(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式Ｉで表されるタンパク質−高分子結合体、
【化１】
0005613050.tif 000023
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５がそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃｌ−５のアルキル、Ｃ２−５のアルケニル、Ｃ２−５のアルキニル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３−８のシクロアルキル、またはＣ３−８のヘテロシクロアルキルであり、
Ａ１およびＡ２がそれぞれ独立して、高分子部位であり、
Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３がそれぞれ独立して、結合または結合性官能基であり、Ｇ３が結合であり、
ＰがＮ末端のアミノ基がＧ３と結合しているタンパク質部位であり、
ｍが０または１−１０の整数であり、および
ｎが１−１０の整数であり、
Ｇ１およびＧ２がそれぞれ
【化２】
0005613050.tif 000024
であり、ＯがＡ１またはＡ２と結合しており、ＮＨが化学式Ｉに示される炭素原子に結合している。
【請求項２】
Ａ１およびＡ２がそれぞれ１０―３０ｋＤの分子量を有するｍＰＥＧ部位である、請求項１に記載のタンパク質−高分子結合体。
【請求項３】
Ｐが、そのＮ末端にさらに１−４のアミノ酸残基を含む修飾されたインターフェロン部位である、請求項２に記載のタンパク質−高分子結合体。
【請求項４】
ｎが２である、請求項３に記載のタンパク質−高分子結合体。
【請求項５】
前記結合体が、
【化３】
0005613050.tif 000025
であり、
ｍＰＥＧは２０ｋＤの分子量を有し、ＩＦＮがインターフェロンα２ｂである、請求項４に記載のタンパク質−高分子結合体。
【請求項６】
Ｃ型肝炎ウイルス感染症またはＢ型肝炎ウイルス感染症の治療のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質−高分子結合体を含む薬剤。
【請求項７】
Ｐが、Ｎ−末端にさらに１−４のアミノ酸残基を有する修飾されたインターフェロンαである、請求項１に記載のタンパク質−高分子結合体。
【請求項８】
Ｐが、インターフェロンα、ヒト成長ホルモン、またはエリスロポイエチンである、請求項１に記載のタンパク質−高分子結合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年８月１６日に出願された米国特許仮出願番号第６０／９５６，２７３号の優先権を主張するものであり、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
細胞生物学および組み換えタンパク質工学における進歩によりタンパク質治療は発展している。
【０００３】
それにもかかわらず、いまだ、大きな障害が存在する。ほとんどのタンパク質は、タンパク質分解をうけやすく、したがって循環系において短い半減期を有している。他の不都合な点は、水への低溶解度および中和抗体の誘導を含んでいる。
【０００４】
例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような高分子のタンパク質への結合はタンパク質分解酵素のタンパク質骨格への接近を阻害し、結果としてタンパク質の安定性を向上する。さらに、水への溶解度を改善し免疫原性を最小限にする。タンパク質へ高分子を結合する効果的な方法が必要とされている。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明の一態様は、１以上の高分子部位、タンパク質部位、およびリンカーを含む実質的に純粋（≧８０％純度）な結合体に関連する。前記結合体において、１以上の高分子部位は前記リンカーと結合しており、タンパク質部位のＮ末端の窒素原子はリンカーに結合している。前記リンカーは共有結合、Ｃ１−１０のアルキレン、Ｃ２−１０のアルケニレン、またはＣ２−１０のアルキニレンであり、前記タンパク質部位がインターフェロンα部位、ヒト成長ホルモン部位、またはエリスロポイエチンである。好ましくは、前記結合体の純度が９０％以上である。この結合体は予想以上に長い生体内半減期を有している。
【０００６】
本発明の他の態様は化学式Ｉのタンパク質−高分子結合体に関している；
【０００７】
【化１】
0005613050.tif 000002
【０００８】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃｌ−５のアルキル、Ｃ２−５のアルケニル、Ｃ２−５のアルキニル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３−８のシクロアルキル、またはＣ３−８のヘテロシクロアルキルであり、Ａ１およびＡ２はそれぞれ独立して、高分子部位であり、Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３はそれぞれ独立して、結合または結合性官能基であり、Ｐはタンパク質部位であり、ｍは０または１−１０の整数であり、ｎは１−１０の整数である。
【０００９】
上記化学式において、タンパク質−高分子結合体は以下に示す形態の一以上を有していてよい。Ｇ３は結合であり、Ｐは、Ｎ末端のアミノ基がＧ３と結合するタンパク質部位であり、Ａ１およびＡ２は分子量が２−１００ｋＤ（好ましくは１０−３０ｋＤ）であるポリアルキレンオキシド部位であり、Ｇ１およびＧ２がそれぞれ
【００１０】
【化２】
0005613050.tif 000003
【００１１】
