(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子標的薬の治療対象の癌であるが該分子標的薬が無効な癌または該分子標的薬に対する感受性が低下している癌の該分子標的薬に対する感受性を増強する医薬組成物であって、
前記分子標的薬が、ゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、トラスツズマブ、ＥＫＢ５６９、ＨＫＩ２７２１、ＢＩＢＷ２９９２、ＰＦ２９９８０４、ＣＬ−３８７，７８５およびＣＩ−１０３３から選択されるＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬であり、
前記治療対象の癌が、肺癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、脳腫瘍、膵臓癌、胆のう癌、腎癌、慢性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍、食道癌または頭頸部腫瘍であり、
前記無効な癌または感受性が低下している癌が、ＭＥＴ受容体遺伝子の増幅を伴わず、ＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系の活性化によって無効または感受性低下が誘導された癌であり、
抗ＨＧＦ中和抗体、ＮＫ４、ＳＵ１１２７４、ＰＨＡ６６５７５２、ＰＦ２３４１０６６、ＸＬ８８０、ＡＲＱ１９７、ＭＫ２４６１、ＭＰ４７０、ＳＧＸ５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、抗ＭＥＴ受容体抗体、ＭＥＴ受容体遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＭＥＴ受容体遺伝子のｓｈＲＮＡ、ＭＥＴ受容体遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＭＥＴ受容体細胞外領域のＨＧＦ結合部分を有するタンパク質から選択されるＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質を含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬が、ゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブおよびトラスツズマブから選択される可逆的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬が、ＥＫＢ５６９、ＨＫＩ２７２１、ＢＩＢＷ２９９２、ＰＦ２９９８０４、ＣＬ−３８７，７８５およびＣＩ−１０３３から選択される不可逆的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
分子標的薬の治療対象の癌であるが該分子標的薬が無効な癌または該分子標的薬に対する感受性が低下している癌の治療薬であって、
前記分子標的薬が、ゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、トラスツズマブ、ＥＫＢ５６９、ＨＫＩ２７２１、ＢＩＢＷ２９９２、ＰＦ２９９８０４、ＣＬ−３８７，７８５およびＣＩ−１０３３から選択されるＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬であり、
前記治療対象の癌が、肺癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、脳腫瘍、膵臓癌、胆のう癌、腎癌、慢性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍、食道癌または頭頸部腫瘍であり、
前記無効な癌または感受性が低下している癌が、ＭＥＴ受容体遺伝子の増幅を伴わず、ＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系の活性化によって無効または感受性低下が誘導された癌であり、
前記分子標的薬と抗ＨＧＦ中和抗体、ＮＫ４、ＳＵ１１２７４、ＰＨＡ６６５７５２、ＰＦ２３４１０６６、ＸＬ８８０、ＡＲＱ１９７、ＭＫ２４６１、ＭＰ４７０、ＳＧＸ５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、抗ＭＥＴ受容体抗体、ＭＥＴ受容体遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＭＥＴ受容体遺伝子のｓｈＲＮＡ、ＭＥＴ受容体遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＭＥＴ受容体細胞外領域のＨＧＦ結合部分を有するタンパク質から選択されるＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質とを組み合わせてなることを特徴とする癌治療薬。
【請求項５】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬が、ゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブおよびトラスツズマブから選択される可逆的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬である請求項４に記載の癌治療薬。
【請求項６】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬が、ＥＫＢ５６９、ＨＫＩ２７２１、ＢＩＢＷ２９９２、ＰＦ２９９８０４、ＣＬ−３８７，７８５およびＣＩ−１０３３から選択される不可逆的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬である請求項４に記載の癌治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子標的薬の治療対象の癌であるが該分子標的薬が無効な癌または該分子標的薬に対する感受性が低下している癌の該分子標的薬に対する感受性を増強する医薬組成物および治療薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肺癌はわが国における死亡数第１位の悪性腫瘍であり、有効な治療法の確立が急務の課題である。近年、肺癌に対し分子標的薬である上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor、以下「ＥＧＦＲ」と記す）チロシンキナーゼ阻害薬（ゲフィチニブ、エルロチニブ）が認可され、ＥＧＦＲ遺伝子変異を有する肺癌症例や非喫煙者に著効することから、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬は肺癌に対する特効薬と考えられている。しかし、奏効症例の大半が１年程度で獲得耐性を生じて再燃することや、ＥＧＦＲ遺伝子変異を有する肺腺癌の２５−３０％はゲフィチニブに自然耐性を示すことから、ＥＧＦＲ遺伝子変異を有する肺腺癌におけるゲフィチニブおよびエルロチニブ耐性の克服は臨床的にも重要な検討課題である。
肺癌におけるＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬の耐性に関して、非特許文献１には、ゲフィチニブ耐性を獲得した肺癌細胞にＭＥＴ遺伝子の増幅が見られ、ＭＥＴ阻害剤とゲフィチニブとの併用により、当該ゲフィチニブ耐性肺癌細胞の増殖が抑制されたことが記載されている。また、本発明者らは、線維芽細胞との相互作用によるスキルス胃癌細胞へのゲフィチニブ耐性誘導がＮＫ４の遺伝子治療の併用により抑制されたことを報告している（非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Engelman J.A. et al., Science: 316, 1039-1043 (2007)
【非特許文献２】Namiki Y. et al., Int. J. Cancer: 118, 1545-1555 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ゲフィチニブやエルロチニブなどの分子標的薬に耐性を示す癌の当該分子標的薬に対する感受性を増強する医薬組成物、およびゲフィチニブやエルロチニブなどの分子標的薬に耐性を示す癌に対して有効な癌治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の発明を包含する。
