(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生抑制剤の候補化合物を血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞に投与する候補化合物投与工程と、
前記候補化合物を投与された前記血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞を保持する細胞保持工程と、
タンパク質のリン酸化を検出するシグナル検出工程と、を有し、
前記シグナル検出工程においてリン酸化が検出される前記タンパク質が、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αである血管新生抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記シグナル検出工程において、ヒト二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲのＴｈｒ４５１又はこれに対応する二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲのアミノ酸残基のリン酸化、及び／又はヒト真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのＳｅｒ５１又はこれに対応する真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのアミノ酸残基のリン酸化を検出する請求項１に記載の血管新生抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞が、毛細血管由来内皮細胞、大血管・臍帯静脈由来内皮細胞、及び網膜血管由来内皮細胞からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項１又は２に記載の血管新生抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記シグナル検出工程において、リン酸化特異的抗体を用いたイムノブロッティング法、３２Ｐオートラジオグラフィー法、リン酸化特異的抗体を用いた免疫染色法、ゲルシフト法、及び特異的抗体とリン酸化特異的抗体とを用いた免疫沈降法からなる群から選ばれる少なくとも一種を用いて前記タンパク質のリン酸化を検出する請求項１から３のいずれかに記載の血管新生抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞において、血管新生抑制シグナル遺伝子の候補遺伝子の発現量を変化させる発現量変更工程と、
前記候補遺伝子の発現量を変化させた前記血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞を保持する細胞保持工程と、
タンパク質のリン酸化を検出するシグナル検出工程と、を有し、
前記シグナル検出工程においてリン酸化が検出される前記タンパク質が、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αである、血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記シグナル検出工程において、ヒト二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲのＴｈｒ４５１又はこれに対応する二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲのアミノ酸残基のリン酸化、及び／又はヒト真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのＳｅｒ５１又はこれに対応する真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのアミノ酸残基のリン酸化を検出する請求項５に記載の血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記発現量変更工程が、血管内皮細胞若しくはこれに由来する培養細胞において、血管新生抑制シグナル遺伝子の候補遺伝子を過剰発現する過剰発現工程、又は血管内皮細胞若しくはこれに由来する培養細胞において、血管新生抑制シグナル遺伝子の候補遺伝子の発現を抑圧する発現抑圧工程である、請求項５又は６に記載の血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞が、毛細血管由来内皮細胞、大血管・臍帯静脈由来内皮細胞、及び網膜血管由来内皮細胞からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項５から７のいずれかに記載の血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記シグナル検出工程において、リン酸化特異的抗体を用いたイムノブロッティング法、３２Ｐオートラジオグラフィー法、リン酸化特異的抗体を用いた免疫染色法、ゲルシフト法、及び特異的抗体とリン酸化特異的抗体とを用いた免疫沈降法からなる群から選ばれる少なくとも一種を用いて前記タンパク質のリン酸化を検出する請求項５から８のいずれかに記載の血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生抑制剤のスクリーニング方法、及び血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生とは、既存の血管から新しい血管が形成される現象であり、悪性（固形）腫瘍、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、関節リウマチ等の炎症性疾患等において、その発症や進展に深く関与していることが知られている。例えば、固形腫瘍が増殖するには、血管新生によって栄養や酸素の供給と、老廃物の除去の道を確保することが必須である。また、癌治療上、重要な問題となっている転移において、その道を確保するという意味で血管新生が重要なステップとなっている。糖尿病性網膜症や加齢黄斑変性症に関しては、血管新生そのものが病態であり、放置すると失明に至る。従って、血管新生を抑制することが両疾患の予防・治療に結びつくと考えられ、その予防薬・治療薬の開発が行われている。【０００３】
このように、血管新生は、種々の病変において観察され、それぞれの病態の進展を助長するので、この血管新生の抑制がこれらの病態の予防・治療の観点から注目され、血管新生を阻害する物質を検索すべく鋭意研究がなされている。その結果、現在では、多くの血管新生抑制物質が開発され、その中のいくつかの物質については、臨床上での有効性が検討されている。【０００４】
例えば、エンドスタチンやアンジオスタチン等の血管新生抑制因子は、最も有用な腫瘍休眠療法薬と位置づけられ、実験動物の固形腫瘍を顕著に退縮させ（非特許文献１）、反復投与を行っても従来の抗がん剤のような薬剤耐性を示さないため（非特許文献２）、副作用の少ない理想的な抗癌剤となる可能性が指摘されていた。しかし、これらの因子は実用化されても抗腫瘍効果を示すのに有効な投与量を合成することは容易ではなく、且つ製造コストも高くなることから、分子量５０，０００に及ぶアンジオスタチンの臨床開発に断念した企業もある。【０００５】
そこで、アンジオスタチンよりも低分子量（分子量約２０，０００）のエンドスタチンが期待を集め、米国において末期悪性腫瘍患者に対する臨床治験が行われたが、細胞内情報伝達メカニズムは不明であった。【０００６】
