(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に光を照射し、該照射光と前記試料との相互作用により該試料から得られる光を測定する分光測定装置であって、
a) 目的成分を含まない溶媒を前記試料とし、前記照射光の波長若しくは測定する光の波長を所定の範囲で走査、又は前記試料から得られる光を分光して所定の範囲で多波長同時検出することによって得られた第１の測定データと、目的成分を含む溶媒を前記試料とし、前記照射光の波長若しくは測定する光の波長を所定の範囲で走査、又は前記試料から得られる光を分光して所定の範囲で多波長同時検出することによって得られた第２の測定データとを記憶する記憶手段と、
b) 前記第１の測定データと前記第２の測定データに基づいて各波長における前記目的成分と照射光の相互作用の大きさを表す値を求めると共に、前記第１の測定データから各波長における溶媒由来のノイズ量の推定値を求め、前記目的成分と照射光の相互作用の大きさを表す値と前記ノイズ量の推定値との比から各波長における感度指標の推定値を求める感度指標推定手段と、
を有することを特徴とする分光測定装置。
【請求項２】
前記相互作用が試料による蛍光発光であり、前記分光測定装置が、所定波長の光を励起光として試料に照射する励起光学系と、該励起光の照射を受けて試料が発する蛍光を検出する検出光学系とを備えた蛍光測定装置であって、
前記記憶手段が、目的成分を含まない溶媒を前記試料とし、前記励起光の波長を所定の範囲で走査することによって得られた第１の測定データと、目的成分を含む溶媒を前記試料とし、前記励起光の波長を所定の範囲で走査することによって得られた第２の測定データとを記憶するものであり、
且つ、前記感度指標推定手段が、前記第１の測定データと第２の測定データに基づいて各励起波長における前記目的成分の蛍光強度値を求めると共に、前記第１の測定データから各励起波長における溶媒由来のノイズ量の推定値を求め、前記目的成分の蛍光強度値と前記ノイズ量の推定値の比から各励起波長における感度指標の推定値を求めるものであることを特徴とする請求項１に記載の分光測定装置。
【請求項３】
前記相互作用が試料による蛍光発光であり、前記分光測定装置が、所定波長の光を励起光として試料に照射する励起光学系と、該励起光の照射を受けて試料が発する蛍光を検出する検出光学系とを備えた蛍光測定装置であって、
前記記憶手段が、目的成分を含まない溶媒を前記試料とし、前記検出光学系で検出する蛍光の波長を所定の範囲で走査、又は前記試料が発する蛍光を分光して所定の範囲で多波長同時検出することにより得られた第１の測定データと、目的成分を含む溶媒を前記試料とし、前記検出光学系で検出する蛍光の波長を所定の波長範囲で走査、又は前記試料が発する蛍光を分光して所定の範囲で多波長同時検出することにより得られた第２の測定データとを記憶するものであり、
且つ、前記感度指標推定手段が、前記第１の測定データと第２の測定データに基づいて各蛍光波長における目的成分の蛍光強度値を求めると共に、前記第１の測定データから各蛍光波長における溶媒由来のノイズ量の推定値を求め、前記目的成分の蛍光強度値と前記ノイズ量の推定値の比から各蛍光波長における感度指標の推定値を求めるものであることを特徴とする請求項１に記載の分光測定装置。
【請求項４】
前記感度指標推定手段が、前記第２の測定データより求められる蛍光スペクトルから前記第１の測定データより求められる蛍光スペクトルを減算することにより前記各波長における目的成分の蛍光強度値を求めるものであり、且つ前記第１の測定データより求められる蛍光スペクトル上の各波長における蛍光強度値を１／２乗することにより前記各波長における溶媒由来のノイズ量の推定値を求めるものであることを特徴とする請求項２又は３に記載の分光測定装置。
【請求項５】
更に、前記試料に照射する光を検知する対照光検出器を備え、
前記感度指標推定手段が、前記第２の測定データより求められる蛍光スペクトルから前記第１の測定データより求められる蛍光スペクトルを減算することにより前記各波長における目的成分の蛍光強度値を求めるものであり、且つ前記第１の測定データから各波長における前記蛍光検出器の出力電流Imと前記対照光検出器の出力電流Ixとを求め、以下の式を用いて前記各波長における溶媒由来のノイズ量の推定値ΔFを求めるものであることを特徴とする請求項２又は３に記載の分光測定装置。
【数１】
0005516486.tif 000023
ただし、Bmは前記蛍光検出器及びその信号処理における周波数帯域幅、Bxは前記対照光検出器及びその信号処理における周波数帯域幅
【請求項６】
前記相互作用が試料による吸光であり、前記分光測定装置が、試料に光を照射する照射光学系と、前記試料を通過した光を検出する透過光検出器とを備えた吸光度測定装置であって、
前記記憶手段が、目的成分を含まない溶媒を前記試料とし、前記試料に照射する照射光の波長若しくは測定する光の波長を所定の範囲で走査、又は前記試料を通過した光を分光して所定の範囲で多波長同時検出することによって得られた第１の測定データと、目的成分を含む溶媒を前記試料とし、前記試料に照射する照射光の波長若しくは測定する光の波長を所定の範囲で走査、又は前記試料を通過した光を分光して所定の範囲で多波長同時検出することによって得られた第２の測定データとを記憶するものであり、
前記感度指標推定手段が、前記第１の測定データと第２の測定データに基づいて各波長における目的成分の吸光度を求めると共に、前記第１の測定データから各波長における溶媒由来のノイズ量の推定値を求め、前記目的成分の吸光度値と前記ノイズ量の推定値の比から各波長における感度指標の推定値を求めるものであることを特徴とする請求項１に記載の分光測定装置。
【請求項７】
前記感度指標推定手段が、前記第１の測定データから各波長における前記透過光検出器の出力電流Isを求め、以下の式を用いて前記溶媒由来のノイズ量の推定値ΔAを求めるものであることを特徴とする請求項６に記載の分光測定装置。
【数２】
0005516486.tif 000024
【請求項８】
更に、前記試料に照射する照射光を検知する対照光検出器を備え、
前記感度指標推定手段が、前記第２の測定データより求められる吸収スペクトルから前記第１の測定データより求められる吸収スペクトルを減算することにより、前記各波長における目的成分の吸光度を求めるものであり、且つ前記第１の測定データから各波長における前記透過光検出器の出力電流Iと前記対照光検出器の出力電流I0とを求め、以下の式を用いて前記各波長における溶媒由来のノイズ量の推定値ΔAを求めるものであることを特徴とする請求項６に記載の分光測定装置。
【数３】
0005516486.tif 000025
ただし、Bは前記透過光検出器及びその信号処理における周波数帯域幅、B0は前記対照光検出器及びその信号処理における周波数帯域幅
【請求項９】
前記感度指標推定手段によって求められた感度指標の推定値が最も高感度となる波長をその後の測定に使用する波長として設定する波長設定手段を有することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の分光測定装置。
【請求項１０】
コンピュータを請求項１〜９のいずれかにおける記憶手段及び感度指標推定手段として機能させるためのプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分光測定装置及びそのプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光測定装置や吸光度測定装置等の分光測定装置は、分光法を利用して試料中の目的成分の検出や測定を行う装置である。
【０００３】
一般に蛍光測定装置は、光源が発する光から所定波長の光を分離し、その光を励起光として試料に照射する励起分光系、励起光を受けたときに試料が発する蛍光から所定波長の光を分離する蛍光分光系、及び、蛍光分光系により分離された光を検出してその量に応じた信号を出力する光検出手段を備えている（例えば、特許文献１を参照）。
【０００４】
基底状態の物質を励起状態とするために必要な励起光の波長、及び励起状態の物質が基底状態に戻るときに発する蛍光の波長は物質によって異なるため、上記のような蛍光測定装置を用いた測定では、検出しようとする成分（目的成分）に応じて測定に用いる励起波長及び前記光検出手段で検出する蛍光波長を適切に設定する必要がある。そのため、従来の蛍光測定装置では、測定に際し、予め以下のような手順で目的成分の検出に最適な励起波長及び蛍光波長が決定される。
【０００５】
（１）溶媒のみが試料セル内に存在している状態において、励起波長を固定し蛍光波長を走査することにより、各蛍光波長における蛍光強度を示すスペクトル（以下、これを「蛍光側スペクトル」と呼ぶ）を取得する。
（２）目的成分と溶媒が試料セル内に存在している状態において、上記と同様にして蛍光側スペクトルを取得する。
（３）（２）で得られたスペクトルから（１）で得られたスペクトルを減算することにより、目的成分の蛍光側スペクトルを求め、該スペクトルにおいて最も蛍光強度の高い波長を最適蛍光波長として決定する。
（４）次に、溶媒のみが試料セル内に存在している状態において、蛍光波長を固定し励起波長を走査することにより、各励起波長における蛍光強度を示す蛍光スペクトル（以下、これを「励起側スペクトル」と呼ぶ）を取得する。
