(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶媒において高濃度の溶液中における可逆的に会合する巨大分子の自己会合を特徴付けるための方法であって、
１．対象となる分子の溶液の一連のｋのアリコートを濃度ｃf,ｆ＝１…ｋで光散乱光度計に導入するステップを含み、前記光散乱光度計は、
ｉ．注入された各々の希釈アリコートを光線で照らし、
ｉｉ．そこから散乱した光の強度を、感光性検出器が配置されている１つ以上の角度位置θで検出し、前記方法はさらに、
２．各々の希釈アリコートｆの濃度ｃfを決定するステップと、
３．前記検出された散乱光の強度から過剰なレイリー比Ｒ（ｃf,θ）を形成するステップと、
４．ｋの希釈液ｃf,ｆ＝１…ｋにより熱力学的非理想性を補正するよう前記過剰なレイリー比を
【数１】
0005500365.tif 000044
として表現するステップとを含み、式中、Ｍは単量体のモル質量であり、ｉは、自己会合する各々のｉ−量体（ｉ−ｍｅｒ）の次数であり、ｃf,iは、ｆ番目の希釈アリコート中のｉ−量体（ｉ−ｍｅｒ）の部分平衡濃度であり、
【数２】
0005500365.tif 000045
であり、λは照明光線の波長であり、
【数３】
0005500365.tif 000046
は、ｉ−量体（ｉ−ｍｅｒ）の平均二乗半径であり、
【数４】
0005500365.tif 000047
であり、ｎは前記溶液の屈折率であり、ＮAはアボガドロ数であり、ｄｎ／ｄｃは前記溶液中の前記巨大分子の屈折増分であり、前記方法はさらに、
５．平衡会合定数、会合の化学量論、不適格な画分、第２および第３ビリアル係数、ならびにモル質量のうちのいくつかまたはすべてを決定するために、前記過剰なレイリー比の前記表現を会合モデルの方程式に適合させるステップを含む、方法。
【請求項２】
Ａ2が、分子構造から得られる分子半径ｒの推定値に基づいて、除外された容積値
【数５】
0005500365.tif 000048
として推定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ａ2が、動的光散乱、示差粘度測定または同様の実験技術によって決定される流体力学半径に対応する分子半径ｒの推定値に基づいて、除外された容積値、
【数６】
0005500365.tif 000049
として推定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ａ3が０に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
【数７】
0005500365.tif 000050
がすべてのｉ−量体（ｉ−ｍｅｒ）について０に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
【数８】
0005500365.tif 000051
が、Ｒ（ｃf,θ）の分母においてのみすべてのｉ−量体（ｉ−ｍｅｒ）について０に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アリコートが手作業で準備され、シンチレーションバイアルによって検出器に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アリコートが手作業で準備され、ポンプによって検出器に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アリコートが準備され、最も高い所望の濃度で貯蔵溶液を希釈する複式ポンプによって自動的に検出器に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記濃度を決定するステップは、
ａ．光散乱光度計に沿って濃度検出器を配置するステップと、
ｂ．光散乱光度計および濃度検出器の両方のフローセルを満たすように十分な容積の希釈アリコートを注入するステップと、
ｃ．前記濃度検出器から信号を検出するステップと、
ｄ．巨大分子の既知の応答係数に基づいて信号を濃度に変換するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記濃度を決定するステップは、
ａ．濃度検出器において高濃度溶液の濃度を測定するステップと、
ｂ．希釈手順のパラメータから各々の希釈アリコートの濃度ｃjを計算するステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記濃度検出器がＵＶ／可視光吸光光度計を含み、前記応答係数が吸収係数である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記濃度検出器が示差屈折計を含み、前記応答係数が屈折増分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記適合させるステップは、レーベンバーグ・マルカート（Levenberg-Marquardt）非
線形最小二乗適合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
溶媒において高濃度の溶液中における可逆的に会合する２つの巨大分子種のヘテロ会合を特徴付けるための方法であって、
１．各々の巨大分子種の高濃度溶液を含有する貯蔵器と、前記溶媒を含有する別の貯蔵器とを準備するステップと、
２．前記溶媒および前記高濃度溶液のアリコートを混合することにより前記高濃度溶液の一連のｋの組成アリコート［ｃXf,ｃXf］,ｆ＝１…ｋを準備するステップとを含み、各々の組成アリコートは、濃度ｃXfの巨大分子Ｘおよび濃度ｃYfの巨大分子Ｙを含み、前記方法はさらに、
３．前記組成アリコートを連続的に光散乱光度計に注入するステップを含み、前記光散乱光度計は、
