(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）のアミノ酸配列またはＴＩＭＰの生物活性断片であって且つ活性マトリックスメタロプロテイナーゼを阻害する断片のアミノ酸配列を含み、該ＴＩＭＰまたは生物活性断片が、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーに連結されている融合構築物（ＴＩＭＰ−ＧＰＩ）の、瘢痕の形成を予防または阻害するための被験体の皮膚病変の処置薬の調製のための使用。
【請求項２】
前記ＴＩＭＰが、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、またはＴＩＭＰ−４からなる群より選択される、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記ＴＩＭＰがヒトＴＩＭＰ−１である、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
前記融合構築物が、ＧＰＩアンカリングを方向づけるための１つまたは複数のＧＰＩシグナル配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の使用。
【請求項５】
前記ＧＰＩアンカーがリンパ球機能関連抗原（ＬＦＡ−３）またはその部分に由来している、請求項１〜４のいずれか一項記載の使用。
【請求項６】
前記融合構築物が、０．５〜５μｇ／ｍｌの濃度で投与される、請求項１〜５のいずれか一項記載の使用。
【請求項７】
前記融合構築物が、１μｇ／ｍｌの濃度で投与される、請求項６記載の使用。
【請求項８】
前記瘢痕が肥厚性瘢痕またはケロイド形成である、請求項１〜７のいずれか一項記載の使用。
【請求項９】
前記融合構築物が界面活性剤、密閉剤、または担体物質と共に用いられる、請求項１〜８のいずれか一項記載の使用。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項で定義された融合構築物を含有する、瘢痕の形成を予防または阻害するための被験体の皮膚病変の処置薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、融合構築物、癌の処置のための当該融合構築物の使用、および再生医療における当該融合構築物の使用の分野に関する。具体的には、本発明は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型メタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）を含む構築物に関する。加えて、本発明の融合構築物は、創傷治癒適用の分野において有用な効果的再生剤である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌研究におけるＴＩＭＰ
癌の治療は困難な課題のままであり、異なる治療的アプローチおよびストラテジーを用いて、様々な成功度合いを示している。１つの公知のアプローチは、癌細胞の免疫媒介性溶解に対する感受性を増加させることである。腫瘍の免疫媒介性溶解に対する感受性は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の生物学、および特に、腫瘍標的細胞によるＭＭＰの細胞表面発現に結びつけられている。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分を分解し、組織リモデリング、組織浸潤、および転移に関与している（Egeblad & Werb, 2002; Itoh & Nagase, 2002）。ＭＭＰ活性はまた、パーフォリン／グランザイム媒介性およびＦＡＳ媒介性アポトーシスの両方の効率に関連している（Egeblad & Werb, 2002に概説されている）。ＭＭＰ活性が、４種の内因性インヒビター、すなわちマトリックスメタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、およびＴＩＭＰ−４（Bode & Maskos, 2003））を含む多くのレベルで制御されることが示された。ＭＭＰとＴＩＭＰの間のインビボのバランスが、マトリックス再吸収とマトリックス沈着のいずれが起こるかを決定する（Nagase & Woessner, 1999）。
【０００３】
内因性メタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）は、腫瘍増殖、転移、およびアポトーシスの緩和を含む多様な生理学的/生物学的機能を示す。ＴＩＭＰのこれらの多様な生物活性は、ＴＩＭＰ／ＭＭＰ／細胞表面タンパク質相互作用の化学量論に一部結びつけられている。細胞傷害性リンパ球の補充は、腫瘍に対する防御における１つの潜在的経路を表す。腫瘍細胞に浸潤し、認識する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が同定されているが、効果的な抗腫瘍免疫は、しばしば、効率的には発生しない。この無効力が、疾患の進行期あるいは局所的手術不能による不完全な外科切除後の残存腫瘍細胞の完全排除を妨げる１つの理由である。細胞傷害性リンパ球におけるこの機能的欠損の原因は現在、明らかではない。
【０００４】
一般に、ＣＴＬおよびＮＫ細胞の抗腫瘍効果は、パーフォリン／グランザイム媒介性またはＦＡＳ媒介性（ＣＤ９５／ＣＳＤ９５Ｌ）アポトーシス経路のいずれかを通して媒介される（Kagi et al., 1994）。パーフォリン経路は、標的細胞のＣＴＬまたはＮＫ認識中に分泌される細胞毒により媒介される（Kagi et al., 1994）。ＣＤ９５、またはＦＡＳデスレセプターは、タンパク質の細胞死ファミリーの制御因子に属し、腫瘍細胞の免疫媒介性アポトーシスにおいて中心的な重要性をもつ（Nagata, 1999）。ヒトＦＡＳ／ＣＤ９５／Ａｐｏ−１は、１回膜貫通糖タンパク質受容体（３２５アミノ酸、４５〜４８ｋＤａ）である。ＦＡＳリガンド（ＦＡＳリガンド、ＦＡＳＬ、ＣＤ９５Ｌ）は、複合的な膜タンパク質であり、ＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＦＡＳＬは、ＴＮＦα、リンフォトキシン（ＬＴ）のα鎖およびβ鎖、ＣＤ４０リガンド、ならびにＣＤ３０リガンドを含むＴＮＦファミリーのメンバーである。ＦＡＳの作用は、ＦＡＤＤ（ＦＡＳ関連デスドメイン）／ＭＯＲＴ１（そのＣ末端にデスドメインを有し、ＦＡＳの細胞質デスドメインに結合するアダプタータンパク質）を介して媒介される。多くの腫瘍は、ＦＡＳ経路を通して媒介されるアポトーシスに抵抗性であることが見出されている（Frost et al., 2003；Igney & Krammer, 2002に概説されている）。
【０００５】
本発明のＴＩＭＰ−ＧＰＩ構築物を試験するためのモデル系として、腎細胞癌の細胞系が例として用いられている。腎細胞癌（ＲＣＣ）は、癌の主要原因の第７位である。ＲＣＣを有する患者の約３分の１が診察時に転移性疾患に罹っており、最高５０％まで腎摘出術後、再発する（Vogelzang & Stadler, 1998）。ＲＣＣは治療が難しく、インターフェロン−αおよびインターロイキン−２のような免疫学的治療が、一般的に、化学療法または放射線療法より効果的である（Vogelzang & Stadler, 1998）。細胞傷害性リンパ球は、ＲＣＣを含む腫瘍に対する防御における潜在的成分を代表する。
【０００６】
ＴＩＭＰファミリーの１つのメンバーであるＴＩＭＰ−１は、幅広く作用するＭＭＰインヒビターである（Bode & Maskos, 2003）。それは、表面結合タンパク質との会合を通してのみ細胞表面上に検出されうる可溶性タンパク質である（Brew et al., 2000; Klier et al., 2001）。癌生物学におけるＴＩＭＰ−１の全体的役割は、依然として矛盾した報告の主題である（Brand, 2002）。現在までのところ、ＴＩＭＰ−１が、血管新生、細胞遊走、および増殖に役割を果たすことが認められている（Brand, 2002）。最近、ＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰ−１タンパク質がｂＦＧＦに応答して内皮細胞遊走を顕著に抑制することが示された（Djafarzaden R et al., 2004）。
【０００７】
癌治療のための通常のストラテジーおよびアプローチは、いったん腫瘍が発生するとその腫瘍細胞は排除が難しいという問題に未だ悩まされている。原発腫瘍は、通常、手術により患者から除去される。しかしながら、場合によっては、すべての領域に外科医が応じられるとは限らず、従って、腫瘍細胞は身体に残存し、そこでそれらは二次腫瘍へ発展しうる。これは、原発腫瘍の不完全な外科切除の結果である。
【０００８】
そこで、本発明は、個体において、特に、原発腫瘍の不完全な外科切除を受けた患者において、腫瘍細胞の増殖を低下または緩和するための効果的な抗癌剤およびストラテジーを提供する。本発明の抗癌剤は、インビトロでの細胞系およびインビボでの組織の両方において腫瘍細胞を死滅させるのに有用である。
【０００９】
再生医療におけるＴＩＭＰの役割
本発明は、さらに、再生医療の分野において有用である。再生医療の分野における１つの重要な領域は、創傷治癒過程に関係している。創傷治癒は、組織傷害に対する自然の回復応答に関し、最終的に傷害組織の再表面形成、再構成、および抗張力の回復を生じる細胞的事象の複雑なカスケードを含む。この過程は、一般的に、異なる細胞型の補充および増殖、細胞マトリックスの同化、ならびに免疫監視の増加に関与する。
【００１０】
創傷治癒は、適時かつ連続的な様式で進行し、４つの一般的な段階、すなわち、炎症、肉芽形成、再上皮化、および組織リモデリング、に分けることができる。創傷治癒過程の各段階は、特別のシグナル伝達経路により制御される。創傷治癒の間、増殖因子およびサイトカインの発現が増加し、特に、ＴＮＦ、ＩＬ−１、およびＩＬ−６のレベルが増加することが報告されている。最初の炎症段階はエフェクタータンパク質ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、およびＣＳＦが関与するものであり、この段階でマクロファージと好中球の両方が補充され、フィブリン塊が形成される。肉芽形成段階では、線維芽細胞が、増殖し、創傷へ遊走し、そしてＥＣＭを分泌する。この後者の段階に関与するエフェクタータンパク質としては、ＭＭＰ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、およびＶＥＧＦが挙げられる。創傷治癒における第三の段階である再上皮化は、創傷へ遊走するケラチノサイトの増殖によって特徴付けられ、また、創傷収縮の原因である筋線維芽細胞の増加によっても特徴付けられる。この段階はエフェクタータンパク質ＭＭＰ、ＫＧＦ、ＴＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ｕＰＡおよびｔＰＡが関与するものであり、結果として、創傷表面の再上皮化、乾燥痂皮の解離、およびバリアの形成が生じる。最後の組織リモデリング段階では、線維芽細胞が、瘢痕組織の形成、線維芽細胞のアポトーシス、およびケラチノサイトの活性化から分化への切り換えへ導くコラーゲン性マトリックスを産生する。この最後の段階に関与する既知のエフェクタータンパク質としては、ＴＧＦ−ｂ１、ＭＭＰ、およびＴＩＭＰが挙げられる。
【００１１】
従って、創傷治癒のほとんどの局面に関与するエフェクター細胞は線維芽細胞とケラチノサイトであり、瘢痕形成に加えて線維芽細胞（ＭＭＰ−１、−２、−３、および−１３）とケラチノサイト（ＭＭＰ−１、−２、−３、および−１０）の両方の遊走に重要な役割を果たすＭＭＰ（Singer & Clark, 1999）も関与する。ＭＭＰのそれぞれは、ＥＣＭ内において異なる基質特異性を有し、ＥＣＭ分解およびターンオーバーに重要な役割を果たす。ＭＭＰファミリーには、とりわけ、コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１８）、ストロメライシン（ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１）、ゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９）、マトリライシン（ＭＭＰ−７）、メタロエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）、および一連の膜結合型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）が含まれる。ＭＭＰの機能は、周囲のＥＣＭをタンパク分解的に破壊することであるため、創傷治癒、すなわち傷害組織の再構築中の当該プロテアーゼ活性とＥＣＭ沈着との間のバランスは、最適に維持されることが必要である。ＭＭＰ活性の制御はＴＩＭＰタンパク質により調節されるが、それらはたいていの細胞により産生され、１：１の比でＭＭＰを阻害するように作用する。タンパク分解的な破壊とＥＣＭ沈着との間のこの繊細なバランスが妨害される場合、異常な創傷治癒のような障害、例えば、慢性創傷、過剰瘢痕化、またはケロイド瘢痕化、が結果として生じうる。
【００１２】
それゆえに、創傷治癒過程中、プロテアーゼ活性とＥＣＭ沈着との間の生理学的バランスを制御する、または生理学的バランスに影響を及ぼす必要性が存在する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明の融合構築物は、増加したＭＭＰレベルと一般に関連している、例えばケロイド瘢痕化または慢性創傷における、ＭＭＰプロテアーゼ活性とＥＣＭ沈着との間のバランスの妨害により定義される状態の処置に効果的な再生剤を提供する。加えて、本発明の融合構築物は、創傷治癒過程中の瘢痕の形成を低下、最小化、または阻害するのに効果的な再生剤を提供する。
【発明の開示】
【００１４】
発明の概要
本発明は、新規な抗腫瘍剤および癌の処置のための方法を提供する。
【００１５】
本発明は、ＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰが、効果的に癌細胞増殖を低下または緩和する、ならびに、インビトロとインビボの両方の細胞系における癌細胞の死滅を促進する、という驚くべき知見に基づいている。極めて効果的な化学療法剤を生み出すために、ＴＩＭＰの構造的および機能的決定基とグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーとを（および任意でムチンとを）結合した。このアプローチでは、精製されて癌細胞に加えられた場合に表面膜に組み入れられる、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）にアンカーされた（繋ぎとめられた）ＴＩＭＰタンパク質を利用する。ＴＩＭＰ−ＧＰＩとムチンドメインとを融合すると、表面細胞膜上でのＴＩＭＰタンパク質の提示がさらに増強され、当該融合構築物は、癌細胞を免疫媒介性破壊に対して感受性とするのにより効果的なものとなる。
【００１６】
以下の実施例では、インビトロの細胞系およびインビボの組織の両方において、ＴＩＭＰが腫瘍細胞の増殖を阻害し、腫瘍発生を低下させる可能性を有することが実証されている。ＴＩＭＰをＧＰＩアンカーに連結したＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰを外因的に投与すると、ＴＩＭＰタンパク質が癌細胞の細胞膜へ効率的に挿入される。ＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰ−１が癌細胞表面に発現することで、ＦＡＳ媒介性アポトーシス経路を誘導するような可能性のある治療的関連性を有する種々の生物学的効果が癌細胞に誘導された。以下の実施例で示すように、前記した癌細胞の増殖抑制は用量依存的であることが認められた。
【００１７】
ＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰ−１タンパク質はまた、プロＭＭＰ−２およびプロＭＭＰ−９の分泌を遮断し、多様なＭＭＰの細胞表面会合を劇的に変化させた。最も重要なことには、通常はＦＡＳ−アポトーシス抵抗性である腫瘍細胞系が、ＦＡＳ／ＣＤ９５媒介性の死滅に対して感受性となった。ＧＰＩ−ＴＩＭＰによる処置は、抗アポトーシス性ＢＣＬ２タンパク質の下方制御と、それに対応するアポトーシス促進性ＢＡＸタンパク質の増加をもたらす。このようなアポトーシス促進性タンパク質のより高濃度へのシフトは、ＴＩＭＰでその表面を設計された癌細胞のＦＡＳ媒介性アポトーシスに対する感受性を増加させる要因の１つでありうる。
【００１８】
上記アプローチを用いて、原発腫瘍の不完全な外科切除後の残存癌の処置における治療的適用に本発明のＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰタンパク質またはポリペプチドが特に有用であることが証明されている。
【００１９】
さらに、腎細胞癌（ＲＣＣ）を含む腫瘍細胞は本質的にＦＡＳ媒介性死滅に抵抗性であるため、本発明は、腫瘍細胞をＦＡＳ媒介性アポトーシスの影響を受けやすいものとするための効果的な手段を提供する。
【００２０】
第一の様相において、本発明は、メタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）のアミノ酸配列またはその生物活性断片を含む融合構築物（ＴＩＭＰ−ＧＰＩまたはＴＩＭＰ−ムチン−ＧＰＩ）であって、該ＴＩＭＰまたはその生物活性断片が、後にグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーのアミノ酸配列が続くムチンドメインのアミノ酸配列に連結されている、融合構築物、に関する。
【００２１】
好ましい態様において、ＴＩＭＰの３’末端は、ＧＰＩ連結配列へ直接的に融合しており、かつムチンドメインを含まない。
【００２２】
「ムチン」という用語は、大きな、高度にグリコシル化されたタンパク質のファミリーに関連する。ムチンの１つのクラスは、原形質膜における保持に有利に働く疎水性膜貫通ドメインの存在による膜結合型であるが、ムチンのもう１つのクラスは、粘膜表面上に分泌される。ムチン遺伝子はムチン単量体をコードしており、ムチン単量体は棒形アポムチンのコアとして代表的に合成され、棒形アポムチンのコアは非常に豊富なグリコシル化によって翻訳後修飾される。２つの明確に異なる領域が成熟ムチンに見出される。１つの領域は、アミノ末端およびカルボキシ末端領域を含み、それらは低度にグリコシル化されているがシステイン残基が豊富であり、当該システイン残基はムチン単量体内およびムチン単量体間のジスルフィド結合に関与すると考えられる。第二の中央領域は、１０〜８０残基配列の複数のタンデムリピートの形をなし、アミノ酸残基の過半数はセリンまたはトレオニンである。
【００２３】
一般に、ムチンは、おおよそ百万〜１千万ダルトンの分子量を有するタンパク質の巨大な凝集体として分泌される。これらの凝集体内において、単量体は、ほとんど非共有結合性相互作用によって互いに連結しているが、分子間ジスルフィド結合もこの過程で役割を果たしうる。ＭＵＣ１，２，３Ａ，３Ｂ，４，５ＡＣ，５Ｂ，６〜９，１１〜１３，１５〜１９を含む少なくとも１９個のヒトムチン遺伝子が識別されている。
【００２４】
本発明に用いられる場合のムチンは、好ましくは膜結合型ムチンドメインであり、好ましくは、ＭＵＣ１、ＭＵＣ３Ａ、ＭＵＣ３Ｂ、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１１、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１６、およびＭＵＣ１７、またはそれらの変種もしくは部分からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む（上記ムチンはMoniaux N et al., 2004に概説されている）。他の好ましい態様において、表面会合型ケモカインＣＸＣＬ１６またはフラクタルカイン（ＣＸ３ＣＬ１）から単離されるムチンストーク（mucin stalk）が用いられる。
