(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スルホニルエチルカーバメト基を有し、下記一般式（Ｉ）で表されるインドール基の保護基であって、アセトニトリル、ジクロロメタン、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）、及びＮ−メチルピロリドンからなる群より選択される少なくともいずれかである非プロトン性溶媒中で脱保護可能であることを特徴とするインドール基用保護基。
【化３３】
0005544833.tif 000034
ただし、前記一般式（Ｉ）において、Ｒは、水素原子、アルキル基、フェニル基、及びアルコキシフェニル基のいずれかを表す。
【請求項２】
嵩高い塩基により１５分間以内に脱保護可能である請求項１に記載のインドール基用保護基。
【請求項３】
スルホニルエチルカーバメト基が、チオエチルカーバメート基の形で導入された後、該チオエチルカーバメート基が酸化されることにより合成される請求項１から２のいずれかに記載のインドール基用保護基。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インドール基用保護基、並びに核酸の製造に好適な核酸自動合成用アミダイド及びその前駆体、前記核酸自動合成用アミダイドを用いた核酸合成方法、及び前記核酸合成方法により合成された核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間の全遺伝子情報が既に明らかになった。その結果、研究者や科学者の興味の中心は遺伝子産物である蛋白質の解析に移行している。蛋白質の解析においては、対象となる個々の蛋白質に対してアフィニティー（結合性）を有する分子を得ることによって、初めて実質的な解析が可能になるといっても過言ではない。しかしながら、細胞中には非常に多種類の蛋白質が存在し、そのアミノ酸配列や構造が未知であるものも多い。
【０００３】
ある特定の蛋白質に対してアフィニティーを有する分子を得る最も一般的な手法は、動物の免疫系を用い、アフィニティー抗体を作製する方法である。しかし、この方法では動物を用いるため、多量の蛋白質や多大な工程、費用が必要となり、しかもある特定の物質に対するアフィニティー抗体は生成されないという欠点があった。このような問題を解決するために、生物に依存しないアプタマー法（別名：ＳＥＬＥＸ法）も提案されているが、この方法で得られる分子は、特定の蛋白質に対しては強い相互作用を示すものの、必ずしも全ての蛋白質に応用可能なものではなかった。
【０００４】
そこで本発明者らは、前記アプタマー法を改良し、核酸を用いた修飾アプタマー法を提案している（特許文献１参照）。しかしながら、多種類の修飾核酸を用いているため、良好なＰＣＲ増幅条件の選定が困難であった。また同時に、標的物質に強く結合する機能性分子ほど、ＰＣＲにより増幅しにくいという問題があった。このような問題を解決するために本発明者らは既に、標的物質との結合に関与する官能基とダイマー配列情報とが一対一で対応し、アンモニア処理により除去可能な結合で導入し標的物質と結合させた後に除去し、ＰＣＲ増幅を行うことが、可能な機能性分子の原料アミダイドの合成法を提案している。
【０００５】
一方で、核酸の固相合成は、２０年以上も前から行われており、自動合成装置もその時点で販売されている。核酸の固相合成は、例えば、ヌクレオシドを結合させた固相担体（例えば、ＣＰＧ）にヌクレオシド化合物（アミダイド）を縮合反応させていくことにより行われるが、この縮合反応の際には、前記アミダイドのリン酸部分と他方の水酸基のみを縮合反応に関与させ、それ以外の反応性基は縮合反応に関与させずに行う必要がある。したがって、使用するアミダイドの核酸塩基が有する環外アミノ基等には、保護基を導入して縮合反応への関与を防止し、全縮合反応が終了した後、保護基を脱離する（脱保護する）ことが必要となる。従来から、核酸塩基の環外アミノ基に導入する保護基としては、ベンゾイル基、イソブチリル基等が用いられており、これらの保護基の脱保護には、濃アンモニア水を、５５℃で８時間〜１５時間、作用させる方法が一般的であった。
【０００６】
しかしながら、これらの蛋白質に対してアフィニティー（結合性）を有する核酸の製造においては、このような従来の脱保護条件では、保護基の脱保護とともに、核酸における修飾部分（蛋白質との結合性を有する置換基部分）までもが脱離してしまい、安定して核酸を製造することができないという問題があった。したがって、このような核酸を製造するにあたっては、保護基の脱保護とともに、蛋白質との結合性を有する置換基部分までもが外れてしまわないよう、より緩やかな条件下で保護基の脱保護が可能なアミダイドを用いることが求められている。
【０００７】
例えば、従来の技術において、嵩高い塩基、シアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）で脱保護可能な核酸アミダイドなどが報告されているが（非特許文献１〜２参照）、これらの核酸自動合成用アミダイドは、非プロトン性溶媒であるアセトニトリル中で不安定であり（非特許文献５参照）、実用には向かないものであった。また、ピリジン中、０．５Ｍ  ＤＢＵの条件下、１６時間で脱保護可能である核酸自動合成用アミダイドも報告されている（非特許文献３〜４参照）が、ＤＢＵが高濃度であり、更に長時間による脱保護のため、核酸塩基へのアルキル化が起こるという問題があった。また、メタノール中、Ｋ２ＣＯ３を用いた条件下で脱保護可能である核酸自動合成用アミダイドも報告されている（非特許文献５〜６参照）が、プロトン性溶媒であるメタノール中で塩基のＫ２ＣＯ３を使用するため、エステル等が分解するという問題があった。
【０００８】
したがって、緩やかな条件下での脱保護が可能であり、これにより、蛋白質等の標的物質の解析に好適な核酸を安定して製造することのできる、優れた保護基、前記保護基を有する核酸自動合成用アミダイド、及び前記核酸自動合成用アミダイドを用いた核酸合成方法の開発が、未だ望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００３／０７８６２３号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ，Ｓｃａｎｄ．，Ｂ３７，２６３（１９８３）
【非特許文献２】Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５４，１６５７（１９８９）
【非特許文献３】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４０，４１７１（１９９２）
【非特許文献４】Ｎｕｃｌｅｏｄｉｅｄ  ＆  Ｎｕｃｌｒｏｔｉｄｅｓ  １３，２０５９（１９９４）
【非特許文献５】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４６，６７２９（１９９０）
【非特許文献６】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  ２１，３４９３（１９９３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、従来における前記問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、緩やかな条件下での脱保護が可能であり、これにより、核酸を安定して製造することのできる、優れた保護基、前記保護基を有する核酸自動合成用アミダイド及びその前駆体、前記核酸自動合成用アミダイドを用いた核酸合成方法、及び前記核酸合成方法により得られる核酸を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決するための手段としては、後述の付記に記載の通りである。即ち、
本発明のインドール基用保護基は、後述する一般式（Ｉ）に示される通り、少なくともスルホニルエチルカーバメト基を有する。前記インドール基用保護基は、緩やかな条件下での脱保護が可能であるため、インドール基を導入した核酸塩基やアミダイドから該インドール基を脱離させることなしに、保護基を容易に脱保護することができる。
【００１３】
本発明の核酸自動合成用アミダイドは、後述する一般式（ＩＩ）及び一般式（ＩＩＩ）に示される通り、少なくとも核酸塩基、インドール基、及び前記インドール基を保護するための保護基を有する。前記核酸自動合成用アミダイドは、緩やかな条件下での脱保護が可能であるため、インドール基を脱離させることなしに、保護基を容易に脱保護することができる。