エンドスタチンは、低血清培養下において血管内皮細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを引き起こすが（非特許文献３）、その程度は軽微である。腫瘍細胞は、遺伝子変異のみならず遺伝子発現調節制御によっても増殖能が亢進する上、多くの増殖因子や血管新生促進因子を盛んに産生・分泌し、オートクライン／パラクラインとして自己の増殖を促進させることに加え、更に、新生された血管が豊富な血流を供給しているため、このような軽微な血管内皮細胞の増殖抑制のみで、癌の原発巣・転移巣を退縮させる効果を説明することは困難であった。エンドスタチンがこうした環境下にあっても、現在報告されているような腫瘍血管新生を抑制するためには、内皮細胞に特異的に作用する、強力な細胞シグナルを惹起しなければならない。【０００７】
このような細胞シグナルとしては、例えば、特許文献１に、エンドスタチンにより惹起される、各種遺伝子の発現抑制シグナルが開示されている。この発現抑制シグナルによれば、実験動物において腫瘍退縮効果を示す濃度のエンドスタチンを投与すると、血清・増殖因子・血管新生因子刺激下の培養血管内皮細胞に発現する種々の初期応答遺伝子、アポトーシス・細胞周期・細胞遊走関連遺伝子の発現が顕著に抑制される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−０７５６６５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ，８８，ｐ．２７７−２８５，１９９７
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ，３９０，ｐ．４０４−４０７，１９９７
【非特許文献３】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，ｐ．１１７２１−１１７２６，１９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、培養血管内皮細胞へのエンドスタチンの投与によって、如何にしてこの発現抑制シグナルが惹起されるかについては、依然として明らかにされていなかった。特に、特許文献１には、エンドスタチンによって各種の血管新生関連遺伝子の発現が抑制されることを検知することにより血管新生抑制因子をスクリーニングする方法が開示されているが、このような方法は遺伝子発現量の低下を正確に定量して検出する必要があるため、比較的長時間の時間を要し、多種の化合物について効率よくスクリーニングするには不適であった。同様に、エンドスタチンにより発現抑制される遺伝子を検出するためにも、短時間で容易に当該シグナルを検出できる、スクリーニング方法が求められていた。【００１１】
本発明は、以上の課題に鑑みてなされたものであり、血管新生関連遺伝子の発現抑制作用の上流の情報伝達経路を解明し、これを利用することにより、短時間のうちに従来のスクリーニング方法と同様の作用を惹起できる血管新生抑制剤のスクリーニング方法、及び血管新生抑制遺伝子のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、血管内皮細胞にエンドスタチンを投与した場合、特定のタンパク質のリン酸化が引き起こされ、このリン酸化を介して血管新生に関与する種々の遺伝子の発現が抑制されていること、及びこの特定のタンパク質のリン酸化を検出することにより、血管新生抑制シグナルを短時間のうちに簡易な方法で検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下のものを提供する。【００１３】
（１）  血管新生抑制剤の候補化合物を血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞に投与する候補化合物投与工程と、前記候補化合物を投与された前記血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞を保持する細胞保持工程と、エンドスタチンを投与することによりリン酸化されるタンパク質のリン酸化を検出するシグナル検出工程と、を有する血管新生抑制剤のスクリーニング方法。【００１４】
（１）に記載の発明によれば、エンドスタチンを投与することによりリン酸化されるタンパク質のリン酸化を検出することにより、血管新生抑制剤のスクリーニングを行う。タンパク質のリン酸化は、血管新生抑制剤の候補化合物を血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞に投与した後、短時間のうちに生起する。このため、多種の候補化合物についてスクリーニングを行う場合であっても、効率よくスクリーニングを行うことができる。【００１５】
（２）  エンドスタチンを投与することによりリン酸化される前記タンパク質が、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αである（１）に記載の血管新生抑制剤のスクリーニング方法。【００１６】
（２）に記載の発明は、血管新生抑制剤のスクリーニング方法で、エンドスタチンを投与することによって生起するリン酸化を検出する対象となるタンパク質を特定したものである。これらのタンパク質は、血管新生抑制剤の投与によりリン酸化され、血管新生抑制シグナルが伝達されると考えられるので、これらのタンパク質をリン酸化検出の対象とすることにより、血管新生抑制剤を高い精度・確度をもってスクリーニングすることができる。【００１７】
（３）  血管新生抑制剤の候補化合物を血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞に投与する候補化合物投与工程と、前記候補化合物を投与された前記血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞を保持する細胞保持工程と、タンパク質のリン酸化を検出するシグナル検出工程と、を有し、前記シグナル検出工程においてリン酸化が検出される前記タンパク質が、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αである血管新生抑制剤のスクリーニング方法。【００１８】
（３）に記載の発明によれば、エンドスタチンを投与することによりリン酸化されるタンパク質に限定されず、他の血管新生抑制因子の投与によってリン酸化されることが予想される二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのリン酸化を検出することにより、血管新生抑制剤のスクリーニングを行うため、幅広い種類の候補化合物について効率よくスクリーニングを行うことができる。【００１９】
（４）  前記シグナル検出工程において、ヒト二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲのＴｈｒ４５１又はこれに対応する二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲのアミノ酸残基のリン酸化、及び／又はヒト真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのＳｅｒ５１又はこれに対応する真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのアミノ酸残基のリン酸化を検出する（２）又は（３）に記載の血管新生抑制剤のスクリーニング方法。【００２０】