［１］分子標的薬の治療対象の癌であるが該分子標的薬が無効な癌または該分子標的薬に対する感受性が低下している癌の該分子標的薬に対する感受性を増強する医薬組成物であって、ＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質を含有することを特徴とする医薬組成物。
［２］無効な癌または感受性が低下している癌が、ＭＥＴ受容体遺伝子の増幅を伴わないことを特徴とする前記［１］に記載の医薬組成物。
［３］分子標的薬がＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬である前記［１］または［２］に記載の医薬組成物。
［４］ＥＧＦＲ阻害薬が可逆的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬である前記［３］に記載の医薬組成物。
［５］ＥＧＦＲ阻害薬が不可逆的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬である前記［３］に記載の医薬組成物。
［６］ＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質が、抗ＨＧＦ中和抗体、ＮＫ４、ＭＥＴ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、抗ＭＥＴ受容体抗体、ＭＥＴ受容体発現抑制物質、およびＭＥＴ受容体細胞外領域のＨＧＦ結合部分を有するタンパク質からなる群より選択される１種以上である前記［１］〜［５］のいずれかに記載の医薬組成物。
［７］分子標的薬の治療対象の癌が、肺癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、脳腫瘍、膵臓癌、胆のう癌、腎癌、慢性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍、食道癌、頭頸部腫瘍、または胃癌である前記［１］〜［６］のいずれかに記載の医薬組成物。
［８］分子標的薬の治療対象の癌であるが該分子標的薬が無効な癌または該分子標的薬に対する感受性が低下している癌の治療薬であって、該分子標的薬とＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質とを組み合わせてなることを特徴とする癌治療薬。
［９］無効な癌または感受性が低下している癌が、ＭＥＴ受容体遺伝子の増幅を伴わないことを特徴とする前記［８］に記載の癌治療薬。
［１０］分子標的薬がＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬である前記［８］または［９］に記載の癌治療薬。
［１１］ＥＧＦＲ阻害薬が可逆的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬である前記［１０］に記載の癌治療薬。
［１２］ＥＧＦＲ阻害薬が不可逆的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬である前記［１０］に記載の癌治療薬。
［１３］ＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質が、抗ＨＧＦ中和抗体、ＮＫ４、ＭＥＴ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、抗ＭＥＴ受容体抗体、ＭＥＴ受容体発現抑制物質、およびＭＥＴ受容体細胞外領域のＨＧＦ結合部分を有するタンパク質からなる群より選択される１種以上である前記［８］〜［１２］のいずれかに記載の癌治療薬。
［１４］分子標的薬の治療対象の癌が、肺癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、脳腫瘍、膵臓癌、胆のう癌、腎癌、慢性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍、食道癌、頭頸部腫瘍、または胃癌である前記［８］〜［１３］のいずれかに記載の癌治療薬。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、ゲフィチニブやエルロチニブなどの分子標的薬に耐性を示す癌の当該分子標的薬に対する感受性を増強する医薬組成物を提供することができる。また、ゲフィチニブやエルロチニブなどの分子標的薬に耐性を示す癌に対して有効な癌治療薬を提供することができる。本発明は、癌患者に福音をもたらすものであり、その社会的意義は極めて大きなものである。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１（ａ）】ＰＣ−９肺癌細胞の培地に各濃度のゲフィチニブおよび各濃度のＨＧＦを添加して７２時間培養した後の増殖率を示した図である。
【図１（ｂ）】ＨＣＣ８２７肺癌細胞の培地に各濃度のゲフィチニブおよび各濃度のＨＧＦを添加して７２時間培養した後の増殖率を示した図である。
【図２】ＨＣＣ８２７肺癌細胞の培地にゲフィチニブを添加してまたは添加しないで、さらに、抗ＨＧＦ中和抗体またはコントロールＩｇＧで前処理したＨＧＦを添加して７２時間培養した後の増殖率を示した図である。
【図３（ａ）】ＰＣ−９肺癌細胞の培地に各濃度のゲフィチニブおよび各種増殖因子を添加して７２時間培養した後の増殖率を示した図である。
【図３（ｂ）】ＨＣＣ８２７肺癌細胞の培地に各濃度のゲフィチニブおよび各種増殖因子を添加して７２時間培養した後の増殖率を示した図である。
【図４】ＨＧＦ発現ベクターを導入したＰＣ−９肺癌細胞の細胞増殖に対してゲフィチニブ、抗ＨＧＦ中和抗体またはコントロールＩｇＧが及ぼす影響を検討した結果を示す図である。
【図５】ＨＧＦを含むもしくは含まない培地で培養したＰＣ−９肺癌細胞、またはＰＣ−９肺癌細胞とＭＲＣ−５線維芽細胞との共培養系にゲフィチニブ、および抗ＨＧＦ中和抗体またはコントロールＩｇＧをそれぞれ添加してまたは添加しないで７２時間培養した後のＰＣ−９肺癌細胞の増殖率を示した図である。
【図６】ＳＣＩＤマウスの背部皮下に移植したゲフィチニブ感受性ヒト肺癌細胞由来の腫瘍に対する抗ＨＧＦ中和抗体またはＮＫ４とゲフィチニブとの併用効果を検討した結果を示す図である。
【図７】ＳＣＩＤマウスの背部皮下に移植したゲフィチニブ感受性ヒト肺癌細胞由来の腫瘍におけるＨＧＦ濃度測定の結果を示した図である
【図８】Ｈ１９７５肺癌細胞の培地に各濃度のゲフィチニブまたは不可逆的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬ＣＬ−３８７，７８５を添加して７２時間培養した後の増殖率を示した図である。
【図９】Ｈ１９７５肺癌細胞の培地に各濃度の不可逆的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬ＣＬ−３８７，７８５を添加し、さらにＨＧＦを添加してまたは添加しないで７２時間培養した後の増殖率を示した図である。
【図１０】Ｈ１９７５肺癌細胞の細胞増殖に対して不可逆的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬ＣＬ−３８７，７８５、ＨＧＦ、抗ＨＧＦ中和抗体またはＮＫ４が及ぼす影響を検討した結果を示す図である。
【図１１】ＰＣ−９肺癌細胞の細胞増殖に対してゲフィチニブ、ＨＧＦ、抗ＨＧＦ中和抗体、ＮＫ４またはＳＵ１１２７４が及ぼす影響を検討した結果を示す図である。
【図１２】Ｈ１９７５肺癌細胞の細胞増殖に対してＣＬ−３８７，７８５、ＨＧＦ、抗ＨＧＦ中和抗体、ＮＫ４またはＳＵ１１２７４が及ぼす影響を検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の医薬組成物は、ＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質を含有し、分子標的薬の治療対象の癌であるが該分子標的薬が無効な癌または該分子標的薬に対する感受性が低下している癌の該分子標的薬に対する感受性を増強するものである。また、本発明の癌治療薬は、分子標的薬とＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質とを組み合わせてなり、該分子標的薬の治療対象の癌であるが該分子標的薬が無効な癌または該分子標的薬に対する感受性が低下している癌を治療対象とするものである。
【０００９】
