(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）配列番号：１に示される塩基配列の部分配列を含むＣＴＢＰ１遺伝子のアンチセンスＲＮＡ
（ii）配列番号：５に示される塩基配列を含むＣＴＢＰ１遺伝子のアンチセンスＲＮＡ、及び
（iii）前記（i）又は（ii）に記載のアンチセンスＲＮＡの全長の１０％以内の塩基が欠失、付加若しくは置換されているアンチセンスＲＮＡ
のいずれかのアンチセンスＲＮＡ（以下、「ＣＴＢＰ１−ＡＳ」という。）の発現が亢進している前立腺癌及び／又はその転移癌細胞の増殖抑制剤であって、
（a）ＣＴＢＰ１−ＡＳ又はその一部に対するアンチセンス核酸
（b）ＣＴＢＰ１−ＡＳを特異的に切断するリボザイム活性を有する核酸
（c）ＣＴＢＰ１−ＡＳに対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸
（d）（a）乃至（c）のいずれかに記載の核酸をコードする核酸
からなる群より選択されるＣＴＢＰ１−ＡＳの発現阻害物質又は機能阻害物質を有効成分として含む、細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
前記ＣＴＢＰ１−ＡＳが、配列番号１７〜２０のいずれかに記載の塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡである、請求項１に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項３】
前記発現阻害物質又は機能阻害物質が、ＣＴＢＰ１−ＡＳに対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡであって、該二本鎖ＲＮＡの一方が、ＣＴＢＰ１−ＡＳにおける連続した１９〜３０塩基の部分に相補的な配列からなる、請求項１又は２に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項４】
前記発現阻害物質又は機能阻害物質が、ＣＴＢＰ１−ＡＳに対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡであって、該二本鎖ＲＮＡの一方が、配列番号：３〜６及び２４〜５２のいずれかに示される塩基配列に相補的な塩基配列からなる、請求項１又は２に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか1項に記載の細胞増殖抑制剤を含む前立腺癌及び／又はその転移癌の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項６】
ＣＴＢＰ１−ＡＳの発現が亢進している前立腺癌細胞及び／又はその転移癌細胞の増殖抑制剤のスクリーニング方法であって：
ＣＴＢＰ１−ＡＳの発現が亢進している前立腺癌細胞、その転移癌細胞、又はそれらの細胞抽出液と被検化合物とを、アンドロゲン存在下で接触させる工程と；
ＣＴＢＰ１−ＡＳの発現レベルを測定する工程と；
被検化合物の非存在下で測定した場合と比較して、ＣＴＢＰ１−ＡＳの発現レベルを低下させる被検化合物を選択する工程と、
を含む方法。
【請求項７】
ＣＴＢＰ１−ＡＳの発現が亢進している前立腺癌細胞及び／又はその転移癌細胞の増殖抑制剤のスクリーニング方法であって：
ＣＴＢＰ１遺伝子の発現が低下している前立腺癌細胞、その転移癌細胞、又はそれらの細胞抽出液と被検化合物とを、アンドロゲン存在下で接触させる工程と；
前記ＣＴＢＰ１遺伝子の発現レベルを測定する工程と；
被検化合物の非存在下で測定した場合と比較して、前記ＣＴＢＰ１遺伝子の発現レベルを上昇させる被検化合物を選択する工程と、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺癌細胞等、CTBP1遺伝子の所定のアンチセンスRNAの発現が亢進している細胞の増殖抑制剤、細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は、欧米において男性が罹患する最も頻度の高い癌である。日本においても、食生活の欧米化及び人口の高齢化に伴い、前立腺癌の患者数は飛躍的に増加している。治療方法としては、前立腺摘出術をはじめとする外科的治療、抗癌剤による化学療法及び放射線治療が広く応用されている。外科的治療が第一選択であるが、既に癌が進行した状態で診断された場合や、外科手術後の再発などにより手術が困難な場合に、外科的治療以外の治療法が選択される。【０００３】
一般に、前立腺癌の増殖はアンドロゲンにより刺激される。アンドロゲンは、男性への性分化、生殖器官の機能維持、二次性徴の発現、精子形成、骨格筋などにおけるタンパク質同化作用の促進などの機能を有するステロイドホルモンである。ヒトの男性化には、主に二つのタイプのアンドロゲン（テストステロン及びジヒドロテストステロン（DHT））が関与している。テストステロンは、精巣の間質細胞で合成された後、血流によって前立腺細胞などの標的細胞に運ばれ、細胞内で5α−ヒドロゲナーゼによってDHTに変換された後、細胞質内のアンドロゲン受容体（AR）に結合する。DHTと結合したARは活性型に変化して核内へ輸送され、標的遺伝子上のアンドロゲン応答配列に結合し、標的遺伝子の発現を活性化する転写因子として機能する。【０００４】
従って、前立腺癌の外科的治療以外の治療法としては、アンドロゲンの産生及び機能を阻害するホルモン療法がしばしば用いられ、極めて良い効果が得られることが多い。しかしながら、ホルモン療法の後、数年以内にアンドロゲン非依存性前立腺癌が再燃することがある。そのため、アンドロゲン非依存性癌の制御が重要な課題となっている。【０００５】
アンドロゲン依存性癌から非依存性癌への進行の詳細な分子メカニズムは未だ明らかでないが、ARの関与が示唆されている。具体的には、アンドロゲン非依存性癌では、ARが変異や増幅することにより、超低濃度のアンドロゲンやその他のステロイドホルモンなどに感受性を示すようになることが示唆されている（例えば、非特許文献1−3を参照）。そこで、ARとリガンドとの結合を阻害したり、RNAi（RNA  interference）法などによってARの発現や機能を阻害したりすることによって前立腺癌を治療する方法が検討されている（例えば、非特許文献4−6を参照）。
しかしながら、特に再燃した前立腺癌に対しては、ARの機能や発現を阻害する方法にも限界があり、臨床的に十分な方法は未だ開発されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Suzuki H, et al. Endocr. Relat. Cancer 10, 2003, 209-216
【非特許文献２】Chen CD, et al. Nat Med. 10, 2004, 33-39
【非特許文献３】Debes JD, et al. N Eng J Med 351, 2004, 1488-1490
【非特許文献４】Sun A, et al. Int J Cancer. 2009 Jul 29. [Epub ahead of print]PMID: 19642108
【非特許文献５】Compagno D, et al. PLoS One. 2007 Oct 10;2(10):e1006.PMID: 17925854
【非特許文献６】Snoek R, et al. Clin Cancer Res. 2009 Jan 1;15(1):39-47
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、アンドロゲン非依存性前立腺癌にも有効な、細胞増殖抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者らは、ARの阻害が前立腺癌の重要な治療法となっていること、また、内分泌治療が無効となるアンドロゲン非依存性癌においてはARのシグナルがARの変異や増幅によって活性化されていることから、ARの下流シグナルが治療標的として有効であると考えた。そこで、クロマチン免疫沈降法とタイリングアレイを組み合わせる方法（ChIP−chip法；例えば、Cawley S, et al. Cell 116, 2002, 499-509、Kaneshiro K, et al. Genomics. 89, 2007, 178-188を参照。）によりヒト全ゲノムレベルでAR結合部位とヒストンH3アセチル化部位を同定し、さらに、Cap  analysis  gene  expression（CAGE法；例えば、Shiraki T, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2003, 15776-81、FANTOM Consortium, Nat Genet. 41, 2009, 553-562を参照。）により、転写開始点をゲノムワイドで同定してプロモータの使用状況をプロファイルした。
その結果、核内でコリプレッサーとして機能することが知られるCTBP1タンパク質が、ARの転写抑制因子として機能することを見出した。そして、CTBP1について研究を進めるなかで、CTBP1遺伝子のAR結合部位付近のセンスDNAの転写産物、即ち、CTBP1遺伝子のAR結合部位付近のアンチセンスRNAが、アンドロゲンによって強く誘導されることを見出した。
そこで、RNAi法によって当該アンチセンスRNAの機能を抑制すると、CTBP1の発現がmRNAレベル、タンパク質レベルのいずれにおいても上昇する一方で、ARの転写活性は抑制され、前立腺癌細胞の増殖も抑制されることを確認した。
また、当該アンチセンスRNAの発現量は、正常な前立腺に比較して、前立腺癌及びその転移癌細胞において有意に高く、CTBP1の発現量は、正常な前立腺に比較して、前立腺癌及びその転移癌細胞において有意に低いことを確認した。
ヌードマウスの前立腺癌細胞移植モデルにおいても、当該アンチセンスRNAがCTBP1を負に制御していること、当該アンチセンスRNAに対するRNAi効果を有する二本鎖RNAを投与すると、前立腺癌の増殖が抑制されることを確認した。
さらに、CTBP1-ASを抑制することによって前立腺癌の増殖が抑制されるメカニズムについて、RNA結合性転写抑制因子であるPSFがCTBP1-ASと結合し、この複合体が細胞周期を抑制する遺伝子の転写を抑制することによって、細胞増殖を促進すること；同複合体がCTBP1の発現を抑制する結果、ARによる転写活性化を促進すること；従って、CTBP1-ASの発現を抑制すれば、細胞増殖を抑制し、ARの活性化を抑制すること、を見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
即ち、本発明は、
〔１〕（i）配列番号：1に示される塩基配列の部分配列を含むCTBP1遺伝子のアンチセンスRNA
（ii）配列番号：5に示される塩基配列を含むCTBP1遺伝子のアンチセンスRNA、及び
（iii）前記（i）又は（ii）に記載のアンチセンスRNAの変異体、バリアント、又は、前記（i）及び（ii）に記載のアンチセンスRNAにおいて1又は数個の塩基が欠失、付加若しくは置換されているアンチセンスRNA
のいずれかのアンチセンスRNA（以下、「CTBP1−AS」という。）が発現している細胞の増殖抑制剤であって、
CTBP1−ASの発現阻害物質又は機能阻害物質を有効成分として含む、細胞増殖抑制剤；
〔２〕前記CTBP1-ASが、配列番号17〜20のいずれかに記載の塩基配列からなるアンチセンスRNAである、請求項1に記載の細胞増殖抑制剤；
〔３〕前記発現阻害物質又は機能阻害物質が、以下の（a）〜（d）からなる群より選択される化合物である、上記〔1〕又は〔2〕に記載の細胞増殖抑制剤、
（a）CTBP1−AS又はその一部に対するアンチセンス核酸
（b）CTBP1−ASを特異的に切断するリボザイム活性を有する核酸
（c）CTBP1−ASに対してRNAi効果を有する二本鎖核酸
（d）（a）乃至（c）のいずれかに記載の核酸をコードする核酸；
〔４〕前記発現阻害物質又は機能阻害物質が、CTBP1−ASに対してRNAi効果を有する二本鎖RNAであって、該二本鎖RNAの一方が、CTBP1−ASにおける連続した19〜30塩基の部分に相補的な配列からなる、上記〔3〕に記載の細胞増殖抑制剤；
