(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
浮遊細胞及び接着細胞を含む哺乳類細胞で発現させ、細胞外に分泌させようとする、天然において糖鎖修飾されておらず細胞外に放出されないタンパク質をコードするポリヌクレオチドに、NYSNNYSNISNNYSGSで表され、該配列において３、７、１０及び１４番目のS（セリン）がT（トレオニン）であってもよいAsn-X-(Thr/Ser)（Xはプロリンを除くアミノ酸）で表される配列からなるN型-糖鎖付加配列を含む人工的に設計されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを連結し、さらに、該連結したポリヌクレオチドをマウスインターロイキン４のシグナル配列（配列番号１）、マウスインターロイキン5のシグナル配列（配列番号３）、マウスインターロイキン6のシグナル配列（配列番号５）、マウスインターロイキン12のシグナル配列（配列番号７）、マウスインターロイキン13のシグナル配列（配列番号９）、マウスインターロイキン31のシグナル配列（配列番号１１）、ヒトインターロイキン13（配列番号１３）のシグナル配列及びヒトインターロイキン31のシグナル配列（配列番号１５）からなる群から選択される小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチドの下流に連結し、得られたポリヌクレオチドを宿主哺乳類細胞に導入し、該宿主哺乳類細胞を培養し、前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させ細胞外に放出させ、細胞培養上清よりタンパク質を回収することを含む、小胞体移行性シグナル配列及び糖鎖付加配列により、天然において糖鎖修飾されておらず細胞外に放出されないタンパク質の細胞外への放出を促進させる、天然において糖鎖修飾されておらず細胞外に放出されないタンパク質の製造方法。
【請求項２】
小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドの下流に、NYSNNYSNISNNYSGSで表され、該配列において３、７、１０及び１４番目のS（セリン）がT（トレオニン）であってもよいAsn-X-(Thr/Ser)（Xはプロリンを除くアミノ酸）で表される配列からなるN型-糖鎖付加配列を含む人工的に設計されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含み、前記小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチドの下流でありかつ該N型-糖鎖付加配列を含む人工的に設計されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの上流若しくは下流に、発現させようとする天然において糖鎖修飾されておらず細胞外に放出されない目的タンパク質をコードする外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位を含む、浮遊細胞及び接着細胞を含む宿主哺乳類細胞内で組換えタンパク質を製造するために用いる発現ベクターのマルチクローニング部位に、哺乳類細胞で発現させ、細胞外に分泌させようとするタンパク質をコードするポリヌクレオチドを連結し、得られた発現ベクターを宿主哺乳類細胞に導入し、該宿主哺乳類細胞を培養し、前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させ細胞外に放出させ、細胞培養上清より目的タンパク質を回収することを含む、小胞体移行性シグナル配列及び糖鎖付加配列により天然において糖鎖修飾されておらず細胞外に放出されないタンパク質の細胞外への放出を促進させる、天然において糖鎖修飾されておらず細胞外に放出されないタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞で発現させようとするタンパク質をコードするポリヌクレオチドにシグナル配列及び糖鎖付加配列を連結させ、該タンパク質を真核細胞又は動物で発現させ、細胞外に放出させる方法、並びにその方法に用いるポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子より翻訳されるタンパク質は生体における機能において重要な役割を担っている。遺伝子組換え技術の発展により、目的遺伝子の発現方法及びその精製法が開発されてきた。
【０００３】
哺乳類のタンパク質の発現は、本来発現している細胞において発現させるのが望ましいが、その細胞が用いられないときは、タンパク質の折りたたみ等を考慮すると系統的に本来の細胞に近い細胞が望ましい。このため、ほ乳類の組換えタンパク質の製造には、真核細胞を用いるのが好ましい。しかしながら、多くの組換えタンパク質は細胞内で生産され、細胞内に蓄積する。このようなタンパク質を製造するためには、複雑な精製工程が必要になるため、タンパク質の製造に時間がかかり、また大量に製造することも困難であった。
【０００４】
このため、酵母を用いた組換えタンパク質の製造において、細胞内で発現させる組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列にシグナル配列を連結させて、発現させた組換えタンパク質を細胞外に放出させる方法やそのためのベクターが種々開発されていた（特許文献１〜３を参照）。
【０００５】
しかしながら、従来法では、例えば比較的高分子量のタンパク質の細胞外への放出効率は必ずしも高くなく、組換えタンパク質をより効率的に細胞外へ放出する系の開発が望まれていた。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第5010003号公報
【特許文献２】米国特許第4588684号公報
【特許文献３】国際公開第WO00/09718号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、組換えタンパク質を真核細胞宿主で発現させ、細胞外に放出させることにより、組換えタンパク質を効率的に利用する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、組換えタンパク質を宿主細胞内で発現させ、細胞外に放出させる方法において、従来の技術よりも効率的にタンパク質を製造する方法について鋭意検討を行った。本発明者らは、組換えタンパク質を宿主細胞内で発現させる際に、製造しようとする目的の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流に小胞体移行性のシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを融合して発現させ、さらに糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチドを連結させるなどの工夫により、糖鎖修飾させることにより、目的のタンパク質を効率的に細胞外に放出（分泌）させることができることを見出した。
【０００９】
この際、小胞体移行性である、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン12、インターロイキン13又はインターロイキン31のシグナル配列として例示されるシグナル配列と例示したインターロイキンの糖鎖付加配列を利用することにより、効率的に目的のタンパク質を宿主細胞外に放出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
また、前記の小胞体移行性シグナル配列と人工的に設計した糖鎖付加配列を融合させることにより発現させたタンパク質の細胞外への放出は小胞体移行性シグナル配列の種類にはあまり依存せず、糖鎖修飾の存在に大きく依存し、一方で放出されるペプチド配列の構造には大きくは依存していないことを見出した。
【００１１】
本発明において、小胞体移行性シグナル配列と糖鎖付加配列を融合したタンパク質として用いることにより、その下流に融合タンパク質として発現させた目的タンパク質は、接着細胞である繊維芽細胞Cos-1細胞、及び浮遊細胞で上皮細胞であるFreestyle293-F細胞によって発現させたところ、糖鎖付加配列の挿入により糖鎖が付加され、効率的に細胞外に目的タンパク質が放出されることが証明された。また、この効率の良いタンパク質放出は、繊維芽細胞及び上皮細胞で観察され、また、浮遊細胞及び接着細胞で観察されたことより、細胞種に依存しないことが示された。
【００１２】
変異体の解析により、糖鎖が付加されないとタンパク質は効率的に細胞外に放出されないことが判明し、また糖鎖分解酵素による解析で糖鎖付加配列を導入したタンパク質ではN型糖鎖付加の修飾がされていることが証明された。
【００１３】
また、人工的に設計した糖鎖付加配列によっても、タンパク質の放出が促進されたことより、N-型糖鎖の存在自体の重要性が認められ、一次構造よりも糖鎖修飾の重要性が高いことが証明された。
【００１４】
２種類の蛍光タンパク質、及び全長では放出されないサイトカインであるマウスインターロイキン33及び核タンパク質であるヒトp53タンパク質が本発明の方法で培養上清中に効率的に放出されたことより、本発明の有効性が証明された。
【００１５】
小胞体移行性シグナル配列の比較では、タンパク質放出に関しては多少の差こそあれ優劣はつけがたく、糖鎖付加による影響に比べて小さく、小胞体移行性シグナル配列の存在こそが重要で、余り種類は問わない結果となった。しかし、マウスインターロイキン33のシグナル配列では、ほとんど細胞外放出が行われなかったので、シグナル配列の選択の不必要性を示唆するものではない。
【００１６】
比較的大きいヒトの癌抑制遺伝子産物であるヒトp53タンパク質が活性を持って放出されたことより、本発明の手法は活性型のタンパク質の生産についても有用性が認められた。
【００１７】
