(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された第ＩＸ因子（ＦＩＸ）タンパク質変異体であって、該変異体のアミノ酸配列は配列番号３に示されており、新規のグリコシル化部位がその成熟ポリペプチドの１６７位に追加されている、変異体。
【請求項２】
請求項１に記載のＦＩＸ変異体をコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項３】
請求項２に記載のベクターを含む形質転換細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権に関する陳述
本出願は、米国特許法第１１９条ｅ項の下で、その全内容が、引用することにより本明細書の一部をなすものとする２００７年１０月１５日に出願された米国特許仮出願第６０／９９９，０３５号明細書の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、追加のグリコシル化部位を含有する第ＩＸ因子変異体、ならびに前記第ＩＸ因子変異体をコードする核酸構築物に関する。
【背景技術】
【０００３】
第ＩＸ因子は、血漿由来製剤（Ｍｏｎｏｎｉｎｅ（登録商標））および組換えタンパク質（Ｂｅｎｅｆｉｘ（登録商標））の両方として市販で入手できる。Ｍｏｎｏｎｉｎｅ（登録商標）は、精製方法を通して運搬される細菌およびウイルス（例えば、ＨＩＶ、肝炎）による汚染を介して疾患を伝播する可能性があるという不利点を有する。組換えタンパク質（例えば、Ｂｅｎｅｆｉｘ（登録商標））の使用は、これらの問題を回避する。しかし、組換え第ＩＸ因子（ｒＦａｃｔｏｒ  ＩＸ、例えばＢｅｎｅｆｉｘ（登録商標））の薬物動態特性は、ヒト血漿由来第ＩＸ因子（ｐｄＦａｃｔｏｒ  ＩＸ、例えば、Ｍｏｎｏｎｉｎｅ（登録商標））の実験動物モデル系およびヒトにおける静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス注入後の特性と良好には匹敵しない。ｒＦａｃｔｏｒ  ＩＸの余り好都合ではない薬物動態特性に起因して、ｐｄＦａｃｔｏｒ  ＩＸと同一の凝血促進活性レベルを達成するためには、一般には２０〜３０％高用量のｒＦａｃｔｏｒ  ＩＸが必要とされる（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｒｉｌ  １９９８）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．３５，ｎｏ．２  Ｓｕｐｐｌ．２：３３−３８；Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １５，２００１）Ｂｌｏｏｄ  ｖｏｌ．９８（１３）：３６００−３６０６）。
【０００４】
タンパク質へのグリコシル化部位の付加は、それらの半減期を延長させるための重要なツールであることが証明されてきた。例えば、ダルベポエチン−αは、２つの追加のＮ結合グリコシル化部位が付加されるエリスロポエチンの組換え形である（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．「Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３）２１：４１４−４２１）。ダルベポエチンを作製するためには、残基３０および残基３２を突然変異させて１つのグリコシル化部位を作製し、残基８７、残基８８および残基９０を突然変異させて第２グリコシル化部位を作製した。これら２つの追加のグリコシル化部位を備えるダルベポエチンは、通常のエリスロポエチンの３倍の半減期を有していた。さらにその安全性はＥＰＯと区別できなかった。この分子は５つのアミノ酸変化を有するが、２００４年現在においてダルベポエチンに対する抗体開発の事例は確認されていない（Ｓｍａｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．「Ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｕｒｅ  ｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ａｐｌａｓｉａ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．（２００４）１０：２３７−２５０；Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．「Ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ」．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．（２００５）９４：１６２６−１６３５）。ネオグリコシル化部位を付加することもまた、レプチンおよびＭｐｌリガンドの半減期を延長させた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、追加のグリコシル化部位を有する第ＩＸ因子（ＦＩＸ）変異体の産生に関する。組換え第ＩＸ因子変異体は、より大きな回収可能価値および／または増加した半減期を有するので、第ＩＸ因子をより低用量および／またはより低頻度の投与で被験者に投与することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、野生型第ＩＸ因子と比較して１つまたは２つ以上の追加のグリコシル化部位を含む、単離された第ＩＸ因子（ＦＩＸ）タンパク質変異体を提供する。１つ以上の追加のグリコシル化部位は、任意の組み合わせで、追加のアミノ酸の挿入、アミノ酸の欠失、アミノ酸の置換および／またはアミノ酸の再配列によって導入することができる。１つ以上の追加のグリコシル化部位は、特定部位突然変異誘発および／またはＦＩＸ変異体の化学合成によって導入することもできる。
【０００７】
一部の実施形態では、追加のグリコシル化部位の少なくとも１つは、活性化ペプチド内にある。ＦＩＸ変異体は、配列番号３３のヒトＦＩＸアミノ酸配列の第Ｎ１５７およびＮ１６７位間に挿入されたペプチドセグメントを含むことができ、前記ペプチドセグメントは約３〜約１００アミノ酸残基を含むことができる。ペプチドセグメントは、マウス第ＩＸ因子活性化ペプチドの少なくとも一部を含むことができ（例えば、図１、第４行）、マウス活性化ペプチドはグリコシル化部位の数を増加させるために修飾することができる（例えば、図１、第２および３行）。本発明のＦＩＸタンパク質変異体は、ヒトＦＩＸタンパク質であってよい。
【０００８】
本発明のＦＩＸ変異体の１つまたは２つ以上の追加のグリコシル化部位は、Ｎ結合グリコシル化部位、Ｏ結合グリコシル化部位、ならびにＮ結合グリコシル化部位およびＯ結合グリコシル化部位の組み合わせであってよい。
【０００９】
一部の実施形態では、グリコシル化部位は、Ｘはプロリンではないことを前提に、コンセンサス配列ＮＸＴ／Ｓを含むＮ結合グリコシル化部位を含むことができる。他の実施形態では、グリコシル化部位は、
【化１】
0005613876.tif 000002
およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるコンセンサス配列を含むＯ結合グリコシル化部位を含んでいる。さらに、本発明のＦＩＸ変異体は、約１〜約５つの追加のグリコシル化部位を含んでいてよい。
【００１０】
本発明は、本発明のＦＩＸ変異体をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、本発明のベクターを含む形質転換細胞および本発明のＦＩＸ変異体を含むトランスジェニック動物をさらに提供する。
【００１１】
一部の実施形態では、本発明のＦＩＸ変異体の少なくとも１つの追加のグリコシル化部位は、活性化ペプチドの外側にあってよい。
【００１２】
さらに、本発明のＦＩＸ変異体の少なくとも１つの追加のグリコシル化部位は、ＦＩＸの非ヒトホモログの天然型内のグリコシル化されている部位に対応することができ、その非ヒトホモログは、例えば、イヌ、ブタ、ウシまたはマウスであってよい。
【００１３】
さらに本明細書では、第ＩＸ因子タンパク質におけるグリコシル化部位の数を増加させる方法であって、第１のＦＩＸアミノ酸配列および第２のＦＩＸアミノ酸配列を整列させる工程と、ｂ）前記第２のＦＩＸアミノ酸配列内には存在しない前記第１のＦＩＸアミノ酸配列内のグリコシル化部位を同定する工程と、ｃ）工程（ｂ）の前記第１アミノ酸配列内で同定されたグリコシル化部位に対応するグリコシル化部位を導入するために前記第２のＦＩＸアミノ酸配列を修飾する工程とを含み、このとき前記第２のＦＩＸアミノ酸配列を修飾する工程は前記ＦＩＸタンパク質内のグリコシル化部位の数を増加させる方法が提供される。
【００１４】
本発明の方法では、第１のＦＩＸアミノ酸配列は非ヒト種由来であってよく、第２のＦＩＸアミノ酸配列はヒトＦＩＸであってよい。これらの方法のまた別の実施形態では、第１のＦＩＸアミノ酸配列内のグリコシル化部位は、活性化ペプチド内または活性化ペプチドの外側にあってよい。これらの方法は、さらにまた活性化ペプチド内および活性化ペプチドの外側の両方の１つ以上のグリコシル化部位の添加を含んでいる。
【００１５】
本発明は、野生型ＦＩＸと比較して１つ以上の追加の糖鎖を含む単離されたＦＩＸ変異体をさらに提供する。一部の実施形態では、１つ以上の追加の糖鎖は、化学的および／または酵素的方法によってＦＩＸタンパク質に付加される。
【００１６】
本発明のまた別の態様、特徴および利点は、以下に記載する図面から明白になる。
【００１７】
以下では、本発明を例示するためであって限定するためではない以下の図面を参照しながら、本発明のこれらやその他の特徴について記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ヒト第ＩＸ因子変異体を示す図である。第１行はヒト第ＩＸ因子（配列番号５）を示し、第２行はマウスＡＰセグメントの修飾を伴わないマウス活性ペプチド（ＡＰ）セグメントを備えるヒトＦＩＸ（配列番号２）を示し、第３行は付加された１つのグリコシル化部位を備えるマウスＡＰを備えるヒトＦＩＸ（配列番号３）を示し、第４行はマウスＡＰおよび付加された２つのグリコシル化部位を備えるヒトＦＩＸ（配列番号４）を示し、小さな矢印は、成熟ＦＩＸの第１アミノ酸（配列番号３３）を示している。２つの大きな矢印は、活性化ペプチド切断部位を示している。黒い星は、ヒトＦＩＸタンパク質内の２つの既存グリコシル化部位を示している。灰色の星は、提案された追加のグリコシル化部位を示している。
【図２】ヒト第ＩＸ因子のアミノ酸配列（配列番号５）と、イヌ（配列番号１６）、ブタ（配列番号１７）、ウシ（配列番号１８）、およびマウス（配列番号１９）（各々、第２行、第３行、第４行および第５行）由来の相同アミノ酸配列との整列を示す図である。２つの矢印は、活性化ペプチド切断部位を示している。星印は、図示した５つの種の少なくとも１つにおける既存グリコシル化部位を示している。
【図３】数種の哺乳動物種（ウシ（配列番号２０）、ヒツジ（配列番号２１）、ウマ（配列番号２２）、イヌ（配列番号２３）、ネコ（配列番号２４）、ラット（配列番号２５）、マウス（配列番号２６）、ヒト（配列番号２７）、ブタ（配列番号２８）、ウサギ（配列番号２９および３０）、ならびにモルモット（配列番号３１）の活性化ペプチドの整列を示す図である。高可変領域は、白色文字を備える黒色背景として表示されている。図示したコンセンサス配列は、配列番号３２に対応する。
【図４】野生型組換えヒト第ＩＸ因子と比較して１つの追加のグリコシル化部位を含有するヒトＦＩＸ変異体の半減期のボックスプロットを示している。このＦＩＸ変異体の半減期は、約１．５時間まで増加される。ボックスプロット結果の各々は８匹のマウスについての半減期の決定を表している。各ボックスプロットについてのメジアンは、水平の実線によって表され、各セットのマウスの両極値は、グラフ上のエラーバーによって示されている。
【図５】ウシ、イヌ、ヒト、マウス、カモノハシおよびフクロネズミについての完全ＦＩＸアミノ酸配列の整列を示す図である。
【図６】本発明のＦＩＸ変異体の追加の１６８例を示す図であり、Ｏ結合グリコシル化部位付着配列は、活性化ペプチドの外側の領域内に挿入されている。  本発明のまた別の態様、特徴および利点は、以下に記載する実施形態についての詳細な説明から明白になる。
【発明の詳細な説明】
【００１９】
