(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式ＩＩＩ（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表される、化合物：
【化５】
0005564182.tif 000033
（式中、
ｓは、１から５の整数であり、およびｔは、１から１０の整数であり；
Ｒ１は、水素またはＲ６であり；
Ｒ２は、水素またはＲ７であり；
Ｒ１１は、水素、メチル、他のアルキルまたは−Ｒ’’’であり；
Ｚは、−ＯＨ、−ＳＨ、−Ｏ−Ｖ＋、−Ｓ−Ｖ＋、共有結合で連結された分析物、
【化４０Ａ】
0005564182.tif 000034
（式中、Ｘ’は、−Ｏ−または−Ｓ−であり、それぞれのＸ’’は、他から独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉである）
であり；
ここで、該分析物は、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、ステロイド、または１５００ダルトン未満の質量を有する小分子であり；
この場合、
Ｖ＋は、正電荷を有する対イオンであり；
Ｒ’’’は、Ｈ２Ｎ−Ｒ９’−、Ｈ（Ｒ１０）Ｎ−Ｒ９’−、（Ｒ１０）２Ｎ−Ｒ９’−、ＨＯ−Ｒ９’−、またはＨＳ−Ｒ９’−であり；ならびに
Ｒ６、Ｒ７および／またはＲ１０のそれぞれは、他から独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはアリールアルキルであり；
それぞれのＲ９’は、他から独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレンまたはアルキルアリーレンである）；そして
該化合物は、１３Ｃ、１５Ｎまたは１８Ｏで同位体的に濃縮された少なくとも１つの部位を含む、
化合物。
【請求項２】
前記化合物が、下記式（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表される、請求項１に記載の化合物：
【化６】
0005564182.tif 000035
【化７】
0005564182.tif 000036
（式中、
＊は、適宜、１２Ｃの代わりに１３Ｃ、および１４Ｎの代わりに１５Ｎを含む、同位体濃縮部位を示し；
Ｒ１は、水素またはＲ６であり；
Ｒ２は、水素またはＲ７であり；
Ｚは、−ＯＨ、−ＳＨ、−Ｏ−Ｖ＋、−Ｓ−Ｖ＋、共有結合で連結された分析物、
【化４０Ｂ】
0005564182.tif 000037
（式中、Ｘ’は、−Ｏ−または−Ｓ−であり、それぞれのＸ’’は、他から独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉである）
であり；
ここで、該分析物は、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、ステロイド、または１５００ダルトン未満の質量を有する小分子であり；
この場合、
Ｖ＋は、正電荷を有する対イオンであり；および
Ｒ６および／またはＲ７は、他から独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはアリールアルキルである）。
【請求項３】
前記化合物が、下記式（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表される、請求項１に記載の化合物：
【化８】
0005564182.tif 000038
【化９】
0005564182.tif 000039
【請求項４】
請求項１、２または３のいずれかに記載の化合物（その塩形態および／または水和物形態を含む）であって、ここで、該化合物は、１３Ｃ、１５Ｎまたは１８Ｏで同位体的に濃縮された２つ以上の同位体濃縮部位を含む、化合物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物（その塩形態および／または水和物形態を含む）であって、ここで、Ｚが、ペプチドまたはタンパク質である、化合物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物（その塩形態および／または水和物形態を含む）であって、ここで、該化合物は、Ｚが、−ＯＨである、化合物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物（その塩形態および／または水和物形態を含む）であって、ここで、Ｚが、
【化４０Ｃ】
0005564182.tif 000040
（式中、Ｘ’は、−Ｏ−または−Ｓ−であり、それぞれのＸ’’は、他から独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉである）
である、化合物。
【請求項８】
請求項７に記載の化合物（その塩形態および／または水和物形態を含む）であって、ここで、Ｚが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルオキシである、化合物。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載の化合物（その塩形態および／または水和物形態を含む）であって、ここで、該化合物が、較正用標準である、化合物。
【請求項１０】
ａ）それぞれのサンプルが１つ以上の反応性分析物を含む２つ以上のサンプルと、標識試薬セットの異なる標識試薬とを反応させて、それによって、それぞれが１つ以上の標識された分析物を含む２つ以上の差別的に標識されたサンプルを形成すること［この場合、前記セットの異なる標識試薬は、下記式ＩＩＩ’（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表され：
【化１４】
0005564182.tif 000041
（式中、
ｓは、１から５の整数であり、およびｔは、１から１０の整数であり；
Ｒ１は、水素、重水素またはＲ６であり；
Ｒ２は、水素、重水素またはＲ７であり；
Ｒ１１は、水素、重水素、メチル、−Ｃ（Ｈ）２Ｄ、−Ｃ（Ｈ）Ｄ２、−ＣＤ３、他のアルキルまたは−Ｒ’’’であり；
Ｚ’は、
【化４０Ｄ】
0005564182.tif 000042
（式中、Ｘ’は、−Ｏ−または−Ｓ−であり、それぞれのＸ’’は、他から独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉである）
であり；
この場合、
Ｒ’’’は、Ｈ２Ｎ−Ｒ９’−、Ｈ（Ｒ１０）Ｎ−Ｒ９’−、（Ｒ１０）２Ｎ−Ｒ９’−、ＨＯ−Ｒ９’−、またはＨＳ−Ｒ９’−であり；
Ｒ６、Ｒ７および／またはＲ１０のそれぞれは、他から独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはアリールアルキルであり；ならびに
それぞれのＲ９’は、他から独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレンまたはアルキルアリーレンである）；
ここで、前記セットのそれぞれの異なる標識試薬は、同じ総質量を有するが、それぞれの異なる標識試薬の基
【化１４Ａ】
0005564182.tif 000043
（この基がレポーター部分を形成する）は、１３Ｃ、１５Ｎまたは１８Ｏで同位体的に濃縮された１つ以上の部位において固有にコード化されており、質量分析計内で前記基
【化１４Ｂ】
0005564182.tif 000044
と前記標識試薬の残部との結合がフラグメント化すると、固有質量のレポーターイオンが生成される］；および
ｂ）前記２つ以上の差別的に標識されたサンプルまたはその一部分と、場合によっては１つ以上の較正用標準とを混合して、それによって、サンプル混合物を生成すること
を含み、
ここで、該１つ以上の分析物は、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、ステロイド、または１５００ダルトン未満の質量を有する小分子である；
方法。
【請求項１１】
ｃ）前記サンプル混合物またはその画分に関する第一質量分光分析を行うこと；
ｄ）前記第一質量分光分析からの選択質量対電荷比の標識された分析物のイオンを解離エネルギーレベルに付して、それによって、レポーターイオンと前記選択イオンの少なくとも一部の娘フラグメントイオンとを形成すること；および
ｅ）前記選択イオン、レポーターイオンおよび娘フラグメントイオンまたはそれらの画分についての第二の質量分析を行うこと
をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ｆ）前記第二質量分析におけるそれぞれのレポーターイオンの総質量および相対量、ならびに前記娘フラグメントイオンの一部またはすべての総質量および／または絶対質量を決定すること
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｇ）前記娘フラグメントイオンの分析により前記選択質量対電荷比に関連する標識された分析物を決定すること
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
異なる選択質量対電荷比での標識された分析物の選択イオンに対して、工程（ｄ）から（ｇ）を１回以上繰り返すことをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
各回、前記サンプル混合物の異なる画分を用いて、工程（ｃ）から（ｇ）を１回以上繰り返すことをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
それぞれのサンプルが、粗製もしくは加工された細胞溶解物、体液、組織抽出物または細胞抽出物である、請求項１０から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
それぞれのサンプルが、分離プロセスからの画分である、請求項１０から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記分析物のうちの１つ以上が、ペプチドおよび／またはタンパク質である、請求項１０から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
固有質量のそれぞれのレポーターイオンによって、それぞれの標識された分析物の源となったサンプルが同定される、請求項１１から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記セットのそれぞれの異なる標識試薬が、支持体に結合されており、前記支持体には切断可能リンカーによって連結されており、それぞれの異なるサンプルは、前記セットの異なる標識試薬を担持する支持体と反応する、請求項１０から１９のいずれかに記載の方法であって；前記方法は、工程（ｂ）を行う前に、
ｉ）前記支持体を場合によっては洗浄して、前記標識試薬の反応性基と反応しないサンプルの成分を除去すること；
ｉｉ）前記切断可能リンカーを切断して、それによって、それぞれのサンプルが１つ以上の標識された分析物を含む２つ以上の差別的に標識されたサンプルを回収のために放出させること（ここで、特定のサンプルに関連する標識された分析物を、それらに連結された固有質量のレポーター部分により、同定可能および／または定量可能である）；および
ｉｉｉ）標識された分析物のそれぞれのサンプルを、それらを混合する前に、場合によっては回収すること
をさらに含み、
ここで、該リンカーがアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレンまたはアルキルアリーレン基であってアミン、ヒドロキシルまたはチオール基を含む、
方法。
【請求項２１】
ｃ）それぞれのサンプルを少なくとも１つの酵素で消化して、前記サンプルもしくはサンプル混合物の成分を部分的または完全に分解すること；または
ｄ）前記サンプル混合物を分離すること；または
ｅ）ｃ）とｄ）の両方
をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第二質量分析において固有質量のそれぞれのレポーターイオンの相対量が、他のレポーターイオンに対して決定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
前記同定された分析物に関連する固有質量のそれぞれのレポーターイオンの相対量を、前記サンプル混合物を形成するために合わせたそれぞれの差別的に標識されたサンプルの量と相関させて、それによって、前記サンプル混合物を形成するために合わせた２つ以上の差別的に標識されたサンプルそれぞれの中の分析物の相対量を決定する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ｉ）前記サンプル混合物が、前記同定された分析物についての、固有質量のレポーター部分を含む、既知量の較正用標準を含み、および固有質量のそれぞれのレポーターイオンの絶対量が、前記較正用標準に関連する固有レポーターイオンの量を参照することによって決定される；ならびに
ｉｉ）前記サンプル混合物のそれぞれの異なるサンプル中の同定された分析物の絶対量が、固有質量のそれぞれの異なるレポーターイオンの相対量を参照して決定される、
請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
異なる選択質量対電荷比での標識された分析物の選択イオンに対して工程（ｄ）から（ｇ）を１回以上繰り返して、それによって、前記サンプル混合物を形成するために合わせた２つ以上の差別的に標識されたサンプルそれぞれの中の１つ以上の他の分析物の相対量を同定および／または決定することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
異なる選択質量対電荷比での標識された分析物の選択イオンに対して工程（ｄ）から（ｇ）を１回以上繰り返して、それによって、前記サンプル混合物を形成するために合わせた２つ以上の差別的に標識されたサンプルそれぞれの中の１つ以上の他の分析物の絶対量を同定および／または決定することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記分析物が、ペプチドであり、ならびに前記サンプル混合物を形成するために合わせた２つ以上の差別的に標識されたサンプルそれぞれの中の１つ以上のタンパク質の正体および相対量が、前記サンプル混合物を形成するために合わせた２つ以上の差別的に標識されたサンプルそれぞれの中の１つ以上のペプチドの正体および相対量に基づいて決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記分析物が、ペプチドであり、ならびに前記サンプル混合物を形成するために合わせた２つ以上の差別的に標識されたサンプルそれぞれの中の１つ以上のタンパク質の正体および絶対量が、前記サンプル混合物を形成するために合わせた２つ以上の差別的に標識されたサンプルそれぞれの中の１つ以上のペプチドの正体および絶対量に基づいて決定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つの標識試薬が、下記式（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表される、請求項１０に記載の方法：
【化１４−１】
0005564182.tif 000045
【化１５】
0005564182.tif 000046
（式中、
＊は、適宜、１２Ｃの代わりに１３Ｃ、および１４Ｎの代わりに１５Ｎを含む、同位体濃縮部位を示し；
Ｒ１は、水素またはＲ６であり；
Ｒ２は、水素またはＲ７であり；
Ｚ’は、
【化４０Ｅ】
0005564182.tif 000047
（式中、Ｘ’は、−Ｏ−または−Ｓ−であり、それぞれのＸ’’は、他から独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉである）
であり；
この場合、
Ｒ６および／またはＲ７は、他から独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはアリールアルキルである）。
【請求項３０】
少なくとも１つの標識試薬が、下記式（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表される、請求項１０に記載の方法：
【化１６】
0005564182.tif 000048
【化１７】
0005564182.tif 000049
【請求項３１】
少なくとも２つの標識された分析物を含む混合物であって、前記少なくとも２つの標識された分析物は、異なるサンプルに由来し、前記混合物のそれぞれの標識された分析物は、下記式ＩＩＩ’（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表される：
【化２２】
0005564182.tif 000050
（式中、
ｓは、１から５の整数であり、およびｔは、１から１０の整数であり；
Ｒ１は、水素またはＲ６であり；
Ｒ２は、水素またはＲ７であり；
Ｒ１１は、水素、メチル、他のアルキルまたは−Ｒ’’’であり；
Ｚ’’は、共有結合で連結された分析物であり；
ここで、該分析物は、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、ステロイド、または１５００ダルトン未満の質量を有する小分子であり；
この場合、
Ｒ’’’は、Ｈ２Ｎ−Ｒ９’−、Ｈ（Ｒ１０）Ｎ−Ｒ９’−、（Ｒ１０）２Ｎ−Ｒ９’−、ＨＯ−Ｒ９’−またはＨＳ−Ｒ９’−であり；
Ｒ６、Ｒ７および／またはＲ１０のそれぞれは、他から独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはアリールアルキルであり；ならびに
それぞれのＲ９’は、他から独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレンまたはアルキルアリーレンである）；
ここで、基
【化１４Ｃ】
0005564182.tif 000051
（この基がレポーター部分を形成する）は、１３Ｃ、１５Ｎまたは１８Ｏで同位体的に濃縮された１つ以上の部位において固有にコード化されており、質量分析計内で前記基
【化１４Ｄ】
0005564182.tif 000052
と前記標識された分析物の残部との結合がフラグメント化すると、固有質量のレポーターイオンを生じさせ、それによって、２つ以上の標識された分析物それぞれの標識反応が起こったサンプルが同定される）、
混合物。
【請求項３２】
前記分析物の１つ以上が、ペプチドおよび／またはタンパク質である、請求項３１に記載の混合物。
【請求項３３】
前記分析物の１つ以上が、核酸である、請求項３１に記載の混合物。
【請求項３４】
前記分析物の１つ以上が、脂質および／またはステロイドである、請求項３１に記載の混合物。
【請求項３５】
前記分析物の１つ以上が、１５００ダルトン未満の質量を有する小分子である、請求項３１に記載の混合物。
【請求項３６】
前記分析物の２つ以上が、異なる分析物の型である、請求項３１に記載の混合物。
【請求項３７】
少なくとも１つの標識された分析物が、下記式（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表される、請求項３１に記載の混合物：
【化２３】
0005564182.tif 000053
【化２４】
0005564182.tif 000054
（式中、
＊は、適宜、１２Ｃの代わりに１３Ｃ、および１４Ｎの代わりに１５Ｎを含む、同位体濃縮部位を示し；
Ｒ１は、水素またはＲ６であり；
Ｒ２は、水素またはＲ７であり；
Ｚ’’は、共有結合で連結された分析物であり；
ここで、該分析物は、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、ステロイド、または１５００ダルトン未満の質量を有する小分子であり；
この場合、
Ｒ６および／またはＲ７は、他から独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはアリールアルキルである）。
【請求項３８】
少なくとも１つの標識された分析物が、下記式（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表される、請求項３１に記載の混合物：
【化２５】
0005564182.tif 000055
【請求項３９】
請求項１から９のいずれか一項に記載の少なくとも１つの化合物を含むキット。
【請求項４０】
サンプルを差別的に標識することによって、２つ以上の異なるサンプル中の１つ以上の分析物を定量するためのアッセイを行うために選択された、少なくとも１つの追加の試薬をさらに含む、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
前記化合物が、固有質量のレポーター部分を含む標識された較正用標準である、請求項３９に記載のキット。
【請求項４２】
前記化合物が、固有質量のレポーター部分を含む標識試薬である、請求項３９に記載のキット。
【請求項４３】
ａ）
【化２９Ａ】
0005564182.tif 000056
と、
【化２９Ｂ】
0005564182.tif 000057
とを反応させて、それによって、アミノ酸生成物を形成すること；
ｂ）前記アミノ酸生成物と、
【化２９Ｃ】
0005564182.tif 000058
とを反応させること；および
ｃ）前記アミノ酸生成物の酸基を修飾して、それによって、分析物の官能基と反応することができる
【化４０Ｆ】
0005564182.tif 000059
（式中、Ｘ’は、−Ｏ−または−Ｓ−であり、それぞれのＸ’’は、他から独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉである）
を形成すること（ここで、該分析物は、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、ステロイド、または１５００ダルトン未満の質量を有する小分子である）；
を含む方法であって、
ここで、該方法は、下記式ＩＩＩ（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表される化合物を生成し：
【化２９Ｄ】
0005564182.tif 000060
ここで、
ｓは、１から５の整数であり、およびｔは、１から１０の整数であり；
Ｒ１は、水素またはＲ６であり；
Ｒ２は、水素またはＲ７であり；
Ｒ１１は、水素、メチル、他のアルキルまたは−Ｒ’’’であり；
Ｚ’は、
【化４０Ｇ】
0005564182.tif 000061
（式中、Ｘ’は、−Ｏ−または−Ｓ−であり、それぞれのＸ’’は、他から独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉである）
であり；
ここで、Ｒ’’’は、Ｈ２Ｎ−Ｒ９’−、Ｈ（Ｒ１０）Ｎ−Ｒ９’−、（Ｒ１０）２Ｎ−Ｒ９’−、ＨＯ−Ｒ９’−、またはＨＳ−Ｒ９’−であり；
Ｒ６、Ｒ７および／またはＲ１０のそれぞれは、他から独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはアリールアルキルであり；
それぞれのＲ９’は、他から独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレンまたはアルキルアリーレンであり；そして
該化合物は、１３Ｃ、１５Ｎまたは１８Ｏで同位体的に濃縮された少なくとも１つの部位を含む、
方法。
【請求項４４】
少なくとも２つの差別的に標識された分析物分子のフラグメント化後に、質量分析計内に存在するフラグメントイオンであって、前記標識された分析物分子のうちの少なくとも１つは、
【化３０】
0005564182.tif 000062
から成る群より選択される式の化合物であり、
ここで、該分析物は、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、ステロイド、または１５００ダルトン未満の質量を有する小分子であり；
前記フラグメントイオンは、正または負のいずれかの電荷を有し、そして、分子式：１３Ｃ６Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ４Ｃ２Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ３Ｃ３Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ３Ｃ３Ｈ１３１５ＮＮ＋、１３Ｃ２Ｃ４Ｈ１３１５ＮＮ＋、１３ＣＣ５Ｈ１３１５ＮＮ＋、１３ＣＣ５Ｈ１３Ｎ２＋またはＣ６Ｈ１３Ｎ２＋を有する、
フラグメントイオン。
【請求項４５】
分子式：１３Ｃ６Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ４Ｃ２Ｈ１３１５Ｎ２＋または１３Ｃ３Ｃ３Ｈ１３１５Ｎ２＋を有する、請求項４４に記載のフラグメントイオン。
【請求項４６】
前記分析物の差別的に標識された分子のフラグメント化によって誘導されたフラグメントイオンを含む混合物であって、前記差別的に標識された分析物分子のフラグメントイオンは、質量分析計内で生成され、ならびに前記差別的に標識された分析物分子の少なくとも一つは、
【化３１】
0005564182.tif 000063
から成る群より選択される式の化合物であり、かつ
ここで、該分析物は、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、ステロイド、または１５００ダルトン未満の質量を有する小分子であり；
ここで、前記フラグメントイオンは、正または負のいずれかの電荷を有し、そして、分子式：１３Ｃ６Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ４Ｃ２Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ３Ｃ３Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ３Ｃ３Ｈ１３１５ＮＮ＋、１３Ｃ２Ｃ４Ｈ１３１５ＮＮ＋、１３ＣＣ５Ｈ１３１５ＮＮ＋、１３ＣＣ５Ｈ１３Ｎ２＋またはＣ６Ｈ１３Ｎ２＋を有する、
混合物。
【請求項４７】
少なくとも１つのフラグメントイオンが、分子式：１３Ｃ６Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ４Ｃ２Ｈ１３１５Ｎ２＋または１３Ｃ３Ｃ３Ｈ１３１５Ｎ２＋を有する、請求項４６に記載の混合物。
【請求項４８】
同重体標識された分析物分子を含む組成物の、質量分析計内での、フラグメント化によって生成されるフラグメントイオンであって、前記分子の少なくとも１つは、
【化３２】
0005564182.tif 000064
から成る群より選択される式の化合物であり、
ここで、該分析物は、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、ステロイド、または１５００ダルトン未満の質量を有する小分子であり；
前記フラグメントイオンは、正または負のいずれかの電荷を有し、そして、分子式：１３Ｃ６Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ４Ｃ２Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ３Ｃ３Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ３Ｃ３Ｈ１３１５ＮＮ＋、１３Ｃ２Ｃ４Ｈ１３１５ＮＮ＋、１３ＣＣ５Ｈ１３１５ＮＮ＋、１３ＣＣ５Ｈ１３Ｎ２＋またはＣ６Ｈ１３Ｎ２＋を有する、
フラグメントイオン。
【請求項４９】
分子式：１３Ｃ６Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ４Ｃ２Ｈ１３１５Ｎ２＋または１３Ｃ３Ｃ３Ｈ１３１５Ｎ２＋を有する、請求項４８に記載のフラグメントイオン。
【請求項５０】
少なくとも２つの差別的に標識された分析物分子を含むサンプル混合物の画分を質量分析計内でイオン化すること；
フラグメント化のために、選択されたｍ／ｚ値で、前記差別的に標識された分析物分子のうちの少なくとも２つを選択すること；および
解離エネルギーレベルの印加により、前記選択された分析物分子をフラグメント化すること；
によって生成される、フラグメントイオンであって、
この場合、前記差別的に標識された分析物分子の少なくとも１つは、
【化３３】
0005564182.tif 000065
から成る群より選択される式の化合物であり、
ここで、該分析物は、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、ステロイド、または１５００ダルトン未満の質量を有する小分子であり；
前記フラグメントイオンは、正または負のいずれかの電荷を有し、そして、分子式：１３Ｃ６Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ４Ｃ２Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ３Ｃ３Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ３Ｃ３Ｈ１３１５ＮＮ＋、１３Ｃ２Ｃ４Ｈ１３１５ＮＮ＋、１３ＣＣ５Ｈ１３１５ＮＮ＋、１３ＣＣ５Ｈ１３Ｎ２＋またはＣ６Ｈ１３Ｎ２＋を有する、
フラグメントイオン。
【請求項５１】
分子式：１３Ｃ６Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ４Ｃ２Ｈ１３１５Ｎ２＋または１３Ｃ３Ｃ３Ｈ１３１５Ｎ２＋を有する、請求項５０に記載のフラグメントイオン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本願は、米国特許出願第１１／６２５６８８号（２００７年１月２２日出願）に基づく優先権を主張し、そして米国仮特許出願第６０／７６１，７１１号（２００６年１月２４日出願）および米国仮特許出願第６０／７６４，２１６号（２００６年２月１日出願）の利益を主張する（これらの全ては、本明細書に参考として援用される）。
【０００２】
本明細書で使用されるセクションの取り扱いは、単に構成の目的のためのものであり、決して記載された対象を限定するものとして解釈されるべきではない。
【背景技術】
【０００３】
（分野）
本発明は、質量分析法による分析物の決定に関係する方法、混合物、キットおよび組成物に関する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
序論：
本発明は、質量分析による分析物（単数または複数）の決定に関する。分析物は、関心のあるいずれの分子であってもよい。分析物の非限定的な例としては、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、ステロイド、および１５００ダルトン未満の質量を有する小分子が挙げられるが、これらに限定されない。複合混合物中の分析物の相対および／または絶対定量を可能にする固有の標識試薬を使用して、分析物を決定することができる。これらの標識試薬は、複合サンプル混合物の分析のためにセットで使用することができ、この場合、標識試薬は、異性体のものおよび／または同重体のものであり得る。
【０００５】
図１ａを参照して、標識試薬は、レポーター部分、バランス（またはリンカー）部分および反応性基（この場合、反応性基は、組成物の分析物反応形態の分析物によって置換されている）を含む。この一般式の標識試薬および標識された分析物の例は、例えば、同時係属中で、共同所有の米国特許出願公開番号ＵＳ  ２００４−０２１９６８５  Ａ１、ＵＳ  ２００５−０１１４０４２  Ａ１、ＵＳ  ２００５−０１４７９８２  Ａ１、ＵＳ  ２００５−０１４７９８５  Ａ１、ＵＳ  ２００５−０１４７９８７  Ａ１、ＵＳ  ２００５−０１４８７７１  Ａ１、ＵＳ  ２００５−０１４８７７３  Ａ１およびＵＳ  ２００５−０１４８７７４  Ａ１に開示されている。列挙した米国特許公開出願において論じられているように、異性体および／または同重体標識試薬のセットを使用して、例えば、２つ以上の異なるサンプルの分析物に標識付けすることができ、この場合、１セットの異なる標識試薬すべてが同じ総質量を有するが、それぞれのレポーター部分は、固有にコード化することができるので、そのセットのそれぞれのレポーター部分は固有の質量を有する。そのセットのすべての試薬は、固有の質量のレポーター部分を含むことができるが、同じ総質量を有することができるため、バランス（またはリンカー）も、１つ以上の重原子同位体（必須ではないが）を一般に含んで、それによって、そのセットのそれぞれの標識試薬のレポーター／リンカーの組み合わせが同じ総質量を有するように、それぞれの固有レポーターの質量の「バランスをとる」こととなる。
【０００６】
本明細書において、より十分に論じる新規標識試薬（または標識された分析物）の一例を図１ｂに示す。（Ｒ１およびＲ２を除いて）非置換形で図示されているが、本標識試薬が置換されている場合もあり、または非置換である場合もあることは、理解されたい。この図では、一定の結合がフラグメント化されて、その結果、標識試薬または標識された分析物から少なくとも固有レポーター部分および（必須ではないが）典型的にはバランス部分を放出するように示されている。標識された分析物ついては、その後、質量分析計において観察されるそれぞれの固有レポーターイオン（シグネチャーイオンと称される場合もある）を使用して、サンプルおよび／またはサンプル混合物中の分析物の量を定量することができる。
【０００７】
図２ａおよび２ｂは、少なくとも９重実験（９−ｐｌｅｘ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）を容易にするために使用することができる、図１ｂ（例えば、Ｒ１およびＲ２は、他から独立して、水素またはメチルであり得る）に示す基本構造の９つの異なるコード化バージョンを図示するものであり、ここで、アスタリスク（＊）は、適宜、１２Ｃ原子が１３Ｃ原子で置換される場所、または１４Ｎ原子が１５Ｎ原子で置換される場所を図示するために使用されている。様々なレポーター／シグネチャーイオンについての提案構造を図２ｃに図示する。しかし、例えば、そのレポーター部分および／またはバランス部分において１つ以上の水素原子を置換するために重水素も用い、および／または１６Ｏを１８Ｏで置換すれば、９つより多くの異なる化合物を想定できるので、９重実験より多重の実験を行うことができよう。この一般構造の標識試薬／標識された分析物のさらなる置換についてのそのような可能性は、図６ａおよび６ｂを参照して、下でさらに詳細に論じる。
【０００８】
図２ａおよび２ｂ（図中、Ｒ１およびＲ２は、６員環を形成するために用いられることがある）に描かれているものに類似した同重体化合物の代替セットを、図３ａおよび３ｂに図示する。これらの標識試薬は、９つの異なるレポーター／シグネチャーイオンの同じセットを形成することができ、それらの提案構造を図２ｃに図示する。分析物分析のための必要特性を有する代替構造を容易に作製できることは、本発明の実施形態の一般的な適用可能性の例証となる。
【０００９】
一般に、標識試薬、標識された分析物、ならびにそれらの標識試薬および／または標識された分析物への一部の中間体は、下記式Ｉ（その塩形態および／または水和物形態を含む）の化合物によって表すことができる：
【００１０】
【化３４】
0005564182.tif 000002
（式中、Ｚは、−ＯＨ、−ＳＨ、−Ｏ−Ｖ＋、−Ｓ−Ｖ＋、反応性基（分析物の官能基と反応して、それによって標識された分析物を形成することができる）、反応性基の脱離基（該脱離基は、標識試薬と分析物または共有結合で連結された分析物の求核性官能基との反応によって脱離する）であり得、ならびに原子または基Ｖ＋、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｙ、Ｊ、ＫおよびＬは、下でさらに詳細に説明する）。