また、低タンパク質培地中へのタンパク質の放出により、タンパク質精製が非常に容易にできたことより、生産のみならず精製を含めたタンパク質生産に有用であることが確認された。
【００１８】
すなわち、本発明の態様は以下のとおりである。
[１]  小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドの下流に、タンパク質にAsn-X-(Thr/Ser)（Xはプロリンを除くアミノ酸）で表される配列からなるN型-糖鎖付加配列が付加された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、宿主真核細胞内で組換えタンパク質を製造するために用いるポリヌクレオチドであって、前記タンパク質を宿主真核細胞外に放出させるためのポリヌクレオチド。
[２]  小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドの下流に、タンパク質にO型-糖鎖付加配列が付加された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、宿主真核細胞内で組換えタンパク質を製造するために用いるポリヌクレオチドであって、前記タンパク質を宿主真核細胞外に放出させるためのポリヌクレオチド。
【００１９】
[３]  小胞体移行性シグナル配列が、マウスインターロイキン４のシグナル配列（配列番号１）、マウスインターロイキン5のシグナル配列（配列番号３）、マウスインターロイキン6のシグナル配列（配列番号５）、マウスインターロイキン12のシグナル配列（配列番号７）、マウスインターロイキン13のシグナル配列（配列番号９）、マウスインターロイキン31のシグナル配列（配列番号１１）、ヒトインターロイキン13（配列番号１３）のシグナル配列及びヒトインターロイキン31のシグナル配列（配列番号１５）からなる群から選択される、[１]又は[２]のポリヌクレオチド。
[４]  [１]〜[３]のいずれかのポリヌクレオチドを含む、組換えタンパク質を発現し宿主真核細胞外に放出させるための発現ベクター。
[５]  [４]の発現ベクターを含む宿主真核細胞。
【００２０】
[６]  小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドの下流に、Asn-X-(Thr/Ser)（Xはプロリンを除くアミノ酸）で表される配列からなるN型-糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチドを含み、前記小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチドの下流でありかつ該N型-糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチドの上流若しくは下流に、発現させようとする目的タンパク質をコードする外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位を含む、宿主真核細胞内で組換えタンパク質を製造するために用いる発現ベクターであって、前記目的タンパク質を宿主真核細胞外に放出させるための発現ベクター。
【００２１】
[７]  小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドの下流に、O型-糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチドを含み、前記小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチドの下流でありかつ該O型-糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチドの上流若しくは下流に、発現させようとする目的タンパク質をコードする外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位を含む、宿主真核細胞内で組換えタンパク質を製造するために用いる発現ベクターであって、前記目的タンパク質を宿主細胞外に放出させるための発現ベクター。
[８]  [１]〜[３]のいずれかのポリヌクレオチドを宿主真核細胞に導入し、該宿主真核細胞を培養し、前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させ細胞外に放出させ、細胞培養上清より目的タンパク質を回収することを含む、タンパク質の製造方法。
【００２２】
[９]  [６]又は[７]の発現ベクターを宿主真核細胞に導入し、該宿主真核細胞を培養し、前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させ細胞外に放出させ、細胞培養上清より目的タンパク質を回収することを含む、タンパク質の製造方法。
[１０]  [８]又は[９]の方法により製造されたタンパク質。
[１１]  タンパク質にAsn-X-(Thr/Ser)（Xはプロリンを除くアミノ酸）で表される配列からなるN型-糖鎖付加配列が付加され、該N型-糖鎖付加配列にN型-糖鎖が結合し糖鎖修飾された[１０]のタンパク質。
[１２]  天然において糖鎖修飾されないタンパク質にAsn-X-(Thr/Ser)（Xはプロリンを除くアミノ酸）で表される配列からなるN型-糖鎖付加配列が付加され、該N型-糖鎖付加配列にN型-糖鎖が結合した、[１１]の糖鎖修飾されたタンパク質。
【００２３】
[１３]  タンパク質にO型-糖鎖付加配列が付加され、該O型-糖鎖付加配列にO型-糖鎖が結合し糖鎖修飾された[１０]のタンパク質。
[１４]  天然において糖鎖修飾されないタンパク質にO型-糖鎖付加配列が付加され、該O型-糖鎖付加配列にO型-糖鎖が結合した、[１３]の糖鎖修飾されたタンパク質。
[１５]  [１]〜[３]のいずれかのポリヌクレオチドを非ヒト動物に導入し、該動物体内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させ、該タンパク質に対する抗体を製造させることを含む、DNA免疫による抗体の製造方法。
[１６]  小胞体移行性シグナル配列とAsn-X-(Thr/Ser)（Xはプロリンを除くアミノ酸）で表される配列からなる糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチド及び、小胞体移行性シグナル配列を融合させても効率的に宿主外へ放出されない目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞内で組換えタンパク質を製造するために用いるポリヌクレオチドであって、前記目的タンパク質を糖鎖修飾に依存して宿主細胞外に放出させるポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【００２４】
小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、Asn-X-(Thr/Ser)（Xはプロリンを除くアミノ酸）で表される配列からなるN型-糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチド若しくはO型-糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチド並びに目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主真核細胞に導入し、該細胞を培養し、タンパク質を発現させた場合、糖鎖修飾された目的タンパク質は効率的に宿主細胞外に放出される。この方法により、本来細胞外に放出されない導入タンパク質を発現させ、細胞外に放出させることにより、目的のタンパク質を効率的に精製することができる。また、本来放出されるタンパク質においても、糖鎖付加に留意して設計することにより、細胞外への放出効率を向上させることができ、その後の精製等を効率的に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明におけるシグナル配列は、小胞体に存在するGTP結合性の調節タンパク質であるシグナル認識粒子（signal recognition particle: SRP)タンパク質に結合する、15〜30アミノ酸よりなり、さらに主にN末端にある５〜10個の連続する疎水性アミノ酸よりなる疎水性コアを有する小胞体移行性のシグナル配列である。
【００２６】
疎水性アミノ酸には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンが含まれる。シグナル配列中の疎水性アミノ酸は同じアミノ酸であってもよいし、異なるアミノ酸であってもよい。
【００２７】
リボソームにおけるタンパク質の翻訳の際、最初にシグナル部分が合成され、SRPがシグナル配列を認識する。その後、翻訳が一時的に中止され、SRPはリボソームと結合し、この複合体が小胞体膜上のSRP受容体に結合する。シグナル配列がSRPから解離し、小胞体膜にある小孔を貫通して小胞体内に移動すると翻訳が再開され、タンパク質が小胞体内に入る。そしてシグナル配列が小胞体内のペプチダーゼによって切除され、タンパク質がゴルジ体に輸送され、細胞外に放出される。
【００２８】
本発明のシグナル配列は、小胞体移行性シグナルとしての作用を有する配列ならば限定されないが、好ましくはシグナルペプチド認識機構によって、認識され切断されるペプチド配列である。このようなシグナル配列として、例えば、インターロイキン4、インターロイキン5、インターロイキン6、インターロイキン12、インターロイキン13、若しくはインターロイキン31のシグナル配列が挙げられる。マウスインターロイキン4、マウスインターロイキン5、マウスインターロイキン6、マウスインターロイキン12、マウスインターロイキン13及びマウスインターロイキン31のシグナル配列をコードする塩基配列を、それぞれ配列番号１、３、５、７、９及び１１に表し、これらのシグナル配列のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２、４、６、８、１０及び１２に表す。また、ヒトインターロイキン13、及びヒトインターロイキン31のシグナル配列をコードする塩基配列を、それぞれ配列番号１３及び１５に表し、これらのシグナル配列のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１４及び１６に表す。
