(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的配列に対応する２本鎖ＲＮＡの生成のためのＤＮＡ構築物の使用であって、
ＤＮＡ構築物が、
ａ）第一のプロモータと、
ｂ）第二のプロモータと、
第一のプロモータ及び第二のプロモータは互いに対立して配位しており、第一のプロモータの３´末端下流及び第二のプロモータの３´末端下流に位置する、インタープロモータ領域を定義し、
ｃ）インタープロモータ領域に位置する、少なくとも１つのクローニング部位と、
ｄ）少なくとも１つのクローニング部位に挿入された、目的配列に対応するヌクレオチド配列と、
ｅ）第一のプロモータの３´末端側から見て、第一のプロモータの下流及び目的配列に対応するヌクレオチド配列の下流に位置する、第一の転写ターミネータと
を含み、
第一の転写ターミネータは、第一のプロモータに操作的に連結されている、前記使用。
【請求項２】
ＤＮＡ構築物が、
ｆ）第二のプロモータの３´末端側から見て、第二のプロモータの下流及び目的配列に対応するヌクレオチド配列の下流に位置する、第二の転写ターミネータを更に含み、
前記第二の転写ターミネータが第二のプロモータに操作的に連結されている、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
第一の転写ターミネータが、第一のプロモータの３´末端側から見て第一のプロモータの下流、目的配列に対応するヌクレオチド配列の下流、及び第二のプロモータの５´末端下流に位置している、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
第二の転写ターミネータ−が、インタープロモータ領域に位置している、請求項２又は３に記載の使用。
【請求項５】
第二の転写ターミネータが、第二のプロモータの３´末端側から見て第二のプロモータの下流、目的配列に対応するヌクレオチド配列の下流、及び第一のプロモータの５´末端下流に位置している、請求項２又は３に記載の使用。
【請求項６】
第一の転写ターミネータの３´末端が、第二のプロモータの５´末端から、２０００以下のヌクレオチド隔てられた、請求項３〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
第一の転写ターミネータの３´末端が、第二のプロモータの５´末端から、１０００以下のヌクレオチド隔てられた、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
第一の転写ターミネータの３´末端が、第二のプロモータの５´末端から、５００以下のヌクレオチド隔てられた、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
第一の転写ターミネータの３´末端が、第二のプロモータの５´末端から、２００以下のヌクレオチド隔てられた、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
第一の転写ターミネータの３´末端が、第二のプロモータの５´末端から、１００以下のヌクレオチド隔てられた、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
第一の転写ターミネータの３´末端が、第二のプロモータの５´末端から、５０以下のヌクレオチド隔てられた、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
第一の転写ターミネータの３´末端が、第二のプロモータの５´末端から、２０以下のヌクレオチド隔てられた、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
第一の転写ターミネータの３´末端が、第二のプロモータの５´末端から、１０以下のヌクレオチド隔てられた、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
第一の転写ターミネータの３´末端が、第二のプロモータの５´末端から、６以下のヌクレオチド隔てられた、請求項６に記載の使用。
【請求項１５】
第二の転写ターミネータの３´末端が、第一のプロモータの５´末端から、２０００以下のヌクレオチド隔てられた、請求項５又は６に記載の使用。
【請求項１６】
第二の転写ターミネータの３´末端が、第一のプロモータの５´末端から、１０００以下のヌクレオチド隔てられた、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
第二の転写ターミネータの３´末端が、第一のプロモータの５´末端から、５００以下のヌクレオチド隔てられた、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
第二の転写ターミネータの３´末端が、第一のプロモータの５´末端から、２００以下のヌクレオチド隔てられた、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
第二の転写ターミネータの３´末端が、第一のプロモータの５´末端から、１００以下のヌクレオチド隔てられた、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
第二の転写ターミネータの３´末端が、第一のプロモータの５´末端から、５０以下のヌクレオチド隔てられた、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
第二の転写ターミネータの３´末端が、第一のプロモータの５´末端から、２０以下のヌクレオチド隔てられた、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
第二の転写ターミネータの３´末端が、第一のプロモータの５´末端から、１０以下のヌクレオチド隔てられた、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
第二の転写ターミネータの３´末端が、第一のプロモータの５´末端から、６以下のヌクレオチド隔てられた、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
第一のプロモータと第二のプロモータが同一である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
第一のプロモータと第二のプロモータが同一でない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
第一のプロモータと第二のプロモータが、Ｔ７プロモータ、Ｔ３プロモータ、ＳＰ６プロモータから独立して選択される、請求項２４又は２５に記載の使用。
【請求項２７】
クローニング部位が、少なくとも１つの制限部位を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
クローニング部位が、スタッファーＤＮＡ配列の側面に位置している少なくとも２つの制限部位を含む、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
少なくとも２つの制限部位が同一である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
少なくとも１つの制限部位又は少なくとも２つの制限部位が、ＢｓｔＸＩ部位である、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
制限部位がＸｃｍＩ部位である、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３２】
クローニング部位が、ａｔｔＲ１及びａｔｔＲ２組換え配列を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３３】
クローニング部位が、ｃｃｄＢヌクレオチド配列を更に含む、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
ｃｃｄＢヌクレオチド配列が、少なくとも１つのユニークな制限部位を更に含む、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
少なくとも１つのユニークな制限部位が、平滑末端制限部位である、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
平滑末端制限部位がＳｒｆＩ部位である、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
