(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１８４６  Ｈ−ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫＫＫＫＫ−ＮＨ2；
１８４８  Ｈ−ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫＫＫＫＫ−ＮＨ2；
１８２０  Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＴＳＥＬＡＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫＫＫＫＫＫ−ＮＨ2；
１８４９  Ｈ−ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫＫＫＫＫＫ−ＮＨ2；
１８５５  Ｈ−ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ2；
１８５７  Ｈ−ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ2；又は
１８５８  Ｈ−ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ2；
であるグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）アナログ又は医薬として許容されるその塩。
【請求項２】
治療法に使用するための、請求項１に記載のＧＬＰ−２アナログ。
【請求項３】
担体と混和した状態の、請求項１に記載のＧＬＰ−２アナログ又はその塩を含む医薬組成物。
【請求項４】
前記ＧＬＰ−２アナログの塩は、医薬として許容される酸付加塩である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
注射又は輸液による投与に適した液体として処方されるか又は前記ＧＬＰ−２アナログの徐放をひき起こすように処方されている、請求項３又は４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
胃及び腸関連の障害の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための、請求項１に記載のＧＬＰ−２アナログの使用。
【請求項７】
前記胃及び腸関連の障害が、潰瘍、胃炎、消化障害、吸収不良症候群、短腸症候群、盲管症候群、炎症性腸疾患、セリアック病、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血スプルー、腸炎、限局性腸炎（クローン病）、潰瘍性大腸炎、下痢が付随する過敏性腸症候群、小腸損傷又は短腸症候群である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記胃及び腸関連障害が、放射線腸炎、感染性又は感染後腸炎、又は毒性その他の化学療法薬に起因する小腸損傷である、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
化学療法又は放射線治療の副作用の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための、請求項１に記載のＧＬＰ−２アナログの使用。
【請求項１０】
前記副作用が、化学療法に因る下痢、腹部疝痛、又は嘔吐、あるいは化学療法又は放射線療法から生じる腸上皮の構造的及び機能的損傷である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
新生児における腸機能障害、骨粗しょう症又はＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ）媒介型症状の治療用の医薬の製造のための、請求項１に記載のＧＬＰ−２アナログの使用。
【請求項１２】
栄養失調症が関与する症状の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための、請求項１に記載のＧＬＰ−２アナログの使用。
【請求項１３】
前記栄養失調症が関与する症状は、悪液質又は拒食症である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
医薬として許容される担体とともに、癌化学療法薬、及び請求項１に記載のＧＬＰ−２アナログを含む、治療用キット。
【請求項１５】
医薬として許容される担体とともに、癌化学療法薬、及び請求項１に記載のＧＬＰ−２アナログを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はグルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）アナログ及び、例えば胃及び腸関連障害の予防又は治療における及び化学療法及び放射線療法の副作用を改善する目的でのその医学的用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＬＰ−２は、腸の腸内分泌Ｌ細胞内及び脳幹の特定の領域内でのプログルカゴンの翻訳後プロセッシングから放出された３３−アミノ酸ペプチドである。これは、栄養摂取に応答してグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、オキシントモジュリン及びグリセンチンと共に同時分泌される。
【０００３】
ＧＬＰ−２は、クリプト内の基幹細胞増殖の刺激及びビラス上のアポトーシスの阻害を介して小腸粘膜上皮の有意な成長を誘発する（Druckerら、Proc, Natl Acad Sci USA,1996、９３；７９１１−６）。ＧＬＰ−２は同様に、胃内容排出及び胃酸分泌（Wojdemann ら、 I. Clin Endocrinol Metab.1999、８４；２５１３−７）をも阻害し、腸内障壁機能を増強し（Benjamin ら、. Gut,2000、４７；１１２−９）、グルコース輸送担体のアップレギュレーションを介して腸内ヘキソース輸送を刺激し（Cheeseman, Am J Phygiol.1997、Ｒ１９６５−７１）、腸管血流（Guan ら、 Gastroenterology.2003、１２５、１３６〜４７）を増大させる。
【０００４】
ＧＬＰ−２は、クラスＩＩのグルカゴンセクレチンファミリーに属する単一Ｇタンパク質カップリング受容体に結合する（１）。ＧＬＰ−２受容体は、ＧＬＰ−２に対する応答性をもつものとして知られる部位である小腸、結腸及び胃の中でのみ位置特定されてきた（Yustaら、Gastroenterology,.2000、１１９；７４４−５５）。しかしながら、胃腸管内のＧＬＰ−２受容体刺激のための標的細胞はなおも不明瞭であり、ＧＬＰ−２受容体にカップリングされた下流側細胞内メディエータはほとんど理解されていない。
【０００５】
小腸内のＧＬＰ−２がもつ特異的かつ有益な効果が実証されたことから、腸疾患又は腸障害の治療におけるＧＬＰ−２の使用に大きな関心が寄せられることとなった（Sinclair及びDrucker, Physiology 2005；３５７−６５）。さらに、ＧＬＰ−２は、化学療法誘発型粘膜炎、虚血再かん流障害、硫酸デキストラン誘発型大腸炎及び感染性腸疾患の遺伝モデルを含めた、広範な数多くの腸管障害の前臨床的モデルにおいて粘膜上皮障害を予防又は削減することが示されてきた（Sinclair及びDrucker Physiology 2005；３５７−６５）。
【０００６】
ＧＬＰ−２は、Ｈ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＯＨという配列をもつ３３アミノ酸ペプチドとして分泌される。これは、酵素ＤＰＰＩＶによりＮＨ2末端の位置２のアラニン（Ａ）において不活性ヒトＧＬＰ−２（３−３３）へと急速に解裂される。この細胞Ｐ−２（１−３３）の急速な酵素分解は腎クリアランスに加えて、ペプチドについて約７分の半減期を結果としてもたらす（Tavaresら、Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab.２７８：Ｅ１３４−Ｅ１３９、２０００年）。
【０００７】
米国特許第５，９９４，５００号（Druckerら）は、ＧＬＰ−２のアンタゴニスト及び胃腸組織の成長に対するその効果について記述している。該アンタゴニストを、過形成の治療において又は形成不全を誘発するために使用すべき調合薬として処方することが示唆されている。米国特許第５，９９４，５００号では、哺乳動物ＧＬＰ−２の構造は、置換及び欠失といったような突然変異により改変された。
【０００８】
米国特許第６，１８４，２０８号、同第５，７８９，３７９号及び同第６，１８４，２０１号は、ＧＬＰ−２アナログ及びその医学的用途について開示している。該アナログは、全て、ヒトＧＬＰ−２の置換及び／又は欠失によって得られたものである。
【０００９】
Da Cambraら、（Biochemistry 2000、３９、８８８８〜８８９４）は、ＧＬＰ−２の活性のための構造的決定因子について記述している。かかる決定因子の例としては、ＧＬＰ−２受容体の結合及び活性化にとって決定的なものとして言及されているＰｈｅ６及びＴｈｒ５である。
【００１０】
国際公開第９７／３９０３１号では、ＧＬＰ−２アナログ、［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２が開示されている。ここでは、位置２のアラニンは、ＤＰＰＩＶ解裂に対する耐性をペプチドに付与するべくグリシンで置き換えられている。アラニンの置き換えはペプチドの安定性及び効力を増大させることが示されている。該特許出願は、腸上皮粘膜の炎症及び破壊に関連する疾病に対しＧＬＰ−２アナログをいかに使用できるかを記述している。これらの疾病としては、小腸の広範囲切除、炎症性腸疾患、化学療法誘発型粘膜炎及び虚血性障害が含まれる。
【００１１】
国際公開第０２／０６６５１１は、インビボで長い半減期をもつＧＬＰ−２アナログ及び炎症性腸疾患といったような胃腸障害の治療における薬剤としてのそれらの使用について記述している。
【００１２】
国際公開第０１／４１７７９は、化学療法誘発型アポトーシスを阻害し細胞の存続を促進するための前処置としてのｈ［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２の使用について記述する。
【００１３】
本書中に引用された全ての参考文献は、その全体が本書に参考として明示的に内含される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
数多くの科学者により、さまざまな疾患の治療におけるＧＬＰ−２又はそのＧＬＰ−２アナログの使用が提案されてきた。しかしながら、改良型の安定したＧＬＰ−２アナログに対するニーズはなおも存在している。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の概要
広義には、本発明は野生型ＧＬＰ−２に比べてより多くの置換のうちの１つを含み、インビボでの改善された生物活性及び／又は例えばインビトロ安定性検定において査定されるような改善された化学的安定性を有するＧＬＰ−２アナログに関する。より特定的には、本発明の好ましいＧＬＰ−２アナログは、任意には（序文で言及されているような）位置２及び位置３、５、７、１０及び１１のうちの単数又は複数の位置におけるさらなる置換及び／又は野生型ＧＬＰ−２配列の位置３１〜３３に対応するアミノ酸のうちの単数又は複数のものの欠失及び／又はＮ末端又はＣ末端安定化ペプチド配列の付加と組合せた状態で、野生型ＧＬＰ−２配列の任意８、１６、２４及び／又は２８のうちの単数又は複数の位置における置換を含んでいる。改良された化学的安定性及び／又は生物活性を有し得るＧＬＰ−２アナログを提供することと同様に、本発明は又、特に野生型ＧＬＰ−２の位置Ａｓｐ３及び／又はＳｅｐ８及び／又はＡｓｎ１６及び／又はＡｓｎ２４及び／又はＧｌｎ２８のうちの単数又は複数において修飾を含み入れることにより、結腸に比べ小腸内での活性を促進しかつその逆の形でも促進する優先的な腸内成長を有する化合物を提供することにも関する。
【００１６】
従って、１態様において、本発明は、
Ｒ1−Ｚ1−Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ａｌａ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｚ2−Ｒ2
という一般構造式Ｉにより表わされるＧＬＰ−２アナログにおいて、式中、
−  Ｒ1は水素、Ｃ1-4アルキル（例えばメチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイル又はトリフルオロアセチルであり、
−  Ｘ２はＧｌｙ、Ａｌａ又はＳａｒであり、
−  Ｘ３はＧｌｕ又はＡｓｐであり、
−  Ｘ５はＳｅｒ又はＴｈｒであり、
−  Ｘ６はＰｈｅ又はＰｒｏであり、
−  Ｘ７はＳｅｒ又はＴｈｒであり、
−  Ｘ８はＡｓｐ又はＳｅｒであり、
−  Ｘ９はＧｌｕ又はＡｓｐであり、
−  Ｘ１０はＭｅｔ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ又は酸化的に安定したＭｅｔ交換アミノ酸であり、
−  Ｘ１１はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｌｙｓ又はＳｅｒであり、
−  Ｘ１２はＴｈｒ又はＬｙｓであり、
−  Ｘ１３はＩｌｅ、Ｇｌｕ又はＧｌｎであり、
−  Ｘ１４はＬｅｕ、Ｍｅｔ又はＮｌｅであり、
−  Ｘ１５はＡｓｐ又はＧｌｕであり、
−  Ｘ１６はＡｓｎ又はＡｌａであり、
−  Ｘ１７はＬｅｕ又はＧｌｕであり、
−  Ｘ１８はＡｌａ又はＡｉｂであり、
−  Ｘ１９はＡｌａ又はＴｈｒであり、
−  Ｘ２０はＡｒｇ又はＬｙｓであり、
−  Ｘ２１はＡｓｐ又はＩｌｅであり、
−  Ｘ２４はＡｓｎ、Ａｌａ又はＧｌｕであり、
−  Ｘ２８はＧｌｎ、Ａｌａ又はＡｓｎであり、
−  Ｘ３１はＰｒｏ、Ｉｌｅであるか又は欠失しており、
−  Ｘ３２はＴｈｒであるか、又は欠失しており、
−  Ｘ３３はＡｓｐ、Ａｓｎであるか又は欠失しており、
−  Ｒ2はＮＨ2又はＯＨであり、
−  Ｚ1及びＺ2は、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ又はＯｒｎから成る群から選択された３〜２０個のアミノ酸単位のペプチド配列であるか又は不在であり、
−  Ｘ８がＳｅｒであること及び／又はＸ１６がＡｌａであること及び／又はＸ２４がＡｌａであること及び／又はＸ２８がＡｌａであることの中から選択された１又は複数の置換を含む、
ＧＬＰ−２アナログ、又はその薬学的に許容される塩又は誘導体を提供する。
【００１７】
さらなる実施形態においては、該発明は、
Ｒ1−Ｚ1−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｘ５−Ｐｈｅ−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ａｌａ−Ｘ１９−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｚ2−Ｒ2、という一般構造式ＩＩにより表わされ、式中、
−  Ｒ1は水素、Ｃ1-4アルキル（例えばメチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイル又はトリフルオロアセチルであり、
−  Ｘ３はＧｌｕ又はＡｓｐであり、
−  Ｘ５はＳｅｒ又はＴｈｒであり、
−  Ｘ７はＳｅｒ又はＴｈｒであり、
−  Ｘ８はＡｓｐ又はＳｅｒであり、
−  Ｘ９はＧｌｕ又はＡｓｐであり、
−  Ｘ１０はＭｅｔ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ又は酸化的に安定したＭｅｔ交換アミノ酸であり、
−  Ｘ１１はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｌｙｓ又はＳｅｒであり、
−  Ｘ１２はＴｈｒ又はＬｙｓであり、
−  Ｘ１３はＩｌｅ、Ｇｌｕ又はＧｌｎであり、
−  Ｘ１４はＬｅｕ、Ｍｅｔ又はＮｌｅであり、
−  Ｘ１５はＡｓｐ又はＧｌｕであり、
−  Ｘ１６はＡｓｎ又はＡｌａであり、
−  Ｘ１７はＬｅｕ又はＧｌｕであり、
−  Ｘ１９はＡｌａ又はＴｈｒであり、
−  Ｘ２０はＡｒｇ又はＬｙｓであり、
−  Ｘ２４はＡｓｎ又はＡｌａであり、
−  Ｘ２８はＧｌｎ、Ａｌａ又はＡｓｎであり、
−  Ｘ３１はＰｒｏ、Ｉｌｅであるか又は欠失しており、
−  Ｘ３２はＴｈｒであるか、又は欠失しており、
−  Ｘ３３はＡｓｐであるか又は欠失しており、
−  Ｒ2はＮＨ2又はＯＨであり、
−  Ｚ1及びＺ2は、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ又はＯｒｎから成る群から選択された３〜２０個のアミノ酸単位のペプチド配列であるか又は不在であり、
−  Ｘ８がＳｅｒであること及び／又はＸ１６がＡｌａであること及び／又はＸ２４がＡｌａであること及び／又はＸ２８がＡｌａであることの中から選択された単数又は複数の置換を含む、ＧＬＰ−２アナログ又はその薬学的に許容される塩又は誘導体を提供する。
【００１８】
さらなる実施形態においては、該発明は、
Ｒ1−Ｚ1−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｘ５−Ｐｈｅ−Ｘ７−Ｘ８−Ｇｌｕ−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｘ１６−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｚ2−Ｒ2
という一般構造式ＩＩＩにより表わされ、式中、
−  Ｒ1は水素、Ｃ1-4アルキル（例えばメチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイル又はトリフルオロアセチルであり、
−  Ｘ３はＧｌｕ又はＡｓｐであり、
−  Ｘ５はＳｅｒ又はＴｈｒであり、
−  Ｘ７はＳｅｒ又はＴｈｒであり、
−  Ｘ８はＡｓｐ又はＳｅｒであり、
−  Ｘ１０はＭｅｔ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ又は酸化的に安定したＭｅｔ交換アミノ酸であり、
−  Ｘ１１はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｌｙｓ又はＳｅｒであり、
−  Ｘ２４はＡｓｎ又はＡｌａであり、
−  Ｘ２８はＧｌｎ又はＡｌａであり、
−  Ｘ３１はＰｒｏであるか又は欠失しており、
−  Ｘ３２はＴｈｒであるか、又は欠失しており、
−  Ｘ３３はＡｓｐであるか又は欠失しており、
−  Ｒ2はＮＨ2又はＯＨであり、
−  Ｚ1及びＺ2は、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ又はＯｒｎから成る群から選択された３〜２０個のアミノ酸単位のペプチド配列であるか又は不在であり、
−  Ｘ８がＳｅｒであること及び／又はＸ１６がＡｌａであること及び／又はＸ２４がＡｌａであること及び／又はＸ２８がＡｌａであることの中から選択された１又は複数の置換を含む、
ＧＬＰ−２アナログ又はその薬学的に許容される塩又は誘導体を提供する。
【００１９】
一部の実施形態においては、Ｚ1が存在する場合、Ｒ1はＨであり得、Ｚ2が存在する場合、Ｒ2はＯＨであり得る。
【００２０】
本発明の一部の実施形態においては、ＧＬＰ−２アナログは、該出願の序文に記された配列を有する野生型ＧＬＰ−２（１−３３）に対する少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも６３％の配列同一性、より好ましくは少なくとも６６％の配列同一性そしてさらに一層好ましくは少なくとも６９％の配列同一性を有する。
【００２１】
ＧＬＰ−２ポリペプチド配列との関係における「アミノ酸配列同一性百分率（％）」というのは、配列を整列させ必要とあらば最大配列同一性百分率を達成するべく空隙を導入した後の、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮に入れない、野生型ＧＬＰ−２配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基の百分率として定義づけされる。配列の整列は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２及びＡｌｉｇｎソフトウェアといったような公開ソフトウェアを用いて当該技術分野において周知の技術を用いて当業者により実施され得る。例えばAlontschulら、（Methods in Enzymology, 266：４６０〜４８０（１９９６年）； http://blast.wustl/edu/blast/README.html）又はPearsonら（Genomics, 46、２４、３６、１９９７年）そしてＡｌｉｇｎプログラムについてはhttp://molbiol.soton.ac.uk/compute/align.htmlを参照のこと。
【００２２】
本書で本発明に従って使用される配列同一性百分率は、そのデフォルト設定値と共にこれらのプログラムを使用して決定される。より一般的には、当業者であれば、比較中の配列の全長にわたり最大の整列を達成するのに必要とされるあらゆるアルゴリズムを含めて、整列を決定するための適切なパラメータを容易に決定することができる。
【００２３】
一部の好ましい実施形態においては、構造式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩにより表わされたＧＬＰ−２ペプチドアナログは、位置Ｘ８、Ｘ１６、Ｘ２４、及び／又はＸ２８のうちの２つ以上の位置での置換、及び／又はこれらの置換とその他の置換、好ましくは位置Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ１０及び／又はＸ１１における置換の組合せを含む。
【００２４】
構造式Ｉ〜ＩＩＩ内に入るＸ８、Ｘ１６、Ｘ２４及び／又はＸ２８の置換の組合せの例としては、以下のものが含まれる；
Ｓｅｒ８、Ａｌａ１６；
Ｓｅｒ８、Ａｌａ２４；
Ｓｅｒ８、Ａｌａ２８；
Ａｌａ１６、Ａｌａ２４；
Ａｌａ１６、Ａｌａ２８；
Ａｌａ２４、Ａｌａ２８；
Ｓｅｒ８、Ａｌａ１６、Ａｌａ２４；
Ｓｅｒ８、Ａｌａ１６、Ａｌａ２８；
Ｓｅｒ８、Ａｌａ２４、Ａｌａ２８；
Ａｌａ１６、Ａｌａ２４、Ａｌａ２８；
Ｓｅｒ８、Ａｌａ１６、Ａｌａ２４、Ａｌａ２８。
【００２５】
構造式Ｉ〜ＩＩＩ内に入るか又は位置Ｘ８、Ｘ１６、Ｘ２４及び／又はＸ２８での置換と組合わされ得る位置Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ１０及び／又はＸ１１における置換の例としては、
Ｇｌｕ３、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、２４；
Ｇｌｕ３、Ｔｈｒ５、Ｌｅｕ１０、Ｓｅｒ１１、Ａｌａ１６、２４、２８；
Ｇｌｕ３、Ｔｈｒ５、Ｌｅｕ１０、Ｌｙｓ１１、Ａｌａ１６、２４、２８；
Ｇｌｕ３、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ８、Ｌｅｕ１０、Ｌｙｓ１１、Ａｌａ１６、２４、２８；
Ｇｌｕ３、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ８、１１、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１６、２４、２８；
Ｇｌｕ３、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ８、１１、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１６、２４、２８；
