(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
牛乳アレルギーの被験者由来の血液サンプルを含む血液サンプル中の牛乳以外の特定アレルゲンに対するＩｇＥ抗体を固相サンドイッチ免疫学的測定法によって定量するアレルギー検査方法であって、固相担体上にリガンド捕捉抗体又はリガンド捕捉抗体に結合したスペーサーを吸着固定させ、固相担体のリガンド捕捉抗体吸着部位又はスペーサー吸着部位以外のタンパク質吸着部位をブロッキング剤で封止し、次に前記リガンド捕捉抗体と標識された抗ＩｇＥ抗体との間に、リガンドに結合された特定アレルゲンと前記特定アレルゲンに対するＩｇＥ抗体との複合体をサンドイッチし、次に標識された抗ＩｇＥ抗体を検出することを含む方法において、前記ブロッキング剤が、メタクリル酸エステル系合成ポリマーであることを特徴とする方法。
【請求項２】
ブロッキング剤が、ポリオキシエチレンモノメタクリレート、ポリオキシエチレンポリオキシテトラメチレンモノメタクリレート、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンモノメタクリレート、オクチルポリオキシエチレンポリオキシプロピレンモノメタクリレート、及びこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液サンプル中の特定アレルゲンに対するＩｇＥ抗体の量を定量することによって被験者が特定アレルゲンに対するアレルギーを持つかどうかを検査する方法に関し、特に、被験者が、検査対象のアレルゲンに対するアレルギーを持たないのにもかかわらずアレルギーを持つと誤って判定されることを防止することによって判定精度を向上させたアレルギー検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食物や環境物質、大気物質に対するアレルギーを持つ人が増加している。アレルギー反応は、アレルギーを持つ人が、そのアレルギーを生じる物質（アレルゲン）を含む食物を摂取したり、アレルゲンが存在する環境や大気中で生活してアレルゲンを吸込むことによって発生する。従って、アレルギー反応の発生を防止するためには、自分自身の持つアレルギーの種類を予め知ることが望ましい。
【０００３】
アレルギーの検査方法としては、被験者から採取した血液サンプル中の特定アレルゲンに対するＩｇＥ抗体を固相サンドイッチ免疫学的測定法によって定量する方法が一般的である。この方法では、例えば、ガラスフィルターなどの固相担体上にリガンド捕捉抗体を吸着させ、リガンド捕捉抗体吸着部位以外のタンパク質吸着部位をカゼインなどのブロッキング剤で封止したものを準備し、一方、リガンドにカモガヤ花粉などの特定アレルゲンを結合したものを準備し、これを血液サンプルと混合して、リガンドに結合された特定アレルゲンと血液サンプル中の前記特定アレルゲンに対するＩｇＥ抗体との複合体を形成させる。そして、この複合体を含む混合液を、上述の固相担体上にリガンド捕捉抗体を吸着させたものに添加し、複合体中のリガンドの部分をリガンド捕捉抗体に結合させ、次に、酵素などで標識された抗ＩｇＥ抗体を添加し、複合体中のＩｇＥ抗体の部分を標識抗ＩｇＥ抗体に結合させる。次に、複合体に結合しなかった過剰な標識抗ＩｇＥ抗体を除去し、標識の種類に応じた呈色反応を行って、ＩｇＥ抗体に結合された標識抗ＩｇＥ抗体を検出する。得られた検出結果は、予め標準ＩｇＥ抗体を使用して作成しておいた検量線と比較され、血液サンプル中の特定アレルゲンに対するＩｇＥ抗体を定量する。
【０００４】
上記の方法では、ブロッキング剤は、標識抗体を添加した際に、標識抗体が固相担体上の余分なタンパク質吸着部位に非特異的に吸着して生ずる測定誤差や判定ミスを防止するために使用される（特許文献１参照）。
【０００５】
