(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルスと宿主細胞膜との融合を阻害することによりインフルエンザウイルス感染症を治療するための薬学的組成物であって、
薬学的に許容可能な担体と、
配列番号３のアミノ酸配列および配列番号４のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド
とを含む、
薬学的組成物。
【請求項２】
前記薬学的組成物がインフルエンザウイルスと接触することにより、インフルエンザウイルスエンベロープと宿主細胞膜との融合を阻害する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記薬学的に許容可能な担体が緩衝生理食塩水を含む、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
吸入可能な粉末の形態である、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、ポリペプチドのアミノ酸残基に結合している脂質置換部位を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
インフルエンザウイルスと宿主細胞膜との融合を阻害することによりインフルエンザウイルス感染症を治療するための薬学的組成物であって、
緩衝生理食塩水と、
配列番号３のアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド
とを含む、
薬学的組成物。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、ポリペプチドのアミノ酸残基に結合している脂質置換部位を含む、請求項６に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００７年６月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／９３７１２０号の利益を主張するものであり、２００３年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６０／５１７１８１号の利益を主張する２００４年１１月３日に出願された米国特許出願第１０／５７８０１３号の一部継続出願であり、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、インフルエンザウイルスによる細胞のウイルス感染を予防または阻害するのに有効なペプチドを含む組成物、およびそれを用いてインフルエンザ感染症を治療または予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
全てのウイルスは、複製するために、それらの標的細胞に結合および侵入しなくてはならない。クラスＩ膜融合タンパク質を有するＲＮＡウイルスを含む、エンベロープを有するウイルスでは、そのプロセスは、（ａ）標的細胞へのビリオンの結合、（ｂ）原形質膜または内部細胞膜と、ウイルスのエンベロープとの融合、（ｃ）融合孔を生じさせるための、融合領域でのウイルスエンベロープおよび細胞膜の不安定化、（ｄ）孔を介したウイルスＲＮＡの移動、ならびに（ｅ）ウイルスＲＮＡによる細胞機能の改変を伴う。
【０００４】
ウイルス膜と細胞エンベロープとの融合を伴う、上記の段階（ｂ）および（ｃ）は、ウイルスの膜貫通糖タンパク質（融合タンパク質）と、標的細胞の表面タンパク質および膜との相互作用により仲介される。これらの相互作用により、融合タンパク質における立体構造の変化が生じ、その結果、標的細胞の膜の中にウイルス融合ペプチドが挿入される。この挿入の後、融合タンパク質内部でのさらなる立体構造の変化が生じ、それによりウイルスエンベロープと細胞膜とが非常に接近し、その結果、２枚の膜からなる２重層の融合が生じる。
【０００５】
ウイルスは、この融合プロセスが混乱すると、宿主内で拡散および繁殖することができない。この融合プロセスの意図的な混乱は、ペプチドおよびペプチド模倣体を、融合タンパク質の配列、融合タンパク質を認識する抗体、および融合タンパク質に対抗して作用する他の因子に対して相同にすることによって行うことができる。
【０００６】
インフルエンザウイルスであるオルトミクソウイルスのエンベロープタンパク質である血球凝集素２（ＨＡ２）は、原型ＲＮＡウイルスのクラスＩ融合タンパク質である。ＨＡ２は、融合ペプチドと呼ばれる、血球凝集素前駆体タンパク質の切断の際に露出される、アミノ末端の疎水性ドメインを含む。レトロウイルスの膜貫通タンパク質は、融合ペプチドの他に、伸長したアミノ末端ヘリックス（通常は「７個の反復」または「ロイシンジッパー」であるＮ−ヘリックス）、カルボキシ末端ヘリックス（Ｃ−ヘリックス）、および膜貫通ドメインに近接している芳香族モチーフを含む、ＨＡ２の既知の構造と共通のいくつかの構造的特徴を含む。これらの５つのドメインのうち少なくとも４つが存在していると、ウイルスエンベロープタンパク質はクラスＩ融合タンパク質であると定義される。
【０００７】
図１は、クラスＩウイルスの６つのファミリーの融合タンパク質の、５つの前述したドメインを示す。この融合タンパク質は、疎水性の融合ペプチドにおいて始まり、アンカーペプチドにおいて終わり、伸長したアミノ末端のα−ヘリックス（通常は「７個の反復」または「ロイシンジッパー」であるＮ−ヘリックス）、カルボキシ末端のα−ヘリックス（Ｃ−ヘリックス）、および時として、ビリオンエンベロープに近接している芳香族モチーフを組み込む。また、ウイルスファミリーのそれぞれについて、本発明者らにより発見され、米国特許出願第１０／５７８０１３号に記載されている、本明細書において融合開始領域（ＦＩＲ）と呼ばれる６番目のドメインが示されている。
【０００８】
アメリカ合衆国の人口の約１０から２０パーセントが、毎年、季節性インフルエンザに罹患している。ほとんどの人は１〜２週間でインフルエンザから回復するが、非常に若い人、高齢者、および慢性的な病状を有する人は、インフルエンザ後肺炎および他の致命的な合併症を発症することがある。インフルエンザの原因となる作用因子は、インフルエンザウイルスであるオルトミクソウイルスであり、これは、断片化したウイルスゲノムの再集合および突然変異のプロセスを介して新たな株を速やかに生じさせるものである。
【０００９】
Ａ型インフルエンザウイルスの高毒性株は、流行および汎発をもたらし得る。近年では、高い死亡率をもたらし得る、トリインフルエンザＡウイルスの亜型Ｈ５Ｎ１の高病原性株が出現してきている。公衆衛生に対してもバイオテロの潜在的な作用因子としても、インフルエンザによりもたらされる脅威のため、季節性インフルエンザと汎発性インフルエンザの脅威の増大とを制御するための治療法の開発は最優先事項である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、インフルエンザ感染症の治療もしくは予防、および／またはインフルエンザ感染症の個人間での伝染の予防に有用なペプチド、ペプチド類似体、ペプチド誘導体、および薬学的組成物を提供する。本発明のペプチドは、野生型インフルエンザ血球凝集素２タンパク質の融合開始領域（ＦＩＲ）のインフルエンザウイルス−細胞融合阻害部分、またはその変異体を含む。変異体は、野生型血球凝集素２タンパク質配列のアミノ酸残基配列における選択された置換によって、野生型タンパク質とは異なるものである。
【００１１】
第１の実施形態において、本発明の単離されたペプチドは、選択された野生型インフルエンザ血球凝集素２タンパク質の部分の８から４０個の連続したアミノ酸残基、またはその変異体からなる。血球凝集素２タンパク質の部分は、タンパク質の融合開始領域（ＦＩＲ）、ならびにＦＩＲのアミノ末端側およびカルボキシ末端側にある最大５個のアミノ酸残基を含む。この部分にはまた、少なくとも配列ＹＮＡＥＬＬ（配列番号１）またはその変異体が含まれ、この変異体は、Ｙ１Ｓ、Ｙ１Ｔ、Ｙ１Ｗ、Ｙ１Ａ、Ｎ２Ｑ、Ａ３Ｌ、Ａ３Ｉ、Ａ３Ｖ、Ｅ４Ｄ、Ｅ４Ｋ、Ｅ４Ｒ、Ｅ４Ｈ、Ｌ５Ｉ、Ｌ５Ｖ、Ｌ５Ａ、Ｌ６Ｉ、Ｌ６Ｖ、およびＬ６Ａからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換によって、配列番号１と異なるものである。
【００１２】
この第１の実施形態において、変異体は、上記の選択された野生型タンパク質の部分のアミノ酸配列における１つまたは複数のアミノ酸置換によって、選択された野生型配列と異なる。置換は、他の野生型インフルエンザ血球凝集素２タンパク質の対応するアミノ酸残基、または野生型残基の同類置換から選択され得、好ましくは、少なくとも１つの野生型血球凝集素２のアミノ酸配列の対応領域のＷｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面ヒドロパシープロフィールの極大および極小の約５個のアミノ酸残基内にプロフィールの極大および極小を有する変異体について、Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面ヒドロパシープロフィールを維持するように選択され得る。好ましくは、選択された野生型配列の変異体は、野生型配列と少なくとも５０パーセントの配列同一性を有する。  
【００１３】