【００２５】
フラクタルカインは、大きく複雑なケモカイン遺伝子スーパーファミリーのメンバーであり、主に分泌型炎症促進性分子からなる。ケモカインの典型的なコア構造は、位置的に保存されたシステイン残基間のジスルフィド結合により部分的に維持される。ケモカインペプチドの大部分について、よく知られた構造的特徴は、分子内の４つのシステインの分布、すなわち、システインシグネチャーモチーフ：ＣＸＣ、ＣＣ、およびＣ（Ｃはシステインであり、Ｘは任意のアミノ酸残基である）である。４つの異なるケモカインファミリーは、ケモカインペプチドがその分子のＮ末端近くに位置するシステイン残基の構成により区別されうるという観察に基づいて同定されている。フラクタルカイン自身は、ケモカインファミリーの１つと定義され、フラクタルカインのＮ末端システインが３つの残基によって隔てられていること（すなわち、ＣＸ３Ｃモチーフ）と、ムチン様ドメインまたはムチン様ストークを含む広範なＣ末端膜貫通アンカーにより細胞膜へ繋ぎとめられることから、他のケモカインファミリーとは構造的に区別される。従って、本発明の融合構築物内に含まれるムチンおよびフラクタルカインドメインは、細胞膜におけるＴＩＭＰタンパク質のアンカリング（繋ぎとめ）の向上を達成するのに適している。
【００２６】
本発明に用いられるＴＩＭＰは、哺乳動物由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい（４つのＴＩＭＰはMannello F et al., 2001に概説されている）。本発明で使用可能なＴＩＭＰタンパク質の例は、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、またはＴＩＭＰ−４、ならびにマウス、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、およびウシのような他の生物体におけるそれらの対応する変種を含む。
【００２７】
本発明に用いられるＧＰＩアンカーは、好ましくはリンパ球機能関連抗原（ＬＦＡ−３）またはその部分由来であり、膜会合を媒介するＧＰＩ−シグナル配列を含む。
【００２８】
本発明はまた、本発明のＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰ構築物をコードする核酸配列を含む、ＲＮＡまたはＤＮＡのような核酸分子に関する。
【００２９】
本発明の他の様相において、本発明の核酸分子は、本発明の核酸分子の発現のための発現プラスミド、ベクター、または宿主細胞内に含まれている。
【００３０】
本発明はまた、癌、特に、原発腫瘍の外科切除後の残存癌の処置のための本発明のＴＩＭＰ−ＧＰＩまたはＴＩＭＰ−ムチン−ＧＰＩ融合構築物の使用に関する。
【００３１】
本発明の他の様相において、本発明のＴＩＭＰ−ＧＰＩまたはＴＩＭＰ−ムチン−ＧＰＩ融合構築物は、薬学的組成物または医薬に含まれる。他の態様において、本発明のＴＩＭＰ−ＧＰＩまたはＴＩＭＰ−ムチン−ＧＰＩ融合構築物は、抗癌剤または抗癌薬として適切に用いられる。好ましい態様において、本発明の抗癌薬は、残存癌細胞および局所的再発の発生率増加の高リスクをもつ高リスク腫瘍患者において、ならびに進行期疾患または局所的手術不能による明らかな残存腫瘍を有する患者において、腫瘤切除側へ局所的に投与および適用される。好ましくは、融合構築物は、創傷への噴霧、および/または手術が有効ではない領域への注入により投与される。
【００３２】
本発明はまた、有効量のＴＩＭＰ−ムチン−ＧＰＩ融合構築物またはＴＩＭＰ−ＧＰＩ融合構築物に癌細胞系を曝す工程を含む、インビトロでの癌細胞増殖阻害方法に関する。
【００３３】
他の態様において、本発明は、結果として異常な創傷治癒を生じる正常な生理学的ＭＭＰプロテアーゼ活性とＥＣＭ沈着との間のバランスの妨害により定義される状態の処置のための新規の薬剤と方法を提供する。１つの態様において、本発明は、ＭＭＰレベルの増加と一般に関連しているケロイドまたは肥厚性瘢痕化および慢性創傷の処置に適した薬剤と方法を提供する。さらに、本発明はまた、創傷治癒過程中における瘢痕の形成を低下、最小化、または阻害するのに効果的な薬剤と方法を提供する。
【００３４】
定義
本明細書に用いられる場合の「ＴＩＭＰ」という用語は、メタロプロテイナーゼの内因性組織インヒビターを意味し、それは、活性マトリックスメタロプロテイナーゼの阻害、プロＭＭＰ活性化の制御、細胞増殖、および血管新生の調節を含む生理学的／生物学的機能に関与することが知られている。ヒト「ＴＩＭＰファミリー」は、４つのメンバー、すなわちＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、およびＴＩＭＰ−４を含む。本発明で用いられる１つの好ましいメンバーであるＴＩＭＰ−１は、その表面タンパク質との相互作用を通して細胞表面上に検出されうる分泌性タンパク質である（Bode & Maskos, 2003）。
【００３５】
本明細書に用いられる場合の「融合構築物」または「ＴＩＭＰ融合構築物」という用語は、核酸分子と、その核酸分子にコードされるアミノ酸分子の両方を指す。
【００３６】
本発明は、具体的には、配列番号１〜５により定義される配列を含むヌクレオチド配列を含む核酸、その相同体、またはその固有の断片に関する。本発明において、その結果として生じるタンパク質をコードする核酸分子の配列は、第一核酸分子のヌクレオチド配列が、第二核酸分子の配列と少なくとも約７０％相同、好ましくは少なくとも約８０％相同、より好ましくは少なくとも約９０％相同である場合には、第二核酸分子と相同であるとみなされる。２つの核酸配列間の相同性は、公知のＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（Altschul, et al., 1990）を初期設定で用いることで容易に決定できる。別の例として、２つの核酸配列の相同性を確かめるための他の公知の試験は、通常のハイブリダイゼーション条件下で、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、それらがハイブリダイズするかどうかである。
【００３７】
本明細書に開示された核酸配列を考慮すれば、当業者は、様々な型の適用において特定の機能を有する核酸構造を容易に設計することができる。例えば、当業者は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、修復連鎖反応（Repair Chain Reaction）（ＲＣＲ）、ＰＣＲオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＰＣＲ−ＯＬＡ）などのような核酸増幅手段においてプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを構築することができる。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのようなハイブリダイゼーション研究においてプローブとして有用なオリゴヌクレオチドが構築されうる。そのようなプローブに放射性同位元素、蛍光タグ、酵素、および結合部分（例えば、ビオチン）で標識するための多数の方法が知られており、従って、本発明のプローブは、簡単な検出性に対して容易に適応できる。
【００３８】
オリゴヌクレオチドはまた、他の目的のために設計および製造されうる。例えば、本発明は、構造／機能相関の研究に用いるアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび三重鎖形成性オリゴヌクレオチドの設計を可能にする。相同組換えは、ターゲティング手段として用いる本記載の核酸の適応により実行されうる。
【００３９】
本発明の核酸にコードされるタンパク質はさらに、機能的相同体を含む。下記のように、あるタンパク質が特定の機能について他のタンパク質と同じ機能を持つ場合には、そのタンパク質は当該他のタンパク質の機能的相同体とみなされる。相同体は、例えば、そのタンパク質の断片、またはそのタンパク質の置換、付加、もしくは欠失変異体でありうる。
【００４０】
２つのアミノ酸配列が実質的に相同であるかどうかの決定は、本発明の目的として、Pearson & Lipman (1988)によるＦＡＳＴＡ検索に基づいている。例えば、第一タンパク質のアミノ酸配列が、第二タンパク質の配列と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９５％の同一性を有する場合には、第一タンパク質のアミノ酸配列は第二タンパク質のアミノ酸配列と相同であるとみなされる。
【００４１】
配列における１つのアミノ酸を等価のアミノ酸と置換することの可能性はよく知られている。等価であることが知られたアミノ酸の群としては、以下のものが挙げられる：
（ａ）Ａｌａ（Ａ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）；
（ｂ）Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；
（ｃ）Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）；
（ｄ）Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｖａｌ（Ｖ）；および
（ｅ）Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｐ（Ｗ）
【００４２】
本発明の核酸にコードされるタンパク質が本明細書に記載された機能の基準を満たしている限り、アミノ酸配列における置換、付加、および／または欠失が生じていてもよい。他の配列と実質的に同じであるが、１もしくは複数の置換、付加、および／または欠失によって他の配列と区別されるアミノ酸配列は、等価の配列であるとみなされる。
【００４３】
本発明の核酸にコードされるタンパク質のアミノ酸配列において、置換、付加、または欠失されるアミノ酸残基の数は、当該配列におけるアミノ酸残基の数の好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、さらに好ましくは５％未満である。
【００４４】
本明細書に用いられる場合の「ＭＭＰ」という用語は、マトリックスメタロプロテイナーゼを意味し、それは、組織発生および分化、細胞浸潤、創傷治癒の間、ならびに免疫応答の調節剤として作用している少なくとも２６個の細胞外マトリックス分解性メタロエンドペプチダーゼに代表されるＭＭＰスーパーファミリーに属する。
【００４５】
本明細書に用いられる場合の「ＧＰＩ」という用語は、グリコイノシトールリン脂質、特に、Medof et al., 1996に記載されているようなグリコシルホスファチジルイノシトールを意味する。これらのリン脂質様アンカーは、タンパク質の機能に関係のない膜付着のための共通構造を有する。ＧＰＩアンカリングユニットは、ホスホエタノールアミン、３つのマンノース残基、およびイノシトールリン脂質に連結された非アセチル化グルコサミンを含む直鎖状グリカンで構成される。ＧＰＩ配列は、ＧＰＩアンカリングを方向づけるシグナルを含む。
【００４６】
本明細書に用いられる場合の「ムチン」または「ムチンドメイン」という用語は、膜結合型または非膜型糖タンパク質成分を意味する。通常、膜結合型ムチンは、脂質二重層におけるそれらのアンカリングに関与する疎水性配列または膜貫通ドメインを示し、任意的に、ムチン単量体のオリゴマー形成および分泌小胞へのパッケージングにおいて機能する１個または数個のフォンビルブラント因子様ドメインを含む。本明細書に用いられる場合の「ムチン」または「ムチンドメイン」という用語はまた、ムチンストークまたはムチン様ドメインを包含し、それらは、例えばＣＸＣＬ１６ケモカインもしくはフラクタルカイン（ＣＸ３ＣＬ１）に典型的に見出されるムチンストークのようなものである。
【００４７】
本明細書に用いられる場合の「ＴＩＭＰ−ＧＰＩ」融合構築物は、ＧＰＩ連結配列に直接的に融合しているＴＩＭＰに関する。ＴＩＭＰ−ＧＰＩ融合構築物は、内因性ＴＩＭＰ ３’−ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ末端配列の代わりに、天然のＧＰＩアンカー型タンパク質の３’−ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ末端配列（すなわち、ＧＰＩアンカリングを方向づけるシグナルを含む配列）を用いることにより設計される。
【００４８】
本明細書に用いられる場合の「ＴＩＭＰ−ムチン−ＧＰＩ」または「ＴＩＭＰ−ｍｕｃ−ＧＰＩ」は、後にＧＰＩ連結配列が続くムチンドメインに直接的に融合しているＴＩＭＰに関する。ＴＩＭＰ−ムチン−ＧＰＩ融合構築物は、ＴＩＭＰおよびＧＰＩのアミノ酸配列の間にムチンドメインのアミノ酸配列を含むこと以外、ＴＩＭＰ−ＧＰＩについて記載されているように設計される。同様に、「ＴＩＭＰ−フラクタルカイン−ＧＰＩ」または「ＴＩＭＰ−ｆｒａｃ−ＧＰＩ」は、後にＧＰＩ連結配列が続くフラクタルカインドメインに直接的に融合しているＴＩＭＰに関する。
【００４９】
「ＲＣＣ」という用語は腎細胞癌を意味し、それは、現行の化学療法剤および放射線療法に対する腫瘍抵抗性によって治療法の選択肢が制限された進行性腫瘍であると考えられている。ＲＣＣは、ＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰの抗腫瘍活性を示す本発明のモデル系としての役割を果たす。本発明に用いられるモデル細胞系は、病期Ｉ期およびＩＶ期の細胞癌を有する患者から樹立されたＲＣＣ−２６およびＲＣＣ−５３細胞系である。
【００５０】
「ＦＡＳ」という用語は、腫瘍壊死因子／神経成長因子受容体ファミリーのメンバーを意味し、それはＴＮＦ−αと無関係にアポトーシスを誘導する。本技術分野で知られているＦＡＳについての他の略語は、Ａｐｏ１（＝アポトーシス誘導タンパク質１）およびＣＤ９５である。
【００５１】
「再生」という用語は、一般的に、外傷を負わされた或いは別の方法で傷つけられた組織の完全性を回復させることを指す。この用語は、創傷治癒、組織修復、ならびに生理学的傷害および組織損傷の確保が起こった場所で生じる他の型の回復活動を含みうる。
【００５２】
発明の詳細な説明
ＴＩＭＰファミリーおよび細胞表面のタンパク質工学（Protein Engineering）
メタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）サブファミリーの主要な細胞インヒビターとして知られており、異なるＭＭＰ膜に対する様々な程度の有効性と、異なる組織発現パターンおよび制御の様式を示す。ＴＩＭＰは、典型的には、可溶性のマトリックス結合型および細胞会合型ＭＭＰの活性を調節する。すべての４つの哺乳動物ＴＩＭＰは、多くの幅広い類似性を有するが、特有の構造的特徴、生化学的性質、および発現パターンを示し、各ＴＩＭＰが特定のインビボ機能を有することを示唆している。
【００５３】
ＴＩＭＰ−１タンパク質は、ＴＩＭＰファミリーの中で最も広く発現し、かつ研究されたメンバーである。ＴＩＭＰファミリーの他のメンバーとしては、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、およびＴＩＭＰ−４が挙げられる。ＴＩＭＰタンパク質は、天然のタンパク質立体構造に不可欠なジスルフィド結合を形成する一連の保存されたシステイン残基を含む共通の構造的特徴を共有するだけでなく（Brew et al., 2000）、幅広く重複する生物活性も有する。ＴＩＭＰタンパク質の保存されたＮ末端領域は、機能的な阻害活性に必要であるが、多岐にわたるＣ末端領域は、阻害の選択性、および作用物質のＭＭＰへの結合効率を調節すると考えられる（Maskos & Bode, 2003）。しかしながら、ＭＭＰインヒビターとして作用するそれらの能力は別として、様々なＴＩＭＰファミリーメンバーはまた、血管新生応答および炎症応答の調節に加えて増殖とアポトーシスの制御を含む、さらなる生物活性を示すことができる。
【００５４】
ＴＩＭＰ−１は、ほとんどのＭＭＰ（ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−１４を除く）を阻害することが見出されており、優先的には、ＭＭＰ−８を阻害する。ＴＩＭＰ−１は、様々な細胞種により産生および可溶形で分泌され、身体中に広く分布している。それは、２８．５ｋＤａの分子量をもつ広範にグリコシル化されたタンパク質である。ＴＩＭＰ−１はＭＭＰの活性型を阻害し、ＭＭＰ９のプロ型と複合体形成する。ＭＭＰ９と同様に、ＴＩＭＰ−１発現は多くの因子の影響を受ける。ＴＩＭＰ−１の合成の増加は、以下を含む幅広い種類の試薬によって引き起こされる：ＴＧＦβ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦｂ、ＰＭＡ、オールトランス型レチノイン酸（ＲＡ）、ＩＬ１、およびＩＬ１１。
【００５５】
ＴＩＭＰ−２は、様々な細胞種が発現している２１ｋＤａの糖タンパク質である。それは、潜在性ＭＭＰと活性型ＭＭＰのいずれとも、非共有結合性の化学量論的複合体を形成する。ＴＩＭＰ−２は、ＭＭＰ−２を優先的に阻害する。
【００５６】
ＴＩＭＰ−３は、典型的にはＥＣＭに結合しており、ＭＭＰ−１、−２、−３、−９、および−１３の活性を阻害する。ＴＩＭＰ−３は、ＴＩＭＰ−１との３０％のアミノ酸相同性、およびＴＩＭＰ−２との３８％の相同性を示す。ＴＩＭＰ−３は、形質転換細胞のＥＣＭからの脱離を促進すること、および細胞形質転換に関連した形態学的変化を加速することが示されている。
【００５７】
ＥＣＭへの高親和性結合のため、ＴＩＭＰ−３はＴＩＭＰの中でも独特である。ＴＩＭＰ−３は、形質転換細胞のＥＣＭからの脱離を促進すること、および細胞形質転換に関連した形態学的変化を加速することが示されている。ＴＩＭＰ−３はグルコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合ドメインを含み、それは、細胞表面との会合に関与すると考えられる６個のアミノ酸（Ｌｙｓ３０、Ｌｙｓ２６、Ｌｙｓ２２、Ｌｙｓ４２、Ａｒｇ２０、Ｌｙｓ４５）を有する。ＴＩＭＰ−３は、ＴＡＣＥ（ＴＮＦ−α変換酵素）を通常、阻害する唯一のＴＩＭＰである。ＴＡＣＥは可溶性ＴＮＦを放出し、かつＩＬ−６受容体のプロセシングに関与して創傷治癒過程において中心的役割を果たす他のメタロプロテアーゼである。
【００５８】
ＴＩＭＰ−４は、すべての既知のＭＭＰを阻害し、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−７を優先的に阻害する。ＴＩＭＰ４は、ＴＩＭＰ１との３７％のアミノ酸同一性、ならびにＴＩＭＰ２およびＴＩＭＰ３との５１％の相同性を示す。ＴＩＭＰ４は、主に心臓および脳組織において細胞外に分泌され、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）恒常性に関して組織特異的様式で機能すると考えられている。
【００５９】
細胞表面のタンパク質工学は、細胞の表面タンパク質組成を遺伝子移入なしに操作できる潜在的に強力な技術である。対象となるタンパク質のカルボキシル末端領域の代わりに、ＧＰＩシグナルドメインを含むＧＰＩ連結タンパク質からのｍＲＮＡ由来ｃＤＮＡ配列を用いることにより、ＧＰＩ連結タンパク質をコードする融合構築物を作り出すことが可能である。
【００６０】
