(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒ型のピオシン尾部繊維タンパク質由来の基板結合領域（ＢＰＡＲ）、及び異種受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）をコードする核酸分子であって、ここで、該ＢＰＡＲは配列番号１、３、４、７、又は９のＲ型のピオシン尾部繊維タンパク質のＮ末端部のアミノ酸１〜１６４を含み、該ＲＢＤは、別のバクテリオシン、又はバクテリオファージ若しくはプロファージの尾部繊維に由来する核酸分子。
【請求項２】
前記ＲＢＤが、尾部繊維タンパク質の天然に存在するＲＢＤと比較して、１個のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ＲＢＤが、該タンパク質の、Ｃ末端を含む、長さで３４７〜７５５個のアミノ酸を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
発現されたＲＢＤが、細菌細胞表面の毒性因子又は適応性因子（ｆｉｔｎｅｓｓ  ｆａｃｔｏｒ）と結合する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子によってトランスフェクトされたか、若しくは形質転換されたか、又はその核酸分子を含有し、Ｒ型のｈｍｗバクテリオシンの作製に必要とされる他のタンパク質をコードする核酸分子をさらに含む、細菌細胞。
【請求項６】
前記バクテリオシンの内在性尾部繊維タンパク質をコードする配列が、不活化又は欠失される、請求項５に記載の細菌細胞。
【請求項７】
Ｒ型のｈｍｗバクテリオシンをインビトロにおいて作製する方法であって、該方法が、請求項５又は６に記載の細菌細胞を、前記バクテリオシンが産生される結果となる条件下、インビトロで培養する工程を含む、方法。
【請求項８】
対象内の標的の細菌細胞の細胞質膜の完全性に損傷を与える方法に使用するための、請求項５又は６に記載の細菌細胞。
【請求項９】
前記ＢＰＡＲが、配列番号１、３、５、７、又は９のアミノ酸１〜１６９、１〜１７２又は１〜２４０を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記ＲＢＤが、ファージのＰ２、Ｌ−４１３ｃ、ＰＳ１７、ＢＰＰ−１、ＣＴＸ、ＶＨＭＬファージ、又はＴ−７スーパーグループ由来である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記ＲＢＤの同族シャペロンをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記シャペロンが、ファージＰ２（配列番号２５）、Ｌ４１３ｃ（配列番号２８）、ＰＳ１７（配列番号１９）又はＶＨＭＬ（配列番号２２）のＢＲＤについて、それぞれ配列番号２６、２９、２０又は２３である、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記ＲＢＤが、配列番号２５のアミノ酸１５８〜６６９若しくはアミノ酸３２２〜６６９；又は配列番号２８のアミノ酸１５８〜９１３を含む、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１４】
請求項１〜４及び９〜１３のいずれか１項に記載の核酸分子によってコードされる尾部繊維タンパク質を含むｈｍｗバクテリオシン。
【請求項１５】
請求項１４に記載のバクテリオシン、及び薬理学的に許容される担体又は賦形剤を含む、抗細菌組成物。
【請求項１６】
対象の中の細菌細胞の細胞質膜の完全性に損傷を与える方法において使用するための、請求項１４に記載のバクテリオシン。
【請求項１７】
細菌細胞の細胞質膜の完全性に損傷を与えるインビトロにおける方法であって、インビトロにおいて該細菌細胞を請求項１４に記載のバクテリオシンと接触させる工程を含む、方法。
【請求項１８】
有毒祖先細菌から無毒性又は非適応性細菌の子孫を形成する方法であって、該方法が、有毒細菌を請求項１４に記載のバクテリオシンと接触させる工程であって、ここで、該バクテリオシンが、前記有毒祖先細菌の毒性因子又は適応性因子と結合する、工程と、毒性因子をもはや発現しない前記無毒性細菌の子孫を選別する工程と、を含む方法。
【請求項１９】
Ｒ型のピオシン尾部繊維タンパク質由来の基板結合領域（ＢＰＡＲ）、及び異種受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む尾部タンパク質であって、ここで、該ＢＰＡＲは配列番号１、３、４、７、又は９のＲ型のピオシン尾部繊維タンパク質のＮ末端部のアミノ酸１〜１６４を含み、該ＲＢＤは、別のバクテリオシン、又はバクテリオファージ若しくはプロファージの尾部繊維に由来する尾部タンパク質。
【請求項２０】
前記ＢＰＡＲが、配列番号１、３、５、７、または９のアミノ酸１〜１６９、１〜１７２又は１〜２４０を含む、請求項１９に記載のタンパク質。
【請求項２１】
前記ＲＢＤが、ファージのＰ２、Ｌ−４１３ｃ、ＰＳ１７、ＢＰＰ−１、ＣＴＸ、ＶＨＭＬファージ、又はＴ−７スーパーグループ由来である、請求項１９に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００６年５月１５日に出願された、米国特許仮出願第６０／７４７，２９９号と関連しており、これは、その全体が記載されているかのごとく、参照することで組み入れられる。
【０００２】
開示の分野
本開示は、シュードモナスエルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＲ型ピオシンなどの天然の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンの改変された形態を開示する。バクテリオシンは、細菌表面上などの同族結合パートナー（ｃｏｇｎａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐａｒｔｎｅｒ）又は受容体に対しての結合特異性及び親和性をつかさどる領域中の尾部繊維の端部が改変される。毒性因子又は適応性因子（ｆｉｔｎｅｓｓ  ｆａｃｔｏｒ）を含む、細菌表面上の受容体と結合させるなど、改変バクテリオシンの使用方法も開示する。
【背景技術】
【０００３】
開示の背景
現在、細菌性疾患よりも、ウイルス性病原体による脅威に対して世界的に遥かに大きな注目が集まっている。しかし、抗生物質耐性の細菌の蔓延により、病院及びその他の医療施設において、患者の治療が混乱し、抑え込みに費用がかさむという状態が続いている。同時に、慢性疾患に対する薬物及び生活習慣の改善を優先することにより、抗生物質の開発からの撤退が見られる。最近の２０年の間に米国市場に投入された新しい種類の抗生物質はわずかに２種類であった（オキサゾリジン及びリポペプチド）（Ｗｅｎｚｅｌ，２００４）。
【０００４】
米国内だけで、病院での細菌感染のケースは年間２００万件を超えている。そのうち、死亡するのはおよそ９万人である。最も警戒すべき統計は、これらの原因である細菌の７０％超が、少なくとも１種類の抗菌剤に耐性を有するということである（Ｂａｄ  Ｂｕｇｓ，Ｎｏ  Ｄｒｕｇｓ，２００４）。この数値は、警戒すべき割合で増加を続けている。このような抗生物質耐性の院内感染が米国経済におよぼす年間のコストは、５０億ドルを超えている。このような恐ろしい地球規模の状況という現実により、抗菌剤の開発及び使用に対する新しい取り組みを進めざるを得なくなるであろう（Ｔａｌｂｏｔ  ｅｔａｌ．，２００６）。ヒト及び動物の医療において抗生物質の大規模な使用（及び乱用）が盛んに行われた所では、かつては「特効薬」であった多くの抗生物質が今や臨床的な効果が無いというところまで抗生物質に耐性を示す細菌性病原体の出現もまた盛んとなってきた（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｈｒｅａｔｓ  ｔｏ  Ｈｅａｌｔｈ，２００３）。
【０００５】
一つの例として、シュードモナスエルジノーサは、植物及び動物に対するどこにでもいる病原体であり、複数の抗菌剤に対する耐性の発生率が急速に上昇している（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｈｒｅａｔｓ  ｔｏ  Ｈｅａｌｔｈ，２００３；Ｂａｄ  Ｂｕｇｓ，Ｎｏ  Ｄｒｕｇｓ，２００４）。シュードモナスエルジノーサは、好気性、運動性、グラム陰性の桿菌である。シュードモナスエルジノーサは、通常、土壌、水、及び植物中に生息する。これは、健康体の人間に疾患を発症させることはほとんどないものの、全院内感染の約１０％を占める日和見病原体である（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｒｅｐｏｒｔ‐Ｄａｔａ  Ｓｕｍｍａｒｙ  ｆｒｏｍ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９８６‐Ａｐｒｉｌ  １９９６）。シュードモナスエルジノーサは、嚢胞性線維症（ＣＦ）の患者を襲う最も一般的な病原体であって、その検体培養の６１％が陽性を示し（Ｇｏｖａｎ，Ｊ．Ｒ．Ｗ．ａｎｄ  Ｖ．Ｄｅｒｅｔｉｃ，１９９６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，６０（３）：５３０‐５７４）、並びに、集中治療ユニットで見られる２種類の最も一般的な病原体の一つでもある（Ｊａｒｖｉｓ，Ｗ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，２９（ａ  ｓｕｐｐ．）：１９‐２４）。
【０００６】
あるシュードモナスエルジノーサの感染による死亡率は５０％の高さまでの可能性がある。現在、シュードモナスエルジノーサの感染は、抗生物質、特には、薬物の組み合わせにより、依然として効果的に制御することができている。しかし、一般的な抗生物質のいくつかに対する耐性が見られており、それは、特に、集中治療ユニットにおいて問題である（Ａｒｃｈｉｂａｌｄ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓ．，２４（２）：２１１‐２１５；Ｆｉｓｈ，Ｄ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，１５（３）：２７９‐２９１）。さらに、シュードモナスエルジノーサは、複数の抗生物質耐性遺伝子を有するプラスミドを取り込むメカニズムをすでに示しており（Ｊａｋｏｂｙ，Ｇ．Ａ．（１９８６），Ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｖｏｌ．Ｘ，Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，ｐｐ．２６５‐２９４，Ｊ．Ｒ．Ｓｏｋａｃｈ（ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、そして、現時点でシュードモナスの感染に対する認定されたワクチンは存在しない。
【０００７】
他の多くの細菌種と同様に、シュードモナスエルジノーサの株の変異性は非常に顕著である。変異性は多くの異なるメカニズムで発生することが示されており、メカニズムとしては、これらに限定されないが、プロファージの細菌ゲノムへの組み込み（Ｚｉｅｒｄｔ，Ｃ．Ｈ．ａｎｄ  Ｐ．Ｊ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，１９６４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８７：１００３‐１０１０）、バクテリオファージからのサイトトキシン遺伝子の付加（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２２：２３９‐２４４）、及びトランスポゾン経由（Ｓｉｎｃｌａｉｒ，Ｍ．Ｉ．ａｎｄ  Ｂ．Ｗ．Ｈｏｌｌｏｗａｙ，１９８２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５１：５６９‐５７９）などが挙げられる。このような形での多様性により、新たな病原性のメカニズムがシュードモナスエルジノーサへ組み込まれてきた。ＣＦでよく見られるムコイド表現型への転換など、これらの、及びその他のトランジションは、警戒を続ける必要があることを明らかに示している。
【０００８】
これらの問題点が、薬物耐性の菌株の適切な同定及び毒性の根絶を目的とした診断ツール及び治療方法の必要性を指し示している。
【０００９】
多くの細菌は、増殖の過程で、殺菌性の物質であるバクテリオシンを産生する。バクテリオシンは、ポリペプチドから成り、様々な分子量を有する。バクテリオシンは、その抗菌性のために使用されてきたが、中には、多くの臨床的に使用される抗生物質よりも殺菌性の範囲が限られたものがある。例えば、感応性のある、又は感受性の高い生物の受容体部位に結合することで、同一の、又は極めて関連性の高い種に属する細菌を認識し、従ってそれにのみ作用するバクテリオシンが報告されている。
【００１０】
バクテリオシンは、大きく分けて、３種類に分類される。第一の種類は、熱安定性である小さな分子である。この第一の種類の例としては、コリシンＶ（ここで、コリシンは、大腸菌型に特異的である）が挙げられる。第二の種類は、シュードモナスエルジノーサによって産生されるＳ型ピオシンで、分子量がより大きなタンパク質分子である。第三の種類は、遺伝学的にも形態学的にもバクテリオファージの尾部と類似しているバクテリオシンが含まれる。最後の種類の例としては、シュードモナスエルジノーサのＦ型及びＲ型ピオシン、並びにエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）のエンテロコリチシン（ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃｉｎ）が挙げられる。これらのピオシンは、祖先バクテリオファージ（ａｎｃｅｓｔｒａｌ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）由来のものであると報告されており、各々、ラムダファージファミリー、及びＰ２ファージファミリーとの類似性を有する。
【００１１】
Ｒ型ピオシンは、ミオウイルス（ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのバクテリオファージの非柔軟性で収縮性の尾部と類似しており、シュードモナスゲノムの単一の遺伝子クラスター内でコードされる（Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）。図１を参照のこと。標的の細菌と特異的に結合した後、これらのピオシンは、細菌細胞中にポアを形成し、その細胞質膜の完全性に損傷を与え、膜脱分極を起こす。Ｆ型ピオシンもバクテリオファージの尾部と類似しているが、こちらは、柔軟性があり非収縮性の棒状構造を有する。ピオシンは、大部分のシュードモナスエルジノーサによって産生され、２種類以上のピオシンを合成する菌株もある。
【００１２】
Ｒ型ピオシンは、ある種のシュードモナスエルジノーサ菌株によって産生される複雑で高分子量のバクテリオシンであり、特定の他のシュードモナスエルジノーサ菌株に対する殺菌作用を有する（レビューは、Ｍｉｃｈｅｌ‐Ｂｒｉａｎｄ  ａｎｄ  Ｂａｙｓｓｅ，２００２、を参照）。現在まで、５種類のＲ型ピオシンが識別されており、それらの標的範囲に基づいて（下記参照）、Ｒ１からＲ５と称する。菌株ＰＡＯ１は、Ｒ２ピオシンを産生し、これは、１６個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から成る遺伝子クラスター内でコードされ、そのうちの１２個は、バクテリオファージＰ２、ＰＳ１７、ΦＣＴＸ、及びその他のＰ２様ファージのＯＲＦと、高い配列類似性を示す（Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ピオシンの産生は、ＤＮＡ損傷によって誘発され（Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、クラスターの正の転写制御因子（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）であるＰｒｔＮの抑制因子であるＰｒｔＲを分解するＲｅｃＡによって制御される。ピオシン遺伝子の誘発により、細菌細胞１個あたりおよそ２００個のピオシン粒子が合成される結果となり、続いてバクテリオファージ溶解と類似のメカニズムにより細胞が溶解する。ピオシンは、まずその尾部繊維でリポ多糖（ＬＰＳ）と結合し、それに続く鞘部の収縮、並びに細菌の外膜、細胞壁、及び細胞質膜を通してのコアの侵入により、素早くそして特異的に、標的細胞を死滅させる。この侵入により、細胞質膜の完全性が損なわれ、膜電位の脱分極が起こる（Ｕｒａｔａｎｉ  ａｎｄ  Ｈｏｓｈｉｎｏ，１９８４）。多くの観点から、ピオシンは、適合された尾部器官のみから成る、すなわち、カプシドもＤＮＡも含まない、耐プロテアーゼ性及び耐酸性であり非伝染性の抗菌性粒子を産生するためにホストが適合させた欠陥プロファージとみなすことができる。ピオシン遺伝子の複製には、それが包埋された細菌ゲノムの複製が必要である。
【００１３】
５種類の異なるピオシンの受容体特異性は、互いに直線的な関係を持ち、２種類のブランチ（ｂｒａｎｃｈ）を有する（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ，１９７０；Ｍｅａｄｏｗ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，１９７８；Ｋａｇｅｙａｍａ，１９７５）。Ｒ５ピオシンが最も広い範囲を有し、他の４種類の特異性を含む。他の４種類のＲ型の受容体は、Ｒ５から分岐する２種類のブランチ、又は特異性のファミリーを形成する。一つ目のブランチは、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ２に対する受容体を含み、この順で、細胞表面から最も遠位の受容体に特異性を示すのがＲ３ピオシンである。二つ目のブランチは、Ｒ１受容体を含み、これは、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４に対する受容体とは無関係の特異性決定因子を有すると思われる。Ｒ１乃至Ｒ４ピオシンのいずれかに感受性を有するシュードモナスエルジノーサの菌株はすべてＲ５にも感受性を有するが、Ｒ５ピオシンにのみ感受性を有する菌株もあることから、この２種類のブランチは、Ｒ５に対する受容体に属していると考えられる。シュードモナスエルジノーサの菌株には、天然に存在する５種類のＲ型ピオシンすべてに対する耐性を有するものもある。
【００１４】
シュードモナスエルジノーサのピオシンは、主にシュードモナスエルジノーサの菌株を特異的に死滅させるが、ヘモフィリウス（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、及びカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種のある種類の菌株を死滅させることも示されている（Ｆｉｌｉａｔｒａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｍｏｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６；Ｍｏｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，１９８２）。
【００１５】
Ｒ型ピオシンの特異性は、ｐｒｆ１５によってコードされるその尾部繊維によって付与される。ＰＲＦ１５は、ミオウイルスファミリーのファージの、特にＰ２様ファージの尾部繊維と極めて高い関連性を持つ（Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。このような尾部繊維は、図１に示すように、基板構造上に対称に配置されたホモ三量体で、粒子１個あたり６個の複製を有する。尾部繊維のＮ末端領域が基板と結合し、Ｃ末端部分の、恐らくは先端近辺が細菌受容体と結合し、それによって死滅の特異性が付与される。ｐｒｆ１６（Ｒ型ピオシンの場合）によってコードされる同族のシャペロンは、ｐｒｆ１５のすぐ下流に位置し、尾部繊維の適切な折り畳み、及び／又はピオシン構造上での尾部繊維の構築に必要である。Ｒ型ピオシン粒子は、免疫化学的、及び遺伝学的には、特定のシュードモナスエルジノーサのバクテリオファージの尾部に類似していると説明されている（Ｋａｇｅｙａｍａ  １９７５，Ｋａｇｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．１９７９，Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，及びＳｈｉｎｏｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．１９８３ｂ）。Ｒ型ピオシンと、ＰＳ‐１７及びΦＣＴＸなどのシュードモナスバクテリオファージとは、共通の祖先溶原バクテリオファージを通した関連性を有しており、そこから、頭部タンパク質及び複製機能をコードする遺伝子が欠損し、残ったファージ遺伝子が、防御的なＲ型ピオシンの成分としての機能を示すために適応したものである、という提案が成されている（Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）。
【００１６】
類似の高分子量Ｒ型バクテリオシンが、エルシニアエンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）（Ｓｔｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、リステリアモノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（Ｚｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ，１９９５）、スタフィロコッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  ＆  Ｐａｔｔｅｅ，１９８１）、及びエルビニアアミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）（Ｊａｂｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を含むその他の細菌について報告されている。バクテリオシンの分類と命名法は、特に、その由来、化学、及び作用に関する証拠が増加していくことにより、時間とともに変わってきている。通常、バクテリオシンの命名はそれを産生する種に基づいている。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、コリシンと称するバクテリオシンを産生し；シュードモナスエルジノーサはピオシンを産生し；リステリアモノサイトゲネスはモノシン（ｍｏｎｏｃｉｎ）を産生し；エルシニアエンテロコリチカはエンテロコリチシンを産生する；などである。歴史上、分類は約２０種類のコリシンの識別から始まり、これらはＡ‐Ｖと分類された。ほとんどの場合、各々のバクテリオシンは、同一又は分類学的に関連する生物の種に対して特異的に作用すると思われる。ピオシンを産生する菌株は、通常、自身のピオシンに対する耐性を有する。バクテリオシンの濃縮に関する一般的なアッセイについては、米国特許４，１４２，９３９、に記載されている。
【００１７】
上記の文献の引用は、前述の事項のいずいれについてもそれが関連する先行技術であると承認することを意図するものではない。日付の表記及びこれらの文献の内容に関する説明は、出願者が入手可能な情報に基づいており、日付及びこれらの文献の内容の正確性に関していかなる承認をも構成するものではない。
【発明の開示】
【００１８】
開示の概要
本開示は、バクテリオファージの尾部と類似の、しかしそれとは異なる、バクテリオシンの種類の遺伝子操作された形態に関する。このようなバクテリオシンとしては、Ｒ型ピオシン、尾状の（ｔａｉｌ−ｌｉｋｅ）バクテリオシン、Ｒ型バクテリオシン、又はその他のバクテリオファージの尾構造と関連する高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンが挙げられる。引用を簡便にするために、本明細書では、「ｈｍｗバクテリオシン」という用語を、Ｒ型バクテリオシン、Ｆ型及びＲ型ピオシン、モノシン、エンテロコリチシン、並びにメニンゴシン（ｍｅｎｉｎｇｏｃｉｎ）を含むがこれらに限定されない、本開示のバクテリオシンを意味するものとして用いる。
【００１９】
天然のＨＭＷバクテリオシンは、通常、熱不安定性であり、トリプシン耐性であり、ＳＯＳシステムを活性化させる薬剤によって誘発される。例えば、シュードモナス種、リゾビウムルピン（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｕｐｉｎ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、エルシニア種、及びフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種といった腸内細菌の多くでも識別されている。
【００２０】
遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、多くの異なるポリペプチドサブユニットの複数の複製から成り、尾部繊維タンパク質で形成された１若しくは２個以上の尾部繊維を有する。各尾部繊維は、受容体との結合又は相互作用により結合対を形成する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を有する。ＲＢＤは、細菌結合特性を有する尾部繊維の一部であり、そのため結合対の第一の構成部分となる。本明細書で開示するＲＢＤは、改変された尾部繊維を形成する尾部繊維中のタンパク質の改変部を含む。他のポリペプチドサブユニットを有する改変された尾部繊維は、遺伝子操作された（又は、改変された）ｈｍｗバクテリオシンを形成する。ＲＢＤが結合する受容体は、結合対の第二の構成部分であり、これは、尾部繊維が改変されていないバクテリオシンに対する受容体と同じであっても異なっていてもよい。本開示のある態様では、結合対の第二の構成部分は、病原性細菌の毒性因子又は適応性因子である。他の態様では、第二の構成部分は、細胞膜などの細菌細胞の最外層の成分、又は、グラム陽性細菌の場合は、細胞壁成分である。
【００２１】
改変された尾部繊維を持たないｈｍｗバクテリオシンと比べると、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、受容体との相互作用において、その数、方法、及び結合力が異なったものとなり得る。従って、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、改変のないバクテリオシンと比べて、異なる、又は追加的な結合特性（例：結合特異性、親和性、及び／又はアビディティー）を持ち得る。遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、天然分子ではないが、天然分子を改変した形であってよい。別の選択肢として、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、別の非天然のバクテリオシンを改変した形であってもよい。ほとんどの態様において、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、バクテリオシンによって結合される受容体を発現する細菌細胞にとって、致命的な薬剤であることに変わりはない。
【００２２】
第一の局面では、本開示は、改変されたＲＢＤを持つ尾部繊維タンパク質を有するｈｍｗバクテリオシンを含む。ｈｍｗバクテリオシンの限定されない例としては、Ｆ型及びＲ型ピオシンが挙げられる。ある態様では、改変されたＲＢＤは、天然のバクテリオシンと比較して、このドメインのアミノ酸配列に変化を有する。アミノ酸配列の変化の限定されない例としては、１若しくは２個以上のアミノ酸の置換、挿入（付加）、又は欠失が挙げられる。当然、置換、挿入（付加）、及び欠失の１若しくは２個以上の組み合わせも用いることができる。
【００２３】
他の態様では、尾部繊維は、単一の三量体尾部繊維を形成する３個の尾部繊維タンパク質モノマーのうちの１若しくは２個以上に、異種配列、又は非バクテリオシン配列を含む。そして、ネイティブの（ｎａｔｉｖｅ）、若しくは天然のバクテリオシンの尾部繊維が、ホモ三量体でＲＢＤを形成し得るのに対し、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンの尾部繊維は、１若しくは２個のタンパク質モノマーが他と異なるヘテロ三量体、又は、３個のタンパク質モノマーすべてが全く同様に非ネイティブ（非天然）であるホモ三量体のどちらかである。三量体は、１若しくは２個以上のタンパク質モノマー中に異種（又は、非ネイティブ）配列が存在することにより、改変されたＲＢＤを持つ尾部繊維を形成することができる。
【００２４】
異種配列は、従って、構築された三量体中において少なくとも尾部繊維のＲＢＤが変性されるように、そのモノマーの一部に存在する。変性されたＲＢＤでは、その結合特性、及び尾部繊維の性質が変化し、それによって、その尾部繊維を含むｈｍｗバクテリオシンの結合活性が変化する。ある態様では、異種ＲＢＤは、別のバクテリオシン、又は、バクテリオファージ若しくはプロファージからの尾部タンパク質に由来する。多くの場合、異種ＲＢＤは、バクテリオシンの尾部繊維タンパク質、バクテリオファージの尾部繊維タンパク質、又は推定（ｐｒｅｓｕｍｐｔｉｖｅ）尾部繊維タンパク質のＣ末端部の少なくとも一部を含むポリペプチドであり、その配列は、細菌のゲノム内に見られる生存、若しくは欠損溶原性バクテリオファージの遺伝子に由来する。異種ＲＢＤは、ｈｍｗバクテリオシン尾部繊維タンパク質の基板結合領域（ｂａｓｅ  ｐｌａｔｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）（ＢＰＡＲ）を含むポリペプチドと融合する。ＢＰＡＲを含むポリペプチドは、ｈｍｗバクテリオシン尾部繊維のＮ末端部のすべて又は一部を含むことができ、ここで、このＮ末端部は、まさにＣ末端以外であれば尾部繊維のどの部分から構成されていてもよい。
【００２５】
他の態様では、異種ＲＢＤは、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）バクテリオファージの主要トロピズム決定因子（ｍａｊｏｒ  ｔｒｏｐｉｓｍ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）（Ｍｔｄ）に由来する。限定されない例としては、任意にバクテリオファージの尾部繊維のＲＢＤの全体又は一部を有する、改変された、又は多様化された（ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ）Ｍｔｄを含む異種ＲＢＤが挙げられる。ある態様では、バクテリオファージの尾部繊維は、ビブリオハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）ミオウイルス様（ＶＨＭＬ）バクテリオファージ若しくはその多様化された誘導体の尾部繊維、又は多様性を生じさせるレトロエレメント（Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔ）（ＤＧＲ）の構造に損傷を与える別のプロファージ若しくはバクテリオファージの尾部繊維である。
【００２６】
本開示は、さらに、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンの一部分を含み、その一部分は、細菌細胞表面上で受容体と結合し、そして細胞膜の貫通を促進するというバクテリオシンの活性は維持される。従って、その一部分は、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンの結合（認識）活性及び膜貫通活性が維持されるものであればいかなる部分でもよい。ある態様では、その一部分は、切断された１若しくは２個以上のバクテリオシンポリペプチドを含む。
【００２７】
関連する局面では、本開示は、本開示のｈｍｗバクテリオシンの一部であり得る改変された尾部繊維を含む。三量体尾部繊維は、改変されたＲＢＤ又は異種ＲＢＤを持つ１若しくは２個以上の尾部繊維タンパク質を含むことができる。ある態様では、改変された単量体尾部繊維タンパク質は、Ｒ型バクテリオシン由来であり、一方、他の態様では、尾部繊維タンパク質は、バクテリオファージ尾部繊維タンパク質由来である。
【００２８】
本開示は、さらに、改変された尾部繊維タンパク質をコードする核酸配列、並びにそのコード配列を含むベクター及び／又は（宿主）細胞も含む。ベクター及び／又は宿主細胞を用いて、尾部繊維を形成し、本開示の遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンに組み込まれる改変された尾部繊維タンパク質を作製するためのコード配列を発現させることができる。改変された尾部繊維をコードする配列は、改変された尾部繊維タンパク質の存在下でｈｍｗバクテリオシンを産生する、若しくは産生する能力のある細菌細胞中へ導入することもできる。改変された尾部繊維タンパク質の発現により、改変されたｈｍｗバクテリオシンがその細胞によって産生される結果となる。天然のバクテリオシン尾部繊維タンパク質配列が不活性化又は除去された場合、改変されたｈｍｗバクテリオシンのみが産生されることになる。天然のバクテリオシン尾部繊維タンパク質配列が維持された場合、改変されたｈｍｗバクテリオシンは天然バクテリオシンの尾部繊維と共に産生されることになり、産生された改変されたピオシンは、改変されたピオシンと天然のピオシンとの混合物となり得る。さらに、そのような産生宿主細菌から産生されたピオシンは、二価（多価）のピオシン、すなわち、各々が特異的な結合特性を有する２種類の尾部繊維が混合した単一のピオシン粒子を含み得る。そのような多価のピオシンは、一つのピオシン粒子若しくは分子内に複数の、すなわち、２若しくは３個以上の結合及び死滅の特異性（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ）を有する。トランスフェクトされた細菌は増殖して、改変されたｈｍｗバクテリオシンによって、若しくは天然のバクテリオシンと改変されたｈｍｗバクテリオシンとの混合物からのｈｍｗバクテリオシンの１種類によって結合される受容体を発現するその他の細菌の増殖を予防又は阻害するｈｍｗバクテリオシンを産生することができる。
【００２９】
ある態様では、受容体は、改変されたｈｍｗバクテリオシンへの曝露によって有毒又は病原性細菌株の増殖が予防又は阻害されるように、有毒若しくは病原性細菌株の毒性因子又は適応性因子である。遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンが標的とする毒性因子の限定されない例としては、米国特許第６，３５５，４１１号、及び公開特許出願ＷＯ９９／２７１２９号（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）に開示の配列によってコードされるものが挙げられ、これらの文献は、その全体が記載されているかのごとく、参照することで本明細書に組み入れられる。
【００３０】
曝露は、任意に、ｈｍｗバクテリオシンを発現するトランスフェクトされた細菌との接触、又は共培養によって行う。本開示は、対象となる動物若しくは植物上又はその内部において、トランスフェクトされた細菌のインビボでの増殖を可能とすることを含む。トランスフェクトされた細菌をインビボで適用することにより、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンの標的である表面受容体を発現する細菌から保護された状態が提供される。この保護された状態は、免疫状態と類似しており、ここで、トランスフェクトされた細菌は、動物若しくは植物の免疫システム又はその他の防御システムを実質的に増強、又は補助する。
【００３１】
他の態様では、改変された単量体尾部繊維タンパク質のＲＢＤをコードする核酸配列は、そのコード配列の識別、物理的な単離、及び／又は選別を可能とする遺伝子システムの一部である。限定されない例としては、この遺伝子システムは、識別、単離、及び／又は選別を可能とするファージ、溶原性ファージ、形質導入粒子、コスミド、又はファージゲノムの中のコード配列を含む。ある態様では、この配列は、繊維遺伝子の一部分と融合し、発現されて、改変された尾部繊維三量体を産生し、この三量体により、改変されたｈｍｗバクテリオシンは、ＲＢＤのコード配列が識別又は単離された溶原性ファージを内部に有する宿主生物の表面に結合してこれを死滅させる。改変された尾部繊維三量体中の表現型を検出することで、この配列を選別及び／又はスクリーニングし、識別し、並びに単離することができる。ある態様では、この表現型が、所望の、そして恐らくは希少である、受容体結合特性であり得る。
【００３２】
本開示は、改変された尾部繊維タンパク質を各々がコードする複数のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列を有する、ファージ、形質導入粒子、コスミド、又はファージゲノムのライブラリーを含む。ＲＢＤの結合表現型（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）とコード遺伝子型（ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ）とのこの組み合わせにより、コードする配列をライブラリー内で代表するように、複数の改変されたＲＢＤの発現が可能となる。ある態様では、ホモ三量体の尾部繊維が発現して、ライブラリー構成要素の各々の結合表現型を決定するためのスクリーニング又は選別に使用可能となるように、ライブラリーの各構成要素は、１種類の改変された尾部繊維タンパク質をコードする配列を含む。他の態様では、本明細書で開示するヘテロ三量体尾部繊維が発現し、その結合表現型のためのスクリーニング又は選別が可能となるように、ライブラリーの構成要素には、改変された尾部繊維タンパク質をコードする２種類以上の配列を有するものが含まれる。ライブラリーの構成要素の結合表現型は、従って、各々のコード配列と結びつけられている。こうして所望の又は有利なＲＢＤをコードする遺伝子型が識別されると、それを用いて改変されたｈｍｗバクテリオシンのための尾部繊維を作り出すことができる。ＶＨＭＬなどの、自然にＲＢＤを多様化させる尾部繊維の同族のシャペロン機能を用いることで、ＶＨＭＬ由来の多様化されたＲＢＤを含む尾部繊維の適切な折り畳みを確保することができる。
【００３３】
本明細書で開示するベクター、宿主細胞鮪、ファージ、形質導入粒子、コスミド、ファージゲノム、及びライブラリーは、尾部繊維タンパク質をコードする核酸分子を含む組成物と見なすことができる。
【００３４】
本開示のさらなる組成物は、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシン、又はその抗細菌部分を含む。この組成物は、ｈｍｗバクテリオシンのために抗細菌性であり、担体又は賦形剤を含むことができる。当然、担体又は賦形剤は、ｈｍｗバクテリオシンのようなマルチサブユニット複合タンパク質と組み合わせての使用に適するものである。ある態様では、担体又は賦形剤は、組成物を臨床的に又は農業に使用することができるように、薬理学的に許容されるものである。他の態様では、担体又は賦形剤は、ヒト又は非ヒト動物などへの、局所、肺、胃腸、又は全身の投与に適するものである。追加的な態様では、担体又は賦形剤は、限定されない例として、植物又は植物からの生鮮食品などの、非動物の生物への投与に適するものである。
【００３５】
本明細書で開示する組成物は、２種類以上の遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンを含有することができ、又は、これに限定されないが、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンと共に使用することが所望される天然ｈｍｗバクテリオシンを含む、１若しくは２種類以上の追加的な薬剤を含有することができる。追加的な薬剤の限定されない例としては、酵素、抗生物質、抗真菌剤、殺菌剤、鎮痛剤、及び抗炎症剤が挙げられる。
【００３６】
さらなる局面では、本開示は、本明細書で述べるｈｍｗバクテリオシン関連産物の使用方法を提供する。本開示の態様は、細菌細胞の増殖を阻害する、又は細菌細胞の死滅を誘発する方法を含む。そのような方法は、感受性の高い細菌細胞を、効果量の遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンと、又はその抗細菌部分と接触させる工程を含む。別の選択肢として、ｈｍｗバクテリオシン又はその抗細菌部分を含む組成物を使用することもできる。場合によっては、効果量は、平均して、細菌細胞１個あたりｈｍｗバクテリオシンわずか１個と同等の量とすることができる。当然、それより多い量を用いることもできる。
【００３７】
他の態様では、細菌の細胞質膜の完全性に損傷を与える方法を提供する。その損傷により、膜電位の喪失、及び／又は細胞内容物の一部の喪失という結果をもたらすことができる。そのような方法は、膜を、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシン又はその抗細菌部分と接触させる工程を含む。多くの場合、膜は、有毒又は病原性細菌の膜である。
【００３８】
ある態様では、本開示の方法は、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシン又はその抗細菌部分を、対象内部にインビボで適用（又は、投与）することを含むことができる。別の選択肢として、その方法は、インビトロ又はエクスビボでの接触工程を含むことができる。
【００３９】
さらなる追加的な局面では、本開示は、有毒の祖先細菌から無毒性の細菌を形成する方法を提供する。この方法は、有毒細菌に、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシン又はその抗細菌部分を接触させ、有毒細菌の毒性因子又は適応性因子に結合させる工程を含む。この接触工程は、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシン又はその抗細菌部分の用いた量によって、細菌のすべてが死滅するわけではない条件下、又は細胞の増殖が完全に阻害されるわけではない条件下で行うことができる。この接触工程では、標的である細菌が、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシン若しくはその抗細菌部分に耐えて生き残り、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシン若しくはその抗細菌部分に対して感受性のない（従って、耐性のある）無毒性変異体又は改変された子孫細菌となった場合にのみ繁殖することができるような、選択的な負荷をかける。ある態様では、その耐性は、毒性因子若しくは適応性因子の、又は遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシン若しくはその抗細菌部分に対する受容体の発現の欠損に起因するものであり、それによって、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンの攻撃が回避される。別の態様では、その耐性は、毒性因子又は適応性因子が、改変されたピオシンのＲＢＤに対する効果的な受容体として作用せず、そして、変化した形態ではその毒性又は適応性の機能も失うように変化することに起因する場合もある。生き残った子孫による耐性の獲得、及びその結果としての、元は有毒であった細菌の毒性又は適応性の変化は、インビボ又はインビトロで測定し、その失われた病原性を実証することができる。
【００４０】
関連する局面では、本開示は、有毒の細菌の毒性因子又は適応性因子と結合してそれら因子を通しての殺菌効果を媒介する遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシン又はその抗細菌部分を接触させることによる、無毒性の細菌の集団を維持する方法を提供する。ｈｍｗバクテリオシンの存在により、有毒の細菌の増殖（又は、発生、又は繁殖）が防がれ集団が、無毒性に維持される。ある態様では、この接触工程は、本明細書で述べるように、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシン又はその抗細菌部分を発現する細菌細胞を用いて行うことができる。
【００４１】
本開示の１若しくは２個以上の態様に関する詳細を、以下に示す添付の図面及び説明の中で述べる。本開示のその他の特徴、目的、及び利点は、図面及び詳細な説明、並びに請求項から明らかとなるであろう。
【００４２】
定義
本明細書で用いるｈｍｗバクテリオシンには、Ｒ型ピオシン、尾状のバクテリオシン、Ｒ型バクテリオシン、Ｆ型及びＲ型ピオシン、モノシン、メニンゴシン、又はその他の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンが含まれる。ｈｍｗバクテリオシンには、改変された形態のＲ型及びＦ型ピオシン、エンテロコリチシン、モノシン、及びメニンゴシンが含まれる（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ”Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ．”Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９１（５）：１６９６‐９，１９６６、を参照）。改変された、又は遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、シュードモナスエルジノーサのＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、又はＲ５ピオシンから選択される改変されたＲ型ピオシンであってよい。本開示のバクテリオシンは、熱不安定性、軽い耐酸性、トリプシン耐性、約６５，０００×ｇによる遠心分離で沈殿可能、及び電子顕微鏡で分割可能という性質であり得る（Ｊａｂｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：５７０４‐５７１０，２００２；Ｄａｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｎ  ２７：４６７‐４７９，１９９６；Ｂｒａｄｌｅｙ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖｓ．３１：２３０‐３１４，１９６７；  及びＫａｇｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９：４７１‐４７６，１９６２、を参照）。多くの場合、本明細書で開示する遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、１若しくは２個以上のこれらの性質を、いずれの組み合わせでもよく有する。本明細書で開示するバクテリオシン及び遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンに共通の追加的な性質は、これらは核酸を有さず、従って、多くのバクテリオファージでは可能であるような、標的細菌を死滅させた後、又はその間の自身の複製ができないという、複製欠損であるということである。
【００４３】
本明細書で開示するピオシン及びその他のｈｍｗバクテリオシンは、複数のタンパク質又はポリペプチドのサブユニットを含む複雑な分子であり、ミオウイルスファミリーのバクテリオファージの尾部構造と類似している。天然のピオシンでは、サブユニット構造はシュードモナスエルジノーサのゲノムなどの細菌ゲノムによってコードされ、ピオシンを形成して他の細菌に対する自然防御として働く（Ｋａｇｅｙａｍａ，１９７５）。単一のピオシン粒子により、感受性を有する標的細菌を死滅させることができる（Ｋａｇｅｙａｍａ，１９６４；Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  ＆  Ｓｈｉｇａ，１９７９；Ｍｏｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０；Ｓｔｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００４４】
「標的細菌」とは、本開示の遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンに結合され、及び／又はその増殖、生存、若しくは複製がそれによって阻害される細菌を意味する。「増殖の阻害」、又はその変形した形の用語は、細菌細胞の分裂速度の低下若しくは停止、又は細菌細胞の分裂の停止、又は細菌の死を意味する。
【００４５】
本明細書で用いる「核酸」という用語は、通常、一本鎖又は二本鎖の形の、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマー（単独、又は混合物）を意味する。この用語は、ヌクレオチド類似体、又は改変バックボーン残基若しくは結合を含む核酸を包含することができ、これらは、合成、天然、若しくは非天然のものであり、基準となる核酸と類似の結合、構造、若しくは機能特性を有し、並びに、基準となるヌクレオチドと類似の方法で代謝される。そのような類似体の限定されない例としては、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２‐０‐メチルリボヌクレオチド、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。核酸という用語は、状況によっては、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドと交換可能に用いられる場合もある。
【００４６】
特定の核酸配列は、その保存的に改変されたバリアント（縮退コドン置換、など）、及び相補配列、並びに明示された配列も包含する。特に、縮退コドン置換は、１若しくは２個以上の選択された（又はすべての）コドンの第三（「ウォッブル（ｗｏｂｂｌｅ）」）の位置が混合塩基及び／又はジデオキシイノシン残基で置換された配列を作り出すことで達成することができる。従って、本明細書で開示するタンパク質配列をコードする核酸配列は、本明細書で述べるように、その改変されたバリアントも包含する。
【００４７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、通常、本明細書において交換可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを意味する。アミノ酸は、本明細書では、公知の３文字記号、又はＩＵＰＡＣ‐ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号で表すことができる。
