(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドを細胞培養物中で産生させる方法であって、
（１）ａ．目的とするポリペプチドをコードする核酸を含む細胞；および
ｂ．７ｍＭ〜３０ｍＭのロイシン、７ｍＭ〜３０ｍＭのリシン、７ｍＭ〜３０ｍＭのトレオニン、７ｍＭ〜３０ｍＭのプロリンおよび７ｍＭ〜３０ｍＭのバリンを含む、細胞培養培地
を含む細胞培養物を提供する工程；および
（２）該細胞培養物を、目的とするポリペプチドの発現を可能にする条件のもとで維持する工程
を含む、方法。
【請求項２】
ポリペプチドを細胞培養物中で産生させる方法であって、
（１）ａ．目的とするポリペプチドをコードする核酸を含む細胞；および
ｂ．細胞培養培地中のロイシン、リシン、トレオニン、プロリンおよびバリンの合わせた濃度が３５ｍＭ〜１５０ｍＭであり、細胞培養培地中のアミノ酸の濃度が１２０ｍＭ〜３５０ｍＭである
細胞培養培地
を含む細胞培養物を提供する工程；および
（２）該細胞培養物を、目的とするポリペプチドの発現を可能にする条件のもとで維持する工程
を含む、方法。
【請求項３】
精製されたポリペプチドをローディング液から回収する方法をさらに含む、請求項２に記載の方法であって、該方法は、
該ローディング液を、媒体が媒体１ｍＬあたり少なくとも２．８ｍｇのポリペプチドと結合することをもたらす操作条件下で、カラム内の媒体に通す工程であって、ここで、該媒体は、荷電したイオン交換媒体、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂および固定化金属アフィニティークロマトグラフィー樹脂からなる群から選択される、工程；および
該精製されたポリペプチドをカラム溶出液から回収する工程
を含む、方法。
【請求項４】
精製されたポリペプチドをローディング液から回収する方法をさらに含む、請求項２に記載の方法であって、該方法は、
該ローディング液を、少なくとも０．１の分配係数によって定義される操作条件下でカラム内の媒体に通す工程；および
精製されたポリペプチドをカラム溶出液から回収する工程
を含む、方法。
【請求項５】
ポリペプチドを細胞培養物中で産生させる方法であって、
（１）ａ．目的とするポリペプチドをコードする核酸を含む細胞；および
ｂ．体積が、細胞培養培地体積の６０％〜９９％である、開始細胞培養培地
を含む、細胞培養物を提供する工程；
（２）供給用細胞培養培地を工程（１）による細胞培養物に提供する工程であって、該供給用細胞培養培地の体積は、細胞培養培地体積の１％〜４０％であり、そして、得られた細胞培養培地は、７ｍＭ〜３０ｍＭのロイシン、７ｍＭ〜３０ｍＭのリシン、７ｍＭ〜３０ｍＭのトレオニン、７ｍＭ〜３０ｍＭのプロリンおよび７ｍＭ〜３０ｍＭのバリンを含み；および
（３）該細胞培養物を、目的とするポリペプチドの発現を可能にする条件のもとで維持する工程
を含む、方法。
【請求項６】
前記細胞培養培地が３ｍＭ以上のチロシンを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞培養培地中のロイシン、リシン、トレオニンおよびバリンの合わせた濃度が、該細胞培養培地中の全必須アミノ酸の濃度の６０％〜８０％である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞培養培地中の各必須アミノ酸の合わせた濃度が、該細胞培養培地中の全アミノ酸の濃度の３０％〜５０％である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞培養培地中のアミノ酸の濃度が１２０ｍＭ〜３５０ｍＭである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞培養物中のプロリンの濃度が１ｍＭを超えて維持される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞培養物中のプロリンの濃度が２ｍＭを超えて維持される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞培養物が大規模細胞培養物である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が動物細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが精製される、請求項１、２および５〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記培地が規定培地である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００６年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６０／８５８，２８９号の優先権の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、例えば、ポリペプチドの産生において用いられる細胞培地で使用される細胞培養培地を合理的に設計するための方法；開示された方法により設計される細胞培養培地；多量の目的とするポリペプチド（例えば、抗体）を、そのような培地を使用して産生させる方法；本明細書中に開示される方法および培地を使用して産生されるポリペプチド；および、そのようなポリペプチドを含有する医薬組成物に関連する。本発明は大規模細胞培養物において特に有用である。本明細書中に開示される方法および組成物は、著量のポリペプチドを、回分式、流加回分式および灌流式の動物細胞培養物において産生させるために特に有用である。
【背景技術】
【０００３】
（関連する背景技術）
市販されているとしても、または、単に開発中であるとしても、大部分のバイオテクノロジー製造物がタンパク質治療剤であり、従って、これらのポリペプチドを細胞培養物で製造することが要求される。さらには、（例えば、細菌細胞とは対照的に）、動物細胞の細胞装置が、ポリペプチド治療剤の多くの形態（例えば、グリコシル化されたタンパク質、または、ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）など）を製造するために要求されることが多い。その結果として、これらのポリペプチドの細胞培養での産生を最適化すること、具体的には、動物細胞培養物におけるこれらのポリペプチドの産生を最適化することがますます求められている。
【０００４】
細菌細胞培養と比較した場合、動物細胞培養は産生速度がより低く、また、典型的にはより低い産生収率をもたらす。従って、著しい量の研究が、ポリペプチド産生量を最適化する動物細胞培養条件、すなわち、高い細胞密度および高い力価を裏付ける条件に焦点を当てている。例えば、細胞培養培地中のグルコース濃度を低い濃度で維持すること、および、産生段階における細胞を約４００ｍＯｓｍ〜６００ｍＯｓｍの浸透圧重量モル濃度で培養することは、動物細胞培養による組換えタンパク質の産生を増大させることが明らかにされており、ただし、この場合、すべての段階における培養はまた、選択されたグルタミン濃度（好ましくは０．２ｍＭ〜約２ｍＭの間）で行われる。流加回分式プロセスにおける動物細胞培養へのグルコースの供給が制限されることにより、乳酸の産生が、グルコースの一定速度での供給を必要とすることなく制御することもまた明らかにされている。さらに、アミノ酸の総累積濃度、個々のアミノ酸の濃度、ならびに、個々のアミノ酸の相互の比率（例えば、グルタミン対アスパラギン）および総アミノ酸に対する比率（例えば、グルタミン対総アミノ酸）を大規模細胞培養の培地において修正することにより、実質的に改善された大規模なポリペプチド産生がもたらされ得ることが知られている。
【０００５】
従来、動物細胞培養のための培地研究は３つの技術に焦点を当てている：１）開始用培地の培地成分を富化し、また、培地供給の頻度を増大すること；２）多因子設計を種々の培地強度および種々の成分濃度に適用すること；および、３）馴化（使用済み）培地を、アミノ酸、ビタミンおよび他の成分について分析し、低いレベルにあるか、または枯渇しているそのような成分を加えること。これらの方法では、一般に、細胞密度、生存性および力価応答が、最適化の指標として使用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記の方法では、細胞が検出され、細胞に、最適化されたタンパク質産生のための実際の栄養分要求が提供されるのではなく、むしろ、細胞のための栄養分要求が、最終結果に基づいて、すなわち、細胞密度、生存性および力価に基づいて間接的に検出されるにすぎない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、例えば、ポリペプチドの産生において用いられる大規模細胞培養で使用される細胞培養培地（例えば、大規模細胞培養培地）を合理的に設計するための方法；開示された方法により設計される細胞培養培地（例えば、大規模細胞培養培地）；多量の目的とするポリペプチド（例えば、抗体）を、そのような培地を使用して産生させる方法；本明細書中に開示される方法および培地を使用して産生されるポリペプチド；および、そのようなポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。これらの方法および組成物は、細胞の培養（例えば、細胞の回分式培養、流加回分式培養および灌流式培養）のために有用である。これらの方法および組成物は、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）の大規模培養（例えば、回分式培養、流加回分式培養および灌流式培養）のために特に有用である。
【０００８】
本発明の合理的に設計された培地は、細胞集団における使用のために計算される濃度のアミノ酸、細胞維持における使用のために計算される濃度のアミノ酸、および、目的とするポリペプチドへの取り込みのために計算される濃度のアミノ酸を含有する。
【０００９】
１つの実施形態において、本発明は、下記の工程を含む、ポリペプチドを細胞培養物中で産生させる方法を提供する：目的とするポリペプチドをコードする核酸を含む細胞と、細胞集団における使用のために計算される濃度のアミノ酸、細胞維持における使用のために計算される濃度のアミノ酸、および、目的とするポリペプチドへの取り込みのために計算される濃度のアミノ酸を含む所望される細胞培養培地とを含む細胞培養物を提供する工程；および、細胞培養物を、目的とするポリペプチドの発現を可能にする条件のもとで維持する工程。本発明の１つの実施形態において、所望される細胞培養培地は、下記の式：
Ａ＝［（Ｍ＊Ｘ）＋（Ｎ＊Ｐ）＋（Ｙ＊Ｍ＊Ｘ）］＊Ｆ
（式中、Ｘは、１単位の細胞集団あたり使用されるアミノ酸の濃度であり、Ｐは、１単位のポリペプチド力価あたり目的とするポリペプチドへの取り込みのために使用されるアミノ酸の濃度であり、Ｍは、細胞培養物の所望されるピーク細胞密度のための乗数であり、Ｎは、目的とするポリペプチドの所望される濃度のための乗数であり、Ｙは細胞維持係数であり、Ｆは基礎係数である）
に従う基礎調節された濃度Ａアミノ酸を含む。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、下記の工程を含む、ポリペプチドを細胞培養物中で産生させる方法を提供する：目的とするポリペプチドをコードする核酸を含む細胞と、開始細胞培養培地の体積が、所望される細胞培養培地体積の体積の約６０％〜９９％である開始細胞培養培地とを含む細胞培養物を提供する工程；供給用細胞培養培地を細胞培養物に提供する工程（ただし、供給用細胞培養培地の体積は、所望される細胞培養培地体積の約１％〜４０％であり、かつ、得られた所望される細胞培養培地は、細胞集団における使用のために計算される濃度のアミノ酸、細胞維持における使用のために計算される濃度のアミノ酸、および、目的とするポリペプチドへの取り込みのために計算される濃度のアミノ酸を含む）；および、細胞培養物を、目的とするポリペプチドの発現を可能にする条件のもとで維持する工程。本発明の１つの実施形態において、得られた所望される細胞培養培地は、下記の式：
Ａ＝［（Ｍ＊Ｘ）＋（Ｎ＊Ｐ）＋（Ｙ＊Ｍ＊Ｘ）］＊Ｆ
（式中、Ｘは、１単位の細胞集団あたり使用されるアミノ酸の濃度であり、Ｐは、１単位のポリペプチド力価あたり目的とするポリペプチドへの取り込みのために使用されるアミノ酸の濃度であり、Ｍは、細胞培養物の所望されるピーク細胞密度のための乗数であり、Ｎは、目的とするポリペプチドの所望される濃度のための乗数であり、Ｙは細胞維持係数であり、Ｆは基礎係数である）
に従う基礎調節された濃度Ａアミノ酸を含み、また、細胞培養物を、目的とするポリペプチドの発現を可能にする条件のもとで維持することを含む。本発明の別の実施形態において、開始細胞培養培地は、下記の式：
Ｂ＝［Ａ−（Ｚ＊Ｖ）］／（１  Ｖ）
（式中、Ｚは供給用細胞培養培地中のアミノ酸の濃度であり、Ｖは、所望される細胞培養培地体積の割合としての供給用培養培地の体積である）
に従うアミノ酸の濃度Ｂを含む。本明細書中に開示される方法の別の実施形態において、Ｙが０〜約１．５である。本明細書中に開示される方法のさらに別の実施形態において、Ｆが約１〜約１．５である。本明細書中に開示される方法のさらなる実施形態において、Ｙが０〜約１．５であり、かつ、Ｆが約１〜約１．５である。
【００１１】
本明細書中に開示される方法の１つの実施形態において、所望される細胞培養培地は約３ｍＭ以上のチロシンを含む。本明細書中に開示される方法の別の実施形態において、所望される細胞培養培地は、約７ｍＭ〜約３０ｍＭのロイシン、約７ｍＭ〜約３０ｍＭのリシン、約７ｍＭ〜約３０ｍＭのトレオニン、約７ｍＭ〜約３０ｍＭのプロリン、および／または、約７ｍＭ〜約３０ｍＭのバリンを含む。本明細書中に開示される方法のさらなる実施形態において、所望される細胞培養培地中のロイシン、リシン、トレオニン、プロリンおよびバリンの合わせた濃度が約３５ｍＭ〜約１５０ｍＭである。さらに別の実施形態において、所望される細胞培養培地中のロイシン、リシン、トレオニンおよびバリンの合わせた濃度が、所望される細胞培養培地中の全必須アミノ酸の濃度の約６０％〜約８０％である。
【００１２】
本明細書中に開示される方法の１つの実施形態において、所望される細胞培養培地中の各必須アミノ酸の合わせた濃度が、所望される細胞培養培地中の全アミノ酸の濃度の約３０％〜約５０％である。本明細書中に開示される方法の別の実施形態において、所望される細胞培養培地中のアミノ酸の濃度が約１２０ｍＭ〜約３５０ｍＭである。本明細書中に開示される方法のさらなる実施形態において、細胞培養物中のプロリンの濃度が約１ｍＭを超えて維持される。本明細書中に開示される方法のさらに別の実施形態において、細胞培養物中のプロリンの濃度が約２ｍＭを超えて維持される。ポリペプチドを産生させる方法のいくつかの実施形態において、細胞培養は大規模細胞培養である。別の実施形態において、細胞は動物細胞である。
【００１３】
本発明のさらなる局面は、本明細書中に開示される方法に従って産生されるポリペプチドを提供する。本発明の別の局面は、本明細書中に開示される方法に従って産生されるポリペプチドと、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
本発明のさらなる局面は、下記の工程を含む細胞培養方法を提供する：細胞と、細胞集団における使用のために計算される濃度のアミノ酸、および、細胞維持における使用のために計算される濃度のアミノ酸を含む所望される細胞培養培地とを含む細胞培養物を提供する工程；および、細胞培養を、細胞培養物における細胞の成長および複製を可能にする条件のもとで維持する工程。本発明の１つの実施形態において、所望される細胞培養培地は、下記の式：
Ａ’＝［（Ｍ＊Ｘ）＋（Ｙ＊Ｍ＊Ｘ）］＊Ｆ
（式中、Ｘは、１単位の細胞集団あたり使用されるアミノ酸の濃度であり、Ｍは、細胞培養物の所望されるピーク細胞密度のための乗数であり、Ｙは細胞維持係数であり、Ｆは基礎係数である）
に従う基礎調節された濃度Ａ’アミノ酸を含む。本発明の細胞培養方法のいくつかの実施形態において、細胞培養は大規模細胞培養である。別の実施形態において、細胞は動物細胞である。
【００１５】
本発明のさらなる局面は、約１２０ｍＭ〜約３５０ｍＭのアミノ酸の総濃度を含む細胞培養培地を提供する。本発明の別の局面は、約１２０ｍＭ〜約３５０ｍＭのアミノ酸の総濃度を含む、目的とするポリペプチドの産生において使用される細胞培養培地を提供する。
【００１６】
本発明の別の局面は、細胞集団における使用のために計算される濃度のアミノ酸、細胞維持における使用のために計算される濃度のアミノ酸、および、目的とするポリペプチドへの取り込みのために計算される濃度のアミノ酸を含む、目的とするポリペプチドの産生において使用される細胞培養培地を提供する。本発明の１つの実施形態において、目的とするポリペプチドの産生において使用される細胞培養培地は、下記の式：
Ａ＝［（Ｍ＊Ｘ）＋（Ｎ＊Ｐ）＋（Ｙ＊Ｍ＊Ｘ）］＊Ｆ
（式中、Ｘは、１単位の細胞集団あたり使用されるアミノ酸の濃度であり、Ｐは、１単位のポリペプチド力価あたり目的とするポリペプチドへの取り込みのために使用されるアミノ酸の濃度であり、Ｍは、細胞培養物の所望されるピーク細胞密度のための乗数であり、Ｎは、目的とするポリペプチドの所望される濃度のための乗数であり、Ｙは細胞維持係数であり、Ｆは基礎係数である）
に従う基礎調節された濃度Ａアミノ酸を含む。
【００１７】
本発明のさらに別の局面は、下記の式：
Ａ’＝［（Ｍ＊Ｘ）＋（Ｙ＊Ｍ＊Ｘ）］＊Ｆ
（式中、Ｘは、１単位の細胞集団あたり使用されるアミノ酸の濃度であり、Ｍは、細胞培養物の所望されるピーク細胞密度のための乗数であり、Ｙは細胞維持係数であり、Ｆは基礎係数である）
に従う基礎調節された濃度Ａ’アミノ酸を含む細胞培養培地を提供する。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は大規模細胞培養培地である。他の実施形態において、細胞培養培地は動物細胞培養培地である。
【００１８】
本発明のさらに別の局面は、目的とするポリペプチドを細胞培養物中で産生させるための細胞培養培地で使用されるアミノ酸の最適化された濃度を決定するための方法であって、目標細胞密度での細胞培養物における細胞の細胞集団のために要求されるアミノ酸濃度を決定すること；目的とするポリペプチドを目標ポリペプチド力価で細胞培養物中で産生させるために要求されるアミノ酸濃度を決定すること；細胞培養物における細胞の細胞維持のために要求されるアミノ酸濃度を決定すること；および、これらの濃度を、目的とするポリペプチドを細胞培養物中で産生させるための細胞培養培地で使用されるアミノ酸の最適化された濃度を提供するために加えることを含む、そのような方法を提供する。
【００１９】
本発明のさらなる局面は、目的とするポリペプチドを細胞培養物中で産生させるための細胞培養培地で使用されるアミノ酸の最適化されたアミノ酸濃度Ａを決定するための方法であって、設定された目標細胞密度における細胞の細胞集団のために要求されるアミノ酸濃度Ｘを決定すること；目的とするポリペプチドを、設定されたポリペプチド力価で産生させるために要求されるアミノ酸濃度Ｐを決定すること；および、最適化されたアミノ酸濃度Ａを、下記の式：
Ａ＝［（Ｍ＊Ｘ）＋（Ｎ＊Ｐ）＋（Ｍ＊Ｙ＊Ｘ）］＊Ｆ
（式中、Ｍは、細胞培養物の所望される目標細胞密度のための乗数であり、Ｎは、目的とするポリペプチドの所望される目標濃度のための乗数であり、Ｙは細胞維持係数であり、Ｆは基礎係数である）
に従って決定することを含む、そのような方法を提供する。最適化されたアミノ酸濃度を決定するための方法のいくつかの実施形態において、細胞培養は大規模細胞培養である。他の実施形態において、細胞は動物細胞である。
【００２０】
本発明の他の特徴および利点が下記の詳細な説明および請求項から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】抗ＩＬ−２２を発現させるために操作されたＣＨＯ細胞について、細胞密度（Ｙ軸；「細胞密度（１０６細胞／ｍＬ）」）を時間（Ｘ軸、「日数」）の経過とともに示す。細胞を実施例２の合理的に設計された培地で培養した。
【図２】抗ＩＬ−２２を発現させるために操作されたＣＨＯ細胞について、抗ＩＬ−２２抗体の力価（Ｙ軸；「力価（ｇ／Ｌ）」）を時間（Ｘ軸、「日数」）の経過とともに示す。細胞を実施例２の合理的に設計された培地で培養した。
【図３】抗ＩＬ−２２を発現させるために操作されたＣＨＯ細胞について、細胞密度（Ｙ軸；「細胞密度（１０６細胞／ｍＬ）」）を時間（Ｘ軸、「日数」）の経過とともに示す。細胞を実施例３の合理的に設計された培地で培養した。
【図４】抗ＩＬ−２２を発現させるために操作されたＣＨＯ細胞について、抗ＩＬ−２２抗体の力価（Ｙ軸；「力価（ｇ／Ｌ）」）を時間（Ｘ軸、「日数」）の経過とともに示す。細胞を実施例３の合理的に設計された培地で培養した。
