(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンカーと、該リンカーの第１の端に結合した酸素濃度応答性りん光団と、該リンカーの第２の端に結合したけい光団とを含む化合物であって、酸素濃度応答性りん光団の三重項準位が、けい光団の三重項準位よりも小さいことを特徴とし、酸素濃度応答性りん光団が下記式（１）のイリジウム錯体であり、けい光団が下記式（７）の基を含み、リンカーが下記式（８）の構造またはプロリン残基数が４〜２０のポリプロリン構造を含む、化合物。
【化１】
0005500594.tif 000021
【化２】
0005500594.tif 000022
【化３】
0005500594.tif 000023
各環の炭素−炭素結合の１またはそれ以上は2重結合であってもよい。
【請求項２】
下記いずれかの化合物である、請求項１に記載の化合物。
【化４】
0005500594.tif 000024
【請求項３】
請求項１または２に記載の化合物を含む酸素応答性発光プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規化合物およびそれを含む酸素濃度に依存して発光色が変化する機能性発光プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
イリジウム（III）錯体（非特許文献１〜４）はりん光を発することが知られており、有機ELディスプレイなどへの応用が期待されている。
一方、本発明者らは、イリジウム錯体（(btp)2Ir(acac)）が酸素濃度に依存してりん光を発することを発見し、イリジウム錯体（(btp)2Ir(acac)）の室温りん光（強度，寿命）を用いた生体組織中における酸素濃度計測方法を開発した（特許文献１）。また、(btp)2Ir(acac)のりん光強度，寿命の測定から，リポソーム膜中の酸素濃度の定量，癌細胞中の酸素濃度の可視化，担癌マウス中の腫瘍の可視化に成功した（特許文献１）。
さらに、酸素濃度に依存して近赤外領域にりん光を発する化合物も開発した（特許文献２）。さらに、水溶性を持たせたりん光化合物も開発した（特許文献３）。【０００３】
細胞のようなミクロな構造体の特定の部位の酸素濃度を非侵襲的かつ高感度に計測する方法として、上記のようなイリジウム錯体を用いた発光プローブ法は非常に有効である。一般に発光プローブを用いた酸素濃度計測法は、プローブ分子の発光が酸素分子との衝突によって消光を受けること、すなわち、発光プローブの発光強度が酸素濃度に依存して変化することを利用する。しかしながら、発光強度の変化から酸素濃度を求める方法は、プローブ分子の濃度と励起光強度分布が均一な場合には正確な値を与えるが、細胞内酸素濃度計測のように、プローブ分子の濃度分布が均一でない場合には、濃度の影響を受けてしまい、解析が困難になるという問題点もあった。
そこで、濃度の影響を受けない方法として、発光寿命の変化を利用する方法が考えられているが、一般に発光寿命の測定にはパルスレーザーのような高価な光源と高度な光計測技術が必要なため、装置が大掛かりになってしまうという欠点を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】飛田成史、吉原利忠、竹内利行、穂坂正博、特開2008-281467
【特許文献２】吉原利忠、飛田成史、穂坂正博、竹内利行、特願2008-185151
【特許文献３】吉原利忠、飛田成史、穂坂正博、竹内利行、特願2008-239660
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】S. Lamansky, P. Djurovich, D. Murphy, F. Abdel-Razzaq, H. Lee, C. Adachi, P. E. Burrows, S. R. Forrest, and M. E. Thompson, J. Am. Chem. Soc., 123, 4303 (2001).
【非特許文献２】H. Konno，Chem. Times, 199, 13 (2006).
【非特許文献３】M. Nonoyama, Bull. Chem. Soc. Jpn., 47, 767 (1974).
【非特許文献４】S. Sprouse, K. A. King, P. J. Spellane, and R. J. Watts, J. Am. Chem. Soc., 106, 6647 (1984).