他に規定しない限り、本明細書で使用する技術および科学用語はすべて、本発明が属する当分野の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有している。本発明の説明において使用する用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的とし、本発明を限定することは意図していない。
【００２０】
［用語の定義］
本明細書で使用する「１つの（ａ、ａｎ）」または「その（ｔｈｅ）」は、１つまたは２つ以上を意味することができる。例えば、「１つの（ａ）」細胞は、単一細胞または複数の細胞を意味することができる。
【００２１】
さらにまた本明細書で使用する「および／または」は、１つ以上の関連する列挙した項目の任意および全ての可能性のある組み合わせ、ならびに選択的に解釈される（「または（ｏｒ）」）場合は組み合わせの欠如を指し、およびこれを包含している。
【００２２】
本明細書で使用する用語「約」は、例えば量（例えば、メチル化の量）などの測定可能な数値に関する場合は、特定された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらに±０．１％の変動を含むことが意図されている。
【００２３】
本明細書で使用する移行句「〜から本質的になる」は、請求項の範囲がその請求項において言及される特定の材料または工程、および請求された発明の「基本的および新規な特性へ実質的に影響を及ぼさないもの」を含むと解釈すべきであることを意味する。Ｉｎ  ｒｅ  Ｈｅｒｚ，５３７  Ｆ．２ｄ  ５４９，５５１−５２，１９０  Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｑ．４６１，４６３（ＣＣＰＡ  １９７６）（原文における強調）を参照されたい；さらに、ＭＰＥＰ  §２１１１．０３を参照されたい。そこで、本発明の請求項において使用される場合の用語「〜から本質的になる」は、「〜を含む」と同等と解釈すべきであるとは意図されていない。
【００２４】
用語「薬物動態的特性」は、その通常の慣習的意味を有し、第ＩＸ因子タンパク質の吸収、分布、代謝および排出に関する。
【００２５】
「バイオアベイラビリティ（生体内利用率）」の通常の慣習的意味は、全身性循環に到達する生物学的に活性な薬物の投与された用量の分画もしくは量である。本発明の実施形態の状況では、用語「バイオアベイラビリティ」は、通常の慣習的意味を含んでいるが、さらに、第ＩＸ因子タンパク質が生物活性である程度を含むためにより幅広い意味を有すると考えられている。第ＩＸ因子の場合には、例えば、「バイオアベイラビリティ」の１つの測定は、注入後の循環内で得られた第ＩＸ因子タンパク質の凝血促進活性である。
【００２６】
「翻訳後修飾」は、その通常の慣習的意味を有し、リーダー配列の除去、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、アスパラギン酸残基のβ−ヒドロキシル化、アスパラギン残基のＮ結合グリコシル化、セリンおよび／またはトレオニン残基のＯ結合グリコシル化、チロシン残基の硫酸化、セリン残基のリン酸化およびそれらの任意の組み合わせを含むがそれらに限定されない。
【００２７】
本明細書で使用する「生物学的活性」は、ヒト血漿に由来する標準物質に関連して決定される。第ＩＸ因子については、標準物質は、ＭＯＮＯＮＩＮＥ（登録商標）（ＺＬＢ  Ｂｅｈｒｉｎｇ社）である。標準物質の生物学的活性は１００％であると見なされる。
【００２８】
用語「プロセッシング因子」は、機能的第ＩＸ因子の形成を促進する任意のタンパク質、ペプチド、非ペプチド補因子、基質および／または核酸を含む広義語である。そのようなプロセッシング因子の例には、対合塩基性アミノ酸転換（もしくは切断）酵素（ＰＡＣＥ）、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）、およびビタミンＫ依存性γ−グルタミルカルボキシラーゼ（ＶＫＧＣ）が含まれるがそれらに限定されない。
【００２９】
本明細書で使用する用語「第ＩＸ因子タンパク質」は、野生型第ＩＸ因子タンパク質ならびに天然型またはＧｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（「Ｔｈｅ  Ｍａｌｍｏ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ，ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｄｉｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｒｅｓｉｄｕｅ  １４８  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｉｎ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ｔｗｏ  ｏｔｈｅｒ  ＦＩＸ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ」Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４２：５７３−５８０（１９８８））に記載されたような合成変異体（例えば、１４８位でのヒトＦＩＸの活性化ペプチド内でのＴ／Ａ二形性（ナンバリングは１４８位でＴを示す、配列番号３３の成熟ヒトＦＩＸアミノ酸配列に基づく））を含んでいる。そこで、本発明のＦＩＸタンパク質は、配列番号３３のアミノ酸配列を有する成熟ヒトＦＩＸタンパク質を含んで、１４８位でのアミノ酸はＴまたはＡであってよく、被験者はこの部位でＴまたはＡのいずれかに対してヘテロ接合性またはホモ接合性のいずれかであってよい。本発明のＦＩＸタンパク質は、文献（例えば、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ３３８  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ｆｒｏｍ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｔｏ  ａｌａｎｉｎｅ  ｃａｕｓｅｓ  ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１２０８９−９４（１９９８）；Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ」ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９３：１１０６８−７３（１９９６）；Ｈｏｒｓｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅ  ３６１（４５８ｐａｇｅｓ）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１（それらの各々の全内容は参照して本明細書に組み込まれる）を参照されたい）において公知であるようなＦＩＸの突然変異型をさらに含むことができる。本発明のＦＩＸタンパク質は、当分野において公知であるように、任意の他の天然型ヒトＦＩＸ変異体または現在公知である、もしくは今後同定される合成ヒトＦＩＸ変異体、それらの誘導体および活性フラグメント／活性ドメインをさらに含んでいる。本発明の第ＩＸ因子タンパク質は、機能的ＦＩＸ凝固因子として折り畳まれたＦＩＸ（軽鎖および重鎖）のための２つの非隣接ポリペプチド鎖を生じさせる、プロテアーゼの作用によって（または核酸レベルで除去することによってタンパク質からそれを遺伝子工学によって取り除くことによって）タンパク質から活性化ペプチドが切断されている分子であるＦＩＸの薬理学的活性形をさらに含んでいる。詳細には、グリコシル化度を増加させるための修飾（例えば、Ｎ結合および／またはＯ結合グリコシル化）を有する第ＩＸ因子変異体は、詳細には広義語に含まれている。
【００３０】
用語「半減期」は、通常の慣習的意味ならびに第ＩＸ因子についての科学文献において見いだされる通常の慣習的意味を含む広義語である。詳細には、この定義には、注入時に測定された初期値から初期値の半分までへの減少についての注入後時間を規定する第ＩＸ因子と関連するパラメータの測定値が含まれる。一部の実施形態では、ＦＩＸの半減期は、当分野において周知であるように、そして本明細書で記載するように、様々なイムノアッセイにおいて第ＩＸ因子に対する抗体を使用して血中および／または血液成分中において測定することができる。または、半減期は、当分野において周知であるように、そして本明細書で記載するように、標準的な凝固アッセイを含む機能的アッセイを使用して第ＩＸ因子活性における減少として測定することができる。
【００３１】
本明細書で使用する用語「回収」は、ＦＩＸの注入、注射、またはさもなければ送達もしくは投与後のＦＩＸのレベルを測定する目的で、生物学的サンプル（例えば、血液もしくは血液製剤サンプル）を回収する最も早い実際的時間にレシピエント動物もしくはヒト被験者の循環中で検出された、ＦＩＸ抗原レベルまたはＦＩＸプロテアーゼもしくは凝血活性レベルを含むがそれらに限定されない任意の許容できる方法によって測定されるＦＩＸの量を含んでいる。最新の方法を用いると、ＦＩＸ回収を測定するための初期の生物学的サンプリング時間は、典型的にはＦＩＸの注入、注射、またはさもなければ送達／投与後の初期１５分間以内に含まれるが、科学および／または臨床技術が向上するにつれてより迅速なサンプリング時間を予想することは合理的である。本質的に、ＦＩＸについての回収値は、レシピエント動物もしくは患者への注入、注射、またはさもなければ送達後のできる限り早い時点にレシピエントの循環中で測定できる、注入、注射またはさもなければ送達もしくは投与されたＦＩＸの最大画分を表すことがここでは意図されている。
【００３２】
用語「グリコシル化部位」は、その通常の慣習的意味を有する広義の用語である。本出願の状況においては、この用語は潜在的に炭水化物成分を受け入れる両方の部位、ならびにその上では炭水化物成分が実際に付着し、オリゴ糖および／または炭水化物のための受容体として機能できる任意のアミノ酸配列を含んでいるタンパク質、詳細にはＦＩＸ内の部位に適用される。
【００３３】
用語「単離（された）」は、細胞物質、ウイルス物質、および／または培養培地（組換えＤＮＡ技術によって生成された場合）、または化学的前駆体もしくはその他の化学薬品（化学的に合成した場合）を実質的に含んでいない核酸またはポリペプチドを意味することができる。さらに、「単離フラグメント」は、フラグメントとして自然には発生しない、そして天然状態では見いだされない核酸またはポリペプチドのフラグメントである。
【００３４】
「単離された細胞」は、通常はその天然状態で結合している他の細胞および／または組織成分から分離されている細胞である。例えば、単離された細胞は、細胞培養の一部である細胞である。単離された細胞は、さらにまた、例えば、治療作用またはさもなければ有益な作用を付与するために、被験者に投与される、または導入される細胞であってよい。
【００３５】
本発明の一部の実施形態は、１つ以上の追加のグリコシル化部位を有する第ＩＸ因子変異体に関する。「追加の」または「新規な」グリコシル化部位は、ＦＩＸ変異体内のグリコシル化部位の数が第ＩＸ因子の「野生型」形内に通常存在するグリコシル化部位の数より多いことを意味する。本発明の第ＩＸ因子タンパク質は、血漿由来ＦＩＸならびにＦＩＸの組換え形を含むことができる。一般に、本発明の実施形態は、本発明のＦＩＸ分子内のグリコシル化部位の数を増加させることに関する。しかし、グリコシル化部位の数を増加させるため、および／または糖鎖の数を増加させるために修飾できる本発明の第ＩＸ因子タンパク質は、特定の「野生型」ＦＩＸアミノ酸配列に限定されないが、その理由は天然型もしくは合成ＦＩＸ変異体は、グリコシル化部位の数を増加させるため、および／または糖鎖の数を増加させるために本発明の方法によって修飾することもできるからであることを理解されたい。
【００３６】
本発明は、追加の糖鎖を含有するＦＩＸ変異体にさらに関する。そのような追加の糖側鎖は、本明細書に記載された方法によって本発明のＦＩＸ変異体内に導入された追加のグリコシル化部位の１つ以上に存在することができる。または、追加の糖側鎖は、当分野において周知であるように、ＦＩＸ分子にそのような糖鎖を導入するために化学的および／または酵素的方法の結果としてＦＩＸタンパク質上の部位に存在することができる。「追加の」または「新規な」糖鎖は、ＦＩＸ変異体内の糖鎖の数が第ＩＸ因子の「野生型」形内に通常存在する糖鎖の数より多いことを意味する。様々な実施形態では、約１〜約５００の追加の糖側鎖（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０）を付加することができる。
