(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡの存在の検出方法であって、以下のステップ：
（Ａ）鋳型として前記試料から誘導したＲＮＡを使って逆転写反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的逆転写生成物を生成させ；
（Ｂ）ＨＣＶに特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー対を使用して前記逆転写生成物を増幅せしめることにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物を生成させ、
ここで前記プライマー対は、以下の：
（ａ）正プライマー 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28) 〔配列番号１〕と逆プライマー 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R26)〔配列番号４〕；および
（ｂ）正プライマー 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25) 〔配列番号２〕と逆プライマー 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) 〔配列番号７〕；
から成る群より選ばれた逆プライマー
から成る群より選ばれ；そして
（Ｃ）前記増幅生成物を検出する、
ここで前記増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ  ＲＮＡの存在を示す
を含む前記方法。
【請求項２】
前記逆転写反応がランダムオリゴヌクレオチドプライマーを使って行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記逆転写反応が、ＨＣＶ  ＲＮＡ中の配列に相当する配列を有する１または複数のオリゴヌクレオチドプライマーを使って行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、核酸一塩基置換および転写媒介増幅から成る群より選ばれた方法により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記検出が、ゲル電気泳動により前記増幅生成物を視覚化することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記検出が、１または複数のＨＣＶ特異的オリゴヌクレオチドプローブを含有する固体支持体上で前記増幅生成物を捕捉し、そして比色アッセイを使って前記捕捉された生成物を定量することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記正プライマーが(C131F25)である場合には、前記プローブは、以下の：
（ａ）5'-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-25-PRB) 〔配列番号13〕および
（ｂ）5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-27-PRB) 〔配列番号12〕から成る群より選ばれたメンバーを含み；そして
前記正プライマーが(C69F28)である場合には、前記プローブは、以下の：
（ｃ）5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3' (C96-22-PRB) 〔配列番号11〕を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が血液、血清、血漿、尿、唾液および脳脊髄液から成る群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＤＮＡの増幅方法であって、以下のステップ：
（Ａ）ＨＣＶ  ＤＮＡを含むＤＮＡ試料に対して、ＨＣＶに特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー対を使ってポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物を生成させる
を含み、ここで、
前記プライマー対が、以下の：
（ａ）正プライマー 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28) 〔配列番号１〕と逆プライマー 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R26)〔配列番号４〕；および
（ｂ）正プライマー 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25) 〔配列番号２〕と逆プライマー 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) 〔配列番号７〕；
から成る群より選ばれた逆プライマー
から成る群より選ばれることを特徴とする前記方法。
【請求項１０】
以下のステップ：
（Ｂ）前記増幅生成物を検出する
ことを更に含み、ここで、前記増幅生成物の検出が前記試料中にＨＣＶ  ＤＮＡの存在を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出が、ゲル電気泳動により前記増幅生成物を視覚化することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出が、１または複数のＨＣＶ特異的オリゴヌクレオチドプローブを含有する固体支持体上で前記増幅生成物を捕捉し、そして比色アッセイを使って捕捉された生成物を定量することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記正プライマーが(C131F25)である場合には、前記プローブは、以下の：
（ａ）5'-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-25-PRB) 〔配列番号13〕および
（ｂ）5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-27-PRB) 〔配列番号12〕から成る群より選ばれたメンバーを含み；そして
前記正プライマーが(C69F28)である場合には、前記プローブは、以下の：
（ｃ）5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3' (C96-22-PRB)〔配列番号11〕を含む、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明が属する技術分野】
【０００１】  本発明は、生物学的試料中の核酸配列、特に感染性微生物に由来する配列の改良検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、世界中の大部分の輸血後肝炎の症例とかなりの割合の散在性（または地域社会獲得性）肝炎の症例の原因である、非経口的に伝染するウイルスである。世界人口の１％超がＨＣＶに感染していると見積もられている。ＨＣＶ感染は急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変および肝細胞癌に関係がある。【０００３】  ＨＣＶは現在フラビウイルス科（Flaviviridae）の中の独自のヘパチウイルス属（Hepacivirus ）として分類されている。そのゲノムは、約3,000 アミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードする単一の大きな転写解読枠（ＯＲＦ）を有する約9,500 ヌクレオチドの正鎖ＲＮＡ分子から成る。この大きなＯＲＦの上流には、ゲノムの最も高度に保存された領域である約340 ヌクレオチドの５′非コード領域（ＮＣＲ）がある。このＯＲＦの５′領域は（５′→３′方向で）キャプシドタンパク質、２つのエンベロープ糖タンパク質（Ｅ１とＥ２）および未知の機能を有する小さなタンパク質（Ｐ７）をコードする。このＯＲＦの３′領域は、プロテアーゼ、プロテアーゼ／ヘリカーゼ二機能性タンパク質、ＲＮＡポリメラーゼおよび調節タンパク質を包含する非構造タンパク質をコードする。