【００２９】
シグナル配列を有するタンパク質のシグナル配列を利用する場合、シグナル配列部分をコードするポリヌクレオチドのみを目的のタンパク質の上流に連結させてもよいし、シグナル配列を有する該タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、シグナル配列部分を含む連続する断片をコードするポリヌクレオチドを目的のタンパク質の上流に連結させてもよい。
【００３０】
N型-糖鎖付加配列（N型-糖鎖修飾配列）は、アミノ酸配列、Asn-X-(Thr/Ser)で表されるN型-糖鎖付加配列である。ここで、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Thr/SerはThr又はSerを示す。N-結合型糖鎖がAsn-X-(Thr/Ser)（NXT/S)のAsnにN-結合型で結合する。該配列の具体例として、NYS、NYT、NAS、NAT、NTS、NTT等が挙げられる。糖鎖付加配列が存在するとタンパク質が小胞体に移行後ゴルジ体において糖鎖が付加され、非調節性に細胞外へ放出される。
【００３１】
本発明において、N型-糖鎖付加配列のみならず、O型-糖鎖付加配列を用いることもできる。EGFPタンパク質と融合させ発現させた実験において、細胞外放出タンパク質はO型-糖鎖修飾を示す電気泳動上で分子量の増加が示されており、これはN型のみならずO型-糖鎖修飾も同様の細胞外放出効率を上昇させる活性を有することを示す。
【００３２】
本発明において、組換えタンパク質として産生させ細胞外に放出させる目的のタンパク質は限定されず、あらゆるタンパク質を本発明の方法で生産することができる。
【００３３】
好ましくは、細胞外に放出されないタンパク質が列挙できる。このようなタンパク質として、例えば天然において本来糖鎖修飾されないタンパク質が挙げられる。さらに、細胞質タンパク質、核タンパク質等細胞外に放出されないタンパク質が挙げられる。さらに、シグナル配列を変換し糖鎖配列が付加されたことにより、非調節的に放出される細胞外分泌タンパク質を挙げることができる。このようなタンパク質として、例えばマウスIL-33が挙げられる。
【００３４】
糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチドを、細胞外に放出させる目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに連結させて用いる場合、糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチドは、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流（5'側）に連結しても、下流(3'側）に連結してもよい。この場合、小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドの下流に、タンパク質にO型-糖鎖付加配列が付加された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００３５】
配列番号１７にマウスインターロイキン31のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドの下流(3'側）にN型-糖鎖修飾配列を連結したポリヌクレオチドの配列（GSS-artificial)を示す。該ポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列(GSSアミノ酸）を配列番号１８に示す。配列番号１８に表されるアミノ酸において糖鎖付加配列が小胞体移行性シグナル配列の下流に存在している。しかしながら、この糖鎖付加配列は人工的に設計されたものであり、天然には存在しない。N型-糖鎖が付加され得るアミノ酸は４箇所存在する。この配列の下流に蛍光タンパク質を融合させたところ、糖鎖が付加され細胞外に放出された。従って、糖鎖付加配列は天然に存在する糖鎖付加配列に限定されない。
【００３６】
また、天然において小胞体移行性シグナル配列及び糖鎖付加配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、そのタンパク質の遺伝子が含むシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを利用することもできる。この場合、そのタンパク質の遺伝子のシグナル配列からタンパク質をコードするORF(open reading frame）の少なくとも糖鎖付加配列までの連続するポリヌクレオチドを製造しようとする目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流(5'側）に連結して用いることができる。また、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに天然のタンパク質のシグナル配列を含む全長配列をコードするポリヌクレオチドを連結してもよい。
【００３７】
このようなシグナル配列及び糖鎖付加配列を含む天然のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、インターロイキン13及びインターロイキン31をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。インターロイキン13及びインターロイキン31が由来する動物種は限定されないが、ヒト、マウス由来のものが好適に用い得る。
【００３８】
例えば、配列番号１９に表されるシグナル配列を含むマウスインターロイキン31をコードするポリヌクレオチド、配列番号２１に表されるシグナル配列を含むヒトインターロイキン31をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。それぞれのポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列を配列番号２０及び配列番号２２に示す。
【００３９】
これらの塩基配列と相補的な配列からなる塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドであって、配列番号１９又は２１に表される塩基配列からなるポリヌクレオチドがコードするタンパク質の活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドも用いることができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１XSSC、0.1％  SDS、37℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「0.5XSSC、0.1％  SDS、42℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「0.2XSSC、0.1％  SDS、65℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほど高い相同性を有するDNAの単離、検出を期待しうる。ただし、上記のSSC、SDS及び温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、ポリヌクレオチド濃度、ポリヌクレオチドの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。また、配列番号１９又は２１に表される塩基配列とＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて該プログラムのデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される80％以上、好ましくは約90％以上、より好ましくは約95％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドも用いることができる。
【００４０】
なお、マウスインターロイキン33に例示されるように、発現させようとする目的タンパク質が天然において糖鎖付加配列を有する場合、小胞体移行性シグナル配列と融合させることにより、この糖鎖付加配列に糖鎖が付加され、細胞外放出が促進される。このような状況では、この天然において存在する糖鎖付加配列を利用することができるので、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流又は下流に糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチドを連結する必要は必ずしもない。マウスインターロイキン33の塩基配列を配列番号２３に、そのアミノ酸配列を配列番号２４に示す。この場合も、このポリヌクレオチドは本発明の「小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドの下流に、タンパク質にO型-糖鎖付加配列若しくはAsp-X-(Thr/Ser)（Xはプロリンを除くアミノ酸）で表される配列からなるN型-糖鎖付加配列が付加された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド」に包含される。また、配列番号２３に表される塩基配列と相補的な配列からなる塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドであって、配列番号２３に表される塩基配列からなるポリヌクレオチドがコードするタンパク質の活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドも用いることができる。さらに、配列番号２３に表される塩基配列とＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて該プログラムのデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される80％以上、好ましくは約90％以上、より好ましくは約95％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドも用いることができる。
