(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化状態の間葉系幹細胞にＣＤ２７１発現ベクターまたは細胞膜透過化型リコンビナントＣＤ２７１タンパク質を導入することによって、間葉系幹細胞の未分化状態を維持する方法。
【請求項２】
ＣＤ２７１発現ベクターが配列表配列番号１に記載のＣＤ２７１をコードする遺伝子の全部が組み込まれた発現ベクターである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＤ２７１発現ベクターが図１に記載のＣＤ２７１発現ベクターである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法によって、未分化状態が維持された間葉系幹細胞。
【請求項５】
ＣＤ２７１発現ベクターを含む間葉系幹細胞の未分化状態を維持するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ２７１（ＮＧＦＲ，ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：低親和性神経成長因子レセプターまたはｐ７５ＮＴＲ、ｐ７５  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｐ７５神経成長因子レセプター、以下、ＣＤ２７１とする）を用いて間葉系幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの未分化状態を維持する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞（以下、ＭＳＣｓとする）、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの細胞は、未分化であり、多能性を有する細胞として知られている。しかし、長期培養や培養条件の微細な変化によって多能性が喪失されたり、非特異的な分化が誘発されたりするという問題があり、様々な未分化状態を維持する方法が検討されてきた。
例えば、Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｉｎ、ＡＯＦ２、ＴＩＦ１β等をコードする遺伝子をこれらの細胞に導入する方法（特許文献１〜３）や、Ｗｎｔファミリーのタンパク質を含む未分化状態の維持用培地を用いて培養する方法（特許文献４）等が開発されている。
【０００３】
Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｉｎ、ＡＯＦ２、ＴＩＦ１βは、マウスＥＳ細胞が未分化状態を維持しながら増殖する際に必要となるＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆａｃｔｏｒ）存在下で、マウスＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子として知られている。しかし、これらは細胞質あるいは核内において発現するため、目的とするタンパク質が発現したか否かを細胞が生きたままの状態で確認することは困難である。従って、導入処理後の細胞集団において、タンパク質を発現している細胞と発現していない細胞を選別することが容易ではなく、それぞれの細胞が混在した状態であるため、その後の実験、解析等の障害となる可能性がある。
通常、この問題を解決するために、遺伝子導入を行う際に、ジェネティシン、ハイグロマイシン等の薬剤に対する耐性遺伝子を同時に導入し、それらの薬剤を用いて細胞を選別する。しかし、この方法はあくまでも薬剤耐性遺伝子の発現を確認するものであって、目的遺伝子の発現そのものを直接的に確認するものではない。また、目的遺伝子を発現している細胞のみを選別するためには、薬剤耐性となった細胞をシングルコロニーから培養する必要があるが、これには長期間の培養が必要となるため、その後の分化に影響を与える可能性も考えられる。従って、Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｉｎ、ＡＯＦ２、ＴＩＦ１β等の細胞質あるいは核内において発現する遺伝子を導入する方法はさまざまな問題を含んでいる。
【０００４】
ＣＤ２７１は、従来、神経系の細胞の細胞膜に局在して発現し、神経細胞の発生、生存および分化に関与することが知られていた。そして、近年、ＭＳＣｓの細胞膜にも特異的に発現していることが示され、ＭＳＣｓの最適なマーカーとして、ＣＤ２７１を用いた骨髄抽出液などからＭＳＣｓを濃縮する方法が開発されている（特許文献５）。
ＣＤ２７１は細胞膜に局在して発現することから、Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｉｎ、ＡＯＦ２、ＴＩＦ１β等の細胞質あるいは核内において発現する遺伝子を導入する場合と異なり、ＣＤ２７１を導入した場合に、蛍光ラベルしたＣＤ２７１に対する抗体を用いることによって、ＣＤ２７１を発現している細胞と発現していない細胞を生きたまま選別することが可能であるという利点がある。
しかし、ＣＤ２７１のＭＳＣｓにおける機能については明らかにされておらず、ＣＤ２７１を用いることにより、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの未分化状態が維持できることも予測されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−７２１８６号公報
【特許文献２】特開２００９−４５００４号公報
【特許文献３】特開２００９−１１２５５号公報
【特許文献４】特開２００６−３４５７０２号公報