【００３７】
一部の実施形態では、少なくとも１つの追加のグリコシル化部位は、第ＩＸ因子の活性化ペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＦＩＸ活性化ペプチド）内にある。特定の実施形態では、ＦＩＸ変異体は、配列番号３３のヒト第ＩＸ因子アミノ酸配列のＮ１５７位とＮ１６７位との間に１つ以上のグリコシル化部位を導入するペプチドセグメントの挿入を有する。
【００３８】
挿入は、グリコシル化部位の数を増加させるために本発明のＦＩＸ変異体内へ導入することができ、そのような挿入は１〜１００の任意の数のアミノ酸残基（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９および１００）を含む、約１〜約１００アミノ酸残基を含むことができる。
【００３９】
特定の実施形態では、挿入は、例えばマウス（例えば、図１の第４行および配列番号２に示したように）などの非ヒト種由来の第ＩＸ因子活性化ペプチドの全部または少なくとも一部（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のアミノ酸残基）を含んでいる。他の実施形態では、ヒトＦＩＸ配列は、グリコシル化部位の数を増加させるために修飾されている非ヒト（例えば、マウス）ＦＩＸ活性化ペプチドを含めるように修飾される（例えば、図１の第２および３行ならびに配列番号３および４に示したように）。また別の実施形態では、ヒトＦＩＸアミノ酸配列は、カモノハシを含む任意の非ヒトＦＩＸタンパク質の活性化ペプチドのアミノ酸セグメントの挿入によって修飾することができる（図５）。配列番号３０５は、例えばマウス活性化ペプチド由来の挿入されたペプチドセグメントのための図１に示したようにアミノ酸残基１６６と１６７との間に、または活性化ペプチド内の任意の他の部位で、ヒトＦＩＸの活性化ペプチド内に導入することができる１４アミノ酸セグメントを提供する。配列番号３０６は、アミノ酸残基１６６と１６７との間に挿入されたカモノハシの１４アミノ酸配列を備える成熟ヒトＦＩＸ変異体を提供する。この挿入されたペプチド配列は、本明細書の教示による追加のグリコシル化部位を導入するためにさらに修飾することができる。図５に提供されたカモノハシＦＩＸについてのアミノ酸配列は、タンパク質の活性および／または機能が悪影響を受けることはないという期待を抱いて、少なくとも１４アミノ酸をＦＩＸタンパク質の活性化ペプチド内に挿入できることをさらに示している。
【００４０】
グリコシル化部位は、Ｎ結合グリコシル化部位、Ｏ結合グリコシル化部位および／またはＮ結合グリコシル化部位とＯ結合グリコシル化部位との組み合わせから選択することができる。一部の実施形態では、付加されたグリコシル化部位はＮ結合グリコシル化部位を含んで、Ｘがプロリンではないことを前提に、コンセンサス配列はＮＸＴ／Ｓである。
【００４１】
一部の実施形態では、約１〜約５のグリコシル化部位は、ＦＩＸアミノ酸配列に付加することができる。様々な実施形態では、約１〜約５０のグリコシル化部位（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０）を付加することができる。本発明の実施形態は、Ｎ結合またはＯ結合グリコシル化部位のいずれかが、特定アミノ酸の挿入、欠失または置換によって作製されているＦＩＸ変異体を含んでいる。特定の実施形態では、挿入、欠失および／または置換は、図１において矢印によって示された活性化ペプチドの領域内にある。ヒトＦＩＸ活性化ペプチドのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号１として提供されている。
【００４２】
一部の実施形態では、付加されたグリコシル化部位は、Ｏ結合グリコシル化部位を含んで、コンセンサス配列は、
【化２】
0005613876.tif 000003
であってよいが、それらに限定されない。
【００４３】
ＦＩＸアミノ酸配列内に導入された追加のグリコシル化部位は、ＦＩＸタンパク質のアミノ酸配列全体のいずれかの場所に導入できることが想定されている。そこで、一部の実施形態では、追加のグリコシル化部位は、活性化ペプチド内（図１において矢印によって示され、配列番号３３の成熟ヒトＦＩＸアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜１８０）、活性化ペプチドの外側（例えば、活性化ペプチドの前および／または後）または活性化ペプチド内および活性化ペプチドの外側の両方に導入される。そこで、配列番号３３に示した成熟ヒトＦＩＸタンパク質のアミノ酸配列の４１５アミノ酸のナンバリングに基づくと、グリコシル化付着部位は、アミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２，１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０，１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５，１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５のいずれか、およびこれらの任意の組み合わせの間に追加のアミノ酸残基を挿入することによって導入することができる。本明細書で使用する「グリコシル化付着部位」または「グリコシル化部位」は、アミノ酸配列に、糖付着コンセンサス配列（すなわち、糖（単糖、オリゴ糖、または多糖）を付着させるためのコンセンサス配列として機能する一連のアミノ酸）を意味することができる、またはそれに糖成分が共有結合している実際のアミノ酸残基を意味することができる。糖成分は、単糖（単糖分子）、オリゴ糖、または多糖であってよい。
【００４４】
特定の実施形態では、追加のアミノ酸は、例えばアミノ酸１４５，１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２のいずれかおよびそれらの任意の組み合わせ間などの活性化ペプチドを作り上げるアミノ酸残基のいずれかの間に挿入できる、および／またはそれらと置換することができる。さらに、本発明の同一のインサートは、活性化ペプチド内を含む、ＦＩＸタンパク質のアミノ酸配列内の同一および／または相違する場所に複数回導入することができる。さらに、相違するインサートおよび／または同一のインサートは、活性化ペプチド内を含む、ＦＩＸタンパク質のアミノ酸配列全体のアミノ酸残基間の同一および／または相違する場所に１回以上導入することができる。
【００４５】
当分野では、一部のタンパク質は極めて多数の糖側鎖を支持することができ、Ｏ結合グリコシル化部位間の間隔は１つおきというわずかなアミノ酸であってよいことが周知である（例えば、Ｋｏｌｓｅｔ  ＆  Ｔｖｅｉｔ  「Ｓｅｒｇｌｙｃｉｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６５：１０７３−１０８５（２００８）およびＫｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｇｇｒｅｃａｎ」Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：１９−３２（２００２）を参照されたい）。Ｎ結合グリコシル化部位については、部位間の間隔は、３、４、５もしくは６アミノ酸というわずかな数であってよい（例えば、それらの各々の全内容が引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Ｌｕｎｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．「Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＯＲ８３ｂ  ｏｄｏｒａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ」ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８１：５６０１−５６０４（２００７）；Ａｐｗｅｉｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．「Ｏｎ  ｔｈｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ，ａｓ  ｄｅｄｕｃｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ  ｄａｔａｂａｓｅ」Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４７３：４−８（１９９９１）を参照されたい）。
【００４６】
さらに、本発明のＦＩＸタンパク質は、Ｎ結合グリコシル化部位、Ｏ結合グリコシル化部位、またはＮ結合およびＯ結合グリコシル化部位の両方を導入するために突然変異（例えば、アミノ酸の置換、付加および／または欠失）によって修飾することができる。例えば、機能的ＦＩＸタンパク質の表面上のアミノ酸残基は、１つ以上のグリコシル化部位を導入するための修飾（例えば、突然変異）のために適切である、当分野において標準である分子モデリング法によって同定することができる。このアプローチの１つの特定の例は、成熟ヒトＦＩＸタンパク質内の各アミノ酸の相対表面露出度（ｓｕｒｆａｃｅ  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）を決定するために使用される分子モデリング計算の結果を示す、表２に提供されている。溶媒露出度（ｓｏｌｖｅｎｔ  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）の計算は、このＦＩＸタンパク質の実際の三次元構造の結晶構造決定に基づいている。第１列はアミノ酸名を列挙し、第２列はその対応するアミノ酸についての配列位置を列挙し、「合計」と題する列は各アミノ酸について相対単位で計算溶媒露出度値を示している。合計列内のより高い数値は、特定アミノ酸が溶媒にはるかに多く露出されていると計算されることを意味している（すなわち、折り畳みタンパク質の表面上）。本発明のために、６０以上のカットオフ値は、グリコシル化部位の数を増加させるために、本発明の方法によって修飾できるＦＩＸ分子の表面上のアミノ酸残基を同定するために任意に選択された。
【００４７】
例えば、一部の実施形態では、６０以上の合計値を有する３つの連続アミノ酸残基は、追加のグリコシル化部位を導入するための修飾のために検討することができ、そのような領域は表２の合計列内で陰影が付けられている（活性化ペプチドを作り上げるアミノ酸残基は、表２においても陰影が付けられている）。しかし、６０は、一例として使用される任意のカットオフであり、追加のグリコシル化部位を組み込むために修飾するためのアミノ酸候補を選択するために、任意の他のカットオフ値を選択することができる。さらに、このアプローチは、ＦＩＸタンパク質内のアミノ酸残基を修飾のためにいかに選択するかの単に一例であって、そこで、追加のグリコシル化部位を成熟ヒトＦＩＸタンパク質内に組み込むために修飾できるアミノ酸残基は、表２の合計列内で任意の特定の数値を有するアミノ酸残基に限定されない。当分野において周知の方法による、そして本明細書で教示するように成熟ＦＩＸアミノ酸配列内の任意のアミノ酸残基を修飾すること、そして周知の方法および本明細書に記載した方法によって活性、安定性、回収、半減期などについて、結果として生じる任意のＦＩＸ変異体を試験することは、本発明の範囲内、および当業者の技術の範囲内に含まれる（例えば、引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｏｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１６８５４−６２（２００４）を参照されたい）。
【００４８】
本発明の実施形態は、第ＩＸ因子の回収率および／または半減期および／または安定性を向上させるためにグリコシル化部位が付加されている、組換え第ＩＸ因子変異体に向けられる。グリコシル化部位は、Ｎ結合および／またはＯ結合グリコシル化部位であってよい。特定の実施形態では、少なくとも１つのＮ結合グリコシル化部位が付加される。活性化ペプチド内に１つ以上の追加のＮ結合グリコシル化部位を備えるヒトＦＩＸ変異体の多数の例は、本明細書では配列番号３４〜９１として提供されている。
