(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコセレブロシドの蓄積に関連するリソソーム蓄積障害を発症する危険性があるか、または前記障害であると診断された患者においてそれを予防および／または治療するための医薬であって、５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、またはこれらの薬学的に許容可能な塩、もしくは溶媒和物、またはこれらの２つ以上の任意の組み合わせを含む医薬。
【請求項２】
前記リソソーム蓄積障害がグルコセレブロシダーゼの欠乏に関連する、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記リソソーム蓄積障害がグルコセレブロシダーゼの変異に関連する、請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項５】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、または
その薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項６】
前記リソソーム蓄積障害がニーマンピック病またはゴーシェ病である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項７】
有効量の少なくとも１つの他の治療薬が投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項８】
前記少なくとも１つの他の治療薬がイミグルセラーゼまたは１，５−（ブチルイミノ）−１，５−ジデオキシ−Ｄ−グルシトールである、請求項７に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、またはこれらの薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、またはこれらの２つ以上の任意の組み合わせを用いる、リソソーム蓄積障害の予防および／または治療方法を提供する。特に、本発明はゴーシェ病の予防および／または治療方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
リソソーム蓄積障害はリソソーム機能の欠損によって引き起こされ、細胞のリソソーム内に物質の蓄積が生じる。この欠損は、通常、脂質、グリコーゲン、糖タンパク質、またはムコ多糖の代謝のために必要とされる単一の酵素の欠乏の結果である。最も一般的なリソソーム蓄積障害であるゴーシェ病は、糖脂質グルコセレブロシド（グルコシルセラミドとしても知られている）の蓄積を特徴とする。ゴーシェ病の症状には、脾腫および肝腫大、肝機能不全、骨格障害および骨病変（痛みを伴うことがある）、重篤な神経学的合併症、リンパ節および隣接関節（時々）の腫脹、腹部の膨張、茶色がかった皮膚の着色、貧血、低血小板、ならびに強膜の脂肪性黄色沈着物が含まれる。さらに、ゴーシェ病を患っている人々は感染症の影響をより受けやすいこともある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
より高い生活の質を患者に提供すると共により良い臨床結果を達成する、リソソーム蓄積障害の予防および／または治療方法が必要とされている。特に、より高い生活の質を患者に提供すると共により良い臨床結果を達成する、ゴーシェ病の予防および／または治療方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、リソソーム蓄積障害を発症する危険性があるか、または中枢神経系の変性障害であると診断された患者においてそれを予防および／または治療するための方法を提供し、本方法は、それを必要としている患者に、５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、またはこれらの薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、またはこれらの２つ以上の任意の組み合わせである有効量の治療薬を投与することを含む。一実施形態では、本方法は、５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくはプロドラッグを投与することを含む。一実施形態では、本方法は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくはプロドラッグを投与することを含む。一実施形態では、本方法は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール塩酸塩を投与することを含む。一実施形態では、本方法は、５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくはプロドラッグを投与することを含む。一実施形態では、本方法は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくはプロドラッグを投与することを含む。一実施形態では、本方法は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオールを投与することを含む。一実施形態では、本方法は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオールを投与することを含む。一実施形態では、リソソーム蓄積障害は少なくとも１つの糖脂質の蓄積に関連する。一実施形態では、リソソーム蓄積障害は少なくとも１つのスフィンゴ糖脂質の蓄積に関連する。一実施形態では、リソソーム蓄積障害はグルコセレブロシドの蓄積に関連する。一実施形態では、リソソーム蓄積障害はグルコセレブロシダーゼの欠乏に関連する。一実施形態では、リソソーム蓄積障害はグルコセレブロシダーゼの変異に関連する。一実施形態では、リソソーム蓄積障害はニーマンピック病である。一実施形態では、リソソーム蓄積障害はゴーシェ病である。一実施形態では、本方法はさらに、有効量の少なくとも１つの他の治療薬を投与することを含む。一実施形態では、本方法は、少なくとも１つの他の治療薬がイミグルセラーゼまたは１，５−（ブチルイミノ）−１，５−ジデオキシ−Ｄ−グルシトールであることを含む。
【０００５】
また本発明は、ゴーシェ病を発症する危険性があるか、またはパーキンソン病であると診断された患者においてそれを予防および／または治療するための方法も提供し、本方法は、それを必要としている患者に、有効量の（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、またはこれらの薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、またはこれらの２つ以上の任意の組み合わせを投与することを含む。一実施形態では、本方法は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくはプロドラッグを投与することを含む。一実施形態では、本方法は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール塩酸塩を投与することを含む。一実施形態では、本方法は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくはプロドラッグを投与することを含む。一実施形態では、本方法は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオールを投与することを含む。一実施形態では、本方法はさらに、有効量の少なくとも１つの他の治療薬を投与することを含む。一実施形態では、少なくとも１つの他の治療薬は、イミグルセラーゼまたは１，５−（ブチルイミノ）−１，５−ジデオキシ−Ｄ−グルシトールである。
【０００６】
また本発明は、
・ 有効量の５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、またはこれらの薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、またはこれらの２つ以上の任意の組み合わせを有する容器と、
・ この容器を用いてリソソーム蓄積障害を予防および／または治療するための使用説明書と
を含むキットも提供する。一実施形態では、リソソーム蓄積障害はゴーシェ病である。
【０００７】
また本発明は、５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、またはこれらの薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、またはこれらの２つ以上の任意の組み合わせを用いて、細胞内のグルコセレブロシダーゼの活性を生体外で増強するための方法も提供する。
【０００８】
さらに、本発明は、リソソーム蓄積障害を発症する危険性があるか、またはリソソーム蓄積障害であると診断された患者からの細胞を、５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、またはこれらの薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、またはこれらの２つ以上の任意の組み合わせである治療薬と生体外で接触させることと、細胞のライセートをリソソームグルコセレブロシダーゼ活性についてアッセイすることとを含む、治療可能な患者の診断方法を提供し、治療薬で処置されていない別の細胞に対するリソソームグルコセレブロシダーゼ活性の増大によって、患者が治療可能であり得ることが示される。一実施形態では、リソソーム蓄積障害はゴーシェ病である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】単回の３０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基相当）の経口用量の酒石酸ＩＦＧまたは化合物Ａの塩酸塩形態を投与したマウスにおける、参照化合物（ＩＦＧ）および試験化合物の（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール（本明細書では、化合物Ａと称する）の血漿中レベルを示す。
【図１Ｂ】単回の３０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基相当）の経口用量の酒石酸ＩＦＧまたは化合物Ａの塩酸塩形態を投与したマウスにおける、参照化合物（ＩＦＧ）および試験化合物（化合物Ａ）の脳内レベルを示す。
