(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなる単離ポリペプチド、
（ｂ）配列番号２の連続したアミノ酸配列全体にわたって少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、および
（ｃ）配列番号１によってコードされるアミノ酸配列からなる単離ポリペプチド
からなる群から選択される、Ｓ６Ｋ１および／または４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化する単離ポリペプチド。
【請求項２】
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補体からなるポリヌクレオチド、および
（ｃ）配列番号１の連続した配列全体にわたって少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、Ｓ６Ｋ１および／または４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
からなる群から選択される単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、１以上の発現コントロールエレメントに作動可能に連結している、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２または３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチド、請求項２もしくは３に記載のポリヌクレオチド、または請求項４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチド、または請求項２に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現する条件下で、請求項５に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項２に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを産生するための方法。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドを調整する作用物質をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドを試験作用物質と接触させるステップと、
（ｂ）前記ポリペプチドの活性の任意の変化を検出するステップと
を含み、活性の変化が、請求項１に記載のポリペプチドを調整することができる作用物質を示す、
前記方法。
【請求項８】
請求項１に記載のポリペプチドの発現および／または活性を調整する作用物質をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチド、または請求項２に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む、またはこれを発現する、請求項５に記載の宿主細胞を提供するステップと、
（ｂ）前記宿主細胞を試験作用物質と接触させるステップと、
（ｃ）前記ポリペプチドの発現および／または活性の任意の変化を検出するステップと
を含み、発現および／または活性の変化が、請求項１に記載のポリペプチドの発現および／または活性を調整することができる作用物質を示す、前記方法。
【請求項９】
（ａ）前記活性が、Ｓ６Ｋ１および／または４Ｅ−ＢＰ−１のリン酸化を測定することによって検出される、または
（ｂ）前記活性が、ｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現を測定することによって検出される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記発現が、配列番号１を含む核酸のレベルを測定することによって検出される、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[発明の分野]
本発明は、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）タンパク質の切断型変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
[発明の背景]
ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）は、セリン／トレオニンキナーゼであり、これは、ＰＩ３Ｋ関連キナーゼの大きなファミリーに属し、これは、さらに、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ、ＡＴＭおよびＡＴＲを含む。生化学的研究および遺伝学的研究から、ｍＴＯＲが、増殖因子刺激、エネルギー、および栄養素利用能を統合して、細胞増殖、大きさ、および細胞周期進行を担う生合成プロセスを調節することが実証された。様々な細胞外のキューに応じたｍＴＯＲキナーゼ活性の調節は、最近の１０年間で広範囲に研究されてきた。プロテインキナーゼＰＫＢ／ＡｋｔおよびＡＭＰＫ、腫瘍抑制因子ＰＴＥＮおよび結節性硬化症複合体ＴＳＣ１／２、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｒｈｅｂ、足場タンパク質ＲａｐｔｏｒおよびＲｉｃｔｏｒを含む、様々な酵素活性、足場、およびアダプター機能を有する広範囲の細胞タンパク質は、ｍＴＯＲへのシグナル伝達およびｍＴＯＲの活性の調節に関係している。活性化状態において、ｍＴＯＲは、Ｓ６Ｋ、４Ｅ−ＢＰ１、およびＰＫＢ／Ａｋｔなどの主な下流の標的のリン酸化によって、シグナル伝達および代謝情報を伝達する。様々な研究所の研究により、ｍＴＯＲが、ｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）およびｍＴＯＲＣ２と称される、２つの機能的に異なる複合体で存在することが示された。ｍＴＯＲＣ１は、基本的な構成成分ｍＴＯＲ、ｒａｐｔｏｒ、およびｍＬＳＴ８／ＧβＬを含み、ラパマイシンに対して感受性である。ｍＴＯＲＣ２は、ラパマイシン非感受性であると考えられており、ｍＴＯＲ、Ｒｉｃｔｏｒ、およびｍＬＳＴ８／ＧβＬを含む。ラパマイシンおよびその類似体は、多くの臨床治験において抗癌剤として目下評価されている。そのうえ、それらは、現在、冠動脈形成術の後の、ステント留置後の再狭窄を低下させるステントのコーティングに広く使用されている。２つのＴＯＲ遺伝子を有する酵母とは対照的に、哺乳動物は、約２８０ｋＤａの分子量を有する単一ポリペプチドをコードすることが知られている、たった１つの遺伝子を有する。
【０００３】
ｍＴＯＲのうちで１つの重要な下流の標的は、Ｓ６Ｋである。Ｓ６キナーゼ（ｐ７０  Ｓ６キナーゼ（ｐ７０Ｓ６ｋ））は、真核生物のリボソームの４０Ｓサブユニットの構成成分であるリボソームＳ６タンパク質のＳ６リン酸化を担う（つまり、ｍＲＮＡの翻訳およびタンパク質合成を担う細胞性機構）。それはまた、哺乳動物細胞における主な生理学的Ｓ６キナーゼとも考えられている（Proud、1996 Trends Biochem.Sci.21:181〜185ページ）。４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ６は、真核生物のリボソームの４０Ｓサブユニットの構成成分である。Ｓ６タンパク質は、ホルモンまたは増殖因子誘発性の細胞増殖などのある種の細胞シグナル伝達イベントに応じてリン酸化される。
【０００４】
Ｓ６キナーゼは、多種多様の、インスリンなどの増殖因子およびマイトジェンによって活性化される（Alessiら、1998  Curr.Biol.8:69〜81ページ）。Ｓ６キナーゼ活性を調節するある種の薬剤が、同定されており、これには、Ｓ６キナーゼの最も強力な阻害剤であるラパマイシンが含まれる（Pullenら、1997 FEBS Letters 410:78〜82ページ）。Ｓ６キナーゼアルファおよびＳ６キナーゼベータの構造およびいくつかの機能は、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第６，８３０，９０９号において開示されている。
【０００５】
Ｓ６キナーゼは、リン酸化される上に、アセチル化されることが示された。Ｓ６キナーゼタンパク質は、ｐ３００アセチルトランスフェラーゼおよびＰ／ＣＡＦアセチルトランスフェラーゼによってｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもアセチル化されることが分かった。Ｓ６Ｋアセチル化が増加する条件（つまり、ＨＤＡＣ阻害剤の存在／ｐ３００の過剰発現）において、Ｓ６キナーゼ活性および４１２リン酸化が低下すると表現するのがより正確である。Ｐループリシン（P-loop lysine）（ｐ３００によってｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセチル化される）のグルタミンへの変異は、これはアセチル化に似ているが、Ｓ６Ｋの完全な不活性化および４１２リン酸化の減少（loss）をもたらす。Ｓ６Ｋ２（Ｓ６Ｋベータ）は、さらに、ＡＴフックＤＮＡ結合モチーフを有することが示された。したがって、Ｓ６キナーゼ２タンパク質は、ＤＮＡに結合し、それによって活性化され、これは、引き続いて、そのキナーゼ活性を刺激する。そのため、Ｓ６Ｋ２は、マイトジェンおよび栄養素に応じて増殖促進効果を伝達すると考えられる。これは、Ｓ６Ｋ２が、ＤＮＡと複合体を形成し、この相互作用によって活性化される場合に、リン酸化による転写因子および／またはクロマチンリモデリングタンパク質の調節を伴う可能性がある。Ｓ６キナーゼタンパク質活性の調節および関連する方法は、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる国際公開第２００７／０１９４２１号において開示されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
[発明の要旨]
本発明は、ｍＴＯＲベータ（ｍＴＯＲβ）と呼ばれるｍＴＯＲの新規に見出されたスプライス形態に関する。特に、本発明は、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、および
（ｃ）配列番号１によってコードされるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド
からなる群から選択される、Ｓ６Ｋ１および／または４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化する単離ポリペプチドを提供する。
【０００７】
本発明はまた、以下のものも提供する：
（ａ）本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補体を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１の連続した配列全体にわたって少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、Ｓ６Ｋ１および／または４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびに
（ｄ）配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補体に、６８℃で０．１×ＳＳＣを用いる条件下でハイブリダイズし、Ｓ６Ｋ１および／または４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化するタンパク質をコードする単離核酸分子
からなる群から選択される単離ポリヌクレオチド。
本発明のポリヌクレオチドを含むベクター。
本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、または本発明のベクターを含む宿主細胞。
本発明のポリペプチドに特異的に結合する単離抗体。
本発明のポリペプチド、または本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現する条件下で、本発明の宿主細胞を培養するステップを含む、ポリペプチドを産生するための方法。
ｍＴＯＲベータ活性を調整する作用物質をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）本発明のポリペプチドを試験作用物質と接触させるステップと、
（ｂ）前記ポリペプチドの活性の任意の変化を検出するステップと
を含み、活性の変化が、ｍＴＯＲベータ活性を調整することができる作用物質を示す方法。
ｍＴＯＲベータの発現および／または活性を調整する作用物質をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）本発明のポリペプチド、または本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含むまたは発現する、請求項５に記載の宿主細胞を提供するステップと、
（ｂ）前記宿主細胞を試験作用物質と接触させるステップと、
（ｃ）前記ポリペプチドの発現および／または活性の任意の変化を検出するステップと
を含み、発現および／または活性の変化が、ｍＴＯＲベータの発現および／または活性を調整することができる作用物質を示す方法。
本発明のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患を治療するための方法であって、その必要のある対象へ有効量の作用物質を投与するステップを含み、前記作用物質が、前記ポリペプチドの活性および／または発現を変化させる方法。
前記ポリペプチドの異常な発現と関連する疾患の治療における使用のための、本発明のポリペプチドの活性および／または発現を変化させる作用物質。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】Ｃ末端抗ｍＴＯＲ抗体およびＦ１１抗ｍＴＯＲ抗体を使用した、ラット組織におけるｍＴＯＲの発現のウェスタンブロット分析を示した図である。ラット組織のタンパク質抽出物（３０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、ＰＶＤＦメンブランに転写し、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇより入手したＣ末端ｍＴＯＲポリクローナル抗体を用いてプローブした（上のパネル）。その後、メンブランをストリップし（strip）、抗アクチン抗体を用いてリプローブした（下のパネル）。
【図２】ヒト組織におけるｍＴＯＲ発現のノーザンブロット分析を示した図である。ブロットをストリップし、β−アクチン発現に関してリプローブした（下のパネル）。
【図３】Ｃ末端抗ｍＴＯＲ抗体を用いた、Ｈｅｐ２Ｇ、Ｈｅｋ２９３およびＭＣＦ７細胞からの、ｍＴＯＲβの免疫沈降を示した図である。Ｈｅｐ２Ｇ、Ｈｅｋ２９３およびＭＣＦ７細胞の溶解物をＣ末端抗ｍＴＯＲ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて免疫沈降させ、免疫複合体を、Ｎ末端抗ｍＴＯＲ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いてウェスタンブロットにおいてプローブした。
【図４】ＰＣＲによる、ヒト細胞株における潜在的ｍＴＯＲスプライス変異体の同定を示した図である。図４Ａは、Ｈｅｐ２Ｇ、ＨＥＫ２９３およびＭＣＦ７に由来する全ＲＮＡおよびｍＴＯＲベータＲＮＡについてのアガロースゲルを示す。全ＲＮＡを、Ｈｅｐ２Ｇ、ＨＥＫ２９３およびＭＣＦ７細胞株から精製し、第１鎖ＤＮＡに転換した。一連のｍＴＯＲ特異的プライマーをＰＣＲ反応に使用し、潜在的スプライス変異体を探索した。増幅断片を、２％アガロースゲルにおいて電気泳動により解析した。最も顕著なバンドをゲルから切り取り、配列を分析した。一組のプライマー（Ｎ１およびＣ３）は、３種の細胞株から、常に１００ｂｐの断片を増幅した。グリセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＤＰＨ）およびβアクチンの特異的断片を増幅し、第１鎖ＤＮＡの添加コントロールおよび質的コントロールとして使用した。図４Ｂは、Ｎ１およびＣ３のｍＴＯＲ特異的プライマーを用いて増幅された、１００ｂｐのＰＣＲ断片の配列アラインメントを示す図である。増幅断片を配列決定し、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗのプログラムを用いてアラインメントを行った。潜在的スプライス融合の位置を、矢印で示してある。図４Ｃは、Ｎ１およびＣ３のｍＴＯＲ特異的プライマーを用いて増幅させた１００ｂｐのＰＣＲ産物のアミノ酸配列を示す図である。潜在的スプライス融合の位置を、矢印で示してある。ｍＴＯＲの、Ｎ末端領域およびＦＡＴＮドメインに対応する配列にアンダーラインを引いてある。
【図５】完全長ｍＴＯＲαおよびｍＴＯＲβのスプライシングアイソフォームのドメイン構成を示す図である。各ドメインの位置を、そのアミノ酸の位置を含めて示す。抗ｍＴＯＲ抗体に対応するエピトープの局在化を示す。公知のｍＴＯＲの結合パートナーの相互作用を媒介する領域にアンダーラインを引いてある。それぞれがタンパク質間の相互作用にかかわる、３７〜４３のアミノ酸の２０のＨＥＡＴモチーフ（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ、ＥＦ３、ＰＰ２ＡのサブユニットおよびＴｏｒ）が存在する。ＨＥＡＴ１８および１９は、ｍＴＯＲをＥＲまたはゴルジ体の標的とするために十分である。ｍＴＯＲは、これらのＨＥＡＴ領域を介して二量化する。ＦＡＴドメイン＝ＦＲＡＰ／ＡＴＭ／ＴＲＡＰＰ；ＦＡＴＮ＝Ｎ末端のＦＡＴドメイン；ＦＡＴＣ＝Ｃ末端のＦＡＴドメイン。ＦＡＴＣドメインは、ｍＴＯＲキナーゼの活性および機能にとって必要であることが見出された。ＦＲＢ（ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合）ドメインは、ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合に必要かつ十分な、１１ｋＤａの保存領域である。ＫＤ＝キナーゼドメイン、ＰＩ３Ｋ−関連ドメインと考えられている。ＲＤ＝調節ドメイン。
【図６】ｍＴＯＲβが、血清刺激に反応して、全ｍＴＯＲαのアミノ酸配列のＳｅｒ２４４８に対応するセリン残基においてリン酸化され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのキナーゼアッセイにおいて、Ｓ６Ｋ１および４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化することを示す図である。図６Ａは、ｐｃＤＮＡ３．１  ｍＴＯＲβの形質移入により、ｍＴＯＲβを発現する細胞のゲルを示す図である。ＨＥＫ２９３細胞に、ｐｃＤＮＡ３．１またはｐｃＤＮＡ３．１  ｍＴＯＲβを形質移入した。１日後、細胞を２４時間飢餓状態にし、その後、１０％ウシ胎児血清を用いて１時間刺激した。ラパマイシン（１０ｎＭ）を、刺激する３０分前に加えた。細胞を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、Ｃ末端抗ｍＴＯＲおよびｐＳ２４４８  ｍＴＯＲ抗体を用いて免疫ブロットを行った。図６Ｂは、ｍＴＯＲのｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイの結果を示す図である。ＨＥＫ２９３細胞に、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１／ＦＬＡＧ−ｍＴＯＲβまたはｐｃＤＮＡ３．１／ＦＬＡＧ−ｍＴＯＲａを形質移入した。２日後、細胞を溶解し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫沈降させた。Ｈｉｓ−４Ｅ−ＢＰｌおよびＨｉｓ−Ｓ６Ｋ１Ｃを基質として用いて、免疫複合体をｍＴＯＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイに使用した。キナーゼ反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、４Ｅ−ＢＰ１  ｐ６５およびＳ６Ｋ１  ｐ３８９に対するリン酸化特異的抗体を用いて免疫ブロットを行った。免疫沈降したＦＬＡＧ−ｍＴＯＲαおよびＦＬＡＧ−ｍＴＯＲβのレベルを、抗ＦＬＡＧを用いてウェスタンブロットを行うことによって測定した。
【図７】ｍＴＯＲβと、Ｒａｐｔｏｒ、ＲｉｃｔｏｒおよびＧβＬとの特異的相互作用を示す図である。ＨＥＫ２９３細胞に、ｐｃＤＮＡ３．１−ｍＴＯＲβ−ＦＬＡＧおよびｐＲＫ−Ｒａｐｔｏｒ−ＨＡまたはｐｃＤＮＡ３．１−ｍＴＯＲβ−ＦＬＡＧおよびｐＲＫ−Ｒｉｃｔｏｒ−ＭｙｃまたはｐｃＤＮＡ３．１−ｍＴＯＲβ−ＦＬＡＧおよびｐｃＲＫ−ＧβＬを形質移入した。溶解細胞の上清を、抗ＦＬＡＧ抗体またはコントロールの非特異的抗体を用いて、免疫沈降させた。形質移入細胞（１５μｇ）由来の免疫複合体または全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、抗ＨＡ、抗Ｒｉｃｔｏｒまたは抗ＧβＬ抗体を用いたウェスタンブロットにおいてプローブした。
【図８】ｍＴＯＲβが、ｍＴＯＲαと比較して、ラパマイシンに対する感受性が低いことを示す図である。ＨＥＫ２９３細胞に、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１  ｍＴＯＲβまたはｐｃＤＮＡ３．１  ｍＴＯＲαを形質移入した。１日後、細胞を２４時間飢餓状態にし、その後、１０％血清を用いて１時間刺激した。様々な濃度のラパマイシンを、刺激する３０分前に加えた。細胞を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、Ｃ末端ｍＴＯＲ抗体、抗アクチンおよび様々なリン酸化特異的抗体を用いて免疫ブロットした。
【図９】ｍＴＯＲβの細胞内局在化を示す図である。対数増殖期のＨＥＫ２９３細胞を、ProteoExstract Extraction kit(Calbiochem)を使用して分画化した。ｍＴＯＲαおよびｍＴＯＲβを、抗ｍＴＯＲ  Ｃ末端抗体を使用して、全分画から免疫沈降させ、免疫複合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、抗ｍＴＯＲ  Ｎ末端抗体を用いて免疫ブロットした。抗４ＥＢＰ１、ＨＳＰ６０およびｃ−Ｊｕｎ抗体を、それぞれ細胞質、メンブランおよび核の分画のコントロールとして使用した。
【図１０】ｍＴＯＲβの過剰発現は細胞増殖を誘導するが、ｍＴＯＲαは誘導しないことを示す図である。ｍＴＯＲβｗｔ、ｍＴＯＲαｗｔまたはＥＧＦＰを過剰発現するＨｅｋ２９３安定細胞株を、様々な濃度（２５０、５００、１０００および２０００細胞／ウェル）で９６ウェルプレートに播種し、標準条件下で７日間増殖させた。その後、細胞数を、Ｒｅｓｏｓｕｒｉｎに基づくアッセイにより各ウェルにおいて測定した。各細胞株に関する正規化増殖曲線を、６つの独立した実験からのデータを使用して計算した（Ａ）。ｃ−ｍｙｃおよびその転写標的に対する抗体を用いた、安定細胞株の全細胞溶解物のウェスタンブロット分析（Ｂ）。タンパク質のレベルを濃度測定し、アクチンを正規化し、倍率をＥＧＦＰ発現安定細胞株に対して計算した（Ｃ）。
【図１１】ｍＴＯＲβキナーゼ活性が、増殖の導入に必要であることを示す図である。ｍＴＯＲβｗｔ、ｍＴＯＲβキナーゼ不活性型（ｍＴＯＲβ kinase dead）またはＥＧＦＰを過剰発現するＨＥＫ２９３安定細胞株を、様々な濃度（１０００、２０００、４０００および８０００細胞／ウェル）で９６ウェルプレートに播種し、標準条件下で５日間増殖させた。その後、細胞数を、Ｒｅｓａｚｕｒｉｎに基づくアッセイにより各ウェルにおいて測定した。各細胞株に関する正規化増殖曲線を、６つの独立した実験からのデータを使用して計算した（Ａ）。ｃ−ｍｙｃおよびその転写標的に対する抗体を用いた、安定細胞株の全細胞溶解物のウェスタンブロット分析。タンパク質のレベルを、濃度測定し、アクチンを正規化し、倍率をＥＧＦＰ発現安定細胞株に対して計算した（Ｂ）。