【０００４】  世界中からのＨＣＶコード配列の分析により、個々のウイルス分離株間で相当な配列変異が明らかになった。更に、個々の患者からのＨＣＶ配列の分析により、関連するが同一でない配列を含むいわゆる「準種 "quasi-species"」としてウイルスが流布することが示された。分離株間と個々の患者間に存在する変異は、ウイルスによりコードされるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが低い信頼度を有することの結果であると考えられる。ＨＣＶの遺伝的変異の程度は、感染の予防、診断および制御にとって重要な意味を持つ。【０００５】  ＨＣＶ感染の血清学的診断は、典型的には組換えＨＣＶタンパク質またはペプチドを結合する抗体を検出する市販のエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）により測定される。陽性ＥＩＡ結果は組換え免疫ブロットアッセイ（ＲＩＢＡ）により確かめることができるが、ＥＩＡもＲＩＢＡ法も現在の感染と過去の感染を区別することはできない。循環しているウイルスは典型的には低いウイルス価であるために、ウイルスタンパク質についての直接アッセイの開発は成功していない。更に、抗体に依存するアッセイは一般に、暴露後２〜３カ月間はＨＣＶ感染を検出することができない。
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  従って、ＨＣＶへの患者の暴露後数日以内にＨＣＶウイルス血症を検出するのに十分な位感受性であるＨＣＶについての改良アッセイが当該技術分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  本発明は、一面では、生物学的試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡの存在の検出方法に向けられる。この方法は、
(A) 鋳型として前記試料から誘導したＲＮＡを使って逆転写反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的逆転写生成物を生成させ；
(B) ＨＣＶに特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー対を使用して前記逆転写生成物を増幅せしめることにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物を生成させ、
前記プライマー対は
(a) 正プライマー  5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28) 〔配列番号１〕と逆プライマー  5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R26)〔配列番号４〕；または
(b) 正プライマー  5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25) 〔配列番号２〕と逆プライマー  5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) 〔配列番号７〕；および
(c) 正プライマー  5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26)〔配列番号３〕と
(i)  5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3' (C282R27)〔配列番号５〕および
(ii) 5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3' (C287R27)〔配列番号６〕
から成る群より選ばれた逆プライマー
から成る群より選ばれ；そして
(C) 前記増幅生成物を検出する
という各段階を含んで成り、前記増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ  ＲＮＡの存在を示すことを特徴とする。
【０００８】  別の面では、本発明はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＤＮＡの増幅方法に向けられる。この方法は、
(A) ＨＣＶ  ＤＮＡを含有するＤＮＡ試料において、ＨＣＶに特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー対を使ってポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物を生成させる
ことを含んで成り、ここで前記プライマー対は
(a) (i)  5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28)〔配列番号１〕，
(ii) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25)〔配列番号２〕および
(iii)5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26) 〔配列番号３〕
から成る群より選ばれた正プライマーと
(b) (i)  5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R26) 〔配列番号４〕，
(ii) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3' (C282R27)〔配列番号５〕，
(iii)5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3' (C287R27)〔配列番号６〕および
(iv) 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25)〔配列番号７〕
から成る群より選ばれた逆プライマー
とを含んで成る。
【０００９】  第三の面では、本発明は生物学的試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡの存在の検出方法に向けられる。この方法は、
(A) 鋳型として前記試料から誘導したＲＮＡを使って逆転写反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的逆転写生成物を生成させ；
(B) 正プライマーと逆プライマーを使って前記逆転写生成物を増幅させることにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物を生成させ、
前記正プライマーがオリゴヌクレオチド 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27) 〔配列番号８〕から成り、そして前記逆プライマーがオリゴヌクレオチド 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配列番号９〕から成り；そして
(C) 前記増幅生成物を検出する
という各段階を含んで成り、前記増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ  ＲＮＡの存在を示すことを特徴とする。
【００１０】  第四の面では、本発明はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＤＮＡの増幅方法に向けられる。この方法は、
(A) ＨＣＶ  ＤＮＡを含有するＤＮＡ試料において、正プライマーと逆プライマーを使ってポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物を生成させる
ことを含んで成り、前記正プライマーがオリゴヌクレオチド 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27) 〔配列番号８〕から成り、そして前記逆プライマーがオリゴヌクレオチド 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配列番号９〕から成る。