しかしながら、このようにブロッキング剤で標識抗体の非特異的吸着を防止しているにもかかわらず、アレルギー検査の現場では、原因不明の異常測定値が頻発していた。従って、この原因を追求して判定精度をさらに向上させることが求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−１９１０７３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、固相サンドイッチ免疫学的測定法によるアレルギー検査において、ブロッキング剤を使用してもなお発生する原因不明の異常測定値の原因を究明し、その発生を防止する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、特定の傾向を持つ被験者の血液サンプルをアレルギー検査した場合にのみ異常測定値が発生していることを見出し、この原因をさらに追求したところ、このような異常測定値は、ブロッキング剤がウシタンパク質由来のカゼインであり、被験者がこのカゼインと同じウシ由来の物質（例えば牛乳）についてのアレルギーを持つ場合に生じていることを見出した。そして、本発者らは、被験者が持つ可能性の高いアレルギーの原因物質を含まないブロッキング剤を使用することにより異常測定値の発生を低減することができることを見出した。
【０００９】
本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものであり、以下の（１）〜（２）の構成を有する。
（１）牛乳アレルギーの被験者由来の血液サンプルを含む血液サンプル中の牛乳以外の特定アレルゲンに対するＩｇＥ抗体を固相サンドイッチ免疫学的測定法によって定量するアレルギー検査方法であって、固相担体上にリガンド捕捉抗体又はリガンド捕捉抗体に結合したスペーサーを吸着固定させ、固相担体のリガンド捕捉抗体吸着部位又はスペーサー吸着部位以外のタンパク質吸着部位をブロッキング剤で封止し、次に前記リガンド捕捉抗体と標識された抗ＩｇＥ抗体との間に、リガンドに結合された特定アレルゲンと前記特定アレルゲンに対するＩｇＥ抗体との複合体をサンドイッチし、次に標識された抗ＩｇＥ抗体を検出することを含む方法において、前記ブロッキング剤が、メタクリル酸エステル系合成ポリマーであることを特徴とする方法。
（２）ブロッキング剤が、ポリオキシエチレンモノメタクリレート、ポリオキシエチレンポリオキシテトラメチレンモノメタクリレート、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンモノメタクリレート、オクチルポリオキシエチレンポリオキシプロピレンモノメタクリレート、及びこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする（１）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のアレルギー検査方法は、固相サンドイッチ免疫学的測定法において、ブロッキング剤として動植物由来でない合成ポリマーを使用しているため、被験者が動植物に対してアレルギーを持っていたとしても、ブロッキング剤に起因する異常測定値が発生しない。従って、本発明のアレルギー検査方法は、判定精度が高く、被験者が検査対象のアレルゲンに対してアレルギーを持たないにもかかわらずアレルギーを持つと誤って判定されることがない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１ａ−ｃ】図１ａ−ｃは、従来公知の固相サンドイッチ免疫学的測定法の手順を示す。
【図１ｄ−ｆ】図１ｄ−ｆは、従来公知の固相サンドイッチ免疫学的測定法の手順を示す。
【図１ｇ−ｈ】図１ｇ−ｈは、従来公知の固相サンドイッチ免疫学的測定法の手順を示す。
【図２ａ−ｃ】図２ａ−ｃは、ブロッキング剤としてカゼインを使用した場合と動植物由来でない合成ポリマーを使用した場合との、固相担体上での反応の相違を示す。
【図２ｄ−ｅ】図２ｄ−ｅは、ブロッキング剤としてカゼインを使用した場合と動植物由来でない合成ポリマーを使用した場合との、固相担体上での反応の相違を示す。
【図２ｆ−ｇ】図２ｆ−ｇは、ブロッキング剤としてカゼインを使用した場合と動植物由来でない合成ポリマーを使用した場合との、固相担体上での反応の相違を示す。