ここで、「これに対応する二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲのアミノ酸残基」とは、ヒト二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲと相同性を持ち、これと同等の機能を有する他生物の二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲにおいて、Ｔｈｒ４５１と対応するリン酸化部位となるアミノ酸残基を指す。同様に、「これに対応する真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのアミノ酸残基」とは、ヒト真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αと相同性を持ち、これと同等の機能を有する他生物の真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αにおいて、Ｓｅｒ５１と対応するリン酸化部位となるアミノ酸残基を指す。【００２１】
また、ここで、「ヒト二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ」、及び「ヒト真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２α」とは、それぞれ、ヒトにおける二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、及び真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αを指す。【００２２】
（４）に記載の発明は、血管新生抑制剤のスクリーニング方法で、エンドスタチン等の血管新生抑制因子を投与することによって生起するリン酸化を検出する対象となるタンパク質のアミノ酸残基を特定したものである。これらのタンパク質のアミノ酸残基は、血管新生抑制剤の投与によりリン酸化され、血管新生抑制シグナルが伝達されると考えられるので、これらのタンパク質のアミノ酸残基をリン酸化検出の対象とすることにより、血管新生抑制剤を高い精度・確度をもってスクリーニングすることができる。【００２３】
（５）  前記血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞が、毛細血管由来内皮細胞、大血管・臍帯静脈内皮細胞、及び網膜血管由来内皮細胞からなる群から選ばれる少なくとも一種である（１）から（４）のいずれかに記載の血管新生抑制剤のスクリーニング方法。【００２４】
（５）に記載の発明は、血管新生抑制剤のスクリーニング方法に用いられる細胞の種類を限定したものである。これらの細胞は、入手・取り扱いが容易であり、且つエンドスタチンに対する感受性が高いので、血管新生抑制シグナルに伴う特定のタンパク質のリン酸化を容易に検出することができ、血管新生抑制剤のスクリーニング方法を効率的に行うことができる。【００２５】
（６）  前記シグナル検出工程において、リン酸化特異的抗体を用いたイムノブロッティング法、３２Ｐオートラジオグラフィー法、リン酸化特異的抗体を用いた免疫染色法、ゲルシフト法、及び特異的抗体とリン酸化特異的抗体とを用いた免疫沈降法からなる群から選ばれる少なくとも一種を用いて前記タンパク質のリン酸化を検出する（１）から（５）のいずれかに記載の血管新生抑制剤のスクリーニング方法。【００２６】
ここで、「特異的抗体」とは、シグナル検出工程において検出の目的となる特定のタンパク質に対し、リン酸化／非リン酸化を問わず特異的に結合することができる抗体を指し、「リン酸化特異的抗体」とは、リン酸化された当該特定のタンパク質に対し、特異的に結合することができる抗体を指す。【００２７】
（６）に記載の発明は、血管新生抑制剤のスクリーニング方法において、特定のタンパク質のリン酸化を検出するための具体的手法について規定したものである。これらの手法は、タンパク質のリン酸化を効率よく、且つ高い精度・確度をもって検出することができるので、血管新生抑制剤のスクリーニング方法を、効率よく、且つ高い精度・確度をもって検出することができる。【００２８】
（７）  血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞において、血管新生抑制シグナル遺伝子の候補遺伝子の発現量を変化させる発現量変更工程と、前記候補遺伝子の発現量を変化させた前記血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞を保持する細胞保持工程と、エンドスタチンを投与することによりリン酸化されるタンパク質のリン酸化を、前記細胞において検出するシグナル検出工程と、を有する血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法。【００２９】
ここで、「血管新生抑制シグナル遺伝子」とは、エンドスタチン及びこれと相同性を有する血管新生抑制因子の下流因子をコードする遺伝子であって、エンドスタチン及びこれと相同性を有する血管新生抑制因子の投与により活性化又は不活性化される、血管新生関連遺伝子の発現抑制シグナルのシグナル経路を構成する因子をコードする遺伝子を指す。
【００３０】
（８）  エンドスタチンを投与することによりリン酸化される前記タンパク質が、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αである（７）に記載の血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法。【００３１】
（９）  血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞において、血管新生抑制シグナル遺伝子の候補遺伝子の発現量を変化させる発現量変更工程と、前記候補遺伝子の発現量を変化させた前記血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞を保持する細胞保持工程と、タンパク質のリン酸化を検出するシグナル検出工程と、を有し、前記シグナル検出工程においてリン酸化が検出される前記タンパク質が、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αである、血管新生抑制剤のスクリーニング方法。【００３２】
（１０）  前記シグナル検出工程において、ヒト二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲのＴｈｒ４５１又はこれに対応する二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲのアミノ酸残基のリン酸化、及び／又はヒト真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのＳｅｒ５１又はこれに対応する真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのアミノ酸残基のリン酸化を検出する（８）又は（９）に記載の血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法。【００３３】
（１１）  前記発現量変更工程が、血管内皮細胞若しくはこれに由来する培養細胞において、血管新生抑制シグナル遺伝子の候補遺伝子を過剰発現する過剰発現工程、又は血管内皮細胞若しくはこれに由来する培養細胞において、血管新生抑制シグナル遺伝子の候補遺伝子の発現を抑圧する発現抑圧工程である、（７）から（１０）のいずれかに記載の血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法。【００３４】
（１２）  前記血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞が、毛細血管由来内皮細胞、大血管・臍帯静脈由来内皮細胞、及び網膜血管由来内皮細胞からなる群から選ばれる少なくとも一種である（７）から（１１）のいずれかに記載の血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法。【００３５】
