(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学構造：
【化４−１】
0005535233.tif 000069
を有する化合物Ｉｈ３ｅ、または薬学的に許容されるその塩、水和物、あるいはそのグリシンアミノ酸抱合体またはタウリンアミノ酸抱合体。
【請求項２】
グリシンアミノ酸抱合体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
タウリンアミノ酸抱合体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
薬学的に許容される塩である、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩、もしくは水和物と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的に許容される組成物。
【請求項６】
被験体において疾患を治療または予防するための組成物であって、該組成物は、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を含み、さらに該疾患は、代謝性疾患、炎症性疾患、肝疾患、自己免疫疾患、心臓疾患、腎臓疾患、癌、および胃腸疾患から選択される、組成物。
【請求項７】
前記疾患は、糖尿病である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記疾患は、肥満症である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記疾患は、糖尿肥満である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩、もしくは水和物を含む、被験体において疾患を治療または予防するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００８年１１月１９日出願の、欧州特許出願第０８１６９４６２．２号に対して優先権を主張し、その内容が本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＴＧＲ５をモジュレートする化合物、ならびに様々な疾患の治療および／または予防方法において有用な組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＴＧＲ５受容体は、胆汁酸（ＢＡ）に応答する細胞表面受容体として同定されてきたＧタンパク質共役受容体である。ＴＧＲ５の一次構造および胆汁酸へのその応答性は、ヒト、ウシ、ウサギ、ラット、およびマウスにおいてＴＧＲ５中で高度に保存されていることが見出されており、したがって、ＴＧＲ５は重要な生理機能を有することが示唆されている。ＴＧＲ５は、リンパ組織だけでなく、他の組織において広範に分布していることが見出されてきた。高レベルのＴＧＲ５ｍＲＮＡは、胎盤、脾臓、および単球／マクロファージにおいて検出されてきた。胆汁酸は、細胞膜から細胞質へのＴＧＲ５融合タンパク質の内部移行を誘発することが示されてきた。非特許文献１。ＴＧＲ５は、ｈＧＰＣＲ１９と同一であることが見出されてきた（非特許文献２による報告）。
【０００４】
ＴＧＲ５は、多様な細胞型において広範に発現しているｃＡＭＰの細胞内蓄積と関連している。マクロファージ中のこの膜受容体の活性化が炎症性サイトカイン生成を減少させる一方（非特許文献１）、脂肪細胞および筋細胞中のＢＡによるＴＧＲ５の刺激は、エネルギー支出を増強する（非特許文献３）。この後者の作用は、２型ヨードチロニン脱ヨード酵素（Ｄ２）のｃＡＭＰ依存性誘発を伴い、これはＴ４をＴ３に局所的に変換することによって、甲状腺ホルモン活性の増加をもたらす。エネルギー代謝の制御におけるＴＧＲ５の役割と一致して、雌性ＴＧＲ５ノックアウトマウスは、高脂肪食に曝露されたときに体重増加による有意な脂肪蓄積を示し、これはＴＧＲ５の欠乏がエネルギー支出を減少させ、肥満症を誘発することを示す（非特許文献４）。エネルギー恒常性におけるＴＧＲ５の関与に加えて、およびそれと一致して、胆汁酸による膜受容体の活性化はまた、マウス腸内分泌細胞系におけるグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）生成を促進することが報告されてきた（非特許文献５）。上記の観察全てに基づいて、ＴＧＲ５は、疾患、例えば、肥満症、糖尿病および代謝性症候群の治療のための魅力的な標的である。
【０００５】
代謝性疾患の治療および予防のためのＴＧＲ５アゴニストの使用に加えて、ＴＧＲ５モジュレーターをモジュレートする化合物はまた、他の疾患、例えば、中枢神経疾患、および炎症性疾患の治療に有用である（特許文献１および特許文献２）。ＴＧＲ５のモジュレーターはまた、胆汁酸およびコレステロール恒常性、脂肪酸吸収、ならびにタンパク質および炭水化物消化をレギュレートする方法を提供する。
【０００６】
比較的僅かな例のＴＧＲ５アゴニストが、文献において記載されてきた。最近、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）の２３−アルキル−置換誘導体および６，２３−アルキル−二置換誘導体（下記に示す化合物６α−エチル−２３（Ｓ）−メチル−ケノデオキシコール酸など）は、ＴＧＲ５の強力および選択的なアゴニストとして報告されてきた（非特許文献６）。
【０００７】
【化１】
0005535233.tif 000002
特に、天然胆汁酸（ＢＡ）のＣ２３位におけるメチル化（Ｓ−配置）は、ＦＸＲ（ファルネソイドＸ受容体）活性化よりも、顕著な選択性をＴＧＲ５に与え、一方では、６α−アルキル置換は、両方の受容体における作用強度を増加させる。他のＴＧＲ５アゴニストのいくつかの例には、６−メチル−２−オキソ−４−チオフェン−２−イル−１，２，３，４−テトラヒドロ−ピリミジン−５−カルボン酸ベンジルエステル（特許文献３、武田薬品工業株式会社、日本、２００４年）およびオレアノール酸（ｏｌｅａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）（非特許文献７；Ｉｔｏ、Ｆ．ら、特許文献３、２００４年）が含まれる。より最近では、鏡像異性のケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびリトコール酸（ＬＣＡ）の初めての合成によって、天然ＢＡとＴＧＲ５との相互作用の特異性の研究への道が可能となった（非特許文献８）。
【０００８】
最近開発されたＴＧＲ５アゴニストはまた、ＢＡの遺伝子性対非遺伝子性作用の薬理学的差異を初めて提供し、情報価値の高い構造活性相関研究をまた可能にし、例えば、ＴＧＲ５における付属結合ポケットの存在は、リガンド選択性の決定において極めて重要な役割を果たすことが見出された（非特許文献６を参照されたい）。これに関連して、疾患の予防および治療とのその関係についてより理解するために、より強力および選択的なＴＧＲ５モジュレーターを利用できることは、受容体活性化に影響を与えるさらなる特徴をさらに同定し、この受容体の生理および薬理作用を特性決定するのに必要である。
【０００９】
この目的のために、特に関心があるのは、下記に示す構造を有する化合物コール酸（ＣＡ）の生物学的および物理化学的特性であった。
【００１０】
【化２】
0005535233.tif 000003
コール酸は、高く評価されている伝統的な漢方薬である牛黄のビリルビンと共に、主要成分の１つとしてまた報告されている、ヒトおよび多くの動物種における一次胆汁酸である（非特許文献９）。コール酸（ＣＡ）は、分子の極性側に配向している、Ｃ−１２におけるさらなるアルファ−ヒドロキシル基の存在によって、上記のケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびその誘導体と異なる。この「軽微な」構造的差異は、これらの２種の胆汁酸の著しく異なる物理化学的および生物学的特徴を説明する。ＣＤＣＡに対して、プロトン化したＣＡは、その疎水性／親水性バランスおよび極性の結果として、約４倍より可溶性であり、相対的により界面活性でない。さらに、ＣＡは、ＴＧＲ５に対して中程度のアゴニスト活性（ＥＣ５０＝１３．６μＭ）を示す一方、ＦＸＲ受容体に対して活性（ＥＣ５０＞１００μＭ）を欠いている。よりさらに重要な考慮として、食餌誘発性肥満マウスにおける０．５％ｗ／ｗでのＣＡの薬理学的投与は、代謝性症候群を効率的に予防および治療することが従前報告されてきた（非特許文献５）。この研究は胆汁酸の内分泌機能に関する興味深い結果を提供した一方、必要とされる高投与量（０．５％ｗ／ｗ）は、その用量では他の未知の標的のモジュレーションを除外できなかったため、代謝性疾患との関連でＴＧＲ５の治療上の妥当性に関する概念実証がまた制限された。さらなる問題はまた、広範および効率的な腸内細菌による７α−脱ヒドロキシル化による毒性二次代謝産物であるＢＡ  ＤＣＡの生成に起因する、臨床試験における高用量のＣＡを試験することに関連する危険性であった（非特許文献１０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第０１／７７３２５号
【特許文献２】国際公開第０２／８４２８６号
【特許文献３】国際公開第２００４０６７００８号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｋａｗａｍａｔａ，Ｙ．ら、２００３年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７８号、９４３５頁〜９４４０頁
【非特許文献２】Ｔａｋｅｄａら、２００２年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、５２０号、９７〜１０１頁
【非特許文献３】Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００６年、４３９号、４８４〜４８９頁
【非特許文献４】Ｍａｒｕｙａｍａ，  Ｔ．ら、Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、２００６年、１９１号、１９７〜２０５頁
【非特許文献５】Ｋａｔｓｕｍａ，  Ｓ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、２００５年、３２９号、３８６頁
【非特許文献６】Ｐｅｌｌｉｃｃｉａｒｉ，  Ｒ．ら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．、２００７年、５０号、４２６５〜４２６８頁
【非特許文献７】Ｓａｔｏ，  Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、２００７年、３６２号、７９３〜７９８頁
【非特許文献８】Ｋａｔｏｎａ，  Ｂ．  Ｗ．ら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．、２００７年、５０号、６０４８〜６０５８頁
【非特許文献９】Ｃｈｅｎ，  Ｘ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００２年、６３号、５３３〜５４１頁
【非特許文献１０】Ｎａｇｅｎｇａｓｔ，  Ｆ．  Ｍ．、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ、１９９５年、３１Ａ号、１０６７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、様々な疾患の治療および／または予防のためのＴＧＲ５モジュレーターを開発することが必要とされている。本発明は、ＴＧＲ５をモジュレートする化合物、および疾患を治療または予防するためにこれらの化合物を使用する方法を同定した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
式Ａ：
【化４０】
0005535233.tif 000004
による化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグ
［式中、Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、置換もしくは非置換アルキル、またはハロゲンであり、
Ｒ２は、水素またはα−ヒドロキシであり、
Ｒ３は、水素、ヒドロキシ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、
Ｒ４は、水素、置換もしくは非置換アルキル、またはハロゲンであり、
Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキル、またはアリールであり、
Ｒ６は、水素、非置換もしくは置換アルキルであり、またはＲ５およびＲ６はそれらが結合している炭素と一緒になって、サイズが３個、４個、５個、または６個の原子の環を形成し、
Ｒ７は、水素、置換もしくは非置換アルキル、またはヒドロキシであり、
Ｒ８は、水素、置換もしくは非置換アルキルであり、
Ｒ９は、水素、置換もしくは非置換アルキルであり、または一緒になってＲ８およびＲ９は、カルボニルを形成し、
Ｒ１０は、Ｒ３またはＳＯ３Ｈであり、
ｍは、整数０、１、２、３、４、または５であり、
ｎは、整数０、１、２、３、４、または５である］。
（項目２）
式ＩＩＩ：
【化４１】
0005535233.tif 000005
を有する項目１に記載の化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグ
［式中、Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、またはハロゲンであり、
Ｒ２は、水素またはα−ヒドロキシであり、
Ｒ３は、ヒドロキシ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、
Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキル、またはアリールであり、
Ｒ６は、水素であり、またはＲ５およびＲ６はそれらが結合している炭素と一緒になって、サイズが３個、４個、５個、または６個の原子の環を形成し、
Ｒ７は、水素、非置換もしくは置換アルキル、またはヒドロキシであり、
Ｒ８は、水素、非置換もしくは置換アルキルであり、
Ｒ９は、水素、非置換もしくは置換アルキルであり、またはＲ８およびＲ９はそれらが結合している炭素と一緒になって、カルボニルを形成し、
Ｒ１０は、Ｒ３またはＳＯ３Ｈであり、
ｍは、整数０、１、２、３、４、または５であり、
ｎは、整数０、１、２、３、４、または５である］。
（項目３）
式ＩＩＩＡ：
【化４２】
0005535233.tif 000006
を有する項目２または３に記載の化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグ
［式中、Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、またはハロゲンであり、
Ｒ３は、ヒドロキシ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、
Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキル、またはアリールであり、
Ｒ６は、水素であり、またはＲ５およびＲ６はそれらが結合している炭素と一緒になって、サイズが３個、４個、５個、または６個の原子の環を形成し、
Ｒ７は、水素、非置換もしくは置換アルキル、またはヒドロキシであり、
Ｒ８は、水素、非置換もしくは置換アルキルであり、
Ｒ９は、水素、非置換もしくは置換アルキルであり、またはＲ８およびＲ９はそれらが結合している炭素と一緒になって、カルボニルを形成し、
Ｒ１０は、Ｒ３またはＳＯ３Ｈであり、
ｍは、整数０、１、２、３、４、または５であり、
ｎは、整数０、１、２、３、４、または５である］。
（項目４）
Ｒ８およびＲ９がそれらが結合している炭素と一緒になって、カルボニルを形成する、項目１から３のいずれか一項に記載の化合物。
（項目５）
Ｒ１０が、Ｒ３である、項目４に記載の化合物。
（項目６）
Ｒ３が、ヒドロキシル、ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＯ３Ｈ、およびＮＨＣＨ２ＣＯ２Ｈから選択される、項目１から５のいずれか一項に記載の化合物。
（項目７）
Ｒ６が、水素である、項目１から６のいずれか一項に記載の化合物。
（項目８）
Ｒ５が、Ｓ−配置である、項目１から７のいずれか一項に記載の化合物。
（項目９）
Ｒ５が、非置換アルキルである、項目１から８のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１０）
Ｒ５が、メチルである、項目９に記載の化合物。
（項目１１）
化学構造：
【化４３−１】
0005535233.tif 000007
を有する化合物Ｉｈ３ｅ、あるいはその塩、溶媒和物、水和物、グリシンもしくはタウリンアミノ酸抱合体、またはプロドラッグ。
（項目１２）
化合物Ｉｇ３ｅ、Ｉｈ３ｅ、Ｉｉ３ｅ、Ｉｇ４ｅ、Ｉｈ４ｅ、Ｉｉ４ｅ、Ｉｇ５ｅ、Ｉｈ５ｅ、およびＩｉ５ｅから選択される、項目３に記載の化合物。
（項目１３）
【化４３−２】
0005535233.tif 000008
から選択される、項目２に記載の化合物。
（項目１４）
薬学的に許容される塩である、項目１から１３のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１５）
項目１から１４のいずれか一項に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグと、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的に許容される組成物。
（項目１６）
被験体において疾患を治療または予防する方法において使用するための化合物であって、該方法は、項目１から１４のいずれか一項に記載の化合物を投与することを含み、さらに該疾患は、代謝性疾患、炎症性疾患、肝疾患、自己免疫疾患、心臓疾患、腎臓疾患、癌、および胃腸疾患から選択される、化合物。
（項目１７）
項目１から１４のいずれか一項に記載の化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグを含む、被験体において疾患を治療または予防するためのキット。
本発明は、ＴＧＲ５モジュレーター、ならびに様々な疾患を治療および／または予防するためのそれらの使用に関する。本発明は、式Ａ：
【００１５】
【化３】
0005535233.tif 000009
による化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグに関する。
式Ａにおいて、可変部分Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は、詳細な記載において下記で定義する化学部分の各々の基から選択することができる。本発明には、本発明の化合物または薬学的に許容されるその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグと、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物が含まれる。本発明には、被験体において疾患を治療または予防する方法において使用するための化合物が含まれる。本発明にはまた、被験体において疾患を治療または予防するための医薬の製造における、本発明の組成物あるいは化合物、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグの使用が含まれる。一態様において、疾患は、代謝性疾患、炎症性疾患、肝疾患、自己免疫疾患、心臓疾患、腎臓疾患、癌、および胃腸疾患から選択される。
【００１６】
上記の説明は、下記のその詳細な記載を理解するために、および当技術分野に対する本発明の貢献をより認識するために、本発明のより重要な特徴を広く記載する。本発明の他の目的および特徴は、実施例と併せて考慮すれば、下記の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、固形飼料摂食マウスおよび高脂肪摂食マウスにおける体重増加に対する化合物Ｉｈ３ｅの影響を示すグラフである。
【図２−１】図２は、化合物Ｉｈ３ｅで処理した高脂肪摂食マウスの代謝プロファイルの変化を示す一連の９つのグラフ（Ａ〜Ｉ）である。化合物Ｉｈ３ｅで処理した食餌誘発性肥満マウスにおける血漿分析。Ａ〜Ｄは、肝酵素に関する。Ｆ〜Ｉは、血漿脂質に関する。
【図２−２】図２は、化合物Ｉｈ３ｅで処理した高脂肪摂食マウスの代謝プロファイルの変化を示す一連の９つのグラフ（Ａ〜Ｉ）である。化合物Ｉｈ３ｅで処理した食餌誘発性肥満マウスにおける血漿分析。Ａ〜Ｄは、肝酵素に関する。Ｆ〜Ｉは、血漿脂質に関する。
【図２−３】図２は、化合物Ｉｈ３ｅで処理した高脂肪摂食マウスの代謝プロファイルの変化を示す一連の９つのグラフ（Ａ〜Ｉ）である。化合物Ｉｈ３ｅで処理した食餌誘発性肥満マウスにおける血漿分析。Ａ〜Ｄは、肝酵素に関する。Ｆ〜Ｉは、血漿脂質に関する。
【図２−４】図２は、化合物Ｉｈ３ｅで処理した高脂肪摂食マウスの代謝プロファイルの変化を示す一連の９つのグラフ（Ａ〜Ｉ）である。化合物Ｉｈ３ｅで処理した食餌誘発性肥満マウスにおける血漿分析。Ａ〜Ｄは、肝酵素に関する。Ｆ〜Ｉは、血漿脂質に関する。
【図２−５】図２は、化合物Ｉｈ３ｅで処理した高脂肪摂食マウスの代謝プロファイルの変化を示す一連の９つのグラフ（Ａ〜Ｉ）である。化合物Ｉｈ３ｅで処理した食餌誘発性肥満マウスにおける血漿分析。Ａ〜Ｄは、肝酵素に関する。Ｆ〜Ｉは、血漿脂質に関する。
【図３−１】図３は、化合物Ｉｈ３ｅで処理した固形飼料摂食マウスおよび高脂肪摂食マウスにおける血漿インスリン分析および経口グルコース負荷試験の結果を示す一連のグラフ（Ａ〜Ｂ）である。
【図３−２】図３は、化合物Ｉｈ３ｅで処理した固形飼料摂食マウスおよび高脂肪摂食マウスにおける血漿インスリン分析および経口グルコース負荷試験の結果を示す一連のグラフ（Ａ〜Ｂ）である。
【図４】図４は、化合物Ｉｈ３ｅで処理した固形飼料食マウスにおけるグルコースレベルの変化を示すグラフである。
【図５−１】図５は、化合物Ｉｈ３ｅで処理した固形飼料摂食マウスおよび高脂肪摂食マウスにおける試験食後のインビボでのインスリン放出を示す一連のグラフ（Ａ〜Ｄ）である。
【図５−２】図５は、化合物Ｉｈ３ｅで処理した固形飼料摂食マウスおよび高脂肪摂食マウスにおける試験食後のインビボでのインスリン放出を示す一連のグラフ（Ａ〜Ｄ）である。
【図６−１】図６は、化合物Ｉｈ３ｅで処理した固形飼料摂食マウスおよび高脂肪摂食マウスにおける間接熱量測定によって測定された、酸素消費およびＣＯ２生成を示す一連のグラフ（Ａ〜Ｄ）である。
【図６−２】図６は、化合物Ｉｈ３ｅで処理した固形飼料摂食マウスおよび高脂肪摂食マウスにおける間接熱量測定によって測定された、酸素消費およびＣＯ２生成を示す一連のグラフ（Ａ〜Ｄ）である。
【図７−１】図７は、化合物Ｉｈ３ｅで処理した固形飼料摂食マウスおよび高脂肪摂食マウスにおいて、間接熱量測定後に計算した呼吸交換率（ＲＥＲ）値を示す３つのグラフ（Ａ〜Ｃ）である。
【図７−２】図７は、化合物Ｉｈ３ｅで処理した固形飼料摂食マウスおよび高脂肪摂食マウスにおいて、間接熱量測定後に計算した呼吸交換率（ＲＥＲ）値を示す３つのグラフ（Ａ〜Ｃ）である。
【図８】図８は、化合物Ｉｈ３ｅで処理した固形飼料摂食マウスおよび高脂肪摂食マウスについての、運動活性ならびに食物および水摂取を示す一連のグラフ（Ａ〜Ｂ）である。
【図９−１】図９は、化合物Ｉｈ３ｅで処理した固形飼料摂食マウスおよび高脂肪摂食マウスについての器官重量の変化を示す一連のグラフ（Ａ〜Ｃ）である。
【図９−２】図９は、化合物Ｉｈ３ｅで処理した固形飼料摂食マウスおよび高脂肪摂食マウスについての器官重量の変化を示す一連のグラフ（Ａ〜Ｃ）である。
【図１０】図１０は、ＮａＣｌ（０．１５Ｍ）中の化合物Ｉｈ３ｅ（ｍＭ）の濃度の対数に対してプロットした表面張力を示すグラフである。
【図１１】図１１は、化合物Ｉｈ３ｅを使用して行った十二指腸注入実験についての胆汁流のチャートである。
【図１２】図１２は、化合物Ｉｈ３ｅを使用して行った大腿部注入実験についての胆汁流のチャートである。
【図１３】図１３は、化合物Ｉｈ３ｅを使用して行った大腿部および十二指腸注入実験における時間に対する分泌速度を示すグラフである。
【図１４−１】図１４は、化合物Ｉｈ３ｅおよびその代謝物に関する一連のグラフ（Ａ〜Ｄ）である。図１４Ａは、静脈内実験において質量分析法を使用して胆汁中で同定された化合物Ｉｈ３ｅおよびその主要な代謝物を示す。データは、絶対面積値として報告する。図１４Ｂは、図１４Ａの拡大表示である。図１４Ｃは、質量分析法を使用して胆汁中で同定された化合物Ｉｈ３ｅおよびその主要な代謝物を示す。図１４Ｄは、図１４Ｃの拡大表示である。
【図１４−２】図１４は、化合物Ｉｈ３ｅおよびその代謝物に関する一連のグラフ（Ａ〜Ｄ）である。図１４Ａは、静脈内実験において質量分析法を使用して胆汁中で同定された化合物Ｉｈ３ｅおよびその主要な代謝物を示す。データは、絶対面積値として報告する。図１４ｂは、図１４Ａの拡大表示である。図１４Ｃは、質量分析法を使用して胆汁中で同定された化合物Ｉｈ３ｅおよびその主要な代謝物を示す。図１４Ｄは、図１４Ｃの拡大表示である。
【図１４−３】図１４は、化合物Ｉｈ３ｅおよびその代謝物に関する一連のグラフ（Ａ〜Ｄ）である。図１４Ａは、静脈内実験において質量分析法を使用して胆汁中で同定された化合物Ｉｈ３ｅおよびその主要な代謝物を示す。データは、絶対面積値として報告する。図１４ｂは、図１４Ａの拡大表示である。図１４Ｃは、質量分析法を使用して胆汁中で同定された化合物Ｉｈ３ｅおよびその主要な代謝物を示す。図１４Ｄは、図１４Ｃの拡大表示である。
【図１５】図１５は、ヒト糞便培養物における化合物Ｉｈ３ｅ（三角）およびＣＡ（四角）の安定性を示すグラフである。
【図１６】図１６は、化合物Ｉｈ３ｅによって誘発されるエキソビボでのＧＬＰ−１の用量依存的放出を示す棒グラフである。
【図１７−１】図１７Ａは、マウスＢｘＤ遺伝子参照集団におけるＴＧＲ５およびＣｏｘＶＩ１ａの肝臓ｍＲＮＡ発現についての相関図を示す（ｎ＝４１）。図１７Ｂは、示された濃度の化合物Ｉｈ３ｅで１時間処理したＳＴＣ−１細胞におけるＣｏｘ活性を示す棒グラフである。ビヒクルまたはアデニル酸シクラーゼ阻害剤ＭＤＬ−１２３３０−Ａ（ＭＤＬ）（１μＭ）を、処理の１５分前に加えた（ｎ＝３）。
【図１７−２】図１７Ｃは、ＸＦ２４細胞外流動分析器（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定したＳＴＣ−１細胞における酸素消費を示すグラフである。第１の垂直な点線は、培地へのビヒクルまたはＭＤＬ−１２３３０−Ａ（ＭＤＬ）の添加を示し、第２の点線は、１μＭでの化合物Ｉｈ３ｅによる処理を示す（ｎ＝１０）。図１７Ｄは、図Ｂにおけるように処理したＳＴＣ−１細胞におけるＡＴＰ／ＡＤＰ比を示す棒グラフである（ｎ＝３）。
【図１７−３】図１７Ｅは、図Ａに記載したのと同様の戦略による、マウスＢｘＤ遺伝子参照集団におけるＴＧＲ５およびＫｉｒ６．２の肝臓ｍＲＮＡ発現についての相関図を示す。図１７Ｆは、リアルタイム定量的ＰＣＲによって測定した、対照またはｍＴＧＲ５ｓｈＲＮＡで３６時間トランスフェクトされたＳＴＣ−１細胞におけるＴＧＲ５、ＣｏｘＩＶ、およびＫｉｒ６．２のｍＲＮＡ発現レベルを示す棒グラフである。標的ｍＲＮＡレベルは、３６Ｂ４ｍＲＮＡレベルに正規化した（ｎ＝３）。データは、平均±ＳＥとして示す。独立スチューデントｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔｅｓｔ）；＊ｐ＜０．０５。
【図１８−１】図１８Ａは、テネシー大学、ＧｅｎｅＮｅｔｗｏｒｋのウェブサイトで見出されるような、マウスＢｘＤ遺伝子参照集団（ｎ＝４１）におけるＴＧＲ５およびＣａｖ２．２の肝臓ｍＲＮＡ発現についての相関図を示す。図１８Ｂは、ｍｏｃｋベクター、ｈＴＧＲ５発現ベクター、またはｈＴＧＲ５ｓｉＲＮＡで３６時間トランスフェクトされ、かつ１μＭ（Ｂ）の化合物Ｉｈ３ｅで処理したＮＣＩ−Ｈ７１６細胞における細胞内カルシウムレベルを示すグラフである。矢印は、化合物Ｉｈ３ｅの処理を表す（ｎ＝３）。
【図１８−２】図１８Ｃは、ｍｏｃｋベクター、ｈＴＧＲ５発現ベクター、またはｈＴＧＲ５ｓｉＲＮＡで３６時間トランスフェクトされ、１０μＭ（Ｃ）の化合物Ｉｈ３ｅで処理したＮＣＩ−Ｈ７１６細胞における細胞内カルシウムレベルを示すグラフである。矢印は、化合物Ｉｈ３ｅの処理を表す（ｎ＝３）。図１８Ｄは、ビヒクルまたはアデニル酸シクラーゼ阻害剤ＭＤＬ−１２３３０−Ａ（ＭＤＬ）（１０μＭ）の存在下で、３μＭの化合物Ｉｈ３ｅで処理した（矢印によって示す）ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞における細胞内カルシウムレベルを示すグラフである。ＭＤＬまたはビヒクルを、化合物Ｉｈ３ｅ処理の１５分前に加えた（ｎ＝３）。
【図１８−３】図１８Ｅは、１％グルコース、次いで１μＭの化合物Ｉｈ３ｅ（ｎ＝３）で処理したＮＣＩ−Ｈ７１６細胞における細胞内カルシウムレベルを示すグラフである。図１８Ｆは、１％グルコースもしくは１μＭの化合物Ｉｈ３ｅ、または両方の薬剤を組合せたもので処理したＮＣＩ−Ｈ７１６細胞におけるＧＬＰ−１放出を示す棒グラフである（ｎ＝３）。
【図１８−４】図１８Ｇは、対照、ｍＴＧＲ５発現ベクター、またはｍＴＧＲ５ｓｈＲＮＡで３６時間トランスフェクトされ、次いで示した濃度の化合物Ｉｈ３ｅに３０分曝露されたＳＴＣ−１細胞におけるＧＬＰ−１放出を示す棒グラフである。ＤＰＰ４阻害剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、０．１％で培地中に加えた（ｎ＝３）。図１８Ｈは、ビヒクルまたはアデニル酸シクラーゼ阻害剤ＭＤＬ−１  ２３３０−Ａ（１０μＭ）の存在下で、ｍＴＧＲ５発現ベクターでトランスフェクトされたＳＴＣ−１細胞におけるＧＬＰ−１放出に対する３０分の化合物Ｉｈ３ｅ処理の影響を示す棒グラフである。ＭＤＬまたはビヒクルを化合物Ｉｈ３ｅ処理の１５分前に加えた。ＤＰＰ４阻害剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、０．１％で培地中に加えた（ｎ＝３）。データは、平均±ＳＥとして示す。独立スチューデントｔ検定；＃ｐ＜０．０５、ビヒクル対化合物Ｉｈ３ｅ処理；＃ｐ＜０．０５、ビヒクル対ＭＤＬ−１  ２３３０−Ａ処理。
【図１９−１】図１９Ａは、１０週間ＨＦ食を摂食した雄性ＴＧＲ５−Ｔｇマウス、および同じ期間ＣＤまたはＨＦ食を摂食した同齢の雄性同腹仔における、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）の結果を示すグラフである。全てのマウスは、ＨＦ食の開始時には８週齢であった。ＴＧＲ５−Ｔｇおよび対照同腹仔の体重は、各々３７．９±１．７ｇおよび３７．０±１．８ｇであった（ｎ＝８；統計的に差異なし）。隣接する棒グラフは、平均曲線下面積（ＡＵＣ）を表す（ｎ＝８）。
【図１９−２】図１９Ｂおよび１９Ｃは、ＯＧＴＴの間（１９Ｂ）または試験食曝露の前および後（１９Ｃ）のインスリン（上のパネル）およびＧＬＰ−１（下のパネル）の血漿レベルを示す（ｎ＝８）。
【図１９−３】図１９Ｄは、対照マウス、および１８週間ＨＦ食を摂食し、示した濃度のＬＣＡに１時間曝露されたＴＧＲ５−Ｔｇ雄性マウスから単離した回腸移植片からのＧＬＰ−１放出を示す棒グラフである（ｎ＝４）。図１９Ｅは、２０週間ＨＦ食を摂食したＴＧＲ５−Ｔｇ雄性マウスから、または同じ期間ＣＤもしくはＨＦ食を摂食した同齢の雄性同腹仔からの、代表的な免疫蛍光インスリン染色した膵臓切片の一連の写真である。
【図１９−４】図１９Ｆは、（図１９Ｅ）において記載したようにＣＤまたはＨＦ食を摂食した雄性ＴＧＲ５−Ｔｇマウスおよび対照同腹仔からの膵島の分布プロファイルを示す棒グラフである。膵島を、ＩｍａｇｅＪ分析ソフトウェアによって計数し、各々１５０μＭの間隔がある４つのＨ＆Ｅ染色した交互の膵臓切片上で寸法を計った（ｎ＝５）。図１９Ｇは、（図１９Ｅ）において記載したようにＣＤまたはＨＦ食を摂食した雄性ＴＧＲ５−Ｔｇマウスおよび対照同腹仔からのコラゲナーゼ−単離した膵島におけるインスリン量を示す棒グラフである。図１９Ｈは、８週間ＨＦ食を摂食したＴＧＲ５−／−およびＴＧＲ５＋／＋雄性マウスにおけるＯＧＴＴの結果を示すグラフである。挿入図は、平均ＡＵＣを示す。分析時のＴＧＲ５−／−およびＴＧＲ５＋／＋雄性マウスの体重は、各々４６．３±３．９ｇおよび５１．９±２．０ｇであった（ｎ＝８；統計的に差異なし）。
【図１９−５】図１９Ｉおよび１９Ｊは、３０分前に先行して食塩水または化合物Ｉｈ３ｅ（３０ｍｇ／ｋｇ）を経口投与（単独またはジペプチジル−ペプチダーゼ−４阻害剤（ＤＰＰ４ｉ、３ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせた）した、経口グルコース曝露の後の、ＣＤ摂食ＴＧＲ５＋／＋（図１９Ｉ）およびＴＧＲ５−／−マウス（図１９Ｊ）における血漿ＧＬＰ−１レベルを示すグラフである（ｎ＝６）。データは、平均±ＳＥとして示す。独立スチューデントｔ検定；＃ｐ＜０．０５、ＨＦ摂食マウス対ＨＦ摂食、化合物Ｉｈ３ｅ処理マウス；＃ｐ＜０．０５、ＨＦ摂食マウス対ＣＤ摂食マウス（（Ｉ）および（Ｊ）を除く）、＊食塩水またはＤＰＰ４ｉ処理マウス対化合物Ｉｈ３ｅまたはＩｈ３ｅ＋ＤＰＰ４ｉ処理マウス、および＃食塩水処理マウス対ＤＰＰ４ｉ処理マウスを評価。
【図２０−１】図２０Ａは、ＣＤ摂食マウス、ＨＦ摂食マウス、およびＨＦ摂食Ｉｈ３ｅ処理雄性Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスにおける、ＨＰＬＣによる血漿の化合物Ｉｈ３ｅレベルの測定の結果を示すグラフである。図２０Ｂは、１４週間のＨＦ摂食の後に開始した（矢印で示された時）化合物Ｉｈ３ｅ（３０ｍｇ／ｋｇ／日）を伴う食事介入の結果を示すグラフである。全ての群における体重変化を、研究の間に亘り追跡した（ｎ＝８）。
【図２０−２】図２０Ｃは、８週間の食事介入の後にｑＮＭＲによって評価した体組成を示す棒グラフである（ｎ＝８）。図２０Ｄは、ＣＤ摂食対照マウスの重量のパーセントとして表した器官質量を示す棒グラフである。図２０Ｅは、食物摂取を示す棒グラフである（ｎ＝８）。
【図２０−３】図２０Ｆは、食事介入の開始の６週間後に１８時間の期間に亘りモニターし、酸素消費（ＶＯ２）および二酸化炭素放出（ＶＣＯ２）の測定によって評価した、自発的な水平方向の活動およびエネルギー支出を示す一連の棒グラフである。呼吸商（ＲＱ）を、比ＶＣＯ２／ＶＯ２として計算した。棒グラフは、平均ＡＵＣを表す。ＲＱについて、棒グラフは平均を表す（ｎ＝８）。図２０Ｇは、１８週間の食事介入の後にリアルタイム定量的ＰＣＲによるＢＡＴにおける遺伝子発現を示す棒グラフである。標的ｍＲＮＡレベルは、３６Ｂ４ｍＲＮＡレベルに正規化した（ｎ＝８）。
【図２０−４】図２０Ｈは、ビヒクルまたは３μＭの化合物Ｉｈ３ｅと共に１２時間培養した、ＣＤ摂食Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスから単離した初代培養褐色脂肪細胞を示すグラフである。Ｏ２消費は、ＸＦ２４細胞外流動分析器（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した（ｎ＝５）。点線は、２５０ｎＭおよび５００ｎＭで連続的投与した脱カップリング剤であるＦＣＣＰの添加を示す。図２０Ｉは、食事介入の終わりにおける肝臓の、凍結切片のオイルレッドＯ（ＯＲＯ）染色（上のパネル）およびパラフィン包埋切片のシリウスレッド染色（下のパネル）の代表的な写真である一連の写真である。線維症を矢印によって示す。
【図２０−５】図２０Ｊは、フォルチ法によって抽出した肝臓試料における脂質含量を示す一連の棒グラフである（ｎ＝８）。図２０Ｋおよび２０は、食事介入の終わりにおける肝酵素（図２０Ｋ）および脂質（図２０Ｌ）の血漿レベルを示す一連の棒グラフである（ｎ＝８）。データは、平均±ＳＥとして表す。独立スチューデントｔ検定；＊ｐ＜０．０５、ＨＦ摂食マウス対ＨＦ摂食Ｉｈ３ｅ処理マウス；および＃ｐ＜０．０５、ＨＦ摂食マウス対ＣＤ摂食マウス。
【図２１−１】図２１Ａは、１０週間の間ＨＦ食を摂食させることによって誘発された肥満症の発症に続いて、８週間３０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物Ｉｈ３ｅを補充された、ＣＤ摂食およびＨＦ摂食の雄性Ｃ５７ＢＬ６／ＪマウスにおけるＯＧＴＴの結果を示すグラフである。挿入図は、平均ＡＵＣを示す。ビヒクルおよび化合物Ｉｈ３ｅ処理マウスの体重は、各々３８．０８±１．８３ｇおよび３２．２６±０．９５ｇであった（ｎ＝８；ｐ＜０．０５）。図２１Ｂは、３週間の化合物Ｉｈ３ｅを伴う食事介入の後の、ＤＩＯマウスにおける空腹時血糖および血液インスリン（４時間の絶食）を示すグラフである（上のパネル）。ＤＩＯマウスにおけるＯＧＴＴの間の血漿インスリンレベル（下のパネル）。