【図２ｈ−ｉ】図２ｈ−ｉは、ブロッキング剤としてカゼインを使用した場合と動植物由来でない合成ポリマーを使用した場合との、固相担体上での反応の相違を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明のアレルギー検査方法について詳述する。
本発明は、血液サンプル中の特定アレルゲンに対するＩｇＥ抗体を固相サンドイッチ免疫学的測定法によって定量するアレルギー検査方法において、標識抗体の固相担体への非特異的吸着を防止するためのブロッキング剤として、動植物由来でない合成ポリマーを使用することにより、異常測定値の発生を防止して判定精度を向上させたことを特徴とする。
【００１３】
本発明のアレルギー検査方法自体は、従来公知の方法を採用するものであり、食物、環境物質、大気物質などの様々なアレルゲンのうちどのアレルゲンに対して被験者がアレルギーを持つのかを判定するものである。アレルギー反応は、被験者の体内に侵入したアレルゲンが、マスト細胞の表面にあるＩｇＥ抗体と結合することによって開始される。アレルギーを持つ人は、特定のアレルゲンに対するＩｇＥ抗体を血液中に多量に含む。例えば、カモガヤ花粉アレルギーの人は、カモガヤ花粉に対するＩｇＥ抗体を血液中に多量に含み、ハウスダストアレルギーの人は、ハウスダストに対するＩｇＥ抗体を血液中に多量に含む。アレルギー検査は、この現象を利用したものであり、被験者の血液サンプル中の特定アレルゲンに対するＩｇＥを定量することにより、被験者がこの特定アレルゲンに対してアレルギーを持つかどうかを判定するものである。
【００１４】
具体的には、特定アレルゲンに対するＩｇＥ抗体の定量は、従来公知の固相サンドイッチ免疫学的測定法によって行われる。以下、この測定法の手順について、図１を参照して説明する。
【００１５】
固相サンドイッチ免疫学的測定法では、まず、図１（ａ）に示すように固相担体を準備し、そこに、図１（ｂ）に示すようにリガンド捕捉抗体を添加して吸着固定させる。固相担体は、液相中の特定成分をその上に固定して液相から分離できるようにするためのものである。固相担体としては、タンパク質を吸着できるものであればいかなるものも使用することができ、例えば、ガラスフィルター、磁性粉子、ラテックス、金コロイド、ナイロンメンブレンなどであることができる。これらの中でも、取扱いの容易さや費用の点から、ガラスフィルターが好ましい。リガンド捕捉抗体は、次に添加されるリガンドと抗原抗体反応によって結合してリガンドを固相担体上に固定するためのものであり、例えば、リガンドがビオチンである場合、リガンド捕捉抗体は抗ビオチン抗体である。リガンド捕捉抗体は、固相担体に直接固定される必要はなく、リガンド捕捉抗体とリガンドが結合するときに、リガンド結合アレルゲン同士が立体障害により結合困難になることを防ぎ、感度を向上させるために抗ヤギ抗体などのスペーサーを介して間接的に固定されてもよい。
【００１６】
図１（ｂ）に示す状態では、固相担体上の一部のタンパク質吸着部位にのみリガンド捕捉抗体が吸着されており、残りのタンパク質吸着部位は空いている。この状態で他の試薬を添加すると、試薬中の標識抗体がこれらの吸着部位に吸着され、標識として検出されてしまい、測定結果に誤差が生じたり判定ミスが生じたりするおそれがある。これを防止するため、図１（ｃ）に示すようにブロッキング剤を添加して、固相担体上の余分なタンパク質吸着部位を封止する。
【００１７】
一方、図１（ｄ）に示すように、検査対象のアレルギーの原因となる特定のアレルゲンをリガンドに結合したものを準備する。例えば、カモガヤ花粉アレルギーの検査の場合、特定アレルゲンはカモガヤ花粉であり、ハウスダストアレルギーの検査の場合、特定アレルゲンはハウスダストである。リガンドとしては、免疫学的測定法において従来公知のいかなるものも使用することができ、例えばビオチンやジゴキシゲニン（ＤＩＧ）であることができる。特定アレルゲンへのリガンドの結合は、ビオチン化試薬などの公知の手段によって行うことができる。
【００１８】
