(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を染色体上に本来有するラルストニア属微生物であって、かつ該ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の少なくとも一部が、アエロモナス・キャビエ由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素又はその変異体をコードする遺伝子に置換され、
本来の染色体上のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子のコードする酵素活性が無くなり、かつアエロモナス・キャビエ由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子が発現されている、
３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシトリデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシペンタデカン酸及び３−ヒドロキシヘキサデカン酸からなる群より選択されるモノマーユニットの２種以上から構成される共重合ポリエステルを生産するラルストニア属微生物。
【請求項２】
共重合ポリエステルが３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸のモノマーユニットで構成されることを特徴とする、請求項１に記載のラルストニア属微生物。
【請求項３】
ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を染色体上に本来有する微生物がラルストニア・ユートロファであることを特徴とする、請求項１または２に記載のラルストニア属微生物。
【請求項４】
ラルストニア・ユートロファがラルストニア・ユートロファＨ１６株であることを特徴とする、請求項３に記載のラルストニア属微生物。
【請求項５】
変異体が、以下の（ａ）、（ｂ）いずれかのアミノ酸置換を少なくとも一つ以上行ったものである、請求項１に記載のラルストニア属微生物。
（ａ）１４９番目のアミノ酸のアスパラギンをセリンに置換
（ｂ）１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸をグリシンに置換
【請求項６】
外因性のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子が、１４９番目のアミノ酸のアスパラギンをセリンに置換し、かつ１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸をグリシンに置換した、配列番号９のアミノ酸配列で示されるアエロモナス・キャビエ由来の変異体酵素をコードするものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のラルストニア属微生物。
【請求項７】
本来の染色体上のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の開始コドンから終始コドンまでが、アエロモナス・キャビエ由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の開始コドンから終始コドンに置換されている、請求項１に記載のラルストニア属微生物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラルストニア属微生物を用いたポリエステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生分解性ポリエステルであるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の商業的生産に有用な、改良された微生物株と、それを利用するＰＨＡの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカン酸は、広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機分子ポリマーである。これらのポリマーは生分解性を有し、熱可塑性高分子であること、また、再生可能資源から産生されることから、環境調和型素材または生体適合型素材として工業的に生産し、多様な産業へ利用する試みが行われている。【０００３】
このポリエステルを構成するモノマーは、一般名３−ヒドロキシアルカン酸であって、具体的には３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、あるいはよりアルキル鎖の長い３−ヒドロキシアルカン酸が単重合もしくは共重合することにより、ポリマー分子が形成されている。３−ヒドロキシ酪酸（以下３ＨＢと略す）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と略す）は、１９２５年にバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）で最初に発見されたが、このＰ（３ＨＢ）は結晶性が高いため、硬くて脆い性質を持っており、実用的には応用範囲が限られている。この為、この性質の改良を目的とした研究がなされてきた。【０００４】
その中で、３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）とからなる共重合体（以下Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）と略す）の製造方法が開示されている（例えば、特許文献１、特許文献２参照）。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）はＰ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むため、幅広い用途に応用できると考えられた。しかしながら、実際にはＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）は３ＨＶモル分率を増加させても、それに伴う物性の変化が乏しく、特に柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取っ手等、硬質成型体の分野にしか利用されなかった。【０００５】
また、アルキル鎖の炭素数が６から１６の３−ヒドロキシアルカン酸で構成される中鎖ＰＨＡは、Ｐ（３ＨＢ）やＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）よりも結晶性が低く、弾力に富むことが知られており（非特許文献１参照）、異なる分野への用途が期待されている。中鎖ＰＨＡの製造研究は、シュードモナス属のＰＨＡ合成酵素遺伝子を、シュードモナス属、ラルストニア属、大腸菌に導入することによって行われてきたが、いずれも生産性が低く工業生産に適したものではなかった（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４参照）。【０００６】
