(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラベル非依存検出バイオセンサをインターロゲーションする光学インターロゲーションシステムであって、
バイオセンサに向けて光ビームを射出する射出システムと、
前記バイオセンサからの光ビームを収集して当該収集された光ビームを表す信号を出力する受信システムと、
前記受信システムにおける光検出器ピクセルを横切った光学共振の少なくとも一部をオーバーサンプリングし、前記光学共振をスムージングし、かつ当該オーバーサンプリングされかつスムージングされた光学共振に基づいた共振位置または共振セントロイドを演算することによって前記信号の前記光学共振内のピクセレーション振動を減少させるプロセッサと、を含み、
前記プロセッサは、さらに、オーバーサンプリングされかつスムージングされた１の光学共振に基づいて演算された１の共振位置または共振セントロイドと、オーバーサンプリングされかつスムージングされた他の光学共振に基づいて演算された他の共振位置または共振セントロイドとの間のシフトを検出することによって、前記バイオセンサの上面における生物学的事象または生化学的事象を監視することを特徴とする光学インターロゲーションシステム。
【請求項２】
請求項１に記載の光学インターロゲーションシステムであって、前記プロセッサは、
前記光学共振のフーリエ変換を演算し、
前記フーリエ変換にフィルタ関数を乗算し、
当該フィルタリングされた関数の両側に０を加え、
逆フーリエ変換を演算して前記オーバーサンプリングされてスムージングされた光学共振を得ることによって、前記光学共振をオーバーサンプリングしてスムージングすることを特徴とする光学インターロゲーションシステム。
【請求項３】
請求項１に記載の光学インターロゲーションシステムであって、前記プロセッサは、
前記信号内の前記光学共振をオーバーサンプリングして階段関数の如くなし、
ローパスフィルタによって当該オーバーサンプリングされた光学共振をコンボリューションすることによって前記光学共振をオーバーサンプリングしかつスムージングすることを特徴とする光学インターロゲーションシステム。
【請求項４】
請求項１に記載の光学インターロゲーションシステムであって、前記光学共振の少なくとも一部のオーバーサンプリングは、前記光学共振の少なくとも一部を表す前記信号内のデータ点の各々をＮ個のデータ点で置換することを伴うことを特徴とする光学インターロゲーションシステム。
【請求項５】
請求項１に記載の光学インターロゲーションシステムであって、前記プロセッサは、３次スプライン補間プロセスを適用することによって前記光学共振の少なくとも一部をオーバーサンプリングかつスムージングすることを特徴とする光学インターロゲーションシステム。
【請求項６】
請求項１に記載の光学インターロゲーションシステムであって、前記プロセッサは前記光学共振をオーバーサンプリングした後にスムージングするか、または前記プロセッサは前記光学共振をスムージングした後にオーバーサンプリングすることを特徴とする光学インターロゲーションシステム。
【請求項７】
請求項１に記載の光学インターロゲーションシステムであって、前記信号内の光学共振の全体がオーバーサンプリングされかつスムージングされることを特徴とする光学インターロゲーションシステム。
【請求項８】
請求項１に記載の光学インターロゲーションシステムであって、前記光学共振の前記少なくとも一部の前記オーバーサンプリングは、前記光学共振の前記少なくとも一部を表す前記信号内のデータ点の各々の複製を伴い、データ点の各々はΔλの間隔で配され、当該各々のデータ点と同一の信号または強度値を有するＮデータ点が波長においてΔλ／Ｎの間隔で配されることを特徴とする光学インターロゲーションシステム。
【請求項９】
請求項１または８に記載の光学インターロゲーションシステムシステムであって、閾値を有する前記セントロイドは前記閾値の上側の全ての点に関して以下のアルゴリズムを適用することによって演算されることを特徴とする光学インターロゲーションシステム。
Ｙ＞閾値である全てのＹに対して：
Ｙ′＝Ｙ−閾値
セントロイド＝（ΣＸ＊Ｙ′）／（ΣＹ′）
ここで、Ｙは所与の光検出器の応答であり、Ｘは所与の光検出器で測定された波長である。
【請求項１０】
請求項９に記載の光学インターロゲーションシステムであって、前記セントロイド内の前記閾値近傍に位置している前記信号内の前記光学共振の一部がオーバーサンプリングされかつスムージングされることを特徴とする光学インターロゲーションシステム。
【請求項１１】
請求項１０に記載の光学インターロゲーションシステムであって、前記閾値が、ピクセレーション起因の非線形性の不利益を受けることなく光学共振のピークの最大パワーの１０％以上に設定されることを特徴とする光学インターロゲーションシステム。
【請求項１２】
請求項１または９に記載の光学インターロゲーションシステムであって、前記光検出器ピクセルがＣＣＤ(charge‐coupled device)ピクセルであることを特徴とする光学インターロゲーションシステム。
【請求項１３】
ラベル非依存検出バイオセンサをインターロゲーションする方法であって、前記方法が、
バイオセンサに向けて光ビームを射出するステップと、
前記バイオセンサからの光ビームを収集するステップと、
当該収集された光ビームに対応する信号を生成するステップと、
前記収集するステップにおいて光検出器ピクセルを横切った前記光学共振の少なくとも一部をオーバーサンプリングするステップを行い、前記光学共振をスムージングするステップを行い、当該オーバーサンプリングされかつスムージングされた光学共振に基づく共振位置または共振セントロイドを演算するステップを行うことによって、ピクセレーション効果によって生起する前記信号の光学共振における振動を低減するステップと、
オーバーサンプリングされかつスムージングされた１の光学共振に基づいて演算された１の共振位置または共振セントロイドと、オーバーサンプリングされかつスムージングされた他の光学共振に基づいて演算された他の共振位置または共振セントロイドとの間のシフトを検出することによって、前記バイオセンサの上面における生物学的事象または生化学的事象を監視するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記オーバーサンプリングするステップ及び前記スムージングするステップが、
前記光学共振のフーリエ変換を演算し、
前記フーリエ変換にフィルタ関数を乗算し、
当該フィルタリングされた関数の両側に０を追加し、