次に、このリガンドが結合された特定アレルゲンを、被験者の血液サンプルと混合する。血液サンプルは、被験者から採取したままの全血であってもよいし、採取後の血液を遠心分離して得た血清であってもよい。被験者がこの特定アレルゲンに対してアレルギーを持つ場合、被験者の血液サンプル中にはこの特定アレルゲンに対するＩｇＥ抗体が含まれているので、このＩｇＥ抗体が特定アレルゲンに抗原抗体反応により結合して、図１（ｅ）に示されるような複合体が形成される。また、被験者のアレルギーの度合いが強いほど、特定のアレルゲンに対するＩｇＥ抗体の量が多いため、形成される複合体の量が多くなる。被験者がこの特定アレルゲンに対してアレルギーを持たない場合、被験者の血液サンプル中にはこの特定アレルゲンに対するＩｇＥ抗体はほとんど含まれておらず、微量の複合体しか形成されない。
【００１９】
次に、この複合体を含む混合液を、図１（ｃ）の固相担体に添加すると、複合体中のリガンドの部分と固相担体上のリガンド捕捉抗体との間で抗原抗体反応が生じ、図１（ｆ）に示すように、複合体中のリガンドの部分がリガンド捕捉抗体に結合される。
【００２０】
次に、標識された抗ＩｇＥ抗体を添加すると、複合体中のＩｇＥ抗体の部分と標識された抗ＩｇＥ抗体との間で抗原抗体反応が生じ、図１（ｇ）に示すように、複合体中のＩｇＥ抗体の部分が、標識された抗ＩｇＥ抗体に結合される。抗ＩｇＥ抗体の標識としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリ性ホスファターゼ等の酵素、ヨウ素１２５等の放射性同位元素（ＲＩ）、アクリジニウム化合物等の発光物質あるいはフルオレセインイソチオシアネート等の蛍光物質などを使用することができる。これらの中でも、取扱いの容易さや検出方法の簡便さの点から、酵素が好ましい。
【００２１】
なお、標識された抗ＩｇＥ抗体の添加時期は、複合体を含む混合液を固相担体に添加した後に限定されず、図１（ｅ）の複合体形成の後に、標識された抗ＩｇＥ抗体を混合液に添加してもよい。この場合、図１（ｈ）に示すような、リガンド、特定アレルゲン、特定アレルゲンに対するＩｇＥ抗体の複合体に、標識化された抗ＩｇＥ抗体がさらに結合したものがまず形成され、次に、これが固相担体に添加されて図１（ｇ）に示す状態になる。
【００２２】
その後、固相担体を洗浄して、複合体に結合しなかった過剰な標識抗ＩｇＥ抗体を除去し、標識の種類に応じた検出方法で、ＩｇＥ抗体に結合された標識抗ＩｇＥ抗体を検出する。例えば、標識として西洋ワサビペルオキシダーゼを使用した場合は、この酵素の基質であるテトラメチルベンジジンを固相担体に添加し、酵素反応によって生じる青色の色調を検出する。検出結果を、予め標準ＩｇＥ抗体を使用して作成しておいた検量線と比較して、血液サンプル中の特定アレルゲンに対するＩｇＥ抗体を定量する。定量されたＩｇＥ抗体の量から、ＣＡＰ−ＲＡＳＴなどの公知の判定基準に従って、被験者が検査対象の特定のアレルゲンに対してアレルギーを持つかどうかを判定する。
【００２３】
本発明のアレルギー検査方法は、以上のような従来公知のアレルギー検査方法において、固相担体への標識抗体の非特異的吸着を防止するためのブロッキング剤として、動植物由来でない合成ポリマーを使用することを特徴とする。かかるブロッキング剤としては、ブロッキング剤用合成ポリマーとして販売されているいかなるものも使用できるが、例えば、生化学バイオビジネス株式会社から「Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ＥＬＩＳＡ」の商品名で販売されているポリオキシエチレンモノメタクリレート、日油株式会社から「Ｎ１０１」の商品名で販売されているポリオキシエチレンポリオキシテトラメチレンモノメタクリレート、日油株式会社から「Ｎ１０２」の商品名で販売されているポリオキシエチレンポリオキシプロピレンモノメタクリレート、ナノビオテック株式会社から「ＮａｎｏＢｉｏ  Ｂｌｏｃｋｅｒ」の商品名で販売されているオクチルポリオキシエチレンポリオキシプロピレンモノメタクリレートなどのメタクリル酸エステル系のブロッキング剤を挙げることができる。
【００２４】