〔５〕前記発現阻害物質又は機能阻害物質が、CTBP1−ASに対してRNAi効果を有する二本鎖RNAであって、該二本鎖RNAの一方が、配列番号：3〜6及び24〜52のいずれかに示される塩基配列に相補的な塩基配列からなる、上記〔3〕に記載の細胞増殖抑制剤；
〔６〕前記CTBP1−ASが発現している細胞が、前立腺癌細胞及び／又はその転移癌細胞である、上記〔1〕から〔5〕のいずれか1項に記載の細胞増殖抑制剤；
〔７〕上記〔1〕から〔6〕のいずれか1項に記載の細胞増殖抑制剤を含む医薬組成物；
〔８〕上記〔1〕から〔6〕のいずれか1項に記載の細胞増殖抑制剤を治療有効量投与することを含む、前立腺癌の予防又は治療方法；
〔９〕CTBP1−ASが発現している細胞の増殖抑制剤のスクリーニング方法であって：CTBP1−ASが発現している細胞又はその細胞抽出液と被検化合物とを、アンドロゲン存在下で接触させる工程と；CTBP1−ASの発現レベルを測定する工程と；被検化合物の非存在下で測定した場合と比較して、CTBP1−ASの発現レベルを低下させる被検化合物を選択する工程と、を含む方法；
〔１０〕CTBP1−ASが発現している細胞の増殖抑制剤のスクリーニング方法であって：CTBP1遺伝子が発現している細胞又はその細胞抽出液と被検化合物とを、アンドロゲン存在下で接触させる工程と；前記CTBP1遺伝子の発現レベルを測定する工程と；被検化合物の非存在下で測定した場合と比較して、前記CTBP1遺伝子の発現レベルを上昇させる被検化合物を選択する工程と、を含む方法；
〔１１〕前記CTBP1−ASが発現している細胞が、前立腺癌細胞及び／又はその転移癌細胞である、上記〔9〕又は〔10〕に記載の方法；
〔１２〕前立腺癌の予後を判定する検査方法であって：患者の前立腺から採取した細胞におけるCTBP1−ASの発現レベルを測定する工程と；前記発現レベルを正常な前立腺細胞における発現レベルと比較する工程と、を含む方法；及び
〔１３〕前立腺癌の予後を判定する検査方法であって：患者の前立腺から採取した細胞におけるCTBP1遺伝子の発現レベルを測定する工程と；前記発現レベルを正常な前立腺細胞における発現レベルと比較する工程と、を含む方法、
に、関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の細胞増殖抑制剤によれば、CTBP1−ASの発現又は機能を阻害することにより、前立腺癌細胞などCTBP1−ASの発現が亢進している細胞の増殖を効率的に抑制することができる。
本発明の細胞増殖抑制剤は、CTBP1−ASの発現又は機能を阻害することによってARの下流シグナルの転写活性を抑制するので、ARの変異や増幅によってARのシグナルが活性化されているアンドロゲン非依存性癌に対しても有効であるものと考えられる。
本発明の細胞増殖抑制剤として、CTBP1−ASに対するRNAi効果を有する二本鎖核酸を用いれば、標的選択制が高く、細胞が本来持っている機構を利用するので安全性も高い。【００１１】
また、本発明は、CTBP1−ASの発現が亢進している細胞の増殖抑制剤を被検化合物から効率よく選択するスクリーニング方法、前立腺癌の予防又は治療方法、並びに、前立腺癌の予後を判定する検査方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図1は、LNCaP細胞にCTBP1−ASに対するsiRNA又はコントロール二本鎖RNAを投与し、CTBP1−ASの発現量を測定した結果を示す。CTBP1−AS発現は、アンドロゲン（R1881）で誘導され、CTBP1−ASに対するsiRNAの投与により抑制された。
【図２】図2は、LNCaP細胞にCTBP1−ASに対するsiRNA又はコントロール二本鎖RNAを投与し、CTBP1の発現量（mRNAレベル）を測定した結果を示す。CTBP1の発現は、アンドロゲンで抑制され、CTBP1−ASに対するsiRNAの投与により、アンドロゲンによる抑制効果が減少した。
【図３】図3は、LNCaP細胞にCTBP1−ASに対するsiRNA又はコントロール二本鎖RNAを投与し、CTBP1の発現量（タンパク質レベル）を測定した結果を示す。CTBP1の発現は、アンドロゲンで抑制され、CTBP1−ASに対するsiRNAの投与により、アンドロゲンによる抑制効果が減少した。
【図４】図4Aは、LNCaP細胞にPSAルシフェラーゼベクターを導入し、CTBP1−ASに対するsiRNA又はコントロール二本鎖RNAを投与して、CTBP1−ASによるARの転写活性への影響を確認した結果である。ルシフェラーゼ活性即ちARの転写活性は、アンドロゲンにより上昇し、CTBP1−ASに対するsiRNAの投与により抑制された。図4B及びCは、同じ細胞におけるアンドロゲン応答遺伝子の発現を調べた結果である。アンドロゲン応答遺伝子の発現量は、アンドロゲンにより増加したが、siRNAの投与により抑制された。
【図５】図5は、CTBP1−ASの機能抑制によるLNCaP細胞増殖への影響をMTSアッセイで調べた結果を示す。CTBP1−ASに対するsiRNAを投与すると、細胞増殖が抑制された。
【図６】図6は、マウスの腫瘍モデルにおいて、CTBP1−ASの機能抑制による腫瘍体積への影響を確認した結果を示す。マウスの皮下に移植された腫瘍細胞の増殖は、CTBP1−ASに対するsiRNAの投与により著しく抑制された。
【図７】図7は、マウスの腫瘍モデルにおいて、CTBP1−ASの機能抑制による腫瘍重量への影響を確認した結果を示す。マウスの皮下に移植された腫瘍細胞の増殖は、CTBP1−ASに対するsiRNAの投与により著しく抑制された。
【図８】図8は、マウスの腫瘍モデルにおける、CTBP1−AS及びCTBP1のRNAレベルの発現量を測定した結果を示す。CTBP1−ASに対するsiRNAの投与により、腫瘍中のCTBP1−ASの発現量は減少し、CTBP1の発現量は増加した。
【図９】図9は、マウスの腫瘍モデルにおける、CTBP1のタンパク質レベルの発現量を測定した結果を示す。CTBP1−ASに対するsiRNAの投与により、腫瘍中のCTBP1タンパク質の発現量は増加した。
【図１０】図10は、公開されている発現プロファイルデータをもとに、AX747592に特異的なプローブのシグナル量を抽出し、正常、癌、転移のそれぞれのサンプルにおける発現量の比較検討を行った結果を示す。癌及び転移癌組織におけるCTBP1−ASの発現量は、正常の前立腺に比較して有意に高かった。
【図１１】図11Aは、前立腺癌細胞におけるCTBP1の発現を免疫染色法により評価した結果を示す。正常細胞に比較して、前立腺癌細胞ではCTBP1の発現量は低下していた。図11Bは、CTBP1高発現群と低発現群の生存率を比較した結果を示す。CTBP1高発現群は、低発現群に比較して生存率が有意に高かった。図11Cは、免疫染色法による正常前立腺と前立腺癌の代表的な切片の像を示す。
【図１２】図12は、3’ RACE PCR法を用いてCTBP1-ASd以外のCTBP1-ASを探索した結果、存在が確認されたCTBP1-ASa、CTBP1-ASb及びCTBP1-ASdの配列を示す模式図である。
【図１３】図13は、LNCaP細胞由来のRNAを用いてCTBP1-ASの発現を確認したノーザンブロッティングの結果である。約5kbの長さの転写産物が検出され、CTBP1-ASbが主に発現していることが示唆された。
【図１４】図14は、CTBP1-ASの局在を、核内RNA、細胞質RNAを用いたノーザンブロッティングによって解析した結果と（図14a）、RNAからcDNAを合成してqRT-PCRで発現量を測定した結果（図14b、GAPDHで補正）を示す。
【図１５】図15a及びbは、LNCaP細胞と、アンドロゲン枯渇抵抗性モデルとなるLTAD細胞とにおいて、アンドロゲン刺激によるCTBP1及びCTBP1-ASの発現への影響をウェスタンブロッティング及びノーザンブロッティングにより解析した結果を示す。図15c及びdは、LNCaP細胞又はLTAD細胞において、アンドロゲン刺激を行って、又は行わないで、CTBP1-ASの発現抑制をRNAi法により行い、細胞増殖能を比較した結果を示す。
【図１６】図16は、ヌードマウスにアンドロゲン枯渇抵抗性モデルのLTAD細胞を移植し、CTBP1-ASに対するsiRNAを局注し、腫瘍体積（b）、CTBP1-ASのmRNAレベルでの発現量（c）、CTBP1のタンパク質レベルでの発現量（c）を測定した結果である。
【図１７】図17は、CTBP1の発現抑制に、RNA結合性転写抑制因子のPSFが関与することを確認した結果である。RNAiによりPSFの転写を抑制すると、アンドロゲン刺激によるCTBP1の発現の抑制度が低下した。
【図１８】図18は、PSFとCTBP1-ASがアンドロゲン依存的に結合することを示す免疫沈降の結果である。
【図１９】図19は、RNA-FISHによって、PSFとCTBP1-ASの局在を解析した結果である。PSFとCTBP1-ASの局在はほぼ一致していた。
【図２０】図20は、PSFと、細胞周期との関係を解析した結果を示す。
【図２１】図21は、PSFに対するsiRNAを用いて、PSFによるSMAD3とp53の制御を、qRT-PCR（a）及びウェスタンブロッティング（b）により解析した結果を示す。
【図２２】図22は、CTBP1-ASに対するsiRNAを用いて、CTBP1-ASによる細胞周期関連因子の制御を調べた結果を示す。
【図２３】図23は、CTBP1-ASとPSFにより遺伝子発現制御機構を示す説明図である。
【図２４】図24は、26種類のsiRNAについてCTBP1-AS発現抑制効果を調べた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
<細胞増殖抑制剤>
本発明に係る細胞増殖抑制剤は、CTBP1−ASが発現している細胞の増殖を抑制することを特徴とし、CTBP1−ASの発現阻害物質又は機能阻害物質を有効成分として含む。
【００１４】
本明細書において、CTBP1とは、C末端結合タンパク質（C−terminal binding protein 1）を意味し、CTBP1遺伝子とは、CTBP1タンパク質をコードする遺伝子を意味する。CTBP1は、核内でコリプレッサー（co−repressor）として機能することが知られている（Kim JH, et al. Nat Struct Mol Biol. 12, 2005, 423-428、Senyuk V, et al. Arch Biochem Biophys. 441, 2005, 168-173）。例えば、ZEB1遺伝子などの転写抑制に関与することが報告されており、一般に転写を負に制御すると考えられている（Chinnadurai G, Int J Biochem Cell Biol. 39, 2007, 1593-1607）。
【００１５】
後述する実施例に示されるとおり、本発明者らは、CTBP1が前立腺癌細胞において有意に発現が低下していること、また、mRNAレベル及びタンパク質レベルのいずれの発現においても、アンドロゲンに抑制されることを見出した。
【００１６】
本明細書において、CTBP1−ASとは、CTBP1遺伝子のAR結合部位付近で発現する、以下の（i）〜（iii）のいずれかのCTBP1遺伝子のアンチセンスRNAを意味する。
（i）配列番号：1に示される塩基配列の部分配列を含むCTBP1遺伝子のアンチセンスRNA、及び
（ii）配列番号：5に示される塩基配列を含むCTBP1遺伝子のアンチセンスRNA、及び
（iii）前記（i）又は（ii）に記載のアンチセンスRNAの変異体、バリアント、又は、前記（i）又は（ii）に記載のアンチセンスRNAにおいて1又は数個の塩基が欠失、付加若しくは置換されているアンチセンスRNA
なお、アンチセンスRNAとは、遺伝子の二本鎖DNAのうちセンス鎖（センスDNA）を鋳型として作られる転写産物を意味する。
【００１７】
CTBP1-ASは、本発明に係る細胞増殖抑制剤の標的となる分子である。生体内において、上記（i）〜（iii）のいずれかを満たすアンチセンスRNAは複数存在するが、それらのすべてがCTBP1-ASとなり得る。以下、（i）〜（iii）をそれぞれ具体的に説明する。
【００１８】
（i）配列番号：1に示される塩基配列の部分配列を含むCTBP1遺伝子のアンチセンスRNA
