(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞選別ユニット（１１０、２１０、３１０）を含むマイクロチャネルのアレイがエッチングされた基板（３）を備えており、該基板（３）の周囲に保護カバー（２）が接合されているマイクロ流体システム（１、１０１）であって、
前記選別ユニットは、それぞれが２０μｍ〜５００μｍの範囲のサイズであって、２０〜１００００個の細胞からなっているランゲルハンス島などの比較的凝集性に乏しい細胞集団（Ａ）を、当該選別ユニットを流れる際に、当該選別ユニットの出口に位置する並列に配置された少なくとも２つの選別マイクロチャネル（１１１〜１１４）へと分離することができる偏向手段（２１１、３１１）を備えており、
前記少なくとも２つの選別マイクロチャネル（１１１〜１１４）は、当該選別マイクロチャネルと同数に分類された選別後の集団（Ａｔ）を、やはり前記アレイに形成されている前記選別後の集団（Ａｔ）をカプセル化するためのユニット（１２０、２２０、３２０）へと運ぶように、それぞれ設計されており、
前記選別ユニット（１１０、２１０、３１０）は、前記集団（Ａ）をサイズによって選別するための少なくとも１つの選別ステージを備えており、前記選別ステージは、それぞれ前記選別後の集団（Ａｔ）のための少なくとも２つのサイズ分類を前記選別マイクロチャネル（１１１〜１１４）に生成するように設計されており、
前記カプセル化ユニット（１２０）は、並列に配置された複数のカプセル化サブユニット（１２１〜１２４）を備えており、
前記複数のカプセル化サブユニット（１２１〜１２４）は、それぞれ前記選別マイクロチャネル（１１１〜１１４）に連通しており、
前記それぞれのカプセル化サブユニット（１２１〜１２４）は、対応する選別マイクロチャネルを流れるサイズ分類の選別後の集団（Ａｔ）をカプセル化するように設計されているマイクロ流体システム（１、１０１）。
【請求項２】
前記選別ステージまたは各選別ステージの前記偏向手段（２１１、３１１）は、受動的な流体力学的手段であり、
前記受動的な流体力学的手段は、当該選別ステージの少なくとも１つのマイクロチャネル（３１２）に含まれる偏向柱（３１１）からなる設備による決定論的横変位（ＤＬＤ）を有する形式の手段であり、好ましくは流体力学的フォーカシング形式の手段であり、あるいは主マイクロチャネル（１１５）に対して横方向に配置されたろ過マイクロチャネル（１１１〜１１４）による流体力学的ろ過を有する形式の手段である、請求項１に記載のマイクロ流体システム（１、１０１）。
【請求項３】
前記選別ステージまたは各選別ステージの前記偏向手段は、静電気力もしくは磁力または電磁波もしくは音波に組み合わせられた流体力学的手段である、請求項１に記載のマイクロ流体システム（１、１０１）。
【請求項４】
各カプセル化サブユニット（１２１〜１２４）は、前記カプセル（Ｃ）を形成するための装置（１２７、２２１）を備えており、
前記装置（１２７，２２１）は、Ｔ分岐装置、マイクロ流体流フォーカシング装置（ＭＦＦＤｓ）、マイクロチャネル（ＭＣ）アレイ装置、およびマイクロノズル（ＭＮ）アレイ装置からなるグループから選択される、請求項１に記載のマイクロ流体システム（１、１０１）。
【請求項５】
各カプセル化サブユニット（１２１〜１２４）は、各分類の前記選別後の集団（Ａｔ）を含んでいる水相（３２１）と、該水相に非混和である相（３２１）、例えば油相と、の間の物質の交換器を備えており、
前記交換器は、圧力の上昇によって前記２つの相の間の界面が破れることによって前記カプセル（Ｃ）が形成されるように設計されている、請求項１に記載のマイクロ流体システム（１、１０１）。
【請求項６】
前記カプセル化ユニット（１２０、２２０）は、形成されたカプセル（Ｃ）をゲル化するための手段（１２５、１３５、１４５、２２５）をさらに備えており、
前記ゲル化手段（１２５、１３５、１４５、２２５）は、マイクロチャネルで構成された物質の交換器を備えており、
前記交換器は、カプセルを含んでいる例えば油−アルギン酸塩形式のカプセル化相から水性または非水性のゲル化相へとカプセルを移すことを目的とする、請求項１、４、５のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム（１、１０１）。
【請求項７】
前記選別後の集団（Ａｔ）を、該集団を含んでいる培地から該集団を前記カプセル化ユニット（１２０、２２０、３２０）に収容するように意図されたカプセル化相へと移すように設計された流体移送モジュール（２０）は、前記マイクロチャネルのアレイにさらに形成されており、
前記移送モジュールは、前記選別マイクロチャネル（１１１〜１１４）のそれぞれに流体連通しており、前記選別ユニット（１１０、２１０、３１０）における圧力損失を最小化するように設計されている、請求項１、４、５のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム（１、１０１）。
【請求項８】
前記選別ユニット（１１０、２１０、３１０）を前記カプセル化ユニット（１２０、２２０、３２０）へと接続するためのモジュール（３０、４０）をさらに備えており、
前記接続モジュールは、前記カプセル化ユニットを前記選別ユニットに直接または選択的に連通させることによって、前記２つのユニットが層流の状態を維持するように設計されている、請求項１、４〜７のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム（１、１０１）。
【請求項９】
前記接続モジュールは、前記選別マイクロチャネル（１１１〜１１４）を前記カプセル化ユニット（１２０、２２０、３２０）へとそれぞれ接続する中間マイクロチャネルで構成されており、
前記中間マイクロチャネルは、上流および下流の前記層流の状態を維持するために適した寸法および形状を有している、請求項８に記載のマイクロ流体システム（１、１０１）。
【請求項１０】
前記接続モジュール（３０、４０）は、前記選別後の集団（Ａｔ）を保存するための緩衝マイクロリザーバ（３１、４１）を備えており、
前記緩衝マイクロリザーバ（３１、４１）のそれぞれへと、前記選別マイクロチャネル（１１１〜１１４）のうちの１つが開いており、
前記緩衝マイクロリザーバ（３１、４１）のそれぞれは、前記選別後および濃縮後の集団を運ぶように意図された出口マイクロチャネル（３３、４３）を介して、前記カプセル化ユニット（１２０、２２０、３２０）へと選択的に接続され、
前記出口マイクロチャネル（３３、４３）は、例えば気泡式または溶解可能な阻止ゲルを有する形式の流体バルブ（３２、４２）を備えており、
前記バルブの開放および閉鎖のそれぞれによって、各マイクロリザーバの前記選別後の集団の濃度が、前記カプセル化ユニットにおいて形成されるカプセル（Ｃ）の数の関数としてそれぞれ低下および上昇させられ、
各マイクロリザーバ（３１、４１）は、好ましくは、前記バルブ（３２、４２）が閉鎖されているときに前記集団（Ａｔ）を含んでいる相を前記集団（Ａｔ）を残して排出できるように設計された複数の微細な横出口マイクロチャネル（３４、４４）をさらに有している、請求項８に記載のマイクロ流体システム（１、１０１）。
【請求項１１】
２０μｍ〜５００μｍの範囲のサイズであって、２０〜１００００個の細胞からなっているランゲルハンス島などの比較的凝集性に乏しい細胞集団（Ａ）を選別するための方法であって、
前記集団を、分離すべき該集団のサイズおよび数に適した構造を有しているマイクロ流体システム（１、１０１）のマイクロチャネルアレイに流す工程と、
前記集団を、該集団のサイズに従って互いに偏向させる工程と、を含んでおり、
前記偏向は、前記集団を少なくとも２つの選別マイクロチャネル（１１１〜１１４）へと案内するような方法で行われ、
前記少なくとも２つのマイクロチャネル（１１１〜１１４）は、該少なくとも２つのマイクロチャネル（１１１〜１１４）と同数に分類された選別後の集団（Ａｔ）を並列に、この同じシステムにおける集団のカプセル化を目的として運搬し、
それぞれ前記選別後の集団（Ａｔ）のための少なくとも２つのサイズ分類を前記選別マイクロチャネル（１１１〜１１４）に生成するために、前記集団（Ａ）をサイズによって選別するための少なくとも１つの選別ステージが使用され、
それぞれの選別ステージが、
‐流体力学的フォーカシング、決定論的横変位（ＤＬＤ）、または流体力学的ろ過による受動的な流体力学的偏向、または、
‐静電気力もしくは磁力または電磁波もしくは音波に組み合わせられた流体力学的偏向
を使用し、
前記選別後の集団（Ａｔ）は、前記選別マイクロチャネル（１１１〜１１４）に並列にそれぞれ連通した複数のカプセル化サブユニット（１２１〜１２４）で、自動化された方法でカプセル化され、前記それぞれのカプセル化サブユニット（１２１〜１２４）は、対応する選別マイクロチャネルを流れるサイズ分類の選別後の集団（Ａｔ）をカプセル化する選別方法。
【請求項１２】
選別後の集団（Ａｔ）のそれぞれのサイズ分類について、当該カテゴリの各集団を可能な限り密接に囲む所定のサイズのカプセル（Ｃ）が形成され、好ましくは値Ｄａ未満の臨界サイズに従う選別後の集団の分類について、約Ｄａ＋２０μｍ〜Ｄａ＋１５０μｍのカプセルサイズのカプセル（Ｃ）が形成される、請求項１１に記載の選別および連続的なカプセル化の方法。
【請求項１３】
前記カプセル（Ｃ）は、選別後の集団（Ａｔ）の各分類について、Ｔ分岐装置、マイクロ流体流フォーカシング装置（ＭＦＦＤｓ）、マイクロチャネルアレイ（ＭＣアレイ）装置、およびマイクロノズルアレイ（ＭＮアレイ）装置からなるグループから選択される装置（１２７、２２１）によって形成され、
