(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性溶媒、ホスファターゼ活性を有する酵素、オルトバナジン酸塩、マンニトール及びジチオスレイトールを含んで成る液体組成物であって、該マンニトールの濃度が１ｍＭ〜１００ｍＭであり、そしてオルトバナジン酸塩に対するマンニトールのモル比が１以上であることを特徴とする、液体組成物。
【請求項２】
前記オルトバナジン酸塩の濃度が、０．１ｍＭ〜１０ｍＭであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記オルトバナジン酸塩の濃度が、０．５ｍＭ〜５ｍＭであることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、更に、二価又は三価の正電荷金属イオンのためのキレート剤を含んで成ることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
中性ｐＨを伴い、そして０．７ｍＭ〜１．２ｍＭの濃度におけるＣａ2+イオンを含有する緩衝水溶液中に溶解された配列番号１のペプチド中のホスホチロシン残基のリン酸エステル結合を加水分解可能なホスファターゼ活性を有する酵素における、バナジン酸塩（Ｖ）、オリゴマーバナジン酸塩（Ｖ）及びこれらの混合物から成る群から選択されるイオン化合物の阻害効果を増強するための糖アルコールのin vitro における使用であって、
ここで、溶液中の糖アルコールの濃度が１ｍＭ〜１００ｍＭであり、そして
該糖アルコールがマンニトール又はグリセロールから選択されることを特徴とする、使用。
【請求項６】
前記ホスファターゼ活性が１．５％〜４０％の値に低下される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
中性ｐＨを伴い、そして０．７ｍＭ〜１．２ｍＭの濃度におけるＣａ2+イオンを含有する緩衝水溶液中に溶解された配列番号１のペプチド中のホスホチロシン残基のリン酸エステル結合を加水分解可能なホスファターゼ活性を有する酵素における、バナジン酸塩（Ｖ）、オリゴマーバナジン酸塩（Ｖ）及びこれらの混合物から成る群から選択されるイオン化合物の阻害効果を増強するためのin vitro における方法であって、
（ａ）  （ｉ）イオン化合物、及び（ｉｉ）糖アルコールを含んで成る組成物であって、ここでイオン化合物に対する糖アルコールのモル比が１以上である組成物を水性溶媒に溶解する工程、及び
（ｂ）  該ホスファターゼ活性を有する酵素を工程（ａ）の溶液と接触させる工程、
を含んで成り、
ここで、溶液中の糖アルコールの濃度が１ｍＭ〜１００ｍＭであり、そして
該糖アルコールがマンニトール又はグリセロールから選択されることを特徴とする、方法。
【請求項８】
前記溶液中のオルトバナジン酸塩の濃度が、０．１ｍＭ〜１０ｍＭであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記イオン化合物及び糖アルコールが、乾燥物質として、ホスファターゼ活性を有する酵素を含有する水性試料に添加されることを特徴とする、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
包装材料、並びに（ｉ）バナジン酸塩（Ｖ）、オリゴマーバナジン酸塩（Ｖ）及びこれらの混合物から成る群から選択されるイオン化合物及び（ｉｉ）糖アルコールを含んで成る組成物を含んで成るキットであって、ここでイオン化合物に対する糖アルコールのモル比が１以上であり、該糖アルコールの濃度が１ｍＭ〜１００ｍＭであり、そして該糖アルコールがマンニトール又はグリセロールから選択される、キット。
【請求項１１】
前記組成物が、更に、還元剤及び／又は二価又は三価の正電荷金属イオンのためのキレート剤を含んで成ることを特徴とする、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記組成物が、錠剤の形態における乾燥物質として供されることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はホスファターゼの生物化学に関係する。特に、本発明は、異なるホスファターゼ酵素のバナジウム含有阻害剤とともに添加剤として使用することができる化合物を扱う。本発明に従う添加化合物は、阻害効果の増強を供する。結果として、低濃度のバナジウム含有化合物は、ホスファターゼの十分な阻害を達成するために使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
ホスファターゼは、リン酸モノエステルをリン酸イオンと遊離ヒドロキシル基を有する分子に加水分解する酵素である。該作用は、ＡＴＰのような化学エネルギー変換分子を使用することによりリン酸基をこれらの基質に付着させる、ホスホリラーゼ及びキナーゼとは正反対である。
【０００３】
