(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含む間質性肺炎治療剤。
【請求項２】
前記間質性肺炎は、特発性間質性肺炎である、請求項１記載の間質性肺炎治療剤。
【請求項３】
前記複合体は、リコンビナントイムノトキシンである、請求項１又は２記載の間質性肺炎治療剤。
【請求項４】
前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項１〜３のいずれか１項記載の間質性肺炎治療剤。
【請求項５】
前記抗体は、葉酸受容体αに結合しない、請求項１〜４のいずれか１項記載の間質性肺炎治療剤。
【請求項６】
前記抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列から成るポリペプチド、又は7以上の連続アミノ酸から成るその部分ペプチド、に対して誘起されたものである、請求項１〜５のいずれか１項記載の間質性肺炎治療剤。
【請求項７】
前記抗体は、配列番号２に示すアミノ酸配列から成るポリペプチド、又は7以上の連続アミノ酸から成るその部分ペプチド、に対して誘起されたものである、請求項１〜５のいずれか１項記載の間質性肺炎治療剤。
【請求項８】
前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、それらの抗体フラグメント、又は組換え抗体である、請求項１〜７のいずれか１項記載の間質性肺炎治療剤。
【請求項９】
前記抗体は、抗ヒト葉酸受容体βマウスモノクローナル抗体又は抗マウス葉酸受容体βラットモノクローナル抗体のいずれかの重鎖(H鎖)可変領域及び/又は軽鎖(L鎖)可変領域の各アミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の間質性肺炎治療剤。
【請求項１０】
前記抗体は、以下の(a)、(b)又は(c)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の間質性肺炎治療剤：
(a) 配列番号３に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド；
(b) 配列番号３に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号３に示す塩基配列と少なくとも90％の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記抗体は、以下の(a)、(b)又は(c)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の間質性肺炎治療剤：
(a) 配列番号４に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド；
(b) 配列番号４に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号４に示す塩基配列と少なくとも90％の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記抗体は、以下の(a)、(b)又は(c)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の間質性肺炎治療剤：
(a) 配列番号５に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド；
(b) 配列番号５に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号５に示す塩基配列と少なくとも90％の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記抗体は、以下の(a)、(b)又は(c)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の間質性肺炎治療剤：
(a) 配列番号６に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド；
(b) 配列番号６に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号６に示す塩基配列と少なくとも90％の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記抗体は、以下の(a)、(b)又は(c)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の間質性肺炎治療剤：
(a) 配列番号７に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド；
(b) 配列番号７に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号７に示す塩基配列と少なくとも90％の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記抗体は、以下の(a)、(b)又は(c)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の間質性肺炎治療剤：
(a) 配列番号８に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド；
(b) 配列番号８に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号８に示す塩基配列と少なくとも90％の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記抗体は、以下の(a)、(b)又は(c)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の間質性肺炎治療剤：
(a) 配列番号９に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド；
(b) 配列番号９に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号９に示す塩基配列と少なくとも90％の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記抗体は、以下の(a)、(b)又は(c)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の間質性肺炎治療剤：
(a) 配列番号１０に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド；
(b) 配列番号１０に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号１０に示す塩基配列と少なくとも90％の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記細胞毒素は、緑膿菌外毒素(Pseudomonas aeruginosa exotoxin)リシンA鎖(ricin A chain)、脱糖鎖リシンA鎖(deglycosylated ricin A chain)、リボゾーム不活性化タンパク質(a ribosome inactivating protein)、アルファサルシン(alpha-sarcin)、ゲロニン(gelonin)、アスペルギリン(aspergillin)、リストリクトシン(restrictocin)、リボヌクレアーゼ(ribonuclease)、エポドフィロトキシン(epidophyllotoxin)、ジフテリアトキシン(diphtheria toxin)から成る群から選択されるものである、請求項１〜１７のいずれか１項記載の間質性肺炎治療剤。
【請求項１９】
前記複合体は、配列番号１１に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号１２に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、請求項１〜１８のいずれか１項記載の間質性肺炎治療剤。
【請求項２０】
前記複合体は、配列番号１３に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号１４に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、請求項１〜１８のいずれか１項記載の間質性肺炎治療剤。
【請求項２１】
葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体を含む間質性肺炎診断剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な間質性肺炎治療剤、より具体的には葉酸受容体βに対する抗体を有効成分とする間質性肺炎治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
間質性肺炎は、肺の間質を炎症の場とする疾患の総称である。間質性肺炎の中でも特発性間質性肺炎は人口１０万人あたり２０人程度が罹患する特定疾患で、平均余命は２．５〜５年である。短い平均余命の原因には、根治的療法が確立していないことが挙げられる。間質性肺炎において炎症の遷延化に伴う組織の線維化が顕著であることから、線維化の抑制は該疾患の治療に直結すると考えられている。
臨床的に間質性肺炎の線維化組織ではマクロファージの増加が観察される。マウスを用いたモデルによると、マクロファージを炎症組織に誘導させるタンパク質因子（ＭＣＰ１）や、マクロファージが分泌するサイトカインの抑制は、間質性肺炎の症状を緩和させる。さらに、マクロファージそのものを攻撃する抗ＣＤ１１抗体を投与することによっても線維化の抑制や病態の緩解が認められる（非特許文献１）。
以上のことから、間質性肺炎を促進させるタンパク質（サイトカイン）を広範に分泌するマクロファージを標的とすることは、該疾患の治療に効果的であると考えられる。
しかしながら、非特許文献１で報告された抗体は、正常組織や血液中のマクロファージに発現するＣＤ１１をも認識することから、易感染症などの副作用リスクが否定できず、したがって実際の治療薬としては不向きである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｍｏｅｌｌｅｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ：Ａ  ｕｓｅｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｔｏ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｐｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ？  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００８  ４０（３）：３６２−８２
【発明の概要】
【０００４】
このように、間質性肺炎の病状に関与するマクロファージを特異的に標的化し、副作用のリスクを低減する新規な治療剤を開発するニーズがある。
そこで本発明は、副作用のリスクが低減された新規な間質性肺炎の治療剤を提供することを目的とする。
葉酸受容体β（ＦＲβ）は、炎症に関連するマクロファージ、特に関節リウマチや悪性脳腫瘍中に局在するマクロファージの細胞表面に高レベルで発現される一方で、正常組織や末梢血では発現されないか又は非常に低レベルで発現されることが知られている（Ｎａｇａｙｏｓｈｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２００５  Ｓｅｐ；５２（９）：２６６６−７５；Ｎａｇａｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２００６  Ｏｃｔ；５４（１０）：３１２６−３４；及びＴａｋｕ  Ｎａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，２００９  Ｏｃｔ（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ：Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２４，２００９）；５８（１０）：１５７７−１５８６参照）。
本発明者らは今回、マウスを用いた間質性肺炎モデルにおいて、線維化が進行しつつある組織中のマクロファージでＦＲβ発現が強発現していることを見出した。
そこで本発明者らは、抗マウスＦＲβに対するリコンビナントタイプイムノトキシンを作製し、同モデルにおける治療効果を検討したところ、間質性肺炎による致死率が低減するとともに（偽薬投与群では７／１５個体が生存、イムノトキシン投与群では１４／１５個体が生存）、線維化の程度も抑制できることを組織化学的解析にて確認することができた。
本願発明は上記知見に基づくものであり、以下の特徴を包含する。
（１）葉酸受容体β（ＦＲβ）に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含む間質性肺炎治療剤。