ｉ．注入された各々の希釈液を光線で照らし、
ｉｉ．そこから散乱した光の強度を、感光性検出器が配置されている１つ以上の角度位置で検出し、前記方法はさらに、
４．濃度検出器による各組成アリコートｆの組成［ｃXf,ｃYf］と、前記溶液中の前記巨大分子の応答係数とを決定するステップと、
５．前記検出された散乱光強度から過剰なレイリー比Ｒ（ｃXf,ｃYf,θ）を形成するステップと、
６．前記ｋの希釈液ｃf,ｆ＝１…ｋにより熱力学的非理想性を補正するよう前記過剰なレイリー比を
【数９】
0005500365.tif 000052
として表現するステップとを含み、式中、Ｍは単量体のモル質量であり、ｉおよびｊはＸｉＹｊ錯体の化学量論比であり、ｃf,ijは、ｆ番目の組成アリコートでのＸｉＹｊ錯体の部分平衡濃度であり、
【数１０】
0005500365.tif 000053
であり、λは照明光線の波長であり、
【数１１】
0005500365.tif 000054
は、ＸｉＹｊ錯体の平均二乗半径であり、
【数１２】
0005500365.tif 000055
であり、ｎは前記溶液の屈折率であり、ＮAはアボガドロ数であり、ｄｎ／ｄｃXおよびｄｎ／ｄｃYは前記溶液中の前記巨大分子ＸおよびＹの屈折増分であり、前記方法はさらに、
７．平衡会合定数、会合の化学量論、不適格な画分、第２ビリアル係数、およびモル質量のうちのいくつかまたはすべてを決定するために、前記過剰なレイリー比の前記表現を会合モデルの方程式に適合させるステップを含む、方法。
【請求項１６】
Ａ2,XおよびＡ2,Yは、それぞれ、分子構造から得られる分子半径ｒXおよびｒYの推定値に基づいて、除外された容積値
【数１３】
0005500365.tif 000056
として推定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ａ2,XおよびＡ2,Yは、動的光散乱、示差粘度測定または同様の実験技術によって決定される流体力学半径に対応する分子半径ｒXおよびｒYの推定値に基づいて、除外された容積値
【数１４】
0005500365.tif 000057
として推定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
【数１５】
0005500365.tif 000058
は、すべてのｉｊについて、Ｒ（ｃf,θ）の分母において０に設定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
【数１６】
0005500365.tif 000059
は、すべてのｉｊについて、Ｒ（ｃf,θ）の分子および分母において０に設定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記アリコートが手作業で準備され、シンチレーションバイアルによって検出器に導入される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記アリコートが手作業で準備され、ポンプによって検出器に導入される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記アリコートが準備され、溶媒、および最も高い所望の濃度の分子ＸおよびＹの貯蔵溶液を吸込み、これらの溶液を所望の組成に混合し、次にアリコートを検出器に送達する３連ポンプによって自動的に検出器に導入される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成を決定するステップは、
ａ．光散乱光度計に沿って濃度検出器を配置するステップと、
ｂ．光散乱光度計および濃度検出器の両方のフローセルを満たすように十分な容積の組成アリコートを注入するステップと、
ｃ．前記濃度検出器から信号を検出するステップと、
ｄ．巨大分子の既知の応答係数および混合手順によって規定されるそれらの比率に基づいて信号を組成［ｃXf,ｃYf］に変換するステップとを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成を決定するステップは、
ａ．光散乱光度計に沿って濃度検出器を配置するステップを含み、濃度検出器は、分子が有する２つの無関係の特性に感受性があり、前記組成を決定するステップはさらに、
ｂ．光散乱光度計および濃度検出器の両方のフローセルを満たすように十分な容積の組成アリコートを注入するステップと、
ｃ．前記濃度検出器から信号を検出するステップと、
ｄ．前記無関係の特性に対する巨大分子の既知の応答係数に基づいて信号を組成［ｃXf,ｃYf］に変換するステップとを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記２つの特性が、２つの異なる波長の分光吸光度である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記２つの特性が、１つの波長における分光吸光度、および屈折増分である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成を決定するステップは、
ａ．濃度検出器において各々の高濃度溶液を測定するステップと、
ｂ．アリコート混合手順のパラメータから各々の組成アリコートの組成［ｃXf,ｃYf］
を計算するステップとを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
前記濃度検出器がＵＶ／可視光吸光光度計を含み、前記応答係数が吸収係数である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
前記濃度検出器が示差屈折計を含み、前記応答係数が屈折増分である、請求項１５に記載の方法。
【請求項３０】