Ｇｌｕ３、Ｓｅｒ８、１１、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１６、２４、２８；
Ｇｌｕ３、Ｌｅｕ１０、Ｓｅｒ１１、Ａｌａ１６、２４、２８；
Ｇｌｕ３、Ｌｅｕ１０、Ｌｙｓ１１、Ａｌａ１６、２４、２８；
Ｇｌｕ３、Ｔｈｒ５、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、１６、２４、２８；
Ｇｌｕ３、Ｔｈｒ５、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、１６、２４、２８、Ｉｌｅ２１；
Ｇｌｕ３、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ８、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、１６、２４、２８；
Ｇｌｕ３、Ｓｅｒ８、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、１６、２４、２８；
Ｇｌｕ３、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、１６、２４、２８；
Ｔｈｒ７、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、２４；
Ｔｈｒ７、Ｌｅｕ１０、Ｌｙｓ１１、Ａｌａ２４；
Ｔｈｒ７、Ｌｅｕ１０、Ｓｅｒ１１、Ａｌａ２４；
Ｔｈｒ７、Ｌｅｕ１０、Ｓｅｒ８、１１、Ａｌａ２４；
Ｔｈｒ７、Ｓｅｒ８、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、２４；
Ｔｈｒ７、Ｓｅｒ８、Ｌｅｕ１０、Ｌｙｓ１１、Ａｌａ２４；
Ｓｅｒ８、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、２４；
Ｌｅｕ１０、Ａｌａ２４；
Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、Ａｌａ２４；
Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、２４、２８；
Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、１６、２４、２８；
Ｌｅｕ１０、Ｌｙｓ１１、Ａｌａ２４；
Ｌｅｕ１０、Ｓｅｒ１１、Ａｌａ２４；
Ｌｅｕ１０、Ｓｅｒ８、１１、Ａｌａ２４；
又は、位置８、１６、２４及び／又は２８での上述の変更と組合せた状態での位置Ｘ３１〜Ｘ３３のうちの１又は複数のものにおける欠失、が含まれる。
【００２６】
本発明のＧＬＰ−２化合物の特定的な例は、以下の詳細な説明の中で記されている。
【００２７】
改善された化学的安定性及び生物活性を有し得るＧＬＰ−２アナログを提供することに加えて、本発明は又、結腸に加えて小腸内での活性を促進しかつその逆の形でも促進する優先的成長を有する化合物を提供することにも関する。特に、本書で記述する実験は、野生型ＧＬＰ−２の位置Ａｓｐ３及び／又はＳｅｒ８及び／又はＡｓｎ１６及び／又はＧｌｎ２８における置換が、テスト動物に投与された場合に、結腸質量の増加に比べ小腸重量の優先的増加を提供するということを示している。これらの発見事実は、結腸に対し比較的少ない効果しかもたない一方で小腸における効果を促進する及びその逆の形で促進する成長の増加を得ることが有利である身体条件を治療するために、例示された化合物が有益であることを意味している。
【００２８】
かくして、小腸の成長をひき起こすために好ましい化合物は標準的に野生型ＧＬＰ−２の位置３、８、１６及び／又は２８に単数又は複数の置換を含んでいる。かかる化合物は選択的に結腸よりもむしろ小腸の成長をひき起こし得る。従ってこれらは、小腸に影響を及ぼす又は小腸に関連する身体条件のために使用可能である。
【００２９】
好ましくは、かかる小腸−選択的化合物は、位置Ｘ３、Ｘ７、Ｘ１６、Ｘ２４、Ｘ２８、Ｘ３１、Ｘ３２及び／又はＸ３３のうちの複数の位置における置換を含む。かくして、小腸選択的化合物は、Ｘ３がＧｌｕ、Ｘ７がＳｅｒ、Ｘ１６がＡｌａ、Ｘ２４がＡｌａ、Ｘ２８がＡｌａ、Ｘ３１がＩｌｅ、Ｘ３２がＴｈｒ及びＸ３３がＡｓｐである置換のうちの２つ以上の置換を含み得る、任意には、位置Ｘ３１、Ｘ３２及びＸ３３のアミノ酸残基を欠失させることができる。
【００３０】
小腸内の上皮成長を優先的に刺激する例示されている化合物には、１８０９、１８１８、１８１９、１８２０、１８２６、１８２７、１８４４、１８４５、１８４６、１８４８、１８４９、１８５０、１８５１、１８５２、１８５３、１８５５、１８５７、１８５８、１８５９が含まれる。
【００３１】
一方、これらの修飾を有していない本発明の化合物、例えば位置１０、１１及び／又は２４に単数又は複数の置換を含んでいない本発明の化合物は、小腸ではなくむしろ結腸の優先的成長を誘発するために好まれる可能性がある。従って、これらを結腸に影響を及ぼす又は結腸に関連する身体条件の治療のために使用することができる。
【００３２】
このような結腸選択的化合物は、位置Ｘ３、Ｘ８及び／又はＸ２４における置換のうちの２つ以上のものを含み得る。例えば、これらはＸ３がＡｓｐ、Ｘ８がＡｓｐ及びＸ２４がＡｌａであることの中から選択された２つ以上の置換を含み得る。任意には、位置Ｘ３１、Ｘ３２及びＸ３３におけるアミノ酸残基を欠失させることができる。
【００３３】
結腸内の上皮成長を優先的に刺激する例示された化合物には、１８３０、１８３１、１８３５、１８３６、１８３９、１８４０、１８４１及び１８４３が含まれる。
【００３４】
小腸又は結腸内の優先的成長の無い例示された化合物：［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２（すなわち参照分子）、１５５９、１８２１、１８２２、１８２３、１８２５、１８２８、１８２９、１８３２、１８３３、１８３４、１８４２、１８５４。
【００３５】
該発明の化合物は、同様に、化学的安定性、例えば酸加水分解、酸化及び脱アミドに対する安定性をも増大させた。位置Ｘ３及び／又はＸ３３における置換は、酸加水分解に対する安定性を改善させ得ると考えられている。位置Ｘ１０における置換は、酸化安定性を改善し得る。位置Ｘ１１、Ｘ１６及び／又はＸ２４のうちの単数又は複数の位置における置換は、脱アミドに対する安定性を増大させ得る。従って、該発明のＧＬＰ−２アナログは、Ｇｌｙ２−ＧＬＰ−２に比べて、酸性溶液内での分解、脱アミド、及び／又は酸化的分解に対する増強された安定性を示し得る。
【００３６】
好ましくは、ＧＬＰ−２アナログは、以下の例７で記述される分解試験のうちの少なくとも１つにおいて、初期純度に比べ少なくとも７０％の観察された純度を維持している。付加的に又は代替的に、このＧＬＰ−２アナログは、０．１ＭのＨＣｌ溶液中で１２日後初期純度に比べ少なくとも６０％の観察純度を維持し得る。付加的に又は代替的に、ＧＬＰ−２アナログは、０．１ＭのＮＨ4ＨＣＯ3溶液中で６日後に、初期純度に比べ少なくとも７０％の観察純度を維持し得る。
【００３７】
さらなる態様においては、本発明は、本書で定義づけされているようなＧＬＰ−２アナログ又はその塩又は誘導体を担体との混和状態で含む組成物を提供している。好ましい実施形態においては、組成物は、薬学的に許容される組成物であり、担体は薬学的に許容される担体である。ＧＬＰ−２ペプチドアナログは、ＧＬＰ−２アナログの薬学的に許容される酸付加塩であり得る。
【００３８】
さらなる態様においては、本発明は、医療に使用するための本書で定義づけされている通りのＧＬＰ−２アナログ又はその塩を提供している。
【００３９】
さらなる態様においては、本発明は、腸機能の障害をもつ新生児、骨粗しょう症及びＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ）媒介症状の治療の如き、胃及び腸関連障害の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための、ＧＬＰ−２アナログ又はその塩又は誘導体の使用を提供する。一例を挙げると、かかる胃及び腸関連障害は、潰瘍、胃炎、消化障害、吸収不良症候群、短腸症候群、盲管症候群、炎症性腸疾患、セリアック病（例えば、グルテン性腸症又は小児脂肪便症から発生するもの）、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血スプルー、腸炎、限局性腸炎（クローン病）、潰瘍性大腸炎、下痢が付随する過敏性腸症候群、小腸損傷又は短腸症候群を含む。
【００４０】
該発明のＧＬＰ−２アナログで治療することができるか又は予防的又は治療的にＧＬＰ−２アナログが有用であり得るその他の身体条件としては、放射線腸炎、感染性又は感染後腸炎又は毒性その他の化学療法薬に起因する小腸損傷が含まれる。これには、下痢、腹部疝痛及び嘔吐といったような化学療法の副作用を低減させかつ化学療法又は放射線療法の結果としての腸上皮の構造的及び機能的損傷を削減させるべく、化学療法又は放射線療法の１治療単位の前、又はそれと同時、又はその後にＧＬＰ−２アナログを投与することが必要とされ得る。
【００４１】
従って該発明は同様に、各々任意には薬学的に許容される担体と組合せた形での本発明のＧＬＰ−２アナログ及び癌化学療法薬を含む治療用キットをも提供する。２つの治療薬は、別々に投与するため（例えば別々のバイアル内で）個別に包装され得、そうでなければ同じ組成物中で提供することもできる。かくして、該発明はさらに、癌治療薬及び本発明のＧＬＰ−２アナログを薬学的に許容される担体と組合せた形で含む医薬組成物をもさらに提供している。
【００４２】
胃腸粘膜新生組織形成を有するか又は胃腸粘膜新生組織形成のリスクが高い患者については、胃腸粘膜新生組織形成の刺激又は悪化といったような低い副作用のリスクを削減又は消滅させるように化合物を選択することが望ましい可能性がある。例えば、結腸新生組織形成（良性又は悪性のいずれであろうと）を有するか又は結腸新生組織形成が発生するリスクのある患者を治療するための化合物を選択する場合、非選択的化合物又は小腸に比べ結腸に対する選択性の高い化合物よりも、結腸に比べ小腸に対する選択性が高い化合物を選択することが、より適切であり得る。
【００４３】
その他の態様においては、本発明は、例えば消耗性症候群悪液質及び拒食症といったような身体条件などの栄養失調の治療及び／又は予防のための医薬を製造のためのＧＬＰ−２アナログの使用をも提供する。
【００４４】
さらなる態様においては、本発明は、本書に定義づけされている通りのＧＬＰ−２アナログをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供している。
【００４５】
さらなる態様においては、本発明は、任意にはその発現を導くための配列と組合された状態での上述の核酸配列を含む発現ベクター、及び該発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。好ましくは、宿主細胞はＧＬＰ−２アナログを発現し分泌する能力をもつ。さらな態様においては、本発明は、ＧＬＰ−２アナログを発現するのに適した条件下で宿主細胞を培養する段階及びかくして生産されたＧＬＰ−２アナログを精製する段階を含む、ＧＬＰ−２アナログの生産方法を提供する。
【００４６】
該発明はさらに、療法中で使用するための該発明の核酸、該発明の発現ベクター、該発明のＧＬＰ−２アナログを発現し分泌する能力をもつ宿主細胞を提供する。該核酸、発現ベクター及び宿主細胞は、ＧＬＰ−２アナログ自体で治療され得る本書中に記述した障害のいずれかの治療のために使用可能なものである、ということがわかるだろう。従って、該発明のＧＬＰ−２アナログを含む治療用組成物又は該発明のＧＬＰ−２アナログの投与に対する言及は、前後関係からその他の必要性がある場合を除き、該発明の核酸、発現ベクター又は宿主細胞の投与を包含するものとみなされるべきである。
【００４７】
さらなる態様においては、本発明は、本書で定義された通りのＧＬＰ−２アナログ又はその塩又は誘導体、又は該発明の核酸、発現ベクター又は宿主細胞を有効量投与することによる、それを必要とする患者の体内で胃及び腸関連の障害を治療する方法を提供している。胃及び腸関連の障害の例は、以上で提供されている。
【００４８】
さらなる一態様においては、本発明は、本書で定義された通りのＧＬＰ−２アナログ又はその塩又は誘導体又は該発明の核酸、発現ベクター又は宿主細胞を有効量投与する段階を含む、それを必要とする患者における化学療法又は放射線療法の副作用を治療又は予防する方法を提供している。
【００４９】
さらなる態様においては、本発明は、本書で定義された通りのＧＬＰ−２アナログ又はその塩又は誘導体又は該発明の核酸、発現ベクター又は宿主細胞を有効量投与する段階を含む、それを必要とする患者における、消耗性症候群悪液質及び拒食症といったような身体条件などの栄養失調を治療又は予防する方法を提供する。
【００５０】
本発明の実施形態についてここで、添付図面を参照しながら、制限ではなく例を用いてより詳細に記述する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
本発明の詳細な説明
定義
相反する規定のないかぎり、上述の記述中で使用されている特定の用語に対しては以下の定義が与えられる。
【００５２】
明細書及び請求の範囲全体を通して、天然アミノ酸についての従来の１文字及び３文字コードならびに、サルコシン（Ｓａｒ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）及びα−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）といったようなその他のα−アミノ酸に対する一般的に受容されている３文字コードが使用される。該発明のペプチト中の全てのアミノ酸残基は、好ましくはＬ−立体配置を有する。しかしながらＤ−立体配置のアミノ酸も同様と存在し得る。
【００５３】
本発明の好ましい化合物は、特に腸の成長をひき起こす上で少なくとも１つのＧＬＰ−２生物活性を有する。これは、例えばテスト動物をＧＬＰ−２アナログで治療するか又は腸又はその一部分の質量を決定する実施例中で記述されているように、インビボ検定において査定することができる。
【００５４】
本発明のＧＬＰ−２アナログは、以上で定義されている通り、未変性ＧＬＰ−２に比べて単数又は複数のアミノ酸置換、欠失、反転又は付加を有する。この定義には同様に、同義語ＧＬＰ−２ミメティック及び／又はＧＬＰ−２アゴニストが含まれる。さらに、本発明のアナログは、そのアミノ酸側基、α−炭素原子、末端アミノ基又は末端カルボン酸基のうちの単数又は複数のものの化学的修飾を有し得る。化学的修飾には、化学的部分の付加、新しい結合の創造及び化学的部分の除去が含まれるがこれらに制限されるわけではない。アミノ酸側基における修飾には、制限的意味なく、リジンε−アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジン又はリジンのＮ−アルキル化、グルタミン酸又はアスパラギン酸カルボン酸基のアルキル化、及びグルタミン又はアスパラギンの脱アミドが含まれる。末端アミノの修飾には、制限的意味なく、ｄｅｓ−アミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ−低級アルキル及びＮ−アシル修飾が含まれる。末端アルボキシ基の修飾には、制限的意味なく、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド及び低級アルキルエステル修飾が含まれる。好ましくは、本書では、低級アルキルはＣ1−Ｃ4アルキルである。さらに、単数又は複数の側鎖又は末端基を、通常の技能をもつペプチド科学者にとって既知の保護基で保護することも可能である。アミノ酸のα−炭素は、モノ又はジメチル化され得る。
【００５５】
存在する場合、酸化的に安定したＭｅｔ−交換アミノ酸というのは、Ｍｅｔ（Ｏ）（メチオニンスルホキシド）、Ｍｅｔ（Ｏ）2（メチオニンスルホン）、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｘ（Ｇｌｕ又はＧｌｎ）、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ及び好ましくはＬｅｕ、Ｎｌｅ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＧｌｙから成る群の中から選択されるものを意味する。
【００５６】
該発明のペプチドを、塩又はその他の誘導体の形で提供することも同様に可能であることを理解すべきである。塩には、酸付加塩及び塩基性塩といったような薬学的に許容される塩が含まれる。酸付加塩の例としては、塩酸塩、クエン酸塩及び酢酸塩が含まれる。塩基性塩の例としては、カチオンが、ナトリウム及びカリウムといったアルカリ金属、カルシウムといったアルカリ土類金属及びＲ3及びＲ4が独立して任意に置換されたＣ1-6アルキル、任意に置換されたＣ2-6アルケニル、任意に置換されたアリール又は任意に置換されたヘテロアリールを表わすものとしてアンモニアイオン+Ｎ（Ｒ3）3（Ｒ4）の中から選択されている塩が含まれる。薬学的に許容される塩のその他の例は、「レミントンの薬学」第１７版、Ｅｄ．Alfonso R.Gennaro C.編）、Mark Publishing Company、Easton、ペンシルバニア州、米国、１９８５年及びさらに最新版、ならびにEncyclopaedia of Pharmaceutical Technologyの中で記述されている。
【００５７】
該発明のＧＬＰ−２アナログのその他の誘導体としては、Ｍｎ2+及びＺｎ2+といった金属イオンとの配位錯体、インビボ加水分解可能エステルといったエステル、遊離酸又は塩基、水和物、プロドラッグ又は脂質が含まれる。当該技術分野において周知の技術を用いて、化合物中に存在するヒドロキシ又はカルボン酸基と適切なカルボン酸又はアルコール反応パートナーとの間でエステルを形成させることが可能である。化合物のプロドラッグとしてインビボ又はインビトロで親化合物の１つへと転換可能である誘導体。標準的には、化合物の生物活性のうちの少なくとも１つが、その化合物のプロドラッグ形態において削減されることになり、化合物又はその代謝生成物を放出するべくプロドラッグの転換により、これを活性化することが可能である。プロドラッグの例としては、インサイチュで除去されて活性化合物を放出し得るか又はインビボで薬物のクリアランスを阻害するのに役立ち得る保護基の使用が含まれる。
【００５８】
存在する場合、Ｚ1及びＺ2は各々独立して３〜２０又は４〜２０個のアミノ酸残基、例えば４〜１５の範囲内、より好ましくは４〜１０の範囲内、特に４〜７の範囲内のアミノ酸残基、例えば、４、５、６又は７個のアミノ酸残基、例えば６個のアミノ酸残基のペプチド配列を表わしている。ペプチド配列Ｚ内のアミノ酸残基の各々は独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｏｒｎの中から選択され得る。好ましくは、アミノ酸残基は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ及びＭｅｔ、ならびに国際公開第０１／０４１５６号に定義されているような構造式Ｉの中に入るアミノ酸、例えばＤｂｕ（２，４ジアミノ酪酸）又はＤｐｒ（２，３−ジアミノプロパン酸）、より好ましくはＧｌｕ、Ｌｙｓ及びＭｅｔ、特にＬｙｓから選択される。上述のアミノ酸は、Ｄ又はＬのいずれかの立体配置を有し得るが、好ましくは上述のアミノ酸はＬ−立体配置を有する。特に好ましい配列Ｚは４、５又は６個の連続するリジン残基、特に６個の連続するリジン残基の配列である。配列例又は国際公開第０１／０４１５６号の中で示されている。
【００５９】
一部の実施形態においては、Ｚ1は不在である。このような場合には、Ｚ2は存在していてもいなくてもよい。
【００６０】
本発明は、以下の実験区分の中でさらに記述されている以下のペプチドを内含する。
【００６１】
基準ＧＬＰ−２アナログ
１５５９Ｈ−［Ｇｌｙ２］ｈＧＬＰ−２−ＯＨ
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＵＱＴＫＩＴＤ−ＯＨ。
【００６２】
本発明のＧＬＰ−２アナログの例： 
１８０９［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｔｈｒ５、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２−（Ｌｙｓ）6−ＮＨ2
ＨＧＥＧＴＦＳＤＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ6−ＮＨ2；
１８１０［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｔｈｒ５、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、１６、２４、２８、Ｉｌｅ２１］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−（Ｌｙｓ）6−ＮＨ2
ＨＧＥＧＴＦＳＤＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＩＦＩＡＷＬＩＡＴＫ6−ＮＨ2；
１８１１［Ｇｌｙ２、Ｐｒｏ６、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２−ＮＨ2
ＨＧＤＧＳＰＳＤＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ2；
１８１２［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、２４］ｈＧＬＰ−２−ＮＨ2
ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＡＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫＩＴＤ−ＮＨ2；
１８１３［Ｇｌｙ２、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ2；
１８１４［Ｇｌｙ２、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、２４、２８］ｈＧＬＰ−２−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＬＡＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ2；
１８１５［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ2；
１８１８［Ｇｌｙ２、Ｓｅｒ８、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、２４］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−Ｋ6−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫ6−ＮＨ2；
１８１９［Ｇｌｙ２、Ｌｅｕ１０、Ｓｅｒ１１、Ａｌａ２４］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−Ｋ6−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＬＳＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫ6−ＮＨ2；
１８２０［Ｇｌｙ２、Ｔｈｒ７、Ｓｅｒ８、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、２４］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−Ｋ6−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＴＳＥＬＡＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫ6−ＮＨ2；