（５）目的成分及び溶媒が試料セル内に存在している状態において、上記と同様にして励起側スペクトルを取得する。
（６）（５）で得られたスペクトルから（４）で得られたスペクトルを減算することにより目的成分の励起側スペクトルを求め、該スペクトルにおいて最も蛍光強度の高い波長を最適励起波長として決定する。
なお、ここでは蛍光側スペクトル、励起側スペクトルの順に測定しているが、この逆の順序で測定を行う場合もある。
【０００６】
上記の方法によれば、最も高い蛍光強度が得られる励起波長及び蛍光波長を最適励起波長及び最適蛍光波長として選択することが可能である。
【０００７】
一方、吸光度測定装置は、一般に光源が発する光から所定波長の光を分離し、その光を照射光として試料に照射する照射光学系と、試料を通過した光（透過光）を検出してその量に応じた信号を出力する光検出手段を備えている。
【０００８】
吸収される光の波長は物質によって異なるため、上記のような吸光度測定装置を用いた測定では、測定しようとする成分（目的成分）に応じて測定に用いる照射光の波長を適切に設定する必要がある。そのため、従来の吸光度測定装置では、測定に際し、予め文献等により目的成分の吸収波長を調べたり、以下のような手順で目的成分の測定に最適な波長を調べたりする必要がある。
【０００９】
（１）溶媒のみが試料セル内に存在している状態において、照射光の波長を走査することにより、吸収スペクトルを取得する。
（２）目的成分と溶媒が試料セル内に存在している状態において、上記と同様にして吸収スペクトルを取得する。
（３）（２）で得られたスペクトルから（１）で得られたスペクトルを減算することにより、目的成分の吸収スペクトルを求め、該スペクトルにおいて最も吸光度の高い波長を最適波長として決定する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開2001-83093号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、上記従来の最適波長の決定方法を液体クロマトグラフ用の検出器として用いられる蛍光測定装置又は吸光度測定装置に適用した場合、これらの波長が必ずしも液体クロマトグラフ分析において最もＳＮ比が高くなる（従って、検出限界が小さくなる）波長と一致しない場合がある。これは、上記従来の最適波長決定方法では、液体クロマトグラフ装置におけるベースラインの変動、すなわち移動相送液時のノイズの大小が考慮されていないことに起因する。
【００１２】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、ＳＮ比が最大となり検出限界が最小となる波長を最適波長として決定することのできる分光測定装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するためになされた本発明に係る分光測定装置は、試料に光を照射し、該照射光と前記試料との相互作用により該試料から得られる光を測定する分光測定装置であって、
a) 目的成分を含まない溶媒を前記試料とし、前記照射光の波長若しくは測定する光の波長を所定の範囲で走査、又は前記試料から得られる光を分光して所定の範囲で多波長同時検出することによって得られた第１の測定データと、目的成分を含む溶媒を前記試料とし、前記照射光の波長若しくは測定する光の波長を所定の範囲で走査、又は前記試料から得られる光を分光して所定の範囲で多波長同時検出することによって得られた第２の測定データとを記憶する記憶手段と、
b) 前記第１の測定データと前記第２の測定データに基づいて各波長における前記目的成分と照射光の相互作用の大きさを表す値を求めると共に、前記第１の測定データから各波長における溶媒由来のノイズ量の推定値を求め、前記目的成分と照射光の相互作用の大きさを表す値と前記ノイズ量の推定値との比から各波長における感度指標の推定値を求める感度指標推定手段と、
を有することを特徴としている。
【００１４】
ここで、「前記目的成分と照射光の相互作用の大きさを表す値と前記ノイズ量の推定値との比」とは、「溶媒由来のノイズ量の推定値」に対する「目的成分と照射光の相互作用の大きさを表す値」の比であってもよく、「目的成分と照射光の相互作用の大きさを表す値」に対する「溶媒由来のノイズ量の推定値」の比であってもよい。また、前記各波長における「感度指標」とは、その波長における測定感度の大小を表す指標であって、例えば、前記「目的成分と照射光の相互作用の大きさを表す値」を前記「溶媒由来のノイズ量の推定値」で除算して得られるＳＮ比の推定値などを前記感度指標として用いることができる。この場合、感度指標の数値が大きいほど測定感度が高いことになる。また、これに限らず、例えば、前記「溶媒由来のノイズ量の推定値」を前記「目的成分と照射光の相互作用の大きさを表す値」で除算した値に目的成分の濃度を乗算することで検出限界となる濃度に相当する値を求め、これを前記感度指標としてもよい。この場合、感度指標の数値が小さいほど測定感度が高いこととなる。
【００１５】
また、本発明に係る装置の第１の態様のものは、前記相互作用が試料による蛍光発光であり、前記分光測定装置が、所定波長の光を励起光として試料に照射する励起光学系と、該励起光の照射を受けて試料が発する蛍光を検出する検出光学系とを備えた蛍光測定装置であって、
前記記憶手段が、目的成分を含まない溶媒を前記試料とし、前記励起光の波長を所定の範囲で走査することによって得られた第１の測定データと、目的成分を含む溶媒を前記試料とし、前記励起光の波長を所定の範囲で走査することによって得られた第２の測定データとを記憶するものであり、
且つ、前記感度指標推定手段が、前記第１の測定データと第２の測定データに基づいて各励起波長における前記目的成分の蛍光強度値を求めると共に、前記第１の測定データから各励起波長における溶媒由来のノイズ量の推定値を求め、前記目的成分の蛍光強度値と前記ノイズ量の推定値の比から各励起波長における感度指標の推定値を求めるものであることを特徴としている。
【００１６】
また、本発明に係る装置の第２の態様のものは、前記相互作用が試料による蛍光発光であり、前記分光測定装置が、所定波長の光を励起光として試料に照射する励起光学系と、該励起光の照射を受けて試料が発する蛍光を検出する検出光学系とを備えた蛍光測定装置であって、
前記記憶手段が、目的成分を含まない溶媒を前記試料とし、前記検出光学系で検出する蛍光の波長を所定の範囲で走査、又は前記試料が発する蛍光を分光して所定の範囲で多波長同時検出することにより得られた第１の測定データと、目的成分を含む溶媒を前記試料とし、前記検出光学系で検出する蛍光の波長を所定の波長範囲で走査、又は前記試料が発する蛍光を分光して所定の範囲で多波長同時検出することにより得られた第２の測定データとを記憶するものであり、
且つ、前記感度指標推定手段が、前記第１の測定データと第２の測定データに基づいて各蛍光波長における目的成分の蛍光強度値を求めると共に、前記第１の測定データから各蛍光波長における溶媒由来のノイズ量の推定値を求め、前記目的成分の蛍光強度値と前記ノイズ量の推定値の比から各蛍光波長における感度指標の推定値を求めるものであることを特徴としている。
【００１７】
前記第１の態様及び第２の態様において、前記感度指標推定手段は、例えば、前記第２の測定データより求められる蛍光スペクトルから前記第１の測定データより求められる蛍光スペクトルを減算することにより前記各波長における目的成分の蛍光強度値を求め、且つ前記第１の測定データより求められる蛍光スペクトル上の各波長における蛍光強度値を１／２乗することにより前記各波長における溶媒由来のノイズ量の推定値を求めるものとすることができる。
【００１８】
液体クロマトグラフ装置における検出手段として用いられる蛍光測定装置では微小な光量を扱うため、蛍光信号に含まれるノイズは光電変換に伴うショットノイズが支配的となる。ショットノイズの大きさは測定された蛍光強度値の平方根に比例し、更に、上記第２の測定データより求められる蛍光スペクトルと第１の測定データより求められる蛍光スペクトルの差分は目的成分のみの蛍光スペクトルに相当するため、上記感度指標推定手段により、各励起波長又は各蛍光波長における感度指標の推定値が求められる。従って、例えば上記感度指標の推定値をモニタ等で表示することにより、ユーザは感度が最高となる励起波長又は蛍光波長を知ることができる。
【００１９】
また、前記第１の態様及び第２の態様に係る装置は、前記試料に照射する光を検知する対照光検出器を更に備え、
前記感度指標推定手段が、前記第２の測定データより求められる蛍光スペクトルから前記第１の測定データより求められる蛍光スペクトルを減算することにより前記各波長における目的成分の蛍光強度値を求め、且つ前記第１の測定データから各波長における前記蛍光検出器の出力電流Imと前記対照光検出器の出力電流Ixとを求め、以下の式を用いて前記各波長における溶媒由来のノイズ量の推定値ΔFを求めるものとすることもできる。
【００２０】
【数４】
0005516486.tif 000002
ただし、Bmは前記蛍光検出器及びその信号処理における周波数帯域幅、Bxは前記対照光検出器及びその信号処理における周波数帯域幅
【００２１】
なお、本発明に係る分光測定装置は、前記第１の態様と第２の態様の機能を兼ね備えたものとし、ユーザが最適励起波長と最適蛍光波長の両方を知ることのできる構成とするとより望ましい。
