(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中に含有する糖鎖を標識化する方法であって、
（ａ）生体試料から糖鎖を特異的に捕捉する物質である糖鎖捕捉物質に糖鎖を捕捉する工程、
（ｃ）糖鎖捕捉物質から糖鎖を遊離させる工程、
（ｄ）遊離された糖鎖を標識化する工程、
を含み、
（ｄ）の工程において、前記糖鎖の標識化が、アミノ基を有する化合物による前記糖鎖の還元的アミノ化反応によりなされ、
（ａ）、（ｃ）、（ｄ）の工程を同一の反応容器内で連続して行うことを特徴とする糖鎖標識方法。
【請求項２】
生体試料中に含有する糖鎖を標識化する方法であって、
（ａ）生体試料から糖鎖を特異的に捕捉する物質である糖鎖捕捉物質に糖鎖を捕捉する工程、
（ｂ）糖鎖を捕捉した糖鎖捕捉物質を洗浄する工程
（ｃ）糖鎖捕捉物質から糖鎖を遊離させる工程、
（ｄ）遊離された糖鎖を標識化する工程、
を含み、
（ｄ）の工程において、前記糖鎖の標識化が、アミノ基を有する化合物による前記糖鎖の還元的アミノ化反応によりなされ、
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）の工程を同一の反応容器内で連続して行うことを特徴とする糖鎖標識方法。
【請求項３】
（ａ）の工程において、糖鎖捕捉物質が糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有する担体である請求項１又は２記載の糖鎖標識方法。
【請求項４】
前記官能基が、ヒドラジド基又はアミノオキシ基である請求項３記載の糖鎖標識方法。
【請求項５】
前記糖鎖捕捉物質が下記の（式１）で表される架橋型ポリマー構造を有するものである請求項４記載の糖鎖標識方法。
【化１】
0005500067.tif 000013
（Ｒ1，Ｒ2は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5はＨ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
【請求項６】
前記糖鎖捕捉物質が下記の（式２）で表される架橋型ポリマー構造を有するものである請求項５記載の糖鎖標識方法。
【化２】
0005500067.tif 000014
（ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
【請求項７】
（ｃ）の工程において、糖鎖捕捉物質に酸処理を行なう工程を有する請求項１〜６いずれか記載の糖鎖標識方法。
【請求項８】
（ａ）および（ｃ）の工程において、反応溶媒を蒸発させる工程を有する請求項１〜７いずれか記載の糖鎖標識方法。
【請求項９】
前記アミノ基を有する化合物が紫外可視吸収特性又は蛍光特性を有するものである請求項１又は２記載の糖鎖標識方法。
【請求項１０】
前記アミノ基を有する化合物が、８−Ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ，８−Ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ，７−ａｍｉｎｏ−１，３−ｎａｐｈｔａｌｅｎｅｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，２−Ａｍｉｎｏ９（１０Ｈ）−ａｃｒｉｄｏｎｅ，５−Ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，Ｄａｎｓｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ，２−Ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ，７−Ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ，２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ，２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ，３−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ，７−Ａｍｉｎｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ，３−（Ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）−６−ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅ，２−Ａｍｉｎｏ−６−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ，Ｅｔｈｙｌ  ｐ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ，ｐ−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｎｉｔｒｉｌｅ，及び７−ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄから選ばれる少なくとも１つである請求項９記載の糖鎖標識方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０いずれか記載の糖鎖標識方法によって標識化した糖鎖を検出する工程を含む、糖鎖の検出方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０いずれか記載の糖鎖標識方法によって標識化した糖鎖を分取する工程を含む、糖鎖の分取方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中に含まれる糖鎖を効率よく精製、標識するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖、糖タンパク、糖ペプチド、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク、核酸、脂質などといった生体高分子は、医学、細胞工学、臓器工学などのバイオテクノロジー分野において重要な役割を担っており、これら物質による生体反応の制御機構を明らかにすることはバイオテクノロジー分野の発展に繋がることになる。【０００３】
