(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌の培養方法であって、
タンパク質分解酵素により分解された乳清を含む培養液を調製する培養液調製工程と、
バクテリオシンを生産する乳酸菌を前記培養液に接種し、前記乳酸菌が接種された培養液のｐＨを５以上６以下に維持しながら前記乳酸菌を培養する培養工程と、
６０００Ｇ以上の遠心分離で前記乳酸菌が培養された培養液から前記乳酸菌が濃縮された濃縮菌液を分離する分離工程と、
を備える。
【請求項２】
請求項１に記載の乳酸菌の培養方法において、
前記培養工程は、前記乳酸菌が接種された培養液のｐＨを、５．２以上５．８以下に維持する。
【請求項３】
請求項１に記載の乳酸菌の培養方法において、
前記培養工程は、前記乳酸菌が接種された培養液にアルカリ溶液を加えることにより、前記乳酸菌が接種された培養液のｐＨを調節する。
【請求項４】
発酵乳の製造方法であって、
ヨーグルトミックスを生成する原料乳生成工程と、
バクテリオシンを生産する乳酸菌であるバクテリオシン生産菌を培養し、前記バクテリオシン生産菌が濃縮された濃縮菌液を生成する濃縮菌液生成工程と、
前記ヨーグルトミックスの総重量を基準として０．０１重量％以上０．１重量％以下の前記濃縮菌液を、前記ヨーグルトミックスに添加する添加工程と、
前記濃縮菌液が添加されたヨーグルトミックスを発酵させる発酵工程と、
を備え、
前記濃縮菌液生成工程は、
タンパク質分解酵素により分解された乳清を含む培養液を調製する培養液調製工程と、
前記バクテリオシン生産菌を前記培養液に接種し、前記バクテリオシン生産菌が接種された培養液のｐＨを５以上６以下に維持しながら、前記バクテリオシン生産菌を培養する培養工程と、
６０００Ｇ以上の遠心分離で前記バクテリオシン生産菌が培養された培養液から前記濃縮菌液を分離する分離工程と、
を含む。
【請求項５】
請求項４に記載の発酵乳の製造方法において、
前記ヨーグルトミックスに添加される前記濃縮菌液の量は、前記ヨーグルトミックスの総重量を基準として０．０１重量％以上０．０５重量％以下である。
【請求項６】
請求項４に記載の発酵乳の製造方法において、
前記培養工程は、前記バクテリオシン生産菌が接種された培養液のｐＨを、５．２以上５．８以下に維持する。
【請求項７】
請求項４に記載の発酵乳の製造方法において、
前記培養工程は、前記バクテリオシン生産菌が接種された培養液にアルカリ溶液を加えることにより、前記バクテリオシン生産菌が接種された培養液のｐＨを調節する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バクテリオシンを生産する乳酸菌の培養方法、およびバクテリオシンを生産する乳酸菌を含む発酵乳の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヨーグルトなどの発酵乳は、生乳、脱脂粉乳、ホエイ（乳清）タンパク質などが混合された原料乳（ヨーグルトミックス）にスターターを添加し、ヨーグルトミックスを発酵させることにより製造される。スターターには、ブルガリア菌およびサーモフィラス菌などの乳酸菌が用いられる。【０００３】
ヨーグルトミックスは、製造後に０〜１０℃の温度に冷却され、冷蔵された状態で出荷される。冷蔵中のヨーグルトには乳酸菌が生きた状態で存在しているため、ヨーグルトは、流通過程および家庭などでの保存期間に、少しずつ発酵して酸度が上昇する。この結果、ヨーグルトの風味が、賞味期間内であっても変化するという問題がある。【０００４】
また、一部の乳酸菌が、バクテリオシンと呼ばれる抗菌性のタンパク質またはペプチドを生産することが知られている。下記特許文献１〜３に示すように、バクテリオシンを生産する乳酸菌を利用して、食品の保存性を向上させることができる。【０００５】
特許文献１に係る発明では、バクテリオシンを生産するラクティス菌をヨーグルトのスターターとして利用する。ヨーグルトミックスの発酵に伴って、ラクティス菌がバクテリオシンを生産する。ラクティス菌により生産されたバクテリオシンは、ヨーグルトの酸度上昇を抑制するため、ヨーグルトの保存性を向上させることができる。【０００６】
特許文献２では、乳および乳成分を主成分とする液体培地を用いてビフィズス菌とラクティス菌とを共生培養している。共生培養後の培養液を食品の保存剤として、食品（食パン、うどんなど）に添加することにより、食品の保存性を向上させるとともに、食品に良好な風味を付与することができる。【０００７】
