(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パーキンソン病、ジストニー、振せんおよびテンカンから成る群から選択される運動障害を処置するための、ボツリヌス毒素を有効成分として含有する医薬組成物であって、頭蓋内注射によって、または調節放出システムとして頭蓋内埋め込みによって投与される組成物。
【請求項２】
ボツリヌス毒素が、A、B、C1、D、E、FおよびG型ボツリヌス毒素から成る群から選択される請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
ボツリヌス毒素がA型ボツリヌス毒素である請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
下脳領域に投与する請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
橋領域に投与する請求項1に記載の組成物。
【請求項６】
中橋領域に投与する請求項1に記載の組成物。
【請求項７】
淡蒼球に投与する請求項1に記載の組成物。
【請求項８】
視床に投与する請求項1に記載の組成物。
【請求項９】
運動障害がパーキンソン病である請求項1または3に記載の組成物。
【請求項１０】
パーキンソン病における振せん、運動緩徐または運動異常を処置するための請求項9に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】（技術分野）
本発明は、運動障害の処置法に関する。本発明は特に、神経毒の頭蓋内投与による運動障害の処置法に関する。
【０００２】 運動障害
運動障害は、1つまたはそれ以上の筋肉または筋肉群に関係する神経学的障害である。運動障害は、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、進行性核上性麻痺、ウィルソン病、ツレット症候群、テンカン、および種々の慢性振せん、チックおよびジストニーを包含する。種々の臨床的に観察される運動障害は、脳の同一または類似の領域に由来する。例えば、脳幹神経節の異常（脳半球の深部の大きい細胞群）は、種々の運動障害の原因要素であると推定されている。
【０００３】  振せんは、異常な不随運動を特徴とする。本能性振せんは、罹患した体の部分（多くの場合、腕または手）を使用する際、例えば、字を書こうとする際、または微細な調整された手の動きをする際に、最大になる。一般的な化学療法は、低血圧および心拍数変化の副作用を有する薬剤プロプラノロール（Inderal）の使用である。安静時振せんは、パーキンソン病、およびパーキンソン症候群の特徴を有する症候に一般的である。安静時振せんは、肢が静止している際に最大になる。多くの場合、手を伸ばしてコップを取るような細かい動きを患者がしようとする際に、振せんは消失する。全身性抗コリン作用性薬剤を使用して成功している場合がある。
【０００４】  ジストニーは、体または四肢に関して捻れた歪んだ姿勢を生じうる連続筋肉収縮を特徴とする不随意運動障害である。ジストニーの原因は、生化学的異常、変性障害、精神医学的機能不全、毒素、薬剤および中枢神経系外傷を包含する。現在、視床切開および／または視床下部切開またはカンポトミー（campotomy）は、ジストニーを処置する好ましい神経外科法であり、パーキンソン病の外科的処置と同様の技術および脳標的を使用して行われる。Tasker R., Surgical Treatment of the Dystonias, Gildenberg P. L. ら、Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery, McGraw-Hill（1998），  第105章, p. 1015-1032。
【０００５】  特定のジストニーは、痙性斜頚、眼瞼痙攣および書痙を包含する。痙性斜頚は、通常、成人に発症し、首が一方に不随意的に回ることを含む。頭および首が回っていることを初めは気付かない人もある。眼瞼痙攣は、眼瞼を間欠的に激しく閉じることを含む不随意運動である。書痙は、人が字を書くか、または手で他の動作を行う際に生じる痙攣異常姿勢である。症状が進行して、腕および肩に関係しうる。
【０００６】  チック障害（ツレット症候群を含む）は一般に、極めて速い、短い型にはまった繰り返される運動である。一般的なチックは、運動系に関係するか、または性質において音声的である。運動性チックは、多くの場合、眼瞼、眉または他の顔筋ならびに上肢に関係する。音声チックは、うなり（grunting）、喉清浄化（throat clearing）、咳、またはののしり（cursing）に関係する。チック障害を有する患者は、特定のチックを行うよう強い衝動を感じると述べる場合が多く、その動作を行わなければ、強い圧迫感が自分自身の中に増大するのを実際に感じうる。例えば、一方の腕の突然の動きに関係する運動性チックは、患者が自分の手の上に座れば、短時間は調節しうるが、ほとんど抑制できないその動作への衝動が支配して、チック動作を生じてしまう。
【０００７】  ツレット症候群は、幼少期にまたは青年期に始まる場合が多いチック障害であり、男性にかなり多い。多発性運動性チックならびに音声チックが存在する。チックは、多くの場合、1つの体の部分の関与から他の部分の関与に変化し、該疾患は、間欠的に良くなったり悪くなったりし、ほぼ最少の活動の期間、および機能するのが困難な患者もいる場合がある他の期間が存在する。他の神経行動的困難は、症候群を伴う場合が多い。これらは、注意欠陥障害（ADHD）および強迫性障害を包含する。大部分のチック障害の処置は、脳内のドーパミンの量を減少させる薬剤、例えばドーパミン拮抗薬を使用する。残念なことに、これらの薬剤は、パーキンソン症候群（硬直、遅い動き、および振せん）を包含する他の運動障害のような副作用を伴う。ツレット症候群の他に、チックは、頭部損傷、一酸化炭素中毒、脳卒中、薬物使用および精神遅滞に関係している。
【０００８】  進行性核上性麻痺は、患者が初めに自分の目を縦に（上下）動かすのにかなり困難になり、次に、全ての眼の運動が制限される運動障害（眼筋麻痺）である。患者は、痴呆、硬直、運動緩徐（遅い動き）および転倒傾向（propensity for falls）も発症しうる。
【０００９】  ハンチントン舞踏病は、神経学的および精神医学的特徴の両方を有する遺伝性疾患である。ほとんどの場合、40才代または50才代で発症するが、早いおよび遅い発症もありうる。該疾患は、神経学的または精神的状態の変化で開始される。神経学的徴候は、種々であるが、舞踏病を包含する。舞踏病（「踊ること」を意味するギリシャ語に由来する）は、ダンス的、痙攣的な短時間の一連の動きであり、体の部分を次々に動かす。ぎこちなさ、落ち着きのなさ、飛び跳ねも生じうる。特に顎のまわりの顔面運動が生じうる。歩行および姿勢の困難を生じる場合も多い。精神医学的症状が、パラノイア、錯乱、または人格変化として存在しうる。疾患が進行するのに伴って、重大な痴呆が発症する。MRI画像は、尾状核として既知の脳幹神経節の部分（運動に関与）の萎縮（縮み）を示す。
【００１０】  ウイルソン病は、神経系および肝臓機能に関与する障害である。神経学的問題は、振せん、共調運動不能、転倒、不明瞭な話し方、硬直および痙攣を包含する。精神医学的問題が生じ、この疾患を処置しなければ、患者は重度の肝臓損傷を発症しうる。高い銅レベルおよびセルロプラスミンレベルを示す。
【００１１】  残念なことに、前記の運動障害は、薬物療法に耐性になりうる。薬剤耐性振せんは、安静時振せん、例えばパーキンソン病において起こる振せん、動作時振動せん、例えば、本能性振せん、多発性硬化症振せん、外傷後振せん、片麻痺後振せん（脳卒中後痙性）、ニューロパシーに関連した振せん、書字振せん、およびテンカンを包含する。
【００１２】 パーキンソン病
パーキンソン病は、高齢者において発症が増加する運動障害である。パーキンソン病は、米国において60才以上の人口の約1％が罹患する老齢者の一般的無力化疾患（disabling disease）である。パーキンソン病の発症は、年齢と共に増加し、該疾病を発症している人の累積寿命リスク（cumulative lifetime risk）は約40人に1人である。症状は、四肢の顕著な振せん、運動緩徐、硬直および姿勢変化を包含する。認められるパーキンソン病の病態生理学的原因は、黒質区画部を有して成る脳幹神経節、脳幹に存在する基底核における、ドーパミン生産細胞の進行性破壊である。ドーパミン作用性ニューロンの減少は、アセチルコリンの相対的過剰を生じる。Jellinger, K. A., Post Mortem Studies in Parkinson's Disease − Is It Possible to Detect Brain Areas For Specific Symptoms？,J Neural Transm 56（Supp）; 1−29：1999。
【００１３】  パーキンソン病は進行性疾患であり、該疾患は、中等度四肢硬直および頻繁でない振せんで始まり、10年またはそれ以上の期間で、頻繁な振せんおよび記憶障害、抑制不能な振せんおよび痴呆に進行する。
【００１４】  パーキンソン病の処置に使用される薬剤は、L−ドパ、セレジリン、アポモルフィンおよび抗コリン作用薬を包含する。L−ドパ（レボ−ジヒドロキシ−フェニルアラニン）（シネメット）は、血液脳関門を通過しうるドーパミン先駆物質であり、脳内でドーパミンに変換しうる。残念なことに、L−ドパは体内で短い半減期を有し、長期使用後（即ち、約4〜5年後）に、L−ドパの効果は散発性かつ予測不能性になり、運動機能の変動、運動異常および精神医学的副作用を生じる。さらに、L−ドパは、ビタミンB欠乏症を発症しうる。
【００１５】  セレジリン（デプレニール、エルデプリル）は、L−ドパの代替薬として使用され、脳内のドーパミンの分解を減少させることによって作用する。残念なことに、セレジリンは、約9ヶ月間の使用後に非有効性になる。アポモルフィン、ドーパミン受容体作用薬は、パーキンソン病の処置に使用されているが、それだけで使用した場合の重度の嘔吐、ならびに皮膚反応、感染、嗜眠状態およびいくつかの精神医学的副作用を生じる。
【００１６】  全身投与される抗コリン作用薬（例えば、ベンズヘキソールおよびオルフェネドリン）もパーキンソン病の処置に使用され、脳内で生産されるアセチルコリンの量を減少させ、それによってパーキンソン病に存在するドーパミン／アセチルコリンの不均衡を是正することによって作用する。残念なことに、抗コリン作用薬を全身投与された患者の約70％は、幻覚を含む重度の神経精神医学的副作用、ならびにジスキネジー運動、および視覚作用、嚥下困難、口の渇きおよび残尿を包含する広い抗コリン作用薬分布から生じる他の副作用を生じる。例えば、Playfer, J. R., Parkinson's Disease, Pastgrad Med J. 73；257−264：1997およびNadeau, S. E., Parkinson's Disease, J Am Ger Soc, 45；233−240：1997参照。
【００１７】  1969年のL−ドパの導入前は、定位脳手術がパーキンソン病の数少ない有効処置法の1つであった。L−ドパ療法の長期制限を含むパーキンソン病の処置薬に関連した重大な既知の欠陥および欠点によって、神経外科的介入に再び関心が持たれるようになった。片側定位視床切開は、対側振せんおよび硬直の抑制に有効であることが分かっているが、片側不全麻痺のリスクを有する。両側視床切開は、会話および嚥下障害の高リスクを有する。定位淡蒼球切開術、淡蒼球（脳幹神経節）の部分の外科的切除を使用して成功している場合もある。外科的切除の他に、中間腹側核に配置した高周波刺激電極は、異常運動を抑制する場合があることが分かった。コンピューター連動断層撮影法および磁気共鳴画像法を包含するプローブの正確な配置を可能にする種々の方法が存在する。残念なことに、パーキンソン病の運動不能、会話および歩行障害は、これらの外科的方法によってほとんど改善せず、該方法は全て破壊的脳損傷を生じる。
