(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で示される化合物又はその薬剤学的に許容される塩を含む、老化による老人性難聴及び耳毒性薬物による難聴から選択される難聴の治療又は予防のための薬剤学的組成物：
【化１】
0005564118.tif 000025
前記式において、
Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１‐Ｃ１０アルキル、Ｃ２‐Ｃ１０アルケニル、Ｃ１‐Ｃ１０アルコキシ、及び‐（ＣＨ２）ｎ‐フェニルからなる群より選択され、若しくはＲ１及びＲ４若しくはＲ２及びＲ３が相互連結されてなる二重結合又はＣ４‐Ｃ６の環構造であってよく；
Ｒ７〜Ｒ１０は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１‐Ｃ１０アルキル、及びＣ１‐Ｃ１０アルコキシからなる群より選択され；
Ｘは、Ｏ又はＳであり；
Ｙは、Ｃ又はＯであり；
ｍは、０又は１であり、ｍが０である場合、その隣接炭素原子は、直接結合により環状構造を成し；
ｎは、０〜１０の整数である。
【請求項２】
化学式１で示される化合物が化学式１‐１で示される化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物：
【化２】
0005564118.tif 000026
前記式において、Ｒ１〜Ｒ１０、及びｍは、請求項１において定義されたとおりである。
【請求項３】
化学式１で示される化合物が化学式１‐３で示される化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物：
【化３】
0005564118.tif 000027
前記式において、Ｒ１〜Ｒ１０、及びＸは、請求項１において定義されたとおりである。
【請求項４】
化学式１で示される化合物が化学式１‐４で示される化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物：
【化４】
0005564118.tif 000028
前記式において、Ｒ１〜Ｒ１０、Ｘ、及びＹは、請求項１において定義されたとおりである。
【請求項５】
Ｒ１及びＲ２は、Ｃ１‐Ｃ１０アルキルであり、
Ｒ３〜Ｒ１０は、水素であり、
Ｘは、Ｏであり、
Ｙは、Ｃであることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
難聴が老化による老人性難聴であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
難聴が耳毒性薬物による難聴であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、
Ｒ３〜Ｒ１０は、水素であり、
Ｘは、Ｏであり、
Ｙは、Ｃであることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナフトキノン系化合物を含む難聴の治療又は予防のための組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
内耳の蝸牛管の基底膜上に配列された聴覚上皮群であるコルチ器官は、あらゆる感覚の組織のうち最も少ない数の感覚受容細胞である聴覚有毛細胞により機能をする。人間の蝸牛殻は、１３７，０００，０００個の視力感覚受容細胞を持つ網膜に比べ、わずか２０，０００個の感覚受容細胞のみを持っている。哺乳類において、聴覚有毛細胞は、単に胚発生の間にのみ作られ、出生後に消失すると再び作られない。したがって、有毛細胞の損失は明白かつ不可逆的な聴力損傷を引き起こす。
【０００３】
聴力損傷は、外傷、老化、過度な騒音及び公害、抗生物質（たとえば、ゲンタマイシン）、ループ利尿剤及び白金系抗癌剤（たとえば、シスプラチン）等の耳毒性薬物、感染、自己免疫疾患及び遺伝性疾患といった多様な原因によって誘発された聴覚有毛細胞の細胞死が主な原因として明らかにされている。
【０００４】
最近、難聴の予防及び治療に効果的な物質を見出すための様々な研究が進められ、抗酸化剤、Ｎ‐メチル‐Ｄ‐アスパルテート（ＮＭＤＡ）拮抗剤、細胞死滅抑制剤等についての研究が報告されたが、今までのところ難聴の予防及び治療と関連して承認された薬物はない。
【０００５】
一方、ナフトキノン系化合物は、一部薬剤学的組成物の有効成分として知られている。そのうち、β‐ラパコン（β‐ｌａｐａｃｈｏｎｅ）は、南米において自生するラパコ（ｌａｐｈａｃｈｏ）の木（Ｔａｂｅｂｕｉａ  ａｖｅｌｌａｎｅｄａｅ）から、デュニオン（ｄｕｎｎｉｏｎｅ）とα‐デュニオン（ａｌｐｈａ‐ｄｕｎｎｉｏｎｅ）は、南米に自生するストレプトカルプスデュニー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃａｒｐｕｓ  ｄｕｎｎｉｉ）の葉から得られる。このような天然の三環式（ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ）ナフトキノン（ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ）誘導体は、南米地域では古くから抗癌剤をはじめ、南米地域の代表的な風土病であるシャーガス病（Ｃｈａｇａｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）を治療するための薬として広く使用され、その効果もまた優れているものと知られている。特に、これらの抗癌剤としての薬理作用が西洋世界に知られ始めるとともに、人々の注目を受け始め、米国特許第５，９６９，１６３号に開示されているように、これら三環式ナフトキノン誘導体は、実際に多様な研究グループにより各種抗癌剤として開発されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、老化、耳毒性薬物等による聴力損傷を治療又は予防することができる薬物を開発するために鋭意研究検討した結果、ナフトキノン系化合物が、聴覚損傷の治療又は予防に効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、ナフトキノン系化合物を含む難聴の治療又は予防のための組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、下記化学式１又は２で示される化合物、その薬剤学的に許容される塩、プロドラッグ（ｐｒｏｄｒｕｇ）、溶媒化物又は異性体を含む、難聴の治療又は予防のための組成物に関する。