【００２２】
また、本発明に係る装置の第３の態様のものは、前記相互作用が試料による吸光であり、前記分光測定装置が、試料に光を照射する照射光学系と、前記試料を通過した光を検出する透過光検出器とを備えた吸光度測定装置であって、
前記記憶手段が、目的成分を含まない溶媒を前記試料とし、前記試料に照射する照射光の波長若しくは測定する光の波長を所定の範囲で走査、又は前記試料を通過した光を分光して所定の範囲で多波長同時検出することによって得られた第１の測定データと、目的成分を含む溶媒を前記試料とし、前記試料に照射する照射光の波長若しくは測定する光の波長を所定の範囲で走査、又は前記試料を通過した光を分光して所定の範囲で多波長同時検出することによって得られた第２の測定データとを記憶するものであり、
前記感度指標推定手段が、前記第１の測定データと第２の測定データに基づいて各波長における目的成分の吸光度を求めると共に、前記第１の測定データから各波長における溶媒由来のノイズ量の推定値を求め、前記目的成分の吸光度値と前記ノイズ量の推定値の比から各波長における感度指標の推定値を求めるものであることを特徴としている。
【００２３】
前記第３の態様において、前記感度指標推定手段は、例えば、前記第１の測定データから各波長における前記透過光検出器の出力電流Isを求め、以下の式を用いて前記溶媒由来のノイズ量の推定値ΔAを求めるものとすることができる。
【００２４】
【数５】
0005516486.tif 000003
【００２５】
また、前記第３の態様に係る装置は、更に、前記試料に照射する照射光を検知する対照光検出器を備えるものであって、
前記感度指標推定手段が、前記第２の測定データより求められる吸収スペクトルから前記第１の測定データより求められる吸収スペクトルを減算することにより、前記各波長における目的成分の吸光度を求め、且つ前記第１の測定データから各波長における前記透過光検出器の出力電流Iと前記対照光検出器の出力電流I0とを求め、以下の式を用いて前記各波長における溶媒由来のノイズ量の推定値ΔAを求めるものとすることもできる。
【００２６】
【数６】
0005516486.tif 000004
ただし、Bは前記透過光検出器及びその信号処理における周波数帯域幅、B0は前記対照光検出器及びその信号処理における周波数帯域幅
【００２７】
また、上記本発明に係る分光測定装置は、更に、前記感度指標推定手段によって求められた感度指標の推定値が最も高感度となる波長をその後の測定に使用する波長として設定する波長設定手段を備えたものとすることが望ましい。これにより、測定条件の設定に掛かる手間を省力化することができる。
【００２８】
また、本発明は、コンピュータを上記のような記憶手段及び感度指標推定手段として機能させるためのプログラムも提供する。
【発明の効果】
【００２９】
以上のように本発明に係る分光測定装置及びプログラムによれば、ＳＮ比が高く検出限界が小さくなる波長を求めることができるため、目的成分の検出に最適な波長で測定を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の第１の実施例に係る蛍光測定装置を備えた液体クロマトグラフシステムの概略構成を示す模式図。
【図２】同実施例に係る蛍光測定装置の光学系の構成を示す平面図。
【図３】同実施例に係る蛍光測定装置の制御系の構成を示すブロック図。
【図４】同実施例に係る蛍光測定装置における最適波長の決定手順を示すフローチャート。
【図５】本発明の第２の実施例に係る蛍光測定装置の光学系の構成を示す平面図。
【図６】本発明の第３の実施例に係る吸光度測定装置の光学系の構成を示す平面図。
【図７】同実施例に係る吸光度測定装置の制御系の構成を示すブロック図。
【図８】同実施例に係る吸光度測定装置における最適波長の決定手順を示すフローチャート。
【図９】同実施例に係る吸光度測定装置における試料セル及び検出器の変形例を示す模式図。
【図１０】本発明の第４の実施例に係る吸光度測定装置の光学系の構成を示す平面図。
【図１１】同実施例に係る吸光度測定装置における最適波長の決定手順を示すフローチャート。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明を実施するための形態について実施例を用いて説明する。
【実施例１】
【００３２】
図１は、本実施例に係る蛍光測定装置を備えた液体クロマトグラフ分析システム（以下、ＬＣシステム）の概略構成である。該ＬＣシステムは、溶媒（すなわちクロマトグラフ分析の移動相）を収容した溶媒容器１０及び前記溶媒をカラム４１に送るためのポンプ２０と、試料成分の分離を行うカラム４１を内装するカラムオーブン４０と、ポンプ２０からカラム４１に送られる溶媒中に試料液を注入する試料注入装置３０を備えており、カラム４１から溶出した試料成分を順次検出するための検出器５０として本実施例に係る蛍光測定装置を用いるものである。
【００３３】
図２は本実施例に係る蛍光測定装置の光学系の概略的構成を示す図である。光源（例えば、キセノンランプ）５１の発する光は集光鏡５２によって集光され、励起側入口スリット５３を通って励起側回折格子５４に入射する。励起側回折格子５４に入射した光は該回折光子５４により波長方向に分散され、その一部が励起側出口スリット５６を通過する。こうして励起側出口スリット５６を通過した光が本発明における励起光に相当する。なお、励起側回折格子５４には回転軸５４ａを中心として回折格子５４を回転駆動させるための励起側格子駆動機構５５が備えられており、該格子駆動機構５５で回折格子５４の向きを変えることにより、励起光の波長を所定波長範囲内で任意に設定することができる。
【００３４】
励起側出口スリット５６を通過した励起光は集光鏡５７により試料セル６０に向けて反射され、該集光鏡５７と試料セル６０の間の光路上に配置されたビームスプリッタ５８によって２方向に分離される。すなわち、励起光の一部はビームスプリッタ５８を通過して試料セル６０に到達し、励起光の他の部分はビームスプリッタ５８により反射され、対照光検出器（例えばフォトダイオード）５９により検出される。なお、対照光検出器５９から出力される検出信号は、光源光量の変動が与える蛍光信号の変動を補正するために用いられる。
【００３５】
試料セル６０に励起光が到達すると、その中の試料が蛍光を発する。この蛍光の一部は、集光鏡６１によって反射され、蛍光側入口スリット６２を通過して蛍光側回折格子６３に到達する。蛍光側回折格子６３に入射した光は該回折格子６３によって波長方向に分散され、その一部が蛍光側出口スリット６５を通過して蛍光検出器（例えば光電子増倍管）６６により検出される。蛍光側回折格子６３には回転軸６３ａを中心として回折格子６３を回転駆動するための蛍光側格子駆動機構６４が備えられており、蛍光検出器６６により検出される光の波長は、前記格子駆動機構６４で回折格子６３の向きを変えることにより、所定波長範囲内で任意に設定することができる。
【００３６】
図３は、本実施例に係る蛍光測定装置の制御系の概略的構成を示すブロック図である。この制御系の中心は制御演算部７０であり、ユーザは操作部７１を通じて制御演算部７０へ各種命令や設定データを入力することができる。また、モニタ等を備えた表示部７２で測定結果等が表示される。ユーザが、励起光を生成する波長（励起波長）や蛍光を検出する波長（蛍光波長）を設定し、測定開始命令を制御演算部７０へ入力すると、制御演算部７０は、励起側回折格子５４及び蛍光側回折格子６３が設定された各波長に対応する方向に向くように励起側格子駆動機構５５及び蛍光側格子駆動機構６４を制御し、光源５１を点灯する。また、光源５１を点灯した状態で、励起側回折格子５４又は蛍光側回折格子６３を所定の角度範囲で回動させるよう励起側格子駆動機構５５又は蛍光側格子駆動機構６４を制御することにより、励起波長又は蛍光波長を設定された波長範囲で走査することもできる（詳細は後述する）。測定の間、蛍光検出器６６及び対照光検出器５９からの出力電流は、それぞれプリアンプ６６ａ、５９ａにおいて所定のゲインで電圧変換され、Ａ／Ｄ変換部６６ｂ、５９ｂでデジタルデータに変換される。制御演算部７０は、これらのデジタルデータを順次データ処理部７４へ送出する。
【００３７】
データ処理部７４は、信号補正部７５、スペクトル生成部７６、最適波長決定部７７、及びクロマトグラム生成部７８を備えており、信号補正部７５は蛍光検出器６６側の出力信号を対照光検出器５９側の出力信号で除算することで補正し、該補正後の信号を蛍光信号としてスペクトル生成部７６又はクロマトグラム生成部７８に送出する。クロマトグラム生成部７８は、該蛍光信号に基づき蛍光強度の時間変化を表すクロマトグラムを作成する。一方、スペクトル生成部７６は、前記蛍光信号に基づき各励起波長又は蛍光波長における蛍光強度を示す蛍光スペクトルを作成する。生成された蛍光スペクトルは記憶部７３に格納され、最適波長決定部７７では、記憶部７３に格納されたスペクトルに基づいて所定の演算が行われる（詳細は後述する）。なお、この例では記憶部７３が本発明における記憶手段に、最適波長決定部７７、信号補正部７５、及びスペクトル生成部７６が本発明における感度指標推定手段として機能する。
【００３８】