アレルギー検査方法を含む免疫学的測定におけるブロッキング剤としては、カゼイン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチンなどのウシ由来の物質を使用することが普通である。これらはそれぞれ、ウシの乳、血、骨を原料としており、安価で大量に入手することができる。また、これらのウシ由来の物質のブロッキング剤は、従来から多くの実験で使用されており、測定系の構築が容易である。しかしながら、本発明者らは、アレルギー検査方法においてブロッキング剤としてこれらのウシ由来の物質を使用すると、被験者の傾向によっては異常な測定値が発生することを見出した。その理由について、図２を参照して説明する。
【００２５】
まず、牛乳アレルギーを持つがカモガヤ花粉アレルギーを持たない被験者がカモガヤ花粉アレルギーを持つかどうかについてカゼインブロッキング剤を使用して検査する場合について考える。この被験者の血液サンプルには、牛乳に対するＩｇＥ抗体が多量に含まれるが、カモガヤ花粉に対するＩｇＥはほとんど含まれていない。
【００２６】
この場合、固相担体へのリガンド捕捉抗体の吸着固定及び余分なタンパク質吸着部位のブロッキング剤での封止が、図２（ａ）〜（ｃ）に示すように行われ、リガンドとカモガヤ花粉との結合が、図２（ｄ）に示すように行われる。次に、リガンドが結合されたカモガヤ花粉を、被験者の血液サンプルと混合すると、血液サンプル中のカモガヤ花粉に対する微量のＩｇＥ抗体が、カモガヤ花粉に抗原抗体反応により結合して、図２（ｅ）に示されるような複合体がごく少量形成される。ここまでは、図１（ａ）〜（ｅ）と同様である。被験者は牛乳アレルギーを持つので、その血液サンプル中には、牛乳に対するＩｇＥ抗体が多量に含まれるが、このＩｇＥ抗体は、カモガヤ花粉を抗原として認識せず、カモガヤ花粉に結合しない。
【００２７】
次に、この複合体を含む混合液を、図２（ｃ）の固相担体に添加すると、複合体はごく少量しかないので、大部分のリガンド捕捉抗体には、図２（ｆ）に示すように、複合体ではなく、リガンドとカモガヤ花粉の結合物が結合する。一方、多量の牛乳に対するＩｇＥ抗体が、図２（ｆ）に示すように、固相担体上のブロッキング剤（カゼイン）を抗原として認識し、ブロッキング剤（カゼイン）に抗原抗体反応によって結合する。次に、標識された抗ＩｇＥ抗体を添加すると、この抗体は、ブロッキング剤に結合した牛乳に対するＩｇＥ抗体を認識して抗原抗体反応を生じ、図２（ｇ）に示すように、ブロッキング剤上の牛乳に対するＩｇＥ抗体に、標識された抗ＩｇＥ抗体が結合される。この状態で標識の検出を行うと、牛乳に対するＩｇＥ抗体の量も、カモガヤ花粉に対するＩｇＥ抗体の量として測定されてしまうので、この血液サンプルは多量のカモガヤ花粉に対するＩｇＥ抗体を含むという測定結果が得られ、カモガヤ花粉に対するＩｇＥ抗体がほとんど含まれておらず本来陰性と判定されるべき血液サンプルが、陽性や擬陽性と誤判定されてしまう。
【００２８】
これに対して、ブロッキング剤として動植物由来でない合成ポリマーを使用する本発明のアレルギー検査方法では、カモガヤ花粉とカモガヤ花粉に対するＩｇＥ抗体との複合体を形成させるところまではブロッキング剤としてカゼインを使用する場合と同様であるが、この複合体を含む混合液を固相担体に添加しても、図２（ｈ）に示すように、牛乳に対するＩｇＥ抗体は、固相担体上のブロッキング剤を抗原として認識せず、ブロッキング剤に結合しない。従って、標識された抗ＩｇＥ抗体を添加しても、図２（ｉ）に示すように、標識された抗ＩｇＥ抗体が、リガンド捕捉抗体に結合された複合体以外の部分に結合することがなく、カモガヤ花粉に対するＩｇＥ抗体が過剰に定量されてしまうことがないので正しい判定を行うことができる。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３０】
実施例１
（１）抗ビオチン抗体固定化固相担体の作成