【０００９】
【化１】
0005564118.tif 000002
【００１０】
【化２】
0005564118.tif 000003
【００１１】
前記式において、
Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、置換若しくは非置換されたＣ１‐Ｃ１０アルキルアミノ、置換若しくは非置換されたＣ１‐Ｃ１０ジアルキルアミノ、置換若しくは非置換されたＣ１‐Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換されたＣ２‐Ｃ１０アルケニル、置換若しくは非置換されたＣ２‐Ｃ１０アルキニル、置換若しくは非置換されたＣ１‐Ｃ１０アルコキシ、置換若しくは非置換されたＣ１‐Ｃ１０アルコキシカルボニル、置換若しくは非置換されたＣ１‐Ｃ１０アシル、置換若しくは非置換されたＣ３‐Ｃ８シクロアルキル、置換若しくは非置換されたＣ３‐Ｃ８ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換されたＣ４‐Ｃ１０アリール、置換若しくは非置換されたＣ４‐Ｃ１０ヘテロアリール、及び置換若しくは非置換された‐（ＣＨ２）ｎ‐アリールからなる群より選択され、若しくはこれらのうち２つの置換基が相互連結されてなる二重結合、又は置換若しくは非置換されたＣ３‐Ｃ６の環構造であってよく、前記環構造は、飽和構造又は部分的若しくは全体的不飽和構造であってよく、ここで、置換基は、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１‐Ｃ１０アルキル、Ｃ２‐Ｃ１０アルケニル、Ｃ２‐Ｃ１０アルキニル、Ｃ１‐Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１‐Ｃ１０アルコキシカルボニル、Ｃ１‐Ｃ１０アルキルアミノ、Ｃ３‐Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３‐Ｃ８ヘテロシクロアルキル、Ｃ４‐Ｃ１０アリール、及びＣ４‐Ｃ１０ヘテロアリールからなる群より選択された一つ以上であってよく；
Ｒ７〜Ｒ１０は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、置換若しくは非置換されたＣ１‐Ｃ１０アルキルアミノ、置換若しくは非置換されたＣ１‐Ｃ１０ジアルキルアミノ、置換若しくは非置換されたＣ１‐Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換されたＣ２‐Ｃ１０アルケニル、置換若しくは非置換されたＣ２‐Ｃ１０アルキニル、置換若しくは非置換されたＣ１‐Ｃ１０アルコキシ、置換若しくは非置換されたＣ１‐Ｃ１０アルコキシカルボニル、置換若しくは非置換されたＣ１‐Ｃ１０アシル、置換若しくは非置換されたＣ３‐Ｃ８シクロアルキル、置換若しくは非置換されたＣ３‐Ｃ８ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換されたＣ４‐Ｃ１０アリール、置換若しくは非置換されたＣ４‐Ｃ１０ヘテロアリール、及び置換若しくは非置換された‐（ＣＨ２）ｎ‐アリールからなる群より選択され、若しくはこれらのうち２つの置換基が相互連結されて置換若しくは非置換されたＣ３‐Ｃ６の環構造であってよく、前記環構造は、飽和構造又は部分的若しくは全体的不飽和構造であってよく、ここで、置換基は、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１‐Ｃ１０アルキル、Ｃ２‐Ｃ１０アルケニル、Ｃ２‐Ｃ１０アルキニル、Ｃ１‐Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１‐Ｃ１０アルコキシカルボニル、Ｃ１‐Ｃ１０アルキルアミノ、Ｃ３‐Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３‐Ｃ８ヘテロシクロアルキル、Ｃ４‐Ｃ１０アリール、及びＣ４‐Ｃ１０ヘテロアリールからなる群より選択された一つ以上であってよく；
Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ’であり、ここで、Ｒ’は、水素又はＣ１‐Ｃ６アルキルであり；
Ｙは、Ｃ、Ｓ、Ｎ又はＯであり、ここで、ＹがＳ又はＯである場合、Ｒ５及びＲ６はいかなる置換基でもなく、ＹがＮである場合、Ｒ５は、水素又はＣ１‐Ｃ６アルキルであり、Ｒ６は、いかなる置換基でもなく；
ｍは、０又は１であり、ｍが０である場合、その隣接炭素原子は、直接結合により環状形構造を成し、
ｎは、０〜１０の整数である。
【００１２】
好ましくは、前記Ｘは、Ｏ又はＳであり、Ｙは、Ｃ又はＯであってよい。
【００１３】
一の好ましい例において、前記Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、置換若しくは非置換されたＣ１‐Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換されたＣ２‐Ｃ１０アルケニル、置換若しくは非置換されたＣ１‐Ｃ１０アルコキシ、及び‐（ＣＨ２）ｎ‐フェニルからなる群より選択され、若しくはＲ１及びＲ４若しくはＲ２及びＲ３が相互連結されてなる二重結合又はＣ４‐Ｃ６の環構造であってよく、ここで、置換基は、Ｃ１‐Ｃ１０アルキルであってよい。
【００１４】
他の好ましい例において、前記Ｒ７〜Ｒ１０は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、置換若しくは非置換されたＣ１‐Ｃ１０アルキル、及び置換若しくは非置換されたＣ１‐Ｃ１０アルコキシからなる群より選択されてよい。
【００１５】
前記化学式１又は２で示される化合物のうち好ましい例としては、ＸがＯであり、ＹがＣである下記化学式１‐１若しくは２‐１で示される化合物、又はＸがＳである下記化学式１‐２又は２‐２で示される化合物を挙げることができる。
【００１６】
【化３】
0005564118.tif 000004
【００１７】
【化４】
0005564118.tif 000005
【００１８】
【化５】
0005564118.tif 000006