【００４９】
活性化ペプチド内に１つ以上の追加のＯ結合グリコシル化部位を備えるヒトＦＩＸ変異体の多数の他の例は、本明細書では配列番号９２〜１３２として提供されている。さらに、活性化ペプチド内で１つ以上の追加のＮ結合グリコシル化部位および１つ以上のＯ結合グリコシル化部位を備えるヒトＦＩＸ変異体の多数の例は、本明細書では、配列番号３４〜９１に示したＮ結合グリコシル化部位を導入するために作製された修飾を配列番号９２〜１３２に示したＯ結合グリコシル化部位を導入するために作製された修飾と、任意の組み合わせおよび任意の順序で結合する工程によって提供される。そのような組み合わせは、一層より多くのグリコシル化部位を導入する活性化ペプチド内および／または活性化ペプチドの外側の任意の追加の修飾をさらに含むことができる。本明細書で配列番号３４〜１３２に規定したアミノ酸配列について記載されたそのような結合修飾は、当業者によって容易に同定可能であり、そのような組み合わせ全部を規定している各々の個別アミノ酸配列が本明細書に明示的に提供されているかのように同程度まで本発明の実施形態に含まれる。
【００５０】
本明細書で言及するように、一部の実施形態では、少なくとも１つの追加のグリコシル化部位は、活性化ペプチドの外側にある部位でＦＩＸアミノ酸配列内に導入される。好ましくは、少なくとも１つの追加のグリコシル化部位は、例えば図２に示したように、第ＩＸ因子の非ヒトホモログの天然型内でグリコシル化されている部位に対応し、このときグリコシル化部位は図に示したすべての非ヒト種におけるアミノ酸２６０〜２６２で同定されるが、ヒトＦＩＸタンパク質内に自然には存在しない。ヒトＦＩＸの成熟（すなわち、分泌）形である配列番号３３のアミノ酸配列のアミノ酸２６２でセリンもしくはトレオニンを導入するためのヒトＦＩＸアミノ酸配列の修飾は、ヒトタンパク質内に追加のＮ結合グリコシル化部位を導入する。好ましくは、非ヒトホモログは、イヌ、ブタ、ウシ、またはマウス由来である。
【００５１】
活性化ペプチドの外側に１つ以上の追加のＮ結合グリコシル化部位を備えるヒトＦＩＸ変異体、または追加のＮ結合およびＯ結合グリコシル化部位の組み合わせを備えるヒトＦＩＸ変異体の多数の例は、本明細書では配列番号１３５〜３０４として提供されている。活性化ペプチドの外側に１つ以上の追加のＯ結合グリコシル化部位を備えるヒトＦＩＸ変異体の多数の他の例は、本明細書では図６に提供されている。図６および配列表に示した修飾は、本明細書に提供された他の例のいずれかに示した修飾と結合できること、そして図６および配列表に示した修飾は図示した特定のＮ結合またはＯ結合グリコシル化部位コンセンサス配列には限定されないことは、容易に理解される。本発明のＮ結合および／またはＯ結合グリコシル化部位コンセンサス配列のいずれか、ならびに当分野において公知の任意のその他の配列は、本発明の実施形態に含まれ、本発明のＦＩＸ内に個別に、他のＯ結合グリコシル化部位コンセンサス配列および／または任意のＮ結合グリコシル化部位コンセンサス配列との任意の組み合わせで、ＦＩＸタンパク質上のグリコシル化部位の数を増加させるために導入することができる。
【００５２】
本発明の追加の実施形態は、第ＩＸ因子タンパク質におけるグリコシル化部位の数を増加させる方法であって、ａ）第１および第２の第ＩＸ因子アミノ酸配列を整列させる工程と、ｂ）前記第２のＦＩＸアミノ酸配列内には存在しない前記第１のＦＩＸアミノ酸配列内で１つ以上のグリコシル化部位を同定する工程と、ｃ）工程（ｂ）の前記第１アミノ酸配列内で同定された１つ以上のグリコシル化部位に対応する前記第２のＦＩＸアミノ酸配列内に１つ以上の新規または追加のグリコシル化部位を導入するために、前記第２のＦＩＸアミノ酸配列を変化させる工程と、のうちの１つ以上を含む方法に関する。特定の実施形態では、第１アミノ酸配列は非ヒト種由来の第ＩＸ因子であり、第２アミノ酸配列はヒト第ＩＸ因子である。所定の実施形態では、１つ以上の新規または追加のグリコシル化部位は、第２のＦＩＸアミノ酸配列の活性化ペプチド内に導入される。他の実施形態では、１つ以上の新規または追加のグリコシル化部位は、第２のＦＩＸアミノ酸配列の活性化ペプチドの外側で導入され、また別の実施形態では、１つ以上の新規または追加のグリコシル化部位は、任意の組み合わせおよび任意の場所で、第２のＦＩＸアミノ酸配列の活性化ペプチド内および第２のＦＩＸアミノ酸配列の活性化ペプチドの外側の両方で導入される。本発明の方法では、新規または追加のグリコシル化部位は、任意の組み合わせでＮ結合および／またはＯ結合グリコシル化部位であってよい。
【００５３】
本発明の方法は、第１のＦＩＸアミノ酸配列（例えば、１、２、３、４、５または６アミノ酸内）内にグリコシル化部位を含有する対応する領域の近傍内の第２のＦＩＸアミノ酸配列を修飾する工程と、ならびに第１のＦＩＸアミノ酸配列内の対応する領域内の位置と同一の正確なアミノ酸位置で第２のＦＩＸアミノ酸配列を修飾する工程とを含んでいる。
【００５４】
さらに本明細書では、本発明のＦＩＸアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、それらから本質的になる、および／またはそれらからなる核酸が提供される。そのような核酸は、例えば発現カセットなどのベクター内に存在している可能性がある。そこで、本発明のまた別の実施形態は、本発明の第ＩＸ因子変異体のいずれかをコードするヌクレオチド配列を発現させるために設計された発現カセットに関する。本発明の核酸および／またはベクターは、細胞内に存在していてよい。そこで、本発明の様々な実施形態は、ベクター（例えば、発現カセット）を含有する組換え宿主細胞に関する。そのような細胞は、単離できる、および／またはトランスジェニック動物内に存在している可能性がある。このため、本発明の所定の実施形態は、本発明の第ＩＸ因子変異体のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むトランスジェニック動物にさらに関する。
【００５５】
ヒト、マウス、モルモットおよびカモノハシのＦＩＸの活性化ペプチドのアミノ酸配列の比較は、マウスＦＩＸアミノ酸配列がその活性化ペプチド内に存在する追加の９アミノ酸を有し、モルモットＦＩＸアミノ酸配列はその活性化ペプチド内に存在する追加の１０アミノ酸残基を有し、そしてカモノハシはその活性化ペプチド内に存在する追加の１４アミノ酸残基を有することを明らかにしている（図５）。これらの追加のアミノ酸は、ヒト第ＩＸ因子内の２つの天然型グリコシル化部位（Ｎ１５７およびＮ１６７）間にある。
【００５６】
ヒトおよびマウスＦＩＸは、本質的に同一の構造を有し、ヒト酵素はマウス内で機能できる。ヒトＦＩＸはマウス内で見いだされる追加の９つのアミノ酸セグメントを伴わずに機能するので、第ＩＸ因子分子のこの領域は、その配列内で分子の構造的、生化学的、またはさもなければ機能的完全性における実質的消失を伴わずに挿入、置換および／または欠失を含む修飾を容認することができる。マウス内に挿入された９つのアミノ酸は、表面残基である可能性が極めて高く（構造的試験によって裏付けられている）、このためグリコシル化酵素による修飾のために利用することができる。天然ヒト第ＩＸ因子内では、２つのＮ結合グリコシル化部位は、活性化ペプチドのアミノおよびカルボキシル切断部位各々から離れた１２および１４アミノ酸である。そこで、本発明の一部の実施形態では、半減期および／またはバイオアベイラビリティを向上する目的でグリコシル化部位を付加するために、ヒト第ＩＸ因子タンパク質のＮ１５７およびＮ１６７間に追加のアミノ酸残基を付加することができる。様々な実施形態では、グリコシル化部位は、Ｏ結合グリコシル化のための付着配列および／またはＮ結合グリコシル化のためのコンセンサス配列を含むために、天然配列の挿入、欠失および／または修飾によって付加される。
【００５７】
活性化ペプチドのためのヒト配列は、成熟タンパク質の残基１４６で始まる。天然グリコシル化部位は、Ｎ１５７およびＮ１６７にある（配列番号３３）。一部の実施形態では、追加のアミノ酸残基は、追加のグリコシル化部位を提供するための２つの正常グリコシル化部位（ヒト配列内のＮ１５７およびＮ１６７間）間に挿入できる。一部の実施形態では、約３〜約１００の追加のアミノ酸残基が付加される。他の実施形態では、約５〜約５０のアミノ酸残基が付加される。また別の実施形態では、約５〜約２０のアミノ酸残基が付加される。さらにまた別の実施形態では、約７〜約１５のアミノ酸残基が付加される。典型的には、アミノ酸残基は、プロリンが、Ｎ結合グリコシル化のためのコンセンサス配列であるグリコシル化部位ＮＸＴ／Ｓにおいて「Ｘ」として使用されないことを前提に、２０個の生物学的アミノ酸から選択される。表１は、２０個の共通生物学的アミノ酸およびそれらの略語を示している。
【００５８】
Ｎグリコシル化部位および／またはＯグリコシル化部位を付加することができる。グリコシル化部位を付加するためのコンセンサス配列は、当分野において公知であり、Ｎグリコシル化のためのコンセンサス配列「ＮＸＴ／Ｓ」（式中、Ｘはプロリンではない）を含んでいる。Ｏグリコシル化部位はより多様であり、一般には付着のための「コンセンサス配列」を有していない。好ましい実施形態では、第ＩＸ因子のための追加のＯ結合グリコシル化部位は、例えば第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、タンパク質Ｃおよびタンパク質Ｓなどの他の凝固タンパク質において見いだされる、Ｏ結合グリコシル化のためのコンセンサス配列を含めるために、天然配列の挿入、欠失および／または修飾によって導入される。例えば、配列ＣＸＸＧＧＴ／Ｓ−Ｃ（配列番号９）は、数個の凝固因子およびＯ結合オリゴ糖を付加するためのコンセンサス配列としての止血タンパク質内で見いだされる（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｓｔｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃｏｘ，ｅｄ．，３３（３）：１５１−２０８（１９９８））。一部の実施形態では、グリコシル化部位は、
【化３】
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を含むがそれらに限定されない、Ｏ結合グリコシル化部位を含んでいる。
【００５９】
上記の配列内では、グリコシル化のための付着点には下線が引かれている。一部の実施形態では、ＦＩＸ変異体は、例えば以下の三量体、Ｇ−Ｔ／Ｓ−Ｃ、ＳＴ−Ｅ／Ｄ、ＩＴＱ、ＳＴＱ、ＦＴ−Ｒ／Ｋ、Ｅ／Ｄ−ＳＮおよびＧＳＣなどのいずれかの側に残基を備える、Ｏ結合グリコシル化のためのＳ／Ｔ残基の挿入によって調製される。その他の変形には、実際のグリコシル化部位のためのＳおよびＴの互換性が含まれる。Ｓは、Ｔと置換されてよく、ＴはＳと置換されてよい。本発明の実施形態は、Ｎ結合またはＯ結合グリコシル化いずれかのためのシグナルであると考えられる任意の配列の、挿入、欠失および／または置換による付加に関する。
【００６０】
一部の実施形態では、マウス、ヒトおよびその他の哺乳動物第ＩＸ因子配列由来の内因性Ｎ結合付着配列およびＯ結合付着配列が、活性化ペプチド内に挿入される。これらは、個別に、または組み合わせて挿入することができる。所定の実施形態では、挿入されるセグメントは、個別に、タンデムリピートで、複数で、そのほかで存在する可能性がある、グリコシル化部位間のスペーサー領域を含んでいる。本発明のスペーサー領域は、長さが１〜約１００アミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９および１００）であってよい。一部の実施形態では、例えば、スペーサー領域は、１〜約２０アミノ酸であってよい。他の実施形態では、スペーサー領域は、１〜約１０アミノ酸であってよい。また別の実施形態では、スペーサー領域は、１〜約５アミノ酸残基であってよい。
【００６１】
本発明のスペーサー領域は、立体障害を減少もしくは排除し、適切なグリコシルトランスフェラーゼによる効率的な認識を提供するために、付加された炭水化物付着部位間および／または天然型グリコシル化部位および付加されたグリコシル化部位間に含まれる。本発明のスペーサー領域は、アミノ酸残基の任意の組み合わせから構成されてよいが、アミノ酸残基がシステインもしくはプロリンではないことを前提に、そしてスペーサーのアミノ酸配列が疎水性である約１０％を超える残基（例えば、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンおよびバリン）を有していないことを前提に構成される。