近年、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと略す）との２成分共重合ポリエステル（以下Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と略す）およびその製造方法について研究がなされた（特許文献３、特許文献４参照）。これら報告のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の製造方法は、土壌より単離されたアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）を用いてオレイン酸等の脂肪酸やオリーブオイル等の油脂から発酵生産するものであった。また、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の性質に関する研究もなされている（非特許文献５参照）。この報告では、炭素数が１２個以上の脂肪酸を唯一の炭素源としてアエロモナス・キャビエを培養し、３ＨＨ組成が１１〜１９ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を発酵生産している。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨ組成の増加にしたがって、Ｐ（３ＨＢ）の硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）を上回る柔軟性を示すことが明らかにされた。すなわちＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨ組成を変えることで、硬質ポリエステルから軟質ポリエステルまで応用可能な幅広い物性を持つため、テレビの筐体等のように硬さを要求されるものからフィルム等のように柔軟性を要求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できる。しかしながら、本製造方法では菌体生産量４ｇ／Ｌ、ポリエステル含量３０％とポリエステル生産性は低いものであり、本ポリエステルの実用化に向けた生産方法としては未だ不十分と言わざるを得なかったため、実用化に向けて更に高い生産性が得られる方法が探索された。【０００７】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の工業生産を目指した取組みもなされている。アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）を用いた培養では、オレイン酸を炭素源とした４３時間の流加培養において、菌体生産量９５．７ｇ／Ｌ、ポリエステル含量４５．２％、３ＨＨ組成１７％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が生産された（非特許文献６参照）。また、アエロモナス・ハイドロフィラを、炭素源としてグルコース及びラウリン酸を用いて培養し、菌体生産量５０ｇ／Ｌ、ポリエステル含量５０％を達成した（非特許文献７参照）。しかしながら、アエロモナス・ハイドロフィラはヒトに対して病原性を有する（非特許文献８参照）ことから、工業生産に適した種とはいえない。また、これらの培養生産では高価な炭素源を使用するため、製造コストの観点より安価な炭素源の利用も求められている。【０００８】
このため、安全な宿主での生産及び生産性の向上を目指した取組みが行なわれた。アエロモナス・キャビエよりポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子がクローニングされた（特許文献５、非特許文献９参照）。本遺伝子をラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、旧アルカリゲネス・ユートロファス）に導入した形質転換体を用いてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産を行った結果、菌体生産性は４ｇ／Ｌ、ポリエステル含量は３０％であった。更に本形質転換体を炭素源として植物油脂を用いて培養した結果、菌体生産量４ｇ／Ｌ、ポリエステル含量８０％が達成された（非特許文献１０参照）。更に培養条件の改善により、菌体生産量４５ｇ／Ｌ、ポリエステル含量６２．５％、３ＨＨ組成８．１％にまで向上したように、培養方法に関する研究もなされた（特許文献６参照）。【０００９】
また、フラクトースを炭素源としてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産できるラルストニア・ユートロファも構築されたが、本菌株のポリエステル生産性は低く、実生産に適しているとはいえなかった（非特許文献１１参照）。
大腸菌を宿主としたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産株も構築された。アエロモナス属のＰＨＡ合成酵素遺伝子及びラルストニア・ユートロファのＮＡＤＰ−アセトアセチルＣｏ―Ａ還元酵素遺伝子等を大腸菌に導入した株が構築された。ドデカンを炭素源として同大腸菌を培養した結果、４０．８時間培養で菌体量７９ｇ／Ｌ、ポリエステル含量２７．２％、３ＨＨ組成１０．８％という生産性であった（非特許文献１２参照）。【００１０】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産性向上並びに３ＨＨ組成制御を目指して、ＰＨＡ合成酵素の人為的な改変が行なわれた。アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素変異体のなかで、１４９番目のアミノ酸のアスパラギンがセリンに置換された変異体酵素や、１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異体酵素は、大腸菌内でのＰＨＡ合成酵素活性や３ＨＨ組成が向上していることが示された（非特許文献１３参照）。また、同酵素の５１８番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換された変異体酵素や２１４番目のバリンがグリシンに置換された変異体酵素は、大腸菌でのＰＨＡ合成酵素活性やポリエステル含量が向上したことが報告されている（非特許文献１４参照）。しかし、これらは宿主として特殊な大腸菌を用いており未だポリエステル含量は低いことから、これらの変異体酵素の特徴を活かした工業的生産に向けた更なる改良が必要であった。【００１１】
組換えＤＮＡ技術を応用して作製された菌株を用いて、ＰＨＡを工業的規模で培養する際に最も重要な課題の一つは、導入した遺伝子の安定性である。遺伝子の導入にはプラスミドを用いる方法や宿主染色体へ組み込む方法などが利用されている。しかしながら、プラスミドは組換え菌が増殖、分裂する際に脱落することが知られている（特許文献７参照）。このためプラスミドが脱落した菌体はＰＨＡ生産能を失うので商業的生産性を低下させることにつながる。従来、組換え菌体の培養では抗生物質を培地に添加することでプラスミド保持菌体のみを選択的に生育保持させる対応が一般的であるが、抗生物質使用によるコストアップ、培養廃液中の残留抗生物質による環境への影響などが問題となっている。また、プラスミドの安定化のためにＲ１プラスミド由来のｐａｒＢ遺伝子をＰ（３ＨＢ）生産プラスミドに組み入れた組換え大腸菌が作製された（非特許文献１５参照）。この大腸菌は、１１０−１２０世代の培養後もほぼ１００％プラスミドを保持していた。しかしながら、なお、プラスミドは脱落の危険性を含んでいる。【００１２】