【００１９】
【化６】
0005564118.tif 000007
【００２０】
前記式において、Ｒ１〜Ｒ１０、Ｙ、及びｍは、前記化学式１において定義されたとおりである。
【００２１】
他の好ましい例において、前記化学式１又は２で示される化合物は、ｍが０であるとともに隣接炭素原子が直接結合により環状構造（ｆｕｒａｎ環）を形成する下記化学式１‐３又は２‐３で示される化合物であってよい。以下においては、時に「フラン化合物」又は「フラノ‐ｏ‐ナフトキノン（ｆｕｒａｎｏ‐ｏ‐ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ）誘導体」と称したりもする。
【００２２】
【化７】
0005564118.tif 000008
【００２３】
【化８】
0005564118.tif 000009
【００２４】
前記式において、Ｒ１〜Ｒ１０、及びＸは、前記化学式１において定義されたとおりである。
【００２５】
また、前記化学式１又は２で示される化合物は、ｍが１である下記化学式１‐４又は２‐４で示される化合物であってよい。以下では、時に、「ピラン（ｐｙｒａｎ）化合物」又は「ピラノ‐ｏ‐ナフトキノン（ｐｙｒａｎｏ‐ｏ‐ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ）誘導体」と称したりもする。
【００２６】
【化９】
0005564118.tif 000010
【００２７】
【化１０】
0005564118.tif 000011
【００２８】
前記式において、Ｒ１〜Ｒ１０、Ｘ、及びＹは、前記化学式１において定義されたとおりである。
【００２９】
他の好ましい例において、前記化学式１又は２で示される化合物は、Ｒ７及びＲ８が相互接続されて環構造を形成した下記化学式１‐５若しくは１‐６で示される化合物又は下記化学式２‐５若しくは２‐６で示される化合物であってよい。
【００３０】
【化１１】
0005564118.tif 000012
【００３１】
【化１２】
0005564118.tif 000013
【００３２】
【化１３】
0005564118.tif 000014
【００３３】
【化１４】
0005564118.tif 000015
【００３４】
前記式において、
Ｒ１〜Ｒ１０、Ｘ、Ｙ、及びｍは、前記化学式１において定義されたとおりであり、
Ｒ１１〜Ｒ１８は、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１‐Ｃ１０アルキル、Ｃ２‐Ｃ１０アルケニル、Ｃ２‐Ｃ１０アルキニル、Ｃ１‐Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１‐Ｃ１０アルコキシカルボニル、Ｃ１‐Ｃ１０アルキルアミノ、Ｃ３‐Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３‐Ｃ８ヘテロシクロアルキル、Ｃ４‐Ｃ１０アリール、又はＣ４‐Ｃ１０ヘテロアリールである。
【００３５】
好ましくは、Ｒ１１〜Ｒ１８は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１‐Ｃ１０アルキル、Ｃ２‐Ｃ１０アルケニル、Ｃ２‐Ｃ１０アルキニル、Ｃ１‐Ｃ１０アルコキシ、Ｃ３‐Ｃ８シクロアルキル、又はフェニルであってよい。
【００３６】
本発明において使用される用語「薬剤学的に許容される塩」とは、化合物が投与される有機体に深刻な刺激を引き起こさず、かつ化合物の生物学的活性と物性を損傷させない、化合物の剤形を意味する。前記薬剤学的に許容される塩は、薬剤学的に許容される陰イオンを含有する無毒性酸付加塩を形成する酸、たとえば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸等の無機酸、酒石酸、蟻酸、クエン酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、サリシン酸といった有機カルボン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ‐トルエンスルホン酸といったスルホン酸等により形成された酸付加塩が含まれる。一方、塩基付加塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等により形成されたアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩、リシン、アルギニン、グアニジン等のアミノ酸塩、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ‐メチル‐Ｄ‐グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、ジエタノールアミン、コリン及びトリエチルアミンといった有機塩等が含まれる。本発明に係る化学式１又は２で示される化合物は、通常的な方法によりその塩に転換されてよい。
【００３７】
用語「プロドラッグ」とは、生体内において親薬剤（ｐａｒｅｎｔ  ｄｒｕｇ）に変換される物質を意味する。プロドラッグは、親薬剤よりも投与しやすいため、しばしば使用される。たとえば、これらは、口腔投与により生理活性を得てよいのに対し、親薬剤はそうでなくてよい。プロドラッグはまた、親薬剤よりも薬剤組成物において向上した溶解度を有していてもよい。たとえば、プロドラッグは、水溶解度が移動性に害となるが一旦水溶解度が有利な細胞では物質代謝により活性体であるカルボン酸に加水分解される、細胞膜の通過を容易にするエステルとして投与される化合物であってよい。プロドラッグの他の例は、ペプチドが活性部位を明らかにするように物質代謝により変換される酸基に結合されている短いペプチド（ポリアミノ酸）であってよい。本発明のプロドラッグは、国際特許公開ＷＯ０６／０２０７１９号に記載されている化合物が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００３８】
本発明において使用される用語「溶媒化物（ｓｏｌｖａｔｅ）」とは、非共有的な分子間力（ｎｏｎ‐ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｏｒｃｅ）により結合された化学量論的（ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ）又は非化学量論的（ｎｏｎ‐ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ）な量の溶媒を含んでいる本発明の化合物又はその塩を意味する。好ましい溶媒としては、揮発性、非毒性、及び／又は人間への投与に適した溶媒があり、前記溶媒が水である場合、水和物（ｈｙｄｒａｔｅ）を意味する。