（１３）  前記シグナル検出工程において、リン酸化特異的抗体を用いたイムノブロッティング法、３２Ｐオートラジオグラフィー法、リン酸化特異的抗体を用いた免疫染色法、ゲルシフト法、及び特異的抗体とリン酸化特異的抗体とを用いた免疫沈降法からなる群から選ばれる少なくとも一種を用いて前記タンパク質のリン酸化を検出する（７）から（１２）のいずれかに記載の血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法。【００３６】
（７）から（１３）に記載の発明は、（１）から（６）に記載の発明を血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法の発明として捉えたものである。従って、（７）から（１３）に記載の発明によれば、（１）から（６）に記載の発明と同等の効果を得ることができる。【００３７】
特に、（１１）に記載の発明においては、発現量変更工程において血管新生抑制シグナル遺伝子の候補遺伝子の過剰発現又は発現抑制を行うことにより、シグナル検出工程において生起しうる血管新生抑制シグナルを検出する。この手法を採用することにより、血管新生抑制シグナルを促進する機能を有する遺伝子又は抑制する機能を有する遺伝子をスクリーニングすることができる。
【発明の効果】
【００３８】
本発明の血管新生抑制剤のスクリーニング方法によれば、エンドスタチンを投与することによりリン酸化されるタンパク質のリン酸化を検出することにより、血管新生抑制剤のスクリーニングを行うため、多種の候補化合物についてスクリーニングを行う場合であっても、効率よくスクリーニングを行うことができる。【００３９】
また、本発明の血管新生抑制剤のスクリーニング方法によれば、エンドスタチンを投与することによりリン酸化されるタンパク質に限定されず、他の血管新生抑制因子の投与によってリン酸化されることが予想される二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのリン酸化を検出することにより、血管新生抑制剤のスクリーニングを行うため、幅広い種類の候補化合物について効率よくスクリーニングを行うことができる。【００４０】
同様に、本発明の血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法によれば、エンドスタチンを投与することによりリン酸化されるタンパク質のリン酸化を検出することにより、血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニングを行うため、多種の候補遺伝子についてスクリーニングを行う場合であっても、効率よくスクリーニングを行うことができる。【００４１】
また、本発明の血管新生抑制剤のスクリーニング方法によれば、エンドスタチンを投与することによりリン酸化されるタンパク質に限定されず、他の血管新生抑制因子の投与によってリン酸化されることが予想される二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのリン酸化を検出することにより、血管新生抑制剤のスクリーニングを行うため、幅広い種類の候補化合物について効率よくスクリーニングを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の試験例１に係る抗体マイクロアレイの結果を示す図面である。
【図２】本発明の試験例２に係る定量的ウェスタンブロッティング法の結果を示す図面である。
【図３】本発明の試験例３に係るウェスタンブロッティング法の結果を示す図面である。
【図４】本発明の試験例４に係る蛍光抗体法の結果を示す図面である。
【図５】ＰＫＲ遺伝子の発現量を示す図面である。
【図６】ＩＤ１遺伝子の発現量を示す図面である。
【図７】ＩＤ３遺伝子の発現量を示す図面である。
【図８】ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αｖ遺伝子の発現量を示す図面である。
【図９】Ｆｌｔ遺伝子の発現量を示す図面である。
【図１０】ＥｐｈｒｉｎＡ１遺伝子の発現量を示す図面である。
【図１１】本発明の試験例７に係るリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ法の結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００４４】
＜血管新生抑制剤のスクリーニング方法＞
以下、本発明の血管新生抑制剤のスクリーニング方法について説明する。
【００４５】
本発明の血管新生抑止剤のスクリーニング方法は、血管新生抑制剤の候補化合物を血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞に投与する候補化合物投与工程と、当該候補化合物を投与された当該血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞を保持する細胞保持工程と、エンドスタチンを投与することによりリン酸化されるタンパク質のリン酸化を検出するシグナル検出工程と、を有する。
【００４６】
また、本発明の血管新生抑止剤のスクリーニング方法は、血管新生抑制剤の候補化合物を血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞に投与する候補化合物投与工程と、当該候補化合物を投与された当該血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞を保持する細胞保持工程と、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのリン酸化を検出するシグナル検出工程と、を有するものでもある。
【００４７】
［候補化合物投与工程］
候補化合物投与工程においては、血管新生抑制剤の候補化合物を血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞に投与する。候補化合物は、一種のみ単独で投与してもよいし、二種以上を併用して投与してもよい。
【００４８】
（候補化合物）
候補化合物としては、特に限定されるものではなく、低分子化合物であってもよいし、高分子化合物であってもよい。低分子化合物としては、創薬の過程において製造された多数の化合物を挙げることができ、これらの化合物を血管新生抑制剤の化合物ライブラリーとして、血管新生抑制剤のスクリーニングに用いることができる。また、高分子化合物としては、タンパク質を例示することができ、例えば、血管新生の抑制と関連性の高い細胞における特異的ｃＤＮＡを発現することにより得られる分泌タンパク質のライブラリーや、血管新生の抑制と関連する特定のシグナルを受けて、発現量が亢進する性質を有する分泌タンパク質のライブラリー等を血管新生抑制剤のスクリーニングに用いることができる。
【００４９】
これらの中でも、血管新生抑制剤としての用途が見出された場合に、大量合成や患者への投与が容易であるという観点から、低分子化合物を用いることが好ましい。
【００５０】
（血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞）
血管新生抑制剤のスクリーニングに用いることができる、血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞としては、特に限定されるものではなく、どのようなものを用いてもよい。具体的には、ヒト血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞である、皮膚毛細血管由来内皮細胞、臍帯静脈内皮細胞、腫瘍組織より分離した血管内皮細胞、及び網膜血管内皮細胞、並びにこれらに由来する株化細胞；マウス血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞である、腎由来血管内皮細胞株、リンパ節由来内皮細胞株、膵島由来血管内皮細胞株、及びＥＳ細胞由来血管内皮細胞；ラット血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞である、肺動脈由来初代培養内皮細胞又はこれに由来する培養細胞株、大動脈由来初代培養内皮細胞、及び腫瘍組織より分離した血管内皮細胞を用いることができる。これらの細胞の中でも、入手・取り扱いの容易であること、腫瘍血管新生や網膜血管新生等の病態をより正確に反映すること、及びエンドスタチンに対する感受性が高いことから、ヒト毛細血管由来内皮細胞、腫瘍組織より分離した血管内皮細胞、臍帯静脈内皮細胞、及び網膜血管内皮細胞が好ましい。