【００４１】
本発明は、目的のタンパク質を宿主細胞で発現させ、該宿主細胞外に放出（分泌）させるためのポリヌクレオチドを包含し、該ポリヌクレオチドは、小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、O型-糖鎖付加配列若しくはAsp-X-(Thr/Ser)（Xはプロリンを除くアミノ酸）で表される配列からなるN型-糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチド並びに目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。該ポリヌクレオチドは小胞体移行性シグナルをコードするポリヌクレオチドの下流に、糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチド及び目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチドは、目的のタンパク質に糖鎖付加配列が付加された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチドの下流に存在する。糖鎖付加配列は、複数連結してもよい。すなわち、本発明のタンパク質を真核細胞で発現させ細胞外に放出させるために用いるポリヌクレオチドは、例えば、小胞体移行性シグナルをコードするポリヌクレオチド-｛Asn-X-(Thr/Ser)｝N（Nは、１〜５の整数）をコードするポリヌクレオチド-目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる。また、小胞体移行性シグナルをコードするポリヌクレオチド、糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチド及び目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの間には、他のヌクレオチド配列が含まれていてもよい。
【００４２】
実際、赤色蛍光タンパク質(Dsred)及び緑色蛍光タンパク質(EGFP)を用いた実験において、NYTNNYSNISNNYSの配列(配列番号９６）で示される人工的に設計された１４アミノ酸からなるN型-糖鎖付加配列において、小胞体移行性シグナル配列の下流に発現させると糖鎖が付加され、またそれに伴い生産されたタンパク質の細胞外放出が誘起されることが示された。
【００４３】
このポリヌクレオチドの上流には、プロモーターが作動可能に連結されていてもよい。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば宿主が酵母である場合は、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター、HSV-TKプロモーターなどが挙げられる。また、薬剤（インデューサー）の添加等の特定の条件下で誘導的に作用する誘導性のプロモーターを用いてもよい。
【００４４】
本発明の真核細胞において目的組換えタンパク質を発現し細胞外に分泌させるためのポリヌクレオチドは、さらに、当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加部位、選択マーカー、SV40複製オリジン等を含んでいてもよい。
【００４５】
本発明は、小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドの下流に、タンパク質にO型-糖鎖付加配列若しくはAsn-X-(Thr/Ser)（Xはプロリンを除くアミノ酸）で表される配列からなるN型-糖鎖付加配列が付加された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びにプロモーター等を含む、宿主細胞内で組換えタンパク質を製造するために用いる発現カセットをも包含する。
【００４６】
本発明は、小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドの下流に、タンパク質にAsn-X-(Thr/Ser)（Xはプロリンを除くアミノ酸）で表される配列からなるN型-糖鎖付加配列が付加された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主真核細胞に導入し、該宿主真核細胞を培養し、前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させ細胞外に放出させ、細胞培養上清より目的タンパク質を回収することを含む、タンパク質の製造方法を包含する。
【００４７】
本発明の真核細胞において目的組換えタンパク質を発現し細胞外に放出させるためのポリヌクレオチドは、ベクターに組込み宿主真核細胞に導入すればよい。
【００４８】
本発明の方法で用いる真核細胞としては、酵母、昆虫細胞、鳥類細胞、両生類細胞、爬虫類細胞、哺乳類細胞が挙げられる。
【００４９】
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12、スキゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）NCYC1913、NCYC2036、ピキア パストリス（Pichia pastoris）等が挙げられる。
【００５０】
昆虫細胞としては、Sf21などの夜盗蛾細胞等が挙げられる。
両生類細胞としては、アフリカツメガエル卵細胞等が挙げられる。
【００５１】
哺乳類細胞としては、例えば、HEK293細胞、FreeStyle293細胞、FL細胞などのヒト細胞； COS-7、Veroなどのサル細胞；CHO、dhfr遺伝子欠損CHO細胞などのチャイニーズハムスター細胞；マウスＬ細胞、マウスAtT-20細胞、マウスミエローマ細胞などのマウス細胞；ラットGH3細胞などのラット細胞等が挙げられる。
【００５２】
発現ベクターとしては、pKA1、pCDM8、pSVK3、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBVベクター、pRS、pYE82などが例示できる。また、pIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-N1、pEGFP-C１などを発現ベクターとして用いれば、Hisタグ、FLAGタグ、GFPなど各種タグを付加した融合タンパク質として発現させることもできる。
【００５３】
これらの細胞の中でも、低タンパク質濃度条件下で培養し得る細胞を用いた場合、培養上清からの精製が容易に行えるので望ましい。低タンパク質濃度条件下で培養し得る細胞として、例えば、FreeStyle293細胞が挙げられる。
【００５４】
ベクターは、小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、O型-糖鎖付加配列若しくはAsn-X-(Thr/Ser)（Xはプロリンを除くアミノ酸）で表される配列からなるN型-糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞内で組換えタンパク質を製造するために用いるポリヌクレオチドを含む。本発明は、このような組換えタンパク質を発現し宿主細胞外に放出させるための発現ベクター及び該ベクターを導入した宿主細胞を包含する。
【００５５】
さらに、目的のタンパク質を連結させる部位として、マルチクローニング部位を含ませておきその部位に目的のタンパク質をコードする外来遺伝子を組込んでもよい。この場合、本発明のベクターは、小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチドの下流にO型-糖鎖付加配列若しくはAsn-X-(Thr/Ser)（Xはプロリンを除くアミノ酸）で表される配列からなるN型-糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチド並びに目的タンパク質をコードする外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位を含む宿主細胞内で組換えタンパク質を製造するために用いる発現ベクターである。
【００５６】
酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法[Becker, D.M. et al.：Methods. Enzymol., 194： 182(1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75： 1929(1978)]、酢酸リチウム法[Itoh, H.：J. Bacteriol., 153：163(1983)]等が挙げられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００５７】
本発明の真核細胞において目的組換えタンパク質を発現し細胞外に分泌させるためのポリヌクレオチドを含むベクターを導入した宿主真核細胞を培養することにより、目的のタンパク質を発現させ、細胞外すなわち培養上清中に放出させることができる。培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００５８】