逆フーリエ変換を演算して前記オーバーサンプリングされかつスムージングされた光学共振を得ることによって実行されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法であって、当該オーバーサンプリングするステップ及び前記スムージングするステップが、
前記信号内の前記光学共振をオーバーサンプリングして階段関数の如くなし、
ローパスフィルタによって当該オーバーサンプリングされた光学共振をコンボリューションすることによって実行されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の方法であって、前記光学共振の少なくとも一部をオーバーサンプリングするステップは、前記光学共振の少なくとも一部を表す前記信号内のデータ点の各々をＮ個のデータ点で置換することを伴うことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１３に記載の方法であって、前記オーバーサンプリングするステップ及び前記スムージングするステップが、３次スプライン補間プロセスを適用することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１３に記載の方法であって、前記オーバーサンプリングするステップ及び前記スムージングするステップは、順序が互いに入れ替え可能であることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１３に記載の方法であって、前記信号内の前記光学共振の全体がオーバーサンプリングされかつスムージングされることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１３に記載の方法であって、前記光学共振の前記少なくとも一部の前記オーバーサンプリングは、前記光学共振の前記少なくとも一部を表す前記信号内のデータ点の各々の複製を伴い、データ点の各々はΔλの間隔で配され、当該各々のデータ点と同一の信号または強度値を有するＮデータ点が波長においてΔλ／Ｎの間隔で配されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１３または２０に記載の方法であって、閾値を有する前記セントロイドは前記閾値の上側の全ての点に関して以下のアルゴリズムを適用することによって演算されることを特徴とする方法。
Ｙ＞閾値である全てのＹに対して：
Ｙ′＝Ｙ−閾値
セントロイド＝（ΣＸ＊Ｙ′）／（ΣＹ′）
ここで、Ｙは所与の光検出器の応答であり、Ｘは所与の光検出器で測定された波長である。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記セントロイド内の前記閾値近傍に位置している前記信号内の前記光学共振の一部がオーバーサンプリングされかつスムージングされることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の方法であって、前記閾値が、ピクセレーション起因の非線形性の不利益を受けることなく光学共振のピークの最大パワーの１０％以上に設定されることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１３または２１に記載の方法であって、前記光検出器ピクセルがＣＣＤ(charge‐coupled device)ピクセルであることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許出願第６０／７８１，３９７号（発明名称「Optimized Method for LID Biosensor Resonance Detection」、出願日２００６年３月１０日）の利益を主張したものであり、当該出願の開示内容は全体として本明細書に含まれている。
【０００２】
本発明は、問題のある寄生反射及び／またはピクセレーション効果の影響を受けずに、ラベル非依存検出（ＬＩＤ）バイオセンサとインターロゲーション可能かつ当該バイオセンサの頂部における生物学的事象をモニタリング可能な光学的インターロゲーションシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
今日、非接触光学センサ技術が生物学的研究の多くの領域に用いられ、増加する精密かつ時間の制約のあるアッセイの実施に役立っている。これらのアッセイにおいて、光学的インターロゲーションシステムは、生体基質がバイオセンサのセンサ領域内にもたらされたときの光学センサの屈折率における変化または光学応答／光学共振の変化をモニタリングするのに利用される。生体基質の存在は、当該物質が物質結合や吸着等のような生化学的反応をひきおこしたときに、バイオセンサの光学共振を変化させる。この光学共振の変化は、費用及び蛍光色素の実験的摂動を完全に回避したラベルフリーアッセイにおいて直接的に生物学的事象をモニタリングすることを可能にする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
光学的インターロゲーションシステムは、バイオセンサにおいて生物学的事象（例えば薬剤が結合してタンパク質になること等）が生起しているかどうかを判定するための、ある種の共振検出アルゴリズムを実施する必要がある。微小な生化学的結合事象を検出可能なことを保証するために、共振検出アルゴリズムは共振スペクトル位置または共振角度位置における微小なシフトを検出するようにデザインされる必要がある。ここにおいて、当該シフトはしばしば共振幅自体の非常に微小な一部である。例えば、共振導波路回折格子バイオセンサの典型的な共振幅は１ｎｍ以下であり得るが、微小な生化学的結合事象はわずか０．００１ｎｍ以下の変化しか示さないだろう。残念ながら、今日において共振検出アルゴリズムの適切な最適化は困難である。なぜなら、バイオセンサ１０２の光学共振の分解能及び線形性には、（１）問題のある寄生反射によって引き起こされる測定ノイズの存在及び／または（２）問題のあるピクセレーション効果によって引き起こされる測定アーティファクト（技術上の原因による不自然な結果）による悪影響があり得るからである。従って、光学インターロゲーションシステムには、問題のある寄生反射及び／またはピクセレーション効果を解決することによって光学共振検出の最適化を可能とする要求がある。この要求及びその他の要求は、本発明の光学インターロゲーションシステム及び方法によって満足される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、問題のある寄生反射及び／またはピクセレーション効果の影響を受けずに、ラベル非依存検出バイオセンサとインターロゲーション可能かつバイオセンサの頂部における生物学的事象のモニタリングが可能な光学インターロゲーションシステムを含む。１つの実施例において、本発明の光学インターロゲーションシステムは、バイオセンサとインターロゲーション可能でありかつローパスフィルタアルゴリズムを使用して光学共振のスペクトルに含まれる問題のある寄生反射をデジタル的に除去し、バイオセンサ上で生物学的事象が生起したかどうかを判定することを容易とすることが可能である。他の実施例において、本発明の光学インターロゲーションシステムは、バイオセンサとインターロゲーション可能でありかつオーバーサンプリング／スムージング（平滑化）アルゴリズムを使用して、問題のあるピクセレーション効果によって引き起こされる評価される光学共振の位置における振動を減衰させ、バイオセンサにおいて生物学的事象が生起したかどうかを判定することを容易とすることが可能である。