配列番号：1に示される塩基配列からなるCTBP1遺伝子のアンチセンスRNAは、そのcDNAがAccession Number： AX747592（配列番号：2）として知られるものであり、CTBP1遺伝子のAR結合部位付近のセンスDNAの転写産物である。
配列番号：1に示される塩基配列の部分配列を含むCTBP1遺伝子のアンチセンスRNAとしては、
配列番号：1に示される塩基配列の一部の塩基配列のみからなるアンチセンスRNA；
配列番号：1に示される塩基配列の5’末端を含む部分配列を含み、さらにその5’末端に1以上の塩基が結合しているアンチセンスRNA；及び、
配列番号：1に示される塩基配列の3’末端を含む部分配列を含み、さらにその3’末端に1以上の塩基が結合しているアンチセンスRNA、が挙げられる。
配列番号：1に示される塩基配列の部分配列を含む限り、生体内で発現しているアンチセンスRNAは、すべて（i）のアンチセンスRNAに該当するが、本発明の細胞増殖抑制剤の標的としては、配列番号：1に示される塩基配列の3’末端を含む部分配列からなるアンチセンスRNA、及び、配列番号：1に示される塩基配列の3’末端を含む部分配列を含み、さらにその3’末端に1以上の塩基が結合しているアンチセンスRNAが特に好ましい。ここで、「配列番号：1に示される塩基配列の3’末端を含む部分配列」としては、例えば、配列番号：1に記載の塩基配列の1300位から3’末端までの部分配列、1200位から3’末端までの部分配列、800位から3’末端までの部分配列、等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１９】
（ii）配列番号：5に示される塩基配列を含むCTBP1遺伝子のアンチセンスRNA
配列番号：5に示される塩基配列を含むCTBP1遺伝子のアンチセンスRNAとしては、配列番号：5に記載の塩基配列のみからなるアンチセンスRNA、及び、配列番号：5に記載の塩基配列の3’末端及び／又は5’末端に1以上の塩基が結合しているアンチセンスRNA、が挙げられる。
配列番号：5に示される塩基配列は、配列番号：1に記載の塩基配列の2348位〜2372位に相当する。3’末端及び／又は5’末端に結合する塩基の数は特に限定されない。本発明者らは、後述する実施例に示すとおり、この領域を標的とするsiRNAを投与すると、ARの転写活性が抑制され、前立腺癌細胞の増殖も抑制されることを確認した。従って、配列番号：5に示される塩基配列を含むCTBP1−ASの発現阻害物質又は機能阻害物質が、本発明の細胞増殖抑制剤の有効成分として好適であることは明らかである。
（ii）のアンチセンスRNAの例として、配列番号：23に記載の塩基配列を含むアンチセンスRNAも好ましい。
【００２０】
（iii）（i）又は（ii）に記載のアンチセンスRNAの変異体、バリアント、又は、前記（i）及び（ii）に記載のアンチセンスRNAにおいて1又は数個の塩基が欠失、付加若しくは置換されているアンチセンスRNA
（i）又は（ii）に記載のアンチセンスRNAの変異体又はバリアントとしては、例えば、5’オルタナティブスプライシングや3’オルタナティブスプライシングなどのスプライシングバリアントを含む各種のバリアント、一塩基多型（SNP）やコピー数多型（CNV）などの多型、突然変異体（例えば癌による突然変異体）が挙げられる。
これらの変異体やバリアントも、CTBP1遺伝子のAR結合部位付近のセンスDNAの転写産物として発現し得るものであり、本発明に係る細胞増殖抑制剤の標的となり得る。
（i）又は（ii）に記載のアンチセンスRNAにおいて1又は数個の塩基が欠失、付加若しくは置換されているアンチセンスRNAで、欠失等する塩基の数は、それがCTBP1遺伝子のAR結合部位付近のセンスDNAの転写産物である限り特に限定されないが、1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個程度、あるいは全体の長さの10％以内、好ましくは5％以内、より好ましくは1％以内である。欠失等する塩基の場所も特に限定されず、それぞれのアンチセンスRNAの5’末端又は3’末端であってもよく、末端以外の塩基であってもよい。また、複数個所において欠失、付加及び／又は置換されていてもよい。
このようなアンチセンスRNAも、CTBP1遺伝子のAR結合部位付近のセンスDNAの転写産物として発現し得るものであり、本発明に係る細胞増殖抑制剤の標的となり得る。
【００２１】
CTBP1-ASの具体例としては、配列番号：17〜21に記載の塩基配列からなるRNAが挙げられる。
配列番号：17に記載の塩基配列からなるRNAは、配列番号：1に記載の塩基配列の698位から3’末端を含み、さらに3’末端に522塩基のRNAが結合した、全長3710塩基のRNAである（以下、「CTBP1-ASc」と呼ぶ。）。
配列番号：18に記載の塩基配列からなるRNAは、配列番号：1に記載の塩基配列の698位から3’末端を含み、さらに3’末端に1853塩基のRNAが結合した、全長5041塩基のRNAである（以下、「CTBP1-ASb」と呼ぶ。）。
配列番号：19に記載の塩基配列からなるRNAは、配列番号：1に記載の塩基配列の698位から3’末端を含み、さらに3’末端に12568塩基のRNAが結合した、全長15756塩基のRNAである（以下、「CTBP1-ASa」と呼ぶ。）。
配列番号：20に記載の塩基配列からなるRNAは、配列番号：1に記載の塩基配列の697位から3’末端までに相当する全長3189塩基のRNAである（以下、「CTBP1-ASd」と呼ぶ。）。
これらのいずれのアンチセンスRNAも、CTBP1遺伝子のAR結合部位付近のセンスDNAの転写産物として発現していることが確認されたものであり、本発明に係る細胞増殖抑制剤の標的となり得る。
【００２２】
本発明者らは、前立腺癌細胞LNCaPを用いた解析によって、CTBP1−ASの発現がアンドロゲンで強く誘導されることを今般新たに見出した。CTBP1−ASはタンパク質モチーフをコードしないノンコーディングRNAである。CTBP1−ASの発現レベルは前立腺癌細胞において上昇している。CTBP1−ASをRNAi法で阻害すると、ARの転写活性が抑制され、癌細胞の増殖が著しく抑制される。
後述する実施例に示されるとおり、CTBP1-ASは、RNA結合性の転写抑制因子であるPSFと結合して複合体を形成すると、細胞周期を抑制する遺伝子（例えばSMAD3、p53）の転写を抑制する。その結果、細胞増殖が促進される。
一方、CTBP1-ASとPSFの複合体は、ヒストン脱アセチル化酵素と協調して、CTBP1の転写も抑制する。本来、CTBP1はアンドロゲン受容体の転写を抑制する機能を有しているので、CTBP1の転写が抑制されることでアンドロゲン受容体による転写活性化が亢進する。その結果、細胞増殖につながる。
従って、CTBP1-ASの発現を抑制すると、後述する実施例に示されるとおり、アンドロゲン抵抗性癌細胞においてもその増殖を抑制することができる。
なお、本明細書において、細胞の増殖を抑制するとは、細胞の増殖を停止又は遅延させることを意味する。
【００２３】
本発明に係る細胞増殖抑制剤は、CTBP1−ASを発現するすべての細胞に有効であるが、特にCTBP1−ASの発現が亢進している細胞の増殖抑制に有用である。本明細書において、CTBP1−ASの発現が亢進している細胞とは、CTBP1−ASの発現レベルが、正常な非分裂細胞に比較して有意に上昇している細胞を意味する。CTBP1−ASの発現が亢進している細胞としては、例えば、前立腺癌細胞及びその転移癌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。なお、前立腺癌の転移癌細胞とは、前立腺癌の転移巣における癌細胞を意味する。
【００２４】
本明細書において、CTBP1−ASの発現阻害物質とは、CTBP1−ASの転写、即ちCTBP1遺伝子のDNAを鋳型としてCTBP1−ASを産生する転写を完全に阻害する物質、又は当該転写を有意に低減させる物質を意味する。なお、本明細書において「発現」は、DNAを鋳型として転写酵素により相補的なRNAが産生される転写、DNAが有する遺伝情報に基づくタンパク質の合成、及び、mRNAが有する遺伝情報に基づいてタンパク質が合成される翻訳を含む。
【００２５】
本明細書において、CTBP1−ASの機能阻害物質とは、CTBP1−AS自体に作用してその機能を完全に阻害する物質、又は当該機能を有意に低減させる物質を意味する。例えば、CTBP1−ASの分解を促進する物質やCTBP1−ASにハイブリダイズする物質が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において、CTBP1−ASの機能とは、CTBP1の発現を抑制し、AR下流シグナルを活性化することを意味する。従って、CTBP1−ASの機能を阻害することは、CTBP1の発現を亢進させ、AR下流シグナルの活性化を抑制することを意味する。
【００２６】
本発明で用いられるCTBP1−ASの発現阻害物質又は機能阻害物質は、上記機能を有する限りどのような物質であってもよく、例えば、低分子化合物；高分子化合物；抗体、酵素等を含むタンパク質；一本鎖DNA、二本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、一本鎖若しくは二本鎖のDNA及びRNAを含むキメラ核酸、その他人工核酸（ペプチド核酸（PNA）、locked nucleic acid（LNA））等を含む核酸、などが挙げられる。
【００２７】
CTBP1−ASの発現阻害物質又は機能阻害物質としては、例えば、以下のものが好ましく用いられる。
（a）CTBP1−AS若しくはその一部に対するアンチセンス核酸
（b）CTBP1−ASを特異的に切断するリボザイム活性を有する核酸
（c）CTBP1−ASに対してRNAi効果を有する二本鎖核酸
（d）上記（a）乃至（c）のいずれかに記載の核酸を発現し得る核酸
【００２８】
（a）CTBP1−AS若しくはその一部に対するアンチセンス核酸
アンチセンス核酸法は、発現阻害方法としてよく知られている。標的遺伝子（基本的には転写産物であるmRNA）に相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸（アンチセンス核酸）を細胞内に導入し、当該標的遺伝子にハイブリダイズさせることによって遺伝子の発現を阻害する方法である。
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、CTBP1−ASの一部に相補的な配列であることが好ましいが、完全に相補的でなくてもよい。例えば、アンチセンス核酸の90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上がCTBP1−ASの一部に相補性を有する。アンチセンス核酸の長さは、CTBP1−ASの機能阻害効果が得られる限り特に限定されないが、一般的には10塩基長〜100塩基長、好ましくは15〜30塩基長である。
アンチセンス核酸は、CTBP1−ASの塩基配列に基づき、公知のソフトウェア等を用いて当業者が適宜設計し、合成することができる。なお、アンチセンス核酸はDNA、RNA、DNA及びRNAを含むキメラ核酸のいずれであってもよく、また、修飾されていてもよい。修飾された核酸としては、例えば、リン酸エステル基をチオリン酸エステル基又はメチルホスホネート基で置換したもの等が挙げられる。
【００２９】
（b）CTBP1−ASを特異的に切断するリボザイム活性を有する核酸
CTBP1−ASの機能阻害物質としては、CTBP1−ASを特異的に切断するリボザイム活性を有する核酸も挙げられる。リボザイムは、標的RNAを触媒的に加水分解する核酸分子であり、標的RNAと相補的な配列を有するアンチセンス領域と、切断反応を担う触媒中心領域から構成されている（例えば、Ribozyme： Biochemistry and Biotechnology （Krupp, G. & Gaur, R. K. eds： Eaton Publishing, MA, 2000）。CTBP1−ASを特異的に切断するリボザイムも、当業者が公知の方法に従って適宜設計することができる。リボザイムは一般的にはRNA分子であるが、DNA−RNAキメラ型分子を用いることもできる。
【００３０】
（c）CTBP1−ASに対してRNAi効果を有する二本鎖核酸