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、プローブ濃度に影響されることなく酸素濃度を簡便に測定することのできる酸素応答性発光プローブを提供することを課題とする。
【０００７】
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、リンカーと、該リンカーの第１の端に結合した酸素濃度応答性りん光団と、該リンカーの第２の端に結合したけい光団とを含む新規化合物の合成に成功し、該化合物が自身の濃度に影響されることなく、酸素濃度に依存して発光色が変化することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１] リンカーと、該リンカーの第１の端に結合した酸素濃度応答性りん光団と、該リンカーの第２の端に結合したけい光団とを含む化合物。
[２] 酸素濃度応答性りん光団の三重項準位が、けい光団の三重項準位よりも小さいことを特徴とする、[１]に記載の化合物。
[３] 酸素濃度応答性りん光団がイリジウム錯体を含む基である、[１]または[２]に記載の化合物。
[４] イリジウム錯体が下記一般式（I）で表される構造を有する、[３]に記載の化合物。
[５] イリジウム錯体が下記（１）〜（４）のいずれかの構造を有する、[３]に記載の化合物。
[６] けい光団が下記（５）〜（７）のいずれかの基を含む、[１]〜[５]のいずれかに記載の化合物。
[７] リンカーが下記（８）の構造を含む、[１]〜[６]のいずれかに記載の化合物。
[８] リンカーがポリプロリンである、[１]〜[６]のいずれかに記載の化合物。
[９] 下記化合物（９）または（１３）である、[１]〜[８]のいずれかに記載の化合物。
[１０] [１]〜[９]のいずれかに記載の化合物を含む酸素応答性発光プローブ。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】酸素応答性発光プローブにおける、けい光団とりん光団の励起状態緩和過程における好ましいエネルギー関係を示す図。
【図２】C343-Chol-BTPの励起状態緩和過程におけるエネルギー関係を示す図。
【図３】C343-Chol-BTPのアセトニトリル中の発光スペクトルを示す図。
【図４】アセトニトリル中のC343-Chol-BTPについて、空気飽和条件およびアルゴン置換条件での発色像を示す図（写真）。キセノンランプで励起し、430nmのバンドパスフィルターを用いた。
【図５】アセトニトリル中のC343-Chol-BTPについて、溶存酸素分圧を変えて測定した発光スペクトルを示す図。
【図６】アセトニトリル中のC343-Chol-BTP について、479nmでモニターした蛍光強度（If）と614nmでモニターしたりん光強度（Ip）の比を酸素分圧に対してプロットした結果を示す図。
【図７】C343-Pro4-BTPのアセトニトリル中、空気飽和条件（aerated）およびアルゴン置換条件（Ar）での発光スペクトルを示す図。
【図８】DMPC（dimyristoyl phosphatidylcholine）脂質二分子膜中のC343-Pro4-BTPについて、溶存酸素分圧を変えて測定した発光スペクトルを示す図。
【図９】DMPC脂質二分子膜中のC343-Pro4-BTP について、479nmでモニターした蛍光強度（If）と614nmでモニターしたりん光強度（Ip）の比を酸素分圧に対してプロットした結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に本発明を詳しく説明する。
【００１１】
本発明の化合物は、酸素濃度応答性りん光団と酸素非感受性であるけい光団とが、それぞれリンカーの第１及び第２の端に結合して連結されたものである。けい光団の三重項準位がりん光団の三重項準位よりも低いとりん光団からけい光団にエネルギー移動が起こり、りん光強度の著しい低下をきたすことがあるので、酸素濃度に依存して発光色が変化する発光プローブを設計するには、図１に示すように、けい光団の励起三重項（T1）準位が、りん光団の励起三重項（T1'）準位よりも高くなるように発光団を組み合わせることが好ましい。
【００１２】
りん光団としては、酸素濃度に依存したりん光を発する基であれば特に制限されないが、イリジウム錯体を含む基であることが好ましい。
イリジウム錯体は、Ir(III)を中心金属とし、芳香族系分子を配位子とする金属錯体を意味するが、例えば、下記文献１）〜４）に開示されたようなものが例示される。配位子の芳香族系分子としては、当該配位子を含むイリジウム錯体がりん光を発するものであれば特に制限されないが、窒素原子、酸素原子、硫黄原子などのヘテロ原子を含む芳香族系配位子が好ましい。
1) S. Lamansky, P. Djurovich, D. Murphy, F. Abdel-Razzaq, H. Lee, C. Adachi, P. E. Burrows, S. R. Forrest, and M. E. Thompson, J. Am. Chem. Soc., 123, 4303 (2001).