なお、上記データ処理部７４及び記憶部７３等の機能は蛍光測定装置本体に内蔵された専用コンピュータによって具現化してもよいが、典型的には、所定のプログラムをインストールされたパーソナルコンピュータ等によって具現化される。この場合、該パーソナルコンピュータは、上記ＬＣシステムを構成する各装置と相互に接続されたシステムコントローラを介して蛍光測定装置本体に接続されるか、直接、蛍光測定装置本体に接続され、該パーソナルコンピュータによって上記制御系の機能の一部が実現される。
【００３９】
以下、本実施例の蛍光測定装置による最適蛍光波長及び最適励起波長の決定手順について図４のフローチャートを用いて説明する。
【００４０】
（１）走査範囲の設定（ステップＳ１１）
まず、ユーザが操作部７１で所定の操作を行うことにより、励起波長及び蛍光波長のそれぞれについて波長走査を行う範囲、励起側の波長走査を行うときの蛍光波長、及び蛍光側の波長走査するときの励起波長を設定する。
【００４１】
（２）溶媒の蛍光側スペクトル測定（ステップＳ１２）
続いて、溶媒（移動相）のみを試料セル６０に収容（キュベットセルに収容又はフローセルに封入）し、励起波長をステップＳ１１で設定された波長に固定した状態で蛍光波長を走査してその際の蛍光スペクトルを測定する。具体的には、まず、ユーザが操作部７１から光源５１を点灯し蛍光波長の走査開始を指示することにより、励起側回折格子５４が所定の角度まで回転して停止する。続いて、蛍光側回折格子６３が上記ステップＳ１１で設定された波長範囲に対応した角度範囲で回動し、その間に蛍光検出器６６側及び対照光検出器５９側から出力される信号がデータ処理部７４に送られる。データ処理部７４では、信号補正部７５において蛍光検出器６６側の出力信号が対照光検出器５９側の出力信号を用いて補正され、得られた蛍光信号に基づいてスペクトル生成部７６で各蛍光波長における蛍光強度を表すスペクトル（以下、「蛍光側スペクトル」と呼ぶ）が生成されて、記憶部７３に格納される。
【００４２】
また、スペクトル生成部７６は、このときのＡ／Ｄ変換部６６ｂの出力信号とプリアンプ６６ａにおける電流−電圧変換のゲインから蛍光検出器６６の出力電流を逆算し、各波長における蛍光検出器６６の出力電流値を示すスペクトル（以下、「蛍光検出器の電流スペクトル」と呼ぶ）を生成して記憶部７３に格納する。また同様に、Ａ／Ｄ変換部５９ｂの出力信号とプリアンプ５９ａにおける電流−電圧変換のゲインから対照光検出器５９の出力電流を逆算し、各波長における対照光検出器５９の出力電流値を示すスペクトル（以下、「対照光検出器の電流スペクトル」と呼ぶ）を作成して記憶部７３に格納する。なお、以上で取得された溶媒の蛍光側スペクトル、蛍光検出器の電流スペクトル、及び対照光検出器の電流スペクトルが前記本発明の第２の態様のものにおける第１の測定データに相当する。
【００４３】
（３）試料溶液の蛍光側スペクトル測定（ステップＳ１３）
次に、試料セル６０内に目的成分を含む溶媒（以下「試料溶液」と呼ぶ）を収容した状態で、上記ステップＳ１２と同様にして試料溶液の蛍光側スペクトルを取得して、記憶部７３に格納する。なお、ここで取得された試料溶液の蛍光側スペクトルが前記本発明の第２の態様のものにおける第２の測定データに相当する。
【００４４】
（４）最適蛍光波長の決定（ステップＳ１４）
以上により、蛍光側スペクトルの測定が完了したら、制御演算部７０は、ステップＳ１２で取得された溶媒の各種のスペクトルとステップＳ１３で取得された試料溶液の蛍光側スペクトルを記憶部７３からデータ処理部７４へ読み出す。データ処理部７４の最適波長決定部７７では、試料溶液の蛍光側スペクトルから溶媒の蛍光側スペクトルを減算することにより、目的成分の蛍光側スペクトルが求められ、更に、ステップＳ１２で取得された前記蛍光検出器の電流スペクトル及び対照光検出器の電流スペクトルから溶媒由来のノイズ量の推定値を算出する。
【００４５】
ここで、溶媒由来のノイズ量の推定値は以下のようにして求められる。各波長における蛍光検出器６６の出力電流をIm、対照光検出器５９の出力電流をIxとすると、蛍光検出器６６におけるショットノイズΔImと、対照光検出器５９におけるショットノイズΔIxは、それぞれ、ΔIm＝√(2qImBm)、ΔIx＝√(2qIxBx)で表される（q：電子の電荷、Bm：蛍光検出器側の周波数帯域幅、Bx：対照光検出器側の周波数帯域幅、通常BmとBxは等しく設定する）。また、蛍光検出器６６側のプリアンプ６６ａのゲインをkm、対照光検出器５９側のプリアンプ５９ａのゲインをkxとすると、蛍光強度F(Im,Ix)は次の式で算出される。
【００４６】
【数７】
0005516486.tif 000005
【００４７】
蛍光検出器６６におけるショットノイズΔImと、対照光検出器５９におけるショットノイズΔIxは電流変動の標準偏差であり、ノイズ量ΔFの分散(ΔF)2は次の式で求められる。
【００４８】
【数８】
0005516486.tif 000006
【００４９】
これらから溶媒のノイズ量ΔFは、以下の式で推定される。
【００５０】
【数９】
0005516486.tif 000007
【００５１】
この式は、プリアンプのゲインkx、km及び電子の電荷qが定数であることから、ノイズ量ΔFは次式のように表すこともできる。
【００５２】
【数１０】
0005516486.tif 000008
【００５３】
このとき、各波長のＳＮ比の大小を比較する目的においては次の式で算出されるノイズ量ΔFを代用することができる。
【００５４】
【数１１】
0005516486.tif 000009
【００５５】
さらに、蛍光検出器側の周波数帯域幅Bmと対照光検出器側の周波数帯域幅長Bxを通常は等しく設定することから、その場合は次の式のノイズ量ΔFを使用することができる。
【００５６】
【数１２】
0005516486.tif 000010
【００５７】
そして、最適波長決定部７７は、以上により求められた溶媒由来の各波長におけるノイズ量の推定値によって前記目的成分の蛍光側スペクトル上の各波長における蛍光強度値を除算することにより、各波長におけるＳＮ比の推定値を求め、この値が最大となる蛍光波長を最適蛍光波長として決定する。
【００５８】
（５）溶媒の励起側スペクトル測定（ステップＳ１５）
続いて、溶媒のみを試料セル６０に収容し、蛍光波長を所定の一点に固定した状態で励起波長を走査してその際の蛍光スペクトルを測定する。このときの蛍光波長は、ステップＳ１１で設定された蛍光波長、ステップＳ１４で求められたＳＮ比が最大となる蛍光波長、前記目的成分の蛍光側スペクトルの蛍光強度値が最大となる蛍光波長のいずれかに設定する。具体的には、まず、ユーザが操作部７１から励起波長の走査開始を指示することにより、蛍光側回折格子６３が所定の角度まで回転して停止する。続いて、励起側回折格子５４が上記ステップＳ１１で設定された波長範囲に対応した角度範囲で回動し、その間に蛍光検出器６６側及び対照光検出器５９側から出力される信号がそれぞれデータ処理部７４に送られる。データ処理部７４では、信号補正部７５において蛍光検出器６６側の出力信号が対照光検出器５９側の出力信号を用いて補正され、得られた蛍光信号に基づいてスペクトル生成部７６で各励起波長における蛍光強度を表すスペクトル（以下、「励起側スペクトル」と呼ぶ）が生成されて、該スペクトルが記憶部７３に格納される。
【００５９】
また、スペクトル生成部７６は、このときのＡ／Ｄ変換部６６ｂの出力信号とプリアンプ６６ａにおける電流−電圧変換のゲインから蛍光検出器６６の出力電流を逆算し、各波長における蛍光検出器６６の出力電流値を示す蛍光検出器の電流スペクトルを生成して記憶部７３に格納する。また同様に、Ａ／Ｄ変換部５９ｂの出力信号とプリアンプ５９ａにおける電流−電圧変換のゲインから対照光検出器５９の出力電流を逆算し、各波長における対照光検出器５９の出力電流値を示す対照光検出器の電流スペクトルを作成して記憶部７３に格納する。なお、ここで取得された溶媒の励起側スペクトル、蛍光検出器の電流スペクトル、及び対照光検出器の電流スペクトルが前記本発明の第１の態様のものにおける第１の測定データに相当する。
【００６０】
（６）試料溶液の励起側スペクトル測定（ステップＳ１６）
続いて、試料セル６０内に上記試料溶液を収容した状態で、ステップＳ１５と同様にして励起側スペクトルを取得して記憶部７３に格納する。なお、ここで取得された試料溶液の励起側スペクトルが前記本発明の第１の態様のものにおける第２の測定データに相当する。
【００６１】
（７）最適励起波長の決定（ステップＳ１７）
以上で取得された励起側スペクトルを用いて、上記ステップＳ１４と同様の方法により最適励起波長の決定を行う。すなわち、制御演算部７０は、ステップＳ１５で取得された溶媒の各種のスペクトルとステップＳ１６で取得された試料溶液の励起側スペクトルデータを記憶部７３からデータ処理部７４へ読み出す。データ処理部７４の最適波長決定部７７では、前記試料溶液の励起側スペクトルから前記溶媒の励起側スペクトルを減算することにより、目的成分の励起側スペクトルが求められ、更に、ステップＳ１５で取得された前記蛍光検出器の電流スペクトル及び対照光検出器の電流スペクトルから溶媒由来のノイズ量の推定値を算出する。
【００６２】
ここで、溶媒由来のノイズ量の推定値ΔFはステップＳ１４と同様に以下のようにして求められる。
【００６３】
【数１３】
0005516486.tif 000011
【００６４】