分子標的薬は、癌細胞の持つ特異的な性質を分子レベルでとらえ、それを標的として効率よく作用するように作られた薬を意味し、抗体等のタンパク質、ペプチド、核酸、低分子化合物などが含まれる。本発明における分子標的薬は限定されず、例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、イマチニブ、イブリツモマブチウキセタン、ゲムツズマブオゾガマイシン、スニチニブ、セツキシマブ、ソラフェニブ、タミバロテン、トラスツズマブ、トレチノイン、パニツムマブ、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、リツキシマブ、バンデタニブ、ラパチニブ、ソラフェニブ、セツキシマブなどの公知の分子標的薬が挙げられる。なかでも、ＥＧＦＲ（Epidermal Growth Factor Receptor：上皮成長因子受容体）チロシンキナーゼ阻害薬が好ましい。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬は癌細胞の表面に発現しているＥＧＦＲからのシグナル伝達を阻害することで抗癌作用を発揮する薬剤である。また、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬には可逆的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬と不可逆的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬が含まれるが、いずれのＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬も本発明における分子標的薬として好適である。可逆的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ（ＥＧＦＲファミリーを含む）阻害薬としては、例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、トラスツズマブなどが挙げられ、不可逆的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬としては、例えば、ＥＫＢ５６９、ＨＫＩ２７２１、ＢＩＢＷ２９９２、ＰＦ２９９８０４、ＣＬ−３８７，７８５、ＣＩ−１０３３などが挙げられる。
【００１０】
本発明において、分子標的薬の治療対象の癌は限定されないが、例えば、肺癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、脳腫瘍（グリオーマ、グリオブラストーマ、髄芽腫など）、膵臓癌、胆のう癌、腎癌、慢性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍、食道癌、頭頸部腫瘍、胃癌などが好適である。
【００１１】
分子標的薬が無効な癌とは、分子標的薬の標的となる分子そのものに関る変異、その分子が関るシグナル伝達系で働く他の分子の変異、その分子の関るシグナル伝達系とは直接無関係であっても他の分子に生じる変異、過剰発現、あるいは他の原因によって引き起こされる活性化、などによって分子標的薬が無効な癌である。そのような癌には、分子標的薬による治療以前からそのような性質（薬剤耐性）をもっている癌、ならびに分子標的薬による治療の間に獲得されたものとしてそのような性質をもっている癌が含まれる。また、分子標的薬に対する感受性が低下している癌とは、分子標的薬の標的となる分子そのものに関る変異、その分子が関るシグナル伝達系で働く他の分子の変異、その分子の関るシグナル伝達系とは直接無関係であっても他の分子に生じる変異、過剰発現、あるいは他の原因によって引き起こされる活性化、などによって分子標的薬に対する感受性が低下した癌である。そのような癌には、分子標的薬による治療以前からそのような性質（感受性が低い）をもっている癌、ならびに分子標的薬による治療の間に獲得されたものとしてそのような性質をもっている癌が含まれる。
【００１２】
分子標的薬に対して無効または感受性が低下している癌の発生原因については未だ不明な部分が多い。例えばゲフィチニブの場合、治療対象の癌は非小細胞肺癌であり、特にＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９の欠失による変異、あるいは８５８番目のＬｅｕがＴｈｒに変異することなどによって引き起こされる活性型変異を有するＥＧＦＲを発現する非小細胞肺癌に有効である。しかしながら、ゲフィチニブによる治療の前あるいは治療中に、ＥＧＦＲに生じる新たな変異（７９０番目のＴｈｒがＭｅｔに変異することなど）あるいはＭＥＴ受容体の遺伝子増幅によってゲフィチニブが無効になること、あるいはゲフィチニブに対する感受性が低下することが知られている。詳細には、ゲフィチニブに対する感受性が低下したＥＧＦＲ活性型変異を有する非小細胞肺癌の約２０％にＭＥＴ受容体の遺伝子増幅が観察され（非特許文献１を参照）、約５０％にはＥＧＦＲのアミノ酸配列に新たな変異（Ｔ７９０Ｍ等）が観察される。
【００１３】
また、本発明者らは、ＥＧＦＲ活性型変異を有する非小細胞肺癌において、ＨＧＦの作用によってゲフィチニブが無効になること、あるいはゲフィチニブに対する感受性が低下することを見出した。この知見は、ＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系の活性化が分子標的薬に対する無効または感受性の低下の原因の１つであることを示したものである。上述のように、ゲフィチニブに獲得耐性となったＥＧＦＲ活性型変異を有する非小細胞肺癌の約２０％にＭＥＴ受容体の遺伝子増幅が観察され、約５０％にはＥＧＦＲに新たな変異が観察されるが、残りの約３０％の原因は未だ解明されていない。また、ＥＧＦＲ活性型変異を有する非小細胞肺癌患者の約３０％はゲフィチニブに対して自然耐性を示すことも知られている。本発明者らが見出したＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系の活性化による分子標的薬に対する無効または感受性の低下は、ＭＥＴ受容体の遺伝子増幅がなく、ＥＧＦＲの新たな変異もないにも関わらずゲフィチニブに対する無効または感受性低下を示す癌の原因の１つであると考えられる。
【００１４】
本発明における「分子標的薬の治療対象の癌であるが該分子標的薬が無効な癌または該分子標的薬に対する感受性が低下している癌」としては、特に限定されるものではないが、ＭＥＴ受容体遺伝子の増幅を伴わない癌であることが好ましい。ＭＥＴ受容体遺伝子の増幅を伴っているか否かは、例えば、目的の癌細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ＭＥＴ受容体遺伝子部分を増幅可能な適切なプライマーを用いて定量的ＰＣＲを行い、ＭＥＴ受容体遺伝子の増幅がない細胞を試料としたときの結果と比較することで確認することができる。
【００１５】
また、本発明における「分子標的薬の治療対象の癌であるが該分子標的薬が無効な癌または該分子標的薬に対する感受性が低下している癌」としては、ＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系の活性化によって無効または感受性低下が誘導された癌であることが好ましい。特に好ましくは、ＭＥＴ受容体遺伝子の増幅を伴わず、かつ、ＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系の活性化によって無効または感受性低下が誘導された癌である。
【００１６】
ＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質は、ＭＥＴ受容体からのシグナル伝達を阻害する物質を意味し、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子化合物などが含まれる。具体的には、ＨＧＦに作用してＨＧＦとＭＥＴ受容体の結合を阻害すること、ＭＥＴ受容体に作用してＨＧＦとＭＥＴ受容体の結合を阻害すること、ＭＥＴ受容体に作用してＭＥＴ受容体からのシグナル伝達を阻害すること、ＭＥＴ受容体の発現を阻害することなどによりＭＥＴ受容体からのシグナル伝達が阻害される。本発明において好適なＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質としては、例えば、抗ＨＧＦ中和抗体、ＮＫ４、ＭＥＴ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、抗ＭＥＴ受容体抗体、ＭＥＴ受容体発現抑制物質、ＭＥＴ受容体細胞外領域のＨＧＦ結合部分を有するタンパク質等が挙げられる。
【００１７】
