(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１、２、６〜８、１０〜１４、１６〜１７又は４０〜４１のいずれか１つの化合物であって、
【化５９】
0005645658.tif 000090
【化６０】
0005645658.tif 000091
【化６１】
0005645658.tif 000092
【化６２】
0005645658.tif 000093
【化６３】
0005645658.tif 000094
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、ｍは各々独立に４から１６の整数である、化合物。
【請求項２】
化合物であって、
Ａ）式２６の化合物であって、
【化６４】
0005645658.tif 000095
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは蛍光性検出部分である、化合物であって、
ここで、該化合物は、式２０の化合物であって、
【化６５】
0005645658.tif 000096
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である、化合物；
Ｂ）式２７の化合物であって、
【化６６】
0005645658.tif 000097
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは蛍光性検出部分である、化合物であって、
ここで、該化合物は、式２１の化合物であって、
【化６７】
0005645658.tif 000098
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である、化合物；
Ｃ）式２８の化合物であって、
【化６８】
0005645658.tif 000099
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは蛍光性検出部分である、化合物；
Ｄ）式２９の化合物であって、
【化６９】
0005645658.tif 000100
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは蛍光性検出部分である、化合物であって、
ここで、該化合物は、式２３の化合物であって、
【化７０】
0005645658.tif 000101
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である、化合物；
Ｅ）式３０の化合物であって、
【化７１】
0005645658.tif 000102
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは蛍光性検出部分である、化合物であって、
ここで、該化合物は、式２４の化合物であって、
【化７２】
0005645658.tif 000103
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である、化合物；
Ｆ）式３１の化合物であって、
【化７３】
0005645658.tif 000104
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは蛍光性検出部分である、化合物であって、
ここで、該化合物は、式２５の化合物であって、
【化７４】
0005645658.tif 000105
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である、化合物；または
Ｇ）式３２〜３７のいずれか１つの化合物であって、
【化７５】
0005645658.tif 000106
【化７６】
0005645658.tif 000107
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは各々独立に蛍光性検出部分である、化合物。
【請求項３】
式１０
【化１０】
0005645658.tif 000108
の化合物と式１
【化１−１】
0005645658.tif 000109
の化合物；
式１２
【化１２】
0005645658.tif 000110
の化合物と式１の化合物；
式１４
【化１４】
0005645658.tif 000111
の化合物と式１の化合物；
式１６
【化１６−１】
0005645658.tif 000112
の化合物と式１の化合物；
式４０
【化４０−１】
0005645658.tif 000113
の化合物と式１の化合物；
式１０の化合物と式２０
【化２０】
0005645658.tif 000114
の化合物；
式１０の化合物と、式２０の化合物と、式１の化合物；
式１１
【化１１】
0005645658.tif 000115
の化合物と式２１
【化２１】
0005645658.tif 000116
の化合物；
式１１の化合物と式２２
【化２２】
0005645658.tif 000117
の化合物；
式１２の化合物と式２３
【化２３】
0005645658.tif 000118
の化合物；
式１２の化合物と、式２３の化合物と、式１の化合物；
式１３
【化１３】
0005645658.tif 000119
の化合物と式２４
【化２４】
0005645658.tif 000120
の化合物；
式１３の化合物と式２５
【化２５】
0005645658.tif 000121
の化合物；
式１０の化合物と式２６
【化２６】
0005645658.tif 000122
の化合物；
式１０の化合物と、式２６の化合物と、式１の化合物；
式１１の化合物と式２７
【化２７】
0005645658.tif 000123
の化合物；
式１１の化合物と式２８
【化２８】
0005645658.tif 000124
の化合物；
式１２の化合物と式２９
【化２９】
0005645658.tif 000125
の化合物；
式１２の化合物と、式２９の化合物と、式１の化合物；
式１３の化合物と式３０
【化３０】
0005645658.tif 000126
の化合物；
式１３の化合物と式３１
【化３１】
0005645658.tif 000127
の化合物；
式１０の化合物と式３２
【化３２】
0005645658.tif 000128
の化合物；
式１０の化合物と、式３２の化合物と、式１の化合物；
式１１の化合物と式３３
【化３３】
0005645658.tif 000129
の化合物；
式１１の化合物と式３４
【化３４】
0005645658.tif 000130
の化合物；
式１２の化合物と式３５
【化３５】
0005645658.tif 000131
の化合物；
式１２の化合物と、式３５の化合物と、式１の化合物；
式１３の化合物と式３６
【化３６】
0005645658.tif 000132
の化合物；または
式１３の化合物と式３７
【化３７】
0005645658.tif 000133
の化合物、
を含む組成物であって、
式中のｎは各々独立に４から１６の整数であり、
ｍは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは蛍光性検出部分である、
組成物。
【請求項４】
Ａ）請求項１または２に記載の１種類以上の化合物と、式１ａの化合物とを含み、
【化７７−１】
0005645658.tif 000134
式中、ｐは８から１３の整数であり、
Ｒｆは２：１の比のＣＦ３とＣＦ２ＣＦ３である、組成物であって、
ここで、該組成物は、式１ａの化合物８０〜９５％ｖ／ｖを含む、組成物；または
Ｂ）請求項１または２に記載の１種類以上の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む、組成物であって、
ここで、該組成物は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテル  ８０〜９５％ｖ／ｖを含む、組成物。
【請求項５】
請求項１若しくは２に記載の化合物、又は請求項３若しくは４に記載の組成物を含む、乳濁液であって、ここで該乳濁液は、以下のうちの１つ以上によって特徴付けられる：
該乳濁液は、ブロック共重合体を更に含み、
ここで、該ブロック共重合体は、平均分子量１９００、２９００又は８４００を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体である；
該乳濁液は、脂質を更に含み、
ここで、該脂質は、ＤＭＰＣである；
該乳濁液は、ポリエチルアミンを更に含む；
該乳濁液は、硫酸プロタミンを更に含む；
該乳濁液は、直径２００ｎｍ未満の平均粒径を有する；
該乳濁液は、４℃から３７℃の範囲の温度で安定である；または
該乳濁液は、０．１から０．２の範囲の多分散指数を有する、
乳濁液。
【請求項６】
以下の
式１
【化１−２】
0005645658.tif 000135
の化合物と、式１６
【化１６−２】
0005645658.tif 000136
の化合物と、式１７
【化１７】
0005645658.tif 000137
の化合物と、式１ａ
【化７７−２】
0005645658.tif 000138
の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１８
【化１８】
0005645658.tif 000139
の化合物と、式１９
【化１９】
0005645658.tif 000140
の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式４０
【化４０−２】
0005645658.tif 000141
の化合物と、式４１
【化４１】
0005645658.tif 000142
の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数１５３及び平均ＰＰＯ単位数２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１ａの化合物と、式１の化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数７４及び平均ＰＰＯ単位数５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤とを含む乳濁液であって、該乳化剤が、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である、乳濁液；
式１ａの化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数７４及び平均ＰＰＯ単位数５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤とを含む乳濁液であって、該乳化剤が、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である、乳濁液；
式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数７４及び平均ＰＰＯ単位数５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤とを含む乳濁液であって、該乳化剤が、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である、乳濁液；
式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数７４及び平均ＰＰＯ単位数５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤とを含む乳濁液であって、該乳化剤が、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である、乳濁液；
式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数７４及び平均ＰＰＯ単位数５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤とを含む乳濁液であって、該乳化剤が、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である、乳濁液；
式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数７４及び平均ＰＰＯ単位数５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤とを含む乳濁液であって、該乳化剤が、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である、乳濁液；
式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数７４及び平均ＰＰＯ単位数５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤とを含む乳濁液であって、該乳化剤が、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である、乳濁液；及び
式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数７４及び平均ＰＰＯ単位数５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤とを含む乳濁液であって、該乳化剤が、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である、乳濁液
からなる群から選択される乳濁液であって、
式中のｎは各々独立に４から１６の整数であり、
ｐは８から１３の整数であり、
Ｒｆは２：１の比のＣＦ３とＣＦ２ＣＦ３である、
乳濁液。
【請求項７】
式１の化合物と式３８の化合物とを含む組成物を調製する方法であって、
【化７９】
0005645658.tif 000143
（式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
ＸとＹの一方又は両方はジエチルアミド以外のアミドである）
１）２個のメチルエステル末端基を有するペルフルオロポリエーテルメチルエステル（３９）を、ジエチルアミン以外の第一級又は第二級脂肪族アミンと反応させること、
【化８０】
0005645658.tif 000144
２）無修飾メチルエステル末端基を過剰のジエチルアミンと反応させること、
３）未反応ジエチルアミンを除去すること、及び
４）フッ素化溶媒中の選択的抽出、又はフルオロプス相固体抽出、及びろ過によって不揮発性未反応アミンを除去すること
を含む、方法。
【請求項８】
薄膜法を使用することを含む、ブロック共重合体を用いたＰＦＰＥ誘導体の乳濁液又は請求項５若しくは６に記載の乳濁液を調製する方法。
【請求項９】
微小流動化又は超音波処理を含む、請求項５又は６に記載の乳濁液を調製する方法。
【請求項１０】
組成物であって、
Ｉ）細胞を標識するための組成物であって、請求項１又は２に記載の化合物を含むフッ化炭素画像化試薬を含み、該細胞を、該フッ化炭素画像化試薬が該細胞と会合するような条件下で該組成物とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることを特徴とする、組成物；
ＩＩ）被験体における細胞を検出するための組成物であって、請求項１又は２に記載の化合物を含むフッ化炭素画像化試薬で標識された細胞を含み、該組成物は、該被験体に投与され、該被験体の少なくとも一部分が核磁気共鳴技術によって検査され、それによって該被験体中の標識された細胞が検出されることを特徴とする、組成物；
ＩＩＩ）移植レシピエント中の移植細胞を検出するための組成物であって、請求項１又は２に記載の化合物を含むフッ化炭素画像化試薬でその少なくとも一部が標識された移植細胞を含み、該組成物は、該移植レシピエントに投与され、該移植レシピエントの少なくとも一部分が核磁気共鳴技術によって検査され、それによって該標識された細胞が検出されることを特徴とする、組成物；
ＩＶ）細胞数をｉｎ  ｖｉｖｏで定量するための組成物であって、請求項１又は２に記載の化合物を含むフッ化炭素画像化試薬で標識された細胞を含み、該組成物は被験体に投与され、該被験体の少なくとも一部分が核磁気共鳴技術によって検査され、それによって該被験体中の標識された細胞が検出され、そして関心領域（ＲＯＩ）中の標識された細胞の数が定量されることを特徴とする、組成物；
Ｖ）細胞を標識するための組成物であって、請求項１又は２に記載の化合物を含むフッ化炭素画像化試薬を含み、該組成物は、該フッ化炭素画像化試薬が該細胞と会合するような条件下でｉｎ  ｖｉｖｏで該細胞と接触されることを特徴とする、組成物；又は
ＶＩ）被験体における細胞を検出するための組成物であって、請求項１又は２に記載の化合物を含むフッ化炭素画像化試薬を含み、該組成物は、該被験体に投与され、そして該被験体の少なくとも一部分が核磁気共鳴技術によって検査され、それによって該被験体中の標識された細胞が検出されることを特徴とする、組成物。
【請求項１１】
被験体に投与するための標識細胞製剤であって、
ａ）細胞、及び
ｂ）該細胞と会合する請求項１又は２に記載の化合物を含むフッ化炭素画像化試薬
を含む、標識細胞製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願）
本願は、２００７年７月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／９５９，１３５号および２００８年１月２８日に出願された同第６１／０６２，７１０号に対する優先権の利益を主張する。上述の出願のそれぞれの開示は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
多数の生物学的過程が細胞集団によって行われている。例えば、免疫系細胞は、血流から炎症又は感染領域に動員され、患部に免疫細胞が蓄積する。自己免疫疾患、癌及び感染症に冒された組織では、免疫細胞の著しい浸潤が起こることが多い。同様に、移植拒絶は、移植された組織に侵入してそれを破壊する宿主免疫細胞によって媒介される。骨髄で生じた幹細胞が血流を介して移動して、損傷を受けた組織の再生を支援する証拠も増えつつある。
【０００３】
さらに、生物学的療法の最も目前にある有望な領域は、新興の細胞療法分野を含む。細胞療法は、体外、すなわちｅｘ  ｖｉｖｏで選択され、増殖され、薬理学的に処理された治療用細胞の投与によるヒト疾患の治療と広義には定義される。これらの細胞は、患者（自己細胞）、他人（同種細胞）、別の生物体（異種細胞）、又は不死化細胞系に由来し得る。
【０００４】
細胞は、複雑な機能を果たすその能力、及び周囲組織又は宿主生物体における変化に対するその応答性のために、究極の治療系である。細胞療法の最も単純な様式では、細胞を単離し、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させ、患者に移植して、疾患機序に直接対応する可溶性因子を産生させ、分泌させることができる。細胞は、体内の特定の部位に帰る能力、循環から退出する能力、及び特定の組織に融合する、又は新しい組織に分化する能力に基づく、組織、臓器又は免疫応答の再構成のような複雑な仕事も行うことができる。腫ようを死滅させ、又は転移を治療するために、別の細胞治療用物質をプログラムすることができる（例えば、免疫療法剤）。
【０００５】
動的な細胞集団は、重大な疾患において鍵となる役割を果たすが、細胞の位置及び動きをｉｎ  ｖｉｖｏでモニターする現行技術はかなり限られる。典型的には、細胞運動は、組織生検の組織学的解析によって得られる「スナップショット」においてのみモニターされる。しかし、組織試料を採取するプロセスは、細胞の挙動を変化させることが多く、さらに、特定の組織又は臓器からは限定された数の生検しか得られない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、さらに、ｅｘ−ｖｉｖｏでの摘出組織において、細胞運動を研究する幾らかの進展がなされた。生きている生物体の非観血的分析のための既存の機器は、現在、生細胞を追跡するには不適当である。大部分のほ乳動物組織は光学的に不透明であるので、生物発光（例えば、ルシフェラーゼ）技術などの光に基づく画像化技術は、深部構造を可視化するのに無効であることが多い。放射性標識プローブを用いた陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）技術は、高感度である。しかし、ＰＥＴ計測手段は、数ミリメートルの分解能に限られることが多く、組織及び臓器の詳細を分析することができない。さらに、標識された細胞は、典型的なＰＥＴ放射性同位体の半減期を超える期間では検出することができず、一般に、ＰＥＴは長期的な研究には有用でない。細胞プロセスの基礎的な理解を得るためには、特定の細胞型の集団動力学をｉｎ  ｖｉｖｏで可視化及び定量化する新しい方法を開発しなければならない。
【０００６】
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）は、非観血的であり、光学的に不透明な対象を観察することができ、軟部組織を適度に高い空間分解能で対比するので、広範に用いられる臨床診断ツールである。従来のＭＲＩは、解剖学的構造を可視化することにほとんど焦点がおかれ、任意の特定の細胞型に対する特異性を持たない。従来のＭＲＩに用いられる「プローブ」は、移動性の水分子中に広範に分布するプロトン（１Ｈ）である。生きている対象における細胞特異的画像化を容易にするために、新しいクラスの外来のＭＲＩプローブ又は試薬が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ある態様においては、本開示は、核磁気共鳴技術によって検出することができるフッ化炭素画像化試薬などの画像化試薬を用いて細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで標識する新規な方法及び試薬を提供する。ある態様においては、本開示は、特定の位置における標識細胞数をｉｎ  ｖｉｖｏで定量化する方法及びソフトウェアを提供する。細胞は、フッ化炭素、例えばペルフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）を含む標識で標識することができる。生体組織の内在フッ素含量は無視し得るので、ｉｎ  ｖｉｖｏ  １９Ｆ  ＭＲＩは、標識された細胞を検出する有効な手段を提供することができる。一部の実施形態においては、次いで、これらの画像を従来の１Ｈ  ＭＲＩの上に重ねて、解剖学的部位を決定する。
【０００８】
標識された細胞を対象に投与し、続いて核磁気共鳴技術によって検出することができる。核磁気共鳴（ＮＭＲ）技術の例としては、ＭＲＩ及び局在型磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）が挙げられる。核磁気共鳴技術は非観血的手順として一般に実施されるので、標識された細胞は、生きている対象において１つ以上の時点で検出することができる。標識された細胞は、細胞培養物において、又は（ことによっては、移植レシピエントに移植する前の）対象から取り出された組織外植片、臓器及び組織、人工的に生成された組織、細胞をまいた種々の基質及び構造体など、核磁気共鳴技術を実施することができる本質的にあらゆる他の環境において、検出することもできる。
【０００９】
ある態様においては、本開示は、細胞を標識する方法を提供する。かかる方法は、フッ化炭素画像化試薬が細胞と会合するような条件下で、培養細胞をフッ化炭素画像化試薬とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることを含み得る。ペルフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）は、適切なフッ化炭素画像化試薬の例である。画像化試薬は、界面活性剤を含むことが多い乳濁液として処方することができる。場合によっては、フッ化炭素画像化試薬の取り込みを促進する試薬の存在下で、細胞をフッ化炭素画像化試薬と接触させることができる。カチオン性脂質などの種々のカチオン性分子、硫酸プロタミン、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、適切な取り込み促進試薬の例である。別のかかる試薬は、本明細書に記載されており、本明細書に鑑みて、当分野で公知である。ある実施形態においては、界面活性剤の組成は、促進試薬を必要とせずに、乳濁液の細胞内取り込みを促進するカチオン性表面を乳濁液粒子に付与するように設計することができる。ある実施形態においては、取り込み促進化合物は、フッ化炭素と結合する。ある実施形態においては、細胞は電気穿孔法によってパーフルオロカーボン乳濁液粒子で標識される。
【００１０】
フッ化炭素画像化試薬は、細胞によって内部に取り込まれ得るが、細胞外表面にも会合し得る。細胞外表面との会合は、画像化試薬を細胞標的部分と結合させることによって増加させることができる。細胞標的部分は、細胞外環境に曝露されるエピトープに結合する抗体など、所望の細胞に結合する本質的にあらゆる分子的実体とすることができる。細胞内への画像化試薬の取り込みは、画像化試薬を内部移行部分と結合させることによって増加させることができる。内部移行部分は、細胞内への画像化試薬の移行を刺激又は促進する任意の分子的実体である。例としては、受容体に結合する内部移行ペプチド及び部分又は、例えば受容体媒介性エンドサイトーシスによって、内部に取り入れられる別の細胞表面タンパク質が挙げられる。細胞は、原核及び真核細胞を含めて、本質的にあらゆる細胞であり得る。好ましい実施形態においては、細胞はほ乳動物細胞である。ある実施形態においては、細胞は、樹状細胞、Ｔ細胞などの免疫系細胞である。細胞は、細胞療法の、又は末梢血幹細胞移植、骨髄移植などの移植の一部として対象に投与するために調製された幹細胞又は細胞とすることもできる。別の細胞型、例えば、胚性幹細胞、すい島、肝細胞などは、恐らくは療法と併せて、標識し、画像化することができる。
【００１１】
ある態様においては、本開示は、細胞を新規フッ化炭素画像化試薬で標識する方法を提供する。好ましいフッ化炭素画像化試薬は、以下の諸性質の１つ以上を有する：低細胞傷害性；化学シフトアーチファクトを最小化するために大部分は単一の狭い共鳴を理想的には有する単純な１９Ｆ  ＮＭＲスペクトル；１分子当たり多数のＮＭＲ的に同等なフッ素原子；及び多数の細胞型の効率的標識化を可能にする処方に対する適合性。
【００１２】
本発明は、本発明の方法における画像化試薬として使用することができる、その化合物の精製調製物を含めた新規ペルフルオロポリエーテル化合物（例えば、式１〜４１の化合物）を提供する。本発明は、本発明の新規ペルフルオロポリエーテルジアミド化合物の規定の混合物を含む新規組成物も提供する。
【００１３】
例えば、ある態様においては、本開示は、式１〜９のいずれか１つの化合物を提供する。
【００１４】
【化１】
0005645658.tif 000002
【００１５】
【化２】
0005645658.tif 000003
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。
【００１６】
ある態様においては、本開示は、式１０〜１５のいずれか１つの化合物を提供する。
【００１７】
【化３】
0005645658.tif 000004
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
ｍは各々独立に４から１６の整数である。
【００１８】
ある態様においては、本開示は、式１６〜１７又は４０〜４１のいずれか１つの化合物を提供する。
【００１９】
【化４】
0005645658.tif 000005
【００２０】
【化５】
0005645658.tif 000006
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。
【００２１】
ある態様においては、本開示は、式１８又は１９のどちらか１つの化合物を提供する。
【００２２】
【化６】
0005645658.tif 000007
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。
【００２３】
ある態様においては、本開示は、式２６の化合物を提供する。
【００２４】
【化７】
0005645658.tif 000008
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは蛍光性検出部分である。
【００２５】
特定のかかる実施形態においては、式２６の化合物は式２０の化合物である。
【００２６】
【化８】
0005645658.tif 000009
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。
【００２７】
ある態様においては、本開示は、式２７の化合物を提供する。
【００２８】
【化９】
0005645658.tif 000010
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは蛍光性検出部分である。
【００２９】
特定のかかる態様においては、式２７の化合物は式２１の化合物である。
【００３０】
【化１０】
0005645658.tif 000011
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。
【００３１】
ある態様においては、本開示は、式２８の化合物を提供する。
【００３２】
【化１１】
0005645658.tif 000012
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは蛍光性検出部分である。
【００３３】
特定のかかる態様においては、式２８の化合物は式２２の化合物である。
【００３４】
【化１２】
0005645658.tif 000013
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。
【００３５】
ある態様においては、本開示は、式２９の化合物を提供する。
【００３６】
【化１３】
0005645658.tif 000014
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは蛍光性検出部分である。
【００３７】
特定のかかる態様においては、式２９の化合物は式２３の化合物である。
【００３８】
【化１４】
0005645658.tif 000015
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。
【００３９】
ある態様においては、本開示は、式３０の化合物を提供する。
【００４０】
【化１５】
0005645658.tif 000016
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは蛍光性検出部分である。
【００４１】
特定のかかる態様においては、式３０の化合物は式２４の化合物である。
【００４２】
【化１６】
0005645658.tif 000017
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。
【００４３】
ある態様においては、本開示は、式３１の化合物を提供する。
【００４４】
【化１７】
0005645658.tif 000018
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは蛍光性検出部分である。
【００４５】
特定のかかる態様においては、式３１の化合物は式２５の化合物である。
【００４６】
【化１８】
0005645658.tif 000019
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。
【００４７】
ある態様においては、本開示は、式３２〜３７のいずれか１つの化合物を提供する。
【００４８】
【化１９】
0005645658.tif 000020
【００４９】
【化２０】
0005645658.tif 000021
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは各々独立に蛍光性検出部分である。
【００５０】
ある態様においては、本開示は、式１０の化合物と式１の化合物とを含む組成物を提供する。
【００５１】
ある態様においては、本開示は、式１２の化合物と式１の化合物とを含む組成物を提供する。
【００５２】
ある態様においては、本開示は、式１４の化合物と式１の化合物とを含む組成物を提供する。
【００５３】
ある態様においては、本開示は、式１６の化合物と式１の化合物とを含む組成物を提供する。
【００５４】
ある態様においては、本開示は、式４０の化合物と式１の化合物とを含む組成物を提供する。
【００５５】
ある態様においては、本開示は、式１６の化合物と式１７の化合物とを含む組成物を提供する。特定のかかる実施形態においては、組成物は式１の化合物を更に含む。
【００５６】
ある態様においては、本開示は、式１９の化合物と式１９の化合物とを含む組成物を提供する。特定のかかる実施形態においては、組成物は式１の化合物を更に含む。
【００５７】
ある態様においては、本開示は、式４０の化合物と式４１の化合物とを含む組成物を提供する。特定のかかる実施形態においては、組成物は式１の化合物を更に含む。
【００５８】
ある態様においては、本開示は、式１０の化合物と式２０の化合物とを含む組成物を提供する。
【００５９】
ある態様においては、本開示は、式１０の化合物と、式２０の化合物と、式１の化合物とを含む組成物を提供する。
【００６０】
ある態様においては、本開示は、式１１の化合物と式２１の化合物とを含む組成物を提供する。
【００６１】
ある態様においては、本開示は、式１１の化合物と式２２の化合物とを含む組成物を提供する。
【００６２】
ある態様においては、本開示は、式１２の化合物と式２３の化合物とを含む組成物を提供する。
【００６３】
ある態様においては、本開示は、式１２の化合物と、式２３の化合物と、式１の化合物とを含む組成物を提供する。
【００６４】
ある態様においては、本開示は、式１３の化合物と式２４の化合物とを含む、組成物を提供する。
【００６５】
ある態様においては、本開示は、式１３の化合物と式２５の化合物とを含む組成物を提供する。
【００６６】
ある態様においては、本開示は、式１０の化合物と式２６の化合物とを含む組成物を提供する。
【００６７】
ある態様においては、本開示は、式１０の化合物と、式２６の化合物と、式１の化合物とを含む組成物を提供する。
【００６８】
ある態様においては、本開示は、式１１の化合物と式２７の化合物とを含む組成物を提供する。
【００６９】
ある態様においては、本開示は、式１１の化合物と式２８の化合物とを含む組成物を提供する。
【００７０】
ある態様においては、本開示は、式１２の化合物と式２９の化合物とを含む組成物を提供する。
【００７１】
ある態様においては、本開示は、式１２の化合物と、式２９の化合物と、式１の化合物とを含む組成物を提供する。
【００７２】
ある態様においては、本開示は、式１３の化合物と式３０の化合物とを含む組成物を提供する。
【００７３】
ある態様においては、本開示は、式１３の化合物と式３１の化合物とを含む組成物を提供する。
【００７４】
ある態様においては、本開示は、式１０の化合物と式３２の化合物とを含む組成物を提供する。
【００７５】
ある態様においては、本開示は、式１０の化合物と、式３２の化合物と、式１の化合物とを含む組成物を提供する。
【００７６】
ある態様においては、本開示は、式１１の化合物と式３３の化合物とを含む組成物を提供する。
【００７７】
ある態様においては、本開示は、式１１の化合物と式３４の化合物とを含む組成物を提供する。
【００７８】
ある態様においては、本開示は、式１２の化合物と式３５の化合物とを含む組成物を提供する。
【００７９】
ある態様においては、本開示は、式１２の化合物と、式３５の化合物と、式１の化合物とを含む組成物を提供する。
【００８０】
ある態様においては、本開示は、式１３の化合物と式３６の化合物とを含む組成物を提供する。
【００８１】
ある態様においては、本開示は、式１３の化合物と式３７の化合物とを含む組成物を提供する。
【００８２】
ある態様においては、本開示は、式１〜１７又は２０〜３７又は４０〜４１のいずれか１つの１種類以上の化合物と式１ａの化合物とを含む組成物を提供する。ある実施形態においては、組成物は、式１〜３７又は４０〜４１のいずれか１つの１種類以上の化合物を含み得る。ある実施形態においては、組成物は、式１ａの化合物８０〜９５％ｖ／ｖを含む。
【００８３】
ある態様においては、本開示は、式１〜１７又は２０〜３７又は４０〜４１のいずれか１つの１種類以上の化合物とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物を提供する。ある実施形態においては、組成物は、式１〜３７又は４０〜４１のいずれか１つの１種類以上の化合物を含み得る。ある実施形態においては、組成物は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテル８０〜９５％ｖ／ｖを含む。
【００８４】
ある態様においては、本開示は、次式の化合物を含む組成物を提供する。
【００８５】
【化２１】
0005645658.tif 000022
ある態様においては、本開示は、式１〜１７若しくは２０〜３７、４０〜４１、１ａのいずれか１つの化合物又はペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルを含む乳濁液を提供する。ある態様においては、本開示は、式１〜２０〜３７、４０〜４１、１ａのいずれか１つの化合物又はペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルを含む乳濁液を提供する。ある態様においては、本開示は、式１０の化合物と式１の化合物、式１２の化合物と式１の化合物、式１４の化合物と式１の化合物、式１６の化合物と式１の化合物、式１０の化合物と式２０の化合物、式１０の化合物と式２０の化合物と式１の化合物、式１１の化合物と式２１の化合物、式１１の化合物と式２２の化合物、式１２の化合物と式２３の化合物、式１２の化合物と式２３の化合物と式１の化合物、式１３の化合物と式２４の化合物、式１３の化合物と式２５の化合物、式１０の化合物と式２６の化合物、式１０の化合物と式２６の化合物と式１の化合物、式１１の化合物と式２７の化合物、式１１の化合物と式２８の化合物、式１２の化合物と式２９の化合物、式１２の化合物と式２９の化合物と式１の化合物、式１３の化合物と式３０の化合物、式１３の化合物と式３１の化合物、式１０の化合物と式３２の化合物、式１０の化合物と式３２の化合物と式１の化合物、式１１の化合物と式３３の化合物、式１１の化合物と式３４の化合物、式１２の化合物と式３５の化合物、式１２の化合物と式３５の化合物と式１の化合物、式１３の化合物と式３６の化合物、又は式１３の化合物と式３７の化合物を含む組成物を含む乳濁液を提供する。ある態様においては、乳濁液は、ブロック共重合体を更に含む。ある実施形態においては、ブロック共重合体は、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（プロピレンオキシド）とを含むトリブロック共重合体である。特定のかかる実施形態においては、ブロック共重合体は、平均分子量１９００、平均ＰＥＯ単位数約２２、例えば２１．５９、及び平均ＰＰＯ単位数約１６、例えば１６．３８を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体である。特定のかかる実施形態においては、ブロック共重合体は、平均分子量２９００、平均ＰＥＯ単位数約２６、例えば２６．３６、及び平均ＰＰＯ単位数約３０、例えば３０．００を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体である。特定のかかる実施形態においては、ブロック共重合体は、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体である。ある態様においては、乳濁液は、脂質を更に含む。特定のかかる態様においては、脂質はＤＭＰＣである。ある態様においては、脂質を更に含む乳濁液は、ブロック共重合体を更に含む。ある実施形態においては、ブロック共重合体は、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（プロピレンオキシド）とを含むトリブロック共重合体である。特定のかかる実施形態においては、ブロック共重合体は、平均分子量１９００、平均ＰＥＯ単位数約２２、例えば２１．５９、及び平均ＰＰＯ単位数約１６、例えば１６．３８を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体である。ある態様においては、乳濁液は、ポリエチレンイミンを更に含む。ある態様においては、乳濁液は、硫酸プロタミンを更に含む。ある態様においては、硫酸プロタミンを更に含む乳濁液は、ブロック共重合体を更に含む。ある実施形態においては、ブロック共重合体は、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（プロピレンオキシド）とを含むトリブロック共重合体である。特定のかかる実施形態においては、ブロック共重合体は、平均分子量１９００、平均ＰＥＯ単位数約２２、例えば２１．５９、及び平均ＰＰＯ単位数約１６、例えば１６．３８を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体である。特定のかかる実施形態においては、ブロック共重合体は、平均分子量２９００、平均ＰＥＯ単位数約２６、例えば２６．３６、及び平均ＰＰＯ単位数約３０、例えば３０．００を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体である。特定のかかる実施形態においては、ブロック共重合体は、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体である。ある態様においては、乳濁液は、直径２００ｎｍ未満の平均粒径を有する。ある態様においては、乳濁液は、温度４℃から３７℃で安定である。ある態様においては、乳濁液は、０．１から０．２の多分散指数を有する。
【００８６】
ある態様においては、本開示は、式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む乳濁液；式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体；式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミン；式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミン；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミン；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体；式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミン；式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体；式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミン；式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体；式１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミン；式１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体；式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミン；式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミン；式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体；式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミン；式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミン；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体；式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミン；式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体；式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミン；式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体；式１ａの化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数
