組成がロットごとで変動する。現在、研究者は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）およびコーティング基質のロットを、毎週ベースでプレスクリーニングしているが、それに費やされる時間を制限するために、ＥＳ培養用の最適なＥＣＭ組成物でコーティングされた、安定な、すぐに使用できる基質を提供することが有益であろう。好ましくは、この培養システムは、ロット相互の一貫性を有することであり、それは、標準化されたＥＳ培養を行うのに必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、多分化能胚幹細胞を、実質的に未分化な状態で、上記細胞の増殖を支持するための支持細胞層を用いずに、安定かつ一貫して増殖させるための培養装置と、そのような培養装置を用いた方法とを提供するものであり、上記幹細胞は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）コーティングされた表面で増殖される。驚いたことに、胚幹細胞培養物を増殖させ、未分化状態に維持するためには、細胞用の３Ｄマトリックスを産生するのに十分な量の細胞外マトリックスコーティングを与える必要がないということが判明した。むしろ、上記細胞外マトリックスコーティングは、適切なコンフォメーションにあり飽和レベルの細胞外のマトリックスタンパク質を与えるのに十分な最小限の溶液濃度で上記細胞培養表面に吸着または結合していることのみが必要とされている。本明細書における定義では、「飽和レベル」という用語は、さらに多くのＥＣＭタンパク質を上記コーティング溶液中に添加しても、洗浄後に上記表面に吸着しているＥＣＭタンパク質の量が増大しないであろうことを意味する。飽和レベルは、ＥＬＩＳＡおよびコロニー数の両方に含まれる様々な手段で測定することができる。
【００１０】
本発明は、ｈＥＳ細胞を含めた胚幹細胞を増殖させるため、および、それらの自己複製特性および多分化能特性を培養中で長期間にわたって維持するための、改善された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）コーティングの培養表面を提供する。
【００１１】
詳細には、本発明は、基質と、その表面の細胞外マトリックスコーティングとを含む細胞培養用生成物を提供するものであり、上記コーティングは、上記基質表面に飽和レベルの細胞外マトリックスタンパク質を与えるのに十分な最小限の溶液濃度で、上記基質の少なくとも１つの表面に吸着または結合している。いくつかの実施形態では、上記基質表面に吸着または結合している細胞外マトリックスタンパク質の総量は約２００ｎｇ／ｃｍ２から約６５０ｎｇ／ｃｍ２である。
【００１２】
詳細には、本発明は、基質と、その表面のコーティングとを含む細胞培養用生成物を提供する。コーティングは、少なくとも１つの細胞外マトリックスタンパク質を含み、細胞外マトリックスタンパク質および水性溶媒を含有するコーティング溶液によって形成することができ、コーティング溶液中の総タンパク質組成は約１０μｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌ、またはそれより高濃度である。コーティング溶液中の総タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍｌを超えている場合には、総タンパク質が、上記表面のタンパク質結合能力を超えている可能性がある。しかし、この場合には、非結合のタンパク質は表面から洗い落としてもよい。
【００１３】
本発明は、さらに、基質と、コーティング溶液から基質表面に付着したコーティングとを含む細胞培養用生成物を提供する。コーティング溶液は、細胞外マトリックスタンパク質の混合物および水性溶媒を含み、コーティング溶液中の総タンパク質濃度は約１０μｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌ以上である。
【００１４】
本発明の細胞培養用生成物は、コーティングされていないが、それ以外は同一の対照表面に吸着した細胞外マトリックスタンパク質の密度と比較した、コーティングされた表面に吸着した細胞外マトリックスタンパク質の密度によって特徴付けることができる。詳細には、本発明は、表面を規定する基質物質と、上記基質の表面に付着したコーティングとを含む細胞培養用生成物を提供するものであり、コーティングは、コラーゲン、ラミニン、エンタクチン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）から選択された少なくとも１つの細胞外マトリックスタンパク質を含み、表面に吸着した細胞外マトリックスタンパク質の密度は、ＥＬＩＳＡによってＯＤを得た場合、コーティングされた細胞培養用生成物上で実施したＥＬＩＳＡアッセイにより、コーティングされていない対照細胞培養用生成物と比較した光学密度（ＯＤ）の比率が約４．０超となるような密度である。いくつかの実施形態では、コーティングされていない細胞培養用生成物と比較した、コーティングされた細胞培養用生成物上で実施したＥＬＩＳＡにおけるＯＤは約４から約５である。ＥＬＩＳＡアッセイは、（ａ）上記表面を洗浄して、吸着していないタンパク質を除去するステップと；（ｂ）上記細胞外マトリックスタンパク質に対して産生された過剰量の一次抗体を上記表面と接触させるステップと；（ｃ）上記表面を洗浄して、上記細胞外マトリックスタンパク質に対して産生された非結合の一次抗体を除去するステップと；（ｄ）上記一次抗体に対して産生され、かつホースラディシュペルオキシダーゼ酵素に結合している過剰量の二次抗体を上記表面と接触させるステップと；（ｅ）上記表面を洗浄して、非結合の二次抗体を除去するステップと；（ｆ）テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質の溶液を上記表面と接触させて、反応混合物を形成させるステップと；（ｇ）上記反応混合物の色の変化が上記ＴＭＢ基質の酸化を示した後に、上記反応混合物に酸性停止液を添加するステップと；（ｈ）波長４５０ｎｍにおけるＯＤを測定するステップとを含む。
【００１５】
本発明者らは、コーティング溶液中の細胞外マトリックス成分が、約０．６μｇ／ｃｍ２から約６．０μｇ／ｃｍ２までの間で、胚幹細胞を増殖させるのに十分な細胞培養装置を提供するのに十分であることを発見した。いくつかの実施形態では、表面処理およびＥＣＭタンパク質の特性に応じて、ポリスチレン表面などの表面に結合したタンパク質の量を約２００ｎｇ／ｃｍ２から約６５０ｎｇ／ｃｍ２の範囲にとることができる。細胞外マトリックスコーティングは、乾燥させることができ、それによって、細胞外マトリックス成分を含有する一貫性を備えた表面が得られる。一実施形態では、装置を、室温で長期間にわたって貯蔵することができる。一実施形態では、装置を、室温で少なくとも２週間保存することができる。
【００１６】
本発明の培養装置は、他のプロトコールで見られるものより、コーティングされた表面におけるタンパク質複合体の凝集が少なく、かつ、培養装置表面に吸着されるタンパク質の量が多い。結合した細胞外マトリックス成分を洗浄し、それによって非結合のタンパク質を除去できること、およびそれを乾燥できることと併せて、本発明の培養装置は、ロット相互の一貫性がより高い、胚幹細胞を増殖させるための表面を提供する。
【００１７】
本発明は、ｉ）細胞を培養するのに適した容器と、ｉｉ）一定濃度の細胞外マトリックス成分とを含む、多分化能胚幹細胞を培養するための培養装置も提供するものであり、細胞外マトリックスは、容器の少なくとも１つの表面に乾燥状態で存在し、培養装置は、任意選択で、ｉｉｉ）乾燥状態の細胞外マトリックスを安定させるのに適した薬剤も含む。
【００１８】
本発明の細胞培養用生成物／装置を調製する方法も提供する。いくつかの実施形態では、上記方法は、細胞外マトリックスコーティング溶液を基質の表面に塗布するステップを含むものであり、コーティング溶液中の総タンパク質濃度は約１０μｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌである。この方法は、基質表面でコーティング溶液をインキュベートするステップ；インキュベートした上記コーティング溶液を基質から除去するステップ；および除去ステップの後に基質を洗浄するステップも含む。最後に、この方法は、洗浄した基質を乾燥させるステップ；および、乾燥基質を滅菌するステップを含む。
【００１９】
他の実施形態では、培養方法は、ａ）少なくともラミニンを含む細胞外マトリックスを一定濃度で含有する第１の溶液を、細胞培養に適した容器に塗布するステップと、ｂ）細胞外マトリックスが上記容器に結合するのを可能にするのに十分な時間にわたって、容器をインキュベートするステップと、ｃ）上記第１の溶液を容器から除去するステップと、ｄ）容器を洗浄して、容器中に残留しているいかなる第１の溶液も除去するステップと、ｅ）容器を乾燥させるステップとを含む。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックスはラミニンの混合物を含む。例えば、１１のラミニンのアイソフォームが提案されており、適した混合物は、これらのアイソフォームのうち２つ以上を含有できる。いくつかの別の実施形態では、細胞外マトリックスはラミニンおよびエンタクチンの混合物を含む。さらに別の実施形態では、上記細胞外マトリックスはラミニンおよびコラーゲンＩＶの混合物を含む。
【００２０】
さらに、胚幹細胞を培養する方法も提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、基質と、コーティング溶液から基質表面に付着したコーティングとを含む細胞培養用生成物を用意するステップを含む。このコーティング溶液は、細胞外マトリックスタンパク質の混合物および水性溶媒を含み、コーティング溶液中の総タンパク質濃度は約１０μｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌである。この培養方法は、胚幹細胞および培地の懸濁液を細胞培養用生成物に添加するステップ；および、上記胚幹細胞を、３７℃の加湿雰囲気中、５％ＣＯ２でインキュベートして、胚幹細胞増殖を行うための未分化コロニーを産生させるステップも含む。
【００２１】