【特許文献５】特開２００９−６０８４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＣＤ２７１を用いて間葉系幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの未分化状態を維持する方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの多能性の未分化細胞に、ＣＤ２７１を発現するベクターを導入する、または細胞膜透過化型リコンビナントＣＤ２７１タンパク質を直接導入することによって、これらの細胞の各種細胞系統への分化が抑制され、これらの細胞の未分化状態を維持できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明者らは、本発明において、ＣＤ２７１を発現するベクターを導入することで強制発現させた骨髄由来の間葉系幹細胞や歯髄由来の間葉系幹細胞において、骨芽細胞および脂肪細胞等への分化や、骨芽細胞／象牙芽細胞への分化が抑制されたことを確認している。
【０００８】
すなわち、本発明は次の（１）〜（９）の間葉系幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの未分化状態を維持する方法等に関する。
（１）未分化状態の細胞にＣＤ２７１発現ベクターまたは細胞膜透過化型リコンビナントＣＤ２７１タンパク質を導入することによって、細胞の未分化状態を維持する方法。
（２）ＣＤ２７１発現ベクターが配列表配列番号１に記載のＣＤ２７１をコードする遺伝子の全部または一部が組み込まれた発現ベクターである上記（１）に記載の方法。
（３）ＣＤ２７１発現ベクターが図１に記載のＣＤ２７１発現ベクターである上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）未分化状態の細胞が、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞のいずれかである上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）上記（１）〜（４）に記載の方法によって、未分化状態が維持された細胞。
（６）細胞の未分化状態を維持するためのＣＤ２７１発現ベクターまたは細胞膜透過化型リコンビナントＣＤ２７１タンパク質。
（７）ＣＤ２７１発現ベクターまたは細胞膜透過化型リコンビナントＣＤ２７１タンパク質のいずれか１つ以上を含む細胞の未分化状態を維持するためのキット。
（８）ＣＤ２７１を有効成分とする、細胞分化を抑制する、または細胞の未分化状態を維持するための組成物。
（９）上記（８）に記載の組成物を含む、脂肪細胞への細胞分化を抑制することによるメタボリックシンドローム対処用の医薬品。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法を用いることにより、未分化状態が長期的に維持された間葉系幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞を提供することができる。また、ＣＤ２７１を発現するベクターや、細胞膜透過化型リコンビナントＣＤ２７１タンパク質を、これらの細胞の未分化状態維持物質として提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＣＤ２７１発現ベクターを示した図である（実施例１）。
【図２】ＣＤ２７１ポジティブ細胞におけるＣＤ２７１の発現を確認した図である（試験例１）。
【図３】ＣＤ２７１ポジティブ細胞におけるアルカリフォスファターゼの活性レベルとＣＤ２７１の発現量の相関を示した図である（試験例２）。
【図４】ＣＤ２７１強制発現細胞における未分化状態の維持を確認した図である（実施例２）。
【図５】ＣＤ２７１強制発現細胞における未分化状態の維持を確認した図である（実施例２）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の「細胞の未分化状態を維持する方法」は、ＣＤ２７１をコードする遺伝子を含む組換え遺伝子又は当該組換え遺伝子が挿入されたＣＤ２７１発現ベクターを幹細胞等の細胞に導入することで、細胞の未分化状態を維持することができる方法であればいずれの方法も含むことができる。ＣＤ２７１発現ベクターの導入により、幹細胞等の導入細胞内でＣＤ２７１を強制発現させることで幹細胞の未分化状態を制御することが好ましい。
【００１２】
本発明の「ＣＤ２７１発現ベクター」は、ＣＤ２７１をコードする遺伝子を含む組換え遺伝子又は当該組換え遺伝子が挿入されたＣＤ２７１を発現できるベクターであればいずれのものも含むことができる。例えば、配列表配列番号１に記載のＣＤ２７１をコードする遺伝子が配列表配列番号２に記載の発現ベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３に組み込まれたＴＯＹＯＢＯ  ｃＤＮＡ  Ｃｌｏｎｅｓ  ＮＧＦＲ，Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＦＣＣ１１７Ｃ０２（図１）等の市販の製品や、ＣＤ２７１をコードする遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社）、ｐＣＭＶ５、ｐＥＧＦＰシリーズ（クロンテック社）、ｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶシリーズ（ＳＩＧＭＡ社）等の発現ベクターに組み込んだもの等が挙げられる。本発明の「ＣＤ２７１発現ベクター」に組み込まれるＣＤ２７１遺伝子は、幹細胞等の細胞の未分化状態を維持できるものであれば、ＣＤ２７１をコードする遺伝子の全部でなくてもよく、ＣＤ２７１の機能領域等、必要な配列のみをコードする遺伝子であってもよい。