特許文献３には、酵母エキスなどが添加されたホエイ培地を用いて、ラクティス菌を培養し、培養後のホエイ培地からラクティス菌を除去した風味改良剤が記載されている。この風味改良剤を用いることにより、魚介類の生臭さを消したり、食品に旨味などを付与したりすることができる。【０００８】
【特許文献１】特開平４−２１１３６０号公報
【特許文献２】特開平８−１８７０７１号公報
【特許文献３】特開２００４−２８３１０９号公報
【０００９】
上述したように、特許文献１に係る発明は、バクテリオシンを生産するラクティス菌をスターターとして使用する。このため、ラクティス菌をスターターとして使用しないヨーグルトの酸度の上昇を抑えることが困難である。【００１０】
また、流通時および保存時のヨーグルトの酸度の上昇を抑えることを目的として、特許文献２に係る食品保存剤、または特許文献３に係る風味改良剤を添加剤としてヨーグルトミックスに添加することが考えられる。しかし、添加剤が一定の割合でヨーグルトミックスに添加された場合、添加剤の原料である酵母エキスなどにより、ヨーグルト本来の風味が損なわれるおそれがある。したがって、バクテリオシンを生産する乳酸菌の培養物をヨーグルトミックスに添加する場合、培養物の添加量を極力少なくすることが望ましい。
【発明の開示】
【００１１】
本発明の乳酸菌の培養方法は、タンパク質分解酵素により分解された乳清を含む培養液を調製する培養液調製工程と、バクテリオシンを生産する乳酸菌を前記培養液に接種し、前記乳酸菌が接種された培養液のｐＨを５以上６以下に維持しながら前記乳酸菌を培養する培養工程と、を備える。
【００１２】
本発明の乳酸菌の培養方法は、従来の培養方法により得られた培養液と比べて数十倍程度の高い抗菌活性を示す培養液を得ることができる。つまり、本発明の乳酸菌の培養方法は、バクテリオシンを効率よく生産することができる。
【００１３】
本発明の発酵乳の製造方法は、ヨーグルトミックスを生成する原料乳生成工程と、バクテリオシンを生産する乳酸菌であるバクテリオシン生産菌を培養し、前記バクテリオシン生産菌が濃縮された濃縮菌液を生成する濃縮菌液生成工程と、前記ヨーグルトミックスの総重量を基準として０．０１重量％以上０．１重量％以下の前記濃縮菌液を、前記ヨーグルトミックスに添加する添加工程と、前記濃縮菌液が添加されたヨーグルトミックスを発酵させる発酵工程と、を備え、前記濃縮菌液生成工程は、タンパク質分解酵素により分解された乳清を含む培養液を調製する培養液調製工程と、前記バクテリオシン生産菌を前記培養液に接種し、前記バクテリオシン生産菌が接種された培養液のｐＨを５以上６以下に維持しながら、前記バクテリオシン生産菌を培養する培養工程と、前記バクテリオシン生産菌が培養された培養液から前記濃縮菌液を分離する分離工程と、を含む。
【００１４】
本発明に係る発酵乳の製造方法は、添加剤としてヨーグルトミックスに添加される濃縮菌液の添加量を削減することができる。このため、ヨーグルト本来の風味を損なうことなく、ヨーグルトの酸度の上昇を防ぐことができる。
【００１５】
それゆえに、この発明の目的は、乳酸菌がバクテリオシンを効率よく生産することができる乳酸菌の培養方法と、発酵乳の酸度の上昇を抑えることができる発酵乳の製造方法を提供することである。
【００１６】
この発明の目的、特徴、局面、および利点は、以下の詳細な説明と添付図面によって、明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１で用いるホエイ分解培地の組成を示す図である。
【図２】実施例１におけるガセリ菌の培養結果を示す図である。
【図３】実施例２で用いるホエイ分解培地の組成を示す図である。
【図４】実施例２におけるガセリ菌の培養結果を示す図である。
【図５】遠心分離時の遠心加速度と濃縮菌液の抗菌活性との対応関係を示すグラフである。
【図６】実施例４で用いるヨーグルトミックスの組成を示す図である。
【図７】実施例４に係るヨーグルトを５℃で保存したときの酸度の経時変化を示すグラフである。
【図８】実施例４に係るヨーグルトを１０℃で保存したときの酸度の経時変化を示すグラフである。
【図９】実施例５で用いるヨーグルトミックスの組成を示す図である。
