(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｃ１）、（ｃ２）、および（ｃ３）からなる群から選択されるポリペプチドである、グルコース脱水素酵素：
（ａ１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１〜２５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド；
（ａ３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド；
（ｂ１）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１〜２５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド；
（ｂ３）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド；
（ｃ１）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｃ２）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列において、１〜２５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド；
（ｃ３）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
下記（ａ１）、（ａ２）および（ａ３）からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項１に記載のグルコース脱水素酵素：
（ａ１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１〜２５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド；
（ａ３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
下記（ｂ１）、（ｂ２）および（ｂ３）からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項１に記載のグルコース脱水素酵素：
（ｂ１）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１〜２５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド；
（ｂ３）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
下記（ｃ１）、（ｃ２）および（ｃ３）からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項１に記載のグルコース脱水素酵素：
（ｃ１）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｃ２）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列において、１〜２５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド；
（ｃ３）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のグルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
下記（Ａ１）〜（Ａ４）のいずれかである請求項５記載のＤＮＡ：
（Ａ１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ａ３）配列表の配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．２倍濃度のＳＳＣ溶液を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄する条件下でハイブリダイズし、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ａ４）配列表の配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
下記（Ｂ１）〜（Ｂ４）のいずれかである請求項５記載のＤＮＡ：
（Ｂ１）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｂ２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｂ３）配列表の配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．２倍濃度のＳＳＣ溶液を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄する条件下でハイブリダイズし、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｂ４）配列表の配列番号４に記載の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
下記（Ｃ１）〜（Ｃ４）のいずれかである請求項５記載のＤＮＡ：
（Ｃ１）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｃ２）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｃ３）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．２倍濃度のＳＳＣ溶液を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄する条件下でハイブリダイズし、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｃ４）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれかに記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかに記載のグルコース脱水素酵素、または、請求項１０に記載の形質転換体を用いて、ＮＡＤＰとグルコースからＮＡＤＰＨを生成させる、ＮＡＤＰＨの生産方法。
【請求項１２】
ＮＡＤＰＨを補酵素とする還元酵素源を用いた酵素的還元反応において、請求項１〜４のいずれかに記載のグルコース脱水素酵素、または、請求項１０に記載の形質転換体を用いてＮＡＤＰＨを再生することを特徴とする、還元反応システム。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載のグルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡ、およびＮＡＤＰＨを補酵素とする還元酵素をコードするＤＮＡの両方が導入されて両酵素活性を獲得した形質転換体を用いる請求項１２記載の還元反応システム。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれかに記載のグルコース脱水素酵素、または、請求項１０に記載の形質転換体を用いることを特徴とする、バイオセンサー。
【請求項１５】
ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＰの検出および／または濃度測定用の、請求項１４に記載のバイオセンサー。
【請求項１６】
Ｄ−グルコースもしくは２−デオキシ−Ｄ−グルコースの検出および／または濃度測定用の、請求項１４に記載のバイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規グルコース脱水素酵素、その遺伝子、その遺伝子を含むベクター、そのベクターで形質転換された形質転換体、およびそれらを利用した還元反応システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコース脱水素酵素は、グルコースと酸化型ニコチアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ）または酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ）より、Ｄ−δ−グルコノラクトン（以下、グルコノラクトン）と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨ）を生成する反応を触媒する酵素である。これらグルコース脱水素酵素は細菌、酵母から哺乳類に至るまで広く存在しているが、その多くが補酵素としてのＮＡＤ、ＮＡＤＰの両方に活性を有する。【０００３】
一方、ＮＡＤＰ特異的なグルコース脱水素酵素は、そのＮＡＤＰ特異的な性質を利用し、バイオセンサーやＮＡＤＰ特異的脱水素酵素による還元反応の補酵素再生酵素として利用し得る産業上有用な酵素である。バイオセンサーとしての利用としては、例えば、ＮＡＤＰＨ酸化酵素とグルコース−６−リン酸脱水素酵素（後述）とを利用したＮＡＤＰＨの高感度測定法が報告されている（非特許文献1）。また、国際公開第ＷＯ２００６／０９０８１４号パンフレットには、２級アルコールのエナンチオマー混合物を実質的に単一なエナンチオマーからなる光学活性２級アルコールに変換する光学活性２級アルコールの製造方法の記載があるが、効率的に光学活性２級アルコールを製造するためには、使用するＮＡＤＰ特異的なグルコース脱水素酵素のＮＡＤＰ／ＮＡＤ活性比は高ければ高いほど望ましい（特許文献1）。【０００４】
補酵素としてのＮＡＤＰに対して特異的に作用するグルコース脱水素酵素は、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、サッカロミセス属（Saccharomyces）属由来のものが知られている（特許文献2、3、非特許文献2、3参照）。 このうち、アミノ酸配列や該酵素をコードするDNA配列の情報が明らかとなっているのは、クリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）JCM3687株のＮＡＤＰ特異的グルコース脱水素酵素だけである。このように、公知のＮＡＤＰ特異的なグルコース脱水素酵素の数は少なく、またそのアミノ酸配列や該酵素をコードするＤＮＡ配列の情報は更に少ない。したがって、ＮＡＤＰ特異的なグルコース脱水素酵素、及び該酵素をコードする塩基配列情報及び該酵素のアミノ酸配列情報の提供が望まれていた。【０００５】
一方、補酵素としてのＮＡＤＰに特異的に作用する酵素のその他の例として、グルコース−６−リン酸脱水素酵素がある。クリプトコッカス属、アスペルギルス（Aspergillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属等の一部のグルコース−６−リン酸脱水素酵素はグルコースにも活性を示し、即ちＮＡＤＰ特異的グルコース脱水素活性を有することが知られている。しかしながら、そのグルコース脱水素活性はグルコース−６−リン酸脱水素活性に対して１５％以下であり（非特許文献4）、グルコース脱水素酵素としての利用には適していない。そのため、グルコース−６−リン酸脱水素酵素を用いてＮＡＤＰをＮＡＤＰＨへ効率的に還元するためには、高価なグルコース−６−リン酸が必要となり、経済的な方法とはいえない。【０００６】
ラクトバシラス（Lactobacillus）属細菌のグルコース脱水素酵素活性については、過去に研究されており、該酵素活性は有さないと報告されている（非特許文献5）。また、遺伝子データベースであるジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）には、ラクトバシラス属細菌のグルコース脱水素酵素として、ラクトバシラス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）NCFM株及びラクトバシラス・サリバリウス・スブスピー・サリバリウス（Lactobacillus salivarius subsp. salivarius）UCC118株由来のポリペプチドが登録されている。しかし、いずれのポリペプチドも、グルコース脱水素酵素活性を有するかどうかを実験的に確認した、という報告はこれまでにない。このように、ラクトバシラス属細菌のグルコース脱水素酵素に関しては、これまでに全く報告が無いといっても良い。【０００７】