【図２１−２】図２１Ｃは、３０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物Ｉｈ３ｅで６週間処理した１４週齢のＣＤ摂食ｄｂ／ｄｂ雄性マウスにおけるＯＧＴＴの結果を示すグラフである。挿入図は、平均ＡＵＣを示す（ｎ＝８）。図２１Ｄは、６週間の化合物Ｉｈ３ｅによる処理の後の、ｄｂ／ｄｂマウスにおける空腹時（４時間）血糖および血液インスリンを示すグラフである（上のパネル）。ＤＩＯマウスにおけるＯＧＴＴの間の血漿インスリンレベル（下のパネル）。図２１Ｅは、ＤＩＯマウス（１０週間の間ＨＦ食を摂食させることによって誘発された肥満症の発症の後）における、化合物Ｉｈ３ｅ（３０ｍｇ／ｋｇ／日）を伴う１０週間の食事介入後、高インスリン正常血糖クランプ法（１０ｍＵインスリン／分／ｋｇ）において、平衡状態（正常血糖）での平均グルコース注入速度によって評価したインスリン感受性を示す一連の２つの棒グラフである（ｎ＝５）。肝臓グルコース生成およびインスリンによるその抑制の評価、ならびにグルコース消失速度は、３Ｈ−グルコースを使用して平衡状態で評価した（ｎ＝５）。
【図２１−３】図２１Ｆは、１４Ｃ−２−デオキシグルコーストレーサーを使用して測定した、示された組織におけるインスリン刺激によるグルコース取込みを示す一連の棒グラフである（ｎ＝５）。図２１Ｇは、リアルタイム定量的ＰＣＲによって行われた肝臓における遺伝子発現プロファイリングを示す一連の棒グラフである。標的ｍＲＮＡレベルを、３６Ｂ４レベルに正規化した（ｎ＝８）。データは、平均±ＳＥとして示す。独立スチューデントｔ検定；＊ｐ＜０．０５、ＨＦ摂食マウス対ＨＦ摂食、化合物Ｉｈ３ｅ処理マウス；および＃ｐ＜０．０５、ＨＦ摂食マウス対ＣＤ摂食マウス。
【図２２】図２２Ａは、研究の結果を示す一連のグラフであり、ＴＧＲ５＋／＋およびＴＧＲ５−／−雄性マウスはＨＦ食を９週間摂食し、第１のＯＧＴＴをその後行った。次いで、ＨＦに、化合物Ｉｈ３ｅを３０ｍｇ／ｋｇ／日で補充した。化合物Ｉｈ３ｅによる処理が開始された４週間後に、第２のＯＧＴＴを行った。曲線は、ＴＧＲ５＋／＋（左のパネル）およびＴＧＲ５−／−（右のパネル）マウスにおける化合物Ｉｈ３ｅによる４週間の処理の前および後の耐糖能を表す。挿入図は、平均ＡＵＣを表す。ＴＧＲ５＋／＋マウスにおいて、化合物Ｉｈ３ｅ処理の前および後の体重は、各々４６．８６±３．５４ｇおよび４３．５０±３．４７ｇであった（ｎ＝８；統計的に差異なし）。ＴＧＲ５〜／マウスにおいて、化合物Ｉｈ３ｅ処理の前および後の体重は、各々５４．３４±２．２３ｇおよび５２．３０±２．７２ｇであった（ｎ＝８；統計的に差異なし）。図２２Ｂは、ＴＧＲ５＋／＋（左のパネル）およびＴＧＲ５−／−（右のパネル）マウスにおいて、化合物Ｉｈ３ｅによる４週間の処理の前および後に、ＤＩＯにおけるＯＧＴＴの間に同時に測定した血漿インスリンレベルを示す一連のグラフである。挿入図は、平均ＡＵＣを表す（ｎ＝８）。データは、平均±ＳＥとして示す。独立スチューデントｔ検定；＊ｐ＜０．０５、ビヒクル対化合物Ｉｈ３ｅ７処理マウス。
【図２３】図２３は、１時間の大腿部注入実験における１μｍｏｌ／分／ｋｇでの化合物Ｉｈ３ｅおよびＩｉ３ｅの胆汁流量、ならびに対照として３％ＢＳＡ生理溶液を１時間注入する大腿部実験における胆汁流量を示すグラフである。
【図２４】図２４は、１μｍｏｌ／分／ｋｇで１時間の大腿部実験において、時間に対する化合物Ｉｈ３ｅおよびタウロ（ｔａｕｒｏ）−Ｉｈ３ｅ分泌速度を示すグラフである。
【図２５】図２５は、１μｍｏｌ／分／ｋｇで１時間の大腿部実験において、時間に対する化合物Ｉｉ３ｅおよびタウロ−Ｉｉ３ｅ分泌速度を示すグラフである。
【図２６】図２６は、大腿部注入実験の間に集めた胆汁試料中に同定された化合物Ｉｈ３ｅおよびその主要な代謝物を示すグラフである。データは絶対面積値として報告する。
【図２７】図２７は、図２６の拡大表示である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
１つまたは複数の本発明の実施形態の詳細を、下記の付随的な記載において記載する。本明細書に記載されているものと同様または等しい任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、方法および材料をこれから記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、記載から明らかであろう。明細書において、文脈によって明らかにそれ以外のことの指示がない限り、単数形にはまた複数が含まれる。他に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。矛盾する場合は、本明細書が優先する。
【００１９】
定義
便宜上、明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語を、ここに集める。
【００２０】
「治療する」という用語は、本明細書において使用する場合、病態または状態を軽減、緩和、減少、解消、モジュレート、または寛解、すなわち退行をもたらすことを意味する。
【００２１】
「予防する」という用語は、本明細書において使用する場合、特に、患者または被験体が病態または状態にかかりやすい、あるいは病態または状態を罹患する危険性があるときに、患者または被験体において病態または状態が起こることを完全にもしくは殆ど完全に阻止することを意味する。予防にはまた、例えば、病態または状態が既に存在し得るとき、病態または状態を抑制し、すなわちその発生を抑止し、病態または状態を軽減または寛解、すなわち退行をもたらすことを含むことができる。
【００２２】
「６−Ｅｔ，２３（Ｓ）−ＭｅＣＡ」という用語は、化学構造：
【００２３】
【化４−１】
0005535233.tif 000010
を有する化合物Ｉｈ３ｅを意味する。代わりに、化合物Ｉｈ３ｅはまた、６α−エチル−（２３Ｓ）−メチル−３α，７α，１２αトリヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸と称し得る。
【００２４】
本明細書において使用する場合、「ＢＡ」とは、胆汁酸および胆汁酸誘導体を意味する。胆汁酸は、コレステロール由来のステロイドカルボン酸である。一次胆汁酸は、コール酸およびケノデオキシコール酸である。体内で、これらの酸は、胆汁中に分泌される前に、グリシンまたはタウリンと抱合する。
【００２５】
「アルキル」には、直鎖アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル）、分岐鎖アルキル基（例えば、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル）、シクロアルキル（例えば、脂環式）基（例えば、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含めた飽和脂肪族基が含まれる。特定の実施形態において、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格中に６個またはより少ない炭素原子を有する（「低級アルキル」と称される）（例えば、直鎖についてＣ１〜Ｃ６は、１個、２個、３個、４個、５個、または６個の炭素原子を意味し、分岐鎖についてＣ３〜Ｃ６は、３個、４個、５個、または６個の炭素原子を意味する）。いくつかの例において、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格中に４個またはより少ない炭素原子を有する。さらに、シクロアルキルは、それらの環状構造中に３個、４個、５個、６個、７個、または８個の炭素原子を有する。
【００２６】
「置換アルキル」という用語は、炭化水素骨格の少なくとも１個または複数の炭素上の１個または複数の水素原子と置き換えた置換基を有するアルキル部分を意味する。このような置換基には、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくは芳香族複素部分を含むことができる。
【００２７】
「アリール」には、０個から４個のヘテロ原子を含み得る５員および６員の「非共役」または単環の芳香族基、および少なくとも１個の芳香環を有する「共役」または多環式系を含めた、芳香族性を有する基が含まれる。アリール基の例には、ベンゼン、フェニル、ピロール、フラン、チオフェン、チアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、およびピリミジンなどが含まれる。さらに、「アリール」という用語には、多環式アリール基、例えば、三環式、二環式、例えば、ナフタレン、ベンゾオキサゾール、ベンゾジオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾチオフェン、メチレンジオキシフェニル、キノリン、イソキノリン、ナプトリジン（ｎａｐｔｈｒｉｄｉｎｅ）、インドール、ベンゾフラン、プリン、ベンゾフラン、デアザプリン、またはインドリジンが含まれる。環状構造中にヘテロ原子を有するそれらのアリール基はまた、「アリール複素環」、「複素環」、「ヘテロアリール」または「複素環式芳香族化合物」と称し得る。芳香環は、上記のような置換基（例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくは芳香族複素部分）で、少なくとも１つの環位置において置換されていてもよい。アリール基はまた、多環式系（例えば、テトラリン、メチレンジオキシフェニル）を形成するために、芳香族ではない脂環または複素環と縮合または架橋することができる。
【００２８】
炭素の数が他に特定されない限り、「低級アルキル」には、上記定義のようなアルキル基が含まれるが、その骨格構造中に１〜１０個、例えば、１〜６個の炭素原子を有する。
【００２９】
「アルコキシ」または「アルコキシル」という用語には、酸素原子に共有結合しているアルキル、アルケニル、およびアルキニル基が含まれる。アルコキシ基（またはアルコキシルラジカル）の例には、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、プロポキシ、ブトキシ、およびペントキシ基が含まれる。
【００３０】
「エーテル」という用語には、２個の異なる炭素原子またはヘテロ原子に結合している酸素を含有する化合物または部分が含まれる。例えば、この用語には、別のアルキル基に共有結合している酸素原子に共有結合しているアルキル、アルケニル、またはアルキニル基を意味する「アルコキシアルキル」が含まれる。
【００３１】
「エステル」という用語には、カルボニル基の炭素に結合している酸素原子に結合している炭素またはヘテロ原子を含有する化合物および部分が含まれる。「エステル」という用語には、アルコキシカルボキシ基（メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ペントキシカルボニルなど）が含まれる。アルキル、アルケニル、またはアルキニル基は、上記定義の通りである。
【００３２】
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」という用語には、−ＯＨまたは−Ｏ−を有する基が含まれる。
【００３３】
「ハロゲン」という用語には、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素などが含まれる。「ペルハロゲン化」という用語は一般に、全ての水素がハロゲン原子で置き換えられている部分を意味する。
【００３４】
「アニオン基」とは、本明細書において使用する場合、生理的ｐＨにおいて負に帯電している基を意味する。アニオン基には、カルボキシレート、スルフェート、スルホネート、スルフィナート、スルファメート、テトラゾリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、またはホスホロチオエートまたはその機能的等価物が含まれる。アニオン基の「機能的等価物」は、生物学的同配電子体、例えば、カルボン酸基の生物学的同配電子体を含むことを意図する。生物学的同配電子体は、古典的な生物学的同配電子同等物および非古典的な生物学的同配電子同等物の両方を包含する。古典的および非古典的な生物学的同配電子体は、当技術分野において公知であえる（例えば、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，  Ｒ．  Ｂ．、Ｔｈｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｃｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．、１９９２年、１９〜２３頁を参照されたい）。別のアニオン基は、カルボキシレートである。
【００３５】
「不安定な官能基」という用語は、不安定な連結、例えば、生理条件下の加水分解または切断の影響を受けやすい官能基または結合を含有する置換パターンを意味する（例えば、中性ｐＨ範囲の水溶液）。不安定な官能基の例には、アセタールおよびケタールが含まれる。
【００３６】
「結晶多形」または「多形」という用語は、化合物、その塩または溶媒和物について複数の結晶形が存在することを意味する。胆汁酸類似体化合物の結晶多形は、異なる条件下の結晶化によって調製される。
【００３７】
「Ｒ−ＥＭＣＡ」という用語は、構造：
【００３８】
【化４−２】
0005535233.tif 000011
を有する化合物６α−エチル−２３（Ｒ）−メチルコール酸を意味する。代わりに、６α−エチル−（２３Ｒ）−メチル−３α，７α，１２αトリヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸と称し得る。
【００３９】
さらに、本発明の化合物、例えば、化合物の塩は、水和もしくは非水和（無水）形態で、または他の溶媒分子との溶媒和物として存在することができる。水和物の非限定的例には、一水和物、二水和物などが含まれる。溶媒和物の非限定的例には、エタノール溶媒和物、アセトン溶媒和物などが含まれる。
【００４０】
「溶媒和物」とは、化学量論量または非化学量論量の溶媒を含有する溶媒付加形態を意味する。いくつかの化合物は、結晶性固体の状態の固定モル比の溶媒分子を捕捉する傾向を有し、したがって溶媒和物を形成する。溶媒が水である場合、形成された溶媒和物は水和物であり、溶媒がアルコールであるとき、形成された溶媒和物はアルコラートである。水和物は、水の１個または複数の分子と、水がその中でＨ２Ｏとしてその分子状態を保持する物質の１つとの組合せによって形成され、このような組合せは、１種または複数の水和物を形成することができる。
【００４１】
本発明の化合物のいくつかの構造には、不斉炭素原子が含まれることが注目される。したがって、このような不斉性から生じる異性体（例えば、全てのエナンチオマーおよびジアステレオマー）は、他に示さない限り本発明の範囲内に含まれることが理解される。このような異性体は、古典的な分離技術によって、および立体化学的に制御された合成によって実質的に純粋な形態で得ることができる。エナンチオマー（Ｒ−およびＳ−配置）は、Ｒ．Ｓ．Ｃａｈｎ、Ｃ．Ｉｎｇｏｌｄ、およびＶ．Ｐｒｅｌｏｇによって開発された系によって命名される。
【００４２】
さらに、本出願において議論されている構造および他の化合物には、その全てのアトロプ異性体が含まれる。アトロプ異性体は、２種の異性体の原子が空間において異なって配置されている立体異性体の１タイプである。アトロプ異性体は、それらの存在が、中心的結合の周りの大きな基の回転障害によってもたらされる束縛回転に負っている。このようなアトロプ異性体は典型的には、混合物として存在するが、クロマトグラフィー技術における最近の進歩の結果、選択した場合において２種のアトロプ異性体の混合物を分離することが可能となった。
【００４３】
「安定的な化合物」および「安定的な構造」とは、反応混合物からの有用な程度の純度への単離、および効果的な治療剤への製剤の後で残存するのに十分に頑強な化合物を示すことを意味する。
【００４４】
本明細書において使用する場合、「類似体」という用語は、他のものと構造的に同様であるが、組成が僅かに異なる化合物を意味する（異なる元素の原子による１個の原子の置換え、または特定の官能基の存在下、または別の官能基による１個の官能基の置換えなど）。したがって、類似体は、機能および外観が参照化合物と同様である、または相当する化合物である。
【００４５】
本明細書に定義されているように、「誘導体」という用語は、例えば、「胆汁酸誘導体」という用語において、共通の中核の４員環状構造を有し、本明細書に記載されているような様々な基で置換されている化合物を意味する。
【００４６】
「生物学的同配電子体（ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｅ）」という用語は、原子または原子の群と、別の大まかに同様な原子または原子の群との交換から得られる化合物を意味する。生物学的等価性の置換えは、物理化学的または位相幾何学的に基づいていてもよい。カルボン酸の生物学的同配電子体の例には、アシルスルホンイミド、テトラゾール、スルホネート、およびホスホネートが含まれる。例えば、ＰａｔａｎｉおよびＬａＶｏｉｅ、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．、９６号、３１４７〜３１７６頁（１９９６年）を参照されたい。
【００４７】
「併用療法」（または「同時療法」）には、これらの治療剤（すなわち、本発明の化合物および少なくとも１種の第２の薬剤）の相互作用からの有益な効果を提供することを意図する特定の治療計画の一部として、本発明の化合物および少なくとも第２の薬剤の投与が含まれる。組合せの有益な効果には、これらに限定されないが、治療剤の組合せから得られる薬物動態学的または薬力学的相互作用が含まれる。組合せにおけるこれらの治療剤の投与は典型的には、確定した期間（通常、選択した組合せによって、数分、数時間、数日または数週間）に亘って行う。「併用療法」とは、偶発的および任意に本発明の組合せをもたらす別々の単独療法の一部として、これらの治療剤の２つ以上の投与を包含することを意図し得るが、一般にそうではない。「併用療法」は、順次の態様でのこれらの治療剤の投与（すなわち、各治療剤が異なる時間で投与される）、ならびに実質的に同時の態様でのこれらの治療剤、または治療剤の少なくとも２つの投与を包含することを意図する。実質的同時投与は、例えば、被験体に、一定の比率の各治療剤を有する単一のカプセル剤、または治療剤の各々について複数の単一のカプセル剤を投与することによって達成することができる。各治療剤の連続的または実質的同時投与は、これらに限定されないが、経口経路、静脈内経路、筋内経路、および粘膜組織を通した直接吸収を含めた任意の適当な経路によって達成できる。治療剤は、同じ経路によって、または異なる経路によって投与することができる。例えば、選択した組合せの第１の治療剤は、静脈内注射によって投与してもよく、一方組合せの他の治療剤は、経口的に投与してもよい。代わりに、例えば、全ての治療剤を経口的に投与してもよく、または全ての治療剤を静脈内注射によって投与してもよい。治療剤が投与される順序は、厳密には決定的ではない。
【００４８】
「併用療法」はまた、他の生物活性のある成分および非薬物療法（例えば、手術または機械的処置）とのさらなる組合せにおける、上記のような治療剤の投与を包含する。併用療法が非薬物治療をさらに含む場合、非薬物治療は、治療剤および非薬物治療の組合せの相互作用からの有益な効果が達成される限り、任意の適切な時間で行い得る。例えば、適当な場合、非薬物治療が治療剤の投与から一時、恐らく数日または数週間除かれるとき、有益な効果は依然として達成される。
【００４９】
「非経口投与」および「非経口的に投与する」という用語は、本明細書において使用する場合、通常注射による経腸および局所投与以外の投与方法を意味し、これらだけに限定されないが、静脈内、筋内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内の注射および注入が含まれる。
【００５０】
「肺」という用語は、本明細書において使用する場合、その本源的機能が患者における外部環境とのガス交換、例えば、Ｏ２／ＣＯ２交換である任意の部分、組織または器官を意味する。「肺」とは典型的には、気道の組織を意味する。したがって、「肺投与」という語句は、本明細書に記載されている製剤を、その本源的機能が外部環境とのガス交換である任意の部分、組織または器官に投与することを意味する（例えば、口、鼻、咽頭、口腔咽頭部、咽頭喉頭部、喉頭、気管、気管分岐部（ｃａｒｉｎａ）、気管支、細気管支、肺胞（ａｌｖｅｏｌｉ））。本発明の目的のために、「肺」にはまた、気道に付随する組織または腔、特に、洞が含まれる。
【００５１】
本発明の化合物、または化合物の組合せの「治療有効量」は、化合物（または化合物（複数可））の量（含量または濃度）である。一実施形態において、治療有効量の化合物が治療を必要としている被験体に投与されるとき、疾患から生じる症状は、直ちに、または１回もしくは複数回の化合物の投与後に寛解する。被験体に投与される化合物の量は、特定の障害、投与方法、同時投与される化合物（もしあれば）、および被験体の特徴（身体全体の健康、他の疾患、年齢、性別、遺伝子型、体重および薬物耐性など）によって決まる。当業者であれば、これらおよび他の要因によって適当な投与量を決定することができるであろう。
【００５２】
「予防的有効量」という用語は、疾患の危険性を予防または減少させるために投与される本発明の化合物、または化合物の組合せの量（含量または濃度）、すなわち、予防または防止作用を実現するのに必要な量を意味する。被験体に投与される本化合物の量は、特定の障害、投与方法、同時投与される化合物（もしあれば）、および被験体の特徴（身体全体の健康、他の疾患、年齢、性別、遺伝子型、体重および薬物耐性など）によって決まる。当業者であれば、これらおよび他の要因によって適当な投与量を決定することができるであろう。
【００５３】
「危険性を減少させる」という用語は、本明細書において使用する場合、特に、患者または被験体が中枢神経系疾患、炎症性疾患および／または代謝性疾患を発生させる傾向があるときに、患者においてこのような発生する見込みまたは可能性が減少することを意味する。
【００５４】
本発明の化合物の「薬学的に許容される塩」または「塩」は、イオン結合を含有する化合物の生成物であり、典型的には化合物を、被験体に投与するのに適した酸または塩基と反応させることによって生成される。
【００５５】
本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される塩」とは、本発明の化合物の誘導体を意味し、親化合物を、その酸性または塩基性塩を作製することによって修飾する。薬学的に許容される塩の例には、これらに限定されないが、塩基性残基（アミンなど）の鉱酸塩または有機酸塩；酸性残基（カルボン酸など）のアルカリ塩または有機塩などが含まれる。薬学的に許容される塩には、例えば、無毒性無機酸または有機酸から形成される親化合物の従来の無毒性塩または第四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、このような従来の無毒性塩には、これらに限定されないが、２−アセトキシ安息香酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、酢酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、重炭酸、炭酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリコリアルサニル酸、ヘキシルレソルシン酸、ヒドラバミン酸、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸塩、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフトエ酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリルスルホン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ナプシル酸、硝酸、シュウ酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、リン酸、ポリガラクツロン酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、スバセチン酸、コハク酸、スルファミン酸、スルファニル酸、硫酸、タンニン酸、酒石酸、およびトルエンスルホン酸から選択される無機酸および有機酸由来のものが含まれる。
【００５６】
本発明の薬学的に許容される塩は、従来の化学的手法によって塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、このような塩は、水もしくは有機溶媒中で、または２つの混合物中で、これらの化合物の遊離酸または遊離塩基形態を、化学量論量の適当な塩基または酸と反応させることによって調製することができる。一般に、非水性媒体（エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなど）が好ましい。適切な塩の一覧は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、ＵＳＡ、１４４５頁（１９９０年）に見出される。
【００５７】
「薬学的に許容される」という語句は、当該技術分野において承認されている。特定の実施形態において、この用語には、正しい医学的判断の範囲内で、妥当な便益／リスク比と釣り合い、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した組成物、ポリマーおよび他の材料および／または剤形が含まれる。
【００５８】
「薬学的に許容される担体」という語句は、当該技術分野において承認されており、例えば、任意の対象組成物を、１つの器官または体の部分から、別の器官または体の部分へと運ぶ、または輸送することに関与する、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶剤または封入材料などの薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルが含まれる。各担体は、対象組成物の他の成分と適合性であり、患者に有害ではないという意味で「許容され」なくてはならない。特定の実施形態において、薬学的に許容される担体は、非発熱性である。薬学的に許容される担体としての機能を果たし得る材料のいくつかの例には、（１）糖（ラクトース、グルコースおよびスクロースなど）；（２）デンプン（トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンなど）；（３）セルロース、およびその誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなど）；（４）トラガカント粉末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤（カカオバターおよび坐剤ワックスなど）；（９）油（落花生油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油など）；（１０）グリコール（プロピレングリコールなど）；（１１）ポリオール（グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなど）；（１２）エステル（オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど）；（１３）寒天；（１４）緩衝剤（水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど）；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質なしの水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝液；および（２１）医薬製剤において用いられる他の無毒性で適合性の物質が含まれる。
【００５９】
「組成物」または「薬学的に許容される組成物」は、本発明の化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグを含有する製剤である。一実施形態において、医薬組成物は、バルクまたは単位剤形である。単位剤形は、例えば、カプセル剤、ＩＶバッグ、錠剤、エアゾール吸入器上の単一のポンプ、またはバイアルを含めた種々の形態のいずれかである。組成物の単位用量中の活性成分（例えば、本発明の化合物またはその塩の製剤）の含量は有効量であり、関連する特定の治療によって変化する。患者の年齢および状態によって投与量に対して通常の変動を行うことが必要なときがあることを当業者であれば認識するであろう。投与量はまた、投与経路によって決まる。経口、肺、直腸、非経口、経皮的、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、鼻腔内などを含めて種々の経路が意図される。本発明の化合物の局所的または経皮的投与のための剤形には、散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、溶液剤、パッチ剤および吸入剤が含まれる。別の実施形態において、活性化合物を、無菌状態下にて、薬学的に許容される担体と共に、および必要とされる任意の保存剤、緩衝液、または噴射剤と共に混合する。
【００６０】
「フラッシュドーズ（ｆｌａｓｈ  ｄｏｓｅ）」という用語は、急速に分散する剤形である化合物の製剤を意味する。
【００６１】
「即時放出」という用語は、相対的に短期間、一般に約６０分までの、剤形からの化合物の放出と定義される。「調節放出」という用語には、遅延放出、徐放、およびパルス放出が含まれると定義される。「パルス放出」という用語は、剤形からの薬物の一連の放出と定義される。「持続放出」または「徐放」という用語は、長期間に亘る剤形からの化合物の連続放出と定義される。
【００６２】
「被験体」には、哺乳動物、例えば、ヒト、ペット動物（例えば、イヌ、ネコ、鳥など）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ニワトリなど）、および実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、鳥など）が含まれる。典型的には、被験体は、ヒトである。
【００６３】
本発明の化合物にはまた、プロドラッグまたは生理的に同等の誘導体が含まれる。「プロドラッグ」または「生理的に同等の誘導体」には、インビボで代謝的に変換され、活性薬物を生成する薬物の前駆体形態が含まれる。本発明は、本発明の方法において使用されるＴＧＲ５モジュレート化合物にインビボで変換されるプロドラッグの使用をさらに意図する（例えば、Ｒ．  Ｂ．  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、１９９２年、「Ｔｈｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｃｔｉｏｎ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、第８章を参照されたい）。このようなプロドラッグを使用して、ＴＧＲ５モジュレート化合物の体内分布（例えば、典型的には血液脳関門を通過しない化合物を、血液脳関門を通過させることを可能にする）または薬物動態を変化させることができる。例えば、アニオン基、例えば、カルボキシレート、スルフェートまたはスルホネートを、例えば、アルキル基（例えば、メチル基）またはフェニル基でエステル化し、エステルを生じさせることができる。エステルが被験体に投与されるとき、エステルは、酵素的または非酵素的に、還元的または加水分解的に切断され、アニオン基が示される。このようなエステルは、環状、例えば、環状スルフェートもしくはスルホンでよく、または２つ以上のアニオン部分が、連結基によってエステル化されてもよい。アニオン基は、部分（例えば、アシルオキシメチルエステル）でエステル化することができ、その部分は切断され、中間体であるＴＧＲ５モジュレート化合物が示され、中間体であるＴＧＲ５モジュレート化合物は引き続いて分解され、活性ＴＧＲ５モジュレート化合物を生じさせる。一実施形態において、プロドラッグは、カルボキシレート、スルフェートまたはスルホネートの還元された形態、例えば、アルコールまたはチオールであり、プロドラッグは、インビボでＴＧＲ５モジュレート化合物に酸化される。さらに、アニオン部分は、インビボで能動的に輸送され、または標的器官によって選択的に取り込まれる基へとエステル化することができる。
【００６４】
本明細書において使用する場合、「アミノ酸抱合体」という用語は、任意の適切なアミノ酸を有する本発明の化合物の抱合体を意味する。タウリン（ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＯ３Ｈ）およびグリシン（ＮＨＣＨ２ＣＯ２Ｈ）は、アミノ酸抱合体の例である。化合物の適切なアミノ酸抱合体は、胆汁または腸液において増強された完全性という追加された優位性を有する。適切なアミノ酸は、タウリンおよびグリシンに限定されない。本発明は、本発明の化合物のアミノ酸抱合体を包含する。さらに具体的には、本発明には、化合物Ｉｈ３ｅのアミノ酸抱合体が含まれる。またさらに具体的には、本発明には、化合物Ｉｈ３ｅのタウリンおよびグリシン抱合体が含まれる。
【００６５】
「本発明の化合物」という用語は、本明細書に記載されている式を有する化合物を意味する。
【００６６】
「ＴＧＲ５モジュレーター」という用語は、ＴＧＲ５受容体と相互作用する任意の化合物を意味する。相互作用は、ＴＧＲ５受容体のアンタゴニスト、アゴニスト、部分アゴニスト、またはインバースアゴニストとして作用する化合物に限定されない。一態様によれば、本発明の化合物は、ＴＧＲ５受容体のアンタゴニストとして作用する。別の態様において、本発明の化合物は、ＴＧＲ５受容体のアゴニストとして作用する。別の態様において、本発明の化合物は、ＴＧＲ５受容体の部分アゴニストとして作用する。別の態様において、本発明の化合物は、ＴＧＲ５受容体のインバースアゴニストとして作用する。慣例的には、リガンドのプロファイルは、内因性であれまたは合成であれ、Ｆｕｒｃｈｇｏｔｔによって１９６６年に最初に記載されたその内在的有効性「ｅ」によって特性決定される。内在的有効性は、異なるリガンドが同じ数の受容体を占有する一方で、様々な生物学的反応を生じさせる程度を表すために使用される。一般に、「アゴニスト」という用語は、別の分子または受容体部位の活性を増強する化合物を意味する。アゴニストとは、古典的な定義によって、オルソステリック、アロステリック、インバースまたはコアゴニストであろうとなかろうと、受容体に結合し、その受容体の状態を変化させ、生物学的作用をもたらす特性を有する。結果的に、アゴニズムは、生物作用を生じさせるアゴニストまたはリガンドの特性として定義される。これと対照的に、「アンタゴニスト」は、同じ受容体巨大分子に対する高親和性を有するが、非常に少ないまたは無視できる内在的有効性を有する本質的アゴニストであり、したがってアゴニストの生物学的作用を立体的に妨げる。特性として、アンタゴニズムは、機能的または生理学的であってよく、アゴニストは、前者において受容体部位についての直接競合を有し、後者において異なる受容体−メッセンジャー系を介する拮抗作用を有する。さらに具体的には、ＴＧＲ５アゴニストは、ＴＧＲ５に結合し、受容体を発現している細胞において環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の濃度を少なくとも２０％増加させる受容体リガンドまたは化合物である。逆に、ＴＧＲ５アンタゴニストは、アゴニストの活性をアンタゴナイズまたは遮断し、それによってｃＡＭＰの濃度の減少をもたらす化合物であろう。
【００６７】
本発明は、ＴＧＲ５受容体モジュレート活性を有する化合物、ならびに代謝性疾患、炎症性疾患、肝疾患、自己免疫疾患、心臓疾患、腎臓疾患、癌、および胃腸疾患を含めた様々な疾患を治療および／または予防するためのそれらの使用に関する。さらに、本発明は、本明細書に記載されている式の化合物に関する。
【００６８】
化合物および組成物
一態様において、本発明は、式Ａ：
【００６９】
【化５】
0005535233.tif 000012
の化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグに関し、式中、Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、置換もしくは非置換アルキル、またはハロゲンであり、Ｒ２は、水素またはα−ヒドロキシであり、Ｒ３は、水素、ヒドロキシ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、Ｒ４は、水素、置換もしくは非置換アルキル、またはハロゲンであり、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキル、またはアリールであり、Ｒ６は、水素、非置換もしくは置換アルキルであり、またはＲ５およびＲ６はそれらが結合している炭素と一緒になって、サイズが３個、４個、５個、または６個の原子の環を形成し、Ｒ７は、水素、置換もしくは非置換アルキル、またはヒドロキシであり、Ｒ８は、水素、置換もしくは非置換アルキルであり、Ｒ９は、水素、置換もしくは非置換アルキルであり、または一緒になってＲ８およびＲ９は、カルボニルを形成し、Ｒ１０は、Ｒ３またはＳＯ３Ｈであり、ｍは、整数０、１、２、３、４、または５であり、ｎは、整数０、１、２、３、４、または５である。一態様において、Ｒ５がメチルであり、Ｒ１がヒドロキシルであり、Ｒ３がヒドロキシルまたはＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３Ｈであるとき、Ｒ４は、水素ではない。
