(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノスケール孔を設ける方法において、
（ａ）（ｉ）厚さを規定する互いに対向する外表面を有するとともにナノスケール孔（５４）を貫通して設ける基板材（２６）と、（ｉｉ）前記互いに対向する外表面の一方に隣接して設けられて前記基板との界面を規定する揮発性材料（３４）と、を備えた多層アセンブリ（１４）を設けるステップと、
（ｂ）前記多層アセンブリを通してレーザー（１２）を適用するステップであって、前記揮発性材料に浸透された前記レーザーのエネルギーが前記揮発性材料に吸収される、ステップと、
（ｃ）前記多層アセンブリにレーザー（１２）を続けて適用して前記界面に衝撃波を発生させることにより前記基板材から前記基板材を構成する材料を除去するとともに、前記界面の反対側の前記基板材の前記外表面に向かう前記衝撃波の伝播方向に前記基板材に孔を設けるステップと、
を順次有することを特徴とするナノスケール孔を設ける方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｃ）に先立って、前記レーザーを前記界面からみて反対側の前記基板材の前記外表面（４６）に適用して、前記界面に対して反対側の前記基板材の前記外表面（４６）に開口するとともに前記基板材の前記厚さ未満の量だけ前記外表面から前記界面に向かって前記基板材内へ延在する第１のクレーター（４２）をアブレーションにより設けるステップを有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記孔の直径を１０００ナノメートル未満とすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記基板材を透明な材料で構成する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記基板材をホウケイ酸ガラスで構成する請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記基板材の表面部にポケット（２８）をあらかじめ形成したうえで前記孔を該ポケット内の中央に設けるステップを有していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記揮発性材料が、水およびアセトンからなる群から選ばれることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記揮発性材料を液体で構成するとともに、前記基板材と前記基板材のための裏当て材（３２）との間に、前記揮発性材料の厚さをなすスペーサ（３１）を設けることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記孔に先端熱加工面が設けられるように、前記レーザーを適用することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記レーザーを、１９２ないし１５７ナノメートルの波長のものとすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イオンチャネルを経由した細胞膜経由のイオン輸送および分子輸送の調査をするための「パッチクランピング（ｐａｔｃｈ  ｃｌａｍｐｉｎｇ）」に関し、特に、細胞膜を容易に封止することができるナノスケールないしミクロスケールの細孔群を提供する基板（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜を構成する脂質二重層（ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒ）は、細胞内へのイオンの流れおよび細胞外へのイオンの流れを制御するイオンチャネル（ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ）を有している。特定のイオンチャネルは、自然発生したシグナリング分子と薬物分子とを含むシグナリング分子（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に応じて開く。治療薬剤の開発においては薬剤の副作用を防止するため、または、イオンチャネルに関連した疾患の治療のための肯定的な治療効果を得るうえで、イオンチャネルに対する薬剤の効果を判定することが必要である。
【０００３】
イオンチャネルの反応の解析は、いわゆるパッチクランプ（ｐａｔｃｈ  ｃｌａｍｐ）、若干の吸引力によって細胞の表面に付着させたマイクロピペット（ｍｉｃｒｏｐｉｐｅｔｔｅ）を用いて従来行われている。細胞の内部への電気的接続は、例えば、鋭い吸引力パルスをピペットに適用して、細胞壁に孔を空けることによって確立することができる。（前記電気的接続により）細胞膜にわたる小さな電気的変化を測定することで、特定のイオンチャネルの開閉を推測することができる。
【０００４】
これらの測定に係る少量の電流は、ピペットと細胞壁との間に極めて高抵抗のシールを必要とする（ギガオームシールまたはギガシール）。典型的には、ギガオームシールは、１５〜２０ギガオームのオーダとされ、少なくとも５ギガオームとされる。
