(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の含膜貫通構造ドメインを有する改変された光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質であって、該改変された光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質が、
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のチャネルオプシン２あるいはその相同体又は変異体における含膜貫通構造ドメインの少なくとも１つがこれに相当するＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのチャネルオプシン１に由来する含膜貫通構造ドメイン又は該含膜貫通構造ドメインのアミノ酸領域において１個〜１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入若しくは欠失を有し、かつ未改変の該含膜貫通構造ドメインと同等の機能特性を有するポリペプチド、又は該含膜貫通構造ドメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列相同性を有し、かつ未改変の該含膜貫通構造ドメインと同等の機能特性を有するポリペプチドで置換されているか、或いは、
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のチャネルオプシン１あるいはその相同体又は変異体における含膜貫通構造ドメインの少なくとも１つがこれに相当するＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのチャネルオプシン２に由来する含膜貫通構造ドメイン又は該含膜貫通構造ドメインのアミノ酸領域において１個〜１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入若しくは欠失を有し、かつ未改変の該含膜貫通構造ドメインと同等の機能特性を有するポリペプチド、又は該含膜貫通構造ドメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列相同性を有し、かつ未改変の該含膜貫通構造ドメインと同等の機能特性を有するポリペプチドで置換されてなり、
かつ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの野生型チャネルオプシン１又はチャネルオプシン２に比較して、弱い不活性化及び高い周波数応答性のいずれかの機能特性を少なくとも有し、前記相同体又は変異体が、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のチャネルオプシン１又はチャネルオプシン２のアミノ酸領域において１個〜１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入若しくは欠失を有し、かつ未改変のＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のチャネルオプシン１又はチャネルオプシン２と同等の機能特性を有するポリペプチド、又はＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のチャネルオプシン１又はチャネルオプシン２のアミノ酸領域のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列相同性を有し、かつ未改変の該Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のチャネルオプシン１又はチャネルオプシン２と同等の機能特性を有するポリペプチドである、前記タンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｌ）のいずれかに示すポリペプチド又は該ポリペプチドのアミノ酸領域において１個〜１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入若しくは欠失を有し、かつ該ポリペプチドと同等の機能特性を有するポリペプチド、又は該ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列相同性を有し、かつ該ポリペプチドと同等の機能特性を有するポリペプチドを含む、請求項１記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１１７と配列番号４のアミノ酸７９〜３１５とからなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１〜１６４と配列番号４のアミノ酸１２６〜３１５とからなるポリペプチド
（ｃ）配列番号２のアミノ酸１〜１８４と配列番号４のアミノ酸１４６〜３１５とからなるポリペプチド
（ｄ）配列番号２のアミノ酸１〜２１２と配列番号４のアミノ酸１７４〜３１５とからなるポリペプチド
（ｅ）配列番号２のアミノ酸１〜２４２と配列番号４のアミノ酸２０４〜３１５とからなるポリペプチド
（ｆ）配列番号２のアミノ酸１〜２７６と配列番号４のアミノ酸２３８〜３１５とからなるポリペプチド
（ｇ）配列番号２のアミノ酸１１８〜３４５と配列番号４のアミノ酸１〜７８とからなるポリペプチド
（ｈ）配列番号２のアミノ酸１６５〜３４５と配列番号４のアミノ酸１〜１２５とからなるポリペプチド
（ｉ）配列番号２のアミノ酸１８５〜３４５と配列番号４のアミノ酸１〜１４５とからなるポリペプチド
（ｊ）配列番号２のアミノ酸２１３〜３４５と配列番号４のアミノ酸１〜１７３とからなるポリペプチド
（ｋ）配列番号２のアミノ酸２４３〜３４５と配列番号４のアミノ酸１〜２０３とからなるポリペプチド
（ｌ）配列番号２のアミノ酸２７７〜３４５と配列番号４のアミノ酸１〜２３７とからなるポリペプチド
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸１〜１６４と配列番号４のアミノ酸１２６〜３１５とからなるポリペプチド又は該ポリペプチドのアミノ酸領域において１個〜１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入若しくは欠失を有し、かつ該ポリペプチドと同等の機能特性を有するポリペプチド、又は該ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列相同性を有し、かつ該ポリペプチドと同等の機能特性を有するポリペプチドを含む、請求項２記載のタンパク質。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸１〜２４２と配列番号４のアミノ酸２０４〜３１５とからなるポリペプチド又は該ポリペプチドのアミノ酸領域において１個〜１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入若しくは欠失を有し、かつ該ポリペプチドと同等の機能特性を有するポリペプチド、又は該ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列相同性を有し、かつ該ポリペプチドと同等の機能特性を有するポリペプチドを含む、請求項２記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
プロモーターと機能的に連結された請求項５記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項記載のタンパク質を発現する細胞。
【請求項８】
神経細胞である請求項７記載の細胞。
【請求項９】
配列番号２のアミノ酸１〜１６４と配列番号４のアミノ酸１２６〜３１５とからなるポリペプチド又は該ポリペプチドのアミノ酸領域において１個〜１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入若しくは欠失を有し、かつ該ポリペプチドと同等の機能特性を有するポリペプチド、又は該ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列相同性を有し、かつ該ポリペプチドと同等の機能特性を有するポリペプチドを含む、請求項１記載のタンパク質。
【請求項１０】
配列番号２のアミノ酸１〜２４２と配列番号４のアミノ酸２０４〜３１５とからなるポリペプチド又は該ポリペプチドのアミノ酸領域において１個〜１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入若しくは欠失を有し、かつ該ポリペプチドと同等の機能特性を有するポリペプチド、又は該ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列相同性を有し、かつ該ポリペプチドと同等の機能特性を有するポリペプチドを含む、請求項１記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変された光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び該タンパク質を発現する細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
淡水池沼に普通に生息しているクラミドモナスは、葉緑体を持ち、光合成をする単細胞真核生物である緑藻類に属している。クラミドモナスは、眼点と呼ばれる特殊な膜領域で光を受容し、鞭毛運動を制御することにより、光に集まる習性（すなわち走光性）を有している。
クラミドモナスの一種Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの眼点に分布している原核生物型ロドプシンファミリータンパク質の遺伝子配列が解明され、公開されている（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ４６１３９７）。このタンパク質は、可視光に応答してイオンを透過させ、膜電位を制御しているので、生物界における光受容体チャネルの事例である（非特許文献１、２）。
クラミドモナスにおいては、２種類の原核生物型ロドプシンタンパク質、チャネルオプシン１とチャネルオプシン２がある。これらは、光受容体チャネルの一種であり、単一の分子で、光感受性とイオンチャネルの機能をあわせ持っている。チャネルオプシン１は、カエル（ゼノパス）の卵母細胞に発現させると、光に応答してＨ＋を透過させる性質をもっている（非特許文献１）。チャネルオプシン２は、Ｎａ＋などの陽イオン透過性もあわせもち、培養哺乳類細胞（ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ）に発現させることで、４００〜５００ｎｍの青色光に応答した脱分極が引き起こされることが報告されている（非特許文献２）。