【００７０】
本発明の一態様において、Ｒ１は、水素またはヒドロキシである。Ｒ１は、ヒドロキシである。Ｒ１は、水素である。Ｒ２は、α−ヒドロキシである。Ｒ１は、ヒドロキシであり、Ｒ２は、α−ヒドロキシである。Ｒ１は、ヒドロキシであり、Ｒ２は、Ｈである。Ｒ１は、ヒドロキシであり、Ｒ２は、Ｈである。Ｒ１またはＲ２の少なくとも１つは、ヒドロキシである。Ｒ１またはＲ２の少なくとも１つは、水素である。Ｒ１およびＲ２は、同じである。Ｒ１およびＲ２は、各々α−ヒドロキシである。Ｒ１およびＲ２は、各々水素である。
【００７１】
本発明の別の態様において、Ｒ１０は、Ｒ３である。Ｒ３は、ヒドロキシル、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈである。Ｒ３は、ヒドロキシルである。Ｒ３は、ヒドロキシルでない。Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈである。Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈであり、ｍは、２である。Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈである。Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、ｎは、１である。
【００７２】
本発明の別の態様において、Ｒ４は、水素または非置換アルキルである。Ｒ４は、水素である。Ｒ４は、非置換アルキルである。Ｒ４は、非置換アルキルである。Ｒ４は、メチルまたはエチルである。Ｒ４は、メチルである。Ｒ４は、エチルである。Ｒ３およびＲ４は、同じである。Ｒ３およびＲ４は、異なる。Ｒ３およびＲ４は、各々水素である。Ｒ３は、ヒドロキシルであり、Ｒ４は、水素である。Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈであり、Ｒ４は、水素である。Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈであり、Ｒ４は、水素であり、ｍは、２である。Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、Ｒ４は、水素である。Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、Ｒ４は、水素であり、ｎは、１である。Ｒ３は、Ｈであり、Ｒ４は、非置換アルキルである。Ｒ３は、ＯＨであり、Ｒ４は、メチルである。Ｒ３は、ＯＨであり、Ｒ４は、エチルである。Ｒ３は、ＯＨであり、Ｒ４は、メチルである。
【００７３】
別の態様において、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキルである。Ｒ５は、Ｓ−配置である。Ｒ５は、Ｒ−配置である。Ｒ５は、メチルまたはエチルである。Ｒ５は、Ｓ−メチルである。Ｒ５は、Ｒ−メチルである。Ｒ５は、Ｓ−エチルである。Ｒ５は、Ｒ−エチルである。Ｒ５は、フェニルで置換されている置換アルキルである。Ｒ５は、ベンジルである。Ｒ５は、Ｓ−ベンジルである。Ｒ５は、Ｒ−ベンジルである。Ｒ５は、アリールである。Ｒ５は、フェニルである。Ｒ４およびＲ５は、各々非置換アルキルである。Ｒ４およびＲ５は、各々非置換アルキルであり、Ｒ５は、Ｓ−配置であり、Ｒ４は、アルファ−配置である。Ｒ４およびＲ５は、各々非置換アルキルであり、Ｒ１は、ヒドロキシである。Ｒ４およびＲ５は、各々非置換アルキルであり、Ｒ２は、水素である。Ｒ４およびＲ５は、各々非置換アルキルであり、Ｒ１は、ヒドロキシであり、Ｒ２は、水素である。
【００７４】
本発明の一態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、水素である。Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、水素である。Ｒ２およびＲ３は、水素である。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４の少なくとも１つは、水素である。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４の少なくとも２つは、水素である。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４の少なくとも３つは、水素である。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４の少なくとも４つは、水素である。
【００７５】
本発明の一態様において、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は、水素であり、Ｒ３は、ＯＨである。Ｒ２およびＲ４は、水素であり、Ｒ３は、ＯＨである。Ｒ２は、水素であり、Ｒ３は、ＯＨである。Ｒ１、Ｒ２、またはＲ４の少なくとも１つは、水素であり、Ｒ３は、ＯＨである。Ｒ１、Ｒ２、またはＲ４の少なくとも２つは、水素であり、Ｒ３は、ＯＨである。Ｒ１、Ｒ２およびＲ４は、水素であり、Ｒ３は、ＯＨである。
【００７６】
本発明の別の態様において、Ｒ１またはＲ７の少なくとも１つは、非置換アルキルである。Ｒ１またはＲ７の少なくとも１つは、メチルである。Ｒ１またはＲ７の少なくとも１つは、エチルである。Ｒ１またはＲ７の少なくとも１つは、プロピルである。Ｒ１は、メチルである。Ｒ１は、エチルである。Ｒ１は、プロピルである。Ｒ７は、メチルである。Ｒ７は、エチルである。Ｒ７は、プロピルである。Ｒ１およびＲ７の両方は、非置換アルキルである。Ｒ１およびＲ７の両方は、メチルである。Ｒ１およびＲ７の両方は、エチルである。Ｒ７は、水素である。Ｒ７は、ヒドロキシである。Ｒ１は、水素である。Ｒ１は、ヒドロキシルである。Ｒ１またはＲ７の１つは、非置換アルキルであり、他のＲ１またはＲ７は、水素である。Ｒ１またはＲ７の１つは、非置換アルキルであり、他のＲ１またはＲ７は、ヒドロキシである。Ｒ１またはＲ７の少なくとも１つは、非置換アルキルであり、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキルである。Ｒ１またはＲ７の少なくとも１つは、メチルであり、Ｒ５は、メチルである。Ｒ７は、ヒドロキシであり、Ｒ１およびＲ５の両方は、非置換アルキルである。Ｒ１は、ヒドロキシルであり、Ｒ７およびＲ５の両方は、非置換アルキルである。Ｒ１またはＲ７の少なくとも１つは、非置換アルキルであり、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキルであり、さらにＲ５は、Ｓ−配置である。Ｒ１またはＲ７の少なくとも１つは、非置換アルキルであり、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキルであり、さらにＲ５は、Ｒ−配置である。
【００７７】
別の態様において、Ｒ１は、ヒドロキシであり、Ｒ７は、メチルである。Ｒ１は、メチルであり、Ｒ７は、ヒドロキシである。Ｒ６は、非置換アルキルである。Ｒ６は、メチルである。Ｒ６は、エチルである。Ｒ６は、プロピルである。
【００７８】
別の態様において、Ｒ８は、水素である。Ｒ８は、非置換アルキルである。Ｒ８は、メチルである。Ｒ８は、エチルである。Ｒ８は、プロピルである。Ｒ２は、α−ヒドロキシであり、Ｒ８は、非置換アルキルである。別の態様において、Ｒ８およびＲ９は、カルボニルを形成する。
【００７９】
一態様において、Ｒ１０は、Ｒ３である。Ｒ３は、ヒドロキシルである。Ｒ８またはＲ９の少なくとも１つは、水素である。Ｒ８およびＲ９は、両方とも水素である。Ｒ８またはＲ９の少なくとも１つは、非置換アルキルである。Ｒ８またはＲ９の少なくとも１つは、メチルである。Ｒ８またはＲ９の少なくとも１つは、エチルである。別の態様において、Ｒ１０は、ＳＯ３Ｈである。
【００８０】
本発明の別の態様において、Ｒ２、Ｒ４およびＲ６が各々水素であり、Ｒ３がヒドロキシルであり、Ｒ１およびＲ７の１つが水素またはヒドロキシルであるとき、他のＲ１またはＲ７は、メチルでない。別の態様において、Ｒ２がα−ＯＨであり、Ｒ３がヒドロキシルであり、Ｒ４およびＲ６が各々水素であり、Ｒ１およびＲ７の１つが水素またはヒドロキシルであるとき、他のＲ１またはＲ７は、メチルでない。別の態様において、本発明には、下記の化合物が含まれない。３α，７α−ジヒドロキシ−７β−メチル−５β−コラン酸、３α，７β−ジヒドロキシ−７α−メチル−５β−コラン酸、３α−ヒドロキシ−７ε−メチル−５β−コラン酸、３α，７β，１２α−トリヒドロキシ−７α−メチル−５β−コラン−２４−酸；３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−７β−メチル−５β−コラン−２４−酸；および３α，１２α−ジヒドロキシ−７ε−メチル−５β−コラン−２４−酸。
【００８１】
本発明の別の態様において、Ｒ３がヒドロキシルであり、Ｒ１およびＲ７の１つがメチルであり、他のＲ１およびＲ７が水素またはヒドロキシルであるとき、Ｒ２、Ｒ４およびＲ６は、全てが水素ではない。別の態様において、Ｒ２がα−ＯＨであり、Ｒ３がヒドロキシルであり、Ｒ１およびＲ７の１つがメチルであり、他のＲ１およびＲ７が水素またはヒドロキシルであるとき、Ｒ４およびＲ６は、全てが水素ではない。
【００８２】
一態様によれば、本発明は、式Ｉ：
【００８３】
【化６】
0005535233.tif 000013
の化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグを提供し、式中、Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、またはハロゲンであり、Ｒ２は、水素またはα−ヒドロキシであり、Ｒ３は、ヒドロキシ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、Ｒ４は、水素、非置換もしくは置換アルキル、またはハロゲンであり、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキル、またはアリールであり、Ｒ６は、水素であり、またはＲ５およびＲ６はそれらが結合している炭素と一緒になって、サイズが３個、４個、５個、または６個の原子の環を形成し、ｍは、整数０、１、２、３、４、または５であり、ｎは、整数０、１、２、３、４、または５である。一態様において、Ｒ５がメチルであり、Ｒ１がヒドロキシルであり、Ｒ３がヒドロキシルまたはＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３Ｈであるとき、Ｒ４は、水素ではない。
【００８４】
一態様において、本発明は、Ｒ１が水素またはヒドロキシである化合物を提供する。Ｒ１は、ヒドロキシである。Ｒ１は、水素である。Ｒ１は、α−ヒドロキシである。Ｒ１は、β−ヒドロキシである。
【００８５】
別の態様において、本発明は、Ｒ１がハロゲンである化合物を提供する。Ｒ１は、フッ素である。Ｒ１は、α−フッ素である。Ｒ１は、β−フッ素である。α−およびβ−配置におけるＲ１の立体配置を下記に示す。
【００８６】
【化７】
0005535233.tif 000014
別の態様において、本発明は、Ｒ２がα−ヒドロキシである化合物を提供する。Ｒ２は、水素である。Ｒ１は、β−ヒドロキシであり、Ｒ２は、α−ヒドロキシである。Ｒ１は、β−ヒドロキシであり、Ｒ２は、Ｈである。Ｒ１は、α−ヒドロキシであり、Ｒ２は、Ｈである。
【００８７】
別の態様において、本発明は、Ｒ１またはＲ２の少なくとも１つがヒドロキシである化合物を提供する。別の態様において、Ｒ１またはＲ２の少なくとも１つは、水素である。Ｒ１およびＲ２は、同じである。Ｒ１およびＲ２は、各々α−ヒドロキシである。Ｒ１およびＲ２は、各々水素である。
【００８８】
別の態様において、本発明は、Ｒ３が水素、ヒドロキシル、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈである化合物を提供する。Ｒ３は、ヒドロキシルである。Ｒ３は、ヒドロキシルでない。Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈである。別の態様において、Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈであり、ｍは、２である。Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈである。別の態様において、Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、ｎは、１である。
【００８９】
別の態様において、Ｒ４は、水素またはアルキルである。Ｒ４は、水素である。Ｒ４は、低級アルキルである。Ｒ４は、低級アルキルであり、低級アルキル基は、アルファ配置である。アルファ配置のＲ４とは、Ｒ４が下記の構造において示される立体配置を有することを意味する。
【００９０】
【化８】
0005535233.tif 000015
別の態様において、Ｒ４は、ハロゲンである。Ｒ４は、フッ素である。Ｒ４は、ハロゲンであり、ハロゲンは、アルファ配置である。Ｒ４は、α−フッ素である。
【００９１】
別の態様において、Ｒ４は、メチルまたはエチルである。Ｒ４は、メチルである。Ｒ４は、エチルである。Ｒ４は、α−メチルである。Ｒ４は、α−エチルである。Ｒ３およびＲ４は、同じである。Ｒ３およびＲ４は、異なる。Ｒ３およびＲ４は、各々水素である。Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈであり、Ｒ４は、水素である。Ｒ３は、ヒドロキシルであり、Ｒ４は、水素である。別の態様において、Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈであり、Ｒ４は、水素であり、ｍは、２である。Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、Ｒ４は、水素である。別の態様において、Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、Ｒ４は、水素であり、ｎは、１である。
【００９２】
別の態様において、Ｒ３は、ＯＨであり、Ｒ４は、アルキルである。Ｒ３は、ＯＨであり、Ｒ４は、低級アルキルである。低級アルキルは、アルファ配置である。Ｒ３は、ＯＨであり、Ｒ４は、メチルである。Ｒ３は、ＯＨであり、Ｒ４は、エチルである。Ｒ３は、ＯＨであり、Ｒ４は、α−メチルである。Ｒ３は、ＯＨであり、Ｒ４は、α−エチルである。
【００９３】
別の態様において、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキルである。Ｒ５は、非置換もしくは置換低級アルキルである。Ｒ５は、Ｓ−配置である。Ｒ５は、Ｒ−配置である。Ｒ５は、メチルまたはエチルである。Ｒ５は、Ｓ−メチルである。Ｒ−メチル。Ｒ５は、Ｓ−エチルである。Ｒ−エチル。Ｒ５は、フェニルで置換されているアルキルである。Ｒ５は、フェニルで置換されている低級アルキルである。Ｒ５は、ベンジルである。Ｒ５は、Ｓ−ベンジルである。Ｒ５は、Ｒ−ベンジルである。
【００９４】
別の態様において、Ｒ５は、アリールである。Ｒ５は、フェニルである。
【００９５】
別の態様において、Ｒ４およびＲ５は、各々非置換アルキルである。Ｒ４およびＲ５は、各々非置換低級アルキルである。Ｒ４およびＲ５は、各々非置換低級アルキルであり、Ｒ５は、Ｓ−配置である。Ｒ４およびＲ５は、各々非置換低級アルキルであり、Ｒ４は、アルファ配置である。別の態様において、Ｒ４およびＲ５は、水素ではない。
【００９６】
別の態様において、Ｒ４およびＲ５は、各々非置換低級アルキルであり、Ｒ１は、α−ヒドロキシである。Ｒ４およびＲ５は、各々非置換低級アルキルであり、Ｒ２は、水素である。Ｒ４およびＲ５は、各々非置換低級アルキルであり、Ｒ１は、α−ヒドロキシであり、Ｒ２は、水素である。
【００９７】
別の態様において、Ｒ５およびＲ６はそれらが結合している炭素と一緒になって、サイズが３個、４個、５個、または６個の原子の環を形成する。Ｒ５およびＲ６はそれらが結合している炭素と一緒になって、３員環を形成する。３員環は、下記の立体配置：
【００９８】
【化９】
0005535233.tif 000016
を有する。
３員環は、下記の立体配置：
【００９９】
【化１０−１】
0005535233.tif 000017
を有する。
【０１００】
別の態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、水素である。Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、水素である。Ｒ２およびＲ３は、水素である。別の態様において、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は、水素であり、Ｒ３は、ＯＨである。Ｒ２およびＲ４は、水素であり、Ｒ３は、ＯＨである。Ｒ２は、水素であり、Ｒ３は、ＯＨである。
【０１０１】
別の態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４の少なくとも１つは、水素である。別の態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４の少なくとも２つは、水素である。別の態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４の少なくとも３つは、水素である。別の態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、水素である。別の態様において、Ｒ１、Ｒ２、またはＲ４の少なくとも１つは、水素であり、Ｒ３は、ＯＨである。別の態様において、Ｒ１、Ｒ２、またはＲ４の少なくとも２つは、水素であり、Ｒ３は、ＯＨである。別の態様において、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は、水素であり、Ｒ３は、ＯＨである。別の態様において、本発明は、Ｒ５は、メチルであり、Ｒ４は、水素であり、Ｒ２は、ＨまたはＯＨであるときに、含まれない。
【０１０２】
本発明の別の態様において、化合物は、
【０１０３】
【化１０−２】
0005535233.tif 000018
から選択される。
【０１０４】
本発明の別の態様において、化合物は、化合物Ｉｄ、Ｉｅ、Ｉｆ、Ｉｄ１、Ｉｌ、Ｉｍ、およびＩｎから選択されない。別の態様において、化合物は、ＩｅｌおよびＩｆ１から選択されない。
【０１０５】
本発明の別の態様には、式Ｉ：
【０１０６】
【化１１】
0005535233.tif 000019
の化合物またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグと、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物または医薬が含まれ、式中、Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、またはハロゲンであり、Ｒ２は、水素またはα−ヒドロキシであり、Ｒ３は、ヒドロキシ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、Ｒ４は、水素、非置換もしくは置換アルキル、またはハロゲンであり、Ｒ５は、非置換もしくは置換低級アルキル、またはアリールであり、Ｒ６は、水素であり、またはＲ５およびＲ６はそれらが結合している炭素と一緒になって、サイズが３個、４個、５個、または６個の原子の環を形成し、ｍは、整数０、１、２、３、４、または５であり、ｎは、整数０、１、２、３、４、または５である。別の態様において、本発明には、式Ｉの化合物を含む組成物または医薬が含まれ、ただし、Ｒ５がメチルであり、Ｒ１がヒドロキシルであり、Ｒ３がヒドロキシまたはＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３Ｈであるとき、Ｒ４は、水素ではない。
【０１０７】
本発明の別の態様には、式ＩＡ：
【０１０８】
【化１２−１】
0005535233.tif 000020
の化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、式中、Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、置換もしくは非置換アルキル、またはハロゲンであり、Ｒ２は、水素またはα−ヒドロキシであり、Ｒ３は、ヒドロキシ、水素、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、Ｒ４は、水素、置換もしくは非置換アルキル、またはハロゲンであり、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキル、またはアリールであり、Ｒ６は、水素、非置換もしくは置換アルキルであり、またはＲ５およびＲ６はそれらが結合している炭素と一緒になって、サイズが３個、４個、５個、または６個の原子の環を形成し、Ｒ７は、水素、置換もしくは非置換アルキル、またはヒドロキシであり、ｍは、整数０、１、２、３、４、または５であり、ｎは、整数０、１、２、３、４、または５である。一態様において、Ｒ５がメチルであり、Ｒ１がヒドロキシルであり、Ｒ３がヒドロキシまたはＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３Ｈであるとき、Ｒ４は、水素ではない。
【０１０９】
一態様において、Ｒ１は、水素またはヒドロキシである。Ｒ１は、ヒドロキシである。Ｒ１は、水素である。Ｒ１は、ヒドロキシであり、Ｒ２は、α−ヒドロキシである。Ｒ１は、ヒドロキシであり、Ｒ２は、Ｈである。Ｒ１は、ヒドロキシであり、Ｒ２は、Ｈである。Ｒ１またはＲ２の少なくとも１つは、ヒドロキシである。Ｒ１またはＲ２の少なくとも１つは、水素である。Ｒ１およびＲ２は、同じである。Ｒ１は、ヒドロキシルであり、Ｒ２は、α−ヒドロキシである。Ｒ１およびＲ２は、各々水素である。
【０１１０】
一態様において、Ｒ３は、水素、ヒドロキシ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈである。Ｒ３は、ヒドロキシである。Ｒ３は、ヒドロキシではない。Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈである。Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈであり、ｍは、２である。Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈである。Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、ｎは、１である。
【０１１１】
別の態様において、Ｒ４は、水素または非置換アルキルである。Ｒ４は、水素である。Ｒ４は、非置換アルキルである。Ｒ４は、非置換アルキルである。Ｒ４は、メチルまたはエチルである。Ｒ４は、メチルである。Ｒ４は、エチルである。Ｒ３およびＲ４は、同じである。Ｒ３およびＲ４は、異なる。Ｒ３およびＲ４は、各々水素である。Ｒ３は、ＯＨであり、Ｒ４は、水素である。
【０１１２】
別の態様において、Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈであり、Ｒ４は、水素である。Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈであり、Ｒ４は、水素であり、ｍは、２である。Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、Ｒ４は、水素である。Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、Ｒ４は、水素であり、ｎは、１である。Ｒ３は、ＯＨであり、Ｒ４は、非置換アルキルである。Ｒ３は、ＯＨであり、Ｒ４は、非置換アルキルである。Ｒ３は、ＯＨであり、Ｒ４は、メチルである。Ｒ３は、ＯＨであり、Ｒ４は、エチルである。Ｒ３は、ＯＨであり、Ｒ４は、メチルである。
【０１１３】
一態様において、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキルである。Ｒ５は、Ｓ−配置である。Ｒ５は、Ｒ−配置である。Ｒ５は、メチルまたはエチルである。Ｒ５は、Ｓ−メチルである。Ｒ５は、Ｒ−メチルである。Ｒ５は、Ｓ−エチルである。Ｒ５は、Ｒ−エチルである。Ｒ５は、フェニルで置換されている。Ｒ５は、ベンジルである。Ｒ５は、Ｓ−ベンジルである。Ｒ５は、Ｒ−ベンジルである。別の態様において、Ｒ５は、アリールである。例えば、Ｒ５は、フェニルである。
【０１１４】
Ｒ４およびＲ５は、各々非置換アルキルである。Ｒ４およびＲ５は、各々非置換アルキルであり、さらにＲ５は、Ｓ−配置である。Ｒ４およびＲ５は、各々非置換アルキルである。Ｒ４およびＲ５は、各々非置換アルキルであり、Ｒ１は、ヒドロキシである。Ｒ４およびＲ５は、各々非置換アルキルであり、Ｒ２は、水素である。Ｒ４およびＲ５は、各々非置換アルキルであり、Ｒ１は、ヒドロキシであり、Ｒ２は、水素である。
【０１１５】
一態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、水素である。Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、水素である。Ｒ２およびＲ３は、水素である。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４の少なくとも１つは、水素である。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４の少なくとも２つは、水素である。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４の少なくとも３つは、水素である。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、水素である。
【０１１６】
一態様において、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は、水素であり、Ｒ３は、ＯＨである。Ｒ２およびＲ４は、水素であり、Ｒ３は、ＯＨである。Ｒ２は、水素であり、Ｒ３は、ＯＨである。Ｒ１、Ｒ２、またはＲ４の少なくとも１つは、水素であり、Ｒ３は、ＯＨである。Ｒ１、Ｒ２、またはＲ４の少なくとも２つは、水素であり、Ｒ３は、ＯＨである。Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４の全ては、水素であり、Ｒ３は、ＯＨである。
【０１１７】
別の態様において、Ｒ１またはＲ７の少なくとも１つは、非置換アルキルである。Ｒ１またはＲ７の少なくとも１つは、メチルである。Ｒ１またはＲ７の少なくとも１つは、エチルである。Ｒ１またはＲ７の少なくとも１つは、プロピルである。Ｒ１およびＲ７の両方は、非置換アルキルである。Ｒ１およびＲ７の両方は、メチルである。Ｒ１およびＲ７の両方は、エチルである。Ｒ１およびＲ７は、同じである。Ｒ１およびＲ７は、異なる。Ｒ７は、水素である。Ｒ７は、ヒドロキシである。Ｒ１またはＲ７の１つは、非置換アルキルであり、Ｒ１またはＲ７の残りは、水素である。Ｒ１またはＲ７の１つは、非置換アルキルであり、Ｒ１またはＲ７の残りは、ヒドロキシである。Ｒ１またはＲ７の少なくとも１つは、非置換アルキルであり、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキルである。Ｒ１またはＲ７の少なくとも１つは、メチルであり、Ｒ５は、メチルである。
【０１１８】
Ｒ１およびＲ５の両方は、非置換アルキルであり、Ｒ７は、ヒドロキシである。Ｒ７およびＲ５の両方は、非置換アルキルであり、Ｒ１は、ヒドロキシである。Ｒ１またはＲ７は、非置換アルキルであり、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキルであり、さらにＲ５は、Ｓ−配置である。Ｒ１またはＲ７は、非置換アルキルであり、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキルであり、さらにＲ５は、Ｒ−配置である。
【０１１９】
別の態様において、Ｒ１は、ヒドロキシであり、Ｒ７は、メチルである。Ｒ１は、メチルであり、Ｒ７は、ヒドロキシである。Ｒ６は、非置換アルキルである。Ｒ６は、メチルである。Ｒ６は、エチルである。Ｒ２およびＲ６は、各々水素である。Ｒ２およびＲ６は、水素であり、Ｒ５は、非置換アルキルである。Ｒ２およびＲ６は、水素であり、Ｒ５は、非置換アルキルであり、Ｒ１またはＲ７の少なくとも１つは、非置換アルキルである。
【０１２０】
一態様において、化合物は、
【０１２１】
【化１２−２】
0005535233.tif 000021
から選択される。
【０１２２】
本発明の別の態様において、Ｒ２、Ｒ４およびＲ６が各々水素であり、Ｒ３がヒドロキシルであり、Ｒ１およびＲ７の１つが水素またはヒドロキシルであるとき、他のＲ１またはＲ７は、メチルでない。別の態様において、Ｒ２がα−ＯＨであり、Ｒ３がヒドロキシルであり、Ｒ４およびＲ６が各々水素であり、Ｒ１およびＲ７の１つが水素またはヒドロキシルであるとき、他のＲ１またはＲ７は、メチルでない。別の態様において、本発明には、下記の化合物が含まれない。３α，７α−ジヒドロキシ−７β−メチル−５β−コラン酸、３α，７β−ジヒドロキシ−７α−メチル−５β−コラン酸、３α−ヒドロキシ−７ε−メチル−５β−コラン酸、３α，７β，１２α−トリヒドロキシ−７α−メチル−５β−コラン−２４−酸；３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−７β−メチル−５β−コラン−２４−酸；および３α，１２α−ジヒドロキシ−７ε−メチル−５β−コラン−２４−酸。
【０１２３】
本発明の別の態様において、Ｒ３がヒドロキシルであり、Ｒ１およびＲ７の１つがメチルであり、他のＲ１およびＲ７が水素またはヒドロキシルであるとき、Ｒ２、Ｒ４およびＲ６は、全てが水素ではない。別の態様において、Ｒ２がα−ＯＨであり、Ｒ３がヒドロキシルであり、Ｒ１およびＲ７の１つがメチルであり、他のＲ１およびＲ７が水素またはヒドロキシルであるとき、Ｒ４およびＲ６は、水素ではない。
【０１２４】
本発明の別の態様には、式ＩＡ：
【０１２５】
【化１３】
0005535233.tif 000022
の化合物またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグと、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物または医薬が含まれ、式中、Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、置換もしくは非置換アルキル、またはハロゲンであり、Ｒ２は、水素またはα−ヒドロキシであり、Ｒ３は、ヒドロキシ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、Ｒ４は、水素、置換もしくは非置換アルキル、またはハロゲンであり、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキル、またはアリールであり、Ｒ６は、水素、非置換もしくは置換アルキルであり、またはＲ５およびＲ６はそれらが結合している炭素と一緒になって、サイズが３個、４個、５個、または６個の原子の環を形成し、Ｒ７は、水素、置換もしくは非置換アルキル、またはヒドロキシであり、ｍは、整数０、１、２、３、４、または５であり、ｎは、整数０、１、２、３、４、または５である。
【０１２６】
本発明の一態様において、Ｒ５がメチルであり、Ｒ１がヒドロキシルであり、Ｒ３がヒドロキシルまたはＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３Ｈであるとき、Ｒ４は、水素ではない。
【０１２７】
本発明の別の態様には、式ＩＩ：
【０１２８】
【化１４−１】
0005535233.tif 000023
の化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、式中、Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、置換もしくは非置換アルキル、またはハロゲンであり、Ｒ２は、水素またはα−ヒドロキシであり、Ｒ４は、水素、置換もしくは非置換アルキル、またはハロゲンであり、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキル、またはアリールであり、Ｒ６は、水素、非置換もしくは置換アルキルであり、またはＲ５およびＲ６はそれらが結合している炭素と一緒になって、サイズが３個、４個、５個、または６個の原子の環を形成し、Ｒ７は、水素、置換もしくは非置換アルキル、またはヒドロキシであり、Ｒ８は、水素、置換もしくは非置換アルキルである。一態様において、Ｒ５がメチルであり、Ｒ１がヒドロキシルであるとき、Ｒ４は、水素ではない。
【０１２９】
一態様において、Ｒ１は、水素またはヒドロキシである。Ｒ１は、ヒドロキシである。Ｒ１は、水素である。Ｒ１は、β−ヒドロキシである。Ｒ２は、α−ヒドロキシである。Ｒ１は、ヒドロキシであり、Ｒ２は、α−ヒドロキシである。Ｒ１は、ヒドロキシであり、Ｒ２は、Ｈである。Ｒ１またはＲ２の少なくとも１つは、ヒドロキシである。Ｒ１またはＲ２の少なくとも１つは、水素である。Ｒ１およびＲ２は、同じである。Ｒ１は、ヒドロキシルであり、Ｒ２は、α−ヒドロキシである。Ｒ１およびＲ２は、各々水素である。
【０１３０】
別の態様において、Ｒ４は、水素または非置換アルキルである。Ｒ４は、水素である。Ｒ４は、非置換アルキルである。Ｒ４は、非置換アルキルである。Ｒ４は、メチルまたはエチルである。Ｒ４は、メチルである。Ｒ４は、エチルである。
【０１３１】
一態様において、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキルである。Ｒ５は、Ｓ−配置である。Ｒ５は、Ｒ−配置である。Ｒ５は、メチルまたはエチルである。Ｒ５は、Ｓ−メチルである。Ｒ５は、Ｒ−メチルである。Ｒ５は、Ｓ−エチルである。Ｒ５は、Ｒ−エチルである。Ｒ５は、フェニルで置換されている。Ｒ５は、ベンジルである。Ｒ５は、Ｓ−ベンジルである。Ｒ５は、Ｒ−ベンジルである。Ｒ５は、アリールである。Ｒ５は、フェニルである。Ｒ４およびＲ５は、各々非置換アルキルである。Ｒ４およびＲ５は、各々非置換アルキルであり、さらにＲ５は、Ｓ−配置である。Ｒ４およびＲ５は、各々非置換アルキルであり、Ｒ１は、ヒドロキシである。Ｒ４およびＲ５は、各々非置換アルキルであり、Ｒ２は、水素である。Ｒ４およびＲ５は、各々非置換アルキルであり、Ｒ１は、ヒドロキシであり、Ｒ２は、水素である。
【０１３２】
一態様において、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は、水素である。Ｒ２およびＲ４は、水素である。Ｒ２は、水素である。Ｒ１、Ｒ２、またはＲ４の少なくとも１つは、水素である。Ｒ１、Ｒ２、またはＲ４の少なくとも２つは、水素である。Ｒ１、Ｒ２、またはＲ４の全ては、水素である。
【０１３３】
一態様において、Ｒ１またはＲ７は、非置換アルキルである。Ｒ１またはＲ７は、メチルである。Ｒ１またはＲ７は、エチルである。Ｒ１またはＲ７は、プロピルである。Ｒ１およびＲ７の両方は、非置換アルキルである。Ｒ７は、水素である。Ｒ７は、ヒドロキシである。Ｒ１またはＲ７の１つは、非置換アルキルであり、Ｒ１またはＲ７の残りは、水素である。Ｒ１またはＲ７の１つは、非置換アルキルであり、Ｒ１またはＲ７の残りは、ヒドロキシである。Ｒ１またはＲ７の少なくとも１つは、非置換アルキルであり、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキルである。Ｒ１またはＲ７の少なくとも１つは、メチルであり、Ｒ５は、メチルである。Ｒ７は、ヒドロキシであり、Ｒ１およびＲ５の両方は、非置換アルキルである。Ｒ１は、ヒドロキシであり、Ｒ７およびＲ５の両方は、非置換アルキルである。Ｒ１またはＲ７の少なくとも１つは、非置換アルキルであり、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキルであり、さらにＲ５は、Ｓ−配置である。Ｒ１またはＲ７の少なくとも１つは、非置換アルキルであり、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキルであり、さらにＲ５は、Ｒ−配置である。Ｒ７は、ヒドロキシであり、Ｒ１およびＲ５の両方は、非置換アルキルであり、さらにＲ５は、Ｓ−配置である。Ｒ７は、ヒドロキシであり、Ｒ１およびＲ５の両方は、非置換アルキルであり、さらにＲ５は、Ｒ−配置である。Ｒ１は、ヒドロキシであり、Ｒ７およびＲ５の両方は、非置換アルキルであり、さらにＲ５は、Ｓ−配置である。Ｒ１は、ヒドロキシであり、Ｒ７およびＲ５の両方は、非置換アルキルであり、さらにＲ５は、Ｒ−配置である。Ｒ１は、ヒドロキシであり、Ｒ７は、メチルである。Ｒ１は、メチルであり、Ｒ７は、ヒドロキシである。