【００１４】
本発明の核酸自動合成用アミダイド用前駆体は、本発明の核酸自動合成用アミダイドの前駆体であり、後述する構造式（３）から（７）のいずれかで表される。本発明の前記核酸自動合成用アミダイドを合成する際に本発明の前記前駆体を経ることで、本発明の核酸自動合成用アミダイドを高収率で得ることができる。
【００１５】
本発明の核酸合成方法は、本発明の前記核酸自動合成用アミダイドを用いる。前記核酸合成方法は、本発明の前記核酸自動合成用アミダイドを用いるため、インドール基を脱離させない程度の、緩やかな条件下で保護基の脱保護を行うことができる。したがって、前記核酸合成方法によれば、核酸を、安定して製造することができる。
【００１６】
本発明の核酸は、本発明の前記核酸合成方法により得られる。前記核酸は、本発明の前記核酸合成方法により得られるものであるため、インドール基を有する核酸である。前記核酸は、インドール基を介して、蛋白質等の標的物質との結合が可能であり、したがって、前記核酸は、例えば、蛋白質等の標的物質の解析に、好適に利用可能である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、緩やかな条件下での脱保護が可能であり、これにより、核酸を安定して製造することのできる、優れた保護基、前記保護基を有する核酸自動合成用アミダイド及びその前駆体、前記核酸自動合成用アミダイドを用いた核酸合成方法、及び前記核酸合成方法により得られる核酸を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、実施例１における構造式（３）で表される化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２】図２は、実施例１における構造式（４）で表される化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３】図３は、実施例１における構造式（５）で表される化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４−１】図４−１は、実施例１における構造式（１）で表される核酸自動合成用アミダイドの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４−２】図４−２は、実施例１における構造式（１）で表される核酸自動合成用アミダイドの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図５】図５は、実施例１における構造式（６）で表される化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図６】図６は、実施例１における構造式（７）で表される化合物の３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図７−１】図７−１は、実施例１における構造式（２）で表される核酸自動合成用アミダイドの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図７−２】図７−２は、実施例１における構造式（２）で表される核酸自動合成用アミダイドの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図７−３】図７−３は、実施例１における構造式（２）で表される核酸自動合成用アミダイドのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図８】図８は、実施例２におけるＨＰＬＣチャート１である。
【図９】図９は、実施例２におけるＨＰＬＣチャート２である。
【図１０】図１０は、実施例２におけるＨＰＬＣチャート３である。
【図１１】図１１は、実施例２におけるＨＰＬＣチャート４である。
【図１２】図１２は、実施例２におけるＨＰＬＣチャート５である。
【図１３】図１３は、本発明の核酸自動合成用アミダイド（構造式（１）で表される核酸自動合成用アミダイド）における脱保護機構を表した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（インドール基用保護基）
本発明のインドール基用保護基は、インドール基の保護基であって、スルホニルエチルカーバメト基を有し、下記一般式（Ｉ）で表される。
【化１】
0005544833.tif 000002
【００２０】
ただし、前記一般式（Ｉ）において、Ｒは、水素原子、アルキル基、フェニル基、及びアルコキシフェニル基のいずれかを表す。
【００２１】
前記インドール基用保護基は、非プロトン性溶媒中で脱保護可能な保護基、即ち、緩やかな条件下で脱保護可能な保護基である。
ここで、前記「緩やかな条件下で脱保護可能」とは、例えば、前記保護基が、非プロトン性溶媒中で、嵩高い塩基により脱保護可能であることをいう。
【００２２】
前記非プロトン性溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）、Ｎ−メチルピロリドンなどが挙げられる。これらの中でも、ＤＮＡ合成機を用いて脱保護する場合は、アセトニトリルが好ましい。
前記非プロトン性溶媒を用いることにより、前記インドール基を有する核酸塩基やアミダイドなどから、前記インドール基が前記保護基の脱保護とともに脱落することなく、安定してインドール基含有核酸を製造できる。
【００２３】
前記嵩高い塩基としては、Ｌｅｗｉｓ則やＢｒｏｎｓｔｅｄ−Ｌｏｗｒｙ則に従う塩基であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］−５−ノネン（ＤＢＮ）、テトラメチルグアニジンなどが挙げられる。これらの中でも、前記保護基は、前記アセトニトリル中、前記ＤＢＵにより脱保護されることが好ましい。
【００２４】
前記保護基の脱保護に要するＤＢＵの濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．５Ｍ以下が好ましく、０．１Ｍ以下がより好ましく、０．０１Ｍ以下が特に好ましい。
前記脱保護は、脱離副生成物及びＤＢＵの濃度が増加しない状態、即ち、ＤＮＡ合成後、固相担体上で固定された状態で、ＤＢＵ含有溶液を流し、ＤＮＡは固相担体上、脱離副生成物は溶液中になるよう物理的に分離できることが好ましい。
前記ＤＢＵ、脱離副生成物、及びＤＮＡを分離せず、濃縮し、ＤＢＵ濃度が０．５Ｍを超えると、核酸塩基へのアルキル化が起こることがある。
【００２５】
前記保護基の脱保護に要する時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、８時間以内が好ましく、１時間以内がより好ましく、１５分間以内が特に好ましい。
脱離副生成物を分離せずに、前記脱保護に要する時間が８時間を超えると、核酸塩基へのアルキル化が起こることがある。
【００２６】
前記インドール基用保護基において、前記スルホニルエチルカーバメト基は、塩基性条件では不安定であるため、前記非プロトン性溶媒中で嵩高い塩基により脱保護されるが、インドール基に前記インドール基用保護基を導入する場合も塩基性条件で行なわれることが好ましく、そのため、前記スルホニルエチルカーバメト基は、塩基性条件で安定なチオエチルカーバメート基の形で前記インドール基に導入された後、該チオエチルカーバメート基が酸化されることにより合成されることが好ましい。
【００２７】
前記インドール基用保護基は、穏やかな条件で脱保護可能であるため、インドール基を導入した核酸合成などに好適に利用可能である。
【００２８】
（核酸自動合成用アミダイド）
本発明の核酸自動合成用アミダイドは、非プロトン性溶媒中で脱保護可能な保護基により保護されたインドール基を有し、かつ下記一般式（ＩＩ）及び下記一般式（ＩＩＩ）の少なくともいずれかで表される。
【化２】
0005544833.tif 000003
【化３】
0005544833.tif 000004
【００２９】
ただし、前記一般式（ＩＩ）及び前記一般式（ＩＩＩ）において、Ｘは、核酸塩基を表し、Ｙは、前記インドール基を表し、Ｚは、前記インドール基を保護するための保護基を表し、Ｚ’は、前記核酸塩基を保護するための保護基を表し、Ｑは、水素原子及び水酸基のいずれかを表し、ｎ及びｍは、０及び１のいずれかの整数を表す。前記核酸塩基は、任意の置換基を有していてもよい。
【００３０】
前記一般式（ＩＩ）及び前記一般式（ＩＩＩ）において、前記ｍが０の場合、モノマーの核酸自動合成用アミダイドを表す。