【図１Ｃ】単回の３０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基相当）の経口用量の酒石酸ＩＦＧまたは化合物Ａの塩酸塩形態を投与したマウスにおける、参照化合物（ＩＦＧ）および試験化合物（化合物Ａ）の脳内レベル対血漿中レベルの比率を示す。
【図２】単回の３０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基相当）の経口用量の酒石酸ＩＦＧまたは化合物Ｂの遊離塩基を投与したマウスにおける、参照化合物（ＩＦＧ）および試験化合物の（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール（本明細書では、化合物Ｂと称する）の脳内レベルを示す。
【図３】Ａ〜Ｄは、それぞれ、（ｉ）対照媒体、（ｉｉ）１００ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基相当）の参照化合物（酒石酸ＩＦＧ）、または（ｉｉｉ）１０もしくは１００ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基相当）の試験化合物（化合物Ａの塩酸塩形態）の９回の用量からなる２週間の投薬計画で投与したＣ５７ＢＬ／６マウスの脳、脾臓、肝臓および肺内のＧＣａｓｅのレベルを示す。これらの図中のバーの上に見られる値は、対照よりも何倍増大したかを表すことに留意する。同様に、これらの図中では、記号「＊」は対照と比較したｔ検定でｐ＜０．０５を表し、記号「＃」は、参照化合物（酒石酸ＩＦＧ）で処置したマウスと比較したｔ検定でｐ＜０．０５を表す。
【図４】Ａ〜Ｄは、それぞれ、（ｉ）対照媒体、（ｉｉ）１００ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基相当）の参照化合物（酒石酸ＩＦＧ）、または（ｉｉ）１、３、１０、３０もしくは１００ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基相当）の試験化合物（化合物Ａの塩酸塩形態）の９回の用量からなる２週間の投薬計画で投与したＣ５７ＢＬ／６マウスの脳、脾臓、肝臓および肺内のＧＣａｓｅのレベルを示す。これらの図中のバーの上に見られる値は、対照よりも何倍増大したかを表すことに留意する。同様に、これらの図中では、記号「＊」は対照と比較したｔ検定でｐ＜０．０５を表し、記号「＃」は、参照化合物（酒石酸ＩＦＧ）で処置したマウスと比較したｔ検定でｐ＜０．０５を表す。
【図５】Ａ〜Ｄは、それぞれ、（ｉ）対照媒体、（ｉｉ）１０もしくは１００ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基相当）の参照化合物（酒石酸ＩＦＧ）、または（ｉｉｉ）１０もしくは１００ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基相当）の試験化合物（化合物Ｂ）の９回の用量からなる２週間の投薬計画で投与したＣ５７ＢＬ／６マウスの脳、脾臓、肝臓および肺内のＧＣａｓｅのレベルを示す。これらの図中のバーの上に見られる値は、対照よりも何倍増大したかを表すことに留意する。同様に、これらの図中では、記号「＊」は対照と比較したｔ検定でｐ＜０．０５を表し、記号「＃」は、参照化合物（酒石酸ＩＦＧ）で処置したマウスと比較したｔ検定でｐ＜０．０５を表す。
【図６Ａ】単回の静脈内用量の３ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基相当）の化合物Ａの塩酸塩形態を投与したラットにおける、試験化合物（化合物Ａ）の血漿中レベルを示す。
【図６Ｂ】単回の経口用量の１０、３０、または３００ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基相当）の化合物Ａの塩酸塩形態を投与したラットにおける、化合物Ａの血漿中レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書で使用される場合、次の用語は、以下で説明される定義を有するものとする。
【００１１】
本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、言及された障害に関連する１つまたは複数の症状を寛解させることを意味する。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「予防する」という用語は、言及された障害の症状を軽減することを意味する。
【００１３】
本明細書で使用される場合、「有効量」という語句は、言及された障害を発症する危険性があるか、または言及された障害であると診断された患者を予防および／または治療し、従って所望の治療効果をもたらすために有効な量を意味する。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は哺乳類（例えば、ヒト）を意味する。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「リソソーム蓄積障害」という語句は、リソソーム中に基質の蓄積をもたらす異常代謝から生じる疾患群のいずれかを指す。表１は、例示的なリソソーム蓄積障害およびそれに関連する欠損酵素の非限定的な一覧を含む。
【００１６】
【表１】
0005645918.tif 000002
【００１７】
最も一般的なリソソーム蓄積障害であるゴーシェ病は、糖脂質グルコセレブロシド（グルコシルセラミドとしても知られている）の蓄積を特徴とする。神経障害の不在（１型）または幼児期の神経障害の存在（２型）または青年期の神経障害の存在（３型）によって示されるゴーシェ病の３つの表現型が記載されている。例えば、Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ，Ｇａｕｃｈｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｄｖ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １９９３年，２１：３７７−４４１を参照されたい。
【００１８】
ゴーシェ病の３つの型は、常染色体劣性様式で遺伝する。子供が罹患するためには両親共にキャリアでなければならない。両親が共にキャリアであれば、それぞれの妊娠で、子供が罹患する機会は４人に１人、すなわち２５％である。変異のキャリアかもしれない家族に対しては、遺伝カウンセリングおよび遺伝子検査が推奨される。それぞれの型は特定の変異に連結している。ゴーシェ病を生じる既知の変異は全部で約８０存在する（例えば、ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｖ．Ａ．：Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ．Ａ  Ｃａｔａｌｏｇ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８年（第１２版）を参照）。
【００１９】
１型ゴーシェ病は汎民族性（ｐａｎｅｔｈｎｉｃ）であるが、特にアシュケナージ系ユダヤ人家系の人々の間で広がっており、アシュケナージ系ユダヤ人のキャリア率は１７人に１人である。Ｎ３７０Ｓおよび８４ＧＧ変異はアシュケナージ系ユダヤ人の間で最も頻度の高いグルコセレブロシダーゼ遺伝子の変異であり、全般的に健康なアシュケナージの人々において、Ｎ３７０Ｓについては１７．５人に１人、そして８４ＧＧについては４００人に１人の割合であり、それぞれ軽度および重度のゴーシェ病に関連する。８４ＧＧ変異は、アシュケナージ系ユダヤ人の間でほぼ例外なく生じる。ゴーシェ病を有するアシュケナージ系の患者において同定される他のまれなグルコセレブロシダーゼ遺伝子の変異形には、Ｌ４４４Ｐ、ＩＶＳ２＋１Ｇ→Ａ、Ｖ３９４Ｌ、およびＲ４９６Ｈが含まれる。アシュケナージ系ユダヤ人における１型ゴーシェ病の提示とは対照的に、日本人の患者では、１型ゴーシェ病は重篤かつ進行性になりがちである（Ｉｄａら，Ｔｙｐｅ  １  Ｇａｕｃｈｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ：Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈｉｓｔｏｒｙ  ｉｎ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１９８４年，２４（５）：７３−８１を参照）。さらに、グルコセレブロシダーゼ遺伝子変異形Ｌ４４４Ｐの１つまたは２つのコピーに関連する３型ゴーシェ病はノールボッテン地方からのスウェーデン人の患者において広く見られる。
【００２０】
ゴーシェ病の確定診断は遺伝子検査により行われる。多数の異なる変異が存在するので、診断を確認するためにグルコセレブロシダーゼ遺伝子の配列決定が必要とされることもある。出生前診断が利用可能であり、既知の遺伝的危険因子がある場合には有用である。しかしながら、ゴーシェ病の診断は、アルカリホスファターゼ、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）および免疫グロブリンの高レベルなどの生化学的異常によって、あるいは「縮れた紙（ｃｒｉｎｋｌｅｄ  ｐａｐｅｒ）」細胞質および糖脂質を含んだマクロファージを示す細胞分析によっても暗示され得る。特に、ニーマンピック病は、グルコセレブロシドに加えてＧＭ２−ガングリオシドおよびＧＭ１−ガングリオシドの蓄積を特徴とする点で類似している（Ｖａｎｉｅｒら，Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．１９９８年，８：１６３−７４）。
【００２１】
ゴーシェ病の症状には以下のものが含まれる：
・  痛みのない肝腫大および脾腫（脾臓の大きさは、通常の大きさが５０〜２００ｍｌであるのとは対照的に、１５００〜３０００ｍｌであり得る）
・  脾機能亢進症：血液細胞の急速で早期の破壊であり、貧血、好中球減少および血小板減少（感染症および出欠の危険性の増大を伴う）を起こす
・  肝硬変（まれである）
・  神経症状はいくつかの型のゴーシェ病にのみ発生する（以下を参照）：
・  ＩＩ型：重篤な痙攣、筋緊張亢進、精神遅滞、無呼吸
・  ＩＩＩ型：ミオクローヌスとしても知られている筋攣縮、痙攣、認知症、眼筋の失行
・  骨粗鬆症：グルコシルセラミドの蓄積により７５％が目に見える骨異常を発症する、三角フラスコの形状の大腿遠位の変形が一般的に記載されている