【図１０】実施例５に係るヨーグルトを５℃で保存したときの酸度の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について説明する。本実施の形態における乳酸菌の培養方法は、培地のｐＨが一定の範囲（ｐＨが５以上６以下）内となるように、アルカリ溶液を培地に加えながら乳酸菌を培養する。これにより、生菌数あたりの抗菌活性が非常に高い乳酸菌の培養物を得ることができる。
【００１９】
本実施の形態に係る乳酸菌の培養方法において、培養の対象となる乳酸菌は、バクテリオシンを生産することができる乳酸菌（以下、「バクテリオシン生産菌」と呼ぶ）である。ガセリ菌などのラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌、ラクティス菌などのラクトコッカス（Lactococcus）属に属する乳酸菌などを、本実施の形態に係る乳酸菌の培養方法を用いて培養することができる。具体的には、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９（Lactobacillus  gasseri  OLL2959，NITE BP-224，特許微生物寄託センター）、ラクティス菌ＯＬＳ３３１１（Lactococcus lactis subsp. lactis OLS3311，FERM
BP-10966，特許生物寄託センター）、クレモリス菌ＯＬＳ３３１２（Lactococcus lactis
subsp. cremoris OLS3312，FERM BP-10967，特許生物寄託センター）などを例示できる。
【００２０】
本実施の形態に係る乳酸菌の培養方法について具体的に説明する。まず、ホエイ（乳清）を含むホエイ水溶液に、プロテアーゼなどのタンパク質分解酵素を添加して、ホエイ水溶液中のホエイタンパク質を分解させる。タンパク質分解酵素の添加前に、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）などのホエイタンパク質をホエイ水溶液に添加してもよい。
【００２１】
次に、ビール酵母エキスなどの酵母エキスをホエイ水溶液に添加して、バクテリオシン生産菌の培養に用いるホエイ分解培地を調製する。ホエイ分解培地に、窒素源として、ホエイタンパク質の他に、肉エキス、魚肉エキスなどを添加してもよい。また、ホエイ分解培地に、硫酸鉄、硫酸マグネシウムなどの無機栄養物、およびモノオレイン酸デカグリセリン、モノオレイン酸ソルビタンなどの乳化剤を添加してもよい。ホエイ分解培地に、アスコルビン酸ナトリウムなどを添加してもよい。
【００２２】
ホエイ分解培地にバクテリオシン生産菌を接種し、バクテリオシン生産菌を培養する。好ましくは、ホエイ分解培地のｐＨが６以下になるまでバクテリオシン生産菌を培養させた後に、バクテリオシン生産菌を培養中のホエイ分解培地のｐＨを５以上６以下の範囲に調整しながら、バクテリオシン生産菌を培養する。より好ましくは、ホエイ分解培地のｐＨが５.８以下になるまでバクテリオシン生産菌を培養させた後に、ホエイ分解培地のｐＨを５．２以上５．８以下の範囲に調整しながら、バクテリオシン生産菌を培養する。さらに好ましくは、ホエイ分解培地のｐＨを５．５以上５．８以下の範囲に調整しながら、バクテリオシン生産菌を培養する。ｐＨの調整は、ホエイ分解培地にアルカリ溶液を添加することにより行うことができる。アルカリ溶液として、炭酸カリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液などを用いることができる。
【００２３】
バクテリオシン生産菌の培養後に、バクテリオシン生産菌を培養したホエイ分解培地（培養液）からバクテリオシン生産菌が濃縮された濃縮菌液を分離する。濃縮菌液の分離には、遠心分離または膜分離を用いることができる。遠心分離により濃縮菌液を分離する場合、遠心加速度は６０００（Ｇ）以上であることが好ましい。
【００２４】
このようにして得られたバクテリオシン生産菌の濃縮菌液は、培養中にホエイ分解培地のｐＨが調整されることなく培養されたバクテリオシン生産菌の濃縮菌液に比べ、数十倍以上の高い抗菌活性を有する。すなわち、ホエイ分解培地のｐＨを５〜６に維持しながらバクテリオシン生産菌を培養することにより、濃縮菌液の抗菌活性を制御しながら、抗菌活性の高い濃縮菌液を効率よく得ることができる。
【００２５】