（２）前記間質性肺炎は特発性間質性肺炎である、上記（１）記載の間質性肺炎治療剤。
（３）前記複合体は、リコンビナントイムノトキシンである、上記（１）又は（２）記載の間質性肺炎治療剤。
（４）前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、上記（１）〜（３）のいずれか記載の間質性肺炎治療剤。
（５）前記抗体は、葉酸受容体αに結合しない、上記（１）〜（４）のいずれか記載の間質性肺炎治療剤。
（６）前記抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は７以上の連続アミノ酸からなるその部分ペプチド、に対して誘起されたものである、上記（１）〜（５）のいずれか記載の間質性肺炎治療剤。
（７）前記抗体は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は７以上の連続アミノ酸からなるその部分ペプチド、に対して誘起されたものである、上記（１）〜（５）のいずれか記載の間質性肺炎治療剤。
（８）前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、それらの抗体フラグメント、又は組換え抗体である、上記（１）〜（７）のいずれか記載の間質性肺炎治療剤。
（９）前記抗体は、抗ヒト葉酸受容体βマウスモノクローナル抗体又は抗マウス葉酸受容体βラットモノクローナル抗体のいずれかの重鎖（Ｈ鎖）可変領域及び／又は軽鎖（Ｌ鎖）可変領域の各アミノ酸配列中の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む、上記（１）〜（８）のいずれか記載の間質性肺炎治療剤。
（１０）前記抗体は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すポリヌクレオチドによりコードされるＨ鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む、上記（１）〜（９）のいずれか記載の間質性肺炎治療剤：
（ａ）配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１１）前記抗体は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すポリヌクレオチドによりコードされるＬ鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む、上記（１）〜（９）のいずれか記載の間質性肺炎治療剤：
（ａ）配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１２）前記抗体は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すポリヌクレオチドによりコードされるＨ鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む、上記（１）〜（９）のいずれか記載の間質性肺炎治療剤：
（ａ）配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号５に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号５に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号５に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１３）前記抗体は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すポリヌクレオチドによりコードされるＬ鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む、上記（１）〜（９）のいずれか記載の間質性肺炎治療剤：
（ａ）配列番号６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＦＲβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号６に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１４）前記抗体は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すポリヌクレオチドによりコードされるＨ鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む、上記（１）〜（９）のいずれか記載の間質性肺炎治療剤：
（ａ）配列番号７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号７に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号７に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号７に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１５）前記抗体は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すポリヌクレオチドによりコードされるＬ鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む、上記（１）〜（９）のいずれか記載の間質性肺炎治療剤：
（ａ）配列番号８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号８に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号８に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号８に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１６）前記抗体は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すポリヌクレオチドによりコードされるＨ鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む、上記（１）〜（９）のいずれか記載の間質性肺炎治療剤：
（ａ）配列番号９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号９に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号９に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号９に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１７）前記抗体は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すポリヌクレオチドによりコードされるＬ鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む、上記（１）〜（９）のいずれか記載の間質性肺炎治療剤：
（ａ）配列番号１０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１０に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＦＲβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１０に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１８）前記細胞毒素は、緑膿菌外毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ）リシンＡ鎖（ｒｉｃｉｎ  Ａ  ｃｈａｉｎ）、脱糖鎖リシンＡ鎖（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｒｉｃｉｎ  Ａ  ｃｈａｉｎ）、リボゾーム不活性化タンパク質（ａ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、アルファサルシン（ａｌｐｈａ−ｓａｒｃｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、アスペルギリン（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｎ）、リストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、リボヌクレアーゼ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）、エポドフィロトキシン（ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、ジフテリアトキシン（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ）からなる群から選択されるものである、上記（１）〜（１７）のいずれか記載の間質性肺炎治療剤。
（１９）前記複合体は、配列番号１１に示すポリペプチドからなるＨ鎖と、配列番号１２に示すポリペプチドからなるＬ鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、上記（１）〜（１８）のいずれか記載の間質性肺炎治療剤。
（２０）前記複合体は、配列番号１３に示すポリペプチドからなるＨ鎖と、配列番号１４に示すポリペプチドからなるＬ鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、上記（１）〜（１８）のいずれか記載の間質性肺炎治療剤。
（２１）葉酸受容体β（ＦＲβ）に結合する抗体を含む間質性肺炎診断剤。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００９−０４６８２６号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図１は、間質性肺炎と診断された患者検体（上図）、およびブレオマイシン投与マウス間質性肺炎モデル（下図）における、抗マウスＦＲβマウスモノクローナル抗体を用いた肺領域の免疫組織学的染色を示す。ＦＲβ抗体で認識される細胞は赤色に発色している。
図２は、ブレオマイシン投与マウスモデルにおいて、本発明のリコンビナントイムノトキシンの投与がマウスの生存率を改善することを示す。
図３は、ブレオマイシン投与マウスモデルにおける、本発明のリコンビナントイムノトキシン又は偽薬（ＦＲβへの結合性が欠損している）の投与後の肺領域の免疫組織学的染色を示す。ＦＲβ抗体で認識される細胞は赤色に発色している。
図４は、ブレオマイシン誘発性肺線維症マウスモデルにおける、本発明のリコンビナントイムノトキシン又は偽薬（ＦＲβへの結合性が欠損している）の投与後の肺における腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、ＣＣ  ケモカインリガンド（ＣＣＬ）２又はＣＣＬ１２産生細胞の免疫組織化学染色（上図）及び当該細胞のカウント（下図）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明の間質性肺炎治療剤は、葉酸受容体β（ＦＲβ）に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含むことを特徴とし、これにより、ＦＲβ発現性マクロファージの細胞死を選択的に引き起こし、かつ間質性肺炎の進行に伴う肺の線維化を抑制することができる。
本明細書で使用する「葉酸受容体β」又は「ＦＲβ」は、間質性肺炎の病変部（すなわち線維化細胞）に局在するマクロファージ（以下、間質性肺炎関連マクロファージとも称する）の細胞表面に発現される受容体タンパク質である。ＦＲβは正常組織や末梢血中のマクロファージでは発現されないか又は非常に低レベルで発現される。
哺乳動物には、ヒトを含む霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジなどの家畜動物、イヌ、ネコなどのペット動物などが含まれる。好ましい哺乳動物はヒトである。
本明細書で使用される「葉酸受容体β（ＦＲβ）に結合する抗体」は、ＦＲβタンパク質を認識して該タンパク質に結合することができる抗体であり、以下に述べるように、該抗体は、無傷の抗体であってもよいし、或いは、間質性肺炎関連マクロファージとの結合親和性を有する限り、抗体フラグメントや合成抗体（例えば組換え抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体など）であってもよい。これらの抗体はまた、間質性肺炎により線維化した細胞がその表面にＦＲβを発現するような場合には、間質性肺炎関連マクロファージ及び該線維化細胞の両方に結合することを可能にする。抗体をヒトに対して使用する場合、好ましい抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。