【００１８】 テンカン
痙攣は、中枢神経系ニューロンの集合体からの異常な過剰の高同期放電（hypersynchronous discharge）による発作性事象である。テンカンは、慢性的な潜在するプロセスによって、人が再発性痙攣を有する状態である。テンカンの多くの原因の中に、臨床的および病理学的性質が特徴的な、特定の潜在する病因を示唆する種々のテンカン症候群が存在する。テンカンの有病率は、1000人中5〜10人と推定される。重度の穿通性頭部外傷は、最大50％のテンカン発症リスクを伴う。テンカンの他の原因は、脳卒中、感染および遺伝的感受性を包含する。
【００１９】  鎮痙性薬物療法は、大部分のテンカン患者の処置の主要な方法であり、種々の薬剤が使用されている。例えば、Fauci, A. S. ら、Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, 第14版（1998），p. 2321参照。抗テンカン薬の有効な組み合わせを見出そうとする努力にもかかわらず、テンカン患者の20％は薬物療法に耐性である。従って、手術が選択肢となりうる。ビデオ−EECモニタリングを使用して、痙攣病巣の解剖学的位置を限定し、異常な電気生理学的活性を、痙攣の行動的発現に関係付けることができる。定期的な頭皮または頭皮−蝶形骨記録は、位置決定に一般に充分である。高解像MRIスキャンを定期的に使用して、構造的病変を同定する。SPECTおよびPETのような機能画像化試験は、解剖学的異常を有する明らかなテンカン誘発領域の位置決定を裏付けるのを助ける。一旦、痙攣開始の推定位置が同定されると、神経心理学的試験および頚動脈内アモバルビタール試験（和田試験）を包含する追加試験を使用して、言語および記憶位置決定を評価し、テンカン誘発領域の外科的除去の可能な機能的結果を決定する。ある場合には、外科的方法の際に皮質マッピングを行うことによって、切除の正確な程度を決定しうる。これは、テンカン様障害の程度および問題とする皮質領域の機能を確認するための、電気生理学的記録および覚醒患者の皮質刺激を含む。
【００２０】  側頭葉テンカンを有する患者についての最も一般的な外科的方法は、前内側側頭葉の切除（側頭ロベクトミー）または、下にある海馬および扁桃のより限定された除去を包含する。外側頭葉領域から生じる局所痙攣は、局所新皮質切除によって抑制しうる。残念なことに、約5％の患者は、手術によって臨床的に重大な合併症を発症し、側頭ロベクトミーで処置された患者の約30％はなお痙攣を有する。
【００２１】  局所テンカンは、脳のほとんどあらゆる部分に関係し、一般に、機能不全の局限性病変から生じる。局所テンカンの１つに精神運動痙攣がある。現在の処置法は、局所テンカン性発作に罹患しやすくする器質脳疾患の領域に由来する異常棘波を位置決定するEEGを使用し、次に、将来の発作を予防するために病巣を外科的に切除することを含む。
【００２２】 脳運動系
大脳のいくつかの領域は、運動活性に影響を与える。従って、脳卒中によって生じるような大脳の運動皮質への損傷は、前庭および網様脳幹核の抑制を除去し、次に、それらは自発的に活性になり、抑制解除された下脳領域によって影響を受けた筋肉の痙攣を生じる。
【００２３】  大脳の副運動系は、脳幹神経節である。脳幹神経節は、皮質から大部分の情報（input）を受け取り、大部分のその信号を皮質に送る。脳幹神経節は、尾状核、被殻、淡蒼球、黒質（細胞層部を含む）および視床下核を包含する。脳幹神経節から運動皮質への異常信号は、パーキンソン病における大部分の異常を生じるので、これらの信号を遮断することによってパーキンソン病を処置しようとする努力がなされている。従って、視床の腹外側核および腹前側核に外傷（lesion）を作って、脳幹神経節から皮質へのフィードバック回路を遮断している。さらに、淡蒼球切断、淡蒼球の一部の外科的切除、を使用してパーキンソン病の運動障害を効果的に処置している。
【００２４】  外科的介入は、ドーパミン作用欠乏によって病理学的に視床を抑制していた運動経路を中断することによって、補助すると考えられる。次に、抑制された視床は、運動発生に関与する皮質ニューロンネットワークを過小刺激する。従って、手術は、視床抑制を除去し、薬物耐性運動障害の処置に使用されている。Speelman, J. D. ら, Thalamic Surgery and Tremor, Mov Dis 13（3）；103−106：1998。
【００２５】  振せんおよび他のパーキンソン症候群症状の処置のための頭蓋内外傷を、淡蒼球およびレンズ核わなに形成している。淡蒼球切断の長期結果は、失望させるものである場合もある。外科的な振せん抑制の肯定的な結果は、下記の視床核の外傷によって得られた：（1）腹中間（Vim）核または腹外側後（VLp）核；（2）腹前側（ventrooralis anterior）（Voa）核（VoaおよびVopは、集合的に、腹外側前側核（VLa）と称される）；（3）腹後側（ventrooralis posterior）（Vop）核；（4）視床下核（カンポトミー）；および（5）CM−Pf視床核。一般に、腹外側視床は、パーキンソン病および他の全身投与薬剤耐性振せんの処置における、最良の外科的標的である。Brophy, B. P. ら, Thalamotomy for Parkinsonian Tremor, Stereotact Funct Neurosurg, 69；1-4：1997。皮質の視床興奮は、ほとんど全ての皮質活性に必要である。
【００２６】  定位脳手術（神経画像化および電気生理学的記録によって補助）は、進行した薬物抵抗性パーキンソン病の処置に使用され、過活動淡蒼球および視床下核を標的としている。コンピューター断層撮影法または磁気共鳴画像法による脳画像化の補助によって、参照のために脳アトラス（atlas）を使用して電極およびプローブを脳内に配置する。淡蒼球（即ち、後腹側淡蒼球）、脳幹神経節、視床核および視床下核の種々の部分において、外傷を作って、パーキンソン病の運動障害の処置がなされている。残念なことに、外科的脳外傷は、言語、視覚および認識脳領域の損傷のリスクを有する。神経移植は有望であるが、さらに研究を必要とする。さらに、振せん抑制のための電極使用による深い脳刺激は、ワイヤ侵食、リード線摩擦、埋め込みパルス発生器の感染、埋め込みパルス発生器の機能不全、電気ショックおよびリード線移動による問題を生じうる。電極刺激による他の合併症は、構語障害、平行異常、不全麻痺および歩行障害を包含しうる。例えば、Koller, W. C. ら, Surgical Treatment of Parkinson's Disease, J Neurol Sci 167；1−10：1999、およびSchuurman P. R. ら, A Comparison of Continuous Thalamic Stimulation and Thalamotomy for Suppression of Severe Tremor, NEJM 342（7）；461−468：2000参照。
【００２７】  外科的切除または刺激の他に、外部放射線処置（ガンマナイフ放射線手術）も、限定された程度で、薬物抵抗性パーキンソン症候群の振せん処置に使用されている。この方法の短所は、振せんの減少が放射線手術から1週間〜8ヶ月遅れ、長期間の利益ならびに放射線の副作用が現在不明なことである。
【００２８】  前記のように、パーキンソン症候群の振せんおよび他の運動障害の処置は、視床切開術および／または視床下部領域のパリドフーガル（pallidofugal）繊維の中断によって行われ、淡蒼球切断術も使用されている。脳幹神経節回路構成の現在の概念は、パーキンソン病における線条体ドーパミンの減少が、淡蒼球の外側部分への線条体投射（projection）の過剰活性を生じることを提案している。生じた外側淡蒼球活性減少は、それの主要投射部位である視床下核の抑制解除を生じる。次に、増加した視床下部活性は、脚橋核（PPN）および腹側外側（VL）視床に投射する淡蒼球の内部分の過剰活性を生じる。従って、視床核および内部淡蒼球の過剰活性は、PPNおよびVL視床への投射を介して、振せん、運動緩徐および運動機能減少のパーキンソン症候群を生じる。視床下核の外傷、および淡蒼球切断術、特に後腹側淡蒼球切断は、パーキンソン患者の運動不能の有効な処置を可能にした。
【００２９】 ボツリヌス毒素
クロストリジウム属は、形態および機能によって分類される127より多い種を有する。
嫌気性グラム陽性細菌であるボツリヌス菌（Clostridium botulinum）は、ボツリヌス中毒と呼ばれる神経麻痺性障害をヒトおよび動物において引き起こす強力なポリペプチド神経毒であるボツリヌス毒素を産生する。ボツリヌス菌の胞子は、土壌中に見出され、滅菌と密閉が不適切な零細缶詰工場の食品容器内で増殖する可能性があり、これが多くのボツリヌス中毒症例の原因である。ボツリヌス中毒の影響は、通例、ボツリヌス菌の培養物または胞子で汚染された食品を飲食した18〜36時間後に現れる。ボツリヌス毒素は、消化管内を弱毒化されないで通過することができ、そして末梢運動ニューロンを攻撃することができるようである。ボツリヌス毒素中毒の症状は、歩行困難、嚥下困難および会話困難から、呼吸筋の麻痺および死にまで進行し得る。
【００３０】  A型ボツリヌス毒素は、人類に知られている最も致死性の天然の生物学的物質である。市販A型ボツリヌス毒素（精製された神経毒複合体）（商品名BOTOX（登録商標）１００単位バイヤルとしてカリフォルニア、アーヴィンのAllegan Inc. から入手可能）の約50ピコグラム（約56アトモル）がマウスにおけるLD50である。BOTOX（登録商標）の１単位は、約50ピコグラムのA型ボツリヌス毒素複合体を含んでいる。興味深いことに、モル基準でA型ボツリヌス毒素の致死力はジフテリアの18億倍、シアン化ナトリウムの6億倍、コブロトキシンの3000万倍、コレラの1200万倍である。Natuaral Toxins II［B. R. Singhら編、Plenum Press、ニューヨーク（1976）］のSingh、Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins、第63〜84頁（第4章）（ここで、記載されるA型ボツリヌス毒素LD50 0.3ng＝1Uとは、BOTOX（登録商標）約0.05ng=1Uという事実に補正される）。1単位(U)のボツリヌス毒素は、それぞれが18〜20グラムの体重を有するメスのSwiss Websterマウスに腹腔内注射されたときのLD50として定義される。
【００３１】  7種類の血清学的に異なるボツリヌス神経毒が特徴付けられており、これらは、型特異的抗体による中和によってそのそれぞれが識別されるボツリヌス神経毒血清型A、B、C1、D、E、FおよびGである。ボツリヌス毒素のこれらの異なる血清型は、それらが冒す動物種、ならびにそれらが惹起する麻痺の重篤度および継続時間が異なる。例えば、A型ボツリヌス毒素は、ラットにおいて生じる麻痺率により評価された場合、B型ボツリヌス毒素よりも500倍強力であることが確認されている。また、B型ボツリヌス毒素は、霊長類では480U/kgの投与量で非毒性であることが確認されている。この投与量は、A型ボツリヌス毒素の霊長類LD50の約12倍である。Moyer E ら, Botulinum Toxin Type B：Experimental and Clinical Experience, "Therapy With Botulinum Toxin" (Jankovic, J. ら編）（Marcel Deckler, Inc.）の第6章71-85頁。ボツリヌス毒素は、コリン作動性の運動ニューロンに大きな親和性で結合して、ニューロンに移動し、シナプス前のアセチルコリン放出を阻止するようである。