前記一般式（ＩＩ）及び前記一般式（ＩＩＩ）において、前記ｍが１の場合、ダイマーの核酸自動合成用アミダイドを表す。前記ダイマーの核酸自動合成用アミダイドは、少なくとも一方が、前記インドール基Ｙを有するモノマーの核酸自動合成用アミダイドを含んでいればよく、前記一般式（ＩＩＩ）で表されるように、他方の核酸自動合成用アミダイドは、核酸塩基Ｘ又は保護基Ｚ’を有する核酸塩基Ｘのみを有するものであってもよい。また、前記ダイマーの核酸自動合成用アミダイドは、下記一般式（ＩＶ）で表されるものであってもよい。
【化４】
0005544833.tif 000005
ただし、前記一般式（ＩＶ）において、Ｘは、核酸塩基を表し、Ｙは、前記インドール基を表し、Ｚは、前記インドール基を保護するための保護基を表し、Ｚ’は、前記核酸塩基を保護するための保護基を表し、Ｑは、水素原子及び水酸基のいずれかを表し、ｎは、０及び１のいずれかの整数を表す。前記核酸塩基は、任意の置換基を有していてもよい。
【００３１】
＜インドール基＞
前記一般式（ＩＩ）、前記一般式（ＩＩＩ）、及び前記一般式（ＩＶ）において、Ｙで表されるインドール基としては、前記インドール基の保護基Ｚが、緩やかな条件下で脱保護される際に、併せて脱離されてしまわないよう、前記一般式（ＩＩ）、前記一般式（ＩＩＩ）、及び前記一般式（ＩＶ）において、核酸塩基Ｘに導入されていることが好ましい。
【００３２】
前記インドール基は、前記一般式（ＩＩ）、前記一般式（ＩＩＩ）、及び前記一般式（ＩＶ）において核酸塩基Ｘと直接結合していてもよく、後述する核酸塩基が有する置換基を介して結合していてもよい。
【００３３】
＜インドール基を保護するための保護基＞
前記一般式（ＩＩ）、前記一般式（ＩＩＩ）、及び前記一般式（ＩＶ）において、Ｚで表される保護基は、前記インドール基Ｙを保護するための保護基であり、その種類としては、非プロトン性溶媒中で脱保護可能な保護基、即ち、緩やかな条件下で脱保護可能な保護基であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、本発明の前記一般式（Ｉ）で表されるインドール基用保護基が好ましい。これらの中でも、前記保護基は、前記一般式（Ｉ）において、Ｒが、アルコキシフェニル基が好ましく、ｐ−メトキシフェニル基が、核酸自動合成用アミダイドの収率が高い点でより好ましい。
【００３４】
＜核酸塩基＞
前記一般式（ＩＩ）、前記一般式（ＩＩＩ）、及び前記一般式（ＩＶ）において、Ｘで表される核酸塩基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）などが挙げられる。これらの中でも、前記核酸塩基としては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）が好ましい。
また、前記核酸塩基Ｘは、核酸塩基を有していれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述するヌクレオシド化合物であってもよいし、前記核酸塩基が置換基を有していてもよい。
更に、前記一般式（ＩＩＩ）及び前記一般式（ＩＶ）で表される核酸自動合成用アミダイドにおいては、前記核酸塩基Ｘは、前記核酸塩基の保護基Ｚ’を有していてもよい。前記一般式（ＩＩＩ）及び前記一般式（ＩＶ）において、前記保護基Ｚ’が０の場合、即ち前記核酸塩基が前記Ｚ’を有さない場合、前記核酸塩基Ｘは、飽和した核酸塩基を示す。
【００３５】
前記核酸塩基Ｘに前記インドール基Ｙ又は前記置換基が導入される位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、アデニン核酸塩基の６位、シトシン核酸塩基の６位、グアニン核酸塩基の２位などが好ましい。
【００３６】
＜＜ヌクレオシド化合物＞＞
前記ヌクレオシド化合物とは、核酸の合成に用いられるヌクレオシド又はヌクレオシド誘導体のモノマーをいい、前記ヌクレオシド誘導体には、末端がアミダイド化された「核酸合成用アミダイド」が含まれる。
【００３７】
前記ヌクレオシド化合物としては、例えば、特開２００８−１６２９９２号、特開２００８−２３０９８５号、特開２００９−０６２３０７号等の公報に記載のアミダイドなどを用いることができる。また、リン酸結合部以外に保護基を有しないアミダイド、例えば、サイアニン色素アミダイド、市販のｄＴアミダイドなどを用いることもできる。
【００３８】
＜＜置換基＞＞
前記置換基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、天然又は非天然のアミノ酸、金属錯体、蛍光色素、酸化還元色素、スピンラベル体、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、下記一般式（１０１）〜（１１０）で表される基などの構造を含むことができる。
【００３９】
【化５】
0005544833.tif 000006
【００４０】
前記天然又は非天然のアミノ酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、バリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、アルギニン、グルタミン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、システイン、スレオニン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、グリシン、セリンなどが挙げられる。
【００４１】
前記金属錯体としては、金属イオンに配位子が配位した化合物であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｒｕビピリジル錯体、フェロセン錯体、ニッケルイミダゾール錯体などが挙げられる。
【００４２】
前記蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フルオレセイン系列、ローダミン系列、エオシン系列、ＮＢＤ系列等の蛍光色素などが挙げられる。
【００４３】
前記酸化還元色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ロイコアニリン、ロイコアントシアニン等のロイコ色素などが挙げられる。
前記スピンラベル体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、鉄Ｎ−（ジチオカルボキシ）サルコシン（ｓａｒｃｏｓｉｎｅ）、ＴＥＭＰＯ（テトラメチルピペリジン）誘導体などが挙げられる。
【００４４】
前記炭素数１〜１０のアルキル基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基などが挙げられる。
これらは、置換基で更に置換されていてもよい。
【００４５】
−核酸塩基の保護基−
前記一般式（ＩＩＩ）及び前記一般式（ＩＶ）において、Ｚ’で表される前記核酸塩基の保護基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、非プロトン性溶媒中で脱保護可能な保護基、即ち、緩やかな条件下で脱保護可能な保護基であることが好ましい。
前記核酸塩基の保護基としては、例えば、特開２００７−２２５５０７号、特開２００８−１６２９９２号、特開２００８−２３０９８５号、特開２００９−０６２３０７号等の公報に記載の核酸塩基の保護基などを用いることができる。また、前記インドール基用保護基を核酸塩基の保護基として用いることも可能である。
【００４６】
＜具体例＞
前記核酸自動合成用アミダイドの具体例としては、例えば、下記構造式（１）〜（２）で表されるものなどが挙げられるが、前記核酸自動合成用アミダイドとしては、これらに限定されるものではない。
【化６】
0005544833.tif 000007
【化７】
0005544833.tif 000008
【００４７】
＜製造＞
前記一般式（ＩＩ）及び前記一般式（ＩＩＩ）で表されるモノマーの核酸自動合成用アミダイドの合成方法としては、特に制限はなく、例えば、後述する実施例に記載の方法などにより合成することができる。
【００４８】
前記一般式（ＩＩ）、前記一般式（ＩＩＩ）、及び前記一般式（ＩＶ）で表されるダイマーの核酸自動合成用アミダイドを得る方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記モノマーの核酸自動合成用アミダイドと、前記モノマーの核酸自動合成用アミダイド又は前記ヌクレオシド化合物とを連結する方法などが挙げられる。
【００４９】