第２の実施形態において、本発明のペプチドは、残基７２〜１１３の範囲のタンパク質領域からの、野生型インフルエンザＡもしくはインフルエンザＢの血球凝集素２タンパク質のＦＩＲの８〜４０個のアミノ酸残基部分、またはその変異体を含み、この変異体は、野生型配列における１つまたは複数のアミノ酸残基の置換によって、野生型配列の残基７２〜１１３と異なるものである。変異体における置換は、他の野生型血球凝集素２タンパク質の対応アミノ酸残基またはその同類置換から選択され、好ましくは、ペプチドのＷｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅヒドロパシープロフィールの全形態を保存するように、すなわち、対応する野生型血球凝集素２のアミノ酸配列のＷｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅヒドロパシープロフィールの極大および極小の約５個のアミノ酸残基内に極大および極小を有する変異体について、Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅヒドロパシープロフィールを維持するように選択される。好ましくは、この実施形態における変異体は、同類置換によって、野生型配列と異なるものである。  
【００１４】
第３の実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列（ＥＶＥＧＲＩＱＤＬＥＫＹＶＥＤＴＫＩＤＬＷＳＹＮＡＥＬＬＶＡＬＥＮＱＨＴＩＤＬＴＤＳ）の８〜４０個の連続したアミノ酸残基、またはその変異体からなる。配列番号２は、野生型インフルエンザＡの亜型Ｈ３の血球凝集素２タンパク質（配列番号１９）のアミノ酸残基７２から１１３を含む。８〜４０個のアミノ酸ペプチドは、少なくとも、配列番号２のアミノ酸残基２３〜２８またはその変異体を含む。この実施形態において、変異体は、Ｅ１Ｄ、Ｅ１Ｎ、Ｅ１Ｑ、Ｖ２Ｇ、Ｖ２Ｓ、Ｖ２Ｔ、Ｖ２Ｉ、Ｖ２Ｌ、Ｖ２Ａ、Ｖ２Ｍ、Ｖ２Ｃ、Ｅ３Ｄ、Ｅ３Ｎ、Ｅ３Ｑ、Ｇ４Ｔ、Ｇ４Ｓ、Ｇ４Ｋ、Ｇ４Ｒ、Ｇ４Ｈ、Ｇ４Ｑ、Ｇ４Ｎ、Ｒ５Ｋ、Ｒ５Ｈ、Ｒ５Ｑ、Ｒ５Ｎ、Ｉ６Ｌ、Ｉ６Ｖ、Ｉ６Ａ、Ｉ６Ｍ、Ｉ６Ｃ、Ｑ７Ｎ、Ｑ７Ｅ、Ｑ７Ｄ、Ｑ７Ｇ、Ｑ７Ｓ、Ｑ７Ｔ、Ｄ８Ｅ、Ｄ８Ｎ、Ｄ８Ｑ、Ｄ８Ｍ、Ｄ８Ｃ、Ｌ９Ｉ、Ｌ９Ｖ、Ｌ９Ａ、Ｌ９Ｍ、Ｌ９Ｃ、Ｅ１０Ｄ、Ｅ１０Ｎ、Ｅ１０Ｑ、Ｅ１０Ｉ、Ｅ１０Ｌ、Ｅ１０Ｖ、Ｅ１０Ａ、Ｅ１０Ｍ、Ｅ１０Ｃ、Ｋ１１Ｒ、Ｋ１１Ｈ、Ｋ１１Ｄ、Ｋ１１Ｅ、Ｋ１１Ｎ、Ｋ１１Ｑ、Ｙ１２Ｗ、Ｙ１２Ｋ、Ｙ１２Ｒ、Ｙ１２Ｈ、Ｖ１３Ｉ、Ｖ１３Ｌ、Ｖ１３Ａ、Ｖ１３Ｇ、Ｖ１３Ｔ、Ｖ１３Ｓ、Ｖ１３Ｍ、Ｖ１３Ｃ、Ｅ１４Ｄ、Ｅ１４Ｋ、Ｅ１４Ｒ、Ｅ１４Ｈ、Ｄ１５Ｅ、Ｄ１５Ｒ、Ｄ１５Ｎ、Ｄ１５Ｑ、Ｔ１６Ｇ、Ｔ１６Ｓ、Ｔ１６Ａ、Ｔ１６Ｑ、Ｔ１６Ｎ、Ｋ１７Ｆ、Ｋ１７Ｒ、Ｋ１７Ｍ、Ｋ１７Ｃ、Ｋ１７Ｉ、Ｋ１７Ｖ、Ｋ１７Ｌ、Ｋ１７Ａ、Ｉ１８Ｌ、Ｉ１８Ｖ、Ｉ１８Ａ、Ｉ１８Ｔ、Ｉ１８Ｓ、Ｉ１８Ｇ、Ｉ１８Ｑ、Ｉ１８Ｎ、Ｄ１９Ｅ、Ｄ１９Ｎ、Ｄ１９Ｑ、Ｌ２０Ｉ、Ｌ２０Ｖ、Ｌ２０Ａ、Ｌ２０Ｃ、Ｌ２０Ｍ、Ｗ２１Ｙ、Ｗ２１Ａ、Ｓ２２Ｔ、Ｓ２２Ｇ、Ｓ２２Ａ、Ｓ２２Ｍ、Ｓ２２Ｃ、Ｙ２３Ｗ、Ｙ２３Ｓ、Ｙ２３Ｔ、Ｙ２３Ａ、Ｎ２４Ｑ、Ｎ２４Ｄ、Ｎ２４Ｅ、Ａ２５Ｉ、Ａ２５Ｖ、Ａ２５Ｌ、Ａ２５Ｍ、Ｅ２６Ｄ、Ｅ２６Ｋ、Ｅ２６Ｒ、Ｅ２６Ｈ、Ｌ２７Ａ、Ｌ２７Ｉ、Ｌ２７Ｖ、Ｌ２７Ｍ、Ｌ２８Ｉ、Ｌ２８Ｖ、Ｌ２８Ａ、Ｌ２８Ｍ、Ｖ２９Ｉ、Ｖ２９Ｌ、Ｖ２９Ａ、Ｖ２９Ｍ、Ａ３０Ｉ、Ａ３０Ｌ、Ａ３０Ｖ、Ａ３０Ｍ、Ａ３０Ｃ、Ｌ３１Ｉ、Ｌ３１Ｖ、Ｌ３１Ａ、Ｌ３１Ｍ、Ｌ３１Ｃ、Ｅ３２Ｄ、Ｅ３２Ｎ、Ｅ３２Ｑ、Ｎ３３Ｑ、Ｎ３３Ｑ、Ｑ３４Ｅ、Ｎ３３Ｅ、Ｑ３４Ｅ、Ｑ３４Ｄ、Ｑ３４Ｇ、Ｑ３４Ｓ、Ｑ３４Ｔ、Ｈ３５Ｋ、Ｈ３５Ｒ、Ｈ３５Ｎ、Ｈ３５Ｑ、Ｔ３６Ｓ、Ｔ３６Ｇ、Ｉ３７Ｌ、Ｉ３７Ｖ、Ｉ３７Ａ、Ｉ３７Ｍ、Ｉ３７Ｃ、Ｄ３８Ｅ、Ｄ３８Ｎ、Ｄ３８Ｑ、Ｌ３９Ｆ、Ｌ３９Ｉ、Ｌ３９Ｖ、Ｌ３９Ｍ、Ｌ３９Ｃ、Ｌ３９Ａ、Ｌ３９Ｅ、Ｌ３９Ｄ、Ｌ３９Ｎ、Ｌ３９Ｑ、Ｔ４０Ｈ、Ｔ４０Ｒ、Ｔ４０Ｋ、Ｔ４０Ｓ、Ｔ４０Ｇ、Ｔ４０Ａ、Ｔ４０Ｍ、Ｄ４１Ｅ、Ｄ４１Ｎ、Ｄ４１Ｑ、Ｓ４２Ｇ、Ｓ４２Ｔ、Ｓ４２Ｉ、Ｓ４２Ｌ、Ｓ４２Ｖ、Ｓ４２Ａ、Ｓ４２Ｍ、およびＳ４２Ｃからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換によって、配列番号２と異なるものである。
【００１５】
特定の好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、野生型インフルエンザＡ血球凝集素２（ＨＡ２）タンパク質またはインフルエンザＢ血球凝集素（ＨＢ）タンパク質のＦＩＲの部分に相当する、配列番号３〜１３のあらゆる配列の少なくとも８個の連続したアミノ酸残基からなるペプチドである。他の好ましい実施形態において、ペプチドは、配列番号３〜１３のいずれか１つの変異体の少なくとも８個の連続したアミノ酸残基からなる。この代替的な実施形態において、変異体は、上述の第３の実施形態において記載されたものに類似した、１つまたは複数のアミノ酸置換、好ましくは同類置換によって、選択された配列と異なる。
【００１６】
フェレットの鼻腔に投与されると、本明細書においてインフルエンザ阻害剤３（Ｆ３）と呼ばれる本発明のペプチドは、この動物におけるインフルエンザの発症および動物から動物へのインフルエンザの伝染を効果的に遮断した。Ｆ３のアミノ酸配列は、ヒトにおいて現在広まっているＡ／Ｈ３Ｎ２株を含むほとんどのインフルエンザＡのＨ３亜型ウイルスのＨＡ２の残基８４〜９９と同一である。Ｆ３はまた、免疫プラークアッセイにおいて、低いｎＭ範囲（＜５ｎＭ）のＩＣ５０で、組換えＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスに対して、ならびにインフルエンザＢの２つの株（Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２およびＢ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１０／２００３）に対して、試験管内で活性である。これらの異なるインフルエンザＡ株およびＢ株の多様性を考慮すると、Ｆ３はほとんどのインフルエンザウイルスに対して効果的であると思われる。
【００１７】
他の態様において、本発明は、本発明のペプチドの類似体（例えば、環状ペプチド、または非天然アミノ酸を含むペプチド）と、本発明のペプチドまたは類似体の誘導体であって、このペプチドまたは類似体が、ペプチドの残基に結合している非ＨＡ２由来の基を含む誘導体（例えば、脂質または非インフルエンザＨＡ２ペプチド配列）と、本発明のペプチド、類似体、または誘導体に特異的な（すなわち、それらに特異的および選択的に結合することが可能な）単離された抗体とを提供する。
【００１８】
本発明の別の態様は、インフルエンザ感染症を治療または予防するための治療方法における、本発明のペプチド、類似体、誘導体、または抗体の使用である。この使用には、インフルエンザを治療するための医薬品を調製するための、本発明のペプチド、類似体、誘導体、または抗体の使用が含まれ得る。本発明のペプチド、類似体、誘導体、および抗体は、薬学的に許容可能な担体と組み合わせた薬学的組成物内に含まれ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ｉ型ウイルスの６個のファミリーから得られた融合タンパク質の、これまでに同定された５個のドメイン、および融合開始領域（ＦＩＲ）として知られている第６のドメインを示す図である。
【図２】ＨＡ２変異体のＨ１（配列番号１７）、Ｈ２（配列番号１８）、Ｈ３（配列番号１９）、Ｈ４（配列番号２０）、Ｈ５（配列番号２１）、Ｈ６（配列番号２２）、Ｈ７（配列番号２３）、Ｈ９（配列番号２４）、Ｈ１０（配列番号２５）、Ｈ１３（配列番号２６）、Ｈ１４（配列番号２７）、Ｈ１５（配列番号２８）、およびＨ１６（配列番号２９）の配列アラインメントを示す図である。
【図３】インフルエンザＢ血球凝集素２であるＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／１９８８のアミノ酸残基配列（配列番号３０）を示す図である。
【図４】インフルエンザＡおよびインフルエンザＢの血球凝集素２タンパク質の残基７２〜１１３、具体的にはインフルエンザＡの亜型Ｈ１（配列番号１７）、Ｈ２（配列番号１８）、Ｈ３（配列番号１９）、Ｈ４（配列番号２０）、Ｈ５（配列番号２１）、Ｈ６（配列番号２２）、Ｈ７（配列番号２３）、Ｈ９（配列番号２４）、Ｈ１０（配列番号２５）、Ｈ１３（配列番号２６）、Ｈ１４（配列番号２７）、Ｈ１５（配列番号２８）、Ｈ１６（配列番号２９）、およびインフルエンザＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／１９８８の血球凝集素２（配列番号３０）の残基７２〜１１３の比較を示す図である。
【図５】ウイルス−細胞融合についての潜在的なメカニズムを示す図である。
【図６】インフルエンザウイルスＡ／Ｃａｌ／０７／０４で曝露し、本発明のペプチドまたは対照ペプチドで治療したフェレットの２つの群で観察された病理的応答を示す図である。
【図７】本発明のペプチドまたは対照ペプチドで処理し、インフルエンザウイルスＡ／Ｃａｌ／０７／０４に感染させたフェレットから得られた試料のウイルス力価分析を示す図である。
【図８】インフルエンザＡのＨ１血球凝集素２についての、Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面ヒドロパシープロットを示す図である。
【図９】インフルエンザＡのＨ２血球凝集素２についての、Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面ヒドロパシープロットを示す図である。
【図１０】インフルエンザＡのＨ３血球凝集素２についての、Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面ヒドロパシープロットを示す図である。
【図１１】インフルエンザＡのＨ４血球凝集素２についての、Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面ヒドロパシープロットを示す図である。
【図１２】インフルエンザＡのＨ５血球凝集素２についての、Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面ヒドロパシープロットを示す図である。