【図５】抗ＩＬ−２２を発現させるために操作されたＣＨＯ細胞について、抗ＩＬ−２２抗体の力価（Ｙ軸；「力価（ｇ／Ｌ）」）を時間（Ｘ軸、「日数」）の経過とともに示す。細胞を、「従来培地」（従来の細胞培養要求に基づく培地、例えば、米国特許出願公開第２００６／０１２１５６８号を参照のこと）、本明細書中の方法を使用して調製された「合理的設計培地」、または、「従来培地＋プロリン」（これは、「従来培地」に添加されたさらなる３．７ｍＭのプロリンを含有する）で培養した（実施例４参照）。
【図６】抗ＩＬ−２２を発現させるために操作されたＣＨＯ細胞について、細胞密度（Ｙ軸；「細胞密度（１０６細胞／ｍＬ）」）を時間（Ｘ軸、「日数」）の経過とともに示す。細胞を、「従来培地」、「合理的設計培地」または「従来培地＋プロリン」で培養した（実施例４参照）。
【図７】抗ＩＬ−２２を発現させるために操作されたＣＨＯ細胞について、細胞生存性（Ｙ軸；「生存性［％］」）を時間（Ｘ軸、「日数」）の経過とともに示す。細胞を、「従来培地」、「合理的設計培地」または「従来培地＋プロリン」で培養した（実施例４参照）。
【図８Ａ】抗ＩＬ−２２を発現させるために操作されたＣＨＯ細胞について、示されたアミノ酸の濃度（Ｙ軸；「［μＭ］」）（（図８Ａ）プロリン；（図８Ｂ）トレオニン；（図８Ｃ）バリン；（図８Ｄ）トリプトファン；または（図８Ｅ）チロシン）を時間（Ｘ軸、「日数」）の経過とともに示す。細胞を、「従来培地」、「合理的設計培地」または「従来培地＋プロリン」で培養した（実施例４参照）。
【図８Ｂ】抗ＩＬ−２２を発現させるために操作されたＣＨＯ細胞について、示されたアミノ酸の濃度（Ｙ軸；「［μＭ］」）（（図８Ａ）プロリン；（図８Ｂ）トレオニン；（図８Ｃ）バリン；（図８Ｄ）トリプトファン；または（図８Ｅ）チロシン）を時間（Ｘ軸、「日数」）の経過とともに示す。細胞を、「従来培地」、「合理的設計培地」または「従来培地＋プロリン」で培養した（実施例４参照）。
【図８Ｃ】抗ＩＬ−２２を発現させるために操作されたＣＨＯ細胞について、示されたアミノ酸の濃度（Ｙ軸；「［μＭ］」）（（図８Ａ）プロリン；（図８Ｂ）トレオニン；（図８Ｃ）バリン；（図８Ｄ）トリプトファン；または（図８Ｅ）チロシン）を時間（Ｘ軸、「日数」）の経過とともに示す。細胞を、「従来培地」、「合理的設計培地」または「従来培地＋プロリン」で培養した（実施例４参照）。
【図８Ｄ】抗ＩＬ−２２を発現させるために操作されたＣＨＯ細胞について、示されたアミノ酸の濃度（Ｙ軸；「［μＭ］」）（（図８Ａ）プロリン；（図８Ｂ）トレオニン；（図８Ｃ）バリン；（図８Ｄ）トリプトファン；または（図８Ｅ）チロシン）を時間（Ｘ軸、「日数」）の経過とともに示す。細胞を、「従来培地」、「合理的設計培地」または「従来培地＋プロリン」で培養した（実施例４参照）。
【図８Ｅ】抗ＩＬ−２２を発現させるために操作されたＣＨＯ細胞について、示されたアミノ酸の濃度（Ｙ軸；「［μＭ］」）（（図８Ａ）プロリン；（図８Ｂ）トレオニン；（図８Ｃ）バリン；（図８Ｄ）トリプトファン；または（図８Ｅ）チロシン）を時間（Ｘ軸、「日数」）の経過とともに示す。細胞を、「従来培地」、「合理的設計培地」または「従来培地＋プロリン」で培養した（実施例４参照）。
【図９】抗ＩＬ−２２を発現させるために操作されたＣＨＯ細胞について、細胞密度（Ｙ軸；「細胞密度（１０６細胞／ｍＬ）」）を時間（Ｘ軸、「日数」）の経過とともに示す。細胞を「合理的設計培地」または「維持係数および基礎係数を伴わない合理的設計培地」で培養した。図は５回の独立した反復実験（ｎ＝５）を表す（実施例６参照）。
【図１０】抗ＩＬ−２２を発現させるために操作されたＣＨＯ細胞について、細胞生存性（Ｙ軸；「生存性［％］」）を時間（Ｘ軸、「日数」）の経過とともに示す。細胞を「合理的設計培地」または「維持係数および基礎係数を伴わない合理的設計培地」で培養した。図は５回の独立した反復実験（ｎ＝５）を表す（実施例６参照）。
【図１１】抗ＩＬ−２２を発現させるために操作されたＣＨＯ細胞について、抗体力価（Ｙ軸；「力価（ｇ／Ｌ）」）を時間（Ｘ軸、「日数」）の経過とともに示す。細胞を「合理的設計培地」または「維持係数および基礎係数を伴わない合理的設計培地」で培養した。図は５回の独立した反復実験（ｎ＝５）を表す（実施例６参照）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される用語「回分式培養」は、培地ならびに細胞自体を含めて、細胞を培養することにおいて究極的には使用される成分のすべてが培養プロセス開始時に与えられる細胞培養方法を示す。回分式培養は典型的にはある時点で停止され、培地における細胞および／または成分が集められ、必要に応じて精製される。
【００２３】
本明細書中で使用される用語「流加回分式培養」は、さらなる成分が培養プロセス開始後のある時点で培養物に与えられる細胞培養方法を示す。与えられる成分は典型的には、培養プロセスの期間中に枯渇した、細胞のための栄養補充物を含む。流加回分式培養は典型的にはある時点で停止され、培地における細胞および／または成分が集められ、必要に応じて精製される。本発明の好ましい実施形態において、細胞培養は、回分式培養または流加回分式培養である動物細胞培養（例えば、哺乳動物細胞培養）である。
【００２４】
本明細書中で使用される用語「灌流式培養」は、さらなる成分が培養プロセス開始後に連続的または半連続的に培養物に与えられる細胞培養方法を示す。与えられる成分は典型的には、培養プロセスの期間中に枯渇した、細胞のための栄養補充物を含む。培地における細胞および／または成分の一部が典型的には連続的または半連続的に集められ、必要に応じて精製される。
【００２５】
本明細書中で使用される用語「バイオリアクター」は、原核生物細胞培養または真核生物細胞培養、例えば、動物細胞培養（例えば、哺乳動物細胞培養など）の成長のために使用される任意の容器を示す。バイオリアクターは、細胞（例えば、哺乳動物細胞）の培養のために有用である限り、任意のサイズのものが可能である。典型的には、バイオリアクターは少なくとも３０ｍｌであり、１リットル、１０リットル、１００リットル、２５０リットル、５００リットル、１０００リットル、２５００リットル、５０００リットル、８０００リットル、１０，０００リットル、１２，００００リットルまたはそれ以上、あるいは、任意の中間の体積とすることができる。ｐＨおよび温度（これらに限定されない）を含めて、バイオリアクターの内部条件は、典型的には、培養期間の期間中において制御される。バイオリアクターは、ガラス、プラスチックまたは金属を含めて、本発明の培養条件のもとで培地に懸濁された哺乳動物細胞培養を保持するために好適である多くの材料から構成され得る。本明細書中で使用される用語「製造用バイオリアクター」は、目的とするポリペプチドまたはタンパク質の産生において使用される最終的なバイオリアクターである。大規模細胞培養の製造用バイオリアクターの体積は一般には約１００ｍｌよりも大きく、典型的には少なくとも約１０リットルであり、５００リットル、１０００リットル、２５００リットル、５０００リットル、８０００リットル、１０，０００リットル、１２，００００リットルまたはそれ以上、あるいは、任意の中間の体積とすることができる。当業者は、本発明を実施することにおいて使用される好適なバイオリアクターを承知しており、また、そのようなバイオリアクターを選ぶことができる。
【００２６】
本明細書中で使用される用語「細胞密度」、用語「細胞濃度」または同様な用語は、所与の体積の培地に存在する細胞のそのような数、重量、量などを示す。「ピーク細胞密度」または同様な用語は、所与の体積の培地において到達し得る細胞の最大数を示し、また、「所望されるピーク細胞密度」または同様な用語は、実施者が所与の細胞体積において得たいと思う（例えば、目標とする）細胞の最大数を示す。様々なそのような目標値が当業者には明らかであり、例えば、当業者は、所望される細胞集団に関して目標値を表すことができ、そのような目標値は計測の１つまたは複数の適切な単位（例えば、細胞集団の所望されるピーク単位）とすることができる。
【００２７】
本明細書中で使用される用語「細胞生存性」は、培養されている細胞が所与の１組の培養条件または実験変動のもとで生存することができることを示す。本明細書中で使用されるこの用語はまた、特定の時刻で生存している細胞のそのような一部分をそのような時刻での培養における細胞総数（生細胞および死細胞）に関連して示す。
【００２８】
本明細書中で使用される用語「培養物」および用語「細胞培養物」は、細胞集団の生存および／または成長にとって好適な条件のもとで細胞培養培地に懸濁される細胞集団を示す。本明細書中で使用される場合、これらの用語は、細胞集団（例えば、動物細胞培養物）と、その集団が懸濁される培地とを含む組合せを示す場合がある。
【００２９】
本明細書中で使用される用語「積算生細胞密度」または用語「ＩＶＣ」は、培養が行われた時間量が乗じられた、培養期間を通した生細胞の平均密度を示す。産生されたポリペプチドおよび／またはタンパク質の量が、培養期間を通して存在する生細胞の数に比例していると仮定すると、積算生細胞密度は、培養期間を通して産生されたポリペプチドおよび／またはタンパク質の量を推定するための有用なツールである。
【００３０】
本明細書中で使用される用語「培地」、用語「細胞培養培地」および用語「培養培地」は、成長している動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）に与えられる栄養分を含有する溶液を示す。典型的には、このような溶液は、最小限の成長および／または生存のために細胞によって要求される必須アミノ酸および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、ならびに、微量元素を提供する。このような溶液はまた、ホルモンおよび増殖因子を含めて、最低限の速度を超えて成長および／または生存を高める様々な成分を含有することができる。このような溶液は、好ましくは、細胞の生存および増殖のために最適なｐＨおよび塩濃度に配合される。１つの実施形態において、培地は規定培地である。規定培地は、すべての成分が既知の化学構造を有する培地である。本発明の別の実施形態において、培地は、この分野で知られている任意の供給源または方法に由来するアミノ酸（１つまたは複数）を含有することができ、そのようなアミノ酸には、単一アミノ酸の添加（１つまたは複数）、あるいは、ペプトンまたはタンパク質加水分解物（動物起原または植物起原を含む）の添加（１つまたは複数）のどちらかに由来するアミノ酸（１つまたは複数）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
本明細書中で使用される用語「播種する」は、細胞培養物をバイオリアクターまたは別の容器に与えるプロセスを示す。細胞は別のバイオリアクターまたは容器で事前に増殖されられている場合がある。代替として、細胞は凍結され、例えば、細胞をバイオリアクターまたは容器に与える直前に解凍されている場合がある。この用語は、１個だけの細胞を含めて、任意の細胞数を示す。
【００３２】
本明細書中で使用される用語「力価」は、所与の量の培地体積によって除された、動物細胞培養によって産生される目的とするポリペプチドの総量を示す。従って、「力価」は濃度を示す。力価は、典型的には、１ミリリットルの培地あたりのポリペプチドのミリグラム数の単位で表される。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」には、少なくとも１つ（典型的には２つ）のＶＨドメインまたはその一部分および／あるいは少なくとも１つ（典型的には２つ）のＶＬドメインまたはその一部分を含むタンパク質が含まれる。いくつかの実施形態において、抗体は、重鎖免疫グロブリン鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖が、例えば、ジスルフィド結合によって相互に連結される、２つの重鎖免疫グロブリン鎖および２つの軽鎖免疫グロブリン鎖の四量体である。抗体またはその一部分を、齧歯類、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類）、ラクダ科動物など（これらに限定されない）を含めて、任意の起原から得ることができ、あるいは、抗体またはその一部分を、例えば、当業者には広く知られている方法によって、組換え産生することができ（例えば、キメラ体、ヒト化体にすることができ）、および／または、インビトロ作製することができる。
【００３４】
抗体の「抗原結合性フラグメント」の用語に包含される結合性フラグメントの例には、下記のものが含まれるが、それらに限定されない：（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわち、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわち、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の１つのアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント；（ｖｉ）ラクダ科動物の重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）またはラクダ化された重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）；（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ；下記参照）；（ｖｉｉｉ）二重特異性抗体；および（ｉｘ）Ｆｃ領域に融合された免疫グロブリン分子の１つまたは複数のフラグメント。さらには、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ）が別個の遺伝子によってコードされるが、これら２つのドメインは、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対形成して一価の分子（これは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている）を形成する１つのタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって、組換え法を使用して結合することができる；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３−２６；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：５８７９−８３を参照のこと。そのような単鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合性フラグメント」の用語に包含されることが意図される。このようなフラグメントは、当業者に知られている従来の技術を使用して得ることができ、また、これらのフラグメントは、無傷な抗体が評価されるのと同じ様式で機能について評価される。
【００３５】
「抗原結合性フラグメント」は場合により、例えば、安定性、エフェクター細胞機能または補体結合の１つまたは複数を高める成分をさらに含むことができる。例えば、抗原結合性フラグメントは、ＰＥＧ化された成分、アルブミン、あるいは、重鎖および／または軽鎖の定常領域をさらに含むことができる。
【００３６】
「二重特異性」抗体または「二機能性」抗体を除き、抗体は、その結合部位のそれぞれが同一であることが理解される。「二重特異性」または「二機能性抗体」は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人為的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含めて、様々な方法によって作製することができる。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ（１９９０）、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９：３１５−２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１５４７−５３を参照のこと。
【００３７】
表現「タンパク質」または表現「タンパク質生成物」は、アミノ酸からなる１つまたは複数の鎖を示す。本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」は「ポリペプチド」と同義的であり、また、この分野では一般に理解されるように、連続するペプチド結合によって連結されるアミノ酸の少なくとも１つの鎖を示す。いくつかの実施形態において、「目的とするタンパク質」または「目的とするポリペプチド」は、宿主細胞に形質転換されている外因性の核酸分子によってコードされるタンパク質である。いくつかの実施形態において、「目的とするタンパク質」が、宿主細胞が形質転換されている外因性ＤＮＡによってコードされる場合、外因性ＤＮＡの核酸配列により、アミノ酸の配列が決定される。いくつかの実施形態において、「目的とするタンパク質」は、宿主細胞にとって内因性である核酸分子によってコードされるタンパク質である。いくつかの実施形態において、そのような内因性の目的とするタンパク質の発現は、例えば、１つまたは複数の調節配列を含有することができ、かつ／あるいは、目的とするタンパク質の発現を高めるタンパク質をコードすることができる外因性の核酸分子により宿主細胞をトランスフェクションすることによって変化させる。本発明の方法および組成物は、目的とする任意のタンパク質を産生させるために使用することができ、そのようなタンパク質には、商業的用途、実験的用途および／または他の用途において有用である、医薬用特性、診断用特性、農業用特性、および／または、様々な他の特性のいずれかを有する様々なタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。加えて、目的とするタンパク質はタンパク質治療剤であることが可能である。すなわち、タンパク質治療剤は、生物学的作用を、タンパク質治療剤が作用する身体内の領域に対して有するか、または、タンパク質治療剤が様々な中間体を介して遠方で作用する身体の領域に対して有するタンパク質である。タンパク質治療剤の様々な例が下記においてより詳しく議論される。いくつかの実施形態において、本発明の方法および／または組成物を使用して産生されたタンパク質はプロセシングおよび／または修飾されている場合がある。例えば、本発明に従って産生されるタンパク質はグリコシル化される場合がある。
【００３８】
本発明は、任意の治療剤タンパク質（例えば、医薬的または商業的に関連する酵素、受容体、抗体（例えば、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体）、Ｆｃ融合タンパク質、サイトカイン、ホルモン、調節因子、増殖因子、凝固作用因子／凝固因子、抗原結合性薬剤など）を都合良く産生させるための細胞を培養するために使用することができる。当業者は、本発明に従って産生させることができる他のタンパク質を承知しており、また、本明細書中に開示される方法を、そのようなタンパク質を産生させるために使用することができる。
【００３９】
発現構築物および組換え宿主細胞の作製
本発明では、組換え宿主細胞（例えば、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞）、すなわち、目的とするポリペプチドをコードする核酸を含有する発現構築物によりトランスフェクションされた細胞が使用される。表現「動物細胞」は、非脊椎動物、非哺乳脊椎動物（例えば、鳥類、爬虫類および両生類）および哺乳動物の細胞を包含する。非脊椎動物細胞の限定されない例には、下記の昆虫細胞が含まれる：スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（毛虫）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）（カイコ／カイコガ）。
【００４０】
数多くの哺乳動物細胞株が、目的とするポリペプチドの組換え発現のための好適な宿主細胞である。哺乳動物宿主細胞株には、例えば、ＣＯＳ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＴＭ４、ＶＥＲＯ０７６、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ−３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＭＭＴ、ＭＲＣ５、ＦＳ４、ＣＨＯ、２９３Ｔ、Ａ４３１、３Ｔ３、ＣＶ−１、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２、Ｃｏｌｏ２０５、２９３、ＨｅＬａ、Ｌ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、ＦＲｈＬ−２、Ｕ９３７、ＨａＫ、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｒａｔ２、ＢａＦ３、３２Ｄ、ＦＤＣＰ−１、ＰＣ１２、Ｍ１ｘ、マウスミエローマ（例えば、ＳＰ２／０およびＮＳ０）およびＣ２Ｃ１２細胞、同様にまた、形質転換された霊長類細胞株、ハイブリドーマ、正常な二倍体細胞、ならびに、一次組織および一次外植片のインビトロ培養に由来する細胞株が含まれる。目的とするポリペプチドを発現することができる任意の真核生物細胞を、開示された培地設計方法において使用することができる。数多くの細胞株が様々な商業的供給元から入手可能であり、例えば、Ａｍｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などから入手可能である。本発明の１つの実施形態において、細胞培養では、例えば、大規模細胞培養では、ハイブリドーマ細胞が用いられる。抗体産生ハイブリドーマ細胞の構築はこの分野では広く知られている。本発明の１つの実施形態において、細胞培養では、例えば、大規模細胞培養では、ＣＨＯ細胞が用いられる。