ホスファターゼは２つの主要なカテゴリー：金属酵素（これは活性のためのこれらの活性部位における２又はそれ以上の金属イオンの存在に依存する）、及び非金属酵素、に分類することができる。これらのカテゴリーは更なるサブカテゴリーに分けることができる。該金属酵素は、最も大量のホスファターゼ含んで成り、そしてアルカリホスファターゼ（３つの金属イオン、そのうち触媒的に活性であるものは２つのみである）、セリンスレオニンホスファターゼ、及びイノシトールモノホスファターゼといった酵素を含有する。最も知られている非金属酵素は、プロテインチロシンホスファターゼであり、これはホスホ−チロシン残基を加水分解する。
【０００４】
タンパク質におけるリン酸基の存在又は不存在は、多くの生物化学及び特にシグナル伝達経路において調節的な役割を果たすことが知られている。チロシン残基は、プロテインキナーゼによりリン酸基でタグ化（リン酸化）することができる。そのリン酸化状態において、該チロシン残基はホスホチロシンとして知られる。チロシンリン酸化はシグナル伝達及び酵素活性の制御において重要な工程の１つと考えられる。ホスホチロシンは、特異抗体を介して検出することができる。特定のキナーゼ及びホスファターゼは、一緒に、シグナル伝達経路の酵素、受容体及びほかの成分、転写因子並びにほかの機能性タンパク質の活性を制御する。
【０００５】
従って、生体試料中のリン酸化タンパク質を検出することを目的とする多くの生物化学的方法が存在する。例えば、採取された細胞物質を溶解し、そして該タンパク質画分を１次元（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）又は２次元（例えば、第１次元：等電点フォーカシング、第２次元：ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）分離にかけ、そして個々のバンド又はスポットのリン酸化タンパク質をホスホセリン−又はホスホチロシン−特異抗体により検出する。他のより具体的な検出方法は、特にリン酸化タンパク質と特異的に結合する抗体を使用する。このような抗体は、バイオプシー材料からのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片中のリン酸化標的タンパク質の組織細胞化学的な検出のために頻繁に用いられる。
【０００６】
使用される検出方法に関わらず、リン酸化タンパク質の分析の結果は、実験が開始された時点、すなわち細胞が溶解されるか、あるいは組織が固定され、そして切片化された時点おけるリン酸化の状態を反映することが望まれる。より一般には、一定の時点においてタンパク質リン酸化の状態を保存することが望ましい。保存は、これらの標的タンパク質から加水分解されるリン酸エステルを防ぐことにより達成される。この目的を達成するために、当業界において、ホスファターゼ活性を阻害することができる多くの物質が供されている。阻害剤は、リン酸化タンパク質の検出のためのアッセイを行うときだけでなく、大量のリン酸化タンパク質を精製されるときにも慣習的に適用される。
【０００７】
バナジウム含有ホスファターゼ活性阻害剤のなかで、過バナジン酸塩及びバナジン酸塩が最もよく知られており、かつ最も広く利用される物質である。バナジン酸塩は、リン酸加水分解の転移状態を模倣し、一般的なホスファターゼ阻害剤として考えられるリン酸類似体である。しかしながら、バナジン酸塩は、チロシンホスファターゼ（Huyer, G., et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 843-851)及びアルカリホスファターゼ（例えば、Stankiewicz, P. J., et al., Met. Ions Biol. Syst. 31 (1995) 287-324)を阻害するために特に適当であると考えられている。しかしながら、他のホスファターゼ、例えば、ＡＴＰアーゼ、グルコース−６ホスファターゼ、酸ホスファターゼ又はフルクトース−２，６−ビスホスファターゼの阻害もまた報告されている。
【０００８】
しかしながら、有効量のバナジン酸塩を供するためには、マイクロモル又はミリモル範囲における濃度でなければならないという不利益がある。これに関して、「有効量」は、１×（１回）〜５０×（５０回）である場合、１×濃度においてホスファターゼの活性を２０倍低下させる水溶液中の阻害剤の濃度として理解される。バナジン酸塩に対して、ほかのホスファターゼ活性の阻害剤は、ナノモル濃度において有効であることが知られている。その例はカンタリジンである。
【０００９】