【００１１】
従って、一部の実施形態では、分析物を、下記式Ｉ’（その塩形態および／または水和物形態を含む）の化合物によって表される標識試薬と反応させることによって、分析物に標識付けすることができる：
【００１２】
【化３５】
0005564182.tif 000003
（式中、Ｚ’は、分析物の官能基と反応して、それによって標識された分析物を形成することができる反応性基、または反応性基の脱離基を表し、ならびに原子または基Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｙ、Ｊ、ＫおよびＬは、下でさらに詳細に説明する）。前記標識試薬はセットで使用することができ、この場合、セットは、異性体化合物および／または同重体化合物を含み、その結果、それらの標識された分析物も異性体および／または同重体であり得る。
【００１３】
従って、さらに、一部の実施形態において、標識された分析物は、下記式Ｉ’’（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表すことができる：
【００１４】
【化３６】
0005564182.tif 000004
（式中、Ｚ’’は、標識試薬に（恐らく、反応性基のさらなる原子または基により）共有結合で連結された分析物を表し、ならびに原子または基Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｙ、Ｊ、ＫおよびＬは、下でさらに詳細に説明する）。
【００１５】
さらに、一部の実施形態において、標識試薬の中間体は、下記式Ｉ’’’（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表すことができる：
【００１６】
【化３７】
0005564182.tif 000005
（式中、Ｚ’’’は、−ＯＨ、−ＳＨ、−Ｏ−Ｖ＋、−Ｓ−Ｖ＋を表し、ならびに原子または基Ｖ＋、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｙ、Ｊ、ＫおよびＬは、下でさらに詳細に説明する）。前記中間体を使用して、例えば、本明細書に開示する標識試薬を生成すること（標識試薬のインサイチュー生成を含む）ができ、前述のインサイチューで生成された標識試薬を使用して、分析物に標識付けすることができる。
【００１７】
図示されている化合物において、基Ｙ−Ｊ−は、レポーター部分を表す。従って、異性体および／または同重体セットの標識試薬は、そのセットのそれぞれの異なる標識試薬が同じ総質量を有するようにコード化され得るが、そのセットのそれぞれの異なる標識試薬の基Ｙ−Ｊ−は、例えば１つ以上の同位体濃縮部位を用いることによって、固有にコード化されるので、質量分析計内でその基Ｙ−Ｊ−の基Ｊとその標識された分析物（またはそのフラグメント）の残部との結合がフラグメント化すると（図１ｃ参照）、固有質量のレポーターイオンが生成されることができる。レポーター部分に関連したイオン（すなわち、シグネチャーイオンまたはレポーターイオン）のピーク強度は、分析されるサンプル中の標識された分析物の量（多くの場合、濃度および／または分量として表わされる）と相関させることができる。従って、異性体および／または同重体標識試薬のセットを使用して、２つ以上の異なるサンプルの分析物に標識付けすることができ、この場合、前記標識試薬は、異なるサンプルごとに異なる場合もあり、ならびに前記標識試薬は、固有の質量のレポーター部分を含むことができ、それをその標識された分析物の源となったサンプルに関連付けることができる。従って、それぞれのレポーター部分の存在および／または量などの情報は、複数の異なるサンプルの標識付けの産物を混合することによって誘導された標識された分析物の複合混合物の分析からのものであっても、２つ以上の異なるサンプル中の分析物と相関させることができる。
【００１８】
本明細書中で説明するように、９つ以上の異性体および／または同重体標識試薬から成るセットを作ることができ、それによって、９重以上の実験が可能となる（１つの例示的分析の実例は、図１９ａおよび１９ｂにおいて見出すことができる）。例えば、それぞれ差別的に標識付けされ、その後混合された９つ（またはそれ以上）の異なるサンプルにおいて分析物を同時に同定および／または定量することも可能である。かかる分析は、図２ａ／２ｂまたは３ａ／３ｂのいずれかに図示するセットの異なる標識試薬でそれぞれ標識された９つの異なるサンプルの混合物から固有のレポーターイオン（これは、図２ｃに示す構造を有し得る）を決定することによって、達成することができる。従って、本発明の実施形態は、複合サンプル混合物の多重分析に特によく適する。例えば、本発明の一部の実施形態は、プロテオーム解析および／またはゲノム解析において、ならびにゲノムおよびプロテオーム解析に関連した相関試験のために使用することができる。本発明の一部の実施形態は、小分子分析、例えば、脂質、ステロイドまたはアミノ酸分析のためにも使用することができる。異性体および／または同重体試薬を使用できる実験解析としては、経時変化研究、バイオマーカー解析、多重プロテオーム解析、ＭｕｄＰＩＴ実験、アフィニティー・プルダウン、翻訳後修飾（ＰＴＭ）の判定（例えば、米国特許出願公開番号ＵＳ  ２００５−０２０８５５０  Ａ１参照）および多重対照実験が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
下で説明する図面が、説明のみを目的とするものであることは、当業者には理解されよう。これらの図面は、如何なる点においても、本教示の範囲を限定を意図するものではない。
【００２０】
特許、特許出願、論文、本、論説およびインターネットウェブページをはじめとする（しかし、これらに限定されない）、本出願に引用するすべての文献および同様の資料は、そうした文献および同様の資料の形式に関わらず、任意およびすべての目的で、それらの全体が本明細書に参照により特に取り入れられている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（定義）
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用されることとなり、ならびに適宜、単数形で用いられている用語は複数形も包含し、複数形は単数形も包含することとなる。下で述べる任意の定義が任意の他の文献（本明細書に参照により取り入れられている任意の文献を含む）におけるその語の使用法と矛盾する場合には、（例えば、その用語がそもそも使用されている文献において）相反する意味が明確に意図されていない限り、本明細書およびそれに関連する特許請求の範囲を解釈するために、下で述べる定義が常に支配するものとする。ここでの「または」の使用は、別様に述べられていない限り、または「および／または」の使用が明確に不適切でない限り、「および／または」を意味する。ここでの「ａ（不定冠詞）」の使用は、別様に述べられていない限り、または「１つ以上」の使用が明確に不適切でない限り、「１つ以上」を意味する。含む「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」は、交換可能に用いられており、限定を意図しない。さらに、１つ以上の実施形態の説明に用語「含む」が用いられている場合、一部の具体的な事例では、そのまたはそれらの実施形態を、「から本質的に成る」および／または「から成る」という言葉を用いて代替的に説明することがあることは、当業者には理解されるであろう。
【００２２】
ａ．）ここで用いる場合、「分析物」は、決定され得る関心のある分子を指す。分析物の非限定的な例としては、タンパク質、ペプチド、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）、炭水化物、脂質、ステロイド、および１５００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量を有する他の小分子が挙げられるが、これらに限定されない。分析物の源、すなわち分析物を含むサンプルは、それがいずれの源からのものであってもよいので、限定ではない。分析物（単数または複数）は、天然のものである場合もあり、または合成のものである場合もある。分析物の源、すなわち分析物を含むサンプル、の非限定的な例としては、細胞もしくは組織、またはそれらの培養物（もしくは二次培養物）が挙げられる。分析物源の他の非限定的な例としては、粗製もしくは加工された細胞溶解物、体液、組織抽出物、細胞抽出物、または分離プロセス、例えばクロマトグラフ分離、１Ｄ電気泳動分離、２Ｄ電気泳動分離もしくは毛管電気泳動分離、からの画分（もしくは部分）が挙げられるが、これらに限定されない。体液としては、血液、尿、糞便、髄液、脳液、羊水、リンパ液、または腺分泌からの液が挙げられるが、これらに限定されない。加工細胞溶解産物とは、細胞を溶解するために必要な処理に加えて、細胞溶解産物を、回収した材料のさらなる加工を行うように処理することを意味する。例えば、前記サンプルは、１つ以上のタンパク質分解酵素で細胞溶解産物を処理して、それによって、前駆体ペプチドおよび／またはタンパク質を消化することにより形成されたペプチドである１つ以上の分析物を含む、細胞溶解産物であってもよい。
【００２３】
ｂ．）用いられる文脈に基づいて明瞭に意図されていないとき（例えば、別様に命ずる具体的な構造に言及しているとき）などを除き、「エステル」は、エステルおよび／またはチオエステルの両方を指す。
【００２４】
ｃ．）ここで用いる場合、「フラグメント化」は、共有結合の破断を指す。
【００２５】
ｄ．）ここで用いる場合、「フラグメント」は、フラグメント化の産物（名詞）またはフラグメント化を生じさせる操作（動詞）を指す。
【００２６】
ｅ．）ここで用いる場合、「水和形」は、化合物もしくは混合物の任意の水和状態、または化合物の１より大きな水和状態を指す。例えば、ここで論じる標識試薬は、半水和物、一水和物、二水和物などであり得る。さらに、ここに記載する標識試薬のサンプルは、一水和物、二水和物および半水和物形態を同時に含むことがある。
【００２７】
ｆ．）ここで用いる場合、ハロゲン基は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉを指す。
【００２８】
ｇ．）化合物に関してここで用いる場合、「同位体的に濃縮された」は、１つ以上の重原子同位体（例えば、重水素、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３７Ｃｌまたは８１Ｂｒなどの安定な同位体）で濃縮された化合物（例えば、標識試薬）を指す。一部の実施形態では、不安定な同位体（例えば、１４Ｃまたは３Ｈ）も使用することがある。「濃縮された」とは、重原子同位体の量が天然同位体存在度を超えていることを意味する。様々な実施形態において、同位体濃縮化合物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０またはそれ以上の同位体濃縮部位を含むことがある。
【００２９】
同位体濃縮は、１００％有効ではないため、化合物のサンプル中に、より低い濃縮状態の不純物が存在する場合があり、これらは、より小さい質量を有するであろう。同様に、過剰濃縮（例えば、望ましくない濃縮）のため、および天然同位体存在度のため、化合物のサンプル中に、より大きい質量の不純物が存在する場合がある。一部の実施形態において、組み込まれているそれぞれの重原子同位体は、少なくとも８０パーセントの同位体純度で同位体濃縮部位に存在し得る。一部の実施形態において、組み込まれているそれぞれの重原子同位体は、少なくとも９３パーセントの同位体純度で同位体濃縮部位に存在し得る。一部の実施形態において、組み込まれているそれぞれの重原子同位体は、少なくとも９６パーセントの同位体純度で同位体濃縮部位に存在し得る。一部の実施形態において、組み込まれているそれぞれの重原子同位体は、少なくとも９８パーセントの同位体純度で同位体濃縮部位に存在し得る。
【００３０】
ｈ．）ここで用いる場合、「同位体濃縮部位」は、重原子異性体でその原子の軽いバージョンが置換されている（例えば、１３Ｃでの１２Ｃの置換、１８Ｏでの１６Ｏの置換、１５Ｎでの１４Ｎの置換、または重水素での水素の置換）、化合物中の位置を指す。
【００３１】
ｉ．）化合物に関してここで用いる場合、「軽（い）」は、重原子同位体で濃縮されていない化合物を指す。原子に関してここで用いる場合、「軽（い）」は、その原子の最低質量同位体を指す。化合物に関してここで用いる場合、「重（い）」は、少なくとも１つの重原子同位体で濃縮されている化合物を指す。原子に関してここで用いる場合、「重（い）」は、その原子の重い質量の同位体を指す。
【００３２】
ｊ．）ここで用いる場合、「標識試薬」は、決定のための分析物へのマーク付けに適する部分を指す。用語標識は、用語タグおよびマークならびに他の等価の用語およびフレーズと同義である。例えば、標識された分析物は、タグ付きまたはマーク付き分析物とも呼ばれることがある。従って、用語「標識」、「タグ」、「質量タグ」、「マーク」およびこれらの用語の派生語は等価であり、交換可能であり、ならびに決定のための分析物へのマーク付けに適する、またはマークが付けられた部分を指す。時として、標識試薬は、タグ付け試薬または質量タグ付け試薬と呼ばれることがある。
【００３３】
ｋ．）ここで用いる場合、「天然同位体存在度」は、自然界における同位体（単数または複数）の天然普及率を基にした化合物中で見出される１つ以上の重い同位体のレベル（または分布）を指す。例えば、生植物質から得られた天然化合物は、典型的に、１２Ｃを基準にして約１．０８％の１３Ｃを含有するであろう。
【００３４】
ｌ．）ここで用いる場合、同重体は、同じ公称総質量の（重原子同位体の同位体含有率および／または分布を除いて）構造的に区別できない化合物である。あらゆる疑念を避けるために、図４ａの化合物１〜４は、本明細書において述べる定義による同重体である。比較すると、ここで用いる場合、異性体は、同じ公称グロス重量の構造的に区別できる化合物である。例示的異性同重体を図４ｂに図示する。
【００３５】
ｍ．）ここで用いる場合、「支持体」、「固体支持体」、「固体担体」または「樹脂」は、任意の固相材料を意味する。固体支持体は、「支持体」、「合成支持体」、「固相」、「表面」、「膜」および／または「支持体」などの用語を包含する。固体支持体は、有機ポリマー、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミド、ならびにそれらのコポリマーおよびグラフトから成り得る。固体支持体は、無機のもの、例えばガラス、シリカ、細孔制御ガラス（ＣＰＧ）、または逆相シリカであってもよい。固体支持体の構造は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、膜または表面の形態であり得る。表面は、平面、実質的に平面または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性である場合もあり、または無孔である場合もあり、および膨潤特性を有する場合もあり、または膨潤特性を有さない場合もある。固体支持体は、ウエル、凹または他の容器、器、地形または位置の形態で形成することができる。試薬のロボット送達のためにまたは検出方法および／もしくは計器によって、アドレス可能な様々な位置で、複数の固体支持体を配列ことができる。
【００３６】
ｎ．）ここで用いる場合、「サンプル、またはその画分」または「サンプル画分」は、サンプルの画分を指すために用いることができる。サンプルの画分は、サンプルの画分を単に抜き取ることによって生じさせることができ、でなければ、２つ以上の画分に分画されたサンプルを生じさせる分離プロセスを行うことによって生じさせることができる。その記述の内容が別様に示していない限り、これらのフレーズは、等価であり、交換可能であり、ならびにサンプルの画分（または部分）のどちらのタイプの作成も指す。
ｏ．）ここで用いる場合、「シグネチャーイオン」および「レポーターイオン」は、交換可能であり、両方が、標識試薬または標識された分析物のフラグメント化によりレポーター部分から生じた固有の質量のレポーターイオンを指す。シグネチャーイオンまたはレポーターイオンによって、分析物に標識付けするために使用された固有の標識試薬が特定され、ＭＳ／ＭＳ分析におけるそのピーク強度を、分析されるサンプル中に存在する標識された分析物の量と相関させることができる。ここで用いる場合、シグネチャーイオンまたはレポーターイオンは、時として、単にレポーターと呼ばれる。ここで用いる場合、レポーター部分も、時として、レポーターと呼ばれる。レポータ部分が、標識試薬、標識された分析物またはそれらのフラグメントに付いている基を指し、レポーターイオンが、標識試薬、標識された分析物またはそれらのフラグメントにレポーター部分を連結させる結合のフラグメント化によって生じるフラグメントイオンを指すことは、理解されるはずである。従って、「レポーター」という語が用いられている文脈は、その意図する意味を示すこととなる。「固有レポーター部分」というフレーズが、「固有質量のレポーター部分」と等価であり、交換可能であること、および「固有レポーターイオン」が、「固有質量のレポーターイオン」と等価であり、交換可能であることも理解されるはずである。
【００３７】
ｐ．）ここで用いる場合、用語「塩形態」は、化合物の塩または化合物の塩の混合物を包含する。加えて、化合物の双性イオン形も用語「塩形態」に包含される。アミンまたは他の塩基性の基を有する化合物の塩は、例えば、塩化水素、臭化水素、酢酸、過塩素酸などのような、適する有機または無機酸との反応によって、得ることができる。第四級アンモニウム基を有する化合物は、対イオン、例えば塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、酢酸イオン、過塩素酸イオンなど、も含有することがある。カルボン酸または他の酸性官能基を有する化合物の塩は、適する塩基、例えば水酸化物塩基、とその化合物を反応させることによって作製することができる。従って、酸性官能基の塩は、対カチオン、例えばナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなど、を有することがある。
【００３８】
ｑ．）ここで用いる場合、「合成化合物」は、天然経路の操作をはじめとするプロセスの操作によって作られる化合物を指す。従って、合成化合物は、合成化学技術を用いて生成することができる。しかし、ここで用いる場合、「合成化合物」は、例えば、酵素的方法（例えば、細菌または酵母などの生物にそれらを改変する同位体濃縮化合物を与えて、それによって、本明細書に記載する、同位体濃縮標識試薬、または標識試薬の中間体を生成することを含む）によって生成される化合物も包含することを意図する。
【００３９】
ｒ．）ここで用いる場合、「合成濃縮された」または「合成的に濃縮された」は、本明細書に記載する、同位体濃縮標識試薬、または標識試薬への中間体を結果的に生じさせる、合成または天然プロセスの操作を指す。
【００４０】
ｓ．）原子または分子の質量を、多くの場合、最も近い整数原子質量単位または最も近い十分の一もしくは百分の一原子質量単位に概算できることは、十分に認められている。ここで用いる場合、「総質量」は、絶対質量、ならびに（異なる原子タイプの同位体の使用が、使用される異なる同位体タイプの質量の非常に小さな相違を検出することができようと、できまいと、（異性体および／または同重体標識試薬のセットまたはキットの中のレポーター／リンカーの組み合わせの総質量が同じであるように）レポーターおよび／またはリンカー部分の質量のバランスをとることを目的としてそれらが機能的に等価であるほど質量の点で類似している）一定範囲内の近似質量を指す。
【００４１】
例えば、酸素の通常の同位体は、１６．０（実際質量１５．９９４９）および１８．０（実際質量１７．９９９２）の総質量を有し、炭素の通常の同位体は、１２．０（実際質量１２．０００００）および１３．０（実際質量１３．００３３６）の総質量を有し、窒素の通常の同位体は、１４．０（実際質量１４．００３１）および１５．０（実際質量１５．０００１）の総質量を有する。これらの値は近似しているが、セットの１つの標識の中の同位体濃縮部位で１８Ｏ同位体を使用する場合、（１６．０の総質量を有する酸素の同位体を上回る）追加の２質量単位は、例えば、１６Ｏを含むセットの異なる標識において、その標識内の他の場所に、２つの１２Ｃ原子の代わりに２つの炭素１３Ｃ原子、２つの１４Ｎ原子の代わりに２つの１５Ｎ原子、またさらには、１２Ｃと１４Ｎの代わりに１つの１３Ｃ原子と１つの１５Ｎ原子を組み込んで１８Ｏの埋め合わせをすることにより、埋め合わせることができることは、当業者には理解されるであろう。このようにして、そのセットの２つの異なる標識は、同じ総質量を有することができる。なぜならば、そのセットまたはキットのすべての標識における２ダルトンの質量の増加を結果的に達成するための２つの１３Ｃ原子（２つの１２Ｃ原子の代わりとして）、２つの１５Ｎ原子（２つの１４Ｎ原子の代わりとして）、１つの１３Ｃと１つの１５Ｎ（１２Ｃと１４Ｎの代わりとして）または１つの１８Ｏ原子（１つの１６Ｏ原子の代わりとして）の使用の間の質量に関する非常に小さい実際の相違は、分析の本質への障害とならないからである。
【００４２】
これは、図４ａを参照して説明することができる。図４ａにおいて、化合物３のレポーター／リンカーの組み合わせ（図４ａ；分子式：Ｃ５１３ＣＨ１１１５Ｎ２Ｏ）は、２つの１５Ｎ原子および１つの１３Ｃ原子、ならびに１３０．０８５の総理論質量を有する。比較すると、同重体１のレポーター／リンカー部分（図４ａ；分子式：Ｃ５１３ＣＨ１１Ｎ２１８Ｏ）は、１つの１８Ｏ原子および１つの１３Ｃ原子、ならびに１３０．０９５の総理論質量を有する。化合物１および３は、重原子同位体含有率を除いて構造的に区別できない同重体であり得るが、レポーター／リンカー部分の絶対質量にわずかな違いがあり得る（それぞれ、質量１３０．０９５対質量１３０．０８５）。しかしながら、質量分析計が、同重体１および３から生じるレポーターイオンの絶対質量間の小さな相違を測定するために十分な感度であろうと、なかろうと、これは分析への障害とならないので、化合物１および３のレポーター／リンカー部分の総質量は、本発明のためには１３０．１である。
【００４３】
同様に、図４ｂを参照して、化合物５および６のレポーター／リンカー部分の質量がそれぞれ１４４．１１１および１４４．１００である２つの異性同重体を説明する。質量分析計が、化合物５および６から生じるレポーターイオンの絶対質量間の小さな相違を測定するために十分な感度であろうと、なかろうと、それは分析への障害とならないので、これらの化合物のレポーター／リンカー部分の総質量は、本発明のためには１４４．１である。
【００４４】
図４ａおよび４ｂから、構造内の同じ重原子同位体の分布が、異性体および／または同重体標識試薬のセットを作るための唯一の考慮事項ではないことは、明らかである。重原子同位体タイプを混合物して、所望の総質量の異性体および／または同重体を得ることが可能である。このようにして、重原子同位体の選択（組み合わせ）とそれらの分布の両方を、本発明の実施形態に有用な異性体および／または同重体標識試薬の製造の際の考慮に利用できる。
【００４５】
ｔ．）ここで用いる場合、用語「アルキル」は、完全に飽和されていることがある、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ２〜Ｃ８炭化水素または環状Ｃ３〜Ｃ８炭化水素（すなわち、シクロアルキル基、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基またはシクロヘキシルメチレン基）を指す。ここで用いるとき、用語「アルキル」は、置換されているまたは非置換であることがある基を指す。用語「アルキル」は、アルキル鎖内の１つ以上のメチレン基が、−Ｏ−、−Ｓｉ−または−Ｓ−などのヘテロ原子によって置換されていることがある化合物も指すと意図される。一部の実施形態において、アルキル基は、完全に飽和されていることがある、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ２〜Ｃ６炭化水素または環状Ｃ３〜Ｃ６炭化水素であり得る。
【００４６】
ｕ．）ここで用いる場合、用語「アルキレン」は、少なくとも２つの部分への少なくとも２つの結合点を含む、直線状もしくは分枝状アルキル鎖または環状アルキル基（例えば、−｛ＣＨ２｝−（メチレン）、−｛ＣＨ２ＣＨ２｝−（エチレン）、
【００４７】
【化３８】
0005564182.tif 000006
など（この場合の大括弧は、結合点を示す））を指す。ここで用いるとき、用語「アルキレン」は、置換されているまたは非置換であることがある基を指す。用語「アルキレン」は、そのアルキレン基のアルキル鎖内の、もしあれば、１つ以上のメチレン基が、−Ｏ−、−Ｓｉ−または−Ｓ−などのヘテロ原子によって置換されていることがある化合物も指すと意図される。一部の実施形態において、アルキレン基は、Ｃ１〜Ｃ１０炭化水素であり得る。一部の実施形態において、アルキレン基は、Ｃ２〜Ｃ６炭化水素であり得る。
【００４８】
ｖ．）ここで用いる場合、「アルケニル」は、１つ以上の二重結合を含む、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ２〜Ｃ８炭化水素または環状Ｃ３〜Ｃ８炭化水素を指す。ここで用いるとき、用語「アルケニル」は、置換されているまたは非置換であることがある基を指す。用語「アルケニル」は、そのアルケニル基のアルキル鎖内の、もしあれば、１つ以上のメチレン基が、−Ｏ−、−Ｓｉ−または−Ｓ−などのヘテロ原子によって置換されていることがある化合物も指すと意図される。一部の実施形態において、アルケニル基は、１つ以上の二重結合を含む、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ２〜Ｃ６炭化水素または環状Ｃ３〜Ｃ６炭化水素であり得る。
【００４９】
ｗ．）ここで用いる場合、用語「アルケニレン」は、少なくとも２つの部分への２つの結合点を含むアルケニル基を指す。ここで用いるとき、用語「アルケニレン」は、置換されているまたは非置換であることがある基を指す。用語「アルケニレン」は、そのアルケニレン基のアルキル鎖内の、もしあれば、１つ以上のメチレン基が、−Ｏ−、−Ｓｉ−または−Ｓ−などのヘテロ原子によって置換されていることがある化合物も指すと意図される。
【００５０】
ｘ．）ここで用いる場合、用語「アルキニル」は、１つ以上の三重結合を含む、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ２〜Ｃ８炭化水素または環状Ｃ３〜Ｃ８炭化水素を指す。ここで用いるとき、用語「アルキニル」は、置換されているまたは非置換であることがある基を指す。用語「アルキニル」は、そのアルキニル基のアルキル鎖内の、もしあれば、１つ以上のメチレン基が、−Ｏ−、−Ｓｉ−または−Ｓ−などのヘテロ原子によって置換されていることがある化合物も指すと意図される。一部の実施形態において、アルキニル基は、１つ以上の三重結合を有する、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ２〜Ｃ６炭化水素または環状Ｃ３〜Ｃ６炭化水素であり得る。
【００５１】
ｙ．）ここで用いる場合、用語「アルキニレン」は、少なくとも２つの部分への２つの結合点を含むアルキニル基を指す。ここで用いるとき、用語「アルキニレン」は、置換されているまたは非置換であることがある基を指す。用語「アルキニレン」は、そのアルキニレン基のアルキル鎖内の、もしあれば、１つ以上のメチレン基が、−Ｏ−、−Ｓｉ−または−Ｓ−などのヘテロ原子によって置換されていることがある化合物も指すと意図される。
【００５２】
ｚ．）ここで用いる場合、用語「脂肪族の」は、上で定義したとおりの一切の直線状、分枝状または環状アルキル、アルケニルおよびアルキニル部分を指す。ここで用いるとき、用語「脂肪族の」は、置換されているまたは非置換であることがある基を指す。
ａａ．）ここで用いる場合、単独でまたは別の部分の一部として（例えば、アリールアルキルなど）の用語「アリール」は、フェニルなどの炭素環式芳香族基を指す。アリール基は、１つの炭素環式芳香族環がもう１つの炭素環式芳香族環と融合している融合多環式芳香族環系（例えば、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントラシル、２−アントラシルなど）、または１つの炭素環式芳香族環が１つ以上の炭素環式非芳香族環と融合している融合多環式芳香族環系（例えば、テトラヒドロナフチレン、インダンなど）も包含する。ここで用いる場合、用語「アリール」は、置換されているまたは非置換であることがある基を指す。
【００５３】
ａｂ．）ここで用いる場合、用語「ヘテロアリール」は、窒素、硫黄および酸素から、他から独立して、選択される１、２、３または４個のヘテロ原子を含む、芳香族複素環を指す。ここで用いる場合、用語「ヘテロアリール」は、置換されているまたは非置換であることがある基を指す。ヘテロアリールは、１つまたは２つの環、例えばシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環、に融合していることもある。分子へのヘテロアリールの結合点は、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキルまたはアリール環上にある場合があり、ならびにヘテロアリール基は、炭素原子またはヘテロ原子によって付いている場合がある。ヘテロアリール基の例としては、イミダゾリル、フリル、ピロリル、チエニル、チアゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、ピリジニル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、キノリル、イソキノリニル、インダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチアゾリル、インドリジニル、イミダゾピリジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、オキサゾリル、テトラゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、インドリル、テトラヒドロインドリル、アザインドリル、イミダゾピリジル、キナゾリニル、プリニル、ピロロ［２，３］ピリミジル、ピラゾロ［３，４］ピリミジルまたはベンゾ（ｂ）チエニルが挙げられ、これらのそれぞれは、場合によって置換されていることがある。
【００５４】
ａｃ．）ここで用いる場合、用語「アリーレン」は、少なくとも２つの部分への少なくとも２つの結合点を含む、アリールまたはヘテロアリール基（例えば、フェニレンなど）を指す。炭素環式非芳香族環に融合したアリーレンの結合点は、芳香族環上にある場合もあり、非芳香族環上にある場合もある。ここで用いる場合、用語「アリーレン」は、置換されているまたは非置換であることがある基を指す。
【００５５】
ａｄ．）ここで用いる場合、用語「アリールアルキル」は、アルキレンリンカーによって別の部分に結合している、アリールまたはヘテロアリール基を指す。ここで用いる場合、用語「アリールアルキル」は、置換されているまたは非置換であることがある基を指す。用語「アリールアルキル」は、そのアリールアルキル基のアルキル鎖内の、もしあれば、１つ以上のメチレン基が、−Ｏ−、−Ｓｉ−または−Ｓ−などのヘテロ原子によって置換されていることがある化合物も指すと意図される。
【００５６】
ａｅ．）ここで用いる場合、用語「アリールアルキレン」は、少なくとも２つの部分への少なくとも２つの結合点を有するアリールアルキル基を指す。第二の結合点は、芳香族環上にある場合もあり、またはアルキレン基上にある場合もある。ここで用いる場合、用語「アリールアルキレン」は、置換されているまたは非置換であることがある基を指す。用語「アリールアルキレン」は、そのアリールアルキレン基のアルキル鎖内の、もしあれば、１つ以上のメチレン基が、−Ｏ−、−Ｓｉ−または−Ｓ−などのヘテロ原子によって置換されていることがある化合物も指すと意図される。アリールアルキレンが置換されているとき、置換基は、そのアリールアルキレンの芳香族環部分またはアルキレン部分のいずれかまたは両方にある場合がある。
【００５７】
ａｆ．）ここで用いる場合、用語「場合によって置換されている」および「置換されているまたは非置換である」は、等価であり、交換可能である。任意のアルキル、アルキレン、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、アリール、アリールアルキル、アリーレン、ヘテロアリールまたはアリールアルキレン基についての適する置換基は、本発明の実施形態において用いられる反応条件下で安定である任意の置換基を含む。適する置換基の非限定的な例としては、アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、シクロヘキシルなど）基、ハロアルキル（例えば、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル−など）基、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシなど）基、アリール（例えば、フェニル）基、アリールアルキル（例えば、ベンジル）基、ニトロ基、シアノ基、四級化窒素原子またはハロゲン基（例えば、フッ素、塩素、臭素および／もしくはヨウ素）基が挙げられる。
【００５８】
加えて、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、アリール、アリールアルキル、アリーレン、ヘテロアリールまたはアリールアルキレン基の任意の部分も＝Ｏまたは＝Ｓで置換されていることがある。
【００５９】
ａｈ．）ここで用いる場合、用語「活性エステル」は、塩基性条件下でアミン、アルコールおよび一定のチオールと容易に反応して、それぞれ、アミド、エステルおよびチオエステルを生じさせることができる化合物を指す。活性エステルが有機化学分野において十分に確立されている用語である証拠として、Ｌｅｏ  Ａ  Ｐａｑｕｅｔｔｅ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５をさらに参照する。
【００６０】
ａｉ．）ここで用いる場合、用語「複素環」は、そのまたはそれらの環内の少なくとも２つの異なる構成要素の原子を含む任意の環状分子構造を指す。複素環が有機化学分野において十分に確立されている用語である証拠として、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９７をさらに参照する。
ａｊ．）ここで用いる場合、用語「脱離基」は、置換または転移反応中に、その反応の基質の残部または主要部分とみなされるものから離れる、電荷を有するまたは有さない、任意の原子または基を指す。脱離基が有機化学分野において十分に確立されている用語である証拠として、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９７をさらに参照する。
【００６１】
ａｋ．）ここで用いる場合、用語「保護基」は、分子内の官能基と反応し、それに結合して、その官能基がその分子の後続の反応に参加することを防ぐ化学基を指すが、後にこの基を除去して、それによって未保護官能基を再び生じさせることができる。保護基が有機化学分野において十分に確立されている用語である証拠として、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９７をさらに参照する。
本発明の様々な実施形態の説明：
下のこの「概説」セクションにおいて述べる論考は、本明細書に記載する本発明の様々な実施形態の一部にまたはすべてに関係し得ると理解される。