CTBP1−ASの機能阻害物質としては、CTBP1−ASに対してRNAi効果を有する二本鎖核酸も好ましい。RNAiは、二本鎖核酸によって誘導される配列特異的な遺伝子発現抑制機構である。標的特異性が非常に高く、生体内にもともと存在する遺伝子発現抑制メカニズムを利用する方法なので安全性が高い。
【００３１】
哺乳動物細胞に用いられる場合は、通常19〜30塩基程度、好ましくは21塩基〜25塩基程度の二本鎖の小分子RNA（small interference RNA； siRNA）が用いられる。但し、細胞内で酵素（Dicer）により切断されてsiRNAとなりうる、より長い二本鎖RNAを用いてもよい。
RNAiによる標的RNA分子の切断は、まず、siRNAがArgonauteと呼ばれるタンパク質による片側鎖切断又はRNAヘリカーゼによる巻き戻しによって一本鎖化され、Argonauteと結合して作動複合体であるRISC（RNA induced silencing complex）を形成する。RISC内では、siRNAは標的RNAを探索するガイド分子として働き、Argonauteは標的RNAを切断するRNA分解酵素（Slicer）として機能する。
【００３２】
一般的なsiRNAは、19塩基の完全に相補的な二本鎖領域をもち、センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれの3’末端に2塩基の突出塩基（オーバーハング）を有しているが、オーバーハングを有しないブラントエンド型であってもよい。例えば、25塩基のブラントエンドRNAは、インターフェロン応答遺伝子の活性化を最小にし、センス鎖由来のオフターゲット効果を防ぎ、血清中で安定性が非常に高いという利点を有し、in vivoでの使用にも適している。
【００３３】
本発明に用いられるsiRNAは、CTBP1−ASの配列から、他の遺伝子に類似した配列がない領域であること、活性の高いsiRNAのコンセンサス配列を含むこと、配列に3塩基の周期性をもつこと、GC含量が約35〜45％であること等、活性の高いsiRNAを得るための公知の方法に従って、設計することができる。siRNAの設計には、公知の活性予測アルゴリズムを用いることもでき、かかる活性予測アルゴリズムとしては、siExplorer、siDirect、BIOPREDsi等が公開されている。
RNAi効果を有する二本鎖核酸は、二本鎖RNAであってもよいし、DNA−RNAキメラ型二本鎖核酸であってもよく、人工核酸を含んでいてもよい。キメラ型はRNAi効果を有する二本鎖RNAの一部をDNAに換えたものであり血清中での安定性が高く、免疫応答誘導性が低いことが知られている。
また、上記二本鎖核酸は、2’−OH基の修飾、バックボーンのホスホロチオエートによる置換やボラノホスフェート基による修飾、リボースの2位と4位が架橋されたLNA（locked nucleic acid）の導入などによって、ヌクレアーゼに対する耐性や安定化を高めることもでき、このような修飾された二本鎖核酸も本発明に包含される。
【００３４】
（d）上記（a）乃至（c）のいずれかに記載の核酸を発現し得る核酸
上記（a）〜（c）はいずれも核酸であり、合成後に生体に投与することもできるが、これらの核酸をコードする核酸を生体内に導入し、細胞内で上記（a）〜（c）の核酸を発現するように構成してもよい。
例えば、転写によってアンチセンス核酸を発現しうるDNA、又は転写によってリボザイム活性を有する核酸を発現しうるDNAを含むベクターを細胞内に導入すれば、細胞内で発現したRNAがCTBP1−ASの機能を阻害しうる。
また、CTBP1−ASに対してRNAi効果を有する二本鎖RNAの各鎖をコードするDNAを含むベクターを細胞内に導入すればよい。細胞内で二本鎖がそれぞれ発現しハイブリダイズすることによって、CTBP1−ASに対するRNAi効果が発揮される。また、RNAi効果を有する二本鎖RNAを発現させるために、二本鎖RNAの各鎖がループを介して結合した一本鎖RNAをコードするDNAを含むベクターを用いることもできる。発現した一本鎖RNAは分子内でハイブリダイズしてshort hairpin RNAを構成し、Dicerによってループ構造部分が切断され、siRNAとなる。
このように、目的の核酸を細胞内で発現させることができるコンストラクトは、当業者が適宜設計し、細胞内に導入することが可能である。
【００３５】
上記（c）CTBP1−ASに対してRNAi効果を有する二本鎖核酸としては、例えば、配列番号：1に示されるCTBP1−ASの塩基配列において、1804位〜1828位（配列番号：3）、1894位〜1918位（配列番号：4）、2348位〜2372位（配列番号：5）、3063位〜3087位（配列番号：6）の領域を標的とするものが挙げられる。
これらを標的とする二本鎖核酸は、いずれか一本がこれらの標的と相補的な塩基配列を有するRNAであり、もう一本がそれに相補的な塩基配列を有するRNAであるものが挙げられる。このような、二本鎖核酸としては以下の表に示すものがある。
【表１】
0005645171.tif 000002
また上記4つの領域を標的とする二本鎖核酸は、いずれか一本が標的RNAと1〜3塩基ミスマッチを有するRNAであり、もう一本がそれに相補的な塩基配列を有するRNAであっても、RNAi効果を得られる限り本発明の二本鎖核酸に含まれる。
CTBP1−ASの機能阻害物質又は発現阻害物質としては、配列番号：5に示される領域を標的とするsiRNA（例えば、siRNA［3］）が特に好ましい。
また、（c）CTBP1−ASに対してRNAi効果を有する二本鎖核酸としては、CTBP1−ASにおける配列番号：24〜52で表される配列を標的とするものも挙げられる。かかる二本鎖核酸としては、配列番号：53〜78で表される塩基配列からなるRNAと、それぞれに相補的なRNAとの二本鎖核酸が挙げられる。中でも、No.3、4、6、10、12、18及び24の核酸はCTBP1-ASの発現を抑制する効果が高い。
【００３６】
<医薬組成物>
本発明の医薬組成物は、上述した本発明に係る細胞増殖抑制剤を含む。従って、本発明の医薬組成物は、CTBP1−ASの発現が亢進している細胞に投与すると当該細胞に対して増殖抑制効果を発揮するので、AR依存的な細胞増殖が関与する疾患の予防又は治療薬として特に有用である。AR依存的な細胞増殖が関与する疾患としては、例えば、AR依存的な癌（典型的には前立腺癌）や前立腺肥大症が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体や添加物を含んでいてもよい。かかる担体としては、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤、賦形剤、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３７】
本発明の医薬組成物は、様々な形態、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤などとすることができる。好ましい態様は、注射剤であり、非経口（例えば、静脈内、経皮、腹腔内、筋内）で投与することが好ましい。
【００３８】
本発明の医薬組成物が、細胞増殖抑制剤として上記（a）〜（c）等の核酸を含む場合、リポソーム、高分子ミセル、カチオン性キャリア等のキャリアに核酸を封入して製剤化することができる。また、プロタミンのような核酸キャリアを利用してもよい。これらのキャリアに抗体等を結合させて、患部を標的化することも好ましい。また、核酸にコレステロール等を結合させて血中滞留性を高めることも可能である。
【００３９】
細胞増殖抑制剤として、上記（a）乃至（c）のいずれかに記載の核酸をコードする核酸を含む場合には、当該核酸を、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターに挿入し、細胞内に投与することができる。
【００４０】
<治療方法>
本発明に係る前立腺癌の予防又は治療方法は、本発明の細胞増殖抑制剤を治療有効量投与することを特徴とする。
本明細書において、治療有効量とは、治療する疾患の一つ又は複数の症状が、それによりある程度緩和される作用物質の量を意味する。従って前立腺癌の場合、腫瘍サイズの低下；腫瘍の転移の阻害（遅延又は停止）；腫瘍増殖の阻害（遅延又は停止）、及び癌と関連する一つ又は複数の症状の緩和、の少なくとも1つを示す量を意味する。細胞増殖抑制剤は、上述した医薬組成物として投与することができる。
【００４１】
<スクリーニング方法>
本発明に係る細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法の第一の態様は、CTBP1−ASを発現する細胞又は細胞抽出液と被検化合物とを、アンドロゲン存在下で接触させる工程と、CTBBP1−ASの発現レベルを測定する工程と、被検化合物の非存在下で測定した場合と比較して、CTBP1−ASの発現レベルを低下させる被検化合物を選択する工程と、を含む。
【００４２】
CTBP1−ASを発現する細胞としては、CTBP1−ASを発現している細胞である限り特に限定されないが、例えば、ヒトの各種癌細胞を用いることができる。中でもCTBP1−ASを高発現する前立腺癌細胞（LNCap細胞等）や、その転移癌細胞が好ましい。また、子宮頸癌細胞株HeLa細胞、腎臓由来の細胞株293細胞、乳癌細胞株MCF7細胞なども用いることができる。十分にCTBP1−ASを発現していない細胞は、CTBP1−ASをコードするDNAを含む発現ベクターを導入することにより、CTBP1−ASを発現する細胞として使用することも可能である。
本発明のスクリーニング方法では、細胞自体ではなく、細胞抽出液を用いることもできる。細胞抽出液は、当業者が公知の方法によって調製することが可能である。
【００４３】
本発明のスクリーニング方法に用いられる被検化合物は特に限定されないが、例えば、有機化合物、無機化合物、核酸（アンチセンス核酸、リボザイム、siRNA、RNAアダプター等）、ペプチド、タンパク質（抗体等）、糖などが挙げられる。
【００４４】
被検化合物と、CTBP1−ASを発現する細胞又は細胞抽出液との接触は、例えば、被検化合物を細胞の培地や細胞抽出液に添加することにより行うことができる。
また、被検化合物が核酸の場合は、カチオニック・リポソーム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法などによって細胞内に被検化合物を導入することができる。被検化合物がsiRNAの場合は、市販のトランスフェクションキットを用い、指示書に従って行ってもよい。
被検化合物と細胞又は細胞抽出液との接触をアンドロゲン存在下で行うことにより、CTBP1−ASの発現を安定的に上昇させられるので、被検化合物の効果を確認することができる。例えば、被検化合物と接触させた後、3日後に細胞の培地や細胞抽出液にアンドロゲンを添加するとよい。
CTBP1−ASの発現レベルを測定する工程は、mRNAの発現量を測定可能なあらゆる方法を用いて行うことができるが、例えば、細胞からRNAを回収し、Real−time  PCRやノーザンハイブリダイゼーション法によって解析することができる。なお、CTBP1−ASはノンコーディングRNAであるため、ここでいう発現レベルとはRNAレベルでの発現である。
被検化合物の非存在下で測定した場合とは、被検化合物を接触させたのと同じ細胞又は細胞抽出液に、被検化合物を添加せずにアンドロゲンのみを添加して、CTBP1−ASの発現レベルを測定した場合を意味する。この場合の測定値と、被検化合物と接触させた場合の測定値とを比較して、後者のほうが有意に低い値であった場合、当該被検化合物は、CTBP1−ASの発現が亢進している細胞の増殖抑制剤として選択される。
【００４５】
本発明に係る細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法の第二の態様は、CTBP1遺伝子を発現する細胞又は細胞抽出液と被検化合物とを、アンドロゲン存在下で接触させる工程と、CTBBP1遺伝子の発現レベルを測定する工程と、被検化合物の非存在下で測定した場合と比較して、CTBP1遺伝子の発現レベルを上昇させる被検化合物を選択する工程と、を含む。