約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミン；式１ａの化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミン；式１ａの化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体；ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミン；ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミン；ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体；式１ａの化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である。）；式１ａの化合物と、式１の化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である。）；式１ａの化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である。）；式１ａの化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である。）；ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である。）；式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である。）；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である。）；式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である。）；式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である。）；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である。）；式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である。）；又は式４２の化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である。）を提供する。
【００８７】
ある態様においては、本開示は、式１の化合物と式３８の化合物とを含む組成物を調製する方法であって、
【００８８】
【化２２】
0005645658.tif 000023
（式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
ＸとＹの一方又は両方はジエチルアミド以外のアミドである。）
１）２個のメチルエステル末端基を有するペルフルオロポリエーテルメチルエステル（３９）を、ジエチルアミン以外の第一級又は第二級脂肪族アミンと反応させること、
【００８９】
【化２３】
0005645658.tif 000024
２）無修飾メチルエステル末端基を過剰のジエチルアミンと反応させること、及び
３）未反応ジエチルアミンを除去すること、及び
４）場合によっては、フッ素化溶媒中の選択的抽出、又はフルオロプス（ｆｌｕｏｒｏｐｕｓ）相固体抽出、及びろ過によって不揮発性未反応アミンを除去すること
を含む方法を提供する。
【００９０】
場合によっては、画像化試薬は、乳濁液として処方することができる。好ましい乳濁液は、体温（ヒトの場合３７℃）、及び４℃、室温（２０〜２５℃）などの貯蔵温度で安定である。好ましくは、乳濁液は、対象細胞による造影剤の取り込みを容易にするように設計される。乳濁液は、直径５００ｎｍ未満の平均粒子（又は液滴）径を有し得る（乳濁液は、直径５００ｎｍより大きい粒子を含み得るが、当分野で公知の方法によって計算して５００ｎｍ未満の算術平均粒径を有することを意味する。）。ある実施形態においては、乳濁液の平均粒径は、４００ｎｍ未満、又は３００ｎｍ未満、又は２００ｎｍ未満、又は１００ｎｍ未満である。
【００９１】
ある態様においては、本開示は、ＰＦＰＥ誘導体の乳濁液をブロック共重合体を用いて低エネルギー方法によって調製する方法を提供する。ある実施形態においては、ブロック共重合体は、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（プロピレンオキシド）とを含むトリブロック共重合体である。ある実施形態においては、低エネルギー方法を含む乳濁液を調製する方法を使用して、本願の乳濁液のいずれかを調製することができる。ある実施形態においては、低エネルギー方法は、薄膜法を含む。
【００９２】
ある態様においては、本開示は、ＰＦＰＥ誘導体の乳濁液をブロック共重合体を用いて高エネルギー方法によって調製する方法を提供する。ある実施形態においては、ブロック共重合体は、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（プロピレンオキシド）とを含むトリブロック共重合体である。ある実施形態においては、高エネルギー方法を含む乳濁液を調製する方法を使用して、本願の乳濁液のいずれかを調製することができる。ある実施形態においては、高エネルギー方法は、微少溶液操作（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を含む。ある実施形態においては、高エネルギー方法は、均質化を含む。ある実施形態においては、高エネルギー方法は、超音波処理を含む。
【００９３】
ある態様においては、本開示は、乳濁液として処方された二重蛍光１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳ試薬を提供する。方法は、標識された細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの蛍光検出を含み得る。
【００９４】
ある態様においては、本開示は、対象における細胞を検出する方法を提供する。方法は、フッ化炭素画像化試薬で標識された細胞を対象に投与すること、及び対象の少なくとも一部分を核磁気共鳴技術によって検査することを含み得る。かかる分析は、ＭＲＩ又はＭＲＳを含み得る。ＭＲＩ又はＭＲＳは、１９Ｆ分布の画像のデータを収集すること、及び１９Ｆ分布の画像を作成することを含み得る。画像化は、従来の解剖学的１Ｈ画像のデータを収集すること、及び従来の解剖学的１Ｈ画像を作成することも含み得る。好ましい一実施形態においては、１９Ｆと１Ｈの画像は、場合によっては重ね合わせ又は重塁によって、作成、比較される。場合によっては、標識された細胞は１９Ｆ  ＭＲＳを用いて検出することができる。好ましい一実施形態においては、従来の解剖学的１Ｈ画像をテンプレートとして使用して、１９Ｆ  ＭＲＳの１個以上の局在的なボクセルの位置を誘導する。ＮＭＲデータは、生データと処理済データの両方を含むと理解される。
【００９５】
ある態様においては、本開示は、細胞数をｉｎ  ｖｉｖｏで定量化する方法を提供する。方法は、フッ化炭素画像化試薬で標識された細胞を対象に投与すること；及び対象の少なくとも一部分を核磁気共鳴技術によって検査し、それによって対象における標識された細胞を検出すること；及び関心領域（ＲＯＩ）中の標識細胞数を定量化することを含み得る。ある実施形態においては、本開示は、標識された細胞を含む移植片のレシピエントにおける標識された細胞を定量化する方法を提供する。
【００９６】
特定の細胞集団の標識化剤の平均「細胞用量」を較正することは、ｉｎ  ｖｉｖｏ定量の必要条件であり得る。細胞用量のｉｎ  ｖｉｖｏ当量は、細胞１個又は１細胞量当たりの１９Ｆ分子数として表されるが、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞１個当たりの標識量の任意の尺度であると理解される。ある実施形態においては、標識細胞集団の細胞１個又は１細胞量当たりの平均１９Ｆ分子数は、細胞を対象に投与する前に、又は移植前に、まずｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定（すなわち、較正）される。ある実施形態においては、標識細胞集団の細胞１個又は１細胞量当たりの平均１９Ｆ分子数は、標識された細胞の検査と同時に測定（すなわち、較正）される。ある実施形態においては、標識細胞集団の細胞１個又は１細胞量当たりの平均１９Ｆ分子数は、標識された細胞の検査後に較正される。ある実施形態においては、標識細胞集団の細胞１個又は１細胞用量当たりの平均１９Ｆ分子数は、必ずしも患者向けではないが、特定の標識化プロトコル又は一組の条件の結果として標識化剤の細胞用量の較正に使用される、特定のタイプの試験細胞集団において較正される。次いで、細胞用量の値は、同じ細胞集団タイプにおいて、同じ標識化プロトコルを用いて、その後の標識化及びｉｎ  ｖｉｖｏ画像化実験に使用される。ある実施形態においては、標識化剤の細胞用量又は細胞量は、種々の定量技術を用いて、例えば、既知標識細胞数の細胞ペレットの１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルの積分面積を用いて、測定される。１９Ｆ  ＮＭＲに加えて、多数の他の定量方法を使用して、本明細書に記載の標識化試薬の細胞量又は細胞用量を測定することができる。ある実施形態においては、細胞量又は細胞用量は、前のデータから表す、又は推定することができる。ある実施形態においては、細胞用量又は細胞量は、Ｆ１９分子において直接数えなくてもよいが、標識化試薬の細胞用量の単位は、それの代表的なものであり、等価であると理解される。
【００９７】
ある実施形態においては、定量化は、ＲＯＩと同じ視野中の較正済み１９Ｆ信号の使用を含む。較正済み１９Ｆ信号は、本明細書に記載の種々の較正技術、又はこの記述から明らかになるであろう別の技術のいずれかによって、信号と対象内のＲＯＩ中の代表的１９Ｆ分子数又は細胞量との関係を推定することができるような信号である。例として、較正は、既知量の１９Ｆ分子のバイアルをＲＯＩの画像化中にＭＲＩ検出野に配置することによって実施することができる。それによって、ＲＯＩ内の信号強度と１９Ｆ分子数の関係を計算することができる。あるいは、１Ｈなどの別の核を較正標準で使用することができる。
【００９８】
ある実施形態においては、本開示は、ＲＯＩ内の標識細胞数をｉｎ  ｖｉｖｏで定量化する方法を提供する。例えば、細胞投与及びｉｎ  ｖｉｖｏ  １９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳ後に、ＲＯＩ中の全（例えば、積分）１９Ｆ信号強度を較正済み１９Ｆ基準と比較することができる。１９Ｆ基準は、例えば、既知濃度の１９Ｆ核を含む溶液を含む容器であり得る。容器は、好ましくは、画像化対象又は患者の外部若しくは横に、又は場合によっては内部に、データ収集前に配置される。好ましい実施形態においては、基準は、同じ画像視野中の対象と一緒に画像化される。場合によっては、基準は、別のスキャンで画像化することができ、又は外部基準を使用しなくてもよい。
【００９９】
１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータセットからの重要なパラメータセットを計算的に操作又は組み合わせることによって、本明細書に記載のようにＲＯＩ中に存在する標識細胞数を計算することができる。例えば、重要なパラメータセットとしては、（ｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された標識化剤の細胞用量（すなわち、Ｆｃ）、（ｉｉ）標識された細胞の投与後の１つ以上の時点において対象において採集されたｉｎ  ｖｉｖｏ  １９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータセット、（ｉｉｉ）ボクセル体積、（ｉｖ）面内のボクセル面積（すなわち、画像ピクセルの面積）、（ｖ）場合によっては、１９Ｆ比較基準からのＭＲＩ／ＭＲＳデータセット、（ｖｉ）場合によっては、対象材料における１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータの測定ジョンソン雑音、（ｖｉｉ）場合によっては、対象材料における１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータセットの１個以上のボクセルの測定信号ノイズ比（ＳＮＲ）、（ｖｉｉｉ）場合によっては、比較基準からの１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータセットの１個以上のボクセルの測定ＳＮＲ、（ｉｘ）場合によっては、対象材料の１９Ｆ  ＮＭＲ緩和時間（Ｔ１、Ｔ２及びＴ２＊）、（ｘ）場合によっては、比較基準の１９Ｆ  ＮＭＲ緩和時間（Ｔ１、Ｔ２及びＴ２＊）を挙げることができる（例えば、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｃｈａｐｔｅｒ  ４，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｄ．Ｄ．Ｓｔａｒｋ  ａｎｄ  Ｗ．Ｇ．Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｍｏｓｂｙ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ  １９９９参照）。当業者は、標識細胞数をｉｎ  ｓｉｔｕで定量化するのに使用することができる、他のパラメータ、上記セットの組合せ、又はその派生物、特に１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータセットからの派生物を誘導することができる。ある実施形態においては、上記の重要なパラメータセットを使用して、測定された標識細胞数の確度又は信頼度の定量的又は統計学的尺度を誘導することができる。
【０１００】
重要なパラメータ（上記ｉ〜ｘ）、これらの任意のサブセット、又はその組合せ若しくは近似のいずれかを組み合わせて、Ｎｃで示される、対象材料中の１９Ｆ  ＭＲＩによって見られる有効標識細胞数を推定する多数の方法がある。例えば、次式を使用することができる。
【０１０１】
【数１】
0005645658.tif 000025
式中、Ｎｃ＝ＲＯＩ中の全標識細胞数；［ＦＲ］＝較正済み１９Ｆ基準溶液（又はゲル）の１９Ｆ濃度；ｖ＝ボクセル体積；ＩＲ＝ＭＲＩ／ＭＲＳスキャンによって収集され、１個以上のボクセルにわたって平均された、較正済み１９Ｆ基準の平均強度；Ｆｃ＝ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された標識化剤の平均１９Ｆ細胞用量；ＮＲＯＩ＝標識された細胞を含むＲＯＩ中のボクセル数；Ｉｃ（ｉ）＝標識された細胞を含むＲＯＩ中のｉ番目のボクセルの画像強度；ｉ＝標識された細胞を含むＲＯＩ中のボクセルの単位のない指数である。
【０１０２】
ある態様においては、本開示は、１９Ｆ標識された細胞の定量化のための計算システム、及び場合によっては測定細胞数の不確実性の統計学的尺度を提供する。ある実施形態においては、本開示は、コンピュータ、コンピュータに動作可能に接続されたコンピュータ読み取り可能媒体、及びＲＯＩ中の１９Ｆ標識細胞数をｉｎ  ｖｉｖｏで定量化することができるコンピュータ読み取り可能媒体プログラムコードを提供する。ある実施形態においては、システムは、基準と比較した、１９Ｆ信号強度とＲＯＩ中の標識された細胞の体積との比によって、標識細胞数を計算する。ある実施形態においては、システムは、ある式に従って標識細胞数を計算する。式の例は上述されている。ある実施形態においては、定量化は、較正済みＮＭＲ信号を細胞用量に関係づけることを含む。
【０１０３】
ある態様においては、本開示は、１９Ｆ標識された細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ定量化を実施するためのその中に具体化されたコンピュータ読み取り可能プログラムコードを有するコンピュータ読み取り可能媒体、及び場合によっては測定細胞数の不確実性の統計学的尺度を提供する。ある態様においては、コンピュータ読み取り可能媒体プログラムコードは、磁気共鳴技術によって検出されるＲＯＩ中の１９Ｆ標識細胞数を計算する。ある実施形態においては、システムは、基準と比較した、１９Ｆ信号強度とＲＯＩ中の標識された細胞の体積との比によって、標識細胞数を計算する。ある実施形態においては、システムはある式に従って標識細胞数を計算する。ある実施形態においては、同じコンピュータを使用して、細胞数計算に付随する統計学的信頼係数を計算することができる。ある実施形態においては、定量化は、較正済みＮＭＲ信号を細胞用量に関係づけることを含む。
【０１０４】
ある態様においては、本開示は、細胞を標識する方法であって、式１〜１７、２０〜３７、４０〜４２、１ａのいずれか１つの化合物又はペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルを含むフッ化炭素画像化試薬と細胞を、フッ化炭素画像化試薬が細胞と会合するような条件下でｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることを含む、方法を提供する。ある態様においては、本開示は、式１〜１７若しくは２０〜３７、４０〜４２、１ａのいずれか１つの化合物又はペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルを含む乳濁液を提供する。ある態様においては、本開示は、式１８又は１９のどちらか１つの化合物を含むフッ化炭素画像化試薬を提供する。
【０１０５】
ある態様においては、本開示は、対象における細胞を検出する方法であって、
ａ）式１〜１７、２０〜３７、４０〜４２、１ａのいずれか１つの化合物又はペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルを含むフッ化炭素画像化試薬で標識された細胞を対象に投与すること、及び
ｂ）対象の少なくとも一部分を核磁気共鳴技術によって検査し、それによって対象中の標識された細胞を検出すること
を含む方法を提供する。
【０１０６】
ある態様においては、本開示は、移植レシピエント中の移植細胞を検出する方法であって、
ａ）式１〜１７、２０〜３７、４０〜４２、１ａのいずれか１つの化合物又はペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルを含むフッ化炭素画像化試薬でその少なくとも一部が標識された移植細胞を移植レシピエントに投与すること、
ｂ）対象の少なくとも一部分を核磁気共鳴技術によって検査し、それによって、標識された細胞を検出すること
を含む方法を提供する。
【０１０７】
ある態様においては、本開示は、細胞数をｉｎ  ｖｉｖｏで定量化する方法であって、
ａ）式１〜１７、２０〜３７、４０〜４２、１ａのいずれか１つの化合物又はペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルを含むフッ化炭素画像化試薬で標識された細胞を対象に投与すること、及び
ｂ）対象の少なくとも一部分を核磁気共鳴技術によって検査し、それによって対象中の標識された細胞を検出すること、及び
ｃ）関心領域（ＲＯＩ）中の標識細胞数を定量化すること
を含む方法を提供する。
【０１０８】
ある態様においては、本開示は、細胞を標識する方法であって、式１〜１７、２０〜３７、４０〜４２、１ａのいずれか１つの化合物又はペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルを含むフッ化炭素画像化試薬と細胞を、フッ化炭素画像化試薬が細胞と会合するような条件下でｉｎ  ｖｉｖｏで接触させることを含む、方法を提供する。
【０１０９】
ある態様においては、本開示は、対象における細胞を検出する方法であって、
ａ）式１〜１７、２０〜３７、４０〜４２、１ａのいずれか１つの化合物又はペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルを含むフッ化炭素画像化試薬を対象に投与すること、及び
ｂ）対象の少なくとも一部分を核磁気共鳴技術によって検査し、それによって対象中の標識された細胞を検出すること
を含む方法を提供する。
【０１１０】
ある態様においては、本開示は、対象に投与するための標識細胞製剤であって、
ａ）細胞、及び
ｂ）細胞と会合する式１〜１７、２０〜３７、４０〜４２、１ａのいずれか１つの化合物又はペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルを含むフッ化炭素画像化試薬
を含む製剤を提供する。
【０１１１】
上記方法のある実施形態においては、本開示は、式１〜１７若しくは２０〜３７、４０〜４２、１ａのいずれか１つの化合物又はペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルを含む乳濁液を提供する。上記方法のある実施形態においては、本開示は、式１８又は１９のどちらか１つの化合物を含むフッ化炭素画像化試薬を提供する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
式１、２又は６〜８のいずれか１つの化合物であって、
【化５９】
0005645658.tif 000026
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である、化合物。
（項目２）
式１０〜１５のいずれか１つの化合物であって、
【化６０】
0005645658.tif 000027
【化６１】
0005645658.tif 000028
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である、化合物。
（項目３）
式１６〜１７又は４０〜４１のいずれか１つの化合物であって、
【化６２】
0005645658.tif 000029
【化６３】
0005645658.tif 000030
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である、化合物。
（項目４）
式２６の化合物であって、
【化６４】
0005645658.tif 000031
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは蛍光性検出部分である、化合物。
（項目５）
前記化合物が式２０の化合物であって、
【化６５】
0005645658.tif 000032
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である、項目４に記載の化合物。
（項目６）
式２７の化合物であって、
【化６６】
0005645658.tif 000033
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは蛍光性検出部分である、化合物。
（項目７）
前記化合物が式２１の化合物であって、
【化６７】
0005645658.tif 000034
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である、項目６に記載の化合物。
（項目８）
式２８の化合物であって、
【化６８】
0005645658.tif 000035
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは蛍光性検出部分である、化合物。
（項目９）
式２９の化合物であって、
【化６９】
0005645658.tif 000036
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは蛍光性検出部分である、化合物。
（項目１０）
前記化合物が式２３の化合物であって、
【化７０】
0005645658.tif 000037
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である、項目９に記載の化合物。
（項目１１）
式３０の化合物であって、
【化７１】
0005645658.tif 000038
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは蛍光性検出部分である、化合物。
（項目１２）
前記化合物が式２４の化合物であって、
【化７２】
0005645658.tif 000039
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である、項目１１に記載の化合物。
（項目１３）
式３１の化合物であって、
【化７３】
0005645658.tif 000040
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは蛍光性検出部分である、化合物。
（項目１４）
前記化合物が式２５の化合物であって、
【化７４】
0005645658.tif 000041
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である、項目１３に記載の化合物。
（項目１５）
式３２〜３７のいずれか１つの化合物であって、
【化７５】
0005645658.tif 000042
【化７６】
0005645658.tif 000043
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは各々独立に蛍光性検出部分である、化合物。
（項目１６）
式１０の化合物と式１の化合物とを含む、組成物。
（項目１７）
式１２の化合物と式１の化合物とを含む、組成物。
（項目１８）
式１４の化合物と式１の化合物とを含む、組成物。
（項目１９）
式１６の化合物と式１の化合物とを含む、組成物。
（項目２０）
式４０の化合物と式１の化合物とを含む、組成物。
（項目２１）
式１０の化合物と式２０の化合物とを含む、組成物。
（項目２２）
式１０の化合物と、式２０の化合物と、式１の化合物とを含む、組成物。
（項目２３）
式１１の化合物と式２１の化合物とを含む、組成物。
（項目２４）
式１１の化合物と式２２の化合物とを含む、組成物。
（項目２５）
式１２の化合物と式２３の化合物とを含む、組成物。
（項目２６）
式１２の化合物と、式２３の化合物と、式１の化合物とを含む、組成物。
（項目２７）
式１３の化合物と式２４の化合物とを含む、組成物。
（項目２８）
式１３の化合物と式２５の化合物とを含む、組成物。
（項目２９）
式１０の化合物と式２６の化合物とを含む、組成物。
（項目３０）
式１０の化合物と、式２６の化合物と、式１の化合物とを含む、組成物。
（項目３１）
式１１の化合物と式２７の化合物とを含む、組成物。
（項目３２）
式１１の化合物と式２８の化合物とを含む、組成物。
（項目３３）
式１２の化合物と式２９の化合物とを含む、組成物。
（項目３４）
式１２の化合物と、式２９の化合物と、式１の化合物とを含む、組成物。
（項目３５）
式１３の化合物と式３０の化合物とを含む、組成物。
（項目３６）
式１３の化合物と式３１の化合物とを含む、組成物。
（項目３７）
式１０の化合物と式３２の化合物とを含む、組成物。
（項目３８）
式１０の化合物と、式３２の化合物と、式１の化合物とを含む、組成物。
（項目３９）
式１１の化合物と式３３の化合物とを含む、組成物。
（項目４０）
式１１の化合物と式３４の化合物とを含む、組成物。
（項目４１）
式１２の化合物と式３５の化合物とを含む、組成物。
（項目４２）
式１２の化合物と、式３５の化合物と、式１の化合物とを含む、組成物。
（項目４３）
式１３の化合物と式３６の化合物とを含む、組成物。
（項目４４）
式１３の化合物と式３７の化合物とを含む、組成物。
（項目４５）
項目１から１５のいずれか一項に記載の１種類以上の化合物と、式１ａの化合物とを含み、
【化７７】
0005645658.tif 000044
式中、ｐは８から１３の整数であり、
Ｒｆは２：１の比のＣＦ３とＣＦ２ＣＦ３である、組成物。
（項目４６）
前記組成物が式１ａの化合物８０〜９５％ｖ／ｖを含む、項目４５に記載の組成物。
（項目４７）
項目１から１５のいずれか一項に記載の１種類以上の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む、組成物。
（項目４８）
前記組成物がペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテル８０〜９５％ｖ／ｖを含む、項目４７に記載の組成物。
（項目４９）
次式の化合物。
【化７８】
0005645658.tif 000045
（項目５０）
項目１から１５若しくは４９のいずれか一項に記載の化合物、又は項目１６から４８のいずれか一項に記載の組成物を含む、乳濁液。
（項目５１）
ブロック共重合体を更に含む、項目５０に記載の乳濁液。
（項目５２）
前記ブロック共重合体が、平均分子量１９００、２９００又は８４００を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体である、項目５１に記載の乳濁液。
（項目５３）
脂質を更に含む、項目５０に記載の乳濁液。
（項目５４）
前記脂質がＤＭＰＣである、項目５３に記載の乳濁液。
（項目５５）
ブロック共重合体を更に含む、項目５４に記載の乳濁液。
（項目５６）
前記ブロック共重合体が、平均分子量１９００を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体である、項目５５に記載の乳濁液。
（項目５７）
ポリエチルアミンを更に含む、項目５０に記載の乳濁液。
（項目５８）
硫酸プロタミンを更に含む、項目５０に記載の乳濁液。
（項目５９）
ブロック共重合体を更に含む、項目５８に記載の乳濁液。
（項目６０）
前記ブロック共重合体が、平均分子量１９００を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体である、項目５９に記載の乳濁液。
（項目６１）
前記乳濁液が直径２００ｎＭ未満の平均粒径を有する、項目５０に記載の乳濁液。
（項目６２）
前記乳濁液が温度４℃から３７℃で安定である、項目５０に記載の乳濁液。
（項目６３）
前記乳濁液が０．１から０．２の多分散指数を有する、項目５０に記載の乳濁液。
（項目６４）
以下からなる群から選択される乳濁液：
式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１ａの化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
式１ａの化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
式１ａの化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、硫酸プロタミンとを含む、乳濁液；
ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、ポリエチルアミンとを含む、乳濁液；
ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３及び平均ＰＰＯ単位数約２９を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体とを含む、乳濁液；
式１ａの化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤とを含む乳濁液であって、前記乳化剤が、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である、乳濁液；
式１ａの化合物と、式１の化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤とを含む乳濁液であって、前記乳化剤が、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である、乳濁液；
式１ａの化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤とを含む乳濁液であって、前記乳化剤が、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である、乳濁液；
式１ａの化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤とを含む乳濁液であって、前記乳化剤が、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である、乳濁液；
ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤とを含む乳濁液であって、前記乳化剤が、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である、乳濁液；
式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤とを含む乳濁液であって、前記乳化剤が、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である、乳濁液；
式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤とを含む乳濁液であって、前記乳化剤が、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である、乳濁液；
式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤とを含む乳濁液であって、前記乳化剤が、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である、乳濁液；
式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤とを含む乳濁液であって、前記乳化剤が、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である、乳濁液；
式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤とを含む乳濁液であって、前記乳化剤が、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である、乳濁液；
式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤とを含む乳濁液であって、前記乳化剤が、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である、乳濁液；及び
式４２の化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４及び平均ＰＰＯ単位数約５６を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体と、乳化剤とを含む乳濁液であって、前記乳化剤が、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤である、乳濁液。
（項目６５）
式１の化合物と式３８の化合物とを含む組成物を調製する方法であって、
【化７９】
0005645658.tif 000046
（式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
ＸとＹの一方又は両方はジエチルアミド以外のアミドである）
１）２個のメチルエステル末端基を有するペルフルオロポリエーテルメチルエステル（３９）を、ジエチルアミン以外の第一級又は第二級脂肪族アミンと反応させること、
【化８０】
0005645658.tif 000047
２）無修飾メチルエステル末端基を過剰のジエチルアミンと反応させること、
３）未反応ジエチルアミンを除去すること、及び
４）場合によっては、フッ素化溶媒中の選択的抽出、又はフルオロプス相固体抽出、及びろ過によって不揮発性未反応アミンを除去すること
を含む、方法。
（項目６６）
ＰＦＰＥ誘導体の乳濁液をブロック共重合体を用いて低エネルギー方法によって調製する方法。
（項目６７）
低エネルギー方法を含む、項目５０から６４のいずれか一項に記載の乳濁液を調製する方法。
（項目６８）
前記低エネルギー方法が薄膜法を含む、項目６６又は６７のどちらか一項に記載の方法。
（項目６９）
高エネルギー方法を含む、項目５０から６４のいずれか一項に記載の乳濁液を調製する方法。
（項目７０）
前記高エネルギー方法が微少溶液操作である、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記高エネルギー方法が超音波処理である、項目６９に記載の方法。
（項目７２）
細胞を標識する方法であって、項目１から１５又は４９のいずれか一項に記載の化合物を含むフッ化炭素画像化試薬と前記細胞を、前記フッ化炭素画像化試薬が前記細胞と会合するような条件下でｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることを含む、方法。
（項目７３）
対象における細胞を検出する方法であって、
ａ）項目１から１５又は４９のいずれか一項に記載の化合物を含むフッ化炭素画像化試薬で標識された細胞を前記対象に投与すること、及び
ｂ）前記対象の少なくとも一部分を核磁気共鳴技術によって検査し、それによって前記対象中の標識された細胞を検出すること
を含む、方法。
（項目７４）
移植レシピエント中の移植細胞を検出する方法であって、
ａ）項目１から１５又は４９のいずれか一項に記載の化合物を含むフッ化炭素画像化試薬でその少なくとも一部が標識された移植細胞を移植レシピエントに投与すること、
ｂ）前記対象の少なくとも一部分を核磁気共鳴技術によって検査し、それによって前記標識された細胞を検出すること
を含む、方法。
（項目７５）
細胞数をｉｎ  ｖｉｖｏで定量化する方法であって、
ａ）項目１から１５又は４９のいずれか一項に記載の化合物を含むフッ化炭素画像化試薬で標識された細胞を前記対象に投与すること、
ｂ）前記対象の少なくとも一部分を核磁気共鳴技術によって検査し、それによって前記対象中の標識された細胞を検出すること、及び
ｃ）関心領域（ＲＯＩ）中の標識細胞数を定量化すること
を含む、方法。
（項目７６）
細胞を標識する方法であって、項目１から１５又は４９のいずれか一項に記載の化合物を含むフッ化炭素画像化試薬と前記細胞を、前記フッ化炭素画像化試薬が前記細胞と会合するような条件下でｉｎ  ｖｉｖｏで接触させることを含む、方法。
（項目７７）
対象における細胞を検出する方法であって、
ａ）項目１から１５又は４９のいずれか一項に記載の化合物を含むフッ化炭素画像化試薬を前記対象に投与すること、及び
ｂ）前記対象の少なくとも一部分を核磁気共鳴技術によって検査し、それによって前記対象中の標識された細胞を検出すること
を含む、方法。
（項目７８）
対象に投与するための標識細胞製剤であって、
ａ）細胞、及び
ｂ）前記細胞と会合する項目１から１５又は４９のいずれか一項に記載の化合物を含むフッ化炭素画像化試薬
を含む、標識細胞製剤。
【０１１２】
この開示から明らかなように、本明細書に記載の組成物及び方法は、種々の臨床手順において有用である。例えば、本開示は、移植レシピエント、別のタイプの細胞療法のレシピエントなどのレシピエント中のドナー細胞を検出する方法を提供する。かかる方法は、フッ化炭素画像化試薬でその少なくとも一部が標識された移植細胞を移植レシピエントに投与すること、及び対象の少なくとも一部分を核磁気共鳴技術によって検査し、それによって、標識された細胞を検出することを含み得る。標識された細胞の検出は、１回又は繰り返し実施することができ、移植レシピエント中の標識された細胞の位置及び輸送についての情報を提供するように実施することができる。細胞レシピエントの例としては、骨髄移植片（又は一般に、ただしそれだけではないが、骨髄、末梢血又はさい帯血に由来する、造血幹細胞を含む細胞画分）のレシピエント、及び別の細胞又は臓器移植レシピエントが挙げられる。臓器移植レシピエントとしては、肝臓、心臓、肺、腎臓、すい臓組織、神経組織、他の移植片などのドナー臓器のレシピエントが挙げられる。レシピエントとしては、ドナー細胞のレシピエントも挙げられる。ドナー細胞は、ドナーに直接由来し得（自己細胞の場合、「ドナー」は、レシピエントと同じ個体である。）、又は使用前に、限られた若しくは大規模な培養に供することができる。ドナー細胞は、有用な細胞の出所として役立つ本質的にあらゆる組織に由来し得るものであり、造血幹細胞、血管芽細胞、肝幹細胞、神経幹細胞、筋幹細胞（例えば、衛星細胞）、心筋細胞前駆細胞、すい臓幹細胞、血管内皮前駆細胞、間葉幹細胞、骨若しくは軟骨前駆細胞などの（前駆細胞を含めた）幹細胞を挙げることができ、又は樹状細胞、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞）、軟骨細胞、骨芽細胞などの成熟細胞を挙げることができる。投与用細胞は、自己、異種とすることができ、さらにはブタなどの別の生物体に由来し得る。本発明の別の態様は、以下の開示から明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８を用いて１×  ＨＢＳＳ緩衝剤中で超音波処理によって乳化されたＰＦＰＥアミド１。乳濁液を１×  ＨＢＳＳで希釈し、粒径を動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。データは、２つの独立した測定値の平均である（平均±ＳＤ）。ＰＦＰＥアミド１の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、２１．６ｍｏｌ％Ｆ６８及び１×  ＨＢＳＳ緩衝剤の存在下で２２．２ｍｇ／ｍＬであり、２本の曲線のグラフの交差点から推定された。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）で実施された測定。
【図２】ＰＦＰＥアミド１の乳化に対する中性親油性蛍光色素の効果。Ｌ３５を用いて水中で超音波処理によって乳化されたＢＯＤＩＰｙ−ＰＦＰＥアミド１６及びＰＦＰＥアミド１を含む組成物。親油性色素は、ＰＦＰＥ乳濁液の粒径及び多分散性にさほど影響しない。データは、３つの独立した測定値の平均である（平均±ＳＤ）。
【図３】ＢＯＤＩＰｙで標識されたＰＦＰＥアミドオイルの蛍光強度。Ｌ３５を用いて水中で乳化されたＢＯＤＩＰｙ−ＰＦＰＥアミド１６及びＰＦＰＥアミド１を含む組成物。データは、３つ組で測定された平均蛍光強度である（平均±ＳＤ）。
【図４】追加の乳化剤も界面活性剤もなしで、水中で超音波処理によって乳化されたＰＥＧ−ＰＦＰＥアミド１４及びＰＦＰＥアミド１を含む組成物。粒径は、ＤＬＳによって測定された。データは、２つの独立した測定値の平均である  平均±ＳＤ。
【図５】追加の乳化剤も界面活性剤もなしで、１×  ＨＢＳＳ中で超音波処理によって乳化されたＰＥＧ−ＰＦＰＥアミド１４及びＰＦＰＥアミド１を含む組成物。粒径は、ＤＬＳによって測定された。データは、２つの独立した測定値の平均である（平均±ＳＤ）。
【図６】追加の乳化剤も界面活性剤もなしで、水中における１０の異なるｍｏｌ％でのＰＥＧ−ＰＦＰＥアミド１０及びＰＦＰＥアミド１を含む組成物の乳化の粒径測定。