培養終了後、公知の方法で細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。細胞内からの抽出と比べ、放出されたタンパク質は不純物若しくは夾雑物も少なく、また抽出時における界面活性剤の使用も不必要であり、この点からも活性タンパク質として回収する上で有効である。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００５９】
産生されたタンパク質から糖鎖を糖鎖分解酵素を用いて取り除くこともできる。しかしながら、糖鎖付加により新たな活性を発現タンパク質に付与することもあり、この場合は、糖鎖付加配列は有用な糖鎖タンパク質の調製にも有効である。
【００６０】
本発明は、本発明の方法により製造されたタンパク質を包含する。該タンパク質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。従って、修飾されたタンパク質も本発明のタンパク質の範囲に含まれる。このような翻訳後の修飾としては、N末端メチオニンの脱離、N末端アセチル化、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミストレイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。
【００６１】
本発明の小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドの下流に、タンパク質にO型-糖鎖付加配列若しくはAsn-X-(Thr/Ser)（Xはプロリンを除くアミノ酸）で表される配列からなるN型-糖鎖付加配列が付加された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むタンパク質発現ベクターは、DNA免疫に利用することができる。具体的には、真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、発現タンパク質が血中に放出されるため、免疫が生じ、目的タンパク質に反応する血清を採取することにより作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。免疫した動物の脾臓から採取したB細胞とミエローマを融合させてハイブリドーマを作成すれば、モノクローナル抗体を産出することができる。
【００６２】
また細胞外に導入タンパク質が放出されるため、遺伝子治療及びDNAワクチンにも使用できる。さらに、細胞外分泌タンパク質を生産する細胞を樹立することにより、細胞治療にも応用できる。また細胞内に存在し通常は自己と認識されているタンパク質を細胞外に放出させて免疫原性を誘導し、自己免疫疾患モデルマウスの作成に用いることも出来る。
【実施例】
【００６３】
次に実施例を示しこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、DNAの組換えに関する基本的な操作及び酵素反応は、文献(“Molecular Cloning, Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)に従った。制限酵素及び各種修飾酵素は特に記載のない場合には、Invitrogen社製のものを用いた。各酵素反応の緩衝液組成及び反応条件は付属の説明書に従った。
【００６４】
方法
（１）発現ベクターの構築
N末端にKozak配列及びEcoRIサイト、C末端にXhoIサイトを配置したcDNAを作製するため、プライマー配列（配列番号２５及び配列番号２６）を用いて、Balb/Cマウスの脾臓細胞のcDNAをテンプレートとして、Phusion PCR kit（Finnzyme社、フィンランド）の使用説明書に基づいて、PCRを行った。96℃2分+（98℃15秒、58℃15秒、72℃１分）×35+72℃１分の条件で行った。PCRについて以下特に記載しない場合は、前述の条件を用いた。
【００６５】
得られたPCRフラグメント（574b.p.）をATP（Invitrogen社）存在下、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（Invitrogen社）によりリン酸化し、クローニングベクターpBluescript2SK+のEcoRVサイトに平滑末端の形でクローニングを行い、GenebankのクローンXM_132344における当該領域と一致する配列番号２７で表される配列を含むクローンを得た。
【００６６】
マウスIL-31のC末端にEGFPタンパク質及びヒスチジンタグと融合させるため、このプラスミドをテンプレートとし、N末端にKozak配列及びEcoRIサイトを配置し、C末端側の終了コドンをXhoIサイトに変更する配列を持ったプライマー配列（配列番号２５及び配列番号２８）を用いて、PCRを行ない、pBluescript2Sk+のEcoRVサイトにサブクローニングを行い、変異が無く全長のcDNAを持つクローン(mIL31-fus/pBSK2+)を得た。
【００６７】
同様にマウスIL-4、5、6、12及び13をC末端にEGFPタンパク質及びヒスチジンタグと融合させるため、N末端にKozak配列及びEcoRIサイトを配置し、C末端側の終了コドンをBamHIサイトに変更する配列を持ったプライマーを用いてBalb/Cマウスの脾臓細胞のcDNAをテンプレートとして、PCRを行ない、mIL-31の時と同様にpBluescript2SK+のEcoRVサイトにサブクローニングを行い、変異が無く全長のcDNAを持つクローン(mIL-x-fus/pBSK2+(X=4,5,6,12,13))を得た。マウスIL-4には配列番号２９及び３０で表されるプライマーを、IL-5には配列番号３１及び３２で表されるプライマーを、IL-6には配列番号３３及び３４で表されるプライマーを、IL-12には配列番号３５及び３６で表されるプライマーを、IL-13には配列番号３７及び３８で表されるプライマーをそれぞれ用いた。
【００６８】
クラゲ蛍光タンパク質（EGFP）を用いて解析を行うため、哺乳類発現ベクターpcDNA3.1-MH-A+(Invitrogen社)のHindIIIからXhoIサイトの間にプライマー配列（配列番号３９及び配列番号４０）をアニールしたマルチプルクローニングサイトの変更を行ない、HindIII、EcoRI、BamHI及びXhoIの位置を変更したプラスミドpcDNA3.1-modified+ を得た。
【００６９】
緑色蛍光タンパク質（EGFP）発現ベクターであるpEGFP-C1(Clonetech社)をテンプレートとして、配列番号４１及び４２で表されるプライマーを用いてPCRを行い、EGFPのcDNAを増幅した。得られたフラグメントをpBluescript2SK+のEcoRVサイトにサブクローニングを行い、PCR及びオリゴ合成中に変異の入らなかったクローンを選択した。このプラスミドを制限酵素BamHIとSalIで切断し、切り出されたフラグメントをプラスミドpcDNA3.1-modified+のBamHIからXhoIサイトの間にサブクローニングを行い、EGFP発現ベクターEGFP-H/pcDNA3.1ベクターを得た。
【００７０】
この発現ベクターはCMVプロモーターの下流に以下のポリヌクレオチド配列（配列番号４３）を持ち、配列番号４４のタンパク質（EGFP-H)を発現する。
この変更により、XhoIサイトはライゲーションにより、新しい位置に移動している。
【００７１】
この作成したベクター（EGFP-H/pcDNA3.1）のEcoRIとBamHIの間に、mIL-X-fus/pBSK2+ （X=4,5,6,12,13）をEcoRIとBamHIで切断したフラグメントを挿入し、マウス全長インターロイキンとEGFPとヒスチジンタグの融合タンパク質を発現するベクター（mIL-X-EGFPH/pcDNA3.1）（X=4,5,6,12,13）を得た。
【００７２】
mIL-4-EGFPH/pcDNA3.1発現ベクターは配列番号４５で表されるタンパク質（mIL-4-EGFPH)を発現させる。mIL-5-EGFPH/pcDNA3.1発現ベクターは配列番号４６で表されるタンパク質(mIL-5-EGFPH)を発現させる。mIL-6-EGFPH/pcDNA3.1発現ベクターは配列番号４７で表されるタンパク質(mIL-6-EGFPH)を発現させる。mIL-12-EGFPH/pcDNA3.1発現ベクターは配列番号４８で表されるタンパク質(mIL-12-EGFPH)を発現させる。mIL-13-EGFPH/pcDNA3.1発現ベクターは配列番号４９で表されるタンパク質(mIL-13-EGFPH)を発現させる。
【００７３】
同様にmIL31-fus/pBSK2+をEcoRIとXhoIで切断し、得られたフラグメントをこの作成したベクター（EGFP-MH/pcDNA3.1-MH-A+）のEcoRIとXhoIの間に導入し、マウス全長インターロイキン31とEGFPとヒスチジンタグの融合タンパク質を発現するベクター（mIL-31-EGFPH/pcDNA3.1）を得た。
【００７４】
mIL-31-EGFPH/pcDNA3.1発現ベクターは配列番号５０で表されるタンパク質(mIL-31-EGFPH)を発現させる。
【００７５】
マウスインターロイキン31の細胞外分泌に必要な領域を決定するため、ベクター（mIL-31-EGFPH/pcDNA3.1）の改変を行った。mIL-31-EGFPH/pcDNA3.1をテンプレートとして、発現ベクターのCMVプロモーター領域内に存在する配列を持つプライマー（配列番号５１）と以下に示すプライマーによりmIL31の一部領域をPCRにより増幅し、得られたフラグメントをEcoRIとBamHIにより切断し、EGFPH/pcDNA3.1ベクターのEcoRIとBamHIの間に導入し、各々の変異体を作成した。
【００７６】