前記カプセル（Ｃ）は、好ましくは、各分類の前記選別後の集団（Ａｔ）を含んでいる水相（３２１）と、該水相に非混和である相（３２２）、例えば油相と、の間の物質の交換によって形成され、圧力の上昇によって前記２つの相の間の界面が破れることで、前記カプセルが形成される、請求項１１または１２に記載の選別および連続的なカプセル化の方法。
【請求項１４】
形成されたカプセル（Ｃ）は、該カプセルおよび該カプセルを含んでいる例えば油−アルギン酸塩形式のカプセル化相を水性または非水性のゲル化相へと移すことによってゲル化される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の選別および連続的なカプセル化の方法。
【請求項１５】
選別時の圧力損失を最小にするために、それぞれのカプセル化の前に、前記選別後の集団（Ａｔ）が、該集団を含んでいる培地から該集団を含むように意図されるカプセル化相へと移される、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の選別および連続的なカプセル化の方法。
【請求項１６】
選別とカプセル化との間の流体接続をさらに備えており、
前記流体接続は、対応するマイクロチャネル内の層流の状態を維持する効果を有しており、前記選別後の集団（Ａｔ）を直接または選択的に前記カプセル化相に連通させる、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の選別および連続的なカプセル化の方法。
【請求項１７】
前記流体接続は、選別時およびカプセル化時に前記層流の状態を維持するために適した寸法および形状を有している微細な中間マイクロチャネルによってなされる、請求項１６に記載の選別および連続的なカプセル化の方法。
【請求項１８】
前記流体接続は、選別後の集団を保存する緩衝マイクロリザーバ（３１、４１）内の選別後の集団（Ａｔ）の各分類の濃度を調節することによってなされ、
前記緩衝マイクロリザーバ（３１、４１）は、前記選別マイクロチャネル（１１１〜１１４）のうちの１つに連通するとともに、選別後および濃縮後の集団を運ぶ出口マイクロチャネル（３３、４３）へと、流体バルブ（３２、４２）を介して選択的に接続され、
前記バルブの開放および閉鎖のそれぞれによって、前記マイクロリザーバ内の前記選別後の集団の濃度が、形成されているカプセル（Ｃ）の数の関数としてそれぞれ低下および上昇させられることで、空のカプセルの形成が最小化され、
前記マイクロリザーバは、前記バルブが閉鎖されているときに前記集団を含んでいる水相を前記集団を残して排出できるように設計された複数の微細な横出口マイクロチャネル（３４、４４）を備えている、請求項１６に記載の選別および連続的なカプセル化の方法。
【請求項１９】
前記細胞集団（Ａｔ）は、ランゲルハンス島であり、５０μｍ未満のサイズに従って選別された島について、７０μｍ〜２００μｍの範囲のカプセル（Ｃ）のサイズでカプセル化が行われ、選別された最大の島について、６５０μｍに達することができるカプセルサイズでカプセル化が行われる、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の選別および連続的なカプセル化の方法。
【請求項２０】
細胞、細菌、細胞小器官、もしくはリポソーム、または細胞集団（Ａｔ）を、好ましくは、最初の事例では付着分子による対象の分類に従い、細胞集団の事例ではサイズ分類に従って選別し、次いで選別後の各分類について連続的かつ自動的な様相でカプセル化を行うための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム（１、１０１）の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ランゲルハンス島などの細胞集団を選別するため、および選別後の集団をそれら選別後の集団のサイズに適したサイズのカプセルに連続的かつ自動的に封入するためのマイクロ流体システムおよび方法に関する。本発明は、特には、そのような細胞集団の選別およびカプセル化の間の接続に適合されるが、より広くには、特に細胞、細菌、細胞小器官、またはリポソームの選別およびカプセル化の間の接続にも適用される。
【背景技術】
【０００２】
細胞のカプセル化は、細胞または細胞集団を、移植の際の免疫系による攻撃から守るために、マイクロカプセル内に固定することからなる技法である。カプセルの多孔性が、栄養素の分子や酸素分子など、カプセル化された細胞の代謝に不可欠な低分子量の分子の進入を許さなければならないと同時に、抗体または免疫系の細胞など、より大きな分子量の物質の進入を阻止しなければならない。すなわち、カプセルのこの選択的な透過性が、カプセル化された提供者の細胞と、移植の受け手の免疫系の細胞との間に、直接の接触がないことを保証するように設計され、移植の際に使用される免疫抑制処置（この処置は、強力な副作用を有している）の量を抑えることを可能にする。
【０００３】
カプセル化の多数の用途の中でも、膵臓に位置し、インスリンを生成することによって体内の血糖を調節するβ細胞を含むいくつかの細胞種で構成されている壊れやすい細胞の塊であるランゲルハンス島への適用を挙げることができる。これらの島のカプセル化は、インスリン依存の糖尿病（免疫系が自身のインスリン生成β細胞を破壊してしまう自己免疫疾患）を処置するために使用される従来からの細胞療法（例えば、膵臓または島の移植）の代替である。
【０００４】
生成されるカプセルは、特には生体適合性、機械的強度、および選択的な透過性など、特定の基準に合致していなければならない。他の基本的な基準は、カプセルのサイズであり、細胞集団のサイズを調節することで、以下が可能になるからである（非特許文献１を参照）。
【０００５】
‐細胞の周囲の「無用な」ポリマーの量を少なくでき、したがって細胞の応答時間を短縮することができる。例えば、適切なサイズのカプセルに包まれたランゲルハンス島による血糖の調節は、グルコースがより素早く島へと拡散し、生成されたインスリンがより素早く島から外に出るため、より迅速になる。
【０００６】
‐カプセル内への酸素の拡散がより迅速になることで、細胞の酸素化が改善され、壊死領域の出現の危険が少なくなるため、カプセル化された島の生存性が最大化される。
【０００７】
‐移植すべきカプセルの体積が小さくなり、これは、カプセルを組織の血管再生により適した領域に埋め込むことを可能にする。実際、この血管再生は、カプセル化された細胞の壊死を防ぐために不可欠である。なぜならば、細胞は、特には栄養素および酸素が良好に供給されるよう、血液ネットワークの近くに位置していなければならないからである。例えば、この体積の縮小は、インスリン依存の糖尿病の処置において、カプセル化された島を、血管生成により有利な領域である肝臓または脾臓、ならびに立体障害の理由でカプセルが通常埋め込まれる腹腔に埋め込むことを可能にする。
【０００８】
生体適合性、機械的強度、または選択的な透過性といった特性を、文献に従って十分に得ることができるように見受けられる一方で、カプセルのサイズについては、文献に従って十分に得ることができるとは言えず、このことは、ランゲルハンス島のカプセル化において特に問題である。これは、現時点で本出願人の知るすべての文献において、これらの島の周囲に形成されるカプセルのサイズが固定されており、平均で６００〜８００μｍ程度である一方で、これらの島は、わずか２０〜４００μｍの範囲のサイズを有するためである。したがって、島のサイズにかかわらずに固定であって同一であるカプセルのサイズは、とりわけ最も効果的な島は最も小さい島であることが最新の研究によって示されている（非特許文献２を参照）ため、問題である。
【０００９】
公知の主要なカプセル化方法は、好みに応じて、
‐同軸な液体または空気ジェット（４００μｍ〜８００μｍの範囲のサイズを有するカプセルが生成される（ただし、生成されるカプセルの平均サイズは、４００μｍよりも６００〜８００μｍにより近い））、
‐ポテンシャルの相違（カプセルのサイズを小さくすることが優先される場合に最も一般的に使用されるカプセル化技法であり、この場合、カプセルのサイズは２００〜８００μｍの範囲である）、または
‐振動技法（使用される溶液の粘度に制約されることがあるという欠点を抱えている）
を使用する。
【００１０】
これらの技法の主たる欠点は、以下のとおりである。
【００１１】
‐カプセルのサイズが、カプセル化すべきランゲルハンス島のサイズに必ずしも適していない。
【００１２】
‐カプセルがゲル化されてポリカチオンの槽へと落とされ、その後に手作業で回収される点で、カプセル化の手順が自動化を欠いており、結果としてカプセルごとの重合時間にばらつきが生じる。
【００１３】
‐カプセルのサイズの分散が、液滴のサイズが小さくなるにつれて大きくなる。
【００１４】
‐生成されるカプセルの再現性に欠けており、生成されるカプセルが必ずしも球形でない。
【００１５】
近年では、細菌、細胞、細胞小器官、ウイルス、核酸、またはたんぱく質のサイズの選別に適したマイクロ流体システムが、開発されてきており、それらのシステムの中でも、以下を挙げることができる。
【００１６】