ＤＮＡ構築物がプラスミド又はベクターの形態にある、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３８】
少なくとも１つのクローニング部位に挿入された、目的配列に対応するヌクレオチド配列を有しないプラスミド又はベクターが、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２又は配列番号１３に例示されたヌクレオチド配列を有する、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
２本鎖ＲＮＡの生成のためのＤＮＡ構築物が菌株に宿している請求項１〜３８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４０】
前記菌株が大腸菌株である、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
菌株が線虫に与えられる、請求項３９又は４０に記載の使用。
【請求項４２】
菌株がＣ．  ｅｌｅｇａｎｓに与えられる、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
菌株がＣ．  ｅｌｅｇａｎｓ  ｎｕｃ−ｌ変異体に与えられる、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
生成された２本鎖ＲＮＡがＲＮＡ阻害に使用される、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４５】
生成された２本鎖ＲＮＡが、線虫におけるＲＮＡ阻害に使用される、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
生成された２本鎖ＲＮＡが、Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓにおけるＲＮＡ阻害に使用される、請求項４５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２本鎖ＲＮＡの発現に用いられる改良型ベクター構築物に関し、より詳細には、インビトロおよびインビボでの２本鎖ＲＮＡの発現に用いられる改良型ベクター構築物に関する。
【背景技術】
【０００２】
２本鎖ＲＮＡ阻害（ＲＮＡｉ）効果の出現以来、遺伝子発現を制御するツールとして、ＷＯ９９／３２６１９およびＷＯ００／０１８４６に記述されるように、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成のために設計された専用ベクターの必要性が認識されている。
【０００３】
ハイレベルのｄｓＲＮＡを生成するために設計されたクローニングベクターについては、過去にＰｌａｅｔｉｎｃｋ他（ＷＯ００／０１８４６）およびＴｉｍｍｏｎｓ他（Ｎａｔｕｒｅ誌３９５〜８５４（１９９８年））によって説明がなされている。これらのベクターは一般的にはマルチプルクローニング部位（ＭＣＳ）を含み、向かい合わせの２つの転写プロモータが隣接するＭＣＳに、目的とするＤＮＡ断片をクローニングすることができる。基本的に、これらの３つのコンポーネント（プロモータ１、ＭＣＳおよびプロモータ２）が全体システムを構成する。適切な発現システムでは、ＭＣＳにクローニングされたＤＮＡが両方向に転写され、それによって２本の相補的ＲＮＡ鎖が生成されることになる。
【０００４】
周知のシステムの欠点は、クローニングされた断片以外も転写されてしまうということである。ＲＮＡポリメラーゼによる読み取りによって、ベクター全体が転写され、しかもそれは両方向での転写となる。クローニングされたＤＮＡ断片の転写に限って、ＲＮＡｉに適した活性ｄｓＲＮＡが得られることになるので、上記ベクター部分の転写は、無用で非効率的なＲＮＡをもたらす。より詳細には、これら転写の８０％が非特異的であり、従って非効果的であるとみなすことができる。
【０００５】
先行技術のプラスミドおよび発現システムによって生成される大量の非特異的ＲＮＡは、好ましくない副作用をもたらす。第１に、ｄｓＲＮＡを発現するＥ．ｃｏｌｉのような導入媒体を介するＣ．ｅｌｅｇａｎｓへのｄｓＲＮＡ導入に基づくＲＮＡｉプロトコルにおいて（ＷＯ  ００／０１８４６参照）、大型のＲＮＡ鎖は導入媒体にとって有毒であると考えられる。結果として、Ｅ．  ｃｏｌｉに蓄積する大量のＲＮＡが個体数の大部分を死滅させる。第２に、おそらく更に重要となるであろうが、阻害能力が低下することである。大量の非特異的ｄｓＲＮＡの存在により、特定配列に拮抗的な環境をもたらす。これらの非特異的領域が大きいので、例えばＣ．  ｅｌｅｇａｎｓ細胞内で、テンプレートに従うｄｓＲＮＡ配列の、目的とするタンパク質の発現を阻止する能力は低下する。また、そのような非特異的ｄｓＲＮＡによる阻害については、Ｔｕｓｈｌ他のＧｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３：３１９１−３１９７（１９９９年）でもショウジョウバエで示されている。遺伝子発現を阻害する能力に影響を及ぼすだけでなく、特異的ｄｓＲＮＡの生成量を制限する。第３に、ベクターバックボーン部の転写、より詳細には、複製および関連構造の起点の転写は、プラスミドの不安定性とプラスミドの再組織化を招くので、ｄｓＲＮＡ生成を減少させる。効果的なｄｓＲＮＡの濃度がこのように比較的低いと、今度は非効率的なＲＮＡｉを招くことになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
結論として、上記ベクターには以下の欠点がある。すなわち、導入媒体にとって有毒である。転写による非特異的生成の比率が高まるほど、その非特異的領域の存在によってｄｓＲＮＡの阻害能力が低下する。プラスミドが再組織化したり、プラスミドが導入媒体から欠損する率が高い。従って、本発明の目的は、ｄｓＲＮＡ生成に関し、先行技術のベクターの欠点を回避する改良型ベクターを提供することである。
【０００７】
ＲＮＡ転写のインビトロ合成、例えばＲＮＡプローブの生成で用いられるベクターは、かねてから当該技術分野では周知であり、普通に用いられてきた（例えば、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他（編集人）によるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４年）；Ｊｅｎｄｒｉｓａｋ他の米国特許第４，７７６，０７２号、クローン化ＤＮＡ配列の一方の鎖のＲＮＡコピーをインビトロで生成するためのベクター）。標準的なインビトロ転写プロトコルでは、一般的に、所望の転写物の３’末端に位置する制限部位で転写ベクターを線形化することにより、ベクター配列の転写の読み取り問題を回避する。しかしながら、テンプレートが両方向に転写されることが重要であるインビボ転写またはｄｓＲＮＡ生成にとってこの解決策は適切ではない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ここで、本発明は、ｄｓＲＮＡ生成のための先行技術のベクターが遭遇する問題に対し、転写ターミネータの活用に基づく新規の解決策を提案する。概要を述べると、この解決策は、少なくとも１つのプロモータに操作的に連結された少なくとも１つの転写ターミネータの活用から成り、ターミネータは、プロモータが開始する転写を阻止する。そしてプロモータの３’末端とターミネータの５’末端との間に挿入されたどのＤＮＡ断片も転写され、ベクターバックボーンの望ましくない転写は行わない。以下で更に述べるように、ベクターは２つのプロモータおよび２つのターミネータで構成されることが好ましい。
【０００９】
従って、本発明の第一の局面によれば、インタープロモータ領域に隣接する向かい合わせの２つのプロモータを含むＤＮＡ構築物が提供され、この構築物は更に、前記プロモータのうちの一方のプロモータの転写領域下流に位置する少なくとも１つの転写ターミネータを含む。詳細には、本発明は、以下を含むＤＮＡ構築物を提供する：
ａ）第一のプロモータ、および
ｂ）第二のプロモータ
を含み；
第一および第二のプロモータは相互に反対の配向にあり、かつ
ｃ）第一のプロモータの３’末端の下流で、かつ第二のプロモータの３’末端の下流に位置するインタープロモータ領域を画成し；
ＤＮＡ構築物は更に：
ｄ）インタープロモータ領域に位置する少なくとも１つのクローニング部位；および
ｅ）第一のプロモータの下流で、かつ少なくとも１つのクローニング部位の下流に位置する（第一のプロモータの３’末端から見た場合）第一の転写ターミネータ；を含み、第一の転写ターミネータは第一のプロモータに操作的に連結される。
