(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１４、配列番号１５及び配列番号３５で表される核酸配列からなる群から選択されたいずれか一つの核酸配列を含み、膵臓癌細胞または組織に特異的に結合できる核酸アプタマーであって
前記核酸アプタマーがＤＮＡである場合には、前記核酸配列においてＵはＴであることを特徴とする核酸アプタマー。
【請求項２】
前記核酸アプタマーの長さが、２５〜８５ｎｔｓであることを特徴とする請求項１に記載の核酸アプタマー。
【請求項３】
前記核酸アプタマーは、配列番号４１で表される核酸配列であることを特徴とする請求項１に記載の核酸アプタマー。
【請求項４】
配列番号１〜１３で表される核酸配列からなる群から選択されたいずれか一つの核酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸アプタマー。
【請求項５】
配列番号１で表される核酸配列（ＳＱ１）であることを特徴とする請求項１に記載の核酸アプタマー。
【請求項６】
配列番号２で表される核酸配列（ＳＱ２）であることを特徴とする請求項１に記載の核酸アプタマー。
【請求項７】
配列番号４で表される核酸配列（ＳＱ４）であることを特徴とする請求項１に記載の核酸アプタマー。
【請求項８】
配列番号３６で表される核酸配列であることを特徴とする請求項１に記載の核酸アプタマー。
【請求項９】
配列番号３８で表される核酸配列であることを特徴とする請求項１に記載の核酸アプタマー。
【請求項１０】
配列番号３９で表される核酸配列であることを特徴とする請求項１に記載の核酸アプタマー。
【請求項１１】
配列番号４０で表される核酸配列であることを特徴とする請求項１に記載の核酸アプタマー。
【請求項１２】
化学的変形を含むことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸アプタマーであって、前記化学的変形が、前記核酸アプタマーに含まれる少なくとも１種のヌクレオチドのリボースの２'の位置において、ヒドロキシル基が水素原子、フッ素原子、−Ｏ−アルキル基、−Ｏ−アシル基及びアミノ基のいずれか一つで置換されたものである前記核酸アプタマー。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸アプタマーまたはその化学的変形を含む核酸アプタマーを利用することを特徴とする、膵臓癌の診断補助方法。
【請求項１４】
前記核酸アプタマーはすい臓組織、又はすい臓細胞の試料と接触させる工程を含む請求項１３に記載の診断補助方法。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸アプタマーまたはその化学的変形を含む核酸アプタマーを含有する、膵臓癌の診断用組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸アプタマーまたはその化学的変形を含む核酸アプタマーが固定されている膵臓癌診断用センサー。
【請求項１７】
請求項１６に記載の膵臓癌診断用センサーを利用することを特徴とする、膵臓癌の診断補助方法。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸アプタマーまたはその化学的変形を含む核酸アプタマーを含有する、膵臓癌診断用キット。
【請求項１９】
請求項１８に記載の膵臓癌診断用キットを利用することを特徴とする、膵臓癌の診断補助方法。
【請求項２０】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸アプタマーまたはその化学的変形を含む核酸アプタマーを含有する、膵臓癌の治療用組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸アプタマーまたはその化学的変形を含む核酸アプタマーを含有する、膵臓癌特異的薬品伝達組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸アプタマーまたはその化学的変形を含む核酸アプタマーを利用した膵臓癌細胞特異的表面バイオマーカーの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓癌細胞または組織を特異的に認識し、そして結合することによって膵臓癌の診断及び治療に利用できる核酸アプタマー及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、癌診断及び治療のために多数のバイオマーカーに関する研究が行われているが、そのうちで癌細胞特異的膜タンパク質は、検出可能な量で体液に頻繁に出ており、体液における臨床的提示は、生検サンプルの侵襲的な方法よりさらに好ましいため、最も適切なバイオマーカーとして考慮されている。また、癌イメージング（cancer imaging）とターゲット化治療戦略（targeted theraqeutic strategies）のため、タンパク質は魅力的なバイオマーカーと考えられている。
【０００３】
ところが、バイオマーカー同定分野は、一次的に２Ｄゲル電気永動（２Ｄ−ＧＥ）質量分析器（Mass Spectroscopy）に依存するが、このような技術を用いた膜タンパク質の解明は非常に限られていた。全細胞タンパク質のほんの３０％だけが膜から来ており、このうち５％だけが２Ｄ−ＧＥを利用して検出できるからである。従って、代案として、結合されたターゲットを確認するためのツールとして用いられる膜タンパク質に関する特異的なプローブが開発された。
【０００４】
過去十年間ターゲットタンパク質に高い親和性と特異性を持って結合できる核酸プローブアプタマー分野は盛んに研究されてきており、特にＳＥＬＥＸ（Systemic Enrichment of Ligands using Exponential Enrichment）技術を利用して分離するアプタマーは、多数の疾病関連タンパク質と関連して開発されてきており、これらのうちの多くは、最近それの自体を治療剤として利用したり、イメージング化または薬品伝達体のツールとして利用するために臨床治験中である（Lee, J.F. et al., Curr Opin Chem Biol., 10(3):282, 2006; Gilbert, J.C. et al., Circulation., 116(23):2678, 2007）。
【０００５】
アプタマーは、従来のＳＥＬＥＸ法に加えて、複合ターゲット、即ち、生きている細胞及び組織に対してＣｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法を利用して得られる（Guo et al. Int. J. Mol. Sci., 9(4):668, 2008）。このＣｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法は、表面マーカーターゲットが知られていない場合でも、疾患細胞に対するアプタマーを開発することができるという長所がある。さらに、ターゲットタンパク質は、分離した状態では、その本来の特性を示すことができず、生理的状態にあるターゲットタンパク質の、選別過程における、さらに機能的な接近が可能になるため、Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法は、従来のＳＥＬＥＸプロセスに比べて長所を持っている。そこで、Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸアプローチを用いて一番最初にテネイシン−Ｃ（tenascin-C）に対するｓｓＤＮＡアプタマーが開発され（Daniels et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100(26):15416, 2003）、以後急性骨髄性細胞に対するＰＴＫ７（protein tyrosine kinase）アプタマー（Shangguan, D. et al., J. Proteome. Res., 7(5):2133, 2008）及び小細胞肺癌細胞に対するＤＮＡアプタマー（Chen H.W. et al., Chem. Med. Chem., 3(6):991, 2008）がさらに開発された。サブトラクティブＳＥＬＥＸを利用して、分化したＰＣ１２細胞に結合できるが母細胞には結合されず、臨床診断に有用なＤＮＡアプタマーが合成された（Brand, R. & Mahr, C., Curr. Gastroenterol. Rep., 7(2):122, 2005; Lee, M.X. & Saif, M.W., Jop., 10(2):104, 2009）。しかし、Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法は、細胞表面プロテアソームの複雑性のため、最適化され特異的な選別過程による限定的な調節を要する。従って、適切な陰性選別過程が、Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸプロセスの成功のために必須である。
【０００６】