‐「決定論的横変位（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」、すなわち「ＤＬＤ」によって選別を行うシステム（非特許文献６〜８、ならびに例えば文献ＷＯ−Ａ−２００４／０３７３７４、ＵＳ−Ａ−２００７／００５９７８１、およびＵＳ−Ａ−２００７／００２６３８１を参照）。このシステムは、障害物の周期的なアレイを使用して、選別対象の粒子の経路を選択的に妨げることにもとづいている。装置の形状によって決まる臨界サイズＤｃよりも小さい粒子は、全体としては、柱などの障害物による偏向を受けないが、このサイズＤｃよりも大きい粒子は、柱の各列において同じ方向に偏向させられる。結果として、最大の粒子の経路が、最小の粒子の経路に対して偏向させられ、粒子のサイズ分離が可能になる。ＤＬＤ技法においては、２つの隣接する柱の間の間隔が、偏向させようとする粒子のサイズよりも常に大きいことが指定されている。この装置は、血液サンプル（赤血球、白血球、および血漿の分離）に適している。
【００１７】
‐流体力学的ろ過によって選別を実行するシステム（非特許文献９，１０、ならびに文献ＪＰ−Ａ−２００７  ０２１４６５，ＪＰ−Ａ−２００６  ２６３６９３、およびＪＰ−Ａ−２００４  １５４７４７を参照）。これは、主チャネルおよび横チャネル間の流量の適切な比を選択することによって、それら横チャネルの流体抵抗を調節することからなる。結果として、臨界サイズ（流体抵抗の値によって決まる）よりも大きいサイズの粒子は、たとえ横チャネルの幅よりも小さいサイズであっても、これらの横チャネルに進入することができない。
【００１８】
‐流線の偏向のみを使用してサイズによる選別を行うより単純なシステム（非特許文献１１，１２、ならびに例えば文献ＷＯ−Ａ−２００６／１０２０２５８を参照）。選別領域において、流線が低圧領域に向かって偏向させられる。流線の位置の相違が強調され、粒子は、自身の慣性中心が位置している流線をたどるため、小さな粒子と大きな粒子との間の位置の相違が強調される。
【００１９】
‐臨界値よりも小さいサイズを有する分子の通過を許し（文献ＵＳ−Ａ−２００５／０１３３４８０を参照）、あるいは粒子の濃縮または粒子を運んでいる流体の分離のために、流体のみの通過を許す（この場合には、文献ＷＯ−Ａ−２００６／０７９００７を参照）ことができるフィルタを使用する選別システム。これらのフィルタ選別システムの主たる限界は、粒子によって流路が詰まりかねない点にある。
【００２０】
‐マイクロ流体装置を外部のフィールド（例えば、光学的な蛍光または吸収の測定（文献ＷＯ−Ａ−２００２／０２３１６３およびＷＯ−Ａ−０２／４０８７４を参照）、光学トラップ、誘電泳動、伝導度測定、電位差測定または電流測定、リガンド／レセプタの結合の検出、など）に組み合わせてなる選別システム。
【００２１】
これらの文献に提示されたすべてのマイクロ流体選別システムの主たる欠点は、それらが、ランゲルハンス島または同様のサイズの他の比較的凝集力に乏しい集団など、細胞集団の選別に全く適していないことである。実際、すでに述べたように、これらの集団のそれぞれは、そのサイズ（単一の細胞の約１０μｍに対し、ランゲルハンス島では２０μｍ〜４００μｍ）および弱い凝集力（使用されるマイクロ流体選別システムにおいて、弱いせん断応力が使用されなければならないことを意味する）ゆえに、細胞とはかなり異なった挙動を示す。
【００２２】
そのような細胞集団を選別するための本出願人が知る唯一のシステムは、Ｕｎｉｏｎ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａ社によって市販されている「ＣＯＰＡＳ」として知られるフローサイトメトリである。このシステムは、マイクロ流体式ではないが、レーザ照射のビーム内で集団のそれぞれの飛行時間を測定することによって、集団をサイズによって選別する（非特許文献１３］を参照）。
【００２３】
近年では、マイクロ流体カプセル化システムも開発されてきており、それらは、特には
・Ｔ分岐（非特許文献１４を参照）、
・マイクロ流体流フォーカシング装置（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｆｌｏｗ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ：ＭＦＦＤ）のオリフィス（非特許文献１５を参照）、
・構造化マイクロチャネル（非特許文献１６を参照）、または
・ノズル（非特許文献１７を参照）
において形成することができる乳濁液を使用する。
【００２４】
これらのカプセル化システムは、多数の文献の主題であり、とりわけ文献ＷＯ−Ａ−２００４／０７１６３８、ＵＳ−Ａ−２００７／００５４１１９、ＦＲ−Ａ−２７７６５３５、ＪＰ−Ａ−２００３  ０７１２６１、およびＵＳ−Ａ−２００６／０１２１１２２が挙げられ、さらに詳しくは、細胞または細胞集団のカプセル化ならびに形成されたカプセルのゲル化について、文献ＵＳ−Ａ−２００６／００５１３２９、ＷＯ−Ａ−２００５／１０３１０６、およびＷＯ−Ａ−２００６／０７８８４１が挙げられる。
【００２５】
ゲル化工程は、文献ＵＳ−Ａ−２００６／００５１３２９およびＷＯ−Ａ−２００５／１０３１０６に記載されているように、コイルの形態のマイクロチャネルまたはＨ字形のマイクロチャネルを有するマイクロシステムにおいて直接的に実行される。
【００２６】
これらのマイクロ流体カプセル化システムの主要な欠点は、導入部において上述した欠点と同じであり、細胞集団のサイズにかかわらず、ただ１つのカプセルサイズしか得られない点にある。本出願人の知るところでは、Ｗｙｍａｎらの装置（非特許文献１８および文献ＵＳ−Ａ−２００７／０００９６６８を参照）だけが、カプセルのサイズをランゲルハンス島などの細胞集団のサイズに合わせることを、カプセル化される島のサイズと関係なく２０μｍの領域の一定な厚さを有しているカプセルで包むことによって可能にしている。後者の文献においては、水相が油相の上方に配置され、これら２つの相のそれぞれの相対密度を調節することによって、島が水／油の界面に発見される。界面から特定の距離において油中に配置されたサンプリングチューブが、水相および島を微細なジェットにて取り出すことを可能にし、この微細なジェットが、表面張力の作用のもとで崩れ、固定の厚さの微細なヒドロゲル被膜が島の表面に残され、ＵＶ照射によって重合を生じる。しかしながら、この装置は、巨視的な装置であって、マイクロ流体システムではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】De Vos, Association between capsule diameter, adequacy of encapsulation, and survival of microencapsulated rat islet allografts. Transplantation, 1996. 62: p. 893-899.
【非特許文献２】Lehmann, R., Superiority of small islets in human islet transplantation. Diabetes, 2007. 56: p. 594-603.
【非特許文献３】Zimmermann, Fabrication of homogeneously cross-linked, functional alginate microcapsules validated by NMR-, CLSM-, and AFM-imaging. Biomaterials, 2003. 24: p. 2083-2096.
【非特許文献４】Goosen, Electrostatic droplet generation for encapsulation of somatic tissue: assessment of high-voltage power supply. Biotechnol.Prog., 1997. 13(497-502).
【非特許文献５】Seifert, Production of small, monodispersed alginate beads for cell immobilization. Biotechnol.Prog., 1997. 13: p. 562-568.
【非特許文献６】Huang, Continuous particles separation through deterministic lateral displacement. Science, 2004. 304(987-990).
【非特許文献７】Davis, Deterministic hydrodynamics: taking blood apart. PNAS, 2006. 103(40): p. 14779-14784.
【非特許文献８】Inglis, Critical particle size for fractionation by deterministic lateral displacement. Lab on a chip, 2006. 6: p. 655-658.
【非特許文献９】Yamada, Microfluidic particle sorter employing flow splitting and recombining. Anal.Chem, 2006. 78: p. 1357-1362.
【非特許文献１０】Yamada, Hydrodynamic filtration for on-chip particle concentration and classification utilizing microfluidics. Lab on a chip, 2005. 5: p. 1233-1239.