【０１３４】
別の態様において、Ｒ６は、非置換アルキルである。Ｒ６は、メチルである。Ｒ６は、エチルである。Ｒ８は、水素である。
【０１３５】
Ｒ８は、非置換アルキルである。Ｒ８は、メチルである。Ｒ８は、エチルである。Ｒ２は、α−ヒドロキシであり、Ｒ８は、非置換アルキルである。
【０１３６】
本発明の別の態様において、化合物は、
【０１３７】
【化１４−２】
0005535233.tif 000024
から選択される。
【０１３８】
本発明の別の態様には、式ＩＩ：
【０１３９】
【化１５】
0005535233.tif 000025
の化合物またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグと、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物または医薬が含まれ、式中、Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、置換もしくは非置換アルキル、またはハロゲンであり、Ｒ２は、水素またはα−ヒドロキシであり、Ｒ４は、水素、置換もしくは非置換アルキル、またはハロゲンであり、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキル、またはアリールであり、Ｒ６は、水素、非置換もしくは置換アルキルであり、またはＲ５およびＲ６はそれらが結合している炭素と一緒になって、サイズが３個、４個、５個、または６個の原子の環を形成し、Ｒ７は、水素、置換もしくは非置換アルキル、またはヒドロキシであり、Ｒ８は、水素または置換もしくは非置換アルキルである。一態様において、Ｒ５がメチルであり、Ｒ１がヒドロキシルであり、Ｒ３がヒドロキシルまたはＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３Ｈであるとき、Ｒ４は、水素ではない。
【０１４０】
本発明の別の態様には、式ＩＩＩ：
【０１４１】
【化１６】
0005535233.tif 000026
による化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、式中、Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、またはハロゲンであり、Ｒ２は、水素またはα−ヒドロキシであり、Ｒ３は、ヒドロキシ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキル、またはアリールであり、Ｒ６は、水素であり、またはＲ５およびＲ６はそれらが結合している炭素と一緒になって、サイズが３個、４個、５個、または６個の原子の環を形成し、Ｒ７は、水素、非置換もしくは置換アルキル、またはヒドロキシであり、Ｒ８は、水素、非置換もしくは置換アルキルであり、Ｒ９は、水素、非置換もしくは置換アルキルであり、またはＲ８およびＲ９はそれらが結合している炭素と一緒になって、カルボニルを形成し、Ｒ１０は、Ｒ３またはＳＯ３Ｈであり、ｍは、整数０、１、２、３、４、または５であり、ｎは、整数０、１、２、３、４、または５である。
【０１４２】
本発明の別の態様には、式ＩＩＩＡ：
【０１４３】
【化１７】
0005535233.tif 000027
による化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、式中、Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、またはハロゲンであり、Ｒ３は、ヒドロキシ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキル、またはアリールであり、Ｒ６は、水素であり、またはＲ５およびＲ６はそれらが結合している炭素と一緒になって、サイズが３個、４個、５個、または６個の原子の環を形成し、Ｒ７は、水素、非置換もしくは置換アルキル、またはヒドロキシであり、Ｒ８は、水素、非置換もしくは置換アルキルであり、Ｒ９は、水素、非置換もしくは置換アルキルであり、またはＲ８およびＲ９はそれらが結合している炭素と一緒になって、カルボニルを形成し、Ｒ１０は、Ｒ３またはＳＯ３Ｈであり、ｍは、整数０、１、２、３、４、または５であり、ｎは、整数０、１、２、３、４、または５である。
【０１４４】
本発明の一態様には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ１は、ヒドロキシルである。本発明の別の態様には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ８およびＲ９はそれらが結合している炭素と一緒になって、カルボニルを形成し、Ｒ１０は、Ｒ３である。一態様において、Ｒ３は、ヒドロキシ、ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＯ３Ｈ、およびＮＨＣＨ２ＣＯ２Ｈから選択される。一態様において、Ｒ３は、ヒドロキシである。一態様において、Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＯ３Ｈである。一態様において、Ｒ３は、ＮＨＣＨ２ＣＯ２Ｈである。本発明の一態様には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ６は、水素である。本発明の一態様には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ５は、非置換アルキルである。一態様において、Ｒ５は、メチルである。本発明の一態様には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ５は、Ｓ−配置である。本発明の一態様には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ５は、Ｓ−配置であり、Ｒ５は、メチルである。本発明の一態様には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ７は、水素である。
【０１４５】
本発明の一態様には、化合物Ｉｇ３ｅ、Ｉｈ３ｅ、Ｉｉ３ｅ、Ｉｇ４ｅ、Ｉｈ４ｅ、Ｉｉ４ｅ、Ｉｇ５ｅ、Ｉｈ５ｅ、およびＩｉ５ｅから選択される化合物が含まれる。
【０１４６】
本発明の別の態様には、式ＩＩＩＢ：
【０１４７】
【化１８】
0005535233.tif 000028
による化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、式中、Ｒ３は、ヒドロキシ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキル、またはアリールであり、Ｒ８は、水素、非置換もしくは置換アルキルであり、Ｒ９は、水素、非置換もしくは置換アルキルであり、またはＲ８およびＲ９はそれらが結合している炭素と一緒になって、カルボニルを形成し、Ｒ１０は、Ｒ３またはＳＯ３Ｈであり、ｍは、整数０、１、２、３、４、または５であり、ｎは、整数０、１、２、３、４、または５である。本発明の一態様には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ５は、非置換アルキルである。一態様において、Ｒ５は、メチルである。本発明の一態様には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ５は、Ｓ−配置である。本発明の一態様には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ５は、Ｓ−配置であり、Ｒ５は、メチルである。本発明の一態様には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ８およびＲ９はそれらが結合している炭素と一緒になって、カルボニルを形成する。本発明の一態様には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ１０は、Ｒ３である。一態様において、Ｒ３は、ヒドロキシ、ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＯ３Ｈ、およびＮＨＣＨ２ＣＯ２Ｈから選択される。一態様において、Ｒ３は、ヒドロキシである。一態様において、Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＯ３Ｈである。一態様において、Ｒ３は、ＮＨＣＨ２ＣＯ２Ｈである。
【０１４８】
本発明の別の態様には、式ＩＩＩＣ：
【０１４９】
【化１９】
0005535233.tif 000029
による化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、式中、Ｒ３は、ヒドロキシ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキル、またはアリールであり、ｍは、整数０、１、２、３、４、または５であり、ｎは、整数０、１、２、３、４、または５である。本発明の一態様には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ３は、ヒドロキシ、ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＯ３Ｈ、およびＮＨＣＨ２ＣＯ２Ｈから選択される。一態様において、Ｒ３は、ヒドロキシである。一態様において、Ｒ３は、ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＯ３Ｈである。一態様において、Ｒ３は、ＮＨＣＨ２ＣＯ２Ｈである。本発明の一態様には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ５は、非置換アルキルである。一態様において、Ｒ５は、メチルである。本発明の一態様には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ５は、Ｓ−配置である。本発明の一態様には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ５は、Ｓ−配置であり、Ｒ５は、メチルである。
【０１５０】
本発明の別の態様には、式ＩＶ：
【０１５１】
【化２０−１】
0005535233.tif 000030
による化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、式中、Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、またはハロゲンであり、Ｒ２は、水素またはα−ヒドロキシであり、Ｒ３は、ヒドロキシ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、Ｒ５は、非置換もしくは置換アルキル、またはアリールであり、Ｒ６は、水素であり、またはＲ５およびＲ６はそれらが結合している炭素と一緒になって、サイズが３個、４個、５個、または６個の原子の環を形成し、ｍは、整数０、１、２、３、４、または５であり、ｎは、整数０、１、２、３、４、または５である。
【０１５２】
一態様において、本発明には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ１は、ヒドロキシである。別の態様において、本発明には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ１は、アルファヒドロキシである。一態様において、本発明には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ１は、ベータヒドロキシである。一態様において、本発明には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ１は、メチルである。
【０１５３】
一態様において、本発明には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ５は、非置換アルキルである。一態様において、本発明には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ５は、メチルである。一態様において、本発明には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ５は、Ｒ−配置である。一態様において、本発明には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ５は、Ｓ−配置である。
【０１５４】
一態様において、本発明には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ６は、水素である。一態様において、本発明には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ２は、水素である。一態様において、本発明には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ２は、アルファヒドロキシである。一態様において、本発明には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれ、Ｒ３は、ヒドロキシルである。
【０１５５】
本発明の一態様には、
【０１５６】
【化２０−２】
0005535233.tif 000031
から選択される化合物が含まれる。
【０１５７】
本発明には、化合物Ｉｈ３ｅ：
【０１５８】
【化２１】
0005535233.tif 000032
またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれる。一態様において、本発明には、化合物Ｉｈ３ｅのタウリン抱合体：
【０１５９】
【化２２】
0005535233.tif 000033
またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれる。一態様において、化合物Ｉｈ３ｅのグリシン抱合体：
【０１６０】
【化２３−１】
0005535233.tif 000034
またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグが含まれる。
【０１６１】
本発明の一態様には、
【０１６２】
【化２３−２】
0005535233.tif 000035
が含まれる。
【０１６３】
本発明の一態様には、
【０１６４】
【化２３−３】
0005535233.tif 000036
が含まれる。
【０１６５】
本発明の一態様には、
【０１６６】
【化２３−４】
0005535233.tif 000037
が含まれる。
【０１６７】
一態様において、本発明には、本発明の化合物が含まれ、該化合物は、薬学的に許容される塩である。
【０１６８】
本発明の一態様には、本発明の化合物または薬学的に許容されるその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグと、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物が含まれる。
【０１６９】
本発明にはまた、本発明の放射性標識化合物が含まれる。放射性標識化合物は、従来の技術を使用して調製することができる。例えば、本発明の放射性標識化合物は、適当な触媒の存在下で本発明の化合物とトリチウムガスとを反応させることによって調製し、本明細書に記載されている式を有する放射性標識化合物を生成することができる。一実施形態において、本発明の化合物は、トリチウム標識される。
【０１７０】
使用および方法
本発明には、被験体において疾患を治療または予防するための医薬の製造における、化合物または薬学的に許容されるその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグの使用が含まれる。本発明にはまた、本発明の化合物、または薬学的に許容されるその塩、水和物、もしくはプロドラッグを投与することによって、被験体において疾患を治療または予防する方法が含まれる。
【０１７１】
本発明の一態様には、疾患が代謝性疾患、炎症性疾患、肝疾患、自己免疫疾患、心臓疾患、腎臓疾患、癌、および胃腸疾患から選択される使用または方法が含まれる。
【０１７２】
一態様において、本発明には、肥満症、糖尿病、糖尿肥満（ｄｉａｂｅｓｉｔｙ）、代謝性症候群、インスリン抵抗性（前糖尿病性（ｐｒｅ−ｄｉａｂｅｔｉｃ）インスリン抵抗性を含む）、高血圧症、および脂質異常症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）から選択される代謝性疾患が含まれる。一態様において、代謝性疾患は、肥満症である。別の態様において、代謝性疾患は、糖尿病である。一態様において、糖尿病は、糖尿病前症およびＩＩ型糖尿病から選択される。一態様において、代謝性疾患は、代謝性症候群である。一態様において、代謝性疾患は、インスリン抵抗性である。一態様において、代謝性疾患は、異脂肪血症である。一態様において、代謝性疾患は、糖尿肥満である。「糖尿肥満」という用語は、被験体が糖尿病および過剰な体重の両方を有する状態を意味する。
【０１７３】
一態様において、本発明には、アレルギー、変形性関節症（ＯＡ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、虫垂炎、気管支喘息、膵炎、アレルギー性皮疹、および乾癬から選択される炎症性疾患が含まれる。
【０１７４】
一態様において、本発明には、関節リウマチ、多発性硬化症、およびＩ型糖尿病から選択される自己免疫疾患が含まれる。
【０１７５】
一態様において、本発明には、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）、短腸症候群（照射後大腸炎）、顕微鏡的大腸炎、過敏性腸症候群（吸収不良）、および細菌過剰繁殖から選択される胃腸疾患が含まれる。
【０１７６】
一態様において、本発明には、糖尿病性腎症、慢性腎不全、糸球体腎炎、高血圧性腎硬化症、慢性糸球体腎炎、慢性移植糸球体症、慢性間質性腎炎、および多発性嚢胞（ｐｏｌｙｓｙｓｔｉｃ）腎疾患から選択される腎臓疾患が含まれる。
【０１７７】
一態様において、本発明には、結腸直腸癌、肝臓癌、肝細胞（ｈｅｐｔａｃｅｌｌｕｌａｒ）癌、胆管癌、腎臓癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、およびインスリノーマ（ｉｎｓｕｌａｎｏｍａ）から選択される癌が含まれる。
【０１７８】
一態様において、本発明には、非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患、慢性ウイルス性肝炎、アルコール性肝疾患、薬剤誘発性肝炎、ヘモクロマトーシス、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、門脈高血圧症、胆汁不飽和、ゴーシェ病、ウィルソン病、α１−アンチトリプシン欠損症、完全非経口栄養（ＴＰＮ）、胆石症、ＴＰＮに関連する胆汁鬱滞および敗血症から選択される肝疾患が含まれる。
【０１７９】
一態様において、本発明には、自己免疫疾患であるエリテマトーデスが含まれる。
【０１８０】
一態様において、本発明には、うっ血性心不全、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、狭心症、動脈硬化症および脳血管疾患（出血、脳卒中、脳血管梗塞）から選択される心臓疾患が含まれる。
【０１８１】
一態様において、本発明には、本発明の化合物がＴＧＲ５アゴニストである使用または方法が含まれる。一態様において、ＴＧＲ５  ＥＣ５０とＦＸＲ  ＥＣ５０の選択性比は、０．０５未満である。
【０１８２】
一態様において、本発明には、化合物または組成物を経口的、非経口的、静脈内、または局所的に被験体に投与する使用または方法が含まれる。一態様において、被験体はヒトである。
【０１８３】
本発明の一態様には、被験体に治療有効量の本発明の化合物を投与することを含む使用または方法が含まれる。一態様において、本発明には、それを必要としている被験体に投与することを含む、使用または方法が含まれる。本発明には、被験体に予防的有効量の本発明の化合物を投与することを含む使用または方法が含まれる。
【０１８４】
本発明の化合物および組成物は、様々な経路、例えば、経口、皮下、筋内、静脈内、または腹腔内によって投与することができる。医薬組成物を投与する言及した経路は、７０ｋｇの成人ヒトについて１日当たり約０．０１〜５０００ｍｇ、好ましくは５〜５００ｍｇのＦＸＲリガンドの１日用量での、経口、皮下、および静脈内である。適当な用量は、単一の１日用量で、または適当な間隔で示される分割用量として、例えば、１日当たり２回、３回、４回、もしくはそれ以上の部分用量として投与し得る。
【０１８５】
本発明の化合物を含有する医薬組成物を調製するために、不活性で薬学的に許容される担体を使用する。医薬担体は、固体または液体でよい。固形調製物には、例えば、散剤、錠剤、分散性顆粒剤、カプセル剤、カシェ剤、および坐剤が含まれる。固体担体は、希釈剤、香味剤、可溶化剤、滑沢剤、懸濁化剤、結合剤、または錠剤崩壊剤として作用することができる１種または複数の物質でよく、固体担体はまた、封入材料でよい。
【０１８６】
散剤において、担体は一般に、微粉化した活性成分、例えば、本発明の化合物との混合物中にある微粉化した固体である。錠剤において、活性成分は、適切な割合で必要な結着性（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｙ）を有する担体と混合され、所望の形状およびサイズに圧縮される。
【０１８７】
坐剤の形態の医薬組成物を調製するために、脂肪酸グリセリドおよびカカオバターの混合物などの低融点ワックスを最初に融解し、例えば、撹拌することによって活性成分をその中に分散させる。次いで、溶融した均一な混合物を、好都合なサイズの型に注ぎ、冷却し、凝固させる。
【０１８８】
散剤および錠剤は、約５％〜約７０重量％の本発明の化合物の活性成分を好ましくは含有する。適切な担体には、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ラクトース、糖、ペクチン、デキストリン、デンプン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、カカオバターなどが含まれる。
【０１８９】
医薬組成物には、封入材料を担体として有する活性化合物の製剤を含むことができ、本発明の化合物（他の担体を有するまたは有さない）が担体で囲まれているカプセル剤（担体はこのように化合物と関連している）を提供する。同様に、カシェ剤をまた含めることができる。錠剤、散剤、カシェ剤、およびカプセル剤は、経口投与に適した固体剤形として使用することができる。
【０１９０】
液体医薬組成物には、例えば、経口または非経口投与に適した溶液剤、懸濁剤、および経口投与に適した乳剤が含まれる。水、緩衝水、食塩水、ＰＢＳ、エタノール、またはプロピレングリコールを含む溶剤中の、活性成分の無菌水溶液または活性成分の無菌溶液は、非経口投与に適した液体組成物の例である。組成物は、生理条件に近づくのに必要な薬学的に許容される補助物質（ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、界面活性剤など）を含有し得る。
【０１９１】
無菌溶液は、活性成分（例えば、本発明の化合物）を所望の溶剤系に溶解させ、次いでこのように得られた溶液を、メンブランフィルターを通過させ、それを無菌化することによって、または代わりに、無菌化合物を事前に無菌化した溶剤に無菌状態下にて溶解することによって調製することができる。このように得られた水溶液は、そのまま使用するために包装し、または凍結乾燥してもよく、凍結乾燥した調製物は投与前に無菌水性担体と合わせる。調製物のｐＨは典型的には、３〜１１、さらに好ましくは５〜９、最も好ましくは７〜８である。
【０１９２】
本発明の化合物を含有する医薬組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。治療的適用において、組成物は、疾患およびその合併症の症状を治癒、逆行、または少なくとも部分的に遅延もしくは抑止させるのに十分な量で投与される。疾患およびその合併症の症状を治癒、逆行、または少なくとも部分的に遅延もしくは抑止させるのに適切な量は、「治療有効用量」と定義される。予防的適用において、組成物を、疾患およびその合併症の症状を予防するのに十分な量で投与する。疾患およびその合併症の症状を予防するのに適切な量は、「予防的有効用量」として定義される。
【０１９３】
治療用途のために有効な量は、疾患または状態の重症度、ならびに患者の体重および全身状態によるが、一般に７０ｋｇの患者について１日当たり約０．１ｍｇ〜約２，０００ｍｇの化合物の範囲であり、７０ｋｇの患者について１日当たり約５ｍｇ〜約５００ｍｇの化合物の投与量がより一般に使用される。
【０１９４】
予防的適用において、本発明の化合物を含有する医薬組成物は、疾患を発症しやすい、またはその他の点で発症する危険性がある患者に、病徴の発症を遅延させ、または予防するのに十分な量で投与される。このような量は、「予防的有効用量」であると定義される。この使用において、化合物の正確な量は再び患者の健康状態および体重によるが、一般に７０ｋｇの患者について１日当たり約０．１ｍｇ〜約２，０００ｍｇの範囲であり、より一般には７０ｋｇの患者について１日当たり約５ｍｇ〜約５００ｍｇである。
【０１９５】
組成物の単回投与または多回投与は、治療を行う医師が用量レベルおよびパターンを選択して行うことができる。いずれにしても、医薬製剤は、患者において疾患を効果的に治療または予防するのに十分な含量の本発明の化合物を提供すべきである。
【０１９６】
本発明はまた、本発明の使用および方法による疾患を予防または治療するためのキットを提供する。一態様において、本発明には、被験体において疾患を治療または予防するためのキットが含まれ、キットは、本発明の化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグを含む。キットには典型的には、有効量の本発明の化合物、ならびに情報に関する材料（治療し得る患者のタイプ、スケジュール（例えば、用量および頻度）、ならびに投与経路などの記載を含めた医薬組成物の投薬の仕方の説明書を含有する）を含有する医薬組成物が含まれる。
【０１９７】
いくつかの本発明の代表的な化合物を、下記に示す。
【０１９８】
下記の次の化合物Ｉａ〜Ｉｒ５は、少なくとも式Ｉに関する。
【０１９９】
【化２４】
0005535233.tif 000038
【０２００】
【化２５】
0005535233.tif 000039
【０２０１】
【化２６】
0005535233.tif 000040
【０２０２】
【化２７】
0005535233.tif 000041
【０２０３】
【化２８】
0005535233.tif 000042
【０２０４】
【化２９】
0005535233.tif 000043
【０２０５】
【化３０】
0005535233.tif 000044
【０２０６】
【化３１】
0005535233.tif 000045
【０２０７】
【化３２】
0005535233.tif 000046
【０２０８】
【化３３】
0005535233.tif 000047
【０２０９】
【化３４】
0005535233.tif 000048
【０２１０】
【化３５】
0005535233.tif 000049
【０２１１】
【化３６】
0005535233.tif 000050
本明細書において引用した全ての公開資料および特許文献は、このような公開資料または文献の各々が明確に個々に参照により本明細書中に組み込まれていることが示されたように参照により本明細書中に組み込まれている。公開資料および特許文献を引用することは、いずれかが関連する従来技術であることを認めることを意図せず、それらの内容または日付についての何らかの承認を構成しない。本発明を書面による説明によってこれまで記載してきたが、本発明が種々の実施形態で実施することができ、上記の記載および下記の実施例が、例示の目的のためであり、下記の特許請求の範囲を限定するものではないことを当業者であれば認識するであろう。
【実施例】
【０２１２】
（実施例１）
ＴＧＲ５モジュレーターの合成
本発明の化合物、および関連する誘導体は、当業者に公知の方法によって合成することができる。これらの化合物を合成するための詳細な方法は、下記に記載されている。また、ＷＯ０２／０７２５９８、ＷＯ２００４／０００７５２１、ＥＰ１５６８７０６およびＥＰ１３５７８２を参照されたい。Ｒ１が水素であり、Ｒ２およびＲ３がヒドロキシであり、Ｒ４が低級アルキル基である化合物の場合、式（Ｉ）の化合物は、下記のスキームによって得ることができる。
【０２１３】
【化３７】
0005535233.tif 000051
メチルケノデオキシコラノエート（１）を、触媒量のｐ−トルエンスルホン酸（ｐ−ＴＳＡ）の存在下でジオキサン中の３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピランで処理することによって、３位および７位において保護し、相当する３α，７α−テトラヒドロピラニルオキシ類似体（２）を得た。リチウムジイソプロピルアミドを塩基として、およびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を溶媒として使用した、−７８℃での２とヨウ化メチル（または適当なハロゲン化アルキル）との反応、それに続くメタノール性ＨＣｌによる処理によって、相当するメチル２３−メチル−３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−オエート（３）を得た。メチルエステル３のアルカリによる加水分解、およびフラッシュクロマトグラフィーによる精製によって、所望の２３（Ｓ）−メチル−３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（Ｉｂ）および２３（Ｒ）−メチル−３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（Ｉｃ）を得た。
【０２１４】
２３（Ｒ）−および２３（Ｓ）−メチル−３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（Ｉｂ、Ｉｃ）の調製
ａ）メチル３α，７α−ジテトラヒドロピラニルオキシ−５β−コラン−２４−オエート（２）
ｐ−トルエンスルホン酸（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（２０．１ｍｌ、０．０９８ｍｏｌ）を、メチル３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−オエート（１）（２．０ｇ、４．９ｍｍｏｌ）のジオキサン（６ｍＬ）溶液に加えた。反応混合物を室温で１５分間を撹拌した。次いで、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）を加え、混合物を真空下で部分的に濃縮し、ＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機画分をブライン（１×５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空下で蒸発させた。残渣を、シリカゲルカラム上のクロマトグラフィーによって精製した。石油エーテル／酢酸エチル（８０／２０）による溶出によって、２．５ｇの純粋な化合物２（９０％収率）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ：  ０．６４  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１８），  ０．８９  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１９），  ０．９２  （ｄ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−２１），  ３．３１−３．６７  （ｍ，  ４Ｈ，  −ＣＨ２ＯＣＨ−），  ３．６５  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＯ２ＣＨ３），  ３．６７  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−３），  ３．８８  （ｂｒｓ，  １Ｈ，  ＣＨ−７），  ４．６７  （ｂｒｓ，  １Ｈ，  −Ｏ−ＣＨ−Ｏ−），  ４．７３  （ｂｒｓ，  １Ｈ，  −Ｏ−ＣＨ−Ｏ−）．
ｂ）メチル２３（Ｒ，Ｓ）−メチル−３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−オエート（３）
ｎ−ブチルリチウム（４．３ｍＬ、ヘキサン中の２．２Ｍの溶液）を、−７８℃にてジイソプロピルアミン（１．４ｍＬ、１０．１ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液に滴下で添加した。系を−７８℃でさらに３０分間保ち、次いで乾燥ＴＨＦ（１４ｍＬ）に溶解したメチル３α，７α，１２α−テトラヒドロピラニルオキシ−５β−コラン−２４−オエート（２）（１．８ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を、混合物に滴下で添加した。２０分後、乾燥ＴＨＦ（７ｍＬ）に溶解したヨウ化メチル（１．４ｍＬ、２２．０ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、混合物を室温に一晩温めた。溶媒を真空下で除去し、１０％ＨＣｌによって酸性化し、ＥｔＯＡｃ（５×５０ｍＬ）で抽出し、５％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液（２×５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（無水Ｎａ２ＳＯ４上で）、濾過し、真空下で蒸発させた。次いで、粗残渣をＨＣｌ（２Ｎ）のＭｅＯＨ（５０ｍＬ）溶液で１２時間処理した。残渣を真空下で蒸発させ、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２×５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空下で蒸発させた。残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。石油エーテル／酢酸エチル（７０／３０）による溶出によって、１．１ｇ（２．７ｍｍｏｌ）の純粋な化合物３（８４％収率）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ：  ０．６２  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１８），  ０．８７  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１９），  ０．９２  （ｄ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−２１），  ２．３８  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−２３），  ３．２７−３．４０  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−３），  ３．５５  （ｂｒｓ，  １Ｈ，  ＣＨ−７），  ３．６３  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＯ２ＣＨ３）．
ｃ）２３（Ｒ）−メチル−３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（Ｉｂ）および２３（Ｓ）−メチル−３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（Ｉｃ）