【図１２】ｍＴＯＲβが、細胞周期のＧ１期進行にとって重要であることを示す図である。ｍＴＯＲβ、ｍＴＯＲαまたはＥＧＦＰを安定して過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を、ＢｒｄＵを用いて３０分間パルス標識し、２時間ごとに、２４時間追跡した。ＢｒｄＵの組込みを、ＦＡＣＳ分析により測定した。各細胞株に関して観察された細胞周期のＧｌ期、Ｓ期およびＧ２期の存続期間をグラフに表した。ＳＤ、ｐ＝０．０５。
【図１３】ｍＴＯＲβの過剰発現が、細胞を、飢餓誘導性細胞死から保護することを示す図である（Ａ）。ｍＴＯＲβキナーゼ活性は、生存促進作用（pro-survival effect）の媒介に必要である（Ｂ）。ｍＴＯＲβｗｔ、ｍＴＯＲαｗｔ、ｍＴＯＲβキナーゼ不活性型またはＥＧＦＰを過剰発現する、Ｈｅｋ２９３安定細胞株を、６０時間血清飢餓状態にした。細胞の生存を、Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ色素排除アッセイにより評価した。データは、５つの実験の平均±ＳＥである。＊Ｐ値≦０．０１。
【図１４】ｍＴＯＲβの過剰発現が、細胞発癌性の増加をもたらすことを示す図である。ｍＴＯＲβ、ｍＴＯＲαまたはＥＧＦＰを安定して過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を培養培地中のアガロースの薄層にプレーティングした。１４日後、ＭＴＴを使用してコロニーを染色した（Ａ）。コロニーを、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して計測し、倍率をプロットした（Ｂ）。データは、４つの実験の平均±ＳＥである。＊Ｐ値≦０．０１。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
[配列表の簡単な説明]
配列番号１は、ヒトｍＴＯＲベータスプライス変異体をコードするポリヌクレオチド配列であり、配列番号２は、ヒトｍＴＯＲベータタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号３は、完全長ヒトｍＴＯＲアルファタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であり、配列番号４は、ヒトｍＴＯＲアルファタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号５〜８は、実施例４において使用したプライマーである。
配列番号９は、ヒトＭＣＦ７、Ｋｅｈ２９３およびＨＥＰ２Ｇ細胞株から、ＰＣＲにより作製された増幅断片であり、配列番号１０は、配列番号９によりコードされたアミノ酸配列である。
【００１０】
[発明の詳細な説明]
本発明は、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）タンパク質の新規のスプライス形態の同定および特徴付けに基づくものである。ｍＴＯＲの新規のスプライス形態（以後ｍＴＯＲベータまたはｍＴＯＲβと称される）の存在が示されたのはこれが最初である。本発明は、ｍＴＯＲベータタンパク質のアッセイおよびその活性の研究に基づくものである。
【００１１】
ｍＴＯＲベータは、目下知られているｍＴＯＲ（以後ｍＴＯＲα）のＮ末端アミノ酸１〜２３およびのＣ末端アミノ酸１８６７〜２５４９のスプライス融合物であり、これは、７０６アミノ酸長の融合タンパク質をもたらす（配列番号２）ことが決定された。融合タンパク質において、調節性のＨＥＡＴドメインおよびＦＡＴドメインは失われている。ｍＴＯＲβに対応するｍＲＮＡの転写物は、心臓および肝臓において高度に発現するが、腎臓、肝臓、血液、小腸、および大腸は、ｍＴＯＲβのタンパク質レベルが最も高いこともまた示された。さらに、完全長ｍＴＯＲαと同様に、スプライス形態もまた、基質提示分子Ｒａｐｔｏｒ、Ｒｉｃｔｏｒ、およびＧβＬと結合することができる。ｍＴＯＲβはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、Ｓ６Ｋ１および４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化することができる。そのうえ、ｍＴＯＲβは、血清刺激に応じて、全ｍＴＯＲαアミノ酸配列のＳｅｒ２４４８（Ｓ２４４８）に対応するセリン残基（ｍＴＯＲβのＳｅｒ６０５）でリン酸化されることが示された。全ｍＴＯＲαアミノ酸配列のＳｅｒ２４４８に対応するセリン残基でのｍＴＯＲβのリン酸化は、ラパマイシンに対して感受性である。さらに、ｍＴＯＲαと比較した場合に、ｍＴＯＲβは、ラパマイシンに対してそれほど感受性ではないことが示された。
【００１２】
本明細書において使用される場合、「ｍＴＯＲベータ」（ｍＴＯＲβ）という用語は、ｍＴＯＲのスプライス形態を指す。例えば、発明者らは、配列番号２のポリペプチドが、天然に存在するヒトｍＴＯＲベータポリペプチドであることを見出した。このタンパク質は、７０６アミノ酸長であると考えられ、約２１２１ヌクレオチド長である配列番号１の核酸によってコードされる。本明細書において使用される場合、「ｍＴＯＲアルファ」（ｍＴＯＲα）という用語は、完全長の、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）タンパク質を指す。例えば、ヒトｍＴＯＲアルファポリペプチドは、約２５４９アミノ酸長であるタンパク質であると考えられ（配列番号４）、配列番号３のヌクレオチドによってコードされると考えられる。
【００１３】
[ポリペプチド]
本発明は、ｍＴＯＲベータポリペプチドを提供する。
【００１４】
「ポリペプチド」は、２つ以上のサブユニットのアミノ酸、アミノ酸類似体、または他のペプチドミメティック（peptidomimetic）の化合物を指すのに、その最も広い意味で、本明細書において使用される。「ポリペプチド」という用語は、したがって、短いペプチド配列ならびにさらに、より長いポリペプチドおよびタンパク質を含む。本明細書において使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンを含む天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸もしくは合成アミノ酸のいずれか、ならびにＤ光学異性体またはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およびペプチドミメティック（peptidomimetic）を指す。
【００１５】
本発明のポリペプチドは、好ましくは単離形態で提供される。本明細書において使用される場合、物理的な方法、力学的な方法、または化学的な方法が、タンパク質と通常に結合している細胞性成分からタンパク質を取り出すために用いられる場合に、タンパク質は、単離されると表現される。当業者は、単離タンパク質を得るために、標準的な精製法を容易に用いることができる。
【００１６】
本発明は、ｍＴＯＲベータ（ｍＴＯＲβ）ポリペプチドを含む。本発明によるｍＴＯＲベータポリペプチドは、本明細書において記載される場合、天然に存在するｍＴＯＲベータポリペプチドであってもよく、またはその変異体、誘導体、もしくは断片であってもよい。本発明の一実施形態において、ｍＴＯＲベータポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなる、またはそれから本質的になる、またはそれを含む。本発明の一実施形態において、ｍＴＯＲベータポリペプチドは、配列番号４のｍＴＯＲαポリペプチドにおけるそれらのアミノ酸などのｍＴＯＲαのＮ末端アミノ酸１〜２３とＣ末端アミノ酸１８６７〜２５４９の間のスプライス融合物である。本発明の他の実施形態において、ｍＴＯＲベータポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７５％または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなり、またはそれから本質的になり、またはそれを含み、Ｓ６Ｋ１および／または４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化する。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、配列番号１のヌクレオチド配列によってまたは配列番号１を含むポリヌクレオチドなど、本明細書に記載されている本発明のポリヌクレオチドによってコードされ得る。本発明のポリペプチドは、配列番号１の連続した配列全体にわたって少なくとも８０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによって、または配列番号１のポリヌクレオチドに、６８℃で０．１×ＳＳＣを用いる条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ得る。そのようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、Ｓ６Ｋ１および／または４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化することができるであろう。
【００１８】
ｍＴＯＲベータポリペプチドは、天然に存在するｍＴＯＲベータポリペプチドまたはその変異体、誘導体、もしくは断片であってもよい。天然に存在するｍＴＯＲベータポリペプチドは、任意の種、好ましくは哺乳動物種において天然に発現されるｍＴＯＲベータポリペプチドであってもよい。例えば、適した天然に存在するｍＴＯＲベータポリペプチドは、ヒト、非ヒト霊長動物、げっ歯動物（例えばラットもしくはマウス）、ウサギ、ウマ、または家畜動物（例えばヤギ、ヒツジ、ブタ、もしくはウシ）からの哺乳動物ｍＴＯＲベータポリペプチドであってもよい。ｍＴＯＲベータポリペプチドは、ウサギ、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヒト、または非ヒト霊長動物のｍＴＯＲβポリペプチドであってもよい。好ましくは、ｍＴＯＲベータポリペプチドは、ヒトｍＴＯＲベータポリペプチドである。例えば、ヒトｍＴＯＲベータポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２において提供される。ヒトｍＴＯＲベータポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１において提供される。本発明によるｍＴＯＲベータポリペプチドは、ヒトポリペプチドなどの任意のそのような天然に存在するｍＴＯＲベータポリペプチドであってもよく、またはその対立遺伝子変異体であってもよい。対立遺伝子変異体は、上記に記載されるアミノ酸配列とはわずかに異なるアミノ酸配列を有するが、開示されているタンパク質と関連する同じまたは類似した生物学的機能をなお有するであろう。
【００１９】
ｍＴＯＲベータポリペプチドは、天然に存在するｍＴＯＲベータペプチドの誘導体、類似体、ポリペプチド断片、またはミメティックなどの変異ポリペプチドであってもよい。そのような変異ポリペプチドは、好ましくは、天然に存在するｍＴＯＲベータペプチドと同じ生物学的機能または活性を保持する。活性は、天然に存在するｍＴＯＲベータポリペプチドが有する任意の活性であってもよい。ｍＴＯＲベータの多くの活性は、本明細書において開示されている。適した変異ポリペプチドは、任意の１以上のこれらの活性を有し得る。例えば、変異ポリペプチドは、アセチル化される能力および／または第２のタンパク質をリン酸化する能力および／またはＤＮＡに結合する能力を保持することができる。例えば、適した変異ポリペプチドは、ｃＭｙｃに対する影響を誘発することができる。適した変異ポリペプチドは、配列番号４の全ｍＴＯＲαアミノ酸配列のＳ２４４８（配列番号２のｍＴＯＲβポリペプチドのＳｅｒ６０５）に対応するセリン残基でリン酸化することができる。適した変異ポリペプチドは、Ｓ６Ｋ１をリン酸化する能力を有し得る。適した変異ポリペプチドは、４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化する能力を有し得る。適した変異ポリペプチドは、Ｓ６Ｋ１および４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化する能力を有し得る。適した変異ポリペプチドは、Ｒａｐｔｏｒ、Ｒｉｃｔｏｒ、およびＧβＬの１つ、２つ、または３つすべてと相互作用することができる。適した変異ポリペプチドは、細胞増殖を誘発することができる。適した変異ポリペプチドは、飢餓誘発性の細胞死から細胞を保護することができる。適した変異ポリペプチドは、細胞の発癌能を増加させることができる。適した変異ポリペプチドは、細胞周期のＧ１期の期間を減少させることができる。これらの活性を評価するための方法は、本明細書において記載され、当業者によって容易に理解されると思われる。実施例は、どのようにそのような活性が評価され得るか、および例としての配列番号２のポリペプチドの使用を示す。これらの方法は、本明細書において記載される、他のポリペプチドを用いる使用に容易に適応させることができる。
【００２０】
本発明のｍＴＯＲβポリペプチドは、完全長ｍＴＯＲαポリペプチドの１以上の機能を保持することができる。これらの機能は、キナーゼ活性；配列番号４のｍＴＯＲαアミノ酸配列のＳ２４４８（配列番号２のｍＴＯＲβポリペプチドのＳｅｒ６０５）に対応するセリン残基のリン酸化による活性化；Ｓ６Ｋ１をリン酸化する能力および／または４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化する能力などの他のタンパク質をリン酸化する能力；Ｒａｐｔｏｒ、Ｒｉｃｔｏｒ、およびＧβＬのうちの１つ、２つ、または３つすべてと相互作用するまたは結合する能力のうちの１以上を含んでいてもよい。
【００２１】
本発明のｍＴＯＲベータポリペプチドは、完全長ｍＴＯＲアルファポリペプチドの活性とは異なる、天然に存在するｍＴＯＲベータの少なくとも１つの活性を保持することができる。例えば、本明細書において記載されるように、ｍＴＯＲβを発現する細胞は、ｍＴＯＲαを発現する細胞よりも速く増殖し、ｍＴＯＲαではなくｍＴＯＲβの発現は、ｃ−Ｍｙｃタンパク質発現の誘発を導き、ｍＴＯＲβを発現する細胞は、ｍＴＯＲαを発現する細胞よりもＧ１期の期間が短く、ｍＴＯＲαではなくｍＴＯＲβの発現は、血清飢餓の影響から細胞を保護し、ｍＴＯＲβの発現は、ｍＴＯＲαを発現する細胞と比較して、細胞発癌能の増加を導く。本発明のｍＴＯＲβポリペプチドは、ｍＴＯＲαポリペプチドと比較した場合に、任意の１以上のこれらの差異を保持することができる。
【００２２】
ポリペプチド変異体は、配列番号２のポリペプチドなどの天然に存在するｍＴＯＲβポリペプチドの欠失変異体、追加変異体、または置換変異体を含むが、これらに限定されない。例えば、適した変異体は、そのような配列の置換変異体、欠失変異体、もしくは追加変異体であってもよく、または任意のそのような配列の断片であってもよい。変異ポリペプチドは、配列番号２など、天然に存在するｍＴＯＲβポリペプチド配列から、１、２、３、４、５、１０までの、２０までの、３０までの、４０までの、５０までの、もしくは７５までのまたはそれ以上のアミノ酸置換および／またはアミノ酸欠失を含んでいてもよい。
【００２３】
「置換」変異体は、好ましくは、１以上のアミノ酸の同数のアミノ酸との交換および保存的アミノ酸置換を行うことを伴う。ポリペプチドは、１以上のアミノ酸の１以上の他のアミノ酸との保存的置換を有し得る。当業者は、様々なアミノ酸が、類似した特徴を有することを認識している。ポリペプチドの１以上のそのようなアミノ酸は、そのポリペプチドの所望の特性（アセチルトランスフェラーゼ活性など）を排除することなく、１以上の他のそのようなアミノ酸によって置換することができることが多い。例えば、アミノ酸は、類似した特性を有する代替アミノ酸（例えば、他の塩基性アミノ酸、他の酸性アミノ酸、他の中性アミノ酸、他の荷電アミノ酸、他の親水性アミノ酸、他の疎水性アミノ酸、他の極性アミノ酸、他の芳香族アミノ酸、または他の脂肪族アミノ酸）と置換されてもよい。適した置換基を選択するために使用することができる２０の主要なアミノ酸のいくつかの特性は、以下の通りである。
【表１】
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【００２４】
例えば、アミノ酸のグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンは、互いに置換することができることが多い（脂肪族側鎖を有するアミノ酸）。これらの起こり得る置換のうちで、グリシンおよびアラニンが互いに置換するために使用される（それらは相対的に短い側鎖を有するので）こと、ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシンが互いに置換するために使用される（それらは疎水性である、より大きな脂肪族側鎖を有するので）ことが好ましい。互いに置換することができることが多い他のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）、リシン、アルギニン、およびヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギンおよびグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；ならびにシステインおよびメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）を含む。
【００２５】
本明細書において使用される場合、保存的変異体は、上記に記載した機能／活性などのタンパク質の生物学的機能または生物学的活性に不利に影響を与えない、アミノ酸配列の変化を指す。例えば、保存的変異体は、アセチル化されるためのそれらの能力、第２のタンパク質をリン酸化する能力、およびＤＮＡに結合する能力を保持することができる。置換、挿入、または欠失は、変化した配列が、タンパク質と関連する生物学的機能または生物学的活性を妨げるまたは妨害する場合に、タンパク質に影響を与えると表現される。例えば、タンパク質の全体的な荷電、構造、または疎水性／親水性の特性は、生物学的活性に不利に影響を与えることなく変化させることができる。したがって、アミノ酸配列は、タンパク質の生物学的活性に不利に影響を与えることなく、例えばポリペプチドをより疎水性または親水性にするために変化させることができる。
【００２６】
変異ポリペプチドは、配列番号２において記載される全配列など、天然に存在するｍＴＯＲβポリペプチド配列と少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、および最も好ましくは、少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。例えば、ヒトＴＯＲ、マウスＴＯＲ、およびラットＴＯＲは、タンパク質レベルで９５％の同一性を共有する。これらのレベルのアミノ酸同一性のどれでも、完全長の天然に存在するｍＴＯＲβポリペプチド配列にわたって存在していてもよく、またはその５０、１００、１５０、２００、もしくはそれ以上のアミノ酸など、完全長配列の一部にわたって存在していてもよい。これらのレベルのアミノ酸同一性のどれでも、完全な連続ｍＴＯＲβポリペプチド配列にわたって存在していてもよい。配列同一性のレベルは、ｍＴＯＲβ配列の異なる領域において変動してもよい。例えば、変異体ｍＴＯＲβは、完全長の天然に存在するｍＴＯＲβポリペプチドにわたって少なくとも７５％のアミノ酸同一性を有し得るが、いくつかの領域内でより高いレベルの配列同一性を有し得る。例えば、そのような変異ポリペプチドは、天然に存在する配列からの１以上の保存ドメインを保持することができる。
【００２７】
そのような配列に関しての同一性または相同性は、あらゆる保存的置換を配列同一性の一部として考慮せずに、最大のパーセント相同性を達成するために配列を整列し、必要であればギャップを導入した後に、知られているペプチドと同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合として本明細書において定義される。融合タンパク質またはポリペプチド配列へのＮ末端、Ｃ末端、もしくは内部の伸長、欠失、もしくは挿入は、相同性に影響を与えるとして解釈されないものとする。
【００２８】
アミノ酸配列に関連して、「配列同一性」は、以下のパラメーターを用いて、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用して評価した場合に確定される値を有する配列を指す（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４、前掲）：ペアワイズアラインメントパラメーター−メソッド：アキュレート、マトリックス：ＰＡＭ、ギャップ開始ペナルティー：１０．００、ギャップ伸長ペナルティー：０．１０；マルチプルアラインメントパラメーター−マトリックス：ＰＡＭ、ギャップ開始ペナルティー：１０．００、ディレイに対する％同一性：３０、ペナライズエンドギャップ：オン、ギャップ分離距離：０、ネガティブマトリックス：ノー、ギャップ伸長ペナルティー：０．２０、残基特異的ギャップペナルティー：オン、親水性ギャップペナルティー：オン、親水性残基：ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ。特定の残基での配列同一性は、単に誘導体化された同一の残基を含むことが意図される。
【００２９】
好ましい「誘導体」または「変異体」は、天然に存在するアミノ酸の代わりに、配列において現われるアミノ酸がその構造的な類似体であるものを含む。配列において使用されるアミノ酸はまた、ペプチドの機能が著しく不利に影響を与えられないという条件で、誘導体化または改変、例えば標識することもできる。
【００３０】
上記に記載した誘導体および変異体は、ペプチドの合成の間にまたは産生後の改変によってまたはペプチドが組換え形態である場合に、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、または核酸の酵素による切断および／もしくはライゲーションの公知の技術を使用して調製することができる。
【００３１】
ポリペプチドの欠失変異体および挿入変異体は本発明の範囲内である。アミノ酸欠失は、所望の活性を保持しながら、ポリペプチドの全長および分子量を低下させることができるので、有利となり得る。これは、特定の目的に必要とされるポリペプチドの量を低下させることを可能にすることができる。「欠失」変異体は、個々のアミノ酸の欠失、２つ、３つ、４つ、もしくは５つのアミノ酸などのアミノ酸の小さなグループの欠失、または特異的なアミノ酸ドメインもしくは他の特徴の欠失などのより大きなアミノ酸領域の欠失を含んでいてもよい。ポリペプチドに関するアミノ酸挿入もまた行うことができる。これは、ポリペプチドの性質を変化させるために（例えば同定、精製、または発現を補助するために）行われてもよい。上記に定義されるようなポリペプチドの配列に関するアミノ酸変化を組み込むポリペプチド（置換、欠失、または挿入のいずれにせよ）は、任意の適した技術を使用して提供することができる。例えば、所望の配列変化を組み込む核酸配列は、部位特異的突然変異誘発によって提供することができる。次いで、これは、そのアミノ酸配列における対応する変化を有するポリペプチドの発現を可能にするために使用することができる。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、配列番号２において開示されているアミノ酸配列を有するポリヌクレオチドなどの天然に存在するｍＴＯＲβ分子およびそのいずれかのアミノ酸配列変異体を含み、１以上のアミノ酸残基は、開示されているコード配列のＮ末端もしくはＣ末端にまたはその配列内に挿入されている。上記に説明されるように、配列番号２のｍＴＯＲβポリペプチドは、完全長ｍＴＯＲαポリペプチドからの２つの断片を共にスプライスすることによって形成される。配列番号２は、したがって、配列番号４のアミノ酸１〜２３および１８６７〜１５４９を含む。変異体ｍＴＯＲβは、他の天然に存在するｍＴＯＲαポリペプチド由来など、他のｍＴＯＲαポリペプチド由来の等価な断片を含んでいてもよい。関連するポリペプチドにおける等価なアミノ酸は、例えば配列のアラインメントおよび比較によって容易に同定することができる。変異体ｍＴＯＲβは、したがって、天然に存在するｍＴＯＲαポリペプチドからのＮ末端断片およびＣ末端断片を組み合わせることによって形成されてもよい。変異体ｍＴＯＲβポリペプチドはまた、そのようなＮ末端断片およびＣ末端断片から配列が変わってもよい。例えば、変異体ｍＴＯＲβポリペプチドは、任意の天然に存在するｍＴＯＲαポリペプチドからの関係のあるＮ末端断片およびＣ末端断片と比較した場合に、上記に論じられるアミノ酸配列同一性の程度のいずれかを有し得る。