また、本実施の形態に係る濃縮菌液を食品用保存剤として食品に添加する場合、本実施の形態に係る濃縮菌液の食品への添加量を従来の食品用保存剤に比べて少なくすることができる。つまり、本実施の形態に係る濃縮菌液は、食品用保存剤として食品に添加されることにより、食品本来の風味が変化することを抑制しつつ、食品の保存性を向上させることができる。
【００２６】
次に、本実施の形態に係る発酵乳（ヨーグルト）の製造方法について具体的に説明する。まず、原料乳であるヨーグルトミックスを調製する。ヨーグルトミックスは、たとえば、生乳に脱脂粉乳、ホエイタンパク質、および水などを混合することにより調製される。なお、ヨーグルトミックスに砂糖、果肉、果汁などを添加してもよい。
【００２７】
ヨーグルトミックスを従来と同様に均質化および殺菌した後で、ヨーグルトミックスに、スターターと、上記乳酸菌の培養方法で得たバクテリオシン生産菌やその濃縮菌液とを接種する。バクテリオシン生産菌の濃縮菌液の接種量は、好ましくは、ヨーグルトミックスの総重量を基準として、０．０１重量％以上０．１重量％以下である。さらに好ましくは、バクテリオシン生産菌の濃縮菌液の接種量は、０．０１重量％以上０．０５重量％以下である。
【００２８】
なお、スターターとして用いられる乳酸菌は、バクテリオシン生産菌と同一の乳酸菌であってもよいし、異なる乳酸菌であってもよい。また、ヨーグルトミックスを均質化する工程や殺菌工程の前に、濃縮菌液をヨーグルトミックスに添加してもよい。
【００２９】
バクテリオシン生産菌やその濃縮菌液が接種されたヨーグルトミックスを発酵させることにより、ヨーグルトが製造される。発酵条件は、従来と同じ条件でよい。本実施の形態で説明した方法により製造されたヨーグルトは、濃縮菌液が添加されないヨーグルトと比べて、製造直後からの酸度の上昇が抑制される。これは、濃縮菌液に含まれる高濃度のバクテリオシンが、ヨーグルト中のブルガリア菌の活動を抑制するためである。このように、本実施の形態で説明した方法により製造されたヨーグルトは、製造直後の良好な風味を従来と比べて賞味期限（２週間程度）内にわたって安定的に維持できる。
【００３０】
また、本実施の形態に係る発酵乳の製造方法では、食品用保存剤として用いられる濃縮菌液の使用量を、従来の食品用保存剤の使用量の１０分の１程度に抑えることができる。したがって、ヨーグルト本来の風味が、濃縮菌液の添加により損なわれることを防止できる。
【実施例】
【００３１】
以下、図面を参照しつつ、本発明に係る乳酸菌の培養方法の実施例について説明する。【００３２】
｛実施例１｝
図１は、実施例１で使用するホエイ分解培地の組成を示す図である。まず、実施例１で使用するホエイ分解培地を調製した。具体的には、ホエイ分解培地の総重量を基準として、８．７０重量％のホエイパウダー（明治乳業社製）と、１．５０重量％のホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ８０、ＮＺＭＰ社製）と、８８．８０重量％の水とを混合して、ホエイ水溶液を調製する。０．１０重量％のタンパク質分解酵素（プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ、天野エンザイム社製）をホエイ水溶液に添加して、ホエイ水溶液中のホエイタンパク質を分解させた。【００３３】
ホエイタンパク質が分解されたホエイ水溶液に、０．２０重量％のビール酵母エキス（アサヒビール社製）と、０．５０重量％の魚肉エキス（マルハニチロ食品社製）と、０．１０重量％のアスコルビン酸ナトリウムと、０．０５重量％の硫酸鉄（ＦｅＳＯ４）と、０．０５重量％の乳化剤（サンソフトＱ−１７Ｓ（モノオレイン酸デカグリセリン）、太陽化学社製）とを添加して、ホエイ分解培地を調製した。【００３４】
次に、生菌数が２〜４×１０７ｃｆｕ／ｍｌとなるように、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９（Lactobacillus  gasseri  OLL2959，NITE BP-224，特許微生物寄託センター）をホエイ分解培地に接種した。ホエイ分解培地のｐＨが５．５になるまでガセリ菌ＯＬＬ２９５９を培養させた後で、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９を中和培養した。具体的には、ホエイ分解培地のｐＨが常に５．５以上となるように炭酸カリウム水溶液（４０重量％）をホエイ分解培地に添加し、攪拌しながら、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９を３４℃、２２時間の条件で培養した（中和培養）。なお、中和培養は、炭酸ガスを吹き込んだ嫌気条件の下で行われている。中和培養の後に、ホエイ分解培地（培養液）中のガセリ菌ＯＬＬ２９５９の生菌数を、ＢＣＰ培地を用いた混釈培養法により測定した。ガセリ菌ＯＬＬ２９５９の生菌数は、１．８１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌであった。【００３５】