一方、染色体上に組み込まれた遺伝子は安定であると考えられ、ＰＨＡの合成に関する遺伝子を染色体に組み込んだ微生物が報告されている（特許文献８、非特許文献１６、非特許文献１７参照）。【００１３】
特許文献８が開示している、ＰＨＡ生合成酵素をコードする遺伝子を大腸菌の染色体にランダムに挿入することによって作製された大腸菌株は細胞乾燥重量の８５％を超えるレベルでＰ（３ＨＢ）を産生した。しかしながら、実用的物性に優れたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を大腸菌に産生させるためには、基質モノマー供給のための遺伝子をさらに共存させる必要や、または高価な脂肪酸などを培地へ供給させる必要があり、なお、高い生産効率を達成するための妨げになっている。さらには、染色体上にランダムに遺伝子を組み込む場合には、組み込まれた部位によっては、その部位上の、あるいはその部位周辺の遺伝子の発現に影響を及ぼし、ＰＨＡ生産株として充分な能力を発揮できない状況が存在する。【００１４】
外因性のＰＨＡ合成酵素遺伝子を宿主にプラスミド状で導入する場合や、染色体上に組み込む場合、ラルストニア属やシュードモナス属のような、元来ＰＨＡを生産する微生物種を宿主として使用するときは、その元来のＰＨＡが生産できなくなった菌株が利用されてきた。そのような菌株は変異操作を経て作製されているので、その親株と比べて増殖能力や生物活性が劣っており（非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０等参照）、ＰＨＡ生産株として充分な生産能力を発揮しているとは言い難い。【００１５】
一方で、ラルストニア・ユートロファの染色体上のＰＨＡ合成酵素遺伝子をクロマチウム・ビノッサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ）由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子と置換した報告では、野生株を上回る細胞乾燥重量の９１％のＰ（３ＨＢ）を蓄積した（非特許文献１７）。しかしながら、菌体量が１．８ｇ／Ｌと低く、生産ポリエステルも堅くてもろいＰ（３ＨＢ）であって広範な用途が期待できるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）ではなかったことから、ポリエステルの商業的生産には未だ課題を抱えていた。【００１６】
【特許文献１】特開昭５７−１５０３９３号公報
【特許文献２】特開昭５９−２２０１９２号公報
【特許文献３】特開平５−９３０４９号公報
【特許文献４】特開平７−２６５０６５号公報
【特許文献５】特開平１０−１０８６８２号公報
【特許文献６】特開２００１−３４００７８号公報
【特許文献７】特開昭５９−２０５９８３号公報
【特許文献８】米国特許６５９３１１６号明細書
【非特許文献１】Ｍａｄｉｓｏｎ等、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６３：２１−５３（１９９９）
【非特許文献２】Ｍａｔｓｕｓａｋｉ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０：６４５９−６４６７（１９９８）
【非特許文献３】Ｍａｔｓｕｓａｋｉ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３：４０１−４０９（２０００）
【非特許文献４】Ｌａｎｇｅｎｂａｃｈ等、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１５０：３０３−３０９（１９９７）
【非特許文献５】Ｄｏｉ等、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２８：４８２２−４８２８（１９９５）
【非特許文献６】Ｌｅｅ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６７：２４０−２４４（２０００）
【非特許文献７】Ｃｈｅｎ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５７：５０−５５（２００１）
【非特許文献８】国立感染症研究所  病原体等安全管理規定  別表１付表１（１９９９）
【非特許文献９】Ｆｕｋｕｉ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９：４８２１−４８３０（１９９７）
【非特許文献１０】Ｆｕｋｕｉ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．，４９：３３３―３３６（１９９８）
【非特許文献１１】Ｆｕｋｕｉ等、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３：６１８−６２４（２００２）
【非特許文献１２】Ｐａｒｋ等、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２：２４８−２５４（２００１）
【非特許文献１３】Ｋｉｃｈｉｓｅ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８：２４１１−２４１９（２００２）
【非特許文献１４】Ａｍａｒａ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５９：４７７−４８２（２００２）
【非特許文献１５】Ｌｅｅ等、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３２：２０３−２１１（１９９４）
【非特許文献１６】Ｋｒａｎｚ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３：３００３−３００９（１９９７）
【非特許文献１７】Ｙｏｒｋ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３：４２１７−４２２６（２００１）
【非特許文献１８】Ｓｃｈｌｅｇｅｌ等、Ａｒｃｈ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．，７１：２８３−２９４（１９７０）
【非特許文献１９】Ｓｃｈｕｂｅｒｔ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０：５８３７−５８４７（１９８８）
【非特許文献２０】Ｐｅｏｐｌｅｓ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１５２９８−１５３０３（１９８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
以上のように、ＰＨＡの商業生産には未だ多くの課題が存在した。