このアプローチは、より伝統的な遺伝子移入アプローチを超える多数の利点を提供する。例えば、この方法は、トランスフェクションすることが困難または不可能である細胞（例えば、一次微小血管内皮細胞、一次標的細胞など）に適用できる。細胞表面に加えられるタンパク質の量については、（ＦＡＣＳまたは免疫蛍光法により）調節および定量化することができる。さらに、複数のＧＰＩアンカー型タンパク質については、同じ細胞へ逐次的にまたは同時に挿入することができる。分子工学（molecular engineering）を通して、タンパク質精製および実験中の試薬のモニタリングの助けとなる付加的なエピトープタグを発現することが可能である。薬剤は腫瘍または腫瘍周囲領域へ直接的に注入することができ、腫瘍増殖における選択的白血球補充またはＦＡＳ誘導性アポトーシスへの効果を確認することができる。
【００６１】
癌の処置のためのＴＩＭＰ融合構築物
悪性腫瘍の予後は、ほとんど、腫瘍の臨床的および病理学的病期に依存する。たいていの癌腫（例えば、一次および二次腫瘍）は、ほとんどの場合、完全に外科的に除去できる。しかし、進行期癌を再切除することはしばしば不可能であり、それが疾患の早期再発および疾患関連死亡率の増加と関連している。
【００６２】
特に乳癌において、拡大した腫瘍サイズ（＞２ｃｍ）をもつ進行期疾患が、遠隔転移の発生および限られた生存と関連している。大きな腫瘍容積も残存癌の存在についての臨界パラメーターであると考えられ、残存癌は局所的再発および遠隔転移の伝播の高リスクも示す。同様に、グリア芽細胞腫（星状細胞腫悪性度ＩＶ）のような脳腫瘍も、考えられる他の腫瘍監視の標的である。それは、完全な外科切除がほとんどの場合不可能であり、かつ第一次手術の１年以内に局所的再発が全症例の９５％に生じているからである。
【００６３】
残存癌に関連する問題を解決するために、特に、不完全な外科切除後の残存癌の処置に有用な新規の癌治療法の選択肢を特定することが必要であった。
【００６４】
解決法として、本発明はＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰを提供する。ＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰは、切除端へ局所的に投与することで免疫細胞を引きつけることができ、残存腫瘍の監視を残存癌細胞に集中させることができる。
【００６５】
この目的のために、ＴＩＭＰタンパク質がＧＰＩでアンカーされ、それを精製して癌細胞に加えると、癌細胞の表面膜へ組み入れられて、完全に機能する。内因性３’−ｍＲＮＡ末端配列の代わりに、天然のＧＰＩアンカー型タンパク質の３’−ｍＲＮＡ末端配列（すなわち、ＧＰＩアンカリングを方向づけるシグナルを含む配列）を用いることにより、事実上、いかなるＴＩＭＰタンパク質もＧＰＩアンカー型誘導体として発現することができる。
【００６６】
本発明において、精製ＧＰＩ−ＴＩＭＰタンパク質の腫瘍細胞系の表面膜への組み入れは、精製ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、ＴＩＭＰ−１−ムチン−ＧＰＩ、または組換えヒト（ｒｈ）ＴＩＭＰ−１対照タンパク質と細胞系とのインキュベーションにより実証される。下記に詳述されているように、ＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰ−１の表面発現により、結果としてＴＩＭＰ−１についての強い表面シグナルを生じた。
【００６７】
本明細書に用いられる場合、「単離および／または精製された」という用語は、ＤＮＡまたはポリペプチド分子のインビトロでの単離であって、天然の細胞環境からの単離、および、核酸またはポリペプチドのような細胞の他の構成成分との会合物からの単離を指し、これにより配列決定、複製、および発現が可能となる。例えば、「単離されたＧＰＩ連結配列」は、連結配列の少なくとも一部分をコードする９個より多い、好ましくは３６個より多い、より好ましくは４５個もしくはそれ以上の連続したヌクレオチド塩基を含むＲＮＡまたはＤＮＡ、それらの変種、或いはそれらに相補的なＲＮＡまたはＤＮＡである。この相補的なＲＮＡまたはＤＮＡは、連結配列をコードするＲＮＡまたはＤＮＡに相補的で、本技術分野でよく知られた方法で定義されるストリンジェントな条件下で安定に結合を維持するものである。従って、当該ＲＮＡまたはＤＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡの天然源において通常、会合している少なくとも１つの混入核酸を含まない点において、ならびに、好ましくはいかなる他の哺乳動物ＲＮＡまたはＤＮＡも実質的に含まない点において、「単離」されている。
【００６８】
本明細書に用いられる場合、「組換え核酸」（例えば、「組換えＤＮＡ配列」）という用語は、単離された核酸（例えば、ＤＮＡ）であって、任意の適切な組織源（tissue source）に由来し、或いは該組織源から単離され、その後にインビトロで化学的に改変されていてもよい核酸を指し、その配列は天然には存在しないか、天然に存在する配列に相当するが、外因性ＤＮＡで形質転換されていないゲノム内で位置するであろう場所に位置しない。組織源に「由来する」ＤＮＡの例は、所定の生物体内で有用な断片であると同定されているＤＮＡ配列で、その後、本質的に純粋な形で化学合成されたものである。組織原から「単離された」ＤＮＡの例は、該組織源から化学的手段（例えば、制限エンドヌクレアーゼの使用）によって切り取られ、または取り出された有用なＤＮＡ配列であり、それにより、本発明に用いるために、遺伝子工学における公知の方法によってさらなる操作（例えば、増幅）を施こすことができるようになる。
【００６９】
異なる膜貫通配列を有し且つ特定の細胞質拡張部分に結合する従来のポリペプチドアンカーと違って、これらのリン脂質様アンカーは、タンパク質の機能に関係のない膜付着のための一般的な機構として共通構造を用いる。ＧＰＩアンカリングユニットは、ホスホエタノールアミン、３つのマンノース残基、およびイノシトールリン脂質に連結された非アセチル化グルコサミンを含む直鎖状グリカンで構成される。それらは、小胞体（ＥＲ）において組み立て式に合成され、ＥＲ膜を横断する転位の時点で、一次翻訳産物に付加される。該ＧＰＩ修飾産物は、その後、ＥＲおよびゴルジでグリコシル化され、続いて、細胞表面へ輸送される。
【００７０】
本発明で使用可能な好ましいＧＰＩ連結配列はＧＰＩアンカーに由来するものであり、ＧＰＩアンカーは、例えば、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、５’ヌクレオチダーゼ（ＣＯ７３）のような酵素；リンパ球機能関連抗原（ＬＦＡ−３；ＣＤ５８）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）のような接着分子；崩壊促進因子（ＤＡＦまたはＣＤ５５）のような補体調節タンパク質、またはＦｅｙ受容体ＩＩＩ Ｂ型（Ｆｃ−ｙ−ＲＩＩＩまたはＣＤ１６ｂ）、Ｔｈｙ−１（ＣＤ９０）、Ｑａ−２、Ｌｙ−６Ａ、反応性溶解の膜インヒビター（ＭＩＲＬまたはＣＤ５９）のような他のもの、から単離される。本発明の目的のためには、リンパ球機能関連抗原（ＬＦＡ−３）が好ましい。当業者は、いかなる他の公知のＧＰＩアンカーもまた本発明の実施に使用できることを認識しているだろう。
【００７１】
ＴＩＭＰ−ＧＰＩの構築のために、ＴＩＭＰの完全長配列、あるいはＴＩＭＰの活性を保持するその機能的活性部分のいずれかが、融合構築物に使用できる。同様に、ＧＰＩ配列の一部もまた、その部分がＴＩＭＰタンパク質の癌細胞の表面細胞膜への組み入れを可能にする限り使用できる。
【００７２】
以下において、ＴＩＭＰ融合構築物に関する複数の態様が記載されており、癌の処置のために、および再生医療の分野における薬剤として、該構築物が生産され、提供された。第一の態様において、ＴＩＭＰ分子は、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、およびＴＩＭＰ−４からなる群より選択され、好ましくは、ＧＰＩ配列に融合している。
【００７３】
他の好ましい態様において、ＧＰＩ配列は３６アミノ酸の長さである。
【００７４】
さらに他の態様において、ＴＩＭＰ分子は、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、およびＴＩＭＰ−４からなる群より選択され、後にＧＰＩ配列が続くムチンドメインまたはフラクタルカインドメインに融合している。
【００７５】
他の態様において、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、およびＴＩＭＰ−４からなる群より選択され且つＧＰＩ配列に融合しているＴＩＭＰタンパク質、または同群より選択され且つ後にＧＰＩ配列が続くムチンドメインもしくはフラクタルカインドメインに融合しているＴＩＭＰタンパク質は、Ｃ末端で切り詰められる。好ましい態様において、該ＴＩＭＰ分子は、最初の５０個、５０〜１００個、または５０〜１５２個のＮ末端アミノ酸残基へ切り詰められる。より好ましくは、ＴＩＭＰ分子は、最初の１５２個のＮ末端アミノ酸残基へ切り詰められ、かつＴＩＭＰ−１分子である。「切り詰められた（短縮型）」（truncated）という用語は、天然のＴＩＭＰ核酸配列もしくはタンパク質に見出される核酸塩基もしくはアミノ酸残基の完全数より少なく含むＴＩＭＰ核酸もしくはアミノ酸配列、或いは、望まない配列が除去されている核酸もしくはアミノ酸配列を指す。
【００７６】
さらに他の態様において、ＴＩＭＰ融合構築物は、配列番号１、２、３、４、および５からなる群より選択される配列により定義される。
【００７７】
その後、機能性ＴＩＭＰポリペプチドまたはタンパク質を得るために、得られた構築物を任意の適切な細胞系または宿主細胞で発現させることができる。この目的のために、適切な公知のベクターまたはプラスミドのいずれもが、本発明のＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰタンパク質を発現させるのに使用できる。以下により詳細に記載されているように、ＴＩＭＰ−ＧＰＩタンパク質で（および対照としてｒｈＴＩＭＰ−１タンパク質で）処理された標的癌細胞は、当該タンパク質構築物により認識され、結果として、ＦＡＳ媒介性アポトーシスによって死滅した。
【００７８】
好ましい態様において、および例として、本発明の融合構築物の発現に用いられる１つのベクターは、ヒト伸長因子１αのプロモーター、それに続くマルチクローニングサイト、および構築物のバイシストロニック発現を可能にする内部リボソーム結合サイト、および選択マーカーとして用いられるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を含む（Mack, et al., P.N.A.S. USA 92:7021, 1995）。ＴＩＭＰタンパク質の３’末端（カルボキシル末端）は、ＧＰＩ連結配列（例えば、リンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３））に直接的に融合するか、後にＧＰＩシグナルが続く、ＣＸＣＬ１６もしくはフラクタルカイン（ＣＸ３ＣＬ１）から単離されたムチン様ドメインに融合している。上記で示されているように、これらのムチンドメインは、主として、細胞−細胞間相互作用を促進することが示されたセリン／トレオニン／グリシン／プロリン残基で構成される。結果として生じた融合構築物は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠損チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞へトランスフェクションされ、Mack, et al., P.N.A.S. USA 92:7021-7025, 1995に記載のように選抜が行われる。好ましい態様において、トランスフェクションされた細胞は、遺伝子増幅により発現率を増加させるためにメトトレキセートに曝されうる。
【００７９】
他の態様において、ＴＩＭＰ−ＧＰＩタンパク質の膜組み入れの効率を増加させるために、ＴＩＭＰ−ＧＰＩ構築物はさらにムチンドメインに融合されうる。ムチンは、腺上皮の表面の内側を覆う分泌性粘液において初めて同定された、膜結合型または非膜型糖タンパク質成分である。膜結合型ムチンは、脂質二重層におけるそれらのアンカリングに関与する疎水性配列または膜貫通ドメインを示す。現在、合計２１個の遺伝子が名称ＭＵＣを受けている：ＭＵＣ１〜２、ＭＵＣ３Ａ、ＭＵＣ３Ｂ、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ６〜１３、ＭＵＣ１５〜２０（Moniaux N, et al., 2004）。ムチンの５つの共通の特徴は以下のとおりである：（１）粘液層への分泌、（２）高分子量Ｏ−糖タンパク質、（３）固有でかつ中央に位置した大きなエキソンによりコードされるタンデムリピートアレイの存在、（４）高パーセンテージのセリン残基とトレオニン残基を含む予測ペプチドドメインの存在、ならびに（５）ｍＲＮＡ発現の複雑なパターン。１つの例外として（ＭＵＣ７）、分泌性ムチン（ＭＵＣ２、ＭＵＣ５Ａ、ＭＵＣ５Ｂ、およびＭＵＣ６）は、ムチン単量体のオリゴマー形成および分泌小胞へのパッケージングにおいて機能する、１個または数個のフォンビルブラント因子様ドメインとシステインリッチなペプチドとを有する。典型的には、分泌性ムチンは、特定化された上皮細胞により独占的に発現され、粘液に分泌され、ヒト身体内において限定された発現パターンを示す。この４つの分泌性ムチンは、ゲル形成ムチンとも呼ばれるが、プロフォンビルブラント因子との高レベルの類似性をもつ共通構造を有する。それらはまた、フォンビルブラント因子のＤドメインとの相同性から、５つのＤドメインを有することも知られている。
【００８０】
膜結合型ムチンは、ＭＵＣ１、ＭＵＣ３Ａ、ＭＵＣ３Ｂ、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１１、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１６、およびＭＵＣ１７で構成される。膜アンカー型ムチンは、ＭＵＣ４を例外として、ＳＥＡ（ウニ精子タンパク質(Sea urchin sperm protein)、エンテロキナーゼ(Enterokinase)、およびアグリン(Agrin)）モジュールを含む。ＭＵＣ３Ａ〜Ｂ、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１１〜１２、およびＭＵＣ１７は、２〜３個の上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）様ドメインを含む。本発明で使用できる膜結合型ムチンの例は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、およびＭＵＣ１２である。本発明の好ましい態様において、表面会合型ケモカインＣＸＣＬ１６またはフラクタルカイン（ＣＸ３ＣＬ１）のムチンストークが用いられる。ＣＸＣＬ１６は、ＣＸＣケモカインサブファミリーのメンバーである。このサブグループの他のメンバーと違って、ＣＸＣＬ１６は構造的に異なり、４つの別個のドメインを有する：ケモカインドメインはムチン様ストークを介して細胞表面に繋ぎとめられており、ムチン様ストークが、順に、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに付着している。フラクタルカイン（ＣＸ３ＣＬ１）はＣＸＣＬ１６と類似した構造を有し、ＣＸＣＬ１６とフラクタルカインはいずれも、細胞表面上に発現した場合には接着分子として働き、細胞表面から切断されると可溶性ケモカインが化学誘引物質として働く。
【００８１】
好ましくは、ムチンドメインは、公知の通常の遺伝子工学的方法によって、ＴＩＭＰ配列の３’末端とＧＰＩアンカー配列の５’末端との間に融合される。本発明の得られたＴＩＭＰ−ムチン−ＧＰＩ融合構築物は、その後、任意の適切な公知の細胞系または宿主細胞においてトランスフェクションされ、発現することができる。当業者は、いかなる他のムチンまたはムチンドメインも本発明の目的に適していることを認識しているだろう。
【００８２】
好ましい態様において、ＴＩＭＰ分子に融合したフラクタルカインは、ＣＸ３ＣＬ１のアミノ酸１００位〜３４２位を含み、その後にＧＰＩ配列が続く。よりいっそう好ましい態様において、ＴＩＭＰ分子は、最初の１５２個のＮ末端アミノ酸へ切り詰められたＴＩＭＰ−１分子である（配列番号５）。
【００８３】
ＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰタンパク質の調製のためのＴＩＭＰ−１（Bode & Maskos, 2003）の使用が本発明において好ましいが、当業者は、他のＴＩＭＰもまた本発明の実施に使用できることを認識しているだろう。有用であるヒトＴＩＭＰのさらなる例は、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、およびＴＩＭＰ−４である（Mannello F, et al., 2001）。用いられるＴＩＭＰは、ヒトの源（human source）由来であり、ヒト癌細胞を処置するために投与される。当業者は、ヒト以外の生物体におけるＴＩＭＰ、特にＴＩＭＰ−１、の相同体もまた腫瘍細胞を殺す同様の効果を有することを認識しているだろう。例えば、いくつかの態様において、イヌ、ネコ、マウス、ウサギ、ウシ、またはヒツジ、およびトリのような動物由来のＴＩＭＰ−１の配列が、本発明のＴＩＭＰ−ＧＰＩ融合構築物の構築に使用できる。その後、ＴＩＭＰ−ＧＰＩキメラは、ヒト個体について記載されているのと同様の様式で腫瘍部位に投与される。
【００８４】
ＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰで処置されうる腫瘍および癌細胞としては以下の癌が挙げられるが、限定されるわけではない：乳癌、腎癌(renal cancer)、前立腺癌、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌(kidney cancer)、副腎癌、甲状腺癌、血液癌、皮膚癌、脳の癌、子宮頚癌、腸癌(intestinal cancer)、肝臓癌、結腸癌、胃癌、腸癌(intestine cancer)、消化管癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）癌、子宮癌、卵巣癌、および肺癌、ならびにそれらの転移癌。
【００８５】
残存癌の処置のために、ＴＩＭＰ−ＧＰＩは、残存癌細胞および局所的再発の発生率増加の高リスクをもつ高リスク腫瘍患者において、ならびに進行期疾患または局所的手術不能による明らかな残存腫瘍を有する患者において、腫瘤切除側へ局所的に投与および適用される。融合構築物は、好ましくは、０．５〜５μｇ／ｍｌタンパク質の濃度で、より好ましくは０．５〜１μｇ／ｍｌ、または１〜２μｇ／ｍｌの濃度で投与される。約１μｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−ＧＰＩ濃度またはＴＩＭＰ−ムチン−ＧＰＩ濃度が最も好ましい。当該タンパク質は、任意の適用可能な投与経路により個体へ投与されうる。この処置は、融合構築物が創傷へ噴霧されるように、または手術が有効ではない領域へ注入されるように、手術中に行われることが好ましい。この目的のために、本発明のＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰ融合構築物は、１もしくは複数の通常の公知の担体、希釈剤、および賦形剤をさらに含む医薬組成物または医薬の成分でありうる。
【００８６】
下記の実施例から結論づけられるように、ＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰは、ＣＴＬ誘導性アポトーシスとＮＫ細胞誘導性アポトーシス（パーフォリン／グランザイム媒介性溶解経路）によるのではなく、むしろＦＡＳ／ＣＤ９５媒介性アポトーシスを含む第二の経路によって抗腫瘍活性（すなわち腫瘍細胞の死滅）を誘導するとみられる（さらなる詳細について、実施例５および６；図５および６を参照）。さらに、多くの腫瘍細胞はＦＡＳ媒介性アポトーシスに対して抵抗性であるところ、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩでの処置によって当該細胞系はＦＡＳ媒介性アポトーシスに対して感受性となったが、対照のｒｈＴＩＭＰ−１での処置では感受性とならなかった。