前記連結する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、亜リン酸トリエステル結合（Ｐ（ＯＲ）３）を介して連結されることが好ましい。
前記亜リン酸トリエステル結合を介してなる前記一般式（ＩＩ）、前記一般式（ＩＩＩ）、及び前記一般式（ＩＶ）で表されるダイマーの核酸自動合成用アミダイドは、リン酸トリエステル結合を介してなるダイマーアミダイドと比較して、塩基性条件で安定性が高く、精製が容易である。そのため、精製が困難な、リン酸トリエステル結合を介して連結してなるダイマーアミダイドと比較して、高純度の核酸自動合成用アミダイドとして得ることができる。
【００５０】
前記亜リン酸トリエステル結合の反応に用いる化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、亜リン酸塩化物、亜リン酸ジ塩化物などを用いることができるが、副反応を抑える意味で、後述する実施例に記載の方法が好適であると考えられる。
【００５１】
（核酸自動合成用アミダイド用前駆体）
本発明の核酸自動合成用アミダイド用前駆体は、本発明の前記核酸自動合成用アミダイドの前駆体であり、下記構造式（３）〜（７）で表される。
【化８】
0005544833.tif 000009
【化９】
0005544833.tif 000010
【化１０】
0005544833.tif 000011
【化１１】
0005544833.tif 000012
【化１２】
0005544833.tif 000013
【００５２】
前記核酸自動合成用アミダイド用前駆体は、前記核酸自動合成用アミダイドの合成経路で安定に存在するため、前記核酸自動合成用アミダイドは、前記核酸自動合成用アミダイド用前駆体を経て合成されることで、高収率で得ることができる。
【００５３】
（核酸合成方法）
本発明の核酸合成方法は、本発明の前記核酸自動合成用アミダイドを用いることを特徴とする。
前記核酸合成方法は、前記核酸自動合成用アミダイドを用いて核酸を合成する方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジエステル法、トリエステル法、ホスファイト法、ホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスファイト法等の縮合反応に、固相法を組み合わせた従来の核酸合成方法を利用することができる。
前記核酸合成方法は、例えば、従来の核酸自動合成装置を用いて行うことができる。
【００５４】
前記核酸合成方法においては、前記核酸自動合成用アミダイドを、一種単独で使用してもよいし、二種以上を併用してもよい。また、前記核酸合成方法に用いるアミダイド（ヌクレオシド化合物）としては、前記核酸自動合成用アミダイドのみならず、他のアミダイドを組み合わせて用いてもよい。
この場合、前記他のアミダイドとしては、前記したような緩やかな条件下で脱保護可能なアミダイドを用いることが好ましく、このようなアミダイドとしては、例えば、特開２００８−１６２９９２号、特開２００８−２３０９８５号、特開２００９−０６２３０７号等の公報に記載のアミダイドなどを用いることができる。
【００５５】
前記核酸合成方法においては、前記核酸自動合成用アミダイドと、前記核酸自動合成用アミダイド及び前記他のアミダイドの少なくともいずれかとの縮合反応の後、前記核酸自動合成用アミダイド及び前記他のアミダイドの保護基の脱保護を行う。
前記脱保護の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記したような緩やかな条件下で行われることが好ましく、例えば、非プロトン性溶媒中で、嵩高い塩基により脱保護を行うことが好ましい。
前記非プロトン性溶媒、前記嵩高い塩基としては、前記同様である。また、脱保護に要する濃度及び時間としても、前記同様である。
【００５６】
前記脱保護は緩やかな条件下で行われるため、前記核酸自動合成用アミダイドにおけるインドール基は脱離されない。
【００５７】
（核酸）
本発明の核酸は、本発明の前記核酸合成方法により得られることを特徴とする。即ち、前記核酸は、その少なくとも一部に、インドール基を有する修飾ヌクレオチド単位を含んでなるものである。
【００５８】
前記核酸を構成するヌクレオチド単位の個数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０個〜２００個が好ましく、２０個〜１００個がより好ましく、３０個〜８０個が特に好ましい。
なお、前記核酸を構成するヌクレオチド単位のうち、前記核酸自動合成用アミダイドに由来する修飾ヌクレオチド単位の割合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５９】
前記核酸は、ＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列のいずれであってもよい。また、前記ＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列は、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。
【００６０】
前記核酸は、インドール基を有してなるため、インドール基を介して蛋白質等の標的物質との結合が可能である。したがって、前記核酸は、例えば、蛋白質等の標的物質の解析に、好適に利用可能である。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例及び比較例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら制限されるものではない。また、以下の実施例及び試験例中、「％」は、特に明記のない限り「モル％」を表す。
【００６２】
（実施例１：核酸自動合成用アミダイドの合成）
構造式（１）で表される核酸自動合成用アミダイド、及び、構造式（２）で表される核酸自動合成用アミダイドを以下のようにして合成した。
保護基としては、前記一般式（Ｉ）において、Ｒがｐ−メトキシフェニル基の化合物を用いた。
【００６３】
【化１３】
0005544833.tif 000014
【００６４】
＜構造式（３）で表される化合物の合成＞
クロロエタノール５．０ｍＬ（７４．９ｍｍｏｌ）を１００ｍＬの脱水ジメチルフォルムアミドに溶解し、４−メトキシチオフェノール８．７ｍＬ（７１．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を窒素ガスで５分間パージした。続いて、炭酸ナトリウム３１ｇ（２２４ｍｍｏｌ）を加えた後に、氷冷下１５分間静置した後、室温で３０分間攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。酢酸エチル溶液を減圧濃縮することにより構造式（８）で表される化合物１３．０４ｇを得た。
【００６５】
トリフォスゲン７．００ｇ（２３．５９ｍｍｏｌ）を８０ｍＬの脱水テトラヒドロフランに溶解した。本溶液を表冷し、構造式（８）で表される化合物１３．０４ｇ（最大７０．７８ｍｍｏｌ）、ピリジン６．０１ｍＬ（７４．３２ｍｍｏｌ）及び８０ｍＬの脱水テトラヒドロフランの混合溶液を約３０分間かけて滴下した。室温で３０分間攪拌した後、再び表冷し、イミダゾール４．８２ｇ（７０．７８ｍｍｏｌ）及びピリジン６．０１ｍＬ（７４．３２ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分間攪拌した。反応混合物にヘキサン１６０ｍＬを加え、攪拌した後にろ過し、濾物をテトラヒドロフラン：ヘキサン（１：１（体積比））で洗浄した。濾液及び洗浄液を減圧濃縮することにより構造式（９）で表される化合物２０．０２ｇを得た。
【００６６】
３−インドール酢酸１１．２７ｇ（６４．３５ｍｍｏｌ）を１３０ｍＬの脱水ジメチルフォルムアミドに溶解し、６０重量％水素化ナトリウム−オイル混合物５．６６ｇ（１４１．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した後、氷冷し、構造式（９）で表される化合物  ２０．０２ｇ（最大７０．７８ｍｍｏｌ）の７１ｍＬ脱水ジメチルフォルムアミドの冷却溶液を加え５分間攪拌した後、室温で３０分間攪拌した。反応混合物に塩化アンモニム１３．８ｇを加え減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し水で洗浄した。酢酸エチル溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（１％酢酸一定、酢酸エチル：ヘキサン＝１：２→１：１（体積比））にて精製し、構造式（３）で表される化合物１２．５２ｇ（３２．４８ｍｍｏｌ）を得た。