【００１１】  第五の面では、本発明は生物学的試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡの存在の検出方法に向けられる。この方法は、
(A) 鋳型として前記試料から誘導したＲＮＡを使って逆転写反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的逆転写生成物を生成させ；
(B) ＨＣＶに特異的な１または複数の５′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対と１または複数の３′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対とを使って、前記逆転写生成物を増幅させることにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物を生成させ、
前記５′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が
(a) (i)  5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28)〔配列番号１〕，
(ii) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25)〔配列番号２〕および
(iii)5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26) 〔配列番号３〕
から成る群より選ばれた正プライマーと
(b) (i)  5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R26) 〔配列番号４〕，
(ii) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3' (C282R27)〔配列番号５〕，
(iii)5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3' (C287R27)〔配列番号６〕および
(iv) 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25)〔配列番号７〕
から成る群より選ばれた逆プライマーとを含んで成り；そして
前記３′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対の各々がオリゴヌクレオチド 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27) 〔配列番号８〕から成る正プライマーと、オリゴヌクレオチド 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配列番号９〕から成る逆プライマーとを含んで成り；そして
(C) 前記増幅生成物を検出する
という各段階を含んで成り、前記増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ  ＲＮＡの存在を示すことを特徴とする。
【００１２】  第六の面では、本発明はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＤＮＡの増幅方法に向けられる。この方法は
(A) ＨＣＶ  ＤＮＡを含有するＤＮＡ試料において、ＨＣＶに特異的な１または複数の５′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対と１または複数の３′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対とを使ってポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物を生成させ、
前記５′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が
(a) (i)  5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28)〔配列番号１〕，
(ii) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25)〔配列番号２〕および
(iii)5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26) 〔配列番号３〕
から成る群より選ばれた正プライマーと
(b) (i)  5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R26) 〔配列番号４〕，
(ii) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3' (C282R27)〔配列番号５〕，
(iii)5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3' (C287R27)〔配列番号６〕および
(iv) 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25)〔配列番号７〕
から成る群より選ばれた逆プライマーとを含んで成り；そして
前記３′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対の各々がオリゴヌクレオチド 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27) 〔配列番号８〕から成る正プライマーと、オリゴヌクレオチド 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配列番号９〕から成る逆プライマーとを含んで成る
ことを特徴とする。
【００１３】  逆転写反応を実施する本発明の方法の或る態様では、逆転写反応はランダムオリゴヌクレオチドプライマーを使って行うか、あるいは１または複数のＨＣＶ特異的逆転写プライマー、即ち、ＨＣＶ  ＲＮＡ中の配列に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドを使って行ってもよい。増幅の検出方法としては、非限定的に、(a) 電気泳動および(b) ＨＣＶ特異的プローブが取り付けられた固体支持体上への増幅生成物の捕捉に続く比色アッセイによる結合生成物の定量が挙げられる。
【００１４】  更なる面では、本発明はＨＣＶ  ＲＮＡから誘導されたＨＣＶ  ＤＮＡを増幅させるためのキットに向けられる。このキットは１または複数の５′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対を含んで成り、前記５′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が
(a) (i)  5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28)〔配列番号１〕，
(ii) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25)〔配列番号２〕および
(iii)5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26) 〔配列番号３〕
から成る群より選ばれた正プライマーと
(b) (i)  5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R26) 〔配列番号４〕，
(ii) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3' (C282R27)〔配列番号５〕，
(iii)5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3' (C287R27)〔配列番号６〕および
(iv) 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25)〔配列番号７〕
から成る群より選ばれた逆プライマーとを含んで成る。
