(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１と配列番号３によりそれぞれコードされるか又は配列番号１と配列番号３のそれぞれと少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされる二つのフラボノイド3'5'ヒドロキシラーゼ（F3'5'H）酵素、及び配列番号５によりコードされるか又は配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるジヒドロフラボノール-4-レダクターゼ（DFR）酵素をコードする発現された遺伝物質を含む、変更された花色を示す遺伝子改変カーネーション植物又はその子孫。
【請求項２】
請求項１に記載の発現された遺伝物質を含む、請求項１に記載の遺伝子改変カーネーション植物に由来する子孫、生殖物質、切り花、組織培養可能な細胞又は再生可能な細胞。
【請求項３】
以下の工程：
配列番号１と配列番号３によりそれぞれコードされるか又は配列番号１と配列番号３のそれぞれと少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされる二つのフラボノイド3'5'ヒドロキシラーゼ（F3'5'H）酵素、及び配列番号５によりコードされるか又は配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるジヒドロフラボノール-4-レダクターゼ（DFR）酵素をコードする発現可能な遺伝物質を、カーネーション植物の再生可能な細胞内に導入する工程；並びに
該細胞から植物を再生させる工程、又は該再生した植物の子孫を取得する工程；
を含む、変更された花色を示す遺伝子改変カーネーション植物の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
出願データ
本願は、2007年11月15日出願の米国仮特許出願第60/988,293号（これの全内容が参照により本明細書に組み入れられる）と関連しており、それに基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
分野
本発明は、一般に、植物の遺伝子改変の分野に関する。より具体的には、本発明は、所望の色表現型を発現する、遺伝子改変植物に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
本明細書において本発明者らが言及した刊行物の書誌の詳細は、本明細書の最後にまとめられている。
【０００４】
本明細書中の先行技術に関する言及は、この先行技術がいずれかの国における共通の一般知識の一部を形成することの認識または何らかの型の示唆ではなく、そのように解釈されるできではない。
【０００５】
花または観賞植物もしくは園芸植物の産業は、花および／または植物の新しい異なる品種を開発しようと努力している。そのような新規の品種を作出するための有効な方式は、花色の操作を通したものである。古典的な育種技術は、今日入手可能な花および／または植物の商業的品種のほぼ全てについて、広範囲の色を作製するために、ある程度の成功を持って使用されている。しかしながら、このアプローチには、特定の種の遺伝子プールの制約のため限界があり、この理由のため、単一の種が完全なスペクトルの色の品種を有することは稀である。例えば、植物、または花、葉、果実、および茎のような植物部分の新規な色の品種の開発は、切り花、観賞植物、および園芸植物の市場の両方において大きな機会を与えるであろう。花または観賞植物もしくは園芸植物の産業において、カーネーションの新規の色の品種の開発は、特に興味深い。これには、異なる色の花のみならず、葯および花柱も含まれる。
【０００６】
花色は、主に、フラボノイド、カロテノイド、およびベタレインという三つの型の色素に因る。三つのうち、フラボノイドは、最も一般的なものであり、黄色〜赤色〜青色の範囲に寄与する。花色に主に寄与するフラボノイド分子は、シアニジンおよびそのメチル化誘導体ペオニジン、デルフィニジンおよびそのメチル化誘導体ペチュニジンおよびマルビジン、ならびにペラルゴニジンのグリコシル化誘導体であるアントシアニンである。アントシアニンは、花弁の上皮細胞の液胞または葉の表皮下細胞の液胞に局在している。
【０００７】
フラボノイド色素はフェニルプロパノイド経路の二次代謝物である。フラボノイド色素の生合成経路（フラボノイド経路）は十分に確立されており（Holton and Cornish,Plant Cell 7:1071-1083,1995（非特許文献1）；Mol et al,Trends Plant Sci.3:212-217,1998（非特許文献2）；Winkel-Shirley,Plant Physiol.126:485-493,2001a（非特許文献3）；およびWinkel-Shirley,Plant Physiol.127:1399-1404,2001b（非特許文献4）、Tanaka and Mason,In Plant Genetic Engineering,Singh and Jaiwal(eds)SciTech Publishing Llc.,USA,1:361-385,2003（非特許文献5）、Tanaka et al,Plant Cell,Tissue and Organ Culture 80:1-24,2005（非特許文献6）、Tanaka and Brugliera,In Flowering and Its Manipulation,Annual Plant Reviews Ainsworth(ed),Blackwell Publishing,UK,20:201-239,2006（非特許文献7)）、図1に示される。フラボノイド経路の第1の重要な基質のうちの一つであるp-クマロイル-CoAへのフェニルアラニンの変換には、三つの反応および酵素が関与している。それらの酵素は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（PAL）、桂皮酸4-ヒドロキシラーゼ（C4H）、および4-クマル酸:CoAリガーゼ（4CL）である。経路において最初に取り組まれた工程は、（アセチルCoAおよびCO2に対するアセチルCoAカルボキシラーゼ（ACC）の作用により提供される）マロニル-CoA 3分子のp-クマロイル-CoA 1分子との縮合を含む。この反応は、酵素カルコンシンターゼ（CHS）により触媒される。この反応の生成物2',4,4',6'テトラヒドロキシ-カルコンは、通常、酵素カルコンフラバノンイソメラーゼ（CHI）により迅速に異性化され、ナリンゲニンが生成する。続いて、ナリンゲニンが、フラバノン3-ヒドロキシラーゼ（F3H）により、中央の環の3位でヒドロキシル化され、ジヒドロケンフェロール（DHK）が生成する。
【０００８】
DHKのB環のヒドロキシル化のパターンは、花弁色の決定において重要な役割を果たす。B環は、3'位、または3'位および5'位の両方でヒドロキシル化され得、それぞれ、ジヒドロケルセチン（DHQ）またはジヒドロミリセチン（DHM）が生成する。経路のこの部分に関与する重要な二種の酵素は、いずれも、シトクロムP450クラスの酵素のメンバーであるフラボノイド3'ヒドロキシラーゼ（F3'H）およびフラボノイド3',5'ヒドロキシラーゼ（F3'5'H）である。
【０００９】
F3'Hは、多くの植物種において、赤およびピンクの花色に寄与する、シアニジンベースの色素をもたらすフラボノイド経路内の重要な酵素である。
【００１０】
ジヒドロフラボノール（DHK、DHQ、DHM）からの有色アントシアニンの生成をもたらす、経路の次の工程は、ロイコアントシアニジンの生成をもたらすジヒドロフラボノール-4-レダクターゼ（DFR）を含む。続いて、ロイコアントシアニジンは、アントシアニジン、ペラルゴニジン、シアニジン、およびデルフィニジンに変換される。これらのフラボノイド分子は、正常な生理的条件の下で不安定であり、糖転移酵素の作用を通した3位におけるグリコシル化が、アントシアニジン分子を安定化し、従って、アントシアニンの蓄積を可能にする。一般に、糖転移酵素は、UDP糖からフラボノイド分子へ糖部分を転移させ、グリコシル化の位置に関する高い特異性およびアクセプター基質に関する比較的低い特異性を示す（Seitz and Hinderer,Anthocyanins.In:Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants.Constabel and Vasil(eds.),Academic Press,New York,USA,5:49-76,1988（非特許文献8)）。アントシアニンは、糖（グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース、およびキシロース）に関連した3,5-ジグリコシドおよび3,7-ジグリコシドとしても、3-モノシド（monosides）、3-ビオシド（biosides）、および3-トリオシド（triosides）としても存在することができる（Strack and Wray,In:The Flavonoids-Advances in Research since 1986.Harborne,J.B.(ed),Chapman and Hall,London,UK,1-22,1993（非特許文献9)）。
【００１１】
アントシアニジン分子の安定化に関与している糖転移酵素には、UDPグルコースからアントシアニジン分子の3-O位に、グルコース部分を移動させ、アントシアニジン3-O-グルコシドを生成させるUDPグルコース:フラボノイド3-グルコシルトランスフェラーゼ（3GT）が含まれる。
【００１２】
多くのアントシアニジン配糖体は、アシル化誘導体の形態で存在する。アントシアニジン配糖体を修飾するアシル基は、構造に基づき二つの主要なクラスに分類され得る。脂肪族アシル基には、マロン酸またはコハク酸が含まれ、芳香族クラスには、p-クマル酸、コーヒー酸、およびフェルラ酸のようなヒドロキシ桂皮酸、ならびにp-ヒドロキシ安息香酸のような安息香酸が含まれる。
【００１３】
アントシアニジン配糖体のB環の3'位および5'位におけるメチル化も起こり得る。シアニジンベースの色素のメチル化は、ペオニジンの生成をもたらす。デルフィニジンベースの色素の3'位のメチル化はペチュニジンの生成をもたらし、3'位および5'位のメチル化はマルビジン生成をもたらす。マルビジンのメチル化は、5-O位および7-O位においても起こり得、カペンシニン（5-O-メチルマルビジン）および5,7-ジ-O-メチルマルビジンが生成する。
【００１４】
上記の修飾に加えて、色素が局在している液胞またはコンパートメントのpH、ならびにフラボノールおよびフラボンのような他のフラボノイドとの同時色素沈着（co-pigmentation）が、花弁色に影響を与える場合がある。フラボノールおよびフラボンも、芳香族アシル化され得る（Brouillard and Dangles,In:The Flavonoids-Advances in Research since 1986.Harborne,J.B.(ed),Chapman and Hall,London,UK,1-22,1993（非特許文献10)）。
【００１５】
カーネーション花は、遺伝子型に依って、二つの型のアントシアニジン、ペラルゴニジンおよびシアニジンを産生することができる。F3'H活性の非存在下では、ペラルゴニジンが産生され、そうでない場合にはシアニジンが産生される。ペラルゴニジンには、通常、無色のフラボノール、ケンフェロールが伴う。シアニジン色素には、通常、ケンフェロールおよびケルセチンの両方が伴う。ペラルゴニジンおよびケンフェロールはいずれもDHKに由来し；シアニジンおよびケルセチンはいずれもDHQに由来する（図1）。
【００１６】