・  黄褐色の皮膚の色素沈着
【００２２】
化学合成
ａ．イソファゴミン（ｉｓｏｆａｇｏｍｉｎｅ）（ＩＦＧ、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（ヒドロキシメチル）−３，４−ピペリジンジオール））
イソファゴミン（ＩＦＧ、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（ヒドロキシメチル）−３，４−ピペリジンジオール））は、以下の構造：
【化１】
0005645918.tif 000003
を有する化合物を指す。イソファゴミンの合成は、参照によって本明細書中に援用される米国特許第５，８４４，１０２号明細書（Ｓｉｅｒｋｓら）の１７欄５３行目〜２０欄６行目、および参照によって本明細書中に援用される米国特許第５，８６３，９０３号明細書（Ｌｕｎｄｇｒｅｎら）の実施例１、５欄２０行目〜７欄３３行目に記載されている。ＩＦＧおよびＰｌｉｃｅｒａＴＭとしても知られている酒石酸イソファゴミンにはＣＡＳ番号９１９３６４−５６−０が割り当てられている。酒石酸イソファゴミンの調製は、米国特許出願公開第２００７／０２８１９７５Ｉの段落［００４６］〜［００５０］に記載されており、酒石酸イソファゴミンの精製は、段落［００５１］〜［００５３］に記載されており、これらはいずれも特に参照によって本明細書中に援用される。
【００２３】
ｂ．（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール塩酸塩の合成
【化２】
0005645918.tif 000004
【００２４】
（４ａＲ，８Ｒ，８ａＲ）−６−ベンジル−２，２−ジメチルヘキサヒドロ−４Ｈ−［１，３］ジオキシノ［５，４，ｃ］ピリジン−８−オール（２）。
乾燥ＤＭＦ（７５ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ−５−（ヒドロキシメチル）ピペルジン−３，４−ジオール（１）（５．９ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（６．４ｇ、４６．０ｍｍｏｌ）を添加した後、塩化ベンジル（４．８ｍＬ、４２．０ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を７０℃に１４時間加熱し、その時点で、ｔｌｃにより出発材料を検出できなかった。溶媒を真空中で蒸発させ、残渣を最小量の水中に再び溶解させた。溶液をＥｔＯＡｃで１０〜１２回抽出し、合わせた抽出物をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過した。ろ液を真空中で蒸発させて、さらに精製することなく使用することができる黄褐色の固体として表題化合物（７．５ｇ、７９％）を得た。黄褐色の固体をＤＭＦ（７５ｍＬ）中に溶解させ、トルエンスルホン酸（６．７ｇ、３５．０ｍｍｏｌ）を添加した後、２−メトキシプロペン（７．２ｍＬ、７５．０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。一晩攪拌した後、さらに７．２ｍＬの２−メトキシプロペンを添加し、混合物を再び室温で一晩攪拌した。この時点で、ｔｌｃにより出発材料を検出できなかった。反応混合物に水酸化ナトリウム（５０％水溶液、５ｍＬ）を添加し、溶媒を真空中で蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ中に溶解させ、水で洗浄した。洗浄水を合わせ、ＥｔＯＡｃで１回洗浄した。これを最初の抽出物と合わせ、塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶液をろ過し、溶媒を蒸発させて、ろう様の固体を得た。この固体は、直接次の工程で使用することができる。クロマトグラフィ（ＣＨＣｌ３中０〜５％（９／１  ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ））から分析サンプルを得ることができ、表題化合物が得られた。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）１．３５（ｓ，３Ｈ）、１．３９（ｓ，３Ｈ）、１．６６（ｔ，１Ｈ）、１．８３（ｍ，１Ｈ）、１．９５（ｔ，１Ｈ）、２．５６（ｄｄｄ，１Ｈ）、３．０３（ｄｄｄ，１Ｈ）、３．３０（ｔ，１Ｈ）、３．６−３．８（ｍ，５Ｈ）、７．２７（ｍ，５Ｈ）。
【００２５】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−１−ベンジル−３−（ベンジルオキシ）−５−（ヒドロキシメチル）ピペルジン−４−オール（３）。
ＤＭＦ（５０ｍＬ）中の２（４．４ｇ、１５．９ｍｍｏｌ）の溶液に９５％のＮａＨ（０．４３ｇ、１７．９ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物をＮ２下で１時間攪拌した。次に、塩化ベンジル（１．９ｍＬ、１６．３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。約１４時間後に、ＤＭＦを真空中で蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ中に溶解させ、水で洗浄してから塩水で洗浄し、次にＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶液をろ過し、ろ液を真空中で蒸発させて、粗生成物を得た。０〜２５％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出するシリカゲルにおけるクロマトグラフィにより、２．１ｇの白色発泡体が得られた。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）１．１５（ｍ，１Ｈ）、１．１９（ｓ，３Ｈ）、１．３９（ｓ，３Ｈ）、１．９−２．０５（ｍ，４Ｈ）、２．５３（ｄｄｄ，１Ｈ）、３．０４（ｄｄｄ，１Ｈ）、３．３（ｓ，１Ｈ）、３．４５−３．８（ｍ，４Ｈ）、７．２（ｍ，１０Ｈ）。これをＭｅＯＨ（１００ｍＬ）中に溶解させ、２−ＰｒＯＨ中６ＮのＨＣｌを１．５ｍＬ添加し、混合物を室温で攪拌した。１時間後、ｔｌｃにより判断すると、出発材料はなくなった。溶媒を蒸発させ、残渣を１０％のＮａ２ＣＯ３中に溶解させ、ＥｔＯＡｃ（２×）で抽出した。合わせた抽出物を水のごく一部で洗浄してから、塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶液をろ過し、ろ液を蒸発させて、表題化合物（１．７ｇ、３３％）を得た。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）１．６−１．９５（ｍ，３Ｈ）、２．６３（ｄｄｄ，１Ｈ）、３．００（ｄｄｄ，１Ｈ）、３．２５−３．６５（ｍ，５Ｈ）、４．３５（ｄ，１Ｈ）、４．５（ｄ，１Ｈ）、７．２（ｍ，１０Ｈ）。
【００２６】
（（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−１−ベンジル−４，５−ビス（ベンジルオキシ）−ピペルジン−３−イル）メタノール（４ｂ）。
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の３（１．１ｇ、３．３６ｍｍｏｌ）の溶液にＮａＨ（０．１０ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を添加し、反応を室温で３０分間攪拌し、この時点で塩化ベンジル（０．３８ｍＬ、３．３ｍｍｏｌ）を添加し、反応を室温で一晩攪拌した。溶媒を真空中で蒸発させ、残渣をＥｔＯＡｃ中に溶解させ、水で洗浄してから、塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶液をろ過し、ろ液を蒸発させて、４ａおよび４ｂの混合物（およそ２／１の混合物）を得た。混合物を０〜５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出するシリカゲルにおいてクロマトグラフ分析した。主要な位置異性体に相当する画分を合わせて、４ａ（０．４９ｇ、３５％）を無色の油として得た。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）１．８１（ｔ，２Ｈ）、１．９６（ｍ，１Ｈ）、２．８０（ｍ，１Ｈ）、３．０５（ｄｄｄ，１Ｈ）、３．３−３．６（ｍ，６Ｈ）、４．４１（ｓ，２Ｈ）、４．５５（ｑ，２Ｈ）、７．２（ｍ，１５Ｈ）。マイナーな位置異性体に相当する画分を合わせて、４ｂ（０．２３ｇ、１６％）を無色の油として得た。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）１．８−２．０（ｍ，３Ｈ）、２．７２（ｄｄ，１Ｈ）、３．０５（ｄｄｄ，１Ｈ）、３．２７（ｔ，１Ｈ）、３．４−３．６（ｍ，４Ｈ）、３．６５（ｍ，１Ｈ）、４．５６（ｓ，２Ｈ）、４．６０（ｄ，１Ｈ）、４．９０（ｄ，１Ｈ）、７．２（ｍ，１５Ｈ）。
【００２７】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−１−ベンジル−３，４−ビス（ベンジルオキシ）−５−（フルオロメチル）ピペルジン−４−オール（５）。
ＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）中の４ｂ（０．３２ｇ、０．７７ｍｍｏｌ）の溶液を氷／塩水浴中で−１５〜−２０℃に冷却した。これに三フッ化（ジエチルアミノ）硫黄（０．１５ｍＬ、１．１５ｍｍｏｌ）を添加し、反応を約２０分間攪拌させ、この時点で、ｔｌｃにより判断すると、出発材料は消費されていた。ＮａＨＣＯ３の添加により反応を失活させ、混合物をＥｔＯＡｃ（２×）で抽出した。合わせた抽出物を塩水で洗浄してから、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶液をろ過し、ろ液を蒸発させて粗生成物を得た。シリカゲルクロマトグラフィ（０〜２５％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により、所望の生成物（０．２ｇ、６３％）が無色の油として得られた。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）１．９−２．１５（ｍ，３Ｈ）、２．８８（ｄｄ，１Ｈ）、３．１２（ｄｄｄ，１Ｈ）、３．３６（ｔ，１Ｈ）、３．５５（ｄ，１Ｈ）、３．６５（ｍ，１Ｈ）、４．３−４．６（ｍ，３Ｈ）、４．６３−４．６５（ｍ，３Ｈ）、４．９５（ｄ，１Ｈ）、７．２（ｍ，１５Ｈ）。
