(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
三倍体メス牡蠣の卵を二倍体オス牡蠣の精子と受精させる段階と；
前記受精された卵から第一極体の放出を阻止する段階と；及び
前記受精された卵を培養して生育可能な四倍体牡蠣を生産する段階と；を含み、第一極体の放出阻止は、サイトカラシンＢ（ＣＢ）と６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）に、前記受精された卵を接触させる段階を含み、
前記接触は、前記受精された卵と、サイトカラシンＢ（ＣＢ）と６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）とを順次に接触させることである
生育可能な四倍体牡蠣を生産する方法。
【請求項２】
三倍体メス牡蠣の卵を二倍体オス牡蠣の精子と受精させる段階と；
前記受精された卵から第一極体の放出を阻止する段階と；及び
前記受精された卵を培養して生育可能な四倍体牡蠣を生産する段階と；を含み、第一極体の放出阻止は、サイトカラシンＢ（ＣＢ）と６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）に、前記受精された卵を接触させる段階を含み、
前記接触は、サイトカラシンＢ（ＣＢ）と前記受精された卵を接触させた後、６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）と前記受精された卵とを接触させることである
生育可能な四倍体牡蠣を生産する方法。
【請求項３】
前記接触は、受精後５分にサイトカラシンＢ（ＣＢ）と前記受精された卵を接触させた後、受精後１０分に６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）と前記受精された卵とを接触させることである
請求項２に記載の生育可能な四倍体牡蠣を生産する方法。
【請求項４】
前記接触は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中の０．２５ないし１．０ｐｐｍ濃度のサイトカラシンＢ（ＣＢ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中の０．２５ないし１．０ｐｐｍ濃度の６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）に前記受精された卵を添加することである
請求項１、請求項２または請求項３に記載の生育可能な四倍体牡蠣を生産する方法。
【請求項５】
前記接触は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中の０．２５ないし０．７５ｐｐｍ濃度のサイトカラシンＢ（ＣＢ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中の０．２５ないし０．７５ｐｐｍ濃度の６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）に前記受精された卵を添加することである
請求項４に記載の生育可能な四倍体牡蠣を生産する方法。
【請求項６】
前記接触は、受精された後５分ないし１５分でなることである
請求項１または請求項２に記載の生育可能な四倍体牡蠣を生産する方法。
【請求項７】
前記培養は、１８℃ないし３０℃で塩度１７ｐｐｔないし３３ｐｐｔでなることである
請求項１または請求項２に記載の生育可能な四倍体牡蠣を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生育可能な四倍体牡蠣を効率的に生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどの有性生殖動物は、二セットの染色体を有してあり、二倍体と呼ばれる。減数分裂は、世代ごとに染色体の数が二倍になることを防ぐために染色体の数を半分に減らす過程である。これは、二段階の過程であって、こういった過程を通じて一つの二倍体細胞が各々一つの染色体セットを有する四つの半数体（ｈａｐｌｏｉｄ）細胞になる。このような半数体細胞の一つ、または、四つ全ては、配偶子と知られた機能的な卵子、または、精子と成熟されることができる。
【０００３】
四倍体牡蠣は、三倍体、交雑及び他の育種プログラムを含めた様々な目的のために重要である。三倍体牡蠣は、二倍体の正常的な生殖期間の間に正常的な二倍体牡蠣に比べてより良い味と向上した成長率などの特定の商業的利点を有すると知られている。
【０００４】
現在には、そういった三倍体牡蠣は、特定染色体セット操作技術を用いて正常的な二倍体牡蠣から生産されるが、そういった技術によって卵母細胞での減数分裂は、卵母細胞が第二減数分裂の間に第二極体を放出する代わりに卵母細胞内に保有するように操作される
【０００５】