【０００６】
本発明のさらに完全な理解は、添付する図とともに後述する詳細な説明を参照することで得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は本発明の２つの異なった実施例に従った機能のために構成された光学インターロゲーションシステムのブロック図である。
【図２】図２は本発明の第１実施例に従って、本発明の第１実施例に従って、本発明の第１実施例に従って、問題のある寄生反射に起因する測定ノイズを如何に減衰させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図３】図３は本発明の第１実施例に従って、問題のある寄生反射に起因する測定ノイズを如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図４】図４は本発明の第１実施例に従って、問題のある寄生反射に起因する測定ノイズを如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図５】図５は本発明の第１実施例に従って、問題のある寄生反射に起因する測定ノイズを如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図６】図６は本発明の第１実施例に従って、問題のある寄生反射に起因する測定ノイズを如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図７】図７は本発明の第１実施例に従って、問題のある寄生反射に起因する測定ノイズを如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図８】図８は本発明の第１実施例に従って、問題のある寄生反射に起因する測定ノイズを如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図９】図９は本発明の第１実施例に従って、問題のある寄生反射に起因する測定ノイズを如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図１０】図１０は本発明の第１実施例に従って、問題のある寄生反射に起因する測定ノイズを如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図１１】図１１は本発明の第２実施例に従って、問題のあるピクセレーション効果に起因する測定アーティファクト如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図１２】図１２は本発明の第２実施例に従って、問題のあるピクセレーション効果に起因する測定アーティファクト如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図１３】図１３は本発明の第２実施例に従って、問題のあるピクセレーション効果に起因する測定アーティファクト如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図１４】図１４は本発明の第２実施例に従って、問題のあるピクセレーション効果に起因する測定アーティファクト如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図１５】図１５は本発明の第２実施例に従って、問題のあるピクセレーション効果に起因する測定アーティファクト如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図１６】図１６は本発明の第２実施例に従って、問題のあるピクセレーション効果に起因する測定アーティファクト如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図１７】図１７は本発明の第２実施例に従って、問題のあるピクセレーション効果に起因する測定アーティファクト如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図１８】図１８は本発明の第２実施例に従って、問題のあるピクセレーション効果に起因する測定アーティファクト如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図１９】図１９は本発明の第２実施例に従って、問題のあるピクセレーション効果に起因する測定アーティファクト如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図２０】図２０は本発明の第２実施例に従って、問題のあるピクセレーション効果に起因する測定アーティファクト如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図２１】図２１は本発明の第２実施例に従って、問題のあるピクセレーション効果に起因する測定アーティファクト如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図２２】図２２は本発明の第２実施例に従って、問題のあるピクセレーション効果に起因する測定アーティファクト如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図２３】図２３は本発明の第２実施例に従って、問題のあるピクセレーション効果に起因する測定アーティファクト如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【図２４】図２４は本発明の第２実施例に従って、問題のあるピクセレーション効果に起因する測定アーティファクト如何に減少させ得るのかの説明の補助として使用される図とグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