【図７】追加の乳化剤も界面活性剤もなしで、１×  ＨＢＳＳ中における１０の異なるｍｏｌ％でのＰＥＧ−ＰＦＰＥアミド１０及びＰＦＰＥアミド１を含む組成物の乳化の粒径測定。
【図８】Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ３５を用いたＰＦＰＥアミド１の乳化に対するＰＥＧ−ＰＦＰＥ−アミド１０の効果。乳濁液を超音波処理によって調製した。
【図９】粒径及び多分散指数（ＰＤＩ）を、中性脂質ＤＭＰＣを用いて乳化されたＰＦＰＥアミド１に対して、薄膜法と超音波処理方法の組合せを用いて種々の比で測定した。データは、２つの測定値の平均である（平均±ＳＤ）。
【図１０】中性脂質ＤＭＰＣを用いて１×  ＨＢＳＳ中で乳化されたＰＦＰＥアミド１のサイズ及び体積分布。粒径は、２つの独立した測定値の平均に従って、１５９ｎｍであり、ＰＤＩ＝０．１８２であると求められた。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）で実施された測定。
【図１１】脂質を用いたＰＦＰＥアミド１乳濁液の低及び高エネルギー乳化プロセスの粒径及びＰＤＩの比較。超音波処理によって、乳濁液液滴サイズがかなり減少した。データは、２つの測定値の平均である（平均±ＳＤ）。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）で実施された測定。
【図１２】ＤＤＡＢ／ＤＭＰＣ／ＰＦＰＥアミド１乳濁液の特性分析。超音波処理によって、乳濁液液滴サイズ及びＰＤＩが減少した。データは、２つの測定値の平均である（平均±ＳＤ）。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）で実施された測定。
【図１３】単独の、さらに、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）と組み合わせた、ＰＦＰＥアミド１の乳化に対する異なる量のカチオン性脂質（ＣＴＡＢ）の効果の動的光散乱試験。ＣＴＡＢ濃度の増加に伴うサイズ及びＰＤＩの大きな変化なし。
【図１４】カチオン性脂質をＰＦＰＥアミド１乳濁液に添加することによるゼータ電位符号の逆転。データは、２つの測定値の平均である（平均±ＳＤ）。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）で実施された測定。
【図１５】ＰＦＰＥアミド１／ＰＥＩ水中乳濁液の光散乱強度分布によるサイズ分布。ＰＥＩの存在は、サイズにもＰＤＩにも影響しなかった。
【図１６】超音波処理によって調製された硫酸プロタミン／ＰＦＰＥアミド１ナノ粒子の粒径及びＰＤＩ測定。硫酸プロタミン量が増加すると、サイズとＰＤＩの両方が増加した。
【図１７】硫酸プロタミン／ＰＦＰＥアミド１のゼータ電位測定。硫酸プロタミンが０．５％ｗ／ｗに達すると、粒径が増加し、ゼータ電位の符号が正に変化した。データは、２つの測定値の平均である（平均±ＳＤ）。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）で実施された測定。
【図１８】細胞送達の改善のために硫酸プロタミンで被覆されたＰＦＰＥアミド１／Ｌ３５乳濁液の動的光散乱（ＤＬＳ）測定。硫酸プロタミンの存在によって、被覆粒子の粒径がわずかに増加した。
【図１９】１×  ＨＢＳＳ中のＰＦＰＥアミド１／Ｆ６８乳濁液の微少溶液操作後の粒径及びＰＤＩ測定。パス回数が増加すると、粒径及びＰＤＩが減少した。
【図２０】ＤＬＳ測定によって評価した１×  ＨＢＳＳ中のＰＦＰＥアミド１／Ｆ６８微少溶液操作乳濁液の経時安定性。データは、２つの独立した測定値の平均である（平均±ＳＤ）。
【図２１】それぞれ倍率１５０×及び７０×の電子顕微鏡法（ＥＭ）測定は、ＰＦＰＥアミド１／Ｆ６８微少溶液操作乳濁液の平均サイズ２００ｎｍの輪郭のはっきりした液滴を示した。
【図２２】水中で調製し、室温で貯蔵したＰＦＰＥアミド１／Ｌ３５及びＰＦＰＥアミド１／Ｌ６４を含む微少溶液操作乳濁液の安定性。データは、２つの独立した測定値の平均である（平均±ＳＤ）。サイズ及びＰＤＩの経時変化がないことによって示されるように、乳濁液は７週間安定であった。
【図２３】水中でＰＥＩ（低ＭＷ）を用いて／用いないで微少溶液操作したＰＦＰＥアミド１／Ｆ６８乳濁液の安定性。すべての乳濁液を初期濃度で貯蔵し、各測定前に水で１０倍希釈した。データは、異なる温度での貯蔵後にＤＬＳによって経時的に測定した直径として示される粒径である。
【図２４】図２４Ａは、微少溶液操作後のＰＦＰＥ−オキシド／Ｆ６８乳濁液とＰＦＰＥアミド１／Ｆ６８のＤＬＳ比較。両方の化合物は、同じように乳化し、同一の粒径及びＰＤＩを示す。図２４Ｂは、３つの異なる温度４、２５及び３７℃におけるＰＦＰＥ−オキシド／Ｆ６８／ＰＥＩ乳濁液の長期安定性（２５０日間）。データは、経時的に測定したＺ平均（すなわち、ｎｍ単位の直径）である。
【図２５】ＰＦＰＥ−オキシド／Ｆ６８／ＰＥＩ乳濁液の１９Ｆ  ＮＭＲ。−９１．６ｐｐｍの主ＰＦＰＥ−オキシドピークは、ＰＦＰＥアミド１乳濁液と同じ化学シフトを有する。ＰＦＰＥオキシド１ａの更なる同定ピークは、−５８．９５１及び−９３．６４１ｐｐｍである。スペクトルは、４７０ＭＨｚで得られた。ＴＦＡ（ＣＦ３ＣＯＯＨ）（０．１％ｖ／ｖ）は、−７６．００ｐｐｍの内部基準である。
【図２６】細胞培養培地中の３７℃における血清存在下でのＰＦＰＥ乳濁液の安定性。乳濁液を微少溶液操作によって調製した。データは、更に希釈せずに測定した、細胞標識化濃度及び異なる時点における、細胞培養培地中のＤＬＳ測定値である。
【図２７】水中で薄膜法及び加熱によって調製されたＰＦＰＥ−チラミド６／Ｆ６８乳濁液の濃度の関数としての光散乱強度及び粒径の測定値。データは、３つの独立した測定値の平均である（平均±ＳＤ）。ＳＤは小さすぎて、示したグラフスケールでは見ることができない。
【図２８】水中でのＰＦＰＥ−チラミド６／Ｆ６８乳濁液の安定性。乳濁液を室温で貯蔵し、各測定前に水で１０倍希釈した。データは、２つの測定値の平均である（平均±ＳＤ）。
【図２９】薄膜法によって調製したＰＦＰＥ（２−ヒドロキシル）エチルオキシエチルアミド２／Ｆ６８乳濁液の水及び１×  ＨＢＳＳ中の２つの異なる温度におけるＤＬＳ測定値。乳濁液液滴は、水中ではかなり小さかった。
【図３０】Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）対細胞数。この図は、樹状細胞（ＤＣ）のＰＦＰＥ標識化後に細胞数及び生存度を推定するための代表的な発光相関曲線を示す。データは、３つ組で実施した測定の平均である（平均±ＳＤ）。
【図３１】ＰＦＰＥアミド１／Ｌ３５乳濁液で標識されたＤＣの１９Ｆ  ＮＭＲスペクトル。細胞を３時間標識し、洗浄し、トリプシン処理し、１×  ＰＢＳに再懸濁させた。ＴＦＡを信号定量化の基準として使用した。
【図３２】Ｌ３５を用いて超音波処理によって乳化させた種々のＰＦＰＥ誘導体を用いてＤＣを標識化。図３２Ａは、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ発光−細胞数相関曲線から推定された細胞数。データは、２つの独立した標識化試験の平均である（平均±ＳＤ）。図３２Ｂは、ＤＣ細胞懸濁液の１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルから推定されたフッ素含有量。データは、２つの独立した測定値の平均である（平均±ＳＤ）。
【図３３】Ｌ３５を用いて超音波処理によって乳化され、細胞標識化前に硫酸プロタミンで被覆されたＰＦＰＥ誘導体によるＤＣの標識化。図３３Ａは、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ発光−細胞数相関曲線から推定された細胞数。データは、２つの独立した標識化試験の平均である（平均±ＳＤ）。図３３Ｂは、ＤＣ細胞懸濁液の１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルから推定されたフッ素含有量。データは、２つの独立した測定値の平均である（平均±ＳＤ）。
【図３４】樹状細胞におけるＰＦＰＥ−チラミド／Ｆ６８乳濁液の取り込み。ＰＦＰＥと複合化されたチラミンは、細胞内取り込みを促進し、細胞毒性を低下させる。図３４Ａは、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ発光測定から推定された細胞生存度。図３４Ｂは、１９Ｆ取り込み測定は、乳濁液用量と線形相関を示す。データは、２つの独立した測定値の平均である。
【図３５】硫酸プロタミンを含む及び含まないＰＦＰＥ／Ｌ３５乳濁液を用いたジャーカット細胞の標識化。図３５Ａは、細胞数をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ発光−細胞数相関曲線から推定した。図３５Ｂは、ジャーカット細胞懸濁液の１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルから推定されたフッ素含有量。硫酸プロタミンで被覆されたナノエマルジョン液滴の取り込みの劇的増加が観察された。データは、２つの独立した測定値の平均である（平均±ＳＤ）。
【図３６】ＰＦＰＥアミド／Ｌ３５で標識されたＴ細胞ペレットの１９Ｆ  ＮＭＲスペクトル。ＴＦＡを基準として使用した。
【図３７】ＰＦＰＥで標識されたジャーカット細胞の長期生存度。標識された細胞を９６ウェルプレート中で培養し、生存度をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏによって各時点で試験した。データは、３つ組実験の平均である（平均±ＳＤ）。
【図３８】Ｌ３５を用いて水中で超音波処理によって乳化させ、Ｔ細胞標識化に使用したＢＯＤＩＰｙ−ＰＦＰＥアミド１６及びＰＦＰＥアミド１。Ｔ細胞におけるＰＦＰＥ−ＢＯＤＩＰｙ／Ｌ３５乳濁液取り込みを、共有結合したＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ色素の蛍光信号によって測定した。これらの定量的蛍光測定は、用量依存的取り込みを示している。
【図３９】ＰＦＰＥ−ＢＯＤＩＰｙ／Ｌ３５乳濁液で標識されたＴ細胞からの蛍光信号と１９Ｆ  ＮＭＲ信号の相関。データは、２つ組実験の平均である（平均±ＳＤ）。データは、二重蛍光性１９Ｆ標識の有用性を示している。
【図４０】ＢＯＤＩＰｙ−ＰＦＰＥ／Ｌ３５乳濁液で標識されたＤＣ（図４０Ａは未処理であり、図４０Ｂは標識されている。）、及び硫酸プロタミンで被覆されたＢＯＤＩＰｙ−ＰＦＰＥ／Ｌ３５（図４０Ｃは未処理であり、図４０Ｄは標識されている。）の蛍光画像。
【図４１】ＰＥＩを含む及び含まないＰＦＰＥ−オキシド／Ｆ６８乳濁液で標識されたジャーカット細胞。取り込みは、ＰＥＩによって数倍増加した。データは、３つ組実験の平均である（平均±ＳＤ）。
【図４２】懸濁状態で標識された非食細胞（ジャーカット細胞）におけるＰＦＰＥ−オキシド／Ｆ６８／ＰＥＩ乳濁液の用量依存的取り込み。データは、３つ組実験の平均である（平均±ＳＤ）。
【図４３】Ａｌｅｘａ６４７−ＰＦＰＥアミド／Ｌ３５乳濁液の測定であって、図４３Ａは吸光度検量線であり、図４３Ｂは蛍光検量線であり、図４３Ｃは、乳濁液蛍光発光スペクトルが遊離色素のそれと同じであることを示す。
【図４４−１】ＰＦＰＥアミド及びＰＦＰＥ乳濁液生成物のＧＣ／ＦＩＤ記録。両方の試料は、使用条件下で同じポリマー分布及び保持時間を示す。
【図４４−２】ＰＦＰＥアミド及びＰＦＰＥ乳濁液生成物のＧＣ／ＦＩＤ記録。両方の試料は、使用条件下で同じポリマー分布及び保持時間を示す。
【図４５】ＰＦＰＥアミド１及び出発材料ＰＦＰＥエステル３９の１Ｈ  ＮＭＲ。メチル基ピーク（４．１ｐｐｍ）の消滅は、ＰＦＰＥエステルからＰＦＰＥアミドへの転化の指標として役立ち、カップリング反応のモニターに使用された。
【図４６】ＰＦＰＥを完全に可溶化するｄ３−トリフルオロエタノール溶媒中のＰＦＰＥアミド１の１３Ｃ  ＮＭＲ。
【図４７】ＰＦＰＥエステル３９の１３Ｃ  ＮＭＲ。
【図４８】ＰＦＰＥアミド１の１９Ｆ  ＮＭＲスペクトル。前末端（ｐｒｅｔｅｒｍｉｎａｌ）ＣＦ２基の特徴的ピークは−７４．４ｐｐｍにある。ＴＦＡ基準を−７６ｐｐｍに設定した。
【図４９】ＰＦＰＥエステルの１９Ｆ  ＮＭＲスペクトル。前末端ＣＦ２基の特徴的ピークは−８０．３ｐｐｍにある。このピークの化学シフトをアミンカップリング及びアミド合成の指標として使用した。
【図５０】ＰＦＰＥアミド１のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析。
【図５１】選択的疎フルオロ性（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｂｉｃ）溶媒溶出によってＦｌｕｏｒｏＦｌａｓｈ上で精製されたＰＦＰＥ−チラミドの１Ｈ  ＮＭＲ。
【図５２】ＰＦＰＥ−チラミドの１９Ｆ  ＮＭＲ。特徴的ピークは前末端ＣＦ２基の場合−７８．８ｐｐｍにある。
【図５３】本発明の説明のための一実施形態によるコンピュータ１０４の機能を実施するための汎用コンピュータシステム２００の機能ブロック図。
【図５４】微少溶液操作によって調製したＡ）ＰＦＰＥ−オキシド／Ｆ６８の３つの異なる温度における長期安定性（２５０日間）及びＢ）ＰＦＰＥ−オキシド／Ｆ６８／硫酸プロタミンナノエマルジョン。測定をＤＬＳによって行った。硫酸プロタミンを含むナノエマルジョンは、温度が高い（２５及び３７℃）ほど高い安定性を示す。低温（４℃）では、両方の乳濁液は２５０日間安定であった。
【図５５】ＤＣにおける硫酸プロタミンを含む／含まないＰＦＰＥ−オキシド／Ｆ６８乳濁液の取り込み用量曲線。データは、２つの独立した測定値の平均である（平均±ＳＤ）。取り込みの劇的な増加（例えば、ほぼ１桁）が、硫酸プロタミンを組み入れたＰＦＰＥオキシド１ａナノエマルジョンで認められた。
【図５６】ＰＦＰＥオキシド１ａとブレンドし、Ｆ６８及びＰＥＩを用いて水中で微少溶液操作によって乳化させたＢＯＤＩＰｙ−ＰＦＰＥアミド１６及びＰＦＰＥアミド１を用いて標識された活性化一次Ｔ細胞。図５６ＡはＤＩＣ画像、図５６ＢはＣＤ４−ＦＩＴＣ（緑）抗体で染色された細胞表面、図５６ＣはＢＯＤＩＰｙ−ＰＦＰＥナノエマルジョン（赤）。
【図５７】３時間共インキュベーション後のブレンドＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ  ＰＦＰＥアミド／ＰＦＰＥオキシド１ａナノエマルジョンで標識された非食細胞のジャーカット細胞における１９Ｆ  ＮＭＲと蛍光の相関。データは、２つ組実験の平均である（平均±ＳＤ）。データは、二重蛍光性１９Ｆ標識の有用性を示している。
【図５８】ブレンドナノエマルジョンで標識されたＤＣの蛍光画像である。ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ  ＰＦＰＥブレンドナノエマルジョンを示す。図５８ＡはＤＩＣ画像を示し、図５８ＢはＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ  ＰＦＰＥ（赤）を示す。ＦＩＴＣ  ＰＦＰＥブレンドナノエマルジョンも示す。図５８ＣはＤＩＣ画像であり、図５８ＤはＦＩＴＣ  ＰＦＰＥ（緑）を示す。
【図５９】ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲカダベリン濃度対吸光度較正曲線。トリフルオロエタノール中の最大吸光度として実験的に決定した固定吸収波長５９３ｎｍで吸光度を測定した。データは、３つの独立した測定値の平均である（平均±ＳＤ）。
【図６０】Ｆ６８及び硫酸プロタミンを用いて微少溶液操作によって調製したＦＩＴＣ  ＰＦＰＥアミド／ペルフルオロ−１５−クラウン−５ナノエマルジョンと一緒にインキュベートした９Ｌ細胞。細胞を漸増濃度のナノエマルジョンに３時間曝露した。図６０Ａは、細胞数をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ発光−細胞数相関曲線から推定した。図６０Ｂは、９Ｌ細胞懸濁液の１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルから推定されたフッ素含有量。データは、２つの独立した測定値の平均である（平均±ＳＤ）。
【図６１】Ｐ１０５／Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ混合ミセルを用いて調製したＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ  ＰＦＰＥアミド／ペルフルオロ−１５−クラウン−５ナノエマルジョンと一緒にインキュベートしたＲＡＷ細胞。細胞を漸増濃度のナノエマルジョンに２４時間曝露し、細胞負荷を１９Ｆ  ＮＭＲによって測定した。データ（細胞負荷、１９Ｆ／細胞）は、２つ組測定の平均である（平均±ＳＤ）。
【図６２】ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ  ＰＦＰＥアミド１／ペルフルオロ−１５−クラウンエーテル／Ｐ１０５／Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬナノエマルジョンで標識されたＲＡＷ２６４．１細胞の１９Ｆ  ＮＭＲスペクトル。細胞をナノエマルジョンと一緒に２４時間インキュベートし、洗浄し、解体し、１×  ＰＢＳに再懸濁させた。ＴＦＡ（−７６．００ｐｐｍ）を信号定量化の基準として使用した。標識された細胞は、スペクトル中の−９２．４７ｐｐｍに見られる。
【図６３】ＤＣにおけるＣＦ３ナノエマルジョン取り込みに対する効果界面活性剤量。図６３Ａは、１９Ｆ  ＮＭＲによって測定したＤＣにおける取り込み量、図６３Ｂは、異なるナノエマルジョンに３時間曝露後の細胞生存率。データは、２つの独立した測定値の平均である（平均±ＳＤ）。
【図６４】３時間インキュベーション後のＤＣにおけるナノエマルジョンＡ４の用量依存的取り込み。取り込みを１９Ｆ  ＮＭＲによって測定した。データは、４つの独立した測定値の平均である（平均±ＳＤ）。
【図６５】ナノエマルジョンＡ４で標識されたＤＣの１９Ｆ  ＮＭＲスペクトル。標識された細胞は−７２．５ｐｐｍのピークで表され、ＴＦＡは−７６．０ｐｐｍにおいて基準として働く。
【発明を実施するための形態】
【０１１４】
１．概要
ある態様においては、本開示は、フッ化炭素画像化試薬などの核磁気共鳴画像化試薬を用いて細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで標識化し、標識された細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで定量化する新規な方法及び試薬を提供する。ある態様においては、本開示は、核磁気共鳴画像化試薬を用いて細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで標識化する新規な方法及び試薬を提供する。標識された細胞は、１９Ｆ核磁気共鳴技術（例えば、ＭＲＩ／ＭＲＳ）によって検出することができ、本明細書に記載の方法によって定量化することができる。１９Ｆ核磁気共鳴技術は、内因的なバックグラウンド信号が存在しないために、生物系に対する優れた画像化ツールである。フッ素は、生きている生物体においては存在したとしても極めて低レベルであり、一般に液体状態核磁気共鳴技術によって検出可能である化学的形態ではない。これは、従来の１Ｈ  ＭＲＩとは全く異なる。従来の１Ｈ  ＭＲＩは、微細な解剖学的詳細を可視化するものの、特定の細胞集団を選択的に検出することができない。本明細書に開示するある種の方法は、全身又は体の一部をスクリーニングして、生きている対象における標識された細胞の分布を可視化することができる。１９Ｆ核磁気共鳴によって検出される標識された細胞の正確な解剖学的位置は、例えば、解剖学的詳細を与える１Ｈ  ＭＲＩ画像の重ね合わせによって決定することができる。好ましい実施形態においては、１Ｈ画像は、（対象を移動させずに）１９Ｆ画像と同じ画像化期間中に取得され、確実に登録される。さらに、本明細書に開示する核磁気共鳴技術は、組織試料、切除された臓器、及び細胞培養の場合のような、ｅｘ  ｖｉｖｏの状況で効果的に適用することができる。本明細書に開示する画像化技術は、多数の生物学的及び医学的問題に適用することができる。
【０１１５】
ある態様においては、本発明の方法は、１９Ｆ画像化試薬を用いて細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで標識化すること、標識された細胞を対象に投与すること、及び対象における標識された細胞を検出することを含み得る。標識される細胞は、粗製細胞画分若しくは組織試料とすることができ、又は細胞は、標識化前に培養することができ、及び／又は濃縮することができる。例えば、標識化前に特定の細胞型を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって選択することができる。対象となり得る多様な細胞型に対して、他の選別又は選択的濃縮方法が当分野で公知である。標識される細胞のタイプは、画像化試薬の性質によって調節することもできる。例えば、画像化試薬の単純なコロイド状懸濁液は、貪食作用を有する細胞によってより急速に吸収される傾向がある。別の例として、画像化試薬は、特定の細胞集団への画像化試薬の選択的ターゲティングを容易にする標的部分と一緒に処方することができ、又は該標的部分に共有結合することができる。画像化試薬については更に後述する。標識化後、かかる細胞の意図した用途に矛盾しない任意の方法で、細胞を即時投与することができ、又は細胞を貯蔵し、更に培養し、精製し、濃縮し、分離させ、若しくは加工することができる。
【０１１６】
ある態様においては、標識された細胞を治療目的で投与する。本明細書に記載の技術は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又は組織外植片などの任意の他の所望の環境における細胞治療用物質の輸送をモニターするのに使用することができる。骨髄細胞移植片は、癌の切除療法のレシピエントにおいて長年広く用いられている。造血幹細胞が濃縮された細胞集団などの種々の精製細胞集団も骨髄の代わりに使用されてきた。例えば、細胞は、さい帯血又は末梢血から収集することができる。血流に入った後、幹細胞は、一般に骨髄に移動し、そこで新しい白血球、赤血球及び血小板を産生し始める。この生着は、通常、移植後約２から４週間内に起こる。伝統的に、生着は、血球数を頻繁に試験することによってモニターされ、免疫機能の完全な回復には、一般に、数か月（自己移植レシピエントの場合）から数年（同種移植又は同系移植を受けた患者の場合）を要する。骨髄穿刺による細胞試料採取によって、移植された細胞の機能についての更なる情報を提供することができる。これらのモニタリング技術は、移植される細胞（又はかかる細胞の何らかの小画分）のｅｘ  ｖｉｖｏ標識化によって強化することができ、したがって移植された細胞の位置及び動きを核磁気共鳴技術によって非観血的にモニターすることができる。非骨髄破壊的同種移植（すなわち、低強度移植）は、幾つかのタイプの癌の治療に有効であり得る類似の細胞療法である。一般に、この技術は、より低い放射線量及び／又は化学療法剤量、並びに移植片対宿主病（任意の残留宿主癌細胞に対する移植片由来の免疫細胞の作用）の制限に依拠し、十分な抗癌活性、及び患者の造血系を回復させる移植細胞の潜在的造血能力をもたらす。伝統的な切除移植同様、本発明の技術を使用して、非骨髄破壊的同種移植における移植細胞の位置及び動きをモニターすることができる。
【０１１７】
細胞治療用物質は、治療用タンパク質の送達用にも開発されている。一実施形態においては、細胞は、単離され、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖され、次いで移植されて可溶性因子を産生及び分泌することができる。可溶性因子は、局所的にも（例えば、酵素、サイトカイン及び神経伝達物質）離れても（例えば、ホルモン及び成長調節物質）活性であり得る。細胞は、体内の特定の部位に帰る能力、循環から退出する能力、及び周囲組織に融合する、又は分化して損傷組織を置換する能力に基づく、組織、臓器又は免疫応答の再構成などの複雑な治療目的を達成するために、患者に投与することもできる。幹細胞療法は、神経疾患を含めた無数の疾患、特に細胞死（例えば、パーキンソン病、卒中、及び外傷に起因する脳傷害）、心血管障害（例えば、心筋梗塞）、（例えば、悪液質又は他の消耗性疾患に罹った患者における）筋再生、糖尿病におけるすい臓再生、肝再生などを特徴とする疾患にも提案されてきた。各場合において、細胞又はその亜集団は、投与前に画像化試薬を用いてｅｘ  ｖｉｖｏで標識することができ、したがってこれらの細胞をｉｎ  ｖｉｖｏでモニターすることができる。核磁気共鳴技術によるｉｎ  ｖｉｖｏモニタリングは、例えば、投与された細胞の生存度を評価するのに有用であり得る。医師は、標識された細胞が投与後に患者において検出される程度に応じて投薬スケジュールを調整することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏモニタリングは、治療用細胞が所望の位置に局在したかどうかを判定するのにも有用であり得る。一般に、治療用細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの遊走挙動並びに治療用細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの数及び／又は生存率と、治療成績との相関を検討することができる。かかる相関が確立されると、適切な投与量、投与様式、及び患者を利する追加の治療的介入を選択するのに役立ち得る予後指標として、治療用細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ画像化を使用することができる。これらの画像化方法は、治療用細胞が所望の標的に送達された時間、場所、及び送達されたかどうかをｉｎ  ｖｉｖｏで検出することができるので、本発明のある種の画像化の進歩は、広範囲の細胞治療方針を利するものである。さらに、標識された細胞の検出は、特定の臓器又は組織などのＲＯＩ中の標識された細胞の定量化によって強化することができる。
【０１１８】
本明細書に開示する技術の一適用例は、樹状細胞（ＤＣ）の追跡である。ＤＣは、最も効率的な抗原提示細胞であることが知られており、ナイーブＴ細胞を刺激して、免疫応答を惹起する能力を有する。ＤＣは、体内の免疫応答の最も強力な刺激物質であるので、ＤＣは、患者の免疫系に対する腫ようの「可視性」を高める実行可能な治療手法である。ＤＣは、開発における腫ようワクチンの焦点である。種々の方法を使用して、樹状細胞を腫よう抗原にｅｘ  ｖｉｖｏで曝露し、その後、感作された（ｅｄｕｃａｔｅｄ）樹状細胞を再注入して、Ｔ細胞によって媒介される腫よう死滅の発生を刺激する。国際公開第２００５０７２７８０号に示された、ＤＣ及び他の細胞型の標識化及び追跡に本開示の一実施形態を適用するデータを、参照により本明細書に援用する。
【０１１９】
ＤＣに加えて、他の細胞型は、癌、及び糖尿病などの他の疾患における免疫療法に見込みがあることが実証されたが、その進展は、動物及びヒトに移植後のその動きを観察することができないことを含めて、多数の要因によって阻まれてきた。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、収集し、ｅｘ  ｖｉｖｏで処理し、移植すると、転移性腫よう細胞を死滅させる能力を示した。ｅｘ  ｖｉｖｏで処理され、移植されて癌免疫を増進させる更なる細胞型としては、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、腫よう浸潤リンパ球及び活性化キラー単球が挙げられる。病原性細胞を攻撃する白血球であるＴ細胞の移植は、臨床試験が開始されつつあるすい癌を含めた種々の癌に対して、さらに、多発性硬化症及びＨＩＶ感染症に対して、見込みがあることが示された。
【０１２０】
ある態様においては、標識された細胞を非治療目的で対象に投与する。例えば、細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで標識し、対象に投与し、次いで検出することができ、標識された細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでは類似の非標識細胞と同様に振る舞い、したがって内在性細胞集団の挙動をモニターするのに使用することができると予想される。モニタリングは、特に免疫系細胞、多数のタイプの幹細胞、血液由来の細胞などの極めて移動性であることが知られている細胞の場合には、細胞の動きを追跡する目的で使用することができる。モニタリングは、移植部位における非移動性細胞の生存度又は付着を追跡する目的で使用することもできる。筋肉、肝臓、すい臓、腎臓、脳、又は皮膚などの多数の組織の細胞は、比較的動かない傾向にあるが、標識の消失は、高い死亡率、低い付着、又は他の情報を示し得る。現代の細胞培養及び選別技術によって、種々の幹細胞型、免疫細胞型、及び他の血球型を含めて、実質的にあらゆる所望の細胞集団の選択的な貯留及び標識化が可能である。例えば、細胞表面マーカーを使用して、混合細胞集団を選別し、目的集団を精製することができる。（その両方を参照によりその全体を本明細書に援用する）国際公開第２００５０７２７８０号及び米国特許仮出願第６０／７９２００３号に記載のように、Ｔ細胞と樹状細胞の両方をｅｘ  ｖｉｖｏで標識し、ｉｎ  ｖｉｖｏで検出することができる。
【０１２１】
例として、標識された免疫細胞は、患者における免疫細胞の動きの検出可能な代理として使用することができる。免疫細胞は、炎症性疾患及び自己免疫異常、並びに癌及び動脈硬化巣形成に関与し、その宿主のマーカーである。一般方法論として、免疫細胞の動員を含む任意のプロセスは、標識された免疫細胞を患者に投与することによって、患者において検出することができる。特定の領域における標識の蓄積は、体の当該部分に発生する免疫応答の程度の指標を与える。伝統的に、これらのタイプの試験は、生きている対象に不適合である組織学的技術を含む。本開示のある種の方法は、ヒト疾患の治療方針の展開を容易にすることができる。選択された免疫細胞集団を非観血的に、かつ放射性同位体を使用せずに追跡する能力は、多発性硬化症、糖尿病、臓器移植拒絶のモニタリング、及び癌など、基本的臨床免疫学の多数の領域に影響を及ぼし得る。例えば、腫ようは免疫細胞によって大きく浸潤されることが多い。標識された細胞は、対象において画像化して、腫ようの位置を明らかにすることができ、場合によっては、非観血的な検出スクリーニングとして有用であり得る。癌の早期検出は重大な問題であり、最も初期の癌は、消耗性の化学療法剤に頼らずに手術によって容易に治療される。同様に、別の炎症性疾患の進行は、患者における免疫細胞の動力学を追跡することによってモニターすることができる。免疫抑制療法の有効性を評価することもできる。臓器移植レシピエントの場合、レシピエントは、移植を受ける前に標識免疫細胞を１回受けることができる。次いで、移植片における免疫細胞の蓄積のｉｎ  ｖｉｖｏモニタリングを拒絶の早期警告徴候として使用することができる。移植片の場合、代替の生検は臓器拒絶のリスクを増加させることがよく知られているので、本明細書に開示する方法は特に望ましい。
【０１２２】
追加の例として、骨髄細胞移植又は末梢血幹細胞移植に使用される細胞は、本明細書に記載のようにｅｘ  ｖｉｖｏで標識し、投与し、核磁気共鳴技術によってｉｎ  ｖｉｖｏでモニターすることができる。かかるモニタリングを使用して、レシピエントの骨空洞中のドナー細胞の移植、並びにレシピエントにおける標識された細胞の生存率及び動きを評価することができる。医師は、レシピエントにおけるドナー細胞の輸送に関する情報を、手順の成功又は失敗の可能性の初期徴候として使用することができる。このタイプの早期検出によって、医師は、移植後の治療計画をそれに応じて調整することができる。検出技術を適用することができる別の細胞癌治療用物質は、同種の非骨髄破壊的又は低強度移植片である。この手順は、ドナーリンパ球輸注療法と一緒に使用して、癌細胞を破壊する移植片対腫よう効果を促進することができる。ここで、移植細胞の集団全体又は一画分を注入前に標識することができる。次いで、核磁気共鳴技術を使用して、細胞が体内で通行する場所を決定することができる。それによって、手順の有効性を示すことができる。拒絶を最小化するために同種細胞の用量を制限することが望ましいことが多いので、細胞の輸送パターンを使用して、用量を較正することができる。上記癌細胞療法においては、治療効果を有すると考えられる移植細胞（例えば、ＣＤ３４＋幹細胞又はＴ細胞）の１個以上の亜集団を選択的に標識することが望ましい場合がある。
【０１２３】
更なる例として、血管新生などの新しい組織の形成に関与する細胞を標識し、対象に投与し、検出して、組織形成のホットスポットを特定することができる。例えば、平滑筋細胞及び／又は内皮前駆細胞を標識し、血流に導入することができる。かかる細胞は、血管新生作用部位に蓄積すると予想される。血管新生作用は、月経サイクル、妊娠早期、動脈閉塞に応じた側副血管形成、腫よう形成、及び創傷治癒などの生理学的及び病理学的事象に関連し得る。同様に、線維芽細胞などの創傷治癒に関与する細胞は、細胞挙動をモニターするために、標識し、全身的に又は傷害の疑われる部位に投与することができる。
【０１２４】
例えば、標識された心筋細胞系列細胞凝集体又はそれに由来する細胞を含む、医薬品又は送達装置は、心臓治療のための製剤を含めて、ヒト又は動物の体の治療のために提供することができる。心筋細胞系列細胞は、心組織における収縮及び／又は歩調取り作用を再構成する、又は補う方法において、患者に投与することができる（その全体を本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００６００４０３８９号、同２００５０１１２１０４号、同２００５０２４４３８４号参照）。
【０１２５】
本発明によれば、標識された心筋細胞系列細胞を使用して、疾患又は変性によって損傷を受けた横紋心筋（ｓｔｒｉａｔｅｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ）を再生又は修復する。標識された心筋細胞系列細胞は、レシピエントの健常な組織と融合して、死んだ又は損傷を受けた細胞の機能を置換し、それによって全体として心筋を再生する。心筋は、通常は、潜在的修復能力を持たない。標識された心筋細胞系列細胞は、例えば、幾つかの主要な適応症に対する心筋再生に使用される：（ｉ）虚血性心臓移植（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｓ）、（ｉｉ）うっ血性心不全患者のための療法、（ｉｉｉ）冠動脈バイパス移植を受けた患者の更なる疾患の防止、（ｉｖ）伝導組織（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ）再生、（ｖ）血管平滑筋再生、及び（ｖｉ）弁再生。
【０１２６】
細胞の投与は、種々の手順によって、心臓を対象とすることができる。局所的な投与が好ましい。間葉幹細胞は、優先順に自己、同種又は異種を含めて、広範な出所に由来することができる。以下を含めて、幾つかの実施形態がこの態様には存在する。本発明は、これらの細胞の発達をｉｎ  ｖｉｖｏでモニターすることができる。
【０１２７】
心筋細胞系列細胞は、心筋細胞前駆細胞、又は分化した心筋細胞であり得る。分化した心筋細胞は、心房型でも心室型でもよい、主要心筋細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）、結節性（ペースメーカー）心筋細胞；伝導心筋細胞；及び作業（収縮性）心筋細胞の１つ以上を含む。ある実施形態においては、細胞は、衛星細胞などの筋前駆細胞を含む筋試料（又は別の試料）に由来する（米国特許出願公開第２００５０２４４３８４号参照）。ある実施形態においては、細胞は、間葉幹細胞（ＭＳＣ）である（米国特許出願公開第２００５０１１２１０４号参照）。
【０１２８】
「心筋細胞前駆体」は、心筋細胞を含めた子孫を（脱分化も再プログラムもなしに）生成する能力のある細胞と定義される。かかる前駆体は、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、筋節ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＧＡＴＡ４、Ｎｋｘ２．５、Ｎ−カドヘリン、β１−アドレナリン受容体（β１−ＡＲ）、ＡＮＦ、ＭＥＦ−２転写因子ファミリー、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、ミオグロビン又は心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）を含めて、ただしそれだけに限定されない、系列に典型的なマーカーを発現し得る。
【０１２９】
目的とする生物学的部位又は構造に細胞が完全に会合しているので、かかる構造の可視化を助ける唯一の目的のために、標識された細胞を投与し得ることが判明する場合もある。上述したように、免疫細胞は、腫ように特徴的に浸潤する。したがって、標識された免疫細胞を、腫ようを可視化する目的で投与することができる。
【０１３０】
本明細書に開示する技術は、ヒト疾患の動物モデルの研究に適用することができる。疾患の種々の動物モデルによって、１つ以上の細胞集団の動力学又は生存の変化を明らかにすることができる。かかる細胞集団を標識し、動物に投与し、モニターすることができる。例えば、糖尿病に対するＮＯＤマウスモデルのすい臓への免疫細胞の浸潤をモニターすることができる。動物モデルの別の例としては、実験的アレルギー性脳脊髄炎（多発性硬化症モデル）、神経こう肉腫腫ようモデル、及び臓器移植拒絶が挙げられる。これらのモデルにおいて表現型的に明確な免疫細胞集団を追跡することによって、病因の諸相を解明することができ、細胞輸送が治療用物質によってどのように影響されるかをモニターすることができる。この方法を使用して、例えば、動物モデルにおいて所望の効果を有する薬物をスクリーニングすることができる。薬物スクリーニングアッセイは、標識された細胞を動物に投与すること、及び細胞を試験薬剤の存在下でｉｎ  ｖｉｖｏで検出することを含み得る。試験薬剤の存在と相関した細胞挙動の変化によって、治療効果を示すことができる。かかる変化は、例えば、試験薬剤処理前後の同じ動物、又は別の未処理動物を含めて、適切な基準との比較によって検出することができる。試験薬剤に加えて、これらの方法を使用して、運動療法、傷害、遺伝子変化などの試験条件の効果を評価することができる。例として、自己免疫疾患治療薬物は、免疫細胞が患部組織に蓄積する傾向を減少させると予想される。定常状態の評価に加えて、本明細書に開示する方法を使用して、細胞が特定の部位に到達する速度、ある部位における信号の持続時間などの細胞の動力学的性質を評価することができる。薬物スクリーニングアッセイは、種々の障害に関係する免疫細胞のある種のグループなどの厳密に定義された細胞集団のｉｎ  ｖｉｖｏモニタリングと組み合わせると、特に強力であり得る。例えば、標識された細胞傷害性Ｔ細胞のモニタリングは、移植拒絶の防止に有用であり得る薬物を特定するのに特に有用であり得る。細胞をｉｎ  ｖｉｖｏでモニターする能力は、例えば、作製された種々のトランスジェニック又は変異マウスのいずれをも含めて、本質的にあらゆる実験動物の分析に適用することができる強力なアッセイをもたらす。
【０１３１】
幾つかのグループは、ＭＲＩ造影剤を用いた免疫細胞の標識化及び可視化を研究した。別の研究者らは、ＭＲＩ造影剤を用いて、幹細胞、及びニューロン前駆体などの細胞型を標識した。これらの研究の大多数は、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）剤を組み入れることによって、細胞を磁力的に異なるものにする。別のタイプの金属イオン、特にガドリニウム及びマンガンを組み入れた造影剤で標識された細胞も使用された。これらの金属イオン系薬剤を利用する研究では、化合物は直接画像化されず、その代わりに、周囲の水に対するその間接的な効果を観察する。薬剤の存在は、化合物近くの水の緩和時間（Ｔ１、Ｔ２又はＴ２＊）を短縮する傾向がある。これらの効果は、緩和時間強調画像において検出することができる。ＳＰＩＯ剤は、例えば、近くの可動水分子が受ける磁場を局所的に撹乱させることによって、従来の１Ｈ画像にコントラストを付与する。この局所的撹乱は、Ｔ１、Ｔ２又はＴ２＊を変える。画像化試薬中の１９Ｆ核からの信号は、直接検出することができ、場合によっては、画像化されるので、本明細書に記載の方法は、金属イオン系造影剤を用いたすべての方法とは明確に異なる。
【０１３２】
標識された細胞を金属イオン系造影剤を用いて検出することの固有の欠点は、標識された細胞を含むと考えられる領域におけるグレースケールコントラストの微妙な変化を解釈する必要がある状況にあることが多いことである。組織中に存在する高濃度の可動性の水からの大きい１Ｈバックグラウンド信号は、標識された細胞を含む領域を明確に特定することを困難にし得る。これは、標識された細胞の体内分布が演繹的に未知である場合に特に問題になる。「スナップショット」画像の結果は、標識された細胞が特定の組織中に存在するかどうかに関して不確かであることが多い。これは、肝臓、又はひ臓中など、解剖学的（Ｔ２又はＴ２＊強調）画像において本質的に暗く見える、鉄分の多い臓器中のＳＰＩＯ標識された細胞を検出しようとしたときに特に悩ましい問題である。特定の臓器において数時間にわたる微速度撮影の画像強度変化を検出して、標識された細胞の蓄積を検証することに頼らなければならないことが多い。さらに、関心領域における金属イオン系造影剤を用いた標識された細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの定量化は問題があり、一般に、緩和時間強調ＭＲＩ又は定量的緩和時間ＭＲＩマップを用いてこれを実施する簡単で信頼できる方法はない。
【０１３３】
ある態様においては、本開示は、多スペクトル感応性１９Ｆ  ＭＲＩ試薬を提供する。ある実施形態においては、ＭＲＩ試薬間の広範なスペクトル分離は、ある細胞型（例えば、一周波数で標識されたＤＣ）を別の細胞型（例えば、ＰＦＰＥで標識されたＴ細胞）と同時に画像化することができるので、２チャネルＭＲＩ画像化に有用である。ある実施形態においては、これによって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞−細胞相互作用を１９Ｆ  ＭＲＩによって研究することができる。ある実施形態においては、２チャネルＭＲＩは、非観血法、及び実時間細胞−細胞相互作用におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの研究によって、より多く、次いで１細胞型を同時に追跡することができることになる。かかる適用は、例えば癌及び炎症の分野において、高度に関連する。
【０１３４】
したがって、本明細書に開示する方法及び組成物は、医薬品及び生物学の分野において大いに必要とされるツールを提供する。
【０１３５】
２．画像化試薬及び製剤
主題の方法に用いられる画像化試薬は、フッ化炭素、すなわち、少なくとも１個の炭素−フッ素結合を含む分子である。１９Ｆ原子のために、本明細書に開示する画像化試薬は、１９Ｆ  ＭＲＩ、及びＭＲＳ技術などの他の核磁気共鳴技術によって検出することができる。ある好ましい実施形態においては、フッ化炭素画像化試薬は、以下の諸性質の１つ以上を有する：１）低細胞傷害性；２）化学シフトアーチファクトを最小化するために単一の狭い共鳴を理想的には有する単純な１９Ｆ  ＮＭＲスペクトル；３）各分子における多数のＮＭＲ的に同等なフッ素原子を用いた高感度；４）多数の細胞型の効率的標識化を可能にするように処方され、食細胞に限定されない。好ましくは、画像化試薬は、炭素に結合した複数のフッ素、例えば、炭素に結合した５個を超える、１０個を超える、１５個を超える、又は２０個を超えるフッ素を含む。好ましくは、少なくとも４個、少なくとも８個、少なくとも１２個、又は少なくとも１６個のフッ素は、ほぼ同じＮＭＲ化学シフトを有する。
【０１３６】
培養中の細胞を標識化する場合、画像化試薬は、以下の少なくとも３つの様相の１つ以上で使用することができる：１）共有結合性会合も他の結合性会合も形成せずに、標的細胞によって内部に取り入れられる、又は吸収される、画像化試薬；２）標的細胞に共有結合的に付着する画像化試薬；及び３）標的細胞上に存在する分子に結合する抗体、又はリガンドなどの分子とカップリングする画像化試薬。