【００１３】
本発明の「細胞膜透過化型リコンビナントＣＤ２７１タンパク質」とは、ポリアルギニンなどの細胞膜透過性を有する物質が結合されたＣＤ２７１タンパク質のことをいう。ここで、幹細胞等に導入するＣＤ２７１タンパク質は、幹細胞等の細胞の未分化状態を維持できるものであればＣＤ２７１タンパク質全部でなく、その一部をポリアルギニンなどの細胞膜透過性を有する物質に結合したものであってもよい。
【００１４】
本発明の「未分化状態の細胞」とは、自己複製能と多分化能の二つの機能を維持している状態の細胞のことをいい、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞等において、これらの機能が維持された細胞のことをいう。
【００１５】
本発明の「細胞の未分化状態を維持するためのキット」とは、ＣＤ２７１を幹細胞等の細胞内で発現させるための「ＣＤ２７１発現ベクター」やＣＤ２７１を幹細胞等の細胞内に導入するための「細胞膜透過化型リコンビナントＣＤ２７１タンパク質」、さらに、これらの導入等に必要な一連の試薬一式等を１つ以上組合せてキット化したもののことをいう。
【００１６】
「ＣＤ２７１を有効成分とする、細胞分化を抑制する、または細胞の未分化状態を維持するための組成物」とは、ＣＤ２７１を有効成分として、細胞分化の抑制や、細胞の未分化状態を維持できる組成物であればいずれのものも含まれる。  
有効成分とするＣＤ２７１は、ＣＤ２７１を細胞内で発現するための本発明の「ＣＤ２７１発現ベクター」や、細胞内に導入するための「細胞膜透過化型リコンビナントＣＤ２７１タンパク質」であってもよい。この組成物は、有効成分とするＣＤ２７１以外に、薬学的に許容可能な担体等を含むこともできる。
【００１７】
本発明の「ＣＤ２７１を有効成分とする、細胞分化を抑制する、または細胞の未分化状態を維持するための組成物」は、細胞分化の抑制や、細胞の未分化状態が維持できることから、例えば、細胞の脂肪細胞への分化を抑制することにより、肥満抑制剤等の医薬品の製造や、メタボリックシンドロームの予防や治療等、メタボリックシンドロームの対処に用いることができる。また、細胞の骨芽細胞への分化を抑制することにより、過剰な骨形成によって生じる大理石症、骨硬化症などの予防や治療や、そのための医薬品の製造等に用いることもできる。本発明において有効成分とされるＣＤ２７１は、分化した細胞の増殖によって起きる過形成を抑制する因子として機能することが期待できる。
【００１８】
以下、試験例、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１９】
［試験例］
ＭＳＣｓの最も顕著な特徴は多分化能を有し、骨芽細胞や脂肪細胞などに分化することである。そこで、ＭＳＣｓに特異的に発現するＣＤ２７１は、このＭＳＣｓの多分化能に関与した機能を有すると考え、ＣＤ２７１を発現している細胞と発現していない細胞において、その分化能の違いを検討した。
【００２０】
［試験例１］
フローサイトメトリーを用いて、ヒト乳歯歯髄からＣＤ２７１を発現している細胞（ＣＤ２７１ポジティブ細胞）とＣＤ２７１を発現していない細胞（ＣＤ２７１ネガティブ細胞）をそれぞれフローサイトメトリー（ＣＤ２７１：ＰＥ−Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ２７１  Ｃａｔ：５５７１９６，ＢＤ  ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＴＭ、ＡＰＣ  Ｍｏｕｓｅ−Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ９０  Ｃａｔ：５５９８６９，ＢＤ  ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＴＭ）を用いて選別した。
まず、間葉系の幹細胞（ＭＳＣｓ）のマーカーであるＣＤ９０の抗体を用いて間葉系の幹細胞（ＭＳＣｓ）を単離し、次にＣＤ２７１の抗体を用いてこのうちのＣＤ２７１ポジティブ細胞を選別した。骨芽細胞／象牙芽細胞・脂肪細胞・神経細胞への分化能を有している歯髄細胞は間葉系細胞であり、ＣＤ９０を発現していることから、歯髄細胞におけるＣＤ２７１ポジティブ細胞も、間葉系の幹細胞（ＭＳＣｓ）に該当し得る。
選別した細胞をそれぞれ、２０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むα−ＭＥＭ培地でコンフルエント状態になるまで培養した。次にそれぞれの細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを生成し、これをもとにＣＤ２７１のｍＲＮＡ発現を、リアルタイムＰＣＲ法を用いて確認した。
その結果、ＣＤ２７１ポジティブ細胞ではＣＤ２７１ネガティブ細胞と比較して約４０倍のＣＤ２７１を発現していることが確認された（図２）。
リアルタイムＰＣＲ法には、以下のプライマー、試薬、解析機器を用いた。
Ｐｒｉｍｅｒ：Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｐｒｉｍｅｒ，ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  ＩＤ：ＨＡ０３６６９９，タカラバイオ社
試薬：ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ，製品コード：ＲＲ０８１Ａ，タカラバイオ社
解析機器：Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＩＩ  Ｓｙｓｔｅｍ，製品コード：ＳＣ２００Ｎ，Ｃｅｐｈｅｉｄ社