本発明の目的は、工業的規模の培養プロセスにおいて、広範な用途が期待できる共重合ポリエステルを安定的に高レベルで蓄積する組換え微生物株を提供すること、およびそれを利用した共重合ポリエステルの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者は、上述の課題を解決するために鋭意検討した結果、染色体上に存在するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を外因性のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子に置換したポリエステル生産微生物が、安定的に高レベルのＰＨＡを蓄積できることを見いだした。【００１９】
ＰＨＡの合成を安定にするためには、染色体上に遺伝子を導入することが有効であることが示唆されていたが、野生株を用いそのＰＨＡ合成酵素遺伝子を部位特異的に他のＰＨＡ合成酵素遺伝子に置換することで、既存遺伝子の破壊と導入遺伝子の発現を同時に行って共重合ポリエステルを蓄積させた場合の効果は知られておらず、また、従来知られていた技術から単純には予測することもできなかった。【００２０】
実施例に示したように、ラルストニア・ユートロファＨ１６株の染色体上のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子をアエロモナス・キャビエ由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素変異体遺伝子に置換した微生物株は、４８時間の培養で菌体生産量１１０．４ｇ／Ｌ、ポリエステル含量７３．８ｗｔ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産した。この生産性はこれまで報告されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産性を大きく上回っていた。またこの株は培養のすべての工程で抗生物質やその他のいかなる選択圧も必要とせず、培養の終了時には実質的にすべての細胞がＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を蓄積していることを見いだした。【００２１】
即ち本発明は以下の通りである。
［１］ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を染色体上に本来有する微生物であって、かつ該ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の少なくとも一部が外因性のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子に置換されている、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシトリデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシペンタデカン酸及び３−ヒドロキシヘキサデカン酸からなる群より選択されるモノマーユニットの２種以上から構成される共重合ポリエステルを生産する微生物。【００２２】
［２］共重合ポリエステルが３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸のモノマーユニットで構成されることを特徴とする、［１］に記載の微生物。
［３］ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を染色体上に本来有する微生物がラルストニア・ユートロファであることを特徴とする、［１］または［２］に記載の微生物。【００２３】
［４］ラルストニア・ユートロファがラルストニア・ユートロファＨ１６株であることを特徴とする、［３］に記載の微生物。
［５］外因性のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子が、アエロモナス・キャビエ由来の酵素又はその変異体をコードするものである、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の微生物。
［６］変異体が、以下の（ａ）、（ｂ）いずれかのアミノ酸置換を少なくとも一つ以上行ったものである、［５］に記載の微生物。
（ａ）１４９番目のアミノ酸のアスパラギンをセリンに置換
（ｂ）１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸をグリシンに置換【００２４】
［７］外因性のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子が、１４９番目のアミノ酸のアスパラギンをセリンに置換し、かつ１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸をグリシンに置換した、配列番号９のアミノ酸配列で示されるアエロモナス・キャビエ由来の変異体酵素をコードするものである、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の微生物。
［８］ＫＮＫ−００５株である微生物。
［９］［１］〜［８］のいずれか１項に記載の微生物を用いたポリエステルの製造方法。【００２５】
本発明における共重合ポリエステルとは、以下の一般式：【００２６】
【化１】
0005468779.tif 000002
【００２７】
（式中、Ｒ１及びＲ２は炭素数１以上であるアルキル基を表し、ポリマー中同一でも異なっていてもよい。ｍおよびｎは該ポリマーのモノマー単位数を表し、１以上である。）で表される３−ヒドロキシアルカン酸をモノマー単位とする重合体のうち、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシトリデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシペンタデカン酸及び３−ヒドロキシヘキサデカン酸からなる群より選択されるモノマー単位の２種または３種以上から構成される共重合ポリマーである。
上記共重合ポリエステルとしては、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸のモノマーユニットで構成されるものが好ましい。【００２８】
本発明で用いる微生物は、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を生物種として原初的にその染色体ＤＮＡに有する微生物であれば特に制限なく使用することができ、別の炭素源が利用できるように改変された微生物、基質モノマーの生成や取り込みが改変された微生物、または生産を増大するように改変された微生物を含む。例としては、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ（分類学上、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒと同一）等のＲａｌｓｔｏｎｉａ属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ等のＡｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ等のＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ等のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属等の細菌類が含まれる。安全性及び生産性の観点から好ましくはＲａｌｓｔｏｎｉａ属であり、より好ましくはＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａであり、更に好ましくはＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株である。【００２９】