2) H. Konno，Chem. Times, 199, 13 (2006).
3) M. Nonoyama, Bull. Chem. Soc. Jpn., 47, 767 (1974).
4) S. Sprouse, K. A. King, P. J. Spellane, and R. J. Watts, J. Am. Chem. Soc.,106, 6647 (1984)
【００１３】
好ましいイリジウム錯体として、下記のものが挙げられる。
【化１】
0005500594.tif 000002
ｍ、ｎ、ｚが０〜３の整数である。
XおよびYは 水素、またはアルキル基，アルコキシ基，アミノ基，ジメチルアミノ基，トリフルオロメチル基，シアノ基，アセチル基、カルボキシル基，アルキルエステル基，およびアルキルアミド基から選択される置換基を示す。
【００１４】
特に好ましいイリジウム錯体として、下記のものが挙げられる。
【化２】
0005500594.tif 000003
なお、これらりん光団の励起三重項（T1'）準位はそれぞれ、198, 182, 172, 170 kJ/molである。
【００１５】
けい光団は上記りん光団に応じて適宜選択することができ、NBD（4-Nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole）、FITC、またはクマリン系色素，ローダミン類，BODIPY，シアニン系色素などが例示されるが、下記のNBD、FITC、またはC343が好ましい。
【化３】
0005500594.tif 000004
なお、これらけい光団の励起三重項（T1）準位はそれぞれ181, 197, 206 kJ/molである。
【００１６】
けい光団とりん光団を連結するリンカーは両者を化学的に結合するものであれば特に制限されないが、けい光団とりん光団との近接を避けるため、けい光団とりん光団を連結するリンカーは、できるだけ剛直であることが望ましい。また、その長さは20Å以上であることが好ましい。長さの上限は特に制限はないが、30Å以下であることが好ましい。リンカー部分の分子量としては，4,000以下が好ましい。
ステロイド、ポリペプチドは比較的容易に発光団と結合させることができるため、リンカーとして好適に使用しうる。また、ペプチド残基としてアスパラギン酸、リシンのような水溶性アミノ酸を含むペプチドを用いれば、発光プローブに水溶性を持たせることもできる。ポリペプチドとしてはアミノ酸残基数4-20のポリペプチドが好ましく、例えば、ポリプロリンが例示される。
例えば、リンカーとして下記のようなコレステロール骨格を含むものを用いることもできる。
【化４】
0005500594.tif 000005
なお、各環の炭素−炭素結合の１またはそれ以上は2重結合であってもよい。
【００１７】
より具体的には、下記の化合物が挙げられる。ただし、本発明の化合物は酸素濃度に依存した発色を示すものである限り、下記化合物に限定されるものではない。
【化５】
0005500594.tif 000006
【００１８】
化合物（９）は図２に示す通り、図１のエネルギー関係を満たしている。
また、化合物（１０）および（１１）も図１のエネルギー関係を満たしている。
また、化合物（１３）も図１のエネルギー関係を満たしている。
一方、化合物（１２）は図１のエネルギー関係を満たしていないが、その場合でも、剛直で長いリンカー（decaproline）を介して発光団を結合すれば、エネルギー移動が抑制され、けい光とりん光の両方を取り出すことができる。
【００１９】
本発明の化合物は、りん光団化合物と、けい光団化合物を両端に反応性の基を有するリンカー化合物と反応させることによって得ることができる。例えば、上記化合物（９）は、後述の実施例に記載の方法に従って合成することができる。なお、化合物（９）においてBTPに代えてBTQ、BTIQ、BTPHを用いることにより、下記のC343-Chol-BTQ、C343-Chol-BTIQ、C343-Chol-BTPHを得ることができる。
【００２０】
また、化合物（９）においてC343に代えて他のけい光団を用いることもできる。
【００２１】
本発明の化合物は、酸素濃度に応じてその発光色が変化するため、その発色に基づいて酸素濃度を測定するための酸素応答性発光プローブとして用いることができる。例えば、化合物（９）の場合、紫色のときは酸素濃度が低く、青色のときは酸素濃度が高いというような判定ができる（図４）。
【００２２】
また、あらかじめ酸素濃度と、りん光強度と蛍光強度の比（Ip/If）との関係を求めておくことにより、酸素濃度を定量的に測定することも可能である。
【数１】
0005500594.tif 000007
【００２３】
本発明の酸素応答性発光プローブを用いて試料中の酸素濃度を検出する場合、本発明の酸素応答性発光プローブを試料に添加してインキュベートした後、プローブを励起してりん光を観察できるような蛍光顕微鏡、蛍光測定装置、蛍光イメージング装置などを用いてりん光を観察することができる。
【実施例】
【００２４】
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００２５】
[合成例]