【非特許文献１１】Yamada, Pinched flow fractionation: continuous size separation of particles utilizing a laminar flow profile in a pinched microchannel. Anal.Chem, 2004. 76: p. 5465-5471.
【非特許文献１２】Takagi, Continuous particle separation in a microchannel having asymmetrically arranged multiple branches. Lab on a chip, 2005. 5: p. 778-784.
【非特許文献１３】Internet site of the company Union Biometrica, the address of which is http://www.unionbio.com/applications/app_notes/app_islet.html
【非特許文献１４】Thorsen, Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device. Physical Review Letters, 2001. 86(18): p. 4163-4166.
【非特許文献１５】Anna, Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied physics letters, 2003. 82(3): p. 364-366.
【非特許文献１６】Sugiura, Interfacial tension driven monodispersed droplet formation from microfabricated channel array. Langmuir, 2001. 17: p. 5562-5566.
【非特許文献１７】Sugiura, Size control of calcium alginate beads containing living cells using micronozzle array. Biomaterials, 2005. 26: p. 3327-3331.
【非特許文献１８】Wyman, Immunoisolating pancreatic islets by encapsulation with selective withdrawal. Small, 2007. 3(4): p. 683-690.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
本発明は、上述のすべての欠点を改善するマイクロ流体システムであって、細胞選別ユニットを含むマイクロチャネルアレイがエッチングされた基板を備えており、該基板の周囲に保護カバーが接合されているマイクロ流体システムを提案することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
この趣旨で、本発明によるマイクロ流体システムにおいては、選別ユニットが、それぞれがおおむね２０μｍ〜５００μｍの範囲のサイズおよびおおむね２０〜１００００個の細胞を有しているランゲルハンス島などの比較的凝集性に乏しい細胞集団を、当該選別ユニットを流れる際に、好ましくはそれらのサイズに従って、当該選別ユニットの出口に位置する並列に配置された少なくとも２つの選別マイクロチャネルへと分離することができる偏向手段を備えており、前記少なくとも２つの選別マイクロチャネルが、当該選別マイクロチャネルと同数に分類された選別後の集団を、やはり当該アレイに形成されている選別後の集団をカプセル化するためのユニットへと運ぶように、それぞれ設計されている。
【００３０】
細胞集団または細胞集団を被覆するカプセルの「サイズ」という用語は、本明細書において、実質的に球形の集団またはカプセルの場合には、直径を意味することが意図されており、さらに一般的には、この集団またはカプセルの最大の横断寸法（例えば、回転楕円体の近似では、楕円形断面の長軸）を意味することが意図されている。
【００３１】
本発明によるマイクロシステムの選別に専用のマイクロチャネルが、ランゲルハンス島などの細胞集団を、それらの規模によって、偏向によって分離できることに注目できる。これは、単一の細胞の選別にしか適していない公知のマイクロ流体システムから大きく相違する。実際、これらの島のサイズが、公知の様相で２０〜４００μｍの範囲であるのに対し、細胞については平均で１〜１０μｍであり、島は、それらの壊れやすさおよび弱い凝集ゆえに、単一の細胞よりもさらに注意深く取り扱わなければならず、このことが、選別ユニットにおいて加えることができるせん断応力の範囲を制限している。
【００３２】
好都合には、前記選別ユニットは、前記集団をサイズによって選別するための少なくとも１つの選別ステージを備えてもよく、そのような選別ステージは、それぞれ前記選別後の集団のための少なくとも２つのサイズ分類を前記選別マイクロチャネルに生成するように設計される。
【００３３】
本発明によるシステムの所与のマイクロチャネルのグループによって形成されるサイズ選別ステージが、所望のとおりの数のサイズ分類を（並列に設けられる選別マイクロチャネルの数の関数として）得ることを可能にし、特にはこの選別に続いて、形成されるカプセルのサイズを選別後の細胞集団の各分類のサイズに合わせることを可能にする点に、注目できる。
【００３４】
また、複数のサイズ選別ステージを連続的に接続（すなわち、選別ステージを次々に配置）して、選別ユニットの最終的な有効性を最適にできることにも注目できる。
【００３５】
本発明の一実施形態によれば、前記選別ステージまたは各選別ステージの前記偏向手段が、受動的な流体力学的手段であり、この受動的な流体力学的手段が、当該選別ステージの少なくとも１つのマイクロチャネルに含まれる偏向柱からなる設備による決定論的横変位（ＤＬＤ）を有する形式の手段であり、好ましくは流体力学的フォーカシング形式の手段であり、あるいは主マイクロチャネルに対して横方向に配置されたろ過マイクロチャネルによる流体力学的ろ過を有する形式の手段である。
【００３６】
変形例として、前記選別ステージまたは各選別ステージの前記偏向手段は、本発明によれば、静電気力もしくは磁力または電磁波もしくは音波に組み合わせられた流体力学的手段であってよい。
【００３７】
本発明の別の特徴によれば、前記選別後の集団をそれらの分類の関数として自動的にカプセル化できるカプセル化ユニットが、前記選別マイクロチャネルに流体連通して前記アレイにさらに形成されており、このカプセル化ユニットが、選別後の各集団の周囲に、生体適合性であり、機械的に強く、選択的に透過性である単層または多層のカプセルを連続的に形成することができる。
【００３８】
このカプセル化ユニットは、並列に配置された複数のカプセル化サブユニットを備えてもよく、これら複数のカプセル化サブユニットが、それぞれ前記選別マイクロチャネルに連通しており、該選別マイクロチャネルを流れる選別後の集団のそれぞれのサイズ分類について、当該分類の各集団を可能な限りぴったりと囲むように設計された所定のサイズのカプセルを形成する。
【００３９】
好都合には、各カプセル化サブユニットが、前記カプセルを形成するための装置であって、Ｔ分岐装置、マイクロ流体流フォーカシング装置（ＭＦＦＤ）、マイクロチャネル（ＭＣ）アレイ装置、およびマイクロノズル（ＭＮ）アレイ装置で構成されるグループから選択される装置を備えてもよい。
【００４０】
変形例として、各カプセル化サブユニットは、各分類の前記選別後の集団を含んでいる水相と、該水相に非混和である相、例えば油相、との間の物質の交換器を備えてもよく、この交換器が、圧力の上昇によって前記２つの相の間の界面が破れることによって前記カプセルが形成されるように設計されている。
【００４１】
本発明の別の特徴によれば、前記カプセル化ユニットが、形成されたカプセルをゲル化するための手段をさらに備えてもよく、このゲル化手段が、マイクロチャネルで構成された物質の交換器であって、カプセルを含んでいる、例えば油−アルギン酸塩形式の、カプセル化相から水性または非水性のゲル化相へとカプセルを移すために専用である交換器を備える。
【００４２】
このようにして、本発明によるマイクロシステムが、今や作業者が、カプセル化および出口におけるあらかじめ選別された集団のサイズに合わせられているカプセルの回収に必要な物質に対応する種々のリザーバを満たすだけでよいという意味で、細胞集団のカプセル化手順の完全な自動化を可能にすることに、注目できる。
【００４３】
したがって、マイクロシステムが、選別、カプセル形成、およびゲル化の各工程を、連続的かつ自動化された様相で実行し、単純なカプセル化および多層のカプセル化の双方に適合させることが可能である。後者の場合には、カプセル化モジュールが、カプセルを洗浄するための工程、および他のポリマーまたはポリカチオンの溶液に接触させる工程を組み込むことによって、複雑化される。
【００４４】