一方、サイトカラシンＢ（ＣＢ）と６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）は、受精された卵において減数分裂の途中に第一極体（ＰＢ１）の細胞外への放出を阻止する化合物として各々知られている。
【０００６】
また、例えば特許文献１には、貝類を垂下式にて養殖する方法において、セメントを主成分とし、アルカリ土類金属の炭酸塩を１０〜５０質量％含有する水硬性組成物のスラリーからなる接着材により、稚貝を垂下連へ固定することを特徴とする貝類の養殖方法が記載されている。
【０００７】
しかし、前記の従来技術によってもサイトカラシンＢ（ＣＢ）と６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）との調合を用いて四倍体牡蠣を効率的に生産する方法は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−２３７０３６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、生育可能な四倍体牡蠣を効率的に生産する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、三倍体メス牡蠣の卵を二倍体オス牡蠣の精子と受精させる段階と;前記受精された卵から第一極体の放出を阻止する段階と;及び前記受精された卵を培養して生育可能な四倍体牡蠣を生産する段階と;を含み、第一極体の放出阻止はサイトカラシンＢ（ＣＢ）と６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）に前記受精された卵を接触させる段階を含むことである、生育可能な四倍体牡蠣を生産する方法を提供する。
【００１１】
前記方法は、三倍体メス牡蠣の卵を二倍体オス牡蠣の精子と受精させる段階を含む。三倍体牡蠣は、商業的に購入できる（Ａｌｌｅｎ，Ｊｒ．、Ｓ.Ｋ.（１９８８）；Ｏｃｅａｎｕｓ  ３１、５８−６３）。三倍体牡蠣は、染色体セット操作技術を用いて、卵母細胞（ｏｏｃｙｔｅ）で減数分裂が操作されて、第二減数分裂の間、第二極体を放出する代わりに卵母細胞内に第二極体を保有するようにすることによって、二倍体牡蠣（ｄｉｐｌｏｉｄ  ｏｙｓｔｅｒ）から生産されることができる。
【００１２】
三倍体牡蠣は、産卵（ｓｐａｗｎｉｎｇ）前にフローサイトメトリーによって調査され、その倍数性（ｐｌｏｉｄｙ）を確認することができる。
【００１３】
三倍体牡蠣の卵は、三倍体メス牡蠣を切開することによって（ｓｔｒｉｐ  ｓｐａｗｎｉｎｇ）収集することができる。卵は、濾過した海水で洗浄し、２５μｍスクリーンのような適切なスクリーン上に保有されることができる。本発明の一具体例に用いられる前記三倍体牡蠣は、高温及び豊富な餌を有する環境に置くことによって条件化されたものである場合がある。前記条件化は、冬眠（ｗｉｎｔｅｒ  ｄｏｒｍａｎｃｙ）の直後に配偶子形成（ｇａｍｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）の初期段階で始めることが好ましい。
【００１４】
次に、前記卵は、正常的二倍体オスから得られた精子で受精される。受精に用いられる精子の量は、卵一つ当たりに約十個以上の精子細胞であることがあり得る。前記受精は、知られた方法によってなることができる。例えば、前記卵と精子とを海水の中で接触させることによってなることができる。
【００１５】
前記方法は、また、前記受精された卵から第一極体の放出を阻止する段階を含む。第一極体の放出阻止は、サイトカラシンＢ（ＣＢ）と６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）に前記受精された卵を接触させる段階を含むことがあり得る。
【００１６】
前記接触は、前記受精された卵が第一極体を放出する時間の３０％ないし９０％の時間範囲でなることがあり得る。前記接触は、例えば、受精された後５分ないし１５分でなることがあり得る。
【００１７】
前記接触は、前記受精された卵とサイトカラシンＢ（ＣＢ）と６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）とを同時に接触させることがあり得る。また、前記接触は、前記受精された卵とサイトカラシンＢ（ＣＢ）と６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）とを順次に接触させることがあり得る。
【００１８】
例えば、前記接触は、サイトカラシンＢ（ＣＢ）と前記受精された卵とを接触させた後、６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）と前記受精された卵とを接触させることがあり得る。前記接触は、例えば、サイトカラシンＢ（ＣＢ）と前記受精された卵とを、前記受精された卵が第一極体を放出する時間の３０％ないし９０％の時間範囲で接触させた後、６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）と前記受精された卵とを、前記受精された卵が第一極体を放出する時間の５０％ないし９０％の時間範囲で接触させることがあり得る。