第二の態様は、第一の態様と比較して、CTBP1遺伝子を発現している細胞を使用する点と、CTBP1遺伝子の発現レベルを測定する点、及び、CTBP1遺伝子の発現レベルを上昇させる被検化合物を選択する点が異なる。
【００４６】
CTBP1遺伝子を発現する細胞としては、例えば、前立腺癌細胞（LNCap細胞等）や、その転移癌細胞を用いることができる。また、CTBP1遺伝子を発現する細胞は、CTBP1遺伝子を発現しない細胞に、CTBP1遺伝子をコードするDNAを含む発現ベクターを導入して作製することもできる。なお、発現ベクターを導入する場合、CTBP1遺伝子の全長をコードするDNAのみでなく、一部をコードするDNAを用いて、CTBP1遺伝子の一部を発現させてもよい。CTBP1遺伝子はCTBP1タンパク質をコードするので、ここでいう発現は、転写と翻訳の両方を含む。
【００４７】
CTBP1遺伝子の発現レベルは、mRNAレベルでの発現、タンパク質レベルの発現のいずれも、当業者が公知の方法に従って測定することができる。mRNAレベルの場合、例えばCTBP1−ASと同様に、Real−time PCRやノーザンハイブリダイゼーション法を用いて測定することができる。タンパク質レベルの場合、SDS−PAGE等の電気泳動法や、CTBP1タンパク質に対する抗体を用いたウェスタンブロッティング法により測定を行うことも可能である。
上述のとおり、CTBP1−ASの発現又は機能を阻害することにより、CTBP1タンパク質の発現は上昇し、ARの転写活性は抑制され、CTBP1−ASの発現が亢進している細胞の増殖も抑制される。従って、被検化合物の非存在下で測定した場合と比較して、CTBP1遺伝子の発現レベルを上昇させる被検化合物を選択すれば、CTBP1−ASの発現が亢進している細胞に対する増殖抑制剤を得ることができる。
【００４８】
本発明に係るスクリーニング方法は、さらに、被検化合物を前立腺癌細胞等、CTBP1−ASの発現が亢進している細胞に投与して細胞増殖アッセイ（MTSアッセイ）を行う工程や、被検化合物を担癌動物に投与して腫瘍細胞の増殖への効果を確認する工程等を含んでもよい。これらの工程により、被検化合物の効果をさらに検証することができる。
【００４９】
<検査方法>
本発明の前立腺癌の予後を判定する検査方法は、患者の前立腺から採取した細胞におけるCTBP1−AS又はCTBP1遺伝子の発現レベルを測定する工程と、その発現レベルを正常な前立腺細胞における発現レベルと比較する工程と、を含む。
本発明者らは、患者の前立腺癌細胞及びその転移癌細胞においては、CTBP1−ASの発現量が正常細胞に比較して有意に高く、CTBP1遺伝子の発現量が正常細胞に比較して有意に低いことを確認した。また、CTBP1−ASの発現量の上昇、又は、CTBP1遺伝子の発現量の減少が、前立腺癌患者の予後と相関関係を有することを見出した。
従って、本発明の検査方法による検査の結果、CTBP1−ASの発現が正常細胞に比較して有意に高い場合、予後は不良となる可能性が高いものと予測することができ、CTBP1の発現が正常細胞に比較して有意に低い場合、予後は良好となる可能性が高いものと予測することができる。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが何らこれらに限定されるものではない。
以下の実施例において使用された方法を説明する。
［RNA Fishならびに蛍光免疫染色］
CTBP1-ASを検出するためのアンチセンスCTBP1-ASプローブは、RNA labeling kit（Roche社）を用い、その使用説明書に従って作製した。colocalization studyのために、LNCaP細胞は、24ウェルの培養容器においてカバーグラス上で培養した。アンドロゲン処理から24時間後に、PBSで細胞を洗浄し、3.6％ホルムアルデヒドと10％酢酸（in PBS）中に20分室温で静置して固定し、0.5％Triton X-100中に5分室温で静置して透過処理を行った。PBS洗浄後、プローブとハイブリダイズさせた（湿室で42℃、一晩）。Alexa555を結合させたロバ抗DIG抗体で検出した。次に内因性PSFは、ウサギ抗PSF抗体と4℃で一晩反応させた後、Alexa488を結合させた抗ウサギIgG抗体で検出した。共焦点顕微鏡で撮像した。【００５１】
［RNA免疫沈降（RIP）］
15cmディッシュでコンフルエントなLNCaP細胞を回収し、1mlのNP40 lysis buffer（50mM Tris pH8.0、150mM NaCl、1%NP40）に再懸濁した。Sin3A、PSF、NONOに対する抗体又はIgG（それぞれ、Santa cruz Biotechnology社、Sigma社、BD社、Sigma社）を上清に加え、4℃で一晩回転させた。30μLのプロテインGビーズを加え、4℃で2時間、穏やかに回転させながらインキュベートした。Lysis bufferを用いてビーズを3回洗浄し、1mlのISOGENに再懸濁した。共沈したRNAを単離し、CTBP1-ASのmRNAレベルをqRT-PCRで解析した。【００５２】
［ノーザンブロッティング］
アンチセンスCTBP1-ASプローブの調製と、それに続くノーザンブロッティングによる解析は、Northern blot starter kit（Roche社）を用い、使用説明書に従って行った。1μgのトータルRNAを変性させ、ホルムアルデヒド含有アガロースゲル（1×MOPS buffer中）にローディングした。RNAをHybond-XL membrane（Roche社）に移し、DIGで標識した、CTBP1-ASの中央部にわたるRNAプローブで検出した。  【００５３】
［マイクロアレイ］
LNCaP細胞のトータルRNAをISOGEN試薬（Nippon Gene社）で回収した。発現解析マイクロアレイとして、Gene chip human exon 1.0 ST array（Affymetrix社）を使用説明書に従って用いた。データ解析は、Affymetrix Microarray Suite softwareを用いて行った。比較用アレイについては、すべてのプローブセットからのデータを用いて標準化した。【００５４】
［ChIP及び定量リアルタイムPCR］
ChIPは常法に従って行った(Takayama K， et al. Oncogene 26, 4453-63 (2007))。1%ホルムアルデヒド５分間処理により蛋白、DNA架橋を行った後、細胞を回収し蛋白DNA抽出液を作成し超音波処理を行った。特異抗体および非特異的IgGにより一晩反応させた後、protein A/G アガロースにより蛋白DNA複合体を回収した。洗浄した後、65度一晩反応させ脱架橋した。DNAはエタノール沈殿により回収した。IgGコントロールに対するFold enrichmentは、SYBR green I fluorescenceを用いて、SYBR green PCR master mix（Applied Biosystems社）と、ABI Prism 7000 system（Applied Biosystems社）とにより、リアルタイムPCRで定量した。それぞれのPCR産物は、Comparative cycle threshold法（Ct法）により相対的に定量した。外部標準としてはGAPDHを用いた。使用したプライマーの配列は下表に示す。
【表２】
0005645171.tif 000003
【００５５】
［リアルタイムRT-PCR］
トータルRNAをISOGEN試薬を用いて単離した。最初のcDNA鎖はPrimescript RT reagent kit（Takara社）を用いて産生した。mRNAはリアルタイムPCRで定量した。
使用したプライマーを下表に示す。
【表３】
0005645171.tif 000004
【００５６】
［siRNA］
CTBP1-AS、CTBP1（HSS102437）、NONO (HSS143135)、PSF (HSS109643)、Sin3A (HSS177954)を標的とするStealth RNAiシステムと、ネガティブコントロールをInvitrogen社から購入した。細胞のトランスフェクションは、Lipofectamine RNAi MAX reagent（Invitrogen社）を用いて、実験の48から72時間前に行った。CTBP1-ASに対するsiRNAの配列は、5’-UUAUGUCUCCAGCAAGCUUGGである。【００５７】
［In vivo 腫瘍形成アッセイ］
LNCaP細胞（3×106細胞）又はLTAD細胞（1×107細胞）を、5週齢のオスのヌードマウス20匹の両側に皮下注射した。LTAD細胞を移植したマウスは、腫瘍体積が100mm3に達した時点で精巣摘出を行った。5μgのCTBP1-ASに対するsiRNA又はコントロールsiRNAを、Lipofectamine RNAi MAX transfection Reagentを用いて、週に3回、腫瘍中にトランスフェクトした。腫瘍体積は、0.5×r1×r2×r3（r1＜r2＜r3）の式に従って求めた。【００５８】
［細胞増殖アッセイ］
細胞は、96ウェルプレートで、3×103細胞／ウェルで培養した。pcDNA3 CTBP1-ASの安定な細胞株を1％FBSを含むRPMI培地に播種した。RNAi実験のためには、細胞は、プレートに移した24時間後にステルスRNAでトランスフェクトした。MTSアッセイは、cell titer reagent（Promega社）を用い、使用説明書に従って行った。実験は5回ずつ繰り返した。【００５９】
［細胞培養及び試薬］
LNCaP細胞（ヒト前立腺癌細胞）は、10％FBS、50units/mlのペニシリン、及び50μg/mlのストレプトマイシンを含むRPMI培地で培養した。アンドロゲン処理に先立ち、細胞は、5％dextran charcoal stripped FBSを含むフェノールレッドフリー培地で48時間から72時間培養した。使用した抗体は、Sin3A (AK-11)、p53 (Pab-240)、p21 (F-5)、CyclinD1 (C-20)、CyclinA (H-432)、CyclinB1 (H-433) (Santa cruz Biotechnology社)、CTBP1 (#612042)、NONO (#611278)(BD bioscience社)、AcH3K9 (#07-352) (Upstate社)、PSF (#61045) (Novus Biologicals社)、SMAD3 (#04-1035) (Millipore社)。AR、AcH3およびβ-actinに対する抗体は、Takayamaらの報告に述べられている（Takayama K， et al. Oncogene 26, 4453-63 (2007)；Cancer Res. 69(1):137-42(2009)；Oncogene 30(5):619-30(2011)）。Dihydrotestosterone, BicaltamideはWako社より購入した。【００６０】
［ウェスタンブロッティング、免疫沈降］
常法に従って行った(Takayama K， et al. Oncogene 26, 4453-63 (2007))。細胞をNP40バッファーにより回収し蛋白抽出液を作成した。適当量をLaemmli sample バッファー中で5分間沸騰させ、SDS-PAGEにより分離した。PVDF膜に転写したのち５％スキムミルクによりブロッキングを行い一次抗体と4℃にて一晩反応させた。ウサギもしくはマウスIgGに対する二次抗体と一時間反応させたのち発色し撮影を行った。【００６１】
［ルシフェラーゼアッセイ］
LNCaP細胞は、トランスフェクションに先立って、5％のcharcoal stripped FBSを加えたフェノールレッドフリー培地で24時間インキュベートした。次に、FuGENE6 reagent（Roche Diagnostics社）を用い、ARBSを含むpGL3ベクターならびにtk-PRLを細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後、常法に従ってルシフェラーゼ活性を測定した。RNAiを組み合わせたルシフェラーゼアッセイでは、RNAのトランスフェクションは、アンドロゲン刺激の72時間前に行った。【００６２】
［細胞周期解析］