メチル２３−メチル−３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−オエート０．９７ｇ（２．３ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（２５ｍＬ）に溶解させ、ＭｅＯＨ（５．７ｍＬ、１４．２．ｍｍｏｌ）中の１０％ＮａＯＨと共に加えた。混合物を１６時間還流させた。混合物を３ＮのＨＣｌで酸性化し、ＥｔＯＡｃ（３×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機画分をブライン（１×５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空下で蒸発させた。残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（９５／５）による溶出によって、１．５ｇ（６５％）の２３（Ｓ）−メチル−３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸および３３０ｍｇの２３（Ｒ）−メチル−３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸を得た。
２３（Ｓ）−メチル−３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（Ｉｂ）：ｍｐ：１２５〜１２６℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）  δ：  ０．４４  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１８），  ０．６９  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１９），  ０．７３−０．７６  （ｄ，  ３Ｈ  ＣＨ３−２１），  ０．９３−０．９７  （ｄ，  ３Ｈ，  −ＣＨ３），  ２．３６  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−２３），  ３．１５−３．３８  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−３），  ３．６２  （ｂｒｓ，  １Ｈ，  ＣＨ−７）．  １３Ｃ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）  δ：  １１．５５，  １８．４３，  １８．８７，  ２０．４９，  ２２．６９，  ２８．１５，  ２８．５７，  ３０．１４，  ３２．６５，  ３４．４３，  ３４．６１，  ３４．９４，  ３５．２３，  ３７．０６，  ３９．１７，  ３９．６０，  ４０．８１，  ４１．４０，  ４２．５７，  ４６．５４，  ５０．２９，  ５６．６３，  ６８．２４，  ７１．６２，  １７９．９９．
２３（Ｒ）−メチル−３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（Ｉｃ）：ｍｐ：１６３〜１６４℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）  δ：  ０．４３  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１８），  ０．６５  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１９），  ０．６５−０．６９  （ｄ，  ３Ｈ  ＣＨ３−２１），  ０．８３−０．８６  （ｄ，  ３Ｈ，  −ＣＨ３），  ２．２０  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−２３），  ３．０９−３．１５  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−３），  ３．５８  （ｂｒｓ，  １Ｈ，  ＣＨ−７）．  １３Ｃ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）  δ：  １１．９４，  １６．４０，  １８．３０，  ２０．９３，  ２３．０６，  ２３．８９，  ２８．８５，  ３０．５２，  ３３．０８，  ３４．１６，  ３４．９１，  ３５．３８，  ３５．６８，  ３７．１４，  ３９．４９，  ３９．６４，  ４０．０４，  ４０．１７，  ４１．９２，  ４３．０５，  ５０．６９，  ５７．１０，  ６８．５１，  ７２．０１，  １８１，０９．
（実施例２）
２３（Ｓ）−および２３（Ｒ）−メチル−６α−メチル−３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（Ｉｂ３、Ｉｃ３）の調製
下記の化合物は、実施例１の手順によって６α−メチル−３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸のアルキル化によって調製した。
２３（Ｓ）−メチル−６α−メチル−３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（Ｉｂ３）：ｍｐ：９８〜１００℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ：  ０．６３  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１８），  ０．８９  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１９），  ０．９２−１．００  （ｍ，  ６Ｈ，  ＣＨ３−２１およびＣＨ３−６），  １．１５−１．１９  （ｄ，  ３Ｈ，  −ＣＨ３），  ２．４５−２．７３  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−２３），  ３．３１−３．５２  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−３），  ３．５８  （ｂｒｓ，  １Ｈ，  ＣＨ−７）．  １３Ｃ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ：  １１．７６，  １５．７２，  １８．５８，  １８．８８，  ２０．６３，  ２３．１１，  ２３．６５，  ２８．１９，  ３０．２１，  ３０．４７，  ３２．６４，  ３３．７９，  ３３．９７，  ３４．６１，  ３５．４２，  ３５．６６，  ３７．０３，  ３９．６０，  ４０．０１，  ４０．７１，  ４２．７１，  ４７．３５，  ５０．４４，  ５６．６０，  ７２．３４，  ７２．８７，  １８２．３７．
２３（Ｒ）−メチル−３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（Ｉｃ３）：ｍｐ：８９〜９０℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）  δ：  ０．６５  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１８），  ０．８８  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１９），  ０．８８−０．９２  （ｍ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−６），  ０．９５−０．９９  （ｄ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−２１），  １．０８−１．１４  （ｄ，  ３Ｈ  −ＣＨ３），  ２．３５  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−２３），  ３．２９−３．４８  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−３），  ３．５７  （ｂｒｓ，  １Ｈ，  ＣＨ−７）．  １３Ｃ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）  δ：  １１．７０，  １５．６６，  １６．０２，  １８．００，  ２０．６１，  ２３．０９，  ２３．６０，  ２８．５１，  ３０．３９，  ３２．６１，  ３３．７２，  ３３．９２，  ３５．３８，  ３５．６５，  ３６．３３，  ３９．５７，  ３９．９４，  ４２．７７，  ４７．３０，  ５０．３９，  ５６．５３，  ７２．２２，  ７２．８３，  １８０．５０．
（実施例３）
２３（Ｒ）−および２３（Ｓ）−メチル−３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（Ｉｈ、Ｉｉ）の調製
下記の化合物は、実施例１の手順によって３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸のアルキル化によって調製した。
２３（Ｓ）−メチル−３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（Ｉｈ）：ｍｐ：２３７〜２３９℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ：  ０．６３  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１８），  ０．８７  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１９），  ０．９６−０．９８  （ｍ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−２１），  １．０７−１．１１  （ｄ，  ３Ｈ，  −ＣＨ３），  ２．４４−２．７３  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−２３），  ３．３５−３．５０  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−３），  ３．８２  （ｂｒｓ，  １Ｈ，  ＣＨ−７）  ３．９５  （ｂｒｓ，  １Ｈ，  ＣＨ−１２）．  １３Ｃ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ）  δ：  １２．７２，  １７．６０，  １９．２４，  １９．２４，  ２３．００，  ２３．１９，  ２６．５９，  ２７．７８，  ２８．８８，  ３０．７２，  ３４．７７，  ３５．２２，  ３５．６６，  ３７．１９，  ４１．８４，  ４６．１９，  ４７．２７，  ４９．０１，  ６６．６９，  ７０．８８，  ７１．４５，  １７８．２５．
２３（Ｒ）−メチル−３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（Ｉｉ）：ｍｐ：２２１〜２２３℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ：  ０．６３  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１８），  ０．８７  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１９），  ０．９６−０．９８  （ｍ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−２１），  １．０７−１．１１  （ｄ，  ３Ｈ，  −ＣＨ３），  ２．４４−２．７３  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−２３），  ３．３５−３．５０  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−３），  ３．８２  （ｂｒｓ，  １Ｈ，  ＣＨ−７）  ３．９５  （ｂｒｓ，  １Ｈ，  ＣＨ−１２）．  １３Ｃ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ）  δ：  １２．７６，  １６．８８，  １７．３１，  ２３．０４，  ２３．２４，  ２６．６２，  ２８．１２，  ２８．９４，  ３０．８１，  ３３．９７，  ３４．８０，  ３５．２８，  ３５．７１，  ３７．２０，  ４１．８５，  ４６．２９，  ４７．４４，  ６６．６７，  ７０．８６，  ７１．４５，  １７８．７７．
（実施例４）
２３（Ｒ）−および２３（Ｓ）−メチル−６α−メチル−３α，７α，１２ａ−トリヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（Ｉｈ３、Ｉｉ３）の調製
下記の化合物は、実施例１の手順によって、６α−メチル−３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸のアルキル化によって調製した。
２３（Ｓ）−メチル−６α−メチル−３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（Ｉｈ３）：ｍｐ：１３１〜１３４℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）  δ：  ０．６５  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１８），  ０．８７  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１９），  ０．９７−１．００  （ｍ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−２１），  １．１４−１．１８  （ｄ，  ３Ｈ，  −ＣＨ３），  １．２３  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−６），  ２．５２  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−２３），  ３．３２−３．５０  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−３），  ３．５５  （ｂｒｓ，  １Ｈ，  ＣＨ−７）  ３．９４  （ｂｒｓ，  １Ｈ，  ＣＨ−１２）．  １３Ｃ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）  δ：  １２．４３，  １４５．６６，  １７．６２，  １８．９２，  ２２．７０，  ２３．１４，  ２６．２１，  ２７．４５，  ２８．０１，  ３０．０３，  ３３．４４，  ３４．１１，  ３４．４２，  ３５．３０，  ３６．７１，  ３９．９７，  ４０．４５，  ４１．７３，  ４６．４５，  ４７．２５，  ７２．１３，  ７２．７６，  ７３．０１，１８０．５３．
２３（Ｒ）−メチル−６α−メチル−３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（Ｉｉ３）：ｍｐ：１０９〜１１０℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤ３ＯＤ）  δ：  ０．７２  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１８），  ０．９１  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１９），  １．０７−１．１１  （ｍ，  ６Ｈ，  −ＣＨ３およびＣＨ３−２１），  ２．３７−２．５３  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−２３），  ３．１５−３．４２  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−３），  ３．５３  （ｂｒｓ，  １Ｈ，  ＣＨ−７）  ３．９７  （ｂｒｓ，  １Ｈ，  ＣＨ−１２）．  １３Ｃ−ＮＭＲ  （ＣＤ３ＯＤ）  δ：  １１．６１，  １５．０４，  １５．３２，  １６．１５，  ２２．０４，  ２２．７５，  ２６．２７，  ２７．６２，  ２８．１８，  ２９．６１，  ３２．９１，  ３３．７４，  ３４．３１，  ３５．０６，  ３５．１８，  ３６．５６，  ３９．７０，  ４０．２５，  ４１．６８，  ４６．１９，  ４６．３１，  ７１．７６，  ７１．７７，  ７２．６２，  １８０．１１．
（実施例５）
２３（Ｒ）−および２３（Ｓ）−メチル−３α−ヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（Ｉｐ、Ｉｑ）の調製
下記の化合物は、実施例１の手順によって３α−ヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸のアルキル化によって調製した。
２３（Ｓ）−メチル−３α−ヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（Ｉｐ）：ｍｐ：１６１〜１６２℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）  δ：  ０．６０  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１８），  ０．８８  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１９），  ０．９２−１．０１  （ｍ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−２１），  １．１３−１．１６  （ｄ，  ３Ｈ，  −ＣＨ３），  ２．５５  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−２３），  ３．６０  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−３）．  １３Ｃ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）  δ：  １１．９７，  １８．５２，  １８．８７，  ２０．７３，  ２３．３０，  ２４．１４，  ２６．３４，  ２７．１０，  ２８．１５，  ３０．１８，  ３４．４８，  ３４．５０，  ３５．２３，  ３５．７４，  ３６．０６，  ３７．０１，  ４０．１３，  ４０．３４，  ４０．７４，  ４１．９９，  ４２．６８，  ５６．４３，  ５６．７５，  ７１．７０，  １８１．４２．
２３（Ｒ）−メチル−３α−ヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（Ｉｑ）：ｍｐ：１５２〜１５３℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）  δ：  ０．６３  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１８），  ０．８９  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−１９），  ０．９４−１．０３  （ｍ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−２１），  ２．４５  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−２３），  ３．５９  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ−３）．  １３Ｃ−ＮＭＲ  （ＣＤ３ＯＤ）  δ：  １１．９８，  １５．９７，  １８．００，  ２０．７５，  ２３．３１，  ２４．１４，  ２６．３４，  ２７．１１，  ２８．４８，  ３０．２６，  ３３．６８，  ３４．５０，  ３５．２６，  ３５．７７，  ３６．１５，  ３６．４６，  ３９．５９，  ４０．１３，  ４０．３６，  ４２．０１，  ４２．７９，  ５６．４５，  ５６．７６，  ７１．７１，１８１．０２．
（実施例６）
２３（Ｓ）−メチル−３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸（Ｉｈ３ｅ）の調製
【０２１５】
【化３８】
0005535233.tif 000052
２３（Ｓ）−メチル−３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オエート（２）の合成：
１（２．７８ｇ、６．３７ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１２０ｍｌ）溶液に、ｐＴＳＡ（０．１２ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を加え、混合物を超音波で９０分間処理した。次いで、混合物を減圧下で濃縮し、このように得られた残渣をＡｃＯＥｔ（１２０ｍｌ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（３×１００ｍｌ）、ブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮し、２（定量的収率）を得て、それを次のステップでそれ以上精製することなく使用した。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ０．６３  （３Ｈ，  ｓ，  １８−ＣＨ３），  ０．８４−０．８８  （６Ｈ，  ｓ，  １９−ＣＨ３  ＋  ＣＨ３ＣＨ２），  ０．９７  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ６．６２  Ｈｚ，  ２１−ＣＨ３），  ３．３０  （１Ｈ，  ｍ．  ３−ＣＨ），  ３．４８  （３Ｈ，  ｓ，  ＣＯＯＣＨ３），  ３．６２  （１Ｈ，  ｍ，  ７−ＣＨ），  ３．９７  （１Ｈ，  ｍ，  １２−ＣＨ）．
メチル３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−６α−エチル−５β−２４−オエート（３）：
２（２．５０ｇ、５．５５ｍｍｏｌ）のＣＨＣｌ３（６０ｍｌ）およびジメトキシメタン（３４．１０ｍｌ、１６６．６６ｍｍｏｌ）溶液に、Ｐ２Ｏ５（１４．１８ｇ、９９．９０ｍｍｏｌ）を少しずつで加え、このように得られた懸濁液を４５分間機械で撹拌した。次いで、混合物をデカントし、有機層をＮａＨＣＯ３（１０％）（５０ｍｌ）で１０分間処理した。次いで、有機層を分離し、水層をＣＨＣｌ３（３×５０ｍｌ）で抽出した。集めた有機層をブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮し、３（３．１４ｇ、９７％）を得て、それを次のステップでそれ以上精製することなく使用した。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ：    ０．６７  （３Ｈ，  ｓ，  １８−ＣＨ３），  ０．８８−１．０４  （９Ｈ，  ｍ，  １９−ＣＨ３  ＋  ＣＨ３ＣＨ２  ＋  ２１−ＣＨ３），  ３．３０  （１Ｈ，  ｍ．  ３−ＣＨ），  ３．３０−３．４０  （７Ｈ，  ｍ，  ３−ＣＨ  ＋  ２  ｘ  ＣＨ３ＯＣＨ２Ｏ），  ３．４５  （３Ｈ，  ｓ，  ＣＨ３ＯＣＨ２Ｏ），  ３．５０  （１Ｈ，  ｍ，  ７−ＣＨ），  ３．６６  （３Ｈ．  ｓ，  ＣＯＯＣＨ３），  ３．７９  （１Ｈ，  ｍ，  １２−ＣＨ），  ４．５７  −  ４．７５  （６Ｈ，  ｍ，  ３  ｘ  ＣＨ３ＯＣＨ２Ｏ）．
２３（Ｓ）−メチル−３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸（Ｉｈ３ｅ）：
−７８℃に冷却してＮ２雰囲気下のジイソプロピルアミン（０．５６ｍｌ、４．０２６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５ｍｌ）（蒸留したばかりである）溶液に、ヘキサン中の１１ＢｕＬｉ（２．５Ｎ）（１．５３ｍｌ、３．８４０ｍｍｏｌ）を滴下で添加した。反応物を−７８℃で３０分間撹拌し、次いで蒸留したばかりのＴＨＦ（７ｍｌ）に溶解した３の溶液（３５０ｍｇ、０．６０１ｍｍｏｌ）を滴下で添加した。このように得られた溶液を、−７８°で９０分間撹拌した。ヨードメタン（０．５６ｍｌ、９．０１５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を−７８℃で６０分間撹拌し、次いで一晩室温へとゆっくりと温めた。次いで、混合物を減圧下で濃縮し、このように得られた残渣をＨ２Ｏ（３０ｍｌ）で希釈し、ＡｃＯＥｔ（３×３０ｍｌ）で抽出した。集めた有機層をブライン（３０ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。次いで、残渣をＭｅＯＨ／ＨＣｌ（３７％）の溶液（２０ｍｌ、２０：１ｖｏｌ／ｖｏｌ）で４５°にて８時間処理した。混合物を減圧下で濃縮し、このように得られた残渣をＨ２Ｏ（３０ｍｌ）で希釈し、ＡｃＯＥｔ（３×３０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。このように得られた残渣を、ＮａＯＨ（１０％）のＭｅＯＨ（１５ｍｌ）溶液で４５℃にて２４時間処理した。次いで、混合物を減圧下で濃縮し、このように得られた残渣をＨ２Ｏ（２０ｍｌ）で希釈し、ｉＰｒ２Ｏ（３×１５ｍｌ）で洗浄し、ＨＣｌ（３Ｎ）で酸性化し、最終的にＣＨＣｌ３（３×２０ｍｌ）で抽出した。有機層をブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。このように得られた残渣を中圧クロマトグラフィー（カラム：「ＲＰ−１８Ｌｏｂａｒ  Ｂ」、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、５：５〜６：４、５０ｐｓｉ）によって精製し、４（４７ｍｇ、４１％）を得た。
Ｍｐ：１９５〜１９７℃
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３  ＋  ＣＤ３ＯＤ）  δ：  ０．６３  （３Ｈ，  ｓ，  １８−ＣＨ３），  ０．８４−０．８８  （６Ｈ，  ｍ，  １９−ＣＨ３  ＋  ＣＨ３ＣＨ２），  ０．９８  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ６．６０  Ｈｚ，  ２１−ＣＨ３），  １．１０  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ６．８０  Ｈｚ，  ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯＯＨ），  ２．６１  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯＯＨ），  ３．３５  （１Ｈ，  ｍ．  ３−ＣＨ），  ３．６５  （１Ｈ，  ｍ，  ７−ＣＨ），  ３．９２  （１Ｈ，  ｍ，  １２−ＣＨ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３  ＋  ＣＤ３ＯＤ）  δ：  １１．５１，  １２．３４，  １７．５２，  １９．１９，  ２２．０９，  ２２．６７，  ２３．１１，  ２６．６５，  ２７．４０，  ２８．０５，  ２９．８３，  ３３．３１，  ３４．５６，  ３５．０６，  ３５．４０，  ３８．６７，  ３９．９０，  ４１．１１，  ４１．３９，  ４１．６９，  ４５．１０，  ４６．３９，  ４７．３２，  ７０．６５，  ７１．７９，  ７２．９０，  １８２．０７．
（実施例７）
化合物Ｉｏ５、Ｉｐ５、Ｉｑ５、およびＩｒ５の合成
【０２１６】
【化３９】
0005535233.tif 000053
３α，７α−ジヒドロキシ−２２，２３−メチレン−５β−コラン−２４−酸（Ｉｏ５、Ｉｐ５、Ｉｑ５、およびＩｒ５）
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）中のジアゾ酢酸エチル（０．４７８ｇ、１．１９ｍｍｏｌ）を、乾燥ＣＨ２Ｃ１２（１５ｍＬ）中の四酢酸二ロジウム（ＩＩ）（９ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）の存在下で窒素下にて室温で、３α，７α−ジアセトキシ−５−ノルコラン−２２，２３−エン（１）（０．６ｇ、１．３９ｍｍｏｌ）の撹拌した懸濁液にゆっくりと滴下で添加した。反応混合物を濾過し、Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空下で蒸発させ、それによって４種のジアステレオマーエステル２の混合物を得た。引き続いてエステル２をＥｔＯＨ（１５ｍＬ）に溶解させ、１０ＮのＮａＯＨ（１０ｍＬ）の溶液で還流させながら４時間処理し、冷却し、冷たいＨ２Ｏ（５０ｍＬ）に注ぎ、２ＮのＨＣｌで酸性化し、ＥｔＯＡｃ（３×１５ｍＬ）で抽出した。有機相をブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲル上でクロマトグラフにかけた。ＡｃＯＨ（０．１％）を有するＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９６／４）による溶出によって、０．０８７ｇ（１５％収率）の（２２Ｓ，２３Ｓ）−３α，７α−ジヒドロキシ−２２，２３−メチレン−５β−コラン−２４−酸（Ｉｏ５）および０．０６５ｇ（１１．５％収率）の（２２Ｒ，２３Ｒ）−３α，７α−ジヒドロキシ−２２，２３−メチレン−５β−コラン−２４−酸（Ｉｑ５）を得た。０．１％ＡｃＯＨを有するＣＨ２Ｃ１２／ＭｅＯＨ（９５．５／４．５）による溶出によって、０．１８ｇ（３２％収率）の（２２Ｓ，２３Ｒ）−３α，７α−ジヒドロキシ−２２，２３−メチレン−５β−コラン−２４−酸（Ｉｐ５）および０．１５ｇ（２６．７％収率）の（２２Ｒ、２３Ｓ）−３α，７α−ジヒドロキシ−２２，２３−メチレン−５β−コラン−２４−酸（Ｉｒ５）を白色の固体として得た。
Ｉｏ５．Ｍｐ：１４８〜１５０℃［α］２０Ｄ＋５．１６（ｃ１、ＥｔＯＨ）。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤ３ＯＤおよびＣＤＣ１３）  δ：    ０．６７  （ｓ，  ３Ｈ，  １８−ＣＨ３），  ０９０  （ｓ，  ３Ｈ，  １９−ＣＨ３），  ０．９６  （ｄ，  Ｊ＝６．６８  Ｈｚ，  ３Ｈ，  ２１−ＣＨ３），  ３．４０−３．５０  （ｍ，  １Ｈ，  ３−ＣＨ），  ３．８５  （ｍ，  １Ｈ，  ７−ＣＨ）．    １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＣＤＣ１３）  δ：    １２．２０，  １６．８０，  １７．０８，  ２０．８０，  ２１．００，  ２３．１５，  ２４．１０，  ２８．３０，  ３０．８０，  ３１．３０，  ３３．３０，  ３４．８０，  ３４．９０，  ３５．４０，  ３５．７０，  ３９．８０，  ３９．９０，  ４１．８０，  ４３．４０，  ５０．５５，  ５８．２０，  ６８．９０，  ７２．３０，  １７７．００．
Ｉｑ５．ＭＰ：＞２３０℃。［α］２０Ｄ−３８．１９（ｃ１．１、ＣＨ３Ｃｌ／ＭｅＯＨ１：１）。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤ３ＯＤおよびＣＤＣ１３）  δ：    ０．５０  （ｓ，  ３Ｈ，  １８−ＣＨ３），  ０．８６  （ｓ，  ３Ｈ，  １９−ＣＨ３），  ０．９６  （ｄ，  Ｊ＝  ６．４０  Ｈｚ，  ３Ｈ，  ２１−ＣＨ３），  ３．４０−３．６０  （ｍ，  １Ｈ，  ３−ＣＨ），  ３．８０  （ｍ，  １Ｈ，  ７−ＣＨ）．    １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＣＤＣ１３）  δ：    １２．００，  １２．５０，  ２０．９０，  ２１．００，  ２１．１０，  ２３．００，  ２３．８０，  ２７．１０，  ３０．５０，  ３１．００，  ３２．１０，  ３３．１０，  ３４．８０，  ３５．３０，  ３５．６０，  ３９．５０，  ３９．７０，  ３９．８５，  ４１．８０，  ４３．００，  ５０．４０，  ５８．５０，  ６８．６０，  ７２．００，  １７６．９０．
Ｉｐ５．Ｍｐ：２２１〜２２５℃。［α］２０Ｄ−４０．２２（ｃ１、ＥｔＯＨ）。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤ３ＯＤおよびＣＤＣ１３）  δ：  ０．５６  （ｓ，  ３Ｈ，  １８−ＣＨ３），  ０．８６  （ｓ，  ３Ｈ，  １９−ＣＨ３），  １．１６  （ｄ，  Ｊ＝  ６．６０  Ｈｚ，  ３Ｈ，  ２１−ＣＨ３），  ３．１０−３．３０  （ｍ，  １Ｈ，  ３−ＣＨ），  ３．８５  （ｍ，  １Ｈ，  ７−ＣＨ）．    １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＣＤＣ１３）  δ：  １２．１０，  １８．３０，  １８．５５，  ２０．００，  ２０．９０，  ２３．１０，  ２４．００，  ２８．２０，  ３０．７０，  ３１．７０，  ３３．２０，  ３４．８０，  ３５．４０，  ３５．７０，  ３９．８０，  ４０．１０，  ４１．８０，  ４３．１５，  ５０．４０，  ５７．８０，  ６８．９０，  ７２．２０，  １７８．４０．
Ｉｒ５．Ｍｐ：１３６〜１４０℃。［α］２０Ｄ＋１３．６６（ｃ１、ＥｔＯＨ）。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤ３ＯＤおよびＣＤＣ１３）  δ：  ０．５６  （ｓ，  ３Ｈ，  １８−ＣＨ３），  ０．８６  （ｓ，  ３Ｈ，  １９−ＣＨ３），  ０．９６  （ｄ，  Ｊ＝６．６６  Ｈｚ，  ３Ｈ，  ２１−ＣＨ３），  ３．４０−３．６０  （ｍ，  １Ｈ，  ３−ＣＨ），  ３．８０  （ｍ，  １Ｈ，  ７−ＣＨ）．    １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＣＤＣ１３）  δ：    １２．００，  １３．５０，  １９．９０，  ２０．９０，  ２２．５０，  ２３．１０，  ２４．００，  ２８．００，  ３０．７０，  ３１．６０，  ３３．２０，  ３４．９０，  ３５．４０，  ３５．６５，  ３９．７０，  ３９．７３，  ４１．８０，  ４３．１０，  ５０．４０，  ５８．００，  ６８．８０，  ７２．２０，  １７７．６０．
（実施例８）
インビトロのＴＧＲ５およびＦＸＲ活性
ＴＧＲ５受容体に対する本発明の化合物の作用強度および有効性を、インビトロアッセイを使用して評価した。
【０２１７】
表１は、本発明の化合物が強力および選択的なＴＧＲ５モジュレーターであることを示す。胆汁酸のＣ−２３位におけるアルキル基の導入は、ＦＸＲに対して、ＴＧＲ５受容体について選択性を与える。これは、表１に示されているように、ＦＸＲおよびＴＧＲ５上のＣＤＣＡ、６−ＭｅＣＤＣＡおよび６，２３−ジＭｅ−ＣＤＣＡ（２３−Ｒ，Ｓ異性体混合物）について得られる生物学的結果の観察から明らかである。６，２３−ジＭｅ−ＣＤＣＡは、ＦＸＲ受容体に対して、ＴＧＲ５について１００倍より強力である。インビトロアッセイを使用したＴＧＲ５受容体結合の記載については、例えば、Ｋａｗａｍａｔａ，  Ｊ．、Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ、２００３年、第２７８巻、第１１号、９４３５〜９４４０頁を参照されたい。ＦＸＲに対する活性は、無細胞ＥＬｉＳＡを使用してヒトＦＸＲへのＳＲＣ−１ペプチドのリクルート作用について、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によってアッセイした。Ｂｌａｎｃｈａｒｄら、ＷＯ００／３７０７７を参照されたい。
【０２１８】
【表１】
0005535233.tif 000054
表２および３は、ＴＧＲ５活性について評価したさらなる化合物を示す。ルシフェラーゼ活性を、ｈＴＧＲ５を安定的に発現し、またはｈＴＧＲ５発現ベクターおよびｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）駆動ルシフェラーゼレポーター遺伝子を過渡的にコトランスフェクトされたＣＨＯ細胞において決定した。化合物のいくつかをルシフェラーゼレポーターアッセイにさらに供し、核胆汁酸受容体ＦＸＲを活性化させるそれらの能力についてスコア化した。
【０２１９】
【表２】
0005535233.tif 000055
＊データは、ＴＧＲ５でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞におけるＣＲＥ駆動ルシフェラーゼレポーターアッセイの少なくとも３つの独立した実験の平均値を表す。単位は、ＥＣ５０についてμＭ、および有効性について１０μＭのＬＣＡ値の％である。
【０２２０】
【表３−１】