中和培養後のホエイ分解培地（培養液）を遠心分離（遠心加速度：６０００Ｇ）することにより、実施例１に係るガセリ菌ＯＬＬ２９５９の濃縮菌液を得た。実施例１に係る濃縮菌液の抗菌活性を、後述する方法を用いて測定した。この結果、実施例１に係る濃縮菌液の１ｍｌあたりの抗菌活性は、７２４００ＡＵ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｕｎｉｔ）であった。実施例１に係る濃縮菌液の１×１０９ｃｆｕあたりの抗菌活性は、約４０００ＡＵであった。
【００３６】
なお、実施例１に係るホエイ分解培地を用いて、ｐＨの条件を変更しながらガセリ菌ＯＬＬ２９５９を中和培養した。この結果、ｐＨが５．２〜５．８の条件で中和培養して得られた濃縮菌液の抗菌活性が、実施例１に係る濃縮菌液の抗菌活性と同様の値となった。また、ｐＨが５〜６の条件で中和培養して得られた濃縮菌液の抗菌活性は、実施例１に係る濃縮菌液の抗菌活性よりもやや低い値となった。【００３７】
中和培養の効果を確認するために、実施例１と同様の手順でガセリ菌ＯＬＬ２９５９を接種したホエイ分解培地を、３７℃、２０時間の条件で静置して、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９を静置培養した（比較例１）。静置培養したホエイ分解培地（培養液）を遠心分離（重力加速度：６０００Ｇ）して、比較例１に係る濃縮菌液を得た。【００３８】
静置培養後のホエイ分解培地（培養液）において、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９の生菌数は、２．６３×１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。また、比較例１に係る濃縮菌液の１ｍｌあたりの抗菌活性は、１００ＡＵ未満であった。比較例１に係る濃縮菌液の１×１０９ｃｆｕあたりの抗菌活性は、約４０ＡＵ未満であった。【００３９】
図２に、実施例１および比較例１における、培養後のガセリ菌ＯＬＬ２９５９の生菌数および濃縮菌液の抗菌活性の測定結果を示す。上述したように、１×１０９ｃｆｕあたりの抗菌活性は、実施例１に係る濃縮菌液で４０００ＡＵであった。比較例１に係る濃縮菌液で約４０ＡＵ未満であった。すなわち、中和培養により得られた濃縮菌液（実施例１）の生菌数あたりの抗菌活性は、静置培養により得られた濃縮菌液（比較例１）の生菌数あたりの抗菌活性の１００倍程度となった。【００４０】
また、中和培養後のホエイ分解培地（培養液）中のガセリ菌ＯＬＬ２９５９の生菌数は、静置培養後のホエイ分解培地（培養液）中の生菌数より一桁程度で大きい。このことから、中和培養時において、ホエイ分解培地のｐＨを５．５以上に維持することにより、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９の活動が活発となったため、バクテリオシンが効率よく生産されたと推測される。【００４１】
このように、ホエイ分解培地の培養中のｐＨを５〜６の範囲に調整しながら、バクテリオシン生産菌を中和培養することにより、濃縮菌液の抗菌活性を非常に高い状態に制御することができた。【００４２】
｛実施例２｝
図３は、実施例２で使用するホエイ分解培地の組成を示す図である。実施例２で使用するホエイ分解培地を調製するために、実施例１と同様の手順で、ホエイタンパク質が分解されたホエイ水溶液を調製した。【００４３】
ホエイタンパク質が分解されたホエイ水溶液に、０．２０重量％のビール酵母エキス（アサヒビール社製）と、０．５０重量％の魚肉エキス（マルハニチロ食品社製）と、０．１０重量％のアスコルビン酸ナトリウムと、０．０５重量％の硫酸鉄（ＦｅＳＯ４）と、０．０５重量％の乳化剤（サンソフト８１Ｓ（モノオレイン酸ソルビタン）、太陽化学社製）とを添加して、ホエイ分解培地を調製した。実施例２では、使用する乳化剤が実施例１のものと異なる。【００４４】