また、ペディオコッカス（Pediococcus）属細菌のグルコース脱水素酵素活性については、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）、ペディオコッカス・シェレビッシェ（Pediococcus cerevisiae）が該酵素活性を有することが報告されている（非特許文献5）。しかし、これらのＮＡＤＰに対する特異性に関する報告はない。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００６／０９０８１４号パンフレット
【特許文献２】特公昭63-109773号公報
【特許文献３】特開2006-262767号公報
【非特許文献１】北海道立工業試験場報告 第293巻，p141-145, 1994年
【非特許文献２】J. Bacteriol., 第184巻，3号，p672-678, 2002年
【非特許文献３】Methods Enzymol., 第89巻, p159-163,1982年
【非特許文献４】Arch. Biochem. Biophys., 第228巻，1号，p113-119, 1984年
【非特許文献５】J. Bacteriol., 第90巻，3号，p653-660, 1965年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明はＮＡＤＰに対して特異的に作用する新規グルコース脱水素酵素及びその利用法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題に鑑み、ＮＡＤＰに特異的に作用する新規なグルコース脱水素酵素をスクリーニングした。その結果、これまでに報告されているＮＡＤＰ特異的なグルコース脱水素酵素に比べて、よりＮＡＤＰに対して特異性の高い新規なグルコース脱水素酵素を乳酸菌より見出すことができた。そして、該酵素遺伝子を宿主生物に導入することにより、本酵素を大量発現させることにも成功した。【００１０】
本発明は、以下の１又は複数の特徴を有する。【００１１】
本発明の一つの特徴は、乳酸菌由来、特にラクトバシラス（Lactobacillus）属細菌もしくはペディオコッカス（Pediococcus）属細菌に由来し、ＮＡＤＰに対して特異的に作用するグルコース脱水素酵素である。【００１２】
本発明の別の特徴は、下記（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｃ１）、（ｃ２）および（ｃ３）からなる群から選択されるポリペプチドである、乳酸菌、特にラクトバシラス（Lactobacillus）属細菌、ペディオコッカス（Pediococcus）属細菌に由来し、ＮＡＤＰに対して特異的に作用するグルコース脱水素酵素である。
（ａ１）  配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ａ２）  配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド；
（ａ３）  配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド；
（ｂ１）  配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ２）  配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド；
（ｂ３）  配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド。
（ｃ１）  配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｃ２）  配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド；
（ｃ３）  配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド。【００１３】
本発明の別の特徴は、下記（Ａ１）〜（Ａ４）のいずれかのＤＮＡである。
（Ａ１）  配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ａ２）  配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ａ３）  配列表の配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ａ４）  配列表の配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。【００１４】
本発明の別の特徴は、下記（Ｂ１）〜（Ｂ４）のいずれかのＤＮＡである。
（Ｂ１）  配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｂ２）  配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｂ３）  配列表の配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｂ４）  配列表の配列番号４に記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。【００１５】
本発明の別の特徴は、下記（Ｃ１）〜（Ｃ４）のいずれかのＤＮＡである。
（Ｃ１）  配列表の配列番号１２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｃ２）  配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｃ３）  配列表の配列番号１２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｃ４）  配列表の配列番号１２に記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。【００１６】
本発明の別の特徴は、本発明のグルコース脱水素酵素または本発明のＤＮＡを導入した形質転換体およびその処理物を用いてＮＡＤＰとグルコースからＮＡＤＰＨを生成させる、ＮＡＤＰＨの生産方法である。【００１７】
本発明の別の特徴は、ＮＡＤＰＨを補酵素とする還元酵素源を用いた酵素的還元反応において、本発明のグルコース脱水素酵素または本発明のＤＮＡを導入した形質転換体およびその処理物を用いてＮＡＤＰＨを再生することを特徴とする、還元反応システムである。【００１８】
本発明の別の特徴は、本発明のグルコース脱水素酵素または本発明のＤＮＡを導入した形質転換体を用いた各種化合物検出用のバイオセンサーである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、新規グルコース脱水素酵素、その遺伝子、その遺伝子を含むベクター、そのベクターで形質転換された形質転換体、それらを利用したＮＡＤＰＨ生産方法及び還元反応システムが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明について実施形態を用いて詳細に説明する。なお、本発明はこれらにより限定されるものではない。【００２１】
本発明のグルコース脱水素酵素は、補酵素としてＮＡＤＰに対して特異的に作用するグルコース脱水素酵素（ＮＡＤＰ特異的グルコース脱水素酵素）である。これについて、以下に説明する。【００２２】
ＮＡＤＰに対する特異性について
上記の「ＮＡＤＰに対して特異的に作用する」とは、ＮＡＤに対しては事実上作用せず、ＮＡＤＰに対してのみ作用することである。これは、以下に記載の酵素活性測定方法により、ＮＡＤもしくはＮＡＤＰを用いた場合のグルコース脱水素酵素活性を測定し、ＮＡＤＰ使用時の酵素活性値をＮＡＤ使用時の酵素活性値で割った値（ＮＡＤＰ／ＮＡＤ活性比）が３００以上であることを意味する。好ましくは、ＮＡＤＰ／ＮＡＤ活性比が５００以上、より好ましくは１０００以上、更に好ましくは５０００以上であり、最も好ましくは１００００以上である。【００２３】
［グルコース脱水素酵素活性の測定方法］
１．０Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中に、ＮＡＤもしくはＮＡＤＰを２．０ｍＭ、グルコース１００ｍＭおよび評価したいグルコース脱水素酵素を含む反応液を２５℃で反応させ、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨ量の増加に伴う波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより、グルコースのグルコノラクトンへの酸化反応の進行を容易に評価することができる。グルコース脱水素酵素活性１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの生成を触媒する酵素量とした。【００２４】
本発明のグルコース脱水素酵素の取得について
本発明のグルコース脱水素酵素は、当該活性を有する乳酸菌、特にラクトバシラス（Lactobacillus）属細菌もしくはペディオコッカス（Pediococcus）属細菌から単離することができる。該酵素を有する乳酸菌は、例えば、以下の方法で見出すことができる。【００２５】
乳酸菌を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集める。得られた菌体を、超音波破砕機、あるいは、グラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得る。先に記載したグルコース脱水素酵素活性の測定方法により、ＮＡＤ、ＮＡＤＰを用いた場合の活性値を測定することにより、ＮＡＤＰに対して特異的なグルコース脱水素酵素を有するかどうかを容易に評価できる。【００２６】
乳酸菌を培養するための培地としては、その乳酸菌が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地、例えばＭＲＳ培地など、を用いることができる。培養は、例えば、温度２５℃から３７℃で、嫌気条件下で静置培養を行い得る。【００２７】
乳酸菌からの該酵素の単離は、公知の蛋白質精製法を適宜組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、以下のように実施できる。まず、当該ラクトバシラス属細菌を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離、あるいは、濾過等により菌体を集める。得られた菌体を、超音波破砕機、あるいは、グラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得る。そして、熱処理、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いることにより、該無細胞抽出液から本発明のグルコース脱水素酵素を単離する。【００２８】
本発明のグルコース脱水素酵素の起源は、乳酸菌由来であれば限定されるものではない。好ましくは、ラクトバシラス（Lactobacillus）属細菌、ペディオコッカス（Pediococcus）属細菌が挙げられる。【００２９】