ガラスフィルターを固相担体とし、その上に、リガンド捕捉抗体としての抗ビオチン抗体ヤギＩｇＧを、スペーサーとしての抗ヤギ抗体ウサギＩｇＧを介して固定した。具体的には、ガラスフィルターと吸収層とを組み込んだブロット装置（特開平７−２１８４３８号公報参照）のフィルター上部から１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液（湿潤液：ｐＨ７．４）を添加し、次に、５０μｇ／ｍＬの抗ヤギ抗体ウサギＩｇＧ溶液（１００ｍＭクエン酸緩衝液：ｐＨ３．０）を２００μＬ添加して、３０分間放置した。次に、２００μｇ／ｍＬの抗ビオチン抗体ヤギＩｇＧ溶液（１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液：ｐＨ７．４）を５０μＬ添加し、さらに３０分間放置し、次に、ブロッキング剤と防腐剤とを含有する安定化剤混合液を添加した。ブロッキング剤としては、（ｉ）生化学バイオビジネス株式会社から「Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ＥＬＩＳＡ」の商品名で販売されているポリオキシエチレンモノメタクリレートを使用した。その後、ブロット装置を一昼夜凍結乾燥し、抗ビオチン抗体ヤギＩｇＧが抗ヤギ抗体ウサギＩｇＧを介して固定されたガラスフィルター（抗ビオチン抗体固定化固相担体）を作成した。
【００３１】
（２）標準ＩｇＥ抗体を使用した検量線の作成
ヒトＩｇＥ抗体標品（次の５種類の濃度のＩｇＥ抗体標準液（ｉｕ／ｍＬ）：０、０．３５、０．７、３．５、１７．５、５０．０、１００）各５０μＬに、抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体をビオチン化試薬で標識した試薬５μＬを加え、５分間３７℃で加温混合して混合液を調製した。（１）で作成した抗ビオチン抗体固定化固相担体を組み込んだブロット装置に上述の（ｉ）のブロッキング剤と防腐剤とを含有するブロック液を各５０μＬ添加し、次に、上述の混合液５０μＬを滴下した。２分間３７℃で加温した後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＥマウスモノクローナル抗体溶液を２０μＬ滴下し、３７℃２分間加温した。次に、０．５重量％の非イオン界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ−２０）を含有する緩衝化生理食塩水からなる洗浄液８０μＬを２回、直前に供給した溶液が完全に吸収された後に滴下し、固相担体に残った過剰の標識抗体を除去した。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼの基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）の溶液を４０μＬ添加して３７℃で反応させ、波長６７０ｎｍのレーザー光を光源とする積分球検出器で固相担体表面の青色の色調の反射率（ΔＫ／Ｓ）を測定した。具体的には、ブロット装置に基質を添加した後、６分以内で２回（ａ秒後、及びｂ秒後）、反射率を測定した。基質の添加時からａ秒後、ｂ秒後の反射率をそれぞれ（Ｋ／Ｓ）ａ、（Ｋ／Ｓ）ｂとして、基質の添加直後の反射率（ΔＫ／Ｓ）を、下記の式に従って計算した。
ΔＫ／Ｓ＝（（Ｋ／Ｓ）ｂ−（Ｋ／Ｓ）ａ）×６０／（ｂ−ａ）
各ＩｇＧ抗体濃度における基質の添加直後の反射率をプロットし、検量線を作成した。
【００３２】
（３）被験者の血液サンプル中の特定アレルゲンに対するＩｇＥ抗体の定量及びアレルギー判定
牛乳アレルギーであるがカモガヤ花粉アレルギーでないことが予め判明している１０人の被験者（被験者Ａ〜Ｊ）から血液サンプルを採取し、サンプル中の牛乳に対するＩｇＥ抗体及びカモガヤ花粉に対するＩｇＥ抗体をそれぞれ定量し、アレルギーの有無を判定した。具体的な手順は、以下の通りであった。
【００３３】