【図１３】インフルエンザＡのＨ６血球凝集素２についての、Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面ヒドロパシープロットを示す図である。
【図１４】インフルエンザＡのＨ７血球凝集素２についての、Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面ヒドロパシープロットを示す図である。
【図１５】インフルエンザＡのＨ９血球凝集素２についての、Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面ヒドロパシープロットを示す図である。
【図１６】インフルエンザＡのＨ１０血球凝集素２についての、Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面ヒドロパシープロットを示す図である。
【図１７】インフルエンザＡのＨ１３血球凝集素２についての、Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面ヒドロパシープロットを示す図である。
【図１８】インフルエンザＡのＨ１４血球凝集素２についての、Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面ヒドロパシープロットを示す図である。
【図１９】インフルエンザＡのＨ１５血球凝集素２についての、Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面ヒドロパシープロットを示す図である。
【図２０】インフルエンザＡのＨ１６血球凝集素２についての、Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面ヒドロパシープロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、インフルエンザ感染症の治療もしくは予防、またはインフルエンザ感染症の個人間での伝染の予防に有用なペプチド、ペプチド類似体、ペプチド誘導体、抗体、および薬学的組成物を提供する。本発明は、野生型インフルエンザ血球凝集素２タンパク質の融合開始領域（ＦＩＲ）の部分に対するアミノ酸配列の類似性を有するペプチドを利用するものである。本発明のペプチドは、インフルエンザウイルス−細胞融合を阻害し得、それにより、インフルエンザ感染症を治療および／または予防することができる。本発明のペプチドは、ＦＩＲの領域における野生型インフルエンザウイルス血球凝集素２タンパク質の選択された部分、または選択された部分の変異体を含み得る。変異体は、野生型血球凝集素２タンパク質配列のアミノ酸残基配列における選択された置換によって、野生型タンパク質と異なる。理論に拘泥されるものではないが、本発明のペプチドは、ウイルスの融合ペプチドのＦＩＲドメインと標的細胞の表面との正常な相互作用に干渉することにより、例えば、活性化または融合に必要なタンパク質凝集または立体構造の変化に干渉することにより、インフルエンザ感染症を予防および治療すると考えられる。
【００２１】
第１の実施形態において、本発明の単離されたペプチドは、タンパク質の融合開始領域（ＦＩＲ）と、ＦＩＲのアミノ末端側およびカルボキシ末端側にある最大５個のアミノ酸残基とを含む、選択された野生型インフルエンザ血球凝集素２タンパク質の部分の、８から４０個の連続したアミノ酸残基、好ましくは９から１６個の連続したアミノ酸残基、またはその変異体からなる。８〜４０個のアミノ酸ペプチドには、少なくとも配列ＹＮＡＥＬＬ（配列番号１）またはその変異体が含まれ、この変異体は、Ｙ１Ｓ、Ｙ１Ｔ、Ｙ１Ｗ、Ｙ１Ａ、Ｎ２Ｑ、Ａ３Ｌ、Ａ３Ｉ、Ａ３Ｖ、Ｅ４Ｄ、Ｅ４Ｋ、Ｅ４Ｒ、Ｅ４Ｈ、Ｌ５Ｉ、Ｌ５Ｖ、Ｌ５Ａ、Ｌ６Ｉ、Ｌ６Ｖ、およびＬ６Ａからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換によって、配列番号１と異なるものである。配列番号１は、全ての特徴付けられたインフルエンザＡ血球凝集素２タンパク質のＦＩＲの最も高度に保存された部分の１つに相当する（すなわち、インフルエンザＡ血球凝集素２配列の残基９４〜９９）。ＦＩＲのアミノ酸配列には、タンパク質のＮ−ヘリックスにおける残基７７辺りで始まり、選択された野生型血球凝集素２タンパク質の残基１１０から残基１１９の範囲にある残基で終わる、選択された野生型血球凝集素２タンパク質の部分が含まれる。本明細書中に記載される、インフルエンザのＦＩＲのカルボキシ末端は、Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面疎水性が増大する領域が開始する残基１０４（Ｎ−ヘリックスのカルボキシ末端）を超えて、最初の残基の直前にある残基である。言い換えれば、ＦＩＲは、野生型血球凝集素２タンパク質のＷｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面ヒドロパシープロフィールにおいて、Ｎ−ヘリックス（残基７７）において始まり、Ｎ−ヘリックスのカルボキシ末端の約１５残基後に終わるピークを示す、アミノ酸残基の配列を特徴とする。ピーク領域（すなわちＦＩＲ）のカルボキシ末端は、ヒドロパシープロフィールにおける極小を特徴とする。ＦＩＲのカルボキシ末端での極小の直後にある残基は、ヒドロパシープロフィールにおける別のピーク（すなわち、界面疎水性が増大する領域）を開始する。
【００２２】
この第１の実施形態において、変異体は、上記の選択された野生型タンパク質の部分のアミノ酸配列における１つまたは複数のアミノ酸置換によって、選択された野生型配列と異なる。置換は、他の野生型インフルエンザ血球凝集素２タンパク質の対応するアミノ酸残基、または対応する残基の同類置換から選択され、好ましくは、少なくとも１つの野生型血球凝集素２のＦＩＲのアミノ酸配列の対応領域のＷｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面ヒドロパシープロフィールの極大および極小の約５個のアミノ酸残基内に、プロフィールにおける極大および極小を有する変異体について、Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面ヒドロパシープロフィールを維持するように選択される。例えば、野生型血球凝集素２は、インフルエンザＡ血球凝集素２（配列番号１７〜２９）のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１５、およびＨ１６変異体からなる群から選択される亜型から、または、インフルエンザＢ血球凝集素２タンパク質（配列番号３０）から得ることができる。インフルエンザＡ血球凝集素２の亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１５、およびＨ１６のアミノ酸配列は、図２に示されており、ＦＩＲ領域は黒い輪郭で囲まれている。インフルエンザＢ血球凝集素２のアミノ酸配列（配列番号３０）は、図３に示されている。好ましくは、選択された野生型配列の変異体は、野生型配列と少なくとも５０パーセントの配列同一性（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％の配列同一性）を有する。
【００２３】
第２の実施形態において、本発明のペプチドは、野生型インフルエンザＡもしくはインフルエンザＢの血球凝集素２タンパク質のＦＩＲの残基７２〜１１３の８〜４０個、好ましくは９〜１６個の連続したアミノ酸残基、またはその変異体を含み、この変異体は、１つまたは複数のアミノ酸残基の置換によって、野生型配列の残基７２〜ら１１３と異なるものである。変異体における置換は、他の野生型血球凝集素２タンパク質の対応アミノ酸残基またはその同類置換から選択され、好ましくは、野生型ペプチドのＷｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅヒドロパシープロフィールの全形態を保存するように、すなわち、対応する野生型血球凝集素２のアミノ酸配列のＷｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅヒドロパシープロフィールの極大および極小の約５個のアミノ酸残基内に極大および極小を有する変異体について、Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅヒドロパシープロフィールを維持するように選択される。例えば、好ましくは、この実施形態における変異体は、特定の野生型アミノ酸配列の同類置換を含む。
【００２４】
本明細書において用いる場合、「同類置換」という用語およびその文法上の変形は、野生型残基とは異なるがその野生型残基と同一のアミノ酸クラスにある、ペプチドの配列におけるアミノ酸残基（すなわち、非極性残基に置き換わる非極性残基、芳香族残基に置き換わる芳香族残基、極性非荷電残基に置き換わる極性非荷電残基、荷電残基に置き換わる荷電残基）の存在を言う。さらに、同類置換は、それが置き換わる野生型残基と同一の符号で、かつ通常はそれと同様の程度の界面ヒドロパシー値を有する残基を包含し得る。
【００２５】
本明細書において用いる場合、用語「非極性残基」は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびプロリンを言い、用語「芳香族残基」は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンを言い、用語「極性非荷電残基」は、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、およびグルタミンを言い、用語「荷電残基」は、負に荷電したアミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸ならびに正に荷電したアミノ酸であるリジン、アルギニン、およびヒスチジンを言う。