【００６２】
Ｉ．概説
標識試薬：
前に論じたように、標識試薬は、一般に、レポーター部分、バランス部分（またはリンカー部分）および反応性基を含む（図１ａ）。本明細書に開示する一部の新規標識試薬は、下記一般式Ｉ’（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表すことができる：
【００６３】
【化３９】
0005564182.tif 000007
（式中、Ｚ’は、反応性基、または反応性基の脱離基を表し、ならびに原子または基Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｙ、Ｊ、ＫおよびＬは、下でさらに詳細に説明する）。式Ｉ’によって表される化合物について、その分子のレポーター部分およびバランス部分を示す。他の同重体標識試薬についての式は、図１ｄで見つけることができる。
【００６４】
反応性基：
本方法、混合物、キットおよび／または組成物実施形態において使用される標識試薬（単数または複数）の反応性基（時として、略記「ＲＧ」の使用によって表される）は、サンプルの１つ以上の反応性分析物の１つ以上の官能基と反応することができる、任意の求電子または求核基であり得る。一部の実施形態において、反応性基は、リンカー（バランス）に関連する原子または基を含むと考えることができることも理解されるであろう。例えば、反応性基が活性エステルまたは酸ハロゲン化物基である場合、その活性エステルまたは酸ハロゲン化物のカルボニル基は、一部の実施形態において、異性体および／または同重体標識試薬のセットの中のレポーター部分の質量のバランスをとるためにリンカーに付随していると考えることもでき、この場合、カルボニル炭素は、標識試薬中、および標識された分析物中の双方に存在する。従って、一部の実施形態において、反応性基は、反応性基の脱離基を単に表すと解釈することができる。
【００６５】
反応性基が、下で論じる幾つかの特定の部分によって表されているとき、その分析物は、リンカー（バランス）に、そのリンカー（バランス）の一部であると見なすことができるまたはできない１つ以上の追加の原子または基によって、連結させることができる。
【００６６】
反応性基は、既に存在している場合もあり、またはインサイチューで作製される場合もある。反応性基のインサイチュー作製は、反応性分析物不在下で行われる場合もあり、または反応性基の存在下で行われる場合もある。例えば、カルボン酸基を、水溶性カルボジイミド（例えば、塩酸１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド；ＥＤＣ）でインサイチューで修飾して、それによって、分析物のアルキルまたはアリールアミン基などの求核因子と反応させることができる求電子基を作製することができる。一部の実施形態において、ＥＤＣでの標識試薬のカルボン酸基の活性化は、アミン（求核因子）含有分析物の存在下で行うことができる。一部の実施形態において、アミン（求核因子）含有分析物は、ＥＤＣとの最初の反応を行った後に付加させることもできる。他の実施形態において、反応性基は、保護基のインサイチュー除去によって、インサイチューで生成することができる。従って、求核因子および／または求電子因子の反応によって分析物の誘導体化を行うことができる任意の既存のまたは新たに作られた試薬（単数または複数）が、本発明の方法、混合物、キットおよび／または組成物実施形態によって考慮されている。
標識試薬の反応性基が、求電子基である場合、それは、分析物（単数または複数）の適する求核基と反応することができる。標識試薬の反応性基が、求核基である場合、それは、分析物（単数または複数）の適する求電子基と反応することができる。適する求核基と求電子基の多数のペアが公知であり、化学および生化学技術分野において使用されることが多い。分析物（例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、ステロイド、または１５００ダルトン未満の質量を有する他の小分子）とカップリングさせてそれらの誘導体化を行うことができる、適する求核または求電子基を含む試薬の非限定的な例は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃａｔａｌｏｇ＆Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ａ  Ｐｅｒｓｔｏｒｐ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ），Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ  ６１１０５，ＵＳＡに記載されている。他の適する試薬は、当該技術分野において周知であり、非常に多数の他の供給業者、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、から市販されている。
標識試薬の反応性基は、アミン反応性基である場合がある。例えば、前記アミン反応性基は、活性エステルである場合がある。前記活性エステルは、ペプチド合成では周知であり、ならびにペプチド合成の際に一般に用いられる条件下でアミノ酸のＮ−αアミンと容易に反応させることができる一定のエステルを指す。（参照：Ｌｅｏ  Ａ  Ｐａｑｕｅｔｔｅ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５）。前記アミン反応性活性エステル基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル（ＮＨＳＳ）、ペンタフルオロフェニルエステル（Ｐｆｐ）、２−ニトロフェニルエステル、３−ニトロフェニルエステル（３−ＮＰ）、４−ニトロフェニルエステル（４−ＮＰ）、２，４−ジニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル（Ｐｆｐ）、ペンタクロロフェニルエステル（Ｐｃｐ）、３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンエステル（Ｄｈｂｔ）、ヒドロキシピロリジノンエステル（ＮＨＰ）、２，４−ジハロフェニルエステル（参照：図８、および下の標題：「標識試薬の製造のための実例となる方法」のもとでの論考）、２，２，２−トリフルオロエタニルエステルまたは１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパニルエステルであってもよい。例えば、前記活性エステルの脱離基（一部の実施形態において、本明細書では一般にＺ’と呼ばれ、例えば、この場合、変数ＲＧは、その反応性基の脱離基部分とのみ同義である）は、式：
【００６７】
【化４０】
0005564182.tif 000008
（式中、Ｘ’は、−Ｏ−または−Ｓ−であり、それぞれのＸ’’は、他から独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉである）
によって表すことができる（代表化合物の活性エステルの合成のさらに詳細な説明については、米国特許出願公開番号ＵＳ  ２００５−０１４８７７１  Ａ１参照）。上記のものすべてが、活性エステルのアルコールまたはチオール脱離基であり、この場合、前記アルコールまたはチオール脱離基は、その活性エステル基のカルボニル炭素とアミノ酸のＮ−α−アミンとの反応によって置換することができる。本明細書に記載する任意の適する標識／タグ付け試薬の活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）が、本明細書において提供する開示と周知の手順を併用して作製できることは、通常の専門家には明らかであろう（例えば、Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６）．“Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ”ｉｎ“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｎｉｑｕｅｓ”，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２  ｐａｇｅｓ  １３７−１６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）も参照；Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  Ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｅｄｉｔｏｒ：Ｒｏｇｅｒ  Ｅｐｔｏｎ，ＳＰＣＣ（ＵＫ）Ｌｔｄ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，１９９０も参照）。
【００６８】
一部の実施形態において、標識試薬の反応性基は、混合酸無水物である場合がある。なぜならば、混合酸無水物は、アミン基と効率的に反応して、それによってアミド結合を生成することが知られているからである。混合酸無水物は、周知であり、ならびに有機および／またはペプチド化学分野において適用されることが多い方法を用いて作製することができる。
【００６９】
一部の実施形態において、標識試薬の反応性基は、酸ハロゲン化物基、例えば、酸フッ化物基（Ｃａｒｐｉｎｏら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１２：９６５１（１９９０）参照）または酸塩化物基であり得る。
【００７０】
一部の実施形態において、標識試薬の反応性基は、チオール反応性基である場合がある。例えば、チオール反応性基は、α−ハロ−アシル、α−ハロチオンまたはα−ハロイミンのマレイミド、アルキルハロゲン化物、アリールハロゲン化物であり得る。ハロゲン化物またはハロとは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素の原子を意味する。前記チオール反応性基は周知であり、ならびにペプチド化学分野において適用されることが多い方法を用いて作製することができる。
【００７１】
一部の実施形態において、標識試薬の反応性基は、ヒドロキシル反応性基である場合がある。例えば、ヒドロキシル反応性基は、トリチル−ハロゲン化物またはシリル−ハロゲン化物反応性部分であり得る。前記トリチル−ハロゲン化物反応性部分は、置換されていることもあり（例えば、Ｘ’’’−メトキシトリチル、Ｘ’’’−ジメトキシトリチル、Ｘ’’’−トリメトキシトリチルなど）、または非置換であることがある（この場合、ｘは、反応性基をリンカー（すなわち、バランス）に連結させる結合である）。前記シリル反応性部分は、アルキル置換シリルハロゲン化物、例えば、Ｘ’’’−ジメチルシリル、Ｘ’’’−ジトリエチルシリル、Ｘ’’’−ジプロピルシリル、Ｘ’’’−ジイソプロピルシリルなど（この場合、Ｘ’’’は、反応性基をリンカー（すなわち、バランス）に連結させる結合である）であり得る。前記反応性基は周知であり、ならびに核酸化学分野において適用されることが多い方法を用いて作製することができる。
【００７２】
一部の実施形態において、標識試薬の反応性基は、求核基、例えば、アミン基、ヒドロキシル基またはチオール基である場合がある。一部の実施形態において、前記求核反応性基は、アミノアルキル基、ヒドロキシアルキル基またはチオアルキル基であり得る。前記反応性基は周知であり、ならびに有機化学分野において適用されることが多い方法を用いて作製することができる。
【００７３】
レポーター部分：
本発明の実施形態において使用される標識試薬（単数または複数）のレポーター部分（時として、略記「ＲＰ」の使用によって表される）は、決定することができる固有質量（または質量対電荷比）を有する基であり得る。従って、セットのそれぞれのレポーター部分は、固有の総質量を有する。異なるレポーター部分が、それらの固有総質量を実現するために、１つ以上の重原子同位体を含むことがある。例えば、炭素の同位体（１２Ｃ、１３Ｃおよび１４Ｃ）、窒素の同位体（１４Ｎおよび１５Ｎ）、酸素の同位体（１６Ｏおよび１８Ｏ）または水素の同位体（水素、重水素および三重水素）が存在し、レポーター部分の種々の基の作製に使用することができる。これらは、他の軽および重原子同位体もレポーター部分に使用することができるので、限定ではない。軽および重原子同位体を含むレポーター部分を作製するために適する基本出発原料は、様々な市場の供給業者、例えば、マサチューセッツ州、アンドーヴァーのＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ｗｗｗ．ｉｓｏｔｏｐｅ．ｃｏｍでのリストまたは「基本出発原料」参照）およびＩｓｏｔｅｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの一部門）から入手することができる。Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＩｓｏｔｅｃは、注文合成契約のもとで所望される化合物も作製するであろう。同典拠。
【００７４】
レポーター部分は、固定電荷を含むか、またはイオン化することが可能なことがある。レポーター部分は、固定電荷を含むか、またはイオン化が可能なこともあるため、標識試薬は、単離されることもあり、あるいは塩（もしくは塩の混合物）または双性イオン形の反応性分析物に標識付けするために使用されることもある。レポーター部分のイオン化（またはレポーターイオン）は、質量分析計におけるその決定を容易とする。従って、標識された分析物中のレポーター部分の存在は、フラグメントイオン（時として、シグネチャーイオン（またはレポーターイオン）と呼ばれる）として決定することができる。イオン化されたとき、レポーターイオンは、正または負の正味電荷を１つ以上含むことができる。従って、レポーターイオンは、１つ以上の酸性基および／または塩基性基を含むことがある。なぜならば、そうした基は、質量分析計において容易にイオン化され得るからである。例えば、レポーター部分は、１つ以上の塩基性窒素原子（正電荷）または１つ以上のイオン化可能酸性基、例えばカルボン酸基、スルホン酸基もしくはリン酸基（負電荷）を含むことがある。少なくとも１つの塩基性窒素を含むレポーター部分の非限定的な例としては、置換または非置換、モルホリン、ピペリジンまたはピペラジン含有化合物が挙げられる。
【００７５】
固有レポーター部分を関心のあるサンプルと会合させ、それによって、その固有レポーター部分でそのサンプルの１つまたは多数の分析物に標識付けすることができる。このようにして、（一般に、レポーターイオンとして検出される）固有レポーター部分についての情報を、そのサンプルの分析物の１つまたはすべてについての情報と関連付けることができる。しかし、固有レポーター部分は、そのレポーターイオンを決定するとき、分析物に物理的に連結している必要はない。むしろ、レポーターイオンの固有総質量は、例えば、標識された分析物のイオンをフラグメント化して、それによって娘フラグメントイオンおよびレポーターイオンを生じさせた後、タンデム質量分析計の第二質量分析で決定することができる。決定されたレポーターイオンを使用して、決定された分析物の源となったサンプルを同定することができる。さらに、他のレポーターイオンの量に対する、または較正用標準に関連するレポーターイオン（例えば、特定のレポーターで標識された分析物）に対する、固有レポーターイオンの量を用いて、サンプル（単数または複数）中の分析物（例えば、サンプル混合物を形成するために使用されるもの）の相対および／または絶対量（多くの場合、濃度および／または分量として表される）を決定することができる。従って、特定のサンプル中の１つ以上の分析物の量などの情報を、それぞれの特定のサンプルに標識付けするために使用されるレポーター部分と関連付けることができる。分析物（単数または複数）の正体も決定する場合、その情報を、異なるレポーターイオンに関する情報と相関させて、それによって、１つまたは多数のサンプル中のそれぞれの標識された分析物の正体および量の決定を容易にすることができる。
【００７６】
レポーター部分は、置換または非置換Ｎ−アルキル化酢酸部分のメチレン炭素に共有結合で連結された窒素原子を含む場合があり、この場合、カルボン酸基ではなく置換または非置換メチレン基が、そのレポーターの一部である。カルボン酸基は、そのレポーターをリンカーに連結させるために使用することができる。前記窒素原子は、１、２または３つの基でアルキル化されていることがある。例えば、窒素原子を含む部分は、置換第二アミン、例えばジメチルアミン、ジエチルアミンまたはジプロピルアミンである場合がある。
【００７７】
レポーター部分は、置換または非置換酢酸部分でＮ−アルキル化されている窒素原子を含む（そのＮ−アルキル酢酸部分のカルボニル炭素によって分析物が連結される）５、６または７員複素環である場合があり、この場合、カルボン酸基ではなく置換または非置換メチレン基が、そのレポーターの一部である。前記複素環は、芳香族である場合もあり、または非芳香族である場合もある。従って、レポーター部分は、式Ｙ−Ｊ−（式中、基Ｙは、５、６または７員複素環を表すことができ、および基Ｊは、酢酸部分の置換または非置換メチレン基を表すことができる）によって表すことができる。前記複素環は、置換されていることもあり、または非置換であることもある。例えば、前記複素環部分の置換基としては、アルキル、アルコキシおよび／またはアリール基が挙げられる。前記置換基は、支持体に分析物を連結させるために適する、保護されたまたはされていない基、例えばアミン、ヒドロキシルまたはチオール基を含むことができる。前記複素環は、追加のヘテロ原子、例えば、１つ以上のケイ素、窒素、酸素および／または硫黄原子を含むことがある。
【００７８】
レポーター部分は、分析物の分析には一般的な条件のもとで実質的にサブフラグメント化しないように選択することができる。あらゆる疑念を避けるために、これは、任意の特徴であり、必須の特徴ではない。レポーターは、質量分析計において標識された分析物のフラグメント化を生じさせるために印加される解離エネルギーの条件下で実質的にサブフラグメント化しないように選択することができる。「実質的にサブフラグメント化しない」とは、関心のある分析物の良好な分析に付されたときに、バックグラウンドノイズより大きいレポーターフラグメントを検出することが難しいまたは不可能であることを意味する。
【００７９】
一部の実施形態において、レポーターイオンの総質量は、決定しようと努める分析物の質量、または分析物の予想されるいずれかのフラグメントの質量と比較して、異なるように意図的に選択することができる。例えば、タンパク質またはペプチドが分析物である場合、レポーターイオンの総質量は、任意の天然アミノ酸もしくはペプチドまたはそれらの予想されるフラグメントイオンと比較して、異なるように選択することができる。これは、分析物に依存して、同時に同じ質量を有する可能性のあるいずれのサンプル成分もないことがいずれの分析結果にも信頼性を加え得るので、分析物の決定を容易にし得る。バックグラウンドがペプチドについてほとんど期待できない質量範囲の例は、表１において見出すことができる。
【００８０】
表１：ペプチド分析に関連した標識フラグメントイオンｍ／ｚの選択のための可能な「クワイエットゾーン」
【００８１】
【表１】
0005564182.tif 000009
レポーター部分は、高分子でない場合もある。レポーター部分は、２５０原子質量単位（ａｍｕ）未満のｍ／ｚのシグネチャーイオンを生じさせるように選択することができる。レポーター部分は、２００ａｍｕ未満のｍ／ｚのシグネチャーイオンを生じさせるように選択することができる。レポーター部分は、１５０ａｍｕ未満のｍ／ｚのシグネチャーイオンを生じさせるように選択することができる。第一質量分析において同一同時質量を有する他のサンプル成分がない、このような小分子は、第二質量分析において容易に決定することができる。この文脈において、第二質量分析は、第一質量分析において決定される選択イオンに関して、一般にタンデム質量分析計において（または、例えば、単段型計器におけるポストソース分解によって）行うことができる。特定の質量対電荷比のイオンは、可能なフラグメント化に関する第一質量分析およびさらなる質量分析から特異的に選択できるため、第一質量分析から選択されなかったイオンは第二質量分析に繰り越されず、従って、第二質量分析のスペクトルを汚染しない。さらに、質量分析計の感度および検出器の線形性（定量のため）は、この低質量範囲では相当確固たるものであり得る。加えて、質量分析計技術の現状は、この質量範囲で１ダルトン未満のベースライン質量分解能を見込むことができるものである。
【００８２】
バランス（またはリンカー）部分：
分析物との反応が起こったか否かに依存して、レポーター部分を分析物にまたはレポーター部分を反応性基に連結させるために、本発明の実施形態と共に使用することができる標識試薬（単数または複数）のバランス（またはリンカー）部分（時として、略記の使用により「ＬＫ」と呼ばれる）。リンカーは、中性種を生じさせる（すなわち、質量分析計においてニュートラルロスを受ける）ように選択することができ、この場合、質量分析計においてリンカーをレポーター部分に連結させる結合（ＲＬ結合）とリンカーを分析物に連結させる結合（ＬＡ結合）の両方がフラグメント化する。リンカーは、解離エネルギーレベルに付されたとき、リンカーの中性フラグメントのみを結果的に生じさせるサブフラグメント化を含めて、サブフラグメント化するように設計することができる。リンカーは、１つ以上の検出可能なフラグメントを生じさせることができるように設計することができる。
【００８３】
リンカー部分は、混合物のそれぞれの標識された分析物についての、またはセットおよび／もしくはキットの標識試薬についてのレポーター部分間の総質量の差をその質量によって埋め合わせるために、１つ以上の重原子同位体を含むことがある。さらに、レポーター／リンカーの組み合わせ（すなわち、レポーター／リンカー部分）の総合総質量（すなわち、全体として考えた総質量）は、混合物のそれぞれの標識された分析物について、またはセットおよび／もしくはキットの標識試薬について、同じであり得る。さらに具体的には、リンカー部分は、異なるサンプルからの標識された分析物のレポーター部分間の総質量の差を埋め合わせることができ、この場合、そのレポーター部分の固有総質量は、その標識された分析物の源となったサンプルと相関し、ならびにそのレポーター／リンカーの組み合わせの総合総質量は、その源となったサンプルに関係なくサンプル混合物のそれぞれの標識された分析物について同じである。このようにして、２つ以上の異なるサンプル中の同一の分析物の総質量は、標識付けされ、その後、サンプル混合物を形成するために混合されても同じ総質量を有することができる。
【００８４】
例えば、標識された分析物、または分析物に標識付けするためのセットおよび／もしくはキットの標識試薬は、異性体および／または同重体であり得る。従って、（サンプル混合物から取った）特定の質量対電荷比のイオンが、そのサンプル混合物の最初の質量分析から質量分析計において選択される（すなわち、選択イオンである）場合、それらの選択イオンにおいてそのサンプル混合物を構成する種々のサンプルからの同一分析物を、そのサンプル混合物中のそれらそれぞれの濃度および／または分量に比例して表すことができる。従って、リンカーは、分析物にレポーターを連結させるばかりでなく、固有レポーター部分の異なる質量を埋め合わせて、それによって様々なサンプルの標識された分析物中のレポーター／リンカー部分の総質量を一致させることにも役立つことができる（図２ａ／２ｂおよび３ａ／３ｂ参照）。
【００８５】
リンカーは、標識試薬におけるレポーター部分のための質量バランスとしての役割を果すことができるため、そのリンカーにおける原子数が多いほど、セットおよび／またはキットの異なる異性体／同重体標識試薬の可能な数が多くなる。別の言い方をすると、リンカーが含む原子の数が多いほど、存在することができるレポーター／リンカーの組み合わせは多い。これは、リンカーのほぼいずれの位置ででも同位体を置換して、それによってそのリンカー部分の異性体および／または同重体を生じさせることができるからであり、この場合、そのリンカー部分を用いて、そのレポーター部分の異なる質量を相殺し、それによって固有の異性体および／または同重体標識試薬のセットを作る。標識試薬のこのような多様なセットは、同じおよび／または異なるサンプル中の分析物の多重分析に特によく適する。
【００８６】
セットおよび／またはキットの標識試薬の合計数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上であり得る。セットまたはキットの標識試薬の多様性は、レポータおよびリンカー部分の原子数、軽い同位体を置換するために利用できる重原子同位体、および同位体を合成的に配置することができる様々な合成立体配置によってのみ制限される。しかし、上で提案したように、非常に多数の同位体濃縮基本出発原料が、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＩｓｏｔｅｃなどの製造業者から容易に入手できる。そのような同位体濃縮基本出発原料は、同重体および異性体標識試薬のセットを製造するために利用する合成プロセスにおいて使用することができ、または同重体および異性体標識試薬のセットを製造するために利用する合成プロセスにおいて使用することができる同位体濃縮出発原料を製造するために使用することができる。この主題は、下の標題：「標識試薬の製造のための実例となる方法」のもとでさらに詳細に論じる。
【００８７】
標識試薬セットでの使用に適する同重体標識試薬の作製の一部の例を下でさらに詳細に論じる。例えば、リンカー部分は、下記式Ｉ＃：
【００８８】
【化４１】
0005564182.tif 000010
によって表すことができ、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｋ、Ｌ、Ｒ１およびＲ２によって表される原子または基は、下でさらに詳細に説明する。
【００８９】
レポーター／リンカーの組み合わせ（すなわち、レポーター／リンカー部分）：
標識試薬は、互いに直接連結しているレポーター部分とリンカー部分を含むことがある。上で説明したように、レポーター／リンカー部分は、標識試薬のセットおよび／またはキットのそれぞれのメンバーについて総質量が同一であり得る。さらに、レポーター部分をリンカー部分に連結させる結合は、解離エネルギーレベルに付されたとき、選択イオンの少なくとも一部ではフラグメント化され、その結果、リンカー部分および／またはリンカー／分析物部分からレポーターイオンを放出するように設計することができる。従って、（質量分析計において質量対電荷（すなわち、ｍ／ｚ）比として観察される）レポーターイオンの総質量およびその強度をＭＳ／ＭＳ分析において直接観察することができる。
【００９０】
レポーター／リンカー部分は、セットまたはキットの様々な標識試薬の中の同じまたは異なる重原子同位体の様々な組み合わせを含むことがある。科学文献では、これは、時として、「コーディング」、「同位体コーディング」または単に「コード化」と呼ばれている。例えば、Ａｂｅｒｓｏｌｄらは、同位体コード化アフィニティータグを開示している（ＩＣＡＴ；ＷＯ  ００／１１２０８参照）。１つの態様において、Ａｂｅｒｓｏｌｄらの試薬は、Ａｂｅｒｓｏｌｄが２つ以上の同じ質量標識試薬、例えば異性体および／または同重体標識試薬、を教示していない点で、本発明の標識試薬とは異なる。むしろ、Ａｂｅｒｓｏｌｄらは、彼らの試薬の「軽い」および「重い」バージョンについて教示している。
【００９１】
一部の実施形態において、レポーターおよび／またはリンカー部分は、標識試薬または標識された分析物を支持体に固定するために使用することができる原子または基を含むことがある。固定化は、直接的である場合もあり、または間接的である場合もある。例えば、直接的固定化は、一部の実施形態では、レポーターおよび／またはリンカーに関連する原子または基（例えば、レポーターおよび／またはリンカーのアルキルアミン置換基）が、固定化をもたらすように支持体の反応性基（例えば、切断可能なリンカー）と直接相互作用し得る場合、発生する。比較すると、間接的固定化は、例えば、レポーターおよび／またはリンカーの置換基（例えば、レポーターおよび／またはリンカーのアルキルアミン置換基）が修飾され（例えば、ビオチン化され）、その修飾基が、固定化をもたらすように支持体の反応性基（例えば、アビジンまたはストレプタビジン）と相互作用する場合、発生する。従って、本発明では、分析物を支持体に結合した標識試薬と反応させることができる実施形態（この場合、異なるサンプルを異なる支持体と反応させるために、それぞれの支持体が固有の標識試薬を含む）、ならびにそれぞれの異なるサンプルを異なる標識試薬と反応させ、その後、それらの反応生成物を同じまたは異なる支持体に固定する実施形態が考えられる。いずれの場合も、サンプル混合物は、一般に、質量分析法による分析のために支持体（単数または複数）から標識された分析物を切断することによって得られる（図５参照）。
【００９２】
質量分析計／質量分析法（ＭＳ）：
本発明の方法は、タンデム質量分析計、および分子イオンを選択し、およびフラグメント化する能力を有する他の質量分析計を使用して実施することができる。タンデム質量分析計（および、より低い程度の、単段型質量分析計）は、分子イオンをそれらの質量対電荷（ｍ／ｚ）比に従って選択およびフラグメント化し、その後、得られたフラグメント（娘）イオンスペクトルを記録するする能力を有する。さらに具体的には、娘フラグメントイオンスペクトルは、選択されたイオンを解離エネルギーレベル（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ））に付すことによって生成することができる。例えば、特定のｍ／ｚ比の標識付ペプチドに対応するイオンを第一質量分析から選択し、フラグメント化し、第二質量分析において再分析することができる。このようなタンデム質量分析を行うことができる代表的計器としては、磁気４セクター、タンデム飛行時間型、トリプル四極子、イオントラップ型、およびハイブリッド四極子飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ）質量分析計が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
質量分析計のこれらのタイプは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）をはじめとする（しかし、これらに限定されない）様々なイオン化源と併用することができる。分析物がまだ固定電荷を有さない第一質量分析のために、イオン化源を用いて荷電種を生成することができる。追加の質量分析計器およびフラグメント化法としては、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ計器におけるポストソース分解、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（飛行時間型）−ＴＯＦ  ＭＳを用いる高エネルギーＣＩＤが挙げられる。タンデム質量分析計の最近の論評については、Ｒ．Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  ａｎｄ  Ｄ．Ｇｏｏｄｌｅｔｔ，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０１：２６９−２９５（２００１）を参照されたい。
【００９４】
解離エネルギーレベルによるフラグメント化：
質量分析計において行われるプロセスの結果として結合がフラグメント化し得ることは、十分に認められている。さらに、結合のフラグメント化は、質量分析計においてイオンを解離エネルギーレベルに付すことによって誘導することができる。例えば、前記解離エネルギーレベルは、質量分析計において衝突誘起解離（ＣＩＤ；時として、衝突活性化解離またはＣＡＤとも呼ばれる）によって生じさせることができる。フラグメントを生じさせる解離エネルギーレベルを付与するための他の例示的技法として、光解離、電子捕獲解離（ＥＣＤ）、電子移動解離（ＥＴＤ；米国特許出願公開第２００５−１９９８０４号Ａ１およびＳｙｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１０１（２６）：９５２８−９５３３（２００４）参照）、および表面誘起解離（ＳＩＤ）が挙げられる（しかし、これらに限定されない）ことは、質量分析技術分野の通常の技術者には理解されよう。本明細書を解釈するために、解離エネルギーレベルは、質量分析計においてフラグメント化を生じさせる任意のタイプの気相化学反応を含むと考えることもできる。
【００９５】
衝突誘起解離により結合をフラグメント化するプロセスは、不活性ガスとの衝突によって選択イオンの運動エネルギー状態を結合のフラグメント化が発生する点まで上昇させることを含む。例えば、衝突セル内での不活性ガス（例えば、窒素、ヘリウムまたはアルゴン）との衝突によって、運動エネルギーを移動させることができる。イオンに移動させることができる運動エネルギーの量は、衝突セルに入ることができる気体分子数に比例する。存在するガス分子が多いほど、選択イオンに移動させることができる運動エネルギーの量は多く、存在する気体分子が少ないほど、移動する運動エネルギーは少ない。
【００９６】
従って、質量分析計内の解離エネルギーレベルを制御できることは明らかである。一定の結合が他の結合より不安定であることも十分に認められている。分析物またはレポーター／リンカー部分における結合の不安定性は、その分析物またはレポーター／リンカー部分の性質に依存する。従って、分析物および／または標識（例えば、レポーター／リンカーの組み合わせ）を決定可能な方法でフラグメント化することができるように、解離エネルギーレベルを調整することができる。質量分析計の要素に対してそのような日常的調整を行って、それによって適切な解離エネルギーレベルを達成して、その結果、標識された分析物のイオンの少なくとも一部をイオン化レポーター部分および娘フラグメントイオンへとフラグメント化する方法は、当業者に理解されるであろう。
【００９７】
例えば、第一質量分析から選択／単離されるイオンに解離エネルギーを印加することができる。タンデム質量分析計では、抽出されたイオンを解離エネルギーレベルに付し、その後、第二質量分析計に移すことができる。選択されたイオンは、選択された質量対電荷比を有することができる。その質量対電荷比は、質量分析計の特徴に依存する一定範囲内の質量対電荷比であり得る。衝突誘起解離を用いるとき、イオンは、それらを衝突セル（ここで解離エネルギーを印加して、それによってフラグメントイオンを生じさせることができる）に通すことによって、第一質量分析装置から第二質量分析装置に移すことができる。例えば、分析のために第二質量分析装置に送られるイオンは、残留（未フラグメント化）選択イオンの若干量または一部、ならびに標識された分析物のレポーターイオン（シグネチャーイオン）および娘フラグメントイオンを含むことができる。
【００９８】
コンピュータ支援データベース解析による分析物の決定：