【０１３７】
第１のタイプの画像化試薬は、ペルフルオロクラウンエーテル、及び細胞によって吸収される他のペルフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）を含み、好ましくは、細胞中でかなりの時間分解せずに保持され、例えば、細胞中で少なくとも１時間、少なくとも４時間、少なくとも約１日、少なくとも約３日、さらには少なくとも約１週間の半減期を有する。明白な理由のために、画像化試薬は、通常の細胞機能に干渉せず、標識化に使用される濃度で細胞傷害性も示さないことが好ましい。本明細書で示すように、ペルフルオロポリエーテルは、標識された細胞に対する毒性効果が低い。
【０１３８】
第２のタイプの画像化試薬としては、露出したチオール、アミノ及び／又はヒドロキシル基などの細胞表面の求核性部位と反応する求電子化合物が挙げられる。したがって、マレイミド、ヨウ化アルキル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（ＮＨＳ又はスルホ−ＮＨＳエステル）、アシルスクシンイミドなどの画像化試薬は、細胞表面と共有結合を形成し得る。タンパク質カップリングに使用される他の技術は、画像化試薬を細胞表面タンパク質にカップリングさせるように改作することができる。かかるカップリングの更に別の手法については、Ｍｅａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １：２〜１２を参照されたい。
【０１３９】
第３のタイプの画像化試薬は、第２のタイプの画像化試薬を細胞自体ではなく、細胞を標的にしたリガンド又は抗体である機能部分と反応させることによって調製することができる。適切なリガンド及び抗体を目的用途に対して選択することができる。例えば、造血細胞を選択的に標的にするリガンドは、本明細書に記載の画像化試薬で標識し、注射などによって患者に投与することができる。
【０１４０】
あるいは、画像化試薬は、アンテペンネペディア（ａｎｔｅｐｅｎｎｅｐｅｄｉａ）タンパク質、ＨＩＶトランス転写活性促進（ＴＡＴ）タンパク質、マストパラン、メリチン、ボンボリチン、デルタヘモリシン、パーダキシン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、クラスリン、ジフテリア毒素、Ｃ９補体タンパク質、又はこれらの任意の断片などの無差別の内部移行ペプチドとカップリングすることができる。この無差別の分子を用いてｅｘ  ｖｉｖｏで処理された細胞は、画像化試薬を吸収する。かかる標識された細胞をほ乳動物などの動物に移植すると、画像化試薬を使用して、移植細胞を核磁気共鳴技術によって可視化及び／又は追跡することができる。
【０１４１】
一実施形態においては、内部移行ペプチドは、ショウジョウバエアンテペンネペディアタンパク質又はそのホモログに由来する。ホメオタンパク質アンテペンネペディアの６０アミノ酸長ホメオドメインは、生体膜を介して転位置することが示され、それがカップリングする異種ポリペプチドの転位置を促進し得る。例えば、Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：１０４４４〜１０４５０、及びＰｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １０２：７１７〜７２２を参照されたい。このタンパク質の１６アミノ酸長と小さい断片は、内部移行を起こすのに十分であることが立証された。Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１８１８８〜１８１９３を参照されたい。
【０１４２】
内部移行ペプチドの別の例は、ＨＩＶトランス活性化因子（ＴＡＴ）タンパク質である。このタンパク質は、４個のドメインに分割されると考えられる（Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：３５５１〜３５６１）。精製ＴＡＴタンパク質は、組織培養中の細胞によって吸収され（Ｆｒａｎｋｅｌ  ａｎｄ  Ｐａｂｏ，（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５５：１１８９〜１１９３）、ＴＡＴの残基３７〜６２に対応する断片などのペプチドは、細胞によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで急速に吸収される（Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５５：１１７９〜１１８８）。高塩基性領域は、内部移行、及び核への内部移行部分のターゲティングを媒介する（Ｒｕｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１〜８）。高塩基性領域中に存在する配列を含むペプチド又は類似体は、フッ素化画像化試薬と結合して、内部移行、及び細胞内環境への試薬のターゲティングを助けることができる。
【０１４３】
対象となる別のＰＦＰＥ組成物は、種々の末端基を用いて誘導体化された線状ＰＦＰＥである。線状化合物は、種々の機能的実体を、種々のタイプの機能部分などの末端基と結合させることができる利点を有する。これらの線状化合物の１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルは、一般に、大環状化合物よりも複雑であるが、十分分離された２本のＮＭＲ信号を有するＰＦＰＥを使用することもできる。この場合、より小さい共鳴に適用される１個以上のオフ共鳴飽和パルスを組み入れるＭＲＩパルス系列を使用して、あらゆる化学シフトアーチファクトを除去することが望ましいこともある。
【０１４４】
本発明は、本発明の方法における画像化試薬として使用することができるその化合物の精製調製物を含めて、ある種の新規ペルフルオロポリエーテルジアミド化合物を提供する。例えば、本発明は、式１〜９のいずれか１つの化合物を提供する。
【０１４５】
【化２４】
0005645658.tif 000048
【０１４６】
【化２５】
0005645658.tif 000049
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。
【０１４７】
ある実施形態においては、線状ペルフルオロポリエーテルは、一方又は両方の末端において、比較的親水性の部分を用いて誘導体化することができる。例えば、親水性部分は、ポリエチレングリコールとすることができ、したがって一方又は両方の末端の水溶性領域と中央の疎水性領域とを有するブロック共重合体を形成することができる。水系環境で混合すると、このタイプの画像化試薬はミセルを形成する傾向にあり、ＰＦＰＥコアが水溶性被膜によって包囲される。ある範囲の分子量を有するアミノ−ＰＥＧブロックが市販されている。ある実施形態においては、本発明は、１個以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を含む新規ペルフルオロポリエーテルジアミド化合物を提供する。これらの誘導体化ペルフルオロポリエーテルジアミド化合物は、本発明の方法において画像化試薬として使用することができる。例えば、本発明は式１０〜１５のいずれか１つの化合物を提供する。
【０１４８】
【化２６】
0005645658.tif 000050
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
ｍは各々独立に４から１６の整数である。
【０１４９】
線状ＰＦＰＥの特に有用な適用例は、１９Ｆ核磁気共鳴技術によって検出することができ、第２の検出方法による検出を容易にする検出部分を含む、「デュアルモード」薬剤の合成である。例として、末端基に付加した蛍光成分を使用して、１９Ｆ  ＭＲＩ及び蛍光顕微鏡法を用いて可視化することができる画像化試薬を作製することができる。広範囲の蛍光成分をデュアルモード薬剤に使用することができる。フルオレセイン及びその誘導体（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓからすべて入手可能である、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８及び５１４、ジクロロフルオレセイン、カルボキシフルオレセインなど）、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ、フィコエリトリン、ローダミン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ＢＯＤＩＰｙ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、並びにＦｌｕｏｒＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含めて、多数の適切な蛍光団が公知である。蛍光成分としては、フルオレセイン、ベンゾオキサジオアゾール（ｂｅｎｚｏｘａｄｉｏａｚｏｌｅ）、クマリン、エオシン、ルシファーイエロー、ピリジルオキサゾール及びローダミンの誘導体が挙げられる。これら及び多数の他の例示的な蛍光成分は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）に見いだすことができる。更に別の蛍光成分としては、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能な「量子ドット」製品などの蛍光ナノ結晶が挙げられる。かかるナノ結晶は、適切な発光スペクトルを有する半導体コア（例えば、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ）と、下地コア材料に効率的に結合することができる非放射性の透明な比較的非反応性の材料で構成されるシェル（例えば、ＺｎＳ）と、（例えば、生理水溶液中の溶解性についての）望ましい溶解性、及び本明細書に記載のフッ化炭素への付加に対して可能な反応基を与える被膜とを用いて構築することができる。
【０１５０】
蛍光検出を可能にするデュアルモード画像化試薬は、種々の適用例において特に有用である。例えば、蛍光標識によって、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの蛍光に基づく細胞選別機序を使用することができる。細胞選別は、例えば、標識化に成功した細胞集団を濃縮するのに望ましい場合がある。これは、よりまれな細胞集団を標識化の対象にする場合に特に有用であり得る。デュアルモード薬剤は、生きている対象に移植した後に、標識された細胞を探し出し、特徴づけるのにも有用である。この適用例においては、細胞は、対象からある時間そこに存在した後に生検採取することができ、又は何らかの別の手段によって収集することができる。次いで、収集した細胞の生物学的分析を実施することができる。例えば、収集した細胞に対してＦＡＣＳ分析を実施することができ、細胞を蛍光ＰＦＰＥ標識についてポジティブ選択した後、特定の細胞表面マーカーの発現について（異なる色の蛍光プローブを用いて）細胞を評価して、移植後に起こった細胞表現型のあらゆる変化を調べることができる。蛍光標識は、特に３次元共焦点蛍光顕微鏡法を用いて、細胞の蛍光顕微鏡法に使用することもできる。蛍光顕微鏡法は、標識された細胞を含む深部組織のｉｎ  ｖｉｖｏ可視化には一般に有用でないが、表面組織は、組織試料と同様に、可視化することができる。二重標識化は、フッ化炭素を用いた任意の新しい核磁気共鳴標識化方法を較正及び検証するのに特に有益である。例えばＭＲＩ／ＭＲＳによって得られた結果は、（生検又は別の方法で採取された）培養標識細胞とｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、蛍光検出によって得られた結果と可能な程度に比較することができる。単位分子又はナノ粒子当たりの既知の蛍光信号強度を使用して、細胞用量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで較正することができる（すなわち、Ｆｃ）。
【０１５１】
ある実施形態においては、本発明は、１個以上の蛍光検出基を含む新規ペルフルオロポリエーテルジアミド化合物を提供する。これらの誘導体化ペルフルオロポリエーテルジアミド化合物は、本発明の方法において画像化試薬として使用することができる。例えば、本発明は、式１６〜１９又は４０〜４１のいずれか１つの化合物を提供する。
【０１５２】
【化２７】
0005645658.tif 000051
【０１５３】
【化２８】
0005645658.tif 000052
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（商標）から入手可能なＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７蛍光色素の残基である。
【０１５４】
ある実施形態においては、本発明は、１個以上の蛍光検出基と１個以上のＰＥＧ基とを含む新規ペルフルオロポリエーテルジアミド化合物を提供する。これらの誘導体化ペルフルオロポリエーテルジアミド化合物は、本発明の方法において画像化試薬として使用することができる。例えば、本発明は式２６〜３７のいずれか１つの化合物を提供する。
【０１５５】
【化２９】
0005645658.tif 000053
【０１５６】
【化３０】
0005645658.tif 000054
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
Ｄｙｅは蛍光性検出部分である。
【０１５７】
ある実施形態においては、式２６の化合物は、式２０の化合物によって表される。
【０１５８】
【化３１】
0005645658.tif 000055
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。
【０１５９】
ある実施形態においては、式２７の化合物は、式２１の化合物によって表される。
【０１６０】
【化３２】
0005645658.tif 000056
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。
【０１６１】
ある実施形態においては、式２８の化合物は、式２２の化合物によって表される。
【０１６２】
【化３３】
0005645658.tif 000057
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。
【０１６３】
ある実施形態においては、式２９の化合物は、式２３の化合物によって表される。
【０１６４】
【化３４】
0005645658.tif 000058
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。
【０１６５】
ある実施形態においては、式３０の化合物は、式２４の化合物によって表される。
【０１６６】
【化３５】
0005645658.tif 000059
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。
【０１６７】
ある実施形態においては、式３１の化合物は、式２５の化合物によって表される。
【０１６８】
【化３６】
0005645658.tif 000060
式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。
【０１６９】
ある実施形態においては、本発明は、例えばｎの値が異なる、式１〜３７又は４０〜４１のいずれか１つの２種類以上の化合物を含む組成物を提供する。
【０１７０】
本発明は、本発明の方法における画像化試薬として使用することができるその化合物の精製調製物を含めて、ＰＦＰＥとは実質的に異なる化学シフトを有するある種の化合物を提供する。例えば、本発明は、式４２の化合物を提供する。
【０１７１】
【化３７】
0005645658.tif 000061
本発明は、上記化合物の組合せを含む新規組成物も提供する。例えば、本発明は、式１０の化合物と式１の化合物とを含む組成物を提供する。ある実施形態においては、式１０の化合物と式１の化合物を含む組成物は、式１０の化合物と式１の化合物を１：１から１：１００のモル比で含む。ある実施形態においては、式１０の化合物と式１の化合物を含む組成物は、式１０の化合物と式１の化合物を１：２のモル比で含む。
【０１７２】
本発明は、式１２の化合物と式１の化合物とを含む更なる組成物を提供する。ある実施形態においては、式１２の化合物と式１の化合物を含む組成物は、式１２の化合物と式１の化合物を１：１から１：１００のモル比で含む。ある実施形態においては、式１２の化合物と式１の化合物を含む組成物は、式１２の化合物と式１の化合物を１：４のモル比で含む。
【０１７３】
本発明は、式１４の化合物と式１の化合物とを含む更なる組成物を提供する。ある実施形態においては、式１４の化合物と式１の化合物を含む組成物は、式１４の化合物と式１の化合物を１：１から１：１００のモル比で含む。ある実施形態においては、式１４の化合物と式１の化合物を含む組成物は、式１４の化合物と式１の化合物を１：１０のモル比で含む。
【０１７４】
本発明は、式１６の化合物と式１の化合物とを含む更なる組成物を提供する。ある実施形態においては、式１６の化合物と式１の化合物を含む組成物は、式１６の化合物と式１の化合物を１：１から１：１００のモル比で含む。ある実施形態においては、式１６の化合物と式１の化合物を含む組成物は、式１６の化合物と式１の化合物を１：１００のモル比で含む。
【０１７５】
本発明は、式１８の化合物と式１の化合物とを含む更なる組成物を提供する。ある実施形態においては、式１８の化合物と式１の化合物を含む組成物は、式１８の化合物と式１の化合物を１：１から１：２００のモル比で含む。ある実施形態においては、式１８の化合物と式１の化合物を含む組成物は、式１８の化合物と式１の化合物を１：５０のモル比で含む。
【０１７６】
本発明は、式４０の化合物と式１の化合物とを含む更なる組成物を提供する。ある実施形態においては、式４０の化合物と式１の化合物を含む組成物は、式４０の化合物と式１の化合物を１：１から１：２００のモル比で含む。ある実施形態においては、式４０の化合物と式１の化合物を含む組成物は、式４０の化合物と式１の化合物を１：４０のモル比で含む。
【０１７７】
本発明は、式１６の化合物と式１７の化合物とを含む更なる組成物を提供する。特定のかかる実施形態においては、組成物は式１の化合物を更に含む。
【０１７８】
本発明は、式１９の化合物と式１９の化合物とを含む更なる組成物を提供する。特定のかかる実施形態においては、組成物は、式１の化合物を更に含む。
【０１７９】
本発明は、式４０の化合物と式４１の化合物とを含む更なる組成物を提供する。特定のかかる実施形態においては、組成物は、式１の化合物を更に含む。
【０１８０】
本発明は、式１０の化合物と式２０の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０１８１】
本発明は、式１０の化合物と、式２０の化合物と、式１の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０１８２】
本発明は、式１１の化合物と式２１の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０１８３】
本発明は、式１１の化合物と式２２の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０１８４】
本発明は、式１２の化合物と式２３の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０１８５】
本発明は、式１２の化合物と、式２３の化合物と、式１の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０１８６】
本発明は、式１３の化合物と式２４の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０１８７】
本発明は、式１３の化合物と式２５の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０１８８】
本発明は、式１０の化合物と式２６の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０１８９】
本発明は、式１０の化合物と、式２６の化合物と、式１の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０１９０】
本発明は、式１１の化合物と式２７の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０１９１】
本発明は、式１１の化合物と式２８の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０１９２】
本発明は、式１２の化合物と式２９の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０１９３】
本発明は、式１２の化合物と、式２９の化合物と、式１の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０１９４】
本発明は、式１３の化合物と式３０の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０１９５】
本発明は、式１３の化合物と式３１の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０１９６】
本発明は、式１０の化合物と式３２の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０１９７】
本発明は、式１０の化合物と、式３２の化合物と、式１の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０１９８】
本発明は、式１１の化合物と式３３の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０１９９】
本発明は、式１１の化合物と式３４の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０２００】
本発明は、式１２の化合物と式３５の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０２０１】
本発明は、式１２の化合物と、式３５の化合物と、式１の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０２０２】
本発明は、式１３の化合物と式３６の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０２０３】
本発明は、式１３の化合物と式３７の化合物とを含む更なる組成物を提供する。
【０２０４】
本発明は、上記化合物とＰＦＰＥオキシド、式１ａ（ペルフルオロポリ（エチレングリコール）ジアルキルエーテル、Ｅｘｆｌｕｏｒ  Ｉｎｃ．，ＴＸ）との組合せを含む組成物も提供する。
【０２０５】
【化３８】
0005645658.tif 000062
式中、ｐは８から１３の整数であり、
Ｒｆは、１９Ｆ  ＮＭＲ分析に基づいて２：１の比のＣＦ３とＣＦ２ＣＦ３である。
【０２０６】
例えば、本発明は、式１〜９のいずれか１つの化合物と式１ａの化合物とを含む組成物を提供する。ある実施形態においては、本発明は、式１の化合物と式１ａの化合物とを含む組成物を提供する。更なる例として、本発明は、式１０の化合物と式１ａの化合物とを含む組成物を提供する。本発明は、式１０の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１２の化合物と式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１２の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１４の化合物と式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１４の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１６の化合物と式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１６の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１８の化合物と式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１８の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式４０の化合物と式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式４０の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１０の化合物と、式２０の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１０の化合物と、式２０の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１１の化合物と、式２１の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１１の化合物と、式２２の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１２の化合物と、式２３の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１２の化合物と、式２３の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１３の化合物と、式２４の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１３の化合物と、式２５の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１０の化合物と、式２６の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１０の化合物と、式２６の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１１の化合物と、式２７の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１１の化合物と、式２８の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１２の化合物と、式２９の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１２の化合物と、式２９の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１３の化合物と、式３０の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１３の化合物と、式３１の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１０の化合物と、式３２の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１０の化合物と、式３２の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１１の化合物と、式３３の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１１の化合物と、式３４の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１２の化合物と、式３５の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１２の化合物と、式３５の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１３の化合物と、式３６の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１３の化合物と、式３７の化合物と、式１ａの化合物とを含む更なる組成物を提供する。上記のいずれかのある実施形態においては、組成物は、式１ａの化合物８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％ｖ／ｖなど、式１ａの化合物８０〜９５％ｖ／ｖを含む。
【０２０７】
本発明は、上記化合物とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルの組合せを含む組成物も提供する。例えば、本発明は、式１〜９のいずれか１つの化合物とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物を提供する。ある実施形態においては、本発明は、式１の化合物とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物を提供する。本発明は、さらに、式１ａの化合物とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物を提供する。更なる例として、本発明は、式１０の化合物とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物を提供する。更なる例として、本発明は、式１０の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物を提供する。本発明は、式１２の化合物とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。更なる例として、本発明は、式１２の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物を提供する。本発明は、式１４の化合物とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。更なる例として、本発明は、式１４の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物を提供する。本発明は、式１６の化合物とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。更なる例として、本発明は、式１６の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物を提供する。本発明は、式１８の化合物とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。更なる例として、本発明は、式１８の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物を提供する。本発明は、式４０の化合物とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。更なる例として、本発明は、式４０の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物を提供する。本発明は、さらに、式１６の化合物と、式１７の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物を提供する。本発明は、さらに、式１８の化合物と、式１９の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物を提供する。本発明は、さらに、式４０の化合物と、式４１の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物を提供する。本発明は、式１０の化合物と、式２０の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１０の化合物と、式２０の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１１の化合物と、式２１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１１の化合物と、式２２の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１２の化合物と、式２３の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１２の化合物と、式２３の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１３の化合物と、式２４の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１３の化合物と、式２５の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１０の化合物と、式２６の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１０の化合物と、式２６の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１１の化合物と、式２７の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１１の化合物と、式２８の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１２の化合物と、式２９の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１２の化合物と、式２９の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１３の化合物と、式３０の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１３の化合物と、式３１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１０の化合物と、式３２の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１０の化合物と、式３２の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１１の化合物と、式３３の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１１の化合物と、式３４の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１２の化合物と、式３５の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１２の化合物と、式３５の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１３の化合物と、式３６の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。本発明は、式１３の化合物と、式３７の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む更なる組成物を提供する。上記のいずれかのある実施形態においては、組成物は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテル８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％ｖ／ｖなど、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテル８０〜９５％ｖ／ｖを含む。
【０２０８】
本発明は、細胞による取り込みに適した本発明の上記化合物又は組成物の製剤も提供する。例えば、本発明の化合物又は組成物は、乳濁液として処方することができる。例えば、本発明は、式１〜３７又は４０〜４１のいずれか１つの化合物を含む乳濁液を提供する。本発明は、さらに、式１０の化合物と式１の化合物とを含む組成物；式１２の化合物と式１の化合物とを含む組成物；式１４の化合物と式１の化合物とを含む組成物；式１６の化合物と式１の化合物とを含む組成物；式１８の化合物と式１の化合物とを含む組成物；式４０の化合物と式１の化合物とを含む組成物；式１６の化合物と式１７の化合物とを含む組成物；式１６の化合物と、式１７の化合物と、式１の化合物とを含む組成物；式１８の化合物と式１９の化合物とを含む組成物；式１８の化合物と、式１９の化合物と、式１の化合物とを含む組成物；式４０の化合物と式４１の化合物とを含む組成物；式４０の化合物と、式４１の化合物と、式１の化合物とを含む組成物；式１０の化合物と式２０の化合物とを含む組成物；式１０の化合物と、式２０の化合物と、式１の化合物とを含む組成物；式１１の化合物と式２１の化合物とを含む組成物；式１１の化合物と式２２の化合物とを含む組成物；式１２の化合物と式２３の化合物とを含む組成物；式１２の化合物と、式２３の化合物と、式１の化合物とを含む組成物；式１３の化合物と式２４の化合物とを含む組成物；式１３の化合物と式２５の化合物とを含む組成物；式１０の化合物と式２６の化合物とを含む組成物；式１０の化合物と、式２６の化合物と、式１の化合物とを含む組成物；式１１の化合物と式２７の化合物とを含む組成物；式１１の化合物と式２８の化合物とを含む組成物；式１２の化合物と式２９の化合物とを含む組成物；式１２の化合物と、式２９の化合物と、式１の化合物とを含む組成物；式１３の化合物と式３０の化合物とを含む組成物；式１３の化合物と式３１の化合物とを含む組成物；式１０の化合物と式３２の化合物とを含む組成物；式１０の化合物と、式３２の化合物と、式１の化合物とを含む組成物；式１１の化合物と式３３の化合物とを含む組成物；式１１の化合物と式３４の化合物とを含む組成物；式１２の化合物と式３５の化合物とを含む組成物；式１２の化合物と、式３５の化合物と、式１の化合物とを含む組成物；式１３の化合物と式３６の化合物とを含む組成物；又は式１３の化合物と式３７の化合物とを含む組成物を含む乳濁液を提供する。
【０２０９】
本発明は、さらに、式１の化合物と式１ａの化合物などの式１〜９のいずれか１つの化合物と式１ａの化合物とを含む組成物；式１０の化合物と式１ａの化合物とを含む組成物；式１０の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１２の化合物と式１ａの化合物とを含む組成物；式１２の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１４の化合物と式１ａの化合物とを含む組成物；式１４の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１６の化合物と式１ａの化合物とを含む組成物；式１６の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１８の化合物と式１ａの化合物とを含む組成物；式１８の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式４０の化合物と式１ａの化合物とを含む組成物；式４０の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１６の化合物と、式１７の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１８の化合物と、式１９の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式４０の化合物と、式４１の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１０の化合物と、式２０の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１０の化合物と、式２０の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１１の化合物と、式２１の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１１の化合物と、式２２の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１２の化合物と、式２３の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１２の化合物と、式２３の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１３の化合物と、式２４の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１３の化合物と、式２５の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１０の化合物と、式２６の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１０の化合物と、式２６の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１１の化合物と、式２７の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１１の化合物と、式２８の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１２の化合物と、式２９の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１２の化合物と、式２９の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１３の化合物と、式３０の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１３の化合物と、式３１の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１０の化合物と、式３２の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１０の化合物と、式３２の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１１の化合物と、式３３の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１１の化合物と、式３４の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１２の化合物と、式３５の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１２の化合物と、式３５の化合物と、式１の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；式１３の化合物と、式３６の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物；又は式１３の化合物と、式３７の化合物と、式１ａの化合物とを含む組成物を含む乳濁液を提供する。上記のいずれかのある実施形態においては、組成物は、式１ａの化合物８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％ｖ／ｖなど、式１ａの化合物８０〜９５％ｖ／ｖを含む。
【０２１０】