用いたプライマーの配列と得られた変異体発現ベクターの関係は以下のとおりであった。配列番号５２で表されるプライマー及び配列番号５１で表されるプライマーよりSS-EGFPH/pcDNA3.1が、配列番号５３で表されるプライマー及び配列番号５１で表されるプライマーよりΔ-EGFPH/pcDNA3.1が、配列番号５４で表されるプライマー及び配列番号５１で表されるプライマーよりGSS-EGFPH/pcDNA3.1が、配列番号５５で表されるプライマー及び配列番号５１で表されるプライマーよりGSS(DD)-EGFPH/pcDNA3.1が作成された。
【００７７】
次にシグナルシーケンスと人工的な糖鎖修飾サイトを構築するため、mIL-31-EGFPH/pcDNA3.1をテンプレートとしてプライマー（配列番号５１及び配列番号５６）を用いてPCRを行い、シグナルシーケンスを含むフラグメントを得た。同時に合成オリゴDNA（配列番号５７）をテンプレートとして、プライマー（配列番号５８及び配列番号５９）を用いてPCRを行い、人工的な糖鎖修飾サイトを持つフラグメントを作成した。各々のフラグメントを精製し等量混合し、このフラグメントをテンプレートとして、プライマー（配列番号５１及び配列番号５９）を用いてPCRを行い、PCRによって２つのフラグメントを結合させ、増幅することによりcDNAフラグメントを作成した。精製後EcoRIとBamHIにより切断し、EGFPH/pcDNA3.1ベクターのEcoRIとBamHIの間に導入し、シグナルシーケンスと人工的な糖鎖修飾サイトを持つ発現ベクターSS-Art-EGFPH/pcDNA3.1を作成した。SS-EGFPH/pcDNA3.1は配列番号６０で表される、Δ-EGFPH/pcDNA3.1は配列番号６１で表される、GSS-EGFPH/pcDNA3.1は配列番号６２で表される、GSS(DD)-EGFPH pcDNA3.1は配列番号６３で表される、SS-Art-EGFPH/pcDNA3.1は配列番号６４で表されるタンパク質を各々発現させる。
【００７８】
ヒト末梢単核球のcDNAをテンプレートとして、プライマー（配列番号６５及び配列番号６６）を用いてPCRを行い、C末端にXhoIサイトを配置した、ヒトp53タンパク質をコードするcDNAを増幅した。得られたフラグメントを、リン酸化を行い、pBluescript 2 SK+のEcoRVサイトに平滑末端によりクローニングを行った。PCRによる変異、また、プライマー合成中の変異の無いクローンを選択し、BamHI及びXhoIで切断し、pcDNA3.1-myc-His-A+のBamHI及びXhoIの間にサブクローニングし、p53発現ベクターp53H/pcDNA3.1を得た。p53H/pcDNA3.1ベクターは配列番号６７で表されるタンパク質（p53タンパク質）を発現させる。
【００７９】
h-p53-his/pcDNA3.1-MH-A+ベクターをBamHI及びXbaIで切断し、得られたフラグメントをSS-EGFPH/pcDNA3.1又はGSS-EGFPH/pcDNA3.1のBamHI及びXbaIサイトの間に導入し、SS-EGFPH/pcDNA3.1からSS-p53H/pcDNA3.1を、GSS-EGFPH/pcDNA3.1からGSS-p53H/pcDNA3.1を得た。SS-p53H/pcDNA3.1は配列番号６８で表されるタンパク質（ss-p53Hタンパク質）を、GSS-p53H/pcDNA3.1は配列番号６９で表されるタンパク質(GSS-p53Hタンパク質）をそれぞれ発現させる。
【００８０】
マウスインターロイキン33の発現ベクター
マウス脾臓のcDNAをテンプレートとして、プライマー（配列番号７０及び７１）を用いてPCRを行い、C末端にXhoIサイトを配置した、マウスインターロイキン33(mIL-33)をコードするcDNAを増幅した。得られたフラグメントを、リン酸化を行い、pBluescript 2 SK+のEcoRVサイトに平滑末端によりクローニングを行った。PCRによる変異、また、プライマー合成中の変異の無いクローンを選択し、BamHI及びXhoIで切断し、pcDNA3.1-myc-His-A+のBamHI及びXhoIの間にサブクローニングし、mIL-33発現ベクターmIL-33H/pcDNA3.1を得た。
【００８１】
このベクターをテンプレートとしてプライマー（配列番号７１及び７２）を用いてPCRを行い、mIL-33の成熟した部分をコードするcDNAフラグメントを増幅した。得られたフラグメントを、リン酸化を行い、pBluescript 2 SK+のEcoRVサイトに平滑末端によりクローニングを行い、PCRによる変異及びプライマー合成中の変異の無いクローンを選択し、BamHI及びXhoIで切断しSS-p53H/pcDNA3.1のBamHI及びXhoIの間にサブクローニングし、mIL31のシグナル配列の下流に成熟型mIL-33を配置した発現ベクターSS-mIL-33H/pcDNA3.1を得た。
【００８２】
mIL-33H/pcDNA3.1は配列番号７３で表されるタンパク質（mIL-33タンパク質）を、SS-mIL-33H/pcDNA3.1は配列番号７４で表されるタンパク質(SS-mIL-33Hタンパク質）をそれぞれ発現させる。
【００８３】
細胞培養
HEK-293及びCos-1細胞はDulbecco's modified Eagle’s medium（DMEM）(Gibco-Invitrogen社)、10％牛胎児血清、(Gibco-Invitrogen) (Hyclone, Logan, UT,USA)及びペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco-Invitrogen)の培地を用い、37℃５％二酸化炭素環境下で細胞培養を行った。
【００８４】
FreeStyle293-T（FS-293T）(Invitrogen社)細胞はFreeStyle medium(Invitrogen社)の培地を用い、Invitrogen社のマニュアルに従って37℃８％二酸化炭素存在下でロータリーシェーカーにより振盪培養を行った。
【００８５】
各種発現プラスミドはDH5α-FTに形質転換を行い、NucleoBond Xtra Midiプラスミド精製キット（Macherey-Nagel社Duren、ドイツ）の操作手引書に従って精製を行った。またトランスフェクションはHEK-293及びCos-1細胞はLipofectamine2000(Invitrogen社)を、FS293-T細胞は293fectin(Invitrogen社)を用いて操作手引書に従い、行った。この際、血清を用いる際はLow immunogloblin fetal bovine serum (Invitrogen社)を替わりに用い、ウエスタンブロットにおけるイムノグロブリンの非特異的検出を防いだ。
【００８６】
トランスフェクションの後、３日後に細胞上清を取り、2000ｇで５分間遠心を行い、細胞上清とした。HEK-293及びCos-1細胞は上清を取り除いた後、培地と同量のPBSで２回洗浄し、培地と同量の0.5％SDS含有PBSで細胞を溶解し、100℃で５分過熱処理を行った。FreeStyle-293Tの場合は細胞を遠心法によりPBSバッファーで洗浄し、培地と同量の0.5％SDS含有PBSで細胞を溶解し、100℃で５分過熱処理を行った。
(PBS: 137 mMNaCl, 8.1 mMNa2HPO4, 2.68 mM KCl and 1.47 mM KH2PO4, pH7.4)
【００８７】
ウエスタンブロット
細胞上清と細胞分画抽出液をToyobo社のCanGetSignalキット（富山、日本）のプロトコルに従って、Hybond-P(PVDF)メンブラン(Amersham)を用いてウエスタンブロットを行った。１次抗体にはAnti-His-tag抗体（PM002、MBL  日本）を用い、２次抗体にはAnti-rabbit-IgG-HRPコンジュゲート抗体（Cat.NA934V  GE healthcare社  UK）を用い、Amersham社（Oakville, Ontario, Canada）ECL plus検出キットのプロトコルに従って、Hyperfilm-ECL（Amersham社）に感光させ検出を行った。
【００８８】
得られた画像はBio-rad社の画像読取装置Chem Doc XRSを用いて、電子画像化し、デンシトメトリーは付属のQuantity Oneソフトウエアーにより行った。
【００８９】
Art-DsredH/pcDNA3.1の作成
赤色蛍光タンパク質発現ベクターpDsRed-Monomer-C1（クロンテック社）を鋳型として、プライマー（配列番号７５及び配列番号７６）を用いてPCRを行い、蛍光タンパク質をコードするcDNAを増幅し、電気泳動後精製し、684塩基からなる配列番号７７で表される塩基配列をコードするcDNAを得た。
【００９０】
配列番号７８で表されるプライマーをリン酸化し、これに配列番号７９で表されるプライマーを等量混合し、アニールさせ、平滑化を行い配列番号８０で表されるcDNAを得た。配列番号７４及び配列番号８０で表されるcDNAをライゲーションし、精製後、このcDNAを鋳型として燐酸化された配列番号７９及び配列番号７４で表されるプライマーを用いてPCRを行い、配列番号８１に表される747塩基のcDNAを得、このcDNAをpBluescript2SK+のEcoRVサイトにサブクローニングし、プライマー合成中及びPCR中に変異の無い人工糖鎖付加サイトと赤色蛍光タンパクタンパク質をコードするcDNAを含むプラスミドを得た。Invitrogen社pcDNA3.1-MH-A+ ベクターのEcoRVとXbaIで切断し配列番号８２及び８３で表される合成DNAをアニールさせたものを挿入したサブクローン化したプラスミドをXhoIとEcoRIで切断し、配列番号８１に表される配列もつプラスミドをEcoRIとSalIで切断し精製した747塩基のcDNAをサブクローニングし、糖鎖付加配列を含む赤色蛍光タンパク質を発現するベクターであるArt-DsredH/pcDNA3.1を得た。
【００９１】
Art-DsredH/pcDNA3.1は配列番号８４で表されるタンパク質（Art-DsredHタンパク質）を発現させる。