であり、ＯがＡ１またはＡ２と結合しており、ＮＨは化学式Ｉに示される炭素原子に結合していて、またはＧ１およびＧ２はそれぞれ尿素、スルフォンアミドまたはアミドであって、そのＮは化学式Ｉに示される炭素原子と結合していて、ｍは４であり、ｎは２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれＨであり、Ｐはインターフェロン部位またはさらに１−４のアミノ酸残基を含む修飾されたインターフェロン部位である。
【００１２】
「アルキル」の用語は、１価の直鎖または分岐した炭化水素ラジカルを意味する。アルキル基は、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、およびｎ−ペンチルを含む。同様に、「アルケニル」または「アルキニル」の用語は、１以上のＣ＝Ｃ二重結合または１以上のＣ≡Ｃ三重結合を含む１価の直鎖または分岐した炭化水素ラジカルを意味する。
【００１３】
「アルキレン」の用語は、２価の直鎖または分岐した炭化水素ラジカルを意味し、同様に、「アルケニレン」または「アルキニレン」の用語は、１以上のＣ＝Ｃ二重結合または１以上のＣ≡Ｃ三重結合を含む２価の直鎖または分岐した炭化水素ラジカルを意味する。
【００１４】
「アリール」の用語は、少なくとも一つの芳香環を有する炭化水素環系（一環または二環）を意味する。アリール部位は、以下に制限されないが、例えばフェニル、ナフチル、ピレニルを含む。
【００１５】
「ヘテロアリール」の用語は、環系にＯ、Ｎ、またはＳのようなヘテロ原子を少なくとも一つ含み、残りは炭素である、少なくとも一つの芳香環を有する炭化水素環系（一環または二環）を意味する。ヘテロアリール部位は、以下に制限されないがフリル、ピロリル、チエニル、オキサゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、キナゾリニル、およびインドリルを含む。
【００１６】
「シクロアルキル」の用語は、炭素のみ環原子に有する、部分的または全体的に飽和した一環または二環系を意味する。以下に制限されないが、例えば、シクロプロパニル、シクロペンタニル、およびシクロヘキサニルを含む。
【００１７】
「ヘテロシクロアルキル」の用語は、環原子として、炭素のほかに、１以上のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、またはＳ）を有する、部分的にまたは全体的に飽和した一環または二環系を意味する。以下に制限されないが、例えば、ピペリジン、ピペラジン、モルフォリン、チオモルフォリン、および１，４−オキサゼパンを含む。
【００１８】
本明細書に記載されるアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキルは、置換部位および非置換部位の両方を含む。置換基の例は、Ｃ１−１０のアルキル、Ｃ２−１０のアルケニル、Ｃ２−１０のアルキニル、Ｃ３−８のシクロアルキル、Ｃ５−８のシクロアルケニル、Ｃ１−１０のアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、アミノ、Ｃ１−１０のアルキルアミノ、Ｃ１−２０のジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、Ｃ１−１０のアルキルスルフォンアミド、アリールスルフォンアミド、ヒドロキシ、ハロゲン、チオ、Ｃ１−１０のアルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、カルボキシル、およびカルボン酸エステルである。
【００１９】
「ポリアルキレンオキシド部位」の用語は、直線、分岐、または星型のポリアルキレンオキシド由来の一価のラジカルを意味する。ポリアルキレンオキシド部位の分子量は２−１００ｋＤであっていい。当該ポリアルキレンオキシド部位は飽和または不飽和である。ポリアルキレンオキシド部位は、以下に制限されないが、例えば、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリイソプロピレンオキシド、ポリブテニレンオキシド、およびそれらの共重合体を含む。デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、または炭化水素系高分子のような他の高分子もまた使用可能であり、それらも抗原性、毒性がなく、または免疫応答性を引き起こさない限り、ポリアルキレンオキシドに替えて使用されうる。前記ポリアルキレンオキシドは置換されている、または非置換である。例えば、メトキシでキャップされたポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）でありうる。
【００２０】
「タンパク質部位」の用語は、天然のタンパク質または修飾されたタンパク質のどちらかに由来する一価のラジカルを意味する。前記天然のタンパク質はインターフェロンα、インターフェロンβ、ヒト成長ホルモン、エリストロポイエチン、および顆粒球コロニー刺激因子または抗体でありうる。前記修飾されたタンパク質は、例えば、インターフェロンαおよびインターフェロンのＮ末端にさらに１−４のアミノ酸残基を含むタンパク質でありうる。そのような修飾されたインターフェロンは、例えば、
【００２１】
【化３】
0005613050.tif 000004
【００２２】
であり、ＩＦＮはインターフェロンα２ｂ部位を示し、そのＮ末端のアミノ基はカルボニル基に結合する。
【００２３】