一方、膵臓癌（Pancreatic adenocarcinoma）は、世界的に１４番目に多発する癌として、米国だけ見ると、癌関連死亡者のうち４番目の死亡要因に該当する。このようなすい臓腫瘍の約９０％は、ＰＤＡＣ（ductal adenocarcinomas、腺管癌）である（Bardeesy, N.& DePinho, R.A., Nat. Rev. Cancer, 2(12):897, 2002）。これは、非常に低い平均生存率を持つ非常に攻撃的な悪性癌である。高い死亡率との関連は、低い診断率と従来の化学療法的治療に対する高い耐性に起因する（Koliopanos, A. et al., Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int., 7(4):345, 2008）。この腫瘍のただ１５〜２０％だけが切除可能であり、これに対する早期診断マーカーの限界が、適切な時期の検出における問題となっている（Brand, R. & Mahr, C., Curr. Gastroenterol. Rep., 7(2):122、2005; Lee, M.X. & Saif, M.W., Jop., 10(2):104, 2009）。従って、早期診断及び効果的な治療剤開発を助ける新規な膵臓癌バイオマーカーの開発が求められている。
【０００７】
そこで、本発明者は早期膵臓癌診断及び膵臓癌治療に利用できる膵臓癌特異的なアプタマーを分離しようと鋭意努力した結果、Ｃｅｌｌ ＳＥＬＥＸ（Syetematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）工程を介して膵臓癌細胞株にのみ特異的に結合するアプタマーを選別した後、選別されたアプタマーが正常なすい臓組織には結合せず、膵臓癌細胞株にのみ特異的に結合することを確認して、本発明を完成した。
【発明の要約】
【０００８】
本発明の第一の目的は、膵臓癌細胞または組織に特異的に結合する核酸アプタマーを提供することである。
本発明の第二の目的は、前記核酸アプタマーを含有する膵臓癌の検出方法を提供することである。
本発明の第三の目的は、前記核酸アプタマーを利用した膵臓癌の診断または治療用組成物を提供することである。
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は配列番号１４、配列番号１５及び配列番号３５で表される核酸配列からなる群から選択されたある一つの核酸配列またはその断片を含み、膵臓癌細胞または組織に特異的に結合できる２０〜１００ｎｔｓの核酸アプタマー（ここで、前記核酸アプタマーがＤＮＡである場合には、前記核酸配列においてＵはＴであることを特徴とする）を提供する。
【００１０】
本発明の他の特徴及び具現例は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求の範囲からより一層明白になる。
【００１１】
本発明はまた、前記核酸アプタマーまたはその化学的変形を含む核酸アプタマーを利用することを特徴とする膵臓癌の検出方法を提供する。
本発明はまた、前記核酸アプタマーまたはその化学的変形を含む核酸アプタマーを含有する、膵臓癌の診断または治療用組成物を提供する。
本発明はまた、前記核酸アプタマーまたはその化学的変形を含む核酸アプタマーを投与することを特徴とする、膵臓癌の診断または治療方法を提供する。
本発明はまた、前記核酸アプタマーまたはその化学的変形を含む核酸アプタマーの膵臓癌の診断または治療用用途を提供する。
本発明はまた、前記核酸アプタマーまたはその化学的変形を含む核酸アプタマーが固定されている、膵臓癌診断用センサーを提供する。
本発明はまた、前記核酸アプタマーまたはその化学的変形を含む核酸アプタマーを含有する、膵臓癌診断用キットを提供する。
本発明はまた、前記膵臓癌診断用センサーまたは膵臓癌診断用キットを利用することを特徴とする、膵臓癌の検出方法を提供する。
本発明はまた、前記核酸アプタマーまたはその化学的変形を含む核酸アプタマーを含有する、膵臓癌特異的薬品伝達組成物を提供する。
本発明はまた、前記核酸アプタマーまたはその化学的変形を含む核酸アプタマーを利用した、膵臓癌細胞特異的表面バイオマーカーの検出方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に係る膵臓癌細胞または組織に特異的に結合するアプタマーの選別過程の概略図である。
【図２】前記図１の概略図に従ってＣｅｌｌ−ＳＥＬＥＸプロセスを行って取得した１４番目ラウンドのアプタマープールの配列を分析した結果である。
【図３】Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸを行った各段階のアプタマープールの膵臓癌細胞株に対する結合親和度をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した結果グラフである。
【図４】Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸを行った１４番目ラウンドのアプタマープールに対し蛍光検出方法を利用して結合親和度を確認した写真である。
【図５】Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸを行った１４番目ラウンドのアプタマープールの膵臓癌細胞株及びその他癌細胞株に対する結合親和度を定量的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した結果のグラフである。
【図６】本発明に係るアプタマーの膵臓癌細胞株に対する結合親和度をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した結果のグラフである。
【図７】本発明に係るアプタマーのＣａＰａｎ−１細胞株に対する結合親和度を示したグラフである。
【図８】本発明に係るアプタマーのＰａｎｃ−１細胞株に対する結合親和度を示したグラフである。
【図９】本発明に係るアプタマーＳＱ１の膵臓癌細胞株及び正常細胞株に対する結合親和度を蛍光検出法で確認した写真である。
【図１０】本発明に係るアプタマーＳＱ２の膵臓癌細胞株及び正常細胞株に対する結合親和度を蛍光検出法で確認した写真である。
【図１１】本発明に係るアプタマーＳＱ６の膵臓癌細胞株及び正常細胞株に対する結合親和度を蛍光検出法で確認した写真である。
【図１２】本発明に係るアプタマーＳＱ２、ＳＱ４及びＳＱ８の膵臓癌細胞株ＣａＰａｎ−１に対する結合親和度を蛍光検出法で確認した写真である。
【図１３】本発明に係るアプタマーＳＱ２、ＳＱ４及びＳＱ８の膵臓癌細胞株Ｐａｎ−１に対する結合親和度を蛍光検出法で確認した写真である。
【図１４】本発明に係るアプタマーＳＱ２、ＳＱ４及びＳＱ８の膵臓癌細胞株Ａｓｐｃ−１に対する結合親和度を蛍光検出法で確認した写真である。
【図１５】本発明に係るアプタマーＳＱ２、ＳＱ４及びＳＱ８の膵臓癌細胞株Ｂｘｐｃ−３に対する結合親和度を蛍光検出法で確認した写真である。
【図１６】本発明に係るアプタマーＳＱ２、ＳＱ４及びＳＱ８の膵臓癌細胞株Ｈａｐａｆ−ＩＩに対する結合親和度を蛍光検出法で確認した写真である。
【図１７】本発明に係るアプタマーＳＱ２、ＳＱ４及びＳＱ８の膵臓癌細胞株Ｍｉａｃａｐａ−２に対する結合親和度を蛍光検出法で確認した写真である。
【図１８】本発明に係るアプタマーＳＱ１乃至ＳＱ８の膵臓癌細胞株ＣａＰａｎ−１に対する結合親和度を蛍光検出法で確認した写真である。
【図１９】本発明に係るアプタマーＳＱ１乃至ＳＱ８の膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ１に対する結合親和度を蛍光検出法で確認した写真である。
【図２０】ＳＱ２アプタマーの一部配列を切断したアプタマーの膵臓癌細胞株に対する結合親和度の相対的な比を示したグラフである。
【図２１】ＳＱ２アプタマーの二次構造（Ａ）及びＳＱ２ ６−３０の二次構造（Ｂ）である。
【図２２】ＳＱ２ ６−３０の膵臓癌細胞株及び正常細胞株に対する結合親和度を蛍光検出法で確認した写真である。
【図２３】ＳＱ２ ６−３０の非膵臓癌細胞株であるＳＫ−Ｎ−ＳＨ、Ｔ９８Ｇ、Ａ５４９及びＢｅｎｄ−３細胞株に対する結合親和度を蛍光検出法で確認した写真である。
【図２４】ＳＱ２ ６−３０の非膵臓癌細胞株であるＨｅｌａ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＬｎＣａｐ及びＳＫ−Ｂｒ３、Ｔ９８Ｇ、Ａ５４９及びＢｅｎｄ−３細胞株に対する結合親和度を蛍光検出法で確認した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
本発明の詳細な説明などにおいて使用される主な用語の定義は、下記の通りである。
【００１４】
本願において「核酸アプタマー」とは、高い親和性でターゲット物質を特異的に認識できる小さい一本鎖オリゴ核酸をいう。
本願において「試料」とは、膵臓癌マーカーを含有していると推定されて分析が行われる組成物を意味し、すい臓組織、すい臓細胞、血液、血清、血漿、唾液、喀痰及び尿などが該当する。
本願において「９０％以上１００％未満の相同性を持つ核酸配列」とは、一個乃至数個のヌクレオチドが追加、欠失または置き換えられて９０％以上１００％未満のホモロジーを有する配列であって、類似の膵臓癌細胞株結合能を示す核酸配列を意味する。
【００１５】