本発明は、さらに、式１の化合物とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルなどの式１〜９のいずれか１つの化合物とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１ａの化合物とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１０の化合物とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１０の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１２の化合物とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１２の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１４の化合物とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１４の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１６の化合物とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１６の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１８の化合物とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１８の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式４０の化合物とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式４０の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１６の化合物と、式１７の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１８の化合物と、式１９の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式４０の化合物と、式４１の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１０の化合物と、式２０の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エテとを含む組成物；式１０の化合物と、式２０の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１１の化合物と、式２１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１１の化合物と、式２２の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１２の化合物と、式２３の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１２の化合物と、式２３の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１３の化合物と、式２４の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１３の化合物と、式２５の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１０の化合物と、式２６の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１０の化合物と、式２６の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１１の化合物と、式２７の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１１の化合物と、式２８の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１２の化合物と、式２９の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１２の化合物と、式２９の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１３の化合物と、式３０の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エテとを含む組成物；式１３の化合物と、式３１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１０の化合物と、式３２の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１０の化合物と、式３２の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１１の化合物と、式３３の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１１の化合物と、式３４の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１２の化合物と、式３５の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１２の化合物と、式３５の化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物；式１３の化合物と、式３６の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エテとを含む組成物；又は式１３の化合物と、式３７の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとを含む組成物を含む乳濁液を提供する。上記のいずれかのある実施形態においては、組成物は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテル８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ｖ／ｖなど、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテル８０〜９５％ｖ／ｖを含む。
【０２１１】
ある実施形態においては、乳濁液は、ポリエチレンとポリプロピレングリコールのブロック共重合体を更に含み得る。ある実施形態においては、乳濁液は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）を更に含み得る。非イオン性Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）界面活性剤、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）／ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）／ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）ブロック（ＡＢＡ型）、（ＰＥＯ／ＰＰＯ／ＰＥＯ）ブロック共重合体は、ＰＥＯ／ＰＰＯ比の関数として広範囲の親水性／疎水性を示し、したがってマトリックスの異なる水和度と同様に、ＰＬＡなどのポリマーを用いて異なる相分離形態が得られると予想することができる。特に、水和は、エステル骨格の加水分解によるポリマー分解を決定するのに重要な役割を果たす。ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの１９８９  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、Ａｔｔｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２６，２５（１９８５）、及びＫｒｅｚａｎｏｓｋｉ、米国特許第４，１８８，３７３号に記載のように、これらの重合体界面活性剤はｉｎ  ｖｉｖｏで最小の毒性を示し、その一部は臨床用途である。これらの材料は、ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手することができる。ある実施形態においては、本発明の乳濁液は、ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドとを含むトリブロック共重合体を更に含む。
【０２１２】
ある実施形態においては、本発明の乳濁液は、平均分子量１９００のポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）のトリブロック共重合体を含む。特定のかかる実施形態においては、トリブロック共重合体は、５０％ＰＥＯ含有量を含み、平均ＰＥＯ単位数約２２、例えば２１．５９、及び平均ＰＰＯ単位数約１６、例えば１６．３８である。特定のかかる実施形態においては、トリブロック共重合体の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）値は１９である。ＨＬＢ値は以下の式から計算することができる。
【０２１３】
【数２】
0005645658.tif 000063
式中、ｎは、ポリマーのＰＥＯセグメント中の繰り返し単位数であり、ｍは、ポリマーのＰＰＯセグメント中の繰り返し単位数である。例示的なトリブロック共重合体は、ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手することができ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ３５の商品名で販売されている。
【０２１４】
ある実施形態においては、本発明の乳濁液は、平均分子量２９００のポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）のトリブロック共重合体を含む。特定のかかる実施形態においては、トリブロック共重合体は、４０％ＰＥＯ含有量を含み、平均ＰＥＯ単位数約２６、例えば２６．３６、及び平均ＰＰＯ単位数約３０、例えば３０．００である。特定のかかる実施形態においては、トリブロック共重合体の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）値は１５である。例示的なトリブロック共重合体は、ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手することができ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ６４の商品名で販売されている。
【０２１５】
ある実施形態においては、本発明の乳濁液は、平均分子量８４００のポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）のトリブロック共重合体を含む。特定のかかる実施形態においては、トリブロック共重合体は、８０％ＰＥＯ含有量を含み、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７である。特定のかかる実施形態においては、トリブロック共重合体の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）値は２９である。例示的なトリブロック共重合体は、ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手することができ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８の商品名で販売されている。
【０２１６】
ある実施形態においては、本発明の乳濁液は、平均分子量６５００のポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）のトリブロック共重合体を含む。特定のかかる実施形態においては、トリブロック共重合体は、５０％ＰＥＯ含有量を含み、平均ＰＥＯ単位数約７４、例えば７３．８６、及び平均ＰＰＯ単位数約５６、例えば５６．０３である。特定のかかる実施形態においては、トリブロック共重合体の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）値は１５である。例示的なトリブロック共重合体は、ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手することができ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｐ１０５の商品名で販売されている。
【０２１７】
ある実施形態においては、乳濁液は、脂質を更に含み得る。脂質を更に含む本発明の乳濁液のある実施形態においては、脂質はＤＭＰＣである。脂質を更に含む本発明の乳濁液のある実施形態においては、乳濁液は、ブロック共重合体を更に含む。ある実施形態においては、ブロック共重合体は、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（プロピレンオキシド）とを含むトリブロック共重合体である。特定のかかる実施形態においては、ブロック共重合体は、平均分子量１９００、平均ＰＥＯ単位数約２２、例えば２１．５９、及び平均ＰＰＯ単位数約１６、例えば１６．３８を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体である。ある実施形態においては、本発明の乳濁液は、ＤＭＰＣと、平均分子量１９００、平均ＰＥＯ単位数約２２、例えば２１．５９、及び平均ＰＰＯ単位数約１６、例えば１６．３８を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ３５）とを更に含む。
【０２１８】
ある実施形態においては、乳濁液は、ポリエチルアミンを更に含み得る。
【０２１９】
ある実施形態においては、乳濁液は、硫酸プロタミンを更に含み得る。硫酸プロタミンを更に含む本発明の乳濁液のある実施形態においては、乳濁液は、ブロック共重合体を更に含む。ある実施形態においては、ブロック共重合体は、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（プロピレンオキシド）とを含むトリブロック共重合体である。特定のかかる実施形態においては、ブロック共重合体は、平均分子量１９００、平均ＰＥＯ単位数約２２、例えば２１．５９、及び平均ＰＰＯ単位数約１６、例えば１６．３８を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ３５）である。ある実施形態においては、本発明の乳濁液は、硫酸プロタミンと、平均分子量１９００、平均ＰＥＯ単位数約２２、例えば２１．５９、及び平均ＰＰＯ単位数約１６、例えば１６．３８を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ３５）とを更に含む。
【０２２０】
ある実施形態においては、乳濁液は、乳化剤を更に含み得る。特定のかかる実施形態においては、乳化剤も非イオン性可溶化剤である。ある実施形態においては、乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む。特定のかかる実施形態においては、乳化剤は、ポリエチレングリコールの脂肪酸エステル、遊離ポリエチレングリコール及びエトキシル化グリセリロールを更に含む。ある実施形態においては、乳化剤は、ヒマシ油とエチレンオキシドを１：３５のモル比で反応させることによって調製される。例示的な乳化剤は、ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手することができ、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬの商品名で販売されている。
【０２２１】
ある実施形態においては、本発明は、上記の任意の組合せを企図する。当業者は、本明細書に開示する乳濁液の個々の可能な成分、例えば、式１〜３７、４０〜４１、１ａのいずれか１つの化合物若しくはペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテル、ブロック共重合体（例えば、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（プロピレンオキシド）とを含むトリブロック共重合体、脂質、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む乳化剤、ポリエチルアミン、又は硫酸プロタミンのすべての具体的組合せが本発明の範囲内であることを認識するであろう。例として、乳濁液は、式１〜３７、４０〜４１、１ａのいずれか１つの１種類以上の化合物又はペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、ブロック共重合体（例えば、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（プロピレンオキシド）とを含むトリブロック共重合体と、脂質と、ポリエチルアミン及び／又は硫酸プロタミンとを含み得る。
【０２２２】
ある実施形態においては、乳濁液は、式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、硫酸プロタミン；式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）；式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、硫酸プロタミン；式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、硫酸プロタミン；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、硫酸プロタミン；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）；式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、硫酸プロタミン；式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）；式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、硫酸プロタミン；式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）；式１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、硫酸プロタミン；式１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）；式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、硫酸プロタミン；式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、ポリエチルアミン；式１ａの化合物と、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）；式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、硫酸プロタミン；式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、硫酸プロタミン；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８
．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）；式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、硫酸プロタミン；式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）；式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、硫酸プロタミン；式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、ポリエチルアミン；式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）；式１ａの化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、硫酸プロタミン；式１ａの化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、ポリエチルアミン；式１ａの化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）；ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、硫酸プロタミン；ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）と、ポリエチルアミン；ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量８４００、平均ＰＥＯ単位数約１５３、例えば１５２．７３、及び平均ＰＰＯ単位数約２９、例えば２８．９７を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８）；式１ａの化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４、例えば７３．８６、及び平均ＰＰＯ単位数約５６、例えば５６．０３を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｐ１０５）と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ）である）；式１ａの化合物と、式１の化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４、例えば７３．８６、及び平均ＰＰＯ単位数約５６、例えば５６．０３を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｐ１０５）と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ）である）；式１ａの化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４、例えば７３．８６、及び平均ＰＰＯ単位数約５６、例えば５６．０３を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｐ１０５）と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ）である）；式１ａの化合物と、式１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４、例えば７３．８６、及び平均ＰＰＯ単位数約５６、例えば５６．０３を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｐ１０５）と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ）である）；ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４、例えば７３．８６、及び平均ＰＰＯ単位数約５６、例えば５６．０３を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｐ１０５）と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ）である）；式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４、例えば７３．８６、及び平均ＰＰＯ単位数約５６、例えば５６．０３を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｐ１０５）と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ）である）；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４、例えば７３．８６、及び平均ＰＰＯ単位数約５６、例えば５６．０３を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｐ１０５）と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ）である）；式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４、例えば７３．８６、及び平均ＰＰＯ単位数約５６、例えば５６．０３を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｐ１０５）と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ）である）；式１の化合物と、式１６の化合物と、式１７の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４、例えば７３．８６、及び平均ＰＰＯ単位数約５６、例えば５６．０３を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｐ１０５）と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ）である）；式１の化合物と、式１８の化合物と、式１９の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４、例えば７３．８６、及び平均ＰＰＯ単位数約５６、例えば５６．０３を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｐ１０５）と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ）である）；又は式１の化合物と、式４０の化合物と、式４１の化合物と、式１ａの化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４、例えば７３．８６、及び平均ＰＰＯ単位数約５６、例えば５６．０３を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−
ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｐ１０５）と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ）である）を含む。
【０２２３】
ある実施形態においては、乳濁液は、式４２の化合物と、平均分子量６５００、平均ＰＥＯ単位数約７４、例えば７３．８６、及び平均ＰＰＯ単位数約５６、例えば５６．０３を有するポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｐ１０５）と、乳化剤（該乳化剤は、グリセロールポリエチレングリコールリシノレアートを含む非イオン性可溶化剤（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ）である。）とを含む。
【０２２４】
本発明の乳濁液は、好ましくは、十分な細胞内取り込みを可能にする粒径分布を有する。ある実施形態においては、均一な粒径が有利であり得る。所望の粒径均一度は、用途に応じて変わり得る。ある実施形態においては、乳濁液は、直径５００ｎｍ未満、又は４００ｎｍ未満、又は３００ｎｍ未満、又は２００ｎｍ未満の平均粒径を有する。場合によっては、粒子の２５％、又は５０％、又は７５％以上が選択範囲内にある。粒径は、例えば、光散乱技術によって、又はＥＭ顕微鏡写真を用いて乳濁液粒子を可視化することによって、評価することができる。大部分の幹細胞など、比較的少量の細胞質を有するある種の細胞型においては、乳濁液は、直径２００ｎｍ未満、又は１００ｎｍ未満、又は５０ｎｍ未満の平均粒径を有する。
【０２２５】
細胞用乳濁液は、好ましくは、広い温度範囲で安定であるべきである。ある実施形態においては、乳濁液は、体温（ヒトの場合３７℃）、及び４℃、室温（２０〜２５℃）などの貯蔵温度で安定である。例えば、乳濁液を４℃などの２〜１０℃の範囲の低温で貯蔵し、次いで乳濁液を室温（例えば、１８から２８℃、より典型的には２０から２５℃）に加温することが望ましいことが多い。細胞の標識化後、乳濁液は温度約３７℃になる。したがって、好ましい乳濁液は、冷蔵温度から体温までの温度で所望の粒径範囲を保持する。ある実施形態においては、乳濁液は、温度４℃から３７℃で安定である。
【０２２６】
ある実施形態においては、乳濁液は、０．１から０．２の多分散指数を有する。
【０２２７】
本発明は、ＰＦＰＥ誘導体の乳濁液をブロック共重合体を用いて低エネルギー方法によって調製する方法を提供する。ある実施形態においては、ブロック共重合体は、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（プロピレンオキシド）とを含むトリブロック共重合体である。
【０２２８】
本発明は、さらに、低エネルギー方法を含む、乳濁液を調製する方法を提供する。特定のかかる実施形態においては、低エネルギー方法は、薄膜法を含む。
【０２２９】
本発明の乳濁液のある実施形態においては、乳濁液は、ＰＦＰＥ−オキシド１ａを更に含む。
【０２３０】
本発明は、式１の化合物と式３８の化合物とを含む組成物を調製する方法であって、
【０２３１】
【化３９】
0005645658.tif 000064
（式中、ｎは各々独立に４から１６の整数であり、
ＸとＹの一方又は両方はジエチルアミド以外のアミドである。）
１）２個のメチルエステル末端基を有するペルフルオロポリエーテルメチルエステル（３９）を、ジエチルアミン以外の第一級又は第二級脂肪族アミンと反応させること、
【０２３２】
【化４０】
0005645658.tif 000065
２）無修飾メチルエステル末端基を過剰のジエチルアミンと反応させること、及び
３）未反応ジエチルアミンを除去すること、及び
４）場合によっては、フルオラス相シリカゲル（ＦｌｕｏｒｏＦｌａｓｈ、Ｆｌｕｏｒｏｕｓ  Ｉｎｃ．）を用いた固相抽出及びろ過によって、不揮発性アミンを除去すること
を含む方法も提供する。
【０２３３】
ある実施形態においては、８０％を超える、又は８５％を超える、又は９０％を超える、又は９１％を超える、又は９２％を超える、又は９３％を超える、又は９４％を超える、又は９５％を超えるメチルエステル末端基がアミドに転化される。
【０２３４】
ある実施形態においては、過剰のジエチルアミンを減圧除去する。
【０２３５】
ある実施形態においては、試料をフルオラスシリカゲルカラムＦｌｕｏｒｏＦｌａｓｈ（Ｆｌｕｏｒｏｕｓ  Ｉｎｃ．）に充填した後、過剰の不揮発性アミンを疎フルオロ性溶媒によって溶出させる。
【０２３６】
ある実施形態においては、ジエチルアミン以外のアミン１当量未満をペルフルオロポリエーテルメチルエステル３９と反応させる（例えば、ペルフルオロポリエーテルメチルエステル３９に比べてジエチルアミン以外のアミン１００ｍｏｌ％未満を反応させる。）。ある実施形態においては、ジエチルアミン以外のアミンの９０ｍｏｌ％未満、又は８０ｍｏｌ％未満、又は７０ｍｏｌ％未満、又は６０ｍｏｌ％未満、又は５０ｍｏｌ％未満、又は４０ｍｏｌ％未満、又は３０ｍｏｌ％未満、又は２０ｍｏｌ％未満、又は１０ｍｏｌ％未満をペルフルオロポリエーテルメチルエステル３９と反応させる。特定のかかる実施形態においては、ジエチルアミン以外のアミンとペルフルオロポリエーテルメチルエステル３９の反応を完結するまで進める。ジエチルアミン以外のアミンが未反応のまま残るある実施形態においては、エタノール、ＴＨＦなどの有機溶媒を用いた選択的抽出によってジエチルアミン以外の未反応アミンを除去する。ある実施形態においては、未反応アミン別の次いでジエチルアミンを、フルオラス相カラムから疎フルオロ性溶媒によって溶出させる。
【０２３７】
ある実施形態においては、上記方法を用いて調製される組成物は、式１０の化合物と式１の化合物とを含む組成物；式１２の化合物と式１の化合物とを含む組成物；式１４の化合物と式１の化合物とを含む組成物；式１６の化合物と式１の化合物とを含む組成物；又は式１８の化合物と式１の化合物とを含む組成物；又は式４０の化合物と式１の化合物とを含む組成物の場合、上で定義したとおりである。
【０２３８】
ＰＥＴ画像化に適した検出部分を使用して、核磁気共鳴技術とＰＥＴ技術によって検出可能であるデュアルモード画像化試薬を作製することもできる。例えば、１８Ｆ同位体は、ＰＥＴ検出方法の強力な標識である。フッ化炭素画像化試薬は、１８Ｆと１９Ｆ同位体の混合物を含むことができ、したがってＭＲＩ／ＭＲＳとＰＥＴに適したデュアルモード標識を与える。１８Ｆと１９Ｆは、別々のモノマー中で添加して混合共重合体を形成することもでき、又は１８Ｆ部分は、線状ポリエーテルのどちらの末端でも位置することができ、その位置においては大部分の他の機能部分が付加される。１８Ｆは、ＮＭＲ信号を持たず、したがって、例えば、ＮＭＲ線幅を減少させる傾向、ＮＭＲスペクトルを単純化する傾向、又は核磁気共鳴技術によって得られる読み取りに悪影響を及ぼす共鳴からの化学シフトを軽減する傾向にある位置において付加されているのかもしれない。さらに、フッ化炭素画像化試薬の分子は、１１Ｃ、１５Ｏ、１３Ｎなどの有効なＰＥＴプローブである別の放射性同位体を含むことができる。当業者は、本明細書に鑑みて、この開示の画像化試薬の末端基に組み入れることができ、又は、例えば、末端基に付加することができる、多数の他のＰＥＴ検出可能な部分を考案することができる。
【０２３９】
乳濁液の諸性質は、主として、画像化試薬自体の諸性質、使用する界面活性剤及び／又は溶媒の性質、及び処理装置のタイプ（例えば、超音波処理器、マイクロフルイダイザー、ホモジナイザーなど）によって、制御することができる。あるＰＦＰＥ分子を用いて乳濁液を形成する方法は、参照によりその全体を本明細書に援用する米国特許第５，３３０，６８１号及び同４，９９０，２８３号に広範に記載されている。濃縮水溶液中の多価アルコール、糖類などのポリヒドロキシル化化合物の連続相は、有効であり得る。以下の多価アルコール及び糖類が特に有効であることが判明した：グリセロール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、グルコース、フルクトース、サッカロース、マルチトール、グリセロールの二量体化合物（ジグリセロール又はビス（２，３−ジ−ヒドロキシプロピル）エーテル、糖としての固体水溶性ポリヒドロキシル化化合物、並びにトリグリセロール及びテトラグリセロールとしてのグリセロール縮合物。乳濁液中の分散は、カチオン、アニオン、両性及び非イオン界面活性剤を含めて、従来の界面活性剤の存在下で実施することができる。適切な界面活性剤の例としては、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸エステル（スルホコハク酸ヘミエステル）、ココ−アンホカルボキシグリシナート（ｃｏｃｏ−ａｍｐｈｏｃａｒｂｏｘｙｇｌｙｃｉｎａｔｅ）、カリウムセチルホスファート、ナトリウムアルキルポリオキシエチレンエーテルカルボキシラート、カリウムベンザルコニウムクロリド、アルキルアミドプロピルベタイン、セチルステアリリック（ｓｔｅａｒｉｌｉｃ）エトキシル化アルコール、及びソルビタンエトキシラート（２０）モノオレアートＴｗｅｅｎ  ２０が挙げられる。熱力学式を使用して、所望の粒径及び安定性を有する乳濁液を与える画像化試薬の混合物を予測しようとすることはできるが、種々の混合物の実際の試験が最も有効であることが一般に認められている。混合物の乳化は簡単で短時間であり、広範囲の組合せを迅速に試験して、本明細書に開示する方法における使用に適した乳濁液を生じる組合せを特定することができる。
【０２４０】
好ましくは、乳濁液は、対象細胞による画像化試薬の取り込みを容易にするように設計される。界面活性剤は、多量のＰＦＰＥ（例えば、本発明の化合物又は組成物におけるように、ＰＦＰＥアミド）を水相に輸送する安定な乳濁液を形成するように設計することができる。さらに、界面活性剤は、可能な最短のインキュベーション時間で乳濁液粒子の細胞内送達を増加させる性質を有することができる。ＰＦＰＥ（例えば、本発明の化合物又は組成物におけるように、ＰＦＰＥアミド）の細胞内添加量を増加させると、標識された細胞に対する感度が向上する。さらに、培養時間を最小化することは、一次細胞培養物を用いて作業するときには重要であり得る。細胞内取り込み効率は、細胞型に依存する。例えば、マクロファージ及び一部の樹状細胞がほぼあらゆる粒子を貪食するのに対して、対象となる他の細胞型はわずかの食作用性しかない場合がある。どちらの場合でも、取り込み効率は、乳濁液粒子表面が培養中に細胞内取り込みを促進する性質を有する（すなわち「自己送達（ｓｅｌｆ−ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ）」乳濁液粒子）ように界面活性剤を設計することによって、かなり高めることができる。乳濁液粒子表面は、適切な界面活性剤設計によって、親油性、場合によってはカチオン性を有するようにすることができる。例えば、界面活性剤は、細胞表面に結合又は融合し、それによって乳濁液粒子取り込みを増強する傾向がある、カチオン性脂質、中性脂質などの脂質、水中油型乳濁液、ミセル、混合ミセル、又はリポソームを含むことができる。ある実施形態においては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで送達ビヒクルとして使用されるコロイド系は、リポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。かかる系の調製及び使用は当分野で周知である。適切なカチオン性脂質は、以下のとおりであり、その全体を本明細書に援用する：Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，ＰＮＡＳ  ８４，７４１３〜７４１７；Ｅｐｐｓｔｅｉｎ他、米国特許第４，８９７，３５５号）、（Ｒｏｓｅ、米国特許第５，２７９，８３３号；Ｅｐｐａｎｄ他、米国特許第５，２８３，１８５号；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ他、米国特許第５，３３４，７６１号；Ｎａｎｔｚ他、米国特許第５，５２７，９２８号；Ｂａｉｌｅｙ他、米国特許第５，５５２，１５５号；Ｊｅｓｓｅ、米国特許第５，５７８，４７５号）。別の手法としては、細胞への侵入を容易にする界面活性剤ペプチド（例えば、オリゴＡｒｇ９及びＴＡＴ様ペプチド）、又は特定の細胞表面分子を標的にする抗体への組み入れが挙げられる。さらに、ある実施形態においては、小さいカチオン性タンパク質を硫酸プロタミンなどの界面活性剤に組み入れて、細胞内取り込みを増強することができる。硫酸プロタミンは、細胞に対して無毒であり、ヘパリン拮抗物質としてヒトにおける使用がＦＤＡによって認可されている。ある実施形態においては、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系を使用する。追加の移入剤の使用、細胞の電気穿孔の使用などによる、乳化されたフッ化炭素の取り込みを増強する他の手法を本明細書に記載する。
【０２４１】
好ましい実施形態においては、乳濁液は、取り込み促進試薬を添加する必要なしに、「自己送達」性を有する。前記乳濁液は、好ましくは安定であり、数か月又は数年の品質保持期間を有する。
【０２４２】
界面活性剤及び取り込み促進試薬は、排他的な群であることを意味するものではなく、場合によっては重複してもよいと理解される。
【０２４３】
「アシル」という用語は、当分野で認識されており、一般式ヒドロカルビルＣ（Ｏ）−、好ましくはアルキルＣ（Ｏ）−によって表される基を指す。
【０２４４】
「アシルアミノ」という用語は、当分野で認識されており、アシル基で置換されたアミノ基を指し、例えば、式ヒドロカルビルＣ（Ｏ）ＮＨ−によって表すことができる。
【０２４５】
「アシルオキシ」という用語は、当分野で認識されており、一般式ヒドロカルビルＣ（Ｏ）Ｏ−、好ましくはアルキルＣ（Ｏ）Ｏ−によって表される基を指す。
【０２４６】
「アルコキシ」という用語は、それに付加した酸素を有するアルキル基、好ましくは低級アルキル基を指す。代表的なアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどが挙げられる。
【０２４７】
「アルコキシアルキル」という用語は、アルコキシ基で置換されたアルキル基を指し、一般式アルキル−Ｏ−アルキルによって表すことができる。
【０２４８】
本明細書では「アルケニル」という用語は、少なくとも１個の二重結合を含む脂肪族基を指し、「非置換アルケニル」と「置換アルケニル」の両方を含むものとする。後者は、アルケニル基の１個以上の炭素上の水素を置換する置換基を有するアルケニル部分を指す。かかる置換基は、１個以上の二重結合に含まれる、又は含まれない、１個以上の炭素上に存在し得る。さらに、かかる置換基としては、安定性が論外である場合を除いて、以下に考察するように、アルキル基に対して企図されるすべての置換基が挙げられる。例えば、１個以上のアルキル、カルボシクリル、アリール、ヘテロシクリル又はヘテロアリール基によるアルケニル基の置換が企図される。
【０２４９】
「アルキル」という用語は、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基及びシクロアルキル置換アルキル基を含めて、飽和脂肪族基の基を指す。好ましい実施形態においては、直鎖又は分枝鎖アルキルは、その骨格中に３０以下（例えば、直鎖の場合Ｃ１〜Ｃ３０、分枝鎖の場合Ｃ３〜Ｃ３０）、より好ましくは２０以下の炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、その環構造中に３〜１０個の炭素原子を有し、より好ましくは環構造中に５、６又は７個の炭素を有する。
【０２５０】
さらに、本明細書、実施例、及び特許請求の範囲を通して使用する「アルキル」（又は「低級アルキル」）という用語は、「非置換アルキル」と「置換アルキル」の両方を含むものとする。後者は、炭化水素骨格の１個以上の炭素上の水素を置換する置換基を有するアルキル部分を指す。かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、（カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、又はアシルなどの）カルボニル、（チオエステル、チオアセタート、又はチオホルマートなどの）チオカルボニル、アルコキシル、ホスホリル、ホスファート、ホスホナート、ホスフィナート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルファート、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、又は芳香族若しくは複素環式芳香族部分を挙げることができる。炭化水素鎖上で置換された部分は、それ自体を適宜置換できることが当業者によって理解されるであろう。例えば、置換アルキルの置換基としては、アミノ、アジド、イミノ、アミド、（ホスホナート及びホスフィナートを含めた）ホスホリル、（スルファート、スルホンアミド、スルファモイル及びスルホナートを含めた）スルホニル及びシリル基、並びにエーテル、アルキルチオ、（ケトン、アルデヒド、カルボキシラート及びエステルを含めた）カルボニル、−ＣＦ３、−ＣＮなどの置換及び非置換体を挙げることができる。例示的な置換アルキルについては後述する。シクロアルキルは、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノアルキル、カルボニル置換アルキル、−ＣＦ３、−ＣＮなどで更に置換することができる。
【０２５１】