本発明で用いる外因性のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子は、各種のＰＨＡ蓄積生物に由来する遺伝子のうち共重合ポリエステルを蓄積させるものであればどのようなものでもよい。そのような遺伝子としては例えば、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ（非特許文献９）、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｃｏｒａｌｌｉｎａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１９９６４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｔｉｍｍ  等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０９：１５−３０（１９９２））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ（Ｈｕｉｓｍａｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：２１９１−２１９８（１９９１））、Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ  ｖｉｏｌａｃｅａｅ（Ｌｉｅｂｅｒｇｅｓｅｌｌ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３８：４９３−５０１（１９９３））などから単離されているポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子がある。好ましくは、アエロモナス・キャビエ由来の酵素又はその変異体をコードするものである。【００３０】
また、目的とする酵素活性が失われない範囲内でアミノ酸配列が改変するようにそれらの遺伝子の塩基配列の一部を改変したものも使用することができる。例えば、非特許文献１３に記載されている、１４９番目のアミノ酸のアスパラギンがセリンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子（Ｎ１４９Ｓ変異体遺伝子）、１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子（Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子）、または、上記の２つのアミノ酸置換が組み合わされた、配列番号９のアミノ酸配列で示されるアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子等を好ましく用いることができる。
上記の遺伝子はプロモーターおよび／またはリボソーム結合部位を有し得るが、必ずしも必要ではない。【００３１】
ポリエステル合成酵素遺伝子の置換の態様は、染色体上に本来存在するポリエステル合成酵素遺伝子（被置換遺伝子）のコードする酵素活性が無くなり、かつ外因性のポリエステル合成酵素遺伝子（置換遺伝子）が発現されるように置き換わっていればどのような置き換わり方でもよい。置換後に、被置換遺伝子が染色体上からすべて失われていてもよいし、一部が存在していてもよく、分断されて存在していてもよい。置換の一つの態様として、置換遺伝子がリボソーム結合部位を有し、かつプロモーターを有しない場合は被置換遺伝子のプロモーターの下流に接続されるような置き換わり方が選択できる。また、置換の別の一つの態様として、置換遺伝子がプロモーターおよびリボソーム結合部位を有しない場合は被置換遺伝子のリボソーム結合部位の下流に接続されるような置き換わり方が選択できる。置換後に発現するポリエステル合成酵素蛋白は、置換遺伝子のコードする単独の蛋白であるような置き換わり方であっても、被置換遺伝子がコードする蛋白との融合蛋白であるような置き換わり方であってもよい。本発明で用いるポリエステル合成酵素遺伝子の置換の態様は以上の例示に限定されるものではないが、好ましい態様としては被置換遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを、置換遺伝子の開始コドンから終止コドンまで置換するものである。【００３２】
染色体上の遺伝子を部位特異的に置換する方法は当業者に周知である。代表的な方法としては、トランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ｏｈｍａｎ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６２：１０６８−１０７４（１９８５））や相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Ｎｏｔｉ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：１９７−２１７（１９８７））などがあり、また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子を置換遺伝子に共存させて、第二段階の相同組換えによってｓａｃＢ遺伝子が脱落した微生物株をシュークロース添加培地耐性株として容易に単離する方法（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６：１１９５−１２０４（１９９２）、Ｌｅｎｚ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：４３８５−４３９３（１９９４））も利用することができるが、染色体上の遺伝子を置換できればその方法は特に制限されない。
以下にＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａのＰＨＡ合成酵素遺伝子（ｐｈａＣＲｅ）をＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅのＰＨＡ合成酵素遺伝子（ｐｈａＣＡｃ）に置換する場合の置換方法を、より具体的に例示する。【００３３】
まず、置換フラグメントを作製する。置換フラグメントは、ｐｈａＣＲｅのコーディング配列（ＣＤＳ：開始コドンから終止コドンまでを含む）直前の上流配列にｐｈａＣＡｃのＣＤＳがつながり、その後にｐｈａＣＲｅのＣＤＳ直後の下流配列がつながった形とする。すなわち、ＣＤＳのみがｐｈａＣＡｃのものに置き換わったｐｈａＣＲｅのＤＮＡフラグメントである。上流配列と下流配列は染色体上の遺伝子と相同組換えを起こすために必要な相同配列であって、一般的にはその長さが長いほど組換え頻度は高くなるが、相同組換えさえ起こればよく、その長さは任意に設定できる。【００３４】