図１を参照すると、バイオセンサ１０２をインターロゲーション可能な、本発明に従った光学インターロゲーションシステム１００のブロック図が示されている。示されているように、当該光学インターロゲーションシステムは射出システムを有する。当該射出システムは光源１０４（例えば広域スペクトル光源）を含み、当該光源１０４は光ビーム１０６（例えば白色光１０６）をレンズ化光ファイバ１０８に出力する。当該レンズ化光ファイバはバイオセンサ１０２（例えば回折格子結合光導波路バイオセンサ１０２）に向けて光ビーム１０６を射出する。当該光学インターロゲーションシステムは、バイオセンサ１０２から反射してきた光ビーム１１０を受信するレンズ化光ファイバ１１２を有する受信システム１０３も含む。代替実施例として、射出光ファイバ及び受信光ファイバ１１２は単一本の光ファイバであり得、例示の単一本のファイバインターロゲーションシステムは、本願と同一出願人による米国特許出願第１１／０５８，１５５号（出願日２００５年２月１４日）において開示されている。当該文献の内容は参照されることによって本明細書に含まれている。受信システム１０３は、レンズ化光ファイバ１１２からの反射光ビーム１１０を受信する検出器１１４（例えばスペクトルメータ１１４、ＣＣＤアレイ１４０）を含む。検出器１１４は、信号１１６（スペクトル共振１１７を表したもの）をプロセッサ１１８に出力する。プロセッサ１１８は信号１１６を処理し、問題となる寄生反射及び／またはピクセレーション効果を解決することでスペクトル共振１１７の位置の検出を最適化する。プロセッサ１１８は、バイオセンサ１０２の頂部における生物学的事象（例えばリガントが生物学的結合をして検体になる事象）のモニタリングに使用される最適化された信号１２０を出力する。プロセッサ１１８が信号１１６を最適化する方法は、バイオセンサ１０２の構造及び動作に関しての簡単な説明の後で詳細に記述される。
【０００９】
バイオセンサ１０２は、バイオセンサ１０２の頂面における屈折率の変化を利用する。当該変化は発射された光ビーム１０６及び反射光ビーム１１０の導波路結合特性に影響を与える。これらの変化は、生体基質１２２（例えば細胞、分子、タンパク質、薬剤、化合物、核酸、ペプチド、炭水化物）がバイオセンサの上層１２４（センサ領域１２４）に存在するか否かのような生物学的事象のラベルフリーなモニタリングを可能とする。例えば、生体基質１２２はバイオセンサの上層１２４上に付着せしめられるバルク流体内に通常は存在する。このバルク流体内の生体基質１２２の存在が、バイオセンサの頂面１２６における屈折率を変化させる。
【００１０】
バイオセンサ１０２の機能は、回折格子１２８及び導波路１３０の構造を解析することによって最も良く理解されるであろう。波数ベクトルが以下に記載する式１に示される共振状態を満たすときにのみ、回折格子１２８に向けられた光ビーム１０６は導波路１３０にカップリングする。
【００１１】
【数１】
0005628243.tif 000002
【００１２】
ここにおいてｋｘ′は入射波数ベクトルのｘ成分であり、ｋｘは導波モード波数ベクトルであり、κは格子ベクトルである。格子ベクトルκは回折格子１２８のラインと垂直な方向をもちかつ２π／Λによって与えられる大きさをもつベクトルとして定義される。ここにおいてΛは格子周期（ピッチ）である。このことは、波長λ及び入射角θを用いて式２の様にも表すことができる。
【００１３】
【数２】
0005628243.tif 000003
【００１４】
ここにおいて、θは光ビーム１０６の入射角であり、ｎｉｎｃは入射媒体の屈折率であり、λは光ビーム１０６の波長であり、ｎｅｆｆは導波路１３０の有効屈折率である。導波路１３０は有効屈折率を有し、それは光が導波路１３０を通り抜けて伝播するときに見られる光導波路モード場である屈折率の重みづけられた平均である。当該光導波路モードは、導波路１３０よりも広い空間的な範囲を持つことが好ましく、当該空間的範囲は物質１３２の屈折率に依存する。結果として、当該光導波路モードは、上層１２４（センサ領域１２４）内に広がるエバネッセント波／テール（ｔａｉｌ）を有し、これは生体基質がバイオセンサの頂面に近接したときまたは接触したときに引き起こされる任意の表面変化に感応する。
【００１５】
既述された式２に示された式は、式３に示される様にさらに都合のよい形式で書き直すことができる。
【００１６】
【数３】
0005628243.tif 000004
【００１７】
これは線形方程式で、ｓｉｎθがｙ軸、λがｘ軸、Λｎｅｆｆがｘ切片、−１／Λが傾きである。式３を得るため、式から除去できるようにｎｉｎｃは１に設定される。この近似は空気（ｎ〜１．０００３）が最も標準的な入射媒体故に使用される。この関係は図２に示されるグラフにおいて描画されている。生体基質１２２が表面１２６に結合すると、導波路１２２の屈折率はシフトせしめられ、バイオセンサ１０２の共振波長または共振角の変化が引き起こされる。このシフティングは、図２に示された直線のｘ切片のシフトにおいて見ることができる。
【００１８】
この様なバイオセンサの共振状態（例えば共振波長または共振角）がインターロゲーションされて、バイオセンサ１０２から反射してくる光ビーム１１０の観測によって屈折率の変化が判定される。このような共振導波路回折格子バイオセンサ１０２からの屈折率の変化のモニタリングのための２つの異なった動作モードが存在する−角度インターロゲーションまたは空間インターロゲーション。角度インターロゲーションにおいて、名目上単波長の光ビーム１０６は焦点合わせされて、照射角の範囲を形成して、バイオセンサに内に指向せしめられる。反射光ビーム１１０は検出器１１４（例えばＣＣＤアレイ１１４）によって受信される。バイオセンサ１０２によって反射された共振角度の位置をモニタリングすることによって、バイオセンサ表面１２６上またはその近傍の結合、すなわち屈折率変化をモニタリングすることができる。角度インターロゲーションの概念は、図３において示されたグラフによって図示されている。スペクトルインターロゲーションにおいて、名目上コリメーションされた広帯域光ビーム１０６がバイオセンサ１０２内に供給されていて、反射光ビーム１１０は収集されて検出器１１４（例えばスペクトルメータ１１４）に供給される。共振波長（ピーク）のスペクトル位置の観測によって、バイオセンサ表面１２６上またはその近傍での結合つまり屈折率変化をモニタリングすることができる。スペクトルインターロゲーションの概念は、図４に示されているグラフにおいて図示されている。本発明において、説明の焦点はスペクトルインターロゲーションの方法に置かれているが、本発明はどちらのインターロゲーション法に対しても部分的に使用され得る。さらに、本発明は、バイオセンサ１０２に広域スペクトルを送信し、バイオセンサ１０２から反射される波長を測定する機器構成１００に焦点を当て得る。本発明と同様の概念は、機器構成１００においても使用され得、当該機器構成１００は調節可能な波長源１０４を使用して、バイオセンサ１０２から反射されるパワーを調節可能な波長源１０４の波長の関数として測定する。