DFRにより示される基質特異性は、植物に蓄積されるアントシアニンを調節する。ペチュニアおよびシンビジウムのDFRはDHKを還元せず、従って、それらはペラルゴニジンベースの色素を蓄積しない（Forkmann and Ruhnau,Z Naturforsch C.42c,1146-1148,1987（非特許文献11）、Johnson et al,Plant Journal,19,81-85,1999（非特許文献12)）。アイリス、デルフィニウム、シクラメン、リンドウ、シンビジウムを含む多くの重要な草花種は、内因性DFRの基質特異性のため、ペラルゴニジンを蓄積しないと推定されている（Tanaka and Brugliera,2006（前記）（非特許文献7)）。
【００１７】
カーネーションにおいて、DFR酵素は、二つのジヒドロフラボノールをロイコアントシアニジンへと代謝することができ、ロイコアントシアニジンは、最終的には、花色を担う色素アントシアニンへと変換される。DHKは、アンズ色〜赤レンガ色のカーネーションを与える、ペラルゴニジンベースの色素の前駆物質ロイコペラルゴニジンに変換される。DHQは、ピンク色〜赤色のカーネーションを与える、シアニジンベースの色素の前駆物質ロイコシアニジンに変換される。カーネーションDFRは、DHMを、デルフィニジンベースの色素の前駆物質ロイコデルフィニジンに変換することもできる（Forkmann and Ruhnau,1987（前記）（非特許文献11)）。しかしながら、野生型または古典的由来のカーネーション系統は、F3'5'H酵素を含有しておらず、従って、DHMを合成しない。
【００１８】
ペチュニアDFR酵素は、カーネーションDFRとは異なる特異性を有する。これはDHQをロイコシアニジンに変換することができるが、DHKをロイコペラルゴニジンに変換することはできない（Forkmann and Ruhnau,1987（前記）（非特許文献11)）。F3'5'H酵素を含有しているペチュニア系統において、ペチュニアDFR酵素は、この酵素により産生されたDHMをロイコデルフィニジンに変換することができることも公知である。ロイコデルフィニジンは、さらに修飾され、青色の花を主に担うデルフィニジンベースの色素を生成させる（図1参照）。ペチュニアDFRは、DHQおよびDHMの両方を変換することができるが、DHMをはるかに効率的に変換することができ、従って、デルフィニジンの産生が優先される（Forkmann and Ruhnau 1987（前記）（非特許文献11)）。
【００１９】
キクに見出されるアントシアニンは、一般に、シアニジンベースである。デルフィニジンベースの色素は、F3'5'H活性の欠如のために存在せず、ペラルゴニジンベースの色素は、稀にしか見出されない。ペラルゴニジンベースの色素がキクに存在しないのは、DFRの特異性ではなく、F3'H活性の存在のためであることが示唆されている。例えば、キク花弁にシトクロムP450阻害剤を供給すると、ペラルゴニジンベースの色素が検出された（Schwinn et al,Phytochemistry,35:145-150,1993（非特許文献13)）。
【００２０】
バラおよびガーベラは、一般に、シアニジンおよび／またはペラルゴニジンベースのアントシアニンを蓄積する。デルフィニジンベースのアントシアニンは、一般に、主としてF3'5'H活性の欠如のため、野生型または古典的由来のバラまたはガーベラの花には見出されない。
【００２１】
F3'5'Hをコードするヌクレオチド配列は、クローニングされている（参照により本明細書に組み入れられる国際特許出願PCT/AU92/00334（特許文献1）、ならびに参照により本明細書に組み入れられるHolton et al,Nature,366:276-279,1993（非特許文献14）および国際特許出願PCT/AU03/01111（特許文献2）を参照のこと）。これらの配列は、ペチュニア（国際特許出願PCT/AU92/00334（特許文献1）およびHolton et al,1993（前記）（非特許文献14）を参照のこと）、タバコ（国際特許出願PCT/AU92/00334（特許文献1）を参照のこと）、カーネーション（参照により本明細書に組み入れられる国際特許出願PCT/AU96/00296（特許文献3）を参照のこと）、およびバラ（国際特許出願PCT/AU03/01111（特許文献2）を参照のこと）におけるフラボノイドの3',5'-ヒドロキシル化の改変において有効であった。
【００２２】
カーネーションは、世界で最も広く栽培されている切り花のうちの一つである。
【００２３】
現在および過去に栽培されたカーネーションの切り花品種は数千存在する。これらは、植物の形態、花のサイズ、および花型に基づき、三つの一般的な群に分けられる。三つの花型とは、スタンダード、スプレー、およびミディである。市販されているカーネーションの大部分は、二つの主要な群、スタンダードおよびスプレーに属する。スタンダードカーネーションは、茎一本につき単一の大きい花が必要とされる条件の下での栽培用である。側枝および脇芽は、終端の花のサイズを増加させるために除去される（この過程は摘芽と呼ばれる）。スプレーおよび／またはミニチュアは、茎一本につき多数の比較的小さな花を与えるための栽培用である。外側の花が茎の「ファン」を形成するよう、中央の花のみが除去される。
【００２４】
一本の茎に複数の花芽があるのは、様々な型のフラワーアレンジメントにとって好適であり、産業の大衆市場部門において使用される花束にかさを提供するため、スプレーカーネーション品種は、花業界において人気がある。
【００２５】
カーネーション切り花産業はスタンダード栽培品種およびスプレー栽培品種で占められており、米国においては各型の販売数はほぼ等しい。日本においては、スプレー型品種が、販売されているカーネーション花の70％（体積）を占め、欧州においては、スプレー型カーネーションが、逆競りで取り引きされるカーネーション花のおよそ50％を占める。逆競り取引きは、欧州全体での消費の優れた指標である。
【００２６】
スタンダード型およびミディ型のカーネーションにおいては、新しい色を導入する遺伝子操作が成功しているが（Tanaka and Brugliera,2006（前記）（非特許文献7)；国際特許出願PCT/AU96/00296（特許文献3）を参照のこと）、これはスプレーカーネーションには適用されていない。カーネーションの色の分類には青色が欠如しており、これは、遺伝子改変スタンダード型カーネーション品種の導入を通して、つい最近充足された。しかしながら、手持ちサイズのアレンジメントおよびスモールテーブル環境のような、多数の比較的小さなカーネーション花が必要とされる花束およびフラワーアレンジメントのような特定の目的には、スタンダード型品種を使用することができない。
【００２７】
特に、商業的に人気のある特定のスプレーカーネーションは、カーネーションのコルチナチャネル（Kortina Chanel）系統（ダイアンサス・カリオフィルス（Dianthus caryophyllus）cv.コルチナチャネル）である。この品種は、優れた生長特徴、およびフザリウム（Fusarium）のような真菌病原体に対する中程度〜良好な耐性を有する。多数の品種がコルチナチャネルの「変種」として発売されている。これらには、コルチナ、ロイヤルレッドコルチナ（Royal Red Kortina）、セリースコルチナ（Cerise Kortina）、およびダスティコルチナ（Dusty Kortina）が含まれる。しかしながら、本発明の出現前には、紫色／青色スプレーカーネーションは入手不可能であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２８】
【特許文献１】国際特許出願PCT/AU92/00334
【特許文献２】国際特許出願PCT/AU03/01111
【特許文献３】国際特許出願PCT/AU96/00296
【非特許文献】
【００２９】
【非特許文献１】Holton and Cornish,Plant Cell 7:1071-1083,1995
【非特許文献２】Mol et al,Trends Plant Sci.3:212-217,1998
【非特許文献３】Winkel-Shirley,Plant Physiol.126:485-493,2001a
【非特許文献４】Winkel-Shirley,Plant Physiol.127:1399-1404,2001b
【非特許文献５】Tanaka and Mason,In Plant Genetic Engineering,Singh and Jaiwal(eds)SciTech Publishing Llc.,USA,1:361-385,2003
【非特許文献６】Tanaka et al,Plant Cell,Tissue and Organ Culture 80:1-24,2005
【非特許文献７】Tanaka and Brugliera,In Flowering and Its Manipulation,Annual Plant Reviews Ainsworth(ed),Blackwell Publishing,UK,20:201-239,2006
【非特許文献８】Seitz and Hinderer,Anthocyanins.In:Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants.Constabel and Vasil(eds.),Academic Press,New York,USA,5:49-76,1988
【非特許文献９】Strack and Wray,In:The Flavonoids-Advances in Research since 1986.Harborne,J.B.(ed),Chapman and Hall,London,UK,1-22,1993
【非特許文献１０】Brouillard and Dangles,In:The Flavonoids-Advances in Research since 1986.Harborne,J.B.(ed),Chapman and Hall,London,UK,1-22,1993
【非特許文献１１】Forkmann and Ruhnau,Z Naturforsch C.42c,1146-1148,1987
【非特許文献１２】Johnson et al,Plant Journal,19,81-85,1999
【非特許文献１３】Schwinn et al,Phytochemistry,35:145-150,1993
【非特許文献１４】Holton et al,Nature,366:276-279,1993
【発明の概要】
【００３０】
概要
本明細書の全体にわたって、文脈上特記されない限り、「を含む（comprise）」という単語、または「を含む（comprises）」もしくは「を含む（comprising）」のような変形は、明示された要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の包含を意味し、その他の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の排除を意味するものではないことが理解される。
【００３１】
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、配列ID番号（SEQ ID NO）により参照される。SEQ ID NOは、配列ID<400>1（SEQ ID NO:1）、<400>2（SEQ ID NO:2）等に数的に対応する。
【００３２】
本明細書の全体にわたって使用される配列IDの概要は、表1に提供される。
【００３３】
本発明は、変更された花部を示す、遺伝子改変植物を提供する。より具体的には、本発明は、遺伝子改変カーネーション、さらに具体的には、変更された花部を示す、遺伝子改変スプレーカーネーションを提供する。変更された花部は、花、花弁、葯、および花柱を含む組織または器官における、紫色〜青色のような赤紫色〜青色の範囲の色である。一つの態様において、色は、色が完全飽和色の順に配置され、低飽和度の低輝度の色が横に並べられている、英国王立園芸協会（Royal Horticultural Society）（RHS）カラーチャートを使用して決定される。色群は観察可能なスペクトルを通して進み、本願において言及される色は、一般に、ファン（Fan）2に含有されている赤紫色群（RHSCC 58-74）、紫色群（RHSCC 75-79）、紫スミレ色群（RHSCC 81-82）、スミレ色群（RHSCC 83-88）、スミレ青色群（89-98）、青色群（RHSCC 99-110）にある。色は、61A、64A、71A、71C、72A、81A、86A、および、87A、ならびにそれらの中間または近くの色を含む範囲より選択される。