この中でも、糖鎖は、非常に多様性に富んでおり、天然に存在する生物が有する様々な機能に関与する物質である。糖鎖は生体内でタンパク質や脂質などに結合した複合糖質として存在することが多く、生体内の重要な構成成分の一つである。生体内の糖鎖は細胞間情報伝達，タンパク質の機能や相互作用の調整などに深く関わっていることが明らかになりつつある。【０００４】
なお、糖鎖とは、グルコース，ガラクトース，マンノース，フコース，キシロース，Ｎ−アセチルグルコサミン，Ｎ−アセチルガラクトサミン，シアル酸などの単糖およびこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に結合した分子の総称である。【０００５】
例えば、糖鎖を有する生体高分子としては、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロテオグリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響を与える糖脂質、及び細胞間相互作用や細胞認識に関与している糖タンパク質等が挙げられる。これらの生体高分子に含まれる糖鎖が、この生体高分子と互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明らかにされつつある。さらに、このような糖鎖と細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、及び細胞の癌化との関係が明確にされれば、この糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは臓器工学とを密接に関連させて新たな展開を図ることが期待できる。【０００６】
また、糖タンパク質性医薬品ではその糖鎖が生物活性発現等に重要な役割を担っている場合が多い。したがって、糖タンパク質性医薬品の品質管理のパラメーターとして、糖鎖の評価はきわめて重要であり、特に抗体医薬品についてはその糖鎖構造が抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を左右するとの報告がされており、糖鎖構造解析の重要性が高まっている。【０００７】
そのため近年糖鎖構造を迅速、簡便に、かつ精度高く解析する方法が求められるようになり、高速液体クロマトグラフィ(ＨＰＬＣ)、核磁気共鳴法、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ法）、質量分析法、レクチンアレイ法などの多種多様の方法により糖鎖解析が行われている。【０００８】
これら種々の手法を用いて糖鎖を解析するためには、あらかじめ生体試料中に含まれるタンパク質、ペプチド、脂質、核酸などと糖鎖を分離・精製することが必要である。また、ＨＰＬＣやＣＥは分離の良さ、再現性の良さ、定量性、感度の高さなどと言った点から広く用いられる手法であるが、高い感度を得るために糖鎖の還元末端を還元アミノ化法等により標識化する必要がある。しかしながら、これら糖鎖の精製や標識化は時間と工数がかかり、一度に多量の試料を調整するのは困難を要する。【０００９】
上述した課題を解決する技術として、例えば特許文献１に記載された特定の糖鎖捕捉物質を用いて実現される試料調整方法が挙げられる。
【特許文献１】国際公開第２００８／０１８１７０号パンフレット
【発明の開示】
【００１０】
上記でも述べたように、糖鎖の分離・精製および標識化には時間と工数を要する。糖鎖の分離・精製には例えば、イオン交換樹脂、逆相クロマトグラフィ、活性炭、ゲル濾過クロマトグラフィなどの手法が用いられるが、これらの分離手段は糖を特異的に認識する方法ではないので、莢雑物（ペプチド、タンパク質など）の混入が避けられず、また糖鎖の構造によって回収率に差異が生じることが多い。また、糖鎖を標識するには、精製工程後得られた糖鎖試料を完全に乾燥させる必要があるなど、精製から標識化まで一連の操作に数日要してしまう。
【００１１】
本発明の目的は、生体試料から糖鎖を精製し標識する工程を、簡便に行なう方法を提供することである。
【００１２】
本発明は以下の通りである。
（１）生体試料中に含有する糖鎖を標識化する方法であって、
（ａ）生体試料から糖鎖を特異的に捕捉する物質である糖鎖捕捉物質に糖鎖を捕捉する工程、
（ｃ）糖鎖捕捉物質から糖鎖を遊離させる工程、
（ｄ）遊離された糖鎖を標識化する工程、
を含み、（ｄ）の工程において、前記糖鎖の標識化が、アミノ基を有する化合物による前記糖鎖の還元的アミノ化反応によりなされ、（ａ）、（ｃ）、（ｄ）の工程を同一の反応容器内で連続して行うことを特徴とする糖鎖標識方法。
（２）生体試料中に含有する糖鎖を標識化する方法であって、
（ａ）生体試料から糖鎖を特異的に捕捉する物質である糖鎖捕捉物質に糖鎖を捕捉する工程、
（ｂ）糖鎖を捕捉した糖鎖捕捉物質を洗浄する工程
（ｃ）糖鎖捕捉物質から糖鎖を遊離させる工程、
（ｄ）遊離された糖鎖を標識化する工程、
を含み、（ｄ）の工程において、前記糖鎖の標識化が、アミノ基を有する化合物による前記糖鎖の還元的アミノ化反応によりなされ、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）の工程を同一の反応容器内で連続して行うことを特徴とする糖鎖標識方法。
（３）（ａ）の工程において、糖鎖捕捉物質が糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有する担体である（１）又は（２）記載の糖鎖標識方法。
（４）前記官能基が、ヒドラジド基又はアミノオキシ基である（３）記載の糖鎖標識方法。