各波長のＳＮ比の大小を比較する目的においては、ノイズ量の推定値ΔFは次式で求められる値が使用できる。
【００６５】
【数１４】
0005516486.tif 000012
【００６６】
また、蛍光検出器側の周波数帯域幅Bmと対照光検出器側の周波数帯域幅各波長Bxを等しく設定した場合、ノイズ量の推定値ΔFは次式で求められる値が使用できる。
【００６７】
【数１５】
0005516486.tif 000013
【００６８】
そして、最適波長決定部７７は、以上により求められた溶媒由来の各波長におけるノイズ量の推定値によって前記目的成分の励起側スペクトル上の各波長における蛍光強度値を除算することにより、各波長におけるＳＮ比の推定値を求め、この値が最大となる励起波長を最適励起波長として決定する。
【００６９】
（８）結果の表示（ステップＳ１８）
上記一連の行程が完了したら、制御演算部７０は上記ステップＳ１４、１７で決定された最適蛍光波長及び最適励起波長の値を表示部７２に表示させる。なお、最適蛍光波長及び最適励起波長の値を表示する代わりに、各励起波長又は各蛍光波長におけるＳＮ比を示すグラフを表示することで、最適波長を視覚的に分かりやすく表すようにしてもよい。
【００７０】
以上の最適蛍光波長及び最適励起波長の決定手順は対照光検出器を装備した蛍光測定装置について示した例であるが、これを、対照光検出器を持たない蛍光測定装置の場合や、対照光検出器の受光量に対し蛍光検出器の受光量がはるかに小さく、蛍光測定装置のＳＮ比への影響が蛍光検出器側のノイズが大部分で対照光検出器側のノイズがほとんど影響しない場合の最適蛍光波長及び最適励起波長の決定手順に変形した例について、図４のフローチャートを用いて説明する。
【００７１】
（１）走査範囲の設定（ステップＳ１１）
まず、ユーザが操作部７１で所定の操作を行うことにより、励起波長及び蛍光波長のそれぞれについて波長走査を行う範囲、励起側の波長走査を行うときの蛍光波長、蛍光側の波長走査するときの励起波長を設定する。
【００７２】
（２）溶媒の蛍光側スペクトル測定（ステップＳ１２）
続いて、溶媒（移動相）のみを試料セル６０に収容（キュベットセルに収容又はフローセルに封入）し、励起波長をステップＳ１１で設定された波長に固定した状態で蛍光波長を走査してその際の蛍光スペクトルを測定する。具体的には、まず、ユーザが操作部７１から光源５１を点灯し蛍光波長の走査開始を指示することにより、励起側回折格子５４が所定の角度まで回転して停止する。続いて、蛍光側回折格子６３が上記ステップＳ１１で設定された波長範囲に対応した角度範囲で回動し、その間に蛍光検出器６６から出力される信号がデータ処理部７４に送られる。データ処理部７４では、得られた蛍光信号に基づいてスペクトル生成部７６で各蛍光波長における蛍光強度を表すスペクトル（以下、「蛍光側スペクトル」と呼ぶ）が生成されて、記憶部７３に格納される。
【００７３】
（３）試料溶液の蛍光側スペクトル測定（ステップＳ１３）
次に、試料セル６０内に目的成分を含む溶媒（以下「試料溶液」と呼ぶ）を収容した状態で、上記ステップＳ１２と同様にして蛍光側スペクトルを取得して、記憶部７３に格納する。
【００７４】
（４）最適蛍光波長の決定（ステップＳ１４）
以上により、蛍光側スペクトルの測定が完了したら、制御演算部７０は、ステップＳ１２で取得された溶媒の蛍光側スペクトルとステップＳ１３で取得された試料溶液の蛍光側スペクトルを記憶部７３からデータ処理部７４へ読み出す。データ処理部７４の最適波長決定部７７では、試料溶液の蛍光側スペクトルから溶媒の蛍光側スペクトルを減算することにより、目的成分の蛍光側スペクトルが求められ、更に、該目的成分の蛍光側スペクトル上の各波長における蛍光強度値が前記溶媒の蛍光側スペクトル上の対応する波長における蛍光強度値の平方根で除算される。蛍光検出器６６におけるノイズの大半はショットノイズであり、該ショットノイズの大きさは測定された蛍光強度の平方根に比例するため、以上の演算で得られる値が最大となる波長がＳＮ比が最大となる蛍光波長（すなわち最適蛍光波長）となる。
【００７５】
（５）溶媒の励起側スペクトル測定（ステップＳ１５）
続いて、溶媒のみを試料セル６０に収容し、蛍光波長を所定の一点に固定した状態で励起波長を走査してその際の蛍光スペクトルを測定する。このときの蛍光波長は、ステップＳ１１で設定された蛍光波長、ステップＳ１４で求められたＳＮ比が最大となる蛍光波長、前記目的成分の蛍光側スペクトルの蛍光強度値が最大となる蛍光波長のいずれかに設定する。具体的には、まず、ユーザが操作部７１から励起波長の走査開始を指示することにより、蛍光側回折格子６３が所定の角度まで回転して停止する。続いて、励起側回折格子５４が上記ステップＳ１１で設定された波長範囲に対応した角度範囲で回動し、その間に蛍光検出器６６から出力される信号がデータ処理部７４に送られる。データ処理部７４では、得られた蛍光信号に基づいてスペクトル生成部７６で各励起波長における蛍光強度を表すスペクトル（以下、「励起側スペクトル」と呼ぶ）が生成されて、該スペクトルが記憶部７３に格納される。
【００７６】
（６）試料溶液の励起側スペクトル測定（ステップＳ１６）
続いて、試料セル６０内に上記試料溶液を収容した状態で、ステップＳ１５と同様にして励起側スペクトルを取得して記憶部７３に格納する。
【００７７】
（７）最適励起波長の決定（ステップＳ１７）
以上で取得された励起側スペクトルを用いて、上記ステップＳ１４と同様の方法により最適励起波長の決定を行う。すなわち、制御演算部７０は、ステップＳ１５で取得された溶媒の励起側スペクトルとステップＳ１６で取得された試料溶液の励起側スペクトルデータを記憶部７３からデータ処理部７４へ読み出す。データ処理部７４の最適波長決定部７７では、前記試料溶液の励起側スペクトルから前記溶媒の励起側スペクトルを減算することにより、目的成分の励起側スペクトルが求められ、更に、該目的成分の励起側スペクトル上の各波長における蛍光強度値が、前記溶媒の励起側スペクトル上の対応する波長における蛍光強度値の平方根で除算される。以上の演算によって得られる値が最大となる波長がＳＮ比が最大となる励起波長（すなわち最適励起波長）となる。
【００７８】
（８）結果の表示（ステップＳ１８）
上記一連の行程が完了したら、制御演算部７０は上記ステップＳ１４、１７で決定された最適蛍光波長及び最適励起波長の値を表示部７２に表示させる。なお、最適蛍光波長及び最適励起波長の値を表示する代わりに、各励起波長又は各蛍光波長におけるＳＮ比を示すグラフを表示することで、最適波長を視覚的に分かりやすく表すようにしてもよい。
【００７９】
なお、上記では各波長における目的成分の蛍光強度値を各波長の溶媒由来の推定されたノイズで除算した推定ＳＮ比が最大となる波長を最適な波長としているが、これに限定されるものではなく、例えば、前記試料溶液として目的成分を既知濃度で含むものを使用し、各波長における溶媒由来のノイズ量の推定値を同一波長における目的成分の蛍光強度値で除算した値と、前記試料溶液中における目的成分の濃度とに基づいて検出限界に相当する値を求め、その値が最小となる波長を最適な波長としてもよい。また、溶媒の蛍光側スペクトル、試料溶液の蛍光側スペクトル、溶媒の励起側スペクトル、及び試料溶液の励起側スペクトルの順に測定を行ったが、測定順序は上記に限定されるものではない。例えば、蛍光側と励起側のスペクトル測定の順序を逆にしてもよい。あるいは、溶媒の蛍光側スペクトルと励起側スペクトルを続けて測定し、次に試料溶液の蛍光側スペクトルと励起側スペクトルを続けて測定して、溶媒と試料溶液の交換の手間を減らしてもよい。
【００８０】
以上により求められた最適蛍光波長及び最適励起波長を用いて上記ＬＣシステムによるクロマトグラフ分析を行う際には、まず、ユーザが操作部７１を用いて光源５１を点灯し、上記最適蛍光波長及び最適励起波長を測定に使用する蛍光波長及び励起波長として設定する。すると励起側回折格子５４及び蛍光側回折格子６３がそれぞれ設定された最適波長に対応した角度まで回転して停止する。その後、ユーザがクロマトグラフ測定の開始を指示すると測定が開始される。これにより、カラムから順次溶出してフローセル６０を通過する溶媒及び目的成分が最適励起波長及び最適蛍光波長で測定され、保持時間を横軸、蛍光強度を縦軸としたクロマトグラムがクロマトグラム生成部７８で生成される。
【００８１】
以上の通り、本発明に係る蛍光測定装置によれば、ＳＮ比が高く検出限界が小さくなる励起波長及び／又は蛍光波長を求めることができ、目的成分の検出に最適な波長で測定を行うことが可能となる。
【００８２】
なお、上記実施例では、最適波長の決定を行う際に、測定試料である溶媒や試料溶液をキュベットセルに収容又はフローセルに封入し、ユーザが手動で測定試料の交換及び蛍光側又は励起側スペクトルの測定開始の指示を行う構成としたが、本発明に係る蛍光測定装置は、前記試料溶液をフローセルに通液させながら、所定のタイミングで自動的に蛍光側スペクトル及び励起側スペクトルの測定を実行する構成とすることもできる。この場合、前記スペクトルの測定タイミングは、例えば、記憶部７３等に記憶されたタイムプログラム等によって決定されるものとしてもよく、あるいは蛍光検出器６６等から出力される蛍光信号に基づいて目的成分の通過を検出することにより決定されるものとしてもよい。
【００８３】