「インターフェロンα」の用語は、ウイルスの複製、細胞増殖を阻害し、および遺伝子応答を調製する、非常に相同性のある種に特異的なタンパク質群を意味する。Ｂｏｎｎｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄ．，１９８４，３（６）：５８０−５９８．および  Ｆｉｎｔｅｒ，  Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．，１９８６，３  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１５７−１６０．を参照されたい。
【００２４】
シェリング社（米国ニュージャージー州ケニルワース）製のイントロン−Ａ  インターフェロン（Ｉｎｔｒｏｎ−Ａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、ホフマン・ラ・ロシュ社（米国ニュージャージー州ナトリー）製のロフェロン  インターフェロン（Ｒｏｆｅｒｏｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、ボエリンガーインゲルハイム製薬社（米国コネチカット州リッチフィールド）製のベロフォー  アルファ  ２  インターフェロン（Ｂｅｒｏｆｏｒ  ａｌｐｈａ  ２  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、住友社（日本）製のスミフェロン（Ｓｕｍｉｆｅｒｏｎ）、およびグラクソ・ウェルカム社（英国ロンドン）製のウェルフェロン  インターフェロン  アルファ−ｎｌ（ＩＮＳ）（Ｗｅｌｌｆｅｒｏｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ−ｎｌ  （ＩＮＳ））を含む多くの型のインターフェロンαタンパク質が市場で入手可能である。
【００２５】
以下に前駆体または成熟型のヒト型インターフェロンαタンパク質の５つのアミノ酸配列の例を列挙する。
【００２６】
【化４】
0005613050.tif 000005
【００２７】
【化５】
0005613050.tif 000006
【００２８】
【化６】
0005613050.tif 000007
【００２９】
【化７】
0005613050.tif 000008
【００３０】
【化８】
0005613050.tif 000009
【００３１】
一例において、本発明の結合体の作製に使用するインターフェロンαタンパク質は、上記列挙されるアミノ酸配列または成熟インターフェロンαに対応する断片と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％または９９％）同一であるアミノ酸配列を有している。
【００３２】
「ヒト成長ホルモン」の用語は、天然のヒト成長ホルモンの前駆体または成熟体およびその機能性変異体、すなわち、天然のヒト成長ホルモンと少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％または９９％）が同一であるアミノ酸配列を有し、ヒト成長ホルモンと同一の生理活性を示すものを意味する。（前駆体および成熟体の）天然のヒト型成長ホルモンのアミノ酸配列を以下に示している。
【００３３】
【化９】
0005613050.tif 000010
【００３４】
【化１０】
0005613050.tif 000011
【００３５】
エリスロポイエチン（ＥＰＯ）は肝臓または腎臓で製造され、赤血球生成または赤血球の産生を調製する糖タンパク質ホルモンである。米国特許第５，６２１，０８０号参照。前記ヒトＥＰＯ（前駆体または成熟体）のアミノ酸配列を以下に示す。
【００３６】
【化１１】
0005613050.tif 000012
【００３７】
【化１２】
0005613050.tif 000013
【００３８】
本発明の結合体を作製するために使用されるエリスロポイエチンタンパク質は、適当な種、例えばヒト、マウス、ブタ、ウシ、により製造される前駆体または成熟体のＥＰＯタンパク質である。一例において、前記エリスロポイエチンタンパク質は、上記アミノ酸配列の一つと少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％または９９％）が同一であるアミノ酸配列を有する。
【００３９】
２つのアミノ酸配列の「相当性（％）」は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７，１９９３で修正されたＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８，１９９０に記載される、演算式を使用して決定される。そのような演算式は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２  １５  ：４０３−１０，１９９０の、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒ．２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質の調査は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、文字長＝３で実行することで、本発明のタンパク質分子に相当するアミノ酸配列が得られる。２つの配列間にギャップがある際には、ギャップＢＬＡＳＴがＡｌｔｓｃｈｕｌ等のＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５（１７）：３３８９−３４０２，１９９７．に記載されるように利用されうる。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメーターが使用されうる。
【００４０】