【００８７】
ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩタンパク質による処置がＢＣＬ２タンパク質の発現を低下させ、ＢＡＸタンパク質の発現を増加させることも見出された。ＢＣＬ２タンパク質は、アポトーシスの制御に関与するタンパク質のファミリーを代表する。このファミリーのいくつかのメンバー（ＢＣＬ２およびＢＣＬ−ＸＬのような）は抗アポトーシス性であるが、別のもの（ＢａｄまたはＢＡＸのような）はアポトーシス促進性である。細胞のアポトーシス刺激に対する感受性は、アポトーシス促進性ＢＣＬ２ファミリーメンバーと抗アポトーシス性ＢＣＬ２ファミリーメンバーとの間のバランスに依存する。加えて、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ処置のＢＣＬ２およびＢＡＸの発現への効果が確認され、癌細胞をＴＩＭＰ−１−ＧＰＩで処置するとアポトーシス促進性ＢＡＸの発現が増加し、抗アポトーシス性ＢＣＬ２の発現が減少したことが示されている。
【００８８】
配列番号１、２、３、４、および５にそれぞれコードされたＴＩＭＰ融合構築物について、同様の結果が得られた。
【００８９】
要約すれば、マイクログラムからミリグラム量の組換えＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰタンパク質を生産する方法の有効性と、これらの分子の癌細胞の表面への組み入れ可能性とが合わさることにより、癌の処置のための効果的なツールが提供される。
【００９０】
再生医療に用いるＴＩＭＰ融合構築物
さらに、本発明の融合構築物は、再生医療、特に創傷治癒の分野で用いるのに適している。上記のように、ＧＰＩに或いはムチン−ＧＰＩやフラクタルカイン−ＧＰＩに融合しているＴＩＭＰタンパク質は細胞表面膜へ効率的に組み入れられるが、それは、タンパク質−タンパク質相互作用と関係なく細胞表面に機能性ドメインを集中させる。本発明のＴＩＭＰ融合構築物は、典型的には、全く安定であり、増幅された新規の生物活性を示す。
【００９１】
上記のように、ＭＭＰとＴＡＣＥは、いずれも創傷治癒の過程に重大な役割を果たしている。増加したＭＭＰレベルは、様々な創傷治癒障害、とりわけ、慢性創傷発生に関連している。ＴＩＭＰはＭＭＰの天然のインヒビターであるため、本発明の融合構築物はまた、例えば、再生医療において、創傷治癒の過程を制御するための効果的な治療剤として用いることができ、ＭＭＰレベルにおける増加により特徴付けられる障害を処置するのに適している。
【００９２】
従って、本発明は、再生医療で用いるのに適した、および／またはＭＭＰレベルにおける増加により特徴付けられる障害を処置するための薬剤ならびに方法を提供する。好ましい態様において、本発明の融合構築物は、過剰瘢痕化、ならびにケロイドもしくは肥厚性瘢痕化および／または慢性創傷を含む異常な創傷治癒を処置または予防するために用いられる。さらなる好ましい態様において、本発明の融合構築物は、瘢痕組織の形成を阻害または予防するために用いられる。
【００９３】
典型的な創傷治癒応答は、特定化された細胞の創傷部位への移動により特徴付けられる。一般に、血小板と炎症細胞が傷害の場所に到着する最初の細胞であり、これらの分子が重要な機能と、結合組織細胞および他の治癒因子の流入に必要であるサイトカインを含む化学的シグナルとを提供する。「創傷」という用語は、正常な生理学的構造および機能の破壊を意味する。従って、創傷治癒過程は、最終的に生理学的連続性および機能の回復を生じる複雑かつ動的な一連の事象を指す。
【００９４】
創傷が治癒すると、通常、その場所には瘢痕が発生する。正常な創傷治癒の経過中に、脂肪組織、結合組織、および上皮のような単一組織が再生される。しかしながら、皮膚は２つの胚葉に由来するより複雑な器官であるため、それは、大部分線維性の組織、すなわち瘢痕の形成によって治癒する。
【００９５】
正常な創傷治癒において、ＭＭＰのタンパク分解活性は、遺伝子の転写や当該酵素の産生といった様々な機構により、および内因性ＴＩＭＰインヒビターの局所的分泌により制御される。創傷修復中、生理学的バランスは、ＭＭＰとＴＩＭＰの活性の間に存在する。しかしながら、マトリックスメタロプロテアーゼは、慢性創傷においてそのレベルが上昇し、そのような高いＭＭＰ濃度により創傷治癒過程が損なわれることが知られている。マクロファージ、線維芽細胞、好中球、上皮細胞、および内皮細胞を含む複数の細胞型が、炎症性サイトカインのような特定の生化学的シグナルの存在下においてＭＭＰを合成する。ＭＭＰは細胞外マトリックスの成分のほとんど全部を消化する能力があり、それが、ＭＭＰのタンパク質分解活性と、組織のタンパク質成分を合成し且つ沈着させる他の細胞活性との間の必要なバランスを脅かす。
【００９６】
図８は、組織リモデリング過程、線維症、およびこの過程を調節することに関与する因子の概観を提供する。特定の傷害、寄生虫感染、または自己免疫応答に対する急性および慢性の炎症性反応が起こると、線維形成因子が発現および分泌されて、線維芽細胞およびケラチノサイトの活性化が導かれる。これらの線維形成因子としては、とりわけ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、ＭＯＢ、ＴＧＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ｂＦＧＦ、ＴＮＦ−α、およびＰＤＧＦ−ＢＢが挙げられる。おそらく、これらのサイトカインのうちで最も重要なものは以下の２つである：ＴＮＦ。線維芽細胞に対して分裂促進性であり、血管新生を促進し、マクロファージ、肥満細胞、およびＴリンパ球により分泌される。；ＴＧＦ−α。ケラチノサイトおよび線維芽細胞に対して分裂促進性であり、ケラチノサイト遊走を刺激し、マクロファージ、Ｔリンパ球、およびケラチノサイトにより分泌される。ＴＮＦおよびＴＧＦ分泌を含む段階は、創傷治癒過程の炎症期から組織再構築の過程、すなわち増殖期、への遷移を示す。
【００９７】
活性化によって、線維芽細胞は、ＴＧＦ−βと組み合わせて線維芽細胞の増殖へ導くＩＬ−６を分泌する。ＴＧＦ−βはまた、線維芽細胞分化を促進する。これらの増殖および分化過程により、コラーゲン、フィブロネクチン、ＴＩＭＰ、ＭＭＰ、および他のＥＣＭタンパク質が全体的に増加し、ＥＣＭ生成の増加とＥＣＭターンオーバーの減少が導かれる。
【００９８】
本発明は、開示される融合構築物、すなわち、ＧＰＩアンカー、ムチン−ＧＰＩアンカー、もしくはフラクタルカイン−ＧＰＩアンカーに融合したＴＩＭＰタンパク質またはそれらの変異体が、サイトカインおよび創傷治癒の過程に関与する他の重要な酵素の発現レベルおよび／または活性に影響を及ぼす強力な薬剤として使用できる、という予想外の知見に基づいている。従って、本発明は、創傷治癒の過程を制御する（例えば、瘢痕組織の形成を支配し、阻害し、または予防する）ための、および創傷治癒過程に関連した他の公知の機能障害を処置するための効果的な再生剤ならびに方法を提供する。
【００９９】
異常な創傷治癒
ケロイドおよび肥厚性瘢痕化は、過剰コラーゲンの蓄積を特徴とし、それらの外見により互いに区別できる。ケロイドと肥厚性瘢痕は、いずれも皮膚表面の外部を過度に治癒する創傷である。ケロイド瘢痕は、典型的には、創傷のサイズおよび形を超えて拡大し続けるが、肥厚性瘢痕は元の創傷の物理的境界内で拡大する。肥厚性瘢痕化は、一般的に、組織傷害後すぐに観察できるが、ケロイド瘢痕は、遅くも傷害の時点から１年後に形成しうる。しかしながら、異常な瘢痕化のほとんど全部の事例は、入れ墨、火傷、刺傷、予防接種、外傷、手術、または感染を含む生理学的傷害に関連している。
【０１００】
肥厚性瘢痕およびケロイドは、どちらも、典型的な創傷治癒過程の変化として説明できる。典型的な創傷において、同化および異化過程は、最初の傷害から約６〜８週間後に平衡に達する。瘢痕の成熟中、皮膚の抗張力は、コラーゲン線維が徐々に架橋結合するにつれて向上する。この時点で、瘢痕は通常、充血性であり、肥厚している場合がある。しかしながら、初期の瘢痕組織は、数ヶ月間かけて次第に鎮静し、典型的には外見は平ら、白色、柔軟、および場合により伸張しているより成熟した瘢痕になる傾向がある。創傷治癒過程の同化段階と異化段階との間のアンバランスがある場合、より多くのコラーゲンが分解されるより産生され、それゆえに、瘢痕は四方八方に成長しうる。
【０１０１】
肥厚性およびケロイド瘢痕組織を処置するための単一の最適な方法はまだ開発されておらず、従って、これらの異常な瘢痕の再発率は顕著である。
【０１０２】
要約すれば、ＭＭＰとＴＩＭＰを含むサイトカインおよび特定の酵素は、創傷治癒の過程と瘢痕組織の形成に重大な役割を果たしている。さらに、ＭＭＰおよびサイトカインのレベルにおける異常な発現は、しばしば、異常な創傷治癒と関連している。
【０１０３】
従って、本発明は、創傷治癒の過程を制御するための、および／または創傷治癒と一般的に関連した機能障害を処置するための効果的な再生剤ならびに方法を提供する。具体的には、本発明の融合構築物は、これらの望ましくない過程を効果的に制御し、変化させ、阻害し、または予防するのに利用できる。本発明の融合構築物は、薬として製剤化し、傷害部位に投与することができる。１つの態様において、傷害部位は、手術、火傷、注射、刺傷、予防接種、外傷、手術、または感染により生じたものである。他の態様において、傷害部位に投与できる医薬の調製に用いられる融合構築物は、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、ＴＩＭＰ−２−ＧＰＩ、ＴＩＭＰ−３−ＧＰＩ、ＴＩＭＰ−４−ＧＰＩ、ＴＩＭＰ−１−ｍｕｃ−ＧＰＩ、ＴＩＭＰ−２−ｍｕｃ−ＧＰＩ、ＴＩＭＰ−３−ｍｕｃ−ＧＰＩ、およびＴＩＭＰ−４−ｍｕｃ−ＧＰＩ、またはそれらの変異体からなる群より選択される。
【０１０４】
ＴＩＭＰ構築物の製剤化および投与様式
本発明のＴＩＭＰ構築物に基づいた薬学的組成物は、１もしくは複数の生理学的に許容される担体または賦形剤を用いて通常の様式で製剤化することができる。技術および製剤については、一般的に、Remrnington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Paに見出されうる。注入を目的として、本発明の化合物は、溶液に、好ましくはハンクス液またはリンガー液のような生理学的に適合した緩衝液に、製剤化することができる。さらに、当該化合物を固形状に製剤化し、使用直前に再溶解または懸濁してもよい。凍結乾燥された形状も適している。
【０１０５】
これらの製剤に加えて、当該化合物はまた、デポー調製物として製剤化してもよい。これらの長時間作用性デポー製剤は、埋め込み（例えば、皮下または筋肉内に）または注入により投与することができる。従って、この化合物は、適切な重合体や疎水性の物質と共に（例えば、許容される油におけるエマルジョンとして）、またはイオン交換樹脂として、または難溶性塩のような難溶性誘導体として、製剤化することができる。他の適切なデリバリーシステムとしては、長期間に渡る薬物の局所的および非侵襲性デリバリーの可能性を提供するミクロスフェアが挙げられる。この特別な技術は前毛細血管のサイズを有するミクロスフェアを利用するもので、炎症または虚血を引き起こすことなく、冠動脈カテーテルを介して組織（例えば、心臓または他の器官）の任意の選択された部分へ注入される。投与された治療用物質はミクロスフェアからゆっくり放出され、周囲組織に存在する細胞（例えば、傷ついた細胞や癌性細胞）によって容易に取り込まれる。
【０１０６】
局所的投与のために、本発明のオリゴマーは、当技術分野において一般的に知られた軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化することができる。オリゴマーを含む洗浄溶液は、傷害や炎症を処置するために、または治癒過程を広く加速するために、局所的に用いることができる。
【０１０７】
本発明のＴＩＭＰ構築物を含む医薬を調製する場合には、１種より多い、好ましくは２種、よりいっそう好ましくは３種の異なるＴＩＭＰ構築物を組み合わせることができる。このアプローチでは、ＴＩＭＰファミリーの異なるメンバーの増幅された新規の生物活性を優先的に組み合わせて細胞表面を標的とすることができ、相乗効果を導くことができる。例えば、ＴＩＭＰ−１融合構築物は、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ１４を除いて、ほとんどのＭＭＰを阻害する。それゆえに、いずれのＴＩＭＰ−１構築物も、いずれのＴＩＭＰ−２構築物やＴＩＭＰ−４構築物（どちらもＭＭＰ−２を優先的に阻害する）と組み合わせることができる。従って、この組み合わせによって、ＭＭＰファミリーのより完全な阻害を達成することができる。
【０１０８】
従って、１つの態様において、本発明の製剤はＴＩＭＰ−１構築物、またはＴＩＭＰ−２および／もしくはＴＩＭＰ構築物を含む。好ましい態様において、当該製剤は、配列番号１にコードされる短縮型（truncated）ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、配列番号５にコードされる短縮型ＴＩＭＰ−１−ｆｒａｃ−ＧＰＩ、および配列番号２にコードされる短縮型ＴＩＭＰ−１−ｍｕｃ−ＧＰＩからなる群より選択されるＴＩＭＰ−１構築物、ならびにＴＩＭＰ−２および／またはＴＩＭＰ−４構築物を含む。好ましくは、ＴＩＭＰ−２構築物は配列番号３にコードされるものである。
【０１０９】
さらなる態様において、当該製剤は本発明のＴＩＭＰ−３構築物を含み、それは、好ましくは配列番号４にコードされるものであり、配列番号１にコードされる短縮型ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、短縮型ＴＩＭＰ−１−ｆｒａｃ−ＧＰＩ、短縮型ＴＩＭＰ−１−ｍｕｃ−ＧＰＩ、ＴＩＭＰ−２、およびＴＩＭＰ−４構築物からなる群より選択されるＴＩＭＰ構築物の少なくとも１つと共にＴＡＣＥを阻害する。好ましくは、ＴＩＭＰ−１構築物およびＴＩＭＰ−２構築物は、それぞれ、配列番号１、２、３、および５にコードされるものである。
【実施例】
【０１１０】
実施例
以下の実施例において、ＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰの癌細胞への抗腫瘍効果がより詳細に説明される。記載された実験はヒトＴＩＭＰ−１で行われているが、本発明はＴＩＭＰのこの型に限定されるべきではない。
【０１１１】
以下の実施例において、ＧＰＩアンカーをＴＩＭＰ−１に融合させた。規定濃度のこの阻害性タンパク質を細胞表面タンパク質−タンパク質相互作用と関係なく３つの腎細胞癌（ＲＣＣ）細胞系（ＲＣＣ−２６、ＲＣＣ−５３、およびＡ４９８）の表面に集中させるためである。以下に示されているように、外から加えられたＴＩＭＰ−１−ＧＰＩは、ＲＣＣ細胞へ効率的に挿入し、ＭＭＰの細胞表面との会合を劇的に変化させた。ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩによる処理は、ＲＣＣ増殖を阻害し、通常はＦＡＳ抵抗性のＲＣＣ細胞を、ＦＡＳ誘導性アポトーシスに対して感受性にしたが、細胞傷害性エフェクター細胞によるパーフォリン媒介性溶解を変化させなかった。ＦＡＳ媒介性アポトーシスに対する感受性の増加は、アポトーシス促進性ＢＣＬ−２ファミリータンパク質と抗アポトーシス性ＢＣＬ−２ファミリータンパク質とのバランスにおける変化と相関した。
【０１１２】
ＲＣＣ−２６（Schendel et al., 1993）およびＲＣＣ−５３細胞系は、それぞれ、病期第Ｉ期および第ＩＶ期の明細胞癌を有する地元の患者から樹立された。それにより、それらは、ＲＣＣの２つの臨床的に両極端をなすものを代表する。腫瘍浸潤ＣＴＬが、両方の患者の腫瘍から単離された。これらの天然のエフェクター細胞はインビボで腫瘍成長を制御することができなかったが、ＲＣＣ−２６およびＲＣＣ−５３の表面マーカー染色により、ＭＨＣクラスＩの十分な表面発現が明らかにされ、両方の系統は、インビトロでアロ腫瘍特異的および抗腫瘍特異的ＣＴＬを誘導することが示された（(Schendel et al., 2000)およびＤＪＳ、未発表の観察）。Ａ４９８は、最初に５２歳男性の腫瘍から単離され、ＲＣＣの良く研究された例である（Giard et al., 1973）。
【０１１３】
実施例１
外から加えられたＴＩＭＰ−１−ＧＰＩのＲＣＣ−５３の表面への組み入れ
ＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰ−１タンパク質を、以前に記載されているように（Djafarzadeh et al., 2004）、作製および単離した。精製されたＧＰＩ−ＴＩＭＰ−１タンパク質の、ＲＣＣ−５３、ＲＣＣ−２６、またはＡ４９８  ＲＣＣ細胞系の表面膜への組み入れを、７００ｎｇ／ｍｌの精製ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩまたは組換えヒト（ｒｈ）ＴＩＭＰ−１対照タンパク質との細胞系の１時間のインキュベーションにより実証した。表面会合したＴＩＭＰ−１タンパク質について、その後、ＦＡＣＳを用いて検出した（図１Ａ）。対照ｒｈＴＩＭＰ−１を添加してもＦＡＣＳシフトにおける変化は導かれなかったが、ＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰ−１を添加した場合には、ＴＩＭＰ−１についての強い表面シグナルが生じた。
【０１１４】
外から加えられたタンパク質がＧＰＩアンカーされたことを実証するために、まずＲＣＣ−５３細胞をＴＩＭＰ−１−ＧＰＩタンパク質（２００ｎｇ／ｍｌまたは７００ｎｇ／ｍｌ）とインキュベートし、次いで、６０ｎｇ／ｍｌ ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）で処理した。ＦＡＣＳ分析により、ＰＬＣ消化後のＴＩＭＰ−１細胞表面シグナルの完全な喪失が実証された（図１Ｂ）。ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ組み込み効率を測定するために、膜から解放されたＴＩＭＰ−１を洗浄緩衝液に収集し、ＴＩＭＰ−１特異的ＥＬＩＳＡを用いて定量した（図１Ｃ）。その結果、開始時のＴＩＭＰ−１抗原の６６％が２００ｎｇ／ｍｌの試料から回収され、一方３１％が７００ｎｇ／ｍｌインキュベーションから回収されていた。
【０１１５】
実施例２
ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩタンパク質はプロＭＭＰ−２およびプロＭＭＰ−９のＲＣＣ−５３からの放出を遮断する
ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の発現の増加は、ＲＣＣの不良な予後と相関する（Hemmerlein et al., 2004）。病期ＩＶ期明細胞癌細胞系ＲＣＣ−５３は恒常的にプロＭＭＰ−２とプロＭＭＰ−９の両方を分泌する（図２）。増加性表面ＴＩＭＰ−１レベルの、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９タンパク質の恒常的放出への効果を、ゼラチナーゼ酵素電気泳動アッセイ（Djafarzadeh et al., 2004; Klier et al., 2001）を用いて調べた。６００ｎｇ／ｍｌや１２００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＩＭＰ−１タンパク質では、プロＭＭＰ−２やプロＭＭＰ−９の分泌に何ら効果は生じなかった。これに対し、１０ｎｇ／ｍｌから開始してＴＩＭＰ−１−ＧＰＩで処理すると、プロＭＭＰ−２とプロＭＭＰ−９のいずれについても増殖培地への放出量が濃度依存的に減少した。
【０１１６】
実施例３
ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩでの処理はマトリックスメタロプロテイナーゼの表面発現の増加を導く
ゼラチナーゼ酵素電気泳動法実験の結果に基づくと、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩが細胞表面上にＭＭＰを隔離するように作用する可能性がある。ＴＩＭＰ−１は、ＭＭＰ−１４とＭＭＰ−１６を例外として、ほとんどの活性型のＭＭＰに結合する（Brew et al., 2000; Lang et al., 2004）。ＲＣＣ−５３を７００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩタンパク質と２４時間インキュベートした後、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、およびＭＭＰ−１６特異的抗体を用いてＦＡＣＳ分析を行ったところ、ＭＭＰ−１４を例外として、それぞれのＭＭＰについて平均チャネル蛍光強度（ＭＦＩ）が増加した。ｒｈＴＩＭＰ−１対照タンパク質では、ＦＡＣＳシグナルに明確な効果は生じなかった（データ非提示）。ＭＨＣクラスＩ（汎クラスＩおよびＨＬＡ−Ａ２）およびＩＣＡＭ−１を含む他のタンパク質の表面発現は、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ処理では生じなかった。ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ処理されたＲＣＣ５３をＰＬＣで１時間消化（図１で行われたように）しても、ＭＭＰの増加は認められなかった（図３Ａおよび３Ｂ）。細胞表面上のＭＭＰの蓄積は、図２に示されたプロＭＭＰ−２およびプロＭＭＰ−９の分泌低下を反映した。このＭＭＰ放出の見かけ上の遮断をさらに調べるために、対照ＲＣＣ５３細胞、または７００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＩＭＰ−１もしくはＴＩＭＰ−１−ＧＰＩで２４時間処理された細胞由来の培地（無血清）について、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１２、およびＭＭＰ−１３に対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット実験を行った（図３Ｃ）。対照ＲＣＣ−５３細胞由来の培地において、各ＭＭＰの存在が見出された。ｒｈＴＩＭＰ−１とインキュベートしても、ＭＭＰの分泌は排除されなかった。これに対し、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩは、調べられた各ＭＭＰの放出を完全に遮断すると考えられた。
【０１１７】
このＭＭＰの表面蓄積の、細胞のＥＣＭに浸潤する能力への効果を評価するために、細胞の遊走／浸潤能力を、ＥＣＭコーティング化膜での改良型ボイデンチャンバーアッセイを用いて調べた。ＲＣＣ−５３細胞のＥＣＭに浸潤する全体的な能力は、それほど顕著ではなかった（データ非提示）。浸潤を増強するために、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を下部ウェルへ加え、実験を４８時間、実行した。最適な浸潤応答は４ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦで見られ（データ非提示）、この応答をベースライン浸潤、またはゼロ％阻害として設定した（図３Ｄ）。３５０ｎｇ／ｍｌまたは７００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＩＭＰ−１またはＴＩＭＰ−１−ＧＰＩで３０分間、前処理されたＲＣＣ−５３細胞を洗浄し、ボイデンチャンバーの上部ウェルへ加えた。続いて、遊走／浸潤における相対的増加または減少を測定した（「材料および方法」を参照）。ｒｈＴＩＭＰ−１での処理は細胞の浸潤を部分的に遮断したが、７００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−ＧＰＩは、ＲＣＣ−５３細胞の浸潤を完全に遮断した（図３Ｄ）。
【０１１８】
実施例４
ＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰ−１はＲＣＣの増殖に影響を及ぼす
ＴＩＭＰ−１表面エンジニアリング（TIMP surface engineering）のＲＣＣの増殖への効果を評価するために、ＭＴＴアッセイを行った。ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩタンパク質を外から加えると、２４時間目、４８時間目、および７２時間目において、ＲＣＣ−５３とＡ４９８の増殖が用量依存的に減少することが見出された（図４Ｂ）。ＲＣＣ−２６細胞は極めてゆっくり増殖し（４８＋時間の倍加速度）、一般的傾向として増殖の抑制が示唆された（図４Ｃ）。ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ試薬と等モル濃度のホスファチジルイノシトール（Sigma, Germany, Nr. P6636）を用いた追加の対照実験では、細胞の増殖における有意な変化は導かれなかった（データ非提示）。
【０１１９】
実施例５
細胞媒介性細胞傷害
ＭＭＰ活性は、細胞傷害性Ｔ細胞活性により誘導されるアポトーシス（パーフォリン／グランザイムおよびＦＡＳ媒介性アポトーシスの両方）に対する標的細胞の感受性に結びつけられている（Egeblad & Werb, 2002）。ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩが有するＲＣＣの細胞依存性死滅への効果を、同種異系ＣＴＬ誘導性アポトーシスおよびＮＫ細胞誘導性アポトーシスを用いて調べた。同種異系ＣＴＬ媒介性アッセイにおいて、ＲＣＣ−５３、Ａ４９８、およびＲＣＣ−２６標的細胞を、７００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＩＭＰ−１またはＴＩＭＰ−１−ＧＰＩで処理し、その後、Ｃｒ51で標識し、同種異系ＣＤ８＋ ＣＴＬ ＪＢ４（図５Ａ）またはＮＫ細胞系（図５Ｂ）とインキュベートした。ＲＣＣ腫瘍細胞系は、ＣＴＬおよびＮＫ細胞の両方により認識され、効果的に死滅した。ＴＩＭＰ−１またはＴＩＭＰ−１−ＧＰＩでの処理では、３つのＲＣＣ細胞系について、ＣＴＬ媒介性アポトーシスとＮＫ細胞媒介性アポトーシスのいずれに対する感受性も変化しなかった。
【０１２０】
実施例６
ＴＩＭＰ−ＧＰＩ処理はＲＣＣをＦＡＳ媒介性死滅に対して感受性にする
ＣＴＬ／ＮＫ実験では、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ処理が、クロム放出アッセイで測定されるパーフォリン／グランザイム媒介性溶解経路に影響を与えないことが示された。この経路は、貯蔵サイトカインの分泌を用いてアポトーシスを惹起するように迅速に働き、２つの主要な免疫惹起性細胞死機構の１つを表す（Trapani et al., 2000）。第二の経路は、ＦＡＳ／ＣＤ９５連結を含む。次に、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ処理のＦＡＳ媒介性アポトーシスへの効果を調べた。
【０１２１】
ＲＣＣ系統上のＦＡＳ発現を、まず、非活性化抗ＦＡＳ ｍＡＢ（Ｌ−９５８）（H. Engelmann、未発表結果）を用いたフローサイトメトリーにより評価した。未処理の細胞、ならびに７００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩまたはｒｈＴＩＭＰ−１対照タンパク質で２４時間処理された細胞をＬ−９５８で染色し、分析した。ＦＡＳタンパク質はすべての３つのＲＣＣ系統で強く発現していた。ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩやｒｈＴＩＭＰ−１での処理は、ＦＡＳの細胞表面発現に影響を及ぼさなかった（図６Ａ）。
【０１２２】
抗ＦＡＳ ｍＡＢ Ｌ−９５７は、ＦＡＳ発現細胞においてアポトーシスを誘導できる（H. Engelmann、未発表結果）。フローサイトメトリーによりアポトーシスを検出するために、Ｌ−９５７での処理後のアネキシンＶ−フルオロイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の結合およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）のＲＣＣ細胞への取り込みを用いた。図６Ｂに実証されているように、ＲＣＣ−２６およびＲＣＣ−５３は主として、ＦＡＳ媒介性アポトーシスに抵抗性であった。未処理細胞とＬ−９５７処理した細胞の蛍光強度（ＭＦＩ）は類似していた。ＭＦＩのわずかな増加が、Ｌ−９５７処理に応答してＲＣＣ−５３に見られた。これらの観察結果は、ＲＣＣが一般的にＦＡＳ媒介性アポトーシスに抵抗性であるという以前の報告（Frost et al., 2003）と一致している。これらの細胞系は、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ（Ｌ−９５７＋ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ）で処理するとＦＡＳ媒介性アポトーシスに対して感受性になったが、対照ｒｈＴＩＭＰ−１（Ｌ−９５７＋ｒｈＴＩＭＰ−１）で処理しても感受性にならなかった（図６Ｂ）。Ａ４９８は、活性化抗ＦＡＳ ｍＡＢに感受性がより高いことが見出され（Ｌ−９５７処理試料におけるアネキシン−ＭＦＩの増加により検出される）、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ処理によりＡ４９８細胞のアポトーシスは有意に増進されたが、ｒｈＴＩＭＰ−１処理では増進されなかった。
【０１２３】
ＲＣＣ−２６およびＡ４９８細胞は、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ処理後にＦＡＳ誘導性アポトーシスの劇的な増加を示したが、ＲＣＣ−５３細胞系は、感受性においてそれほど顕著ではない増加しか示さなかった（６２から９３へのＭＦＩにおける変化）。ＲＣＣ−５３のＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ／ＦＡＳ誘導性アポトーシスを確認するために、細胞質クロマチンの検出に基づいた第二のＥＬＩＳＡアッセイを採用した。このアッセイの利点として、結果の解釈について主観性が入らないこと、およびアネキシンＶ染色と比較して感度が高いこと挙げられる。クロマチンＥＬＩＳＡは、少なくも３００個のアポトーシス細胞を検出することができ、細胞表面上のアネキシンＶの初期の存在からかなり下流のアポトーシス事象を測定する。アネキシンＶ ＦＡＣＳ分析に見出されたように（図６Ｂ）、ＲＣＣ−５３をＬ−９５７単独で処理すると、アポトーシスのわずかな増加が引き起こされた（図６Ｃ）。しかしながら、ＲＣＣ−５３細胞をＴＩＭＰ−１−ＧＰＩで処理すると、抗ＦＡＳ誘導性アポトーシスに対する細胞の感受性が用量依存な様式で劇的に増加した。
【０１２４】
これらの結果は、癌細胞をＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰで処理すると、ＦＡＳ誘導性アポトーシスによる癌細胞の死滅がもたらされることを実証している。従って、ＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰは抗腫瘍剤として有用である。
【０１２５】
実施例７
ＲＣＣのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ処理はＢＣＬ−２タンパク質の発現を低下させ、ＢＡＸタンパク質の発現を増加させる
ＢＣＬ−２タンパク質は、アポトーシスの制御に関与するタンパク質のファミリーを代表する（Igney & Krammer, 2002に概説されている）。このファミリーのいくつかのメンバー（ＢＣＬ−２およびＢＣＬ−ＸＬのような）は抗アポトーシス性であるが、別のもの（ＢａｄまたはＢＡＸのような）はアポトーシス促進性である。細胞のアポトーシス刺激に対する感受性は、アポトーシス促進性ＢＣＬ−２ファミリーメンバーと抗アポトーシス性ＢＣＬ−２ファミリーメンバーとの間のバランスに依存しうる（Igney & Krammer, 2002）。次に、ＢＣＬ−２の発現およびＢＡＸの発現に対するＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ処理の効果を調べた。ＲＣＣ細胞を７００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩまたはｒｈＴＩＭＰ−１対照と２４時間プレインキュベートした後、１μｇ／ｍｌ Ｌ−９５７（または対照ｍＡＢ）でさらに１６時間刺激した。続いて、ＢＣＬ−２タンパク質とＢＡＸタンパク質のレベルを、細胞内ＦＡＣＳおよびウェスタンブロットを用いて測定した。すべての３つの細胞系において、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩでの処理により、アポトーシス促進性ＢＡＸの発現が増加し、抗アポトーシス性ＢＣＬ−２の発現が減少した。ウェスタンブロットアッセイでも同様のパターンが見られた（図７Ａ、Ｂ、およびＣ）。
【０１２６】
実施例８
外から加えられたＴＩＭＰ−１−ムチン−ＧＰＩのＲＣＣ−５３の表面への組み入れ
ＴＩＭＰ−１−ムチン−ＧＰＩタンパク質を、実施例１に記載したように作製および単離した。細胞系を７００ｎｇ／ｍｌの精製ＴＩＭＰ−１−ムチン−ＧＰＩまたは組換えヒト（ｒｈ）ＴＩＭＰ−１対照タンパク質と１時間インキュベートすることにより、ＲＣＣ−５３、ＲＣＣ−２６、またはＡ４９８  ＲＣＣ細胞系の表面膜に精製ＧＰＩ−ＴＩＭＰ−１タンパク質が組み入れられることを実証した。表面会合したＴＩＭＰ−１−ムチン−ＧＰＩタンパク質を、ＦＡＣＳを用いて検出した。ＴＩＭＰ−１−ムチン−ＧＰＩ構築物は、表面膜へ効率的に組み入れられ、抗腫瘍活性を効果的に促進した。
【０１２７】
実施例９
個体における残存癌の処置のためのＴＩＭＰ−ＧＰＩ
ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩまたはＴＩＭＰ−ムチン−ＧＰＩ試薬を、外科的腫瘍切除後、切除領域へ局所的に１μｇ／ｍｌで投与する。手術不能の腫瘍、グリア芽細胞腫（星状細胞腫悪性度ＩＶ  ＷＨＯ）を外科的に除去し、当該試薬を創縫合前に導入する。
【０１２８】
実施例１０
個体における残存癌の処置のためのＴＩＭＰ−ＧＰＩ
ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩまたはＴＩＭＰ−ムチン−ＧＰＩ試薬の１μｇ／ｍｌの量を外科的腫瘍切除後、切除領域へ局所的に投与する。腫瘍、進行期の乳癌、を外科的に除去し、特に局所的再発の臨床的リスクがある場合には、当該試薬を創縫合前に導入する。
【０１２９】
実施例１１
腫瘍転移のモデルにおけるＴＩＭＰ−ＧＰＩの評価
ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩの腫瘍転移への効果を評価した。マウスのモデルを用い、肝臓へ効率的に転移するＴ細胞リンパ腫を、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩとｒｈＴＩＭＰ−１対照タンパク質のいずれかで前処理した。尾静脈を介して生じた腫瘍を投与し、肝臓における腫瘍の分布を３日後と７日後に測定した。その結果、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ処理された細胞の方がＴＩＭＰ処理された対照細胞と比較して、微小転移のレベルが有意に低いことが実証された。
【０１３０】
実施例１２
マトリゲル浸潤アッセイ
ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩの、実施例１１の腫瘍細胞系への効果を、一連のマトリゲル実験において分析した。その結果、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩが、ｒｈＴＩＭＰ−１と比較して、Ｔ細胞腫瘍系細胞のマトリゲル浸潤を起こす能力に著しい効果を生じることが確認された。
【０１３１】
実施例１３
ＴＩＭＰ融合構築物の線維芽細胞のフィブロネクチン産生への効果
ｒｈＴＩＭＰ−１とＴＩＭＰ−１−ＧＰＩの存在下または非存在下で、線維芽細胞を集密的（confluent）になるまで培養した。発現および分泌したフィブロネクチンを、抗フィブロネクチン抗体を用いるウェスタンブロット分析により定量した（β−アクチンを対照とした）。図９はこの実験の結果を示しており、ｒｈＴＩＭＰ−１（７００ｎｇ／ｍｌにおける）存在下ではフィブロネクチン発現の有意な減少は全く見られなかったが、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ存在下（７００ｎｇ／ｍｌ）では線維芽細胞が分泌するフィブロネクチンは強力に低下したことを明らかに実証している。
【０１３２】
加えて、線維芽細胞により転写されるフィブロネクチンＲＮＡをノーザンブロット分析により評価した。線維芽細胞を、１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞活性化ＴＮＦ−αの存在下（図１０Ａ）または非存在下（図１０Ｂ）において、３５０ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌの変性ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、および７００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、それぞれと共に培養した。さらに、０％、１％、５％、または１０％のＦＣＳを培地中に含めた。
【０１３３】
これらの結果は、３５０ｎｇ／ｍｌ濃度のＴＩＭＰ−１−ＧＰＩにおいて、転写されたフィブロネクチンＲＮＡが、ＴＮＦ−αが培地に存在するかどうかに関係なく、かつ培地のＦＣＳ含有量に関係なく、有意に低下したことを明確に実証している。７００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩでは、フィブロネクチンＲＮＡはほとんど検出できなかった。
【０１３４】
従って、ＴＩＭＰ−ＧＰＩ融合構築物は、線維芽細胞における成長因子であるフィブロネクチンの合成および分泌の両方を効率的に阻害する。
【０１３５】
実施例１４
ＴＩＭＰ融合構築物の線維芽細胞のＩＬ−６産生への効果
実施例１３のノーザンブロット分析を、ＩＬ−６ ＲＮＡに対するプローブを用いて繰り返した。すなわち、線維芽細胞を、１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞活性化ＴＮＦ−αの存在下（図１１Ａ）または非存在下（図１１Ｂ）において、３５０ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌの変性ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、および７００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、それぞれと共に培養した。さらに、０％、１％、５％、または１０％のＦＣＳを培地中に含めた（図１１）。
【０１３６】
これらの結果は、３５０ｎｇ／ｍｌ濃度のＴＩＭＰ−１−ＧＰＩにおいてすでに、転写されたＩＬ−６ ＲＮＡが、ＴＮＦ−αが培地に存在するかどうかに関係なく、かつ培地のＦＣＳ含有量に関係なく、際立って低下したことを明確に実証している。
【０１３７】
従って、ＴＩＭＰ−ＧＰＩ融合構築物は、線維芽細胞における創傷治癒に関与するさらに別の重要なサイトカインであるＩＬ−６の合成および分泌を効率的に阻害する。