上記タイムプログラムによる自動測定を行う場合には、試料注入から所定時間後の第１のタイミング及び目的成分の溶出時間に対応した第２のタイミングでそれぞれスペクトル測定を実行するよう定めたタイムプログラムを予めユーザが操作部７１を用いて設定して記憶部７３に記憶させる。その後、フローセル６０内にカラム４１から溶出してくる溶媒が通液され、試料注入装置３０によって溶媒流路中に試料が注入されると共に、該試料注入のタイミングを示すトリガ信号が発信される。制御演算部７０は、試料注入装置３０から直接、又はシステムコントローラを介して前記トリガ信号を受信し、前記タイムプログラムに従って各部を制御することにより試料注入直後の溶媒のみがフローセル６０内に存在する時点における蛍光側スペクトル（又は励起側スペクトル）と、溶媒及び目的成分がフローセル内に存在する時点における蛍光側スペクトル（又は励起側スペクトル）を取得する。
【００８４】
また、上記目的成分の通過検出による自動測定を行う場合には、カラム４１から溶出する溶媒をフローセル６０内に通液させ、試料注入装置３０によって溶媒流路中に試料が注入された直後にまず溶媒の蛍光側スペクトル（又は励起側スペクトル）の測定を実行し、その後、励起波長及び蛍光波長を各々所定の一点に固定した状態で蛍光信号をモニタし、該蛍光強度の変化から試料成分の通過が検知された時点で自動的に当該成分を含む溶媒の蛍光側スペクトル（又は励起側スペクトル）の測定を行う。
【００８５】
なお、上記のようにフローセル６０内を通過する目的成分のスペクトルを測定する際には、より確実な測定が行えるよう、フローセル６０内に目的成分が存在しているタイミングで、流路切替バルブ（図示略）等によってカラム４１から溶出される溶媒の流路を切り換えることによりフローセル６０内への溶媒の流入を一時的に停止させ、フローセル６０内に試料成分を留めた状態で波長走査を行うことが望ましい。
【実施例２】
【００８６】
次に、本発明の第２の実施例に係る蛍光測定装置について説明する。図５に本実施例に係る蛍光測定装置の光学系の構成の一例を示す。なお、図２と同一の構成については同一の符号を付し、適宜説明を省略する。本実施例の蛍光測定装置は、実施例１の蛍光測定装置における蛍光側格子駆動機構６４、蛍光側出口スリット６５、及び該スリット６５を通過した光を検出する蛍光検出器６６の代わりに、ＣＣＤ等の受光素子を直線状に複数個配置して成るマルチチャンネル型の光検出器６７を設けたものである。本実施例では、蛍光側回折格子６３によって波長分散された蛍光はマルチチャンネル型光検出器６７によって所定の波長範囲に亘って多波長同時検出される。このような構成によれば、蛍光波長の走査が不要なため、最適波長の決定に掛かる時間を短縮できると共に、一度の励起波長の走査により、励起波長、蛍光波長、及び蛍光強度から成る三次元データを得ることができるため、各蛍光波長との組み合わせを考慮したより最適な励起波長を決定することができる。
【００８７】
以上、実施例を用いて本発明を実施するための形態について説明したが、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲で適宜変更が許容されるものである。
【００８８】
例えば、本発明に係る蛍光測定装置は、最適励起波長及び／又は最適蛍光波長をユーザに通知する通知手段に加えて、又は該通知手段の代わりに、最適蛍光波長及び／又は最適励起波長を以降の測定で使用する蛍光波長及び／又は励起波長として自動的に設定する波長設定手段を備えたものとしてもよい。この場合、最適波長決定部７７での演算により推定ＳＮ比が最大となった励起波長又は蛍光波長が、制御演算部７０によって以降の測定に使用する波長として決定され、記憶部７３に記憶される。すなわち、この場合、制御演算部７０及び記憶部７３が本発明における波長設定手段に相当する。
【００８９】
また、本発明に係る蛍光測定装置は、フローセル６０内に溶媒及び目的成分を通液させながら、所定の間隔でくり返し蛍光波長又は励起波長の走査を行うことにより、時間−波長−蛍光強度の３軸から成る三次元データを生成する機能を備えたものとしてもよい。この場合、試料注入直後におけるスペクトル（蛍光スペクトル又は励起スペクトル）を上記目的成分を含まない溶媒のスペクトルとし、その後の各時点で取得されたスペクトルを上記目的成分を含む溶媒のスペクトルとして上記同様の演算を行うことにより、試料注入後の各時点における最適蛍光波長又は最適励起波長を決定することができるため、一回の試料注入によって該試料中に含まれる複数の成分についてそれぞれ最適波長を決定することができる。従って、これにより決定された試料注入後の各時点における最適蛍光波長及び／又は最適励起波長を定めたタイムプログラムをユーザが手動で又は制御演算部７０によって自動的に設定して記憶部７３に記憶させ、該タイムプログラムに従って励起波長及び／又は蛍光波長を時間的に変化させながら上記ＬＣシステムによる分析を実行させることで、カラム４１によって時間的に分離されて溶出する各種試料成分をそれぞれ最適な蛍光波長及び／又は励起波長で検出することが可能となる。
【００９０】
また更に、本発明に係る蛍光測定装置は、試料をキュベットセルに収容又はフローセルに封入した状態で、励起波長又は蛍光波長の一方を所定の間隔で段階的に変化させながら、その各段階において他方を所定の波長範囲でくり返し走査することにより、励起波長−蛍光波長−蛍光強度の３軸から成る三次元データを生成するものとしてもよい。これにより、ＳＮ比が最大となる蛍光波長及び励起波長の組み合わせを知ることができ、より最適な波長設定を行うことが可能となる。
【実施例３】
【００９１】
以下、本発明に係る吸光度測定装置の実施例について説明する。図６は、本実施例に係る吸光度測定装置の光学系の概略的構成を示す。なお、本実施例に係る吸光度測定装置は図１と同様のＬＣシステムにおいて、カラム４１から溶出した試料成分を順次検出するための検出器５０として用いられるものである。
【００９２】
光源（例えば、重水素ランプ）８１の発する光は集光鏡８２によって集光され、入口スリット８３を通ってミラー８４に入射する。ミラー８４で反射された光は回折格子８５に入射し、波長方向に分散され、ミラー８７に入射する。ミラー８７の反射光はビームスプリッタ８８に入射し、２方向に分離される。すなわち、ビームスプリッタ８８を通過した光はスリット９３を通過して試料セル９０に入射し、この試料セル９０を通過した光（透過光）の光量がフォトダイオード等から成る透過光検出器９１で検出される。一方、ビームスプリッタ８８で反射された光はスリット９２を通過して対照光検出器（例えば、フォトダイオード）８９で検出される。なお、回折格子８５には、回転軸８５ａを中心として回折格子８５を回転駆動するための格子駆動機構８６が設けられており、該格子駆動機構８６で回折格子８５の向きを変えることにより試料セル９０に照射する光（照射光）の波長を所定波長範囲内で任意に設定することができる。
【００９３】
図７は、本実施例に係る吸光度測定装置の制御系の概略的構成を示すブロック図である。この制御系の中心は制御演算部１００であり、ユーザは操作部１０１を通じて制御演算部１００へ各種命令や設定データを入力することができる。また、モニタ等を備えた表示部１０２で測定結果等が表示される。ユーザが操作部１０１を通じて光源の点灯と照射光の波長を設定し、測定開始命令を制御演算部１００に入力すると、制御演算部１００は、光源８１を点灯し、回折格子８５が設定された波長に対応した方向を向くように格子駆動機構８６を制御する。また、光源８１を点灯した状態で、回折格子８５を所定の角度範囲で回転させるように格子駆動機構８６を制御することにより、照射光の波長を設定された波長範囲で走査することもできる（詳細は後述する）。測定の間、透過光検出器９１及び対照光検出器８９からの出力電流は、それぞれプリアンプ９１ａ、８９ａにおいて所定のゲインで電圧に変換され、Ａ／Ｄ変換部９１ｂ、８９ｂでデジタルデータに変換される。制御演算部１００は、これらのデジタルデータを順次データ処理部１０４へ送出する。
【００９４】
データ処理部１０４は、吸光度算出部１０５、スペクトル生成部１０６、最適波長決定部１０７、及びクロマトグラム生成部１０８を備えている。吸光度算出部１０５は、前記の透過光検出器９１側の出力信号を対照光検出器８９側の出力信号で除算し、その対数をとった値に負の符号をつけることで吸光度を算出し（後述の［数１６］参照）、得られた吸光度データを順次、スペクトル生成部１０６又はクロマトグラム生成部１０８に送出する。クロマトグラム生成部１０８は、前記吸光度データに基づき吸光度の時間変化を表すクロマトグラムを作成する。一方、スペクトル生成部１０６は、前記吸光度データに基づき各波長における吸光度を示す吸収スペクトルを作成する。また、詳細は後述するが、スペクトル生成部１０６は各波長における透過光検出器９１及び対照光検出器８９の出力電流を示すスペクトルの生成も行う。スペクトル生成部１０６で生成された各種スペクトルは記憶部１０３に格納される。最適波長決定部１０７は、記憶部１０３に格納されたスペクトルに基づいて所定の演算を行う（詳細は後述する）。なお、この例では記憶部１０３が本発明における記憶手段に相当し、最適波長決定部１０７、吸光度算出部１０５、及びスペクトル生成部１０６が協同して本発明における感度指標推定手段として機能する。
【００９５】