前記適合させるステップが、レーベンバーグ・マルカート非線形最小二乗適合を含む、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
たとえばタンパク質、多糖類、合成高分子などの巨大分子は、溶液中でさまざまなタイプの相互作用を受ける。非特異的で反発的なこれらの相互作用のうちいくつかは、一般に「熱力学的非理想性（thermodynamic non-ideality）」と称される。中には、特異的であろうと非特異的であろうと、誘引的であり、可逆的会合をもたらすものがあり、この場合、単量体と会合された錯体との部分的濃度の比が、溶液中の分子の全体濃度、分子の特有の特性および溶媒に左右される平衡状態に達する。さらに、可逆的会合状態は、溶液の官能性に影響を及ぼす。たとえば、製薬産業においては、可逆的な抗体オリゴマーを存在させることにより溶液粘性を高める場合があるが、これは、これらの抗体を含有する治療製剤の製造および送達に悪影響を及ぼす。抗体薬剤のオリゴマー形態は免疫原性リスクの高まりを示す可能性がある。このような巨大分子について、平衡会合定数および会合化学量論の形で会合状態を決定することは、基礎をなす相互作用を理解および制御するのに必須の工程である。
【０００２】
溶液中の非可逆的な集合体または強固に結合された錯体を特徴付けるための標準的な方法、たとえば、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ：size-exclusion chromatography）、多角度静的光散乱との併用型ＳＥＣ（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ：SEC in combination with multi-angle static light scattering）、または沈殿速度（ＳＶ：sedimentation velocity）などは、不十分な可逆的会合には適用することができない。というのも、これらの特徴付け技術は、希釈や、錯体の分離につながり、これにより平衡状態からのずれを招いてしまうからである。
【０００３】
強力に相互作用する可逆的会合を特徴付けることで公知である一般的な方法には、沈降平衡法（ＳＥ：sedimentation equilibrium）、等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ：isothermal titration calorimetry）、および組成勾配多角度静的光散乱（ＣＧ−ＭＡＬＳ：composition gradient multi-angle static light scattering）が含まれる。ＳＥでは、分子の溶液を分析用超遠心分離機に配置し、極めて高速で回転させて、平衡分布を形成し、これを記録して分析する。分布の特定形状には、自己会合する単量体および錯体の量や、会合化学量論についての情報が含まれている。ＩＴＣでは、自己会合の場合、溶液が溶媒に対して滴定されるか、または、ヘテロ会合の場合、初めに巨大分子を１つしか含まない溶液が第２の巨大分子に対して滴定され、そして、溶液が発するかまたは吸収する熱の量が測定される。この熱測定および滴定曲線の対応する形状、すなわち、熱対滴定容積および濃度は、相互作用の強さおよび会合化学量論についての必要な情報を含んでいるが、但し、典型的には、化学量論だけを特徴付ければよい。ＣＧ−ＭＡＬＳでは、一連の希釈液が準備され、ＭＡＬＳ検出器に送達される。濃度に対する散乱光強度の依存性を分析して、会合化学量論と平衡会合定数とを決定することもできる。ＣＧ−ＭＡＬＳは、沈降平衡させるのにさほど長い平衡時間を必要としないので、特に有用な技術となる。加えて、ＣＧ−ＭＡＬＳは、結果として複数のオリゴマー状態をもたらす会合と、同時に起こる自己会合およびヘテロ会合とを決定するには、ＩＴＣよりも優れている。会合の相互作用が強力である場合、溶液は、通常、低濃度で特徴付けられる。しかしながら、会合の相互作用が、抗体薬剤調合の場合によく見られるように弱いものである場合、溶液は、しばしば１０〜１００ｇ／Ｌの範囲で高濃度で特徴付けられなければならない。
【０００４】
１ｇ／Ｌを上回る分子濃度では、非特異的で、典型的には反発的な相互作用が有意なものとなり、ＳＥ、ＩＴＣおよびＣＧ−ＭＡＬＳの可逆的会合の測定に影響を及ぼすこととなる。したがって、しばしば、分析時に非特異的な相互作用の原因にもなるはずである濃度範囲で弱い会合の特徴付けを行なわなければならない。
【０００５】
非特異的な相互作用を受けた溶液中の複数種による光の静的散乱を説明する理論は、「変動理論（fluctuation theory）」として公知であるが、カークウッド（Kirkwood）およびゴールドバーグ（Goldberg）によって化学物理学ジャーナル（J. Chem. Phys.：Journal of Chemical Physics）（第１８巻、５４〜５９頁、１９５０年）に記載されている。単一の非会合種に対する希釈条件下で変動理論を光散乱に適用することは周知であり、わずかに３つのパラメータ、すなわち、モル質量、平均二乗半径および第２ビリアル係数しか必要としない。溶液濃度が上昇すると、より高次のビリアル係数が使用されなければならず、分析を連続的に行なうことがより困難になる。ミントン（Minton）により生物物理学ジャーナル（Biophys. J.：Biophysical Journal）（第９３巻、１３２１〜１３２８頁、２００７年）に記載された単純化は、「有効剛体球近似（effective hard sphere approximation）」またはＥＨＳＡとして公知であり、分子間の非特異的相互作用が、分子の実半径とは異なり得る有効半径を有する不透過性球体の非特異的相互作用に等しいものであると想定している。ＥＨＳＡの枠組みは、他の場合には処理し難い、１０〜１５０ｇ／Ｌの高濃度でのＣＧ−ＭＡＬＳおよび他のデータの解釈に有用である。フェルナンデス（Fernandez）およびミントンは、生物物理学ジャーナル（Biophysical J.：Biophysical Journal）（第９６巻、１９９２〜１９９８頁、２００９年）において、ＥＨＳＡと組合された変動理論が、７０ｇ／Ｌまでの濃度での１つまたは２つのオリゴマー状態に対するタンパク質の可逆的な自己会合についてのＣＧ−ＭＡＬＳ分析にうまく適用され得ることを示している。