「結合性官能基」の用語は、２価の官能基であって、一方の末端は高分子部位に結合し、他方の末端はタンパク質と結合していることを意味する。例えば、以下に制限されないが、−Ｏ−、−Ｓ−、カルボン酸エステル、カルボニル、炭酸エステル、アミド、カルバメート、ウレア、スルフォニル、スルフィニル、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、亜リン酸エステルまたはリン酸エステル基を含む。
【００４１】
上記、タンパク質−高分子結合体は、もし可能であれば、フリーまたは塩の形態でありうる。例えば、塩は、アニオンと本発明のタンパク質−高分子結合体の正電荷を帯びた基（例えばアミノ）との間で形成されうる。適当なアニオンは、塩化物、臭化物、沃化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、および酢酸塩のアニオンが挙げられる。同様に、塩はカチオンと本発明のタンパク質−高分子結合体の陰電荷を帯びた基（例えばカルボン酸エステル）との間で形成されうる。適当なカチオンは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、およびテトラメチルアンモニウムイオンのようなアンモニウムカチオンが挙げられる。
【００４２】
さらに、タンパク質−高分子結合体は１以上の二重結合、または１以上の不斉中心を有していてもいい。そのような結合体は、ラセミ体、ラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマー、ジアステレオマー混合物、およびシス−もしくはトランス−またはＥ−もしくはＺ−二重結合異性体として起こりうる。
【００４３】
本発明のタンパク質−高分子結合体の一例は、以下に示される。
【００４４】
【化１３】
0005613050.tif 000014
【００４５】
式中、ｍＰＥＧは分子量２０ｋＤであり、ＩＦＮはインターフェロンα２ｂ部位である。
【００４６】
本発明の他の形態は、タンパク質−高分子結合体の調製に有益な化合物に関する。当該化合物は化学式ＩＩであり、
【００４７】
【化１４】
0005613050.tif 000015
【００４８】
式中、Ｘは反応性基であり；Ａ１およびＡ２はそれぞれ独立して高分子部位である。またはＡ１およびＡ２の一方が高分子部位であり、他方が反応性基であり、Ｇ１、Ｇ２およびＧ３はそれぞれ独立して結合または結合性官能性基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃｌ−５のアルキル、Ｃ２−５のアルケニル、Ｃ２−５のアルキニル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３−８のシクロアルキル、Ｃ３−８のヘテロシクロアルキル、または−Ｇ４−Ｘ’であり、ここでＧ４は結合または結合性官能基であり、Ｘ’は反応性基であり、ｍおよびｎはそれぞれ独立して、０または１−１０の整数であり、ここで、もし−Ｇ３−Ｘが−ＣＯ（Ｏ）−Ｎ−スクシンイミジルであるならば、ｎは１−１０の整数である。
【００４９】
一実施形態において、Ｘ、Ｘ’、Ａｌ、Ａ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびｍは上記に定義されるのと同様であり、ｎは１−１０の整数である。
【００５０】
化学式ＩＩのある化合物は、以下の形態を１以上有する。高分子部位は１以上の反応性基である。Ｇ３は結合であり、Ｐはタンパク質部位であり、そのＮ末端のアミノ基がＧ３に結合している。Ａ１およびＡ２は分子量２−１００ｋＤ（好ましくは１２−３０ｋＤ）のポリ
アルキレンオキシド部位であり、Ｇ１およびＧ２はそれぞれ
【００５１】
【化１５】
0005613050.tif 000016
【００５２】
であり、ここで、ＯはＡ１またはＡ２に結合し、ＮＨは化学式Ｉに示される炭素原子に結合している。ｍは４であり、ｎは１である。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれＨである。ＸはＣＨ（＝Ｏ）または脱離基（例えばスクシンイミジルやｐ−ニトロフェノキシ）である。
【００５３】
「反応性基」の用語は、他の官能基と反応し、その他の官能基により置換されるまたはその他の官能基と結合しうる官能基を意味する。反応性基は脱離基、求核基、アルデヒド、またはＭｉｃｈａｅｌ受容体でありうる。
【００５４】
「脱離基」の用語は、直接置換またはイオン化の際に共役結合の１つから電子対を脱離できる官能性基を意味する。（例えば、Ｆ．Ａ．Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｒ．Ｊ．Ｓｕｎｂｅｒｇ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照。）脱離基の例は、以下に制限されないが、メタンスルホネート、トリフラート、ｐ−トルエンスルホネート、沃化物、臭化物、塩化物、トリフルオロアセテート、スクシンイミジル（「Ｓｕ」）、ｐ−ニトロフェノキシ、ピリジン−２−イル−オキシを含む。
【００５５】
「求核基」の用語は電子豊富な官能性基を意味し、電子対を供給することによって求電子剤のような電子受容基と反応する。
【００５６】
「求電子基」は電子の乏しい官能性基を意味し、電子対を受け取ることによって求核剤のような電子供給性基と反応する。Ｍｉｃｈａｅｌ受容体は求電子基のサブセットである。それらは、求核剤と接触すると、Ｍｉｃｈａｅｌ反応を起こす。典型的なＭｉｃｈａｅｌ受容体はα，β−不飽和ケトン部位を含む。
【００５７】
化学式ＩＩの例示的な化合物は、以下に示される。
【００５８】
【化１６】
0005613050.tif 000017
【００５９】
