(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプロピルアルコール生産系を備えた大腸菌において、
強化されたＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）活性を含む強化酵素活性を有するイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項２】
前記強化酵素活性が、さらに、強化されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性及び強化されたチオラーゼ活性の少なくともいずれかを含む、請求項１に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項３】
前記強化酵素活性が、前記強化されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性及び前記強化されたＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）活性及び前記強化されたチオラーゼ活性である請求項１記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項４】
前記強化酵素活性が、菌体外から導入された酵素遺伝子による強化及び菌体内の酵素遺伝子の発現増強による強化の少なくとも一方に由来するものである請求項１〜請求項３のいずれか１項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項５】
前記強化酵素活性が、宿主大腸菌のゲノム上の強化及びプラスミド導入による強化の少なくとも一方に由来するものである請求項１〜請求項４のいずれか１項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項６】
前記強化酵素活性が、エシェリヒア属細菌由来の各酵素をコードする遺伝子に由来するものである請求項１〜請求項５のいずれか１項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項７】
前記イソプロピルアルコール生産系が、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼの各酵素遺伝子により構築されたものである請求項１〜請求項６のいずれか１項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項８】
前記イソプロピルアルコール生産系が、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼの各酵素遺伝子により構築されたものであり、かつ各酵素遺伝子が、それぞれ独立に、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも１種の原核生物に由来するものである請求項１〜請求項７のいずれか１項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項９】
アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性が、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素をコードする遺伝子に由来するものであり、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素をコードする遺伝子に由来するものであり、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、チオラーゼ活性、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性及びＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）活性がエシェリヒア・コリ由来の各酵素をコードする遺伝子に由来するものである請求項７又は請求項８に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項１０】
請求項１〜請求項９のいずれか１項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソプロピルアルコール生産細菌及びこれを用いたイソプロピルアルコール生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロピレンは、ポリプロピレンなどの合成樹脂や石油化学製品の重要な基礎原料であり、自動車用バンパーや食品容器、フィルム、医療機器などに幅広く使われている。
植物由来原料から製造されたイソプロピルアルコールは、脱水工程を経てプロピレンに変換できることから、カーボンニュートラルなプロピレンの原料として有望である。京都議定書によって２００８年から２０１２年の間に先進国全体で二酸化炭素排出量を１９９０年比で５％削減することが義務付けられている現在、カーボンニュートラルなプロピレンはその汎用性から地球環境上極めて重要である。【０００３】
植物由来原料を資化してイソプロピルアルコールを生産する細菌は既に知られている。例えば国際公開２００９／００８３７７号パンフレットには、グルコースを原料としてイソプロピルアルコールを生産するように改変された細菌が開示されており、イソプロピルアルコールの選択性が高いことから工業生産用生体触媒として優れた性質を持つと記載されている。【０００４】
イソプロピルアルコール製造大腸菌においては、イソプロピルアルコールの原料がグルコースであるため、解糖および異化によって得られる夥しい数の化合物全てが副生成物となり得る。一方これらの化合物は大腸菌が生育するために必須な物質となっている場合があるため、これらの副反応で消費されるグルコースの量を完全に抑制することはできない。従って、副生成物を最小化し且つイソプロピルアルコールの生産速度を上げるためには大腸菌内で起こる全ての代謝反応を考慮しながらイソプロピルアルコールへの代謝の流れを最大にする必要があり、生物活性と物質生産の観点から、種々の技術が提案されている。【０００５】
例えば、国際公開２００９／００８３７７号パンフレットには、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼの各遺伝子が導入され、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生成しうるイソプロピルアルコール生成細菌が開示されている。このイソプロピルアルコール生産細菌の能力は、生産速度０．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、蓄積量２８．４ｇ／Ｌであると記載されている。【０００６】
国際公開２００９／０４９２７４号パンフレット及びＡｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７３（２４），ｐｐ．７８１４−７８１８，（２００７）には、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ及び、セカンダリーアルコールデヒドロゲナーゼの各遺伝子が導入され、イソプロピルアルコールを製造する大腸菌が開示されている。これらの細菌の能力は生産速度０．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、収率４３．５％、蓄積量４．９ｇ／Ｌであると記載されている。【０００７】
国際公開２００９／０２８５８２号パンフレットには、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡ：アセテートＣｏＡ−トランスフェラーゼ及びアセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの各遺伝子が導入され、イソプロピルアルコールを製造する大腸菌が開示されている。この細菌の能力は、蓄積量９．７ｇ／Ｌであると記載されている。【０００８】
Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７７（６），ｐｐ．１２１９−１２２４，（２００８）には、チオラーゼ、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、アセトアセテートデカルボキシラーゼ、プライマリー−セカンダリーアルコールデヒドロゲナーゼの各遺伝子が導入され、イソプロピルアルコールを製造する大腸菌が開示されている。この細菌の能力は生産速度０．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、収率５１％、蓄積量１３．６ｇ／Ｌであると記載されている。【０００９】
国際公開２００９／１０３０２６号パンフレットには、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、アセチルＣｏＡ：アセテートＣｏＡ−トランスフェラーゼ及びアセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの各遺伝子が導入され、イソプロピルアルコールを製造し得る大腸菌が開示されている。この細菌の能力は、収率５０％、生産速度０．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、最終生産量１４ｇ／Ｌと期待されると記載されている。【００１０】
国際公開２００９／２４７２１７号パンフレットには、アセトアセテートデカルボキシラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、チオラーゼ及び２−プロピルアルコールデヒドロゲナーゼの各遺伝子が導入され、イソプロピルアルコールを製造し得る大腸菌が開示されている。この細菌の能力は、最終生産量２ｇ／Ｌと記載されている。【００１１】
ここで、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、セカンダリーアルコールデヒドロゲナーゼ、プライマリー−セカンダリーアルコールデヒドロゲナーゼ及び２−プロピルアルコールデヒドロゲナーゼは、名称が異なるものの同じ反応を触媒する酵素であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセチルＣｏＡ：アセテートＣｏＡ−トランスフェラーゼ及びＣｏＡ−トランスフェラーゼは、名称が異なるものの同じ反応を触媒する酵素である。また、アセト酢酸デカルボキシラーゼとアセトアセテートデカルボキシラーゼは名称が異なるものの同じ反応を触媒する酵素であり、チオラーゼとアセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼも名称が異なるものの同じ反応を触媒する酵素である。従って、これらの文献によるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、生産性に種々違いはあるもののイソプロピルアルコールを製造するために利用している酵素は、国際公開２００９／００８３７７号パンフレットに記載されている、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼの４種と同様のものであり、生産性や収率を向上させるなどを目的とする場合、従来は、これら４種の酵素を検討していた。【００１２】
一方、微生物における物質生産の収率及び生産性を向上させる方策として、微生物が持つ酵素リンゴ酸デヒドロゲナーゼを欠失させる方法が知られている。
例えば、国際公開２００９／０２３４９３号パンフレットには、大腸菌による１，４−ブタンジオールの生産において、該大腸菌が保有するリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子とトランスヒドロゲナーゼ遺伝子を同時に破壊することで収率が上がると記載されている。【００１３】
また、国際公開２００９／０１２２１０号パンフレットには、大腸菌によるエタノールの生産において、該大腸菌が保有するリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子とＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を同時に破壊することで収率が上がると記載されている。
更に、国際公開２００９／１１１６７２号パンフレットには、酵母によるドデカノールの生産において、該酵母が保有するアセトアルデヒド−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子とＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子とリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を同時に破壊することが生産性向上に効果があると記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、イソプロピルアルコールを生産可能な上記細菌のいずれも、充分な生産能力を有しているとは言い難く、イソプロピルアルコール生産細菌によるイソプロピルアルコール生産の収率と生産速度を向上させることは、解決すべき大きな課題であった。