【００１９】
干渉縞のフィルタリングについて
バイオセンサ１０２をインターロゲーションすることに関する１つの一般的な問題は、光ビーム１０６がバイオセンサの頂面１２６によって反射されるよりも前に、光ビーム１０６の一部がバイオセンサの基板１３２の第１の面で反射する場合に起きる。光ビーム１０６がバイオセンサの頂面１２６によって反射されると、その一部はバイオセンサの基板１３２の第１の面によってさらに反射され得る。これらの寄生反射１０６’及び１１０は図５において示されている。寄生反射１０６’及び１１０’の存在は、光ビーム１０６’、１１０及び１１０’の受信において、ファブリペロー共振縞と同等な縞１３４の生成を引き起こす。図６は、これらの縞１３４を有するスペクトル共振１１７のスペクトルを示したグラフである。このグラフは、高分解能のスペクトルメータ１１４によって生成され、当該スペクトルメータは縞１３４の周期よりも非常に小さい分解能を有している。
【００２０】
寄生反射１０６’によって起きる縞１３４に関する問題を減らすのに用いられ得る公知の解決方法は、レンズ化ファイバ１０８及び１１２とバイオセンサの基板１３２との間に光アイソレータ１３６を挟む（図１を参照）ことを含む。この解決方法は、本願と同一出願人による米国特許第ＵＳ２００５０２６４８１８号、発明の名称「Optical Interrogation Systems with Reduced Parasitic Reflections and a Method for Filtering Parasitic Reflections」に記載されている。当該文献の内容は本明細書に含まれる。
【００２１】
光アイソレータ１３６は、基板１３２の第１の面から反射してくる寄生反射１０６’をフィルタリングして除去するために良好に機能する。しかし、光アイソレータ１３６は、バイオセンサ１０２内部で生成された寄生反射１１０’をフィルタリングすることはできない。なぜなら、光ビーム１１０は、バイオセンサ１０２内部で反射すると、直線偏光になってしまうからである。結果として、光アイソレータ１３６は、スペクトル共振１１７のテール（ｔａｉｌ）における縞を著しく減衰させるが、（光アイソレータ１３６を使用していない図６と比較して）いくらかの残余変調は観測され得る。
【００２２】
縞１３４の可視性は４つの主要な要素の関数である。第１の要素はスペクトルメータの分解能である。第２の要素はスペクトルメータのピクセルサイズ及び分光に依存する信号サンプリングである。第３の要素はスペクトル共振１１７の幅である。そして、第４の要素は、バイオセンサの基板の厚さ及び屈折率に依存する縞周期である。例えば、図８は中分解能スペクトルメータ１１４（縞周期と同程度の分解能を持つもの）によって実験的に得られたスペクトル共振１１７を示したグラフである。この例において、光学共振幅は約０．９ｎｍ、スペクトルメータ分解能は０．１８ｎｍかつサンプリングは０．０９ｎｍであった。縞周期は約０．３３ｎｍであった。
【００２３】
本発明は、測定された信号１１６／スペクトル共振に対してローパスフィルタ１３８を使用して、共振位置測定の縞１３４の影響を除去／減少させる。ここでは様々な異なるタイプのローパスフィルタ１３８を使うことが可能である。例えば、測定された信号１１６と矩形関数またはガウス関数（例示である）でありうる他の関数との間のコンボリューション積を演算可能なものでもよい。この例示のローパスフィルタ１３８は、以下のように表わされる。
【００２４】
【数４】
0005628243.tif 000005
【００２５】
ｙは信号である。
【００２６】
【数５】
0005628243.tif 000006
【００２７】
はコンボリューション積である。Ｇはフィルタ関数（例えば、ガウス関数、矩形関数（ボックスカー関数）、シンク関数等）である。Ｙ′はフィルタリングされた信号１２０である。
【００２８】
他の例において、ローパスフィルタは測定された信号１１６のフーリエ変換を演算して、このフーリエ変換にフィルタ関数を乗算することが可能である。フィルタリングされた信号１２０は、この積の逆フーリエ変換として得ることができる。この例示のローパスフィルタ１３８は以下のように表わされる。
【００２９】
【数６】
0005628243.tif 000007
【００３０】
ｙは信号である。Ｇはフィルタ関数である。ＦＦＴはフーリエ変換である。
ＦＦＴ−１は逆フーリエ変換である。Ｙ′はフィルタリングされた信号１２０である。
【００３１】
この問題の他の解決方法は、スペクトルメータ１１４解像度を意図的に減少させることから構成されても良い。このことを従来の格子ベースのスペクトルメータ１１４で行う１つの方法は、スペクトルメータの入射スリットまたはファイバの焦点をミスアラインすることを含む。この解決方法は有効であるけれども、測定ノイズが共振幅の平方根に比例する故に好ましい解決方法ではない。従って、スペクトルメータがミスアラインされた場合、スペクトル共振１１７は増加し、スペクトル共振１１７の位置の評価における不確実さも増加する。
【００３２】
ローパスフィルタ１３８を使用する利点を有効にするため、寄生反射縞１３４を含む従来のスペクトル共振１１７が演算される。そして、セントロイドアルゴリズムによって評価される共振位置の実際の共振位置からの最大偏差（または縞エラー効果）が演算される。位相（すなわち共振ピークに関連する位置）が変化することによって縞１１４が共振ピークを横切って動くので、縞エラー効果が光学共振位置の評価において生成される。例えば、セントロイド演算が行われて光学共振位置が評価される。図９は、使用されたローパスフィルタ１３８の幅に応じた縞エラー効果の変化を示したグラフである。
【００３３】
理想的には、寄生縞１３４の有害な影響を抑えるのに十分に広い幅を有するローパスフィルタを使用するべきである。理論上はローパスフィルタ１３８の幅の上限はない。実際には、ローパスフィルタの幅が増加することによって、共振は拡大されかつ測定ノイズはフィルタリングされる。従って、ローパスフィルタ１３８によって共振は拡大するが、共振位置でノイズは影響しない。実際、図９はローパスフィルタの幅の増加後に縞エラー効果がさらには変化しないときに起こるローパスフィルタの幅における限界を示している。図９に示された例において、良好な妥協は５００ｐｍの周辺の幅のローパスフィルタの使用を伴う。
【００３４】
本発明の当該実施例を実施するために、光学インターロゲーションシステム１００と組み合わされたバイオセンサ１０２は２つの条件を満たさなければならないことを注意しなくてはならない。