（btp)2Ir(sa)の合成
2-ベンゾチエニルピリジン（1175.4mg，3.0mmol）、塩化イリジウム三水和物（純度：90％，1373.6mg，6.5mmol）に2-エトキシエタノール（90ml）、水（30ml）を加え、16時間還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体（859mg，0.66mmol）、トリフルオロメタンスルホン酸銀（377.2mg，1.47mol）に脱水アセトン（120ml）を加え3時間還流し、溶液をろ過した。得られたろ液にスクシニルアセトン（308.8mg，1.95mol）、トリエチルアミン（1ml）を加え室温にて20時間撹拌した。溶液を減圧乾固し、得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム：メタノール（9：1，v/v））を用いて生成した（収量：993.5mg，収率：97.5%）。
1H HNR (300 MHz, d-DMSO, TMS, RT)：δ 8.60-8.51(2H, m), 8.01-7.98(2H, d), 7.78-7.74(2H, q), 7.70-7.62(2H, q), 7.23-7.21(2H, q), 7.10-7.08(2H, q), 6.83-6.77(2H, t), 6.30-6.24(2H, t), 5.43(1H, s), 2.37-2.22(4H, m), 1.76(3H, s)
【化６】
0005500594.tif 000008
【００２６】
C343-Cho24の合成
クマリン343（287.8mg，1.0mmol）、Fmocエチレンジアミン（345.2mg，1.08mmol）、ジイソプロピルエチルアミン（340μl，2mmol）にDMF（6ml）を加え縮合剤としてHATU（418mg，1.10mmol）を用いて、氷浴下3時間撹拌した。溶液に水を注ぎ、固体を析出させろ過した。得られた生成物をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム：メタノール9：1）を用いて生成した（収量：380mg、収率：69%）。得られた固体（380mg、0.69mmol）に2%DBU/DMF（10ml）溶液を加え3時間室温で撹拌した。溶液に水を加え、クロロホルムを用いて抽出を行い、クロロホルム溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、ろ液を減圧乾固した。得られた油状物質をエタノール（10ml）に溶解させ3β-ヒドロキシ-Δ5-コレン酸（262 mg、0.70mmol）、DMT-MM（415mg、1.5mmol）を加え、室温にて20時間撹拌した。反応液を減圧乾固し、得られた素生成物をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム：メタノール9：1）を用いて精製した（収量：280mg、収率：58%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 9.09(1H, s), 8.50(1H, s), 6.96(1H, s), 6.89(1H, s), 5.31(1H, s), 3.62-3.58(2H, t), 3.55-3.50(2H, t), 3.34(4H, m), 2.87-2.83(2H, t), 2.78-2.74(2H, t), 1.95(4H, m), 2.23-0.62(34H, m, cholesterol moiety)
【化７】
0005500594.tif 000009
【００２７】
C343-Chol-BTPの合成
C343-Cho24（101mg、0.148mol）、(btp)2Ir(sa) （122mg、0.158mol）、無水2-メチル-6-ニトロ安息香酸（MNBA、104mg、0.302mol）、ジメチルアミノピリジン（6.5mg、0.053mol）、トリエチルアミン（65μl、0.46mol）をDMF（8ml）に溶解させ、室温にて20時間撹拌した。反応液に水を注ぎ、酢酸エチルを用いて抽出を行い、酢酸エチル溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、ろ液を減圧乾固した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて精製した（収量：85.5mg、収率：41%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 9.1(1H, s), 8.58(1H, s), 8.39(2H, d), 7.75(2H, q), 7.64-7.62(4H, d), 7.05-6.95(5H, m), 6.79(2H, d), 6.55(1H, s), 6.25-6.15(2H, m), 5.29(2H, s), 3.65-3.55(2H, m), 3.48-3.42(2H, m), 3.33(4H, m), 2.89(2H, t), 2.77(2H, t), 2.31-2.16(4H, m), 1.97(4H, m), 1.79(3H, s), 2.23-0.62(34H, m, cholesterol moiety)