【００３３】
変異体ｍＴＯＲβは、上記に定義されるようなｍＴＯＲβ活性を有するポリペプチドを形成するために、共にスプライスすることができるｍＴＯＲαポリペプチドと異なる断片を含んでいてもよい。
【００３４】
例として配列番号４のｍＴＯＲαポリペプチドを使用して、本発明のｍＴＯＲβポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１〜２３を含んでいてもよく、またはｍＴＯＲαのＮ末端からのより多いもしくはより少ないアミノ酸を含んでいてもよい。ｍＴＯＲαの適した断片は、配列番号４の残基１から開始してもよく、またはアミノ酸２、３、４、５、６、またはより後のアミノ酸などの後の残基から開始してもよい。ｍＴＯＲαの適した断片は、配列番号４の残基２３で終了してもよく、またはアミノ酸１８、１９、２０、２１、２２、２４、２５、２６、２７、もしくは２８またはより前もしくはより後のアミノ酸残基などの異なる残基で終了してもよい。これらの開始点および終了点の任意の組合せもまた、適した断片を形成するために使用することができる。ｍＴＯＲαのＮ末端からの適した断片は、例えば１５、１７、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、３０、３５、またはそれ以上のアミノ酸長であってもよい。
【００３５】
同様に、ｍＴＯＲβポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１８６７〜２５４９を含んでいてもよく、またはｍＴＯＲαのＣ末端からのより多いもしくはより少ないアミノ酸を含んでいてもよい。ｍＴＯＲαの適した断片は、配列番号４の残基１８６７から開始してもよく、またはアミノ酸１８６０、１８６１、１８６２、１８６３、１８６４、１８６５、１８６６、１８６８、１８６９、１８７０、１８７１、１８７２、１８７３、またはより前もしくはより後のアミノ酸などの異なる残基から開始してもよい。ｍＴＯＲαの適した断片は、配列番号４の残基２５４９で終了してもよく、またはアミノ酸２５４８、２５４７、２５４６、２５４５、２５４４、またはより前のアミノ酸残基などのより前の残基で終了してもよい。しかしながら、ｍＴＯＲαのＣ末端断片が、配列番号４のアミノ酸２５１７〜２５４９に位置するＦＡＴＣドメインを含むことが好ましい。これらの開始点および終了点の任意の組合せもまた、適した断片を形成するために使用することができる。ｍＴＯＲαのＣ末端からの適した断片は、例えば６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６９０、６９５、７００まで、またはそれ以上のアミノ酸長であってもよい。
【００３６】
ｍＴＯＲβポリペプチドは、ｍＴＯＲαポリペプチドからのそのようなＮ末端断片およびＣ末端断片の任意の組合せを含んでいてもよい。そのような断片は、本明細書に記載されている置換、追加、または欠失によって、天然に存在する配列からさらに改変することができる。
【００３７】
上記に記載されるように、ｍＴＯＲβポリペプチドは、ｍＴＯＲαの少なくとも１つの機能／活性などのｍＴＯＲβの少なくとも１つの機能／活性を保持するであろう。図５において示されるように、配列番号２のｍＴＯＲβは、ｍＴＯＲαからのある種のドメインを保持するが、他のものを欠く。例えば、配列番号２のｍＴＯＲβは、ｍＴＯＲαからの調節性のＨＥＡＴドメインおよびＦＡＴＮドメインを欠く。そのため、これらのドメインは、ｍＴＯＲβの機能にとって不必要であるように思われる。そのため、ｍＴＯＲβポリペプチドは、ｍＴＯＲαポリペプチドからの１つ、それ以上、またはすべてのＨＥＡＴドメインを欠いていてもよい。ｍＴＯＲβは、機能性のＨＥＡＴドメインを完全に欠いてもよい。ｍＴＯＲβポリペプチドは、ｍＴＯＲαポリペプチドからのＦＡＴＮドメインを欠いてもよい。ｍＴＯＲβポリペプチドは、機能性のＦＡＴドメインを欠いてもよい。
【００３８】
しかしながら、配列番号２のｍＴＯＲβポリペプチドは、ｍＴＯＲαからの他のドメインを保持する。これらのドメインからのアミノ酸または構造的な特徴は、ｍＴＯＲβの様々な活性を担っていてもよい。そのため、ｍＴＯＲβポリペプチドは、ＦＲＢドメインおよび／またはキナーゼドメイン（ＫＤ）および／または調節性ドメインおよび／またはＦＡＴＣドメインを保持することができる。ＦＲＢドメインは、ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合に必要であり、かつ十分である。ｍＴＯＲβポリペプチドは、ＦＲＢドメインを保持することができる。ｍＴＯＲβポリペプチドは、ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合能力を付与する代替ドメインまたは変異ドメインを保持することができる。キナーゼドメインは、Ｐ１３キナーゼ関連ドメインである。ｍＴＯＲβポリペプチドは、キナーゼドメインを保持することができる。ｍＴＯＲβポリペプチドは、Ｐ１３キナーゼ能力を付与する代替ドメインまたは変異ドメインを保持することができる。ＦＡＴＣドメインは、ｍＴＯＲキナーゼの活性および機能に必要である。ｍＴＯＲβポリペプチドは、ＦＡＴＣドメインを保持することができる。ｍＴＯＲβポリペプチドは、そのようなｍＴＯＲβキナーゼの活性および機能を付与する代替ドメインまたは変異ドメインを保持することができる。ｍＴＯＲβポリペプチドは、キナーゼドメインおよびＦＡＴＣドメインの両方などのｍＴＯＲαからの２つ以上のこれらのドメインを保持することができる。ｍＴＯＲβポリペプチドはまた、Ｒａｐｔｏｒおよび／またはＲｉｃｔｏｒおよび／またはＧβＬに対する機能性の結合部位を保持することができる。
【００３９】
本発明のポリペプチドはまた、少なくとも１つの残基によって置換された、配列番号２において開示されているアミノ酸配列および開示されている配列のアミノ酸配列変異体を有するポリヌクレオチドなどの天然に存在するｍＴＯＲβ分子または上記に定義されるようなそれらの断片を含む。そのような断片は、ペプチドまたはポリペプチドとも称されるが、ＡＴフックドメインなどの知られているタンパク質ドメインに対応する、アミノ酸配列の領域として同定されるタンパク質の機能性の領域および強い親水性の領域を含有し得る。領域は、すべて、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）などの一般に入手可能なタンパク質配列分析ソフトウェアを使用することによって容易に同定可能である。
【００４０】
本発明によるポリペプチド「断片」は、切断によって、例えばポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端からの１以上のアミノ酸の除去によって作製することができる。１０まで、２０まで、３０まで、４０まで、５０まで、６０まで、７５まで、またはそれ以上のアミノ酸は、Ｎ末端および／またはＣ末端からこのように除去することができる。断片はまた、１以上の内部の欠失によって生成することができる。
【００４１】
本発明のポリペプチドは、さらなる追加の配列、例えば下記に記載されるポリヌクレオチドおよびベクターによってコードされる配列を含んでいてもよい。ポリペプチドは、リーダー配列、つまり、ポリペプチドのターゲティングまたは調節において機能するポリペプチドのアミノ末端のまたはその近くの配列を含んでいてもよい。例えば、ポリペプチドを体内の特定の組織に向ける配列、または発現に際してポリペプチドのプロセシングもしくはフォールディングを助ける配列が、ポリペプチド中に含まれていてもよい。様々なそのような配列は、当該分野において周知であり、例えばポリペプチドの所望の特性および産生方法に応じて当業者によって選択することができる。
【００４２】
ポリペプチドは、ポリペプチドまたはポリペプチドの発現を同定もしくはスクリーニングするためにタグまたは標識をさらに含んでいてもよい。適した標識は、１２５Ｉ、３２Ｐ、もしくは３５Ｓなどの放射性同位元素、蛍光標識、酵素標識、またはビオチンなどの他のタンパク質標識を含む。適したタグは、日常的なスクリーニング法によって同定することができる短いアミノ酸配列であってもよい。例えば、特定のモノクローナル抗体によって認識される短いアミノ酸配列が含まれていてもよい。
【００４３】
本発明のポリペプチドは、本明細書において定義されるように、化学的に改変し、例えば翻訳後に改変することができる。例えば、それらは、グリコシル化することもでき、または改変アミノ酸残基を含んでいてもよい。それらは、アミドおよびポリペプチドとのコンジュゲートを含む、ポリペプチド誘導体の多種多様の形態とすることができる。
【００４４】
化学的に改変されたペプチドはまた、機能性の側鎖の反応によって化学的に誘導体化される１以上の残基を有するペプチドをも含む。そのような誘導体化された側鎖は、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、およびホルミル基を形成するために誘導体化された側鎖を含む。遊離カルボキシル基は、塩、メチルエステルおよびエチルエステルもしくは他のタイプのエステル、またはヒドラジドを形成するために誘導体化することができる。遊離水酸基は、Ｏアシル誘導体またはＯアルキル誘導体を形成するために誘導体化することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、Ｎ−イム−ベンジルヒスチジンを形成するために誘導体化することができる。ペプチドはまた、リン酸化（例えば、３アミノリン酸化）によって、およびグリコシル化（例えば、マンノシル化）によって改変することができる。
【００４５】
２０の標準的なアミノ酸の１以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するものもまた、化学的に修飾されたペプチドとして含まれていてもよい。例えば、４−ヒドロキシプロリンは、プロリンの代わりに用いられてもよく、またはホモセリンは、セリンの代わりに用いられてもよい。
【００４６】
企図されるポリペプチドの変異体および／または誘導体は、例えば相同組換え、部位特異的突然変異誘発、またはＰＣＲ突然変異誘発による所定の変異を含有するものならびにウサギ、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、および非ヒト霊長動物種を含むが、これらに限定されない他の動物種の対応するタンパク質ならびにタンパク質のファミリーの対立遺伝子または他の天然に存在する変異体；ならびにタンパク質が、天然に存在するアミノ酸以外の部分（例えば、酵素または放射性同位元素などの検出可能な部分）を用いて、置換による手段、化学的な手段、酵素による手段、または他の適切な手段によって共有結合で改変された誘導体をさらに含む。
【００４７】
[ｍＴＯＲベータペプチドミミック]
ｍＴＯＲβの三次元構造に似たペプチドミメティックを産生することができる。そのようなペプチドミメティックは、例えば、より経済的な生産、より高い化学的安定性、薬理学的特性の増強（半減期、吸収、効力、効能など）、特異性の変化（例えば生物学的活性の広域スペクトル）、抗原性の低下などを含む、天然に存在するペプチドに対して有意な利点を有し得る。
【００４８】
そのようなミメティックは、任意の１以上の上記に論じられるｍＴＯＲβの機能または活性を有し得る。一形態において、ミメティックは、ｍＴＯＲβ二次構造の要素に似たペプチド含有分子である。他の実施形態において、ミメティックは、ｃＭｙｃに結合することができる。代替の実施形態において、ミメティックは、Ｒａｐｔｏｒ、Ｒｉｃｔｏｒ、およびＧβＬのいずれか１つと結合することができる。他の実施形態において、ミメティックは、Ｓ６Ｋ１および／または４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化することができる。
【００４９】
ペプチドミメティックの使用の背景にある根本的な理論的根拠は、タンパク質のペプチドバックボーンが、主として、抗体および抗原の相互作用に類似する、分子の相互作用を促進するようにアミノ酸側鎖を方向付けるために存在するということである。ペプチドミメティックは、天然分子に類似した、分子の相互作用を可能にすることが予想される。他の形態において、ペプチド類似体は、鋳型ペプチドの特性と類似性の特性を有する非ペプチド薬剤として医薬品産業において一般に生産される。これらのタイプの非ペプチド化合物はまた、ペプチドミメティックまたはペプチドミメティック（peptidomimetic）とも称され（参照によって本明細書において組み込まれるFauchere(1986)Adv.Drug Res.15、29〜69ページ；Veber & Freidinger(1985)Trends Neurosci.8、392〜396ページ；Evansら(1987)J.Med.Chem、30、1229〜1239ページ）、コンピュータ化された分子モデリングの支援によって通常開発される。
【００５０】
治療的に有用なペプチドに構造的に類似したペプチドミメティックは、等価な治療効果または予防効果をもたらすために使用することができる。一般に、ペプチドミメティックは、パラダイムポリペプチド（つまり、生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）に構造的に類似しているが、当該分野において知られている方法による、ペプチド中に通常で見つけられない化学的連結によって必要に応じて交換される１以上のペプチド連結を有する。ペプチドミメティックの標識は、定量的構造−活性データおよび分子モデリングによって予測される、ペプチドミメティック上の非干渉位置へ、直接またはスペーサー（例えばアミド基）を通して、１以上の標識を共有結合することを通常伴う。そのような非干渉位置は、一般に、ペプチドミメティックが結合して、治療効果をもたらす高分子と直接接触しない位置である。ペプチドミメティックの誘導体化（例えば標識）は、ペプチドミメティックの所望の生物学的活性または薬理学的活性に実質的に干渉しないはずである。
【００５１】
ペプチドミメティックの使用は、コンビナトリアルケミストリーを使用して増強して、薬剤ライブラリーを作り出すことができる。ペプチドミメティックの設計は、例えば腫瘍細胞へのペプチドの結合を増加または減少させるアミノ酸変異を同定することによって支援することができる。使用することができるアプローチは、酵母２ハイブリッド法（Chienら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88、9578〜9582ページを参照されたい）およびファージディスプレイ法の使用を含む。２ハイブリッド法は、酵母におけるタンパク質−タンパク質相互作用を検出する（Fieldsら(1989)Nature 340、245〜246ページ）。ファージディスプレイ法は、固定されたタンパク質ならびにラムダおよびＭ１３などのファージの表面上に発現したタンパク質の間の相互作用を検出する（Ambergら(1993)Strategies 6、2〜4ページ；Hogrefeら(1993)Gene 128、119〜126ページ）。これらの方法は、ペプチド−タンパク質相互作用の正の選択および負の選択、ならびにこれらの相互作用を決定する配列の同定を可能にする。
【００５２】
[核酸分子]
本発明は、ｍＴＯＲベータポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００５３】
本明細書において使用される場合、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、区別なく使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、デオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、および／もしくはシトシン）またはリボヌクレオチド、またはその類似体のいずれかを指す。そのようなポリヌクレオチドは、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスであってもよい。この用語は、分子の一次構造および二次構造のみを指し、あらゆる特定の三次形態に限定されない。ポリヌクレオチドの非限定的な例は、遺伝子、遺伝子断片、ＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ、線状のＤＮＡ分子（例えば制限断片）中に見つけられる二本鎖ＤＮＡ、ウイルス、染色体、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーを含む。二本鎖ＤＮＡ分子の配列などのポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡの非転写鎖（例えばｍＲＮＡに相同性の配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向の配列のみを提供する通常の慣習に従って、本明細書において記載することができる。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチドは、単離形態または精製形態で提供することができる。本明細書において使用される場合、核酸分子は、核酸分子が、他のポリペプチドをコードする混在物質（contaminant）である核酸分子から実質的に分離される場合に、「単離される」と表現される。
【００５５】
本発明のポリヌクレオチドは、上記に定義されるような本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ）であってもよい。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列に相補的なポリヌクレオチドであってもよい。本発明のポリヌクレオチドは、適切なストリンジェンシー条件下で、オープンリーディングフレームにわたって、本発明のポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズするポリヌクレオチドであってもよい。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２の連続したアミノ酸配列全体と少なくとも約７５％または少なくとも約９５％の同一性を共有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。特に企図されるのは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびアンチセンス分子ならびに天然源に由来するにせよ、合成されるにせよ代替バックボーンに基づくまたは代替塩基を含む核酸である。しかしながら、本発明によるタンパク質をコードする核酸をコードする、それに適切なストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、またはそれに相補的であるものを含むそのような核酸は、あらゆる先行技術の核酸に対して新しくかつ自明でないとしてさらに定義される。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチドは、上記に記載されるように、ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドであってもよい。本発明のポリヌクレオチドは、ｍＴＯＲβポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドであってもよい。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２のｍＴＯＲβポリペプチドをコードする配列、配列番号２のｍＴＯＲβポリペプチドを含むもしくはそれから本質的になるポリペプチド、または上記に記載したそのいずれかの変異体もしくは断片を含んでいてもよい。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の核酸配列または遺伝子コードにおける重複性を通してのみ配列番号１から変わった核酸配列、つまり、配列番号１と同じポリペプチドをコードする他の核酸配列を含んでいてもよく、それから本質的になってもよく、またはそれからなってもよい。
【００５７】
核酸「コード配列」または選択されるポリペプチドを「コードする」核酸配列は、適切な調節配列のコントロール下に配置された場合に、ｉｎ  ｖｉｖｏで転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列に対して３’に位置するであろう。本発明の目的のために、そのような核酸配列は、ウイルス、原核生物、または真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ウイルスもしくは原核生物のＤＮＡまたはＲＮＡからのゲノム配列、および合成ＤＮＡを含むことができるが、これらに限定されない。
【００５８】
本発明のポリヌクレオチドは、ｍＴＯＲβポリペプチドをコードする天然に存在する核酸であってもよい。例えば、配列番号１のポリヌクレオチドは、配列番号２のｍＴＯＲβポリペプチドをコードする。本発明のポリヌクレオチドは、そのようなポリペプチドの変異体であってもよく、または上記に記載した天然に存在するｍＴＯＲβポリペプチドの変異体をコードしてもよい。
【００５９】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２の連続したアミノ酸配列全体など、天然に存在するｍＴＯＲβポリペプチドと少なくとも約７５％の配列同一性、好ましくは、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％もしくはそれ以上、少なくとも約９７％、または最も好ましくは、少なくとも約９９％もしくはそれ以上の同一性を有するポリペプチドをコードしてもよい。本発明のポリヌクレオチドは、特にオープンリーディングフレームにわたって、配列番号１のヌクレオチド配列など、天然に存在するｍＴＯＲβポリヌクレオチド配列または配列番号２のポリペプチドをコードする他のポリヌクレオチドと少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％もしくはそれ以上、少なくとも約９７％もしくはそれ以上、最も好ましくは、９９％の配列同一性を共有してもよい。
【００６０】
相同性または同一性を測定するための方法は、当該分野において周知であり、本文脈において、相同性は、核酸同一性に基づいて計算されることが当業者らによって理解されるであろう。そのような相同性は、少なくとも１５、好ましくは、少なくとも３０、例えば少なくとも４０、６０、１００、２００、またはそれ以上の連続ヌクレオチドの領域にわたって存在してもよい。そのような相同性は、無改変ｍＴＯＲβポリヌクレオチドまたは無改変ｍＴＯＲβポリペプチド配列の全長にわたって存在してもよい。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するために使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えばそのデフォルト設定で使用）（Devereuxら(1984)Nucleic Acids Research 12、387〜395ページ）。ＰＩＬＥＵＰアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムもまた、例えばAltschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290〜300ページ；Altschul,S,Fら(1990)J Mol Biol 215:403〜10ページにおいて記載されるように、相同性を計算するまたは配列を並べるために使用することができる（典型的にそれらのデフォルト設定で）。
【００６１】