【００１５】  更に別の面では、本発明はＨＣＶ  ＲＮＡから誘導されたＨＣＶ  ｃＤＮＡを増幅させるためのキットに向けられる。このキットは１または複数の３′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対を含んで成り、前記３′ＮＣＲプライマー対の各々がオリゴヌクレオチド 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27) 〔配列番号８〕から成る正プライマーと、オリゴヌクレオチド 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配列番号９〕から成る逆プライマーとを含んで成る。
【００１６】  別の面では、本発明はＨＣＶ  ＤＮＡの存在を検出するためのキットに向けられる。このキットは１または複数の５′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対を含んで成り、前記５′ＮＣＲプライマー対の各々が
(a) (i)  5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28)〔配列番号１〕，
(ii) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25)〔配列番号２〕および
(iii)5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26) 〔配列番号３〕
から成る群より選ばれた正プライマーと
(b) (i)  5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R26) 〔配列番号４〕，
(ii) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3' (C282R27)〔配列番号５〕，
(iii)5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3' (C287R27)〔配列番号６〕および
(iv) 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25)〔配列番号７〕
から成る群より選ばれた逆プライマーとを含んで成る。
【００１７】  更に別の面では、本発明はＨＣＶ  ＲＮＡの存在を検出するためのキットに向けられる。このキットは１または複数の３′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対を含んで成り、前記３′ＮＣＲプライマー対の各々がオリゴヌクレオチド 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27) 〔配列番号８〕から成る正プライマーと、オリゴヌクレオチド 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配列番号９〕から成る逆プライマーとを含んで成る。
【発明の実施態様】
【００１８】  本発明者らは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡ中に存在する特定の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとして用いると、生物学的試料中のＨＣＶ  ＲＮＡの検出がより効率的であることを発見した。従って、本発明は、低コピーレベルのＨＣＶ  ＲＮＡを検出する、改善された、１回の逆転写／増幅アッセイを提供する。オリゴヌクレオチドプライマーは、配列保存、分子内または分子間相互作用、およびアンプリコンと周囲配列の推定二次構造に基づいて選択される。更に、プライマーとアッセイ方法は、ＨＣＶゲノムの多領域、多ウイルス種、および内部陽性配列（ＩＰＣ）ＲＮＡ（またはＤＮＡ）の同時増幅（または同時検出）を可能にするようにデザインされる。ＨＣＶゲノムの多領域の同時増幅／検出はアッセイ感度を増加させ、そしてＩＰＣの同時増幅はＰＣＲの阻害により生じる偽陽性結果の可能性を減少させる。
【００１９】  分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよびタンパク質生化学の多数の技術、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, 第Ｉ，IIおよびIII 巻, 1997（F.M. Ausubel編)；Sambrook他, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York ; DNA Cloning: A Practical Approach,第ＩおよびII巻, 1985 (D.N. Glover 編) ; Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M.L. Gait編) ; Transcription and Translation, 1984 (Hames & Higgins編) ; A Practical Guide to Molecular Cloning; 双書, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) ; Protein Purification: Principles and Practice, 第２版（Springer-Verlag, N.Y. ）中に説明された技術を、本発明を実施する際に使用する。
【００２０】  本明細書中で用いる「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、ポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチドまたは混合ポリリボ／ポリデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのプリンおよびピリミジン含有ポリマーを言う。これには一本鎖および二本鎖分子、例えばＤＮＡ−ＤＮＡ，ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、並びにアミノ酸主鎖に塩基を結合することにより形成された「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。これには修飾塩基を含有する核酸も含まれる。
【００２１】  本明細書中で用いる核酸配列の「相補体」とは、元の配列と共にワトソン−クリック塩基対合に参加するアンチセンス配列を言う。
【００２２】  本明細書中で用いる「プライマー」は、着目の一本鎖核酸配列と共に二重鎖を形成しそして例えば逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼを使って相補鎖の重合を可能にする、長さ約10〜約50ヌクレオチド、好ましくは長さ約12〜約25ヌクレオチド、最も好ましくは約12〜約18ヌクレオチドの単離されたオリゴヌクレオチドである。
【００２３】  本明細書中で用いる「単離された」核酸とは、それの元の環境（例えば、それが天然に存在する混合物であるならそれの天然の環境、それが合成物であるなら反応混合物）から分離されている成分を言う。単離された核酸は、典型的には、最初にそれが関連していた成分の約50％未満、好ましくは約75％未満、そして最も好ましくは約90％未満を含有する。
【００２４】  指摘した配列「から誘導された」核酸配列とは、その指摘した配列の一領域に相当する配列を言う。これには、その配列に相同であるかまたは相補的である配列も含まれる。
【００２５】  内部陽性対照（＝ＩＰＣ）標的核酸とは、典型的には制限エンドヌクレアーゼの作用により後で直鎖状にされるプラスミドベクター中にクローニングされた合成核酸配列を指して言う。ＩＰＣは、典型的には一般的なプローブ結合領域を取り囲む複数のプライマー結合配列を有し、そして核酸増幅反応において偽陽性結果に対する包括的な対照として働く。
【００２６】  好ましい内部陽性対照標的ＤＮＡの配列は下記のものである：
5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGATCGTG-3'〔配列番号10〕。