【化８】
0005500594.tif 000010
【００２８】
実施例１
C343-Chol-BTPの発光スペクトル
図３に示すようにC343-Chol-BTPの発光スペクトルは、C343のけい光とBTPのりん光からなる。酸素が存在しないアルゴン（Ar）置換下では、けい光とりん光の両方の発光が認められ、空気飽和下(aerated)ではりん光が消光し、けい光のみが観測される。けい光強度とりん光強度の比から酸素濃度を定量することができる。図４に、アセトニトリル中、空気飽和条件またはAr置換条件において、C343-Chol-BTP（濃度10.7μM）の発光の像を示した。その結果、C343-Chol-BTPは、空気飽和条件では青色、Ar置換条件では紫色を呈することがわかった。【００２９】
図５にアセトニトリル中のC343-Chol-BTP （濃度5.7μM）について、溶存酸素分圧を変えて測定した発光スペクトルを示す。それによると、酸素分圧の増加とともにりん光のみが消光しているのがわかる。【００３０】
図６にアセトニトリル中のC343-Chol-BTP（濃度5.7 μM）について、479nmでモニターした蛍光強度と614nmでモニターしたりん光強度の比を酸素分圧に対してプロットした結果を示す。Stern-Volmerの式に基づいた解析から、蛍光とりん光の強度比を測定すれば、溶液中の酸素分圧を計測できることがわかる。【００３１】
参考例１
ビス[2-(2'-ベンゾチエニル)-キノリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）（(btq)2Ir(acac)）の合成【００３２】
2-ベンゾチエニルキノリンの合成
ベンゾ[b]チオフェン-2-イルボロン酸（990mg、5.6mmol）、2-クロロキノリン（937mg、5.7mmol）をトルエン（20ml）、エタノール（10ml）に溶解させ、パラジウム触媒（200mg、0.17mmol）、2M炭酸ナトリウム水溶液（20ml）を加え、N2置換下、5時間還流した。反応溶液を水に注ぎ、クロロホルムで抽出を行い、クロロホルム溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、ろ液を減圧乾固した。得られた固体をトルエンで洗浄した（収量：888mg、収率：61%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 8.20-8.17(1H, d), 8.15-8.12(1H, d), 7.98(1H, S), 7.96-7.93(1H, d), 7.91-7.88(1H, q), 7.86-7.83(1H, q), 7.82-7.79(1H, d), 7.75-7.70(1H, t), 7.55-7.50(1H, t), 7.39-7.36(2H, q)
【化９】
0005500594.tif 000011
【００３３】
ビス[2-(2'-ベンゾチエニル)-キノリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）の合成
2-ベンゾチエニルキノリン（581mg、2.2mmol）、塩化イリジウム三水和物（純度：90％、392mg、1.0mmol）に2-エトキシエタノール（30ml）、水（10ml）を加え、16時間還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体（304mg、0.20mmol）に2-メトキシエタノール（25ml）、アセチルアセトン（1ml）、炭酸ナトリウム（170mg）を加え還流を加え2時間還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて生成した（収量：262mg、収率：79%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 8.17-8.14(2H, d), 8.01-7.98(2H, d), 7.85-7.83(2H, d), 7.75-7.73(2H, d), 7.71-7.68(2H, d), 7.37-7.32(2H, t), 7.73-7.23(2H, t), 7.02-6.97(2H, t), 6.57-6.52(2H, t), 6.32-6.30(2H, d), 4.63(1H, s), 1.55(6H, s)
【化１０】
0005500594.tif 000012
【００３４】
参考例２
ビス[1-(2'-ベンゾチエニル)-キノリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）（(btiq)2Ir(acac)）の合成【００３５】
1-ベンゾチエニルイソキノリンの合成