しかしながら、該阻害効果は、安定なバナジン酸塩含有錯体を形成する方法により増強できることが報告されている。例えば、ビスペルオキソ（ビピリジン）オキソバナジン酸カリウム（Ｖ）及びビスペルオキソ（１，１０フェナントロリン）オキソバナジン酸カリウム（Ｖ）はともに、オルトバナジン酸塩よりも強力である。しかしながら、バナジン酸塩の錯体形成は、作用強度の改善のために必須というわけではない。例えば、ヒドロキシルアミン又はジメチルヒドロキシルアミンは、自発的にバナジン酸塩と錯体を形成する。これらの錯体の作用強度は、同程度を維持するか、あるいは一定の範囲に低下する（Cuncic, C., et al., Biochem. Pharmacol. 58 (1999) 1859-1867)。細胞型アッセイにおいて、これらの２つの化合物は、細胞ルーメン中のバナジン酸塩の取り込みを増大することが発見された（Nxumalo, F., et al., Biol. Inorg. Chem. 3 (1998) 534-542; Cuncic, C., et al., Biochem. Pharmacol. 58 (1999) 1859-1867)。
【００１０】
更に、ＥＤＴＡのような一定の錯体形成試薬の存在において、バナジン酸塩のホスファターゼ阻害効果は、約１，０００倍減少することが知られている（Huyer, G., et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 843-851)。ＥＤＴＡは安定化剤、及び金属酵素、例えば、ホスファターゼ及びプロテアーゼの阻害剤として生物化学において頻繁に使用されるために、これはとくに不利益となる。細胞溶解液の調製における使用のためのほかの重要な安定化剤はジチオスレイトール（ＤＴＴ）である。本発明者は、ＤＴＴがまた、ホスファターゼにおいてバナジン酸塩の阻害効果を有意な程度に低下することを発見した。
【００１１】
当業界における不利益の観点において、本発明の目的は、ホスファターゼ活性を有する酵素においてバナジン酸塩含有化合物の阻害効果を増強するほかの化合物を提供することである。本発明の他の目的は、バナジン酸塩含有化合物におけるＥＤＴＡ及びＤＴＴの負の効果に反作用する化合物を提供することである。
【００１２】
本発明者は、ポリオールの存在下において、ホスファターゼ及び特にホスホチロシン特異性ホスファターゼにおけるバナジン酸塩の阻害効果が増強される、という驚くべき発見をした。この効果は、極めて単純なポリオール、例えば、グリセロールだけでなく、糖アルコール、例えば、マンニトールでも観察された。さらにより驚くべきことには、バナジン酸塩におけるＥＤＴＡ及びＤＴＴの負の効果が有意に減少するか、あるいは完全に消滅することが発見された。
【発明の開示】
【００１３】
本発明の第１の態様は、ホスファターゼ活性を有する酵素を阻害するための、（ｉ）バナジル（ＩＩ）、バナジン酸塩（ＩＶ）、バナジン酸塩（Ｖ）、オリゴマーバナジン酸塩（Ｖ）、及びこれらの混合物から成る群から選択されるイオン化合物、並びに（ｉｉ）ポリオール、を含んで成る組成物の使用である。本発明の第２の態様は、（ｉ）バナジル（ＩＩ）、バナジン酸塩（ＩＶ）、バナジン酸塩（Ｖ）、オリゴマーバナジン酸塩（Ｖ）、及びこれらの混合物から成る群から選択されるイオン化合物、並びに（ｉｉ）ポリオール、を含んで成る組成物であって、該ポリオールとバナジン酸塩含有化合物のモル比が等しいか、あるいは１：１以上であることを特徴とする組成物である。本発明の第３の態様は、ホスファターゼ活性を有する酵素を阻害するための方法であって、（ａ）（ｉ）バナジル（ＩＩ）、バナジン酸塩（ＩＶ）、バナジン酸塩（Ｖ）、オリゴマーバナジン酸塩（Ｖ）、及びこれらの混合物から成る群から選択されるイオン化合物、並びに（ｉｉ）ポリオールを含んで成る組成物を水性溶媒中に溶解する工程、そして（ｂ）該ホスファターゼ活性を有する酵素を工程（ａ）の溶液と接触させる工程、を含んで成る方法である。本発明の第４の態様は、包装材料、及び（ｉ）バナジル（ＩＩ）、バナジン酸塩（ＩＶ）、バナジン酸塩（Ｖ）、オリゴマーバナジン酸塩（Ｖ）及びこれらの混合物から成る群から選択されるイオン化合物、並びに（ｉｉ）ポリオール、を含んで成る組成物を含んで成るキットである。
【００１４】
発明の詳細な説明
一定の用語は、特定の意味を伴い使用され、あるいは本発明の説明において最初に定義される。本発明を理解する目的のために、本発明を説明するために使用される用語は、これらの定義が以下に記載される定義と矛盾するか、あるいは部分的に矛盾する場合以外、当業界に許容されるこれらの定義により定義される。定義に矛盾がある場合には、用語の意味は、以下に記載される定義により第１に定義される。
【００１５】
本願の明細書及び特許請求の範囲において使用される「含んで成る」の用語は、「制限することなく含む」ことを意味する。化合物、例えば、阻害剤又は添加剤を表す用語との組み合わせにおける「ａ」の記載は、「１又は複数」を示すように使用される。「ホスファターゼ阻害剤」は、ホスファターゼ酵素活性によりリン酸エステルが加水分解し、これにより標的分子からリン酸イオンの放出を阻害するために有効な物質である。「水性」溶液は、水性溶媒が、少なくとも８０［ｖ／ｖ］％、より好ましくは９５［ｖ／ｖ］％、よりさらに好ましくは９９［ｖ／ｖ］％、なおよりさらに好ましくは１００［ｖ／ｖ］％の水を含んで成る水性溶媒である溶液と理解される。当業者は、該溶液が更に、１又は複数の更なる化合物、例えば、塩、緩衝液、阻害剤、添加剤及び生物学的分子を含んで成り、そして該１又は複数の化合物が液体溶媒に溶解することを認識する。