いくつかの他の実施形態では、胚幹細胞を増殖させる方法は、ａ）多分化能胚幹細胞を増殖させるための装置を用意するステップを含むものであり、この装置は細胞を培養するのに適した容器および一定濃度の細胞外マトリックスを含み、細胞外マトリックスは少なくともラミニンを含み、かつ、細胞外マトリックスは容器の少なくとも１つの表面に乾燥状態で存在する。この方法はさらに、ｂ）適切な支持細胞培養によって事前に条件付けされた細胞培養培地を容器に添加するステップ；および、ｃ）未分化多分化能胚幹細胞を容器に添加するステップも含む。さらにこの方法は、ｄ）多分化能胚幹細胞を含有する容器を適切な条件下でインキュベートして、多分化能胚幹細胞の増殖を可能にするステップも含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（培養装置）
ここでは、胚幹細胞、特にｈＥＳ細胞を含めた細胞を増殖させ、それらの自己複製特性および多分化能特性を培養中で長期間にわたって維持するための、改善されたコーティング済み培養表面を提供する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）はＥＨＳ腫瘍から得られるので、本来的に、タンパク質の濃度および組成がロットごとで変動する。本発明は、毎週ベースで、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）およびコーティング基質のロットをプレスクリーニングするのに、研究者が多大な時間を費やす必要性を取り除く。詳細には、本発明は、ＥＳ培養用の改善されたＥＣＭ組成物でコーティングされた、安定な、すぐに使用できる基質を提供する。この細胞培養用生成物は、ロット相互の一貫性を提供する。これは、標準化されたＥＳ培養を行うのに必要である。「細胞培養用生成物」および「培養装置」などの用語は、本明細書では同義的に使用できるものと考えられている。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本発明は、基質と、コーティング溶液から基質表面に付着したコーティングとを含む細胞培養用生成物を対象とする。コーティング溶液は、細胞外マトリックスタンパク質の混合物および水性溶媒を含むものであり、コーティング溶液中の総タンパク質濃度は、約１０μｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌである。いくつかの好ましい実施形態では、コーティング溶液中の総タンパク質濃度が約３０μｇ／ｍｌから約３００μｇ／ｍｌである。さらに好ましい実施形態では、上記コーティング溶液中の総タンパク質濃度は約３０μｇ／ｍｌから約２００μｇ／ｍｌである。
【００２４】
コーティングは、細胞外のマトリックスタンパク質の混合物を含有することが好ましい。いくつかの実施形態では、コーティングは、ラミニンおよび少なくとも１つの他の細胞外マトリックス成分の混合物を含有する。いくつかの実施形態では、混合物は複数のラミニンのアイソフォームを含有する。いくつかの他の実施形態では、混合物は少なくとも１つのラミニンおよびエンタクチンを含有する。さらに別の実施形態では、混合物は少なくとも１つのラミニンおよびコラーゲンＩＶを含有する。
【００２５】
本発明で有用な細胞外マトリックス分子の非限定な例には、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、様々なプロテオグリカン、グルコサミノグリカン、および同様なものが含まれる。細胞外マトリックス成分を溶液中に懸濁し、細胞を培養するのに適した容器に塗布する。一実施形態では、細胞外マトリックス成分が、基底膜を形成する分子で構成されている。
【００２６】
上述の通り、いくつかの実施形態では、コーティングはラミニンおよび少なくとも１つの他の細胞外マトリックス成分の混合物を含有する。いくつかの実施形態では、コーティングはラミニンの混合物を含有する。
【００２７】
いくつかの他の実施形態では、コーティングは、ラミニン／コラーゲンＩＶ混合物を含有する。ラミニン／ＩＶ型コラーゲン混合物に適した重量比は約１．５から２．５である。一実施形態では、このコーティングは、以下に示す成分、すなわち、エンタクチン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）、および成長因子のうちの１つまたは複数をさらに含有する。いくつかの実施形態では、コーティングはラミニン／エンタクチン混合物を含有する。
【００２８】
さらに別の実施形態では、コーティングはラミニン／エンタクチン混合物を含有する。例えば、適したコーティング溶液は、ＢＤラミニン／エンタクチン複合体（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．社；カタログ番号３５４２５９）を希釈することによって調製できる。ラミニン／エンタクチン複合体に適した重量比は約５から約９である。一実施形態では、このコーティングは、以下のもの、すなわちＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）、成長因子、およびこれらの組合せから選択された成分をさらに含む。
【００２９】
さらに別の実施形態では、細胞外マトリックスコーティングは、少なくともラミニン、コラーゲンＩＶ、およびエンタクチンを含有する。一実施形態では、ラミニン成分は、細胞外マトリックス成分の約４０％から約７０％である。一実施形態では、コラーゲンＩＶ成分は、細胞外マトリックス成分の約２０％から約４０％である。一実施形態では、エンタクチン成分は、細胞外マトリックス成分の約３％から約１５％の間で含まれている。一実施形態では、細胞外マトリックス成分が、ヘパリン硫酸塩プロテオグリカン、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、およびＴＧＦ−βなどの成長因子、マトリックスメタロプロテイナーゼ、またはこれらの組合せをさらに含有する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、コーティングは少なくともラミニン、コラーゲンＩＶ、エンタクチン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカンを含有する。例えば、コーティング溶液は、ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）基底膜マトリックス（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．社、米国マサチューセッツ州ベッドフォード所在）などの基底膜タンパク質抽出物を希釈することによって調製できる。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）に適した重量比は、約５から約９である。このタンパク質抽出物は、重量部で、約５０〜８５％ラミニン、５〜３０％コラーゲンＩＶ、１〜１０％エンタクチン（ニドジェン）、および１〜１０％ヘパラン硫酸プロテオグリカンを含有する。例えば、一実施形態では、上記コーティング溶液は、約５６％ラミニン、約３１％コラーゲンＩＶ、および約８％エンタクチン、ならびにヘパリン硫酸塩プロテオグリカン、成長因子、およびマトリックスメタロプロテイナーゼを含有するＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリックスを希釈することによって調製できる。
【００３１】
一実施形態では、細胞外マトリックスコーティングは、約６１％ラミニン、約３０％コラーゲンＩＶ、および約７％エンタクチン、ならびにヘパリン硫酸塩プロテオグリカン、成長因子、およびマトリックスメタロプロテイナーゼを含有する。例えば、上記コーティング溶液は、市販品であるＧｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．社、米国マサチューセッツ州ベッドフォード所在）から調製してもよい。Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、ラミニン、コラーゲンＩＶ、およびエンタクチンを、それぞれ、約６１％、３０％、および７％の量で含有する。
【００３２】
一実施形態では、細胞外マトリックスは哺乳類胎盤膜から得られた細胞外マトリックスを含有する。一実施形態では、上記胎盤膜はヒト胎盤膜である。
【００３３】
コーティング溶液中に懸濁された、細胞を培養するのに適した表面に塗布された細胞外マトリックス成分の濃度は、細胞培養表面で胚性細胞を未分化状態に維持する一貫した性能を可能にする最適な細胞外マトリックス層を上記表面に生じる濃度である。本発明者らは、表面における上記細胞外マトリックス成分の濃度が低過ぎる場合、胚幹細胞が増殖しているコロニーの数が減少することがあることを見出した。溶液中の細胞外マトリックス成分の濃度が高過ぎる場合には、細胞外マトリックス成分が溶液中で沈殿し、それによって、表面で、飽和レベル未満のタンパク質を含む不均一なマトリックスが生成されることがある。これは、胚幹細胞が増殖する能力に影響を与える可能性がある。
【００３４】
一実施形態では、細胞培養装置は、その表面に、細胞外マトリックス成分の薄層を含有する。一実施形態では、細胞外マトリックス成分は、容器の少なくとも１つの表面に乾燥状態で存在する。
【００３５】
本発明の一実施形態では、細胞外マトリックス成分は約１０μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍＬの濃度で容器に塗布される。一実施形態では、細胞外成分は約３０μｇ／ｍＬから約３００μｇ／ｍＬの濃度で容器に塗布される。特定の実施形態では、細胞外成分は約１００μｇ／ｍｌの濃度で容器に塗布される。
【００３６】
容器に塗布される、一定濃度の細胞外マトリックス成分を含有する溶液の量は、容器のタイプおよびサイズ、ならびに溶液中の細胞外成分の濃度に応じて変動しうる。一実施形態では、容器面積１ｃｍ２あたりに塗布される溶液は、約０．０５ｍＬから約０．５ｍＬまでの間である（ｍＬ／ｃｍ２）。一実施形態では、約０．１ｍＬ／ｃｍ２から約０．２ｍＬ／ｃｍ２までの間の溶液が容器に塗布される。
【００３７】
一実施形態では、溶液は、容器面積１ｃｍ２あたりの細胞外マトリックス成分（μｇ／ｃｍ２）が約０．１μｇから約１０μｇまでの間になるように塗布される。一実施形態では、溶液は、約０．６μｇ／ｃｍ２から６．０μｇ／ｃｍ２までの間になるように容器に塗布される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、コーティングが基質表面に乾燥状態で存在している。コーティングを乾燥させれば、その結果得られる生成物がより安定したものとなる。さらに細胞培養用生成物は、コーティング過程によって調製することが好ましく、この過程には、非結合のタンパク質を洗浄するステップが含まれる。これによって、量が制御されない非結合タンパク質が洗い落とされるので、ロット相互の一貫性を高めることが可能となる。最終のコーティング済みの基質は、ＥＳ細胞を含めた細胞を培養し、細胞増殖の間、それらを未分化状態に維持するのに有用である。