0005535233.tif 000056
【０２２１】
【表３−２】
0005535233.tif 000057
ａデータは、少なくとも３つの独立した実験の平均値を表す。有効性についての値は、１０μＭのＬＣＡ（ＴＧＲ５）または１０μＭの６ＥＣＤＣＡ（ＦＸＲ）に対する活性の％として表す。
ｂ定常活性化（Ｐｌａｔｅａｕ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）レベルに達しない。試験した最高濃度は、Ｉｂについて１２５μＭ、Ｉｉについて１００ｍＭであった。
【０２２２】
表２および３におけるデータは、当技術分野において公知の方法を使用して、例えば、下記のように決定することができる。
【０２２３】
プラスミド
ＮＩＨ哺乳動物遺伝子コレクションクローンＭＧＣ：４０５９７（ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６／ｈＴＧＲ５またはｐＴＧＲ５とも称される）およびｐｃＤＮＡ３．１（＋）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から入手した。ｐＣＲＥ−ＬｕｃおよびｐＣＭＶβは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から入手した。ｐＣＭＸ−ｈＦＸＲおよびｐＣＭＸ−ｍＲＸＲαは、Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ博士（ハワードヒューズ医学研究所、テキサス大学サウスウェスタン医療センター）からの親切な寄贈であった。ｐＥｃＲＥｘ７−Ｌｕｃは、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａ．Ｈｅｙｍａｎ博士（Ｘ−ｃｅｐｔｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＣＡ）からの親切な寄贈であった。
【０２２４】
細胞培養
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞およびＣＯＳ１細胞は、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。細胞培養培地、血清および補充物は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎまたはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからであった。全てのＣＨＯ細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１００μＭの非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を補充した最小必須培地α（α−ＭＥＭ）中に保持した。ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ−１６４０中に懸濁状態で保持した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１００μＭのＮＥＡＡを補充したイーグル培地中に保持した。ＣＯＳ１細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に保持した。全ての細胞培養培地に、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシンを補充した。細胞は、３７℃にて５％ＣＯ２雰囲気中で増殖させ、２〜６日毎に移し、各実験のために新たに蒔いた。
【０２２５】
一過性トランスフェクション
ＣＨＯ細胞を、３．５×１０４細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに蒔き、２４時間培養し、次いでメーカーの指示によって各ウェル中でリポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、１５０ｎｇのヒト（ｈ）ＴＧＲ５発現プラスミド（ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６／ｈＴＧＲ５）および１００ｎｇのｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）駆動ルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ）でトランスフェクトした。６時間のインキュベーション後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で一度洗浄し、培地を０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＤＭＥＭと交換した。さらに１８時間のインキュベーション後、細胞を、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有する新鮮なＤＭＥＭ中の異なる濃度の各化合物で５時間処理した。処理後、細胞を、凍結融解サイクルによって５０μｌの溶解緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．６）、２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールおよび１％（ｖ／ｖ）ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で溶解させ、下記のようにルシフェラーゼアッセイに供した。
【０２２６】
ＣＯＳ１細胞を、１０％（ｖ／ｖ）チャコール処理ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中に２．５×１０４細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに蒔き、２４時間培養し、次いで各ウェル中でリポフェクタミン２０００試薬を使用して、２５ｎｇのｈＦＸＲ発現プラスミド（ｐＣＭＸ−ｈＦＸＲ）、２５ｎｇのマウス（ｍ）レチノイドＸ受容体α（ＲＸＲα）発現プラスミド（ｐＣＭＸ−ｍＲＸＲａ）、５０ｎｇのレポータープラスミド（ｐＥｃＲＥｘ７−Ｌｕｃ）、および５０ｎｇのｐＣＭＶβ（内部対照として）でトランスフェクトした。２４時間後、細胞をＰＢＳで２度洗浄し、１０％（ｖ／ｖ）チャコール処理ＦＢＳを補充した新鮮なＤＭＥＭ中の異なる濃度の各化合物で２４時間処理した。処理後、凍結融解サイクルによって５０μｌの溶解緩衝液で細胞を溶解させ、下記のようにルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼアッセイの両方に供した。正規化したルシフェラーゼ値は、ルシフェラーゼ活性をβ−ガラクトシダーゼ活性で除することによって決定した。
【０２２７】
ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼアッセイ
ルシフェラーゼアッセイのために、２０μｌの細胞ライセートを、１００μｌのルシフェラーゼ反応緩衝液［２３５μＭのルシフェリン、２６５μＭのＡＴＰおよび１３５μＭのコエンザイムＡ（ＣｏＡ）］と混合し、発光をＣｅｎｔｒｏＸＳ３  ＬＢ９６０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂａｄ  Ｗｉｌｄｂａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で決定した。β−ガラクトシダーゼアッセイのために、１０μｌの細胞ライセートを、１００μｌの緩衝液Ｚ［６０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭのＫＣ１、１ｍＭのＭｇＳＯ４、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノールおよび０．７５ｍｇ／ｍｌのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）］と混合し、３７℃で０．５〜３時間インキュベートした。５０μｌの停止緩衝液（１ＭのＮａ２ＣＯ３）を加えることによって反応を停止させ、４２０ｎｍでの光学濃度を決定した。
【０２２８】
ヒトＴＧＲ５を安定的に発現しているＣＨＯ細胞の確立（ＣＨＯ−ＴＧＲ５細胞）
ＣＨＯ細胞は、リポフェクタミン２０００を使用して、３．８μｇのｈＴＧＲ５発現プラスミド（ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６／ｈＴＧＲ５）、３．８μｇのＣＲＥ駆動ルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ）および０．４μｇのネオマイシン耐性遺伝子発現プラスミド［ｐｃＤＮＡ３．１（＋）］でトランスフェクトした。トランスフェクタントを４００μｇ／ｍｌのＧ４１８スルフェートと共に選択し、単一のクローンを独立して９６ウェルプレート中で増殖させた。ＴＧＲ５−発現ＣＨＯ細胞系をＬＣＡ処理によってスクリーニングし、続いてルシフェラーゼアッセイを行った。
【０２２９】
ｃＡＭＰ生成分析
ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞を、使用の直前に、メーカーの指示に従って０．７５ｍｇ／ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングした９６ウェルプレートに、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中に６×１０４細胞／ウェルの濃度で蒔き、２４時間培養し、それによってプレートの底への細胞接着が可能となった。ＣＨＯ−ＴＧＲ５細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１００μＭのＮＥＡＡ、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇの硫酸ストレプトマイシンを補充したα−ＭＥＭ中で３．５×１０４細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに蒔き、２４時間培養した。細胞をＰＢＳで２度洗浄し、培地をｃＡＭＰアッセイ培地［０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．５ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を含有するＤＭＥＭ］と交換した。３７℃での３０分間のインキュベーションの後、細胞を、新鮮なｃＡＭＰアッセイ培地中で各化合物によって３０分間処理した。処理後、培地を廃棄し、ｃＡＭＰ−スクリーンキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、メーカーの指示によってｃＡＭＰ量を決定した。
【０２３０】
５０％有効濃度（ＥＣ５０）および有効性の決定
各条件について３連または４連でアッセイを行った。ＥＣ５０値を、プロビット解析によって決定した。ＴＧＲ５アゴニスト研究について１０μＭのＬＣＡ値の割合、およびＦＸＲアゴニスト研究について１０μＭの６α−Ｅｔ−ＣＤＣＡ値の割合を、各々計算することによって有効性を決定した。基本（ビヒクル処理）条件の平均値を引いた後、値をＥＣ５０および／または有効性決定に適用した。平均ＥＣ５０の計算および異なる化合物の間のＥＣ５０の比較を、対数変換の後に行った。
【０２３１】
統計解析
統計解析をスチューデントｔ−検定によって行い、ｐ＜０．０５は統計的に有意であるとみなした。
【０２３２】
【表３Ａ−１】
0005535233.tif 000058
表３Ａにおけるデータは、下記に記載する方法を使用して得た。
【０２３３】
ＦＲＥＴアッセイ（細胞内ｃＡＭＰレベルの検出）
受容体結合アッセイは、ＦＲＥＴアッセイを使用してサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）のレベルを測定することによって行った。ヒト腸細胞系（ＮＣＩ−Ｈ７１６）を、使用の直前に、メーカーの指示に従って０．７５ｍｇ／ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングした９６ウェルプレートに、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中に１２×１０３細胞／ウェルの濃度で蒔き、２４時間培養し、それによってプレートの底への細胞接着が可能となった。細胞をＰＢＳで２度洗浄し、培地をｃＡＭＰアッセイ培地［０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび１ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を含有するＯＰＴＩＭＥＭ］と交換した。３７℃で６０分間のインキュベーション後、細胞を、ユウロピウムキレート−ストレプトアビジンおよびＡＬＥＸＡ  Ｆｌｕｏｒ６４７−抱合抗体抗ｃＡＭＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を含有する刺激緩衝液（ＨＢＳＳ（ｐＨ７．４）中の５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡ）中で１時間室温にて、増加する濃度の化合物Ｉｈ３で処理した。細胞内ｃＡＭＰのレベルを、Ｌａｎｃｅキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で決定した。リトコール酸（Ｌｉｔｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）を、対照リガンドとして使用した。Ｚ’因子を使用して、アッセイを検証した。非線形回帰曲線は、制約なしに、４パラメーター式およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｉｎｃ．）を使用することによって行い、ＥＣ５０値を得た。
【０２３４】
Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイ
ＦＸＲに対する活性を、リクルート作用コアクチベーターアッセイにおいてＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ技術を使用することによってアッセイした。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎは、生体分子相互作用を研究するために使用するビーズをベースとする化学アッセイである。ビーズ上に捕獲された分子の結合は、１つのビーズから他のビーズへのエネルギー移動をもたらし、最終的に発光シグナルを生じさせる。パートナーが相互作用するとき、化学エネルギーはドナービーズからアクセプタービーズに移動し、シグナルが生じる。胆汁酸刺激によって、ＧＳＴ−ＦＸＲ−ＬＢＤは、Ｓｒｃ−１ペプチドと相互作用する。抗ＧＳＴ−コーティングされたアクセプタービーズを使用して、ＧＳＴ−融合ＦＸＲ−ＬＢＤを捕獲し、一方では、ビオチン化−ＳＲＣ−１ペプチドは、ストレプトアビジンドナービーズによって捕獲した。６８０ｎｍでの照明によって、化学エネルギーは、複合体ストレプトアビジン−ドナー／Ｓｒｃ−１−ビオチン／ＧＳＴＦＸＲ−ＬＢＤ／抗ＧＳＴ−アクセプターを介してドナービーズからアクセプタービーズに移動し、シグナルが生じる。アッセイは、１０ｎＭの最終濃度の精製したＧＳＴ標識ＦＸＲ−ＬＢＤタンパク質、３０ｎＭのビオチン化Ｓｒｃ−１ペプチド、２０μｇ／ｍｌの抗ＧＳＴアクセプタービーズおよび１０μｇ／ｍｌのストレプトアビジンドナービーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を含有する２５μｌの最終容量を使用して、低容量の白色３８４ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）中で行った。アッセイ緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭのＫＣｌ、０．１％ＢＳＡ、および１ｍＭのＤＴＴを含有した。１μｌのリガンド（１００％ＤＭＳＯ中で可溶化した）による刺激時間を、室温にて３０分に固定した。各ウェル中のＤＭＳＯの濃度を、４％の最終濃度で維持した。検出ミックス（アクセプタービーズおよびドナービーズ）を加えた後、プレートを、室温にて暗中４時間インキュベートし、次いでＥｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレート分析器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取った。用量反応曲線を３連で行い、Ｚ’因子を使用して、アッセイを検証した。非線形回帰曲線は、制約なしに、４パラメーター式およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｉｎｃ．）を使用することによって行い、ＥＣ５０値を得た。
【０２３５】
細胞培養、トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＰＧ２およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を各々、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％Ｌ−グルタミンおよび１０％ウシ胎児血清（高グルコース）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補充したＥ−ＭＥＭおよびＤＭＥＭ中で培養した。細胞を３７℃にて５％ＣＯ２中で増殖させた。全てのトランスフェクションは各々、５：２のＦｕｇｅｎｅ  ＨＤトランスフェクション試薬（μｌ）とＤＮＡ（μｇ）（Ｒｏｃｈｅ）を使用して行った。トランスフェクションの２４時間前に、ＨＥＫ２９３ＴまたはＨｅｐＧ２細胞を、各々１０，０００または１５，０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播種した。一過性トランスフェクションを、１００ｎｇのレポーターベクターｐＧＬ４．２９［ｌｕｃ２Ｐ／ＣＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａ）、トランスフェクション効率性についての内部対照として４０ｎｇのｐＧＬ４．７４（Ｒｅｎｉｌｌａ）、および１０ｎｇの発現プラスミドｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ｈＴＧＲ５、ＮＩＨ哺乳動物遺伝子コレクションクローンＭＧＣ：４０５９７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。ｐＧＥＭベクターを加え、各アッセイにおいてトランスフェクトされたＤＮＡの量（２μｇ）を正規化した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を、増加する濃度の化合物Ｉｈ３ｅで１８時間刺激した。対照培養物は、ビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）単独を摂取した。次いで、細胞／ウェルを含有する７５μｌの培地に７５μｌのＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えることによって、細胞を溶解させた。ウミシイタケルシフェラーゼ活性を、多量のＤｕａｌ−Ｇｌｏ  Ｓｔｏｐ  ＆  Ｇｌｏ試薬および最初の培地を加えることによって測定した。ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼ単位とウミシイタケルシフェラーゼ単位の比として表した。各データポイントは、３連のアッセイの平均である。各実験は、少なくとも３回繰り返した。
【０２３６】
【表３Ａ−２】
0005535233.tif 000059
＊表３Ａに示した結果は、直前に記載した手順を使用して得た。
【０２３７】
胆汁酸環上のＣ−６位においてアルファ−エチル基を有する化合物が好ましい。さらに具体的には、２３−メチルコール酸のＣ−６位においてアルファ−エチル基を有する化合物が最も好ましい。上記の表３Ａに示されているように、Ｃ−６位においてアルファ−エチル基を有する化合物は、相当するＣ−６アルファ−メチル誘導体より驚いたことに予想外により強力である。
【０２３８】
（実施例９）
食餌誘発性肥満症マウスモデルにおけるオレアノール酸および６−エチル，２３−メチル−コール酸（Ｉｈ３ｅ）の代謝活性
研究のゴールは、ＴＧＲ５アゴニスト（オレアノール酸（ＯＡ）または６エチル，２３−メチルコール酸（Ｉｈ３ｅ））が、肥満症および関連するインスリン抵抗性の発生をインビボで修正するかを明らかにすることである。この可能性を試験するために、事前に１０週間高脂肪食に供した雄性Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスに、食物投与によってＯＡ／Ｉｈ３ｅを１６週間投与した。
【０２３９】
ＩＩ−プロトコル
前の研究において、ＯＡは、食物嫌悪をもたらさない選択的ＴＧＲ５アゴニストとして観察された。しかし、１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量のＯＡで処理した動物は、毒性のいくつかの徴候を示した一方、より低い用量は耐容性良好であった。したがって、この研究において、ＯＡは５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与した。
【０２４０】
インビトロ研究において、Ｉｈ３ｅを強力および選択的なＴＧＲ５リガンドとして同定した。約５０分の１の低い濃度で投与したＩｈ３ｅについて、毒性の問題は予想されなかった。
【０２４１】
この研究のために、４８匹の雄性Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウス（５週齢）を、２つの群に分けた。１０週間の期間、２４匹（１、２および３群）の動物の１群は固形飼料食を摂取し、一方、他の２４匹は高脂肪食を摂取した（４、５および６群）。次いで、１６週間の期間、動物を分析した。１０匹の動物の５群を、下記のように割り当てた。
１：固形飼料食
２：固形飼料食＋ＯＡ（５０ｍｇ／ｋｇ／日）
３：固形飼料食＋６Ｅｔ２３ＭｅＣＡ（Ｉｈ３ｅ）（３０ｍｇ／ｋｇ／日）
４：高脂肪食
５：高脂肪食＋ＯＡ（５０ｍｇ／ｋｇ／日）
６：高脂肪食＋６Ｅｔ２３ＭｅＣＡ（Ｉｈ３ｅ）（３０ｍｇ／ｋｇ／日）
全研究の間に、体重および食物摂取を週に２回モニターした。
第２週：全ての群について、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ｄｅｘａスキャン）によって体組成を分析した。
第１週：トランスアミナーゼ、グルコース、トリグリセリド、コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃおよびインスリンの血清レベルを、全ての群において１２時間の絶食期間の後に測定し、次いでマウスに示したような食事を供した（０日目）。
第２週：トランスアミナーゼ、グルコース、トリグリセリド、コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃおよびインスリンの血清レベルを、全ての群において１２時間の絶食期間の後に測定した（１４日目）。
第４週：全ての動物を腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）に供することによって、耐糖能を決定した。動物は、この試験の前に１２時間絶食させた。
１、４、５および６群（固形飼料食、高脂肪食および高脂肪食ＯＡ／６Ｅｔ２３ＭｅＣＤＣＡ（Ｉｈ３ｅ））の夜間のエネルギー支出を、間接熱量測定によって測定した。
第８週：全ての群について、ｄｅｘａスキャンによって体重組成を再び分析した。
トランスアミナーゼ、グルコース、トリグリセリド、コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃおよびインスリンの血清レベルを、全ての群において１２時間の絶食期間の後に測定した（５６日目）。
第９週：４、５および６群（高脂肪食摂食マウス）の概日活動を、３０時間の期間研究した。
第１０週：血圧および心拍数の測定を、４、５および６群に行った。
第１１週：全ての動物の直腸の温度を、１０：００ａｍに室温で測定した。
概日活動の測定を、１、２、３および４群について行った。
第１２週：４、５および６群に腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）を行うことによって、耐糖能を分析した。ＩＰＧＴＴの間、血液をまた集め、インスリンレベルを分析した。これらの試験の前に動物を１２時間絶食させた。
全ての群において、２４時間の期間に亘り糞便を集め、糞便の脂質含量を、測定した。
第１６週：全ての動物において、４℃に曝した動物の体温を測定することによって、寒冷試験を行った。
【０２４２】
３日後、動物を屠殺した。屠殺時に、血液を集め、血漿脂質（ＴＣ、ＴＧ、ＨＤＬ−Ｃ、ＦＦＡ）；肝機能（ＡＬＡＴ、ＡＳＡＴ、アルカリＰａｓｅ、γ−ＧＴ）；グルコースおよびインスリン；血漿の選択した群のリポタンパク質プロファイルについて分析した（サイズ排除クロマトグラフィー）。
【０２４３】
肝臓、小腸、脂肪組織（ＷＡＴおよびＢＡＴ）、膵臓、心臓および筋肉を集め、秤量し、標準的組織学的検査（ＨＥ染色、コハク酸デヒドロゲナーゼ染色、オイルレッド−Ｏ染色および細胞形態）；組織脂質含量；ミトコンドリアを分析するためのＢＡＴおよび筋肉に対する電子顕微鏡検査；定量的ＲＴ−ＰＣＲによる代謝およびエネルギー恒常性に関与する選択した遺伝子の発現研究のためのＲＮＡ単離；対象タンパク質（例えば、ＰＧＣ−１α）のアセチル化などの翻訳後修飾の研究のためのタンパク質抽出を含めたさらなる分析のために保存した。
【０２４４】
ＩＩＩ−詳細な手順
Ａ−動物手順および食事
動物の収容および取扱い
マウスは、欧州共同体の基準によって、温度（２０〜２２℃）および湿度を制御した動物飼養場中で、１２時間：１２時間（７：００に点灯）の明暗サイクルで、特定の無菌条件において群で収容した（５匹の動物／ケージ）。動物に水および食物を自由に摂取させた。
【０２４５】
飲料水
水道水の化学組成を、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｄ’Ｈｙｄｒｏｌｏｇｉｅ、ＵＬＰ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇにおいて、定期的に分析し、潜在的な有毒物質がないことを確認した。飲料水をＨＣｌおよびＨＣｌＯ４で処理し、ｐＨを５〜５．５に、および塩素濃度を５〜６ｐｐｍに維持した。
【０２４６】
食事
標準的げっ歯類用固形飼料食はＵＡＲから入手し、高脂肪食はＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔから入手した。マウスに、固形飼料食（１６％タンパク質、３％脂肪、５％繊維、５％灰分）、または高脂肪食（２０％タンパク質、２０％炭水化物、６０％脂肪）を摂食させた。オレアノール酸および６Ｅｔ２３ＭｅＣＤＣＡ（Ｉｈ３ｅ）を、粉末状固形飼料食または粉末状高脂肪食と下記の割合で混合した。５０ｍｇ／ｋｇ／日処理について０．５ｇのＯＡ／ｋｇ（食物）、および１０ｍｇ／ｋｇ／日処理について０．０８ｇの６Ｅｔ２３ＭｅＣＡ（Ｉｈ３ｅ）／ｋｇ（食物）。次いで、ペレットを再構成した。対照群は、会社から提供されたままの食物ペレットを摂取した。高脂肪食の粘稠性によって、ＯＡとの混合において水は加えなかった。再構成することがより難しい固形飼料食の場合、最少量の水を粉末に加え、ペレットを再構成し、それを次いで空気乾燥させた。新しいバッチの食物を毎週調製した。
【０２４７】
採血
麻酔下で後眼窩洞から、または尾静脈から血液を集めた。
【０２４８】
麻酔
ｄｅｘａスキャニング実験のために、動物を腹腔内注射によって投与したケタミン（２００ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（Ｘｙｌａｓｉｎｅ）（１０ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔した。静脈穿刺のために、動物をイソフルラン−Ｏ２混合物の吸入によって麻酔した。
【０２４９】
Ｂ−生化学
試験は、市販の試薬（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用してＯｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ−４００自動化実験室ワークステーションで行った。
【０２５０】
脂質およびリポタンパク質の分析
酵素アッセイによって、血清トリグリセリド、総コレステロールおよびＨＤＬコレステロールを決定した。血清ＨＤＬコレステロール含量は、リンタングステン酸／Ｍｇ（例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によるａｐｏ  Ｂ−含有リポタンパク質の沈殿後に決定した。遊離脂肪酸レベルは、和光純薬（例えば、Ｎｅｕｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのキットによって供給者によって明記されているように決定した。
【０２５１】
代謝および内分泌の調査
血液グルコース濃度を、Ｍｅｄｉｓｅｎｓｅ  Ｐｒｅｃｉｓ電極（例えば、Ａｂｂｏｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｅｄｉｓｅｎｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＵＳＡ）を使用してＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｑ．Ｉ．Ｄ分析器（例えば、Ｍｅｄｉｓｅｎｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ）によって測定した。この方法は、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｑ．Ｉ．Ｄ分析器の値を古典的なグルコース測定と比較することによって検証した。最少量の血液を必要とし、したがってＩＰＧＴＴの間など複数の測定のために用いることができるため、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｑ．Ｉ．Ｄ法を選択した。血漿インスリン（例えば、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を、メーカーの仕様書に従ってＥＬＩＳＡによって決定した。
【０２５２】
Ｃ−代謝試験
リポタンパク質プロファイル
リポタンパク質プロファイルは、３種の主要なリポタンパク質のクラスであるＶＬＤＬ、ＬＤＬ、およびＨＤＬの分離を可能にする高速タンパク質液体クロマトグラフィーから得た。
腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）−経口グルコース負荷試験
ＩＰＧＴＴは、一晩（１２時間）絶食したマウスで行った。マウスに、無菌食塩水（０．９％ＮａＣｌ）中の２０％グルコースの溶液を、２ｇグルコース／ｋｇ体重の用量で腹腔内（ＩＰＧＴＴ）に注射した。グルコースおよびインスリンのモニターのために、グルコース溶液の投与前および投与の１５分、３０分、４５分、７５分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分後に、血液を尾静脈から集めた。グルコース上昇曲線下面積を、インスリン感受性の尺度として計算した。一方、相当するインスリンレベルは、インスリン分泌貯蔵を示す。
【０２５３】
エネルギー支出
エネルギー支出を、Ｏｘｙｍａｘ装置（例えば、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）で１２時間の間の酸素消費を測定することによって間接熱量測定によって評価した。このシステムは、オープンサーキットからなり、空気がプラスチックケージを出入りする（ケージ毎に１匹のマウス）。動物に食物および水を自由に摂取させた。非常に正確なＣＯ２およびＯ２センサーによって、両方の空気量におけるＯ２およびＣＯ２濃度の差異を測定し、これによって、ケージに入ってくる空気の気流が一定である場合の、一定の期間において消費された酸素量を得る。装置から出力されるデータを連結したコンピューターで処理し、分析し、エクスポート可能なＥｘｃｅｌファイルで示した。値は、ＶＯ２として通常公知であるｍｌ×ｋｇ−１×ｈ−１として表した。
【０２５４】
Ｄｅｘａスキャニングによる体脂肪含量の決定
Ｄｅｘａ分析は、超高分解能ＰＩＸＩＭＵＳシリーズデンシトメーター（０．１８×０．１８ｍｍピクセル、ＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）によって行った。骨塩密度（ＢＭＤ、ｇ／ｃｍ２）および体組成は、ＰＩＸＩＭＵＳソフトウェア（バージョン１．４ｘ、ＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用することによって決定した。
【０２５５】
Ｄ−非侵襲性血圧測定および脈拍
Ｖｉｓｉｔｅｃｈ  ＢＰ−２０００血圧分析システムは、オペレーターの介入なしに４匹の覚醒しているマウスに対して同時に複数の測定をするために使用するコンピューターによる自動化されたテイルカフ（ｔａｉｌ’ｃｕｆｆ）システムである。マウスを加熱したプラットフォーム上の個々の暗いチャンバー中に収容し、それらの尾をテイルカフに通した。システムは、カフ圧力を決定することによって血圧を測定し、そこでは尾への血流が除去される。光電センサーによって、標本の脈拍を検出する。システムは、頸動脈において同時に測定される平均動脈内圧力と密接に一致することが示されてきた結果をもたらす。これによって、収縮期血圧および心拍数の再現性のある値を得ることが可能となる。これは、システム中での１週間の動物の訓練を必要とした。
【０２５６】
Ｅ−概日活動
自発的運動活性は、各々がスライディングフロア、取り外し可能なケージで構成され、移動性の運動活性および後ろ足で立つことを測定することを可能にする赤外線キャプターを備えた個々の箱を使用して測定した。電子インターフェース（例えば、Ｉｍｅｔｒｏｎｉｃ、Ｐｅｓｓａｃ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、箱をコンピューターに連結した。装置への慣れ、ならびに夜間および昼間の活動を測定するために、マウスを３２時間試験した。消費した水の含量を、自動式リックメーターを使用して試験期間の間に測定した。
【０２５７】
研究の結果を図１〜９に示す。図１は、固形飼料摂食マウスおよび高脂肪摂食マウスにおける体重増加に対する化合物Ｉｈ３ｅの影響を示す。体重増加を、１６週間に亘り測定した。化合物Ｉｈ３ｅで処理した高脂肪摂食マウスは、ビヒクルで処理した高脂肪摂食マウスより低い体重増加を示した。図２は、化合物Ｉｈ３ｅが高脂肪摂食マウスの代謝プロファイルを改善させることを示す。化合物Ｉｈ３ｅで処理した食餌誘発性肥満マウスにおける血漿および心拍数分析の結果を、血糖、肝酵素（ＬＤＨ、ＡＳＡＴ、およびＡＬＡＴ）ならびにプラスミド脂質（総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、およびトリグリセリド）のレベルを含めて図２に示す。化合物Ｉｈ３ｅで処理した高脂肪摂食マウスは、ビヒクルで処理した高脂肪摂食マウスより低い血糖、肝酵素、および血漿脂質を示した。化合物Ｉｈ３ｅで処理した高摂食マウスの心拍数はまた、ビヒクルで処理した高脂肪摂食マウスと比較してより低い心拍数を示した。図３は、化合物Ｉｈ３ｅが高脂肪摂食マウスにおいて耐糖能を改善することを示す。図３Ａに示すように、１０週間後、血漿インスリンレベルは、ビヒクルで処理したマウスと比較して、化合物Ｉｈ３ｅで処理した固形飼料摂食マウスおよび高脂肪摂食マウスの両方において増加した。図３Ｂに示すように、１２週間後、グルコースレベルは、化合物Ｉｈ３ｅで処理した高脂肪摂食マウスにおいてより低いことが示された。図４は、化合物Ｉｈ３ｅで処理した固形飼料食摂食マウスにおける２００分の期間に亘るグルコースレベルとしての経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）の結果を示す。図５（グラフＡ〜Ｄ）は、試験食後のインビボでのインスリン放出を示す。図５Ａは、３０分に亘るインスリン放出を示す。図５Ｂは、基礎インスリンレベルと比較した、インスリン放出における増加（倍）を示す。インスリンレベルは、ビヒクルで処理したマウスと比較して、化合物Ｉｈ３ｅで処理した高脂肪摂食マウスにおいて約１２分でより高いレベルに達した。図５Ｃおよび５Ｄは、基礎インスリンレベルと比較した、インスリン放出における増加（倍）を示す。化合物Ｉｈ３ｅで処理した高脂肪摂食マウスにおける増加（倍）は、図５Ｄに示すように１５分および３０分時点の両方においてより大きかった。図６（グラフＡ〜Ｄ）および７（グラフＡ〜Ｃ）は、化合物Ｉｈ３ｅで処理したマウスが、ＨＦＤ（高脂肪食）によって呼吸交換率（ＲＥＲ）が増加することを示し、これはグルコースを酸化させるマウスの能力を維持する、マウスのインスリン感受性の改善と関連するものとして説明することができる。図８（グラフＡおよびＢ）は、ビヒクル処理と比較した、処理した高脂肪摂食マウスおよび処理した固形飼料摂食マウスの運動活性および食物／水摂取を示す。高脂肪食を摂取し、化合物Ｉｈ３ｅで処理したマウスについての食物／水摂取は、ビヒクルで処理したマウスに対して摂取の僅かな増加を示した。図９（グラフＡ〜Ｃ）は、器官重量の変化を示す。図９Ｂおよび９Ｃは、固形飼料食を摂取したマウスの重量と比較した、体重、肝臓、腎臓、心臓、ｐｅｒｉ  ＷＡＴ、ｅｐｉ  ＷＡＴ、Ｓｃ  ＷＡＴ、およびＢＡＴにおける変化率を示す。全ての器官において、化合物Ｉｈ３ｅで処理した高脂肪摂食マウスは、変化率の減少を示した。