【００６７】
＜構造式（４）で表される化合物の合成＞
構造式（３）で表される化合物１０．１１ｇ（２６．２３ｍｍｏｌ）を６６ｍＬのジクロロメタンに溶解し、氷冷下７０％  ｍ−クロロ過安息香酸、水混合物１３．２８ｇを加え、３０分間攪拌した。反応溶液を水で洗浄し、ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（２％酢酸一定、ジクロロメタン：酢酸エチル＝１：０→４：１（体積比））にて精製し、構造式（４）で表される化合物８．９１ｇ（２１．３４ｍｍｏｌ、８１％）を得た。
【００６８】
【化１４】
0005544833.tif 000015
【００６９】
＜構造式（１０）で表される化合物の合成＞
構造式（１０）で表される化合物は、特願２００７−０６９３７８号明細書（ＸＩＶで表される化合物）に示された合成方法に従い合成した。
【００７０】
＜構造式（５）で表される化合物の合成＞
構造式（１０）で表される化合物１８．４２ｇ（２１．３４ｍｍｏｌ）を４２ｍＬ脱水ジクロロメタンに溶解し、トリエチルシラン５．１１ｍｌ（３２．０１ｍｍｏｌ）及びジアザビシクロウンデセエン４．７９ｍＬ（３２．０１ｍｍｌ）を加え室温にて１０分間攪拌した後に、トリエチルアミン塩酸塩５．２９ｇ（３８．４１ｍｍｏｌ）を加え、５分間以上攪拌し、溶液Ａを得た。
構造式（４）で表される化合物８．９１ｇ（２１．３４ｍｍｏｌ）を脱水ジメトキシエタンに溶解し減圧濃縮する操作を３回行った。残渣を６５ｍＬの脱水ジクロロメタンに懸濁し、ジイソプロピルエチルアミン４．０９ｍＬ（２３．４７ｍｍｏｌ）及びＯ−ベンゾトリアゾリル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート８．５０ｇ（２２．４１ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分間攪拌した。本溶液を上記溶液Ａに加え室温にて３０分間攪拌した。反応溶液を水で洗浄し、ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（酢酸エチル：エタノール＝１９：１→９：１（体積比））にて精製し、構造式（５）で表される化合物２１．３０ｇ（２０．４８ｍｍｏｌ、９６％）を得た。
【００７１】
＜構造式（１）で表される核酸自動合成用アミダイドの合成＞
構造式（５）で表される化合物１５．８８ｇ（１５．２７ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル、脱水ジクロロメタンに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を４６ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン９３ｍｇ（０．７６ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン３．０２ｍＬ（１８．３２ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト３．７５ｍＬ（１６．８０ｍｍｏｌ）の１５ｍＬ塩化メチレン溶液を５分間以上かけて滴下した。混合溶液を氷冷下５分間攪拌し、４℃で一晩静置した。続いてメタノール３．０ｍＬを加え、３０分間攪拌した。反応溶液を水で洗浄し、ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（２％ピリジン含有酢酸エチル−ヘキサン（２：１（体積比））：２％ピリジン及び７％エタノール含有酢酸エチル＝１：０→０：１（体積比））にて精製し、構造式（１）で表される核酸自動合成用アミダイド１４．９６ｇ（７９％）を得た。
【００７２】
＜構造式（６）で表される化合物の合成＞
構造式（５）で表される化合物２１．３０ｇ（２０．４８ｍｍｏｌ）を脱水ジオキサンに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を６２ｍＬの脱水ジオキサンに溶解し、ジメチルアミノピリジン１５０ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド６．３４ｇ（３０．７２ｍｍｏｌ）及びレブリン酸３．１５ｍＬ（３０．７２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。反応溶液に４ｍＬのメタノールを加え、３０分間攪拌した。不溶物をろ過し、濾液を減圧濃縮し、ジクロロメタンで希釈し水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を９７ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下、７．２ｍＬのトリフロロ酢酸を加え、０℃で１時間攪拌した後、８２ｍＬの脱水メタノール及び１１ｍＬの脱水ピリジンを加えた。反応混合物を室温一晩攪拌した。反応混合物を水で洗浄し、ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン：エタノール＝１９：１→９１：９（体積比））にて精製し、構造式（６）で表される化合物１４．６９ｇ（８６％）を得た。
【００７３】
【化１５】
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【００７４】
＜構造式（７）で表される化合物の合成＞
構造式（６）で表される化合物１２．５４ｇ（１５．０ｍｍｏｌ）及びｄＴアミダイド（グレンリサーチ株式会社製）１１．５０ｇ（１５．４４ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリルに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を６０ｍＬの脱水アセトニトリルに溶解し、テトラゾール５．２５ｇ（７５．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した。続いてメタノール３．０ｍＬを加え３０分間攪拌した。溶液をジクロロメタンで希釈し水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。残渣を７５ｍＬのピリジンに溶解し、氷冷下、１Ｍヒドラジン１水和物含有ピリジン：酢酸（５：２（体積比））溶液２２．５ｍＬを加え、０℃で３０分間攪拌し、構造式（７’）で表される化合物の消失が確認できるまで、１５分間毎に、１Ｍヒドラジン１水和物含有ピリジン：酢酸（５：２（体積比））溶液７．５ｍＬを加えた。氷冷下、アセトン３７．５ｍＬを加え０℃で１０分間攪拌した後ジクロロメタンで希釈し水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。得られた残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン：エタノール＝９４：６→９：１（体積比））にて精製し、構造式（７）で表される化合物  １５．１ｇ（７３％）を得た。
【００７５】
＜構造式（２）で表される核酸自動合成用アミダイドの合成＞
構造式（７）で表される化合物１５．１０ｇ（１０．９３ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル、脱水ジクロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を４０ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下、ジメチルアミノピリジン６６ｍｇ（５．４５ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン２．２８ｍＬ（１３．１１ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト２．６８ｍＬ（１２．０２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン１１ｍＬ希釈溶液を加えた。混合溶液を４℃で一晩攪拌した。続いてメタノール２．２ｍＬを加え３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を（２％ピリジン含有ジクロロメタン−ヘキサン（２：１（体積比））：２％ピリジン含有ジクロロメタン＝０：１００→１００：０、続けて２％ピリジン含有ジクロロメタン：２％ピリジン、２０％エタノール、及び２％ピリジン含有ジクロロメタン＝１：０→３：１（体積比））にて精製し、構造式（２）で表される核酸自動合成用アミダイド１１．０６ｇ（６２％）を得た。