本明細書で使用する「細胞毒素」又は「細胞毒性剤」は、間質性肺炎関連マクロファージ及び、場合により、線維化細胞を死滅させる又は障害する能力をもつ任意の物質を指す。
１．複合体
本発明の治療剤の有効成分としての複合体は、上記のとおり、間質性肺炎関連マクロファージの表面に発現する分子標的としてのＦＲβと結合する抗体と、該マクロファージ（及び場合により、線維化細胞）の細胞死を引き起こす細胞毒素又は細胞毒性剤とから基本的に構成される。
ここで、細胞死は、細胞の死滅、殺傷又は障害を意味し、細胞毒素又は細胞毒性剤によって引き起こされる。細胞毒素は、いわゆるトキシンとも呼ばれるタンパク質であるのに対して、細胞毒性剤は、低分子量の化学療法剤であり、前者には、微生物、特に細菌由来のトキシンが含まれ、一方、後者には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、分子標的薬、植物アルカロイド、ホルモン剤などが含まれる。
本発明の複合体が上記抗体と細胞毒素からなるとき、これらの成分は融合タンパク質の形態をとることができる。この場合、細胞毒素は、好ましくは抗体タンパク質のＣ末端に、必要に応じてリンカー（例えばペプチド）を介して、結合することができる。一方、本発明の複合体が上記抗体と細胞毒性剤からなるとき、これらの成分は、結合のための官能基を介して共有結合又は非共有結合によって結合することができる。
１．１  抗体
本発明において、上記抗体は、間質性肺炎関連マクロファージのＦＲβに特異的に結合するものである。ここで、「特異的」とは、上記抗体が上記マクロファージのＦＲβと免疫学的反応により結合するが、ＦＲβ又はそれと８０％以上の配列同一性をもつタンパク質以外のタンパク質とは実質的に結合しないことを意味する。この点で、上記抗体は、ＦＲのアイソフォームの１つであるＦＲα（例えばヒトＦＲαはヒトＦＲβとの間に約７０％のアミノ酸配列同一性がある（特表  ２００８−５０００２５））と結合しないことが望ましい。
本発明で使用可能な抗体は、抗原であるＦＲβタンパク質又はその部分ペプチドに結合可能な抗体分子全体又はそのフラグメントである。部分ペプチドは、５以上、好ましくは７以上、より好ましくは８以上の連続アミノ酸を有する。一般に、抗原性エピトープ又は抗原決定基は、約５〜約１０アミノ酸からなり、かつ連続的アミノ酸配列又は不連続的アミノ酸配列を有する。
本発明の抗体は、ＦＲβと結合する、好ましくは特異的に結合する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、それらの抗体フラグメントのいずれであってもよい。
本発明の抗体はまた、いずれの免疫グロブリン（Ｉｇ）クラス（ＩｇＡ，ＩｇＧ，ＩｇＥ，ＩｇＤ，ＩｇＭなど）及びサブクラス（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２など）のものあってもよい。また、免疫グロブリンの軽鎖は、κ又はλのいずれであってもよい。
本発明の抗体フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、重鎖モノマー又はダイマー、軽鎖モノマー又はダイマー、１つの重鎖と１つの軽鎖からなるダイマーなどを含む。このようなフラグメントの作製方法は当該技術分野で公知であり、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼによる抗体分子の消化、或いは公知の遺伝子工学的手法により得ることができる。
本発明の抗体はまた、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などであってもよい。組換え抗体には、例えば一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体などが含まれる。二重特異性抗体は、２つの異なる結合特異性を有する抗体を指し、例えばｄｉａｂｏｄｙ、ＳｃＤｂ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｄｉａｂｏｄｙ），ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖなどが含まれる（浅野竜太郎，生化学７７（１２）１４９７−１５００，２００５参照）。
以下、本発明において使用するための抗体の作製方法について詳述する。
本発明において使用可能な抗体を作製するにあたり、最初に免疫原（抗原）として使用するタンパク質、すなわちＦＲβタンパク質又はその部分ペプチドを調製する。ここで部分ペプチドは、５以上、好ましくは７以上の連続アミノ酸からなる配列を有するものである。免疫原として使用することができるＦＲβタンパク質の由来は、標的とするＦＲβと特異的に結合することができる抗体を誘起できるものであるものであれば特に限定されず、例えばヒト、マウス等の哺乳動物に由来するＦＲβタンパク質又はその部分ペプチドを免疫原として使用する。本発明では、免疫原として、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるヒトＦＲβタンパク質又はその部分ペプチド、あるいは配列番号２に示すアミノ酸配列からなるマウスＦＲβタンパク質又はその部分ペプチドを使用することができる。免疫原として、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるヒトＦＲβタンパク質又はその部分ペプチドを使用することが特に好ましい。
かかるＦＲβタンパク質又はその部分ペプチドは、ＦＲβのアミノ酸配列情報（例えば配列番号１など）に基づき、当該技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法などにより調製することができる。ヒトを含む他の哺乳動物由来のＦＲβの配列情報は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ、米国）、ＥＭＢＬ（ＥＢＩ、欧州）などから入手可能である。
あるいは、遺伝子組換え手法を利用して、ＦＲβタンパク質又はその部分ペプチドを生産することも可能である。簡単に説明すると、ＦＲβタンパク質をコードするＤＮＡの配列を適当なタンパク質産生用ベクターに連結し、標的ＦＲβタンパク質又はその部分ペプチドが発現し得るように宿主中に導入し、該宿主中でＦＲβタンパク質又はその部分ペプチドを生産することができる。この手法は当業者に周知であり、この場合に採用するベクター、宿主細胞、形質転換方法、培養方法、標的タンパク質の精製方法は、当業者が適宜選択することができる。遺伝子組換え手法については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９８）などを参照することができる。
上記のようにして調製したＦＲβタンパク質又はその部分ペプチドを免疫原として、本発明の抗体を製造することができる。あるいは、標的ＦＲβタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクター、或いは該タンパク質又はその部分ペプチドを発現する哺乳動物細胞を免疫原として使用して、本発明の抗体を製造してもよい。
本発明のポリクローナル抗体は、上記のようにして作製した免疫原を、哺乳動物、例えばウサギ、ラット、マウスなどに免疫して、抗血清を得ることによって製造することができる。具体的には、上記免疫原を、必要に応じて免疫原性を高めるためのアジュバントと共に、哺乳動物に静脈内、皮下又は腹腔内投与する。アジュバントとしては、市販の完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム、ミョウバン（Ａｌｕｍ）、ムラミルペプチド（細菌細胞壁関連ペプチドの一種）等を使用することができる。その後、数日から数週間の間隔で、１〜７回の免疫を行い、最後の免疫日から１〜７日後に、ＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法などによって抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血して抗血清を得る。このようにして取得した抗血清は、そのまま使用してもよいし、ＦＲβタンパク質又はその部分ペプチドを固定化したカラムで１回又は数回精製処理を行った後に使用してもよい。
本発明で使用可能なモノクローナル抗体は、以下のようにして作製することができる。すなわち、上記のようにして免疫感作した哺乳動物から得た抗体産生細胞（例えば脾臓由来リンパ球細胞、リンパ系細胞など）と自己抗体産生能のないミエローマ細胞からハイブリドーマを調製し、ハイブリドーマをクローン化し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造することができる。かかるハイブリドーマの製造方法は当該技術分野で周知であり、例えばＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−９６）の方法に準じて行うことができる。
本発明のモノクローナル抗体の例として、ヒトＦＲβ発現細胞により免疫されたマウスの脾細胞と、マウスミエローマ細胞とを融合させることにより得られたマウス−マウスハイブリドーマクローン３６ｂ又はクローン９４ｂが産生するモノクローナル抗体等を挙げることができる。
また本発明のモノクローナル抗体の他の例として、マウスＦＲβ発現細胞により免疫されたラントの脾細胞と、ラットミエローマ細胞とを融合させることにより得られたラット−ラットハイブリドーマクローンＣＬ５又はクローンＣＬ１０が産生するモノクローナル抗体等を挙げることができる。
本発明は、上記のようにして作製したハイブリドーマが有する核酸であって、該ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のＨ鎖又はＬ鎖を含む抗体をコードする遺伝子を包含する。これらの核酸はハイブリドーマから通常の遺伝子工学的手法により得ることができ、またその塩基配列も公知の塩基配列決定法により決定することができる。例として、マウス−マウスハイブリドーマクローン３６ｂ細胞が産生するモノクローナル抗体のＨ鎖可変領域遺伝子及びＬ鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号３及び４に、マウス−マウスハイブリドーマクローン９４ｂ細胞が産生するモノクローナル抗体のＨ鎖可変領域遺伝子及びＬ鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号５及び６に示す。また他の例として、ラット−ラットハイブリドーマクローンＣＬ５が産生するモノクローナル抗体のＨ鎖可変領域遺伝子及びＬ鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号７及び８に、ラット−ラットハイブリドーマクローンＣＬ１０が産生するモノクローナル抗体のＨ鎖可変領域遺伝子及びＬ鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号９及び１０に示す。
本発明は、上記のようにして作製したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のＨ鎖可変領域遺伝子（例えば配列番号３、５、７、９）、Ｌ鎖可変領域遺伝子（例えば配列番号４、６、８、１０）に制限されず、これらの遺伝子の変異体を包含する。
かかる変異体としては例えば以下のものを挙げることができる。
（ｉ）上記Ｈ鎖又はＬ鎖可変領域遺伝子において、１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有し、かつＦＲβに結合する同等もしくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体；（ｉｉ）上記Ｈ鎖可変領域コード核酸又はＬ鎖可変領域コード核酸と実質的に同一の塩基配列を有し、かつＦＲβに結合する同等もしくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体；及び（ｉｉｉ）上記Ｈ鎖可変領域コード核酸又はＬ鎖可変領域コード核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＦＲβに結合する同等もしくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体。
本発明のＨ鎖及びＬ鎖可変領域遺伝子の関連で使用する「数個」という用語は、１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個を指す。
本発明のＨ鎖及びＬ鎖可変領域遺伝子の関連で使用する「実質的に同一」とは、上記のようにして作製したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のＨ鎖可変領域遺伝子（例えば配列番号３、５、７、９）、Ｌ鎖可変領域遺伝子（例えば配列番号４、６、８、１０）と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有することを意味する。なお、２つの配列間の同一性％は、配列が共有する同一な位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一な位置の数／位置（例えば、一部重複する位置）の総数ｘ１００）。