置換フラグメントには遺伝子置換の際に選択マーカーとなる遺伝子を付加することができる。選択マーカーとなる遺伝子は例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、アンピシリン等の抗生物質の耐性遺伝子や各種の栄養要求性を相補する遺伝子等が使用できる。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａで行う場合にはカナマイシンの耐性遺伝子が好適である。【００３５】
さらにそれらに加えて、第二段階の相同組み換えによって選択マーカー遺伝子を含む領域が脱落した微生物株の選択を容易にするための遺伝子が付加できる。そのような遺伝子としてはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子が例示できる（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６：１１９５−１２０４（１９９２））。この遺伝子が発現している微生物株はシュークロースを含む培地で生育できないことが知られており、シュークロースを含む培地での生育によりこの遺伝子を脱落によって失った株を選択することが容易となる。【００３６】
これらで構成された置換フラグメントは宿主微生物株中で複製しないベクターに接続することによって遺伝子置換用のプラスミドが作製される。ラルストニア属やシュードモナス属等で利用できるこのようなベクターには例えば、ｐＵＣベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＢＲ３２２ベクターあるいはそれらと同じ複製起点を持つベクター等が挙げられる。さらには、接合伝達を可能にするｍｏｂ、ｏｒｉＴなどのＤＮＡ配列を共存させることも可能である。【００３７】
このような構成で作製された遺伝子置換用のプラスミドＤＮＡはエレクトロポレーション法や接合伝達法などの公知に方法によりＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ等の微生物に導入することができ、相同組換えを行うことができる。
次に相同組換えによって染色体上に遺伝子置換用のプラスミドＤＮＡが挿入された株の選択を行う。選択は遺伝子置換用のプラスミドＤＮＡに共存させた選択用の遺伝子に基づいた方法によって行うことができる。カナマイシン耐性遺伝子を用いた場合にはカナマイシンを含む培地で生育してきた株から選ぶことができる。【００３８】
次の段階で第二の相同組換えによって染色体上から選択マーカー遺伝子を含む領域が脱落した株を選択する。挿入時に利用した選択用の遺伝子に基づいて、例えばカナマイシンを含む培地で生育できなくなった株を選択してもよいが、ｓａｃＢ遺伝子を遺伝子置換用プラスミドに共存させている場合は、シュークロースを含む培地で生育してくる株から容易に選択できる。このようにして得られた株が所望するように遺伝子が置換された株かどうか確認するには、ＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法、ＤＮＡ塩基配列の決定など、公知の方法が使用できる。以上のようにしてＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａのＰＨＡ合成酵素遺伝子（ｐｈａＣＲｅ）がＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅのＰＨＡ合成酵素遺伝子（ｐｈａＣＡｃ）に置換された株を取得することができる。このような株としては、以下の実施例で作製したＫＮＫ−００５株等が挙げられる。【００３９】
本発明において、本発明の微生物を炭素源存在下で増殖させることにより、微生物体内に共重合ポリエステルを蓄積させることができる。炭素源としては、糖、油脂または脂肪酸を用いることができる。炭素源以外の栄養源として、窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を任意に用いることができる。【００４０】
糖としては、例えばグルコース、フラクトース等の炭水化物が挙げられる。油脂としては、炭素数が１０以上である飽和・不飽和脂肪酸を多く含む油脂、例えばヤシ油、パーム油、パーム核油等が挙げられる。脂肪酸としては、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸等の飽和・不飽和脂肪酸、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩等の脂肪酸誘導体が挙げられる。
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。【００４１】
そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
培養温度は、その菌が生育可能な温度であればよいが、２０℃から４０℃が好ましい。培養時間は、特に制限はないが、１〜１０日間程度で良い。
得られた該培養菌体に蓄積されたポリエステルは公知の方法により回収することができる。【００４２】
ポリエステルの回収は、例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離器等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてポリエステルを抽出する。このポリエステルを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてポリエステルを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてポリエステルを回収することができる。
ポリエステル生産確認の簡易法としては、Ｎｉｌｅｒｅｄを用いた染色法を利用できる。すなわち、組換え菌が生育する寒天培地にＮｉｌｅｒｅｄを加え、組換え菌を１〜７日間培養し、組換え菌が赤変するか否かを観察することにより、ポリエステル生産の有無を確認できる。
【発明の効果】
【００４３】
本発明によれば、産業用発酵過程においてポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）を安定的に高生産できる組換え微生物株が提供され、高純度のポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）が簡便かつ大量に、しかも安価に製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下に実施例で本発明を説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら制限されるものではない。
（実施例１）遺伝子置換用プラスミドの作製