【００２１】
［試験例２］
上記試験例１と同様に選別培養したＣＤ２７１ポジティブ細胞とＣＤ２７１ネガティブ細胞を、骨芽細胞分化誘導培地（１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−２、５０μｇ／ｍｌ  Ｌ−ａｓｃｏｒｂａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１０ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２０％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むα−ＭＥＭ培地）でさらに６日、１２日、２４日間培養し、骨芽細胞分化の指標とされるアルカリフォスファターゼの活性をａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  （ＡＬＰ）ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｒｅａｄｙ−ｔｏｕｓｅｔａｂｌｅｔｓ，Ｒｏｃｈｅ）を用いた染色によって比較した。また、上記試験例１と同様の方法で、培養したそれぞれの細胞からｔｏｔａｌＲＮＡを生成し、これをもとにＣＤ２７１のｍＲＮＡ発現を、リアルタイムＰＣＲ法を用いて確認した。
その結果、ＣＤ２７１ポジティブ細胞では、ＣＤ２７１ネガティブ細胞と比較して、アルカリフォスファターゼの活性化が抑制された。また、ＣＤ２７１ポジティブ細胞においては、アルカリフォスファターゼの活性レベルの上昇にともない、ＣＤ２７１の発現量が減少した（図３）。
【００２２】
上記試験例１、２の結果より、ＣＤ２７１を発現しているヒト乳歯歯髄において、骨芽細胞への分化が抑制される傾向が観察されたことから、ＭＳＣｓに特異的に発現するＣＤ２７１が、細胞の分化を抑制する働きあることが示唆された。
【実施例１】
【００２３】
＜間葉系幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞の未分化状態を維持する方法＞
マウス由来の未分化間葉系幹細胞株であるＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞にＣＤ２７１を遺伝子導入することによって、恒常的にＣＤ２７１を発現させることで、この細胞の未分化状態を維持した。
【００２４】
１．試料
１）Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（理化学研究所・細胞開発銀行より入手）を、１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，１００Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含む細胞培養液中（α−ＭＥＭ）で、ＣＯ２インキュベーターを用い、３７℃，５％ＣＯ２の条件下で培養した。
２）ＣＤ２７１発現ベクター
配列表配列番号１に記載のＣＤ２７１をコードする遺伝子が配列表配列番号２に記載の発現ベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３に組み込まれたＴＯＹＯＢＯ  ｃＤＮＡ  Ｃｌｏｎｅｓ  ＮＧＦＲ，Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＦＣＣ１１７Ｃ０２（図１）を用いた。
図１のｃＤＮＡ部分はＣＤ２７１をコードする遺伝子（配列表配列番号１）を指す。
【００２５】
２．Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞へのＣＤ２７１発現ベクターの導入
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を、１０％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，１００Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含む細胞培養液中（α−ＭＥＭ）で、５０％コンフルエント状態になるまで６ウェルディッシュで前培養した。その後、培養液を、５％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍを含む細胞培養液（α−ＭＥＭ）に交換し、２〜３時間の前培養を行った。
ＴＯＹＯＢＯ社から購入したＣ２７１発現ベクター（ＴＯＹＯＢＯ  ｃＤＮＡ  Ｃｌｏｎｅｓ  ＮＧＦＲ，Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＦＣＣ１１７Ｃ０２）をＤＮＡ制限酵素ＳｃａＩで切断し、線状化ベクターを生成した。また、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに含まれるジェネティシン耐性遺伝子発現領域をＤＮＡ制限酵素ＫｐｎＩおよびＡｐＬＩで切り出した。
線状化したＣＤ２７１発現ベクター（２μｇ）とｐｃＤＮＡ３．１ベクターから切り出したジェネティシン耐性遺伝子発現領域を含むＤＮＡ（０．３μｇ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸを用いて付属のマニュアルに従って細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから６時間後に細胞培養液を１０％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，１００Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含む細胞培養液に交換し、２４時間培養した。その後、ジェネティシン存在下で１０日間培養した。その後、蛍光ラベルしたＣＤ２７１抗体を用いてＦＡＣＳ解析を行い、ＣＤ２７１を発現している細胞を選別した。