２つの配列間の同一性％の決定は、例えばカーリン（Ｋａｒｌｉｎ）及びアルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）（１９９３）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７）において改変されたカーリン及びアルトシュール（１９９０）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４）のアルゴリズムを用いて行うことができる。この種のアルゴリズムは、アルトシュールら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。また、比較用のギャップが入ったアライメントを得るためには、アルトシュールら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載されたＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを用いるとよい。または、分子間の遠隔的な関連を検出する反復検索を行うためにＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いることもできる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを用いる際には、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．参照）。配列比較のために使用できるアルゴリズムのその他の好ましい例として、例えばマイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）及びミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）（１９８８）、ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズムである。この種のアルゴリズムは、ＧＣＣ配列整列化ソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に組み込まれている。
本明細書において使用する「ストリンジェントな条件」とは、これに限定されるものではないが、例えば３０℃〜５０℃で、３〜４×ＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）、０．１〜０．５％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、より好ましくは４０℃〜４５℃で、３．４×ＳＳＣ、０．３％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、および１×ＳＳＣ溶液、０．２×ＳＳＣ溶液による室温での連続した洗浄などの条件を挙げることができる。ただし、上記条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記の又は他の要素（例えば、ハイブリダーゼーションプローブの濃度、長さ及びＧＣ含量、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
本明細書において「同等」とは、例えばＦＲβ抗原に対する結合特異性、結合親和性といった生物学的な活性が実質的に同一であることを指す。またこの用語は、実質的に同質の活性を有する場合を含んでもよく、ここでいう「同質」の活性とは、ＦＲβ抗原に対する特異的結合性といった活性の性質が同一であること、或いは生理的性質、薬理的性質、又は生物学的性質が同一であることをいう。
これらのハイブリダイゼーションにおける「ストリンジェントな条件」の他の例については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（上記）、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）などに記載されており、これらの条件を本発明に使用してもよい。
上記変異体は、天然に生じたものであってもよいし、人為的に変異を導入したものであってもよい。人為的な変異の導入は、例えば部位特異的変異導入法（Ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いて常法により導入することができる（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，１９８４  ８１：５６６２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記））。
本発明では、上記のように作製したハイブリドーマに基づき、遺伝子組換え技術を用いて組換え抗体を作製することもできる。
具体的には、作製したハイブリドーマからモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞といった宿主に導入して、宿主において組換え抗体を生産させることができる（Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ．，ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．，１９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ，Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．，１９９３  ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ）。
さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなマウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ又はブタを作製し、ＦＲβタンパク質又はその部分ペプチドを抗原として免疫したのち、そのトランスジェニック動物の血液、ミルク中などからその抗体遺伝子に由来する抗体を大量に取得することも可能である。また、上記トランスジェニック動物のなかには、内因性抗体遺伝子を欠失したかつヒト抗体遺伝子を保有するマウスやウシなどのヒト抗体産生動物も知られているので、このような動物を利用する場合には、ヒトＦＲβに結合する完全ヒト抗体を得ることができる（例えば国際公開ＷＯ  ９６／９６３４０９６、ＷＯ  ９６／３３７３５、ＷＯ９８／２４８９３など）。さらにまた、当該動物の抗体産生細胞（例えばＢ細胞）とミエローマ細胞から作製したハイブリドーマをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する場合には、上記のような手法で、モノクローナル抗体を産生することもできる。このとき、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々の条件に応じて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知の栄養培地又は基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
産生されたモノクローナル抗体は、当該技術分野において周知の方法、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより精製することができる。
本発明で使用可能な抗体はまた、キメラ抗体であることができる。本発明のキメラ抗体は、例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２−４５４に記載される技術を用いて製造することができる。これらの技術では、適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を適当な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングする。キメラ抗体は、異なる動物種に由来する異なる部分が存在する分子である。キメラ抗体として、例えば、抗ＦＲβマウス又はラットモノクローナル抗体のＨ鎖及び／又はＬ鎖可変領域と他の哺乳動物由来の免疫グロブリン定常領域とを有する抗体を挙げることができる。
本発明においてはまた、例えばマウス又はラットモノクローナル抗体由来の可変領域又は超可変領域を含む可変領域の一部と、ヒト免疫グロブリンの定常領域、又はヒト免疫グロブリンの可変領域の一部及び定常領域、とを有する抗体、例えば「ヒト化抗体」を挙げることができる。ヒト化抗体の場合、マウス由来の抗体領域部分は約１０％未満が望ましい。
上記ヒト化抗体は、例えば抗ヒトＦＲβマウスモノクローナル抗体（又は抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体）のＨ鎖可変領域及び／又はＬ鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、２及び３）を含むアミノ酸配列を含むことができる。さらに具体的には、以下の抗体を例示することができる。
（１）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すポリヌクレオチドによりコードされるＨ鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む抗体：
（ａ）配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（２）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すポリヌクレオチドによりコードされるＬ鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む抗体：
（ａ）配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（３）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すポリヌクレオチドによりコードされるＨ鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む抗体：
（ａ）配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号５に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号５に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号５に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（４）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すポリヌクレオチドによりコードされるＬ鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む抗体：
（ａ）配列番号６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＦＲβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号６に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（５）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すポリヌクレオチドによりコードされるＨ鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む抗体：
（ａ）配列番号７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号７に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号７に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号７に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（６）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すポリヌクレオチドによりコードされるＬ鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む抗体：
（ａ）配列番号８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号８に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号８に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号８に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（７）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すポリヌクレオチドによりコードされるＨ鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む抗体：