本発明は一観点において、ＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵＲＣＣＵＧＡＲＤＭＢＢＢ（ＲはＧまたはＡ、ＤはＡ、ＵまたはＧ、ＭはＡまたはＣ、ＢはＧ、ＣまたはＵである；配列番号３５）、次の配列番号１４及び配列番号１５で表される核酸配列からなる群から選択されたある一つの核酸配列またはその断片を含み、膵臓癌細胞または組織に特異的に結合できる核酸アプタマーに関する。
【００１６】
本発明において、前記配列番号３５で表される核酸配列は好ましくは、ＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵＧＣＣＵＧＡＡＡＡＧＣＵ（配列番号４１）であることを特徴とし、前記配列番号３５で表示される核酸配列を含む膵臓癌細胞または組織に特異的に結合できる核酸アプタマーは、次の配列番号１乃至１３で表される核酸配列からなる群から選択されたある一つの核酸配列を含むことを特徴とする。
ＳＱ１：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＵＵＡＧ  ＣＧＧＵＡＵＣＡＣＧ  ＡＵＵＡＣＵＵＡＣＣ  ＵＵＣＧＵＵＧＣＵＧ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号１）
ＳＱ２：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＡＡＡＧ  ＣＵＡＵＣＧＣＣＣＡ  ＡＵＵＣＧＣＡＧＵＧ  ＡＵＡＵＣＣＵＵＵＡ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号２）
ＳＱ３：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＡＡＡＣ  ＣＵＧＧＵＣＵＣＵＣ  ＵＧＵＣＡＧＣＡＡＡ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号３）
ＳＱ４：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＧＵＡＧ  ＣＵＧＧＧＵＣＣＧＵ  ＣＣＣＣＡＣＡＣＡＵ  ＵＡＣＣＡＵＵＵＧＵ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号４）
ＳＱ５：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＡＡＡＣ  ＵＧＧＵＧＵＡＣＣＵ  ＣＵＵＵＧＣＣＣＵＡ  ＵＣＵＵＡＵＣＵＧＧ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号５）
ＳＱ６：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＡＧＡＣ  ＵＧＧＡＵＡＵＡＣＵ  ＣＵＵＡＡＧＣＡＵＵ  ＵＣＵＡＵＡＡＵＣＧ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３'（配列番号６）
ＳＱ７：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＡＡＣＵ  ＧＣＵＧＣＡＵＣＧＵ  ＣＵＣＣＣＡＣＧＵＡ  ＵＵＡＣＡＣＡＵＧＡ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号７）
ＳＱ８：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＡＡＡＧ  ＵＵＧＡＡＣＵＣＣＡ  ＡＡＵＡＣＧＣＧＣＵ  Ｇ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号８）
Ｓ４９：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＡＡＡＧ  ＵＧＧＣＣＵＣＣＣＵ  ＡＣＡＡＡＧＡＡＣＵ  ＵＡＵＡＵＣＡＵＣＣ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号９）
Ｓ２０：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＡＡＡＧ  ＵＵＵＡＵＣＣＣＣＣ  ＵＵＵＵＡＧＣＧＵＵ  ＵＡＣＣＡＵＡＡＵＧ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号１０）
Ｓ５９：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＡＣＣＵＧＡＡＡＡＣ  ＵＧＧＵＵＵＣＣＧＧ  ＣＡＵＣＣＣＧＵＡＵ  ＵＧＣＧＧＣＵＵＵＡ  Ｃ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号１１）
Ｓ１１：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＡＧＡＧ  ＣＧＡＡＧＵＡＡＡＵ  ＣＵＣＵＣＡＣＵＧＣ  ＧＵＣＡＣＵＡＣＡ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号１２）
Ｓ５２：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＡＣＣＵＧＡＧＵＡＧ  ＣＧＵＵＵＣＣＣＧＧ  ＣＡＵＵＡＵＡＣＵＡ  ＵＡＡＡＣＵＵ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３'（配列番号１３）
Ｓ６８：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＣＣＵＧＡＡＡＧＵＵ  ＵＧＧＡＵＡＵＣＵＵ  ＧＧＣＧＣＵＵＧＡＣ  ＵＡＧＡＡＡＡＣＵＵ  ＧＡＡＡＵＵＵＧＵ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号１４）
Ｓ３：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＣＵＵＡＵＧＵＵＣＡ  ＵＧＣＣＡＧＣＧＣＡ  ＡＵＵＧＣＣ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号１５）
【００１７】
前記において、各アプタマーの５'末端と３'末端の下線の部分は、下記配列番号１６で見られるように、ＰＣＲ増幅とｃＤＮＡ合成のために導入された部分である。
【００１８】
この時、前記核酸アプタマーを構成する全ヌクレオチドの数は、２０〜２００ｎｔｓであり、好ましくは２０〜１００ｎｔｓであることを特徴とする。また、さらに好ましくは２５ｎｔｓ以上であることを特徴とするか８５ｎｔｓ以下であることを特徴とする。全ヌクレオチドの数が少ない場合、化学合成及び大量生産がより容易で、かつ費用面における長所も大きい。また、化学修飾も容易で生体内の安全性も高く、毒性も低くなる。さらに、前記核酸アプタマーに含まれる各ヌクレオチドは同一または異なる一つ以上の化学的変形を含むことができるが、例えば、リボースの２'の位置において、ヒドロキシル基が任意の原子または基で置き換えられているヌクレオチドであってもよい。このような任意の原子または基としては、例えば、水素原子、フッ素原子または−Ｏ−アルキル基（例：−Ｏ−ＣＨ３）、−Ｏ−アシル基（例：−Ｏ−ＣＨＯ）、アミノ基（例：−ＮＨ２）で置き換えられているヌクレオチドが挙げられる。また、核酸アプタマーは、一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡとして提供されるものであって、本発明において前記核酸がＤＮＡである場合には、前記核酸配列においてＵはＴと表示され、このような配列が本発明の範囲に含まれることは本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者にとっては自明なことである。
【００１９】
本発明の実施例では図１に示したように、前記配列番号１乃至１５で表される核酸配列のアプタマーをＳＥＬＥＸ工程を介して選別した後、リアルタイムＰＣＲ法、蛍光検出方法及び平衡ろ過法を介して親和度を測定して、前記配列番号１乃至１５で表される核酸配列が膵臓癌細胞株に対し特異的に結合することを確認した。
【００２０】
本発明に係る核酸アプタマーは、ＣＣＵＧＡ、ＧＣＣＵＧＡＡＡ、またはＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵＲＣＣＵＧＡＲＤＭＢＢＢ（配列番号３５）等のように共通して保存される領域を持つことが明らかになるが、このような共通に保存される領域の存在は、前記配列番号１乃至１５で表される核酸配列のうち選択されたある一つの核酸配列と９０％以上１００％未満の相同性を持つ核酸配列は膵臓癌細胞株に特異的に結合できる核酸アプタマーであることを意味する。本発明に係る核酸アプタマー同士の配列の類似性を見ると、前記配列番号１乃至１５で表される核酸配列のうち選択されたある一つの核酸配列に対して一個乃至数個のヌクレオチドが追加、欠失または置き換えられて９０％以上１００％未満の配列に共通性があれば、本発明に係る核酸アプタマーと類似する膵臓癌細胞株結合能を示すことは自明なことである。特に、本発明の一実施例では５'末端の一部と３'末端の一部を切断した場合にも、膵臓癌細胞株に対する親和度を示すことを確認した。このような実験結果は、本発明に係るアプタマーにおいて一個乃至数個のヌクレオチドが追加、欠失または置き換えられて９０％以上１００％未満の配列に共通性があれば、本発明に係る核酸アプタマーと類似する膵臓癌細胞株結合能を示すことは自明であることを立証するものである。