【００４８】
毒性因子は、生物の病原性に寄与するが、その一般的な生存能には寄与しない分子である。毒性因子を失うことにより、生物の病原性は下がるが、生存能が必ずしも下がるとは限らない。毒性因子は、例えば、遺伝子発現の制御、接着性若しくは移動性の付与、抗生物質の排出、又はバイオフィルムを含む防御皮膜の形成など、多くの機能のいずれか一つを有することができる。
【００４９】
適応性因子は、生物の一般的な生存能、増殖速度、又はその環境下での競合性に寄与する分子である。適応性因子を失うことにより、生物は生存能又は競合性が低下し、この欠陥により、間接的に病原性が低下する。適応性因子も、例えば、栄養素、イオン、又は水の摂取、細胞膜若しくは細胞壁の構成成分又は保護剤の形成、核酸の複製、修復、又は変異誘発、環境的な若しくは競合的な攻撃からの防御又はそれに対する攻撃など、数多くの機能のいずれか一つを有することができる。
【００５０】
毒性因子及び適応性因子の中には細菌の表面に存在するものがあり、それによって本明細書で開示するｈｍｗバクテリオシンが接触可能となる。表面の、ある毒性因子又は適応性因子と結合することにより、ｈｍｗバクテリオシンは、細胞膜に孔を開け、細胞質膜の完全性に損傷を与え、及び／又は細胞の膜電位を消失させて、死滅を媒介することができる。ｈｍｗバクテリオシンによる結合及び死滅を恐らくは補助していると思われるこれらの表面の接触可能な分子は、外膜のタンパク質、多糖、及びリポ多糖である。従って、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンの標的として考えられるのは、外膜のタンパク質、多糖、及びリポ多糖である毒性因子及び適応性因子である。遺伝子操作されたピオシンの標的である毒性因子のいくつかの限定されない例としては、膜内開裂プロテアーゼ（ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）（ｉＣＬＩＰ）であるメタロプロテアーゼ；ＩＬ及びＩＩＬ、ガラクトース結合及びフコース結合レクチン；接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（ＭＳＣＲＡＭＭ）タンパク質；及びＡＣＥなどのアドヘシンが挙げられる。
【００５１】
特定の毒性因子の標的化への最終的な成功は、その細菌表面上でのトポグラフィー、その表面での密度、恐らくは外膜内でのその２次元的な移動性、及び病原体の臨床分離株又は野外分離株でのその広がりに依存する。例えば、ＯｐｒＭは、例えば、ＭｅｘＡＢ系などの複数の排出ポンプに関与するポリン様外膜タンパク質であり、多くのグラム陰性細菌で広く見られる（Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｃｏｃｋ，２０００）。ＯｐｒＭと同様に、ＴｏｌＣは、グラム陰性病原体の多くの排出ポンプに必要なアクセサリータンパク質である（Ｋｏｒｏｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｐｉｄｄｏｃｋ，２００６）。さらに、セクレチンのＹｃｒＣファミリーのいくつかの構成要素は、シュードモナスエルジノーサ及びエルシニアぺスチスなどの多くのグラム陰性病原体がその哺乳類ホストを中毒化するために依存する３型分泌系（「Ｔ３ＳＳ」）による病原性エフェクタータンパク質の転座に必要である、外膜タンパク質である（Ｇａｌａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｍｅｒ，１９９９；Ｋｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｃｏｒｎｅｌｉｓ，２００６）。さらに、ＹｓｃＷファミリーの構成要素は、やはり外膜にアンカリングしてセクレチンを膜内へ挿入する補助となる、リポタンパク質である（Ｂｕｒｇｈｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００５２】
毒性因子及び適応性因子のさらなる限定されない例としては、大腸菌アクアポリンＺ水チャネル（Ｃａｌａｍｉｔａ，２０００、参照）などのアクアポリン；ＲｅｔＳ（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；及びＺｏｌｆａｇｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、参照）；７ＴＭＲ‐ＤＩＳＭファミリーの構成要素（Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、参照）；ＯｐｒＭ（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；及び配列番号１１、参照）；ＯｐｒＪ（配列番号１２）、ＯｐｒＮ（配列番号１３）、ＡｐｒＦ（配列番号１４）、ＯｐｍＭ（配列番号１５）、ＯｐｍＡ（配列番号１６）、ＯｐｍＤ（配列番号１７）、ＯｐｍＥ（配列番号１８）、ＯｐｍＱ（配列番号３５）、ＯｐｍＢ（配列番号３６）、ＯｐｍＪ（配列番号３７）、ＯｐｍＧ（配列番号３８）、ＯｐｍＩ（配列番号３９）、ＯｐｍＨ（配列番号４０）、ＯｐｍＫ（配列番号４１）、ＯｐｍＮ（配列番号４２）、ＯｐｍＦ（配列番号４３）、又はＯｐｍＬ（配列番号４４）などの細菌タンパク質；ポリンのＯｐｒＤファミリー（Ｔａｍｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、参照）；ＡＣＥ、又はエンテロコッカスフェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）ＯＧ１ＲＦがコードするＡＣＥ遺伝子（Ｓｒｅｅｄｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；及びＲｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９、参照）；ガラクトース結合及びフコース結合レクチン、ＰＡ‐ＩＬ及びＰＡ‐ＩＩＬ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、参照）；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、に記載の植物及び動物の毒性遺伝子；細胞外ピロリン酸部分（Ｂｏｎｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、参照）；メタロプロテアーゼ（Ｒｕｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、参照）；並びにトランスポゾンがコードする表面分子（Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、参照）、が挙げられる。
【００５３】
本開示のｈｍｗバクテリオシンが標的とするその他の毒性因子の限定されない例としては、米国特許第６，３５５，４１１号及びＷＯ９９／２７１２９号に開示のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にコードされた毒性因子が挙げられ、これらの文献はその全体が記載されているかのごとく、参照することで本明細書に組み入れられる。ある態様では、本明細書で開示するバクテリオシンが標的とする因子は、以下に示す米国特許からのＯＲＦにコードされる因子である。
【００５４】
【表１Ａ】
0005603070.tif 000002
【００５５】
【表１Ｂ】
0005603070.tif 000003
【００５６】
【表１Ｃ】
0005603070.tif 000004
【００５７】
本開示を実施する形態の詳細な説明
一般事項
ｈｍｗバクテリオシンは、急速に細菌を死滅させる能力を有する。インビボでの研究に関するいくつかの初期の報告によると、それはマウスでのこの用途で有効であり得ることが示されている（Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４；Ｍｅｒｒｉｋｉｎ  ａｎｄ  Ｔｅｒｒｙ，１９７２）。発明者らは、野生型のＲ２型ピオシンを腹腔内、又は静脈内投与することで、抗生物質耐性のシュードモナスエルジノーサが引き起こす急性腹膜炎にかかったマウスを治療することができること、及び、Ｒ２型ピオシンが、１回の投与量中に１０9個のピオシン又は全タンパク質量で１μｇ未満などという非常に少ない投与量で作用することができる（データは示さず）ということを最近になってつきとめた。
【００５８】
しかしながら、抗菌剤として臨床的に有用なｈｍｗバクテリオシンに関して、殺菌範囲の狭さという問題には対処しなければならない。このことは、通常の細菌叢に影響を及ぼすことなく特定の種又は菌株を特異的に標的とすることができるという点で有益であると見なすことができるが、公知のバクテリオシンに感受性を有する種／菌株の種類は限らている。例えば、ピオシンは、ある種のシュードモナスエルジノーサ株によって産生されることが現在知られており、狭い範囲の他のシュードモナスエルジノーサ株及び数種類のその他のグラム陰性種に対して活性を有する。その他の種からのＲ型バクテリオシンも報告されているが（エルビニア、Ｊａｂｒａｎｅ  ２００２を参照、及びエルシニアエンテロコリチカ、Ｓｔｒａｕｃｈを参照、など）、その存在は限られていると思われる。一方、ミオウイルスファージは、非常に広く分布して一般的であり、様々な種類の細菌で見られる。
【００５９】
本開示は、ピオシンの標的範囲を変化させることができ、そしていかなるｈｍｗバクテリオシンでもそのようにできることを実証するものである。ピオシン及びその関連するファージの両方において、主たるその範囲の決定因子は尾部繊維に存在し、それが細菌表面に特異的に結合し、そのＣ末端部分（ＲＢＤ）とＬＰＳ又はその他の細胞の表面構造の成分との相互作用を起こす。ＬＰＳは、種及び細菌株間で大きく異なる場合があり、バクテリオファージの尾部繊維自体が、特に細胞表面と相互作用を起こすこのＣ末端領域において、大きく異なっている（Ｔｅｔａｒｔ， Ｄｅｓｐｌａｔｓ，）。この多様性は、ファージが変化するホストの表面に適応し続けていることを反映していると思われる。同じホストに感染する異なる種類のファージが（大腸菌ファージＰ２、Ｍｕ、及びＰ１）、尾部繊維のＣ末端部分で配列類似性を有することが確認されており（Ｈａｇｇａｒｄ‐Ｌｊｕｎｇｑｕｉｓｔ  Ｅ，Ｈａｌｌｉｎｇ  Ｃ，Ｃａｌｅｎｄａｒ  Ｒ．）、このような遺伝子領域における水平移行（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）がホストの特異性に関与している可能性が高いことを示唆している。例えば、Ｒ２ピオシンは、大腸菌ファージＰ２とも非常に高い関連性を有するファージであるシュードモナスファージｐｈｉＣＴＸと、非常に高いレベルでの配列類似性を有している。Ｒ２ピオシンとＰ２の尾部繊維配列を比較すると、Ｃ末端（ＲＢＤ）よりもＮ末端（ＢＰＡＲ）の方が高い配列類似性が見られ、Ｃ末端がホストの特異性に関与していることが示唆される。
【００６０】
本明細書で開示するように、尾部繊維遺伝子のＣ末端を遺伝子操作することにより、ピオシン又はその他のｈｍｗバクテリオシンの標的範囲を変化させることが可能である。重要なことは、この範囲の変化は種のバリアを越えて起こすことができることであり、天然のＲ型ピオシン及びその他の天然のｈｍｗバクテリオシンを本明細書で開示するように改変して、より広い標的範囲を有する抗菌剤を開発することができることを示している。
【００６１】
改変ｈｍｗバクテリオシン
本開示は、結合特異性及び／又は親和性が変化した遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンを提供する。ある態様では、本開示のｈｍｗバクテリオシンは、病原性細菌の毒性因子又は適応性因子として作用する表面の露出した分子と特異的に結合する。「特異的に（又は、選択的に）結合する」とは、多くの場合タンパク質及びその他の生物学的物質の不均一な集団の中で、結合したリガンドの存在によって決定される結合反応を意味する。結果として、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは特異的に結合すると、一般に、病原性細菌を死滅させることができる。さらに、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンに対する耐性を獲得するために、標的である病原性細菌は、ｈｍｗバクテリオシンの認識部位又は結合部位を欠失することが必要となる。言い換えると、改変ｈｍｗバクテリオシンが、特異的にそして限定的に毒性因子又は適応性因子をその受容体として用いる場合、その細菌は、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンによる死滅から逃れるためには、その毒性因子又は適応性因子を欠失せざるを得なくなる。
【００６２】
本開示の改変ｈｍｗバクテリオシンは、バクテリオファージの尾部と類似しているが、未改変、天然、若しくはネイティブのバクテリオシンと比べて変化した結合能力、又は受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を有する。ＲＢＤは、本明細書で述べる組換えＤＮＡ技術を用いることで、アミノ酸配列を変化させることができる。「組換え」という用語は、通常、細胞、又は核酸、タンパク質、若しくはベクターに対して用いる場合、その細胞、核酸、タンパク質、又はベクターが、異種核酸若しくはタンパク質の導入、又はネイティブの核酸若しくはタンパク質の変化により改変されたことを意味するか、又は、その細胞がそのように改変された細胞に由来するものであることを意味する。従って、組換え細胞は、ネイティブ（非組換え）の形態の細胞内では見られない遺伝子を発現するか、又は、ネイティブの遺伝子を発現するが、それは異常発現であるか、過小発現であるか、若しくはまったく発現しない。
【００６３】
多くの態様では、ＲＢＤは、改変して、別のバクテリオシン又はバクテリオファージからの尾部繊維のＲＢＤとすることができる。本明細書で開示する限定されない例の一つとして、Ｒ２ピオシンのＲＢＤは、ファージ（異なるホストに感染する）の尾部繊維タンパク質のＣ末端部分（ＲＢＤ）をＲ２尾部繊維タンパク質のＮ末端部分（ＢＰＡＲ）と融合させることで改変される。Ｐ２尾部繊維のＣ末端をＲ２のＰＲＦ１５へ融合し、Ｐ２同族シャペロンを共発現することによって、Ｒ２の標的細菌の範囲を、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃを死滅させるように変化させる。図２を参照のこと。
【００６４】
追加的な態様では、ｈｍｗバクテリオシンは別の方法で遺伝子操作される。本開示は、細菌（病原性細菌など）の表面分子を認識する、又は標的とするように設計、又は選択されたｈｍｗバクテリオシンを含む。その表面分子は、ｈｍｗバクテリオシンによって認識又は結合される細菌上の受容体と見なすことができる。
【００６５】
本開示は、ｈｍｗバクテリオシンの尾部繊維が受容体と結合又は相互作用して結合対を形成する性質に基づいている。この結合又は相互作用は、結合対の第一の要素である尾部繊維のＲＢＤにより、結合対の第二の要素である受容体との間で発生する。多くの態様では、受容体は、細菌細胞の表面分子又はその一部分である。他の態様では、受容体は、病原性細菌の毒性因子又は適応性因子としての性質を有する分子である。
【００６６】
本明細書で開示する改変された、又は遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、基板結合領域（ＢＰＡＲ）、及び改変された若しくは異種のＲＢＤの両方を持つ尾部繊維を含む。本明細書で述べるように、尾部繊維は、３個の尾部繊維タンパク質サブユニットからなる三量体構造であり、その各々はさらに、尾部繊維のＢＰＡＲに対応してこれを形成する第一のドメイン、及び尾部繊維の改変された若しくは異種のＲＢＤに対応する、そしてこれを形成する第二のドメインを有する。
【００６７】
通常、「異種の」とは、タンパク質又は核酸配列の一部分に関して用いられる場合、その配列が、自然状態ではお互いに同じ関係では通常は見られない２若しくは３個以上のサブ配列を含むことを示す。例えば、異種タンパク質とは、そのタンパク質が、自然状態ではお互いに同じ関係では見られない２若しくは３個以上のサブ配列を含むことを示す。「異種の」とは、また、そのアミノ酸配列若しくは核酸配列が、通常は他の配列と共には見られないか、又は、通常は選択されたプラスミド、ベクター、若しくはホスト内には含まれない、ということも意味する。すなわち、これから利用されようとしているシステムにとってネイティブなものではないということである。例えば、タンパク質で、その野性源ではない生物によって産生されたタンパク質である。
【００６８】
従って、多くの態様では、本開示は、ｈｍｗバクテリオシンの尾部繊維タンパク質であって、そのタンパク質のＢＰＡＲと、改変された又は異種のＲＢＤとを有するタンパク質を含む。ＢＰＡＲは、通常、尾部繊維タンパク質のＮ末端領域にあり、一方、ＲＢＤは、通常、Ｃ末端領域にある。改変された、又は異種のＲＢＤ以外は、尾部繊維タンパク質は、いかなる天然のｈｍｗバクテリオシンのものであってもよく、ピオシン、モノシン、エンテロコリチシン、又はメニンゴシンが限定されない例として挙げられる。ある態様では、本明細書で述べるように、各々配列番号１、３、５、７、９で表されるＲ１‐ピオシン、Ｒ２‐ピオシン、Ｒ３‐ピオシン、Ｒ４‐ピオシン、及びＲ５‐ピオシンの尾部繊維タンパク質を用いることができる。追加的な態様では、尾部繊維タンパク質は、配列番号４５のΦＣＴＸファージのもの、又は配列番号１９のファージＰＳ１７のもの、又は配列番号２１及び２２のＶＨＭＬバクテリオファージのものであってよい。
【００６９】
本開示の態様は、図３に示すように、ｈｍｗバクテリオシンの尾部繊維タンパク質ＢＰＡＲ、及びバクテリオファージの尾部繊維タンパク質からのＲＢＤの組み合わせを含む。ある場合では、組み合わせは、バクテリオシンの尾部繊維タンパク質の１位から約１６４位又は２４０位までのＮ末端アミノ酸を含むことができる。このポリペプチド断片は、ＲＢＤを有するそのＣ末端部分を含むバクテリオファージの尾部繊維タンパク質の領域と融合することができる。この領域は、１位から約１５０位まで、約１７０位まで、約１９０位まで、約２９０位まで、約３００位まで、又は約３２０位までのＮ末端領域が欠失したポリペプチド断片であってよい。
【００７０】
Ｒ２ピオシン及びＰ２ファージの尾部繊維を限定されない例として用いると、ＢＰＡＲを有する断片としては、１位から１６４又は２４０位までのＮ末端アミノ酸を挙げることができる。図４乃至図７を参照のこと。ＲＢＤを有する断片としては、Ｐ２又は関連ファージの尾部繊維タンパク質の、約３４７乃至約７５５のアミノ酸の長さであるＣ末端を挙げることができる。融合は、組換えＤＮＡ技術により、ｐｒｆ１５などのＲ２尾部繊維タンパク質をコードする核酸配列、及び尾部繊維タンパク質をコードするＰ２ファージのＨ遺伝子を用いて容易に行うことができる。ＲＢＤの同族シャペロンは、改変された尾部繊維を機能性ピオシン構造へと確実に構築するために、融合尾部繊維遺伝子と共発現する必要がある。図８を参照のこと。
【００７１】
他の態様では、改変されたＲＢＤは、天然のＲＢＤと比べて、又は尾部繊維タンパク質中に存在するＢＰＡＲと比べて、ＲＢＤのアミノ酸配列の変化を含んでいる。アミノ酸配列の変化の限定されない例としては、１若しくは２個以上のアミノ酸の置換、挿入（付加）、又は欠失が挙げられる。
【００７２】
ＲＢＤアミノ酸残基の置換を含む態様では、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２２％、約２４％、約２６％、約２８％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、若しくは約５０％、又はそれを超える割合の尾部繊維タンパク質中のＣ末端が置換される。ある態様では、置換は、Ｃ末端から約２４５、約２６０、約２７５、若しくは約２９０個、又はそれを超す数の残基内に存在する。
【００７３】
置換の位置は、その領域内の１若しくは２箇所以上のいずれの組み合わせであってもよい。典型的な位置としては、これらに限定されないが、配列番号１、３、５、７、又は９における、４４８、４４９、４５２、４５３、４５４、４５５、４５９、４６０、４６２、４６３、４６４、４６９、４７２、４７３、４７４、４７５、４７８、４８０、４８４、４８５、４８６、４９１、４９４、４９６、４９７、４９８、４９９、５０５、５０６、５０７、５０８、５１０、５１２、５１４、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２３、５２７、５２８、５３０、５３１、５３３、５３５、５３７、５３８、５４１、５４３、５４６、５４８、５６１、６０３、６０４、６０５、６０６、６１０、６１８、６２１、６２４、６２６、６２７、６２８、６２９、６３１、６３２、６３３、６３８、６４１、６４２、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５７、６５９、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、及び６９１位、並びにこれらのいずれかの組み合わせが挙げられる。ある態様では、置換は、本明細書で述べるように、保存的である。他の態様では、置換は、非保存的置換である。
【００７４】
さらなる態様では、尾部繊維タンパク質のＣ末端の同じ領域内において、アミノ酸残基の挿入及び欠失を行うことができる。
【００７５】
バクテリオファージからのＲＢＤ
その他のＲＢＤ源としては、これらに限定されないが、Ｔ‐４及びその他のＴ‐偶数若しくは偽Ｔ‐偶数ファージ（ｐｓｅｕｄｏ  Ｔ‐ｅｖｅｎ  ｐｈａａｇｅ）、Ｔ‐３ファージ及びＴ‐７ファージ、ファージのＴ‐７スーパーグループ（Ｔ‐７  ｓｕｐｅｒ‐ｇｒｏｕｐ）、Ｍｕファージ、Ｐ２２ファージ、Ｌ‐４１３ｃファージ、並びにラムダファージが挙げられる。
【００７６】
多様化によるＲＢＤ
さらなる態様では、尾部繊維タンパク質は、２００６年６月８日公開の米国特許出願公開第２００６‐０１２１４５０号（その全体が記載されているかのごとく、参照することで本明細書に組み入れられる）に記載のように、多様性を生じさせるレトロエレメント（ＤＧＲ）を配置することで構造を多様化させる生物由来のＲＢＤによる置換、又はその挿入を含む。ボルデテラバクテリオファージＢＰＰ‐１の主要トロピズム決定因子（Ｍｔｄ）は、そのような構造の一つである。Ｍｔｄの配列は、本明細書で開示する配列番号２４によって表される。他の態様では、置換は、Ｍｔｄ配列の一部分で行われ、これらに限定されないが、例えば配列番号２４の４９から３８１までの残基、１７１から３８１までの残基、又は３０６から３８１までの残基の領域である。配列番号３の６９１位より後ろの部分などの尾部繊維タンパク質の末端へ、Ｍｔｄ配列、又はその断片のいずれか（上記で挙げたものなど）を挿入することは、本明細書で開示する態様の範囲内である。Ｍｔｄ配列、又はその断片のいずれか（上記で挙げたものなど）による置換は、尾部繊維タンパク質のいずれの非ＢＰＡＲ領域に対しても行うことができる。限定されない例としては、配列番号１、３、５、７、又は９の領域で、約６４３、６２５、５６２、４４８、４２８、２３１、及び１６３位から始まりその配列のＣ末端までが挙げられる（これらの置換の実例は、図４乃至図７を参照）。
【００７７】
本明細書で述べるように、尾部繊維中のＭｔｄ配列は、多様化して複数の改変された又は異種のＲＢＤを産生することができる。Ｍｔｄをコードする核酸配列は、鋳型領域（ＴＲ）に、シス又はトランスで、操作によって結合させることができる可変領域（ＶＲ）を有し、それによってＴＲはＶＲの部位特異的な変異原性を誘導する鋳型配列となる。ＶＲ領域とＴＲ領域との間の操作による結合には、逆転写酵素（ＲＴ）活性をコードする配列との操作による結合も含み、これはＶＲに対してトランスに存在することができる。ＭｔｄのＶＲの可変部位は、おおむね相同的な鋳型領域であるＴＲのアデニン残基に対応しており、それ自身はインバリアントであり、ＶＲ内の配列の変化に不可欠である。従って、最初の分子はＶＲと同一のＴＲを含む場合があるが、ＴＲ内に存在するアデニン残基が、ＶＲ配列内の対応する位置に変異原性、又は多様化をもたらす結果となる。従って、ＴＲ配列がＶＲ内の配列の完全な直接のリピートである場合、ＶＲ領域の多様化により、ＴＲ配列を変えることなく、ＴＲ内にも見られる１若しくは２箇所以上のアデニン残基が別のヌクレオチド、すなわち、シトシン、チミン、又はグアニンへと変異する結果となる。このシステムを用いて、本明細書で述べる改変された尾部繊維タンパク質のＶＲ領域を、従ってＲＢＤを、変化させることができる。
【００７８】
多様化により、尾部繊維タンパク質は、得られるＲＢＤが、配列番号２４で表されるボルデテラバクテリオファージＢＰＰ‐１の主要トロピズム決定因子（Ｍｔｄ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の相同性を有するように変化させることができる。本明細書で述べるように、尾部繊維タンパク質とＭｔｄとの結合は、Ｍｔｄ配列若しくはその一部分の尾部繊維タンパク質配列への置換あっても、又は挿入であってもよい。従って、得られる尾部繊維は、上記で挙げたように、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の相同性を有する結合ドメインによる置換、又は挿入を含むものであると見なすことができる。
【００７９】