１８２１［Ｇｌｙ２、Ｌｅｕ１０、Ｌｙｓ１１、Ａｌａ２４］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−Ｋ6−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＬＫＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫ6−ＮＨ2；
【００６３】
１８２２［Ｇｌｙ２、Ｔｈｒ７、Ｌｅｕ１０、Ｌｙｓ１１、Ａｌａ２４］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−Ｋ6−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＴＤＥＬＫＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫ6−ＮＨ2；
１８２３［Ｇｌｙ２、Ｔｈｒ７、Ｓｅｒ８、Ｌｅｕ１０、Ｌｙｓ１１、Ａｌａ２４］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−Ｋ6−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＴＳＥＬＫＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫ6−ＮＨ2；
１８２４［Ｇｌｙ２、Ｔｈｒ７、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、２４］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−Ｋｓ−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＴＤＥＬＡＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫ6−ＮＨ2；
１８２５［Ｇｌｙ２、Ｓｅｒ８、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、２４］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫ−ＮＨ2；
１８２６［Ｇｌｙ２、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ２４］ｈＧＬＰ−２−Ｋ6−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＬＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫＩＴＤＫ6−ＮＨ2；
１８２７［Ｇｌｙ２、Ｔｈｒ７、Ｌｅｕ１０、Ｓｅｒ１１、Ａｌａ２４］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−Ｋ6−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＴＤＥＬＳＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫ6−ＮＨ2；
１８２８［Ｇｌｙ２、Ｔｈｒ７、Ｌｅｕ１０、Ｓｅｒ８、１１、Ａｌａ２４］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−Ｋ6−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＴＳＥＬＳＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫ6−ＮＨ2；
【００６４】
１８２９［Ｇｌｙ２、Ｌｅｕ１０、Ｓｅｒ８、１１、Ａｌａ２４］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−Ｋ6−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫ6−ＮＨ2；
１８３０［Ｇｌｙ２、Ｌｅｕ１０、Ｓｅｒ１１、Ａｌａ２４］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＬＳＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫ−ＮＨ2；
１８３１［Ｇｌｙ２、Ｔｈｒ７、Ｌｅｕ１０、Ｓｅｒ１１、Ａｌａ２４］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＴＤＥＬＳＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫ−ＮＨ2；
１８３２［Ｇｌｙ２、Ｔｈｒ７、Ｌｅｕ１０、Ｓｅｒ８、１１、Ａｌａ２４］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＴＳＥＬＳＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫ−ＮＨ2；
１８３３［Ｇｌｙ２、Ｌｅｕ１０、Ｓｅｒ８、１１、Ａｌａ２４］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫ−ＮＨ2；
１８３４［Ｇｌｙ２、Ｔｈｒ７、Ｓｅｒ８、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、２４］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＴＳＥＬＡＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫ−ＮＨ2；
１８３５［Ｇｌｙ２、Ｌｅｕ１０、Ｌｙｓ１１、Ａｌａ２４］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＬＫＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫ−ＮＨ2；
【００６５】
１８３６［Ｇｌｙ２、Ｔｈｒ７、Ｌｅｕ１０、Ｌｙｓ１１、Ａｌａ２４］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＴＤＥＬＫＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＵＱＴＫ−ＮＨ2；
【００６６】
１８３９［Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、Ａｌａ２４］ｈＧＬＰ−２（１−３３）−Ｋ6−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＬＡＴＩＬＤＮ  ＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫＩＴＤＫ6−ＮＨ2；
１８４０［Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、Ａｌａ２４］ｈＧＬＰ−２（１−３３）−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＬＡＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫＩＴＤ−ＮＨ2；
１８４１［Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、Ａｌａ２４］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＬＡＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫ−ＮＨ2；
１８４２［Ｔｈｒ７、Ｓｅｒ８、Ｌｅｕ１０、Ｌｙｓ１１、Ａｌａ２４］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−ＮＨ2ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＴＳＥＬＫＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫ−ＮＨ2；
１８４３［Ｔｈｒ７、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、Ａｌａ２４］ｈＧＬＰ−２（１−３０）−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＴＤＥＬＡＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫ−ＮＨ2；
１８４４［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ８、１１、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２（１−３３）−（Ｌｙｓ）６−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ6−ＮＨ2；
【００６７】
１８４５［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｔｈｒ５、Ｌｅｕ１０、Ｓｅｒ１１、Ａｌａ１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２（１−３３）−（Ｌｙｓ）6−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＥＧＴＦＳＤＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ6−ＮＨ2；
１８４６［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｓｅｒ８、１１、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２（１−３３）−（Ｌｙｓ）6−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ6ＮＨ2；
１８４７［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｌｅｕ１０、Ｓｅｒ１１、Ａｌａ１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２（１−３３）−（Ｌｙｓ）6−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ6−ＮＨ2；
１８４８［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ８、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２（１−３３）−（Ｌｙｓ）6−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ6−ＮＨ2；
１８４９［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｓｅｒ８、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２（１−３３）−（Ｌｙｓ）6−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ6−ＮＨ2；
１８５０［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｌｅｕ１０、Ｌｙｓ１１、Ａｌａ１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２（１−３３）−（Ｌｙｓ）6−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＫＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ6−ＮＨ2；
【００６８】
１８５１［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｔｈｒ５、Ｌｅｕ１０、Ｌｙｓ１１、Ａｌａ１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２（１−３３）−（Ｌｙｓ）6−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＥＧＴＦＳＤＥＬＫＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ6−ＮＨ2；
１８５２［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ８、Ｌｅｕ１０、Ｌｙｓ１１、Ａｌａ１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２（１−３３）−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＫＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ6−ＮＨ2；
１８５３［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ８、１１、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２（１−３３）−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ2；
１８５４［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｔｈｒ５、Ｌｅｕ１０、Ｓｅｒ１１、Ａｌａ１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２（１−３３）−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＥＧＴＦＳＤＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ2；
１８５５［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ８、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２（１−３３）−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ2；
１８５６［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｓｅｒ８、１１、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２（１−３３）−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ2；
【００６９】
１８５７［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｌｅｕ１０、Ｓｅｒ１１  、Ａｌａ１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２（１−３３）−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ2；
１８５８［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｓｅｒ８、Ｌｅｕ１０、Ａｌａ１１、１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２（１−３３）−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ2；
１８５９［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｌｅｕ１０、Ｌｙｓ１１、Ａｌａ１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２（１−３３）−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＫＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ2；
１８６０［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｔｈｒ５、Ｌｅｕ１０、Ｌｙｓ１１、Ａｌａ１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２（１−３３）−ＮＨ2
Ｈ−ＨＧＥＧＴＦＳＤＥＬＫＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ2；
１８６１［Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ８、Ｌｅｕ１０、Ｌｙｓ１１、Ａｌａ１６、２４、２８］ｈＧＬＰ−２（１−３３）−ＮＨ2
ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＫＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ。
【００７０】
本発明の特に好ましい化合物には、化合物１８３４、１８４６、１８４７、１８４８、１８４９、１８５５、１８５７及び１８５８が含まれる：
１８３４  Ｈ−ＨＧＤＧＳＦＴＳＥＬＡＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫ−ＮＨ2；
１８４６  Ｈ−ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ6ＮＨ2；
１８４７  Ｈ−ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ6−ＮＨ2；
１８４８  Ｈ−ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ6−ＮＨ2；
１８４９  Ｈ−ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ6−ＮＨ2；
１８５５  Ｈ−ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ2；
１８５７  Ｈ−ＨＧＥＧＴＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ2；
１８５８  Ｈ−ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ2。
【００７１】
安定性試験
当業者であれば、例えば以下で記述されているものに基づいてＧＬＰ−２アナログの分解生成物の検出のための適切な方法（例えば定量的方法）を設計することができる。分解は、任意の与えられたＧＬＰ−２アナログ内のアミノ酸の同一性及び位置及びｐＨ、溶液及び温度といった条件に応じて、酸化、加水分解及び脱アミドとして起こり得る。化合物は、それをストレスの加わった条件（すなわち分解をひき起こす可能性のある条件）の下でインキュベートし、その後残りの無傷のペプチドの含有量について分析した時点で、化合物安定性に従って格付けすることができる。さらに、ストレスの加わった条件下で得た主要分解生成物について得られた知識は、後のあらゆる分析方法の開発にとって重要になる。
【００７２】
ＧＬＰアナログを検出するための定量分析
当業者であれば同様に、インビトロ細胞系の機能的研究の一部として又は哺乳動物に対する投与の後のＧＬＰアナログの吸収、分配、代謝及び排泄を調査するため、複雑な環境又は溶液（例えば血漿、尿、組織ホモジネート、細胞ホモジネート、唾液又はそれに類似するもの）の中のＧＬＰアナログの検出のための方法（例えば定量的方法）を設計することもできるだろう。
【００７３】
１つの実施形態においては、定量的検定はＧＬＰアナログ又はそのフラグメントに対して発生させられた抗体に基づくことができる。免疫化された動物から得た抗体は、定量的検定のために使用可能である。１つの例では、マルチウェル平板内に不動化された分子の１部分の親和力をもつ第１の抗体を用いて、直接的サンドイッチＥＬＩＳＡを準備することができる。このとき、標本をウェルに適用し、第１の抗体によりＧＬＰアナログを捕捉する。捕捉されたＧＬＰアナログを次に、ＧＬＰアナログのもう１つの部分に対する親和力を有する第２の抗体によって認識する。第２の抗体は、酵素（ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はベータガラクトシダーゼ）又は放射性同位元素で標識され得る。このとき、捕捉されたＧＬＰアナログの量を、発色基質の付加又は放射線放射の直接的計数又はシンチレーションにより検出することができる。代替的には、捕捉されたＧＬＰアナログの量を、第２の抗体に対する親和力をもつ標識された抗体の付加により間接的に検出することができる。標本中の濃度は、ＧＬＰアナログを既知の量含む外部標準曲線から得た応答から推定可能である。代替的には、直接的競合、免疫検定を準備するために抗体を使用することができ、この場合ＧＬＰアナログに特異的な抗体がマルチウェル平板上に固定化され、標本は予め定義された固定濃度の標識されたＧＬＰアナログと共にウェル内でインキュベートされる。該標識は、酵素、蛍光プローブ、放射性同位元素又はビオチンであり得、例えば酵素に特異的な基質（例えば発色基質、蛍光基質又は化学発光基質）、シンチレーション又は酵素に連結されたアビジンを用いて検出可能であり、それに続いて上述の通りの検出が行われる。結合し標識されたＧＬＰアナログの量は、適切な方法により検出可能であり、上述の通りの外部標準曲線から得られる応答から、標本中に存在するＧＬＰアナログの濃度が導出される。
【００７４】
もう１つの実施形態においては、定量的検定は、液体クロマトグラフィタンデム質量分光分析法に基づくものであり得る。このようなセットアップでは、研究すべきＧＬＰアナログに特異的なフラグメントからの応答は、不活性ガス（Ｈｅ又はＡｒ）との衝突により誘発される親化合物のフラグメント化の時点で監視される。フラグメント化に先立ち、標本の構成要素を逆相クロマトグラフィにより分離することができ、そうでなければ、標本を直接質量分析計の中に注入することができる。適切な場合には、標本を前処理（プロテアーゼ阻害物質の添加、タンパク質沈降、固相抽出、免疫親和性抽出などに付すことができる。標本中に存在するＧＬＰアナログの濃度は、潜在的には、研究すべきＧＬＰアナログに類似する内部標準を用いて応答の補正の後、上述のとおりの外部標準曲線から得られた応答から導出される。
【００７５】
特異的抗体の作製
ＧＬＰアナログ又はそのフラグメントに対する特異的抗体は、哺乳動物の中で誘発され、血清から精製され得る。ＧＬＰアナログ又はフラグメントは、ウサギ、マウス又はその他の哺乳動物を免疫化するためにアジュバントと共に直接使用され得、そうでなければ、ＧＬＰアナログ又はそのフラグメントを担体分子（すなわちキーホールリンペットヘモシアニン、オボアルブミン、アルブミンなど）に対して化学的に連結させアジュバントと共に注射することもできる。抗体の親和性及び選択性を改善するため長期間にわたり２〜４週間の間隔をおいて注射をくり返すことができる。ポリクローナル抗体を血清から直接収穫することができる。モノクローナル抗体を得るためには、抗体生産ハイブリドーマを形成するべく、好ましくはマウスといった免疫化した動物から単離したβ細胞を腫瘍細胞と融合させるべきである。適切なクローン及び抗体のスクリーニング及び選択は、固定化したＧＬＰアナログ又はそのペプチドを用いて実施可能であり、それに続いて標識された抗抗体での検出が行われる。代替的には、スクリーニング及び選択は、固定化された抗体に基づくものであり得、それに続いて標識されたＧＬＰアナログ又はそのフラグメントでの検出が行われる。全てのケースにおいて、標識は、放射性同位元素、酵素、螢光プローブ又はビオチンであり得、例えば酵素に特異的な基質（例えば発色基質、螢光基質又は化学発光基質）、シンチレーション又は酵素に連結されたアビジンを用いて検出され得、それに続いて記述された通りの検出が行われる。