【００３９】
用語「異性体（ｉｓｏｍｅｒ）」とは、同一の化学式又は分子式を有するが、光学的又は立体的に異なる本発明の化合物又はその塩を意味する。
【００４０】
以下において、別途の説明がない限り、用語「化学式１又は２で示される化合物」又は「ナフトキノン系化合物」は、化合物それ自体、その薬剤学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒化物及び異性体をすべて含む概念として使用される。
【００４１】
用語「アルキル」は、不飽和基がなく、炭素及び水素を含有するラジカルを意味する。アルキルラジカルは、直鎖（線形）又は分枝鎖（枝形）であってよい。例示的なアルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ‐ブチル、ｓｅｃ‐ブチル等が含まれるが、これに限定されない。
【００４２】
Ｃ１‐Ｃ１０アルキルは、直鎖又は分枝鎖アルキル主鎖に、１〜１０個の炭素原子を有するアルキル基である。アルキル基は、任意に置換されてよい。置換される場合、アルキル基は、任意の特定の結合点において（任意の所定炭素原子において）置換基が４個以下で置換されてよい。
【００４３】
一方、アルキル基がアルキル基に置換される場合、これは「分枝鎖型アルキル基」と同じ意味で使用される。
【００４４】
用語「アルケニル」は、前述したアルキルと長さ及び置換可能性において類似するが、一つ以上の炭素‐炭素二重結合を含有する不飽和脂肪族基を意味する。たとえば、「アルケニル」は、直鎖アルケニル基（たとえば、エテニル、プロフェニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル）、分枝鎖アルケニル基、及びシクロアルケニル基（たとえば、シクロプロフェニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル）が含まれる。また、「アルケニル」は、一つ以上の炭化水素主鎖炭素を代替する酸素、窒素、硫黄又はリン原子を含むアルケニル基をさらに含んでいてもよい。具体的な例において、直鎖又は分枝鎖アルケニル基は、主鎖に６個以下の炭素原子を持っていてよく（たとえば、直鎖の場合Ｃ２‐Ｃ６、分枝鎖の場合Ｃ３‐Ｃ６）。同様に、シクロアルケニル基は、環構造に３〜８個の炭素原子を持っていてよく、さらに好ましくは５〜６個の炭素原子を持っていてよい。
【００４５】
用語「アルキニル」は、前述したアルキルと長さ及び置換可能性において類似するが、一つ以上の炭素‐炭素三重結合を含有する不飽和脂肪族基を意味する。たとえば、「アルキニル」は、直鎖アルキニル基（たとえば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニル）、及び分枝鎖アルキニル基（アルキル又はアルケニル置換されたアルキニル基を含む）を含む。また、「アルキニル」は、一つ以上の炭化水素主鎖炭素を代替する酸素、窒素、硫黄又はリン原子を含むアルキニル基をさらに含んでいてもよい。具体的な例において、直鎖又は分枝鎖アルキニル基は、主鎖に６個以下の炭素原子を持つ（たとえば、直鎖の場合Ｃ２‐Ｃ６、分枝鎖の場合Ｃ３‐Ｃ６）。
【００４６】
前記アルキル、アルキニル及びアルケニルがそれぞれ置換された場合、置換基は、たとえば、ヒドロキシ、カルボキシレート、オキソ、ハロゲン（たとえば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ１‐Ｃ６ハロアルキル（たとえば、ＣＣｌ３又はＣＦ３）、カルバモイル（‐ＮＨＣＯＯＲ又は‐ＯＣＯＮＨＲ）、ウレア（‐ＮＨＣＯＮＨＲ）、チオール、シアノ、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、Ｃ１‐Ｃ１０アルキルチオ、Ｃ４‐Ｃ１０アリールチオ、Ｃ１‐Ｃ１０アルキル、Ｃ１‐Ｃ１０アルコキシ、Ｃ４‐Ｃ１０アリールオキシ、Ｃ１‐Ｃ１０アルキルカルボニルオキシ、Ｃ４‐Ｃ１０アリールカルボニルオキシ、Ｃ３‐Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３‐Ｃ８シクロアルキルオキシ、Ｃ２‐Ｃ１０アルケニル、Ｃ２‐Ｃ１０アルキニル、Ｃ４‐Ｃ１０アリール、アミノカルボニル、Ｃ１‐Ｃ１０アルキルカルボニル、Ｃ３‐Ｃ８シクロアルキルカルボニル、Ｃ３‐Ｃ８ヘテロシクロアルキルカルボニル、Ｃ４‐Ｃ１０アリールカルボニル、Ｃ４‐Ｃ１０アリールオキシカルボニル、Ｃ１‐Ｃ１０アルコキシカルボニル、Ｃ３‐Ｃ８シクロアルキルオキシカルボニル、Ｃ３‐Ｃ８ヘテロシクロアルキルオキシカルボニル、Ｃ１‐Ｃ１０アルキルスルホニル、Ｃ４‐Ｃ１０アリールスルホニル、Ｃ１‐Ｃ１０アルキルアミノ、Ｃ３‐Ｃ８ヘテロシクロアルキル、Ｃ４‐Ｃ１０ヘテロアリール等であってよい。
【００４７】
好ましくは、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１‐Ｃ１０アルキル、Ｃ２‐Ｃ１０アルケニル、Ｃ２‐Ｃ１０アルキニル、Ｃ１‐Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１‐Ｃ１０アルコキシカルボニル、Ｃ１‐Ｃ１０アルキルアミノ、Ｃ３‐Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３‐Ｃ８ヘテロシクロアルキル、Ｃ４‐Ｃ１０アリール、及びＣ４‐Ｃ１０ヘテロアリールから選択された一つ以上であってよい。
【００４８】
用語「シクロアルキル」は、炭素原子間での交番や共鳴二重結合なく、３〜１５個の炭素原子、好ましくは、３〜８個の炭素原子を含有するアルキル種である。シクロアルキルは、１〜４個の環を含んでいてよい。例示的なシクロアルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アダマンチル等が含まれる。シクロアルキルの例示的な置換基としては、ハロゲン、Ｃ１‐Ｃ１０アルキル、Ｃ１‐Ｃ１０アルコキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、チオール、Ｃ１‐Ｃ１０アルキルチオ等を挙げることができる。