好ましくは、前記マイクロチャネルのアレイに、前記選別後の集団を該集団を含んでいる培地から該集団を前記カプセル化ユニットに収容するように意図されたカプセル化相へと移すように設計された移送モジュールが形成され、この移送モジュールが、前記選別マイクロチャネルのそれぞれに流体連通しており、前記選別ユニットにおける圧力損失を最小化するように設計されている。
【００４５】
実際、移植を目的とする島は、培地に保存されるが、カプセル化のために、ポリマー溶液（最も頻繁には、低いせん断応力でも高い粘性である非ニュートン流体）へと移さなければならない。カプセル化の手順を可能な限り自動化するために、前記移送モジュールが、流体抵抗が押しのけられる溶液の粘性に比例するという事実に鑑み、選別ユニットにおける圧力損失を抑えるために、選別ユニットとカプセル化ユニットとの間においてマイクロシステムへと一体化される。
【００４６】
この移送モジュールは、マイクロシステムの合計の圧力を低くし、したがって加えられる圧力が高すぎる場合の漏れの危険性を少なくするという利点も有している。
【００４７】
本発明の他の重要な特徴によれば、前記マイクロ流体システムが、好都合には、前記選別ユニットを前記カプセル化ユニットへと接続するためのモジュールをさらに備え、この接続モジュールが、前記カプセル化ユニットを前記選別ユニットに直接または選択的に連通させることによって、これら２つのユニットに層流の状態を維持するように設計される。
【００４８】
公知のマイクロシステムがいずれも、選別工程をカプセル化工程へと接続してはいないことに注目できる。ここで、この接続は、選別ユニットの流体工学がカプセル化ユニットの流体工学を妨げる可能性があるため、容易には実現できない。したがって、これら２つのユニットに層流の状態を維持するために、関係するマイクロチャネルの全体としての圧力損失（すなわち、流体抵抗）をモデル化する必要がある。このモデル化は、カプセル化が最も一般的には非ニュートンポリマー（例えば、アルギン酸塩）を使用するため、特に複雑である。非ニュートンポリマーの粘性は、当該流体へと加えられるせん断応力に依存し、したがって全体システムのモデル化を難しくする。
【００４９】
本発明の１つの典型的な実施形態によれば、この接続モジュールが、前記選別マイクロチャネルを前記カプセル化ユニットへとそれぞれ接続する中間マイクロチャネルで構成されており、これらの中間マイクロチャネルが、上流および下流の前記層流の状態を維持するために適した寸法および形状を有している。
【００５０】
この典型的な実施形態によるこの接続モジュールの欠点は、これらの中間マイクロチャネルに必要とされる緻密な寸法設計に加え、多数の空カプセルが各カプセル化サブユニットにおいて形成されかねず、カプセル化サブユニットの出口において空カプセルと選別後の集団を含んでいるカプセルとの間の最終的な選別が必要になりかねない点にある。
【００５１】
本発明の他の好ましい典型的な実施形態によれば、この接続モジュールが、選別後の集団を保存するための緩衝マイクロリザーバを備えており、これらの緩衝マイクロリザーバのそれぞれへと、前記選別マイクロチャネルのうちの１つが開いており、緩衝マイクロリザーバのそれぞれが、選別および濃縮後の集団を運ぶように意図された出口マイクロチャネルであって、例えば気泡式または溶解可能な阻止ゲル（カプセル化にアルギン酸塩が使用される場合には、好ましくはアルギン酸塩ゲルを含んでいる）を有する形式の流体バルブを備えている出口マイクロチャネルを介して、前記カプセル化ユニットへと選択的に接続され、前記バルブの開放および閉鎖のそれぞれによって、各マイクロリザーバの前記選別後の集団の濃度が、前記カプセル化ユニットにおいて形成されるカプセルの数の関数としてそれぞれ低下および上昇させられる。
【００５２】
この好ましい流体バルブ接続モジュールが、この各マイクロリザーバの濃度の調節によって、空カプセルの形成を最小限にすることを可能にする点に、注目できる。
【００５３】
好都合には、各緩衝マイクロリザーバが、前記バルブが閉鎖されているときに前記集団を含んでいる相を前記集団を残して排出できるように設計された複数の微細な横出口マイクロチャネルをさらに有することができる。
【００５４】
一般に、本発明によるマイクロ流体システムは、カプセル化ユニットによって形成されたカプセルを個人へ移植できることに相違ないため、殺菌可能でなければならないことに注目できる。
【００５５】
おおむね２０μｍ〜５００μｍの範囲のサイズであって、おおむね２０〜１００００個の細胞からなっているランゲルハンス島などの比較的凝集性に乏しい細胞集団を選別するための本発明による方法は、前記集団を、分離すべき該集団のサイズおよび数に適した形状を有しているマイクロ流体システムのマイクロチャネルアレイに流す工程と、前記集団を、該集団のサイズなど、該集団のパラメータのうちの１つに従って互いに偏向させる工程と、で構成され、前記偏向は、前記集団を少なくとも２つの選別マイクロチャネルへと案内するような方法で行われ、該少なくとも２つのマイクロチャネルが、該少なくとも２つのマイクロチャネルと同数に分類された選別後の集団を並列に、この同じシステムにおける集団のカプセル化を視野に運搬する。
【００５６】
好都合には、それぞれ前記選別後の集団のための少なくとも２つのサイズ分類を前記選別マイクロチャネルに生成するために、前記集団をサイズによって選別するための少なくとも１つの選別ステージが使用され、
それぞれの選別ステージが、
−好ましくは流体力学的フォーカシングにより、決定論的横変位（ＤＬＤ）により、もしくは流体力学的ろ過による受動的な流体力学的偏向、または
−静電気力もしくは磁力または電磁波もしくは音波に組み合わせられた流体力学的偏向
を使用する。
【００５７】
本発明の他の特徴によれば、これら選別後の集団を、さらにカプセル化することが可能であり、このカプセル化は、選別後の各集団の周囲に生体適合性であり、機械的に強く、選択的に透過性である単層または多層のカプセルを連続的に形成することによって、前記集団の分類の関数として、並列に、自動化された様相で行われる。
【００５８】
好都合には、選別後の集団の各サイズ分類について、当該カテゴリの各集団を可能な限りぴったりと囲む所定のサイズのカプセルが形成され、好ましくは値Ｄａ未満の臨界サイズに従う選別後の集団の分類について、約Ｄａ＋２０μｍ〜Ｄａ＋１５０μｍ、好ましくはＤａ＋５０μｍのカプセルサイズのカプセルが形成される。
【００５９】
好ましくは、これらのカプセルが、選別後の集団の各分類について、Ｔ分岐装置、マイクロ流体流フォーカシング装置（ＭＦＦＤ）、マイクロチャネル（ＭＣ）アレイ装置、およびマイクロノズル（ＭＮ）アレイ装置で構成されるグループから選択される装置によって形成される。
【００６０】
変形例として、これらのカプセルを、各分類の選別後の集団を含んでいる水相と、この水相に非混和である相、例えば油相、との間の物質の交換によって形成することができ、圧力の上昇によって前記２つの相の間の界面が破れることで、前記カプセルが形成される。
【００６１】
本発明の他の特徴によれば、形成されたカプセルが、それらのカプセルおよびそれらのカプセルを含んでいる、例えば油−アルギン酸塩形式の、カプセル化相を水性または非水性のゲル化相へと移すことによってゲル化される。
【００６２】
カプセル化に使用されるポリマーは、例えばカプセル化に最も一般的に使用されるポリマーである、アルギン酸塩ヒドロゲルであってよい。しかしながら、本発明によるカプセル化は、このヒドロゲルに限られず、カプセル化ユニットが選択されるポリマーが必要とするゲル化の種類に合わせて構成される限りにおいて、これらに限られるわけではないがキトサン、カラギーナン、アガロースゲル、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など、他のカプセル化材料も選択可能である。
【００６３】
好ましくは、選別時の圧力損失を最小にするために、それぞれのカプセル化の前に、選別後の集団が、該集団を含んでいる培地から該集団を含むように意図されるカプセル化相へと移される。
【００６４】
また好ましくは、本発明による方法は、選別とカプセル化との間の流体接続をさらに含み、この流体接続が、対応するマイクロチャネルに層流の状態を維持する効果を有し、この流体接続が、前記選別後の集団を直接または選択的に前記カプセル化相に連通させる。
【００６５】
上述のように、この接続は、選別時およびカプセル化時に層流の状態を維持するために適した寸法および形状を有している中間マイクロチャネルによって実行することができる。
【００６６】
変形例として、この接続を、好ましくは、選別後の集団を保存する緩衝マイクロリザーバ内の選別後の集団の各分類の濃度を調節することによって実行でき、緩衝マイクロリザーバは、前記選別マイクロチャネルのうちの１つに連通するとともに、選別および濃縮後の集団を運ぶ出口マイクロチャネルへと、流体バルブを介して選択的に接続され、このバルブの開放および閉鎖のそれぞれによって、前記マイクロリザーバ内の選別後の集団の濃度が、形成されているカプセルの数の関数としてそれぞれ低下および上昇させられることで、空のカプセルの形成が最小化される。また、このマイクロリザーバが、好都合には、前記バルブが閉鎖されているときに前記集団を含んでいる相のみを前記集団を残して排出できるように設計された複数の微細な横出口マイクロチャネルを備えている。