【００２７】  本明細書中に開示するいずれかの配列またはそれの部分配列を含んで成る核酸は、常法により調製することができる。例えば、Matteucci 他, 1981, J. Am. Chem. Soc. 103:3185のホスホロアミダイト固体支持体法、Yoo 他, 1989, J. Biol. Chem. 764:17078の方法、または他の周知の方法を使って、ＤＮＡを合成することができる。当該技術分野で既知である多数の手段により核酸を修飾することもできる。そのような修飾の非限定例としては、メチル化、「キャップ付加」、類似体による１もしくは複数の天然ヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば無電荷結合（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）もしくは荷電結合（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）が挙げられる。核酸は１または複数の追加の共有結合した成分、例えば、タンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）、挿入剤（例えばアクリジン、ソラレンなど）、キレート化剤（例えば金属、放射性金属、鉄、酸化金属など）およびアルキル化剤を含んでもよい。「核酸」なる用語にはＰＮＡも含まれる。核酸は、メチルもしくはエチルホスホトリエステルまたはアルキルホスホロアミデート結合の形成により誘導体にすることができる。更に、本発明の核酸配列は、直接または間接的に検出可能なシグナルを提供することができる標識により修飾されてもよい。典型的な標識としては、放射性同位体、蛍光分子、ビオチンなどが挙げられる。
【００２８】  本明細書中で用いる「増幅」とは、非限定的に、核酸がコピーされる相互作用工程を言う。適当な増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、転写媒介増幅および核酸一塩基増幅が挙げられる。
【００２９】  本発明は、生物学的試料中のＨＣＶの検出方法を提供する。この方法は、
(i) 試料中に含まれるかまたは試料から誘導されたＲＮＡを鋳型として使って逆転写反応を行い；
(ii)ＨＣＶ  ＲＮＡの５′または３′非コード領域内の配列に相当する配列を有する増幅プライマー対を使って逆転写生成物を増幅させることにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物を生成させ；そして
(iii) 前記ＨＣＶ特異的増幅生成物を検出する
ことにより実施される。ＨＣＶ特異的増幅生成物の検出が、試料中のＨＣＶ  ＲＮＡの存在を示す。
【００３０】  本発明によれば、任意の常法により患者から生物学的試料が得られる。適当な生物学的試料としては、非限定的に、血液、血清、血漿、尿、母乳および脳脊髄液が挙げられる。好ましくは、血漿がＨＣＶ  ＲＮＡの入手源として使われる。
【００３１】  生物学的試料は、試料中に含まれるＲＮＡ、特にＨＣＶ  ＲＮＡへの逆転写試薬の接近を与えるようなやり方で処理する。生物学的試料「から誘導された」ＲＮＡは、最初は試料中に存在していたもので且つ試料を処理することによってそのＲＮＡへの接近が増大された任意のＲＮＡである。好ましくは、当該技術分野で周知の方法、例えばチオシアン酸グアニジウムを使用する方法、またはGentra Systems, Inc. (Minneapolis MN) からのPureScriptのような市販の試薬と方法を使用する方法を用いて、試料からＲＮＡを抽出する。ＲＮアーゼからのＲＮＡ、別のタンパク質および／または逆転写反応を妨害する可能性のある他の成分からの分離をもたらすいずれの抽出方法を使ってもよい。
【００３２】  次いで、試料を(a) ランダムプライマー、例えばPharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey から得られるランダムヘキサマー、および／または(b) ＨＣＶ  ＲＮＡゲノム配列の５′もしくは３′ＮＣＲ領域由来のプライマーを使った逆転写反応にかける。逆転写は、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, 第Ｉ, IIおよびIII 巻, 1997 (F.M. Ausubel編) ; 米国特許第5,322,770 号明細書 ; Young他, J. Clin. Microbiol. 31(4):882 (1993) ; Myers他, Biochemistry 30(3):7661 (1991)中に記載されたような、常用手段を使って実施される。逆転写プライマーとしての使用に適した他のプライマーおよび本発明において使用することができる逆転写方法としては、同時係属米国特許出願第 09/ 号, 代理人書類番号2094/OE287に記載されたものが挙げられる。
【００３３】  逆転写反応の後、生成物を増幅させる。任意の増幅方法を使ってもよく、増幅方法の非限定例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、鎖置換反応、核酸一塩基増幅および転写媒介増幅が挙げられる。好ましくはＰＣＲが使われる。典型的には、ＰＣＲに必要な全ての成分を含む反応混合物が直接逆転写反応混合物に添加される。次いで、使用するプライマー対により特定される条件を使って増幅反応を実施する。
【００３４】  本発明者らは、特定のＨＣＶ特異的増幅プライマー対が患者試料中のＨＣＶ  ＲＮＡを検出する際に特に有利であることを発見した。ＨＣＶゲノムの５′ＮＣＲから誘導された有用なプライマーの非限定例として、下の第１表に列挙されたプライマーが挙げられる。
【００３５】
【表１】
0005450914.tif 000002
【００３６】  センスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドの任意組合せをそれぞれ正プライマーと逆プライマーとして使用することができる。増幅に使われる好ましい５′ＮＣＲプライマー対としては
(a) 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28) 〔配列番号１〕と
5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R26)〔配列番号４〕；および
(b) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25) 〔配列番号２〕と
5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) 〔配列番号７〕
が挙げられる。
【００３７】  好ましい態様では、増幅プライマー対が 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' 〔配列番号１〕と 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' 〔配列番号４〕から成る。別の好ましい態様では、増幅プライマー対が 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'〔配列番号２〕と 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'〔配列番号７〕から成る。
【００３８】  ＨＣＶゲノムの３′ＮＣＲから誘導された有用なプライマーの非限定例としては、 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27) 〔配列番号８〕から成る正プライマーと 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配列番号９〕から成る逆プライマーが挙げられる。
【００３９】  本発明は多重増幅、即ち同一反応混合物中での複数の異なるプライマー対セットを使った異なる配列の同時増幅も包含する。多重増幅反応において同時に使うことができる好ましいプライマー対のセットは
(a) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' 〔配列番号２〕と
5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' 〔配列番号７〕（５′対）
および