上記のデータ処理部１０４及び記憶部１０３等の機能は、吸光度測定装置の本体に内蔵された専用コンピュータによって具現化してもよく、所定のプログラムをインストールしたパーソナルコンピュータ等によって具現化してもよい。後者の場合、該パーソナルコンピュータは、吸光度測定装置本体に直接、接続されるか、上記ＬＣシステムを構成する各装置と相互に接続されたシステムコントローラを介して吸光度測定装置本体に接続され、該パーソナルコンピュータによって上記制御系の機能の一部が実現されることとなる。
【００９６】
以下、本実施例の吸光度測定装置による最適波長の決定手順について図８のフローチャートを用いて説明する。
【００９７】
（１）走査範囲の設定（ステップＳ２１）
まず、ユーザが操作部１０１で所定の操作を行うことにより、波長走査を行う範囲を設定する。
【００９８】
（２）溶媒の吸収スペクトル測定（ステップＳ２２）
続いて、溶媒（移動相）のみを試料セル９０に収容（キュベットセルに収容又はフローセルに封入）し、照射光の波長を走査してその際の吸収スペクトルを測定する。具体的には、まず、ユーザが操作部１０１を操作して光源８１を点灯させ、波長の走査開始を指示することにより、回折格子８５が上記ステップＳ２１で設定された波長範囲に対応した角度範囲で回動し、その間に透過光検出器９１側及び対照光検出器８９側から出力される信号がデータ処理部１０４に送られる。データ処理部１０４では、吸光度算出部１０５において前記透過光検出器９１側及び対照光検出器８９側の出力信号に基づいて前記溶媒の吸光度が順次算出され、更に、スペクトル生成部１０６で各波長における該溶媒の吸光度を示す吸収スペクトル（以下、「溶媒の吸収スペクトル」と呼ぶ）が生成されて記憶部１０３に格納される。
【００９９】
また、スペクトル生成部１０６は、このときのＡ／Ｄ変換部９１ｂの出力信号とプリアンプ９１ａにおける電流−電圧変換のゲインから透過光検出器９１の出力電流を逆算し、各波長における透過光検出器９１の出力電流値を示すスペクトル（以下、「透過光検出器の電流スペクトル」と呼ぶ）を生成して記憶部１０３に格納する。また同様に、Ａ／Ｄ変換部８９ｂの出力信号とプリアンプ８９ａにおける電流−電圧変換のゲインから対照光検出器８９の出力電流を逆算し、各波長における対照光検出器８９の出力電流値を示すスペクトル（以下、「対照光検出器の電流スペクトル」と呼ぶ）を作成して記憶部１０３に格納する。なお、以上で取得された溶媒の吸収スペクトル、透過光検出器の電流スペクトル、及び対照光検出器の電流スペクトルが前記本発明の第３の態様のものにおける第１の測定データに相当する。
【０１００】
（３）試料溶液の吸収スペクトル測定（ステップＳ２３）
次に、試料セル９０内に目的成分を含む溶媒（以下「試料溶液」と呼ぶ）を収容した状態で、上記ステップＳ２２と同様にして各波長における試料溶液の吸光度を示す吸収スペクトル（以下、「試料溶液の吸収スペクトル」と呼ぶ）を取得して、記憶部１０３に格納する。この試料溶液の吸収スペクトルが前記本発明の第３の態様のものにおける第２の測定データに相当する。
【０１０１】
（４）最適波長の決定（ステップＳ２４）
以上により、スペクトル測定が完了したら、制御演算部１００は、ステップＳ２２及びステップＳ２３で取得された各種スペクトルを記憶部１０３からデータ処理部１０４へ読み出し、最適波長決定部１０７に最適波長の決定を実行させる。最適波長決定部１０７は、前記試料溶液の吸収スペクトルから前記溶媒の吸収スペクトルを減算することにより、各波長における目的成分の吸光度を示すスペクトル（以下、「目的成分の吸収スペクトル」と呼ぶ）を求め、更に、前記透過光検出器の電流スペクトル及び対照光検出器の電流スペクトルから溶媒由来の吸光度のノイズ推定値を算出する。
【０１０２】
ここで、溶媒由来の吸光度のノイズ推定値は以下のようにして求められる。各波長における透過光検出器９１の出力電流をI、対照光検出器８９の出力電流をI0とすると、透過光検出器９１におけるショットノイズΔIと、対照光検出器８９におけるショットノイズΔI0は、それぞれ、ΔI＝√(2qIB)、ΔI0＝√(2qI0B0)で表される（q：電子の電荷、B：透過光検出器側の周波数帯域幅、B0：対照光検出器側の周波数帯域幅）。また、透過光検出器９１側のプリアンプ９１ａのゲインをk、対照光検出器８９側のプリアンプ８９ａのゲインをk0とすると、吸光度A(I,I0)は次の式で算出される。
【０１０３】
【数１６】
0005516486.tif 000014
ここでlogは常用対数である。
【０１０４】
透過光検出器９１におけるショットノイズΔIと、対照光検出器８９におけるショットノイズΔI0は電流変動の標準偏差であり、ノイズΔAの分散(ΔA)2は次の式で求められる。
【０１０５】
【数１７】
0005516486.tif 000015
【０１０６】
これらから溶媒由来の吸光度のノイズΔAは、以下の式で推定される。
【０１０７】
【数１８】
0005516486.tif 000016
ここでlnは自然対数を示す。
【０１０８】
この式は、電子の電荷qが定数であることから、ノイズΔAは次式のように表すことができる。
【０１０９】
【数１９】
0005516486.tif 000017
【０１１０】
このとき、各波長のＳＮ比の大小を比較する目的においては次の式で算出されるノイズ量ΔAを代用することができる。
【０１１１】
【数２０】
0005516486.tif 000018
【０１１２】
さらに、透過光検出器側の周波数帯域幅Bと対照光検出器側の周波数帯域幅B0を通常は等しく設定することから、その場合はノイズΔAは次式のように表すことができる。
【０１１３】
【数２１】
0005516486.tif 000019
【０１１４】
そして、最適波長決定部１０７は、以上により求められた溶媒由来の吸光度のノイズ推定値によって前記目的成分の吸収スペクトル上の各波長における吸光度値を除算することにより、各波長におけるＳＮ比の推定値を求め、この値が最大となる波長を最適波長として決定する。
【０１１５】
（５）結果の表示（ステップＳ２５）
上記一連の行程が完了したら、制御演算部１００は上記ステップＳ２４で求められた最適波長の値を表示部１０２に表示させる。なお、最適波長の値を表示する代わりに、各波長におけるＳＮ比を示すグラフを表示することで、最適波長を視覚的に分かりやすく表すようにしてもよい。
【０１１６】
以上により求められた最適波長を用いて上記ＬＣシステムによるクロマトグラフ分析を行う際には、まず、ユーザが操作部１０１を用いて光源８１を点灯し、上記最適波長を測定に使用する波長として設定する。すると、回折格子８５が設定された最適波長に対応した角度まで回転して停止する。その後、ユーザがクロマトグラフ測定の開始を指示すると、カラムから順次溶出してフローセルを通過する溶媒及び目的成分が最適波長で測定され、保持時間を横軸、吸光度を縦軸としたクロマトグラムがクロマトグラム生成部１０８で生成される。
【０１１７】
以上の通り、本発明に係る吸光度測定装置によれば、ＳＮ比が高く検出限界が小さくなる波長を求めることができ、目的成分の検出に最適な波長で測定を行うことが可能となる。また、上記手順ではＳＮ比を求めているが、各波長における溶媒由来のノイズ量の推定値を同一波長における目的成分の吸光度値で除算した値と、前記試料溶液中における目的成分の濃度とに基づいて検出限界に相当する値を求め、その値が最小となる波長を最適な波長としてもよい。
【０１１８】
なお、上記実施例では、最適波長の決定を行う際に、測定試料である溶媒や試料溶液をキュベットセルに収容又はフローセルに封入し、ユーザが手動で測定試料の交換及びスペクトル測定開始の指示を行う構成としたが、本発明に係る吸光度測定装置は、前記試料溶液をフローセルに通液させながら、所定のタイミングで自動的に吸収スペクトルの測定を実行する構成とすることもできる。この場合、前記スペクトルの測定タイミングは、例えば、記憶部１０３等に記憶されたタイムプログラム等によって決定されるものとしてもよく、あるいは透過光検出器９１側の出力信号に基づいて目的成分の通過を検出することにより決定されるものとしてもよい。
【０１１９】
上記タイムプログラムによる自動測定を行う場合には、試料注入から所定時間後の第１のタイミング及び目的成分の溶出時間に対応した第２のタイミングでそれぞれスペクトル測定を実行するよう定めたタイムプログラムを予めユーザが操作部１０１を用いて設定して記憶部１０３に記憶させる。その後、フローセル９０内にカラム４１から溶出してくる溶媒が通液され、試料注入装置３０によって溶媒流路中に試料が注入されると共に、該試料注入のタイミングを示すトリガ信号が発信される。制御演算部１００は、試料注入装置３０から直接、又はシステムコントローラを介して前記トリガ信号を受信し、前記タイムプログラムに従って各部を制御することにより試料注入直後の溶媒のみがフローセル９０内に存在する時点における吸収スペクトルと、溶媒及び目的成分がフローセル内に存在する時点における吸収スペクトルを取得する。
【０１２０】
また、上記目的成分の通過検出による自動測定を行う場合には、カラム４１から溶出する溶媒をフローセル９０内に通液させ、試料注入装置３０によって溶媒流路中に試料が注入された直後にまず溶媒の吸収スペクトルの測定を実行し、その後、波長を所定の一点に固定した状態で吸光度信号をモニタし、該吸光度の変化から試料成分の通過が検知された時点で自動的に当該成分を含む溶媒の吸収スペクトルの測定を行う。