【００２８】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール塩酸塩（６）。
ＥｔＯＨ（４０ｍＬ）中の５（０．２４ｇ、０．５７ｍｍｏｌ）の溶液に、２−ＰｒＯＨ中６ＮのＨＣｌを０．５ｍＬ添加した。溶媒を真空中で蒸発させ、次にＥｔＯＨにより２回以上共蒸発させた。残渣をＥｔＯＨ中に溶解させ、触媒としてＰｄ（ＯＨ）２を用いて５５ｐｓｉで水素化した。１４時間後に、出発材料はもはや検出できなかった。溶液をろ過し、ろ液を真空中で蒸発させた。残渣をアセトンで粉状にしてからろ過し、表題化合物としてオフホワイトの固体（０．０９ｇ、８５％）を得た。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）１．９５−２．０５（ｍ，１Ｈ）、２．６５（ｔ，１Ｈ）、２．８５（ｔ，１Ｈ）３．１５−３．４（ｍ，３Ｈ）、３．５５（ｍ，１Ｈ）、４．５５（ｍ，１Ｈ）、４．６５（ｍ，１Ｈ）、５．４５−５．６（ｄｄ，２Ｈ）、９．０５（ｂｒｓ，２Ｈ）。
【化３】
0005645918.tif 000005
【００２９】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−１−ベンジル−３−（ベンジルオキシ）−５−（フルオロメチル）ピペルジン−４−オール（７）。
ピリジン（３００ｍＬ）中に溶解して氷浴中で冷却した３（２６．０ｇ、７９．５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴｓＣｌ（１６．６ｇ、８７．５ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加した。添加が完了したら、反応混合物を室温まで温め、一晩攪拌した。溶媒を真空中で蒸発させ、残渣をＥｔＯＡｃ中に溶解させた。溶液を水（２×）で洗浄してから、塩水で洗浄し、次にＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶液をろ過し、ろ液を真空中で蒸発させて粗生成物が得られ、これを高真空下で乾燥させた。残渣をＴＨＦ（４００ｍＬ）中に溶解させ、１．０ＭのＢｕ４ＮＦ（１００ｍｍｏｌ、１００ｍＬ）を添加し、混合物を加熱還流させた。２時間後に、出発材料は残っていなかった。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、水（２×）で洗浄してから、塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶液をろ過し、ろ液を真空中で蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィ（２５％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により粗生成物を精製して、表題化合物（７．５ｇ、２工程で２９％）を得た。
【００３０】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール塩酸塩（６）。
ＥｔＯＨ（１５０ｍＬ）中の７（７．５ｇ、２２．８ｍｍｏｌ）の溶液に、２−ＰｒＯＨ中５ＮのＨＣｌ（７ｍＬ）を添加した。溶液を真空中で蒸発させ、次にＥｔＯＨにより２回以上共蒸発させた。得られた材料をＥｔＯＨ（１００ｍＬ）中に溶解させ、得られた溶液をＰｄ（ＯＨ）２により５０ｐｓｉで一晩水素化した。ろ過により触媒を除去し、ろ液を真空中で蒸発させた。残渣をアセトンで粉状にし、淡黄色の固体を捕集した。得られた固体をＥｔＯＨから再結晶して、表題化合物をオフホワイトの固体（ｍｐ ２００〜２０２℃）として得た。１ＨＮＭＲ ＤＭＳＯ ｄ６は前のスペクトルと一致した。
【００３１】
ｃ．（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオールの合成
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオールの遊離塩基を得るための１つのアプローチは、上記のセクション「ｂ」で記載されるように（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール塩酸塩を合成した後、ＣＨＣｌ３中５〜１５％のＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ（９：１）を用いる（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール塩酸塩のクロマトグラフィを行い、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオールのＨＣｌ塩形態をその遊離塩基に転化することである。
【００３２】
ｄ．（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオールの合成
【化４】
0005645918.tif 000006
【００３３】
（２Ｓ，３Ｓ，４ａＲ，８Ｓ，８ａＲ）−６−ベンジル−８−（クロロメチル）−２，３−ジメトキシ−２，３−ジメチルオクタヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｃ］ピリジン（２）。
クロロホルム（３５ｍＬ）中の（（２Ｓ，３Ｓ，４ａＲ，８Ｒ，８ａＲ）−６−ベンジル−２，３−ジメトキシ−２，３−ジメチルオクタヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｃ］ピリジン−８−イル）メタノール（１）（２．５ｇ、７．１ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化チオニル（１．３ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を、ＴＬＣ（９８：２  ＣＨ２Ｃｌ２／２−ＰｒＯＨ）により反応が完了したと判断されるまで、４〜８時間加熱還流させた。溶媒および過剰の試薬を真空中で蒸発させ、残渣をクロマトグラフ（９８：２  ＣＨ２Ｃｌ２／２−ＰｒＯＨ）で分析して、表題化合物（２．２ｇ、８５％）を得た。生成物をＨＰＬＣ／ＭＳによって特徴付けた（ＭＨ＋＝３６９）。純度は９５％よりも高いと判断された。
【００３４】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−１−ベンジル−５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール（３）。
ジクロロメタン（１５ｍＬ）中の（２Ｓ，３Ｓ，４ａＲ，８Ｓ，８ａＲ）−６−ベンジル−８−（クロロメチル）−２，３−ジメトキシ−２，３−ジメチルオクタヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｃ］ピリジン（２）（２．２ｇ、５．９ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（０．３５ｍｏｌ、２６ｍＬ）を添加した。反応混合物を約１時間加熱還流させ、この時点で、ＴＬＣにより反応は完了したと判断された。過剰の溶媒およびＴＦＡを真空中で蒸発させ、シリカゲル（ＣＨＣｌ３中２〜８％のＭｅＯＨ）を用いて残渣をクロマトグラフ分析した。画分を合わせ、蒸発させて、（１．３ｇ、８７％）を表題化合物として得た。生成物をＨＰＬＣ／ＭＳにより特徴付けし（ＭＨ＋＝２５５）、９５％よりも高い純度であると判断された。
【００３５】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール（４）。
ＥｔＯＨ中に溶解した（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−１−ベンジル−５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール（３）（５．１ｍｍｏｌ、１．３ｇ）に、５ＮのＨＣｌ（４．７ｍｍｏｌ、０．９４ｍＬ）を添加した。溶液を真空中で蒸発させ、次にＥｔＯＨにより２〜３回共蒸発させた。残渣をＥｔＯＨ中に再び溶解させ、Ｐｄ（ＯＨ）２（０．２７ｇ）と混ぜ合わせ、５５ｐｓｉで１２時間水素化した。続いて、ダイカライト（ｄｉｃａｌｉｔｅ）により触媒をろ過し、ろ液を蒸発させて、粗生成物（４）をＨＣｌ塩として得た。次にこれをクロマトグラフ（ＣＨＣｌ３中５〜１５％のＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ（９：１））で分析して、０．４ｇの（４）を１６５のＭＨ＋を有する白色固体として得た。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）１．６（ｍ，１Ｈ）、２．２（ｍ，３Ｈ）、２．９（ｍ，３Ｈ）、３．１５（ｍ，１Ｈ）、３．６（ｍ，１Ｈ）、３．８（ｄｄ，１Ｈ）、４．６８（ｄ，１Ｈ）、４．８８（ｄ，１Ｈ）。
【００３６】
ｅ．（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール塩酸塩の合成
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオールの塩酸塩を得るための１つのアプローチは、上記のセクション「ｄ」で記載されるように（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオールを合成した後、ＨＣｌ（水溶液または２−ＰｒＯＨ溶液（多くの場合販売されているように）のいずれか）により再び酸性化し、それにより、遊離塩基を（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオールのＨＣｌ塩形態に転化し、続いて、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール塩酸塩を単離することである。
【００３７】
あるいは、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオールの合成は、ＣＨＣｌ３中５〜１５％のＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ（９：１）を用いてＨＣｌ塩がクロマトグラフ分析される最後のクロマトグラフ工程がこの工程で（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオールの粗ＨＣｌ塩形態の遊離塩基への転化をもたらすことを除いて、上記のセクション「ｄ」に記載されるように追随され得る。むしろ、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオールの粗ＨＣｌ塩形態は、結晶化によって精製され得る。