【００２６】
図４は、図２に示されるインフルエンザＡ血球凝集素２亜型のそれぞれの残基７２〜１１３を、インフルエンザＢ血球凝集素２の対応領域（すなわち、配列番号３０の残基７２〜１１３）と共に比較するものである。図４において明らかであるように、異なる血球凝集素亜型の間で顕著な配列類似性が存在する。インフルエンザＡ血球凝集素２亜型のそれぞれの残基７２〜１１３の領域は、Ｈ３亜型の対応領域（すなわち配列番号２）に対して、５０パーセント以上の配列同一性を有する。配列番号２と様々な他の亜型の残基７２〜１１３との間の配列同一性のパーセンテージは、以下の通りである。Ｈ４およびＨ１４は、配列番号２と約９５．２％の配列同一性を有し、Ｈ７およびＨ１５は配列番号２と約５９．５％の配列同一性を有し、Ｈ１０およびＨ１６は配列番号２と約５４．７％の配列同一性を有し、Ｈ５およびＨ６は配列番号２と約５２％の配列同一性を有し、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ９、およびＨ１３は配列番号２と５０％の配列同一性を有する。インフルエンザＢ血球凝集素２の残基７２〜１１３は、配列番号２と約３０．９％の配列同一性を有するが、配列番号２とインフルエンザＢタンパク質の残基７２〜１１３との間の差異は、主に同類置換である。
【００２７】
図２、図３、および図４から明らかであるように、既知の野生型血球凝集素２タンパク質は、２つ以上のアミノ酸クラスに属する残基７２〜１１３の範囲における位置でアミノ酸残基を集合的に有する。したがって、このような場合において、本発明のペプチドの変異体は、これらのような位置で、２つ以上のアミノ酸クラスからのアミノ酸置換も含み得る。好ましくは、選択された野生型配列の変異体は、野生型配列と少なくとも５０％の配列同一性（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％の配列同一性）を有する。
【００２８】
第３の実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列（ＥＶＥＧＲＩＱＤＬＥＫＹＶＥＤＴＫＩＤＬＷＳＹＮＡＥＬＬＶＡＬＥＮＱＨＴＩＤＬＴＤＳ）の８〜４０個の連続したアミノ酸残基、好ましくは９〜１６個の連続したアミノ酸残基、またはその変異体からなる。配列番号２は、野生型インフルエンザＡの亜型Ｈ３の血球凝集素２タンパク質の、アミノ酸残基７２〜１１３を含む部分である。この実施形態において、ペプチドは少なくとも配列番号２のアミノ酸残基２３から２８またはその変異体を含み、この変異体は、１つまたは複数のアミノ酸置換によって、配列番号２と異なるものである。変異体配列における１つまたは複数のアミノ酸残基の置換は、表１に示される置換の群から選択される。好ましくは、変異体は、配列番号２と少なくとも５０％の配列同一性（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％の配列同一性）を有する。表１において、置換の第１の欄が好ましく、置換の第２の欄がより好ましく、第１の欄にあるものよりも保存的であるが、置換の第３の欄は、本発明のペプチドに含まれ得る代替物である。
【００２９】
【表１】
0005450402.tif 000002
0005450402.tif 000003
0005450402.tif 000004
【００３０】
特定の好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、野生型インフルエンザＡ血球凝集素２（ＨＡ２）タンパク質またはインフルエンザＢ血球凝集素（ＨＢ）タンパク質のＦＩＲの部分に相当する、表２に示されるあらゆる配列（配列番号３〜１３）の少なくとも８個の連続したアミノ酸残基からなるペプチドである。他の好ましい実施形態において、ペプチドは、配列番号３〜１３のいずれか１つの変異体の少なくとも８個の連続したアミノ酸残基からなる。この代替的な実施形態において、変異体は、上述の第３の実施形態において記載されたものに類似した、１つまたは複数のアミノ酸置換、好ましくは同類置換、また好ましくは表１に示されるようなペプチドのそれぞれの位置での対応する置換残基から選択されたものによって、選択された配列と異なる。
【００３１】
さらに、図２および図４に示される配列は、アラインされた血球凝集素２のアミノ酸配列の指示された位置でのコンセンサス残基に相当する多くの残基を太字で示す。本明細書において用いる場合、アミノ酸配列のアラインメントの比較におけるアミノ酸残基に適用される用語「コンセンサス」は、アラインされた配列の大部分において所与の位置で現れるアミノ酸を言う。図２において、コンセンサス残基は、この図において示される１３個の配列の少なくとも７個において所与の位置で現れるアミノ酸である。図４において、コンセンサス残基は、この図において示される１４個の配列の少なくとも８個において所与の位置で現れるアミノ酸である。図４において比較される血球凝集素２配列の残基７２〜１１３の領域において、コンセンサス残基は、Ｖ７３、Ｅ７４、Ｒ７６、Ｉ７７、Ｌ８０、Ｄ８６、Ｄ９０、Ｗ９２、Ｓ９３、Ｙ９４、Ｎ９５、Ａ９６、Ｅ９７、Ｌ９８、Ｌ９９、Ｖ１００、Ｌ１０１、Ｌ１０２、Ｅ１０３、Ｎ１０４、Ｔ１０７、Ｄ１０９、Ｄ１１２、およびＳ１１３である。好ましくは、本明細書において記載されるあらゆる実施形態を含む本発明のペプチドには、ペプチドに包含されるＨＡ２タンパク質の領域またはその変異体内の全てのコンセンサス残基までを含む、これらのコンセンサス残基の１つまたは複数が含まれる。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
インフルエンザＢ血球凝集素２ペプチド（配列番号８）を除く、表２における全ての配列は、配列番号３と５０パーセント超の配列同一性を有し、すなわち、配列番号４、５、９、および１３は配列番号３と６２．５パーセントの同一性であり、配列番号６、７、９、１０、１１、および１２は、配列番号３と５６．２パーセントの同一性である。インフルエンザＢ血球凝集素２は配列番号３と約３１パーセントの配列同一性を有するが、配列番号８と配列番号３との間の差異は、主に同類置換である。さらに、配列番号３〜１３により示されるペプチドのそれぞれには、コンセンサス残基Ｄ８６、Ｄ９０、Ｗ９２、Ｓ９３、Ｙ９４、Ｎ９５、Ａ９６、Ｅ９７、Ｌ９８、Ｌ９９、Ｖ１００、Ｌ１０１、およびＬ１０２の１つまたは複数が含まれる。
【００３４】
別の態様において、本発明は、本発明のペプチドの類似体を提供する。１つの実施形態において、類似体は、環状構造を形成するためにジスルフィド結合（すなわちシスチン架橋）を共有する少なくとも２つのシステイン残基を含む環状ペプチドを含む。それぞれのシステイン残基は、独立して、ペプチドの残基、直接的にもしくは結合ペプチド配列を介してペプチドのアミノ末端に結合した残基、または、直接的にもしくは結合ペプチド配列を介してペプチドのカルボキシ末端に結合した残基である。環状ペプチド構造は、多くのペプチドの生体内での生体安定性を改善することが知られている。
【００３５】
別の実施形態において、類似体は少なくとも１つの非天然アミノ酸残基（すなわち、Ｄ−アミノ酸残基、Ｎ−メチルバリンなどのＮ−メチル化残基、ヒドロキシプロリン、アミノ酪酸など）を含む。非天然アミノ酸の特定のこのような置換は、多くのペプチド化合物（例えば、Ｄ−アミノ酸、ヒドロキシプロリン）におけるペプチダーゼによる切断に対する抵抗性を付与すること、またはペプチドのα−ヘリックス含有量（例えばアミノ酪酸）を増大させることが知られている。
【００３６】
さらに別の実施形態において、類似体は、１つまたは複数のプロリン、グリシン、またはグルタミン酸残基での、ペプチドのアミノ酸残基の１つまたは複数の天然アミノ酸の置換を含み得る。プロリン残基およびグリシン残基は、必要であれば、または所望により、ペプチドのα−ヘリックス含有量を混乱させ得るが、グルタミン酸残基は、ペプチドのα−ヘリックス含有量を増大させ得る。
【００３７】
さらに別の態様において、本発明は、追加の基を含む本発明のペプチドまたは類似体の誘導体を提供する。１つの実施形態において、追加の基は、エステル結合、アミド結合、エーテル結合、チオエステル結合、またはチオエーテル結合を介してペプチドに結合している、Ｃ８からＣ２０のアルキル基またはカルボン酸アルキル基などの脂質である。例えば、誘導体は、ペプチドの残基に結合しているミリスチン酸基などの脂肪アルキルエステル基を含み得る。脂質の置換は、例えば、ペプチドの生体安定性を増大させ得る。
【００３８】
別の実施形態において、誘導体は、ペプチドのアミノ酸残基の１つまたは複数の側鎖上のアミノ置換基、ヒドロキシル置換基、またはチオール置換基に付加されているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を含む。このようなＰＥＧ誘導体は、例えば、高レベルのペプチダーゼを含む肝臓などの器官における取り込みを阻害することにより、タンパク質の薬物動態を改善し得ることが多い。
【００３９】
さらに別の誘導体の実施形態において、ペプチドには、８〜４０個のアミノ酸からなるペプチドのアミノ末端、そのペプチドのカルボキシ末端、または両方の末端に結合した、非ＨＡ２ポリペプチド配列が含まれる。非ＨＡ２配列は、非ＨＡ２タンパク質（例えば血清アルブミン）、もしくは非ＨＡ２タンパク質の部分であり得るか、または、例えば、好ましくはペプチドのカルボキシ末端に付加された、ＡＳＫＳＫＳＫ（配列番号１５）などのペプチドの可溶化に用いられる配列もしくはその変異体を含み得る。
【００４０】