抗ＨＧＦ中和抗体は、ＨＧＦに結合してその活性を減退または消失させる抗体であればよく、例えば、ＨＧＦに結合してＨＧＦがＭＥＴ受容体に結合できなくする抗ＨＧＦ抗体等が挙げられる。抗ＨＧＦ中和抗体は、ＨＧＦまたはそのフラグメントを免疫原として用い、後述する公知の方法で作製することができる。得られた抗体が中和抗体であることは、得られた抗体によりＨＧＦの活性が中和されることを調べることによって確認することができる。具体的には、例えば、ＨＧＦによる初代培養肝細胞のＤＮＡ合成の促進作用を中和する活性、あるいはＨＧＦによって引き起こされるＭＤＣＫイヌ腎上皮細胞の細胞分散促進作用を中和する活性を調べることによって確認することができる。なお、本発明におけるＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質には、既に開発中または今後開発される抗体医薬としてのＨＧＦに対するヒト化モノクローナル抗体も含まれる。
【００１８】
ＮＫ４は、ＨＧＦのα鎖のＮ末端ヘアピンドメインと４つのクリングルドメインを有するタンパク質であり、ＭＥＴ受容体に結合し、ＨＧＦのアンタゴニストとして作用する（Date.K et al., FEBS Lett, 420, 1-6(1997)、Date.K et al., Oncogene, 17, 3045-3054(1998)）。ＮＫ４は、例えばＮＫ４をコードする遺伝子を用いて公知の遺伝子組換え技術によりＮＫ４発現ベクターを構築し、これを適当な宿主に導入して発現させた組み換えＮＫ４を回収、精製して取得することができる。あるいは、ＮＫ４をコードする遺伝子を適当なベクターに組み込み、そのＮＫ４発現ベクターを用いることによる遺伝子医薬や遺伝子治療用ベクターもＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質としてのＮＫ４に含まれる。ＮＫ４をコードする遺伝子としては、例えば配列番号１または３に示される塩基配列からなる遺伝子が挙げられるが、これに限定されるものではない。なお、配列番号１の塩基配列からなるＮＫ４遺伝子がコードするタンパク質は配列番号２のアミノ酸配列からなるＮＫ４であり、配列番号３の塩基配列からなるＮＫ４遺伝子がコードするタンパク質は配列番号４のアミノ酸配列からなるＮＫ４である。
【００１９】
ＭＥＴ受容体チロシンキナーゼ阻害剤は、ＭＥＴ受容体のチロシンキナーゼ活性を抑制する物質であればよく、例えば、ＳＵ１１２７４（Pfizer）、ＰＨＡ６６５７５２（Pfizer）、ＰＦ２３４１０６６（Pfizer）、ＸＬ８８０（Exelixis）、ＡＲＱ１９７（ArQule）、ＭＫ２４６１（Merck）、ＭＰ４７０（SuperGen）、ＳＧＸ５２３（SGX Pharmaceutical）、ＪＮＪ３８８７７６０５（Johnson & Johnson）などを含むＭＥＴ受容体チロシンキナーゼ活性の阻害剤などが挙げられるが、これらに限らず、ＭＥＴ受容体チロシンキナーゼ活性を阻害する分子も含まれる。
【００２０】
抗ＭＥＴ受容体抗体は、ＭＥＴ受容体に結合してシグナル伝達を阻害する抗体であればよい。例えば、ＭＥＴ受容体のＨＧＦ結合部位に結合してＨＧＦの結合を阻害する抗体等が挙げられる。抗ＭＥＴ受容体抗体はＭＥＴ受容体またはそのフラグメントを免疫原として用い、後述する公知の方法で作製することができる。得られた抗体がシグナル伝達を阻害する抗体であることは、例えば、得られた抗体によりＨＧＦの活性が中和されることを調べることによって確認することができる。具体的には、例えば、ＨＧＦによる初代培養肝細胞のＤＮＡ合成の促進作用を中和する活性、あるいはＨＧＦによって引き起こされるＭＤＣＫイヌ腎上皮細胞の細胞分散促進作用を中和する活性を調べることによって確認することができる。
【００２１】
ＭＥＴ受容体発現抑制物質は、ＭＥＴ受容体の発現を抑制する物質であればよく、例えば、ＭＥＴ受容体遺伝子のｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）、ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。ＭＥＴ受容体遺伝子としては、例えば配列番号５に示される塩基配列からなる遺伝子が挙げられるが、これに限定されるものではない。ｓｉＲＮＡは、約２０塩基（例えば、約２１〜２３塩基）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡであり、このようなｓｉＲＮＡを細胞に発現させることにより、そのｓｉＲＮＡの標的となる遺伝子（本発明においてはＭＥＴ受容体遺伝子）の発現を抑制することができる。ｓｈＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、３'末端に突出部を有する短いヘアピン構造からからなる約２０塩基対以上の分子のことをいう。そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様に標的となる遺伝子（本発明においてはＭＥＴ受容体遺伝子）の発現を抑制することができる。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、ＭＥＴ受容体遺伝子の発現を抑制できるものであればどのような形態であってもよい。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成することができる。また、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡをインビトロで合成することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＥＴ受容体遺伝子のＤＮＡ配列中の連続する５から１００の塩基配列に対して相補的な、またはハイブリダイズするヌクレオチドであればよく、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよい。また、機能に支障がない限り修飾されたものであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは常法によって合成することができ、例えば、市販のＤＮＡ合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製など）によって容易に合成することができる。
【００２２】
ＭＥＴ受容体細胞外領域のＨＧＦ結合部分を有するタンパク質は、ＭＥＴ受容体細胞外領域のＨＧＦ結合部分を有しＨＧＦと結合するタンパク質であればよく、ＭＥＴ受容体細胞外領域の全部からなるタンパク質、ＭＥＴ受容体細胞外領域の部分タンパク質であってＨＧＦ結合部分を有するタンパク質、ＭＥＴ受容体細胞外領域のＨＧＦ結合部分を有しＭＥＴ受容体細胞外領域以外のタンパク質を含むタンパク質などが挙げられる。ＭＥＴ受容体細胞外領域のＨＧＦ結合部分を有するタンパク質は、例えばＭＥＴ受容体をコードする遺伝子の一部を用いて公知の遺伝子組換え技術により発現ベクターを構築し、これを適当な宿主に導入して発現させた組み換えタンパク質を回収、精製して取得することができる。ＭＥＴ受容体の細胞外領域は、例えば、ヒトＭＥＴ受容体の場合、そのアミノ酸配列（配列番号６、GenBank Accession No. X54559を参照）の第１位−第９３２位が該当する（参考文献：Michieli P, Mazzone M, Basilico C, Cavassa S, Sottile A, Naldini L, Comoglio PM. Targeting the tumor and its microenvironment by a dual-function decoy Met receptor. Cancer Cell. 2004; 6: 61-73.）。
【００２３】
ＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質が抗体（例えば、抗ＨＧＦ中和抗体、抗ＭＥＴ受容体抗体など）の場合、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子でもよく、抗原に特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等）でもよい。ポリクローナル抗体は、例えば以下のようにして作製し、取得することができる。すなわち、抗原（例えばＨＧＦ、ＭＥＴ受容体またはこれらのフラグメント）をＰＢＳに溶解し、所望により通常のアジュバント（例えばフロイント完全アジュバント）を適量混合したものを免疫原として哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を免疫する。免疫方法は特に限定されないが、例えば、１回または適当な間隔で複数回、皮下注射または腹腔内注射する方法が好ましい。次いで、常法に従い、免疫した動物から血液を採取して血清を分離し、ポリクローナル抗体画分を精製することにより取得することができる。モノクローナル抗体は、上記免疫された哺乳動物から得た免疫細胞（例えば脾細胞）とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによってモノクローナル抗体を得ることができる。また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換え型のモノクローナル抗体を産生させることもできる。