【００４１】
代替として、目的とするポリペプチドを下等真核生物（例えば、酵母など）または原核生物（例えば、細菌など）において組換え産生させることが可能である場合がある。好適な酵母株には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属の株、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、または、目的とするポリペプチドを発現することができる任意の酵母株が含まれる。好適な細菌株には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、または、目的とするポリペプチドを発現することができる任意の細菌株が含まれる。細菌における発現は、組換えタンパク質を取り込む封入体の形成をもたらすことがある。従って、組換えタンパク質の再折りたたみが、活性な物質またはより活性な物質を作製するために必要となる場合がある。正しく折り畳まれた異種タンパク質を細菌の封入体から得るためのいくつかの方法がこの分野では知られている。これらの方法では一般に、タンパク質を封入体から可溶化すること、その後、タンパク質を、カオトロピック剤を使用して完全に変性することを伴う。システイン残基がタンパク質の一次アミノ酸配列に存在するときには、多くの場合、再折りたたみを、ジスルフィド結合の正しい形成を可能にする環境（レドックス系）において達成することが必要である。再折りたたみの一般的な方法が、Ｋｏｈｎｏ（１９９０）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：１８７−９５、欧州特許ＥＰ０４３３２２５および米国特許第５，３９９，６７７号に開示される。
【００４２】
本発明では、目的とするポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドから構成される様々な構築物が、プラスミド、ベクターおよび転写カセットまたは発現カセットの形態で使用される。ベクターは、ベクターが機能的に連結される遺伝子の発現を行わせることができる。そのようなベクターは本明細書中では「組換え発現ベクター」または「発現ベクター」として示される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的なベクター形態であるので、交換可能に使用することができる。しかしながら、本発明は、同等な機能を果たす他の形態の発現ベクターを包含することが意図され、そのような発現ベクターには、様々なウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、改変アルファウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
動物細胞におけるタンパク質の発現のために好適である様々な構築物がこの分野では広く知られている。例えば、ポリヌクレオチドを、例えば、Ｋａｕｆｍａｎら（１９９１）、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９：４４８５−９０に開示されるｐＭＴ２発現ベクターまたはｐＥＤ発現ベクターに存在する発現制御配列などの発現制御配列に機能的に連結することができる。他の好適な発現制御配列が、この分野で知られているベクターにおいて見出され、これらには、ＨａｌｏＴａｇ（商標）ｐＨＴ２、ｐＡＣＴ、ｐＢＩＮＤ、ｐＣＡＴ（登録商標）３、ｐＣＩ、ｐｈＲＧ、ｐｈＲＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ、ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭＡＸ、ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭＡＸ−Ｅ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＢｕｄＣＥ４、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）；ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ、ｐＳＧ５  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）；ｐＤＮＲ−Ｄｕａｌ、ｐＤＮＲ−ＣＭＶ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）；およびｐＳＭＥＤＡ（Ｗｙｅｔｈ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）が含まれるが、これらに限定されない。組換えタンパク質を発現させる一般的な方法もまた知られており、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ（１９９０）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：５３７−６６に例示される。
【００４４】
本明細書中で定義されるように、「機能的に連結される」は、発現されるポリペプチドと、発現制御配列との間における共有結合による結合を、コードされたタンパク質が、トランスフェクションされた宿主細胞によって発現される様式で形成するように酵素的または化学的に連結されることを意味する。
【００４５】
本発明の組換え発現構築物はさらなる配列を有することができ、例えば、調節配列（例えば、ベクターの複製（例えば、複製起点、目的とするポリペプチド（またはペプチド）をコードする核酸配列の転写）、または、コードされたポリペプチドの発現のいずれかを調節する配列）、タグ配列（例えば、ヒスチジンなど）、および、選択可能なマーカー遺伝子などを有することができる。用語「調節配列」は、転写、複製または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび任意の他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル、転写スプライス部位）を包含することが意図される。そのような調節配列が、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）に記載されている。当業者は、調節配列の選択を含めて、発現ベクターの設計が、宿主細胞の選択および所望されるタンパク質発現のレベルを含めて様々な要因に依存することを認識する。哺乳動物宿主細胞におけるタンパク質の発現のための好ましい調節配列には、高レベルのタンパク質発現を行わせるウイルスエレメントが含まれ、例えば、ＦＦ−１ａプロモーターおよびＢＧＨポリＡに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、ＣＭＶプロモーターおよび／またはエンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、ＳＶ４０プロモーターおよび／またはエンハンサー）、アデノウイルスに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ならびに、ポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーが含まれる。ウイルスの調節エレメントおよびその配列が、例えば、米国特許第５，１６８，０６２号、同第４，５１０，２４５号および同第４，９６８，６１５号に記載される（これらのはすべてがその全体において本明細書中に参考として組み込まれる）。
【００４６】
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を含めて、適切な調節配列を適切であるように含有する好適なベクターを選択または構築することのどちらもができる。誘導可能なプロモーター配列を有するベクター、例えば、テトラサイクリン誘導ベクター、例えば、ｐＴｅｔ−ＯＮ（商標）およびｐＴｅｔ−Ｏｆｆ（商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用することによって達成されるタンパク質の誘導可能な発現もまた、開示された方法において使用することができる。発現ベクターに関するさらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、編者：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）を参照のこと。核酸を操作するための多くの知られている技術およびプロトコル、例えば、核酸構築物の調製、変異誘発法、配列決定、細胞内へのＤＮＡの導入、遺伝子発現およびタンパク質の分析における多くの知られている技術およびプロトコルもまた、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版）、編者：Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ（１９９２）に詳しく記載されている。
【００４７】
目的とするポリペプチドを産生させるための発現構築物に挿入されるポリヌクレオチドは、細胞培養で使用される宿主細胞において発現させることができる任意のポリペプチドをコードすることができる。従って、ポリヌクレオチドは、全長の遺伝子産物、全長遺伝子の一部分、ペプチドまたは融合タンパク質をコードすることができる。そのようなポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡからなる場合があり、また、任意の動物に由来することができる。ポリヌクレオチドを、この分野では広く知られている方法によって、例えば、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによって細胞または生物から単離することができ、あるいは、知られている従来の化学合成法によって作製することができる。そのような化学的に合成されたポリヌクレオチドは、天然ポリヌクレオチドと共通する生物学的性質を有することができ、従って、天然ポリヌクレオチドの代用物として用いることができる。
【００４８】
ポリペプチドはまた、目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを１つまたは複数の昆虫発現ベクター（例えば、バキュロウイルスベクターなど）における好適な制御配列に機能的に連結し、昆虫細胞発現システムを用いることによって組換え産生させることができる。バキュロウイルス／Ｓｆ９発現システムのための材料および方法がキットの形態で市販されている（例えば、ＭＡＸＢＡＣ（登録商標）キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。
【００４９】
発現構築物による宿主細胞（例えば、動物細胞）のトランスフェクションを、この分野では広く知られている数多くの方法によって達成することができる。細胞を一過性トランスフェクションまたは安定的トランスフェクションのいずれかに供することができる。いくつかの異なる十分に確立された方法が、分子（具体的には核酸）を宿主細胞（例えば、動物細胞）に送達するために存在する。細胞タイプ、所望されるトランスフェクション（すなわち、一過性または安定的）、および、具体的な実験要件、例えば、困難な細胞株または初代細胞のトランスフェクション、トランスフェクションされた分子のタイプ（ゲノムＤＮＡ、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド）、または、選ばれた発現構築物などに依存して、それぞれの移入方法は、当業者には知られている長所および短所を有する。一般的なトランスフェクション方法には、例えば、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、遺伝子銃、電気穿孔法、ナノ粒子送達、ポリアミン、エピソームおよびポリエチレンイミンが含まれる。加えて、数多くのトランスフェクションキットおよびトランスフェクション試薬が、様々な企業から市販されており、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＶＯＹＡＧＥＲ（商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標））、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）（ＧＥＮＥＪＵＩＣＥ（商標））、Ｑｉａｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）（ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（商標））、Ｏｒｂｉｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）（ＳＡＰＰＨＩＲＥ（商標））、および、当業者には知られている多くの他の企業から市販されている。様々なトランスフェクションプロトコルもまた、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版）、編者：Ｄａｖｉｓら、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ、ＣＴ（１９９４）に見出され得る。
【００５０】
本発明では、細胞培養（例えば、大規模動物細胞培養）が、多量の目的とするポリペプチドを産生させるために使用される。大規模な一過性トランスフェクションのための様々な方法が、Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｓｅｒｉｅｓ）、編者：Ｌｕｂｉｎｉｅｃｋｉ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ（１９９０）；Ｋｕｎａｐａｒａｊｕら（２００５）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９１：６７０−７７；Ｍａｉｏｒｅｌｌａら（１９８８）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１４０６−１０；Ｂａｌｄｉら（上掲）；Ｌａｎ  Ｐｈａｍら（上掲）；Ｍｅｉｓｓｎｅｒら（上掲）；Ｄｕｒｏｃｈｅｒら（上掲）に開示される。一般に、哺乳動物細胞培養における大規模な一過性の遺伝子発現では、いくつかの共通するタイプのトランスフェクション様式のいずれか１つ（例えば、ポリエチレンイミン、電場パルス、ＣＡＬＦＥＣＴＩＯＮ（商標）またはリン酸カルシウム）を、高いトランスフェクション効率を所望される規模または体積（例えば、１０リットルを超える体積）で達成するために用いることができる（Ｄｅｒｏｕａｚｉら（上掲）；Ｒｏｌｓら（１９９２）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０６（１）：１１５−２１；ＷｕｒｍおよびＢｅｒｎａｒｄ（１９９９）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０（２）：１５６−５９；ＳｃｈｌａｅｇｅｒおよびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ（１９９９）、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３０（１−３）：７１−８３；Ｊｏｒｄａｎら（１９９８）、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２６（１）：３９−４７；Ｌｉｎｄｅｌｌら（２００４）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１６７６（２）：１５５−６１）。これらの大規模培養は一般には、撹拌プレートを伴うバイオリアクター、振とう機またはインキュベーターにおいて成長させられ、これらの大規模培養はまた、「攪拌」培養または「懸濁」培養として知られている場合がある。従って、細胞をプレートまたはフラスコに付着させる従来のトランスフェクションとは対照的に、開示された方法では一般に、懸濁培養が使用される。大規模細胞培養は一般には、約１００ｍｌよりも大きい体積を有する細胞培養であると見なされる。
【００５１】
いくつかの例において、目的とするポリペプチドを発現する細胞株を最初に作製し、その後、大規模細胞培養に播種するために使用することができる。目的とするタンパク質を発現する安定な細胞株を、本明細書中に開示される一過性トランスフェクションのために使用される方法を含めて、様々な広く知られている方法によって作製することができる。一般に、安定な細胞株は、化学的に定義された培地における長期間の成長および選択によって作製される。例えば、目的とするポリペプチドをコードする核酸を用いて（例えば、リン酸カルシウム沈殿またはリポソームトランスフェクションによって）トランスフェクションされた細胞を、ネオマイシン／ジェネテシン（Ｇ４１８）に対する抵抗性を与えるネオマイシン抵抗性遺伝子を有するベクターにより同時にトランスフェクションすることができる。トランスフェクションされた細胞は、その後、Ｇ４１８含有培地において成長させられ、生存する細胞が、安定に発現する細胞株を作製するためにクローン拡大される。この細胞株のアリコートを、その後、大規模細胞培養に播種するために、また、多量の目的とするタンパク質を産生させるために使用することができる。
【００５２】
細胞をトランスフェクションするためには、細胞播種密度（例えば、約１ｘ１０５細胞／ｍｌ培養〜約３ｘ１０６細胞／ｍｌ培養）、血清濃度（例えば、０％〜１０％）、インキュベーション温度（例えば、約２０℃〜３８℃）、トランスフェクションビヒクルまたはトランスフェクション試薬（化学的または電気的）、培養体積（例えば、約５ｍｌ〜２０リットル）およびインキュベーション時間（例えば、約２４時間〜１４４時間）を含めて、いくつかの変数を最適化することが要求される。それぞれの細胞タイプについて、最適なパラメーターは異なる。しかしながら、選ばれた宿主細胞のトランスフェクションを利用する当業者に知られている様々な参考文献により提供されるように、商業的供給元により、特定の細胞タイプをトランスフェクションするための最適化指針が一般には提供される。これらの情報源は、選ばれた宿主細胞のトランスフェクションを導くために使用することができ、または、それからの簡便な試行錯誤が、最適なトランスフェクションパラメーターを提供するために使用され得る出発点として使用することができる。
【００５３】
細胞培養
目的とするポリペプチドを産生させるための典型的な手法には、回分式培養および流加回分式培養が含まれる。回分式培養プロセスは従来的には、大規模な製造用培養に特定の細胞密度の種培養物を接種すること、細胞を、細胞の成長および生存性の助けになる条件のもとで成長させること、培養物を、細胞が指定の細胞密度に達したときに集めること、および、発現ポリペプチドを精製することを含む。流加回分式培養手法では、回分式培養に、細胞の成長期間中に消費される栄養分および他の成分を補充するさらなる工程（１つまたは複数）が含まれる。当業者は、本発明が、回分式システム、流加回分式システムおよび灌流式システム（これらに限定されない）を含めて、細胞が培養される任意のシステムにおいて用いられ得ることを認識する。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、細胞を流加回分式システムにおいて成長させる。
【００５４】
従来の培養（例えば、回分式培養および流加回分式培養）に伴う繰り返し起こる未解決の問題の１つが、細胞の成長、生存性および発現ポリペプチドの産生に対する有害な影響を有する代謝老廃物の産生である。特に有害な影響を有する２つの代謝老廃物が乳酸およびアンモニウムであり、これらはグルコース代謝およびグルタミン代謝の結果としてそれぞれ産生される。グルタミン代謝の結果としてのアンモニウムの酵素的産生に加えて、アンモニウムはまた、経時的な非代謝的分解の結果として細胞培養物において蓄積する。