【００６２】
一部の実施形態では、ＮＸＴ／Ｓは、１つ以上の追加のグリコシル化部位を付加するために挿入アミノ酸配列内に組み込まれる。「Ｘ」は、プロリンが好ましくないことを除いて、任意の生物学的アミノ酸であってよい。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加のグリコシル化部位が第ＩＸ因子変異体に付加される。他の実施形態では、２つの追加のグリコシル化部位が付加される。また別の実施形態では、３つの追加のグリコシル化部位が付加される。さらにまた別の実施形態では、４つの追加のグリコシル化部位が付加される。さらに別の実施形態では、５つの追加のグリコシル化部位が付加される。一部の実施形態では、６つの追加のグリコシル化部位が付加される。他の実施形態では、６つを超える追加のグリコシル化部位が付加される。
【００６３】
１つの実施形態では、成熟ヒトＦＩＸアミノ酸配列（配列番号３３）の１６１位でのＡｌａは、１つの追加のグリコシル化部位を提供するためにＡｓｎと置換される。また別の実施形態では、マウス活性化ペプチド由来のペプチドセグメントは、１つの追加のグリコシル化部位（図１、第３行、配列番号３）または２つの追加のグリコシル化部位（配列番号４、図１、第２行）を作製するために、マウス配列の修飾を備えてヒトＦＩＸ活性化ペプチド内に挿入される。また別の実施形態では、配列ＶＦＩＱＤＮＩＴＤ（配列番号６）は、ヒトＦＩＸ配列内にＮ結合グリコシル化部位を導入するために配列番号３３の成熟ヒトＦＩＸアミノ酸配列の残基１６１と１６２との間に挿入される。さらにまた別の実施形態では、また別の新規なグリコシル化部位は、ＶＦＩＱＤＮＩＴＤインサート内でＡｓｐをＡｓｎと置換する工程によって付加される。挿入された配列は、ＶＦＩＱＤＮＩＴＮ（配列番号７）を生じさせる。上記で考察した実施形態は、ヒト第ＩＸ因子タンパク質内で１〜４つの追加のグリコシル化部位を提供するために組み合わせることができる。
【００６４】
また別の実施形態では、５つの追加のグリコシル化部位を提供する以下の配列が付加される。グリコシル化部位は、ボールド体および下線付きで示されている。
【化４】
0005613876.tif 000005
【００６５】
一部の実施形態では、グリコシル化部位は、活性化ペプチドの外側の部位で付加される。これらの追加の部位は、例えば、ヒト由来の第ＩＸ因子のアミノ酸配列を他の種由来の第ＩＸ因子アミノ酸配列と整列させる工程と、非ヒト種におけるグリコシル化部位の位置を決定する工程とによって選択することができる。ヒトＦＩＸアミノ酸配列内の相同または同等位置は、次にグリコシル化部位を提供するために修飾される。本方法は、潜在的Ｎグリコシル化およびＯグリコシル化部位の両方を同定するために使用できる。
【００６６】
このアプローチの１つの例は、ヒトＦＩＸアミノ酸配列（配列番号１）がイヌ、ブタ、ウシおよびマウス各々由来のＦＩＸアミノ酸配列と整列させられている図２に提供されている。第５の星の位置では、ヒトを除く図示された全種においてグリコシル化部位が存在し、これはグリコシル化がこの位置では良好に忍容されることを示している。イヌ、ブタ、ウシおよびマウスＦＩＸアミノ酸配列は、この部位（ＮＸＴ／Ｓ）でのＮグリコシル化のためのコンセンサス配列を有し、ヒトＦＩＸアミノ酸配列は有していない。その代りに、ヒトＦＩＸアミノ酸配列はＮＡＡである。コンセンサス配列ＮＡＴ／Ｓを生成するためのアミノ酸２６２でのヒトＦＩＸアミノ酸配列の突然変異は、ヒトＦＩＸタンパク質内のこの位置で追加のグリコシル化部位を導入する。
【００６７】
本発明によるＦＩＸ変異体は、当分野において周知であり、本明細書で提供した実施例のセクションに記載された方法によって生成され、特性付けられる。これらの方法には、当分野において周知であるように、凝固時間の決定（部分トロンボプラスチン時間（ＰＰＴ）アッセイ）ならびに、適切なイムノアッセイおよび／または活性アッセイによって回収、半減期、およびバイオアベイラビリティを決定するための試験動物へのＦＩＸ変異体の投与が含まれる。
【００６８】
一部の実施形態では、組換え第ＩＸ因子タンパク質は、本明細書に記載した方法工程の１つ以上によって生成される。本明細書に記載した方法によって生成される組換え第ＩＸ因子タンパク質は、医薬組成物中に含めることができる。一部の実施形態は、本明細書に記載した方法によって生成された組換え第ＩＸ因子タンパク質を含むキットに関する。組換え第ＩＸ因子タンパク質は、それを必要とする被験者（例えば、ヒト患者）へ有効量の組換え第ＩＸ因子タンパク質を投与する工程によって出血性疾患を治療する方法において使用できる。
【００６９】
遺伝子組み換え細胞を作製するためには、多数の発現ベクターを使用できる。一部の発現ベクターは、選択された高発現性細胞に好ましい様々な条件下でトランスフェクト細胞の増幅後に大量の組換えタンパク質を発現するように設計される。一部の発現ベクターは、選択圧下で増幅の必要を伴わずに大量の組換えタンパク質を発現するように設計される。本発明は、当分野において標準であり、任意の特異的発現ベクターもしくは発現系の使用には依存しない方法による、遺伝子組換え細胞の産生を含んでいる。
【００７０】
大量の第ＩＸ因子タンパク質を生成するために遺伝子組換えされた細胞を作製するために、細胞は、前記タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクターを用いてトランスフェクトされる。一部の実施形態では、標的タンパク質は、標的タンパク質の適正な翻訳後修飾を所定の細胞系において発生させる、選択されたコトランスフェクト酵素を用いて発現させられる。
【００７１】
細胞は、様々な起源から選択することができるが、さもなければ核酸、好ましくは第ＩＸ因子タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクターを用いてトランスフェクトできる細胞であってよい。
【００７２】
本発明の実践は、他の場所で特に指示されない限り、当分野の技術の範囲内に含まれる分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来型技術を使用する。そのような技術は、文献の中で十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｓ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ  Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，ａｎｄ  Ｗｕ，ｅｄｓ．，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８７（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ  １９８６）を参照されたい。本明細書に言及したすべての特許、特許出願、および刊行物は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００７３】
［遺伝子工学技術］
遺伝子組換え技術によるクローン化遺伝子、組換えＤＮＡ、ベクター、形質転換宿主細胞、タンパク質およびタンパク質フラグメントの産生は、周知である。例えば、Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第４，７６１，３７１号明細書の第６段落第３行〜第９段落第６５行、Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第４，８７７，７２９号明細書の第４段落第３８行〜第７段落第６行、Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇへの米国特許第４，９１２，０３８号明細書の第３段落第２６行〜第１４段落第１２行、およびＷａｌｌｎｅｒへの米国特許第４，８７９，２２４号明細書の第６段落第８行〜第８段落第５９行を参照されたい。
【００７４】
ベクターは、複製可能なＤＮＡ構築物である。ベクターは、本明細書では第ＩＸ因子タンパク質をコードする核酸を増幅させる、および／または第ＩＸ因子タンパク質をコードする核酸を発現させる、いずれかのために使用される。発現ベクターは、第ＩＸ因子タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、適切な宿主内で第ＩＸ因子タンパク質を生成するためにヌクレオチド配列の発現を実行することのできる適切な制御配列へ機能的に連結している、複製可能な核酸構築物である。そのような制御配列に対する必要は、選択された宿主および選択された形質転換方法に依存して変動する。一般に、制御配列には、転写プロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳の停止を制御する配列が含まれる。
【００７５】
ベクターは、プラスミド、ウイルス（例えば、アデノウイルス、サイトメガロウイルス）、ファージ、および統合可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、組換えによって宿主ゲノム内に統合可能なフラグメント）を含んでいる。ベクターは、宿主ゲノムとは無関係に複製して機能する、または一部の例では、ゲノム自体内に統合することができる。発現ベクターは、発現させるべき遺伝子に機能的に連結している、そして宿主生体内で機能的であるプロモーターおよびＲＮＡ結合部位を含有することができる。
【００７６】
ＤＮＡ領域もしくはヌクレオチド配列は、それらが相互に機能的に関連する場合に、機能的に連結している、または機能的に関連している。例えば、プロモーターは、それが配列の転写を制御する場合はコーディング配列に機能的に連結している、またはリボソーム結合部位は、それが配列の翻訳を許容できるように配置される場合、コーディング配列に機能的に連結している。
【００７７】
形質転換された宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築された第ＩＸ因子タンパク質ベクターを用いて形質転換、形質導入、および／またはトランスフェクトされている細胞である。
【００７８】
適切な宿主細胞には、原核生物、酵母または例えば哺乳動物細胞および昆虫細胞などの高等真核細胞が含まれる。多細胞生体由来の細胞は、組換え第ＩＸ因子タンパク質合成のための特に適切な宿主であり、哺乳動物細胞が特に好ましい。細胞培養内でのそのような細胞の繁殖は、ルーチン手技になってきている（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３））。有用な宿主細胞系の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ならびにＷＩ１３８、ＨＥＫ  ２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、ＣＶ、およびＭＤＣＫ細胞系である。そのような細胞のための発現ベクターは、通常は（必要であれば）、複製起源、発現対象であってそれと機能的に結び付いている第ＩＸ因子タンパク質をコードするヌクレオチド配列から上流に位置するプロモーターを、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位（イントロン含有ゲノムＤＮＡが使用される場合）、ポリアデニル化部位、および転写終結配列と共に含んでいる。好ましい実施形態では、発現は、参照して本明細書に全体として組み込まれる米国特許第５，８８８，８０９号明細書の発現系を用いてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内で実施される。
【００７９】
脊椎動物細胞を形質転換させる際に使用すべき発現ベクター内の転写および翻訳制御配列は、ウイルス起源によって提供されることが多い。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、およびシミアン（Ｓｉｍｉａｎ）ウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する。例えば、米国特許第４，５９９，３０８号明細書を参照されたい。
【００８０】
複製起源は、例えばＳＶ４０もしくはその他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）起源などに由来して外因性起源を含めるためのベクターの構築によって提供することができる、または宿主細胞染色体複製機序によって提供することができる。ベクターが宿主細胞染色体内に統合される場合は、宿主細胞染色体で十分であることが多い。