【００５１】
（投与方法）
血管新生抑制剤のスクリーニングにおいて、候補化合物を投与するための投与方法としては、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を採用することができる。具体的には、候補化合物を溶解した溶液を、血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞を培養するための培養液に添加し、候補化合物の存在下で継続的に細胞を保持してもよいし、比較的高濃度の候補化合物を培養液に添加し、短時間のうちに候補物質を添加した培養液を除去してもよい。これらの投与方法は、血管新生抑制剤のスクリーニング方法での取得を目的とする化合物の想定される性質によって、適宜選択すればよい。
【００５２】
［細胞保持工程］
細胞保持工程においては、候補化合物を投与された血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞を保持する。候補化合物を投与された細胞を保持することで、予想される血管新生抑制シグナルのシグナル伝達がなされる結果、エンドスタチンの投与によりリン酸化されるタンパク質のリン酸化や、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのリン酸化を促進することができ、後述するシグナル検出工程におけるリン酸化タンパク質の検出感度を向上させることができる。
【００５３】
細胞を保持する際の条件としては、特に限定されるものではなく、当該細胞を培養するための通常の条件を用いればよい。具体的には、２％以上１７％以下の二酸化炭素の存在下において、３３℃以上３８℃以下の条件で保持することができる。また、保持する際の培地は、使用する細胞の種類に応じて、適宜選択することができるが、例えば、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地、及びＨＡＭ培地を挙げることができる。
【００５４】
細胞保持工程において、細胞を保持する時間としては、１分以上８時間以下であることが好ましく、３分以上６時間以下であることがより好ましく、１０分以上６０分以下であることが更に好ましい。１分未満である場合には、細胞内における目的とするタンパク質のリン酸化が十分に進行しないおそれがあり、シグナル検出工程において検出するシグナルの感度が低下するおそれがある。８時間を超える場合には、血管新生抑制剤のスクリーニング方法に要する時間が長時間化することにより、スクリーニングの効率が低下するおそれがあるほか、受容体及びその他の因子の脱感作により目的とするタンパク質のリン酸化の程度が低下するおそれがあり、好ましくない。
【００５５】
［シグナル検出工程］
シグナル検出工程においては、エンドスタチンを投与することによりリン酸化されるタンパク質のリン酸化を検出する。シグナル検出工程を経ることにより、血管新生抑制剤の候補化合物のうちで、血管新生抑制シグナルを生起する化合物を特定することができる。
【００５６】
また、シグナル検出工程においては、エンドスタチンを投与することによりリン酸化されるタンパク質に限定されず、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのリン酸化を検出する。シグナル検出工程を経ることにより、幅広い種類の血管新生抑制剤の候補化合物について効率よくスクリーニングを行うことができる。
【００５７】
（エンドスタチンを投与することによりリン酸化されるタンパク質）
本発明においては、エンドスタチンを投与することによりリン酸化されるタンパク質のリン酸化を検出することにより、血管新生抑制シグナルの活性化を検出する。エンドスタチンを投与することによりリン酸化されるタンパク質としては、特に限定されるものではなく、エンドスタチンの下流において、血管新生関連遺伝子の発現制御に関与する任意の血管新生抑制シグナル因子を利用することができる。
【００５８】
このような血管新生抑制シグナル因子としては、例えば、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αを挙げることができ、そのリン酸化部位としては、ヒト二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲのＴｈｒ４５１又はＴｈｒ４４６、及び／若しくはヒト真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのＳｅｒ５１、又は、これらのヒトのタンパク質と相同性を有し、これらのヒトのタンパク質と同等の機能を有する他生物の二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ若しくは真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αにおいて、ヒトのタンパク質におけるそれぞれのリン酸化部位と対応するアミノ酸残基を挙げることができる。なお、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲにおけるリン酸化部位の中でもＴｈｒ４５１が好ましく、真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２におけるリン酸化部位αの中でもＳｅｒ５１が好ましい。
【００５９】
このようなリン酸化部位における血管新生抑制シグナル因子のリン酸化を検出の対象とすることにより、血管新生抑制剤を高い精度・確度をもってスクリーニングすることができる。
【００６０】
（二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、及び真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２α）
シグナル検出工程においては、エンドスタチンによりリン酸化されるタンパク質に限定されず、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのリン酸化を検出することによっても、血管新生抑制シグナルの活性化を検出することができる。二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦのリン酸化を検出することにより、血管新生抑制剤を高い精度・確度をもってスクリーニングすることができる。ここで、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲにおけるリン酸化部位の中でもＴｈｒ４５１が好ましく、真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αにおけるリン酸化部位の中でもＳｅｒ５１が好ましい。
【００６１】