（ａ）配列番号９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号９に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号９に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号９に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（８）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すポリヌクレオチドによりコードされるＬ鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む抗体：
（ａ）配列番号１０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１０に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＦＲβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１０に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＲβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
なお、配列番号３〜１０のＣＤＲ１〜３のヌクレオチド位置を下記表１に示す。
【表１】
0005544626.tif 000002
上記マウスドナー配列に適するヒトアクセプター抗体配列は、マウス可変領域のアミノ酸配列の既知のヒト抗体のＨ鎖又はＬ鎖の配列とのコンピュータ比較によって同定されうる。そのフレームワーク配列がマウスＬ鎖可変領域及びＨ鎖可変領域のフレームワーク領域と高い配列同一性を表すヒト抗体からの可変ドメインは、マウスフレームワーク配列を用いてＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（米国）を利用するＫａｂａｔデータベースに照会することによって同定することができる。このとき、マウスドナー配列と８０％以上、好ましくは９０％以上の配列の同一性を共有するアクセプター配列を選択することができる。ラットドナー配列についても同様に、それに適するヒトアクセプター抗体配列を同定することができる。
このようにして同定されたヒトアクセプター抗体Ｈ鎖及びＬ鎖配列をコードする塩基配列をベースにして、その可変領域の一部をマウス抗体のものと置換するように組換えを行う。得られたヒト／マウスキメラＨ鎖及びＬ鎖をコードするＤＮＡを発現ベクターに組込み、適当な宿主細胞に形質転換することによって、ヒト化抗体をクローン化、産生することができる。
上記のようなキメラ抗体、ヒト化抗体は、ヒトへの適用に際し、抗原性を低減できるという利点を有する。
本発明の抗体はまた、例えば米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４６に記載される技術を用いて作製した、ＦＲβタンパク質又はその部分ペプチドに対する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であってもよい。本発明の一本鎖抗体は、例えば本発明のモノクローナル抗体のＨ鎖可変領域（例えば配列番号３、５、７、９）及びＬ鎖可変領域遺伝子（例えば配列番号４、６、８、１０）の配列情報に基づき、常法に従ってそれぞれＨ鎖フラグメントとＬ鎖フラグメントを調製し、アミノ酸架橋によってＦｖ領域のＨ鎖フラグメントとＬ鎖フラグメントとを連結し、一本鎖のポリペプチドを得ることにより形成することができる。
１．２  細胞毒素又は細胞毒性剤
本発明に使用することができる細胞毒は、間質性肺炎関連マクロファージの細胞死を誘導する目的で使用することができる任意の細胞毒素であり、例えば緑膿菌外毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ）、リシンＡ鎖（ｒｉｃｉｎ  Ａ  ｃｈａｉｎ）、脱糖鎖リシンＡ鎖（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｒｉｃｉｎ  Ａ  ｃｈａｉｎ）、リボゾーム不活性化タンパク質（ａ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、アルファサルシン（ａｌｐｈａ−ｓａｒｃｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、アスペルギリン（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｎ）、リストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、リボヌクレアーゼ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）、エポドフィロトキシン（ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、ジフテリアトキシン（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ）などを挙げることができる。本発明においては、特に、ＰＥ３８等の緑膿菌外毒素を使用することが好ましい。
あるいは、本発明に使用することができる細胞毒性剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、分子標的薬、植物アルカロイド、ホルモン剤などから適宜選択可能である。このような細胞毒性剤としては、間質性肺炎関連マクロファージを死滅させることができるものが好ましい。また、ＦＲβを細胞表面に発現する線維化細胞の場合には、線維化細胞の死滅も誘導可能な細胞毒性剤を利用することができる。
１．３  リコンビナントイムノトキシンなどの複合体
本発明の複合体の１つであるリコンビナントイムノトキシンを作製するために、上記のようにして作製された本発明の抗体又はその部分ペプチドは細胞毒素とコンジュゲートされる。すなわち、本発明に係るリコンビナントイムノトキシンとは、標的（すなわちＦＲβタンパク質）に結合する本発明の上記抗体が、細胞毒素又はそのサブユニットにコンジュゲートされたキメラ分子である。本発明においては、植物や細菌等に由来する細胞毒素、ヒト起源の細胞毒素、合成の細胞毒素を使用することができる。
本発明の抗体と細胞毒素とのコンジュゲートは、以下のようにして行うことができる。すなわち、抗体分子中の反応性基（例えばアミノ基、カルボキシル基、水酸基等）を利用し、該反応性基と反応しうる官能基をもつ細胞毒と該抗体とを接触させることによって、本発明のリコンビナントイムノトキシンを得ることができる。あるいは、本発明の抗体のＨ鎖可変領域遺伝子（配列番号３、５、７、９）及びＬ鎖可変領域遺伝子（配列番号４、６、８、１０）の配列情報に基づき、遺伝子工学的手法により、Ｈ鎖フラグメント又はＬ鎖フラグメントのいずれかを細胞毒素との融合タンパク質として作製し、細胞毒素と融合していない他方のフラグメントと一緒に、ＳＨ結合を介して一本鎖抗体又は二本鎖抗体を形成させることによって、本発明のリコンビナントタンパク質を作製してもよい。ＳＨ結合を介したＨ鎖フラグメントとＬ鎖フラグメントの結合は、βメルカプトエタノールやジチオスレイトールなどの還元剤などによってメルカプト基（−ＳＨ基）を露出後、両者を混和することによって達成することができる。
本発明のリコンビナントイムノトキシンの一例として、それぞれ上記マウス−マウスハイブリドーマクローン３６ｂ細胞又はクローン９４ｂが産生するモノクローナル抗体と緑膿菌外毒素とのリコンビナントイムノトキシンであるリコンビナントイムノトキシンが挙げられる。マウス−マウスハイブリドーマクローン３６ｂと緑膿菌外毒素のリコンビナントイムノトキシンは、例えば配列番号１１に示すポリペプチドからなるＨ鎖と、配列番号１２に示すポリペプチドからなるＬ鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である。またマウス−マウスハイブリドーマクローン９４ｂが産生するモノクローナル抗体と緑膿菌外毒素とのリコンビナントイムノトキシンは、例えば配列番号１３に示すポリペプチドからなるＨ鎖と、配列番号１４に示すポリペプチドからなるＬ鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である。
本発明の複合体のもう１つの例は、上記のＦＲβに結合する抗体と細胞毒性剤との結合体である。一般に、抗体の定常領域、好ましくはＣ末端側に細胞毒性剤を結合することができる。結合は、抗体蛋白質のＮＨ２基、ＳＨ基、ＯＨ基、ＣＯＯＨ基などを利用し、これと反応性の官能基をもつ細胞毒性剤とを、場合により例えば炭化水素リンカーを介して、化学的に結合することによって実施できる。
２．治療剤
こうして作製された本発明の複合体は、間質性肺炎関連マクロファージに特異的に高発現しているＦＲβを標的とし、間質性肺炎関連マクロファージの細胞死を誘導して肺の線維化を抑制することができる（下記実施例４、及び図２、３参照）。
このように、本発明のリコンビナントイムノトキシン等の複合体は、ミサイル療法等の治療目的に使用可能な複合体であり、間質性肺炎に対する治療効果を有するものである。また、本発明の複合体は、間質性肺炎において特異的に高発現しているＦＲβを標的とするため、正常細胞への影響が少なく、副作用のリスクが低いという利点を有する。
本発明の複合体は、これを有効成分として含む間質性肺炎治療剤として製剤化される。すなわち、本発明の間質性肺炎治療剤は、治療上有効量の複合体を含むものである。ここで、「治療上有効量」とは、所与の症状や用法について治療効果を与え得る量を指し、間質性肺炎治療剤を適用する対象の性別、年齢、体重、疾患の重篤度、投与経路など様々な要因に応じて変化する。例えば、所与の用法に従って、６０ｋｇの成人に、本発明の複合体が１日当たり２００μｇ以上、好ましくは５００μｇ以上の量で投与される量を治療上有効量として含むことができる。
本発明の間質性肺炎治療剤は、本発明の複合体に加えて、生理学的に許容し得る製薬上の添加物、例えば希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、酸化防止剤、等張化剤、賦形剤及び担体などの１種以上を含むことができる。また間質性肺炎の治療に効果的な他の薬剤との混合物としてよい。かかる薬剤として、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、トリアムシノロン等のステロイド剤や、ピルフェニドンなどを挙げることができる。
本発明の間質性肺炎治療剤は、経口投与、或いは注射、例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与（すなわち静脈内又は筋肉内投与）用に製剤化することができる。注射用製剤は、保存剤を添加して、例えばアンプル又は複数回投与容器中の単位投与剤形として提供することができる。あるいは、本発明の間質性肺炎治療剤は、好適なビヒクル、例えば発熱物質不含の滅菌水などで使用前に再構成するための凍結乾燥粉剤としてもよい。
投与経路は、経口経路、並びに静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内の注射などが考えられる。あるいは、患者の患部に直接本発明の間質性肺炎治療剤を接触させてもよい。
本発明の間質性肺炎治療剤は、その病因にＦＲβ発現性マクロファージが関与しているものであればいずれの間質性肺炎の治療に用いてもよく、例えば、特発性間質性肺炎や、肺線維化が認められた膠原病、がん治療時における放射線や薬剤によって誘発された肺線維症などに有用である。
本発明の間質性肺炎治療剤を適用する対象は特に限定されず、健常者、間質性肺炎に罹患している患者、間質性肺炎を治療している患者、間質性肺炎の予防を検討している健常者等のいずれであってもよい。またその対象はヒトに限らず、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。例えば、ヒト以外の哺乳動物として、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコなどを例として挙げることができる。
３．間質性肺炎の診断
上記節１．１で説明した本発明の抗体又はそのフラグメントは、間質性肺炎の診断、例えば、間質性肺炎の存在又は不在、及び該疾患を有するリスクを判定するために使用することができる。具体的には、本発明の間質性肺炎の診断方法（以下、本発明の方法という）は、本発明の抗体又はそのフラグメントを使用してサンプル中の該疾患に由来するＦＲβを免疫学的に検出又は測定することを含んでいる。