一部の実施形態において、分析物は、既知または「理論的」分析物のスペクトルとのコンピュータ支援比較によって分析される娘イオンフラグメント化パターンに基づいて決定することができる。例えば、低エネルギーＣＩＤ条件下でフラグメント化されたペプチドイオンの娘フラグメントイオンスペクトルを、多数の別個のフラグメント化事象の合計と考えることができる。一般的な命名法は、破断するアミド結合による娘フラグメントイオンと、結合分断後に電荷を保持しているペプチドフラグメントとを区別している（Ｒｅｏｐｓｔｏｒｆｆら，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１１：６０１（１９８８））。分断しやすいアミド結合のＮ末端側での電荷保持は、結果として、ｂ型イオンの形成をもたらす。電荷が、破断したアミド結合のＣ末端側に残る場合、そのフラグメントイオンは、ｙ型イオンと呼ばれる。ｂおよびｙ型イオンに加えて、ＣＩＤ質量スペクトルは、他の診断フラグメントイオン（娘フラグメントイオン）を含有することがある。これらとしては、グルタミン、リシンおよびアルギニンからのアンモニアのニュートラルロス（−１７ａｍｕ）、またはセリンおよびトレオニンなどのヒドロキシル含有アミノ酸からの水の喪失（−１８ａｍｕ）によって生じるイオンが挙げられる。一定のアミノ酸は、低いエネルギーＣＩＤ条件下で他のものより容易にフラグメント化することが観察された。これは、プロリンまたはアスパラギン酸残基を含有するペプチドについて特に明らかであり、アスパルチル−プロリン結合ではよりいっそう明らかである（Ｍａｋ，Ｍ．ら，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１２：８３７−８４２（１９９８））。従って、Ｚ’’’−ｐｒｏ二量体またはＺ’’’−ａｓｐ二量体（この場合、Ｚ’’’は、任意の中性アミノ酸であり、ｐｒｏは、プロリンであり、およびａｓｐは、アスパラギン酸である）のペプチド結合は、他のすべてのアミノ酸二量体の組み合わせ間のペプチド結合と比較して、より不安定である傾向がある。
【００９９】
従って、ペプチドおよびタンパク質サンプルについて、低エネルギーＣＩＤスペクトルは、オーバーラップするｂ系およびｙ系イオン、同じペプチドからの内部フラグメントイオン、ならびにイモニウムおよび他のニュートラルロスイオンに関する重複した配列特異的情報を含む。そのようなＣＩＤスペクトルを解釈して、親ペプチドのアミノ酸配列を新たに組み立てることは、難しく、時間がかかるが、行うことはできる。コンピューター支援による新規配列決定方法に関する最近の進歩は、Ｈｕａｎｇ，Ｙ．，Ｒｏｓｓ，Ｐ．，Ｓｍｉｒｎｏｖ，Ｉ，Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．ａｎｄ  Ｐａｐｐｉｎ，Ｄ．２００３，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ６ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  ＭＳ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｕｇ  ２４−２８，２００３，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＣＡに記載されている。ペプチド配列の同定に関する最も有意な進歩は、タンパク質およびＤＮＡ配列データベース中に既に存在するペプチド配列とペプチドＣＩＤスペクトルを相関させるコンピューターアルゴリズムの開発であった。そのようなアプローチは、ＳＥＱＵＥＳＴ（Ｅｎｇ，Ｊ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，５：９７６−９８９（１９９４））およびＭＡＳＣＯＴ（Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｄ．ら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２０：３５５１−３５６７（１９９９））などのプログラムによって例示される。
【０１００】
簡単に言うと、実験的ペプチドＣＩＤスペクトル（ＭＳ／ＭＳスペクトル）を、タンパク質またはゲノム配列データベースから得たペプチド配列からコンピューターによって生成した「理論」娘フラグメントイオンスペクトルと、マッチングまたは相関させる。このマッチングまたは相関は、ＭＳ／ＭＳモードでの娘フラグメントイオンの予想質量と観察質量との類似性に基づく。可能性のあるマッチングまたは相関を、どれほどよく実験フラグメントパターンと「理論」フラグメントパターンが一致するかによって評点付けする。所与のペプチドアミノ酸配列についてのデータベース検索に対する制約は、非常に差別的であるので、全ゲノムまたは発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースにおける任意の所与のタンパク質を同定するために単一のペプチドＣＩＤスペクトルで十分であり得る。他の総説については、Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：５−８（２０００）およびＹａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９：８９３−９００（１９９８）を参照されたい。
【０１０１】
従って、ＭＳ／ＭＳスペクトルの娘フラグメントイオン分析は、標識された分析物の分析物を決定するために用いることができるばかりでなく、決定された分析物の源となった分析物を決定するために用いることもできる。例えば、ＭＳ／ＭＳ分析におけるペプチドの同定は、タンパク質の酵素的消化の結果としてペプチドが切断されたタンパク質を決定するために用いることができる。こうした分析は、他の分析物、例えば核酸、脂質および／またはステロイド、に適用できると考えられる。
【０１０２】
ＲＬ結合およびＬＡ結合：
レポーター部分の原子とリンカー部分の原子との結合がＲＬ結合である。リンカー部分の原子と分析物の原子との結合がＬＡ結合である。一部の実施形態において、ＲＬ結合およびＬＡ結合は、解離エネルギーレベルに付されたとき、選択イオンの少なくとも一部においてフラグメント化し得る。従って、一部の実施形態では、標識された分析物の選択イオンの少なくとも一部においてＲＬ結合とＬＡ結合の両方がフラグメント化するように、質量分析計における解離エネルギーレベルを調整することができる。
【０１０３】
ＲＬ結合のフラグメント化は、分析物からレポーター部分を放出させるので、レポーターイオンを分析物から独立して決定することができる。ＬＡ結合のフラグメント化は、ＲＬ結合が既にフラグメント化しているか否かに依存して、分析物からレポーター／リンカー部分を、または分析物からリンカーを放出させる。一部の実施形態において、ＲＬ結合は、ＬＡ結合より不安定であり得る。一部の実施形態において、ＬＡ結合は、ＲＬ結合より不安定であり得る。一部の実施形態において、ＲＬおよびＬＡ結合は、同じ相対不安定性のものであり得る。簡単に述べると、ＲＬ結合は、フラグメント化し、それによってレポーターイオンを放出するように設計されるが、ＬＡ結合は、本発明の様々な実施形態においてフラグメント化することもあり、またはしないこともある。
【０１０４】
一部の実施形態において、関心のある分析物がタンパク質またはペプチドであるとき、アミド（ペプチド）結合に関してＲＬ結合とＬＡ結合の相対不安定性を調整することができる。ＲＬ結合、ＬＡ結合またはＲＬとＬＡ両方の結合は、代表的なアミド（ペプチド）結合と比較して、より不安定である場合もあり、同等である場合もあり、またはさほど不安定でない場合もある。例えば、解離エネルギーの条件下、ＲＬ結合および／またはＬＡ結合は、Ｚ’’’−ｐｒｏ二量体またはＺ’’’−ａｓｐ二量体（この場合、Ｚ’’’は、任意の天然アミノ酸であり、ｐｒｏは、プロリンであり、およびａｓｐは、アスパラギン酸である）のペプチド結合と比較して、さほどフラグメント化しやすくないことがある。一部の実施形態において、ＲＬ結合およびＬＡ結合は、代表的なアミド結合とほぼ同じ解離エネルギーレベルでフラグメントし得る。一部の実施形態において、ＲＬおよびＬＡ結合は、代表的なアミド結合と比較して、より大きな解離エネルギーレベルでフラグメント化し得る。
【０１０５】
一部の実施形態において、ＲＬ結合およびＬＡ結合は、ＲＬ結合のフラグメント化が結果としてＬＡ結合のフラグメント化を生じさせるように、およびＬＡ結合のフラグメント化が結果としてＲＬ結合のフラグメント化を生じさせるように存在し得る。このように、ＲＬおよびＬＡ両方の結合は、本質的に同時にフラグメント化し得るので、部分的な標識を含む分析物またはその娘フラグメントイオンの実質的な量がない。「分析物の実質的な量」とは、部分的に標識された分析物の２５％未満、および好ましくは１０％未満を質量分析計において（例えば、ＭＳ／ＭＳ分析において）決定できることを意味する。
【０１０６】
一部の実施形態において、（例えば、ＭＳ／ＭＳ分析において）質量スペクトルには分析物の標識付フラグメントと無標識フラグメントとの間に明瞭な境界があるため、この特徴は、娘フラグメントイオンスペクトルのコンピュータ支援解析からの分析物の同定を単純化することができる。なざならば、分析物の娘フラグメントイオンを分析するために用いられる質量計算に標識の残余の補正を適用する必要がないからである。さらに、分析物のフラグメントイオンは、一部の実施形態において、完全に標識付けされているか、（部分的に標識付けされているのではなく）標識付けされていないかのいずれかであり得るため、解離エネルギーレベルの印加によって引き起こされる標識された分析物のフラグメント化の結果として生じる部分的に標識された分析物の不安定な単結合のそれぞれの側に同位体が存在する場合のように、破断結合全体にわたる同位体分布によって生じる娘フラグメントイオンの質量のばらつきが、ほとんどまたはまったくないことがある。
【０１０７】
分析物の標識付け：
前に論じたように、分析物は、その分析物の官能基を標識試薬の反応性基と反応させることによって標識付けすることができる。分析物上の官能基は、求電子基のものである場合もあり、または求核基のものである場合もあり、ならびに標識試薬の官能基は、求電子基または求核基以外である場合もある。その求電子と求核が反応して、分析物と標識試薬の間に共有結合を形成することができる。
【０１０８】
標識反応は、溶液中で行うことができる。一部の実施形態において、分析物または標識試薬の一方は、支持体に結合していることがある。標識反応は、時として、水性条件で行うことができる。生体分子、例えばタンパク質、ペプチドおよび／または核酸、の標識付けには、水性条件を選択することができる。標識反応は、時として、有機溶媒または有機溶媒の混合物中で行うことができる。小分子である分析物には、有機溶媒を選択することができる。水と有機溶媒（単数または複数）の混合物は、広範にわたって使用することができる。例えば、分析物に標識付けするために、水と約５パーセントから約９５パーセントの有機溶媒（単数または複数）（ｖ／ｖ）の溶液を調製し、使用することができる。一部の実施形態において、分析物に標識付けするために、水と約５０パーセントから約９５パーセントの有機溶媒（単数または複数）（ｖ／ｖ）の溶液を調製し、使用することができる。一部の実施形態において、分析物に標識付けするために、水と約６５パーセントから約８０パーセントの有機溶媒（単数または複数）（ｖ／ｖ）の溶液を調製し、使用することができる。有機溶媒の非限定的な例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、Ｎ−メチルピロリジン（ＮＭＰ）、ならびにアルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノールおよび／またはブタノールが挙げられる。当業者は、日常的な実験と併用して、当該技術分野において入手できる知識および本明細書において提供する開示を用いるだけで、標識試薬の性質および分析物の性質に依存して分析物の標識付けを容易とする適切な溶媒条件を決定することができるであろう。
【０１０９】
標識反応を行うとき、ｐＨを調節することができる。ｐＨは、４〜１０の範囲内であり得る。この範囲外のｐＨであってもよい。一般に、非水性反応の塩基性は、非求核有機塩基の添加によって調節することができる。適する塩基の非限定的な例としては、Ｎ−メチルモルホリン、トリエチルアミンおよびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンが挙げられる。あるいは、生物学的緩衝液、例えば（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）もしくは４−モルホリンエタン−スルホン酸（ＭＥＳ）、または無機緩衝液、例えば炭酸ナトリウムおよび／もしくは重炭酸ナトリウムを使用して、水含有溶媒のｐＨを調節することができる。反応性基の少なくとも１つは、求電子性であり得るため、求核基を一切含有しない緩衝液を選択することが望ましいことがある。当業者は、通常の実験を適用して、標識試薬での分析物の標識を容易にするための標識反応のｐＨ調節に使用することができる他の緩衝液を特定することができる。従って、当業者は、日常的な実験と併用して、本明細書において提供する開示を用いるだけで、標識試薬の性質および分析物の性質に依存して、分析物の標識を容易にするために適切な溶媒およびｐＨ条件を決定することができるであろう。
【０１１０】
サンプルの加工：
本発明の一定の実施形態において、サンプルは、分析物（単数または複数）に標識付けする前ならびにした後に加工することができる。加工によって分析物（単数または複数）の標識付けを容易にすることができる。加工によって、サンプル成分の分析を容易にすることができる。加工によって、サンプルの取り扱いを簡素化することができる。加工によって、前述の２つ以上を容易にすることができる。
【０１１１】
例えば、サンプルは、酵素または化学物質で処理することができる。前記酵素は、プロテアーゼ（タンパク質およびペプチドを分解するため）、ヌクレアーゼ（核酸を分解するため）または何らかの他の酵素であり得る。大いに予測できる分解パターンを有する酵素を選択することができる。サンプル成分を分解するために、２つ以上のプロテアーゼおよび／または２つ以上のヌクレアーゼ酵素を一緒に使用してもよいし、または他の酵素と共に使用してもよい。
【０１１２】
例えば、タンパク質分解酵素トリプシンは、リシンまたはアルギニンと不特定のアミノ酸の間のペプチド結合を切断して、それによって、アミン末端（Ｎ−末端）とリシンまたはアルギニンカルボキシル末端アミノ酸（Ｃ−末端）とを含むペプチドを生じさせる、セリンプロテアーゼである。このように、タンパク質の切断からのペプチドは予測可能であり、ならびにトリプシン消化からのサンプル中のそれらの存在および／または分量は、それらの源となったタンパク質の存在および／または分量を示すことができる。さらに、ペプチドの遊離アミン末端は、その標識付けを容易にする良好な求核因子であり得る。他の例示的タンパク質分解酵素としては、パパイン、ペプシン、ＡｒｇＣ、ＬｙｓＣ、Ｖ８プロテアーゼ、ＡｓｐＮ、プロナーゼ、キモトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＡ、Ｂ、Ｃなど）が挙げられる。
【０１１３】
例えば、タンパク質（例えば、タンパク質ｇ）は、トリプシンなどのプロテアーゼで消化されたとき、３つのペプチド（例えば、ペプチドＢ、ＣおよびＤ）を生成し得る。従って、トリプシンなどのタンパク質分解酵素で消化されたサンプルであって、分析した際、ペプチドＢ、ＣおよびＤを含有することが確認されるサンプルは、元々タンパク質ｇを含んでいたと言うことができる。ペプチドＢ、ＣおよびＤの分量は、消化されたサンプル中のタンパク質ｇの分量とも相関するであろう。このように、サンプル（またはその画分）中のペプチドＢ、ＣおよびＤのうちの１つ以上の正体および／または分量の任意の決定を用いて、原サンプル（またはその画分）中のタンパク質ｇを同定および／または定量することができる。
【０１１４】
一定の酵素の活性は予測可能であるため、配列がわかっているタンパク質の分解から生成されるペプチドの配列は、予測することができる。この情報を用いて、「理論」ペプチド情報を生成することができる。従って、実際のサンプルの質量分析法分析からの娘フラグメントイオン（上で説明したとおり）についてのコンピュータ支援解析における「理論」ペプチドフラグメントの決定を用いて、１つ以上の未知サンプル中の１つ以上のペプチドまたはタンパク質を決定することができる（例えば、上の「コンピュータ支援データベース解析による分析物の決定」と題するセクションを参照のこと）。
【０１１５】
一部の実施形態において、サンプル加工は、標識付けすべき分析物（単数または複数）の前駆体の処理を含む場合がある。例えば、標識付けすべき分析物（単数または複数）が、消化されたタンパク質に由来するペプチドであり、この例についての標識試薬が、ペプチドまたはペプチド分析物のアミン基（例えば、リシンのＮ−α−アミン基およびＮ−ε−アミン基）と反応するように選択される場合、標識反応を容易にする様式でそのサンプルのタンパク質（分析物前駆体分子）を加工することができる。この例では、タンパク質を還元剤（例えば、トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ））で還元し、その後、チオール基をブロッキング試薬（例えば、メタンチオスルホン酸メチル（ＭＭＴＳ））との反応によってブロックすることができる。このようにして、タンパク質のチオール基はブロックされ、それ故、分析物のアミンと標識試薬との標識反応に干渉しない。
【０１１６】
容易に入手できる試薬、および日常の実験を活用して適応させることができるプロトコルを用いて、一定の他の前駆体分子の処理を行うことができることは、当業者には理解されるであろう。試薬および条件の正しい選択は、標識付けすべき分析物および標識試薬の性質に依存して選択することができる。
【０１１７】
一部の実施形態において、サンプル加工は、標識試薬で標識付けされていようと、いまいと、固体支持体への分析物または分析物前駆体の固定化を含むことがある。固定化としては、共有結合的固定化ならびに吸着および他の非共有結合的固定化手段（例えば、静電的固定化）を挙げることができる。一部の実施形態において、固定化は、サンプルの複雑さの減少を容易にすることができる。一部の実施形態において、固定化は、分析物の標識付けを容易にすることができる。一部の実施形態において、固定化は、分析物前駆体の標識付けを容易にすることができる。一部の実施形態において、固定化は、一定の特性を含むサンプル成分（例えば、それらはシステイン部分を含むまたは、またはそれらにはシステイン部分がない）の画分の選択的標識付けを容易にすることができる。一部の実施形態において、固定化は、精製を容易にすることができる。固定化は、前述の２つ以上を容易にすることができる。
【０１１８】
サンプル混合物の分離を含む分離：
一部の実施形態において、標識された分析物のサンプルまたはサンプル混合物の加工は、分離を含むことがある。標識付もしくは無標識分析物、標識付もしくは無標識分析物前駆体、またはそれらの画分に対して、１以上の分離を行うことができる。固相捕捉から得られた１つ以上の画分、または分離プロセスの他の産物に対して１以上の分離を行うことができる。前述の２つ以上に対して分離を行うことができる。
【０１１９】
例えば、異なるサンプルからの差別的に標識された分析物を含むサンプル混合物を作製することができる。差別的に標識されたとは、他とは異なるそれぞれの標識が、同定できる固有の特性を含む（例えば、それぞれの標識が、ＭＳ／ＭＳ分析において固有の「シグネチャーイオン」を生じさせる固有のレポーター部分を含む）ことを意味する。サンプル混合物を分析するために、サンプル混合物の成分を分離し、そのサンプル混合物の１つの画分のみに対して質量分析を行ってもよい。このようにして、分析の複雑さを実質的に減少させることができる。なぜならば、分離された分析物を質量について個々に分析し、それによって分析プロセスの感度を増すことができるからである。勿論、サンプル混合物の１つ以上の追加の画分に対して分析を１回以上繰り返して、それによってそのサンプル混合物のすべての画分の分析を可能にすることもできる。
【０１２０】
差別的に標識付けされている同一の分析物が、そのサンプル混合物中のそれらの存在度に比例した濃度で、または分量で、共溶離する分離条件を用いて、サンプル混合物を構成するそれぞれのサンプル中のそれぞれの標識された分析物の量を決定することができる（但し、そのサンプル混合物に添加されたそれぞれのサンプルの量が分かっていることを条件とする）。従って、一部の実施形態において、サンプル混合物の分離は、質量分析（例えば、ＭＳ／ＭＳ分析）において決定されたシグナルとサンプル混合物中の差別的に標識された分析物の量との相関を維持しながら、分析を単純化することができる。
【０１２１】
前記分離は、クロマトグラフィーによって行うことができる。例えば、液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）を用いて、サンプルの分離および質量分析を行うことができる。さらに、関心のある分析物の分離に適する任意クロマトグラフ分離プロセスを用いることができる。例えば、前記クロマトグラフ分離は、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（すなわち、アニオン交換クロマトグラフィーもしくはカチオン交換クロマトグラフィー）、サイズ排除クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーであり得る。
【０１２２】
前記分離は、電気泳動的に行うことができる。用いることができる電気泳動分離技術の非限定的な例としては、１Ｄ電気泳動分離、２Ｄ電気泳動分離および／または毛管電気泳動分離が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２３】
同重体標識試薬または試薬のセットを使用して、サンプルの分析物に標識付けすることができる。標識試薬のセットの同重体標識は、構造的に区別不能である（およびフラグメント化によって分析物からレポーターが除去されるまでは総質量では区別不能であり得る）ため、同重体標識試薬は、分離工程を行う際に特に有用である。従って、異なる同重体標識で標識された同一組成物のすべての分析物は、厳密に同じ様式でクロマトグラフ（すなわち、共溶離）することができる。それらは構造的に区別不能であるため、分離プロセスからの溶離物は、そのサンプル混合物中の分析物に標識付けした量に比例する量のそれぞれの同重体標識された分析物を含むことができる。さらに、サンプル混合物をどのように作製したかという知識（サンプル混合物を作製するために添加されたサンプルおよび他の任意成分（例えば、較正用標準）の部分）から、そのサンプル混合物中の標識された分析物の量を、その源となったサンプル中のその標識された分析物の量に逆に関連付けることができる。
【０１２４】
標識試薬が異性体のものである場合もある。異性体は、時として、クロマトグラフ分離されることがあるが、差別的に標識されたすべての同一分析物を共溶離する（この場合、すべての標識された分析物の量が、サンプル混合物中のそれらの濃度および／または分量に比例して溶離物中に存在する）ように分離プロセスを動作させることができる場合があり、すなわち条件次第である。
【０１２５】
分析物の相対および絶対定量：
一部の実施形態において、サンプル混合物の差別的に標識された同一分析物の相対定量が可能である。例えば、差別的に標識された同一分析物の相対定量は、質量分析において（例えば、第一質量分析において観察された、選択された標識された分析物についての第二質量分析において）決定されるレポーターイオン（すなわち、シグネチャーイオン）の相対量（例えば、報告されるピークの面積および／または高さ）の比較によってできる。別の言い方をすると、それぞれのレポーターイオンを、サンプル混合物を形成するために使用した特定のサンプルについての情報と相関させることができる場合、質量分析において観察される他のレポーターイオンに対するそのレポーターイオンの相対量は、そのサンプル混合物中のその分析物の相対量である。サンプル混合物を形成するために合わせた成分が分かっている場合、そのサンプル混合物を作製するために使用したそれぞれのサンプル中の分析物の相対量は、選択された質量対電荷の標識された分析物について観察されたレポーターイオンの相対量に基づいて逆算することができる。このプロセスを、第一質量分析において観察された異なる標識された分析物のすべてについて繰り返すことができる。このようにして、サンプル混合物を形成するために使用した異なるサンプルそれぞれの中のそれぞれの反応性分析物の相対量（多くの場合、濃度および／または分量で表される）を決定することができる。
【０１２６】
他の実施形態において、分析物の絶対定量を決定することができる。これらの実施形態については、１つ以上の差別的に標識された分析物（較正用標準（単数または複数））の既知量をサンプル混合物に添加することがある。較正用標準は、サンプル混合物の分析物に標識付けするために使用した標識セットの異性体および／または同重体標識で標識付けされる予想分析物であり得る（但し、較正用標準のレポーター部分が、そのサンプル混合物を形成するために使用したいずれのサンプルと比較しても、固有のものであることを条件とする）。較正用標準（単数または複数）についてのレポーターイオンの相対量を、サンプル混合物の差別的に標識された分析物についてのレポーターイオン（単数または複数）の相対量との関係で決定したら、そのサンプル混合物に添加された較正用標準の量を参照して、そのサンプル混合物中のすべての差別的に標識された分析物の絶対量（多くの場合、濃度および／または分量で表される）を計算することができる。このようにして、（その分析物の源となったサンプル中に較正用標準が存在するため）それぞれの差別的に標識された分析物の絶対量も、そのサンプル混合物を作製した方法に関する知識に基づいて決定することができる。
【０１２７】
上述のことにもかかわらず、レポーターイオン（シグネチャーイオン）の強度に対する補正を、レポーター部分中の任意の天然または人工同位体の存在度について、適宜、行うことができる。レポーター部分のシグネチャーイオンにおける不純物の同位体存在度について補正するための方法は、非常にたくさん存在する。そうした補正の例は、「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｆｏｒ  Ｄｅ−Ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｎｇ  Ａ  Ｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ」と題する、同時係属中で、共同所有の公開された米国特許第７，１０５，８０６号において見出すことができる。基本的には、単一標識試薬の同位体クラスターに関連した上側質量ピークおよび下側質量ピークの強度は、数式および計算を用いる標識試薬のオーバーラッピング同位体クラスターの重畳スペクトルの逆重畳によって決定することができる。どのようにして値を決定するかに関わらず、それぞれのレポーターイオン（すなわち、シグネチャーイオン）の強度を正確に定量することに払われる注意が大きいほど、原サンプル中の分析物の相対および絶対定量は正確になるであろう。
【０１２８】
プロテオーム解析：
本発明の実施形態は、質量分析技術を用いて迅速および反復的にサンプルを多重分析および再分析することができるため、複雑な分析に用いることができる。例えば、サンプル混合物を、１つ以上のサンプル中の１つ以上の分析物の量について分析することができる。サンプル混合物を構成したサンプルについての分析物（単数または複数）の量（多くの場合、濃度および／または分量で表される）を決定することができる。サンプルの加工および質量分析を迅速に行うことができるため、これらの方法を何回もくり返して、サンプル混合物の多数の差別的に標識された分析物の量を、その分析物の源となったサンプル中でのそれらの相対および／または絶対量に関して決定することができる。
【０１２９】
このような迅速な多重分析が有用である１つの用途は、プロテオーム解析の分野における用途である。プロテオミクスは、生物学的プロセスの構造、機能および調節の点からゲノム配列にコードされた情報を説明する実験的アプローチと見ることができる。これは、細胞または組織によって発現される全タンパク質成分の系統的分析によって達成することができる。本発明の方法、混合物、キットおよび／または組成物実施形態と併用される質量分析法は、そうした包括的タンパク質分析のための１つの可能性のあるツールである。
【０１３０】
例えば、９つの同重体標識試薬から成るセットを用いて、例えば特定の刺激因子に対する成長細胞の応答に基づき、タンパク質発現のアップまたはダウンレギュレーションを決定するために、１つ実験で９つの時間点を得ることが可能である。１つ以上の対照を組み込めば、より少ない時間点で実施することも可能である。同じ多重実験に関して二重反復実験または三重反復実験を行うことも可能である。すべての場合、単一の多重実験でタンパク質発現のアップまたはダウンレギュレーションを、場合によっては１つ以上の任意の対照および／またはサンプルリピートに関して、決定することができる。さらに、サンプル混合物の加工を並行して行うため、結果を直接比較できるので、プロトコルまたは実験条件に関するわずかな変化を説明するために補正を適用する必要がない。従って、これらの同重体標識試薬を使用することができる実験解析としては、経時変化研究、バイオマーカー解析、多重プロテオーム解析、ＭｕｄＰＩＴ実験、アフィニティー・プルダウン、翻訳後修飾（ＰＴＭ）の判定および多重対照実験が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３１】
ＩＩ．組成物
一部の実施形態において、本発明は、下記式Ｉ（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表される組成物に関する：
【０１３２】
【化４２】
0005564182.tif 000011
（式中、基Ｙ−Ｊは、任意のレポーター基である）。適するレポーター基の特徴は、本明細書において前に説明した。適するレポーター基の特徴は、米国特許出願公開番号ＵＳ  ２００４−０２１９６８５−Ａ１の特にパラグラフ４１−４７にも記載されている。
【０１３３】
例えば、前記レポーターは、置換されているまたは非置換であることがある、および場合によっては支持体に切断可能に連結されていることがある、５、６または７員複素環を含むことができ、この場合、前記複素環は、基Ｊに共有結合によって連結された少なくとも１個の環窒素原子を含む。基Ｊは、式−ＣＪ’２−によって表される置換または非置換メチレン基であり得、式中、それぞれのＪ’は、他から独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、−Ｒ３、−ＯＲ３、−ＳＲ３、−Ｒ３’ＯＲ３または−Ｒ３’ＳＲ３である。基Ｋは、式−（ＣＫ’２）ｎ−または−（（ＣＫ’２）ｍ−Ｘ３−（ＣＫ’２）ｍ）ｐ−によって表される基であり得、式中、ｎは、２から１０の整数であり、それぞれのｍは、他から独立して、１から５の整数であり、ｐは、１から４の整数であり、およびそれぞれのＫ’は、他から独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、−Ｒ４、−ＯＲ４、−ＳＲ４、−Ｒ４’ＯＲ４または−Ｒ４’ＳＲ４である。基Ｌは、式−（ＣＬ’２）ｑ−または−（（ＣＬ’２）ｍ−Ｘ３−（ＣＬ’２）ｍ）ｐ−によって表される基であり得、式中、ｑは、１から１０の整数であり、それぞれのｍは、他から独立して、１から５の整数であり、ｐは、１から４の整数であり、およびそれぞれのＬ’は、他から独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、−Ｒ５、−ＯＲ５、−ＳＲ５、−Ｒ５’ＯＲ５または−Ｒ５’ＳＲ５である。基Ｒ１およびＲ２に関しては、（１）Ｒ１は、水素、重水素またはＲ６であり、およびＲ２は、水素、重水素またはＲ７であるか；（２）Ｒ１およびＲ２は、一緒に、２個の窒素原子を架橋する環を形成する、式−（ＣＲ’２）ｑ−または−（（ＣＲ’２）ｍ−Ｘ３−（ＣＲ’２）ｍ）ｐ−によって表される基であり、式中、ｑは、１から１０の整数であり、それぞれのｍは、他から独立して、１から５の整数であり、ｐは、１から４の整数であり、およびそれぞれのＲ’は、他から独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、−Ｒ６、−ＯＲ６、−ＳＲ６、−Ｒ６’ＯＲ６または−Ｒ６’ＳＲ６である。原子または基Ｘ１は、＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＨまたは＝ＮＲ７であり、それぞれのＸ２は、他から独立して、＝Ｏまたは＝Ｓであり、およびそれぞれのＸ３は、他から独立して、−Ｏ−または−Ｓ−である。基Ｚは、−ＯＨ、−ＳＨ、−Ｏ−Ｖ＋、−Ｓ−Ｖ＋、反応性基、反応性基の脱離基、または共有結合で連結された分析物であり；この場合、Ｖ＋は、正電荷を有する対イオンである。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６および／またはＲ７のそれぞれは、他から独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはアリールアルキルである。例えば、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６および／またはＲ７のそれぞれは、他から独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルであり得る。Ｒ３’、Ｒ４’、Ｒ５’および／またはＲ６’のそれぞれは、他から独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレンまたはアルキルアリーレンである。例えば、Ｒ３’、Ｒ４’、Ｒ５’および／またはＲ６’のそれぞれは、他から独立して、メチレン、エチレン、プロピレン、シクロプロピレン、ｎ−ブチレン、シクロブチレン、ｎ−ペンチレン、シクロペンチレン、ｎ−ヘキシレンまたはシクロへキシレンであり得る。
【０１３４】
上記組成物は、同位体的に濃縮（すなわち、コード化）されていることがある。上記組成物は、１つ以上の重原子同位体を含むように同位体的に濃縮されていることがある。上記組成物は、２つ以上の重原子同位体を含むように同位体的に濃縮されていることがある。上記組成物は、３つ以上の重原子同位体を含むように同位体的に濃縮されていることがある。上記組成物は、４つ以上の重原子同位体を含むように同位体的に濃縮されていることがある。
【０１３５】
上記５、６または７員複素環は、Ｊが共有結合で連結されていることがある少なくとも１つの窒素原子を含む任意の５、６または７員複素環であり得る。例えば、それは、置換または非置換モルホリン、ピペリジンまたはピペラジンであり得る。可能性のある置換基は、上の「定義」セクションで説明しており、この場合、前記複素環は前記置換基のうちの１つ以上を含むことがある。例えば、置換基は、水素、重水素、メチル、−Ｃ（Ｈ）２Ｄ、−Ｃ（Ｈ）Ｄ２、−ＣＤ３または他のアルキルであり得る。前記置換基は、前記環のヘテロ原子に連結していることがある。例えば、前記複素環は、Ｎ−メチルピペラジンであり得る。前記複素環は、芳香族である場合もあり、または非芳香族である場合もある。
【０１３６】
一部の実施形態において、上記レポーター部分は、支持体に切断可能に連結されている場合がある。様々な支持体が当該技術分野において周知である。例えば、トリチル部分を含む様々な支持体が市販されており、でなければ作製することができる（例えば、塩化トリチル支持体（トリチル−Ｃｌ）または塩化２−クロロトリチル支持体）。図５を参照して、支持体結合標識試薬の実施形態を説明する。図５を参照して、この支持体を分析物で処理して、その結果、標識された分析物を生じさせることができる。図解されているように、その後、その支持体を酸で処理して、分析のためにその標識された分析物を放出させることができる。
【０１３７】