【００６７】
好都合には、本発明の方法における前記選別される細胞集団が、ランゲルハンス島であり、５０μｍ未満のサイズに従って選別された島について、７０μｍ〜２００μｍの範囲のカプセルサイズでカプセル化が行われ、例えば５００μｍのサイズに従って選別されたる最大の島について、６５０μｍに達することができるカプセルサイズでカプセル化が行われる。
【００６８】
上述のように、マイクロ流体システムの本発明による１つの用途は、細胞、細菌、細胞小器官、もしくはリポソーム、または細胞集団を、好ましくは、最初の事例では付着分子による対象の分類に従い、細胞集団の事例ではサイズ分類に従って選別し、次いで選別後の各分類について連続的かつ自動的な様相でカプセル化を行うことで構成される。
【００６９】
実際に、本発明は、細胞集団のサイズによる選別およびその後のカプセル化のみに限定されるわけではなく、広くには、細胞、細菌、細胞小器官、またはリポソームの選別とその後のカプセル化との任意の組み合わせであって、これらのきわめて異なる粒子からなる異種集団において細胞、細菌、細胞小器官、またはリポソームを選別し、対象の細胞／細菌／細胞小器官／リポソームのみをカプセル化するような方法での選別およびカプセル化の組み合わせに関することに、注目できる。
【００７０】
本発明の他の利点、特徴、および詳細が、添付の図面を参照してあくまでも例として提示される以下のさらなる説明から、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】製造方法の第１の段階にある本発明によるマイクロ流体システムの概略横断面図であり、基板の酸化を示している。
【図２】製造方法の第２の段階にある図１のシステムの概略横断面図であり、前記酸化後の基板上への感光樹脂の塗布を示している。
【図３】製造方法の第３の段階にある図２のシステムの概略横断面図であり、マイクロチャネルを生成するためのフォトリソグラフィおよびドライエッチングという後続の工程の結果を示している。
【図４】製造方法の第４の段階にある図３のシステムの概略横断面図であり、ディープエッチング工程の結果を示している。
【図５】製造方法の第５の段階にある図４のシステムの概略横断面図であり、樹脂の剥離およびウェットエッチングによる脱酸の工程の結果を示している。
【図６】製造方法の第６の段階にある図５のシステムの概略横断面図であり、酸化工程の結果を示している。
【図７】製造方法の第７の段階にある図６のシステムの概略横断面図であり、マイクロチャネルの断面を定めるための保護カバーの貼り付けの工程の結果を示している。
【図８】本発明の典型的な実施形態によるマイクロ流体システムの一部分の上方からの概略図であり、流体力学的ろ過による選別のためのユニットおよび該ユニットへと接続されたＴ分岐によるカプセル化のためのユニットを示している。
【図９】流体力学的フォーカシングによる選別を備えている本発明による選別ユニットの一例における流線をモデル化する画像である。
【図１０】決定論的横変位（ＤＬＤ）偏向手段を備えている本発明による選別ユニットのマイクロチャネルの上方からの概略図である。
【図１１】図１０の丸囲み部分の詳細図であり、これらの偏向手段によって得られる軌跡の偏向の例を記号的に示している。
【図１２】流体力学的ろ過による選別を備えている本発明による選別ユニットの別の例における流線をモデル化する画像である。
【図１３】選別後の島を培地からカプセル化に用いられるアルギン酸塩の溶液へと移すためのモジュールを形成しているマイクロチャネルの構成配置を概略的に表わしている画像である。
【図１４】本発明による選別／カプセル化方法の実現の例において、４つのカプセル化サブユニットへとそれぞれ接続された４つの選別ステージを示しているブロック図である。
【図１５】Ｔ分岐のフォーカシング装置を概略的に示している画像であり、本発明による各カプセル化サブユニットにおいて乳濁液を形成するように意図されている。
【図１６】ＭＦＦＤ形式のフォーカシング装置を概略的に示している画像であり、本発明による各カプセル化サブユニットにおいて乳濁液を形成するように意図されている。
【図１７】形成されたカプセルを油相から水相へと移すために本発明によるカプセル化ユニットに含まれるゲル化モジュールの概略図である。
【図１７ａ】本発明によるカプセル化ユニットに備えることができる図１７の変形例によるゲル化モジュールの概略縦断面図である。
【図１７ｂ】本発明によるカプセル化ユニットに備えることができる図１７ａの変形例によるゲル化モジュールの概略縦断面図である。
【図１７ｃ】図１７ａまたは図１７ｂのゲル化モジュールの出口に計画される分離部材の本発明による変形例の一部分の概略縦断面図である。
【図１８】選別ステージおよび対応するカプセル化サブユニットへと接続される本発明の第１の例による接続モジュールの概略図である。
【図１９】選別ステージおよび対応するカプセル化サブユニットへと接続される本発明の第２の例による接続モジュールの概略図である。
【図２０】好ましくは決定論的横変位（ＤＬＤ）によって実行されるサイズの選別に後続する本発明の別の典型的な実施形態による受動流体カプセル化ユニットの概略図である。
【図２１】本発明によるカプセル化ユニットの概略図であり、特にはフォーカシング装置による３層カプセルの形成およびそのゲル化の工程を示している。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
本発明によるマイクロ流体システム１は、例えば、シリコン上のマイクロエレクトロニクスの公知の方法にもとづく種々の工程（すなわち、特には基板３上でのリソグラフィ、ディープエッチング、酸化、剥離、および保護カバー２の接合）を説明している図１〜図７を参照して、製造することができる。このシリコン上の技法は、きわめて正確（マイクロメートル程度）であり、エッチングの深さおよびユニットの幅の両方に関して制約がないという利点を有している。より具体的には、マイクロシステム１を製造するための手順は、以下のとおりである。
【００７３】
酸化ケイ素４（図１）が、シリコン基板上に成膜される。次いで、感光樹脂５が、前面への塗布によって成膜され（図２）、その後に酸化ケイ素４が、フォトリソグラフィおよび酸化ケイ素４のドライエッチングによって、樹脂５の層を通してシリコン基板３までエッチングされる（図３）。
【００７４】
次いで、この基板３が、ディープエッチング６によって、所望されるマイクロチャネルの深さまでエッチングされ（図４）、その後に樹脂が、「剥離」される（図５）。次いで、残っている熱酸化ケイ素４が、ウェットエッチングによる脱酸によって除去され（図５）、その後に、新たな熱酸化物７の層が成膜される（図６）。
【００７５】
次いで、得られたチップが切り出され、ガラスまたは観察を可能にすべく透明である他の材料で作られた保護カバー２が、例えば陽極接合または直接接合によって貼り付けられる（図７）。
【００７６】
マイクロチャネルまたは毛管（不図示）の組み立ての前に、疎水シラン化形式の表面処理を行うことも可能である。
【００７７】
上述の手順は、たどることができる多数の製造手順のうちの１つである。さらには、基板３について、例えばＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）または他のエラストマーなどといったシリコン以外の材料も、例えばフォトリソグラフィによって前もって作成されたマスター（すなわち、母型）上への成形によって、、使用することが可能である。この製造技法が、マイクロ流体システムが、選別ユニットおよびカプセル化ユニットの間を接続するためのモジュールを備えており、そのようなモジュールが、図１８および図１９を参照して、流体バルブを備えている場合に、きわめて適していることに注意すべきである。
【００７８】
図８に示した本発明の例によるマイクロ流体システム１０１は、一方では、流体力学的ろ過によって集団Ａをサイズによって選別するためのユニット１１０と、カプセル化ユニット１２０とを備えている。選別ユニット１１０は、４つの横選別チャネル１１１〜１１４を終端としている。カプセル化ユニット１２０は、４つのカプセル化サブユニット１２１〜１２４へと分割され、４つのカプセル化サブユニット１２１〜１２４のそれぞれが、上記マイクロチャネルのそれぞれへと接続され、サイズ分類Ａｔの選別済みの集団を輸送する。
【００７９】
この分類ユニット１１０の原理が、図１２に示されており、壁への集団Ａの集中にもとづいている。より具体的には、この図１２に関して、横マイクロチャネル１１１〜１１３の流体抵抗が、主マイクロチャネル１１５とこれらの横マイクロチャネルとの間の流量の比を適切に選択することによって調節される。その結果、集団Ａは、それらのサイズおよびこれらの横マイクロチャネルのそれぞれの流体抵抗の関数として、横チャネル１１１〜１１３のうちの１つにだけ進入することができる。横マイクロチャネルの流体抵抗は、そのようなマイクロチャネル１１１、１１２、１１３、または１１４に進入できる集団Ａのサイズ範囲を割り出すために、精密に計算される。