【００８１】
ウイルス複製起源を含有するベクターを使用するのではなく、選択可能なマーカーおよび第ＩＸ因子タンパク質をコードする核酸を用いた同時形質転換法によって、哺乳動物細胞を形質転換させることができる。適切な選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである。この方法は、全体として引用することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許第４，３９９，２１６号明細書においてさらに記載されている。
【００８２】
組換え脊椎動物細胞培養内での第ＩＸ因子タンパク質の合成に適応させるために適切なその他の方法には、それらの各々の全内容が引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Ｇｅｔｈｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ２９３：６２０（１９８１）；Ｍａｎｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：４０；およびＬｅｖｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、欧州特許出願公開第１１７，０６０（Ａ）号明細書および欧州特許出願公開第１１７，０５８（Ａ）号明細書に記載された方法が含まれる。
【００８３】
例えば、昆虫細胞（例えば、培養されたヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞）などの宿主細胞および例えばバキュロウイルス発現ベクター（例えば、核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＭＮＰＶ、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）ＭＮＰＶ、ラチプルシア・オウ（Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ  ｏｕ）ＭＮＰＶ、またはガレリア・オウ（Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｏｕ）ＭＮＰＶに由来するベクター）は、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第４，７４５，０５１号明細書および第４，８７９，２３６号明細書に記載されているように、本発明を実施する際に使用できる。一般に、バキュロウイルス発現ベクターは、ポリへドリン転写開始シグナルからＡＴＧ開始部位までの範囲に及ぶ位置でポリヘドリン遺伝子に挿入して、バキュロウイルス・ポリヘドリン・プロモーターの転写制御下で発現させるヌクレオチド配列を含有する、バキュロウイルスゲノムを含んでいる。
【００８４】
原核宿主細胞は、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または桿菌類を含んでいる。高等真核細胞は、以下に記載するように哺乳動物起源の株化細胞系を含んでいる。典型的な宿主細胞は、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）および大腸菌２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）である。極めて多様な適切な原核細胞および微生物ベクターを利用できる。大腸菌は、典型的にはｐＢＲ３２２を用いて形質転換させられる。組換え微生物発現ベクターにおいて最も一般的に使用されるプロモーターには、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース・プロモーター系（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６１５（１９７８）；およびＧｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４（１９７９））、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０）および欧州特許出願公開第３６，７７６号明細書）およびｔａｃプロモーター（Ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１（１９８３））が含まれる。プロモーターおよびＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核宿主発現のため）は、第ＩＸ因子タンパク質をコードする核酸に機能的に連結している。すなわち、それらはＤＮＡからの第ＩＸ因子メッセンジャーＲＮＡの転写を促進できるように配置されている。
【００８５】
例えば酵母培養などの真核微生物は、さらにまたタンパク質コーディングベクターを用いて形質転換させることができる（例えば、米国特許第４，７４５，０５７号明細書を参照されたい）。サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、最も一般に使用される下等真核宿主微生物であるが、多数の他の菌株も一般に利用できる。酵母ベクターは２μ酵母プラスミドもしくは自己複製配列（ＡＲＳ）由来の複製起源、プロモーター、第ＩＸ因子タンパク質をコードする核酸、ポリアデニル化および転写終結のための配列、ならびに選択遺伝子を含有していてよい。典型的なプラスミドは、ＹＲｐ７である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １０：１５７（１９８０））。酵母ベクター内の適切な促進配列には、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３（１９８０）またはその他の糖分解酵素（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．７：１４９（１９６８）；およびＨｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：４９００（１９７８））のためのプロモーターが含まれる。酵母発現において使用するための適切なベクターおよびプロモーターについては、Ｒ．Ｈｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、欧州特許第７３，６５７号明細書の中にさらに記載されている。
【００８６】
本発明のクローン化コーディング配列は、マウス、ラット、イヌ、フクロネズミ、ウサギ、ネコ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ウシ、モルモット、フクロネズミ、カモノハシ、およびヒトを含む任意の起源の種のＦＩＸをコードすることができるが、好ましくはヒト起源の第ＩＸ因子タンパク質をコードする。本明細書に開示したタンパク質をコードする核酸とハイブリダイズできる第ＩＸ因子をコードする核酸もまた含まれる。そのような配列のハイブリダイゼーションは、標準インサイチュー（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションアッセイにおいて本明細書に開示した第ＩＸ因子タンパク質をコードする核酸に対して、減少したストリンジェンシー条件下またはさらにストリンジェントな条件（例えば、６０℃またはさらに７０℃での、０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳを用いた洗浄ストリンジェンシーによって表されるストリンジェントな条件）下で実施できる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  Ｅｄ．１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を参照されたい。
【００８７】
本発明によって生成されたＦＩＸ変異体は、公知の方法によってトランスジェニック動物において発現させることができる。例えば、引用することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許第６，３４４，５９６号明細書を参照されたい。簡潔に言えば、トランスジェニック動物は、農耕動物（例えば、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ウサギなど）、齧歯類（例えば、マウス、ラットおよびモルモット）、ならびに愛玩動物（例えば、ネコおよびイヌ）を含むことができるが、それらに限定されない。一部の実施形態では、例えばブタ、ヒツジ、ヤギおよびウシなどの家畜動物が特に好ましい。
【００８８】
本発明のトランスジェニック動物は、前記ポリヌクレオチドが成熟動物の生殖系列細胞のＤＮＡ内に安定性で統合され、通常のメンデル型（Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ）方法で受け継がれるような方法で、本発明のヒト第ＩＸ因子変異体をコードする適切なポリヌクレオチドを単細胞胚内へ導入する工程によって生成される。本発明のトランスジェニック動物は、体液および／または組織中でＦＩＸ変異体を生成する表現型を有する。ＦＩＸ変異体は、例えば治療使用のために、これらの体液および／または組織から取り出され、加工処理される（例えば、その全内容が引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｌｋ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｓｈｅｅｐ」Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：４８７−４９２（１９８９）；Ｖａｎ  Ｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．「Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ：ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｃａｎ  ｅｎａｂｌｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ」Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  １０（４）：７０−７７（２００４）を参照されたい）。
【００８９】
ＤＮＡ分子は、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム媒介沈降法、リポソーム融合法、または全能性幹細胞もしくは多能性幹細胞のレトロウイルス感染法を含むがそれらに限定されない、様々な手段によって胚内に導入することができる。形質転換細胞は、次にトランスジェニック動物を形成するために胚内に導入してそこに組み込むことができる。トランスジェニック動物を作製する方法は、例えば、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｂｙ  Ｌ．Ｍ．Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７に記載されている。トランスジェニック動物は、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：６４−６６（１９９６）およびＷｉｌｍｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３（１９９７）に記載されたような胚もしくは成熟細胞系を用いる核移植もしくはクローニングの方法を使用して生成することもできる。ＤＮＡの細胞質インジェクション法を利用するまた別の技術は、米国特許第５，５２３，２２２号明細書に記載されているように使用される。
【００９０】