【００３４】
（表１）配列IDの概要
0005500556.tif 000002
【００３５】
改変された植物、特に、遺伝子改変スプレーカーネーションは、少なくとも二つのF3'5'H分子および少なくとも一つのDFRをコードする遺伝子配列を含む。本発明がカーネーションに関する限り、カーネーションスプレーは、便利には、コルチナ、ロイヤルレッドコルチナ、セリースコルチナ、およびダスティコルチナのようなコルチナチャネルの変種を含むコルチナチャネルを遺伝的背景とする。本発明に含まれるその他のカーネーション栽培品種は、クリームシンデレラ（Cream Cinderella）、シンデレラ、セリースウェストパール（Cerise Westpearl）、ベガ（Vega）、アーティサン（Artisan）、およびランデブー（Rendezvous）である。
【００３６】
従って、本発明の一つの局面は、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素をコードする発現された遺伝物質を含む、選択された組織において変更された花部を示す遺伝子改変植物に関する。これに関して「変更された花部」という用語は、遺伝子操作前の植物（例えば、親植物または同一種の植物）の花部との比較を意味する。「をコードする」という用語には、機能性のF3'5'H酵素およびDFR酵素を産生する遺伝物質の発現が含まれる。
【００３７】
特定の態様において、植物は、スプレーカーネーションである。
【００３８】
従って、本発明のもう一つの局面は、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素をコードする発現された遺伝物質を含む、選択された組織において変更された花部を示すスプレーカーネーションに関する。
【００３９】
本発明のさらにもう一つの局面は、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素をコードする発現された遺伝子配列を含む、紫色〜青色の組織を示す遺伝子改変コルチナチャネルスプレーカーネーション系統またはその変種に関する。
【００４０】
本発明のもう一つの局面は、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素をコードする発現された遺伝子配列を含む、紫色〜青色の組織を示す遺伝子改変キクに関する。
【００４１】
本発明のさらにもう一つの局面は、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素をコードする発現された遺伝子配列を含む、紫色〜青色の組織を示す遺伝子改変バラに関する。
【００４２】
本発明のまたさらにもう一つの局面は、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素をコードする発現された遺伝子配列を含む、紫色〜青色の組織を示す遺伝子改変ガーベラに関する。
【００４３】
本発明のさらにもう一つの局面は、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素をコードする発現された遺伝子配列を含む、紫色〜青色の組織を示す遺伝子改変された観賞用の植物または園芸植物に関する。
【００４４】
特定の態様において、本発明は、本明細書においてコルチナチャネル（KC）/pCGP2442として同定される遺伝子改変スプレーカーネーションならびにその子孫および変種を提供する。
【００４５】
遺伝子改変植物に由来する、子孫、生殖物質、切り花、組織培養可能な細胞、および再生可能な細胞も、本発明の一部を形成する。
【００４６】
本発明は、紫色〜青色を有する組織を含む変更された花部を示すコルチナチャネルカーネーションまたはその変種を含むスプレーカーネーションのような遺伝子改変植物の製造における、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素をコードする遺伝子配列の使用にも関する。
【００４７】
F3'5'Hは任意の起源に由来し得、二つが同一の植物油に由来してもよいし、または異なる植物種に由来してもよい。ビオラspおよびサルビアspに由来するF3'5'H酵素をコードするヌクレオチド配列は、特に有用である（表1を参照のこと）。同様に、DFR酵素をコードするヌクレオチド配列は、ペチュニアsp（例えば、表1を参照のこと）、アイリス、シクラメン、デルフィニウム、リンドウ、シンビジウム（Cimbidium）のような（これらに限定はされない）任意の種に由来し得る。ビオラspおよびサルビアspに由来するF3'5'H、ならびにペチュニアspに由来するDFRの適当なヌクレオチド配列は、表1に示される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
いくつかの図面は、色の表現または要素を含有している。カラーの写真は、請求により特許権所有者から、または適切な特許庁から入手可能である。特許庁から入手する場合には、費用が課せられる可能性がある。
【図１】アントシアニンを産生する大部分の植物に存在するアントシアニジン3-グルコシドの生成を示す、フラボノイド色素の生合成経路の模式図である。経路に含まれる酵素は、以下のように示されている：PAL＝フェニルアラニンアンモニアリアーゼ；C4H＝ケイ皮酸4-ヒドロキシラーゼ；4CL＝4-クマル酸:CoAリガーゼ；CHS＝カルコンシンターゼ；CHI＝カルコンフラバノンイソメラーゼ；F3H＝フラバノン3-ヒドロキシラーゼ；DFR＝ジヒドロフラボノール-4-レダクターゼ；ANS＝アントシアニジンシンターゼ、3GT＝UDP-グルコース:フラボノイド3-O-グルコシルトランスフェラーゼ。その他の略語には、DHK＝ジヒドロケンフェロール、DHQ＝ジヒドロケルセチン、DHM＝ジヒドロミリセチンが含まれる。
【図２】バイナリープラスミドpCGP2442の概略図である。pCGP2442の構築は実施例1に記載される。選択された制限エンドヌクレアーゼ部位（AscI、PacI、PmeI）が示されている。略語には、LB＝A.ツメファシエンス（tumefaciens）Tiプラスミドの左の境界、RB＝A.ツメファシエンスTiプラスミドの右の境界領域、TetR＝抗生物質テトラサイクリンに対する耐性遺伝子複合体。遺伝子因子の説明については、表2を参照のこと。
【図３】トランスジェニックコルチナチャネル/pCGP2442スプレーカーネーション系統由来の花を示す写真である。A：トランスジェニック系統19890（左側）およびコルチナチャネル非トランスジェニック対照（右側）に由来する花；B：トランスジェニック19907由来の花。
【図４】コルチナチャネル/pCGP2442スプレーカーネーション系統の花弁のサイズおよび形を示す写真である。A：コルチナチャネル非トランスジェニック対照花の花弁；B：トランスジェニックコルチナチャネル/pCGP2442系統19907の花の花弁；C：トランスジェニックコルチナチャネル/pCGP2442系統19890の花の花弁。
【図５】コルチナチャネル/pCGP2442スプレーカーネーション系統の花部分を示す写真である。A：非トランスジェニックコルチナチャネル対照；B：トランスジェニック系統19907；C：トランスジェニック系統19890。花粉が可視である（矢印）。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
詳細な説明
文脈上特記されない限り、本明細書において使用される単数形には複数の局面も含まれる。従って、例えば、「植物」なる言及には、単一の植物のみならず複数の植物も含まれ；「葯」なる言及には、単一の葯のみならず複数の葯も含まれ；「本発明」なる言及には、発明の単一の局面または複数の局面が含まれ；他も同様である。
【００５０】
本発明は、変更された花部を示す、カーネーション植物、特に、スプレーカーネーションのような遺伝子改変植物を意図する。変更された花部とは、花、花弁、葯、および花柱を含む、任意の組織または器官内であり得る。本明細書において意図される特定の花部には、紫色〜青色のような赤紫色〜青色の範囲の色が含まれる。色の決定は、英国王立園芸協会（RHS）カラーチャート（RHSCC）で便利に測定され、81A、86A、87Aの色、および上記範囲の末端の間またはそのいずれかに近い色が含まれる。「花部」という用語は、厳密に解釈されるべきではなく、花および花弁のみならず、任意の有色の細胞、組織器官、またはそれらの一部分に関する。
【００５１】
従って、本発明の一つの局面は、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素をコードする発現された遺伝物質を含む、選択された組織において変更された花部を示す遺伝子改変植物に関する。
【００５２】
特定の態様において、植物はカーネーションである。従って、本発明のもう一つの局面は、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素をコードする発現された遺伝物質を含む、選択された組織において変更された花部を示すスプレーカーネーションに関する。
【００５３】
本発明には、任意のスプレーカーネーションが包含されるが、コルチナチャネル系列（その変種を含む）のカーネーションが特に有用である。コルチナチャネルの有用な変種には、コルチナ、ロイヤルレッドコルチナ、セリースコルチナ、およびダスティコルチナが含まれる。
【００５４】
従って、本発明のもう一つの局面は、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素をコードする発現された遺伝子配列を含む、紫色〜青色の組織を示す遺伝子改変コルチナチャネルスプレーカーネーション系列またはその変種に関する。
【００５５】
さらにより具体的には、本発明は、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素をコードする発現された遺伝子配列を含む、変更された花部を示す遺伝子改変コルチナチャネル（KC）/pCGP2442（KC/2442またはコルチナチャネル/2442とも呼ばれる）を提供する。
【００５６】
コルチナチャネルトランスジェニック系列の例には、19890および19907が含まれる。
【００５７】
本明細書において意図されるその他の遺伝子改変カーネーションには、スプレーカーネーションであるセリースウェストパール、ベガ、およびアーティサン、ならびにスタンダードカーネーションであるクリームシンデレラ、シンデレラ、およびランデブーが含まれる。
【００５８】
本明細書において意図されるその他の遺伝子改変植物には、キク、バラ、ガーベラ、トルコギキョウ、チューリップ、ユリ、ゲラニウム、ペチュニア、アイリス、トレニア（Torenia）、ベゴニア（Begonia）、シクラメン（Cyclamen）、ニーレンベルギア（Nierembergia）、カタランタス（Catharanthus）、ペラルゴニウム（Pelargonium）、ラン、ブドウ、リンゴ、ユーフォルビア（Euphorbia）、またはフクシア（Fuchsia）、およびその他の観賞植物または園芸植物が含まれる。
【００５９】
本発明のもう一つの局面は、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素をコードする発現された遺伝子配列を含む、紫色〜青色の組織を示す遺伝子改変キクに関する。
【００６０】
本発明のさらにもう一つの局面は、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素をコードする発現された遺伝子配列を含む、紫色〜青色の組織を示す遺伝子改変バラに関する。
【００６１】
本発明のさらにもう一つの局面は、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素をコードする発現された遺伝子配列を含む、紫色〜青色の組織を示す遺伝子改変ガーベラに関する。