【００１０】
インタープロモータ領域は更に、以下の領域として画成することも可能である：第一のプロモータの３’末端と第二のプロモータの３’末端との間のＤＮＡ領域とし、この領域は、第一のプロモータの下流で、かつ第二のプロモータの下流にあり、第一のプロモータおよび第二のプロモータの５’末端を含まないことが好ましい。向かい合わせの第一のプロモータおよび第二のプロモータは、それぞれの５’末端から３’末端の方向への発現を促して３’末端の下流で転写を開始し、それによってインタープロモータ領域に存在するヌクレオチド配列の両鎖の転写が行われる。
【００１１】
本発明のＤＮＡ構築物内にある２つのプロモータは同一であっても異なっていてもよく、基本的にどのようなタイプであってもよい。この構築物で用いられるプロモータの厳密な性質は、ＤＮＡ構築物が機能すると予想される発現システムの性質に依存する（例：原核生物対真核生物宿主細胞）。バクテリオファージプロモータ、例えば、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６プロモータは、適切なＲＮＡポリメラーゼとの結合にのみ依存する高レベルな転写を可能にする利点を備えているので、本発明の構築物での使用に好ましい。それらのプロモータは個々に独立して選択することができる。また、ファージプロモータは多様な宿主システム、すなわち、原核生物および真核生物宿主の両方で機能できる。但し適切なポリメラーゼが宿主細胞に存在するものとする。
【００１２】
インタープロモータ領域に隣接する「向かい合わせの」２つのプロモータ構造は、一方のプロモータが転写の開始を促すことによってインタープロモータ領域のセンス鎖が転写され、他方のプロモータが転写の開始を促すことによってインタープロモータ領域のアンチセンス鎖が転写されるようになっており、この構造は、当該技術分野、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ（米国ウィスコンシン州マディソン）のベクターのｐＧＥＭ７シリーズで周知の構造である。
【００１３】
本発明のＤＮＡ構築物が先行技術のそれと異なる点は、一方のプロモータの転写領域下流に位置する少なくとも１つの転写ターミネータが存在することである。以下で説明するように、転写ターミネータは、一方向性または双方向性であり、一方向性あるいは双方向性ターミネータの選択は、インタープロモータ領域の内外のどちらにターミネータを配置するかによって影響を受ける。ターミネータは、原核生物や真核生物由来のターミネータであっても、ファージ由来のターミネータであってもよい。バクテリオファージターミネータ、例えばＴ７、Ｔ３およびＳＰ６ターミネータが特に好ましい。唯一の要件は、ターミネータが転写領域下流に位置することに関連して、プロモータで開始される転写をターミネータが終結させることができなくてはならないことである。実際に、それらはプロモータとターミネータが「機能的組み合わせ」を形成しなくてはならない。すなわち、プロモータで始動するＲＮＡポリメラーゼのタイプに対してターミネータが機能的でなくてはならないことを意味する。一例を挙げると、真核生物ＲＮＡｐｏｌＩＩプロモータと真核生物ＲＮＡｐｏｌＩＩターミネータは一般的に機能的組み合わせを形成する。バクテリオファージプロモータおよびターミネータを本発明の構築物に用いる場合、ファージプロモータとターミネータは両方ともポリメラーゼ特有であるので、機能的組み合わせの選択が特に重要になる。機能的組み合わせを形成するためには、プロモータとターミネータの両方が同一のポリメラーゼにとって特異的であるのがよい。例えば、Ｔ７プロモータとＴ７ターミネータ、Ｔ３プロモータとＴ３ターミネータ等。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（Ａ）〜（Ｅ）は、本発明によるＤＮＡ構築物のそれぞれ異なる実施の形態の概略図であり、プロモータおよび転写ターミネータエレメントの相対的配置を示す。
【図２】（Ａ）は、比較のために付した、先行技術のクローニングベクターの概略図である。（Ｂ）〜（Ｅ）は、本発明によるＤＮＡ構築物の更なる実施の形態の概略図であり、インタープロモータ領域内の異なるクローニング部位の活用を示す。
【図３】ｐＧＮ１を図示（プラスミドマップ）する。
【図４】ｐＧＮ９を図示（プラスミドマップ）する。
【図５】プラスミドｐＧＮ１の断片のヌクレオチド配列を図示し、向かい合わせのＴ７プロモータの位置を示すために注釈をつけた。
【図６】Ｔ７転写ターミネータのヌクレオチド配列を示す。
【図７】Ｔ７転写ターミネータをｐＧＮ１に挿入するために用いるオリゴヌクレオチド配列、ｏＧＮ２７、ｏＧＮ２８、ｏＧＮ２９、ｏＧＮ３０を示し、Ｔ７ｐｏｌターミネータ配列の位置および様々な制限部位の位置がマークされている。
【図８】プラスミドｐＧＮ９の断片のヌクレオチド配列を図示し、向かい合わせのＴ７プロモータおよびＴ７転写ターミネータの位置を示すために注釈をつけた。
【図９】（Ａ）は、ｐＧＮ２９を図示（プラスミドマップ）し、（Ｂ）はｐＧＮ３９を図示（プラスミドマップ）し、（Ｃ）はプラスミドＴｏｐｏＲＮＡｉを図示（プラスミドマップ）する。
【図１０】プラスミドｐＧＮ９の完全なヌクレオチド配列を示す。
【図１１】プラスミドｐＧＮ２９の完全なヌクレオチド配列を示す。
【図１２】プラスミドｐＧＮ３９の完全なヌクレオチド配列を示す。
【図１３】プラスミドＴｏｐｏＲＮＡｉの完全なヌクレオチド配列を示す。
【図１４】プラスミドｐＧＮ４９Ａの完全な配列を示す。
【図１５】プラスミドｐＧＮ５９Ａの完全な配列を示す。
【図１６】ｐＧＮ４９Ａを図示（プラスミドマップ）する。
【図１７】ｐＧＮ５９Ａを図示（プラスミドマップ）する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
一実施の形態において、本発明のＤＮＡ構築物は、第一のプロモータの下流で、かつ少なくとも１つのクローニング部位の下流に配置された（第一のプロモータの３’末端から見た場合）単体の転写ターミネータを含み、第一の転写ターミネータは第一のプロモータに操作的に連結され、単体の転写ターミネータはインタープロモータ領域に配置されるように成してもよい。
【００１６】
代替の編成では、ＤＮＡ構築物はインタープロモータ領域外に配置された単体の転写ターミネータを含む。更に別の実施の形態では、ＤＮＡ構築物が２つの転写ターミネータを含み、それぞれを２つのプロモータの一方の転写領域下流に配置させる。この構造では、何れか一方または両方のターミネータをインタープロモータ領域内に配置してもよい。本発明のＤＮＡ構築物におけるこのような様々な実施の形態については、添付図面を参照して以下でより詳細に説明する。また、インタープロモータ領域外の第一の転写ターミネータの位置を更に以下のように、すなわち、第一のプロモータの下流で、少なくとも１つのクローニング部位の下流であり、かつ第二のプロモータの５’末端の下流に第一の転写ターミネータが位置する（第一のプロモータの３’末端から見た場合）ように定めてもよい。
【００１７】
また、インタープロモータ領域外の第二の転写ターミネータの位置を更に以下のように、すなわち、第二のプロモータの下流、少なくとも１つのクローニング部位の下流、および第一のプロモータの５’末端の下流に第二の転写ターミネータが位置する（第二のプロモータの３’末端から見た場合）よう定めてもよい。
【００１８】
更に、ターミネータがインタープロモータ領域に配置されない場合、第一のプロモータの５’末端と第二のターミネータの３’末端との距離、または第二のプロモータの５’末端と第一のターミネータの３’末端との距離を短くすることが好ましく、言い換えれば、第一の転写ターミネータの３’末端をヌクレオチド２０００個以下分だけ第二のプロモータの５’末端から離間させるが、好ましくはヌクレオチド１０００個以下分で、更に好ましくはヌクレオチド５００個以下分で、更に一層好ましくはヌクレオチド２００個以下分で、特に好ましくはヌクレオチド１００個以下分で、特に一層好ましくはヌクレオチド５０個以下分で、更に一層好ましくはクレオチド２０個以下分で、特に好ましくはヌクレオチド１０個以下分で、特にヌクレオチド６個以下分である。
【００１９】
更に、第二の転写ターミネータがインタープロモータ領域外に配置される場合、好ましくは第二の転写ターミネータの３’末端をヌクレオチド２０００個以下分だけ第一のプロモータの５’末端から離間させるが、好ましくはヌクレオチド１０００個以下分で、更に好ましくはヌクレオチド５００個以下分で、更に一層好ましくはヌクレオチド２００個以下分で、特に好ましくはヌクレオチド１００個以下分で、特に一層好ましくはヌクレオチド５０個以下分で、更に一層好ましくはヌクレオチド２０個以下分で、特に好ましくはヌクレオチド１０個以下分で、特にヌクレオチド６個以下である。