コントロールsiRNA又はPSFに対するsiRNAのトランスフェクションのあと、96時間インキュベートしてから細胞を回収した。細胞は遠心処理し、PBSで洗浄した後、穏やかに振とうしながら、3mlの氷冷した70％エタノールをゆっくり加えて固定した。使用時までに4℃で保管した。細胞周期解析の日、細胞を遠心処理し、PBSで洗浄した後、100μg/mlのRNaseA（Takara社）を含むPBS中に、106個／1mlで再懸濁し、37℃で30分インキュベートした。DNA含有量を測定するため、30,000個の細胞をFACS Calibur flow cytometryで、Cell Quest software（BD Biosciences社）を用いて解析した。【００６３】
［マイクロアレイデータの解析］
CTBP1-ASに対するsiRNAと、PSFに対するsiRNAを用いたマイクロアレイ解析をそれぞれ独立に行った。PSFに対するsiRNAを用いた実験により、700の遺伝子がPSFにより抑制を受ける遺伝子であるものと推測された。これらの標的遺伝子の機能の特定にはDAVIDを用い、パスウェイ解析にはREACTOMEを用いた。両方の解析において、コントロールサンプルから300の遺伝子がアンドロゲンにより抑制される遺伝子として同定された。【００６４】
<CTBP1−ASの発見>
本発明者らは、ARの下流シグナルの阻害が前立腺癌治療の治療標的として有効であると考え、クロマチン免疫沈降法とタイリングアレイを組み合わせる方法（ChIP−chip法）により、ARが直接標的とする遺伝子を解明する方法を確立した（Takayama K. et al. Oncogene 26, 2007, 4453-4463、Takayama K. et al. Cancer Res. 69, 2009, 137-142）。さらに、アンドロゲンによる転写ネットワークを解明するため、ARに加えてヒストンH3K9／K14アセチル化の抗体を用いてヒト全ゲノムレベルでChIP−chip解析を行い、AR結合部位（ARBS）とヒストンH3アセチル化部位（AcH3）を同定した。【００６５】
また、LNCaP細胞を用いて、Cap Analysis gene expression（CAGE）を行った。CAGEは、mRNAの5’末端から20塩基のDNAタグのコンカテマーをシークエンスして、転写開始点をゲノムワイドで同定し、プロモータの使用状況をプロファイルするハイスループットな方法である。CAGE解析により、ヒトゲノム中にCAGEタグをマッピングし、タグの集積する領域をタグクラスター（TC）と定義した。TC内で、時間によってタグの分布が有意に変化するものを同定した。【００６６】
近年アンチセンス転写産物が近傍の遺伝子発現を制御することが報告されていること（Katayama S. et al. Science 309, 2005, 1564-1566）、また、ARの転写制御は前立腺癌の発症の重要なシグナルであることから、AR転写活性とアンチセンス転写産物の関係は癌の進行を説明するための重要な要素であると考えられた。そこで、アンチセンスTCに制御されるアンドロゲン応答遺伝子を探索したところ、CTBP1を見出した。
また、CTBP1のARBS付近に、アンドロゲンで活性化されるアンチセンスのTCを見出した。GENBANKによれば、これはAX747506のex3を転写開始点とするものであることがわかった。そこで、このアンチセンスRNAをCTBP1-ASdと名付けた（配列番号：20）。【００６７】
CTBP1-ASdは、330アミノ酸の配列をコードする配列を含む。しかしながら、本発明者らによるPfamを用いた解析で、このアミノ酸配列はタンパク質モチーフをコードしないことがわかった。また、Netstartを用いて解析したところ、最初のメチオニンがタンパク質翻訳開始点として機能する可能性が低いことがわかった。さらに、IVT法（in vitro transcription法）により実験したところ、CTBP1-ASdからのタンパク質合成は認められなかった（データ示さず）。これらの結果は、CTBP1-ASdがタンパク質モチーフをコードしないノンコーディングRNAであることを意味する。【００６８】
<CTBP1-ASdに対するRNAi効果を有するsiRNAの調製>
siRNAは、CTBP1-ASdの塩基配列を基に設計したstealth RNAi（Invitrogen社）を用いた。一般的なsiRNAより長い25塩基長のブラントエンド型二本鎖RNAであり、インターフェロン応答遺伝子の活性化を最小にできる、センス鎖由来のオフターゲット効果を防ぐことができる、血清中での安定性が非常に高い、等の特徴を有し、in vivoでの使用実績もある。
siRNAの配列は、Invitrogen社のウェブサイトのRNAiデザイナーにより最適部位を決定した。作製したsiRNAの配列は以下のとおりである。
【表４】
0005645171.tif 000005
以下の実施例において、siRNA投与群には、上記siRNA［3］を投与した。また、siRNA実験（in vivoの実験を除く）のコントロールには、CTBP1-ASdに対してRNAi効果を示さない二本鎖RNA（Stealthtm RNAi Negative Control Medium GC Duplex, Invitrogen 12935-300）を投与した。【００６９】
<CTBP1-ASのアンドロゲン依存的発現及びCTBP1遺伝子のアンドロゲン依存的発現抑制に対するsiRNA投与の効果>
実験には、AR陽性のヒト前立腺細胞株LNCaP細胞を用いた。細胞培養には、10％ウシ胎児血清（FBS，Sigma社）、100μg／mlストレプトマイシン、100U／mlペニシリン（Invitrogen社）を含むRPMI1640（Sigma社）を細胞培養液として用いた。空気中に5％の炭酸ガスを含む培養器内にて37℃で培養した。
LNCaP細胞1×105個を6穴プレートで培養した。翌日、20nM、50nMのsiRNAを、Hiperfect Transfection Reagent（Quiagen社）と、OPTI−MEM（Invitrogen社）を用いて細胞内に導入した。48時間後に10nMのアンドロゲンR1881またはVehicleにより刺激した。さらに24時間培養した後、ISOGEN（Nippon gene社）を用いてRNAを回収した。
mRNAの発現解析をReal−time PCR（Prism7000システム；Applied biosystems社）により行った。Real−time PCR法により得られる増幅曲線から、細胞内での転写産物の発現量をΔΔCt法で求めた。GADPH遺伝子の発現量を基準に発現量を補正した。【００７０】
CTBP1-ASの発現を測定した結果を図1に示す。コントロールにおいては、アンドロゲン依存的にCTBP1-ASの発現が促進されたが、siRNA投与群の細胞では、siRNAの濃度依存的にCTBP1-ASの発現が抑制された。50nMのsiRNAを投与した細胞では、アンドロゲンによる発現誘導は60−80％の発現抑制を受けた。【００７１】
CTBP1のmRNAの発現を測定した結果を図2に示す。コントロールにおいては、アンドロゲンにより、CTBP1のmRNA発現は抑制された。一方、siRNA投与群では、siRNA濃度依存的に、アンドロゲンによるCTBP1の発現抑制効果が消失した。
また、10nMのR1881で処理し、24時間後にタンパク質を回収してウエスタンブロット法によりCTBP1のタンパク質レベルでの発現量を測定した。結果を図3に示す。タンパク質レベルでもアンドロゲン投与により発現が抑制されるが、siRNA投与により、発現抑制効果がsiRNAの濃度依存的に減少した。【００７２】
<ルシフェラーゼアッセイ>
CTBP1-ASによるARの転写活性への影響を確認するため、ルシフェラーゼアッセイを行った。
ルシフェラーゼベクターは、pGL3−basic（Promega社）のプロモータ領域に、代表的なアンドロゲン応答遺伝子であるPSA（Prostate specific antigen）のプロモータとエンハンサーを挿入して作製した（PSA−LUC）。PSA−LUCは、AR結合部位を有し、アンドロゲン応答性にプロモータが活性化される。
LNCaP細胞を24穴プレート3×104個／ウェルとなるように散布し培養した。2.5％チャコール血清含有フェノールレッドフリー培地にて2日間培養後、PSA−LUCを導入し、翌日、10nMのR1881又はVehicleにより刺激した。24時間後に細胞を回収した。ルシフェラーゼ活性をDual−Luciferase Reporter Assay System（Promega社）を用いて測定した。
siRNA及びコントロール二本鎖RNAは、ベクターを細胞に導入する2日前に前述の方法で投与した。【００７３】
結果を図4Aに示す。コントロールでは、ルシフェラーゼ活性が著しく上昇し、アンドロゲンの投与によりARの転写活性が亢進して、PSAプロモータ及びエンハンサーが活性化されたことが示された。一方、siRNA投与群では、ルシフェラーゼ活性は著しく抑制を受けた。【００７４】
また同じ細胞におけるアンドロゲン応答遺伝子の発現を調べた結果を図4B及びCに示す。コントロールでは、アンドロゲンにより、代表的なアンドロゲン応答遺伝子であるFKBP5及びTMPRSS2の発現量が増加しているが、siRNAを投与群では、siRNAの濃度依存的に発現量の増加が抑制された。
以上の結果から、CTBP1-ASを抑制するとARの転写活性も抑制されることが確認された。【００７５】
<CTBP1-ASの機能抑制によるLNCaP細胞増殖への影響>
CTBP1-ASによるLNCaP細胞への細胞レベルの影響をMTSアッセイにより解析した。
96穴プレートに、LNCaP細胞を3×103個／ウェルになるように継代培養した。ルシフェラーゼアッセイと同様に、翌日siRNAを投与した。48時間、72時間、96時間後にCell titer 96（Promega社）を用いて1時間反応させた。
MTSアッセイは、PES（phenazine ethosulfate）を介して、テトラゾリウム塩（3−（4，5−dimethylthiazol−2−yl）−5−（3−carboxymethoxyphenyl）−2−（4−sulfophenyl）−2H−tetrazolium， inner salt；MTS）を発色物質であるホルマザン産物へ変換する還元反応に基づいて、生細胞数を測定する方法である。マイクロプレートリーダーにて、吸光度490nmで細胞増殖能を測定した。
結果を図5に示す。コントロールに比較して、siRNA投与群では細胞増殖が有意に抑制され、CTBP1-ASがLNCaP細胞の増殖を促進していることがわかった。【００７６】
<CTBP1-ASの機能抑制によるin vivoの腫瘍増殖への影響>
CTBP1-AS、及びCTBP1-ASの機能抑制が、in vivoで腫瘍増殖に与える影響を解析した。
LNCaP細胞をマウスの皮下に移植するために、PBS及びマトリゲル（BD bioscience社）と混合した。マウス1匹あたり、1×107個、PBS100μl、マトリゲル100μlとなるようにし、20匹分を一度に調製した。
6週齢のオスのBALB／cヌードマウス（日本クレア社）の皮下に、25G注射針を用いて注入した。【００７７】
siRNAの腫瘍内への注入には、Gene silencer（Genlantis社）を用いた。5μgのsiRNAを、5μlのGene silencerとOPTI−MEMにて混合し、マウスの腫瘍内に局注した。コントロール群には、以下の塩基配列からなる二本鎖RNAを同様に投与した。
AAGACGAUCGUUCGGGACAACAUAA  （配列番号：15）
UUAUGUUGUCCCGAACGAUCGUCUU  （配列番号：16）
siRNAの注入は、マウスへの癌細胞移植後、細胞が皮下に生着したと考えられる2週間後より、週2回行った。
マウスの腫瘍の大きさは週1回計測した。長径（r1）及び短径（r2、r3）を2ヶ所計測し、（r1×r2×r3）／2の式に従って腫瘍の大きさを求めた。
移植後10週にマウスを犠牲死させ、腫瘍を皮下から摘出した。腫瘍は重量を計測した後、一部はISOGENによるRNA抽出に供し、cDNA合成後、Real time−PCRによりCTBP1-AS及びCTBP1のRNAレベルの発現量を測定した。一部はSDS lysis buffer（10mM Tris−HCl，pH7.5、2％SDS、10％メルカプトエタノール）により溶解してタンパク質抽出に供し、ウエスタンブロット法によりCTBP1の発現量を測定した。【００７８】