【００３２】  血清型に関係なく、毒素中毒の分子メカニズムは類似していると考えられ、少なくとも3つのステップまたは段階を含む。プロセスの第一段階において、毒素は、重鎖、H鎖および細胞表面受容体との特異的相互作用によって、標的ニューロンのシナプス前膜に結合し；受容体は、ボツリヌス毒素の各型、およびテタヌス毒素に関して異なっていると考えられる。H鎖のカルボキシル末端部分、HCは、毒素が細胞表面を標的にするのに重要であると考えられる。
【００３３】  第二段階において、毒素は、中毒化された細胞の形質膜を通過する。毒素は、先ず、受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞に包み込まれ、毒素を含有するエンドソームが形成される。次に、毒素は、エンドソームから出て、細胞の細胞質に入る。この段階は、約5.5またはそれ以下のpHに応答して毒素の配座変化を誘発するH鎖のアミノ末端部分HNによって媒介されると考えられる。エンドソームは、エンドソーム内pHを減少させるプロトンポンプを有していることが知られている。配座シフトは、毒素における疎水残基を露出させ、これは、毒素がそれ自身をエンドソーム膜に埋め込むことを可能にする。次に、毒素（または最小において軽鎖）は、エンドソーム膜を通過して細胞質に転位する。
【００３４】  ボツリヌス毒素活性のメカニズムの最後の段階は、重鎖、H鎖、および軽鎖、L鎖を結合するジスルフィド結合の減少を含む。ボツリヌス毒素およびテタヌス毒素の全毒性活性は、ホロトキシンのL鎖に含有され；L鎖は、亜鉛（Zn＋＋）エンドペプチダーゼであり、これは、認識、および神経伝達物質含有小胞と形質膜の細胞質表面との結合、および小胞と形質膜との融合に重要なタンパク質を選択的に開裂する。テタヌス神経毒、ボツリヌス毒素／B／D、／F、および／Gは、シナプトブレビン（小胞関連膜タンパク質（VAMP）とも称される）、シナプトソーム膜タンパク質を分解させる。シナプス小胞の細胞質表面に存在する大部分のVAMPは、これらの開裂現象のいずれか1つの結果として除去される。血清型AおよびEはSNAP−25を開裂する。血清型C1のボツリヌス毒素は、シンタキシンを開裂すると初めは考えられていたが、シンタキシンおよびSNAP−25を開裂することが見い出された。各毒素は、異なる結合を特異的に開裂する（同じ結合を開裂するB型ボツリヌス毒素（およびテタヌス）は除く）。
【００３５】  ボツリヌス毒素は、活動過多な骨格筋によって特徴付けられる神経筋障害を処置するために臨床的状況において使用されている。A型ボツリヌス毒素複合体は、本態性眼瞼痙攣、斜視および片側顔面痙攣の処置のために米国食品医薬品局によって承認された。非A型ボツリヌス毒素は、A型ボツリヌス毒素に比べ、明らかに、低い効力および／または短い活性の持続性を有している。末梢筋肉内A型ボツリヌス毒素の臨床的効果は、通常、注射後1週間以内に認められる。A型ボツリヌス毒素の単回筋肉内注射による症候緩和の典型的な継続時間は平均して約3ヶ月であり得る。
【００３６】  すべてのボツリヌス毒素血清型が神経筋接合部における神経伝達物質アセチルコリンの放出を明らかに阻害するようであるが、そのような阻害は、種々の神経分泌タンパク質に作用し、かつ／またはこれらのタンパク質を異なる部位で切断することによって行われる。例えば、A型およびＥ型ボツリヌス毒素は共に25キロダルトン（kD）のシナプトソーム会合タンパク質（SNAP-25）を切断するが、タンパク質内の異なるアミノ酸配列を標的とする。B型、D型、F型およびG型のボツリヌス毒素は小胞会合タンパク質（VAMP、これはまたシナプトブレビンとも呼ばれる）に作用し、それぞれの血清型によってこのタンパク質は異なる部位で切断される。最後に、C1型ボツリヌス毒素は、シンタキシンおよびSNAP-25の両者を切断することが明らかにされている。作用機序におけるこれらの相違が、様々なボツリヌス毒素血清型の相対的な効力および／または作用の継続時間に影響していると考えられる。明らかに、ボツリヌス毒素の基質は、種々の異なる細胞型に見出すことができる。Biochem J 1; 339 (pt 1): 159−65; 1999、およびMov Disord; 10(3): 376; 1995 参照（ランゲルハンス島Ｂ細胞は少なくともＳＮＡＰ-25およびシナプトブレビンを含んでいる）。
【００３７】  ボツリヌス毒素タンパク質分子の分子量は、既知のボツリヌス毒素血清型の7つのすべてについて約150kDである。興味深いことに、これらのボツリヌス毒素は、会合する非毒素タンパク質とともに150kDのボツリヌス毒素タンパク質分子を含む複合体としてクロストリジウム属細菌によって放出される。例えば、A型ボツリヌス毒素複合体は、900kD、500kDおよび300kDの形態としてクロストリジウム属細菌によって産生され得る。B型およびC1型のボツリヌス毒素は700kDまたは500kDの複合体としてのみ産生されるようである。D型ボツリヌス毒素は300kDおよび500kDの両方の複合体として産生される。最後に、E型およびF型のボツリヌス毒素は約300kDの複合体としてのみ産生される。これらの複合体（すなわち、約150kDよりも大きな分子量）は、非毒素のヘマグルチニンタンパク質と、非毒素かつ非毒性の非ヘマグルチニンタンパク質とを含むと考えられる。これらの2つの非毒素タンパク質（これらは、ボツリヌス毒素分子とともに、関連する神経毒複合体を構成する）は、変性に対する安定性をボツリヌス毒素分子に与え、そして毒素が摂取されたときに消化酸からの保護を与えるように作用すると考えられる。また、より大きい（分子量が約150kDよりも大きい）ボツリヌス毒素複合体は、ボツリヌス毒素複合体の筋肉内注射部位からのボツリヌス毒素の拡散速度を低下させ得ると考えられる。
【００３８】  生体外試験によって、ボツリヌス毒素は、脳幹組織の一次細胞培養物からの、アセチルコリンおよびノルエピネフィリンの両方のカリウムカチオン誘発放出を阻害することが示されている。さらに、ボツリヌス毒素は、脊髄ニューロンの一次培養物において、グリシンおよびグルタミン酸塩の両方の誘発放出を阻害し、脳シナプトソーム試料において、ボツリヌス毒素は、神経伝達物質アセチルコリン、ドーパミン、ノルエピネフィリン（Habermann E. ら, Tetanus Toxin and Botulinum A and C Neurotoxins Inhibit Noradrenaline Release From Cultured Mouse Brain, J Neuroche 51(2)；522−527：1988）、CGRP、サブスタンスPおよびグルタミン酸塩（Sanchez-Prieto, J. ら, Botulinum Toxin A BIocks Glutamate Exocytosis From Guinea Pig Cerebral Cortical Synaptosomes, Eur J. Biochem 165；675−681：1987）のそれぞれの放出を阻害することも報告されている。従って、適切な濃度を使用した場合、大部分の神経伝達物質の刺激誘発放出は、ボツリヌス毒素によって阻止される。例えば、Pearce, L. B., Pharmacologic Characterization of Botulinum Toxin For Basic Science and Medicine, Toxicon 35（9）；1373−1412,1393（1997）；Bigalke H. ら、Botulinum A Neurotoxin Inhibits Non-Cholinergic Synaptic Transmission in Mouse Spinal Cord Nuerons in Culture, Brain Research 360；318−324：1985；Habermann E., Inhibition by Tetanus and Botulinum A Toxin of the Release of ［3H］Noradrenaline and ［3H］GABA From Rat Brain Homogenate, Experientia 44；224−226：1998；Bigalke H. ら、Tetanus Toxin and Botulinum A Toxin Inhibit Release and Uptake of Various Transmitters, as Studied with Particulate Preparations From Rat Brain and Spinal Cord, Naunyn−Schmiedeberg's Arch Pharmacol 316；244−251：1981、およびJankovic J. ら、Therapy With Botulinum Toxin, Marcel Dekker, Inc.,（1994），p. 5参照。
【００３９】  A型ボツリヌス毒素は、発酵槽においてクロストリジウムボツリヌスの培地を定着させ増殖させ、次に、既知の方法によって発酵混合物を採取し精製することによって得ることができる。すべてのボツリヌス毒素血清型は、まずボツリヌス菌によって不活性な単鎖タンパク質として産生され、神経活性となるためにはプロテアーゼによって切断またはニッキングされなければならない。A型およびG型のボツリヌス毒素血清型を産生する細菌株は内因性プロテアーゼを有するので、A型およびG型の血清型は細菌培養物から主にその活性型で回収することができる。これに対して、C1型、D型およびE型のボツリヌス毒素血清型は非タンパク質分解性菌株によって合成されるので、培養から回収されたときには、典型的には不活性型である。B型およびF型の血清型はタンパク質分解性菌株および非タンパク質分解性菌株の両方によって産生されるので、活性型または不活性型のいずれでも回収することができる。しかし、例えば、B型ボツリヌス毒素を産生するタンパク質分解性菌株でさえも、産生された毒素の一部を切断するだけである。切断型分子と非切断型分子との正確な比率は培養時間の長さおよび培養温度に依存する。したがって、例えばB型ボツリヌス毒素の製剤はいずれも一定割合が不活性であると考えられ、このことが、A型ボツリヌス毒素と比較したB型ボツリヌス毒素の知られている著しく低い効力の原因であると考えられる。臨床製剤中に存在する不活性なボツリヌス毒素分子は、その製剤の総タンパク質量の一部を占めることになるが、このことはその臨床的効力に寄与せず、抗原性の増大に関連づけられている。また、B型ボツリヌス毒素は、筋肉内注射された場合、同じ用量レベルのA型ボツリヌス毒素よりも、活性の継続期間が短く、そしてまた効力が低いことも知られている。
【００４０】  ボツリヌス菌のＨall A株から、≧３×１０７Ｕ／ｍｇ、Ａ260／Ａ2780．６０未満、およびゲル電気泳動における明確なバンドパターンという特性を示す高品質結晶A型ボツリヌス毒素を生成し得る。Shantz, E. J. ら、Properties and use of Botulinum toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine、Microbiol Rev．５６：８０−９９（１９９２）に記載されているように既知のＳhanz法を用いて結晶A型ボツリヌス毒素を得ることができる。通例、A型ボツリヌス毒素複合体を、適当な培地中でA型ボツリヌス菌を培養した嫌気培養物から分離および精製し得る。既知の方法を用い、非毒素タンパク質を分離除去して、例えば次のような純ボツリヌス毒素を得ることもできる：比効力１〜２×１０８ＬＤ５０Ｕ／ｍｇまたはそれ以上の分子量約１５０ｋＤの精製A型ボツリヌス毒素；比効力１〜２×１０８ＬＤ５０Ｕ／ｍｇまたはそれ以上の分子量約１５６ｋＤの精製Ｂ型ボツリヌス毒素；および比効力１〜２×１０７ＬＤ５０Ｕ／ｍｇまたはそれ以上の分子量約１５５ｋＤの精製Ｆ型ボツリヌス毒素。
【００４１】  ボツリヌス毒素および毒素複合体は、List Biological Laboratories, Inc. （キャンベル、カリフォルニア）；the Centre for Applied Microbiology and Research（ポートン・ダウン、イギリス）；Wako（日本、大阪）；Metabiologics（マディソン、ウィスコンシン）；およびSigma Chemicals（セントルイス、ミズーリ）から入手し得る。