【００８０】
集団Ａを壁に集中させるための溶液Ｓが、分岐１１７〜１１９を介して主マイクロチャネル１１５に連通している二次マイクロチャネル１１６へと注入され、この溶液Ｓは、例えば培地またはアルギン酸塩など、ユニット１１０の入り口Ｅにおいて注入される集団Ａを含んでいる溶液と同じであってよい。
【００８１】
このようにして、選別ユニット１１０は、ランゲルハンス島などの細胞集団Ａを、以下の４つの分類に従って選別できるようにする。
【００８２】
‐１００μｍよりも小さい島Ａｔ
‐１００〜２００μｍの島Ａｔ
‐２００〜３００μｍの島Ａｔ、および
‐３００μｍを超える島Ａｔ
図１２の変形例として、図８のシステムにおいて、図９の流体力学的フォーカシングによって選別を行うためのユニット２１０を使用することも、可能であると考えられる。図９において、選別前の集団Ａの導入口、フォーカシング流体Ｓを使用する動的フォーカシング装置２１１、ならびに偏向ゾーン２１２の出口に位置する第１の選別マイクロチャネル２１３および第２の選別マイクロチャネル２１４を見て取ることができる。細胞集団が自身の慣性中心が位置している流線をたどるという仮説に従い、第１の選別マイクロチャネル２１３が、最小であるという事実ゆえに偏向させられて選別された集団Ａｔ１を運び、第２の選別マイクロチャネル２１４が、最大であるとして選別された集団Ａｔ２を運ぶ。フォーカシング流体の一部（集団を含んでいない）のための出口マイクロチャネル２１５も、このゾーン２１２の出口に配置されている。
【００８３】
図１２の別の変形例によれば、図８のシステムにおいて、柱３１１のアレイを使用してＤＬＤによって選別を行うための図１０および図１１のユニット３１０を使用することも、可能であると考えられる。柱３１１のアレイが、マイクロチャネル３１２の内部に所定の方法で配置され、その幾何学的特徴によって、細胞集団の臨界サイズＤｃがもたらされる。Ｄｃよりも小さな粒子は、柱３１２のアレイによって偏向されることがなく、全体として流体の流線をたどる一方で、Ｄｃよりも大きい粒子は、柱３１２のそれぞれの横列において偏向させられ、結果として最小の粒子から分離される。複数の選別ステージを、互いに縦列に配置できることに注意すべきである。この選別ユニット３１０は、選別対象の集団Ａを含んでいる溶液と同時に注入されるフォーカシング用バッファ液Ｆを使用する。
【００８４】
図１０に見て取ることができるとおり、このユニット３１０の出口において、集団を含まないバッファ液Ｆ、ならびに３つの分類の選別済み集団Ａｔ１、Ａｔ２、およびＡｔ３（この典型的な実施形態においては、２００μｍ未満、２００〜３００μｍ、および３００μｍよりも大きいランゲルハンス島にそれぞれ対応する）が、回収される。このように、この例においては、異なる幾何学的特徴の２つの選別ステージが縦列に配置され、２つの臨界選別サイズＤｃ１＝２００μｍおよびＤｃ２＝３００μｍを得ることを可能にしている。
【００８５】
図８に戻ると、選別済みの集団Ａｔを運ぶ４つの横選別マイクロチャネル１１１〜１１４が、ここではＴ分岐型である４つのカプセル化サブユニット１２１〜１２４へとそれぞれ開いている。４つのカプセル化サブユニット１２１〜１２４のそれぞれを、油Ｈが、図１５を参照してカプセルＣを形成するために通過している。図１５には、公知の方法で、この分岐点において合流する２つの相（油およびアルギン酸塩）の間の接触による乳濁液の形成が示されている。変形例として、図８のＴ分岐を図１６のＭＦＦＤフォーカシング装置（この例においては、２つの油相および１つのアルギン酸塩相を合流させる）で置き換えることも、可能であると考えられる。
【００８６】
図１７が、図８のそれぞれのカプセル化サブユニット１２１〜１２４において使用することができ、アルギン酸塩主体のカプセルＣをゲル化のために油相から水相へと移すことができるゲル化モジュール１２５について、考えられる１つの構造を例として示している。このモジュール１２５は、例えば全体としてＨ字形であるが、
‐Ｈ字の縦棒の上端の上流に接続され、水溶液にてＣａ２＋イオンを運ぶように意図された入り口マイクロチャネル１２６と、この同じ縦棒の下端に位置し、合流する３つのマイクロチャネルを備えており、その２つが油相を運ぶように意図され、３つ目がアルギン酸塩を運ぶように意図されており、油中にアルギン酸Ｎａ主体のカプセルＣを形成するＭＦＦＤ形式のカプセル化装置１２７と、
‐Ｈ字の他方の縦棒の上端の下流に接続され、Ｃａ２＋イオンを含んでいる水溶液とこれらのアルギン酸塩主体の運ばれたカプセルＣとの混合物を含むように意図された出口マイクロチャネル１２８と、この他方の縦棒の下端に位置する油相を収容しているマイクロチャネル１２９と、
を備えている。
【００８７】
図１７ａの変形例に示されているゲル化モデル１３５は、本質的には、
‐＊上流においてカプセル化された細胞集団Ａｔを含んでいる油相を運ぶように意図された水平向きの入り口マイクロチャネル１３６、および
＊上記マイクロチャネルに連通しており、上記集団を被覆しているカプセル（アルギン酸塩などの親水性化合物を主体とする）を重合によってゲル化させることができるカルシウムなどの物質を含んでいる水相を、上記マイクロチャネルに側方から注入するように意図された垂直向きの入り口マイクロチャネル１３７
からなる２つの入り口１３６および１３７と、
‐セパレータまたは「壁」１４０（例えば、これらに限られるわけではないが、ケイ素、ガラス、またはＰＤＭＳなどのエラストマーで作られる）によって互いに隔てられ、この壁１４０の各側に位置している
＊カプセル化された細胞集団Ａｔがカプセルを構成している材料（例えば、アルギン酸塩）の親水性ゆえに油相から上方の水相へと移動することで、カプセル化された細胞集団Ａｔを含んでいる水相を運ぶように意図された上側出口１３８、および
＊油相の取り出しのための下側出口１３９
からなる２つの出口１３８および１３９と、
を備えている。
【００８８】
図１７ｂに示されているゲル化モジュール１４５は、上述の親水性の引き寄せによる移動の場所である水平向きの入り口マイクロチャネル１３６の領域に、ＤＬＤ装置において使用される形式の軌道変更ピラーまたは柱１４６の設備（すなわち、隣り合う２つのピラー１４６間の間隔が、カプセル化された集団Ａｔのサイズよりも大きい）を有しており、上述の親水性の引き寄せによる移動に決定論的横変位の効果を付加することによって、カプセル化された集団Ａｔの油相から上方の水相への横変位を増幅できるようにしている点においてのみ、図１７ａのゲル化モジュールから相違している。
【００８９】
図１７ａまたは図１７ｂによるゲル化モジュール１３５、１４５のセパレータ１４０の変形実施形態を示している図１７ｃに示されているように、水相および油相の分離を最適にするために、「２枚壁」の形態のセパレータ１５０を好都合に使用することが可能である。このセパレータ１５０は、中央のすき間チャネル１５３によって互いに隔てられつつ重ねられた２枚の壁または仕切り１５１および１５２で構成されている点においてのみ、先のセパレータとから相違しており、モジュール１３５または１４５の出口において、それぞれより純粋な油相または水相の回収を可能にするとともに、このすき間チャネル１５３によって、中央の水溶液／油の界面を除去することを可能にしている。より具体的には、このチャネル１５３について計画される幅が、ゲル化モジュール１３５、１４５から出るカプセル化済みの集団Ａｔを運ぶことがないような幅である。この２枚仕切りのセパレータ１５０が、特には油中に残る微量の水溶液を少なくして、この油を再使用可能にすることに、注意すべきである。
【００９０】
これらの図１７、図１７ａ、図１７ｂ、および図１７ｃの変形例として、例えば、これに限られるわけではないが、ゲル化を水層においてではなく、１−ウンデカノールにおいて直接実行する図２１による３つのアルギン酸塩−ポリ−Ｌ−リシン−アルギン酸塩層を有するカプセル化ユニット２２０に含まれているゲル化モジュール２２５を使用することが可能である。
【００９１】
この図２１に見て取ることができるとおり、カプセルが、ＭＦＦＤ形式のカプセル化装置２２１の段階で生成され、次いでモジュール２２５において、ＣａＩ２を含んでいる１−ウンデカノールの流れを導入することによってゲル化される。次いで、第１のＨ形洗浄モジュール２２６の段階において、水相へと移されて洗浄される。
【００９２】
次いで、カプセルは、コイル状のチャネル２２７においてＰＬＬ（ポリ−Ｌ−リシン）ポリカチオンの溶液に接触させられる。コイル状のチャネル２２７は、このＰＬＬ溶液におけるカプセルの培養時間の調節を可能にする。続いて、このカプセルが、第２の洗浄モジュール２２８において未結合のＰＬＬを取り除くためにＮａＣｌ溶液で洗浄され、次いでＮａＣｌ洗浄液も、マイクロチャネル２２９において除去される。
【００９３】
最終工程において、カプセルは、取り付けモジュール２３０においてアルギン酸塩の外側層で被覆され、ユニット２２０の出口において３層のアルギン酸塩−ＰＬＬ−アルギン酸塩のカプセルが得られる。
【００９４】