本発明は、イソプロピルアルコールを、速く且つ高い収率で生産できる大腸菌及び該大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産方法を提供することを目的とする。
【問題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は上記状況を鑑みてなされたものであり、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌及びイソプロピルアルコール生産方法は、以下のとおりである。
【００１６】
［１］  イソプロピルアルコール生産系を備えた大腸菌において、強化されたＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）活性を含む強化酵素活性を有するイソプロピルアルコール生産大腸菌。
［２］  前記強化酵素活性が、さらに、強化されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性及び強化されたチオラーゼ活性の少なくともいずれかを含む、［１］記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
［３］  前記強化酵素活性が、前記強化されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性及び前記強化されたＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）活性及び前記強化されたチオラーゼ活性である［１］記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
［４］  前記強化酵素活性が、菌体外から導入された酵素遺伝子による強化及び菌体内の酵素遺伝子の発現増強による強化の少なくとも一方に由来するものである［１］〜［３］のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
［５］  前記強化酵素活性が、宿主大腸菌のゲノム上の強化及びプラスミド導入による強化の少なくとも一方に由来するものである［１］〜［４］のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
［６］  前記強化酵素活性が、エシェリヒア属細菌由来の各酵素をコードする遺伝子に由来するものである［１］〜［５］のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
［７］  前記イソプロピルアルコール生産系が、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、及びチオラーゼの各酵素遺伝子により構築されたものである［１］〜［６］のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
［８］  前記イソプロピルアルコール生産系が、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼの各酵素遺伝子により構築されたものであり、かつ各酵素遺伝子が、それぞれ独立に、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも１種の原核生物に由来するものである［１］〜［７］のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
［９］ アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性が、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素をコードする遺伝子に由来するものであり、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素をコードする遺伝子に由来するものであり、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、チオラーゼ活性、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性及びＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）活性がエシェリヒア・コリ由来の各酵素をコードする遺伝子に由来するものである［７］又は［８］に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
［１０］  ［１］〜［９］のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の評価実験１にかかる各種ＩＰＡ生産大腸菌のＩＰＡ生産能力を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌は、イソプロピルアルコール生産系を備えると共に、強化されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性、強化されたＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）活性、及び、強化されたチオラーゼ活性からなる群より選択された少なくとも１つの強化酵素活性を有するイソプロピルアルコール生産系大腸菌である。
本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌では、上記の３種の酵素活性のうちの少なくとも１つの強化酵素活性を備えているため、イソプロピルアルコールを速く且つ高い収率で生産することができる。
【００１９】
即ち本発明は、イソプロピルアルコール生産系の活性を高めるために種々検討した結果、グルコースの代謝経路にある酵素の一つであるリンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰ＋の酸化還元に関与する酵素であるＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）活性、イソプロピルアルコール生産系のひとつであるチオラーゼ活性の少なくともいずれかの活性を強化することによって、該大腸菌による生成物であるイソプロピルアルコールの生産速度が上がり、収率が向上することを見出したものである。
【００２０】
本発明における「活性」又は「能力」の「強化」とは、強化前のイソプロピルアルコール生産大腸菌での各種酵素活性が強化後に高まることを広く意味する。
強化の方法としては、イソプロピルアルコール生産大腸菌が本来有している各種酵素の活性が高まれば、特に制限はなく、菌体外から導入された酵素遺伝子による強化、菌体内の酵素遺伝子の発現増強による強化又はこれらの組み合わせを挙げることができる。
【００２１】
菌体外から導入された酵素遺伝子による強化としては、具体的には、宿主由来の酵素よりも高活性の酵素をコードする遺伝子を、宿主細菌の菌体外から菌体内に導入して、導入された酵素遺伝子による酵素活性を追加又は、宿主由来の酵素遺伝子による酵素活性を当該導入された酵素遺伝子による酵素活性に置換すること、宿主由来の酵素遺伝子又は菌体外からの酵素遺伝子の数を２以上に増加させること、又はこれらの組み合わせを挙げることができる。
菌体内の酵素遺伝子の発現増強による強化としては、具体的には、酵素遺伝子の発現を増強する塩基配列を宿主細菌の菌体外から菌体内に導入すること、宿主細菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーターを他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子の発現を強化させること、又はこれらの組み合わせを挙げることができる。
本発明において「宿主」とは、ひとつ以上の遺伝子の菌体外からの導入を受けた結果、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌となる当該大腸菌を意味する。
【００２２】
なお、本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
以下に、本発明について説明する。
【００２３】
本発明におけるリンゴ酸デヒドロゲナーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．４０に分類され、Ｌ−リンゴ酸からピルビン酸とＣＯ２を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、Ｔｒｉｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ等のＴｒｉｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ属原虫、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ  等のＲｈｉｚｏｂｉｕｍ細菌、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｆａｔａｒｉｃｕｓ等のＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ細菌、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ等のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ等のＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属細菌由来のものが挙げられる。
【００２４】
本発明において用いられるリンゴ酸デヒドロゲナーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ細菌、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ細菌、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌又はＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属細菌などの原核生物に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００２５】
有用物質の生産向上を目的として、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性及び該酵素をコードする遺伝子の発現を強化した知見は、現在までに一切見られない。むしろ、微生物による物質生産においては、ＷＯ２００９／０２３４９３、ＷＯ２００９／０１２２１０、ＷＯ２００９／１１１６７２に記載されているように、生産性や収率を向上させるためには微生物内に存在するリンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性又は該酵素をコードする遺伝子を欠失させるべきであるとの考え方が一般的である。よって、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性を強化することによりイソプロピルアルコールの生産速度と収率が向上することは、全く予想外であった。
【００２６】
本発明におけるＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．６．１．２に分類され、以下の反応を触媒する酵素の総称を指す。
ＮＡＤＰＨ  ＋  ＮＡＤ＋  ⇔ＮＡＤＰ＋  ＋  ＮＡＤＨ
ここで、ＮＡＤＰとはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）であり、ＮＡＤＰＨとはその還元型を指す。また、ＮＡＤとはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）であり、ＮＡＤＨとはその還元型を指す。
【００２７】
ＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ及びＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ等のＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ等のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属細菌由来のものが挙げられる。