【００４２】  純粋なボツリヌス毒素は非常に不安定なので、通例、医薬組成物を製造するために使用されない。更に、ボツリヌス毒素複合体、例えばA型毒素複合体は、表面変性、熱およびアルカリ性条件による変性に対しても非常に感受性である。不活性化毒素はトキソイドタンパク質を形成し、これは免疫原性であり得る。その結果生じる抗体の故に、患者が毒素注射に対して応答しなくなり得る。
【００４３】  酵素一般について言えるように、ボツリヌス毒素（細胞内ペプチダーゼ）の生物学的活性は、少なくとも部分的にはその三次元形状に依存する。すなわち、A型ボツリヌス毒素は、熱、種々の化学薬品、表面の伸長および表面の乾燥によって無毒化される。しかも、既知の培養、発酵および精製によって得られた毒素複合体を、医薬組成物に使用する非常に低い毒素濃度まで希釈すると、適当な安定剤が存在しなければ毒素の無毒化が急速に起こることが知られている。毒素をｍｇ量からｎｇ／ｍｌ溶液へ希釈するのは、そのような大幅な希釈によって毒素の比毒性が急速に低下する故に、非常に難しい。毒素含有医薬組成物を製造後、何箇月も、または何年も経過してから毒素を使用することもあるので、毒素は安定剤、例えばアルブミンおよびゼラチンにより安定化することができる。
【００４４】  市販のボツリヌス毒素含有医薬組成物は、BOTOX（登録商標）（カリフオルニア、アーヴィンのAllergan，Inc. から入手可能）の名称で市販されている。BOTOX（登録商標）は、精製A型ボツリヌス毒素複合体、アルブミンおよび塩化ナトリウムから成り、無菌の減圧乾燥形態で包装されている。このA型ボツリヌス毒素は、Ｎ−Ｚアミンおよび酵母エキスを含有する培地中で増殖させたボツリヌス菌のＨall株の培養物から調製する。そのA型ボツリヌス毒素複合体を培養液から一連の酸沈殿によって精製して、活性な高分子量毒素タンパク質および結合ヘマグルチニンタンパク質から成る結晶複合体を得る。結晶複合体を、塩およびアルブミンを含有する溶液に再溶解し、滅菌濾過（０．２μ）した後、減圧乾燥する。減圧乾燥生成物は、−５℃またはそれ以下の冷凍庫内で貯蔵する。BOTOX（登録商標）は、筋肉内注射前に、防腐していない無菌塩類液で再構成し得る。BOTOX（登録商標）の各バイアルは、A型ボツリヌス毒素精製神経毒複合体約１００単位（Ｕ）、ヒト血清アルブミン０．５ｍｇおよび塩化ナトリウム０．９ｍｇを、防腐剤不含有の無菌減圧乾燥形態で含有する。
【００４５】  減圧乾燥BOTOX（登録商標）を再構成するには、防腐剤不含有の無菌生理食塩水（０．９％Sodium Chloride Injection）を使用し、適量のその希釈剤を適当な大きさの注射器で吸い上げる。BOTOX（登録商標）は、泡立てまたは同様の激しい撹拌によって変性すると考えられるので、そのバイアルに希釈剤を穏やかに注入する。BOTOX（登録商標）は、滅菌の理由から、バイアルを冷凍庫から取り出して再構成してから４時間以内に投与する。この４時間の間、再構成したBOTOX（登録商標）は冷蔵庫において２〜８℃で保管し得る。再構成し、冷蔵したBOTOX（登録商標）は、少なくとも２週間、その効能を維持する（Neurology, 48：249−53：1997）。
【００４６】  A型ボツリヌス毒素は下記のような臨床的状況において使用されていることが報告されている：
（1）頸部ジストニーを処置するための筋肉内注射（多数の筋肉）あたり約75単位〜125単位のBOTOX（登録商標）；
（2）眉間のしわを処置するための筋肉内注射あたり約5単位〜10単位のBOTOX（登録商標）（5単位が鼻根筋に筋肉内注射され、10単位がそれぞれの皺眉筋に筋肉内注射される）；
（3）恥骨直腸筋の括約筋内注射による便秘を処置するための約30単位〜80単位のBOTOX（登録商標）；
（4）上瞼の外側瞼板前部眼輪筋および下瞼の外側瞼板前部眼輪筋に注射することによって眼瞼痙攣を処置するために筋肉あたり約1単位〜5単位の筋肉内注射されるBOTOX（登録商標）；
【００４７】  （5）斜視を処置するために、外眼筋に、約1単位〜5単位のBOTOX（登録商標）が筋肉内注射されている。この場合、注射量は、注射される筋肉のサイズと所望する筋肉麻痺の程度（すなわち、所望するジオプター矯正量）との両方に基づいて変化する。
（6）卒中後の上肢痙性を処置するために、下記のように5つの異なる上肢屈筋にBOTOX（登録商標）が筋肉内注射される：
（a）深指屈筋：7.5U〜30U
（b）浅指屈筋：7.5U〜30U
（c）尺側手根屈筋：10U〜40U
（d）橈側手根屈筋：15U〜60U
（e）上腕二頭筋：50U〜200U。5つの示された筋肉のそれぞれには同じ処置時に注射されるので、患者には、それぞれの処置毎に筋肉内注射によって90U〜360Uの上肢屈筋BOTOX（登録商標）が投与される。
（7）偏頭痛を処置するために、25UのBOTOX（登録商標）の頭蓋骨膜注射（眉間筋、前頭筋、側頭筋に対称的に注射される）は、25U注射後3ヶ月間にわたって、偏頭痛の頻度、最大重度、関連嘔吐および急性薬使用の減少した測定値によって示されるように、賦形剤と比較して偏頭痛の予防的処置として有意な利益を示す。
【００４８】  さらに、筋肉内ボツリヌス毒素は、パーキンソン病患者における振せんの処置に使用されているが、結果はそれほど顕著ではない。Marjama−Jyons, J. ら、Tremor−Predominant Parkinson's Disease, Drugs ＆ Aging 16（4）；273−278：2000。
【００４９】  A型ボツリヌス毒素は、最大12ヶ月間にわたって有効性を有することができ（European J. Neurology 6（Supp 4）：S111−S1150：1999）、27ヶ月間にもわたって有効性を有する場合もある（The Laryngoscope 109：1344−1346：1999）。しかし、BOTOX（登録商標）の筋肉注射の一般的な持続期間は、約3〜4ヶ月である。
【００５０】  様々な臨床的状態を処置するためにA型ボツリヌス毒素が成功していることにより、他のボツリヌス毒素血清型が注目されている。2つの市販のA型ボツリヌス毒素製剤（BOTOX（登録商標）およびDysport（登録商標））ならびにB型およびF型のボツリヌス毒素の製剤（ともにWako Chemicals（日本）から得られる）の研究が、局所的な筋肉弱化効能、安全性および抗原性を明らかにするために行われた。ボツリヌス毒素製剤が右腓腹筋の頭部に注射（0.5単位／kg〜200.0単位／kg）され、筋肉の弱さが、マウスの指外転評価アッセイ（DAS）を使用して評価された。ED50値を用量応答曲線から計算した。さらなるマウスには、LD50量を決定するために筋肉内注射が行われた。治療指数をLD50／ED50として計算した。別のマウス群には、BOTOX（登録商標）（5.0単位／kg〜10.0単位／kg）またはB型ボツリヌス毒素（50.0単位／kg〜400.0単位／kg）が後肢に注射され、そして筋肉の弱さおよび増大した水の消費が調べられた。後者は、口渇の推定的なモデルである。抗原性は、ウサギに毎月筋肉内注射することによって評価された（B型ボツリヌス毒素については1.5ng／kgまたは6.5ng／kg、あるいはBOTOX（登録商標）については0.15ng／kg）。
【００５１】  最大筋肉弱さおよび継続期間はすべての血清型について用量に関連していた。DASのED50値（単位／kg）は下記の通りであった：BOTOX（登録商標）：6.7、Dysport（登録商標）：24.7、B型ボツリヌス毒素：27.0〜244.0、F型ボツリヌス毒素：4.3。BOTOX（登録商標）は、B型ボツリヌス毒素またはF型ボツリヌス毒素よりも長い作用継続時間を有した。治療指数値は下記の通りであった：BOTOX（登録商標）：10.5、Dysport（登録商標）：6.3、B型ボツリヌス毒素：3.2。水の消費は、B型ボツリヌス毒素が注射されたマウスが、BOTOX（登録商標）の場合よりも大きかったが、B型ボツリヌス毒素は、筋肉を弱くさせることにおいては効果が低かった。注射した4ヶ月後、4羽のうち2羽（1.5ng／kgで処置された場合）および4羽のうち4羽（6.5ng／kgで処置された場合）のウサギがB型ボツリヌス毒素に対する抗体を生じた。別の研究において、BOTOX（登録商標）で処置された9羽のウサギはどれも、A型ボツリヌス毒素に対する抗体を示さなかった。
【００５２】  DASの結果は、A型ボツリヌス毒素の相対的な最大効力がF型ボツリヌス毒素と同等で、F型ボツリヌス毒素の効力はB型ボツリヌス毒素よりも大きいことを示している。効果の継続期間については、A型ボツリヌス毒素はB型ボツリヌス毒素よりも大きく、B型ボツリヌス毒素の効果継続期間はF型ボツリヌス毒素よりも大きかった。治療指数値により示されるように、A型ボツリヌス毒素の2つの市販製剤（BOTOX（登録商標）およびDysport（登録商標））は異なる。B型ボツリヌス毒素を後肢に注射した後に認められる増大した水消費の挙動は、この血清型の臨床的に有意な量がネズミの全身循環に入ったことを示している。これらの結果はまた、A型ボツリヌス毒素と匹敵し得る効力を達成するためには、それ以外の調べられた血清型の量を増大する必要があることを示している。投薬量の増大は安全性を損なう可能性がある。さらに、ウサギにおいて、B型はBOTOX（登録商標）よりも抗原性が大きかった。これは、おそらくは、B型ボツリヌス毒素の効果的な用量を達成するために、より多量のタンパク質が注射されたためである。Eur J Neurol 1999 Nov; 6 (Suppl 4): S3−S10。
【００５３】  ボツリヌス毒素は、末梢位置において薬理作用を有するのに加え、中枢神経系における阻害作用も有すると考えられる。Weigandらの論文、Nauny−Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1976；292, 161−165、およびHabermannの論文、Nauny-Schmiedeberg's Arch. Parmacol. 1974；281, 47−56は、ボツリヌス毒素が逆行輸送（retrograde transport）によって脊髄領域に上昇しうることを示している。従って、末梢位置、例えば筋肉内に注射されたボツリヌス毒素は、脊髄に逆行輸送される。
【００５４】  米国特許第5989545号は、特定の標的成分に化学的に共役させるかまたは組換え的に融合させた修飾クロストリジウム神経毒またはそのフラグメント、好ましくはボツリヌス毒素を使用して、脊髄に薬剤を投与することによって痛みを治療しうることを開示している。
【００５５】 アセチルコリン
典型的には、単一タイプの小分子の神経伝達物質のみが、哺乳動物の神経系において各タイプのニューロンによって放出される。神経伝達物質アセチルコリンが脳の多くの領域においてニューロンによって分泌されているが、具体的には運動皮質の大錐体細胞によって、基底核におけるいくつかの異なるニューロンによって、骨格筋を神経支配する運動ニューロンによって、自律神経系（交感神経系および副交感神経系の両方）の節前ニューロンによって、副交感神経系の節後ニューロンによって、そして交感神経系の一部の節後ニューロンによって分泌されている。本質的には、汗腺、立毛筋および少数の血管に至る節後交感神経線維のみがコリン作動性であり、交感神経系の節後ニューロンの大部分は神経伝達物質のエピネフリンを分泌する。ほとんどの場合、アセチルコリンは興奮作用を有する。しかし、アセチルコリンは、迷走神経による心臓の抑制のように、抑制作用を一部の末梢副交感神経終末において有することが知られている。