【００３９】
一実施形態では、基質表面のコーティングが、ブロッキング溶液からさらに形成される。ブロッキング溶液は、少なくとも１つのブロッキング剤と、緩衝剤または細胞培養培地などの水性溶媒とを含有する。いくつかの実施形態では、ブロッキング剤は、ゼラチン、ショ糖、トレハロースまたはこれらの組合せでよい。「ブロッキング剤」という用語は、本明細書では、「安定化剤」という用語と同義的に使用できると考えられている。ブロッキング剤は約０．１から約５．０％ｗ／ｖの量でブロッキング溶液中に存在していることが好ましい。
【００４０】
本発明者らは、例えば、ショ糖などの少なくとも１つのブロッキング剤を含有するブロッキング溶液で、基質表面のブロッキングを行うと、より高い温度での老化促進試験の間における乾燥したコーティングの安定性が増大することを見出した。例えば、本発明者らは、ショ糖などのブロッキング／安定化剤によって、細胞外マトリックス成分を有意に分解させずに、長期間の室温保存を許容する細胞培養用生成物／培養装置の能力が強化されることを見出した。一実施形態では、細胞培養用生成物を、少なくとも２週間室温で保存することができる。これは例えば、冷凍庫、冷蔵庫または低温室の空間を節約する。さらに、細胞培養用生成物は室温で保存することができるので、細胞培養用生成物を使用前に解凍する必要がなく、そのため時間も節約される。
【００４１】
本発明の一実施形態では、乾燥状態の細胞外マトリックスコーティングを含有する細胞培養装置は、室温における上記細胞培養装置の長期間の保存を可能にする安定化剤を含有できる。詳細には、本発明は、ｉ）細胞を培養するのに適した容器、ｉｉ）一定濃度の細胞外マトリックス成分を含む、多分化能胚幹細胞を培養するための培養装置を提供することであり、細胞外マトリックスは、容器の少なくとも１つの表面に乾燥状態で存在し、培養装置は、任意選択で、ｉｉ）乾燥状態の細胞外マトリックスを安定させるのに適した薬剤も含む。安定化剤の添加によって、上記コーティング中の上記細胞外マトリックス成分の分解が有意に阻止されると考えられている。
【００４２】
安定化剤は、細胞培養皿またはフラスコなどの容器の少なくとも１つの表面に、コーティング中の細胞外マトリックス成分の分解が阻止または抑制されるような適切な濃度で塗布できる。一実施形態では、安定化剤は約０．１％から約５．０％ｗ／ｖの濃度で塗布される。一実施形態では、安定化剤は約１．２５％ｗ／ｖの濃度で塗布される。この濃度は、単位容積溶液あたりにおける安定化剤の重量として測定してもよい。例示的実施形態では、安定化剤の重量をグラムで測定することができ、溶液の容積をミリリットルで測定することができる。
【００４３】
胚幹細胞の増殖を妨害しないが、細胞外マトリックスの分解を阻止できるいかなる安定化剤も本発明で使用できる。一実施形態では、安定化剤を、以下のもの、すなわち、ショ糖、トレハロース、およびこれらの組合せから選択する。一実施形態では、安定化剤はショ糖である。
【００４４】
コーティング溶液およびブロッキング溶液を調製するのに使用される水性溶媒は、例えば、ＰＢＳなどの緩衝剤でも、あるいは細胞培養培地でもよい。いくつかの実施形態では、ＤＭＥＭ、ＫＯ／ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩまたは当技術分野で知られている他の細胞培養培地は、コーティング溶液を調製するのに使用される水性溶媒としての使用に適している。適した水性溶媒希釈剤は、細胞培養に適合した条件を提供するいかなる細胞培養培地も含むことができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで特定の細胞型へと誘導されるまで、ＥＳ細胞を自己複製状態および未分化状態に維持するものが好ましい。そのような培地は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国カリフォルニア州カールズバッド所在）またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国ミズーリ州セントルイス所在）から購入できる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、コーティング溶液は、約７．０から約８．５までの間のｐＨを有する。このｐＨは、コーティング溶液のｐＨを約７．０から８．５の範囲内に維持できるいかなる緩衝剤成分を用いて維持してもよい。この範囲内にある可能な緩衝剤システムには、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、１，３−ビス（トリス［ヒドロキシメチル］メチルアミノ）プロパン；３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸：ＤＩＰＳＯ；Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［−４−ブタンスルホン酸］：ＨＥＰＢＳ；Ｎ−（４−（２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジンエタンスルホン酸：ＨＥＰＥＳ；３−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸：ＭＯＢＳ；ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス［２−ヒドロキシプロパンスルホン酸：ＰＯＰＳＯ；Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸：ＴＡＰＳ；３−（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸：ＴＡＰＳＯ；Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸：ＴＥＳ；Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン：トリシン；Ｎ−エチルモルホリン、ジメチルロイシルグリシン、５，５−ジエチルバルビツール酸ナトリウム、および２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオールが含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
さらに別のいくつかの実施形態では、コーティング溶液は酸性ｐＨを有することができる。例えば、コラーゲンは通常、ｐＨの低い酸性酸中でコーティングを行う。酸性酸はコーティングの乾燥中に気化するであろう。コラーゲンは、より高いｐＨでゲルを形成するので、コラーゲンに関しては酸性ｐＨのコーティング溶液が好ましい。
【００４７】
一実施形態では、細胞培養用生成物のＥＣＭコーティングは、希釈された基底膜タンパク質抽出物から形成される。本明細書における定義では、「細胞外マトリックス」（基底膜は特定のタイプである）は、細胞によって産生され、周囲の培地中に分泌される物質である。「細胞外マトリックス」という用語は、本明細書では、「基底膜」という用語と同義的に使用できると考えられている。細胞外マトリックスは、細胞によって分泌され、それに細胞が付着するフレームワークを形成している間質基底膜を形成できる。この基底膜は、細胞を間充織結合組織から分離し、細胞の成長および分化に必要な空間的配向性および安定性を提供する。細胞外マトリックス分子もしくは基底膜は、成長因子の隔離、貯蔵、および組織への提示に関係付けられている。
【００４８】
基底膜は様々な成分を含有する。基底膜は細胞外マトリックスの特定のタイプであり、主としてラミニンおよびＩＶ型コラーゲンで構成されている。その主要成分はラミニンであり、その後に、コラーゲンＩＶ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチンが続いている。
【００４９】
細胞外マトリックス分子もしくは基底膜は、当技術分野で既知であり、市販されている。例えば、ＥＨＳマウス肉腫腫瘍からの細胞外マトリックスは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．社、米国マサチューセッツ州メドフォード所在）、ＥＣＭゲル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国ミズーリ州セントルイス所在）、およびＣｕｌｔｒｅｘ（商標）（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ社、米国メリーランド州ゲイザースバーグ所在）として市販されている。さらに別の適当なＥＣＭ分子には、例えばラミニン／エンタクチン複合体（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．社）が含まれる。
【００５０】
「細胞外マトリックス」という用語は、当技術分野で承認されている。その構成成分には、以下のタンパク質、すなわち、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン、トロンボスポンジン、エラスチン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリリン、メロシン、アンキリン、コンドロネクチン、リンクタンパク質、骨シアロタンパク質、オステオカルシン、オステオポンチン、エピネクチン（ｅｐｉｎｅｃｔｉｎ）、ヒアルロネクチン、アンジュリン（ｕｎｄｕｌｉｎ）、エピリグリン、およびカリーニン（ｋａｌｉｎｉｎ）のうち１つまたは複数が含まれる。他の細胞外マトリックス分子も記載されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれている非特許文献２を参照のこと）。将来発見されるかもしれない、現在は未知な細胞外マトリックスも、当業者ならば容易にそれを細胞外マトリックスとして特性決定できるであろうから、「細胞外マトリックス」という用語には、それも包含されるものとする。
【００５１】
Ｅｎｇｌｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウス腫瘍から抽出された基底膜マトリックスがよく知られており、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）というブランド名で販売されている。このマウス腫瘍には、基底膜タンパク質が豊富に存在する。主要なマトリックス成分は、ラミニン、コラーゲンＩＶ、エンタクチンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカンであり、同定されていないいくつかの化合物に加えて、成長因子、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ［コラゲナーゼ］）、および他のプロテイナーゼ（プラスミノーゲン活性化因子）も含有している。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリックスゲルは、室温で、再構成基底膜を形成し、これは、構造、組成、物理的特性、および典型的な機能的特性を保持する能力において、ｉｎ  ｖｉｖｏの基底膜に類似している。
【００５２】
上述の通り、本発明の細胞培養用生成物を調製するのに使用されるコーティング溶液は、細胞外マトリックスタンパク質の混合物を含有できる。望ましい一実施形態では、基底膜タンパク質抽出物（例えば、参照によりその全内容が本明細書に組み込まれている特許文献１に記載のものなど）として入手された細胞外マトリックスを希釈することによって、コーティング溶液を得る。このタンパク質抽出物は、重量比で、約５０〜８５％のラミニン、５〜３０％のコラーゲンＩＶ、１〜１０％のエンタクチン（ニドジェン）、および１〜１０％のヘパラン硫酸プロテオグリカンを含有する。このタンパク質抽出物は、加熱された際に、堅い安定したゲル（すなわち３次元マトリックス）に重合できる。詳細には、細胞外マトリックスタンパク質は、約１５〜４０℃、好ましくは約２２〜３７℃の温度で十分な時間インキュベートされた場合に重合する。タンパク質は、この組成物の温度をこの範囲より低く維持することによって、可溶性の形態に維持することができる。細胞外マトリックス保存組成物は、−２０℃で保存し、上記コーティング溶液を調製するためには、水性溶媒で希釈する前に解凍し、４℃に保持することが好ましい。
【００５３】
本発明の細胞培養用生成物を調製するのに使用されるコーティング溶液は、様々な成分を含有でき、それらの成分は、コーティング中の成長因子の、細胞への接触性に影響を与えることができ、かつ／または細胞接着を補助し、かつ／またはコーティング中のタンパク質の構造に影響を与える。これらの成分には、塩、希釈剤、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、および／または中和抗体を含めることができるが、これらに限定されない。
【００５４】
適している中和抗体には、細胞外マトリックス中に本来存在する成長因子に対して、成長因子を減少させるか、もしくはそれらの効力を阻害することによって影響を与える化合物が含まれる。適している中和抗体には、以下のもの、すなわちＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、およびＩＧＦ−１のうちの１つに対する抗体を含めることができるが、これらに限定されない。
【００５５】
基質のコーティングには、その他にも様々な物質を含有させることができる。それらには、細胞、抗体、酵素、受容体、成長因子、細胞外マトリックスの追加成分、サイトカイン、ホルモン、および薬物が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックスタンパク質はこれらの物質に結合することができる。これらの生物学的に活性な物質が存在する場合には、培養細胞の特性または挙動を加減または調節するために、それらを容易に培養細胞に対して用いることができる。
【００５６】
細胞培養を行う通常の研究に用いる基質には、プラスチック、ガラス、および微孔性フィルター（例えば、セルロース、ナイロン、グラスファイバー、ポリスチレン、ポリエステル、およびポリカーボネート）が含まれる。バッチ細胞培養もしくは連続細胞培養または遺伝子工学で用いるバイオリアクター用の基質には、中空繊維管またはマイクロキャリアビーズが含まれる。血管または骨移植用の基質には、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））、セラミックス、および関連した高分子材料などの物質が含まれる。これらの基質はいずれも、本発明での使用に適している。
【００５７】
いくつかの実施形態では、基質／容器は、基質または容器の少なくとも１つの表面への、細胞外マトリックス成分の吸着または結合を可能にできるいかなる適切な物質でできたものでもよい。そのような物質には、以下のもの、すなわち、セルロース、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ナイロン、ガラス、ポリエチレンテレフタラート、ポリメチルペンタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、およびこれらの組合せを含めることができる。利用できるその他の材料には、Ｐｅｒｍａｎｏｘ（登録商標）、ポリエステル、ポリアミド、ポリイミド、およびガラス容器などを含めたシリカベースの物質が含まれる。前述の物質のいかなる組合せも、使用できる。これらの物質は、多孔質のものでも、または非多孔質のものでもよい。
【００５８】
本発明によって企図されている好ましい基質配置／容器には、マルチウェルプレート（６ウェルおよび２４ウェルプレートなど）、培養皿（ペトリ皿など）、培養フラスコ、回転ビン、回転管、バイオリアクター、および同様のものを含めた回転ビンが含まれる。
（調製方法）
本発明は、安定な、すぐに使用できる細胞培養生成物を調製する方法を提供する。この方法は、細胞外マトリックスコーティング溶液を基質の表面に塗布するステップを含むものであり、コーティング溶液中の総タンパク質濃度は約１０μｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌである。この方法は、基質表面でコーティング溶液をインキュベートするステップ；インキュベートされたコーティング溶液を基質から除去するステップ；および、除去ステップの後に、基質を洗浄するステップも含む。最後に、この方法は、洗浄された基質を乾燥させるステップと、乾燥基質を滅菌するステップとを含む。コーティングを塗布するのに適した基質は、例えば、上述のものから選択することができる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、洗浄ステップは、蒸留水、緩衝剤または培養培地で基質を洗浄するステップを含む。他の実施形態では、洗浄ステップは、ブロッキング溶液で基質を洗浄するステップを含む。例えば、細胞培養用生成物を調製するのに用いられる洗浄ステップはブロッキング溶液を利用でき、それによって、ウェルの洗浄およびブロッキングの両方が同時に、かつ効果的に行われる。
【００６０】
上述の通り上記細胞培養用生成物／細胞培養装置を調製する方法は、除去ステップの後であり、かつ少なくとも１つのブロッキング剤および水性溶媒を含むブロッキング溶液で洗浄するステップの前または洗浄ステップ中に、基質の表面をブロッキングするステップをさらに含むことができる。ブロッキング剤は、限定されるものではないが、ゼラチン、ショ糖、トレハロース、およびこれらの組合せから選択できる。ブロッキングステップは、以下により詳細に記述する通り、より高い温度での老化促進試験の間、表面の安定性を強化することが判明した。ブロッキングステップに関しては、除去ステップの前に実施すること、および／または、ブロッキングステップを複数のステップに分離して、除去ステップの前後に行うことが可能でありうる。
【００６１】
一実施形態では、本発明は、
ｉ）一定濃度の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を含有する第１の溶液を細胞培養に適した容器に塗布するステップと、
ｉｉ）容器への、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の吸着または結合を可能にするのに十分な時間にわたって、第１の溶液を含有する容器をインキュベートするステップと、
ｉｉｉ）第１の溶液を容器から除去するステップと、
ｉｖ）容器を洗浄して、残留している第１の溶液も除去するステップと、
ｖ）任意選択的に、細胞外マトリックスを安定させるのに適した組成物を含有する第２の溶液の塗布するステップと、
ｖｉ）任意選択的に、細胞外マトリックスを安定させるのに適した組成物を含有する第２の溶液の除去するステップと、
ｖｉｉ）任意選択的に、容器の洗浄を行い、残留しているいかなる第２の溶液も除去するステップと、
ｖｉｉｉ）容器を乾燥させるステップと
を含む、細胞培養装置を調製する方法を提供する。
【００６２】
細胞外マトリックス成分を含有する溶液は、フラスコまたは細胞培養皿などの容器の少なくとも１つの表面で、容器への、細胞外マトリックス成分の吸着を可能にするのに十分な温度および時間でインキュベートすることができる。例えば、吸着を確実にするために、容器を室温で約１から約４時間までの間インキュベートすることができる。代わりに、容器を４℃で終夜インキュベートすることができる。
【００６３】
容器の乾燥は、任意の適した方法で、任意の時間にわたって行うことができる。一実施形態では、容器を、乾燥炉内において減圧下、室温で乾燥させる。一実施形態では、容器を、乾燥炉内において室温で少なくとも１６時間乾燥させる。
【００６４】
培養装置が乾燥した後に、任意選択で、それを滅菌することができる。一実施形態では、紫外（ＵＶ）光を用いて、装置を滅菌する。
【００６５】
このコーティング手順は、通常、以下の通りに行われる。６ウェルのマルチウェルプレートには、１ウェルあたり約０．５から２．０ｍｌのコーティング溶液（好ましくは約４℃）を塗布し；２４ウェルのマルチウェルプレートには、１ウェルあたり約０．２５から１．０ｍｌを塗布し；９６ウェルプレートには、１ウェルあたり約５０μｌから１００μｌを塗布する。さらに、３５ｍｍの皿には、約０．５から２．０ｍｌを塗布し、６０ｍｍの皿には、０．５から４．０ｍｌを塗布し、１００ｍｍの皿には、２．０から１２．０ｍｌを塗布する。
【００６６】
塗布の後に、コーティング溶液をインキュベートして、溶液中にある細胞外のマトリックスタンパク質を基質表面に吸着させる。詳細には、コーティングされる基質を、好ましくは約２２℃から約３０℃の温度で、約３０分間から約４時間の時間にわたってインキュベートして、タンパク質を基質表面に吸着させる。その後、コーティング溶液を除去し（例えば吸引によって）、コーティングされた基質を水性溶媒（例えば、緩衝剤、ｄｄＨ２Ｏ、培養培地）で洗浄して、非結合のタンパク質を除去する。ブロッキング溶液を使用することによって、上述の通り、コーティングされた基質の安定性が強化される。
【００６７】