【００５５】
従来の培地配合物は、様々な市販の培地、例えば、ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最少必須培地（［ＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ改変イーグル培地（［ＤＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）などを含めて、比較的高いレベルのグルコースおよびグルタミンを含有する（他のアミノ酸に対する比較でのグルタミン）。以前には、これらの成分は、細胞のための主要な代謝エネルギー源であるので、多量に要求されると考えられていた。しかしながら、これらの栄養分の急速な消費は、上記で記載されたように、乳酸およびアンモニウムの蓄積を引き起こす。加えて、グルコースおよびグルタミンの高い初期レベル、ならびに、乳酸およびアンモニウムのその後の蓄積は、高い浸透圧重量モル濃度、すなわち、多くの場合、それだけで、細胞の成長、細胞の生存性およびポリペプチドの産生にとって有害である状態をもたらす。本明細書中に開示される合理的に設計された培地は、有害な代謝産物の蓄積を減らすために修正することができる。そのような修正が、例えば、米国特許出願公開第２００５／００７００１３号（制限されたグルコース供給）および同第２００６／０１２１５６８号（アミノ酸含有量およびアミノ酸比率の修正）に見出され得る（これらはともに本明細書によりその全体において本明細書中に参考として組み込まれる）。
【００５６】
合理的培地設計および配合物
従来の培地配合物は、本発明の培地配合物との比較では、比較的低いレベルの総アミノ酸から始まる。例えば、ＤＭＥ−Ｆ１２（ダルベッコ改変イーグル培地およびハムＦ１２培地の５０：５０混合物）は総アミノ酸含有量が７．２９ｍＭであり、ＲＰＭＩ−１６４０として知られている従来の細胞培養培地は総アミノ酸含有量が６．４４ｍＭである（例えば、Ｍｏｒｔｏｎ（１９７０）、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ、６：８９−１０８；Ｈａｍ（１９６５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．５３：２８８−９３；Ｍｏｏｒｅら（１９６７）、Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｎ．１９９：５１９−２４参照。これらはすべてが参考として本明細書中に組み込まれる）。より近年の培地配合物（例えば、米国特許出願公開第２００６／０１２１５６８号に開示される培地など）は、より高いレベルのアミノ酸および栄養分を含有する。しかしながら、従来の配合物は、細胞成長、細胞維持、および、組換えポリペプチドを産生させるために使用される細胞培養については産生要求を含む実際の計算された細胞要求に基づいていない。これらの変数を使用して、はるかにより高い、それにもかかわらず、非毒性で所定の濃度の総アミノ酸を有する培地配合物を決定する方法が本明細書中に提供される。
【００５７】
本明細書中に記載される細胞培養培地配合物（例えば、大規模細胞培養培地配合物）では、例えば、本明細書中に記載される他の培養工程に従って使用されたとき、および、例えば、様々な修正（例えば、米国特許出願公開第２００６／０１２１５６８号に見出される修正など）に従って使用されたとき、細胞密度およびポリペプチド力価が最適化される。本明細書中に記載される培地配合物のアミノ酸濃度は、１）細胞集団、２）細胞維持、および、３）ポリペプチド産生のために要求されるアミノ酸（１つまたは複数）の濃度に基づく。本発明の１つの実施形態において、細胞培養培地は、細胞集団における使用のために計算されるアミノ酸（１つまたは複数）の濃度、細胞維持における使用のために計算されるアミノ酸（１つまたは複数）の濃度、および、目的とするポリペプチドへの取り込みのために計算されるアミノ酸（１つまたは複数）の濃度を含む。本発明の別の実施形態において、細胞培養培地は、下記の式によって表されるアミノ酸の濃度Ａを含有する：
Ａ＝［（Ｍ＊Ｘ）＋（Ｎ＊Ｐ）＋（Ｙ＊Ｍ＊Ｘ）］＊Ｆ
（式中、Ｘは、１単位の細胞集団あたり使用されるアミノ酸の濃度であり、Ｐは、１単位のポリペプチド力価あたり目的とするポリペプチドへの取り込みのために使用されるアミノ酸の濃度であり、Ｍは、所望される細胞集団（すなわち、細胞集団の所望されるピーク単位）のための乗数であり、Ｎは、目的とするポリペプチドの所望される濃度（すなわち、所望されるポリペプチド力価または目標ポリペプチド力価）のための乗数であり、Ｙは細胞維持係数であり、Ｆは基礎係数である）。
【００５８】
上記式における、１単位のポリペプチド力価あたり目的とするポリペプチドへの取り込みのために使用されるアミノ酸の濃度Ｐは、組換えタンパク質の一次構造、すなわち、ポリペプチドのアミノ酸含有量に基づく。従って、Ｐは、大規模細胞培養によって産生されることになる目的とするポリペプチドに基づいて変化する。その後、Ｐは、Ｎ、すなわち、目的とするポリペプチドの所望される濃度のための乗数（すなわち、所望されるポリペプチド力価または目標ポリペプチド力価）を使用して、目的とするポリペプチドの目標濃度のためのアミノ酸要求に変換することができる。下記の本発明のいくつかの代表的例において、ポリペプチド力価の基本単位は１ｇ／Ｌである。本明細書中に提供される式を使用する代表的な計算を含む表１（下記）において、１０ｇ／Ｌの力価での目的とするポリペプチドのために要求される細胞培養培地のアミノ酸濃度（縦列４）が、１ｇ／Ｌのために要求されるアミノ酸の濃度Ｐ（縦列２）に乗数Ｎ（この場合、Ｎ＝１０）を乗じることによって決定される。
【００５９】
表１：所望される細胞集団における１０ｇ／Ｌの抗体の目標力価のために要求される基礎調節されたアミノ酸濃度の代表的な決定（この場合、所望される細胞集団は１５ｘ１０６細胞／ｍｌの所望されるピーク細胞密度によって表される）
【００６０】
【表１】
0005564259.tif 000002
乗数Ｎは、例えば、積算生細胞密度（ＩＶＣ）に特定の細胞株の比産生性（ｑｐ）を乗じることによって計算することができる（Ｎ＝ＩＶＣ＊ｑｐ）。例えば、特定の細胞株の播種密度が０．８ｘ１０６細胞／ｍｌであり、６日目および１０日目における細胞密度が１５ｘ１０６細胞／ｍｌであり、１８日目における細胞密度が１１ｘ１０６細胞／ｍｌ（すなわち、６日目および１５日目における値の７３％）であるならば、ＩＶＣ＝２１１ｘ１０６（細胞／ｍｌ）＊日である（すなわち、［（０．８＋１５）／２］＊６日＋［（１５＋１５）／２］＊４日＋［（１５＋１１）／２］＊８日）。選ばれた細胞株の平均比産生性（ｑｐ）が、例えば、４７μｇ／１０６細胞／日であるならば、１８日目において、Ｎ＝１０ｇ／Ｌである（すなわち、２１１ｘ１０６（細胞／ｍｌ）＊日ｘ４７μｇ／１０６細胞／日）。当業者は、これらの計算が任意の細胞株に関して行われ得ること、または、Ｎが細胞の特性および起原に基づいて推定され得ることを認識する。代替として、乗数Ｎは、ＩＶＣおよびｑｐから計算される必要はなく、簡便には、特定の細胞培養についての妥当な目標力価とすることができる。ＩＶＣおよびｑｐの計算、ならびに、妥当なＮ値およびＭ値のさらなる選択を記載する予言的一例が、実施例５（下記）として提供される。
【００６１】
本明細書中で使用されるように、「細胞集団」および「細胞密度」などは細胞の集団を示す。例えば、細胞集団は細胞ペレットを示すことができる。本明細書中で使用されるように、「所望される細胞集団」などは、実施者が細胞培養物において得たいと欲する細胞の集団（例えば、細胞ペレット）を示す。本明細書中で使用されるように、「細胞集団の単位」などは、細胞集団を表すいくつかの様式（例えば、細胞数、細胞密度、細胞体積、充填細胞体積、乾燥細胞重量など）を反映する。当業者は、どれが、例えば、特定の実験条件について、細胞集団の単位を表す最も好都合または適切な様式であるかを理解する。当業者はまた、細胞集団の単位に依存して、Ｍ、すなわち、所望される細胞集団（すなわち、細胞集団の所望されるピーク単位）のための乗数が、所望されるピーク細胞数、所望されるピーク細胞密度、所望されるピーク細胞体積、所望されるピーク充填細胞体積、所望されるピーク乾燥重量などのいずれかによって表されることを理解する。
【００６２】
本発明の１つの実施形態において、細胞集団の単位が細胞密度によって表され、所望される細胞集団が、所望されるピーク細胞密度によって表される。別の実施形態において、細胞集団の単位が乾燥細胞重量または乾燥細胞集団によって表される。脱水された細胞集団は、そのような細胞集団に存在するすべてのタンパク質、炭水化物、脂質および核酸から本質的にはなる。従って、アミノ酸の濃度Ｘを、最初に、既知数の細胞を細胞ペレットに分離し、細胞ペレットを乾燥し、続いて、乾燥ペレットを酸加水分解にさらし、それにより、細胞ペレットの細胞タンパク質を、その後でアミノ酸分析計によって定量され得る個々のアミノ酸に溶解することによって実験的に決定することができる（例えば、実施例１参照）。これにより、所与の細胞数のアミノ酸濃度Ｘが提供され、その後、このアミノ酸濃度Ｘは、Ｍ、すなわち、所望されるピーク細胞密度のための乗数を使用して、所望されるピーク細胞密度のためのアミノ酸要求に変換することができる。表１において、１５ｘ１０６細胞／ｍｌの所望されるピーク細胞密度のために要求される細胞培養培地の総アミノ酸濃度（縦列５）が、１０６細胞／ｍｌのために要求されるアミノ酸の濃度Ｘ（縦列３）に乗数Ｍ（この場合、Ｍ＝１５）を乗じることによって決定される。従って、本発明のいくつかの代表的な例において、細胞集団の単位は１０６細胞／ｍｌである。代替として、例えば、分解し易いことが知られているアミノ酸については、上記の式において使用されるアミノ酸の濃度Ｘは、文献値から、例えば、Ｎｙｂｅｒｇら（１９９９）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６２：３２４−３５；Ｎａｄｅａｕら（２０００）、Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．２：２７７−９２；および、Ｂｏｎａｒｉｕｓ（１９９６）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５０：２９９−３１８から、あるいは、この分野で知られているそのような刊行物または類似する刊行物に開示される方法から決定することができる。
【００６３】
所望される細胞集団についての乗数Ｍが、例えば、所望されるピーク細胞密度について表されるとき、Ｍは、細胞株の産生性が最大となる密度によって、または、具体的な成長速度に基づく特定の期間における細胞株についての予測された密度によって、特定の細胞株のピーク密度として選ぶことができる。
【００６４】
細胞維持のために要求される細胞培養培地のアミノ酸濃度Ｙは、所望される細胞集団（例えば、所望されるピーク細胞密度）のために要求されるアミノ酸濃度のある割合である。本発明の１つの実施形態において、維持要求は、栄養分により誘導される毒性の危険性を伴わない細胞使用のための十分な栄養分を提供する、所望される細胞集団要求の０％〜３００％の範囲である。本発明の別の実施形態において、維持要求は、栄養分により誘導される毒性の危険性を伴わない細胞使用のための十分な栄養分を提供する、所望される細胞集団要求の０％〜１５０％の範囲である。維持要求は、培養の継続期間が増大するに従って増大する（例えば、２１日間の培養については１００％〜１５０％の維持）。表１において、細胞維持のために要求される細胞培養培地のアミノ酸濃度（縦列６）が、所望されるピーク細胞密度のために要求されるアミノ酸濃度（縦列５）に、この代表的な例では、長期間に及ぶ培養期間を可能にするために１００％である細胞維持係数Ｙを乗じることによって決定される。維持係数Ｙは、培養されている細胞の特有の代謝要求に依存して、細胞毎に（また、細胞株毎に）異なる。さらに、培養されている細胞についての維持要求もまた、プロセスにおける変動性のために、例えば、接種密度、培養継続期間、温度変化の時間などのために変化する。最初の指針として、例えば、０日目〜５日目での培養については（１日あたり）０％の維持を、６日目〜１０日目での培養については（１日あたり）３％〜５％の維持を、１１日目〜２１日目での培養については（１日あたり）７％〜１０％の維持を与えることができる。２１日を超えるプロセスについては、培養物に、そのようなさらなる日数について（１日あたり）２％〜５％の維持を与えることができる。当業者は、密度および力価を最適化するために維持係数Ｙを調節することが、単に日常的な試行錯誤の問題にすぎないことを認識する。アミノ酸濃度を細胞維持要求に従って調節することは、細胞培養の増大した生存性および産生性のために重要であり、従って、本発明の重要な局面である。例えば、アミノ酸濃度を細胞維持要求に従って調節することにより、細胞培養が、より大きな細胞密度、細胞生存性を持続し、また、より大きいポリペプチド力価をもたらすことが可能になる（例えば、実施例６参照）。
【００６５】
１）所望される細胞集団のアミノ酸要求（縦列５）、２）所望される細胞維持のアミノ酸要求（縦列６）、および、３）目標力価のための所望されるポリペプチド産生のアミノ酸要求（縦列４）が決定されると、目標細胞培養の計算された総アミノ酸濃度を得ることができる。表１において、目標細胞培養のために要求される細胞培養培地の計算された総アミノ酸濃度（縦列７）が、１０ｇ／Ｌの力価での目的とするポリペプチドのために要求される細胞培養培地のアミノ酸濃度（縦列４）、１５ｘ１０６細胞／ｍｌの所望されるピーク細胞密度のために要求される細胞培養培地のアミノ酸濃度（縦列５）、および、選択されたレベルの細胞維持のために要求される細胞培養培地のアミノ酸濃度（縦列６）を加えることによって決定される。
【００６６】
目標細胞培養のために要求される細胞培養培地の計算された総アミノ酸濃度が上記のように得られると、その値が、アミノ移動の駆動力（例えば、物質移動のために要求される外部アミノ酸、細胞膜を横断する輸送を生じさせるために要求される外部アミノ酸など）を考慮する基礎係数Ｆによって、所望される細胞培養培地アミノ酸濃度Ａに調節される。この調節された値Ａが、本明細書中では「基礎調節されたアミノ酸濃度」または「最適化された濃度」として示される。基礎調節された濃度Ａアミノ酸は、開始用培地の体積および灌流式培養または流加回分式培養のための何らかの供給物の体積を含む培養の最終的体積に対して表される、培養に送達されるアミノ酸の累積総量を示す。総アミノ酸濃度を基礎調節されたアミノ酸濃度に調節することは、より高い細胞生存性、細胞密度およびポリペプチド力価を可能にするので、本発明の重要な局面である（例えば、実施例６を参照のこと）。
【００６７】
細胞培養培地の計算された総アミノ酸濃度を２００％に至るまで増大させる基礎係数Ｆは、１（０％の増大）から３（２００％の増大）の範囲である。本発明の１つの実施形態において、Ｆについての範囲は１〜１．５の間である。本発明の別の実施形態において、１未満のＦの値は、細胞培養培地の計算された総アミノ酸濃度（表１、縦列７）を修正することによって相殺することができ、これを、所望される細胞集団のために要求されるアミノ酸濃度、細胞維持のために要求されるアミノ酸濃度、および／または、目的とするポリペプチドへの取り込みのために要求されるアミノ酸濃度を修正することによって達成することができる。例えば、０．５の基礎係数は、細胞培養培地の計算された総アミノ酸濃度を、例えば、２倍（または２倍以上）増大することによって相殺することができ、これを、Ｍ、Ｘ、Ｎ、Ｐおよび／またはＹを変更することによって達成することができる。表１において、目標力価および所望されるピーク細胞密度のために要求される細胞培養培地の基礎調節されたアミノ酸濃度Ａ（縦列８）が、細胞培養培地の計算された総アミノ酸濃度（縦列７）に、表１の代表的な例では１．３（これは、細胞培養培地の計算された総アミノ酸濃度を超える３０％の増大に対応する）である基礎係数Ｆを乗じることによって決定される。
【００６８】
アミノ酸の基礎調節されたアミノ酸濃度Ａを含有する培地は、本明細書中では「所望される細胞培養培地」として示される。従って、「所望される細胞培養培地」は、基礎調節された濃度Ａを含有する目的の培地を表す。この培地は、上記の式によって決定された少なくとも１つのアミノ酸濃度を含む。好ましくは、所望される細胞培養培地は、上記の式によって決定された２つ以上のアミノ酸濃度を含有する。より好ましくは、所望される細胞培養培地は、上記の式によって決定された少なくとも１２個の調節されたアミノ酸濃度を含有し、例えば、上記の式によって決定された、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンの調節された濃度を含有する。所望される細胞培養培地中の基礎調節されたアミノ酸濃度Ａが、アミノ酸（１つまたは複数）を個々に加えること、ペプトンまたは他のタンパク質加水分解物を加えること（これらに限定されない）を含めて、多くの手段によって、および／あるいは、別の高濃度の細胞培養培地（例えば、供給用細胞培養培地（または培地ミックス、例えば、培地粉末））を開始細胞培養培地（または開始細胞培養培地ミックス、例えば、培地粉末）に加えることによって達成され得ることが当業者によって理解される。当業者は、ペプトン（または他のタンパク質加水分解物）の添加が、選ばれた特定のペプトン製品のアミノ酸含有量によって、または、特定のペプトンにより提供されるアミノ酸濃度を決定すること（例えば、一般には、５ｇ／Ｌのペプトンは約４０ｍＭ〜約５０ｍＭの総アミノ酸の濃度を提供する）によって指示され得ることを理解する。
【００６９】
所望される細胞培養培地のアミノ酸濃度は、本明細書中に開示される本発明の式によって決定される少なくとも１つの基礎調節されたアミノ酸濃度Ａに基づく。しかしながら、そのような濃度は、所望される細胞培養培地中のアミノ酸の他の濃度と同様に、いくつかの要因の影響のために、基礎調節されたアミノ酸濃度（１つまたは複数）から変化させることができる。例えば、いくつかのアミノ酸が培養期間中に産生される場合があり、従って、そのようなアミノ酸は低いレベルで保つことができる。他のアミノ酸を、発表された値に基づいて変化させることができる（例えば、米国特許出願公開第２００６／０１２１５６８号参照）。さらに、いくつかのアミノ酸（例えば、メチオニン）が特定の細胞タイプによってより大きい速度で消費される場合があり、従って、そのようなアミノ酸は過剰に添加されなければならない。さらに他のアミノ酸（例えば、プロリンなど）は細胞成長およびポリペプチド産生のための駆動力をもたらし（実施例４参照）、これらのアミノ酸は、場合により、上記の本発明の式によって決定されるよりも大きい量で添加されなければならない。加えて、上記の式を使用して得られた濃度が毒性であると見なされるならば、基礎調節されたアミノ酸濃度を修正することができる（例えば、セリン、チロシン、メチオニンおよびバリンのレベルの検討）。所望される細胞培養培地において使用されるアミノ酸（１つまたは複数）の基礎調節されたアミノ酸濃度Ａを得たとき、基礎調節されたアミノ酸濃度を、様々な要因に基づいて、例えば、本明細書中に記される要因などに基づいて変更することは当業者の知識の範囲内である。
【００７０】
さらなる培地成分、例えば、ビタミン、塩、グルコース、様々な元素を、様々な情報源（例えば、米国特許出願公開第２００５／００７００１３号および同第２００６／０１２１５６８号）から計算することができる（または基づくことができる）。さらに、上記の式を使用して得られたアミノ酸の基礎調節されたアミノ酸濃度Ａは、別のアミノ酸に関連して特定の比率（例えば、グルタミン対アスパラギンの比率）を与えるために、または、所望される合わせた濃度（例えば、グルタミンおよびアスパラギンの合わせた濃度）に含まれるように修正することができる。例えば、温度変化と組み合わされた高アスパラギン・低グルタミンの培地は乳酸の取り込みを可能にし、それにより、細胞培養を解毒することが知られている（米国特許出願公開第２００６／０１２１５６８号）。従って、グルタミンおよび／またはアスパラギンの基礎調節されたアミノ酸濃度Ａを、最適な比率を得るために修正したいと望むことができる。
【００７１】
所望される細胞培養培地において使用される基礎調節されたアミノ酸濃度の合わせた濃度が高いこと（すなわち、２４３ｍＭを超えていること）が表１における代表的な例から認められる。従って、高濃度のアミノ酸を、そのような濃度が目標の細胞密度およびポリペプチド力価のための計算されたアミノ酸要求に基づくならば、毒性または力価損失を伴うことなく、所望される細胞培養培地において使用することができるという発見が本明細書中に開示される。本発明の１つの実施形態において、所望される細胞培養培地中のアミノ酸の合わせた濃度は約１２０ｍＭ〜約２５０ｍＭの間である。他の実施形態において、所望される細胞培養培地中のアミノ酸の合わせた濃度は約２５０ｍＭよりも大きく、例えば、約２６０ｍＭ、２７０ｍＭ、２８０ｍＭ、２９０ｍＭ、３００ｍＭ、３１０ｍＭ、３２０ｍＭ、３３０ｍＭ、３４０ｍＭ、３５０ｍＭ、３６０ｍＭ、３７０ｍＭ、３８０ｍＭ、３９０ｍＭ、４００ｍＭ、４１０ｍＭ、４２０ｍＭ、４３０ｍＭ、４４０ｍＭ、４５０ｍＭ、４６０ｍＭ、４７０ｍＭ、４８０ｍＭ、４９０ｍＭ、５００ｍＭまたは５１０ｍＭ、あるいは、任意の中間の値である。