【００１９】
前記接触の一具体例は、サイトカラシンＢ（ＣＢ）と前記受精された卵とを、受精された後５分ないし１５分で接触させた後、６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）と前記受精された卵とを、受精された後８．３分ないし１５分で接触させることがあり得る。
【００２０】
また、前記接触は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中の０．２５ないし１．０ｐｐｍ濃度のサイトカラシンＢ（ＣＢ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中の０．２５ないし１．０ｐｐｍ濃度の６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）に前記受精された卵を添加することがあり得る。
【００２１】
例えば、前記接触は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中の０．２５ないし０．７５ｐｐｍ濃度のサイトカラシンＢ（ＣＢ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中の０．２５ないし０．７５ｐｐｍ濃度の６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）に前記受精された卵を添加することがあり得る。
【００２２】
前記方法は、また、前記受精された卵を培養して生育可能な四倍体牡蠣を生産する段階;を含む。
【００２３】
前記培養は、当業界に知られた通常の受精された卵の培養方法によって培養されることができる。例えば、前記培養は、１８℃ないし３０℃、例えば、２３℃ないし２８℃でなることがあり得る。前記培養は、塩度１７ｐｐｔないし３３ｐｐｔ、例えば、約２０ｐｐｔないし２２ｐｐｔでなることがあり得る。
【００２４】
前記方法において、牡蠣は、マガキ属（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ属）であることがあり得る。マガキ属の牡蠣には、マガキ（真牡蠣：Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）、クラソストレア・シカマイ（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｓｉｋａｍａｉ）、クラソストレア・リブラリス（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｒｉｖｕｌａｒｉｓ）及びアメリカガキ（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｖｉｒｇｉｎｉｃａ）からなる群から選択されることがあり得る。また、前記牡蠣は、アコヤガイ属（Ｐｉｎｃｔａｄａ属）の牡蠣であることがあり得る。例えば、前記牡蠣は、クロチョウガイ（Ｐｉｎｃｔａｄａ  ｍａｒｇａｒｉｔｉｆｅｒａ）であることがあり得る。
【００２５】
本発明の方法によって、通常的な二倍体牡蠣が天然的に生育できる自然条件で成長及び成熟することのできる四倍体牡蠣が生成されることができ、前記四倍体牡蠣は、二倍体牡蠣と交配され、三倍体牡蠣を生成することができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の一具体例によると、三倍体牡蠣及び二倍体牡蠣から四倍体牡蠣を効率的に生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明を、実施例を通じてより詳しく説明する。しかし、これら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されることはない。
【００２８】
本実施例に用いられた三倍体太平洋牡蠣（ｔｒｉｐｌｏｉｄ  Ｐａｃｉｆｉｃ  ｏｙｓｔｅｒ）は、２年目であって、第二極体（ＰＢ２）の放出を阻止することによって製造された。三倍体牡蠣は、産卵前にフローサイトメトリーを通じて個別的に確認した。配偶子は、剥奪産卵（ｓｔｒｉｐ  ｓｐａｗｎｉｎｇ）によって収集した。
【００２９】
卵は、８５μｍスクリーンを通過させ、大きな組織の破片を除去して２５μｍスクリーン上で洗浄した。全ての受精及び処理は、２μｍスクリーンに濾過した２５℃ないし２８℃の海水で行われた。本実施例に用いられた海水の塩度は、約２０ｐｐｔないし２２ｐｐｔであった。
【００３０】
三倍体から由来した卵は、二倍体から由来した半数体精子（ｈａｐｌｏｉｄ  ｓｐｅｒｍ）で受精された。卵を受精した後、受精された卵を次のように区分した:対照群、比較群、及び実験群。
【００３１】