【００２１】
一方、本発明の他の実施例においては、前記配列番号１乃至１５で表される核酸配列を含む１４番目のラウンドのアプタマープールの場合、膵臓癌細胞株以外他のヒト癌細胞株に対しては殆ど結合せず特異的に膵臓癌細胞株を検出することを確認した。特に、分離したアプタマーＳＱ１、ＳＱ２及びＳＱ６に対して、蛍光検出法を介して正常すい臓癌細胞株（ＨＰＥＤＥ）との対照実験を行うことによって、膵臓癌細胞株である、各々膵臓癌末期段階と初期段階を示す膵臓癌細胞株のＣａＰａｎ−１とＰａｎｃ−１を全て特異的に検出することを提示して、本発明に係るアプタマーが膵臓癌マーカーを検出して膵臓癌診断に有用に用いられることを確認した。特に、本発明に係るアプタマーがＰａｎｃ−１も検出できることは、本発明に係る核酸アプタマーが、膵臓癌の早期診断を可能にすることを意味する。また、本発明のまた他の実施例においては、本発明に係る核酸アプタマーが陽性選別過程において用いられた膵臓癌細胞株のみでなく、他の膵臓癌細胞株にも特異的に結合することが明らかになり、実際膵臓癌の診断に有用に利用される可能性があることを確認した。さらに、本発明の他の実施例においては、本発明に係る核酸アプタマーが膵臓癌以外他の癌細胞株は認識しないことを提示した。
【００２２】
従って、他の観点において、本発明は前記核酸アプタマーを含有する膵臓癌診断用組成物に関する。
【００２３】
本発明は、さらに他の観点において、前記核酸アプタマーを利用した膵臓癌の検出方法に関する。この時、前記方法は、前記核酸アプタマーとすい臓組織、すい臓細胞、血液、血清、血漿、唾液、喀痰及び尿の選択される試料と接触させる段階を含むことを特徴とする。前記試料は、ほ乳類、好ましくは人体から分離したものであって、最小侵襲で確保可能な試料または分泌体液、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養液成分試料等膵臓癌マーカーを含む試料であれば、前記に限定されないことは自明である。
【００２４】
前記核酸アプタマーを試料と接触させる場合、試料中に存在する膵臓癌マーカーと前記核酸アプタマーとの特異的な結合が起こる。従って、蛍光等で核酸アプタマーを標識して結合させた後、シグナルの存否を確認することによって、膵臓癌を検出できるようになる。
【００２５】
また、試料中前記核酸アプタマーと結合した物質の分析を介して、膵臓癌バイオマーカーを分離できるが、本発明は他の観点において、前記核酸アプタマーを利用した膵臓癌細胞特異的表面バイオマーカーの検出方法に関する。例えば、前記核酸アプタマーの末端にビオチンを付着し、膵臓癌細胞株の細胞膜抽出タンパク質試料と結合させた後、ストレプトアビジンが付着した磁性粒子を介して沈殿させた後に質量分析器（Mass spectrometry）を利用してアプタマーに特異的に結合する膵臓癌特異的表面バイオマーカーを探索することができる。
【００２６】
一方、前記膵臓癌細胞または組織に特異的に結合する核酸アプタマーは、ビーズ、粒子、ディップスティック（dipstick）、繊維、フィルター、膜及び硝子スライドのような通常の支持体及びシランまたはシリケート支持体等の固体支持体に固定され、検出センサーに提供されて、膵臓癌診断に利用されるが、本発明は、他の観点において、前記膵臓癌細胞または組織に特異的に結合する核酸アプタマーが固定されている膵臓癌診断用センサーに関する。
【００２７】
前記固体支持体は、少なくとも一つの実質的に固い表面を含むが、その表面上に前記核酸アプタマードが動けないように固定される。この時、前記核酸アプタマーは全ての通常の化学的カップリング方法によって固定化される。例えば、前記核酸アプタマーの末端にビオチンを結合させて複合体を形成し、前記チップ等の基板表面にストレプトアビジンを固定化させて、前記ビオチンと基板表面に固定化されたストレプトアビジンの相互作用によって前記核酸アプタマーを基板表面に固定化することができる。
【００２８】
一方、本発明に係る方法は、携帯性を高めるため、キット状で提供できる。即ち、本発明は、また他の観点において、前記膵臓癌細胞または組織に特異的に結合するアプタマーを含有する膵臓癌診断用キット（kit）に関する。この膵臓癌診断用キットは必要に応じて緩衝溶液及び検出と分析のための容器を含むことができる。この膵臓癌診断用キットは、瓶、筒（tub）、小さい袋（sachet）、封筒（envelope）、チューブ、アンプル（ampoule）等のような形態を有し、これらは部分的にまたは全体的にプラスチック、ガラス、紙、ホイル、ワックス等から形成してもよい。容器は、完全にまたは部分的に分離可能な栓を装着してもよく、この栓は最初から容器の一部であってもよく、または機械的に、接着により、またはその他の手段によって容器に付着できる。また、容器は、注射針によって内容物に接近できるストッパーを備えてもよい。前記キットは外部パッケージを含むことができ、外部パッケージは構成要素の使用に関する使用説明書を含んでもよい。
【００２９】
また、癌細胞株に特異的に結合するアプタマーが癌細胞株に結合されることによって、癌の機構を阻害して該当癌の治療に利用できることは、本発明が属する技術分野において公知の事実であり、本発明に係るアプタマーが膵臓癌細胞または組織に特異的に結合して、膵臓癌の機構を阻害し、これを含有する組成物が膵臓癌治療のための組成物として提供できることは、本発明が属する技術分野において当業者には自明なことである。また、アプタマーをリポソームまたはナノ粒子の表面に付着することによって、リポソームまたはナノ粒子内部に含まれる抗ガン剤、トキシン、癌成長阻害遺伝子、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）等を膵臓癌細胞に選択的に伝達できる。また、本発明に係るアプタマーに公知の膵臓癌特異的医薬、癌細胞の死滅を誘導するトキシン及び抗ガン剤、または単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、シトシンデアミナーゼ（cytosine deaminase、ＣＤ）等の公知の自殺遺伝子、または膵臓癌の成長及び転移に重要な役割を果たす遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡを直接付着して、膵臓癌細胞株に伝達できる。従って、本発明は、前記核酸アプタマーを含有する膵臓癌特異的薬品伝達組成物の形態で提供できる。（aptamer-siRNA conjugate: Silence. 2010 Feb 1;1(1):4. "Aptamer-targeted cell-specific RNA interference." Zhou J, Rossi JJ.; aptamer-toxin conjugate: Cancer Res. 2006 Jun 15;66(12):5989-92. "Aptamer:toxin conjugates that specifically target prostate tumor cells." Chu TC, Marks JW 3rd, Lavery LA, Faulkner S, Rosenblum MG, Ellington AD, Levy M.; aptamer-liposome: Chem Commun (Camb). 2010 Jan 14;46(2):249-51. Epub 2009 Nov 23. "A liposome-based nanostructure for aptamer directed delivery." Kang H, O'Donoghue MB, Liu H, Tan W.）
【００３０】
本発明の組成物におけるアプタマーは、これらの薬学的に許容可能な塩の形態で用いられてもよく、また単独で、または他の薬学的活性化合物との組み合わせで用いられてもよい。
本発明に係る医薬組成物は、各々通常の方法により剤形化できるが、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾール等の剤形、外用剤、座薬及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して用いられる。組成物に含まれる担体、賦形剤及び希釈剤としてはラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニールピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる。
【００３１】
製剤化する場合には、通常用いる充鎮剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤等の希釈剤または賦形剤を用いて調剤される。非経口投与のための製剤には滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステル等が用いられる。座薬の基剤としては、ウィテプゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン等が用いられる。
【００３２】