上記のような光受容体チャネルは、医療、福祉・介護、情報通信を含む様々な分野に利用されることが見込まれている。
例えば、特許文献１は、遺伝子工学的方法を用いて、チャネルオプシン２を神経細胞に導入・発現することにより、光感受性を新たに付与した神経細胞が創出されることを開示している。また、この技術をイン・ビボおよびイン・ビトロの系に応用することにより、光照射により神経細胞ネットワークを働かせることが試みられている（非特許文献３〜６）。
さらに、さまざまな原因により網膜の光受容体細胞が変性した動物を用いて、神経節細胞や双極細胞などにチャネルオプシン２を導入・発現することにより、視力を回復させることが行われている（非特許文献７、８）。
【特許文献１】特開２００６−２１７８６６号公報
【非特許文献１】Ｎａｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，２３９５−２３９８．
【非特許文献２】Ｎａｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００，１３９４０−１３９４５．
【非特許文献３】Ｂｏｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８，１２６３−１２６８．
【非特許文献４】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２，１７８１６−１７８２１．
【非特許文献５】Ｉｓｈｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ  ５４，８５−９４．
【非特許文献６】Ａｒｅｎｋｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎｅｕｒｏｎ  ５４，２０５−２１８．
【非特許文献７】Ｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎｅｕｒｏｎ  ５０，２３−３３．
【非特許文献８】Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４８，３８２１−３８２６．
【発明の開示】
【０００３】
上記のような試みは、光受容体チャネルを哺乳類細胞などの真核生物細胞に導入・発現させ、これを光照射により惹起される脱分極などの機能制御に用いるというコンセプトを基礎とする。このような光受容体チャネルの応用において、光受容体チャネルは、概して、光電流の不活化が弱い、コンダクタンスが大きい、周波数応答特性が高いといった機能を有することが望まれるが、これらを充足する光受容体チャネルは現在までに見出されていない。
また、例えば、光受容体チャネルを網膜の神経細胞に導入・発現させることにより失明患者の視覚を回復させる試みにおいては、さらに、微弱な光を感知できること、波長選択性が低く白色光に応答すること等の機能を有することが望ましい。
したがって、機能制御のための使用に望ましい機能を有し、目的とする用途に応じて更なる機能特性が付与された光受容体チャネルを提供することは非常に有用である。
そこで、本発明は、様々な機能特性が改善又は付与された光受容体チャネル型タンパク質を提供することを目的とする。
本発明者らは、緑藻類クラミドモナス由来の２種類の光受容体チャネル型タンパク質、チャネルオプシン１及びチャネルオプシン２の構造−機能連関を解析する過程で、これらのチャネルオプシン間で含膜貫通構造ドメインを組換えた様々なハイブリッドアポタンパク質を作製したところ、これらの中に、野生型と異なる機能特性を保持するハイブリッドアポタンパク質が存在することを見出した。また、これに伴い、チャネルオプシン１及びチャネルオプシン２の様々な機能特性に関与する含膜貫通構造ドメインを同定することができ、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の特徴を包含する。
（１）  複数の含膜貫通構造ドメインを有する改変された光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質であって、含膜貫通構造ドメインの少なくとも１つはこれに相当するＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのチャネルオプシン１に由来する含膜貫通構造ドメイン又はその変異体である、及び／又は、含膜貫通構造ドメインの少なくとも１つはこれに相当するＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのチャネルオプシン２に由来する含膜貫通構造ドメイン又はその変異体である、前記タンパク質。
（２）  含膜貫通構造ドメインの少なくとも１つはこれに相当するＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのチャネルオプシン１に由来する含膜貫通構造ドメイン又はその変異体であり、かつ含膜貫通構造ドメインの少なくとも１つはこれに相当するＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのチャネルオプシン２に由来する含膜貫通構造ドメイン又はその変異体である、上記（１）記載のタンパク質。
（３）  光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質はチャネルオプシン１であり、含膜貫通構造ドメインの少なくとも１つはこれに相当するＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのチャネルオプシン２に由来する含膜貫通構造ドメイン又はその変異体である、上記（１）記載のタンパク質。
（４）  前記光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質はＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のチャネルオプシン１である、上記（３）記載のタンパク質。
（５）  光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質はチャネルオプシン２であり、含膜貫通構造ドメインの少なくとも１つはこれに相当するＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのチャネルオプシン１に由来する含膜貫通構造ドメイン又はその変異体である、上記（１）記載のタンパク質。
（６）  前記光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質はＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のチャネルオプシン２である、上記（５）記載のタンパク質。
（７）  以下の（ａ）〜（ｌ）のいずれかに示すポリペプチド又はその変異体を含む、上記（１）〜（６）のいずれか記載のタンパク質。
（ａ）  配列番号２のアミノ酸１〜１１７と配列番号４のアミノ酸７９〜３１５とからなるポリペプチド
（ｂ）  配列番号２のアミノ酸１〜１６４と配列番号４のアミノ酸１２６〜３１５とからなるポリペプチド
（ｃ）  配列番号２のアミノ酸１〜１８４と配列番号４のアミノ酸１４６〜３１５とからなるポリペプチド
（ｄ）  配列番号２のアミノ酸１〜２１２と配列番号４のアミノ酸１７４〜３１５とからなるポリペプチド
（ｅ）  配列番号２のアミノ酸１〜２４２と配列番号４のアミノ酸２０４〜３１５とからなるポリペプチド
（ｆ）  配列番号２のアミノ酸１〜２７６と配列番号４のアミノ酸２３８〜３１５とからなるポリペプチド
（ｇ）  配列番号２のアミノ酸１１８〜３４５と配列番号４のアミノ酸１〜７８とからなるポリペプチド
（ｈ）  配列番号２のアミノ酸１６５〜３４５と配列番号４のアミノ酸１〜１２５とからなるポリペプチド
（ｉ）  配列番号２のアミノ酸１８５〜３４５と配列番号４のアミノ酸１〜１４５とからなるポリペプチド
（ｊ）  配列番号２のアミノ酸２１３〜３４５と配列番号４のアミノ酸１〜１７３とからなるポリペプチド
（ｋ）  配列番号２のアミノ酸２４３〜３４５と配列番号４のアミノ酸１〜２０３とからなるポリペプチド
（ｌ）  配列番号２のアミノ酸２７７〜３４５と配列番号４のアミノ酸１〜２３７とからなるポリペプチド
（８）  配列番号２のアミノ酸１〜１６４と配列番号４のアミノ酸１２６〜３１５とからなるポリペプチド又はその変異体を含む、上記（７）記載のタンパク質。
（９）  配列番号２のアミノ酸１〜２４２と配列番号４のアミノ酸２０４〜３１５とからなるポリペプチド又はその変異体を含む、上記（７）記載のタンパク質。
（１０）  上記（１）〜（９）のいずれか記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１１）  プロモーターと機能的に連結された上記（１０）記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（１２）  上記（１）〜（９）のいずれか記載のタンパク質を発現する細胞。
（１３）  神経細胞である上記（１２）記載の細胞。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００８−０７６５３８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、（Ａ）Ｃｈｏｐ１及びＣｈｏｐ２のアミノ酸一次構造アライメント、及び（Ｂ）チャネルオプシン遺伝子のＣ末端をＶｅｎｕｓに置き換えた改変型ロドプシンタンパク質の含膜貫通構造ドメイン構造を示す。
図２は、実施例で作製したハイブリッドアポタンパク質の含膜貫通構造ドメイン構造を示す。
図３は、実施例で使用した実験装置の概略図を示す。
図４は、実施例で使用したブースター回路の回路図を示す。
図５は、（Ａ）ハイブリッドＡｂｃｄｅｆｇを発現したＨＥＫ２９３細胞及び（Ｂ）ハイブリッドＡＢｃｄｅｆｇを発現したＨＥＫ２９３細胞の共焦点画像を示す。
図６Ａは、ハイブリッドＡｂｃｄｅｆｇを発現させたＨＥＫ２９３細胞の光電流（上段：青色光、下段：緑色光）及びハイブリッドＡＢｃｄｅｆｇを発現させたＨＥＫ２９３細胞の光電流（上段：青色光、下段：緑色光）を示す。図６Ｂは、青色光応答と緑色光応答のＧ／Ｂ比（Ｇｒｅｅｎ／Ｂｌｕｅ  ｒａｔｉｏ）によるハイブリッドアポタンパク質の吸収波長応答特性の比較を示す。
図７Ａは、ハイブリッドＡｂｃｄｅｆｇ光電流のＩ−Ｖ関係（黒：細胞外Ｎａ＋濃度１４２ｍＭ、赤：細胞外Ｎａ＋濃度が２０ｍＭ）を示す。図７Ｂは、ハイブリッドＡｂｃｄｅｆｇ光電流のＩ−Ｖ関係（黒：細胞外Ｎａ＋濃度が１４２ｍＭ、赤：細胞外Ｎａ＋濃度が２０ｍＭ）を示す。図７Ｃは、それぞれのハイブリッドアポタンパク質に関する、光電流反転電位のシフトの比較を示す。