好ましい実施形態では、基質表面で、コーティングを乾燥させる。これは、２２℃から約３０℃の範囲にある温度、そして好ましくは４０〜６０％の相対湿度での乾燥によって実現できる。本発明者らは、そのような乾燥によって、上記生成物の安定性が改善されることを見出した。乾燥基質は、例えば、ＵＶ滅菌によって滅菌することができる。その後、滅菌された乾燥基質を、耐湿性容器中に包装することができる。それが望ましい場合には、包装された乾燥基質を−２０℃で保存し、その後、使用前にそれを解凍することができる。
【００６８】
乾燥基質は、細胞培地または別の無菌培地（例えば滅菌水）を用いて、細胞を添加する前に、任意選択で再水和させることができる。例えば、細胞培養培地などの再水和溶液を用いて、室温で、約２分間から約２時間、乾燥基質を再水和させることができる。再水和溶液は、その後、使用直前に除去することができる。代わりに、培地を添加して、乾燥基質を再水和させることができ、その後、約２分から約２時間後に、細胞懸濁液を培地に添加することができる。
【００６９】
（使用方法）
本発明は、支持細胞を含まない培養物中における、胚幹細胞の増殖を可能にする。この細胞増殖は、ｍＥＦなどの支持細胞の培養によって条件付けされた培地または他の培地調合物と、細胞外マトリックスコーティングとを用いることによって支持できる。
【００７０】
上述の通り、ＥＨＳ腫瘍から得られるＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）などの基質ゲルでは、本来的に、タンパク質の濃度および組成がロット相互で変動する。本発明は、ＥＳ培養用の最適なＥＣＭ組成物でコーティングされた、安定な、すぐに使用できる基質を提供する。この細胞培養装置／生成物は、ロット相互の一貫性を提供する。これは、標準化されたＥＳ培養を行うのに必要である。
【００７１】
詳細には、本発明による細胞培養装置は、未分化状態にある胚幹細胞の一貫性のある増殖を可能にする。細胞培養装置表面の細胞外マトリックスコーティングは、好ましくは、乾燥状態で存在し、それによって、結果として得られる生成物がより安定なものとなる。また、細胞外マトリックスコーティングは、ショ糖などの安定化剤／ブロッキング剤を含有することが好ましい。本発明者らは、コーティング中に安定化剤／ブロッキング剤を含有させることによって、乾燥コーティングの安定性が強化されることを見出した。さらに、細胞培養用生成物は、洗浄されて、非結合のタンパク質を含まないことが好ましい。これによって、量が制御されない非結合のタンパク質が洗い落とされるので、ロット間における一貫性の増大が可能となる。
【００７２】
本発明の組成物および細胞培養用生成物／装置は、ＥＳ細胞の培養を含めた様々な適用に使用できる。本発明者らは、改善されたＥＣＭコーティングの細胞培養表面が、ＥＳ細胞の自己複製特性および多分化能特性を長期間にわたって維持するのに有用であることを見出した。さらに、特定の細胞型へのＥＳ細胞の細胞分化は、ＥＳ細胞がその中で増殖している培養培地への成長因子の添加によるものなど、特定の方法で方向付けることができるが、その研究を本発明の組成物を用いて行うこともできる。
【００７３】
本発明による細胞培養用生成物は、ヒトなどの霊長類に由来する胚幹細胞を含めた胚幹細胞を、未分化状態で維持し、さらに増殖させることができる。いくつかの実施形態では、ＥＳ細胞がヒトＥＳ細胞である。例えば、ヒトＥＳ細胞には、例えば、以下の細胞系、すなわちＨ１、Ｈ７、Ｈ９、およびＨ１４が含まれるが、これらに限定されない。これらの細胞系は、例えば、ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社（米国ウィスコンシン州マディソン所在）およびＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；米国ヴァージニア州マナッサス所在）から入手できる。他の実施形態では、ＥＳ細胞はマウスＥＳ細胞であり、その例および供給元は当技術分野で周知である。
【００７４】
一実施形態では、胚幹細胞を培養する方法は、基質と、基質表面にコーティング溶液から付着したコーティングとを含む本発明の細胞培養用生成物を用意するステップを含む。コーティング溶液は、細胞外マトリックスタンパク質の混合物および水性溶媒を含むものであり、コーティング溶液中の総タンパク質濃度は約１０μｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌである。この培養方法は、胚幹細胞および培地の懸濁液を細胞培養用生成物に添加するステップ；および、胚幹細胞を、３７℃の加湿雰囲気中、５％ＣＯ２でインキュベートして、胚幹細胞増殖を行うための未分化コロニーを産生させるステップも含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、培養する方法は、細胞培養用生成物を解凍するステップをさらに含み、細胞培養用生成物は、使用する前に−２０℃に保存することができる。他の実施形態では、培養方法は、胚幹細胞の懸濁液を添加する前に、細胞培養培地を用いて細胞培養用生成物を水和させるステップを含むことができる。
【００７６】
一実施形態では、多分化能胚幹細胞を未分化状態で増殖させる方法は、
ａ）以下のステップ、すなわち、
ｉ）一定濃度の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を含有する第１の溶液を細胞培養に適した容器に塗布するステップと、
ｉｉ）容器への、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の吸着または結合を可能にするのに十分な時間にわたって第１の溶液を含有する容器をインキュベートするステップと、
ｉｉｉ）第１の溶液を容器から除去するステップと、
ｉｖ）容器を洗浄して、残留しているいかなる第１の溶液も除去するステップと、
ｖ）任意選択的に、細胞外マトリックスを安定させるのに適した組成物を含有する第２の溶液の塗布するステップと、
ｖｉ）任意選択的に、細胞外マトリックスを安定させるのに適した組成物を含有する第２の溶液の除去するステップと、
ｖｉｉ）任意選択的に、容器の洗浄を行い、残留しているいかなる第２の溶液も除去するステップと、
ｖｉｉｉ）容器を乾燥させるステップと
を含めたステップによって形成される培養装置を用意するステップ；
ｂ）適切な支持細胞培養によって事前に条件付けされた、適した細胞培養培地を容器に添加するステップ；
ｃ）適切な濃度の未分化多分化能胚幹細胞を容器に添加するステップ；ならびに、
ｄ）適切な条件でインキュベートして、多分化能胚幹細胞の増殖を可能にするステップを含む。
【００７７】
一実施形態では、ステップｂ）およびｃ）を逆の方向で実施することができ、その場合、ステップｂ）の前にステップｃ）を行う。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ＥＳ細胞を培養するのに使用される培地は、条件付けられ、または規定された細胞培養培地である。一実施形態では、培地は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）で補足されたＭＥＦ条件培地である。ｂＦＧＦは、約４から約２０ｎｇ／ｍｌの量で、上記培地中に存在することができる。しかし、培養する方法は、この培養培地に限定されないと考えられている。例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングされた表面でのＥＳ細胞の培養には、多くの培地が適合していることが以前に示されている。例えば、ＨＥＦ１条件培地（例えば、非特許文献３参照）、ＨＥＳ−ｄｆ条件培地（例えば、非特許文献４参照）、Ｋ−ＶｉｔｒｏＨＥＳ培地（例えば、非特許文献５参照）、および、１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有するＴｅｓＳＲ１培地（例えば、非特許文献６参照）が、この点に関して有用であると以前に判明した。
【００７９】
例として、条件培地の調製は、照射されているか、あるいはマイトマイシンＣで不活性化されている初代マウス胚線維芽細胞を、例えば、４ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子を含有するＤＭＥＭ、Ｋ／Ｏ  ＤＭＥＭ、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２（ｂＦＧＦ）などの血清リプレースメント培地で培養することによって実施できる。通常、３７℃で１日後に、培養上清を採集し、βＦＧＦを含めた追加の成長因子で補足する。より詳細には、支持細胞を含まない培養に適した基礎培地は、以下の成分、すなわち、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ社＃１１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ社＃１０８２９−０１８；Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２／５０％ＤＭＥＭ基礎培地；２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ社＃１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ社＃１１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ社＃Ｍ７５２２；および、組換え体ヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ社＃１３２５６−０２９から作製できる。例示的な血清含有ＥＳ培地には、８０％ＤＭＥＭ（通常、ＫＯ  ＤＭＥＭ）、熱不活性化されていない２０％規定ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭ  ｐ−メルカプトエタノールを用いて作製されたものである。この培地は、濾過し、２週間を超えない期間、４℃で保存する。無血清ＥＳ培地は、８０％ＫＯ  ＤＭＥＭ、２０％血清代替物、１％非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノールでできている。すべての血清代替物が機能するわけではなく、効果的な血清代替物は、Ｇｉｂｃｏ社＃１０８２８−０２８（独占処方；製造会社から入手可能な生成物）である。この培地は、濾過し、２週間を超えない期間、４℃で保存する。条件付けに用いる細胞と併せる直前に、ヒトｂＦＧＦを、最終濃度４ｎｇ／ｍＬで添加することができる。
【００８０】