【０００５】
薬剤スクリーニングでは多数回にわたるイオンチャネル測定が必要となることがある。したがって、現在の慣行においては、ピペットは、それぞれ細胞を受容することができる複数の細孔が設けられたプレートで代替されうる。プレートのアレイによって複数の細胞の並行処理が可能となり、ピペットに比べてより容易に自動化装置に組み込むことができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
プレート構造体にナノスケール孔（ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ｈｏｌｅ）を設けることは相対的に困難である。ある技術では、ガラス基板または水晶基板に対して重イオンを照射して分子損傷（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄａｍａｇｅ）の痕跡（これはフッ化水素酸などで選択的にエッチングされてもよい）を残すことが必要となり、このエッチングのタイミングは、前記基板の反対側まで突き抜けて正確な孔サイズで孔が設けられるように制御される。
【０００７】
レーザーを用いて、あらかじめ薄くされたガラス基板を貫通するクレーターをアブレーションにより形成する第２の技術を用いれば、前記ナノスケール孔を設けるために必要となる重イオン加速器を用いなくてすむ。レーザー持続時間およびレーザー出力を制御することによって、適切な孔サイズを有する概して円錐形のクレーターを基板の反対側まで貫通させることができる。
【０００８】
レーザーによる前記アプローチの不利な点として、溶解したガラスと破片とを孔の出口に拡散させてしまうという問題がある。この破片は、細胞膜と孔のリップ部とを適切に接着する妨げとなるものであり、また、形成した孔の電気的抵抗の低下につながるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、レーザーを用いて基板に該基板を貫通するナノスケール細孔を設けるための改善された技術を提供するものである。この技術においては、基板は、該基板とは異なる熱膨張物質によって裏当てが施されている。孔形成の最終段階において、レーザーによって加熱された前記熱膨張物質が、基盤の反対面に凹状のクレーターを生じさせる衝撃波を生じさせる。このクレーターは、レーザーによって設けられた前記クレーターの表面と交わる。前記衝撃波は、細孔の出口を火造り（先端熱加工）（ｆｉｒｅ  ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）する類のものであり、実質的に、細孔が細胞膜との高抵抗シールを形成する能力を増大させる。火造り（ｆｉｒｅ  ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）は、熱または炎を用いてざらつき（不均質性）を溶解させて、表面張力の作用のもとで平滑にさせるものである。
【００１０】
具体的には、本発明は、ナノスケール孔を設ける方法を提供し、この方法は、基板材の裏面に近接して設けられた第２の、衝撃波を含む裏当て材によって裏当てされた、ナノスケール孔を有する基板材を備えた層状構造を設けるステップを含むものである。集束レーザーを第１の期間の間、基板材の表面部に適用して、基板材の表面部に開口しているとともに該基板材の厚さ未満の量だけ基板材内へ延在している第１のクレーターをアブレーションにより形成する。集束レーザーの適用は、第２の期間の間継続されて、第１のクレーターの向こう側の材料を加熱させて、基板材の裏面部から始まって基板材内に延在している第２のクレーターを生成させる衝撃波を生起させる。この第２のクレーターは第１のクレーターと接続されて、それにより、第１のクレーターと第２のクレーターとの間に孔径を有する開口が設けられる。
【００１１】
少なくとも本発明の一実施形態の目的は、標準的なレーザー孔形成の間に生じる、基板裏面上への破片の発生を低減させるナノスケール細孔を提供することにある。
【００１２】
孔径は１０００ナノメートル未満であってもよい。
【００１３】
少なくとも本発明の一実施形態の目的は、パッチクランプ用途に用いられるのに適した細孔を設けることにある。
【００１４】
前記基板材は透明な材料で構成されてもよい。
【００１５】
少なくとも本発明の一実施形態の目的は、細胞膜の電気的測定および光学的測定の双方を許容する、光の伝達を許容する基板材を提供することにある。
【００１６】
掘られるべき前記基板材は、ホウケイ酸ガラスで構成されている。
【００１７】
少なくとも本発明の一実施形態の目的は、電気生理学的用途に適した基板を提供することにある。
【００１８】
前記方法は、前記基板材の表面部にポケットをあらかじめ形成するステップを含んでもよく、前記第１のクレーターは、前記ポケット内の実質的に中央に配置されてもよい。
【００１９】
少なくとも本発明の一実施形態の目的は、構造的完全性の点で要求される基板の任意の厚さを確保することにある。
【００２０】
本発明は、前記基板材と前記裏当て材との間に蒸発可能な材料を用いてもよい。
【００２１】
少なくとも本発明の一実施形態の目的は、改善された孔形成のための増大された圧力波を提供することにある。