（５）前記糖鎖捕捉物質が下記の（式１）で表される架橋型ポリマー構造を有するものである（４）記載の糖鎖標識方法。
【００１３】
【化１】
0005500067.tif 000002
【００１４】
（Ｒ1，Ｒ2は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5はＨ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
（６）前記糖鎖捕捉物質が下記の（式２）で表される架橋型ポリマー構造を有するものである（５）記載の糖鎖標識方法。
【００１５】
【化２】
0005500067.tif 000003
【００１６】
（ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
（７）（ｃ）の工程において、糖鎖捕捉物質に酸処理を行なう工程を有する（１）〜（６）いずれか記載の糖鎖標識方法。
（８）（ａ）および（ｃ）の工程において、反応溶媒を蒸発させる工程を有する（１）〜（７）いずれか記載の糖鎖標識方法。
（９）前記アミノ基を有する化合物が紫外可視吸収特性又は蛍光特性を有するものである（１）又は（２）記載の糖鎖標識方法。
（１０）前記アミノ基を有する化合物が、
８−Ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ，８−Ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ，７−ａｍｉｎｏ−１，３−ｎａｐｈｔａｌｅｎｅｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，２−Ａｍｉｎｏ９（１０Ｈ）−ａｃｒｉｄｏｎｅ，５−Ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，Ｄａｎｓｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ，２−Ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ，７−Ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ，２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ，２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ，３−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ，７−Ａｍｉｎｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ，３−（Ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）−６−ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅ，２−Ａｍｉｎｏ−６−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ，Ｅｔｈｙｌ  ｐ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ，ｐ−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｎｉｔｒｉｌｅ，及び７−ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、
から選ばれる少なくとも１つである（９）記載の糖鎖標識方法。
（１１）（１）〜（１０）いずれか記載の糖鎖標識方法によって標識化した糖鎖を検出する工程を含む、糖鎖の検出方法。
（１２）（１）〜（１０）いずれか記載の糖鎖標識方法によって標識化した糖鎖を分取する工程を含む、糖鎖の分取方法。
【００１７】
本発明の糖鎖標識方法によれば、生体試料中に含有する糖鎖等の標的化合物の精製及び標識化を同一の反応容器内にて行え、標的化合物を簡便に標識することが可能となる。また、ＨＰＬＣやＣＥなどの分析に一般的に用いられるアミノ化合物による標識も簡便に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。【００１９】
【図１】実験例１にて得られた２−ＡＢ標識ウシ由来フェツイン糖鎖を高速液体クロマトグラフィにより測定した結果を示すチャート図である。
【図２】実験例２にて得られた２−ＡＢ標識ウシ血清由来ＩｇＧ糖鎖を高速液体クロマトグラフィにより測定した結果を示すチャート図である。
【図３】実験例３にて得られた２−ＡＢ標識ウシ由来フェツイン糖鎖を高速液体クロマトグラフィにより測定した結果を示すチャート図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、生体試料中に含有する糖鎖を標識化する方法であって、
（ａ）生体試料から糖鎖を特異的に捕捉する物質である糖鎖捕捉物質に糖鎖を捕捉する工程、
（ｂ）糖鎖を捕捉した糖鎖捕捉物質を洗浄する工程
（ｃ）糖鎖捕捉物質から糖鎖を遊離させる工程、
（ｄ）遊離された糖鎖を標識化する工程、
を含み、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）の工程を同一の反応容器内で連続して行う糖鎖標識方法である。【００２１】
（ａ）の工程において、糖鎖を特異的に捕捉する物質は糖鎖のアルデヒド基と反応する官能基を有していることが好ましい。官能基としてはヒドラジド基又はオキシルアミノ基であることがより好ましい。【００２２】
このような糖鎖捕捉物質としては、下記（式１）又は（式２）で表される構造を有する架橋型ポリマーを担体として用いることが好ましい。【００２３】
【化３】
0005500067.tif 000004
【００２４】