図８は、それぞれのハイブリッドアポタンパク質の光受容チャネルの単位膜容量あたりのホールセルコンダクタンスを示す。
図９Ａは、照射パルス光の相対的な大きさを示す。図９Ｂ及びＣは、それぞれハイブリッドＡｂｃｄｅｆｇ及びＡＢｃｄｅｆｇの光電流に関する、光の強さに対する電流応答の比較を示す。
図１０Ａは、野生型Ｃｈｏｐ２（１−３１５）ａｂｃｄｅｆｇの光電流（黒）とハイブリッドＡＢｃｄｅｆｇの光電流（赤）との比較を示す。図１０Ｂは、それぞれのハイブリッドアポタンパク質について、不活性化の強さを定常光電流と最大光電流の比（ｐｌａｔｅａｕ／ｐｅａｋｒａｔｉｏ）で定量化した結果を示す。
図１１Ａは、ハイブリッドＡｂｃｄｅｆｇ（黒）とハイブリッドＡＢｃｄｅｆｇ（赤）における、光電流の立ち上がりの比較を示す。図１１Ｂは、ハイブリッドＡｂｃｄｅｆｇ（黒）とハイブリッドＡＢｃｄｅｆｇ（赤）における、光電流終了の比較を示す。図１１Ｃは、光電流のＯＮ速度常数及びＯＦＦ速度常数の、ハイブリッドアポタンパク質及び野生型アポタンパク質間での比較を示す。
図１２は、チャネルオプシン・ワイドレシーバー（ｃｈｏｐＷＲ）の含膜貫通構造ドメイン構造およびアミノ酸１次構造を示す。
図１３は、チャネルオプシン・ファストレシーバー（ｃｈｏｐＦＲ）の含膜貫通構造ドメイン構造およびアミノ酸１次構造を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明は、改変された光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質（以下、「改変型ロドプシンタンパク質」又は「ハイブリッドアポタンパク質」とも称する）に関する。具体的には、光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質が有する複数の含膜貫通構造ドメインのうちの少なくとも１つが、これに相当する、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのチャネルオプシン１（以下、「Ｃｈｏｐ１」とも称する）に由来する含膜貫通構造ドメイン又はその変異体である、及び／又は、これに相当する、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのチャネルオプシン２（以下、「Ｃｈｏｐ２」とも称する）に由来する含膜貫通構造ドメイン又はその変異体である、光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質に関する。
本明細書で使用する「含膜貫通構造ドメイン」とは、光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質において、バクテリオロドプシンとの相同性から推定される膜貫通構造を含む領域を指す。
１．改変型ロドプシンタンパク質
本発明の改変型ロドプシンタンパク質は、光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質中の含膜貫通構造ドメインの少なくとも１つが、これに相当する、Ｃｈｏｐ１に由来する含膜貫通構造ドメイン又はその変異体である、及び／又は、これに相当する、Ｃｈｏｐ２に由来する含膜貫通構造ドメイン又はその変異体であることを特徴とする。
すなわち、本発明の改変型ロドプシンタンパク質は、光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質が、Ｃｈｏｐ１において見出された好ましい機能特性を示す含膜貫通構造ドメイン、及び／又は、Ｃｈｏｐ２において見出された好ましい機能特性を示す含膜貫通構造ドメインを、これに相当する含膜貫通構造ドメイン領域で含んでいる結果、好ましい機能特性を保持する。
Ｃｈｏｐ１及びＣｈｏｐ２は、異なる機能特性を有するため、本発明の改変型ロドプシンタンパク質は双方の好ましい機能特性を有することが好ましい。したがって、本発明において、光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質は、好ましくは、Ｃｈｏｐ１において見出された好ましい機能特性を示す含膜貫通構造ドメインと、Ｃｈｏｐ２において見出された好ましい機能特性を示す含膜貫通構造ドメインとを、これらに相当する含膜貫通構造ドメイン領域で含む。
１．１  光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質
本明細書で使用する光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質とは、光受容機能及びチャネル機能の両方（以下、「光受容チャネル機能」とも称する）を有する古細菌型ロドプシンファミリータンパク質を指す。古細菌型ロドプシンファミリータンパク質に属する構造的に近縁のタンパク質として、現在までに、Ｃｈｏｐ１及びＣｈｏｐ２、好塩菌由来のバクテリオロドプシン、ハロロドプシン、センサリーロドプシン、プロテオロドプシン、緑藻類のオプシンタンパク質、菌類に見出されている機能不明のオプシンタンパク質などが知られており、いずれも本発明において使用することができる。
本発明において好ましい光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質は、Ｃｈｏｐ１又はＣｈｏｐ２、或いはそれらの相同体又は変異体である。なお、Ｃｈｏｐ１及びＣｈｏｐ２の遺伝子配列及びアミノ酸配列は公知である（Ｃｈｏｐ１：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３８５７４８、Ｃｈｏｐ２：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ４６１３９７）。Ｃｈｏｐ１の遺伝子配列及びアミノ酸配列を配列番号１及び２に、Ｃｈｏｐ２の遺伝子配列及びアミノ酸配列を配列番号３及び４にそれぞれ示す。
ここで、「相同体」とは、異なる生物由来の同一機能をもつタンパク質（又は核酸）を指す。相同体タンパク質及びそれをコードする核酸の配列は、ＮＣＢＩ、ＥＭＢＬなどの著名なデータベースにアクセスすることによって、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムを利用して検索することができる。またかかる相同体核酸又は遺伝子は定法に従って単離することができる。例えば、塩基配列情報を格納したデータベースを用いて特定した遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーを設計、化学合成し、対象の生物から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とする前記プライマーを用いたＰＣＲによって、目的とするｃｈｏｐ１又はｃｈｏｐ２遺伝子の相同体を増幅、単離することができる。
本発明で使用するＣｈｏｐ１（又はＣｈｏｐ２）の変異体という用語には、Ｃｈｏｐ１（又はＣｈｏｐ２）のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の置換、付加、挿入又は欠失を有し、かつＣｈｏｐ１（又はＣｈｏｐ２）と同等の機能特性を有するポリペプチド、並びにＣｈｏｐ１（又はＣｈｏｐ２）のアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性の配列相同性を有し、かつＣｈｏｐ１（又はＣｈｏｐ２）と同等の機能特性を有するポリペプチドが含まれる。
本明細書において使用する「数個」とは、１０以下の整数、例えば２〜９、２〜７、２〜５の整数である。また、本明細書において、配列相同性の値は、複数（２つ）のアミノ酸配列間の相同性を演算するソフトウェア（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡＳＹＳ、ＢＬＡＳＴなど）をデフォルトの設定で使用して算出した値をいう。
本明細書において、Ｃｈｏｐ１又はＣｈｏｐ２の関連で使用する「同等の機能特性」とは、例えばＣｈｏｐ１又はＣｈｏｐ２のコンダクタンス、光吸収波長特性、不活性化特性、周波数応答特性といった機能特性の少なくとも１つが実質的に同一であることを指す。
上記Ｃｈｏｐ１（又はＣｈｏｐ２）の変異体は、天然に生じたものであってもよいし、人為的に変異を導入したものであってもよい。人為的な変異の導入は、例えば部位特異的変異導入法や、ＰＣＲを利用した変異導入法などを用いて、ｃｈｏｐ１（又はｃｈｏｐ２）遺伝子に変異を導入することによって行うことができる（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，１９８４  ８１：５６６２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９５  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）。
上記Ｃｈｏｐ１（又はＣｈｏｐ２）の相同体又は変異体が、Ｃｈｏｐ１（又はＣｈｏｐ２）と同等の機能特性を有するか否かは、例えば、電気生理学的手法を用いた膜電位記録や膜電流記録や蛍光プローブを用いた細胞内イオン濃度変化を調べることによってアッセイすることができる。
本発明において、Ｃｈｏｐ１又はＣｈｏｐ２は、必ずしもその全長である必要はなく、光受容チャネル活性を有するＣｈｏｐ１又はＣｈｏｐ２の断片であってもよい。Ｃｈｏｐ１又はＣｈｏｐ２はそれぞれ膜貫通構造を含むＮ末端側領域（Ｃｈｏｐ１：１−３４５（配列番号５）；Ｃｈｏｐ２：１−３１５（配列番号６））に光受容活性があることが報告されており、上記断片としてこれらの領域を含むポリペプチドを使用することが好ましい。
１．２  含膜貫通構造ドメイン
Ｃｈｏｐ１及びＣｈｏｐ２は、バクテリオロドプシンとの類似性から、それぞれ７つの膜貫通構造を有していると仮定される（図１参照）。また、上記の通り、それぞれの仮定膜貫通構造を含むＮ末側領域（Ｃｈｏｐ１：１−３４５、Ｃｈｏｐ２：１−３１５）に光受容チャネル活性があることが報告されている。そこで、Ｃｈｏｐ１の各仮定膜貫通構造それぞれを含む含膜貫通構造ドメインとしてＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇを定義し、Ｃｈｏｐ１のＡ〜Ｇを保持する光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質又はその断片をＡＢＣＤＥＦＧと表記する。同様に、Ｃｈｏｐ２の仮定膜貫通構造それぞれを含む含膜貫通構造ドメインとしてａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇを定義し、Ｃｈｏｐ２の含膜貫通構造ドメインａ〜ｇを保持する光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質又はその断片をａｂｃｄｅｆｇと表記する。例えば、Ａ〜ＤがＣｈｏｐ１由来で、ｅ〜ｇがＣｈｏｐ２由来の光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質又はその断片は、ＡＢＣＤｅｆｇと表記する。
