(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎組織内のグリセルアルデヒド由来終末糖化産物を免疫組織化学的に検出する方法であって、
該グリセルアルデヒド由来終末糖化産物に特異的に結合し得るアプタマーを該腎組織と接触させる工程；および
該腎組織中のグリセルアルデヒド由来終末糖化産物に結合しているアプタマーを検出する工程
を含み、
該アプタマーが、該グリセルアルデヒド由来終末糖化産物に結合するがヒト血清アルブミンには結合しないアプタマーであって、該アプタマーが、少なくとも３５塩基からなり、そして該塩基中のシトシン含有率が少なくとも３５％であるか、または該塩基中のグアニン含有率が少なくとも３２％であり、
該アプタマーが、一本鎖ＤＮＡであり、かつ、配列表の配列番号９に記載の塩基配列を含み、そして、
該アプタマーが、ジゴキシゲニン標識されている、
方法。
【請求項２】
腎組織内のグリセルアルデヒド由来終末糖化産物を免疫組織化学的に検出するためのキットであって、該キットは、該グリセルアルデヒド由来終末糖化産物に特異的に結合し得るアプタマーを備え、該アプタマーが、該グリセルアルデヒド由来終末糖化産物に結合するがヒト血清アルブミンには結合しないアプタマーであって、該アプタマーが、少なくとも３５塩基からなり、そして該塩基中のシトシン含有率が少なくとも３５％であるか、または該塩基中のグアニン含有率が少なくとも３２％であり、
該アプタマーが、一本鎖ＤＮＡであり、かつ、配列表の配列番号９に記載の塩基配列を含み、そして、
該アプタマーが、ジゴキシゲニン標識されている、
キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞または組織内のグリセルアルデヒド由来終末糖化産物（ＡＧＥ−２）を免疫組織化学的に検出する方法およびそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
終末糖化産物（ＡＧＥｓ）は、グルコースなどの還元糖とタンパク質との間の非酵素的糖化反応により生成する構造体の総称である。ＡＧＥｓは、老化や糖尿病に伴って中枢神経などに蓄積し、あるいは神経・感覚器障害や腎症などの糖尿病による合併症の原因と考えられている。最近では、アルツハイマー病などの神経変性疾患、悪性腫瘍の増殖、転移、浸潤などにも関与することが明らかになっている。
【０００３】
ＡＧＥｓは、グルコースだけではなく、グルコースの自動酸化物および分解産物などの種々のアルデヒドまたはカルボニル化合物から生成される。このうち、グリセルアルデヒドに由来する終末糖化産物（グリセルアルデヒド由来終末糖化産物；ＡＧＥ−２）は、ＡＧＥレセプター（ＲＡＧＥ）との結合能力が高く、このＲＡＧＥを介して、糖尿病性網膜症や糖尿病性腎症などの糖尿病血管合併症の発症や進展に強く関与していることが知られている（非特許文献１および非特許文献２）。しかし、その診断法や阻害剤は未だほとんど開発されていない。また、組織内のＡＧＥ−２を検出して、その存在位置を決定および／または定量することは上記疾患の診断に有用であるが、現状では困難である。
【０００４】
ＡＧＥｓの測定方法については、これまでに種々検討されている。最も簡単には、ＡＧＥｓが、黄褐色であり蛍光を発するので、その蛍光を測定する方法がある。しかし、ＡＧＥｓに対する特異性や感度が低いため、特に生体試料に対しては適切ではない。特定の構造のＡＧＥｓについては、ＨＰＬＣ法、ＧＣ／ＭＳ法、ＬＣ／ＭＳ法などを用いて定量することができるが、時間がかかり、例えば、診断におけるような、多数の試料の分析には適していない。
【０００５】
現在のところ、ＡＧＥｓのうちで構造が明らかであるカルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）を認識する抗体（抗ＣＭＬ抗体）を用いる免疫学的測定方法が主として行われている。しかし、感度が低く、しかも抗体自体が高価である。さらに、ＣＭＬが生体内では糖化反応ではなく脂質の過酸化によって生じること、およびＣＭＬが酸化ストレスのマーカーと考えられるようになってきたことから、抗ＣＭＬ抗体を抗ＡＧＥｓ抗体として用いることには問題がある。このように、ＡＧＥｓ全体を認識する抗体は、現在のところ得られていない。
【０００６】
近年、一本鎖ＤＮＡや一本鎖ＲＮＡが種々の立体構造をとり、低分子からタンパク質までの種々の化合物を認識して結合して、抗体のような機能を有し得ることが明らかになっている（非特許文献３および非特許文献４）。このような分子をアプタマーと称する。アプタマーは、ランダム配列の中からＳＥＬＥＸという選別方法によって得られ得る（非特許文献４）。