【００３８】
塩、溶媒和物およびプロドラッグ
本発明の化合物は（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール（本明細書では化合物Ａとも称される）および（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール（本明細書では化合物Ｂとも称される）の薬学的に許容可能な塩、溶媒和物およびプロドラッグを含む。薬学的に許容可能な塩には、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｎなどの無機塩基から誘導される塩、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルエチレンジアミン、グルカミン、トリエチルアミン、コリン、水酸化物、ジシクロヘキシルアミン、メトホルミン、ベンジルアミン、トリアルキルアミン、チアミンなどの有機塩基、アルキルフェニルアミン、グリシノール、フェニルグリシノールのようなキラル塩基の塩、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、チロシン、シスチン、システイン、メチオニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、ヒスチジン、オルニチン（ｏｍｉｔｈｉｎｅ）、リジン、アルギニン、セリンなどの天然アミノ酸、Ｄ−異性体または置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、グアニジン、置換グアニジン（ここで、置換基はニトロ、アミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アンモニウムから選択される）の塩、または置換アンモニウム塩およびアルミニウム塩が含まれる。塩は、適切な場合には、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩、ホウ酸塩、ハロゲン化水素酸塩、酢酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、パルモアート（ｐａｌｍｏａｔｅ）、メタンスルホン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、アスコルビン酸塩、グリセロリン酸塩、ケトグルタル酸塩である酸付加塩を含むことができる。一実施形態では、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオールの薬学的に許容可能な塩は塩酸塩である（本明細書では、化合物Ａ−ＨＣｌとも称される）。
【００３９】
「溶媒和物」は、化合物と、１つまたは複数の溶媒分子との物理的結合を示す。この物理的結合は、様々な度合のイオン結合および共有結合（水素結合を含む）を伴う。特定の場合、例えば１つまたは複数の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子内に取り込まれる場合には、溶媒和物は単離することができるであろう。「溶媒和物」は、溶液相および単離可能な溶媒和物の両方を包含する。「水和物」は、溶媒分子がＨ２Ｏである溶媒和物である。適切な溶媒和物の他の非限定的な例には、アルコール（例えば、エタノラート、メタノラートなど）が含まれる。
【００４０】
プロドラッグは、生体内で活性型に転化される化合物である（例えば、参照によって本明細書中に援用されるＲ．Ｂ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，１９９２年，「Ｔｈｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｃｔｉｏｎ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，第８章を参照）。さらに、プロドラッグについての議論は、Ｔ．ＨｉｇｕｃｈｉおよびＶ．Ｓｔｅｌｌａ，Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓの第１４巻、ならびにＢｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｅｄｗａｒｄ  Ｂ．Ｒｏｃｈｅ編，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７年（いずれも参照によって本明細書中に援用される）において提供される。プロドラッグは、特定の化合物の体内分布（例えば、プロテアーゼの反応部位に通常は入らない化合物を可能にするため）または薬物動態を変更するために使用することができる。例えば、カルボン酸基は、例えばメチル基またはエチル基によりエステル化されて、エステルを生じることができる。エステルが被験者に投与されると、エステルは酵素的もしくは非酵素的に、還元的に、酸化的に、または加水分解的に切断されて、アニオン基を現す。アニオン基は、切断されて中間体化合物を表す部分（例えば、アシルオキシメチルエステル）によりエステル化することができ、これは次に分解して活性化合物を生じる。
【００４１】
プロドラッグの例およびその使用は当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｂｅｒｇｅら  （１９７７年）「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照）。プロドラッグは化合物の最終的な単離および精製の間にその場で調製することもできるし、あるいは、精製した化合物を適切な誘導体化剤と別個に反応させることによって調製することもできる。例えば、ヒドロキシ基は、触媒の存在下でのカルボキシル酸による処理によってエステルに転化させることができる。切断可能なアルコールプロドラッグ部分の例には、置換および非置換の分枝状または非分枝状の低級アルキルエステル部分（例えば、エチルエステル）、低級アルケニルエステル、ジ−低級アルキル−アミノ低級アルキルエステル（例えば、ジメチルアミノエチルエステル）、アシルアミノ低級アルキルエステル、アシルオキシ低級アルキルエステル（例えば、ピバロイルオキシメチルエステル）、アリールエステル（フェニルエステル）、アリール−低級アルキルエステル（例えば、ベンジルエステル）、置換（例えば、メチル、ハロ、またはメトキシ置換基による）アリールおよびアリール−低級アルキルエステル、アミド、低級アルキルアミド、ジ−低級アルキルアミド、ならびにヒドロキシアミドが含まれる。
【００４２】
５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオールおよび５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール（これらの化合物の塩、溶媒和物およびプロドラッグ、ならびにプロドラッグの塩および溶媒和物を含む）の全ての立体異性体（例えば、幾何異性体、光学異性体など）、例えばエナンチオマー型（不斉炭素が存在しなくても存在し得る）、回転異性体型、アトロプ異性体、およびジアステレオマー型を含む、種々の置換基上の不斉炭素のために存在し得るものなどは、本発明の範囲内であることが企図される。これらの化合物の個々の立体異性体は、例えば、他の異性体を実質的に含まないものであってもよいし、あるいは、例えばラセミ体として、または他の全てもしくは他の選択された立体異性体と混合されていてもよい。上記の化合物のキラル中心は、ＩＵＰＡＣ １９７４勧告により定義されるように、Ｓ配置またはＲ配置を有することができる。「塩」、「溶媒和物」、「プロドラッグ」などの用語の使用は、５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオールおよび５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオールのエナンチオマー、立体異性体、回転異性体、互変異性体、ラセミ体またはプロドラッグの塩、溶媒和物およびプロドラッグに等しく適用されることが意図される。
【００４３】
製剤
治療薬は、例えば、経口的に錠剤またはカプセルまたは液体の形態、あるいは注射用の無菌水溶液などにおいて、任意の投与経路に適するように処方することができる。治療薬が経口投与のために処方される場合、錠剤またはカプセルは、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸ナトリウムデンプン）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容可能な賦形剤と共に、従来の手段によって調製され得る。錠剤は、当該技術分野においてよく知られている方法によってコーティングされてもよい。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとってもよいし、あるいは使用前に水または別の適切な媒体を用いて構成するための乾燥製品として提供されてもよい。このような液体調製物は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画された植物油）、または防腐剤（例えば、−ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、またはソルビン酸）などの薬学的に許容可能な添加剤と共に、従来の手段によって調製され得る。液体調製物は、緩衝塩、風味料、着色剤または甘味剤を適切に含有していてもよい。経口投与のための調製物は、治療薬の制御または持続放出を与えるように適切に処方されてもよい。
【００４４】