ベンゾ[b]チオフェン-2-イルボロン酸（997mg、5.6mmol）、1-クロロイソキノリン（946mg、5.8mmol）をトルエン（20ml）、エタノール（10ml）に溶解させ、パラジウム触媒（220mg、0.19mmol）、2M炭酸ナトリウム水溶液（20ml）を加え、N2置換下、5時間還流した。反応溶液を水に注ぎ、クロロホルムで抽出を行い、クロロホルム溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、ろ液を減圧乾固した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて生成した（収量：1.16g、収率：79%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 8.62-8.60(2H, d), 7.96-7.87(3H, m), 7.84(1H, s), 7.78-7.73(1H, d), 7.71-7.67(1H, d), 7.65-7.63(1H, d), 7.42-7.39(2H, m)
【化１１】
0005500594.tif 000013
【００３６】
ビス[1-(2'-ベンゾチエニル)-キノリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）の合成
1-ベンゾチエニルイソキノリン（574mg、2.2mmol）、塩化イリジウム三水和物（純度：90％、398mg、1.0mmol）に2-エトキシエタノール（30ml）、水（10ml）を加え、16時間還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体（250mg、0.17mmol）に2-メトキシエタノール（30ml）、アセチルアセトン（1ml）、炭酸ナトリウム（150mg）を加え還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて生成した（収量：50mg、収率：18%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 8.92-8.88(2H, d), 8.22-8.19(2H, d), 7.88-7.84(2H, m), 7.68-7.64(4H, m), 7.56-7.54(2H, d), 7.32-7.27(2H, m), 6.94-6.91(2H, d), 6.56-6.53(2H, m), 6.18-6.14(2H, d), 5.12(1H, s), 1.63(6H, s)
【化１２】
0005500594.tif 000014
【００３７】
参考例３
ビス[9-(2'-ベンゾチエニル)-フェナンスリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）（(btph)2Ir(acac)）の合成【００３８】
9-クロロフェナンスリジンの合成
フェナンスリジノン（2.0g）にオキシ塩化リン（15ml）、ジメチルアニリン（0.63ml）を加え、3時間還流した。溶液を水に注ぎクロロホルムで抽出を行い、クロロホルム溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、ろ液を減圧乾固した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて生成した（収量：2.1g，収率：96%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 8.63-8.60(1H, d), 8.55-8.52(1H, d), 8.50-8.48(1H, d), 8.11-8.09(1H, d), 7.94-7.92(1H, t), 7.79-7.66(3H, m)
【化１３】
0005500594.tif 000015
【００３９】
9-ベンゾチエニルフェナンスリジリンの合成
ベンゾ[b]チオフェン-2-イルボロン酸（884mg、5.0mmol）、9-クロロフェナンスリジリン（1.0g、4.8mmol）をテトラヒドロフラン（30ml）、パラジウム触媒（160mg、0.14mmol）、2M炭酸ナトリウム水溶液（20ml）を加え、N2置換下、5時間還流した。反応溶液を水に注ぎ、クロロホルムで抽出を行い、クロロホルム溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、ろ液を減圧乾固した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて生成した（収量：1.15g、収率：78%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 8.74-8.71(1H, d), 8.67-8.65(1H, d), 8.62-8.59(1H), 8.26-8.23(1H, d), 7.97-7.88(3H, m), 7.86(1H, s), 7.80-7.67(3H, m), 7.44-7.41(2H)
【化１４】
0005500594.tif 000016
【００４０】
ビス[9-(2'-ベンゾチエニル)-フェナンスリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）の合成