【０００７】
アプタマーは、試験管内で大量に合成できること、抗体よりも結合力が強いものが得られる可能性があること、安定化できることなどの利点を有する。そのため、抗体と同様に、研究、検出、医療などに応用され得る。医療などへの応用が検討されている例としては、ＨＩＶ−１逆転写酵素に対するＲＮＡアプタマー（非特許文献５）、補体Ｃ５に対するＲＮＡアプタマー（非特許文献６）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染を防止するＲＮＡアプタマー（非特許文献７）、老人性黄斑変性症の治療薬として開発中の血管内皮細胞増殖因子に対するＲＮＡアプタマー（非特許文献８）、糸球体間質増殖性糸球体腎炎モデルラットに静脈内注射すると症状が緩和される血小板由来増殖因子に対するアプタマー（非特許文献９）、ショウジョウバエＢ５２タンパク質の過剰発現による異常を正常に戻すＲＮＡアプタマー（非特許文献１０）などが報告されている。
【０００８】
本発明者らは、上述のような問題を鑑み、ＡＧＥ−２を認識して結合するアプタマーの探索を試み、取得している（特許文献１）。
【特許文献１】国際特許出願公開第２００６／０８０２６２号公報
【非特許文献１】Yamagishi S.ら，Biochem. Biophys. Res. Commun.，2002年，290巻，973-978頁
【非特許文献２】Okamoto T.ら，FASEB J.，2002年，16巻，1928-1930頁
【非特許文献３】Ellington A.D.およびSzostak J.W.，Nature，1990年，346巻，818-822頁
【非特許文献４】Tuerk C.およびGold L.，Science，1990年，249巻，505-510頁
【非特許文献５】Kensch O.ら，J. Biol. Chem.，2000年，275巻，18271-18278頁
【非特許文献６】Biesecker G.ら，Immunopharm.，1999年，42巻，219-230頁
【非特許文献７】Wang J.ら，RNA，2000年，6巻，571-583頁
【非特許文献８】Ruckman J.ら，J. Biol. Chem.，1988年，273巻，20556-20567頁
【非特許文献９】Floege J.ら，Am. J. Path.，1999年，154巻，169-179頁
【非特許文献１０】Shi H.ら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1999年，96巻，10033-10038頁
【非特許文献１１】Tessierら，Biochem. J., 2003年, 369巻, 705-719頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、細胞または組織内のＡＧＥ−２を検出して、その存在位置を決定および／または定量するのに適した方法およびキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、細胞または組織内のグリセルアルデヒド由来終末糖化産物（ＡＧＥ−２）を免疫組織化学的に検出する方法を提供し、この方法は
グリセルアルデヒド由来終末糖化産物に特異的に結合し得るアプタマーを細胞または組織と接触させる工程；および
細胞または組織中のグリセルアルデヒド由来終末糖化産物に結合しているアプタマーを検出する工程
を含む。
【００１１】
本発明はさらに、細胞または組織内のグリセルアルデヒド由来終末糖化産物を免疫組織化学的に検出するためのキットを提供し、このキットは、グリセルアルデヒド由来終末糖化産物に特異的に結合し得るアプタマーを備える。
【００１２】
上記アプタマーは、グリセルアルデヒド由来終末糖化産物に結合するがヒト血清アルブミンには結合しないアプタマーであって、該アプタマーが、少なくとも３５塩基からなり、そして該塩基中のシトシン含有率が少なくとも３５％であるか、または該塩基中のグアニン含有率が少なくとも３２％である。
【００１３】
１つの実施態様では、上記アプタマーは、一本鎖ＤＮＡである。
【００１４】
さらなる実施態様では、上記一本鎖ＤＮＡは、配列表の配列番号１から２４のいずれかに記載の塩基配列を含む。
【００１５】
さらなる実施態様では、上記一本鎖ＤＮＡは、配列表の配列番号２５から４１のいずれかに記載の塩基配列を含む。