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株の菌体を鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号１と配列番号２で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子（ｐｈａＣＲｅ）の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ条件は（１）９４℃で２分、（２）９４℃で３０秒、（３）４５℃で３０秒、（４）７２℃で３分、（２）から（４）を２５サイクル、（５）７２℃で５分であり、ポリメラーゼとしてはＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）（東洋紡社製）を同酵素で切断した部位にサブクローニングした（ｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ）。【００４５】
Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ由来のポリエステル合成酵素変異体遺伝子であるＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体は、次のように作製した。まず、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）（東洋紡社製）をＰｓｔＩ処理し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて平滑末端化しライゲーションすることによりＰｓｔＩサイトを欠失させた。次いでこのプラスミドをＸｈｏＩ処理し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて平滑末端化しライゲーションすることによりＸｈｏＩサイトを欠失したプラスミドｐＢｌｕｅ−Ｎｅｗを作製した。このプラスミドのＥｃｏＲＩサイトにｐＪＲＤ２１５−ＥＥ３２ｄ１３（特許文献５）より同酵素で切り出したｄ１３断片をクローニングした（ｐＢｌｕｅ−ｄ１３）。次に、理化学研究所より分与されたクローンＥ２−５０由来のプラスミド（非特許文献１３）を鋳型とし、配列番号３と４に記載のプライマーのセット及び配列番号５と６に記載のプライマーのセットを用いてそれぞれＰＣＲ法により増幅、２断片を得た。その条件は（１）９４℃で２分、（２）９４℃で３０秒、（３）５５℃で３０秒、（４）７２℃で２分、（２）から（４）を２５サイクル、（５）７２℃で５分である。増幅された２断片を等モル混合し再びＰＣＲ反応を行い２断片を結合させた。その条件は（１）９６℃で５分、（２）９５℃で２分、（３）７２℃で１分、（２）から（３）を１２サイクルであり、ポリメラーゼとしてはＰｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いた。目的サイズのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動ゲルより切り出しＰｓｔＩとＸｈｏＩで処理し、同酵素で処理したｐＢｌｕｅ−ｄ１３に断片を入れ替える形でクローニングした（ｐＢｌｕｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ）。塩基配列決定を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、ＰＨＡ合成酵素の１４９番目のアミノ酸であるアスパラギンがセリンに、１７１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸がグリシンに置換された変異遺伝子であることを確認した。このアミノ酸配列を配列番号９に示す。【００４６】
ｐＢｌｕｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇを鋳型として配列番号７と配列番号８で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体の構造遺伝子ＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲ条件は（１）９４℃で２分、（２）９４℃で３０秒、（３）４５℃で３０秒、（４）７２℃で２分、（２）から（４）を２５サイクル、（５）７２℃で５分であり、ポリメラーゼとしてはＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いた。次に、ｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅを制限酵素ＳｂｆＩとＣｓｐ４５Ｉで処理し、同酵素で処理した上記増幅ＤＮＡ断片をｐｈａＣＲｅ構造遺伝子と入れ替える形でクローニングした（ｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ）。【００４７】
次に、プラスミドｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ３７５３３）を制限酵素ＸｈｏＩとＤｒａＩで処理してカナマイシン耐性遺伝子を含む約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を単離後、ＤＮＡブランティングキット（タカラバイオ社製）を用いて末端を平滑化し、ｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇを制限酵素ＳａｌＩで切断後同様に平滑末端化した部位に挿入した（ｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｋｍ）。【００４８】
続いて、プラスミドｐＭＴ５０７１（Ｔｓｕｄａ、ＧＥＮＥ，２０７：３３−４１（１９９８））を制限酵素ＮｏｔＩで処理してｓａｃＢ遺伝子を含む約８ｋｂのＤＮＡ断片を単離し、ｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｋｍを同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子置換用プラスミドｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−ＫｍＳＡＣを作製した。
本実施例で構築した遺伝子置換用プラスミドｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−ＫｍＳＡＣの構成の模式図を図１に示す。【００４９】
（実施例２）遺伝子置換株の作製
遺伝子置換用プラスミドｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−ＫｍＳＡＣで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７００５）を形質転換し、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株の染色体上に組み込まれた株を取得した（第一段階の相同組換え）。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株を選択して選択マーカー遺伝子を含む領域が脱落した株を取得した（第二段階の相同組換え）。さらにＰＣＲによる解析によりｐｈａＣＲｅ遺伝子がＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子に置換された菌株を単離した。この遺伝子置換株をＫＮＫ−００５株と命名し、塩基配列決定を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、染色体上のｐｈａＣＲｅ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでがＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子の開始コドンから終止コドンまでに置換された株であることを確認した。