【００６２】
本発明のさらにもう一つの局面は、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素をコードする発現された遺伝子配列を含む、紫色〜青色の組織を示す遺伝子改変された観賞植物または園芸植物に関する。
【００６３】
遺伝子配列は、F3'5'H酵素およびDFR酵素をコードするヌクレオチド配列を保有している単一の構築物であってもよいし、または複数の遺伝子構築物が利用されてもよい。さらに、遺伝子配列は、植物細胞のゲノムへ組み込まれてもよいし、または染色体外の人工染色体として維持されてもよい。さらに、二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素を発現するスプレーカーネーションの生成は、単独の組換え手段によって生成してもよいし、または従来の育種と組換えDNA操作との組み合わせによって生成してもよい。遺伝子配列は、F3'5'H酵素およびDFR酵素を産生するような転写および翻訳をもたらすプロモーターおよびその他の調節配列と機能的に連結されているという意味で「発現される」。
【００６４】
従って、本発明のもう一つの局面は、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素をコードする発現可能な遺伝物質を、スプレーカーネーション植物のような植物の再生可能な細胞へ導入すること、ならびに、それから植物を再生させるか、または再生した植物からの子孫を入手することを含む、変更された花部を示すスプレーカーネーションのような遺伝子改変植物を作製する方法を意図する。
【００６５】
次いで、植物は、様々な世代にわたる生長または栽培を受けてもよい。従って、遺伝子改変スプレーカーネーションなる言及には、その子孫および姉妹系統、ならびにその変種も含まれる。
【００６６】
本発明のもう一つの局面は、少なくとも二つのF3'5'H酵素または少なくとも一つのDFR酵素のうちの一つをコードする発現可能な遺伝物質を含むスプレーカーネーションのような植物を選択すること、ならびに、この植物を、少なくとも二つのF3'5'H酵素または少なくとも一つのDFR酵素のうちの残りをコードする遺伝物質を含むスプレーカーネーションのような別の植物と交配させ、次いで、遺伝物質を発現するF1以降の世代の植物を選択することを含む、変更された花部を示すスプレーカーネーション系統のような遺伝子改変植物を作製する方法を提供する。
【００６７】
F3'5'H酵素およびDFR酵素をコードするヌクレオチド配列は、ビオラsp、ペチュニアsp、サルビアsp、リシアンサス（Lisianthus）sp、ゲンチアナ（Gentiana）sp、ソリア（Sollya）sp、クリトリア（Clitoria）sp、ケネディア（Kennedia）sp、カンパヌラ（Campanula）sp、ラバンドゥラ（Lavandula）sp、バーベナ（Verbena）sp、トレニアsp、デルフィニウム（Delphinium）sp、ソラナム（Solanum）sp、シネラリアsp、ビチス（Vitis）sp、バビアナ・ストリクタ（Babiana stricta）、ピヌス（Pinus）sp、ピセア（Picea）sp、ラリックス（Larix）sp、ファセオラス（Phaseolus）sp、バシニウム（Vaccinium）sp、シクラメンsp、アイリス（Iris）sp、ペラルゴニウムsp、リパリエ（Liparieae）、ゲラニウム（Geranium）sp、ピスム（Pisum）sp、ラチラス（Lathyrus）sp、カタランタスsp、マルビア（Malvia）sp、ムクナ（Mucuna）sp、ビシア（Vicia）sp、セントポーリア（Saintpaulia）sp、ラガーストレミア（Lagerstroemia）sp、ボウキナ（bouchina）sp、プランバゴ（Plumbago）sp、ヒポカリプタス（Hypocalyptus）sp、ロドデンドロン（Rhododendron）sp、リナム（Linum）sp、マクロプチリウム（Macroptilium）sp、ハイビスカス（Hibiscus）sp、ヒドランゲア（Hydrangea）sp、シンビジウム（Cymbidium）sp、ミレッチア（Millettia）sp、ヘディサルム（Hedysarum）sp、レスペデザ（Lespedeza）sp、アスパラガス（Asparagus）sp、アンチゴノン（Antigonon）sp、ピスムsp、フリージア（Freesia）sp、ブルネラ（Brunella）sp、またはクラーキア（Clarkia）sp等を含む任意の起源に由来し得る。両方のF3'5'H酵素が同一の植物種に由来してもよいし、または異なる植物種に由来してもよい。例えば、一つの態様において、二つのF3'5'H酵素はビオラspおよびサルビアspに由来する。DFRも、同一の植物種または異なる植物種に由来し得る。
【００６８】
本発明は、さらに、紫色〜青色を有する組織を含む、変更された花部を示すコルチナチャネルカーネーションまたはその変種のようなスプレーカーネーションの製造における、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素をコードする遺伝子配列の使用を意図する。
【００６９】
もう一つの態様において、本発明は、紫色〜青色を有する組織を含む、変更された花部を示すバラ、キク、ガーベラ、チューリップ、ユリ、ラン、トルコギキョウ、ベゴニア、トレニア、ゲラニウム、ペチュニア、ニーレンベルギア、ペラルゴニウム、アイリス、インパチェンス、シクラメン、ブドウ、リンゴ、ユーフォルビア、もしくはフクシア、またはその他の観賞植物もしくは園芸植物より選択される遺伝子改変植物の製造における、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素をコードする遺伝子配列の使用を意図する。
【００７０】
切り花、組織培養可能な細胞、再生可能な細胞、植物の一部分、種、生殖物質（花粉を含む）は、全て、本発明に包含される。
【００７１】
上述のように、F3'5'H酵素およびDFR酵素をコードするヌクレオチド配列は、全て、同一の植物種または二つ以上の異なる種に由来し得る。ビオラspおよびサルビアspに由来するF3'5'Hヌクレオチド配列、ならびにペチュニアsp由来のDFRが、本発明の実施において特に有用である。F3'5'H酵素およびDFR酵素をコードするヌクレオチド配列、ならびにそれぞれのアミノ酸配列は、表1に定義される。
【００７２】
F3'5'H酵素をコードする核酸分子は、国際特許出願PCT/AU92/00334およびHolton et al,1993（前記）にも提供されている。これらの配列は、ペチュニア（国際特許出願PCT/AU92/00334およびHolton et al,1993（前記）を参照のこと）、タバコ（国際特許出願PCT/AU92/00334を参照のこと）、およびカーネーション（国際特許出願PCT/AU96/00296を参照のこと）においてフラボノイドの3',5'-ヒドロキシル化を改変するために使用されている。ビオラ、サルビア、およびソリアのようなその他の種に由来するF3'5'Hのヌクレオチド配列が、クローニングされている（国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと）。これらの配列のうちのいずれかが、プロモーターおよび／またはターミネーターと組み合わせられて使用され得る。本発明は、SEQ ID NO:1、3、および9によりコードされるF3'5'H、およびSEQ ID NO:5によりコードされるDFR、あるいは低いもしくは高いストリンジェンシー条件の下で、SEQ ID NO:1、3、5、もしくは9のいずれか、もしくはそれらの相補型にハイブリダイズすることができるか、または最適のアラインメントの後にSEQ ID NO:1もしくは3もしくは5もしくは9との少なくとも約70％の同一性を有するヌクレオチド配列を特に意図する。ターミネーター配列SEQ ID NO:8およびプロモーター配列SEQ ID NO:7、ならびにそれらにハイブリダイズするかまたはそれらとの少なくとも約70％の類似性を有する配列も、本明細書において意図される。
【００７３】
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、またはそれらの相補型にハイブリダイズすることができる核酸分子を画定するためのストリンジェンシーのレベルを決定する目的のため、低ストリンジェンシーには、ハイブリダイゼーションのための少なくとも約0％〜少なくとも約15％v/vホルムアミドおよび少なくとも約1M〜少なくとも約2M塩、ならびに洗浄条件のための少なくとも約1M〜少なくとも約2M塩が含まれ包含される。一般に、低ストリンジェンシーは、約25〜30℃〜約42℃である。温度は変更されてもよく、より高い温度が、ホルムアミドを含める代わりに、かつ／または別のストリンジェンシー条件を与えるため使用されてもよい。ハイブリダイゼーションのための少なくとも約16％v/v〜少なくとも約30％v/vホルムアミドおよび少なくとも約0.5M〜少なくとも約0.9M塩、ならびに洗浄条件のための少なくとも約0.5M〜少なくとも約0.9M塩を含み包含する中ストリンジェンシー、またはハイブリダイゼーションのための少なくとも約31％v/v〜少なくとも約50％v/vホルムアミドおよび少なくとも約0.01M〜少なくとも約0.15M塩、ならびに洗浄条件のための少なくとも約0.01M〜少なくとも約0.15M塩を含み包含する高ストリンジェンシーのような、別のストリンジェンシー条件が、必要に応じて適用されてもよい。一般に、洗浄はTm＝69.3＋0.41（G+C）％で実施される（Marmur and Doty,J.Mol.Biol.5:109,1962）。しかしながら、二重鎖DNAのTmは、ミスマッチ塩基対の数が1％増加する毎に1℃減少する（Bonner and Laskey,Eur.J.Biochem.46:83,1974）。ホルムアミドは、これらのハイブリダイゼーション条件において任意である。従って、特に好ましいストリンジェンシーのレベルは、以下のように定義される：低ストリンジェンシーは、25〜42℃における6×SSC緩衝液、1.0％w/v SDSであり；中ストリンジェンシーは、20℃〜65℃の範囲の温度における2×SSC緩衝液、1.0％w/v SDSであり；高ストリンジェンシーは、少なくとも65℃の温度における0.1×SSC緩衝液、0.1％w/v SDSである。
【００７４】
少なくとも70％の同一性なる言及には、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、および100％の同一性が含まれる。SEQ ID NO:2、4、6、または10のアミノ酸配列の類似性のレベルで、比較がなされてもよい。従って、SEQ ID NO:2または4または6または10に示されたアミノ酸配列との少なくとも70％の類似性を有するF3'5'H酵素またはDFRをコードする核酸分子が、本明細書において意図される。同様に、少なくとも70％の類似性には、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、および100％の類似性または同一性が含まれる。
【００７５】
F3'5'H酵素およびDFRをコードする核酸分子は、一つまたは複数のプロモーターおよび／またはターミネーターを含む。一つの態様において、より高いpHを有する組織におけるF3'5'Hおよび／またはDFRのヌクレオチド配列の発現を指図するプロモーターが選択される。
【００７６】