【００１６】
さらなる実施態様では、上記一本鎖ＤＮＡは、配列表の配列番号１または９のいずれかに記載の塩基配列を含む。
【００１７】
別の実施態様では、上記アプタマーは、標識されている。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、細胞または組織内のＡＧＥ−２を免疫組織化学的に検出できる方法およびキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（ＡＧＥ−２アプタマー）
アプタマーとは、上述のように、特定の化合物に特異的に結合し得る一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡである。本発明においては、この特定の化合物がＡＧＥ−２である。本発明で使用されるＡＧＥ−２アプタマーは、ＡＧＥ−２に結合するがヒト血清アルブミンには結合しない。一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡのいずれであってもよい。
【００２０】
本発明で使用されるＡＧＥ−２アプタマーは、少なくとも３５塩基からなり、好ましくは少なくとも５０塩基かつ多くとも１２０塩基からなる。３４塩基以下の場合は、ＡＧＥ−２と結合しない。
【００２１】
ＡＧＥ−２アプタマーは、該アプタマーを構成する塩基中にシトシンまたはグアニンのいずれか一方を多く含むことが好ましい。シトシンが多い場合は、シトシン含有率は少なくとも３５％、少なくとも４０％あるいは少なくとも５０％であってもよい。グアニンが多い場合は、塩基中のグアニン含有率は、少なくとも３２％、少なくとも３５％あるいは少なくとも４０％であってもよい。このような塩基含有率であることにより、アプタマーはＡＧＥ−２に結合しやすくなる。
【００２２】
具体的な例としては、配列表の配列番号１から２４のいずれかに記載の塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡが挙げられる。「塩基配列を含む」というときは、当該塩基配列からなる場合および当該塩基配列にさらに塩基が付加、欠失、または置換された場合を含む。但し、このような塩基の付加、欠失、または置換は、アプタマーとしての性質、例えば、ＡＧＥ−２への結合能を損なわない限りである。これらの一本鎖ＤＮＡは、５４〜５８塩基からなりかつ塩基中のシトシン含有率が少なくとも３５％である塩基配列を含む。別の具体的な例としては、配列表の配列番号２５から４１のいずれかに記載の塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡが挙げられる。これらの一本鎖ＤＮＡは、６１〜６６塩基からなりかつ塩基中のグアニン含有率が少なくとも３２％である塩基配列を含む。
【００２３】
ＡＧＥ−２アプタマーは、アプタマーを得るための一般的な方法であるＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）法によって得られ得る。一本鎖ＤＮＡをライブラリー源とするＳＥＬＥＸ法の概要を以下に説明する。まず、任意の２つのプライマー配列で挟まれた適当な長さのランダム配列を含むテンプレートＤＮＡを合成する。本発明においては、ランダム配列の長さは、３５塩基〜１２０塩基が適切である。このテンプレートＤＮＡをＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）で増幅して、ランダムＤＮＡアプタマープールを得る。次いで、このランダムＤＮＡアプタマープールを標的物質と会合させ、結合しなかったＤＮＡを除去し、そして結合したＤＮＡアプタマーを抽出する。得られたＤＮＡアプタマーを、上記プライマー配列を用いるＰＣＲによって増幅する。このとき、５〜８ｍＭのＭｇ２＋存在下でＰＣＲを行って、複製の正確性を低下させて変異を導入しやすくすることにより、標的物質との会合前のＤＮＡアプタマープールに存在しない新たなＤＮＡアプタマーを含むＤＮＡアプタマープールが得られる。新たなＤＮＡアプタマーは、結合力がより強い可能性があり、すなわち、ＤＮＡアプタマーが進化する可能性が生じる。この進化したＤＮＡアプタマープールについて、上記の一連の操作を５〜１５ラウンド繰り返すことによって、標的物質に特異的に結合するＤＮＡアプタマーが得られる。最終ラウンドの後、得られたＤＮＡアプタマープールは、当業者が通常行う操作によってクローニングされ、次いで配列決定される。このＳＥＬＥＸ法における、テンプレートＤＮＡの合成、ＰＣＲなどの操作、ならびにクローニングおよび配列決定は、当業者が通常用いる方法によって行われる。本発明のＡＧＥ−２アプタマーは、このようにして決定された配列に基づいて、当業者が通常用いる方法によって化学合成することができる。