本発明の特定の実施形態では、治療薬は、治療薬が血液脳関門を越えて神経細胞に効果を及ぼすことができるように全身的な摂取を可能にする剤形で投与される。例えば、非経口／注射可能な使用に適した治療薬の医薬製剤は、通常、無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および注射可能な無菌溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。全ての場合に、剤形は無菌でなければならず、そして容易に注射できる程度まで流動性でなければならない。剤形は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、または植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、そして界面活性剤の使用によって、適切な流動性を保持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗菌薬および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ベンジルアルコール、ソルビン酸などによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことは合理的であろう。注射可能な組成物の長期にわたるる吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｍｏｎｏｓｔｅｒａｔｅ）またはゼラチンを組成物中に使用することによってもたらすことができる。
【００４５】
注射可能な無菌溶液は、必要とされる量の治療薬を、必要に応じて上記で列挙した様々な他の成分と共に適切な溶媒中に取り込んだ後、ろ過または最終滅菌を行うことによって調製される。一般に、分散液は、基本的な分散媒体および上記で列挙したものからの必要とされる他の成分を含有する無菌媒体中に、滅菌された種々の活性成分を取り込むことによって調製される。注射可能な無菌溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、予め無菌ろ過されたその溶液から、活性成分および任意の付加的な所望の成分の粉末が得られる。
【００４６】
製剤は、賦形剤を含有することができる。製剤中に含まれ得る薬学的に許容可能な賦形剤は、緩衝液（クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、および重炭酸緩衝液など）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（血清アルブミン、コラーゲン、およびゼラチンなど）、塩（ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ、および塩化ナトリウムなど）、リポソーム、ポリビニルピロリドン、糖（デキストラン、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールなど）、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ−４０００、ＰＥＧ−６０００）、グリセロール、グリシンまたは他のアミノ酸、ならびに脂質である。製剤と共に使用するための緩衝系には、クエン酸、酢酸、重炭酸、およびリン酸緩衝液が含まれる。リン酸緩衝液は好ましい実施形態である。
【００４７】
また製剤は、非イオン性洗剤を含有することもできる。好ましい非イオン性洗剤には、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、オクチルα−グルコシド、オクチルβ−グルコシド、Ｂｒｉｊ  ３５、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、およびＴｗｅｅｎ  ２０が含まれる。
【００４８】
投与経路
治療薬は、経口または非経口（静脈内、皮下、動脈内、腹腔内、点眼、筋肉内、経頬、経直腸、経膣、眼窩内、脳内、皮内、頭蓋内、脊髄内、脳室内、くも膜下腔内、大槽内、関節内、肺内、鼻腔内、経粘膜、経皮、または吸入を含む）で投与することができる。１つの好ましい実施形態では、治療薬は経口投与される。
【００４９】
治療薬の投与は定期的な製剤のボーラス注射によるものでもよいし、あるいは外部（例えば、点滴バッグ）または内部（例えば、生体侵食性（ｂｉｏｅｒｏｄａｂｌｅ）埋没物）のリザーバーから静脈内または腹腔内投与によって投与されてもよい。例えば、米国特許第４，４０７，９５７号明細書および米国特許第５，７９８，１１３号明細書（それぞれ参照によって本明細書中に援用される）を参照されたい。肺内送達方法および装置は、例えば、米国特許第５，６５４，００７号明細書、米国特許第５，７８０，０１４号明細書、および米国特許第５，８１４，６０７号明細書（それぞれ参照によって本明細書中に援用される）に記載されている。その他の有用な非経口送達システムには、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み型点滴システム、ポンプ送達、カプセル化細胞送達、リポソーム送達、ニードル送達注射、ニードルレス注射、噴霧器、エアロゾル化装置（ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｒ）、エレクトロポレーション、および経皮パッチが含まれる。ニードルレス注射デバイスは、米国特許第５，８７９，３２７号明細書、米国特許第５，５２０，６３９号明細書、米国特許第５，８４６，２３３号明細書および米国特許第５，７０４，９１１号明細書（その明細書は参照によって本明細書中に援用される）に記載されている。上記の製剤はいずれもこれらの方法を用いて投与することができる。
【００５０】
皮下注射は自己投与を可能にする利点を有し、静脈内投与と比べて長期の血漿中半減期ももたらす。さらに、患者の利便性のために設計された詰め替え可能な注射ペンおよびニードルレス注射デバイスなどの様々なデバイスを、本明細書において議論されるような本発明の製剤と共に使用することができる。
【００５１】
投薬量
適切な薬剤調製物は単位剤形である。このような剤形では、調製物は、適切な量、例えば所望の目的を達成するために有効な量の活性成分を含有する適切なサイズの単位用量に細分される。特定の実施形態では、治療薬は、１日に１回または複数回の用量（例えば、１日１回、１日２回、１日３回）が投与される。特定の実施形態では、治療薬は間欠的に投与される。
【００５２】
例示的な投薬計画は、２００８年６月１１日に国際公開第２００８／１３４６２８号パンフレットとして公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０８／６１７６４号明細書、および２００９年１０月２３日に出願された米国特許出願第１２／６０４，８５５号明細書（これらはいずれも参照によってその全体が本明細書中に援用される）に記載されている。一実施形態では、治療薬は、間欠的な投薬計画（最初は「負荷用量」が毎日与えられ、その後毎日でない間隔の投与が行われることを含む）において投与される。
【００５３】
言及された障害を予防または治療するために有効な治療薬の量は、当業者によってケースバイケースで決定することができる。治療薬の投与の量および頻度は、患者の年齢、状態および体格、ならびに障害を発症する危険度、または治療中の言及された障害の症状の重症度などの因子を考慮して、担当臨床医（医師）の判断に従って調節されるであろう。
【００５４】
併用薬物療法
本発明の治療薬は、少なくとも１つの他の治療薬と併用して投与することもできる。少なくとも１つの他の治療薬を伴った本発明の治療薬の投与は、連続的な投与または同時の投与を包含すると理解される。一実施形態では、治療薬は、別個の剤形において投与される。別の実施形態では、２つ以上の治療薬が同一の剤形において同時に投与される。
【００５５】
特定の実施形態では、本発明の治療薬は、抗ジスキネジア薬（例えば、カルビドパ、レボドパ）、抗感染症薬（例えば、ミグルスタット）、抗悪性腫瘍薬（例えば、ブスルファン、シクロホスファミド）、胃腸薬（例えば、メチルプレドニゾロン）、微量栄養素（例えば、カルシトリオール、コレカルシフェロール、エルゴカルシフェロール、ビタミンＤ）、血管収縮薬（例えば、カルシトリオール）である少なくとも１つの他の治療薬と併用して投与される。１つの好ましい実施形態では、上記の他の治療薬は、障害がゴーシェ病である場合に投与される。
【００５６】
特定の実施形態では、本発明の治療薬は、アロプレグナノロン、低コレステロール食、またはスタチン（例えば、Ｌｉｐｉｔｏｒ（登録商標））などのコレステロール低下薬、フェノフィブラート（Ｌｉｐｉｄｉｌ（登録商標））などのフィブラート、ナイアシン、および／またはコレスチラミン（Ｑｕｅｓｔｒａｎ（登録商標））などの結合樹脂と併用して投与される。
【００５７】
一実施形態では、本発明の治療薬は、遺伝子治療と併用して投与される。遺伝子治療は、グルコセレブロシダーゼなどの置換遺伝子、またはＳＮＣＡ遺伝子の抑制ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の両方によるものが企図される。遺伝子治療は、２００４年２月１７日に出願された米国特許第７，４４６，０９８号明細書にさらに詳細に記載されている。
【００５８】
一実施形態では、本発明の治療薬は、抗炎症薬（例えば、イブプロフェンまたは他のＮＳＡＩＤ）である少なくとも１つの他の治療薬と併用して投与される。
【００５９】
一実施形態では、本発明の治療薬は、Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシン（Ｚａｖｅｓｃａ（登録商標）、Ａｃｔｅｌｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＵＳ，Ｉｎｃ．，（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳ）から入手可能なミグルスタット）などのグルコセレブロシダーゼの基質阻害薬と併用して投与される。
【００６０】
本発明の治療薬と、１つまたは複数の他のリソソーム酵素の治療薬である少なくとも１つの他の治療薬との併用も企図される。以下は、リソソーム酵素の治療薬の非限定的な一覧である。
【００６１】
【表２】
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【００６２】
【表３】
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【００６３】
特定の実施形態では、本発明の治療薬は、抗ジスキネジア薬（例えば、カルビドパ、レボドパ）、抗感染症薬（例えば、シクロスポリン、ミグルスタット、ピリメタミン）、抗悪性腫瘍薬（例えば、アレムツズマブ、アザチオプリン、ブスルファン、クロファラビン、シクロホスファミド、メルファラン、メトトレキセート、リツキシマブ）、抗リウマチ剤（例えば、リツキシマブ）、胃腸薬（例えば、メチルプレドニゾロン）、微量栄養素（例えば、カルシトリオール、コレカルシフェロール、エルゴカルシフェロール、葉酸、ビタミンＤ）、妊娠調節薬（例えば、メトトレキセート）、呼吸器系作用薬（例えば、テトラヒドロゾリン）、血管収縮薬（例えば、カルシトリオール、テトラヒドロゾリン）である少なくとも１つの治療薬と併用して投与される。