ラクトバシラス属として、例えば、Lactobacillus acetotolerans、Lactobacillus acidipiscis、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus agilis、Lactobacillus algidus、Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus amylolyticus、Lactobacillus amylophilus、Lactobacillus amylotrophicus、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus animalis、Lactobacillus arizonensis、Lactobacillus aviarius subsp. araffinosus、Lactobacillus aviarius subsp. aviarius、Lactobacillus bavaricus、Lactobacillus bifermentans、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus bulgaricus、Lactobacillus camelliae、Lactobacillus casei、Lactobacillus casei subsp. alactosus、Lactobacillus casei subsp. casei、Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum、Lactobacillus casei subsp. rhamnosus、Lactobacillus casei subsp. tolerans、Lactobacillus catenaformis、Lactobacillus cellobiosus、Lactobacillus coleohominis、Lactobacillus collinoides、Lactobacillus composti、Lactobacillus concavus、Lactobacillus confusus、Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis、Lactobacillus coryniformis subsp. torquens、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus curvatus subsp. melibiosus、Lactobacillus cypricasei、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus、Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii、Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis、Lactobacillus diolivorans、Lactobacillus divergens、Lactobacillus durianis、Lactobacillus equi、Lactobacillus farciminis、Lactobacillus farraginis、Lactobacillus ferintoshensis、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus fornicalis、Lactobacillus fructivorans、Lactobacillus fructosus、Lactobacillus frumenti、Lactobacillus fuchuensis、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus graminis、Lactobacillus halotolerans、Lactobacillus hamsteri、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus heterohiochii、Lactobacillus hilgardii、Lactobacillus homohiochii、Lactobacillus ingluviei、Lactobacillus intestinalis、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus kandleri、Lactobacillus kefir、Lactobacillus kefiranofaciens、Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens、Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum、Lactobacillus kefirgranum、Lactobacillus kefiri、Lactobacillus kimchii、Lactobacillus kitasatonis、Lactobacillus lactis、Lactobacillus leichmannii、Lactobacillus lindneri、Lactobacillus malefermentans、Lactobacillus mali、Lactobacillus maltaromicus、Lactobacillus manihotivorans、Lactobacillus mindensis、Lactobacillus minor、Lactobacillus minutus、Lactobacillus mucosae、Lactobacillus murinus、Lactobacillus nagelii、Lactobacillus oris、Lactobacillus panis、Lactobacillus pantheris、Lactobacillus parabuchneri、Lactobacillus paracasei subsp. paracasei、Lactobacillus paracasei subsp. tolerans、Lactobacillus paracollinoides、Lactobacillus parafarraginis、Lactobacillus parakefir、Lactobacillus parakefiri、Lactobacillus paralimentarius、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus perolens、Lactobacillus piscicola、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus plantarum subsp. plantarum、Lactobacillus pontis、Lactobacillus psittaci、Lactobacillus rennini、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus rimae、Lactobacillus ruminis、Lactobacillus sake、Lactobacillus sakei subsp. carnosus、Lactobacillus sakei subsp. sakei、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus salivarius subsp. salicinius、Lactobacillus sanfranciscensis、Lactobacillus sanfrancisco、Lactobacillus satsumensis、Lactobacillus sharpeae、Lactobacillus sp.、Lactobacillus suebicus、Lactobacillus thailandensis、Lactobacillus thermotolerans、Lactobacillus uli、Lactobacillus vaccinostercus、Lactobacillus vaginalis、Lactobacillus vini、Lactobacillus viridescens、Lactobacillus vitulinus、Lactobacillus xylosus、Lactobacillus yamanashiensis subsp. mali、Lactobacillus yamanashiensis subsp. yamanashiensis、Lactobacillus zeae などを挙げることができる。好ましくは Lactobacillus plantarum、Lactobacillus pentosusであり、より好ましくは、Lactobacillus plantarum JCM1149株、Lactobacillus pentosus JCM1558株が挙げられる。【００３０】
ペディオコッカス（Pediococcus）属細菌としては、例えば、Pediococcus acidilactici、Pediococcus cellicola、Pediococcus damnosus、Pediococcus dextrinicus、Pediococcus halophilus、Pediococcus inopinatus、Pediococcus parvulus、Pediococcus pentosaceus、 Pediococcus siamensis、Pediococcus urinaeequi を挙げることができる。好ましくはPediococcus parvulusであり、より好ましくは、Pediococcus parvulus JCM5889株が挙げられる。【００３１】
当該微生物は、独立行政法人理化学研究所 バイオリソースセンター（ＪＣＭ：〒305-0074  茨城県つくば市高野台３-１-１）より入手することができる。【００３２】
本発明のポリペプチドについて
本発明のポリペプチドとしては、例えば以下の（ａ１）〜（ａ３）のポリペプチドを挙げることができる。
（ａ１）  配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ａ２）  配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド；
（ａ３）  配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド。【００３３】
上記（ａ２）、（ａ３）について、以下に詳説する。【００３４】
（ａ２）のポリペプチドについて
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley and Sons, Inc., 1989）等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、グルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有する限りは、上記ポリペプチドに包含される。【００３５】
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において、アミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加される場所は特に制限されないが、高度保存領域を避けるのが好ましい。ここで、高度保存領域とは、由来の異なる複数の酵素について、アミノ酸配列を最適に整列させて比較した場合に、複数の配列間でアミノ酸が一致している位置を表す。高度保存領域は、配列番号１に示したアミノ酸配列と、公知の微生物由来のアルコール脱水素酵素のアミノ酸配列とを、ＧＥＮＥＴＹＸ等のツールを用いて比較することにより確認することができる。【００３６】
置換、挿入、欠失及び／又は付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。【００３７】
また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする。
（第１群：中性非極性アミノ酸）Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Cys, Pro, Phe 
（第２群：中性極性アミノ酸）Ser, Thr, Gln, Asn, Trp, Tyr
（第３群：酸性アミノ酸）Glu, Asp 
（第４群：塩基性アミノ酸）His, Lys, Arg