【００４９】
用語「ヘテロシクロアルキル」は、環炭素が窒素、硫黄、酸素等のヘテロ原子で置換されている置換体であって、飽和又は不飽和７〜１１員二環式複素環式環、又は安定した非芳香族３〜８員単環式複素環式環を意味し、融合、スピロ又は架橋されて追加の環を形成していてよい。各々の複素環は、１個以上の炭素原子と１〜４個のヘテロ原子からなる。ヘテロシクロアルキル基は、安定した構造を創出する任意の環内に結合されてよい。好ましい例としては、フラン、チオフェン、ピロール、ピロリン、ピロリジン、オキサゾール、チアゾール、イミダゾール、イミダゾリン、イミダゾリジン、ピラゾール、ピラゾリン、ピラゾリジン、イソチアゾール、トリアゾール、チアジアゾール、ピラン、ピリジン、ピペリジン、モルホリン、チオモルホリン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ピペラジン、トリアジン等を挙げることができるが、これらのみに限定されるものではない。
【００５０】
用語「アリール」は、共役π電子系を持っている少なくとも一つの環を有しているカルボサイクリックアリール（たとえば、フェニル）とヘテロサイクリックアリール（たとえば、ピリジン）を含む芳香族置換体を意味する。前記用語は、モノサイクリック又は融合環ポリサイクリック（すなわち、炭素原子の隣接した対を分けて持つ環）のグループを含む。アリール基は、炭素環式であってよく、または芳香族環内に任意に１〜４個のヘテロ原子（たとえば、窒素、硫黄又は酸素）を含有していてよく、これを「ヘテロアリール」ともいう。
【００５１】
前記アリール又はヘテロアリールの例としては、フェニル、ナフチル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、キナゾリニル、チアゾリル、ベンゾチオフェニル、フラニル、イミダゾリル、チオフェニル等を挙げることができるが、これらのみに限定されるものではない。
【００５２】
前記シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリールは、任意に置換されていてよく、置換基の例としては、ヒドロキシ、ハロゲン、チオール、シアノ、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、Ｃ１‐Ｃ１０アルキルチオ、Ｃ４‐Ｃ１０アリールチオ、Ｃ１‐Ｃ１０アルキル、Ｃ１‐Ｃ１０アルコキシ、Ｃ４‐Ｃ１０アリールオキシ、Ｃ１‐Ｃ１０アルキルカルボニルオキシ、Ｃ４‐Ｃ１０アリールカルボニルオキシ、Ｃ３‐Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３‐Ｃ８シクロアルキルオキシ、Ｃ２‐Ｃ１０アルケニル、Ｃ２‐Ｃ１０アルキニル、Ｃ４‐Ｃ１０アリール、カルボキシレート、アミノカルボニル、Ｃ１‐Ｃ１０アルキルカルボニル、Ｃ３‐Ｃ８シクロアルキルカルボニル、Ｃ３‐Ｃ８ヘテロシクロアルキルカルボニル、Ｃ４‐Ｃ１０アリールカルボニル、Ｃ４‐Ｃ１０アリールオキシカルボニル、Ｃ１‐Ｃ１０アルコキシカルボニル、Ｃ３‐Ｃ８シクロアルキルオキシカルボニル、Ｃ３‐Ｃ８ヘテロシクロアルキルオキシカルボニル、Ｃ４‐Ｃ１０アリールオキシカルボニル、Ｃ１‐Ｃ１０アルキルスルホニル、Ｃ１‐Ｃ１０アルキルアミノ、Ｃ４‐Ｃ１０アリールスルホニル、Ｃ３‐Ｃ８ヘテロシクロアルキル、Ｃ４‐Ｃ１０ヘテロアリール等を挙げることができるが、これらのみに限定されるものではない。
【００５３】
本発明に係る化合物のうち特に好ましい例としては、下記表１のものを挙げることができるが、これらのみに限定されるものではない。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
本発明に係る組成物に使用される前記ナフトキノン系化合物は、国際特許公開ＷＯ０６／０８８３１５号及びＷＯ０６／０２０７１９号に開示された方法で製造していてよく、その他公知の方法及び／又は有機合成の分野の技術を根幹とした多様な方法により製造されてよい。前記方法を基に、置換基の種類に応じて適切な合成方法を使用して、多様な誘導体を合成してよい。
【００５６】
本明細書において、「難聴」は、伝音性難聴と感覚神経性難聴を含んでいてよく、好ましくは、蝸牛管の音を感知する機能に異常が生じ、又は音による刺激を脳へ伝達する聴神経又は中枢神経系の異常により発生する感覚神経性難聴を含み、特に、老化による老人性難聴及び耳毒性薬物による難聴を含む。
【００５７】
本発明に係る組成物に使用される前記ナフトキノン系化合物は、老人性難聴及び耳毒性薬物による難聴動物モデルにおいて聴性脳幹反応閾値の回復効果を示し、聴覚有毛細胞の細胞枯死を抑制し、ＨＭＧＢ１（ｈｉｇｈ‐ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｂｏｘ‐１）の発現増加を抑制して、老化又は耳毒性薬物による聴力損傷を保護するのに効果を示した。
【００５８】
したがって、本発明による組成物は、難聴の治療又は予防のための薬剤学的組成物として使用されてよい。
【００５９】
本発明に係る薬剤学的組成物は、経口的に（たとえば、服用若しくは吸引）又は非経口的に（たとえば、注射、経皮吸収、直腸投与）投与されてよく、注射は、たとえば、静脈注射、皮下注射、筋肉内注射又は腹腔内注射であってよい。本発明に係る薬剤学的組成物は、投与経路に応じて、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、ファインサブティレ（ｆｉｎｅ  ｓｕｂｔｉｌａｅ）、粉剤、舌下錠剤、坐剤、軟膏、注射剤、乳濁液剤、懸濁液剤、シロップ剤、噴霧剤等に剤形化されてよい。前記様々な形態の本発明に係る薬剤学的組成物は、各剤形に通常的に使用される薬剤学的に許容される担体（ｃａｒｒｉｅｒ）を使用する公知技術によって製造されてよい。薬剤学的に許容される担体の例は、賦形剤、結合剤、崩解剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、潤滑剤、防腐剤、抗酸化剤、等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）、緩衝剤、被膜剤、甘味剤、溶解剤、基剤（ｂａｓｅ）、分散剤、湿潤剤、懸濁化剤、安定剤、着色剤等を含む。