【０００６】
組合された変動／ＥＨＳＡ理論は厳密なものであるが、単量体および錯体を含む２または３を上回る数の種を処理しなければならない場合には数学的に非常に複雑になる。さらに多くの重要なシステムでは、会合についての複数の化学量論が呈示されており、すなわち、単量体といくつかの錯体との間の平衡状態が同時に達成される。一例として、二量体、三量体、四量体などを高次のオリゴマーに至るまで形成する漸進的な自己会合が挙げられる。別の例として、同時に起こる自己会合およびへテロ会合が挙げられる。これらの場合について完全な変動理論方程式を詳細に書き出すことだけでなく、以下の方程式１の複素方程式によってデータを分析することももちろん、極めて困難である。
【０００７】
したがって、ＣＧ−ＭＡＬＳを用いて高濃度の巨大分子の可逆的な会合を分析するための方法は、熱力学的非理想性についてのより扱いやすい表現を用いているにもかかわらず、会合定数および化学量論についての標的を正確に決定するものであり、有利なものとなるだろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】化学物理学ジャーナル（Journal of Chemical Physics）第１８巻、５４〜５９頁（１９５０年）
【非特許文献２】生物物理学ジャーナル（Biophysical Journal）第９３巻、１３２１〜１３２８頁（２００７年）
【非特許文献３】生物物理学ジャーナル（Biophysical Journal）第９６巻、１９９２〜１９９８頁（２００９年）
【発明の概要】
【０００９】
この発明は、複雑な複数の化学量論を簡易に分析するのに適した非常に扱いやすい形で、可逆的に会合する高濃度の溶液からＣＧ−ＭＡＬＳデータを表現する方法を提供する。
【００１０】
加えて、この発明の方法を用いることにより、上述の扱いやすい表現を用いたＣＧ−ＭＡＬＳにより、高濃度の巨大分子溶液についての平衡会合パラメータ、すなわち、会合錯体の化学量論、平衡会合定数および存在する不適格な画分の基準が決定される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】可逆的に自己会合する種の溶液の非理想性を表現するための方法を示すフロー図である。
【図２】可逆的錯体を形成する２つの成分種の溶液についての非理想性を表現するための方法を示すフロー図である。
【図３】可逆的な会合がなされた１つ以上の種の平衡会合パラメータを決定するのに用いられる装置を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
理論的説明
多成分の静的光散乱についての一般化された変動理論の結果は、入射光が垂直に平面偏光され、入射光の方向に対して角度θをなす水平面において観察がなされるものと想定すると、以下の通りである。
【００１３】
【数１】
0005500365.tif 000002
【００１４】
ここで、Ｒ（ｃX,θ）は、組成ｃXの巨大分子の溶液から如何なる散乱角度でも検出される過剰なレイリー比（Rayleigh ratio）を表わしている。この場合、Ｘはさまざまな単量体種を表わし、ｃXは、各々の種の重量／体積濃度［ｃ1，ｃ2，ｃ3…］の全体を表わし、過剰なレイリー比は、溶液のレイリー比と純溶媒のレイリー比との差であり、溶液のレイリー比は、
【００１５】
【数２】
0005500365.tif 000003
【００１６】
であり、Ｉは、入射強度Ｉのために散乱する地点からの距離ｒsにおいて観察される単位立体角ごとの分散光の強度であり、ｖは分散量であり、
【００１７】
【数３】
0005500365.tif 000004
【００１８】
であり、ｎ0は溶液の屈折率であり、ＮAはアボガドロ数であり、λ0は真空中における入射光の波長であり、ｍおよびｎは、自由な単量体および錯体を含んで存在するさまざまな種を表わし、ｃnは、単位体積当たりの質量単位でのｎ番目の種の重量濃度であり、Ｑ1,m,nは、概してｍおよびｎ個の分子内におけるサイズおよび質量の分布に依存する散乱角θの何らかの関数であり、θが０（ゼロ）に近づくかまたは全体のサイズが、
【００１９】
【数４】
0005500365.tif 000005
【００２０】
よりもはるかに小さくなるにつれて１の値に近づく。
【００２１】
【数５】
0005500365.tif 000006
【００２２】
この場合、δm,nは、ｍ＝ｎであれば１に等しく、それ以外の場合には０に等しくなる。γnは、成分ｎの熱力学的活量であり、Ｑ2,m,nは、概してｍおよびｎ個の分子内におけるサイズおよび質量の分布に依存するθの何らかの関数であり、θが０に近づくかまたはサイズが、
【００２３】
【数６】
0005500365.tif 000007
【００２４】
よりもはるかに小さくなるにつれて１の値に近づく。
【００２５】
【数７】
0005500365.tif 000008
【００２６】
ｄｎ／ｄｃmは、ｍ番目の種の示差屈折率増分である。ｍ番目の種がタイプＸのｉx単量体、タイプＹのｉY単量体などからなるヘテロ錯体である場合、ｄｎ／ｄｃmは、成分分子についての寄与する屈折率増分の重量平均である。屈折増分の重量平均は、
【００２７】
【数８】
0005500365.tif 000009
【００２８】