【００２４】
本発明においては、ＳＥＬＥＸ法における標的物質はＡＧＥ−２であり、好ましくはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）との結合体である。ＡＧＥ−２は、培養法、化学合成法などの任意の方法によって合成され得る。培養法では、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を、Ｄ−グリセルアルデヒドと数日間インキュベートする。化学合成法は、例えば、Tessierらの方法（非特許文献１１）に従って行われる。具体的には、アセチル−リジンとグリセルアルデヒドとをリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で混合し、さらにジエチレントリアミンペンタ酢酸および２５％（ｖ／ｖ）メタノールを加えて、３７℃で数日間反応させることによって得られる。得られたＡＧＥ−２は、ＳＥＬＥＸ法において用いる場合は、適切な固相（例えば、ビーズなど）に固定化されていることが好ましい。
【００２５】
得られたアプタマーのＡＧＥ−２との結合親和性は、ＡＧＥ−２が蛍光を発することを利用して、ＡＧＥ−２にアプタマーを添加したときのＡＧＥ−２の蛍光強度の減弱によって測定できる。このようにして、本発明のアプタマーのうち、親和性の強いアプタマーを選択することができる。
【００２６】
ＡＧＥ−２アプタマーは、より安定化させる目的で、修飾ヌクレオチド／ヌクレオチドを用いて合成されていてもよい。
【００２７】
（細胞または組織中のＡＧＥ−２の免疫組織化学検出）
本発明によれば、上記ＡＧＥ−２アプタマーを用いて、細胞または組織内のＡＧＥ−２の存在および位置を決定できる。ＡＧＥ−２アプタマーは、目的の細胞または組織と接触すると、細胞または組織内に存在するＡＧＥ−２を認識し結合する。次いで、このＡＧＥ−２アプタマーを検出することにより、ＡＧＥ−２アプタマーが結合しているＡＧＥ−２の位置、したがって細胞または組織中に存在するＡＧＥ−２の存在および位置を決定できる。さらに、検出されたＡＧＥ−２アプタマーの量を算定して、細胞または組織内に存在するＡＧＥ−２を定量できる。
【００２８】
本発明は、上記ＡＧＥ−２アプタマーを用いることにより、ＡＧＥ−２を免疫組織化学的に検出する方法（以下、免疫染色法ともいう）を提供する。本発明の方法では、上記ＡＧＥ−２アプタマーを組織または細胞と接触させて、組織または細胞中に存在するＡＧＥ−２に対してＡＧＥ−２アプタマーを反応させ、組織または細胞内の抗原ＡＧＥ−２に結合しているＡＧＥ−２アプタマーを検出する。ＡＧＥ−２アプタマーを接触させる細胞または組織は、当業者が通常用いる手順に従って固定される。さらに、例えばパラフィンまたはＯＣＴコンパウンドを用いる包埋、凍結、および薄片化を行い、標本が調製され得る。必要に応じて、調製した標本中の抗原の賦活化処理（例えば、タンパク質分解酵素処理または加熱処理（マイクロウェーブ法など））を行い得る。免疫染色法は、用手により、または市販の免疫染色装置を用いて行い得る。例えば、シーケンザ免疫染色センター（シャンドン製）は、カバープレートによるマニュアルドロッピング方式で容易に染色を行うことができ、好適に用いられ得る。
【００２９】
ＡＧＥ−２の免疫組織化学検出に用いられるＡＧＥ−２アプタマーとして、具体的な例としては、上述したような、配列表の配列番号１から２４のいずれかに記載の塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡが挙げられる。別の具体的な例として、上述したような、配列表の配列番号２５から４１のいずれかに記載の塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡが挙げられる。
【００３０】
好ましくは、配列表の配列番号１または配列番号９に記載の塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡであるアプタマーが用いられる。
【００３１】
ＡＧＥ−２アプタマーの細胞または組織中のＡＧＥ−２への結合および当該アプタマーの免疫組織化学検出を妨げない程度に、一本鎖ＤＮＡは、上記の塩基配列に数個以内の塩基が付加、欠失、または置換されている配列を有してもよい。