【００７６】
ＧＬＰ−２アナログの合成
固相又は液相ペプチド合成を用いて、該発明のアナログを合成することが好ましい。これに関連して、国際公開第９８／１１１２５号そして中でもFields、GBら、２００２年、「固相ペプチド合成の原則と実践」、Synthetic Peptides（第２版）などの数多くの文献中及びその中の例に対する参照が指示される。
【００７７】
かくして、ＧＬＰ−２アナログは、
（ａ）  固相又は液相ペプチド合成を用いてペプチドを合成し、このようにして得られた合成ペプチドを回収する段階；又は
（ｂ）  ペプチドが天然発生アミノ酸により構成される場合、宿主細胞内のペプチドをコードする核酸構成体を発現させ宿主細胞培養から発現生成物を回収する段階；又は
（ｃ）  ペプチドが天然発生アミノ酸により構成される場合、該ペプチドをコードする核酸構成体の無細胞インビトロ発現をもたらし、発現生成物を回収する段階；
を含む方法、又は
該ペプチドのフラグメントを得るための（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の方法の組合せ、その後ペプチドを得るためにフラグメントをライゲートする段階及び該ペプチドを回収する段階；
を含めた数多くの方法で合成可能である。
【００７８】
かくして、該発明の一部のアナログについては、遺伝子工学技術を開発することが有利であるかもしれない。これは、ペプチドが充分に大きい場合（又は融合構成体として生産された場合）及び該ペプチドが、生体内でＲＮＡから翻訳され得る天然発生のアミノ酸しか含まない場合にあてはまる。
【００７９】
組換え型遺伝子工学の目的では、該発明のペプチドをコードする核酸フラグメントが重要な化学的生成物である。従って、本発明のさらなる態様では、該発明のＧＬＰ−２アナログをコードする核酸配列を含む核酸分子が提供されており、ここでペプチドは、天然発生アミノ酸で構成されている。該発明の核酸フラグメントはＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントのいずれかである。
【００８０】
該発明の核酸フラグメントは、通常、該発明の核酸フラグメントを担持するクローニング又は発現ベクターを形成するべく適切なベクターの中に挿入されることになる。該発明のこれらのベクターの構築に関する詳細は、形質転換された細胞及び微生物に関連して以下で論述されることになる。ベクターは、利用の目的及びタイプに応じて、プラスミド、ファージ、コスミド、ミニ染色体又はウィルスの形をとる可能性があるが、一部の細胞中で過渡的にのみ発現される裸のＤＮＡも重要なベクターであり得る。該発明の好ましいクローニング及び発現ベクター（プラスミドベクター）は、自己複製の能力を有し、かくして、その後のクローニングのための高レベルの発現又は高レベルの複製を目的とする高いコピー数を可能にする。
【００８１】
該発明のベクターの概要には、５’→３’の方向でかつ作用可能に連結された形で、以下の要素が含まれる。すなわち、該発明の核酸フラグメント発現を駆動するためのプロモータ、任意にはポリペプチドフラグメントの膜内への組込み又はペプチドを補正するための組合せられた分泌、精製タグ及び酸素トリミングなどの数多くの用途のためのリーダーペプチド又は（細胞外位相へ又は該当する場合にはペリプラズマ内への）その分泌を可能にするリーダーペプチドをコードする核酸配列、該発明のペプチドをコードする核酸フラグメント、そして任意にはターミネータをコードする核酸配列。生産株又は細胞系列の中で発現ベクターを操作する場合、宿主細胞内に導入された時点でベクターが宿主細胞ゲノム内に組込まれるのは、好ましい形質転換済み細胞の遺伝的安定性を目的としてのことである。
【００８２】
該発明のベクターは、該発明の修飾ペプチドを生産するべく宿主細胞を形質転換するのに使用される。同じく該発明の一部を成すかかる形質転換細胞は、該発明のベクター及び核酸フラグメントの伝播のために使用されるか又は該発明のペプチドの組換え体生産のために使用される培養細胞又は細胞系列であり得る。
【００８３】
該発明の好ましい形質転換細胞は、細菌（例えばエシェリキア属（例えばE.cob（大腸菌））、バシラス属（Bacillus subtilis（枯草菌））、サルモネラ又はマイコバクテリア属（好ましくは、非病原性、例えばM. bovis BCGなど）、酵母（例えばSaccharomyces cerevisiae）及び原生動物といった微生物である。代替的には、形質転換細胞は、多細胞生体に由来する。すなわちこれは真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞であり得る。同様に、ヒトに由来する細胞も有利であり得る。以下の細胞系列及びベクターについての論述を参照のこと。クローニング及び／又は最適化された発現を目的とする場合、形質転換細胞が該発明の核酸フラグメントを複製する能力をもつことが好ましい。核フラグメントを発現する細胞が該発明の好ましい有用な実施形態である。これらは、該発明のペプチドの小規模又は大規模調製のために使用可能である。
【００８４】
形質転換細胞を用いて該発明のペプチドを生産する場合、不可欠であるというには程遠いが、発現生成物が培地内に移出されるか又は形質転換細胞の表面上に担持されることが望ましい。
【００８５】
有効な生産細胞が同定された場合、それを基礎として、該発明のベクターを担持しペプチドをコードする核酸フラグメントを発現する安定した細胞系列を確立することが好ましい。好ましくは、この安定した細胞系列は、該発明のペプチドを分泌するか又は担持し、かくしてその精製を促進する。
【００８６】
一般的には、宿主細胞と相容性ある種に由来するレプリコン及び制御配列を含有するプラスミドベクターを宿主と結びつけて使用する。ベクターは通常複製部位ならびに、形質転換細胞内での表現型選択を提供する能力をもつマーキング配列を担持している。例えば、E. coliは標準的に、E. coli種から誘導されたプラスミドであるＰＢＲ３２２を用いて（ただし他にも有用なプラスミドは数多く存在する）形質転換される（例えば、Bolirarら、１９７７年を参照のこと）。ＰＢＲ３２２プラスミドは、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有し、かくして、形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。ＰＢＲプラスミド又はその他の微生物プラスミド又はファージは、発現のため原核微生物により使用され得るプロモータをも含有するか又はこれを含有するように修飾されなくてはならない。
【００８７】
原核生物組換えＤＮＡ構築において最も一般的に使用されているプロモータとしてはβ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトースプロモータ系（Chang ら、１９７８年；Itakura ら、１９７７年；Goeddel ら、１９７９年）及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系（Goeddel ら、１９７９年、欧州特許第００３６７７６Ａ号）が含まれる。これらが最も一般的に使用されているものの、その他の微生物プロモータも発見され利用されており、そのヌクレオチド配列に関する詳細が公表され、当業者がそれらをプラスミドベクターで機能的にライゲートできるようにしている（Siebwenlistら、１９８０年）。
【００８８】
原核動物に加えて、酵母培養といったような真核微生物も使用可能であり、同じくここでは、プロモータは発現を駆動する能力をもたなくてはならない。Saccharomyces cerevisiaeつまり一般的パン酵母は、真核微生物の間で最も一般的に使用されているが、数多くのその他の菌株が一般的に入手可能である。Saccharomyces（サッカロミセス）内での発現のためには、例えば、プラスミドＹＲP７が一般的に使用される（Stinchcombら、１９７９、Kingsmanら、１９７９、Tschemperら、１９８０）。このプラスミドはすでに、例えばＡＴＣＣＮｏ．４４０７６又はＰＥＰ４−１といったようなトリプトファン内で成長する能力が欠如している酵母の突然変異体菌株のための選択マーカーを提供するｔｒｐｌ遺伝子を含有する（Jones、１９７７年）。このとき、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐｌ病変の存在は、トリプトファンの不在下での成長によりトク形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。
【００８９】
酵母ベクター内の適切な促進配列としては、３−ホスホグリセラートキナーゼ（Hitzmanら、１９８０年）又はその他の糖分解酵素（Hessら、１９６８年；Hallandら、１９７８年）例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼのためのプロモータが含まれる。適切な発現でラスミドを構築する上で、これらの遺伝子と結びつけられた終止配列は同様に、ｍＲＮＡのポリアデニル化及び終結を提供するべく発現されることが望まれる配列の３’のところで発現ベクター内にライゲートされる。
【００９０】
成長条件により制限される転写というさらなる利点を有するその他のプロモータは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝と結びつけられた分解酵素及び前述のグリセルアルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼ及びマルトース及びガラクトース利用を担当する酵素のためのプロモータ領域である。酵母コンパチブル・プロモータ、複製起点及び終結配列を含むあらゆるプラスミドベクターが適切である。
【００９１】
微生物に加えて、多細胞生体に由来する細胞培養も同様に、宿主として使用可能である。原則として、脊椎動物又は無脊椎動物のいずれの培養からであれ、あらゆるこのような細胞培養が実際に使用可能である。しかしながら、脊椎動物細胞では最も有利であり、培養（組織培養）中の脊椎動物の増殖は、近年日常的な手順となっている（組織培養、１９７３年）。このような有用な宿主細胞系列の例は、ＶＥＲＯ及びＨeＬa細胞、チャイニーズハムスタ卵巣（ＣＨＯ）細胞系列、及びＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７２９３、Spodoptera frugiperda（ＳＦ）細胞（i.a.Protein Sciences,1000 Risearch Parkway, Meriden, CT06450、米国及びInvitrogenなどから、完全な発現系として市販）、POBox2312、9704CH Groningen,オランダのInvitrogenから入手可能なD. Melanogaster細胞系Ｓ2、及びＭＤＣＫ細胞系列である。
【００９２】
かかる細胞のための発現ベクターは、通常（必要とあらば）、任意の必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写ターミネータ配列と共に、発現されるべき遺伝子の前にあるプロモータである複製起点を含む。
【００９３】
哺乳動物細胞の中での使用向けには、発現ベクター上の制御機能は往々にしてウィルス材料により提供される。例えば、一般に使用されるプロモータは、ポリオーマ、アデノウィルス、そして最も高い頻度ではシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）から誘導される。ＳＶ４０ウィルスの早期及び晩期プロモータは、両方共、ＳＶ４０ウィルス複製起点を同様に含むフラグメントとして容易に得られることから、特に有用である（Fiersら、１９７８年）、ＨｉｎｄＩＩＩ部位からウィルス複製起点内にあるＢｇＩＩ部位に向かって延びる約２５０ｂｐの配列が内含されていることを条件として、より小さい又はより大きいＳＶ４０フラグメントも同様に使用可能である。さらに、かかる制御配列が宿主細胞系と相容性をもつことを条件として、所望の遺伝子配列と通常結びつけられているプロモータ又は制御配列を利用することも可能である。
【００９４】
ＳＶ４０又はその他のウィルス（例えばポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）から誘導され得るような外因性起点を内含するように、ベクターの構築によって複製起点を提供することもできるし、或いは又、宿主細胞染色体複製機序によりこれを提供することもできる。ベクターが宿主細胞染色体の中に組込まれる場合には、往々にして後者で充分である。
【００９５】
組換え体生産プロセスにおいて満足な収率を得るためには、（精製を容易にするための）親和性タグとして役立ち得る融合パートナーにペプチドを融合させることによって及び／又はペプチドの多重反復を有することによって、融合タンパク質としてアナログを調製することが有利であり得る。これらの方法には、ペプチダーゼのための適切な解裂部位の存在が必要であるが、当業者であれば、その基調を成す遺伝構成体をいかに調製するかがわかるだろう。
【００９６】
組換え体の調製の後、該発明のペプチドを、多段階クロマトグラフィ（イオン交換、サイズ排除及び親和性クロマトグラフィ技術）を含めた、当該技術分野において一般に知られた方法により精製することができる。
【００９７】
代替的には、天然発生アミノ酸から成るペプチドを、無細胞系内でインビトロで調製することができる。これは、ペプチドが推定上の宿主細胞について毒性を有し得る場合に、特に好都合である。かくして、本発明は同様に、該発明のペプチドを調製するために無細胞インビトロ翻訳／発現の使用をも考慮している。これに関係して例えば米国Ambion Inc、2130 Woodward, Austin, Tx 78744-1832,から市販のインビトロ翻訳キット、材料及び技術文書の参照が指示される。
【００９８】
最後に、例えば半合成アナログを調製するように、利用可能な方法を組合わせることも同様に可能である。このようなセットアップにおいては、少なくとも２つの別々の段階又は方法を用いてペプチドフラグメントを調製し、その後、最終的ペプチド生成物を得るべく該フラグメントをライゲートする。
【００９９】
医薬組成物及び投与
本発明のＧＬＰ−２アナログ又はその塩又は誘導体は、貯蔵又は投与のために調製され、薬学的に許容される担体中の治療上有効な量の本発明のＧＬＰ−２ペプチド又はその塩又は誘導体を含む医薬組成物として処方され得る。
【０１００】
本発明の化合物の治療上有効な量は、投与経路、治療対象の哺乳動物のタイプ及び考慮中の特定の哺乳動物の身体的特徴によって左右されることになる。これらの因子及びこの量を決定することに対するそれらの関係は、ペプチドを大腸に送達するべく最適な効能を達成するように調整され得るが、医術の当業者にとっては周知である体重、食餌、同時投薬治療その他の因子によっても左右される。
【０１０１】
胃及び腸関連の障害を治療又は予防するのに有効な量でＧＬＰ−２アナログ又はその塩が存在している医薬組成物を提供することは、該発明の範囲内に入る。
【０１０２】
酸性部分を有する該発明の化合物の薬学的に許容される塩を、有機及び無機塩基を用いて形成することができる。塩基を用いて形成される適切な塩としては、金属塩例えばアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩、例えばナトリウム、カリウム又はマグネシウム塩；アンモニア塩及び有機アミン塩、例えばモルホリン、チオモルホリン、ピペリジン、ピロリジン、モノ、ジ又はトリ低級アルカリアミン（例えばエチル−ｔｅｒｔ−ブチル、ジエチル、ジイソプロピル、トリエチル、トリブチル又はジメチルプロピルアミン）、又はモノ、ジ又はトリヒドロキシ低級アルキルアミン（例えばモノ、ジ又はトリエタノールアミン）で形成されたものが含まれる。内部塩も形成可能である。同様にして、本発明の化合物が塩基性部分を含有する場合には、有機及び無機酸を用いて塩を形成することができる。例えば、酢酸、プロピオン酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、マロン酸、マンデル酸、リンゴ酸、フタル酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸及びカンファースルホン酸ならびにその他の既知の薬学的に許容される酸といった酸から塩を形成することができる。リジン、グリシン又はフェニルアラニンといったようなアミノ酸でアミノ酸付加塩を形成することもできる。
【０１０３】
医術の当業者にとって明白であるように、「治療上有効な量」の本発明のペプチド又は薬学組成物は、治療対象の年令、体重及び哺乳動物種、利用される特定の化合物、特定の投与様式及び所望の効果及び治療指標に応じて変動することになる。これらの因子及びこの量の決定とそれらの関係は、医術において周知であることから、治療上有効な投薬量レベル、本書中で記述されている腸及び胃に関連する疾病を予防しかつ／又は治療するという所望の結果を達成するのに必要な量ならびに本書で開示されているその他の医学的適応症の決定は、当業者の技量範囲内に入るものである。
【０１０４】
本書で使用する通り、「治療上有効な量」というのは、一定の与えられた身体条件又は病理の症候を低減させ、好ましくは該身体条件又は病理を患う個体の体内において生理学的応答を正規化する量である。症候の削減又は生理学的応答の正規化は、当該技術分野において日常的な方法を用いて決定され得、一定の与えられた身体条件又は病理に応じて変動し得る。１つの態様では、単数又は複数のＧＬＰ−２アナログ又は単数又は複数のＧＬＰ−２アナログを含む医薬組成物の治療上有効な量というのは、実質的に該身体条件又は病理を患わない個体におけるパラメータの同じ値まで（好ましくはその値の＋３０％以内、より好ましくは＋２０％以内、そしてさらに一層好ましくは１０％以内まで、測定可能な生理学的パラメータを回復する量である。
【０１０５】
該発明の１実施形態においては、本発明の化合物又は医薬組成物の投与はより低い投薬量レベルで開始され投薬量レベルは、腸及び胃関連の疾病といったような関連する医学的適応症を予防／治療する所望の効果が達成されるまで増加させられる。これが、治療上有効な量を定義づけることになる。単独で又は医薬組成物の一部としての本発明のペプチドについては、かかる投与量は体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇ〜１００ｍｇの間、例えば約０．０１ｍｇ〜１０ｍｇの間、例えば１０〜１００μｇの間にあり得る。
【０１０６】
治療用途のためには、選択されたＧＬＰ−２アナログは、薬学的に許容される担体と共に処方され、選択された投与経路によりペプチドを送達するのに適している。本発明の目的では、末梢非経口経路には、静脈内、筋肉、皮下及び腹腔内投与経路が含まれる。本発明において使用される一部の化合物は同様に、経口、直腸内、鼻腔内又は下気道経路による投与にも適したものであり得る。これらがいわゆる経口でない経路である。当該薬学組成物は、該発明のＧＬＰ−２アナログ又はその塩又は誘導体及び薬学的に許容される担体を含む。適切な薬学的に許容される担体は、希釈剤、賦形剤などといったようなペプチドベースの薬剤と共に従来使用されるものである。治療用途のための薬学的に許容される担体は、薬学において周知であり、例えば「レミントンの薬学」、Mack Publishing Co.（A.R.Gennaro 編、１９８５年）の中で記述されている。例えば、わずかに酸性又は生理的ｐＨのリン酸緩衝生理食塩水及び無菌食塩水を使用することができる。ｐＨ緩衝剤は、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、トリス／ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、重炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、好ましい緩衝剤であるヒスチジン、アルギニン、リジン又は酢酸塩又はその混合物であり得る。好ましい緩衝液範囲はｐＨ４〜８、ｐＨ６．５〜８、より好ましくはｐＨ７〜７．５である。パラ、メタ及びオルト−クレゾール、メチル及びプロピルパラベン、フェノール、ベンジルアルコール、安息香酸ナトリウム、安息香酸、ベンジル安息香酸塩、ソルビン酸、プロパン酸、ｐ−ヒドロキン安息香酸エステルといったような防腐剤を医薬組成物内に提供することができる。例えばアスコルビン酸、メチオニン、トリプトファン、ＥＤＴＡ、アスパラギン、リジン、アルギニン、グルタミン及びグリシンといったような、酸化、脱アミド、異性化、ラセミ化、環化、ペプチド加水分解を防止する安定化剤を該医薬組成物中に提供することができる。ドデシル硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、カルホキンメチルセルロース、シクロデキストリンといったような、凝集、フィブリル化及び沈降を防止する安定化剤を、該医薬組成物内に提供することができる。エタノール、酢酸又は酢酸塩又はその塩といったような、可溶化用の又は凝集を防止するための有機修飾剤を該医薬組成物内に提供することができる。塩化ナトリウムなどの塩又は最も好ましい炭水化物例えばデキストロース、アンニトール、ラクトース、トレハロース、スクロース又はその混合物といったような等張性生成剤を該医薬組成物内に提供することができる。
【０１０７】
トゥイーン２０、 トゥイーン８０、ＳＤＳ（マ）、ポロキサマー例えばプルロニックＦ−６８、フルオロニックＦ−１２７といったような洗浄剤を、該医薬組成物内に提供することができる。該医薬組成物は、染料さらには着香剤さえ提供することができる。もう１つの実施形態においては、ＧＬＰ−２ペプチドアナログの薬学的に許容される酸付加塩が提供される。懸濁剤を使用することが可能である。
【０１０８】
凍結乾燥製品の凍結乾燥のため、医薬処方物中にエタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、２−プロパノール、エタノール、グリセロール、ポリエチレングリコールを提供することができる。凍結乾燥のため、医薬組成物内に、膨張性薬剤及び等張性生成剤例えば塩、例えば塩化ナトリウム、炭水化物例えばデキストロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、スクロース又はその混合物、アミノ酸例えばグリシン、グルタマート、又は賦形剤例えばシステイン、レシチン又はヒト血清アルブミン又はそれらの混合物を提供することができる。
【０１０９】
本発明の医薬組成物は、経口投与のための錠剤、カプセル又はエリキシル剤：直腸投与のための座薬；好ましくは注入投与向けの無菌溶液又は無菌粉末又は懸濁液などとして処方され使用され得る。投与量及び投与方法は、最適な効能を達成するべく調製可能であるが、これは、医術の当業者であれば認識するであろう。体重、食餌、同時投薬治療及びその他の因子といったような因子により左右されることになる。
【０１１０】
投与が、１日１回の静脈内又は皮下といったような非経口投与となる場合には、水溶液又は懸濁液として、使用直前の再調製又は注入に先立つ液体中の懸濁に適した凍結乾燥された固形形態として、又はエマルジョンとして、従来の形態で、注射可能な医薬組成物を調製することが可能である。
【０１１１】
凍結乾燥された製品の再調製のための希釈剤は、以上のリストからの適切な緩衝液、水、塩水、デキストロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、スクロース、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、塩酸システイン；又は洗浄剤例えばトゥイーン２０、トゥイーン８０、ポロキサマー例えばプルロニックＦ−６８又はプルロニックＦ−２７、ポリエチレングリコールを添加した状態及び／又は防腐剤例えばパラ、メタ及びオルトクレゾール、メチル及びプロピルパラベン、フェノール、ベンジンアルコール、安息香酸ナトリウム、安息香酸、ベンジル−安息香酸、ソルビン酸、プロパン酸、Ｐ−ヒドロキン安息香酸を添加した状態及び／又は有機修飾剤例えばエタノール、酢酸、クエン酸、乳酸又はそれらの塩を添加した状態での注射用の水であり得る。