(b) 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' 〔配列番号８〕と
5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' 〔配列番号９〕（３′対）
である。
【００４０】  増幅後、増幅生成物は、当該技術分野で周知の任意方法、例えば非限定的に、アガロースまたはアクリルアミドゲル中でのゲル電気泳動法；非同位体比色検出法、例えばSureCell系（例えば下記の実施例１を参照のこと）；ＥＣｉ検出法；蛍光検出法；および化学発光法を使って検出することができる。そのような検出法に有用な試薬は、例えばMolecular Probes, Eugene, Oregonおよび Ortho Clinical Diagnostics, Inc., Rochester, NYから入手可能である。
【００４１】  ＨＣＶ特異的増幅生成物の検出は、試料中にＨＣＶ  ＲＮＡが存在することを示す。ゲル電気泳動を用いた場合、ＨＣＶ特異的増幅生成物は、反応に用いた増幅プライマーに相当する配列を有するＨＣＶ  ＲＮＡ中の位置により推定されるようなそれらのサイズにより確認される。比色検出用に有用なＨＣＶ特異的５′ＮＣＲ捕捉プローブとしては、非限定的に、5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3' 〔配列番号11〕、5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' 〔配列番号12〕および5'-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' 〔配列番号13〕が挙げられる。ＨＣＶ特異的３′ＮＣＲ捕捉プローブとしては、非限定的に、5'-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3' 〔配列番号14〕および5'-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3' 〔配列番号15〕が挙げられる。
【００４２】  １または複数の正および負５′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対を含有する、ＨＣＶ  ＲＮＡから誘導されたＨＣＶ  ＤＮＡを増幅するためのキットを調製することができ、ここで前記正プライマーは
5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28) 〔配列番号１〕，
5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25) 〔配列番号２〕または
5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26)〔配列番号３〕
であることができ；そして前記逆プライマーは
5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R26)〔配列番号４〕，
5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3' (C282R27) 〔配列番号５〕，
5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3' (C287R27) 〔配列番号６〕または
5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) 〔配列番号７〕
であることができる。
【００４３】  １または複数の正および負３′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対を含有する、ＨＣＶ  ＲＮＡから誘導されたＨＣＶ  ＤＮＡを増幅するためのキットも調製することができ、ここで前記正プライマーは
5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27)〔配列番号８〕であることができ；そして逆プライマーは
5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27) 〔配列番号９〕であることができる。
【００４４】  ＨＣＶ  ＲＮＡから誘導されたＨＣＶ  ＤＮＡの増幅について上述した５′ＮＣＲおよび３′ＮＣＲプライマーを含んで成る、ＨＣＶ  ＤＮＡの存在を検出するためのキットも本発明の範囲内に含まれる。
【００４５】  それらのキットは逆転写、増幅および生成物検出のための試薬および説明書を更に含んでもよい。例えば、該キットは逆転写酵素、デオキシヌクレオチド、ＤＮＡ増幅反応に適した耐熱性ポリメラーゼ、並びに核酸の標識および検出用の試薬を含んで成ることができる。
【００４６】  本発明は、ＨＣＶ感染の診断において；抗ＨＣＶ療法処置の効能の試験において；およびＨＣＶ感染試料についての輸血用血液製剤のスクリーニングにおいて利用することができる。
【実施例】
【００４７】  下記の実施例は非限定的に本発明を例証する。
実施例１：生物学的試料中のＨＣＶの検出：５’ＨＣＶ増幅プライマーと Roche Amplicor ＨＣＶアッセイの比較
下記の実験は、本発明のＨＣＶアッセイとRoche Amplicor系を比較するために行った。【００４８】Ａ．方法
１．試料調製：
血漿試料から、 PureScript ＲＮＡ単離試薬（Gentra Systems, Minneapolis MN）を使ってＲＮＡを調製した。体液についての製造業者のプロトコルへの変更として、20 gではなく40 gのグリコーゲンをウイルスＲＮＡの沈澱に役立つ担体として使用することを含んだ。更に、大部分において、ＲＮＡのイソプロピルアルコール沈澱とエタノールによるＲＮＡペレットの洗浄の後に、製造業者により提供されるＲＮＡハイブリダイゼーション溶液ではなく、ＲＴ緩衝液混合物中にＲＮＡペレットを再懸濁した。【００４９】  ２．逆転写：
ジエチルピロカルボネート（DEPC）で処理した水の中に50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0.4 mM 各dNTP (Pharmacia Biotech), 4 M のランダムヘキサマー (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)または特異的逆転写プライマーおよび20単位のRNasin（Promega, Madison, Wisoconsin）を含有する溶液50  Ｌ中の100 Ｕの組換えモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素（ＲＴ）（Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland ）を添加することにより、ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成を触媒した。42℃で30分間のインキュベーション後、ＲＴ反応液を100 ℃に５分間維持してＲＴ活性を破壊した。各反応液を１分間冷却した後、16000 ×ｇで４秒間超遠心した。【００５０】  ３．ＰＣＲ増幅：
ＰＣＲは、25 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl2, 0.725 mM EDTA, 54 mM KCl, 3.72 mM NaCl, 40 M DTT, 108  g/mlのゼラチン（IV型）, 9.5 ％グリセロール, 0.02％Tween 20, 0.02％NP40, 子ウシ胸腺ＤＮＡ(2  g), 1.2 mMの各dNTP, 0.4 M の各プライマー, 10コピーの線状化した内部陽性対照（ＩＰＣ）プラスミドＤＮＡおよび16  ＵのTaq ポリメラーゼを含む溶液 100  Ｌ中でPE9600サーモサイクラー（Perkin-Elmer）中で行った。Taq に対するモノクローナル抗体 TP1-12 とTP4-9 （それらの調製は米国特許第5,338,671 号明細書に開示されている）をそれぞれ50：１と５：１のモル比で反応液に添加して、Taq ポリメラーゼに対する抗体のモル比55：１を提供した。96℃で３分間の最初の変性の後、96℃で５秒と68℃で40秒から成る40サイクルの増幅を行った。サイクルの終了後、103 ℃で５分間の最終加熱段階を行ってTaq ポリメラーゼを失活させた。使用したプライマーを下記の第２表に示す。【００５１】