本発明の方法は、これが抗体を用いるアッセイ（すなわち免疫学的アッセイ）である限り、いずれの手法に基づいて行うこともできる。したがって、本発明の抗体又はそのフラグメントを前記アッセイで使用する抗体として用いてＦＲβを検出することができる。例えばＦＲβは、免疫組織染色、酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ及びＥＩＡ）などのイムノアッセイ、免疫蛍光アッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はウエスタンブロッティングを用いることによって検出することができる。
本発明の方法で試験されるべきサンプルは、間質性肺炎に由来するＦＲβを含む可能性のある生物学的サンプルであれば特に制限されない。サンプルの例として、細胞又は器官の抽出物、組織切片、肺洗浄液、バイオプシーなどを挙げることができる。本発明の抗体又はそのフラグメントを用いることによって測定されるＦＲβの存在量は、間質性肺炎のリスクの指標として特に有用である。
例えば、本明細書に記載される抗体及びそのフラグメントは、ＦＲβを定量的又は定性的に検出するために使用することができる。本発明の抗体（又はそのフラグメント）は、例えばＦＲβのｉｎ  ｓｉｔｕ検出のために、さらに組織学的に使用することができる。ｉｎ  ｓｉｔｕ検出は、被験体から組織学的サンプル、例えばパラフィン包埋した組織切片（外科標本など）、を取り出し、これに標識した本発明の抗体をアプライすることによって行うことができる。
ＦＲβのためのイムノアッセイは、典型的には、調査する被験体由来のサンプルを、検出可能に標識された本発明の抗体の存在下でインキュベートすること、及び当該分野で周知の多くの技術のいずれかによって、結合した抗体を検出すること、を含んでいる。
抗ＦＲβ抗体の結合活性は、周知の方法に従って測定することができる。当業者は、慣用の実験を使用することによって各測定に効果的な及び最適なアッセイ条件を決定することができる。
本発明の方法は、他の間質性肺炎診断手法と併用することが好ましい。上記の通り、ＦＲβは、間質性肺炎の他、関節リウマチや悪性腫瘍などの病変部位に局在するマイクロファージの細胞表面上でも発現が認められることがあるため、他の診断手法と併用することで、間質性肺炎の診断精度を高めることができる。本発明の方法で使用することができる他の間質性肺炎診断手法としては、血液検査、レントゲン、関節液、胸水、腹水、バイオプシー、肺洗浄液などを挙げることができる。
【実施例】
【０００７】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
実施例１
抗ヒトＦＲβマウスモノクローナル抗体及び抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体の製造
［抗原であるＦＲβ発現細胞の調製］
関節リウマチ滑膜またはＢａｌｂ／ｃマウス肝臓からＴｒｉｚｏｌ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて添付説明書に従って全ＲＮＡを抽出後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて添付説明書に従ってｃＤＮＡを合成した。次に、１μｌのリウマチ滑膜、またはＢａｌｂ／ｃマウス肝臓ｃＤＮＡをそれぞれ別個にＢｉｏｎｅｅｒ  ＰＣＲ  ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）に加え、１０ピコモル量に調整したセンス（ヒトリウマチ滑膜：ａｇａａａｇａｃａｔｇｇｇｔｃｔｇｇａａａｔｇｇａｔｇ（配列番号１５）；マウス肝臓：ｔｃｔａｇａａａｇａｃａｔｇｇｃｃｔｇｇａａａｃａｇ（配列番号１６））およびアンチセンスプライマー（ヒトリウマチ滑膜：ｇａｃｔｇａａｃｔｃａｇｃｃａａｇｇａｇｃｃａｇａｇｔｔ（配列番号１７）；マウス肝臓：ｃｃｃａａｃａｔｇｇａｔｃａｇｇａａｃｔ（配列番号１８））を加え、９４℃２０秒、５８℃３０秒、７２℃６０秒で３０サイクルＰＣＲを行い、その後７２℃５分で反応させることにより、ヒトあるいはマウスＦＲβを増幅した。増幅したＦＲβ遺伝子のＰＣＲ産物をプラスミドＰＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲーションを行った。すなわちＰＣＲ産物２．５μｌにＮａＣｌ溶液を１μＬ、滅菌蒸留水１．５μｌ、ベクタープラスミド（ＰＣＲ２．１−ＴＯＰＯ）１μＬを加えて室温で５分間インキュベートし、その内の２μＬを大腸菌（ＴＯＰ１０Ｆ’）に加えて氷中で３０分反応後、４２℃３０秒の熱処理し、氷中で２分間静置し、２５０μＬのＳＯＣ培地を加えた後、３７℃で１時間シェーカー内で培養した。培養終了後、ＬＢ培地に捲き、３７℃で一晩培養した。
大腸菌培養の為、プレート上より採取した白いコロニーをアンピシリン（５０ｍｇ／ｍＬ）を含むＬＢ液体培地に加えて３７℃一晩培養した。プラスミドの精製はＱｉａｇｅｎプラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）にて行った。組み込まれたＦＲβ遺伝子は、制限酵素ＥｃｏＲＩによる処理後、アガロース電気泳動に展開し、約０．８ｋｂ（７８２ｂｐ）のＦＲβ遺伝子産物を確認後、その部位を切り出し、遺伝子産物の抽出をＱｕｉａｇｅｎ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）にて精製した。次にあらかじめＥｃｏＲＩ処理を行った哺乳細胞発現用ベクターｐＥＲ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．ｐＥＦ−ＢＯＳ，ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９９０；１８（１７）：５３２２）と混和し、Ｔ４  ｌｉｇａｓｅ（Ｒｏｓｈｅ）を用いてライゲーションを行った。ライゲーション産物の大腸菌（ＴＯＰ１０Ｆ’）への遺伝子導入ならびに、ＦＲβ遺伝子の確認は上記と同様の手法で行った。
ｐＥＦ−ＢＯＳに組み込まれたＦＲβ遺伝子を確認後、ヒトＦＲβを含むベクターはマウスＢ３００−１９細胞に、マウスＦＲβを含むベクターはラットＲＢＬ２Ｈ３細胞にそれぞれ遺伝子導入を行った。すなわち、あらかじめ１ｘ１０５個に調整した各細胞に、２０μＬのリポフェクタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）と混和したＦＲβベクター１μｇを加えて遺伝子導入を行った。遺伝子導入されたＢ３００−１９マウス細胞およびラットＲＢＬ２Ｈ３細胞は抗生物質Ｇ４１８耐性を獲得するため、１ｍｇ／ｍＬの濃度のＧ４１８を含む培地にて遺伝子導入された細胞を選択培養した。遺伝子導入された細胞のＦＲβ遺伝子導入の確認はＰＣＲ法にて行った。すなわち、１ｘ１０７個に調整した各細胞をｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にてｃＤＮＡを合成し、１０ピコモル量に調整したセンス（ヒトリウマチ滑膜：ａｇａａａｇａｃａｔｇｇｇｔｃｔｇｇａａａｔｇｇａｔｇ（配列番号１５）；マウス肝臓：ｔｃｔａｇａａａｇａｃａｔｇｇｃｃｔｇｇａａａｃａｇ（配列番号１６））およびアンチセンスプライマー（ヒトリウマチ滑膜：ｇａｃｔｇａａｃｔｃａｇｃｃａａｇｇａｇｃｃａｇａｇｔｔ（配列番号１７）；マウス肝臓：ｃｃｃａａｃａｔｇｇａｔｃａｇｇａａｃｔ（配列番号１８））をＢｉｏｎｅｅｒ  ＰＣＲ  ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）に加え、９４℃２０秒、５８℃３０秒、７２℃６０秒で３０サイクルＰＣＲを行い、その後７２℃５分で反応させることにより、ヒトあるいはマウスＦＲβを増幅した。増幅後アガロース電気泳動を行い、ＦＲβが示すバンド０．８ｋｂを確認した。
［抗ヒトＦＲβマウスモノクローナル抗体および抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体の作製］
ＦＲβ発現マウスＢ３００−１９細胞あるいはラットＲＢＬ２Ｈ３細胞を１ｘ１０７個に調整し、フロインド完全アジュバンドと混合し、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（抗ヒトＦＲβモノクローナル抗体用）あるいはＷｈｉｓｔｅｒ  Ｋｙｏｔｏラット（抗マウスＦＲβモノクローナル抗体用）の尾部に３ヵ所、腹腔内に免疫した。この免疫を２〜４回繰り返した。
モノクローナル抗体の作成はＫｏｌｅｒの方法（Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−９６）に従って行った。すなわち、脾臓あるいは腸骨リンパ節を取りだし、単一細胞に解離させた。解離した細胞を骨髄腫由来の細胞（ＮＳ−１）と細胞融合させてハイブリドーマを作製し、ＨＡＴ選択培地にて培養し、培養上清中に分泌された抗体を、先のＦＲβ発現細胞との反応性で選別を行った。
得られたハイブリドーマのクローン化は、９６穴プレートの各穴あたり１細胞となるように調整した限界希釈培養にて行った。クローン化細胞の選別は、ＦＲβ発現細胞との反応性で行った。
クローン化したハイブリドーマを１ｘ１０７個に調整し、ヌードマウス腹腔内に投与して腹水を調整し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム（ＧＥバイオサイエンス）にてモノクローナル抗体を精製した。精製したマウスおよびラットモノクローナル抗体のアイソタイプは、アイソタイピングＥＬＩＳＡキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて決定した。その結果、抗ヒトＦＲβマウスモノクローナル抗体はＩｇＧ２ａタイプのクローン３６ｂとＩｇＧ１タイプの９４ｂの二つが得られ、抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体は、ＩｇＧ２ａタイプのＣＬ５とＣＬ１０の二つが得られた。これら各抗体の抗原に対する反応性はフローサイトメトリーにて解析した。
［抗ヒトＦＲβマウスモノクローナル抗体および抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体の重鎖遺伝子可変領域（ＶＨ）および軽鎖遺伝子可変領域（ＶＬ）遺伝子の決定］
マウスハイブリドーマクローン３６ｂ、９４ｂを１ｘ１０７個にそれぞれ調整し、ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にてｃＤＮＡを合成した。３６ｂおよび９４ｂはＩｇ−Ｐｒｉｍｅ  Ｋｉｔを用いてＶＨおよびＶＬの遺伝子をＰＣＲにて決定した。ＰＣＲ条件は添付の説明書に従って行った。すなわち、９４℃６０秒、５０℃６０秒、７２℃１２０秒で３０サイクルＰＣＲを行い、その後７２℃５分で反応させ、ＶＨおよびＶＬの遺伝子を増幅した。増幅したＶＨおよびＶＬのＰＣＲ産物をプラスミドＰＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲーションし、大腸菌（ＴＯＰ１０Ｆ’）に遺伝子導入した。遺伝子導入した大腸菌よりプラスミドを精製し、３６ｂ、９４ｂのＶＨおよびＶＬの塩基配列を決定した。塩基配列はＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｏｒ  Ｖ３．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（ＡＢＩ）を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をＡＢＩ３１０  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにて解析した。
ラットハイブリドーマクローンＣＬ５、ＣＬ１０を１ｘ１０７個にそれぞれ調整し、ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にてｃＤＮＡを合成した。次に、Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅ  ＫｉｔおよびラットＶＨ増幅用にデザインしたプライマー（ｃａｃｃａｔｇｇａｇｔｔａｃｔｔｔｔｇａｇ（配列番号１９））を用い、ＶＨおよびＶＬの遺伝子をＰＣＲに増幅させた。増幅したＶＨおよびＶＬのＰＣＲ産物をプラスミドＰＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲーションし、大腸菌（ＴＯＰ１０Ｆ’）に遺伝子導入した。次に、大腸菌よりプラスミドを精製し、ＶＨおよびＶＬの塩基配列を決定した。塩基配列はＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｏｒ  Ｖ３．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（ＡＢＩ）を用いてＰＣＲを行い、ＡＢＩ  ３１０  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにて解析した。
実施例２
ヒト間質性肺炎およびマウスブレオマイシン間質性肺炎モデルにおけるＦＲβ陽性マクロファージの免疫組織学的検出
［ヒト間質性肺炎組織の免疫組織化学的染色］