【００７２】
所望される細胞培養培地において使用されるアミノ酸の上記で特定される基礎調節された濃度Ａは、回分式培養、流加回分式培養および灌流培養において使用することができる。回分式培養において使用されるとき、所望される細胞培養培地において使用されるアミノ酸の初期濃度が、基礎調節されたアミノ酸濃度Ａである。流加回分式培養または灌流式培養において使用されるとき、基礎調節されたアミノ酸濃度Ａは、開始用培地の体積およびすべての供給物の体積を含む培養に送達されるアミノ酸（１つまたは複数）の累積総量を表す。従って、連続供給（例えば、３日目〜２１日目での供給）または周期的な供給（例えば、２日毎〜３日毎での供給）のいずれかを使用する流加回分式培養については、開始用培地は、下記の式に従ってアミノ酸の開始濃度Ｂを含有するように操作される：
Ｂ＝［Ａ−（Ｚ＊Ｖ）］／（１−Ｖ）
（式中、Ｚは供給用細胞培養培地中のアミノ酸の濃度であり、Ｖは、所望される細胞培養培地体積の割合としての供給用培養培地の体積である）。
【００７３】
開始アミノ酸濃度Ｂを得るために要求される計算の代表的な一例が表２（下記）に提供される。表２において、いくつかの基礎調節されたアミノ酸濃度Ａ（縦列２）が、１７％の供給物体積（Ｖ＝１７％）および供給用培地アミノ酸濃度Ｚ（縦列４）に基づいて開始用培地アミノ酸濃度Ｂ（縦列５）に変換される。この例では、いくつかの基礎調節されたアミノ酸濃度Ａ（縦列２）および開始アミノ酸濃度Ｂ（縦列５）が、縦列３および縦列６において太字で示される値に修正される。アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミンおよびシステインの濃度の修正が、米国特許出願公開第２００６／０１２１５６８号によって示唆される濃度に基づいた；メチオニンは、予測されたよりも大きい量でのその消費を補償するために５０％調節された；アラニン、グルタミン酸およびグリシンが培養によって産生され（従って、低いレベルで保たれる）；セリン、チロシンおよびバリンの濃度が非毒性レベルに減らされた。従って、開始アミノ酸濃度Ｂは、基礎調節されたアミノ酸濃度Ａまたは修正後の基礎調節されたアミノ酸濃度のいずれかに基づき得ることが理解される。
【００７４】
当業者は、所望される細胞培養培地を流加回分式細胞培養および灌流式細胞培養の期間中に得るために使用される供給用培地は、培養が行われる容器（例えば、バイオリアクターまたは振とうフラスコ）における溢れを避けるために、また、培地成分を希釈することを避けるために、できる限り高濃度にしなければならないことを理解する。表２に示される例において、好ましい供給用培地が「供給培地」として示され、供給培地のアミノ酸濃度Ｚが縦列４に示される。しかしながら、所望される基礎調節されたアミノ酸濃度Ａが目標体積において達成される限り、任意の高濃度の供給用培地を使用することができ、または、高濃度のアミノ酸を開始細胞培養培地に提供する任意の方法を使用することができる。高濃度のアミノ酸を細胞培養物に提供するそのような方法が一般には使用され、そのような様々な方法が当業者には広く知られている。
【００７５】
開始細胞培養培地中のアミノ酸の開始濃度Ｂが、アミノ酸（１つまたは複数）を個々に加えること、ペプトンおよび／または他のタンパク質加水分解物を加えること、ならびに／あるいは、別の高濃度の培養培地（または培地ミックス、例えば、培地粉末）を開始細胞培養培地（または開始細胞培養培地ミックス、例えば、培地粉末）に加えること（これらに限定されない）を含めて、多くの手段によって達成され得ることが当業者によって理解される。供給用細胞培養培地中のアミノ酸の濃度Ｚが、アミノ酸（１つまたは複数）を個々に加えること、ペプトンおよび／または他のタンパク質加水分解物を加えること、ならびに／あるいは、別の高濃度の培養培地（または培地ミックス、例えば、培地粉末）を供給用細胞培養培地（または供給用細胞培養培地ミックス、例えば、培地粉末）に加えること（これらに限定されない）を含めて、多くの手段によって達成され得ることもまた当業者によって理解される。
【００７６】
開始細胞培養培地において使用されるアミノ酸の合わせた濃度が高いこと（すなわち、１２５ｍＭを超えていること）が表２における代表的な例から認められる。従って、高濃度のアミノ酸を、その開始アミノ酸濃度が、所望されるピーク細胞密度および所望されるポリペプチド力価のための計算されたアミノ酸要求に基づくならば、開始細胞培養培地において毒性または力価損失を伴うことなく使用することができるという発見が本明細書中に開示される。本発明の１つの実施形態において、アミノ酸の合わせた濃度は約７０ｍＭ〜約５１０ｍＭの間である。本発明の１つの実施形態において、アミノ酸の合わせた濃度は約１２０ｍＭ〜約３５０ｍＭの間である。本発明の別の実施形態において、開始細胞培養培地中のアミノ酸の合わせた濃度は約７０ｍＭ〜約１４０ｍＭの間である。本発明の別の実施形態において、開始細胞培養培地中のアミノ酸の合わせた濃度は約１４０ｍＭを超えている。
【００７７】
表２：１０ｇ／Ｌの抗体の目標力価、１５ｘ１０６細胞／ｍｌの所望されるピーク細胞密度および１７％の供給物のための開始アミノ酸濃度の代表的な決定
【００７８】
【表２】
0005564259.tif 000003
表３Ａおよび表３Ｂに示されるように、所望される細胞培養培地において使用されるアミノ酸の基礎調節されたアミノ酸濃度Ａの決定、および、開始細胞培養培地において使用される開始アミノ酸濃度Ｂの決定を、任意の所望される目標ポリペプチド力価および所望されるピーク（目標）細胞密度について計算することができる。大規模培養の所望されるピーク細胞密度は、流加回分式培養については約３〜約４０×１０６細胞／ｍＬの範囲である。本発明の１つの実施形態において、所望されるピーク細胞密度は約５〜約２０×１０６細胞／ｍＬの範囲である。大規模培養の目標力価は約３〜約２５ｇ／Ｌの範囲である。本発明のさらに別の実施形態において、大規模培養の目標力価は約５〜約２０ｇ／Ｌの範囲である。例えば、表３において、所望されるピーク細胞密度は１０〜１５×１０６細胞／ｍＬの範囲であり、目標力価は３ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌまで変化する。
【００７９】
表３Ａ：様々な目標力価（これは目標ポリペプチド力価についての乗数Ｎによって表される）および所望されるピーク細胞密度（これは所望されるピーク細胞密度についての乗数Ｍによって表される）についての基礎調節されたアミノ酸濃度Ａの代表的な例
【００８０】
【表３Ａ】
0005564259.tif 000004
表３Ｂ：様々な目標力価（これは目標ポリペプチド力価についての乗数Ｎによって表される）および所望されるピーク細胞密度（これは所望されるピーク細胞密度についての乗数Ｍによって表される）についての開始用培地アミノ酸濃度Ｂの代表的な例；開始用培地アミノ酸濃度が、供給物および他の修正を基礎調節されたアミノ酸濃度から引くことにより決定された。
【００８１】
【表３Ｂ】
0005564259.tif 000005
これらの式を、大規模ポリペプチド産生のための基礎調節されたアミノ酸濃度（１つまたは複数）を決定するために、また、大規模ポリペプチド産生のための所望される細胞培養培地配合物を開発するために使用して、本発明らは、大きい力価および高い細胞密度の培養をもたらすいくつかの基準を特定している。５ｇ／Ｌよりも大きい力価を生じさせるための基準が、表４に示される値によって表されており、これらの基準には、下記の１つまたは複数（これらに限定されない）が含まれる：約３ｍＭ以上のチロシン；約７ｍＭ〜約３０ｍＭのプロリン；約７ｍＭ〜約３０ｍＭのバリン；約７ｍＭ〜約３０ｍＭのロイシン；約７ｍＭ〜約３０ｍＭのトレオニン；約７ｍＭ〜約３０ｍＭのリシン；約３５ｍＭ〜約１５０ｍＭの間である、ロイシン、リシン、プロリン、トレオニンおよびバリンの合わせた濃度；所望される細胞培養培地中の全必須アミノ酸の約６０％〜約８０％である、ロイシン、リシン、トレオニンおよびバリンの合わせた濃度；所望される細胞培養培地中の全アミノ酸の約３０％〜約５０％である、所望される細胞培養培地中の各必須アミノ酸の合わせた濃度；および／または、約７５ｍＭ〜約５１０ｍＭの全アミノ酸の合わせた濃度。
【００８２】
表４：様々な目標力価および所望されるピーク細胞密度（これらは上記で記される通りであり、ポリペプチド力価の基本単位は１ｇ／Ｌであり、細胞集団の基本単位は１０６細胞／ｍｌである）のための合理的設計培地についてのアミノ酸含有量の代表的な例および関係
【００８３】
【表４】
0005564259.tif 000006
表４において、太字のアミノ酸は、バリン、トレオニン、ロイシンおよびリシンであり、斜体字のアミノ酸は必須アミノ酸である（例えば、アルギニン、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、リシン、メチオニン、トリプトファン、トレオニンおよびバリン；ＣＨＯ細胞培養については、プロリンがさらに必須アミノ酸である；必須アミノ酸の定義が、異なる細胞などに適用されるとき、当業者は必須アミノ酸の定義における変化を承知している）。表４は、様々な目標細胞密度（Ｍ）、目標力価（Ｎ）、細胞維持要求（Ｙ）および基礎調節（Ｆ）におけるＣＨＯ細胞のための代表的な所望される細胞培養培地を提供する。
【００８４】
当業者は、本発明の合理的に設計された培地が、目的とするポリペプチドを産生させるために使用され得るか、または、ポリペプチド産生のために設計されない細胞培養物において使用され得るかのどちらであってもよいことを認識する。加えて、合理的に設計された培地は、例えば、目的とする外因性ポリペプチドを産生させるために操作された宿主細胞を含有しない細胞培養（例えば、大規模細胞培養）、または、目的とする内因性ポリペプチドを産生させるために培養されない細胞培養（例えば、大規模細胞培養）の効率的な成長、複製および／または維持のために、開示された細胞培養方法において使用することができる。そのような場合において、所望される細胞培養培地は、目的とするポリペプチドへの取り込みのために要求されるアミノ酸（１つまたは複数）を計上する必要はなく、代わりに、１）所望される細胞集団、および、２）細胞維持のために要求されるアミノ酸（１つまたは複数）の濃度に基づくアミノ酸濃度（１つまたは複数）を含有する。開示された細胞培養方法において使用されるそのような所望される細胞培養培地は、下記の式に従う基礎調節された濃度Ａ’アミノ酸を含有する：
Ａ’＝［（Ｍ＊Ｘ）＋（Ｙ＊Ｍ＊Ｘ）］＊Ｆ
（式中、Ｘは、１単位の細胞集団あたり使用されるアミノ酸の濃度であり、Ｍは、細胞培養物の所望されるピーク細胞集団（例えば、所望されるピーク細胞密度）のための乗数であり、Ｙは細胞維持係数であり、Ｆは基礎係数である）。
この式に従って作製された所望される細胞培養培地は、その後、細胞培養物における細胞の成長および複製を可能にする条件のもとでの細胞培養に与えられる。本発明の１つの実施形態において、細胞培養方法では、大規模細胞培養が使用される。本発明の別の実施形態において、細胞培養方法では、動物細胞が使用される。
【００８５】
細胞培養培地へのプロリン添加
本明細書中に開示される合理的培地設計方法を使用した場合、高いプロリンレベルを細胞培養（例えば、大規模細胞培養）の培養期間を通して維持することにより、増大したポリペプチド力価および増大した細胞密度がもたらされることが明らかにされている。このプロリン「閾値」は約１ｍＭ〜約２ｍＭの範囲であり、この閾値を超えて維持される細胞培養物中のプロリンのレベルは、高い細胞密度、大きい力価の大規模細胞培養をもたらすための駆動力であるようである。興味深いことに、このプロリン主導の増大したポリペプチド力価および細胞生存性は、（増大した消費率を満たすために）さらなるアミノ酸についての培養要求を同時に増大させる。このことにより、本明細書中の合理的に設計された培地配合物が高いアミノ酸濃度を含有する理由が少なくとも部分的には説明される。
【００８６】
細胞培養の提供
哺乳動物細胞を回分式培養および流加回分式培養によるポリペプチドの産生のために調製する様々な方法がこの分野では広く知られている。上記のように、発現を達成するために十分な核酸（典型的には、目的とするポリペプチドをコードする核酸と、任意の機能的に連結された遺伝子制御エレメントとを含有するベクター）を多数の広く知られている技術によって宿主細胞株に導入することができる。典型的には、細胞は、どの宿主細胞がベクターを実際に取り込んで、目的とするポリペプチドまたはタンパク質を発現するかを明らかにするためにスクリーニングされる。哺乳動物細胞によって発現された目的とする特定のポリペプチドまたはタンパク質を検出する従来の方法には、免疫組織化学、免疫沈殿、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡観察、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の各技術、生物学的活性アッセイ、および、アフィニティークロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない。当業者は、発現したポリペプチドまたはタンパク質を検出するための他の適切な技術を承知している。多数の宿主細胞が目的とするポリペプチドまたはタンパク質を発現するならば、列挙された技術の一部またはすべてを、どの細胞がそのポリペプチドまたはタンパク質を最も高いレベルで発現するかを明らかにするために使用することができる。
【００８７】
目的とするポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞が特定されると、その細胞は、当業者には広く知られている様々な方法のいずれかによって培養で拡大培養される。目的とするポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞は、典型的には、その細胞を所定の温度において、また、細胞の生存、成長および生存性の助けとなる培地において成長させることによって拡大培養される。最初の培養は任意の体積であることが可能であり、しかし、多くの場合、目的とするポリペプチドまたはタンパク質の最終的な産生において使用される製造用バイオリアクターの培養体積よりも少ない体積であり、また、しばしば、細胞は、製造用バイオリアクターに播種する前に、増大する体積のバイオリアクターにおいて数回、継代される。細胞培養は、細胞への培地の酸素供給および栄養分の分散を増大させるために撹拌または振とうすることができる。代替として、または、加えて、この分野では広く知られている特別な散布デバイスを、培養物への酸素供給を増大および制御するために使用することができる。本発明に従って、当業者は、ｐＨ（例えば、６．６〜７．６）、温度（例えば、２５℃〜４２℃）、酸素および二酸化炭素のレベル（例えば、Ｏ２：１０％〜８０％、および、ＣＯ２：７％〜１５％、培養期間を通して）、および、浸透圧重量モル濃度（例えば、２６０〜３４０ｍＯｓｍ／ｋｇの開始時浸透圧重量モル濃度）など（これらに限定されない）を含めて、細胞培養の特定の内部条件を制御または調節することが有益であり得ることを理解する。
【００８８】
本明細書中で使用される用語「接種物」は、大規模動物培養が行われる製造用容器（例えば、製造用バイオリアクター）に播種するために使用される、目的とするポリペプチドを発現する核酸を含有する細胞の所定の体積を示すために使用される。本発明の１つの実施形態において、接種物の体積は最終的体積の約６０〜８０％である。
【００８９】
製造用バイオリアクターにおける開始時細胞密度は当業者によって選ぶことができる。本発明に従って、製造用バイオリアクターにおける開始時細胞密度は、培養体積あたり１個ほどの少ない細胞であることが可能である。本発明の好ましい実施形態において、製造用バイオリアクターにおける開始時細胞密度は約０．１から約１０ｘ１０６個／ｍＬ以上の生細胞までの範囲が可能である。
【００９０】
初期および中間の細胞培養は、次の中間的バイオリアクターまたは最終的な製造用バイオリアクターに播種する前に任意の所望される密度に成長させることができる。本発明の１つの実施形態において、接種物の細胞密度は約０．５〜１×１０６細胞／ｍｌである。細胞のほとんどが播種前に依然として生存していることが好ましいが、完全な生存性またはほぼ完全な生存性は要求されない。本発明の１つの実施形態において、細胞を、例えば、低速度の遠心分離によって上清から取り出すことができる。取り出された細胞を、何らかの望ましくない代謝老廃物または培地成分を除くために、次のバイオリアクターに播種する前に培地により洗浄することもまた望ましい場合がある。そのような培地は、細胞が以前に成長させられた培地であり得るか、あるいは、本発明の実施者によって選択される異なる培地または洗浄液であり得る。
【００９１】
その後、細胞は、製造用バイオリアクターに播種するために適切な密度に希釈することができる。細胞は、本発明の実施者の必要性および要望に依存して、または、（例えば、細胞が、製造用バイオリアクターに播種する前に短期間にわたって貯蔵されることになるならば）細胞自体の特定の要求を受け入れるために、別の培地または溶液に希釈することができ、例えば、開始細胞培養培地または所望される細胞培養培地に希釈することができる。
【００９２】
初期成長段階
製造用容器が、上記のように播種されると、動物細胞培養は、本明細書中に開示される本発明の式によって得られた所望される細胞培養培地を使用する初期成長段階において、かつ、細胞培養の生存、成長および生存性の助けとなる条件のもとで維持することができる。正確な条件は、細胞タイプ、細胞が得られた生物、ならびに、発現ポリペプチドまたは発現タンパク質の性質および特性に依存して変化する。
【００９３】
製造用バイオリアクターは、ポリペプチドまたはタンパク質の大規模な産生のために適切である任意の体積であることが可能である。好ましい実施形態において、製造用バイオリアクターの体積は少なくとも５００リットルである。他の好ましい実施形態において、製造用バイオリアクターの体積は、１０００リットル、２５００リットル、５０００リットル、８０００リットル、１０，０００リットル、１２，０００リットルまたはそれ以上、あるいは、任意の中間の体積である。当業者は、本発明を実施する際に使用される好適なバイオリアクターを承知しており、そのような好適なバイオリアクターを選ぶことができる。製造用バイオリアクターは、発現、あるいは、産生されたポリペプチドまたはタンパク質の安定性を妨げない、細胞の成長および生存性の助けとなる任意の材料から組み立てられ得る。
【００９４】
初期成長段階における細胞培養の温度は、主として、細胞培養が依存として生存したままである温度の範囲に基づいて選択される。例えば、初期成長段階の期間中、ＣＨＯ細胞は３７℃でよく成長する。一般には、ほとんどの哺乳動物細胞が約３５℃〜３９℃の範囲内でよく成長する。本発明の１つの実施形態において、成長段階（０日目〜３日目）のための温度が３７℃であり、産生段階（３日目以降）のための温度が３１℃である。当業者は、細胞の必要性および実施者の製造要求に依存して、細胞を成長させるための適切な温度（１つまたは複数）を選択することができる。
【００９５】
本発明の１つの実施形態において、初期成長段階の温度が単一の一定した温度で維持される。別の実施形態において、初期成長段階の温度が、ある温度範囲内で維持される。例えば、温度を、初期成長段階の期間中、絶えず増大または低下させることができる。代替として、温度を、初期成長段階の期間中、様々な時間において不連続な量で増大または低下させることができる。当業者は、単一の温度または多数の温度が使用されることが望ましいかどうか、および、温度が、絶えず、または、不連続な量によって調節されることが望ましいかどうかを決定することができる。
【００９６】
細胞は、実施者の必要性および細胞自体の要求に依存して、初期成長段階の期間中、より長い時間、または、より短い時間成長させることができる。１つの実施形態において、細胞は、乱されずに成長することが許されるならば、細胞を最終的に到達する最大生細胞密度の所与の割合である生細胞密度を達成するために十分な期間にわたって成長させる。例えば、細胞を、最大生細胞密度の１パーセント以上、５パーセント以上、１０パーセント以上、１５パーセント以上、２０パーセント以上、２５パーセント以上、３０パーセント以上、３５パーセント以上、４０パーセント以上、４５パーセント以上、５０パーセント以上、５５パーセント以上、６０パーセント以上、６５パーセント以上、７０パーセント以上、７５パーセント以上、８０パーセント以上、８５パーセント以上、９０パーセント以上、９５パーセント以上または９９パーセント以上の所望される生細胞密度を達成するために十分な期間にわたって成長させることができる。