本発明において用いられるＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）の遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属細菌などの原核生物に由来するものを挙げることができ、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００２８】
本発明におけるチオラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．３．１．９に分類され、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）細菌、ズーグロア・ラミゲラ（Ｚｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａ）等のズーグロア属細菌、リゾビウム種（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）等のブラディリゾビウム属細菌、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）等のカンジダ属細菌、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｌｌｉｎｕｓ）等のストレプトマイセス属細菌、エンテロコッカス・ファカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）等のエンテロコッカス属細菌由来のものが挙げられる。
【００２９】
本発明において用いられるチオラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるチオラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種の細菌、ズーグロア・ラミゲラ等のズーグロア属細菌、リゾビウム種の細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム等のブラディリゾビウム属細菌、カンジダ・トロピカリス等のカンジダ属細菌、カウロバクター・クレセンタス等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス等のストレプトマイセス属細菌、エンテロコッカス・ファカリス等のエンテロコッカス属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。より好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はエシェリヒア属細菌などの原核生物に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００３０】
本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌は、上記の３種の酵素活性をそれぞれ高めた強化酵素活性のうち少なくとも１つの酵素活性を備えている。３種の強化酵素活性のうち、チオラーゼ活性は、後述するイソプロピルアルコール生産系のひとつを構成する酵素でもあるため、本大腸菌の強化酵素活性の対象として含まれる場合、チオラーゼ活性を更に強化したものであることを要する。このような強化としては前述の通り、チオラーゼをコードする遺伝子の発現をプラスミド又はゲノム上で強化すること、チオラーゼ遺伝子のコピー数を増加すること又はこれらの組み合わせなどを挙げることができる。
【００３１】
本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、イソプロピルアルコール生産系を備えた大腸菌であり、遺伝子組み換えにより導入又は改変されたイソプロピルアルコール生産能力を保有する大腸菌をいう。このようなイソプロピルアルコール生産系は、対象となる大腸菌にイソプロピルアルコールを生産させるものであればいずれのものであってもよい。
好ましくは、イソプロピルアルコールの生産に関与する酵素活性の強化を挙げることができる。本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及び前述したチオラーゼ活性の４種類の酵素活性が、菌体外から付与され若しくは菌体内において発現増強され、又はこれら双方がなされていることが更に好ましい。
【００３２】
本発明における「遺伝子組み換えにより」との文言は、生来の遺伝子の塩基配列に対する別のＤＮＡの挿入、あるいは遺伝子のある部分の置換、欠失又はこれらの組み合わせによって塩基配列上の変更が生じているものであれば全て包含し、例えば、突然変異が生じた結果得られたものであってもよい。
【００３３】
本発明におけるアセト酢酸デカルボキシラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号４．１．１．４に分類され、アセト酢酸からアセトンを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）等のクロストリジウム属細菌、バチルス・ポリミクサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）等のバチルス属細菌由来のものが挙げられる。
【００３４】
本発明の宿主細菌に導入されるアセト酢酸デカルボキシラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はバチルス属細菌に由来するものを挙げることができ、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム、バチルス・ポリミクサ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００３５】
本発明におけるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．８０に分類され、アセトンからイソプロピルアルコールを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）等のクロストリジウム属細菌由来のものが挙げられる。
【００３６】
本発明の宿主細菌に導入されるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム属細菌に由来するものを挙げることができ、例えばクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００３７】
本発明におけるＣｏＡトランスフェラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．８．３．８に分類され、アセトアセチルＣｏＡからアセト酢酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）等ファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：大腸菌）等エシェリヒア属細菌由来のものが挙げられる。
【００３８】
本発明において用いられるＣｏＡトランスフェラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム・アセトブチリカム等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ等のファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。より好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はエシェリヒア属細菌に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００３９】
本発明におけるイソプロピルアルコール生産のために用いられるチオラーゼとは、前述の通り、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．３．１．９に分類され、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。そのようなチオラーゼに関する事項については、前述した事項がそのまま適用される。
【００４０】
このうち、上記４種類の酵素はそれぞれ、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも１種由来のものであることが酵素活性の観点から好ましく、なかでも、アセト酢酸デカルボキシラーゼ及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼがクロストリジウム属細菌由来であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア属細菌由来である場合と、これら４種類の酵素がいずれもクロストリジム属細菌由来である場合が更に好ましい。
【００４１】
なかでも本発明にかかる４種類の酵素はそれぞれ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジュリンキ又はエシェリヒア・コリのいずれか由来のものであることが酵素活性の観点から好ましく、アセト酢酸デカルボキシラーゼがクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼが、それぞれクロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の酵素であり、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼが、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素であることがより好ましく、上記４種類の酵素は、酵素活性の観点から、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性がクロストリジウム・アセトブチリカム由来であり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア・コリ由来であることが特に好ましい。
【００４２】
本発明において、チオラーゼ活性を含むイソプロピルアルコール生産系を備えているイソプロピルアルコール生産大腸菌の例として、ＷＯ２００９／００８３７７号に記載のｐＩＰＡ/Ｂ株又はｐＩａａａ/Ｂ株を例示できる。また、該大腸菌には、イソプロピルアルコールの生産に関与する酵素のうち、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性とチオラーゼ活性の増強は該大腸菌のゲノム上の各遺伝子の発現を強化することで行い、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性とアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性の増強は各遺伝子の発現をプラスミドで強化した株（ｐＩａ/Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株と呼ぶことがある）を含む。
【００４３】
本発明では、強化酵素活性としては、イソプロピルアルコール生産性をより効果的に向上させる観点から、強化されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性が含まれることが好ましい。強化されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性及び強化されたチオラーゼ活性が含まれること、又は強化されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性及び強化されたＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）活性が含まれることが更に好ましく、強化されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性及び強化されたＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）活性及び強化されたチオラーゼ活性の強化酵素活性をいずれも備えていることが最も好ましい。
また、本発明では、上記リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）及びチオラーゼをコードする各遺伝子の発現を増強することが最も好ましい。これにより、各酵素の活性を単独で強化した場合と比してイソプロピルアルコールの生産性及び収率を驚異的に向上させることできる。
【００４４】
本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌の好ましい態様としては、上記ｐＩＰＡ/Ｂ株、ｐＩａａａ/Ｂ株又はｐＩａ/Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株に、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性又は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性に加えてＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）及び／又はチオラーゼ活性を強化した株である。この株におけるチオラーゼ活性は、プラスミドとゲノム上の両方でチオラーゼをコードする遺伝子の発現を増強したものであってもよい。