（Ｒ1，Ｒ2は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5はＨ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）【００２５】
Ｒ1は、−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示し、例えば下記のものを挙げることができる。なお式中、ａ、ｂ、ｄは１から５の整数を表し、ｃは１から１０の整数を表す。【００２６】
【化４】
0005500067.tif 000005
【００２７】
Ｒ2は、−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示し、例えば下記のものを挙げることができる。下記式中、ｅ、ｆは１から５の整数を表し、ｇは１から１０の整数を表す。【００２８】
【化５】
0005500067.tif 000006
【００２９】
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、Ｈ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示し、例えば下記のものを挙げることができる。下記式中、ｈは１から４の整数を表す。【００３０】
【化６】
0005500067.tif 000007
【００３１】
また、このような（式１）のうち、特に好適な物質Ａとしては、下記の（式２）で表される架橋型ポリマー構造を有するものが挙げられる。【００３２】
【化７】
0005500067.tif 000008
【００３３】
（ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）【００３４】
その他市販のヒドラジド基含有架橋粒子、例えば、アフィゲルＨｚ（ＢＩＯ−ＲＡＤ、１５３−６０４７）、ＣａｒｂｏＬｉｎｋ（ＴＭ） Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｇｅｌ（ＰＩＥＲＣＥ、２０３９１）、ＵｌｔｒａＬｉｎｋ（Ｒ） Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ Ｇｅｌ（ＰＩＥＲＣＥ、５３１４９）などを用いても良い。【００３５】
また、糖鎖捕捉物質として、下記（式５）又は（式６）で表される構造を有する架橋型ポリマーを担体として用いることもできる。【００３６】
【化８】
0005500067.tif 000009
【００３７】
（Ｒ1，Ｒ2は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5はＨ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）。また、Ｒ1からＲ5の具体例としては、（式１）での説明にて挙げられたものと同様のものを挙げることができる。【００３８】
さらに、このような（式５）で示したポリマー粒子において、下記の（式６）で表される構造を有するポリマー粒子を好適に使用することもできる。【００３９】
【化９】
0005500067.tif 000010
【００４０】
（ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）【００４１】
これらの糖鎖捕捉物質のうち、ヒドラジド基を含有する物質を好適に使用することができる。【００４２】
また、糖鎖と糖鎖捕捉物質とを反応させる反応系においてｐＨが酸性の条件であるのが好ましく、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。反応温度に関しては４〜９０℃が好ましく、好ましくは２５〜９０℃で、さらに好ましくは４０〜９０℃である。反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、より好ましくは１０分間〜２時間である。反応は、糖鎖の捕捉反応を効率よく行う観点から、開放系で行って溶媒を完全に蒸発させることが好ましい。【００４３】
続いて、（ｂ）の工程では、（ａ）の工程で糖鎖が捕捉された糖鎖捕捉物質を洗浄して、糖鎖捕捉物質に捕捉されなかった糖鎖、他の生体試料などを除去する。糖鎖捕捉物質の洗浄に用いられる溶液としては、グアニジンや界面活性剤の水溶液のようなタンパク変性剤溶液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、水および水性緩衝液などが使用される。ここで、洗浄に水溶液が用いられる場合、この水溶液のｐＨは中性付近であることが好ましく、そのｐＨは４〜１０、より好ましくは６〜８である。【００４４】
なお、（ｂ）の洗浄工程は、当初の生体試料の状態、例えば糖鎖以外の物質の混在の程度によっては行わなくても構わない。【００４５】
（ｃ）の工程では、糖鎖が捕捉された糖鎖捕捉物質から糖鎖を遊離させる、すなわち糖鎖を糖鎖捕捉物質から切り出す反応を行う。この工程では、酸と有機溶媒の混合溶媒あるいは酸と水と有機溶媒の混合溶媒にて、糖鎖捕捉物質に酸処理を行うのが好ましい。酸と水と有機溶媒の混合溶媒の場合、水の含有率は好ましくは０．１％〜９０％、より好ましくは０．１％〜８０％、さらに好ましくは０．１％〜５０％である。水の代わりに水性緩衝液を含有しても良い。緩衝液の濃度は好ましくは０．１ｍＭ〜１Ｍ、より好ましくは０．１ｍＭ〜５００ｍＭ、さらに好ましくは１ｍＭ〜１００ｍＭである。反応溶液のｐＨは好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。使用する酸は例えば、酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、塩酸、クエン酸、リン酸、硫酸が好ましく、より好ましくは酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、リン酸、さらに好ましくは酢酸、トリフルオロ酢酸である。反応温度に関しては４〜９０℃が好ましく、好ましくは２５〜９０℃で、さらに好ましくは４０〜９０℃である。反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、より好ましくは１０分間〜３時間である。反応は、糖鎖を遊離させる反応を効率よく行う観点から、開放系で行って溶媒を完全に蒸発させることが好ましい。【００４６】