本発明の組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬品形態、投与経路及び期間により異なるが、当業者によって適宜選択される。本発明の組成物は、ラット、マウス、家畜、ヒト等のほ乳動物に多様な経路で投与でき、投与の全ての方式は予想され、例えば、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内、髄腔内または脳血管内の注射によって投与される。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当技術分野において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００３４】
《実施例１：膵臓癌細胞株に特異的に結合するアプタマーの分離》
１−１：ｓｓＲＮＡライブラリー及びＰＣＲ増幅とｃＤＮＡ合成のためのプライマーの準備
次の配列を持つランダムなｓｓＤＮＡライブラリーを化学的に合成して、ＰＡＧＥ（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｋｏｒｅａ）で分離した。
５’−ＡＴＡ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＴＡＴ  ＴＣＡ  ＡＴＴ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＡＧ  ＡＴＡ  ＧＴＡ  ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＡＴＣ  Ｔ−３’（配列番号１６）
【００３５】
初期プールは、７×１０１３分子を含んでいた。配列番号１７のＮ４０アップストリームプライマー（upstream primer）と配列番号１８のＮ４０ダウンストリームプライマー（downstream primer）がＰＣＲ増幅とｃＤＮＡ合成に用いられた。
アップストリームプライマー：５’−ＧＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴＡＣＣＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴ−３’（配列番号１７）
ダウンストリームプライマー：５’−ＡＧＡＴＴＧＣＡＣＴＴＡＣＴＡＴＣＴ−３’（配列番号１８）
【００３６】
増幅されたライブラリーをＤｕｒａｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Eqicentre）を利用してＲＮＡに変換した。この時、２’−Ｆ ＵＴＰと２’−Ｆ ＣＴＰを各々ＵＴＰ、ＣＴＰの代わりに用いることによって作製したＲＮＡは、ＵとＣが２’−ＯＨの代わりに２’−Ｆを持つようになり、これはＲＮＡ加水分解酵素に対する抵抗力を高めることによって生体応用が可能にするためである。
【００３７】
１−２：Ｐａｎｃ−１とＣａＰａｎ−１に特異的に結合するアプタマーの選別
図１に示したように、ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ−１（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）とＣａＰａｎ−１（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に対し、陽性選別を行うが、各選別ラウンド毎に細胞株を変更して行った。
【００３８】
即ち、前記実施例１−２のＮ４０ ＲＮＡライブラリーを９５℃で５分間結合緩衝溶液（４．５ｇ／Ｌグルコース、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡ、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むダルベッコＰＢＳ）で変成させた（denaturing）後、氷上で急冷させた。次に、単層で育てた５×１０６細胞株（Ｐａｎｃ−１またはＣａＰａｎ−１に対し交互に行う）に前記ライブラリー５００ｎＭを４℃で３０分間処理した後、非結合の配列は、洗浄用緩衝溶液（４．５ｇ／Ｌグルコース、５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むダルベッコＰＢＳ）で各５分間２回の連続洗浄を介して分画した。その後、洗浄用緩衝溶液を用いて前記細胞を回収した後、９５℃で５分間加熱することによって細胞表面に結合された配列を溶出させて、ＰＣＩ抽出（phenol: chloroform: isoamyl alcohol extraction；Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）で分離した。得られたＲＮＡは、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ（商品名） Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を利用して逆転写し、ＰＣＲ増幅した。分離したＰＣＲ産物は、Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｂｉｏｎ，ＵＳＡ）を利用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行った。
【００３９】
前記陽性選別過程を１０回行った後、２回の中間陰性選別過程を正常すい臓細胞株であるＨＰＥＤＥ（Ｏｎｔａｒｉｏ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｒｏｎｔｏ）に対し行った。この時、図１のように陽性選別過程を共に交互に行い、結果的に陽性選別過程は全１４回行われ、陰性選別過程は全２回行われた。
【００４０】
高い親和度と特異性を持つアプタマーの選別のため、各ラウンドに用いられる細胞株の数は、段々減らして１×１０６まで減少させ、洗浄の持続時間は、段々増加させて１５分まで増加させ、結果的に、緩衝溶液内の酵母ｔＲＮＡの濃度は２倍になるようにした。
【００４１】
結合アプタマーに対する濃縮は、リアルタイム定量ＰＣＲ（real-time qPCR）を利用して定量化されたが、１４番目ラウンドでこのような濃縮は飽和状態に達したため、１４番目選別の産物をＴＡベクター（ＲＢＣ，Ｋｏｒｅａ）を利用してクローニングした。製造された５０個のクローンは、Ｍｕｌｔｉａｌｉｇｈｎソフトウェア（http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html）を利用して配列分析し、クローン上での共通する配列を分析した。その結果、図２のように５０個のクローンで次の１５種の配列を取得され、これから得た本発明に係るＲＮＡアプタマー配列は次の通りである。
ＳＱ１：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＵＵＡＧ  ＣＧＧＵＡＵＣＡＣＧ  ＡＵＵＡＣＵＵＡＣＣ  ＵＵＣＧＵＵＧＣＵＧ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号１）
ＳＱ２：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＡＡＡＧ  ＣＵＡＵＣＧＣＣＣＡ  ＡＵＵＣＧＣＡＧＵＧ  ＡＵＡＵＣＣＵＵＵＡ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号２）
ＳＱ３：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＡＡＡＣ  ＣＵＧＧＵＣＵＣＵＣ  ＵＧＵＣＡＧＣＡＡＡ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号３）
ＳＱ４：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＧＵＡＧ  ＣＵＧＧＧＵＣＣＧＵ  ＣＣＣＣＡＣＡＣＡＵ  ＵＡＣＣＡＵＵＵＧＵ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号４）
ＳＱ５：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＡＡＡＣ  ＵＧＧＵＧＵＡＣＣＵ  ＣＵＵＵＧＣＣＣＵＡ  ＵＣＵＵＡＵＣＵＧＧ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号５）
ＳＱ６：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＡＧＡＣ  ＵＧＧＡＵＡＵＡＣＵ  ＣＵＵＡＡＧＣＡＵＵ  ＵＣＵＡＵＡＡＵＣＧ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３'（配列番号６）
ＳＱ７：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＡＡＣＵ  ＧＣＵＧＣＡＵＣＧＵ  ＣＵＣＣＣＡＣＧＵＡ  ＵＵＡＣＡＣＡＵＧＡ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号７）
ＳＱ８：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＡＡＡＧ  ＵＵＧＡＡＣＵＣＣＡ  ＡＡＵＡＣＧＣＧＣＵ  Ｇ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号８）