本発明の別の好ましい誘導体は、本発明のペプチドからなる第１のペプチドセグメント（例えば、野生型配列の残基７２〜１１３の領域からの野生型インフルエンザＨＡ２タンパク質の部分の８〜４０個の連続したアミノ酸残基またはその変異体）と、第１のペプチドセグメントのアミノ末端、カルボキシ末端、またはアミノ末端およびカルボキシ末端の両方に結合している非ＨＡ２ペプチド配列を含む、少なくとも１つのさらなるペプチドセグメントとを含む、単離されたポリペプチドである。
【００４１】
別の態様において、本発明は、本発明のペプチド、類似体、または誘導体に特異的な（すなわち、それらに特異的および選択的に結合することが可能な）単離された抗体を提供する。このような抗体は、本発明の組成物で治療されている患者から得られた生体試料における本発明のペプチド、類似体、または誘導体の濃度の存在を決定するための試薬として有用である。さらに、野生型血球凝集素２亜型の部分を含む本発明のペプチドを標的とする抗体はまた、天然の血球凝集素２タンパク質にも結合することができる。このような結合は、同様に、ある程度のレベルの、インフルエンザウイルス−細胞融合プロセスの阻害をもたらし得る。好ましくは、抗体は、マウスなどのヒト以外の動物の抗体に由来するキメラ抗体またはヒト化抗体であり得るモノクローナル抗体である。所与のタンパク質またはペプチドからモノクローナル抗体を調製する方法は、当技術分野において周知である。キメラ抗体またはヒト化抗体を調製する方法もまた、当業者に周知である。
【００４２】
本発明の別の態様は、インフルエンザ感染症を治療または予防する方法において用いることができる、本発明のペプチド、類似体、誘導体、または抗体を含む薬学的組成物である。特定の好ましい実施形態において、この組成物には、患者、例えば鼻道または気道への、ペプチド、類似体、誘導体、または抗体の送達に適した、薬学的に許容可能な媒体または担体中の、本発明のペプチド、類似体、誘導体、または抗体が含まれる。鼻道または気道に活性成分を送達するのに適した媒体および担体は当技術分野において周知であり、生理食塩水、緩衝生理食塩水、吸入可能な粉末などが含まれる。担体にはまた、界面活性剤、防腐剤、分散剤などの他の賦形剤成分が含まれ得る。組成物は、エアロゾル、エアロゾル化していない液体、軟膏、またはクリーム（例えば鼻への適用のため）などとして送達され得る。本発明の薬学的組成物は、インフルエンザに罹患している患者に対して、インフルエンザを阻害する量の本発明の薬学的組成物を投与することにより、インフルエンザ感染症を治療または予防するための方法の一部として用いることができる。
【００４３】
本発明の別の態様は、インフルエンザ感染症を治療または予防するための、本発明のペプチド、類似体、誘導体、抗体、または薬学的組成物の使用である。これには、インフルエンザを治療するための医薬品を調製するための、本発明のペプチド、類似体、誘導体、または抗体の使用が含まれ得る。
【００４４】
インフルエンザウイルス
インフルエンザＡウイルスには複数の亜型が存在する。それぞれのウイルス亜型は、ウイルスの脂質膜エンベロープ内に埋め込まれた２つの糖タンパク質の変形物の、１つの特定の組み合わせを含む。亜型を規定する２つの糖タンパク質は、血球凝集素２（ＨＡ２）およびノイラミニダーゼである。ＨＡ２にはそれぞれＨ１からＨ１６と呼ばれる１６個の既知の変異体が存在し、ノイラミニダーゼにはそれぞれＮ１からＮ９と呼ばれる９個の既知の変異体が存在する。それぞれのウイルス亜型は、その血球凝集素２変異体およびノイラミニダーゼ変異体の数によって特定され、特徴付けられる。例えば、インフルエンザＡ亜型Ｈ３Ｎ２はブタインフルエンザであり、亜型Ｈ５Ｎ１はトリインフルエンザである。
【００４５】
ＨＡ２は、インフルエンザウイルスを含むオルトミクソウイルスファミリーにおける全てのウイルスの融合タンパク質である。全てのインフルエンザウイルスのＦＩＲはそのＨＡ２糖タンパク質内に存在する。１６個の既知のＨＡ２変異体であるＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６のうち１３個のアミノ酸配列は、図２に示されている（それぞれ、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、および２９）。Ｈ８、Ｈ１１、およびＨ１２亜型の配列は報告されていない。Ｈ３血球凝集素２の融合開始領域は、現在、図２に示されるＨ３のアミノ酸配列の残基７７〜１１９（配列番号１９）として同定されている。
【００４６】
配列番号３のアミノ酸配列ＶＥＤＴＫＩＤＬＷＳＹＮＡＥＬＬ（配列番号１９の残基８４〜９９、Ｈ３  ＨＡ２）を具現する、本明細書においてインフルエンザ阻害剤３（Ｆ３）と呼ばれる単離されたペプチドは、現在、強力な抗ウイルス特性を有することが明らかにされている。ランダムにスクランブルされた配列ＳＷＬＶＮＫＩＹＬＴＤＤＥＶＥＬ（配列番号１４）における、同一の１６個のアミノ酸を含む単離されたペプチドは、認識可能な抗ウイルス特性を示さない。Ｆ３の抗ウイルス特性には、血球凝集アッセイにより明らかにされた、ウイルス結合の阻害が含まれる。Ｆ３はまた、プラークアッセイにより明らかにされたように、ウイルスの結合、融合、および感染も阻害する。
【００４７】
抗インフルエンザウイルス活性
Ｆ３は、それぞれのＨＡ２タンパク質の全ての配列および構造の両方において顕著な多様性を示す広範なＨ１、Ｈ３、Ｈ５、およびインフルエンザＢウイルスに対する強力な感染阻害活性を有する。Ｆ３の広範な活性は、少なくとも部分的に、ＦＩＲ、特に全ての既知のインフルエンザＡ亜型およびインフルエンザＢの残基８４〜９９で表されるＦＩＲの部分が、ＨＡ２タンパク質における最も高度に保存された領域の１つであるという事実に関連している可能性がある。理論に拘泥されるものではないが、Ｆ３と野生型ＨＡ２亜型の対応領域（残基８４〜９９）との間の配列類似性により、ペプチドがＨＡ亜型の全てでＦＩＲの対応部分に効果的に結合するかまたはそれと相互作用することが可能になると考えられる。この相互作用は、融合プロセスの際のＨＡタンパク質の正常な働きに干渉する（例えば、融合プロセスが進行するために必要なタンパク質凝集または立体構造の変化に干渉することによる）。
【００４８】
Ｆ３は、標準的なＦＭＯＣ化学を用いて、ＰＥＧ−ＰＳ−ＰＡＬ樹脂上にグラム量で合成されている。大量のタンパク質生成物は、ＨＰＬＣを用いて＞９５％まで精製されており、残りの物質は主に、短い関連ペプチドである。精製されたペプチドは、溶媒を除去するために凍結乾燥した。凍結乾燥粉末は、例えばヘキサフルオロイソプロパノール内にそれを溶解し、超高純度の窒素流（Ｐｒａｘａｉｒ  ＵＨＰ、９９．９９９％）を用いて溶媒を蒸発させることにより、さらに処理することができる。そして、得られた粉末は、１０ｍＭのリン酸カリウムまたはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの水性緩衝液内に粉末を溶解することにより、後に再構成することができる。溶液中のＦ３の濃度は、ｍｇ／ｍｌ＝（Ａ２８０×ｍｗ）／ｅという式を用いて決定することができ、この式において、ｅは２８０ｎｍでのペプチドのアミノ酸配列における２つの発色性アミノ酸の分子吸光係数の合計であり、すなわち、５５６０（Ｔｒｐ）＋１２００（Ｔｙｒ）の合計の場合、ｅ＝６７６０である。
【００４９】
Ｆ３は、強力かつ広範囲にわたるインフルエンザＡウイルス阻害活性を有し、プラーク減少アッセイにおいてピコモル濃度での阻害を示す。オーバーレイとしてＡＶＩＣＥＬ（登録商標）微結晶セルロースを用いる免疫プラークアッセイ（Ｍａｔｒｏｓｏｖｉｃｈら、２００６年）を用いて、単層を固定し、インフルエンザウイルスの核タンパク質に対する特異的抗体で染色することにより、プラークを検出した。ペプチド阻害アッセイにおいて、ペプチドは、約１００のプラーク形成単位（ｐｆｕ）のウイルスで約１時間プレインキュベートし、その後、単層の感染に用いた。（１）ペプチドが、プレインキュベーション段階において用いた濃度と同じ濃度でオーバーレイ内に含まれる、標準的な条件、または（２）ペプチドがオーバーレイ内に含まれない条件という２つの条件をインキュベーションに用いた。
【００５０】
Ｆ３を、インフルエンザＡウイルスのＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）亜型を用いて行うＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ（「ＭＤＣＫ」）細胞プラークアッセイを用いて、インフルエンザＡウイルスの複数の亜型の阻害について評価した。５０μＭから２．５μＭの希釈のＦ３およびランダムにスクランブルされた対照ペプチド（配列番号１４）を用いて、ウイルスの感染性に対するこれらのペプチドの効果を評価した。Ｆ３および対照ペプチドの６個の希釈を、Ｈ１Ｎ１ウイルス亜型に対して試験し、それぞれのペプチドの別の６個の希釈を、Ｈ３Ｎ２ウイルス亜型に対して試験した。
【００５１】
条件（１）において、Ｆ３は、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２インフルエンザＡウイルスのいくつかの異なる株（stain）による正常なサイズのプラークの形成を、約１００〜５００ピコモル濃度（ｐＭ）の範囲のＩＣ５０で阻害した。条件（２）では、正常なサイズのプラークの阻害についてのＩＣ５０は、Ｆ３では約１０から１００ナノモル濃度（ｎＭ）の範囲であった。条件（１）での低いｎＭ濃度（＜１０ｎＭ）または条件（２）での低いμＭ（＜１０μＭ）では、「小さいプラーク」の存在が明らかであった。
【００５２】
スクランブルされた対照ペプチドは、いずれの条件下でもインフルエンザＡウイルスのプラーク形成を阻害せず、このことは、ペプチドのアミノ酸配列が重要であること、および非特異的な効果が阻害の原因とはなり得ないことを示すものである。
【００５３】