ヌクレオチド配列レベルまたはアミノ酸配列レベルでの相同性または配列同一性は、配列類似性検索に調整される、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘによって用いられるアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴ(Basic Local Alignment Search Tool)分析によって好ましくは決定される(Altschulら(1997)Nucleic Acids Res.25、3389〜3402ページおよびKarlinら(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87、2264〜2268ページ、両者とも参照によって完全に組み込まれる）。ＢＬＡＳＴプログラムによって使用されるアプローチは、最初に、クエリー配列およびデータベース配列の間で、ギャップを用いて（不連続）およびギャップを用いずに（連続）、類似したセグメントを考慮すること、次いで、同定された、すべてのマッチの統計的有意性を評価すること、ならびに最後に、あらかじめ選択された有意性の閾値を満たす、それらのマッチのみを集計することである。配列データベースの類似性検索における基本的な問題の論述については、参照によって完全に組み込まれるAltschulら(1994)Nature Genetics 6、119〜129ページを参照されたい。ヒストグラム、ディスクリプション、アラインメント、エクスペクト（つまり、データベース配列に対してマッチを報告するための統計的有意性閾値）、カットオフ、マトリックス、およびフィルター（低複雑性）についての検索パラメーターは、デフォルト設定とする。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘによって使用されるデフォルトのスコア化マトリックスは、８５のヌクレオチド長またはアミノ酸長にわたるクエリー配列に対して推奨されるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスとする（参照によって完全に組み込まれるHenikoffら(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89、10915〜10919ページ）。
【００６２】
ｂｌａｓｔｎについては、スコア化マトリックスは、Ｎ（つまり、ミスマッチ残基に対するペナルティースコア）に対する、Ｍ（つまり、マッチ残基のペアに対するリワードスコア）の比によって設定され、ＭおよびＮについてのデフォルト値は、それぞれ、＋５および−４とする。４つのｂｌａｓｔｎパラメーターは、以下のように設定した：Ｑ＝１０（ギャップ生成ペナルティー）；Ｒ＝１０（ギャップ伸長ペナルティー）；ウィンク＝１（クエリーに沿ってすべてのｗｉｎｋｔｈ位置でワードヒットを生成する）；およびｇａｐｗ＝１６（ギャップアラインメントが生成されるウィンドウ幅を設定する）。等価なＢｌａｓｔｐパラメーター設定はＱ＝９；Ｒ＝２；ウィンク＝１；およびｇａｐｗ＝３２とした。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０において入手可能な配列の間のＢｅｓｔｆｉｔ比較は、ＤＮＡパラメーターＧＡＰ＝５０（ギャップクリエーションペナルティー）およびＬＥＮ＝３（ギャップ伸長ペナルティー）を使用し、タンパク質比較において等価な設定はＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２とする。
【００６３】
変異ポリヌクレオチドは、３まで、５まで、１０まで、１５まで、２０まで、３０まで、５０まで、１００まで、またはそれ以上の変異（これらはそれぞれ、置換、欠失、または挿入であってもよい）によって、関係のあるポリヌクレオチドにおける配列と異なっていてもよい。これらの変異は、少なくとも３０、例えば少なくとも４０、６０、もしくは１００、またはそれ以上の、変異体の連続ヌクレオチドの領域にわたって、または完全長の変異体もしくはそれが由来するポリヌクレオチドにわたって測定されてもよい。
【００６４】
本発明の変異ポリヌクレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチドなどの天然に存在するｍＴＯＲβポリヌクレオチドなどのｍＴＯＲβポリヌクレオチドまたはそのいずれかの相補体とバックグラウンドを有意に超えるレベルでハイブリダイズすることができる。変異体および元のポリヌクレオチドの間の相互作用によって生成されるシグナルレベルは、典型的に、「バックグラウンドハイブリダイゼーション」の少なくとも１０倍、好ましくは、少なくとも１００倍強い。相互作用の強度は、例えば３２Ｐを用いてプローブを放射標識することによって測定されてもよい。そのような変異体は、本発明のポリペプチドをコードしてもよく、またはコードしなくてもよい。好ましい分子は、配列番号１の相補体にハイブリダイズし、上記に定義されるようなｍＴＯＲβポリペプチドなどの機能性のタンパク質をコードするものである。より好ましいハイブリダイズ分子は、配列番号１のオープンリーディングフレームの相補体鎖に上記の条件下でハイブリダイズするものである。
【００６５】
そのようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントな条件下で生じる。「ストリンジェントな条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度および高温、例えば、少なくとも５０℃の温度の、０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ＳＤＳを用いる条件または（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミドなどの変性剤、例えば、４２℃の、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％  Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭｌ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を含む５０％（容量／容量）ホルムアミドを用いる条件とする。他の例は、少なくとも４２℃の温度での、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストラン中でのハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での４２℃での洗浄とする。当業者は、明瞭で検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを適切に得るために、ストリンジェンシー条件を容易に決定し、変えることができる。
【００６６】
本発明は、コード核酸分子の断片をさらに提供する。本発明のポリヌクレオチドは、したがって、本明細書において記載されるポリヌクレオチドのいずれかの断片であってもよく、または上記に記載した断片ポリペプチドをコードしてもよい。本明細書において使用される場合、コード核酸分子の断片は、全タンパク質コード配列の小さな部分を指す。断片の大きさは、意図される使用によって決定される。例えば、断片が、タンパク質の活性部分をコードするように選ばれる場合、断片は、タンパク質の機能性の領域をコードすることができるほど十分に大きい必要がある。断片が、核酸プローブまたはＰＣＲプライマーとして使用されることになっている場合、次いで、断片長は、プロ−ビング／プライミングの間に相対的に少数の偽陽性しか得られないように選ばれる。
【００６７】
本発明によるポリヌクレオチド「断片」は、切断によって、例えば、ポリヌクレオチドの一端または両端からの１以上のヌクレオチドの除去によって作製することができる。１０まで、２０まで、３０まで、４０まで、５０まで、７５まで、１００まで、２００まで、またはそれ以上の核酸は、このように、ポリヌクレオチドの３’端末および／または５’端末から除去することができる。断片はまた、１以上の内部の欠失によって生成することができる。
【００６８】
本発明の核酸分子の断片（つまり、合成オリゴヌクレオチド）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためにプローブもしくは特異的プライマーとして、または本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列を合成するために使用することができる。そのような分子は、化学的な技術、例えばMatteucciら(1981)J.Am.Chem.Soc.103、3185〜3191ページのリン酸トリエステル法または自動合成法を使用することによって容易に合成することができる。そのうえ、より大きなＤＮＡセグメントは、遺伝子の様々なモジュールセグメントを定義する一群のオリゴヌクレオチドの合成、その後に続く、完全な修飾遺伝子を構築するためのオリゴヌクレオチドのライゲーションなどのよく知られている方法によって、容易に調製することができる。好ましい実施形態において、本発明の核酸分子は、少なくとも約２１２１ヌクレオチドの連続したオープンリーディングフレームを含む。
【００６９】
本発明のポリペプチドは、したがって、それをコードし、発現することができるポリヌクレオチドから産生することもでき、またはその形態で送達することもできる。本発明のポリヌクレオチドは、例としてSambrookら(1989、Molecular Cloning-a laboratory manual;Cold Spring Harbor Press)において記載されるように、当該分野において周知の方法によって合成することができる。すなわち、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーのスクリーニングまたはコード配列を含むことが知られているベクターからポリペプチドのコード配列を得ることなどによって、組換え法を使用して得ることができる。さらに、所望の配列は、フェノール抽出およびｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのＰＣＲなどの標準的な技術を使用して、所望の配列を含有する細胞および組織から直接単離することができる。ポリヌクレオチド配列はまた、クローニングするのではなく、合成により産生することもできる。
【００７０】
本発明の核酸分子は、診断上の目的およびプローブのための目的のために、検出可能な標識を含有するようにさらに改変することができる。多種多様のそのような標識は、当該分野において知られており、本明細書において記載されるコード分子とともに容易に用いることができる。適した標識は、ビオチン、放射標識ヌクレオチド、およびその他同種のものを含むが、これらに限定されない。当業者は、本発明の核酸分子の標識変異体を得るために任意のそのような標識を容易に用いることができる。翻訳の間にタンパク質配列の中に組み込まれるアミノ酸の欠失、追加、または変化による一次構造自体に対する改変は、タンパク質の活性を破壊することなく行うことができる。そのような置換または他の変化は、本発明の企図される範囲内にある核酸によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質をもたらす。
【００７１】
[ベクターおよび宿主細胞]
本発明のポリヌクレオチドは、発現ベクターなどのベクター中に提供することができる。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、およびベクターは宿主細胞中に提供することができる。
【００７２】
本発明は、コード配列を含有する組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）をさらに提供する。本明細書において使用される場合、ｒＤＮＡ分子は、ｉｎ  ｓｉｔｕで分子操作に供されるＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子を生成するための方法は、当該分野においてよく知られており、例えばSambrookら(2001)、Molecular Cloning-A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。好ましいｒＤＮＡ分子において、コードＤＮＡ配列は、発現コントロール配列および／またはベクター配列に作動可能に連結されている。本発明の一実施形態において、コード配列は、配列番号１またはその断片を含有する。代替の実施形態において、コード配列は、配列番号２のポリペプチドまたはその断片をコードする。
【００７３】
本発明の核酸分子は、挿入配列に作動可能に連結されたコントロール配列を含み、したがって、標的被験体種におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの本発明のポリペプチドの発現を可能にする発現カセットの形態で提供することができる。これらの発現カセットは、引き続いて、ベクター内に典型的に提供される。適したベクターは、十分な量の遺伝情報を運ぶことができ、本発明のポリペプチドの発現を可能にすることができる任意のベクターであってもよい。
【００７４】
ベクターは、さらなるプロセシングのための大量の核酸の調製のために（クローニングベクター）またはポリペプチドの発現のために（発現ベクター）、本発明の核酸の操作を単純化するために使用することができる。そのようなタンパク質は、ｍＴＯＲβ、配列番号２の任意のアミノ酸残基で１以上の変異を含むタンパク質、およびその誘導体ポリペプチドを含む。ベクターは、プラスミド、ウイルス（ファージを含む）、および組み込まれたＤＮＡ断片（つまり、組換えによって宿主ゲノムの中に組み込まれる断片）を含む。
【００７５】
本発明のｍＴＯＲβポリペプチドのコード配列が、一旦調製または単離されると、それは、任意の適したベクターの中にクローニングすることができ、それによって、ｍＴＯＲβコード配列を全く含まない細胞が実質的に存在しないように細胞を維持することができる。本明細書において記載されるように、多数のクローニングベクターが当業者らに知られている。クローニングベクターは、発現コントロール配列を含有する必要はない。
【００７６】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド配列またはｒＤＮＡ分子を含む発現ベクターをも含む。そのような発現ベクターは、分子生物学の技術分野において日常的に構築され、例えば、プラスミドＤＮＡならびに適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー、および例えば、本発明のペプチドの発現を可能にするために必要である可能性がある、正しい向きで位置するポリアデニル化シグナルなどの他の要素の使用を伴っていてもよい。他の適したベクターは、当業者に明白であろう。さらなる例として、この点に関して、発明者らはSambrookらに言及する。したがって、本発明のポリペプチドは、そのようなベクターを細胞に送達し、ベクターから転写が生じることを可能にすることによって提供することができる。好ましくは、本発明のまたはベクター中での本発明における使用のためのポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現を提供することができるコントロール配列に作動可能に連結され、つまり、ベクターは発現ベクターである。
【００７７】
「作動可能に連結された」とは、そのように記載される構成成分が、それらの通常の機能を実行するように構成されている要素の配置をさす。したがって、核酸配列に作動可能に連結された、プロモーターなどの所与の調節配列は、ふさわしい酵素が存在する場合に、その配列の発現をもたらすことができる。プロモーターは、プロモーターが配列の発現を指示するように機能する限り、その配列と連続している必要はない。したがって、例えば、介在性の、翻訳されていないが、転写された配列は、プロモーター配列および核酸配列の間に存在することができ、プロモーター配列はなお、コード配列に「作動可能に連結された」と見なすことができる。
【００７８】
本発明の配列をコードするタンパク質ファミリーのうちの１つが、作動可能に連結されるベクターおよび／または発現コントロール配列の選考は、当該分野においてよく知られているように、所望の機能特性、例えば、タンパク質発現および形質転換されることになっている宿主細胞に直接依存する。本発明によって企図されるベクターは、本発明のポリヌクレオチドの（例えば、ｒＤＮＡ分子中に含まれる構造遺伝子の）宿主染色体の中への複製または挿入を少なくとも指示することができ、そして好ましくはその発現もまた指示することができる。
【００７９】
配列をコードする、作動可能に連結されたタンパク質の発現を調節するために使用される発現コントロールエレメントは、当該分野において知られており、誘発性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、および他の調節性の要素を含むが、これらに限定されない。好ましくは、誘発性プロモーターは、宿主細胞の培地中で栄養素に応答性であるなどのように、容易にコントロールされる。
【００８０】
一実施形態において、コード核酸分子を含有するベクターは、原核生物レプリコン（つまり、それを用いて形質転換された細菌宿主細胞などの原核生物宿主細胞中で、染色体外で、自律複製および組換えＤＮＡ分子の維持を指示する能力を有するＤＮＡ配列）を含むであろう。そのようなレプリコンは、当該分野においてよく知られている。そのうえ、原核生物レプリコンを含むベクターはまた、その発現が薬剤抵抗性などの検出可能なマーカーを付与する遺伝子を含んでいてもよい。典型的な細菌の薬剤抵抗性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する抵抗性を付与する遺伝子である。
【００８１】
原核生物レプリコンを含むベクターは、大腸菌（E. coli）などの細菌宿主細胞中でのコード遺伝子配列の発現（転写および翻訳）を指示することができる原核生物プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターをさらに含むことができる。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写が生じることを可能にするＤＮＡ配列によって形成される発現コントロールエレメントである。細菌宿主と適合性のプロモーター配列は、本発明のＤＮＡセグメントの挿入のための好都合な制限部位を含有するプラスミドベクター中に典型的に提供される。典型的なそのようなベクタープラスミドは、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、およびｐＢＲ３２９（BioRad）、ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（Pharmacia）である。
【００８２】
真核細胞と適合性の発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞と適合性の発現ベクターもまた、コード配列を含有するベクターまたはｒＤＮＡ分子を形成するために使用することができる。ウイルスベクターを含む真核細胞発現ベクターは、当該分野で周知であり、いくつかの商業的供給源から入手可能である。典型的に、そのようなベクターは、所望のＤＮＡセグメントの挿入に好都合な制限部位を含有して提供される。典型的なそのようなベクターは、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Pharmacia）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（International Biotechnologies,Inc.）、ｐＴＤＴ１（ATCC）、本明細書において記載されるベクターｐＣＤＭ８、ならびに同様な真核生物発現ベクターである。
【００８３】
例示的な真核生物発現系は、当該分野において周知のワクシニアウイルスを用いる発現系である（例えば国際公開第８６／０７５９３号を参照されたい）。酵母発現ベクターは、当該分野において公知である（例えば米国特許第４，４４６，２３５号および同第４，４３０，４２８号を参照されたい）。他の発現系は、ベクターｐＨＳＩであり、これは、チャイニーズハムスター卵巣細胞を形質転換する（国際公開第８７／０２０６２号を参照されたい）。哺乳動物組織は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼなどの選択可能なマーカーをコードするＤＮＡ、およびｍＴＯＲβまたは誘導体をコードするＤＮＡを用いて同時形質転換されてもよい。野生型ＤＨＦＲ遺伝子が用いられる場合、ＤＨＦＲが欠損しており、したがって、ヒポキサンチン、グリシン、およびチミジンを欠くｈｇｔ培地中でのトランスフェクションの成功に関するマーカーとしてのＤＨＦＲコード配列の使用を可能にする宿主細胞を選択することが好ましい。
【００８４】
本発明のベクターとして使用されるまたは本発明のｒＤＮＡ分子を構築するために使用される真核細胞発現ベクターは、真核細胞中で有効な選択可能なマーカー（好ましくは、薬剤抵抗性選択マーカー）をさらに含んでいてもよい。好ましい薬剤抵抗性マーカーは、その発現がネオマイシン抵抗性をもたらす遺伝子、つまり、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である（Southernら(1982)J.Mol.Anal.Genet.1、327〜341ページ）。代替的には、選択可能なマーカーは、別個のプラスミド上に存在することができ、それらの２つのベクターは、宿主細胞の同時トランスフェクションによって導入され、選択可能なマーカーについて、適切な薬剤中で培養することによって選択される。
【００８５】
発現ベクター中のコントロール配列は、転写プロモーター、適したリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結をコントロールする配列などの転写コントロール配列ならびに翻訳コントロール配列を含んでいてもよい。一実施形態において、発現ベクターは、ｍＴＯＲβ遺伝子の安定した発現を促進するためのおよび／または形質転換細胞を同定するための選択遺伝子を含んでいてもよい。しかしながら、発現を維持するための選択遺伝子は、真核生物の宿主細胞を使用して、同時形質転換系における別個のベクターによって供給することができる。
【００８６】
適したベクターは、一般に、意図される発現宿主と適合性の種に由来するレプリコン（非組込みベクターにおける使用のための複製開始点）およびコントロール配列を含有する。本明細書において使用される場合、「複製可能な」ベクターという用語によって、そのようなレプリコンを含有するベクターおよび宿主ゲノム中への組込みによって複製されるベクターを包含することが意図される。
【００８７】
宿主細胞のための発現ベクターは、たいてい、複製開始点、リボソーム結合部位と共に、ｍＴＯＲベータポリペプチドコード配列から上流に位置するプロモーター、ポリアデニル化部位、および転写終結配列を含む。発現ベクターは、転写コントロール配列および翻訳コントロール配列を含んでいてもよい。これらは、宿主細胞中でのコード配列の発現を提供するプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、およびその他同種のものなどのＤＮＡ調節配列である。当業者らは、ある種のこれらの配列は、ある種の宿主における発現に必要とされないことを十分に理解するであろう。微生物を用いる使用のための発現ベクターは、宿主によって認識される複製開始点、宿主中で機能するプロモーター、および選択遺伝子を含有する必要があるのみである。
【００８８】
本明細書において使用される場合、「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合することができ、下流の（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的のために、プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位と境を接しており（包括的に）、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含むように上流に（５’方向）伸長する。転写開始部位およびＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメインは、プロモーター配列内に見つけられる。真核生物のプロモーターは、常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有することが多い。