Ｃｈｏｐ１の含膜貫通構造ドメインＡ〜Ｇは以下に示すアミノ酸領域である。
ドメインＡ：配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１１７
ドメインＢ：配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１１８〜１６４
ドメインＣ：配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１６５〜１８４
ドメインＤ：配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１８５〜２１２
ドメインＥ：配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸２１３〜２４２
ドメインＦ：配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸２４３〜２７６
ドメインＧ：配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸２７７〜３４５
またＣｈｏｐ２の含膜貫通構造ドメインａ〜ｇは以下に示すアミノ酸領域である。
ドメインａ：配列番号４に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜７８
ドメインｂ：配列番号４に示すアミノ酸配列のアミノ酸７９〜１２５
ドメインｃ：配列番号４に示すアミノ酸配列のアミノ酸１２６〜１４５
ドメインｄ：配列番号４に示すアミノ酸配列のアミノ酸１４６〜１７３
ドメインｅ：配列番号４に示すアミノ酸配列のアミノ酸１７４〜２０３
ドメインｆ：配列番号４に示すアミノ酸配列のアミノ酸２０４〜２３７
ドメインｇ：配列番号４に示すアミノ酸配列のアミノ酸２３８〜３１５
本発明において、Ｃｈｏｐ１（又はＣｈｏｐ２）の含膜貫通構造ドメインの変異体（以下、「変異型含膜貫通構造ドメイン」ともいう）は、含膜貫通構造ドメインのアミノ酸領域において１個〜数個のアミノ酸の置換、付加、挿入又は欠失を有し、かつ未改変の含膜貫通構造ドメインと同等の機能特性を有するポリペプチド、並びに含膜貫通構造ドメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有し、かつ未改変の含膜貫通構造ドメインと同等の機能特性を有するポリペプチドを含む。なお、「数個」及び配列相同性の値は、上に定義されている。
変異型含膜貫通構造ドメインの関連で使用する「同等の機能特性」とは、変異型含膜貫通ドメインがもつ機能特性の種類（コンダクタンス、光吸収波長特性、不活性化特性、周波数応答特性など）が未改変の含膜貫通ドメインと実質的に同一であること、及び変異型含膜貫通ドメインがもつ機能特性の性質（コンダクタンスの強度、光吸収波長域、光電流の不活化の程度、周波数応答性の程度など）が未改変の含膜貫通ドメインと実質的に同一であることを含む。
上記変異型含膜貫通構造ドメインは、天然に生じたものであってもよいし、人為的に変異を導入したものであってもよい。人為的な変異の導入は、例えば部位特異的変異導入法や、ＰＣＲを利用した変異導入法などを用いて、含膜貫通構造ドメインをコードするポリヌクレオチドに変異を導入することによって行うことができる（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，１９８４  ８１：５６６２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら．，前述；Ａｕｓｕｂｅｌら，前述）。
１．３  改変型ロドプシンタンパク質の構築
本発明の改変型ロドプシンタンパク質は、光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質中の含膜貫通構造ドメインの少なくとも１つが、これに相当する、Ｃｈｏｐ１由来の含膜貫通構造ドメイン又はその変異体である、及び／又は、これに相当する、Ｃｈｏｐ２由来の含膜貫通構造ドメイン又はその変異体であることを特徴とする。言い換えれば、本発明の改変型ロドプシンタンパク質は、光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質中の含膜貫通構造ドメインの少なくとも１つが、これに相当するＣｈｏｐ１由来の含膜貫通構造ドメイン又はその変異体で置換されている、及び／又は、これに相当するＣｈｏｐ２由来の含膜貫通構造ドメイン又はその変異体で置換されているものともいえる。これにより、Ｃｈｏｐ１又はＣｈｏｐ２の好ましい機能特性が付与された改変型ロドプシンタンパク質を提供することができる。「これに相当する含膜貫通構造ドメイン」とは、置換される含膜貫通構造ドメインと、機能特性の種類（コンダクタンス、光吸収波長特性、不活性化特性、周波数応答特性など）において同一であるが、機能特性の性質（コンダクタンスの強度、光吸収波長域、光電流の不活化の程度、周波数応答性の程度など）において同一であるか又は異なる含膜貫通構造ドメインを指す。例えば、上記Ｃｈｏｐ１のドメインＡに相当するＣｈｏｐ２の含膜貫通構造ドメインは、上記ドメインａである。
また、上記Ｃｈｏｐ１の含膜貫通構造ドメイン、及びＣｈｏｐ２の含膜貫通構造ドメインは、それぞれ異なる機能特性を有するため、Ｃｈｏｐ１の含膜貫通構造ドメイン及びＣｈｏｐ２の含膜貫通構造ドメインの両方を種々の組合せで保持させることにより、様々な機能特性を有する光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質のラインナップを提供することができる。
例えば、Ｃｈｏｐ１の含膜貫通構造ドメインＡ〜Ｇ及びＣｈｏｐ２の含膜貫通構造ドメインａ〜ｇの機能特性に基づき、本発明の改変型ロドプシンタンパク質は、増大したコンダクタンス、長波長の光応答性の増大、弱い不活性化、高い周波数応答性といった機能特性の少なくとも１つを有することができる。
コンダクタンスの増大は、微弱光に対しても、大きな膜電位応答、膜電流応答を生ずるという点で好ましい機能特性である。
長波長の光応答性の増大は、活性化に試用できる光の波長帯域が拡大する、白色光に対する応答が増大するという点で好ましい機能特性である。
弱い不活性化は、光入力パターンをより正確に膜電位・膜電流に反映する、繰り返し刺激で応答が減衰しないという点で好ましい機能特性である。
高い周波数応答性は、高周波で変動する光情報に対する応答が減衰しないという点で好ましい機能特性である。
光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質がＣｈｏｐ１である場合には、本発明の改変型ロドプシンタンパク質は、Ｃｈｏｐ１の含膜貫通構造ドメインの少なくとも１つ（例えばドメインＡ）に代えて、Ｃｈｏｐ２の含膜貫通構造ドメイン（例えばドメインａ）を保持させることにより創出することができる。
また、光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質がＣｈｏｐ２である場合には、本発明の改変型ロドプシンタンパク質は、Ｃｈｏｐ２の含膜貫通構造ドメインの少なくとも１つ（例えばドメインａ）に代えて、Ｃｈｏｐ１の含膜貫通構造ドメイン（例えばドメインＡ）を保持させることにより創出することができる。
このようなＣｈｏｐ１とＣｈｏｐ２との間で創出される改変型ロドプシンタンパク質として、以下に例示するポリペプチド又はその変異体を含むタンパク質が挙げられる。
（Ａｂｃｄｅｆｇ）  配列番号２のアミノ酸１〜１１７と配列番号４のアミノ酸７９〜３１５とからなるポリペプチド
（ＡＢｃｄｅｆｇ）  配列番号２のアミノ酸１〜１６４と配列番号４のアミノ酸１２６〜３１５とからなるポリペプチド
（ＡＢＣｄｅｆｇ）  配列番号２のアミノ酸１〜１８４と配列番号４のアミノ酸１４６〜３１５とからなるポリペプチド
（ＡＢＣＤｅｆｇ）  配列番号２のアミノ酸１〜２１２と配列番号４のアミノ酸１７４〜３１５とからなるポリペプチド
（ＡＢＣＤＥｆｇ）  配列番号２のアミノ酸１〜２４２と配列番号４のアミノ酸２０４〜３１５とからなるポリペプチド
（ＡＢＣＤＥＦｇ）  配列番号２のアミノ酸１〜２７６と配列番号４のアミノ酸２３８〜３１５とからなるポリペプチド
（ａＢＣＤＥＦＧ）  配列番号２のアミノ酸１１８〜３４５と配列番号４のアミノ酸１〜７８とからなるポリペプチド
（ａｂＣＤＥＦＧ）  配列番号２のアミノ酸１６５〜３４５と配列番号４のアミノ酸１〜１２５とからなるポリペプチド
（ａｂｃＤＥＦＧ）  配列番号２のアミノ酸１８５〜３４５と配列番号４のアミノ酸１〜１４５とからなるポリペプチド
（ａｂｃｄＥＦＧ）  配列番号２のアミノ酸２１３〜３４５と配列番号４のアミノ酸１〜１７３とからなるポリペプチド
（ａｂｃｄｅＦＧ）  配列番号２のアミノ酸２４３〜３４５と配列番号４のアミノ酸１〜２０３とからなるポリペプチド
（ａｂｃｄｅｆＧ）  配列番号２のアミノ酸２７７〜３４５と配列番号４のアミノ酸１〜２３７とからなるポリペプチド
上記ポリペプチドの各変異体には、上記ポリペプチドの各アミノ酸配列において１個〜数個のアミノ酸の置換、付加、挿入又は欠失を有し、かつ上記ポリペプチドと同等の機能特性を有するポリペプチド、並びに上記ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有し、かつ上記ポリペプチドと同等の機能特性を有するポリペプチドを含む。なお、「数個」、配列相同性の値及び「同等の機能特性」については、上に定義されている。
上記変異体は、天然に生じたものであってもよいし、人為的に変異を導入したものであってもよい。人為的な変異の導入は、例えば部位特異的変異導入法や、ＰＣＲを利用した変異導入法などによる積極的な変異の導入（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，１９８４  ８１：５６６２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら．，前述；Ａｕｓｕｂｅｌら，前述）の他、上記ポリペプチドの発現効率を高める操作等、製造の便宜的側面から生じたものであってもよい。
Ｃｈｏｐ１とＣｈｏｐ２との間で創出される上記改変型ロドプシンタンパク質の中でも、ＡＢＣＤＥｆｇ（以下、「チャネルオプシン・ワイドレシーバー（ｃｈｏｐ  ＷＲ）」とも称する）が、コンダクタンス、長波長の光吸収の大きさ、不活性化の弱さなどが顕著に優れている。また、Ｎａ＋イオンに対する選択性も高い。チャネルオプシン・ワイドレシーバーは、微弱光の受容に優れており、例えば組織の深部にある細胞に導入する用途において優れた改変型ロドプシンタンパク質である。