弱酸性から中性付近で、糖鎖切り出し反応を行うことができるため、従来の強酸性処理、たとえば１０％トリフルオロ酢酸処理による切出しのような強酸の存在下での切出し反応に比べて、シアル酸残基の脱離など糖鎖の加水分解などを引き起こすことを抑制することができるようになる。【００４７】
（ｄ）の工程では（ｃ）の工程で得られた遊離の糖鎖を標識化する。標識化の方法は、アミノ基を有する化合物により、例えば還元的アミノ化反応を用いて任意のアミノ化合物で標識化する反応であることが好ましい。反応系においてｐＨが酸性から中性の条件であるのが好ましく、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜８であり、さらに好ましくは２〜７である。反応温度に関しては４〜９０℃が好ましく、好ましくは２５〜９０℃で、さらに好ましくは４０〜９０℃である。アミノ化合物の濃度は、１ｍＭ〜１０Ｍであるのが好ましく、還元剤の濃度は、１ｍＭ〜１０Ｍであるのが好ましい。反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、より好ましくは１０分間〜３時間である。【００４８】
ここで、アミノ基を有する化合物は、紫外可視吸収特性又は蛍光特性を有することが好ましく、例えば下記の群から選ばれる少なくとも１つであることが好ましい。【００４９】
８−Ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ，８−Ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ，７−ａｍｉｎｏ−１，３−ｎａｐｈｔａｌｅｎｅｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，２−Ａｍｉｎｏ９（１０Ｈ）−ａｃｒｉｄｏｎｅ，５−Ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，Ｄａｎｓｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ，２−Ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ，７−Ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ，２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ，２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ，３−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ，７−Ａｍｉｎｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ，３−（Ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）−６−ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅ，２−Ａｍｉｎｏ−６−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ，Ｅｔｈｙｌ  ｐ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ，ｐ−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｎｉｔｒｉｌｅ，及び７−ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ。【００５０】
特に、アミノ化合物が２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅの場合、ｐＨが酸性から中性の条件で、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜８であり、さらに好ましくは２〜７である。反応温度に関しては４〜９０℃、好ましくは３０〜９０℃で、さらに好ましくは４０〜８０℃である。アミノ化合物の濃度は１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜１０Ｍで、さらに好ましくは１００ｍＭ〜１Ｍである。還元剤の濃度は、１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜１０Ｍ、さらに好ましくは１００ｍＭ〜２Ｍである。反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、さらに好ましくは１時間〜３時間である。【００５１】
また、還元剤は例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、メチルアミンボラン、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、ピコリンボラン、ピリジンボランなどが使用可能であるが、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用するのが反応性の面から考えて好ましい。【００５２】
（ｄ）の工程後、得られる溶液は標識された糖鎖と過剰量加えた未反応アミノ化合物、還元剤が存在するため、これら余剰試薬を除去する工程を行うのが好ましい。シリカカラムによる除去、ゲル濾過による除去、イオン交換樹脂による除去、いずれの方法を用いても良いが、シアル酸の離脱を防ぐために使用する溶媒は中性であるのが好ましい。【００５３】