【００６０】
本発明に係る薬剤学的組成物は、薬剤の形態に応じて異なるが、前記ナフトキノン系化合物を約０．０１〜１００重量％含む。
【００６１】
本発明の薬剤学的組成物の具体的な投与量は、治療されるヒトを含む哺乳動物の種類、体重、性別、疾患の程度、医師の判断等に応じて異なってよい。好ましくは、経口投与の場合には、一日に体重１ｋｇあたり有効成分０．００１〜５００ｍｇが投与され、非経口投与の場合には、一日に体重１ｋｇあたり有効成分０．００１〜１０００ｍｇが投与される。前記総一日投与量は、疾患の程度、医師の判断等に応じて、一回で又は数回に分けて投与されてよい。
【００６２】
他の態様により、本発明に係る組成物は、難聴の改善又は予防のための健康機能食品として使用されてよい。
【００６３】
本発明に係る健康機能食品の種類には特別な制限がなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液剤、エマルジョン、シロップ剤等の経口型製剤形態であってもよく、またキャンディー、菓子、ガム、アイスクリーム、麺類、パン、飲料等、一般的な食品に添加されてもよい。
【００６４】
本発明の健康機能食品は、形態に応じて、通常的な方法で、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、甘味剤、芳香剤、保存剤、界面活性剤、潤滑剤、賦形剤等、食品学的に許容される担体を適切に使用して製造されてよい。
【００６５】
前記健康機能食品の製造において、前記ナフトキノン系化合物の含量は、健康機能食品の形態に応じて異なるが、約０．０１〜１００重量％の濃度である。
【発明の効果】
【００６６】
本発明に係るナフトキノン系化合物を含む組成物は、多様な原因による難聴、特に老化による老人性難聴及び耳毒性薬物による難聴の治療又は予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】２ヶ月と１２ヶ月の実験動物の聴性脳幹反応閾値を示したグラフである。
【図２】１５ヶ月の実験動物における実験群間の聴性脳幹反応閾値の変化を測定したグラフである。
【図３】１８ヶ月の実験動物における実験群間の聴性脳幹反応閾値の変化を測定したグラフである。
【図４】２１ヶ月の実験動物における実験群間の聴性脳幹反応閾値の変化を測定したグラフである。
【図５】２４ヶ月の実験動物における実験群間の聴性脳幹反応閾値の変化を測定したグラフである。
【図６】老化による聴覚有毛細胞の細胞枯死に対するβ‐ラパコン（βＬ）の抑制効果を示した図である。
【図７】老化によるＨＭＧＢ１の発現増加に対するβ‐ラパコン（βＬ）の抑制効果を示した図である。
【図８】６週齢の実験動物における実験群間の聴性脳幹反応閾値の変化を測定したグラフである。
【図９】シスプラチン（ＣＤＤＰ）による聴覚有毛細胞の細胞枯死に対するβ‐ラパコン（βＬ）の抑制効果を示したグラフである。
【図１０】シスプラチン（ＣＤＤＰ）による炎症媒介分子の発現増加に対するβ‐ラパコン（βＬ）の抑制効果を示した図である。
【図１１】マウスにおけるシスプラチン（ＣＤＤＰ）によるＨＳＰ６０の放出増加に対するβ‐ラパコン（βＬ）の抑制効果を示したグラフである。
【図１２】ＨＥＩ‐ＯＣ１細胞におけるシスプラチン（ＣＤＤＰ）によるＨＳＰ６０の放出増加に対するβ‐ラパコン（βＬ）の抑制効果を示したグラフである。
【図１３】シスプラチン（ＣＤＤＰ）による聴覚有毛細胞の細胞枯死におけるＨＳＰ６０の役割を示したグラフである。
【図１４】シスプラチン（ＣＤＤＰ）によるＨＭＧＢ１の放出増加に対するβ‐ラパコン（βＬ）の抑制効果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
以下、実施例により、本発明についてより具体的に説明することとする。これらの実施例は、単に本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないということは、当業者にとって自明である。
【００６９】
＜実験例１：老人性難聴動物モデル実験＞
〔実験例１‐１：実験動物の準備〕
本実験には、年齢に伴う聴力損傷モデルとしてよく知られているＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。１２ヶ月のＣ５７ＢＬ／６マウスを中央実験動物社（韓国）から直接購入して２４ヶ月まで飼育しつつ、３ヶ月ごとに聴力を測定した。実験に使用したすべてのマウスは、恒温（２２〜２６℃）及び恒湿（５５〜６０％）となる無菌動物室で飼育した。
【００７０】
実験群は、正常的な飼料を自由に与えられた群（対照群）、食餌を７０％に制限した群（カロリー制限群（ｃａｌｏｒｉｃ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）：ＣＲ群）と、０．０６％のβ‐ラパコン（化合物１）を含む飼料を与えられた群（βＬ群）とに分けてすべての実験を行った。
【００７１】
〔実験例１‐２：聴性脳幹反応（Ａｕｄｉｔｏｒｙ  Ｂｒａｉｎｓｔｅｍ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ＡＢＲ）の閾値変化〕
本実験では、聴性脳幹反応検査のために、すべての実験動物をキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）（５ｍｇ／ｋｇ）とケタミン（３０ｍｇ／ｋｇ）の混合液で筋肉麻酔を施行し、防音室でＴＤＴシステム（Ｔｕｃｋｅｒ‐Ｄａｖｉｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＦＬ、ＵＳＡ）を使用して聴性脳幹反応閾値の変化を測定した。
【００７２】
挿入型イヤーチップ（ｅａｒ  ｔｉｐ）（３．５ｍｍ，  Ｎｉｃｏｌｅｔ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，  Ｉｎｃ．）を外耳道に位置させ、電極は、活動電極を頭頂部に、基準電極は測定する耳の後外部に、接地電極は反対側の耳の後外部に位置させた後、４、８、１６及び３２ｋＨｚで、９０ｄＢ  ＨＬの強さから１０ｄＢずつ下げながら閾値を測定した。
【００７３】