また上記改変型ロドプシンタンパク質の中で、ＡＢｃｄｅｆｇ（以下、「チャネルオプシン・ファストレシーバー（ｃｈｏｐ  ＦＲ）」とも称する）が、周波数応答特性において、顕著に優れている。また、コンダクタンス、不活性化の弱さ、Ｎａ＋イオンに対する選択性においても優れている。チャネルオプシン・ファストレシーバーは、高周波で変動する光情報の受容に優れており、例えば光で情報入力できる神経細胞ネットワークモジュールの素材として優れた改変型ロドプシンタンパク質である。
１．４  改変型ロドプシンタンパク質の作製
本発明の改変型ロドプシンタンパク質は、光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質遺伝子、及びｃｈｏｐ１遺伝子及びｃｈｏｐ２遺伝子の配列情報に基づき、遺伝子工学的手法により製造することができる。
具体的には、まず本発明の改変型ロドプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、「改変型ロドプシン遺伝子」ともいう）を調製する。改変型ロドプシン遺伝子は、当業者に公知の手法によって調製することができる。例えば、光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質をコードする遺伝子の配列情報と、ｃｈｏｐ１遺伝子及びｃｈｏｐ２遺伝子の配列情報に基づき、所望の改変型ロドプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを化学合成することができる。或いは、上記配列情報に基づいて、光受容体チャネル型ロドプシン遺伝子の所望領域を増幅するＰＣＲプライマーと、ｃｈｏｐ１遺伝子及び／又はｃｈｏｐ２遺伝子の所望ドメインを増幅するＰＣＲプライマーとを設計・化学合成し、対象の生物から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とする前記ＰＣＲによって、改変型ロドプシン遺伝子を構成する光受容体チャネル型ロドプシン遺伝子領域と、Ｃｈｏｐ１及び／又はＣｈｏｐ２ドメイン領域をコードするポリヌクレオチドとをそれぞれ増幅し、これらを連結することによって調製してもよい。
次に、プロモーターと機能的に連結された、本発明の改変型ロドプシン遺伝子を、宿主菌体内で複製維持が可能であり、このタンパク質を安定に発現させることができ、該遺伝子を安定に保持できる発現ベクターに組み込み、得られた組換え発現ベクターを用いて宿主を形質転換し、宿主において本発明の改変型ロドプシンタンパク質を生産させることができる。組換え技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ら（上記）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ら（上記）を参照することができる。
発現ベクターとしては、これに限定されるものではないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２８、ｐＧＥＸ４Ｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、及び他のプラスミドＤＮＡ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、及び他のプラスミドＤＮＡ）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、及び他のプラスミドＤＮＡ）、λファージ（λｇｔ１１、λＺＡＰ等）、哺乳動物用プラスミド（ｐＣＭＶ、ｐＳＶ４０）、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどの動物ウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなどの昆虫ウイルスベクター等）、植物用ベクター（バイナリベクターｐＢＩ系等）、コスミドベクターなどを用いることができる。
本明細書で使用する「機能的に連結された」とは、プロモーター配列が目的のポリヌクレオチド配列の転写を開始することができるような、プロモーター配列と目的のポリヌクレオチド配列との間の機能的な結合をいう。
プロモーターは特に制限されず、宿主に応じて適するプロモーターを選択すればよく、また当該技術分野で公知の構成的プロモーター、誘導性プロモーターのいずれを用いてもよい。本発明においては、特に構成的プロモーターを用いることが好ましい。例えば本発明において使用することができるプロモーターとして、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧプロモーター、シナプシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ＣａＭＶプロモーター、解糖系酵素プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ｔｈｙ１プロモーターなどを挙げることができる。
改変型ロドプシン遺伝子の発現ベクターへの挿入は、例えば、改変型ロドプシン遺伝子にフランキングする制限酵素部位を作製又は連結し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することにより行う。発現ベクターは、プロモーター及び改変型ロドプシン遺伝子の他、必要に応じてエンハンサー及び他のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（アンピシリン耐性マーカー、テトラサイクリン耐性マーカーなどの薬剤耐性遺伝子マーカー、ＬＥＵ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３などの栄養要求性相補遺伝子マーカー、ＡＰＨ、ＤＨＦＲ、ＴＫなどの優性選択マーカーなど）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）などを含んでもよい。
宿主を形質転換するには、プロトプラスト法、スフェロプラスト法、コンピテントセル法、ウイルス法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ジーンボンバートメント法、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション等を用いて行うことができる。
得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件で培養する。形質転換体の培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、２５〜３７℃で３〜６時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は、必要に応じて、組換え発現ベクターに挿入した選択マーカーに応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。また形質転換に使用する宿主は、本発明の改変型ロドプシンタンパク質を発現できるものであれば特に制限されるものではなく、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等）、動物細胞（ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
本発明の改変型ロドプシンタンパク質は、形質転換体の培養により得られた培養物（培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞若しくは菌体のホモジェネートなど）から一般的な方法によって分取や精製を行い、限外濾過濃縮、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化等によって、その活性を保持するかたちで得ることができる。或いは、本発明の改変型ロドプシンタンパク質は、単離・精製を行うことなく、該タンパク質を発現する細胞の形態で提供してもよい。この場合、形質転換に使用する宿主細胞は、その後の用途に適した宿主細胞、例えば神経細胞、好ましくヒト神経細胞である。
また、本発明の改変型ロドプシンタンパク質を医療用途に使用する場合には、該タンパク質発現用ベクターの形態で提供してもよい。この場合には、細胞への導入効率、該細胞内での複製維持、安定性、発現効率等に優れた発現ベクターを用いることが好ましい。このようなベクターとして、これに限定されるものではないが、例えばアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクター、（自立複製可能な）プラスミド、トランスポゾンなどを挙げることができる。
２．用途
光受容体チャネル型ロドプシンの１つであるバクテリオロドプシンは、その機能が明らかになって以降、視覚回復（例えば特開２００２−３６３１０７）や基礎研究のリサーチツール（例えば特表２００４−５２１６０４）としての用途だけでなく、光電変換素子（例えば特開２００２−２７１２６５、特開２０００−６７９３９）や光学情報記憶物質（例えば特表２００６−５１５６８３）、または神経モデル素子（例えば特開平６−２９５３５０）への用途が考えられてきた物質である。しかしながら、バクテリオロドプシンの特徴である１個のフォトンあたり１個の電子が移動するという点から、上記の用途に用いることについては解決すべき課題が残されている。
これに対し、チャネルロドプシンの場合、１個のフォトンを吸収してイオンチャネルが開口するので、移動する電子数がはるかに多く、その結果、効率の高い光電変換が期待される。一方で、野生型チャネルロドプシンにおいては脱感作の影響を考慮する必要があるなどの問題もある。
本発明によれば、機能特性において、野生型の光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質と大きく異なる改変型ロドプシンタンパク質の様々なラインナップが得られる。したがって、用途に応じて改変型ロドプシンタンパク質を選び出して使用することができる。
２．１  視覚回復及び治療への利用可能性
ヒトの眼球においては、網膜にある受容体細胞で光が感知され、双極細胞を経て、神経節細胞に活動が伝えられる。神経節細胞の軸索突起が視神経として脳に神経を送っている。網膜色素変性症や加齢にともなう黄斑変性症などにおいては、受容体細胞が変性することにより視力を失う。前者は、遺伝的な背景のあるもので、比較的若い時に失明するが、世界中に１５０万人の患者がいるといわれる。後者は、６５歳以上における失明の最大要因である。このような患者では、網膜の神経節細胞は健常である。そこで、網膜の双極細胞や神経節細胞は、本来光感受性を有しないが、野生型のＣｈｏｐ２（１−３１５）ａｂｃｄｅｆｇを遺伝子工学的方法を介して網膜の神経細胞に導入・発現させることにより、視覚を回復する研究が行われている。