【００５６】  自律神経系の遠心性シグナルは交感神経系または副交感神経系のいずれかを介して身体に伝えられる。交感神経系の節前ニューロンは、脊髄の中間外側角に存在する節前交感神経ニューロン細胞体から伸びている。細胞体から伸びる節前交感神経線維は、脊椎傍交感神経節または脊椎前神経節のいずれかに存在する節後ニューロンとシナプスを形成する。交感神経系および副交感神経系の両方の節前ニューロンはコリン作動性であるので、神経節にアセチルコリンを適用することにより、交感神経および副交感神経の両方の節後ニューロンが興奮し得る。
【００５７】  アセチルコリンは、2種類の受容体、ムスカリン性受容体およびニコチン性受容体を活性化する。ムスカリン性受容体は、副交感神経系の節後ニューロンによって刺激される全ての効果器細胞、ならびに交換神経系の節後コリン作用性ニューロンによって刺激される効果器細胞に見られる。ニコチン性受容体は、副腎髄質、ならびに交換神経系および副交感神経系の両方の節前ニューロンと節後ニューロンの間のシナプスにおいて節後ニューロンの細胞表面に存在する自律神経節内に見られる。ニコチン性受容体も、多くの非自律神経終末、例えば、神経筋接合部における骨格筋線維の膜に見られる。
【００５８】  アセチルコリンは、小さい透明な細胞内小胞がシナプス前のニューロン細胞膜と融合したときにコリン作動性ニューロンから放出される。非常に様々な非ニューロン分泌細胞、例えば副腎髄質（PC12細胞株と同様に）および膵臓の島細胞が、それぞれカテコールアミン類および副甲状腺ホルモンを大きな高密度コア小胞から放出する。PC12細胞株は、交感神経副腎発達の研究のために組織培養モデルとして広範囲に使用されているラットのクロム親和性細胞腫細胞のクローンである。ボツリヌス毒素は、（エレクトロポレーションによるように）透過性にされた場合、または脱神経支配細胞に毒素を直接注射することによって、両タイプの細胞からの両タイプの化合物の放出をインビトロで阻害する。ボツリヌス毒素はまた、皮質シナプトソーム細胞培養物からの神経伝達物質グルタメートの放出を阻止することが知られている。
【００５９】  神経筋接合部は、筋肉細胞への軸索の近接によって、骨格筋において形成される。神経系を通って伝達される信号は、終末軸索において活動電位を生じ、イオンチャンネルを活性化し、例えば神経筋接合部の運動終板において、ニューロン内シナプス小胞から神経伝達物質アセチルコリンを放出させる。アセチルコリンは細胞外空間を通過して、筋肉終板の表面において、アセチルコリン受容体タンパク質と結合する。一旦、充分な結合が生じると、筋肉細胞の活動電位は、特異的膜イオンチャンネル変化を生じ、その結果、筋肉細胞収縮が生じる。次に、アセチルコリンが筋肉細胞から放出され、細胞外空間においてコリンエステラーゼによって代謝される。代謝物は、さらにアセチルコリンに再処理するために終末軸索に戻される。
【００６０】 コリン作用性脳系
運動および視覚視床の両方のコリン作用性影響は、脳幹および基底前脳に由来する。例えば、Billet S. ら、Cholinergic Projections to the Visual Thalamus and Superior Colliculus, Brain Res. 847；121−123：1999およびOaKman, S. A. ら、Characterization of the Extent of Pontomesencephallic Cholinergic Neuron's projections to the Thalamus：Comparison with Projections to Midbrain Dopaminergic Groups, Neurosci 94（2）；529−547：1999参照。従って、アセチルコリンエステラーゼ（AchE）染色法を使用する組織化学研究およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）免疫化学を使用する逆行性追跡に基づいて、視床ニューロンの脳幹による上行コリン作用性刺激が存在しうることが既知である。Steriade M. ら、Brain Cholinergic Systems, Oxford University Press（1990）、第1章。実際に、多くの視床核は、脳幹網様体から緻密なコリン作用性神経支配を受ける。上記文献p. 167。既知の脳幹コリン作用性細胞群は下記に位置する：（1）結合腕のまわりの中心被蓋領域内に位置し、脚橋被蓋核を形成するCh5位置と称される位置の吻側橋、および；（2）Ch6位置と称される位置、中脳水道周囲および室周囲灰白質に埋封されている外側背側被蓋核における、中脳の尾部。Ch5およびCH6細胞群は、ほぼコリン作用性ニューロンだけから成り、一緒になって、橋コリン作用性系を形成する。Ch5−Ch6コリン作用性群は、直接的上行投射を与え、該投射は、上丘、腹側蓋前野、後交連の間質大型細胞核、外側手綱核、視床、大型細胞視索前核、外側乳頭核、基底前脳、嗅球、内側前前頭皮質および橋核を包含する中脳、間脳および終脳における多くの標的構造において終結する。Stone T. W．， CNS Neurotransmitters and Neuromodulators： Acetylcholine, CRC Press（19950, P. 16。Schafer M. K. −Hら、Cholinergic Neurons and Terminal Fields Revealed by Immunochemistry for the Vesicular Acetylcholine Transporter. I. Central Nervous System, Neuroscience, 84（2）；331−359：1998も参照。Ch1−8コリン作用性核の三次元位置決定は、ヒトにおいてマッピンングされている。例えば、Tracey, D. J. ら,Neurotransmitters in the Human Brain, Plenum Press（1995），p. 136−139参照。
【００６１】  さらに基底前脳（前脳）は、視床背側核ならびに新皮質、海馬、扁桃および嗅球のコリン作用性神経支配を与える。例えば、Steridae, p. 136−136参照。かなりの部分のニューロンがコリン作用性である基底前脳領域は、内側中隔核（Ch1）、対角帯核の垂直枝（Ch2）、対角帯核の水平枝（Ch3）、およびCh3細胞群の背側に位置する大細胞基底核（Ch4）を包含する。Ch1およびCh2は、海馬へのコリン作用性投射の主要成分を与える。Ch3セクターにおける細胞は、嗅球に投射する。
【００６２】  さらに、コリン作用性ニューロンは、視床に存在する。Rico, B. ら、A Population of Cholinergic Neurons is Present in the Macaque Monkey Thalamus, Eur J Neurosci, 10；2346−2352：1998。
【００６３】  脳のコリン作用系の異常は、アルツハイマー病、パーキンソン病およびレヴィー体を有する痴呆を包含する神経精神医学的障害において一致して確認されている。従って、アルツハイマー病において、海馬および皮質へのコリン作用性投射の低活性が存在する。レヴィー体を有する痴呆患者において、過度の新皮質コリン作用性欠損が存在すると考えられ、パーキンソン病においては、脚橋コリン作用性ニューロンの減少が存在する。注目すべきことに、ヒトの脳におけるコリン作用活性の生体内画像が報告されている。Perryら、Acetylcholine in Mind： a Neurotransmitter Correlate of Consciousness？， TINS 22（6）；273−280：1999。
【００６４】  従って、長期活性、投与された選択頭蓋内標的組織からの低拡散率、および処置投与レベルにおける少ない全身作用の特性を有する薬剤の投与によって、運動障害を効果的に処置する方法が必要とされている。
【００６５】（発明の開示）
本発明は、この要求を満たし、長期活性、投与された頭蓋内部位からの低拡散率、および処置投与レベルにおける極少ない全身作用の特性を有する薬剤の投与によって、運動障害を効果的に処置する方法を提供する。
【００６６】  以下の定義を使用する。
「約」は、凡そかまたはほぼを意味し、本明細書に示されている数値に関連して、記載されているかまたは要求されている数値の±10％を意味する。
【００６７】  「生物学的活性」は、神経毒に関して、アセチルコリンのような神経伝達物質、またはそれぞれインシュリンまたは膵液のような内分泌物または外分泌物の、合成、エキソサイトーシス、受容体結合および／または取込みに影響を与える能力を包含する。
【００６８】  「局所投与」は、薬剤の生物学的作用を必要とする動物体上または内の部位におけるかまたは該部位の近くにおける、薬剤の直接投与を意味する。局所投与は、静脈投与または経口投与のような、全身性経路の投与を含まない。
【００６９】  「神経毒」は、神経細胞表面受容体に特異的親和性を有する生物学的に活性な分子を意味する。神経毒は、純粋毒素としての、および1種類またはそれ以上の非毒素、毒素関連タンパク質との複合体としての、クロストリジウム毒素を包含する。
【００７０】  「頭蓋内」は、頭蓋の中、あるいは脊髄の背側末端かまたはその近くを意味し、髄質、脳幹、橋、小脳および大脳を包含する。
【００７１】  本発明の運動障害の処置法は、患者への神経毒の頭蓋内投与によって行われ、それによって運動障害の症状が緩和される。神経毒は、クロストリジウム・ボツリナム、クロストリジウム・ブチリカムおよびクロストリウジウム・ベラッティから成る群から選択される細菌によって作られるか、またはクロストリジウム・ボツリナム、クロストリジウム・ブチリカムまたはクロストリウジウム・ベラッティによって作られる神経毒をコードする好適な宿主（即ち、組換え変性大腸菌）によって発現させることができる。好ましくは、神経毒は、A、B、C1、D、E、FおよびG型ボツリヌス毒素のようなボツリヌス毒素である。
【００７２】  運動障害の処置のために、下脳領域、橋領域、中央橋領域、淡蒼球および／または脳の視床領域を包含する種々の脳領域に神経毒を投与しうる。
【００７３】  神経毒は、天然神経毒と比較してそれのアミノ酸の少なくとも1が、欠失、改質または置換されている改質神経毒であってもよく、改質神経毒は、組換え製造神経毒あるいはその誘導体またはフラグメントであってもよい。
【００７４】  本発明の神経毒の頭蓋内投与は、調節放出ボツリヌス毒素システムの埋め込みの段階を含みうる。本発明の詳しい態様は、処置有効量のボツリヌス毒素を患者に頭蓋内投与し、それによって運動障害の症状を処置する運動障害の処置法である。処置される運動障害は、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、進行性核上性麻痺、ウィルソン病、ツレット症候群、テンカン、慢性振せん、チック、ジストニーおよび痙性を包含する。
【００７５】  本発明の他の態様は、振せん抑制活性を有する神経毒を選択し；運動障害に影響を与える頭蓋内標的組織を選択し；処置有効量の選択毒素を標的組織に頭蓋内投与し、それによって運動障害を処置する；段階を含んで成る運動障害の処置法である。
【００７６】  従って、本発明の運動障害の処置法は、哺乳動物に神経毒を頭蓋内投与し、それによって哺乳動物の運動障害の症状を緩和する段階を有する。使用されるボツリヌス毒素は、高有効性、容易入手性、および種々の障害の処置におけるA型ボツリヌス毒素の臨床使用の長い歴史により、A型ボツリヌス毒素であるのが最も好ましい。
【００７７】  驚くべきことに、本発明者は、A型ボツリヌス毒素のようなボツリヌス毒素を約10−3U／kg〜約10U／kgの量で頭蓋内投与して、ヒト患者の運動障害を緩和しうることを見出した。好ましくは、使用されるボツリヌス毒素は約10−2U／kg〜約1U／kgの量で頭蓋内投与される。より好ましくは、ボツリヌス毒素は約10−1U／kg〜約1U／kgの量で投与される。最も好ましくは、ボツリヌス毒素は約0.1単位〜約5単位の量で投与される。重要なことに、神経毒の水溶液を投与した場合に、本発明の方法の運動障害緩和効果は約2ヶ月〜約6ヶ月間持続し、調節放出インプラントとして神経毒を投与した場合に、最大約5年間持続しうる。