【００８９】
一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマウイルス、ウシパピローマウイルス、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス、マウスまたはヒトのいずれか）、ラウス肉腫ウイルス、アデノウイルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する。他のコントロール配列（例えばターミネーター、ｐｏｌｙＡ、エンハンサー、または増幅配列）もまた使用することができる。
【００９０】
発現ベクターは、ｍＴＯＲβコード配列または誘導体ポリペプチドコード配列が適切な調節配列を有するベクター中に位置するように構築される。コントロール配列に関してのコード配列の位置付けおよび向きは、コード配列が、コントロール配列の「コントロール」下で転写され、翻訳される、つまり、コントロール配列でＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼが、コード配列をｍＲＮＡに転写するようなものとする。コントロール配列は、以前に記載したクローニングベクターなどのベクターの中への挿入に先立って、コード配列にライゲーションすることができる。代替的には、コード配列は、コントロール配列および適切な制限部位をすでに含有している発現ベクターの中に直接クローニングすることができる。選択される宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、コントロール配列は、ｍＴＯＲβコード配列または誘導体ポリペプチドコード配列に対して異種のものであってもよく、または相同（homologous）のものであってもよく、コード配列は、イントロンを含有するゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかとすることができる。
【００９１】
「シグナル配列」は、コード配列の前に含むことができる。この配列は、細胞表面にポリペプチドを向けるまたは細胞外のスペースにポリペプチドを分泌するように宿主細胞に指示するポリペプチドに対して、Ｎ末端のシグナルペプチドをコードする。このシグナルペプチドは、タンパク質が細胞を出る前に、宿主細胞によって切り取られる。シグナル配列は、原核生物および真核生物に固有の多種多様のタンパク質と関連することが分かり得る。例えば、固有の酵母タンパク質であるアルファ因子は、酵母から分泌され、そのシグナル配列は、異種タンパク質に付着して、培地の中に分泌させることができる（米国特許第４，５４６，０８２号を参照されたい）。さらに、アルファ因子およびその類似体は、サッカロミセス（Saccharomyces）およびクリベロミセス（Kluyveromyces）などの多種多様の酵母から異種タンパク質を分泌することが分かった（例えば、ＥＰ  ８８３１２３０６．９、ＥＰ  ０３２４２７４、およびＥＰ  ０３０１６６９を参照されたい）。哺乳動物細胞における使用のための例は、ＶＩＩＩｃ因子軽鎖を発現させるために使用されるｔＰＡシグナルである。
【００９２】
核酸構築物の「異種」領域は、自然界においてより大きな核酸分子と関連して見つけられないそのより大きな分子内の核酸の同定可能なセグメントである。したがって、異種領域が、哺乳動物遺伝子をコードする場合、その遺伝子は、通常、生物源のゲノムにおいて哺乳動物ゲノムＤＮＡの側面に位置しないＤＮＡが側面に位置するであろう。異種のコード配列の他の例は、コード配列それ自体が自然界において見出されない構築物（例えばゲノムコード配列がイントロンを含有するｃＤＮＡまたは固有の遺伝子と異なるコドンを有する合成配列）である。
【００９３】
本発明のベクターおよび発現カセットは、宿主細胞ゲノムに相同なフランキング配列を好ましくはさらに含む「裸の核酸構築物（naked nucleic acid construct）」として直接投与することができる。本明細書において使用される場合、「裸のＤＮＡ」という用語は、その産生をコントロールするための短いプロモーター領域と共に本発明のポリヌクレオチドを含むプラスミドなどのベクターを指す。それは、ベクターがいかなる送達媒体中でも運ばれるものではないので、「裸の」ＤＮＡと呼ばれる。そのようなベクターが、真核細胞などの宿主細胞に入る場合、それがコードするタンパク質は、細胞内で転写され、翻訳される。
【００９４】
本発明のベクターは、したがって、プラスミドベクター、すなわち、自律的に複製する、染色体外の環状ＤＮＡ分子または線状ＤＮＡ分子であってもよい。代替的には、本発明のベクターは、例えば、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびアデノウイルスなどの組換えウイルスベクターを用いる感染などの当該分野において知られている多種多様のウイルス技術を使用して、適した宿主細胞の中に導入されてもよい。ウイルスベクターの代わりとして、リポソーム調製物は、本発明の核酸分子を送達するために代替的に使用することができ、または本発明の核酸分子は、カプセルに包んでもよく、微粒子担体に吸着させてもよく、または微粒子担体と結合させてもよい。
【００９５】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を用いて形質転換された宿主細胞など、本発明のポリペプチドを発現するように改変された細胞をさらに提供する。宿主細胞は、原核生物であってもよく、または真核生物であってもよい。本発明のタンパク質の発現に有用な真核細胞は、細胞株が、細胞培養法と適合性であり、発現ベクターの増殖および遺伝子産物の発現と適合性である限り、限定されない。そのような細胞は、一過性または好ましくは安定した、哺乳動物細胞もしくは昆虫細胞などの高等真核細胞株および酵母細胞などの下等真核細胞を含む。好ましい真核生物の宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞、好ましくは、マウス細胞株、ラット細胞株、サル細胞株、またはヒト細胞株からの細胞などの脊椎動物細胞を含むが、これらに限定されない。好ましい真核生物の宿主細胞は、ＣＣＬ６１としてＡＴＣＣから入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＲＬ  １６５８としてＡＴＣＣから入手可能なＮＩＨスイスマウス胚細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、および同様な真核生物組織培養細胞株を含む。好ましくは、選択される細胞株は、安定しているだけではなく、ポリペプチドの成熟グリコシル化および細胞表面発現を可能にする細胞株であろう。発現は、形質転換卵母細胞中で達成されてもよい。適したペプチドは、トランスジェニック非ヒト動物、好ましくはマウスの細胞中で発現させることができる。本発明のペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト動物は、本発明の範囲内に含まれる。本発明のペプチドはまた、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）卵母細胞またはメラニン保有細胞中で発現させることができる。
【００９６】
任意の原核生物宿主は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクター、またはｒＤＮＡ分子を発現させるために使用することができる。一実施形態において、好ましい原核生物宿主は、大腸菌（E. coli）である。
【００９７】
本発明のポリヌクレオチド、ベクター、またはｒＤＮＡ分子による適切な細胞宿主の形質転換は、使用されるベクターおよび用いられる宿主系のタイプに典型的に依存する、周知の方法によって達成される。原核生物宿主細胞の形質転換に関して、エレクトロポレーション法および塩処理法が典型的に用いられる。例えば、Cohenら(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69、2110ページ；およびSambrookら(1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。ｒＤＮＡを含有するベクターによる脊椎動物細胞の形質転換に関して、エレクトロポレーション法、カチオン性脂質法、または塩処理法が典型的に用いられる。例えば、Grahamら(1973)Virol.52、456ページ；Wiglerら(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76、1373〜1376ページを参照されたい。
【００９８】
形質転換に成功した細胞、つまり本発明のポリヌクレオチド、ベクター、またはｒＤＮＡ分子を含有する細胞は、選択可能なマーカーの選択を含む、周知の技術によって同定することができる。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入から結果として生じる細胞は、単一コロニーを産生するためにクローニングすることができる。それらのコロニーからの細胞は、採取し、溶解することができ、それらのＤＮＡ内容物は、Southern((1975)J.Mol.Biol.98、503〜504ページ)もしくはBerentら((1985)Biotech.3、208〜209ページ)によって記載される方法などの方法を使用してｒＤＮＡの存在について検査することができ、または細胞から産生されたタンパク質は、免疫学的方法によってアッセイすることができる。
【００９９】
本発明のそのような細胞株は、本発明のポリペプチドを産生するために日常的な方法を使用して培養することができ、または本発明のポリペプチドを被験体に送達するために治療的にもしくは予防で使用することができる。例えば、本発明のポリペプチドを分泌することができる細胞株を、被験体に投与することができる。代替的には、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、またはベクターを、ｅｘ  ｖｉｖｏで被験体由来の細胞に投与することもでき、次いで、その細胞は、被験体の体に戻すこともできる。例えば、形質転換細胞の被験体へのｅｘ  ｖｉｖｏ送達および再移植の方法は、公知である（例えば、デキストラン媒介性のトランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、エレクトロポレーション、および核の中への直接的なマイクロインジェクション）。
【０１００】
選択される発現系および宿主に応じて、目的のペプチド（ｍＴＯＲβまたはその変異体もしくは誘導体など）は、ポリペプチドが発現する条件下で、上記に記載される発現ベクターなどの外来性ＤＮＡ構築物または異種ＤＮＡ構築物によって形質転換された宿主細胞を増殖させることによって産生することができる。ｍＴＯＲβまたはその誘導体ポリペプチドなどの目的のペプチドは、次いで、宿主細胞から単離され、精製される。発現系が、増殖培地の中にタンパク質またはペプチドを分泌する場合、そのタンパク質は、無細胞培地から直接精製することができる。適切な増殖条件および最初の粗製回収方法の選択は、当該分野の技術の範囲内である。
【０１０１】
形質転換宿主細胞は、核酸をコードするｍＴＯＲβまたはｍＴＯＲβ誘導体ポリペプチドを含有するベクターのいずれかを用いて形質転換またはトランスフェクトされた細胞である。発現ポリペプチドは、発現ペプチド中の適したプロセシングシグナル（例えば相同的または異種のシグナル配列）のコントロール下で培養上清の中に分泌されることができる。
【０１０２】
細胞は、外来性または異種の核酸が細胞の内部に導入されている場合、そのような核酸によって「形質転換されている（transformed）」。形質転換核酸は、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡの中に組み込まれ（共有結合）てもよく、または組み込まれなくてもよい。原核生物において、例えば、形質転換核酸は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのエピソームエレメント上に維持されてもよい。真核細胞に関して、安定して形質転換された細胞は、染色体複製を通して娘細胞によって遺伝されるように形質転換ＤＮＡが染色体の中に組み込まれる細胞である。この安定性は、真核細胞が、形質転換核酸を含有する娘細胞の集団から構成される細胞株またはクローンを確立する能力によって実証される。
【０１０３】
本明細書において使用される場合、「細胞株」は、何世代もの間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定した増殖が可能な初代細胞のクローンである。本明細書において使用される場合、核酸配列は、少なくとも約８５パーセント（好ましくは、少なくとも約９０パーセント、より好ましくは、少なくとも約９５パーセント、より好ましくは、少なくとも約９７パーセント、最も好ましくは、少なくとも約９９パーセント）の、ヌクレオチド配列の定義された長さにわたってヌクレオチドがマッチする場合、「実質的な同一性」を示す。実質的に同一の配列は、例えば、特定のその系について定義されるようなストリンジェントな条件下で、サザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当該分野の技術の範囲内である。
【０１０４】
高等真核細胞培養物は、脊椎動物細胞由来であっても昆虫を含む無脊椎動物細胞由来であっても、本発明のタンパク質を発現させるために使用することができ、その増殖の手順は公知である。
【０１０５】
[ｒＤＮＡ分子を使用する組換えタンパク質の産生]
本発明は、本明細書において記載される核酸分子を使用して、本発明のタンパク質を産生するための方法をさらに提供する。大まかに言えば、タンパク質の組換え形態の産生は以下のステップを典型的に伴う。第１に、配列番号２のアミノ酸またはその誘導体をコードする核酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる核酸分子などの本発明のタンパク質をコードする核酸分子が得られる。第２に、その核酸分子は、次いで、上記に記載されるように、適したコントロール配列を有する作動可能な連結中に好ましくは配置されて、タンパク質オープンリーディングフレームを含有する発現ユニットを形成する。
【０１０６】
発現ユニットは、適した宿主を形質転換するために使用され、形質転換宿主は、組換えタンパク質の産生を可能にする条件下で培養される。必要に応じて、組換えタンパク質は培地または細胞から単離され、タンパク質の回収および精製は、いくつかの不純物が許容されてもよいある場合において、必要ではないことがある。
【０１０７】
それぞれの先のステップは、多種多様の方法において行うことができる。例えば、所望のコード配列は、ゲノム断片から得られ、適切な宿主中で直接使用することができる。多種多様の宿主中で作動可能な発現ベクターの構築は、上記に記載されるように、適切なレプリコンおよびコントロール配列を使用して達成される。コントロール配列、発現ベクター、および形質転換方法は、遺伝子を発現させるために使用される宿主細胞のタイプに応じ、またこれらは、前に詳細に論じられた。適した制限部位は、通常で入手可能ではない場合、これらのベクターの中に挿入するための切り取ることができる遺伝子を提供するために、コード配列の末端に追加することができる。当業者は、組換えタンパク質を産生するために、当該分野において公知の任意の宿主／発現系を本発明の核酸分子を用いる使用に容易に適応させることができる。
【０１０８】
[抗体]
本発明の他のクラスの作用物質は、ｍＴＯＲベータ（ｍＴＯＲβ）と免疫反応性の抗体である。好ましい実施形態において、抗体は、ｍＴＯＲアルファとではなく、ｍＴＯＲベータ（ｍＴＯＲβ）と免疫反応性である。抗体作用物質は、抗体によって標的とされるように意図されるタンパク質のそれらの部分を抗原性領域として含有するペプチドを用いて適した哺乳動物被験体を免疫化することによって得られる。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってもよい。
【０１０９】
ｍＴＯＲベータの活性部位に結合する抗体は、本発明において包含される。本発明の一実施形態において、抗体は、４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化するｍＴＯＲベータの活性部位に結合する。本発明の他の実施形態において、抗体は、Ｓ６Ｋ１をリン酸化するｍＴＯＲベータの活性部位に結合する。代替の実施形態において、抗体は、ｃＭｙｃ発現の誘発を導くｍＴＯＲベータ中の部位に結合する。
【０１１０】
このタンパク質の活性を阻害することができる抗体もまた、本発明において包含される。
【０１１１】
抗体は、十分な長さである場合、ｍＴＯＲベータ（ｍＴＯＲβ）、変異体、および単離結合パートナーなど、本発明のペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質、または所望の場合もしくは免疫原性を増強することが必要とされる場合、適した担体にコンジュゲートしたそれらを使用して、適切な免疫化プロトコールにおいて、適した哺乳動物宿主を免疫することによって調製される。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、または他の担体タンパク質などの担体との免疫原性コンジュゲートを調製するための方法は、当該分野においてよく知られている。ある状況において、例えば、カルボジイミド試薬を使用する直接的な抱合は、有効である可能性があり、他の場合において、当該分野においてよく知られている連結試薬は、ハプテンへの到達性を提供するのに望ましい可能性がある。ハプテンペプチドは、例えば担体への連結を促進するために、システイン残基を用いてアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかで伸長させることができるまたはシステイン残基を散在させることができる。免疫原の投与は、当該分野において一般に理解されるように、適した期間にわたる注射によって、適したアジュバントを使用して一般に行われる。免疫化スケジュールの間に、抗体の力価は、抗体形成の妥当性を決定するために得られる。
【０１１２】
抗ペプチド抗体は、例えば、ｍＴＯＲベータ（ｍＴＯＲβ）のカルボキシ末端１５アミノ酸に対応する合成ペプチドを使用して生成することができる。キナーゼ上のリン酸化部位に結合する抗体もまた生成することができ、これらは、ｍＴＯＲベータ（ｍＴＯＲβ）タンパク質上のリン酸化部位に結合する抗体を含む。合成ペプチドは、１〜３アミノ酸長ほどの小さいものとすることができるが、好ましくは、少なくとも４またはそれ以上のアミノ酸残基長とする。ペプチドは、標準的な方法を使用してＫＬＨに連結させ、ウサギなどの動物の中に免疫することができる。ポリクローナル抗ｍＴＯＲベータ（ｍＴＯＲβ）抗体は、次いで、例えば、共有結合ペプチドを含有するＡｃｔｉｇｅｌビーズを使用することによって精製することができる。
【０１１３】
このように産生されたポリクローナル抗血清は、医薬組成物のための、いくつかの適用に満足のいくようなものであってもよいが、モノクローナル調製物の使用が好ましい。所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株は、一般に知られているように、リンパ球または脾臓細胞の不死化をもたらすＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的な方法または改良版を使用して調製することができる。所望の抗体を分泌する不死化細胞株は、抗原がペプチドハプテンであるイムノアッセイによってスクリーニングされる。ポリペプチドまたはタンパク質。所望の抗体を分泌する適切な不死化細胞培養物が、同定される場合、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたは腹水中での生産によって培養することができる。特に興味があるのは、ＦＫ５０６／ラパマイシンドメイン、キナーゼドメイン、または調節性ドメインを認識するモノクローナル抗体である。
【０１１４】
次いで、所望のモノクローナル抗体は、培養上清または腹水上清から回収される。免疫学的に有意な部分を含有するモノクローナルまたはポリクローナル抗血清の断片は、アンタゴニストおよび完全抗体（intact antibody）として使用することができる。Ｆａｖ断片、ｓｃＦＶ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ’）２断片などの免疫学的に反応性の断片の使用は、これらの断片が、一般に、全免疫グロブリンほど免疫原性ではないので、特に治療的状況において好ましいことが多い。
【０１１５】
Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆａｂ断片、およびＦｖ断片などの抗原結合性断片、つまり、抗原結合部位を含む、抗体の「可変」領域からの抗体断片を使用することができる。抗体は、ヒト変異体、ヒト化変異体、または先のもののキメラ変異体であってもよい。そのような抗体は、被験体に投与される場合、それほど免疫原性とならない可能性がある。ヒト化抗体またはキメラ抗体を生産するための方法は、当該分野においてよく知られている。企図される抗体はまた、異なるアイソタイプおよびアイソタイプサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＭ）を含む。これらの抗体は、脊椎動物において、ハイブリドーマ細胞株中で、もしくは他の細胞株中で、それらを産生させることによって、または組換え手段によって調製することができる。これらの抗体を調製する方法に対する言及については、Harlow & Lane(1988)、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Pressを参照されたい。
【０１１６】
抗体または断片はまた組換え手段によって、現在の技術を使用して産生することができる。受容体の所望の領域に特異的に結合する領域もまた、多数の種起源を有するキメラとの関連において産生することができる。
【０１１７】
[治療方法]
本発明はまた、ｍＴＯＲベータの異常な発現と関連する疾患の治療のための方法であって、ｍＴＯＲベータの活性および／または発現を調整することができる作用物質の有効量をその必要のある被験体に投与するステップを含む方法に関する。そのような作用物質は、そのため、そのような疾患の治療（治療的なものであってもよいおよび／もしくは予防的なものであってもよい）、診断、または予防において使用することができる。異常な発現は、例えば、ｍＴＯＲベータの発現の増加またはｍＴＯＲベータの発現の減少であってもよい。適した作用物質は、ｍＴＯＲベータのレベルを補足することになっているかまたは低下させることになっているかに応じて選択することができる。
【０１１８】
一実施形態において、作用物質は、ｍＴＯＲベータの阻害剤である。そのような阻害剤は、例えば、ｍＴＯＲベータ遺伝子の発現もしくはタンパク質産生を阻害またはそれを妨げることによって、あるいはｍＴＯＲベータのｍＲＮＡもしくはタンパク質を除去または分解するように作用することによって、存在するｍＴＯＲベータの量を低下させるように作用することができる。そのような阻害剤は、ｍＴＯＲベータの活性、例えば上記に論じられるようなｍＴＯＲベータの任意の活性または機能を低下させるように作用することができる。適した阻害剤は、ｍＴＯＲベータに結合し、その機能を妨げる分子であってもよい。例えば、適した阻害剤は、ｍＴＯＲベータに結合する抗体であってもよい。他の実施形態において、作用物質は、ｍＴＯＲベータアンタゴニストである。
【０１１９】
他の実施形態において、作用物質は、ｍＴＯＲベータのプロモーターまたはアクチベーターである。そのような作用物質は、存在するｍＴＯＲベータタンパク質の量を増加させるように作用することができる。例えば、作用物質は、本明細書に記載されているポリヌクレオチド、ベクター、ｒＤＮＡ、ポリペプチド、または宿主細胞であってもよい。作用物質は、例えば、細胞または生物内での分解プロセスに対するｍＲＮＡまたはポリペプチドの抵抗性を増加させることによって、ｍＴＯＲベータのｍＲＮＡまたはポリペプチドのライフスパンを増加させるように作用することができる。そのような作用物質は、ｍＴＯＲベータの活性または機能、例えば、上記に論じられるようなｍＴＯＲベータの任意の活性または機能を増加させるように作用することができる。