更に好ましい態様としては、上記ｐＩＰＡ/Ｂ株、ｐＩａａａ/Ｂ株又はｐＩａ/Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株に、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性又は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性に加えてＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）及び／又はチオラーゼの活性を同時に強化した株である。この株においてチオラーゼ活性は、プラスミドとゲノム上の両方でチオラーゼをコードする遺伝子の発現を増強したものであってもよい。
【００４５】
特に好ましい態様としては、上記ｐＩＰＡ/Ｂ株、ｐＩａａａ/Ｂ株又はｐＩａ/Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株にリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性、ＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）活性及びチオラーゼ活性を同時に強化した株である。この株においてチオラーゼ活性は、プラスミドとゲノム上の両方でチオラーゼをコードする遺伝子の発現を増強したものであってもよい。
更に最も好ましい態様としては、上記又はｐＩａ/Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株にリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性、ＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）活性及びチオラーゼ活性を同時に強化した株である。この株において、チオラーゼ活性は、プラスミドとゲノム上の両方でチオラーゼをコードする遺伝子の発現を増強したものであってもよい。
【００４６】
本発明における遺伝子のプロモーターとは、上記いずれかの遺伝子の発現を制御可能なものであればよいが、恒常的に微生物内で機能する強力なプロモーターで、かつグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターであり、具体的にはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーターやセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのプロモーターを例示することができる。
本発明におけるプロモーターとはシグマ因子を有するＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始する部位を意味する。例えばエシェリヒア・コリ由来のＧＡＰＤＨプロモーターはＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、塩基番号３９７−４４０に記されている。
【００４７】
大腸菌由来のＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ａｔｏＤ及びａｔｏＡ）とチオラーゼ遺伝子（ａｔｏＢ）は、ａｔｏＤ、ａｔｏＡ、ａｔｏＢの順番で大腸菌ゲノム上でオペロンを形成しているため（Journal of Baceteriology Vol.169 pp 42-52 Lauren Sallus Jenkinsら）、ａｔｏＤのプロモーターを改変することによって、ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子とチオラーゼ遺伝子の発現を同時に制御することが可能である。
このことから、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が宿主大腸菌のゲノム遺伝子より得られたものである場合、充分なイソプロピルアルコール生産能力を獲得する観点から、両酵素遺伝子の発現を担うプロモーターを他のプロモーターと置換する等によって両酵素遺伝子の発現を増強することが好ましい。ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性の発現を増強するために用いられるプロモーターとしては、前述のエシェリヒア・コリ由来ＧＡＰＤＨプロモーター等を挙げることができる。
【００４８】
本発明におけるこれらの酵素の活性は、菌体外から菌体内へ導入されたもの又は、宿主細菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させたものとすることができる。
酵素活性の導入は、例えば酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて宿主細菌の菌体外から菌体内に導入することにより行うことができる。このとき、導入される酵素遺伝子は、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれであってもよい。菌体外から菌体内へ遺伝子を導入する際に必要なゲノムＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、ＰＣＲ（Polymerase  Chain  Reaction）、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Sambrook, J., et al.,  ”Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)などに記載されている。
【００４９】
本発明において酵素の活性を強化した大腸菌とは、何らかの方法によって該酵素活性が強化された大腸菌を指す。これらの大腸菌は、例えば該酵素及び蛋白質をコードする遺伝子を、前述したものと同様の遺伝子組換え技術を用いて菌体外から菌体内にプラスミドを用いて導入する又は、宿主大腸菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させる、等の方法を用いて作出することができる。
【００５０】
本発明において大腸菌とは、本来、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産する能力を有するか否かに関わらず、何らかの手段を用いることにより植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産する能力を有し得る大腸菌を意味する。
【００５１】
ここで上記の遺伝子組換えの対象となる大腸菌としては、イソプロピルアルコール生産能を有しないものであってもよく、上記の各遺伝子の導入及び変更が可能であればいずれの大腸菌であってもよい。
より好ましくは、イソプロピルアルコール生産能が予め付与された大腸菌であることができ、これにより、より効率よくイソプロピルアルコールを生産させることができる。
【００５２】
このようなイソプロピルアルコール生産大腸菌としては、例えばＷＯ２００９／００８３７７号パンフレットに記載されているアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与され、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生成しうるイソプロピルアルコール生成大腸菌などを挙げることができる。
【００５３】
本発明のイソプロピルアルコール生産方法は、上記イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産させることを含むものであり、即ち、上記イソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料とを接触させて、培養する工程と、接触により得られたイソプロピルアルコールを回収する回収工程とを含むものである。
【００５４】
上記イソプロピルアルコール生産方法に用いられる植物由来原料は、植物から得られる炭素源であり、植物由来原料であれば特に制限されない。本発明においては、根、茎、幹、枝、葉、花、種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物を指し、更に植物体、植物器官、またはそれらの分解産物から得られる炭素源のうち、微生物が培養において炭素源として利用し得るものも、植物由来原料に包含される。
【００５５】
このような植物由来原料に包含される炭素源には、一般的なものとしてデンプン、スクロース、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース等の糖類、またはこれら成分を多く含む草木質分解産物、セルロース加水分解物など又はこれらの組み合わせを挙げることができ、更には植物油由来のグリセリン又は脂肪酸も、本発明における炭素源に含んでもよい。
【００５６】
本発明における植物由来原料の例示としては、穀物等の農作物、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿等、又はこれらの組み合わせを好ましく挙げることができ、その原料としての使用形態は、未加工品、絞り汁、粉砕物等、特に限定されない。また、上記の炭素源のみの形態であってもよい。
【００５７】
培養工程におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料との接触は、一般に、植物由来原料を含む培地でイソプロピルアルコール生産大腸菌を培養することにより行われる。
【００５８】
植物由来原料とイソプロピルアルコール生産大腸菌との接触密度は、イソプロピルアルコール生産大腸菌の活性によって異なるが、一般に、培地中の植物由来原料の濃度として、グルコース換算で初発の糖濃度を混合物の全質量に対して２０質量％以下とすることができ、大腸菌の耐糖性の観点から好ましくは、初発の糖濃度を１５質量％以下とすることができる。この他の各成分は、微生物の培地に通常添加される量で添加されればよく、特に制限されない。
【００５９】
また培地中のイソプロピルアルコール生産大腸菌の含有量としては、大腸菌の種類及び活性によって異なるが一般に、初発の菌濃度を培養液に対して０．１質量％から３０質量％、培養条件制御の観点から好ましくは１質量％〜１０質量％とすることができる。
【００６０】
イソプロピルアルコール生産大腸菌の培養に用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、及び乳酸を生産するために微生物が要求する有機微量元素、核酸、ビタミン類等が含まれた通常用いられる培地であれば特に制限はない。
【００６１】
本発明の培養に際して、培養条件は特別の制限はなく、例えば好気条件下でｐＨ４〜９、好ましくはｐＨ６〜８、温度２０℃〜５０℃、好ましくは２５℃〜４２℃の範囲内でｐＨと温度を適切に制御しながら培養することができる。
【００６２】
前記混合物中への気体の通気量は、特に制限はないが、気体として空気のみを用いる場合には、一般的に０．０２ｖｖｍ〜２．０ｖｖｍ（ｖｖｍ；通気容量〔ｍＬ〕／液容量〔ｍＬ〕／時間〔分〕）であり、大腸菌への物理的ダメージを抑制する観点から０．１ｖｖｍ〜２．０ｖｖｍで行うことが好ましい。
【００６３】
培養工程は、培養開始から混合物中の植物由来原料が消費されるまで、又はイソプロピルアルコール生産大腸菌の活性がなくなるまで継続させることができる。培養工程の期間は、混合物中のイソプロピルアルコール生産大腸菌の数及び活性並びに、植物由来原料の量により異なるが、一般に、１時間以上、好ましくは４時間以上であればよい。一方、植物由来原料又はイソプロピルアルコール生産大腸菌の再投入を行うことによって、培養期間は無制限に連続することができるが、処理効率の観点から、一般に５日間以下、好ましくは７２時間以下とすることができる。その他の条件は、通常の培養に用いられる条件をそのまま適用すればよい。
【００６４】
培養液中に蓄積したイソプロピルアルコールを回収する方法としては、特に制限はないが、例えば培養液から菌体を遠心分離などで除去した後、蒸留や膜分離等通常の分離方法でイソプロピルアルコールを分離する方法が採用できる。
【００６５】
なお、本発明のイソプロピルアルコールの生産方法は、イソプロピルアルコール生産のための培養工程の前に、使用するイソプロピルアルコール生産大腸菌を適切な菌数又は適度な活性状態とするための前培養工程を含んでいてもよい。前培養工程は、イソプロピルアルコール生産細菌の種類に応じた通常用いられる培養条件による培養であればよい。
【００６６】