【００２４】
抗体をヒトに適用する場合には、ヒトの抗体と同じ定常領域を持つように改変したキメラ抗体、ＣＤＲ（complementarity determining region：相補性決定領域）以外の領域をヒト由来としたヒト化抗体を用いることが好ましく、さらには、抗体産生に関与するヒト遺伝子を導入したマウス等のトランスジェニック動物を用いて産生したヒト型モノクローナル抗体を用いることがさらに好ましい。また、ヒト型抗体産生にはファージディスプレー法を用いることもできる。このようにして得られた抗体の抗原認識領域をプローテアーゼ等で切り出し、Ｆｖ、ＦａｂやＦ（ａｂ’）２として用いることもできる。
【００２５】
タンパク質をヒトに適用する場合には、ヒト由来のタンパク質を用いることが好ましい。ヒト由来のタンパク質は、当該タンパク質をコードするヒト遺伝子を用いて、公知の遺伝子組み換え技術により、組み換えタンパク質として製造することができる。例えば、ヒトＮＫ４遺伝子の塩基配列は配列番号１または３に示され、これらがコードするアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２または４に示される。また、ヒトＭＥＴ受容体遺伝子の塩基配列は配列番号５に示され、コードするアミノ酸配列は配列番号６に示される。
【００２６】
本発明の医薬組成物は、ＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とし、医薬品分野で通常使用される担体または添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒；水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
【００２７】
このような添加剤として、具体的には、乳糖、白糖、マンニトール、塩化ナトリウム、ブドウ糖、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸塩等の賦形剤；水、エタノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースＮａ、セラック、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ゼラチン、デキストリン、プルラン等の結合剤；クエン酸、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム二水和物、無水リン酸一水素ナトリウム、無水リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等のｐＨ調整剤；カルメロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピセルロース、カルメロース、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、クロスポビドン、ポリソルベート８０等の崩壊剤；第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の他の吸収促進剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ポリエチレングリコール、コロイド状ケイ酸、ショ糖脂肪酸類等の滑沢剤；黄酸化鉄、黄色三二酸化鉄、三二酸化鉄、βカロテン、酸化チタン、食用色素（例えば、食用青色１号等）、銅クロロフィル、リボフラビン等の着色剤；並びにアスコルビン酸、アスパルテーム、アマチャ、塩化ナトリウム、果糖、サッカリン、粉糖等の矯味剤等が例示できる。
【００２８】
本発明の医薬組成物の有効成分が核酸（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）の場合、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などを利用することができる。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをウイルスベクターを用いて生体に投与する場合は、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターを利用することができる。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡを導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。
【００２９】
本発明の医薬組成物の投与量は、目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、有効成分の種類などを考慮して、適宜設定される。約６５〜７０ｋｇの体重を有する平均的なヒトを対象とした場合、１日当たり０．０５ｍｇ〜２０００ｍｇ程度が好ましく、０．１ｍｇ〜２００ｍｇ程度がより好ましい。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
【００３０】
本発明の癌治療薬は、分子標的薬とＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質とを組み合わせてなるものであればよく、例えば、分子標的薬と上記本発明の医薬組成物とを組み合わせてなるものが好適である。ＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質は、分子標的薬と同時に投与してもよい。また、ＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質を投与してから順次に分子標的薬を投与してもよいし、分子標的薬を投与してから順次にＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質を投与してもよい。さらに、ＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質を投与し、時間をおいて別々に分子標的薬を投与してもよいし、分子標的薬を投与し、時間を置いて別々にＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質を投与してもよい。投与順序および投与間隔は、用いられるＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質を含む製剤、およびそれと併用される分子標的薬、治療すべきがん細胞の種類、患者の状態などに応じて、適宜選択することができる。ここで、「同時に」とは、ほぼ同じ時間に投与することをいい、「別々に」とは、異なった時間に別々に投与することをいい、例えば、１日目に１つの薬剤、２日目にもう１つの薬剤を投与するような場合をいう。「順次に」とは、順番に従って投与することをいい、例えば、最初に１つの薬剤を投与し、次いで、決められた時間後に、他の薬剤を投与するような場合をいう。
【００３１】
本発明の癌治療薬は、分子標的薬の治療対象の癌であるが該分子標的薬が無効な癌または該分子標的薬に対する感受性が低下している癌に対して、感受性を増強させながら分子標的薬を作用させるので、非常に効率よく癌を治療することが可能となる。つまり、分子標的薬による治療が有効であったといえども、分子標的治療薬に対する感受性はいくつかの要因によって低下することが多く、癌を著しく縮小、あるいはほぼ完全に消失させるほどの効果は認められない。これに対して本発明の癌治療薬では、癌を著しく縮小、あるいはほぼ完全に消失させるほどの治療効果をもたらすことが可能となる。また、たとえ分子標的治療薬による効果が一定期間あらわれたとしても、治療を開始してからまもなく、あるいは多くの場合１年以内に、分子標的治療薬に対して感受性が低下する結果、癌患者が望むほどの延命に至ることはない。これに対して、本発明の癌治療薬では、癌を著しく縮小、あるいはほぼ完全に消失させるほどの治療効果をもたらすことが可能となるため、著しい延命、あるいは根治に至ることが可能となる。その結果、本発明は癌患者に福音をもたらし、その社会的意義は極めて大きなものである。