上記で記載の「複数個のアミノ酸」とは、例えば、２５個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、５個、４個、３個、または２個以下のアミノ酸、を意味する。【００３８】
（ａ３）のポリペプチドについて
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドが、グルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有する場合は、これも本発明のポリペプチドに含まれる。配列表の配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドは本発明のポリペプチドに含まれるが、その配列同一性は９２％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上が更に好ましく、９９％以上がより最も好ましい。【００３９】
アミノ酸配列の配列同一性は、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列と、評価したいアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を比較総アミノ酸数で除して、さらに１００を乗じた値で表される。【００４０】
また、本発明のポリペプチドとしては、以下の（ｂ１）〜（ｂ３）のポリペプチドを挙げることができる。
（ｂ１）  配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ２）  配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド；
（ｂ３）  配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド。【００４１】
上記（ｂ２）、（ｂ３）の意味するところは、前述の（ａ２）、（ｂ２）と同様である。【００４２】
また、本発明のポリペプチドとしては、以下の（ｃ１）〜（ｃ３）のポリペプチドを挙げることができる。
（ｃ１）  配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｃ２）  配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド；
（ｃ３）  配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチド。【００４３】
上記（ｃ２）、（ｃ３）の意味するところは、前述の（ａ２）、（ａ３）と同様である。【００４４】
なお、配列表の配列番号１、３、および１１に示すアミノ酸配列について、タンパク質配列データベースＧｅｎｂａｎｋを対象にＢＬＡＳＴプログラムを用いてホモロジー検索を実施したところ、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）の短鎖アルコース脱水素酵素（アクセスデータ番号：ＡＢＪ６７１８４）が最も高い配列同一性を示し、その配列同一性は、配列１とは８７．７％、配列３とは８３．９％、配列１１とは８３．９％であった。但し、本ポリペプチドは短鎖アルコール脱水素酵素と報告されているものの、あくまで配列からの機能推定であり、実際に短鎖アルコール脱水素酵素活性を有することは、これまでに報告されていない。また、本酵素がグルコース脱水素酵素活性を有すること、ＮＡＤＰＨ特異的なグルコース脱水素酵素活性を有することについてはこれまでに報告されていない。【００４５】
また、グルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有する限り、配列番号１、３または１１に記載のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。たとえば、ヒスチジンタグやＨＡタグのようなタグ配列を付加することができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また、グルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。【００４６】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニングについて
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で該酵素を発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。該酵素が取得できれば、該酵素の起源となる生物より、当業者であれば公知の方法で、このようなＤＮＡを取得できる。例えば、以下に示した方法で取得できる。【００４７】
なお、本明細書において後述する、ＤＮＡクローニング、ベクターの調製及び形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）等の成書に記載されている方法により実施することができる。また、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％（ｗ／ｖ）を意味する。【００４８】
まず、先の「本発明のグルコース脱水素酵素の取得について」で記載した方法で単離された本発明の酵素について、適当なエンドペプチダーゼを用いて消化し、生じたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣにより分取する。そして、例えば、ＡＢＩ４９２型プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、これらのペプチド断片のアミノ酸配列の一部または全部を決定する。【００４９】
このようにして得られたアミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅するためのＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）プライマーを合成する。次に、通常のＤＮＡ単離法、例えば、Ｖｉｓｓｅｒ等の方法（Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (2000)）により、該ポリペプチドの起源となる微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌ  ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）等を用いて行うことができる。【００５０】
該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、インバース（Ｉｎｖｅｒｓｅ）ＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)）によりその全体の配列を決定することができる。【００５１】
また、本発明のポリヌクレオチドの別の取得方法として、本発明と同じ機能、すなわちグルコース脱水素酵素活性を有する公知のポリペプチドのアミノ酸配列情報をもとにした取得方法が挙げられる。すなわち、公知のグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドについて、そのアミノ酸配列を比較することにより高度保存領域を推定する。【００５２】
この高度保存領域のアミノ酸配列をもとにして、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部を増幅するためのＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）プライマーを合成する。本発明のポリペプチドの起源となる微生物の染色体ＤＮＡを調製し、この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部を増幅し、前記と同様に操作して、その塩基配列を決定する。この塩基配列が決定できれば、上記と同様に、例えば、インバース（Ｉｎｖｅｒｓｅ）ＰＣＲ法によりその全体の塩基配列を決定することができる。【００５３】
このようにして得られる本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとして、例えば、配列表の配列番号２、配列番号４もしくは配列番号１２に示す塩基配列を含むＤＮＡを挙げることができる。以下に、配列番号２、配列番号４及び配列番号１２に示す塩基配列について説明する。【００５４】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの配列について
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとして、例えば、配列表の配列番号２、配列番号４もしくは配列番号１２に示した塩基配列からなるＤＮＡ、又は、配列表の配列番号２、配列番号４もしくは配列番号１２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、を挙げることができる。【００５５】
ここで、「配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ」とは、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡで、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを意味する。【００５６】
「配列表の配列番号４に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ」および「配列表の配列番号１２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ」についても同様である。【００５７】
ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning, A laboratory manual, second edition （Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡをあげることができる。好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。【００５８】
以上のようにハイブリダイゼーション条件を記載したが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。【００５９】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号１２に示されるＤＮＡと、配列同一性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上のＤＮＡをあげることができ、コードされるポリペプチドが、グルコースとＮＡＤＰに作用してグルコノラクトンとＮＡＤＰＨを生成する活性を有する限り、上記ＤＮＡに包含される。【００６０】
ここで、「配列同一性（％）」とは、対比される２つのＤＮＡを最適に整列させ、核酸塩基(例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。【００６１】
配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：GCG Wisconsin Package（Program Manual for The Wisconsin Package, Version8, 1994年9月, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Medison, Wisconsin, USA 53711; Rice, P. (1996) Program Manual for EGCG Package, Peter Rice, The Sanger Centre, Hinxton Hall, Cambridge, CB10 1RQ, England）、及び、the ExPASy World Wide Web分子生物学用サーバー（Geneva University Hospital and University of Geneva, Geneva, Switzerland）。【００６２】