本発明のイソプロピルアルコールの生産方法は、好ましくは、前記イソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物中に気体を供給しながら、該イソプロピルアルコール生産大腸菌を培養する培養工程と、前記培養により生成したイソプロピルアルコールを混合物から分離し回収する回収工程とを含む。
【００６７】
この方法によれば、混合物に気体を供給しながら生産大腸菌を培養する（通気培養）。この通気培養により、生産されたイソプロピルアルコールは混合物中に放出されると共に、混合物から蒸散し、この結果、生成したイソプロピルアルコールを混合物から容易に分離することができる。また、生成したイソプロピルアルコールが混合物から連続的に分離するため、混合物中のイソプロピルアルコールの濃度の上昇を抑制することができる。これにより、イソプロピルアルコール生産大腸菌のイソプロピルアルコールに対する耐性を特に考慮する必要がない。
なお、本方法における混合物とは、大腸菌の培養に一般的に用いられる基本培地を主体とすればよい。培養条件については、前述した事項がそのまま適用される。
【００６８】
回収工程では、培養工程で生成され、混合物から分離したイソプロピルアルコールを回収する。この回収方法としては、通常培養により混合物から蒸散したガス状又は飛沫状のイソプロピルアルコールを収集することができるものであればよい。このような方法としては、一般に用いられる密閉容器等の収集部材へ収容すること等を挙げることができるが、なかでも、イソプロピルアルコールのみを純度高く回収できる観点から、イソプロピルアルコールを捕捉するための捕捉液と、混合物から分離したイソプロピルアルコールとを接触することを含むものであることが好ましい。
【００６９】
本方法では、イソプロピルアルコールは、捕捉液又は混合物に溶解した態様として回収することができる。そのような回収方法としては、例えば国際公開２００９／００８３７７号パンフレットに記載された方法などが挙げられる。回収されたイソプロピルアルコールは、ＨＰＬＣ等の通常の検出手段を用いて確認することができる。回収されたイソプロピルアルコールは、必要に応じて更に精製することができる。このような精製方法としては、蒸留等をあげることができる。
回収されたイソプロピルアルコールが水溶液の状態である場合には、本イソプロピルアルコールの生産方法は、回収工程に加えて、脱水工程を更に含んでいてもよい。イソプロピルアルコールの脱水は、常法により行なうことができる。
【００７０】
捕捉液又は混合物に溶解した態様として回収可能なイソプロピルアルコールの生産方法に適用可能な装置としては、例えば、国際公開２００９／００８３７７号パンフレットの図１に示される生産装置を挙げることができる。
この生産装置では、イソプロピルアルコール生産細菌と植物由来原料とを含む培地が収容された培養槽に、装置外部から気体を注入するための注入管が連結され、培地に対してエアレーションが可能となっている。
また、培養槽には、連結管を介して、捕捉液としてのトラップ液が収容されたトラップ槽が連結されている。このとき、トラップ槽へ移動した気体又は液体がトラップ液と接触してバブリングが生じる。
これにより、培養槽で通気培養により生成したイソプロピルアルコールは、エアレーションによって蒸散して培地から容易に分離される共に、トラップ槽においてトラップ液に補足される。この結果、イソプロピルアルコールを、より精製された形態で連続的に且つ簡便に生産することができる。
【００７１】
本発明のイソプロピルアルコールの生産方法では、イソプロピルアルコールを速く生成することができ、同様の方法で通常得られる生産速度は本発明を適用しない場合と比較して高い。生産方法の条件や用いられるイソプロピルアルコール生産大腸菌の状態によって異なるが、生産速度が０．７〜２．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、好ましくは０．９〜１．９ｇ／Ｌ／ｈｒとすることができる。また、本発明のイソプロピルアルコールの生産方法では、イソプロピルアルコールをグルコースから効率よく生成することができ、同様の方法で通常得られる収率は本発明を適用しない場合と比較して高い。生産方法の条件や用いられるイソプロピルアルコール生産大腸菌の状態によって異なるが、培養工程終了時において収率が５１〜８０％、好ましくは５１〜６６％とすることができる。
【００７２】
本発明において収率とは、基質であるグルコースが代謝産物であるイソプロピルアルコールに変換される化学量論式に基づく変換率を示している。イソプロピルアルコール製造大腸菌においてはグルコース１ｍｏｌからイソプロピルアルコールは１ｍｏｌ生成されるため、グルコース及びイソプロピルアルコールの分子量（グルコース＝１８０、イソプロピルアルコール＝６０）を勘案すると、グルコース１８０ｇを全てイソプロピルアルコールへ変換したとしてもイソプロピルアルコールは６０ｇしか生成されず、それ以上にはなり得ない。この理論上最大となる変換率を本発明では収率１００％とする。
【００７３】
このように本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌は、イソプロピルアルコールを速く、高い収率で生産することが出来るため、例えば、本発明の大腸菌触媒を用いてイソプロピルアルコールの製造を行った場合、培養７２時間で９７ｇ／Ｌ以上のイソプロピルアルコールを蓄積することができ、従来触媒と比較してはるかに高い生産性を獲得することができる。
【実施例】
【００７４】
以下に、本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。なお、記載中の「％」は特に断らない限り、質量基準である。
［実施例１］
＜［Ｂ：：ｐｎｔＡ］  エシェリヒア・コリＢ株ｐｎｔゲノム強化株の作製＞
エシェリヒア・コリＢ株のゲノム上のｐｎｔＡ遺伝子プロモーターをＧＡＰＤＨプロモーターへ置換し、ｐｎｔＡ遺伝子の発現を強化した。
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）αサブユニットをコードする遺伝子（以下、ｐｎｔＡと略することがある）の塩基配列も報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０４１９５）。また、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡ上において、ｐｎｔＡは膜トランスヒドロゲナーゼ  βサブユニット（ｐｎｔＢ）とオペロンを形成していることも知られている。【００７５】
上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇｃｔｃａａｔｔｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号１）、及びａｃａｇａａｔｔｃｇｃｔａｔｔｔｇｔｔａｇｔｇａａｔａａａａｇｇ（配列番号２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＭｆｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１９（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２５１４）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、さらにアルカリフォスファターゼ処理したものとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニー１０個を、それぞれアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、プラスミドを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化した際、ＧＡＰＤＨプロモーターが切り出されないものを選抜し、さらに、ＤＮＡ配列を確認しＧＡＰＤＨプロモーターが正しく挿入されたものをｐＵＣｇａｐＰとした。得られたｐＵＣｇａｐＰを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。【００７６】
さらにｐｎｔＡを取得するために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｇｃａｇｃａａｔｔｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇｃｇａａｔｔｇｇｃａｔａｃｃａａｇ（配列番号３）、及びｇｇａｃａａｇｃｔｔａａｔｔｔｔｔｇｃｇｇａａｃａｔｔｔｔｃａｇｃ（配列番号４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＭｆｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１．６ｋｂｐのｐｎｔＡフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントを先に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣｇａｐＰと混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ｐｎｔＡが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰｐｎｔＡと命名した。
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【００７７】
先述した通り、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡは明らかとされており、ｐｎｔＡの近傍の塩基配列も報告されている。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のｐｎｔＡの５’近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、ａｔｇｇｔａｃｃｇｃａｇｔａａｔａｃｇｃｔｇｇｔｔｇｃ（配列番号５）とｃｃｔｃｔａｇａｃｔｔｃｃａｔｃｇｇｔｔｔｔａｔｔｇａｔｇａｔｇｇ（配列番号６）を用いて、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎＩとＸｂａＩで処理した。【００７８】
また、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のＧＡＰＤＨプロモーターの配列情報に基づいて作製されたｇｇｔｃｔａｇａｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号７）と、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のｐｎｔＡの配列情報に基づいて作製された配列番号４のプライマーを用いて、先に作製した発現ベクターｐＧＡＰｐｎｔＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨプロモーターとｐｎｔＡからなる約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理した。【００７９】
上記により得られたｐｎｔＡ５’近傍領域のＤＮＡ断片、およびＧＡＰＤＨプロモーターとｐｎｔＡからなるＤＮＡ断片を温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）〔Hashimoto-Gotoh, T., Gene, 241, 185-191 (2000)〕をＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られるＤＮＡ断片と混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５α株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、ｐｎｔＡ５’近傍領域、ＧＡＰＤＨプロモーター、ｐｎｔＡが正しく挿入されていることを確認した。このプラスミドをエシェリヒア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体を、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。得られた培養菌体を、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で培養しコロニーを得た。得られたコロニーを、抗生物質を含まないＬＢ液体培地で３０℃で４時間培養し、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【００８０】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれを、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにこれらのクローンのゲノムＤＮＡからＰＣＲによりＧＡＰＤＨプロモーターとｐｎｔＡを含む約１．７ｋｂｐ断片を増幅させ、ｐｎｔＡプロモーター領域がＧＡＰＤＨプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをエシェリヒア・コリＢ株ｐｎｔＡ欠失ＧＡＰｐｐｎｔＡゲノム挿入株（以降、Ｂ：：ｐｎｔ株と略することがある）と命名した。