Ｆ３はまた、免疫プラークアッセイにおいて、低いｎＭ範囲（＜５ｎＭ）のＩＣ５０で、組換えＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス、ならびにインフルエンザＢの２つの株（Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２およびＢ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１０／２００３）に対して試験管内で活性である。これらの異なるインフルエンザＡ株およびＢ株の多様性を考慮すると、Ｆ３はほとんどのインフルエンザウイルスに対して効果的であると思われる。
【００５４】
米国特許出願第１０／５７８０１３号において教示されている方法を用いて、Ｈ１亜型のインフルエンザＡウイルスのＦＩＲは、今や、Ｈ１のＨＡ２配列（配列番号１７）の残基７７〜１１０として同定されている。本明細書においてインフルエンザ阻害剤１（Ｆ１）と呼ばれる、配列番号４のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドはまた、プラークアッセイにおいて、Ｈ１およびＨ３のインフルエンザＡウイルス亜型の両方に対して強力な（ピコモル濃度での）抗ウイルス活性を有する。Ｆ１のアミノ酸配列は、Ｈ１のＦＩＲ配列である配列番号１７の残基８４〜１０２と合致する。
【００５５】
本発明のペプチドの作用のメカニズムをより良く理解するため、例えば、ウイルス複製サイクルにおけるどの段階がＦ３、Ｆ１、および関連するインフルエンザウイルス阻害ペプチドによって阻害されるかを決定するために、様々なインフルエンザ株で研究が行われている。最適な数の赤血球および最適な濃度のインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）では、Ｆ３およびＦ１の両方が約１０μＭの濃度でインフルエンザウイルス誘発性の血球凝集を阻害した。最適な細胞およびウイルスの希釈（両方について１：８）では、Ｆ３は１２．５から６．２５μＭの濃度で血球凝集を阻害した。同様の結果が、他のＨ３およびＨ１株、すなわち、Ｈ１Ｎ１株であるＡ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９およびＡ／ＷＳＮ／３３、Ｈ３Ｎ２株であるＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００４、Ａ／ＮｅｗＹｏｒｋ／５５／０４、およびＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２で得られた。逆に、Ｆ３のスクランブルされた変形物である配列番号１４のアミノ酸配列を有する対照ペプチドは、いずれの濃度でも血球凝集を阻害しなかった。
【００５６】
ウイルスは、より濃度が高いと血球凝集の阻害を克服することが可能であり、このことは、確率的な機序を示唆している。この従来のウイルスと細胞との結合アッセイの結果は、本発明のペプチドがビリオンと直接的に相互作用して細胞への結合を阻害することを示唆している。逆にＦＵＺＥＯＮ（登録商標）抗ＨＩＶ薬は、寿命の短い融合中間体と相互作用し、ビリオン構造とは相互作用しない（Ｄｅｂｎａｔｈ、２００６年；Ｐｌａｔｔ、Ｄｕｒｎｉｎ、およびＫａｂａｔ、２００５年）。天然のビリオン構造との直接的な相互作用は、少なくとも部分的に、ウイルス感染性アッセイにおける、ＦＵＺＥＯＮ（登録商標）抗ＨＩＶ薬（ＨＩＶ−１株に応じて４から２８０ｎＭ）と比較して非常に高いＦ３およびＦ１の有効性（正常なサイズのプラークで約２００ｐＭ）の原因となる可能性がある。上述した小さなプラークは、ビリオン上のＨＡがリフォールディングしたことによる可能性がある。
【００５７】
ＨＡのリフォールディングは、これまでに、ＨＡと相互作用することが知られているインフルエンザＡウイルスの小分子阻害剤に晒した後に生じることが示唆されている（Ｃｉａｎｃｉら、１９９９年；Ｌｕｏ、ＣｏｌｏｎｎｏおよびＫｒｙｓｔａｌ、１９９６年；Ｌｕｏら、１９９７年）。この侵入阻害剤およびその他（Ｈｏｆｆｍａｎら、１９９７年）は、ＨＡを重要な治療標的として同定したため、１９９０年代後半における非常に重要な進歩であった。しかし、このような小分子阻害剤はこれまでインフルエンザ薬として開発されておらず、それは、この阻害剤が比較的効果が低く、ＩＣ５０が低度から中程度のμＭ濃度の範囲であることによる可能性が最も高い。急成長しているウイルス侵入阻害剤の分野において確立されてきている統一見解は、小分子薬が、大規模なタンパク質構造の遷移ならびにＨＡおよび他のウイルス融合タンパク質がウイルス侵入プロセスの際に受ける複数の細胞内相互作用に効果的に介在し得ない可能性があるというものである。
【００５８】
インフルエンザウイルスビリオン−細胞融合のプロセスについてのワーキングモデルは、数十年にわたるインフルエンザウイルスおよび他のＲＮＡウイルスについての熱心な研究から推定することができる。このようなモデルの概略図が図５に示されている。いくつかの側面においては依然として仮説的であるが、このモデルは、薬剤開発の標的として役立ち得るインフルエンザＡウイルスの糖タンパク質の構造／機能モチーフの重要性を強調し得るものである。図５において、パネルＡは、シアロ脂質またはシアロタンパク質を構成する、細胞受容体へのインフルエンザ血球凝集素１（ＨＡ１）タンパク質の結合を示す。パネルＢは、エンドサイトーシス小胞内へのインフルエンザビリオンの侵入を示す。Ｍ２ビロポリンとして知られているインフルエンザウイルスタンパク質は、ｐＨを低下させ、ＨＡ２タンパク質のヘリックスドメインの再構成を引き起こす。Ｆ３のアミノ酸配列（配列番号３）に対応するＨＡ２タンパク質の配列は、準安定性の「スプリング」配列の隣に位置している。再構成により、ＨＡ２タンパク質の融合ペプチド部分が小胞膜と相互作用することが可能になる。パネルＣおよびＤは、ウイルスおよび細胞の膜を非常に接近させる「ｌｅａｓｈ−ｉｎ  ｇｒｏｏｖｅ」メカニズムによるＨＡ２の「跳ね返り」を示している。明確にするために、ＨＡ１およびシアロ受容体はパネルＣ〜Ｅには示されていない。パネルＣ’は、二層膜に結びつき得る軌道を形成するＨＡ２の配列が細胞およびウイルスの膜の混合を容易にし得る、別のメカニズムを示す。パネルＥは、「融合孔」の形成、およびウイルスから細胞内へのリボ核タンパク質セグメントの侵入を示す。
【００５９】
生存動物での研究
フェレットは通常、ヒトのインフルエンザウイルス感染についての最良のモデルであると考えられる（Ｇｏｖｏｒｋｏｖａら、２００５年；Ｈａｍｐｓｏｎ、２００６年；ＭａｈｅｒおよびＤｅＳｔｅｆａｎｏ、２００４年；ｖａｎ  Ｒｉｅｌら、２００７年）。実際、インフルエンザワクチンの有効性についての欧州連合のガイダンスでは、フェレットモデルでの試験が必要とされている。マウスおよび他の小さな哺乳動物をインフルエンザＡウイルスのヒト株に感染させることはできるが、これは典型的には、季節性株の場合、新たな宿主へのウイルスの適合を必要とする。逆に、フェレットは、適合させることなく、ヒトインフルエンザＡウイルスのほとんどの株に感染させることができる。マウスにおける適合させたインフルエンザＡウイルスの組織分布および発症機序は、ヒトの疾患において生じるものと異なる（Ｌｕら、１９９９年）。フェレットにおけるインフルエンザＡウイルスの感染の発症機序は、ヒトにおいて観察されるものと非常に類似している。フェレットに、実験的に鼻腔内に接種すると、上気道におけるウイルスの局所的な複製が生じる。フェレットの気道におけるシアル酸受容体の分布はヒトに類似している（ｖａｎ  Ｒｉｅｌら、２００６年；Ｙｅｎら、２００７年）。
【００６０】
インフルエンザを有するヒトに非常に類似した様式で、フェレットは活動の低下、熱、食欲不振、鼻水、くしゃみ、呼吸困難、下痢、結膜からの分泌物、および神経学的徴候を発症する。フェレットおよびヒトの両方における主な病理的所見は、線毛を有する気道上皮の落屑、ならびに浸潤性の炎症細胞による鼻腔の粘膜下組織の浸潤である。インフルエンザウイルスによるフェレットの感染後４８時間以内に、鼻の気道上皮のほぼ完全な破壊が生じ、基底膜のみが残る。
【００６１】
フェレットおよびヒトにおけるインフルエンザの間の主な差異は、疾患の症状が現れる時間の長さである。フェレットは、感染後１日以内にインフルエンザの症状を発症し始めるが、感染の４日後までには、周知の所見（活動の低下、熱、食欲不振、鼻水、くしゃみなど）のほとんどが消えている。ヒトインフルエンザＡウイルスの多くの株が様々な程度でフェレットの下気道に感染し得ることに注目されたい。ヒトにおけるように、インフルエンザＡウイルスの高病原性株は、フェレットにおいて、上気道から脳へ、または下気道から血液循環および他の器官へ広がり得る。流行しているトリインフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１株は、フェレットにおいて、致命的な感染を確立し得る（Ｇｏｖｏｒｋｏｖａら、２００５年；Ｔｈｉｒｙら、２００７年；ＶａｈｌｅｎｋａｍｐおよびＨａｒｄｅｒ、２００６年）。
【００６２】
最初のインビトロでの研究は、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、およびＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）を含む、ヒトにおいて現在広まっている亜型に対応するインフルエンザＡウイルスの、良く特徴付けられた実験株に焦点を当てたものである。ペプチドＦ３およびＦ１は、実験室において広範囲には評価されていないＨ１Ｎ１（Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）株およびＨ３Ｎ２（Ａ／ＮＹ／５５／０４、Ａ／Ｃａｌ／０７／０４）株の臨床分離株を含む、インフルエンザＡウイルスのいくつかの他の株に対するプラーク減少アッセイにおいて同様の効率を示した。これらのような最近の臨床分離株での研究は、ヒトにおいて現在インフルエンザの原因となっているウイルスを用いた治療法の有効性を確立するために重要である。重要なことに、これらの株はまた、フェレットにおいて、鼻腔内への接種の後にこの種の鼻甲介および肺において高い力価となるインフルエンザをもたらした。