【００１６】
本発明の組成物は、バナジル（ＩＩ）、バナジン酸塩（ＩＶ）、バナジン酸塩（Ｖ）、オリゴマーバナジン酸塩（Ｖ）、及びこれらの混合物から成る群から選択されるイオン化合物を含んで成る。極めて好ましくは、該イオンバナジウム含有化合物は、オルトバナジン酸塩（Ｖ）及びそのオリゴマーである。好ましいオリゴマーは、ジ−、トリ、及びテトラバナジン酸イオンから成る群から選択される。本発明の組成物中の他の極めて好ましいイオン化合物は、ペルオキソバナジン酸イオンである。しかしながら最も好ましくはオルトバナジン酸塩（ＶＯ43-）である。
【００１７】
本発明の組成物中の「ポリオール」は、２又はそれ以上のヒドロキシル基が炭素原子と共有結合している水溶性有機化合物である。本発明のポリオールの２つのヒドロキシル基は２つの隣接炭素原子と結合していることが好ましい。いいかえると、好ましくいポリオールは２つの近接ヒドロキシル基を含んで成る。しかしながら、２以上の近接ヒドロキシル基を有するポリオールが好ましい。極めて周知でありかつ極めて好ましい近接ヒドロキシル基を有するポリオールは、糖アルコールである。「糖アルコール」は、炭水化物の水素付加形態であり、このカルボニル基（アルデヒド又はケトン）は１級又は２級ヒドロキシル基に還元されている。炭水化物の非水素付加形態もまた「還元」糖として好ましい。
【００１８】
本発明に従う組成物は、好ましくは４〜１００個の炭素原子を有する糖アルコールを含んで成る。この観点において、非還元性のモノ−、ジ−、トリ−及びテトラサッカライドが極めて好ましい。
【００１９】
極めて好ましい糖アルコールは、非還元性モノサッカライドである。このような糖アルコールは、Ｃ４糖アルコールであってよく、そして好ましくはトレイトール及びエリスリトールから成る群から選択される。また極めて好ましくは、該糖アルコールは、Ｃ５糖アルコールであり、そして好ましくはリビトール、アラビトール、キシリトール及びリキシトールから成る群から選択される。また極めて好ましくは、該糖アルコールは、Ｃ５デオキシ糖アルコールであり、好ましくはデオキシリビトール及びデオキシアラビトールから成る群から選択される。また極めて好ましくは、該糖アルコールは、Ｃ６糖アルコールであり、そして好ましくはアリトール、アルトリトール、マンニトール、グルシトール、グリトール、イジトール、ガラクチトール、及びタリトールから成る群から選択される。
【００２０】
本発明に従い、デオキシ糖アルコールは、糖アルコールの用語により包含されるが、ただし、該デオキシ糖は、４又はそれ以上の近接ヒドロキシル基の対を供する必要がある。極めて好ましい糖アルコールは、Ｃ６デオキシ糖アルコールであり、好ましくはデオキシグルシトール、及びデオキシマンニトールから成る群から選択される。また極めて好ましくは、該糖アルコールは、Ｃ２位においてほかの置換基を有する糖アルコールであり、好ましい例は、Ｎ−アセチルグルシトールアミン−２である。
【００２１】
ジサッカライド及びモノサッカライドは共に、糖アルコールを形成することができる；しかしながら、ジサッカライドに由来する糖アルコール（例えば、マルチトール及びラクチトール）は、たった１つのアルデヒド基のグリコシド結合が還元に利用できるために、完全には水素付加されない。同じことは、トリサッカライド及びより高級のサッカライドにも適用できる。従って、非還元性ジ−若しくはトリサッカライド、又は最大１００個の炭素原子を有する非還元性高級オリゴサッカライドが、本発明の実施において極めて優れた利点を伴い使用することができる。スクロースは極めて好ましい糖アルコールである。スクロースについて注目すべきことは、大抵のポリサッカライドと異なり、グリコシド結合がグルコース及びフルコースの両方の還元末端間で形成され、そして一方の還元末端と他方の非還元末端間では形成されないことである。この効果は、他のサッカライドユニットに対する更なる結合を阻害する。これは遊離アノマー炭素原子を含有しないことから、非還元糖である。
【００２２】
本発明に従い、好ましいポリオールとイオンバナジウム含有化合物のモル比は１：１以上である。極めて好ましくは、該モル比は、１００：１〜１：１である。さらにより好ましくは、該モル比は、７０：１〜５：１である。さらにより好ましくは、該モル比は、５０：１〜１０：１である。
【００２３】
バナジウム含有阻害剤の不存在下においてホスファターゼ活性（１００％）を対照として、本発明に従うバナジル（ＩＩ）、バナジン酸塩（ＩＶ）、バナジン酸塩（Ｖ）、オリゴマーバナジン酸塩（Ｖ）から成る群から選択されるイオン化合物とポリオール化合物の組み合わせを該試料中に添加すると、実質的に該ホスファターゼ活性を低下することができる。該活性は、好ましくは１．５％〜４０％の値、より好ましくは１．５％〜３０％の値、更により好ましくは１．５％〜２０％の値、更により好ましくは１．５％〜１０％の値に低下する。