【００２２】
前記蒸発可能な材料は、水とされてもよい。
【００２３】
少なくとも本発明の一実施形態の目的は、相対的に安全な蒸発可能な物質の使用を許容することにある。
【００２４】
前記蒸発可能な物質は、前記基盤材と前記裏当て材との間に、該蒸発可能な物質の厚さを規定するスペーサによって保持された液体であってもよい。
【００２５】
少なくとも本発明の一実施形態の目的は、衝撃波形成に係るパラメータの精密制御を許容することにある。
【００２６】
前記集束レーザーは、先端熱加工面を設けるために前記第２のクレーターが融解温度に達するように印加されてもよい。
【００２７】
少なくとも本発明の一実施形態の目的は、細胞膜により高抵抗なシールを形成するために、開口（アパーチャ）に対して改善されたシール表面を設けることにある。
【００２８】
これらの具体的な特徴および利点は、請求項に記載された範囲に入るところの実施形態の一部に適用されるものであって、発明の範囲を確定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の一実施形態に係る平面状のパッチクランプ・プレートを製造するために用いられる装置の概略を示した図である。
【図２】図１に示す装置によって製造されるパッチクランプのブロック図である。
【図３】揮発性物質で充填された隙間による、裏当て材に対するパッチクランプ基板のスペーシングを示した、図２中の３−３線に沿う断面図である。
【図４】第１のクレーターを形成するレーザーアブレーションの初期段階を示すとともに基板の表面への融解した破片の散乱を示した、図３と同様の図である。
【図５】基板を貫通した第１のクレーターの発生前における、基板を経由して揮発性物質へのエネルギーの伝達を示す図３と同様の図である。
【図６】基板の背後の揮発性物質による衝撃波の形成を示す図５と同様の図である。
【図７】第１のクレーターの反対側で衝撃波によって火造りされた第２のクレーターが生成された後における、図６に示す基板の拡大図である。
【図８】パッチクランプ用途における図７に示す基板の利用を単純化して示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
図１を参照すると、本発明は、細くコリメートされた（ｎａｒｒｏｗ  ｃｏｌｌｉｍａｔｅｄ）ビーム１２を、メカニカルステージ１６によって保持された基板アセンブリ１４の表面（ｆｒｏｎｔ  ｓｕｒｆａｃｅ）に向けるように構成された、コリメーション・集束用光学要素１１を備えたエキシマレーザー１０を用いている。レーザーの波長レンジは、例えば、１９２ないし１５７ナノメートル（ｎｍ）である。
【００３１】
エキシマレーザー１０およびメカニカルステージ１６は、後述するように、連続するパルスによってエキシマレーザー１０を出力制御する制御信号２２をエキシマレーザー１０に送信するとともに、メカニカルステージ１６のｘ−ｙ方向制御を行うための制御信号２２をアクチュエータモータ２４に送信するように構成された、技術分野において公知のタイプの自動化されたコントローラ１８によって制御されている。
【００３２】
図２および図３を参照すると、基板アセンブリ１４は、その上側に、基板（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）２６、例えば約１５０ミクロンの厚さを有するホウケイ酸塩で構成されたカバースリップを備えている。この上側の基板２６の表面は、規則的なｘ−ｙ格子状のロケーション２９にて形成された複数の陥没またはくぼみ２８を有している。前記複数のくぼみ２８は、成型、研磨またはエッチングにより基板２６に設けられており、軸１５に沿って測定して１００〜１０００ミクロン（μ）の厚さとなるロケーション２９における薄肉部３０をなしている。くぼみ２８の直径は、相対的に大きく、例えば、５．０ミリメートルであり、構造的な便宜のために、ロケーション２９の外側領域においては概してより厚肉な基板２６が提供されるようになっている。
【００３３】
基板２６は、基板２６の裏面に隣接して配置されているとともに例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で構成された任意的なスペーサ３１によって該基板２６から離隔して設けられた、裏当てプレート（ｂａｃｋｅｒ  ｐｌａｔｅ）３２を有している。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）は、精密に制御されたスペーサ厚さを提供するために集積回路技術を用いて製作されたモールドを介して、基板２６の裏面に鋳造されているか、または、スパンコーティング（ｓｐｕｎ−ｃｏａｔｅｄ）されて選択的に基板２６の縁部を除いて除去して構成されてもよい。
【００３４】