Ｓ４９：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＡＡＡＧ  ＵＧＧＣＣＵＣＣＣＵ  ＡＣＡＡＡＧＡＡＣＵ  ＵＡＵＡＵＣＡＵＣＣ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号９）
Ｓ２０：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＡＡＡＧ  ＵＵＵＡＵＣＣＣＣＣ  ＵＵＵＵＡＧＣＧＵＵ  ＵＡＣＣＡＵＡＡＵＧ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号１０）
Ｓ５９：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＡＣＣＵＧＡＡＡＡＣ  ＵＧＧＵＵＵＣＣＧＧ  ＣＡＵＣＣＣＧＵＡＵ  ＵＧＣＧＧＣＵＵＵＡ  Ｃ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号１１）
Ｓ１１：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＧＣＣＵＧＡＡＧＡＧ  ＣＧＡＡＧＵＡＡＡＵ  ＣＵＣＵＣＡＣＵＧＣ  ＧＵＣＡＣＵＡＣＡ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３'（配列番号１２）
Ｓ５２：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＡＣＣＵＧＡＧＵＡＧ  ＣＧＵＵＵＣＣＣＧＧ  ＣＡＵＵＡＵＡＣＵＡ  ＵＡＡＡＣＵＵ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号１３）
Ｓ６８：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＣＣＵＧＡＡＡＧＵＵ  ＵＧＧＡＵＡＵＣＵＵ  ＧＧＣＧＣＵＵＧＡＣ  ＵＡＧＡＡＡＡＣＵＵ  ＧＡＡＡＵＵＵＧＵ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３’（配列番号１４）
Ｓ３：５’−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵ  ＣＵＵＡＵＧＵＵＣＡ  ＵＧＣＣＡＧＣＧＣＡ  ＡＵＵＧＣＣ  ＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３'（配列番号１５）
【００４２】
前記で各アプタマーの５'末端と３'末端のアンダーライン部分は実施例１−１の配列番号１６に示すように、ＰＣＲ増幅とｃＤＮＡ合成のために導入された部分で配列番号１乃至１５の核酸配列は、共通してこれらの部分を含む。また、配列番号１乃至１４の核酸配列は、共通してＣＣＵＧＡ配列を持つことが確認され、このうちＳＱ２（配列番号２）、ＳＱ３（配列番号３）、ＳＱ５（配列番号５）、ＳＱ８（配列番号８）、Ｓ４９（配列番号９）及びＳ２０（配列番号１０）の核酸アプタマーは、特にＧＣＣＵＧＡＡＡＡの共通して保存される配列を持つことが明らかになった。
【００４３】
即ち、本発明に係るアプタマーで５'側の配列が特に保存されていることを確認でき、特に配列番号１乃至１３のアプタマーの場合、ＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵＲＣＣＵＧＡＲＤＭＢＢＢ（ＲはＧまたはＡ、ＤはＡ、ＵまたはＧ、ＭはＡまたはＣ、ＢはＧ、ＣまたはＵである；配列番号３５）のような保存された配列を持つことを確認した。
【００４４】
《実施例２：Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸを行ったアプタマープールの膵臓癌細胞株に対する検出活性測定》
２−１：リアルタイムＰＣＲ法を利用した膵臓癌細胞株に対する結合親和度測定
定量的なＲＴ−ＰＣＲ法を利用して、ＳＥＬＥＸ法を行う前の初期ｓｓＲＮＡプール（pool）、各５番目、１０番目及び１４番目選別ラウンドから分離して取得した溶出物に対し結合親和度を測定した。
【００４５】
即ち、前記初期ライブラリー及び各ラウンドのＲＮＡプールの１００ｎＭを１×１０６のＣａＰａｎ−１細胞株及びＰａｎｃ−１細胞株に対し各々処理した。この時、対照群として正常なヒトすい臓細胞株のＨＰＥＤＥ細胞株を利用した。
【００４６】
結合前（in-put）アプタマープールと結合後（out-put）アプタマープール共にｃＤＮＡ合成のための鋳型として用いられたが、各ラウンドの希釈されたｃＤＮＡは、Ｓｔｅｐ−Ｏｎｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｍａｃｈｉｎｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して、製造者のプロトコルにより定量リアルタイムＰＣＲによって分析して、インプットに対するアウトプット信号の比を計算した。この時、前記ＰＣＲに用いられたプライマーは、前記配列番号１７及び配列番号１８のプライマーと同一である。
【００４７】
その結果、図３に示したように、出発物質であるＮ４０ライブラリーからＳＥＬＥＸ選別ラウンドを経ることによって、各ラウンドから取得されたアプタマープールが濃縮されて、結合されるＲＮＡの％が増加することを確認することができた。それに対して、正常すい臓管細胞株（ＨＰＥＤＥ）の場合、陰性選別過程を経た後には、結合率が減少することを確認することができた。
【００４８】
即ち、本発明に係るＣｅｌｌ−ＳＥＬＥＸプロセスを経ることによって、正常すい臓細胞株は認識せず、癌が誘発された膵臓癌細胞株のみを特異的に認識するアプタマープールに濃縮されることを確認することができた。
【００４９】
２−２：蛍光検出を利用した膵臓癌細胞株に対する結合親和度測定
蛍光検出を介して結合親和度を測定するため、５'ＴＭＡＲＡ標識されたダウンストリームプライマーを利用した。ＴＭＡＲＡ−標識された３'プライマーでは、５’−ＴＡＭＲＡ−ＡＧＡＴＴＧＣＡＣＴＴＡＣＴＡＴＣＴ−３’（配列番号１９）を利用した。
【００５０】
まず、接合（annealing）緩衝溶液（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮＨ４Ａｃ）上のＴＭＡＲＡ標識されたプライマーを初期ＲＮＡライブラリーと１４番目ラウンドのアプタマープールと各々同じ濃度で混合した後、熱変成に従って段々冷却させる過程を経て、３７℃で２０分間静置（incubation）する過程を経ながら、接合させた。ペトリ皿の底で育った細胞株を前記１μＭの標識されたアプタマープールと結合緩衝溶液（４．５ｇ／Ｌグルコース、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡ、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むダルベッコＰＢＳ）上で、２０分間３７℃で培養した後、洗浄緩衝溶液（４．５ｇ／Ｌグルコース、５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むダルベッコＰＢＳ）で素早く２回洗浄した後、蛍光顕微鏡（fluorescence microscope：Ｏｌｙｍｐｕｓ）で蛍光を４００×倍率で検出した。
【００５１】
その結果、図４に示したように、前記実施例２−１の結果と類似して、Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸプロセスを経ることによって正常すい臓細胞株は認識せず、癌が誘発された膵臓癌細胞株のみを特異的に認識するアプタマープールに濃縮されることを確認することができた。
【００５２】
２−３：他の癌細胞株に対する結合親和度測定
本発明で最終的に得た１４番目ラウンドを行ったアプタマープールの他のヒト癌細胞株に対する結合親和度を確認するため、膵臓癌細胞株であるＣａＰａｎ−１と共にＨｅｌａ（子宮頸部癌、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｔ９８Ｇ（膠芽腫、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＭＤＡＭＢ−２３１（乳癌、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）及びＨｕｈ７（肝癌、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に対し、前記実施例２−１と同様の方法で定量的なＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００５３】
その結果、図５に示したように、１４番目ラウンドを行ったアプタマープールの場合、他の癌細胞株にはほとんど結合しないが、特異的に膵臓癌細胞株を検出することを確認することができた。
【００５４】
《実施例３：分離した各アプタマーの膵臓癌細胞株に対する検出活性測定》
３−１：リアルタイムＰＣＲ法を利用した膵臓癌細胞株に対する結合親和度測定
実施例１で取得したアプタマーの膵臓癌細胞株に対する検出活性を測定するため、ＣａＰａｎ−１細胞株及びＰａｎｃ−１細胞株に対し前記実施例３−１と同じ方法で定量的なＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００５５】