【０１１２】
さらに、望ましい場合には、注射可能な医薬組成物は、湿潤剤又はｐＨ緩衝剤といったような少量の非毒性補助物質を含有し得る。吸収増強調製物（例えばリポゾーム、洗浄剤及び有機酸）を利用することが可能である。
【０１１３】
該発明の１つの実施形態においては、該化合物は、例えば完全非経口栄養療法中の患者（例えば新生児、又は悪液質又は拒食症患者）のための液体栄養サプリメントとして使用される場合などの輸液投与又は例えば皮下、腹腔内又は静脈内注射といった注入投与向けに処方され、従って無菌で発熱物質の無い形態で水溶液として利用され、例えばわずかに酸性又は生理的ｐＨまで緩衝される。筋肉投与のための処方は、植物油、例えば菜種油、トウモロコシ油又は大豆油中での溶液又は懸濁液をベースにしたものであり得る。これらのオイルベースの処方物は、例えばＢＨＡ（ブチル化ヒドロキシアニソール）及びＢＨＴ（ブチル化ヒドロキシトルエン）といった酸化防止剤により安定化され得る。
【０１１４】
かくして、当該ペプチド化合物は、蒸留水といったようなビヒクル中又は塩水、リン酸緩衝生理食塩水、５％デキストロース溶液又は油中で投与され得る。ＧＬＰ−２アナログの溶解度は、望ましい場合、洗浄剤及び乳化剤といったような溶解度向上剤を取入れることにより向上させることが可能である。
【０１１５】
水性担体又はビヒクルを注入物質として使用する目的で、望ましい作用部位まで緩慢に放出されるよう注入部位に又は注入部位の近くにＧＬＰ−２アナログを被着させるのに役立つ量のゼラチンで補完することができる。ヒアルロン酸といったような代替的ゲル化剤も同様にデポー剤として有用であり得る。
【０１１６】
本発明の１実施形態においては、処方物には以下のものが含まれる：
ａ．  ０．５ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは３〜２００ｍＭ、最も好ましくは２０〜１００ｍＭの最終濃度を得るべく水中に溶解させられたＬ−ヒスチジン；
ｂ．  最高３５０ｍＭ、好ましくは３０〜３００ｍＭ、最も好ましくは１００ｍＭ〜２３０ｍＭを得るためのマシニトール；及び
ｃ．  最高２００ｍＭ、好ましくは０．０５〜１００ｍＭ、最も好ましくは０．５〜５０ｍＭを溶液中に得るための酢酸。
【０１１７】
１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５〜５０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度を得るべく適切な量の治療用化合物が添加される。
【０１１８】
ｐＨは、４〜８、好ましくは６．５〜７．５、最も好ましくは６．７〜７．３という最終ｐＨに調整される。結果として得られる溶液は、標的重量に調整され、無菌ろ過され、薬学的用途のためバイアル内の適切なアリコートへと送り出される。処方物は、液体製品か又は凍結乾燥製品かに応じてさらに加工される。
【０１１９】
本発明のもう１つの実施形態においては、処方物には以下のものが含まれる：
ａ．  ０．５ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは３〜２００ｍＭ、最も好ましくは２０〜１００ｍＭのＬ−ヒスチジンという最終濃度を得るべく水中に溶解させられたＬ−ヒスチジン；
ｂ．  最高２００ｍＭ、好ましくは０．５〜１００ｍＭ、最も好ましくは１００ｍＭ〜２３０ｍＭを得るためのＬ−アルギニン；
ｃ．  最高３５０ｍＭ、好ましくは３０〜３００ｍＭ、最も好ましくは１００ｍＭ〜２３０ｍＭを得るためのマンニトール；及び
ｄ．  最高２００ｍＭ、好ましくは０．０５〜１００ｍＭ、最も好ましくは０．５〜５０ｍＭを溶液中に得るための酢酸。
【０１２０】
１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５〜５０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度を得るべく適切な量の治療用化合物が添加される。
【０１２１】
ｐＨは、４〜８、好ましくは６．５〜７．５、最も好ましくは６．７〜７．３という最終ｐＨに調整される。結果として得られる溶液は、標的重量に調製され、無菌ろ過され、薬学的用途のためバイアル内の適切なアリコートへと送り出される。処方物は、液体製品か又は凍結乾燥製品かに応じてさらに加工される。
【０１２２】
本発明のさらにもう１つの実施形態においては、処方物には以下のものが含まれる：
ａ．  最高２００ｍＭ、好ましくは３〜１００ｍＭ、最も好ましくは５〜５０ｍＭのＬ−ヒスチジンという最終濃度を得るべく水中に溶解させられたＬ−ヒスチジン；
ｂ．  最高２００ｍＭ、好ましくは０．５〜１００ｍＭ、最も好ましくは１００ｍＭ〜２３０ｍＭを得るためのＬ−アルギニン：
ｃ．  最高３５０ｍＭ、好ましくは３０〜３００ｍＭ、最も好ましくは１００ｍＭ〜２３０ｍＭを得るためのマンニトール；及び
ｄ．  最高２００ｍＭ、好ましくは０．０５〜１００ｍＭ、最も好ましくは０．５〜５０ｍＭを溶液中に得るための酢酸。
【０１２３】
１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５〜５０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度を得るべく適切な量の治療用化合物が添加される。
【０１２４】
ｐＨは、４〜８、好ましくは６．５〜７．５、最も好ましくは６．７〜７．３という最終ｐＨに調整される。結果として得られる溶液は、標的重量に調製され、無菌ろ過され、薬学的用途のためバイアル内の適切なアリコートへと送り出される。処方物は、液体製品か又は凍結乾燥製品かに応じてさらに加工される。
【０１２５】
本発明のさらにもう１つの実施形態においては、処方物には以下のものが含まれる：
ａ．  ０．５ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは３〜２００ｍＭ、最も好ましくは２０〜１００ｍＭのＬ−ヒスチジンという最終濃度を得るべく水中に溶解させられたＬ−ヒスチジン；
ｂ．  最高２００ｍＭ、好ましくは０．５〜１００ｍＭ、最も好ましくは１００ｍＭ〜２３０ｍＭを得るためのＬ−アルギニン；
ｃ．  最高３５０ｍＭ、好ましくは３０〜３００ｍＭ、最も好ましくは１００ｍＭ〜２３０ｍＭを得るためのマンニトール；及び
ｄ．  最高２００ｍＭ、好ましくは０．０５〜１００ｍＭ、最も好ましくは０．５〜５０ｍＭを溶液中に得るための酢酸。
【０１２６】
１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５〜５０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度を得るべく適切な量の治療用化合物が添加される。
【０１２７】
ｐＨは、４〜８、好ましくは６．５〜７．５、最も好ましくは６．７〜７．３という最終ｐＨに調整される。結果として得られる溶液は、標的重量に調整され、無菌ろ過され、薬学的用途のためバイアル内の適切なアリコートへと送り出される。処方物は、液体製品か又は凍結乾燥製品かに応じてさらに加工される。
【０１２８】
本発明のさらにもう１つの実施形態においては、処方物には以下のものが含まれる：
ａ．  最高２００ｍＭ、好ましくは３〜１００ｍＭ、最も好ましくは５〜５０ｍＭのＬ−ヒスチジンという最終濃度を得るべく水中に溶解させられたＬ−ヒスチジン；
ｂ．  最高２００ｍＭ、好ましくは０．５〜１００ｍＭ、最も好ましくは１００ｍＭ〜２３０ｍＭを得るためのマンニトール；
ｃ．  最高３５０ｍＭ、好ましくは３０〜３００ｍＭ、最も好ましくは１００ｍＭ〜２３０ｍＭを得るためのマンニトール；及び
ｄ．  最高２００ｍＭ、好ましくは０．０５〜１００ｍＭ、最も好ましくは０．５〜５０ｍＭを溶液中に得るための酢酸。
【０１２９】
１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５〜５０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度を得るべく適切な量の治療用化合物が添加される。
【０１３０】
ｐＨは、４〜８、好ましくは６．５〜７．５、最も好ましくは６．７〜７．３という最終ｐＨに調整される。結果として得られる溶液は、標的重量に調製され、無菌ろ過され、薬学的用途のためバイアル内の適切なアリコートへと送り出される。処方物は、液体製品か又は凍結乾燥製品かに応じてさらに加工される。
【０１３１】
本発明のさらにもう１つの実施形態においては、処方物には以下のものが含まれる：
ａ．  ０．５ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは３〜２００ｍＭ、最も好ましくは２０〜１００ｍＭのＬ−ヒスチジンという最終濃度を得るべく水中に溶解させられたＮ−酢酸塩；
ｂ．  最高３５０ｍＭ、好ましくは３０〜３００ｍＭ、最も好ましくは１００ｍＭ〜２３０ｍＭを得るためのマンニトール。
【０１３２】
１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５〜５０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度を得るべく適切な量の治療用化合物が添加される。
【０１３３】
ｐＨは、４〜８、好ましくは６．５〜７．５、最も好ましくは６．７〜７．３という最終ｐＨに調整される。結果として得られる溶液は、標的重量に調整され、無菌ろ過され、薬学的用途のためバイアル内の適切なアリコートへと送り出される。処方物は、液体製品か又は凍結乾燥製品かに応じてさらに加工される。
【０１３４】
該発明のＧＬＰ−２アナログは同様に、ＧＬＰ−２ペプチドアナログの長時間の持続的投与のための低速放出植込みデバイスとしても処方され得る。このような持続放出処方物は、体外に位置づけされたパッチの形をとることもできる。持続放出処方物の例としては、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−コーグリュール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、シアル酸、ケイ酸塩、コラーゲン、リポソームなどといった生体適合性ポリマーの複合材料を含む。持続放出型処方物は、高い局所的濃度の該発明のＧＬＰ−２アナログを提供することが望ましい場合に特に有利なものであり得る。
【０１３５】
ＧＬＰ−２アナログは、単位投与又は多回投与量のいずれかで、腸栄養量のペプチドの入った無菌充填されたバイアル又はアンプルの形で利用可能である。バイアル又はアンプルは、直ちに投与可能な処方物として、ＧＬＰ−２アナログ及び所望の担体を含有し得る。代替的には、バイアル又はアンプルは、滅菌水又はリン酸緩衝生理食塩水といったような適切な担体の中での再調製に適した凍結乾燥形態といった形でＧＬＰ−２ペプチドを収納し得る。
【０１３６】
注射製剤の代替案として、ＧＬＰ−２アナログはその他の経路による投与向けに処方可能である。錠剤、カプセルなどといったような経口剤形を、標準的な薬学的実践方法に従って処方することが可能である。本発明に従うと、ＧＬＰ−２アナログは、小腸組織の成長からの利益を享受することになる個体を治療するために投与される。
【０１３７】
キトサン又は洗浄剤例えばトゥイーン２０、トゥイーン８０、ポロキサマー例えばプルロニックＦ−６８、プルロニックＦ−１２７；ブリッジ３５、ブリッジ７２、クレモフォールＥＬといったようなエンハンサーを添加して、鼻腔剤形を処方することができる。
【０１３８】
本発明のペプチド化合物は、単独で、又は改炎症効果をもつ化合物と組合わせた形で使用可能である。理論により束縛されることを望むわけではないが、かかる組合せ治療が当該ペプチドアナログの有益な治療効果を強化することが想定される。
【０１３９】
患者の治療にとって最も適切である治療的投薬及び投薬計画は、当然のことながら、治療すべき疾病又は身体条件に応じて及び患者の体重及びその他のパラメータに応じて変動する。何らかの特定の理論によって束縛されることは望まないものの、μｇ／ｋｇ単位の範囲内の投与量及びより短い又はより長い治療期間又は頻度が、特に小腸質量の統計学的に有意な増加といったような治療上有用な結果を生み出し得ることが予想されている。一部のケースでは、治療的投薬計画には、初期治療の停止後に発生する組織の回帰を予防するのに適した維持投与量の投与が含まれていてよい。ヒト用に最も適した投薬量サイズ及び投薬計画は、本発明で得られた結果によって誘導され得、適切に設計された臨床試験の中で確認可能である。
【０１４０】
有効な投薬量及び治療プロトコルは、実験動物の体内で低投与量で開始し次に効果を監視しながら投薬量を増加させ、投薬計画を系統的に変動もさせる従来の手段によって決定可能である。一定の与えられた対象のための最適な投薬量を決定する場合、臨床医は数多くの因子を考慮に入れることができる。
【０１４１】
該発明に従ったＧＬＰ−２ペプチドのヒト投与量は、１つの実施形態において、一日体重１ｋｇにつき約１０μｇから約１０ｍｇ、好ましくは約５０μｇから約５ｍｇ、そして最も好ましくは約１００μｇ〜１ｍｇであり得る。
【０１４２】
病状
本発明のペプチドは、本書で記述されているような有効量のＧＬＰ−２アナログ又はその塩を投与することによる、食道の上部消化管を含む胃腸障害を患う個体の予防又は治療のための医薬品として有用である。胃及び腸関連の障害としては、あらゆる原因の潰瘍（例えばペプチド潰瘍、薬物誘発型潰瘍、感染又はその他の病原体に関係する潰瘍）、消化障害、吸収不良症候群、短腸症候群、盲管症候群、炎症性腸疾患、セリアック病（例えばグルテン性腸症又は小児脂肪便症から発生するもの）、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血スプルー、腸炎、潰瘍性大腸炎、小腸損傷及び化学療法誘発型下痢／粘膜炎（ＣＩＤ）が含まれる。
【０１４３】
一般に上述の通り、増大した小腸質量及びその結果としての正常な小腸粘膜構造及び機能の維持の利益を享受することになる個体は、当該ＧＬＰ−２アナログでの治療に対する候補である。ＧＬＰ−２アナログで治療可能な特定の身体条件としては、熱由来のアルファーグリアジンに対する毒性反応の結果発生し、グルテン誘発型腸疾患又はセリアック病の結果でもあり得、小腸のビラスの著しい喪失を特徴とするセリアック病を含むさまざまな形態のスプルー；感染の結果発生し、ビラスの部分的な平坦化を特徴とする熱帯性スプルー；分類不能型免疫不全又は低ガンマグロブリン血症患者においてよく見られ、ビラス高さの著しい減少を特徴とする低ガンマグロブリン血症スプルーが含まれる。ＧＬＰ−２アナログの治療的効能は、ビラス形態を調べるための腸内生検、栄養素吸収の生化学査定、患者の体重増加又はこれらの身体条件に付随する症候群の改善によって監視することができる。
【０１４４】
該発明のＧＬＰ−２アナログで治療可能であるか又はＧＬＰ−２アナログが予防的に有用であり得るその他の身体条件には、上述の放射線腸炎に加えて感染性又は感染後腸炎及び癌化学療法又は毒性作用物質に起因する小腸損傷が含まれる。
【０１４５】
ＧＬＰ−２アナログは同様に、栄養失調、例えば悪液質及び拒食症の治療用にも使用可能である。
【０１４６】
該発明の特定の実施形態は、腸損傷及び機能不良の予防及び／又は治療のための当該ペプチドの使用に関する。かかる損傷及び機能不良は、癌化学療法治療の周知の副作用である。化学療法投与は、往々にして、粘膜炎、下痢、細菌転位（Bacterial translocation）、吸収不良、腹部けいれん、胃腸出血及び嘔吐といったような胃腸系に関係する望ましくない副作用と結びつけられる。これらの副作用は、腸上皮の構造的及び機能的損傷の臨床的結果であり、往々にして化学療法の投与量及び頻度を減少させることを必要とする。当該ＧＬＰ−２ペプチドアゴニストの投与は、腸クリプト内の栄養作用を増強させることができ、化学療法後の損傷した腸上皮と交換するための新しい細胞を急速に提供する。当該ペプチドを投与することにより達成される究極的な目標は、癌治療のための最適な化学療法投薬計画を作り上げながら化学療法治療を受けている患者の胃腸損傷に関連する病的状態を軽減させることにある。本発明に従って、予防的又は治療的な同時処置を、放射線療法を受けているか又は受ける直前の患者に対して提供することができる。
【０１４７】
小腸粘膜の基幹細胞は、その速い増殖速度に起因して、化学療法の細胞毒性効果を受ける可能性が特に高い（Keefeら、Gut2000 ;４７；６３２〜７）。小腸粘膜に対する化学療法誘発型損傷は、臨床的に胃腸粘膜炎と呼ばれることが多く、小腸の吸収性及び障壁機能障害により特徴づけされる。例えば、広く使用されている化学療法薬である５−ＦＵ、イリノテカン及びメトトレキナートは、げっ歯類の小腸内のクリプト減形成及びビラス萎縮を導くアポトーシスを増大させることが示されてきた（Keefeら、Gut 47: ６３２〜７、２０００年；Gibson ら、J Gastroenterol Hepatol. Sep;18(9):１０９５〜１１００、２００３年; Tamaki ら、J lnt Med Res. 31(1):６〜１６、２００３年）。
【０１４８】
化学療法薬は、投与から２４時間後に腸クリプト内のアポトーシスを増大させ、その後ビラス面積、クリプト長、１クリプトあたりの有系分裂計数及びヒトの体内での化学療法から３日後の腸細胞高さを減少させることが示されてきた（Keefeら、Gut 2000；４７：６３２〜７)。かくして、小腸内部の構造的変化は、腸の機能不全そして一部のケースでは直接下痢を誘発する。
【０１４９】
癌療法後の胃腸粘膜炎は、漸進的には寛解するものの、ひとたび確立すると基本的に治療不可能であることから、増々重大な問題になっている。一般的に用いられている癌細胞増殖抑制剤５−ＦＵ及びイリノテカンで実施された研究は、これらの薬物での有効な化学療法が小腸の構造的無欠性及び機能に主に影響を及ぼし、一方結腸は比較的感応性が低く、主として粘液形成の増加で応答する、ということを実証した（Gibsonら、J Gastroenterol Hepatol. Sep; 18(9): １０９５〜１１００、２００３年；Tamaki ら、J lnt Med Res. 31(1):６〜１６、２００３年）。
【０１５０】
本発明の新規ＧＬＰ−２アナログは、胃腸障害及び化学療法の副作用の予防及び／又は治療において有用であり得る。この潜在的に重要である治療的利用分野は、５−ＦＵ、アルトレタミン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クリサンタスパーゼ（Crisantaspase）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、リポゾーマル・ドキソルビシン、ロイコボリン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール・ウラシル、テモゾロミド、チオテパ、チオグアニン（Tioguanine/Thioguanine）、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、リポゾーマル・ドキソルビシン、ロイコボリン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール・ウラシル、テモゾロミド、チオテパ、チオグアニン（Tioguanine/Thioguanine）、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビンといったような（ただしこれらに制限されるわけではない）現在使用されている化学療法薬に適用可能である。
【０１５１】
当該ペプチドは、ＧＬＰ−２アナログ又はその塩を有効量投与することにより新生児を治療する方法において利用可能であると想定されている。腸の発達不足に起因する新生児摂食合併症は、当該ペプチドアゴニストを用いることによって克服可能である。
【０１５２】
もう１つの実施形態においては、該発明は、必要としている患者に対しＧＬＰ−２アナログ又はその塩を有効量投与することによりＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ）媒介条件を治療する方法を記述している。かかる疾病には、ＤＰＰ−ＩＶ酵素が過剰発現される身体条件が含まれる。
【０１５３】
薬学組成物は１つの実施形態においては、上述のとおりの前記ＧＬＰ−２アナログ又はその塩又は誘導体の低速放出をひき起こすように処方され得る。
【０１５４】
当該ペプチドは、有効量のＧＬＰ−２アナログ又はその塩を投与することにより新生児を治療する方法において利用可能であると予想されている。腸の発達不足に起因する新生児摂食合併症は、当該ペプチドアゴニストを用いることによって克服可能である。
【０１５５】
もう１つの実施形態においては、該発明は、必要としている患者に対しＧＬＰ−２アナログ又はその塩を有効量投与することによりＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）媒介条件を治療する方法を記述している。かかる疾病には、ＤＰＰ−ＩＶ酵素が過剰発現される身体条件が含まれる。
【実施例】
【０１５６】
以下の実施例は、該発明の好ましい態様を例示するように提供されており、該発明を制限することが意図されているわけではない。
【０１５７】
一般的ペプチド合成
器具及び合成戦略
ペプチドは、側鎖官能基のための適切な保護基及びＮ−α−アミノ保護基として９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）を用いて、ろ過用のポリプロピレンフィルタが備わったポリエチレン容器の中でバッチ式に合成された。
【０１５８】
溶剤
強いカチオン交換樹脂（Lewatit S 100 MB/H強酸、Bayer AG Leverkusen, ドイツ）が詰まったカラムを通過させることにより、溶剤ＤＭＦ（Ｎ．Ｎ−ジメチルホルムアミド、Riedel de-Haen、ドイツ）を精製し、遊離アミンが存在する場合に黄色（Ｄｈｂｔ−Ｏ−アニオン）を発生させる３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ−ＯＨ）を添加することにより使用前に遊離アミンについて分析した。溶剤ＤＣＭ（ジクロロメタン、分析グレード、Riedelde - Haen、ドイツ）を精製なく直接使用した。アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード、Lab-Scan、ダブリン、アイルランド）を精製なく直接使用した。
【０１５９】
アミノ酸
Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸を、適切な側鎖保護形態でAdvanced Chem Tech (ＡＣＴ)から購入した。
【０１６０】
カップリング試薬
Riedel de - Haen、ドイツから、カップリング試薬ジイソプロビルカルボジイミド（ＤＩＣ）を購入した。
【０１６１】
固体支持体
ＴｅｎｔａＧｅｌＳ樹脂０．２２−０．３１ｍｍｏｌ／ｇ上でペプチドを合成した。Ｃ末端アミド化ペプチドが好ましい場合には、ＴｅｎｔａＧｅｌＳ−Ｒａｍ、ＴｅｎｔａＧｅｌＳ  ＲＡＭ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）Ｆｍｏｃ（Rapp polymere、ドイツ）を使用し、一方Ｃ末端遊離カルボン酸が好まれる場合には、ＴｅｎｔａＧｅｌＳ  ＰＨＢ、ＴｅｎｔａＧｅｌＳ  ＰＨＢ  Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）Ｆｍｏｃを使用した。
【０１６２】
触媒及びその他の試薬
ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）をAldrich、ドイツから購入し、ピペリジル及びピリジンをRiedel - de Haen、フランクフルト、ドイツから購入した。エタンジチオールをRiedel - de Haen、フランクフルト、ドイツから購入した。３．４−ジヒドロ−３−ヒドロキジ−４−オキソ−１、２、３−ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ−Ｈ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨｏＢｔ）（ＨｏＡｔ）をFluka、スイスから得た。無水酢酸をFlukaから得た。
【０１６３】
カップリング手順
ＤＭＦ中のＤＩＣを用いて、ＨＯｂｔ又はＨＯＡｔ及び適切なＮａ保護されたアミノ酸から作られたインサイチュ生成のＨＯｂｔ又はＨＯＡｔエステルとして、アミノ酸をカップリングした。試験中のＦｍｏｃ脱保護を防止するべく８０℃で実施されたニンヒドリン試験によりアジル化を検査した（Larsen,B. D. and Holm, A., Int. J. Peptide Protein Res. 43、１９９４年、１〜９）。
【０１６４】
Ｎ−α−アミノ保護基（Ｆｍｏｃ）の脱保護
ＤＭＦ中の２０％のピペリジンを用いて処理（１×５及び１×１０分）した後、ドレン済みＤＭＦへのＤｈｂｔ−ＯＨの添加後いかなる黄色も検出できなくなるまでＤＭＦ（５×１５ｍｌ、各５分）で洗浄することによって、Ｆｍｏｃ基の脱保護を実施した。
【０１６５】
ＨＯＢt−エステルのカップリング
３当量のＮ−α−アミノ保護されたアミノ酸を３当量のＨＯｂｔ及び３当量のＤＩＣとともにＤＭＦ中に溶解し、そしてその後樹脂に添加した。
【０１６６】
酸を用いた樹脂からのペプチドの解裂
９５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、Riedel−de Haen、フランクフルト、ドイツ）−水ｖ／ｖ又は９５％のＴＦＡ及び５％のエタンジチオールｖ／ｖで、室温２時間の処理により樹脂からペプチドを解裂させた。ろ過した樹脂を９５％のＴＦＡ−水で洗浄し、減圧下でろ過物及洗液を蒸発させた。残渣をエーテルで洗浄し、酢酸−水から凍結乾燥させた。粗製凍結乾燥製品を高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により分析し、質量分析（ＭＳ）により同定した。
【０１６７】
ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂（ＰＥＧ−ＰＳ）上のバッチ式のペプチド合成
ろ過用のポリプロピレンフィルタが備わったポリエチレン容器中にＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂（１ｇ、０．２３〜０．２４ｍｍｏｌ／ｇ）を入れた。樹脂をＤＭＦ（１５ｍｌ）中で膨潤させ、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで処理して、リンカ−ＴｅｎｔａＧｅｌＳ  ＲＡＭ上か又は樹脂ＴｅｎｔａＧｅｌＳ  ＲＡＭ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）Ｆｍｏｃ上の第１のアミノ酸上のいずれかで初期Ｆｍｏｃ基を除去した。樹脂をドレンして、ドレン済みＤＭＦに対するＤｈｂｔ−ＯＨの添加後にいかなる黄色も検出できなくなるまでＤＭＦで洗浄した。配列に従ったアミノ酸を、上述の通り予め形成されたＦｍｏｃ−保護されたＨＯｂｔエステル（３当量）としてカップリングした。相反する既定のないかぎり、カップリングを２時間続けた。樹脂をドレンし、ＤＭＦ（５×１５ｍｌ、各５分）で洗浄して、余剰の試薬を除去した。上述の通りのニンヒドリン試験により全てのアシル化を検査した。合成完了後、ペプチド−樹脂をＤＭＦ（３×１５ｍｌ、各５分）、ＤＣＭ（３×１５ｍｌ、各１分）及び最終的にジエチルエーテル（３×１５ｍｌ、各１分）で洗浄し、真空下で乾燥させた。ペプチドを、以上で記述した通り樹脂から解裂し、以下で記述する通りに粗製ペプチド生成物を分析し精製した。
【０１６８】
ＨＰＬＣ条件
HP 1100クォータナリポンプ、HP 1100オートサンプラー、HP 1100カラムサーモスタット及びHP 1100多波長検出器から成るHew Lett Pachard ＨＰ１１００ＨＰＬＣシステムを用いて、グラジエントＨＰＬＣ分析を行なった。計器制御及びデータ収集のためには、ＬＣソフトウェア（rev. A. 06.01）用のHewlett Packard Chemstationを使用した。以下のカラム及びＨＰＬＣ緩衝液系を用いた：
カラム：ＶＹＤＡＣ２３８ＴＰ５４１５、Ｃ−１８．５ｍｍ、３００Å、１５０×４．６ｍｍ。
緩衝液：Ａ：ＭＱＶ中の０．１％ＴＦＡ；Ｂ：０．０８５％のＴＦＡ、１０％のＭＱＶ、９０％ＭeＣＮ。
グラジエント：０〜１．５分、０％のＢ
１．５〜２５分、５０％のＢ
２５〜３０分、１００％のＢ
３０〜３５分、１００％のＢ
３５〜４０分、０％のＢ
フロー１、ｍｌ／分、オーブン温度４０℃、ＵＶ検出：１＝２１５nm
【０１６９】
粗製ペプチドのＨＰＬＣ精製
粗製ペプチド生成物をPer Septive Biosystems VISIONワークステーションで精製した。計器制御及びデータ収集のためには、ＶＩＳＩＯＮ３．０ソフトウェアを使用した。以下のカラム及びＨＰＬＣ緩衝液系を用いた。
カラム：Kromasil KR 100Å, １０ｍｍのＣ−８，２５０×５０．８ｍｍ。
緩衝液系：緩衝液：Ａ：ＭＱＶ中の０．１％ＴＦＡ、Ｂ：０．０８５％のＴＦＡ、１０％のＭＱＶ、９０％のＭeＣＮ。
グラジエント：０〜３７分、０〜４０％のＢ
フロー  ３５ｍｌ／分、ＵＶ検出：１＝２１５ｎｍ及び２８０ｎｍ。
【０１７０】
質量分析
ペプチドを、超グラジエントメタノール（Labscan、ダブリン、アイルランド）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（Millipore、ベッドフォード、マサチューセッツ州）及びギ酸（Merch、ダルムシュタット、ドイツ）（５０：５０：０．１v／v／v）の中に溶解させて、１〜１０ｍｇ／ｍｌの間の濃度を得た。ＬＣＴ質量分析計（Micromass、マンチェスター、英国）、精度＋／−０．１m／zを用いてＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより正の極性モードでペプチド溶液（２０ｍｌ）を分析した。
【０１７１】
基本合成手順
全ての合成において、ろ過用ポリプロピレンフィルタが備わったポリエチレン容器の中に乾燥ＴｅｎｔａＧｅｔ−Ｓ−Ｒａｍ樹脂（１ｇ、０．２２〜０．３１ｍｍｏｌ／ｇ）を入れた。樹脂をＤＭＦ（１５ｍｌ）中で膨潤させ、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで処理して、樹脂上の非プロトン化アミノ基の存在を確保した。樹脂をドレンして、ドレン済みＤＭＦに対するＤｈｂｔ−ＯＨの添加後にいかなる黄色も検出できなくなるまでＤＭＦで洗浄した。配列に従ったアミノ酸を、上述の通り予め形成されたＦｍｏｃ−保護されたＨＯＢｔエステル（３当量）としてカップリングした。相反する既定のないかぎり、カップリングを２時間続けた。樹脂をドレンし、ＤＭＦ（５×１５ｍｌ、各５分）で洗浄して、余剰の試薬を除去した。８０℃で行ったニンヒドリン試験により全てのアシル化を検査した。合成完了後、ペプチド−樹脂をＤＭＦ（３×１５ｍｌ、各５分）、ＤＣＭ（３×１５ｍｌ、各１分）及び最終的にジエチルエーテル（３×１５ｍｌ、各１分）で洗浄し、真空下で乾燥した。次にペプチドを、以上で記述した通り樹脂から解裂し、凍結乾燥させた。上述の通り分取ＨＰＬＣを用いた精製の後、ペプチド生成物を収集し、ペプチドの同一性をＥＳ−ＭＳにより確認した。以下でさらに例示した全てのペプチドの合成のためにこの手順を使用した。
【０１７２】
合成された化合物
上述の技術を用いて、上述の方法（表１）を使用して化合物１８０９〜１８６１及び参照化合物１５５９（Ｈ−［Ｇｌｙ２］ｈＧＬＰ−２−ＯＨ）を合成した。
【０１７３】
【表１】
0005405105.tif 000002
【０１７４】
【表２】
0005405105.tif 000003
【０１７５】
例１：化合物１８４６の合成
ＴｅｎｔａＧｅｌＳ  ＲＡＭ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）Ｆｍｏｃ上のＨ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−ｌｉｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ｌｌｅ−Ａｌａ−Ｔ  ｒｐ−Ｌｅｕ−ｌｌｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−ｌｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＮＨ2
ろ過用フィルタの備わったポリエチレン容器の中に乾燥ＴｅｎｔａＧｅｌＳ  ＲＡＭ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）Ｆｍｏｃ（０．２４ｍｍｏｌ／ｇ、１ｇ）を入れ、Ｎ末端ヒスチジンのカップリングを終了するまで、「ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂上のバッチ式ペプチド合成」の下で記述された通りに処理した。すべてのカップリングを一晩続行した。アシル化を、先に記述した通り検査した。合成の完了及びＮ末端Ｆｍｏｃ基の脱保護の後、ペプチドを上述の通り樹脂から解裂した。先に記述した通り分取ＨＰＬＣを用いて精製した後、９０％より優れた純度で２８．８ｍｇのペプチド生成物を収集し、ペプチドの同一性をＭＳにより確認した（Ｍ実測値４３１５．３８、Ｍ計算値４３１５．４１）。
【０１７６】
例２：化合物１８４６の合成
ＴｅｎｔａＧｅｌＳ  ＲＡＭ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）Ｆｍｏｃ上のＨ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−ｌｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ｌｌｅ−Ａｌａ−Ｔ  ｒｐ−Ｌｅｕ−ｌｌｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−ｌｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＮＨ2
ろ過用フィルタの備わったポリエチレン容器の中に乾燥ＴｅｎｔａＧｅｌＳ  ＲＡＭ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）Ｆｍｏｃ（０．２４ｍｍｏｌ／ｇ、１ｇ）を入れ、Ｎ末端ヒスチジンのカップリングを終了するまで、「ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂上のバッチ式ペプチド合成」の下で記述された通りに処理した。すべてのカップリングを一晩続行した。アシル化を、先に記述した通り検査した。合成の完了及びＮ末端Ｆｍｏｃ基の脱保護の後、ペプチドを上述の通り樹脂から解裂した。先に記述した通り分取ＨＰＬＣを用いて精製した後、９０％より優れた純度で２３０ｍｇのペプチド生成物を収集し、ペプチドの同一性をＭＳにより確認した（Ｍ実測値４３１３．６３、Ｍ計算値４３１３．４３）。
【０１７７】
例３：化合物１８５５の合成
ＴｅｎｔａＧｅｌＳ  ＲＡＭ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）Ｆｍｏｃ上のＨ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−ｌｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ｌｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−ｌｉｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−ｌｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＮＨ2
ろ過用フィルタの備わったポリエチレン容器の中に乾燥ＴｅｎｔａＧｅｌＳ  ＲＡＭ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）Ｆｍｏｃ（０．２ｍｍｏｌ／ｇ、１ｇ）を入れ、Ｎ末端ヒスチジンのカップリングを終了するまで、「ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂上のバッチ式ペプチド合成」の下で記述された通りに処理した。すべてのカップリングを一晩続行した。アシル化を、先に記述した通り検査した。合成の完了及びＮ末端Ｆｍｏｃ基の脱保護の後、ペプチドを上述の通り樹脂から解裂した。先に記述した通り分取ＨＰＬＣを用いて精製した後、９６％より優れた純度で２７．３ｍｇのペプチド生成物を収集し、ペプチドの同一性をＭＳにより確認した（Ｍ実測値３５４７、Ｍ計算値３５４６．８４）。
【０１７８】
例４：化合物１８５７の合成
ＴｅｎｔａＧｅｌＳ  ＲＡＭ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）Ｆｍｏｃ上のＨ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＧＩｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−ｌｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ｌｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−ｌｌｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−ｌｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＮＨ2
ろ過用フィルタの備わったポリエチレン容器の中に乾燥ＴｅｎｔａＧｅｌＳ  ＲＡＭ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）Ｆｍｏｃ（０．２ｍｍｏｌ／ｇ、１ｇ）を入れ、Ｎ末端ヒスチジンのカップリングを終了するまで、「ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂上のバッチ式ペプチド合成」の下で記述された通りに処理した。すべてのカップリングを一晩続行した。アシル化を、先に記述した通り検査した。合成の完了及びＮ末端Ｆｍｏｃ基の脱保護の後、ペプチドを上述の通り樹脂から解裂した。先に記述した通り分取ＨＰＬＣを用いて精製した後、９４％より優れた純度で３９．３ｍｇのペプチド生成物を収集し、ペプチドの同一性をＭＳにより確認した（Ｍ実測値３５４４．８８、Ｍ計算値３５４４．８６）。
【０１７９】
例５：化合物１８４６Ａ（酢酸塩）の合成
化合物１８４６のトリフルオロ酢酸塩から酢酸塩への対イオン交換。化合物１８４６の精製合成ペプチド生成物を、粗製合成ペプチド生成物の精製のために使用されたＨＰＬＣ緩衝液内のトリフルオロ酢酸の存在（０．１％v／v）に起因して、トリフルオロ酢酸塩として単離する。
【０１８０】
対イオントリフルオロ酢酸塩を酢酸塩と交換するために、酢酸塩上の強塩基イオンを詰めたカラムにペプチドの溶液を通した（Dowex １×８）。３６５ｍｇの化合物１を４０ｍｌの水の中に溶解させる。酢酸塩上の４０ｍｌの強塩基イオン交換樹脂が入ったカラムに溶液を通す（Dowex １×８；容量１．３３ｍｅｑ／ｍｌ樹脂）。その後、樹脂を４×３０ｍｌの水で洗浄し、溶出液を収集し、凍結乾燥させ、ＨＰＬＣ分析に従って９７％という純度で３１２ｍｇの酢酸塩を結果として得る。
【０１８１】
例６：化合物１８４８Ｃ（塩化物）の合成
化合物１８４８のトリフルオロ酢酸塩（Ｔｆａ）から塩化物（Ｃｌ-）への対イオン交換。
５０ｍｌの０．１Ｍの塩酸中に１００ｍｇの化合物１を溶解させ、結果としての溶液を凍結乾燥した。残留磁気を５０ｍｌの水中で溶解させ、再び凍結乾燥させ、その結果、ＨＰＬＣに従って９３％という純度をもつ塩化物８６ｍｇを得た。
【０１８２】
例７：化学的安定性試験
ＧＬＰ−２アナログを精製水の中に溶解させ、その後ＨＣｌ、ＮａＯＨ、Ｈ2Ｏ2又はＮＨ4ＨＣＯ3を含有する溶液中に希釈させた。溶液を４０℃でインキュベートして、加水分解、脱アミド及び酸化生成物を生産した。標本をＲＰ−ＨＰＬＣにより分析し、残りの無傷化合物の百分率を、相対的安定性の尺度として決定した。主要分解生成物をＬＣ−ＭＳにより試しに同定した。使用したペプチドは表３に列挙されている。
【０１８３】
【表３】
0005405105.tif 000004
【０１８４】
その他の試験対象ＧＬＰ−２アナログのための基準として化合物ＺＰ１５５９、Ｇｌｙ2−ＧＬＰ−２を使用した。ＧＬＰ−２アナログの中で、配列が参照化合物ＺＰ１５５９と異なっている位置が太字フォントで示されている。配列は表３に列挙されている。
【０１８５】
化合物は、その配列に従って対としてかつＣ末端−Ｋ6拡張を伴って及び伴わずに列挙されている。
【０１８６】
【表４】
0005405105.tif 000005
【０１８７】
実験に使用する化学物質は表４中で列挙されている。
【０１８８】
【表５】
0005405105.tif 000006
【０１８９】
まず水を≧１８ＭΩｃｍの抵抗に対し脱塩し、次にＭｉｌｌｉ−Ｑシステム（Milliporp, Bedford、米国）を通過させた。最終的にＭｉｌｌｉ−Ｑ精製水（ＭＱＷ）を最終的に０．２２μｇの無菌フィルタ（Millipak 40 Gamma Gald, Millipore）を通して抜栓した。
【０１９０】
試験対象のＧＬＰ−２アナログ及び基準Ｇｌｙ2−ＧＬＰ−２、ＺＰ１５５９を水中で溶解させ、その後ＨＣｌ、ＮaＯＨ、Ｈ2Ｏ2又はＮＨ4ＨＣＯ3を含有する溶液中に希釈させた。標本を４０℃でインキュベートさせて、それぞれに加水分解、脱アミド及び酸化生成物を生成させた。元の主ピークの純度についてはＲＰ−ＨＰＬＣにより化合物を分析し、主ピーク及び主要分解生成物の質量による同一性確認のためＬＣ−ＭＳにより、化合物を分析した。
【０１９１】
ストレス溶液の調製
０．２ＭのＨＣｌ：  ＭＱＷ４ｍＬ及び１ＭのＨＣｌ１ｍＬ。
０．０２ＭのＮａＯＨ：  ＭＱＷ４ｍＬ及び０．１ＭのＮａＯＨ０．１Ｍ。
０．２ＭのＮＨ4ＨＣＯ3、ｐＨ８：  ５０ｍＬのＭＡＷ中で０．７９ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶解させた。
１％のＨ2Ｏ3：  ＭＱＷ５．８ｍＬ及び３０％のＨ2Ｏ2０．２ｍＬ。
【０１９２】
サンプル溶液：
ＧＬＰ−２アナログをまず最初に、４ｍｇ／ｍＬの濃度までＭＱＷ中で溶解させ、次に１：１の比率でストレス溶液中にてさらに希釈した（例えば１２５μＬプラス１２５μＬ）。最終濃度は、それぞれ０．１ＭのＨＣｌ、０．０１ＭのＮａＯＨ、０．１ＭのＮＨ4ＨＣＯ3及び０．５％のＨ2Ｏ2でのストレス条件についてＧＬＰ−２アナログ２ｍｇ／ｍＬであった。
【０１９３】
溶液を暗所で４０℃でインキュベートし、次に、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳによる分析に先立ち０．５ｍｇ／ｍＬの濃度（７５０μＬの添加）まで溶出液Ａ中で希釈した。
【０１９４】
【表６】
0005405105.tif 000007
【０１９５】
ＲＰ−ＨＰＬＣ
Agilent Technologres, Inc製のChem Station（Revision A.08.03［８４７］）ソフトウェアの制御下でAgilent Series 1100 HPLCシステム上でＲＰ−ＨＰＬＣ分析を実施した。ピーク積分の生データをAgilent Techrologies Revision BOL.03ソフトウェアを用いてChem Store C／Ｓサーバーに入れた。
【０１９６】
【表７】
0005405105.tif 000008
【０１９７】
ＬＣ−ＭＳ
分析ＬＣ−ＭＳ分析を、オンライン脱ガス装置、クォーテナリグラジェントポンプ、オートサンプラー、カラムオーブン、ＵＶ検出器から成るAgilent Technologres 1100 HPLC計器上で実施した。英国Micro Mass製のMasslynx×３．５ソフトウェアの制御下でMicromass ＬＣＴ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）質量分析計とＨＰＬＣ計器をインタフェースさせた。
【０１９８】
【表８】
0005405105.tif 000009
【０１９９】
【表９】
0005405105.tif 000010
【０２００】
ストレス条件下でのインキュベーション後にＲＰ−ＨＰＬＣにより測定された化合物純度として、結果を表９に示す。この純度は、Ｔ＝０で測定された純度との関係におけるストレス溶液中でのインキュベーションの後の残りの無傷化合物についての１つの尺度である。これらの結果は、この分析的ＲＰ−ＨＰＬＣ方法により観察されていない、隠れている可能性のある分解生成物を考慮に入れていない。
【０２０１】
ＬＣ−ＭＳ方法により、ストレス試験標本中の主要な分解生成物を試しに同定した。この分析的ＬＣ−ＭＳ方法によっては、親化合物及び副次的分解生成物に対する異性体は全く観察されなかった。試験的同定が表１１〜１５に列挙されている。
【０２０２】
試験対象のＧＬＰ−２アナログは、Ｃ末端−Ｋ6拡張を伴う及び伴わないその配列に応じて対として列挙されている。
【０２０３】
【表１０】
0005405105.tif 000011
【０２０４】
ＮａＯＨ中でインキュベートされた化合物についての結果は、安定性の差異が全く観察されなかったことから、列挙されていない。分解生成物及び主要ピークは全て、ＬＣ−ＭＳ分析による同じ質量を有している。これらの化合物はおそらく経時的にラセミ化された。表９中の結果は、試験対象のＧＬＰ−２アナログが全般的に、Ｇｌｙ2−ＧＬＰ−２基準、ＺＰ１５５９よりもさらに化学的に安定していることを示している。
【０２０５】
酸加水分解の間、試験対象のＧＬＰ−２アナログは、ＺＰ１８２０及びＺＰ１８３４以外、Ｇｌｙ2−ＧＬＰ−２基準ＺＰ１５５９よりも安定している。これは主として、位置３にあるアミノ酸Ａｓｐに起因する。ＡｓｐではなくＧｌｕがアミノ酸３と４Ａｓｐ−Ｇｌｙの間の解裂を最小限におさえることができる。試験対象のその他のＺＰＧＬＰ−２アナログはまさに同じ安定性をもつが、Ｃ末端−Ｋ6、ＺＰ１８５５、ＺＰ１８５７及びＺＰ１８５８の無い化合物についてわずかに高い安定性を伴う。この差異は、位置３３Ａｓｐのアミノ酸によって説明がつく。Ｃ−末端−Ｋ6の無い化合物においては、このアミノ酸はＣ末端であり、アミノ酸３２と３３Ｔｙｒ−Ａｓｐの間の解裂は、アミノ酸３３及び３４Ａｓｐ−Ｌｙｓの間の解裂よりも緩慢に発生する。安定性の差異はＡｓｐに起因するものであり、Ｃ−末端−Ｋ6に起因するものではない。
【０２０６】
加速された酸化の条件下（Ｈ2Ｏ2、同様に表１０及び１３参照）では、試験対象のＧＬＰ−２アナログは、Ｇｌｙ2−ＧＬＰ−２基準ＺＰ１５５９よりもはるかに安定している。これはおそらく、ＺＰ１５５９内の位置１０のＭｅｔの酸化に起因するものである。例外としては、ＺＰ１８５５があり、これは説明のつかない低い安定性を示す。これは、ＺＰ１８５５のバッチに特異的であり得、これを説明するためにはさらなる研究が必要となる。
【０２０７】
脱アミド化を促進する条件下での安定性、試験対象のＧＬＰ−２アナログは、Ｇｌｙ2−ＧＬＰ−２基準、ＺＰ１５５９よりもさらに安定している。これはおそらくは、試験対象ＧＬＰ−２アナログのための配列中に存在しない位置１１、１６及び２４でのＺＰ１５５９、Ａｓｎ内の複数の脱アミド部位に起因している。
【０２０８】
ＬＣ−ＭＳによる主要な分解生成物の試験的同定
【表１１】
0005405105.tif 000012