【００２０】
先に定義されたように、用語「インタープロモータ領域」は、２つのプロモータ間のＤＮＡ配列すべてを意味する。上記で説明したように、本発明の特定の実施の形態では、転写ターミネータがインタープロモータ領域内にあってもよい。インタープロモータ領域は、有利になるようにｄｓＲＮＡ生成用テンプレートを形成するヌクレオチド配列を含んでもよい。この配列の厳密な長さおよび性質は本発明において重要ではない。本発明は更に、インタープロモータ領域がクローニング部位を含むＤＮＡ構築物を提供する。ｄｓＲＮＡ生成用テンプレートを形成するＤＮＡ断片を２つのプロモータ間に挿入する際に、クローニング部位はそれを促す機能を有する。従って本発明では、ｄｓＲＮＡ生成のためのテンプレートベクターの構築物で汎用的な一連のクローニングベクターを提供する。また、クローニングベクターはクローニング部位へ挿入されたＤＮＡ断片を有し、そのようなクローニングベクターに由来するベクターも本発明の適用範囲に含まれる。
【００２１】
クローニング部位は更に、以下を１つ以上含んでもよい：
−少なくとも１つの制限部位（当該技術分野で周知である）、または１つ以上の更なる制限部位（例：マルチプルクローニング部位を提供する（当該技術分野で周知である））；
−スタッファーＤＮＡ（例：２つのＢｓｔＸＩ制限部位、または２つのＸｃｍＩ制限部位等、少なくとも２つの制限部位が隣接する）；
−ａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２組換え部位；
−ｃｃｄＢヌクレオチド配列；
−更にＳｒｆＩ制限部位等、少なくとも１つの特異的平滑末端制限部位を備えるｃｃｄＢヌクレオチド；および／または
−少なくとも１つのクローニング部位に挿入されるＤＮＡ断片。
本発明で提供されるすべてのＤＮＡ構築物が、有利になるように、例えばプラスミドベクター等の複写可能なクローニングベクターの一部を形成してもよい。向かい合わせのプロモータ、インタープロモータ領域および転写ターミネータだけでなく、ベクター「バックボーン」は更に、複写可能なベクターで共通して見られる特徴、例えば抗生物質耐性遺伝子等の宿主細胞および選択マーカー内での自律複製を可能にする複製起点等を１つ以上有する。選択マーカー遺伝子（例：抗生物質耐性遺伝子）自体はプロモータおよび転写ターミネータを有してもよいが、それらは本発明で必要なプロモータおよびターミネータエレメントとは全く無関係であり、特定のベクターが本発明の適用範囲内に収まるか否かを判定する際に考慮に入れるものでないことは言うまでもない。
【００２２】
本発明によるＤＮＡ構築物は、当該技術分野において周知の、例えば  Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ他（編集人）のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，１９９４年）に記載されるような標準的な組換え技術を用いたコンポーネント配列エレメントから容易に構築され、当該技術分野に精通する者は以下の本発明の詳細な説明および添付の実施例からそれを理解できるであろう。
【００２３】
以下の概略図を参照して、本発明によるＤＮＡ構築物についてここで詳細に説明する。
【００２４】
図１（Ａ）〜（Ｅ）は、本発明によるＤＮＡ構築物のそれぞれ異なる実施の形態の概略図であり、プロモータおよび転写ターミネータエレメントの相対的配置を示す。
【００２５】
図２（Ａ）は、比較のために付した、先行技術のクローニングベクターの概略図である。
【００２６】
図２（Ｂ）〜（Ｅ）は、本発明によるＤＮＡ構築物の更なる実施の形態の概略図であり、インタープロモータ領域内の異なるクローニング部位の活用を示す。
【００２７】
図を参照すると、図１（Ａ）は本発明による第一のＤＮＡ構築物で、向かい合わせの２つのプロモータ、すなわちインタープロモータ領域ｃ）にそれぞれ隣接する第一のプロモータａ）および第二のプロモータｂ）を含むプラスミドベクターを略示し、インタープロモータ領域は第一のプロモータの３’末端の下流で、かつ第二のプロモータの３’末端の下流にある。第一のプロモータおよび第二のプロモータは同一であっても異なっていてもよい。本実施の形態は、第一の転写ターミネータｅ）および第二の転写ターミネータｆ）を含み、両者ともインタープロモータ領域内に位置する。この実施の形態では、第一のターミネータおよび第二のターミネータは一方向性ターミネータであることが好ましい。
【００２８】
ＤＮＡ断片を少なくとも１つのクローニング部位ｄ）に挿入してもよい。このような断片が、第一のプロモータａ）および第二のプロモータｂ）の誘導により転写される（すなわち両鎖が転写される）ことで、挿入されたＤＮＡ断片の２本鎖ＲＮＡと結合する２つのＲＮＡ断片が生成される（インビトロおよびインビボの両方で）。
【００２９】
ゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、その他コード配列等、所望のＤＮＡ配列が少なくとも１つのクローニング部位に挿入される。何れの特定の説明に制限されることなく、ａ）およびｅ）が機能的組み合わせを形成する場合、ａ）で転写を開始するＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも１つのクローニング部位、および少なくとも１つのクローニング部位に挿入されるＤＮＡ断片を含むインタープロモータ領域を転写し、ＲＮＡポリメラーゼがｅ）に到達すると転写を終結させられると考えられている。同様に、ｂ）で転写を開始するＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも１つのクローニング部位、および少なくとも１つのクローニング部位に挿入されるＤＮＡ断片を含むインタープロモータ領域を転写し、ＲＮＡポリメラーゼがｆ）に到達すると転写を終結させられる。ターミネータは、ＲＮＡポリメラーゼが転写を中断、停止して、テンプレートから解離するようにさせる。これによってベクターバックボーンの無制限な転写が阻止され、重要でないＤＮＡの非特異転写を抑制する。
【００３０】
インタープロモータ領域は更に、２本鎖ＲＮＡ阻害に対して目的に合致したヌクレオチド配列を含む。この配列は目的とする断片に対して「ＴＦ」と呼ばれる。ｄｓＲＮＡに転写される場合、この配列は目的とする遺伝子の特異的２本鎖ＲＮＡ阻害を担う。目的とする断片はゲノムＤＮＡの断片または目的とする遺伝子のｃＤＮＡから形成してもよい。その厳密な長さおよびヌクレオチド配列は本発明において重要ではない。
【００３１】
図１（Ａ）に示す編成において、２つのターミネータはインタープロモータ領域内でＴＦの何れかの側に位置する。各ターミネータはそれぞれ一方のプロモータの転写領域下流に位置し、第一のターミネータｅ）は第一のプロモータａ）の転写領域下流に位置し、第二のターミネータｆ）は第二のプロモータｂ）の転写領域下流に位置する。上記のようにａ）およびｅ）が機能的組み合わせを形成すると考えると、ａ）で転写を開始するＲＮＡポリメラーゼはＴＦまで含むインタープロモータ領域を転写し、ｅ）に到達すると転写を終結する。同様に、ｂ）で転写を開始するＲＮＡポリメラーゼは反対側の鎖のＴＦまで含むインタープロモータ領域を転写し、ｆ）に到達すると転写を終結する。ターミネータは、ＲＮＡポリメラーゼが転写を中断、停止して、テンプレートから解離するようにさせる。これによってベクターバックボーンの無制限な転写が阻止され、重要でないＤＮＡの非特異転写を抑制する。
【００３２】
このベクターから生じた転写物は、ベクター内のターミネータの厳密な配置に依存し、ＴＦ領域に対応するほぼ完全な特異的ｄｓＲＮＡである。挿入されたＤＮＡ断片の両側にあるＴＦ領域の下流末端にターミネータ配列を直接配置することにより、転写物の長さはテンプレートに従った配列の長さにまで完全に短くされる。従って、より多くの特異的ｄｓＲＮＡが得られる。ここで更に、ベクターバックボーンの非転写によりＤＮＡ構築物はより安定する。後者の特性（安定性）と、ここで相対的に高くなった特異的転写率とが相まって、より多くの短い特異的ｄｓＲＮＡ鎖を合成するのに好適なシステムが提供される。このように転写物の量が比例して増加すると、特異的ｄｓＲＮＡの濃度が高まり、ＲＮＡｉプロトコルにおける阻害効果が増す。導入媒体におけるｄｓＲＮＡの発現に基づくＲＮＡｉプロトコルでは、ＲＮＡの発現の増加によって導入媒体にもたらされる毒性レベルが、このベクターの使用により最低レベルとなる。
【００３３】