宿主−ベクター系及び形質転換体について
本発明のグルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入することにより、ポリペプチド発現ベクターが作製できる。また、この組換えベクターで宿主生物を形質転換して得られる形質転換体を培養することにより、本発明の酵素を発現させることができる。更に、本発明の酵素をコードするポリヌクレオチドを染色体中に導入する方法なども利用できる。【００６３】
上記で用いる発現ベクターとしては、適当な宿主生物内で当該ＤＮＡがコードするポリペプチドを発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。【００６４】
このようなベクターは、例えば大腸菌の場合では、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮ１８（実施例３参照）、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３公報）などが挙げられる。【００６５】
本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。【００６６】
本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。【００６７】
各種生物において利用可能なベクター、プロモーターなどに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。【００６８】
各ポリペプチドを発現させるために用いる宿主生物は、各ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むポリペプチド発現ベクターにより形質転換され、導入したＤＮＡがコードするポリペプチドを発現することができる生物であれば、特に制限はされない。利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア(Escherichia)属、バシラス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、及びラクトバシラス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌、ロドコッカス(Rhodococcus)属及びストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ピキア(Pichia)属、及びキャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母、ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、及びトリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ、などが挙げられる。【００６９】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。【００７０】
本発明の酵素をコードするＤＮＡを含む組み換えベクターは、公知の方法により宿主微生物に導入できる。例えば、組換えベクターとして前記の発現ベクターｐＵＣＮ１８に配列番号２に示すＤＮＡを導入した本発明のベクターであるプラスミドｐＮＧＬＰ（実施例３参照）を、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）などを用いて、そのプロトコールに従って操作することにより、当該ベクターを宿主細胞に導入した形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＧＬＰ）（実施例５参照）が得られる。【００７１】
また、組換えベクターとして前記の発現ベクターｐＵＣＮ１８に配列番号４に示すＤＮＡを導入した本発明のベクターであるプラスミドｐＮＧＬＰ２（実施例４参照）を、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）などを用いて、そのプロトコールに従って操作することにより、当該ベクターを宿主細胞に導入した形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＧＬＰ２）（実施例５参照）が得られる。【００７２】
また、組換えベクターとして前記の発現ベクターｐＵＣＮ１８に配列番号１２に示すＤＮＡを導入した本発明のベクターであるプラスミドｐＮＧＰＰ２（実施例１４参照）を、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）などを用いて、そのプロトコールに従って操作することにより、当該ベクターを宿主細胞に導入した形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＧＰＰ２）（実施例１４参照）が得られる。【００７３】
また、本発明のグルコース脱水素酵素及び後述するＮＡＤＰＨを補酵素とする還元酵素活性を有するポリペプチドの両ポリペプチドを、同一菌体内で発現させた形質転換体も育種することができる。すなわち、本発明の酵素をコードするＤＮＡ及び還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる他、これら２種類のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それらを同一の宿主細胞に導入することによっても得られうる。【００７４】
ＮＡＤＰとグルコースからのＮＡＤＰＨの生産
［反応条件］
本発明の酵素もしくは本発明の酵素を発現させた形質転換体を用いて、ＮＡＤＰとグルコースからＮＡＤＰＨへ変換することによりＮＡＤＰＨを生産する場合、以下のように実施され得る。但し、以下の方法に限定されるわけではない。【００７５】
例えば１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７）などのような適当な溶媒中にグルコース、ＮＡＤＰを添加する。これに本発明の酵素もしくは／及び本発明の酵素を発現させた形質転換体の培養物及び／またはその処理物など、を添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。【００７６】
ここで、処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、菌体破砕物、またはそれらの固定化物等で、本発明の酵素触媒活性が残存している物を意味する。【００７７】
反応はバッチ式あるいは連続方式で行われ得る。添加するグルコースの量は、ＮＡＤＰと同じモル量以上添加するのが好ましい。反応の途中で新たにＮＡＤＰもしくはグルコースを追加添加しても良い。【００７８】
この反応は５〜８０℃、好ましくは１０〜６０℃、より好ましくは２０〜４０℃の温度で行われ、反応中反応液のｐＨは４〜８．５、好ましくは５〜８、より好ましくは６〜７．５、特に好ましくは７に維持する。【００７９】
また、反応には水系溶媒を用いてもよいし、水系の溶媒と有機系の溶媒とを混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ヘキサン、イソプロパノール、ジイソプロピルエーテル、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。【００８０】
ＮＡＤＰＨを補酵素とする還元酵素源を用いた酵素的還元反応
［酵素的還元反応］
ＮＡＤＰＨを補酵素とする還元酵素源を用いた酵素的還元反応を実施する場合、補酵素としてＮＡＤＰＨが必要となる。反応系にＮＡＤＰＨを必要な量だけ添加しても実施しうる。しかし、酸化された該補酵素（ＮＡＤＰ）を還元型ＮＡＤＰＨに変換する能力を有する本発明のグルコース脱水素酵素とグルコースと共に反応を行うことにより、高価なＮＡＤＰの使用量を大幅に削減することができる。【００８１】
ＮＡＤＰＨを補酵素とする還元酵素源を用いた酵素的還元反応において、ＮＡＤＰＨを効率的に再生するために、本発明のグルコース脱水素酵素、グルコース及びＮＡＤＰを還元反応系内に添加して実施しうるが、本発明の酵素をコードするＤＮＡ及びＮＡＤＰＨを補酵素とする還元酵素をコードするＤＮＡの両者により形質転換された形質転換体を触媒とした場合は、ＮＡＤＰＨを補酵素とする還元酵素を別に調製し反応系内に添加しなくても、効率的に反応を行うことができる。このような形質転換体は、先述の「宿主−ベクター系及び形質転換体について」で記載した方法により得られる。【００８２】
［ＮＡＤＰＨを補酵素とする還元酵素］
ＮＡＤＰＨを補酵素とする還元酵素源としては、ＮＡＤＰＨを補酵素とする還元酵素活性があれば特に限定されない。例えば、各種微生物もしくはその処理物、精製酵素や市販の酵素でも良い。【００８３】
上記の処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、菌体破砕物、またはそれらの固定化物等で、該ポリペプチドの酵素触媒活性が残存している物を意味する。更にそれらは、ポリペプチド自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得る。また、微生物は遺伝子組換えにより還元酵素活性を向上させた組換え菌であっても良い。これらは、公知の酵素でも良いし、新たに見出した酵素でも良い。【００８４】
ＮＡＤＰＨを補酵素とする還元酵素活性を有する酵素としては、例えば、カルボニル還元酵素、アルデヒド還元酵素、共役ポリケトン還元酵素、アルドース還元酵素などの各種の還元酵素、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、などの各種の酸化還元酵素、旧黄色酵素などを挙げることができる。これら以外にも、酵素ハンドブック（朝倉書店、1982）などに記載されているＮＡＤＰＨを補酵素とする還元酵素なども挙げられる。【００８５】
［還元反応条件］
本発明の酵素もしくは本発明の酵素を発現させた形質転換体を用いてＮＡＤＰをＮＡＤＰＨへ変換させながら、ＮＡＤＰＨを補酵素とする還元酵素源を用いた還元反応を行う場合、以下のように実施され得る。但し、以下の方法に限定されるわけではない。【００８６】
例えば１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７）などのような適当な溶媒中にグルコース、ＮＡＤＰ及び還元したいカルボニル化合物を添加する。これに本発明の酵素もしくは／及び本発明の酵素を発現させた形質転換体の培養物及び／またはその処理物など、及びＮＡＤＰＨを補酵素とする還元酵素源を添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。【００８７】
ここで、処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、菌体破砕物、またはそれらの固定化物等で、該ポリペプチドの酵素触媒活性が残存している物を意味する。【００８８】
反応はバッチ式あるいは連続方式で行われ得る。バッチ方式の場合、還元基質であるカルボニル化合物は、０．０１〜１００％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１〜７０％、より好ましくは０．５〜５０％の仕込み濃度で添加されうる。また、反応の途中で新たに基質を追加添加しても良い。【００８９】
この反応は５〜８０℃、好ましくは１０〜６０℃、より好ましくは２０〜４０℃の温度で行われ、反応中反応液のｐＨは３〜９、好ましくは５〜８、より好ましくは５．５〜７．５に維持する。反応はバッチ式あるいは連続方式で行われ得る。【００９０】
また、反応には水系溶媒を用いてもよいし、水系の溶媒と有機系の溶媒とを混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ヘキサン、イソプロパノール、ジイソプロピルエーテル、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。【００９１】