【０２５８】
（実施例１０）
物理化学的性質
水溶性
固体ＢＡ（化合物Ｉｈ３ｅについてのプロトン化した形態）を、５ｍｌのＨＣｌ（０．１Ｍ）に懸濁させた。１週間のインキュベーション後、飽和溶液をＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルター（０．２２μｐｍ）で濾過し、ＢＡの濃度を、Ｃ１８カラム（１５０ｍｍ×２ｍｍ、皮内、４μｍ）および移動相（１５ｍＭの酢酸（ｐＨ５）およびアセトニトリルを含有する水）を使用して、ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって測定した。流量は１５０μｌ／分であった。質量分析の取得は、負のイオン化のＥＳＩ源を使用して多段反応モニタリングモードで行った。水溶性は、μｍｏｌ／リットルとして表した。
【０２５９】
化合物Ｉｈ３ｅの水溶性は、相当するジヒドロキシＢＡより高く、ＣＡの水溶性と同程度の値である９９ｐＭである（表４を参照されたい）。
【０２６０】
【表４】
0005535233.tif 000060
ａＷｓ：水溶性とはプロトン化種としてのＢＡを意味し、したがって高度に可溶性（ｈｓ）であるＴＣＤＣＡ、およびＴＵＤＣＡについて評価しない。
ｂＣＭＣ：０．１５ＭのＮａＣｌ水溶液中で決定した臨界ミセル濃度。
ｃＳＴＣＭＣ：０．１５ＭのＮａＣｌ水溶液中のＣＭＣでの表面張力。
ｄＬｏｇＰＡ：イオン化種として研究した胆汁酸の１−オクタノール−水分配係数。
＊：文献からの値。
【０２６１】
化合物Ｉｈ３ｅ中の２３−メチル基の存在は、水溶性を損なわない。化合物Ｉｈ３ｅは、天然ＢＡおよび従前に研究された合成類似体の範囲の溶解度値を示す。さらに、化合物Ｉｈ３ｅの相対的に良好なアルブミン結合を考えると、血液中の化合物Ｉｈ３ｅの循環は促進されることができ、それによって筋肉および褐色脂肪組織などの末梢組織におけるＴＧＲ５の全身性ターゲティングを助長する。実施例９、１６および１７は、この仮説をさらに支持する。
【０２６２】
臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）
界面活性、すなわちミセルを形成する傾向を、ナトリウム塩として水中で可溶性である全ての荷電分子について評価した（ｐＫａまで２単位）。臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、静的方法のように、潜在的な不純物によって僅かに影響される表面張力値を与える最大気泡圧力法を使用して、表面張力（ＳＴ）測定によって決定した。張力計は、窒素源と連結した２本のガラス製プローブ（０．５ｍｍおよび４．０ｍｍの直径）を備えたＳｅｎｓａｄｙｎｅ６０００（Ｃｈｅｍ−Ｄｙｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）であった。気泡の発生頻度は、２６℃にて蒸留水中で１気泡／秒であり（Ｐ＝２．７ａｔｍ）、較正を再蒸留水およびメタノールで行った。ＮａＣｌ（０．１５Ｍ）中のＢＡナトリウム塩溶液の表面張力を、０．１３〜５０ｍＭの範囲内で様々な濃度で測定した。表面張力値は、胆汁酸塩濃度の対数に対してプロットした。曲線の２つの部分（単量体およびミセル相）に相当する回帰線を、最小二乗法を使用して計算し、線の交差点をＣＭＣ値として取った。ＳＴ対濃度曲線から、ＣＭＣにおける表面張力の値（単量体および多量体種の間の平衡）をまた計算し、関連する表面張力低下能力を有するミセルのサイズと関連する界面活性力についての情報を得た。
【０２６３】
ＣＭＣは、非平衡条件、すなわち不純物が表面張力の結果に僅かに影響する条件において表面張力測定によって評価した（図１０）。化合物Ｉｈ３ｅは、低いＣＭＣではあるが、ＣＭＣにおける表面張力値によって示されるように、中程度の界面活性および表面張力低下能力を示す（低界面活性とは、膜または細胞への低毒性を意味する）。
【０２６４】
オクタノール／水分配係数
スルフェートおよびスルホン化類似体は、全てのｐＨ値において常にイオン化するため、イオン化形態の全ての分子についてオクタノール／水分配係数を測定し、したがってカルボキシ類似体を高ｐＨで研究した。１−オクタノール／水分配係数（ｌｏｇ  Ｐ）を、従来の振盪フラスコ手順を使用して評価した。実験は、０．１Ｍのリン酸緩衝液によってｐＨ８で緩衝化した０．１ｍＭの胆汁酸塩溶液で行い、ＢＡの完全なイオン化を確実にした。ｌｏｇ  Ｐ値は、プロトン化種ではなくイオン化形態のＢＡを意味し、各ＢＡの最初の濃度は、それ自体のＣＭＣ値より低かった。水性緩衝液は事前に１−オクタノールで事前飽和させ、水で事前飽和させた５ｍｌの１−オクタノールを次いで加え、試料を連続撹拌しながら室温で２週間平衡化させた。遠心分離後、２つの相を注意深く分離した。水相中のＢＡ濃度は、Ｃ１８カラム（１５０ｍｍ×２ｍｍ、皮内、４μｍ）および、移動相として、１５ｍＭの酢酸（ｐＨ５）およびアセトニトリルを含有する水を使用して、ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳで測定した。流量は１５０μａｌ／分であり、カラムを４５℃に維持した。質量分析取得は、負のイオン化のＥＳＩ源を使用して多段反応モニタリングモードで行った。
【０２６５】
３α位、７α位および１２α位において３個のヒドロキシル基を有するカルボキシル化された化合物Ｉｈ３ｅは、６位におけるエチルおよび２３位におけるメチルの存在の結果として、天然類似体ＣＡ（１．４対１．１）に対して僅かにより高い親油性を示す。
【０２６６】
アルブミン結合
アルブミン結合の程度を、固定したＢＡ−アルブミン比で平衡透析によって評価した。ＢＡを１００μＭの濃度で５％ウシ血清アルブミン−食塩溶液（ｐＨ７．２）に溶解させ、２５℃で２４時間静置した。２ミリリットルのこの溶液を、２５ｍｌの食塩溶液に対して１２〜１４，０００の分画分子量を有するセルロースサック中で透析した。２５℃にて７２時間の穏やかな機械的撹拌によって系を平衡化させた。透析した溶液（遊離の非結合画分に相当する）および開始溶液のＢＡ濃度を、前の分析と同じ条件でＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって決定した。
【０２６７】
アルブミン結合のパーセントを、当初のＢＡ濃度からおよび透析した画分中の非結合濃度から計算した。データを、表４に報告する。
【０２６８】
化合物Ｉｈ３ｅのアルブミン結合割合は、ＣＡより僅かに高く、これは２３メチルおよび６エチル基の存在に由来する。
【０２６９】
（実施例１１）
ヒト糞便培養物中のインビトロの代謝安定性
腸内細菌に対する安定性
（実施例１１ａ）
７ａ−脱ヒドロキシル化
ホモジナイズした新鮮なヒト糞便（５００ｍｇ）を、無菌バイアルに移し、それに５ｍＬの殺菌した肉の細切れ−グルコース培地（Ｓｃｏｔｔ  Ｌａｂ．、Ｆｉｓｋｖｉｌｌｅ、ＲＩ）を加えた。次いで、ＢＡを０．０５ｍＭの最終濃度で加えた。バイアルを３７℃でインキュベートし、次いでＢＡの添加の０時間後、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後および２４時間後に、１５０μＬの３０％ＫＯＨによって反応を停止させた。試料を、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清から、ＢＡをＣ−１８固相抽出によって単離し、ＴＬＣおよびＨＰＬＣ−ＥＳ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。
【０２７０】
シリカゲルの０．２５ｍｍ厚さのプレート（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用した薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、第１のスクリーニング試験として用いた。抱合ＢＡの分離のために使用した溶媒系は、プロピオン酸／酢酸イソアミル／水／Ｎ−プロパノール（３：４：１：２、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ；溶媒Ｉ）からなり、非抱合ＢＡの溶媒系は、酢酸／四塩化炭素／イソプロピルエーテル／酢酸イソアミル／水／Ｎ−プロパノール／ベンゼン（１：４：６：８：２：２、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ；溶媒ＩＩ）であった。分離したＢＡが、５％ホスホモリブデン酸エタノール溶液と共に示された。
【０２７１】
化合物Ｉｈ３ｅは、ヒト糞便培養物中でインキュベートされたときに非常に安定的であり、２４時間後でさえ、化合物の８５％超は無修飾で回収された。これに反して、参照天然類似体であるＣＤＣＡはほぼ１時間の半減期時間を示し、８時間のインキュベーション後に、殆ど完全に代謝（７−脱ヒドロキシル化）され、リトコール酸を形成した。
【０２７２】
Ｉｈ３ｅについて長時間のインキュベーション後、７−オキソ誘導体の７−脱ヒドロキシル化および中間体形成は実際に消失した。
【０２７３】
（実施例１１ｂ）
腸内細菌はタウリンおよびグリシン抱合ＢＡのＣ２４アミド結合を加水分解し、ＣＡの７α−ヒドロキシル基を除去し、デオキシコール酸（ＤＣＡ）などの毒性のある親油性二次ＢＡの形成をもたらすことが公知である（Ｒｉｄｌｏｎ，  Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．、２００６年、４７号、２４１〜２５９頁）。腸管内菌叢が媒介する７−脱ヒドロキシル化に対する化合物Ｉｈ３ｅの感受性を決定するために、その代謝安定性を、Ｒｏｄａ，  Ａ．ら、Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．、１９９４年、３５号、２２６８〜２２７９頁に記載されているようにヒト糞便ブロス培養物において評価した。化合物Ｉｈ３ｅは、この過程に対して感受性でないようであり、非常に安定的であることが示され、化合物の９５％超は１２時間のインキュベーション後無修飾であった。比較すると、１時間後にＣＡ（コール酸）の５０％超が、および８時間以内に９０％までが代謝された（図１５）。化合物Ｉｈ３ｅの増大された安定性は、細菌の７α−脱ヒドロキシル化過程に立体障害を与えるＣ６位のアルキル化と関連していると思われる。
【０２７４】
側鎖の安定性
これらの結果によると、化合物Ｉｈ３ｅの側鎖は、腸内細菌酵素活性によって修飾されなかった。
【０２７５】
これらのデータは、Ｃ−６位におけるエチル基の存在が、立体障害によって、酸化または除去に対して７−ヒドロキシル基を保護していることを示唆する。付加化合物において、Ｉｈ３ｅは、また側鎖代謝について非常に安定的である。微量な代謝物は、ＨＰＬＣ−ＥＳ−ＭＳ／ＭＳによって見出されなかった。これらのデータは、嫌気性細菌の存在下にて下部消化管内容物中で、これらの類似体が安定的であることを示唆する。
【０２７６】
（実施例１２）
胆汁瘻ラットにおける十二指腸（皮内）および大腿部（静脈内）投与後の化合物Ｉｈ３ｅの胆汁分泌および代謝
（実施例１２Ａ）
目的および原理
胆汁酸の構造的修飾は、それらの肝臓取込み、肝臓の輸送および分泌および腸管吸収に影響する可能性がある。したがって、静脈内および皮内投与の両方の後の胆汁分泌に関する知識は、それらの代謝に関する知識と共に、さらなる研究のための化合物選択における要点である。
【０２７７】
化合物Ｉｈ３ｅの腸管吸収の機序および効率性を評価するために、化合物を、同じ用量で静脈内（大腿部注入）および経口的（十二指腸注入）の両方で投与し、その胆汁分泌速度を胆汁瘻ラットモデルにおいて評価した。
【０２７８】
静脈内および皮内投与の間の時間に対する胆汁分泌の曲線下面積における差異は、その腸管吸収を説明し、そのバイオアベイラビリティーについての情報を与える。さらに、肝臓および腸の代謝はまた非常に異なる可能性があり、したがって、化合物Ｉｈ３ｅおよびその主要な肝代謝物の胆汁分泌を決定した。
【０２７９】
胆汁分泌作用
−十二指腸注入
胆汁瘻ラットモデルは、ボローニャ大学実験室施設で発育した。化合物Ｉｈ３ｅを、ラット群に十二指腸注入（皮内）によって１μｍｏｌ／ｋｇ／分の用量で投与した（１時間の注入）。ラットは、注入の前、間、および後に異なる時間で胆汁試料を集める胆汁瘻を有した。十二指腸注入実験のために、６匹のラット（２５０±１０ｇ）を処理した。胆汁試料を１５分毎に４時間集めた。さらに、３匹の対照ラットを、時間およびサンプリングについて同じ条件下にて食塩溶液で処理した（十二指腸対照ラット）。
【０２８０】
化合物Ｉｈ３ｅの十二指腸注入は、胆汁流量を有意に増加させ、約１２０μＬ／分／ｋｇの最大値に達した。この現象は注入期間の間に開始し、少なくとも３時間続いた。
【０２８１】
化合物Ｉｈ３ｅは、強力な胆汁分泌作用を示し、この胆汁分泌作用はその構造に関連すると考えられている。Ｃ−２３位におけるメチル基は、抱合を部分的に防止し、この分子は、胆嚢肝シャント経路を経ることができる。比較のために、ＣＤＣＡの十二指腸注入は、胆汁流を僅かに増加させ、８０μＬ／分／ｋｇを超えなかった。
【０２８２】
−静脈内注入
大腿部注入実験のために、６匹のラットを処理した。図１２は、研究の間の胆汁流を示す。大腿部注入は、７５分の定常状態の後に開始し、６０分間続けた。胆汁試料を１５分毎に４時間集めた。さらに、時間およびサンプリングについて同じ条件下で３匹のラットを３％ＢＳＡ食塩溶液で処理した（大腿部対照ラット）。３％ＢＳＡ食塩水ビヒクル（対照、ｎ＝１）の静脈への注入の間の胆汁流は、実験の全期間に４０〜８０μＬ／分／ｋｇの範囲の値を維持した。
【０２８３】
化合物Ｉｈ３ｅの静脈への注入は、胆汁流量を有意に増加させ、この現象は、注入期間の開始１５分後に始まり、少なくとも２時間続いた。胆汁分泌作用は、皮内注入実験において達成されたものと殆ど同様であった。
【０２８４】
胆汁分泌
静脈内および皮内実験の間に集めた胆汁試料を分析し、化合物Ｉｈ３ｅおよびその代謝物の胆汁分泌を決定した。
【０２８５】
ＨＰＬＣ−ＥＳ−ＭＳ／ＭＳ分析
化合物Ｉｈ３ｅの純粋な結晶性粉末は、ペルージャのＲ．Ｐｅｌｌｉｃｃｉａｒｉの試験施設から入手した。メタノール中のストック溶液（１ｍｍｏｌ／Ｌ）を調製し、処理用溶液は、適当な容量の一次溶液を希釈することによって調製した。メタノールおよびアセトニトリル（ａｃｅｔｒｏｎｉｔｒｉｌｅ）は、ＨＰＬＣグレードの純度のものであった。アンモニアは３０％、酢酸は９９．８％であった。全ての試薬は、Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ  Ｒｅａｇｅｎｔｓから入手した。ＨＰＬＣグレードの水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステムによって調製した。
【０２８６】
試料の調製
ラット胆汁試料を室温にし、短時間撹拌し、１５ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝５．０）：アセトニトリル＝７０：３０（ｖ／ｖ）で１：１００ｖ／ｖ（十二指腸注入からの胆汁試料）および１：１００または１：２００ｖ／ｖ（大腿部注入からの胆汁試料）に希釈した。最終溶液をオートサンプラーバイアル中に移し、１０μＬをクロマトグラフィーカラム中に注入した。
【０２８７】
ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ法
ラット胆汁試料は、負のイオン化モードのエレクトロスプレー（ＥＳＩ）源を使用して、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって分析した。液体クロマトグラフィーのために、オートサンプラーと連結したＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５分離モジュールを使用した。オートサンプラーを７℃に維持した。ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ  ＯＤＳ、４×２．０ｍｍ、皮内、プレカラムによって保護されているＳｙｎｅｒｇｉ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ  Ｃ１８カラム（１５０×２．０ｍｍ、皮内、４μｍの粒径）（両方ともＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘから供給されている）上で分離を行った。１５ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝５．００）を移動相Ａとして、アセトニトリルを移動相Ｂとして使用して、分析物を溶出させた。移動相Ｂを３０％から６４％に１０分で増加させ、次いで１０分で１００％にし、１０分間一定に保った。流量は１５０μＬ／分であり、カラムは４５℃に維持した。カラム流出液を、多段反応モニタリング（ＭＲＭ）取得モードで作動するトリプル四重極質量分析計（Ｑｕａｔｔｒｏ−ＬＣ、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）に連結しているＥＳＩ源に導入した。窒素を、１００Ｌ／時間の流量でネブライザーガスとして、および９３０Ｌ／時間で脱溶媒和ガスとして使用した。イオン源遮断および脱溶媒和温度を、各々８０℃および１８０℃に設定した。キャピラリー電圧は３．０ｋＶであった。ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアバージョン４．０を、データ収集および処理のために使用した。さらに、シングルＭＳまたはタンデムＭＳ／ＭＳ配置の両方における質量分析法を使用して実験を行い、代謝物を同定した。
【０２８８】
定量化
５点検量線を毎日調製し、２連で注入した。較正試料は、移動相中で調製する０．１〜２０μｍｏｌ／Ｌの濃度範囲内で得た。線形検量線パラメーターは、最小二乗回帰分析を使用して、分析物ピーク面積対分析物濃度のプロットから得た（重量＝１／ｘ２）。相関係数は、≧０．９８１であった。
【０２８９】
化合物Ｉｈ３ｅのタウリン抱合代謝物をまた推定した。遊離およびタウリン抱合種の間のＥＳ−ＭＳ／ＭＳにおける異なる反応を考慮して、補正因子を推定し、ＨＰＬＣ−ＭＲＭデータセットクロマトグラムから得た面積値に適用した。最終的に、遊離胆汁酸について得た検量線を使用して、タウリン抱合代謝物を推定した。
【０２９０】
投与された類似体の薬物動態（胆汁分泌）：静脈内対皮内の比較
データは、１μｍｏｌ／Ｋｇ／分の用量での十二指腸のおよび大腿部注入の後に、胆汁中にそれ自体として回収された化合物の分泌速度を意味する。
【０２９１】
表５は、十二指腸注入（１時間、７５分〜１３５分の範囲）の間に集めたラット胆汁試料から得た化合物Ｉｈ３ｅについての濃度および分泌値を示す。
【０２９２】
【表５】
0005535233.tif 000061
表６は、大腿部注入（１時間、７５分〜１３５分の範囲）の間に集めたラット胆汁試料から得た濃度および分泌値を示す。
【０２９３】
【表６】
0005535233.tif 000062
ａ−：計算せず
【０２９４】
【表６Ａ】
0005535233.tif 000063
【０２９５】
【表６Ｂ】
0005535233.tif 000064
静脈内投与後の化合物Ｉｈ３ｅの胆汁分泌は効率的であり、化合物は相対的に高い割合で胆汁中に回収された。動力学的プロファイルによって、化合物が肝臓によって効率的に取り込まれ、部分的にそれ自体として胆汁中に分泌され、またより少ない程度でより極性の化合物に代謝されたことが示された（図１３、１４ａおよび１４ｂ）。任意の特定な理論に束縛されるものではないが、Ｃ−２３位におけるメチル基の存在は、タウリンおよびグリシンとの抱合過程を妨げると考えられており、これは、殆ど全ての天然のカルボキシル化されたＢＡの効率的な分泌に部分的に関連する。これは、ジヒドロキシＢＡ、およびより少ない程度でトリヒドロキシＢＡについて必要である。胆汁中のその回収の程度はまた、投与した用量に関連する。皮内投与後、胆汁中の回収は、静脈内投与後の回収より僅かに低かった。これは、化合物は腸に効率的に吸収されないことを示唆する（図１３、１４ｃおよび１４ｄ）。物理化学的特性を考慮すれば、本発明者らは、この化合物は受動拡散機序（ＬｏｇＰ＝１．４４）によって吸収されることを予想したが、能動的機序は関与していなかったようであった。３個のヒドロキシル基の存在は、分子が一方で、肝臓によって効率的に取り込まれ、部分的に胆汁中に分泌されることを可能にする。３個のヒドロキシル基の存在はまた、分子が腸によって吸収されることを妨げる。
【０２９６】
（実施例１２Ｂ）
下記に示す表における結果は、化合物Ｉｈ３ｅが強力な胆汁分泌作用を有することを明らかにし、最大胆汁分泌速度（ＳＶ０）は、ＣＤＣＡおよびＣＡの最大胆汁分泌速度より有意に高い。
【表Ａ】
0005535233.tif 000065
【０２９７】
αデータは、６つの独立した実験の平均値および標準偏差を表す。皮内投与のために使用したビヒクルは、食塩溶液であった。静脈内投与のために使用したビヒクルは、３％ＢＳＡ食塩溶液（ｐＨ７．２）であった。ＳＶ０：最大胆汁分泌速度（（μＬ／分）／ｋｇ体重）。ＳＢＡ：最大ＢＡ分泌速度（（μｍｏｌ／分）／ｋｇ体重）。％遊離：それ自体としての分子の、胆汁中に回収された投与した用量の割合。％抱合型：抱合ＢＡとして回収された投与した用量の割合。
【０２９８】
したがって、上記の表における結果は、化合物Ｉｈ３ｅが抱合に耐性であり、静脈内または十二指腸内注入の後で、化合物の９０％超がその非抱合形態で胆汁中に分泌されることを示す。対照的に、ＣＤＣＡおよびＣＡは、胆汁中にそれ自体として分泌され得ず、抱合ステップを必要とする。したがって、化合物Ｉｈ３ｅのＣ２３（Ｓ）メチル基は、カルボキシルＣｏＡ活性化およびそれに続く抱合を防止し、それによって小管吸収および強力な胆汁分泌作用を有するその胆嚢肝シャント経路に有利であることが予想される。
【０２９９】
化合物の側鎖アミド化および胆汁分泌作用に対するＣ２３メチル基の配置の影響をさらに研究するために、他のエピマー、すなわち、６α−エチル−２３（Ｒ）−メチルコール酸（上記の表においてＲ−ＥＭＣＡ）について同様の分析がまた行われた。最大胆汁分泌速度（ＳＶ０）の検査は、Ｒ−ＥＭＣＡの胆汁分泌作用が、化合物Ｉｈ３ｅよりも低いが、ＣＡよりさらに高いことを示す。その結果、これらのデータは、Ｃ−２３メチル基の配向がカルボキシル基の抱合のために重要であり、Ｃ２３（Ｓ）エピマーの場合、メチル部分は、抱合酵素の触媒ポケット中への適合が不十分であることを示唆する。全体で、これらの結果は、相対的に少ない肝臓での抱合にも関わらず、化合物Ｉｈ３ｅが効率的に吸収され、腸肝循環を経ることを示す。低率の抱合はまた、化合物Ｉｈ３ｅが肝臓の初回通過クリアランスを回避し、全身的血液循環に達することを可能にし得る。
【０３００】
肝代謝
事前のスクリーニングのために、期待される化合物に基づいて、従前の実験およびデータ、ならびに化合物Ｉｈ３ｅの構造および物理化学的特性に従って、可能性がある代謝物の探索を行った。
【０３０１】
化合物Ｉｈ３ｅは、親化合物（無修飾）として主として分泌され、肝臓によって僅かにのみ代謝された。主要な代謝物はタウリン抱合体であり、モノグルクロニドが少量で存在した。代謝は、静脈内および皮内投与の両方について同様である。胆汁中の回収を考慮して、本発明者らは、他の代謝物を同定することを期待した。Ｃ−２３位におけるメチル基の存在は、殆ど全ての天然のカルボキシル化されたＢＡの効率的な分泌のために部分的に必要な、タウリンおよびグリシンとの抱合過程を妨げる。これは、ジヒドロキシＢＡ、およびより少ない程度でトリヒドロキシＢＡにとって、それらが既に非常に極性であるため、必要である。グルクロニドの形成は、より高い用量で投与される場合、関連し得る。
【０３０２】
図１４ａは、静脈内実験における質量分析法を使用した胆汁中で同定された化合物Ｉｈ３ｅおよびその主要な代謝物を示す。データは絶対面積値として報告する（ｎ＝５）。図１４ｂは、図１４ａの拡大表示である。図１４ｃは、実験における質量分析法を使用した胆汁中で同定された化合物Ｉｈ３ｅおよびその主要な代謝物を示す。データは絶対面積値として報告する。図１４ｄは、図１４ｃの拡大表示である。
【０３０３】
要約すれば、化合物Ｉｈ３ｅは、中程度に親水性であり、穏やかな界面活性を有する。その肝臓取込みは、効率的なようである。胆汁分泌はまた、化合物が主として無修飾で分泌され、限定される程度でタウリンと抱合して分泌されることを考えると効率的である。腸管吸収もまた完全ではないにしても効率的であり、分子は胆汁中に分泌されるのに、投与した用量で広範な肝代謝を必要としない。Ｃ−２３位におけるメチル基の存在は、胆汁分泌のためのタウリンとの広範な抱合を防止する。したがって、その強力な胆汁分泌作用に関与している胆嚢肝シャント経路を経る分子の肝臓共鳴時間が増加する。
【０３０４】
（実施例１３）
ＨｅｐＧ２細胞に対するインビトロの毒性
本発明の化合物を、ＨｅｐＧ２細胞アッセイを使用してインビトロの毒性について評価した。ＡＴＰ減少をモニターすることによってＨｅｐＧ２細胞の細胞毒性を決定し、カスパーゼ−３活性化をモニターすることによってＨｅｐＧ２細胞アポトーシスを決定した。結果を表７に示す。
【０３０５】
細胞毒性
細胞生存率を、Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ  ＡＴＰ−Ｌｉｔｅ１ＳＴＥＰを使用して測定した。ＡＴＰは、全ての代謝的に活性な細胞において存在し、細胞が壊死またはアポトーシスを起こすときに非常に急速に濃度が減少するため、細胞生存率についてのマーカーである。ＨｅｐＧ２細胞（１×１０４）を９６ウェルプレートに播種し、１ｎＭ〜３００μＭの化合物Ｉｈ３ｅを１０倍希釈で３７℃にて４時間刺激した。プレートを室温で１０分間平衡化させ、１００μｌのＡＴＰ−Ｌｉｔｅ１ＳＴＥＰ試薬を、細胞を含有する１００μｌの培地に加えた。発光を、Ｖｉｃｔｏｒ  Ｌｉｇｈｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｅｍｒ）で読み取った。実験シグナルを、バックグラウンドから差し引いた。タモキシフェンを細胞毒性の陽性対照として使用し、一方陰性対照は非処理細胞であった。
【０３０６】
アポトーシス
カスパーゼは、アポトーシスの分子制御に関与し、ＴｒｕＰｏｉｎｔカスパーゼ−３基質は、カスパーゼ−３活性の感受性で強固で均一な時間分解蛍光アッセイを可能にする。ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）を、ピルビン酸ナトリウムを有さないＨｅｐＧ２培地と共に９６ウェルプレートに播種した（１×１０４）。１ｎＭ〜３００μＭの試験化合物Ｉｈ３ｅの段階希釈によって、３連で細胞を３７℃で４時間刺激した。スタウロスポリンを、アポトーシス細胞の陽性対照として使用した。陰性対照は、１．無刺激細胞；２．細胞を含まない培地単独；３．カスパーゼ基質を有さずにインキュベートした細胞であった。溶解緩衝液およびカスパーゼ−３基質を細胞に加え、１時間および２４時間後、ＥｎＶｉｓｉｏｎで蛍光を測定した。
【０３０７】
壊死
ＰｒｏｍｅｇａのＣｙｔｏＴｏｘ  ＯＮＥ均質膜完全性アッセイを使用して壊死細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌａｃｔａｔｏ  ＤｅＨｙｄｒｏｘｅｇｅｎａｓｅ）（ＬＤＨ）の放出を測定することによって、細胞壊死を分析した。ＨｅｐＧ２細胞（１×１０４）を９６ウェルプレート中に播種した。１８時間のインキュベーション後、ピルビン酸ナトリウムを有さない新鮮な培地および無血清を置き換え、化合物Ｉｈ３ｅを０．１μＭ〜５００μＭの用量反応で加えた。Ｔｒｉｔｏｎ（１％）を、最大ＬＤＨ放出対照として使用した。タモキシフェンを、壊死誘導物質として使用した。蒔いた細胞を、インキュベーター中にさらに４時間戻した。上清を新しいプレートに移し、同じ用量のＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ試薬をプレートに加えた。１時間のインキュベーション後、蛍光をＥｎＶｉｓｉｏｎ多標識プレートリーダーによって５６０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長で読み取った。
【０３０８】
【表７】
0005535233.tif 000066
（実施例１４）
ＮＲ選択性アッセイ
本発明の化合物の選択性を、当技術分野において公知のアッセイ方法を使用して評価した。具体的には、下記のアッセイ法を使用した。
ＦＸＲおよびＬＸＲ：コアクチベーターのリクルート作用（ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）
ＴＧＲ５：ヒト腸細胞系（ＮＣＩ−Ｈ７１６）上のｃＡＭＰレベル
ＰＸＲ：リガンド競合アッセイ（結合アッセイ）
ＣＡＲ：コアクチベーターのリクルート作用（Ｌａｎｔｈａｓｃｒｅｅｎ）
表８は、これらのアッセイの結果を示す。
【０３０９】
ＴＲ−ＦＲＥＴコアクチベーターアッセイ
Ｌａｎｔｈａｓｃｒｅｅｎアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、核内受容体選択性アッセイのために使用した。キットは、テルビウム標識抗ＧＳＴ抗体、フルオレセイン標識コアクチベーターペプチド、および均一なミックス−アンド−リードアッセイフォーマット中のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）によってタグを付けられたＮＲリガンド結合ドメインを使用する。アッセイは、３８４マイクロウェルプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）中で行った。２０μｌの総アッセイ反応物には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって供給されたアッセイ緩衝液中の５ｎＭのＧＳＴ標識したＮＲ、１２５ｎＭのコレギュレーターペプチド、５ｎＭのＴＢ−抗ＧＳＴ標識した抗体（テルビウム−抗グルタチオンＳトランスフェラーゼ標識）、５ｍＭのＤＴＴおよび様々な濃度の化合物Ｉｈ３ｅが含まれた。陰性対照は化合物Ｉｈ３ｅを欠いていたが、アゴニストウェル中に含有されるその他の全てを含有した。暗中での１時間のインキュベーションに続いて、ＴＲ−ＦＲＥＴ測定をＥｎｖｉｓｉｏｎ中で行った。放出率５２０／４９５を、様々なリガンド濃度に対してプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用し、可変の勾配を有するＳ字状曲線式を使用してデータを分析し、ＥＣ５０値を得た。
【０３１０】
【表８】
0005535233.tif 000067
（実施例１５）
化合物の安定性
化合物Ｉｈ３ｅの安定性を、当技術分野において公知の方法を使用して決定した。細胞画分濃度は、０〜１５〜３０〜６０〜１２０〜２４０〜３６０〜１４４０分の時間経過に亘り１ｍｇ／ｍｌであった。陽性対照は、０〜１０〜２０〜４０〜６０〜１２０の時間経過に亘りテストステロン（１０００ｎｇ／ｍｌ）；７−ヒドロキシクマリン（１２９６ｎｇ／ｍｌ）；安息香酸（２４４０ｎｇ／ｍｌ）であった。使用した分析法は、勾配極性によるＣ１８カラム上のＬＣ／ＭＳ分離であった。取得は、単一のイオンモニタリングで行った。結果を表９において下記に示す。
【０３１１】
【表９】
0005535233.tif 000068
（実施例１６）
エキソビボでのＧＬＰ−１の放出
図１６は、化合物Ｉｈ３ｅが、ＧＬＰ−１の放出を劇的に用量依存的にエキソビボで誘発することを示す。図１６は、１８週齢のＨＦ摂食ＴＧＲ５−Ｔｇ雄性マウスから単離した回腸移植片におけるエキソビボでのＧＬＰ−１放出に対する、示した濃度の化合物Ｉｈ３ｅへの１時間の曝露の影響を示す（ｎ＝４）。データは平均±ＳＥとして表す。独立スチューデントｔ検定、（＊）Ｐ＜０．０５、化合物Ｉｈ３ｅ処理回腸移植片対ビヒクル処理。
【０３１２】
下記の実験手順を、実施例１７〜２１において利用する。
【０３１３】
化学物質および試薬
全ての生化学試薬は、示されない場合は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＤＰＰ４阻害剤（ＤＰＰ４ｉ）であるシタグリプチンは、Ｃ．Ｕｌｌｍｅｒ博士（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）からの親切な寄贈であった。化合物Ｉｈ３ｅは、以前に記載された通りに合成した（Ｍａｃｃｈｉａｒｕｌｏら、２００８年；Ｐｅｌｌｉｃｃｉａｒｉら、２００７年）。
【０３１４】
細胞培養
インビトロ実験を、ビヒクル（ＤＭＳＯ）または化合物Ｉｈ３ｅで処理したＳＴＣ−１またはＮＣＩ−Ｈ７１６細胞において行った。化合物Ｉｈ３ｅを、以前に記載されているようにＴＧＲ５に対するそのアゴニスト活性について評価した（Ｍａｃｃｈｉａｒｕｌｏら、２００８年、Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｆ．  Ｍｏｄｅｌ．、４８号、１７９２頁；Ｐｅｌｌｉｃｃｉａｒｉら、２００７年、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．、５０号、４２６５〜４２６８頁）。ｃＡＭＰ生成を、記載されているように行った（Ｓａｔｏら、２００８年、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．、５１号、１８３１頁；Ｗａｔａｎａｂｅら、２００６年、Ｎａｔｕｒｅ、４３９号、４８４頁）。５５０ｎｍでの完全還元型チトクロムｃ（Ｓｉｇｍａ）の酸化によって、Ｃｏｘ活性を評価した（Ｆｅｉｇｅら、２００８ｂ、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．、８号、３４７頁）。ＡＴＰ／ＡＤＰ比およびＧＬＰ−１放出を、メーカーの指示（各々、ＢｉｏｖｉｓｉｏｎおよびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）に従って測定した。初代培養褐色脂肪細胞を、以前に記載されているように調製し（Ｗａｔａｎａｂｅら、２００６年、Ｎａｔｕｒｅ、４３９号、４８４頁）、回腸移植片を、確立した方法に従って調製した（Ｃｉｍａら、２００４年、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、２００号、１６３５〜１６４６頁）。
【０３１５】
細胞内カルシウム定量化
ＮＣＩ−Ｈ７１６（４０，０００細胞）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングした黒色９６ウェルプレートに播種した。トランスフェクションの７２時間後に、細胞をアッセイ緩衝液（ＨＢＳＳ１ｘ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］）中で２度洗浄し、メーカーのプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってＦｌｕｏ−４ＡＭで細胞内カルシウムについてアッセイした。
【０３１６】
生化学および組織化学
血漿パラメーターならびに肝臓および糞便の脂質含量を、記載されているように測定した（Ｍａｔａｋｉら、２００７年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、２７号、８３３０〜８３３９頁）。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、シリウスレッド、およびオイルレッドＯ染色を、記載されているように行い（Ｍａｒｋら、２００７年、Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、第２９章、ユニット２９Ｂ、２４頁）、顕微鏡写真はＣＣＤカメラを備えた広視野顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で取った。膵臓の切片について、膵島は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して１５０μＭの間隔がある４つのＨＥ染色した代替の切片からサイズ計測および計数した（１群毎に５匹の動物）。インスリンの免疫蛍光染色は、記載されているように行った（Ｆａｊａｓら、２００４年、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、１１３号、１２８８頁）。さらに、膵島を、オンラインで入手可能な手順（例えば、ＪＯＶＥ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓのウェブサイト）を参照されたい）に従って、ＨＦ摂食ＴＧＲ５−Ｔｇマウスからの膵臓のコラゲナーゼ消化によって単離した。−２０℃にて酸エタノール中でのＯ／Ｎインキュベーション後にインスリンを抽出し、メーカーの指示（Ｍｅｒｃｏｄｉａ）に従ってＰＢＳ−希釈試料上のＥＬＩＳＡによって測定した。ＧＬＰ−１放出を、当技術分野において公知の方法によってインビトロ、エキソビボ、およびインビボで測定した。