ＡＢＲ検査中、覚醒所見を見せたり、呼吸抑制で死亡したりしたケースはなく、グループ間のＡＢＲ閾値の比較は、一元配置分散分析（ｏｎｅ‐ｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ）（ＡＮＯＶＡ）検定を施行し、Ｐ値０．０５以下を有意なものとして受け入れた。
【００７４】
図１に示したところのように、１２ヶ月の実験動物の基準聴力は、２ヶ月の実験動物の聴力に比べて、前半部において聴性脳幹反応閾値が平均１０ｄＢ  ＳＰＬ以上、統計的に有意に上昇した。
【００７５】
その後、１５ヶ月の実験動物において、３つの実験群ごとに聴性脳幹反応閾値の変化を測定した。その結果、図２に示したところのように、４、８、１６及び３２ｋＨｚにおいて測定した聴性脳幹反応閾値が、対照群ではそれぞれ７０±１０、３３．３３±５．７７、４０±１０及び５０±１０ｄＢ  ＳＰＬ、βＬ郡ではそれぞれ６３．３３±１１．５５、３３．３３±１５．２８、４６．６７±５．７７及び５３．３３±５．７７ｄＢ  ＳＰＬ、ＣＲ群ではそれぞれ５３．３３±１１．５５、３３．３３±５．７７、２６．６７±１１．５５及び３６．６７±５．７７ｄＢ  ＳＰＬで、対照群に比べて３２ｋＨｚのみにおいて統計的に有意に聴性脳幹反応閾値の回復を見せた（ｐ＜０．０５）。
【００７６】
１８ヶ月の実験動物において、３つの実験群ごとに聴性脳幹反応閾値の変化を測定した結果、図３に示したところのように、４、８、１６及び３２ｋＨｚにおいて測定した聴性脳幹反応閾値が、対照群ではそれぞれ８０±１０、６３．３３±５．７７、７６．６７±５．７７及び８０±１０ｄＢ  ＳＰＬ、βＬ群ではそれぞれ８０±０、４６．６７±１１．５５、５６．６７±１１．５５及び６６．６７±１１．５５ｄＢ  ＳＰＬ、ＣＲ群ではそれぞれ７３．３３±５．７７、４３．３３±５．７７、４３．３３±５．７７及び５６．６７±５．７７ｄＢ  ＳＰＬで、対照群に比べて８〜３２ｋＨｚにおいて統計的に有意に聴性脳幹反応閾値の回復を見せた（ｐ＜０．０５）。
【００７７】
その後、２１ヶ月の実験動物において、３つの実験群ごとに聴性脳幹反応閾値の変化を測定した結果、図４に示したところのように、４、８、１６及び３２ｋＨｚにおいて測定した聴性脳幹反応閾値が、対照群ではそれぞれ８６．６７±５．７７、７３．３３±５．７７、７３．３３±５．７７及び８０±０ｄＢ  ＳＰＬ、βＬ群ではそれぞれ５６．６７±５．７７、４６．６７±５．７７、５３．３３±１５．２８及び４６．６７±５．７７ｄＢ  ＳＰＬで、対照群に比べて１６ｋＨｚを除いた残りの領域において統計的に有意に聴性脳幹反応閾値の回復を見せ（ｐ＜０．０５）、ＣＲ群ではそれぞれ７３．３３±５．７７、５６．６７±５．７７、５６．６７±５．７７及び７３．３３±１１．５５ｄＢ  ＳＰＬで、対照群に比べて３２ｋＨｚを除いた残りの領域において統計的に有意に聴性脳幹反応閾値の回復を見せた（ｐ＜０．０５）。
【００７８】
２４ヶ月の実験動物において、３つの実験群ごとに聴性脳幹反応閾値の変化を測定した結果、図５に示したところのように、４、８、１６及び３２ｋＨｚにおいて測定した聴性脳幹反応閾値が、対照群ではそれぞれ８６．６７±５．７７、８３．３３±５．７７、８３．３３±５．７７及び９０±０ｄＢ  ＳＰＬ、βＬ群ではそれぞれ７３．３３±５．７７、４３．３３±５．７７、５３．３３±５．７７及び５３．３３±１１．５５ｄＢ  ＳＰＬで、対照群に比べてすべての領域において統計的に有意に聴性脳幹反応閾値の回復を見せ（ｐ＜０．０５）、４ｋＨｚを除く８〜３２ｋＨｚにおいては対照群に比べて３０ｄＢ  ＳＰＬ以上聴性脳幹反応閾値が回復した。一方、ＣＲ群ではそれぞれ８３．３３±５．７７、６３．３３±５．７７、８３．３３±５．７７及び８３．３３±１１．５５ｄＢ  ＳＰＬで、対照群に比べてただ８ｋＨｚの領域のみにおいて統計的に有意に聴性脳幹反応閾値の回復を見せた（ｐ＜０．０５）。
【００７９】
〔実験例１‐３：有毛細胞及びミトコンドリアの損傷確認〕
有毛細胞の損傷を確認するために実験動物の内耳を摘出した後、蝸牛の尖部から中間回転部分を対象に、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）‐媒介ｄＵＴＰニック末端標識（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ‐ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄＵＴＰ  ｎｉｃｋ  ｅｎｄ‐ｌａｂｅｌｉｎｇ）（ＴＵＮＥＬ）染色を行った後、蛍光顕微鏡でＴＵＮＥＬ陽性細胞を分析した。
【００８０】
その結果、図６に示したところのように、２４ヶ月になった実験動物の対照群では、外有毛細胞と内有毛細胞をはじめとする周辺細胞の細胞枯死が観測されたのに対し、βＬ群では、内耳前半部において老化に伴う細胞枯死が大幅に抑制されることを観察することができた。
【００８１】
また、β‐ラパコンにより老化に伴うミトコンドリアの損失が抑制されるかを確認するために、２４ヶ月になった実験動物の３つの実験群において、透過型電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＴＥＭ）を通じてミトコンドリアの形態的変形検査を施行した。
【００８２】
その結果、２４ヶ月になった実験動物の対照群とＣＲ群では２ヶ月になった実験動物と比較して確然と多くの数のミトコンドリアが消失又は破損したのに対し、２４ヶ月になったβＬ群では、他の実験群と異なり、２ヶ月になった実験動物と類似した数と形態のミトコンドリアを観察することができた。
【００８３】
こうした結果は、β‐ラパコンが老化に伴う有毛細胞及びミトコンドリアの損傷を抑制することを明確に示している。
【００８４】
〔実験例１‐４：ＨＭＧＢ１の発現分析〕
ミトコンドリアの損傷及び形態変換に重要であると知られているＨＭＧＢ１の発現に及ぼすβ‐ラパコンの効果を調べるために、組織染色を行った。
【００８５】
その結果、図７に示したところのように、２１ヶ月になった実験動物の対照群とＣＲ群では、２ヶ月になった実験動物と比較してＨＭＧＢ１の発現が内耳前半部にかけて確然と増加した一方、２１ヶ月になったβＬ群では、他の実験群よりもＨＭＧＢ１の発現が顕著に減少していることを観察することができた。
【００８６】
したがって、β‐ラパコンは、老化に伴うＨＭＧＢ１の発現増加を抑制することにより、内耳組織にある細胞の細胞枯死とミトコンドリアの数及び形態変形を抑制して、老化に伴う聴力損傷を保護するのに優れた効果があることを確認することができた。