さらに他の態様において、本発明は化学式Ｉのタンパク質−高分子結合体を調製する方法を特徴付け、タンパク質部位ＰのＮ末端におけるアミノ基は官能基Ｇ３に結合している。当該方法はＮ末端フリーのタンパク質Ｈ−Ｐと、Ｘが脱離基であることを除いて上記化学式ＩＩと同じ式の２量体枝分かれ分子とのカップリング反応を含む。Ｎ末端フリーのタンパク質Ｈ−Ｐはタンパク質部位Ｐの末端のアミノ基におけるＮ原子が水素原子Ｈに結合しているタンパク質を意味する。言い換えれば、Ｈ−Ｐは末端に第１級または第２級のアミノ基を有する。あるいは、当該方法は、（１）直前に述べたＮ末端フリーのタンパク質Ｈ−Ｐと、Ｇ３が結合であり、ｎは０または１−９の整数であり、ＸがＣＨＯであることを除いて上記化学式ＩＩと同じ化学式の２量体枝分かれ分子とのカップリング反応と、（２）カップリング生成物を還元してタンパク質−高分子結合を形成することを含む。
【００６０】
インターフェロンはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症を治療する免疫調節剤である。さらに、インターフェロン（例えば、インターフェロンα）は非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、エイズ関連のカポジ肉腫、濾胞性リンパ腫、悪性黒色腫、コンジローマアクミナータ（ｃｏｎｄｙｌｏｍａ  ａｃｃｕｍｉｎａｔａ）の治療で使用されうる。したがって、本発明の他の態様は、上記される疾患を本願に記載されるインターフェロン−高分子結合体を用いて治療する方法に関する。
【００６１】
この治療用途およびこれらの疾患の１つの治療のための薬剤の製造のための当該結合体の使用に加えて、上記疾患のいずれかに使用されるインターフェロン−高分子結合体を含む組成物もまた本発明の範囲に含まれる。
【００６２】
本発明の１以上の実施形態の詳細は以下の記載に開示される。本発明の他の特徴、目的および利点は当該記載および請求項から明らかであろう。
【００６３】
詳細な説明
本発明のタンパク質−高分子結合体は、化学分野でよく知られた合成方法を用いて調製されうる。例えば、リンカー分子を同時にまたは徐々に、二つの高分子と結合し、続けてタンパク質分子をこのリンカー分子に結合し、本発明のタンパク質−高分子結合を形成する。
【００６４】
化学式ＩＩの化合物も本発明の範囲に含まれる。これらの化合物はちょうど記載されたタンパク質−高分子結合体を作製するために有用である。それらは、化学分野でよく知られる合成方法により調製されうる。例示的な合成スキームおよび実際の実施例は以下に記載される。
【００６５】
スキームＩは、本発明のタンパク質−高分子結合体の調製例を示す。ジアミン化合物１はアセタール基を有するが、これをＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートｍＰＥＧ（すなわち化合物２）と反応して２つＰＥＧ化された化合物３を形成し、続いてこれをアルデヒド４に変換する。このアルデヒド化合物はフリーアミノ基を有するタンパク質と還元的なアルキル化反応により反応させて、本発明のタンパク質−高分子結合体を得る。
【００６６】
【化１７】
0005613050.tif 000018
【００６７】
このように合成されたタンパク質−高分子結合体はイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、電気泳動、透析、限界ろ過、超遠心分離のような方法でさらに精製されうる。
【００６８】
上記される化学反応は溶媒、試薬、触媒、保護基および脱保護基試薬ならびに特定の反応条件を使用することを含む。その反応は、最終的にタンパク質−高分子結合体を合成できるために、本願に記載される段階の前または後に、適当な保護基を付加または除去する段階をさらに含んでいてもいい。さらに、所望のタンパク質−高分子結合体を与えるため、様々な合成段階はシーケンスを変更し、またはオーダーを変更して達成されうる。適切なタンパク質−高分子結合体を合成するのに有用な合成化学的変換および保護基の（保護および脱保護）方法は当該分野に知られており、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４）；  ａｎｄ  Ｌ．  Ｐａｑｕｅｔｔｅ，  ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９５）およびそれらの続版に記載されている方法が挙げられる。
【００６９】
本発明の結合体はとても高純度である。つまり結合体分子の８０％以上において、高分子部位は、同じタンパク質部位のＮ末端の同じ窒素原子に結合する。言い換えれば、結合体分子の少なくとも８０％において、タンパク質部位はその配列および高分子部位に結合する位置など全ての点において同一である。
【００７０】
本発明の結合体は、結合体の形態において製薬的に活性であってもいい。代わりにそれは、タンパク質部位および高分子部位間の結合を酵素が切断することで、生体内に製薬的に活性なタンパク質を放出しうる。生体内で結合を切断するのに関与する酵素の例としては、酸化酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、またはデヒドロゲナーゼ）、還元的酵素（例えば、ケトレダクターゼ）および加水分解酵素（例えば、プロテアーゼ、エステラーゼ、スルファターゼ、またはホスファターゼ）を含む。
【００７１】
したがって、本発明の一態様は、病気（例えばＨＢＶまたはＨＣＶ感染症）を治療するために上記されるタンパク質−高分子結合体の１以上を効果的な量で、投与する方法に関する。特に病気は効果的な量のタンパク質−高分子結合体の１以上を患者に投与して治療されうる。そのような患者は、適した診断方法の結果を基に、健康管理の専門家により判断されうる。
【００７２】