【００６３】
全ての研究で、ウイルスの分離株は、標準的な手順を用いて、ニワトリの孵化卵（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓまたはＬｏｕｉｓｉａｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔから入手した）において増殖させた。尿膜腔液を、接種の１日後に１１日齢の卵から採取し、ウイルスプールを、標準的な手順を用いて、シチメンチョウの赤血球（ｔＲＢＣ）（Ｌａｍｐｉｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）に対する血球凝集活性について試験した。陽性の血球凝集（＞２５６ＨＡ単位）プールを、上述したようにウイルスプラークアッセイによって滴定し、曝露研究に用いるまで液体窒素内で保存した。ペプチドはリン酸緩衝液内で調製し、緩衝された溶液を、麻酔したフェレットの鼻道にピペットを用いて直接適用した（鼻腔内投与経路）。
【００６４】
曝露研究１
フェレットは、１日に１回または２回、鼻腔内経路によって、約０．３ｍｇ／Ｋｇの用量で、ウイルス暴露の前に２日間にわたり（−２日目および−１日目）、Ｆ３、またはペプチドのスクランブルされた対照変形物（配列番号１４）で前処理した。最後の処理の１２時間後、動物を、感染用量を見出す研究において決定された最少感染用量の少なくとも１００倍である、約１０５ｐｆｕのＨ３Ｎ２インフルエンザＡ／Ｃａｌ／０７／０４株を鼻腔内に接種することにより感染させた。ペプチドを、０日目の約１２時間後、ならびにウイルス暴露後の１日目および２日目に、０．３ｍｇ／Ｋｇ用量でフェレットに再投与した。２日目に、スクランブルされた対照ペプチドで処理した全てのフェレットは、顕著な呼吸困難（速くて浅い呼吸）、高熱、およびくしゃみを発症していた。逆に、Ｆ３で処理した動物はいずれも重篤な呼吸困難は有していなかったが、一部（前投与を１日に２回行った群の２／５、前投与を１日に１回行った群の１／６）が、いくつかの非常に軽度の呼吸徴候およびわずかな熱を示した。３日目に、Ｆ３で処理した全てのフェレットはインフルエンザの臨床徴候を示していなかったが、スクランブルされた対照ペプチドで処理したフェレットの５０％は依然として倦怠状態であり、スクランブルされた対照ペプチドで処理したフェレットの１００％が顕著な鼻水を示していた。明らかに、Ｆ３はこの最初の曝露実験において、顕著でかつ驚くほど効果的な処理の利益を提供するものである。
【００６５】
曝露研究２
第２の曝露研究において、１２頭のフェレットがＦ３処理群に含まれ、１２頭のフェレットが対照ペプチド群に含まれた。動物は約１０５ｐｆｕのインフルエンザＡ／Ｃａｌ／０７／０４に感染させた。しかし、この研究において、フェレットは、事前のウイルス暴露処理を行うことなく、０日目のウイルス暴露の４時間後に、０．３ｍｇ／ＫｇのＦ３または対照ペプチドで処理した。２日目に、スクランブルされた対照ペプチドで処理した全ての１２頭のフェレットは、顕著な呼吸困難、高熱、およびくしゃみを発症していた。逆に、Ｆ３で処理した動物はいずれも、この時点では、呼吸困難の何らかの徴候またはインフルエンザの他の徴候は有していなかった。図６は、生存中の研究期間にわたる両方の処理群についての呼吸困難（パネルＡ）、鼻水（パネルＢ）、および活性（パネルＣ）の観察によって得られた、研究の間にフェレットにおいて観察された病理的応答を示す。
【００６６】
図６に示されるように、Ｆ３で処理した動物は、対照群と比較して、病理的応答の顕著な低減を示した。Ｆ３処理群の２頭の動物のみが、インフルエンザの軽度の徴候を発症し、これは、ペプチドでの処理を停止した２日後である、実験の４日目に生じた。臨床パラメーターに加え、鼻の気道ならびに肺および肺外の組織を、ウイルス力価の分析、肉眼的な病変の分析、および病理組織学的分析のために、研究期間にわたり１日おきに採取した。Ｆ３で処理した動物は正常な肺の外見を示した。逆に、対照ペプチドで処理したフェレットは炎症の痕跡を示した。Ｆ３で処理したフェレットから得た組織は、対照ペプチドで処理した動物と比較して病変が顕著に低減しており、対照ペプチドで処理したフェレットは、浸潤、気管支炎症を示し、インフルエンザ感染症に特徴的な気管支滲出を有していた。
【００６７】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析およびインフルエンザウイルスの核タンパク質遺伝子に対する保存されたプライマーにより、処理され感染したフェレットから得られた組織ホモジネートにおける、ウイルスのゲノムＲＮＡレベルの信頼性のある分析が可能である。鼻の気道の試料を研究期間の間に動物から回収した。これらの試料から得られたウイルス力価は図７のパネルＡに示されている。研究の１日目に脳、気管、肝臓、脾臓、および血液から得られたフェレットの組織ホモジネートの分析の結果は、図７のパネルＢに示されている。パネルＡのデータは、フェレットの鼻洗浄液におけるインフルエンザウイルスの力価のピークが２．０ｌｏｇ１０よりも大きく減少し、肺では６．０ｌｏｇ１０よりも大きく減少したことを示す。これらの結果は、Ｆ３がフェレットの上気道におけるインフルエンザウイルスの複製を顕著に低減させたことを示す。パネルＢのデータは、Ｆ３が同様に下気道および他の器官へのウイルスの拡散を効果的に遮断したことを示す。
【００６８】
インフルエンザのＦＩＲの同定
インフルエンザウイルスのＦＩＲのカルボキシ末端は、Ｎ−ヘリックスのカルボキシ末端（残基１０４）を越えて見られるＷｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面ヒドロパシープロットにおいて正に増大する界面疎水性を示す、最初のペプチド配列の直前の残基として定義することができる。以下の表３は、１９９６年にＷｉｍｌｅｙおよびＷｈｉｔｅにより記載された、膜界面でのタンパク質についてのＷｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面疎水性スケールを示す。この疎水性またはヒドロパシーのスケールは、疎水性膜の２重層の界面から水性相へのペプチド残基の移動に必要な自由エネルギー変化に基づくものである。このスケールにおいて、モル当たりのキロカロリーで示されている正の自由エネルギー（ΔＧ）は、より疎水性の残基を示す（すなわち、疎水性膜から水へ疎水性残基が移動するためにはエネルギーが加えられなくてはならない。同様に、負の自由エネルギーは、より親水性の残基を示す。
【００６９】
Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面疎水性のプロットにおいて、ＦＩＲはヒドロパシーのピーク領域（すなわち、疎水性における２つの極小の間に位置する疎水性における極大を含む、比較的高い疎水性の領域として特徴付けられる。このピーク領域はＨＡ２タンパク質のＮ−ヘリックスにおいて始まり、Ｎ−ヘリックスを超えた約１５残基内で終わる。
【００７０】
【表３】
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【００７１】
ウェブサイト：ｂｌａｎｃｏ．ｂｉｏｍｏｌ．ｕｃｉ．ｅｄｕ／ｍｐｅｘから入手可能なＭｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＭＰＥｘ）などのコンピュータプログラムを用いて、タンパク質またはポリペプチドについての界面ヒドロパシープロフィールを計算することができる。ＭＰＥｘプログラムはＷｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅヒドロパシースケールを組み込み、これらのペプチド配列の界面疎水性の程度を確認する好ましい方法を構築する。ＭＰＥｘコンピュータプログラムは、図２に示される１３個の配列決定されたＨＡ２変異体のそれぞれにおけるＦＩＲのカルボキシ末端を特徴付けるために用いた。ＭＰＥｘコンピュータプログラムは、目的のタンパク質またはペプチドについて、固定された数の連続したアミノ酸残基（好ましくは約１９個の残基）からなるウィンドウにおける全ての残基についての全残基ヒドロパシー値を平均化し、そのウィンドウにおけるヒドロパシーの平均値をウィンドウにおける中間の残基についてのヒドロパシースコアとしてプロットすることにより、Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面ヒドロパシースコアをプロットする。ウィンドウは次に、アミノ末端からカルボキシ末端の方向へ移動する１残基分シフトされ、このプロセスは、目的の領域におけるそれぞれの残基についてのヒドロパシースコアが決定されるまで繰り返される。
【００７２】
図２に示される１３個のＨＡ２亜型の全てについてのＷｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ界面ヒドロパシープロフィールは、１９個のアミノ酸残基のウィンドウを用いて、ＭＰＥｘプログラムを用いて調製した。ＦＩＲのアミノ末端は、界面ヒドロパシーが極小の後に徐々に増大し始めるところである、タンパク質のＮ−ヘリックス内のポイント（すなわち、これまでに試験されているＨＡ２タンパク質の全てについての残基７７）で見られる。ＦＩＲのカルボキシ末端は、Ｎ−ヘリックスを越えた、疎水性における最初の極小の直前の残基、すなわち、Ｎ−ヘリックスのカルボキシ末端を越えて見られる正に増大している界面疎水性を有する最初のペプチド配列の直前の残基である。図２に示されるそれぞれのインフルエンザＡのＨＡ２亜型において、Ｎ−ヘリックスは残基１０４で終わっている。Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅヒドロパシースコアのプロットは、ＦＩＲのカルボキシ末端の位置の確認に有用となるためにゼロ軸上を交差する必要はなく、先行するペプチド残基に対してヒドロパシースコアが増大するだけでよい。