【００９７】
別の実施形態において、細胞は、規定された期間にわたって成長させることができる。例えば、細胞培養の開始濃度、細胞を成長させる温度、および、細胞の固有成長速度に依存して、細胞を、０日、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日またはそれ以上の日数にわたって成長させることができる。場合により、細胞を１ヶ月またはそれ以上にわたって成長させることができる。初期成長段階の温度での播種用バイオリアクターにおける細胞の成長が、その接種時における製造用バイオリアクターにおける生細胞密度が既に最大生細胞密度の所望される割合であるほどに十分であったならば、細胞を製造用バイオリアクターにおいて０日間成長させる。本発明の実施者は、ポリペプチドまたはタンパク質の製造要求および細胞自体の必要性に依存して、初期成長段階の持続期間を選ぶことができる。
【００９８】
細胞培養は、細胞への酸素供給および栄養物の分散を増大させるために初期成長段階の期間中において撹拌または振とうすることができる。本発明に従って、当業者は、ｐＨ、温度、酸素供給など（これらに限定されない）を含めて、初期成長段階の期間中のバイオリアクターのいくつの内部条件を制御または調節することが有益であり得ることを理解する。例えば、ｐＨを、適量の酸または塩基を供給することによって制御することができ、また、酸素供給を、この分野では広く知られている散布デバイスにより制御することができる。
【００９９】
培養条件の変化
初期成長段階が終了したとき、培養条件（１つまたは複数）を、第２の組の培養条件が適用され、代謝の変化が培養において生じるように変化させることができる。阻害性代謝産物（最も注目すべきものが乳酸およびアンモニアである）の蓄積により、成長が阻害される。代謝の変化は、例えば、細胞培養の温度、ｐＨ、浸透圧重量モル濃度または化学的誘導剤レベルにおける変化によって達成されるが、例えば、比グルコース消費速度に対する比乳酸産生速度の比率における低下によって特徴づけることができる。１つの限定されない実施形態において、培養条件を、培養の温度を変化させることによって変化させる。本発明の別の実施形態において、温度の変化が１日目〜７日目に生じる。本発明の別の実施形態において、温度を２９℃〜３２℃に変化させる。本発明の別の実施形態において、温度の変化が３日目に生じ、温度を３１℃に変化させる。温度変化および代謝変化に関する様々な教示がこの分野において見出され得る（例えば、米国特許出願公開第２００６／０１２１５６８号を参照のこと）。
【０１００】
その後の産生段階
細胞培養の条件を、上記で議論されたように変化させると、細胞培養は、細胞培養の生存および生存性の助けとなり、かつ、十分なレベル（例えば、商業的に十分なレベル）での所望されるポリペプチドまたはタンパク質の発現のために適切である第２の組の培養条件のもとでのその後の産生段階のために維持することができる。
【０１０１】
上記で議論されたように、培養を、温度、ｐＨ、浸透圧重量モル濃度および酪酸ナトリウムレベル（これらに限定されない）をはじめとする数多くの培養条件の１つまたは複数を変化させることによって変化させることができる。１つの実施形態において、培養の温度を変化させる。この実施形態によれば、その後の産生段階の期間中、培養は、初期成長段階の温度または温度範囲よりも低い温度または温度範囲で維持される。例えば、その後の産生段階の期間中、ＣＨＯ細胞は組換えポリペプチドおよび組換えタンパク質を２５℃〜３５℃の範囲内でよく発現する。本発明の１つの実施形態において、産生段階が３日目以降で始まる。本発明の別の実施形態において、産生段階が３１℃で行われる。米国特許出願公開第２００６／０１２１５６８号において議論されるように、多数の不連続な温度変化を、細胞密度または生存性を増大させるために、あるいは、組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質の発現を増大させるために用いることができる。
【０１０２】
本発明の式に従って、所望される細胞集団（例えば、細胞密度）および産生力価（例えば、目標力価）が、基礎調節されたアミノ酸濃度Ａおよび開始アミノ酸濃度Ｂを確立するために選択される。従って、一般には、細胞は、所望される細胞密度または産生力価に達するまで、あるいは、所望される細胞密度または産生力価に近い値に達するまで、その後の産生段階において維持される。１つの実施形態において、細胞は、組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質の力価が最大に達するまで、その後の産生段階において維持される。別の実施形態において、培養物を、実施者の製造要求、あるいは、細胞自体の必要性または生存性に依存して、この点よりも前で集めることができる。例えば、細胞を、最大生細胞密度の１パーセント以上、５パーセント以上、１０パーセント以上、１５パーセント以上、２０パーセント以上、２５パーセント以上、３０パーセント以上、３５パーセント以上、４０パーセント以上、４５パーセント以上、５０パーセント以上、５５パーセント以上、６０パーセント以上、６５パーセント以上、７０パーセント以上、７５パーセント以上、８０パーセント以上、８５パーセント以上、９０パーセント以上、９５パーセント以上または９９パーセント以上の生細胞密度を達成するために十分な期間にわたって維持することができる。場合により、生細胞密度を最大にし、その後、生細胞密度を、培養物を集める前に、あるレベルにまで低下させることが望ましい場合がある。極端な一例では、生細胞密度を、培養物を集める前に、ゼロに近づけるか、または、ゼロにすることが望ましい場合がある。
【０１０３】
本発明の別の実施形態において、細胞を、その後の産生段階の期間中、規定された期間にわたって成長させることができる。例えば、その後の成長段階の開始時における細胞培養の濃度、細胞を成長させる温度、および、細胞の固有成長速度に依存して、細胞を、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日またはそれ以上の日数にわたって成長させることができる。場合により、細胞を１ヶ月またはそれ以上にわたって成長させることができる。本発明の実施者は、ポリペプチドまたはタンパク質の製造要求および細胞自体の必要性に依存して、その後の産生段階の継続期間を選ぶことができる。培養の継続期間は、細胞維持のために要求されるアミノ酸濃度を決定するために役立ち、そのようなアミノ酸濃度は、本発明では、例えば、細胞集団のために要求されるアミノ酸濃度の０％〜１５０％の範囲であり得る。
【０１０４】
いくつかの場合には、細胞によって枯渇させられたか、または代謝された栄養分または他の培地成分を、その後の産生段階の期間中において細胞培養に補充すること、すなわち、細胞培養に供給することが有益または必要である場合がある。例えば、細胞培養のモニタリングの期間中に枯渇したことが認められる栄養分または他の培地成分を細胞培養に補充することが有益である場合がある（下記の「細胞培養条件のモニタリング」の節を参照のこと）。代替として、または、加えて、細胞培養への補充をその後の産生段階の前に行うことが有益または必要である場合がある。限定されない一例として、ホルモンおよび／または他の増殖因子、特定のイオン（例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩など）、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、微量元素（通常の場合には非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、脂質、アミノ酸、あるいは、グルコース（または他のエネルギー源）を細胞培養に補充することが有益または必要である場合がある。
【０１０５】
これらの補充成分はすべてが、細胞培養に一度に添加（すなわち、供給）することができ、または、一連の添加で細胞培養に与えることができる。本発明の１つの実施形態において、補充成分が、分割量で多数回、細胞培養に与えられる。別の実施形態において、補充成分の特定のものだけを最初に与え、残りの成分をその後において与えることが望ましい場合がある。本発明のさらに別の実施形態において、細胞培養には、これらの補充成分が連続して供給される。
【０１０６】
本発明に従って、細胞培養に添加される総体積は、最適には、最少量に保たなければならない。例えば、細胞培養に添加される供給用培地の総体積、すなわち、細胞培養に添加される、補充成分を含有する溶液の総体積は、補充成分を与える前の細胞培養の体積の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％であり得る。従って、供給用培地は、バイオリアクターの溢れまたは培地成分の希釈を避けるために高濃度でなければならない。供給用培地は、好ましくは、同じｐＨ、温度などで、しかし、開始用培地に対して栄養分の高い濃度で主培養に与えられる。本発明の１つの実施形態において、供給用培地は、表２の縦列４において「供給培地」として示される供給用培地である。
【０１０７】
本発明の１つの実施形態において、開始アミノ酸濃度Ｂを有する細胞培養には、基礎調節されたアミノ酸濃度Ａを達成するために、さらなるアミノ酸（１つまたは複数）が補充される。本発明の別の実施形態において、細胞培養には、約３日目から２１日目までの連続供給が与えられるか、または、２日毎〜３日毎の定期的供給が与えられる。本発明の別の実施形態において、供給が、（２１日間の培養については）約３日目から約２０日目までボーラス供給として行われる。本発明の別の実施形態において、供給が、約２日毎〜３日毎の定期的供給として行われる。本発明のさらに別の実施形態において、供給体積は総細胞培養体積の約１％〜約４０％である。
【０１０８】
細胞培養は、細胞への酸素供給および栄養分の分散を増大させるために、その後の産生段階の期間中において撹拌または振とうすることができる。本発明に従って、当業者は、ｐＨ、温度、酸素供給など（これらに限定されない）を含めて、その後の成長段階の期間中のバイオリアクターのいくつかの内部条件を制御または調節することが有益であり得ることを理解する。例えば、ｐＨを、適量の酸または塩基を供給することによって制御することができ、また、酸素供給を、この分野では広く知られている散布デバイスにより制御することができる。
【０１０９】
細胞培養条件のモニタリング
本発明のいくつかの実施形態において、実施者は、成長途中の細胞培養のいくつかの条件を定期的にモニターすることが有益または必要であることを見出す場合がある。細胞培養条件をモニターすることにより、実施者は、細胞培養が、目的とする組換えポリペプチドを準最適なレベルで産生しているかどうか、または、培養が、準最適な産生段階にまさに入ろうとしているかどうかを明らかにすることができる。いくつかの細胞培養条件をモニターするためには、少量の培養物を分析のために取り出すことが必要である場合がある。当業者は、そのような取り出しは潜在的には汚染を細胞培養に持ち込み得ることを理解し、また、そのような汚染の危険性を最小限に抑えるための適切な注意を払う。
【０１１０】
限定されない例として、温度、ｐＨ、細胞密度、細胞生存性、累積生細胞密度、乳酸レベル、アンモニウムレベル、浸透圧重量モル濃度、または、発現ポリペプチドの力価をモニターすることが有益または必要である場合がある。当業者がこれらの条件を測定することを可能にする数多くの技術がこの分野では広く知られている。例えば、細胞密度を、血球計、コールター・カウンターまたは細胞密度試験（ＣＥＤＥＸ（登録商標）、Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ）を使用して測定することができる。生細胞密度を、培養サンプルをトリパンブルーにより染色することによって求めることができる。死細胞のみがトリパンブルーを取り込むので（すなわち、生細胞は色素を排除するので）、生細胞密度を、細胞の総数を計数し、色素を取り込む細胞の数を細胞の総数によって除し、逆数を取ることによって求めることができる。ＨＰＬＣを、乳酸、アンモニウム、あるいは、発現ポリペプチドまたは発現タンパク質のレベルを求めるために使用することができる。代替として、発現ポリペプチドまたは発現タンパク質のレベルを、標準的な分子生物学技術によって、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシー染色、ウエスタンブロッティング、ブラッドフォードアッセイ、ローリー法、ビウレットアッセイおよびＵＶ吸光度などによって求めることができる。リン酸化およびグリコシル化を含めて、発現ポリペプチドまたは発現タンパク質の翻訳後修飾をモニターすることもまた有益または必要である場合がある。
【０１１１】
細胞培養により産生されたポリペプチドの採取
細胞培養により産生される目的とするポリペプチドは、その後、様々な適用における使用のために、培養培地から、または、細胞抽出物から精製することができる。ポリペプチドの可溶性形態を馴化培地から精製することができる。ポリペプチドの膜結合型形態を、総膜画分を発現細胞から調製し、膜を非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）など）により抽出することによって精製することができる。細胞質ゾルタンパク質または核タンパク質を、宿主細胞を（機械的力、パールボンブ、超音波処理、界面活性剤などにより）溶解し、細胞膜画分を遠心分離によって除き、上清を保持することによって調製することができる。
【０１１２】
ポリペプチドを、当業者には知られている他の方法を使用して精製することができる。例えば、開示された方法によって産生されたポリペプチドを、市販されているタンパク質濃縮フィルターを使用して、例えば、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）限外ろ過装置またはＰＥＬＬＩＣＯＮ（登録商標）限外ろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して濃縮することができる。濃縮工程の後、濃縮物を精製マトリックス（例えば、ゲルろ過媒体など）に加えることができる。代替として、アニオン交換樹脂（例えば、ＭｏｎｏＱカラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いることができる；そのような樹脂は、ペンダント状のジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）基を有するマトリックスまたは基体を含有する。精製のために使用されるマトリックスは、タンパク質精製において一般に用いられるアクリアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたは他のタイプが可能である。代替として、カチオン交換工程をタンパク質の精製のために使用することができる。好適なカチオン交換体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが含まれる（例えば、Ｓ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）カラム、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
【０１１３】
培養上清からのポリペプチドの精製ではまた、アフィニティー樹脂（例えば、コンカナバリンＡ−アガロース、ＡＦ−ＨＥＰＡＲＩＮ６５０、ヘパリン−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）またはＣｉｂａｃｒｏｎブルー３ＧＡ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）など）；フェニルエーテル、ブチルエーテルまたはプロピルエーテルのような樹脂を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム；あるいは、標識されたタンパク質に対する抗体を使用する免疫アフィニティーカラムでの１回または複数回のカラム工程を含むことができる。最後に、疎水性ＨＰＬＣ媒体（例えば、ペンダント状のメチル基または他の脂肪族基を有するシリカゲル）（例えば、Ｎｉ−ＮＴＡカラム）を用いる１回または複数回の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）工程を、タンパク質をさらに精製するために用いることができる。代替として、ポリペプチドを、精製を容易にする形態で組換え発現させることができる。例えば、ポリペプチドを、様々なタンパク質との融合体として、例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）などとの融合体として発現させることができる。融合タンパク質の発現および精製のための様々なキットが、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）からそれぞれ市販されている。タンパク質はまた、小さいエピトープ（例えば、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグまたはＦｌａｇタグ）により標識し、その後、選ばれたエピトープに対する特異的な抗体を使用して同定または精製することができる。様々な一般的なエピトープに対する抗体が数多くの商業的供給元から入手可能である。
【０１１４】
従来のクロマトグラフィー精製様式（例えば、フロースルークロマトグラフィー精製様式および結合溶出クロマトグラフィー精製様式）に対する代替として、本発明の方法によって産生されたポリペプチドは、クロマトグラフィー精製カラムを弱分配様式（調製物に含有される少なくとも１つの生成物、および、少なくとも１つの汚染物または不純物がともにクロマトグラフィー樹脂またはクロマトグラフィー媒体に結合する技術）で操作することによって精製することができる。弱分配様式では、そのような少なくとも１つの不純物がポリペプチド生成物よりも強固に媒体に結合する；従って、（ローディング液の）負荷が続くとき、結合していないポリペプチド生成物が選択的に媒体を通過し、カラム溶出液から回収される。そのような精製では、高い生成物回収だけでなく、大きい度合いの不純物削減がもたらされる。そのような精製は、荷電したイオン交換媒体、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー樹脂およびヒドロキシアパタイト樹脂（これらに限定されない）を含めて、この分野では知られている媒体および樹脂で達成することができる。少なくとも１つの実施形態において、不純物／汚染物の弱分配条件下での除去が、ローディング液が１ｍｌの媒体／樹脂あたり少なくとも２．８ｍｇの生成物と結合する媒体／樹脂を通過するときに生じる。少なくとも１つの他の実施形態において、不純物／汚染物の弱分配条件下での除去が、ローディング液が、少なくとも０．１の分配係数によって定義される操作条件で媒体／樹脂を通過するときに生じる。精製された生成物は、媒体／樹脂を含有するカラムの溶出液から回収される。
【０１１５】
表５には、フロースルー（ＦＴ）様式、結合溶出（Ｂ−Ｅ）様式および弱分配様式（ＷＰ）の間での特徴における違いがまとめられる。
【０１１６】
【表５】
0005564259.tif 000007
分配係数（Ｋｐ）は、溶液中の生成物の濃度（Ｃ）に対する吸着した生成物の濃度（Ｑ）の比率である。従って、弱分配様式についてのＫｐは、フロースルー様式についてのＫｐと、結合溶出様式についてのＫｐとの中間であり、例えば、約０．１〜２０の間である。弱分配様式の精製のための適正な条件（例えば、塩、緩衝液、ｐＨなど）を決定するために、ハイスループットスクリーニング研究または回分式精製スクリーニング研究を行うことができる。従って、当業者は、生成物の分配係数Ｋｐを操作条件の関数として求めることができる（実施例７．１参照）。
【０１１７】
弱分配様式を使用する様々な精製方法が米国特許出願第１１／３７２，０５４号および同第１１／５１０，６３４号に詳しく記載される（これらはともにその全体が本明細書中に参考として組み込まれる）。
【０１１８】
様々な組合せでの、または、他の知られている方法と一緒での前記精製工程のいくつかまたはすべてを、本明細書中に記載される大規模動物細胞培養方法および培地によって産生される目的とするポリペプチドを精製するために用いることができる。
【０１１９】
細胞培養によって産生されたポリペプチドを含有する医薬組成物