【００３２】
ＡＧＥ−２アプタマーの検出のために、ＡＧＥ−２アプタマーは、予め標識されていることが好ましい。アプタマーの標識は、任意の核酸標識法を用いることができる。このような標識法には、放射線同位元素標識、ジゴキシゲニン標識、ビオチン標識、色素標識などが挙げられる。放射線同位元素標識は、オートラジオグラフィーにより可視化できる。ジゴキシゲニン標識は、抗ジゴキシゲニン抗体を用いて検出可能であり、免疫組織化学的な可視化の点で好ましい。ビオチン標識は、抗ビオチン抗体によって、またはストレプトアビジンもしくはアビジンによっても検出可能である。これらの標識の検出のために、抗体は、色素をさらに結合し得る。あるいは、抗体は、蛍光または発光ドメインを付加してもよい。
【００３３】
ＡＧＥ−２の免疫組織化学検出に供する試料としては、代表的には、種々の生物に由来する種々の細胞または組織が挙げられる。例えば、腎臓、網膜、神経細胞、血管などが挙げられる。
【００３４】
本発明は、細胞または組織内のＡＧＥ−２を免疫組織化学的に検出するためのキットも提供する。このキットは、ＡＧＥ−２検出用の試薬として、ＡＧＥ−２アプタマーを備える。キットに備えられるＡＧＥ−２アプタマーは、免疫組織化学検出方法における説明と同様である。好ましくは、配列表の配列番号１または配列番号９に記載の塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡであるアプタマーである。ＡＧＥ−２アプタマーは、上記のように標識され得る。
【００３５】
本発明のキットはまた、免疫染色法で通常使用され得る任意の試薬も備え得る。そのような試薬としては、アプタマーの標識に依存する、適切な検出用試薬が挙げられる。ＡＧＥ−２検出のための指示書をさらに備え得る。
【００３６】
本発明の方法およびキットは、ＡＧＥ−２が関与する疾患、例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害などの糖尿病合併症、アルツハイマー病などの神経変性疾患、悪性腫瘍の増殖、転移、浸潤などを検出または診断するのに利用することができる。
【実施例】
【００３７】
（実施例１：ＡＧＥ−２アプタマーの取得）
（１−１：一本鎖ランダムオリゴＤＮＡの作製）
３４、５６、または７２塩基のランダム領域およびその両側にプライマー部位（配列番号４２および４３）を含む一本鎖ランダムオリゴＤＮＡの合成を、次のように行った。
【００３８】
まず、３’末端のヌクレオチドが３’水酸基を介して結合されたＣＰＧ（controlled pore glass）担体をカラムに詰めた。次いで、リボースの５’位の保護基であるジメトキシトリチル基をトリクロロ酢酸によって除去して、脱トリチル化した。リボースの３’位の水酸基がリン酸シアノエチルアミダイト誘導体である２番目のヌクレオチドを、脱トリチル化された１番目のヌクレオチドの５’水酸基に、塩基触媒（テトラゾール）を用いてカップリングさせ、未反応の５’水酸基を無水酢酸によってアセチル化した。２つのヌクレオチド間の結合を、ヨードを用いて酸化して、３価のリンから５価のリン酸エステルへ変換した。上記の脱トリル化からリン酸エステルへの変換までの操作を目的の鎖長になるまで繰り返した。ランダム部分の配列は、カップリング反応の際に、４種のヌクレオチドアミダイト混合物（ｄＮＴＰ）を使用して行った。反応後、カラムからアンモニア処理によってオリゴＤＮＡを切り出し、逆相カートリッジカラムによって精製した。凍結乾燥後、適量の水に溶解し、ＳＥＬＥＸライブラリーのテンプレートＤＮＡとした。
【００３９】
（１−２：ＡＧＥ−２の合成）
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Sigma社製）を無菌状態で、Ｄ−グリセルアルデヒドと３７℃にて７日間インキュベートした。未反応糖を、まずＰＤ−１０ゲル濾過カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を通した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の透析によって除去した。使用する前に、Ｅｎｄｏｓｐｅｃｙ  ＥＳ−２０Ｓシステム（生化学工業）を用いて、エンドトキシンがないことを確認した。
【００４０】
（１−３：ＡＧＥ−２のビーズへの結合）