なお、エシェリシア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【００８１】
［実施例２］
＜［ｐＧＡＰ−Ｉａａａ／Ｂ：：ｐｎｔ］  エシェリヒア・コリ由来チオラーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターを導入したエシェリヒア・コリＢ株ｐｎｔゲノム強化株の作製＞
以下のように、ＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）遺伝子（ｐｎｔ）の発現を強化したイソプロピルアルコール製造大腸菌を作製した。
ＷＯ２００９／００８３７７の実施例４に記載されているｐＧＡＰ−Ｉａａａを、実施例１で作製したＢ：：ｐｎｔ株に形質転換することで、ｐＧＡＰ−Ｉａａａ／Ｂ：：ｐｎｔ株を得た。ｐＧＡＰ−Ｉａａａとは、エシェリヒア・コリ由来チオラーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、クロストリジウム・アセトブチリカム由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、及びクロストリジウム・ベイジェリンキ由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を、エシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプロモーターを用いて強発現する機能を持つ発現ベクタープラスミドのことである。ｐＧＡＰ−Ｉａａａの作製方法は、ＷＯ２００９／００８３７７の実施例４に明記されている。【００８２】
［実施例３］
＜［Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ］  エシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤＡＢゲノム強化株の作製＞
大腸菌由来のＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ａｔｏＤ及びａｔｏＡ）とチオラーゼ遺伝子（ａｔｏＢ）は、ａｔｏＤ、ａｔｏＡ、ａｔｏＢの順番で、大腸菌ゲノム上でオペロンを形成しているため（Journal of Baceteriology Vol.169 pp 42-52 Lauren Sallus Jenkinsら）、ａｔｏＤのプロモーターを改変することによって、ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子とチオラーゼ遺伝子の発現を同時に制御することが可能である。そこで、宿主大腸菌のゲノム上のａｔｏＤ遺伝子のプロモーターをＧＡＰＤＨプロモーターに置換し、ゲノム上のａｔｏＤ、ａｔｏＡ及びａｔｏＢ遺伝子の発現を強化した大腸菌を作製した。【００８３】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のＣｏＡトランスフェラーゼ  αサブユニットをコードする遺伝子（以下、ａｔｏＤと略することがある）の塩基配列も報告されている。すなわちａｔｏＤはＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム配列の２３２１４６９〜２３２２１３１に記載されている。【００８４】
上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプロモーター配列を使用することができる。ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇｃｔｃａａｔｔｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号１）、及びａｃａｇａａｔｔｃｇｃｔａｔｔｔｇｔｔａｇｔｇａａｔａａａａｇｇ（配列番号２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＭｆｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１９（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２５１４）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、さらにアルカリフォスファターゼ処理したものとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニー１０個を、それぞれアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、プラスミドを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化した際、ＧＡＰＤＨプロモーターが切り出されないものを選抜し、さらに、ＤＮＡ配列を確認しＧＡＰＤＨプロモーターが正しく挿入されたものをｐＵＣｇａｐＰとした。得られたｐＵＣｇａｐＰを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化した。【００８５】
さらにａｔｏＤを取得するために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇａａｔｔｃｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａａａａｃａａａａｔｔｇａｔｇａｃａｔｔａｃａａｇａｃ（配列番号８）、及びｇｃｇｇｔａｃｃｔｔａｔｔｔｇｃｔｃｔｃｃｔｇｔｇａａａｃｇ（配列番号９）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化することで約６９０ｂｐのａｔｏＤフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントを先に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化したｐＵＣｇａｐＰと混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ａｔｏＤが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰａｔｏＤと命名した。
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【００８６】
上述した通り、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡにおけるａｔｏＤの塩基配列も報告されている。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のａｔｏＤの５’近傍領域の遺伝子情報に基づいて作製されたｇｃｔｃｔａｇａｔｇｃｔｇａａａｔｃｃａｃｔａｇｔｃｔｔｇｔｃ（配列番号１０）とｔａｃｔｇｃａｇｃｇｔｔｃｃａｇｃａｃｃｔｔａｔｃａａｃｃ（配列番号１１）を用いて、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。【００８７】
また、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のＧＡＰＤＨプロモーターの配列情報に基づいて作製されたｇｇｔｃｔａｇａｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号１２）とエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のａｔｏＤの配列情報に基づいて作製された配列番号９のプライマーを用いて、先に作製した発現ベクターｐＧＡＰａｔｏＤを鋳型としてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨプロモーターとａｔｏＤからなる約７９０ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。【００８８】
上記により得られたフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩ、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化し、このフラグメントを、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）〔Hashimoto-Gotoh, T., Gene, 241, 185-191 (2000)〕をＰｓｔＩとＫｐｎＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５α株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをエシェリヒア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。得られた培養菌体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で培養しコロニーを得た。得られたコロニーを、抗生物質を含まないＬＢ液体培地で３０℃で２時間培養し、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【００８９】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれを、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらのクローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりＧＡＰＤＨプロモーターとａｔｏＤを含む約７９０ｂｐ断片を増幅させ、ａｔｏＤプロモーター領域がＧＡＰＤＨプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをエシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤ欠失ＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入株（以降、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株と略することがある）と命名した。【００９０】
［実施例４］
＜［ｐＧＡＰ−Ｉａ］  クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターの構築＞
イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＩＰＡｄｈ）を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ＮＲＲＬ  Ｂ−５９３のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ａａｔａｔｇｃａｔｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａａａｇｇｔｔｔｔｇｃａａｔｇｃｔａｇｇ（配列番号１３）、及びｇｃｇｇａｔｃｃｃｔｃｇａｇｔｔａｔａａｔａｔａａｃｔａｃｔｇｃｔｔｔａａｔｔａａｇｔｃ（配列番号１４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳｐｈＩ、ＢａｍＨＩで消化することで約１．１ｋｂｐのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと、ｐＢＲｇａｐＰ（ＷＯ２００９／００８３７７の実施例４に記載されている）を制限酵素ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収しＩＰＡｄｈが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰ−ＩＰＡｄｈと命名した。【００９１】
アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ａｄｃ）を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ８２４のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ｃａｃｔｃｇａｇｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇｔｔａａａｇｇａｔｇａａｇｔａａｔｔａａａｃａａａｔｔａｇｃ（配列番号１５）、及びｇｇａａｔｔｃｇｇｔａｃｃｇｔｃｇａｃｔｃｔａｇａｇｇａｔｃｃｔｔａｃｔｔａａｇａｔａａｔｃａｔａｔａｔａａｃｔｔｃａｇｃ（配列番号１６）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで約７００ｂｐのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと、先に作製したプラスミドｐＧＡＰ−ＩＰＡｄｈを制限酵素ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで得られるフラグメントとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、ａｄｃが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰ-Ｉａと命名した。