【００６４】
特定の実施形態では、本発明の治療薬は、β−ヘキソサミニダーゼＡの治療薬および／または酸β−ガラクトシダーゼの治療薬である少なくとも１つの治療薬と併用して投与される。特定の実施形態では、本発明の治療薬は、抗感染症薬（例えば、ミグルスタット）、抗悪性腫瘍薬（例えば、アレムツズマブ、ブスルファン、シクロホスファミド）、胃腸薬（例えば、メチルプレドニゾロン）である少なくとも１つの治療薬と併用して投与される。一実施形態では、上記の併用は、ニーマンピック病（例えば、ニーマンピック病Ｃ型）の危険性を有するか、あるいはニーマンピック病であると診断された被験者に投与される。
【実施例】
【００６５】
本発明はさらに以下に提示される実施例によって説明される。このような実施例の使用は説明のためだけのものであって、本発明または例示された任意の用語の範囲および意味を決して限定しない。同様に、本発明は、本明細書に記載される特定の好ましい実施形態のどれにも限定されない。実際、本明細書を読めば、本発明の多くの修正および変更は当業者には明らかになるであろう。従って、本発明は、特許請求の範囲が権利を与えられる均等物の全範囲と共に、特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。
【００６６】
実施例１  阻害定数の決定
酵素阻害アッセイを用いて、本明細書において記載される小分子の薬理学的シャペロンに対するＧＣａｓｅの結合親和性（本明細書では、Ｋｉ結合定数により定義される）を実験的に決定した。簡単に言うと、使用した酵素阻害アッセイは、試験化合物が結合して、蛍光発生基質の加水分解を防止する能力を濃度依存的な形でモニターした。特に、様々な量の各試験化合物の存在または不在下で４−メチルウンベリフェリル―β―Ｄ−グルコピラノシド（４−ＭＵ−β−Ｄ−Ｇｌｃ）蛍光発生基質を用いて、組換えヒトＧＣａｓｅ（ｒｈＧＣａｓｅ、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）、Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐ．）の酵素活性を測定した。得られたデータは、全ての試験サンプルを非阻害対照サンプル（化合物なし、１００％の酵素活性に相当する）と比較することによって分析し、試験化合物の存在下での残留酵素活性を決定した。続いて、規格化した残留活性データ（ｙ軸）を試験化合物の濃度（ｘ軸）に対してグラフに描き、酵素活性の５０％阻害（ＩＣ５０と定義）に至る試験化合物濃度を外挿した。次に、各試験化合物のＩＣ５０値をＣｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式（以下に詳述される）に挿入して、試験化合物に対するＧＣａｓｅの結合親和性を正確に反映する絶対阻害定数Ｋｉを得た。ｐＨ７．０（小胞体のｐＨ）およびｐＨ５．２（リソソームのｐＨ）の両方で酵素阻害アッセイを実施して、小胞体およびリソソームにおけるＧＣａｓｅに対する化合物の結合親和性（すなわち、効力）を洞察した。
【００６７】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（生体外）アッセイ
ｐＨ７．０およびｐＨ５．２において、０．２５％のタウロコール酸ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液からなる緩衝液「Ｍ」中、種々の濃度の試験化合物を調製した。同じ緩衝液「Ｍ」中に、ｐＨ７．０およびｐＨ５．２において、酵素（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）、ヒト酵素β−グルコセレブロシダーゼの組換え型）も希釈した。基質溶液は、両方のｐＨにおいて、０．１５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む緩衝液「Ｍ」中、３ｍＭの４−メチルウンベリフェロンβ−Ｄ−グルコピラノシドで構成した。１５μｌの種々の濃度の阻害薬または緩衝液「Ｍ」のみに、５μｌの希釈酵素を添加し、５０μｌの基質調製物と共に３７℃で１時間インキュベートして、ｐＨ７．０およびｐＨ５．２におけるβ−グルコシダーゼ活性を査定した。同量の０．４Ｍのグリシン（ｐＨ１０．６）の添加により反応を停止させた。３５５ｎｍの励起および４６０ｎｍの発光を用いて、プレートリーダーにおいて１秒／ウェルで蛍光を測定した。酵素を添加しない、または阻害剤を添加しないインキュベーションを用いて、それぞれ、酵素のない場合の活性および最大活性を定義し、所与のアッセイの阻害％を規格化した。参照化合物（酒石酸ＩＦＧ）および試験化合物（化合物Ａおよび化合物Ｂの塩酸塩形態）についてのこの阻害アッセイの結果は、以下の表２Ａに要約される。
【００６８】
【表４】
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【００６９】
Ｉｎ  ｓｉｔｕ（その場）アッセイ
正常な被験者から樹立した線維芽細胞を用いて、リソソームＧＣａｓｅ活性に対するＩＦＧおよびその誘導体の効果をその場でアッセイした。４８ウェルプレートに播種した細胞を、指示される濃度の化合物と共に１６〜２４時間インキュベートした。用量−反応アッセイのために、細胞をｉｎ  ｓｉｔｕ基質５−（ペンタフルオロベンゾイルアミノ）フルオレセインジ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＰＦＢＦＤβＧｌｕ）と共に１時間インキュベートし、続いて溶解させて、化合物の存在下での基質の加水分解の程度を決定した。このアッセイでは、ＩＣ５０を中心に５桁を包含する様々な１２の濃度を使用した。特に、以下の濃度範囲を使用した：化合物Ａ：１×１０−５〜３．３３×１０−１１、ＩＦＧ：３．３３×１０−５〜１×１０−１０、化合物Ｂ：３×１０−５〜９×１０−１１。ここで、化合物は、指定される範囲内で、最高濃度から１：３で連続的に希釈した。化合物が存在しない場合の活性に対する化合物の存在下の活性の比率として阻害を決定した。ウォッシュアウトアッセイのために、ＩＣ９０に等しい濃度の化合物により細胞を１６〜２４時間処理した。細胞を徹底的に洗浄し、薬物を含まない培地中でインキュベートして、細胞からの正味の化合物流出を可能にした。次に、化合物を除去した後２時間の間隔で、全部で８時間にわたってリソソームＧＣａｓｅ活性について細胞を試験した。経時的な活性の増大を単一指数関数に当てはめて、化合物のウォッシュアウト時間を決定した。これらの阻害アッセイの結果は、以下の表２Ｂに要約される。
【００７０】
【表５】
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【００７１】
特に、試験化合物（化合物Ａおよび化合物Ｂの塩酸塩形態）は、ＧＣａｓｅ活性の濃度依存性の増大を引き起こすことが分かった。さらに、酒石酸ＩＦＧ（試験化合物）と比較すると、化合物Ａおよび化合物Ｂの塩酸塩形態は、はるかに低い濃度で酵素活性を同じ最大レベルに高めた。
【００７２】
実施例２：血液脳関門の透過
マウスへの経口投与後に、参照化合物（酒石酸ＩＦＧ）および試験化合物（ＩＦＧ−誘導体、化合物Ａおよび化合物Ｂの塩酸塩形態）の血液脳関門（ＢＢＢ）の透過をアッセイした。このために、８週齢の野生型雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に単回の３０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基相当）の経口用量の参照化合物または試験化合物を経管栄養によって投与した（ｎ＝３マウス／時点）。投薬溶液を水中で調製した。投薬後、次の時点：投薬後０、０．５、１、および４時間において、マウスをＣＯ２で安楽死させた。安楽死の後、全血を下大静脈からリチウムヘパリン管内に採取した。同様に、各マウスから脳を採取した。全血を２７００ｇ、４℃で１０分間回転させることによって血漿が得られ、その後これをドライアイス上に保存した。全脳を冷ＰＢＳ中で洗浄して、汚染血液を除去し、ブロット乾燥し、ドライアイス上で瞬時に凍結させ、最後に分析まで−８０℃で保存した。分析のための脳サンプルを調製するために、組織１ｍｇあたり４００μｌの水中で、５０〜１００ｍｇの組織をホモジナイズした。次に、サンプルを遠心分離により浄化した。次に、２５μｌの脳ホモジネートの上澄みまたは２５μｌの血漿を２５μｌのアセトニトリル：水（９５／５）と混ぜ合わせた。これに、２５μｌのアセトニトリルおよび５０μｌの内部標準（（７０：３０）アセトニトリル：メタノール中０．５％のギ酸中、１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＧ１３Ｃ２−１５Ｎ）を追加した。サンプルを再び遠心分離により浄化し、７５μｌの上澄みを７５μｌのアセトニトリルと混ぜ合わせた。次に、ＰＰＤ  Ｉｎｃ．（３２３０  Ｄｅｍｉｎｇ  Ｗａｙ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ５３５６２）においてＬＣ−ＭＳ／ＭＳによりサンプルを化合物レベルについて分析した。簡単に言うと、５ｍＭのギ酸アンモニウムおよび（Ａ）９５：５のアセトニトリル：水、または（Ｂ）７０：２０：１０のメタノール：水：アセトニトリル中０．０５％のギ酸からなる移動相の混合物で平衡化された、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｂｅｔａｓｉｌ，Ｓｉｌｉｃａ−１００、５０×３ｍｍ、５μカラムを用いた。２０μｌ〜３０μｌの間のサンプルを分析のために注入した。特に、ＩＦＧ、化合物Ａおよび化合物Ｂの保持時間はそれぞれ４．９１分、４．３３分、および４．３２分である。ＭＳ／ＭＳについては、以下のイオン質量（Ｑ１／Ｑ３、ａｍｕ）：ＩＦＧ１３Ｃ２−１５Ｎ、同位体で標識された内部標準（１５１．１／１１５．１）、ＩＦＧ（１４８．１／１１２．１）、化合物Ａ（１５０．１／１０３．１）、化合物Ｂ（１６６．２／１３０．１）を有する分析物をＭＲＭにより監視した。化合物Ｂを分析する際、内部標準として化合物Ａを使用した（１５０．１／１３０．１）。薬物濃度を計算するために、それぞれの化合物の分子量を用い、そして１ｇの組織が１ｍＬの体積に相当すると仮定して、血漿（ｎｇ／ｍＬ）および脳（ｎｇ／ｇ）の生データをｎＭに変換した。時間の関数としての濃度をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン４．０２でプロットした。