アシル、アシルオキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、又はアルコキシなどの化学部分に関連して用いられるときの「Ｃｘ〜ｙ」という用語は、ｘからｙ個の炭素を鎖中に含む基を含むことを意味する。例えば、「Ｃｘ〜ｙアルキル」という用語は、トリフルオロメチル、２，２，２−チルフルオロエチル（ｔｉｒｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌ）などのハロアルキル基を含めて、ｘからｙ個の炭素を鎖中に含む直鎖アルキル及び分枝鎖アルキル基を含めた、置換又は非置換飽和炭化水素基を指す。Ｃ０アルキルは、基が末端位置にある場合には水素を示し、内部の場合には結合を示す。「Ｃ２〜ｙアルケニル」及び「Ｃ２〜ｙアルキニル」という用語は、長さ及び可能な置換が上記アルキルに類似しているが、少なくとも１個の二重又は三重結合をそれぞれ含む、置換又は非置換不飽和脂肪族基を指す。
【０２５２】
本明細書では「アルキルアミノ」という用語は、少なくとも１個のアルキル基で置換されたアミノ基を指す。
【０２５３】
本明細書では「アルキルチオ」という用語は、アルキル基で置換されたチオール基を指し、一般式アルキルＳ−によって表すことができる。
【０２５４】
本明細書では「アルキニル」という用語は、少なくとも１個の三重結合を含む脂肪族基を指し、「非置換アルキニル」と「置換アルキニル」の両方を含むものとする。後者は、アルキニル基の１個以上の炭素上の水素を置換する置換基を有するアルキニル部分を指す。かかる置換基は、１個以上の三重結合に含まれる、又は含まれない、１個以上の炭素上に存在し得る。さらに、かかる置換基としては、安定性が論外である場合を除いて、上で考察したように、アルキル基に対して企図されるすべての置換基が挙げられる。例えば、１個以上のアルキル、カルボシクリル、アリール、ヘテロシクリル又はヘテロアリール基によるアルキニル基の置換が企図される。
【０２５５】
本明細書では「アミド」という用語は、以下の基を指す。
【０２５６】
【化４１】
0005645658.tif 000066
式中、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素若しくはヒドロカルビル基を表し、又はＲ９とＲ１０はこれらが結合しているＮ原子と一緒に、４から８個の原子を環構造中に有する複素環を完成する。
【０２５７】
「アミン」及び「アミノ」という用語は、当分野で認識されており、非置換と置換アミンの両方、及びその塩、例えば、以下によって表すことができる部分を指す。
【０２５８】
【化４２】
0005645658.tif 000067
式中、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１０’は各々独立に水素若しくはヒドロカルビル基を表し、又はＲ９とＲ１０はこれらが結合しているＮ原子と一緒に、４から８個の原子を環構造中に有する複素環を完成する。
【０２５９】
本明細書では「アミノアルキル」という用語は、アミノ基で置換されたアルキル基を指す。
【０２６０】
本明細書では「アラルキル」という用語は、アリール基で置換されたアルキル基を指す。
【０２６１】
本明細書では「アリール」という用語は、環の各原子が炭素である置換又は非置換単環芳香族基を含む。好ましくは、環は、５から７員環、より好ましくは６員環である。「アリール」という用語は、２個以上の炭素が、隣接する２個の環に共通である、２個以上の環式環を有し、環の少なくとも１個が芳香族である、多環式環構造も含む。例えば、その他の環式環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール及び／又はヘテロシクリルであり得る。アリール基としては、ベンゼン、ナフタレン、フェナントレン、フェノール、アニリンなどが挙げられる。
【０２６２】
「カルバマート」という用語は、当分野で認識されており、以下の基を指す。
【０２６３】
【化４３】
0005645658.tif 000068
式中、Ｒ９及びＲ１０は独立に水素若しくはアルキル基などのヒドロカルビル基を表し、又はＲ９とＲ１０は介在原子（単数又は複数）と一緒に、４から８個の原子を環構造中に有する複素環を完成する。
【０２６４】
本明細書では「炭素環」、「カルボシクリル」及び「炭素環式」という用語は、環の各原子が炭素である非芳香族飽和又は不飽和環を指す。好ましくは、炭素環は、３から１０個の原子、より好ましくは５から７個の原子を含む。
【０２６５】
本明細書では「カルボシクリルアルキル」という用語は、炭素環基で置換されたアルキル基を指す。
【０２６６】
「カルボナート」という用語は、当分野で認識されており、基−ＯＣＯ２−Ｒ９を指す。式中、Ｒ９はヒドロカルビル基である。
【０２６７】
本明細書では「カルボキシ」という用語は、式−ＣＯ２Ｈによって表される基を指す。
【０２６８】
本明細書では「エステル」という用語は、基−Ｃ（Ｏ）ＯＲ９を指す。式中、Ｒ９はヒドロカルビル基である。
【０２６９】
本明細書では「エーテル」という用語は、酸素を介して別のヒドロカルビル基に連結されたヒドロカルビル基を指す。したがって、ヒドロカルビル基のエーテル置換基は、ヒドロカルビル−Ｏ−であり得る。エーテルは、対称でも非対称でもよい。エーテルの例としては、複素環−Ｏ−複素環及びアリール−Ｏ−複素環が挙げられるが、それだけに限定されない。エーテルは、一般式アルキル−Ｏ−アルキルによって表すことができる「アルコキシアルキル」基を含む。
【０２７０】
本明細書では「ハロ」及び「ハロゲン」という用語は、ハロゲンを意味し、クロロ、フルオロ、ブロモ及びヨードを含む。
【０２７１】
本明細書では「ヘタラルキル（ｈｅｔａｒａｌｋｙｌ）」及び「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘタリール基で置換されたアルキル基を指す。
【０２７２】
「ヘテロアリール」及び「ヘタリール」という用語は、置換又は非置換芳香族単環構造、好ましくは５から７員環、より好ましくは５から６員環であって、その環構造が、少なくとも１個のヘテロ原子、好ましくは１から４個のヘテロ原子、より好ましくは１又は２個のヘテロ原子を含む、置換又は非置換芳香族単環構造を含む。「ヘテロアリール」及び「ヘタリール」という用語は、２個以上の炭素が、隣接する２個の環に共通である、２個以上の環式環を有し、環の少なくとも１個が複素環式芳香族である、多環式環構造も含む。例えば、その他の環式環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール及び／又はヘテロシクリルであり得る。ヘテロアリール基としては、例えば、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、及びピリミジンなどが挙げられる。
【０２７３】
本明細書では「ヘテロ原子」という用語は、炭素又は水素以外の任意の元素の原子を意味する。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素及び硫黄である。
【０２７４】
「ヘテロシクリル」、「複素環」及び「複素環式」という用語は、置換又は非置換非芳香環構造、好ましくは３から１０員環、より好ましくは３から７員環であって、その環構造が、少なくとも１個のヘテロ原子、好ましくは１から４個のヘテロ原子、より好ましくは１又は２個のヘテロ原子を含む、置換又は非置換非芳香環構造を指す。「ヘテロシクリル」及び「複素環式」という用語は、２個以上の炭素が、隣接する２個の環に共通である、２個以上の環式環を有し、環の少なくとも１個が複素環式である、多環式環構造も含む。例えば、その他の環式環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール及び／又はヘテロシクリルであり得る。ヘテロシクリル基としては、例えば、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、モルホリン、ラクトン、ラクタムなどが挙げられる。
【０２７５】
本明細書では「ヘテロシクリルアルキル」という用語は、複素環基で置換されたアルキル基を指す。
【０２７６】
本明細書では「ヒドロカルビル」という用語は、＝Ｏ又は＝Ｓ置換基を持たない炭素原子を介して結合し、典型的には少なくとも１個の炭素−水素結合及び主に炭素骨格を有するが、場合によってはヘテロ原子を含んでもよい基を指す。したがって、メチル、エトキシエチル、２−ピリジル及びトリフルオロメチルのような基を本願ではヒドロカルビルとみなすが、（連結炭素上に＝Ｏ置換基を有する）アセチル、（炭素ではなく酸素を介して連結された）エトキシなどの置換基はヒドロカルビルとはみなさない。ヒドロカルビル基としては、アリール、ヘテロアリール、炭素環、複素環、アルキル、アルケニル、アルキニル及びその組合せが挙げられるが、それだけに限定されない。
【０２７７】
本明細書では「ヒドロキシアルキル」という用語は、ヒドロキシ基で置換されたアルキル基を指す。
【０２７８】
アシル、アシルオキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、又はアルコキシなどの化学部分に関連して用いるときの「低級」という用語は、置換基中１０個以下、好ましくは６個以下の非水素原子が存在する基を含むことを意味する。例えば、「低級アルキル」とは、１０個以下、好ましくは６個以下の炭素原子を含むアルキル基を指す。ある実施形態においては、本明細書に定義するアシル、アシルオキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアルコキシ置換基は、単独であろうと、列挙においてヒドロキシアルキル、アラルキル（この場合、例えば、アルキル置換基中の炭素原子を数えるときには、アリール基内の原子を考慮しない。）などの別の置換基との組み合わせであろうと、それぞれ低級アシル、低級アシルオキシ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル又は低級アルコキシである。
【０２７９】
「ポリシクリル（ｐｏｌｙｃｙｃｌｙｌ）」、「多環」及び「多環式」という用語は、２個以上の原子が、隣接する２個の環に共通である、２個以上の環（例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール及び／又はヘテロシクリル）を指す。例えば、環は「縮合環」である。多環の環の各々は、置換でも非置換でもよい。ある実施形態においては、多環の各環は、環中に３から１０個、好ましくは５から７個の原子を含む。
【０２８０】
「置換された」という用語は、骨格の１個以上の炭素上の水素に代わる置換基を有する部分を指す。「置換」又は「で置換された」は、かかる置換が置換原子及び置換基の許容される原子価に従い、さらに、置換が、例えば再配列、環化、脱離などによって自発的に変化しない、安定な化合物をもたらすという、絶対的条件を含むことが理解されるであろう。本明細書では「置換された」という用語は、有機化合物のすべての許容できる置換基を含むことが企図される。広範な一態様においては、許容できる置換基としては、有機化合物の非環式及び環式、分枝及び非分枝、炭素環式及び複素環式、芳香族及び非芳香族の置換基が挙げられる。許容できる置換基は、適切な有機化合物の場合は１個以上とすることができ、同じでも異なってもよい。本発明では、窒素などのヘテロ原子は、水素置換基、及び／又はヘテロ原子の原子価を満たす本明細書に記載の有機化合物の任意の許容できる置換基を有することができる。置換基としては、本明細書に記載の任意の置換基、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、（カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、又はアシルなどの）カルボニル、（チオエステル、チオアセタート、又はチオホルマートなどの）チオカルボニル、アルコキシル、ホスホリル、ホスファート、ホスホナート、ホスフィナート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルファート、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、又は芳香族若しくは複素環式芳香族部分を挙げることができる。炭化水素鎖上で置換された部分は、それ自体が適宜置換され得ることを当業者は理解するであろう。
【０２８１】
「非置換」と特に示さない限り、本明細書の化学部分の表記は、置換変種を含むと理解される。例えば、「アリール」基又は部分という表記は、置換と非置換の両方の変種を暗黙的に含む。
【０２８２】
「スルファート」という用語は、当分野で認識されており、基−ＯＳＯ３Ｈ、又は薬学的に許容されるその塩を指す。
【０２８３】
「スルホンアミド」という用語は、当分野で認識されており、下記一般式によって表される基を指す。
【０２８４】
【化４４】
0005645658.tif 000069
式中、Ｒ９及びＲ１０は独立に水素若しくはアルキルなどのヒドロカルビルを表し、又はＲ９とＲ１０は介在原子（単数又は複数）と一緒に、４から８個の原子を環構造中に有する複素環を完成する。
【０２８５】
「スルホキシド」という用語は、当分野で認識されており、基−Ｓ（Ｏ）−Ｒ９を指す。式中、Ｒ９はヒドロカルビルである。
【０２８６】
「スルホナート」という用語は、当分野で認識されており、基ＳＯ３Ｈ、又は薬学的に許容されるその塩を指す。
【０２８７】
「スルホン」という用語は、当分野で認識されており、基−Ｓ（Ｏ）２−Ｒ９を指す。式中、Ｒ９はヒドロカルビルである。
【０２８８】
本明細書では「チオアルキル」という用語は、チオール基で置換されたアルキル基を指す。
【０２８９】
本明細書では「チオエステル」という用語は、基−Ｃ（Ｏ）ＳＲ９又は−ＳＣ（Ｏ）Ｒ９を指す。式中、Ｒ９はヒドロカルビルである。
【０２９０】
本明細書では「チオエーテル」という用語は、酸素が硫黄で置換されたエーテルと等価である。
【０２９１】
「尿素」という用語は、当分野で認識されており、下記一般式によって表すことができる。
【０２９２】
【化４５】
0005645658.tif 000070
式中、Ｒ９及びＲ１０は独立に水素若しくはアルキルなどのヒドロカルビルを表し、又はＲ９のどちらかの存在はＲ１０及び介在原子（単数又は複数）と一緒に、４から８個の原子を環構造中に有する複素環を完成する。
【０２９３】
本発明のある種の化合物は、特定の幾何又は立体異性体として存在し得る。本発明は、本発明の範囲内にある、シス及びトランス異性体、Ｒ及びＳ鏡像異性体、ジアステレオマー、（ｄ）異性体、（ｌ）異性体、そのラセミ混合物、及びその別の混合物を含めて、すべてのかかる化合物を企図する。追加の不斉炭素原子がアルキル基などの置換基中に存在してもよい。すべてのかかる異性体及びその混合物が本発明に包含されるものとする。
【０２９４】
実質的に異性体的に純粋な化合物を調製する方法は、当分野で公知である。例えば、本発明の化合物の特定の鏡像異性体が所望である場合、不斉合成によって、又はキラル補助基を用いた誘導によって、調製することができ、生成するジアステレオマー混合物を分離し、補助基を切断して、純粋な所望の鏡像異性体が得られる。あるいは、分子がアミノなどの塩基性官能基又はカルボキシルなどの酸性官能基を含む場合、ジアステレオマーの塩は、適切な光学的に活性な酸又は塩基を用いて形成され、続いてこうして形成されたジアステレオマーを当分野で周知の分別結晶又はクロマトグラフィー手段によって分離し、続いて純粋な鏡像異性体を回収することができる。あるいは、鏡像異性的に濃縮された混合物及び純粋な鏡像異性化合物は、キラル中心における立体化学が不変のままである反応、又はその完全な反転をもたらす反応と組み合わせて、鏡像異性的に純粋な合成中間体を用いて調製することができる。特定の立体中心を反転させる、又は不変のままにする技術、及び立体異性体の混合物を分離する技術は当分野で周知であり、特定の状況に対して適切な方法を選択することは当業者の能力の十分な範囲内にある。一般に、Ｆｕｒｎｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｖｏｇｅｌ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｌｔｄ．，Ｅｓｓｅｘ，１９９１，ｐｐ．８０９〜８１６、及びＨｅｌｌｅｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２３：１２８（１９９０）を参照されたい。
【０２９５】
３．細胞及び標識化
本明細書に記載の方法は、原核細胞と真核細胞の両方、好ましくはほ乳動物細胞を含めて、広範囲の細胞と一緒に使用することができる。細胞調製技術は、細胞培養、クローン化、核移植、遺伝子改変及び封入を含む。
【０２９６】
適切なほ乳動物細胞の部分的なリストとしては、血球、筋芽細胞、骨髄細胞、末梢血細胞、さい帯血細胞、心筋細胞（及びその前駆体）、軟骨細胞（軟骨組織の細胞）、樹状細胞、胎児神経組織、線維芽細胞、肝細胞（肝臓の細胞）、すい臓の島細胞、角化細胞（皮膚細胞）及び幹細胞が挙げられる。ある好ましい実施形態においては、使用される細胞は、分割された免疫細胞集団である。認識されている免疫細胞亜集団としては、Ｂリンパ球（Ｆｃ受容体、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ１９＋、ＣＤ２１＋）、ヘルパーＴリンパ球（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８−）、細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＤ３＋、ＣＤ４−、ＣＤ８＋）、ナチュラルキラー細胞（ＣＤ１６＋）などのリンパ球、単球、好中球及びマクロファージを含めた単核食細胞、並びに樹状細胞が挙げられる。対象となり得る他の細胞型としては、好酸球及び好塩基球が挙げられる。
【０２９７】
細胞は、自己（すなわち、同じ個体に由来）でも、同系（すなわち、同一遺伝子の同腹仔、一卵生双生児などの遺伝的に同一の個体に由来）でもよいが、同種細胞（すなわち、同じ種の遺伝的に異なる個体に由来する細胞）も企図される。それよりは好ましくないが、トランスジェニックブタ由来の細胞などの異種（すなわち、レシピエントとは異なる種に由来する）細胞を投与することもできる。ドナー細胞が異種であるときには、細胞は、同じ目内の種の個体、より好ましくは同じ上科又は科から得られることが好ましい（例えば、レシピエントがヒトであるときには、細胞は、霊長類、より好ましくはヒト上科の一メンバーに由来することが好ましい。）。
【０２９８】
細胞は、医学的及び倫理的に適切である場合、出生前（例えば、胚又は胎児）、乳児（例えば、ヒトにおいては誕生から約３歳まで）、小児（例えば、ヒトにおいては約３歳から約１３歳まで）、青年（例えば、ヒトにおいては約１３歳から約１８歳まで）、若年成体（例えば、ヒトにおいては約１８歳から約３５歳）、成体（ヒトにおいては約３５歳から約５５歳まで）又は初老（例えば、ヒトにおいては約５５歳以上）を含めて、ドナー個体の任意の発生段階から得ることができる。
【０２９９】
多数の実施形態においては、細胞は、画像化試薬が細胞によって吸収されるように、細胞を画像化試薬の乳濁液に接触させることによって標識される。食細胞と非食細胞の両方をかかる方法によって標識することができる。例えば、国際公開第２００５０７２７８０号に示されるように、樹状細胞（食細胞）と神経こう肉腫細胞（非食細胞）のどちらも、細胞を画像化試薬の乳濁液に接触させることによって標識することができる。
【０３００】
ある態様においては、本発明の方法は、１９Ｆ画像化試薬を用いて細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで標識化すること、及び対象における標識された細胞を検出することを含み得る。標識すべき細胞は、貪食作用などの細胞の特定の性質によって決定することができる。標識された細胞は、画像化試薬の投与経路によって制御することができる。標識される細胞のタイプは、画像化試薬の性質によって調節することができる。例えば、画像化試薬の単純なコロイド状懸濁液は、貪食作用を有する細胞によってより急速に吸収される傾向がある。別の例として、画像化試薬は、特定の細胞集団への画像化試薬の選択的ターゲティングを容易にする標的部分と一緒に処方することができ、又は該標的部分に共有結合することができる。ある実施形態においては、フッ化炭素画像化試薬は、式１〜１７、２０〜３７若しくは４０〜４１のいずれか１つの化合物、又はペルフルオロ−１５−クラウンエーテルを含み得る。
【０３０１】
ある実施形態においては、標識される細胞は幹細胞である。幹細胞療法は、高線量照射及び／又は化学療法剤を用いた癌治療の切除療法の一部として一般に使用される。切除療法は、例えば末梢血、さい帯血又は骨髄から得ることができる、造血幹細胞又は造血幹細胞を含む細胞集団を一般に使用する。このタイプの細胞又はその一部を標識し、ｉｎ  ｖｉｖｏで追跡して、適切な位置における生存及び移植をモニターすることができる。別のタイプの幹細胞は、多種多様な障害の治療薬としてますます魅力的になっている。
【０３０２】
例として、細胞は、マウス胚性幹細胞、又は別のモデル動物由来のＥＳ細胞とすることができる。かかる細胞の標識化は、場合によっては胚性幹細胞治療法を開発するための前臨床研究プログラムの一部として、マウスに投与されたかかる細胞の結末を追跡するのに有用であり得る。マウス胚性幹細胞の例としては、Ｍ．Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ９，２５２３（１９９５）に記載のＪＭ１  ＥＳ細胞系、及びＧ．Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，Ｐ．Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ５，１５１３（１９９１）に記載のＲＯＳＡ系、及び米国特許出願第６，１９０，９１０号に記載のマウスＥＳ細胞が挙げられる。多数の他のマウスＥＳ系がＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から入手可能である。ヒト胚性幹細胞の例としては、以下の供給業者から入手可能なものが挙げられる：Ａｒｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＣｙＴｈｅｒａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．，Ａｔｈｅｎｓ，Ｇｅｏｒｇｉａ、ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ、Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｇｏｅｔｅｂｏｒｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｏｅｔｅｂｏｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ、Ｍａｒｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．−Ｍａｒｉａ  Ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ、ＭｉｚＭｅｄｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ−Ｓｅｏｕｌ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｔａｔａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂａｎｇａｌｏｒｅ，Ｉｎｄｉａ、Ｐｏｃｈｏｎ  ＣＨＡ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ、Ｒｅｌｉａｎｃｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ、ＲｅＮｅｕｒｏｎ，Ｓｕｒｒｅｙ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｔｅｃｈｎｉｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｉｆａ，Ｉｓｒａｅｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、及びＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｌｕｍｎｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎが挙げられる。さらに、胚性幹細胞の例は、以下の米国特許及び特許出願公開に記載されている：６，２４５，５６６；６，２００，８０６；６，０９０，６２２；６，３３１，４０６；６，０９０，６２２；５，８４３，７８０；２００２００４５２５９；２００２００６８０４５。好ましい実施形態においては、ヒトＥＳ細胞は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって提供され、ｈｔｔｐ：／／ｅｓｃｒ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいて利用可能である、認可された細胞系のリストから選択される。ある好ましい実施形態においては、胚性幹細胞系は、Ｄｒ．Ｊ．Ｔｈｏｍｓｏｎ（Ｕｎｉｖ．  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から入手されるＷＡ０９系、並びにどちらも現在のＮＩＨ登録簿に記載されているＵＣ０１及びＵＣ０６系からなる群から選択される。
【０３０３】
ある実施形態においては、開示する方法に使用される幹細胞は、中枢神経系（例えば、米国特許第６，４６８，７９４号；同６，０４０，１８０号；同５，７５３，５０６号；同５，７６６，９４８号参照）、神経堤（例えば、米国特許第５，５８９，３７６号；同５，８２４，４８９号参照）、嗅球若しくは末梢神経組織（例えば、米国特許出願公開第２００３０００３５７４号；同２００２０１２３１４３号；同２００２００１６００２号、及びＧｒｉｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２２（２）：４３７〜４５参照）、脊髄（例えば、米国特許第６，３６１，９９６号、同５，８５１，８３２号参照）、又は副腎、下垂体、腸のある部分などの神経内分泌系列（例えば、米国特許第６，１７１，６１０号、及びＫｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１８９６１〜６７に記載のＰＣ１２細胞参照）に由来する幹細胞などの神経又は神経内分泌起源の幹細胞である。好ましい実施形態においては、神経幹細胞は、末梢組織又は容易に治癒する組織から得られ、それによって移植用自己細胞集団を与える。
【０３０４】
造血又は間葉幹細胞は、開示するある方法に使用することができる。最近の研究は、容易に単離される骨髄由来造血幹細胞（ＨＳＣ）及び間葉幹細胞（ＭＳＣ）が、以前に認識されたよりも広範な潜在的分化能力を有することを示唆している。精製ＨＳＣは、血中のすべての細胞を生じるだけでなく、肝細胞のような内胚葉に通常は由来する細胞に成長することもできる（Ｋｒａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃｅｌｌ  １０５：３６９〜７７；Ｌａｇａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ６：１２２９〜３４）。同様に、末梢血及びさい帯血由来のＨＳＣは、有用な範囲の潜在的発生能力をもたらすと予想される。ＭＳＣも、同様に、例えば神経細胞マーカーを発現することができる子孫を生成する、多分化能であるように見える（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１４３〜７；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １７４：１１〜２０）。造血幹細胞の例としては、米国特許第４，７１４，６８０号；同５，０６１，６２０号；同５，４３７，９９４号；同５，９１４，１０８号；同５，９２５，５６７号；同５，７６３，１９７号；同５，７５０，３９７号；同５，７１６，８２７号；同５，６４３，７４１号；同５，０６１，６２０号が挙げられる。間葉幹細胞の例としては、米国特許第５，４８６，３５９号；同５，８２７，７３５号；同５，９４２，２２５号；同５，９７２，７０３号に記載のもの、国際公開第００／５３７９５号；同００／０２６５４号；同９８／２０９０７号に記載のもの、並びにＰｉｔｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．及びＺｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）に記載のものが挙げられる。
【０３０５】
幹細胞系は、好ましくは、げっ歯類（例えば、マウス又はラット）、霊長目（例えば、サル、チンパンジー又はヒト）、ブタ、反すう動物（例えば、ウシ、ヒツジ及びヤギ）などのほ乳動物、特にヒトに由来する。ある実施形態においては、幹細胞は、自己の出所又はＨＬＡ型が適合した出所に由来する。例えば、幹細胞は、すい臓ホルモン産生細胞を必要とする対象（例えば、インスリン産生細胞を必要とする糖尿病患者）から得ることができ、培養して、自己インスリン産生細胞を作製することができる。他の幹細胞源は、筋組織由来の幹細胞、皮膚（真皮又は表皮）由来の幹細胞、脂肪由来の幹細胞など、対象から容易に得られる。
【０３０６】
一部の好ましい実施形態においては、ヒト投与用細胞は、Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）又は他の国の相当する規制行政機関によって設定された良好な組織診療指針に適合すべきである。かかる細胞系を開発する方法は、ドナー試験、並びに非ヒト細胞及び生成物への曝露の回避を含み得る。
【０３０７】
ドナー（場合によっては、患者がドナーである。）に由来する細胞は、送達する細胞の目的に従って、未分画又は分画された細胞として投与することができる。細胞は、分画して、ある細胞型を濃縮した後に投与することができる。分画方法は当分野で周知であり、一般にポジティブ選択（すなわち、特定の性質に基づく細胞の保持）とネガティブ選択（すなわち、特定の性質に基づく細胞の除去）の両方を含む。当業者には明白であるように、ポジティブ及びネガティブ選択に使用される特定の性質（例えば、表面マーカー）は、所望の細胞集団に依存する。細胞の選択／濃縮に使用される方法は、免疫親和性技術又は密度遠心分離法を含み得る。免疫親和性技術は、当分野で周知のように、種々の形態を取り得るが、あるタイプの分離技術と組み合わせて抗体又は抗体誘導体を一般に利用する。分離技術は、一般に、抗体が結合した細胞と抗体が結合していない細胞との物理的分離をもたらすが、抗体が結合した細胞を死滅させる分離技術をネガティブ選択に使用することができる場合もある。
【０３０８】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、パニング、免疫磁気分離、イムノアフィニティークロマトグラフィー、抗体媒介性補体結合、免疫毒素、密度勾配分離などを含めて、任意の適切な免疫親和性技術を、使用する選択細胞の選択／濃縮に利用することができる。免疫親和性プロセスにおける処理後、所望の細胞（ポジティブ選択の場合には免疫親和性試薬が結合した細胞、ネガティブ選択の場合には免疫親和性試薬が結合していない細胞）を収集し、更なるラウンドの免疫親和性選択／濃縮に供し、又は患者への投与のために確保する。
【０３０９】
免疫親和性選択／濃縮は、典型的には、所望の細胞型を含む細胞の調製物を抗体又は抗体由来の親和性試薬（例えば、所与の表面マーカーに特異的な抗体）と一緒にインキュベートし、次いで結合した親和性試薬を利用して、抗体が結合した細胞又は結合していない細胞を選択することによって実施される。選択プロセスは、一般に、単細胞を含む液滴を、結合した親和性試薬の有無によって異なる容器に誘導すること（ＦＡＣＳ）によって、固相基質に（直接的又は間接的に）結合した抗体を利用すること（パニング、イムノアフィニティークロマトグラフィー）によって、又は磁場を利用して、親和性試薬を介して磁性粒子に結合した細胞を収集すること（免疫磁気分離）によって、実施することができるなどの物理的分離を含む。あるいは、望ましくない細胞は、親和性試薬が結合した細胞に細胞傷害性侵襲を誘導する親和性試薬を用いて、調製物から除去することができる。細胞傷害性侵襲は、親和性試薬（例えば、補体結合）によって活性化することができ、又は親和性試薬（例えば、リシンＢ鎖などの免疫毒素）によって標的細胞に局在化させることができる。
【０３１０】
本明細書に開示する方法は、細胞のｉｎ  ｖｉｖｏモニタリングに頻繁に使用されると予想されるが、その方法論は、培養中、組織試料又は他のｅｘ  ｖｉｖｏ細胞材料中の細胞のモニタリングにも同様に有効であることに留意されたい。治療用の場合、細胞は、患者への投与準備中の所望の段階で標識することができる。
【０３１１】
種々の方法を使用して、細胞を画像化試薬で標識することができる。一般に、細胞は、画像化試薬が細胞と会合するように、画像化試薬と接触して配置される。条件は、細胞生存率を維持するように設計された標準細胞培養条件であることが多い。「会合」という用語は、画像化試薬と細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏであろうとｉｎ  ｖｉｔｒｏであろうと、細胞の位置についての有用な情報を画像化試薬が提供することができるように十分な時間、物理的に十分に近接したままである任意の様式を包含するものとする。画像化試薬は、例えば、食作用又は界面活性剤によって媒介される細胞への侵入後に、細胞内に位置することができる。樹状細胞、マクロファージ、Ｔ細胞などの免疫細胞は、高度に食作用性であることが多く、本明細書及び他の研究で示されたデータは、かかる細胞及び他の食細胞タイプが容易に標識されることを示している。幹細胞などの他の細胞型も、貪食作用にかかわらず、標識することができる。画像化試薬は、細胞膜に挿入することができ、又は細胞の細胞外成分に共有結合的若しくは非共有結合的に結合することができる。例えば、本明細書に記載のある種の線状フッ化炭素は、誘導体化されて、１個以上の標的部分に付加することができる。標的部分は、画像化試薬と標識すべき細胞との会合を容易にするように選択される。標的部分は、細胞膜へのフッ化炭素の非特異的挿入を生じるように（例えば、疎水性アミノ酸配列、又はパルミトイル部分、ミリストイル部分などの他の疎水性部分）、又は細胞への非特異的侵入を容易にするように、設計することができる。標的部分は、受容体リガンドの場合と同様に、細胞表面成分に結合することができる。標的部分は、特異的結合対の一メンバーとすることができ、パートナーは細胞表面成分である。標的部分は、例えば、受容体のリガンド、又はモノクローナル、ポリクローナル抗体、免疫グロブリンの可変部分を含む種々のポリペプチド結合剤のいずれかなどの抗体（例えば、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一ドメイン抗体、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体（ｔｒｉｂｏｄｉｅｓ）、四重特異性抗体）とすることができる。ある実施形態においては、フッ化炭素画像化試薬は、式１〜１７、２０〜３７若しくは４０〜４１のいずれか１つの化合物、又はペルフルオロ−１５−クラウンエーテルを含み得る。
【０３１２】
フッ化炭素乳濁液を用いた細胞の標識化は、移入剤を用いて細胞送達を助けることによっても促進することができる。移入剤は、カチオン性脂質、カチオン性リポソーム、ポリカチオンなどからなることが多い。移入剤は、フッ化炭素乳濁液標識化剤と前もって混合され、それによって乳濁液粒子に会合し、又は乳濁液粒子を被覆する。次いで、移入剤で処理された乳濁液粒子を培養細胞に添加し、細胞が標識されるようにインキュベートする。一般的な移入剤としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ）ＦｕＧｅｎｅ、ＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、及びポリ−Ｌ−リシンが挙げられる。小さいタンパク質は、多数のタイプのプロタミンなどの移入剤として使用することもできる。プロタミンは、大部分の脊椎動物における精子の核中の主要なＤＮＡ結合タンパク質であり、体細胞の細胞核の５％未満の体積でＤＮＡを包み込む。プロタミンは、アルギニンが豊富で、強塩基である、低分子量の単純タンパク質である。市販プロタミンは、サケ及びある別の種の魚の精子に由来する。本明細書では「プロタミン」という用語は、アルギニンが豊富な低分子量カチオン性ポリペプチドを指す。プロタミン分子は、典型的には、約２０から約２００個のアミノ酸を含み、一般には、少なくとも２０％、５０％又は７０％のアルギニンを含むことを特徴とする。プロタミンは、硫酸、リン酸、塩化物などの１個以上の対イオンと一緒に、塩として処方されることが多い。
【０３１３】
本願において提供するデータは、プロタミン（例えば、硫酸プロタミン）が、ＰＦＰＥフッ化炭素乳濁液粒子を培養細胞に送達するのに極めて有効であることを示している。適切な硫酸プロタミンは、種々の出所（例えば、サケ、ニシン、マスなど）に由来し、ヒストン又は任意の組換え誘導体と一緒に、さらに、ヒストンも任意の組換え誘導体もなしで、種々の等級及び形態（例えば、ＵＳＰ、等級ＩＩ、ＩＩＩ、Ｘなど）があり得る。移入剤として使用することができる他のプロタミン溶液の例としては、リン酸プロタミン、塩化プロタミン、硫酸プロタミン２、硫酸プロタミン３、硫酸プロタミン１０及びプロタミン遊離塩基が挙げられる。
【０３１４】
本願において提供するデータは、フッ化炭素画像化試薬（例えば、式１〜１７、２０〜３７又は４０〜４１のいずれか１つの化合物）を用いて調製される自己送達可能なナノエマルジョンを示し、場合によってはブロック共重合体（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標））界面活性剤と一緒に、ＰＥＩ又は硫酸プロタミンを含む。細胞とある自己送達可能なナノエマルジョンとの単純な共インキュベーションは、移入試薬を必要とせずに、画像化に十分な細胞標識化をもたらす。
【０３１５】
細胞電気穿孔法も、フッ化炭素乳濁液粒子を細胞に送達するのに使用することができる。電気穿孔法は、標識化が極めて迅速なプロセスであり、移入剤の使用を必要としないという利点を有する。多数の細胞電気穿孔法が広範囲の細胞型に対して当分野で知られており、幾つかの市販電気穿孔機器が入手可能である（例えば、ＢＴＸ，Ｉｎｃ．、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｉｎｃ．、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．など）。電気穿孔法は、核酸、分子及び小粒子を細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで送達するのに使用される。磁気電気穿孔法（ｍａｇｎｅｔｏｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）は、細胞培養におけるＭＲＩに有効であることが示された（Ｗａｌｃｚａｋ  Ｐ．，Ｍａｇｎ  Ｒｅｓｏｎ  Ｍｅｄ．２００５．Ｏｃｔ；５４（４）：７６９〜７４）。米国仮特許出願第６０／７９２００３号に示されたデータは、細胞電気穿孔法が、線状ＰＦＰＥフッ化炭素乳濁液粒子を樹状細胞に送達するのに有効であり、同じ方法を用いて、幹細胞などの多数の他の食細胞及び非食細胞タイプをフッ化炭素標識するのに障壁がないことを示した。
【０３１６】
細胞を治療計画に使用する場合、注射、及び細胞を種々の臓器に移植する特別な装置の使用を含めて、種々の方法が細胞の送達に使用されてきた。本発明は、任意の特定の送達方法に拘束されない。本明細書に示すデータは、細胞が特定の部位に直接送達されるか、全身的に送達されるかにかかわらず、標識された細胞をモニターできることを示している。例えば、標識されたＤＣは、組織への直接的な局所的移植、又は静脈内注射後に、画像化することに成功し、Ｔ細胞は、腹腔内注射後に画像化された。細胞は、注射又は移植による対象への導入を容易にする送達装置に挿入することができる。かかる送達装置は、細胞及び流体をレシピエント対象の体に注射する管、例えばカテーテルを含み得る。好ましい一実施形態においては、管は、さらに、本開示の細胞を対象の所望の位置に導入することができる針、例えばシリンジを有する。細胞は、送達用に種々の異なる形態で調製することができる。例えば、細胞は、かかる送達装置に含まれるときに、溶液又はゲルに懸濁させることができ、又は支持マトリックスに埋め込むことができる。細胞は、本開示の細胞がその中で生存可能なままである、薬学的に許容される担体又は希釈剤と混合することができる。薬学的に許容される担体及び希釈剤としては、食塩水、緩衝水溶液、溶媒及び／又は分散媒が挙げられる。かかる担体及び希釈剤の使用は当分野で周知である。溶液は、好ましくは、無菌及び流体である。好ましくは、溶液は、製造及び貯蔵の条件下で安定であり、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの使用によって、細菌、真菌などの微生物の汚染作用に対して保護される。本開示の溶液は、本明細書に記載の細胞を薬学的に許容される担体又は希釈剤及び、必要に応じて、上に列挙した他の成分に組み入れ、続いてろ過滅菌によって調製することができる。
【０３１７】
４．核磁気共鳴技術
本明細書に記載のように、核磁気共鳴技術を使用して、標識細胞集団を検出することができる。「検出する」という用語は、標識された分子又は細胞の有無を、特に核磁気共鳴技術によって、確認する任意の試みを含むのに使用される。「検出する」という用語は、定量的測定及び２又は３次元画像生成を含めて、より高度な測定も含むものとする。例えば、ＭＲＩを使用して、かかる細胞の画像を作成することができる。多くの場合、標識された細胞は、生きている対象に投与することができる。細胞の投与後、対象のある一部又は対象全体をＭＲＩによって調べて、ＭＲＩデータセットを作成することができる。本明細書において使用される「データセット」という用語は、対象材料の磁気共鳴探査中に収集された生データ、収集パラメータ、並びに生データから加工、変換又は抽出された情報を含むものとする。生データとしては、自由誘導減衰、スピンエコー、誘発エコー及び／又はグラディエントエコーを含めて、ＭＲＩ／ＭＲＳによって得られる過渡的信号が挙げられる。加工された情報の例としては、対象材料の２次元又は３次元絵画的表現が挙げられる。加工された情報としては、強度画像、実像及び想像画像成分、並びに関連する位相マップ画像も挙げることができる。抽出された情報の別の例は、対象材料中の画像化試薬又は１９Ｆ信号の量又は濃度を表すスコアである。対象材料中の１９Ｆ信号の量、及び移植前の細胞１個当たりの画像化試薬の平均量の較正を使用することによって、対象材料中の細胞の絶対数を推定することができる。対象材料中に存在する１９Ｆ信号の量は、多数の方法で表すことができ、又は計算することができる。例えば、関心領域（ＲＯＩ）の１９Ｆ信号の平均信号ノイズ比（ＳＮＲ）を測定し、使用して、標識された細胞の存在量を計算することができる。ある実施形態においては、１９Ｆ信号の平均強度又はピクセル若しくはボクセル的合計を使用して、標識された細胞の存在量を計算することができる。このタイプのデータは、例えば、ひ臓、及び標識された細胞に特に関連する他の臓器などの対象の単一領域において、収集することができる。標識された細胞は、対象における以外の状況において調べることができる。培養中の標識された細胞を調べることが望ましい場合もある。ある実施形態においては、標識された細胞を組織試料若しくは組織培養物に適用することができ、又は組織試料若しくは組織培養物内で作製することができ、したがって、標識された細胞をその状況で画像化することもできる。例えば、移植すべき臓器、組織又は他の細胞材料を画像化試薬と接触させて、標識された細胞を対象におけるかかる移植片の移植前に作製することができる。
【０３１８】