第ＩＸ因子産生トランスジェニック動物は、第ＩＸ因子をコードする配列を含むキメラ構築物を導入する工程によって得ることができる。トランスジェニック動物を得るための方法は周知である。例えば、すべてが引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ  ＴＨＥ  ＭＯＵＳＥ  ＥＭＢＲＹＯ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  １９８６）；Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：８８（１９９１）；Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４１：３４３（１９８５），Ｋｒａｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＧＥＮＥＴＩＣ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＥＡＲＬＹ  ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＥＭＢＲＹＯ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）；Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：６８０（１９８５）；Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，１７５，３８５号明細書；Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，１７５，３８４号明細書、Ｊａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｍｅｄ．２４：２７３（１９９２），Ｂｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｉｍ．Ｏｇｇｉ．１１：２１（１９９３），Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，４７６，９９５号明細書を参照されたい。
【００９１】
一部の実施形態では、プロモーターが、乳汁が合成される生理学的条件下では他の組織におけるより哺乳動物組織中で活性であるという点で哺乳動物組織中で「活性」である、ｃｉｓ作用性調節領域を使用できる。そのようなプロモーターには、短鎖および長鎖乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）、短鎖および長鎖α、βおよびκカゼイン、α−ラクトアルブミンおよびβ−ラクトグロブリン（「ＢＬＧ」）プロモーターが含まれるが、それらに限定されない。本発明によると、発現タンパク質の他の体液内、特別には血液中および尿中への分泌を指令するシグナル配列もまた使用できる。そのような配列の例には、第ＩＸ因子、タンパク質Ｃ、および組織型プラスミノーゲン活性化因子のシグナルペプチドを含む分泌凝固因子のシグナルペプチドが含まれる。
【００９２】
上記で考察したプロモーターに加えて転写を調節する特に有用な配列は、エンハンサー、スプライスシグナル、転写終結シグナル、ポリアデニル化部位、緩衝配列、ＲＮＡプロセッシング配列および導入遺伝子の発現を調節する他の配列である。
【００９３】
好ましくは、発現系もしくは構築物は、所望の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列の下流にある３’未翻訳領域を含んでいる。この領域は、導入遺伝子の発現を増加させることができる。これに関連して特に有用な３’未翻訳領域は、ポリＡシグナルを提供する配列である。
【００９４】
適切な異種３’未翻訳配列は、例えば、ＳＶ４０スモールｔ抗原、カゼイン３’未翻訳領域、または当分野において周知の他の３’未翻訳配列に由来してよい。リボソーム結合部位は、ＦＩＸの発現の効率を増加させる際にも重要である。同様に、ＦＩＸの翻訳後修飾を調節する配列は、本発明において有用である。
【００９５】
第ＩＸ因子コーディング配列は、それらを発現させるためのベクターおよび宿主細胞と共に、引用することにより本明細書の一部をなすものとする、欧州特許出願第３７３０１２号明細書、欧州特許出願第２５１８７４号明細書、国際出願第８５０５３７６号明細書、国際出願第８５０５１２５号明細書、欧州特許出願第１６２７８２号明細書、および国際出願第８４００５６０号明細書において開示されている。
【００９６】
追加のグリコシル化部位を有するＦＩＸタンパク質における変異体は、ＰＣＲを用いて例えば特定部位突然変異誘発などの組換え方法によって生成することができる。または、第ＩＸ因子変異体は、１つ以上の追加のグリコシル化部位を備える第ＩＸ因子タンパク質を調製するために化学合成することができる。
実施例
【実施例１】
【００９７】
ヒトＦＩＸアミノ酸配列内への１つのグリコシル化部位の付加
活性化ペプチド内に１つの追加のグリコシル化部位を有するヒトＦＩＸの変異体をＣＨＯ細胞内で生成した。この変異体は安定性であり、通常の活性および野生型組換えヒトＦＩＸと比較して増加した半減期を有している。
【００９８】
ベクター。野生型組換えヒトＦＩＸまたは組換えヒトＦＩＸの変異体をコードする核酸を発現させるために、ＩＣＯＳ由来のＦＩＸ−ｐＤＥＦ３８  ＣＨＥＦ−１プロモーター含有ベクターを使用した。
【００９９】
ＦＩＸ変異体。これらの実験のために調製したヒトＦＩＸ変異体は、活性化ペプチド内に挿入された１つの追加のグリコシル化部位（配列番号３、図１、第３行）を含有する９つの追加のアミノ酸を含んでいる。ボールド体で記載された９つの付加されたアミノ酸を備えるこの変異体の活性化ペプチドの配列はＡＥＴＶＦＰＤＶＤＹＶＮＳＴＥＡＥＴＩＬＤＮＩＴＤＧＡＩＬＮＮＩＴＱＳＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号１３３）であり、これは配列番号３３の成熟ヒトＦＩＸアミノ酸配列に基づくナンバリングを用いて、Ｎ末端ではアミノ酸１４６およびＣ末端ではアミノ酸１８１を示している。
【０１００】
ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞のトランスフェクション。細胞は１５ｍＬの増殖培地を含有する１２５ｍＬの振とうフラスコ内で３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で播種し、３７℃でインキュベートする。３日目に、細胞密度は約１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬでなければならない。ＤＮＡ−ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００  ＣＤ複合体は、２０μｇのＤＮＡを６５０μＬのＯＰＴＩＰＲＯ  ＳＦＭ内へ希釈し、穏やかに混合し、室温（ＲＴ）で５分間にわたりインキュベートすることによって調製する。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００  ＣＤは、使用前に穏やかに混合し、４５μＬを６５０μＬのＯＰＴＩＰＲＯ  ＳＦＭ中に入れ、穏やかに混合し、５分間にわたりＲＴでインキュベートすることによって希釈した。インキュベーション後、希釈したＤＮＡおよび希釈したＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００  ＣＤを結合し、穏やかに混合し、ＲＴで３０〜４５分間にわたりインキュベートし、ＤＮＡ−ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００  ＣＤ複合体を形成させる。インキュベーション後、ＤＮＡ−ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００  ＣＤ複合体を振とうフラスコ内へ加える。４８時間後、細胞を遠沈させ、培地を３０ｍＬのＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、製品番号１２６８１−０１１）と取り替える。安定性トランスフェクト細胞を得るために、この培地を２〜３日毎に取り替える。
【０１０１】
ＦＩＸ発現細胞の選択。ｄｈｆｒ遺伝子はＤＧ４４細胞内では不活性化されるので、選択マーカーとしてはｄｈｆｒ遺伝子（Ｅｇｒｉｅ  ＪＣ，Ｂｒｏｗｎｅ  ＪＫ．「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＥＳＰ）」Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００１；１６  Ｓｕｐｐｌ  ３：３−１３）を使用した。安定性に発現するｄｈｆｒ陽性ＤＧ４４細胞は、細胞増殖のためにＨＴを必要とせず、ＣＤ  ＣＨＯ培地中で増殖させることができる。
【０１０２】
混合ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞トランスフェクタントおよび２９３細胞クローンから収集した培地からのｈＦＩＸ変異体タンパク質の精製１。ｒｈＦＩＸ変異体タンパク質の精製は、以下のとおりであった。ＥＤＴＡ（２００ｍＭ、ｐＨ７．４）およびベンズアミジン（１Ｍ溶液）は、各々４ｍＭおよび５ｍＭの最終濃度まで粗培養培地へ加えた。ｒｈＦＩＸ変異体タンパク質を含有する培養培地を４℃でＱセファロースアニオン交換樹脂と混合した。Ｑセファロース樹脂は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭベンズアミジンを用いて前平衡させた。カラムを１Ｌの平衡バッファーを用いて洗浄し、次にＥＤＴＡを含まない２００ｍＬの平衡バッファーを用いて洗浄した。ｒｈＦＩＸ変異体タンパク質を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２により溶出した。
【０１０３】
ＦＩＸ活性。変異体組換えヒトＦＩＸの機能的活性は、１００μＬのヒトＦＩＸ欠損性血漿を１００μＬの自動活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試薬（Ｔｒｉｎｉｔｙ  ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＳＡ社）、および８０μＬのＯｗｒｅｎ−Ｋｏｌｌｅｒバッファーで希釈した２０μＬの試験サンプルとともに、３７℃で３分間にわたりインキュベートすることによって決定した。反応を開始させるために、１００μＬの２５ｍＭ  ＣａＣｌ２を加え、血塊形成時間を肉眼で測定した。正常プールヒト血漿の凝固活性を１００％と見なした。ＦＩＸ特異的活性は、凝固活性をイムノアッセイによって決定したＦＩＸタンパク質の総量で割り、単位／ｍｇとして表示する。野生型ＦＩＸについての特異的活性は１１６単位／ｍｇであり、１つの追加のグリコシル化部位を備えるＦＩＸについては１０４単位／ｍｇである。
【０１０４】
ＦＩＸのサイズ。ＣＨＯ細胞内で作製された精製血漿ＦＩＸおよび精製野生型組換えＦＩＸと比較して、１つの追加のグリコシル化部位を備える精製ＦＩＸのサイズにおける明白な増加は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって検出した。糖類を酵素的に除去すると、ＦＩＸ変異体は、同様に処理した野生型組換えＦＩＸと近似して移動する。
【０１０５】
半減期。半減期の測定は、８匹のＢ型血友病マウスに１つの追加のグリコシル化部位を備えるＦＩＸ変異体を注射し、８匹の相違するＢ型血友病マウスに野生型組換えＦＩＸを注射することによって実施した。１００単位／ｋｇのＦＩＸを各群のＢ型血友病マウスに注射した。注射後、循環中に残留するＦＩＸの量は、１５分後、４時間後、１２時間後、２４時間後、および４８時間後に決定した。循環中に残留するＦＩＸの量は、標準物質として野生型ＦＩＸを用いるＥＬＩＳＡによって測定した。ＥＬＩＳＡのための抗体は、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社から入手した（製品番号、ＳＡＦＩＸ−ＡＰ  ＳＡＦＩＸ−ＡＰＨＲＰ）。曲線は、一次指数関数的減衰に当てはめた。
【０１０６】