対照群で受精された卵は、化学物質で処理することなく培養された。比較群１及び比較群２で、前記受精された卵は、第一極体の放出を阻止するためにサイトカラシンＢ（以下、「ＣＢ」とする。)で処理された。ＣＢは、ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」とする。）に溶解させて準備し、受精された卵に０．５％ＤＭＳＯ含有の０．２５ｍｇ／ｌ（比較群１）及び０．５％ＤＭＳＯ含有の０．５ｍｇ／ｌ（比較群２）の最終濃度で添加した。
【００３２】
比較群３及び比較群４で、前記受精された卵は、第一極体の放出を阻止するために６−ジメチルアミノプリン（以下、「ＤＭＡＰ」とする。)で処理された。ＤＭＡＰは、ＤＭＳＯに溶解させて準備し、受精された卵に０．５％ＤＭＳＯ含有の０．２５ｍｇ／ｌ（比較群３）及び０．５％ＤＭＳＯ含有の０．５ｍｇ／ｌ（比較群４）の最終濃度で添加した。
【００３３】
実験群１及び実験群２で、前記受精された卵は、第一極体の放出を阻止するためにＣＢ及びＤＭＡＰで処理された。ＣＢとＤＭＡＰは、ＤＭＳＯに溶解させて準備し、受精された卵に０．５％ＤＭＳＯ含有の０．２５ｍｇＣＢ／ｌ及び０．２５ｍｇＤＭＡＰ／ｌ（実験群１）及び０．５％ＤＭＳＯ含有の０．５ｍｇＣＢ／ｌ及び０．５ｍｇＤＭＡＰ／ｌ（実験群２）の最終濃度で添加した。
【００３４】
前記対照群、比較群及び実験群１及び２で、各処理は、受精後５分に始めて１５分の間に続いた。各処理後、受精された卵を１％ＤＭＳＯ−海水で洗浄し、６５卵／ｍｌの密度で培養した。
【００３５】
実験群３で、前記受精された卵は、第一極体の放出を阻止するために、ＣＢ及びＤＭＡＰで処理された。ＣＢとＤＭＡＰは、ＤＭＳＯに溶解させて準備し、受精された卵に０．５％ＤＭＳＯ含有の０．２５ｍｇＣＢ／ｌの最終濃度で受精した後５分に処理を始めて、受精後１０分に０．２５ｍｇＤＭＡＰ／ｌの最終濃度で添加し、受精後１５分まで続いた（実験群３）。
【００３６】
実験群４で、前記受精された卵は、第一極体の放出を阻止するためにＣＢ及びＤＭＡＰで処理された。ＣＢとＤＭＡＰは、ＤＭＳＯに溶解させて準備し、受精された卵に０．５％ＤＭＳＯ含有の０．５ｍｇＣＢ／ｌの最終濃度で受精後５分に処理を始めて、受精後１０分に０．５ｍｇＤＭＡＰ／ｌの最終濃度で添加し、受精後１５分まで続いた（実験群４）。実験群３及び４で、各処理後、受精された卵を１％ＤＭＳＯ−海水で洗浄して６５卵／ｍｌの密度で培養した。
【００３７】
【表１】
0005613240.tif 000002
【００３８】
表１の百分率分裂は、受精後９０分ないし１２０分で決定された。分割された胚芽の生存率は、受精後１日、７日及び３５日（ｓｐａｔ）に記録した。表１に示したように、実験群１ないし４は、対照群及び比較群に比べて分裂百分率及び受精後３５日生存率において、著しく高かった。即ち、受精された卵から第一極体の放出を阻止する段階において、ＣＢとＤＭＡＰとを調合して用いることによって、高い効率で幼生を生産することができた。
【００３９】
また、これら試料採取日に生存幼生の倍数組成（ｐｌｏｉｄｙ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を、フローサイトメトリーを用いて決定した。受精後三ヶ月に、生存牡蠣を採取して体重及び染色体数を計数した。染色体分析のために、牡蠣を集中的摂食（ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ｆｅｅｄｉｎｇ）と共に１２時間の間、コルヒチン（０．００５％）で処理した。牡蠣の内臓は、殻から分離し、重さを計った。
【００４０】
次に、全身体（ｗｈｏｌｅ  ｂｏｄｙ）を切って酢酸／メタノール混合物（１：３）の中に固定した。適切な量の固定された試料をスライドに注いで空気乾燥した。スライドをリーシュマン染色（Ｌｅｉｓｈｍａｎ'ｓ  ｓｔａｉｎ）した。染色体損失の信号を示さない最低１０個の中期細胞等（ｍｅｔａｐｈａｓｅ  ｃｅｌｌｓ）が各牡蠣に対して計数された。染色体数が確実に決定された固体等のみを分析に用いた。２０、３０及び４０個の染色体を有した牡蠣を各々二倍体、三倍体及び四倍体と各々名づけた。
【００４１】
表２は、受精後三ヶ月で、実験群由来５０個の牡蠣に対して体重及び染色数を測定した結果である。明らかに染色体が計数されたもののみをデータに含ませて、測定可能な中期細胞のない牡蠣は、分析から外した。
【００４２】
【表２】
0005613240.tif 000003
【００４３】
表２に示したように、受精後三ヶ月で長さ１ないし４ｃｍの牡蠣の中で、四倍体牡蠣は７８％ないし７９．６％の範囲で、高い比率を占めていた。
【００４４】
本実施例の結果から、受精された卵から第一極体の放出を阻止する段階において、ＣＢとＤＭＡＰとを調合して用いることによって、高い効率で四倍牡蠣を生産することができた。
【００４５】
生産された四倍体牡蠣は、天然二倍体牡蠣が生育する条件で生育することができた。また、前記四倍体牡蠣は、二倍体牡蠣と交配させることによって三倍体牡蠣を生産することができた。また、前記四倍体牡蠣は、四倍体牡蠣同士に交配させることによって、他の四倍体牡蠣を生産することができた。