一般に、本開示の標識化剤は、従来のＭＲＩ検出システム用に設計される。ＭＲＩの最も一般的な実施においては、対象材料に含まれる可動性の水の分子中の水素核（プロトン、１Ｈ）を観察する。本明細書に開示する標識を検出するために、代わりの核、すなわち１９Ｆを検出する。１９Ｆ  ＭＲＩは、１Ｈと比較してほんのわずか小さい固有の感度を有する。相対感度は約０．８３である。どちらも、＋１／２の核スピンを有する。１９Ｆの同位体自然存在比は１００％であり、１Ｈの場合の９９．９８５％に匹敵する。検出及び画像形成の背後にある物理的原理は、１Ｈと１９Ｆ  ＭＲＩの両方で同じである。対象材料は大きな静磁場中に置かれる。この場は、１Ｈ又は１９Ｆ核に付随する磁気モーメントを場の方向に沿って整列させる傾向がある。核は、核が共振によってエネルギーを吸収する場合に磁場強度に比例した特徴的な周波数であるラーモア周波数におけるパルス状高周波（ＲＦ）照射によって平衡から乱される。ＲＦを取り除くと、核は、受信アンテナにおいて過度電圧を誘導する。この過度電圧は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）信号を構成する。空間的情報は、大きな静的場に重ねられる磁場勾配の選択的印加によって、ＮＭＲ信号の周波数及び／又は位相の両方においてコードされる。過度電圧は、一般にデジタル化され、次いでこれらの信号は、例えばコンピュータを用いて処理されて、画像を生成する。
【０３１９】
一定磁場強度においては、１９Ｆのラーモア周波数は、１Ｈと比較してほんのわずか低い（約６％）。したがって、従来のＭＲＩスキャナーのハードウェアとソフトウェアの両方を改作して、１９Ｆデータを取得することが簡単である。１９Ｆの検出は、ＭＲＩ、ＭＲＳ、他の技術などの異なるタイプの磁気共鳴スキャンと組み合わせることができる。典型的には、１Ｈ  ＭＲＩ画像を得て、１９Ｆ画像と比較することが望ましい。生きている生物体又は他の生体組織においては、プロトンＭＲＩは、対象材料の画像を与え、１９Ｆ画像において検出される標識された細胞の解剖学的状況を明確にすることができる。本開示の好ましい一実施形態においては、データを同一セッション中に１９Ｆと１Ｈの両方で収集する。２つのデータセットが空間的により確実に重なるように、これらの取得中には対象を移動させない。通常、１９Ｆと１Ｈのデータセットは、どの順でも逐次的に取得される。１９Ｆと１Ｈのラーモア周波数から電気的に調整されるＲＦコイル（すなわち、アンテナ）を構築することができる。これら２つの周波数間の調整は、（例えば、電気機械的可変コンデンサ又は誘導子によって）手動で、又は能動電子回路によって電気的に、実施することができる。あるいは、ＭＲＩ機器のハードウェア及び／又はソフトウェアを適切に改変して、両方のデータセットを同時に取得して、例えば、画像化時間を節約することができる。１９Ｆと１Ｈデータセットの同時取得は、１９Ｆと１Ｈのラーモア周波数に電気的に同時に調整することができるＲＦコイル又はアンテナを必要とする（すなわち、複同調コイル）。あるいは、ＲＦコイルは、両方のラーモア周波数（すなわち、１９Ｆと１Ｈ）を網羅する広範囲に調整された１つの電気共振を有する「広帯域」とすることができる。蛍光検出などの他の画像化技術を１９Ｆ  ＭＲＩと組み合わせることができる。これは、フッ化炭素画像化試薬が、蛍光成分を用いて誘導体化された場合に特に望ましい。別の実施形態においては、１９Ｆ  ＭＲＩスキャンは、本明細書に記載の二重モデル放射性１８Ｆ／１９Ｆフッ化炭素標識化試薬を用いることによって、同じ対象又は患者においてＰＥＴスキャンと組み合わせることができる。
【０３２０】
ＭＲＩ検査は、当分野で公知である任意の適切な方法に従って実施することができる。多数の異なるタイプのＭＲＩパルス系列、又はデータ収集を調整するためにＭＲＩ装置によって使用される指令のセット、及び信号処理技術（例えば、フーリエ変換及び投影再構成）は、画像データを収集及び処理するために長年にわたって開発されてきた（例えば、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｄ．Ｄ．Ｓｔａｒｋ  ａｎｄ  Ｗ．Ｇ．Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｍｏｓｂｙ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ  １９９９参照。）。この開示の試薬及び方法は、任意の特定の画像化パルス系列、又は生のＮＭＲ信号の処理方法に拘束されない。例えば、この開示を適用することができるＭＲＩ方法は、スピンエコー、誘発エコー、グラディエントエコー、自由誘導減衰に基づく画像化、及びその任意の組合せを広く包含する。ｋ空間中の１本を超えるライン、又はｋ空間の大きいセグメントが各励起信号から取得される高速画像化技術も、１９Ｆ（又は１Ｈ）データの取得に極めて適している。高速画像化技術の例としては、高速スピンエコー手法（例えば、ＦＳＥ、ターボＳＥ、ＴＳＥ、ＲＡＲＥ又はＨＡＳＴＥ）、エコープラナー法（ＥＰＩ）、複合グラディエントエコー・スピンエコー技術（例えば、ＧＲＡＳＥ）、スパイラルイメージング、及びバーストイメージングが挙げられる。新しい改善されたパルス系列及び信号処理方法の開発は、絶えず進歩している分野であり、当業者は、その解剖学的状況における１９Ｆ標識された細胞を画像化する複数の方法を考案することができる。
【０３２１】
核磁気共鳴技術の別の例として、ＭＲＳを使用して、局所的な組織又は臓器におけるフッ化炭素で標識された細胞の存在を検出することができる。通常、ＭＲＳ法は、従来のＭＲＩスキャナーを用いて実施される。局所的な関心体積（ＶＯＩ）は、従来の解剖学的１Ｈ  ＭＲＩスキャン内で規定されることが多い。続いて、ＶＯＩ内で観察された１９Ｆ  ＮＭＲ信号の大きさは、標識細胞数、及び／又は組織若しくは臓器中に存在する細胞１個当たりのＰＦＰＥの平均濃度に直接関連する。はるかに大きい対象内のＶＯＩを分離する方法は当分野で周知である（例えば、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，Ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｄ．Ｄ．Ｓｔａｒｋ  ａｎｄ  Ｗ．Ｇ．Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｍｏｓｂｙ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ  １９９９参照）。例としては、ＶＯＩ近くの局在型ＲＦ表面コイル、表面スポイリング、表面コイルＢ１勾配法、スライス選択的Ｂ０勾配技術、ＳＴＥＡＭ、ＰＲＥＳＳ、画像選択的ｉｎ  ｖｉｖｏ分光法（ＩＳＩＳ）、及び磁気共鳴分光イメージング（ＭＲＳＩ）の使用が挙げられる。新しい改善されたパルス系列及び信号処理方法の開発は、ＭＲＳでは絶えず進歩しており、当業者は、ＶＯＩ中のフッ化炭素標識された細胞から生ずる１９Ｆ  ＮＭＲ信号を検出する複数の方法を考案することができる。
【０３２２】
ある実施形態においては、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、又はＲＯＩ内の対象材料中で、標識細胞数を定量化する方法を提供する。ＲＯＩとしては、対象におけるすべての標識された細胞、又はすい臓などの特定の臓器、リンパ節などの特定の組織、若しくは検出可能なＭＲＩ／ＭＲＳ１９Ｆ信号を示す任意の領域若しくは１個以上のボクセルにおける標識された細胞を挙げることができる。ＲＯＩは、特定の実験を除いては不明確な領域であり得る。本明細書に記載のように、標識された細胞を対象材料中又はｉｎ  ｖｉｖｏで定量化することができる幾つかの方法がある。
【０３２３】
特定の細胞集団の移植前の１９Ｆ標識化剤の平均「細胞用量」を較正することは、対象材料又は患者における定量的細胞測定の必要条件であることが多い。細胞型が異なると、標識化剤をｉｎ  ｖｉｔｒｏで吸収する固有の能力が異なり、したがって標識化剤の細胞用量も変動すると予測される。さらに、異なる出所（例えば、異なる患者）から得られた同じタイプの異なる細胞は、標識化剤に対する親和性が異なり得る。したがって、細胞用量の較正が必要であり得る。この較正を使用して、最初に、標識化プロトコル（すなわち、インキュベーション条件、細胞を標識化フッ化炭素乳濁液と一緒にインキュベートする期間、標識化中の培地中のフッ化炭素乳濁液の濃度など）を変更して、標識された細胞が画像化すべき対象において実際に使用される前にある範囲の細胞用量を得ることができる。あるいは、標識化条件及びプロトコルを固定することができ、画像化すべき対象におけるその後の定量化のために、細胞１個当たりの標識された平均値１９Ｆをそのままの状態で測定することができる。ある実施形態においては、標識細胞集団の細胞１個当たりの平均１９Ｆ分子（Ｆ）数を、細胞を対象又は患者に投与する前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定（すなわち、較正）する。ある実施形態においては、標識細胞集団の細胞１個当たりの平均１９Ｆ分子（Ｆ）数は、必ずしも患者向けではないが、特定の標識化プロトコル又は一組の条件の結果として標識化剤の細胞用量の較正に使用される、特定のタイプの試験細胞集団において較正される。場合によっては、細胞用量の値は、次いで、同じ細胞集団タイプにおいて、同じ標識化プロトコルを用いて、その後の標識化及びｉｎ  ｖｉｖｏ画像化実験に使用される。
【０３２４】
標識化剤の細胞用量は、種々の定量技術を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することができる。例えば、標識細胞数が既知の細胞ペレット、細胞懸濁液又は細胞溶解物から得られる１次元（１Ｄ）１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルを使用することができる。このスペクトルから、細胞に会合した標識化試薬から生ずる１９Ｆスペクトル又はその一部の積分面積を計算することができる。１９Ｆスペクトルの積分面積は、Ｓｃｅｌｌｓと表記され、細胞ペレット、懸濁液又は溶解物中の１９Ｆの総量に正比例する。１９Ｆ核の絶対数を測定するために、測定されたＳｃｅｌｌｓを１９Ｆ標準に対して正規化することができる。１９Ｆ標準は、例えば、既知の体積及び濃度のフルオロケミカルの溶液とすることができ、Ｆｓｔａｎと表記される標準中の１９Ｆ核の総数を計算することができる。理想的には、適切なフルオロケミカル基準は、好ましくは単一の狭い共鳴を有する（例えば、トリフルオロ酢酸、すなわちＴＦＡ）、単純な１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルを有し、場合によっては標識化フッ化炭素とはかなり異なる１９Ｆ化学シフトを有する。１９Ｆ標準は、測定される標識細胞材料と同じＮＭＲ管中に入れることができ、別の管に入れることができ、又は場合によっては、同じＮＭＲ機器を用いて別の実験で測定することができる。次いで、Ｓｓｔａｎと表記される１９Ｆ標準からのスペクトルの積分面積を測定することができる。続いて、Ｆｃと表記される標識された細胞１個当たりの平均１９Ｆ数を、例えば次式を用いて、計算することができる。
【０３２５】
【数３】
0005645658.tif 000071
式中、Ｎｃｅｌｌｓは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験試料に含まれる標識された細胞の数である。１９Ｆ及び他の核の定量的ＮＭＲ法は、当分野では周知であり、当業者は、上記細胞用量較正手順の多数の変形を考案することができる。１９Ｆ  ＮＭＲに加えて、標識化試薬の細胞用量の測定に使用することができる別の定量方法がある。例えば、試薬は、蛍光、発光、光学又は放射性的に標識することができる。
【０３２６】
１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータセットから標識された細胞の正確な定量化を引き出すために、追加の較正及び標準を使用することができる。例えば、標識された細胞を含む対象材料の実際の１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳスキャン中に、較正済み外部１９Ｆ基準（すなわち、ファントム）を使用することができる。較正されたファントムの画像強度を、１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータセットを解析するときに使用して、対象材料又は患者を調べるときの１９Ｆ核数の絶対的な標準を証明する。較正されたファントムを使用して、画像化すべき特定の対象が装填された特定のＭＲＩ／ＭＲＳシステムの感度を正規化する。１９Ｆ基準は、例えば、既知濃度の１９Ｆ核の溶液を含む１個以上の容器であり得る。好ましい実施形態においては、溶液は、希薄な濃度の乳化されたフッ化炭素標識化試薬を含む。場合によっては、溶液は、例えば適切な溶媒で希釈された、乳化されていないフッ化炭素標識化試薬、ゲル又は液体を含む。場合によっては、溶液は、理想的には単純な１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルを有し、好ましくは単一の狭いＮＭＲ共鳴を有する、別のフルオロケミカルで構成することができる（例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）又はトリフルオロアセトアミド（ＴＦＭ）及び他のフッ素化酸、トリフルオロトルエン又はトリフルオロエタノール）。好ましい実施形態においては、基準溶液のＴ１及びＴ２値は、標識化試薬のそれに類似している。場合によっては、溶液は、パーフルオロカーボン標識された細胞又はその溶解物を含むことができる。非細胞の基準は、より長い貯蔵時間の利点を有する。場合によっては、溶液は、ゲルの形態を取ることができる。溶液を含む容器は、好ましくは密封することができ、種々の形状を取ることができる。好ましい容器形状としては、楕円、円柱、球及び平行六面体形状が挙げられる。１９Ｆ基準溶液を含む１個以上の容器を対象材料の１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳ中に使用することができる。複数の１９Ｆ基準（すなわち容器）を使用する場合、それらは、同じ１９Ｆ濃度又は異なる濃度を含むことができ、後者の場合、理想的には段階的濃度のフルオロケミカルを含む。較正済み１９Ｆ基準容器（単数又は複数）の配置は、好ましくは、画像化対象又は患者の外部若しくは横に、又は場合によっては内部に、データ収集前に配置することができる。好ましい実施形態においては、基準は、同じ画像視野（ＦＯＶ）中の対象と一緒に、１９Ｆ  ＭＲＩを用いて画像化される。場合によっては、１９Ｆ  ＭＲＳデータを、基準において、逐次的に、又は対象データセットと並行して、取得する。場合によっては、基準からのデータは、別々のスキャンで取得されるＭＲＩ／ＭＲＳを用いて取得することができる。場合によっては、外部基準は、１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳ検査ごとに対象と一緒にスキャンされないが、ＭＲＩ／ＭＲＳを用いて取得される基準１９Ｆ信号強度の値は、類似の対象又は模擬の対象のスキャンから使用される。所与の１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳスキャンにおいては、較正済み１９Ｆ標準は、１個以上のボクセルによってサンプル採取することができる。ボクセルによって生成される観察可能な１９Ｆ強度は、溶液（又はゲル）中のフルオロケミカルの濃度、及びボクセル体積に比例し得る。１９Ｆ  ＭＲＩスキャンにおいては、比較基準は、多数のボクセルで構成されることが多い。比較基準における１個、数個又はすべてのボクセルの平均強度を計算することが多い。場合によっては、平均画像強度を、比較基準の１９Ｆ画像内の画定されたＲＯＩにわたって計算する。場合によっては、比較基準容器の物理的形状は、観察された１９Ｆ信号強度を規定するのに寄与する。例えば、１９Ｆ基準溶液を含む体積区画（単数又は複数）は、ボクセル体積よりも小さい。別の実施形態においては、較正済み外部基準は、既知の数の検出可能な１Ｈの１Ｈ信号強度を有する溶液に依拠する。この場合、対象材料中の１９Ｆ信号の感度は、１Ｈ較正済み標準を基準とする。理想的には、（上述した容器に含まれる）１Ｈ較正済み基準中の溶液又はゲルは、好ましくは単一の狭いＮＭＲ共鳴を有する（例えば、Ｈ２Ｏ又はＨ２Ｏ−Ｄ２Ｏ混合物）、単純な１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを生じる。異なる核を除いて、１Ｈ標準基準の使用は、１９Ｆ基準に対して上述した多数の他の点において同じである。場合によっては、較正済み比較基準は、任意の他のＭＲＩ／ＭＲＳ活性な核を含む。ある実施形態においては、基準は、１Ｈ  ＭＲＩ／ＭＲＳによって検出される内臓又は組織であり、データは、生でも、正規化されてもよい。別の実施形態においては、基準は、対象と一緒にスキャンされないが、患者体重、体腔サイズなどの関連する要因によって較正された標準である。
【０３２７】
１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータセットからの２つ以上の重要なパラメータセットを計算的に操作又は組み合わせることによって、本明細書に記載のようにＲＯＩ中に存在する標識細胞数を計算することができる。例えば、重要なパラメータセットとしては、（ｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された標識化剤の細胞用量（すなわち、Ｆｃ）、（ｉｉ）標識された細胞の投与後の１つ以上の時点において対象において採集されたｉｎ  ｖｉｖｏ  １９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータセット、（ｉｉｉ）ボクセル体積、（ｉｖ）面内のボクセル面積（すなわち、画像ピクセルの面積）、（ｖ）場合によっては、１９Ｆ比較基準からのＭＲＩ／ＭＲＳデータセット、（ｖｉ）場合によっては、対象材料における１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータの測定ジョンソン雑音、（ｖｉｉ）場合によっては、対象材料における１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータセットの１個以上のボクセルの測定信号ノイズ比（ＳＮＲ）、（ｖｉｉｉ）場合によっては、比較基準からの１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータセットの１個以上のボクセルの測定ＳＮＲ、（ｉｘ）場合によっては、対象材料の１９Ｆ  ＮＭＲ緩和時間（Ｔ１、Ｔ２及びＴ２＊）、（ｘ）場合によっては、比較基準の１９Ｆ  ＮＭＲ緩和時間（Ｔ１、Ｔ２及びＴ２＊）を挙げることができる（例えば、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｃｈａｐｔｅｒ  ４，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｄ．Ｄ．Ｓｔａｒｋ  ａｎｄ  Ｗ．Ｇ．Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｍｏｓｂｙ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ  １９９９参照）。当業者は、標識細胞数をｉｎ  ｓｉｔｕで定量化するのに使用することができる、他のパラメータ、上記セットの組合せ、又はその派生物、特に１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータセットからの派生物を誘導することができる。ある実施形態においては、上記の重要なパラメータセットを使用して、測定された標識細胞数の確度又は信頼度の定量的又は統計学的尺度を誘導することができる。
【０３２８】
重要なパラメータ（上記ｉ〜ｘ）、これらの任意のサブセット、又はその組合せ若しくは近似のいずれかを組み合わせて、Ｎｃで示される、対象材料中の１９Ｆ  ＭＲＩによって見られる有効標識細胞数を推定する多数の方法がある。例えば、次式を使用することができる。
【０３２９】
【数４】
0005645658.tif 000072
式中、Ｎｃ＝ＲＯＩ中の全標識細胞数；［ＦＲ］＝較正済み１９Ｆ基準溶液（又はゲル）の１９Ｆ濃度；ｖ＝ボクセル体積；ＩＲ＝ＭＲＩ／ＭＲＳスキャンによって収集され、１個以上のボクセルにわたって平均された、較正済み１９Ｆ基準の平均強度；Ｆｃ＝ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された標識化剤の平均１９Ｆ細胞用量；ＮＲＯＩ＝標識された細胞を含むＲＯＩ中のボクセル数；Ｉｃ（ｉ）＝標識された細胞を含むＲＯＩ中のｉ番目のボクセルの画像強度；ｉ＝標識された細胞を含むＲＯＩ中のボクセルの単位のない指数である。
【０３３０】
１９ＦデータセットからＮｃを近似する多数の方法もある。例えば、次式を使用することができる。
【０３３１】
【数５】
0005645658.tif 000073
式中、Ｉｃａｖｇは、標識された細胞を含むＲＯＩの平均強度（すなわち、ＮＲＯＩボクセルの平均強度）である。別の例として、
【０３３２】
【数６】
0005645658.tif 000074
を使用することができる。式中、Ｖｃは、標識された細胞を含むＲＯＩの総体積である。更なる例として、
【０３３３】
【数７】
0005645658.tif 000075
を使用することができる。式中、ＶＲは、１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳにおける基準の有効体積であり、ＮＲは、ＶＲにおける数１９Ｆ核である。上式のすべてにおいて、種々の強度（すなわち、ＩＲ、Ｉｃａｖｇ、Ｉｃ（ｉ））は画像ノイズに対して正規化することができ、したがって、上式は、特定の領域に対する適切なＳＮＲ値の点で同等に表現できることに留意されたい。したがって、標識細胞数Ｎｃを推定する多数の方法があり、これらの基本式の多数の類似の形を基本的数学的操作によって誘導することができる。しかし、すべては、（ｉ〜ｘ）によって記述される入力パラメータに含まれる同じ基本的内容に依拠する。さらに、ＲＯＩ中の標識された細胞の定量化を絶対数又は有効細胞数の面から表す必要はない。ＲＯＩ中の細胞量を示す別の定量的指数を誘導することができる。例えば、比Ｉｃａｖｇ／ＩＲ、又はＲＯＩ及び基準中で観察された平均ＳＮＲ値の比を計算することができる。これらのすべては、上式及び／又はパラメータのサブセットに含まれる。
【０３３４】
細胞数及び関連する指数の上記分析は、フッ化炭素標識の１９Ｆ  ＮＭＲ緩和時間（すなわち、特にＴ１及び／又はＴ２）が較正済み１９Ｆ比較基準中の材料とほぼ同じであると仮定することに注意されたい。緩和時間が類似していない場合、当業者は、Ｔ１とＴ２で表現される、使用する特定の画像化プロトコルの公知のＭＲＩ強度式を使用することによって、これを容易に補正することができる。
【０３３５】
場合によっては、対象材料の１９Ｆ  ＭＲＩデータセットは、（上述したように）実際の細胞定量化計算を実施する前に、後処理にかけることができる。例えば、後処理アルゴリズムとしては、１９Ｆデータセットの「ノイズ除去」を挙げることができる。これは、例えば、画像のしきい値を設定して低強度ノイズを切り離すことによって実施することができる。これは、低値がゼロに設定されるように画像強度を変更することを含む。強度ＭＲＩ画像では、無作為なジョンソン雑音が画像ＦＯＶ全体にわたって明瞭であり、均一に分布することが多い。真の信号を含まない（すなわち、１９Ｆ及び／又は１Ｈ核がない）ことが知られている領域がゼロ又は極めてゼロに近い強度を有するように見えるように、しきい値未満の低レベル画像強度を除去できることは当分野では周知である。このプロセスは、その目的に限って（すなわち「手作業で」又は目視検査によって）、又はコンピュータアルゴリズムを使用することによって、実施することができる。別の実施形態においては、データセットのノイズ除去は、別のアルゴリズムを使用することによって、例えばウェーブレット解析を使用することによって、実施することができ、多数の方法が画像ノイズ除去のために当分野で公知である。以下の参考文献をその全体を本明細書に援用する：Ｋｈａｒｅ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＷＡＶＥＬＥＴＳ  ＭＵＬＴＩＲＥＳＯＬＵＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ，３（４）：４７７〜４９６  ＤＥＣ  ２００５；Ｃｒｕｚ−Ｅｎｒｉｑｕｅｚ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，ＩＭＡＧＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＡＮＤ  ＲＥＣＯＧＮＩＴＩＯＮ，３６５６：２４７〜２５４  ２００５；Ａｗａｔｅ，ＳＰ．，ｅｔ  ａｌ．，ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ  ＩＮ  ＭＥＤＩＣＡＬ  ＩＭＡＧＩＮＧ，ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ，３５６５：６７７〜６８８  ２００５；Ｇａｎｅｓａｎ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，ＩＩＥ  ＴＲＡＮＳＡＣＴＩＯＮＳ，３６（９）：７８７〜８０６  ＳＥＰ  ２００４；Ｓｃｈｅｕｎｄｅｒｓ，Ｐ．，ＩＥＥＥ  ＴＲＡＮＳＡＣＴＩＯＮＳ  ＯＮ  ＩＭＡＧＥ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ，１３（４）：４７５〜４８３  ＡＰＲ  ２００４；Ｇｈｕｇｒｅ，ＮＲ．，ＭＡＧＮＥＴＩＣ  ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ  ＩＭＡＧＩＮＧ，２１（８）：９１３〜９２１  ＯＣＴ  ２００３；Ｂａｏ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，ＩＥＥＥ  ＴＲＡＮＳＡＣＴＩＯＮＳ  ＯＮ  ＭＥＤＩＣＡＬ  ＩＭＡＧＩＮＧ，２２（９）：１０８９〜１０９９  ＳＥＰ  ２００３；Ｗｕ，ＺＱ．，ｅｔ  ａｌ．，ＥＬＥＣＴＲＯＮＩＣＳ  ＬＥＴＴＥＲＳ，３９（７）：６０３〜６０５  ＡＰＲ  ３  ２００３；ＬａＣｏｎｔｅ，ＳＭ．，ｅｔ  ａｌ．，ＭＡＧＮＥＴＩＣ  ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ  ＩＮ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，４４（５）：７４６〜７５７  ＮＯＶ  ２０００；Ｌａｉｎｅ，ＡＦ．，ＡＮＮＵＡＬ  ＲＥＶＩＥＷ  ＯＦ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ，２：５１１〜５５０  ２０００；Ｚａｒｏｕｂｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＭＡＧＮＥＴＩＣ  ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ  ＩＭＡＧＩＮＧ，１８（１）：５９〜６８  ＪＡＮ  ２０００；Ｎｏｗａｋ，ＲＤ．，ＩＥＥＥ  Ｔ��ＡＮＳＡＣＴＩＯＮＳ  ＯＮ  ＩＭＡＧＥ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ，８（１０）：１４０８〜１４１９  ＯＣＴ  １９９９；及びＨｅａｌｙ，ＤＭ．，ｅｔ  ａｌ．，ＡＮＮＡＬＳ  ＯＦ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ，２３（５）：６３７〜６６５  ＳＥＰ−ＯＣＴ  １９９５。
【０３３６】
ゼロフィリング（Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒａｙ  Ｆｒｅｅｍａｎ，Ａｄｄｉｓｏｎ  Ｗｅｓｌｅｙ  Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）、種々の画像補間、ノイズ除去及び画像平滑化アルゴリズム（例えば、Ｔｈｅ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｃ．Ｒｕｓｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ／ＩＥＥＥ  Ｐｒｅｓｓ参照）など、定量化前後の１９Ｆ  ＭＲＩデータセットに適用することができる別のタイプの後処理アルゴリズムが当分野では公知である。
【０３３７】
ある実施形態においては、上記の重要なパラメータセット（ｉ〜ｘ）を使用して、測定された標識細胞数又は関連する指数の確度又は信頼度の定量的又は統計学的尺度を誘導することができる。１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータセットは、ＲＯＩ内のＳＮＲ制限を受けることが多く、したがって、測定の信頼度又は確度の測定規準（ｍｅｔｒｉｃ）を計算することが有用であることが多い。多数の方法が、ＭＲＩ及び他の生物医学的タイプの画像の統計解析のために当分野で公知である。主張する実施形態は、これらの公知の方法を包含すると理解される。
【０３３８】
５．コンピュータ方法
標識された細胞を定量化する方法は、典型的には、かかる定量化の目的で設計されたソフトウェアを動作させることができるコンピュータを用いて実施される。かかるソフトウェアは、独立型プログラムとすることができ、又はＭＲＩ画像処理ソフトウェアなどの別のソフトウェアに組み込むことができる。図５３は、本開示の説明のための一実施形態によるコンピュータの機能を実施するための汎用コンピュータシステム２００の機能ブロック図である。例示的なコンピュータシステム２００は、中央処理装置（ＣＰＵ）２０２、メモリ２０４、及び相互接続バス２０６を備える。ＣＰＵ２０２は、単一のマイクロプロセッサ、又はコンピュータシステム２００をマルチプロセッサシステムとして構成するための複数のマイクロプロセッサを備えることができる。メモリ２０４は、説明上、メインメモリ及び読み出し専用メモリを備える。コンピュータ２００は、例えば、種々のディスクドライブ、テープドライブなどを有する、大容量記憶装置２０８も備える。メインメモリ２０４は、ダイナミックランダムアクセスメモリ（ＤＲＡＭ）及び高速キャッシュメモリも備える。動作中、メインメモリ２０４は、ＣＰＵ２０２による実行のための命令及びデータの少なくとも一部を保存する。
【０３３９】
大容量記憶装置２０８は、ＣＰＵ２０２によって使用されるデータ及び命令を保存するために、１つ以上の磁気ディスク又はテープドライブ又は光ディスクドライブを備えることができる。好ましくはディスクドライブ又はテープドライブの形の、大容量記憶システム２０８の少なくとも１つのコンポーネントは、本開示の細胞定量化の処理に使用されるデータベースを保存する。大容量記憶システム２０８は、データ及びコードをコンピュータシステム２００に入力し、コンピュータシステム２００から出力するために、フロッピー（登録商標）ディスク、コンパクトディスク読み出し専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）、集積回路不揮発性メモリアダプタ（すなわち、ＰＣ−ＭＣＩＡアダプタ）などの種々の携帯用媒体のための１つ以上のドライブを備えることもできる。
【０３４０】
コンピュータシステム２００は、ネットワーク２１２を介したデータ通信用インターフェース２１０として、例として示す、１つ以上の通信用入／出力インターフェースを備えることもできる。データインターフェース２１０は、モデム、イーサネット（登録商標）カード又は任意の他の適切なデータ通信装置とすることができる。コンピュータの機能を提供するために、データインターフェース２１０は、イントラネット、インターネット（ｉｎｔｅｒｎｅｔ）、又はインターネット（ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ）などのネットワーク２１２に、直接的に、又は別の外部インターフェースを介して、比較的高速なリンクを提供することができる。ネットワーク２１２との通信リンクは、例えば、光、有線又は無線（例えば、衛星又はセル方式ネットワーク）とすることができる。あるいは、コンピュータシステム２００は、ネットワーク２１２を介してウェブに基づく通信が可能であるメインフレーム又は別のタイプのホストコンピュータシステムを備えることができる。
【０３４１】
コンピュータシステム２００は、適切な入／出力ポートも備え、又はプログラミング及び／又はデータ検索目的でローカルユーザインターフェースとして働くローカルディスプレイ２１６、キーボード２１４などとの相互接続用相互接続バス２０６を使用する。あるいは、サーバ操作者は、遠隔端末装置からネットワーク２１２を介してシステムを制御及び／又はプログラミングするためにシステム２００と対話することができる。
【０３４２】
コンピュータシステム２００は、種々のアプリケーションプログラムを実行することができ、関連データを大容量記憶システム２０８のデータベースに保存することができる。１つ以上のかかるアプリケーションは、メッセージの受取及び送達を可能にして、定量化に関係するサーバ機能を実行するために、サーバとしての動作を可能にする。
【０３４３】
コンピュータシステム２００に含まれるコンポーネントは、サーバ、ワークステーション、パーソナルコンピュータ、ネットワーク端末などとして使用される汎用コンピュータシステムに典型的に見られるコンポーネントである。実際に、これらのコンポーネントは、当分野で周知である広範なかかるコンピュータコンポーネントであるものとする。本開示のある態様は、定量化システムのサーバ機能のための実行コードおよびデータベースなどのソフトウェアエレメントに関係し得る。
【０３４４】
本開示は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解される。以下の実施例は、本願のある態様及び実施形態の単なる説明のためのものであって、本開示を限定することを意図したものではない。
【実施例】
【０３４５】
国際公開第２００５０７２７８０号に示されたデータは、免疫細胞及び他の細胞型の細胞をフッ化炭素画像化試薬を用いてｅｘ  ｖｉｖｏで容易に標識することができ、標識された細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで検出できることを示した。米国仮特許出願第６０／７９２００３号に示されたデータは、標識された細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ定量化を立証するデータを含めて、開示された方法の更なる実行可能性がもたらされることを示した。本開示の例示的な実施形態は、新規の画像化試薬及び乳濁液を開発し、組織培養におけるその有効性を評価する。
【０３４６】
１．画像化試薬調製
ＰＦＰＥ誘導体化及びナノエマルジョン調製物の単純で極めて効率的で拡大可能な合成方法を示す。ＰＦＰＥエステル３９は、二重蛍光性１９Ｆ  ＭＲＩ試薬、自己送達可能なＰＦＰＥナノ粒子、及び食細胞と非食細胞の両方のタイプにおいて効率の高い取り込みを示すナノ粒子を含めて、種々のナノ粒子の合成のための用途の広い出発材料であることが判明した。細胞内取り込みを促進する乳濁液、及び血清安定性をおそらく増進する乳濁液を示す。製造された乳濁液は、貯蔵温度（４及び２５℃）及び体温（３７℃）で極めて安定であった。乳化プロセスの単純な変更、及びＰＦＰＥ末端基の単純な化学修飾によって、具体的用途に対してナノ粒子の諸性質を微調整することができる。乳濁液安定剤又は結合部位の両方として働き得る種々のアミドに対するＰＦＰＥ末端基の化学修飾の例を示す。
【０３４７】
対称ＰＦＰＥジアミドの合成：
一般に、スキーム１に明示したように、ＰＦＰＥメチルエステルオイル（３９）を過剰のアミン（純粋な液体、又は適切な溶媒中のアミン溶液）と、不活性雰囲気（アルゴン又は窒素）下で室温で混合した。反応物をアミンの反応性に応じて１〜３日間撹拌して、完全に転化させた。アミンを固体として添加したときには、トリフルオロトルエン又はトリフルオロエタノールを溶媒として使用し、アミンの反応性に応じて温度を４０、５０、６０又は７０℃に上昇させた（スキーム２）。メチルエステルピークの消失を１Ｈ  ＮＭＲでモニターすることによって反応の進行を追跡した（図４５）。反応終了後、高真空を使用して、生成したメタノール及び過剰の未反応アミンを除去した。不揮発性アミンを使用したときには、酸性水溶液洗浄を使用して、過剰のアミンを抽出し、所望のＰＦＰＥアミドを適切な溶媒で抽出した。選択的有機溶媒抽出による線状ＰＦＰＥの精製を記載した、最近特許化された手順（米国特許第７，０３８，０６８Ｂ２号）を、ＰＦＰＥアミド誘導体の精製に使用した。有機溶媒抽出が不十分であるときには、フルオラス相シリカゲル（ＦｌｕｏｒｏＦｌａｓｈ、Ｆｌｕｏｒｏｕｓ  Ｉｎｃ．）への吸着と、メタノール、続いてトリフルオロエタノール又はペルフルオロヘキサンを用いた精製生成物の溶出とを使用した。ＰＦＰＥアミド誘導体の構造を１Ｈ、１３Ｃ、１９Ｆ  ＮＭＲ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって確認した。スキーム１に示すように、化合物１、２及び６をこの一般的手順に従って調製した。式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。
【０３４８】
スキーム１：
【０３４９】
【化４６】
0005645658.tif 000076
一般的実験手順
別段の記載がない限り、すべての反応を、炎にあてて乾燥させた丸底フラスコ中で窒素又はアルゴン雰囲気下で実施した。すべての試薬及び溶媒をＡｌｄｒｉｃｈ、Ａｃｒｏｓ、ＴＣＩ又はＬａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓから購入し、更に精製せずに使用した。ＴＨＦ及びＤＭＦは、無水グレードを購入し、更に精製せずに使用した。別段の記載がない限り、１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ３００を用いて、ＣＤＣｌ３中、３００及び７５ＭＨｚで得られた。化学シフトは、残留溶媒信号を内部標準として使用して、百万分率（ｐｐｍ）で記録された。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを以下のように表にした：化学シフト、多重度（ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｑｎ＝五重項、ｍ＝多重線、ｂ＝ブロード）、プロトン数、及び結合定数（群）。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、プロトンデカップリングされたパルス系列を用いて、パルス系列遅延５秒で得られた。１９Ｆ  ＮＭＲは、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ５００を用いて４７０ＭＨｚで水又はアセトン中で得られた。化学シフトは、トリフルオロ酢酸を内部標準として用いて百万分率（ｐｐｍ）として記録された。１９Ｆの化学シフトは−７６．０ｐｐｍであった。低分解能及び高分解能質量スペクトル（それぞれＭＳ及びＨＲＭＳ）は、ペンタフルオロ安息香酸マトリックスを用いたマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）（Ｍａｒｉｅ，Ａ．；Ａｌｖｅｓ，Ｓ．；Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｆ．；Ｔａｂｅｔ，Ｊ．Ｃ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００３），７５，１２９４〜１２９９）、及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７００  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ−ＭＳによって陽イオンモードで得られた。
【０３５０】
【化４７】
0005645658.tif 000077
ペルフルオロポリエーテルジエチルアミド（１）。一般的手順Ａ、低沸点アミンとのＰＦＰＥのカップリング：文献手順を大規模に変更して使用した（Ｐｉａｃｅｎｔｉ，Ｆ．；Ｃａｍａｉｔｉ，Ｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９４），６８，２２７〜２３５）。ペルフルオロポリエーテルメチルエステル３９（８１．０ｇ、５０ｍＬ、４６．３ｍｍｏｌ、Ａｖｅ  ＭＷ＝１７５０）とジエチルアミン（８１．３ｇ、１１５ｍＬ、１．１ｍｏｌ）を丸底フラスコ（５００ｍＬ）中でアルゴン雰囲気下で混合し、室温で７２時間撹拌した。過剰のアミン、及び反応中に生成したメタノールを減圧除去した。生じた褐色オイルをＴＨＦ（２００ｍＬ）で洗浄し、オイルとＴＨＦ相を分離させた。下相を収集し、残留溶媒を減圧除去して、精製ペルフルオロポリエーテルジエチルアミド１（７３．１ｇ、４５ｍＬ、３９．５ｍｍｏｌ、８５％）を黄色からオレンジ色の透明なオイルとして得た：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ６−アセトン）  δ  ＣＨ２  ３．５７−３．４２（４Ｈ、ｍ）、ＣＨ２  ２．８５−２．７５（４Ｈ、ｍ）、ＣＨ３  １．２７−１．９０（６Ｈ、ｍ）、ＣＨ３  １．２２−１．１（６Ｈ、ｍ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ｄ３−トリフルオロエタノール）  δ  Ｃ＝Ｏ  １５９．２（ｔ、ＪＣ−Ｆ＝３２Ｈｚ）、ＯＣＦ２  １２０．２（ｔ、ＪＣ−Ｆ＝４８Ｈｚ）、ＯＣＦ２ＣＦ２  １１６．３（ｔ、ＪＣ−Ｆ＝４４Ｈｚ）、ＣＦ２Ｏ  １１２．５（ｔ、ＪＣ−Ｆ＝４８Ｈｚ）、ＣＨ２  ４４．１、ＣＨ２  ４３．８、ＣＨ３  １４．０、ＣＨ３  １２．１；１９Ｆ（５００ＭＨｚ、基準ＴＦＡ  −７６．０）  ＯＣＦ３  −５８．４、ＯＣＦ２ＮＥｔ２  −７４．４、（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）  −９１．１；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、陽イオン）（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）１６  ２１９４．９０２２［Ｍ＋Ｎａ］＋、（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）１５  ２０７８．８９０４［Ｍ＋Ｎａ］＋、（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）１４  １９６２．９１０７［Ｍ＋Ｎａ］＋、（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）１３  １８４６．９３６４［Ｍ＋Ｎａ］＋、（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）１２  １７３０．９５７３［Ｍ＋Ｎａ］＋、（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）１１  １６１４．９８５１［Ｍ＋Ｎａ］＋、（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）１０  １４９９．０３０９［Ｍ＋Ｎａ］＋、（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）９  １４９９．０３０９［Ｍ＋Ｎａ］＋、（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）８  １３８３．０５３７［Ｍ＋Ｎａ］＋、（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）７  １２６７．０７９９［Ｍ＋Ｎａ］＋、（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）６  １１５１．１０３０［Ｍ＋Ｎａ］＋、（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）５  １０３５．１２６８［Ｍ＋Ｎａ］＋。主モノマー繰り返しのみを示す。質量分析データは、長さの異なるＰＦＰＥ線状分子の分布を示す（図５０）。