１つの追加のグリコシル化部位を備えるＦＩＸ変異体は、図４に示したように、より長い半減期（約１．５時間）を示した。このＦＩＸタンパク質の完全シアリル化が生じるかどうかを決定するためには、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ２によって報告されたように、不完全シアリル化はより短い半減期を生じさせる可能性があるので、この変異体についてのさらなる分析が実施される。シアリル化度を決定するためのアッセイは、当分野において周知である（例えば、それらの各々の全内容は引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Ａｎｕｍｕｌａ  ａｎｄ  Ｄｈｕｍｅ  「Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｏｒｍａｌ  ｐｈａｓｅ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈｌｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｎｔｈｒａｎｉｌｉｃ  ａｃｉｄ」Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８：６８５−６９４（１９９８）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．「Ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ，ｈｙｄｒａｚｉｄｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．４（６）：２０７０−２０８０（２００５））を参照されたい）。
【０１０７】
タンパク質の半減期は、多数の因子によって影響を受ける可能性がある。単純なサイズは、循環中タンパク質が循環中に維持されるかどうか、または身体全体に分布するかどうかに大きな影響を及ぼす。さらに、特異的結合部位は、循環からタンパク質を取り除くことがある。過小シアリル化されている血漿タンパク質は、アシアロ糖タンパク質肝臓受容体によって循環から取り除かれる露出したＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌ残基を有していることは公知である３−５。哺乳動物組織中で示差的に発現する１８種の相違するシアリルトランスフェラーゼ酵素のファミリーが存在する６。ヒトでは、Ｎ−グリコシル化Ｎ末端ガラクトースは、通常はα（２，６）シアル酸で終結する。ＣＨＯまたはＢＨＫ細胞は、Ｎ−グリコシル化末端ガラクトースがα（２，３）−シアリル化ガラクトースによってキャッピングされるＦＩＸを生成する。しかし、２９３細胞内で生成されるＦＩＸは、α（２，６）−ガラクトース上のシアル酸によってキャッピングされる。過小シアリル化は、循環からの増加したクリアランス速度を容易にもたらし、追加のグリコシル化の結果として生じる予想半減期増加を遮蔽できる。過小シアリル化は、インビトロ内（シアル酸を酵素的に加えることによって３）または細胞培養内で、組換えＦＩＸを発現する細胞へシアリル化酵素を加える、またはシアリル化を増加させるために培養条件を操作することのいずれかによって、改善することができる７−１０。さらにまた、Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ  α（２，６）−シアリルトランスフェラーゼに対する遺伝子を用いたＣＨＯ細胞のトランスフェクションが内因性シアリル化酵素を圧倒し、主要修飾として末端α−（２，６）−シアリル−ガラクトースを有する組換えタンパク質の産生を生じさせることもまた証明されている１１。
【０１０８】
本試験は、アミノ酸残基は、その凝固時間へ実質的に影響を及ぼさずにヒト第ＩＸ因子の活性化ペプチド内へ挿入できること、そしてこれらの挿入はヒト第ＩＸ因子の産生に有害な影響を及ぼさないことを証明している。これらの試験はさらに、周知の技術を用いて当業者によって容易に同定されるように、ＦＩＸタンパク質自体内にループバックし、構造を破壊する任意の配列を含有していないことを前提に、任意のアミノ酸配列を第ＩＸ因子の活性化ペプチド内へ組み込むことができることを証明している。さらに半減期を延長させるためにポリエチレングリコールなどの化合物を加えるために特異的部位の化学的付加を可能にするアミノ酸配列を、さらに組み込むことができる。そのような配列は、ルーチン実験を用いて標準プロトコールに従って生成して試験することができる。
【実施例２】
【０１０９】
新規なグリコシル化部位が導入されていないヒトＦＩＸ変異体
極めて様々な配列もまた、ＦＩＸ分子に有害な影響を及ぼさずにヒトＦＩＸの活性化ペプチド内に挿入できるという証明として、以下のアミノ酸配列ＦＬＮＣＣＰＧＣＣＭＥＰ（配列番号１３４）をアミノ酸１６１と１６２との間で活性化ペプチド内に挿入した（ナンバリングは、配列番号３３に示したように成熟ＦＩＸアミノ酸配列に基づく）。この組換えタンパク質は、上記の実施例１に記載した方法に従って分析し、野生型組換えヒトＦＩＸと同一の機能性を有することが証明された。
【０１１０】
当業者には、本発明の精神から逸脱せずに多数の様々な修飾を加えられることは理解される。このため、本発明の形態は例示するためだけであり、本発明の範囲を限定することは意図していないことを明確に理解されたい。
【０１１１】
本明細書で言及した全ての刊行物、特許出願、特許、特許公報、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース・アクセッション番号によって同定された配列、および他の参考文献は、出典が提示されている文章および／または段落に関連する教示のために、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０１１２】
本発明は、本明細書に含まれる特許請求の範囲の同等物とともに、以下の特許請求の範囲によって規定される。
【０１１３】
実施例１のための参考文献
【表１Ａ】
0005613876.tif 000006
【表１Ｂ】
0005613876.tif 000007
【０１１４】
【表２】
0005613876.tif 000008
【０１１５】
【表３Ａ】
0005613876.tif 000009
【表３Ｂ】
0005613876.tif 000010
【表３Ｃ】
0005613876.tif 000011
【表３Ｄ】
0005613876.tif 000012
【表３Ｅ】
0005613876.tif 000013
【表３Ｆ】
0005613876.tif 000014
【表３Ｇ】
0005613876.tif 000015
【表３Ｈ】
0005613876.tif 000016
【表３Ｉ】
0005613876.tif 000017
【表３Ｊ】
0005613876.tif 000018
【図１】
0005613876.tif 000019
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−９】
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【図６−１０】
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【図６−１１】
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【図６−１２】
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【図６−１３】
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【図６−１４】
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【図６−１５】
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【図６−１６】
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【図６−１７】
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【図６−１８】
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【図６−１９】
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【図６−２０】
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【図６−２１】
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【図６−２２】
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【図６−２３】
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【図６−２４】
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【図６−２５】
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【図６−２６】
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【図６−２７】
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【図６−２８】
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【図６−２９】
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【図６−３０】
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【図６−３１】
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【図６−３２】
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【図６−３３】
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【図６−３４】
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【図６−３５】
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【図６−３６】
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【図６−３７】
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【図６−３８】
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【図６−３９】
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【図６−４０】
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【図６−４１】
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【図６−４２】
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【図６−４３】
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【図６−４４】
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【図６−４５】
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【図６−４６】
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【図６−４７】
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【図６−４８】
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【図６−４９】
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【図６−５０】
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【図６−５１】
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【図６−５２】
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【図６−５３】
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【配列表】
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