上記１−２で得たＡＧＥ−２を、PIERCE社のSulfoLink（登録商標）カップリングゲル（カタログ番号２０４０１）を使用して製品の指示書に従って、次のようにビーズに固定化した。
【００４１】
まず、カップリングゲルをカラムにとり、カップリング緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．５）で平衡化した。ＡＧＥ−２をカップリング緩衝液に溶解し、カップリングゲルと混合して、室温で１時間インキュベートした。反応終了後、カップリング緩衝液でカラムを数回洗浄した。Ｌ−システインをカップリング緩衝液に溶解し、カップリングゲルと混合して、室温で３０分間インキュベートした。反応終了後、カップリング緩衝液およびＰＢＳでカラムを数回洗浄した。なお、反応前および反応後の吸光度を測定することによって、ＡＧＥ−２の固定化量を算出した。固定化後のゲル（ビーズ）を小分けし、使用するまで冷暗所に保存した。
【００４２】
（１−４：ＨＳＡのビーズへの結合）
ＨＳＡを、PIERCE社のSulfoLink（登録商標）カップリングゲル（カタログ番号２０４０１）およびUltraLink（登録商標）EDC/DADPA固定化キット（カタログ番号５３１５４）を使用して、ビーズに固定化した。
【００４３】
（１−５：ＳＥＬＥＸ法）
上記１−１で合成したランダムオリゴＤＮＡを鋳型にして、ｆｏｒｗａｒｄプライマー（配列番号４２）とｒｅｖｅｒｓｅプライマー（配列番号４３）によるＰＣＲ（１サイクル：９４℃，１５秒；５５℃，１５秒；７２℃，１５秒×１２サイクル）を行った。増幅後、ｆｏｒｗａｒｄプライマーのみを用いた非対称ＰＣＲによりプラス鎖を増幅した（１サイクル：９４℃，１５秒；５５℃，１５秒；７２℃，１５秒×４５サイクル）。増幅したプラス鎖をアガロースゲル電気泳動によって精製し、ＳＥＬＥＸ用ＤＮＡライブラリーとした。このＳＥＬＥＸ用ＤＮＡライブラリーをＰＢＳに溶かし、９５℃で５分加熱し、室温に戻した。次いで、ＳＥＬＥＸ用ＤＮＡライブラリーと上記１−３で調製したＡＧＥ−２を固定化させたビーズとを混合し、室温で３０分間インキュベートした。インキュベート後、ＰＢＳでビーズを数回洗浄した。適量の水をビーズに加えて混合し、１００℃で５分間加熱し、ＡＧＥ−２ビーズに結合したＤＮＡを解離させて回収した。回収したＤＮＡと上記１−４で調製したＨＳＡを固定化させたビーズとを混合し、室温で１０分間インキュベートした。素通りした（ＨＳＡに結合しなかった）ＤＮＡを回収して、エタノール沈殿法によって濃縮した。濃縮したＤＮＡを鋳型にして、上記の操作を５〜１５ラウンド繰り返した。この時、５〜８ｍＭのＭｇ＋存在下でＰＣＲを行って、変異を導入させた。
【００４４】
（１−６：クローニング）
５〜１５ラウンド後に得られたＤＮＡを、ｆｏｒｗａｒｄプライマー（配列番号４２）およびｒｅｖｅｒｓｅプライマー（配列番号４３）を用いるＰＣＲによって増幅し、アガロースゲル電気泳動によって精製し、そしてＡＧＥ−２特異的ＤＮＡを得た。このＤＮＡをクローニングベクター（Invitrogen社: Zero Blunt（登録商標）TOPO（登録商標）PCR Cloning Kit for Sequencing（カタログ番号Ｋ２８７５Ｊ１０））へ導入し、次のようにして配列を決定した。
【００４５】
まず、ＡＧＥ−２特異的ＤＮＡ（ＰＣＲ産物）とクローニングベクター（ＴＯＰＯベクター）とを混合し、室温で５分間インキュベートした。反応終了後、反応液の一部をコンピテントセルに加え、氷冷下で３０分間インキュベートした。４２℃にて３０秒間ヒートショックした後、氷上で２分間冷却した。冷却した反応液に、キット中に含まれているＳＯＣ培地を加えて３７℃にて１時間培養した。適量を寒天プレート（５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地）に播種し、３７℃にて一晩培養した。無作為に数十個のクローンを選び、アルカリ法によってプラスミドＤＮＡを調製した。
【００４６】
（１−７：配列決定）
上記１−６で得られたプラスミドＤＮＡ中のＡＧＥ−２特異的ＤＮＡの配列を、Applied Biosystem社のABI377を用いてBigDye Terminator Cycle sequence法によって行った。
【００４７】
その結果、３４塩基の一本鎖ＤＮＡからは、ＡＧＥ−２に結合するものが得られなかった。５６塩基の一本鎖ＤＮＡからは、配列番号１〜２４に示す５４〜５８塩基の一本鎖ＤＮＡ、すなわちＡＧＥ−２アプタマーが得られた（表１）。なお、７２塩基の一本鎖ＤＮＡについてもＡＧＥ−２に結合するものが得られたが、配列決定は行っていない。