多様化及び配列の変化のために、尾部繊維及びＭｔｄをコードする核酸分子の組み合わせを用いることができる。従って、尾部繊維タンパク質の全体若しくは一部、及びＭｔｄの全体若しくは一部をコードする配列の核酸の組み合わせは、本開示の態様の範囲内である。他の態様は、本明細書で述べる改変された、又は異種のＲＢＤを有する尾部繊維タンパク質のいずれかをコードする核酸分子を含む。ある態様では、コードされた、改変された若しくは異種のＲＢＤは、天然のＲＢＤと比較して、又は上記で述べる尾部繊維タンパク質内に存在するＢＰＡＲと比較して、ＲＢＤのアミノ酸配列における変化を含む。
【００８０】
追加的な態様では、尾部繊維タンパク質をコードする核酸分子を多様化に利用可能とすることで、本明細書で開示する改変された尾部繊維タンパク質を形成することができる。適切なプロモーターの支配下において、核酸分子はａｔｄ‐ＴＲ‐ｂｒｔ領域に対して５’末端に操作によって配置される。このＴＲ配列はＴＲ’と称することができ、下記で述べるように、ＶＲ配列に基づいて作製することができる。得られる核酸コンストラクトは、ａｔｄの上流の転写終結構造の欠失を有することができる。
【００８１】
上記で述べる尾部繊維タンパク質のＣ末端部をコードする核酸分子の領域は、ＶＲとなるように選択され、そして、変化した際にＶＲによってコードされた配列内でのアミノ酸の変化を誘導する位置にアデニン残基を有するＴＲ’配列と、操作によって連結させる。そのようなアデニン残基は、ＶＲ内の１番目又は２番目のコドンとなるように計画的に設計することができる。ＴＲ’配列は、最初は選択されたＶＲと同一であってよいが、これに続く部位特異的な変異原性、又は新規な核酸合成により、コードされる尾部繊維タンパク質内での変異原性及び多様化を誘導するための対応する位置にアデニン残基を有するＴＲ’配列が作られる。
【００８２】
ｈｍｗバクテリオシンの作製及び使用
本明細書で述べる核酸分子を用いて、改変されたタンパク質又は遺伝子操作されたタンパク質を含む尾部繊維タンパク質を、当業者に公知のいかなる方法によっても、発現させ、作製することができる。ある態様では、発現は、コードされた尾部繊維タンパク質の発現を誘導することができるプロモーターに操作によって結合させた核酸分子を有するベクターを用いて行われる。
【００８３】
多くの態様では、発現は、種々のバクテリオシン及びバクテリオファージで報告されている「シャペロン」をコードする配列など、アクセサリー遺伝子の発現と共に発生させることができる。シャペロンの存在により、必ずしもバクテリオシンの一部となることなく、本開示のｈｍｗバクテリオシンの構築が促進される。シャペロンは、図８に示すものなどの本開示のｈｍｗバクテリオシンに用いられるＲＢＤに対して同族、又は対応するタンパク質であってよい。シャペロンの一つの限定されない例は、Ｒ２ｐｒｆ１６（配列番号４）によってコードされ、それは、ｐｒｆ１５（配列番号３）によってコードされるＲ２ピオシン尾部繊維タンパク質に対応するもの（又は、それに対して同族のシャペロン）である。その他の例としては、Ｐ２内のＧ遺伝子（配列番号２６）、Ｌ‐４１３ｃ上のＧ遺伝子（配列番号２９）、配列番号２０のＰＳ１７尾部繊維に対する同族シャペロン、及びＶＨＭＬバクテリオファージ内のＯｒｆ３８（配列番号２３）が挙げられ、これらは各ファージ中の尾部繊維遺伝子に対して同族のシャペロンである。これらの遺伝子は、Ｔ４の尾部繊維（配列番号３１）の三量体への適切な折り畳みをつかさどるＴ４ファージのｇｐ３８（配列番号３２）と相同的である（Ｂｕｒｄａ，Ｑｕ，Ｈａｓｈ  ｅｍｏｌｈｏｓｓｅｎｉ）。
【００８４】
図８に示すように、非同族シャペロンでは所定の尾部繊維タンパク質の適切な折り畳み、及び／又はそのｈｍｗバクテリオシンへの構築には不十分であり得ることから、同族シャペロンの使用は有利である。限定されない例として、Ｒ２のｐｒｆ１６遺伝子産物は、Ｐ２の尾部繊維のＢＲＤ部に融合したＲ２のＢＰＡＲを含む改変された尾部繊維の折り畳みを相補するには不十分であることが観察されている。理論に束縛されるものではなく、本開示の理解を深めるために提供するものであるが、シャペロンは、同族の尾部繊維タンパク質のＣ末端部分に特異的に作用することができ、その尾部繊維及びそのシャペロンは共進化した（ｃｏ‐ｅｖｏｌｖｅｄ）ものと考えられる。しかし、Ｑｕ  ｅｔ  ａｌ．は、同族シャペロンであるｇｐ３８を必要としないＴ４のｇｐ３７尾部繊維ミュータントを単離した。このミュータントは、ｇｐ３７内にコイルドコイルモチーフの複製を有しており、これ自体が折り畳みに関与している可能性がある。従って、さらに、尾部繊維タンパク質は、同族シャペロンを共発現する必要なく適切に折り畳まれるように、そのような変化を含むように設計することができると考えられる。
【００８５】
従って、本開示の態様は、本明細書で述べるように、改変された又は遺伝子操作された尾部繊維タンパク質をコードし、任意に、シャペロンと共発現する核酸分子でトランスフェクトされた細菌細胞を含む。その核酸分子は、任意にアクセサリー（シャペロン）タンパク質と共に発現して、本開示の改変された又は遺伝子操作された尾部繊維が産生される結果となる。本開示は、２種類以上の核酸分子を用いることで、混合ホモ三量体尾部繊維、又はヘテロ三量体尾部繊維さえも得られる、２種類以上の改変された又は遺伝子操作された尾部繊維タンパク質の発現も含む。さらに、尾部繊維タンパク質及びシャペロンをコードする配列は、プラスミド若しくはその他のベクターなどの単一の核酸分子内に含まれていてもよく、又は別々の分子であってもよい。単一の核酸分子を用いる場合は、その配列は、任意に、同一の制御配列の支配下にあってもよい。別の選択肢として、このコード配列は、別々の制御の支配下であってもよい。
【００８６】
ある態様では、細菌細胞は、さらなるサブユニットを発現して、改変された又は遺伝子操作された尾部繊維を含むｈｍｗバクテリオシンを形成する能力も有する。態様の一つのグループでは、細菌細胞の、内在性尾部繊維タンパク質をコードする配列が不活化、又は欠失している。任意に、尾部繊維タンパク質及び／又はシャペロンをコードする配列を有する核酸分子とは別である、プラスミド又はその他のベクターなどの核酸分子上の配列によって、その他のサブユニットがコードされてもよい。従って、尾部繊維タンパク質及び／又はシャペロンは、１若しくは２種類以上の核酸分子により、その他のサブユニットに対してトランスに提供することができる。
【００８７】
核酸、ベクター、及び細菌細胞を、本明細書で開示する改変された又は遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンを作製する方法で用いることができる。そのような方法は、尾部繊維及びｈｍｗバクテリオシンの発現及び産生をもたらす条件下で上述の核酸分子を有する細菌細胞を培養する工程を含む。本開示のある態様では、その条件は動物内でのインビボである。
【００８８】
態様の一つのグループでは、ｈｍｗバクテリオシンを作製する方法は、改変された又は遺伝子操作された尾部繊維タンパク質を含むバクテリオシンのサブユニットを、宿主細菌内で発現する工程、及び細菌培養物からそのｈｍｗバクテリオシンを回収する工程を含む。宿主細菌は、バクテリオシンの産生に必要なその他のサブユニットをコードし、発現する補完的な産生宿主細菌（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｈｏｓｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）である。「宿主細菌」という用語は、本明細書で開示するｈｍｗバクテリオシンを産生するために用いる細菌を意味する。宿主細菌は、「産生宿主細菌」と称する場合もある。「細菌培養物からのｈｍｗバクテリオシンを回収する工程」は、一般に、宿主細菌培養物からのバクテリオシンの除去を含む。
【００８９】
態様の別の選択肢としてのグループでは、本明細書で述べる改変された尾部繊維を有するｈｍｗバクテリオシンを作製する方法を提供する。この方法は、本明細書で開示するいずれかの手段による改変された尾部繊維タンパク質をコードする核酸分子を作製する工程、及びｈｍｗバクテリオシンが産生される条件下で、その核酸分子を細胞内で発現させる工程を含む。
【００９０】
本開示の態様は、本明細書で述べる尾部繊維タンパク質を有するｈｍｗバクテリオシンを含む。態様の一つのグループでは、このバクテリオシンは、配列番号１、３、５、７、９で表されるアミノ酸配列をその一部に含む尾部繊維タンパク質を有する。他の態様では、バクテリオシンは、改変された、若しくは遺伝子操作されたピオシン、モノシン、エンテロコリチシン、又はメニンゴシンであり、これらは異種の改変されたＲＢＤを含む尾部繊維を有する。多くの態様では、異種の改変されたＲＢＤは、細菌の毒性因子又は適応性因子と結合する。
【００９１】
さらなる態様では、多価の尾部繊維を有する遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンを開示する。Ｘ線結晶解析により、ボルデテラブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）バクテリオファージＢＰＰ‐１のＭｔｄは、複雑に絡み合った錐体形のホモ三量体であって、その錐体の底面にややフラットな受容体結合部位を形成する１２の可変アミノ酸残基のセットを３セット有しており、収束進化したＣ型レクチン（「ＣＴＬ」）ドメイン内に位置することが明らかにされた。５個のＭｔｄバリアントの構造を、１．５オングストロームの解像度で比較することにより、可変残基の主鎖コンフォーメーションは構造的にインバリアントであり、ＣＴＬ及び集合三量体での挿入は両方共に、可変残基の組み合わせの提示のための静的な足場（ｓｔａｔｉｃ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）の形成に関与しており、それによってタンパク質の誤った折り畳みの発生が最小限に抑えられる（ＭｃＭａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。従って、バリアントＭｔｄ繊維の構造が、相互作用を起こさない、溶媒と接触する１２のアミノ酸残基以外は同一であることから、３個の適切に折り畳まれた混合モノマーを含む単一の尾部繊維を作り出すことができる。
【００９２】
その受容体、ボルデテラ毒性因子パータクチン、と結合した主要なＭｔｄ‐Ｐ１バリアントの構造も結晶解析で解明され、特徴が示された。Ｍｔｄの単量体の一つがパータクチンの一つの構造ドメインに結合し；同じＭｔｄの同一の第二の単量体が、同じ（単量体である）パータクチン分子の別の非対称の構造ドメインと結合し；第三のＭｔｄ単量体は結合しない状態で残される。
【００９３】
上述のバリアントＭｔｄ構造、及びＭｔｄとその標的であるパータクチンとの結合相互作用を適用して、多価の尾部繊維の設計及び選択を行うことができる。例えば、Ｍｔｄ単量体は２種類の異なる構造ドメインに対して親和性を示すことができるが、その多量体の形態では、機能的なファージとの結合及び感染を起こすのに十分なアビディティーを有することは明らかである。さらに、ファージとの結合及び感染のために適切なアビディティーを提供するために、繊維のすべての単量体が受容体に結合する必要があるわけではない。これらのデータ及び結論を、少なくともＴ４バクテリオファージ、さらにはミオウイルスに関しては、３個の（ホモ三量体）尾部繊維が受容体と結合するだけで、尾部の鞘の収縮、及びコアの細菌膜の貫通を誘発するという知見と合わせると、多価のｈｍｗバクテリオシンを作り出すいくつかの手段が示唆される。そのような遺伝子操作された多価のｈｍｗバクテリオシンは、ホストの範囲がより広く、同じ細菌生物上でさえも２種類以上の毒性因子若しくは適応性因子と結合する能力を有し、それにより、標的細菌が、標的である該当するすべての受容体の発現の変異的な欠損によって耐性を確立するということがより困難となる。Ｒ型バクテリオシンは、遺伝子操作により、３個の同一の尾部繊維の独立した２組のセットを持たせることができ、一方のセットの繊維は、同一ではない３個の単量体の同じものから成り、もう一方のセットの繊維は、同一ではない３個の単量体の異なるものから成る。各単量体は、ちょうどＭｔｄがそうであるように、２種類の異なるエピトープ（例：２種類の異なる受容体）に対する結合親和性を有することができる。それにより、１２種類の異なる標的受容体（２種類の「エピトープ」／単量体×３種類の単量体／尾部繊維×２セットの異なる尾部繊維／Ｒ型バクテリオシン＝１２種類の標的受容体）のうちのいずれかの１若しくは２種類以上を発現するいかなる細菌も、遺伝子操作された多価のｈｍｗバクテリオシンと結合し、膜の貫通を誘発することになる。そのような遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、非常に広いホストの範囲を有し、さらに、２種類以上の標的受容体を発現する細菌がこの遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンに耐性を有するようになる可能性は極めて低い。
【００９４】
他の局面では、本開示のｈｍｗバクテリオシンを使用する方法を提供する。ある態様では、細菌の細胞質膜の完全性に損傷を与える方法を開示する。その方法は、標的となる細菌を本明細書で開示するｈｍｗバクテリオシン又はその一部分と接触させる工程を含むことができる。別の選択肢として、本明細書で開示するｈｍｗバクテリオシンを含む組成物と接触させることもできる。
【００９５】
態様の一つのグループでは、接触は、対象内でインビボで行われる。従って、対象内の細菌の膜の完全性に損傷を与える方法を開示する。その方法は、本明細書で開示するｈｍｗバクテリオシン又はその一部分を対象へ投与する工程を含むことができる。態様の別のグループでは、接触は、インビトロで行われる。
【００９６】
さらなる追加的な態様では、有毒先祖細菌から、無毒性又は非適応性の子孫細菌を形成する方法を提供する。この方法は、有毒細菌を、該有毒先祖細菌の毒性因子又は適応性因子と結合する本明細書で開示するｈｍｗバクテリオシンと接触させる工程を含むことができる。この方法は、次に、これに続いて、毒性因子又は適応性因子を発現しない無毒性の子孫細菌を選別可能とすることができる。
【００９７】
別の選択肢としての態様では、無毒性の細菌の集団を維持する方法を提供する。この方法は、集団を有毒細菌の毒性因子又は適応性因子と結合するｈｍｗバクテリオシンと接触させる工程を含むことができる。この方法では、次に、これに続いて、有毒細菌の増殖が予防される。理論に束縛されるものではなく、本開示の理解を深めるために提供するものであるが、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンに対する細菌の耐性の出現は、病原性細菌の毒性又は適応性の欠損に付随するものとなる。
【００９８】
本開示の方法は、細菌の増殖が望ましくない又は有害であると考えられる環境に適用することもできる。限定されない例としては、医療環境及び手術室設備を含む環境；並びに、生の肉類又は魚類を取り扱う区域を含む食品加工区域の殺菌が挙げられる。この方法は、熱に弱い物体、医療装置、及び移植臓器を含む移植組織片の殺菌に用いることもできる。
【００９９】
この方法は、独立した治療法として、又は細菌集団の処置など、付属的な治療法として用いることができる。これらの方法と組み合わせて細菌に基づく状態の治療に有用であろうと思われる数多くの抗菌剤（抗生物質、および化学療法薬を含む）が公知である。
【０１００】
標的細菌
本開示の遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、改変することにより、限定されない例として院内細菌又は化膿菌などの病原性細菌を含む、様々な細菌種及び株上の受容体を標的とすることができる。本明細書で述べるように選択された細菌の毒性因子を標的とするのに加え、元々バクテリオファージに対する感受性の高い細菌も、遺伝子操作されたピオシンなどの本開示のｈｍｗバクテリオシンによって阻害される細菌の限定されないグループの例の一つである。これらの細菌には、天然のピオシンに対して感受性の高い、並びに感受性のないグラム陰性細菌が含まれる。さらなる限定されない例としては、グループとしてのグラム陰性細菌、並びにグラム陽性細菌が挙げられる。グラム陽性細菌内のバクテリオシン様の要素に関する報告がある（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＆  Ｐａｔｔｅｅ，１９８１；Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  ＆  Ｐａｔｔｅｅ，１９８１；Ｚｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。ある態様では、標的細菌の同定又は診断を行う。そのような細菌の限定されない例としては、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、又はストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌が挙げられる。
【０１０１】
毒性因子を標的化する限定されない例として、本開示は、ファージ尾部繊維タンパク質ＲＢＤの使用を含み、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７に感染するがＯ１５７抗原を欠損したその変異株には感染しないＡＶ１７と称するＴ‐偶数様、又はＲＢ‐６９様ファージからのｇｐ３７タンパク質のＲＢＤなどである（Ｙｏｉｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。このファージの結合には、病原性生物であるＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７の腸への接着に関与する毒性因子Ｏ１５７抗原の存在が必要であると思われる。従って、本開示のｈｍｗバクテリオシンは、改変されたｈｍｗバクテリオシンがＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７の毒性因子Ｏ１５７抗原を標的とするように、上述のファージＡＶ１７のｇｐ３７タンパク質からのＲＢＤを有する改変された尾部繊維タンパク質（配列番号３３）を含むことができる。ＡＶ１７尾部繊維の同族シャペロンは、配列番号３４の配列を有する。
【０１０２】
その他の標的細菌としては、ヒトの局所的な（ｔｏｐｉｃａｌ）又は限局性の（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）シュードモナスエルジノーサ感染の原因となる細菌が含まれる。「感染」とは、対象内、又は組織内、又は非細菌の細胞内での細菌の増殖を意味し、ここで、この細菌は、実際に若しくは潜在的に、対象内、又は組織内、又は非細菌の細胞内において疾患又は症状を引き起こし得るものである。感染に対する処置は、物体又は物質の予防的な処置を含むことができる。限定されない例としては、提供された臓器、組織、及び細胞；レスピレーター若しくは透析装置のような医療機器；又は、手術中若しくは手術後などの傷が挙げられる。その他の使用としては、さらなる増殖が問題となり得る標的細菌の除去が挙げられる。追加的な態様では、ｈｍｗバクテリオシンを用いて、細菌による感染若しくは汚染を有する植物又は植物の収穫部分の処理、又は、病院若しくは商業的な環境などの標的細菌の環境中での存在の処理が行われる。
【０１０３】
本開示は、細菌を標的とした本明細書で開示するｈｍｗバクテリオシンの投与又はそれとの接触による、以下のような組織及び対象内のそのような感染の治療法を提供する。感染としては、角膜の一般的な感染（「角膜炎」、及び角膜潰瘍）が挙げられ、少なくともその３分の２はシュードモナスエルジノーサによって引き起こされる。これらの病原体のおよそ３０％が、複数の抗生物質に耐性を有すると報告されている（Ｍａｈ‐Ｓａｄｏｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。角膜の細菌感染は、比較的稀であると考えられるが、感染をした目の視力の低下、又は失明さえも可能性があることから、医師による緊急の手当てを要する重症である。治療可能であり、抗生物質耐性のシュードモナスエルジノーサによって引き起こされるその他の一般的な感染としては、例えば、「外耳炎」などの耳への感染（Ｒｏｌａｎｄ  ＆  Ｓｔｒｏｍａｎ，２００２）、重度の火傷及び傷に続発する感染（Ｈｏｌｄｅｒ，１９９３）、及び嚢胞性線維症が挙げられる。嚢胞性線維症は、シュードモナスエルジノーサ及びその近縁種であるバークホルデリアセバシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）によって引き起こされる慢性で抗生物質耐性の感染によって着実に悪化するもので（Ｇｏｖａｎ  ＆  Ｄｅｒｅｔｉｃ，１９９６）、嚢胞性線維症でのこれらの病原体は、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンを用いることで処理することができる。ピオシンなどのバクテリオシンは凍結乾燥に対する耐性があることから（Ｈｉｇｅｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９）、本開示は、上部及び／又は下部気道への送達が成功する確率を高めるために、凍結乾燥した投与用バクテリオシン製剤を含む。
【０１０４】
本明細書で述べる、対象の治療とは、通常、「治療を必要とする対象」の治療である。治療の必要性の判定又は診断は、臨床医などの当業者が、本技術分野で認知される手段を用いて行うことができる。ある態様では、対象とは、生命を脅かす可能性のある細菌感染、又はその生物の健康状態の悪化、若しくは寿命の短縮をもたらす細菌感染を有する動物、又は植物である。
【０１０５】
追加的な態様では、バイオフィルム内の細菌を死滅させる、又はその増殖を阻害する方法を提供する。そのような方法は、バイオフィルム内の細菌を標的とする本明細書で開示するｈｍｗバクテリオシンをバイオフィルと接触させる工程を含むことができる。
【０１０６】
本明細書で述べるように、抗菌ｈｍｗバクテリオシンを用いることで、特定の細菌の増殖、生存、又は複製が阻害される。その細菌は、病原性の株、若しくは環境に有害な株であってよく、又は、予防的な方法で処理してもよい。病原性微生物は、一般に疾患を引き起こすが、特定の状況下でのみそうである場合もある。
【０１０７】
細菌は、院内（病院由来の）感染の細菌、環境細菌、及び（膿を形成する）化膿菌であってもよい。本開示の方法及び組成物を用いて、典型的な病院環境に棲息する細菌を含む院内細菌、又はヒトの皮膚上若しくはヒトの胃腸管内に存在する細菌、又は傷に感染して膿を形成する細菌の増殖を阻害することができる。院内感染は、入院中に発症する感染、又は病院内で行われる処置に関連する感染である。このような処置に関連する感染は、患者が病院を出た後に発症する場合が多い。最も一般的な院内細菌感染は、尿路感染、手術部位の感染、肺炎、クロストリジウムディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連の下痢、及び偽膜大腸炎、並びに細菌が血液から増殖する場合のある重度の全身感染である。
【０１０８】
本開示の方法及び組成物を用いて、グラム陰性又はグラム陽性細菌の増殖を阻害することができる。グラム陽性細菌の限定されない例としては、スタフィロコッカス（化膿性）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（日和見性）、ストレプトコッカス、エンテロコッカス、バシラス、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、及びクロストリジウムが挙げられる。グラム陰性細菌の限定されない例としては、シュードモナス（化膿性）、大腸菌（日和見性）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（日和見性）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）（日和見性）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）（化膿性）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（日和見性）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）（化膿性）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）（化膿性）、グラム陰性非発酵桿菌（アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）など）、及びシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）が挙げられる。化膿性球菌は、球状の細菌であり、動物の様々な化膿性（膿を生成する）感染を引き起こす。これには、グラム陽性球菌であるスタフィロコッカスアウレウス、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、及びストレプトコッカスニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、並びにグラム陰性球菌であるナイセリアゴノレー（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、及びナイセリアメニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）が含まれる。
【０１０９】