以上、糖鎖標識方法について説明したが、本発明は別の側面から、当該糖鎖標識方法によって標識化した糖鎖を検出する工程を含む、糖鎖の検出方法を提供する。また、さらに別の側面から、当該糖鎖標識方法によって標識化した糖鎖を分取する工程を含む、糖鎖の分取方法を提供する。【００５４】
特許文献１に記載の糖鎖捕捉技術では、捕捉した糖鎖の標識化において、過剰試薬を加えて行う交換反応による標識技術を用いているのに対して、本発明では還元アミノ化法による標識技術を用いている。還元アミノ化法は、一般的に行われる反応であるが、通常は糖鎖の精製、脱塩および乾固に時間がかかる。本発明では、担体への捕捉、精製を組み合わせることにより、還元アミノ化法を簡便に行うことを可能にしている。還元アミノ化法による標識は、特許文献１に記載されたような標識化技術と比較して、（１）２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅや２−Ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅと言った一般的に使用されてきた標識化合物に適応可能であることから、それら標識を用いて得られた過去の知見を参考にすることが可能である、（２）糖鎖と標識化合物との結合がより安定であるため長期保存が可能であるという点で、望ましい。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を以下の実験例からなる実施例により説明する。しかし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
本実施例では、モデルケースとして糖タンパク質であるウシ血清由来フェチュインおよびウシ血清由来ＩｇＧの糖鎖を分析試料として調製する方法およびその測定方法を示す。【００５６】
（実験例１）
（生体試料の予備処理）
ウシ血清由来フェチュイン１ ｍｇを１００ｍＭ重炭酸アンモニウム５０μLに溶解させた後、１２０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）を５μＬ加え、６０℃で３０分間反応させた。反応終了後、１２３ｍＭ  ＩＡＡ（ヨードアセトアミド）１０μＬを加えて遮光下、室温で１時間反応させた。続いて４００Ｕのトリプシンによってプロテアーゼ処理をし、タンパク質部分をペプチド断片化した。反応溶液を９０℃で５分処理した後、５ＵのグリコシダーゼＦによる処理を行って糖鎖をペプチドから遊離させ、予備処理済の生体試料を得た。【００５７】
（糖鎖捕捉工程（ａ）、洗浄工程（ｂ））
糖鎖捕捉用の担体であるヒドラジド基を有するビーズ５ｍｇ（ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（Ｒ））、住友ベークライト株式会社製、ＢＳ−４５６０１Ｓ、式２の構造を有し、モノマー仕込み比がｍ：ｎ＝２０：１のポリマー）が入ったディスポカラムに予備処理済の生体試料の懸濁物２０μＬおよび１８０μＬの２％酢酸／アセトニトリル溶液を加え、８０℃で１時間反応させた。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発しビーズが乾固した状態であることを目視で確認した。続いて、グアニジン溶液、水、メタノール、トリエチルアミン溶液にてビーズを洗浄後、１０％無水酢酸／メタノールを添加し、室温で３０分間反応させ、未反応のヒドラジド基をキャッピングした。キャッピング後、メタノール、塩酸水溶液、水にてビーズを洗浄した。【００５８】
（糖鎖遊離工程（ｃ））
ビーズの入ったディスポカラムに超純水２０μLおよび２％酢酸／アセトニトリル溶液１８０μＬを加え、６０℃で２時間反応させた。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発しビーズが乾固した状態であることを目視で確認した。【００５９】
（標識化工程（ｄ））
ビーズの入ったディスポカラムに、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２−ＡＢ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの終濃度がそれぞれ０．３５Ｍ、１Ｍになるように３０％酢酸／ＤＭＳＯ混合溶媒に溶解させて調整した溶液５０μLを添加し、６０℃で２時間反応させた。
上記、糖鎖捕捉工程（ａ）、洗浄工程（ｂ）、糖鎖遊離工程（ｃ）、及び標識化工程（ｄ）は同一の容器であるディスポカラム内で行なった。【００６０】
（余剰試薬除去工程）
反応溶液５０μＬを回収し、アセトニトリルで１０倍に希釈した後、シリカゲル (Ｉａｔｒｏｂｅａｄｓ、６ＲＳ−８０６０、三菱化学ヤトロン製)を詰めたカラムに添加してシリカゲルに標識糖鎖を吸着させた。アセトニトリル、アセトニトリル／水混合溶液（９５：５）にてカラムを洗浄後、超純水５０μＬにて標識糖鎖を回収した。【００６１】
（標識化糖鎖の検出）
得られた標識糖鎖をＨＰＬＣにて測定した。アミノカラム（Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０）を用いて励起波長３３０ｎｍ、蛍光波長４２０ｎｍにて測定した。図１に測定結果を示す。２ＡＢにより標識化された糖鎖が検出された。【００６２】
なお、図１において、１は１シアル酸含有糖鎖由来ピークを示し、２は２シアル酸含有糖鎖由来ピークを示し、３は３シアル酸含有糖鎖由来ピークを示し、４は４シアル酸含有糖鎖由来ピークを示す。【００６３】
（実験例２）
ウシ血清由来フェチュインの代わりにウシ血清由来ＩｇＧを用いた以外は、実験例１と同様に行なった。図２にＨＰＬＣの測定結果を示す。２ＡＢにより標識化された糖鎖が検出された。【００６４】
なお、図２において、５は中性糖由来ピークを示し、６は酸性糖鎖由来ピークを示す。【００６５】
（実験例３）