次に、生菌数が２〜４×１０７ｃｆｕ／ｍｌとなるように、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９をホエイ分解培地に接種した。実施例１と同様に、ホエイ分解培地のｐＨが５．５になるまでガセリ菌ＯＬＬ２９５９を培養させた後で、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９を中和培養した。具体的には、ホエイ分解培地のｐＨが常に５．５以上となるように、炭酸カリウム水溶液（４０重量％）を添加しながら、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９を３４℃、２２時間の条件で中和培養した。その後、ホエイ分解培地（培養液）中のガセリ菌ＯＬＬ２９５９の生菌数を、実施例１と同一の方法を用いて測定した。ガセリ菌ＯＬＬ２９５９の生菌数は、１．８４×１０１０ｃｆｕ／ｍｌであった。【００４５】
中和培養後のホエイ分解培地（培養液）を遠心分離（遠心加速度：６０００Ｇ）して、実施例２に係る濃縮菌液を分離した。実施例２に係る濃縮菌液の１ｍｌあたりの抗菌活性は、５１２００ＡＵであった。実施例２に係る濃縮菌液の１×１０９ｃｆｕあたりの抗菌活性は、約２８００ＡＵであった。抗菌活性の測定には、実施例１と同一の方法（後述）を使用した。
【００４６】
なお、実施例２に係るホエイ分解培地を用いて、ｐＨの条件を変更しながらガセリ菌ＯＬＬ２９５９を中和培養した。この結果、ｐＨが５．２〜５．８の条件で中和培養して得られた濃縮菌液の抗菌活性が、実施例２に係る濃縮菌液の抗菌活性と同様の値となった。また、ｐＨが５〜６の条件で中和培養して得られた濃縮菌液の抗菌活性は、実施例２に係る濃縮菌液の抗菌活性よりも、やや低い値となった。【００４７】
中和培養の効果を確認するために、実施例２と同様の手順でガセリ菌ＯＬＬ２９５９を接種したホエイ分解培地を、３７℃、２０時間の条件で静置培養した（比較例２）。静置培養したホエイ分解培地（培養液）を遠心分離（遠心加速度：６０００Ｇ）して、比較例２に係る濃縮菌液を分離した。
【００４８】
静置培養後のホエイ分解培地（培養液）において、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９の生菌数は、２．６３×１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。また、比較例２に係る濃縮菌液の１ｍｌあたりの抗菌活性は、１００ＡＵ未満であり、１×１０９ｃｆｕあたりの抗菌活性は、約４０ＡＵ未満であった。【００４９】
図４に、実施例２および比較例２における、培養後のガセリ菌ＯＬＬ２９５９の生菌数、および濃縮菌液の抗菌活性の測定結果を示す。上述したように、１×１０９ｃｆｕあたりの抗菌活性は、実施例２に係る濃縮菌液で２８００ＡＵであった。比較例２に係る濃縮菌液で約４０ＡＵ未満であった。すなわち、中和培養により得られた濃縮菌液（実施例２）の生菌数あたりの抗菌活性は、静置培養により得られた濃縮菌液（比較例２）の生菌数あたりの抗菌活性の７０倍以上となった。【００５０】
また、中和培養後のガセリ菌ＯＬＬ２９５９の生菌数は、静置培養後のガセリ菌ＯＬＬ２９５９の生菌数より一桁程度で大きい。実施例２においても、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９の活動が活発となり、バクテリオシンが効率よく生産されたと推測される。【００５１】
このように、実施例２の条件でガセリ菌ＯＬＬ２９５９を中和培養することにより、濃縮菌液の抗菌活性を非常に高い状態に制御することができた。また、実施例１、２に係る濃縮菌液の抗菌活性は、比較例１、２に係る濃縮菌液の抗菌活性の数十倍〜数百倍となっているため、ホエイ分解培地に使用できる乳化剤は、特に限定されないことがわかる。【００５２】
｛抗菌活性の測定方法｝
次に、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９の濃縮菌液の抗菌活性の測定方法について、実施例１に係る濃縮菌液を例にして説明する。実施例２、および比較例１、２に係る濃縮菌液の抗菌活性も、同じ方法により測定している。【００５３】