追加的な態様では、開示された本開示の方法及び組成物を用いることで、細菌、特に抗生物質耐性の細菌の増殖が阻害される。限定されない例としては、多剤耐性（ＭＤＲ）となった数多くの細菌性病原体が挙げられる。
【０１１０】
限定されない代表例としてのピオシンの遺伝子操作
ピオシンは、Ｆｒａｎｃｏｉｓ  Ｊａｃｏｂによって発見され、初めて高分子量バクテリオシンであると報告された（Ｊａｃｏｂ，１９５４）。その他の複数のグラム陰性細菌内で（Ｃｏｅｔｚｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９６８）、並びに、共にグラム陽性生物であるリステリアモノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（Ｚｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）、及びスタフィロコッカスアウレウス内で（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｅ，１９８１）、同様のバクテリオシン様の存在が報告されている。ピオシンは、形態的には収縮した（ミオウイルス）バクテリオファージの尾部に類似しているが、単なる欠損ファージではなく；重要な違いが存在する。例えば、ピオシンとファージの尾部との間には、物理的及び化学的な安定性の違いが存在する（Ｋａｇｅｙａｍａ  ＆  Ｅｇａｍｉ，１９６２；Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０１１１】
ピオシンのホストの範囲は比較的狭く、通常は同じ種の株に限定されるが、例外も存在する（Ｍｏｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ.，１９７６；  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）。一方、ミオウイルスバクテリオファージは、広いホストの範囲を示すことができ、そのホストの範囲は、ピオシンのそれと同様に、その尾部繊維の先端の結合特異性によって決定される（Ｔｅｔａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０１１２】
数多くのファージ尾部繊維において、ファージのホストの範囲、若しくは「トロピズム」、が異なるミュータント又はバリアントは、遺伝子の遠位部（３’末端）の３分の１が異なっている（Ａｃｋｅｒｍａｎｎ，２００３）。限定されない例として、主要トロピズム決定因子（Ｍｔｄ）であるボルデテラバクテリオファージＢＰＰ‐１の受容体結合タンパク質は、配列が大きく異なる（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；  Ｄｏｕｌａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。Ｍｔｄの違いは、ファージにコードされたレトロエレメント（多様性を生じさせるレトロエレメント、又はＤＧＲ）に依存しており、このレトロエレメントは、種々のファージ及び細菌のゲノムでの配列の違いの発生に関係付けられているＤＧＲのファミリーに属する。ボルデテラＤＧＲは、１０13を超える種類のＭｔｄの配列バリアントを産生することができ、考えられる１０14乃至１０16種類の抗体の配列に匹敵する。Ｍｔｄバリアントは、ＤＧＲがコードする逆転写酵素（ｂＲＴ）及び安定な鋳型領域（ＴＲ）が関与する、特有のアデニン特異的変異原性プロセスによって産生される。Ｍｔｄの変異性は、そのＣ末端可変領域（ＶＲ）全体に分散しているアデニンでコードされた１２個のアミノ酸に集中している（Ｄｏｕｌａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。数多くのボルデテラＭｔｄバリアントの三次元結晶構造が解明され、以下に示すように、構造の先端部が結合特異性を、そしてそれによってファージの主要トロピズム（ホストの範囲）を決定していることが確認された（ＭｃＭａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。従って、以下でさらに述べるように、本開示の実施にあたっては、Ｍｔｄ及びそれに関連するＤＧＲシステムを用いることができる。
【０１１３】
多くのシュードモナス種は、Ｒ型ピオシンにための遺伝子を有する（Ｔａｋｅｙａ ｅｔ ａｌ．，１９６９；Ｋａｇｅｙａｍａ，１９７５）。Ｒ型ピオシンの遺伝子座は、約１０の構造遺伝子、並びに制御遺伝子及びシャペロン遺伝子を含む約１６の相補群から成る（Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，１９８３ａ；Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，１９８３ｂ）。形態的にも遺伝子的にも、Ｒ型ピオシンはミオウイルスバクテリオファージの尾部に類似しているいが、頭部構造を持たず、従って、核酸を含有しない（Ｋａｇｅｙａｍａ，１９６４；Ｉｓｈｉｉ ｅｔ ａｌ．，１９６５；Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，１９８２）。Ｐ２関連の祖先種のファージ尾部構造から進化したものと考えられるが、単なる欠損ファージではなく、防御的な殺菌剤としての役割のためにさらに適応したものである（Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ.，２０００）。しかし、バクテリオファージと同様に、ピオシンは、標的細菌上の特定の「受容体」分子と結合し、「コア」又は針様構造によってその膜を貫通する（Ｕｒａｔａｎｉ ＆ Ｈｏｓｈｉｎｏ，１９８４）。膜をコアが膜を貫通したことによる直接の結果として、その細菌は、細胞質膜の完全性の損傷と膜電位の喪失によって死滅し、それは単一のピオシンの攻撃によって発生可能な殺菌現象である（Ｉｉｊｉｍａ，１９７８；Ｕｒａｔａｎｉ ＆ Ｈｏｓｈｉｎｏ，１９８４；Ｓｔｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【０１１４】
典型的なＲ型ピオシンのＲＢＤ、又はＲピオシン結合の受容体結合決定因子は、細菌表面分子と結合する。Ｒ２ピオシン単離物の場合、ＲＢＤは、その尾部繊維のカルボキシ末端部分に存在する。尾部繊維は、ｐｒｆ１５遺伝子産物のホモ三量体である（Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ｐｒｆ１５遺伝子内のＲＢＤの改変、及びその改変されたｐｒｆ１５遺伝子によるＲ型ピオシンを産生するシステムの組換えにより、改変された結合特異性を有する遺伝子操作されたピオシンを作製することができる。
【０１１５】
ボルデテラバクテリオファージの主要トロピズム決定因子（Ｍｔｄ）は、結合ドメインとしてのいくつかの特有の有用な性質を有している。ボルデテラバクテリオファージのＭｔｄの機能的な形態は、ボルデテラの毒性因子タンパク質パータクチンと結合するホモ三量体である。従って、ｍｔｄ遺伝子は、ｐｒｆ１５遺伝子の遠位末端と融合してそのＭｔｄの性質を利用することができる。従って、本明細書で述べるように、本開示の一つの局面は、シュードモナスエルジノーサのＲ型ピオシン尾部繊維タンパク質（Ｐｒｆ１５）とボルデテラファージＢＰＰ‐１の主要トロピズム決定因子（Ｍｔｄ）との間の融合タンパク質の構築を含む。Ｐｒｆ１５‐Ｍｔｄ融合物を用いて、シュードモナスエルジノーサＰＡ０１ピオシンのｐｒｆ１５欠失をトランスで相補し、パータクチンを発現するボルデテラブロンキセプチカ、又はパータクチンを発現する大腸菌と結合させてこれを死滅させることができる。
【０１１６】
さらに、遺伝子型と尾部繊維の結合表現型とが組み合わされるように、Ｐ２又はＰ４バクテリオファージを、ｐｒｆ１５‐ｍｔｄ尾部繊維融合遺伝子を内部に有するサロゲートとして用いることができる。これによって、所望のＲＢＤをコードする尾部繊維遺伝子の効率的な形質導入、選別、及び単離が可能となる。
【０１１７】
投与方法
本開示の遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、適切ないかなる手段によっても投与することができる。限定されない例としては、対象への、局所、又は局在化した投与、並びに肺への投与（吸入）、カテーテル若しくは点滴チューブによる胃腸管への投与、又は全身投与が挙げられる。全身投与の代表的で限定されない例としては、腹腔内投与及び静脈内投与が挙げられる。腹腔内投与及び静脈内投与されたピオシンの防御効果は、投与したピオシンに対してインビトロで感受性を示すシュードモナスエルジノーサ株の致死量を全身感染させたマウスで実証された（Ｍｅｒｒｉｋｉｎ ＆ Ｔｅｒｒｙ，１９７２； Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，１９７４）。ある態様では、本明細書で開示するｈｍｗバクテリオシンと標的細菌集団とを接触させると、そのバクテリオシンが存在しないものと比較して、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、若しくは少なくとも１００００倍、又はそれを超える倍率での個体数の減少が見られる。他の態様では、その接触により、そのバクテリオシンが存在しないものと比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、若しくは少なくとも５０倍、又はそれを超える倍率での検出性の減少という結果を得ることができる。
【０１１８】
本開示の遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、ｈｍｗバクテリオシンに感受性を有する細菌による感染若しくは汚染を被っている、そう診断された、又はその疑いのあるいかなる対象にも投与することができる。そのような対象の限定されない例としては、動物の種（哺乳類、爬虫類、両生類、鳥類、魚類）、並びに昆虫、植物、及び真菌が挙げられる。哺乳類種の限定されない代表例としては、ヒト；非ヒト霊長類；ウシ、ブタ、ヤギ、及びヒツジなどの農業関連の種；マウス、及びラットなどのげっ歯類；イヌ、ネコ、モルモット、ラビット、及びウマなどのペット、ディスプレイ、又はショーのための哺乳類；並びにイヌ及びウマなどの作業用の哺乳類が挙げられる。鳥類の限定されない代表例としては、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、並びにオウム及びインコなどのペット又はショーのためのトリが挙げられる。本開示の遺伝子操作されたバクテリオシンで治療される動物の対象は、四足動物、二足動物、水生動物、脊椎動物、又は昆虫を含む無脊椎動物であってもよい。
【０１１９】
ある態様では、治療される対象は、ヒトの子供、又は成熟期に達していないその他の若い動物である。従って、本開示は、本開示のｈｍｗバクテリオシンに感受性を有する細菌又はその他の微生物による感染を含む小児医学的状態の治療を含む。
【０１２０】
本開示は、ヒト対象又は非ヒト対象の微生物叢中に存在する細菌の望ましくない繁殖の結果であるものなどの日和見感染の治療又は予防を提供する。日和見感染は、対象の免疫抑制状態の結果、又は泌尿生殖器（ＧＵ）若しくは胃腸（ＧＩ）管の共生細菌叢を変化させる抗生物質治療の結果である場合がある。従って、本開示は、免疫抑制状態の対象、及び他の医薬品と接触した対象の治療、又は予防を提供する。抗細菌活性を有するｈｍｗバクテリオシンは、限定されない例として抗生物質、若しくは抗真菌剤などのその他の抗細菌剤、又は抗微生物剤と組み合わせて用いることができる。「抗微生物剤」とは、単細胞生物の増殖を阻害する、若しくはこれを死滅させるために用いることができる薬剤、又は化合物である。抗微生物剤は、抗生物質、化学療法剤、抗体（補体あり、若しくはなしで）、及びＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、若しくは細胞膜の合成又は機能の化学阻害剤が挙げられる。
【０１２１】
ある態様では、ｈｍｗバクテリオシンは、「薬理学的に許容される」賦形剤又は担体と共に製剤される。そのような成分は、過度な有害な副作用なしにヒト、動物、及び／又は植物に用いるのに適するものである。有害な副作用の限定されない例としては、毒性、刺激、及び／又はアレルギー性反応が挙げられる。賦形剤又は担体は、通常、妥当なリスク対効果比に見合ったものである。多くの態様では、担体又は賦形剤は、局所投与又は全身投与に適している。限定されない医薬担体としては、無菌の水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンが挙げられる。例としては、これらに限定されないが、リン酸緩衝食塩水、水、油／水型などのエマルジョン、及び様々な種類の湿潤剤など、標準的な医薬賦形剤が挙げられる。非水性溶液の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョン、又は懸濁液が挙げられ、食塩水及び緩衝媒体が含まれる。非経口用媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、又は固定油が挙げられる。静脈内用媒体としては、体液及び栄養素の補充液、及び電解質補充液（リンゲルデキストロースを主体としたものなど）などが挙げられる。
【０１２２】
本明細書で開示するさらなる製剤及び医薬組成物は、細菌ホストに特異的な単離されたｈｍｗバクテリオシン；同じ細菌ホストを標的とする２、３、５、１０、若しくは２０種類、又はそれを超す種類のバクテリオシンの混合物；及び、異なる細菌ホスト、又は同じ細菌ホストの異なる株を標的とする２、３、５、１０、若しくは２０種類、又はそれを超す種類のバクテリオシンの混合物を含む。
【０１２３】
任意に、本開示のｈｍｗバクテリオシンを含む組成物は、本技術分野で公知の手段を用いて凍結乾燥してもよい。本技術分野で公知のように、その後、再構築して使用することができる。
【０１２４】
さらに、マイクロカプセル化されたｈｍｗバクテリオシンを含む製剤も提供される。ある態様では、これにより、徐放動態特性を提供することができるか、又は経口投与により胃を通過してより小さい若しくは長い腸への到達が可能となる。一般的に、医薬組成物は、様々な形態で作製することができ、例えば、顆粒剤、錠剤、ピル剤、坐薬、カプセル剤（例：経口送達に適合）、マイクロビーズ、マイクロスフェア、リポソーム、懸濁液、軟膏、ペースト、及びローションなどである。経口及び局所での使用に適する医薬品グレードの有機若しくは無機担体、及び／又は希釈剤を用いて、治療上有効な化合物を含む組成物を作ることができる。安定剤、湿潤剤及び乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、又は適切なｐＨを確保するためのバッファーを含むことができる。
【０１２５】
ｈｍｗバクテリオシンが使用されるのは、通常、「安全で効果的な」量又は濃度であり、それは、上述のような過度で有害な副作用を起こすことなく、所望の治療応答をもたらすのに十分な量を意味する。ｈｍｗバクテリオシンは、また、「治療効果のある」量又は濃度で使用することもでき、それは、所望の治療反応を得る効果のある量であり、例えば、これらに限定されないが、細菌細胞の分裂速度を遅延させる、又は細菌細胞の分裂を停止させる、又は細菌を死滅させる若しくは細菌の個体数の増加速度を低下させる効果のある量である。安全で効果的な量、又は治療効果量は、様々な要因で変わるが、熟練した医師であれば、過度な実験をすることなく容易に決定することができる。要因の限定されない例としては、治療を行う特定の状態、対象の身体状態、治療を受ける対象の種類、治療の期間、併用する治療（もしあれば）の性質、及び使用する具体的な製剤が挙げられる。
【０１２６】
さらに、そして、ｈｍｗバクテリオシンに対する細菌の耐性が発生する可能性の予見のもと、バクテリオシンが標的細菌の毒性因子又は適応性因子を標的とする場合、細菌の毒性又は適応性の損傷が伴う場合がある。細菌がｈｍｗバクテリオシン耐性となる主たる、しかし限定されないメカニズムは、バクテリオシンに対する受容体の欠損であることから、本明細書で開示するように毒性因子又は適応性因子を標的とすることは、従来の抗生物質及びバクテリオファージと比べて多くの利点を提供する。従来の抗生物質及びバクテリオファージに対する耐性は、受容体又は抗菌剤の標的分子の欠損以外の、多くの種々のメカニズムが原因であり得る。限定されない例として、本開示のｈｍｗバクテリオシンは、バクテリオシンを細胞環境から除去する細菌の排出ポンプに影響されることがなく、細菌の核酸不活性化メカニズムにも影響されないであろう。
【０１２７】
発明に関する主題事項を一般的に説明したが、以下に示す実施例を参照することで、同じ内容がより容易に理解され、その例は、特に断りのない限り、説明のために提供するのであって、本開示を限定することを意図したものではない。
【実施例】
【０１２８】
以下の例は説明のために提供するものであり、請求する主題事項を制限するものではない。
【０１２９】
実施例１：融合タンパク質を含む改変されたｈｍｗバクテリオシン
ａ）相補システム
本明細書で述べる改変されたｈｍｗバクテリオシンの作製を促進するために、尾部繊維をトランスに相補するためのシステムの構築を確立した。代表モデルとしてＲ２ピオシンを用い、シュードモナスエルジノーサＰＡＯ１ゲノム中のＲ２ｐｒｆ１５コード配列を欠失させることで、改変されたｐｒｆ１５遺伝子産物などの相補尾部繊維タンパク質がトランスに発現されるプラットフォームを作製した。
【０１３０】
一般に、Ｈｏａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．の方法を用いて欠失を発生させ、シュードモナスエルジノーサ株ＰＡＯ１Δｐｒｆ１５を作製した。Ｒ２シャペロンに対する、配列番号４のｐｒｆ１６コード領域は、Ｒ２ｐｒｆ１５遺伝子の末端と８ヌクレオチド分オーバーラップしており、リボソーム結合部位は、配列番号３のｐｒｆ１５コード領域内に位置している。Ｐｒｆ１６タンパク質は、必ずしもピオシン構造中には組み込まれるわけではないものの、最大の活性を得るためには、三量体尾部繊維の構築に必要であると報告されている（図８、及びＮａｙｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。従って、「尾部のない」欠損ピオシンをコードする改変されたピオシンコンストラクトの誘発によりシャペロンが産生されるように、ｐｒｆ１６の転写開始点及びそのリボソーム結合部位は共に無変性のまま維持される。
【０１３１】
簡単に述べると、ＰＲＦ１５のコドン１１‐３０１のインフレームでの欠失を、ＰＡＯ１中で以下のようにして作製した。所望の欠失の上流にある１．１ｋｂのＫｐｎＩ‐ＡｇｅＩ断片を、プライマーとしてＡＶ０８５（５’‐ＧＣＴＴＣＡＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＴＴＴＧＣ）（配列番号４６）及びＡＶ０８８（５’‐ＧＣＣＡＣＡＣＣＧＧＴＡＧＣＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＴＡＴＴＴＣＧＧＡＧＴＡＴ）（配列番号４７）を用いて、ＰＡ０１ゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅し、２．２ｋｂのＡｇｅＩ‐ＥｃｏＲＩ断片を、プライマーとしてＡＶ０８７（５’‐ＡＴＡＣＴＣＣＧＡＡＡＴＡＣＧＧＴＧＧＣＣＴＴＴＣＣＧＣＴＡＣＣＧＧＴＧＴＧＧＣ）（配列番号４８）及びＡＶ０８６（５’‐ＴＣＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＧＣＴＴＧＣＴＧＣＣＧＡＡＧＴＴＣＴＴ）（配列番号４９）を用いて増幅した。得られた制限断片を、ｐＥＸ１８ＧｍのＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ部位へクローンニングし（Ｈｏａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、ｐＥＸＧｍ‐Δｐｒｆ１５を作製した。出来上がったコンストラクトを、エレクトロポレーションによってＰＡＯ１株へ形質導入した（Ｃｈｕａｎｃｈｕｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）。組み込み体を１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンで選別し、次に、分離固体は５μｇ／ｍｌのショ糖を含みＮａＣｌとゲンタマイシンは含まない媒体中で選別した。欠失の候補は、ＰＣＲ分析、ピオシン誘発、及びＰＣＲ増幅断片の配列決定によって確認した。
【０１３２】
ＰＡＯ１Δｐｒｆ１５株は、その親株であるＰＡＯ１と同様に増殖し、ピオシンをコードする遺伝子はＳＯＳ応答を通して誘発可能に維持されており、これが細胞の溶解をもたらす。ピオシン遺伝子産物の産生はある程度はあったと思われるが、ＰＡＯ１Δｐｒｆ１５から安定な「尾部のない」ピオシン粒子は産生されなかったと思われる。
【０１３３】
Ｒ２ピオシンＰｒｆ１５は、まず、コード配列を、ホスト範囲の広いシュードモナス／大腸菌シャトルベクターｐＵＣＰ３０Ｔへクローン化することで、トランスに発現させた。図９を参照。最初のコンストラクトの中には、恒常的に、又はｔａｃプロモーターからのｌａｃＩの支配下で転写が行われるものがあった。しかし、他のコンストラクトでは、転写は、発現がＳＯＳ応答を通して制御されるように、内在性ｐｒｆ１５プロモーターで制御されるように改変された。これにより、改変されたｐｒｆ１５遺伝子の発現を、ＰＡＯ１Δｐｒｆ１５ゲノム内に存在するその他のピオシン遺伝子の発現と同調して誘発することが可能となった。
【０１３４】
簡単に述べると、広いホスト範囲のベクターｐＵＣＰ３０Ｔ（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｈ．Ｐ  ｅｔ  ａｌ．）を、特有のＢｓｐＨＩ部位を充填することで改変し、ｐＵＣＰ３０ＴΔＢｓｐを形成した。ｔａｃプロモーターを、Ｍｔｄ発現ベクター（Ｊｅｆｆｅｒｙ  Ｆ．  Ｍｉｌｌｅｒ氏，ＵＣＬＡより寄贈）から、プライマーＡＶ１１０（５’‐ＴＴＴＡＴＴＡＧＣＧＧＡＡＧＡＧＣＣＧＡＣＴＧＣＡＣＧＧＴＧＣＡＣＣＡＡＴＧ）（配列番号５０）及びＡＶ１１４（５’‐ＣＣＣＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＡＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧ）（配列番号５１）を用いてＰＣＲで増幅し、ｐＵＣＰ３０ＴΔＢｓｐへクローン化してｐＵＣＰ‐ｔａｃを作製した。
【０１３５】
Ｒ２ＰＲＦ１５コード領域は、サブクローンから、プライマーＡＶ１１８（５’‐ＣＴＴＣＣＴＴＴＣＡＴＧＡＣＧＡＣＣＡＡＴＡＣＴＣＣＧＡＡ）（配列番号５２）及びＡＶ１１６（５’‐ＡＣＣＡＣＧＡＡＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣＣＴＣ）（配列番号５３）を用いて増幅し、一方、Ｒ２ｐｒｆ１５及びｐｒｆ１６は、プライマーＡＶ１１８及びＡＶ０８６（５’‐ＴＣＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＧＣＴＴＧＣＴＧＣＣＧＡＡＧＴＴＣＴＴ）（配列番号４９）を用いて増幅した。ｐｒｆ１５及びｐｒｆ１５／１６の増幅した断片は、ＢｓｐＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化されたｐＵＣＰｔａｃへクローン化し、ｐＵＣＰ‐ｔａｃ‐ｐｒｆ１５及びＰＵＣＰ‐ｔａｃ‐ｐｒｆ１５／１６を得た。
【０１３６】
内在性ｐｒｆ１５プロモーターを用いた発現については、ｐｒｆ１５及びｐｒｆ１６を、サブクローンからのｐｒｆ１５の上流の１０８８ｂｐの配列と共に、プライマーＡＶ１０７（５’‐ＣＡＣＣＡＴＣＴＡＧＡＣＡＡＴＡＣＧＡＧＡＧＣＧＡＣＡＡＧＴＣ）（配列番号５４）及びＡＶ０９１（５’‐ＴＣＣＴＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＴＴＧＧＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣＧＣＣＧＴＧ）（配列番号５５）を用いて増幅し、ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＵＣＰ３０Ｔへクローン化して、ｐＵＣＰ‐Ｒ２ｐ‐ｐｒｆ１５／１６を作製した。
【０１３７】
浮遊増殖する対数期にあり（ｉｎ  ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｇｒｏｗｔｈ）発現プラスミドを含む細菌を、３μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで処理し、ピオシンの産生を誘発した。誘発により、安定なピオシンが、野生型ＰＡＯ１と同様の収量で産生された。このピオシンは、ＰＡＯ１に産生されたＲ２ピオシンと同じ殺菌対象の範囲と活性レベルを有していた。安定なピオシン複合体の産生には、尾部繊維タンパク質の発現が、他のピオシンをコードする遺伝子の発現に加えて必要であり、その尾部繊維遺伝子のトランスでの発現で十分であると思われる。
【０１３８】
ｐｒｆ１５がｔａｃプロモーターから恒常的に発現された場合、細胞の増殖速度は、ｌａｃＩ又は内在性プロモーターで制御された場合に比べて著しく低下した。細胞内でのＰＲＦ１５単独の産生は有害であると思われるが、両プロモーターから作られたピオシンの収量は同等である。
【０１３９】