本発明者がＲＮＡｉの応用に最適な構造であるとみなしている、図１（Ａ）に示すタイプのベクターの特定の実施例は、付帯する実施例で説明するプラスミドｐＧＮ９ａである。ベクターは向かい合わせの２つのＴ７プロモータを含むので、ｐＧＮ９で用いられる転写ターミネータはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ特有のターミネータである。しかしながら、Ｔ３またはＳＰ６プロモータ、ターミネータ、ポリメラーゼ、あるいは別の原核生物または真核生物プロモータ、ターミネータに基づく発現システム等、別のシステムを使用することもできる。
【００３４】
図１（Ｂ）は本発明による更なるＤＮＡ構築物であって、インタープロモータ領域ｃ）に隣接する向かい合わせの２つのプロモータａ）およびｂ）を含むプラスミドベクターを概略的に示す。このベクターは２つの転写ターミネータｅ）およびｆ）を含むが、この構造では２つのターミネータがインタープロモータ領域外に位置し、実際にここではターミネータエレメントが２つのプロモータに隣接する。ｅ）はａ）の転写領域下流であり、またｆ）はｂ）の転写領域下流となるような構造である。ここで繰り返すがｅ）は、ａ）が開始する転写を終結させ、またｆ）は、プロモータｂ）が開始する転写を終結させる。図１（Ａ）のように、プロモータ間にターミネータを配置するために一方向性ターミネータが好ましいとされる構造とは異なり、ｄ）の外側にターミネータを配置することで、一方向性ターミネータだけでなく双方向性ターミネータを用いることが可能となる。本発明に従って多くの双方向性ターミネータを用いることができるが、それらは当該技術分野において周知である。一般的に、これらはポリメラーゼに対して非特異的であるとみなされている。
【００３５】
図１（Ｂ）に示す実施の形態では、ｄｓＲＮＡ生成のための先行技術のベクターに対し、図１（Ａ）に示す利点と基本的に同様の利点を提供する。図１（Ｂ）に示すベクターでは、プロモータ領域をも含むわずかに長い転写物となる。このように転写物の長さに比較的小さな相違があっても、それによって、形成されたｄｓＲＮＡはＲＮＡｉシステムの効率に重大な影響を及ぼすことはない。
【００３６】
図１（Ｂ）に示す実施例では、プロモータの５’末端をヌクレオチド２０００個以下分だけ転写ターミネータの３’末端から離間させるようにターミネータおよびプロモータの位置が近接していることが好ましいが、好ましくはヌクレオチド１０００個以下分で、更に好ましくはヌクレオチド５００個以下分で、更に一層好ましくはヌクレオチド２００個以下分で、特に好ましくはヌクレオチド１００個以下分で、特に一層好ましくはヌクレオチド５０個以下分で、更に一層好ましくはヌクレオチド２０個以下分で、特に好ましくはヌクレオチド１０個以下分で、特にヌクレオチド６個以下分である。
【００３７】
図１（Ｃ）は本発明による更なるＤＮＡ構築物であって、インタープロモータ領域ｃ）に隣接する向かい合わせの２つのプロモータａ）およびｂ）を含むプラスミドベクターを概略的に示す。本実施の形態では、一方のターミネータ（この場合ｅ））はｃ）の内側に位置し、他方のｆ）はｃ）の外側に位置する。繰り返すが、ｅ）は、ａ）が開始する転写を終結させ、ｆ）は、プロモータｂ）が開始する転写を終結させる。この構造では、一方のターミネータが逆方向のポリメラーゼの活性を阻害するという問題（例：ｆ）はｂ）が開始する転写を妨げる）に対して有効な解決策を提供する。このベクターは基本的に、先行技術に対して図１（ａ）および図１（ｂ）に示す様々なベクターと同様の利点を提供する。一方のプロモータを転写することにより転写物の長さに比較的小さな相違があっても、ＲＮＡｉシステムの効率に重大な影響を及ぼすことはない。これは、先に定めたように、インタープロモータ領域ｃ）の外側に配置されたターミネータがプロモータに近接している場合に、より顕著となる。
【００３８】
図１（Ｄ）および図１（Ｅ）は本発明による更なる２つのＤＮＡ構築物を概略的に示す。両方ともインタープロモータ領域ｃ）に隣接する向かい合わせの２つのプロモータａ）およびｂ）を含むプラスミドベクターである。これらの実施の形態は、単体ターミネータだけを含む。図１（Ｄ）に示す構造では、ａ）からの転写を終結させる単体ターミネータｅ）をｃ）外に配置する。ＩＰＲの外側にターミネータを配置することにより、このシステムで双方向性ターミネータあるいは一方向性ターミネータの何れであっても用いることができるようになる。図１（Ｄ）に示す実施の形態では、ｅ）がｃ）内に配置される。従って、ａ）を一方向性ターミネータとすることが好ましい。
【００３９】
本発明によるＤＮＡ構築物の更なる実施の形態については、図２（Ｂ）〜図２（Ｅ）で概略的に示す。
【００４０】
これらの実施の形態はすべて、図１（Ａ）に示すプロモータおよびターミネータの最適編成に基づくプラスミドクローニングベクターであり、上記のように、少なくとも１つのクローニング部位へ、ＤＮＡ断片を挿入することを促すクローニング部位を含む。
【００４１】
これらの実施の形態はすべて、図１（Ａ）に示すプロモータおよびターミネータの最適編成に基づくプラスミドクローニングベクターであり、インタープロモータ領域へ、目的とするＤＮＡ断片を挿入することを促すクローニング部位を含む。
【００４２】
図２（Ａ）は、比較のために加えた、先行技術のクローニングベクターの概略図である。このベクターは向かい合わせの２つのプロモータａ）およびｂ）を含むが、両方が同一であっても異なっていてもよく、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）に隣接する。
【００４３】
図２（Ｂ）は本発明によるプラスミドクローニングベクターの第一のタイプを示す。ベクターはインタープロモータ領域に隣接する向かい合わせの第一のプロモータａ）および第二のプロモータｂ）を含む。インタープロモータ領域は更に、以下の領域として定めることも可能である。すなわち第一のプロモータの３’末端と第二のプロモータの３’末端との間をＤＮＡ領域とし、この領域は、第一のプロモータの下流で、かつ第二のプロモータの下流にあり、第一のプロモータおよび第二のプロモータの５’末端を含まないことが好ましい。インタープロモータのプロモータ領域は更に、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）に隣接するターミネータｅ）およびｆ）を含む。ＭＣＳは少なくとも１つの単独の制限部位、好ましくは当該技術分野で周知の制限部位を２つ以上含み、その何れもＤＮＡ断片の挿入に用いてもよい。
【００４４】
図２（Ｃ）は本発明によるプラスミドクローニングベクターの更に異なるタイプを示す。繰り返すがこのベクターは、ターミネータｅ）およびｆ）を含むインタープロモータ領域に隣接する、向かい合わせのプロモータａ）およびｂ）を含む。本実施の形態ではａ）およびｂ）は、ＰＣＲ断片のクローニングを促すように成されたクローニング部位に隣接し、２つの同一の制限部位（この場合ＢｓｔＸＩ部位）が隣接するスタッファーＤＮＡを含む。スタッファーＤＮＡの特異的配列はそれほど重要ではない。但し、前記スタッファーＤＮＡが本発明のＤＮＡ構築物における所望の効果および／または所望の活性を阻害しないものとする。ここでは、本発明のこのような局面によるベクターの実施例として、プラスミドｐＧＮ２９について説明する。
【００４５】
ＢｓｔＸＩ認識部位およびＢｓｔＸＩアダプタを用いるＰＣＲ産物のクローニングは、一般的に当該技術分野で周知である。ＢｓｔＸＩアダプタは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  （Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，  オランダ）等から市販されている。これらのアダプタはより簡単で効率的にＰＣＲ産物をベクターにクローニングするために設計されたノンパリンドローム（非回文）配列のアダプタである。このように、これらのアダプタを用いると、非相補的な（ＣＡＣＡ）オーバーハングを有することにより、アダプタまたはインサートＤＮＡ同士の連結が減らされる。スタッファーＤＮＡが組み込まれているのは、単にＢｓｔＸＩで切断されるベクターと切断されないベクターとの差別化を、その大きさに基づき容易に行えるようにするためである。その厳密な長さおよび配列は重要ではない。
【００４６】