一つの態様において、プロモーター配列は、形質転換される宿主カーネーション植物にネイティブであり、または、その領域が宿主植物において機能性である場合、別の起源に由来してもよい。その他の起源には、ノパリン、オクタピン、マンノピン、またはその他のオピンの生合成のための酵素をコードする遺伝子のプロモーターのようなアグロバクテリウムT-DNA遺伝子；ユビキチンをコードする遺伝子に由来するプロモーターのような植物由来のプロモーター；組織特異的プロモーター（例えば、Conklingらの米国特許第5,459,252号；Advanced TechnologyのWO 91/13992を参照のこと）；（宿主特異的ウイルスを含む）植物ウイルス由来のプロモーター、または部分的にもしくは完全に合成のプロモーターが含まれる。（トウモロコシobi-1遺伝子由来のUbiプロモーター（例えば、米国特許第4,962,028号を参照のこと）のような）植物および（カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、CaMV 35Sのような）ウイルスから単離された様々なプロモーターを含む、カーネーション植物において機能性である可能性のある多数のプロモーター（例えば、Greve,J.Mol.Appl.Genet.1:499-511,1983；Salomon et al,EMBO,J.3:141-146,1984；Garfinkel et al,Cell 27:143-153,1981；Barker et al,Plant Mol.Biol.2:235-350,1983を参照のこと）。その他の態様において、プロモーターは、対応するターミネーターpet D8 3'、carnANS 3'、およびpetDFR 3'（Pet gen DFR由来）とそれぞれ組み合わせられた、AmCHS 5'、carnANS 5'、および／またはpetDFR 5'（Pet gen DFR由来）である。
【００７７】
プロモーター配列は、転写を調節するシス作用性配列を含んでいてもよく、ここで、調節には、例えば、化学的もしくは物理的な抑制もしくは誘導（例えば、代謝物、光、もしくはその他の物理化学的因子に基づく調節、例えば、線虫応答性プロモーターを開示しているWO 93/06710を参照のこと）、または（植物における葉、根、種子等に関連したもののような；例えば、根特異的プロモーターを開示している米国特許第5,459,252号を参照のこと）細胞分化に基づく調節が含まれる。
【００７８】
利用され得るその他のシス作用性配列には、転写および／または翻訳のエンハンサーが含まれる。これらのエンハンサー領域は、当業者に周知であり、ATG開始コドンおよび隣接配列を含み得る。
【００７９】
適当なプロモーターおよび／またはターミネーターと組み合わせられた、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素をコードする核酸分子が、スプレーカーネーションにおけるフラボノイド分子の活性を改変するために使用される。本明細書におけるデルフィニジンベースの分子の量の改変なる言及は、正常な内因性または既存の活性レベルよりも最大30％、より具体的には30〜50％、さらに具体的には50〜75％、またはさらに具体的には75％以上高いまたは低いレベルの上昇または低下に関する。
【００８０】
本明細書において使用される「花部」という用語は、植物の顕花部分、または伸長した節間により栄養部分から通常分離されており、通常、個々の花、苞葉および花柄、および小花柄を含む、複数の花の顕花系をさす。上述のように、「トランスジェニック植物」なる言及は、「遺伝子改変植物」と読み替えられてもよく、第一世代トランスジェニック植物に最終的に由来する子孫またはハイブリッド系統を含む。
【００８１】
本発明は、紫色〜青色を有する組織を含む変更された花部を示すコルチナチャネルカーネーションまたはセリースウェストパールカーネーションまたはそれらの変種のようなスプレーカーネーションの製造における、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFR酵素をコードする遺伝子配列の使用も意図する。
【００８２】
本明細書に記載されたような遺伝子改変スプレーカーネーション植物を作成すること、苗木、種子、再生可能な細胞、組織培養可能な細胞、またはその他の物質を栽培者へ提供すること、商業的販売数の植物を作成すること、ならびに小売り業者または卸売業者に切り花を提供することを含む、栽培ビジネスモデルも提供される。
【００８３】
本発明は、以下の非限定的な実施例によりさらに説明される。これらの実施例においては、以下に概説されるような物質および方法が利用された：
【００８４】
従った方法は、Sambrook et al,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,Cold Spring Harbor,NY,USA,1989またはSambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratories,Cold Spring Harbor,NY,USA,2001またはPlant Molecular Biology Manual(2nd edition),Gelvin and Schilperoot(eds),Kluwer Academic Publisher,The Netherlands,1994またはPlant Molecular Biology Labfax,Croy(ed),Bios scientific Publishers,Oxford,UK,1993に記載されたようなものであった。
【００８５】
クローニングベクターpBluescriptおよびPCR scriptは、Stratagene（USA）より入手された。pCR7 2.1は、Invitrogen（USA）より入手した。
【００８６】
大腸菌形質転換
使用した大腸菌株は、以下の通りであった。
0005500556.tif 000003
M15大腸菌は大腸菌K12に由来し、表現型NalS、StrS、RifS、Thi-、Ara+、Gal+、Mtl-、F-、RecA+、Uvr+、Lon+を有する。
【００８７】
大腸菌株の形質転換は、Inoueら（Gene 96:23-28,1990）の方法に従って実施された。
【００８８】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス株および形質転換
使用した無毒化（disarmed）アグロバクテリウム・ツメファシエンス株は、AGL0（Lazo et al,Bio/technology 9:963-967,1991）であった。
【００８９】
50mLのLB培養物（Sambrook et al,1989（前記））を接種し、28℃で振とうしながら16時間インキュベートすることにより調製された100μLのコンピテントAGL0細胞へ、5μgのプラスミドDNAを添加することにより、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株AGL0にプラスミドDNAを導入した。次いで、細胞をペレット化し、0.5mLの85％(v/v)100mM CaCl2/15％(v/v)グリセロールに再懸濁させた。DNA-アグロバクテリウム混合物を、液体N2中で2分間インキュベートすることにより凍結させ、次いで、37℃で5分間インキュベートすることにより解凍した。次いで、DNA/細菌混合物を、さらに10分間、氷上に置いた。次いで、細胞を1mLのLB（Sambrook et al,1989（前記））培地と混合し、28℃で16時間振とうしながらインキュベートした。プラスミドを保有しているA.ツメファシエンスの細胞を、50μg/mLテトラサイクリンまたは100μg/mLゲンタマイシンのような適切な抗生物質を含有しているLB寒天プレートで選択した。A.ツメファシエンス中のプラスミドの確認を、抗生物質耐性形質転換体から単離されたDNAの制限エンドヌクレアーゼマッピングにより行った。
【００９０】
DNAライゲーション
DNAライゲーションは、製造業者によって推奨された手法に従って、Amersham LigationキットまたはPromega Ligationキットを使用して実施した。
【００９１】
DNA断片の単離および精製
断片は、一般に、1％(w/v)アガロースゲル上に単離し、製造業者によって推奨された手法に従い、QIAEX II Gel Extractionキット（Qiagen）またはBresacleanキット（Bresatec,Australia）を使用して精製した。
【００９２】
制限エンドヌクレアーゼ消化後の突出末端の修復
突出5'末端は、標準的なプロトコル（Sambrook et al,1989（前記））に従って、DNAポリメラーゼIクレノウ断片を使用して修復した。突出3'末端は、標準的なプロトコル（Sambrook et al,1989（前記））に従って、バクテリオファージT4 DNAポリメラーゼを使用して修復した。
【００９３】
核酸からのリン酸基の除去
再環化を防止するため、クローニングベクターからリン酸基を除去するために、典型的には、シュリンプアルカリホスファターゼ（SAP）［USB］を、製造業者の推奨に従って使用した。
【００９４】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
特記しない限り、鋳型としてプラスミドDNAを使用したPCR条件は、全容量50μLでの、2ngのプラスミドDNA、100ngの各プライマー、2μLの10mM dNTP混合物、5μLの10×Taq DNAポリメラーゼ緩衝液、0.5μLのTaq DNAポリメラーゼの使用を含んだ。サイクリング条件には、94℃5分の初期変性工程、それに続く、94℃20秒、50℃30秒、および72℃1分の35サイクル、72℃10分間の最終処理が含まれ、その後、4℃で保管した。
【００９５】
PCRは、Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600において実施された。
【００９６】
DNAプローブの32P標識
DNA断片（50〜100ng）は、Gigaprimeキット（Geneworks）を使用して、50μCiの[α-32P]-dCTPにより放射標識した。未取り込みの[α-32P]-dCTPは、Sephadex G-50（Fine）カラムまたはMicrobiospin P-30 Trisクロマトグラフィカラム（BioRad）でのクロマトグラフィにより除去した。
【００９７】
プラスミド単離
適切な抗生物質選択（例えば、100μg/mLアンピシリンまたは10〜50μg/mLテトラサイクリン等）を含むLBブロス（Sambrook et al,1989（前記））を接種し、振とうしながらおよそ16時間37℃（大腸菌の場合）または29℃（A.ツメファシエンスの場合）で液体培養物をインキュベートすることにより、単一コロニーをインサートについて分析した。アルカリ溶解法（Sambrook et al,1989（前記））を使用するか、またはWizardPlus SV minipreps DNA精製系（Promega）もしくはQiagen Plasmid Miniキット（Qiagen）を使用して、プラスミドDNAを精製した。インサートの存在が決定された後、アルカリ溶解法（Sambrook et al,1989（前記））またはQIAfilter Plasmid Midiキット（Qiagen）を使用して、製造業者によって推奨された条件に従って、大量のプラスミドDNAを50mLの一夜培養物から調製した。
【００９８】
DNA配列分析
DNA配列決定は、Applied BiosystemsのPRISM（商標）Ready Reaction Dye Primer Cycle Sequencingキットを使用して実施した。製造業者によって供給されたプロトコルに従った。サイクル配列決定反応は、Perkin Elmer PCR機（GeneAmp PCR System 9600）を使用して実施した。配列決定の実行は、一般に、University of Queensland（St Lucia,Brisbane,Australia）、およびThe Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research（Melbourne,Australia）において、Australian Genome Research Facilityにより、または自動373A DNAシーケンサー（Applied Biosystems）において実施した。
【００９９】