【００７６】
＜各化合物の構造確認＞
前記各化合物（構造式（１）〜（７）で表される化合物）の構造確認を以下のようにして行った。結果を図１〜図１２に示す。
【００７７】
−１Ｈ−ＮＭＲ−
各サンプル約５ｍｇを重ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、３００．４ＭＨｚにおいて重ジメチルスルホキシドで、１８℃〜２０℃にて測定した。内部標準は、残留プロトンジメチルスルホキシドピークを基準とした。
【００７８】
−３１Ｐ−ＮＭＲ−
各サンプル約５ｍｇを重ジメチルスルホキシドに溶解した。リン３１核磁気共鳴スペクトルとして、１２１．５ＭＨｚにおいて重ジメチルスルホキシドで、２０℃にて測定した。外部標準は、トリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）を用い、−６．２ｐｐｍを基準とし、ＢＣＭにて測定を行った。
【００７９】
−ＨＨｃｏｓｙ−
各サンプル約５ｍｇを重ジメチルスルホキシドに溶解した。ＨＨｃｏｓｙスペクトルとして、３００．４ＭＨｚにおいて重ジメチルスルホキシドで、２０℃にて測定した。内部標準は、重ジメチルスルホキシドピークを基準とした。
【００８０】
（実施例２：構造式（１）で表される核酸自動合成用アミダイドの脱保護の確認）
実施例１で合成した核酸自動合成用アミダイド（構造式（１）で表される核酸自動合成用アミダイド）が、緩やかな条件下で脱保護可能であることを以下のようにして確認した。
【００８１】
図１３に示すように、まず、実施例１で合成した、構造式（１）で表される核酸自動合成用アミダイドと同様のインドール基及び保護基を有する構造式（４）で表される化合物（構造式（１）で表される核酸自動合成用アミダイドの前駆体）１．２ｍＭを２０μＬ用いＨＰＬＣの測定を行った（ＨＰＬＣチャート１、図８）。
【００８２】
また、構造式（４）で表される化合物１．２ｍＭ、及び２０ｍＭ  ＤＢＵ含有ジメチルホルムアミド：アセトニトリル（１：９９（体積比））の混合溶液を室温で１５分間静置した。この反応混合物２０μＬ用いＨＰＬＣの測定を行った（ＨＰＬＣチャート２、図９）。
【００８３】
ＤＮＡ合成機として日本テクノサービス株式会社製のＨ−８−ＦＤＮＡ合成機を用い、０．２μｍｏｌのＳ−Ｓ結合固相レジン（グレンリサーチ株式会社製）に、Ｔアミダイド（グレンリサーチ株式会社製）、構造式（１）で表される核酸自動合成用アミダイドの順に反応させ合成した。この固相レジンに、２０ｍＭ  ＤＢＵ含有アセトニトリルの混合溶液５ｍＬを１時間かけて流したときの溶出溶液を２０μＬ用いＨＰＬＣの測定を行った（ＨＰＬＣチャート３、図１０）。
【００８４】
更に、前記ＤＮＡ合成機を用い、０．２μｍｏｌのＳ−Ｓ結合固相レジンに、Ｔアミダイド（グレンリサーチ株式会社製）、構造式（１）で表される核酸自動合成用アミダイドの順に反応させ合成した。この固相レジンを、前記同様に、２０μＭ  ＤＢＵ含有アセトニトリルの混合溶液で処理した後、アセトニトリルで洗浄し、１００ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）含有リン酸緩衝溶液（ｐＨ８．３）２５０μＬを１時間かけて流したときの溶出溶液を２０μＬ用いＨＰＬＣの測定を行った（ＨＰＬＣチャート４、図１１）。
【００８５】
ＨＰＬＣチャート３の混合溶液（構造式（１）で表される核酸自動合成用アミダイドのＤＢＵ処理サンプル）１１４μＬ及びＨＰＬＣチャート２の混合溶液（構造式（４）で表される化合物）５．７μＬをともにＨＰＬＣで測定したところ、これらは一致した（ＨＰＬＣチャート５、図１２）。
【００８６】
この結果より、構造式（１）で表される核酸自動合成用アミダイドを用いて核酸を合成する際に、アセトニトリル中でのＤＢＵ処理等の緩やかな条件下で脱保護を行うことにより、保護基が外され、インドール基含有核酸を得ることができることが確認された。
【００８７】
なお、実施例２におけるＨＰＬＣ分析条件は以下の通りである。
［ＨＰＬＣ分析条件］
流速：１ｍＬ／分間
Ａ溶液：１００ｍＭトリエチルアンモニウム酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）
Ｂ溶液：アセトニトリル〔Ｂ溶液：０％→４０％（０分間→３０分間）→１００％（３５分間）〕
【００８８】
（実施例３）
構造式（１）で表される核酸自動合成用アミダイドを、実施例１とは異なる保護基を用いて合成した。即ち、保護基としては、前記一般式（Ｉ）において、Ｒがフェニル基の化合物を用いた。
【００８９】
【化１６】
0005544833.tif 000017
【００９０】
＜構造式（２１）で表される化合物の合成＞
トリフォスゲン５．９４ｇ（２０．０ｍｍｏｌ）を１００ｍＬの脱水テトラヒドロフランに溶解した。本溶液を氷冷し２−（フェニルチオ）エタノール８．１０ｍＬ（６０．０ｍｍｏｌ）、ピリジン５．０９ｍＬ（６３．０ｍｍｏｌ）、及び４０ｍＬの脱水テトラヒドロフランの混合溶液を約３０分間かけて滴下した。室温で１５分間攪拌した後、再び氷冷し、イミダゾール４．０９ｇ（６０．０ｍｍｏｌ）及びピリジン５．０９ｍＬ（６３．０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分間攪拌した。この反応混合物にヘキサン１４０ｍＬを加え、攪拌した後にろ過し、濾物をテトラヒドロフラン：ヘキサン（１：１（体積比））で洗浄した。濾液及び洗浄液を減圧濃縮することにより構造式（２１）で表される化合物を得た。
【００９１】
３−インドール酢酸９．４７ｇ（５５．０ｍｍｏｌ）を１１０ｍＬの脱水ジメチルフォルムアミドに溶解し、６０重量％水素化ナトリウム−オイル混合物４．４０ｇ（１４１．６ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間攪拌した後、氷冷し、構造式（２１）で表される化合物の３０ｍＬ脱水ジメチルフォルムアミド溶液を滴下し５分間攪拌した後、室温で３０分間攪拌した。反応混合物に塩化アンモニム１０ｇを加え減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し水で洗浄した。酢酸エチル溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（１％酢酸一定、酢酸エチル：ヘキサン＝１：２→１：１（体積比））にて精製し、構造式（２２）で表される化合物１２．８０ｇ（３６．０３ｍｍｏｌ）を得た。
【００９２】
＜構造式（２３）で表される化合物の合成＞
構造式（２２）で表される化合物１１．３９ｇ（３２．０５ｍｍｏｌ）を８０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、氷冷下７０％  ｍ―クロロ過安息香酸、水混合物１６．２２ｇを加え、３０分間攪拌した。反応溶液を水で洗浄し、ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（２％酢酸一定、ジクロロメタン：酢酸エチル＝１：０→４：１（体積比））にて精製し、構造式（２３）で表される化合物１０．０７ｇ（２５．９８ｍｍｏｌ、８１％）を得た。
【００９３】
【化１７】
0005544833.tif 000018
【００９４】
＜構造式（２４）で表される化合物の合成＞
構造式（１０）で表される化合物１７．２６ｇ（２０．０ｍｍｏｌ）を４０ｍＬ脱水ジクロロメタンに溶解し、トリエチルシラン４．７９ｍｌ（３０．０ｍｍｏｌ）及びジアザビシクロウンデセエン４．４９ｍＬ（３０．０ｍｍｌ）を加え室温にて１０分間攪拌した後にトリエチルアミン塩酸塩４．９６ｇ（３６．０ｍｍｏｌ）を加え５分間以上攪拌し、溶液Ａを得た。
【００９５】
構造式（２３）で表される化合物７．７５ｇ（２０．０ｍｍｏｌ）を脱水ジメトキシエタンに溶解し減圧濃縮する操作を３回行った。残渣を６０ｍＬの脱水ジクロロメタンに懸濁し、ジイソプロピルエチルアミン４．０９ｍＬ（２３．４７ｍｍｏｌ）及びＯ−ベンゾトリアゾリル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート７．９７ｇ（２１．０ｍｍｏｌ）を加え室温にて３０分間攪拌した。本溶液を上記溶液Ａに加え室温にて３０分間攪拌した。反応溶液を水で洗浄し、ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（酢酸エチル：エタノール＝１９：１→９：１（体積比））にて精製し、構造式（２４）で表される化合物１３．２８ｇ（１３．１５ｍｍｏｌ、６６％）を得た。