従って、一部の実施形態において、上記５、６または７員複素環は、それを適する支持体に切断可能に連結させることを容易にする原子または基を含む場合がある。例えば、前記基は、アミノ、ヒドロキシルまたはチオール基を含む、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレンまたはアルキルアリーレン基であり得る。前記原子は、ピペラジン環の第二窒素であり得る。例示的ピペラジン化合物およびそれらの製造方法についての論考は、米国特許出願公開番号ＵＳ  ２００４−０２１９６８５  Ａ１において見出すことができる。例えば、前記支持体結合Ｎ−アルキルピペラジン酢酸化合物をジアミンと反応させ、その後、二酸と反応させて、その結果、標識試薬として使用することができる支持体結合化合物を形成することができ、この場合、反応物の性質に基づいて同位体コード化が可能である。
【０１３８】
再び式Ｉを参照して、（支持体に切断可能に連結されていようと、いまいと）基Ｙ−Ｊ−は、レポーター部分を構成し得る。前記レポーター部分は、少なくとも１つの同位体濃縮部位を含むことがある。前記レポーター部分は、少なくとも２つの同位体濃縮部位を含むことがある。前記レポーター部分は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６もしくは１７またはそれ以上の同位体濃縮部位を含むことがある。例えば、図６ａは、２１の同位体濃縮部位を含むＮ−メチルピペラジンレポーターを図示するものである。
【０１３９】
前記レポーター部分は、固定電荷を含有することがあり、または質量分析計においてイオン化可能であることがある。例えば、塩基性基（例えば、アミン基）を含む化合物は、電荷を導入するように容易にプロトン化され、および酸性化合物（例えば、カルボン酸基）は、容易に脱プロトン化されて、それによって電荷を導入する（参照：Ｒｏｔｈ，Ｋｅｎｎｅｔｈら，“Ｃｈａｒｇｅ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１７：２５５−２７４（１９９８））。
【０１４０】
バランス（リンカー）部分は、下記式Ｉ＃によって表される基によって構成される場合があり：
【０１４１】
【化４３】
0005564182.tif 000012
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ１、Ｘ２、ＫおよびＬは、前に定義したとおりである。前記バランス部分は、少なくとも１つの同位体濃縮部位を含むことがある。前記バランス部分は、少なくとも２つの同位体濃縮部位を含むことがある。前記バランス部分は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６もしくは１７またはそれ以上の同位体濃縮部位を含むことがある。例えば、図６ｂは、２８の同位体濃縮部位を含むバランス部分を図示するものであり、この場合、質量の総増分増加は、３１ダルトン以下であり得る。
【０１４２】
一部の実施形態において、本組成物は、下記式ＩＩ（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表すことができ：
【０１４３】
【化４４】
0005564182.tif 000013
式中、Ｗは、６員複素環の少なくとも１つのＭ基を置換する、およびその６員環の窒素に対してオルト、メタまたはパラに位置する、原子または基である。前記基Ｗは、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｒ’’）−、−Ｎ（Ｒ’’’）−、−Ｐ（Ｒ’’）−、−Ｐ（Ｒ’’’）−、−Ｏ−または−Ｓ−である。−Ｎ（Ｒ’’’）−または−Ｐ（Ｒ’’’）−と選択される場合、この基を用いて、その組成物を支持体に切断可能に連結させることができる。残りの基Ｍのそれぞれは、他から独立して、−ＣＭ’２−であり、式中、それぞれのＭ’は、他から独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、−Ｒ８、−ＯＲ８、−ＳＲ８、−Ｒ８’ＯＲ８または−Ｒ８’ＳＲ８である。基Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２およびＺは、前に定義したとおりである。それぞれのＲ’’は、他から独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはアリールアルキルであり得、およびそれぞれのＲ’’’は、Ｈ２Ｎ−Ｒ９’−、Ｈ（Ｒ１０）Ｎ−Ｒ９’−、（Ｒ１０）２Ｎ−Ｒ９’−、ＨＯ−Ｒ９’−、ＨＳ−Ｒ９’−、またはその化合物を支持体に切断可能に連結させる切断可能リンカーであり得る。それぞれのＲ８および／またはＲ１０は、他から独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはアリールアルキルであり得、ならびにＲ９’は、他から独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレンまたはアルキルアリーレンであり得る。
【０１４４】
一部の実施形態において、本組成物は、下記式ＩＩＩ（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表すことができ：
【０１４５】
【化４５】
0005564182.tif 000014
式中、ｓは、１から５の整数であり、およびｔは、１から１０の整数であり得る。基Ｒ１、Ｒ２およびＺは、前に定義したとおりである。原子または基Ｒ１１は、水素、重水素、メチル、−Ｃ（Ｈ）２Ｄ、−Ｃ（Ｈ）Ｄ２、−ＣＤ３、他のアルキルまたは−Ｒ’’’であり得、この場合、Ｒ’’’は、前に定義したとおりである。例えば、この組成物は、図２ａおよび２ｂに図示されているような化合物Ｖ〜ＸＩＩＩのものから選択することができる。
【０１４６】
一部の実施形態において、本組成物は、下記式ＩＶ（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表すことができ：
【０１４７】
【化４６】
0005564182.tif 000015
式中、ｔ、Ｒ１１およびＺは、前に定義したとおりである。例えば、この組成物は、図３ａおよび３ｂに図示されているような化合物ＸＶ〜ＸＸＩＩＩのものから選択することができる。
【０１４８】
述べたように、本組成物は、塩形態および／または水和物形態で存在することがある。その組成物が塩形態として存在するか否かは、一般に、置換基の性質および数、ならびにそれが存在するおよび／または単離された条件に依存するであろう。アミンなどの塩基性基を酸での処理によってプロトン化して、それによってアミンの塩を形成できることは周知である。例えば、ピペラジン含有標識試薬は、モノＴＦＡ塩、モノＨＣｌ塩、ビスＴＦＡ塩またはビスＨＣｌ塩として得ることができる。（例えば、米国特許出願公開番号第ＵＳ  ２００５−０１４８７７１  Ａ１参照）。カルボン酸などの酸性基を塩基での処理によって脱プロトン化して、カルボン酸塩を形成できることも周知である。同典拠。例えば、カルボン酸の−ＯＨまたはチオカルボン酸の−ＳＨを脱プロトン化して、それぞれ、−Ｏ−Ｖ＋および−Ｓ−Ｖ＋を形成することができ、この場合、のＶ＋は、塩基性対イオン（例えば、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋またはＮＨ４＋）である。アミンなどの塩基性基とカルボン酸などの酸性基の両方を含む化合物は、双性イオン形で存在できることも周知である。これらすべてが塩形態と考えられ、ならびに本組成物のこれらの官能基のイオン化状態は、それらが存在する任意の溶液のｐＨに、または単離される場合には、それらが単離された溶液のｐＨに依存するであろう。通常の当業者には、日常的な実験および本明細書において提供する開示を用いるだけで、本明細書に開示する組成物の塩形態の任意の対イオンの電荷状態および性質を操作する方法が分かるであろう。
【０１４９】
組成物が、水和物として存在するか否かも、それが存在するまたは単離された条件に依存するであろう。水和物は、１つ以上の複合した水分子を単に含むものである。本発明は、一切の可能な水和形を考えている。
【０１５０】
前に説明したように、基Ｚは、共有結合で連結された分析物である。前記分析物は、その分析物を標識試薬と反応させることによって作製することができる。前記分析物は、如何なる分析物であってもよい。例えば、基Ｚは、ペプチドまたはタンパク質であり得る。
【０１５１】
基Ｚは、前に説明したように反応性の基であることがある。従って、一部の実施形態において、化合物は、下で説明するような化合物Ｉ’〜ＸＩＩＩ’またはＸＶ’〜ＸＸＩＩＩ’のいずれかから選択される標識試薬であり得る。一部の実施形態において、本組成物は、図２５ａおよび２５ｂに化合物８０’〜８７’として図示されているものなどの標識試薬であり得る。
【０１５２】
基Ｚは、−ＯＨ、−ＳＨ、−Ｏ−Ｖ＋または−Ｓ−Ｖ＋であることもある。前記の基を活性化して、それによって反応性基の脱離基を生じさせることができる。前記活性化基は、通常、活性化カルボン酸基と呼ばれる。例えば、カルボン酸基（ＣＯＯＨ）の−ＯＨ基は、前に説明したように、水溶性カルボジイミドＥＤＣでインサイチューで活性化することができる。
【０１５３】
基Ｚは、活性化カルボン酸またはチオカルボン酸基（例えば、活性エステル）などの反応性基の脱離基であることもある。例えば、前記反応性基の脱離基は、前に開示したような式７〜１９のアルコールまたはチオール脱離基であり得る。前記活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（すなわち、脱離基は化合物７であり、Ｘ’は−Ｏ−である）であり得る。前に説明したように、活性エステルを分析物の求核基、例えばアミノ基、と反応させて、それによって標識された分析物を形成することができる。従って、こうした化合物は、標識試薬である。
【０１５４】
標識試薬は、異性体のものおよび／または同重体のものである場合がある。標識試薬の他の特性は説明した。例えば、標識試薬は、同じサンプル中または２つ以上の異なるサンプル中の１つ以上の分析物の多重分析に有用であり得る。
【０１５５】
標識試薬は、同位体的に濃縮（すなわち、コード化）されていることがある。前記標識試薬は、１つ以上の重原子同位体を含むように同位体的に濃縮されていることがある。前記標識試薬は、２つ以上の重原子同位体を含むように同位体的に濃縮されていることがある。前記標識試薬は、３つ以上の重原子同位体を含むように同位体的に濃縮されていることがある。前記標識試薬は、４つ以上の重原子同位体を含むように同位体的に濃縮されていることがある。前記標識試薬は、５つ以上の重原子同位体を含むように同位体的に濃縮されていることがある。前記標識試薬は、６つ以上の重原子同位体を含むように同位体的に濃縮されていることがある。前記標識試薬は、７つ以上の重原子同位体を含むように同位体的に濃縮されていることがある。前記標識試薬は、８つ以上の重原子同位体を含むように同位体的に濃縮されていることがある。前記標識試薬は、９つ以上の重原子同位体を含むように同位体的に濃縮されていることがある。
【０１５６】
一部の実施形態において、組成物は、標識された較正用標準であることがある。本明細書において説明するように、較正用標準を既知の分量で混合物に添加して、関心のある分析物の絶対定量分析を容易にすることができる。従って、一部の実施形態において、本発明は、異性体および／または同重体標識試薬で標識された分析物、例えば関心のあるペプチド、に関する。従って、前記標識された較正用標準は、本明細書において説明するような標識試薬で標識されたいずれの分析物であってもよい。典型的には、前記標識試薬は、関心のあるサンプル１つ以上に標識付けするために使用される標識試薬と比較して固有のレポーターを含むように、異性体および／または同重体標識試薬のセットから選択される。
【０１５７】
一部の実施形態において、標識された分析物組成物は、下で説明する化合物Ｉ’’〜ＸＩＩＩ’’またはＸＶ’’〜ＸＸＩＩＩ’’のいずれかから選択することができる。一部の実施形態において、組成物は、図２６ａ〜２６ｂに８０’’〜８７’’として図示されているものなどの標識された分析物であり得る。
【０１５８】
一部の実施形態において、前記組成物は、フラグメントイオンである。例えば、一部の実施形態において、前記組成物は、標識された分析物分子のフラグメント化後に質量分析計内に存在するフラグメントイオンであり得る。例えば、前記フラグメントイオンを生じさせる標識された分析物は、図２６ａ〜２６ｂに図示されているような化合物８０’’〜８７’’から選択することができる。従って、前記フラグメントイオンは、分子式：１３Ｃ６Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ４Ｃ２Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ３Ｃ３Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ３Ｃ３Ｈ１３１５ＮＮ＋、１３Ｃ２Ｃ４Ｈ１３１５ＮＮ＋、１３ＣＣ５Ｈ１３１５ＮＮ＋、１３ＣＣ５Ｈ１３Ｎ２＋またはＣ６Ｈ１３Ｎ２＋を有することがある。一部の実施形態において、前記分子式は、１３Ｃ６Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ４Ｃ２Ｈ１３１５Ｎ２＋および１３Ｃ３Ｃ３Ｈ１３１５Ｎ２＋から選択される。
【０１５９】
前記フラグメントイオンは、少なくとも２つの差別的に標識された分析物分子を含むサンプル混合物の画分を質量分析計においてイオン化すること、およびフラグメント化のために、選択されたｍ／ｚ値でその差別的に標識された分析物分子のうちの少なくとも２つを選択することによって生成させることができる。その後、それらの選択された差別的に標識された分析物分子を、解離エネルギーレベルの印加によってフラグメント化することができる（この場合、前記差別的に標識された分析物分子の少なくとも１つは、８０’’、８１’’、８２’’、８３’’、８４’’、８５’’、８６’’および８７’’から成る群より選択される式の化合物である）。
【０１６０】
ＩＩＩ．標識付けおよび分析のための方法
本発明の一部の実施形態に従って、分析物に標識付けし、その後、決定することができる。標識された分析物、分析物それ自体、分析物の１つ以上のフラグメントおよび／または標識のフラグメントを質量分析によって決定することができる。一部の実施形態において、本発明の方法は、同じサンプル中の異なる分析物の分析に、または２つ以上の異なるサンプル中の同じおよび／もしくは異なる分析物の多重分析に用いることができる。前記２つ以上のサンプルを混合してサンプル混合物を作ってもよい。多重分析では、標識試薬を使用して、分析物の源となったのがサンプル混合物のどのサンプルであったのかを決定することができる。サンプル混合物を形成するために合わせた２つ以上のサンプルそれぞれの中の分析物の（異なるサンプル中の同じ分析物に対する）絶対および／または相対量（多くの場合、濃度または分量で表される）を決定することができる。さらに、分析物のフラグメント（例えば、娘フラグメントイオン）の質量分析を用いて、分析物および／またはその分析物の前駆体（例えば、その分析物の前駆体分子が分解された場所）を同定することができる。
【０１６１】
分析に使用されるサンプルは、標識試薬で標識付けすることができる分析物を含むいずれのサンプルであってもよい。例えば、サンプルは、粗製もしくは加工された細胞溶解物、体液、組織抽出物または細胞抽出物であり得る。サンプルは、分離プロセスからの画分である場合もある。他の可能性のあるサンプルタイプは、本明細書中に記載されている。
【０１６２】
サンプル中の分析物は、標識試薬で標識付けすることができるいずれの分析物であってもよい。例えば、分析物は、ペプチドおよび／またはタンパク質であり得る。他の可能性のある分析物の型は、本明細書に開示されている。
【０１６３】
説明したアプローチの１つの特異点は、（同一の総質量を有する）異性体のものおよび／または同重体のものであり、その分析物の源となったサンプルを同定する固有の標識で、異なるサンプルからの分析物を差別的に標識（すなわち、コード化）することができることに存する。それらの差別的に標識された分析物は、すべてが同一の（グロス）質量対電荷比を有するため、質量分析計のＭＳモードでは区別されない。多くの場合、第一質量分析の前にその混合物に適用され得るクロマトグラフィーまたは電気泳動などの分離技術によってもそれらの標識された分析物を区別できないように、セットの標識試薬が選択される。しかし、衝突誘起解離（ＣＩＤ）などによる解離エネルギーレベルに付されたとき、それらの標識はフラグメント化して、質量分析計内で質量（質量対電荷比）ごとに分解され得る固有のレポーターイオンを生じさせることがきる。ＭＳ／ＭＳ質量スペクトルにおいて観察されるそれぞれの固有レポーターイオンの相対量は、サンプル混合物中の標識された分析物の相対量、および暗に、その源となったサンプル中の分析物の相対量と相関させることができる。従って、レポーターイオン（すなわち、シグネチャーイオン）の相対強度は、サンプル混合物を形成するために合わせた２つ以上の異なるサンプル中の分析物（単数または複数）の相対量を決定するために用いることができる。２つ以上のサンプル中の分析物（単数または複数）の絶対量（多くの場合、濃度および／または分量として表される）は、絶対定量が望まれるそれぞれの分析物についての較正用標準が、そのサンプル混合物に既知量で配合されている場合、レポーターイオン情報から導出することができる。
【０１６４】
例えば、分析物は、サンプルを加工するために酵素的消化反応を用いるタンパク質の分解の結果として生じたペプチドであってもよい。タンパク質分解は、１つ以上のタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン、パパイン、ペプシン、ＡｒｇＣ、ＬｙｓＣ、Ｖ８プロテアーゼ、ＡｓｐＮ、プロナーゼ、キモトリプシンまたはカルボキシペプチダーセ）でのサンプルの処理によって遂行することができる。サンプル混合物中のペプチドの正体および量の決定ならびにその源となったサンプルの同定を（場合によっては、そのサンプルからの他のペプチドの決定と併せて）行うことによって、分解されたペプチドのタンパク質前駆体を同定すること、および／またはその源となったサンプルに対して定量することができる。この方法は、１つ以上のサンプル中の（すなわち、サンプル混合物からの）タンパク質（単数または複数）の多重決定に備えるものであるので、多重法である。
【０１６５】
従って、一部の実施形態において、本発明は、それぞれのサンプルが１つ以上の反応性分析物を含む２つ以上のサンプルと、標識試薬セットの異なる標識試薬とを反応させて、それによって、それぞれが１つ以上の標識された分析物を含む２つ以上の差別的に標識されたサンプルを形成することを含む方法に関する。前記標識試薬は、異なる標識試薬それぞれが固有質量のレポーター部分を含む異性体および／または同重体標識試薬のセットから選択することができる。前記レポーター部分は、いずれのレポーター部分であってもよい。例えば、前記レポーター部分は、置換または非置換ピペリジン、ピペラジンまたはモルホリン基を含むことがある。
【０１６６】
例えば、前記セットの異なる標識試薬は、下記式Ｉ’（その塩形態または水和物形態を含む）によって表すことができ：
【０１６７】
【化４７】
0005564182.tif 000016
式中、原子または基Ｙ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ１およびＸ２は、前に定義したとおりであり、ならびに前記セットのそれぞれの異なる標識試薬は、同じ総質量を有するが、それぞれの異なる標識試薬の基Ｙ−Ｊ（この基がレポーター部分を形成する）は、１つ以上の同位体濃縮部位で固有にコード化されており、質量分析計内でその基Ｙ−Ｊの基Ｊとその標識試薬の残部との結合がフラグメント化すると、固有質量のレポーターイオンが生成される。原子または基Ｚ’は、反応性基または反応性基の脱離基であり得る。
【０１６８】
例えば、前記反応性基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル（ＮＨＳＳ）、ペンタフルオロフェニルエステル（Ｐｆｐ）、２−ニトロフェニルエステル、３−ニトロフェニルエステル（３−ＮＰ）、４−ニトロフェニルエステル（４−ＮＰ）、２，４−ジニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル（Ｐｆｐ）、ペンタクロロフェニルエステル（Ｐｃｐ）、３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンエステル（Ｄｈｂｔ）、ヒドロキシピロリジノンエステル（ＮＨＰ）、２，４−ジハロフェニルエステル（参照：図８、および下の標題：「標識試薬の製造のための実例となる方法」のもとでの論考）、２，２，２−トリフルオロエタニルエステルまたは１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパニルエステルであり得る（すなわち、反応性基の脱離基は、化合物７〜１９の１つであり得る）。
【０１６９】
従って、サンプル混合物の標識された分析物は、式ＩＩ’（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表すことができ：
【０１７０】
【化４８】
0005564182.tif 000017
式中、原子または基Ｙ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ１およびＸ２は、前に定義したとおりである。例えば、変数Ｙは、置換または非置換モルホリン、ピペリジンまたはピペラジン基であり得る。基Ｚ’’は、共有結合で連結された分析物であり得る。
【０１７１】
この標識プロセスは、それぞれが１つ以上の標識された分析物を含む２つ以上の差別的に標識されたサンプルを生じさせることができる。そのサンプルに固有である標識試薬でそれぞれのサンプルの分析物に標識付けしたら、その２つ以上の差別的に標識されたサンプルまたはそれらの一部分を混合して、サンプル混合物を作ることができる。そのサンプル混合物は、場合によって１つ以上の較正用標準を含むことがある。
【０１７２】
サンプル混合物を形成するために合わせたそれぞれのサンプルの容量および／または分量を記録することができる。そのサンプル混合物の総サンプル容量および／または分量に対するそれぞれのサンプルの容量および／または分量は、そのサンプル混合物の分析からそれぞれのサンプル中の同定分析物の量（多くの場合、濃度および／または分量で表される）を決定するために用いることができる比を決定するために、用いることができる。従って、前記サンプル混合物は、複合混合物を含むことがあり、この場合、同じおよび／または異なる分析物の相対量を、２つ以上のサンプルそれぞれの中の分析物の量の相対定量によって、または較正用標準がサンプル混合物にも添加される場合には絶対的に同定および／または定量することができる。
【０１７３】
前記混合物は、例えば、第一質量分析計を使用してサンプル混合物またはその画分に対する第一質量分析を行うことができる分光測定法に付してもよい。その後、その第一質量分析から特定の質量対電荷比のイオンを選択することができる。選択されたイオンを解離エネルギーレベル（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ））に付して、それによって選択イオンのフラグメント化を誘導することができる。標識された分析物の選択イオンを解離エネルギーレベルに付すことによって、それら選択イオンの少なくとも一部分における結合ＲＬおよびＬＡ（上の標題：「ＲＬ結合およびＬＡ結合」のもとでの論考を参照のこと）をフラグメント化することができる。結合ＲＬと結合ＬＡの両方のフラグメント化は、レポーター／リンカー部分のフラグメント化を生じさせることができ、ならびに分析物からのイオン化レポーター部分（すなわち、レポーターイオンまたはシグネチャーイオン）の放出を生じさせることができる。解離エネルギーによる選択イオンのフラグメント化は、分析物の娘フラグメントイオンも生成し得る。その後、それらのイオン（残存選択イオン、娘フラグメントイオンおよびイオン化レポーター部分）またはそれらの画分は、第二質量分析に向けることができる。
【０１７４】
第二質量分析計において、前記選択イオンおよびそれらのフラグメントの第二質量分析を行うことができる。第二質量分析は、選択された質量対電荷比で存在するそれぞれの固有レポーターイオンの総質量（またはｍ／ｚ）および相対量、ならびにサンプル混合物の少なくとも１つの標識された分析物の娘フラグメントイオンの一部またはすべての質量（グロスおよび／または絶対）を決定することができる。選択された質量対電荷比で存在するそれぞれの分析物については、それらの娘フラグメントイオンを使用して、その選択された質量対電荷比で存在する分析物（単数および／または複数）を同定することができる。例えば、この分析は、「コンピュータ支援データベース解析による分析物の決定」と題するセクションにおいて前に記載したとおり行うことができる。
【０１７５】
一部の実施形態において、このプロセスの一定の工程を１回以上繰り返すことができる。例えば、一部の実施形態において、以前に選択されたいずれの質量対電荷比とも異なる、第一質量分析からの選択された質量対電荷比のイオンを解離エネルギーレベルで処理して、それによって、前に説明したようにそれらの選択イオンの少なくとも一部のイオン化レポーター部分（すなわち、レポーターイオン）および娘フラグメントイオンを形成することができる。これらの選択イオン、レポーターイオンおよび娘フラグメントイオン、またはそれらの画分の第二質量分析を行ってもよい。第二質量分析においてそれぞれの固有レポーターイオンの総質量および相対量ならびに娘フラグメントイオンの質量（グロスまたは絶対的）も決定することができる。このように、情報は、第一質量分析からの１つ以上のさらなる分析物を同定および／または定量するために利用することができる。
【０１７６】
一部の実施形態において、サンプル混合物が分画された（例えば、クロマトグラフィーまたは電気泳動によって分離された）場合、前記プロセスを１回以上繰り返すことが有用なことがある。例えば、サンプルの１つ以上のさらなる画分に対して前記プロセスを繰り返すことによって、サンプル混合物全体を分析することが可能である。一部の実施形態では、全プロセスが１回以上繰り返えされるであろうと考えられ、これらの繰り返しそれぞれの中で、上で説明したものなどの一定の工程も１回以上繰り返えされることがあると考えられる。このようにして、可能最大限の程度に、サンプル混合物の内容物からデータを得、それらの内容物を決定することができる。２つ以上のサンプルの新たなセットに対して前記全プロセスを繰り返すこともできる。
【０１７７】
第一および第二質量分析をタンデム質量分析計において行うことができることは、質量分析法の技術分野の通常の技術者には理解されるであろう。タンデム質量分析を行うために適する器機は、本明細書において前に説明した。タンデム質量分析計は好ましいが、単段型質量分析計を使用することもできる。例えば、コーン電圧フラグメント化、続いて、その結果として生じたフラグメントについての単段型四極子または飛行時間型質量分析計を使用する質量分析によって、分析物のフラグメント化を誘導することができる。他の例では、レーザー源を使用して分析物を解離エネルギーレベルに付し、結果として生じたフラグメントを、飛行時間型またはタンデム飛行時間型（ＴＯＦ−ＴＯＦ）質量分析計におけるポストソース分解後、記録することができる。
【０１７８】
一部の実施形態において、本発明の方法は、少なくとも１つの酵素でそれぞれのサンプルを消化して、サンプルの成分を部分的または完全に分解し、その後、そのサンプルの分析物の標識を行うことをさらに含むことがある（上の「サンプルの加工」と題するセクションも参照のこと）。例えば、前記酵素は、プロテアーゼ（タンパク質および／もしくはペプチドを分解するため）またはヌクレアーゼ（核酸を分解するため）であり得る。２つ以上の酵素を一緒に使用して、それによってサンプル成分をさらに分解することもできる。例えば、前記酵素は、タンパク質分解酵素、例えば、トリプシン、パパイン、ペプシン、ＡｒｇＣ、ＬｙｓＣ、Ｖ８プロテアーゼ、ＡｓｐＮ、プロナーゼ、キモトリプシンまたはカルボキシペプチターゼ（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃなど）であり得る。
【０１７９】
一部の実施形態において、方法は、第一質量分析を行う前にサンプル混合物を分離することをさらに含むことがある（「サンプル混合物の分離を含む分離」と題するセクションも参照のこと）。この手法では、第一質量分析をサンプル混合物の画分のみに対して行うことができる。分離は、クロマトグラフィーおよび／または電気泳動を含む任意の分離方法によって行うことができる。例えば、液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）を用いて、質量分析前にそうしたサンプル分離を行うことができる。さらに、関心のある分析物の分離に適する任意のクロマトグラフ分離プロセスを用いることができる。適するクロマトグラフおよび電気泳動分離プロセスの非限定的な例は、本明細書中に記載されている。
【０１８０】
一部の実施形態において、前記方法は、消化および分離工程を用いて実施することができる。これらの工程は任意であるが、多くの場合、例えば、プロテオーム解析を行って、それによって細胞内のタンパク質のアップおよびダウンレギュレーションを決定する場合、一緒に行われる。一部の実施形態において、消化および／または分離工程を伴うまたは伴わない前記方法の工程を１回以上繰り返して、それによって、１つのサンプル中の１つ以上の他の分析物または（支持体結合標識試薬で標識されたサンプルを含む）２つ以上のサンプルそれぞれの中の１つ以上の分析物を同定および／または定量することができる。較正用標準がサンプル混合物中に存在するか否かに依存して、個々の分析物の定量は、他の標識された分析物に相対的である場合もあり、または絶対的である場合もある。
【０１８１】
前に説明したように、娘フラグメントイオンの質量（グロスまたは絶対的）の分析によって、選択イオンに関連する分析物を決定することができる。１つのそうした決定方法は、「コンピューター支援データーベース分析による分析物」と題するセクションにおいて説明する。分析物が決定されると、第二質量分析におけるそれぞれの固有レポーターイオンの総質量および相対量ならびに娘フラグメントイオンの質量に関する情報が、そのサンプル混合物についての他の情報を決定するための基礎となる。
【０１８２】
レポーターイオンの相対量は、質量スペクトルにおけるピーク強度によって決定することができる。一部の実施形態において、それぞれの固有レポーターイオンの量は、質量分析計を使用して得られたレポーターイオン（シグネチャーイオン）のピークの高さまたはピーク幅（もしくはピーク面積）を解析することによって決定することができる。それぞれのサンプルを異なる標識試薬で標識付けすることができ、およびそれぞれの標識試薬は、そのサンプル混合物を調合するために使用された特定の差別的に標識されたサンプルと相関させることができる固有レポーターイオンを生じさせる固有レポーター部分を含むことができるため、第二質量分析における異なるレポーターイオンの決定は、選択された分析物のレポーターイオンの源となった差別的に標識されたサンプルを同定するために用いることができる。（例えば、本発明の多重法によって）多数のレポーターイオンが見出される場合、他のレポーターイオンに対するそれぞれの固有レポーターイオンの相対量を決定することができる。第二質量分析において決定されるそれぞれの固有レポーターイオンの相対量を、そのサンプル混合物中の分析物の相対量と相関させることができるため、そのサンプル混合物を形成するために合わせた差別的に標識されたサンプルそれぞれの中の分析物の相対量（多くの場合、濃度および／または分量として表される）を決定することができる。さらに、決定される分析物が、関心のある別の化合物からの副産物である場合（例えば、その分析物が、分解反応の産物である、例えば、その分析物が、タンパク質の消化によって作られたペプチドである場合）、分析物についての定量情報を、差別的に標識された原サンプルの成分に関係付けることができる。
【０１８３】
上で論じたように、異なる質量対電荷比の選択イオンに対してこの分析を１回以上繰り返して、それによって、そのサンプル混合物を形成するために合わせたそれぞれのサンプル中の１つ以上のさらなる分析物の相対量を得ることができる。さらに、前に「分析物の相対および絶対定量」と題するセクションにおいて論じたように、適宜、天然または人工同位体存在度について、それぞれの固有レポーターイオンに関連したピーク強度の補正を行うことができる。
【０１８４】
一部の実施形態において、前記分析物は、サンプルまたはサンプル混合物中のペプチドであり得る。第一質量分析前に１つ以上のサンプル中のタンパク質を分解することができる場合、サンプルまたはサンプル混合物中のペプチドの分析を用いて、そのサンプルまたはサンプル混合物中の同定可能なタンパク質の量（多くの場合、濃度および／または分量として表される）を決定することができる。さらに、決定を行う目的で、例えば、細胞増殖、発達、分化および／または死に影響を及ぼし得る様々な濃度の物質と共にインキュベートされる細胞におけるタンパク質の量に対する影響の比較のために、異なるサンプルからの情報を比較してもよい。他の非限定的な例としては、疾病および健常組織または細胞培養物の発現タンパク質成分の比較を挙げることができる。これは、感染物質、例えば細菌もしくはウイルス、または他の疾病状態、例えば癌に感染後の細胞、組織または生体液における発現タンパク質レベルの比較を包含し得る。他の例では、タンパク質濃度の経時的変化（経時変化）の研究に着手して、細胞または組織の発現タンパク質成分に対する薬物治療の効果を試験することができる。さらに他の例では、経時的に取った異なるサンプルからの情報を用いて、疾病（例えば、癌）または感染の結果として組織、器官または生体液中の特定のタンパク質の濃度を検出およびモニターすることができる。こうした実験は、１つ以上の対照サンプルを含むことがある。一部の実施形態において、これらの実験は、上で説明した関心のある特徴の２つ以上を決定するために用いることができる。
【０１８５】
一部の実施形態において、分析物は、サンプルまたはサンプル混合物中の核酸フラグメントであり得る。核酸フラグメントに関する情報は、第一質量分析の前にサンプルが分解された、サンプルまたはサンプル混合物中の同定可能な核酸分子の量（多くの場合、濃度および／または分量として表される）を決定するために用いることができる。さらに、科学的関心のある決定を行う目的で、異なるサンプルからの情報を比較してもよい。
【０１８６】
固有レポーター部分を含む較正用標準が、サンプル混合物に既知量（多くの場合、濃度および／または分量として表される）で添加された、選択された質量対電荷比を有する、分析物に連結されている場合、その較正用標準に関連する固有レポーターの量を用いて、そのサンプル混合物を形成するために合わせたサンプルそれぞれの中の分析物の絶対量（多くの場合、濃度および／または分量として表される）を決定することができる。これは、そのサンプル混合物中の較正用標準についての固有のレポーターイオンと会合している分析物の量が分かっており、選択イオンと会合している標識された分析物についてすべての固有レポーターイオンの相対量を決定することができため、可能である。固有レポーター部分（較正用標準についてのレポーター部分を含む）のそれぞれについて決定されたそれぞれの固有レポーターイオンの相対量は、サンプル混合物を形成するために合わせたそれぞれの差別的に標識されたサンプルに関連する分析物の量に比例するので、それぞれのサンプル中の分析物の絶対量（多くの場合、濃度および／または分量として表される）は、そのサンプル混合物を形成するために用いた配合物に関して計算した比に基づいて決定することができる。適宜、それぞれの固有レポーターイオンに関連したピーク強度の補正を、天然または人工同位体存在度について行うことができる。こうした分析法は、特に、複雑な性質の複合サンプルのプロテオーム解析に、とりわけ、第一質量分析の前に標識された分析物の予備的分離（例えば、液体クロマトグラフィーまたは電気泳動分離）を行う場合、有用であり得る。