配列は、MacVector（商標）アプリケーション（9.5.2以前のバージョン）［MacVector Inc,Cary,North Carolina,USA］を使用して分析した。
【０１００】
Genbank、SWISS-PROT、およびEMBLデータベースに対する相同性検索は、FASTAプログラムおよびTFASTAプログラム（Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8):2444-2448,1988）またはBLASTプログラム（Altschul et al,J.Mol.Biol.215(3):403-410,1990）を使用して実施した。配列類似率は、デフォルト設定を使用して、LALIGNプログラム（Huang and Miller,Adv.Appl.Math.12:373-381,1991）またはMacVector（商標）アプリケーション（MacVector Inc,USA）内のClustalWプログラム（Thompson et al,Nucleic Acids Research 22:4673-4680,1994）を使用して入手した。
【０１０１】
多重配列アラインメントは、デフォルト設定を使用して、ClustalW（Thompson et al,1994（前記））を使用して作製した。
【０１０２】
植物形質転換
植物形質転換は、参照により本明細書に組み入れられる国際特許出願PCT/US92/02612、または国際特許出願PCT/AU96/00296、またはLu et al.,Bio/Technology 9:864-868,1991に記載されたようなものであった。その他の方法も利用され得る。
【０１０３】
ダイアンサス・カリオフィルスcv.コルチナチャネルの切り花は、Van Wyk and Son Flower Supply（Victoria）またはPropagation Australia（Queensland,Australia）より入手した。
【０１０４】
トランスジェニック分析
色コード決定
観察された色の説明を提供するため、英国王立園芸協会のカラーチャート第3版および／または第5版（London,UK）（1995年および／または2007年）を使用した。それらは、観察された色表現型を記載するための代替的な手段を提供する。しかしながら、指定された数字は、知覚された色についての案内としてのみ解釈されるべきであり、入手され得る可能性のある色を限定するものと見なされるべきではない。
【０１０５】
カーネーションの花弁は、3つのゾーン、つめ、花冠（cololla）、および舷部からなる（Glimn-Lacy and Kaufman,Botany Illustrated,Introduction to Plants,Major Groups,Flowering Plant Families,2nd ed,Springer,USA,2006）。一般に、花弁舷部のみが有色であり、つめは緑色、花冠は白色調である（図4を参照のこと）。カーネーションの花弁／花／花部の色の参照は、一般に、カーネーション花弁舷部の色に関する。
【０１０６】
クロマトグラフィ分析
薄層クロマトグラフィ（TLC）および高速液体クロマトグラフィ（HPLC）分析は、一般に、Bruglieraら（Plant J.5:81-92,1994）に記載されたようにして実施した。
【０１０７】
一般に、TLCおよびHPLC分析は、花弁舷部から単離された抽出物に対して実施された。
【０１０８】
アントシアニジンの抽出
HPLC分析前に、花弁舷部抽出物中に存在するアントシアニン分子およびフラボノール分子を、アントシアニジンまたはフラボノールコアからグリコシル部分を除去するために酸加水分解した。アントシアニジンおよびフラボノールの標準物を、花抽出物中に存在する化合物の同定を補助するために使用した。
【０１０９】
反応混合物中のアントシアニジンを、10分間で50％Bから60％Bにし、次いで10分間60％B、最後に5分間で60％Bから100％Bにする勾配条件を使用して、勾配溶出を介してHPLCにより分析した。ここで、溶媒AはTFA：H2O（5：995）からなり、溶媒Bはアセトニトリル：TFA：H2O（500：5：495）からなっていた。Asahi Pac ODP-50カートリッジカラム（250mm×4.6mm ID）を、逆相クロマトグラフィ分離のために使用した。流速は1mL/分であり、温度は40℃であった。アントシアニジン化合物の検出は、400〜650nmでShimadzu SPD-M6A三次元検出器を使用して実施された。
【０１１０】
アントシアニジンピークは、公知の標準物、即ち、デルフィニジン、ペチュニジン、マルビジン、シアニジン、およびペオニジンを参照して同定した。
【０１１１】
花発達の段階
カーネーションの花は、以下のように定義された発達段階において採集された:
段階1：芽は閉じている、花弁は可視でない。
段階2：花芽が開き始める：花弁の先端が可視となる。
段階3：ほぼ全ての花弁の先端が露出される。「ペイントブラシ（Paint-brush）段階」。
段階4：外側の花弁が茎に対して45°の角度となる。
段階5：花部が完全に開く。
【０１１２】
TLCまたはHPLC分析のために、最大色素蓄積の段階にある段階4の花から花弁舷部を収集した。
【０１１３】
ノーザンブロット分析のために、フラボノイド経路遺伝子の最大発現の段階にある段階3の花から花弁を収集した。
【０１１４】
実施例1
キメラF3'5'H遺伝子構築物の調製
構築物の調製において使用されたプロモーター、ターミネーター、およびコーディング断片の概要、ならびにそれぞれの略語を、表2に列挙する。
【０１１５】
（表２）構築物の調製において使用された略語
0005500556.tif 000004
0005500556.tif 000005
【０１１６】
コルチナチャネルは、スプレータイプの薄ピンク色（RHSカラーコード65A、65A、65C、73B、73C、73D）のカーネーションである。それは、典型的には、シアニジンベースの色素（花弁の非乾燥重量1g当たり0.08mg）およびケルセチンフラボノールとケンフェロールフラボノールとの混合物（それぞれ花弁の非乾燥重量1g当たり5.3mgおよび4.6mg）を蓄積する。コルチナチャネルは、典型的には、オリジナルより10倍多い量のシアニジン誘導体が蓄積される、より暗い紫ピンク色の花（RHSカラーコード64A、61A、71A）［コルチナ］へと変異することもある。
【０１１７】
コルチナチャネルのスプレーカーネーション背景で新規の紫色／青色の花を作製するため、ペチュニア、パンジー、サルビア、ソリア、およびチョウマメのF3'5'H cDNA断片、ならびに様々なプロモーター断片およびターミネーター断片を利用して、多数のバイナリーベクター構築物を調製した。キメラF3'5'H遺伝子は、他のカーネーションおよびペチュニアにおいて、（ノーザンブロット分析により検出されるように）検出可能な完全なF3'5'H転写物、およびデルフィニジンまたはデルフィニジンベースの分子色素の生成をもたらすことに成功している。表3は、F3'5'H cDNA断片を含有しているバイナリーベクター構築物の一覧を要約している。
【０１１８】
（表３）コルチナチャネルの形質転換において使用されたバイナリーベクター構築物に含有されていたキメラのF3'5'HおよびDFRの遺伝子発現カセットの概要（略語の説明については、表2を参照のこと）
0005500556.tif 000006
【０１１９】
形質転換ベクターpCGP1452、pCGP1972、pCGP1973、pCGP2121、pCGP2122、pCGP2130
形質転換ベクターpCGP1452、pCGP1972、pCGP1973、pCGP2121、pCGP2122、pCGP2130の調製は、国際特許出願PCT/AU03/01111に記載されている。
【０１２０】
形質転換ベクターpCGP1991
形質転換ベクターpCGP1991は、35S 5':SuRB選択可能マーカー遺伝子と共に、AmCHS 5':BPF3'5'H#40:ocs 3'発現カセットおよびペチュニアゲノムDFR-A遺伝子を含有している。
【０１２１】
中間プラスミドpCGP1472（ペチュニアDFR-Aゲノムクローン）の構築
ベクターλ2001（Holton,1992（前記））において、ペチュニア・ハイブリダcv.オールドグローリーブルー（Old Glory Blue）DNAからゲノムライブラリーを作成した。およそ200,000pfuをNZYプレートに播種し、隆起をNENフィルターに採り、フィルターに400,000cpm/mLの32P標識ペチュニアDFR-A cDNA断片（Brugliera et al,1994（前記）に記載されている）をハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたクローンを精製し、各々からDNAを単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化によりマッピングした。これらのクローンのうちの一つの13kbのSacI断片を単離し、pBluescriptIIのSacI末端とライゲートさせ、プラスミドpCGP1472を作出した。より詳細なマッピングは、およそ5.3kbのBglII断片がペチュニアDFR-A遺伝子（Beld et al,.Plant Mol.Biol.13:491-502,1989）全体を含有していることを示した。
【０１２２】
中間プラスミドpCGP1984（pet gen DFR:35S 5':SuRB）の構築
プラスミドpCGP1984は、pWTT2132（DNAP）骨格の中に35S 5':SuRB選択可能マーカー遺伝子と共にペチュニアゲノムDFR-A遺伝子（Pet gen DFR）を含有している。
【０１２３】
プラスミドpCGP1472（上記）を制限エンドヌクレアーゼ（RE）BglIIにより消化し、ペチュニアDFR-A遺伝子全体を含有しているおよそ5.3kbの断片を放出させた。得られた5'突出部を、標準的なプロトコル（Sambrook et al,1989（前記））に従ってDNAポリメラーゼI（クレノウ酵素）を使用して修復した。ベクターpWTT2132（DNAP）をRE KpnIにより消化し、ベクターを直鎖化した。得られたベクターの突出3'末端を、標準的なプロトコル（Sambrook et al,1989（前記））に従い、バクテリオファージT4 DNAポリメラーゼにより除去した。ペチュニアDFR-A遺伝子を含有している5.3kbの断片を、ベクターpWTT2132の修復されたKpnI末端とライゲートさせた。pWTT2132における所望の方向での断片ライゲーションの成功を、テトラサイクリン耐性大腸菌形質転換体から単離されたプラスミドDNAのRE消化により確立した。得られたプラスミドをpCGP1984と名付けた。
【０１２４】
中間プラスミド1971（AmCHS 5':BPF3'5'H#40:petD8 3'）の構築
プラスミドpCGP1971は、pBluescript骨格の中にAmCHS 5':BPF3'5'H#40:petD8 3'からなるキメラ遺伝子を含有している。pCGP1971の構築は、国際特許出願PCT/AU03/01111に記載されている。
【０１２５】
形質転換ベクターpCGP1991（AmCHS 5':BPF3'5'H#40:petD8 3';Pet gen DFR;35S 5':SuRB）の構築
プラスミドpCGP1971をRE EcoRV/NotIにより消化し、キメラAmCHS 5':BPF3'5'H#40:petD8 3'遺伝子を含有している3.5kbの断片を放出させた。得られた5'突出部を、標準的なプロトコル（Sambrook et al,1989（前記））に従って、DNAポリメラーゼI（クレノウ酵素）を使用して修復した。断片を精製し、直鎖化されたプラスミドpCGP1984（上記）の修復されたPstI末端とライゲートさせた。pCGP1984におけるAmCHS 5':BPF3'5'H#40:petD8 3'断片の正確な挿入を、テトラサイクリン耐性大腸菌形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ消化により確立した。得られた形質転換ベクターをpCGP1991と名付けた。