その後、胚幹細胞を支持する成分を細胞が培地中に放出するのを可能にする環境中で、１つまたは複数の培地を、条件付け用の細胞と併せる。任意選択的に、細胞（すなわち、実質的な複製を不能にすること）を、放射線照射（例えば約４０００ラド）、マイトマイシンｃなどの化学的不活性化剤での処理、または任意の他の有効な手段によって不活性化することができる。培地を、幹細胞培養の支持に使用する前に、条件付け用の細胞から分離する場合には、細胞の不活性化は必要でない。
【００８１】
培地中における細胞の培養は、放出される因子の濃度が、分化しないままの胚幹細胞の培養を支持する培地の産生に適したものとなる（または培地成分が消費される）のを可能にするのに十分な時間行う。通常、３７℃における２４時間の培養によって条件付けされた培地は、胚幹細胞培養を２４時間支持する培地を産生する。しかし、上記培養時間を上方調整または下方調整して、適切な時間を構成するものを経験的に（あるいは必須因子の濃度をアッセイすることによって）決定することができる。１バッチの条件培地を収集した後、細胞は、それに続く培養時間の間、さらに別のバッチの培地を条件付けするのに使用できる。このサイクルは、上記細胞が適切な方法で培地を条件付けするそれらの能力を保持している限り何回でも望むだけ行うことができる。例えば、胚幹細胞の分化から生じた線維芽細胞様細胞は、１〜２週間の間、１日間にわたる培地の条件付けに使用することができる。
【００８２】
培地の条件付けに、マウス胚線維芽細胞（ｍＥＦ）を用いることができる。非近交系ＣＦＩマウス（ＳＡＳＣＯ）または他の適した系統からｍＥＦ細胞を得ることができる。一例の方法では、７０％エタノールを含むスワブで妊娠１３日のマウスの腹をこすり、脱落膜をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に除去する。胚を採取し；胎盤、膜、および軟組織を除去し；屠殺体をＰＢＳで２回洗浄する。その後、それらを２ｍＬトリプシン／ＥＤＴＡを含有する１０ｃｍ細菌培養皿に移し、細かく刻む。３７℃で５分インキュベートした後、１０％のＦＢＳを含有する５ｍＬのＤＭＥＭを用いて、トリプシンを不活性化し、混合物を１本の１５ｍＬ円錐管に移す。２分間置いて、細片を定着させ、上清を最終容積１０ｍＬにして、１０ｃｍ組織培養皿またはＴ７５フラスコの表面に播種する。フラスコを２４時間の間平静にインキュベートし、その後、培地を交換する。フラスコが集密状態になったとき（約２〜３日）、それらを新規のフラスコ中に１：２に分割する。マウス胚線維芽細胞は、９０％ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社＃１１９６５−０９２）、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社＃３００７１−０３）、および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有するｍＥＦ培地中で増殖させることができる。Ｔ１５０フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社＃４３０８２５）を使用し、トリプシンを用いて、細胞を１日おきに１：２に分割して、細胞を準集密状態に維持する。
【００８３】
胚幹細胞は、条件培地の存在下、容器表面に適切な分布で播種することができる。マウス胚幹細胞の増殖には、細胞を単細胞浮遊液に分散させることを含む（例えば、非特許文献７参照）。対照的に、支持細胞の非存在下における霊長類胚幹細胞の継代では、霊長類胚幹細胞を小さな集塊に調製することが有益である。
【００８４】
胚幹細胞が分化しているか否かを決定する好都合な方法は、コロニーの形態学的な特徴を追跡することである。例えば、未分化なｈＥＳ細胞に特有な形態学的特徴は、当業者には既知であり、それらには、核／細胞質比率が高いこと、顕著な核小体、およびコロニー形成が緻密で細胞間結合があまり識別できないことが含まれる。継代している間に、いくつかの細胞は分化しうる（特に単一細胞として置換された場合、または大きな集塊の形成が可能とされた場合）。しかし、培養物は通常、培養期間中に、未分化細胞が大きな割合を占める状態に復帰する。増殖中の細胞は、約２０〜４０時間以下の倍加時間を有することが理想的であろう。
【００８５】
本発明に従って増殖される多能性幹細胞は、約７０日間以内に、細胞数の倍加を約５０回、実現できる。
【００８６】
本発明の細胞培養装置は、様々な阻害剤または刺激物質を試験して、細胞試験におけるそれらの有効性を決定するのに使用できる。刺激物質には、成長因子を含めることができ、それらは、当技術分野で知られている。例えば、これらには、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、例えば、ＰＤＧＦ  ＡＡ、ＰＤＧＦ  ＢＢ；インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、例えば、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、例えば、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、β内皮細胞成長因子、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、およびＦＧＦ９；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−Ｐ１、ＴＧＦβ１．２、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３およびＴＧＦ−β５；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、例えば、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３およびＢＭＰ４；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、例えば、ＶＥＧＦおよび胎盤成長因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）、例えば、ＥＧＦ、アンフィレギュリン、ベータセルリンおよびヘパリン結合性ＥＧＦ；インターロイキン、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１４；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、ＣＳＦ−Ｇ、ＣＳＦ−ＧＭ、およびＣＳＦ−Ｍ；神経成長因子（ＮＧＦ）；幹細胞因子；肝細胞成長因子ならびに繊毛様神経栄養因子のうちの１つまたは複数を含むことができる。他の成長因子も文献に記載されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれている非特許文献８を参照のこと）。将来発見されるかもしれない、現在は未知な成長因子も、当業者ならば容易にそれを成長因子として特性決定できるであろうから、「成長因子」という用語には、それも包含されるものとする。
【００８７】
多数の成長因子が、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（米国ミズーリ州セントルイス所在）；Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（米国カリフォルニア州ロスアルトス所在）；Ｇｅｎｚｙｍｅ社（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ所在）；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社（独国所在）；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（米国ミネソタ州ミネアポリス所在）；Ｇｅｎｅｔｅｃｈ（米国カリフォルニア州サンフランシスコ所在）；およびＧＩＢＣＯ社（米国ニューヨーク州グランドアイランド所在）などの業者から購入できる。購入可能な成長因子は、天然型および組換え型の両方が入手できる。
【００８８】
したがって、様々な実施形態において、本発明は、細胞の増殖を支持するための支持細胞層を用いずに、実質的に未分化状態にある多分化能胚幹細胞の安定かつ一貫した増殖を提供する。本発明の、それらおよび他の実施形態、態様、対象、および特徴は、以下に示す例示的実施形態の詳細な説明から、それらを付随の図と併せ、それらを参照して読むことで明らかとなろう。以下の実施例は、例示を目的とするものであり、いかなる意味においても、本発明の実施形態および使用の限定を意図するものではない。
【実施例１】
【００８９】
（ＥＣＭコーティングされた表面の最適化）
安定ですぐに使用できるＥＣＭコーティングされた基質を調製する試みに、まず、ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリックス（カタログ番号３５４２３４；Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ社）を、氷上、４℃で終夜、解凍させた。その後、冷たい（４℃）ＤＭＥＭ（カタログ番号１０３１３−０２１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）またはＫ／Ｏ−ＤＭＥＭ（カタログ番号１０８２９−０１８；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（１０ｍｇ／ｍｌ保存液）の連続希釈（例えば、１：３０、１：１００、１：３００、１：３０００、１：３００００）を調製した。５段階に希釈されたＭａｔｒｉｇｅｌ溶液および対照溶液それぞれのアリコート（２ｍｌ／ウェル）を６ウェルプレート（カタログ番号３５３０４６；Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ社）のウェルに添加し、ウェルの底面全体が覆われるように穏やかに回旋させ、室温で約２時間インキュベートした。各６ウェルプレートは、少なくとも１つの対照ウェルを含んでおり、それに対照溶液が入れられた。対照溶液は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含まない培地であった。
【００９０】
インキュベーションの後、ウェルからＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）希釈液および対照溶液を吸引によって除去し、ウェルの洗浄および非結合物質の除去を行うために、６ｍｌのｄｄＨ２Ｏを添加した。洗浄溶液を添加した後、約５分以内に、吸引によってそれを除去し、フタを付けたまま、プレートを乾燥炉内、室温で終夜、少なくとも約１６時間乾燥させた。乾燥サイクルの後、プレートを炉から取り出し、滅菌用ＵＶトンネルの中を通過させた。その後、滅菌済みのプレートを、耐湿性の真空密閉ホイルバッグ中に個別に包装し、直ちに−２０℃に保存した。