その結果、図６に示したように、膵臓癌細胞株であるＣａＰａｎ−１とｐａｎｃ−１に対する検出活性を確認することができた。特に、分離したアプタマー中配列番号２のＳＱ２及び配列番号６のＳＱ６の場合、前記二つの細胞株共に非常に高い親和度を示すことを確認することができた。
【００５６】
３−２：平衡ろ過法による膵臓癌細胞株に対する解離常数（Ｋｄ）の測定
前記ＳＱ２、ＳＱ４、ＳＱ６及びＳＱ８アプタマー及び高いコピー数を示したＳＱ１アプタマーに対し、結合アッセイを平衡ろ過法によって行った。即ち、１ｎＭ乃至１μＭ濃度範囲で各アプタマーを０．５×１０６のＰａｎ１細胞株及びＣａＰａｎ−１細胞株と培養した後、結合反応を前記実施例１同様に行い、結合された個体数を前記実施例２−１の定量的なＲＴ−ＰＣＲを利用し定量した。
【００５７】
解離常数を算出するため、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ １０．０ソフトウェアを利用して、次の平衡式に結合された膵臓癌細胞株対ｓｓＲＮＡ濃度のパーセント（％）をプロット化して、データポイントを非成形回帰分析によって固定した。
ｙ＝（Ｂｍａｘ・ｓｓＲＮＡ）／（Ｋｄ＋ｓｓＲＮＡ）
この時、ｙは飽和度（saturation）の程度であり、Ｂｍａｘは最大結合ポイントの数であり、Ｋｄは解離（dissociation）常数である。
【００５８】
その結果、図７（ＣａＰａｎ−１）及び図８（Ｐａｎｃ−１）に示したように、膵臓癌細胞株に対し強い結合力を示すことを確認することができたが、特に配列番号２のＳＱ２の場合、実験を行ったアプタマーのうち最も強い親和度を持つことが明らかになった。
【００５９】
３−３：蛍光検出を利用した膵臓癌細胞株に対する結合親和度測定
それと共に、前記ＳＱ２及びＳＱ６アプタマー及び高いコピー数を示したＳＱ１アプタマーの膵臓癌細胞株に対する結合親和度を確認するため、前記実施例２−２と同じ方法で５’ＴＭＡＲＡ標識されたダウンストリームプライマーを利用した蛍光検出を行った。
【００６０】
その結果、図９乃至１１に示したように、ＳＱ１（図９）、ＳＱ２（図１０）及びＳＱ６（図１１）の３個のアプタマー共に正常細胞株であるＨＰＥＤＥではシグナルが確認されなかったが、膵臓癌細胞株であるＣａＰａｎ−１とＰａｎｃ−１の場合、シグナルが確認されることを確認することができた。そこで、本発明に係るアプタマーが膵臓癌細胞株を特異的に検出できるため、膵臓癌細胞株の診断用組成物として有用に用いられることが分かった。特に、初期段階を示す膵臓癌細胞株のＰａｎｃ−１も検出できることが明らかになり、膵臓癌の早期診断に利用される可能性があることを確認した。
【００６１】
《実施例４：分離した各アプタマーの種々の膵臓癌細胞株に対する検出活性測定（１）》
前記ＳＱ２、ＳＱ４及びＳＱ８アプタマーが、Ｐａｎｃ−１及びＣａＰａｎ−１の膵臓癌細胞株以外に他の膵臓癌細胞株も特異的に検出できるか否かを確認するため、さらにＢｘｐｃ−３、Ａｓｐｃ−１、Ｍｉａｃａｐａ−１及びＨａｐａｆ−２の膵臓癌細胞株に対し前記実施例２−２と同じ方法で５'ＴＭＡＲＡ標識されたダウンストリームプライマーを利用した蛍光検出を行った。
【００６２】
その結果、図１２乃至１７に示したように、陽性選別過程において用いられた膵臓癌細胞株であるＣａＰａｎ−１（図１２）とＰａｎ−１（図１３）細胞株のみでなく、他の膵臓癌細胞株のＡｓｐｃ−１（図１４）、Ｂｘｐｃ−３（図１５）、Ｈａｐａｆ−ＩＩ（図１６）及びＭｉａｃａｐａ−２（図１７）に対してもシグナルを確認することができた。即ち、本発明に係るアプタマーが陽性選別過程において用いられた一部の膵臓癌細胞株のみでなく、他の膵臓癌細胞株も共通して検出するのに用いられることが明らかになり、このような検出過程によって膵臓癌診断に有用に用いられることが明らかになった。
【００６３】
《実施例５：分離した各アプタマーの膵臓癌細胞株に対する検出活性測定（２）》
５−１：蛍光検出を利用した膵臓癌細胞株に対する結合親和度測定
蛍光検出を介して結合親和度を測定するため、前記配列番号１９の５'ＴＭＡＲＡ標識されたダウンストリームプライマーを利用した。
【００６４】
まず、接合緩衝溶液（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮＨ４Ａｃ）上のＴＭＡＲＡ標識されたプライマーをＳＱ１乃至ＳＱ８アプタマーと各々同じ濃度で混合した後、熱変成後に順次冷却させる過程を経て、３７℃で２０分間静置過程を経ながら、接合させた。ペトリ皿で育った細胞株ＣａＰａｎ−１またはＰａｎｃ１を前記１００ｎＭの３−ＴＡＭＲＡ標識されたアプタマーと結合緩衝溶液（４．５ｇ／Ｌグルコース、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡ、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むダルベッコＰＢＳ）上で、２０分間３７℃で培養した後、洗浄緩衝溶液（４．５ｇ／Ｌグルコース、５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むダルベッコＰＢＳ）で素早く２度洗浄した後、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で蛍光を４００×倍率で検出した。
【００６５】
その結果、図１８及び図１９に示したように、アプタマーＳＱ１乃至ＳＱ８共に膵臓癌細胞株ＣａＰａｎ−１及びＰａｎｃ１に対し結合親和力があると確認され、特にＳＱ２の結合親和度が最も高いと確認された。
【００６６】
５−２：リアルタイムＰＣＲ法を利用した膵臓癌細胞株に対する結合親和度測定
それと共に、ＳＱ１乃至ＳＱ８アプタマーの膵臓癌細胞株に対する結合親和度を測定するため、実施例３−２と同じ方法で結合アッセイを平衡ろ過法によって行って解離常数を算出した。
【００６７】
【表１】
0005603933.tif 000002
【００６８】
その結果、表１に示したように、実施例５−１と同様にアプタマーＳＱ１乃至ＳＱ８共に結合親和度を示し、特に、ＳＱ１、ＳＱ２、ＳＱ４、ＳＱ６及びＳＱ８が膵臓癌細胞株Ｐａｎ−１及びＣａＰａｎ−１共に高い親和度を示すことを確認することができた。
【００６９】
《実施例６：アプタマー変形体に対する結合親和度測定》
蛍光検出時に、最も親和度が高いことが明らかになったＳＱ２アプタマーの長さを下記のように変化させた後、膵臓癌細胞株であるＣａＰａｎ−１に対する結合親和度を測定した。
【００７０】
ＳＱ２ ｄｏｗｎ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ（配列番号３６）は、ＳＱ２アプタマーの３'末端の１８ｎｔｓを切断したものであり、ＳＱ２ ｕｐ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ（配列番号３７）は、ＳＱ２アプタマーの５'末端を１８ｎｔｓ切断したものであり、ＳＱ２ ６−５８（配列番号３８）はＳＱ２アプタマーの３'末端の１８ｎｔｓと５'末端の５ｎｔｓを切断したものであり、ＳＱ２ ６−５０（配列番号３９）は、ＳＱ２アプタマーの３'末端の２６ｎｔｓと５'末端の５ｎｔｓを切断したものであり、ＳＱ２ １−５０（配列番号４０）は、ＳＱ２アプタマーの３'末端の２６ｎｔｓを切断したものであり、ＳＱ２ ６−３０（配列番号４１）は、ＳＱ２アプタマーの３'末端の５１ｎｔｓと５'末端の５ｎｔｓを切断したものである。
ＳＱ２  ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ（配列番号２）：
５'−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵＧＣＣＵＧＡＡＡＡＧＣＵＡＵＣＧＣＣＣＡＡＵＵＣＧＣＡＧＵＧＡＵＡＵＣＣＵＵＵＡＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３'（７６ｎｔｓ）
ＳＱ２  ｄｏｗｎ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ（配列番号３６）：
５'−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵＧＣＣＵＧＡＡＡＡＧＣＵＡＵＣＧＣＣＣＡＡＵＵＣＧＣＡＧＵＧＡＵＡＵＣＣＵＵＵＡ−３'（５８ｎｔｓ）
ＳＱ２  ｕｐ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ（配列番号３７）：
５'−ＧＣＣＵＧＡＡＡＡＧＣＵＡＵＣＧＣＣＣＡＡＵＵＣＧＣＡＧＵＧＡＵＡＵＣＣＵＵＵＡＡＧＡＵＡＧＵＡＡＧＵＧＣＡＡＵＣＵ−３'（５８ｎｔｓ）
ＳＱ２  ６−５８（配列番号３８）：
５'−ＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵＧＣＣＵＧＡＡＡＡＧＣＵＡＵＣＧＣＣＣＡＡＵＵＣＧＣＡＧＵＧＡＵＡＵＣＣＵＵＵＡ−３'（５３ｎｔｓ）
ＳＱ２  ６−５０（配列番号３９）：
５'−ＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵＧＣＣＵＧＡＡＡＡＧＣＵＡＵＣＧＣＣＣＡＡＵＵＣＧＣＡＧＵＧＡＵ−３'（４５ｎｔｓ）
ＳＱ２  １−５０（配列番号４０）：