【００９２】
マウスインターロイキン（IL-4/5/6/12/13）のシグナル配列の単離
マウスIL-4のシグナル配列を単離するため、mIL-4-EGFPH/pcDNA3.1のプラスミドを鋳型とし、プライマー（配列番号５１及び配列番号８５）を用いPCRを行い、精製後、HindIIIとBamHIで切断し、プラスミドArt-DsredH/pcDNA3.1のHindIIIとBamHIとの間にサブクローニングを行い、目的の構造をもつクローンを選択し、マウスIL-4のシグナル配列と人工糖鎖付加配列と赤色蛍光タンパク質及びヒスチジンタグを融合タンパク質として発現させるベクターSS(mIL4)-Art-DsredH/pcDNA3.1を得た。
【００９３】
マウスIL-5のシグナル配列を単離するため、mIL-5-EGFPH/pcDNA3.1のプラスミドを鋳型とし、プライマー（配列番号５１及び配列番号８６）を用いPCRを行い、精製後、HindIIIとBamHIで切断し、プラスミドArt-DsredH/pcDNA3.1のHindIIIとBamHIとの間にサブクローニングを行い、目的の構造をもつクローンを選択し、マウスIL-5のシグナル配列と人工糖鎖付加配列と赤色蛍光タンパク質及びヒスチジンタグを融合タンパク質として発現させるベクターSS(mIL5)-Art-DsredH/pcDNA3.1を得た。
【００９４】
マウスIL-6のシグナル配列を単離するため、mIL-6-EGFPH/pcDNA3.1のプラスミドを鋳型とし、プライマー（配列番号５１及び配列８７）を用いPCRを行い、精製後、HindIIIとBamHIで切断し、プラスミドArt-DsredH/pcDNA3.1のHindIIIとBamHIとの間にサブクローニングを行い、目的の構造をもつクローンを選択し、マウスIL-6のシグナル配列と人工糖鎖付加配列と赤色蛍光タンパク質及びヒスチジンタグを融合タンパク質として発現させるベクターSS(mIL6)-Art-DsredH/pcDNA3.1を得た。
【００９５】
マウスIL-12のシグナル配列を単離するため、mIL-12-EGFPH/pcDNA3.1のプラスミドを鋳型とし、プライマー（配列番号５１及び配列番号８８）を用いPCRを行い、精製後、HindIIIとBamHIで切断し、プラスミドArt-DsredH/pcDNA3.1のHindIIIとBamHIとの間にサブクローニングを行い、目的の構造をもつクローンを選択し、マウスIL-12のシグナル配列と人工糖鎖付加配列と赤色蛍光タンパク質及びヒスチジンタグを融合タンパク質として発現させるベクター SS(mIL12)-Art-DsredH/pcDNA3.1を得た。
【００９６】
マウスIL-13のシグナル配列を単離するため、mIL-5-EGFPH/pcDNA3.1のプラスミドを鋳型とし、プライマー（配列番号５１及び８９）を用いPCRを行い、精製後、HindIIIとBamHIで切断し、プラスミドArt-DsredH/pcDNA3.1のHindIIIとBamHIとの間にサブクローニングを行い、目的の構造をもつクローンを選択し、マウスIL-13のシグナル配列と人工糖鎖付加配列と赤色蛍光タンパク質及びヒスチジンタグを融合タンパク質として発現させるベクター SS(mIL13)-Art-DsredH/pcDNA3.1を得た。
【００９７】
マウスIL-31のシグナルペプチドを含む発現ベクターSS-EGFP-MH/pcDNA3.1-MH-A+をHindIIIとBamHIで切断し、電気泳動によりマウスIL-31のシグナルペプチドを含むcDNAを精製し、プラスミドArt-DsredH/pcDNA3.1のHindIIIとBamHIとの間にサブクローニングを行い、マウスIL-31のシグナル配列と人工糖鎖付加配列と赤色蛍光タンパク質及びヒスチジンタグを融合タンパク質として発現させるベクター SS(mIL31)-Art-DsredH/pcDNA3.1を得た。
【００９８】
上記の手法で作成した発現ベクターは、SS(mIL4)-Art-DsredH/pcDNA3.1が配列番号９０で表されるタンパク質を、SS(mIL5)-Art-DsredH/pcDNA3.1が配列番号９１で表されるタンパク質を、SS(mIL6)-Art-DsredH/pcDNA3.1が配列番号９２で表されるタンパク質を、SS(mIL12)-Art-DsredH/pcDNA3.1が配列番号９３で表されるタンパク質を、SS(mIL13)-Art-DsredH/pcDNA3.1が配列番号９４で表されるタンパク質を、SS(mIL31)-Art-DsredH/pcDNA3.1が配列番号９５で表されるタンパク質を、CMVプロモーターによりそれぞれ発現させる。
【００９９】
DsRedタンパク質の発現
プラスミドArt-DsredH/pcDNA3.1及びSS(mIL-X)-Art-DsredH/pcDNA3.1（X=4,5,6,12,13,31）を、それぞれFreestyle-293F及びCos-1細胞にEGFPタンパク質発現ベクターと同様の手法でトランスフェクトを行い、上清及び細胞分画のタンパク質の抽出液を得て、12.5％のSDS-PAGEにより電気泳動を行い、融合タンパク質のC末端に配置されたヒスチジンタグをウエスタンブロット法により検出した。
【０１００】
タンパク質の精製
FreeStyle293培地中に放出されたヒスチジンタグ付きタンパク質は遠心により上清を分離後、50mM Tris HCl (pH=7.4)、食塩濃度を0.5N、10mMイミダゾール（ナカライ社）、0.05％Chaps（同人化学）に調整し、Qiagen社のNi-NTA Superflowセファロース（Cat. 30430）にかけて、ヒスチジンタグ付きタンパク質を吸着させた。カラムを50mM Tris HCl (pH=7.4)、食塩濃度を0.5N、10mMイミダゾール、Chaps0.05％のバッファーで洗浄後、PBSバッファーで洗浄し、0.5N食塩、250mMイミダゾールを含むバッファーで溶出した。溶出液をMillipore社のAmicon Ultra-15限外ろ過濃縮フィルター（Cat.UFC901024）で濃縮し、PBS中で透析を行った。得られたサンプルをSDS-PAGE電気泳動を行い、クマジー染色を行った。
【０１０１】
p53タンパク質の活性はActive Motif社のTransAM p53(Cat. 41196)を用いて、添付説明書に従って計測した。
【０１０２】
結果
配列番号４５（mIL-4-EGFPHタンパク質）、配列番号４６（mIL-5-EGFPHタンパク質）、配列番号４７（mIL-6-EGFPHタンパク質）、配列番号４８（mIL-12-EGFPHタンパク質）、配列番号４９（mIL-13-EGFPHタンパク質）及び配列番号５０（mIL-31-EGFPHタンパク質）で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いてFreestyle-293F細胞に発現させ、細胞分画及び細胞上清を試料としてSDS-PAGEにより電気泳動後、C末端のヒスチジンタグを認識する抗体でウエスタンブロット法により発現タンパク質を検出した結果を図１に示す。図１中Cは細胞分画を、Sは上清分画を示す。図１に示すように、インターロイキン６はN型糖鎖付加配列を持たないが、上清に糖鎖修飾したと思われるタンパク質が放出されている。インターロイキン13と31の融合タンパク質が効率的に培地中に放出されている。
【０１０３】
配列番号４４（EGFP-H)、配列番号６０(SS-EGFPH/pcDNA3.1）、配列番号６１（Δ-EGFPH/pcDNA3.1)、配列番号６２(GSS-EGFPH/pcDNA3.1)、配列番号６３(GSS(DD)-EGFPH/pcDNA3.1)、配列番号５０(mIL-31-EGFPH)及び配列番号６４(SS-Art-EGFPH/pcDNA3.1)で表されるアミノ酸配列の各種変異体についてシグナル配列及び糖鎖付加配列の配置の模式図を図２に示す。図中、黒三角で示した部分は、各変異体におけるN-型糖鎖の付加位置を示し、数字はアミノ酸の位置を示す。
【０１０４】
配列番号４４、６０、６１、６２及び６３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いてFreestyle-293F細胞に発現させ、細胞分画及び細胞上清を試料としてSDS-PAGEにより電気泳動後、C末端のヒスチジンタグを認識する抗体でウエスタンブロット法により発現タンパク質を検出した結果を図３に示す。図３中、泳動写真の下のCは細胞分画を示し、Sは上清分画を示す。また、aはSS-EGFPH（配列番号６０）、bはΔ-EGFPH（配列番号６１）、cはGSS-EGFPH（配列番号６２）、dはGSS(DD)-EGFPH（配列番号６３）を示す。図３に示すようにシグナル配列だけではなく、N型糖鎖付加配列を持った時に特に融合タンパク質が効率的に培地中に放出されているのがわかる。
【０１０５】
配列番号４４、６０、６１、６２及び６３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いてCos-1細胞に発現させ、細胞分画及び細胞上清を試料としてSDS-PAGEにより電気泳動後、C末端のヒスチジンタグを認識する抗体でウエスタンブロット法により発現タンパク質を検出した結果を図４に示す。図４中、泳動写真の下のCは細胞分画を示し、Sは上清分画を示す。また、aはEGFPH（配列番号４４）、bはSS-EGFPH（配列番号６０）、cはΔ-EGFPH（配列番号６１）、dはGSS-EGFPH（配列番号６２）、eはGSS(DD)-EGFPH（配列番号６３）を示す。図４に示すように浮遊細胞だけではなく接着細胞においても図３と同じことが確認できる。
【０１０６】