１．スペクトル共振１１７の幅が縞１３４の周期より著しく大きくされるべきである。これは、信号のフーリエ変換が演算される際に、信号の有効部分に関連する中央のローブが高周波数変調の縞に関連する任意の側帯部ローブから良好に分離されるべきであることと同じである。
２．反射信号１１０は縞１３４の周期よりも著しく短い周期でサンプリングされるべきである。この条件が満たされない場合、縞１３４は、スペクトル共振の見かけ上の低周波数の歪みを生成する。この望ましくない影響はエイリアシングとして良く知られている。
【００３５】
図１０は、光学インターロゲーションシステムを使用してバイオセンサをインターロゲーションし、同時に本発明の第１実施例に関連する問題のある寄生反射１３４によって引き起こされる測定ノイズを減少させるための方法１０００のステップを示したフローチャートである。ステップ１００２で開始され、光学インターロゲーションシステム１００及び特に射出システム１０１がバイオセンサ１０２に向けて光ビーム１０６を射出する。ステップ１００４において、光学インターロゲーションシステム１００及び特に受信システム１０３がバイオセンサ１０２からの光ビーム１１０を収集する。ステップ１００６において、光学インターロゲーションシステム１００及び特にスペクトルメータ１１４が収集された光１１０に対応する信号１１６を生成する。そしてステップ１００８において、光学インターロゲーションシステム１００及び特にプロセッサ１１８が、ローパスフィルタ１３８を信号１１６に施して、スペクトル共振１１７の各々の側帯部に存在する問題のある寄生反射１３４をデジタル的に除去／減少する。
【００３６】
スペクトルメータのピクセレーションについて
本発明が解決する第２の問題は、スペクトルメータ１１４内のＣＣＤピクセルの有限なサイズによるものである。図１に示されているように、光１１０がスペクトルメータ１１４に入り、分散され、ＣＣＤ（ｃｈａｒｇｅ‐ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ）アレイ１４０に送られる。ＣＣＤアレイ１４０内の各々のピクセルは、特定のスペクトル領域にマッピングされる。このことはプロセッサ１１８に、ＣＣＤアレイ１４０が読みだしたときの波長の関数（またはスペクトルメータ１１４内のピクセルの関数）に応じた光の強度を示すスペクトルを得かつ記録することを可能せしめる。記録された光学的な情報はピクセル化される。つまり、スペクトルメータ１１４内のＣＣＤピクセルの幅と等しい幅を各々有する有限のビン（ｂｉｎ）内でサンプリングされるのである。
各々のＣＣＤピクセルが到来する全てのスペクトルエネルギーを効果的に積分する故、スペクトル共振１１７の見かけの形状を歪ませ得る。このようなスペクトルのピクセル化またはサンプル化からの歪曲の例は、図１１に示されている。歪み量は、スペクトル共振１１７のピークに対するＣＣＤピクセルのエッジ部に依存する。よって、スペクトル共振１１７がＣＣＤピクセル群を横切ったとき、スペクトル共振１１７の位置評価における周期エラー関数が引き起こされる。この周期エラー関数つまり「ピクセレーション振動」はＣＣＤピクセルのサイズと等しい周期を有する。周期エラー関数の振幅は、光学共振の幅、ＣＣＤピクセルのサイズ、及びスペクトル共振１１７の位置を演算するために選択された特定のアルゴリズムに依存する。このピクセレーション問題はスペクトル検出法に特有ではなく、任意のサンプリングされたスペクトルに対して実際起こり得る。この問題は、ＣＣＤアレイを使用して反射角度強度を空間的にサンプリングする角度インターロゲーションシステムにおいても見られる。
【００３７】
有限なＣＣＤピクセルサイズによる周期エラーを演算するために、理論上のスペクトル共振１１７が各々のＣＣＤピクセルに亘ってシミュレーションされかつ積分される。閾値よりも上の全ての点に対する以下のアルゴリズムの使用によってスペクトル共振１１７のセントロイドが演算される。
Ｙ＞閾値である全てのＹに対して：
Ｙ′＝Ｙ−閾値
セントロイド＝（ΣＸ＊Ｙ′）／（ΣＹ′）
ここで、Ｙは所与のＣＣＤピクセルの応答で、Ｘは所与のＣＣＤピクセルで測定された波長である。閾値は、スペクトル共振１１７部ではない背景の排除を目的とする。このアルゴリズムに対する閾値の概念は図１２に図示されている。
【００３８】
このアルゴリズムによって演算されるセントロイドは、ＣＣＤアレイ上のスペクトル共振１１７の位置の関数である。図１３は、スペクトル共振の実際の位置とアルゴリズムの光学共振の位置の評価との間の偏差である周期エラー関数を示したグラフである。この周期エラー関数は０．８５ｎｍの共振幅及び０．０９ｎｍのピクセルサイズを仮定することで得られている。さらに、スペクトル共振１１７は０．２７ｎｍ移動すると仮定され、閾値は光学共振のピークにおける最大パワーの２５％に設定される。
【００３９】
ピクセレーションエラーを最小化するのに用いられる１つの方法は閾値を減少させる（低下させる）ことを含む。図１４は閾値の関数として演算されたピクセレーションエラーを示した図である。図から明らかなように、閾値が減少すると、共振位置の演算に含まれるであろう信号エネルギ量が増大しかつ位置評価がさらに正確になる。対照的に、閾値を高くすることで共振位置の演算に含まれるだろう信号エネルギは減少しかつ位置評価の正確性は減少する。
【００４０】
しかし、閾値減少に伴う問題はセントロイドが演算される波長窓が非常に大きくなってしまうことである。このことで、セントロイド演算がスペクトル共振１１７からのエネルギをさらに含むことはないが、実際の光学インターロゲーションシステム内に常時存在するノイズ源（例えば検出器の暗電流）からのエネルギを含んでしまうのである。さらに、閾値がさらに下がれば下がるほど、共振増幅が低下する故に非常に少ない増加量の追加エネルギのみが加えられることになるが、演算において使用されるバンド幅（例えばＣＣＤピクセルの数または波長幅が含まれる）でノイズが通常通り増幅されてしまう故に多量のノイズエネルギが加えられてしまう。このように、閾値を０まで下げてピクセレーションに起因するエラーを回避することは、ノイズの量を非常に大きく増大させて光学共振位置の評価を害する。
【００４１】
測定ノイズにおける閾値の影響の説明のために、図１５は測定ノイズにおける閾値減少の影響の理論モデルを示している。そして、セントロイドの演算実験における閾値上昇の影響は図１６のグラフにおいて示されている。この実験において、マイクロウェルプレートに配されかつ水に浸漬している３８４個の共振導波路格子センサ１０２の１０分測定はシステムノイズの評価に使用される。閾値の上昇がシステムの性能を高めることを明確に見ることができる。しかし、閾値が上昇するとピクセレーションに起因するエラーが問題になる。