【表２】
0005450914.tif 000003
【００５２】  推定される生成物サイズを下記の第３表に示す。
【表３】
0005450914.tif 000004
【００５３】  ４．ＰＣＲ生成物の検出：
増幅中に５′−ビオチン標識プライマー（センス鎖）を使用してＰＣＲ生成物をビオチン化した。フロースルー膜の表面上に付着させたラテックス粒子に共有結合せしめたオリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイセーションにより、生成物を捕捉した（SureCell試験）。プローブは 5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3'（C96-27-PRBと称する）〔配列番号11〕；5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' （C252-27-PRB と称する）〔配列番号12〕および5'-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' （C252-25-PRB と称する）〔配列番号13〕であった。生じたプローブ／生成物複合体を、色素前駆体から色素（青色）への酸化的変換を触媒するストレプトアビジン（ＳＡ）−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合体と反応させた。色の強度を色標準に比較することにより、青色の強度を目視により採点した（０〜10）。目に見える色の得点＞３は、全て陽性結果であると見なした。【００５４】  ５．Roche Amplicorアッセイ：
Roche Amplicorアッセイ（Roche Diagnostics, Kaiseraugst, Swithland ）は、製造業者の教示に従って実施した。【００５５】Ｂ．結果
ブラジル人とエジプト人患者からの42の試料のパネルを上述した通りにＨＣＶについて試験した。それらの試料の一部はChiron B-DNAアッセイを使っても試験した。ブラジル人試料はアメリカ人試料に比較してより大きい比率がＨＣＶ遺伝子型３を含むと予想され、そしてエジプト人試料はアメリカでは稀にしか見られない遺伝子型であるＨＣＶ遺伝子型４から大部分成ると予想された。
全ての反応は二重反復試験において行った。プラスの表示は二重反復試験の両方とも陽性であったことを示す。結果を下の第４表に示す。【００５６】
【表４】
0005450914.tif 000005
【００５７】
【表５】
0005450914.tif 000006
【００５８】
【表６】
0005450914.tif 000007
【００５９】  本発明の５′ＮＣＲプライマーを使って得られた結果とRoche アッセイ系を使って得られた結果を下記の第５表と第６表に要約する。【００６０】
【表７】
0005450914.tif 000008
【００６１】
【表８】
0005450914.tif 000009
【００６２】  本発明のプライマーはいずれもRoche Amplicorアッセイに比べて優れた感度を示した。プライマー対69F/133Rの使用は最大感度を提供した。Roche Amplicorアッセイを使った時に陰性であった５つの試料が、本発明のC131/C294 プライマー対を使った場合に陽性であり、またRoche Amplicorアッセイを使った時に陰性であった11の試料が本発明の69F/133Rプライマー対を使った場合に陽性であった。更に、Chiron bDNA アッセイにより検出可能であるウイルス負荷量を有する試料の全てが本発明のプライマーを使って検出されたのに対し、それらのうちの３つの試料がRoche Amplicorアッセイを使うと検出されなかった。陰性対照は本発明のアッセイにおいて１つも陽性として記録されなかった。【００６３】  第二系列の実験において、以前にＨＣＶ抗体について陽性であると決定されたブラジル人からの150 の血漿試料を、Roche Amplicorアッセイと本発明のプライマーを使って試験した。下記の第７表と第８表は、SureCellカラースコアに基づいた結果を示す。各反応ごとに、生成物をゲル上で調べて結果を確かめた。陰性の血漿試料と水（ＲＮＡ不含有）の両方から成る陰性対照（臨床試料の所々に置いた）を各プライマーセットに含めた。全ての陰性対照結果が陰性であった。【００６４】
【表９】
0005450914.tif 000010
【００６５】
【表１０】
0005450914.tif 000011
【００６６】  本発明の５′ＮＣＲプライマー対は２つともRoche アッセイ系に比較して優れた感度を示した。最大感度は69F/133Rプライマー対を使った場合に達成され、このプライマー対はC131/C294 プライマー対に比較して更に３つの追加の試料中のＨＣＶ  ＲＮＡの存在を検出した。【００６７】実施例２：５′ＮＣＲ  ＨＣＶアッセイ感度の分析
次の実験は、本発明の５′ＮＣＲプライマー対を使ったＨＣＶアッセイの感度を調べるために行った。
１．３つの患者試料をＨＣＶ  ＲＮＡの理論的コピー数に基づいて希釈し、そしてRoche Amplicor系および本発明のプライマー対を使ってＨＣＶ  ＲＮＡについてアッセイした。結果を下記の第９表に示す。【００６８】
【表１１】
0005450914.tif 000012
【００６９】  ３セットの希釈患者試料の全てにおいて、本発明の５′ＮＣＲプライマー対を使ったアッセイがRoche アッセイよりも大きい感度を示した。【００７０】  ２．ＨＣＶ陽性であることが知られている血漿をＨＣＶ陰性血漿で希釈し、そして上述した通りに試験した。内部陽性対照（ＩＰＣ）プラスミドを反応あたり10コピー数で反応混合物中に含めた。結果（５つの実験の編集）を下記の第10表に示す。【００７１】
【表１２】
0005450914.tif 000013
【００７２】  C131F/C294R ５′ＮＣＲプライマー対は優れた感度を示し、そしてポイゾン分布分析により推定するとＰＣＲ反応あたりウイルス粒子１個ほどの少数を検出することができた。【００７３】  ３．低いＨＣＶウイルス価（範囲＝316 〜8080コピー数／ml, これはＰＣＲ反応あたり16〜404 コピー数に相当する）を有する患者からの18の患者試料。試験した18個の試料のうちの17個が本発明のアッセイにおいて陽性であった。【００７４】実施例３：生物学的試料中のＨＣＶの検出：３′ＮＣＲ  ＨＣＶ増幅プライマーと Roche Amplicor ＨＣＶアッセイとの比較
ＨＣＶ抗体について陽性であると以前に決定されたブラジル人からの150 個の血漿試料を、Roche Amplicorアッセイと本発明の３′ＮＣＲプライマーを使って試験した。逆転写と増幅は上記実施例１に記載の通りに行った。逆転写は配列 5'-GTATCAGCACTC-3' 〔配列番号16〕を有するプライマーを使って行い、そして増幅はX1F27/57R27 プライマー対を使って行った。各反応にはプラスミドＤＮＡの内部陽性対照（ＩＰＣ）を含めた。増幅生成物の検出は捕捉プローブとして3X30PR25を使ってSureCell系を用いて行った。各反応ごとに、生成物をゲル上で分析して結果を確かめた。陰性の血漿試料と水（ＲＮＡ不含有）の両方から成る陰性対照（臨床試料の所々に置いた）を各プライマーセットに含めた。ＲＴ−ＰＣＲにおいて全てが陰性であった。本発明のプライマーを使って得られた結果とRoche アッセイを使って得られた結果との比較を下の第11表に要約する。【００７５】
【表１３】
0005450914.tif 000014
【００７６】実施例４：生物学的試料中のＨＣＶの検出：本発明とRochester General Hospital（ＲＧＨ）５′ＮＣＲ嵌め込みＰＣＲアッセイとの比較
次の実験は、本発明の３′ＮＣＲ  ＨＣＶプライマーとＲＧＨ嵌め込みＰＣＲ検出法とを比較するために行った。