【００７３】
単回の３０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基相当）の経口用量の酒石酸ＩＦＧまたは化合物Ａの塩酸塩形態を投与したマウスにおいて検出された参照化合物（ＩＦＧ）および試験化合物（化合物Ａ）の血漿中レベルおよび脳内レベルは、それぞれ、図１Ａおよび１Ｂに示される。同様に、これらのマウスにおいて検出された化合物ＡおよびＩＦＧの血漿中レベルに対する脳内レベルの比率は、図１Ｃに示される。驚くことに、これらの結果は、化合物ＡがＩＦＧと比較して血液脳関門をより容易に通過することを反映する。
【００７４】
単回の３０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基相当）の経口用量の酒石酸ＩＦＧまたは化合物Ｂの遊離塩基形態を投与したマウスにおいて検出された参照化合物（ＩＦＧ）および試験化合物（化合物Ｂ）の脳内レベルは図２に示される。特に、化合物Ａの塩酸塩形態の投与後に観察されたレベルよりもさらに高いレベルの化合物Ｂが脳内で検出された。
【００７５】
実施例３：ＧＣａｓｅの増強
経口投与された試験化合物（化合物Ａおよび化合物Ｂの塩酸塩形態）が参照化合物（酒石酸ＩＦＧ）と比較してＧＣａｓｅレベルを高める能力をマウスにおいて査定した。このために、８週齢の野生型雄マウス（Ｃ５７／ＢＬ６）に、単回の経口（経管栄養）用量（図３Ａ〜Ｄ、４Ａ〜Ｄ、および５Ａ〜Ｄに詳述される）の対照の参照化合物（酒石酸ＩＦＧ）または試験化合物（化合物Ａまたは化合物Ｂの塩酸塩形態）を投与した。投薬毎に７匹の動物を使用した。投薬溶液を水中で調製した。化合物は以下のように２週間にわたって投与した：１週目の月曜日〜金曜日（オン）、土曜日〜日曜日（オフ）、２週目の月曜日〜木曜日（オン）、金曜日に剖検。従って、全部で９回の用量（投薬溶液は毎日新たに調製した）を各マウスに与え、最後の投薬と剖検の間に２４時間のウォッシュアウトを置いた。
【００７６】
投薬が完了したら、マウスをＣＯ２で安楽死させ、全血を下大静脈からリチウムヘパリン管内に吸い込んだ。血液を２７００ｇ、４℃で１０分間回転させることによって、血漿を採取した。肝臓、脾臓、肺、および脳の組織を取り出し、冷ＰＢＳ中で洗浄し、ブロット乾燥し、ドライアイス上で瞬時に凍結させ、分析まで−８０℃で保存した。マイクロホモジナイザを用いて氷上で約５０ｍｇの組織をｐＨ５．２の５００μＬのＭｃＩｌｖａｎｅ（ＭＩ）緩衝液（１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、２００ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム、０．２５％のタウロコール酸ナトリウム、および０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ５．２）中に３〜５秒間ホモジナイズすることにより、ＧＣａｓｅレベルを測定した。次に、２．５ｍＭのコンズリトール−Ｂ−エポキシド（ＣＢＥ）と共に、そしてＣＢＥを加えずに、ホモジネートを室温で３０分間インキュベートした。最後に、３．７ｍＭの４−メチルウンベリフェリル−β−グルコシド（４−ＭＵＧ）基質を添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。０．４Ｍのグリシン（ｐＨ１０．６）の添加により反応を停止させた。３５５ｎｍの励起および４６０ｎｍの発光を用いて、プレートリーダーにおいて１秒／ウェルで蛍光を測定した。製造業者の使用説明書に従ってＭｉｃｒｏＢＣＡキットを用いて、ライセート中の全タンパク質を決定した。生の蛍光データを絶対ＧＣａｓｅ活性（ＣＢＥの存在および不在下）に変換するために１．０ｎＭ〜５０μＭの範囲の４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）標準曲線を平衡に描き、１時間にタンパク質１ミリグラム当たりの放出される４−ＭＵのナノモル（ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質／時）として表した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン４．０２を用いてＧＣａｓｅレベルおよびタンパク質レベルを計算した。
【００７７】
図３Ａ〜Ｄはそれぞれ、（ｉ）対照媒体；（ｉｉ）１００ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基相当）の参照化合物（酒石酸ＩＦＧ）、または（ｉｉｉ）１０もしくは１００ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基相当）の試験化合物（化合物Ａの塩酸塩形態）の９回の用量からなる２週間の投薬計画で投与したＣ５７ＢＬ／６マウスの脳、脾臓、肝臓および肺内のＧＣａｓｅのレベルを示す。さらに、表３Ａ〜Ｃはそれぞれ、上記のように処置したマウスの脳、脾臓、および血漿中のＧＣａｓｅの増強のレベルを詳述する。
【００７８】
【表６】
0005645918.tif 000011
【００７９】
【表７】
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【００８０】
【表８】
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【００８１】
同様に、図４Ａ〜Ｄはそれぞれ、（ｉ）対照媒体、（ｉｉ）１００ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基相当）の参照化合物（酒石酸ＩＦＧ）、または（ｉｉ）１、３、１０、３０もしくは１００ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基相当）の試験化合物（化合物Ａの塩酸塩形態）の９回の用量からなる２週間の投薬計画で投与したＣ５７ＢＬ／６マウスの脳、脾臓、肝臓および肺内のＧＣａｓｅレベルを示す。
【００８２】
図３Ａ〜Ｄおよび４Ａ〜Ｄならびに表３Ａ〜３Ｃに反映されるように、化合物Ａの塩酸塩形態を投与したマウスは、対照または酒石酸ＩＦＧを投与したマウスと比較して、脳、脾臓、肝臓および肺内における著しく大きいＧＣａｓｅの増強を統計的に実証した。さらに、酒石酸ＩＦＧよりもはるかに少ない用量の化合物Ａの塩酸塩形態が投与された場合でも、化合物Ａの塩酸塩形態を投与したマウスにおけるＧＣａｓｅの増強は酒石酸ＩＦＧで観察されるよりも予想外に大きかった。
【００８３】
同様に、図５Ａ〜Ｄはそれぞれ、上記のように化合物Ｂおよび酒石酸ＩＦＧで処置したマウスの脳、脾臓、肝臓、肺内で検出されたＧＣａｓｅレベルを示す。さらに、表４Ａ〜４Ｃはそれぞれ、上記のように処置したマウスの脳、脾臓、および血漿中のＧＣａｓｅの増強のレベルを詳述する。
【００８４】
【表９】
0005645918.tif 000014
【００８５】
【表１０】
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【００８６】
【表１１】
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【００８７】
図５Ａ〜Ｄおよび表４Ａ〜４Ｃに反映されるように、化合物Ｂを投与したマウスは、対照または酒石酸ＩＦＧを投与したマウスと比較して、脳、脾臓、肝臓および肺内における著しく大きいＧＣａｓｅの増強を統計的に実証した。さらに、酒石酸ＩＦＧＩＦＧよりもはるかに少ない用量の化合物Ｂが投与された場合でも、化合物Ｂを投与したマウスにおけるＧＣａｓｅの増強は酒石酸ＩＦＧで観察されるよりも予想外に大きかった。
【００８８】
実施例４：ラットの薬物動態
試験化合物のバイオアベイラビリティを査定するためにラットにおいて薬物動態学的（ＰＫ）データを得た。特に、以下のＰＫパラメータを計算した：濃度／時間曲線下面積（ＡＵＣ）により測定されるバイオアベイラビリティ、利用可能な用量の画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｓｅ  ａｖａｉｌａｂｌｅ）（％Ｆ、以下でさらに定義される）、クリアランス（ＣＬ）、分布容積（Ｖｄ）、および半減期（ｔ１／２）。このために、８週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラットに、３ｍｇ／ｋｇの遊離塩基に相当する単回の静脈内（ＩＶ）用量、または１０、３０、および１００ｍｇ／ｋｇの遊離塩基に相当する単回の漸増経口（経管栄養）用量の試験化合物を与えた。投薬群当たり３匹のラットを使用した。２４時間にわたって血液を採取した。静脈内投与後の血液採取の時点は、０、２．５、５、１０、１５、３０、４５分、１、２、４、８、１２、および２４時間であり、経口投与後の血液採取の時点は、０、５、１５、３０、４５分、１、２、３、４、８、１２、および２４時間であった。ＰＰＤにおけるＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって血漿サンプルを化合物レベルについて分析した。Ｗｉｎ−ｎｏｎＬｉｎにおける非コンパートメント分析により生データを分析し、Ｖｄ、％Ｆ、ＣＬ、およびｔ１／２を計算した。
【００８９】
単回の３ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基相当）の静脈内用量の化合物Ａの塩酸塩形態を受けたラットの血漿中レベルは図６Ａに示される。同様に、１０、３０、および３００ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基相当）の単回経口用量の化合物Ａの塩酸塩形態が投与されたラットの血漿中レベルは図６Ｂに示される。上記の研究に基づいた化合物Ａの種々の薬物動態パラメータは以下の表５に詳述される。
【００９０】
【表１２】
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【００９１】
図６Ａおよび６Ｂならびに表５に反映されるように、化合物Ａの塩酸塩形態は、薬理学的シャペロンとしての薬物の開発のために好ましい薬物動態プロファイルを有する。特に、化合物Ａの塩酸塩形態は良好な経口バイオアベイラビリティ（約５０％）および用量比例性、１．０〜２．５時間の半減期、ならびに分布容積を示し、末梢組織内への適切な透過が示唆される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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