配列番号６２（GSS(DD)-EGFPH)及び配列番号６３（GSS-EGFPH)で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いてFreestyle-293F細胞に発現させ、細胞分画及び上清分画を試料としてN-glycosydase Fで変性条件で処理し、N型糖鎖を除去し、各々のサンプルを12.5％SDS-PAGEで電気泳動しC末端のヒスチジンタグを検出したウエスタンブロット解析の結果を図５に示す。図５中、泳動写真の下のCは細胞分画をSは上清分画を示す。GSS-EGFPHの細胞分画及び上清分画とも糖鎖の除去により分子量が低下していることがわかる。GSS-EGFPHの細胞分画の糖鎖付加より上清分画の糖鎖付加が多いことがわかる。糖鎖除去後は両者とも予想される分子量である為、他のタンパク質修飾とは考えられない。
【０１０７】
配列番号６４（GSS(ART)-EGFPH)のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いてFreestyle-293F細胞に発現させ、細胞分画及び、細胞上清を試料としてSDS-PAGEにより電気泳動後、C末端のヒスチジンタグを認識する抗体でウエスタンブロット法により発現タンパク質を検出した結果を図６に示す。図６中、泳動写真の下のCは細胞分画をSは上清分画を示す。図６に示すように、人工的に設計した糖鎖修飾配列でも糖鎖が付き、EGFPタンパク質が放出された。
【０１０８】
配列番号６７（p53H/pcDNA3.1)、配列番号６８(SS-p53H/pcDNA3.1)及び配列番号６９（GSS-p53H/pcDNA3.1)のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いてFreestyle-293F細胞に発現させ、細胞分画及び細胞上清を試料としてSDS-PAGEにより電気泳動後、C末端のヒスチジンタグを認識する抗体でウエスタンブロット法により発現タンパク質を検出した結果を図７に示す。図７中、泳動写真の下のCは細胞分画をSは上清分画を示す。図７に示すように、小胞体移行シグナル配列を糖鎖付加配列を付加したGSS-p53Hの発現タンパク質のみ上清にp53タンパク質が検出された。
【０１０９】
配列番号６７(p53)、配列番号６９(GSS-p53）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いてFreestyle-293F細胞に発現させ、その上清分画に放出されたp53タンパク質の配列選択的DNA結合能をTrans-AMキットにて測定し、その選択的DNA配列結合能を450nmの吸光度として計測した結果を図８に示す。p53タンパク質の活性はActive Motif社のTransAM p53(Cat. 41196)を用いて、添付説明書に従って計測した。図８に示すように、GSSを付加することにより、活性型p53タンパク質が細胞外に放出された。
【０１１０】
配列番号６９に表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いてFreestyle-293F細胞に発現させ、その上清をニッケルキレートカラムにより精製したものの解析の結果を図９に示す。
【０１１１】
FreeStyle293培地中に放出されたヒスチジンタグが付加されたタンパク質は遠心により上清を分離後、50mM Tris HCl (pH=7.4)、食塩濃度を0.5N、10mMイミダゾール（ナカライ社）、0.05％Chaps（同人化学）に調整し、Qiagen社のNi-NTA Superflowセファロース（Cat. 30430）にかけて、ヒスチジンタグ付きタンパク質を吸着させた。カラムを50mM Tris HCl(pH=7.4)、食塩濃度を0.5N、10mMイミダゾール、Chaps0.05％のバッファーで洗浄後、PBSバッファーで洗浄し、0.5N食塩、250mMイミダゾールを含むバッファーで溶出し、溶出液をMillipore社のAmicon Ultra-15限外ろ過濃縮フィルター（Cat.UFC901024）で濃縮し、PBS中で透析を行った。得られたサンプルをSDS-PAGE電気泳動を行い、クマジー染色を行った。
【０１１２】
WBは精製前のC末端のヒスチジンタグによるウエスタンブロット解析を示し、CBBは精製されたタンパク質についてクマジー染色を行った像を示す。矢頭はp53タンパク質の位置を示す。
【０１１３】
図９に示すように、放出されたタンパク質のみが精製され、ウエスタンブロットの像と一致した。
【０１１４】
配列番号７３（インターロイキン33）及び配列番号７４（インターロイキン31のシグナル配列とインターロイキン33の成熟タンパク質を融合させたタンパク質）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いてFreestyle-293F細胞に発現させ、細胞分画及び上清分画を試料としてSDS-PAGEにより電気泳動を行い、C末端に付加してあるヒスチジンタグを検出したウエスタンブロット解析の結果を示す。図１０中、泳動写真の下のCは細胞分画をSは上清分画を示す。
【０１１５】
図１０に示すように、インターロイキン33のシグナル配列では、上清にタンパク質が放出されないが、インターロイキン31のシグナル配列に置換することにより、上清にインターロイキン33のタンパク質が糖鎖が付加された形で放出された。
【０１１６】
配列番号８４(Art-Dsredタンパク質）、配列番号９０（mIL4)、配列番号９１(mIL5)、配列番号９２(mIL6)、配列番号９３(mIL12)、配列番号９４(mIL13)及び配列番号９５(mIL31)のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いてFreestyle-293F細胞に発現させ、細胞分画及び上清分画を試料としてSDS-PAGEにより電気泳動を行い、C末端に付加してあるヒスチジンタグを検出したウエスタンブロット解析の結果を図１１に示す。図１１中、泳動写真の下のCは細胞分画をSは上清分画を示す。
【０１１７】
図１１は、放出されるタンパク質の比較を示すので、各マウスインターロイキンのシグナル配列の放出に関わる影響がわかる。シグナル配列が無い配列番号８４に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は放出されなかったが、シグナル配列がある場合、どのタンパク質も効率的に放出された。また人工的な糖鎖付加配列も細胞外放出に有効であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】配列番号４５、４６、４７、４８、４９及び５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いてFreestyle-293F細胞に発現させたタンパク質のウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図２】配列番号４４、６０、６１、６２、６３、５０及び６４で表されるアミノ酸配列の各種変異体についてシグナル配列及び糖鎖付加配列の配置を模式的に表した図である。
【図３】配列番号６０、６１、６２及び６３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いてFreestyle-293F細胞に発現させたタンパク質のウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図４】配列番号４４、６０、６１、６２及び６３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いてCos-1細胞に発現させたタンパク質のウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図５】配列番号６２及び６３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いてFreestyle-293F細胞に発現させたタンパク質のウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図６】配列番号６４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いてFreestyle-293F細胞に発現させたタンパク質のウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図７】配列番号６７、６８及び６９で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いてFreestyle-293F細胞に発現させたタンパク質のウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図８】配列番号６７及び６９で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いてFreestyle-293F細胞に発現させたp53タンパク質の配列選択的DNA結合能を示す図である。
【図９】配列番号６９で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いてFreestyle-293F細胞に発現させ、その上清をニッケルキレートカラムにより精製した結果を示す図である。
【図１０】配列番号７３及び７４で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いてFreestyle-293F細胞に発現させたタンパク質のウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図１１】配列番号８４、９０、９１、９２、９３、９４及び９５で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いてFreestyle-293F細胞に発現させたタンパク質のウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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