【０１２０】
ｍＴＯＲベータの活性および／または発現を調整することができる有効量は、本明細書に記載されている、適した効果を発揮する量であってもよい。例えば、適した量のｍＴＯＲベータ阻害剤は、ｍＴＯＲベータの活性に対して阻害効果を発揮するのに十分な量であってもよい。有効量はまた、異常なｍＴＯＲベータ発現を示す細胞の増殖を阻害するのに有効な量であってもよい。
【０１２１】
この方法のいくつかの実施形態において、ｍＴＯＲベータの異常な発現と関連する疾患は、前立腺癌、乳癌、多発性骨髄腫、肺癌、非小細胞肺癌、骨癌、肝臓癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚黒色腫もしくは眼球内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、結腸癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、慢性白血病もしくは急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌もしくは尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、神経外胚葉性癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、下垂体腺腫、または先の癌の１つ以上の組合せを含むが、これらに限定されない癌である。前記方法の他の実施形態において、前記異常細胞増殖は、乾癬、良性前立腺肥大症、肥大、または再狭窄（restinosis）を含むが、これらに限定されない良性増殖疾患である。
【０１２２】
本発明の一実施形態において、作用物質は、キナーゼ阻害剤である。本発明の方法において使用することができる例示的なタイプのキナーゼ阻害剤は、ラパマイシン、例えばＲＡＤ００１(Lane(2003)Mol.Targets Cancer Therapeut.259〜260ページ）、ＣＣＩ−７７９、およびＡＰ２３５７３などのラパマイシン誘導体を含むが、これらに限定されない。
【０１２３】
本発明の方法を実施する際に、これらの作用物質は、単独でまたは他の活性成分もしくは非活性成分と組み合わせて使用することができる。そのため、本発明の方法は、癌を含む異常細胞増殖と関連する疾患の治療のために、細胞傷害剤に連結された作用物質を含むポリペプチドの投与を含む。細胞傷害剤の例は、ゲロニン、リシン、サポニン、シュードモナス外毒素、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ジフテリア毒素、補体タンパク質、または細胞との接触に際してその細胞を死滅させることができる当該分野において知られている任意の他の作用物質を含むが、これらに限定されない。
【０１２４】
本発明はまた、本明細書に記載されている分子および作用物質を含む医薬組成物などの組成物に及ぶ。上記に記載したポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、ポリペプチド、細胞、または抗体などの本発明の分子を含む組成物の製剤は、すべて、当業者に容易に入手可能な、標準的な医薬製剤化学および方法論を使用して実行することができる。例えば、本発明の１以上の分子を含有する組成物は、１以上の薬学的に許容できる賦形剤またはビヒクルと組み合わせることができる。湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、およびその他同種のものなどの補助物質は、賦形剤またはビヒクル中に存在していてもよい。これらの賦形剤、ビヒクル、および補助物質は、一般に、組成物を受ける個体において免疫応答を誘発せず、過度の毒性を伴うことなく投与することができる医薬品である。薬学的に許容できる賦形剤は、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロール、およびエタノールなどの液体を含むが、これらに限定されない。例えば、薬学的に許容できる塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、およびその他同種のものなどの鉱酸塩、ならびに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩、およびその他同種のものなどの有機酸の塩もまた、その中に含むことができる。薬学的に許容できる賦形剤、ビヒクル、および補助物質の詳細な論述は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.、N.J.1991)において入手可能である。
【０１２５】
したがって、本発明は、本発明のポリペプチド（例えば、ｍＴＯＲベータまたはその変異体もしくは誘導体）などの本明細書に記載されている分子および希釈剤を含む組成物をさらに提供する。適した希釈剤は、水性もしくは非水性の溶剤またはその組合せとすることができ、追加の構成成分、例えば、タンパク質またはポリペプチドの安定性、可溶性、活性、および／または貯蔵に寄与する水溶性の塩またはグリセロールを含むことができる。
【０１２６】
医薬組成物はまた、ｍＴＯＲベータの活性および／または発現を調整することができる１以上の作用物質ならびに薬学的に許容できる担体を含んでいてもよく、それらから本質的になってもよく、またはそれらからなってもよい。そのような組成物は、上記に記載した本発明の治療法の一部として投与されることになっている作用物質を含んでいてもよい。本発明の医薬組成物は、作用部位へ送達するために薬学的に使用することができる調製物への活性化合物のプロセシングを促進する、賦形剤および助剤を含む、適した薬学的に許容できる担体を含有し得る。非経口投与に適した製剤は、水溶性の形態（例えば、水溶性の塩）の活性化合物の水溶液を含む。そのうえ、適切な油性注射懸濁剤としての活性化合物の懸濁剤を投与することができる。適した脂肪親和性の溶媒またはビヒクルは、脂肪油、例えばゴマ油または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリドを含む。水性の注射懸濁剤は、懸濁剤の粘性を増加させる物質を含有し得る。そのような粘性を増加させる物質の例は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、およびデキストランを含む。必要に応じて、懸濁剤はまた、安定剤を含有し得る。リポソームもまた、細胞の中への送達のために作用物質をカプセルに包むために使用することができる。
【０１２７】
ｍＴＯＲベータの活性および／または発現を調整することができる１以上の作用物質を含む医薬組成物などの本発明の医薬組成物は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、鞘内、頭蓋内、もしくは経皮または頬側の経路を介して投与することができる。例えば、作用物質は、マイクロインフュージョンを介して腫瘍または異常なｍＴＯＲベータ発現の部位に局所的に投与することができる。代替的にまたは同時に、投与は、経口経路によるものとしてもよい。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態、および体重、もしあれば併用の治療の種類、治療の頻度、ならびに所望の効果の性質に依存するであろう。
【０１２８】
個々の必要量は変わるが、それぞれの構成成分の有効量の最適な範囲の決定は、当該分野の技術の範囲内である。本発明のｍＴＯＲベータの活性および／または発現を調整することができる作用物質の投薬量は、典型的に、約１．０ｎｇ／体重ｋｇ〜約０．１３ｍｇ／体重ｋｇを含む。一実施形態において、ｍＴＯＲベータの活性および／または発現を調整することができる作用物質の投薬量は、約１．０ｎｇ／体重ｋｇ〜約０．１ｍｇ／体重ｋｇを含む。好ましい実施形態において、全身投与のための投薬量は、約０．０１μｇ／体重ｋｇ〜約０．１ｍｇ／体重ｋｇを含む。他の実施形態において、ｍＴＯＲベータの活性および／または発現を調整することができる作用物質の投薬量は、約０．１ｍｇ／体重ｋｇ未満を含む。全身投与のためのより好ましい投薬量は、約０．１μｇ／体重ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／体重ｋｇを含む。他の好ましい実施形態において、ｍＴＯＲベータの活性および／または発現を調整することができる作用物質の投薬量は、約０．０５ｍｇ／体重ｋｇ未満を含む。全身投与のための最も好ましい投薬量は、約１．０μｇ／体重ｋｇ〜約０．０１ｍｇ／体重ｋｇの間で含まれる。他の実施形態において、投与される、ｍＴＯＲベータの活性および／または発現を調整することができる作用物質の量は、血清中の、ｍＴＯＲベータの活性および／または発現を調整することができる作用物質の濃度を、約２０．０、１０．０、５．０、２．５０、１．２５、０．６２５、０．３１２５、０．１５６、０．０７８、０．０３９、０．０２０、０．０１０、０．００５、０．００３、０．００１５、０．０００８、０．０００３、または０．０００１ｎＭの濃度に至らせるのに有効な量である。マイクロインフュージョンを介しての部位への直接投与のための好ましい投薬量は、１ｎｇ／体重ｋｇ〜１ｍｇ／体重ｋｇを含む。
【０１２９】
本発明による全身投与のための医薬製剤は、腸内投与、非経口投与、または局所投与用に製剤することができる。実際に、３つのタイプすべての製剤は、有効成分の全身投与を達成するために同時に使用することができる。
【０１３０】
本発明のいくつかの方法について上記に言及されるように、局所投与を使用することができる。液剤、懸濁剤、ゲル、軟膏剤、または硬膏およびその他同種のものなどの任意の一般の局所製剤が用いられてもよい。そのような局所製剤の調製物は、例えば、Gennaroら(2000)Remington’s Pharmaceutical Sciences、Mack Publishingによって例示されるように、医薬製剤の技術分野において記載される。局所適用については、組成物はまた、特にエアロゾル形態の散剤または噴霧剤として投与することもできる。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、吸入によって投与することができる。吸入療法については、有効成分は、計量吸入器による投与に有用な液剤中のものとしてもよく、または乾燥散剤吸入器に適した形態であってもよい。他の実施形態において、組成物は、気管支洗浄による投与に適している。
【０１３１】
経口投与に適した製剤は、硬質ゼラチンカプセル剤もしくは軟質ゼラチンカプセル剤、丸剤、コーティング錠を含む錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、または吸入剤およびその徐放性形態を含む。
【０１３２】
治療目的の本発明の組成物および方法は、例えば、ヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、およびマウスなどの哺乳動物においてｉｎ  ｖｉｖｏでまたはｅｘ  ｖｉｖｏで通常利用することができる。本発明は、ヒト被験体の治療において特に有用である。
【０１３３】
[ｍＴＯＲベータの発現および／または活性を調整する作用物質を同定するための方法]
本発明はまた、ｍＴＯＲベータの発現および／または活性を調整する作用物質を同定する（すなわち、スクリーニングする）ための方法を提供する。本発明の一実施形態において、作用物質は、ｍＴＯＲベータの発現を調整する。他の実施形態において、作用物質は、ｍＴＯＲベータの活性を調整する。ｍＴＯＲの発現および／または活性の減少は、ｍＴＯＲベータを阻害する作用物質を示す。ｍＴＯＲの発現および／または活性の増加は、ｍＴＯＲベータを刺激する作用物質を示す。
【０１３４】
本発明の他の実施形態は、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質などのｍＴＯＲベータ（ｍＴＯＲβ）タンパク質をコードする核酸の発現を調整する作用物質を同定するための方法を提供する。そのようなアッセイは、本発明の核酸の発現レベルの変化をモニターする任意の入手可能な手段を利用してもよい。本明細書において使用される場合、作用物質は、その作用物質が、細胞中の核酸の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる場合、本発明の核酸（例えば、配列番号２の配列を有するタンパク質をコードする核酸または配列番号１を有する核酸）の発現を調整すると表現される。
【０１３５】
したがって、本発明は、ｍＴＯＲベータの活性および／または発現を調整する作用物質をスクリーニングするための、またはそれらの同定のための方法を提供する。
【０１３６】
本発明の方法は、
（ａ）本発明のポリペプチド（本発明のポリペプチドまたは本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドなど）を提供するステップと、
（ｂ）前記ポリペプチドを試験作用物質と接触させるステップと、
（ｃ）前記ポリペプチドの活性の任意の変化を検出するステップと
を含むことができ、活性の変化は、ｍＴＯＲベータ活性を調整することができる作用物質を示す。
【０１３７】
等価な方法もまた、例えば、遺伝子発現を調整することができる作用物質またはｍＴＯＲベータｍＲＮＡのレベルもしくはその転写を調整することができる作用物質を同定するために、本発明のポリヌクレオチドを使用して実行することができる。
【０１３８】
本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実行することができる。本発明の方法は、単離（もしくは実質的に単離された）ポリペプチドまたは精製（もしくは実質的に精製された）ポリペプチドを使用して実行することができる。
【０１３９】
代替的には、ポリペプチドを含む細胞中で方法を実行することができる。例えば、そのような方法は、
（ａ）本発明のポリペプチド（本発明のポリペプチドまたは本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドなど）を含むまたは発現する宿主細胞などの本発明の宿主細胞を提供するステップと、
（ｂ）前記宿主細胞を試験作用物質と接触させるステップと、
（ｃ）前記ポリペプチドの発現および／または活性の任意の変化を検出するステップと
を含むことができ、発現および／または活性の変化は、ｍＴＯＲベータの発現および／または活性を調整することができる作用物質を示す。
【０１４０】
特定の方法は、
（ａ）本発明のポリペプチドを発現する細胞を作用物質に曝露するステップと、
（ｂ）前記ポリペプチドの発現および／または活性の変化を検出するステップと
を含むことができ、発現および／または活性の変化は、ｍＴＯＲベータの発現および／または活性を調整することができる作用物質を示す。
【０１４１】
１つのアッセイフォーマットにおいて、ｍＴＯＲベータ（例えば配列番号１）のオープンリーディングフレームと任意のアッセイすることができる融合パートナーの間にレポーター遺伝子融合物を含有する細胞株を調製することができる。多数のアッセイすることができる融合パートナーは、知られており、容易に入手可能であり、ホタルルシフェラーゼ遺伝子およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む（Alamら、1990 Anal.Biochem.188、245〜254ページ）。次いで、レポーター遺伝子融合物を含有する細胞株は、作用物質またはコントロールに曝露されて、適切な条件および時間下で試験される。作用物質に曝露されたサンプルとコントロールサンプルの間のレポーター遺伝子の差異のある発現により、ｍＴＯＲベータをコードする核酸の発現を調整する作用物質を同定する。
【０１４２】
他のアッセイフォーマットにおいて、作用物質がｍＴＯＲベータ発現を調整する能力は、例えば、ｍＴＯＲベータ発現の調整の結果として発現が調整されるｃ−Ｍｙｃなどのタンパク質の発現の測定に基づくものである。
【０１４３】
追加のアッセイフォーマットは、作用物質が、ｍＴＯＲベータなどの本発明のタンパク質をコードする核酸の発現を調整する能力をモニターするために使用することができる。例えば、ｍＲＮＡ発現は、本発明の核酸へのハイブリダイゼーションによって直接モニターされてもよい。細胞株は、作用物質および／またはｍＴＯＲベータを含むポリペプチドに曝露されて、適切な条件および時間下で試験され、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡは、Sambrookら(2001)Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Pressにおいて開示されている手順などの標準的な手順によって単離される。
【０１４４】
作用物質に曝露された細胞とコントロール細胞の間のＲＮＡ発現レベルの差異を検出するためのプローブは、本発明の核酸から調製することができる。必ずしもではないが、ハイストリンジェンシーの条件下で標的核酸とのみハイブリダイズするプローブを設計することが好ましい。ハイストリンジェンシーの条件下では、高度に相補的な核酸ハイブリッドのみ形成される。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーは、ハイブリッドを形成するための、２つの核酸鎖の間に存在するべき相補性の程度を決定する。ストリンジェンシーは、プローブ：標的ハイブリッドおよび潜在的なプローブ：非標的ハイブリッドの間の安定性の差異を最大限にするように選ぶべきである。
【０１４５】
プローブは、当該分野において知られている方法を通して本発明の核酸から設計されてもよい。例えば、プローブのＧ＋Ｃ含有量およびプローブ長は、その標的配列へのプローブ結合に影響を与え得る。プローブ特異性を最適化するための方法は、一般に、Sambrookら(2001)またはAusubelら(1995)Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Company)において入手可能である。
【０１４６】
ハイブリダイゼーション条件は、それぞれのプローブに必要とされるように、Sambrookら(2001)およびAusubelら(1995)によって記載される方法などの知られている方法を使用して改良される。全細胞ＲＮＡまたはｐｏｌｙＡ  ＲＮＡに富んだＲＮＡのハイブリダイゼーションは、任意の入手可能なフォーマットにおいて達成することができる。例えば、全細胞ＲＮＡまたはｐｏｌｙＡ  ＲＮＡに富んだＲＮＡは、固体支持体に付けることができ、固体支持体は、プローブが、特異的にハイブリダイズであろう条件下で、本発明の配列の少なくとも１つまたはその１つの一部分を含む少なくとも１つのプローブに曝露させることができる。代替的には、本発明の配列の少なくとも１つまたはその１つの一部分を含む核酸断片は、多孔質ガラスウエハーなどの固体支持体に付けることができる。ガラスウエハーは、次いで、付けられた配列が特異的にハイブリダイズであろう条件下でサンプルからの全細胞ＲＮＡまたはｐｏｌｙＡ  ＲＮＡに曝露することができる。そのようなガラスウエハーおよびハイブリダイゼーション法、例えばＢｅａｔｔｉｅ（国際公開第９５／１１７５５号）によって開示されているものは、広く入手可能である。未処理細胞集団および作用物質に曝露された細胞集団のＲＮＡサンプルに所与のプローブが特異的にハイブリダイズする能力について検査することによって、ｍＴＯＲベータタンパク質をコードする核酸の発現をアップレギュレートするまたはダウンレギュレートする作用物質。
【０１４７】
本発明はまた、配列番号２のポリペプチドなどのｍＴＯＲベータポリペプチドの少なくとも１つの活性を調整する作用物質を同定するための方法を提供する。そのような方法またはアッセイは、所望の活性をモニターまたは検出する任意の手段を利用してもよい。これらのアッセイは、ｍＴＯＲベータのリン酸化の検出、Ｓ６Ｋ１のリン酸化の検出、４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の検出、ｃＭｙｃ発現の誘発をモニターすること、またはＳ６Ｋ１および／もしくは４Ｅ−ＢＰ１が第２のタンパク質をリン酸化する能力をモニターすることを含んでいてもよい。本発明の一実施形態において、ｍＴＯＲベータの活性は、ＰＫＢ／Ａｋｔのリン酸化の検出に基づいて検出される。
【０１４８】
１つのフォーマットにおいて、非曝露コントロール細胞集団と比較して、試験されることとなる作用物質に曝露された細胞集団の間の標準単位に標準化された本発明のタンパク質の比活性が、アッセイされてもよい。細胞株または細胞集団は、適切な条件および時間下で試験されることとなる作用物質に曝露される。細胞溶解物は、曝露された細胞株または細胞集団およびコントロールの非曝露細胞株または集団から調製することができる。次いで、細胞溶解物はプローブを用いて分析される。
【０１４９】
抗体プローブは、本発明のタンパク質またはその抗原含有断片を使用し、適切な免疫化プロトコールを利用する、適した哺乳動物宿主の免疫によって調製することができる。免疫原性を増強するために、これらのタンパク質または断片は、適した担体に抱合してもよい。ＢＳＡ、ＫＬＨ、または他の担体タンパク質などの担体との免疫原性コンジュゲートを調製するための方法は、当該分野においてよく知られている。ある状況において、例えば、カルボジイミド試薬を使用する直接的な抱合は、有効である可能性があり、他の場合において、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．によって供給される連結試薬などの連結試薬は、ハプテンへの到達性を提供するのに望ましい可能性がある。ハプテンペプチドは、担体への連結を促進するために、例えばシステイン残基を用いてアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかで伸長させることができるまたはシステイン残基を散在させることができる。免疫原の投与は、当該分野において一般に理解されるように、適した期間にわたる注射によって、適したアジュバントを使用して一般に行われる。免疫化スケジュールの間に、抗体の力価は、抗体形成の妥当性を決定するために得られる。
【０１５０】
このように産生されたポリクローナル抗血清は、医薬組成物のための、いくつかの適用に満足のいくようなものである可能性があるが、モノクローナル調製物の使用が好ましい。所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株は、標準的な方法を使用して調製することができる。例えば、一般に知られているように、リンパ球または脾臓細胞の不死化をもたらすKohler & Milstein(1992) Biotechnology 24、524〜526ページまたは改良版を参照されたい。所望の抗体を分泌する不死化細胞株は、抗原がペプチドハプテン、ポリペプチド、またはタンパク質であるイムノアッセイによってスクリーニングすることができる。所望の抗体を分泌する適切な不死化細胞培養物が、同定される場合、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたは腹水中での産生によって培養することができる。
【０１５１】
所望のモノクローナル抗体は、培養上清または腹水上清から回収することができる。免疫学的に有意な部分を含有するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清の断片は、アンタゴニストおよび完全抗体として使用することができる。Ｆａｂ断片またはＦａｂ’断片などの免疫学的に反応性の断片の使用は、これらの断片が、一般に、全免疫グロブリンほど免疫原性ではないので、特に治療的状況において好ましいことが多い。
【０１５２】
抗体または断片はまた、組換え手段によって、現在の技術を使用して産生することができる。タンパク質の所望の領域に特異的に結合する抗体領域もまた、多数の種起源を有するキメラとの関連において産生することができる。タンパク質の所望の領域に特異的に結合する抗体領域もまた、多数の種起源を有するキメラ、例えばヒト化抗体との関連において産生することができる。抗体は、そのため、米国特許第５，５８５，０８９号またはRiechmannら(1988)Nature 332、323〜327ページにおいて記載されるように、ヒト化抗体またはヒト抗体とすることができる。
【０１５３】