【００７３】
図８〜２０は、インフルエンザＡのＨＡ２融合タンパク質の１３個の配列決定された変異体のＭＰＥｘのＷｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅヒドロパシープロフィールを示す（これらの図において、「Ａ」は、ヒドロパシープロットにおけるピークに特徴を有する、ペプチドのＦＩＲを示す）。ＦＩＲのカルボキシ末端は、図８〜２０のそれぞれにおいて「Ｂ」で示されている。分析から、ＦＩＲのアミノ末端が、それぞれのウイルスＨＡ２亜型において、ＨＡ２配列の残基７７で始まることが決定されている。ＦＩＲのカルボキシ末端は、ＨＡ２亜型のそれぞれについて、残基１１０と１１９との間で変化する。ＦＩＲ領域は、図２において、残基７７〜１１０または１１９の周りにある黒い縁内で強調されている。
【００７４】
改善された活性を有する本発明のペプチドは、ＦＩＲの活性な標的阻害剤タンパク質の部分（例えば配列番号２）と比較して長い（ＨＡのフランキング配列に対応する）か、または切断されている、入れ子型の組のペプチドを調製することによって同定することができる。ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端で３〜６個のアミノ酸分、標的ＨＡアミノ酸配列を伸長するペプチドを、一連のインフルエンザウイルスに対して体系的に試験し、配列のいずれかの側にあるアミノ酸セグメントが感染性の阻害の増大に寄与するかどうかを決定する。標的配列よりも長いペプチドが、標的よりも低いＩＣ５０でインフルエンザＡウイルスの感染性を阻害する場合、標的よりも少ない追加のアミノ酸を有するペプチドを、感染性阻害活性を有する最小のペプチドを決定するために体系的に試験することができる。特定のタイプ／または亜型に特異的な活性ペプチドもまた、阻害活性の大きさを決定するためにインフルエンザウイルスの同一のタイプまたは亜型のさらなる株に対して試験することができる。例えば、配列番号５に基づく標的ペプチドは、ＩＣ５０＜１００ｎＭで複数のＨ５亜型ウイルスを阻害する。
【００７５】
試験に適した他のペプチド変異体は、標的配列における残基をアラニン残基に体系的に変更すること（本明細書において「アラニンスキャニング」と呼ぶ）により決定することができる。野生型ペプチドとのアラニン改変ペプチドの比較により、融合／感染性阻害に重要な残基が同定される。２つ以上のアミノ酸が阻害に影響する場合、重要なそれぞれの残基での変更を用いて、さらなるペプチドを合成することができる。
【００７６】
本発明のペプチドにより推定的に標的化される機能的ドメイン（例えば配列番号３から配列番号１３）は、立体構造がα−ヘリックスである。ヘリシティを改善または混乱させるペプチドの変化は、インフルエンザＡウイルスの融合／感染性阻害剤としてのペプチドの活性を変化させ得る。したがって、活性ペプチドの変異体または類似体は、アミノ酪酸（ＡＩＢ）またはグルタミン酸などのヘリックス含有量に寄与するアミノ酸で他のアミノ酸を置換することにより、調製することができる。同様に、ペプチドにプロリンまたはグリシンを加えると、α−ヘリックス含有量を混乱させることができ、これにより、有益に阻害活性が改善または低減する。コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって同定されるＨＡ２への増大した結合を有するさらなる類似ペプチドもまた、インフルエンザウイルスの感染性の阻害について試験することができる。
【００７７】
鼻腔または肺におけるペプチダーゼは、生体内でのプラットフォーム治療法の有用性を制限する可能性がある。プラーク減少アッセイにおいて活性なペプチド変異体が分解されるかまたは呼吸組織から迅速に排出される場合、ペプチドの安定性および保持を増大させるためのさらなる改変が実施され得る。乾燥粉末、または製剤への変更／付加により、ペプチドの安定性が改善され得る。ジスルフィド環化ペプチドをもたらすために付加された２つのさらなるシステインを有する環化ペプチド類似体は、二次構造を安定化させ得、ペプチドを分解に対してより抵抗性のあるものとし得る。プロリンでの２つ以上の残基の置換によっても、合成ペプチドの安定性を大きく増大させることができる。様々なアミノ末端もしくはカルボキシ末端の改変、またはタンパク質（例えば血清アルブミン）もしくは脂質（例えばミリスチン酸）への結合によっても、ペプチダーゼ切断部位での非天然アミノ酸（ヒドロキシプロリンまたはＤ−アミノ酸）の導入がそうし得るように、ウイルス阻害ペプチドの活性の安定性を改善することができる（Ｑｕｒｅｓｈｉら、１９９０年）。
【００７８】
阻害ペプチドが水性溶液において低い溶解度を示す場合、ペプチド変異体は、ペプチドの溶解度を増大させるためにカルボキシ末端に付加された配列ＡＳＫＳＫＳＫ（配列番号１５）の変形物を用いて合成することができる。この配列は、モデルペプチドの溶解度を増大させるが二次構造は保存することが示されている。溶解度の増大によっても、インフルエンザウイルスエンベロープ介在性の融合の阻害に必要な濃度が低くなり得る。
【００７９】
保存された残基の配列
高度に保存された配列であるＹＮＡＥＬＬ（配列番号１）が、１３個の配列決定されたＨＡ２亜型の１１個のＦＩＲ内に存在すること、および配列番号１において単一のアミノ酸置換を示す対応配列であるＹＮＡＫＬＬ（配列番号１６）が他の２つの亜型において見られることが観察されている。１３個の配列決定されたＨＡ２変異体のうち１つの他の配列のみが、ＹＮＡＥＬＬ（配列番号１）よりも高度に保存されている。その配列であるＡＩＡＧＦＩＥ（配列番号３１、完全長タンパク質の残基５〜１１）はＨＡ２タンパク質の融合ペプチド内またはＦＰ内にある。ＦＰドメインは、クラスＩウイルス融合タンパク質の５個のこれまでに知られているドメインの１つであり、ＦＰドメインは、ウイルスの細胞への融合プロセスにおいて重要な役割を果たすことがこれまでに知られていた。
【００８０】
本発明を記載する関連において（特に以下の特許請求の範囲の関連において）「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という用語ならびに類似の言及の使用は、本明細書において別段の指示がない限り、または文脈からそうでないことが明らかでない限り、単一形および複数形の両方を網羅すると解釈されるものである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別段の記載がない限り、無制限の用語として解釈される（すなわち、「それを含むがそれに限定されない」を意味する）ものである。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書において別段の指示がない限り、その範囲内に収まるそれぞれの個別の値を個別に指すための簡略的な方法として用いることを意図したものにすぎず、それぞれの個別の値は、本明細書においてそれが個別に列挙されたかのように、本明細書内に組み込まれる。本明細書において記載される全ての方法は、本明細書において別段の指示がない限り、または文脈からそうでないことが明らかでない限り、あらゆる適切な順序で実施することができる。本明細書において記載される、あらゆるおよび全ての実施例または例示的な言葉（例えば「そのような（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、本発明をより良く明らかにすることを意図したものにすぎず、そうでないことが特許請求の範囲に記載されていない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいずれの言葉も、特許請求の範囲に記載されていないあらゆる要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。
【００８１】
本発明を実施するための、本発明者らが知っている最良の態様を含む、この発明の好ましい実施形態が、本明細書において記載されている。これらの好ましい実施形態の変形は、前述の記載を読むことで当業者に明らかとなろう。発明者らは、当業者が必要に応じてこのような変形を採用することを予想しており、本発明者らは、本明細書において具体的に記載されているものとは別の態様で本発明が実施されることを意図している。したがって、本発明は、準拠法により認められる、本明細書に添付された特許請求の範囲において記載される対象の全ての改変物および同等物を含むものである。さらに、その全ての可能な変形における上述の要素のあらゆる組み合わせは、本明細書において別段の指示がない限り、または文脈からそうでないことが明らかでない限り、本発明に包含される。
【００８２】
（参考文献）以下の参考文献はそれぞれ、参照によりその全体が組み込まれる。
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【図１】
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【図２−Ａ】
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【図２−Ｂ】
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【図２−Ｃ】
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【図２−Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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