このような目的には、ロドプシンタンパク質に以下のような特性が必要とされる：（ｉ）微弱な光を感知できること；（ｉｉ）波長選択性が低く、白色光に応答すること；（ｉｉｉ）光電流の不活性化が弱いこと。野生型のＣｈｏｐ２（１−３１５）ａｂｃｄｅｆｇは、青色光に対する選択性が高く、光電流が強い不活性化を有しているので、これらの性質において優れているとはいえない。
これに対し、例えばチャネルオプシン・ワイドレシーバーは、コンダクタンスが大きいこと、青から緑の広い波長域に応答すること、光電流の不活性化がほとんど認められないこと、などの優れた特性を有しているため、組織の深部にある細胞に高い光感受性を付与することが期待される。
したがって、網膜光受容体細胞の変性に伴う視覚障害者において、まったく非侵襲的に高い解像度の視覚を回復し、その生活能力を向上させる素材として、最適であることが期待される。
具体的には、本発明の改変型ロドプシンタンパク質（例えばチャネルオプシン・ワイドレシーバー）、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、又は該タンパク質を発現する真核細胞（例えば視神経細胞）を有効成分とする視機能回復用の医薬組成物として使用することができる。
２．２  聴覚系の神経細胞への導入
聴覚系の神経細胞などは、数百Ｈｚの高頻度の活動をすることが知られている。光照射により、これらの神経細胞に高頻度の活動を引き起こすに当たり、光電流の不活性化が弱いこと、および、周波数応答特性の高いことが必要になる。したがって、例えばチャネルオプシン・ファストレシーバー（ｃｈｏｐＦＲ）を用いることにより、これらの神経細胞に高頻度の活動を引き起こすことが期待される。
２．３  基礎研究におけるリサーチツールとしての利用可能性
マウス、ラット、サルなどの哺乳類以外に、ゼブラフィッシュ、昆虫、アメフラシ、線虫など、さまざまな種類の動物を用いて、神経細胞や神経細胞が作るネットワークの機能が研究されている。遺伝子によりコードされるタンパク質が生体でどのような機能を担っているかを研究するにあたり、神経細胞の機能やシナプスの機能を研究することが必要不可欠である。また、神経系に作用する薬品を開発するにあたり、それらの化学物質が、神経細胞の機能やシナプスの機能をどのように修飾するかをアッセイすることが必要である。これらの研究は、ｉｎ  ｖｉｖｏあるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏの神経系において、神経細胞を刺激し、それにより引き起こされる動物の行動やシナプスの活動を計測することにより実施される。神経細胞の刺激は、一般に単極または双極の刺激電極を近づけ、短い電気パルスを通電することにより行われる。しかし、刺激される神経細胞の数、位置、種類などを特定することは困難である。
一方、光受容体チャネルを神経細胞に遺伝子導入して発現させることにより、神経細胞に光感受性を獲得させることができることから、光パルスにより神経細胞を刺激することが試みられている。しかし、野生型チャネルロドプシン（例えばＣｈｏｐ２）の光電流は、速やかに脱感作し、脱感作からの回復に数十秒を要する。したがって、高い頻度で繰り返し刺激することが困難である。
本発明の改変型ロドプシンタンパク質、例えばチャネルオプシン・ワイドレシーバーやチャネルオプシン・ファストレシーバーを発現したときに得られる光電流は、コンダクタンスが大きく、不活性化が弱いので、高頻度で繰り返し刺激する目的に適している。チャネルオプシン・ワイドレシーバーは、長波長側における吸収が大きいので、ブロードバンドの光を用いることによりさらに大きな光電流を惹起することができる。したがって、光パルスにより神経細胞に活動電位閾値を越える大きな脱分極を確実に引き起こすことができ、高い信頼性が期待される。またチャネルオプシン・ファストレシーバーは、追随周波数が大きいので、神経細胞を高頻度で活動させる目的に適している。
これら改変ロドプシンタンパク質を用いることにより、神経細胞や神経細胞が作るネットワークの機能研究や、これらの機能をアッセイ系に用いる薬品の開発を促進することが期待される。さらに、これら改変型ロドプシンタンパク質遺伝子を組み込んだ組換えウイルスベクターや、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、線虫などの遺伝子組換え動物が作製され、研究・開発に広く応用されることが期待される。
２．４  ブレイン・マシン・インターフェース（ＢＭＩ）、ブレイン・コンピューター・インターフェース（ＢＣＩ）への応用
脳情報を解読し、それを機械の制御やコンピューターへの入力情報に利用するとともに、脳に情報をインプットする技術は、ブレイン・マシン・インターフェース（ＢＭＩ）、ブレイン・コンピューター・インターフェース（ＢＣＩ）と呼ばれている。これらは、脳を介した新たなコミュニケーションを可能とする技術であり、その実現のためには、低侵襲で長期安定型の脳情報双方向活用技術の発展が不可欠である。時間・空間的に高密度、高解像度の情報入出力を実現するにあたり、光を双方向的情報媒体として用いることが理想的である。また、光を用いることにより、脳に対する機械的な侵襲を最小限にとどめることができる。
本発明の改変型ロドプシンタンパク質、例えばチャネルオプシン・ワイドレシーバーやチャネルオプシン・ファストレシーバーは、光を用いた脳への情報入力媒体として最適であることが期待される。
２．５  神経細胞ネットワークを利用したコンピューター素子の開発
コンピューターは、情報を早く、正確に処理する能力に優れている。また、ネットワークにより、リアルタイムで世界中のコンピューターと交信することができる。これに対して、脳は、エラーを積極的に作り出し、多くの選択肢の中から環境や状況に最適の解答を引き出す能力に優れている。この能力がインスピレーションや感情などの源になっている。そこで、ニューロンネットワークを人工的なハードウェアと組み合わせることにより、より脳に近い情報処理のできるコンピューターを作製することが試みられている。具体的な方法として、シリコン基板やガラス板を加工して刺激および測定用の電極をマトリックス上に配置し、これに培養ニューロンや脳スライスをセットしたものが用いられている。
また、生きている動物の脳そのものをコンピューターの情報処理に用いる試みもなされている。ニューロンを刺激する方法として、金属や半導体電極による電気刺激法やグルタミン酸投与法が用いられてきた。従来の方法は、空間解像度が低いという問題があり、さらに、生きている動物を用いる場合、多電極刺激装置などを脳に埋め込む必要があるため侵襲的であり、長期間の安全な使用が難しかった。
一方、光受容体チャネルを神経細胞に遺伝子導入して発現させることにより、神経細胞に光感受性を獲得させることができる。培養ニューロンの場合、レーザーなどを用いることにより、個々のニューロン、さらには、その一部を多点同時刺激することが可能になり、複雑なパターンの情報をニューロンネットワークに送り込むことができる。これにより、単純な培養ニューロンネットワークであっても、脳が行っている試行錯誤的な情報処理を再現することが可能になる。生きている動物の大脳皮質を用いる場合は、脳表面からの光照射により、高い解像度をもって、多点同時のパターン刺激が実現される。光刺激を用いる場合、電気的なアーチファクトが生じないので、同時に個々のニューロンの活動をリアルタイムで計測し、コンピューターにフィードバックすることが容易になる。これにより、従来のコンピューターの能力に、パターン認識、自己組織化など脳の優れた能力をあわせもつコンピューターが作られることが期待される。
本発明の改変型ロドプシンタンパク質、例えばチャネルオプシン・ワイドレシーバーやチャネルオプシン・ファストレシーバーは、光を用いた神経細胞ネットワークへの情報入力媒体として最適であることが期待される。また、これら改変型ロドプシンタンパク質の光吸収特性の違いを利用して、マルチチャネルの情報を神経細胞ネットワークに入力することのできる展望がある。例えば、チャネルオプシン・ワイドレシーバーとチャネルオプシン・ファストレシーバーの光電流波長依存性の差を利用したマルチチャネル入力が可能になると考えられる。
２．６  筋肉の力を利用するマイクロマシン（ＭＥＭＳ）の開発
筋肉の最小単位である筋線維（筋細胞）は、微小ではあるが、強い力を生み出すことができる。また、きわめて高いエネルギー効率を有している。これらの利点ゆえに、マイクロマシンの動力に生物由来の収縮メカニズムを利用する試みがなされている（Ｓｏｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｂａｃｈａｎｄ  ａｎｄ  Ｍｏｎｔｅｍａｇｎｏ，２０００；Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｘｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。しかし、マイクロマシンを操作するにあたり、収縮メカニズムをどのように時間・空間的に制御して駆動させるかという難問がある。筋肉では、脊髄の運動神経が筋線維にほぼ一対一のシナプスを形成している。運動神経が興奮することにより、シナプスを介して、筋線維のシナプス部位に活動電位が発生し、これが筋線維形質膜を伝導し、Ｔ−小管を脱分極させることにより、筋収縮が引き起こされる。したがって、神経細胞のレベルで、それぞれの筋線維の収縮を制御することにより、微妙な運動の制御がなされている。しかし、人工のマイクロマシンに神経を支配させ、その活動を制御することはきわめて困難である。個々の筋細胞を直接刺激することが理想的だが、従来の電気刺激法では、時間・空間的な制御に限界があった。
遺伝子工学的に光感受性を組み込んだ筋細胞やマイオブラストクローンを作製し、光で直接筋収縮を制御するにあたり、本発明の改変型ロドプシンタンパク質、例えばチャネルオプシン・ワイドレシーバーやチャネルオプシン・ファストレシーバーは、光を用いた筋収縮媒体として最適であることが期待される。さらに、このような光操作型マイクロマシンを顕微鏡下で自在に操作できるシステムの構築が期待される。例えば顕微鏡下に対象を切断するマイクロシザーズ、対象をつかむマイクログラバー、対象を運搬するマイクロコンベアー、液体中を泳ぐマイクロワームなどが考えられる。これらは、顕微鏡下の精密な微小手術、たとえば、組織の血管や神経を保護しながらがん細胞を除去するような手術に用いられることが期待される。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０００６】
（１）ハイブリッド分子の作製
本実施例においては、まず、Ｃｈｏｐ１（１−３４５）ＡＢＣＤＥＦＧ及びＣｈｏｐ２（１−３１５）ａｂｃｄｅｆｇから図２に示す１２種類のハイブリッドアポタンパク質を作製した。
これらのハイブリッドアポタンパク質は、オーバーラップエクステンションＰＣＲ法により作製した。以下にその過程を具体的に説明する。