上記実施例１に記識した方法を用いて、57R27 プライマーを使って83個の血漿試料を逆転写し、そして3X1F27/57R27プライマー対を使って逆転写生成物を増幅させた。各反応ごとに、生成物をゲル上で分析して結果を確かめた。陰性血漿試料と水（ＲＮＡ不含有）の両方から成る陰性対照（臨床試料の所々に置いた）を実験に含めたが、このアッセイにおいて陰性対照は全て陰性であった。【００７７】  本発明のプライマーを使って得られた結果とRoche アッセイ系を使って得られた結果との比較を下の第12表に要約する。【００７８】
【表１４】
0005450914.tif 000015
【００７９】  これらの結果は、本発明の検出系がＲＧＨ嵌め込みＰＣＲ系に比較して感受性であり且つ特異的であることを証明する。本発明のアッセイは、26個の陰性試料のうちの25個に関してＲＧＨアッセイの結果と一致した。嵌め込みＰＣＲでは、新しい試薬を添加するために反応中にチューブを開けなければならないのに対し、本発明の利点は、嵌め込みＰＣＲを実施する時よりも、後への持ち越し(carryover) の機会が少ない点である。偽陽性結果を示す残りの１つの試料は、嵌め込みＰＣＲプロトコルにより引き起こされる持ち越しの実例であるのかもしれない。【００８０】実施例５：３′ＮＣＲ  ＨＣＶアッセイのコピー感度
次の実験は、本発明の３′ＮＣＲ  ＨＣＶアッセイの検出感度を調べるために行った。
Roche Monitor とChiron b-DNAアッセイを使ってＨＣＶについて既に試験されている血漿試料をBoston Biomedica, Inc.より入手した。ＲＮＡを調製し、1mlあたり20〜1000コピーのＨＣＶ  ＲＮＡを含むように希釈し、そして上記実施例１に記載した方法を使って逆転写と増幅反応にかけた。逆転写は66RT（12マー）プライマー（第13表参照）または57R27 （27マー）プライマー（第14表参照）を使って行い、そしてＰＣＲは1F27正プライマーと57R27 逆プライマーをそれぞれ使って行った。内部陽性対照（ＩＰＣ）プライマーもこのアッセイに含め、これは各試料について陽性結果を与えた。下記に示す結果は、捕捉プローブとして3X-30PRB25を使ったSureCellとゲルバンド上で陽性であった試料の％を示す。【００８１】
【表１５】
0005450914.tif 000016
【００８２】
【表１６】
0005450914.tif 000017
【００８３】  ３′ＮＣＲ  ＨＣＶアッセイは、アッセイ時間の100 ％で1000ウイルスコピー数／mlを検出し、そしてアッセイ時間の88〜100 ％で200 コピー数／mlを検出した。100 コピー数／mlでは、試料のほぼ50％においてウイルスが検出された（12マーのＲＴプライマーを使った時）。ポアソン分布は、反応あたり１コピーで（20個のウイルス粒子／ml）、陽性結果の頻度が約60％であるだろうと推測する。このウイルスレベルでの20％検出の結果は、ＨＣＶの３′非コード領域が全てのウイルス粒子に存在するわけではないという可能性か、または短鎖（12マー）の逆転写プライマーを使った場合にこのアッセイで本質的な感度低下があるという可能性のためかもしれない。同じ試料において５′ＮＣＲプライマーを使って逆転写／増幅アッセイを行うことにより、20コピー数／mlにおいてより高い検出レベルが得られ、後者方の解釈が裏付けられた。これらの結果は、より長鎖（27マー）のプライマーを逆転写に用いることにより、３′ＮＣアッセイの感度を増加することができることを示す（12マーおよび27マーを使った10コピー数／反応の検出を、それぞれ第13表と第14表に比較する）。【００８４】実施例６：異なるＨＣＶ遺伝子型を有する患者試料の分析
次の実験は、異なる遺伝子型を有するＨＣＶの検出を評価するために行った。
１．遺伝子型包括性：
様々なＨＣＶ遺伝子型を表すチンパンジーの血漿を米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から入手した。血漿を調製しそして上記実施例１に記載した通りに処理した。５′ＮＣＲプライマーはC131F とC294R （それぞれ正プライマーと逆プライマー）であり、３′ＮＣＲプライマーは1F27と57R27 （それぞれ正プライマーと逆プライマー）であった。臭化エチジウム染色した４％アガロースゲル上でのＰＣＲ生成物の分析により結果を得た。陽性結果は複製試料に基づいて得られた。下記の第15表（５′ＮＣＲプライマーを使った場合）および第16表（３′ＮＣＲプライマーを使った場合）に結果を示す。【００８５】
【表１７】
0005450914.tif 000018
【００８６】
【表１８】
0005450914.tif 000019
【００８７】  ２．患者試料：
既知遺伝子型を有する27の未希釈患者試料を、上述した通りにC131F およびC294R プライマーを使ってアッセイした。SureCell検出法を使って結果を確認した（ＨＣＶ生成物およびＩＰＣ生成物の捕捉プローブとしてそれぞれ C252-PRB25 とIPC-1Pを使って）。パネルは、ＨＣＶ遺伝子型１〜４と６に感染した代表的な血漿試料を含んだ。患者試料は樣々な地理的領域（スコットランド、チュニジア、サウジアラビアおよび香港）からものであった。各試料は二重反復試験した（例えば６つの遺伝子型１試料を試験した）。【００８８】  本発明のプライマー系は、このパネルに含まれる全ての遺伝子型試料を増幅することができた。C131F25/C294R25 プライマーは、今までに可能な全てのＨＣＶ遺伝子型（遺伝子型１〜６）を同定した。【００８９】  ３．低コピー数試料：
異なる遺伝子型（１〜６，アメリカ合衆国、スコットランド、チュニジア、サウジアラビアおよび香港から得られた）のＨＣＶを含む試料を、Roche Monitor Assay を使って定量し、ＰＣＲ反応あたり50ウイルスコピー数（1000コピー数／ml）に希釈し、そして上述した通りにC131F およびC294R プライマーを使ってアッセイした。
全ての試料が本発明のプライマーを使って検出された。【００９０】実施例７：５′および３′増幅プライマー対の両方を使った多重アッセイ
次の実験は、単一の反応混合物における５′ＮＣＲと３′ＮＣＲの同時増幅の効果を分析するために行った。【００９１】  Ａ．Roche Monitor Assay との比較
反応あたり45〜17,000ウイルスコピー数当量を含む73個の患者試料を試験した。試料は、インターフェロンで治療していた、ＨＣＶに感染していることが知られている患者からのものであった。結果として、数人の患者はほとんどまたは全く循環しているウイルスを持たなかった。５′ＮＣＲプライマー対 131F/294Rと３′ＮＣＲプライマー対 1F27/57R27 並びにＩＰＣプライマーを使って多重方式でこのパネルを試験した。陰性の臨床試料を試験試料の所々に置いた。全ての陰性試料が陰性ＲＴ−ＰＣＲを与えた。その結果を、定量的Roche Monitor Assay (Roche Diagnostics, Kaiseraugst, Switzerland）を使って得られた結果と比較した。その結果を下記の第17表に要約する。【００９２】
【表１９】
0005450914.tif 000020
【００９３】  本発明の５′および３′プライマー対を使った場合、５′ＮＣＲおよび３′ＮＣＲアッセイにおいて、Roche Monitor 結果によると未検出であった追加の試料を検出することができた。このことは本発明のプライマーを使用するアッセイは、低ウイルス負荷量を有する患者をアッセイする場合は Rocheアッセイよりも高い感度を示す。Roche アッセイによって未検出であったこの陽性試料を、別の５′ＮＣＲプライマー 69F/133R を使って確かめた。【００９４】  Ｂ．Roche Amplicor Assayとの比較
組換え免疫ブロットアッセイ（ＲＩＢＡ）を使って中間物として試験した16個の患者試料を、５′プライマー対 131F/294Rと３′プライマー対 1F27/57R27 を使って多重方式で試験した。その結果を定量的Roche Amplicorアッセイを使ったものと比較した。結果を下記の第18表に要約する。【００９５】
【表２０】
0005450914.tif 000021
【００９６】  本発明のアッセイとRoche アッセイとは100 ％の一致が見られた。全てのＰＣＲ反応は、単一のＲＮＡ抽出物から二重反復試験として行った。陰性試料は、別の５′ＮＣＲプライマー対（69F/133R）を使った増幅により確認した。再試験した全ての陰性試料が「真の」陰性試料として確認された。