【００４８】
【表１】
0005414975.tif 000002
【００４９】
表１に示すように、得られたＡＧＥ−２アプタマーはいずれも、該アプタマーを構成する塩基中のシトシン含有率が３５％以上であった。
【００５０】
さらに、６４塩基のランダム領域およびその両側にプライマー部位（配列番号４２および４３）を含む一本鎖ランダムオリゴＤＮＡを鋳型に用いて、同様にしてＡＧＥ−２アプタマーを作製した。
【００５１】
その結果、配列番号２５〜４１に示す６１〜６６塩基の一本鎖ＤＮＡ、すなわちＡＧＥ−２アプタマーが得られた（表２）。
【００５２】
【表２】
0005414975.tif 000003
【００５３】
表２に示すように、得られたＡＧＥ−２アプタマーはいずれも、該アプタマーを構成する塩基中のグアニン含有率が３２％以上であった。
【００５４】
（実施例２：ＡＧＥ−２アプタマーを用いたラット腎組織の染色）
（２−１：糖尿病性腎症を発生したラットからの腎組織凍結切片の作製）
自然発症肥満２型糖尿病ラットであるOtsuka Long-Evans Tokushima Fatty RAT（ＯＬＥＴＦ）および非糖尿病対照のLong-Evans Tokushima Otsuka RAT（ＬＥＴＯ）の４週齢の雄を大塚製薬株式会社より供給をうけ、ＳＰＦ飼育を開始した。ラットに、ラット飼育用ＣＥ−２（日本クレア株式会社）を給餌し、自由摂食・自由飲水で飼育させ、実験に供した。
【００５５】
飼育期間中、随時血糖測定を行い、全てのＯＬＥＴＦラットの糖尿病発症を確認した。さらに、飼育期間中は定期的に体重および血糖値を測定し、そして飼育開始時、糖尿病発症確認時、および飼育終了直前に尿を採取し、尿蛋白を測定した。ＯＬＥＴＦラットの糖尿病発症を確認した後、約４週間飼育して最終実験に供した。ＯＬＥＴＦラットおよびＬＥＴＯラットを麻酔薬で安楽死させ、各ラットから腎臓を摘出した。
【００５６】
摘出した腎臓を当業者が通常用いる方法に従って固定し、次いで固定した腎組織片をＯＣＴコンパウンドに包埋して凍結し、凍結ミクロトーム（クリオスタット）にて薄切した。作製した凍結切片をシラン塗布スライドガラスに貼り付け、凍結切片スライドを得た。
【００５７】
（２−２：ジゴキシゲニン標識ＡＧＥ−２アプタマーの化学合成）
ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−ｄＵＴＰ（Rosche製）０．０１ｍＭをｄＮＴＰに混合した合成用基質を用いたこと以外は、上記１−１と同様にホスホアミダイト法により、上記実施例１で得られたＡＧＥ−２アプタマーの配列に基づいて、各ＡＧＥ−２アプタマーを化学合成した。東洋紡社製のキット「Insert Check −Ready−」を使用してジゴキシゲニン標識ＡＧＥ−２アプタマーの生成を確認した。
【００５８】
（２−３：Alexa Fluor（登録商標）488標識抗ジゴキシゲニンマウスモノクローナル抗体の作製）
抗ジゴキシゲニンマウスモノクローナル抗体（Rosche製；抗ＤＩＧ抗体）を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５、２５℃）に溶解し、得られた４ｍｇ／ｍＬ（0.0267μｍｏｌ／ｍＬ）濃度の溶液を１ｍＬ遮光ビンに入れ、シリコン製のスターラーバーで穏やかに攪拌した。
【００５９】
Alexa Fluor（登録商標）488スクシンイミドエステル（モレキュラープローブ社）１ｍｇ（1.555μｍｏｌ）をコニカルチューブに量りとり、１１６μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、13.405μｍｏｌ／ｍＬ−ＤＭＳＯ濃度の溶液を調製した。
【００６０】
このAlexa Fluor（登録商標）488スクシンイミドエステル溶液３０μＬを抗ＤＩＧ抗体溶液に一気に添加し、よく混合した。穏やかに攪拌しながら、室温下にて２時間、反応を続けた。
【００６１】
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化したHiPrep 26/10脱塩カラム（GEヘルスケアバイオサイエンス）で、Alexa Fluor（登録商標）488標識抗ＤＩＧ抗体と未反応物とを分画した。
【００６２】
得られたAlexa Fluor（登録商標）488標識抗ＤＩＧ抗体の495nmおよび280nmの吸光度から、抗ＤＩＧ抗体１分子当たり３．３分子のAlexa Fluor（登録商標）488が結合している標識抗体が得られた。