オーバーラップエクステンションＰＣＲ法は２つのステップからなっている。まず、最初のステップでは、作製したいハイブリッドアポタンパク質のＮ末側のアミノ酸残基配列をコードするｃＤＮＡフラグメントとＣ末側のアミノ酸残基配列をコードするｃＤＮＡフラグメントをそれぞれＰＣＲによって作製する。この時、Ｎ末側フラグメントを作製する時に使用するリバースプライマーと、Ｃ末側フラグメントを作製する時に使用するフォワードプライマーのｃＤＮＡ配列は相補的な関係になるように設計する。例えば、ハイブリッドＡｂｃｄｅｆｇを作製する場合、ＡドメインのｃＤＮＡフラグメントはｃｈｏｐ１−３４５−ＥｃｏＲＩ−Ｆ１とｃｈｏｐ−ｃｈＲ１プライマーの組み合わせで、ｂｃｄｅｆｇドメインのｃＤＮＡフラグメントはｃｈｏｐ−ｃｈＦ１とｃｈｏｐ２−３１５−ＥｃｏＲＩ−Ｒ１の組み合わせで、それぞれＣｈｏｐ１（１−３４５）とＣｈｏｐ２（１−３１５）を鋳型にして、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）を用いてＰＣＲを行い、それぞれのフラグメントを作製した。２つめのステップでは、Ａフラグメントとｂｃｄｅｆｇフラグメントを混合し、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。この時、Ａフラグメントとｂｃｄｅｆｇフラグメントの片端には互いに相補的な配列が含まれているので、Ａフラグメントのセンス鎖とｂｃｅｄｆｇフラグメントのアンチセンス鎖の間でｃＤＮＡの伸長が起こり、Ａｂｃｄｅｆｇというキメラ分子が作製される。以下、同様にして、ハイブリッドＡＢｃｄｅｆｇの作製では、ｃｈｏｐ１−３４５−ＥｃｏＲＩ−Ｆ１とｃｈｏｐ−ｃｈＲ２の組み合わせでＡＢフラグメントを、ｃｈｏｐ−ｃｈＦ２とｃｈｏｐ２−３１５−ＢａｍＨＩ−Ｒ１の組み合わせでｃｄｅｆｇフラグメントを作製し、２回目のＰＣＲでＡＢｃｄｅｆｇフラグメントを作製した。表１にハイブリッドアポタンパク質作製に使用したプライマーの名称とその配列、表２にそれぞれのハイブリッドアポタンパク質の作製に使用したプライマーの組み合わせと鋳型に用いたｃＤＮＡをまとめた。
【表１】
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【表２】
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オーバーラップエクステンションＰＣＲで作製したハイブリッドアポタンパク質のｃＤＮＡフラグメントの両端は制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩによる切断部位になっている。両制限酵素で処理したｃＤＮＡフラグメントを、ｐＶｅｎｕｓ−Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１ベクターのＤｓＲｅｄ２をＶｅｎｕｓに置換したもの）のＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ間にクローニングして、ハイブリッドアポタンパク質のＣ末側に黄色蛍光タンパク質の一種、Ｖｅｎｕｓを付加した融合タンパク質を発現させる哺乳類細胞発現用プラスミドベクターを作製した。
（２）ＨＥＫ２９３細胞の培養
ヒト胎児腎臓細胞由来のＨＥＫ２９３細胞は６０ｍｍプラスチックディッシュ上（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  ＰＲＩＭＡＲＩＡ  ｄｉｓｈ）で培養し維持した。培養液には９０％Ｄ−ＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清を用いた。コラーゲンコート処理を施した４穴プレート（ＮＵＮＣ）に継代して３０−５０％コンフルエントになった時点で、遺伝子導入処理を行った。遺伝子導入の翌日にトリプシン処理により細胞を分散し、コラーゲンコート処理を施した１２ｍｍ丸形カバーガラス上に細胞を播き直し、その翌日に機能検定を行った。機能検定には１個の単離した細胞を用いた。
（３）遺伝子導入
ＨＥＫ２９３細胞へのロドプシンアポタンパク質遺伝子の導入にはＱｉａｇｅｎ社のＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて、メーカー指定の方法にて遺伝子導入を行った。遺伝子導入には１２ｍｍ丸形カバーガラス１枚辺り０．２〜０．４μｇのロドプシンアポタンパク質発現プラスミドを用いた。
（４）実験装置
レチナールを結合したロドプシンアポタンパク質は４００−５５０ｎｍの光の波長に反応するので、細胞を顕微鏡下まで運ぶ際や、明視野で観察する際に青〜緑色光の含まれない環境を作った。実験室の照明には黄色の蛍光灯（パナソニックＦＬ４０Ｓ。Ｙ−Ｆ）を用い、５２０ｎｍ以下の波長の光を遮断した。また、ＣＲＴモニターの背景色を黄色にした。以下の装置はすべて、エアーテーブル上に設置し、振動の影響を除去した。また、暗幕内に設置し、室内光の影響を除去した。主要な装置の概略を図３に示す。
（ｉ）  正立型落射蛍光顕微鏡（オリンパスＢＨ２−ＲＦＣ）：細胞観察時の透過光はＧＩＦフィルターを介し、波長４９０ｎｍ以下の光を遮断した。Ｖｅｎｕｓの励起・観察には、キセノンランプ光源を用い、光のＯＮ−ＯＦＦは、電磁シャッターにより制御した。フィルターおよびダイクロイックミラーの組み合わせにより、励起光波長４５０−４９０ｎｍ、蛍光波長＞５１５ｎｍによりＣｈｏｐ２−Ｖｅｎｕｓを発現している細胞を同定した。対物レンズには、６０倍水浸レンズ（オリンパスＬＵＭｐｌａｎＰｌ／ＩＲ６０ｘ）を用いた。
（ｉｉ）  青色光（４７７±１０ｎｍ）と緑色光（５３２±１０ｎｍ）の切り替え：落射光源には、キセノンランプを用いた。電気刺激装置（日本光電ＳＥＮ−７２０３）により作成した矩形波パルス電流により電磁シャッターを駆動し、光のＯＮ−ＯＦＦを制御した。光路の途中においたチョッパー（オリンパスＯＳＰ−ＥＸＣＨ）により、青色光バンドパスフィルター（４７７±１０ｎｍ）と緑色光バンドパスフィルター（５３２±１０ｎｍ）切り替えた。光は、ダイクロイックミラーを介して、顕微鏡対物レンズに導入した。
（ｉｉｉ）  青色発光ダイオード（ＬＸＨＬ−ＮＢ９８；Ｌｕｍｉｌｅｄｓ  Ｌｉｇｈｔｉｎｇ  Ｉｎｃ．）：パッチクランプ制御ソフトウェア（アキソンｐ−Ｃｌａｍｐ  ９．１）により、パルスを作製し、ディジタル−アナログ変換装置（アキソンＤＩＧＩＤＡＴＡ１２００）および電気刺激装置（日本光電ＳＥＮ−７２０３）により作成した矩形波パルス電流を、ブースター回路に（図４）により電流増幅し、点灯した。ダイオード光はダイクロイックミラーを介して、顕微鏡対物レンズに導入した。
（ｉｖ）  モノクロメーター（日本分光ＣＡＭ−２３０）：キセノンランプ光を分光し、１０ｎｍ幅の任意の波長を取り出した。取り出された光は、光ファイバーにより、落射蛍光顕微鏡に導入した。光のオン・オフは内蔵の電磁シャッターにより制御した。
（ｖ）  顕微鏡用ＸＹ駆動装置（メディカル・エイジェントＯＸＹ−１）：後述の３次元マイクロマニピュレーターを固定部に設置し、前述の正立型落射蛍光顕微鏡を駆動部に設置した。マイクロメーターにより、Ｘ−Ｙ２軸方向の駆動をそれぞれ微細に制御した。
（ｖｉ）  ３次元マイクロマニピュレーター（ナリシゲＭＸ−１Ｒ）：後述のパッチ電極のホルダーをＸ−Ｙ−Ｚの三軸方向に駆動した。それぞれの駆動軸には、粗動と微動の両様式を併用した。
（ｖｉｉ）  測定用チェンバー：透明アクリル板を加工し、低部にカバーグラスを貼り付けた。ペリスタポンプにより、チェンバーにタイロード液（下記表３参照）を循環させた。チェンバー内に培養細胞を付着させたカバーグラスを置いた。
（ｖｉｉｉ）  フォトダイオード（シャープＢＳ５００Ｂ）：顕微鏡対物レンズの手前で散乱光を受光し、微小電極用増幅器により増幅した。
【表３】
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（５）計測・記録装置およびデータ解析
ＨＥＫ２９３細胞の膜電位と膜電流を同時計測した。また、照射光の強さをフォトダイオード電流として同時計測した。これらは、アナログ−ディジタル変換し、コンピューターに記録した。計測には以下の装置を用いた。
（ｉ）  パッチクランプ増幅器（アキソンＡＸＯＰＡＴＣＨ２００Ａ）：パッチ電極を介して、フィードバックにより膜電位を一定に維持したときの膜電流を計測した（電位固定実験）。
（ｉｉ）  微小電極用増幅器（日本光電ＭＥＺ−８２０１）：フォトダイオードに２０ｎＡの逆電流を通電しながら、光電流を計測した。計測値は、青色発光ダイオードの最大出力に対する相対値で表した。
（ｉｉｉ）  アナログ−ディジタル変換装置（アキソンＤＩＧＩＤＡＴＡ１２００）：パッチクランプ増幅器の電流出力および電圧出力、微小電極用増幅器の電圧出力をアナログ−ディジタル変換し、コンピューターに出力した。また、コンピューターにより作成した矩形波パルスを外部出力した。
（ｉｖ）  コンピューター（デルＯｐｔｉｐｌｅｘ  ＧＸｉ）：パッチクランプ制御ソフトウェア（アキソンｐ−Ｃｌａｍｐ  ９．１）を用いてデータを取得した。また、矩形波パルスを作成した。データの解析には、Ｃｌａｍｐ−ｆｉｔ  Ｖｅｒ．９．２（アキソン）とＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いた。
（６）ホールセルパッチクランプ法
野生型Ｃｈｏｐ１及び２、並びにハイブリッドアポタンパク質の特性をホールセルパッチクランプ法により確認した。すなわち、直径１．５ｍｍのガラス管（ハーバード・アパラータスＧＣ１５０）をパッチピペットプラー（ナリシゲＰＣ−１０）を用いて加熱牽引し、先端径３−４μｍのガラス管ピペット（パッチピペット）を作製し、先端をマイクロフォージ（ナリシゲＭＦ−８３０）にて加熱研磨した。パッチピペットの先端までパッチピペット内液（表３）を満たしパッチ電極を作製した。パッチ電極は、パッチ電極ホルダーに固定した。正立落射蛍光顕微鏡下にＶｅｎｕｓの蛍光によりロドプシンアポタンパク質を発現している細胞を同定した。パッチ電極に陽圧をかけながら、細胞に接近させ、細胞表面に押し当ててディンプル（くぼみ）をつくり、陰圧に切り替えて細胞膜をガラス管に付着させ、さらに強い陰圧をかけてガラス管に付着した部位の膜を破り、細胞内部とガラス管内部を電気的に導通させた（ホールセルモード）。ホールセルモードで以下の電位固定実験をおこなった。
（７）光応答特性を制御している含膜貫通構造ドメインの同定
これらのハイブリッドアポタンパク質にマーカーとして、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰの改変体の一つＶｅｎｕｓをＣ末に配位したコンストラクトｃＤＮＡを作製した。これらをＨＥＫ２９３細胞に導入・発現させたところ、１２種類のハイブリッドアポタンパク質全てにおいて、形質膜に高い発現が認められた（図５）。すなわち、膜タンパク質としての構造が保たれていることが示唆された。Ｖｅｎｕｓの蛍光を手がかりに発現細胞を同定し、ホールセルパッチ電位固定下に光電流を計測した。