であり、この場合、下付き文字Ｘは異なる成分の単量体を指している。方程式（１）は、行列式および副行列式に多くの項が組込まれているために、存在する種の数が２または３を上回っている場合には非常に複雑になる。
【００２９】
【数９】
0005500365.tif 000010
【００３０】
上述の式は、熱力学的非理想性につながる、巨大分子種ｍとｎとの間の本質的な特異的相互作用容積Ｖinteraction／（Ｍm＋Ｍn）を表わしていると理解され得る。
【００３１】
【数１０】
0005500365.tif 000011
【００３２】
に寄与するものとして、中核をなす反発力、さらにはさまざまな静電的かつ変動的な双極子相互作用が含まれる。少なくとも中間的なイオン強度をもつ溶液においては、長期にわたる相互作用が十分にスクリーニングされ、非理想性が短期にわたる相互作用によって支配される。この条件では、特異的相互作用の容積は、質量の合計で割られる分子容積の合計にほぼ比例しており、これは、有効な分子密度
【００３３】
【数１１】
0005500365.tif 000012
【００３４】
によって表わされ得る。
溶液中のさまざまな種が、ｉ−量体（ｉ−ｍｅｒ）を形成するよう自己会合する一種の単量体のオリゴマーとして形成される場合、すべてのｉ−量体（ｉ−ｍｅｒ）の有効密度がほぼ定数ρになることを合理的に予想することもできる。この場合、
【００３５】
【数１２】
0005500365.tif 000013
【００３６】
は、ｍまたはｎとは無関係である。
【００３７】
【数１３】
0005500365.tif 000014
【００３８】
は、一般に、以下のとおり濃度の累乗における列として近似される。
【００３９】
【数１４】
0005500365.tif 000015
【００４０】
この場合、係数Ａ2およびＡ3は、それぞれ、特定の溶媒中における単量体の第２および第３ビリアル係数として公知である。この近似を適用すると、方程式（１）を、科学文献においてこれまで知られていなかった簡略化された形にすることもできる。この場合、すべての非理想的な自己相互作用および異種相互作用は、単に２つのパラメータＡ2およびＡ3で取り込まれる。
【００４１】
【数１５】
0005500365.tif 000016
【００４２】
ここで、Ｒ（ｃ，θ）は、アジマス角θおよび合計巨大分子濃度ｃで観察された過剰なレイリー比である。Ｍは単量体のモル質量である。ｄｎ／ｄｃは、溶媒中の分子の示差屈折率増分である。ｉは自己会合の次数である。ｃiはｉ−量体（ｉ−ｍｅｒ）の平衡状態における重量濃度である。
【００４３】
【数１６】
0005500365.tif 000017
【００４４】
は、垂直に偏光された入射光に対して垂直な面内におけるｉ−量体（ｉ−ｍｅｒ）についての散乱光の角度依存性である。θは、光線の伝搬方向に対して測定される。
【００４５】
【数１７】
0005500365.tif 000018
【００４６】
この場合、ｒは、分子の質量の中心から分子質量要素ｍiまでの距離で、分子のすべての質量要素について積分されたものである。方程式（２）の妥当性が以下のとおり比較的単純な例で示される。
【００４７】
・２種の場合−単量体および１つのｉ−量体（ｉ−ｍｅｒ）
【００４８】
【数１８】
0005500365.tif 000019
【００４９】
このため、以下の項
【００５０】
【数１９】
0005500365.tif 000020
【００５１】
は、他の項よりも高次であるだけでなく、同等の大きさをもつ２つの分量の差であり、このため、１つの二次項と比べても小さくなるはずであり、また、濃度のうちの１つが０に向かうにつれて小さくなるだろう。分母についての最終式は、
【００５２】
【数２０】
0005500365.tif 000021
【００５３】
となるだろう。同様に、種の数がいくつであっても、高次項を無視して以下の式を導き出してもよい。
【００５４】
【数２１】
0005500365.tif 000022
【００５５】
・上述のとおり、ビリアル係数によって、
【００５６】
【数２２】
0005500365.tif 000023
【００５７】
が表され得るが、この場合、近似により、逆密度に密接に関連しているＡ2ＭおよびＡ3Ｍが、単量体およびすべてのオリゴマーに対してほぼ定数となっている。
【００５８】
【数２３】
0005500365.tif 000024
【００５９】
・２種、単量体および１つのｉ−量体（ｉ−ｍｅｒ）の場合、
【００６０】
【数２４】
0005500365.tif 000025
【００６１】
となり、このため、方程式（１）の分子が
【００６２】
【数２５】
0005500365.tif 000026
【００６３】
となる。ここでも、大きさが極めて似ている高次項同士の差を含む項が存在する場合、無視してもよい。同様に、オリゴマー種の数がいくつであっても、最終式は以下のようになるだろう。
【００６４】
【数２６】
0005500365.tif 000027
【００６５】
方程式（１）の分子および分母についてのこれらの近似値を組合わせることにより、方程式（２）が導き出される。数値について調査研究することにより、抜け落ちている項は、最大で数１０ｇ／Ｌの濃度までの非理想性補正全体のほんの一部を占めているにすぎず、このため、この発明の主題となる関係がこのような高い濃度でも適用可能であることが明らかになる。
【００６６】
いくつかの一般的な想定の下では、Ａ2とＡ3との間に一定の関係が想定され得るので、単一のパラメータによりすべての非理想的な挙動が捉えられる。たとえば、分子が剛体球のように挙動すると想定される場合、
【００６７】
【数２７】
0005500365.tif 000028
【００６８】
となる。