本実施例で行った遺伝子置換の手順を図２に模式的に示す。第一段階の相同組換えによって遺伝子置換用プラスミドは染色体中に挿入され、第二段階の相同組換えにより、そのプラスミドに相当する部分が再び環状になって染色体上から離脱する。第二段階の相同組換えの際、相同組換えを起こす位置により元と同じ置換遺伝子（図中のｐｈａＣＲｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ）を伴って離脱する場合（Δ１）と、被置換遺伝子（図中のｐｈａＣＲｅ）を伴って離脱する場合（Δ２）があり、本発明のＫＮＫ−００５株は、Δ２の位置で第二段階の相同組換えが行われたことにより得られる菌である。【００５０】
（実施例３）ポリエステルの生産および精製
種母培地の組成は、１ｗ／ｖ％  Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％  Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％Ｎａ２ＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．８とした。
前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、１．２９ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４  、０．１ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％パームＷオレイン油、０．５ｖ／ｖ％  微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの。）とした。【００５１】
ポリエステル生産培地の組成は０．３８５ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、０・２９１ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４  、０．１ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％  微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの。）、０．０５ｗ／ｖ％ＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）とした。炭素源はパーム核油を分別した低融点画分であるパーム核油オレインを単一炭素源として用い、培養全般を通じ、比基質供給速度が０．０８〜０．１（ｇ油脂）×（ｇ正味乾燥菌体重量）−１×（ｈ）−１となるように流加した。【００５２】
ＫＮＫ−００５株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３０℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールしながら２８時間培養した。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。【００５３】
ポリエステル生産培養は６Ｌの生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製ＭＤＬ−１０００型）に前培養種母を５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量３．６Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。培養は約４８時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した結果、１１０．４ｇ／Ｌであった。【００５４】
得られた乾燥菌体約１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のポリエステルを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が約３０ｍｌになるまで濃縮後、約９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したポリエステルをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ポリエステルの重量を測定し、菌体内のポリエステル含量を算出した。その結果、ＫＮＫ−００５株によるポリエステル含量は４８時間で７３．８（ｗｔ％）という高含量であった。【００５５】
（実施例４）ポリエステル生産能の安定性評価
実施例３のポリエステル生産培養終了時の培養菌液を希釈してＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地に播種し、生育してきたコロニーをＮｉｌｅｒｅｄ含有培地（リン酸水素２ナトリウム・１２水塩  ９ｇ、リン酸２水素カリウム  １．５ｇ、塩化アンモニウム  ０．０５ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩  ０．０２ｇ、フルクトース  ０．５ｇ、塩化コバルト・６水塩  ０．２５ｐｐｍ、塩化鉄（ＩＩＩ）・６水塩  １６ｐｐｍ、塩化カルシウム・２水塩  １０．３ｐｐｍ、塩化ニッケル・６水塩  ０．１２ｐｐｍ、硫酸銅・５水塩  ０．１６ｐｐｍ、Ｎｉｌｅｒｅｄ  ０．５ｍｇ、寒天  １５ｇ／１Ｌ）に接種した。３０℃、３日間の培養後、コロニーが赤色を呈しているものがポリエステルを生産していると判定できる。１００コロニーを調べた結果、すべてのコロニーがポリエステル生産能を保持していた。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明によれば、産業用発酵過程においてポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）を安定的に高生産できる組換え微生物株が提供され、高純度のポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）が簡便かつ大量に、しかも安価に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】実施例１で構築した遺伝子置換用プラスミドｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−ＫｍＳＡＣの構成を示した模式図である。
【図２】実施例２で行った遺伝子置換の手順を模式的に示した図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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