従来、血管新生に関与する種々の遺伝子について、その発現量の変化を見る方法では、非特異的な変化が多く、誤った結果になることが多かった。本発明者らは、これらの遺伝子の発現量の特異的な変化を反映する指標として、タンパク質量のリン酸化量の変化に着目し、「リン酸化抗体マイクロアレイ」技術を用いて、リン酸化されるタンパク質を網羅的に検索し、リン酸化されるタンパク質のリン酸化の度合を検討した。なお、当該「リン酸化抗体マイクロアレイ」技術を用いることで、血管新生に関与する重要なリン酸化タンパク質量の変化を正確に捉えることができる。そして、本発明者らは、このようなタンパク質のリン酸化の度合を指標として検討した結果、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αがリン酸化されるならば、ヒトの血管内皮細胞においても血管新生に関係する遺伝子の発現が抑制されることを見出した。
【００６２】
なお、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのリン酸化を生起する血管新生抑制剤としては、リファンピシン、エンドスタチン、アンジオスタチン等を挙げることができる。
【００６３】
なお、本発明の発明者が、以下に示す実施例において示すとおり、エンドスタチン等により生起される血管新生抑制シグナルは、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲをコードするｍＲＮＡ量を増加させることにより、ＰＫＲの発現量を増加させる作用を有する。このため、シグナル検出工程においてこのＰＫＲのリン酸化を検出する場合には、血管新生抑制シグナルによってＰＫＲのリン酸化が亢進されるのみならず、リン酸化されるべきＰＫＲのタンパク質量自体も増加されるため、シグナル検出工程において、リン酸化ＰＫＲを容易に検出することが可能となる。
【００６４】
（リン酸化の検出方法）
エンドスタチンを投与することによりリン酸化される上記タンパク質におけるリン酸化、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ及び真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２のリン酸化の検出方法としては、特に限定されるものではなく、タンパク質のリン酸化の検出方法として従来公知の手法を採用することができる。具体的には、リン酸化特異的抗体を用いたイムノブロッティング法、３２Ｐオートラジオグラフィー法、リン酸化特異的抗体を用いた免疫染色法、ゲルシフト法、及び特異的抗体とリン酸化特異的抗体とを用いた免疫沈降法を挙げることができる。これらの中でも、操作の簡便性・検出の容易性から、イムノブロッティング法及び免疫染色法が特に好ましい。
【００６５】
上記の検出方法は、従来公知の手法で行うことが好ましい。例えば、イムノブロッティング法であれば、候補化合物を投与し、上述の条件で保持した細胞の全細胞抽出液を取得し、必要に応じて界面活性剤の存在下で変性させた後、タンパク質電気泳動を行い、分離したタンパク質をナイロンメンブレン等のタンパク質吸着膜に転写する。このタンパク質吸着膜に対して、抗リン酸化ＰＫＲ抗体を一次抗体として作用させることによりリン酸化ＰＫＲを検出することができる。
【００６６】
３２Ｐオートラジオグラフィー法においては、γ−３２Ｐ−ＡＴＰを細胞に投与した後に候補化合物を投与し、３２Ｐにより標識されたリン酸化ＰＫＲを細胞内で生成させる。その後、この細胞についてイムノブロッティング法と同様の方法で、タンパク質電気泳動及びタンパク質吸着膜への転写を行い、タンパク質吸着膜に吸着され、３２Ｐにより標識されたリン酸化ＰＫＲを検出する。
【００６７】
リン酸化特異的抗体を用いた免疫染色法においては、候補化合物で処理を行った細胞をホルムアルデヒド等を用いて固定し、必要に応じて界面活性剤により処理した後、抗リン酸化ＰＫＲ抗体を一次抗体として、一次抗体に対する蛍光標識抗体を二次抗体として細胞に作用させることにより、顕微鏡下でリン酸化ＰＫＲが検出可能となる。
【００６８】
ゲルシフト法においては、候補化合物で処理した細胞について、イムノブロッティング法と同様の方法で、タンパク質電気泳動及びタンパク質吸着膜への転写を行い、分離したタンパク質をナイロンメンブレン等のタンパク質吸着膜へ転写する。このタンパク質吸着膜に対して、抗ＰＫＲ抗体を一次抗体として作用させることによりＰＫＲを検出することができる。ＰＫＲを検出することにより、リン酸化されたタンパク質のバンドのシフトを可視化することができるため、タンパク質のリン酸化を検出できる。
【００６９】
特異的抗体とリン酸化特異的抗体とを用いた免疫沈降法においては、候補化合物を投与された細胞から得られた全細胞抽出液について、これに含まれるタンパク質を特異的抗体又はリン酸化特異的抗体と反応させる。その後、沈降した反応物をタンパク質電気泳動及びタンパク質吸着膜への転写を行い、リン酸化特異的抗体又は特異的抗体を一次抗体として作用させることにより、リン酸化タンパク質を検出することができる。
【００７０】
本発明の血管新生抑制剤のスクリーニング方法によれば、エンドスタチンを投与することによりリン酸化されるタンパク質や、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２のリン酸化を検出することにより、血管新生抑制剤のスクリーニングを行う。上述したとおり、標的タンパク質は、血管新生抑制剤の候補化合物を血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞に投与した後、短時間のうちにリン酸化される。このため、多種の候補化合物についてスクリーニングを行う場合であっても、効率よくスクリーニングを行うことができる。
【００７１】
＜血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法＞
以下、本発明の血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法について説明する。なお、血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法についての説明においては、血管新生抑制剤のスクリーニング方法と同様の事項については、説明を省略することがある。
【００７２】
本発明の血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法は、血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞において、血管新生抑制シグナル遺伝子の候補遺伝子の発現量を変化させる発現量変更工程と、当該候補遺伝子の発現量を変化させた当該血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞を保持する細胞保持工程と、エンドスタチンを投与することによりリン酸化されるタンパク質のリン酸化を検出するシグナル検出工程と、を有する。
【００７３】
また、本発明の血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法は、血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞において、血管新生抑制シグナル遺伝子の候補遺伝子の発現量を変化させる発現量変更工程と、当該候補遺伝子の発現量を変化させた当該血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞を保持する細胞保持工程と、タンパク質のリン酸化を検出するシグナル検出工程と、を有し、当該シグナル検出工程においてリン酸化が検出される当該タンパク質が、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αであるものでもある。
【００７４】
［発現量変更工程］