【００３２】
本発明の癌治療薬を構成する分子標的薬とＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質を含む製剤とをキットの形態で組み合わせることも、本発明の範囲に含まれる。すなわち、本発明によるキットは、分子標的薬とＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質を含む製剤とを別々に保持するための分かれた容器、分かれたボトル、分かれたホイルパケットなどの手段を含む。本発明のキットは、様々な剤形の別々の組成物を、様々な投与間隔で投与するのに適している。通常、キットは投与説明書を含み、投与説明書は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００３４】
〔実施例１：活性変異型ＥＧＦＲを発現するヒト非小細胞肺癌細胞株へのＨＧＦによるゲフィチニブ感受性低下の誘導〕
(1)実験材料
ＥＧＦＲのアミノ酸配列の７４６位（Ｅ）〜７５０位（Ａ）を欠失している変異型ＥＧＦＲを発現し、ゲフィチニブ感受性のヒト非小細胞肺癌細胞株ＰＣ−９（以下「ＰＣ−９」と記す）およびＨＣＣ８２７（以下「ＨＣＣ８２７」と記す）を使用した。なお、両細胞ともゲフィチニブに対する耐性（感受性低下）に関与するＥＧＦＲの新たな変異ならびにＭＥＴ受容体の遺伝子増幅ともに認められない細胞である。ＰＣ−９は免疫生物研究所から、ＨＣＣ８２７はＡＴＣＣからそれぞれ購入した。ＰＣ−９およびＨＣＣ８２７の培養には、１０％ＦＢＳ、ペニシリン（100unit/mL）、ストレプトマイシン（100unit/mL）、グルタミン（2mmol/L）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
ゲフィチニブはアストラゼネカから入手した。ＨＧＦ（組換えヒトＨＧＦタンパク質）は、「Kato S, Funakoshi H, Nakamura T, et al. Acta Neuropathol. 2003 Aug;106(2):112-20.」の記載に基づいて作製した。ＥＧＦおよびＩＧＦ−Ｉはインビトロジェンから購入した。ＴＧＦ−αはＢｉｏｓｏｕｒｃｅから購入した。抗ヒトＨＧＦ中和抗体（ヤギ）およびコントロールＩｇＧ（ヤギ）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍから購入した。【００３５】
(2)実験方法
(a)ＨＧＦによるゲフィチニブ耐性（感受性低下）の誘導
ＰＣ−９またはＨＣＣ８２７を９６ウェルプレートに２×１０3個／ウェルで播種し、２４時間培養した。２４時間後に、ゲフィチニブおよびＨＧＦを種々の濃度の組み合わせで添加した。すなわち、０．０１〜１μＭ（最終濃度）となるように５段階の濃度に調製したゲフィチニブを各ウェルに添加した。ゲフィチニブを添加しないウェルも設けた。さらに２〜５０ｎｇ／ｍＬ（最終濃度）となるように５段階の濃度に調製したＨＧＦ溶液を添加した。ＨＧＦを添加しないウェルも設けた。７２時間の培養後、５０μＬのＭＴＴ溶液（２ｍｇ／ｍＬ、シグマ製）を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。培地を除去し、各ウェルに１００μＬのＤＭＳＯを添加して濃青色の結晶を溶解した。マイクロプレートリーダーＭＴＰ−１２０（コロナ電気）を用いて、検出波長５５０ｎｍ、参照波長６３０ｎｍで吸光度を測定した。増殖率は、無処置対照に対する相対値で示した。各実験はトリプリケートで行い、独立した実験を３回実施した。【００３６】
(b)抗ヒトＨＧＦ中和抗体で前処理したＨＧＦによる、ＨＣＣ８２７へのゲフィチニブ耐性（感受性低下）誘導の検討
ＨＧＦ溶液またはＨＧＦを含まない溶媒（対照）に抗ヒトＨＧＦ中和抗体またはコントロールＩｇＧを添加し、３７℃で１時間前処理を行った。上記(a)と同様に、９６ウェルプレートに２×１０3個／ウェルでＨＣＣ８２７を播種し、２４時間培養後、０．３μＭ（最終濃度）のゲフィチニブを添加した。さらに、ゲフィチニブを添加したウェルまたはゲフィチニブを添加していないウェルに対して、上記前処理済の各溶液を添加し、７２時間培養を続けた。培地中の最終濃度は、ＨＧＦが２０ｎｇ／ｍＬ、抗ヒトＨＧＦ中和抗体が２μｇ／ｍＬ、コントロールＩｇＧが２μｇ／ｍＬであった。７２時間の培養後、(a)と同様に、ＭＴＴ法を用いて細胞の増殖を測定し、増殖率を算出した。【００３７】
(c)各種成長因子によるゲフィチニブ耐性（感受性低下）誘導の検討
上記(a)と同様に、９６ウェルプレートに２×１０3個／ウェルでＰＣ−９またはＨＣＣ８２７を播種し、２４時間後に、０．３μＭ（最終濃度）または１μＭ（最終濃度）となるようにゲフィチニブを添加した。さらに２０ｎｇ／ｍＬ（最終濃度）となるようにＨＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−αまたはＩＧＦ−Ｉを添加して７２時間培養を続けた。ゲフィチニブを添加しないウェル、成長因子に変えて培地のみを添加したウェルをそれぞれ設けた。７２時間の培養後、(a)と同様に、ＭＴＴ法を用いて細胞の増殖を測定し、増殖率を算出した。【００３８】
(3)結果
(a)の結果を図１（ａ）および図１（ｂ）に、(b)の結果を図２に、(c)の結果を図３（ａ）および図３（ｂ）にそれぞれ示した。
図１（ａ）および図１（ｂ）から明らかなように、ＨＧＦは、ＰＣ−９およびＨＣＣ８２７のゲフィチニブに対する耐性を濃度依存的に誘導することが示された。また、図２から明らかように、抗ＨＧＦ中和抗体で前処理したＨＧＦはＨＣＣ８２７のゲフィチニブ耐性誘導能を喪失したが、コントロールＩｇＧで前処理したＨＧＦはＨＣＣ８２７のゲフィチニブ耐性誘導能を維持することがわかった。さらに、図３（ａ）および図３（ｂ）から明らかなように、ＨＧＦ以外の成長因子（ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＩＧＦ−Ｉ）は誘導するゲフィチニブ耐性はごくわずかであり、ＨＧＦのゲフィチニブ耐性誘導能が顕著であることが示された。
これらの結果は、たとえ、本来ゲフィチニブに感受性があり、なおかつゲフィチニブに対する耐性に関与するＥＧＦＲの新たな変異やＭＥＴ受容体の遺伝子増幅のないヒト非小細胞肺癌細胞であっても、ＨＧＦはゲフィチニブに対する感受性を低下させること、すなわちゲフィチニブに対する耐性を促すことを示している。【００３９】
〔実施例２：ＨＧＦ発現ベクターを導入したＰＣ−９を用いた検討〕
(1)実験材料
細胞には、実施例１と同じＰＣ−９を用いた。ゲフィチニブ、抗ヒトＨＧＦ中和抗体およびコントロールＩｇＧは実施例１と同じものを使用した。【００４０】
(2)実験方法
ＨＧＦ発現ベクターは「Ueki T, Kaneda Y, Tsutsui H, et al. Hepatocyte growth factor gene therapy of liver cirrhosis in rats. Nature Medicine 5, 226 - 230 (01 Feb 1999)」に従って作製した。トランスフェクション前日に、抗生物質を含まない培地を用いて調製したＰＣ−９を２×１０4個／４００μＬで２４ウェルプレートに播き、２４時間培養した。この細胞にリポフェクタミン２０００（１μＬ）を用いてＨＧＦ発現ベクターをトランスフェクションした（ＰＣ−９／ＨＧＦ）。対照として、ＨＧＦ遺伝子が挿入されていないベクターのみを同様にトランスフェクションした（ＰＣ−９／ｍｏｃｋ）。２４時間培養後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、０．３μＭ（最終濃度）のゲフィチニブ、２μｇ／ｍＬ（最終濃度）の抗ヒトＨＧＦ中和抗体、２μｇ／ｍＬ（最終濃度）のコントロールＩｇＧを、それぞれ添加してまたは添加しないで７２時間培養を続けた。７２時間培養後、実施例１と同様にＭＴＴ法を用いて細胞の増殖を測定し、増殖率を算出した。【００４１】
結果を図４に示した。図４から明らかなように、ＰＣ−９／ｍｏｃｋはゲフィチニブに対して感受性であったが、ＰＣ−９／ＨＧＦはゲフィチニブに対する感受性が低下し耐性を獲得していることが示された。また、ＰＣ−９／ＨＧＦに抗ヒトＨＧＦ中和抗体を添加した場合には、感受性の低下が大幅に抑制されることが示された。