数値解析に精通している当業者にとって自明なものであるように、ＰiにおけるＡ2、Ａ3およびｓｉｎ2（θ／２）の項についての相対的な大きさに応じて、方程式（２）における項のうちのいくつかが無視されてもよい。たとえば、濃度の高さが中程度でしかない溶液中の分子の場合、Ａ3が無視されてもよく、錯体がすべてλ／７０よりも小さい場合には、角度依存性が同様に無視されてもよく、非常に単純な形式
【００６９】
【数２８】
0005500365.tif 000029
【００７０】
が導き出され得る。ここで、
【００７１】
【数２９】
0005500365.tif 000030
【００７２】
は、溶液中の材料の重量／容積濃度の合計である。
溶液中のさまざまな種が２つの異なる単量体ＸおよびＹの錯体として形成された場合、上述したのと同様の想定のもとでは、方程式（１）を、科学文献においてこれまで知られていなかった極めて単純化された形にすることもできる。この場合、非理想的な自己相互作用および異種相互作用はすべて、２つのパラメータＡ2XおよびＡ2Yに取り込まれる。
【００７３】
【数３０】
0005500365.tif 000031
【００７４】
ここで、ＭXおよびＭYは、ＸおよびＹの単量体のモル質量に対応する。ｄｎ／ｄｃXおよびｄｎ／ｄｃYは、特定の溶媒中のＸおよびＹの単量体の示差屈折率増分に対応する。ｉおよびｊは、錯体におけるＸおよびＹの単量体の数である。Ｍij＝ｉＭX＋ｊＭYはモル質量であり、ｃijは、平衡状態におけるＸｉＹｊ錯体の重量濃度である。Ａ2XおよびＡ2Yは、特定の溶媒中のＸおよびＹの単量体の第２ビリアル係数を指している。
【００７５】
【数３１】
0005500365.tif 000032
【００７６】
は、ｉｊ錯体の平均二乗半径である。導出については、同じ単量体のオリゴマーについて記載されたものと同様である。
【００７７】
錯体が約λ／７０よりも小さい場合、角度依存性が無視されてもよく、方程式（４）が、
【００７８】
【数３２】
0005500365.tif 000033
【００７９】
とされてもよい。この場合、
【００８０】
【数３３】
0005500365.tif 000034
【００８１】
は、溶液中のＸおよびＹの重量／容積濃度の合計である。方程式（４）および（５）は、３つ以上の別個の単量体種に容易に一般化され得る。
【００８２】
Ａ2の決定
非理想性パラメータＡ2は演繹的に推定され得るか、または、以下に記載される非理想性補正済みの光散乱方程式および会合モデル方程式に対するデータの適合のパラメータであり得る。
【００８３】
演繹的な情報からＡ2を推定するために、既知の分子半径を公式に代入して、剛体球のＡ2を計算することもできる。
【００８４】
【数３４】
0005500365.tif 000035
【００８５】
単量体の分子半径は、たとえば、ｘ線結晶学によって決定され得るかまたは流体力学半径ｒhの測定値から推定され得るように、構造についての情報から導き出すこともできる。流体力学半径は、巨大分子の特徴付けに精通している当業者にとって公知であるように、希釈条件下で動的光散乱または示差粘度を測定することによって計算され得る。
【００８６】
非理想溶液についての単純化された表現のための方法
したがって、さらなる分析に適した非常に単純化された形式で、可逆的に自己会合する高濃度の溶液からＣＧ−ＭＡＬＳデータを表現するための一方法は、図１に示されるような以下のステップを含む。
【００８７】
１．適度に低い濃度または適切な会合制限溶媒などの非会合条件下で得られた流体力学半径ｒhの示差粘度測定もしくは準弾性光散乱から、または分子の既知の構造から有効な分子半径ｒの好適な推定値を決定する。
【００８８】
２．単量体Ｍの既知のモル質量および推定された有効な分子半径ｒに基づいて、単量体が除外された容積値
【００８９】
【数３５】
0005500365.tif 000036
【００９０】
を推定する。場合によっては、会合が比較的弱く、低濃度での一連の測定値からＡ2を推定することができる。
【００９１】
３．対象となる最大濃度をｃmaxと想定して、最大の非理想性寄与ζ＝２Ａ2Ｍｃmaxの推定値を計算する。ζが予め定められたカットオフ値、たとえば０．３、よりも大きい場合、方程式（２）のＡ3項を維持する。そうでない場合、Ａ3項を削除する。
【００９２】
４．形成が予想される最大オリゴマーの平均二乗半径ｒmaxを推定する。ｒmax＞λ／７０であれば、方程式（２）における角度項を維持する。そうでなければ、角度項を削除する。
【００９３】
５．方程式（２）の最終形式を用いてＣＧ−ＭＡＬＳデータを表現する。巨大分子のうちのいくつかが可逆的会合に不適格であると予想される場合、会合しないが適格な巨大分子と同じビリアル係数を有する別個の種として方程式中で処理する。
【００９４】
さらなる分析に適した極めて単純化された形式で、可逆的にヘテロ会合する高濃度の溶液からＣＧ−ＭＡＬＳデータを表現するための一方法は、図２に示されるような以下のステップを含む。
【００９５】
１．流体力学半径ｒh,Xおよびｒh,Yの示差粘度測定もしくは準弾性光散乱から、または分子の既知の構造から有効な分子半径ｒXおよびｒYの好適な推定値を決定する。
【００９６】
２．単量体ＭXおよびＭYの既知のモル質量ならびに推定された有効な分子半径ｒXおよびｒYに基づいて、単量体が除外された容積値
【００９７】
【数３６】
0005500365.tif 000037
【００９８】
を推定する。場合によっては、会合が比較的弱く、低濃度での一連の測定値からＡ2を推定することができる。
【００９９】
３．形成が予想される最大錯体の平均二乗半径ｒmaxを推定する。ｒmax＞λ／７０である場合、方程式（４）における角度項を維持する。そうでなければ、角度項を削除する。
【０１００】
４．方程式（４）の最終形式を用いてＣＧ−ＭＡＬＳデータを表現する。巨大分子のうちのいくつかが可逆的会合に不適格であると予想される場合、会合しないが適格な巨大分子と同じビリアル係数を有する別個の種として式中で処理する。