野生型Ｃｈｏｐ２（１−３１５）ａｂｃｄｅｆｇの光電流の大きさは、照射光の波長に依存し、４６０ｎｍで最大になる。これは、光エネルギーの吸収効率に波長依存性があることにより説明されている。ハイブリッド光電流の吸収光波長応答特性を比較する目的で、青色光（４７７±１０ｎｍ）と緑色光（５３２±１０ｎｍ）により惹起される光電流を計測した。図６Ａは、それぞれの光電流をハイブリッドＡｂｃｄｅｆｇとＡＢｃｄｅｆｇで比較したものである。ハイブリッドＡＢｃｄｅｆｇの緑色光に対する応答が増大している。青色光応答と緑色光応答のＧ／Ｂ比（Ｇｒｅｅｎ／Ｂｌｕｅ  ｒａｔｉｏ）を用いて、吸収波長応答特性を定量化し、ハイブリッドアポタンパク質と野生型アポタンパク質の間でこれを比較したものを図６Ｂに掲載する。すなわち、ハイブリッドＡｂｃｄｅｆｇは、野生型のチャネルオプシン２（１−３１５）ａｂｃｄｅｆｇとほぼ同様の吸収波長応答特性を示した。これに対し、ハイブリッドＡＢｃｄｅｆｇ、ＡＢＣｄｅｆｇ、ＡＢＣＤｅｆｇでは、長波長側における吸収が増加していた。ハイブリッドＡＢＣＤＥｆｇでは、長波長側における吸収がさらに増加し、野生型のチャネルオプシン１、ＡＢＣＤＥＦＧとほぼ等しかった。すなわち、含膜貫通構造ドメインＢ／ｂおよびＥ／ｅに吸収波長特性を制御している構造があり、これらがｂやｅのときに、長波長側にシフトすることが示唆される。
（８）イオン透過性を制御している含膜貫通構造ドメインの同定
野生型Ｃｈｏｐ１（１−３４５）ＡＢＣＤＥＦＧを発現したゼノパス卵母細胞に発現した光受容チャネルは、高いＨ＋透過性を有するが、Ｎａ＋に対する透過性がほとんどないと報告されている（Ｎａｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｈｅｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。これに対し、野生型Ｃｈｏｐ２（１−３１５）ａｂｃｄｅｆｇは、高いＮａ＋透過性を有することが報告されている（Ｎａｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｉｓｈｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。Ｎａ＋透過性を制御している構造を同定する目的で、ホールセルパッチ内液をＮａ＋−ｇｌｕｔａｍａｔｅ（Ｎａ＋、１００ｍＭ）とし、細胞外液のＮａ＋が１４２ｍＭと２０ｍＭ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃａｍｉｎｅイオン置換）のときの保持電位と光電流のＩ−Ｖ関係を調べた。
図７Ａは、ハイブリッドＡｂｃｄｅｆｇのＩ−Ｖ関係である。外液Ｎａ＋１４２ｍＭでは、約１０ｍＶにおいて極性が反転したが、外液Ｎａ＋２０ｍＭのとき、反転電位は約−１０ｍＶだった。すなわち、約２０ｍＶマイナス側へシフトした。この変化は、野生型Ｃｈｏｐ２（１−３１５）ａｂｃｄｅｆｇに比べ有意に小さい。図７Ｂは、ハイブリッドＡＢｃｄｅｆｇのＩ−Ｖ関係である。反転電位は３０ｍＶ以上シフトした。図７Ｃは、それぞれのハイブリッドアポタンパク質について、光電流の反転電位のシフトを比較したものである。ハイブリッドＡＢＣｄｅｆｇとＡＢＣＤｅｆｇにおいても、反転電位のシフトが有意に小さかった。したがって、これらのハイブリッドオプシンタンパク質では、透過イオンのＮａ＋選択性が低下している可能性がある。これに対し、ハイブリッドＡＢｃｄｅｆｇ、ＡＢＣＤＥｆｇ、ＡＢＣＤＥＦｇ、ＡＢＣＤＥＦＧのＩ−Ｖ関係においては、反転電位のシフトが外液Ｎａ＋により強く依存しており、野生型Ｃｈｏｐ２（１−３１５）ａｂｃｄｅｆｇとの間に有意差は認められなかった。すなわち、透過イオンの選択性が複数の含膜貫通構造ドメインによる制御を受けており、含膜貫通構造ドメインＡ／ａ、Ｂ／ｂ、Ｃ／ｃに重要な機能があることが示唆される。
また、ハイブリッドＡＢＣＤＥＦｇや野生型Ｃｈｏｐ１（１−３４５）ＡＢＣＤＥＦＧの光電流は、他に比べ非常に微弱である傾向が認められた。そこで、図８においては、単位膜容量あたりのホールセルコンダクタンスを比較した。単位膜容量あたりのホールセルコンダクタンスは、光受容チャネルの単一チャネルコンダクタンスとその発現密度に比例する。単位膜容量あたりのホールセルコンダクタンスは、ハイブリッドＡＢＣＤＥｆｇにおいて、最大を示した。
（９）キネティクス特性を制御している含膜貫通構造ドメインの同定
図９Ａは、青色ＬＥＤ照射光（４７０±２５ｎｍ）の相対的な強さを示している。ハイブリッドＡｂｃｄｅｆｇを発現したＨＥＫ２９３細胞において、照射光の強さに依存した光電流が計測された（図９Ｂ）。光電流は、数ミリ秒でピークに達するが、速やかに不活性化することが認められた。この光応答特性は、野生型Ｃｈｏｐ２（１−３１５）ａｂｃｄｅｆｇに類似している。これに対し、ハイブリッドＡＢｃｄｅｆｇの光電流は、ほとんど不活性化しない（図９Ｃ）。図１０Ａは、最大照度の青色ＬＥＤ光を１秒間照射したときの光電流を最大光電流の大きさをあわせて比較したものである。野生型Ｃｈｏｐ２（１−３１５）ａｂｃｄｅｆｇに対し、ハイブリッドＡＢｃｄｅｆｇの光電流は、定常光電流と最大光電流の比が大きいことが示されている。そこで、この比（ｐｌａｔｅａｕ／ｐｅａｋｒａｔｉｏ）でもって、不活性化の強さを定量化した。ハイブリッドアポタンパク質と野生型アポタンパク質の間でこれを比較したものを図１０Ｂに掲載する。すなわち、ハイブリッドＡｂｃｄｅｆｇは、野生型Ｃｈｏｐ２（１−３１５）ａｂｃｄｅｆｇに比べ、不活性化が弱いが、ハイブリッドＡＢｃｄｅｆｇに比較すると、不活性化が強いことがわかった。ハイブリッドＡＢＣＤＥｆｇではさらに不活性化が弱くなる。すなわち、含膜貫通構造ドメインＡ／ａ、Ｂ／ｂ、Ｅ／ｅに不活性化を制御している構造があり、これらがａ、ｂ、ｅのときに、強い不活性化が引き起こされることが示唆される。
図１１Ａは、ハイブリッドＡｂｃｄｅｆｇとハイブリッドＡＢｃｄｅｆｇについて、光電流の活性化（ＯＮ）の速さを比較したものである。また、図１１Ｂは、光電流の脱活性化（ＯＦＦ）の速さを比較したものである。光電流のＯＮ、ＯＦＦともに、ハイブリッドＡＢｃｄｅｆｇにおいて速くなることが認められた。光電流のＯＮ速度常数とＯＦＦ速度常数を、ハイブリッドアポタンパク質と野生型アポタンパク質の間で比較したものを図１１Ｃに掲載する。含膜貫通構造ドメインＢ／ｂがＢのときに、ＯＮ、ＯＦＦ共に速くなり、含膜貫通構造ドメインＥ／ｅがＥになると、ＯＮ、ＯＦＦ共に遅くなることが示唆される。
（１０）ハイブリッドロドプシンタンパク質の特徴付け
１．コンダクタンスが増大した改変型ロドプシンタンパク質
上記の実施例により、含膜貫通構造ドメインＦ／ｆにコンダクタンスを制御している構造の存在が示唆される。したがって、この含膜貫通構造ドメインの構造をｆにすることにより、コンダクタンスを増大した新規ロドプシンタンパク質が創出される。現在までに調べたハイブリッドロドプシンタンパク質の中では、ＡＢＣＤＥｆｇを用いることにより、単位膜容量あたり最大のコンダクタンスが得られる。
２．長波長側における吸収が増加した改変型ロドプシンタンパク質
上記の実施例により、含膜貫通構造ドメインＢ／ｂ、Ｅ／ｅ、Ｆ／ｆ、Ｇ／ｇに吸収波長特性を制御している構造の存在が示唆される。現在までに調べたハイブリッドロドプシンタンパク質の中では、ＡＢＣＤＥＦｇにおいて最も長波長側における吸収が増加しているが、コンダクタンスの大きさを考慮に入れると、ＡＢＣＤＥｆｇが実用に優れている。
３．不活性化の弱い改変型ロドプシンタンパク質
神経細胞などを光刺激する手段として、野生型Ｃｈｏｐ２（１−３１５）ａｂｃｄｅｆｇが用いられてきたが、光電流において強い不活性化が存在するので、短い間隔で繰り返し光刺激をおこなうと、光電流が減少するという欠点があった。同じ大きさの光電流を得るためには、１０秒以上の間隔をあける必要があった。上記の実施例により、含膜貫通構造ドメインＡ／ａ、Ｂ／ｂ、Ｅ／ｅに不活性化を制御している構造があり、これらがＡ、Ｂ、Ｅのときに、不活性化が弱くなることが示唆された。現在までに調べたハイブリッドロドプシンタンパク質の中では、ＡＢＣＤＥｆｇを用いることにより、最も不活性化の弱い光電流が得られる。
４．周波数応答特性の高い改変型ロドプシンタンパク質
神経細胞などを繰り返し光刺激する場合、どれぐらいの周波数の光の点滅に追随した光電流を引き起こすことができるかが重要になる。この追随周波数の大きさは、光電流のＯＮ速度常数に等しい。ＯＮ速度常数の大きさは、含膜貫通構造ドメインＢ／ｂ、Ｅ／ｅに依存しており、Ｂ−Ｅ、ｂ−ｅの組み合わせでは小さく、Ｂ−ｅの組み合わせで大きくなる。現在までに調べたハイブリッドロドプシンタンパク質の中では、ＡＢｃｄｅｆｇ、ＡＢＣｄｅｆｇ、ＡＢＣＤｅｆｇなどを用いることにより、周波数応答特性の高い光電流が得られる。ＯＮ速度常数およびＮａ＋に対する選択性を考慮に入れると、ＡＢｃｄｅｆｇが最も優れている。
５．実用性に優れた改変型ロドプシンタンパク質
上記実施例において作製した改変型ロドプシンタンパク質の中で、ＡＢＣＤＥｆｇ（ｃｈｏｐ  ＷＲ）が、コンダクタンス、長波長側における吸収の大きさ、不活性化の弱さなどにおいて、顕著に優れている。また、Ｎａ＋イオンに対する選択性も高い。したがって、チャネルオプシン・ワイドレシーバーは、微弱光の受容を目的とする用途に優れている。
また、上記実施例において作製した改変型ロドプシンタンパク質の中で、ＡＢｃｄｅｆｇ（ｃｈｏｐ  ＦＲ）が、周波数応答特性において、顕著に優れている。また、コンダクタンス、不活性化の弱さ、Ｎａ＋イオンに対する選択性においても優れている。したがって、チャネルオプシン・ファストレシーバーは、高周波で変動する光情報の受容を目的とする用途に優れている。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明によれば、様々な機能が改善又は付与された光受容体チャネル型タンパク質を提供することができる。
また、チャネルオプシン１の含膜貫通構造ドメインとチャネルオプシン２の含膜貫通構造ドメインとを様々な組合せで含ませることにより、特定の機能に特化した光受容体チャネル型タンパク質を提供することができる。
本発明の改変型ロドプシンタンパク質を応用する用途は、光を介するので、網膜、神経、脳などの組織に対しまったく非侵襲的である。また、本発明による新規光受容チャネル型ロドプシンタンパク質は、時間および空間解像度において従来のチャネルロドプシンタンパク質よりも優れたものとして構築できる。したがって、医療、福祉・介護、情報通信を含む分野において極めて有用な素材である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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