基板２６と裏当てプレート３２との間のスペースは、揮発性材料３４によって充填されている。この揮発性材料３４は好ましくは水であるが、例えば、アセトンなどの他の材料で構成することもできる。前記基板２６と前記裏当てプレート３２との間の前記スペースは、レーザー特性および該裏当てプレート３２を構成する材料特性に応じて実験に基づいて定められなければならないが、別体構成されたスペーサ３１を設けずに、例えば、水の毛細管力によって厳密に提供される分離といった程度のごくわずかなスペースとされてもよい。一実施形態において、基板２６と裏当てプレート３２とは、完全に誘起された反衝撃波（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｓｈｏｃｋ  ｗａｖｅ）、例えば、コリメートされたビーム（ｃｏｌｌｉｍａｔｅｄ  ｂｅａｍ）１２によって提供されるアブレーションとは反対方向に進行する反衝撃波が得られるかぎりは、実質的に互いに隣接していてもよい。
【００３５】
図１および図４を参照すると、エキシマレーザー１０は、第１のロケーション２９の上方に位置し、コントローラ１８によってパルス制御されて、制御されたレーザービーム１２の連続する光パルス４０を発生させる。この光パルス４０は基板２６を構成する基板材料によって吸収されて、第１の時間にわたって、アブレーション（ａｂｌａｔｉｏｎ）により第１のクレーター４２を形成する。第１のクレーター４２から放出された融解した材料４４は、概して基板２６の表面（おもてめん）４６に付着されるので基板２６には実質的な表面ざらつきが生じる。このレーザーアブレーションは、第１のクレーター４２の最深部が基板２６の裏面から３〜１０ミクロンの距離に達するまで継続される。
【００３６】
図５を参照すると、出願人は特定の理論に束縛されることを希望するものではないが、この時点で、パルス４０からの漏出エネルギー５０が基板２６の残りの部分を通過して第１のクレーター４２の向こう側に存在する材料を加熱するとされている。この材料とは、好ましくは前記揮発性材料３４であるが、空気であってもよく、また、反射エネルギーに打たれた基板２６の裏面それ自体であってもよい。
【００３７】
図６に示すように、図５に示す漏出エネルギー５０の効果は、第１のクレーター４２の向こう側の点から開始して、基板２６の裏面からその表面へと通過する衝撃波５２を生成するために急速な熱膨張を生じるというものである。衝撃波５２は、裏当てプレート３２に閉じ込められた場合には基板２６の裏面においてその表面の融解を生じさせるのに十分強力である。
【００３８】
図７を参照すると、最終結果は、第１のクレーター４２と、前記衝撃波５２によって形成された反対面クレーター５３とが交わって形成された、基板２６を貫通する砂時計形状を有する細孔（ｐｏｒｅ）５４である。砂時計形状の細孔５４は、該細孔５４の最も狭い部分をなすくびれ直径５５を有しており、このくびれ直径５５は、１〜２００ミクロンであり好ましくは実質的に１ミクロン未満、例えば、２００ナノメートルである。反対面クレーター５３によって形成された前記砂時計形状の細孔５４の裏側直径５７は、くびれ直径５５よりもはるかに大きく、典型的には少なくとも該くびれ直径５５の２倍とされているであろう。
【００３９】
第１のクレーター４２によって形成された前記砂時計形状の細孔５４の表面部は、反対面クレーター５３の深さの効果を低減することによりくびれ直径５５に対する改善された制御を提供するために、第１の小さな円錐角５６を概して有しているであろう。反対面クレーター５３の第２の円錐角５８は、実質的により大きく、例えば、第１の円錐角５６の２倍である。反対面クレーター５３の直径は、例えば、１０ミクロンのオーダであって、本質的に、衝撃波５２の加熱効果によって生じた火造り（先端熱加工）によって設けられている。
【００４０】
図８を参照すると、基板２６（図７の方向に対して反転して図示している）は、細胞６０を反対面クレーター５３内に収容している。細胞６０の細胞壁６２の一部がくびれ５５において露出しており、細胞６０が第１のクレーター４２を介してアクセスすることができるようになっている。基板２６の側から第１のクレーター４２へと作用するポンプ６７による軽い吸引力は、細胞６０を保持している基板２６側の溶液６４と反対側の基板２６の側における溶液６６との間の５ギガオームないし３０ギガオーム抵抗にて、細胞壁６２を反対面クレーター５３の表面へ付着させている。
【００４１】
ポンプ６７によって表面４６に適用された鋭い吸引力またはその他の手段を用いて、細胞６０の内部と接続されている電極７２を介して細胞６０の外側の溶液６４を基準とした細胞６０の外部と内部との間の電気的な相違を測定することができる高感度電気的検出器７０によって、細胞６０の内部への電気的接続を提供してもよい。
【００４２】
ここにいう火造り、先端熱加工（ｆｉｒｅ  ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）は火によって提供されるものに類似した表面の溶融をさすものであるが、必ずしも燃焼を必要とするものではない。
【００４３】
本発明は、実施形態およびそこに説明された事項に限定されるものではなく、以下の特許請求の範囲に属するところのこれらの実施形態またはそれらの一部の修正された形態、および、異なる実施形態の要素どうしの組合せをも含むものであると具体的に想定されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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