【００６３】
Alexa Fluor（登録商標）488標識抗ＤＩＧ抗体を含む画分の溶液を限外濾過で濃縮し、０．２μｍのメンブレンフィルターで濾過し、ストック溶液とした。使用する際にＰＢＳに最終濃度として１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０５％（ｗ／ｖ）Tween（登録商標）２０を加えた溶液で希釈した。
【００６４】
（２−４：ラット腎組織凍結切片の組織染色）
上記２−１で作製した凍結切片の賦活化処理を以下のように行った。抗原賦活化液として、０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に最終濃度０．１％（ｗ／ｖ）のTween（登録商標）２０を含む溶液を耐熱性のドーゼ（染色瓶）に入れる。その中へ凍結切片スライドを静かに浸漬した。染色ドーゼをオートクレーブ中で１２１℃にて１０分間処理し、次いで室温にて４０分間冷却した。
【００６５】
シーケンザ免疫染色センター（シャンドン社製）を使用して、組織染色を実施した。簡潔には、ＯＬＥＴＦラットおよびＬＥＴＯラット腎臓から作製した凍結切片スライドを各々カバープレートにセットして、シーケンザのカセットに押し込み、カバープレートをスライドに密着させた。
【００６６】
１μｇ／ｍＬ濃度のジゴキシゲニン標識ＡＧＥ−２アプタマー（上記２−２で調製）１００μＬをシーケンザのカセットに添加し、そのまま２時間インキュベートした。次いで、２ｍＬのＰＢＳで洗浄した。次いで、上記２−３で調製したAlexa Fluor（登録商標）488標識抗ＤＩＧ抗体溶液を、ＰＢＳに最終濃度として１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０５％（ｗ／ｖ）Tween（登録商標）２０を含む溶液で１μｇ／ｍＬ濃度に調整し、この溶液１００μＬをシーケンザのカセットに添加して室温にて２時間インキュベートした。次いで、２ｍＬのＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ１容に対してグリセリン９容を含む封入剤をシーケンザのカセットに添加し、スライドを封入した。これにより、組織染色されたスライドが得られた。
【００６７】
組織染色されたスライドを蛍光実体顕微鏡（ニコン  ＳＭＺ１５ＦＬＡ）下で観察し、デジタルカメラで撮影した。
【００６８】
図１は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含む５６塩基からなる一本鎖ＤＮＡであるＡＧＥ−２アプタマーを用いて染色した腎臓凍結切片スライドの蛍光顕微鏡写真である（倍率１００倍）。図１には、糸球体中のメサンギウム組織に蛍光が観察され、ＡＧＥ−２の蓄積が明らかに示された。
【００６９】
図２は、配列表の配列番号９に記載の塩基配列を含む５６塩基からなる一本鎖ＤＮＡであるＡＧＥ−２アプタマーを用いて染色した腎臓凍結切片スライドの蛍光顕微鏡写真である（倍率２００倍）。拡大率が上昇した図２には、メサンギウム組織全体にわたって蛍光が観察された。
【００７０】
したがって、ＡＧＥ−２アプタマーを用いて、メサンギウム組織中のＡＧＥ−２の蓄積が明らかに示された。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明によれば、細胞または組織内のＡＧＥ−２を免疫組織化学的に検出できる方法およびキットが提供される。本発明の方法およびキットは、ＡＧＥ−２が関与する疾患、例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害などの糖尿病合併症、アルツハイマー病などの神経変性疾患、悪性腫瘍の増殖、転移、浸潤などを検出または診断するのに利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含む５６塩基からなる一本鎖ＤＮＡであるＡＧＥ−２アプタマーを用いて染色した腎臓凍結切片スライドの蛍光顕微鏡写真である。
【図２】配列表の配列番号９に記載の塩基配列を含む５６塩基からなる一本鎖ＤＮＡであるＡＧＥ−２アプタマーを用いて染色した腎臓凍結切片スライドの蛍光顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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