【００９１】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）希釈液でコーティングされたプレート表面における、ｈＥＳ細胞の培養を介して得られた結果を、下記、実施例６に要約する。これらの結果は、コーティング溶液から付着したコーティングであって、コーティング溶液中の総タンパク質濃度が約１０μｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌであるコーティングが、適したコーティングに含まれることを示した。いくつかの実施形態では、コーティング溶液中の総タンパク質濃度が約３０μｇ／ｍｌから約３００μｇ／ｍｌであった。他の好ましい実施形態では、コーティング溶液中の総タンパク質濃度が約３０μｇ／ｍｌから約２００μｇ／ｍｌであった。コーティングされた表面の性能は、コロニー数、および細胞分化マーカーの不在、および未分化マーカーの存在によって定義した。
【００９２】
ラミニン／エンタクチンまたはラミニン／コラーゲンＩＶの混合物を含有するＥＣＭ−コーティング溶液は、ＥＣＭ混合物の保存液濃度を、約３０μｇ／ｍｌから約３００μｇ／ｍｌの最終総タンパク質濃度となるように、培地または他の適した水性溶媒中に希釈することによって調製できる。コーティング手順は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）希釈液に関して上述したものと同じである。ラミニン／エンタクチンの混合物でコーティングされたプレート表面における、ｈＥＳ細胞の培養を介して得られた試料結果を、下記、実施例６に要約する。これらの結果は、ラミニン／エンタクチンでコーティングされた表面が、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）希釈液でコーティングされた試験表面および支持細胞対照表面と同程度によい性能であることを示した。
【００９３】
本発明の細胞培養用生成物を調製するのに用いられる前述の洗浄ステップは、任意選択で、ブロッキング溶液を用いて実施することができ、それによって、ウェルの洗浄およびブロッキングが両方とも同時に、かつ効果的に行われると考えられている。本発明者らは、例えば、ショ糖などの少なくとも１つのブロッキング剤を含有するブロッキング溶液を用いて、ウェルの表面をブロッキングすることによって、より高い温度での老化促進試験の間で表面の安定性が増大することを見出した。詳細には、室温または４℃で保存された、ショ糖ブロッキングのウェルから得られたシグナルのダイナミックレンジは、同様な温度におけるブロッキングされていないウェルから得られたものより増大していたことが判明した。これは、例えば図２に示されており、この場合、ブロッキング溶液中にショ糖が１．２５％ｗ／ｖで存在した。いくつかの実施形態では、ブロッキング溶液中に、ショ糖が約０．１から５％ｗ／ｖの量で存在した。トレハロースなどの他の糖、またはゼラチンなどのタンパク質が、この点で有用であろうということも、十分に本発明の企図する範囲内にある。
【００９４】
コーティングされた表面の性能は、主要なＥＣＭ成分に関するＥＬＩＳＡアッセイの結果によってさらに定義された。これらの結果を、下記、実施例２に記述する。
【実施例２】
【００９５】
（コーティングされたプレートの表面に吸着されたタンパク質量の測定）
この実施例は、コーティングされた表面に吸着された細胞外マトリックスタンパク質の、ＥＬＩＳＡアッセイを用いた検出および定量を対象とする。ＥＬＩＳＡアッセイは、抗マウスコラーゲンＩＶ抗体を用いて、プレートコーティング中のコラーゲンＩＶを検出するために設計された。コラーゲンＩＶは主要ＥＣＭ成分である。プレートコーティング中の他のタンパク質の検出も、コーティング組成物中の他のタンパク質に特異的な抗体の使用を介して可能であり、かつ十分に当業者の能力の範囲内にある。
【００９６】
実施例１の記載の通り、コーティングされたプレート（１００μｇ／ｍＬ）、およびコーティングされていない対照プレートを室温になるようにさせた。２ｍＬの洗浄緩衝剤（１×ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムイオンを含まない）１Ｌ中に、Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国ミズーリ州セントルイス所在、製品番号１３７９）０．２ｍＬ）を各ウェルに添加し、洗浄緩衝剤を除去し、ウェルの側面にある余分な液体を除去するために、各プレートをペーパータオルにブロッティングすることによって、コーティングされたプレートを洗浄した。この洗浄手順をさらに２回繰り返した。１ｍＬのブロッキング溶液（１×ダルベッコＰＢＳ中で、ＫＰＬ  １０％ＢＳＡ希釈／ブロッキング緩衝剤（カタログ番号５０−６１−１０）の１：２０（ｖ／ｖ）希釈液）を各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、プレートからブロッキング溶液を除去し、洗浄手順を３回繰り返した。
【００９７】
抗マウスコラーゲンＩＶ一次抗体実効溶液を各ウェル（１ｍｌ／ウェル）に添加した。一次抗体実効溶液は、抗体保存溶液の１：８０（ｖ／ｖ）希釈液（ブロッキング溶液４０ｍＬ中に保存液０．５ｍＬ）として調製した。抗体保存溶液（約１：１００希釈）は、ウサギ抗マウスコラーゲンＩＶ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、カタログ＃ＡＢ７５６Ｐ）をブロッキング溶液（上記）中に希釈することによって調製した。新規ロットの抗マウスコラーゲンＩＶ抗体は、新規抗体ロットの様々な希釈液を用いて作成した用量反応曲線を、最初の抗体ロットの同じ希釈液と比較することによって検定した。対応する新規抗体ロットの希釈率は、用量反応曲線の直線の領域を検討して決定した。一次抗体の実効溶液を添加した後に、プレートを室温で２時間インキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、プレートから一次抗体の実効溶液を除去し、洗浄手順を３回繰り返した。
【００９８】
ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体の実効溶液を各ウェル（１ｍｌ／ウェル）に添加した。二次抗体の実効溶液は、抗体保存溶液の１：１００（ｖ／ｖ）希釈液（ブロッキング溶液４０ｍＬ中に保存液０．４ｍＬ）を調製して調製した。抗体保存溶液（約１：１００希釈）は、二次抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、カタログ＃５５４０２１）をブロッキング溶液（上記）中に希釈して調製した。新規ロットの二次抗体は、新規抗体ロットの様々な希釈液を用いて作成した用量反応曲線を、最初の抗体ロットの同じ希釈液と比較して検定した。対応する新規抗体ロットの希釈率は、用量反応曲線の直線の領域を検討して決定した。二次抗体実効溶液を添加した後に、プレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、プレートから二次抗体の実効溶液を除去し、洗浄手順を３回繰り返した。
【００９９】
室温にさせた後に、ホースラディシュペルオキシダーゼ基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＳｕｒｅＢｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（１成分）ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ社、カタログ＃５３−００−０２）１ｍＬを各ウェルに添加した。プレートを室温で８分間インキュベートして発色させた。８分間後に、酸性停止液（ＫＰＬ社、カタログ＃５０−８５−０５のＴＭＢ停止液）１ｍＬを各ウェルに添加した。反応混合物２００μｌを各ウェルから９６ウェルプレート中に移し、４５０ｎｍにおける吸光度を室温で測定した（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓプレートリーダー）。それらのプレートは、反応停止後５分以内に測定した。同じ反応混合物を含有するウェルの平均Ｏ．Ｄ．測定値は計算した。バックグランドは、試料ウェルの平均Ｏ．Ｄ．を、コーティングされていない対照ウェルの平均Ｏ．Ｄ．で割って計算した。
【０１００】
この実施例に記載した試薬および方法を用いたところ、コーティングされたプレートのウェルは、少なくとも約０．５の光学密度を有した。これらの結果を図１に図示する。コーティングされていないプレートに対する、コーティングされたプレートのウェルの光学密度の比率は約４．０以上であった。
【実施例３】
【０１０１】
（線維芽細胞（ＭＥＦ）支持細胞層の調製）
この実施例は、ＭＥＦ条件培地が採取されたＭＥＦ支持細胞層を調製するのに用いた手順を対象とする。さらに、当技術分野でよく知られている方法に従ってヒト胚性幹細胞を培養するための対照表面としても、ＭＥＦ支持細胞層を用いた。
【０１０２】
（支持細胞用の基層の調製）
不活性化されているＭＥＦ支持細胞（照射されたか、またはマイトマイシン−Ｃ処理されたＣＦ−Ｉ系列、ＡＴＣＣ（米国ヴァージニア州マナッサス所在から入手した））を、長期の培養期間、より良好な支持を与えるために、ゼラチン化細胞培養皿に播種した。詳細には、培養皿を０．１％ゼラチン溶液でコーティングし、その後、室温で約１時間から終夜にわたってインキュベートした。その後、ゼラチンを除去し、ゼラチンでコーティングされた培養皿を、不活性化されている支持細胞を播種する直前に、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でその表面をすすいだ。
【０１０３】
（支持細胞の解凍および培養）
バイアル１本の細胞（照射されたＣＦ−１由来のＭＥＦ；ＡＴＴＣＣより入手、カタログ番号ＳＣＲＣ１０４０．１）を、まず３７℃の水浴中で穏やかに振とうさせることによって解凍した。細胞が解凍されたならば直ちに、バイアルを水浴から取り出し、バイアルの外側を７０％エタノールで処理した。その後、バイアルを組織培養法フードに移し、そこで、この手順で残っているステップを無菌的に実施した。バイアルの細胞内容物は、予め暖められた１０ｍｌのＭＥＦ培地に無菌的に移した。その後細胞を１０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットを４８ｍｌのＭＥＦ培地中に再懸濁し、上述の通り調製されたゼラチン化した６ウェルプレートに、ウェル当り２．５ｍｌの細胞懸濁液を分注した。その後、５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気中でプレートをインキュベートした。約２４時間後に、各ウェル内の培地を、２．５から３．０ｍｌの線維芽細胞培地またはｈＥＳ培地（細胞が翌日使用されることになっている場合）で置換し、プレートをインキュベーターに戻した。