【００２４】
一方で、ポリオールは、ホスファターゼ活性において、イオンバナジウム含有化合物の阻害効果を増強した。他方で、該ポリオールは、錯体形成剤の負の効果を減少した。これは、ホスファターゼ活性が二価又は三価の正電荷金属イオンのためのキレート剤の存在により不利な影響を受けないことを意味する。二価イオンの錯体形成は、従って、例えば、副作用を有することなく、所望されない、いくつかのプロテアーゼの活性を予防することができる。この理由により、本発明の組成物は更に、二価又は三価の正電荷金属イオンのためのキレート剤を含んで成る。好ましいキレート剤は、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、ＥＧＴＡ、及び１，１０−フェナントロリンから成る群から選択される。本発明に従う組成物中のキレート剤の好ましい濃度は、０．１ｍＭ〜５０ｍＭ、より好ましくは０．２ｍＭ〜１０ｍＭ、そして最も好ましくは約１ｍＭである。
【００２５】
更に、該組成物中のポリオールは、イオンバナジウム含有化合物において還元剤の負の効果を低下する。特にＤＴＴはオルトバナジン酸塩によるホスファターゼ活性の阻害を低下する。しかしながら、ポリオールの存在下においてこの低下は逆転する。好ましい還元剤は、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、β−メルカプトエタノール、グルタチオン、及びチオレドキシンから成る群から選択される。本発明に従う組成物中の還元剤の好ましい濃度は、０．１ｍＭ〜３０ｍＭ、より好ましくは０．２ｍＭ〜１０ｍＭ、そして最も好ましくは約１ｍＭである。
【００２６】
本発明の他の態様において、該組成物は、都合の良い形態において消費者に提供される。その例は、一定量の組成物を含有するパッケージ製品である。該包装材料は、好ましくは水蒸気の水との接触を防ぐために選択される。更に１又は複数のパッケージ製品を、乾燥材料、例えば、シリカゲル又は他の適当な物質の存在下で保管することができる。該組成物は、自由流動顆粒の形態において存在することができる。さらにより好ましくは、該組成物は、追加的に、錠剤の処方を促進する更なる物質を含有することができる。
【００２７】
更に、本発明の組成物は、バナジウム含有化合物以外の化合物である１又は複数の追加的なホスファターゼ阻害剤を含有することができる。１又は複数の追加的なホスファターゼ阻害剤は、好ましくはイオン阻害剤、例えば、ＮａＦである。また好ましくは、該阻害剤は、カントリジン、ナフチルホスフェート、及びミクロシスチンから成る群から選択される低分子量化合物である。また好ましくは、該組成物は、カルシニューリン自己抑制ペプチド、及びプロテインホスファターゼ阻害因子２から成る群から選択されるペプチド化合物である。
【００２８】
バナジン酸塩含有化合物に追加したポリオールの存在の驚くべき効果のおかげで、本発明の化合物は、ホスファターゼ活性を有する酵素の阻害のために適当である。該組成物は、酸ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ホスホチロシンホスファターゼ、ＡＴＰアーゼ、ホスホセリン／スレオニンホスファターゼ、及びデュアルホスファターゼから成る群から選択されるホスファターゼを阻害するために特に適当である。最も好ましくは、該組成物は、プロテインチロシンホスファターゼ（すなわち、ホスホチロシン残基のリン酸エステルを加水分解すること、ここでホスホチロシン残基はリン酸化ポリペプチドの一部である）を阻害するために使用される。リン酸化チロシン残基を含有することができ、かつホスホチロシン特異性プロテインホスファターゼのための基質であるポリペプチドの例は、エリスロポイエチンのリン酸化受容体、ｐＥｒｋ１、ｐＥｒｋ２、及びｐＪａｋ２である。
【００２９】
従って、本発明の他の態様は、ホスファターゼ活性を有する酵素を阻害するための方法であって、（ａ）（ｉ）バナジル（ＩＩ）、バナジン酸塩（ＩＶ）、バナジン酸塩（Ｖ）、オリゴマーバナジン酸塩（Ｖ）、及びこれらの混合物から成る群から選択されるイオン化合物、並びに（ｉｉ）ポリオールを含んで成る組成物を水性溶媒中に溶解する工程、そして（ｂ）該ホスファターゼ活性を有する酵素を工程（ａ）の溶液と接触させる工程、を含んで成る方法である。
【００３０】
本発明の更なる態様は、従って、本発明の組成物及び水性溶媒を含んで成る液体組成物である。液体組成物のｐＨは、好ましくは、ホスファターゼ酵素（１又は複数の標的ホスファターゼ）が活性であるｐＨ値に相当する。該ｐＨは、好ましくはｐＨ５．５〜ｐＨ８．５の範囲、より好ましくはｐＨ６．７〜ｐＨ８．０の範囲である。
【００３１】