【０３１７】
酸素消費の測定
細胞の酸素消費を、条件毎に１０の生物学的複製を用いてＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＸＦ２４分析器を使用して測定した（Ｆｅｉｇｅら、２００８ｂ、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．、８号、３４７頁）。
【０３１８】
動物実験
標準化された手順によって動物を収容し、飼育した（ＡｒｇｍａｎｎおよびＡｕｗｅｒｘ、２００６ｂ）。同齢の雄性マウスを、全ての実験に使用した。遺伝子改変マウスモデル（ＧＥＭＭ）、すなわち、ＴＧＲ５−ＴｇおよびＴＧＲ５−／−マウスを、補足データに記載されているように生じさせた。ＧＥＭＭまたはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）におけるＤＩＯは、テキストおよび図の説明文に記載されているように、８週齢マウスにＨＦ食（６０％ｃａｌ／脂肪、Ｄ１２４９２；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ）を少なくとも８週間摂取させることによって誘発させた。食事介入実験において、化合物Ｉｈ３ｅを、３０ｍｇ／ｋｇ／日のインビボ用量に達するのに十分な用量で食事と混合した（Ｆｅｉｇｅら、２００８ａ、Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、第２９章、ユニット２９Ｂ、２５頁）。マウス表現型実験を、ＥＭＰＲＥＳＳプロトコル（例えば、Ｅｍｐｒｅｓｓ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｓｅｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）のウェブサイトを参照されたい）に従って行い、食物および水摂取、体組成（Ａｒｇｍａｎｎら、２００６ａ、Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、第２９章、ユニット２９Ａ、２３頁）、エネルギー支出（Ａｒｇｍａｎｎら、２００６ａ、Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、第２９章、ユニット２９Ａ、２３頁）、グルコースおよび脂質恒常性（Ａｒｇｍａｎｎら、２００６ｂ、Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、第２９章、ユニット２９Ａ、２２頁）；Ｈｅｉｋｋｉｎｅｎら、２００７年、Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｍｏｌ．、第２９章、ユニット２９Ｂ、２３頁；Ｍａｔａｋｉら、２００７年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２７号、８３３０頁）、ならびに血漿生化学（ＡｒｇｍａｎｎおよびＡｕｗｅｒｘ、２００６ａ、Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、第２９章、ユニット２９Ａ、２２頁）を評価することを目的とした。組織および血液を集め、標準化された手順に従って、病理組織診断、血液化学、および遺伝子発現について処理した（ＡｒｇｍａｎｎおよびＡｕｗｅｒｘ、２００６ａ；Ｆｅｉｇｅら、２００８ｂ；Ｍａｒｋら、２００７年；Ｗａｔａｎａｂｅら、２００６年）。高インスリン正常血糖クランプ研究を、最初のインスリンの急速投与（３０ｍＵ／ｋｇ）およびインスリン注入量（１０ｍＵ／分／ｋｇ）の変化を含めて軽微な修正を伴って、記載されているように行った（Ｆｅｉｇｅら、２００８ｂ）。血漿ＧＬＰ−１レベルは、後眼窩穿刺によって集めた血液に対してＥＬＩＳＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって測定した。ｄｂ／ｄｂマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）による実験を、化合物Ｉｈ３ｅを有する（３０ｍｇ／ｋｇ／日）または有さないＣＤを６週間摂食した１４週齢の動物において行った（Ｆｅｉｇｅら、２００８ａ）。
【０３１９】
遺伝子発現プロファイリング
遺伝子発現プロファイリングは、リアルタイム定量的ＰＣＲによって行った（Ｆｅｉｇｅら、２００８ｂ；Ｗａｔａｎａｂｅら、２００６年）。使用したプライマー配列は、Ｋｉｒ６．２遺伝子のために使用されたものを除いて以前から公表されてきた。Ｒ−５’ＡＧＡＴＧＣＴＡＡＡＣＴＴＧＧＧＣＴＴＧ（配列番号１）、Ｆ−５’ＴＡＡＡＧＴＧＣＣＣＡＣＡＣＣＡＣＴＣ（配列番号２）。
【０３２０】
統計
独立スチューデントｔ検定を使用することによって、統計分析を行った。データは平均±ＳＥＭとして表し、０．０５より小さなＰ値は統計的に有意であるとみなした。
【０３２１】
（実施例１７）
ＴＧＲ５ｍＲＮＡ発現
ＢＡとエネルギー支出との間のインビボでの関連（Ｗａｔａｎａｂｅら、２００６年、Ｎａｔｕｒｅ、４３９号、４８４〜４８９頁）は従前に確立されてきた。したがって、ＴＧＲ５シグナル伝達の活性化は、より一般的な様式でミトコンドリア活性に影響し得ることが推測された。この仮説に対する最初の支持を見出すために、テネシー大学、ＧｅｎｅＮｅｔｗｏｒｋのウェブサイトで見出されるような、ＢｘＤ遺伝子参照集団におけるＧｅｎｅＮｅｔｗｏｒｋ肝臓ｍＲＮＡデータベースによってＴＧＲ５ｍＲＮＡ発現を分析した。ＴＧＲ５ｍＲＮＡ発現における広範囲のバリエーションは、異なるＢｘＤマウス系統の間で明らかであった。興味深いことに、ＴＧＲ５ｍＲＮＡ発現は、チトクロムｃオキシダーゼ（Ｃｏｘ）（例えば、ＣｏｘＶＩ１ａ；図１７Ａ）およびＡＴＰシンターゼ（Ａｔｐ６ｖ０ｂ、ＡＴＰアーゼＨ＋輸送Ｖ０サブユニットＢ；Ａｔｐａｆ２、ＡＴＰシンターゼミトコンドリアＦ１複合体構造因子２；Ａｔｐ１  ａ３、ＡＴＰアーゼＮａ＋／Ｋ＋輸送アルファ３ポリペプチド；Ａｔｐ６ｖ１  ｂ２、ＡＴＰアーゼＨ＋輸送Ｖ１サブユニットＢアイソフォーム２）などの、酸化的リン酸化に関与している複合体のサブユニットをコードするいくつかの遺伝子の発現と非常に有意に相関した。この観察と一致して、化合物Ｉｈ３ｅによるＳＴＣ−１細胞の処理は、Ｃｏｘ活性におけるｃＡＭＰ依存性増加をもたらし（図１７Ｂ）、これは細胞の酸素消費の増加（図１７Ｃ）およびＡＴＰ／ＡＤＰ比の上昇（図１７Ｄ）と関連した。この結果は、ヒト腸内分泌細胞系ＮＣＩ−Ｈ７１６において確認され、化合物Ｉｈ３ｅ処理は、ｃＡＭＰ依存性態様でＡＴＰ生成を増加させた。興味深いことに、ＴＧＲ５の発現はまた、ＡＴＰ依存性カリウムチャネル（ＫＡＴＰ）の成分であるＫｉｒ６．２の発現と強く相関した（図１７Ｅ）。これらの相関は、ＣｏｘＩＶおよびＫｉｒ６．２ｍＲＮＡの発現の同時低下をもたらした、ＳＴＣ−１細胞におけるＴＧＲ５ＲＮＡ干渉によってさらに実証された（図１７Ｆ）。
【０３２２】
（実施例１８）
ＴＧＲ５シグナル伝達経路の活性化は、細胞内カルシウムレベルを増加させ、腸内分泌Ｌ細胞内ＧＬＰ−１放出を刺激する
膵臓β細胞において、グルコース代謝に由来するＡＴＰ／ＡＤＰ比の増加はＫＡＴＰチャネルを閉鎖し、形質膜の脱分極をもたらすことが確立されている。この膜脱分極は、カルシウム依存性電圧チャネル（Ｃａｖ）を開放し、カルシウム流入をもたらす。次いで、結果として生じた細胞内カルシウムの増加は、インスリン含有顆粒膜中に存在している開口分泌タンパク質と形質膜中に位置している開口分泌タンパク質との間の直接の相互作用を誘発し（ＹａｎｇおよびＢｅｒｇｇｒｅｎ、２００６年、Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．、２７号、６２１〜６７６頁）、それに続くインスリンの放出をもたらす（Ｎｉｃｈｏｌｓ、２００６年、Ｎａｔｕｒｅ、４４０号、４７０〜４７６頁）。最近の知見は、ＫＡＴＰおよびＣａｖチャネルがまた、腸内分泌Ｌ細胞からのＧＬＰ−１放出において極めて重要な役割を果たすという仮説を支持する（ＲｅｉｍａｎｎおよびＧｒｉｂｂｌｅ、２００２年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５１号、２７５７〜２７６３頁；Ｒｅｉｍａｎｎら、２００８年、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．、８号、５３２〜５３９頁）。興味深いことには、ＢｘＤ参照集団において、本発明者らはまた、ＴＧＲ５発現がＣａｖ２．２の発現と相関したことを見出し（図１８Ａ）、それらの発現は腸内分泌細胞において以前に記載され（Ｒｅｉｍａｎｎら、２００５年、Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、５６３号、１６１〜１７５頁）、それらの発現は膵臓の３種の細胞におけるカルシウム刺激によるインスリン放出に関与している（ＹａｎｇおよびＢｅｒｇｇｒｅｎ、２００６年、Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．、２７号、６２１〜６７６頁）。これに加えて、化合物Ｉｈ３ｅは、ヒト腸内分泌細胞系ＮＣＩ−Ｈ７１６においてカルシウム流入を強力に増加させ、この作用は、ＴＧＲ５過剰発現によって増強され、対照的に、ＴＧＲ５ＲＮＡ干渉によって（図１８Ｂおよび１８Ｃ）、またはアデニル酸シクラーゼ阻害剤ＭＤＬ−１  ２３３０Ａ（ＭＤＬ）の添加によって（図１８Ｄ）鈍った。さらに、グルコースの存在は、細胞内カルシウムのＴＧＲ５依存性増加を増強した（図１８Ｅ）。この作用は、ＭＤＬ−１２−３３０Ａによって阻害されたＮＣＩ−Ｈ７１６細胞からのＧＬＰ−１放出の上昇と相関した（図１８Ｆ）。
【０３２３】
化合物Ｉｈ３ｅによって誘発されるＴＧＲ５が媒介するＧＬＰ−１放出は、マウス腸内分泌ＳＴＣ−１細胞においてさらに確認され、そこではＧＬＰ−１放出に対する化合物Ｉｈ３ｅの影響は、ＴＧＲ５過剰発現によって増強され、一方ではＲＮＡ干渉（図１８Ｇ）によって、またはＭＤＬ−１２−３３０Ａによって防止され、ＴＧＲ５が媒介するＧＬＰ−１放出のｃＡＭＰ依存性をさらに強調する（図１８Ｈ）。まとめると、これらのデータは、ＴＧＲ５が、腸内分泌Ｌ細胞からのＧＬＰ−１の放出を支配する重要な経路をレギュレートすることを示す。
【０３２４】
（実施例１９）
ＴＧＲ５過剰発現は、ＧＬＰ−１分泌をインビボでモジュレートする
増強したＴＧＲ５シグナル伝達の代謝の役割をさらに評価するために、本発明者らは、マウスにおけるＤＩＯとの関連で、インビボでのＴＧＲ５のトランスジェニック過剰発現の影響を評価した。ＴＧＲ５トランスジェニックマウス（ＴＧＲ５−Ｔｇ）は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＲＰ２３−２７８Ｎ１の卵母細胞の注入によって生じた。定量的リアルタイムＰＣＲによって、ＴＧＲ５−Ｔｇマウスは、組み込まれた６コピーのＲＰ２３−２７８Ｎ１  １  ＢＡＣクローンを有することが示され、通常ＴＧＲ５を発現している大部分の組織に限定されている強力なＴＧＲ５ｍＲＮＡ発現をもたらした。耐糖能は、対照ＨＦ摂食同腹子と比較して、高脂肪（ＨＦ）食で１０週間曝露されたＴＧＲ５−Ｔｇマウスにおいて著しく改善し（図１９Ａ）、一方、固形飼料食（ＣＤ）のマウスにおいて差異は認められなかった（データは示さず）。本発明者らの予想と対照的に、ＣＤまたはＨＦ食の野生型とＴＧＲ５−Ｔｇマウスとの間の体重増加に差異は観察されなかった。これはＴＧＲ５−Ｔｇマウスにおける耐糖能の改善が体重減少の交絡作用に起因しない可能性を示す。ＴＧＲ５−Ｔｇマウスにおいてエネルギー支出の増加の結果として体重増加がないことは、運動活性の減少によって説明された。ＧＬＰ−１受容体ノックアウトマウスは顕著な多動性を示すため（Ｈａｎｓｏｔｉａら、２００７年、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、１１７号、１４３〜１５２頁）、本発明者らは、ＴＧＲ５−Ｔｇマウスにおける運動活性の減少がＧＬＰ−１分泌と関連する可能性があるかを評価するために、ＧＬＰ−１受容体アゴニストＥｘ−４を野生型マウスに投与した。Ｅｘ−４は、マウスにおいて運動活性を効率的におよび用量依存的に減少させた。興味深いことに、１ｎｍｏｌ／Ｋｇで、本発明者らは、マウスがまだ適切に摂食していた間に、運動活性の有意な減少を認めた。
【０３２５】
興味深いことに、本発明者らの予想によって、ＴＧＲ５−Ｔｇマウスにおける耐糖能は、経口グルコース負荷に反応した強力なＧＬＰ−１分泌およびインスリン放出と関連した（図１９Ｂ）。増強したＧＬＰ−１分泌の重要性は、血漿ＧＬＰ−１レベルの測定が、マウスへのジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ４）阻害剤の事前の経口投与なしで行ったという事実によって強調された。ＴＧＲ５−ＴｇマウスにおけるこのＧＬＰ−１放出の増強は、これらのマウスにおける運動活性の減少を説明するのに役立つ。ＧＬＰ−１分泌に対するＴＧＲ５過剰発現の影響をさらに調査するために、ＨＦ摂食マウスを試験食に引き続いて曝露し、胆嚢からのＢＡ放出を刺激した。興味深いことに、インスリンおよびＧＬＰ−１分泌に対するＴＧＲ５過剰発現の影響は、単一のグルコース曝露後より、食後により明白であった（図１９Ｃ）。これらの作用は、グルコース曝露と比較すると、試験食によって誘発されたＢＡ流動の増加が原因であることが推測される。この仮説と一致して、ＴＧＲ５−Ｔｇおよび対照マウスからの回腸移植片のリトコール酸（ＬＣＡ）による処理によって、高いＴＧＲ５発現との関連で、ＢＡがＧＬＰ−１放出を誘発する優れたシグナルを提供することを確認した（図１９Ｄ）。これらのデータは、ＧＬＰ−１放出がまたＴＧＲ５発現の増加によって増強されたという、ｍＴＧＲ５−トランスフェクトされたＳＴＣ−１細胞において得た結果とさらに一致した（図１９Ｇ）。本発明者らは、野生型回腸移植片との関連で、ＤＰＰ４酵素によるＧＬＰ−１の急速な分解が、ＬＣＡによって誘発されるＧＬＰ−１放出の中程度の増加を遮蔽し得ることを推測する。
【０３２６】
膵臓機能に対するＧＬＰ−１の影響は、この１０年間に広範に記述されてきており、インスリン−分泌促進物質の作用から、膵島の生存および増殖の促進（Ｄｒｕｃｋｅｒ、２００６年、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．、３号、１５３〜１６５頁）までの範囲に亘る。これに関連して、膵臓切片上のインスリンの免疫蛍光染色によって、ＨＦ摂食対照マウスにおいて観察されるように、低インスリン量を伴う膵島肥大と対照的に、ＨＦ摂食ＴＧＲ５−Ｔｇマウスの膵島は肥大性ではなく、インスリンについてより集中的に染色されたことが明らかになった（図１９Ｅ）。これらのデータと一致して、膵島の計数およびサイズ計測によって、ＴＧＲ５発現が、正常な膵島分布プロファイルの維持をもたらすことを確認した（図１９Ｆ）（恐らく血漿ＧＬＰ−１レベルの増強による）。さらに、単離した膵島のインスリン量は、対照におけるよりもＨＦ摂食ＴＧＲ５−Ｔｇマウスにおいて有意に高かった（図１９Ｇ）。
【０３２７】
グルコース恒常性の維持におけるＴＧＲ５シグナル伝達の役割をさらに確立するために、本発明者らは、ＴＧＲ５対立遺伝子がｌｏｘＰ導入された（ｆｌｏｘｅｄ）マウスをＣＭＶ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスと交配することによって発生させた生殖系列ＴＧＲ５欠損マウス（ＴＧＲ５−／−）の耐糖能を評価した。ＴＧＲ５−Ｔｇマウスにおいて観察したのとは直接対照的に、ＨＦ食に８週間曝露されたＴＧＲ５−／−マウス（図１９Ｈ）において耐糖能が損なわれ、一方、ＣＤ摂食マウスにおいて差異は観察されなかった（データは示さず）。次いで、食塩水もしくは化合物Ｉｈ３ｅ単独、またはＤＰＰ４阻害剤（ＤＰＰ４ｉ）であるシタグリプチンとの組合せにおける投与の３０分後に、ＴＧＲ５＋／＋およびＴＧＲ５−／−マウスを経口グルコース負荷に曝露させることによってＧＬＰ−１分泌を試験した。化合物Ｉｈ３ｅの事前投与は、ＴＧＲ５＋／＋マウスにおいてグルコース曝露の後にＧＬＰ−１放出を中程度に増加させた（図１９Ｉ）。しかし、この作用は、ＤＰＰ４ｉが同時投与されたときに、血漿ＧＬＰ−１の半減期を伸ばすその能力の結果として著しくより明白であった（ＤｒｕｃｋｅｒおよびＮａｕｃｋ、２００６年、Ｌａｎｃｅｔ、３６８号、１６９６〜１７０５頁）（図１９Ｉ）。対照的に、血漿ＧＬＰ−１レベルに対する化合物Ｉｈ３ｅの作用は、ＴＧＲ５−／−マウス（図１９Ｊ）において鈍った。一緒に、これらのデータは、ＧＬＰ−１放出の制御におけるＴＧＲ５シグナル伝達の決定的役割を強調し、インビボでの半合成アゴニスト化合物Ｉｈ３ｅの特異性をさらに示す。
【０３２８】
（実施例２０）
ＴＧＲ５アゴニスト化合物Ｉｈ３ｅは、エネルギー支出を増加させ、高脂肪摂食による肝脂肪症および肥満症を減少させる
ＴＧＲ５−Ｔｇマウスにおける改善されたグルコースおよびインスリンプロファイルを考慮して、本発明者らは次に、１４週間のＨＦ摂食によって糖尿肥満が誘発されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの介入研究において、３０ｍｇ／ｋｇ／日（ｍｋｄ）の用量で食事と混合した化合物Ｉｈ３ｅの治療可能性を評価した。予想どおりに、血漿ＢＡのＨＰＬＣプロファイルによって、処理したマウスのみにおいて化合物Ｉｈ３ｅの存在が確認された（図２０Ａ）。化合物Ｉｈ３ｅの血漿レベルは、ＣＡおよび３−ムリコール酸の血漿レベルの範囲内であった。化合物Ｉｈ３ｅによる処理は、血漿ＢＡ組成にも、ＢＡ合成に関与する酵素（その発現は主として核内受容体の制御下である）の発現プロファイルにも影響しなかったことは注目すべきである。肝臓におけるＦＸＲの古典的な標的遺伝子の発現レベルにおける変化が完全にないこと（コレステロール７α−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７Ａ１）および胆汁酸塩排出ポンプ（ＢＳＥＰ）など（Ｔｈｏｍａｓら、２００８年、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、７号、６７８〜６９３頁））によって、ＴＧＲ５に対する化合物Ｉｈ３ｅの特異性がさらに確認された。
【０３２９】
１０週間の化合物Ｉｈ３ｅによる処理の後、脂肪量の大幅な減少と関連する、約１５％の体重増加の有意な減少は、ＨＦ摂食対照と比較して、ＨＦ摂食Ｉｈ３ｅ処理マウスにおいて観察された（図２０Ｂおよび２０Ｃ）。肝臓および脂肪パッド質量の増加はまた、ＨＦ摂食Ｉｈ３ｅ処理マウスにおいて減少した（図２０Ｄ）。ＣＡについての本発明者らの従前の研究において注目されたように（Ｗａｔａｎａｂｅら、２００６年、Ｎａｔｕｒｅ、４３９号、４８４〜４８９頁）、ＢＡＴ質量の減少は、肩甲骨間の領域における白色脂肪組織（ＷＡＴ）の減少と関連した（図２０Ｄ、データは示さず）。対照ＨＦ摂食マウスとＩｈ３ｅ処理ＨＦ摂食マウスとの間の代謝の変化は、カロリー摂取の減少（図２０Ｅ）または糞便によるエネルギー損失によるものではなく、間接熱量測定の間のＯ２消費およびＣＯ２生成の測定によって示されるように、むしろエネルギー支出の増大の結果であった（図２０Ｆ）。暗期間の間に、Ｉｈ３ｅ処理マウスの呼吸商は、有意に減少し、脂肪燃焼の増加と一致した（図２０Ｆ）。ＢＡＴの遺伝子発現プロファイリングによって、ＴＧＲ５シグナル伝達経路の活性化が、２型デヨードナーゼ遺伝子発現の誘発と共に、エネルギー支出に関与しているいくつかのミトコンドリア遺伝子の増加を誘発することが確認された（図２０Ｇ）。化合物Ｉｈ３ｅによるミトコンドリア呼吸鎖の活性化は、化合物Ｉｈ３ｅで１２時間処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから単離した初代培養褐色脂肪細胞におけるＯ２消費を測定することによってさらに証明された。脱カップリング剤であるカルボニルシアニド−ｐトリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）の添加は、全ての条件において基礎Ｏ２消費を増大させたが、化合物Ｉｈ３ｅで処理したものにおいて有意により明白であった（図２０Ｈ）。エネルギー支出の増強に加えて、オイルレッドＯ染色（図２０Ｉ）および肝臓脂質含量の生化学的定量化（図２０Ｊ）によって評価された脂肪肝の減少によって証明されるように、肝機能がまた改善された。さらに、肝酵素の血漿レベルは、ＨＦ摂食対照と比較して著しく減少し、これはシリウスレッドで染色したＩｈ３ｅ処理マウスの肝臓切片において肝線維症が存在しないことと相関した（図２０Ｉおよび２０Ｋ）。肝機能の改善はまた、化合物Ｉｈ３ｅで処理したＨＦ摂食マウスにおける血漿トリグリセリドおよび非エステル型脂肪酸（ＮＥＦＡ）の有意な減少に反映された（図２０Ｌ）。
【０３３０】
（実施例２１）
ＴＧＲ５アゴニスト化合物Ｉｈ３ｅは、肥満マウスにおいてインスリン感受性を改善する
グルコース恒常性を改善する化合物Ｉｈ３ｅの能力を決定した。各々糖尿肥満の環境的および遺伝的モデルであるＤＩＯおよびｄｂ／ｄｂマウスの両方において、食事と混合した化合物Ｉｈ３ｅ（３０ｍｋｄ）による処理は、グルコースによる経口曝露の後、グルコース刺激によるインスリン分泌プロファイルの改善（図２１Ｂおよび２１Ｄ、下のパネル）と共に、耐糖能を強く改善した（図２１Ａおよび２１Ｃ）。この特徴は、膵臓機能におけるＧＬＰ−１が媒介する改善と一致する。さらに、空腹時グルコースおよびインスリンレベルは、化合物Ｉｈ３ｅで処理したＤＩＯおよびｄｂ／ｄｂマウスの両方において減少した（図２１Ｂおよび２１Ｄ、上のパネル）。グルコース恒常性およびインスリン感受性に対する化合物Ｉｈ３ｅの影響をさらに特性決定するために、これらのＤＩＯマウスに対して高インスリン正常血糖グルコースクランプを行った。耐糖能の改善と一致して、化合物Ｉｈ３ｅで処理したＤＩＯマウスにおいて正常血糖を維持するのに必要なグルコース注入量は、ＣＤ摂食対照マウスにおいて観察されたのとほぼ同一であった（図２１Ｅ）。インスリン抵抗性ＨＦ摂食マウスは、インスリンによるグルコース処理率とグルコース生成の抑制との両方の減少と共に、肝グルコースの内在的生成の増加を示した一方、ＨＦ摂食マウスの化合物Ｉｈ３ｅによる処理によって、これらのパラメーターは、ＣＤ摂食マウスにおいて観察された値に正規化された（図２１Ｅ）。高インスリン正常血糖グルコースクランプの間のインスリン刺激による１４Ｃ−デオキシグルコース取込みの測定によって、化合物Ｉｈ３ｅによるグルコース恒常性の改善が肝臓および筋肉におけるインスリン抵抗性の減少によって主として生じた可能性があることが示された（図２１Ｆ）。これらの作用は、肝臓のグルコース恒常性に関与する重要な遺伝子の発現における正規化と相関する（図２１Ｇ）。
【０３３１】
インビボでのＴＧＲ５に関する化合物Ｉｈ３ｅの特異性に取り組むために、耐糖能に対する３０ｍｋｄでの化合物Ｉｈ３ｅによる４週間の処理の影響を、ＨＦ摂食によって９週間刺激されたＴＧＲ５’およびＴＧＲ５／マウスにおいて比較した。この短期間に亘ってでさえ、化合物Ｉｈ３ｅは、ＨＦ食を摂食したＴＧＲ５＋／＋マウスにおいて、経口グルコース曝露の間のインスリン分泌の正規化と共に（図６Ｂ）、耐糖能を有意に改善した（図６Ａ）。これらの作用は、ＴＧＲ５−／−マウスにおいては鈍ったが、それによってＴＧＲ５についての化合物Ｉｈ３ｅの特異性を支持するさらなる論拠を提供する（図２２Ａおよび２２Ｂ）。
【０３３２】
（実施例２２）
化合物Ｉｈ３ｅおよびＩｉ３ｅについての静脈内投与後の胆汁瘻ラットにおける薬物動態および代謝
２種の純粋なジアステレオ異性体であるＩｈ３ｅとＩｉ３ｅとの差異は、Ｃ−２３メチル基が異なって配向しており、それゆえに２３Ｓおよび２３Ｒ形態を生じることである。この構造の修飾は、２種の化合物の物理化学的特性、代謝および薬物動態を部分的に変更することができる。異なって配向された側鎖におけるＣ−２３メチル基の導入は、２種の異性体を生じさせ、そこではまたカルボキシ基が異なって配向され、アミド化過程またはアミド化形態の脱抱合におけるその反応性は、２種のジアステレオ異性体の間で異なり得る。異なるカルボキシ基の配向はまた、異なる生物学的特性および代謝をもたらすことができる２種の分子の異なる疎水性／親水性バランスに関与している。この点を明白にするために、胆汁瘻ラットモデルへの大腿部注入（静脈内）によって１μｍｏｌ／分／ｋｇ体重の単回用量で２種の純粋な異性体を１時間投与し、胆汁試料を３時間集めた。胆汁流に対する作用、親化合物および主要な代謝物の胆汁分泌に対する作用をまた評価した。
【０３３３】
胆汁流、胆汁分泌作用
方法
この研究は、大腿部注入（静脈内）による２種の化合物の投与によって行った。６匹のラット（体重２６７±１２ｇ）を、１μｍｏｌ／分／ｋｇの用量にて各々のジアステレオ異性体で処理した。７５分の定常状態の後に大腿部注入を開始し、６０分間続けた。胆汁試料を１５分毎に２時間集めた。さらに、３匹のラットを、時間およびサンプリングについて同じ条件下にて３％ＢＳＡ食塩溶液で処理した（大腿部対照ラット）。
【０３３４】
結果
対照３％ＢＳＡ食塩水ビヒクルの静脈への注入の間の胆汁流は、実験の全期間の間４０〜６０μＬ／分／ｋｇの範囲の値を維持した。化合物Ｉｈ３ｅの静脈への注入は、胆汁流量を有意に増加させ、この現象は注入期間の開始１５分後に始まり、注入期間の終った後少なくとも２時間続いた（図２３）。化合物Ｉｉ３ｅの静脈への注入はまた、胆汁流量を増加させたが、この作用は異性体化合物Ｉｈ３ｅについて観察されたものよりも有意に低かった（図２３）。
【０３３５】
静脈への注入後の投与された異性体の薬物動態（胆汁分泌）
静脈内実験の間に異なる時間に集めた胆汁試料を分析し、投与した異性体の胆汁分泌および胆汁中に回収されたそれらの主要な代謝物を決定した。
【０３３６】
材料
各化合物の純粋な結晶性粉末は、ペルージャ大学のＲ．Ｐｅｌｌｉｃｃｉａｒｉの試験施設から入手した。ストック溶液は１ｍｍｏｌ／Ｌでメタノール中にて調製し、処理用溶液は適当な容量の一次溶液を希釈することによって調製した。メタノールおよびアセトニトリルは、ＨＰＬＣグレードの純度のものであった。アンモニアは３０％の純度であり、酢酸は９９．８％の純度であった。全ての試薬は、Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ  Ｒｅａｇｅｎｔｓから入手した。ＨＰＬＣグレードの水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステムによって調製した。
【０３３７】
試料の調製
ラット胆汁試料を室温にし、短時間撹拌し、１５ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝５．０）：アセトニトリル（７０：３０、ｖ／ｖ）で１：１００または１：２００ｖ／ｖに希釈した。最終溶液をオートサンプラーバイアル中に移し、１０μＬをクロマトグラフィーカラムに注入した。試料が直線性範囲の外で見出されたとき、それらを希釈し、再分析した。
【０３３８】
ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ法
ラット胆汁試料は、負のイオン化モードのＥＳＩ源を使用して、ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。液体クロマトグラフィーのために、オートサンプラーと連結したＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５分離モジュールを使用した。オートサンプラーを７℃に維持した。ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ  ＯＤＳ、４×２．０ｍｍ、皮内、プレカラムによって保護されているＳｙｎｅｒｇｉ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ  Ｃ１８カラム（１５０×２．０ｍｍ、皮内、４μｍの粒径）（両方ともＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘから供給されている）上で分離を行った。１５ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝５．０）を移動相Ａとして、アセトニトリルを移動相Ｂとして使用して、分析物を溶出させた。移動相Ｂを３０％から６４％に１０分で増加させ、次いで１０分で１００％にし、１０分間一定に保った。流量は１５０μＬ／分であり、カラムは４５℃に維持した。カラム流出液を、多段反応モニタリング（ＭＲＭ）取得モードで作動するトリプル四重極ＭＳ（Ｑｕａｔｔｒｏ−ＬＣ、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）に連結しているＥＳＩ源に導入した。窒素を、１００Ｌ／時間の流量でネブライザーガスとして、および９３０Ｌ／時間で脱溶媒和ガスとして使用した。イオン源遮断および脱溶媒和温度を、各々８０℃および１８０℃に設定した。キャピラリー電圧は３．０ｋＶであった。ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアバージョン４．０を、データ収集および処理のために使用した。さらに、シングルＭＳおよびタンデムＭＳ／ＭＳ配置の両方における質量分析法を使用して実験を行い、代謝物を同定した。
【０３３９】
定量化
５点検量線を毎日調製し、２連で注入した。較正試料は、移動相中で調製する０．１〜２０μｍｏｌ／Ｌの濃度範囲内で得た。線形検量線パラメーターは、最小二乗回帰分析を使用して、分析物ピーク面積対分析物濃度のプロットから得た（重量＝１／ｘ２）。相関係数は≧０．９９４であった。本発明者らにとって標準物質が利用可能でなかったにも関わらず、化合物Ｉｈ３ｅおよびＩｉ３ｅのタウリン抱合代謝物をまた推定した。事前に推定した補正因子を、遊離およびタウリン抱合種の間のＥＳ−ＭＳ／ＭＳにおける異なる反応を考慮して、ＨＰＬＣ−ＭＲＭデータセットクロマトグラムから得た面積値に適用した。最終的に、遊離ＢＡについて得た検量線を使用して、タウリン抱合代謝物を推定した。
【０３４０】
結果−胆汁分泌−化合物Ｉｈ３ｅ
静脈内投与後の化合物Ｉｈ３ｅの胆汁分泌は効率的であり、化合物は、投与した用量の相対的に高い割合で胆汁中に回収された。動力学的プロファイルは、化合物Ｉｈ３ｅが肝臓によって効率的に取り込まれ、主として無修飾で、またより少ない程度でタウリンと抱合されて、胆汁中に分泌されたことを示す（図２４）。グルクロニドを含めた他の微量な代謝物は、胆汁において微量で同定された（図２６および２７）。
【０３４１】
Ｃ−２３位におけるメチル基の存在は、殆ど全ての天然のカルボキシル化されたＢＡの効率的な分泌に関連する生理学的タウリンおよびグリシンとの抱合過程を妨げる。これは、ジヒドロキシ−ＢＡに、およびより少ない程度でトリヒドロキシ−ＢＡに不可欠である。胆汁中のその回収の程度はまた、コール酸について観察された通りに、投与した用量と関連する（Ｒｏｄａ  Ａ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、８号、１５７１〜６頁、１９８８年）。
【０３４２】
化合物Ｉｈ３ｅの物理化学的特性を考慮に入れ、本発明者らは、この化合物が受動拡散機序によって吸収されるであろうことを予想したが（Ｌｏｇ  Ｐ＝１．４４）、能動的機序は、関与していないようであった。３個のヒドロキシル基の存在によって、分子が肝臓によって効率的に取り込まれ、胆汁中に分泌されることが可能となる。６−エチル基はまた、従前の報告において示されているように、腸内細菌による７−脱ヒドロキシル化を防止する。
【０３４３】
結果−胆汁分泌−化合物Ｉｉ３ｅ
静脈への注入後の化合物Ｉｉ３ｅの胆汁分泌を、図２５において報告する。動力学的プロファイルは、この化合物が、化合物Ｉｈ３ｅよりもより広範に肝臓によって代謝されることを示す。親化合物は、それ自体として、およびより少ない程度でタウリン抱合体として、胆汁中に分泌される。そのジアステレオ異性体化合物Ｉｈ３ｅに対して、抱合の割合はより高く、非抱合形態の最大分泌速度はより低い。これは、非抱合形態としてより高い割合で分泌される異性体（Ｓ）に関して、Ｃ−２３（Ｒ）異性体がアミド化過程により適した側鎖形状および配向を示すことを示唆する。タウリンとの抱合は、胆汁中の化合物Ｉｉ３ｅ回収の改善（投与した用量の概ね７０〜８０％）をもたらす。グルクロニドを含めた他の微量な代謝物が、胆汁中に微量に同定された（図２８〜２９）。
【０３４４】
肝代謝
方法
従前の実験から得たデータ、ならびに研究した類似体の構造的および物理化学的特性を使用して、事前のスクリーニングを行い、可能性がある代謝物を探索した。
【０３４５】
化合物Ｉｈ３ｅ
この分子は、親化合物（無修飾）として主として分泌され、肝臓によってほんの僅かに代謝された。主要な代謝物はタウリン抱合種であり、非常に低いレベルで、モノ−グルクロニド種が検出された（図２６〜２７）。
【０３４６】
Ｃ−２３位におけるメチル基の存在は、殆ど全ての天然のカルボキシル化されたＢＡの効率的な分泌のために必要とされるタウリンおよびグリシンとの抱合過程を妨げる。これは、ジヒドロキシＢＡ、およびより少ない程度でトリヒドロキシＢＡにとって、それらが既に非常に極性であるため、非常に重要である。グルクロニドの形成は、より高い用量で投与される場合、関連し得る。
【０３４７】
化合物Ｉｉ３ｅ
この分子は、親化合物（無修飾）として主として分泌され、肝臓によってまた代謝され、タウリン抱合種が、および非常に低いレベルでモノ−グルクロニド種が形成された（図２７〜２９）。
【０３４８】
Ｃ−２３位におけるメチル基の存在は、殆ど全ての天然のカルボキシル化されたＢＡの効率的な分泌のために必要とされるタウリンおよびグリシンとの抱合過程を妨げる。これは、ジヒドロキシＢＡ、およびより少ない程度でトリヒドロキシＢＡにとって、それらが既に非常に極性であるため、非常に重要である。グルクロニドの形成は、分子がより高い用量で投与される場合、関連し得る。
【０３４９】
化合物Ｉｉ３ｅは、タウリン抱合形態としてジアステレオ異性体化合物Ｉｈ３ｅより高い割合で胆汁中に分泌され（２０〜３０％対５〜１０％）、これは、異なる側鎖形状および化合物Ｉｉ３ｅの僅かにより高い親油性を説明する。
【０３５０】
化合物Ｉｈ３ｅは中程度に親水性であり、穏やかな界面活性を有する。その肝臓取込みは効率的なようである。化合物が主として無修飾で分泌され、限定される程度で、タウリンと抱合することを考慮すると、胆汁分泌はまた効率的である。腸管吸収は天然の非抱合ＢＡなどの受動的機序を介して起こり、その動態は、ジヒドロキシ胆汁酸の動態より僅かに低いコール酸の動態と同様である（Ａｌｄｉｎｉ  Ｒ．ら、Ｓｔｅｒｏｉｄｓ、６１号、５９０〜７頁、１９９６年）。
【０３５１】
化合物Ｉｈ３ｅは、投与した用量で、胆汁中に分泌されるのに、広範な肝代謝を必要としない。Ｃ−２３（Ｓ）位におけるメチル基の存在は、タウリンとの広範な抱合を防止し、分子は効率的に無修飾で分泌されることができる。分子の肝臓滞留時間の増加は、この分子がその強力な胆汁分泌作用に関与している胆嚢肝シャント経路を経るため、小管吸収からもたらされる。
【０３５２】
化合物Ｉｉ３ｅは、化合物Ｉｈ３ｅのジアステレオ異性体である。化合物Ｉｉ３ｅは、異なる側鎖形状の結果として僅かに低い親水性によって特徴付けられる。したがって、Ｃ−２３カルボキシ基は異なって配向しており、これは、分子の異なる親水性−疎水性バランスを説明する。そのより高い親油性の結果として、化合物Ｉｈ３ｅに対して、分子はタウリンとのより広範な抱合を必要とする。最終化合物の側鎖形状によって、ＣｏＡ活性化過程によって媒介される抱合に関与している酵素に対してより低い基質特異性を有するＢＡが恐らく生成される。化合物Ｉｉ３ｅが化合物Ｉｈ３ｅより高く抱合された割合で胆汁中に分泌されることが最終結果である。
【０３５３】
他の実施形態
本発明をその詳細な記載と併せて記載してきたが、上記の記載は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図し、限定することを意図しない。他の態様、利点、および変形形態は、下記の特許請求の範囲内である。添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変化をその中で行い得ることは当業者であれば理解するであろう。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図１９−５】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２０−５】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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