【００８７】
＜実験例２：耳毒性薬物（シスプラチン）による難聴動物モデル実験＞
〔実験例２‐１：実験動物の準備〕
本実験には、６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。実験に使用したすべてのマウスは、恒温（２２〜２６℃）及び恒湿（５５〜６０％）となる無菌動物室で飼育した。
【００８８】
実験群は、ＰＢＳのみを注射した群（対照群）、シスプラチン（４ｍｇ／ｋｇ／日）を４日間腹腔に注射した群（ＣＤＤＰ群）、β‐ラパコン（１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇ）とシスプラチンを４日間注射した群、並びにβ‐ラパコン（４０ｍｇ／ｋｇ）のみを注射した群（βＬ群）に分けて実験を行った。
【００８９】
〔実験例２‐２：聴性脳幹反応の閾値変化〕
ＡＢＲ検査は、実験例１‐２と同一の方法ですべての薬物を注射する前と薬物を与えた後の閾値の変化量を測定し、グループ間のＡＢＲ閾値変化の比較は、一元配置分散分析（ｏｎｅ‐ｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ）（ＡＮＯＶＡ）検定を実施し、Ｐ値０．０５以下を有意なものとして受け入れた。
【００９０】
図８に示したところのように、シスプラチンのみを投与した群（ＣＤＤＰ群）では、すべての領域において聴性脳幹反応閾値が平均３０ｄＢ  ＳＰＬ以上上昇したのに対し、β‐ラパコンとシスプラチンをともに与えた実験群では、すべての領域においてＣＤＤＰ群に比べて統計的に有意に聴性脳幹反応閾値の回復を見せた（ｐ＜０．０５）。また、対照群では、すべての領域においてはっきりとした聴性脳幹反応閾値の変化が見られず、βＬ群でも、対照群と同様、すべての領域において微々たる聴性脳幹反応閾値の変化のみが観察された。
【００９１】
〔実験例２‐３：聴覚有毛細胞の損傷確認〕
β‐ラパコンのシスプラチンによる聴力損傷保護効果が直接的に聴覚有毛細胞の細胞死を抑制するのかを確認するために、聴覚有毛細胞株であるＨＥＩ‐ＯＣ１細胞に、多様な濃度のβ‐ラパコンを３０分前に処理した後、シスプラチンに対する細胞生存率をＭＴＴ方法により測定した。
【００９２】
その結果、図９に示したところのように、β‐ラパコンの単独処理は、２μＭ濃度までＨＥＩ‐ＯＣ１細胞の生存率に影響を及ぼさず、β‐ラパコンがシスプラチン処理による細胞死を濃度依存的に保護することを確認することができた（ｐ＜０．０５）。
【００９３】
また、コルチ器官の体外移植片（ｅｘｐｌａｎｔ）においてもシスプラチン処理時に外有毛細胞と内有毛細胞の形態と配列の変化が発見されたのに対し、β‐ラパコンをシスプラチンとともに処理した実験群では、聴覚有毛細胞の形態と配列が、対照群と類似に維持されることを確認した。
【００９４】
〔実験例２‐４：炎症媒介分子の発現分析〕
シスプラチンによる聴力損傷に重要な因子として知られている炎症媒介分子の発現をＰＣＲ方法により確認してみた。多様な濃度のβ‐ラパコンを３０分前に処理した後、シスプラチンによる炎症媒介分子の発現をＰＣＲ方法により測定した。
【００９５】
その結果、図１０に示したところのように、シスプラチンを処理したＨＥＩ‐ＯＣ１細胞では、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６及びＨＳＰ６０といった炎症を誘発するサイトカインと、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４といった炎症媒介受容体の発現が増加すること確認し、これらもまたβ‐ラパコンの濃度依存的に抑制されることを確認した。
【００９６】
一般的に、ミトコンドリアに存在しているＨＳＰ６０は、細胞外部へ放出されると、ＴＬＲ２やＴＬＲ４と結合しつつ強力な炎症反応を誘発するものと知られている。したがって、マウスやＨＥＩ‐ＯＣ１細胞におけるＨＳＰ６０の量をＥＬＩＳＡ方法を通じて確認した結果、それぞれ図１１及び図１２に示したところのように、シスプラチンを処理したマウスやＨＥＩ‐ＯＣ１細胞では、ＨＳＰ６０の放出が顕著に増加した（ｐ＜０．０５）。しかし、β‐ラパコンをともに処理してやったマウスやＨＥＩ‐ＯＣ１細胞では、β‐ラパコンの濃度依存的にＨＳＰ６０の放出が減少した。
【００９７】
また、細胞染色を通じてＨＳＰ６０の位置変化を確認してみた結果、正常細胞（対照群）では、ＨＳＰ６０がほぼすべてミトコンドリアにおいて発現するのに対し、シスプラチンを処理した細胞では、ＨＳＰ６０が大部分細胞質において発現することを確認することができ、β‐ラパコンとシスプラチンをともに処理した細胞では、ＨＳＰ６０が正常細胞と同様にミトコンドリアのみにおいて発現することを確認することができた。
【００９８】
次に、かかるＨＳＰ６０が直接的にシスプラチンによる聴覚細胞の死に影響を及ぼすかを確認するために、ＨＳＰ６０抗体をシスプラチンとともに処理し、細胞生存率をＭＴＴ方法により測定した結果、図１３に示したところのように、シスプラチンによるＨＥＩ‐ＯＣ１細胞の死がＨＳＰ６０抗体の処理により抑制されることを確認した（ｐ＜０．０５）。
【００９９】
ＨＭＧＢ１は、ＨＳＰ６０とともに、ＴＬＲの活性とそれによる炎症反応に重要な媒介体として知られている。したがって、ＨＭＧＢ１の細胞外放出をＥＬＩＳＡ方法により確認してみた結果、図１４に示したところのように、シスプラチンを処理したＨＥＩ‐ＯＣ１細胞では、過量のＨＭＧＢ１が細胞外へ放出されることを確認することができ、これもまたβ‐ラパコンの濃度依存的に減少することを確認することができた（ｐ＜０．０５）。
【０１００】
したがって、β‐ラパコンは、様々な炎症反応媒体の発現を抑制することにより、シスプラチンによる聴覚有毛細胞の死や聴力損傷を保護するのに優れた効果があることを確認することができた。
【図１】
0005564118.tif 000029
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0005564118.tif 000035
【図８】
0005564118.tif 000036
【図９】
0005564118.tif 000037
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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