以下の実施例、図及び配列表は、本発明、すなわち付随の特許請求の範囲に記載される真の範囲理解を助けるために提供される。本発明の精神と離れることなく記載される手順において改変できることが理解される。
【実施例１】
【００３２】
ホスホチロシン−特異性プロテインホスファターゼの阻害
組換え的に産生したホスホチロシン特異性プロテインホスファターゼの原液（ヒトＴ細胞；Calbiochem；商品番号５３９７３２）を０．１ｍＭのＣａＣｌ2、５０ｍＭのトリスｐＨ７．０を含有する緩衝液中で１：２００の割合に希釈する。分離反応チューブ中で、以下の混合物（ａ〜ｅ）を調製する：３６μｌの希釈酵素溶液、及び４μｌの（ａ）水（１００％の対照として）、（ｂ）１０ｍＭのオルトバナジン酸塩；（ｃ）２０ｍＭのオルトバナジン酸塩；（ｄ）１０ｍＭのオルトバナジン酸塩、２７０ｍＭのマンニトール；（ｅ）１０ｍＭのオルトバナジン酸塩、５４０ｍＭのグリセロールの１つの溶液のいずれか。各混合物を室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートする。続いて、１０μｌのアリコットを各混合物からマイクロウェルプレート中に移す。ホスホチロシン残基を含有する５μｌの緩衝液試験ペプチド溶液（配列Ｒ−Ｒ−Ｌ−Ｉ−Ｅ−Ｄ−Ａ−Ｅ−ｐＹ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｇを有するペプチド；水中１ｍＭ）及び０．１ｍＭのＣａＣｌ2、５０ｍＭのトリスｐＨ７．０を含有する１０μｌの緩衝液を各ウェルに添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートする。該リン酸エステル結合の酵素加水分解からもたらされる遊離リン酸を０．０３４％[ｗ／ｖ]のマラカイトグリーン、１０ｍＭのモリブデン酸ナトリウム、及び３．４％[ｖ／ｖ]のエタノールを追加的に含有する１００μｌの１ＭのＨＣｌ溶液の添加に従う検出反応にかける。該検出反応は、室温で１０分間行い、その間マイクロウェルプレートを常に撹拌する。リン酸の相対的な濃度は、各反応ウェルの吸光度（６２０ｎｍ）の検出に従い検出する。
【実施例２】
【００３３】
ＥＤＴＡ及びＤＴＴの存在下におけるホスホチロシン−特異性プロテインホスファターゼの阻害
組換え的に産生したホスホチロシン特異性プロテインホスファターゼの原液（ヒトＴ細胞；Calbiochem；商品番号５３９７３２）を、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＤＴＴを含有するｐＨ７．２の緩衝液中で１：２００の割合に希釈する。分離反応チューブ中で、以下の混合物（ａ〜ｅ）を調製する：３６μｌの希釈酵素溶液、及び４μｌの（ａ）水（１００％の対照として）、（ｂ）１０ｍＭのオルトバナジン酸塩；（ｃ）２０ｍＭのオルトバナジン酸塩；（ｄ）１０ｍＭのオルトバナジン酸塩、２７０ｍＭのマンニトール；（ｅ）１０ｍＭのオルトバナジン酸塩、５４０ｍＭのグリセロールの１つの溶液のいずれか。各混合物を室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートする。続いて、１０μｌのアリコットを各混合物からマイクロウェルプレート中に移す。ホスホチロシン残基を含有する５μｌの緩衝液試験ペプチド溶液（配列Ｒ−Ｒ−Ｌ−Ｉ−Ｅ−Ｄ−Ａ−Ｅ−ｐＹ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｇを有するペプチド；水中１ｍＭ）及び２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＤＴＴを含有する１０μｌの緩衝液、ｐＨ７．２を各ウェルに添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートする。該リン酸エステル結合の酵素加水分解からもたらされる遊離リン酸を０．０３４％[ｗ／ｖ]のマラカイトグリーン、１０ｍＭのモリブデン酸ナトリウム、及び３．４％[ｖ／ｖ]のエタノールを追加的に含有する１００μｌの１ＭのＨＣｌ溶液の添加に従う検出反応にかける。該検出反応は、室温で１０分間行い、その間マイクロウェルプレートを常に撹拌する。リン酸の相対的な濃度は、各反応ウェルの吸光度（６２０ｎｍ）の検出に従い検出する。
【実施例３】
【００３４】
ＥＤＴＡの存在下におけるホスホチロシン−特異性プロテインホスファターゼの阻害（ここでＤＴＴは追加的に存在するか、あるいは存在しない）