ここで使用される「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」の用語は、タンパク質−高分子結合体を含む組成物を疾患、疾患の兆候、当該疾患に続発病気もしくは疾患、または疾患の傾向のある患者（人間または動物）へ、その疾患、疾患の兆候、当該疾患に続発病気もしくは疾患、または疾患の傾向の治療、緩和、解放、改善、または軽減を目的とする利用または投与として定義される。「効果的な量」は治療される患者に治療効果を与えるタンパク質−高分子結合体の量を意味する。治療効果は客観的（すなわち、何かしらの試験や標識を用いた測定）または主観的（すなわち、患者の主張または効果の感覚）であっていい。
【００７３】
本発明の範囲において、薬剤組成物は、少なくとも一つの上記されるタンパク質−高分子結合体の効果的な量および製薬上許容される媒体を含む。さらに本発明は、１以上の病気を有する患者にタンパク質−高分子結合体の１以上を効果的な量で投与する方法も含む。効果的な服用量は、その分野の当業者に理解されるように、例えばタンパク質−高分子結合体の加水分解速度、治療する病気の種類、投与経路、賦形剤の使用量、および他の処置の治療で同時に用いる可能性によって、変化する。
【００７４】
本発明の方法を実施するために、上記化合物の１以上を含む組成物は非経口的、経口的、経鼻的、経直腸的、局所的、口腔的に投与されうる。本願で使用される「非経口的」の用語は、皮下的、皮内的、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液内、胸骨内、髄腔内、病巣内、腹腔内、気管内、または頭蓋内の注射、さらに適当な輸液方法を意味する。
【００７５】
殺菌注射用組成物は、無毒の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中で、溶液または懸濁液でありうる。例えば、１，３−ブタンジオール中では溶液である。用いられうる許容可能な賦形剤および溶媒は、マンニトール、水、リンガー液、および等張生理食塩水である。さらに、不揮発性油は、従来、溶媒または懸濁媒体（例えば合成モノまたはジグリセリド）として使用される。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体のような脂肪酸は、例えばオリーブ油またはひまし油のような天然の製薬上許容可能な油と同様、注入剤の調製、特にポリオキシエチル化版において有用である。これらの油溶液または懸濁液は、長鎖のアルコール希釈剤もしくは拡散剤またはカルボキシメチルセルロースもしくは同様の拡散剤をも含みうる。他に同時に使用されるツイーンやスパンのような界面活性剤または他の同様の乳化剤または生体用増進剤であって、製薬上許容可能な固体、液体、または他の剤形に一般に使用されるものはその製剤目的のために使用される。
【００７６】
経口投与用の組成物は、カプセル、錠剤、乳化剤、水性懸濁液剤、分散系製剤、および溶液などのいかなる経口可能な剤形でありうる。錠剤の場合、一般的に使用される単体としては、乳糖およびトウモロコシ澱粉が挙げられる。ステアリン酸マグネシウム塩のような平滑剤も添加される。カプセル形態での経口投与において、使用できる希釈剤としては乳糖および乾燥したトウモロコシ澱粉が挙げられる。水性懸濁液または乳化液が経口的に投与される場合、活性成分が乳化剤または懸濁化剤の混ざった油相に懸濁または溶解させられうる。所望があれば、ある種の甘味剤、芳香剤、または着色剤を添加しうる。
【００７７】
鼻腔エアロゾルまたは吸入組成物は医薬製剤の分野に周知の技法により調製されうる。例えば、このような組成物は、ベンジルアルコールもしくは他の適当な防腐剤、バイオアベイラビリティを促進するための吸収促進剤、フッ化炭素、および／または当該分野において既知の他の可溶化もしくは分散剤を用いて、生理食塩水における溶液として調製されうる。上記される化合物を１以上含む組成物は直腸投与用の座薬として投与されうる。
【００７８】
製薬上許容されうる担体は、通常、１以上の活性な上記される化合物と共に用いられる。薬剤組成物の担体は、組成物の活性成分（および好ましくは活性成分を安定化でき）に適合するという意味で「許容されうる」ものであり、治療中の患者に毒であってはならない。１以上の可溶化剤は、上述の化合物の運搬用の製薬上の賦形剤として利用されうる。他の担体は、コロイド状の酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウムおよびＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  ＃１０を例として含む。
【００７９】
適当な生体外評価法がＢ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝ウイルス炎を阻害する上記される結合体の薬効を事前に評価するために使用されうる。結合体は、生体内評価によってＢ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス感染症の治療における薬効をさらに調査されうる。例えば、それらは動物（例えばマウス）またはＢ型肝炎ウイルスもしくはＣ型肝炎ウイルス感染症を有するヒトに投与され、その治療効果が評価されうる。その結果を基に、投薬量範囲および投与経路もまた決定されうる。
【００８０】
以下の例は単に例示として構成されるものであり、いかなる方法で開示される残りの範囲を制限するものであってはならない。さらなる記述しなくても、本願の記載に基づき当業者は本発明を最大限に利用しうる。本願に引用されるすべての刊行物は、その全ての内容を参照により本願に組み込まれる。
【００８１】
［ジ−ＰＥＧアルデヒドの調製］
【００８２】
【化１８】
0005613050.tif 000019
【００８３】