【実施例４】
【０１０４】
（ヒト胚性幹細胞の支持細胞を含まない培養）
この実施例は、上記の実施例１の記載の通りに調製されたＥＣＭコーティングされた表面上でのヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞の培養を対象とする。このｈＥＳ細胞は、ＭＥＦ条件培地の存在下で培養され、この条件培地の調製については下記に記述する。しかしながら、ＥＣＭ表面上での胚幹細胞の培養は本明細書に記載されているものと異なる条件付け及び規定をした培地を用いて成功できることは従来からの研究により確立されているので、本発明の培養方法はＭＥＦ条件培地に限定されるものではないと考えられている。
【０１０５】
（ＭＥＦ条件培地の調製）
ＭＥＦ支持細胞の培養および不活性化は、上記実施例３に記載の通りに行う。ＭＥＦ培地中にＭＥＦ支持細胞を５６，０００細胞／ｃｍ２で播種した。以下の通りの容積、すなわち、６ウェルプレートに対して３ｍｌ／ウェル；７５ｍｌ組織培養フラスコに対して１０ｍｌ；そして、１５０ｍｌ組織培養フラスコに対して２０ｍｌを用いた。ＭＥＦを終夜培養した。条件培地を採取する前夜に、このＭＥＦ上の培地を、４〜１０ｎｇ／ｍｌ  ｈｂＦＧＦで補足されたｈＥＳ細胞培地で置換した。ｈＥＳ培地中でＭＥＦを終夜インキュベーションした後に、支持細胞プレートまたはフラスコから生じた条件培地を収集した。４〜１０ｎｇ／ｍｌのｈｂＦＧＦを含有する新規ｈＥＳＣ培地をＭＥＦに添加し、そして、細胞の終夜培養と、それに続く、条件培地の収集とからなる上記過程を繰り返した。１日１回条件培地を収集して、ＭＥＦを約７日間使用できることが分かった。ｈＥＳ細胞の培養に用いる前に、条件培地に８ｎｇ／ｍｌの追加のｈｂＦＧＦを添加した。
【０１０６】
（ＥＣＭコーティングされた表面上のＭＥＦ条件培地を使用したｈＥＳ細胞の培養）
実施例１の通りに調製されたＥＣＭコーティングされたプレートを、室温で解凍した。その後、８ｎｇ／ｍｌのｈｂＦＧＦで補足された２ｍｌのＭＥＦ条件培地を６ウェルプレートの各ウェルに添加し、このプレートを２時間までの間、ＣＯ２インキュベーター内に置いた。この方法により任意選択的にプレートを水和させた後に、８ｎｇ／ｍｌのｈｂＦＧＦ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ社）で補足したＭＥＦ条件培地中にｈＥＳ細胞を懸濁した細胞懸濁液０．５ｍｌを各ウェルに添加し、３７℃で終夜インキュベーションを行うために、プレートをＣＯ２インキュベーター内に戻した。この日が第０日に相当した。第３日目に、培地を新たな培地で置換する。その後、第７日目まで毎日、培地を新たな培地で置換する。ｈＥＳ細胞のコロニーは、顕微鏡で観察可能であった。その後、これらのｈＥＳ細胞は、継代させるか、または下記の実施例５に記述する通り、分化したｈＥＳ細胞および未分化なｈＥＳ細胞の存在を試験するための免疫細胞化学検査に使用した。
【実施例５】
【０１０７】
（免疫細胞化学プロトコール）
この実施例は、分化したｈＥＳ細胞および未分化なｈＥＳ細胞に関する試験に使用された免疫細胞化学プロトコールを対象とする。詳細には、実施例４の培養されたｈＥＳ細胞の分化状態を決定するために、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製のｈＥＳマーカー抗体（カタログ＃ＳＣ００８）を使用した。このプロトコールは、６ウェルの組織培養プレートで成長させた細胞用のものである。
【０１０８】
実施例４からの培養ｈＥＳ細胞を、２ｍｌのＰＢＳで洗浄した。その後、１ｍｌの４％パラホルムアルデヒドを用いて、細胞の固定を室温で２０分間行った。固定された細胞を２ｍｌのＰＢＳで、各洗浄当り５分間、２回洗浄した。続いて、細胞を、０．１％ＢＳＡ、１０％正常ヤギ血清１ｍｌでブロッキングした。ブロッキング中に、１％ＢＳＡおよび１０％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳを用いて、一次抗体の実効溶液を、製造会社の推薦に基づいた望ましい最終抗体濃度に調製した。ブロッキング溶液および一次抗体溶液の両方に関して、二次抗体の宿主種に応じて、正常血清を別の種に由来するものに置換することができると考えられている。
【０１０９】
ブロッキングの後に、上記細胞を、１ｍｌ／ウェルの希釈された抗体実効溶液と共に、２〜８℃で終夜インキュベートした。その後、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ  ２ｍｌで、各洗浄あたり５分間、３回細胞を洗浄した。
【０１１０】
二次抗体を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで希釈した。有用な蛍光二次抗体には、Ａｌｅｘ４８８または５９４結合型の適切な二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）が含まれた。これらの二次抗体は、製造会社の推薦に従って使用した。室温、暗条件下で、１ｍｌ／ウェルの二次抗体と共に細胞を６０分間インキュベートした。その後、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ  ２ｍｌで、各洗浄あたり５分間、３回、細胞を洗浄した。その後、細胞を２ｍｌのＰＢＳで覆い、蛍光顕微鏡を用いて可視化した。
【０１１１】
これらの免疫細胞化学の結果を実施例６に記述し、下記の表１に要約する。
【実施例６】
【０１１２】
（結果）
ＭＥＦ−ＣＭ中におけるｈＥＳ細胞の培養には、上記の実施例１で記載した通りに調製された培養システムを使用した。しかし、培養する方法は、この培養培地に限定されない。培養の成功は、少なくとも一部は、ＥＳ細胞の起源、分離、および冷凍保存に使用される方法に依存する。さらに、本発明の方法など、長期化にわたって有効性の確認が行われている培養方法が好ましい。
【０１１３】
本発明者らは、ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングされた６ウェルプレートを用いることによって、そして、例えばラミニン／エンタクチンの混合物でコーティングされた６ウェルプレートを用いることによって、培養方法を最適化した。しかしながら、これらは例示的なコーティングであり、本発明はここに記載したコーティングに限定されるものではない。この培養方法は、ＢＤ（商標）ヒトｂＦＧＦ、ｈＥＳコロニーを分離するためにＢＤ（商標）ディスパーゼなどの予め検定された試薬を培地補完物として使用する。
【０１１４】
この方法を用いて、ＷｉＣｅｌｌ社から入手したＨ９および／またはＨ１細胞系を、８ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦが補足されたＭＥＦ−ＣＭの存在下、最適化されたＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ（商標）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）表面上で、個体数の倍加が４０回を超える期間培養した。これらのｈＥＳ細胞は、通常、ＭＥＦ支持細胞上で培養されたものと比較して、ＢｉｏＣｏａｔ（商標）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）表面上で、より大きく拡がり、より大きなコロニーを形成することが、顕微鏡映像によって示された（データは示さない）。
【０１１５】
新規に最適化されたＢｉｏＣｏａｔ（商標）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）表面で培養された細胞の染色は、詳細に特徴付けされている未分化マーカーであるＯｃｔ−３／４およびＳＳＥＡ−４の発現に対して陽性を示し、分化マーカーであるＳＳＥＡ１対して陰性を示した。同様な細胞形態は、ラミニン／エンタクチン表面で培養されたｈＥＳ細胞からも得られ、それらの細胞は分化細胞マーカーＳＳＥＡ１に対して陰性で染色された。これらの結果を以下の表１に示す。
【０１１６】
【表１】
0005541835.tif 000002
【０１１７】
細胞の形態は、新規にコーティングされたＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）プレート上で培養されたコロニーに匹敵しており、以前の報告（例えば、非特許文献９〜１０参照）と一貫したものであった。ｂＦＧＦを含まずＦＢＳが補足された培地中で１０継代にわたり、新規ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ（商標）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）表面上で連続培養されたＨ９細胞は、顕微鏡映像に基づいて胚様体を形成する能力を保持し、このことは、これらの細胞の分化能が改変されていないことを示唆する。予備的なデータは、この表面は、ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）の存在下で良好に機能した本明細書に記載の多数の培地と適合性を有すること、および、（例えば、非特許文献１１参照）示唆されている通り、この表面は他のＥＳ細胞の培養にも使用できることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】コラーゲンＩＶ  ＥＬＩＳＡデータのグラフである。このグラフは、異なるＥＣＭでコーティングされた表面から得られた吸収シグナルを比較するものである。
【図２】異なるブロッキング条件および温度の下で、本発明のＥＣＭコーティングされた表面から得られた％ＯＤシグナル（ｙ軸）を比較する棒グラフである。ｘ軸上に示した条件のそれぞれについて、１番目、２番目、および３番目（右から左へ）の棒グラフは、それぞれ−２０℃、４℃、および室温で得られたシグナルを表す。この実験では、ブロッキング組成物中に１．２５％ｗ／ｖ濃度のショ糖が存在した。
【図１】
0005541835.tif 000003
【図２】
0005541835.tif 000004