バイオセンサーとしての利用
本発明の酵素もしくは本発明の酵素を発現させた形質転換体を用いたバイオセンサーとしては、例えば、以下に記載の化合物を検出または／もしくはその濃度を測定するためのバイオセンサーが挙げられる。
（１）ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＰ
（２）Ｄ−グルコースもしくは２−デオキシ−Ｄ−グルコース。【００９２】
ＮＡＤＰＨ酸化酵素とグルコース−６−リン酸脱水素酵素（G-6-P脱水素酵素）を用いたグルコース−６−リン酸およびＮＡＤＰＨの高感度定量方法が、非特許文献である北海道立工業試験場報告 第293巻，p141-145, 1994年  に報告されている。グルコース−６−リン酸脱水素酵素の代わりに本発明のグルコース脱水素酵素を使用し、上記文献に従って実験することにより、ＮＡＤＰＨ、Ｄ−グルコースもしくは２−デオキシ−Ｄ−グルコースを高感度に定量することができる。
【実施例】
【００９３】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、
Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）。【００９４】
（実施例１）  ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）JCM1149株が有するグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの取得
ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）JCM1149株より、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、以下の方法で取得した。【００９５】
（ＰＣＲプライマーの作製）
公知のグルコース脱水素酵素のアミノ酸配列を比較することにより決定した高度保存領域のアミノ酸配列より、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの一部をＰＣＲにより増幅するためのプライマー１（配列表の配列番号５）および、プライマー２（配列表の配列番号６）を設計し、合成した。【００９６】
（菌の培養、染色体ＤＮＡの調製）
市販のＤｉｆｃｏ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳ  Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）の液体培地（ｐＨ７）１５ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地にラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）JCM1149株を無菌的に一白金耳接種して、３０℃で約７２〜９６時間静置培養した。遠心により菌体を集菌した。菌体からの染色体ＤＮＡの調製は、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＭＯ  ＢＩＯ社製）を用いて行ない、その取り扱い説明書に従って実施した。【００９７】
（ＰＣＲによる遺伝子の増幅）
上記で調製したプライマー１および２を用い、得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、目的遺伝子の一部と考えられる約３４０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。この増幅ＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。精製した増幅断片について、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌ  ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ダイレクトシークエンスにより、その塩基配列を解析した。この塩基配列情報を基に、次のインバースＰＣＲ法により目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全塩基配列を決定した。【００９８】
（インバースＰＣＲ法による目的遺伝子の全長配列の決定）
上記で調製したラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）JCM1149株の染色体ＤＮＡを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ又はＳａｃＩで完全消化し、得られたポリヌクレオチド断片の混合物をＴ４リガーゼにより分子内環化させた。これを鋳型として用い、インバースＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)）により、上記で決定した塩基配列を含む遺伝子の全塩基配列を決定した。その結果を配列表の配列番号２に示した。インバースＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。また、配列番号２に示した塩基配列がコードするポリペプチド（以後、ＧＬＰと略す）のアミノ酸配列を配列番号１に示した。【００９９】
（実施例２）  ラクトバシラス・ペントサス（Lactobacillus pentosus）JCM1558株が有するグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの取得
ラクトバシラス・ペントサス（Lactobacillus pentosus）JCM1558株の染色体ＤＮＡを実施例１に記載と同様の方法で調製した。次に、実施例１で調製したプライマー１および２を用い、調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、目的遺伝子の一部と考えられる約３４０ｂｐのポリヌクレオチド断片が増幅された。増幅断片のポリヌクレオチドの塩基配列は、実施例１と同様の方法で解析し、決定した。この塩基配列情報を基に、次のインバースＰＣＲ法により目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全塩基配列を決定した。【０１００】
上記で調製したラクトバシラス・ペントサス（Lactobacillus pentosus）JCM1558株の染色体ＤＮＡを、制限酵素ＳｐｅＩ又はＥｃｏＲＩで完全消化し、得られたポリヌクレオチド断片の混合物をＴ４リガーゼにより分子内環化させた。これを鋳型として用い、実施例１と同様の方法でインバースＰＣＲを実施し、上記で決定した塩基配列を含む遺伝子の全塩基配列を決定した。その結果を配列表の配列番号４に示した。また、配列番号４に示した塩基配列がコードするポリペプチド（以後、ＧＬＰ２と略す）のアミノ酸配列を配列番号３に示した。【０１０１】
（実施例３） 組換えベクターｐＮＧＬＰの構築
プライマー３（配列表の配列番号７）及びプライマー４（配列表の配列番号８）を用い、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）JCM1149株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後に新たな終始コドン（ＴＡＡ）とＳｐｈＩ認識部位が付加された二本鎖ポリヌクレオチドを得た。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとして、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。【０１０２】
上記のＰＣＲで得られたポリヌクレオチド断片をＮｄｅＩ及びＳｐｈＩで部分消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＳｐｈＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＧＬＰを構築した。【０１０３】
（実施例４）  組換えベクターｐＮＧＬＰ２の構築
プライマー５（配列表の配列番号９）、プライマー６（配列表の配列番号１０）を用い、ラクトバシラス・ペントサス（Lactobacillus pentosus）JCM1558株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号４に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後に新たな終始コドン（ＴＡＡ）とＰｓｔＩ認識部位が付加された二本鎖ポリヌクレオチドを得た。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとして、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。【０１０４】
上記のＰＣＲで得られたポリヌクレオチド断片をＮｄｅＩ及びＰｓｔＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＰｓｔＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＧＬＰ２を構築した。【０１０５】
（実施例５）  形質転換体の作製
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）に付属のプロトコールに従い、実施例３で構築した組換えベクターｐＮＧＬＰ、実施例４で構築した組換えベクターｐＮＧＬＰ２のそれぞれを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセルを形質転換し、形質転換体であるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＧＬＰ）またはＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＧＬＰ２）を得た。【０１０６】
（実施例６）  形質転換体におけるポリペプチドの発現
実施例５で得た２種の形質転換体、および、ベクタープラスミドｐＵＣＮ１８を含む形質転換体であるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）（比較例）のそれぞれを、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のグルコース脱水素酵素活性を測定した。【０１０７】
グルコース脱水素酵素活性は、１．０Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、グルコースを１００ｍＭ、ＮＡＤＰを２ｍＭ、および粗酵素液を添加して２５℃で反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１Ｕと定義した。【０１０８】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＧＬＰ）またはＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＧＬＰ２）においては、活性測定系において吸光度の上昇が認められたことから、ＮＡＤＰとグルコースからのＮＡＤＰＨの生産を確認できた。比較対照であるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）においては、活性測定系において吸光度が上昇せず、ＮＡＤＰＨの生産は認められなかった。【０１０９】
各形質転換体のグルコース脱水素酵素活性を比活性として表１にまとめた。表１に示すように実施例５で得られた２種の形質転換体のいずれにおいても、グルコース脱水素酵素活性を有した。【０１１０】
【表１】
0005603076.tif 000002
【０１１１】
以上の結果から、実施例１及び実施例２で取得したＤＮＡにコードされるポリペプチドは、ＮＡＤＰとグルコースからＮＡＤＰＨを生成する活性を有する酵素、すなわちグルコース脱水素酵素であることが確認できた。【０１１２】