糖鎖捕捉用の担体であるヒドラジド基を有するビーズとしてアフィゲルＨｚ（ＢＩＯ−ＲＡＤ、１５３−６０４７）を用いた以外は、実験例１と同様に行った。アフィゲルＨｚは５０μＬ使用した。図３にＨＰＬＣの測定結果を示す。図で実線は、アフィゲルＨｚ使用の場合、破線は、実験例１のＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（Ｒ）使用の場合を示す。アフィゲルＨｚ使用の場合も、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（Ｒ）を用いた場合と比較すると強度が弱くなるが、２ＡＢにより標識化された糖鎖が検出された。
以下、参考形態の例を付記する。
１．生体試料中に含有する糖鎖を標識化する方法であって、
（ａ）生体試料から糖鎖を特異的に捕捉する物質である糖鎖捕捉物質に糖鎖を捕捉する工程、
（ｃ）糖鎖捕捉物質から糖鎖を遊離させる工程、
（ｄ）遊離された糖鎖を標識化する工程、
を含み、（ａ）、（ｃ）、（ｄ）の工程を同一の反応容器内で連続して行うことを特徴とする糖鎖標識方法。
２．生体試料中に含有する糖鎖を標識化する方法であって、
（ａ）生体試料から糖鎖を特異的に捕捉する物質である糖鎖捕捉物質に糖鎖を捕捉する工程、
（ｂ）糖鎖を捕捉した糖鎖捕捉物質を洗浄する工程
（ｃ）糖鎖捕捉物質から糖鎖を遊離させる工程、
（ｄ）遊離された糖鎖を標識化する工程、
を含み、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）の工程を同一の反応容器内で連続して行うことを特徴とする糖鎖標識方法。
３．（ａ）の工程において、糖鎖捕捉物質が糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有する担体である１又は２に記載の糖鎖標識方法。
４．前記官能基が、ヒドラジド基又はアミノオキシ基である３に記載の糖鎖標識方法。
５．前記糖鎖捕捉物質が下記の（式１）で表される架橋型ポリマー構造を有するものである４に記載の糖鎖標識方法。
【化１】
0005500067.tif 000011
（Ｒ1，Ｒ2は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5はＨ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
６．前記糖鎖捕捉物質が下記の（式２）で表される架橋型ポリマー構造を有するものである５に記載の糖鎖標識方法。
【化２】
0005500067.tif 000012
（ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
７．（ｃ）の工程において、糖鎖捕捉物質に酸処理を行なう工程を有する１〜６のいずれかに記載の糖鎖標識方法。
８．（ａ）および（ｃ）の工程において、反応溶媒を蒸発させる工程を有する１〜７のいずれかに記載の糖鎖標識方法。
９．（ｄ）の工程において、糖鎖の標識化をアミノ基を有する化合物により行う１〜８のいずれかに記載の糖鎖標識方法。
１０．前記アミノ基を有する化合物による糖鎖の標識化が還元的アミノ化反応によりなされるものである９に記載の糖鎖標識方法。
１１．前記アミノ基を有する化合物が紫外可視吸収特性又は蛍光特性を有するものである９又は１０に記載の糖鎖標識方法。
１２．前記アミノ基を有する化合物が、８−Ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ，８−Ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ，７−ａｍｉｎｏ−１，３−ｎａｐｈｔａｌｅｎｅｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，２−Ａｍｉｎｏ９（１０Ｈ）−ａｃｒｉｄｏｎｅ，５−Ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，Ｄａｎｓｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ，２−Ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ，７−Ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ，２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ，２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ，３−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ，７−Ａｍｉｎｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ，３−（Ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）−６−ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅ，２−Ａｍｉｎｏ−６−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ，Ｅｔｈｙｌ  ｐ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ，ｐ−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｎｉｔｒｉｌｅ，及び７−ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄから選ばれる少なくとも１つである９〜１１のいずれかに記載の糖鎖標識方法。
１３．１〜１２のいずれかに記載の糖鎖標識方法によって標識化した糖鎖を検出する工程を含む、糖鎖の検出方法。
１４．１〜１２のいずれかに記載の糖鎖標識方法によって標識化した糖鎖を分取する工程を含む、糖鎖の分取方法。
【図１】
0005500067.tif 000015
【図２】
0005500067.tif 000016
【図３】
0005500067.tif 000017