結果を図6乃至9に示す。
図6に示されるように、コントロールと比較して、siRNA投与群では、腫瘍の増殖が有意に抑制された（p値<0.01）。また、図7に示されるように、腫瘍の重量においても、siRNA投与群では重量の増加が著しく抑制されることが観察された（p値<0.001）。【００７９】
図8に、腫瘍内のCTBP1-AS及びCTBP1のRNAレベルの発現量をReal  time−PCRで測定した結果を示す。4匹のマウスにおける腫瘍中のCTBP1-ASの発現レベルは、コントロール群に比較して、CTBP1-ASに対するRNAiの投与により低下した。一方、CTBP1の発現量は、コントロール群に比較して、CTBP1-ASに対するRNAiの投与により増加した。これらの結果から、in vivoにおいても、CTBP1がCTBP1-ASによる負のコントロールを受けていることが明らかになった。【００８０】
図9に、腫瘍内のCTBP1のタンパク質レベルの発現量をウエスタンブロット法で測定した結果を示す。コントロール群に比較して、RNAi投与群では、CTBP1の発現量が蛋白質レベルでも増加した。
以上の結果から、CTBP1-ASによるCTBP1の抑制のメカニズムが腫瘍モデルにおけるin  vivoの腫瘍増殖においても機能していること、CTBP1-ASを標的として抑制することにより腫瘍増殖の抑制が促されることが確認された。【００８１】
<実際の癌におけるCTBP1-ASの発現>
NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）のGEO Datasetsより公開されているアフィメトリックス社Human Genome U133 Plus 2.0アレイを用いた前立腺、および前立腺癌症例の発現プロファイルのデータ（GSE3325）をダウンロードした。
正常、癌、転移それぞれのサンプルのCTBP1-AS（AX747592）特異的なprobe（1563571_at）に着目しシグナル量を抽出した。各群の間でMann−Whitney順位検定を行い、発現量の比較検討を行った。
結果を図10に示す。癌及び遠隔転移の癌組織におけるCTBP1-ASの発現量は、正常の前立腺に比較して有意に高かった（p値< 0.05、Mann−Whitney順位検定）。この結果から、CTBP1-ASは発癌、癌の悪性化にかかわるものと考えられる。【００８２】
<実際の癌におけるCTBP1の発現>
実際の前立腺癌におけるCTBP1の発現を免疫染色法により評価した。免疫染色法は、鈴木らの方法に従った（Suzuki T. et al. Clin. Cancer Res. 2005 Sep 1;11(17):6148-54）。
症例は東京大学医学部附属病院泌尿器科で1987年より2001年に摘出された前立腺癌の手術標本を有する104症例から選択された。正常部位にあたる切片99例と前立腺癌に該当する切片101例につき、ホルマリン固定後、パラフィン切片を作成した。一次抗体はCTBP1特異的マウスモノクローナル抗体（BD バイオサイエンス社製）を用いた。染色は、免疫組織染色のキットHistofine Kit（ニチレイ社）を用い、3,3'-diaminobenzidine solution[1 mmol/L 3,3'-diaminobenzidine, 50 mmol/L Tris-HCl buffer (PH7.6), and 0.006% H2O2]により発色させた。正常前立腺と前立腺癌の代表的な切片の像を図11Cに示す。
各切片につきCTBP1の核内での陽性率(LI: Labeling Index)を計測し、正常組織及び癌組織におけるCTBP1タンパク質の発現を定量化し比較検討した。
結果を図11Aに示す。正常細胞に比較して、前立腺癌細胞ではCTBP1の発現量は低下していた。
また、前立腺癌の101例について、手術後3ヶ月ごとに5年間外来で経過を追ったデータを使用して、CTBP1高発現群と低発現群の生存率を比較し、Long-rank検定によるKaplan-Meier法を用いて解析した。なお、高発現群と低発現群は、CTBP1の発現を表すLabeling Indexの中央値を基準に分類した。
結果を図11Bに示す。CTBP1高発現群は、低発現群に比較して生存率が有意に高かった。
以上の結果から、CTBP1-ASによるCTBP1の抑制のメカニズムが実際の腫瘍の腫瘍増殖においても機能していることが確認された。【００８３】
<CTBP1-ASd以外のCTBP1-ASの特定>
前立腺癌細胞に発現しているCTBP1-ASd以外のCTBP1−ASを以下の方法で探索した。
LNCaP細胞にR1881 10 nMにて刺激した後、24時間後にRNAを回収した。RNA1μgをDNaseIμl(Roche社、10 U/μl)処理をしたのちRACE Kit (Roche社)をもちいて逆転写反応を行った。つぎにCAGE法により得られた転写開始点付近からのprimerおよび末端のアダプター特異的な配列を有するprimerをもちいてPCR反応を行い、得られたPCR産物をTA Cloning Kit(Invitrogen社)を用いてプラスミドへ挿入した。プラスミドのシークエンスを行いPCR反応により得られた転写産物の配列を解析した。得られた配列をヒトゲノム配列へマッピングを行い転写産物の範囲を決定した。
使用した3’RACE primerとPCR adaptor primerは以下のとおりである。
3' RACE primer : 5'-GACCACGCGTATCGATGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTV-3'  （配列番号：21）
PCR adaptor primer : 5'-GACCACGCGTATCGATGTCGAC-3'  （配列番号：22）【００８４】
この結果、少なくとも図12に示す4種類のCTBP1-ASが存在することがわかった。そのうち一つは上述のCTBP1-ASdであった。CTBP1-ASaの塩基配列は配列番号：19に、CTBP1-ASbの塩基配列は配列番号：18に、CTBP1-AScの塩基配列は配列番号：17にそれぞれ示す。
これらのCTBP1-ASは、いずれも上表に記載のsiRNAの標的配列を含むものである。従って、上述の実施例におけるsiRNAによる発現抑制実験では、これらのCTBP1−ASの発現も抑制されていたと考えられる。【００８５】
また、CTBP1-ASa乃至CTBP1-ASdが共通して有する配列として、配列番号：1に記載のRNA配列の1286位〜3515位の領域（配列番号：23）検出するプローブを作成し、ノーザンブロットを行った。プローブの作製は、DIG Northern Starter Kit （Roche社）を用いてプロトコル通りに行った。
LNCaP細胞にR1881 10 nM刺激を行い0, 6, 12, 18, 24, 48時間にRNAを回収した。RNA(各1μg)はホルムアルデヒド入りのアガロースゲルにて泳動しメンブレンに転写した。メンブレンに上記のプローブ(100 ng/ml)をハイブリダイゼーションさせ、DIG特異抗体を用いて検出した。
実験に用いたRNA量を測定するため同時にβアクチンに対するプローブ(Roche社)を購入し同じメンブレンを用いて検出した。
結果を図13に示す。約5kbの長さの転写産物が検出され、上記4種類のCTBP1-ASのうち、CTBP1-ASbがおもに発現していることが示唆された。【００８６】
<CTBP1-ASの局在>
LNCaP細胞をR1881 10nM又はVehicleにて24時間処理した。細胞を回収し、PARIS kit（Ambion社）を用いて核内RNA、細胞質RNAをそれぞれ抽出した。それぞれのサンプルより、RNA 1μgを泳動し、ノーザンブロットにより発現量を解析した。Loading Controlとしてβ-actinに対するプローブをハイブリダイズさせ、発現量を測定した。それぞれの遺伝子の発現量は、GAPDHで補正した。
結果を図１４に示す。CTBP1-ASは核内に局在することが確認された。【００８７】
<CTBP1-ASのアンドロゲン枯渇抵抗性の癌細胞増殖への関与−in vitro>
LTAD細胞、ならびにLNCaP細胞(2.5 % チャコール血清 3日間培養, R1881 刺激, R1881 + Bicaltamide添加) のLysateを回収し、CTBP1抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。β-actinに対するプローブをRoding Controlとして用いた。
また、CTBP1-ASのLTAD、LNCaP細胞における発現量を比較するために、LTAD細胞,とLNCaP細胞(2.5 % チャコール血清 3日間培養, R1881 刺激, R1881 + Bicaltamide添加)のTotal RNAを回収した。RNA 1μgを泳動、転写し、CTBP1-ASに対するプローブを用いてノーザンブロッティングを行った。
結果を図１５ａ及びｂに示す。LTAD細胞は、アンドロゲン枯渇状態で培養され、ホルモン療法抵抗性モデルとなる。LNCaP細胞にアンドロゲン刺激を行うと、CTBP1の発現はLTAD細胞の場合と同程度に低下し、LTAD細胞においてはCTBP1-ASの発現が著しく増加した。【００８８】
次に、ホルモン依存性又はホルモン枯渇状態での前立腺癌細胞の増殖におけるCTBP1-ASの影響の解析を行った。
LNCaP細胞を2.5%チャコール血清、フェノールレッドフリー培地にて3×103個/well散布し、翌日CTBP1-ASに対するRNAiをtransfectionした。2日後、EtまたはR1881にて刺激し、Day1、3、5にMTS assayを行い、増殖能を評価した。
また、LTAD細胞を2.5%チャコール血清、フェノールレッドフリー培地にて3×103個/well散布し、翌日CTBP1-ASに対するRNAiをtransfectionし、2日後EtまたはR1881にて刺激した。day1、3、5にMTS assayを行い、増殖能を評価した。
結果を図１５ｃに示す。アンドロゲン枯渇抵抗性のLTAD細胞では、アンドロゲン刺激を行わなくても、癌細胞が増殖するが、アンドロゲン依存性の増殖、アンドロゲン非依存性の増殖のいずれも、CTBP1-ASのノックダウンにより抑制された。【００８９】
<CTBP1-ASのアンドロゲン枯渇抵抗性の癌細胞増殖への関与−in vitro>
in vivoで、ホルモン療法耐性株細胞の増殖におけるCTBP1-ASの役割を解析した。
ヌードマウスにLTAD細胞1×107個／匹を皮下移植した。腫瘍が100mm3径に達したところで精巣摘出を施行し、コントロールsiRNA又はCTBP1-ASに対するsiRNAを局注した（5μg／匹、2回／週）。
結果を図１６に示す。in vivoにおいても、CTBP1-ASの発現を抑制することによって、アンドロゲン枯渇抵抗性の腫瘍体積の増加が抑制された（図１６ａ及びｂ）。また、腫瘍中のCTBP1-ASの発現量をqRT-PCRで測定したところ、mRNAレベルで発現が低下していることが確認された（図１６ｃ）。一方、腫瘍中のCTBP1をウェスタンブロッティングで測定したところ、CTBP1-ASのノックダウンにより、CTBP1の発現量が増加していた（図１６ｄ）。【００９０】
<CTBP1の発現抑制に対するRNA結合タンパク質PSFの関与>
PSF、NONO、Sin3Aの3種類の遺伝子の発現を、RNAiにより抑制した。LNCaP細胞に、PSF、NONO、Sin3Aに対するsiRNAをトランスフェクションし、2日後にLysateを回収し、ウェスタンブロッティングにより発現量を検証した。いずれのsiRNAも標的の発現を特異的に抑制することを確認できた。
LNCaP細胞をエタノール又はR1881で24時間処理し、刺激の2日前にコントロールsiRNA又はPSFに対するsiRNAをトランスフェクションした。RNAを回収し、cDNAを合成し、RT-PCRによりCTBP1の発現量を解析した。
結果を図１７ｂに示す。PSFの発現を抑制すると、アンドロゲン刺激によるCTBP1発現の抑制の程度が減少した。
また、AcH3抗体によりChIPを行った。リアルタイムPCRにより、CTBP1、CTBP1-ASのプロモータ領域のヒストンアセチル化レベルを計測し、GAPDHにより補正した。Myoglobin exon領域をネガティブコントロールとして使用した。