市販のＭＲＳ培地（ベクトン・ディッキンソン社製）に、ＭＲＳ培地を基準として０．１％（ｖ／ｖ）の指標菌を添加することにより、試験培地を調製した。指標菌には、ブルガリア菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）ＡＴＣＣ１１８４２（基準株）を用いた。【００５４】
凍結保存された実施例１に係る濃縮菌液を熱水浴中に５分間保持した上で、実施例１に係る濃縮菌液の１％（ｖ／ｖ）水溶液を調製した。濃縮菌液の水溶液を２倍ずつ段階的に希釈して、希釈率の段数の異なる複数の濃縮菌液の希釈液を得た。希釈率の段数は、８〜１２段である。これにより、濃縮菌液の水溶液が２８〜２１２倍に希釈された希釈液を調製した。各段数の希釈液を試験培地にそれぞれ添加し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）を用いて、各段数の希釈液が添加された試験培地を３７℃、２４時間の条件で嫌気培養した。【００５５】
嫌気培養の後に、指標菌が生育しない希釈率の最高段数（ｎ）を確認した。そして、希釈率の最高段数（ｎ）と濃縮菌液の水溶液の濃度（０．０１：１％）とに基づいて、実施例１に係る濃縮菌液の抗菌活性（ＡＵ）を求めた。抗菌活性は、以下の式に基づいて求めることができる。
抗菌活性（ＡＵ）＝希釈率の最高段数（ｎ）／濃縮菌液の水溶液の濃度（０．０１）【００５６】
｛実施例３｝
実施例３では、中和培養されたガセリ菌の濃縮菌液の遠心分離条件を検討した。重力加速度を様々な値に設定して、実施例１に係る中和培養後のホエイ分解培地（培養液）を遠心分離した。そして、遠心分離の条件が異なる各濃縮菌液の抗菌活性を求めた。【００５７】
図５は、遠心加速度と濃縮菌液の抗菌活性との関係を示すグラフである。図５に示すように、遠心分離時の遠心加速度の増加とともに、濃縮菌液の抗菌活性が増加している。そして、遠心分離時の遠心加速度が６０００Ｇ以上のときに、抗菌活性が一定（約７２４００ＡＵ）となった。このことから、６０００Ｇ以上の遠心加速度で濃縮菌液を遠心分離することにより、抗菌活性の高い濃縮菌液を効率的に得られることが明らかになった。
【００５８】
以下、本発明に係る発酵乳の製造方法の実施例として、実施例１に係る濃縮菌液を用いたヨーグルトの製造について説明する。【００５９】
｛実施例４｝
図６は、実施例３で使用した３種類のヨーグルトミックスの組成を示す図である。まず、ヨーグルトミックスの総重量を基準として、８３．９０重量％の牛乳および１．５１重量％の脱脂粉乳（ともに明治乳業社製）と、０．８０重量％のホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ３４、ドモ社製）と、水とを混合して、配合Ａ〜Ｃのヨーグルトミックスを調製した。水の配合比は、図６に示すように、配合Ａ〜Ｃでそれぞれ異なる。【００６０】
配合Ａ〜Ｃのヨーグルトミックスの均質化および殺菌を従来と同様に行い、配合Ａ〜Ｃのヨーグルトミックスを約４０℃に冷却した。冷却後、２．００重量％の乳酸菌スターターを配合Ａ〜Ｃのヨーグルトミックスに接種した。乳酸菌スターターには、明治ブルガリアヨーグルト（明治乳業社製）から分離した乳酸菌を用いた。【００６１】
配合Ｂのヨーグルトミックスに、０．０５重量％の実施例１に係る濃縮菌液を接種した。配合Ｃのヨーグルトミックスに、０．１０重量％の実施例１に係る濃縮菌液を接種した。配合Ａのヨーグルトミックスには、実施例１に係る濃縮菌液を接種しなかった。【００６２】
乳酸濃度が約０．７５％になるまで、配合Ａ〜Ｃのヨーグルトミックスを４０℃の温度で発酵させて、ヨーグルトを製造した。そして、配合Ａ〜Ｃのヨーグルトを５℃および１０℃の温度でそれぞれ冷蔵保存し、ヨーグルトの標準的な賞味期限（製造日から２週間程度）内にわたって、配合Ａ〜Ｃのヨーグルト中の乳酸濃度を測定した。【００６３】
図７は、配合Ａ〜Ｃのヨーグルトを５℃で保存したときの乳酸濃度の経時変化を示す図である。図８は、配合Ａ〜Ｃのヨーグルトを１０℃で保存したときの乳酸濃度の経時変化を示す図である。【００６４】
図７および図８に示すように、保存温度に関係なく、配合Ｂ、Ｃのヨーグルトの乳酸濃度が、配合Ａの乳酸濃度より低くなっている。つまり、配合Ｂ、Ｃのヨーグルトは、実施例１に係る濃縮菌液が接種されることにより、冷蔵状態での発酵が抑制され、ヨーグルト本来の風味および品質を維持できていることが明らかになった。【００６５】