【０２０９】
ＨＣｌによるストレスを受けた溶液
【表１２】
0005405105.tif 000013
【０２１０】
【表１３】
0005405105.tif 000014
【０２１１】
表１２中の結果は、試験対象のＧＬＰ−２アナログについての計測された分子量及びＧｌｙ2−ＧＬＰ−２基準、ＺＰ１５５９が理論分子量に対応していることを示している。
【０２１２】
最も豊富な分解生成物は、アミノ酸３と４；ＺＰ１５５９、ＺＰ１８２０及びＺＰ１８３４中のＡｓｐ及びＧｌｙの間の解裂である。Ｃ−末端−Ｋ6を伴う化合物ＺＰ１８４６、ＺＰ１８４８及びＺＰ１８４９については、位置３３〜３９内のＣ−末端−Ｋ6（Ｌｙｓ6）の喪失に対応する分解生成物が検出された。Ｃ−末端−Ｋ6が無い化合物ＺＰ１８５５及びＺＰ１８５７については、位置３３におけるＣ末端Ａｓｐの喪失に対応する分解生成物が検出された。
【０２１３】
検出された少数の分解生成物は、アミノ酸１５及び１６（ＡｓｐとＡｓｎ又はＡｓｐとＡｌａ）、アミノ酸４及び５（Ｇｌｙ及びＳｅｒ）、アミノ酸２１及び２２（ＡｓｐとＰｈｅ）の間の解裂であった。
【０２１４】
Ｈ2Ｏ2によるストレスを受けた溶液
【表１４】
0005405105.tif 000015
【０２１５】
表１３中の結果は、試験対象のＧＬＰ−２アナログについての計測された分子量及びＧｌｙ2−ＧＬＰ−２基準、ＺＰ１５５９が、理論分子量に対応することを示している。ＺＰ１５５９については、＋１６ＤａのＭＷ（分子量）をもつ主要分解生成物が観察され、これは恐らく、位置１０のＭｅｔの酸化された生成物であり得ると思われる。ＺＰ１８２０及びＺＰ１８３４については、＋１８ＤａのＭＷをもつ主要分解生成物が観察される。これらは恐らくは脱アミド化前駆体中の水の喪失であり得る。さらに、−２ＤａのＭＷをもつ少数生成物が見られ、これは２つの部位における脱アミド化であり得る。＋１６ＤａのＭＷを持つ少数生成物がすべての化合物中に見られ、これらは恐らく、Ｔｒｐの酸化であり得る。全てＣ末端−Ｋ6の無いものである化合物ＺＰ１８５５、ＺＰ１８５７及びＺＰ１８５８については、−１３７Ｄａ及び−６５ＤａのＭＷをもつ少数分解生成物が検出され、これらは、それぞれ位置１のＨｉｓの喪失及び未同定の分解生成物に対応する。
【０２１６】
ＮａＯＨによるストレスを受けた溶液
【表１５】
0005405105.tif 000016
【０２１７】
ＬＣ−ＭＳ分析は、各化合物についての全てのピークにおける同じ分子量を示す。このことはすなわち、最も豊富な分解生成物が、配列内のアミノ酸うちの単数又は複数のもののＬ形態からＤ形態へのラセミ化であることを意味している。このとき、主ピークは単数又は複数のラセミ化生成物を隠している可能性があり、かくして、無傷のペプチドの残留純度は全く決定できなかった。解裂による主要な分解生成物は全く検出されなかった。
【０２１８】
ＮＨ4ＨＣＯ3によるストレスを受けた溶液
【表１６】
0005405105.tif 000017
【０２１９】
表１４中の結果は、試験対象のＧＬＰ−２アナログについての計測された分子量及びＧｌｙ2−ＧＬＰ−２基準、ＺＰ１５５９が、理論ＭＷに対応することを示している。ＺＰ１５５９については、＋１ＤａのＭＷ（分子量）をもつ少数分解生成物が観察され、これは恐らく脱アミド化された生成物であり得ると思われる。ＺＰ１８２０、ＺＰ１８３４及びＺＰ１８４６については、主要化合物の場合と同じＭＷをもつ少数分解生成物が観察される。これらはおそらくは、ラセミ化生成物又は脱アミド化であり得ると思われる。ただし、当該計器のＭＳ分解能は、これを確認するか又は拒絶するのに適切なものではなかった。さらに、これらの生成物は、その他の化合物の中に存在したものの主要ピーク下に隠されている可能性があったため検出されなかった可能性がある。
【０２２０】
試験対象の当該ＧＬＰ−２アナログは、加水分解、酸化及び脱アミド化のためのストレス条件下で参照化合物Ｇｌｙ2−ＧＬＰ−２；１５５９と比べて優れた化学的安定性を有している。化合物１８２０及び１８３４は、酸加水分解に起因して残りの６つの候補よりも低い安定性を有している。最高の化学的安定性は、アミノ酸Ａ3がＡｓｐではなくむしろＧｌｕである場合に見られた。
【０２２１】
残りの６つの候補の化学的安定性の有意な差異は、Ｃ−末端−Ｋ6を有する候補内の−Ｋ6の喪失及びＡｓｐの後の不安定な部位を主な原因として、−Ｋ6の不在による安定性がわずかに優れている点を除き全く観察されなかった。
【０２２２】
例８：Ｃ５７ＢＬマウスにおける化合物の腸成長効果についてのスクリーニング
腸成長を刺激する当該化合物の能力を、雄のＣ５７ＢＬマウスにおいて判定した。個別のマウスグループ（ｎ＝６）に、各化合物を３０ｎｍｏｌ／ｋｇずつｓ．ｃ．で毎日２回連続１０日間投与した。比較を目的として、その他の動物グループには、同じ投薬計画の中で等モル投与量の［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２又はビヒクル（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）のいずれかを投与した。最後の化合物投与量が投与されてから２４時間後に、マウスを屠殺し、（幽門から盲腸までの）小腸及び結腸（盲腸から遠位の腸）を空にして秤量した。体重（ＢＷ）のわずかな差異を補正するため、小腸（ＳＩ）及び結腸の器官質量をＢＷとの関係において表現した。非選択的参照化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２は、食道、胃、小腸及び結腸の両方における胃腸の成長を刺激することが報告されてきており、化合物により誘発された成長パターンの差異を評価するために、化合物Ｘの小腸−結腸感度指数を次のように計算した：
【０２２３】
（ＳＩ／Ｃｏｌｏｎ）X／（ＳＩ／Ｃｏｌｏｎ）[Gly2]GLP-2％
【０２２４】
１．０５以上の小腸−結腸感応性をもつ化合物を、小腸に対する相対的選択性があるものとみなした（表１５）。
【０２２５】
０．９５以下の小腸−結腸感応性をもつ化合物を、結腸に対する相対的選択性があるものとみなした（表１５）。
【０２２６】
表１５．  選択的ＧＬＰ−２アナログのリスト
【０２２７】
【表１７】
0005405105.tif 000018
【０２２８】
結果
該発明に従った当該化合物の腸成長効果を、等モル投与量非選択的参照化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２の効果との関係におけるＳＩ質量を投与量依存的に増加させるペプチドの能力に基づいて決定した。
【０２２９】
この研究からの発見事実は、野生型ＧＬＰ−２配列の位置８、１６、２４及び／又は２８にアミノ酸置換をもつＧＬＰ−２変異体が、Ｃ５７ＢＬマウスにおいて［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２に比べて生物活性を増大させたということを実証している。
【０２３０】
例９：Ｃ５７ＢＬマウスにおける腸成長に対する選択された化合物の投与量応答効果
１８２０、１８５５、１８４６、１８５８、１８４９、１８４８及び１８５７は、これらの化合物が［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２との関係において小腸の質量を増大させた（例８）と同時にストレスの多い条件下で［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２との関係において化学的安定性を増大させた（例７）ことから、リード化合物として選択された。小腸質量に対する１８２０、１８５５、ＺＰ１８４６、１８５８、１８４９、１８４８及び１８５７の投与量応答効果を、雄のＣ５７ＢＬマウスにおいて判定した。個々のマウスグループ（ｎ＝６）に対し、各化合物を５、１５、４５、１３５又は４０５ｎｍｏｌ／ｋｇずつ、ｓ．ｃ．（皮下）で、毎日２回、連続３日間投与した。比較を目的として、同じ投薬計画内で、その他の動物グループに対し、等モル投与量の［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２又はビヒクル（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）を投与した。最後の化合物投与量が投与されてから２４時間後にマウスを屠殺し、（幽門から盲腸までの）小腸を空にして秤量して、小腸質量に対する効果を決定した。
【０２３１】
結果
参照化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２の効果との関係における小腸質量に対する１８２０、１８５５、１８４６、１８５８、１８４９、１８４８及び１８５７の効果は、図１〜５に示されている。試験された各々の投与量において、小腸質量に対する［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２の効果は、１００％で標準化される。該発明に従った化合物１８２０、１８５５、１８４６、１８５８、１８４９、１８４８及び１８５７の腸成長効果を、等モル投与量の［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２の効果との関係におけるＳＩ質量を投与量依存的に増大させるペプチドの能力に基づいて判定した。これらの発見事実に基づき、我々は、８個の置換（ＧＬＰ−２  ８０７に比べてＧ２、Ｅ３、Ｔ５、Ｌ１０、Ａ１１、Ａ１６、Ａ２４、Ａ２８）を含むＧＬＰ−２アナログが、［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２で治療されたマウスと比べ小腸の重量の著しい増大を生じさせるという結論を下すことができる。
【０２３２】
特に、Ｇｌｕに代わってＡｓｐ３、及びＡｌａに代ってＡｓｎ１６、そしてＡｌａに代わってＧｌｎ２８という置換は、結腸に比べ選択的に小腸の重量の増大をもたらす（１８０９と比べて１８３９又は１８４０）。かくして、３個のアミノ酸  Ａｓｐ３、Ａｓｎ１６及びＧｌｎ２８の置換は、結腸質量に比べ小腸重量の選択的増大を結果としてもたらす。
【０２３３】
さらに、セリンに対するＡｓｐ８の置換は選択性のさらなる増大を結果としてもたらし、かくして、結腸の重量に著しい影響を及ぼすことなく小腸の重量の補足的増加をもたらす（１８１８、１８２０、１８４４、１８４６、１８４８、１８４９、１８５２、１８５３、１８５５、１８５８）。
【０２３４】
図１〜４は、ＳＩ−ＢＷ対結腸−ＢＷ比に対する例証された化合物１８４６、１８５５、１８４８、１８５７、１８４９の投与量応答効果が参照化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２との関係において示されている実験結果を示す。試験対象の投与量の各々において、小腸質量に対する［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２の効果が１００％で標準化されている。例証された化合物は全て、位置８、１６及び／又は２８での修飾を共有し、結腸との関係において小腸の成長をひきおこすための選択性の増大を示している。
【０２３５】
例１０：５−ＦＵの投与を受けたマウスにおける小腸萎縮に対する１８４６、１８４８、１８５５及び１８５７の投与量応答効果
小腸基幹細胞の高い増殖速度のため、これらの細胞は、抗癌療法において使用される化学療法薬の細胞傷害性効果に対する感受性標的となっている。その結果、化学療法薬５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）の臨床的使用には往々にして小腸障害が付随する（癌患者における萎縮及び下痢）。我々は、４日間一日一回５０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与するとＣ５７ＢＬマウスにおいて有意な小腸萎縮が誘発されるということを先に示した。５ＦＵにより誘発された小腸萎縮に対するリード化合物１８４６、１８４８、１８５５及び１８５７化合物の効果をマウスにおいて調査した。我々は、４日間一日一回５０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与すると、Ｃ５７ＢＬマウスにおいて有意な小腸萎縮が誘発されるということを先に示した。１８４６、１８４８、１８５５又は１８５７は、５−ＦＵに先立ち３日間そして５−ＦＵ投与と共に４日間一日２回投与された。リード化合物は、健康なマウスにおいて小腸の増大を効果的に刺激することが以前に示された５つの異なる投与量（５、１５、４５、１３５及び４０５ｎｍｏｌ／ｋｇ）で各々投与された（例９）。比較を目的として、１つの動物グループを４０５ｎｍｏｌ／ｋｇの［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２で治療した。小腸に対する５−ＦＵの効果を判定するため、動物グループに対し、５−ＦＵ  Ｉを単独で投与し、未治療のまま放置し（５−ＦＵ対照）、もう１つの動物グループにはビヒクルのみを投与した（ＰＢＳ対照）。
【０２３６】
５−ＦＵは、ＰＢＳ対照との関係においてＣ５７ＢＬマウスにおけるＳＩ−ＢＷ及びＳＩ長の著しい減少を誘発した。５−ＦＵが投与されたマウスにおけるＳＩ−ＢＷ及びＳＩ−長に対する１８４６、１８４８、１８５５又は１８５７の投与量応答効果は、図６〜９に示されている。４０５ｎｍｏｌ／ｋｇの［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２の効果も示されている。１８４６、１８４８、１８５５、または１８５７は、５−ＦＵで誘発されたＳＩ萎縮を投与量依存的に防止し、ＳＩ−ＢＷをＰＢＳ対照と類似したレベルで維持した。等モル投与量で投与されたＺＰ１８４８、ＺＰ１８５５及びＺＰ１８５７は、ＳＩ−ＢＷに対し４０５ｎｍｏｌ／ｋｇの［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２よりもかなり高い効能があった。１８４８及び１８５７は、ＳＩ−長に対し４０５ｎｍｏｌ／ｋｇの［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２よりもかなり高い効能があった。
【０２３７】
例１１：５−ＦＵが投与されたＳＤラットにおける小腸萎縮及び下痢に対する１８４６の投与量応答効果
５−ＦＵにより誘発された小腸萎縮及び下痢に対する臨床候補１８４６の効果をＳＤラットにおいて調査した。我々は、４日間一日一回７５ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵを腹腔内投与すると、ＳＤラットにおいて小腸萎縮及び下痢が誘発されることを先に示した。５−ＦＵに先立つ３日間そして５−ＦＵの投与と合せて４日間一日２回、１８４６（１６、８０及び４００ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄ；ｎ＝１投与量グループあたりラット２０匹）を投与した。該研究には、５−ＦＵ対照及びＰＢＳ対照が内含された。１８４６の最後の投与量が投与されてから２４時間後に、動物の１サブセットを屠殺して、小腸萎縮に対する１８４６の効果を判定した。下痢に対する１８４６の効果を判定するために、投薬期間中及びさらに６日間、全ての動物を一日２回（朝夕）観察した。各々の観察期間において、各々の動物に、該動物が下痢をしているか否か及び下痢の重症度を示す評点［０、下痢無し、１（軽度）、肛門のまわりに糞染色、２（中度）、後肢及び尾部の糞染色及び３（重度）、前肢及び腹部に糞染色］を与えた。
【０２３８】
結果
５−ＦＵは、ＰＢＳ対照に比べＳＤラットにおいて、ＳＩ−ＢＷ及びＳＩ長の有意な減少を誘発した。５−ＦＵで誘発された小腸の萎縮及び下痢に対する１８４６の投与量応答効果は、図１０及び１１に示されている。１８４６は、５−ＦＵ誘発型小腸萎縮を投与量依存的に防止し、ＳＩ−ＢＷ及びＳＩ長を対照と類似のレベルに維持した。最高投与量（４００ｎｍｏｌ／ｋｇ）で投与された時点で、１８４６は、５−ＦＵの投与を受けたラットにおける下痢の発生率及び重症度を低減した。
【０２３９】
例１２：ＳＤラットの小腸におけるクリプト・ビラス長及び筋層厚みの投与量応答効果
ＳＤラットの小腸内でのクリプト−ビラス長及び筋層厚みに対する臨床候補１８４６の効果を調査した。連続５日間一日一回静脈内ボーラスとして１８４６（０．６２、３．４１又は６．２ｍｇ／ｋｇ／日、ｎ＝１投与量グループあたりラット６匹）を投与した。最終投与量が投与されてから２４時間後にラットを屠殺し、組織学的処理のために、空腸（胃十二指腸接合部から３０ｃｍ遠位）及び回腸（回盲接合部から３０ｃｍ近位）から１ｃｍの生検材料を切除した。
【０２４０】
結果
空腸及び回腸内でのクリプト−ビラス長及び筋層厚みに対する１８４６の投与量応答効果は、図１２に示されている。１８４６は、空腸内の平均クリプト−ビラス長及び回腸内の回腸筋層厚を、投与量依存的に増大させた。
【０２４１】
例１３：クローン病のインドメタシン誘発型モデルにおける小腸炎症のマーカーに対する１８４８の効果
クローン病は、小腸の突発性炎症をひき起こす慢性疾患である。インドメタシン誘発型クローンモデルにおける小腸の炎症に対するＧＬＰ−２アナログ１８４８の効果を調査した。我々は、インドメタシンの投与（２日間一日一回、皮下（ｓ．ｃ．））が潰瘍形成を特徴とする小腸の炎症を誘発し、炎症性サイトカイン内で腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）を増大させることを、先に示した。潰瘍形成に対するＺＰ１８４８の効果を判定するために、１８４８（皮下、一日２回（９：００と１２：００）、８、４０及び２００ｎｍｏｌ／ｋｇ）をインドメタシンの初回投与量以前の４日間及びインドメタシンと併用してさらに２日間投与した。コルチコステロイドはクローン病における活性炎症の治療において一般に用いられていることから、正の対照として、コルチコステロイド、プレドニゾロン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．（経口））を使用した。さらに、１つの動物グループに対し、１８４８（２００ｎｍｏｌ／ｋｇ）とプレドニゾロンの両方を投与して、組合せ治療の効果を判定した。１８４８の最終投与量を投与してから２４時間後に、動物を屠殺し、小腸を穏やかにきれいにフラッシングし、固定させた。潰瘍形成の範囲を判定するため、腸間膜反対側縁に沿って腸を切り開き、ポリプロピレン平板上に吊るし、Alcian Green 3 BXで表面染色した。幽門から出発して、小腸を走査し、全ての潰瘍の形状（円形対線形）及びサイズ（円形潰瘍：直径、線形潰瘍：長さ×幅）を標準的定規（分解能：０．５ｍｍ）を用いて測定した。潰瘍というのは、上皮表面が欠如した部域として定義された。最終的に、全ての個別潰瘍の面積の総和により各動物についての合計損傷面積を計算した。
【０２４２】
小腸内のＴＮＦ−αの濃度に対する１８４８の効果を判定するために、上述のとおりに１８４８及びインドメタシンを投与した。しかしながら、屠殺時点で、小腸を等しい長さの３つのセグメント（近位、中央及び遠位）に分けた。市販のＥＬＩＳＡキットを用いて個々のセグメントの各々においてＴＮＦ−α濃度を測定した。
【０２４３】
結果
インドメタシンは、対照グループに比べて強い小腸潰瘍誘発をひき起こした（潰瘍形成の推定範囲３３３±２１ｍｍ2対１０ｍｍ2）。潰瘍形成の推定範囲（ｍｍ2）に対する１８４６の効果は、図１３に示されている。１８４８での治療（８ｎｍｏｌ／ｋｇ、４０ｎｍｏｌ／ｋｇ及び２００ｎｍｏｌ／ｋｇ）は、潰瘍形成の範囲を著しく減少させた（それぞれ２３０±１２ｍｍ2、２１６±１７ｍｍ2、及び１７８±１７ｍｍ2、対インドメタシンＰ＜０．００１）。最高の投与量（２００ｎｍｏｌ／ｋｇ）で使用された時点で、ＺＰ１８４８は、正の対照、プレドニゾロンよりもさらに効果的であった（Ｐ＜０．０５）。
【０２４４】
インドメタシンは、対照動物（３４±７ｐｇ／ｍｇタンパク質、対インドメタシン、Ｐ＜０．０５）に比べ近位セグメント（９７±１４ｐｇ／ｍｇタンパク質）内でＴＮＦ−αの組織レベルの約２．９倍の増加をひき起こした。小腸ＴＮＦ−α濃度に対する１８４６の効果は、図１４に示されている。１８４８での治療（８、４０又は２００ｎｍｏｌ／ｋｇ）は、ＴＮＦ−αの組織レベルを著しく減少させ（それぞれタンパク質１ｍｇあたり４５±１４ｐｇ、４４±９ｐｇ、及び４５±７ｐｇ、）、３回の投与量間には有意な差異は全くなかった。
【０２４５】
インドメタシンは、対照動物（タンパク質１ｍｇあたり３４±６ｐｇ、対インドメタシンＰ＜０．０５）に比べて中央セグメント内のＴＮＦ−αの組織レベルの約３．２倍の増加をひき起こした（タンパク質１ｍｇあたり１０８±９ｐｇ）。１８４８（４０又は２００ｎｍｏｌ／ｋｇ）は、それぞれにＴＮＦ−αの組織レベルを著しく減少させた、対インドメタシンＰ＜０．０５）。
【０２４６】
インドメタシンは、対照動物（タンパク質１ｍｇあたり４５±３ｐｇ、対インドメタシンＰ＜０．０５）に比べて遠位セグメント内のＴＮＦ−αの組織レベルの約１．７倍の増加をひき起こした（タンパク質１ｍｇあたり７５±５ｐｇ）。１８４８は、遠位セグメントにおけるＴＮＦ−αレベルに対し阻害効果を有していたが、効果は、その他のセグメントと比べてさほど顕著ではなかった。プレドニゾロン単独では、３つのセグメント全てにおいてＴＮＦ−αの組織レベルに有意な影響を及ぼさなかったが、プレドニゾロンの投与は、遠位セグメントだけにおいてＴＮＦ−αレベルに対する１８４８（２００ｎｍｏｌ／ｋｇ）の阻害効果を改善した。
【０２４７】
例１４
ヒスチジン、マンニトール及び酢酸塩処方物中１０ｍｇ／ｍＬのＺＰ１８４６の処方
１．  １Ｌ入りビーカー内に８００ｍＬ（ＷＦＩ）の水を満たす。
２．  ビーカー内で１３．９６４ｇのＬ−ヒスチジンを秤量し、１Ｌ入りビーカーに添加する。
３．  ビーカー内で３２．２００ｇのマンニトールを秤量し、１Ｌ入りビーカーに添加する。
４．  １Ｌ入りビーカーに直接６２９μＬの１００％酢酸を添加するか又は１２．５８ｇの５％（ｗ／ｖ）酢酸溶液を秤量してビーカーに添加する。
６．  約９５０ｍＬになるまで満たす。
７．  ｐＨを測定し、必要とあらば１０％の酢酸又は０．２５ＭのヒスチジンでｐＨ６．９〜７．０に調整する。
８．  １１．３１２ｇの薬物物質（ペプチド含有量８８．４％）を秤量し、ビーカーに添加する。
９．  １．０１５ｋｇ（約１０００ｍＬ）になるまで満たし、ｐＨ、オスモル濃度及び密度を測定する。
１０．  直列に連結された２つの無菌フィルタを通して処方物を無菌ろ過する。
１１．  ＬＡＦベンチ内の０．５ｍＬのアリコート中の処方物を２ｍＬの薬学的に承認されたバイアル内に送り出す。
１２．  滅菌され４℃に予め冷却された凍結乾燥機内に投入する前に凍結乾燥ストッパを部分的に設置する。
１３．  凍結、アニール、一次乾燥及び二次乾燥段階から成る凍結乾燥サイクルを４０．５時間にわたり実施する。凍結乾燥機チャンバ内にある間に、窒素下でバイアルにストッパを設置する。
１４．  バイアルを仕分けし、オーバーシール及び圧着を適用する。
【０２４８】
例１５
ヒスチジン、アルギニン、マンニトール及びトレハロース中１０ｍｇ／ｍＬのＺＰ１８４６の処方
１．  １Ｌ入りビーカー内に８００ｍＬ（ＷＦＩ）の水を満たす。
２．  ビーカー内で６．２０５ｇのＬ−ヒスチジンを秤量し、１Ｌ入りビーカーに添加する。
３．  ビーカー内で３．４８４ｇのＬ−アルギニンを秤量し、１Ｌ入りビーカーに添加する。
４．  ビーカー内で３３．４６ｇのマンニトールを秤量し、１Ｌ入りビーカーに添加する。
５．  ビーカー内で１１．１６ｇのトレハロースを秤量し、１Ｌ入りビーカーに添加する。
６．  約９５０ｍＬになるまで満たす。
７．  ｐＨを測定し、必要とあらば１０％の酢酸又は０．２５ＭのヒスチジンでｐＨ６．９〜７．０に調整する。
８．  １１．３１２ｇの薬物物質（ペプチド含有量８８．４％）を秤量し、ビーカーに添加する。
９．  １．０１５ｋｇ（約１０００ｍＬ）まで充填し、ｐＨ、オスモル濃度及び密度を測定する。
１０．  直列に連結された２つの無菌フィルタを通して処方物を無菌ろ過する。
１１．  ＬＡＦベンチ内の０．５ｍＬのアリコート中の処方物を２ｍＬの薬学的に承認されたバイアル内に送り出す。