５'−ＡＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵＧＣＣＵＧＡＡＡＡＧＣＵＡＵＣＧＣＣＣＡＡＵＵＣＧＣＡＧＵＧＡＵ−３'（５０ｎｔｓ）
ＳＱ２  ６−３０（配列番号４１）：
５'−ＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵＧＣＣＵＧＡＡＡＡＧＣＵ−３'（２５ｎｔｓ）
【００７１】
この時、ＳＱ２アプタマーは、Ｔ７プロモーターに対する結合部位を持っており、２−Ｆにより変形されて、前記の通り長さが短くなったアプタマーを得るため、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ Ｔ７転写キット（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を利用して、これらとＴ７プロモーターとのアニール及びｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行った。その次に、前記実施例３−２と同じ方法でＣａＰａｎ−１に対する結合親和度を測定した後、ＳＱ２アプタマーの結合親和度と比較した。
【００７２】
その結果、図２０に示したように、ＳＱ２アプタマーの配列を一部切断した場合にも依然として膵臓癌細胞株に対する親和性を持ち、特にＳＱ２アプタマーの３'末端を切断したＳＱ２ ｄｏｗｎ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ（配列番号３６）はむしろＳＱ２アプタマーより結合親和度が高いことが示された。また、ＳＱ２アプタマーの５'側末端を切断しないか、５ｎｔｓ程度だけ切断した場合、ＳＱ２アプタマーとほぼ同じか、より高い結合親和度を示した。しかし、それに対して、ＳＱ２アプタマーの５'末端を１８ｎｔｓ切断したＳＱ２ ｕｐ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ（配列番号３７）の場合、膵臓癌細胞株ＣａＰａｎ−１に対する結合親和度が相対的に低くなることが示された。それと共に、前記実験結果は、ＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵＧＣＣＵＧＡＡＡＡＧＣＵ（配列番号４１）の２５ｎｔｓの短い配列だけでも、膵臓癌細胞株に対して高い結合親和度を示すことを提示する。
【００７３】
追加的に、図２１に示したように、ＳＱ２ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ（配列番号２）の２次構造（図２１Ａ）とＳＱ２ ６−３０（配列番号４１）の２次構造（図２１Ｂ）を比較すると、ＳＱ２アプタマーの２次構造でステム（stem）１、２及びループ３部分が重要な役割を果たすことが分かる。本構造は、ＲＮＡ ｄｒａｗ １．１ソフトを利用して予測したものであり、２Ｄラジカル構造及び自由エネルギーは、４℃及び３７℃で計算され、配列の５'末端は同心円で表示した。
【００７４】
このような結果は、本発明に係るアプタマーで５'側の保存された配列が重要であることを意味する。本発明で分離した配列番号１乃至１５のアプタマーは、５'末端で保存された配列を持ち、特に配列番号１乃至１３のアプタマーの場合、ＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵＵＲＣＣＵＧＡＲＤＭＢＢＢ（ＲはＧまたはＡ、ＤはＡ、ＵまたはＧ、ＭはＡまたはＣ、ＢはＧ、ＣまたはＵである；配列番号３５）のような保存された配列を持つ。
【００７５】
従って、本発明の配列番号３５で表される核酸配列からなる群から選択されたいずれか一つの核酸配列を含むアプタマーは、膵臓癌細胞または組織に特異的に結合できることが分かる。
【００７６】
《実施例７：Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ａｐｔａｍｅｒの膵臓癌細胞株及びその他癌細胞株に対する検出活性測定》
７−１：蛍光検出を利用した膵臓癌細胞株に対する蛍光活性測定
追加的に、前記２５ｎｔｓの長さに過ぎないが、膵臓癌細胞株に対する結合親和度が優れていることが示されたＳＱ２ ６−３０（配列番号４１）の膵臓癌細胞株ＣａＰａｎ−１、Ｐａｎｃ−１及びＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ）に対する結合親和度を確認するため、前記実施例２−２と同じ方法で５'ＴＭＡＲＡ標識されたダウンストリームプライマーを利用した蛍光検出を行った。
【００７７】
その結果、図２２に示したように、ＳＱ２ ６−３０（配列番号４１）アプタマーは、正常細胞株であるＨＰＥＤＥではシグナルが確認されないが、膵臓癌細胞株であるＣａＰａｎ−１、Ｐａｎｃ−１の場合、シグナルを確認することができた。
【００７８】
従って、一部配列を切断したアプタマーも膵臓癌細胞株を特異的に検出でき、そこで膵臓癌細胞株の診断用組成物として有用に用いられることが分かった。特に、初期膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ−１も検出できることが示され、早期膵臓癌の診断に利用される可能性があることが確認された。
【００７９】
７−２：蛍光検出を利用したその他癌細胞株に対する蛍光活性測定
さらに、本発明に係るアプタマーが膵臓癌のみを特異的に検出できるのか確認するため、他の癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ−３（Ｈｕｍａｎ Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ、ＡＴＣＣ）、ＬｎＣａｐ（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｓｔｒａｔｅ ｃａｎｃｅｒ、ＡＴＣＣ）、Ｈｅｐ Ｇ２（Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＡＴＣＣ）、Ｈｅｌａ（ＡＴＣＣ）、Ａ５４９（Ｈｕｍａｎ Ｌｕｎｇ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＡＴＣＣ）、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、ＡＴＣＣ）、Ｔ９８Ｇ（ＡＴＣＣ）及びＢｅｎｄ−３（Ｍｏｕｓｅ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ、ＡＴＣＣ）細胞株に対し、前記実施例２−２と同じ方法で５'ＴＭＡＲＡ標識されたダウンストリームプライマーを利用した蛍光検出を行った。
【００８０】
【表２】
0005603933.tif 000003
【００８１】
その結果、図２３、２４及び表２に示したように、ＳＱ２ ６−３０（配列番号４１）は、膵臓癌細胞株ではない他の癌細胞株は認識できないことが示された。従って、本発明に係るアプタマーは、特異的に膵臓癌診断及び治療に利用される可能性があることを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
以上説明したように、本発明に係る核酸アプタマーは、正常すい臓組織には結合せず、膵臓癌細胞または組織にのみ特異的に結合して、膵臓癌診断及び治療用組成物として有用に用いられる。さらに、本発明に係る核酸アプタマーは、後期膵臓癌細胞株であるＣａＰａｎ−１だけでなく、初期膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ−１も検出できるため、早期膵臓癌診断に利用でき、膵臓癌患者の生存率を高めるのに寄与できる。
【００８３】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
0005603933.tif 000004
【図２】
0005603933.tif 000005
【図３】
0005603933.tif 000006
【図４】
0005603933.tif 000007
【図５】
0005603933.tif 000008
【図６】
0005603933.tif 000009
【図７】
0005603933.tif 000010
【図８】
0005603933.tif 000011
【図９】
0005603933.tif 000012
【図１０】
0005603933.tif 000013
【図１１】
0005603933.tif 000014
【図１２】
0005603933.tif 000015
【図１３】
0005603933.tif 000016
【図１４】
0005603933.tif 000017
【図１５】
0005603933.tif 000018
【図１６】
0005603933.tif 000019
【図１７】
0005603933.tif 000020
【図１８】
0005603933.tif 000021
【図１９】
0005603933.tif 000022
【図２０】
0005603933.tif 000023
【図２１】
0005603933.tif 000024
【図２２】
0005603933.tif 000025
【図２３】
0005603933.tif 000026
【図２４】
0005603933.tif 000027
【配列表】
0005603933000001.app