【００７８】  本発明の他の好ましい方法は、振せん抑制活性を有する神経毒を選択し；運動障害に影響を与える頭蓋内標的組織を選択し；処置有効量の選択神経毒を標的組織に頭蓋内投与することによって、運動障害を処置する方法である。
【００７９】  本発明の他の好ましい方法は、患者の機能を改善する方法であって、該方法は、患者に神経毒を頭蓋内投与し、それによって、減少した痛み、減少したベッドで過ごす時間、増加した歩行、より健康的な態度、およびより変化に富んだライフスタイルの要素の1つまたはそれ以上における改善によって評価される患者の機能を改善することを含んで成る方法である。
【００８０】  本発明は、神経毒の頭蓋内投与によって、種々の運動障害の有意な長期間の軽減が得られるという発見に基づく。頭蓋内投与は、血液脳関門を迂回させて、全身性投与経路よりかなり多い毒素を脳に輸送する。さらに、ボツリヌス毒素のような毒素の全身性投与は、ボツリヌス毒素が全身循環に入ることによって生じる重度の合併症（ボツリヌス中毒）により禁忌である。さらに、ボツリヌス毒素は、血液脳関門をかなりの程度に通過することができないので、ボツリヌス毒素の全身性投与は、頭蓋内標的組織の処置に実際に適用できない。
【００８１】  本発明は、神経毒の水溶液の注射、および調節放出システム、例えば選択標的部位における神経毒組み込みポリマーインプラントの埋め込みを包含する、選択標的組織への神経毒の頭蓋内投与のあらゆる好適な方法を含む。調節放出インプラントは、繰り返して行う注射の必要性を減少させる。
【００８２】  頭蓋内インプラントは既知である。例えば、悪性神経膠腫の近接照射療法は、定位埋め込み一時性ヨウ素−125間隙カテーテルを包含する。Scharfen. C. O. ら、High Activity Iodine-125 Interstitial Implant For Gliomas, Int. J. Radiation Oncology Biol Phys 24（4）；583−591：1992。さらに、永久頭蓋内低用量125I接種カテーテルインプラントは、脳腫瘍の処置に使用されている。Gasparら、Permanent 125I Implants for Recurrent Malignant Gliomas, Int. J. Radiation Oncology Biol Phys 43（5）：977−982：1999。第66章、p. 577−580、Bellezza D. ら、Stereotactic Interstital Brachytherapy, Gildenberg P. L. ら、Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery, McGraw−Hill（1998）も参照。
【００８３】  さらに、外科的に埋め込まれる生分解性インプラントを使用する間隙化学療法によって、悪性神経膠腫を処置する抗癌剤の局所投与も既知である。例えば、3−ビス（クロロ−エチル）-1-ニトロソウレア（BCNU）（カルムスチン）含有ポリ酸無水物カシェ剤（wafers）の頭蓋内投与を、処置に使用しうることが分かった。Brem, H. ら、The Safety of Interstitial Chemotherapy with BCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy in the Treatment of Newly Diangnosed Malignant Gliomas：Phase I Trial, J. Neuro−Oncology 26；111−123：1995。
【００８４】  ポリ酸無水物ポリマー、Gliadel（登録商標）（Stolle R ＆ D, Inc．，オハイオ州シンシナティ）、ポリ-カルボキシフェノキシプロパンとセバシン酸の20：80の比率のコポリマーを使用してインプラントを製造し、頭蓋内に埋め込んで、悪性神経膠腫の処置が行われている。ポリマーおよびBCNUは、塩化メチレンに同時溶解し、噴霧乾燥して微小球にすることができる。次に、微小球を圧縮成形によって直径1.4cm、厚さ1.0mmのディスクに圧縮し、窒素雰囲気下にアルミニウム箔パウチに充填し、2.2メガラドのγ線照射によって滅菌しうる。ポリマーは、大部分が分解するのに1年以上を要するが、2〜3週間にわたるカルムスチンの放出を可能にする。Brem, H. ら、Placebo-Controlled Trial of Safety and Efficacy of Intraoperative Controlled Delivery by Biodegradable Polymers of Chemotherapy for Recurrent Gliomas, Lancet 345；1008−1012：1995。
【００８５】  インプラントは、必要量の安定化神経毒（例えば、非再構成BOTOX（登録商標））を、塩化メチレンに溶解した好適なポリマーの溶液に室温で混合することによって製造しうる。次に、溶液をペトリ皿に移し、塩化メチレンを真空乾燥機で蒸発させる。必要とされるインプラントの大きさ、従って組み込まれる神経毒の量に依存して、適切な量の乾燥神経毒を組み込んだインプラントを、約8000p.s.i.で5秒間、または30008000p.s.i.で17秒間鋳型において圧縮して、神経毒を封入したインプラントディスクを形成する。例えば、Fung L. K. ら、Pharmacokinetics of Interstitial Delivery of Carmustine 4-Hydroperoxycyclophosphamide and Paclitaxel From a Biodegradable Polymer Implant in the Monkey Brain, Cancer Research 58；672-684：1998参照。
【００８６】  組織内のボツリヌス毒素の生物学的活性の拡散は、用量の関数であると考えられ、段階化する（graduated）ことができる。Jankovic J. ら、Therapy With Botulinum Toxin, Marcel Dekker, Inc.,（1994）, p. 150。
【００８７】  ボツリヌス毒素のような神経毒の局所頭蓋内輸送は、毒素の高局所処置レベルを与え、ボツリヌス毒素のような多くの神経毒は大きすぎて血液脳関門を通過することができないので全身毒性の発生を有意に防止しうる。神経毒を頭蓋内部位に長期間にわたって局所輸送しうる調節放出ポリマーは、全身毒性と血液脳関門によって強要される制限を回避することがき、頭蓋内標的組織への有効な投与を可能にする。同時係属中の米国特許出願第90／587250号（発明の名称「神経毒インプラント」）に開示されている好適なインプラントは、調節放出ポリマーを介して、脳の標的組織に化学療法剤を直接的に導入することを可能にする。使用されるインプラントポリマーは好ましくは疎水性であり、それによって、標的組織環境に毒素が放出されるまで、神経毒を組み込んだポリマーを水誘発分解から保護することができる。
【００８８】  例えばコリン作用性視床への注射またはインプラントによる、本発明のボツリヌス毒素の局所頭蓋内投与は、特にパーキンソン病に関連した振せんの処置における視床切開術の優れた代替法である。
【００８９】  本発明の方法は、Riechert-MundingerユニットおよびZD（Zamorano-Dujovny）多目的位置決定ユニットを使用する神経毒含有インプラントの定位配置を含む。120mLのオムニパク（omnipaque）、350mgヨウ素／mLを注射し、2mmスライス厚みでのコントラスト強調コンピューター連動断層撮影（CT）スキャンは、三次元多平面処理計画（STP、Fischer, Freiburg, Germany）を可能にする。この装置は、磁気共鳴画像法試験に基づく計画を可能にし、明確な標的確認のためにCTおよびMRI標的情報を組み合わせる。
【００９０】  GE CTスキャナー（General Electric Company, ウィスコンシン州ミルウォーキー）との使用のために改変されたLeksell定位システム（Downs Surgical, Inc., ジョージア州ジケーター）、ならびにBrown-Roberts-Wells（BRW）定位システム（Radionics, マサチューセッツ州バーリントン）がこの目的に使用されている。従って、埋め込みを行う朝に、BRW定位枠の環状ベースリング（base ring）を患者の頭蓋に取り付ける。台板にクランプで固定したグラファイトロッドローカライーザーフレームを有する（標的組織）領域において、3mm間隔で連続CT断面が得られる。グラファイトロッド画像のCT座標を使用して、コンピューター処理計画プログラムを、VAX 11／780コンピューター（Digital Equipment Corporation, マサチューセッツ州メナード）で作動させて、CTスペースとBRWスペースの間にマッピングすることができる。
【００９１】  理論に縛られるものではないが、本発明によって実施される方法の処置効果について、機構を提案することができる。即ち、ボツリヌス毒素のような神経毒は、特定のアセチルコリンにおいて、いくつかの異なるCNS神経伝達物質のニューロンエキソサイトーシスを阻害しうる。コリン作用性ニューロンは、視床に存在することが既知である。さらに、コリン作用性核は、脳幹神経節または基底前脳に存在し、運動および感覚大脳領域への投射を有する。従って、本発明の方法の標的組織は、頭蓋内運動野（例えば視床）ならびに頭蓋内運動野に投射する脳コリン作用系自体（例えば基底核）の、神経毒誘発可逆性脱神経を包含する。例えば、コリン作用性神経支配視床核（例えばvim）への神経毒の注射または植え込みは、（1）脳幹神経節から視床に投射するコリン作用性末端への毒素の作用によるVim活性の下方調節；および（2）コリン作用性および非コリン作用性の両方の視床細胞体への毒素の作用による、視床排出量（output）の減衰；を生じ、それによって、化学的視床切開術を提供する。
【００９２】  好ましくは、本発明の方法に使用される神経毒は、ボツリヌス毒素、例えば、血清型A、B、C、D、E、FまたはGボツリヌス毒素の1つである。使用されるボツリヌス毒素は、ヒトにおける高有効性、容易入手性、および筋肉注射によって局所投与される骨格筋および平滑筋障害の処置における既知の使用の故に、A型ボツリヌス毒素であるのが好ましい。B型ボツリヌス毒素は、A型と比較してかなり低い有効性および効能を有することが既知であり、容易入手性でなく、ヒトにおける臨床使用の歴史が短い故に、本発明の方法に使用するのにあまり好ましくない神経毒である。さらに、B型に関する高タンパク質負荷は、免疫原性反応を生じて、B型神経毒の抗体を発生しうる。
【００９３】  本発明による標的組織への頭蓋内投与に選択される神経毒の量は、処置されているかまたは処置される運動障害、その重症度、脳組織関与の程度、選択された神経毒の溶解性ならびに患者の年齢、性、体重および健康状態のような基準に基づいて変化しうる。例えば、影響を受けた脳組織の領域の広さは、注射される神経毒の量に比例すると考えられ、腫瘍抑制効果の量は、大部分の用量範囲において、注射された神経毒の濃度に比例すると考えられる。適切な投与経路および用量は、一般に主治医によって個別的に決められる。そのような決定は、当業者の日常業務である（参照：例えば、Harrison's Principles of Internal Medicine（1998）、Anthony Fauciら編、第14版、McGraw-Hill発行）。