【０１２６】
形質転換ベクターpCGP2205（carnANS 5':BPF3'5Η#18:carnANS 3'）
形質転換ベクターpCGP2205は、プラスミドpCGP1988（国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと）の35S 5':SuRB選択可能マーカー遺伝子カセットに対してタンデムに、キメラcarnANS 5':BPF3'5'H#18:carnANS 3'遺伝子カセットを含有している。
【０１２７】
中間プラスミドpCGP787の構築
カーネーションANSゲノムクローンの単離
Sau3A部分消化物を使用して、EMBL 3ラムダベクター（STRATAGENE）において、ダイアンサス・カリオフィルスcv.ラグナ（Laguna）DNAからゲノムDNAライブラリーを構築した。消化されたゲノムDNAを、グリセロール密度勾配でサイズ分画し、15〜20kbの範囲のDNA断片を含有している画分をプールし、EMBL3λベクターのBamHI末端とライゲートさせた。ライゲーション混合物を、Gigapack XL Gold（PROMEGA）を使用してパッケージングした。ライブラリーの全サイズは、1×106組換え体であった。
【０１２８】
全部で300,000pfuのラグナゲノムライブラリーを、pCGP786（国際特許出願PCT/AU96/00296を参照のこと）由来のカーネーションANS cDNAクローンの32P標識断片によりデュプリケートでスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、高ストリンジェンシー条件（42℃、50％ホルムアミド、0.1％PVP、0.1％BSA、0.1％フィコール、1％SDS、100μg/mL変性ニシン精子DNA）を使用して実施した。洗浄は、65℃で、2×SSC／1％SDSおよび0.2×SSC／1％SDSであった。続いて、ゲノムクローン（4.3）を精製し、さらに特徴決定した。ゲノムクローンの8kbのHindIII断片を、さらなる分析のため、pBluescript KSへとサブクローニングした。得られたプラスミドをpCGP787と名付けた。
【０１２９】
中間プラスミドpCGP1274（ANSプロモーター断片）の構築
カーネーションANS遺伝子由来のプロモーター配列を含有しているおよそ2.5kbの断片を、RE EcoRIおよびBamHIによる消化により、pCGP787（上記）から放出させた。断片を精製し、pBluescript KSのEcoRI/BamHI末端とライゲートさせ、プラスミドpCGP793を得た。この2.5kbの断片は、200bpのANSコーディング配列を含んでいた。次いで、AUGコドンから5'上流にXbaI部位を導入するプライマーを使用したPCRにより、プロモーター断片の3'末端を増幅した。次いで、この700bpのPCR断片を、RE NdeI/XbaIにより消化し、pCGP793（上記）のNdeI/XbaI末端とライゲートさせ、200bpのANSコーディング配列を含まない2.3kbのANSプロモーター断片を作製した。この新しいプラスミドをpCGP1274と名付けた。
【０１３０】
中間プラスミドpCGP1275（carnANS 5':carnANS 3'カセット）の構築
プラスミドpCGP795（上記）を、RE Ecl136II/XbaIにより消化し、0.7kbのANSターミネーター断片を放出させた。断片を精製し、pCGP1274のApaI（平滑末端化）/XbaI末端とライゲートさせ、カーネーションANS遺伝子のプロモーター配列およびターミネーター配列（carnANS 5':carnANS 3'）を含有しているプラスミドpCGP1275を作製した。
【０１３１】
中間プラスミドpCGP2150（carnANS 5':BPF3'5'H#18:carnANS 3'カセット）の構築
プラスミドpCGP1959（BPF3'5'H#18 cDNAクローンを含有している）［国際特許出願PCT/AU03/01111に記載されている］を、RE BamHIおよびAsp718により消化した。末端を修復し、精製されたBPF3'5'H#18保持断片を、pCGP1275（carnANS 5':carnANS 3'を含有している ）の修復されたPstI/XbaI末端とライゲートさせ、プラスミドpCGP2150（carnANS 5':BPF3'5'H#18:carnANS 3'発現カセットを含有している ）を作製した。
【０１３２】
形質転換ベクターpCGP2205の構築
キメラcarnANS 5':BPF3'5'H#18:carnANS 3'遺伝子を、RE ClaIによる消化により、pCGP2150（上記）から放出させた。およそ4.8kbの断片のClaI末端を修復し、断片を単離し、精製し、プラスミドpCGP1988（国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと）の修復されたAsp718I末端とライゲートさせた。35S 5':SuRB選択可能マーカー遺伝子カセットに対してタンデム方向でのcarnANS 5':BPF3'5'H#18:carnANS 3'遺伝子の正確な挿入を、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。形質転換ベクターをpCGP2205と名付けた。
【０１３３】
表3の遺伝子発現カセットを保有しているコルチナチャネルカーネーションの花弁のトランスジェニック分析の結果を、表4に示す。
【０１３４】
（表４）F3'5'H遺伝子発現カセットを含有しているT-DNAにより形質転換されたコルチナチャネルカーネーションの花弁のトランスジェニック分析の結果
0005500556.tif 000007
トランスジーン＝T-DNAに含有されていたキメラのF3'5'HおよびDFRのヌクレオチド配列
pCGP＝形質転換実験において使用された形質転換ベクターのプラスミドpCGP ID番号（詳細については表3を参照のこと）
＃tg＝作製されたトランスジェニックカーネーション系統の総数
TLC＋＝分析された個々の事象の総数に対する（花弁抽出物のTLCの後に事実上決定されたような）デルフィニジンが花弁に検出された個々の事象の数
HPLC＋＝分析された個々の事象の総数に対する（HPLCにより検出されたような）デルフィニジンが花弁に検出された個々の事象の数
最高デルフィニジン％＝トランスジェニック事象の集団についての花弁において検出された最高デルフィニジン％
nd＝未実施
RHSCC＝英国王立園芸協会カラーチャートによる色コードを使用した、最高デルフィニジン量を有する花の花弁色
【０１３５】
結果は、評価されたF3'5'H配列が、全て、カーネーションにおいて安定しており、カーネーション花において新規のデルフィニジンベースの色素の産生をもたらしたことを示唆している。しかしながら、コルチナチャネルスプレーカーネーション品種において、＞80％のデルフィニジンの産生、または新規の商業的に実現可能な色変化をもたらした構築物はなかった。色変化は、全て、RHSカラーチャートの赤紫色群にあった。
【０１３６】
290を超えるトランスジェニックコルチナチャネルスプレーカーネーションが作製された（表4）が、いずれも、紫色／青色へと色が変化した花を生じなかった。最も劇的な色の変化は、商業的に実現可能な新規の色ではない赤色／紫色（RHSカラーコード74a、78a）へのものであった。デルフィニジンベースの色素は産生されたが、それらの量は少なく、商業的に実現可能な新規のスミレ色、紫スミレ色、紫色／青色へと色を改変することはできなかった。
【０１３７】
（DFRが欠損している）白色カーネーションの改変において成功裡に使用されたようなキメラF3'5'HおよびペチュニアDFR遺伝子（pCGP1991に含有されている、表4を参照のこと）［国際特許出願PCT/AU96/00296を参照のこと］の使用ですら、コルチナチャネル背景において、＞80％のデルフィニジンベースの色素の産生、または新規のスミレ色、紫スミレ色、紫青色をもたらさなかった。
【０１３８】
実施例2
デルフィニジンベースのアントシアニン
コルチナチャネルスプレーカーネーション花において、デルフィニジンベースのアントシアニンの量を増加させ、従って、スミレ色／紫色／青色の可能性を増加させるため、二つのF3'5'Hキメラ遺伝子および一つのペチュニアDFR遺伝子の使用を含む新規の構築物を調製した。
【０１３９】
この適用において使用されたDFRゲノム断片は、ペチュニアから単離された。ペチュニアDFR酵素は、ジヒドロケルセチンおよびジヒドロミリセチンのみを基質として使用することができ、ジヒドロケンフェロールは使用することができない（Holton and Cornish,1995（前記））。これは、産生されるアントシアニジンの大部分または全てがデルフィニジンであることを確実にする。
【０１４０】
新しい構築物において使用されたキメラ遺伝子の中のF3'5'Hコーディング配列は、パンジー（pCGP2205の中のcarnANS 5':BPF3'5'H#18:carnANS 3'）およびサルビア（pCGP2122の中のAmCHS 5':Salvia F3'5'H#47:petD8 3'）［表3］に由来するものであった。これらは、これまでにコルチナチャネルスプレーカーネーションにおいてデルフィニジンの最高量の産生において最も効率的であった二つの発現カセットに相当するためである（表4）。
【０１４１】
形質転換ベクターpCGP2442
形質転換ベクターpCGP2442（図2）は、ペチュニアゲノムDFR-A遺伝子、キメラcarnANS:BPF3'5'H#18:carnANS 3'遺伝子、およびプラスミドpWTT2132（国際特許出願PCT/AU03/01111を参照のこと）の35S 5':SuRB選択可能マーカー遺伝子カセットに対してタンデムに、キメラAmCHS:Salvia F3'5'H#47:petD8 3'遺伝子を含有している。
【０１４２】
中間プラスミドpCGP2221（5.3kbのペチュニアDFR-Aゲノムクローン）の構築
プラスミドpCGP2221は、クローニングベクターpNEB193（NEW ENGLAND BIOLABS）の中にpCGP1472（上記）由来のペチュニアDFR-A遺伝子（Pet gen DFR）を含有している。
【０１４３】
プラスミドpCGP1472（上記実施例1）を、RE BglIIにより消化し、Pet gen DFR遺伝子を含有しているおよそ5.3kbの断片を放出させた。得られた5'突出部を、標準的なプロトコル（Sambrook et al,1989（前記））に従って部分修復した。クローニングベクターpNEB193（DNAP）をSalIにより消化し、ベクターを直鎖化した。得られたベクターの突出末端を、標準的なプロトコル（Sambrook et al,1989（前記））に従って部分修復した。Pet gen DFR遺伝子を保持している5.3kbの断片を、ベクターpNEB193の部分修復された末端とライゲートさせた。pNEB193の中のインサートの所望の方向でのライゲーションの成功を、アンピシリン耐性大腸菌形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ消化により確立した。得られたプラスミドをpCGP2221と名付けた。
【０１４４】
中間プラスミドpCGP2117（pBluescriptの中のAmCHS 5':Salvia F3'5'H#47:petD8 3'）の構築
プラスミドpCGP2117は、クローニングベクターpBluescript KSII（Stratagene,USA）の中にAmCHS 5':Salvia F3'5'H#47:petD8 3'発現カセットを含有している。
【０１４５】