図２（Ｄ）は本発明によるプラスミドクローニングベクターの更に異なるタイプを示す。繰り返すがこのベクターは、ターミネータｅ）およびｆ）を含むインタープロモータ領域に隣接する、向かい合わせのプロモータａ）およびｂ）を含む。本実施の形態においてａ）およびｂ）は、制限酵素切断および連結ではなく相同的組換えに基づく「高スループット」クローニングを促すクローニング部位に隣接する。図２（Ｄ）で概略的に示すように、クローニング部位は、Ｅ．  ｃｏｌｉに対する致死性遺伝子（この場合ｃｃｄＢ遺伝子）に隣接するバクテリオファージラムダのａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２組換え部位を含む。
【００４７】
ＤＮＡ断片をこのベクターにクローニングする代替方法（図２（Ｄ）では不図示）は、このベクターの変形から成り、ｃｃｄＢ  ＤＮＡ配列は更に少なくとも１つの特異的制限部位を含み、その少なくとも１つの特異的制限部位はＳｒｆＩ制限部位等の平滑末端制限部位であることが好ましい。その少なくとも１つの特異的制限部位へＤＮＡ断片を挿入すると、ｃｃｄＢ遺伝子の不活性化、更には致死性ｃｃｄＢ遺伝子の不活性化を招く。
【００４８】
図２（Ｄ）に示すベクターの更なる変形には、ａｔｔＲ１およびａｔｔＥ２が存在しない。このようなベクターは少なくとも１つのクローニング部位を含み、前記少なくとも１つのクローニング部位はｃｃｄＢ配列から成り、前記ｃｃｄＢ配列は更に少なくとも１つの特異的制限部位を含み、その少なくとも１つの特異的制限部位はＳｒｆＩ制限部位等の平滑末端制限部位であることが好ましい。その少なくとも１つの特異的制限部位へＤＮＡ断片を挿入すると、ｃｃｄＢ遺伝子の不活性化、更には致死性ｃｃｄＢ遺伝子の不活性化を招く。
【００４９】
ｃｃｄＢヌクレオチド配列および／またはａｔｔＲ部位（Ｒ１および／またはＲ２）を含むこれらのクローニング部位は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．  が市販する  ＧａｔｅｗａｙＴＭクローニングシステムから得られる。ＧａｔｅｗａｙＴＭクローニングシステムについては、Ｈａｒｔｌｅｙ  他のＷＯ９６／４０７２４（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１００８２）で詳細に説明されている。ここに記載の本発明のこの局面によるベクターの実施例はｐＧＮ３９である。
【００５０】
図２（Ｅ）および図２（Ｆ）は本発明による更に別のタイプのプラスミドクローニングベクターを示す。繰り返すがこのベクターは、ターミネータｅ）およびｆ）を備えるインタープロモータ領域ｃ）に隣接する、向かい合わせのプロモータａ）およびｂ）を含む。図２（Ｅ）に示す実施の形態においてｅ）およびｆ）は、ＴＡＴＭクローニングによるＰＣＲ産物の「高スループット」クローニングを促すクローニング部位に隣接する。このクローニング部位は、２つの同一の制限部位が隣接するスタッファーＤＮＡを含み、この２つの同一の制限部位に特有の酵素は、オーバーハングするＴヌクレオチドを生成する。この場合、制限部位はＸｃｍＩ部位であるが、その他に、オーバーハングするＴヌクレオチドを生成するために切断された部位を用いても同様の効果が得られる。オーバーハングするＴヌクレオチドは、オーバーハングするＡヌクレオチドを含むＰＣＲ産物のクローニングを促す。この原理はＴＡＴＭクローニングとして周知である。オーバーハングするＴヌクレオチドに酵素トポイソメラーゼを連結させることで、オーバーハングするＴヌクレオチドに、切断されたベクターを「トポメライズ」することができ、図２（Ｆ）で概略的に示すタイプのクローニングベクターを生成する。また、その結果生じたベクターは、ＴＯＰＯＴＭクローニングとして周知の原理によってＰＣＲ産物のクローニングを促す。
【００５１】
ＴＯＰＯＴＭおよびＴＡＴＭクローニングシステムは両方とも本発明で説明したベクターに関するものではないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  から市販されている。ＴＯＰＯＴＭクローニングシステムについては、ＳｈｕｍａｎのＷＯ９６／１９４９７（ＰＣＴ／ＵＳ９５／１６０９９）で詳細に説明されている。ＴＡＴＭクローニングシステムについては、Ｈｅｒｎｓｔａｄｔ他のＷＯ９２／０６１８９（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０７１４７）で詳細に説明されている。
【００５２】
図２（Ｂ）〜図２（Ｆ）では、図１（Ａ）で示すタイプのベクター内に別のクローニング部位を組み込んだものを示すが、これらのクローニング部位は本発明の何れのＤＮＡ構築物（図１（Ｂ）〜図１（Ｅ）で概略的に示されるＤＮＡ構築物を含む）にも組み込むことができることは、当該技術分野に精通した読者であれば容易に理解できよう。
【００５３】
ＲＮＡｉ技術における本発明のＤＮＡ構築物の用途
前述のように、本発明のＤＮＡ構築物／ベクターは、ＲＮＡｉ技術で用いる２本鎖ＲＮＡの生成において主として適用される。詳細には、この構築物はネマトーダ線虫Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓのインビボＲＮＡｉプロトコルで有用である。
【００５４】
Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓでは、従来からｄｓＲＮＡを線虫に注入することによりＲＮＡｉを行っていた。これらの方法については、国際出願番号ＷＯ９９／３２６１９でＦｉｒｅ他により詳細に説明されている。一言で言えば、市販のインビトロ転写キットを用いて、ＲＮＡの両鎖をインビトロで生成する。ＲＮＡの両鎖はｄｓＲＮＡを形成することが可能となり、その後ｄｓＲＮＡがＣ．  ｅｌｅｇａｎｓに注入される。本発明者が開発した新しいベクターシステムは、従来方法に大幅な改良を加えた。第一に、例えばベクターｐＧＮ９等は２つの同一プロモータを用いて、１つのステップでＲＮＡを生成することができる。第２に、より重要であるが、ターミネータが存在することで、クローン化された目的の断片に限って転写が行われるので、転写物およびそれに伴って形成されたｄｓＲＮＡはより特異的となる。この結果、より効率的なＲＮＡｉが得られる。
【００５５】
Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓでＲＮＡｉ実験を行うための更なる方法については、Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ他のＷＯ  ００／０１８４６で説明されている。この方法では、ｄｓＲＮＡを生成するバクテリアをＣ．  ｅｌｅｇａｎｓ線虫に与える。あたかもｄｓＲＮＡが注入されたかのように、ｄｓＲＮＡは線虫の腸バクテリアを通過し、同様のＲＮＡｉを誘発する。これらの実験に関しては、Ｅ．  ｃｏｌｉ株はＨＴ１１５（ＤＥ３）であることが好ましく、Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ株はｎｕｃ−ｌ；ｇｕｎ−１であることが好ましい。また、有効なｄｓＲＮＡに限って生成されるので、以下の実施例で示すように、本発明によって提供される改良型ベクターはこの方法におけるＲＮＡｉの効率も向上させる。
【００５６】
また、ＲＮＡｉを行う別の方法が、Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ他のＷＯ  ００／０１８４６で説明されている。一言で言うと、この方法は線虫自体でｄｓＲＮＡを生成することに基づくものである。これは、上記のベクターに線虫プロモータを用いることによって行うことができる。またベクターに存在する非Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓプロモータに対して特異的なポリメラーゼを発現するトランスジェニック（形質転換）線虫を用いることもでき、このポリメラーゼがｄｓＲＮＡの転写を促すようにする。プロモータは、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６ＲＮＡプロモータ等、周知のバクテリオファージＲＮＡプロモータから選択することが好ましく、それによって適切なポリメラーゼの結合にのみ依存する高レベル転写を実現させる利点を提供する。
【００５７】