これらの結果から、ＨＧＦの遺伝子発現によってＨＧＦを産生するようになるとゲフィチニブに対する耐性（すなわち感受性の低下）を獲得すること、さらに、そのゲフィチニブに対する耐性はＨＧＦの活性中和、すなわちＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系の阻害によって抑制されること、言換えればＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系の阻害はＨＧＦによってもたらされるゲフィチニブに対する耐性を抑制することが明らかとなった。【００４２】
〔実施例３：線維芽細胞由来のＨＧＦにより誘導された非小細胞肺癌細胞のゲフィチニブ耐性に対するＨＧＦ−ＭＥＴ受容体系阻害物質の効果の検討〕
(1)実験材料
細胞には、実施例１と同じＰＣ−９およびヒト胎児肺由来正常線維芽細胞ＭＲＣ−５（以下「ＭＲＣ−５」と記す）を使用した。ＭＲＣ−５は、例えばＡＴＣＣから入手可能である（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−１７１）。ＰＣ−９の培養には、１０％ＦＢＳ、ペニシリン（100unit/mL）、ストレプトマイシン（100unit/mL）、グルタミン（2mmol/L）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用い、ＭＲＣ−５の培養には、１０％ＦＢＳ、ペニシリン（100unit/mL）、ストレプトマイシン（100unit/mL）、グルタミン（2mmol/L）を含むＤＭＥＭ培地を用いた。
ゲフィチニブはアストラゼネカから入手した。ＨＧＦ（組換えヒトＨＧＦタンパク質）およびＮＫ４（組換えヒトＮＫ４タンパク質）はクリングルファーマ株式会社から入手した。培養細胞実験用の抗ヒトＨＧＦ中和抗体（ヤギ）およびコントロールＩｇＧ（ヤギ）はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍから購入した。動物実験用の抗ヒトＨＧＦ中和抗体（イムノグロブリン）は、ウサギにヒトＨＧＦタンパク質を投与することによって抗血清を調製し、抗血清からプロテインＡカラムを用いたクロマトグラフィーによって精製した。ゲフィチニブは、濃度が２．５ｍｇ／ｍＬとなるように１％Ｔｗｅｅｎ８０含有水に懸濁し、投与用懸濁液とした。ＮＫ４および抗ヒトＨＧＦ中和抗体は生理食塩水（大塚製薬）を用いてそれぞれ１．１３ｍｇ／ｍＬおよび１．０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製にし、投与用溶液とした。【００４３】
(2)実験方法
(a)ＭＲＣ−５由来のＨＧＦによるＰＣ−９のゲフィチニブ耐性誘導および抗ＨＧＦ中和抗体の効果
ＭＲＣ−５（線維芽細胞）とＰＣ−９（肺癌細胞）とを共培養する場合、トランスウェルチャンバー（２４ウェル用、Ｃｏｓｔｅｒ社）を用いた。ＰＣ−９を８×１０３細胞／７００μＬにて下側のウェルに播種する一方、ＭＲＣ−５を１×１０４細胞／３００μＬにて上側のウェルに播種し、２４時間培養した。２４時間培養後、０．３μＭ（最終濃度）のゲフィチニブを添加して、または添加しないで、さらに、２μｇ／ｍＬ（最終濃度）のコントロールＩｇＧもしくは２μｇ／ｍＬ（最終濃度）の抗ヒトＨＧＦ中和抗体を添加して、または添加しないで、７２時間培養を続けた。７２時間培養後、実施例１と同様にＭＴＴ法を用いて下側のウェルに培養したＰＣ−９の増殖を測定し、増殖率を算出した。
一方、ＰＣ−９を単独で培養する場合、ＰＣ−９を８×１０３細胞／７００μＬにて２４ウェルプレートの各ウェルに播種し、２４時間培養した。２４時間培養後、５０ｎｇ／ｍＬ（最終濃度）のＨＧＦを添加して、または添加しないで、０．３μＭ（最終濃度）のゲフィチニブを添加して、または添加しないで、さらに、２μｇ／ｍＬ（最終濃度）のコントロールＩｇＧもしくは２μｇ／ｍＬ（最終濃度）の抗ヒトＨＧＦ中和抗体を添加して、または添加しないで、７２時間培養を続けた。７２時間培養後、実施例１と同様にＭＴＴ法を用いて細胞の増殖を測定し、増殖率を算出した。【００４４】
(b)ＳＣＩＤマウスの異種移植腫瘍に対する抗ＨＧＦ中和抗体またはＮＫ４の効果
ＳＣＩＤマウス（雌、５週齢）は日本クレアから購入した。
ＰＣ−９（５×１０6個）とＭＲＣ−５（５×１０6個）とを含む細胞浮遊液１００μＬをＳＣＩＤマウスの背部皮下に接種した。４日後、腫瘍の直径が４ｍｍを超えたマウスを無作為に５匹ずつ群分けし、表１に示す６群を設けた。【００４５】
【表１】
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【００４６】
ゲフィチニブ投与群（表１の群４，５および６）には、細胞接種４日後から１６日後まで１３日間、ゲフィチニブ（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を１日１回午前中に経口投与した。ゲフィチニブを投与しない群（表１の群１，２および３）には、１％Ｔｗｅｅｎ８０含有水を同様に１日１回経口投与した。抗ＨＧＦ中和抗体投与群（表１の群２および５）には、細胞接種４日後から１６日後まで１３日間、抗ＨＧＦ中和抗体（５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を１日１回ゲフィチニブ投与の直後に腹腔内投与した。ＮＫ４投与群（表１の群３および６）には、細胞接種４日後から１６日後まで１３日間、ＮＫ４（９ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を１日２回に分けてゲフィチニブ投与の直後の午前および夕方に腹腔内投与した。
２日ごとに腫瘍の幅および長さを測定し、腫瘍面積（幅×長さ）を算出した。本実験は腫瘍実験における動物の福祉に関する英国癌研究調整委員会の指針に従って実施した。【００４７】
(3)結果
(a)の結果を図５に示した。図５中ＭｅｄｉｕｍはＨＧＦを添加していない培地で培養したＰＣ−９の増殖を、ｒｈＨＧＦはＨＧＦ（組換えヒトＨＧＦ）を添加した培地で培養したＰＣ−９の増殖を、ＭＲＣ−５はＨＧＦを添加していない培地でＭＲＣ−５と共培養したＰＣ−９の増殖をそれぞれ示す。図５からわかるように、ＰＣ−９をＭＲＣ−５と共培養することによっても、ＭＲＣ−５が産生するＨＧＦによって、培地にｒｈＨＧＦを添加したときと同様にＰＣ−９にゲフィチニブに対する耐性（感受性低下）が誘導され、そのゲフィチニブに対する耐性は抗ヒトＨＧＦ抗体によって抑制されることが明らかとなった。【００４８】
(b)の結果を図６に示した。図６から明らかなように、溶媒の経口投与のみ（対照群、図６中Control）の場合、腫瘍体積は細胞接種１６日後まで経時的に増大した。溶媒経口投与と抗ＨＧＦ中和抗体の投与（図６中HGF Ab）または溶媒経口投与とＮＫ４の投与（図６中NK4）の場合、腫瘍体積は経時的に増大したが、対照群と比較してわずかに腫瘍の増殖速度が低下した。ゲフィチニブ単独経口投与（図６中Gefitinib）の場合、腫瘍体積の増大を抑えたが、有意に退縮させなかった。この結果から、形成された腫瘍はゲフィチニブに対する感受性が低下していることが示された。一方、抗ＨＧＦ中和抗体とゲフィチニブの併用投与（図６中HGFAb＋Gefitinib）またはＮＫ４とゲフィチニブの併用投与（図６中NK4＋Gefitinib）の場合は、腫瘍を顕著に退縮させ、細胞接種１６日後には腫瘍はほとんど消失した（腫瘍体積がほぼ０となった）。【００４９】
〔実施例４：ＳＣＩＤマウスの異種移植腫瘍におけるＨＧＦ濃度の測定〕
上記実施例３と同様に、ＰＣ−９（５×１０6個）とＭＲＣ−５（５×１０6個）とを含む細胞浮遊液１００μＬをＳＣＩＤマウスの背部皮下に接種し、４日後に腫瘍を採取した。対照として、ＰＣ−９のみを同様に接種し、４日後に腫瘍組織を採取した。腫瘍組織をタンパク質分解酵素阻害剤カクテル（20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 M NaCl, 0.1% Tween-80, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF）中にてホモジナイズした後、12,000×ｇにて３０分間遠心した。上清を抽出液とし、抽出液中のヒトＨＧＦをＥＬＩＳＡキット（IMMUNIS HGF EIA, Institute of Immunology）を用いて定量した。【００５０】
結果を図７に示した。図７から明らかなように、ＰＣ−９単独で形成した腫瘍組織からはＨＧＦが検出されなかったが、ＰＣ−９とＭＲＣ−５との混合細胞によって形成された腫瘍組織からは高レベルのＨＧＦが検出された。この結果から、ゲフィチニブ感受性のヒト非小細胞肺癌細胞株ＰＣ−９を正常線維芽細胞ＭＲＣ−５と混合して接種することにより、ＨＧＦが産生され、ＰＣ−９にゲフィチニブ耐性が誘導されることが示された。【００５１】