【０１３８】
実施例１５
ＴＩＭＰ融合構築物の線維芽細胞によるコラーゲン産生への効果
実施例１３および１４で行われたノーザンブロット分析を、コラーゲン１Ａ１（図１２ＡおよびＢ）、コラーゲン４Ａ２（図１２ＣおよびＤ）、およびコラーゲン１６Ａ１（図１２ＥおよびＦ）に対するプローブを用いてそれぞれ繰り返した。すなわち、線維芽細胞を、１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞活性化ＴＮＦ−αの存在下（図１２Ａ、Ｃ、Ｅ）または非存在下（図１２Ｂ、Ｄ、Ｆ）において、３５０ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌの変性ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、それぞれと共に培養した。さらに、０％、１％、５％、または１０％のＦＣＳを培地中に含めた。
【０１３９】
これらの結果は、３５０ｎｇ／ｍｌ濃度のＴＩＭＰ−１−ＧＰＩにおいてすでに、すべての３つの転写されたコラーゲンＲＮＡが、ＴＮＦ−αが培地に存在するかどうかに関係なく、かつ培地のＦＣＳ含有量に関係なく、有意に低下したことを明確に実証している。
【０１４０】
従って、ＴＩＭＰ−ＧＰＩ融合構築物は、ＥＣＭ生成および組織リモデリングにおける必須タンパク質の１つであるコラーゲンの合成および分泌を阻害する。
【０１４１】
実施例１６
ＴＩＭＰ融合構築物の線維芽細胞によるＴＧＦ−β産生への効果
実施例１３〜１５のノーザンブロット分析を、ＴＧＦ−βに対するプローブを用いて繰り返した。すなわち、線維芽細胞を、１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞活性化ＴＮＦ−αの存在下（図１３Ａ）または非存在下（図１３Ｂ）において、３５０ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌの変性ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、それぞれと共に培養した。さらに、０％、１％、５％、または１０％のＦＣＳを培地中に含めた。
【０１４２】
これらの結果は、３５０ｎｇ／ｍｌ濃度のＴＩＭＰ−１−ＧＰＩにおいてすでに、ＴＮＦ−αが培地に存在するかどうかに関係なく、かつ培地のＦＣＳ含有量に関係なく、ＴＧＦ−β ＲＮＡをほとんど検出することができなかったことを明確に実証している。
【０１４３】
従って、上の実施例により示されているように、ＴＩＭＰ−ＧＰＩ融合構築物は、線維芽細胞における創傷治癒に関与するさらにもう１つの重要なサイトカイン、すなわちＴＧＦ−βの合成および分泌を効率的に阻害する。
【０１４４】
実施例１７
さらなるＴＩＭＰ融合構築物の作製
さらなるＴＩＭＰ融合構築物を、後述の「材料および方法」に従って作製および精製した。具体的には、短縮型（truncated）ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ融合構築物（配列番号１）、短縮型ＴＩＭＰ−１−ｍｕｃ−ＧＰＩ融合構築物（配列番号２）、ＴＩＭＰ−２−ＧＰＩ構築物（配列番号３）、ＴＩＭＰ−３−ＧＰＩ構築物およびＴＩＭＰ−３−ＧＰＩの変異型（配列番号４）、ならびに、短縮型ＴＩＭＰ−１−フラクタルカイン−ＧＰＩ融合構築物（配列番号５）を構築、発現、および精製した。
【０１４５】
短縮型ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ融合構築物（配列番号１）は、３６アミノ酸長のＧＰＩアンカーに融合した、ヒトＴＩＭＰ−１タンパク質の最初の１５２個のアミノ酸（すなわち、Ｃ末端アミノ酸１２６〜２０７位が除去された）を含む。短縮型ＴＩＭＰ−１−ｍｕｃ−ＧＰＩ融合構築物（配列番号２）は、３６アミノ酸長のＧＰＩアンカーに融合したヒトＣＸＣＲ１６（ムチン）のアミノ酸２５６〜３８０位に融合した、ヒトＴＩＭＰ−１タンパク質の最初の１５２個のアミノ酸を含む。できた融合構築物は、２９５個のアミノ酸を含み、３２，１１１ｋＤａの分子量を有する。
【０１４６】
完全長ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩから類推して、ＴＩＭＰ−２−ＧＰＩ（配列番号３）およびＴＩＭＰ−３−ＧＰＩは、それぞれ、ＧＰＩアンカー３６アミノ酸長に融合した、ヒトＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−３タンパク質からなる。ＴＩＭＰ−３−ＧＰＩの変異型融合構築物（配列番号４）を作製するために、ヒトＴＩＭＰ−３のＧＡＧ結合ドメイン（当該タンパク質の細胞表面との会合に関与すると考えられる）を、以下の６つの交換により変異させた：Ｒ４３Ａ、Ｋ４５Ａ、Ｋ４９Ａ、Ｋ５３Ａ、Ｋ６５Ａ、およびＫ６８Ａ。短縮型ＴＩＭＰ−１−フラクタルカイン−ＧＰＩ融合構築物（配列番号５）は、３６アミノ酸長のＧＰＩアンカーに融合したヒトＣＸ３ＣＬ１のアミノ酸１００〜３４２位に融合した、ヒトＴＩＭＰ−１のＮ末端部分（アミノ酸１〜１５２位）を含む。
【０１４７】
短縮型ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ（配列番号１）、短縮型ＴＩＭＰ−１−ムチン−ＧＰＩ（配列番号２）、および短縮型ＴＩＭＰ−１−フラクタルカイン−ＧＰＩ（配列番号５）構築物の詳細な試験
ａ）外から加えられる、短縮型ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、短縮型ＴＩＭＰ−１−ムチン−ＧＰＩ、および短縮型ＴＩＭＰ−１−フラクタルカイン−ＧＰＩの細胞表面への組み入れ
短縮型ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、短縮型ＴＩＭＰ−１−ムチン−ＧＰＩ、および短縮型ＴＩＭＰ−１−フラクタルカイン−ＧＰＩを、Djafarzadeh et al., 2004に従って作製および単離した。精製された融合構築物の、ＲＣＣ−５３、ＲＣＣ−２６、またはＡ４９８  ＲＣＣ細胞系の細胞表面膜への組み入れについて、７００ｎｇ／ｍｌの精製された、短縮型ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、短縮型ＴＩＭＰ−１−ムチン−ＧＰＩ、および短縮型ＴＩＭＰ−１−フラクタルカイン−ＧＰＩ、それぞれとの細胞系を１時間インキュベートし、ムチン、フラクタルカイン、およびＧＰＩドメインを欠損しているそれぞれの短縮型ＴＩＭＰ−１の対照ＴＩＭＰ−１タンパク質の場合と比較した。その後、表面会合したタンパク質をＦＡＣＳ分析にて検出した。その結果、対照ＴＩＭＰ−１ではＦＡＣＳシフトにおける少しの変化へも導かれないだろうと予想されたが、短縮型ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、短縮型ＴＩＭＰ−１−ムチン−ＧＰＩ、および短縮型ＴＩＭＰ−１−フラクタルカイン−ＧＰＩでは、いずれもＴＩＭＰ−１についての強い表面シグナルを生じた。
【０１４８】
外から加えられたタンパク質がＧＰＩアンカーされることを実証するために、ＲＣＣ−５３細胞を、まず、短縮型ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、短縮型ＴＩＭＰ−１−ムチン−ＧＰＩ、および短縮型ＴＩＭＰ−１−フラクタルカイン−ＧＰＩ、それぞれ（２００ｎｇ／ｍｌまたは７００ｎｇ／ｍｌ）とインキュベートし、その後、６０ｎｇ／ｍｌホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）で処理した。ＦＡＣＳ分析の結果、ＰＬＣ消化後ではＴＩＭＰ−１細胞表面シグナルが完全に喪失していると予想された。アンカー型ＴＩＭＰ−１構築物の組み込みの効率を測定するために、膜から解放されたＴＩＭＰ−１構築物を洗浄緩衝液に収集し、ＴＩＭＰ−１特異的ＥＬＩＳＡを用いて定量した。開始ＴＩＭＰ−１抗原の大部分が２００ｎｇ／ｍｌの試料から回収されるだろうと予想された。
【０１４９】
ｂ）短縮型ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、短縮型ＴＩＭＰ−１−ムチン−ＧＰＩ、および短縮型ＴＩＭＰ−１−フラクタルカイン−ＧＰＩタンパク質は、プロＭＭＰ−２およびプロＭＭＰ−９のＲＣＣ−５３からの放出を遮断する
ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の発現の増加は、典型的には、ＲＣＣの不良な予後と相関する（Hemmerlein et al., 2004）。病期ＩＶ期明細胞癌細胞系ＲＣＣ−５３は恒常的にプロＭＭＰ−２およびプロＭＭＰ−９の両方を分泌する（図２）。増加性表面ＴＩＭＰ−１レベルの、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９タンパク質の恒常的放出への効果を、ゼラチナーゼ酵素電気泳動アッセイ（Djafarzadeh et al., 2004; Klier et al., 2001）を用いて試験した。６００ｎｇ／ｍｌまたは１２００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＩＭＰ−１タンパク質では、プロＭＭＰ−２またはプロＭＭＰ−９の分泌に効果は見られなかった。対照的に、１０ｎｇ／ｍｌから開始して、短縮型ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、短縮型ＴＩＭＰ−１−ムチン−ＧＰＩ、および短縮型ＴＩＭＰ−１−フラクタルカイン−ＧＰＩ処理では、いずれも、実施例２に記載されたＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ処理に匹敵する、プロＭＭＰ−２およびプロＭＭＰ−９の両方の増殖培地への放出の濃度依存性減少を示していると予想された。
【０１５０】
ｃ）短縮型ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、短縮型ＴＩＭＰ−１−ムチン−ＧＰＩ、および短縮型ＴＩＭＰ−１−フラクタルカイン−ＧＰＩタンパク質は、ＲＣＣの増殖に影響を与える
ＴＩＭＰ−１表面エンジニアリングのＲＣＣの増殖への効果を評価するために、ＭＴＴアッセイを行った。短縮型ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、短縮型ＴＩＭＰ−１−ムチン−ＧＰＩ、および短縮型ＴＩＭＰ−１−フラクタルカイン−ＧＰＩをそれぞれ外から加えると、２４時間目、４８時間目、および７２時間目において、実施例４と匹敵して、ＲＣＣ−５３とＡ４９８の増殖が用量依存的に減少していると予想された。ＲＣＣ−２６細胞は極めてゆっくり増殖していると予想され（４８＋時間倍加速度）、一般的傾向として増殖の抑制が示唆された。
【０１５１】
実施例１８
実施例１７の融合構築物のさらなる評価
実施例１〜１６の実験を、実施例１７の融合構築物を用いて繰り返したところ、同様の結果が予想された。特に、ＴＩＭＰ−２融合構築物は、ほとんどのＭＭＰ（ＭＭＰ−９を除く）を阻害し、優先的にＭＭＰ−２を阻害した。ＴＩＭＰ−３融合構築物は、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９、およびＭＭＰ−１３、加えてＴＡＣＥを阻害した。ＴＩＭＰ−３の変異型融合構築物（配列番号４）の組み込み特性を調べたところ、追加として、細胞膜へ組み込む能力の向上を示した（これらの実験は実施例８の方法に従って行った）。短縮型ＴＩＭＰ−１融合構築物（配列番号１、２、５）は、完全長ＴＩＭＰ−１融合構築物と比較して、類似した生物学的機能を示し、従って、ＴＩＭＰのＮ末端部分がそれらの阻害機能に必須であるという概念を支持した。フラクタルカイン融合構築物（配列番号５）はさらに、ムチン融合構築物（配列番号４）と匹敵する膜組み込み能力を示した。
【０１５２】
結果の考察
本発明によるＧＰＩアンカー型タンパク質を用いる細胞表面エンジニアリングは、従来の遺伝子移入アプローチを超えるいくつかの利点を提供する。すなわち、１）トランスフェクションが困難である細胞、例えば、ＦＡＳ媒介性アポトーシス抵抗性ＲＣＣ細胞、また、初代培養物、骨髄前駆体、および免疫系細胞にも適用できる。２）ほんの少数の細胞しか利用できない場合や、細胞を容易に増殖できない場合でも用いることができる。３）細胞表面を細胞型に関係なく改変することができる。４）細胞表面上に最終的に提示されるタンパク質の量を正確に制御することができる。５）複数のＧＰＩアンカー型タンパク質を、同じ細胞へ逐次的または同時に組み入れることができる。
【０１５３】
ヒトＲＣＣは、現在の化学療法剤および放射線療法に抵抗性であるため、治療法の選択肢が限られた進行性腫瘍である。免疫療法はいくらかの患者にとって有効であり、ＲＣＣが免疫エフェクター機構により標的となりうることを示唆している。ＣＤ８＋ＣＴＬやＮＫ細胞のような腫瘍浸潤リンパ球はしばしば腎臓癌組織に見られ、インビトロで試験された場合には、たびたび自己腫瘍細胞を認識する（Schendel et al., 1997に概説されている）。これらの有望な観察にもかかわらず、腫瘍は、一般的に増殖し続け、ＲＣＣが細胞傷害性機構に対する抵抗性を獲得している可能性があることを示す。起こりうる多くの抗腫瘍応答のためには、免疫系が腫瘍を認識しなければならないだけでなく、癌細胞もまた、ＣＴＬやＮＫ細胞により利用される殺害機構に感受性が高くなければならない。癌細胞は、アポトーシスに対する感受性の低下を含む免疫防御を回避するために様々な機構を進化させている（Dunn et al., 2004に概説されている）。
【０１５４】
ＣＴＬおよびＮＫ細胞は、パーフォリン／グランザイムまたはＦＡＳ／ＦＡＳＬ依存性アポトーシスにより標的細胞を殺す（Kagi et al., 1994）。インビボでの腫瘍制御のための顆粒エキソサイトーシス対ＦＡＳ／ＦＡＳＬ媒介性溶解活性の相対的な重要性については、論争がある。多くの研究が顆粒エキソサイトーシス機構の優位を指摘しているが、パーフォリンノックアウトマウスを用いた他の研究（Seki et al., 2002）は、ＦＡＳ依存性アポトーシスがインビボでより顕著な経路を構成しうることを示唆している。ＲＣＣを含むほとんどの腫瘍細胞は、ＦＡＳ媒介性殺傷に本質的に抵抗性である（Frost et al., 2003）。ＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰの使用は、腫瘍細胞をＦＡＳ媒介性アポトーシスに対して感受性にするための有望な治療アプローチを提示する。
【０１５５】
本発明者らは、ＧＰＩ−ＴＩＭＰ−１を外から添加する細胞エンジニアリングによって、増強されかつ新規なＴＩＭＰ−１生物活性を誘発できることを示した。外から投与されたＴＩＭＰ−１−ＧＰＩは、ＲＣＣの細胞膜へ効率的に挿入され、治療的関連性の可能性と共に、ＲＣＣ細胞系における様々な生物学的効果を引き出されるようになる。
【０１５６】
さらに、ＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰ−１タンパク質は、多様なＲＣＣ発現ＭＭＰの細胞表面会合を劇的に変化させた。これは、ＭＭＰ（プロＭＭＰ−２およびプロＭＭＰ−９を含む）のＲＣＣ細胞からの分泌低下により反映された。ＴＩＭＰ−１はＭＭＰ−２の酵素活性を遮断するが、当該酵素のプロ型に結合することは考えられない。けれども、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ処理後のプロＭＭＰ−２分泌の遮断を実証するデータが、この作用を示唆する。ＴＩＭＰ−１へのＧＰＩアンカーの付加は、ＴＩＭＰ−１タンパク質のＭＭＰに結合する能力を増強した表面化学量論の変化へ導くと思われる。
【０１５７】
膜型ＭＭＰについても、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩの結合の明らかな増加が示された。ＴＩＭＰ−１のＭＭＰ−１５との会合についてはあまり知られていないが、天然ＴＩＭＰ−１がＭＭＰ−１６に対してかなり弱い結合しか示さない（Lang et al., 2004）ことに基づくと、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩタンパク質のＭＭＰ−１６への結合が生じることは、予想されないだろう。ＭＭＰ−１６結合に重要なＴＩＭＰ−１ループの変異分析によれば、ＴＩＭＰ−１における小さな、見かけ上大したことではない変化が、その阻害／結合特性を劇的に変えることが示されている。この場合、ＴＩＭＰ−１の細胞表面上での化学量論の変化は、ＭＭＰ−１６への結合を変えるのに十分であったと思われる。細胞表面上でのＭＭＰの隔離はまた、ＲＣＣ−５３細胞系のＥＣＭ浸潤を起こす能力の低下と関連していた。
【０１５８】
本発明で示したように、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ処理により、ＲＣＣ細胞系の増殖における顕著な用量依存的低下が導かれる。おそらく最も重要なことには、通常はＦＡＳ−アポトーシス抵抗性のＲＣＣ細胞系が、本発明のＴＩＭＰ−ＧＰＩタンパク質での処理後、ＦＡＳ／ＣＤ９５媒介性殺傷に対して感受性になったことである。しかしながら、この薬剤は、パーフォリン経路に対する感受性に影響を及ぼさなかった。これは、ＧＰＩアンカー型ＴＩＭＰが、ＣＴＬ／ＮＫ細胞によるパーフォリン／グランザイム媒介性殺傷によるよりむしろ、ＦＡＳ誘導性アポトーシス経路による抗腫瘍効果を媒介することを示唆している。
【０１５９】
ＦＡＳ−アポトーシス経路はカスパーゼの活性化により制御されるが、クロム遊離アッセイにより測定されるような、顆粒エキソサイトーシスを利用するＣＴＬ／ＮＫによる細胞膜損傷はカスパーゼとは無関係に起こる（Sayers et al., 1998; Seki et al., 2002; Trapani et al., 2000）。カスパーゼの活性化を導く上流の事象は、アポトーシス促進性と抗アポトーシス性のＢＣＬ−２ファミリータンパク質間のバランスに関係している。本発明で示したように、ＧＰＩ−ＴＩＭＰ−１処理によって、抗アポトーシス性ＢＣＬ−２タンパク質の下方制御と、アポトーシス促進性ＢＡＸタンパク質における対応する増加とが生じた。このアポトーシス促進性タンパク質の濃度がより高い方へシフトすることが、ＴＩＭＰ−１表面エンジニアリング化（TIMP surface engineered）ＲＣＣ細胞のＦＡＳ媒介性アポトーシスへの感受性を増加させる１つの理由かもしれない。これらの観察結果は、ＴＩＭＰ−１についての新規な作用を示している。ＴＩＭＰ−３および他のＴＩＭＰ（ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−４）についても、同様の作用を示した（データ非提示）。
【０１６０】
アデノウイルスベクターを用いて血管平滑筋細胞においてＴＩＭＰ−１、−２、または−３を過剰発現させると、モデル基底膜を通ってのそれらの遊走が阻害されることが見出された。ＴＩＭＰ−１の過剰発現は細胞増殖に効果を生じなかったが、ＴＩＭＰ−２では細胞増殖の用量依存的な阻害が起こった。ＴＩＭＰ−３の過剰発現もまた増殖の用量依存的な阻害を引き起こし、加えて、ミトコンドリア膜脱分極およびチトクロム−ｃの漏出を通してのアポトーシスを導いた（Baker et al., 1999; Baker et al., 1998; Smith et al., 1997）。ＴＩＭＰ−３は、他の表面タンパク質との会合とは無関係に、細胞の表面に選択的に結合する唯一のＴＩＭＰタンパク質である（Majid et al., 2002; Smith et al., 1997）。ＧＰＩアンカーを介してＴＩＭＰ−１を細胞表面へ集中させることで、ＴＩＭＰ−３について報告されている効果に似た、新規の生物学的作用が導かれる。
【０１６１】