（１）で作成した抗ビオチン抗体固定化固相担体を組み込んだブロット装置に上述の（ｉ）のブロッキング剤と防腐剤とを含有するブロック液を５０μＬ添加した。一方、ビオチン化カモガヤ花粉・アレルゲン液（Ｇ３）、又はビオチン化牛乳・アレルゲン液（Ｆ２）の各々５μＬに、被験者の血液サンプルから調製した血清を５０μＬ添加し、３７℃で５分間加温した。これらをブロット装置に５０μＬ添加して３７℃で２分間加温した。次に、ブロット装置に西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＥマウスモノクローナル抗体溶液を２０μＬ加えて、３７℃で２分間加温した。ブロット装置に、０．５重量％の非イオン界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ−２０）を含有する緩衝化生理食塩水からなる洗浄液８０μＬを２回、直前に供給した溶液が完全に吸収された後に滴下し、固相担体に残った過剰の標識抗体を除去した。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼの基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）溶液を４０μＬ添加して３７℃で反応させ、（２）と同様にして基質の添加直後の反射率（ΔＫ／Ｓ）を計算した。計算結果を、（２）で作成した検量線と比較して、各アレルゲンに対するＩｇＥ抗体を定量し、以下の表１に示すＣＡＰ−ＲＡＳＴの判定基準に従って、被験者のアレルギーを判定した。その結果を表２に示す。
【００３４】
0005500423.tif 000002
【００３５】
実施例２
ブロッキング剤として（ｉｉ）日油株式会社から「Ｎ１０１」の商品名で販売されているポリオキシエチレンポリオキシテトラメチレンモノメタクリレートを使用した以外は、実施例１と同様にして、抗ビオチン抗体固定化担体を作成し、検量線を作成し、ＩｇＥ抗体の定量及びアレルギー判定を行った。その結果を表２に示す。
【００３６】
実施例３
ブロッキング剤として（ｉｉｉ）日油株式会社から「Ｎ１０２」の商品名で販売されているポリオキシエチレンポリオキシプロピレンモノメタクリレートを使用した以外は、実施例１と同様にして、抗ビオチン抗体固定化担体を作成し、検量線を作成し、ＩｇＥ抗体の定量及びアレルギー判定を行った。その結果を表２に示す。
【００３７】
実施例４
ブロッキング剤として（ｉｖ）ナノビオテック株式会社から「ＮａｎｏＢｉｏ  Ｂｌｏｃｋｅｒ」の商品名で販売されているオクチルポリオキシエチレンポリオキシプロピレンモノメタクリレートを使用した以外は、実施例１と同様にして、抗ビオチン抗体固定化担体を作成し、検量線を作成し、ＩｇＥ抗体の定量及びアレルギー判定を行った。その結果を表２に示す。
【００３８】
比較例１
ブロッキング剤としてカゼインを使用した以外は、実施例１と同様にして、抗ビオチン抗体固定化担体を作成し、検量線を作成し、ＩｇＥ抗体の定量及びアレルギー判定を行った。その結果を表２に示す。
【００３９】
0005500423.tif 000003
【００４０】
表２から明らかなように、牛乳アレルギーを持つがカモガヤ花粉アレルギーを持たない被験者を検査した場合、ブロッキング剤として（ｉ）〜（ｉｖ）の合成ポリマーのいずれかを使用した実施例１〜４では、カモガヤ花粉に対するアレルギークラスはすべての被験者で０又は１（陰性又は擬陽性）と判定されるが、ブロッキング剤としてカゼインを使用した比較例１ではカモガヤ花粉に対するクラスは、１０人中５人の被験者で２又は３（陽性）と判定され、５０％の判定ミスがあった。また、牛乳アレルギーの検査では、実施例１〜５と比較例１のいずれも陽性と正しく判定した。これらの結果から、本発明のアレルギー検査方法は、検査対象のアレルゲンに対するアレルギーを持たないのにもかかわらずアレルギーを持つと誤って判定されるおそれがなく、判定精度が極めて高いことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明のアレルギー検査方法は、判定精度が極めて高いので、食物、環境物質、大気物質などの様々なアレルゲンに対するアレルギーを簡便に検出するために広く利用することができる。
【図１ａ−ｃ】
0005500423.tif 000004
【図１ｄ−ｆ】
0005500423.tif 000005
【図１ｇ−ｈ】
0005500423.tif 000006
【図２ａ−ｃ】
0005500423.tif 000007
【図２ｄ−ｅ】
0005500423.tif 000008
【図２ｆ−ｇ】
0005500423.tif 000009
【図２ｈ−ｉ】
0005500423.tif 000010