【００４２】
代替のアルゴリズムはセントロイドアルゴリズムに加えて、このピクセレーションに起因するエラーを除去するために従来用いられてきた。これらの代替アルゴリズムの例には、制限するわけではないが、（１）公知の共振形状へのピークフィッティング、（２）ナイフエッジ関数の使用、（３）公知の共振形状に関する補正関数の使用を含む。これらのアルゴリズムのいくつかは、ＣＣＤピクセルによって行われる信号エネルギの積分を実質的に「行わない」ことによってデータのピクセレーションを除去しようとする。しかし、これらのアルゴリズムの全ても、セントロイドアルゴリズムに関連する同様の問題からまだ影響を受ける。アルゴリズムが閾値を使用しないならば、スペクトル共振１１７のテール（Ｔａｉｌ）１３４は演算に含まれて測定ノイズは増加する。アルゴリズムが閾値を使用するならば、セントロイドアルゴリズムと同様の周期エラー関数が観測される。
【００４３】
本発明はこの問題を、スペクトル共振１１７を数値的に「オーバーサンプリング」して、「オーバーサンプリングされた」信号全体のセントロイドを演算することで解決する。このオーバーサンプリングは、オリジナルの点と同じ信号または強度値で各々のデータ点をＮ個のデータ点に複製するが、オリジナルのデータ間隔ΔλよりもむしろΔλ／Ｎのステップにて波長（ピクセルナンバ）において配する。このようにして、データアレイが要素Ｎによって拡張される。このようなオーバーサンプリングプロセス１４２は図１７において示されている。
【００４４】
データがオーバーサンプリングされると、ローパスフィルタ（第１実施例の中で示した１つのようなもの）、補間法または他のスムージング操作が使用される。そして、スムージングされた信号上でセントロイドが演算される。代替として、スムージング操作はオーバーサンプリングプロセス中において行われても良い。そして、スペクトル共振１１７がＣＣＤピクセルを横切って移動するときにピクセレーションに起因する振動によって起きるエラーが減少または除去される。このピクセレーションに起因する振動の除去は、オーバーサンプリング及びフィルタリングがスペクトル共振１１７全体において行われた場合または共振曲線を横切っているセントロイド（図１２を参照）内の閾値の近辺だけで行われた場合に完遂され得ることも重要である。
【００４５】
当然ながら、この技術は単にピクセレーションの影響を減少するのに使用され得る技術ではない。本発明に従って、信号のオーバーサンプリング（及び必要なフィルタリング）に使用できるいくつかの例示的なアルゴリズムは以下の通りである。
【００４６】
アルゴリズム例１：３次スプライン補完を使用するオーバーサンプリング：
○３次スプラインはオーバーサンプリング及びスムージングの両方を達成する。なぜならば３次スプライン技術において補間は陰関数だからである。従って、追加のローパスフィルタは必要ない。
【００４７】
アルゴリズム例２：フーリエ法：
○スペクトル共振１１７のフーリエ変換を演算する。
○ローパスフィルタ関数を乗じて縞１３４をフィルタリングし、高周波数のパワーを除去する。
○フィルタリングされた関数の左側と右側に０を加える。
○逆フーリエ変換を演算してフィルタリングされた／オーバーサンプリングされた光学共振１２０を得る。
【００４８】
アルゴリズム例３：ステップ関数：
○スペクトル共振１１７をオーバーサンプリングして階段関数の様にする。
○ガウス関数のようなフィルタ関数によってオーバーサンプリングされた光学共振をコンボリューションする。これで縞１３４をフィルタリングしかつオーバーサンプリングされた光学共振の段差をスムージングする。
【００４９】
図１８は、オーバーサンプリングによって及びオーバーサンプリングによらず生成される周期エラー関数の演算を示したグラフである。約２．５ｐｍの変化を示す関数１８０２はセントロイドアルゴリズムのみで演算される（図１３も参照）。そして、２つの異なる関数１８０４（♯ピクセル毎のオーバーサンプル数＝５）及び１８０６（♯ピクセル毎のオーバーサンプル数＝６）は本発明に従ったオーバーサンプリングプロセス１４２によって演算される。
【００５０】
オーバーサンプリングプロセスを有効にするために、実験はＬＩＤマイクロプレートで行われる。実験において、温水がセンサウェルの１つの中に入れられて、スペクトル位置が時間に亘って変化するスペクトル共振１１７を生成する。そして、光ファイバビームスプリッタを使用して、反射光が分配され８つの異なるスペクトルメータ内に送られる（この配置は図示せず）。検出されたスペクトル共振１１７に縞１３４及びピクセレーションのような測定エラーがない場合、８つのセントロイドは各々のスペクトルメータの任意のコンスタントなオフセット内でお互いを完全にトラッキングするべきである。
【００５１】
図１９は、８台のスペクトルメータによって観測されたセントロイドの評価を示したグラフであり、フィルタリングまたはオーバーサンプリングをすることなく、セントロイドアルゴリズムを直接的に使用して演算されている。この場合、各々のスペクトルメータの第１の測定に０波長シフトの値を割り当てることで、コンスタントなオフセット（キャリブレーション）は各々のスペクトルメータから除去される。結果として、その後の測定は全て開始時の波長に対するシフトとして測定される。図に示されているように、温水が加えられた時には下向きの初期スパイクが存在し、その後はセンサの上の水が冷却されて、波長が指数関数的にゆっくりと上昇する。図に示されているように、８台のスペクトルメータ全てが非常に類似した波長シフトを観測している。実際、図１９に示されているスケールにおいては、８個の軌跡は互いの上に「ほとんど」完全に重なっている。
【００５２】
一瞥すればこれは良好であると思われる。しかし、光学検出システム１００がＲＷＧセンサ１０２（共振波長格子センサ１０２）をインターロゲーションするとき、微小な波長測定の相違がエンドユーザにとって深刻なものとなる。例えば、微小な生化学的結合信号が、バルク屈折率変化における大きな変化上に重なっているとする。そうすると、バルク屈折率変化を参照外にするために、１台のスペクトルメータはウェル内のセンサ１０２の生化学的結合とバルク屈折率シフトを加えたものの観測に使用され得る。そして、他のスペクトルメータは生化学的結合が無いが前記同様のバルク屈折率溶液が加えられた制御ウェル内のセンサ１０２の観測に使用され得る  両方のスペクトルメータが正確に同じバルク屈折率変化を記録したならば、２つの信号を減算することでバルク屈折率シフトは参照外にされ得、関心のある生化学的結合のシフトだけを取り出すことができる。残念なことに、当該結合信号が１ｐｍ程度の大きさであり得る一方で、バルク屈折率変化は１００ｐｍ（１０−３ＲＩＵ）程度の大きさであり得る。この場合、両方のスペクトルメータは１ｐｍよりも非常に高い（バルク屈折率シフトの１％よりも非常に高い）精度を出すために同じバルク屈折率変化を記録しなければならない。さもなければ１ｐｍの結合信号は測定の不正確性に飲み込まれてしまうだろう。スペクトルメータまたはアルゴリズムの〜１００ｆｍレベルに対する応答の線形性を保障することは重要である。