プラスミドコンストラクトを作製して、そこからＲ２ｐｒｆ１６をＲ２ｐｒｆ１５と共に共発現させ、トランスに発現されたＰＲＦ１５の折り畳みためのｐｒｆ１６の適切な一時的な発現を確保した。
【０１４０】
ｂ）組換えｈｍｗバクテリオシン
本明細書で述べるように、その標的範囲に基づいて、Ｒ１からＲ５と称する５種類の異なるＲ型ピオシンが確認されている。尾部繊維タンパク質をコードする遺伝子配列はＲ１（配列番号１）及びＲ２（配列番号３）に対するものしか分かっていないため、Ｒ３（配列番号５）、Ｒ４（配列番号７）、及びＲ５（配列番号９）のピオシンの尾部繊維遺伝子は、その産生株中に存在するこれらの同族シャペロンをコードする配列、それぞれ配列番号６、配列番号８、及び配列番号１０、と共に、ＰＣＲを用いて単離し、配列決定した。ピオシンＲ１及びＲ２のシャペロン遺伝子も、クローン化し、それぞれ配列番号２及び４のように配列決定した。尾部繊維によって範囲が決定されるという仮説を確認するために、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のピオシンの尾部繊維タンパク質をコードする配列を取り出し、それらがＲ２ピオシン構造中へ組み入れられるように、ＰＡＯ１Δｐｒｆ１５中でトランスに発現させた。得られた組換え株の各々は、ピオシンを産生するように誘発し、図２及び８に示すように、各々の範囲をスポットアッセイで測定した。
【０１４１】
ｃ）尾部繊維タンパク質としての融合タンパク質
Ｒ２尾部繊維ｐｒｆ１５遺伝子配列とクテリオファージＰ２のＨ遺伝子配列との融合物を作製し、発現させ、これを用いて本開示のさらなる改変されたｈｍｗバクテリオシンを産生させた。多くの大腸菌株に感染するバクテリオファージＰ２は、尾部繊維をコードするＨ遺伝子（配列番号２５）を有し、これは、Ｒ２ｐｒｆ１５（配列番号３）、特にそのＮ末端コード部分との高い配列類似性を持つ。改変された尾部繊維タンパク質（配列番号２７）をコードするために、標的特異性を与える推定領域（ＲＢＤ）であるＰ２尾部繊維タンパク質のＣ末端の５５１のアミノ酸残基をコードするＨ遺伝子の一部分を、Ｒ２ＰＲＦ１５のＮ末端の基板結合領域（ＢＰＡＲ）部分である１６４のアミノ酸をコードするｐｒｆ１５の一部分と融合させた。
【０１４２】
バクテリオファージＰ２は、Ｇ遺伝子（配列番号２６）によってコードされる推定尾部繊維シャペロンもコードし、これは、Ｒ２ピオシンｐｒｆ１６（配列番号４）によってコードされるシャペロン、及び多くの他のミオウイルスファージのシャペロンと類似している。Ｇ遺伝子にコードされるシャペロンが、融合におけるＰ２尾部タンパク質のＣ末端部分の折り畳みにとって重要であると考えられることから、Ｐ２Ｇ遺伝子を共発現するコンストラクトを作製した。
【０１４３】
１から１６４位のアミノ酸をコードするＲ‐２ｐｒｆ１５の一部分を、プライマーＡＶ１１８及びＡＶ１２７（５’‐ＴＴＣＴＴＴＡＡＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＴＧ）（配列番号５６）を用いてサブクローンから増幅し、ＢｓｐＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。１５８位から６６９位のアミノ酸をコードするＰ２のＨ遺伝子の一部分は、プライマーＡＶ１２４（５’‐ＣＣＴＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＧＣＧＧＣＡＴＴＴＣＣＧ）（配列番号５７）及びＡＶ１２６（５’‐ＴＣＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＣＧＴ）（配列番号５８）を用いてＰ２ファージストック（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃａｌｅｎｄａｒ）から増幅した。Ｐ２Ｈ遺伝子１５８‐６６９にＧ遺伝子をプラスしたものは、プライマーＡＶ１２４及びＡＶ１２５（５’‐ＣＣＴＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＧＣＧＧＣＡＴＴＴＣＣＧ）（配列番号５９）を用いて増幅した。Ｐ２からの各ＰＣＲ産物は、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化した。ｐＵＣＰ‐ｔａｃ‐Ｒ２‐Ｐ２Ｈは、１から１６４位のアミノ酸断片をコードするｐｒｆ１５断片を、１５８から６６９位のアミノ酸断片をコードするＰ２Ｈ遺伝子断片と共に、ＢｓｐＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化されたｐＵＣＰ‐ｔａｃへクローン化することで作製した。ｐＵＣＰ‐ｔａｃ‐Ｒ２‐Ｐ２ＨＧは、１から１６４位のアミノ酸断片をコードするｐｒｆ１５断片を、１５８から６６９位のアミノ酸断片をコードするＰ２Ｈ遺伝子にＧ遺伝子をプラスしたものと共に、ＢｓｐＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化されたｐＵＣＰ‐ｔａｃへクローン化することで作製した。
【０１４４】
簡単に述べると、ＰＡ０１Δｐｒｆ１５は、ｐｒｆ１５‐Ｐ２Ｈ遺伝子融合コンストラクトで形質転換され、マイトマイシンＣによってピオシン産生を誘発した。ピオシン粒子を精製し、スポット試験及び細菌生存率アッセイによって活性の試験を行った（図２参照）。Ｒ２‐Ｐ２融合尾部繊維を有する精製されたピオシン粒子は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ１ａに対する殺菌活性を有したが、シュードモナスエルジノーサ株１３ｓを死滅させることはできなかった。さらに、活性ピオシンを産生するには、Ｐ２Ｇ遺伝子の発現が必要であった。このことは、図８に示すように、尾部繊維のＣ末端部分の適切な折り畳みにシャペロンが必要であるという仮説を裏付けるものである。
【０１４５】
種々のＲ２‐Ｐ２尾部繊維タンパク質融合体の、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ１ａを死滅させる機能性ピオシンを形成する能力を、一連の種々のＲ２‐Ｐ２融合体によって調べた。このような融合体の代表例を、そのＥ．ｃｏｌｉ  Ｃ１ａに対する殺菌活性の有無と共に図４乃至図７に示す。
【０１４６】
ｄ）追加的な融合体
エルシニアぺスチスを標的とする追加的な改変されたｈｍｗバクテリオシンを作製した。Ｌ‐４１３ｃは、ほとんどのエルシニアぺスチス株に感染するエルシニオファージ（ｙｅｒｓｉｎｉｏｐｈａｇｅ）である（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃａｌｅｎｄａｒ，ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）。ほとんどのＬ‐４１３ｃゲノムはＰ２との高い類似性を有するが、重要な例外として配列番号２８の尾部繊維Ｈ遺伝子があり、これは大きく異なっている。理論に束縛されるものではなく、本開示の理解を深めるために提供するものであるが、尾部繊維Ｈ遺伝子の違い、従ってそれがコードするタンパク質の違いは、異なるホストの範囲に最も寄与していると考えられる特徴である。
【０１４７】
しかし、Ｌ‐４１３ｃＨ遺伝子（配列番号２８）のＮ末端は、Ｐ２の対応する部分（配列番号２５）との配列類似性を相当に共有しており、これは、その基板結合の機能によるものと考えられる。Ｒ２ＰＲＦ１５のＮ末端の１から１６４位のアミノ酸をＬ‐４１３ｃ尾部繊維のＣ末端部（１５８位から９１３位）に融合した融合尾部繊維を作製して図１０（配列番号３０）の改変された尾部繊維とするための融合体を構築した。この融合体を、Ｌ‐４１３ｃ尾部繊維同族シャペロン、Ｇ遺伝子（配列番号２９）、と共にＰＡＯ１Δｐｒｆ１５中で発現させた。誘発の後、産生されたピオシン粒子は、エルシニアぺスチスＫＩＭ、並びにＥ．ｃｏｌｉ  Ｃを死滅させ、従って、エルシニオファージＬ‐４１３ｃのホスト範囲と同様の死滅範囲を有する。この改変されたピオシンは、いずれのシュードモナス株も死滅させなかった。
【０１４８】
シュードモナスエルジノーサＲ型ピオシン尾部繊維ＢＰＡＲ（ｐｒｆ１５によってコードされる）と尾部繊維遺伝子ｏｒｆ３４及び／又はＶＨＭＬの尾部繊維遺伝子ｏｒｆ３５からのＲＢＤ（それぞれ、配列番号２１及び２２）との間で作製した新規な融合尾部繊維を用いて、さらなる改変されたｈｍｗピオシン粒子を作製した。このピオシン粒子を作製するために、ＶＨＭＬ同族シャペロン遺伝子（配列番号２３）を、改変された尾部繊維融合遺伝子と共発現させた。改変された尾部繊維を有するピオシンが形成され、これを分析した。得られた、ＶＨＭＬ由来ＲＢＤを有する改変されたｈｍｗバクテリオシンは、天然のＶＨＭＬのＤＧＲによる多様化に供することができる。
【０１４９】
ボルデテラバクテリオファージＢＰＰ‐１の主要トロピズム決定因子（Ｍｔｄ）は、Ｃ型レクチン（ＣＴＬ）ドメインを有し、これは、多くの異なる生物学的状況における、多くの様々な種類の分子に対する結合決定因子として作用する（Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，１９９９；ＭｃＭａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＢＰＰ‐１では、Ｍｔｄは、ファージの尾部末端に位置するホモ三量体球状ドメインとして組み込まれており、そこで、ボルデテラブロンキセプチカ及びボルデテラパータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の外部表面上で発現する毒性因子、表面タンパク質パーテクチンと結合することができる（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００４）。これに関して、Ｍｔｄは、ファージが媒介するホーミング変異原性（ｈｏｍｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）の標的でもあり、それによって、バクテリオファージが、その変化し続けるホストに感染するための新規な結合決定因子を獲得する結果となり得る。
【０１５０】
Ｍｔｄドメイン及びそのいくつかの多様化バリアントに関する最近の構造研究により、三量体構造の繊維の先端が、１０兆個を超えるバリアント結合リガンドを有することができる固定された足場をいかにして形成するかが示された（ＭｃＭａｈｏｎ ｅｔ ａｌ．２００５）。Ｍｔｄドメインをピオシン尾部繊維タンパク質上へ融合し、その後、Ｍｉｌｌｅｒらによって報告されたＤＧＲシステムを用いてＭｔｄドメインを多様化することにより（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｄｏｕｌａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、バリアントの非常に大きなライブラリーが作製され、そこから、結合特異性の異なるピオシン尾部をコードする遺伝子が選別され、入手される。
【０１５１】
実施例２：融合タンパク質のアッセイ
ａ）ピオシンの精製とアッセイ
ＰＡＯ１及び誘導体を、プラスミドを維持するために必要な場合は５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを添加したＧ培地中、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で増殖させた。培養物のＯＤ６００が０．２５０に達したところで、最終濃度３μｇ／ｍｌとなるようにマイトマイシンＣを添加した。培養物を、溶解が発生するまでさらに２．５時間インキュベートした。５μｌのＤＮａｓｅ１を添加し、培養物をさらに３０分間インキュベートした。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＬＡ‐１６．２５０ローターにより、１２０００ｒｐｍで１時間遠心分離することで細片を除去した。上清を氷上で攪拌しながら、そこへ、最終添加体積が溶菌液の上清１００ｍｌに対して６５ｍｌとなるまで飽和硫酸アンモニウムを１ｍｌ／ｍｉｎの割合でゆっくり添加した。これを４℃で一晩貯蔵した。１２０００ｒｐｍで１時間遠心分離することで硫酸アンモニウムの析出物を回収し、ペレットを１０ｍｌのＴＮ５０バッファー（１０ｍＭのｔｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中へ再懸濁した。再懸濁溶液中のピオシン粒子は、次に、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＡ‐２５．５０ローターにより、２００００ｒｐｍ（６５０００×ｇ）の高速で１時間かけて沈殿させ、３乃至５ｍｌのＴＮ５０バッファー中へ再懸濁した。ピオシン調製物は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析により、＞９０％の純度であると判断した。
【０１５２】
ピオシンの定量アッセイは、Ｋａｇａｙａｍａ  ｅｔ ａｌ．，１９６４に記載の方法を若干修正した方法により、生存細菌をカウントすることで行なった。ピオシンサンプルを、標的細菌（およそ１×１０9ＣＦＵ／ｍｌ）と共に３７℃で４０分間インキュベートした。次に、サンプルを希釈し、プレーティングして生存細菌をカウントした。ピオシン粒子の数と生存細菌の画分とは、ポアソン分布、ｍ＝−ｌｎＳ、の関係にあり、ここで、ｍは１細胞あたりの致死事象（ｌｅｔｈａｌ  ｅｖｅｎｔ）の平均回数であり、Ｓは生存細菌の画分である。１ｍｌあたりの活性ピオシン粒子の合計数は、ｍ×細胞数／ｍｌ、となる。このアッセイで使用したのはシュードモナスエルジノーサの１３ｓ株であり、これは、多くの抗生物質に耐性を有するが、５種類のＲ型ピオシンすべてに感受性を有する臨床分離株である。標的である大腸菌は、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｃａｌｅｎｄａｒ氏よりご提供いただいたＣ１ａであった。
【０１５３】
半定量アッセイも、スポット法で行い、ピオシンサンプルをＴＮ５０バッファーで段階希釈して、標的細菌の菌叢上にスポッティングした。３７℃で一晩インキュベートした後、ピオシン活性は、菌叢上の菌の死滅によるクリア領域によって観察することができた。このアッセイフォーマットによる代表的な結果を図２に示す。
【０１５４】
実施例３：遺伝子操作された尾部繊維のスクリーニングのための組換えバクテリオファージ
遺伝子型と尾部繊維の結合表現型とが組み合わされるように、Ｐ４バクテリオファージを、Ｐｒｆ１５に基づく尾部繊維融合遺伝子を内部に有するサロゲートとして用いる。これによって、所望の尾部繊維遺伝子の効率的な選別、及び形質導入が可能となる。
【０１５５】
バクテリオファージＰ２は、他の腸内の種に感染することができる溶原性大腸菌ファージであり、シュードモナスエルジノーサ中で複製することができるが、これに感染することはできない（Ｂｅｒｔａｎｉ  ＆  Ｓｉｘ，１９８８；Ｋａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。Ｒ型ピオシンは、遺伝子的にも構造的にもＰ２と近い関係にあり、Ｈ遺伝子にコードされるＰ２尾部繊維タンパク質は、基板との結合を生ずるｐｒｆ１５のＮ末端部分と相同性を示す（Ｈａｇｇａｒｄ‐Ｌｊｕｎｇｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。Ｐ２又はＰ４バクテリオファージを、プラスミドにコードされた尾部繊維がＰ２ファージにコードされた繊維の代わりに組み込まれたサロゲートファージとして用いることにより、ピオシンでの意図する機能的な関連性と極めて類似する関連性において融合繊維の提示及び選別が可能となる。
【０１５６】
尾部繊維遺伝子型は、遺伝子選別のために、形質導入ファージ粒子内で結合表現型と物理的に組み合わせることができ、これはファージディスプレイ技術と類似している。アンバー変異をその繊維タンパク質（Ｈ）遺伝子に有するＰ２ファージは、通常はバクテリオファージゲノムＤＮＡのパッケージングに対するシグナルとして作用するｃｏｓパッケージング部位（ｃｏｓ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｓｉｔｅ）を有するプラスミドを内部に有する大腸菌に感染する場合（Ｚｉｅｒｍａｎｎ  ＆  Ｃａｌｅｎｄａｒ，１９９１；Ｋａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）、新たに合成されたＰ２ファージの頭部にｃｏｓを含むプラスミドをパッケージすることになる。そのプラスミドは、ｐｒｆ１５に基づく尾部融合遺伝子をコード、及び発現し、ゲンタマイシン耐性を付与する。Ｐ２感染大腸菌内でこのプラスミドから発現された融合尾部繊維は、欠損（アンバーが切断された）Ｈ遺伝子産物（Ｐ２尾部繊維タンパク質）の代わりにＰ２バクテリオファージ中へ組み込まれる。この細菌の溶解により、放出されたＰ２に基づく形質導入粒子は、Ｐ２ゲノムではなくｐｒｆ１５に基づく尾部融合遺伝子を含むｃｏｓ含有プラスミドを持ち、Ｐ２尾部繊維ではなくＰｒｆ１５融合尾部繊維を有する。
【０１５７】
細胞と結合し、バクテリオファージの侵入メカニズムを誘発する能力のある形質導入ファージ粒子は、そこで、標的化に成功した細菌にゲンタマイシン耐性を付与し、そこからゲンタマイシン選別（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）の下での細菌の複製の後、選別された繊維融合遺伝子がプラスミドから単離される。改変尾部繊維ＲＢＤの機能の再設計及び最適化を行うために、プラスミド上の尾部繊維遺伝子を容易にさらに操作して、多くの融合接合部を作り出し、ＲＢＤの多様化を行う。
【０１５８】
この方法により、従来のファージディスプレイシステムを用いた場合の三量体タンパク質のＣ末端ディスプレイによってもたらされる多くの困難も解決される（Ｈｅｌｄ ＆ Ｓｉｄｈｕ，２００４）。バクテリオファージＰ２は、遺伝子的にも形態的にもピオシンに類似する尾部繊維を有する（Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，２０００）。尾部繊維は、Ｐ２及びピオシンの基板へＮ末端を通して結合し、Ｐ２及びＲ２ピオシンの尾部繊維のＮ末端は、著しい配列類似性を有する（Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｈａｇｇａｒｄ‐Ｌｊｕｎｇｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。さらに、Ｐ２関連ファージであるＰＳ１７の尾部繊維遺伝子は、Ｒ２ピオシン尾部繊維遺伝子であるｐｒｆ１５を相補することができる（Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ，１９８４；Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  ＆  Ｉｎａ，１９８９）。
【０１５９】
別の選択肢として、ＲＢＤをＨ遺伝子尾部繊維のＮ末端ドメインへ直接融合させるか、又は、ビブリオハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉｉ）のＶＨＭＬファージ（ＢＰＰ‐１のように、これも機能性ＤＧＲを含む）の尾部繊維遺伝子をＰ２のＨ遺伝子のＮ末端ドメインへ融合させる。
【０１６０】
実施例４：所望の尾部繊維遺伝子を回収する方法
遺伝子操作された尾部繊維遺伝子を持つＰ２、Ｐ４、又はΦＣＴＸバクテリオファージは、ピオシン尾部繊維の遺伝子型を結合表現型と組み合わせるサロゲートとして作用する。サロゲートバクテリオファージの内部に保持される尾部繊維遺伝子の多様化された、又は変異誘発されたライブラリーから特定の結合表現型を選別又はスクリーニングすることにより、所望の結合特異性をコードする尾部繊維遺伝子を単離することができる。選別は、まず不要のバインダーを除去し、その後、残ったサロゲートの中から意図する標的分子と結合するものを単離するか、又はその逆を行うことによってサロゲートバクテリオファージ若しくは形質導入粒子を固相標的分子上へ吸着させるという濃縮サイクルを、１回若しくは複数回行うことによって実施することができる。別の選択肢として、選別は、いずれかの結合工程を単独で適用することによって行うこともできる。最終的には、所望の結合表現型を示すサロゲートを、制限酵素断片のクローン化、又は尾部繊維遺伝子の多様化部の末梢部分の特定のＤＮＡ配列と結合するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ反応により、ＤＮＡ抽出、及び保持されている尾部繊維遺伝子の単離に付すことができる。
【０１６１】
望ましいサロゲートバクテリオファージは、例えばサロゲートバクテリオファージがホストに感染する際に用いる毒性因子又は適応性因子などの目的とする標的分子を発現する細菌の菌叢上で精製されたプラークであってよい。この因子を発現する細菌は、例えば、シュードモナスエルジノーサなどの目的の病原体であってよく、又は、例えば、標的毒性因子若しくは適応性因子を発現するよう遺伝子操作された大腸菌などの非病原体であってもよい。レプリカ平板法又は段階的平板法（ｓｅｒｉａｌ  ｐｌａｔｉｎｇ）を用いて、サロゲートバクテリオファージが、標的因子を発現しない近縁の細菌株上にプラークを形成しないことを確実にすることができる。例えば、特定の毒性因子の発現が欠損したシュードモナスエルジノーサの挿入ミュータントを用いて、その毒性因子若しくは適応性因子を発現する対応する（アイソジェニックな）細菌上でのプラーク形成又はパンニングの前若しくは後に、サロゲートバクテリオファージのスクリーニング、又は吸着による除去を行うことができる。
【０１６２】
サロゲートファージ又は形質導入粒子が標的を発現する細菌上でプラークを形成しない場合であっても、感染又は形質導入された細菌は、内部に保持するプラスミド若しくはファスミドと共に抗生物質耐性を獲得し、従って、選択的な増殖及びそれに続く抽出を行うことで、多コピープラスミド及びその所望の尾部繊維遺伝子を単離することができる。
【０１６３】
このような技術により、所望の特定の結合表現型を示すサロゲートバクテリオファージ又は形質導入粒子の同定及び単離が可能となり、そこから所望の特定の非天然のｈｍｗバクテリオシン尾部繊維遺伝子が抽出される。さらに、サロゲートを哺乳類の分子、細胞、若しくは組織と結合させることにより、治療用ｈｍｗバクテリオシンに組み込まれた場合に有害な事象を起こす恐れのある尾部繊維をコードするいかなる遺伝子もライブラリーから除去することができる。
【０１６４】
挿入ミュータントであるシュードモナスエルジノーサ細菌株のライブラリーが利用可能であり、このミュータントは、病原性の強い親ＰＡ１４シュードモナスエルジノーサとは、各々の重複しないアイソジェニックミュータントから一つ欠損する形で一連の特定の毒性因子の発現が欠損していることだけが異なっている（ａｕｓｕｂｅｌｌａｂ．ｍｇｈ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｃｇｉ‐ｂｉｎ／ｐａ１４／ｈｏｍｅ．ｃｇｉのホームページを参照のこと）。これらのアイソジェニックミュータント株は、他の一般的な表面分子ではなく、標的毒性因子に対するサロゲートバクテリオファージの特異性を確保するためのツールを提供する。例えば、サロゲートＰ４バクテリオファージの集団を、特定の標的毒性因子を欠損したシュードモナスエルジノーサのミュータントの高密度培養物と共にインキュベートすることで、アイソジェニックミュータント及び毒性の親株の両方に存在する表面分子と結合するサロゲートバクテリオファージ又は形質導入粒子を吸着させて集団から除去することができる。除去処理された集団は、所望の毒性因子と結合するサロゲートの濃縮が行われる。特定の毒性因子又は適応性因子を発現する細菌と結合してこれに感染するサロゲートバクテリオファージを単離した後は、各々を、標的因子を欠損しているアイソジェニックミュータント株に感染することができないものについて直接スクリーングすることができる。選別されたプラスミドは、サロゲート形質導入粒子に再パッケージし、吸着‐除去及び感染のプロセスを通してさらなる濃縮、及び最終的には毒性因子又は適応性因子を標的とするための所望の尾部繊維をコードするｐＵＣに基づくプラスミドの精製を行うことで、何度でも再利用可能である。
【０１６５】
実施例５：遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンの作製方法
改変尾部繊維遺伝子は、プラスミドが媒介する対立遺伝子交換反応を用いて、（ｉ）内在するｐｒｔＲ、ｐｒｔＮ、ｐｒｆ１５、及びホリン（ｐｒｆ９又はＰＡ０６１４）遺伝子が欠失若しくは無能力化されたＲピオシン遺伝子クラスター（エンドリシン遺伝子を含む）も、例えば細菌人工染色体（ＢＡＣ）上で、内部に保持する産生細菌中での発現のために、制御されたプロモーターの下、プラスミド中へ組換えられるか、又は（ｉｉ）ＢＡＣベクターそのものを含むピオシンクラスター中へ組換えられる。
【０１６６】
ｌａｃ又はｔａｃなどの遺伝子操作された制御可能なプロモーターを通してのｐｒｔＮの直接の誘発など、ピオシン遺伝子及び遺伝子操作された尾部繊維遺伝子の誘発により、ホスト細胞は、栄養素が枯渇して増殖が止まるまでピオシンを合成する（Ｙｏｕｎｇ，Ｒｙ，２００６）。産生細菌は、ホリン遺伝子の不活化によって細胞の溶解に必要である細胞質エンドリシンの細菌細胞壁への到達が妨げられるため、クロロホルムの非存在下では溶解しない。使い終わった細胞は、遠心分離又はろ過で回収し、その後、細胞質を満たした溶解性ピオシンの回収を所望するまで、凍結する。解凍によって内部細胞膜が破裂し、エンドリシンが放出されて細菌が溶解し、それによって、産物である改変ピオシンが放出される。必要であれば、少量のクロロホルムを細菌ペーストが解凍される水性溶媒に添加することによって、細菌膜の破壊を加速若しくは完了させることができる。