まず、プラスミドpCGP725をRE BamHIにより消化することにより、pCGP725（pBluescript KS骨格の中にAmCHS 5':petHf1:petD8 3'を含有している）［国際特許出願PCT/AU03/01111に記載されている］の中のペチュニアF3'5'H（petHf1）cDNAクローンを放出させた。突出末端を修復し、直鎖化されたプラスミドを、RE XbaIによりさらに消化した。AmCHS 5'配列およびpetD8 3'配列を含むベクターを含有しているおよそ4.9kbの断片を精製し、プラスミドpCGP1999（サルビアF3'5'H#47 cDNAクローンを含有している、国際特許出願PCT/AU03/01111に記載されている）由来のおよそ1.6kbのXhoI/EcoRI断片の修復された末端とライゲートさせ、プラスミドpCGP2117を作製した。
【０１４６】
中間プラスミドpCGP2122（AmCHS 5':salvia F3'5'H#47:petD8 3';35S:SuRB）の構築
プラスミドpCGP2122は、35S 5':SuRB選択可能マーカー遺伝子に対してタンデムにAmCHS 5':salvia F3'5'H#47:petD8 3'発現カセットを含有している。
【０１４７】
まず、プラスミドpCGP2117（上記）を、RE NotIによる消化により直鎖化した。直鎖化されたプラスミドの末端を修復し、次いで、AmCHS 5':salvia F3'5'H#47:petD8 3'カセットをRE EcoRVによる消化により放出させた。次いで、およそ3.6kbの精製された断片を、プラスミドpCGP1988（国際特許出願PCT/AU03/01111に記載されている）の修復されたAsp718末端とライゲートさせた。所望の方向での断片のライゲーションの成功を、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。得られたプラスミドをpCGP2122と名付けた。
【０１４８】
中間プラスミドpCGP2438の構築
構築物pCGP2438は、AmCHS 5':SalviaF3'5'H#47:petD8 3'カセット、carnANS 5':BPF3'5'H#18:carnANS 3'カセット、および35S 5':SuRBカセットを含有している。
【０１４９】
pCGP2150（上記）に含有されていたcarnANS 5':BPF3'5'H#18:carnANS 3'カセットを、RE ClaIによる消化により放出させた。断片を単離し、精製し、pCGP2122（AmCHS:SalviaF3'5'H#47:petD8 3'カセットおよび35S 5':SuRBカセットを含有している）［上記］のSalI「T充填」末端とライゲートさせた。所望の方向での断片のライゲーションの成功を、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。得られたプラスミドをpCGP2438と名付けた。
【０１５０】
形質転換ベクターpCGP2442の構築
形質転換ベクターpCGP2442は、Pet gen DFRに対してタンデムのキメラAmCHS:Salvia F3'5'H#47:petD8 3'遺伝子、ならびにcarnANS 5':BPF3'5'H#18:carnANS 3'遺伝子および35S 5':SuRB選択可能マーカー遺伝子を含有している。
【０１５１】
プラスミドpCGP2300（上記）由来のPet gen DFRクローンを、RE AscIによる消化により放出させた。次いで、精製された5.3kbの断片を、プラスミドpCGP2438（上記）のAscI末端とライゲートさせた。所望の方向での断片のライゲーションの成功を、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析により確立した。得られた形質転換ベクターをpCGP2442（図2）と名付けた。
【０１５２】
（表５）pCGP2442に含有されていたキメラF3'5'H遺伝子およびDFR遺伝子
0005500556.tif 000008
【０１５３】
形質転換ベクターpCGP2442のT-DNA内に含有されている二つのキメラF3'5'H遺伝子および一つのDFR遺伝子を、アグロバクテリウムにより媒介される形質転換を介して、スプレーカーネーション品種コルチナチャネルへ導入した。
【０１５４】
作製された74のトランスジェニック系統のうち、8つが、色の有意なシフト（RHSCC 71A、71C、72A、81A、86A、87A；表6を参照のこと）の花を生じた。これらの系統のHPLC分析により、30〜94％のデルフィニジンが明らかにされた（最高で非乾燥組織重量1グラム当たり3.4gのデルフィニジン）。しかしながら、8つのうち3つの系統（19890、19907、および19898）［表6］のみが、スミレ色、紫色／スミレ色範囲へと色がシフトした花を生じ、スプレーカーネーション（コルチナチャネル）背景における商業的に有益な新規の表現型を表した。
【０１５５】
（表６）トランスジェニックコルチナチャネル系統および花弁舷部のRHSカラーコード
0005500556.tif 000009
【０１５６】
表現型の説明
19890および19907と名付けられた二つのトランスジェニックスプレーカーネーション品種の表現型をさらに調査した。親系統および二つのトランスジェニック系統の花の色は、図3〜5に示される。系統19890および19907は、花の形態学的局面においては親と本質的に類似していたが（表7）、トランスジェニック系統の新しい表現型である、花の花糸および葯における色素の蓄積によって、さらに親と区別され得た。両トランスジェニック系統のいくつかの花柱および葯も、薄紫色への色のシフトを有していたが、親系統の花の花柱および葯は淡黄白色であった（図5）。
【０１５７】
（表７）花測定の概要（平均値）
0005500556.tif 000010
【０１５８】
その他のカーネーション品種への形質転換ベクターpCGP2442の導入
二つのキメラF3'5'H遺伝子および一つのDFR遺伝子を使用して、カーネーション品種コルチナチャネルにおいて、多量のデルフィニジンを得ることに成功したため、同遺伝子を、クリームシンデレラ、シンデレラ、セリースウェストパール、ベガ、アーティサン、ランデブーのような（これらに限定はされない）その他のカーネーション品種へ導入した。
【０１５９】
トランスジェニック植物を上記のように花色について査定し、（対照と比較して）新規の花色を有する系統を商業化のために選択する。
【０１６０】
二つのF3'5'H遺伝子および一つのDFR遺伝子のキクへの導入
キクにおいて機能性の発現カセットに基づく構築物を調製する。
【０１６１】
一例は、RoseCHS:BPF3'5'H#18:nosおよび／またはゲノムシネラリアF3'5'H遺伝子および／またはcarnANS 5':BPF3'5'H#18:carnANS 3'のような二つのF3'5'H遺伝子、ならびにゲノムペチュニアDFR遺伝子（自己のプロモーターおよびターミネーターの制御下にある）［上記］の使用を含みうる。
【０１６２】
キクの形質転換は、国際特許出願PCT/US91/05805、米国特許第251,392号（米国登録5,567,599）に記載されるようにして、または当技術分野において周知のその他の方法により達成される。例えば、Aida et al,Breeding Science,54:51-58,2004；Dolgov et al,Acta Hort 447:329-334,1997、Toguri et al,Plant Biotechnology,20:121-127,2003、Ledger et al,Plant Cell Reports,10:195-199,1991。
【０１６３】
例えば、形質転換ベクターpCGP3440は、ゲノムシネラリアF3'5'H遺伝子（自己のプロモーターおよびターミネーターの制御下にある）［SEQ ID NO:9］およびゲノムペチュニアDFR遺伝子（自己のプロモーターおよびターミネーターの制御下にある）［SEQ ID NO:5］（上記）と共にキメラRoseCHS 5':BPF3'5'H#18:nos 3'遺伝子（国際特許出願PCT/AU03/0111に記載されている）を含有している。
【０１６４】
形質転換ベクターpCGP3440に含有されている二つのF3'5'H遺伝子およびDFR遺伝子を、キク栽培品種インプルーブドリーガン（Improved Reagan）へ導入した。
【０１６５】
全部で52のトランスジェニック植物を土壌に送った。植物に顕花させ、ピンク色からスミレ色／紫色／青色への色のシフトに基づき、選択を行う。上記のように、デルフィニジン量を測定する。
【０１６６】
二つのF3'5'H遺伝子および一つのDFR遺伝子のバラへの導入
バラにおいて機能性の発現カセットに基づく構築物を調製する。国際特許出願PCT/AU03/01111および国際特許出願PCT/JP2004/011958を参照のこと。
【０１６７】
一例は、（国際特許出願PCT/AU03/01111に記載されたような）CaMV 35S:BPF3'5'H#18:ocs 3'および／またはCaMV 35S:BPF3'5'H#40:ocs 3'および／またはCaMV 35S:SalviaF3'5'H#47:ocs 3'のような二つのF3'5'H遺伝子、ならびに（国際特許出願PCT/JP2004/011958に記載されたような）CaMV 35S:iris DFR:ocs 3'のようなバラにおいて機能性のDFRの使用を含むであろう。
【０１６８】
バラの形質転換は、国際特許出願PCT/JP2004/011958、もしくは国際特許出願PCT/US91/04412、もしくはRobinsonおよびFiroozabady（Scientia Horticulturae,55:83-99,1993）、Routら（Scientia Horticulturae,81:201-238,1999）、もしくはMarchantら（Molecular Breeding 4:187-194,1998）に記載されたようにして、または当技術分野において周知のその他の方法により達成される。
【０１６９】
二つのF3'5'H遺伝子および一つのDFR遺伝子のその他の花作物への導入
pCGP2442またはその機能的等価物を、変更された花部を有する遺伝子改変植物を作製するために使用する。選択された植物には、コルチナ、ロイヤルレッドコルチナ、セリースコルチナ、およびダスティコルチナのような他のカーネーション系統が含まれる。非カーネーション植物には、キク、バラ、ガーベラ、およびトルコギキョウ、ユリ、ゲラニウム、トレニア、ベゴニア、シクラメン、ニーレンベルギア、カタランタス、ペラルゴニウム、ラン、ブドウ、リンゴ、ユーフォルビア、またはフクシアのような（これらに限定はされない）その他の観賞植物または園芸植物が含まれる。
【０１７０】
植物を形質転換し再生させるために使用される方法は、本明細書またはScientia Horticulturae:Transformation of Horticultural Crops,55(eds,Germing and Reid)Elsevier,Amsterdam,1993、Deroles et al,In Biotechnology of Ornamental Plants(eds,Geneve,Preece and Markle),CAB International,Wallingford,87-119,1997、Tanaka et al,2005（前記）に記載されたようなものである。遺伝子改変植物の子孫は、少なくとも二つのF3'5'H酵素および少なくとも一つのDFRを発現することができる。色変化には、（RHSカラーチャートによる）赤紫色、紫色、紫スミレ色、スミレ色、スミレ青色、および青色が含まれる。花は植物から切断され、販売のため包装され得る。
【０１７１】
当業者は、本明細書に記載された本発明が、具体的に記載されたもの以外の変動および改変を受け入れることを認識するであろう。本発明には、そのような変動および改変が全て含まれることが理解されるべきである。本発明には、個々にまたは集団的に本明細書において言及された工程、特色、組成物、および化合物の全て、ならびに該工程または特色の二つ以上の任意の全ての組み合わせも含まれる。
【０１７２】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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