図１３は、培地からカプセル化に使用されるアルギン酸塩の溶液へと選別された細胞集団（例えば、ランゲルハンス島）を移すためのモジュール２０であって、本発明によるマイクロ流体システムに好都合に取り入れることができるモジュール２０について、有用な構造を示している。この移送モジュール２０を形成するマイクロチャネルのそれぞれの流体抵抗およびサイズは、これらの選別された集団が、主マイクロチャネルを流れるように強いられ、したがって培地からアルギン酸塩（または、他のポリマー）の溶液へと渡されるように、調節される。
【００９５】
図１８および図１９は、それぞれ図８の選別ステージ１１１〜１１４のうちの１つへと接続でき、かつこの同じ図８の該当するそれぞれのカプセル化サブユニット１２１〜１２４へと接続できる接続モジュール３０および４０について、２つの好ましい例を示している。それぞれの接続モジュール３０、４０は、選別ユニット１１０およびカプセル化１２０の双方を互いに選択的に連通させることによって、これら２つのユニット１１０および１２０において層流の状態を保つように設計されている。
【００９６】
これら２つの図１８および図１９を参照すると、該当の接続モジュール３０、４０が、どちらも、選別された集団を保存するための緩衝マイクロリザーバ３１、４１を有しており、選別マイクロチャネル１１１〜１１４が、この緩衝マイクロリザーバ３１、４１へと開いている。緩衝マイクロリザーバ３１、４１は、流体バルブ３２、４２によって、バルブ３２、４２が開かれたときに選別および濃縮された集団を運ぶように意図された出口マイクロチャネル３３、５０を介して、カプセル化サブユニット１２１〜１２４へと選択的に接続される。さらに、それぞれのマイクロリザーバ３１、４１は、バルブ３２、４２が閉じられたときに集団を含んでいる相を集団なしで排出（例えば、培地またはアルギン酸塩の溶液の排出）できるよう、複数の微細な横出口マイクロチャネル３４、４４を有している。
【００９７】
バルブ３２、４２を閉じることで、カプセル化溶液中の集団の濃度が、形成される空のカプセルの数を少なくするために十分であるような方法で、集団を保存し、特には濃縮することができるようになる。微細なマイクロチャネル３４、４４が、バルブ３２、４２を閉じても該当の選別ステージの上流の流体の流線に変化が生じないようにすることを可能にする（なお、これらのマイクロチャネル３４、４４のサイズは、集団が進入できず、したがってマイクロリザーバ３１、４１に濃縮を生じさせるようなサイズである）。
【００９８】
より具体的には、図１８を参照すると、この例においては、チップに組み込まれた抵抗加熱素子３２ａによって以下の方法で熱的に開放および閉鎖の制御が行われる「気泡」式のバルブ３２が使用される。空気が室温に保たれているとき、バルブ３２は開いている。バルブの駆動チャンバ３２ｂに収容されている空気の温度が上昇すると、結果として気体の圧力が高まり、この気体が出口マイクロチャネル３３へと導入され、流体の通過を阻止する。
【００９９】
より具体的には、図１９を参照すると、この例においては、溶解可能なブロック用ゲルを備え、好ましくはアルギン酸塩ゲルを備えている形式のバルブ４２が使用される。バルブ４２は、アルギン酸塩溶液をＣａ２＋イオンに接触させることによってアルギン酸塩ゲル４２ａを形成することによって閉じられる。バルブ４２の開放は、ＥＤＴＡあるいはクエン酸ナトリウムまたはＥＧＴＡタイプの他の任意のＣａ２＋イオンキレート剤の溶液によるアルギン酸塩ゲル４２ａの溶解に対応する。ＥＤＴＡおよびＣａ２＋溶液の相対圧力を制御することによって、それぞれの種の量が、ＥＤＴＡが過剰である場合に、すべてのＣａ２＋イオンがキレートされて、アルギン酸塩ゲル４２ａがＥＤＴＡによって溶かされるような方法で制御され、反対に、自由なＣａ２＋イオンによってゲルの形成が可能にされるような方法で制御される。
【０１００】
ゲル４２ａの位置は、アルギン酸塩、Ｃａ２＋、およびＥＤＴＡの各相の相対圧力によって決定される。アルギン酸塩を運ぶマイクロチャネル４５が閉塞することがないよう、少量のＥＤＴＡを、このアルギン酸塩と同時に導入することができる。
【０１０１】
ひとたび集団濃縮工程が完了し、アルギン酸塩ゲル４２ａが溶かされると、ＥＤＴＡ循環圧力（出口マイクロチャネル４３に関して互いに反対側にある２つの異なるマイクロチャネル４６および４７へと注入されるＥＤＴＡ）およびＣａ２＋イオン循環圧力（培地を運ぶマイクロチャネル４９に隣接するマイクロチャネル４８へと注入されるＣａ２＋イオン）は、実質的にゼロであってよく、したがって集団の生存性に関して完全に無害であるアルギン酸塩およびこの培地のみが、チャンバ４３内を循環する。さらに、チャンバ４３は、選別および濃縮後の集団を該当のカプセル化サブユニット１２１〜１２４へと運ぶための出口５０、およびＣａ２＋イオンのみを放出するための微細フィルタマイクロチャネル５１ａを備えている出口５１を有している。
【０１０２】
この形式のバルブ４２の主たる利点が、本発明によるマイクロシステムへの組み込みに関して技術的な厄介事が存在しない点にあることに、注意すべきである。
【０１０３】
図２０が、決定論的横変位（ＤＬＤ）によって実行されるサイズ選別に後続する本発明によるカプセル化ユニット３２０の一変形例を概略的に示している。選別後の細胞集団Ａｔが、受動流体工学によってカプセル化され、カプセル化が、局所的な圧力上昇が現れて、水相−油の界面が破れたときに生じる。
【０１０４】
より具体的には、このカプセル化ユニット３２０は、
‐選別された集団Ａｔを溶液（例えば、これらに限られるわけではないが、生理食塩水、培地、またはアルギン酸塩）中に含んでいる水相のための第１の入り口３２１であって、水平なマイクロチャネル３２１ａを定めている第１の入り口３２１、
‐水相に非混和性である相（例えば、油、ウンデカノール、「ＦＣ」）のための第２の入り口３２２であって、前記第１の入り口３２１の反対側かつ下方に設けられた第２の入り口３２２、
‐第１の入り口３２１を介して導入される水相のための２つの反対向きの出口３２３および３２４であって、第１の入り口３２１よりも下方かつ第２の入り口３２２よりも上方に設けられており、マイクロチャネル３２１ａを直角に延長する垂直なマイクロチャネル３２５に連通している２つの（水平な）横マイクロチャネル３２３ａおよび３２４ａによって互いに接続されている２つの反対向きの出口３２３および３２４、ならびに
‐カプセル化された細胞集団Ａｔを含んでいる非混和物または油相を排出するための出口３２６であって、この非混和相のための第２の入り口３２２の反対側の同じ高さに設けられ、第１の入り口３２１から由来する集団を重力によって受け入れるための垂直な排出マイクロチャネル３２５に連通している下部カプセル化マイクロチャネル３２７を、第２の入り口３２２と一緒に形成している出口３２６
を備えている。
【０１０５】
三次元（マイクロ流体の入り口および出口３２１、３２２、３２３、３２４、および３２６が、同じ平面に位置していないという意味で）に形成されたこのカプセル化ユニット３２０が、２つの横マイクロチャネル３２３ａおよび３２４ａの障害からもたらされる上述の局所的な圧力上昇によるだけでなく、重力による細胞集団の沈降の力によってもカプセルＣを形成できることに、注意すべきである。
【０１０６】
結論として、図１４に例として示されるとおり、本発明の選別／カプセル化方法は、所与の数のカプセル化サブユニット１２１〜１２４を、選別ユニット１１０（好ましくは、サイズ選別ユニット）の同数の選別ステージ１１１〜１１４へと、対応する数の接続モジュール３０、４０を介して、自動的な様相で連続的に接続することを可能にする。その結果、例えばランゲルハンス島を、それぞれ相応しいサイズのカプセルに組み合わせられた４つの分類へと選別することができる。
【０１０７】
‐選別ステージ１１１において選別され、カプセル化サブユニット１２１において直径２００μｍのカプセルでカプセル化される１００μｍ未満のサイズの島
‐選別ステージ１１２において選別され、カプセル化サブユニット１２２において直径３００μｍのカプセルでカプセル化される１００〜２００μｍの間のサイズの島
‐選別ステージ１１３において選別され、カプセル化サブユニット１２３において直径４００μｍのカプセルでカプセル化される２００〜３００μｍの間のサイズの島
‐選別ステージ１１４において選別され、カプセル化サブユニット１２４において直径５００μｍのカプセルでカプセル化される３００μｍ超のサイズの島
このように、本発明による方法によれば、形成されるカプセルのサイズを、細胞集団の選別に続いて、選別された集団の種々の分類のサイズに可能な限り近くなるように構成できることが理解される。その結果、好都合なことに、
‐集団の周囲に形成されるポリマーの量が最小限になり、したがって集団の応答時間が最短になり、
‐特には酸素の拡散がより迅速になることで、移植の際の壊死領域の出現の危険性が少なくなるため、カプセル化された集団の生存性が最適化され、
‐移植すべきカプセルの体積が最小限になるため、組織の血管再生にとってより有利な領域にカプセルを埋め込むことが可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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