ホルマリン固定したヒト特発性間質性肺炎組織のパラフィン封埋ブロックを２μｍにて薄切し、組織標本を作製した。得られた標本はキシレンおよびエタノールにてパラフィンの洗浄を行い、さらに抗原回復液（Ｄｉｖａ  Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ，Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）に浸し、１２１℃で１５分間処理した。抗原回復後の標本は、３％牛血清アルブミンを含む１０％ヒト血清にて、免疫組織染色の非特異的吸着のブロッキングを行った。抗体反応には５〜１０μｇ／ｍＬに調整した抗ヒトＦＲβマウスモノクローナル抗体（９４ｂ）または抗ヒトＣＤ６８マウスモノクローナル抗体（クローン名：ＰＧ−Ｍ１，ダコ・ジャパン）を用い、室温で一時間反応させた。反応終了後、リン酸緩衝液で洗浄し、二次抗体反応（抗マウスＩｇＧ，ＭＡＸ−ＰＯ、ニチレイ）を行った。反応終了後、過剰量のリン酸緩衝液にて洗浄を行い、ＦＲβ陽性細胞の発色をＮＯＶＡ  ＲＥＤ（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて行った。
［マウスブレオマイシン間質性肺炎モデルにおけるＦＲβ陽性マクロファージの免疫組織学的検出］
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（日本クレア）、８〜１２週齢にイソフルラン（アボット）呼気麻酔を施し、拡大耳鏡下にて４．５Ｕｎｉｔ／ｋｇ／０．１ｍＬに調整したブレオマイシン（日本化薬）の気管内投与を行った。投与３、７、１４、２１日後にマウスを致死過剰量のイソフルランにて安楽死を施し、両肺を切除し、凍結組織標本用のコンパウンドに封埋させた。封埋後の組織は、クライオスタットにて薄切し、標本スライドグラスを作成した。得られた標本はアセトン固定後、純水にて洗浄してコンパウンドを除去した。洗浄後の標本は０．３％の過酸化水素水にて内因性のペルオキシダーを失活させた後、５％牛血清アルブミンを含む１０％正常マウス血清で次の抗体反応の前処理を行った。抗体反応には５−１０μｇ／ｍＬに調整した抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体（ＣＬ１０もしくはＣＬ５）を用い、室温で一時間反応させた。反応終了後、リン酸緩衝液で洗浄し、二次抗体反応（マウス組織用ＭＡＸ−ＰＯ、ニチレイ）を行った。反応終了後、過剰量のリン酸緩衝液にて洗浄を行い、ＦＲβ陽性細胞の発色をＮＯＶＡ  ＲＥＤ（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて行った。
［結果］
染色結果を図１に示す。図１の上図から明らかな通り、ＣＤ６８を標的としたマクロファージマーカーの局在とＦＲβの局在の大部分が重複しており、ヒト特発性間質性肺炎組織中のマクロファージの多くがＦＲβを高発現していることが分かった。
また、マウスブレオマイシン間質性肺炎モデルにおいて、図１の下図から明らかな通り、肺組織の線維化に伴ってＦＲβ発現性マクロファージが増加していることが分かる。
以上のことから、ＦＲβ発現性マクロファージの選択的除去が、間質性肺炎の治療に有効である可能性が示唆された。
実施例３
リコンビナントイムノトキシンの製造
［免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域（ＶＨ）にシステインの変異を導入］
抗ヒトＦＲβマウスモノクローナル抗体９４ｂの免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域（ＶＨ）の６３番目のアミノ酸グリシン（塩基配列ｇｇｃ）をシステイン（塩基配列ｔｇｔ）に変異させるようにデザインしたプライマーを作製し（センス：ｃａｇａｇｇｃｃｔｇａａｃａｔｔｇｔｃｔｇｇａｇｔｇｇａｔｔｇｇａａｇ（配列番号２０）、アンチセンス：ｃｔｔｃｃａａｔｃｃａｃｔｃｃａｇａｃａｃｔｇｔｔｃａｇｇｃｃｔｃｔｇ（配列番号２１））、Ｑｕｉｃｋ  ｃｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施例１で得た９４ｂのＶＨを含むプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ  ９４ｂＶＨに変異誘発処理を行った。このＰＣＲ反応は、反応液を９５℃３０秒、５５℃６０秒、６８℃４分のサイクルを１２回連続して行った。抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体ＣＬ１０の免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域（ＶＨ）へのシステイン導入も上記と同様の方法にてプライマーをデザインして行った（センス：ｇｔｃｃｇｃｃａｇｇｃｔｃｃａａｃｇａａｇｔｇｔｃｔｇｇａｇｔｇｇ  ｇｔｃｇｃ（配列番号２２）、アンチセンス：ｇｃｇａｃｃｃａｃｔｃｃａｇａｃａｃｔｔｃｇｔｔｇｇａｇｃｃｔｇｇｃｇｇａｃ（配列番号２３））。
次に、反応後のＤＮＡを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに遺伝子導入し、０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で選択培養した。選択した形質転換体のプラスミドをＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＫＩＴ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。さらに塩基配列をＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（ＡＢＩ）とＡＢＩ３１０シーケンサーにて決定し、６３番目のグリシンがシステイン（塩基配列ｔｇｔ）に変異したことを確認した。
［ｐＲＫ７９ＰＥ３８ベクターに変異を導入したＶＨを挿入］
次に、ＰＥ３８遺伝子を含むｐＲＫ７９ベクターｐＲＫ７９ＰＥ３８に、９４ｂＶＨおよびＣＬ１０ＶＨの変異を導入したＶＨの挿入を以下の方法にて行った。
変異を導入した９４ｂの５’末端部と３’末端部のアニーリングプライマーとしてｔａａｇａａｇｇａｇａｔａｔａｃａｔａｔｇｇａｇｇｔｔｃａｇｃｔｇｃａｇｃａｇｔｃ（配列番号２４）とｇｃｃｃｔｃｇｇｇａｃｃｔｃｃｇｇａａｇｃｔｔｔｔｇａｇｇａｇａｃｔｇｔｇａｇａｇｔｇｇ（配列番号２５）を、ＣＬ１０の５’末端部と３’末端部のアニーリングプライマーとしてａｔａｃａｔａｔｇｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａｇｔｃｔｇｇｇ（配列番号２６）とｔｃｃｇｇａａｇｃｔｔｔｔｇａｇｇａｇａｃａｇｔｇａｃｔｇａａｇｃ（配列番号２７）をそれぞれデザインした。アニーリングプライマーにはそれぞれ制限酵素であるＮｄｅＩがあり、この部位でのクローニングにより、ａｔｇを開始コドンとしたタンパク質の発現が可能である。また、もう片方のアニーリングプライマーにはＨｉｎｄＩＩＩ部位が挿入されており、この部位でのクローニングにより、ＶＨとＰＥ遺伝子が結合した融合タンパク質の発現が可能である。
これらのプライマーの組み合わせとｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使って変異を導入したｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−９４ｂＶＨおよびｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＣＬ１０ＶＨプラスミドのＰＣＲを行った。この反応は９４℃２０秒、５５℃３０秒、７２℃６０秒で３０サイクルＰＣＲを行い、その後７２℃５分で反応させた。次に、ＰＣＲ産物を精製し、精製産物に制限酵素ＮｄｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）とＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えて反応後、電気泳動に展開し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲルから目的の大きさのＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡに、制限酵素処理した変異導入ＶＨと同様の制限酵素で処理したｐＲＫ７９ＰＥ３８を添加し、さらにＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いてＶＨとｐＲＫ７９ＰＥ３８のライゲーション反応を行った。ライゲーション反応終了、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に遺伝子導入し、０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地にて形質転換体を選択した。選択した形質転換体のプラスミドｐＲＫ７９−ＶＨＰＥをＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＫＩＴ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。さらに塩基配列をＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（ＡＢＩ）とＡＢＩ３１０シーケンサーにて決定し、変異導入ＶＨの塩基配列がｐＲＫ７９ベクターのＰＥ３８塩基配列と連結していることを確認した。
［免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域にシステイン変異を導入］
抗ヒトＦＲβマウスモノクローナル抗体９４ｂの免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域（ＶＬ）の１２５番目のアミノ酸をシステイン（塩基配列ｔｇｔ）に変異させるようにデザインしたプライマーを作製した（センス：ｔａａｇａａｇｇａｇａｔａｔａｃａｔａｔｇｇａｃａｔｔｇｔｇａｔｇｔｃａｃａａｔｃ（配列番号２８）（このプライマーには制限酵素ＮｄｅＩ切断可能な塩基ｃａｔａｔｇを含むため、この部位でクローニングすることにより、ａｔｇを開始コドンとしたタンパク質の発現が可能である）アンチセンス：ｇｃｔｔｔｇｔｔａｇｃａｇｃｃｇａａｔｔｃｃｔａｔｔｔｇａｔｔｔｃｃａｇｃｔｔｇｇｔｇｃｃａｃａａｃｃｇａａｃｇｔ（配列番号２９）（このプライマーは１２５番目のアミノ酸をシステイン（ｔｇｔ）に変異させ、終始コドンｔａｇに続いて制限酵素ＥｃｏＲＩ切断可能な塩基ｇａａｔｔｃが来るようにデザインしてある）。同様に抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体ＣＬ１０の免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域（ＶＬ）の１２５番目のアミノ酸をシステイン（塩基配列ｔｇｔ）に変異させるようにデザインしたプライマーを作製した（ａｔａｃａｔａｔｇｇａｃａｔｔｇｔｇａｔｇｃｃｃａａｔｃｔｃｃａｔｃｃ（配列番号３０）およびｇｃｔｔｔｇｔｔａｇｃａｇｃｃｇａａｔｔｃｃｔａｔｔｔｇａｔｔｔｃｃａｇｃｔｔｇｇｔｇｃｃａｃａａｃｃｇａａｃｇｔ（配列番号３１））。
これらのプライマーの組み合わせとｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−９４ｂＶＬプラスミドのＰＣＲを行った。この反応は９４℃２０秒、５５℃３０秒、７２℃６０秒で３０サイクルＰＣＲを行い、その後７２℃５分で反応させた。次に、ＰＣＲ産物を精製し、精製産物に制限酵素ＮｄｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）とＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えて反応後、電気泳動に展開し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲルから目的の大きさのＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡに、制限酵素処理した変異導入ＶＬと同様の制限酵素で処理したｐＲＫ７９ＰＥ３８を添加し、さらにＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いてＶＨとｐＲＫ７９ＰＥ３８のライゲーション反応を行った。ライゲーション反応終了、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に遺伝子導入し、０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地にて形質転換体を選択した。選択した形質転換体のプラスミドｐＲＫ７９−ＶＬＰＥをＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＫＩＴ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。さらに塩基配列をＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（ＡＢＩ）とＡＢＩ３１０シーケンサーにて決定し、変異導入ＶＬの１２５アミノ酸がシステインに変異していることや、終始コドンｔａｇが配置されていることを確認した。