２０ｋＤのＰＥＧＯ（Ｃ＝Ｏ）ＯＳｕは、ＳｕｎＢｉｏ  Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡから購入される２０ｋＤのｍＰＥＧＯＨから、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９３，  ４，５６８−５６９に記載される方法に基づき調製された。
【００８４】
６−（１，３−ジオキソラン−２−イル）ヘキサン−１，５−ジアミンのジクロロメタン溶液（ジアミンを９．０３ｍｇ、４７μｍｏｌ含む１１．９７ｇの溶液）を２０ｋＤのＰＥＧＯ（Ｃ＝Ｏ）ＯＳｕ（１．７２ｇ、８６．０μｍｏｌ）を含むフラスコに加えた。ＰＥＧＯ（Ｃ＝Ｏ）ＯＳｕが完全に溶解した後に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７９μＬ、４７８μｍｏｌ）が加えられた。反応混合物を室温で２４時間攪拌し、その後、メチルｔ−ブチルエーテル（２００ｍＬ）を攪拌下滴下した。その後の析出物を集め真空下で乾燥することでジ−ＰＥＧアセタール（１．６９ｇ、９８％）が白色固体として得られた。
【００８５】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ７．１６（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），４．７６（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），４．１０−３．９５（ｍ，４Ｈ），１．８０−１．６５（ｍ，１Ｈ），１．６５−１．５０（ｍ，１Ｈ），１．４８−１．１０（ｍ，６Ｈ）．
【００８６】
【化１９】
0005613050.tif 000020
【００８７】
ジ−ＰＥＧアセタール（４．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）がｐＨ２．０バッファー溶液（クエン酸、４０ｍＬ）に懸濁させられた。反応混合物を３５℃で２４時間攪拌し、その後ジクロロメタン（５０ｍＬ×３）で抽出された。有機相を混合し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮し、ジクロロメタン（２０ｍＬ）に再度溶解した。当該溶液をメチルｔ−ブチルエーテル（４００ｍＬ）に攪拌下滴下した。その後の析出物を回収し、減圧下で乾燥することでジ−ＰＥＧアルデヒド（３．８ｇ、９５％）を白色固体として得た。
【００８８】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ９．６０（ｓ，１Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），４．１０−３．９５（ｍ，４Ｈ），３．９５−３．８０（ｍ，１Ｈ），３．００−２．８５（ｍ，２Ｈ），２．５８−２．３６（ｍ，２Ｈ），１．４６−１．１５（ｍ，６Ｈ）．
［修飾されたインターフェロンの調製］
【００８９】
【化２０】
0005613050.tif 000021
【００９０】
修飾した組換ヒトインターフェロンα２ｂはヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用したＰＣＲ方法によりクローニングされた。オリゴヌクレオチドはヒトインターフェロンα２ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃５００２０７，Ｊａｎｕａｒｙ  ８，２００８）の隣接配列に基づき合成された。生成したＰＣＲ産物はｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に転写された。ＩＦＮ変異体はｐＧＥＭ−Ｔクローンにより再度ＰＣＲで増幅され、その後、サブクローニングとしてＮｄｅｌ／ＢａｍＨＩを用いてタンパク質発現ベクターｐＥＴ−２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターで誘導されるベクター、にサブクローンニングされた。次に、ベクターｐＥＴ−２４ａはＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）菌株に形質転換された。高発現クローンは、カラミシン（５０μｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニカル（５０μｇ／ｍＬ）の存在下で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬを維持することにより選択された。
【００９１】
Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈ培地（ＢＤ、２００ｍＬ）は、１０００ｍＬフラスコ内で、Ｐｒｏ−ＩＦＮ遺伝子を有するＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬの増殖のために使用された。そのフラスコを３７℃で２３０ｒｐｍの回転数で１６時間振とうした。バッチおよび流加培養発酵を５Ｌのジャーファーメンター（Ｂｉｏｆｌｏ３０００；Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）で行った。そのバッチ発酵は１５０ｍＬの終夜前培養接種を使い、カラミシン（５０μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニカル（５０μｇ／ｍＬ）、０．４％グリセロール、および０．５％（ｖ／ｖ）の追跡元素（１０ｇ／ＬのＦｅＳ０４・７Ｈ２Ｏ、２．２５ｇ／ＬのＺｎＳ０４・７Ｈ２Ｏ，１ｇ／ＬのＣｕＳ０４・５Ｈ２Ｏ，０．