幾つかの方法によってプラスミドベクターＤＮＡを線虫に導入することができる。第一に、従来の注入方法（ＥｐｓｔｅｉｎおよびＳｈａｋｅｓ編集のＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ  ４８，  Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）によってＤＮＡを導入することができる。第二に、ＤＮＡ供給によりＤＮＡを導入することができる。ＷＯ  ００／０１８４６でＰｌａｅｔｉｎｃｋ他が示すように、プラスミドの宿主であるＥ．  ｃｏｌｉ株を線虫に与えることにより線虫にプラスミドＤＮＡを導入することができる。Ｅ．  ｃｏｌｉ株はＯＰ５０またはＭＣ１０６１もしくはＨＴ１１５（ＤＥ３）であることが好ましいが、その他の株でも本目的に適する。Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ株はｎｕｃ−１変異株またはｎｕｃ−１；ｇｕｎ−１株であることが好ましい。Ｅ．  ｃｏｌｉのプラスミドＤＮＡは腸バクテリアを通過してネマトーダに導入され、その結果、ｄｓＲＮＡが発現する。上記の他のＲＮＡｉ方法と同様に、新しいベクターシステムを用いることで、特異的ｄｓＲＮＡに限定して生成することができ、ＲＮＡｉを向上させる。
【００５８】
下記のその他の図と共に、以下の実験例を参照して本発明は更に理解されるだろう。
【実施例】
【００５９】
実施例１−ベクター構築物
ここで例示するベクター構築物の開始点は、プラスミドｐＧＮ１であった。このプラスミド（出願人の同時係属国際出願番号ＷＯ  ００／０１８４６に記載）はマルチクローニング部位に隣接する向かい合わせの２つのＴ７プロモータを含む。
【００６０】
ベクター構築物は、当該技術分野において周知の、例えば  Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ他（編集人）のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４年Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．）で説明される標準的な分子生物学技術に従って実行された。
【００６１】
１）ｐＧＮ９の構築物
最初に、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩによってｐＧＮ１を切断した。オリゴヌクレオチドｏＧＮ２７およびｏＧＮ２８（図７）をアニーリングすることで２本鎖断片を生成し、その後ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで切断されたベクターに結合させた。その結果生じたプラスミドを、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって再び切断した。オリゴヌクレオチドｏＧＮ２９およびｏＧＮ３０をアニーリングすることで２本鎖断片を生成し、その後ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたベクターにアニーリングさせた。その結果生じたベクターはｐＧＮ９と呼ばれた（図４および図１０）。
【００６２】
２）更なるクローニングベクター構築物
ｐＧＮ９のＭＣＳを、ＢｓｔＸＩ部位が隣接するスタッファーＤＮＡに置換することによってｐＧＮ２９（図９（Ａ）；図１１）が生成された。ＢｓｔＸＩアダプタは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，オランダ）から市販されている。
【００６３】
ｐＧＮ３９（図９（Ｂ）；図１２）は以下のステップで生成された：ｐＧＮ２９をＢｓｔＸＩで切断した。ＢｓｔＸＩアダプタ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  （Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ  オランダ））がＧＡＴＥＷＡＹＴＭシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）によって提供されたＣａｓｓｅｔｔｅ  Ａに結合された。Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ＡはａｔｔＲｌ、ＣｍＲ、ＣｃｄＡ、ＣｃｄＢ、ａｔｔＲ２を含む。アダプタを有するＣａｓｓｅｔｔｅ  Ａは、その後切断したｐＧＮ２９に結合され、ｐＧＮ３９Ａとなる。ｐＧＮ３９ＡはｃｃｄＢ遺伝子に特異的ＳｒｆＩ部位を含む。
【００６４】
ＴｏｐｏＲＮＡｉベクター（図９（Ｃ）；図１３）は以下の方法で生成された：ｐＧＮ２９をＢｓｔＸＩで切断した。プライマｏＧＮ１０３およびｏＧＮ１０４ならびにテンプレートｐＣＤＭ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  （Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，  オランダ））を用いてＰＣＲを行い、ＸｃｍＩ部位を含むスタッファーが生成された。ＰＣＲ産物にＢｓｔＸＩアダプタが結合され、その結果生じたライゲーション産物はＢｓｔＸＩによって切断したｐＧＮ２９ベクターに結合し、ＴｏｐｏＲＮＡｉベクターとなる。
ｏＧＮ１０３  ：  ５’ＴＡＣＣＡＡＧＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＴＴＴＡＴＣＡＣＴＧＡＴＡＡＧＴＴＧＧ  ３’
ｏＧＮ１０４：  ５’ＴＡＣＣＡＡＧＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＧＣＣＴＧＣＣＴＧＡＡＧＧＣＴＧＣ  ３’
である。
【００６５】
ＰＧＮ４９Ａを構築して特異的非平滑制限部位を追加して挿入し、ＣｍＲ遺伝子ｐＧＮ３９を消失させた。オーバーラップＰＣＲを行った。１回目のＰＣＲはプライマｏＧＮ１２６およびｏＧＮ１２７ならびにテンプレートとしてＰＧＮ３９Ａを用いて行った。プライマｏＧＮ１２８およびｏＧＮ１２９ならびに同様のテンプレートを用いて、第２断片を生成した。その結果生じた断片およびプライマｏＧＮ１２６ＰおよびｏＧＮ１２９Ｐを用いてオーバーラップＰＣＲを行い、最終ＰＣＲ産物を得た。このような最終ＰＣＲ産物を得るために、ＢｓｔＸＩアダプタを結合させ、ＢｓｔＸＩで切断したｐＧＮ２９にライゲーション産物を結合させた。その結果生じたベクターはｐＧＮ４９Ａと呼ばれる。
【００６６】
コントロールベクターを生成し、ｐＧＮ４９Ａクローニングベクターの効率を試験した。このようなベクターはＴ７ターミネータではなくＴ７プロモータを含むものとする。このためｐＧＮ４９ＡのＸｂａＩインサートは切り離され、同様の制限酵素で切断したｐＧＮ１にクローニングされた。その結果生じたベクターはｐＧＮ５９Ａと呼ばれる。
ｏＧＮ１２６  ｐＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＴＡＣＴＡＡＡＡＧＣＣＡＧＡＴＡＡＣＡＧＴＡＴＧＣ
ｏＧＮ１２７  ＧＧＡＧＡＣＴＴＴＡＴＣＧＣＴＴＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＣＡＣＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＴＣＡＣＣ
ｏＧＮ１２８  ：
ＣＣＡＧＴＧＣＡＣＧＴＣＴＣＴＴＡＡＧＣＧＡＴＡＡＡＧＴＣＴＣＣＣＧＴＧＡＡＣＴＴＴＡＣＣＣＧＧＴＧＧ
ｏＧＮ１２９  ｐＧＣＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＧＧＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＴＴＡＴＡＴＴＣＣＣＣＡＧ
である。
【００６７】
実施例２−ＲＮＡにおける改良型ベクターの実用性を示す
この実験の目的は、先行技術で周知のベクターと比較して、２本鎖ＲＮＡ阻害における本発明の改良型ベクターの効率が向上したことを示すことであった。生成されるｄｓＲＮＡが有効であるほど、ＲＮＡｉ機能も向上するので、システム効率の大幅な上昇が見込まれた。コンセプト実験のこのような実証に関する実験システムは、ｄｓＲＮＡを供給したｐＧＮ−２（−ターミネータ）およびｐＧＮ−１２（＋ターミネータ）と共にコントロール兼ダイリュータとしてのＰＧＮ−１（空ベクター）を用いたｓｕｐ３５のＲＮＡｉによって、ｎｕｃ−１／ｐｈａ−ｌ（ｅ２１２３）ｔｓＣ．  ｅｌｅｇａｎｓ変異体中２５℃でのＣ．  ｅｌｅｇａｎｓ生存率を測定することである。ｐｈａ−１ｔｓ／ｓｕｐ−３５変異についてはＳｃｈｎａｂｅｌのＷＯ９９／４９０６６で詳細に説明されている。
【００６８】
Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓのｎｕｃ−１変異によって、野生型Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓよりも優れた取り込み能力（ｄｓＲＮＡ複合体の取り込み等）を示すＣ．  ｅｌｅｇａｎｓ株を提供する。この変異体を主要ＤＮＡｓｅで消失させる。本発明者は先の同時係属出願で、ネマトーダにｄｓＲＮＡを供給することにより、このＣ．  ｅｌｅｇａｎｓ株がＲＮＡｉの向上をもたらすと証明している。