【０１６７】
参考文献
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Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．”Ｔｈｅ  ｂｒｏａｄ  ｈｏｓｔ  ｒａｎｇｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｓｔｒａｉｎ  ＰＡ１４  ｃａｒｒｉｅｓ  ｔｗｏ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｓｌａｎｄｓ  ｈａｒｂｏｒｉｎｇ  ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  ａｎｉｍａｌ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｇｅｎｅｓ．”ＰＮＡＳ  １０１：２５３０‐２５３５，２００４
Ｈｅｌｄ  Ｈ，ＳＳ  Ｓｉｄｈｕ．２００４．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍ１３  Ｍａｊｏｒ  Ｃｏａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．３４０：５８７‐９７
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Ｈｏａｎｇ，Ｔ．Ｔ．，Ｋａｒｋｈｏｆｆ‐Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ｋｕｔｃｈｍａ，Ａ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｈ．Ｐ．，Ａ  ｂｒｏａｄ‐ｈｏｓｔ‐ｒａｎｇｅ  Ｆｌｐ‐ＦＲＴ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｌｙ‐ｌｏｃａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｍａｒｋｅｄ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｍｕｔａｎｔｓ  Ｇｅｎｅ  ２１２（１），７７‐８６（１９９８）
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Ｉｔｏ，Ｓ．，Ｋａｇａｙａｍａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｆ．Ｅｇａｍｉ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｙｏｃｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６  ２０５‐２１４  （１９７０）．
Ｊａｂｒａｎｅ  Ａ，Ｓａｂｒｉ  Ａ，Ｃｏｍｐｅｒｅ  Ｐ，Ｊａｃｑｕｅｓ  Ｐ，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ  Ｉ，Ｖａｎ  Ｂｅｅｕｍｅｎ  Ｊ，Ｔｈｏｎａｒｔ  Ｐ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｒａｃｉｎ  Ｐ，ａ  ｐｈａｇｅ‐ｔａｉｌ‐ｌｉｋｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ，ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ，ｔｈｅ  ｆｉｒｅ  ｂｌｉｇｈｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２  Ｎｏｖ；６８（１１）：５７０４‐１０．
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Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．”Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｍｕｔａｎｔ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．”ＰＮＡＳ  １００（２４）：１４３３９‐１４３４４，２００３
Ｋａｇｅｙａｍａ  Ｍ，Ｆ  Ｅｇａｍｉ．１９６２．Ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｏｍｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｐｙｏｃｉｎ，ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９：４７１‐６
Ｋａｇｅｙａｍａ  Ｍ，Ｋ  Ｉｋｅｄａ，ａｎｄ  Ｆ  Ｅｇａｍｉ．１９６４．Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｐｙｏｃｉｎ．ＩＩＩ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｙｏｃｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：５９‐６４．
Ｋａｇｅｙａｍａ  Ｍ，Ｓｈｉｍｏｍｉｙａ  Ｔ，Ａｉｈａｒａ  Ｙ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍ．１９７９．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ｒ‐ｔｙｐｅ  ｐｙｏｃｉｎｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．３２：９５１‐９５７．
Ｋａｇｅｙａｍａ  Ｍ．１９６４．Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｐｙｏｃｉｎ  Ｉ．Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：４９‐５３
Ｋａｇｅｙａｍａ，Ｍ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｓ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，ｉｎ：Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ｐｐ  ２９１‐３０５  １９７５．
Ｋａｈｎ  ＭＬ，ＲＧ  Ｚｉｅｒｍａｎｎ，ＤＷ  Ｄｅｈｏ，Ｍ  Ｏｗ，Ｇ  Ｓｕｎｓｈｉｎｅ，Ｒ  Ｃａｌｅｎｄａｒ．１９９１．Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｐ２  ａｎｄ  Ｐ４．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０４：２６４‐２８０
Ｋｕｍａｚａｋｉ  Ｔ，Ｙ  Ｓｈｉｍｉｚｕ，ＳＩ  Ｉｓｈｉｉ．１９８２．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｙｏｃｉｎ  Ｒ１  Ｆｉｂｅｒｓ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．９１：８２５‐３５
Ｌｅｅ  ＥＪ，ＤＪ  Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  ＳＭＪ  Ｆｌｅｉｓｚｉｇ．２００３．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＥｘｓＡ  ｉｎ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｉｎ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｍｏｄｅｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．４４：５２２０‐５２２７
Ｌｅｅ  ＦＫ，Ｄｕｄａｓ  ＫＣ，Ｈａｎｓｏｎ  ＪＡ，Ｎｅｌｓｏｎ  ＭＢ，ＬｏＶｅｒｄｅ  ＰＴ，Ａｐｉｃｅｌｌａ  ＭＡ．１９９９  Ｔｈｅ  Ｒ‐ｔｙｐｅ  ｐｙｏｃｉｎ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｃ  ｉｓ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｔａｉｌ‐ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｓｉｎｇｌｅ‐ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６７（２）：７１７‐２５．
Ｌｉｕ  Ｍ，Ｍ  Ｇｉｎｇｅｒｙ，ＳＲ．Ｄｏｕｌａｔｏｖ，Ｙ  Ｌｉｕ，Ａ  Ｈｏｄｅｓ，Ｓ  Ｂａｋｅｒ，Ｐ  Ｄａｖｉｓ，Ｍ  Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｃ  Ｃｈｕｒｃｈｅｒ，Ｋ  Ｍｕｎｇａｌｌ，ＭＡ  Ｑｕａｉｌ，Ａ  Ｐｒｅｓｔｏｎ，ＥＴ  Ｈａｒｖｉｌｌ，ＤＪ  Ｍａｓｋｅｌｌ，ＦＡ  Ｅｉｓｅｒｌｉｎｇ，Ｊ  Ｐａｒｋｈｉｌｌ，ａｎｄ  ＪＦ  Ｍｉｌｌｅｒ．２００４．Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ‐Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒｏｐｉｓｍ‐Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．１８６  ４７６‐４８１
Ｍａｈ‐Ｓａｄｏｒｒａ  ＪＨ，ＳＧ  Ｙａｖｕｚ，Ｄ  Ｍ  Ｎａｊｊａｒ，ＰＲ  Ｌａｉｂｓｏｎ，ＣＪ  Ｒａｐｕａｎｏ，ＥＪ  Ｃｏｈｅｎ．２００５．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｌｅｎｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｕｌｃｅｒｓ．Ｃｏｒｎｅａ．２４：５１‐５８
Ｍａｔｓｕｉ  Ｈ，Ｓａｎｏ  Ｙ，Ｉｓｈｉｈａｒａ  Ｈ，Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  Ｔ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｙｏｃｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｂｙ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  （ｐｒｔＮ）  ａｎｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  （ｐｒｔＲ）  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｇｅｎｅｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９３  Ｍａｒ；１７５（５）：１２５７‐６３．
ＭｃＭａｈｏｎ  ＳＡ，ＪＬ  Ｍｉｌｌｅｒ，ＪＡ  Ｌａｗｔｏｎ，ＤＥ  Ｋｅｒｋｏｗ，Ａ  Ｈｏｄｅｓ，ＭＡ  Ｍａｒｔｉ‐Ｒｅｎｏｍ，Ｓ  Ｄｏｕｌａｔｏｖ，Ｅ  Ｎａｒａｙａｎａｎ，Ａ  Ｓａｌｉ，ＪＦ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐ  Ｇｈｏｓｈ．２００５．Ｔｈｅ  Ｃ‐ｔｙｐｅ  Ｌｅｃｔｉｎ  Ｆｏｌｄ  ａｓ  ａｎ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．１２：８８６‐８９２
ＭｃＮａｍａｒａ  ＮＡ，ＫＡ  Ｐｏｌｓｅ，ＳＡ  Ｆｕｋｕｎａｇａ，ＪＳ  Ｍａｅｂｏｒｉ，ＲＭ  Ｓｕｚｕｋｉ．１９９８．Ｓｏｆｔ  ｌｅｎｓ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｗｅａｒ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．１０５：２３３０‐２３３５
Ｍｅａｄｏｗ，Ｐ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  Ｐ．Ｌ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｒ‐ｔｙｐｅ  ｐｙｏｃｉｎｓ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｅ７９  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｒｅ  ｐａｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＣ１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０８：３３９‐３４３．１９７８
Ｍｅｒｒｉｋｉｎ  ＤＪ，Ｔｅｒｒｙ  ＣＳ．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｙｏｃｉｎ  ７８‐Ｃ２  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９７２  Ｊａｎ；２３（１）：１６４‐５．
Ｍｉｃｈｅｌ‐Ｂｒｉａｎｄ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｂａｙｓｓｅ，Ｃ．Ｔｈｅ  ｐｙｏｃｉｎｓ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．２００２  Ｍａｙ‐Ｊｕｎ；８４（５‐６）：４９９‐５１０．
Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｈｒｅａｔｓ  Ｔｏ  Ｈｅａｌｔｈ：Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ａｎｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，Ｍａｒｃｈ  ２００３  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ
Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．”Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ‐ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇｓ  ｏｆ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．”Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：９１８‐９２１，２００２
Ｍｏｒｓｅ  ＳＡ，Ｊｏｎｅｓ  ＢＶ，ａｎｄ  Ｌｙｓｋｏ  ＰＧ．１９８０．Ｐｙｏｃｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１８（３）：４１６‐２３．
Ｍｏｒｓｅ  ＳＡ，Ｖａｕｇｈａｎ  Ｐ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｄ，ａｎｄ  Ｉｇｌｅｗｓｋｉ  ＢＨ．１９７６．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ  ｂｙ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１０（２）：３５４‐６２．
Ｍｏｓｉｇ  Ｇ  ａｎｄ  Ｆ  Ｅｉｓｅｒｌｉｎｇ．２００６．Ｔ４  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｈａｇｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ．Ｃａｌｅｎｄａｒ，Ｒ．ｅｄ．Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ．ｐｐ２２５‐２６７
Ｎａｋａｙａｍａ  Ｋ，Ｋａｎａｙａ  Ｓ，Ｏｈｎｉｓｈｉ  Ｍ，Ｔｅｒａｗａｋｉ  Ｙ，Ｈａｙａｓｈｉ  Ｔ．Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｈｉ  ＣＴＸ，ａ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ‐ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｐｈａｇｅ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｈａｇｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９  Ｊａｎ；３１（２）：３９９‐４１９．
Ｎａｋａｙａｍａ  Ｋ，Ｔａｋａｓｈｉｍａ  Ｋ，Ｉｓｈｉｈａｒａ  Ｈ，Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  Ｔ，Ｋａｇｅｙａｍａ  Ｍ，Ｋａｎａｙａ  Ｓ，Ｏｈｎｉｓｈｉ  Ｍ，Ｍｕｒａｔａ  Ｔ，Ｍｏｒｉ  Ｈ，Ｈａｙａｓｈｉ  Ｔ．Ｔｈｅ  Ｒ‐ｔｙｐｅ  ｐｙｏｃｉｎ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ｐ２  ｐｈａｇｅ，ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｆ‐ｔｙｐｅ  ｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｌａｍｂｄａ  ｐｈａｇｅ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００  Ｏｃｔ；３８（２）：２１３‐３１．
Ｐａｐａｎｉｋｏｌｏｐｏｕｌｏｕ  Ｋ，Ｖ  Ｆｏｒｇｅ，Ｐ  Ｇｏｅｌｔｚ，ａｎｄ  Ａ  Ｍｉｔｒａｋｉ．２００４．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｔｒｉｍｅｒｓ  ｂｙ  Ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓｈａｆｔ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｆｏｌｄｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４  Ｆｉｂｒｉｔｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７９：８９９１−８９９８
Ｐｒｅｓｔｏｎ  ＭＩ，ＳＭＬ  Ｆｌｅｉｓｚｉｇ，ＴＳ  Ｚａｉｄｉ，ＪＢ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，ＶＤ  Ｓｈｏｒｔｒｉｄｇｅ，ＭＬ  Ｖａｓｉｌ，ＧＢ  Ｐｉｅｒ．１９９５．Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．６３：３４９７‐３５０１
Ｑｕ  Ｙ，Ｈｙｍａｎ  Ｐ，Ｈａｒｒａｈ  Ｔ，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  Ｅ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙｐａｓｓ  ｏｆ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｂｙ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｃｏｉｌｅｄ‐ｃｏｉｌ  ｍｏｔｉｆ  ｉｎ  Ｔ４  ｔａｉｌ  ｆｉｂｅｒ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００４  Ｄｅｃ；１８６（２４）：８３６３‐９．
Ｒａｍｐｈａｌ  Ｒ，ＭＴ  ＭｃＮｉｅｃｅ，ＦＭ  Ｐｏｌａｃｋ．１９８１．Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ｃｏｒｎｅａ：ａ  ｓｔｅｐ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｎ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１３：４２１‐４２５  
Ｒｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．”ＡＣＥ  ｉｓ  ａ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ＭＳＣＲＡＭＭ  ｆｒｏｍ  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２６９３９‐２６９４５，１９９９
Ｒｉｌｅｙ  ＭＡ，ＪＥ  Ｗｅｒｔｚ．２００２．Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｓ：ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，ｅｃｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：１１７‐１３７
Ｒｏｌａｎｄ  ＰＳ，ＤＷ  Ｓｔｒｏｍａｎ．２００２．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｃｕｔｅ  Ｏｔｉｔｉｓ  Ｅｘｔｅｒｎａ．Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ．１１２：１１６６‐１１７７
Ｒｕｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．”Ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ‐ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．”ＰＮＡＳ  ９６（２６）：１４７６５‐１４７７０，１９９９
Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ  ＨＰ．２００１．Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｔｏ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｔｏ  ｍｏｎｉｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１２：４３９‐４４５
Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｈ．Ｐ．，Ｋｌａｓｓｅｎ，Ｔ．ａｎｄ  Ｈｏａｎｇ，Ｔ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ
Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｙ，Ｔ  Ｋａｍａｚａｋｉ，ＳＩ  Ｉｓｈｉｉ．１９８２．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｔ  Ｆｉｂｅｒｓ  ｏｆ  ａ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ‐Ｔａｉｌ‐Ｌｉｋｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ，Ｐｙｏｃｉｎ  Ｒ１  ｂｙ  Ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｏｒｇａｎｏｍｅｒｃｕｒｉａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  Ｔｒｙｐｓｉｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：６９２‐６９５
Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  Ｔ  ＆  Ｓ  Ｉｎａ．１９８９．Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＰＳ１７  ａｎｄ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｒ‐Ｔｙｐｅ  Ｐｙｏｃｉｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７１：２２８７‐２２９２
Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  Ｔ，Ｓ  Ｓｈｉｇａ，Ａ  Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｍ  Ｋａｇｅｙａｍａ．１９８３ｂ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ｐｙｏｃｉｎ  Ｒ２  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ．ＩＩ．Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｙｏｃｉｎ  Ｒ２  ｇｅｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｒ‐ｐｒｉｍｅ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｒ６８．４５．Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１８９：３８２‐３８９
Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  Ｔ，Ｓ  Ｓｈｉｇａ，Ｍ  Ｋａｇｅｙａｍａ．１９８３ａ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ｐｙｏｃｉｎ  Ｒ２  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ．Ｉ．Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｙｏｃｉｎ  Ｒ２  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｔｒｐＣＤ  ａｎｄ  ｔｒｐＥ  ｇｅｎｅｓ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１８９：３７５‐３８
Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  Ｔ，Ｓ  Ｓｈｉｇａ．１９７９．Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔａｉｌ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＰＳ１７．Ｊ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３２：９５８‐９６７
Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  Ｔ．１９８４．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｍｉｘｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｙｏｃｉｎ  Ｒ２  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＰＳ１７  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．４９：３１０‐３１４
Ｓｒｅｅｄｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．”Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  Ａｄｈｅｓｉｎ，ＡＣＥ，Ｍｅｄｉａｔｅｓ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｔｏ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  ＩＶ  ａｎｄ  Ｌａｍｉｎｉｎ  ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ．”Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８（９）：５２１８‐５２２４，２０００
Ｓｔｒａｕｃｈ  Ｅ，Ｋａｓｐａｒ  Ｈ，Ｓｃｈａｕｄｉｎｎ  Ｃ，Ｄｅｒｓｃｈ  Ｐ，Ｍａｄｅｌａ  Ｋ，Ｇｅｗｉｎｎｅｒ  Ｃ，Ｈｅｒｔｗｉｇ  Ｓ，Ｗｅｃｋｅ  Ｊ，Ａｐｐｅｌ  Ｂ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃｉｎ，ａ  ｐｈａｇｅ  ｔａｉｌ‐ｌｉｋｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ，ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ  ｓｔｒａｉｎｓ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００１  Ｄｅｃ；６７（１２）：５６３４‐４２．
Ｔａｋｅｙａ  Ｋ，Ｙ  Ｍｉｎａｍｉｓｈｉｍａ，Ｙ  Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｋ  Ａｍａｋｏ．１９６９．Ｒｏｄ‐ｓｈａｐｅｄ  ｐｙｏｃｉｎ２８，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．４：１４５‐１４９
Ｔａｌｂｏｔ  ＧＨ，Ｊ  Ｂｒａｄｌｅｙ，ＪＥ  Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍ  Ｓｃｈｅｌｄ，ＪＧ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ．２００６．Ｂａｄ  Ｂｕｇｓ  Ｎｅｅｄ  Ｄｒｕｇｓ：Ａｎ  Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｐｉｐｅｌｉｎｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４２：６５７‐６６８
Ｔａｍｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８８（ｌ）：４５‐５４，２００６
Ｔｅｔａｒｔ  Ｆ，Ｃ  Ｄｅｓｐｌａｔｓ，Ｍ  Ｋｕｔａｔｅｌａｄｚｅ，Ｃ  Ｍｏｎｏｄ，Ｈ‐Ｗ  Ａｃｋｅｒｍａｎｎ，ＨＭ  Ｋｉｒｓｃｈ．２００１．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｊｏｒ  Ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｔａｉｌ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｉｄｅ‐Ｒａｎｇｉｎｇ  Ｔ４‐Ｔｙｐｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８３：３５８‐３６６
Ｔｅｔａｒｔ  Ｆ，Ｄｅｓｐｌａｔｓ  Ｃ，Ｋｒｉｓｃｈ  ＨＭ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉｓｔａｌ  ｔａｉｌ  ｆｉｂｅｒ  ｌｏｃｕｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ‐ｅｖｅｎ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｍｏｔｉｆｓ  ｓｗａｐｓ  ａｄｈｅｓｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９８  Ｓｅｐ  ２５；２８２（３）：５４３‐５６．
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＮＥ，ＰＡ  Ｐａｔｔｅｅ．１９８１．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ：ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ‐ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ８０ａ  ｌｙｓａｔｅｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４８：２９４‐３００
Ｔｗｉｎｉｎｇ  ＳＳ，Ｘ  Ｚｈｏｕ，ＤＰ  Ｓｈｕｌｔｅ，ＰＭ  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｂ  Ｆｉｓｈ，Ｊ  Ｍｏｕｌｄｅｒ．１９９６．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ａ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｋｅｒａｔｉｔｉｓ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．３７：５１１‐５２２
Ｕｒａｔａｎｉ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｈｏｓｈｉｎｏ，Ｔ．Ｐｙｏｃｉｎ  Ｒ１  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｃｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ａｎｄ  ｄｅｐｏｌａｒｉｚｅｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８４  Ｆｅｂ；１５７（２）：６３２‐６．
ｖａｎ  Ｈｏｒｎ  ＤＬ，ＳＤ  Ｄａｖｉｓ，ＲＡ  Ｈｙｎｄｉｕｋ，ＴＶＰ  Ａｌｐｒｅｎ．１９７８．Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｋｅｒａｔｉｔｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ：ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃ，ｃｌｉｎｉｃａｌ，ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．１７：１０７６‐１０８６
ｖａｎ  Ｒａａｉｊ  ＭＪ，Ａ  Ｍｉｔｒａｋｉ，Ｇ  Ｌａｖｉｇｎｅ，Ｓ  Ｃｕｓａｃｋ．１９９９．Ａ  ｔｒｉｐｌｅ  β‐ｓｐｉｒａｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｆｉｂｒｅ  ｓｈａｆｔ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｎｅｗ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｔｉｆ  ｆｏｒ  ａ  ｆｉｂｒｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ．４０１：９３５‐３８．
ｖａｎ  Ｒａａｉｊ  ＭＪ，Ｇ  Ｓｃｈｏｅｈｎ，ＭＲ  Ｂｕｒｄａ，Ｓ  Ｍｉｌｌｅｒ．２００１．Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  Ｈｅａｔ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ‐ｓｔａｂｌｅ  Ｐａｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４  Ｓｈｏｒｔ  Ｔａｉｌ  Ｆｉｂｒｅ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１４：１１３７‐１１４６
Ｗｅｉｇｅｌｅ  ＰＲ，Ｅ  Ｓｃａｎｌｏｎ，ａｎｄ  Ｊ  Ｋｉｎｇ．２００３．Ｈｏｍｏｔｒｉｍｅｒｉｃ，β‐Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｖｉｒａｌ  Ａｄｈｅｓｉｎｓ  ａｎｄ  Ｔａｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．１８５：４０２２‐４０３０  
Ｗｅｎｚｅｌ  ＲＰ．２００４．Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｐｉｐｅｌｉｎｅ―Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，Ｃｏｓｔｓ，ａｎｄ  Ｖａｌｕｅｓ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３５１：５２３‐５２６
Ｗｅｓｔ  ＳＨＥ，ＨＰ  Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，ＡＫ  Ｓａｍｐｌｅ，ＬＪ  Ｒｕｎｙｅｎ‐Ｊａｎｅｃｋｙ．１９９４．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ‐Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐＵＣ１８／１９  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｇｅｎｅ  １２８：８１‐８６
Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．”Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｔｏｐｏｌｏｇｙ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｏｕｔｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＯｐｒＭ．”Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（９）：２４０２‐２４１０，２０００
Ｙｏｉｃｈｉ  Ｍ，Ｍ  Ａｂｅ，Ｋ  Ｍｉｙａｎａｇａ，Ｈ  Ｕｎｎｏ，Ｙ  Ｔａｎｊｉ．２００５．Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｉｌ  ｆｉｂｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｐ３８  ｅｎａｂｌｅｓ  Ｔ２  ｐｈａｇｅ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１５：１０１‐１０７
Ｙｏｕｎｇ，Ｒｙ，”Ｐｈａｇｅ  Ｌｙｓｉｓ”ｉｎ  Ｐｈａｇｅｓ，Ｗａｌｄｏｒ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ａｎｄ  Ａｄｈｙａ，ｅｄｓ．ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，ｐ９５，２００６
Ｚｉｅｒｍａｎｎ  Ｒ，Ｒ  Ｃａｌｅｎｄａｒ．１９９１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｓ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ  Ｐ２  ａｎｄ  Ｐ４．Ｇｅｎｅ．９６：９‐１５
Ｚｉｎｋ  Ｒ，ＭＪ  Ｌｏｅｓｓｎｅｒ  ａｎｄ  Ｓ  Ｓｃｈｅｒｅｒ．１９９５．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｙｐｔｉｃ  ｐｒｏｐｈａｇｅｓ（ｍｏｎｏｃｉｎｓ）  ｉｎ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｈｏｌｉｎ／ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ  ｇｅｎｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１４１：２５７７‐２５８４
Ｚｏｌｆａｇｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．”Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｔＳ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｈｙｂｒｉｄ  ｔｗｏ‐ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．”Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｊｕｌ  １５，２００５  Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ
【０１６８】
本明細書で引用した参考文献は、過去に特に組み入れられたものであっても、そうでないものであっても、すべてその全体が参照することで本明細書に組み入れられる。本明細書で用いる「１の（ａ）」、「１の（ａｎ）」、及び「いずれの（ａｎｙ）」という用語は、各々、単数形及び複数形の両方を含むことを意図している。
【０１６９】
ここまで、開示する主題事項をすべて説明したが、当業者であれば、本開示の意図及び範囲から逸脱することなく、また過剰な実験をすることなく、広い範囲の同等のパラメーター、濃度、及び条件で同じことを実施可能であることは正しく認識されるであろう。本開示をその具体的な態様と関連させて説明してきたが、さらなる変更が可能であることは理解されるであろう。本願は、全体として本開示の原理に従い、本主題事項に関連する本技術分野の範囲内の公知の又は従来の実践の範囲内で行われる本開示からの逸脱、及び上述の重要な特徴に適用することができる本開示からの逸脱を含む、本主題事項のいかなる変形、使用、又は改変をも含むことを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】Ｒ型ピオシン粒子の電子顕微鏡写真であり、パネルＡは、６本の尾部繊維のうち４本を示す図であり、パネルＢは、Ｒ型ピオシン粒子の主な構成成分の概略図である。
【図２】野生型ピオシン（Ｒ２）、尾部繊維欠失菌株に産生されたピオシン粒子（ＰＡ０１ΔＰｒｆ１５）、及びＲ２‐Ｐ２尾部繊維融合で相補されたピオシンの、段階希釈（５×）スポットアッセイ（ｓｐｏｔ  ｓｅｒｉａｌ（５×）  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を示す図である。標的細菌はシュードモナスエルジノーサ１３ｓ及びＥ．ｃｏｌｉ  Ｃである。野生型Ｒ２ピオシン粒子は、シュードモナスは死滅させることができるが、大腸菌は死滅できない。尾部繊維欠失菌株は、活性なピオシン粒子を産生しないが、Ｒ２‐Ｐ２尾部繊維融合でトランスに相補されると、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃを死滅させることができる。
【図３】Ｒ２ピオシン構造のＲ２‐Ｐ２尾部繊維融合体による相補を示す図である。Ａに示すように、Ｐ２尾部繊維遺伝子のＣ末端（ＲＢＤ）部分が、Ｒ２尾部繊維のＮ末端（ＢＰＡＲ）部分と融合した。  図３のＢは、野生型Ｒ２ピオシンを示す概略図である（左）。Ｒ２ピオシンをＲ２（ＢＰＡＲ）‐Ｐ２（ＲＢＤ）融合コンストラクトで相補して、キメラ尾部繊維が構造中に組み込まれた粒子（右）を作製する。このＲ２‐Ｐ２粒子は、死滅標的の範囲が変化し、特定の大腸菌株を標的とするようになる。
【図４】複数のＲ２‐Ｐ２融合体、及びそれらの殺菌活性を示す図である。Ｒ２のＮ末端、１から１６４位のアミノ酸（基板結合領域、「ＢＰＡＲ」）を、種々のＰ２のＣ末端（ＲＢＤ）と融合させた。数字は、各々のタンパク質のアミノ酸の位置番号を表している。各々の構築された尾部繊維を有する改変されたピオシンの殺菌活性（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃを標的とする）について、活性を示す場合は（＋）、示さない場合は（−）で表す。
【図５】Ｐ２尾部繊維のＣ末端１５８から６６９位の部分（ＲＢＤ）と融合したＲ２尾部繊維のＮ末端の様々な部分（ＢＰＡＲ）を示す図である。数字は、各々のタンパク質のアミノ酸の位置番号を表している。各々の構築された尾部繊維を有する改変されたピオシンの殺菌活性（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃを標的とする）について、活性を示す場合は（＋）、示さない場合は（−）で表す。
【図６】複数のＲ２‐Ｐ２融合体、及びそれらの殺菌活性を示す図である。Ｒ２のＮ末端、１から２４０位のアミノ酸（ＢＰＡＲ）を、Ｐ２のＣ末端部分（ＲＢＤ）と融合した。数字は、各々のタンパク質のアミノ酸の位置番号を表している。各々の構築された尾部繊維を有する改変されたピオシンの殺菌活性（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃを標的とする）について、活性を示す場合は（＋）、示さない場合は（−）で表す。
【図７】Ｐ２尾部繊維のＣ末端３２２から６６９位の部分（ＲＢＤ）と融合したＲ２尾部繊維のＮ末端の様々な部分（ＢＰＡＲ）を示す図である。数字は、各々のタンパク質のアミノ酸の位置番号を表している。各々の構築された尾部繊維を有する改変されたピオシンの殺菌活性（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃを標的とする）について、活性を示す場合は（＋）、示さない場合は（−）で表す。
【図８】種々のＲ型ピオシン尾部繊維、尾部繊維融合体、及びシャペロンによる、ＰＡ０１Δｐｒｆ１５Ｒ２ピオシン構造のトランスでの相補を示す図である。Ｒ１乃至Ｒ５によって相補されたピオシンの活性は、すべての型のピオシンに感受性を有する指示菌株であるシュードモナスエルジノーサ１３ｓへのスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）によって評価した。Ｒ２‐Ｐ２で相補されたピオシンは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃを指示菌として用いて活性の試験を行い、Ｒ２‐Ｌ‐４１３ｃで相補されたピオシンは、エルシニアぺスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）ＫＩＭ株上で試験を行った。    Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のＰｒｆ１５尾部繊維は、ＰＡ０１Δｐｒｆ１５Ｒ２ピオシンの内在性Ｐｒｆ１６で相補することが可能であった。Ｒ２と比較してＣ末端が異なるＲ１及びＲ５のＰｒｆ１５尾部繊維は、最大の活性を得るためには、それら自身の同族Ｐｒｆ１６（Ｒ２の対応物とは異なっている）が必要であった。各々、ファージＰ２及びＬ‐４１３ｃの尾部繊維のＣ末端（ＲＢＤ）を有する、Ｒ２‐Ｐ２及びＲ２‐Ｌ‐４１３ｃ融合体は両方ともに、ファージのＧ遺伝子によってコードされるそれらの同族の尾部繊維集合シャペロンが必要である。
【図９】ピオシン尾部繊維及びシャペロンの発現ベクターｐＵＣＰ３０Ｔを示す図である。遺伝子ｐｒｆ１５及びｐｒｆ１６は、両種ともに、複製開始点（ｏｒｉ  ｐＲＯ１６００、ｒｅｐ、及びｏｒｉＴ）を有するシュードモナス／大腸菌シャトルベクター（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ）を用いて発現する。クローン部位は、図に示す制限酵素開裂部位で表す。このプラスミドは、ゲンタマイシン耐性（ＧｍＲ）を付与し、培地にゲンタマイシンを添加することで維持される。両遺伝子ともに、転写は、ｌａｃＩＱによって負に制御されるｔａｃプロモーターにより誘発される。シュードモナスエルジノーサ株ＰＡＯ１Δｐｒｆ１５へトランスフォームされた場合、例えばｐｒｆ１５及びｐｒｆ１６などのプラスミドに組み込まれた遺伝子は、ＰＡＯ１Δｐｒｆ１５宿主産生細菌中に残っているこれらのピオシン遺伝子のマイトマイシンＣによる誘発と同時に、ＩＰＴＧによって誘発された後、トランスに発現する。
【図１０】エルシニアぺスチスに特異的なピオシン尾部繊維の構築を示す図である。Ｒ２‐Ｐ２の構築に用いた方法と同様に、Ｌ‐４１３ｃ尾部繊維遺伝子の一部分をコードするＣ末端（ＲＢＤ）を、Ｒ２尾部繊維のＮ末端部分（ＢＰＡＲ）に融合させた。トランスに発現してＲ２尾部繊維欠失株ＰＡ０１Δｐｒｆ１５を相補する場合、エルシニアぺスチスは効果的に死滅させることができるがシュードモナスは死滅させることができないキメラＲ２‐Ｌ-４１３ｃ尾部繊維を有する改変されたピオシン粒子が産生される。
【図１１Ａ】ページ１１Ａ乃至１１Ｊに記載の配列番号１〜５９のアミノ酸配列又は核酸配列を示す図である。
【図１１Ｂ】ページ１１Ａ乃至１１Ｊに記載の配列番号１〜５９のアミノ酸配列又は核酸配列を示す図である。
【図１１Ｃ】ページ１１Ａ乃至１１Ｊに記載の配列番号１〜５９のアミノ酸配列又は核酸配列を示す図である。
【図１１Ｄ】ページ１１Ａ乃至１１Ｊに記載の配列番号１〜５９のアミノ酸配列又は核酸配列を示す図である。
【図１１Ｅ】ページ１１Ａ乃至１１Ｊに記載の配列番号１〜５９のアミノ酸配列又は核酸配列を示す図である。
【図１１Ｆ】ページ１１Ａ乃至１１Ｊに記載の配列番号１〜５９のアミノ酸配列又は核酸配列を示す図である。
【図１１Ｇ】ページ１１Ａ乃至１１Ｊに記載の配列番号１〜５９のアミノ酸配列又は核酸配列を示す図である。
【図１１Ｈ】ページ１１Ａ乃至１１Ｊに記載の配列番号１〜５９のアミノ酸配列又は核酸配列を示す図である。
【図１１Ｉ】ページ１１Ａ乃至１１Ｊに記載の配列番号１〜５９のアミノ酸配列又は核酸配列を示す図である。
【図１１Ｊ】ページ１１Ａ乃至１１Ｊに記載の配列番号１〜５９のアミノ酸配列又は核酸配列を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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