発現量変更工程においては、血管新生抑制シグナル遺伝子の候補遺伝子の発現量を変化させる。発現量を変化させた候補遺伝子が、血管新生抑制シグナルを促進／抑制する因子をコードする血管新生抑制シグナル遺伝子であった場合、血管新生抑制シグナルが増強され、エンドスタチンの投与によりリン酸化されるタンパク質や、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのリン酸化が促進される。このため、候補遺伝子の発現量を変化させた状態で、エンドスタチンの投与によりリン酸化されるタンパク質や、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのリン酸化を検出することにより、血管新生抑制シグナル遺伝子をスクリーニングすることができる。
【００７５】
（候補遺伝子）
血管新生抑制シグナル遺伝子の候補遺伝子としては、特に限定されるものではないが、例えば、血管内皮細胞において発現している遺伝子を挙げることができる。このような遺伝子は、種々の血管内皮細胞におけるｃＤＮＡライブラリーとして、ライブラリーの形態で取得することができる。血管内皮細胞におけるｃＤＮＡライブラリーの製造方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、血管内皮細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いることによりｃＤＮＡに変換後、必要に応じて制限酵素処理を施し、所定のベクターに導入する手法を挙げることができる。
【００７６】
（過剰発現工程）
発現量変更工程は、血管新生抑制シグナル遺伝子の候補遺伝子を過剰発現する過剰発現工程であってもよい。発現量変更工程を過剰発現工程とした場合において、本発明の血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法を行った場合、得られうる血管新生抑制シグナル遺伝子は、血管新生抑制シグナルを増強する作用を持つ遺伝子である。
【００７７】
血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞に血管新生抑制シグナル遺伝子の候補遺伝子を過剰発現する手法としては、特に限定されるものではなく、従来公知の手法を採用することができる。具体的には、プラスミド、コスミド、及びウイルス等のベクターに候補遺伝子を導入し、これを細胞にトランスフェクションさせる方法を挙げることができる。
【００７８】
（発現抑圧工程）
発現量変更工程は、血管新生抑制シグナル遺伝子の候補遺伝子の発現を抑圧する発現抑圧工程であってもよい。発現量変更工程を発現抑圧工程とした場合において、本発明の血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法を行った場合、得られうる血管新生抑制シグナル遺伝子は、血管新生抑制シグナルを抑制する作用を持つ遺伝子である。
【００７９】
血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞において、血管新生抑制シグナル遺伝子の候補遺伝子の発現を抑圧する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、ＲＮＡ干渉法等を挙げることができる。
【００８０】
本発明の血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法によれば、エンドスタチンを投与することによりリン酸化されるタンパク質のリン酸化を検出することにより、血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニングを行う。標的タンパク質は、血管内皮細胞又はこれに由来する培養細胞において血管新生抑制シグナル遺伝子の発現量を変化させた後、短時間のうちにリン酸化される。このため、多種の候補遺伝子についてスクリーニングを行う場合であっても、効率よくスクリーニングを行うことができる。
【００８１】
更に、本発明の血管新生抑制剤のスクリーニング方法によれば、エンドスタチンを投与することによりリン酸化されるタンパク質のリン酸化に限定されず、他の血管新生抑制因子の投与によってリン酸化されることが予想される二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、及び／又は真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのリン酸化を検出することにより、血管新生抑制剤のスクリーニングを行うため、多種の候補化合物についてスクリーニングを行う場合であっても、効率よくスクリーニングを行うことができる。
【実施例】
【００８２】
以下、本発明の実施例について、図面を参照して詳細に説明する。なお、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。【００８３】
＜試験例１＞
リファンピシンはエンドスタチン類似の血管新生抑制作用を有することが知られており、リファンピシンを血管内皮細胞に投与することによってリン酸化されるタンパク質を検索することにより、エンドスタチンを血管内皮細胞に投与することによってリン酸化されるタンパク質の候補タンパク質を得ることができると考えられる。【００８４】
リファンピシンの投与によりリン酸化が誘導されるタンパク質を検索するため、抗体マイクロアレイ技術を用いて、リファンピシン処理により特異的にリン酸化されたタンパク質を検出した。ラット大動脈由来内皮細胞（ｒＡＥＣ）を１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ培地中の４０μｇ／ｍｌのリファンピシンの存在下又は非存在下、３７℃で１０分間保持した後、全細胞抽出液を、特徴づけが行われている６３０種のシグナルタンパク質に対する抗体を固定した「Ｋｉｎｅｘ（登録商標）抗体マイクロアレイ」（Ｋｉｎｅｘｕｓ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ社製）を用いて解析した。得られた結果において、リファンピシンの投与によりリン酸化が特に亢進したタンパク質とその亢進量を示す結果を図１に示す。【００８５】
図１より、ラット大動脈由来内皮細胞をリファンピシンで処理することにより、Ｂａｄ、ｅＩＦ２α、ＰＫＲ１を始めとする種々のタンパク質のリン酸化が亢進していることが分かる。【００８６】
＜試験例２＞
抗体マイクロアレイ技術においては、抗体の交差反応や、タンパク質複合体の形成等に伴うエピトープと抗体との相互作用の遮断により、擬陽性が生じることが知られている。実施例１でリン酸化が確認された複数のタンパク質につき、定量的にウェスタンブロッティング法を行うことにより、これらのリン酸化の亢進の事実を確かめた。【００８７】
ラット大動脈由来内皮細胞（ｒＡＥＣ）を１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ培地中の４０μｇ／ｍｌのリファンピシンの存在下又は非存在下、３７℃で１０分間保持した後、ＡＴＦ２、ｅＩＦ２α、ＰＫＣδ、ＳＴＡＴ１、及びＳＴＡＴ５Ａに対する抗リン酸化タンパク質抗体を用い、定量的ウェスタンブロッティング法により、全細胞抽出液中のリン酸化タンパク質の存在量を調べた。結果を図２に示す。【００８８】
図２より、試験例１の抗体マイクロアレイでリン酸化が亢進していることが示されたタンパク質のうち、少なくとも、ＡＴＦ２、ｅＩＦ２α、ＰＫＣδ、及びＳＴＡＴ５Ａについては、定量的ウェスタンブロッティング法によっても、タンパク質のリン酸化が亢進していることが分かる。一方、ＳＴＡＴ１については、定量的ウェスタンブロッティング法ではリン酸化の亢進が示されず、ＳＴＡＴ１についての試験例１の抗体マイクロアレイでの結果が再現性の無いものであることが分かった。【００８９】
＜試験例３＞