上記の方法においてアッセイされる作用物質は、無作為に選択することができ、または合理的に選択もしくは設計することができる。本明細書において使用される場合、作用物質は、その作用物質が、本発明のタンパク質の結合に、単独でまたはその関連する基質、結合パートナーなどと共に関連する特異的配列を考慮せずに無作為に選ばれる場合、無作為に選択されると表現される。無作為に選択される作用物質の例は、化学ライブラリーもしくはペプチドコンビナトリアルライブラリーまたは生物の増殖ブロスの使用である。
【０１５４】
本明細書において使用される場合、作用物質は、その作用物質が、作用物質の作用に関連する標的部位の配列またはそのコンホメーションを考慮に入れる、無作為ではない基準で選ばれる場合、合理的に選択または設計されると表現される。作用物質は、これらの部位を構成するペプチド配列を利用することによって合理的に選択または合理的に設計することができる。例えば、合理的に選択されるペプチド作用物質は、アミノ酸配列が任意の機能性のコンセンサス部位と同一であるまたはその誘導体であるペプチドとすることができる。
【０１５５】
本発明の作用物質は、例として、ペプチド、ペプチドミメティック、抗体、抗体断片、小分子、ビタミン誘導体、および炭水化物とすることができる。本発明のペプチド作用物質は、当該分野において知られているように、標準的な固相（または液相）ペプチド合成法を使用して調製することができる。そのうえ、これらのペプチドをコードするＤＮＡは、市販で入手可能なオリゴヌクレオチド合成装置を使用して合成されてもよく、標準的な組換え産生システムを使用して組換えで産生してもよい。非遺伝子コードアミノ酸が含まれることとなる場合、固相ペプチド合成を使用する産生が必要とされる。
【０１５６】
[結合パートナーを同定するための方法]
本発明の他の実施形態は、ｍＴＯＲベータまたは誘導体の結合パートナーの単離および同定における使用のための方法を提供する。一般に、本発明のタンパク質は、潜在的な結合パートナーの本発明のタンパク質との結合を可能にする条件下で、潜在的な結合パートナーまたは細胞の抽出物もしくは画分と混合される。混合の後に、本発明のタンパク質と結合するようになったペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または他の分子は、混合物から分離される。本発明のタンパク質に結合した結合パートナーは、次いで、取り出し、さらに分析することができる。結合パートナーを同定し、かつ単離するために、全タンパク質、例えば配列番号２の全アミノ酸配列を含むタンパク質または配列番号１のヌクレオチドによってコードされるタンパク質を使用することができる。代替的には、タンパク質の断片を使用してもよい。
【０１５７】
本明細書において使用される場合、細胞抽出物は、溶解または破壊された細胞から作製される調製物または画分を指す。細胞抽出物の好ましい供給源は、アレルギー性過敏症を有する患者におけるヒト皮膚組織もしくはヒト気道に由来する細胞またはヒト肺組織の生検サンプルに由来する細胞であろう。代替的には、細胞抽出物は、正常組織または入手可能な細胞株、特に顆粒球細胞株から調製することができる。
【０１５８】
多種多様の方法を、細胞の抽出物を得るために使用することができる。細胞は、物理的または化学的な破壊方法を使用して破壊することができる。物理的な破壊方法の例は、超音波処理および機械的分断を含むが、これらに限定されない。化学的な溶解方法の例は、界面活性剤による溶解および酵素による溶解を含むが、これらに限定されない。当業者は、本方法における使用のための抽出物を得るために、細胞抽出物を調製するための方法を容易に適応させることができる。
【０１５９】
細胞の抽出物が調製されたら、抽出物は、タンパク質の結合パートナーとの結合が生じ得る条件下で本発明のタンパク質と混合される。多種多様の条件を使用することができ、最も好ましいのは、ヒト細胞の細胞質において見つけられる条件に非常によく類似している条件である。オスモル濃度、ｐＨ、温度、および使用される細胞抽出物の濃度などの特徴は、タンパク質の結合パートナーとの結合を最適化するために変えることができる。
【０１６０】
適切な条件下で混合した後に、結合した複合体は、混合物から分離される。多種多様の技術は、混合物を分離するために利用することができる。例えば、本発明のタンパク質に特異的な抗体は、結合パートナー複合体を免疫沈降させるために使用することができる。代替的には、クロマトグラフィーおよび密度／沈降遠心分離などの標準的な化学的な分離技術を使用することができる。
【０１６１】
抽出物中に見つけられる非結合細胞性成分の除去の後に、結合パートナーは、従来の方法を使用して、複合体から解離させることができる。例えば、解離は、混合物の塩濃度またはｐＨを変化させることによって達成することができる。混合された抽出物から結合している結合パートナーペアを分離することを支援するために、本発明のタンパク質は、固体支持体上に固定することができる。例えば、タンパク質は、ニトロセルロースマトリックスまたはアクリル酸ビーズに付着させることができる。固体支持体へのタンパク質の付着は、抽出物中に見つけられる他の成分からペプチド／結合パートナーペアを分離することを支援する。同定された結合パートナーは、単一タンパク質または２つ以上のタンパク質から構成される複合体のいずれかとすることができる。代替的には、結合パートナーは、Takayamaら(1997)Methods Mol.Biol.69、171〜184ページもしくはSauderら(1996)J.Gen.Virol.77、991〜996ページの手順に従って、ファーウェスタンアッセイを使用して同定することができる。またはエピトープタグ付きタンパク質もしくはＧＳＴ融合タンパク質を使用して同定することができる。
【０１６２】
代替的には、本発明の核酸分子は、酵母２ハイブリッド系において使用することができる。酵母２ハイブリッド系は、他のタンパク質パートナーペアを同定するために使用され、本明細書において記載される核酸分子を用いるために容易に適応させることができる。
【０１６３】
さらなる説明を伴うことなく、当業者は、先の説明および以下の例示的な実施例を使用して、本発明の作用物質（例えば核酸およびポリペプチド）を作製し、利用し、特許請求の範囲に係る方法を実施することができると考えられる。以下の実際の実施例（working example）は、本発明の実施形態を記載し、残りの開示を限定するものと決して解釈されないものとする。
【実施例】
【０１６４】
[実施例１：ｍＴＯＲ抗体のＣ末端を用いたラット組織のウェスタンブロット分析]
２つのＴＯＲ遺伝子を有する酵母とは対照的に、哺乳動物は、分子量およそ２８０ｋＤａの単一のポリペプチドをコードすることが公知の遺伝子を１つだけ保有する。ｍＴＯＲの調節および下流シグナル伝達をさらに解明するために、モノクローナル抗体（Ｆ１１）を作製した。この抗体（Ｆ１１）は、ウェスタンブロット法、免疫沈降法および免疫蛍光法においてｍＴＯＲを特異的に認識する（データ非掲載）。ＨＥＡＴドメインに対応するｍＴＯＲ（３５０アミノ酸長）の断片を、ＧＳＴ−融合タンパク質として細菌の中で発現させ、免疫化および特異的ハイブリドーマクローンのスクリーニングに使用した。この作製抗体を使用し、ラット組織および様々な細胞株に由来する全細胞溶解物を、ウェスタンブロットで分析した場合、およそ２８０ｋＤａの優勢な免疫反応性の１つのバンドが観察された（図１、下のパネルを参照されたい）。しかし、Ｃ末端ペプチドに対して作製された市販のｍＴＯＲ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）を使用した場合、いくつかの強い免疫反応性のバンドが検出された（図１、上のパネル）。ラットの脳に非常に豊富な２８０−ｋＤａのバンドに加えて、およそ８０ｋＤａおよび９５ｋＤａの強い免疫反応性の２つのバンドが存在した。８０ｋＤａのバンドは、肝臓、血液、腎臓、小腸および大腸において高度に発現しており、一方、肺、胃、脾臓、精巣および脂肪においては、中／低レベルの発現である。興味深いことには、９５ｋＤａのバンドは、肝臓においてのみ非常に高いレベルで検出されているので、臓器特異的であるように思われる（図１、上のパネルを参照されたい）。さらに、肝臓および血液は、およそ１３５ｋＤａの、比較的弱いが、独特なバンドを保有する。抗アクチン抗体を用いて、メンブランをリプローブすることは、タンパク質の添加コントロールとして機能する。低分子量のｍＴＯＲ免疫反応性のバンドの検出は、ｍＴＯＲのスプライシング形態の存在によって、または完全長タンパク質のタンパク質分解によって説明できる。
【０１６５】
[プラスミド構築、ｓｉＲＮＡおよび発現研究の実験手順]
哺乳動物細胞における発現のために、ｍＴＯＲβのための完全長ｃＤＮＡを、タグを付けた真核発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１／ＦＬＡＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中にクローン化した。Ａｓｐ５１４をＧｌｕに置換した、ｍＴＯＲβのキナーゼ不活性点変異体（ＴＯＲαでＡｓｐ２３５７がＧｌｕになったアナログ）を、部位特異的変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、製造業者の推奨に従って作製した。細胞の一過性形質移入を、ＥｘＧｅｎｅ５００試薬（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して、製造業者の推奨する条件下で実施した。ｍＴＯＲのｓｉＲＮＡを、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈから入手した（２１ヌクレオチド長、ヒトｍＴＯＲの２２４１〜２２６１の領域に対応する（Ｋｉｍら、２００２））。ｓｉＲＮＡを、Lipofectamine2000(Invitrogen)を使用して、製造業者の推奨通りに、Ｈｅｋ２９３細胞に形質移入した。Ｓ６Ｋ１のＣ末端領域（Ｈｉｓ−Ｓ６Ｋ１Ｃ、アミノ酸３３２〜５０２）を、６Ｈｉｓ−タグ配列を付けたｐＥＴ２４ａプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）に、インフレームでクローン化した。Ｈｉｓ−Ｓ６Ｋ１Ｃの発現および親和性精製を、それぞれＢＬ２１  ＤＥ３細胞においてＮＴＡ−アガロース（Ｑｉａｇｅｎｅ）を使用して実施した。ｐＣＭＶ  ＦＬＡＧ  ｍＴＯＲαプラスミドは、Ｐｒｏｆ．Ｋ．Ｙｏｎｅｚａｗａ、神戸、日本のご厚意により提供いただいた。
【０１６６】
[試薬、抗体および細胞培養]
抗ＦＬＡＧタグ、抗ＨＡタグおよび抗βアクチン抗体は、Ｓｉｇｍａより購入した。Ｎ末端抗ｍＴＯＲ抗体はＳａｎｔａＣｒｕｚより入手した。他のすべての抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇより購入した。ヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３細胞、ヒト乳房ＭＣＦ７およびヒト肝臓ＨｅｐＧ２細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０単位／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地において維持した。
【０１６７】
[ＲＮＡ精製およびＲＴ−ＰＣＲの実験手順]
全ＲＮＡを、ＨＥＫ２９３、ＭＣＦ７およびＨｅｐＧ２細胞株から、SV Total RNA Isolation System(Promega)を使用して精製した。ReverAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)を使用して、７０℃で５分間、１０μｇの全ＲＮＡおよび５μｇのオリゴｄＴプライマーをアニーリングすることによって、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。その後、ＲＴミックス（最終  １×反応バッファー、４０ＵのＲｉｂｏＬｏｃｋリボヌクレアーゼ阻害剤（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）および１ｍＭのｄＮＴＰ）を溶液に加え、５分間、２５℃においてインキュベートした。RevertAid H Minus Reverse Transcriptase(Fermentas)を加えた後、２５μｌの反応混合物を、１０分間、２５℃および１時間、３７℃でインキュベートした。逆転写酵素反応を、１０分間７０℃でインキュベートすることによって停止させた。反応混合物を、−２０℃で保存し、１μｌをそれぞれＰＣＲに使用した。ＲＴ−ＰＣＲを、ｍＴＯＲのための特異的プライマーのパネルを使用して実施した。グリセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＤＰＨ）の特異的断片およびβアクチンを増幅させ、第１鎖ｃＤＮＡの添加コントロールおよび品質コントロールとして使用した。
【０１６８】
[実施例２：ヒト組織のｍＴＯＲのノーザンブロット分析]
これらの可能性、すなわちｍＴＯＲのスプライシング形態または完全長タンパク質のタンパク質分解の存在を調査するために、ヒト組織のパネル（ＯｒｉＧｅｎｅ）から精製した全ＲＮＡ試料のノーザンブロット分析を、まず実施した。メンブランを、そのＣ末端コード領域に対応するＤＩＧ標識ｍＴＯＲプローブ（７５０ｂｐ）を用いてプローブした。この分析において、ｍＴＯＲプローブと特異的にハイブリダイズするいくつかのバンド（図２）の存在を観察した。予想通りに、広範に発現する、完全長ｍＴＯＲの転写産物に対応すると思われる、およそ８．６Ｋｂのバンドもまた観察された。さらに、１．５から３．５Ｋｂの領域にいくつかの独特なバンドがあり、これらは、肝臓および心臓において非常に豊富であることが示された。最も強いシグナルは、２．７Ｋｂおよび３．２Ｋｂのバンドに対応した。ウェスタンブロット分析およびノーザンブロット分析において得られた結果は、ｍＴＯＲスプライシング形態の存在を強く示唆した。ノーザンブロット分析はさらに、ｍＴＯＲβが心臓および肝臓において高度に発現し、一方、腎臓、肝臓、血液、小腸および大腸は、ｍＴＯＲβのタンパク質レベルが最も高いことを示している。
【０１６９】
[ノーザンブロット分析の実験手順]
様々なヒト組織由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ試料を含むメンブランを、ＯｒｉＧｅｎｅから購入した。ノーザンブロット分析を、DIG Northern Starter kit(Roche Diagnostics)を使用して、製造業者の推奨通りに実施した。ｍＴＯＲ  ＤＩＧ標識ＲＮＡプローブを、ｍＴＯＲのＣ末端コード領域に対応する７５０ｂｐのＰＣＲ産物を、ジオキシゲニン−１１−ＵＴＰを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応の鋳型として使用して、作製した。アクチンのプローブは、製造業者により提供された。
【０１７０】
[実施例３：ｍＴＯＲベータの免疫沈降]
観察された免疫反応性のバンドの性質をさらに調べるために、ｍＴＯＲを、Ｈｅｋ２９３、ＭＣＦ７およびＨｅｐ２Ｇ細胞から、Ｃ末端ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）を使用して免疫沈降させ、Ｎ末端ｍＴＯＲ抗体を用いたウェスタンブロットにおいて免疫複合体をプローブした。図３に示すように、２８０ｋＤａおよび８０ｋＤａの範囲に２つの免疫反応性のバンドが、これら３種の細胞株すべてからの免疫沈降においてはっきりと検出された。しかし、ｍＴＯＲを、これらの３種の細胞株から、Ｆ１１Ｍａｂを使用して免疫沈降させると、２８０ｋＤａの免疫反応性のバンドは１つのみ観察された（データ非掲載）。得られた結果は、Ｎ末端およびＣ末端の両方の配列を保有し、およそ７００アミノ酸長のタンパク質をコードする、潜在的ｍＴＯＲスプライス形態の存在を強く示唆している。したがって、ｍＴＯＲノーザンブロットにおいて検出された、２．７Ｋｂおよび３．２Ｋｂの最も豊富な転写産物は、８０ｋＤａのスプライス変異体をコードする能力を有する。
【０１７１】
[免疫沈降の実験手順]
ＨＥＫ２９３細胞を、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、２ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウムおよびプロテアーゼ阻害剤の混合物（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含む溶解バッファーを用いて抽出した。全細胞抽出物を、１０，０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離器にかけた。内因性または一過性に発現したタンパク質を、タンパク質Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に固定した対応する抗体を用いて、３時間、４℃で免疫沈降させた。その後、免疫複合体を、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ−緩衝生理食塩水、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む洗浄バッファー１（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．５］、４０ｍＭのＮａＣｌおよび２ｍＭのＥＤＴＡ）、５００ｍＭのＬｉＣｌおよび０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む洗浄バッファー１、５００ｍＭのＬｉＣｌを含む洗浄バッファー１ならびに洗浄バッファー２（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．５］および１５０ｍＭのＮａＣｌ）で１回度洗浄した。ＲａｐｔｏｒまたはＲｉｃｔｏｒの免疫沈降研究のために、細胞を、氷冷バッファーＢ（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の代わりに０．３％ＣＨＡＰＳを含むバッファーＡ）に溶解した。ｍＴＯＲ免疫沈降を、バッファーＢで４回洗浄し、洗浄バッファー２で２回洗浄した。免疫複合体を、免疫ブロットのために、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏのキナーゼ反応のために使用した。
【０１７２】
[実施例４：ｍＴＯＲベータの特定]
１以上のｍＴＯＲスプライス形態の存在を証明するために、ｍＴＯＲ特異的オリゴヌクレオチドおよびいくつかのヒト細胞株のパネルを用いることによって、対応するｃＤＮＡのＰＣＲに基づく調査を実施した。この分析において、Ｈｅｋ２９３およびＭＣＦ７系を、潜在的スプライス変異体が観察された場所で使用した。さらに、肝臓がいくつかの潜在的ｍＴＯＲスプライス変異体を保有することを、ノーザンブロットおよびウェスタンブロットにおいて発見したので、肝癌細胞株Ｈｅｐ２Ｇもまた試験した。まず、全ＲＮＡを、対数増殖期細胞から、SV Total RNA Isolation System(Promega)を使用して精製した。その後、各細胞株から精製された、等量のＲＮＡを、ReverAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)を使用することによって、第１鎖ｃＤＮＡに転換した。作製した第１鎖ｃＤＮＡの品質を、アクチンおよびＧＡＤＰＨ断片のＰＣＲ増幅によって試験した。図４は、ＧＡＤＰＨ（５７０ｂｐ）およびβ−アクチン（３５０ｂｐ）の、ほぼ等量のＰＣＲ産物を、全細胞株のｃＤＮＡ調製物からＰＣＲ増幅させたことを示す。ｍＴＯＲ特異的プライマーの様々なセットを用いて作製した第１鎖ｃＤＮＡの広範囲なＰＣＲ分析により、増幅断片のパネルを作製した。最も顕著なバンドを、ゲルから切り取り、配列決定した。得られたｍＴＯＲ配列の中で、潜在的スプライス変異体を含む１つのｍＴＯＲ配列を同定した。およそ１００ｂｐのこのＰＣＲ断片を、Ｎ末端プライマー（Ｎｌ、ＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＣＣＧＧＡＣＣＴＧＣＣＧ（配列番号５））およびＦＡＴＮドメイン（Ｃ３、ＴＴＴＧＧＡＣＡＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＣＴ（配列番号６））の終わりに位置する２次プライマーを用いて増幅した。このＰＣＲ産物を、３種すべての細胞株から特異的に増幅したことに留意することが重要である（図４Ａを参照されたい）。図４Ｂに示すように、増幅断片は、ｍＴＯＲのＮ末端領域およびＦＡＴＮドメインに対応する配列を含む。作製した配列の翻訳により、スプライス部位の点におけるリーディングフレームの連続が明らかに示唆される（図４Ｃを参照されたい）。ｍＴＯＲ（ｍＴＯＲベータ）のこのスプライス形態は、最もＮ末端の２３アミノ酸、およびｍＴＯＲのＣ末端の６８３アミノ酸伸長からなる、７０６アミノ酸長のタンパク質をコードする能力を有する。
【０１７３】
この潜在的ｍＴＯＲスプライス形態の配列をコードする完全長を得るために、作製した第１鎖ｃＤＮＡから、末端の（extreme）Ｎ１（ＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＣＣＧＧＡＣＣＴＧＣＣＧ（配列番号７））およびＣ１（ＴＴＡＣＣＡＧＡＡＡＧＧＧＣＡＣＣＡ（配列番号８））のｍＴＯＲ特異的プライマーを使用して、ＰＣＲ増幅を実施した。このアプローチによって、Ｈｅｋ２９３の第１鎖ｃＤＮＡから、およそ２．３Ｋｂまでのバンドを増幅した。Ｎ末端およびＣ末端の終わりから増幅したバンドの、初回配列分析により、ｍＴＯＲの予測スプライス変異体の存在が確認された。
【０１７４】
その後、増幅ＰＣＲ産物を完全に配列決定し、そのヌクレオチド配列（配列番号１）が、ｍＴＯＲβ特異的イントロン／エクソンをヌクレオチドの６８から７２に有することを見出した。得られた配列は、７０６アミノ残基（配列番号１）のタンパク質をコードできるオープンリーディングフレームを有する。ｍＴＯＲαのＮ末端（１〜２３ａａ）およびＣ末端（１８６７〜２５４９ａａ）の間のスプライス融合の位置を矢印により示す。
【０１７５】
同定されたｍＴＯＲのスプライス形態を「ｍＴＯＲベータ（ｍＴＯＲβ）」および完全長タンパク質（ｍＴＯＲアルファ（ｍＴＯＲα））と名付けた。完全長ｍＴＯＲαと対照的に、ｍＴＯＲβのスプライス形態は、全ＨＥＡＴドメインおよびＦＡＴＮドメインの主要な部分を欠失している（図５を参照されたい）。ＨＥＡＴドメインは、タンパク質間の相互作用の媒介に関係している。ｍＴＯＲにおいて、ＨＥＡＴドメインに対応する配列は、ＲａｐｔｏｒおよびＲｉｃｔｏｒと相互に作用することが見出されており、これらはｍＴＯＲシグナル伝達においてカギとなる物質である。さらに、ＨＥＡＴドメイン領域内の配列は、ｍＴＯＲを小胞体およびゴルジ体に局在化させることが示された。最近の研究により、ＦＡＴドメインはＨＥＡＴ様構造を有し、タンパク質間の相互作用にも関与できることが示された。ｍＴＯＲβは、インタクトなＦＲＢ（ＦＫＢＰ１２／ラパマイシン結合）、キナーゼおよびＦＡＴＣドメインを有する。これらのドメインの存在が、ｍＴＯＲβがタンパク質キナーゼとして働き、その機能はラパマイシンおよびそのアナログによって調節され得ることを示唆する。さらに、ｍＴＯＲβは、最Ｎ末端から、機能未知の２３のアミノ酸およびＦＡＴＮドメインのＣ末端部分を含む。ＦＡＴＮのＣ末端領域のバイオインフォマティック分析により、ＨＥＡＴ様ドメインの存在が指摘され、これは、ＲｉｃｔｏｒおよびＲａｐｔｏｒなどの調節タンパク質との相互作用を容易にできる。
【０１７６】
[実施例５：ｍＴＯＲβの調節および細胞機能]