9-ベンゾチエニルフェナンスリジリン（706mg、2.3mmol）、塩化イリジウム三水和物（純度：90％、398mg、1.0mmol）に2-エトキシエタノール（30ml）、水（10ml）を加え、16時間還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体（343mg、0.20mmol）に2-メトキシエタノール（20ml）、アセチルアセトン（1ml）、炭酸ナトリウム（180mg）を加え2時間還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて生成した（収量：293mg、収率：80%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 9.35-9.33(2H, d), 8.72-8.70(2H, d), 8.46-8.44(2H, d), 7.98-7.87(4H, m), 7.85-7.82(2H, d), 7.73-7.70(2H, d), 7.43-7.38(2H, t), 7.20-7.15(2H, t), 7.04-6.99(2H, m), 6.52-6.51(4H, d), 4.50(1H, s), 1.39(6H, s)
【化１５】
0005500594.tif 000017
【００４１】
表１に、(btq)2Ir(acac)、(btiq)2Ir(acac)、(btph)2Ir(acac)の1,2-ジクロロエタン中におけるりん光スペクトルを示す。また、これらの化合物のりん光は酸素濃度依存性を示した（データは示さず）。【００４２】
【表１】
0005500594.tif 000018
【００４３】
参考例１、２、３において、アセチルアセトンの代わりにスクシニルアセトンを用いることにより、それぞれ(btq)2Ir(sa)、(btiq)2Ir(sa)、(btph)2Ir(sa)を得ることができる。そして、合成例において、(btp)2Ir(sa) の代わりに(btq)2Ir(sa)、(btiq)2Ir(sa)、または(btph)2Ir(sa)を用いることにより、C343-Chol-BTQ、C343-Chol-BTIQ、C343-Chol-BTPHを得ることができる。
【００４４】
なお、T1'＞T1である下記化合物を合成してスペクトルを調べたところ、BTPのりん光がけい光に比べて非常に弱くなった。
【化１６】
0005500594.tif 000019
【００４５】
実施例２
C343-Pro4-BTPの合成
下記の手順でC343とBTPをテトラプロリンリンカーで結合させることにより、C343-Pro4-BTPを合成した。
【化１７】
0005500594.tif 000020
【００４６】
C343-Pro4-BTPの発光スペクトル
図７にアセトニトリル中のC343-Chol-BTP （濃度１μM）について、溶存酸素分圧を変えて測定した発光スペクトルを示す。それによると、アルゴン置換条件ではりん光の発光が見られ、酸素存在下ではりん光が消光しているのがわかる。【００４７】
１ｍＭのDMPCを95:5 Tris-HCl:EtOH 中に加えることにより作製されたDMPC脂質二分子膜（リポソーム）中のC343-Pro4-BTP （濃度１μM）について、溶存酸素分圧を変えて測定した発光スペクトルを図８に示す。それによると、酸素分圧の増加とともにりん光のみが消光しているのがわかる。
このプローブは脂溶性かつ、リポソーム中で凝集性を示さないため、細胞膜もしくは細胞内の小器官の膜に取り込まれると考えられる。したがって、細胞内の酸素濃度計測に有効であると考えられた。【００４８】
図９に上記DMPC脂質二分子膜（リポソーム）中のC343-Pro4-BTP（濃度１μM）について、479nmでモニターした蛍光強度と614nmでモニターしたりん光強度の比を酸素分圧に対してプロットした結果を示す。Stern-Volmerの式に基づいた解析から、蛍光とりん光の強度比を測定すれば、溶液中の酸素分圧を計測できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の酸素応答性発光プローブは、ひとつの分子内に短寿命（ナノ秒オーダー）のけい光を発するけい光団と長寿命（マイクロ秒オーダー）のりん光を発するりん光団を有することが特徴である。けい光は寿命が短いために溶存酸素の影響をほとんど受けない。一方、りん光は、寿命が長いため、励起寿命内に酸素分子と衝突し顕著な消光を受ける。従って、例えば、けい光団に緑色の発光を与える分子を、りん光団に赤色の発光を与える分子を用いれば、酸素が存在しないときには、両発光団の発光が混ざり合うために黄色の発光を与え、酸素が存在すると、赤色りん光が消光するため緑色の発光を与えるインテリジェントな発光プローブとなる。さらにこのプローブを用いて発光スペクトルを測定すれば、けい光強度とりん光強度の比を取るレシオ法によって簡便かつ高感度に酸素濃度を定量することができる。
これにより、本発明の酸素応答性発光プローブは分析化学、生命科学、バイオイメージング分野、医療診断、細胞生物学、環境計測などの分野に用いることができる。具体的には、酸素濃度定量試薬、低酸素細胞画像化試薬、低酸素腫瘍診断試薬などとして用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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