組換え的に産生したホスホチロシン特異性プロテインホスファターゼの原液（ヒトＴ細胞；Calbiochem；商品番号５３９７３２）を、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＤＴＴを含有する緩衝液、ｐＨ７．２（酵素溶液（ｉ）)中、あるいはＤＴＴが存在しない同じ組成を有する緩衝液（酵素溶液（ｉｉ）)で１：２００の割合に希釈する。分離反応チューブ中で、以下の混合物（ａ〜f）を調製する：３６μｌのいずれかの希釈酵素溶液（ｉ）又は（ｉｉ）、及び４μｌの（ａ、ｄ）１０ｍＭのオルトバナジン酸塩；（ｂ、ｅ）１０ｍＭのオルトバナジン酸塩、２７０ｍＭのマンニトール；（ｃ、ｆ）１０ｍＭのオルトバナジン酸塩、５４０ｍＭのグリセロールの１つの溶液のいずれか。各混合物を室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートする。続いて、１０μｌのアリコットを各混合物からマイクロウェルプレート中に移す。ホスホチロシン残基を含有する５μｌの緩衝液試験ペプチド溶液（配列Ｒ−Ｒ−Ｌ−Ｉ−Ｅ−Ｄ−Ａ−Ｅ−ｐＹ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｇを有するペプチド；水中１ｍＭ）、及び１０μｌの２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＤＴＴを含有する緩衝液、ｐＨ７．２（酵素溶液（ｉ）との反応）又は２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＥＤＴＡを含有する緩衝液、ｐＨ７．２（酵素溶液（ｉｉ）との反応）を含有する緩衝液のいずれかを各ウェルに添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートする。該リン酸エステル結合の酵素加水分解からもたらされる遊離リン酸を０．０３４％[ｗ／ｖ]のマラカイトグリーン、１０ｍＭのモリブデン酸ナトリウム、及び３．４％[ｖ／ｖ]のエタノールを追加的に含有する１００μｌの１ＭのＨＣｌ溶液の添加に従う検出反応にかける。該検出反応は、室温で１０分間行い、その間マイクロウェルプレートを常に撹拌する。リン酸の相対的な濃度は、各反応ウェルの吸光度（６２０ｎｍ）の検出に従い検出する。
【実施例４】
【００３５】
オルトバナジン酸塩によるホスホチロシン特異性プロテインホスファターゼの阻害
表１
緩衝水溶液中のオルトバナジン酸塩及び他の化合物を含有する組成物の存在下における残留ホスファターゼ活性を示す。代表されるデータは、図１〜３に与えられるグラフで表されるものである。
【表１】
0005405751.tif 000002
【表２】
0005405751.tif 000003
【実施例５】
【００３６】
昆虫細胞溶解液中のホスファターゼの阻害
２７０ｍｇの昆虫細胞（ＳＦ９）を回収し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で３回洗浄し、そして２．５ｍｌのＭ−Ｐｅｒ(Piece)を使用して１０分間溶解した。遠心分離後、該溶解液を上清として回収した。
【００３７】
ホスホチロシン活性の試験：４５μｌの溶解液に、５μｌの水又はオルトバナジン酸塩（１０ｍＭ）若しくはオルトバナジン酸塩／マンニトール（１０ｍＭ／２７０ｍＭ）のいずれかを添加し、そして室温で１０分間インキュベートした。
【００３８】
続いて、１０μｌのアリコットを各混合物からマクロウェルプレートのウェル中に移した。５μｌの試験ペプチド（Ｒ−Ｒ−Ｌ−Ｉ−Ｅ−Ｄ−Ａ−Ｅ−ｐＹ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｇ；水中１ｍＭ）の溶液及び０．１ｍＭのＣａＣｌ2、５０ｍＭのトリスを含有する１０μｌの緩衝液、ｐＨ７．０を各ウェルに添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。各酵素加水分解によりもたらされた遊離リン酸を、その後、０．０３４％[ｗ／ｖ]のマラカイトグリーン、１０ｍＭのモリブデン酸ナトリウム、及び３．４％[ｖ／ｖ]のエタノールを追加的に含有する１００μｌの１ＭのＨＣｌ溶液の添加を介して検出した。該検出は、室温で１０分間行い、その間マイクロウェルプレートを常に撹拌した。遊離リン酸の相対的な濃度は、各反応ウェルの吸光度（６２０ｎｍ）の検出に従い検出した。
【００３９】
表２
緩衝水溶液中のオルトバナジン酸塩及び他の化合物を含有する組成物の存在下における残留ホスファターゼ活性を示す。代表されるデータは、図４に与えられるグラフで表されるものである。
【表３】
0005405751.tif 000004
【００４０】
ＣＯＳ７細胞溶解液中のホスファターゼの阻害
ＣＯＳ７細胞を回収し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で３回洗浄し、そして２．５ｍｌのＭ−Ｐｅｒ(Piece)を使用して１０分間溶解した。遠心分離後、該溶解液を上清として回収した。
【００４１】
ホスホチロシン活性の試験：４５μｌの希釈溶解液（Ｍ−Ｐｅｒ（Pierce)で１＋４）に、５μｌの水又はオルトバナジン酸塩（１０ｍＭ）若しくはオルトバナジン酸塩／マンニトール（１０ｍＭ／２７０ｍＭ）のいずれかを添加し、そして室温で１０分間インキュベートした。