なお、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ＮＲＲＬ  Ｂ−５９３は細胞・微生物バンクであるＶＴＴカルチャーコレクションより入手することができる。【００９２】
［実施例５］
＜［ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ］  クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びエシェリヒア・コリ由来チオラーゼ遺伝子発現ベクターの構築＞
エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＣＰ０００８１９）、エシェリヒア・コリのチオラーゼ（アセチルＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子（ａｔｏＢ）の塩基配列も報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０８４６５）。ａｔｏＢ（１，１８５ｂｐ）をクローニングするため、ｃｇｇｇａｔｃｃｔｔａａｔｔｃａａｃｃｇｔｔｃａａｔｃａｃ（配列番号１７）、ｔｔｃｃａｔａｔｇａａａａａｔｔｇｔｇｔｃａｔｃｇｔｃ（配列番号１８）、に示すオリゴヌクレオチドプライマーを２種合成した。配列番号１７のプライマーは５’末端側にＮｄｅＩＩ認識部位を、配列番号１８のプライマーは５’末端側にＢａｍＨＩ認識部位それぞれ有している。
エシェリヒア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）のゲノムＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ社製のＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔを用いて調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１７と配列番号１８のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ａｔｏＢ断片と呼ぶことがある）。このａｔｏＢ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化した。この消化断片と、前記ｐＢＲｇａｐＰのＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ消化物とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３７℃で生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、ａｔｏＢが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰ−ａｔｏＢと命名した。得られたプラスミドｐＧＡＰ−ａｔｏＢをＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＧＡＰＤＨプロモーターとａｔｏＢを含む断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、この断片をｇａｐＰ−ａｔｏＢとした。この断片ｇａｐＰ−ａｔｏＢと、実施例４で作成したプラスミドｐＧＡＰ−Ｉａを制限酵素ＢａｍＨＩで消化することで得られる断片とを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社    ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、ｇａｐＰ−ａｔｏＢが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰ−Ｉａ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢと命名した。【００９３】
［実施例６］
＜［ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株］  ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢを導入したエシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤＡＢゲノム強化株の作製＞
上記実施例５に記載されているｐＧＡＰ−Ｉａ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢを、実施例３で作成したＢ：：ａｔｏＤＡＢ株に形質転換し、チオラーゼ遺伝子（ａｔｏＢ）の発現をプラスミドとゲノムの両方で強化したイソプロピルアルコール製造大腸菌ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株を得た。【００９４】
［実施例７］
＜［ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ］  クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びエシェリヒア・コリ由来リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターの構築＞
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、エシェリヒア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ｃｇｇｇａｔｃｃｃｇｇａｇａａａｇｔｃａｔａｔｇｇａｔｇａｃｃａｇｔｔａａａａｃａａａｇ（配列番号１９）、及びｇｃｔｃｔａｇａｔｔａｃａｇｃｇｇｔｔｇｇｇｔｔｔｇｃｇｃ（配列番号２０）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化することで約２３００ｂｐのリンゴ酸デヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと、実施例４で作成したプラスミドｐＧＡＰ−Ｉａを制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化することで得られるフラグメントとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が正しく挿入されていることを確認し、本プラスミドをｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢと命名した。【００９５】
［実施例８］
＜［ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株］  ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢを導入したエシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤＡＢゲノム強化株の作製＞
上記実施例７に記載されているｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢを、実施例３で作成したＢ：：ａｔｏＤＡＢ株に形質転換し、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｍａｅＢ）の発現を強化したイソプロピルアルコール製造大腸菌ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株を得た。【００９６】
［実施例９］
＜［ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ］  クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びエシェリヒア・コリ由来チオラーゼ遺伝子発現ベクターの構築＞
上記実施例７で作製したプラスミドｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢを制限酵素ＢａｍＨＩで消化することで得られるフラグメントと、実施例５と同様にして得たＤＮＡ断片ｇａｐＰ−ａｔｏＢを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社    ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、ｇａｐＰ−ａｔｏＢが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢと命名した。【００９７】
［実施例１０］
＜［ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株］  ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢを導入したエシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤＡＢゲノム強化株の作製＞
上記実施例９に記載されているｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢを、実施例３で作成したＢ：：ａｔｏＤＡＢ株に形質転換し、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｍａｅＢ）とチオラーゼ遺伝子（ａｔｏＢ）の両方の発現を強化したイソプロピルアルコール製造大腸菌ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株を得た。【００９８】
［実施例１１］
＜［Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔ］  エシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤＡＢおよびｐｎｔゲノム強化株の作製＞
実施例１と同様にして得られた、ｐｎｔＡ５’近傍領域のＤＮＡ断片とＧＡＰＤＨプロモーター及びｐｎｔＡからなるＤＮＡ断片とを温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１に導入したプラスミドを、実施例３で作製したＢ：：ａｔｏＤＡＢ株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体を、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。得られた培養菌体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で培養しコロニーを得た。得られたコロニーを、抗生物質を含まないＬＢ液体培地で３０℃で２時間培養し、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【００９９】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれを、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらのクローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりＧＡＰＤＨプロモーターとｐｎｔＡを含む約１．７ｋｂｐ断片を増幅させ、ｐｎｔＡプロモーター領域がＧＡＰＤＨプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをエシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤ欠失ＧＡＰｐａｔｏＤＧＡＰｐｐｎｔＡゲノム挿入株（以降、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔ株と略することがある）と命名した。【０１００】
［実施例１２］
＜［ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔ］  ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢを導入したエシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤ欠失ＧＡＰｐａｔｏＤＧＡＰｐｐｎｔＡゲノム挿入株の作成＞