【００９４】  ボツリヌス毒素のような神経毒は、本発明の方法によって約10−3U／kg〜約10U／kgの量で頭蓋内投与しうることを本発明者は見出した。約10−3U／kgの用量は、小核に輸送した場合に腫瘍抑制効果を生じうる。約10−3U／kgより少ない頭蓋内投与は、顕著な、または持続する処置効果を生じない。10U／kgより多いボツリヌス毒素のような神経毒の頭蓋内投与量は、標的に近接するニューロンの感覚機能または好ましい運動機能の脱神経の有意なリスクを有する。
【００９５】    処置される患者に振せん抑制効果を与えるA型ボツリヌス毒素のようなボツリヌス毒素の頭蓋内投与に好ましい用量範囲は、約10−2U／kg〜約1U／kgである。約10−2U／kgより少ない用量は、観察しうるが比較的低い振せん抑制効果を生じる。処置される患者に抗侵害受容効果を与えるA型ボツリヌス毒素のようなボツリヌス毒素の頭蓋内投与についてのより好ましい用量範囲は、約10−1U／kg〜約1U／kgである。約10−1U／kgより少ない用量は、最適かまたは最長の可能な期間より短い処置効果を生じる。処置される患者に必要とされる振せん抑制効果を与えるA型ボツリヌス毒素のようなボツリヌス毒素の頭蓋内投与に最も好ましい用量範囲は、約0.1単位〜約100単位である。この好ましい用量範囲におけるA型ボツリヌス毒素のようなボツリヌス毒素の頭蓋内投与は、劇的な処置効果を与える。
【００９６】  本発明は、患者の頭蓋内に局所投与した場合に、長期振せん抑制効果を有するあらゆる神経毒の使用を含む。例えば、クロストリジウム・ボツリナム、クロストリジウム・ブチリカムおよびクロストリウジウム・ベラッティのような毒素生産クロストリジウム属細菌の種によって製造される神経毒は、本発明の方法に使用しうるか、または使用のために適合させることができる。さらに、全てのボツリヌス血清型A、B、C1、D、E、FおよびGを本発明に有利に使用しうるが、前記に説明したように、A型が最も好ましく、B型は最も好ましくない血清型である。本発明を実施して、一回の注射によって、ヒトにおいて3ヶ月またはそれ以上にわたって振せん抑制効果を与えることができる。
【００９７】  重要なことに、本発明の方法は、改善した患者機能を与えることができる。「改善した患者機能」は、減少した痛み、減少したベッドで過ごす時間、増加した歩行、より健康的な態度、より変化に富んだライフスタイルおよび／または正常な筋肉緊張によって認められる回復のような要素によって評価される改善であると定義される。改善した患者機能は、改善した生活の質（QOL）と同意語である。QOLは、例えば既知のSF-12またはSF-36健康調査評点法を使用して評価できる。SF-36は、身体機能、身体的問題による役割制限、社会的役割、身体の痛み、一般的な精神的健康、情緒問題による役割制限、活力、および一般的健康認識の8つの領域において、患者の身体的および精神的健康を評価する。得られた評点を、種々の一般集団および患者集団について入手しうる公表数値と比較することができる。
【００９８】  前記のように、驚くべきことに、患者に神経毒を頭蓋内投与することによって、運動障害の有効かつ長期持続性の処置が達成できることを本発明者は見出した。最も好ましい態様において、本発明は、A型ボツリヌス毒素の頭蓋内注射または埋め込みによって行われる。
【００９９】  本発明は、以下のものを含む：（a）細菌培養、毒素抽出、濃縮、保存、凍結乾燥および／または再構成によって得られたかまたは処理された神経毒；および、（b）改質または組換え神経毒、即ち、既知の化学／生化学アミノ酸改質法によるか、または既知の宿主細胞／組換えベクター組換え法によって、1つまたはそれ以上のアミノ酸またはアミノ酸配列を意図的に欠失、改質または置換した神経毒、ならびにそのようにして製造した神経毒の誘導体またはフラグメント。
【０１００】  本発明に使用されるボツリヌス毒素は、真空圧下の容器中における凍結乾燥、真空乾燥形態において、または安定な液体として、保存できる。凍結乾燥の前に、ボツリヌス毒素を、医薬的に許容される賦形剤、安定剤および／またはアルブミンのような担体と混合することができる。凍結乾燥物質は、生理食塩水または水を使用して再構成することができる。
【０１０１】    （実施例）
以下の実施例は、運動障害を処置する本発明の特定の方法を示すが、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１０２】 実施例1
頭蓋内標的組織の位置決定および方法
水溶液の形態かまたはインプラントとしての神経毒を、標的組織に正確に頭蓋内投与するために、定位法を使用することができる。従って、薬剤耐性振せん、即ち、パーキンソン病において起こるような安静時振せん、または動作時振せん、例えば、本能性振せん、多発性硬化症振せん、外傷後振せん、片麻痺後振せん（脳卒中後痙性）、ニューロパシーに関連した振せん、書字振せん、およびテンカンを処置する神経毒の頭蓋内投与は、以下のように行うことができる。
【０１０３】  患者の予備MRIスキャンを行って、前交連−後交連線の長さ、および外骨標識へのそれの配置を得ることができる。次に、枠の底辺を、前交連−後交連線の平面に配列させることができる。CT誘導装置を使用し、脳室造影で補助することができる。後交連は、2-mmのCTスライスで視覚化し、基準点として使用できる。標的注射部位が、腹側外側視床の中間腹側核の基底部である場合、平均座標は、前交連〜後交連6.5mm、側脳室壁〜第三脳室壁11mm、前交連−後交連線より２mm上である。この位置は、感覚視床または視床下部領域を侵害しないと考えられる。
【０１０４】  標的組織の位置決定の生理学的確認は、使用される長針注射器に不随するかまたは組み込まれた電極による高および低周波刺激を使用して行うことができる。2mmの露出先端を有する直径1.6mmのサーミスタを使用することができる（Radionics, マサチューセッツ州バーリントン）。電極高周波刺激（75Hz）に関して、Radionics病変発生器（Radionics Radiofrequency Lesion Generator Model RFG3AV）を使用して0.5〜1.0Vで、感覚異常反応を前肢および手に誘発することができる。低周波（5Hz）において、罹患した肢の振せんの活性化または阻害が2〜3Vで生じた。本発明の方法によれば、電極を使用せずに、外傷を形成する。標的組織の位置決定の確認後に、神経毒を注射し、それによって、可逆性化学視床切開を生じさせる。一般的な注射は、必要とされる単位数（即ち、約0.1〜約5単位）の、約0.1mL〜約0.5mLの水または生理食塩水中のA型ボツリヌス毒素複合体である。低い注射量を使用して、目標からの毒素拡散を最少限にすることができる。一般に、神経伝達物質放出阻害効果は、約2〜4ヶ月以内に消失すると考えられる。従って、代替的神経毒、ポリマーインプラントに組み込まれた神経毒を使用して、長期間にわたる（即ち、約1年〜約6年）所望の位置における処置有効量の毒素の調節連続放出を与えることができ、それによって、毒素を繰り返し注射する必要がなくなる。
【０１０５】  パーキンソン病の処置のための視床下核（STN）のような種々の頭蓋内標的に、神経毒を定位誘導注射するために、いくつかの方法を使用しうる。例えば、電気生理学的記録および片側または両側ＳＴＮ注射用の注射誘導と連結した、外科計画用の三次元（3D）T1-加重画像（weighted images）およびSTNの直接視覚化用のT2-加重画像に依存する定位磁気共鳴（MRI）法を使用しうる。例えば、Bejjani, B. P. ら、Bilateral Subthalamic Stimulation for Parkinson's Disease by Using Three-Dimensional Stereotactic Magnetic Resonance Imaging and Electrophysiological Guidance, J Neurosurg 92（4）；615-25：2000参照。STNは、上中脳に位置する3D卵形両凸低強度（hypointense）構造物として視覚化しうる。STNの中心の座標は、赤核の前縁を標識として使用することによって、前交連−後交連線に関して決めることができる。
【０１０６】  いくつかの平行トラック（tracks）による電気生理学的モニタリングを同時に行って、機能標的を正確に限定しうる。微小電極記録は、高周波自発的運動関連活性、およびSTN内の振せん関連細胞を限定しうる。STNへの神経毒注射は、対側硬直および運動不能を改善し、振せんが存在する場合にそれを抑制しうる。MRI画像法を使用することによって予備決定された標的に向いている中心トラックを、神経毒注射に選択しうる。外科療法による合併症は予期されない。患者は、「オフ」および「オン」投薬状態において、有意に改善されたパーキンソン症候群運動障害を示し、抗パーキンソン症候群薬物療法の使用は、レボドパ誘発運動異常および運動変動の重症度と同様に劇的に減少しうる。
【０１０７】  コンピューター補助されたアトラスに基づく（atlas-based）機能的脳神経外科法を使用して、正確かつ精密に、必要とされる神経毒を注射するか、または神経毒調節放出インプラントを埋め込むことができる。そのような方法は、大脳構造の三次元表示およびリアルタイム操作を可能にする。従って、3つの全ての直行位置における相互予備登録マルチプル脳アトラス（multiple brain atlases）を使用する神経外科計画が可能であり、神経毒注射または埋め込みの標的限定の精度増加、トラクト（tracts）数の減少による外科処置の時間短縮を可能にし、より高性能な軌道の計画を促進する。例えば、Nowinski W. L. ら、Computer-Aided Stereotactic Functional Neurosurgery Enhanced by the Use of the Multiple Brain Atlas Database, IEEE Trans Med Imaging 19（1）；62-69：2000参照。
【０１０８】 実施例2
A型ボツリヌス毒素を使用するパーキンソン病の処置
64才の右手利きの男性は、頻繁に転ぶような四肢の顕著な振せん、運動緩徐、硬直および姿勢変化を有する。丸剤作製様運動振せんが、右手に認められる。脳卒中は除外され、症状が右側においてより重度であることが認められる。パーキンソン病と診断される。実施例1に記載したように、CATスキャンまたはMRI補助定位脳手術を使用して、2単位のA型ボツリヌス毒素（例えばBOTOX（登録商標）、または8単位のDysport（登録商標））を、淡蒼球の左側に注射する。患者は48時間以内に解放され（discharged）、数日（1〜7日）で、右側においてより明瞭であるが、左側においても、パーキンソン症候群の運動症状の有意な改善を得る。運動異常はほぼ完全に消失する。パーキンソン病の運動障害の症状は、約2〜約6ヶ月間にわたって有意に軽減した状態を維持する。長期の処置的軽減のために、適切な量のA型ボツリヌス毒素を組み込んだ１つまたはそれ以上のポリマーインプラントを、標的組織部位に配置しうる。
【０１０９】 実施例3
B型ボツリヌス毒素を使用するパーキンソン病の処置
68才の左手利きの男性は、頻繁に転ぶような四肢の顕著な振せん、運動緩徐、硬直および姿勢変化を有する。丸剤作製様運動振せんが、左側に認められる。脳卒中は除外され、症状が左側においてより重度であることが認められる。パーキンソン病の診断がなされる。実施例1に記載したように、CATスキャンまたはMRI補助定位脳手術を使用して、10〜約50単位のB型ボツリヌス毒素製剤（例えばNeurobloc（登録商標）またはInnervate（登録商標））を、淡蒼球の右側に注射する。患者は48時間以内に解放され、数日（1〜7日）で、左側においてより明瞭であるが、右側においても、パーキンソン症候群の運動症状の有意な改善を得る。運動異常はほぼ完全に消失する。パーキンソン病の運動障害の症状は、約2〜約6ヶ月間にわたって有意に軽減した状態を維持する。長期の処置的軽減のために、適切な量のB型ボツリヌス毒素を組み込んだ1つまたはそれ以上のポリマーインプラントを、標的組織部位に配置しうる。
【０１１０】 実施例4
C1〜G型ボツリヌス毒素を使用するパーキンソン病の処置