（実施例７）  ＧＬＰ、ＧＬＰ２のＮＡＤＰ／ＮＡＤ活性比の測定
実施例６で得られたＧＬＰ、ＧＬＰ２を発現させた形質転換体の無細胞抽出液を用いて、ＮＡＤＰ及びＮＡＤを補酵素としたときの活性を測定した。ＮＡＤＰの場合は、実施例６に記載の方法でグルコース脱水素酵素活性を測定した。また、ＮＡＤの場合は、実施例６に記載のグルコース脱水素酵素の活性測定法において、ＮＡＤＰの代わりにＮＡＤを用いて同様に測定した。また、比較例として、市販の試薬の酵素であるバシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のグルコース脱水素酵素（Ｓｉｇｍａ社製）、バシラス・エスピー（Bacillussp.）由来のグルコース脱水素酵素（Ｗａｋｏ社製）及びクリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）由来のＮＡＤＰ特異的なグルコース脱水素酵素（Ｓｉｇｍａ社製）についても同様に、ＮＡＤＰ及びＮＡＤを補酵素としたときの活性を測定した。更なる比較例として、特開2006-262767号公報に記載の方法により、クリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）JCM3687株由来のＮＡＤＰ特異的グルコース脱水素酵素を発現させた形質転換体を育種し、その無細胞抽出液についても上記と同様に、ＮＡＤＰ及びＮＡＤを補酵素としたときの活性を測定した。【０１１３】
ＮＡＤＰを補酵素として用いた時の活性値を１００％とした場合の相対活性、及びＮＡＤＰ／ＮＡＤ活性比を表２にまとめた。【０１１４】
【表２】
0005603076.tif 000003
【０１１５】
本発明のいずれのグルコース脱水素酵素もＮＡＤＰ／ＮＡＤ活性比は非常に高く、その値は10,000以上であった。比較例となる市販のＮＡＤＰ特異的グルコース脱水素酵素や特開2006-262767号公報に記載のＮＡＤＰ特異的グルコース脱水素酵素に比べて、ＮＡＤＰ／ＮＡＤ活性比は100倍以上高い値を示した。このように、本発明のグルコース脱水素酵素は、公知のＮＡＤＰ特異的グルコース脱水素酵素よりも非常に高いＮＡＤＰ特異性を有した。【０１１６】
（実施例８）  ＧＬＰ、ＧＬＰ２の基質特異性
実施例６で得られたＧＬＰ、ＧＬＰ２を発現させた形質転換体の無細胞抽出液を用いて、グルコース以外の各種の単糖に対する活性を測定した。活性測定は、実施例６に記載の方法の活性測定法において、グルコースの代わりに評価したい単糖を添加して実施した。【０１１７】
グルコースを基質とした時の活性値を１００％とした場合の相対活性として、表３にまとめた。【０１１８】
【表３】
0005603076.tif 000004
【０１１９】
ＧＬＰ、ＧＬＰ２共にＤ−グルコース、２−デオキシ−Ｄ−グルコースに対して高い活性を有した。また、Ｄ−グルコース−６−リン酸に対する活性は、Ｄ−グルコースに対する活性に比べると非常に低いことから、ＧＬＰ、ＧＬＰ２はいずれもグルコース−６−リン酸脱水素酵素ではなく、グルコース脱水素酵素であるといえる。【０１２０】
（実施例９）  ＧＬＰ、ＧＬＰ２の反応至適ｐＨ
実施例６で得られたＧＬＰ、ＧＬＰ２を発現させた形質転換体の無細胞抽出液を用いて、反応至適ｐＨを測定した。活性測定は、実施例６に記載の方法の活性測定法において、１．０Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）の代わりに、ｐＨ４〜９の０．１Ｍブリットンーロビンソン（Britton-Robinson）緩衝液を用いて同様に実施した。【０１２１】
ｐＨ７での活性値を１００％とした場合の相対活性として、表４にまとめた。【０１２２】
【表４】
0005603076.tif 000005
【０１２３】
ＧＬＰ、ＧＬＰ２共に至適ｐＨはｐＨ７付近であった。【０１２４】
（実施例１０）  ＧＬＰを用いた（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの合
成
国際公開第ＷＯ９８／３５０２５号パンフレットに記載の方法で、組換え大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１）を作製した。本菌を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これを用いて該公開公報に記載の方法でＣＲＤ活性を測定したところ、活性を有し、その比活性は１５Ｕ／ｍｇであった。【０１２５】
上記の方法で調製したＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１）の無細胞抽出液４５ｍｌに、実施例６に記載の方法で調製したＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＧＬＰ）の無細胞抽出液５ｍｌ、グルコース５．５ｇ、ＮＡＤＰ１．６ｍｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整しつつ３０℃で攪拌しながら、４−クロロアセト酢酸エチルを１５分間毎に２５０ｍｇずつ添加した。このようにして合計５ｇの４−クロロアセト酢酸エチルを添加し、５時間反応した。反応終了後、反応液を酢酸エチルで抽出し、脱溶剤した後抽出物を下記のガスクロマトグラフィー条件で分析したところ、収率９５％で４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルが生じていた。生成した４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの光学純度を下記の高速液体クロマトグラフィー条件で分析したところ、１００％ｅ．ｅ．のＳ体であった。【０１２６】
このように、ＮＡＤＰＨを補酵素とする還元酵素、本実施例ではＣＲＤ、を用いた酵素的還元反応において、本発明のグルコース脱水素酵素ＧＬＰを用いてＮＡＤＰＨを再生すれば、非常に効率的に還元反応が進行することを確認できた。【０１２７】
［ガスクロマトグラフィー条件］
ＰＥＧ−２０Ｍ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ ＷＡＷ  ＤＭＣＳ １０％  ８０／１００ｍｅｓｈ（ジーエルサイエンス社製）を充填したガラスカラム（ＩＤ ３ｍｍ×１ｍ）を用い、１５０℃でクロマトグラフィーを行い、検出はＦＩＤにより行った。【０１２８】
［高速液体クロマトグラフィー条件］
光学分割カラム ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＢ（ダイセル化学社製）を用いた。移動相としてｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝９／１の混合溶媒を用い、移動相の流速は０．８ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを行なった。検出は２１５ｎｍの吸光度を測定することにより行なった。【０１２９】
（実施例１１）  ＧＬＰ２を用いた（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの合成
Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＧＬＰ）の無細胞抽出液の代わりに、実施例６に記載の方法で調製したＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＧＬＰ２）の無細胞抽出液を用いて、実施例１０と同様に反応した。反応終了後、反応液を酢酸エチルで抽出し、脱溶剤し、収率９４％で１００ｅ．ｅ．の（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルが得られた。【０１３０】
このように、ＮＡＤＰＨを補酵素とする還元酵素、本実施例ではＣＲＤ、を用いた酵素的還元反応において、本発明のグルコース脱水素酵素ＧＬＰ２を用いてＮＡＤＰＨを再生すれば、非常に効率的に還元反応が進行することを確認できた。【０１３１】
（比較例１）  ＧＬＰ、ＧＬＰ２無添加条件下での（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの合成
Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＧＬＰ）の無細胞抽出液の代わりに、実施例６に記載の方法で調製したグルコース脱水素酵素活性を有さないＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）の無細胞抽出液を用いて、実施例１０と同様に反応した。反応終了後、反応液を酢酸エチルで抽出し、脱溶剤したが、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルはほとんど得られなかった。【０１３２】
本比較例の結果からも、酵素的還元反応における本発明のグルコース脱水素酵素の使用の有用性が確認できた。【０１３３】
（実施例１２）  ペディオコッカス・パーブラス（Pediococcus parvulus）JCM5889株が有するグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの取得
プライマー７（配列表の配列番号１３）及びプライマー８（配列表の配列番号１４）を用い、ペディオコッカス・パーブラス（Pediococcus parvulus）JCM5889株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後に新たな終始コドン（ＴＡＡ）とＳａｌＩ認識部位が付加された二本鎖ポリヌクレオチドを得た。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。また、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌ  ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ポリヌクレオチドの塩基配列を解析した。結果を配列表の配列番号１２に示した。また、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチド（以下、ＧＰＰ２と記す）のアミノ酸配列を配列番号１１に示した。
（実施例１３）  組換えベクターｐＮＧＰＰ２の構築
実施例１２で得られたポリヌクレオチド断片をＮｄｅＩ及びＳａｌＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＳａｌＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＧＰＰ２を構築した。【０１３４】
（実施例１４）  形質転換体の作製
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）に付属のプロトコールに従い、実施例１３で構築した組換えベクターｐＮＧＰＰ２を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセルを形質転換し、形質転換体であるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＧＰＰ２）を得た。【０１３５】
（実施例１５）  形質転換体におけるポリペプチドの発現
実施例３で得た形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＧＰＰ２）、及びベクタープラスミドｐＵＣＮ１８を含む形質転換体であるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）（比較例）のそれぞれを、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のグルコース脱水素酵素活性を測定した。【０１３６】