前記の細胞培養培地（例えば、大規模細胞培養培地）および細胞培養方法により、目的とするポリペプチド、例えば、抗体、可溶性受容体、融合タンパク質などがもたらされる。開示された細胞培養方法によって、また、本明細書中に開示される新規な培地および関連した方法を用いて産生されるポリペプチドは、抗体およびそのフラグメントを含めて、インビトロまたはエクスビボで使用することができ、あるいは、医薬組成物に配合し、その必要性のある個体（例えば、ヒト対象体）に投与することができる。本発明のポリペプチドを投与すべきかどうかを決定することにおいて検討するためのいくつかの薬理ゲノム学的アプローチが当業者には広く知られており、これらには、ゲノム全般での関連、候補遺伝子アプローチおよび遺伝子発現プロファイリングが含まれる。本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路との適合性を有するように配合される（例えば、経口用組成物は一般には、不活性な希釈剤または食用キャリアを含む）。投与経路の他の限定されない例には、非経口投与（例えば、静脈内投与）、皮内投与、皮下投与、経口投与（例えば、吸入投与）、経皮投与（局所的投与）、経粘膜投与および直腸投与が含まれる。それぞれの意図された経路と適合し得る様々な医薬組成物がこの分野では広く知られている。
【０１２０】
本発明のポリペプチドは、医薬的に許容され得るキャリアと組み合わされたとき、医薬組成物として使用することができる。そのような組成物は、本発明のポリペプチドに加えて、この分野では広く知られているキャリア、様々な希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤および他の物質を含有することができる。用語「医薬的に許容され得る」は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨害しない非毒性の物質を意味する。キャリアの特性は投与経路に依存する。
【０１２１】
本発明の医薬組成物はまた、対象とされる特定の障害を処置するためのさらなる治療因子または治療薬剤を含有することができる。例えば、２型糖尿病を処置するための医薬組成物はまた、経口用の抗糖尿病剤を含むことができる。医薬組成物は、血栓溶解因子または抗血栓因子（例えば、プラスミノーゲン活性化因子および第ＶＩＩＩ因子など）を含有することができる。医薬組成物はさらに、抗炎症性薬剤を含有することができる。そのようなさらなる因子および／または薬剤は、本発明のポリペプチドとの相乗的作用を生じさせるために、または、本発明のポリペプチドによって引き起こされる副作用を最小限に抑えるために医薬組成物において含むことができる。
【０１２２】
本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドが、他の医薬的に許容され得るキャリアに加えて、両親媒性の薬剤（例えば、水溶液において、ミセル、不溶性単層、液晶またはラメラ層として凝集形態で存在する脂質など）と組み合わされるリポソームの形態である場合がある。リポソーム配合物のための好適な脂質には、限定されないが、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが含まれる。
【０１２３】
本明細書中で使用される用語「治療効果的な量」は、意味のある患者利益（例えば、そのような状態の症状の改善、そのような状態の治癒、または、そのような状態の治癒速度における増大）を示すために十分である医薬組成物または方法のそれぞれの活性な構成成分の総量を意味する。単独で投与される個々の有効成分に対して適用されるとき、この用語はその成分だけを示す。組合せに対して適用されるとき、この用語は、組合せで、または、連続して、または、同時に投与されようとも、治療効果をもたらすその複数の有効成分の組み合わされた量を示す。
【０１２４】
本発明の処置方法または使用方法を実施することにおいて、本発明のポリペプチドの治療効果的な量が対象に投与され、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与される。本発明のポリペプチドは、単独または他の治療法との組合せでのどちらかで本発明の方法に従って投与することができる。１つまたは複数の薬剤とともに併用投与されるとき、本発明のポリペプチドは、第２の薬剤と同時に、または、連続して、そのどちらかで投与することができる。連続して投与されるならば、主治医により、本発明のポリペプチドを他の薬剤との組合せで投与する適切な順序が決定される。
【０１２５】
本発明のポリペプチドの治療効果的な量が経口投与されるとき、結合剤が、錠剤、カプセル、粉末剤、溶液またはエリキシル剤の形態である。錠剤形態で投与されるとき、本発明の医薬組成物は固体のキャリア（例えば、ゼラチンまたは佐剤など）をさらに含有することができる。錠剤、カプセルおよび粉末剤は約５％〜９５％の結合剤を含有し、好ましくは、約２５％〜９０％の結合剤を含有する。液体形態で投与されるとき、液体のキャリア、例えば、水、石油、動物起原または植物起原のオイル（例えば、ピーナッツ油（これには、ピーナッツアレルギーに関して注意が必要である）、鉱油、ダイズ油またはゴマ油など）、あるいは、合成オイルなどを加えることができる。医薬組成物の液体形態はさらに、生理学的食塩水溶液、デキストロース溶液または他の糖類溶液、あるいは、グリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）を含有することができる。液体形態で投与されるとき、医薬組成物は約０．５重量％〜約９０重量％の結合剤を含有し、好ましくは、約１重量％〜約５０重量％の結合剤を含有する。
【０１２６】
本発明のポリペプチドの治療効果的な量が、静脈内注射、皮内注射または皮下注射によって投与されるとき、本発明のポリペプチドは、パイロジェンを含有しない非経口的に許容され得る水溶液の形態である。そのような非経口的に許容され得るタンパク質溶液を、ｐＨ、等張性および安定性などを適正に考慮して調製することは、当業者の範囲内である。静脈内注射、皮内注射または皮下注射のための好ましい医薬組成物は、本発明のポリペプチドに加えて、等張性のビヒクル（例えば、この分野では知られているような塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロース・塩化ナトリウム注射液、乳酸加リンゲル注射液または他のビヒクルなど）を含有しなければならない。本発明の医薬組成物はまた、当業者に知られている安定剤、保存剤、緩衝剤、酸化防止剤または任意の他の添加剤を含有することができる。
【０１２７】
本発明の医薬組成物における本発明のポリペプチドの量は、処置されている状態の性質および重症度、ならびに、患者がこれまでに受けた以前の処置の性質に依存する。最終的には、主治医により、それぞれの個々の患者を処置するための本発明の医薬組成物またはポリペプチドの量が決定される。最初に、主治医は、本発明の医薬組成物またはポリペプチドの少ない用量を投与し、患者の応答を観察する。本発明の医薬組成物またはポリペプチドのより大きい用量を、最適な治療効果がその患者について得られるまで投与することができ、その時点で、投薬量は一般にはさらに増大されない。その必要性のある対象を処置するために使用される様々な医薬組成物は体重１ｋｇあたり約０．１μｇ〜約１００ｍｇの本発明のポリペプチドを含有しなければならないことが意図される。
【０１２８】
本発明の医薬組成物を使用する静脈内（ｉ．ｖ．）治療の継続期間は、処置されている疾患の重症度、ならびに、それぞれの個々の患者の状態および潜在的な特異体質的応答に依存して変化する。本発明の医薬組成物またはポリペプチドのそれぞれの適用の継続期間は、例えば、１時間〜１２時間、６時間〜１８時間、または、１２時間〜２４時間の連続的または断続的なｉ．ｖ．投与の範囲内であり得ることが意図される。本発明の医薬組成物を使用する皮下（ｓ．ｃ．）治療もまた意図される。これらの治療法は、毎日、１週間に１回、または、より好ましくは、２週間に１回、または、１ヶ月に１回施すことができる。最終的には、主治医により、本発明の医薬組成物を使用するｉ．ｖ．治療またはｓ．ｃ．治療あるいは小分子による治療の適切な継続期間、および、本発明の医薬組成物を使用する治療を施す時期が決定される。
【０１２９】
本出願において引用される参考文献、特許、特許出願および刊行物のすべてが、本明細書により、その全体において参考として本明細書中に組み込まれる。
【実施例】
【０１３０】
下記の実施例は、本発明の理解を助けるために示され、しかし、どの点においても本発明の範囲を限定するために意図されず、また、どの点においても本発明の範囲を限定するために解釈してはならない。下記の実施例には、従来の方法（例えば、組換えＤＮＡ技術など）の詳細な記述は含まれない。そのような方法は当業者には広く知られている。
【０１３１】
実施例１
ＣＨＯ細胞のアミノ酸組成の定量
抗体発現ＣＨＯ細胞および組換えタンパク質発現ＣＨＯ細胞のアミノ酸組成を定量するために、すなわち、細胞集団（バイオマス）のアミノ酸全体に対する各アミノ酸のモル百分率を定量するために、下記の手順を行った。簡単に記載すると、抗体または組換えタンパク質（より具体的には、抗ＩＬ−２２抗体（組換えヒト抗ＩＬ−２２抗体）、Ｍｙｏ−０２９抗体（抗ＧＤＦ８ＩｇＧ１モノクローナル抗体）および組換えヒトＢＭＰ−２）を過剰発現する３つのＣＨＯ細胞株を、１日間（ＢＭＰ−２）または３日間（Ｍｙｏ−０２９および抗ＩＬ−２２）、振とうフラスコで成長させた。最終日に、培養物を集め、細胞を遠心分離して１０６細胞／ｍＬの濃度にした。１０６個の細胞を含有するペレットを１ＸＰＢＳにより２回洗浄し、ペレットを５００μＬの５Ｎ  ＨＣｌに再懸濁した。細胞を含有する懸濁物を１００℃で２４時間加熱し、その時点で、懸濁物を真空下で遠心分離した。得られたペレットを５００μＬのＰＢＳに再懸濁し、アミノ酸分析を、ガスクロマトグラフィーまたは液体クロマトグラフィーを使用して行った。
【０１３２】
酸加水分解では、メチオニンおよびトリプトファンがともに酸加水分解の期間中に分解することが明らかにされた。そのため、実施例２および実施例３におけるこれらのアミノ酸の濃度はＣＨＯ細胞についての文献値に基づいた。加えて、グルタミンおよびアスパラギンが加水分解の期間中にそれらの酸型（それぞれ、グルタミン酸およびアスパラギン酸）に変換されたことが明らかにされた。そのため、実施例２および実施例３におけるこれら４つのアミノ酸の濃度は、文献に報告されるグルタミン／グルタミン酸の比率およびアスパラギン／アスパラギン酸の比率に基づいた。それ以外では、これらのＣＨＯ細胞株は類似するアミノ酸組成を有しており、また、他の哺乳動物細胞についての報告値とよく一致したことが明らかにされた（データは示さず）（Ｂｏｎａｒｉｕｓ（１９９６）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５０：２９９−３１８参照）。
【０１３３】
実施例２
合理的に設計された培地を使用する３２体積％の供給物によるＣＨＯ細胞（細胞株１）における１５ｘ１０６細胞／ｍｌの所望されるピーク細胞密度および９ｇ／Ｌの目標抗ＩＬ−２２抗体力価
実施例２．１：合理的に設計された培地
本明細書中に開示される式を使用して、９ｇ／Ｌの抗ＩＬ−２２抗体をＣＨＯ細胞株１において産生する１５ｘ１０６細胞／ｍｌのために要求されるアミノ酸の基礎調節されたアミノ酸濃度Ａを求めた（表６、縦列２）（細胞維持が５０％（すなわち、Ｙ＝０．５）で設定された）。様々なアミノ酸の基礎調節されたアミノ酸濃度Ａ（表６、縦列２）を、表６の縦列３に示される修正後の基礎調節された総アミノ酸濃度を得るために調節した。下記の調節を行った：Ａｓｎ、ＡｓｐおよびＧｌｎのレベルを米国特許出願公開２００６／０１２１５６８号Ａ１に従って設定した；２）Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙが細胞培養によって産生されたので、それらのレベルをより低い値に調節した；３）Ｃｙｓのレベルを、シスチンもまた供給用培地において使用され、また、システインの培地値が米国特許出願公開２００６／０１２１５６８号Ａ１における値に設定されるという事実のために調節した；４）Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅのレベルは、設定されたアミノ酸組成を含有する供給物粉末が、所望される細胞培養培地を作製するために使用され、その結果、正確な一致が不可能であったという事実のために、基礎調節されたアミノ酸濃度Ａよりも２０％〜１００％高くされる。開始用培地アミノ酸濃度Ｂ（表６、縦列４）を、表６の縦列３に示される修正後の基礎調節された総アミノ酸濃度から計算した。
【０１３４】
表６：所望される細胞培養培地配合物
【０１３５】
【表６】
0005564259.tif 000008
実施例２．２：合理的に設計された培地に対する応答での細胞密度および抗体力価
細胞株１の細胞（抗ＩＬ−２２発現ＣＨＯ細胞）を、３日目の培養物を含有する振とうフラスコから得て、１Ｌのバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  ２Ｌ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ））における開始細胞培養培地に０日目に０．７ｘ１０６細胞／ｍｌで接種した。３日目（約８０時間）に、温度を３７℃から３１℃に変化させ、供給培地（表２の縦列４を参照のこと）を、３日目、５日目、６日目、７日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日、１４日目、１７日目、２０日目に、体積比で３．７５％、４％、４％、９％、２％、１％、１％、１％、３％、２％および１％でそれぞれ加えて、表６の縦列３に示されるアミノ酸濃度を含有する所望される細胞培養培地を得た。細胞培養を、ｐＨ７．０において、３０％の溶存酸素レベルで、２００ｒｐｍでの撹拌により維持した。サンプルを、細胞密度（ＣＥＤＥＸ（登録商標）細胞計数装置（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ））、生存性（ＣＥＤＥＸ（登録商標））およびいくつかの代謝産物レベル（Ｎｏｖａ  ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）について試験するために毎日採取した。遠心分離した培地を、プロテインＡでのＨＰＬＣを使用する抗体力価分析のために−８０℃で保存した。
【０１３６】
結果が図１および図２に示される。図１から認められ得るように、最高の細胞密度（約１１ｘ１０６細胞／ｍＬ）が培養の１１日目で達成され、細胞密度はその後は低下した。最高の抗体力価（約７ｇ／Ｌ）が培養の２１日目で得られた。従って、合理的に設計された培地を、大きい細胞密度および大きい抗体力価を生じさせるために使用することができる。
【０１３７】
実施例３
合理的に設計された培地を使用する３３体積％の供給物によるＣＨＯ細胞（細胞株２）における１５ｘ１０６細胞／ｍｌの所望されるピーク細胞密度および１０ｇ／Ｌの目標抗ＩＬ−２２抗体力価
実施例３．１：合理的に設計された培地
本明細書中に開示される式を使用して、（上記で記載される）１５ｘ１０６細胞／ｍｌおよび１０ｇ／Ｌの抗ＩＬ−２２抗体のために要求されるアミノ酸の基礎調節されたアミノ酸濃度Ａを求めた（細胞維持が５０％（すなわち、Ｙ＝０．５）で設定された）。様々なアミノ酸の基礎調節されたアミノ酸濃度Ａ（表７、縦列２）を、表７の縦列３に示される修正後の基礎調節された総アミノ酸濃度を得るために、実施例２において記載されるように調節した。加えて、この培地配合物のために、開始細胞培養培地および供給培地の両方を、一定の組成を有する既存の粉末物から調製した。従って、正確な一致は不可能であった。開始用培地アミノ酸濃度Ｂ（表７、縦列４）を、表７の縦列３に示される修正後の基礎調節された総アミノ酸濃度から計算した。
【０１３８】
表７：所望される細胞培養培地配合物
【０１３９】
【表７】
0005564259.tif 000009
実施例３．２：合理的に設計された培地に対する応答での細胞密度および抗体力価
細胞株２の細胞（抗ＩＬ−２２発現ＣＨＯ細胞）を、３日目の培養物を含有する振とうフラスコから得て、細胞を１Ｌのバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  ２Ｌ）における開始細胞培養培地に０日目に０．７ｘ１０６細胞／ｍｌで接種した。３日目（約８０時間）に、温度を３７℃から３１℃に変化させ、供給物を自動供給ポンプにより連続的に加えて（１日あたり体積比で１．８％）、表７の縦列３に示されるアミノ酸濃度を含有する所望される細胞培養培地を得た。細胞培養を、ｐＨ７．０において、３０％の溶存酸素レベルで、２００ｒｐｍでの撹拌により維持した。サンプルを、細胞密度（ＣＥＤＥＸ（登録商標）細胞計数装置）、生存性（ＣＥＤＥＸ（登録商標））およびいくつかの代謝産物レベル（Ｎｏｖａ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃアナライザー）について試験するために毎日採取した。遠心分離した培地を、プロテインＡでのＨＰＬＣを使用する抗体力価分析のために−８０℃で保存した。
【０１４０】
結果が図３および図４に示される。図３から認められ得るように、最高の細胞密度（約１２ｘ１０６細胞／ｍＬを超える）が培養の１０日目で達成され、細胞密度はその後は低下した。最高の抗体力価（１０ｇ／Ｌを超える）が培養の１９日目で得られた。従って、合理的に設計された培地を、大きい細胞密度および大きい抗体力価を生じさせるために使用することができる。
【０１４１】
実施例４
細胞培養成績に対するプロリン添加の影響
抗体（抗ＩＬ−２２）を産生するＣＨＯ細胞を、ｐＨ制御された振とうフラスコ（１００ｍＬの作業体積を有する５００ｍＬフラスコ）で培養し、温度制御された７％ＣＯ２インキュベーターにおいて約１００ｒｐｍでの振とう機で維持した。細胞を０．７ｘ１０６細胞／ｍＬで播種した。培養継続期間は１８日であった。最初の３日間、細胞は３７℃で維持され、その後、温度を培養の残りについては３１℃に変化させた。ｐＨを、最初の３日間、１Ｍ重炭酸ナトリウムにより制御した。細胞培養培地は、１０ｘ１０６細胞／ｍＬおよび１０ｇ／Ｌの抗体を達成するために、「従来培地」と呼ばれる従来の細胞培養要求に基づく培地と、合理的に設計された培地、すなわち、「合理的設計培地」と呼ばれる、本明細書中に開示される合理的設計を使用して配合された培地とからなった。これら２つの配合物の間における注目すべき大きな違いは、いくつかのアミノ酸（ＰＲＯ、ＴＨＲ、ＧＬＹ、ＴＹＲ、ＴＲＰ、ＶＡＬおよびＰＨＥ）が、「従来培地」と比較した場合、「合理的設計培地」ではより高い濃度で存在することである。示される第３の条件が、「合理的設計培地」におけるプロリンのレベルを得るために、さらなる３．７ｍＭのプロリンが添加された従来培地であり、これは「従来培地＋プロリン」と呼ばれる。これらの配合物が下記の表８に示される。Ｗｙｅｔｈ自家製供給培地（「供給培地」、表２を参照のこと）を、３日目〜４日目、９日目〜１４日目、１７日目において２％、５日目〜６日目において１％、および、７日目において３％の毎日の供給物を含む合計で２３体積％で培養物に加えた。
【０１４２】
表８：プロリン研究のための培地配合物
【０１４３】
【表８】
0005564259.tif 000010
これらの実験からの結果が図５〜図７に示される。従来培地へのプロリンの添加、すなわち、「従来培地＋プロリン」（図５）は、１４日目を終えて「合理的設計培地」に等しい抗体産生をもたらした。図６に示されるように、３つの培地のすべてが高い細胞密度を維持し、最大の密度が１２日目に示された。図７に示されるように、３つの培地のすべてが高い細胞生存性を維持し、「合理的設計培地」での培養が、「従来培地」培地を含有する培地、および、「従来培地＋プロリン」培地を含有する培地に対する比較では、１５日目〜１８日目においてより大きい生存性を維持した。グリシン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンのいずれかの１つの合理的に設計された濃度をそれぞれが含有する様々な他の培地は、「従来培地」よりも大きい抗体力価を生じさせる細胞培養をもたらさなかったので（データは示さず）、プロリンが、高い力価を達成するために要求される律速アミノ酸として働く。このことが図８Ａ〜図８Ｅにおいて例示され、これらの図は、１４日目までに、「従来培地＋プロリン」におけるアミノ酸の多くが極めて低いレベルに達し（チロシンが枯渇したことには留意すること）、それにより、抗体へのこれらのアミノ酸のさらなる取り込みが妨げられたことを示す。この結果はまた、「従来培地＋プロリン」についての傾きが１４日目以降は低下し、一方で、抗体産生が、より高いレベルの他のアミノ酸を含有する「合理的設計培地」については１８日目を終えて維持されるように、力価のグラフ（図５）においてもまた認められる。
【０１４４】
興味深いことに、「従来培地」におけるプロリン濃度は１ｍＭ未満には一度も低下しなかった（図８Ａ）；しかしながら、抗体への総アミノ酸取り込みに対するプロリンの影響が１１日目以降は低下した。この発見は、プロリン閾値が存在すること、すなわち、プロリンの濃度は培養を通して１ｍＭを超えて維持されなければならないことを示唆する。
【０１４５】
実施例５
机上の実験例：新規な細胞株のための最適化された細胞培養培地