71才の女性は、抑制不能な頻繁な振せんが認められる。無力化する（disabling）振せんについて、0.1〜100単位のC1、D、E、FまたはG型ボツリヌス毒素を、腹側外側視床に片側注射する。脳室造影法によって補助して、実施例1に記載したようなCATスキャンまたはMRI補助定位脳手術を使用する。患者は48時間以内に解放され、数日（1〜7日）で、振せんの有意な寛解を得、振せんは約2〜約6ヶ月間にわたって、有意に軽減した状態を維持する。長期の処置的軽減のために、適切な量のC1、D、E、FまたはG型ボツリヌス毒素を組み込んだ1つまたはそれ以上のポリマーインプラントを、標的組織部位に配置しうる。
【０１１１】 実施例5
A型ボツリヌス毒素を使用するジストニーの処理
頭蓋外傷に二次的な、近位四肢筋に影響を与える重度の無力化するジストニーを有する16才の少年は、医原性構語障害および偽延髄（pseudubulbar）作用の高リスクを有する左側の片側視床切開術、両側視床切開術の志願者である。患者は、経皮性神経刺激、EMGのフィードバックディスプレイおよび抗コリン作用性物質（anticholinergics）に反応できないか、または感受性が鈍くなっている。ジストニーは比較的安定であり、患者は手術に充分に耐えることができ、遠位相（distal phasic）および緊張性（tonic）の四肢ジストニーによって有意に無力化されている。
【０１１２】  局所麻酔薬を使用して、好適な定位枠を頭部に適用し、脳室造影法および定位MRIを実施しうる。前交連（AC）および後交連（PC）の定位座標を、スキャナーにおいてコンピューターソフトウエアを使用して決めることができる。PCに基づくソフトウエアを使用して、Schaltenbrand and Bailey and Schaltenbrand and Wahrenアトラスから矢状脳地図を描き直すことができ、患者のAC-PC距離に必要とされるように伸ばすかまたは縮め、患者の頭部への枠の実際の適用のために定位座標に線を引くことができる。標的部位を選択し、それらの座標を読み取り、適切な枠設定を作る。バーホールまたはツイスト−ドリルホールを、同じ矢状面の冠状縫合におけるかまたはそれの吻側に作ることができる。これは、電極軌道が単一矢状面を横切る故に、標的確認に使用される生理学的データをプロットするのを促進しうる。視床の腹尾側核（Vc）を、正中線から15mmに存在する生理学的標識として選択しうる。Vcは、その中の個々の触覚細胞をそれらの分離した受容領域で記録することによるか、または分離突出領域における刺激によって感覚異常を誘発することによって、容易に認識しうる。
【０１１３】  微小電極記録針（直径約25ミクロンの記録電極を有する単線維筋電図記録に使用されるような針）を、微量注射器の内腔に配置することができ、Vcにおいてフィンガー（fingers）の予期される触覚表出に向かって進め、連続記録を行って、確認しうるニューロンを捜す。微小刺激を1mmごとに行うことができ、約10mm上で開始し、標的より下の種々の距離に広げることができる。第一微小電極軌道が、例えば、上肢ジストニーを有する患者の唇の触覚表出に入った場合、第二軌道は、さらに2mm外側で行うことができる。下肢反応に遭遇した際に、次の軌道はさらに2mm内側にすることができる。手の触覚表出が観察された際に、次の軌道はそれの2mm吻側にすることができ、そこにおいて、記録は、特定の対側関節の屈曲、または特定の対側部位における圧力に反応する運動感覚性ニューロンを示す。ジストニーが足に限定される場合、前記の方法を足の視床表出に向けることができる。
【０１１４】  標的への定位MRI誘導記録／刺激針電極の微小刺激位置決定時に、神経毒インプラントを注射することができる。インプラントは、A型ボツリヌス毒素のような神経毒を含んで成ることができ、該神経毒は生分解性ポリマー微小球または生分解性ペレットに組み込まれ、いずれのインプラント形態も合計約20単位（約1ng）の毒素を含有し、インプラントの特性は、インプラント放出部位において、および標的部位の両側の半径約2〜3mmにおいて、処置レベルの毒素を少なくとも約4年間にわたって連続放出することである。インプラントは、基本的に即時に約1単位の毒素を放出することができ、それに続く2〜4ヶ月間にわたってさらに約1単位の量を累積的に放出しうる。
【０１１５】  患者のジストニー収縮は、ほぼ即時に消失し、1回の毒素注射につき約2ヶ月〜約6ヶ月間か、またはインプラントポリマーの特定の放出特性およびそれに充填された神経毒の量に依存して約1〜5年間にわたって、実質的に軽減した状態に維持しうる。
【０１１６】 実施例6
B〜G型ボツリヌス毒素を使用するジストニーの処置
水溶液の形態かまたは好適な神経毒インプラントの形態のB、C1、D、E、FまたはG型ボツリヌス毒素を約1単位〜約1000単位の量で使用して、実施例5の患者を同じプロトコルおよび標的へのアプローチによって同様に処置することができる。そのような処置によって、ジストニー収縮は、1〜7日以内に消失し、1回の毒素注射につき約2〜6ヶ月間か、またはインプラントポリマーの特定の放出特性およびそれに充填された神経毒の量に依存して約1〜5年間にわたって、実質的に軽減した状態に維持しうる。
【０１１７】 実施例7
A型ボツリヌス毒素を使用する振せんの処置
44才の男性は、日常生活の活動を妨げる3年間にわたる重度の無力化する振せんを有する。体の両側における運動症状の非対称も存在し、レボドパは末端運動異常を誘発した。意図する標的細胞の電気刺激による振せんにおける作用を定位検査することによって、振せん細胞を同定する。刺激の作用は、振せんを阻止することが認められる。定位誘導（実施例1と同様）インプラント配置は、正中線から約14〜15mm、運動感覚性および／または随意振せん細胞の中間のAC-PC線より2〜3mm上の部位に行うことができる。標的部位はVLまたはViであることができる。
【０１１８】  インプラントは、生分解性ポリマー微小球に組み込まれたA型ボツリヌス毒素の水溶液、またはA型ボツリヌス毒素生分解性ペレットであることができ、いずれのインプラント形態も合計約20単位（約1ng）の毒素を含有し、インプラントの特性は、インプラント放出部位において、および標的部位の両側の半径約2〜3mmにおいて、処置レベルの毒素を少なくとも約4年間にわたって連続放出することである。インプラントは、基本的に即時に約1単位の毒素を放出することができ、それに続く2〜4ヶ月間にわたってさらに約1単位の量を累積的に放出しうる。特に、
【０１１９】  患者の振動せんは、1〜7日以内に消失し、1回の毒素注射につき約2ヶ月〜約6ヶ月間か、またはインプラントポリマーの特定の放出特性およびそれに充填された神経毒の量に依存して約1〜5年間にわたって、実質的に軽減した状態に維持しうる。特に、右側の位相および緊張性共に、末梢四肢運動の深刻な減衰が生じうる。
【０１２０】 実施例8
B〜G型ボツリヌス毒素を使用する振せんの処置
水溶液の形態かまたは好適な神経毒インプラントの形態のB、C1、D、E、FまたはG型ボツリヌス毒素を約1単位〜約1000単位の量で使用して、上記実施例7の患者を同じプロトコルおよび標的へのアプローチによって同様に処置することができる。そのような処置によって、振せんは、1〜7日以内に消失し、1回の毒素注射につき約2〜6ヶ月間か、またはインプラントポリマーの特定の放出特性およびそれに充填された神経毒の量に依存して約1〜5年間にわたって、実質的に軽減した状態に維持しうる。
【０１２１】 実施例9
A型ボツリヌス毒素を使用するテンカンの処置
22才の右手利きの女性は、テンカンの病歴を有する。MRIおよびEEG記録の分析に基づいて、側頭葉テンカンと診断される。約5〜50単位の神経毒（例えばA型ボツニリヌス毒素）を与えるインプラントを、側頭葉の前部、中側頭回に沿った葉の先端から5〜6cmに、非優位左半球への片側アプローチによって挿入できる。テンカン発作は、約1〜7日以内に実質的に減少し、1回の毒素注射につき約2〜約6ヶ月間か、またはインプラントポリマーの特定の放出特性およびそれに充填された神経毒の量に依存して約1〜5年間にわたって、実質的に軽減した状態に維持しうる。
【０１２２】 実施例10
B〜G型ボツリヌス毒素を使用するテンカンの処置
水溶液の形態かまたは好適な神経毒インプラントの形態のB、C1、D、E、FまたはG型ボツリヌス毒素を約1単位〜約1000単位の量で使用して、上記実施例9の患者を同じプロトコルおよび標的へのアプローチによって同様に処置することができる。そのような処置によって、テンカン発作は、1〜7日以内に消失し、1回の毒素注射につき約2〜6ヶ月間か、またはインプラントポリマーの特定の放出特性およびそれに充填された神経毒の量に依存して約1〜5年間にわたって、実質的に軽減した状態に維持しうる。
【０１２３】  3D  MR画像法および電気生理学的誘導によって補助される、本発明の方法による神経毒注射または調節放出神経毒インプラントの埋め込みは、重度の進行したレボドパ反応性パーキンソン病のような種々の運動障害に苦しむ患者にとって安全かつ有効な処置法である。好適な患者は、前記のような頭蓋内神経毒投与の前に、化学療法、一般に経口L-ドパに完全にではなくても、ほぼ無反応性になった患者を含む。
【０１２４】  本発明の方法は、本能性振せん、多発性硬化症関連振せん、外傷後振せん、片麻痺後振せん、パーキンソン症候群振せんおよびテンカンを包含する種々の運動障害にも使用しうる。
【０１２５】  本発明の運動障害処置のための頭蓋内神経毒投与は、以下を含む多くの利点および長所を有する：
1. 運動障害の症状を劇的に減少しうる。
2. 運動障害の症状を、1回の神経毒注射につき約2〜約4ヶ月間、および調節放出神経毒インプラントの使用によって約1年〜約5年間減少しうる。
3. 注射された、または埋め込まれた神経毒は、頭蓋内標的組織部位に、特定の振せん抑制効果を発揮する。
4. 注射された、または埋め込まれた神経毒は、拡散する傾向または頭蓋内注射部位または埋め込み部位から輸送される傾向をほとんど示さないか、または示さない。
5. 神経毒の頭蓋内注射または埋め込みによって、有意な好ましくない副作用がほとんど生じないか、または生じない。
6. 頭蓋内に注射される神経毒の量は、比較しうる振せん抑制効果を得るために他の投与経路（即ち、筋肉内、括約筋肉、経口または非経口）によって必要とされる同神経毒の量よりかなり少ない。
7. 本発明の方法の振せん抑制効果は、患者のより高い可動性、より積極的な態度、向上した生活の質の好ましい副作用を生じうる。
8. 神経毒の高処置用量を、全身毒性を生じずに、長期間にわたって頭蓋内標的組織に輸送しうる。
【０１２６】  いくつかの好ましい方法に関して本発明を詳しく説明したが、本発明の範囲に含まれる他の態様、改変法、変更法も可能である。例えば、種々の神経毒を、本発明の方法に有効に使用しうる。さらに、本発明は、2種類またはそれ以上の神経毒、例えば、2種類またはそれ以上のボツリヌス毒素を同時にまたは連続的に投与する頭蓋内投与法も含む。例えば、臨床反応の消失または中和抗体が発生するまでA型ボツリヌス毒素を頭蓋内投与し、次に、B型ボツリヌス毒素を投与することができる。または、ボツリヌス血清型A〜Gのいずれか2つまたはそれ以上の組み合わせを頭蓋内投与して、所望の処置効果の開始および期間を調節することができる。さらに、神経毒投与の前に、同時に、または後に、非神経毒化合物を頭蓋内投与して、ボツリヌス毒素のような神経毒がその長期持続性振せん抑制効果を発揮し始める前に、より強化された、またはより迅速な振せん抑制の開始のような補助効果を与えることができる。
【０１２７】  本発明は、神経毒の頭蓋内投与による運動障害の処置用の薬剤の製造における、ボツリヌス毒素のような神経毒の使用も含む。
【０１２８】  本明細書に示した全ての文献、論文、特許、特許出願および出版物は、全体として本発明の開示の一部を構成するものとする。
また、特許請求の範囲に記載した意図および範囲は、前記の好ましい態様の記載に限定すべきでない。