【００５３】
このような良好なスケールにおける各々のスペクトルメータのピーク位置エラーを視覚化するために、各々のスペクトルメータによって演算されたピーク位置と８個の全てのスペクトルメータによって演算されたピーク位置の平均値との差（つまり残余）を演算することが可能である。図２０は、このような残余エラー関数を示したグラフである。スペクトルメータ間の相違はピークと谷までで３ｐｍのオーダーで観測され得、これは光学インターロゲーションシステム１００の所望の線形要求をはるかに上回っている。この問題は本発明によって解決される。
【００５４】
ローパスフィルタ（オーバーサンプリング無）が同じデータセットに使用される場合、残余エラー関数２１０２は図２１のグラフにおいて示されているように得られる。図に示されたように、周期エラーの増幅は減少せしめられるが、スペクトルメータのピクセルのサイズに対応したほぼ０．０９ｎｍの周期の周期エラーが残存する。この周期エラーはスペクトルのピクセレーション故にかつ２５％の閾値が使用されている故に残存する。しかし、Ｎ＝５でデータをオーバーサンプリングして５００ｐｍの幅のローパスフィルタを使用すると、図２１に示された残余エラー関数２１０４を得るだろう。この場合、残余エラー関数２１０４の増幅は５０ｆｍのレベルまで劇的に減少する。この点を説明するために図２２が作成され、オーバーサンプリング／ローパスフィルタアルゴリズムが使用された後の８台すべてのスペクトルメータ残余エラー関数を、図２０のグラフに使用されたものと同じスケールにおいて示している。図示されているように、本発明のオーバーサンプリング／ローパスフィルタアルゴリズムが使用された場合の改善が見られる。この例において、ある標準偏差におけるノイズは０．０３ｐｍまで減少せしめられた。
【００５５】
オーバーサンプリング／ローパスフィルタアルゴリズムが使用された場合の、測定ノイズにおいて用いられ得る異なる閾値の影響を説明するための参照図は図２３に作られている。図２３は、閾値が増加した場合にノイズが如何に減衰され得るかを表したグラフである。オーバーサンプリングベースのアルゴリズムの使用によってのみ、非線形性に起因するピクセレーションの不利益を受けること無く閾値を１０％及びそれ以上まで増加させることが可能である。従って、このようなアルゴリズムは非線形性を減少させるために重要なだけでなく、閾値を増加させることを可能にするために重要かつ光学インターロゲーションシステム１００から最適なノイズパフォーマンスを得るために重要である。
【００５６】
図２４は、光学インターロゲーションシステム１００に使用してバイオセンサ１０２とインターロゲーションし、同時に問題のあるピクセレーション効果に起因する測定アーティファクトの減少させるための本発明の第２実施例に従った方法２４００のステップを示したフローチャートである。ステップ２４０２で開始され、光学インターロゲーションシステム１００及び特に射出システム１０１が光ビーム１０６をバイオセンサ１０２に向けて射出する。ステップ２４０４で、光学インターロゲーションシステム１００及び特に受信システム１０３がバイオセンサ１０２からの光ビーム１１０を収集する。ステップ２４０６で、光学インターロゲーションシステム１００特にスペクトルメータ１１４が収集された光ビーム１１０に対応する信号１１６を生成する。そしてステップ２４０８で、光学インターロゲーションシステム１００及び特にプロセッサ１１８が、（ａ）スペクトル共振１１７の少なくとも一部をオーバーサンプリングし、（ｂ）スペクトル共振１１７をスムージングし、（ｃ）スムージングされオーバーサンプリングされたスペクトル共振１１７に基づいた共振位置または共振セントロイドを演算することによってピクセレーション振動を減衰させる。共振位置または共振セントロイドは、任意のピーク位置決めルーティン（例えば、公知の共振形状、補正関数または重みづけされた（または高次の）セントロイドナイフエッジにピークをフィッティングするルーティン）を使用して演算され得る。オーバーサンプリングステップ及びスムージングステップは置き換え可能であることが理解されるべきである。
【００５７】
前述より、本発明はＬＩＤセンサ及び特に寄生縞のフィルタリング及び検出器のピクセルサイズの制限によって生成される検出エラーの最小化の方法に使用できるピーク検出アルゴリズムに関していることが当業者によって理解されるべきである。このアルゴリズムは、寄生縞フィルタリング及びセンサピクセルサイズの問題がある広域スペクトルインターロゲーションＬＩＤ機器に使用されている。しかし、このアルゴリズムは：（１）調整可能なレーザによって共振導波路回折格子とインターロゲーションする；（２）共振導波路回折格子センサと角度法でインターロゲーションする；（３）スペクトル法または角度法のどちらかで表面プラズモン共振センサとインターロゲーションする他の機器アーキテクチャにも使用できる。
【００５８】
本明細書に記述されている好ましいバイオセンサ１０２の構造についての更に詳しい議論のために、以下の文献が参照される。
・米国特許第４，８１５，８４３号、発明の名称「Optical Sensor for Selective Detection of Substances and/or for the Detection of Refractive Index Changes in Gaseous, Liquid, Solid and Porous Samples」
・K.Tiefenthaler らによる「Integrated Optical Switches and Gas Sensors」Opt. Lett. 10、No. 4、１９８４年４月、１３７−１３９ページ
これらの文献の内容は参照されることによって本明細書に含まれている。
【００５９】
本発明の様々な実施例は添付の図に図示されかつ前述の詳細な説明に記述されているが、本発明は開示された実施例に限定されるものではなく、数値的な再構成、変更及び置換は前述されかつ特許請求の範囲によって画定される本発明の精神から逸脱することなく行うことが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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