【００９６】
＜構造式（２５）で表される化合物の合成＞
構造式（２４）で表される化合物１３．２８ｇ（１３．１５ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル、脱水ジクロロメタンに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を４０ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン８０ｍｇ（０．６６ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン２．６０ｍＬ（１５．７８ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト３．２６ｍＬ（１４．４７ｍｍｏｌ）の１３ｍＬ塩化メチレン溶液を５分間以上かけて滴下した。混合溶液を氷冷下５分間攪拌し、４℃で一晩静置した。続いてメタノール３．０ｍＬを加え３０分間攪拌した。反応溶液を水で洗浄し、ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（２％ピリジン含有酢酸エチル−ヘキサン（２：１（体積比））：２％ピリジン、及び７％エタノール含有酢酸エチル＝１：０→０：１（体積比））にて精製し、構造式（２５）で表される化合物４．８６ｇ（３０％）を得たが、少量の分解物と考えられる不純物の混入が認められ、ＤＮＡ合成機を用いた収率も９５％を超えなかった。
【００９７】
比較例１〜３において、下記一般式（２０１）〜（２０３）で表される保護基を用い、アミダイドの合成を試みた。
【化１８】
0005544833.tif 000019
【００９８】
（比較例１）
前記一般式（２０１）で表される保護基を用いて、以下のようにアミダイドの合成を行った。
【化１９】
0005544833.tif 000020
【００９９】
＜構造式（２６）で表される化合物の合成＞
３−インドール酢酸０．９６ｇ（５．５ｍｍｏｌ）を１１ｍＬの脱水ジメチルフォルムアミドに溶解し、６０重量％水素化ナトリウム−オイル混合物４４０ｍｇ（５．５ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間攪拌した後、氷冷し、ＦＭＯＣＯＳｕ  ２．０２ｇ（６ｍｍｏｌ）の３ｍＬ脱水ジメチルフォルムアミドの溶液を加え５分間攪拌した後、室温で３０分間攪拌した。反応混合物に塩化アンモニム１３．８ｇを加え減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し水で洗浄した。しかし酢酸エチル溶液に構造式（２６）で表される化合物と認められる生成物は存在せず、様々な混合物であった。
【０１００】
（比較例２）
前記一般式（２０２）で表される保護基を用いて、以下のようにアミダイドの合成を行った。
【化２０】
0005544833.tif 000021
【０１０１】
＜構造式（２７）で表される化合物の合成＞
ＦＭＯＣＯＳｕ  ３３．７４ｇ（１００ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのジクロロメタンに溶解し、氷冷下、２−（メチルアミノ）エタノール８．２５ｍＬ（１０５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて一晩攪拌した。反応溶液を水で洗浄し、ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１→１：０（体積比））にて精製し、構造式（２７）で表される化合物２８．７２ｇ（９７％）を得た。
【０１０２】
＜構造式（２９）で表される化合物の合成＞
トリフォスゲン５．９４ｇ（２０．０ｍｍｏｌ）を１００ｍＬの脱水テトラヒドロフランに溶解した。本溶液を氷冷し構造式（２７）で表される化合物１７．８４（６０．０ｍｍｏｌ）、ピリジン５．０９ｍＬ（６３．０ｍｍｏｌ）及び４０ｍＬの脱水テトラヒドロフランの混合溶液を約３０分間かけて滴下した。室温で１５分間攪拌した後、再び氷冷し、イミダゾール４．０９ｇ（６０．０ｍｍｏｌ）及びピリジン５．０９ｍＬ（６３．０ｍｍｏｌ）を加え室温にて３０分間攪拌した。反応混合物にヘキサン１４０ｍＬを加え攪拌した後にろ過し、濾物をテトラヒドロフラン：ヘキサン（１：１（体積比））で洗浄した。濾液及び洗浄液を減圧濃縮することにより構造式（２８）で表される化合物を得た。
【０１０３】
３−インドール酢酸９．４７ｇ（５５．０ｍｍｏｌ）を１１０ｍＬの脱水ジメチルフォルムアミドに溶解し、６０重量％水素化ナトリウム−オイル混合物４．４０ｇ（１４１．６ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間攪拌した後、氷冷し、構造式（２８）で表される化合物の３０ｍＬ脱水ジメチルフォルムアミド溶液を滴下し５分間攪拌した後、室温で３０分間攪拌した。反応混合物に塩化アンモニム１０ｇを加え減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し水で洗浄した。酢酸エチル溶液を減圧濃縮した。しかし酢酸エチル溶液に構造式（２９）で表される化合物と考えられる生成物は存在せず、様々な混合物であった。
【０１０４】
（比較例３）
前記一般式（２０３）で表される保護基を用いて、以下のようにアミダイドの合成を行った。
【化２１】
0005544833.tif 000022
【０１０５】
＜構造式（３０）で表される化合物の合成＞
トリフォスゲン５．９４ｇ（２０．０ｍｍｏｌ）を１００ｍＬの脱水テトラヒドロフランに溶解した。本溶液を氷冷し２−（フェニルチオ）エタノール８．１０ｍＬ（６０．０ｍｍｏｌ）、ピリジン５．０９ｍＬ（６３．０ｍｍｏｌ）及び４０ｍＬの脱水テトラヒドロフランの混合溶液を約３０分間かけて滴下した。室温で１５分間攪拌した後、再び氷冷し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド７．２５ｇ（６３．０ｍｍｏｌ）及びピリジン５．０９ｍＬ（６３．０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン３０ｍＬを加え室温にて３０分間攪拌した。反応混合物にヘキサン１４０ｍＬを加え攪拌した後にろ過し、濾物をテトラヒドロフラン−ヘキサン（１：１（体積比））で洗浄した。濾液及び洗浄液を減圧濃縮した。残渣を５０ｍＬのジクロロメタンに溶解し氷冷下、２−（メチルアミノ）エタノール５．２８ｍＬ（６６．０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間攪拌した。反応溶液を水で洗浄し、ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１→１：０（体積比））にて精製し、構造式（３０）で表される化合物１４．１９ｇ（９３％）を得た。
【０１０６】
＜構造式（３１）で表される化合物の合成＞
トリフォスゲン５．５０ｇ（１８．５２ｍｍｏｌ）を９３ｍＬの脱水テトラヒドロフランに溶解した。本溶液を氷冷し構造式（３０）で表される化合物１４．１９ｇ（５５．６ｍｍｏｌ）、ピリジン４．７１ｍＬ（５８．３ｍｏｌ）及び３７ｍＬの脱水テトラヒドロフランの混合溶液を約３０分間かけて滴下した。室温で１５分間攪拌した後、再び氷冷し、イミダゾール３．７９ｇ（５５．６ｍｍｏｌ）及びピリジン４．７１ｍＬ（５８．３ｍｍｏｌ）を加え室温にて３０分間攪拌した。反応混合物にヘキサン１２０ｍＬを加え攪拌した後にろ過し、濾物をテトラヒドロフラン：ヘキサン（１：１（体積比））で洗浄した。濾液及び洗浄液を減圧濃縮することにより構造式（３１）で表される化合物を得た。
【０１０７】
３−インドール酢酸８．７８ｇ（５１．０ｍｍｏｌ）を１００ｍＬの脱水ジメチルフォルムアミドに溶解し、６０重量％水素化ナトリウム−オイル混合物４．０８ｇ（１３１ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間攪拌した後、氷冷し、構造式（３１）で表される化合物の３０ｍＬ脱水ジメチルフォルムアミド溶液を滴下し５分間攪拌した後、室温で３０分間攪拌した。反応混合物に塩化アンモニム１０ｇを加え減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し水で洗浄した。酢酸エチル溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（１％酢酸一定、酢酸エチル：ヘキサン＝１：２→２：１（体積比））にて精製し、構造式（３２）で表される化合物１４．０３ｇ（３０．７ｍｍｏｌ）を得た。