本明細書中に開示される培地設計方法は、新規な細胞／細胞株を使用する細胞培養を含めて、任意の細胞培養のために使用することができる。新規な細胞株とともに使用される最適化された培地は、下記の式に従ったアミノ酸の少なくとも１つの基礎調節されたアミノ酸濃度Ａを含有する：
Ａ＝［（Ｍ＊Ｘ）＋（Ｎ＊Ｐ）＋（Ｙ＊Ｍ＊Ｘ）］＊Ｆ
乗数Ｍは、上記の式を新規な細胞培養に適用するとき、例えば、１細胞／ｍＬから２０ｘ１０６細胞／ｍＬまで選択することができる。当業者は、成長速度に基づいて計算することができる成長段階の期間中の最大細胞密度を２倍することによって有用なＭの値を計算することができる。
【０１４６】
乗数Ｎは、上記の式を新規な細胞培養に適用するとき、例えば、ＩＶＣに細胞のｑｐを乗じることによって計算することができる。当業者は、ＩＶＣを、「合理的培地設計および配合」と題された節において記載される方法に従って、成長プロフィルを推定することによって計算することができる。当業者は、ｑｐを、抗体または組換えタンパク質の産生を細胞あたりに基づいて測定することによって計算することができる。
【０１４７】
細胞維持係数Ｙは、上記の式を新規な細胞培養に適用するとき、Ｙ＝１（すなわち、所望される細胞集団のために要求されるアミノ酸（１つまたは複数）の１００％）を最初に使用し、その後、Ｙの値を（より大きく、または、より低く）精密化することによって推定することができる。
【０１４８】
基礎係数Ｆは、上記の式を新規な細胞培養に適用するとき、Ｆ＝１．３（すなわち、３０％のさらなるアミノ酸（１つまたは複数））を最初に使用し、その後、Ｆの値を（より大きく、または、より低く）精密化することによって推定することができる。
【０１４９】
実施例６
細胞培養成績に対する維持係数および基礎係数の影響
維持係数Ｙおよび基礎係数Ｆが細胞培養成績のために重要／必須であることを明らかにするために、抗ＩＬ−２２発現ＣＨＯ細胞を０．７ｘ１０６細胞／ｍＬで播種し、７．０のｐＨ設定値および３０％の溶存酸素（ＤＯ）設定値により２Ｌのバイオリアクターにおいて２１日間培養した。ｐＨを２ＮのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３によって制御し、ＤＯを空気（７％のＣＯ２を含有する）の散布によって制御した。培養の温度は最初の３日間は３７℃であり、３日目以降は３１℃に変化させ、培養が終了するまで３１℃のままであった。細胞を、（１）目標タンパク質力価および所望されるピーク細胞密度の両方のために要求されるアミノ酸を含有する培地（しかし、維持係数または基礎係数を計上しない）、すなわち、「維持係数および基礎係数を伴わない合理的設計培地」、または、（２）「合理的設計培地」のどちらかで２１日間培養した。
【０１５０】
図９および図１０において例示されるように、維持係数および基礎係数を計上しない培地は生存性における著しい低下を示し、細胞培養の２１日目において０％にほぼ近づき、また、細胞密度における著しい低下を示した。さらに、図１１は、細胞培養の２１日目において、この同じ培地が５ｇ／Ｌの抗体力価を支えることができただけであったことを明らかにする。
【０１５１】
対照的に、合理的設計培地（維持係数および基礎係数を含む）は、より大きい生存性、細胞密度および抗体力価を示した（図９〜図１１）。細胞培養の２１日目において、合理的設計培地は１０ｇ／Ｌの抗体力価を支えることができた。
【０１５２】
これらの発見は、所望される細胞培養培地中のアミノ酸濃度の決定において維持係数および基礎係数を計上することにより、細胞生存性、細胞密度およびポリペプチド力価によって測定されるような細胞成績が改善されることを示唆する。
【０１５３】
実施例７
アニオン交換クロマトグラフィーを弱分配様式で使用するポリペプチド精製
実施例７．１．弱分配条件およびフロースルー条件を確立するためのハイスループットスクリーニング
初期のスクリーニング研究を最初に行った。このスクリーニング研究により、様々な溶液条件のもとで樹脂に結合した生成物の分配係数および／または濃度が求められ、従って、Ｍａｂ−ＡＡＢ、目的とするポリペプチド、および、ＴＭＡＥ−ＨｉＣａｐ（Ｍ）媒体についての弱分配（ＷＰ）様式およびフロースルー（ＦＴ）様式の操作領域が定義された。このスクリーニングでは塩化ナトリウムの濃度およびｐＨを変化させて、Ｍａｂ−ＡＡＢの結合度合いに対するそれらの影響、および、ＴＭＡＥ媒体に対するプロセス関連不純物（プロテインＡおよびＨＣＰ）を明らかにした。
【０１５４】
試験サンプルにおけるプロテインＡ残留物のレベルを、プロテインＡの酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定した。高分子量凝集物の量を、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）アッセイを使用して測定した。宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のレベルを、ＨＣＰのＥＬＩＳＡを使用して測定した。すべてのスクリーニング研究およびカラム研究を室温で行った。
【０１５５】
５０μＬのＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ媒体を９６ウエルフィルタープレートの各ウエルに加えた。各ウエルを、５０ｍＭグリシンならびに可変量のＴｒｉｓ緩衝液（表９において指定されるｐＨに対する中和のために要求される量に依存する）および塩化ナトリウム（表１０において指定される）から構成される溶液において平衡化した。ｐＨは７．６〜９．０の範囲であり、塩化ナトリウムは０ｍＭ〜８０ｍＭの範囲であった。
【０１５６】
それぞれの横列において使用された緩衝剤溶液は自動分注システム（Ｔｅｃａｎ１００ＲＳＴ）で希釈された。緩衝液のためのストック溶液が、ＨＣｌによりｐＨ３．０に酸性化された５００ｍＭグリシンから作製され、続いて、表９に示されるｐＨレベルに２ＭのＴｒｉｓ塩基により中和された。この滴定により、緩衝液のｐＨに依存するＴｒｉｓのレベルがもたらされた。緩衝液のｐＨを、自動分注システムによって作製される希釈物に対応するストック緩衝液濃度の１対１０の希釈で測定した。ｐＨ３．０へのグリシン酸性化の結果として、緩衝液は約１０ｍＭのイオン強度を最終的な溶液に与える。２回の負荷（ローディング液）攻撃を樹脂に対して行った：カラム負荷濃度にほぼ等しい濃度でのタンパク質溶液による平衡状態において、分配係数（Ｋｐ）を測定するための５ｍｇ／ｍＬ、ならびに、不純物の除去および結合した生成物についての樹脂の結合容量（Ｑ）を測定するための１２２ｍｇ／ｍＬ。
【０１５７】
表９：各ウエルにおける緩衝液タイプおよびｐＨ目標
【０１５８】
【表９】
0005564259.tif 000011
表１０：各ウエルにおけるＮａＣｌレベル（ｍＭ）およびタンパク質攻撃（ｍｇ／ｍＬ）
【０１５９】
【表１０】
0005564259.tif 000012
ハイスループットスクリーニングの第１段階において、各ウエルを、６：１の相体積比（３００ｕＬの溶液：５０ｕＬの樹脂）で、表９および表１０に記載されるようなＮａＣｌおよびｐＨの条件において平衡化した。プレートを２０分間振とうし、これにより、平衡に到達させた。その後、溶液を、フィルタープレートを遠心分離することによって除いた。この平衡化サイクルを３回繰り返した。
【０１６０】
第２段階において、各ウエルにおける樹脂を、適切なＮａＣｌ濃度およびｐＨで、６：１の体積比（３００ｕＬの溶液：５０ｕＬの樹脂）を用いて５ｍｇ／ｍＬ樹脂にまで高濃度のＭＡｂ−ＡＡＢ溶液により攻撃した。３００ｐｐｍのプロテインＡが添加された、１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）におけるＭａｂ−ＡＡＢの３６ｍｇ／ｍＬの溶液をストック溶液として使用した。負荷されたプレートを２０分間振とうし、これにより、樹脂および溶液を平衡化させた。上清を遠心分離によってフィルタープレートから除き、回収プレートに集めた。各ウエルにおける上清でのタンパク質濃度をＡ２８０ｎｍでの吸光度によって求めた。
【０１６１】
第３段階において、樹脂を、表１０に列挙されるＮａＣｌおよびｐＨの指定された条件の溶液を加えることによって洗浄した。上清を２０分間の振とうの後で除いた。第４段階において、２ＭのＮａＣｌを加えて、樹脂に結合した残留するタンパク質を除いた。分配係数を、第３段階および第４段階から溶出した物質量、ならびに、第２段階からの生成物濃度を使用して各ウエルについて計算した。分配係数が表１１に示される。
【０１６２】
表１１：ＭＡｂ−ＡＡＢに対する９６ウエルＨＴＳスクリーニングについての分配係数（Ｋｐ）
【０１６３】
【表１１】
0005564259.tif 000013
表１１に示されるように、Ｋｐの値を使用して、ＭＡｂ−ＡＡＢが種々の強度でＴＭＡＥ媒体に結合する領域を記述することができる。ＭＡｂ−ＡＡＢがＴＭＡＥ媒体に結合する強さを、フロースルー区域（Ｋ≦０．１）、弱分配区域（０．１＜Ｋ＜２０）および結合区域（Ｋ≧２０）へのｐＨおよび塩化物濃度の条件を変化させることによって操作することができる。
【０１６４】
それぞれの区域に由来するすべてのウエルの負荷段階からの上清をサンプリングし、プロテインＡ分析のために提出した。これらのサンプルのアッセイ結果が表１２にまとめられる。ＴＭＡＥクロマトグラフィー工程がプロテインＡの非常に著しい除去を樹脂への限られたタンパク質損失とともにもたらす、ｐＨおよび伝導度の領域が存在する。この領域は、分配係数の値Ｋｐに密接に相関し、何らかの特定のｐＨまたは塩化物濃度には相関しないことが見出された。
【０１６５】
表１２：ＨＴＳスクリーニングからのＭＡｂ−ＡＡＢ結合データについてのプロテインＡのＬｏｇ除去値（ＬＲＶ）
【０１６６】
【表１２】
0005564259.tif 000014
実施例７．２．フロースルー条件下でのカラム操作
下記の実験を、ＭＡｂ−ＡＡＢがカラムとほんの非常に弱く相互作用するだけであるフロースルー（ＦＴ）様式で行った。２回の操作を１１０ｍｇ／ｍｌ樹脂および２００ｍｇ／ｍｌ樹脂の負荷攻撃により行った。
【０１６７】
記載されたすべてのＴＭＡＥ（ＨｉＣａｐＭ）アニオン交換クロマトグラフィー操作のために、下記の条件を使用した（例外が個々の実験記載において記される）。
【０１６８】
操作流速−  １５０〜３００ｃｍ／ｈｒ
平衡化１−  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム体積）
平衡化２−  指定される通り、ローディング液のｐＨおよび塩化物含有量にほぼ等しい
負荷後洗浄−  指定される通り、ローディング液のｐＨおよび塩化物含有量にほぼ等しい
脱離緩衝液−  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム体積）
ＭａｂｓｅｌｅｃｔプロテインＡクロマトグラフィー
モノクローナル抗体を含有する培養物を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｋ−ｐｒｉｍｅ  ４００クロマトグラフィーシステムに接続されたＭａｂＳｅｌｅｃｔカラム（２，３８９ｍＬ）を使用してＰｉｌｏｔ規模で精製した。ＭａｂｓｅｌｅｃｔプロテインＡカラムを３００ｃｍ／ｈｒの流速で５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の５カラム体積により平衡化した。その後、カラムには、１ｍｌの樹脂あたりおよそ４０ｍｇの生成物の負荷量での負荷を行った。この後に、１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）における５カラム体積（ＣＶ）の洗浄、および、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の洗浄液を含有する５ＣＶの洗浄が続いた。その後、カラムを、５０ｍＭグリシン、７５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ３．０）を使用して溶出した。生成物プールを、２Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）を使用してｐＨ７．６に中和した。中和されたピークは塩化物濃度がおよそ９０ｍＭであった。
【０１６９】
ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ（Ｍ）クロマトグラフィー
中和されたプロテインＡプールをさらに、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび７５ｍＭ塩化ナトリウムによるｐＨ７．５での平衡化溶液、負荷溶液および洗浄溶液を用いたＴＭＡＥ工程で精製した。５カラム体積の洗浄を使用した。これら２つの研究のためのカラムの大きさおよび負荷攻撃は、操作１：１１．９ｍｇ／ｍＬのローディング液濃度を用いた７．０ｃｍの直径ｘ２０．６ｃｍのベッド高さ（体積−７９３ｍＬ）、および、操作２：１７．６ｍｇ／ｍＬのローディング液濃度を用いた７．０ｃｍの直径ｘ１３ｃｍのベッド高さ（体積−５００ｍＬ）であった。
【０１７０】
これらの負荷条件はフロースルー（ＦＴ）領域においてであった（表１３）。回分式の結合研究を使用して、分配係数（Ｋｐ）を測定し、また、結合した生成物を、ＵＶ吸光度を使用することによってカラム脱離液におけるタンパク質によって求めた。結合した生成物を求めるこの方法では、典型的には、洗浄期間中の生成物のアイソクラティック溶出のために、負荷期間中に結合した生成物の量が推定される。ローディング液および生成物プールにおけるプロテインＡ、ＨＣＰおよび高分子量凝集物（ＨＭＷ）のレベルを測定し、除去の程度を計算した。結果が表１３に示される。プロテインＡおよびＨＭＷの除去が不良であり、ＨＣＰレベルにおける低下は大きくない。
【０１７１】
表１３：ＨＣＰ、プロテインＡおよびＨＭＷのＦＴ条件下での除去
【０１７２】
【表１３】
0005564259.tif 000015
＊不純物のレベルは、３８．５ｐｐｍのプロテインＡおよび５１，９４３ｐｐｍのＨＣＰ（操作１）、ならびに、８．８ｐｐｍのプロテインＡおよび２５，３９８ｐｐｍのＨＣＰ（操作２）であった。
【０１７３】
実施例７．３．弱分配条件下でのカラム操作（高い生成物による攻撃）
ＴＭＡＥ（ＨｉＣａｐ  Ｍ）アニオン交換クロマトグラフィー
数回のＭａｂｓｅｌｅｃｔプロテインＡ操作を、これらの操作のための負荷物を作製するために、本質的には実施例７．２において記載されるように行った。プロテインＡ工程からの部分精製された抗体プールをさらにＴＭＡＥカラムで精製した。ＴＭＡＥカラムへの負荷は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．２）においてであった。カラム直径は０．５ｃｍであり、ベッド高さは１０ｃｍの高さであった（体積−２．０ｍＬ）。カラムに、２７．７ｍｇ／ｍＬのローディング液濃度による５００ｍｇ／ｍＬ樹脂の負荷への攻撃を行った。
【０１７４】
カラムを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を含有する溶液の５ＣＶにより平衡化し、その後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．２）の溶液を含む別の平衡化工程により平衡化した。その後、カラムを、前段工程からの中和されたプロテインＡピークにより、樹脂１ｍｌあたり５００ｍｇの生成物にまで負荷し、生成物を負荷サイクルの期間中のカラム溶出液および数カラム体積の洗浄画分において回収した。
【０１７５】
これらの負荷条件は弱分配領域においてである。回分式の結合研究を使用して、高いタンパク質濃度での分配係数（Ｋｐ）および生成物結合を測定した。ｐＨ８．２および１２ｍＭのおおよその塩化物濃度において、分配係数Ｋｐが、（ＨＴＳスクリーニングからのデータセットの補間から）１．９であると推定される。
【０１７６】
ＨＣＰおよびプロテインＡのレベルを、およそ２５０ｍｇ／ｍｌ樹脂、３７５ｍｇ／ｍｌ樹脂および５００ｍｇ／ｍｌ樹脂の負荷攻撃を表す負荷工程の期間中の３つの画分において測定した。実施例７．３からの結果が表１４に示される。これらの結果は、不純物が現れることなく、非常に高い生成物による攻撃が弱分配様式において達成され得ることを明らかにする。ＨＣＰおよびプロテインＡの両方における優れた減少がＨＭＷ含有量における５０％の減少と一緒に達成された。表１３におけるフロースルー様式での操作についての結果との比較において、不純物の除去が弱分配様式でははるかにより良好であった。
【０１７７】
表１４：５００ｍｇ／ｍｌのＴＭＡＥ負荷攻撃についての、ＨＣＰ、プロテインＡおよびＨＭＷの除去
【０１７８】
【表１４】
0005564259.tif 000016
＊ローディング液における不純物は、２５，３９８ｐｐｍのＨＣＰ、９９．５ｐｐｍのプロテインＡおよび２．３％のＨＭＷであった。
【０１７９】
実施例７．４．弱分配条件下でのカラム操作（ロバストネス研究）
弱分配の領域におけるＴＭＡＥカラムの成績をさらに確認するために、数回の操作を、プロセスのロバストネスを試験するために、ローディング液におけるｐＨおよびＮａＣｌ濃度を変化させて設計した。すべての操作を２５０ｍｇ／ｍｌ樹脂の負荷攻撃で行った。数回のＭａｂｓｅｌｅｃｔプロテインＡ操作を、これらの操作のための負荷物を作製するために、本質的には実施例７．２に記載されるように行った。それらの操作において変化させた唯一の因子は、プロテインＡ溶出における塩化ナトリウム濃度であり、この場合、プロテインＡ溶出における塩化ナトリウム濃度を、特定の実験についてはＴＭＡＥローディング液におけるＮａＣｌ濃度と一致させるために変化させた。カラムを平衡化２緩衝液により平衡化し、ローディング液のほぼ同じｐＨおよび塩化ナトリウム含有量を有する洗浄緩衝液により洗浄した。
【０１８０】
これらの負荷条件は弱分配領域においてである。回分式の結合研究を使用して、分配係数（Ｋｐ）を測定した。操作が、表１５に列挙される分配係数によって順位づけされる。結合した生成物を、カラム脱離液におけるタンパク質を、ＵＶ吸光度を使用して測定することによって求めた。結合した生成物は７．８ｍｇ／ｍＬ〜２５．３ｍｇ／ｍＬの範囲である。これらの実験から得られる、プロテインＡ、ＨＣＰおよびＨＭＷの結果もまた表１５に示される。すべての不純物の除去が、１３．５ｍＭ〜３８．８ｍＭの総塩化物およびｐＨ７．８〜８．４に及ぶ操作範囲において影響されないことが見出された。
【０１８１】
表１５：ＨＣＰ、プロテインＡおよびＨＭＷのＷＰ様式での除去に関するプロセスのロバストネス研究
【０１８２】
【表１５】
0005564259.tif 000017
＊不純物のレベルは、３８．５ｐｐｍのプロテインＡおよび５１，９４３ｐｐｍのＨＣＰ（操作１）、ならびに、８．８ｐｐｍのプロテインＡおよび２５，３９８ｐｐｍのＨＣＰ（操作２）であった。
＋  ＮａＣｌ、緩衝液および滴定液からのＣｌ−イオンの寄与を含む。
【０１８３】
実施例７．５．まとめ
これらの研究から、プロテインＡの除去（ＬＲＶ）がＫｐとともに強く変化し、一方で、ＨＣＰのＬＲＶが０．２６以上のＫｐの値のすべてで優れており、しかし、（フロースルー条件下では）Ｋｐ＝０．１７において大きく低下することが理解され得る。宿主細胞タンパク質の除去は、低下した負荷攻撃についてさえ、弱分配条件と比較した場合、フロースルー条件については１対数単位を超えて低下している。結合した生成物は、樹脂およびモノクローナル抗体のこの組合せに関して、これらの弱分配条件については７．８ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌの範囲である。分配係数は、０．４１＜Ｋｐ＜５．４の間において最適であるようである。分配係数は、Ｋｐ＝０．１７および１．４ｍｇ／ｍＬ〜３．３ｍｇ／ｍＬの結合した生成物では、すなわち、実施例７．２の条件では最適でないようである。
【０１８４】
これらの研究により、不純物、高分子量凝集物、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質などの存在を大きく低下させる、合理的設計培地での細胞培養を使用して産生させられたポリペプチドを精製する代替様式が示唆される。
【図１】
0005564259.tif 000018
【図２】
0005564259.tif 000019
【図３】
0005564259.tif 000020
【図４】
0005564259.tif 000021
【図５】
0005564259.tif 000022
【図６】
0005564259.tif 000023
【図７】
0005564259.tif 000024
【図８Ａ】
0005564259.tif 000025
【図８Ｂ】
0005564259.tif 000026
【図８Ｃ】
0005564259.tif 000027
【図８Ｄ】
0005564259.tif 000028
【図８Ｅ】
0005564259.tif 000029
【図９】
0005564259.tif 000030
【図１０】
0005564259.tif 000031
【図１１】
0005564259.tif 000032