〔実施例５：不可逆的ＥＧＦＲ阻害薬耐性癌細胞に対する効果の検討〕
(1)実験材料
ゲフィチニブ耐性かつＣＬ−３８７，７８５感受性のヒト非小細胞肺癌細胞株Ｈ１９７５（以下「Ｈ１９７５」と記す）を使用した。Ｈ１９７５は、例えばＡＴＣＣから入手可能である（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−５９０８）。Ｈ１９７５の培養には、１０％ＦＢＳ、ペニシリン（100unit/mL）、ストレプトマイシン（100unit/mL）、グルタミン（2mmol/L）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
ゲフィチニブはアストラゼネカから入手した。ＣＬ−３８７，７８５はコスモバイオから入手した。ＨＧＦ（組換えヒトＨＧＦタンパク質）およびＮＫ４（組換えヒトＮＫ４タンパク質）はクリングルファーマ株式会社から入手した。抗ヒトＨＧＦ中和抗体（Lot No.ALP01）はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。【００５２】
(2)実験方法
(a)Ｈ１９７５に対するゲフィチニブまたはＣＬ−３８７，７８５の効果
８０％コンフルエントのＨ１９７５を剥がして回収し、９６ウェルプレートに２×１０3個／ウェルで播種し、２４時間培養した。２４時間後に、０．０１〜１０μＭ（最終濃度）となるように７段階の濃度に調製したゲフィチニブまたはＣＬ−３８７，７８５を各ウェルに添加し、７２時間培養を続けた。５０μＬのＭＴＴ溶液（２ｍｇ／ｍＬ、シグマ製）を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。培地を除去し、各ウェルに１００μＬのＤＭＳＯを添加して濃青色の結晶を溶解した。マイクロプレートリーダーＭＴＰ−１２０（コロナ電気）を用いて、検出波長５５０ｎｍ、参照波長６３０ｎｍで吸光度を測定した。増殖率は、無処置対照に対する相対値で示した。各実験はトリプリケートで行い、独立した実験を３回実施した。【００５３】
(b)ＨＧＦによるＣＬ−３８７，７８５耐性（感受性低下）の誘導
上記(a)と同様に、９６ウェルプレートに２×１０3個／ウェルでＨ１９７５を播種し、２４時間培養後、０．０３〜３μＭ（最終濃度）となるように５段階の濃度に調製したＣＬ−３８７，７８５を添加した。さらに５０ｎｇ／ｍＬ（最終濃度）に調製したＨＧＦ溶液を添加してまたは添加しないで７２時間培養を続けた。(a)と同様に、ＭＴＴ法を用いて細胞の増殖を測定し、増殖率を算出した。【００５４】
(c)ＨＧＦによるＣＬ−３８７，７８５耐性Ｈ１９７５に対する抗ヒトＨＧＦ中和抗体またはＮＫ４の効果
上記(a)と同様に、９６ウェルプレートに２×１０3個／ウェルでＨ１９７５を播種し、２４時間培養後、表２に示すように０．３μＭ（最終濃度）のＣＬ−３８７，７８５、５０ｎｇ／ｍＬ（最終濃度）のＨＧＦ、２μｇ／ｍＬ（最終濃度）の抗ヒトＨＧＦ中和抗体、０．３μＭ（最終濃度）のＮＫ４をそれぞれ添加し、７２時間培養を続けた。(a)と同様に、ＭＴＴ法を用いて細胞の増殖を測定し、増殖率を算出した。【００５５】
【表２】
0005579699.tif 000003
【００５６】
(3)結果
(a)の結果を図８に、(b)の結果を図９に、(c)の結果を図１０にそれぞれ示した。図８に示したように、Ｈ１９７５はゲフィチニブに耐性、ＣＬ−３８７，７８５には感受性であった。図９から、ＨＧＦを培地に添加することにより、Ｈ１９７５のＣＬ−３８７，７８５に対する感受性が低下することが明らかとなった。そして、図１０から明らかなように、抗ヒトＨＧＦ中和抗体またはＮＫ４は、ＨＧＦによって誘導されるＨ１９７５のＣＬ−３８７，７８５対する感受性低下を阻害することが示された。すなわち、たとえＨＧＦの作用によってＨ１９７５細胞のＣＬ−３８７，７８５に対する感受性が低下したとしても、抗ヒトＨＧＦ中和抗体またはＮＫ４はその感受性の低下を克服することが示された。【００５７】
〔実施例６：ＨＧＦにより誘導された非小細胞肺癌細胞の分子標的薬耐性に対するＭＥＴ受容体チロシンキナーゼ阻害剤ＳＵ１１２７４の効果の検討〕
(1)実験材料
細胞には、ＰＣ−９またはＨ１９７５を使用した。ＰＣ−９およびＨ１９７５の培養には、１０％ＦＢＳ、ペニシリン（100unit/mL）、ストレプトマイシン（100unit/mL）、グルタミン（2mmol/L）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
ゲフィチニブはアストラゼネカから入手した。ＣＬ−３８７，７８５はコスモバイオから入手した。ＨＧＦ（組換えヒトＨＧＦタンパク質）およびＮＫ４（組換えヒトＮＫ４タンパク質）はクリングルファーマ株式会社から入手した。抗ヒトＨＧＦ中和抗体（ヤギ）はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍから購入した。ＳＵ１１２７４はカルバイオケムから入手した。【００５８】
(2)実験方法
(a)ＨＧＦによるゲフィチニブ耐性ＰＣ−９に対するＳＵ１１２７４の効果
９６ウェルプレートに２×１０3個／ウェルでＰＣ−９を播種し、２４時間培養後、表３に示すように２０ｎｇ／ｍＬ（最終濃度）のＨＧＦ、０．３μＭ（最終濃度）のゲフィチニブ、１μｇ／ｍＬ（最終濃度）の抗ヒトＨＧＦ中和抗体、０．３μＭ（最終濃度）のＮＫ４、０．３μＭ（最終濃度）のＳＵ１１２７４をそれぞれ添加し、７２時間培養を続けた。５０μＬのＭＴＴ溶液（２ｍｇ／ｍＬ、シグマ製）を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。培地を除去し、各ウェルに１００μＬのＤＭＳＯを添加して濃青色の結晶を溶解した。マイクロプレートリーダーＭＴＰ−１２０（コロナ電気）を用いて、検出波長５５０ｎｍ、参照波長６３０ｎｍで吸光度を測定した。増殖率は、無処置対照に対する相対値で示した。各実験はトリプリケートで行い、独立した実験を３回実施した。【００５９】
【表３】
0005579699.tif 000004
【００６０】
(b)ＨＧＦによるＣＬ−３８７，７８５耐性Ｈ１９７５に対するＳＵ１１２７４の効果
９６ウェルプレートに２×１０3個／ウェルでＨ１９７５を播種し、２４時間培養後、表４に示すように０．３μＭ（最終濃度）のＣＬ−３８７，７８５、５０ｎｇ／ｍＬ（最終濃度）のＨＧＦ、２μｇ／ｍＬ（最終濃度）の抗ヒトＨＧＦ中和抗体、０．３μＭ（最終濃度）のＮＫ４、１μＭ（最終濃度）のＳＵ１１２７４をそれぞれ添加し、７２時間培養を続けた。(a)と同様に、ＭＴＴ法を用いて細胞の増殖を測定し、増殖率を算出した。【００６１】
【表４】
0005579699.tif 000005
【００６２】
(3)結果
(a)の結果を図１１に、(b)の結果を図１２にそれぞれ示した。図１１から明らかなように、ＳＵ１１２７４は、抗ヒトＨＧＦ中和抗体およびＮＫ４と同様に、ＨＧＦによって誘導されるＰＣ−９のゲフィチニブに対する感受性低下を有意に阻害することが示された。また、図１２から明らかなように、ＳＵ１１２７４は、抗ヒトＨＧＦ中和抗体およびＮＫ４と同様に、ＨＧＦによって誘導されるＨ１９７５のＣＬ−３８７，７８５に対する感受性低下を有意に阻害することが示された。【００６３】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１（ａ）】
0005579699.tif 000006
【図１（ｂ）】
0005579699.tif 000007
【図５】
0005579699.tif 000008
【図６】
0005579699.tif 000009
【図７】
0005579699.tif 000010
【図８】
0005579699.tif 000011
【図９】
0005579699.tif 000012
【図２】
0005579699.tif 000013
【図３（ａ）】
0005579699.tif 000014
【図３（ｂ）】
0005579699.tif 000015
【図４】
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【図１０】
0005579699.tif 000017
【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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