【０１０１】
上述の方程式の適切な形式を決定するこれらの方法についての変形例は、数値解析に精通している当業者にとっては明らかであるだろう。
【０１０２】
可逆的に会合する非理想溶液を特徴付けるための方法
上述の形式のうちのいずれかに従った単純化された方程式において明らかにされる熱力学的非理想性の場合、化学量論および平衡会合定数による相互作用の特徴付けは簡単明瞭であり、理想溶液についてアトリ（Attri）およびミントンによって分析生化学（Anal. Biochem.：Analytical Biochemistry）（第３４６巻、１３２〜１３８頁、２００５年）に記載され、濃縮溶液についてフェルナンデスおよびミントンによって生物物理学ジャーナル（第９６巻，１９９２〜１９９８頁、２００９年）に記載されている方法に類似している。但し、当該方法では、この明細書中に記載されている単純化された形式のいずれかではなく方程式（１）を用いている。
【０１０３】
特徴付けの方法は、１つ以上の巨大分子種を含む一連の溶液を準備するステップと、各々の溶液を自由な単量体といずれかの可逆的に会合する錯体との間で平衡状態にさせるステップと、各溶液の光散乱強度を測定するステップと、光散乱データを一連の過剰なレイリー比に変換するステップと、データを、非理想的な光散乱の適切な単純化された表現と以下に記載される特定の会合モデルについての方程式とに同時に適合させるステップとを含む。
【０１０４】
自己会合についてのモデル方程式は以下のとおりである。
１．特定の化学量論についての対応する平衡会合定数Ｋiに各々の平衡オリゴマー濃度ｃiを関連付ける質量作用と、自由な単量体ｃ1の濃度とについての方程式。
【０１０５】
【数３７】
0005500365.tif 000038
【０１０６】
２．質量保存についての方程式。
【０１０７】
【数３８】
0005500365.tif 000039
【０１０８】
この場合、ｃtotは、準備手順によって決定されるかまたは濃度検出器によって測定されるので、各溶液について既知であり、ｃincは、会合には不適格な巨大分子の濃度であり、別個の種であるとみなされる。
【０１０９】
２つの異なる単量体種ＸおよびＹのヘテロ会合についてのモデル方程式は以下のとおりである。
【０１１０】
１．特定の化学量論についての対応する平衡会合定数Ｋijに各々の平衡錯体濃度ｃijを関連付ける質量作用と、自由な単量体ｃX、ｃYの濃度とについての方程式。
【０１１１】
【数３９】
0005500365.tif 000040
【０１１２】
２．質量保存の方程式。
【０１１３】
【数４０】
0005500365.tif 000041
【０１１４】
この場合、ｃXtotおよびｃYtotは、準備手順によって決定されるかまたは濃度検出器によって測定されるので、各溶液について既知であり、ｃXincおよびｃYincはそれぞれ、会合には不適格なＸおよびＹの巨大分子の濃度であり、付加的な別個の種であるとみなされる。
【０１１５】
レーベンバーグ・マルカート（Levenberg-Marquardt）非線形最小二乗アルゴリズムなどのさまざまな適合アルゴリズムは、数値解析理論から周知である。これらのアルゴリズムは、非理想的な光散乱方程式、質量保存の方程式および質量作用の方程式を含む連立方程式にデータを適合させ、これにより相互作用パラメータＫiまたはＫij、Ａ2などの適合された値を得るのに用いられてもよい。
【０１１６】
測定装置および手順−自己会合
図３を参照すると、対象となる巨大分子の１組のアリコートが濃度ｃ1、ｃ2、…ｃkで、複数の散乱角θvの光検出器を備えるＭＡＬＳ検出器１に導入される。ＭＡＬＳ検出器の一例として、ワイアット・テクノロジ・コーポレイション（Wyatt Technology corporation）（カリフォルニア州（California）、サンタバーバラ（Santa Barbara））から入手されるＤＡＷＮ−ＨＥＬＥＯＳ（登録商標）が挙げられる。
【０１１７】
典型的な手順においては、濃度列はｃs＝αΔｃに対応する。この場合、ｓ＝１、２、…ｋであり、Δｃは、一定の濃度段階であり、ｋは濃度の番号であり、通常、少なくとも５である。ｋの濃度を有する各々のアリコートが準備され、さまざまな方法によって検出器に導入され得る。或る一方法においては、これらのアリコートは手作業で準備され、シンチレーションバイアルまたはキュベットを用いてＭＡＬＳ検出器に配置される。第２の方法においては、アリコートが手作業で準備され、ポンプ２によって光散乱検出器フローセルに注入される。第３の方法においては、アリコートが、コンピュータの制御下で複式ポンプ２によって自動的に準備され、貯蔵溶液６を溶媒７で最大濃度ｃmaxに希釈し、次いで、作製された各アリコートを順次検出器に送達する。希釈および送達を実行することのできる現存するシステムの一例として、ワイアット・テクノロジ・コーポレイション（カリフォルニア州、サンタバーバラ）から入手されるＣａｌｙｐｓｏTMソフトウェアを用いるＣａｌｙｐｓｏTMＳＰ３アクセサリが挙げられる。
【０１１８】
フローセル中のアリコートの実際の濃度は、元の調整されたままの値Ｃsとは異なっている可能性がある。というのも、試料が、システムを通って流れてフィルタ３、表面などと相互作用している間に薄くなるからである。十分な注入量であれば、注入された各濃度で検出器フローセルが十分に平衡化されるので、ＭＡＬＳフローセルにおける実際の濃度を決定するには、濃度Ｃsが調整されたままであるという知識だけで十分である。代替的には、任意の直列型の濃度検出器４を用いて実際の試料濃度を測定してもよい。
【０１１９】