【００６９】
ｐｈａ−ｌ（ｅ２１２３）ｔｓ変異によって、変異体Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ株に１５℃で生存し、２５℃で死滅する表現型を提供する。ｓｕｐ−３５発現の阻害によってこの致死性を抑制できる。従って、ｓｕｐ−３５のＲＮＡｉは、２５℃でｐｈａ−ｌ（ｅ２１２３）の生存を助けるものがよい。ｓｕｐ−３５からｄｓＲＮＡを発現させる場合、本発明のベクターは、２５℃でのｐｈａ−ｌ（ｅ２１２３）ｔｓ変異体の生存率では、ターミネータを含まないベクターと比較してｓｕｐ−３５ＲＮＡｉの効率を上昇させるものがよい。
【００７０】
空ベクターとしてベクターｐＧＮ１が用いられた。ベクターｐＧＮ２（−ターミネータ）はｓｕｐ−３５ＤＮＡの宿主となり、適切な宿主に導入された場合にｓｕｐ−３５ｄｓＲＮＡを発現させるベクターである。このベクターには転写ターミネータを挿入しない。ベクターｐＧＮ１２（＋ターミネータ）は上記のようなベクターで、転写ターミネータを含み、それによって適切な宿主に導入された場合に改良型ｄｓＲＮＡが生成される。従って、このベクターは２つの一方向性転写ターミネータを有し、両ターミネータともインタープロモータ領域内に配置され、ｓｕｐ−３５断片に隣接する。後者のベクターを用いることで、システム効率の上昇（ここでは２５℃でｐｈａ−ｌ（ｅ２１２３）ｔｓ変異体の生存率が向上することを意味する）が見込まれた。
【００７１】
実験条件
１２ウェルのマイクロタイタープレートを１ウェルにつき約２ｍｌのＮＧＭアガーで満たした。（１リットルのＮＧＭアガー：  アガー１５ｇと、ペプトン１ｇと、ＮａＣｌ３ｇと、コレステロール溶液１ｍｌ（５ｍｇ／ｍｌ  ｉｎ  ＥｔＯＨ）とをオートクレーブした後、０．１Ｍ  ＣａＣｌ２  ９．５ｍｌと、０．１Ｍ  ＭｇＳ０４  ９．５ｍｌと、１Ｍ  ＫＨ２Ｐ０４／Ｋ２ＨＰ０４バッファ（ｐＨ６）  ２５ｍｌと、アンピシリン（１００μｇ／ｌ）と、０．１Ｍ  ＩＰＴＧ  ５ｍｌと、ナイスタチン溶液５ｍｌ（１：１  ＥｔＯＨ：ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４  ７．５Ｍに１０ｍｇ／ｍｌで溶解）とを無菌状態で加える。
【００７２】
プラスミドによって形質転換したバクテリアＨＴ１１５（ＤＥ３：Ｆｉｒｅ  Ａ，  Ｃａｒｎｅｇｉｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ、メリーランド州ボルチモア）の一夜培養液約５０μｌを乾いたプレートにたらす。１日目は、生育段階Ｌ４のネマトーダをそれぞれ１つずつウェルに載せた。各ウェルにネマトーダ（Ｐ１）１個とする。２日目に、Ｐ１ネマトーダを新しいウェルにのせ、一日放置して培養させる。同様の手順を３日目も繰り返した。すべてのプレートを２５℃で更に培養し、子孫を形成させた。子孫数をカウントして、Ｓｕｐ３５ＲＮＡｉに誘発された生存数を測定した。
【００７３】
結果
ｓｕｐ−３５ｄｓＲＮＡを発現させるＥ．  ｃｏｌｉを与え、Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ  ｎｕｃ−１／ｐｈａ−ｌ（ｅ２１２３）ｔｓ変異体におけるＲＮＡｉ実験である。
【００７４】
【表１−１】
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【表１−２】
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【００７５】
結論
予測したように、ｐＧＮ１の宿主であるバクテリアを与えた線虫では、この温度でのｐｈａ−１変異の致死効果に因り、生存能力のある子孫は確認されなかった。ｐＧＮ２またはｐＧＮ１２の宿主であるＥ．  ｃｏｌｉをネマトーダに与えると、何れの場合も生存能力のある子孫が確認された。これはｓｕｐ−３５のｄｓＲＮＡを線虫に与えたことによる。２つの供給実験における顕著な違いは希釈列において見られる。ｐＧＮ２の宿主であるバクテリアを、ｐＧＮ１の宿主であるバクテリアで希釈する場合、１／２の低希釈度であっても子孫数は激減する。この希釈列は、適切なＲＮＡｉを誘発するためには高レベルｄｓＲＮＡが必要であることを示唆する。ｐＧＮ１２の宿主であるバクテリアを用いた供給実験では、１／８の希釈度でもかなりの数の子孫が観察されている。これは、ｐＧＮ１２の宿主であるバクテリアにおいて、より一層効果的なｄｓＲＮＡが形成されることを示唆する。ベクターに上記のようなｄｓＲＮＡを発現させるターミネータ配列を加えることで、ＲＮＡｉ効果の発生において大きな利点を提供することを、この実験が明確に示している。
【００７６】
実施例３：Ｔ７ターミネータ（ｐＧＮ４９対ｐＧＮ５９）を用いた場合と、用いない場合のベクターのＲＮＡｉ効率を比較する
３種類の異なる遺伝子をベクターｐＧＮ４９ＡおよびｐＧＮ５９Ａにクローニングした。平滑末端を作るＰｆｕＩＤＮＡポリメラーゼで遺伝子断片を増幅してクローニングを行うようにし、これらのベクターでクローニングを促した。このようなＰＣＲ断片はＳｒｆＩで切断したベクターにクローニングされた。クローンに正しい断片が挿入されたことがＰＣＲによって確認された。ｄｓ発現およびＲＮＡｉによって、子孫の表現型が致死性となるよう断片を選択する。この手順によって素早く容易にＲＮＡｉにおける２つのベクター（ｐＧＮ４９、ｐＧＮ５９）の効率を比較することが可能となる。
【００７７】
【表２】
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【００７８】
標準的手法によって、すべてのプラスミド（ｐＧＷ系列）をＥ．  ｃｏｌｉ  ＡＢ３０１−１０５  （ＤＥ３）バクテリアで形質転換させる。その後ＬＢ／ａｍｐ中で３７℃に保ち、１４〜１８時間バクテリアを繁殖させる。これらの培養物を遠心分離機にかけ、バクテリアのペレットは１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび１００μｇ／μｌアンピシリンを含有するＳ完全バッファに溶解した。
【００７９】
１００μｌのＳ−完全バッファ（終濃度１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび１００μｇ／μｌアンピシリンを含有する）および１０μｌのバクテリア溶液を含む９６ウェルプレートにおいて、３個のネマトーダを各ウェルに入れた。ネマトーダはＬｌ生育段階のものであった。
プレートは２５℃で５〜６日間培養された。幼虫の発育や子孫Ｆ１の発生についてプレートを毎日検査する。
【００８０】
結果
構築された各プラスミドに対して８倍の効率でＲＮＡｉが行われた。この結果は、Ｔ７ターミネータをベクターバックボーンに挿入すると、予測された表現型が１００％発生することを示す。Ｔ７ターミネータを用いない場合、再現性は最大５０％まで低下することもある。その前の実験と同様に、結果では、ターミネータを追加することによりＲＮＡｉ機能が著しく向上することを示す。
【表３】
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【００８１】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２（１）】
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【図１２（２）】
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【図１２（３）】
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【図１３】
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【図１４（１）】
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【図１４（２）】
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【図１５（１）】
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【図１５（２）】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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