５  ｇ／ＬのＭｎＳ０４・Ｈ２０，０．３ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３，２ｇ／ＬのＣａＣ１２・２Ｈ２０，０．１ｇ／Ｌの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４，０．８４ｇ／ＬのＥＤＴＡ、５０ｍｌ／ＬのＨＣ１）を含む３ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈ培地を使用した。溶存酸素濃度は３５％に調整され、そのｐＨは５ＮのＮａＯＨ水溶液を加えることで７．２に保持された。６００ｇ／Ｌのグルコースおよび２０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む供給液が調製された。ｐＨが設定点よりも大きい値に上昇した時、適当量の供給液を加え、培養肉汁中のグルコースの濃度を高めた。Ｐｒｏ−ＩＦＮ遺伝子はＩＰＴＧを最終的に１ｍＭの濃度にまで加えることによって誘導され、培養肉汁は３時間の培養の後収集された。
【００９２】
収集された細胞ペレットは、およそ１：１０の割合（湿重量ｇ／ｍＬ）でＴＥＮ緩衝溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ）に再び懸濁させられ、マイクロ流動化装置で破壊され、その後２０分間１００００ｒｐｍで遠心分離された。封入体（ＩＢ）を含むペレットはＴＥＮ緩衝液で２度洗浄され、上記と同様にして遠心分離された。そのＩＢを含むペレットは、その後１５０ｍＫの４Ｍグアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）水溶液に懸濁され、２００００ｒｐｍで１５分間、遠心分離された。次に、当該ＩＢは５０ｍＬの６ＭのＧｕＨＣｌ溶液に可溶化された。ＧｕＨＣｌで可溶化された材料は、２００００ｒｐｍで２０分間遠心分離された。変性ＩＢを１．５Ｌの新たに調製されたリフォールディング用の緩衝溶液（１００ｍＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５ＭのＬ−アルギニン、２ｍＭのＥＤＴＡ）添加中のみ攪拌して希釈することで、リフォールディングを開始した。当該リフォールディング反応混合物は攪拌なしで４８時間インキュベートされた。そのリフォールディング組換ヒトインターフェロンα２ｂ（すなわちＰｒｏ−ＩＦＮ）は２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１Ｍの尿素、ｐＨ７．０）に透析され、さらにＱセファロースカラムクロマトグラフィーにより精製された。
【００９３】
リフォールディングされた組換ヒトタンパク質Ｐｒｏ−ＩＦＮをＱセファロースカラム（ＧＥ  アマシャム  ファルマシア，ピッツバーグ，ペンシルベニア州）にのせた。当該カラムは２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌの緩衝液（ｐＨ７．０）で前もって平衡化され、洗浄された。生成物は２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）と２００ｍＭの塩化ナトリウムの混合物で溶出された。Ｐｒｏ−ＩＦＮを含む部分は２８０ｎｍでの吸光度を元に集められた。Ｐｒｏ−ＩＦＮの濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ方法を用いたタンパク質評価キット（ピエルス，ロックフォード，イリノイ州）で決定された。
【００９４】
〔タンパク質−高分子結合体の調製〕
【００９５】
【化２１】
0005613050.tif 000022
【００９６】
上記の水（７２ｍＬ）中で調製されたジ−ＰＥＧアルデヒド（１．２ｇ、０．０３ｍｍｏｌ）の溶液に、２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０，５ｍＬ）、Ｐｒｏ−ＩＦＮ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび０．２ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．０の緩衝液２２．２ｍＬ中に２００ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物は室温で１０分間攪拌され、その後水素化シアノホウ素ナトリウム水溶液（４００ｍＭ，１．２５ｍＬ，０．５ｍｍｏｌ）を加えた。当該反応混合物は暗所で１６時間攪拌され、ＳＰ  ＸＬセファロースのカラムクロマトグラフィーにより精製された。所望のタンパク質−高分子結合体を含む部分を保持時間および２８０ｎｍでの吸光度を元に集めた。その結合体の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法を用いたタンパク質評価キット（ピエルス，ロックフォード，イリノイ州）で決定された。当該結合体の単離収率はおよそ４０％以上であった。
【００９７】
他の実施形態
本明細書に開示されるすべての事項はいかなる組合せで組み合わされていてもいい。本明細書に開示される事項は、それぞれ同様の、等価の、または似通った目的を果たす代替事項によって置き換えられてもいい。このように、特記されない限り、それぞれの開示される事項は本質的な事項、そのものまたは同様の事項の一例としてのみ用いられている。
【００９８】
上記から、当業者であれば、本発明の本質的特徴を簡単に確かめられ、本発明の概念の範囲から離れることなく、本発明の様々な使用や条件に適するように変更および改良しうるであろう。よって、他の実施形態も下記請求項の範囲に含まれる。
【配列表】
0005613050000001.app