【００４２】
続いて、１０μｌのアリコットを各混合物からマクロウェルプレートのウェル中に移した。５μｌの試験ペプチド（Ｒ−Ｒ−Ｌ−Ｉ−Ｅ−Ｄ−Ａ−Ｅ−ｐＹ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｇ；水中１ｍＭ）の溶液及び０．１ｍＭのＣａＣｌ2、５０ｍＭのトリスを含有する１０μｌの緩衝液  ｐＨ７．０を各ウェルに添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。酵素加水分解によりもたらされた遊離リン酸を、その後、０．０３４％[ｗ／ｖ]のマラカイトグリーン、１０ｍＭのモリブデン酸ナトリウム、及び３．４％[ｖ／ｖ]のエタノールを追加的に含有する１００μｌの１ＭのＨＣｌ溶液の添加を介して検出した。該検出は、室温で１０分間行い、その間マイクロウェルプレートを常に撹拌した。リン酸の相対的な濃度は、各反応ウェルの吸光度（６２０ｎｍ）の検出に従い検出した。
【００４３】
表３
緩衝水溶液中のオルトバナジン酸塩及び他の化合物を含有する組成物の存在下における残留ホスファターゼ活性を示す。代表されるデータは、図５に与えられるグラフで表されるものである。
【表４】
0005405751.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ポリオールの存在又は不存在下におけるオルトバナジン酸塩によるホスホチロシン特異性プロテインホスファターゼの阻害を示す。実施例１の実験原理について言及する。縦軸は残留するホスファターゼ活性を示す。バーは以下の組成について得られた結果を示す：（１）添加した阻害剤なし（コントロール、１００％残留活性）；（２）１ｍＭのオルトバナジン酸塩；（３）２ｍＭのオルトバナジン酸塩；（４）１ｍＭのオルトバナジン酸塩、２７ｍＭのマンニトール；（５）１ｍＭのオルトバナジン酸塩、５４ｍＭのグリセロール。
【００４５】
【図２】ポリオールの存在下又は不存在下かつＥＤＴＡ及びＤＴＴの存在下におけるオルトバナジン酸塩によるホスホチロシン特異性プロテインホスファターゼの阻害を示す。実施例２の実験原理について言及する。縦軸は残留するホスファターゼ活性を示す。バーは以下の組成について得られた結果を示す：（１）添加した阻害剤なし（コントロール、１００％残留活性）；（２）１ｍＭのオルトバナジン酸塩；（３）２ｍＭのオルトバナジン酸塩；（４）１ｍＭのオルトバナジン酸塩、２７ｍＭのマンニトール；（５）１ｍＭのオルトバナジン酸塩、５４ｍＭのグリセロール。
【００４６】
【図３】ＤＴＴを伴う又は伴わない、ポリオールの存在下又は不存在下かつＥＤＴＡの存在下におけるオルトバナジン酸塩によるホスホチロシン特異性プロテインホスファターゼの阻害を示す。実施例３の実験原理について言及する。縦軸は残留するホスファターゼ活性を示す。バーは以下の組成について得られた結果を示す：（１）１ｍＭのオルトバナジン酸塩、ＥＤＴＡを伴うＨｅｐｅｓバッファー；（２）１ｍＭのオルトバナジン酸塩、ＥＤＴＡ及びＤＴＴを伴うＨｅｐｅｓバッファー；（３）２７ｍＭのマンニトールの存在下における、１ｍＭのオルトバナジン酸塩、ＥＤＴＡを伴うＨｅｐｅｓバッファー；（４）２７ｍＭのマンニトールの存在下における、１ｍＭのオルトバナジン酸塩、ＥＤＴＡ及びＤＴＴを伴うＨｅｐｅｓバッファー；（５）５４ｍＭのグリセロールの存在下における、１ｍＭのオルトバナジン酸塩、ＥＤＴＡを伴うＨｅｐｅｓバッファー；（６）５４ｍＭのグリセロールの存在下における、１ｍＭのオルトバナジン酸塩、ＥＤＴＡ及びＤＴＴを伴うＨｅｐｅｓバッファー。
【００４７】
【図４】マンニトールの存在又は不存在下におけるオルトバナジン酸塩による昆虫細胞溶解液におけるホスファターゼの阻害を示す。実施例５の実験原理について言及する。縦軸は残留するホスファターゼ活性を示す。バーは以下の組成について得られた結果を示す：（１）添加した阻害剤なし（コントロール、１００％残留活性）；（２）１ｍＭのオルトバナジン酸塩；（３）１ｍＭのオルトバナジン酸塩、２７ｍＭのマンニトール。
【００４８】
【図５】マンニトールの存在又は不存在下におけるオルトバナジン酸塩によるＣＯＳ７細胞溶解液におけるホスファターゼの阻害を示す。実施例６の実験原理について言及する。縦軸は残留するホスファターゼ活性を示す。バーは以下の組成について得られた結果を示す：（１）添加した阻害剤なし（コントロール、１００％残留活性）；（２）１ｍＭのオルトバナジン酸塩；（３）１ｍＭのオルトバナジン酸塩、２７ｍＭのマンニトール。
【図１】
0005405751.tif 000006
【図２】
0005405751.tif 000007
【図３】
0005405751.tif 000008
【図４】
0005405751.tif 000009
【図５】
0005405751.tif 000010
【配列表】
0005405751000001.app