グルコース脱水素酵素活性は、１．０Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、グルコースを１００ｍＭ、ＮＡＤＰを２ｍＭ、および粗酵素液を添加して２５℃で反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１Ｕと定義した。【０１３７】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＧＰＰ２）においては、活性測定系において吸光度の上昇が認められたことから、ＮＡＤＰとグルコースからのＮＡＤＰＨの生産を確認できた。比較対照であるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）においては、活性測定系において吸光度が上昇せず、ＮＡＤＰＨの生産は認められなかった。【０１３８】
各形質転換体のグルコース脱水素酵素活性を比活性として表５にまとめた。表５に示すように、実施例１４で得られた形質転換体はグルコース脱水素酵素活性を有した。【０１３９】
【表５】
0005603076.tif 000006
【０１４０】
配列表の配列番号１２に示す塩基配列からなるＤＮＡにコードされる配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＧＰＰ２）は、グルコース脱水素酵素活性を有した。【０１４１】
（実施例１６）  ＧＰＰ２のＮＡＤＰ／ＮＡＤ活性比の測定
実施例１５で得られたＧＰＰ２を発現させた形質転換体の無細胞抽出液を用いて、実施例７と同様にしてＮＡＤＰ／ＮＡＤ活性比を測定した。ＮＡＤＰを補酵素として用いた時の活性値を１００％とした場合の相対活性、及びＮＡＤＰ／ＮＡＤ活性比を表６にまとめた。【０１４２】
【表６】
0005603076.tif 000007
【０１４３】
本発明のグルコース脱水素酵素ＧＰＰ２は、ＮＡＤＰ／ＮＡＤ活性比は非常に高く、その値は10,000以上であった。比較例となる市販のＮＡＤＰ特異的グルコース脱水素酵素や特開2006-262767号公報に記載のＮＡＤＰ特異的グルコース脱水素酵素に比べて、ＮＡＤＰ／ＮＡＤ活性比は100倍以上高い値を示した。このように、本発明のグルコース脱水素酵素は、公知のＮＡＤＰ特異的グルコース脱水素酵素よりも非常に高いＮＡＤＰ特異性を有した。【０１４４】
（実施例１７）  ＧＰＰ２の基質特異性
実施例１５で得られたＧＰＰ２を発現させた形質転換体の無細胞抽出液を用いて、実施例８と同様にして、グルコース以外の各種の単糖に対する活性を測定した。グルコースを基質とした時の活性値を１００％とした場合の相対活性として、表７にまとめた。【０１４５】
【表７】
0005603076.tif 000008
【０１４６】
ＧＰＰ２は、Ｄ−グルコース、２−デオキシ−Ｄ−グルコースに対して高い活性を有した。また、Ｄ−グルコース−６−リン酸に対する活性は、Ｄ−グルコースに対する活性に比べると非常に低いことから、ＧＰＰ２はグルコース−６−リン酸脱水素酵素ではなく、グルコース脱水素酵素であるといえる。【０１４７】
（実施例１８）  ＧＰＰ２の反応至適ｐＨ
実施例１５で得られたＧＰＰ２を発現させた形質転換体の無細胞抽出液を用いて、実施例９と同様にして、反応至適ｐＨを測定した。ｐＨ７での活性値を１００％とした場合の相対活性として、表８にまとめた。【０１４８】
【表８】
0005603076.tif 000009
【０１４９】
ＧＰＰ２の至適ｐＨはｐＨ７付近であった。【０１５０】
（実施例１９）  ＧＰＰ２を用いた（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成
国際公開第ＷＯ２００６／０９０８１４号パンフレットに記載の方法に従い、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールから（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを合成した。実験には以下の組換え生物を用いたが、これらは独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ：〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１−１ 中央第６）に寄託されている。【０１５１】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＳＣＳ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２４：セルロモナス・スピーシーズ（Cellulomonas sp.）ＫＮＫ０１０２株由来のグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子で形質転換された組換え大腸菌（国際公開第ＷＯ０５／１２３９２１号パンフレット参照）。【０１５２】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１）ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８３４：キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）ＩＦＯ０７０５株由来のＮＡＤＰ依存型の還元酵素遺伝子で形質転換された組換え大腸菌（国際公開第ＷＯ９８／０３５０２５号パンフレット参照）。【０１５３】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＳＣＳ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２４を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む滅菌した２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種し、３７℃で１８時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）５０ｍｌに懸濁した。【０１５４】
また、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１）ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８３４を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種し、３７℃で１８時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕し、無細胞抽出液を得た。【０１５５】
上記Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＳＣＳ）の懸濁液２ｍｌ、ラセミ体の３−クロロ−１，２−プロパンジオール  ４０ｍｇ、上記Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１）の無細胞抽出液０．２ｍｌ、ＮＡＤＰ０．３ｍｇ、グルコース１００ｍｇをフラスコに添加し、これに実施例１５に記載の方法で調製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＧＰＰ２）の無細胞抽出液（グルコース脱水素酵素活性１０Ｕ）を添加後、１Ｍの水酸化ナトウム水溶液によりｐＨ７に調整しながら、３０℃で２４時間攪拌した。反応終了後、反応液に硫酸アンモニウムを飽和になるまで添加後、酢酸エチルで抽出した。抽出液中の３−クロロ−１，２−プロパンジオール含量は、下記のガスクロマトグラフィー条件（１）で分析することにより定量し、収率を算出した。また、３−クロロ−１，２−プロパンジオールの光学純度は、トリフルオロアセチル化した後に、下記のガスクロマトグラフィー条件（２）で分析することで解析した。その結果、得られた光学純度９８．７％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールが、収率９４％で得られた。【０１５６】
このように、ＮＡＤＰＨを補酵素とする還元酵素を用いた酵素的還元反応において、本発明のグルコース脱水素酵素ＧＰＰ２を用いてＮＡＤＰＨを再生すれば、非常に効率的に還元反応が進行することを確認できた。【０１５７】
［ガスクロマトグラフィー条件（１）］
カラム      ：ＨＰ−５（30m×0.32mmI.D.）（Agilent Technologies社製）
検出        ：ＦＩＤ
カラム温度  ：初期温度５０℃、最終温度２００℃、昇温速度６℃／分
注入温度    ：１５０℃
検出温度    ：３００℃
［ガスクロマトグラフィー条件（２）］
カラム      ：Ｃｈｉｒａｄｅｘ  Ｇ−ＰＮ（30m×0.32mmI.D.）（ASTEC社製）
検出        ：ＦＩＤ
カラム温度  ：９０℃
注入温度    ：１５０℃
検出温度    ：１５０℃
検出時間    ：Ｒ体１０．０分、Ｓ体１０．６分。【０１５８】
（実施例２０）  （Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの合成
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１）ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８３４を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。【０１５９】
上記の方法で調製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１）の無細胞抽出液４５ｍｌに、実施例４に記載の方法で調製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＧＰＰ２）の無細胞抽出液５ｍｌ、グルコース５．５ｇ、ＮＡＤＰ１．６ｍｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整しつつ３０℃で攪拌しながら、４−クロロアセト酢酸エチルを１５分間毎に２５０ｍｇずつ添加した。このようにして合計５ｇの４−クロロアセト酢酸エチルを添加し、５時間反応した。反応終了後、反応液を酢酸エチルで抽出し、脱溶剤した後抽出物を下記のガスクロマトグラフィー条件で分析したところ、収率９６％で４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルが生じていた。生成した４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの光学純度を下記の高速液体クロマトグラフィー条件で分析したところ、１００％ｅ．ｅ．のＳ体であった。【０１６０】
このように、ＮＡＤＰＨを補酵素とする還元酵素を用いた酵素的還元反応において、本発明のグルコース脱水素酵素ＧＰＰ２を用いてＮＡＤＰＨを再生すれば、ハロアルコール化合物である（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを非常に効率的に還元反応が進行することを確認できた。【０１６１】
［ガスクロマトグラフィー条件］
ＰＥＧ−２０Ｍ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ ＷＡＷ  ＤＭＣＳ １０％  ８０／１００ｍｅｓｈ（ジーエルサイエンス社製）を充填したガラスカラム（ＩＤ ３ｍｍ×１ｍ）を用い、１５０℃でクロマトグラフィーを行い、検出はＦＩＤにより行った。【０１６２】
［高速液体クロマトグラフィー条件］
光学分割カラム ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＢ（ダイセル化学社製）を用いた。移動相としてｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝９／１の混合溶媒を用い、移動相の流速は０．８ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを行なった。検出は２１５ｎｍの吸光度を測定することにより行なった。
【配列表】
0005603076000001.app