ヒト網膜血管内皮細胞（ｈＲＥＣ）又はヒト臍帯静脈内皮細胞（ｈＵＶＥＣ）を、１０％ウシ胎児血清／増殖因子添加ＨａｍＦ１２Ｋ培地中の４０μｇ／ｍｌリファンピシン又は１．０×１０−９Ｍエンドスタチンで処理し、３７℃で１０分間から２４０分間保持した。保持後の全細胞抽出液について、抗リン酸化ＰＫＲ抗体を用いてウェスタンブロッティング法を行い、ＰＫＲのリン酸化の経時変化を調べた。結果を図３（ａ）に示す。【００９０】
同様に、マウス大動脈由来内皮細胞（ｒＡＥＣ）を、サルブリナル（２０μＭ）で処理した系；リファンピシン（４０μｇ／ｍｌ）で処理した系；エンドスタチン（１．０×１０−９Ｍ）で処理した系；ＰＫＲ阻害剤Ａ（２−アミノプリン、１０ｍＭ）で処理した後エンドスタチン（１．０×１０−９Ｍ）で処理した系；ＰＫＲ阻害剤Ｂ（８−（イミダゾール−４−イルメチレン）−６Ｈ−アゾリジノ［５，４−ｇ］ベンゾジアゾール−７−オン、０．３μＭ）処理した後リファンピシン（４０μｇ／ｍｌ）で処理した系；及びＰＫＲ阻害剤Ｂ（同上、０．３μＭ）で処理した後エンドスタチン（１．０×１０−９Ｍ）で処理した系において、処理後の細胞を３７℃で４時間又は８時間保持した。それぞれの全細胞抽出液について、抗リン酸化ＰＫＲ抗体を用いてウェスタンブロッティング法を行い、ＰＫＲのリン酸化の程度を調べた。結果を図３（ｂ）に示す。【００９１】
図３（ａ）に示すとおり、ＰＫＲはヒト網膜血管内皮細胞及びヒト臍帯静脈内皮細胞において、リファンピシン又はエンドスタチンでの処理により、リン酸化が亢進していることが分かった。従って、試験例１で確認されたリファンピシン処理によるＰＫＲのリン酸化は、特異的なものであることが分かる。なお、図３（ｂ）に示すとおり、ラット大動脈由来初代培養血管内皮細胞においても、リファンピシン又はエンドスタチンはＰＫＲをリン酸化したが、同細胞を特定のＰＫＲ阻害剤（８−（イミダゾール−４−イルメチレン）−６Ｈ−アゾリジノ［５，４−ｇ］ベンゾジアゾール−７−オン）で処理した後、リファンピシン又はエンドスタチンで処理した場合においては、ＰＫＲのリン酸化の亢進が認められなかった。【００９２】
＜試験例４＞
ヒト臍帯静脈内皮細胞を、ＨａｍＦ１２Ｋ培地中の４０μｇ／ｍｌリファンピシン又は１．０×１０−９Ｍエンドスタチンで処理し、３７℃で３０分間保持した。保持後の細胞について、抗リン酸化ＰＫＲ抗体を一次抗体として用いた免疫染色を行い、リン酸化ＰＫＲの細胞内における存在を調べた。【００９３】
同様の実験は、ＰＫＲ阻害薬の構造類似体を添加したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＰＫＲ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）を４０μｇ／ｍｌのリファンピシンで処理した系、ＰＫＲ阻害剤Ｂ（８−（イミダゾール−４−イルメチレン）−６Ｈ−アゾリジノ［５，４−ｇ］ベンゾジアゾール−７−オン、０．３μＭ）で前処理後のヒト臍帯静脈内皮細胞を４０μｇ／ｍｌリファンピシン又は１．０×１０−９Ｍエンドスタチンで処理した系においても行った。以上の結果を図４に示す。【００９４】
図４より、リファンピシン又はエンドスタチンでヒト臍帯静脈内皮細胞を処理した場合、細胞内において、ＰＫＲのリン酸化が亢進していることが分かる。このＰＫＲのリン酸化は、特異的ＰＫＲ阻害剤で予め処理したヒト臍帯静脈内皮細胞を、リファンピシン又はエンドスタチンで処理した場合には、認められなかった。【００９５】
＜試験例５＞
ヒト臍帯静脈内皮細胞を、ＨａｍＦ１２Ｋ培地中の４０μｇ／ｍｌリファンピシン又は１．０×１０−８Ｍエンドスタチンにより処理し、３７℃で４時間から８時間保持した。保持後、全細胞抽出液について、ＰＫＲ  ｍＲＮＡをＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を行い、ＰＫＲ  ｍＲＮＡを定量した。同様の操作は、リファンピシン又はエンドスタチンの処理に先立って、ＰＫＲ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒト臍帯静脈内皮細胞についても行った。結果を図５に示す。【００９６】
図５より、リファンピシン又はエンドスタチンにより処理されたヒト臍帯静脈内皮細胞においては、ＰＫＲの発現量が増加していることが分かる。【００９７】
このような結果は、リファンピシン又はエンドスタチンの投与による、タンパク質としてのＰＫＲの発現量の増加を示唆するものである。血管新生抑制シグナルにより、このようにタンパク質としてのＰＫＲの発現量が増大することにより、リン酸化されるべきＰＫＲの量も増大し、結果的により多くのリン酸化ＰＫＲが生成するものと考えられる。このため、実際に血管新生抑制剤のスクリーニング方法や、血管新生抑制シグナル遺伝子のスクリーニング方法を実施する際には、シグナル検出工程においてＰＫＲのリン酸化を検出することにより、感度よくスクリーニングを実施できるものと考えられる。【００９８】
＜試験例６＞
ヒト臍帯静脈内皮細胞を、ＨａｍＦ１２Ｋ培地中の４０μｇ／ｍｌリファンピシン又は１．０×１０−８Ｍエンドスタチンにより処理し、３７℃で４時間から８時間保持した。保持後、全細胞抽出液において、エンドスタチンにより発現抑制されることが知られているＩＤ１遺伝子、ＩＤ３遺伝子、ｉｎｔｅｇｒｉｎαｖ遺伝子、Ｆｌｔ遺伝子、及びＥｐｈｒｉｎ  Ａ１遺伝子について、それぞれＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ法による定量系を確立して、これらのｍＲＮＡの発現量を調べた。同様の操作は、リファンピシン又はエンドスタチンの処理に先立って、ＰＫＲ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒト臍帯静脈内皮細胞についても行った。結果を図６から図１０に示す。【００９９】
図６から図１０より、ＩＤ１遺伝子、ＩＤ３遺伝子、ｉｎｔｅｇｒｉｎαｖ遺伝子、Ｆｌｔ遺伝子、及びＥｐｈｒｉｎ  Ａ１遺伝子の発現は、リファンピシン処理又はエンドスタチン処理により低下していることが分かる。ＰＫＲ  ｓｉＲＮＡによってＰＫＲをノックアウトした場合においては、リファンピシン又はエンドスタチンの処理に伴うこれらの遺伝子発現の低下が起こっていないことから、リファンピシン又はエンドスタチンの処理に伴うこれらの遺伝子発現の低下は、ＰＫＲ依存的であることが分かった。【０１００】
＜試験例７＞
ｅＩＦ２αの脱リン酸化の阻害剤として知られるサルブリナルが、エンドスタチンにより発現抑制される遺伝子群の発現量のどのような影響を与えるかについて、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて調べた。ヒト臍帯静脈内皮細胞を、ＨａｍＦ１２Ｋ培地中の２０μＭサルブリナルで処理し、３７℃で４時間から８時間保持した。保持後、全細胞抽出液において、ＩＤ１遺伝子、ＩＤ３遺伝子、ｉｎｔｅｇｒｉｎαｖ遺伝子、Ｆｌｔ遺伝子、及びＥｐｈｒｉｎ  Ａ１遺伝子について、それぞれＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ法による定量系を確立して、これらのｍＲＮＡの発現量を調べた。結果を図１１に示す。【０１０１】
図１１より、サルブリナルによりｅＩＦ２αの脱リン酸化を阻害して、ｅＩＦ２αの活性を亢進させた場合、ＩＤ１遺伝子、ＩＤ３遺伝子、ｉｎｔｅｇｒｉｎαｖ遺伝子、Ｆｌｔ遺伝子、及びＥｐｈｒｉｎ  Ａ１遺伝子のｍＲＮＡの発現は低下することが分かる。この事実より、リファンピシン又はエンドスタチンの処理により生じるこれらの遺伝子の発現低下は、ｅＩＦ２αの脱リン酸化阻害によっても再現可能であることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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