【０１２１】
なお、上記のようにフローセル９０内を通過する目的成分のスペクトルを測定する際には、より確実な測定が行えるよう、フローセル９０内に目的成分が存在しているタイミングで、流路切替バルブ（図示略）等によってカラム４１から溶出される溶媒の流路を切り換えることによりフローセル９０内への溶媒の流入を一時的に停止させ、フローセル９０内に試料成分を留めた状態で波長走査を行うことが望ましい。
【０１２２】
なお、本実施例では、図６のように、試料セル９０の前段にビームスプリッタ８８を設け、照射光を該ビームスプリッタ８８で分岐させて試料セル９０と対照光検出器８９に入射させる構成としたが、このような構成の他、図９に示すようなフローセル９０を使用する構成としてもよい。図９のフローセル９０は、液体を流通させるための流路９０ａの他に、光を通過させるための貫通孔９０ｂを備えている。所定の手段によって平行化された照射光が該フローセル９０に照射されると、該照射光の一部はレンズ９０ｃに入射して流路９０ａを通過し、レンズ９０ｄを介して後段の透過光検出器９１に入射する。一方、前記照射光の別の一部は貫通孔９０ｂを通過して後段に配置された対照光検出器８９に入射する。このような構成によれば、ビームスプリッタを省略することができ、より安価に製造することが可能となる。
【実施例４】
【０１２３】
次に、本発明に係る吸光度測定装置の他の実施例について説明する。図１０に本実施例に係る吸光度測定装置の光学系の構成を示す。光源１１１から出射された光は集光鏡１１２によって集光されて試料セル１１３に照射される。試料セル１１３を通過した光はミラー１１４によって集光され、スリット１１５上に照射される。スリット１１５を通過した光は凹面回折格子１１６で分光され、フォトダイオードアレイ等の受光素子を直線状に複数個配置して成るマルチチャンネル型の光検出器１１７上に結像される。このような構成によれば、回折格子１１６によって波長分散された光をマルチチャンネル型光検出器１１７によって所定の波長範囲に亘って多波長同時検出することができるため、波長の走査が不要となり、最適波長の決定に掛かる時間を短縮できる。なお、制御系の構成については、格子駆動機構及び対照光検出器等を有しない点以外は、図７に示したものとほぼ同様であるため、図示を省略する。
【０１２４】
以下、本実施例の吸光度測定装置による最適波長の決定手順について図１１のフローチャートを用いて説明する。
【０１２５】
まず、溶媒（移動相）のみを試料セル１１３に収容した状態で該試料セル１１３に光源１１１からの光を照射し、このときマルチチャンネル型光検出器１１７で検出される各波長の透過光量を記憶部１０３に格納する（ステップＳ３１）。次に、目的成分を含む溶媒（以下「試料溶液」と呼ぶ）を試料セル１１３に収容した状態で同様に各波長の透過光量を測定する（ステップＳ３２）。
【０１２６】
このとき測定された試料溶液の透過光量と記憶部１０３に記憶された溶媒の透過光量の比から、吸光度算出部１０５において、各波長における目的成分の吸光度を示すスペクトル（以下、これを「目的成分の吸収スペクトル」と呼ぶ）が次の式で生成され、記憶部１０３に格納される（ステップＳ３３）。
【０１２７】
【数２２】
0005516486.tif 000020
ここで、kはマルチチャンネル型検出器１１７の出力電流を電圧に変換するプリアンプのゲイン、Icは試料溶液の測定時におけるマルチチャンネル型検出器１１７の出力電流、Isは溶媒の測定時におけるマルチチャンネル型検出器１１７の出力電流である。
【０１２８】
次に、最適波長決定部１０７が、上記溶媒の測定におけるマルチチャンネル型光検出器１１７の出力信号（ステップＳ３１で取得され記憶部１０３に格納される）から該マルチチャンネル型光検出器１１７を構成する各受光素子の出力電流を逆算し、これに基づいて各波長における溶媒由来の吸光度のノイズ推定値を算出する。ここで、溶媒測定時におけるマルチチャンネル型光検出器１１７の各受光素子の出力電流をIsとすると、各素子におけるショットノイズΔIsは、ΔIs＝√(2qIsB)で表される（q：電子の電荷、B：周波数帯域幅）。また、本実施例では、対照光検出器を装備していないので吸光度のノイズは［数１８］の対照光検出器に関する項を除いたものになり、溶媒由来のノイズΔAは、以下の式で推定される。
【０１２９】
【数２３】
0005516486.tif 000021
【０１３０】
周波数帯域幅B、電子の電荷qが定数であり、各波長のＳＮ比の大小を比較する目的においては、ノイズ量ΔAは次式のように表すこともできる。
【０１３１】
【数２４】
0005516486.tif 000022
【０１３２】
以上により求められた溶媒由来のノイズ推定値によってステップＳ３３で求めた目的成分の吸収スペクトル上の各波長における吸光度値を除算することにより、各波長におけるＳＮ比の推定値が求められる。そして、この値が最大となる波長が最適波長として決定され（ステップＳ３４）、該最適波長の値が表示部１０２に表示される（ステップＳ３５）。このようにして決定された最適波長は、例えば前記目的成分の定量分析を行う際の波長として利用される。
【０１３３】
なお、本発明に係る吸光度測定装置は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲で適宜変更が許容されるものである。例えば、ＳＮ比の代わりに、各波長の溶媒由来のノイズ推定値を各波長の目的成分の吸光度値で除算した値に前記試料溶液中における目的成分の濃度を乗算することで検出限界となる濃度に相当する値を求めて、その値が最小となる波長を最適波長としてもよい。本発明に係る吸光度測定装置は、最適波長をユーザに通知する通知手段に加えて、又は該通知手段の代わりに、最適波長を以降の測定で使用する波長として自動的に設定する波長設定手段を備えたものとしてもよい。この場合、最適波長決定部１０７での演算により推定ＳＮ比が最大となった波長が、制御演算部１００によって以降の測定に使用する波長として決定され、記憶部１０３に記憶される。すなわち、この場合、制御演算部１００及び記憶部１０３が本発明における波長設定手段に相当する。
【０１３４】
また、本実施例のように固定された回折格子１１６とマルチチャンネル型の光検出器１１７を設ける代わりに、試料セル１１３の後段に、回動する回折格子とその回折光が透過するスリット、及びそのスリットを透過する光を検出する検出器を設けた構成とし、回折格子を回動することにより、試料セルを通過して検出器に入射する光の波長を走査して所定の波長範囲のデータを得るようにしてもよい。
【０１３５】
また、図１０の例では対照光検出器を装備していないが、対照光検出器を装備した場合、その最適波長の決定手順は実施例３と同様となる。この場合の対照光の検出方法の例としては、図１０における集光鏡１１２と試料セル１１３の間にビームスプリッタを設置し、その反射光を透過光とは別途に設置したミラー、スリット、凹面回折格子、マルチチャンネル型の光検出器により集光、分光、検出を行う方法がある。
【０１３６】
また、本発明に係る吸光度測定装置は、フローセル内に溶媒及び目的成分を通液させながら、所定の間隔でくり返し波長の走査を行うことにより、時間−波長−吸光度の３軸から成る三次元データを生成する機能を備えたものとしてもよい。この場合、試料注入直後における吸収スペクトルを上記目的成分を含まない溶媒のスペクトルとし、その後の各時点で取得されたスペクトルを上記目的成分を含む溶媒のスペクトルとして上記同様の演算を行うことにより、試料注入後の各時点における最適波長を決定することができるため、一回の試料注入によって該試料中に含まれる複数の成分についてそれぞれ最適波長を決定することができる。従って、これにより決定された試料注入後の各時点における最適波長を定めたタイムプログラムをユーザが手動で又は制御演算部１００によって自動的に設定して記憶部１０３に記憶させ、該タイムプログラムに従って測定に使用する波長を時間的に変化させながら上記ＬＣシステムによる分析を実行させることで、カラムによって時間的に分離されて溶出する各種試料成分をそれぞれ最適な波長で検出することが可能となる。
【符号の説明】
【０１３７】
５１、８１、１１１…光源
５４、６３、８５、１１６…回折格子
６０、９０、１１３…試料セル
５９、８９…対照光検出器
６６…蛍光検出器
９１…透過光検出器
６７、１１７…マルチチャンネル型光検出器
７０、１００…制御演算部
７１、１０１…操作部
７２、１０２…表示部
７３、１０３…記憶部
７４、１０４…データ処理部
７５…信号補正部
１０５…吸光度算出部
７６、１０６…スペクトル生成部
７７、１０７…最適波長決定部
７８、１０８…クロマトグラム生成部
【図１】
0005516486.tif 000026
【図２】
0005516486.tif 000027
【図３】
0005516486.tif 000028
【図４】
0005516486.tif 000029
【図５】
0005516486.tif 000030
【図６】
0005516486.tif 000031
【図７】
0005516486.tif 000032
【図８】
0005516486.tif 000033
【図９】
0005516486.tif 000034
【図１０】
0005516486.tif 000035
【図１１】
0005516486.tif 000036