ｍＴＯＲβの同定およびクローン化の次に、その調節および細胞機能の調査についての研究を始めた。まず、完全長のｍＴＯＲβを、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターの中に、インフレームで、Ｎ末端ＦＬＡＧ−タグ−エピトープを付けてクローン化した。発現レベル、分子量およびＦＬＡＧ−ｍＴＯＲβの調節を調べるために、Ｈｅｋ２９３細胞に、ｐｃＤＮＡ３．１またはｐｃＤＮＡ３．１／ＦＬＡＧ−ｍＴＯＲβを、一過性に形質移入した。形質移入の１日後、細胞を、３６時間血清飢餓状態にし、ラパマイシンの存在下または不在下で３０分間インキュベートした。１時間の血清刺激後、細胞を溶解し、溶解物をウェスタンブロットまたは免疫沈降に使用した。溶解細胞の上清を、抗ｍＴＯＲポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）を用いて免疫ブロットした場合、ｐｃＤＮＡ３．１／ＦＬＡＧ−ｍＴＯＲβプラスミドが、およそ８０ｋＤａの分子量を有するタンパク質の発現を指示していることは明らかであった（図６Ａ、下のパネルを参照されたい）。内因性ｍＴＯＲβの発現が、ｐｃＤＮＡ３．１またはｐｃＤＮＡ３．１／ＦＬＡＧ−ｍＴＯＲβを形質移入したＨｅｋ２９３細胞において明らかに観察された。ＦＬＡＧエピトープの存在によって、内因性ｍＴＯＲβの移動性と比較してＦＬＡＧ−ｍＴＯＲβの移動性はわずかに遅くなる。この分析はさらに、血清による細胞の飢餓／刺激は、内因性ｍＴＯＲβおよび過剰発現されたｍＴＯＲβの両方のレベルまたはゲル移動性に影響を与えないことを示した。ラパマイシン処理の後も、有意な変化は観察されなかった。
【０１７７】
血清またはＩＧＦ１などの増殖因子による細胞の刺激は、Ｓ２４４８におけるｍＴＯＲαのリン酸化を誘導することが公知である。もともとは、Ｓ２４４８におけるｍＴＯＲαのリン酸化は、ＰＫＢ／Ａｋｔにより媒介されることが見出された。しかし、最近の研究により、Ｓ２４４８のリン酸化にＳ６Ｋが関与する強い証拠が提供されている。ｍＴＯＲβが、血清刺激に反応して、全ｍＴＯＲαのアミノ酸のＳ２４４８に対応するセリン残基においてリン酸化されるかどうかを見出すために、上記の実験から得られた溶解物をＳ２４４８リン酸化特異的抗体を用いてプローブした。図６Ａ（上のパネル）に示すように、内因性ｍＴＯＲβおよび過剰発現されたｍＴＯＲβの、全ｍＴＯＲαのアミノ酸配列のＳ２４４８に対応するセリン残基におけるリン酸化は、血清刺激により、強く誘導される。さらに、このリン酸化事象は、ラパマイシンに感受性である。得られたデータは、ｍＴＯＲαと同様に、全ｍＴＯＲαのアミノ酸配列のＳ２４４８に対応するセリン残基におけるｍＴＯＲβのリン酸化は、血清刺激に反応して誘導され、ラパマイシンに対して感受性であることを実証している。
【０１７８】
ｍＴＯＲβは、ｍＴＯＲαの主要な生理学的基質である、Ｓ６Ｋおよび４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化できるか？この問題に答えるために、ＦＬＡＧ−ｍＴＯＲβまたはＦＬＡＧ−ＴＯＲαを、一過性形質移入Ｈｅｋ２９３細胞から、免疫沈降させた。その後、免疫複合体を、冷ＡＴＰおよび組換え４Ｅ−ＢＰ１またはＨｉｓ−Ｓ６Ｋ１Ｃを含む、ｍＴＯＲキナーゼ反応に使用した。キナーゼ反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、リン酸化特異的抗体のｐＴ３８９−Ｓ６ＫｌおよびｐＳ６５−４Ｅ−ＢＰ１を用いて免疫ブロットした。図６Ｂは、ｍＴＯＲβが、Ｓ６Ｋ１および４Ｅ−ＢＰ１の両方をｉｎ  ｖｉｔｒｏでリン酸化できるが、ｍＴＯＲαより程度が低いことを、疑いの余地なく実証している。
【０１７９】
様々な研究室の実験により、ｍＴＯＲが、その下流基質：Ｓ６Ｋ、４Ｅ−ＢＰ１およびＰＫＢ／Ａｋｔのリン酸化のために、結合パートナーであるＲａｐｔｏｒおよびＲｉｃｔｏｒを必要とすることが示された。このことを考慮に入れて、ｍＴＯＲβと、公知のｍＴＯＲの結合パートナーとの相互作用を試験した。この研究において、ＨＥＫ２９３細胞に、ｐｃＤＮＡ３．１／ＦＬＡＧ−ｍＴＯＲβおよびｐＲＫ−Ｒａｐｔｏｒ−ＨＡまたはｐｃＤＮＡ３．１／ＦＬＡＧ−ｍＴＯＲβおよびｐＲＫ／Ｒｉｃｔｏｒ−ＭｙｃまたはｐｃＤＮＡ３．１／ＦＬＡＧ−ｍＴＯＲβおよびｐｃＲＫ−ＧβＬを、一過性に形質移入した。溶解細胞の上清を、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体またはコントロールの非特異的抗体を用いて、免疫沈降させた。形質移入細胞由来の免疫複合体または全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、様々な抗体を用いて免疫ブロットした。図７は、外因性発現のＲａｐｔｏｒ、ＲｉｃｔｏｒおよびＧβＬが、ｉｎ  ｖｉｖｏでｍＴＯＲβと特異的複合体を形成することを明らかに示している。相互作用の特異性を、関係のない抗体を使用して、免疫沈降アッセイにおいて試験した。このように、完全長ｍＴＯＲαと同様に、スプライス形態もまた、Ｒａｐｔｏｒ、ＲｉｃｔｏｒおよびＧβＬと結合できる。スプライス形態はさらに、Ｓ６Ｋ１および４Ｅ−ＢＰ１をｉｎ  ｖｉｔｒｏでリン酸化できる。
【０１８０】
上述のように、ｍＴＯＲβは、インタクトなＦＲＢドメインを保有する。したがって、ラパマイシンに対するｍＴＯＲαおよびｍＴＯＲβの感受性を比較することは興味深い。この研究において、ＨＥＫ２９３細胞に、ｐｃＤＮＡ３．１／ＦＬＡＧ−ｍＴＯＲβ、ｐｃＤＮＡ３．１／ＦＬＡＧ−ｍＴＯＲαまたはｐｃＤＮＡ３．１を一過性に形質移入した。１日後、細胞を２４時間飢餓状態にし、１０％ＦＣＳで一（１）時間刺激した。様々な濃度のラパマイシン（１ｎＭ、５ｎＭおよび１０ｎＭ）を、血清刺激の３０分前に加えた。細胞溶解物の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、様々な抗体を用いて免疫ブロットした。ｍＴＯＲαおよびｍＴＯＲβの発現を、Ｃ末端ポリクローナルｍＴＯＲ抗体を用いて免疫ブロットすることにより確認した（図８を参照されたい）。メンブランを、Ｓ６Ｋ１（ｐＴ３８９）および４Ｅ−ＢＰ１（ｐＳ７０、ｐＳ３７／４６）において、公知のｍＴＯＲリン酸化部位に対するリン酸化特異的抗体のパネルでプローブすることにより、ｍＴＯＲβを発現する細胞が、ベクター単独またはｐｃＤＮＡ３１／ｍＴＯＲαを形質移入した細胞と比較した場合、ラパマイシンに対して感受性が低いことが示された。特に、感受性は、１ｎＭ程度の低い用量のラパマイシンで処理した細胞においてより明らかであった。
【０１８１】
過去の研究は、主に小胞体およびゴルジ体の膜分画においてｍＴＯＲαを見出した。さらに、ｍＴＯＲは、ミトコンドリア外膜および核内で観察された。完全長ｍＴＯＲのＨＥＡＴドメイン領域（ＨＥＡＴドメイン１８および１９）に位置する配列は、その膜局在化の媒介に関係している。ＨＥＡＴおよびＦＡＴＮドメインが、ｍＴＯＲβに存在しないことを考慮に入れて、分画化によって、その細胞内局在化を調べることは興味深い。対数増殖期のＨＥＫ２９３細胞を、ProteoExstract Extraction kit(Calbiochem)を使用して、分画化した。ｍＴＯＲαおよびｍＴＯＲβの両方を、抗ｍＴＯＲ  Ｃ末端抗体を使用して全分画から免疫沈降させた。免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、抗ｍＴＯＲ  Ｎ末端抗体を用いて免疫ブロットした。予想通り、ｍＴＯＲαが、得られた細胞質、核およびメンブラン分画において検出された。それとは対照的に、ｍＴＯＲβは、細胞質に優勢に局在化した（図９を参照されたい）。調製された細胞内分画の質を、抗４Ｅ−ＢＰｌ、ＨＳＰ６０およびｃ−Ｊｕｎ抗体を用いて免疫ブロットすることにより分析した。現在の免疫蛍光分析を用いて、（飢餓／刺激および細胞ストレスに反応した）一過性形質移入Ｈｅｋ２９３細胞におけるＭｙｃ−ｍＴＯＲαおよびｍＴＯＲβの細胞内局在化を研究する。
【０１８２】
細胞過程の調節におけるｍＴＯＲβの役割をさらに調査するために、ｍＴＯＲβ野生型またはｍＴＯＲα野生型を過剰発現するＨｅｋ２９３安定細胞株を作製した。さらに、ＥＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質(Enhanced Green Fluorescent Protein)）を過剰発現する、ｍＴＯＲβの研究においてコントロールとして使用できる細胞株も開発した。作製した細胞株の初回試験により、ｍＴＯＲαまたはＧＦＰを発現する細胞と比較した場合、野生型ｍＴＯＲβを発現する細胞株がより早く増殖することが示された。このことを考慮に入れて、作製した安定細胞株の増殖率を、Ｐｒｏｍｅｇａの細胞増殖アッセイを使用して調査した。ｍＴＯＲβ  ｗｔ、ｍＴＯＲα  ｗｔまたはＥＧＦＰを過剰発現する安定細胞株を、９６ウェルプレートに様々な濃度で播種し、標準的条件下で７日間増殖させた。その後、各ウェルの細胞数を、Ｒｅｓｏｓｕｒｉｎに基づくアッセイにより測定した。６つの独立した研究において、ｍＴＯＲβ発現細胞は、コントロール細胞と比較してより速く増殖することが見出された（図１０を参照されたい）。対照的に、ｍＴＯＲα  ｗｔ発現細胞は、コントロール細胞と比較して増殖における差は示さなかった。このことにより、細胞増殖の調製におけるｍＴＯＲβの役割が確認されたが、ｍＴＯＲαに関しては確認されなかった。
【０１８３】
ｍＴＯＲβキナーゼ活性が、細胞増殖の調節において役割を有するかどうかを調査するために、同様の実験を、ｍＴＯＲβ野生型、ｍＴＯＲβキナーゼ不活性型（ＫＤ）変異体またはＥＧＦＰを過剰発現するＨｅｋ２９３細胞株において実施した。細胞を、９６ウェルプレートに様々な濃度で播種し、標準的条件下で５日間増殖させた。その後、各ウェルの細胞数を、Ｒｅｓａｚｕｒｉｎに基づくアッセイにより測定した。６つの独立した研究において、ｍＴＯＲβ発現細胞は、コントロール細胞と比較しておよそ１．６倍の速さで増殖することが見出された（図１１を参照されたい）。得られたデータはさらに、ｍＴＯＲβ  ＫＤ変異体が、Ｈｅｋ２９３細胞において発現させた場合、細胞増殖に関するドミナントネガティブ効果を有していないことを示している。ｍＴＯＲβ  ＫＤ過剰発現細胞は、ＥＧＦＰ細胞と比較した場合、ある程度速く増殖したので、わずかに反対の効果を示している。
【０１８４】
ｍＴＯＲβによる細胞増殖の誘導は、様々なシグナル伝達経路により、形質導入できるということが、さらに考えられる。それらの経路の１つである、プロトオンコジーンＭｙｃを介したシグナル伝達を調べた。プロトオンコジーンＭｙｃは、数多くの遺伝子の転写を調節するその能力を介して、細胞の成長、増殖、分化およびアポトーシスに影響を与えることが公知である。ｃＭｙｃは、遺伝的安定性、遊走および血管形成を含む、腫瘍進行の調節にも関係がある。したがって、ｃＭｙｃタンパク質の発現および機能は、厳密に制御されている。実際、多くの様々な経路および因子は、転写および翻訳のレベルにおけるｃＭｙｃの発現および翻訳後修飾を介したそのタンパク質機能を調整することが特定されている。細胞増殖の調節において、ｃＭｙｃは、細胞周期のＧ１／Ｓ移行に関与する遺伝子の発現を制御する。ｍＴＯＲ経路を介したシグナル伝達は、Ｇ１／Ｓ期における細胞周期進行に、深く寄与する。さらに、ラパマイシンは、細胞周期のＧ１／Ｓ移行の公知の阻害剤である。
【０１８５】
ｃＭｙｃがｍＴＯＲβ誘導性増殖に関与するかどうかを試験するために、ＨＥＫ２９３細胞に、ｐＥＧＦＰ、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍＴＯＲβ  ｗｔ、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍＴＯＲβ不活性型変異体またはｐｃＤＮＡ３．１／ｍＴＯＲα  ｗｔを一過性に形質移入した。形質移入２日後、細胞を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ｃ−ｍｙｃおよびその転写標的に対する抗体（例えば、抗Ｍｙｃ（９Ｅ１０）モノクローナル抗体）を用いて免疫ブロットした。図１０Ｂに提示した結果は、ｍＴＯＲβの過剰発現がｃ−Ｍｙｃタンパク質のレベルを有意に増加させるが、ｍＴＯＲαは増加させないことを明らかに実証している。ｍＴＯＲβのキナーゼ不活性型変異体はｃ−Ｍｙｃの発現を刺激しないので（図１１Ｂ）、ｃ−Ｍｙｃ翻訳の誘導は、ｍＴＯＲβキナーゼ活性に依存性である。ｍＴＯＲα、ｍＴＯＲβ  ｗｔおよびＫＤ変異体の一過性発現の発現レベルを、Ｃ末端ｍＴＯＲ抗体を用いた免疫ブロットによりモニターした。ｍＴＯＲβ  ｗｔの過剰発現により、Ｍｙｃ発現のレベルが増加することが見出された。さらに、ｍＴＯＲβを過剰発現するＨｅｋ２９３細胞が、ｍＴＯＲαを過剰発現する細胞よりも非常に早くソルビトール誘導性ストレスから回復することが見出された。
【０１８６】
細胞周期におけるｍＴＯＲβの役割をさらに調査するために、ｍＴＯＲβ、ｍＴＯＲαまたはＥＧＦＰを過剰発現するＨｅｋ２９３細胞を、ＢｒｄＵを用いて３０分間パルス標識し、２時間ごとに２４時間追跡した。細胞に組み込まれたＢｒｄＵを、ＦＡＣＳ分析により測定した。各細胞株に関して観察された細胞周期のＧｌ、ＳおよびＧ２期の存続期間を決定した（図１２を参照されたい）。ＳおよびＧ２期の存続期間は３種の細胞群すべてにおいて同様であった。しかし、Ｇ１期の存続期間は、ｍＴＯＲβ過剰発現細胞において、ｍＴＯＲα細胞またはコントロール細胞より短かった。このことは、ｍＴＯＲβが細胞周期のＧ１進行に関して重要であることを示唆している。
【０１８７】
血清飢餓細胞におけるｍＴＯＲβの効果も評価した。ｍＴＯＲβ  ｗｔ、ｍＴＯＲα  ｗｔ、ｍＴＯＲβキナーゼ不活性型またはＥＧＦＰを過剰発現するＨｅｋ２９３安定細胞株を、６０時間血清飢餓状態にした。細胞の生存を、Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ色素排除アッセイにより評価した。ｍＴＯＲβ  ｗｔの過剰発現により、細胞が飢餓誘導性細胞死から保護され（図１３Ａを参照されたい）、ｍＴＯＲβキナーゼ活性がこの効果の媒介にとって必要であることが見出された（図１３Ｂを参照されたい）。
【０１８８】
細胞の発癌性についてのｍＴＯＲβ発現の効果をさらに調査するために、ｍＴＯＲβ、ｍＴＯＲαまたはＥＧＦＰを安定して過剰発現するＨｅｋ２９３細胞を、培養培地中のアガロースの薄層にプレーティングした。１４日後、コロニーを、ＭＴＴを使用して染色した（図１４を参照されたい）。コロニーを、quantity 1 software (Bio-Rad)を使用して計測し、倍率をプロットした（図１４Ｂを参照されたい）。ｍＴＯＲβの過剰発現は、ｍＴＯＲαを過剰発現する細胞およびコントロール細胞と比較して、細胞発癌性の増加をもたらすことが見出された。
【０１８９】
[ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイの実験手順]
ｍＴＯＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを、すでに公開されているように実施した（Ｋｉｍら、２００２）。簡潔に言うと、キナーゼアッセイを３０μｌで、３０℃において４０分間実施し、５×１０６のＨＥＫ２９３細胞に由来する、洗浄したｍＴＯＲ免疫沈降物の約１／４、１μｇの４Ｅ−ＢＰ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または０．５μｇの組換えＨｉｓ−Ｓ６Ｋ１Ｃ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭのＫＣｌ、２０％グリセロール、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、４ｍＭのＭｎＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴおよび５０μＭのＡＴＰを含んだ。反応を、５×サンプルバッファーを加えることによって停止させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、免疫ブロットによって分析した。
【０１９０】
[免疫ブロット分析の実験手順]
免疫複合体または全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ポリ二フッ化ビニリデンメンブラン（ＰＶＤＦ）上に転写し、ブロッキング溶液（５％ミルク、Ｔｒｉｓ−緩衝生理食塩水／Ｔｗｅｅｎ０．１％）と共に１時間インキュベートした。その後、ブロックしたメンブランを、一次抗体を用いて４℃において一晩プローブした。０．１％のＴｗｅｅｎを含むＴｒｉｓ−緩衝生理食塩水で徹底的に洗浄した後、メンブランを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体を用いて、室温で１時間インキュベートした。抗原−抗体複合体を、ＥＣＬ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して検出した。免疫ブロットをリプローブしなければならない場合、メンブランをまずストリップし(Restore Western Stripping Reagent、Pierce)、別の型の一次抗体と共にインキュベートした。
【０１９１】
[細胞内分画（subcellular fractionation）の実験手順]
ＨＥＫ２９３細胞の細胞内分画を、ProteoExstract Extraction kit(Calbiochem)を使用して、製造業者の推奨通りに実施した。ｍＴＯＲαおよびｍＴＯＲβを、抗ｍＴＯＲ  Ｃ末端抗体を使用して、すべての分画から免疫沈降させた。免疫複合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、抗ｍＴＯＲ  Ｎ末端抗体を用いて免疫ブロットした。抗４Ｅ−ＢＰｌ、ＨＳＰ６０およびｃ−Ｊｕｎ抗体を、それぞれ細胞質、メンブランおよび核の分画に対するコントロールとして使用した。
【０１９２】
[安定細胞株の作製および細胞増殖アッセイの実験手順]
野生型およびキナーゼ不活性型のｍＴＯＲβを過剰発現する安定細胞株を、直鎖状のｐｃＤＮＡ  ３．１／ＦＬＡＧ−Ｔまたはβ  ｗｔまたはｐｃＤＮＡ３．１  ＦＬＡＧ  Ｔまたはβ不活性型ベクターを、ＨＥＫ２９３細胞に形質移入することによって作製した。細胞株を、５００μｇ／ｍｌのジェネティシン（genetecin）で１０日間、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の推奨通りに選択した。細胞増殖アッセイのために、ｍＴＯＲβ  ｗｔ、ｍＴＯＲβキナーゼ不活性型およびＥＧＦＰを過剰発現するＨｅｋ２９３安定細胞株を、９６ウェルプレートに様々な濃度（２５０、５００、１０００および２０００細胞／ウェル）で播種し、標準的条件下で５日間増殖させた。その後、各ウェルの細胞数を、Ｒｅｓｏｓｕｒｉｎに基づくアッセイ(Cell Titer Blue Promega)により、製造業者の推奨通りに測定した。各細胞株に関する正規化増殖曲線を、少なくとも６つの独立した実験からのデータを使用して計算した。
【０１９３】
本発明は、様々な特定の材料、手順および実施例を参照することによって、本明細書に記載および例示しているが、その目的のために選択された材料および手順の特定の組合せに本発明が限定されるものではないことが理解されるべきである。当業者には理解されるであろうが、このような詳細の多くの変形が含まれることを意味する。本明細書および実施例は、後述の特許請求の範囲によって示される本発明の真の範囲および趣旨の、単なる例示と見なされることが目的である。本出願において述べられた、すべての参考文献、特許、特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、以下の態様を包含する。
［１］
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、および
（ｃ）配列番号１によってコードされるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド
からなる群から選択される、Ｓ６Ｋ１および／または４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化する単離ポリペプチド。
［２］
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補体を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１の連続した配列全体にわたって少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、Ｓ６Ｋ１および／または４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびに
（ｄ）配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補体に、６８℃で０．１×ＳＳＣを用いる条件下でハイブリダイズし、Ｓ６Ｋ１および／または４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化するタンパク質をコードする単離核酸分子
からなる群から選択される単離ポリヌクレオチド。
［３］
前記ポリヌクレオチドが、１以上の発現コントロールエレメントに作動可能に連結している、上記［２］に記載のポリヌクレオチド。
［４］
上記［２］または［３］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［５］
上記［１］に記載のポリペプチド、上記［２］もしくは［３］に記載のポリヌクレオチド、または上記［４］に記載のベクターを含む宿主細胞。
［６］
上記［１］に記載のポリペプチドに特異的に結合する単離抗体。
［７］
前記抗体がモノクローナルである、上記［６］に記載の抗体。
［８］
抗体がヒト化されている、上記［６］または［７］に記載の抗体。
［９］
上記［１］に記載のポリペプチド、または上記［２］に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現する条件下で、上記［５］に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、ポリペプチドを産生するための方法。
［１０］
ｍＴＯＲベータ活性を調整する作用物質をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）上記［１］に記載のポリペプチドを試験作用物質と接触させるステップと、
（ｂ）前記ポリペプチドの活性の任意の変化を検出するステップと
を含み、活性の変化が、ｍＴＯＲベータ活性を調整することができる作用物質を示す、前記方法。
［１１］
ｍＴＯＲベータの発現および／または活性を調整する作用物質をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）上記［１］に記載のポリペプチド、または上記［２］に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む、またはこれを発現する、上記［５］に記載の宿主細胞を提供するステップと、
（ｂ）前記宿主細胞を試験作用物質と接触させるステップと、
（ｃ）前記ポリペプチドの発現および／または活性の任意の変化を検出するステップと
を含み、発現および／または活性の変化が、ｍＴＯＲベータの発現および／または活性を調整することができる作用物質を示す、前記方法。
［１２］
前記活性が、Ｓ６Ｋ１および／または４Ｅ−ＢＰ−１のリン酸化を測定することによって検出される、上記［１０］または［１１］に記載の方法。
［１３］
前記活性が、ｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現を測定することによって検出される、上記［１０］または［１１］に記載の方法。
［１４］
前記発現が、配列番号１を含む核酸のレベルを測定することによって検出される、上記［１１］に記載の方法。
［１５］
上記［１］に記載のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患を治療するための方法であって、その必要のある対象へ有効量の作用物質を投与するステップを含み、前記作用物質が、前記ポリペプチドの活性および／または発現を変化させる、前記方法。
［１６］
前記ポリペプチドの異常な発現と関連する疾患の治療における使用のための、上記［１］に記載のポリペプチドの活性および／または発現を変化させる作用物質。
［１７］
前記作用物質が、上記［７］から［９］のいずれか一項に記載の抗体である、上記［１５］に記載の方法または上記［１６］に記載の作用物質。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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