［リコンビナントタンパク質封入体の調製］
上記の変異導入ＶＨを組み込んだプラスミドｐＲＫ７９−９４ｂＶＨＰＥ、ｐＲＫ７９−ＣＬ１０ＶＨＰＥ、変異導入ＶＬを組み込んだプラスミドｐＲＫ７９−ＶＬ９４ｂ、ｐＲＫ７９−ＶＬＣＬ１０を５０ｎｇ調整し、タンパク質発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に遺伝子導入した。遺伝子が導入された大腸菌の選抜は０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地にて３７℃１５〜１８時間の培養で行った。
選択終了後の大腸菌は１０００ｍＬのスーパーブロース培地で３７℃の条件で培養し、可視吸光度６００ｎｍで１．０−１．５に到達するまで培養した。培養後、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｔｈｉｏ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を終濃度１ｍＭになるように培地に添加し、さらに９０分間３７℃で培養した。培養終了後、遠心分離にて大腸菌を回収後、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４、２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）を用いて２００ｍＬとなるまで懸濁した。懸濁終了後、卵白リゾチームを最終濃度０．２ｍｇ／ｍＬとなるように加え、室温で１時間反応させて大腸菌の破壊を行った。破壊後、２０，０００ｘｇで遠心分離を行い、沈殿を回収した。沈殿物はさらに５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４、２．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で２００ｍＬとなるまで懸濁し、卵白リゾチームを最終濃度０．２ｍｇ／ｍＬとなるように加え、室温で１時間反応させた。反応終了後、２０，０００ｘｇで遠心分離を行い、沈殿を回収した。沈殿はさらに５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４、２．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で２００ｍＬとなるまで懸濁し、十分混和させた後、２０，０００ｘｇで遠心分離を行い、沈殿を回収した。この操作を５回繰り返した後の沈殿物をリコンビナントイムノトキシン封入体とし、さらに０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０、６Ｍグアニジン塩酸塩、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で溶解させ、最終濃度１０ｍｇ／ｍＬとなるように調節した。
［リコンビナント二重鎖Ｆｖ抗ＦＲβイムノトキシンの作製］
上記で調製した９４ｂ−ＶＨＰＥと９４ｂ−ＶＬ、ＣＬ１０−ＶＨＰＥとＣＬ１０−ＶＬを混和させ、リコンビナント二重鎖Ｆｖ抗ＦＲβイムノトキシンを作製した。
まず、０．５ｍＬのＶＨＰＥ、０．２５ｍＬのＶＬを混和し、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を最終濃度１０ｍｇ／ｍＬとなるように加え、室温で４時間の還元処理を行った。処理後、７５ｍＬの０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０、０．５Ｍアルギニン、０．９ｍＭ酸化型グルタチオン、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）に溶解させた。この溶液を１０℃で４０時間放置することによって、ＶＨとＶＬを結合させた。結合終了後、分子量１０，０００カットの遠心濃縮器（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  １０、Ａｍｉｃｏｎ）で５ｍＬまで濃縮し、さらに５０ｍＬのトリス緩衝液（ｐＨ７．４、０．１Ｍ尿素、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で希釈した。この希釈液をリコンビナントイムノトキシン精製の出発物質とした。
次に、トリス緩衝液（ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で平衡化したイオン交換カラムＨｉ−Ｔｒａｐ  Ｑ（ＧＥ）に、３０ｍＬ／時間の流速で、上記出発物質を吸着させた後、トリス緩衝液（ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で洗浄した。洗浄後、吸着したリコンビナントタイプイムノトキシンの溶出をトリス緩衝液（ｐＨ７．４、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で行った。溶出サンプルはトリス緩衝液（ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で透析した後、イオン交換カラムＰＯＲＯＳ  ＨＱ（ＰＯＲＯＳ）でさらに精製した。すなわち、透析した精製物質を１０ｍＬ／分の流速で吸着させ、トリス緩衝液（ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で洗浄後、上記緩衝液に０Ｍから１．０ＭのＮａＣｌ勾配を設定することにより、リコンビナントタイプイムノトキシンの溶出を行った。精製リコンビナントタイプイムノトキシンの最終調製はＴＳＫ３００ＳＷ（Ｔｏｓｏｈ）ゲル濾過クロマトグラフィーにて行った。まず、７５％の消毒用エタノールで４８時間洗浄することによってＴＳＫ３００ＳＷカラム中のエンドトキシン除去を行った。次に日本薬局方注射用蒸留水で洗浄し、その後日本薬局方生理食塩水でＴＳＫ３００ＳＷカラムの平衡化を行った。平衡化終了後、リコンビナントタイプイムノトキシンを投与し、流速０．２５ｍＬ／分でカラムからの溶出液を採取した。採取後、０．２２μｍの濾過滅菌機で処理し、純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認後、−８０℃で保存した。
［ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度検定］
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミド電気泳動）は０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む１２％ポリアクリルアミドの平板ゲルを用い、移動相には終濃度０．１％のＳＤＳ、１３０ｍＭグリシン、２５ｍＭトリスを含む水溶液を用いた。各サンプルは終濃度０．１％のＳＤＳを含む１００ｍＭトリス緩衝液ｐＨ６．５で調整し、５分間の煮沸処理を行った。煮沸終了後、平板ゲルにサンプルを投与し、３０ｍＡの定電流で電気泳動を展開させた。展開後、０．０５％のクマシーブリリアントブルーＲ溶液（ナカライテスク）でリコンビナントタイプイムノトキシンの染色を行った。
実施例４
リコンビナントイムノトキシンによる間質性肺炎の治療効果の検証
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス、８〜１２週齢に呼気麻酔を施し、４．５Ｕｎｉｔ／ｋｇ／０．１ｍＬに調整したブレオマイシンの気管内投与を行い、間質性肺炎モデルを作製した。本実施例においては、実施例３で調製したリコンビナントイムノトキシンを使用し（イムノトキシン投与群）、また対照として、ＦＲβとの結合性が欠損している偽薬（ＰＥ３８と抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体ＣＬ１０のＶＨとの融合タンパク質）を使用した（偽薬投与群）。イムノトキシン投与群及び偽薬投与群にはそれぞれ１５個体のマウスを割り当てた。ブレオマイシン投与後３日目より１５日までの間、二日間隔で３μｇ相当のリコンビナントイムノトキシンあるいは偽薬を経鼻的に投与した。ブレオマイシン投与後の生存率を経日的に計測すると共に、投与後２１日目にマウスを安楽死させ、両肺を切除して凍結組織標本用を作製し、上記実施例２と同様にして組織化学的解析を行った。
生存率の追跡結果を図２に示す。図２の結果から明らかな通り、イムノトキシン投与群では、治療期間中は１００％の生存率を示し、また治療終了後５日目の時点で１５個体中１４個体が生存できたのに対し、偽薬投与群では、治療終了後５日目の時点で１５個体中７個体しか生存できなかった。
図３は、イムノトキシン投与群及び偽薬投与群の肺組織の免疫組織染色結果の一例を示す。図３から明らかな通り、イムノトキシン投与群ではＦＲβ発現性マクロファージが除去され（上図）、さらに組織線維化が抑制されていることが分かる（下図）。
以上の結果から、ＦＲβ発現性マクロファージの選択的除去が、間質性肺炎の治療に効果的であることが示された。
実施例５
ブレオマイシン誘発性肺線維症を有するマウスの肺における腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、ＣＣケモカインリガンド（ＣＣＬ）２及びＣＣＬ１２産生細胞の頻度に対するリコンビナントイムノトキシンの効果の検証
マクロファージにより産生されるＴＮＦ−α、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１２等のサイトカインは線維化活性を示すことが知られている。そこで、これらサイトカイン発現に対するリコンビナントイムノトキシン治療の効果を検証するために、ブレオマイシン誘発性肺線維症を有するマウスの肺において、リコンビナントイムノトキシン投与後のＴＮＦ−α、ＣＣＬ２またはＣＣＬ１２産生細胞について免疫組織化学染色を行い、陽性細胞数のカウントを行った。
ブレオマイシン誘発性肺線維症マウスモデルの作製は実施例４と同様にして行い、実施例３で調製したリコンビナントイムノトキシンを使用した（イムノトキシン投与群）。また対照として、ＦＲβとの結合性が欠損している偽薬（ＰＥ３８と抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体ＣＬ１０のＶＨとの融合タンパク質）を使用した（偽薬投与群）。イムノトキシン投与群及び偽薬投与群にはそれぞれ１０個体のマウスを割り当てた。ブレオマイシン投与後３日目より１５日までの間、二日間隔で３μｇ相当のリコンビナントイムノトキシンあるいは偽薬を経鼻的に投与した。投与後２１日目にマウスを安楽死させ、両肺を切除して凍結組織標本用を作製し、上記実施例２と同様にして組織化学的解析を行った。
具体的に免疫組織化学染色は、抗ＴＮＦ−ａヤギ抗体（Ｒ＆Ｄ社）、抗ＣＣＬ２ヤギ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）、抗ＣＣＬ１２ヤギ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）を用い、実施例２と同様の手法で行った。また、ＴＮＦ−α、ＣＣＬ２またはＣＣＬ１２産生細胞数のカウントは、ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ画像解析ソフトウェア（ニコン社製）を用いて行った。
結果を図４に示す。図４において、上図は、健康なマウス（正常）、偽薬投与群およびイムノトキシン投与群の各群におけるＴＮＦ−α産生細胞（それぞれ、パネルＡ、ＤおよびＧ）、ＣＣＬ２産生細胞（それぞれ、パネルＢ、ＥおよびＨ）およびＣＣＬ１２産生細胞（それぞれ、パネルＣ、ＦおよびＩ）を免疫組織化学的に染色した結果の一例を示す。一方、下図は、健康なマウス（正常）、偽薬投与群およびイムノトキシン投与群の各群におけるＴＮＦ−α産生細胞（パネルＪ）、ＣＣＬ２産生細胞（パネルＫ）およびＣＣＬ１２産生細胞（パネルＬ）の計数を示す。縦軸は、４００倍の顕微鏡視野１０個当たりの細胞数を示す。なお、グラフは各群の１０個体の平均値±標準誤差（ＳＥＭ）（＊は、偽薬投与群に対してＰ＜０．０５であることを示す）で表す。
図４から明らかな通り、イムノトキシン投与群ではＴＮＦ−α、ＣＣＬ２およびＣＣＬ１２産生細胞数が減少したことが分かる。
以上の結果から、本発明のリコンビナントイムノトキシンが肺線維症の治療に効果的であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明によれば、副作用のリスクが低減された間質性肺炎治療剤が提供される。本発明の間質性肺炎治療剤は、肺の線維化に関与するＦＲβ発現性マクロファージの細胞死又は細胞傷害を選択的に誘導することによって、間質性肺炎の治療効果をもたらすことができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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