【００２６】
３．Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（ＣＤ２７１強制発現細胞）
導入後のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるＣＤ２７１タンパク発現の確認を、試験例１に記載の方法と同様の方法で確認した。ＣＤ２７１強制発現細胞は、顕微鏡下の観察において、ＣＤ２７１発現ベクター導入による形態的な変化が認められなかった。
【実施例２】
【００２７】
＜ＣＤ２７１強制発現細胞における未分化状態の維持の確認＞
実施例１のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（ＣＤ２７１強制発現細胞）を用い、１）骨芽細胞および２）脂肪細胞への分化を誘導することで、ＣＤ２７１強制発現細胞における未分化状態の維持を確認した。
【００２８】
１）骨芽細胞への分化誘導
実施例１のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（ＣＤ２７１強制発現細胞）をコンフルエント状態になるまで、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むα−ＭＥＭ培地で３週間程度培養した。次に骨芽細胞分化誘導培地（１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−２、１０‐８Ｍ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、５０μｇ／ｍｌ  Ｌ−ａｓｃｏｒｂａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１０ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１０％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むα−ＭＥＭ培地）でさらに１２日間培養し、上記試験例２と同様にアルカリフォスファターゼ染色を行った。比較としてＣＤ２７１を含まない発現ベクターのみを導入した細胞（コントロール細胞）を用いた。
その結果、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（ＣＤ２７１強制発現細胞）では、コントロール細胞と比較して顕著にアルカリフォスファターゼ活性が抑制され、骨芽細胞への分化が抑制されていることが確認された（図４）。
【００２９】
２）脂肪細胞への分化誘導
実施例１のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（ＣＤ２７１強制発現細胞）を上記１）と同様にコンフルエント状態になるまで培養し、その後、脂肪細胞分化誘導培地（１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−２、１０‐８Ｍ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、１０％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むα−ＭＥＭ培地）でさらに１２日間培養し、脂肪細胞の指標とされる脂肪球の形成をＯｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ染色によって観察した。細胞核はヘマトキシリンによって染色した。比較としてＣＤ２７１を含まない発現ベクターのみを導入した細胞（コントロール細胞）を用いた。
その結果、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（ＣＤ２７１強制発現細胞）では、コントロール細胞と比較して顕著に脂肪球の形成が抑制され、脂肪細胞への分化が抑制されていることが確認された（図５）。
【００３０】
上記１）、２）の結果より、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（ＣＤ２７１強制発現細胞）において未分化の状態が維持されていることが示された。従って、本発明のＣＤ２７１を用いる方法により、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞の未分化状態が維持できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の方法を用いることにより、未分化状態が長期的に維持された間葉系幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞を提供することができる。また、ＣＤ２７１を発現するベクターや、細胞膜透過化型リコンビナントＣＤ２７１タンパク質を、これらの細胞の未分化状態維持物質として提供することもできる。さらに、ＣＤ２７１を有効成分とする細胞分化の抑制および未分化状態を維持するための組成物を用い、医薬品（例えば脂肪細胞分化を抑制することによるメタボリックシンドローム治療のための医薬品等）を提供することもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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