ＴＩＭＰ−３は、抗ＦＡＳ抗体、ＴＮＦ−α、およびＴＲＡＩＬにより誘導されるアポトーシスに対する黒色腫細胞の感受性を増加させることが示されている。その作用機構は、ＴＩＭＰ−３処理された黒色腫細胞の表面上のＦＡＳ、ＴＮＦ−ＲＩ、およびＴＲＡＩＬ−ＲＩの一般的な安定化に関連づけられた（Ahonen et al., 2003）。この受容体表面の発現増加は、カスパーゼ−８およびカスパーゼ−３の活性化に関連づけられた（Ahonen et al., 2003）。
【０１６２】
本発明に詳述された実験において、ＲＣＣ細胞は、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ処理後にＦＡＳ表面発現における変化を示さなかった（図６Ａ）。加えて、ＲＣＣ細胞は、ＴＩＭＰ−ＧＰＩ処理にもかかわらず、ＴＮＦ−α誘導性アポトーシス（１ｍｌあたり１００ユニットから１０，０００ユニットまで試験された）に対して抵抗性のままであった（データ非提示）。続くＲＣＣ細胞のＦＡＣＳ分析では、ＲＣＣ−５３におけるＴＮＦ−ＲＩ（ｐ５５）とＴＮＦ−ＲＩＩ（ｐ７５）のレベルは辛うじて検出できるものであり、ＲＣＣ−２６またはＡ４９８細胞系においては発現が全く見られなかった（データ非提示）。表面発現は、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ処理では変化しなかった。従って、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ処理後のＦＡＳ媒介性アポトーシスに対する感受性の増加は、細胞表面上のデスレセプタータンパク質の一般的な安定化を通して媒介されるのではないとみられる。はっきりしているのは、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩでの処理がＢｃｌ−２タンパク質のバランスを変化させて、より「アポトーシス促進性」の発現プロファイルを誘発することである。
【０１６３】
本発明の結果は、腫瘍生物学、ＭＭＰ／ＴＩＭＰ機能とアポトーシス経路の間のさらなる関連性を提供する。ＴＩＭＰタンパク質を直接的またはムチンドメインを介してＧＰＩに連結することで、通常はＦＡＳ誘導性アポトーシスに対して抵抗性である腫瘍細胞を、ＦＡＳ誘導性アポトーシスに対して感受性にする強力な抗腫瘍剤が提示される。この機構により腫瘍細胞は効果的に死滅する。
【０１６４】
融合構築物、特にＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ構築物、ＴＩＭＰ−１−ｍｕｃ−ＧＰＩ構築物、および配列番号１、２、３、４、５で表わされる構築物の、再生医療、例えば創傷治癒の分野における使用に関して、本発明のＴＩＭＰ−ＧＰＩ構築物が、ＥＣＭ産生の増加へ導く組織リモデリングと線維症の過程に関与する重要な酵素およびサイトカイン（フィブロネクチン、コラーゲン、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β）の産生と分泌を効率的に阻害することが本明細書に示されている。従って、ＧＰＩアンカー、またはムチンもしくはフラクタルカインおよびＧＰＩを用いて細胞膜においてアンカーされる場合には、ＴＩＭＰファミリーのメンバー（ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、ＴＩＭＰ−４）は、ＥＣＭ産生とＥＣＭターンオーバーの間の微妙なバランスに影響を及ぼすことにより創傷治癒の過程を効率的に調節するために用いることができる。
【０１６５】
材料および方法
細胞系および細胞培養
ＲＣＣ細胞系であるＲＣＣ−５３とＲＣＣ−２６は、患者試料からD.Ｊ.S.（Munich, Germany）により作製された。ＲＣＣ−５３、ＲＣＣ−２６、およびＡ４９８（American Type Culture Collection）（Giard et al., 1973）は、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Biochrom KG, Berlin）、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（GIBCO BRL, Life Technologies GmbH, Eggenstein, Germany）、１２％加熱不活性化ＦＣＳ（Biochrom KG, Berlin, No. S01 15）を追加したＲＰＭＩ１６４０培地（GIBCO BRL, Life Technologies GmbH, Eggenstein, Germany）中で培養された。新鮮培地を３日ごとに与え、細胞が集密的になった時に培養物を分割した。
【０１６６】
細胞傷害性エフェクター細胞：ＪＢ４は、本発明者ら自身の施設（E.N.）において作製されたＨＬＡ−Ａ２アロ反応性細胞傷害性Ｔエフェクタークローンであり、Milani et al., 2005に記載のようにして隔週の刺激により増幅した。この細胞は、刺激後７日目または８日目に細胞傷害性アッセイに用いた。ヒトＮＫ白血病性細胞系であるＮＫＬ（Robertson et al., 1996）およびＮＫ−９２（Gong et al., 1994）は、C.S. Falk（GSF-Institute of Molecular Immunology, Munich, Germany）の好意により供与され、１５％加熱不活性化ＦＣＳおよび１００Ｕ／ｍｌ 組換えＩＬ−２を含む培地において培養された。細胞傷害性アッセイに用いる前日に、培養物を、新鮮な培地において０．３×１０6細胞／ｍｌに調整した。
【０１６７】
蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析
細胞を１．５ｍＭ ＥＤＴＡ（Biochrom A, Berlin, Germany No. L2113）を含む１×ＰＢＳ中で剥離し、ヒトの下記タンパク質に特異的な抗体と氷上で６０分間、インキュベートした；ＴＩＭＰ−１（ＩＭ３２Ｌ）、ＭＭＰ−１（ＩＭ３５Ｌ−１００）、ＭＭＰ−３（ＩＭ３６Ｌ−１００）、ＭＭＰ−８（ＩＭ３８Ｌ）（CALBIOCHEM, Merck Darmstadt, Germany）；ＭＭＰ−９（ＩＭ  ６１−１００）、ＭＭＰ−２（ＩＭ  ５１Ｌ）（ONCOGENE, Bad Soden, Germany）；ＭＭＰ−７（ＭＡＢ９０７）、ＭＭＰ−１２（ＭＡＢ９１７）、ＭＭＰ−１４（ＭＡＢ９１８１）（R&D Systems, Minneapolis, USA）；ＭＭＰ−１３（ＩＭ４４Ｌ）、ＭＭＰ−１５（ＩＭ４８Ｌ）、ＭＭＰ−１６（ＩＭ５０Ｌ）（CALBIOCHEM, Merck Darmstadt, Germany）、およびＩｇＧ１κ（SIGMA-AlDRICH, Taufkirchen, Germany No. M9269。ＩＣＡＭ−１およびＨＬＡ抗体（Ｗ６／３２およびＨＢ８２）については以前に記載した（Johnson et al., 1988; Barnstable et al., 1978; Parham & Brodsky, 1981）。抗ＦＡＳ（H. Engelmann、未発表データ）、抗ＴＮＦ−ＲＩ、抗ＴＮＦ−ＲＩＩ、およびアイソタイプ対照抗体はBigda et al., 1994に記載のように用いた。細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、ＦＴＩＣ標識ロバ抗マウスモノクローナル抗体（DAKO A/S, Glostrup, Denmark No. F0313）と氷上で４５分間インキュベートし、その後、１×ＰＢＳで３回洗浄し、フローサイトメーター（FACSCalibur, Becton, Dickinson and Company, San Jose, CA, USA）およびCellQuestソフトウェアを用いて分析した。抗ＢＣＬ−２抗体（ALX-804-225）および抗ＢＡＸ抗体（ANC-357-040）はALEXIS（Grunberg, Germany）から取得した。
【０１６８】
ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩタンパク質の精製
ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩタンパク質は、Djafarzadeh, et al., 2004に記載のように製造および精製した。略説すると、ヒトＴＩＭＰ−１を、ｈＴＩＭＰ−１特異的プライマーを用いてｃＤＮＡからクローニングし、ＬＦＡ−３からクローニングされたＧＰＩ−シグナル配列（Kirby et al., 1995; Mdedof et al., 1996）へ翻訳終止コドンなしに融合し、ｐＥＦ−ＤＨＦＲへサブクローニングし、ＤＨＦＲ欠損チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞へ安定に導入し、Mack et al., 1995に記載のように選抜した。ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ融合タンパク質を、界面活性剤Triton X-100による抽出によりＣＨＯ細胞から精製し、続いて、ＤＥＡＥ、ヘパリンセファロース、およびサイズ排除を用いたカラム精製を行った（Djafarzadeh et al., 2004）。
【０１６９】
ＴＩＭＰ−１  ＥＬＩＳＡ
製造会社の説明書に従ったプロトコールによるヒトＴＩＭＰ−１特異的ＥＬＩＳＡ（ＭＡＢ９７０, R&D Systems）で、溶液中のＴＩＭＰ−１のレベルをモニターした。コーティング化抗ヒトＴＩＭＰ−１ ｍＡＢ（ＭＡＢ９７０）、ビオチン化抗ヒトＴＩＭＰ−１検出ｍＡＢ（ＢＡＦ９７０）、およびｒｈＴＩＭＰ−１タンパク質（９７０−ＴＭ）は、R&D Systems GmbH(Wiesbaden, Germany)から購入した。
【０１７０】
ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩの細胞膜への組み入れ
ＲＣＣ−５３細胞（５〜１０×１０6細胞／ｍｌ）を、３７℃／５％ＣＯ2において、２００〜７００ｎｇ／ｍｌの精製されたｈＴＩＭＰ−１−ＧＰＩとインキュベートした。その後、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、ヒトＴＩＭＰ−１特異的モノクローナル抗体（上記参照）を用いてＦＡＣＳにより分析した。
【０１７１】
ホスホリパーゼＣによるＧＰＩアンカー切断
細胞（５〜１０×１０6細胞／ｍｌ）を、無血清培地内で、２００ｎｇまたは７００ｎｇのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩまたはｒｈＴＩＭＰ−１タンパク質と、５％ＣＯ2／３７℃で１時間インキュベートした。これらの細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、３７℃／５％ＣＯ2で３０分間、無血清培地内で、６０ｎｇ／ｍｌ ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen, Germany No. 661-9）で処理した。細胞を３回洗浄し、すべての上清を回収した。
【０１７２】
増殖
ＲＣＣ−５３、Ａ４９８、またはＲＣＣ−２６細胞（３０×１０3／１００μｌ培地）を９６ウェルマイクロタイタープレート内で２４時間、標準条件下で培養し、堅固に付着し、かつ安定に増殖した細胞を得た。上清を捨てた後、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、緩衝液、またはｒｈＴＩＭＰ−１を含む５０μｌの培地を細胞に加え、２４〜７２時間、インキュベートした。次に、（３，５−ジメチルチアゾール−２−イル−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド）ＭＴＴ（SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen, Germany No. M2128）の１ｍｇ／ｍｌ溶液を５０μｌ加えた。３７℃での３時間のインキュベーション後、ホルマザン結晶を、１００μｌのイソプロパノールおよび０．０４Ｎ ＨＣｌの添加により溶解した。続いて、GENios plus TEC AN ELISAリーダーを用いて５５０ｎｍの吸光度を測定した。各実験について少なくとも６ウェルを、実験条件および時点ごとに分析した。
【０１７３】
酵素電気泳動法
ＲＣＣ−５３細胞を２４ウェルプレート内で培養した（５×１０4細胞／ウェル）。培地を、ｒｈＴＩＭＰ−１か増加性量のＴＩＭＰ−１−ＧＰＩのいずれかを含む無血清培地と２４時間で交換し、２４時間、４８時間、および７２時間、インキュベートした。Djafarzadeh et al., 2004記載のように、細胞上清を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Invitrogen, Groningen, Netherlands, No. EC61755BOX）を用いるゼラチン酵素電気泳動法により分析した。組換えＭＭＰ−９酵素（Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden, No. RPN2634）を陽性対照として用いた。
【０１７４】
細胞外浸潤アッセイ
細胞のＥＣＭに浸潤する能力に対するＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ処理対ｒｈＴＩＭＰ−１処理の効果を、市販の細胞浸潤アッセイ（Chemicon International Inc., Temedula, CA, No. ECM 555）を用いて評価した。まず、ＲＣＣ−５３細胞のＥＣＭに浸潤する能力について分析した。インサートの底における浸潤された細胞を、添付のプロトコールに記載のように、剥離し、溶解し、CyQuant色素により検出した。２ｎｇ／ｍｌ〜８ｎｇ／ｍｌの増加性レベルの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を、浸潤を増強するために用いた。最適な遊走は、４ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦで見られた（データ非提示）。次に、対照ｒｈＴＩＭＰ−１またはＲＩＭＰ−１−ＧＰＩの３５０ｎｇ／ｍｌおよび７００ｎｇ／ｍｌでの処理の遊走への効果を測定した。ＴＩＭＰ薬剤の潜在的効果を定量するために、４ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦに対するＲＣ−５３細胞のベースライン遊走を０に設定した。ＶＥＧＦ誘導性遊走に対する１００％「阻害」の値を、ＶＥＧＦの非存在下におけるＲＣＣ−５３細胞の遊走／浸潤として設定した。ｒｈＴＩＭＰまたはＴＩＭＰ−１−ＧＰＩのＲＣＣ−５３細胞浸潤への結果として生じた効果を、「最大」値に対するパーセント変化（負または正）として計算した。
【０１７５】
アポトーシスのアネキシンＶ検出
単細胞レベルでのアポトーシス細胞対壊死細胞の検出および定量は、アネキシンＶ−ＦＬＵＯＳ染色キット（Becton, Dickinson and Company, Heidelberg, Germany, No. 556547）を用いて行った。ＲＣＣ−５３細胞を、２４ウェルプレートへ１×１０6細胞／ウェルで播種し、一晩、付着させた。その後、ウェルを１×ＰＢＳで３回すすぎ、１ｍｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地を加え、続いて、７００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩまたはｒｈＴＩＭＰ−１を加えた。細胞を３７℃／５％ＣＯ2で２４時間インキュベートした。２４時間後、１μｇ／ｍｌ抗ＦＡＳ活性化ｍＡＢ Ｌ−９５７（H. Engelmann、未発表データ）またはアイソタイプ対照を加え、３７℃／５％ＣＯ2で１６時間、さらにインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、ペレットにし、室温で１５分間、染色溶液（アネキシンＶ−フルオレセイン標識試薬およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含むＨｅｐｅｓ緩衝液）に再懸濁した。その後、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。経時変化を調べた結果、ＲＣＣ細胞におけるアネキシンＶ結合がＰＩ反応性に先行していた。
【０１７６】
クロマチン特異的ＥＬＩＳＡによるアポトーシスの測定
アポトーシスについては、Roche社のCell Death Detection ELISA Plusキット(Pensberg, Germany, No. 1774425)を用いて調べた。ＲＣＣ−５３細胞を、４×１０4細胞／ウェルの濃度で９６ウェルディッシュへ播種し、一晩、付着させた。ウェルを１×ＰＢＳで３回すすぎ、２００μｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地を各ウェルへ加え、続いて、７００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩまたはｒｈＴＩＭＰ−１を加えた。その後、細胞を３７℃／５％ＣＯ2で２４時間インキュベートした。ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩまたはｒｈＴＩＭＰ−１との２４時間インキュベーション後、１μｇ／ｍｌ 活性化抗ＦＡＳｍＡＢ Ｌ−９５７またはアイソタイプ対照モノクローナル抗体を加え、３７℃／５％ＣＯ2で１６時間インキュベートした。その後、プレートを遠心分離し、上清を注意深く除去した。細胞ペレットを、製造会社により提供された２００ｍｌの溶解緩衝液へ３０分間置き、遠心分離した。上清のアリコート（２０μｌ）を、細胞質ヌクレオソームの存在を検出するための抗ＤＮＡ抗体および抗ヒストン抗体を用いたＥＬＩＳＡに用いた
【０１７７】
ウェスタンブロット
ウェスタンブロットは、無血清増殖培地におけるＭＭＰの検出に用いられた。用いた抗ＭＭＰ抗体については、上記（ＦＡＣＳ分析）されている。以下を含む組換えヒトＭＭＰウェスタンブロッティングスタンダードは、R&D Systems(Minneapolis, USA)から購入した；ＭＭＰ−１（ＷＢＣ０２４）、ＭＭＰ−２（ＷＢＣ０２５）、ＭＭＰ−３（ＷＢＣ０１５）、ＭＭＰ−８（ＷＢＣ０１７）、ＭＭＰ−１２（ＷＢＣ０１９）、およびＭＭＰ−１３（ＷＢＣ０２０）。ウェスタンブロットはまた、ＢＣＬ−２、ＢＡＸ（モノクローナル抗体について上記参照）、およびβ−アクチン（Acris Hiddenhausen, Germany, No. ab8227）の検出にも用いた。全タンパク質は、市販のウェスタンブロット分析キットChemiluminescent Immunodetection System(Invitrogen, Groningen, Netherlands)を用いて検出した。
【０１７８】
細胞媒介性細胞傷害性
標的細胞をＣｒ51で１〜２時間標識し、９６−Ｖ底プレートで、ウェルあたり２０００細胞の一定細胞数のエフェクター細胞と共インキュベートした。エフェクター細胞の４段階滴定の二連測定を、すべての実験において採用した。自発性遊離および最大遊離を、それぞれ、標的細胞のみをインキュベートすることにより、および標識細胞を直接カウントすることにより、測定した。加湿５％ＣＯ2雰囲気における３７℃での４時間のインキュベーション後、上清を回収し、Lumaplate固体シンチレーションマイクロプレートへ移し、一晩乾燥させ、TopCountマイクロプレートシンチレーションカウンター（Packard, Meriden, CT）上でカウントした。各Ｅ：Ｔ比について、溶解のパーセンテージを以下のとおり計算した：％特異的溶解＝（実験ｃｐｍ−自発性ｃｐｍ／最大ｃｐｍ−自発性ｃｐｍ）×１００。標的細胞の自発性遊離は、常に総最大遊離の＜１５％であった。
【０１７９】