配合Ｃのヨーグルトの乳酸濃度が配合Ｂのヨーグルトの乳酸濃度よりもやや低いことから、濃縮菌液の接種量が多いほど、乳酸濃度の上昇が抑制される傾向にあることがわかる。しかし、濃縮菌液の接種量を増加させるほど、ヨーグルト本来の風味が損なわれるおそれがある。配合Ｂ、Ｃのヨーグルトの乳酸濃度の差はわずかであるため、ヨーグルトの乳酸濃度の上昇を抑えるのであれば、濃縮菌液の接種量は０．０１〜０．０５重量％でよい。【００６６】
なお、配合Ｂ、Ｃのヨーグルトミックスにおいて、実施例１に係る濃縮菌液の接種をヨーグルトミックスの均質化および殺菌の前に行っても、ヨーグルトの乳酸濃度の上昇を抑制する効果に違いはなかった。このことから、濃縮菌液とともに接種されるバクテリオシン生産菌は、死菌でも生菌でもよく、濃縮菌液の抗菌活性に影響を与えないことが明らかとなった。【００６７】
｛実施例５｝
図９は、実施例５で使用した２種類のヨーグルトミックスの組成を示す図である。実施例５に係るヨーグルトミックスには、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）に代えて、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）が添加され、砂糖が新たに添加されている。【００６８】
まず、ヨーグルトミックスの総重量を基準として、８４．２０重量％の牛乳および１．７６重量％の脱脂粉乳（ともに明治乳業社製）と、０．２０重量％のホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ、ニュージーランド・ミルク・プロダクツ社製）と、４．５０重量％の砂糖と、水とを混合して、配合Ｄ、Ｅのヨーグルトミックスを調製した。水の配合比は、図９に示すように、配合Ｄ、Ｅで異なる。【００６９】
配合Ｄ、Ｅのヨーグルトミックスの均質化および殺菌を従来と同様に行い、配合Ｄ、Ｅのヨーグルトミックスを約４０℃に冷却した。冷却後、３．００重量％の乳酸菌スターターを、配合Ｄ、Ｅのヨーグルトミックスに接種した。乳酸菌スターターとして、明治十勝ヨーグルト（明治乳業社製）から分離した乳酸菌を用いた。さらに、配合Ｅのヨーグルトミックスに、０．０５重量％の実施例１に係る濃縮菌液を接種した。配合Ｄのヨーグルトミックスには、実施例１に係る濃縮菌液を接種しなかった。【００７０】
なお、実施例５では、０．１０重量％の濃縮菌液が接種されたヨーグルトミックスを用いなかった。これは、上記実施例４で、濃縮菌液の接種量が０．０５重量％であっても、十分な酸度抑制効果が得られることが明らかになったためである。【００７１】
乳酸濃度が約０．７５％になるまで、配合Ｄ、Ｅのヨーグルトミックスを４０℃の温度で発酵させて、ヨーグルトを製造した。配合Ｄ、Ｅのヨーグルトを、５℃の温度で冷蔵保存し、配合Ｄ、Ｅのヨーグルトの乳酸濃度をヨーグルトの標準的な賞味期限（製造日から約２週間）内にわたって測定した。【００７２】
図１０は、配合Ｄ、Ｅのヨーグルトの乳酸濃度の経時変化を示す図である。図１０に示すように、配合Ｅのヨーグルトの乳酸濃度が、配合Ｄのヨーグルトの乳酸濃度より低くなっている。このことから、実施例１に係る濃縮菌液を加糖ヨーグルトの製造に用いても、加糖ヨーグルトの乳酸濃度の上昇を抑制できることが明らかになった。【００７３】
なお、配合Ｅのヨーグルトミックスにおいて、実施例１に係る濃縮菌液の接種をヨーグルトミックスの均質化および殺菌の前に行っても、ヨーグルトの乳酸濃度の上昇を抑制する効果に違いはなかった。【００７４】
実施例４、５において、実際例１に係る濃縮菌液の食品用保存剤としての接種量は、従来の１０分の１以下である。つまり、実施例４、５で説明した発酵乳の製造方法は、実施例１に係る濃縮菌液の接種に伴うヨーグルト本来の風味の変化を抑えるとともに、ヨーグルト本来の風味を賞味期限内にわたって維持することができる。また、実施例２に係る濃縮菌液を用いて実施例４、５と同様の試験を行った。この結果、実施例２に係る濃縮菌液を用いたヨーグルトについても、実施例１に係る濃縮菌液と同様に、ヨーグルトの酸度の変化を抑制することができた。【００７５】
この発明を添付図面に示す実施態様について説明したが、この発明は、その詳細な説明の記載をもって制約しようとするものではなく、特許請求の範囲に記載する範囲において広く構成される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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