１２．  滅菌され４℃に予め冷却された凍結乾燥機内に投入する前に凍結乾燥ストッパを部分的に設置する。
１３．  凍結、アニール、一次乾燥及び二次乾燥段階から成る凍結乾燥サイクルを４０．５時間にわたり実施する。凍結乾燥機チャンバ内にある間に、窒素下でバイアルにストッパを設置する。
１４．  バイアルを仕分けし、オーバーシール及び圧着を適用する。
【０２４９】
該発明について上述の実施例と併せて記述してきたが、この開示が与えられた時点で当業者には数多くの同等の修正及び変形形態が明らかとなるだろう。従って、記載されている該発明の実施例は、制限的意味のない例示を目的としたものとみなされる。該発明の本質及び範囲から逸脱することなく、記述された実施形態に対しさまざまな変更を加えることが可能である。本書で引用されている全ての文書は、参考として明示的に内含される。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】Ｃ５７ＢＬマウスにおける小腸（ＳＩ）質量に関する４つの小腸選択的化合物（化合物番号１８４６、１８５５、１８４８及び１８５８の完全投与量応答データの例である。化合物は、以下の投与量で３日間皮下注射ｂ．ｉ．ｄ．により投与した：０（ビヒクル）、５、１５、４５、１３５、４０５ｎｍｏｌ／ｋｇ（ｎ＝１投与量グループあたり６）、各投与量レベルでの応答を、非選択的参照化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２で治療した一対治療対象マウスの体内で同じ投与量レベルで得られた応答と比較した。体重（ＢＷ）変化を補正するため、ＳＩ質量をＢＷとの関係において表現し（ＳＩ−ＢＷ比）、各投与量レベルでの成長応答を、非選択的基本化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２で観察された応答に対し正規化した。結果は、１ｋｇあたり５〜４０５ｎｍｏｌの投与量範囲内で、小腸選択的化合物１８４６、１８５５、１８４８及び１８５８の投与量応答関係が非選択的参照化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２と著しく異なっており（２方向ＡＮＯＶＡ内でＰ＜０．０５）、４つの化合物全てが［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２より著しく大きい最大応答で小腸成長を刺激することを実証した。値は平均±ＳＥＭである。*：［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２の等モル投与量との関係においてＰ＜０．０５。
【図２】マウスにおける小腸（ＳＩ）対結腸感度指数に関する４つの小腸選択的化合物（化合物番号１８４６、１８５５、１８４８及び１８５８の完全投与量応答データの例である。化合物は、Ｃ５７ＢＬマウスにおいて以下の投与量で３日間皮下注射ｂ．ｉ．ｄ．により投与した：０（ビヒクル）、５、１５、４５、１３５、４０５ｎｍｏｌ／ｋｇ（ｎ＝１投与量グループあたり６）。各投与量レベルでの応答を、非選択的参照化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２で治療した一対治療対象マウスの体内で同じ投与量レベルで得られた応答と比較した。ＳＩ−結腸感度指数を結腸質量に対するＳＩ質量として計算し、各投与量レベルでの感度指数を、非選択的参照化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２で観察された応答に対し正規化した。結果は、１ｋｇあたり５〜４０５ｎｍｏｌの投与量範囲内で、小腸選択的化合物１８５７及び１８２０の投与量応答関係が非選択的参照化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２と著しく異なっており（２方向ＡＮＯＶＡ内でＰ＜０．０５）、化合物１８４６、１８５５及び１８４８が［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２に比べて増大した最大小腸感度を示すことを実証した。値は平均±ＳＥＭである。*：［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２の等モル投与量との関係においてＰ＜０．０５。
【図３】Ｃ５７ＢＬマウスにおける小腸（ＳＩ）質量に関する４つの小腸選択的化合物（化合物番号１８５７、１８４９及び１８２０の完全投与量応答データの例である。化合物は、以下の投与量で３日間皮下注射ｂ．ｉ．ｄ．により投与した：０（ビヒクル）、５、１５、４５、１３５、４０５ｎｍｏｌ／ｋｇ（ｎ＝１投与量グループあたり６）、各投与量レベルでの応答を、非選択的参照化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２で治療した一対治療対象マウスの体内で同じ投与量レベルで得られた応答と比較した。体重（ＢＷ）変化を補正するため、ＳＩ質量をＢＷとの関係において表現し（ＳＩ−ＢＷ比）、各投与量レベルでの成長応答を、非選択的基本化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２で観察された応答に対し正規化した。結果は、１ｋｇあたり５〜４０５ｎｍｏｌの投与量範囲内で、小腸選択的化合物１８５７、１８４９及び１８２０の投与量応答関係が非選択的参照化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２と著しく異なっており（２方向ＡＮＯＶＡ内でＰ＜０．０５）、両方の化合物が［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２より著しく大きい最大応答で小腸成長を刺激することを実証した。値は平均±ＳＥＭである。*：［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２の等モル投与量との関係においてＰ＜０．０５。
【図４】マウスにおける小腸（ＳＩ）対結腸感度指数に関する３つの小腸選択的化合物（化合物番号１８５７、１８２０及び１８４９の完全投与量応答データの例である。化合物は、Ｃ５７ＢＬマウスにおいて以下の投与量で３日間皮下注射ｂ．ｉ．ｄ．により投与した：０（ビヒクル）、５、１５、４５、１３５、４０５ｎｍｏｌ／ｋｇ（ｎ＝１投与量グループあたり６）。各投与量レベルでの応答を、非選択的参照化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２で治療した一対治療対象マウスの体内で同じ投与量レベルで得られた応答と比較した。ＳＩ−結腸感度指数を結腸質量に対するＳＩ質量として計算し、各投与量レベルでの感度指数を、非選択的参照化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２で観察された応答に対し正規化した。結果は、１ｋｇあたり５〜４０５ｎｍｏｌの投与量範囲内で、小腸選択的化合物１８５７、１８２０及び１８４９の投与量応答関係が非選択的参照化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２と著しく異なっており（２方向ＡＮＯＶＡ内でＰ＜０．０５）、３つの化合物全てが［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２に比べて増大した最大小腸感度を示すことを実証した。値は平均±ＳＥＭである。*：［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２の等モル投与量との関係においてＰ＜０．０５。
【図５】小腸、結腸及び胃の質量に関する非選択的化合物（［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２）及び小腸選択的化合物（化合物１８４８）の完全投与量応答データの例である。化合物は、以下の投与量で３日間、Ｃ５７ＢＬマウス体内で皮下注射ｂ．ｉ．ｄ．により投与した：０（ビヒクル）、５、１５、４５、１３５、４０５ｎｍｏｌ／ｋｇ（ｎ＝１投与量グループあたり６）。結果は、１ｋｇあたり５〜４０５ｎｍｏｌの投与量範囲内で［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２が小腸、結腸及び胃の中で投与量依存性の成長刺激を生み出し、一方化合物１８４８は小腸内で投与量依存性成長刺激を生み出したにすぎないということを実証した。値は、平均±ＳＥＭである。*：ビヒクルとの関係においてＰ＜０．０５。
【図６】例は、細胞増殖抑制剤５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）で治療されているマウスにおけるＡ）小腸対体重比（ＳＩ−ＢＷ）及びＢ）小腸の長さ（ＳＩ長）に対する化合物１８４６（１ｋｇあたり５、１５、４５、１３５、４０５及び８１０ｎｍｏｌ、ｓ．ｃ．（皮下）ｂ．ｉ．ｄ；ｎ＝６／投与量グループ）の効果を示す。化合物１８４６を、毎日腹腔内に５０ｍｇ／ｋｇずつ、５−ＦＵ以前に３日間そして５−ＦＵと共に４日間投与した。基準として、１つの動物グループに対し［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２（４０５ｎｍｏｌ／ｋｇ）を与えた。ビヒクル（ＰＢＳ）で又は５−ＦＵ単独での治療を受けた対照動物の結果も示されている。化合物１８４６は、Ｃ５７ＢＬマウスにおいて５−ＦＵ誘発型小腸萎縮（器官質量の減少及び短縮）を防止した。値は平均±ＳＥＭである。*５−ＦＵとの関係においてＰ＜０．０５。
【図７】例は、細胞増殖抑制剤５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）で治療されているマウスにおけるＡ）小腸対体重比（ＳＩ−ＢＷ）及びＢ）小腸の長さ（ＳＩ長）に対する化合物１８４８（１ｋｇあたり５、１５、４５、１３５、４０５及び８１０ｎｍｏｌ、ｓ．ｃ．（皮下）ｂ．ｉ．ｄ；ｎ＝６／投与量グループ）の効果を示す。化合物１８４８を、毎日腹腔内に５０ｍｇ／ｋｇずつ、５−ＦＵ以前に３日間そして５−ＦＵと共に４日間投与した。基準として、１つの動物グループに対し［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２（４０５ｎｍｏｌ／ｋｇ）を与えた。ビヒクル（ＰＢＳ）で又は５−ＦＵ単独での治療を受けた対照動物の結果も示されている。化合物１８４８は、Ｃ５７ＢＬマウスにおいて５−ＦＵ誘発型小腸萎縮（器官質量の減少及び短縮）を防止し、高い投与量の化合物１８４８は［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２よりもさらに効果的であった。値は平均±ＳＥＭである。*５−ＦＵとの関係においてＰ＜０．０５。＃［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２との関係においてＰ＜０．０５。
【図８】例は、細胞増殖抑制剤５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）で治療されているマウスにおけるＡ）小腸対体重比（ＳＩ−ＢＷ）及びＢ）小腸の長さ（ＳＩ長）に対する化合物１８５５（１ｋｇあたり５、１５、４５、１３５、４０５及び８１０ｎｍｏｌ、ｓ．ｃ．（皮下）ｂ．ｉ．ｄ；ｎ＝６／投与量グループ）の効果を示す。化合物１８５５を、毎日腹腔内に５０ｍｇ／ｋｇずつ、５−ＦＵ以前に３日間そして５−ＦＵと共に４日間投与した。基準として、１つの動物グループに対し［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２（４０５ｎｍｏｌ／ｋｇ）を与えた。ビヒクル（ＰＢＳ）で又は５−ＦＵ単独での治療を受けた対照動物の結果も示されている。化合物１８５５は、Ｃ５７ＢＬマウスにおいて５−ＦＵ誘発型小腸萎縮（器官質量の減少及び短縮）を防止し、最高の投与量の化合物１８５５は等モル投与量の［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２よりもさらに効果的であった。値は平均±ＳＥＭである。*５−ＦＵとの関係においてＰ＜０．０５。＃［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２との関係においてＰ＜０．０５。
【図９】例は、細胞増殖抑制剤５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）で治療されているマウスにおけるＡ）小腸対体重比（ＳＩ−ＢＷ）及びＢ）小腸の長さ（ＳＩ長）に対する化合物１８５７（１ｋｇあたり５、１５、４５、１３５及び４０５ｎｍｏｌ、ｓ．ｃ．（皮下）ｂ．ｉ．ｄ；ｎ＝６／投与量グループ）の効果を示す。化合物１８５７を、毎日腹腔内に５０ｍｇ／ｋｇずつ、５−ＦＵ以前に３日間そして５−ＦＵと共に４日間投与した。基準として、１つの動物グループに対し［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２（４０５ｎｍｏｌ／ｋｇ）を与えた。ビヒクル（ＰＢＳ）で又は５−ＦＵ単独での治療を受けた対照動物の結果も示されている。化合物１８５７は、Ｃ５７ＢＬマウスにおいて５−ＦＵ誘発型小腸萎縮（器官質量の減少及び短縮）を防止し、最高の投与量の化合物１８５７は高投与量の［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２よりもさらに効果的であった。値は平均±ＳＥＭである。*５−ＦＵとの関係においてＰ＜０．０５。＃［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２との関係においてＰ＜０．０５。
【０２５１】
【図１０】例は、細胞増殖抑制剤５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）で治療されている雄のSpague Dawleyラットにおける化合物１８４６（１６、８０、及び４００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日；ｓ．ｃ．ｎ＝６／投与量グループ）の効果を示す。化合物１８４６を、５−ＦＵ（毎日、ｉ．ｐ．（腹腔内）７５ｍｇ／ｋｇ）以前に３日間そして５−ＦＵと共に４日間投与した。結果を、ビヒクル（塩水）又は５−ＦＵ単独で治療した対照動物における応答と比較した。塩水及び５−ＦＵ対照も同様に示されている。化合物１８４６は、ラットにおける５−ＦＵ誘発型小腸萎縮（小腸質量の減少及び腸の短縮）を防止した。値は平均±ＳＥＭである。*５−ＦＵ単独との関係においてＰ＜０．０５。
【図１１】この例は、細胞増殖抑制剤５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）での治療により誘発された下痢に対する化合物１８４６の治療的効果を例示している。ラットを４日間一日一回（１日目〜４日目）７５ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵで治療した：（ｎ＝ラット４０匹）。動物の半数が、５−ＦＵでの４日間の治療の直前３日間（−３日目〜−１日目）及びこの治療中（０日目〜３日目）、化合物１８４６（一日一回ｓ．ｃ．（皮下）４００ｎｍｏｌ／ｋｇ）での付加的な治療を受けた。ラットを、一日２回（朝夕）観察して、動物が下痢をしているか否かを判定し、以下の尺度に従って下痢の重症度を評定した：すなわち、（０）下痢無し、（１）軽度−肛門のまわりに糞染色；（２）中度−後肢と尾部に糞染色；そして（３）重度−前肢及び腹部に糞染色。５日目に、５−ＦＵを単独で受けたSpragne Dawleyラットの約７０％が下痢を発生した（図１１Ａ）のに対し、化合物１８４６で同時治療されたラットのうち下痢を発生したのは３０％にすぎなかった（図１１Ｂ）。これらの結果は、化合物１８４６が小腸の障害ひいては５−ＦＵでの細胞増殖抑制治療中の下痢の発生を効果的に予防することを示している。
【図１２】この例は、空腸（すなわち小腸の中央区分）内の上皮クリプト・ビラス高さ（図１２Ａ）及び筋肉厚み（図１２Ｂ）に対する化合物１８４６の効果を例示している。Spragne Dawleyラットを５日間化合物１８４６（一日一回０．６５、３．４１又は６．２ｍｇ／ｋｇ）で静脈内治療した（ｎ＝１投与量グループあたり６）。次に動物を屠殺し、幽門括約筋から２５ｃｍ離れたところで小腸生検材料（１ｃｍ）を収集した。生検材料を固定し、パラフィン内に包埋させ、切片化し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。染色した切片を顕微鏡検査し、クリプト深さ、ビラス高さ、クリプト−ビラス長及び筋層厚みを測定した。例示されている通り、化合物１８４６は、空腸からの腸上皮内のクリプト−ビラス長の投与量依存性増加を生み出したが、空腸の筋厚みに対してはいかなる効果も有していなかった。これらの結果は、化合物１８４６がまず、小上皮成長の刺激を通して小腸内でその増殖作用を及ぼすことを示唆している。値は平均±ＳＥＭである。*ビヒクル対照（０ｍｇ／ｋｇ／日）との関係においてＰ＜０．０５。
【図１３】この例は、インドメタシンにより誘発された小腸潰瘍に対する化合物１８４８の効果を例示している。雄のSpragne Dawleyラットをビヒクル（塩水：グループ１）又はインドメタシン（２日間一日一回ｓ．ｃ．７ｍｇ／ｋｇ；グループ２〜７）で治療した。インドメタシンは単独で（グループ２）、又はプレドニゾロン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．；グループ３）と組合せて、又は一日一回ｓ．ｃ．で８、４０又は２００ｎｍｏｌ／ｋｇの化合物１８４８と組合せて（グループ４〜６）投与された。最後に１つのラットグループを、プレドニゾロン（１０ｍｇ／ｋｇｓ．ｃ．）及び化合物１８４８（２００ｎｍｏｌ／ｋｇ、ｓ．ｃ．一日一回）の組合せ治療で治療した（グループ７）。化合物１８４８での治療は、２日間のインドメタシン治療の４日前に開始し、このインドメタシン治療中続行した。３日目にラットを屠殺し、剖検の後、小腸を穏やかに１０％のホルマリンでフラッシングし、５分間ホルマリンで満たし、その後、腸を腸間膜反対側縁に沿って切り開き、ポリプロピレン平板上に吊るした。残っている腸内容物を一対のピンセットで入念に除去した。さらに２４時間室温で固定させた後、組織をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で洗い流し、１％の酢酸中の０．５％溶液（Bie & Berntsen）として調製されたAlcian Green ３ＢＸ（Chroma）で２０分間表面染色した。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水での余剰の染色溶液の除去の後、組織調製物を７０％のアルコールに移送し、低倍率（７倍）の立体顕微鏡を用いて分析した。幽門から出発して、小腸を走査し、全ての潰瘍の形状（円形対線形）及びサイズ（円形潰瘍：直径、線形潰瘍：長さ×幅）を標準定規（分解能：０．５ｍｍ）を用いて測定した。潰瘍は、上皮表面が欠如した部域として定義された。治ゆ中の潰瘍においては、たとえビラス（ビラス）構造がより大きな部域内でなおも欠如していた場合でも、なおも上皮表面が欠けていた部域のみが潰瘍とみなされた。全ての分析は、盲検によって実施された。図１３に例示されている通り、インドメタシンは、小腸潰瘍の強い誘発をひき起こした（合計小腸潰瘍形成＝３３３±２１ｍｍ2）。プレドニゾロンでの治療は、約２９％だけ潰瘍形成度の有意な減少をひき起こした。化合物１８４８での治療は、投与量依存的にインドメタシン誘発型潰瘍形成を予防し、最高の投与量では、合計潰瘍形成はほぼ５０％削減された（１７８±１７ｍｍ2）。化合物１８４６に対するこの最大限の応答は、プレドニゾロンの効果よりも大きく、高投与量の化合物１８４８と組合わせたプレドニゾロンの添加は、いかなる付加的効果も生み出さなかった。これらの結果は、化合物１８４８が小腸内のインドメタシン誘発型潰瘍形成を効果的に予防することを示している。値は平均±ＳＥＭである。*インドメタシンに対してＰ＜０．０５（グループ２）。＃プレドニゾロンに対してＰ＜０．０５（グループ３）。
【０２５２】
【図１４】この例は、小腸内のインドメタシン誘発型炎症を有するラットにおけるＴＮＦ−アルファの小腸含有量に対する化合物１８４８の効果を例示している。雄のSpragne Dawleyラットを、ビヒクル（塩水：グループ１）又はインドメタシン（２日間一日一回ｓ．ｃ．７ｍｇ／ｋｇ；グループ２〜７）で治療した。インドメタシンは単独で（グループ２）、又はプレドニゾロン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．；グループ３）と組合せて、又は一日一回ｓ．ｃ．で８、４０又は２００ｎｍｏｌ／ｋｇの化合物１８４８と組合わせて（グループ４〜６）投与された。最後に１つのラットグループを、プレドニゾロン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）及び化合物１８４８（２００ｎｍｏｌ／ｋｇ、ｓ．ｃ．一日一回）の組合せ治療で治療した（グループ７）。化合物１８４８での治療は、２日間のインドメタシン治療の４日前に開始し、このインドメタシン治療中続行した。３日前にラットを屠殺し、剖検の後に小腸を、１）十二指腸及び近位空腸、２）中位及び遠位空腸及び３）回腸に対応する等しい長さの３つのセグメントに解裂した。標本を液体Ｎ2中で瞬間凍結させ、分析まで−８０℃で貯蔵した。小腸セグメントからの細胞タンパク質の均質化及び抽出を以下の手順に従って実施した：組織セグメントを秤量し、組織１グラムあたり１．５ｍｌの体積の氷冷（４℃）抽出緩衝液、０．０５％のアジ化ナトリウム（Fluka）、１％のトゥイーン−８０（Fluka）、２ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ、Fluka）及び各１ｍｇ／ｍｌずつのプロチアーゼ阻害物質アプロチニン、ロイペプチン及びペプスタチンＡ（Roche Diagnostics）を伴う１０ｍＭのトリス−ＨＣＬ（Sigma）及び１ｍＭのＥＤＴＡ（J.T.Baker）(ｐＨ７．６))を加えた。組織をハサミを用いて小さな見本に切断し、３０秒間氷上で間欠的に冷却しながら９５００rpmで２０秒間（ＩＫＡ Ultra Turrax Ｔ２５ホモジナイザー、Janke & Kunkel）３回均質化した。４℃で３０分間２０．０００ｘｇでホモジネートを遠心分離し、上清を収集し、ＴＮＦ−αについての分析まで-２０℃で保管した。メーカーの使用説明書（ラット腫瘍壊死因子α超高感度ＥＬＩＳＡキット、Biosource International Inc.）に従って市販のＥＬＩＳＡキットを用いて、ＴＮＦ−αについて小腸タンパク質抽出物を分析した。検定の検出限界は０．７ｐｇ／ｍｌであった。市販の検定（ＤＣタンパク質検定、Bio-Rad Laborotories Ltd.）を用いて合計タンパク質含有量についてタンパク質抽出物を分析した。合計タンパク質との関係において、ＴＮＦ−αの小腸組織レベルを表現した。化合物１８４８は、炎症性サイトカインＴＮＦ−αの小腸組織レベルを著しく低下させ、この効果は近位セグメント（小腸の最初の３分の1）において最も顕著であった。化合物１８４８は、近位及び中位セグメント（小腸の２番目の３分の1）においてプレドニゾロンよりもさらに効果的であった。興味深いことに、化合物１８４８は、プレトニゾンよりもさらに効果的に小腸内での炎症を抑制し、プレドニゾンは化合物１８４８と組合せて投与された場合にいかなる付加的効果も有していなかった。これらの結果は、化合物１８４８が小腸に影響を及ぼす疾病プロセスに対し顕著な改炎症性潜在能力を有することを示唆している。値は平均±ＳＥＭ��ある。*：インドメタシンに対してＰ＜０．０５（グループ２）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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