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【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１−１】ＲＣＣの細胞膜へのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ組み入れ：Ａ．ＧＰＩ−ＴＩＭＰ−１タンパク質の細胞膜への再組み入れを実証するために、精製されたＴＩＭＰ−１−ＧＰＩまたは対照ｒｈＴＩＭＰ−１を天然ＲＣＣ−２６、ＲＣＣ−５３、およびＡ４９８細胞へ加えた。ＦＡＣＳ分析により細胞表面上でＴＩＭＰ−１を検出した。灰色ヒストグラムは、アイソタイプ対照染色であり、実線ヒストグラムはＴＩＭＰ−１抗体染色を表す。
【図１−２】ＲＣＣの細胞膜へのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ組み入れ：Ｂ．２００ｎｇ／ｍｌまたは７００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩまたはｒｈＴＩＭＰ−１とのインキュベーション後のＧＰＩ結合を実証するために、細胞を６０ｎｇ／ｍｌ ＰＬＣで処理し、その後、ＦＡＣＳ分析に供した。灰色ヒストグラムはアイソタイプ対照を表す。Ｃ．ヒトＴＩＭＰ−１ ＥＬＩＳＡにより、ＰＬＣ消化後にＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ処理されたＲＣＣ細胞から遊離されたＴＩＭＰ−１タンパク質の量を測定した。
【図２】ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩはＲＣＣ−５３からのプロＭＭＰ−２とプロＭＭＰ−９の遊離を阻害する。  酵素電気泳動法により、ＲＣＣ−５３からのＭＭＰ−２タンパク質とＭＭＰ−９タンパク質の分泌を調べた。細胞を増加性量のＴＩＭＰ−１−ＧＰＩまたは対照ｒｈＴＩＭＰ−１で処理し、４８時間後、無血清培養上清を取り出し、ゼラチナーゼ酵素電気泳動法により分析した。
【図３−１】ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩでの処理後のＭＭＰの表面発現：  ＲＣＣ５３細胞を７００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩタンパク質と２４時間インキュベーションした後、以下の各物質に特異的に反応する抗体を用いてＦＡＣＳ分析を行った：（Ａ）ＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、およびＭＭＰ−９、または（Ｂ）ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１６、ＨＬＡ−Ａ２（ＨＢ８２）、汎ＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２）、およびＩＣＡＭ−１。追加の対照として、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩを、ＰＬＣ処理（図１参照）１時間後に表面から切断した。灰色ヒストグラムは、アイソタイプ対照染色であり、実線ヒストグラムはＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ処理された試料を表す。
【図３−２】ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩでの処理後のＭＭＰの表面発現：  ＲＣＣ５３細胞を７００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩタンパク質と２４時間インキュベーションした後、以下の各物質に特異的に反応する抗体を用いてＦＡＣＳ分析を行った：（Ａ）ＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、およびＭＭＰ−９、または（Ｂ）ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１６、ＨＬＡ−Ａ２（ＨＢ８２）、汎ＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２）、およびＩＣＡＭ−１。追加の対照として、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩを、ＰＬＣ処理（図１参照）１時間後に表面から切断した。灰色ヒストグラムは、アイソタイプ対照染色であり、実線ヒストグラムはＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ処理された試料を表す。
【図３−３】ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩでの処理後のＭＭＰの表面発現：Ｃ．一連のＭＭＰのＲＣＣ５３からの分泌について、ウェスタンブロットならびにＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１２、およびＭＭＰ−１３に対するモノクローナル抗体を用いて試験した。７００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＩＭＰ−１あるいはＴＩＭＰ−１−ＧＰＩでＲＣＣ−５３を処理して２４時間後に培地（無血清）を採取し、未処理の対照細胞と比較した。Ｄ．ＭＭＰの細胞表面隔離の、マトリゲルモデル基底膜を通ってのＲＣＣ−５３浸潤への効果を評価した。ＶＥＧＦ（４ｎｇ／ｍｌ）に対するＲＣＣ−５３細胞の最適な遊走をベースラインまたは「ゼロ」に設定し、ＶＥＧＦシグナル無しでの未処理のＲＣＣ−５３について見られる遊走値を１００％阻害値とした。ＲＣＣ−５３細胞を、３５０ｎｇ／ｍｌもしくは７００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＩＭＰ−１或いはＴＩＭＰ−１−ＧＰＩのいずれかで前処理した。１時間後に細胞を洗浄し、遊走チャンバーに加え、遊走への効果を評価した。提示されたデータは、４つのウェルおよび２つの実験からの平均を表す。
【図４】ｒｈＴＩＭＰ−１タンパク質およびＴＩＭＰ−１−ＧＰＩタンパク質のＲＣＣ細胞系の増殖への効果：  ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩタンパク質またはｒｈＴＩＭＰ−１対照タンパク質の増加レベルが、ＲＣＣ−５３（Ａ）、Ａ４９８（Ｂ）、ＲＣＣ−２６（Ｃ）の増殖に与える影響について、ＭＴＴアッセイを用いて調べた。示されているように、２４時間後、４８時間後、または７２時間後にＭＭＴを加えた。
【図５】ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩはパーフォリン媒介性アポトーシスに対するＲＣＣの感受性に影響を与えない。  ＲＣＣ細胞を、未処理（■）、７００ｎｇ／ｍｌ ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ（◇）、またはｒｈＴＩＭＰ−１タンパク質（○）で２４時間処理し、ＣＴＬ ＪＢ４（Ａ）或いはＮＫ細胞系（Ｂ）（ＲＣＣ−５３およびＡ４９８についてＮＫＬ、またはＲＣＣ−２６についてＮＫ−９２）のいずれかとインキュベートした。類似した結果をもつ３つの独立した実験の代表的な例が示されている。
【図６−１】ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩはＦＡＳの発現を増加させないが、細胞をＦＡＳ誘導性アポトーシスに対して感受性にする。Ａ．ＲＣＣ−５３、ＲＣＣ−２６、またはＡ４９８細胞を、７００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩまたはｒｈＴＩＭＰ−１で２４時間処理し、または処理せず、抗ヒトＦＡＳ（Ｌ−９５８）で染色し、フローサイトメトリーによりＦＡＳの表面発現について分析した。モノクローナル抗体アイソタイプ対照染色については灰色ヒストグラムで示している。  これら３つのＲＣＣ細胞系を、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩまたはｒｈＴＩＭＰ−１で処理し、続いてＬ−９５７とインキュベートした。フローサイトメトリーによって生存可能かつ初期のアポトーシスを検出するために、アネキシンＶ−フルオロイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の結合を用いた。
【図６−２】ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩはＦＡＳの発現を増加させないが、細胞をＦＡＳ誘導性アポトーシスに対して感受性にする。  （Ｂ）におけるＲＣＣ−５３細胞の低レベルのアポトーシスについて、より感度の高い細胞質ヌクレオソームＥＬＩＳＡを用いて検証した。Ｌ−９５７とのインキュベーション後、アポトーシスのレベル増加がＴＩＭＰ−１−ＧＰＩのレベル増加とともに検出されたが、ｒｈＴＩＭＰ−１では検出されなかった。
【図６−３】ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩはＦＡＳの発現を増加させないが、細胞をＦＡＳ誘導性アポトーシスに対して感受性にする。
【図７−１】内部ＦＡＣＳ染色およびウェスタンブロットにより分析された、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩまたはｒｈＴＩＭＰ−１での処理後のＲＣＣにおけるＢＣＬ−２とＢＡＸの発現：  ＲＣＣ−５３（Ａ）、ＲＣＣ−２６（Ｂ）、およびＡ４９８（Ｃ）細胞を、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩまたはｒｈＴＩＭＰ−１と２４時間プレインキュベートし、その後、Ｌ−９５７活性化ＦＡＳ抗体でさらに１６時間処理した。細胞を、抗ＢＣＬ−２および抗ＢＡＸモノクローナル抗体でフローサイトメトリーを用いて分析した。並行して、タンパク質を抽出し、ウェスタンブロットにより評価した。ＢＡＸおよびＢＣＬ−２由来のシグナルは、デンシトメトリー後、β−アクチンレベルに対して標準化された。ＦＡＣＳの結果は、ＢＣＬ−２抗体もしくはＢＡＸ抗体、または対応のアイソタイプ抗体のいずれかのＭＦＩに対応する括弧内の値と共にヒストグラムで表わしている。
【図７−２】内部ＦＡＣＳ染色およびウェスタンブロットにより分析された、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩまたはｒｈＴＩＭＰ−１での処理後のＲＣＣにおけるＢＣＬ−２とＢＡＸの発現：  ＲＣＣ−５３（Ａ）、ＲＣＣ−２６（Ｂ）、およびＡ４９８（Ｃ）細胞を、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩまたはｒｈＴＩＭＰ−１と２４時間プレインキュベートし、その後、Ｌ−９５７活性化ＦＡＳ抗体でさらに１６時間処理した。細胞を、抗ＢＣＬ−２および抗ＢＡＸモノクローナル抗体でフローサイトメトリーを用いて分析した。並行して、タンパク質を抽出し、ウェスタンブロットにより評価した。ＢＡＸおよびＢＣＬ−２由来のシグナルは、デンシトメトリー後、β−アクチンレベルに対して標準化された。ＦＡＣＳの結果は、ＢＣＬ−２抗体もしくはＢＡＸ抗体、または対応のアイソタイプ抗体のいずれかのＭＦＩに対応する括弧内の値と共にヒストグラムで表わしている。
【図７−３】内部ＦＡＣＳ染色およびウェスタンブロットにより分析された、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩまたはｒｈＴＩＭＰ−１での処理後のＲＣＣにおけるＢＣＬ−２とＢＡＸの発現：  ＲＣＣ−５３（Ａ）、ＲＣＣ−２６（Ｂ）、およびＡ４９８（Ｃ）細胞を、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩまたはｒｈＴＩＭＰ−１と２４時間プレインキュベートし、その後、Ｌ−９５７活性化ＦＡＳ抗体でさらに１６時間処理した。細胞を、抗ＢＣＬ−２および抗ＢＡＸモノクローナル抗体でフローサイトメトリーを用いて分析した。並行して、タンパク質を抽出し、ウェスタンブロットにより評価した。ＢＡＸおよびＢＣＬ−２由来のシグナルは、デンシトメトリー後、β−アクチンレベルに対して標準化された。ＦＡＣＳの結果は、ＢＣＬ−２抗体もしくはＢＡＸ抗体、または対応のアイソタイプ抗体のいずれかのＭＦＩに対応する括弧内の値と共にヒストグラムで表わしている。
【図８】組織リモデリングおよび線維症の概観：  創傷治癒過程中のＥＣＭ産生とターンオーバーとの微妙なバランスに関与する因子の複雑な相互作用を描く概略図。
【図９】ｒｈＴＩＭＰ−１の存在下における線維芽細胞のフィブロネクチン産生へのＴＩＭＰ融合構築物の効果：  線維芽細胞をｒｈＴＩＭＰ−１とＴＩＭＰ−１−ＧＰＩの存在下または非存在下で集密的になるまで培養した；発現および分泌されたフィブロネクチンを、抗フィブロネクチン抗体（対照としてβ−アクチン）を用いるウェスタンブロット分析により定量した。ｒｈＴＩＭＰ−１（７００ｎｇ／ｍｌにおける）存在下ではフィブロネクチン発現の有意な減少は全く見られなかったが、ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ存在下（７００ｎｇ／ｍｌ）では線維芽細胞が分泌するフィブロネクチンは強力に低下した
【図１０】ＴＮＦ−αの存在下における線維芽細胞のフィブロネクチン産生へのＴＩＭＰ融合構築物の効果：  線維芽細胞を、１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞活性化ＴＮＦ−αの存在下（図１０Ａ）または非存在下（図１０Ｂ）において、３５０ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌの変性ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、および７００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、それぞれと共に培養した。ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩの３５０ｎｇ／ｍｌの濃度において、転写されたフィブロネクチンＲＮＡは、ＴＮＦ−αが培地に存在するかしないかに関係なく、有意に低下した。
【図１１】ＴＩＭＰ融合構築物の線維芽細胞のＩＬ−６産生への効果：  線維芽細胞により転写されるフィブロネクチンＲＮＡについて、ＩＬ−６ ＲＮＡに対するプローブを用いてノーザンブロット分析により評価した。すなわち、線維芽細胞を、１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞活性化ＴＮＦ−αの存在下（図１１Ａ）または非存在下（図１１Ｂ）において、３５０ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌの変性ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、および７００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、それぞれと共に培養した。３５０ｎｇ／ｍｌ濃度のＴＩＭＰ−１−ＧＰＩにおいて、転写されたＩＬ−６ ＲＮＡは、ＴＮＦ−αが培地に存在するかしないかに関係なく、著しく低下した。
【図１２−１】ＴＩＭＰ融合構築物の線維芽細胞のコラーゲン産生への効果：  線維芽細胞により転写されるフィブロネクチンＲＮＡについて、コラーゲン１Ａ１（図１２ＡおよびＢ）、コラーゲン４Ａ２（図１２ＣおよびＤ）、およびコラーゲン１６Ａ１（図１２ＥおよびＦ）に対するプローブを用いるノーザンブロット分析によりそれぞれ評価した。すなわち、線維芽細胞を、１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞活性化ＴＮＦ−αの存在下（図１２Ａ、Ｃ、Ｅ）または非存在下（図１２Ｂ、Ｄ、Ｆ）において、３５０ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌの変性ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、それぞれと共に培養した。３５０ｎｇ／ｍｌ濃度のＴＩＭＰ−１−ＧＰＩにおいて、すべての３つの転写されたコラーゲンＲＮＡは、ＴＮＦ−αが培地に存在するかしないかに関係なく、有意に低下した。
【図１２−２】ＴＩＭＰ融合構築物の線維芽細胞のコラーゲン産生への効果：  線維芽細胞により転写されるフィブロネクチンＲＮＡについて、コラーゲン１Ａ１（図１２ＡおよびＢ）、コラーゲン４Ａ２（図１２ＣおよびＤ）、およびコラーゲン１６Ａ１（図１２ＥおよびＦ）に対するプローブを用いるノーザンブロット分析によりそれぞれ評価した。すなわち、線維芽細胞を、１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞活性化ＴＮＦ−αの存在下（図１２Ａ、Ｃ、Ｅ）または非存在下（図１２Ｂ、Ｄ、Ｆ）において、３５０ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌの変性ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、それぞれと共に培養した。３５０ｎｇ／ｍｌ濃度のＴＩＭＰ−１−ＧＰＩにおいて、すべての３つの転写されたコラーゲンＲＮＡは、ＴＮＦ−αが培地に存在するかしないかに関係なく、有意に低下した。
【図１２−３】ＴＩＭＰ融合構築物の線維芽細胞のコラーゲン産生への効果：  線維芽細胞により転写されるフィブロネクチンＲＮＡについて、コラーゲン１Ａ１（図１２ＡおよびＢ）、コラーゲン４Ａ２（図１２ＣおよびＤ）、およびコラーゲン１６Ａ１（図１２ＥおよびＦ）に対するプローブを用いるノーザンブロット分析によりそれぞれ評価した。すなわち、線維芽細胞を、１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞活性化ＴＮＦ−αの存在下（図１２Ａ、Ｃ、Ｅ）または非存在下（図１２Ｂ、Ｄ、Ｆ）において、３５０ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌの変性ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、それぞれと共に培養した。３５０ｎｇ／ｍｌ濃度のＴＩＭＰ−１−ＧＰＩにおいて、すべての３つの転写されたコラーゲンＲＮＡは、ＴＮＦ−αが培地に存在するかしないかに関係なく、有意に低下した。
【図１３】ＴＩＭＰ融合構築物の線維芽細胞のＴＧＦ−β産生への効果：  線維芽細胞により転写されるフィブロネクチンＲＮＡについて、ＴＧＦ−βに対するプローブを用いるノーザンブロット分析により評価した。すなわち、線維芽細胞を、１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞活性化ＴＮＦ−αの存在下（図１３Ａ）または非存在下（図１３Ｂ）において、３５０ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌの変性ＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、７００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＩＭＰ−１−ＧＰＩ、それぞれと共に培養した。３５０ｎｇ／ｍｌ濃度のＴＩＭＰ−１−ＧＰＩにおいて、ＴＧＦ−β ＲＮＡは、ＴＮＦ−αが培地に存在するかしないかに関係なく、かつ培地のＦＣＳ含量に関係なく、ほとんど検出されなかった。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【配列表】
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