【０１０８】
＜構造式（３３）で表される化合物の合成＞
構造式（３２）で表される化合物１０．６６ｇ（２３．３４ｍｍｏｌ）を６０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、氷冷下７０％  ｍ―クロロ過安息香酸、水混合物１１．８２ｇを加え、３０分間攪拌した。不溶物を濾過した後、反応溶液を水で洗浄し、ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（２％酢酸一定、ジクロロメタン：酢酸エチル＝１：０→２：１（体積比））にて精製し、構造式（３３）  ９．９８ｇ（２０．４２ｍｍｏｌ、８７％）を得た。
【０１０９】
＜構造式（３３）の脱保護検討＞
構造式（３３）をジメチルフォルムアミドに溶解し  １．２ｍＭ、及び２０ｍＭ  ＤＢＵ含有１％ジメチルフォルムアミド−アセトニトリル溶液を室温にて１５分間静置したが、構造式（３３）は、かなり残存し、若干量の３−インドール酢酸が生成することをＴＬＣより確認でき、本条件下で、保護基を完全に除くことが困難であることが分かった。
【０１１０】
以上の実施例１〜３を含む実施形態に関し、更に以下の付記を開示する。
（付記１）  スルホニルエチルカーバメト基を有し、下記一般式（Ｉ）で表されるインドール基の保護基であって、非プロトン性溶媒中で脱保護可能であることを特徴とするインドール基用保護基。
【化２２】
0005544833.tif 000023
ただし、前記一般式（Ｉ）において、Ｒは、水素原子、アルキル基、フェニル基、及びアルコキシフェニル基のいずれかを表す。
（付記２）  非プロトン性溶媒が、アセトニトリル、ジクロロメタン、ＤＭＦ、及びＮ−メチルピロリドンからなる群より選択される少なくともいずれかである付記１に記載のインドール基用保護基。
（付記３）  嵩高い塩基により１５分間以内に脱保護可能である付記１から２のいずれかに記載のインドール基用保護基。
（付記４）  嵩高い塩基が、Ｌｅｗｉｓ則に従う塩基である付記３に記載のインドール基用保護基。
（付記５）  嵩高い塩基が、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］−５−ノネン、及びテトラメチルグアニジンからなる群より選択される少なくともいずれかである付記３から４のいずれかに記載のインドール基用保護基。
（付記６）  １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン  ０．０１Ｍ以下の濃度で脱保護可能である付記５に記載のインドール基用保護基。
（付記７）  スルホニルエチルカーバメト基が、チオエチルカーバメート基の形で導入された後、該チオエチルカーバメート基が酸化されることにより合成される付記１から６のいずれかに記載のインドール基用保護基。
（付記８）  非プロトン性溶媒中で脱保護可能な保護基により保護されたインドール基を有し、かつ下記一般式（ＩＩ）、下記一般式（ＩＩＩ）、及び一般式（ＩＶ）の少なくともいずれかで表されることを特徴とする核酸自動合成用アミダイド。
【化２３】
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【化２４】
0005544833.tif 000025
【化２５】
0005544833.tif 000026
ただし、前記一般式（ＩＩ）及び前記一般式（ＩＩＩ）において、Ｘは、核酸塩基を表し、Ｙは、前記インドール基を表し、Ｚは、前記インドール基を保護するための保護基を表し、Ｚ’は、前記核酸塩基を保護するための保護基を表し、Ｑは、水素原子及び水酸基のいずれかを表し、ｎ及びｍは、０及び１のいずれかの整数を表す。前記核酸塩基は、任意の置換基を有していてもよい。
前記一般式（ＩＶ）において、Ｘは、核酸塩基を表し、Ｙは、前記インドール基を表し、Ｚは、前記インドール基を保護するための保護基を表し、Ｚ’は、前記核酸塩基を保護するための保護基を表し、Ｑは、水素原子及び水酸基のいずれかを表し、ｎは、０及び１のいずれかの整数を表す。前記核酸塩基は、任意の置換基を有していてもよい。
（付記９）  一般式（ＩＩ）、一般式（ＩＩＩ）、及び一般式（ＩＶ）において、インドール基Ｙを保護するための保護基Ｚが、付記１から７のいずれかに記載のインドール基用保護基である付記８に記載の核酸自動合成用アミダイド。
（付記１０）  一般式（ＩＩ）、一般式（ＩＩＩ）、及び一般式（ＩＶ）において、Ｘで表される核酸塩基が、アデニン、グアニン、及びシトシンのいずれかである付記８から９のいずれかに記載の核酸自動合成用アミダイド。
（付記１１）  リン酸基に、シアノエチル基及びその誘導体、フルオレニルメチル基及びその誘導体、フェネチル基及びその誘導体、並びに、ニトロエチル基及びその誘導体からなる群より選択されるいずれかである保護基を更に有する付記８から１０のいずれかに記載の核酸合成用アミダイド。
（付記１２）  下記構造式（１）及び下記構造式（２）の少なくともいずれかで表される付記８から１１のいずれかに記載の核酸自動合成用アミダイド。
【化２６】
0005544833.tif 000027
【化２７】
0005544833.tif 000028
（付記１３）  付記８から１２のいずれかに記載の核酸自動合成用アミダイドの前駆体であり、下記構造式（３）から（７）のいずれかで表されることを特徴とする核酸自動合成用アミダイド用前駆体。
【化２８】
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【化２９】
0005544833.tif 000030
【化３０】
0005544833.tif 000031
【化３１】
0005544833.tif 000032
【化３２】
0005544833.tif 000033
（付記１４）  付記８から１２のいずれかに記載の核酸自動合成用アミダイドを用いることを特徴とする核酸合成方法。
（付記１５）  核酸自動合成用アミダイドと、ヌクレオシド化合物とが縮合反応することにより行われる付記１４に記載の核酸合成方法。
（付記１６）  縮合反応の後、非プロトン性溶媒中で核酸自動合成用アミダイドの保護基の脱保護が行われる付記１５に記載の核酸合成方法。
（付記１７）  非プロトン性溶媒が、アセトニトリル、ジクロロメタン、ＤＭＦ、及びＮ−メチルピロリドンからなる群より選択される少なくともいずれかである付記１４から１６のいずれかに記載の核酸合成方法。
（付記１８）  嵩高い塩基により１５分間以内に脱保護可能である付記１４から１７のいずれかに記載の核酸合成方法。
（付記１９）  嵩高い塩基が、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］−５−ノネン、及びテトラメチルグアニジンからなる群より選択される少なくともいずれかである付記１８に記載の核酸合成方法。
（付記２０）  付記１４から１９のいずれかに記載の核酸合成方法により得られることを特徴とする核酸。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明のインドール基用保護基、並びに核酸自動合成用アミダイド、及び核酸合成方法によれば、緩やかな条件下での脱保護が可能であり、インドール基を含有する本発明の核酸を効率的に得ることができる。得られた本発明の核酸は、前記インドール基を介して蛋白質等の標的物質との結合が可能であり、したがって、前記核酸は、例えば、蛋白質等の標的物質の解析に、好適に利用可能である。
【図１】
0005544833.tif 000035
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
0005544833.tif 000040
【図６】
0005544833.tif 000041
【図７−１】
0005544833.tif 000042
【図７−２】
0005544833.tif 000043
【図７−３】
0005544833.tif 000044
【図８】
0005544833.tif 000045
【図９】
0005544833.tif 000046
【図１０】
0005544833.tif 000047
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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