【０１８７】
例えば、サンプル混合物が、１００ｆｍｏｌ／ｍＬの較正用標準を含み、その較正用標準に関連する固有レポーターイオンの相対強度が１である一方で、第一のサンプルに関連する第一の他の固有レポーターイオンの相対強度が二分の一（１／２または０．５）であり、第二のサンプルに関連する第二の他の固有レポーターイオンの相対強度が２であった場合、（等量のサンプル１とサンプル２を混合してサンプル混合物を作ると仮定して）そのサンプル混合物を形成するために混合した第一の差別的に標識されたサンプル中の分析物の量は、５０ｆｍｏｌ／ｍＬ（０．５×１００ｆｍｏｌ／ｍＬ）であり、そのサンプル混合物を形成するために混合した第二の差別的に標識されたサンプル中の分析物の量は、２００ｆｍｏｌ／ｍＬ（２×１００ｆｍｏｌ／ｍＬ）である。さらに、例えば、分析物が、特定のタンパク質に関連したペプチドである場合、サンプル１中のタンパク質の量は５０ｆｍｏｌ／ｍＬであり、サンプル２中のタンパク質の量は、２００ｆｍｏｌ／ｍＬであると推論することができる。従って、較正用標準の存在によって、サンプル混合物を形成するために混合したそれぞれの差別的に標識されたサンプル中の標識された分析物（および場合によってはそれらの前駆体）の絶対定量が可能となる。
【０１８８】
前に論じたように、異なる質量対電荷比の選択されたイオンに対してこの分析を１回以上繰り返して、それによって、サンプル混合物を形成するために合わせたそれぞれのサンプル中の１つ以上のさらなる分析物の絶対量を得ることができる。さらに、前に論じたように、適宜、それぞれの固有レポーターイオンに関連したピーク強度の補正を天然または人工同位体存在度について行うことができる。
【０１８９】
一部の実施形態において、本明細書に記載する方法は、支持体結合標識付試薬を用いて実施することができる（この場合、そのセットのそれぞれの異なる標識試薬は、支持体に結合しており、その支持体には切断可能なリンカーによって連結されているので、そのセットの異なる標識試薬を担持する支持体とそれぞれの異なるサンプルを反応させることができる）。例示的支持体は、上の「組成物」と題するセクションにおいて論じた（図５、および下の実施例も参照のこと）。この方法によると、分析物を支持体結合標識試薬と反応できるようにした後だがそれらのサンプルを混合する前に、その標識試薬の反応性基と反応しないサンプルの成分を除去するために、その支持体を場合によっては洗浄することがある。分析物を標識試薬と反応できるようにして、それによって標識された分析物を形成し、場合によっては洗浄工程を行ったら、その切断可能なリンカーが切断される条件下でその支持体を処理することによって、その支持体からその（それらの）標識された分析物を放出させることができる。切断したら、それぞれのサンプルが１つ以上の標識された分析物を含む２つ以上の差別的に標識されたサンプルそれぞれを、場合によって回収することができ、この場合、特定のサンプルに関連する標識された分析物を、それらに連結された固有レポーター部分によって同定できおよび／または定量できる。それらを個々に回収しようと、しまいと、切断された生成物を混合してサンプル混合物を作ることができる。
【０１９０】
一部の実施形態において、本明細書に記載する方法は、下記式ＩＩ’（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表すことができる標識試薬を使用して実施することができ：
【０１９１】
【化４９】
0005564182.tif 000018
式中、Ｗ、Ｍ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ１、Ｘ２およびＺ’は、前に説明したとおりである。
【０１９２】
一部の実施形態において、本明細書に記載する方法は、下記式ＩＩＩ’（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表すことができる標識試薬を使用して実施することができ：
【０１９３】
【化５０】
0005564182.tif 000019
式中、ｓ、ｔ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１１およびＺ’は、前に説明したとおりである。
【０１９４】
一部の実施形態において、本方法は、下記式（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表される少なくとも１つの標識試薬を使用して実施することができ：
【０１９５】
【化５１】
0005564182.tif 000020
【０１９６】
【化５２】
0005564182.tif 000021
式中、Ｒ１、Ｒ２およびＺ’は、前に説明したとおりである。記号＊は、適宜、１２Ｃが１３Ｃで置換されている場所、または１４Ｎが１５Ｎで置換されている場所を表す。
【０１９７】
一部の実施形態において、本方法は、下記式ＩＶ’（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表すことができる標識試薬を使用して実施することができ：
【０１９８】
【化５３】
0005564182.tif 000022
式中、ｔ、Ｒ１１およびＺ’は、前に説明したとおりである。
【０１９９】
一部の実施形態において、本方法は、下記式（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表される少なくとも１つの標識試薬を使用して実施することができ：
【０２００】
【化５４】
0005564182.tif 000023
【０２０１】
【化５５】
0005564182.tif 000024
式中、＊およびＺ’は、前に説明したとおりである。
【０２０２】
ＩＶ．プロテオミック・ワークフロー
一部の実施形態において、サンプルの分析物の標識付けは、サンプル加工工程前に行うことができる。一部の実施形態において、分析物の標識付けは、１つ以上のサンプル加工工程後に行うことができる。一部の実施形態において、分析物の標識付けは、とりわけ、サンプル加工工程中に行うことができる。一部の実施形態において、分析物の標識付けは、サンプル加工の最終工程であり、および／またはサンプル混合物の作製の直前である。
【０２０３】
非限定的な例としてプロテオーム解析を使用して、用いることができる少なくとも幾つかの可能なワークフローがある。以下の論考の理解を助けるために、時として、前駆体タンパク質と分析物ペプチドを区別する。しかし、様々な実施形態において、タンパク質および／またはペプチドのいずれかまたは両方を、本明細書に記載する分析物と考えることができることは、理解されるはずである。
【０２０４】
１つのタイプのワークフローにおいて、前駆体タンパク質をペプチド分析物に消化することができ、その後、それに標識付けすることができる。別のタイプのワークフローでは、前駆体タンパク質を標識試薬で標識付けし、その後、それを標識付ペプチド分析物へと消化することができる。別のタイプのワークフローでは、前駆体タンパク質を固体支持体に捕捉し、消化し、その後、その支持体に結合したペプチドに標識付けすることができる。場合によっては、フロースルーペプチドに標識付けすることもできる。もう１つのタイプのワークフローでは、前駆体タンパク質を固体支持体に捕捉し、標識付けし、その後、その支持体に結合したタンパク質を消化して、標識付ペプチドを生成することができる。場合によっては、フロースルーペプチドを分析することもできる。ワークフローに関係なく、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ分析前に、所望される場合には、追加のサンプル加工（例えば、分離工程）をそれらの標識付ペプチドに対して行うことができる。
【０２０５】
Ａ）消化、その後の標識付けを伴う例示的ワークフロー
例えば、図１３を参照して、「対照」サンプルおよび「試験」サンプルを分析することができる。図１３に図解されている例について、その目的が、「対照」および「試験」サンプルタンパク質の（分析物としての）ペプチドの分析である場合、一部の実施形態では、それらのサンプルのタンパク質を場合によっては還元し、場合によってはシステインをブロックし、酵素で消化して、それによって分析物ペプチドを生じさせ、その後の分析のためにそれらに標識付けすることができる。一部の実施形態において、それらの分析物ペプチドは、さらなるサンプル加工なしで標識付けする（タグ付けする）ことができる。どのようにして標識付けするかには関係なく、それぞれの異なるサンプルの分析物を、それぞれが固有質量のレポーター部分を含む異なる標識試薬（例えば、異性体および／または同重体標識のセットの標識試薬）を使用して標識付けすることができる。
【０２０６】
一部の実施形態では、標識付けの前および／または標識付けの後、さらなるサンプル加工が望ましいことがある。例えば、分離工程を行って、関心のない一定のタイプのペプチドを削除し、それによってサンプルの複雑さを減らすことができる。標識付けしたサンプルを混合して、サンプル混合物を得てもよい。一部の実施形態では、標識された分析物ペプチドが、質量スペクトル分析前に分離（例えば、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））または他の分画プロセスに付すことがある。
【０２０７】
別の例示的ワークフローを図１４ａおよび図１５に図解する。図１５は、主として、図１５が、ペプチド捕捉に関係し得るシステインのチオール基の任意のブロックおよび再生工程を図解している点で、図１４ａと異なる。あらゆる疑念を避けるために、図１３、１４ａ、１５および１６〜１８の図解は、２つのサンプルへのワークフローの適用を示しているが、追加のサンプルを加工できることは自明である（但し、それぞれの異なるサンプルまたはサンプル画分をコード化するために追加の差別的標識を利用できることを条件とする）。
【０２０８】
図１４ａは、一部の実施形態において、「対照」サンプルおよび「試験」サンプルを酵素で消化することができ、その後、そのサンプルの成分を切断可能なリンカーによって固相に捕捉することができる方法を図解するものである。例えば、前記支持体は、切断可能なリンカーと、ペプチドの部分と反応する反応性基とを含むことがある（例えば、このような支持体の基本成分の図解については図１４ｂを参照のこと）。システイン含有ペプチドの捕捉に適する支持体の具体的な例を図１４ｃに図示する。システイン含有ペプチドのチオール基は、図示されている支持体のヨードアセテート基と反応させることができる。すべてのペプチドがシステインを含むことは期待できないので、これは、分析すべきサンプルの複雑さを減らすための方法である。なぜならば、システイン部分を伴わないペプチドは、支持体を通って流れ、捕捉されないだろうからである。図１４ａに図解されている加工方法に従って固定すると、それらのペプチドのアミン基に標識試薬で標識付けすることができる（図１４ａ参照）。例えば、「対照」および「試験」サンプルのそれぞれに、１セットの異なる標識、または異性体および／もしくは同重体標識試薬で標識付けすることができる。その後、それらの標識付ペプチド分析物は、支持体から切断する、および／またはさらに加工する（混合物を作ることを含む）、および／または分析することができる（図１４ａ）。
【０２０９】
一部の実施形態では、（支持体の官能基と反応しないため）支持体を通って流れるペプチドを、（廃棄するの代わりに）回収し、異性体および／または同重体標識試薬のセットの標識試薬で標識付けし、支持体から回収した標識付ペプチドとは別にまたは一緒に分析することができる。このタイプのワークフローを図１６および１７に図解する。図１６および１７に図解されているように、固体支持体を通って流れるペプチドには、標識試薬のセットの同じまたは異なる標識試薬で標識付けすることができる。標識試薬に関係なく、場合によってはそれらを、ＭＳ／ＭＳ分析によって分析されるサンプル混合物と混合することができる。それらを独立して分析することもできる。図１６および１７は、支持体上に保持されているペプチドに、支持体上にあるままで標識付けすることができる（図１６）、または支持体から切断された後（図１７）に標識付けすることができる点が異なる。
【０２１０】
図１８を参照して、固体支持体を使用して前駆体タンパク質を捕捉することも可能である。図解されているように、平行経路で２つのサンプルを加工することができる。タンパク質のシステイン部分を捕捉するために適する支持体を図１４ｃに図示する。システイン部分を含まないタンパク質を洗浄で支持体から除去し、場合によっては回収することができる（フロースルー）。場合によっては、それらを消化し、標識付けし、および／またはサンプル混合物と共に分析する、もしくは別々に分析することができる。
【０２１１】
図１８によると、支持体結合タンパク質を消化することができる。その後、ペプチドを含む支持体結合システインに標識試薬で標識付けし、支持体から切断することができる（図１８に示されている選択肢）。でなければ、ペプチドを含む支持体結合システインを、先ず、支持体から切断し、その後、標識試薬で標識付けすることができる（図１８に示されていない選択肢）。異なるサンプルからの標識付ペプチド（システイン部分を含まない標識付ペプチドを場合によっては含む）を混合し、加工し、および／またはサンプル混合物と共に分析する、もしくは別々に分析することができる。
【０２１２】
図１８によると、消化実施の結果として支持体から放出される任意のペプチドを回収することも可能である。一般に、これらは、チオール基を含まないペプチドである。これらのペプチドは、場合によっては標識試薬で標識付けし、場合によっては混合し、加工し、および／またはサンプル混合物と共に分析する、もしくは別々に分析することができる。
【０２１３】
Ｂ）標識付け、その後の消化を伴う例示的ワークフロー
支持体を使用して、分析物を分析のために捕捉しようと、しなかろうと、標識試薬で分析物に標識付けする工程は、消化または他の化学的処理の前に行ってもよいし、または後に行ってもよい（但し、その処理が標識を修飾しないことを条件とする）。タンパク質サンプルについては、サンプルタンパク質を還元し、システインをブロックし、そのサンプルタンパク質のＮ−ε−リシン側鎖アミン基に標識試薬で標識付けし、その後、そのタンパク質を標識付ペプチドへと消化することも可能である。
【０２１４】
それらの起源に関係なく、標識された分析物を分析することができ、または例えば、分離により、および／もしくは支持体への固定化により、さらに加工すること（サンプル混合物の作製を含む）ができる。例えば、サンプルタンパク質のＮ−ε−リシン側鎖アミン基と標識試薬の反応によって前駆体タンパク質に標識付けし、その後、場合によっては、その標識付前駆体タンパク質を支持体に固定することが可能である。その標識付タンパク質をその支持体から切断し、その後、消化することができ、またはその標識付タンパク質を支持体に結合したまま消化することもできる。後者の場合の支持体結合消化は、システイン部分を含まないペプチドを支持体から除去するであろう。これらを回収し、場合によっては、別々に、またはシステイン部分を含む後に放出される標識付ペプチドを含むサンプル混合物の一部として、分析することができる。
【０２１５】
ペプチドへの消化前に前駆体タンパク質に標識付けするとき、その消化パターンを変えることができる。例えば、トリプシンでの消化は、Ｎ−ε−リシン側鎖アミン基が標識で修飾されるため、主としてＣ末端アルギニンペプチドを生じさせると予想される。従って、トリプシンの活性は、Ａｒｇ−Ｃのものに非常に類似したものであり得る。リシン側鎖も含むＣ末端アルギニンペプチドのみに標識付けすることができ、従って、それらのみを質量分析計で検出することができるため、これは、さらに加工および／または分析するサンプルの複雑さをさらに減少させる方法となる。
【０２１６】
一部の実施形態では、タンパク質を還元し、そのシステイン基に標識試薬（すなわち、チオール特異的標識試薬）で標識付けし、その後、分析のためにそのタンパク質を標識付ペプチドへと消化することが可能である。その標識付ペプチド分析物は、分析することができ、または例えば、分離および／もしくは支持体への固定化によって、さらに加工することができる。例えば、リシン側鎖のＮ−α−アミン基および／またはＮ−ε−アミン基と支持体の官能基とを反応させることによって、標識付ペプチドを支持体に固定することが可能である。アミン官能基を含む化合物の固定化のための切断可能なリンカーを有する支持体としては、トリチルリンカーを含む支持体が挙げられる（参照：Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（カリフォルニア州、サンディエゴ）から入手できる塩化トリチル支持体（トリチル−Ｃｌ）または塩化２−クロロトリチル支持体）。このワークフローは、前に説明したものとは異なる。標識された分析物を支持体から切断し、さらに加工する、および／または分析することができる。このプロセスは、実質的な複雑さの減少をもたらさない。なぜならば、消化されたペプチドのすべてが、少なくともＮ−α−アミン基を含むと予想されるからである。
【０２１７】
前述の例は、様々な可能なワークフローを網羅するものと解釈されない。単なる例示と解釈される。標識付けが消化に先行する実施形態に関しては、消化を行う前にさらなるサンプル加工に従事することも可能である。
【０２１８】
Ｃ）概要
前述の論考は、特定の例として、プロテオーム解析および分析物としてのペプチドおよび／もしくはタンパク質の決定に焦点を合わせたが、記載した概念は、過度の実験の実行を伴わずに前述のワークフローを適用することができる多くのタイプの分析物を包含すると解釈される。従って、本開示の範囲は、論じたこれらの特定の例のいずれにも限定されないと解釈される。
【０２１９】
ＩＶ．混合物
一部の実施形態において、本発明は、混合物（すなわち、サンプル混合物）に関する。例えば、本混合物は、同重体および／または異性体で標識された分析物を含むことがある。標識された分析物の例示的混合物ならびにそれらの作製および／または分析方法は、上に示した「標識付けおよび分析のための方法」と題するセクションにおいて説明した。
【０２２０】
本混合物は、それぞれの標識試薬が固有の（グロス）質量のレポーター部分を含む標識試薬のセットの異なる標識試薬でそれぞれのサンプルに標識付けする２つ以上の標識反応の生成物のすべてまたは一部を混合することによって、作ることができる。それぞれの異なる標識試薬の固有レポーター部分によって、２つ以上の標識された分析物それぞれがいずれの標識反応から誘導された（すなわち、由来する）のかを特定することができる。前記標識試薬は、同位体コード化異性体および／または同重体標識試薬であり得る。従って、混合物の２つ以上の標識された分析物が、異性体のものおよび／または同重体のものであることがある。これらの方法に関連した標識試薬および標識された分析物の特徴は、前に説明した。
【０２２１】
本混合物の分析物は、ペプチドである場合もある。本混合物の分析物は、タンパク質である場合もある。本混合物の分析物は、ペプチドおよびタンパク質である場合もある。本混合物の分析物は、核酸分子である場合もある。本混合物の分析物は、炭水化物である場合もある。本混合物の分析物は、脂質である場合もある。本混合物の分析物は、ステロイドである場合もある。本混合物の分析物は、１５００ダルトン未満の質量を有する小分子である場合もある。本混合物の分析物は、２つ以上の異なる分析物の型（例えば、１）脂質およびステロイド；または２）ペプチド、脂質、ステロイドおよび炭水化物）を含む。
【０２２２】
混合物は、本明細書に開示する新規レポーター／リンカー部分を含む、任意のタイプの差別的に標識された分析物を含み得る。例えば、本混合物は、下記式Ｉ’’（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表すことができる少なくとも２つの差別的に標識された分析物を含む場合があり：
【０２２３】
【化５６】
0005564182.tif 000025
式中、原子または基Ｙ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ１およびＸ２は、前に説明したとおりであり、それらの特徴を開示した。一部の実施形態において、前記２つの標識された分析物のそれぞれは、異なるサンプルに由来する場合がある。式Ｉ’’によると、それぞれの異なる標識された分析物の基Ｙ−Ｊ（この基は、レポーター部分を構成する）は、１つ以上の同位体濃縮部位で固有にコード化することができるので、質量分析計内でその基Ｙ−Ｊの基Ｊとその標識された分析物の残部との結合がフラグメント化すると、固有質量のレポーターイオンが生成される。基Ｚ’’は、二重結合で連結された分析物であり得る。それぞれの異なる標識のため、この混合物の一部の標識された分析物は同じであることがあり、一部の標識された分析物は、異なることがある。
【０２２４】
一部の実施形態において、本混合物は、下記式ＩＩ’’（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表すことができる少なくとも２つの差別的に標識された分析物を含む場合があり：
【０２２５】
【化５７】
0005564182.tif 000026
式中、Ｗ、Ｍ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ１、Ｘ２およびＺ’’は、前に説明したとおりである。
【０２２６】
一部の実施形態において、本混合物は、下記式ＩＩＩ’’（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表すことができる少なくとも２つの差別的に標識された分析物を含む場合があり：
【０２２７】
【化５８】
0005564182.tif 000027
式中、ｓ、ｔ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１１およびＺ’’は、前に説明したとおりである。
【０２２８】
一部の実施形態において、本混合物は、下記式（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表すことができる少なくとも２つの差別的に標識された分析物を含む場合があり：
【０２２９】
【化５９】
0005564182.tif 000028
【０２３０】
【化６０】
0005564182.tif 000029
式中、＊、Ｒ１、Ｒ２およびＺ’’は、前に説明したとおりである。
【０２３１】
一部の実施形態において、本混合物は、下記式ＩＶ’’（その塩形態および／または水和物形態を含む）によって表すことができる少なくとも２つの差別的に標識された分析物を含む場合があり：
【０２３２】
【化６１】
0005564182.tif 000030
式中、ｔ、Ｒ１１およびＺ’’は、前に説明したとおりである。
【０２３３】
一部の実施形態において、本混合物は、下記式（その塩形態および／または水和物形態を含む）の少なくとも２つの差別的に標識された分析物を含む場合があり：
【０２３４】
【化６２】
0005564182.tif 000031
【０２３５】
【化６３】
0005564182.tif 000032
式中、＊およびＺ’’は、前に説明したとおりである。
【０２３６】
一部の実施形態において、本発明は、フラグメントイオンの混合物に関する。例えば、本混合物のフラグメントイオンは、少なくとも２つの差別的に標識された分析物分子を含むサンプル混合物の画分を質量分析計においてイオン化すること、およびフラグメント化のために、選択されたｍ／ｚ値で、前記差別的に標識された分析物分子の少なくとも２つを選択することによって、発生させることができる。その後、それらの選択された差別的に標識された分析物分子を、解離エネルギーレベルの印加によって、フラグメント化することができる。一部の実施形態において、前記差別的に標識された分析物分子の少なくとも１つは、図２６ａ〜２６ｂに図示されている８０’’、８１’’、８２’’、８３’’、８４’’、８５’’、８６’’および８７’’から成る群より選択される式の化合物である。従って、フラグメントイオンは、分子式：１３Ｃ６Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ４Ｃ２Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ３Ｃ３Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ３Ｃ３Ｈ１３１５ＮＮ＋、１３Ｃ２Ｃ４Ｈ１３１５ＮＮ＋、１３ＣＣ５Ｈ１３１５ＮＮ＋、１３ＣＣ５Ｈ１３Ｎ２＋またはＣ６Ｈ１３Ｎ２＋を有することがある。一部の実施形態において、前記分子式は、１３Ｃ６Ｈ１３１５Ｎ２＋、１３Ｃ４Ｃ２Ｈ１３１５Ｎ２＋および１３Ｃ３Ｃ３Ｈ１３１５Ｎ２＋から選択される。
【０２３７】
Ｖ．キット
一部の実施形態において、本発明は、キットに関する。本キットは、本明細書に記載する標識試薬、ならびに１つ以上の他の試薬、容器、酵素、緩衝液および／または使用説明書を含むことがある。本キットは、２つ以上の標識試薬と１つ以上の他の試薬のセット、容器、酵素、緩衝液および／または使用説明書を含むことがある。キットの標識試薬の２つ以上が、異性体のものおよび／または同重体のものであり得る。例えば、本キットの１つ以上の標識試薬は、本明細書において前に開示したとおりの式Ｉ’、ＩＩ’、ＩＩＩ’、ＩＶ’、Ｖ’、ＶＩ’、ＶＩＩ’、ＶＩＩＩ’、ＩＸ’、Ｘ’、ＸＩ’、ＸＩＩ’、ＸＩＩＩ’、ＸＶ’、ＸＶＩ’、ＸＶＩＩ’、ＸＶＩＩＩ’、ＸＩＸ’、ＸＸ’、ＸＸＩ’、ＸＸＩＩ’および／またはＸＸＩＩＩ’の化合物（化合物のセットを含む）であり得る。一部の実施形態において、本キットは、本明細書において前に開示したとおりの式Ｉ’’、ＩＩ’’、ＩＩＩ’’、ＩＶ’’、Ｖ’’、ＶＩ’’、ＶＩＩ’’、ＶＩＩＩ’’、ＩＸ’’、Ｘ’’、ＸＩ’’、ＸＩＩ’’、ＸＩＩＩ’’、ＸＶ’’、ＸＶＩ’’、ＸＶＩＩ’’、ＸＶＩＩＩ’’、ＸＩＸ’’、ＸＸ’’、ＸＸＩ’’、ＸＸＩＩ’’および／またはＸＸＩＩＩ’’の標識された分析物を（例えば、較正用標準として）含むことがある。本キットの標識試薬の他の特性は、開示した。本キットは、例えば、同じサンプル中または２つ以上の異なるサンプル中の１つ以上の分析物の多重分析に有用であり得る。
【０２３８】
ＶＩ．標識試薬の製造のための実例となる方法
図７ａ〜７ｃ、図２７ａ〜２７ｃおよび２０〜２１を参照して、同位体コード化標識試薬の作製に用いることができる一般合成戦略を、本発明のさらにもう１つの実施形態として論じる。図解するこれらの方法それぞれが、同位体コード化標識試薬を作製するために用いることができる多くの可能な合成手順の１つを表すことは理解されるだろう。通常の専門家は、日常的な実験および本明細書に提供する開示を用いるだけで、類似した化学構造の他の標識試薬の製造に本手順を容易に適応させることができることも理解されるであろう。従って、本方法の開示は、実例となるものと解釈され、如何なる点においても網羅的なものおよび限定するものとは解釈されない。
【０２３９】
図７ａ〜７ｃ、図２７ａ〜２７ｃおよび２０〜２１において図解する方法は、非コード化化合物について提示するものであるが、それらの非コード化化合物の代わりに同位体コード化試薬を用いて、それによって同位体コード化生成物を生じさせることができることは自明である。なぜならば、前記コード化物質は、その非コード化バージョンと比較して、反応性の点では実質的に同一であるはずであるからである。図７ａ〜７ｃに提示する方法は、下で論じる実施例１〜９によって支持される。これらの実施例は、図２０〜２１において図解する方法も支持する。これらの図解する方法を用いて生成することができる例示的同位体コード化化合物は、本明細書および付随する図（例えば、図９ａ〜９ｃ、１０ａ〜１０ｃ、１２ａ〜１２ｅ、２８ａ〜２８ｂおよび２９ａから２９ｂ）および特許請求の範囲において説明する。
【０２４０】
図７ａおよび２７ａ、工程１および図２０〜２１を参照して、置換または非置換ジアミンを置換または非置換ジカルボン酸または酸無水物と反応させることができる。この反応の生成物は、ジカルボン酸または酸無水物をジアミンに連結させる少なくとも１つのアミド結合（またはチオアミド結合）を含むアミノ酸である。例えば、前記置換または非置換ジアミンは、図２０に化合物２００として図示する構造を有することがあり、前記置換または非置換酸無水物は、図２０に化合物２０１として図示する構造を有することがある。前記反応のアミノ酸生成物は、図２０に化合物２０２として図示する構造を有することもある。
置換または非置換ジアミンのアミン基の一方または両方が、Ｒ１および／またはＲ２として図に示されているＮ−アルキル化基を含むことがある（例えば、図２７ａ参照）。前記ジアミンは、アミン保護基、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ｂｏｃ）または９−フルオレニルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、で部分的に保護されていることがある。他の適するアミン保護基およびそれらの使用方法は、Ｇｒｅｅｎら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９において見出すことができる。通常の専門家は、日常的な実験および本明細書に提供する開示を用いるだけで、他の適する保護基を選択および使用することができるであろう。
【０２４１】
ジカルボン酸を出発原料として選択する場合、それらのカルボン酸基の１つを、保護因子を用いて、例えばかさ高いエステル（例えば、ｔ−ブチルエステル）の形成によって、保護することができる。本明細書で用いる場合、ジカルボン酸または酸無水物が、２つのカルボン酸基または酸無水物基の酸素原子のための置換因子として硫黄原子を含むことがあることは、理解されるであろう。
【０２４２】
一部の実施形態において、ジカルボン酸も、ジアミンも保護されない。一般に、保護は、不純物の生成を回避するように反応を方向付けるために使用される。しかし、試薬が反応して所望の化合物を生成する、および／または精製が容易に達成される場合、保護の必要はない。例えば、出発原料が対称性である場合、保護を回避できることが多い。
【０２４３】
一部の実施形態において、開示する工程のすべてを行う必要はないことも理解されるであろう。実施例において述べるように、Ｆｍｏｃ保護ジアミンの選択によって、図解する方法の工程２（図７ａ〜７ｃおよび図２７ａ〜２７ｃ）を行う必要を無くすことができる。
【０２４４】
図２０を参照して、置換または非置換ジアミンは、Ｋによって表されるアルキル基を含むことがあり（例えば、化合物２００）、この場合、Ｋは、２つのアミン基を架橋する、式−（ＣＫ’２）ｎ−または−（（ＣＫ’２）ｍ−Ｘ３−（ＣＫ’２）ｍ）ｐ−の基であり得、式中、ｎは、２から１０の整数であり、それぞれのｍは、他から独立して、１から５の整数であり、ｐは、１から４の整数であり、およびそれぞれのＫ’は、他から独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、−Ｒ４、−ＯＲ４、−ＳＲ４、−Ｒ４’ＯＲ４または−Ｒ４’ＳＲ４であり、ここで、Ｒ４は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはアリールアルキルである。前記置換または非置換ジアミンは、ジアミンの２つのアミン基の一方または両方が環窒素原子であるピペラジン（例えば、図２１の化合物２０５）などの環状環を含むこともある。一部の実施形態において、前記置換または非置換ジアミンの１つ以上の原子は、重原子同位体で置換されていることがある。図２０および２１を参照して、置換または非置換ジアミンと酸無水物の反応によって形成されるアミノ酸化合物は、それぞれ、２０２および２０６によって表される。
【０２４５】
前記置換または非置換カルボン酸または酸無水物は、酸無水物の２つのカルボン酸基または２つのカルボニル基を架橋する基Ｌを含むことがあり（例えば、図２０の化合物２０１）、この場合、Ｌは、式−（ＣＬ’２）ｑ−または−（（ＣＬ’２）ｍ−Ｘ３−（ＣＬ’２）ｍ）ｐ−によって表され、式中、ｑは、、１から１０の整数であり、それぞれのｍは、他から独立して、１から５の整数であり、ｐは、１から４の整数であり、それぞれのＬ’は、他から独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、−Ｒ５、−ＯＲ５、−ＳＲ５、−Ｒ５’ＯＲ５または−Ｒ５’ＳＲ５であり、ここで、Ｒ５は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはアリールアルキルである。前記置換または非置換ジカルボン酸または酸無水物は、シクロヘキサンまたはシクロペンタン環などの環状環を含むことがあり、この場合、カルボン酸部分（または２つのカルボン酸基によって構成される酸無水物のカルボニル基）の一方または両方がその環状環の置換基である。一部の実施形態では、前記置換または非置換ジカルボン酸または酸無水物中の原子の１つ以上が、重原子同位体で置換されていることがある。
【０２４６】
図７ａ、工程１に図示するように、Ｎ−（ｔ−ｂｏｃ）−Ｎ−メチル−エチレンジアミン１０１をコハク酸無水物１０２と反応させることができる。この反応は、生成物、エチレンジアミン−Ｎ’−コハク酸Ｎ−メチル１０３を生成する。式Ｉ’〜ＸＩＩＩ’およびＶＩ’〜ＸＸＩＩＩ’によって図示されるものなどの化合物の場合、この反応は、リンカー部分の同位体コード化のための１つの方法を表すものであり得る。開示する手順（工程２を伴わない）を用いて式Ｉ’〜ＸＩＩＩ’およびＶＩ’〜ＸＸＩＩＩ’の化合物を生成することができる可能なジアミンおよび酸無水物出発原料は、図９ａ〜９ｃおよび１０ａ〜１０ｃに図示されている。
【０２４７】
図７ａおよび７ｂならびに図２７ａおよび２７ｂ、工程２〜４を参照して、レポーター部分を含む化合物を最終的に連結させることができる支持体結合部分を生じさせる目的で、工程１のアミノ酸生成物のアミンおよび酸官能基を操作することができる。図７ａ、工程２に図示されているように、ｔ−ｂｏｃアミン保護基をＦｍｏｃアミン保護基と交換し、それによってＦｍｏｃ保護化合物１０４を生成する。工程３（図７ａ）では、その化合物を切断可能なリンカーによって支持体にそのカルボン酸官能基により固定して、それによって支持体結合化合物１０５を生成する。そのリンカー部分を固定する支持体は、立体的に障害された切断可能なリンカーを含むことがある。切断可能なリンカーを含む非常に多数の支持体が通常の専門家には周知である。立体障害固体支持体の非限定的な例としては、塩化トリチル支持体（トリチル−Ｃｌ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ  ０１−６４−００７４）、塩化２−クロロトリチル支持体（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ  ０１−６４−００２１）、ＤＨＰＰ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ  Ｑ−１７５５）、ＭＢＨＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐ／Ｎ  ４００３７７）、塩化４−メチルトリチル支持体（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ  ０１−６４−００７５）、塩化４−メトキシトリチル支持体（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ  ０１−６４−００７６）、ヒドロキシ−（２−クロロフェニル）メチル−ＰＳ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ  ０１−６４−０３４５）、Ｒｉｎｋ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ  ０１−６４−０３８０、０１−６４−０２０２）、およびＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＴアルコール支持体（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ  ０１−６４−００７４）が挙げられる。図に示すような塩化トリチル支持体を使用することができる（実施例３参照）。