溶液中の試料の濃度を決定するためのさまざまな方法が公知である。アリコートを手作業で準備するのに適用可能な一方法においては、濃縮または凍結乾燥された試料の適切な質量が量り分けられ、既知の容積の溶媒中に溶解される。第２の方法においては、濃度は分光光度計で吸光度を測定することによって決定される。第３の方法においては、濃度は、ＭＡＬＳ検出器と直列に接続された好適な直列型の濃度検出器４によって決定される。直列型の濃度検出器の例として、同様にワイアット・テクノロジ・コーポレイションから得られるＯｐｔｉｌａｂ（登録商標）ｒＥＸTMが挙げられる。ＵＶ／Ｖis吸収検出器および蛍光検出器を含む他の直列型濃度検出器も公知である。直列型の濃度検出器は、ＭＡＬＳ検出器に対して直列に接続されてもまたは並列に接続されてもよい。ＭＡＬＳ検出器と濃度検出器とが直列に接続される場合、十分な量の試料が、所望の濃度で両方のフローセルを飽和させるよう送達されなければならない。ＭＡＬＳ検出器と濃度検出器とが並列に接続される場合、各々の試料注入の完了時に２つの検出器内の濃度が確実に同じになるように制御しながら、試料の流れをこれら２つの検出器の間で分割しなければならない。試料の流れの分割は、典型的には、所望の比率を維持するように、ニードル弁によって制御され、好適な流量計によって監視される。
【０１２０】
試料が流れ、注入の合間に止められている間にデータが検出器から得られ、上述の適合手順を行なうコンピュータ５によって記憶され、分析される。分析に用いられるデータとしては、流れが停止し、試料が平衡になった後に得られるものが最適である。
【０１２１】
各々の連続した試料がＭＡＬＳ検出器１を通過し、これにより、各々の検出器角度θvでの過剰なレイリー比の値ＲS（ｃS，θv）が連続的な試料濃度ｃSで測定される。次いで、結果として得られる光散乱および濃度信号がコンピュータ手段５によって記憶および処理されて、各々の注入されたアリコートｓについて値ｃS、ＲS（ｃS，θv）が計算される。コンピュータ５は、さらに、会合モデル方程式とともに、方程式（２）またはその単純化された形式に計算結果を適合させることにより、Ｍおよび
【０１２２】
【数４１】
0005500365.tif 000042
【０１２３】
を含む分子特徴、ならびに分子の相互作用特徴Ａ2およびＫiを計算する。分子の相互作用特徴を抽出するためにさまざまな適合手順が実現されてもよい。好ましい実施例においては、適合手順は、ＭおよびＡ2が一定である２つの変数（ｃおよびｓｉｎ2（θ／２））に適用されるようなレーベンバーグ・マルカートアルゴリズムを含む。
【０１２４】
数値解析理論から、測定されたデータを光散乱方程式および会合モデル方程式の形式に適合させることは、レーベンバーグ・マルカート法によるものであろうと他のアルゴリズムによるものであろうと、統計的重み付けを含み得るものであり、これにより、これらの適合を実行するのに用いられるデータが、それらの相互測定された標準偏差によって重み付けされる。
【０１２５】
測定装置および手順−ヘテロ会合
各アリコートが、濃度の異なる２つの巨大分子種ＸおよびＹを、決定すべきさまざまな会合状態で含有していることを除いては、単一種の測定と同様に測定が行なわれる。
【０１２６】
交差型組成勾配として公知である一手順においては、ｋのアリコートが準備される。この場合、ｓ番目のアリコートの組成は［ｓΔｃX,（ｋ-ｓ）ΔｃY］であり、ΔｃXおよびΔｃYは一定の濃度ステップサイズである。
【０１２７】
一定比率の組成勾配として公知である別の手順においては、ｋのアリコートが準備される。この場合、ｓ番目のアリコートの組成は［ｓΔｃX,ｓΔｃY］であり、ΔｃXおよびΔｃYは一定の濃度ステップサイズである。
【０１２８】
所望の組成の種Ｘ、種Ｙおよび溶媒を含むアリコートを生成、混合および送達するようコンピュータによって制御可能な各ポンプを備えるコンピュータ制御型の３連ポンプシステムが複式ポンプシステムの代わりに用いられることは除いては、単一種の測定に用いられるのと同様の装置が用いられる。このような３連ポンプシステムおよび好適な制御ソフトウェアとして、ワイアット・テクノロジ・コーポレイション（カリフォルニア州、サンタバーバラ）のＣａｌｙｐｓｏシステムが挙げられる。
【０１２９】
成分ＸおよびＹの合計濃度、ならびに
【０１３０】
【数４２】
0005500365.tif 000043
【０１３１】
の合計濃度は、それぞれ、準備方法において設定されるとおりに、または、溶液中の２つの種の濃度を測定するための方法によって、予め定められた貯蔵溶液濃度および混合比から決定され得る。
【０１３２】
溶液中の２つの別個の分子の濃度を測定する一方法においては、合計濃度信号が、オンライン濃度検出器４によって測定され、成分濃度が、２つの成分種間の既知の比率と、合計濃度信号に対する各々の成分種による相対的寄与とから計算される。このような方法は、アトリおよびミントンによって分析生化学（第３４６巻、２００５年、１３２〜１３８頁）に記載されている。
【０１３３】
溶液中の２つの別個の分子の濃度を測定するための第２の方法においては、少なくとも２つの異なるオンライン濃度検出手段が用いられ、成分濃度が、濃度信号と、各濃度検出手段に対する各成分種の既知の反応とから決定される。たとえば、示差屈折計およびＵＶ吸収検出器の信号は、それぞれの濃度検出器に対する分子の反応が少なくとも１回の測定の間に異なる場合、同じ溶液中に存在する２つの種の各々の濃度が得られるよう分析され得る。
【０１３４】
光散乱、巨大分子の特徴付けおよび数値解析の技術分野の当業者に明らかになるように、我々が意図しかつ説明してきた方法について、それらの実施のために列挙してきた基本要素から逸脱することのない多くの自明な変形例が存在する。しかし、このような変形例はすべて、上述の発明の自明な実現例であり、添付の特許請求の範囲を参照することにより包含される。
【図１】
0005500365.tif 000060
【図２】
0005500365.tif 000061
【図３】
0005500365.tif 000062