実施例７に記載されているｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢを、実施例１１で作製したＢ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔ株に形質転換し、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｍａｅＢ）とＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）遺伝子（ｐｎｔ）の両方の発現を強化したイソプロピルアルコール製造大腸菌ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔを得た。【０１０１】
［実施例１３］
＜［ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔ］  ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢを導入したエシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤ欠失ＧＡＰｐａｔｏＤＧＡＰｐｐｎｔＡゲノム挿入株の作成＞
実施例５に記載されているｐＧＡＰ−Ｉａ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢを実施例１１で作製したＢ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔ株に形質転換し、チオラーゼ遺伝子（ａｔｏＢ）の発現をプラスミド及びゲノムの両方で強化し、かつＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）遺伝子（ｐｎｔ）の発現を強化したイソプロピルアルコール製造大腸菌ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔを得た。【０１０２】
［実施例１４］
＜［ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔ株］  ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢを導入したエシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤＡＢおよびｐｎｔＡゲノム強化株の作製＞
上記実施例９に記載されているｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢを、実施例１１で作製したＢ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔ株に形質転換し、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｍａｅＢ）とＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）遺伝子（ｐｎｔ）の発現を強化し、更にチオラーゼ遺伝子（ａｔｏＢ）の発現をプラスミド及びゲノムの両方で強化したイソプロピルアルコール製造大腸菌ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔ株を得た。【０１０３】
［評価実験１］
＜［ｐＧＡＰ−Ｉａａａ／Ｂ株］［ｐＧＡＰ−Ｉａａａ／Ｂ：：ｐｎｔＡ株］［ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株］［ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株］［ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株］［ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔ］［ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔ］［ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔ株］によるイソプロピルアルコールの生産＞
本評価実験では、ＷＯ２００９／００８３７７号パンフレット図１に示される生産装置を用いてイソプロピルアルコールの生産を行った。培養槽には３リットル容のものを使用し、トラップ槽には１０Ｌ容のものを使用した。培養槽、トラップ槽、注入管、連結管、排出管は、すべてガラス製のものとした。トラップ槽には、トラップ液としての水（トラップ水）を９Ｌの量で注入した。なお、培養槽には廃液管を設置して、糖や中和剤の流加により増量した培養液を適宜培養槽外に排出した。【０１０４】
ＷＯ２００９／００８３７７号パンフレットに記載のｐＧＡＰ−Ｉａａａ／Ｂ株、上記実施例２で作製したｐＧＡＰ−Ｉａａａ／Ｂ：：ｐｎｔ株、実施例６で作製したｐＧＡＰ−Ｉａ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株、実施例８で作製したｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株、実施例１０で作製したｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株、実施例１２で作製したｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔ株、実施例１３で作製したｐＧＡＰ−Ｉａ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔ株、及び実施例１４で作製したｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔ株を、前培養としてアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，  Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）１００ｍＬを入れた５００ｍＬ容三角フラスコに植菌し、一晩、培養温度３０℃、１２０ｒｐｍで、攪拌しながら前培養を行った。
なおＷＯ２００９／００８３７７号パンフレットに記載のｐＧＡＰ−Ｉａａａ／Ｂ株は、イソプロピルアルコールを生産するためにチオラーゼ活性を付与しているに過ぎず、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性及びＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）活性の双方の強化も成されていないため、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌には該当しない。【０１０５】
得られた前培養物４５ｍＬを、以下に示す組成の培地８５５ｇの入った３Ｌ容の培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＳ−ＰＩ）に移し、培養を行った。培養は大気圧下、通気量０．９Ｌ／ｍｉｎ、撹拌速度５５０ｒｐｍ、培養温度３０℃、ｐＨ７．０（ＮＨ３水溶液で調整）で行った。培養開始から８時間後までの間、４５ｗｔ／ｗｔ％のグルコース水溶液を７．５ｇ／Ｌ／時間の流速で添加した。その後は４５ｗｔ／ｗｔ％のグルコース水溶液を２０ｇ／Ｌ／時間の流速で添加した。培養開始から７２時間までに数回、菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中及びトラップ水中のイソプロピルアルコールの蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水（９Ｌ）中の合算値である。結果を図１及び表１に示した。更に、生産速度、収率及びイソプロピルアルコール蓄積量を表２にまとめて示した。【０１０６】
なお表１中の数値はｇ／Ｌを表し、図１におけるシンボルは次の通りである：
黒丸：ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔ株、
黒四角：ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株
白丸；ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株、
白三角；ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株、
白四角；ｐＧＡＰ−Ｉａａａ／Ｂ：：ｐｎｔ株、
×；ｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ株、
白菱形；ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔ株、
黒菱形；ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔ株。【０１０７】
＜培地組成＞
コーンスティープリカー（日本食品化工製）：２０ｇ／Ｌ
Ｆｅ２ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．１ｇ／Ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４：２ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４：２ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：２ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４：２ｇ／Ｌ  
アデカノールＬＧ１２６（旭電化工業）０．１ｇ／Ｌ
（残部：水）【０１０８】
【表１】
0005628288.tif 000002
【０１０９】
【表２】
0005628288.tif 000003
【０１１０】
これらの結果により、従来のイソプロピルアルコール製造大腸菌（ｐＧＡＰ−Ｉａａａ／Ｂ株）に、ＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）遺伝子（ｐｎｔ）の発現のみを強化した株（ｐＧＡＰ−Ｉａａａ／Ｂ：：ｐｎｔＡ株）、チオラーゼ遺伝子（ａｔｏＢ）の発現のみを付与及びゲノム強化の双方にて強化した株（ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｍａｅＢ）の発現のみを強化した株（ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株）は、いずれも従来のイソプロピルアルコール生産大腸菌よりも高い生産性を示し、蓄積量としては、それぞれ、約１．７倍、約２．０倍、及び約２．１倍となった。また、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｍａｅＢ）の発現のみを強化した株（ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株）では、アセトン、ギ酸、酢酸等の副産物が減少していた。【０１１１】
また、ａｔｏＢ及びｍａｅＢの双方を強化した場合（ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株）、ｍａｅＢ及びｐｎｔの双方の発現を強化した場合（ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｍａｅＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔ）、ａｔｏＢ及びｐｎｔを強化した場合（ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｇａｐＰ−ａｔｏＢ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ：：ｐｎｔ）、ａｔｏＢ及びｍａｅＢ及びｐｎｔ３種全ての酵素遺伝子の発現を強化した場合では、イソプロピルアルコール生産性が更に向上し、蓄積量としては、それぞれ、約２．４倍、約２．３倍、約２．４倍、及び約２．８倍となった。特に、ＮＡＤ（Ｐ）＋トランスヒドロゲナーゼ（ＡＢ特異的）（ｐｎｔ）、チオラーゼ遺伝子（ａｔｏＢ）及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｍａｅＢ）の発現を同時に強化した場合は、ｐＧＡＰ−Ｉａａａ／Ｂ株と比較して生産速度は３．２倍、収率は２．１倍、蓄積量は２．８倍に驚異的に向上することが分かった。【０１１２】
２０１０年３月９日に出願された日本国特許出願第２０１０−０５２２４９号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
【図１】
0005628288.tif 000004
【配列表】
0005628288000001.app