【０２４８】
図７ｂ、工程４に図示されているように、支持体結合化合物１０５の末端アミンの保護基を除去して、それによって、支持体結合生成物化合物１０６の前記アミンとレポーター部分を含む化合物との反応を容易にすることができる。
【０２４９】
従って、一般に、アミノ酸生成物のアミン基を、レポーター部分を含む化合物と反応させて、それによってレポーター／リンカーの組み合わせを形成することができる。図７ａ〜７ｃおよび図２７ａ〜２７ｃに示されているように、一部の実施形態において、この反応を、固体支持体にそのリンカー部分を固定することよって容易にすることができる。しかし、たとえ一部の実施形態において有用でもリンカー部分の固定化が必須でないことは理解されるであろう。
【０２５０】
レポーター部分を含む化合物は、一般に、２つの特徴を含む。１つの特徴は、置換また非置換Ｎ−アルキル化酢酸部分であり得、この場合、その酢酸部分のカルボン酸（またはチオカルボン酸）基をアミノ酸生成物のアミン基と反応させて、それによってアミド結合（またはチオアミド結合）を形成することができる。第二の特徴は、その酢酸部分のメチレン炭素に共有結合で連結されている窒素原子であり得る。この窒素原子を含む部分は、置換第二アミン、例えばジメチルアミン、ジエチルアミンまたはプロピルアミンであり得る。窒素原子を含む部分は、環状化合物、例えば、置換または非置換ピペリジン、ピペラジンまたはモルホリンであり得る。図７ｂに図示されているように、この窒素含有部分は、Ｎ−メチル−ピペラジンである。
【０２５１】
図２０および２１を参照して、アミノ酸生成物（それぞれ、２０２または２０６）は、レポーターを含む化合物（すなわち、化合物２０３）と反応させることができる。この反応の生成物は、レポーター／リンカー部分（すなわち、それぞれ、化合物２０４および２０７）になり得る。
【０２５２】
図７ｂ、工程５を参照して、化合物１０６の末端アミンを置換または非置換Ｎ−アルキルピペラジン酢酸部分（１０７）と反応させて、それによって支持体結合レポーター／リンカー組成物１０８を生成することができる。
【０２５３】
勿論、レポーター部分を含む化合物は、１つ以上の同位体濃縮部位を含むことがある。例えば、図７ｃの置換または非置換Ｎ−アルキルピペラジンまたはＮ−アルキル化酢酸部分は、１つ以上の同位体濃縮部位を含むことがある（図９ａ〜９ｃおよび１０ａ〜１０ｃも参照）。従って、レポーターおよびリンカーのコード化は、ジアミン、二酸（または酸無水物）、およびレポーター部分を含む化合物（例えば、置換または非置換Ｎ−アルキルピペラジン酢酸）のコード化に依存して制御することができる。
【０２５４】
一部の実施形態において、レポーター／リンカーを表す分子のカルボン酸またはチオカルボン酸基をインサイチューで活性化して、それによって分析物の標識付けを容易にすることができる。従って、一部の実施形態では、追加の反応を必要としない。
【０２５５】
一部の実施形態において、レポーター／リンカーの組み合わせを表す分子の酸またはチオ酸基を、分析物の官能基と反応できる反応性基を形成するように修飾することができる。一部の実施形態において、これは、分析物の官能基と反応させることができる所望の反応性基を生じさせる１つ以上の試薬との反応を含むことがある。一部の実施形態において、これは、酸またはチオ酸基の活性化化合物への転化を含むことがある。例えば、レポーター／リンカーの組み合わせのカルボン酸またはチオカルボン酸基を活性化して、それによって、アルコールまたはチオール脱離基を含む活性エステルを作製することができ、この場合、その活性エステルは、分析物の官能基と反応して、それによって標識された分析物を形成することができる。
【０２５６】
図２０および２１を参照して、レポーター／リンカー化合物を表す化合物（それぞれ、化合物２０４および２０７）を修飾して、それによって、それぞれ、Ｉ’またはＩ’’によって表される化合物を生成することができる。例えば、そのカルボン酸またはチオカルボン酸基を活性エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルに転化させることができる。
【０２５７】
図７ｃ、工程６を参照して、レポーター／リンカー化合物を支持体から切断して、それによって中間体１０９を生成することができる。図示されているように、この中間体は、求核因子、例えばタンパク質またはペプチドのアミン基、との反応のために活性化させることができるカルボン酸基を含む。一部の実施形態において、このカルボン酸は、前に説明したようにインサイチューで活性化させることができるが、図７ｃ、工程７に関しては、トリフルオロ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（１１０）との反応によるＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル１１１の形成を図示する。レポーター／リンカー化合物の活性エステルの形成に適する他の方法は、同時係属中で、共同所有の米国特許出願公開番号ＵＳ  ２００５−０１４８７７１  Ａ１において見出すことができる。例示的合成を図８に図示する。一部の例示的活性エステルの脱離基を７〜１９として示す。
【０２５８】
図９ａ〜ｃは、図解されている方法と共に用いて、それによって化合物Ｖ’〜ＸＩＩＩ’を生成することができる、可能な同位体コード化出発原料源を図示するものである。図１０ａ〜ｃ（これらの図中のコード化ピペラジンは、図７ａ〜７ｃにおけるＮ−メチルエチレンジアミンの誘導体の代わりに用いることができる）は、化合物ＸＶ’〜ＸＸＩＩＩ’を生成するために使用することができる可能な同位体コード化出発原料源を図示するものである。単純で容易に入手できる出発原料からのコード化ピペラジン、例えばコード化グリシンおよびグリシンの誘導体（例えば、サクロシン）の作製方法は、当該技術分野において公知である。例えば、異なる特色のコード化ピペラジンおよびＮ−アルキルピペラジン化合物すべての作製方法を、同時係属中で、共同所有の米国特許出願公開番号ＵＳ  ２００４−０２１９６８５  Ａ１、ＵＳ  ２００５−０１４７９８２、ＵＳ  ２００５−０１４７９８５およびＵＳ  ２００５−１０４８７７４  Ａ１において見出すことができる。図１２ｄおよび１２ｅも、図１０ｃに図示されているコード化ピペラジン化合物への合成経路の例を示すものである。図１２ｄおよび１２ｅに図示されている合成経路は、前記公開特許出願に記載されているようなコード化ピペラジン化合物の作製方法に基づく。
【０２５９】
前に述べたように、コード化出発原料、例えばコード化グリシン、サルコシンおよびコハク酸無水物は、様々な市場の供給業者、例えば、マサチューセッツ州、アンドーヴァーのＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ｗｗｗ．ｉｓｏｔｏｐｅ．ｃｏｍでのリストまたは「基本出発原料」参照）およびＩｓｏｔｅｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの一部門）から入手できる。Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＩｓｏｔｅｃは、注文合成契約のもとで所望される化合物の作製もするであろう。同典拠。実施例および図を含む本開示全体を通して、様々な同位体コード化出発原料の源および部数への言及を見出すことができる。しかし、これらの言及は、単に情報のためのものであり、特許請求の範囲に記載する本発明に対する限定またはすべての可能な市場の供給業者の網羅と解釈されない。
【０２６０】
図１１ａ、１１ｂおよび実施例８から９を参照して、公知の合成反応の適応によるＮ−メチル−グリシン（すなわち、サルコシン）の様々なコード化バージョンの作製方法を図解および説明する。例えば、これらのコード化材料は、図９ａ〜ｃおよび図１０ａ〜ｃにおいて参照している様々な米国特許公開出願に記載されているようなレポーターにおいて用いられているコード化Ｎ−メチルピペラジン酢酸部分の作製の際に使用することができる。従って、これらの図解および実施例が、市販されている単純なコード化材料から本明細書に記載する様々なコード化標識試薬を作製する際に有用であり得ることは分かるであろう。
【０２６１】
図１２ａ、１２ｂ、１２ｃ、２８ａおよび２９ａを参照して、公知の合成反応の適応によるＮ−メチル−エチレンジアミンの様々なコード化バージョンの様々な作製方法を図解する。従って、これらの図解が、市販されている単純なコード化材料から本明細書に記載する様々なコード化標識試薬を作製する際に有用であり得ることは分かるであろう。例えば、図１２ｃに関しては、図示されている反応の工程１を行う一般ガイドとして、Ｍｉｃｈｅｌら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｂｏｎｄｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｉｏａｍｉｄｅｓ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｉｏａｌａｎｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｉｏｇｌｙｃｉｎｅｓ．Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６７（８）：１３１２−１３１８（１９８９）に記載されている手順を用いることができると予想される。加えて、図示されている反応の工程２を行う一般ガイドとして、Ｃａｌｌｅｒｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（米国、ニュージャージー州、ＦｌｏｒｈａｍのＢＡＳＦ  Ｃｏｍｐａｎｙ）によって提供されているボラン−テトラヒドロフラン複合体の製品パンフレット（およびその中に開示されている参考文献、例えば、Ａｍｅｄｉａら，Ｓｙｎ．Ｃｏｍｍ．２９：２３７７（１９９９））を用いることができる予想される。
【実施例】
【０２６２】
本教示の態様は、以下の実施例に鑑みてさらに理解することができる（これらの実施例は、如何なる点においても本教示の範囲を限定するものと解釈すべきではない）。
【０２６３】
実施例１：Ｎ−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−メチル−アミノ）−エチル］−スクシンアミド酸（１０３）の合成（工程１−図７ａ）
ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２、３０ｍＬ）中のＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−メチル−エチレンジアミン１０１（５．５ｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）のよく攪拌した溶液に、コハク酸無水物１０２（３．２ｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）を一度に添加した。その反応混合物を１時間、室温で攪拌すると、スラリーが得られた。このスラリーを、さらに処理せずに、工程２において使用した。
【０２６４】
注記：入手可能ならば、Ｎ−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−Ｎ−メチル−エチレンジアミンの使用は、工程２を行う必要をなくすであろう。このため、図９ａ〜ｃは、Ｆｍｏｃ保護Ｎ−メチルエチレンジアミンの使用を提案している。
【０２６５】
実施例２：Ｎ−｛２−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−メチル−アミノ］−エチル｝−スクシンアミド酸（１０４）の合成（工程２−図７ａ）
工程１から生成された化合物１０３のスラリーに、ＣＨ２Ｃｌ２中の８０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）２０ｍＬを添加した。その後、その反応混合物を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）でモニターしながら室温で攪拌した。２時間後、その混合物のＴＬＣは、出発原料の完全消失と極性生成物の形成を示した。その後、過剰な溶媒およびＴＦＡをロータベーパーで除去し、残留物をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、３０ｍＬ×３）と共蒸発させた。その後、その残存油性残留物をアセトン（５０ｍＬ）に再び溶解し、そのｐＨを、ＮａＨＣＯ３（水）溶液を注意深く添加することによって塩基性にした。その後、アセトン（７０ｍＬ）中のＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル−オキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−Ｏｓｕ、１３．５ｇ、０．０３９９ｍｏｌ）の溶液を一度に添加した。その後、その反応混合物を室温で一晩攪拌した。この時点でＴＬＣによって、出発原料の消費が確認された。その後、アセトン／水をロータベーパーで除去し、残留物を水（５０ｍＬ）で希釈し、ジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ、３０ｍＬ×３）で洗浄して、非極性不純物を除去した。その後、水性層を２ＮのＨＣｌで〜２のｐＨに酸性化し、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ、１００ｍＬ×３）で抽出した。その後、合わせた有機部分を水（３０ｍＬ×４）、ブライン（１×３０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させた。その後、ＥｔＯＡｃをロータベーパーで除去し、残留物を高真空下で一晩保持して、Ｎ−｛２−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−メチル−アミノ］−エチル｝−スクシンアミド酸１０４を吸湿性の白色固体として得た（１０．５ｇ、８２％）。ＭＳ：３９７．２（ＭＨ＋）。
【０２６６】
実施例３：支持体結合Ｎ−｛２−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−メチル−アミノ］−エチル｝−スクシンアミド酸（１０５）の合成（工程３−図７ａ）
ＣＨ２Ｃｌ２中のＮ−｛２−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−メチル−アミノ］−エチル｝−スクシンアミド酸（１０４）（５９５ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）の溶液に、（１０ｍＬ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、７７６ｍｇ、６ｍｍｏｌ）、続いて塩化トリチル支持体（１ｇ、１ｍｍｏｌ、Ｐ／Ｎ  ＳＣ５０２８，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ）を添加した。その後、スラリーを１．５時間、室温で攪拌し、その後、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡの溶液（１７：２：１、３×１０ｍＬ）、ＣＨ２Ｃｌ２（３×１０ｍＬ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２×１０ｍＬ）および最後に再びＣＨ２Ｃｌ２（２×１０ｍＬ）で洗浄した。負荷された支持体（１０５）を真空下で乾燥させ、サンプルをＦｍｏｃ負荷について分析した。平均負荷量は、０．５ｍｍｏｌ／ｇであった。この支持体を、さらに処理せずに、工程４において使用した。
【０２６７】
実施例４：支持体結合Ｎ−（２−メチルアミノ−エチル）−スクシンアミド酸（１０６の合成（工程４−図７ｂ）
支持体結合Ｎ−（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−メチルエチレンジアミンスクシネート（１０５）を２０％ピペリジン／ＤＭＦで処理した（１０ｍＬ−塗布し、その後、流出させた）。その後、追加量の２０％ピペリジン／ＤＭＦ（１０ｍＬ）を添加し、スラリーを１０分間攪拌した。その後、その支持体をＤＭＦ（１０ｍＬ×２）、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ×２）および最後にＤＭＦ（１０ｍＬ×２）で洗浄した。その後、脱保護された支持体（１０６）を工程５において直ちに使用した。
【０２６８】
実施例５：支持体結合Ｎ−（２−｛メチル−［２−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−アセチル］−アミノ｝−エチル）−スクシンアミド酸（１０８）の合成（工程５−図７ｂ）
（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−酢酸ビストリフルオロアセテート  １０７（９６５ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（８ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（６４６ｍｇ、５ｍｍｏｌ）に溶解した。この溶液に、ヘキサフルオロリン酸Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム（ＨＡＴＵ、９５０ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を１分間ボルテックスし、支持体（１０６）をそれに添加した。スラリーを２５分間攪拌し、濾過し、ＤＭＦ（１０ｍＬ×３）、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ×２）およびＤＭＦ（１０ｍＬ×２）で洗浄した。その後、支持体を、同じ当量の試薬を使用する２回目のカップリング（すなわち、ダブルカップリング）に付し、その後、ＤＭＦ（１０ｍＬ×３）およびＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ×３）で洗浄した。その後、支持体（１０８）を真空下で乾燥させ、さらに処理せずに工程６において使用した。
【０２６９】
実施例６：Ｎ−（２−｛メチル−［２−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−アセチル］−アミノ｝−エチル）−スクシンアミド酸（１０９）の合成（工程６−図７ｃ）
支持体（１０８）をＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）で処理し、５分間放置した。その後、支持体から溶媒を流出させ、その支持体を再びＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）で処理し、溶媒を回収した。ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２の両方の部分を混合し、その後、ロータベーパーで濃縮した。残留物をＴＨＦ（２０ｍＬ×３）と共蒸発させた。極微量のＴＦＡを高真空下で除去した。その後、残留物を無水エーテルと粉砕した。ゴム状の塊が得られた。この生成物を、攪拌棒を使用して激しく攪拌しながら一晩放置した。得られた白色の固体を遠心分離によって分離し、エーテル（５ｍＬ×３）で洗浄し、高真空下で乾燥させて、１０９を白色の吸湿性固体として得た（３２０ｍｇ、総合収率５９％）。ＭＳ：３１５（ＭＨ＋）。
【０２７０】
実施例７：Ｎ−（２−｛メチル−［２−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−アセチル］−アミノ｝−エチル）−スクシンアミド酸のＮＨＳエステル（１１１）の合成（工程７−図７ｃ）
無水ＴＨＦ（２ｍＬ）中の１０９（１００ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル１１０（４８ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。その反応混合物を室温で２時間攪拌した。ＴＨＦをロータベーパーで除去し、極微量のＴＦＡを追加のＴＨＦ（２ｍＬ×２）との共蒸発によって除去した。その後、ゴム状残留物を冷蔵庫の中で一晩、無水エーテル上で放置した。エーテルをデカントで除去し、残留物を高真空下で保持して、１１１を発泡体として得た（１１０ｍｇ、９３％）。ＭＳ：４１２（ＭＨ＋）。
【０２７１】
実施例８：コード化Ｎ−（ｔ−ｂｏｃ）−サルコシン（２１）の合成（図１１ａ参照）
Ｂｏｃ−１５ＮＨ−１３ＣＨ２−１３ＣＯＯＨ（７ｇ、３９．２９ｍｍｏｌ、１当量、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂ，Ｐ／Ｎ：ＣＮＬＭ−２４１２−０）と磁気攪拌棒が入っている、窒素フラッシュした５００ｍＬ丸底フラスコに、カニューレによって、乾燥ＴＨＦ（１００ｍＬ）を移し入れた。その混合物を室温で、透明な溶液が得られるまで、攪拌した。その後、氷浴を使用して、その溶液を０℃に冷却した。セプタム付きメスシリンダーを窒素でフラッシュし、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（ｔ−ＢｕＯＫ、１５７ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ、４当量）溶液をそれに移し入れた。その後、そのｔ−ＢｕＯＫ溶液を、０℃で攪拌しながら、カニューレおよび圧力差を用いて、その反応混合物に添加した。最初、ゲルが形成し、それが約１分以内に溶解した。その反応物をさらに１０分間、０℃で攪拌した。
【０２７２】
１３ＣＨ３Ｉ（２×１０ｇ、１４０ｍｍｏｌ、３．５６当量、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂ，Ｐ／Ｎ：ＣＬＭ−２８７−１０）のアンプルを冷蔵庫で冷却し（１３ＣＨ３Ｉは、高揮発性であり、冷却した場合にしか空けるべきでない）、窒素ブランケットのもとで開けた。内容物をカニューレにより迅速に反応混合物に移し入れた。その後、その反応混合物を１時間、０℃で激しく攪拌した。その反応物の少量（１００μＬ）を水（１ｍＬ）で処理し、１Ｍ  ＨＣｌの添加によってｐＨ１に酸性化し、ＥｔＯＡｃ（２ｍＬ）で抽出した。ＥｔＯＡｃ層のＴＬＣ分析は、反応が完了していることを示した（Ｒｆ２０＝０．５１、Ｒｆ２１＝０．７０；１：４  ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２−ＡｃＯＨ（１０μＬ／１０ｍＬ）；ＴＬＣは、エタノール（ＥｔＯＨ）中の３％（ｗ／ｖ）ニンヒドリン溶液と共に加熱することによって展開した）。
【０２７３】
その後、ＴＨＦ溶媒を減圧下で除去し、固体を１００ｍＬの水に溶解し、その後、１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ＝１に酸性化した。その水性媒質をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ×２）で抽出した。合わせたＥｔＯＡｃ層を２％（ｗ／ｖ）ＮａＨＳＯ３（５０ｍＬ）＋ブライン（５０ｍＬ）溶液で処理し、激しく混合して、処理中に形成された一切のＩ２を除去した。ＥｔＯＡｃ層をブライン（５０ｍＬ）でさらに洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その後、ＥｔＯＡｃおよび一切のｔｅｒｔ−ブチルアルコール（ｔ−ＢｕＯＨ）を減圧下で除去して、化合物２１を濃稠無色の油または低融点の固体として得た（７．４２ｇ、収率９７％）。ＥＳ−ＭＳ（メタノール（ＭｅＯＨ）中、直接注入）算出ＭＮａ＋（Ｃ５１３Ｃ３Ｈ１５１５ＮＯ４Ｎａ）＝２１６．１０、実測ＭＮａ＋＝２１６．１０。
【０２７４】
実施例９：コード化サルコシンメチルエステル（２３）の合成（図１１ｂ参照）
Ｂｏｃ−１５Ｎ１３ＣＨ３−１３ＣＨ２−１３ＣＯＯＨ（２１、７．４２ｇ、３８．４１ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、４７０ｍｇ、３．４１ｍｍｏｌ）およびＭｅＯＨ（７．８ｍＬ、５×３８．４１ｍｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。その後、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）に溶解したジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、８．３２ｇ、１．０５×３８．４１ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加した。その後、その反応混合物を、徐々に室温に温めながら、一晩、攪拌した。ＴＬＣ分析は、反応が完了したことを示した（Ｒｆ２１＝０．００、Ｒｆ２２＝０．５０；７：３  ヘキサン−ＥｔＯＡｃ；ＴＬＣは、ＥｔＯＨ中の３％（ｗ／ｖ）ニンヒドリン溶液と共に加熱することによって展開した）。ジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ）沈殿を濾過（Ｗｈａｔｍａｎ  ＃２濾紙）によって除去し、濾液を５０ｍＬに濃縮した。その濃縮溶液をＳｉＯ２ゲルに吸着させ、フラッシュクロマトグラフィー（２回実行；１２０ｇ  ＳｉＯ２カラム  Ｉｓｃｏ．；８５ｍＬ／分、０〜５分  ヘキサン中の１０％ＥｔＯＡｃ、５〜２０分  ヘキサン中の２５％ＥｔＯＡｃ）によって精製した。
【０２７５】
純粋な生成物２２を含有する画分を合わせ、ロータリーエバポレーターを使用して室温で５０ｍＬに濃縮した（化合物２２の沸点は低く、高真空に付してはならない）。その濃縮溶液に、ＨＣｌ溶液（６０ｍＬ、ジオキサン中の４Ｍ  ＨＣｌ）を添加し、攪拌した。激しいガス発生が観察された。３０分後、ＴＬＣ分析は、ｔ−Ｂｏｃ脱保護の完了を示した（Ｒｆ２３＝０．００、Ｒｆ２２＝０．５０；７：３  ヘキサン−ＥｔＯＡｃ；ＴＬＣは、ＥｔＯＨ中の３％（ｗ／ｖ）ニンヒドリン溶液と共に加熱することによって展開した）。減圧下で揮発成分を除去して、化合物２３を白色の吸湿性固体として得た（５．２ｇ、２工程を通して収率９４％）。ＥＳ−ＭＳ（ＭｅＯＨ中、直接注入）４について算出したＭＨ＋（Ｃ１３Ｃ３Ｈ１０１５ＮＯ２）＝１０８．０９、実測ＭＨ＋＝１０８．０８、算出Ｍ２Ｈ＋＝２１５．１８、実測Ｍ２Ｈ＋＝２１５．１７。
【０２７６】
実施例１０：支持体結合［Ｇｌｕ１］−フィブリノペプチドＢヒトの合成
［Ｇｌｕ１］−フィブリノペプチドＢヒト［Ｇｌｕ−Ｆｉｂ、ＣＡＳ＃：１０３２１３−４９−６］：このペプチドは、標準的なＦｍｏｃ−ペプチド合成プロトコル（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  ｃａｔａｌｏｇ，２００４−２００５）および次のアミノ酸誘導体を使用して、塩化トリチル樹脂（Ｐ／Ｎ：Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，０１−６４−００７４）上で手作業で組み立てた：Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（Ｐ／Ｎ：Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，０４−１２−１１４５）、Ｆｍｏｃ−ＧＩｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（Ｐ／Ｎ：Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，０４−１２−１０２０）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（Ｐ／Ｎ：Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，０４−１２−１００１）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（Ｐ／Ｎ：Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，０４−１２−１０３９）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｐ／Ｎ：Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，０４−１２−１０８９）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｍｐｅ）−ＯＨ（Ｐ／Ｎ：Ｂａｃｈｅｍ，Ｂ−３５６０）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（Ｐ／Ｎ：Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，０４−１２−１０３０）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（Ｐ／Ｎ：Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，０４−１２−１０３３）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（Ｐ／Ｎ：Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，０４−１２−１００６）。［Ｇｌｕ１］−フィブリノペプチドＢヒトのアミノ酸配列：配列番号１：  Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ。
【０２７７】
実施例１１：Ｆｍｏｃ−Ｎ（Ｍｅ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ（Ｍｅ）−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＨの合成
ＴＨＦ（１５ｍＬ）中のＮＨ（Ｍｅ）−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ（Ｍｅ）（１．６ｍＬ、１５ｍｍｏｌ、Ｐ／Ｎ：Ａｌｆａ−Ａｅｓａｒ，ＵＳＬＦ００６６５３）の溶液を塩化トリチル樹脂（Ｐ／Ｎ：Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，０１−６４−００７４、１ｇ、１．５ｍｍｏｌ）に添加し、懸濁液を１時間、周囲温度で攪拌した。その後、その樹脂を濾過し、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ、１５ｍＬ×３）で洗浄し、ＭｅＯＨ−ＤＭＦ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、１５ｍＬ、４：７：２  ｖ／ｖ、Ｐ／Ｎ：Ａｌｄｒｉｃｈ，３８７６４９）で１５分間処理した。最後にその樹脂を濾過し、ＮＭＰ（１５ｍＬ×３）で洗浄した。
【０２７８】
その後、ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解したコハク酸無水物（Ｐ／Ｎ：Ａｌｄｒｉｃｈ，２３９９６９０、１．５ｇ、１５ｍｍｏｌ）をその樹脂に添加し、続いてＤＩＰＥＡ（２．６１ｍＬ、１５ｍｍｏｌ）を添加した。その後、その樹脂を２０分間、周囲温度で攪拌した。その後、その樹脂を濾過し、ＮＭＰ（１５ｍＬ×３）、続いてアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ、１５×３ｍＬ）で洗浄した。
【０２７９】
その樹脂をＴＦＡ−ＤＣＭ（２０％  ｖ／ｖ、４０ｍＬ）で処理し、濾過し、追加のＴＦＡ−ＤＣＭ（２０％  ｖ／ｖ、１０ｍＬ×５）で洗浄した。濾液を減圧下で油性残留物（ＴＦＡ・Ｎ（Ｍｅ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ（Ｍｅ）−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＨ、１．０７ｇ）へと濃縮し、それを飽和ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８〜９）に溶解した。その後、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕの溶液（Ｐ／Ｎ：Ａｄｖａｎｃｅ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  ＲＣ８０１５、１．４３ｇ、アセトン中の４．２４ｍｍｏｌ（２０ｍＬ））をその水溶液に添加し、２時間、周囲温度で攪拌した。ＴＬＣ分析は、生成物の形成を示した（Ｒｆ＝０．５０；９：１：０．０１  ＤＣＭ−ＭｅＯＨ−ＡｃＯＨ、ＵＶ２５４ｎｍ、ＴＬＣは、エタノール（ＥｔＯＨ）中のニンヒドリンの３％（ｗ／ｖ）溶液と共に加熱することによって展開した）。その後、その反応混合物を濃縮してアセトンを除去し、その後、残留物を水（１５０ｍＬ）で希釈した。非極性不純物をＥｔ２Ｏ（１００ｍＬ×２）での抽出によって除去した。水性層を酸性化し（ｐＨ  〜１、ＨＣｌ、１Ｍ）、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ×２）で抽出した。合わせたＥｔＯＡｃ層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、０．９５ｇのＦｍｏｃ−Ｎ（Ｍｅ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ（Ｍｅ）−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＨを無色の粘稠油として得た。ＥＳ−ＭＳ（ＭｅＯＨ−直接注入）算出ＭＨ＋（Ｃ２２Ｈ２４Ｎ２Ｏ５Ｈ＋）＝３９７．１７、実測ＭＨ＋＝３９７．１６。
【０２８０】
実施例１２：Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＨ・ＤＩＰＥＡの合成
Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２・ＨＣｌ（Ｐ／Ｎ：Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，０１−６３−００６４、１当量（ｅｑｖ．））をＤＣＭ中、ＤＩＰＥＡ（１当量）の存在下でコハク酸無水物（１当量）と反応させて、表題化合物を得た。
【０２８１】
実施例１３：Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ（Ｍｅ）−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＨの合成
アセトン（１５ｍＬ）中のＢｏｃ−ＮＭｅ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２（２６５ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ）のよく攪拌した溶液に、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕの溶液（５６４ｍｇ、１５ｍＬのアセトン中の１．６７ｍｍｏｌ）を添加した。その後、その混合物を２時間、周囲温度で攪拌した。この工程での反応混合物のＴＬＣ分析は、Ｂｏｃ−ＮＭｅ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−Ｆｍｏｃの形成を示した（Ｒｆ＝０．３５；３：７  ＥｔＯＡｃ：ヘキサン、ＵＶ２５４ｎｍ、ＴＬＣは、ＥｔＯＨ中のニンヒドリンの３％（ｗ／ｖ）溶液と共に加熱することによって展開した）。