結果を図１７ｃに示す。PSFを抑制すると、アンドロゲン刺激によるCTBP1発現の抑制度が低下した。このことは、PSFが、CTBP1の発現にプロモータレベルで関与していることを示唆した。【００９１】
<PSFとCTBP1-ASとのアンドロゲン依存的結合>
PSFは、RNA結合性の転写抑制因子である。そこで、PSFとCTBP1-ASとの結合の有無を解析した。
LNCaP細胞をエタノール又はR1881で24時間処理し、刺激の2日前にコントロールsiRNA又はPSFに対するsiRNAをトランスフェクションした。核分画を抽出し、Lysateを回収したのち、Norman IgG PSF、NONOに対する特異抗体を用いて、免疫沈降を行った。Protein Gを利用して免疫沈降を行い、洗浄後、Isogenを用いてRNAを抽出した。トータルRNAより逆転写反応を行い、リアルタイムRT-PCRにより、GAPDH、Myoglobin（MG）、CTBP1-ASの発現量を測定した。
結果を図１８に示す。CTBP1-ASはPSFと、アンドロゲン依存的に結合することが確認された。【００９２】
<RNA-FISHによるCTBP1-ASの局在の解析>
PSFとCTBP1-ASの核内における局在を解析した。LNCaP細胞にエタノール又はR1881を加えて24時間反応させた後、CTBP1-ASに対してRNA FISHを行った。ホルマリン、メタノールにて固定した後、DIGラベルしたCTBP1-ASに対するプローブを使用して、42℃で一晩反応させ、結合させた。翌日、DIGに対する蛍光標識された抗体を結合させ、洗浄後、抗PSF抗体により免疫染色を行った。マウス抗体に対する2次抗体を反応させて検出した。核は、DAPIにより染色した。
結果を図１９に示す。PSFとCTBP1-ASの局在はほぼ一致しており、両者が結合していることが示唆された。【００９３】
<PSFによる細胞周期の制御>
次に、PSFが転写を抑制する他の遺伝子を探索した。
コントロールsiRNA又はPSFに対するsiRNAをトランスフェクションした。エタノール又はR1881による刺激から24時間後にRNAを回収した。RNAを増幅し、マイクロアレイを用いて遺伝子発現を解析した。発現が抑制される遺伝子群と発現が亢進する遺伝子群の中で、アンドロゲンにより変化が抑制される遺伝子を抽出した。アンドロゲンによる遺伝子発現の変化率をLog2変換し、Cluster、Tree viewによりHeat mapを作成した（図２０ａ）。転写に抑制がかかるとより明るい色で示される。
アンドロゲンにより抑制される遺伝子の70％は、siPSFにより当該抑制が解除された。さらに、ほとんどのアンドロゲン仲介性遺伝子の誘導が、siPSFにより抑制された。このことは、PSFがアンドロゲンによる発現抑制を広く介在していることを示唆する。
また、PSFがアンドロゲン作用にかかわる遺伝子群のパスウェイ解析を行った。アンドロゲンにより抑制される遺伝子群の中で、PSF抑制により変化が抑制される遺伝子群について解析したところ、p53やSMAD3など細胞周期に関与する遺伝子が濃縮していた（図中UGT2B15は、アンドロゲンにより発現が抑制されるがPSFによっては影響を受けないネガティブコントロールである。）。
次に、PSF抑制が細胞周期に与える影響をFACSにより解析した。LNCaP細胞、LTAD細胞及びBicR細胞に、コントロールsiRNA又はPSFに対するsiRNAをトランスフェクションし、96時間後に細胞を回収した。FACSにより細胞周期を解析した。S期の細胞分画の割合の変化を、図２０ｂに示す。PSFをノックダウンすると、DNAが合成されるS期の割合が減少し、細胞周期が遅くなる傾向が見られた。
また、図２０ａと同様の実験を、PSFに代えてCTBP1-ASをノックダウンして行い、アンドロゲンによる抑制が解除される遺伝子の種類を比較した。結果を図２０ｃに示す。PSFのノックダウンによりアンドロゲンによる抑制が解除される細胞のうち約50％は、CTBP1-ASのノックダウンによってもアンドロゲンによる抑制が解除される方向を示した。このことは、CTBP1-ASとPSFがアンドロゲンによる遺伝子発現抑制に強調して関与していることを示唆する。【００９４】
<PSFの標的遺伝子であるp53とSMAD3の解析>
p53、SMAD3の発現に対するPSFの影響を解析した。
コントロールsiRNA又はPSFに対するsiRNAをLNCaP細胞にトランスフェクションし、48時間後にエタノール又はR1881で刺激した。24時間後にRNA及びタンパク質を回収した。qRT-PCRによるp53とSMAD3の発現量の測定結果を図２１ａに示す（GAPDHで補正）。ウェスタンブロッティングの結果を図２１ｂに示す（βアクチンをLoading controlとした）。
SMAD3及びp53は、アンドロゲン刺激により、mRNAレベル及びタンパク質レベルのいずれにおいても発現が減少したが、PSFの発現を抑制すると、アンドロゲンによる発現の抑制が解除される傾向があった。このことは、SMAD3やp53は、PSFがないとアンドロゲンによる影響を受けにくいこと、即ち、アンドロゲンによるSMAD3やp53の発現抑制は、PSFを介したものであることを示唆する。【００９５】
<CTBP1-ASによる細胞周期関連因子のアンドロゲン依存的な発現抑制>
p53、SMAD3の発現に対するCTBP1-ASの影響を解析した。
コントロールsiRNA又はCTBP1-ASに対するsiRNAをLNCaP細胞にトランスフェクションし、48時間後にエタノール又はアンドロゲンにより刺激した。48時間後にRNA及びタンパク質を回収し、p53、p21及びSMAD3の発現量を、ウェスタンブロッティングにより解析した。結果を図２２ａに示す。
p53、p21及びSMAD3の発現は、いずれもアンドロゲン刺激により減少したが、CTBP1-ASの発現を抑制することにより、その減少度は低下した。
また、ホルモン枯渇抵抗性前立腺癌細胞であるLTAD細胞をヌードマウスに移植し、腫瘍が形成された後、精巣摘出を行い、コントロールsiRNAまたはCTBP1-ASに対するsiRNAを局注した。3週間後に腫瘍を摘出し、タンパク質を回収してウェスタンブロッティングにより、細胞周期関連遺伝子産物の発現量を解析した。結果を図２２ｂに示す（それぞれn=2）。CTBP１-ASの発現を抑制すると、アンドロゲン依存的な細胞周期関連遺伝子産物の発現抑制が解除された。【００９６】
上記の結果から示唆される、CTBP1-ASとPSFによる遺伝子発現制御機構について、図２３に模式図を示す。
まず、アンドロゲンがアンドロゲン受容体ARに結合すると、CTBP1-ASの転写が増加する。
これにより、ゲノムのグローバルな領域では（図中左の枠内）、CTBP1-ASがPSFに結合して複合体を形成し、この複合体がSMAD3やp53の発現を抑制する。SMAD3やp53は細胞周期を阻害する遺伝子であるため、その発現が抑制されることにより細胞増殖が促進される。
一方、ローカル（図中右の枠内）には、CTBP1-ASの転写が増加すると、CTBP1-ASとPSFの複合体とヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）が結合し、CTBP1の転写を抑制する。CTBP1はアンドロゲン受容体の転写抑制因子であるため、CTBP1の転写が抑制されると、アンドロゲン受容体の転写が増加し、活性化される。
このように、グローバルにおいても、ローカルにおいても、CTBP1-ASの転写が増加すると癌細胞を増殖させる方向に動く。このメカニズムは、CTBP1-AS又はPSFを抑制することにより、癌細胞の増殖を抑制できることを裏付けるものである。【００９７】
<siRNAによるCTBP1-ASの発現抑制>
以下表に示されるCTBP1-ASに対するsiRNAを設計及び合成し、CTBP1-ASの発現抑制への効果を測定した。
【表５】
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結果を図２４に示す。図中、NC、NC2は、ネガティブコントロールを示す。No. 3、4、6、10、12、18及び24のsiRNAは、ネガティブコントロールと比較して、CTBP1-ASの転写を抑制することが確認された。
【配列表フリーテキスト】
【００９８】
配列番号：1は、CTBP1−ASの一態様の塩基配列である。
配列番号：2は、AX747592の塩基配列である。
配列番号：3は、CTBP1−ASの機能を阻害するsiRNAの標的となる領域の塩基配列である。
配列番号：4は、CTBP1−ASの機能を阻害するsiRNAの標的となる領域の塩基配列である。
配列番号：5は、CTBP1−ASの機能を阻害するsiRNAの標的となる領域の塩基配列である。
配列番号：6は、CTBP1−ASの機能を阻害するsiRNAの標的となる領域の塩基配列である。
配列番号：7は、CTBP1−ASの機能を阻害するsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号：8は、CTBP1−ASの機能を阻害するsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号：9は、CTBP1−ASの機能を阻害するsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号：10は、CTBP1−ASの機能を阻害するsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号：11は、CTBP1−ASの機能を阻害するsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号：12は、CTBP1−ASの機能を阻害するsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号：13は、CTBP1−ASの機能を阻害するsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号：14は、CTBP1−ASの機能を阻害するsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号：15は、実施例におけるsiRNAでコントロールとして用いられたsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号：16は、実施例におけるsiRNAでコントロールとして用いられたsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号：17は、CTBP1−AScの塩基配列である。
配列番号：18は、CTBP1−ASbの塩基配列である。
配列番号：19は、CTBP1−ASaの塩基配列である。
配列番号：20は、CTBP1−ASdの塩基配列である。
配列番号：21は、3’ RACE PCRに用いた3’Race primerの塩基配列である。
配列番号：22は、3’ RACE PCRに用いたPCR adaptor primerの塩基配列である。
配列番号：23は、LNCaP細胞由来RNAのノーザンブロッティングに用いたプローブの塩基配列である。
配列番号：24〜52は、CTBP1−ASの機能を阻害するsiRNAの標的となる領域の塩基配列である。
配列番号：53〜104は、CTBP1−ASの機能を阻害するsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号：105〜108は、リアルタイムPCRに用いたプライマーの塩基配列である。
配列番号：109〜118は、リアルタイムRT-PCRに用いたプライマーの塩基配列である。
【図１】
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【図２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１８】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１１Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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