【０２８２】
アセトンの蒸発後、生成物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製して（４０ｇ  Ｉｓｃｏ−シリカカラム、４０ｍＬ／分、２５４ｎｍ、３：７  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン、１８ｍＬの画分を回収、画分１５〜２４は純粋な生成物を有した）、Ｂｏｃ−ＮＭｅ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−Ｆｍｏｃを発泡体として得た（５２０ｍｇ、収率＝８６％）。
【０２８３】
Ｂｏｃ−ＮＭｅ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−Ｆｍｏｃ（５２０ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ）を１時間、周囲温度で、ＴＦＡ−水（１５ｍＬ、９５：５、ｖ／ｖ）で処理し、その時、ＴＬＣ分析は、Ｂｏｃ脱保護の完了を示した。ＴＦＡ−水を減圧下で除去し、得られた油をＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶解した。この溶液に、コハク酸無水物（１３１ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＤＩＰＥＡを（湿潤ｐＨ紙によってｐＨ  〜１０まで）添加した。その後、その混合物を３０分間攪拌した。その後、混合物をＨＣｌ（１Ｍ）で酸性（ｐＨ＝１）にし、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ×３）で抽出した。合わせたＥｔＯＡｃ層をブライン（１００ｍＬ×２）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。ＥｔＯＡｃを減圧下で除去して、表題化合物を無色の油として得た。ＥＳ−ＭＳ（ＭｅＯＨ−直接注入）算出ＭＨ＋（Ｃ２３Ｈ２６Ｎ２Ｏ５Ｈ＋）＝４１１．１０、実測ＭＨ＋＝４１１．０９。
【０２８４】
実施例１４：Ｎ−（Ｆｍｏｃ）−Ｎ’−スクシニル−ピペラジンの合成（図２０）
ＤＣＭ（３０ｍＬ）中のＢｏｃ−ピペラジン（Ｐ／Ｎ：Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｌ１３３６３、５００ｍｇ、２．６８ｍｍｏｌ）の溶液に、コハク酸無水物（２６９ｍｇ、２．６８ｍｍｏｌ）を添加した。その反応物を２時間、周囲温度で攪拌した。ＴＬＣ分析は、スクシニル化Ｂｏｃ−ピペラジンの形成を示した（Ｒｆ＝０．５０；９：１：０．０１  ＤＣＭ−ＭｅＯＨ−ＡｃＯＨ、ＴＬＣは、ＥｔＯＨ中のニンヒドリンの３％（ｗ／ｖ）溶液と共に加熱することによって展開した）。この溶液にＴＦＡ（３０ｍＬ）を添加し、その後、その混合物を１時間、周囲温度で攪拌した。その混合物の揮発成分を減圧下で除去し、得られた油をＴＨＦ（３０ｍＬ）と最低限の量の水に溶解し、ＤＩＰＥＡの添加によってそのｐＨを９に調整した。ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＦｍｏｃ−ＯＳｕ（９０７ｍｇ、２．６９ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、１時間、周囲温度で攪拌した。ＴＬＣ分析は、生成物の形成を示した（Ｒｆ＝０．５５；９：１：０．０１  ＤＣＭ−ＭｅＯＨ−ＡｃＯＨ、ＵＶ２５４ｎｍ、ＴＬＣは、ＥｔＯＨ中のニンヒドリンの３％（ｗ／ｖ）溶液と共に加熱することによって展開した）。その混合物の揮発成分を減圧下で除去し、得られた油を最低限の容量の飽和ＮａＨＣＯ３に溶解した。その後、その水溶液をＥｔ２Ｏ（１００ｍＬ×２）で抽出し、ＨＣｌ（１Ｍ）で酸性（ｐＨ  〜１）にし、ＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ×２）で再び抽出した。合わせたＥｔＯＡｃ層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、無色の油として生成物を得た。
【０２８５】
実施例１５：Ｇｌｕ−Ｆｉｂペプチドへのスクシニル化Ｆｍｏｃ−ジアミンおよびピペラジン酢酸のカップリング：
約１０ｍｇの支持体結合［Ｇｌｕ１］−フィブリノペプチドＢヒト樹脂（参照：実施例１０）をＤＭＦ中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンで処理し（２ｍＬ×１分、濾過、その後、２ｍＬ×５分）、濾過し、洗浄した（ＮＭＰ）。スクシニル化Ｆｍｏｃ−ジアミン（またはそれらのＤＩＰＥＡ塩、例えば、上の実施例１１〜１４において示したもの［化合物１２５を作るために使用した、および関係のない物質の社内生産から入手できるが、本明細書に開示する方法を用いて製造することができた、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＨを除く］、その樹脂上のＧｌｕ−Ｆｉｂ量に対して１０当量）を、ＮＭＰ（〜１ｍＬ）中のＨＡＴＵ（Ｐ／Ｎ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１７０３３、９．５当量）およびＤＩＰＥＡ（３０当量）で活性化した。それらの活性化された化合物をその樹脂に添加し、３０分間混合した。その後、樹脂を濾過し、ＮＭＰで洗浄し、上で論じたように、ＤＭＦ中の２０％（ｖ／ｖ）ピペラジンでＦｍｏｃ基を処理して除去した。その後、ＮＭＰ（〜１．５ｍＬ）中のＨＡＴＵ（９．５当量）およびＤＩＰＥＡ（６０当量）を使用して、ピペラジン酢酸−ＴＦＡ塩（１０当量）を活性化した。その後、その活性化された化合物の溶液をその樹脂に添加した。３０分後、その樹脂をＮＭＰ、続いてＣＨ３ＣＮで洗浄した。その後、９５：５  ＴＦＡ−水を使用して（２００μＬ、２時間）、その樹脂から標識付ペプチドを切断（および脱保護）し、ジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）を使用して沈殿させた。
【０２８６】
様々な標識付ペプチドのＭＳ分析（ＥＳ−ＭＳ、水中、直接注入）からのデータ
化合物１２０：（Ｎ−メチル−ピペラジン）アセチル−Ｎ（Ｍｅ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ（Ｍｅ）−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−Ｇｌｕ−Ｆｉｂ：算出ＭＨ＋＝１８８０．９、実測ＭＨ＋＝１８８０．３
化合物１２１：（Ｎ−メチル−ピペラジン）アセチル−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−Ｇｌｕ−Ｆｉｂ：算出ＭＨ＋＝１８５３．８、実測ＭＨ＋＝１８５３．８
化合物１２２：（Ｎ−メチル−ピペラジン）アセチル−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ（Ｍｅ）−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−Ｇｌｕ−Ｆｉｂ：算出ＭＨ＋＝１８６７．９、実測ＭＨ＋＝１８６７．９
化合物１２３：（Ｎ−メチル−ピペラジン）アセチル−Ｎ（Ｍｅ）−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−Ｇｌｕ−Ｆｉｂ：算出ＭＨ＋＝１８６７．９、実測ＭＨ＋＝１８６７．９
化合物１２４：（Ｎ−メチル−ピペラジン）アセチル−ピペラジン−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−Ｇｌｕ−Ｆｉｂ：算出ＭＨ＋＝１８７９．９、実測ＭＨ＋＝１８７９．０
化合物１２５：（Ｎ−メチル−ピペラジン）アセチル−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−Ｇｌｕ−Ｆｉｂ：算出ＭＨ＋＝１８８０．９０、実測ＭＨ＋＝１８８０．９４。
【０２８７】
実施例１６：図２２ａ、２２ｂ、２３ａ、２３ｂ、２４ａおよび２４ｂの論考
図２２ａは、化合物１２２のＭＳ分析についてのプロットである。標識付ペプチドの＋２および＋３の電荷を有するイオンについて強いピークが観察される。図２２ｂは、図２２ａにおいて観察された＋２ピークの選択およびフラグメント化のＭＳ／ＭＳ分析についてのプロットである。ペプチドの娘フラグメントイオンに加えて、非コード化レポーターイオンについての強いシグナルが、１１３．１０のｍ／ｚで観察される。このデータは、同じ一般構造のコード化標識試薬が、フラグメント化して、分析物の多重分析において使用することができる固有質量のレポーターイオンが生成されることを示唆している。
【０２８８】
図２３ａは、化合物１２４のＭＳ分析についてのプロットである。標識付ペプチドの＋２および＋３の電荷を有するイオンについて強いピークが観察される。図２３ｂは、図２３ａにおいて観察された＋２ピークの選択およびフラグメント化のＭＳ／ＭＳ分析についてのプロットである。ペプチドの娘フラグメントイオンに加えて、非コード化レポーターイオンについての強いシグナルが、１１３．１０のｍ／ｚで観察される。このデータは、同じ一般構造のコード化標識試薬が、フラグメント化して、分析物の多重分析において使用することができる固有質量のレポーターイオンが生成されることを示唆している。
【０２８９】
図２４ａは、化合物１２５のＭＳ分析についてのプロットである。標識付ペプチドの＋２および＋３の電荷を有するイオンについてピークが観察される。図２３ｂは、図２４ａにおいて観察された＋２ピークの選択およびフラグメント化のＭＳ／ＭＳ分析についてのプロットである。ペプチドの娘フラグメントイオンに加えて、非コード化レポーターイオンについての強いシグナルが、１１３．１０のｍ／ｚで観察される。このデータは、同じ一般構造のコード化標識試薬が、フラグメント化して、分析物の多重分析において使用することができる固有質量のレポーターイオンが生成されることを示唆している。
【０２９０】
化合物１２０、１２１および１２３も、化合物１２２、１２４および１２５で観察されたものに類似したＭＳおよびＭＳ／ＭＳ分析下での特徴を示した。すべての場合、レポーターイオンおよび娘フラグメントイオンが観察された。従って、これらのデータは、同じ一般構造のコード化標識試薬が、フラグメント化して、分析物の多重分析において使用することができる固有質量のレポーターイオンが生成されることを示唆している。
【０２９１】
実施例１７：コード化Ｎ−（ｔ−ｂｏｃ）−アミノエタノールの合成（図２８ａ）
工程１（図２８ａ）：
無水ＴＨＦ（２００ｍＬ）中のＮ−Ｂｏｃ−サルコシン（Ｃ３、１５Ｎ）１４０（１０ｇ、５１．７ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、アルゴン圧下、カニューレを使用してＴＨＦ中のＢＨ３・ＴＨＦの１Ｍ溶液（１５．５６ｇ、１８１ｍＬ、１８１ｍｍｏｌ）を滴下した。最初は、穏やかな発泡を維持するように添加速度を制御した。発泡が停止したら、添加速度を増した。添加後、その混合物を０℃で約１．５時間攪拌した。ＴＬＣ分析によって、反応の完了を確認した。その後、０℃で注意深くメタノールを添加することによって、反応を停止させた。その反応混合物をロータベーパーで濃縮した。その後、油性残留物を追加量のメタノール（５００ｍＬ）と共蒸発させた。得られた油性残留物を、Ｃｏｍｂｉ−ｆｌａｓｈ計器を使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、８ｇ（９０％）のＮ−Ｂｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−アミノエタノール（１３Ｃ、１５Ｎ）１４１を無色の油として得た。ＭＳ（１７８，Ｍ＋Ｈ）
工程２，（図２８ａ）
ＤＣＭ（７００ｍＬ）中の１４１（７．８ｇ、４８ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（１６．７ｍＬ、１２０ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、ＭｓＣｌ（Ｐ／Ｎ：Ｆｌｕｋａ  ６４２６０、４．５ｍＬ、５７．６ｍｍｏｌ）を、攪拌しながら４分かけて添加した。０℃でさらに１５分後、その反応混合物をＴＬＣによって分析し、それは新たな生成物の形成を示した（Ｒｆ２＝０．２０、Ｒｆ３＝０．４２；１：１  ヘキサン−ＥｔＯＡｃ；ＴＬＣは、ＥｔＯＨ中の３％（ｗ／ｖ）ニンヒドリン溶液と共に加熱することによって展開した）。
【０２９２】
ＤＣＭを蒸発させ、黄色の固体をＥｔＯＡｃ（１．５Ｌ）に溶解した。ＥｔＯＡｃ層をＨＣｌ（１Ｍ、８００ｍＬ）、続いてブライン（４００ｍＬ×２）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、黄色の油を得た。その油をカラムクロマトグラフィー（１２０ｇ  ＳｉＯ２カラムＩｓｃｏ（×２）；４０ｍＬ／分、０〜５分  ヘキサン中の３５％ＥｔＯＡｃ、５〜１５分  ヘキサン中の４０％ＥｔＯＡｃ。１８ｍＬ画分を回収した；画分９〜２４は、純粋な生成物を有した）によって精製して、Ｂｏｃ＊ＮＨ＊ＣＨ２ＣＨ２ＯＭｓ  １４２を無色の油として得、それを次の工程に直ちに使用した（〜１１．５ｇ）。
【０２９３】
工程３；図２８ａ
化合物１４２（４８ｍｍｏｌ、前の反応から収率１００％と仮定）を、最小限の量のＴＨＦ（〜６０ｍＬ）を使用してケミカルガラス圧力容器に移し入れ、それにメチルアミン（Ｐ／Ｎ：Ａｌｄｒｉｃｈ  ３９５０５６、３１ｇ、１０００ｍｍｏｌ）の２Ｍ溶液（５００ｍＬ）を添加し、蓋をし、４０〜４５℃で一晩（攪拌しながら）加熱した（安全シールド使用）。ＴＬＣ分析（１：１  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）は、１４２の消費完了および新たな生成物の形成を示した（Ｒｆ４＝０．５２；１：１  ＤＣＭ−ＭｅＯＨ＋１％（ｖ／ｖ）Ｅｔ３Ｎ；先ず、ＴＬＣプレートを５分間加熱してＥｔ３Ｎを除去し、その後、ＥｔＯＨ中の３％（ｗ／ｖ）ニンヒドリン溶液と共に加熱することによって展開させた）。その後、反応混合物をロータベーパーで濃縮し、残留物を塩化メチレン（１．５ｍＬ）に溶解し、分離漏斗に移し入れた。１Ｎ  ＮａＯＨ（２００ｍＬ）およびブライン（２００ｍＬ）を添加し、抽出した。有機層を１Ｎ  ＮａＯＨ（２００ｍＬ）およびブライン（２００ｍＬ）でさらに洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。残留物をＣｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈによって精製して、１４３を無色の油として得た（６．４５ｇ、７６％）。ＭＳ（１７７  Ｍ＋Ｈ）。
【０２９４】
実施例１８：６つの同位体コード化部位を含むＦｍｏｃ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ（Ｍｅ）−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＨの合成（図２８ｂ）：
アセトン（２００ｍＬ）中の１４３（６．４ｇ、３６．５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、コハク酸無水物−１３Ｃ４（３．８ｇ、３６．５ｍｍｏｌ）を１度に添加した。その後、トリエチルアミン（５ｍＬ、３６．５ｍｍｏｌ）を滴下し、その反応混合物を室温で３０分間攪拌した。この時点で、ＴＬＣにより、出発原料の完全消失を確認した。その反応混合物をロータベーパーで濃縮し、残留物を塩化メチレン（１００ｍＬ）に溶解した。その後、ジオキサン中のＨＣｌの４Ｍ溶液（１４０ｍＬ）を添加した。５分の間に白色の沈殿が形成した。その上清をＴＬＣによって分析して、出発原料の完全消失を確認した。その反応混合物をロータベーパーで濃縮し、白色固体残留物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（ｐＨ８〜９）に溶解した。その後、前述の溶液にアセトン（４００ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｏｓｕ（１４．５ｇ、４３ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、室温で３時間攪拌した。この時点で、ＴＬＣは、反応の完了を示した。その後、反応混合物をロータベーパーで濃縮し、固体残留物を、エーテル（２００ｍＬ）および水（２００ｍＬ）を使用して分液フラスコに移し入れた。エーテル層を分離し、水性層をエーテル（２００ｍＬ×３）で抽出した。その後、そのエーテル溶液を６Ｍ  ＨＣｌでｐＨ２に酸性化し、ＥｔＯＡｃ（４×２００ｍＬ）で抽出した。合わせたＥｔＯＡｃ抽出物をブライン（５００ｍＬ×３）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。ＥｔＯＡｃをロータベーパーで蒸発させて発泡体を得、それを高真空で保持することにより１４４を白色の固体として収率９５％で得た。ＭＳ（４０３、Ｍ＝Ｈ）
実施例１９：コード化Ｎ−（Ｆｍｏｃ）−Ｎ’−（メチル）−エチレンジアミン・ＨＣｌの合成（図２９ａ）
工程１（図２９ａ）
無水ＴＨＦ（２００ｍＬ）中のＮ−Ｂｏｃ−サルコシン（１３Ｃ３、１５Ｎ）１５０（１０ｇ、５１．７ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、アルゴン圧下、カニューレを使用してＴＨＦ中のＢＨ３・ＴＨＦの１Ｍ溶液（１５．５６ｇ、１８１ｍＬ、１８１ｍｍｏｌ）を滴下した。最初は、穏やかな発泡を維持するように添加速度を制御した。発泡が停止したら、添加速度を増した。添加後、その混合物を０℃で約１．５時間攪拌した。ＴＬＣ分析によって、反応の完了を確認した。その後、０℃で注意深くメタノールを添加することによって、反応を停止させた。その反応混合物をロータベーパーで濃縮した。その後、油性残留物を追加量のメタノール（５００ｍＬ）と共蒸発させた。得られた油性残留物を、Ｃｏｍｂｉ−ｆｌａｓｈ計器を使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、８ｇ（９０％）のＮ−Ｂｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−アミノエタノール（１３Ｃ３、１５Ｎ）１５１を無色の油として得た。ＭＳ（１８０，Ｍ＋Ｈ）。
【０２９５】
工程２（図２９ａ）：
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−アミノエタノール（１３Ｃ３、１５Ｎ）１５１（８ｇ、４４．６ｍｍｏｌ）、四臭化炭素（１７．８ｇ、５３．５ｍｍｏｌ）およびアジ化ナトリウム（８．７ｇ、１３３．８ｍｍｏｌ）の混合物に、アルゴン雰囲気下、カニューレと使用して、無水ＤＭＦ（２４０ｍＬ）を添加し、得られたスラリーを５分間攪拌した。無水ジメチルホルムアミド（４５ｍＬ）中のトリフェニルホスフィン（１４ｇ、５３．５ｍｍｏｌ）の溶液を別のフラスコで作り、アルゴン下で保持した。上述のスラリーに、そのトリフェニルホスフィン溶液を、アルゴン圧下、カニューレを使用して滴下した。確実に定量的に移し入れるために、そのフラスコを追加のＤＭＦ（５ｍＬ）ですすいだ。その反応混合物を温めると明黄色が発現した。その後、その混合物を３０分間、室温で攪拌した。アリコートを取り出し、数滴のエーテルを添加した。その白色の固体を回転沈降させ、上清をＴＬＣによって分析した。出発アルコールの消失（Ｒｆ：０．２４）とより極性が低い生成物の形成（Ｒｆ：０．６５）によって、反応の完了が示された。ジエチルエーテル（１．５Ｌ）をその反応混合物に添加して、酸化トリフェニルホスホニウムを沈殿させた。その後、その得られたスラリーを焼結漏斗とセライトパッドによって濾過した。その白色固体を追加量のエーテル（５００ｍＬ）によって十分に洗浄した。その後、合わせた濾液をブライン（３００ｍＬ×４）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、ロータベーパーにおいて２５℃未満の温度で、中真空下で蒸発させた。その後、残留物を、Ｃｏｍｂｉ−Ｆａｓｈ器機を使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、アジド１５２を無色の油として得、それを、一切分析せずに、次の工程に直接使用した。
【０２９６】
工程３（図２９ａ）：
上の工程から得られたアジド１５２をメタノール（９００ｍＬ）に溶解した。その後、塩化アンモニウム飽和溶液（１８０ｍＬ）を添加し、その反応混合物を室温で５分間攪拌した。その後、亜鉛粉末（８．７ｇ、１３３．８ｍｍｏｌ）をその反応混合物に少しずつ添加した。窒素の発生が観察された。その後、その反応混合物を１０分間、室温で攪拌した。アリコートをＴＬＣによって分析し、出発原料の消失（Ｒｆ：０．６５）によって反応の完了を確認した。固体（未反応亜鉛および水酸化亜鉛）を濾過して除去し、メタノール（２００ｍＬ）で洗浄した。合わせた濾液をロータベーパーで濃縮した。残留物を塩化メチレンに溶解し、６Ｎ  ＮａＯＨ溶液（８００ｍＬ）で抽出した。水性層を塩化メチレン（８００ｍＬ）で逆抽出した。合わせた塩化メチレン抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ロータベーパーで蒸発させて、Ｂｏｃ−アミン  １５３を薄黄色の濃稠油として得た。工程２と３の両方からの総合収率は、８０％であった。ＭＳ（１７９，Ｍ＋Ｈ）
工程４（図２９ａ）：
アセトン（２００ｍＬ）中のそのＮ−Ｍｅ−Ｂｏｃ−アミン  １５３（５．６２ｇ、３１．５ｍｍｏｌ）の溶液に、アセトン（２００ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｏｓｕ（１０．６４ｇ、３１．５ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。その反応混合物を５分間、室温で攪拌した後、８０ｍＬのＮａＨＣＯ３飽和溶液を添加した。その反応混合物を２時間、攪拌し続けた。この時点で、ＴＬＣは、出発原料の消失とより極性が低い生成物の形成をを示した。アセトンをロータベーパーで蒸発させた。半固体残留物をＥｔＯＡｃ（２ｍＬ）、１Ｍ  ＨＣｌ（１２５ｍＬ）、ブライン（１２５ｍＬ）および水（２５０ｍＬ）間で分配した。ＥｔＯＡｃ層を１Ｍ  ＨＣｌ（１００ｍＬ）、ブライン＋水（１５０ｍＬ＋２５０ｍＬ）およびブライン（２５０ｍＬ×２）でさらに洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ロータベーパーで蒸発させて、オフホワイトの固体生成物（１２．６ｇ）を得、それを塩化メチレン（２００ｍＬ）に溶解し、４Ｎ  ＨＣｌ（１８８ｍＬ）で３０分間処理して、Ｆｍｏｃアミン塩酸塩１５４を白色の固体として得た（１０．４ｇ）ＭＳ（３０１、Ｍ＋Ｈ）。
【０２９７】
実施例２０：８つの同位体コード化部位を含むＦｍｏｃ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ（Ｍｅ）−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＨの合成（図２９ｂ）：
塩化メチレン（６００ｍＬ）中の塩酸Ｆｍｏｃ−アミン  １５４（７．２５ｇ、２１．５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、コハク酸無水物（１３Ｃ４）を一度に添加した。その後、Ｅｔ３Ｎ（４．５ｍＬ、３２．３ｍｍｏｌ）を滴下した。その反応混合物を３０分間、室温で攪拌した後、ＴＬＣ分析は、出発原料の完全消失を示した。塩化メチレンをロータベーパーで蒸発させた。得られた残留物をＥｔＯＡｃ（２Ｌ）と１Ｍ  ＨＣｌ（３５０ｍＬ）とで分配した。有機層を１Ｍ  ＨＣｌ（２００ｍＬ）およびブライン（２００ｍＬ×４）でさらに洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて、白色発泡体を得、それを高真空下で４８時間保持して、コード化Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ（Ｍｅ）−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＨ  １５５を白色の固体として得た（７．５ｇ、８６％）。ＭＳ（４０５，Ｍ＋１）
実施例１９および２０に従って作製した組成物は、実質的には上の実施例１〜７（図７ａ〜７ｃも参照）において説明したような合成プロトコル用いて、図２７ａ〜２７ｃのコード化標識試薬の合成において使用することができる。図２５ａ〜２５ｂは、本明細書に開示する一般手順を用いることによって作製することができる幾つかの標識試薬を図示するものである。さらに、図２６ａ〜２６ｂは、図２５ａ〜２５ｃに開示する標識試薬を使用することによって作製することができる幾つかの標識された分析物を図示するものである。上で論じたように、前記標識された分析物は、質量分析計内でフラグメント化すると、フラグメントイオンおよびフラグメントイオンの混合物を生成し、それらを使用して、様々なサンプル中の分析物を定量することができる。
【０２９８】
適切なコード化出発原料の選択により、単に日常的な実験との併用で、上に記載した手順を用いて、本明細書に開示する本発明（単数または複数）による標識試薬として使用することができる様々な他のコード化組成物を作製するできることも理解されるであろう。従って、上に示した実施例は、如何なる点においても限定を意図しない。
【０２９９】
本教示を様々な実施形態に関連して説明しているが、本教示をそうした実施形態に限定する意図はない。それどころか、当業者には理解されるであろうが、本教示は、様々な代替、変更および等価物を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０３００】
【図１−１】図１ａは、標識試薬または標識された分析物の要素およびそのフラグメント化の特徴の図解である。図１ｂは、例示的Ｎ−メチルピペラジン系標識試薬または標識された分析物の一般的要素およびそのフラグメント化の特徴の図解である。図１ｃは、同定された一般式の標識された分析物の一般的要素およびそのフラグメント化の特徴の図解である。
【図１−２】図１ｄは、幾つかの例示的同重体標識試薬の一般式の図解である。
【図２Ａ】図２ａは、図２ｂに図示されている化合物と共に考えあわせると９重セットを作ることができる、様々な同重体化合物の図解である。
【図２Ｂ】図２ｂは、図２ａに図示されている化合物と共に考えあわせると９重セットを作ることができる、様々な同重体化合物の図解である。
【図２Ｃ】図２ｃは、図２ａ、２ｂ、３ａおよび３ｂに図示されている同重体化合物から生成することができるレポーターイオン（すなわち、シグネチャーイオン）についての様々な可能な構造の図解である。
【図３Ａ】図３ａは、図３ｂに図示されている化合物と共に考えあわせると９重セットを作ることができる、様々な同重体化合物の図解である（この場合、バランスは、環構造を含む）。
【図３Ｂ】図３ｂは、図３ａに図示されている化合物と共に考えあわせると９重セットを作ることができる、様々な同重体化合物の図解である（この場合、バランスは、環構造を含む）。
【図４】図４ａは、例示的同重体化合物の図解である。図４ｂは、例示的異性同重体化合物の図解である。
【図５】図５は、例示的支持体結合標識された分析物の支持体からの切断プロセスの図解である。
【図６】図６ａは、レポーターが複数の同位体濃縮部位を含む、標識試薬または標識された分析物の図解である。図６ｂは、バランス（リンカー）が複数の同位体濃縮部位を含む、標識試薬または標識された分析物の図解である。
【図７Ａ】図７ａは、例示的標識試薬の例示的合成の工程１〜３の図解である。
【図７Ｂ】図７ｂは、例示的標識試薬の例示的合成の工程４〜５の図解である。
【図７Ｃ】図７ｃは、例示的標識試薬の例示的合成の工程６〜７の図解である。
【図８】図８は、様々な活性エステルの合成スキームの図解である。
【図９Ａ】図９ａは、本明細書に開示する本発明（単数または複数）の実施により様々な同重体化合物を作製するために使用することができる同位体コード化原料物質を図示する表である。
【図９Ｂ】図９ｂは、本明細書に開示する本発明（単数または複数）の実施により様々な同重体化合物を作製するために使用することができる同位体コード化原料物質を図示する表である。
【図９Ｃ】図９ｃは、本明細書に開示する本発明（単数または複数）の実施により様々な同重体化合物を作製するために使用することができる同位体コード化原料物質を図示する表である。
【図１０Ａ】図１０ａは、本明細書に開示する本発明（単数または複数）の実施により様々な同重体化合物を作製するために使用することができる同位体コード化原料物質を図示する表である。
【図１０Ｂ】図１０ｂは、本明細書に開示する本発明（単数または複数）の実施により様々な同重体化合物を作製するために使用することができる同位体コード化原料物質を図示する表である。
【図１０Ｃ】図１０ｃは、本明細書に開示する本発明（単数または複数）の実施により様々な同重体化合物を作製するために使用することができる同位体コード化原料物質を図示する表である。
【図１１】図１１ａは、コード化Ｎ−メチル−ピペラジン誘導体の作製の際に使用することができるコード化サルコシン誘導体への１つの可能な合成経路の図解である。図１１ｂは、コード化Ｎ−メチル−ピペラジン誘導体の作製の際に使用することができるコード化サルコシン誘導体への１つの可能な合成経路の図解である。
【図１２Ａ】図１２ａは、２つの同位体コード化部位を含むコード化Ｎ−メチルエチレンジアミンへの１つの可能な合成経路の図解である。
【図１２Ｂ】図１２ｂは、４つの同位体コード化部位を含むコード化Ｎ−メチルエチレンジアミンへの１つの可能な合成経路の図解である。
【図１２Ｃ】図１２ｃは、４つの同位体コード化部位を含むコード化Ｎ−メチルエチレンジアミンへの１つの可能な合成経路の図解である。
【図１２Ｄ】図１２ｄは、４つの同位体コード化部位を含むコード化ピペラジンへの１つの可能な合成経路の図解である。
【図１２Ｅ】図１２ｅは、２つの同位体コード化部位を含むコード化ピペラジンへの１つの可能な合成経路の図解である。
【図１３】図１３は、同重体標識試薬（すなわち、標識１および標識２）のセットを使用して試験サンプルおよび対照サンプルを加工するための１つの可能なワークフローの図解である。
【図１４Ａ】図１４ａは、同重体標識試薬（すなわち、標識１および標識２）のセットを使用して試験サンプルおよび対照サンプルを加工するための１つの可能なワークフローの図解である。
【図１４Ｂ】図１４ｂは、捕捉支持体の要素の図解である。
【図１４Ｃ】図１４ｃは、例示的捕捉支持体の図解である。
【図１５】図１５は、同重体標識試薬（すなわち、標識１および標識２）のセットを使用して試験サンプルおよび対照サンプルを加工するための１つの可能なワークフローの図解である。
【図１６】図１６は、同重体標識試薬（すなわち、標識１、標識２、標識３および標識４）のセットを使用して２つのタンパク質サンプルを加工するための１つの可能なワークフローの図解である。
【図１７】図１７は、同重体標識試薬（すなわち、標識１、標識２、標識３および標識４）のセットを使用して２つのタンパク質サンプルを加工するための１つの可能なワークフローの図解である。
【図１８】図１８は、同重体標識試薬（すなわち、標識１、標識２、標識３、標識４、標識５および標識６）のセットを使用して２つのタンパク質サンプルを加工するための１つの可能なワークフローの図解である。
【図１９Ａ】図１９ａは、同重体標識試薬のセットで差別的に標識された９つの異なるサンプルから誘導された、選択された質量のペプチドのＭＳ分析の標識付けおよび生成物（特定のｍ／ｚでのもの）の図解である。
【図１９Ｂ】図１９ｂは、図１９ａに描かれているＭＳ分析から選択された、９つの差別的に標識されたペプチド（特定のｍ／ｚ値のもの）のＭＳ／ＭＳ分析の結果の図解である。
【図２０】図２０は、幾つかの例示的標識試薬への可能な経路の図解である。
【図２１】図２１は、幾つかの例示的標識試薬への可能な経路の図解である。
【図２２Ａ】図２２ａは、本明細書に記載する例示的標識試薬の非コード化バージョンで標識されたペプチド（［Ｇｌｕ１］−フィブリノペプチドＢ  ヒト）についてのＭＳデータのプロットである。
【図２２Ｂ】図２２ｂは、ＣＩＤフラグメント化およびそれらのフラグメントの再分析に付された、図２２ａに図示されている標識付ペプチドの、選択されたピークについてのＭＳ／ＭＳデータのプロットである。
【図２３Ａ】図２３ａは、本明細書に記載する例示的標識試薬の非コード化バージョンで標識されたペプチド（［Ｇｌｕ１］−フィブリノペプチドＢ  ヒト）についてのＭＳデータのプロットである。
【図２３Ｂ】図２３ｂは、ＣＩＤフラグメント化およびそれらのフラグメントの再分析に付された、図２３ａに図示されている標識付きペプチドの、選択されたピークについてのＭＳ／ＭＳデータのプロットである。
【図２４Ａ】図２４ａは、本明細書に記載する例示的標識試薬の非コード化バージョンで標識されたペプチド（［Ｇｌｕ１］−フィブリノペプチドＢ  ヒト）についてのＭＳデータのプロットである。
【図２４Ｂ】図２４ｂは、ＣＩＤフラグメント化およびそれらのフラグメントの再分析に付された、図２４ａに図示されている標識付ペプチドの、選択されたピークについてのＭＳ／ＭＳデータのプロットである。
【図２５ａ】図２５ａは、図２５ｂに図示されている化合物と共に考え合わせると８重セットを作ることができる、様々な同重体標識試薬の図解である。
【図２５ｂ】図２５ｂは、図２５ａに図示されている化合物と共に考え合わせると８重セットを作ることができる、様々な同重体標識試薬の図解である。
【図２６Ａ】図２６ａは、図２６ｂに図示されている化合物と共に考え合わせると８重セットを作ることができる、様々な同重体標識された分析物の図解である。
【図２６Ｂ】図２６ｂは、図２６ａに図示されている化合物と共に考え合わせると８重セットを作ることができる、様々な同重体標識された分析物の図解である。
【図２７Ａ】図２７ａは、例示的標識試薬の例示的合成の工程１〜３の図解である。
【図２７Ｂ】図２７ｂは、例示的標識試薬の例示的合成の工程４〜５の図解である。
【図２７Ｃ】図２７ｃは、例示的標識試薬の例示的合成の工程６〜７の図解である。
【図２８】図２８ａは、２つの同位体コード化部位を含むコード化Ｎ−メチルエチレンジアミンへの１つの可能な合成経路の図解である。図２８ｂは、６つの同位体コード化部位を含むＦｍｏｃ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ（Ｍｅ）−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＨの合成の図解である。
【図２９】図２９ａは、４つの同位体コード化部位を含むコード化Ｎ−メチルエチレンジアミンへの１つの可能な合成経路の図解である。図２９ｂは、８つの同位体コード化部位を含むＦｍｏｃ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ（Ｍｅ）−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＨの合成の図解である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８】
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【図２９】
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