【０３５１】
【化４８】
0005645658.tif 000078
ペルフルオロポリエーテルＯ−（２−ヒドロキシエチル）エタノールアミド（２）。一般的手順Ａを幾つか変更して使用した。２−（２−アミノエトキシ）エタノール（２．２ｇ、２０．９ｍｍｏｌ）をトリエチルアミン（４．２ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）と室温で丸底フラスコ（１００ｍＬ）中でアルゴン雰囲気下で混合した。ペルフルオロポリエーテルメチルエステル３９（１７．５ｇ、１０．８ｍＬ、１０ｍｍｏｌ、Ａｖｅ  ＭＷ＝１７５０）を添加した。反応混合物はすぐに透明褐色になり、その温度は４０℃に上昇する。反応混合物を室温に冷却し、撹拌を４８時間続ける。過剰のトリエチルアミン、及び反応中に生成したメタノールを減圧除去した。粗製反応生成物をＦｌｕｏｒｏ  Ｆｌａｓｈ短カラム（２０ｇ）に充填し、アセトニトリル５０ｍＬで洗浄した。メタノール（１００ｍＬ）で溶出させ、減圧濃縮して、平均ＭＷ１８９５のペルフルオロポリエーテルＯ−（２−ヒドロキシエチル）エタノールアミド２（１１．１ｇ、５．９ｍｍｏｌ、５９％）を暗黄色オイルとして得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ６−アセトン）δ  ＮＨ  ８．５５（２Ｈ、一重線）、ＯＣＨ２  ３．６２（８Ｈ、ｔ、ＪＨ−Ｈ＝５．１Ｈｚ）、ＣＨ２Ｎ  ３．５３（８Ｈ、ｔ、ＪＨ−Ｈ＝４．８Ｈｚ）、ＯＨ  ３．３０（２Ｈ、一重線）；１９Ｆ（４７０ＭＨｚ、基準ＴＦＡ  −７６．０）ＯＣＦ２ＣＯＮＨＣＨ２  −７８．８、（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）−８９．５。
【０３５２】
【化４９】
0005645658.tif 000079
ペルフルオロプリエーテルチラミド（６）。一般的手順Ｂ、固体及び高沸点液体としてのアミンとのＰＦＰＥのカップリング。４−（２−アミノエチル）フェノール（０．８ｇ、６．０ｍｍｏｌ）をクロロホルム（２５ｍＬ）に丸底フラスコ（１００ｍＬ）中で溶解させ、トリエチルアミン（０．９ｇ、１．２ｍＬ、８．６ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で室温で撹拌しながら添加した。ペルフルオロポリエーテルメチルエステル３９（５．０ｇ、３．１ｍＬ、２．９ｍｍｏｌ、Ａｖｅ  ＭＷ＝１７５０）を直ちに添加し、反応混合物を室温で７２時間撹拌した。過剰のトリエチルアミン、及び反応中に生成したメタノールを減圧除去した。以前に報告されたフルオラス固相抽出法に幾つか変更を加えて従った（Ｚｈａｎｇ，Ｗ．；Ｃｕｒｒａｎ，Ｄ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００６），６２，１１８３７〜１１８６５）。フルオラスシリカゲルは、ペルフルオロポリエーテルを吸着し、すべての非フッ素化有機化合物を容易に溶出させる。精製手順は以下のとおりであった。粗製反応生成物をアセトンに溶解させ、アセトニトリル／水（９５：５ｖ／ｖ）を詰めたＦｌｕｏｒｏ  Ｆｌａｓｈ（商標）短カラム（１０ｇ）に充填した。粗製ＰＦＰＥオイルのアセトン溶液を重力によって充填し、次いでＦｌｕｏｒｏ  Ｆｌａｓｈカラムをアセトニトリル／水（８：２ｖ／ｖ）混合物（５０ｍＬ）、続いてメタノール（２００ｍＬ）及びメタノール／トリフルオロエタノール（１：１ｖ／ｖ）（１００ｍＬ）で洗浄した。親フルオロ性メタノール画分を収集し、残留溶媒を減圧除去して、平均ＭＷ１９５０の精製ペルフルオロポリエーテルチラミド６（４．８ｇ、２．５ｍｍｏｌ、８６．２％）を黄色がかったワックス状固体として得た：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ６−アセトン）δ  ＣＨ（Ｃ６Ｈ６）７．０２（４Ｈ、ｄ、ＪＨ−Ｈ＝４．２Ｈｚ）、ＣＨ（Ｃ６Ｈ６）６．７５（４Ｈ、ｄ、ＪＨ−Ｈ＝４．２Ｈｚ）、ＣＨ２  ３．４８（４Ｈ、ｔ、ＪＨ−Ｈ＝７．８Ｈｚ）、ＣＨ２  ２．７６（４Ｈ、ｔ、ＪＨ−Ｈ＝７．５Ｈｚ）；１９Ｆ（４７０ＭＨｚ、基準ＴＦＡ  −７６．０、ｄ６−アセトン）ＯＣＦ３  −５６．４、ＯＣＦ２ＣＯＮＣＨ２  −７８．９、（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）−８９．４。
【０３５３】
１９Ｆ  ＮＭＲ分析
１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルを使用して、ＰＦＰＥエステルをＰＦＰＥアミドから明確に区別することができる。ＰＦＰＥエステル（３９）中のＣＦ２ＣＯＯＭｅ前末端は、−８０．３ｐｐｍの化学シフトを有する（図４９）。ＰＦＰＥ−ジエチルアミド（１）においては、ＣＦ２ＣＯＮ前末端は−７４．４ｐｐｍの化学シフトを有し（図４８）、末端基が第二級アミドを有するＰＦＰＥ−チラミド複合体においては、ＣＦ２ＣＯＮ前末端は−７７．８ｐｐｍの化学シフトを有する（図５２）。
【０３５４】
ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ  ＰＦＰＥ複合体（化合物１６及び１７）の場合、最も特徴的なピークは、ＣＦ２に対する−１２７．７ｐｐｍの色素上の１９Ｆであった。これらの結果は、ＰＦＰＥ修飾の分析、ＰＦＰＥ乳濁液生成物、及び標的細胞におけるＰＦＰＥ取り込み評価における１９Ｆ  ＮＭＲの有用性を示す。
【０３５５】
同様に、化合物７及び８をスキーム２の反応に従って調製した。式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。
【０３５６】
スキーム２：
【０３５７】
【化５０】
0005645658.tif 000080
組成物の合成：
式１の化合物と式１０の化合物；式１の化合物と式１２の化合物；及び式１の化合物と式１４の化合物を含む各組成物を、スキーム３に示す反応に従って調製した。式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。一般に、ＰＦＰＥメチルエステル（３９）をＰＥＧ部分の第一級アミンとまず反応させ、カップリングは、終了するのに十分な時間、通常、室温で１〜３日間許容された。遊離無修飾エステル末端基の残りの部分は、最終段階においてジエチルアミドに転化され、過剰のジエチルアミン及びメタノールの減圧除去後、最終生成物は、ＰＦＰＥジエチルアミド（１）とブレンドされたＰＦＰＥにカップリングした規定モル比のＰＥＧを含んだ。ＰＦＰＥ末端基の２つの異なる修飾の比は、１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲによって容易に確認された。カップリングしない第一級アミンを選択的有機溶媒抽出、通常エタノール又はＴＨＦによって除去した。式１０の化合物と式１の化合物とを含む組成物は、１：２のモル比で生成した。式１２の化合物と式１の化合物とを含む組成物は、１：４のモル比で生成した。式１４の化合物と式１の化合物とを含む組成物は、１：１０のモル比で生成した。
【０３５８】
スキーム３：
【０３５９】
【化５１】
0005645658.tif 000081
式１の化合物と式１６の化合物、及び式１の化合物と式１８の化合物を含む各組成物を、スキーム４に示す反応に従って調製した。式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。
【０３６０】
蛍光性「ブレンド」ＰＦＰＥアミド（ＦＢＰＡ）。
【０３６１】
一般的手順。蛍光色素（ＦＩＴＣ、ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ及びＡｌｅｘａ６４７）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅから、又は１，５−ジアミノペンタン（カダベリン）とのモノ複合体（ｍｏｎｏ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）として、購入された。無修飾第一級アミンは、ＰＦＰＥエステル３９への直接カップリングを許容する。本発明者らの蛍光性ＰＦＰＥの合成手法は、上記モデル反応スキーム３に記載のように、ＰＦＰＥエステル３９への蛍光色素複合体の第一級アミンの効率の高い最初のカップリングに依拠し、完全な転化（＞９９％）は、１Ｈ  ＮＭＲによって室温で４８時間後に認められる。最終生成物はＦＢＰＡ、すなわち、色素ジ複合体（ｄｉ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（例えば、化合物１７、１９又は４１）、色素モノ複合体（例えば、化合物１６、１８又は４０）及びＰＦＰＥアミド１で構成されるＰＦＰＥ誘導体の完全なブレンド混合物である（スキーム４）。
【０３６２】
手短に述べると、蛍光色素（ＦＩＴＣ、ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ又はＡｌｅｘａ６４７）カダベリン複合体を０．５から２．０ｍｏｌ％でＰＦＰＥエステル１のトリフルオロエタノール又はペルフルオロヘキサン溶液に添加した。反応は、室温で不活性雰囲気下で最高４８時間行なわれた。残りの遊離無修飾ＰＦＰＥエステル３９末端基は、最終段階においてジエチルアミドに転化された。過剰の未反応ジエチルアミン及び副生物メタノールを減圧除去した。蛍光色素は、ＰＦＰＥ末端基の一部のみに直接結合し、それによって第二級アミドを形成するので、ＰＦＰＥ末端基の残りを第三級アミドでキャッピングしながら、標識されたＰＦＰＥの蛍光及びＵＶ／ＶＩＳ吸光度測定をカップリング効率の推定に使用した。カップリングしない第一級アミンを選択的有機溶媒抽出（通常、エタノール）によって除去し、又は疎フルオロ性溶媒（例えば、アセトニトリル／水、４：１）によってフルオラス相シリカゲルから溶出させた。
【０３６３】
ＰＦＰＥエステル３９は、トリフルオロエタノール、トリフルオロトルエン及びペルフルオロヘキサンのみに完全に可溶性である。トリフルオロエタノールは、色素とＰＦＰＥオイルの両方を可溶化する唯一の溶媒であった。ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲカダベリンを低濃度で添加し（色素５ｍｇ／ＰＦＰＥオイル１ｍＬ）、トリフルオロエタノール又はペルフルオロヘキサン中で室温で４８時間反応させた。
【０３６４】
スキーム４
【０３６５】
【化５２】
0005645658.tif 000082
ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ  ＰＦＰＥアミド（ＰＦＰＥアミド１、１６及び１７で構成されるＦＢＰＡ）。炎にあてて乾燥させた丸底フラスコ（５０ｍＬ）にペルフルオロポリエーテルメチルエステル３９（３．９６ｍＬ、３．６７ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で充填した。ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲカダベリン（０．０２ｇ、０．０４ｍｍｏｌ）をＰＦＰＥオイルに固体として添加し、徹底的に撹拌した後、ペルフルオロヘキサン溶媒（３．００ｍＬ）、続いてトリエチルアミン（１．５０ｍＬ、１０．８ｍｍｏｌ）を添加した。（あるいは、トリフルオロエタノールは、ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲカダベリンをトリフルオロエタノール溶液として添加するように、蛍光性複合体用溶媒として使用することができる。この手法は、大きな規模で使用される。）反応混合物を、光から保護された、室温で４８時間撹拌した。ジエチルアミン（９．５０ｍＬ、９１．８ｍｍｏｌ）を添加して、すべての未反応エステル末端基を第三級アミドに転化させ、反応を室温で７２時間続けた。過剰のジエチルアミン及びメタノールを減圧除去し、最終の濃青色オイルを以下のように更に精製した。生成物をエタノール洗浄（１０ｍＬ）に供し、次いでフルオラス固相ろ過によって精製した。ＦｌｕｏｒｏＦｌａｓｈカラムをアセトニトリル／水（９５：５ｖ／ｖ）で湿らせた。生成物を負圧によってカラムに充填した。カラムをアセトニトリル（１００ｍＬ）で洗浄し、疎フルオロ性画分を混合し、減圧下で濃縮乾固させ、トリフルオロエタノール（２０ｍＬ）に再溶解させた。次いで、カラムをＴＨＦ（１００ｍＬ）、続いてトリフルオロエタノール（５０ｍＬ）で洗浄し、親フルオロ性画分を混合し、濃縮乾固させ、残留物をトリフルオロエタノール（２０ｍＬ）に溶解させた。これらの溶液を分光光度測定に使用した。ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲカダベリンをトリフルオロエタノールに溶解させ、５９３ｎｍにおける吸光度を測定することによって検量線を作成した。親フルオロ性及び疎フルオロ性画分のＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ濃度を検量線から推定した。ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲカップリング収率は４６．８％であり、純粋なオイル中の蛍光色素の最終濃度は４．６ｍＭであった。ナノエマルジョン調製に使用するまで、ＦＢＰＡオイルを暗所で室温で貯蔵した。吸光度検量線を図５９に示す。
【０３６６】
ＦＢＰＡ中の色素が低濃度であるため、１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ分析は、有用なデータを生成しなかった。フルオラス相抽出を実施して、カップリングしない有機色素を高フッ素化ＰＦＰＥオイルからＦＢＰＡ調製の最終段階で除去した。フルオラス相固体抽出及びＵＶ分光測光法を使用して、複合化を確認し、カップリング収率を計算した。
【０３６７】
ＦＩＴＣ  ＰＦＰＥアミド（ＰＦＰＥアミド１、４０及び４１で構成されるＦＢＰＡ）。炎にあてて乾燥させた丸底フラスコ（５０ｍＬ）にペルフルオロポリエーテルメチルエステル３９（１．６２ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で充填した。ＦＩＴＣ−ＴＲカダベリン（０．０１ｇ、０．０１５ｍｍｏｌ、１ｍｏｌ％）をトリフルオロエタノール（２．０ｍＬ）に溶解させ、ＰＦＰＥオイルに添加し、続いてトリエチルアミン（０．８４ｍＬ、６．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、光から保護された、室温で４８時間撹拌した。ジエチルアミン（１．２４ｍＬ、１２．０ｍｍｏｌ）を添加して、ＰＦＰＥのすべての未反応エステル末端基を第三級アミドに転化させ、反応を室温で７２時間続けた。過剰のジエチルアミン及びメタノールを減圧除去し、最終の暗黄色オイルをエタノールで１回洗浄し、減圧濃縮し、更に精製せずに蛍光性ナノエマルジョン調製に使用した。
【０３６８】
Ａｌｅｘａ６４７  ＰＦＰＥアミド（ＰＦＰＥアミド１、１８及び１９で構成されるＦＢＰＡ）。炎にあてて乾燥させ、アルゴンを流したガラスバイアル（２．５ｍＬ）に、ペルフルオロポリエーテルメチルエステル３９（０．０８６ｍＬ、０．０８ｍｍｏｌ）を充填した。Ａｌｅｘａ６４７−ＴＲカダベリン（０．００２ｇ、０．００２ｍｍｏｌ、２．５ｍｏｌ％）をトリフルオロエタノール（２．０ｍＬ）に溶解させ、ＰＦＰＥオイルに添加し、続いてトリエチルアミン（０．０４ｍＬ、０．２９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、光から保護された、機械的振とう機によって８０ｒｐｍで室温で４８時間振とうした。ジエチルアミン（０．０８、０．７７ｍｍｏｌ）を添加して、ＰＦＰＥのすべての未反応エステル末端基を第三級アミドに転化させ、反応を室温で７２時間続けた。過剰のジエチルアミン及びメタノールを減圧除去し、最終の暗黄色オイルをエタノールで洗浄し、減圧濃縮し、更に精製せずに蛍光性ナノエマルジョン調製に使用した。
【０３６９】
大規模（２５ｍＬ）な微少溶液操作によって、ＦＢＰＡを蛍光性ＰＦＰＥナノエマルジョン調製に使用した。ＰＦＰＥアミドは、微少溶液操作中に、安定であり、ＰＦＰＥオイル相中で蛍光色素を維持した。蛍光測定は、ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ色素スペクトルが、ＰＦＰＥとのカップリング後に変化しないことを示した。同じ手法を用いて、ＰＦＰＥメチルエステル３９を高蛍光性ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７色素で標識して、標識された細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの長期の蛍光画像化を可能にした。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒで標識されたカダベリンをＰＦＰＥメチルエステル３９に２．５ｍｏｌ％で直接カップリングさせ、過剰のジエチルアミンで処理することによって、エステル末端基の残りの部分をジエチルアミドに転化させた。標識化を室温でトリフルオロエタノール中で実施した  蛍光色素をカップリングさせた後、標識されたＰＦＰＥの蛍光及びＵＶ／ＶＩＳ吸光度測定をカップリング効率の推定に使用した（図４３Ａ〜Ｂ）。。同じ手法に従って、ＰＦＰＥエステル３９をカダベリンリンカーを介してＦＩＴＣ色素と２ｍｏｌ％でカップリングさせ、エステル末端基の残りの部分を、過剰のジエチルアミンを用いて第三級アミドに転化させた（スキーム４）。いずれの場合においても、得られる生成物は蛍光性「ブレンド」ＰＦＰＥアミド（ＦＢＰＡ）である。それ自体の相として一緒にとどまる複数のフッ素化オイルの特定の性質のために、これらのオイルを「ブレンド」と命名した。これらの蛍光性オイルは、すべての乳濁液調製実験において独特なオイル相として振る舞った。
【０３７０】
本発明者らは、ＰＦＰＥオキシド１ａとＰＦＰＥアミド１がいかに良く混ざるかも探究した。本発明者らは、複数のＰＦＰＥオイルが任意の所与の比で混ざることを見いだし、ブレンドＰＦＰＥオイル（ＰＦＰＥアミド１とＰＦＰＥオキシド１ａ）を微少溶液操作によるナノエマルジョン調製に使用した。本発明者らは、極めて安定な蛍光性ナノエマルジョンを大規模に調製するために、ＦＢＰＡオイルをＰＦＰＥオキシド１ａとブレンドすることにも成功した。「ブレンド」ＰＦＰＥオイル手法は、すべてのＰＦＰＥ誘導体に適用することができ、すべてのＰＦＰＥ誘導体に適用して、大部分の乳濁液調製に成功した。ＰＦＰＥ誘導体は、水又はオイルと容易に混ざらず、別個の相としてとどまる独特なオイル相を形成する傾向があった。これは、蛍光色素を含む、又はＰＦＰＥアミド１とＰＦＰＥオキシド１ａを異なる比で混合することによって作製された、これらの「ブレンド」オイルのほとんどに当てはまった。
【０３７１】
定義上、「ブレンド」ＰＦＰＥオイルは、ＰＦＰＥオキシド１ａと体積比１／１００〜１／１で混合されたＰＦＰＥ誘導体１を含む。大部分の乳濁液においては、本発明者らは１／９比ｖ／ｖを使用した。ＰＦＰＥアミドが実際にＦＢＰＡである場合、それもＰＦＰＥオキシド１ａと体積比１／１０でブレンドした。これらのブレンドを、以下に詳述する蛍光性ナノエマルジョン調製に使用した。
【０３７２】
アミノ反応性色素Ｃｙ５を使用して、画像化試薬にカップリングさせることができる。かかる場合においては、スキーム５に示すように、式１０の化合物と式１の化合物を含む組成物を使用することができる。式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。
【０３７３】
スキーム５：
【０３７４】
【化５３】
0005645658.tif 000083
一般に、任意のアミノ反応性色素を、アミン官能基を含む上記画像化試薬上にカップリングすることができる。例えば、化合物２７、３０、３３又は３６は、スキーム６の提案された反応に従って調製することができる。式中、ｎは各々独立に４から１６の整数である。さらに、これらの化合物のいずれかを、上述したように、ＰＦＰＥオキシド１ａ及び／又はＰＦＰＥアミド１と更にブレンドして、新しいＦＢＰＡブレンドを形成することができる。これは、ＰＦＰＥ誘導体が水又は有機オイルよりもＰＦＰＥ誘導体とよく混ざる傾向にあることを利用するものである。これらの蛍光性及び非蛍光性ＰＦＰＥ誘導体のいずれも互いに任意の組合せでブレンドすることができ、ナノエマルジョン調製に利用可能な多様なセットのＰＦＰＥオイル、及び最終のナノエマルジョンＭＲＩ試薬の諸性質の更なる微調整をもたらす。
【０３７５】
スキーム６：
【０３７６】
【化５４】
0005645658.tif 000084
標識化ＰＦＰＥで改変されたオイルに使用される色素は低濃度であるため、１９Ｆ  ＮＭＲ及びＭＳデータはカップリング収率の指標としては不十分であった。本発明者らは、通常１ｍｏｌ％以下である色素の存在をＮＭＲ又はＭＳ分析によって認めることはできなかった。代替分析手法を使用した。分光分析と蛍光の組合せを使用して、ＰＦＰＥへの色素カップリングを測定した。高蛍光性Ａｌｅｘａ６４７色素の場合には、極低濃度（０．０５ｍｏｌ％）が、ＰＦＰＥ乳濁液で標識された標的細胞の適切な蛍光標識を与えるのに十分であった。ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ標識の場合には、０．５ｍｏｌ％が十分であった。各色素に対して、検量線をトリフルオロエタノール中で作成して、ＰＦＰＥ、ＰＦＰＥ複合体及び遊離色素の溶解性の差を回避した。蛍光標識されたＰＦＰＥを溶媒抽出又はＦｌｕｏｒｏＦｌａｓｈろ過によって精製して、未反応色素を除去した。次いで、蛍光性ＰＦＰＥオイルをトリフルオロエタノールに溶解させ、ＵＶ／ＶＩＳ吸光度と蛍光の両方を測定した。色素の濃度は、蛍光及びＵＶ／ＶＩＳ吸光度を含めた２つの独立した方法によって、作成した検量線から推定された（図４３Ａ〜Ｂ）。蛍光色素は、巨大分子と複合化すると、その蛍光性を変化させることができることは当分野で公知である。したがって、蛍光標識されたＰＦＰＥ、式１０と式１の化合物、及び式１６と式１の化合物の吸光度及び発光スペクトルを得た。Ａｌｅｘａ  ６４７の蛍光発光スペクトルは、ＰＦＰＥとの複合化によって影響されなかった（図４３Ｃ〜Ｄ）。選択されたＰＦＰＥ誘導体のＨＰＬＣ、１Ｈ、１３Ｃ、１９Ｆ  ＮＭＲ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを含めた分析データの例を図４１〜５２に示す。
【０３７７】
代替チャネルＭＲＩ試薬（化合物４２）：
スキーム７及び以下の手順に従って化合物４２を調製した：
【０３７８】
【化５５】
0005645658.tif 000085
以下の手順は、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（３６）から改変されたものであった。１−オクタノールの無水エーテル溶液（５．２５ｇ、４０．３５ｍｍｏｌ）にトリフェニルホスフィン（１１．１１ｇ、４２．３７ｍｍｏｌ）を添加し、粉体が完全に溶解するまで混合物を室温で１５分間撹拌した。次いで、反応混合物を氷浴（０℃）上に置き、アゾジカルボン酸ジイソプロピル（８．７１ｍＬ、４４．３８ｍｍｏｌ）を滴下した。添加は、アルゴン雰囲気下で実施された。添加中、溶液は淡黄色に変色し、黄色沈殿が生成した。添加終了後、反応混合物を氷バッチ上で更に３０分間撹拌し、次いでペルフルオロ−ｔｅｒｔ−ブタノール（１０．００ｇ、４２．３７ｍｍｏｌ）を一括添加し、生成した混合物を室温で１．５時間撹拌した。粗製反応混合物を短いＳｉＯ２カラムによってろ過して、トリフェニルホスフィンオキシド沈殿物を除去した。ろ液を濃縮し、少量のエーテルに再溶解させ、ＳｉＯ２カラムに充填した。生成物をペルフルオロヘキサン／エーテル（１：１ｖ／ｖ）混合物で溶出させ、減圧濃縮した。未反応ペルフルオロ−ｔｅｒｔ−ブタノールを減圧下で除去して、生成物４２を無色透明オイル（８．３６ｇ、５９．５％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ６−アセトン）δ  ４．１２（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．２Ｈｚ）、１．７９（ｄｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．６、６．３Ｈｚ）、１．４６〜１．３０（ｍ、１０Ｈ）；１９Ｆ  ＮＭＲ（４７７ＭＨｚ、純粋）δ  −７１．３９（ｓ、９Ｆ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．６ＭＨｚ、純粋）δ  １２０．５（ｑ、Ｊ＝２８９．９Ｈｚ）、７０．３、３１．５、２５．１、２２．３；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ３８８．５（Ｍ＋＋Ｋ、４０）。
【０３７９】
２．乳濁液調製
ＰＦＰＥは、疎油性疎水性ポリマーであり、乳化が困難である。一方、これらの性質には明確な利点がある。ＰＦＰＥオイルは、互いに任意の所与の比で容易に混ざり、ナノエマルジョン調製のための独特なフッ素化相を与える。ブレンドＰＦＰＥオイルは、多様なＰＦＰＥ誘導体（例えば、上述したＦＢＰＡ）の簡単なボルテックス撹拌によって容易に利用することができる。次いで、ブレンドオイルは、種々の乳濁液調製物に使用することができ、一般に単一のＰＦＰＥオイル相として振る舞い得る。
【０３８０】
種々の乳化方法を広範に探究した。超音波処理及び微少溶液操作処理技術、並びに薄膜、ボルテックス撹拌などの低エネルギー方法を試験した。すべての乳濁液調製物において、ＰＦＰＥ誘導体は化学的に不変のままであった。脂質、ブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標））及びポリアミンをＰＦＰＥ乳化の賦形剤として使用した。
【０３８１】
超音波処理を用いた実験のすべてにおいて、Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ（Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｉｎｃ．，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を出力２０ワット及び２０ｋＨｚで使用した。プローブの先端をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中の少量の液体、通常０．１〜０．５ｍＬに浸漬する。特に示さない限り、すべての乳化を室温で実施した。
【０３８２】
微少溶液操作を用いた上記実験のすべてにおいて、Ｍ−１１０Ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）を使用圧力４０〜６０ｐｓｉで試料体積１０〜４０ｍＬ（それよりも大きい体積（１００ｍＬまで）を除外しない。）で使用した。微少溶液操作、均質化などを１Ｌを超える大きいバッチの乳濁液生成物の製造に使用することもできる。
【０３８３】
乳濁液処方の具体例：
ＰＦＰＥアミド／Ｆ６８乳濁液：
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８を緩衝剤水溶液（ＨＢＳＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）に１５０ｍｇ／ｍＬで溶解させた。ＰＦＰＥアミド１を１５２ｍｇ／ｍＬで添加し、混合物（２５０μＬ）を１．５ｍＬ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆバイアルに入れ、室温で３０秒間（２０Ｗ及び２０ｋＨｚで）超音波処理した。次いで、乳濁液を１×  ＨＢＳＳで１：３希釈し、粒径を動的光散乱によってＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ中で１時間以内に測定した。ＰＦＰＥアミド１とＦ６８のモル比は４．６：１であった。多分散性（ＰＤＩ）は０．１２から０．１９であり、平均粒径は２００ｎｍであった。ＰＦＰＥアミド１とＦ６８の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、図１に示すように、光散乱強度及び平均直径をプロットし、曲線の交点を探すことによって推定された。
【０３８４】
ＰＦＰＥ／Ｌ３５乳濁液：
ＰＦＰＥアミド１（２４μＬ、３６．５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）とＰｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ３５（５４μＬ、５７．４ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を１．５ｍＬ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中で混合し、１０秒間適切に超音波処理した。次いで、脱イオン水（１２２μＬ）を添加し、混合物を透明になるまで超音波処理した（１０〜１５秒）。上記のように調製した乳濁液は、高濃度で約２〜３時間安定であった。乳濁液を水で１０倍希釈すると、粒径及びＰＤＩは少なくとも３〜５日間一定であった。
【０３８５】
二重蛍光性／ＭＲＩナノエマルジョン標識  −  超音波処理によって調製されたパイロットバージョン：
第１の蛍光性ナノエマルジョンを、ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ  ＰＦＰＥアミドを用いて超音波処理によって調製した。ＰＦＰＥ−ＢＯＤＩＰｙアミド１６とＰＦＰＥアミド１（１ｍｏｌ％色素）を含む組成物を純粋なＰＦＰＥアミド１で種々の濃度で希釈した。所与の混合物色素濃度に対して、ＰＦＰＥ／ＢＯＤＩＰｙ（２４μＬ）をＬ３５（５４μＬ）及び水（１２２μＬ）と一緒に超音波処理した。図２に示すように、ＰＦＰＥ−アミドオイル１中のＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ、親油性中性色素の存在は、ＰＦＰＥアミド１の粒径及び乳化にほとんど影響しなかった。粒径は１１４．１±３１．４ｎｍであり、ＰＤＩは０．１から０．４まで変化した。
【０３８６】
漸増ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ色素濃度（０〜１ｍｏｌ％）を有するＢＯＤＩＰｙ−ＰＦＰＥアミド１６／Ｌ３５乳濁液を水で１０倍希釈した。図３に示すように、蛍光強度を黒色平底９６ウェルプレートにおいてＴＥＣＡＮプレートリーダーを用いて５８０ｎｍ励起及び６３０ｎｍ発光によって測定した。
【０３８７】
親油性蛍光色素の存在は、Ｌ３５を用いた超音波処理によるＰＦＰＥアミド１の乳化に対して実質的に影響しなかった。粒径及びＰＤＩは類似しており、この結果は、取り込みが変化しないことを示唆した。標識化細胞に対して開発される組織培養プロトコルは、ＰＦＰＥナノ粒子の蛍光性と非蛍光性バージョンの両方に使用することができるので、これは重要である。さらに、蛍光性類似体は、細胞標識化プロトコルの開発又は検証の一部として、重要なパラメータＦｃのｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定に使用することができると予測される。したがって、Ｆｃによって測定される平均細胞負荷は、高価な１９Ｆ  ＮＭＲ計測手段ではなく、安価な蛍光光度計を用いて評価することができ、Ｆｃの結果は、ＰＦＰＥの非蛍光性バージョンを用いたその後のｉｎ  ｖｉｖｏ実験に使用することができた。
【０３８８】
Ａｌｅｘａ６４７−ＰＦＰＥアミドを含むナノエマルジョンを上記と同じ手順に従って調製した。Ａｌｅｘａ６４７  ＰＦＰＥアミドをＰＦＰＥアミドで希釈して、ＰＦＰＥに対して０．０５ｍｏｌ％で最終色素濃度を得た。次いで、このＰＦＰＥをＬ３５を用いて乳化させた。平均乳濁液粒径は、１２２±１７ｎｍと測定された。
【０３８９】
ＰＥＧ−ＰＦＰＥアミド１４とＰＦＰＥアミド１の組成物：
ＰＥＧ−ＰＦＰＥアミド１４とＰＦＰＥアミド１を含む組成物（２５μＬ）を、（図４に示すように）水又は（図５に示すように）１×  ＨＢＳＳ  １ｍＬ中で３０秒間超音波処理した。次いで、乳濁液希釈物をＤＬＳを用いて試験した。水中でのＰＥＧ−ＰＦＰＥアミド１４の粒径は１４４±１７．８ｎｍであり、ＰＤＩは０．２から０．３であった。水中の臨界ミセル濃度３３．５ｍｇ／ｍＬは、散乱光強度及び粒径をプロットすることによって推定された（図４）。ＰＥＧ−ＰＦＰＥを１×  ＨＢＳＳ緩衝剤中に乳化すると、粒径は２１１±３６．４ｎｍに増加し、ＰＤＩ範囲は０．１５から０．４０を形成する。図５に示すように、１×  ＨＢＳＳ中のＣＭＣは３０．１ｍｇ／ｍＬと推定された。
【０３９０】
ＰＥＧ−ＰＦＰＥアミド１０とＰＦＰＥアミド１の組成物：
３３ｍｏｌ％ＰＥＧ−ＰＦＰＥアミド１０の組成物をＰＦＰＥアミド１で慎重に希釈することによって、ＰＥＧ−ＰＦＰＥアミド１０とＰＦＰＥアミド１の種々の濃度の組成物を調製した。３３から０ｍｏｌ％の漸減濃度のＰＥＧ−ＰＦＰＥアミド１０を用いて、合計９個のオイル試料を調製した。各オイル（２５μＬ）を水又は１×  ＨＢＳＳ  １２５μＬ中で１０秒間超音波処理し、次いで外相で７５０μＬに希釈し、同じ動力設定で３０秒間超音波処理した。次いで、乳濁液の粒径及びゼータ電位を試験し、室温で貯蔵した。図６及び７に、すべての試料の粒径及び散乱強度を示す。図６に示すように、水を媒体として使用すると、平均粒径は１９５．４±４．５ｎｍであり、ＰＤＩ＝０．１〜０．３であった。図７に示すように、１×  ＨＢＳＳを使用すると、粒径は１９３±１４．５ｎｍで変わらず、ＰＤＩ＝０．１〜０．３であった。
【０３９１】
両方の媒体において、ＰＦＰＥアミド１中のＰＥＧ−ＰＦＰＥアミド１０の量は、粒径又は多分散性に影響しなかった。より少なく、次いで５ｍｏｌ％ＰＥＧ−ＰＦＰＥアミド１０を含む乳濁液は、少なくとも４日間室温で安定であった。これらの安定な乳濁液は、ＤＬＳ測定によって測定して、同じ粒径、散乱強度及び多分散性を維持した。同じ安定性が水とＨＢＳＳ緩衝剤の両方で認められた。わずか２個のエチレンオキシド単位の極めて短いＰＥＧの共有結合性複合化は、２つの目的を果たすことができる。第１に、それは、ターゲティング薬剤及び色素の付加のためのリンカーとして役立つことができる。第２に、それは、形成された液滴の乳化剤と立体的安定剤の両方として作用することによって、乳化を助ける。
【０３９２】
ＰＥＧ−ＰＦＰＥアミド１０とＰＦＰＥアミド１／Ｌ３５の組成物：
１０が４ｍｏｌ％のＰＥＧ−ＰＦＰＥアミド１０とＰＦＰＥアミド１の組成物は、同じ組成物について上述した同じ手順に従って、１×  ＨＢＳＳ中で、超音波処理によってＬ３５を用いてモル比１：１で乳化されたときに、ＰＦＰＥアミド１単体と比較された。データを図８に示す。
【０３９３】
Ｌ３５を乳化剤として使用したときには、ＰＦＰＥアミド１上のＰＥＧ−ＰＦＰＥアミド１０の存在は、粒径に対して大きくは影響しなかった。しかし、Ｌ３５を用いたＰＦＰＥアミド１の乳化は、かなり小さい粒径を与え、次いでＰＦＰＥアミド１は１×  ＨＢＳＳ中で単独で超音波処理された。これらの知見は、ＰＦＰＥアミド乳濁液液滴を包囲する親水基の存在が、乳濁液の安定性を増進することを示している。
【０３９４】
脂質を用いた乳化：
カチオン性脂質ＣＴＡＢ、ＤＤＡＢ、及び中性脂質ＤＭＰＣを単独で使用して、又はＰｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ３５と一緒に使用して、ＰＦＰＥアミド１を乳化させた。これらの脂質は、細胞膜付着を促進することによって、粒子の取り込みを改善すると予想される。陽電荷を有する脂質は、細胞膜の負電荷のために、細胞−粒子相互作用を促進することが知られている。
【０３９５】
脂質の添加は、超音波処理方法に対する変更が必要であった。固体としての脂質を適切な有機溶媒（例えば、クロロホルム又はアセトン）にまず溶解させ、ＰＦＰＥアミド１と混合し、アルゴン気流を用いて乾燥させて薄膜にした。次いで、フィルムを水性媒体（水又は１×  ＨＢＳＳ緩衝剤）を用いてボルテックス撹拌し、５０〜７０℃に１５分間加熱し、室温に冷却しながら再度ボルテックス撹拌した。次いで、乳濁液を超音波処理して、粒径及びＰＤＩを減少させた。
【０３９６】
ＤＭＰＣ／ＰＦＰＥアミド１乳濁液：
トリフルオロエタノール（２００μＬ）中のＰＦＰＥアミド１溶液（１５２ｍｇ／ｍＬ）と、１１２から０ｍｇ／ｍＬの漸減濃度を含むクロロホルム（２００μＬ）中のＤＭＰＣ溶液とをボルテックス撹拌によって混合し、アルゴン気流を用いて乾燥させて薄膜にした。フィルムを室温で３０分間減圧乾燥させて、残留有機溶媒を除去した。フィルムを水（４００μＬ）と混合し、３回１５秒間超音波処理し、水５００μＬで希釈し、２回３０秒間再度超音波処理した。図９に示すように、ＰＦＰＥアミド１とＤＭＰＣのモル比は、１：２、１：１．５、１：１、１：０．５及び１：０．２５であった。すべての乳濁液は透明であり、ＤＬＳ測定前に室温で２４時間保持された。脂質の量が減少するにつれ、粒径は増加し、多分散性は減少した。図１０に示すように、最適な粒径（１５８．５±１．０ｎｍ）及びＰＤＩ（０．１７〜０．１９）は、ＰＦＰＥアミド１とＤＭＰＣのモル比１：０．５で得られた。
【０３９７】
ＰＦＰＥアミド１／脂質混合物に対する高エネルギー乳化の効果を試験するために、上記と同じ手順を使用し、すべての乳濁液を２分割した。半分を超音波処理し、残りの半分を超音波処理しなかった。図１１に示すように、超音波処理を使用すると、粒径はかなり減少した。
【０３９８】
中性脂質を導入しても、水中に乳化されたＰＦＰＥアミド１の本質的に負のゼータ電位は変化しなかった。ＰＦＰＥアミド１を中性Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）を用いて水又は１×  Ｈ  ＢＳＳ中に乳化させたときにも、ゼータ電位は負であった。中性脂質ＤＭＰＣをモデルとして使用して、ＰＦＰＥアミド１を脂質と混合する実行可能性を試験した。次いで、図１４に示すように、カチオン性脂質（ＣＴＡＢ又はＤＤＡＢ）を導入して、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）を用いて作製されたＰＦＰＥアミド１粒子の負のゼータ電位の逆転を検討した。
【０３９９】
ＤＭＰＣ／ＤＤＡＢ／ＰＦＰＥアミド１：
丸底ガラス管中で、ＤＭＰＣ（１８ｍｇ）、ＤＤＡＢ（０〜８ｍｇ）及びＰＦＰＥアミド１（７６ｍｇ）をトリフルオロエタノール（４００μＬ）に溶解させ、ボルテックス撹拌し、アルゴン気流を用いて乾燥させて薄膜にした。次いで、フィルムを更に１５分間減圧乾燥させた。激しくボルテックス撹拌しながら水（１ｍＬ）を添加し、乳濁液を６０℃で１５分間加熱した。各乳濁液を２個の０．５ｍＬ部分に分割し、一方を室温で３０秒間超音波処理し、他方を室温で未処理放置した。全試料をＤＬＳ測定前に水で１／３だけ希釈した。ＤＬＳ測定によれば、この系において粒径及び多分散性を減少させるのに超音波処理が明らかに必要である。短時間の超音波処理（＜２０秒）によって、粒径及び多分散性が劇的に減少した。図１２に示すように、粒径は、４％ＤＤＡＢで最小であった。脂質をＰＦＰＥ乳濁液に導入すると、ＰＦＰＥの高い疎油性のために、高エネルギー乳化方法が必要であった。ＰＦＰＥの疎油性は、脂質含有乳濁液の安定性がより低く、次いで乳濁液においてＰｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）単体を用いて作製された理由も説明する。
【０４００】
ＣＴＡＢ／ＰＦＰＥアミド１：
ＣＴＡＢ及びＰＦＰＥアミド１を丸底ガラス管中でトリフルオロエタノール（３００μＬ）に溶解させた。均一なオフホワイトのフィルムが形成されるまで、アルゴンガスをピペット先端を通して管中に吹き込んだ。管を真空に少なくとも３０分間接続した。激しくボルテックス撹拌しながら水媒体又は１×  ＨＢＳＳを添加し（１ｍＬ／試料）、次いで管を６０℃の水浴中に１５分間置いた。次いで、各試料を３０秒間超音波処理して、粒子を均質化した。ＤＬＳ測定によれば、ＣＴＡＢ量が増加しても粒径は変化しなかった。図１３に示すように、Ｌ３５を共乳化剤として使用するとサイズも変化しなかった。しかし、図１４に示すように、ゼータ電位は、ＣＴＡＢの添加によって増加した。示した百分率は、乾燥材料重量に対するものである。
【０４０１】
超音波処理によるＰＦＰＥアミド１／ポリエチルアミン乳濁液：
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質が細胞に入るのを助けることが知られているポリアミン移入剤である。低分子量ＰＥＩ（例えば、４３０又は８００）は、共乳化剤と、第一級アミノ基を導入してナノ粒子の細胞内取り込みを容易にする手段の両方として利用された。目標は、十分な数の遊離アミノ基を導入すること、並びに粒径及びＰＤＩをできるだけ小さく維持することであった。ＰＥＩは、親水基（すなわち、第一級アミノ基）が多いため、界面活性剤としても役立つ。
【０４０２】
ポリエチルアミン（ＰＥＩ、平均ＭＷ＝８００）中の第一級アミンは、高反応性ＰＦＰＥメチルエステル３９末端基と相互作用する。ＰＦＰＥアミド１と混合されたＰＦＰＥメチルエステル３９の５％を、ＰＥＩを用いた乳化に使用した。ＰＥＩを無水エタノールに溶解させた（１００ｍｇ／ｍＬ）。ＰＦＰＥメチルエステル３９／ＰＦＰＥアミド１、５：９５ｖ：ｖ（５０μＬ）を水（４５０μＬ）及びＰＥＩエタノール溶液（１００μＬ）と一緒にボルテックス撹拌し、ロータリーエバポレーター（ｒｏｔｏｖａｐ）上に４０℃で置いて、エタノールを減圧除去し、次いで２回１０秒間超音波処理した。図１５に示すように、溶液を４倍希釈して、ＤＬＳによって粒径を測定した。これは、これまでに調製された第１のＰＦＰＥ／ＰＥＩ乳濁液であり、ＰＦＰＥは、ポリエチレンイミンと混合する前には調製されなかった。高親水性ＰＥＩは、乳化剤として働き、取り込みに必要なアミノ基を与える。
【０４０３】
超音波処理によるＰＦＰＥアミド１／硫酸プロタミンナノ粒子：
硫酸プロタミンは、一般的な移入試薬であり、生体適合性が高い。硫酸プロタミンは、ヒトへの使用がＦＤＡによって認可され、ヘパリン拮抗物質として臨床的に使用される。その低毒性のために、硫酸プロタミンは、ＤＮＡ及びＲＮＡの望ましい送達試薬になっている。硫酸プロタミンを用いて処方されたＰＦＰＥアミド１のナノ粒子を、細胞内取り込みを促進するように設計した。硫酸プロタミンを用いたＰＦＰＥアミド１の各試験乳濁液の場合、ＰＦＰＥアミド１（５０μＬ）を脱イオン水３００μＬ中で１０秒間超音波処理した。硫酸プロタミン（サルミン硫酸塩、ＵＳＰ）水溶液（３００μＬ、０から２０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、２０秒間激しくボルテックス撹拌した。乳濁液を１０秒間超音波処理し、ＤＬＳ測定のために水で１／３希釈した。図１６及び１７に示すように、硫酸プロタミン量（％ｗ／ｗ）を増加させると、粒径及びゼータ電位が増加した。
【０４０４】
硫酸プロタミンで被覆されたＰＦＰＥアミド１／Ｌ３５乳濁液：
ＰＦＰＥアミド１を、上述したように、Ｌ３５を用いて超音波処理によってモル比１：１で乳化させ、低濃度の硫酸プロタミン（１０μｇ／ｍＬ）を含む無血清培地で希釈した。混合物を室温で３０分間インキュベートした。図１８に示すように、乳濁液を更に希釈せずにＤＬＳによって分析した。硫酸プロタミンを含むコーティングＰＦＰＥアミド１／Ｌ３５乳濁液液滴は、液滴サイズ及びＰＤＩを３０％増加させた。このサイズ増加は、以下で考察するように、ＰＦＰＥ／Ｌ３５粒子の細胞内取り込みに有害作用を示さなかった。ＰＦＰＥアミド１／Ｌ３５ナノエマルジョン液滴を硫酸プロタミンで被覆すると、細胞生存率に負の作用を示さずに（図３５Ａ）、ジャーカット細胞における取り込みが数倍増加した（図３５Ｂ）。
【０４０５】
硫酸プロタミンをＰＦＰＥナノエマルジョンに組み入れるこれらの初期実験は、高度に安定で極めて効率的なＰＦＰＥ／Ｆ６８／硫酸プロタミン乳濁液の設計の基礎として役立った。この新しい乳濁液においては、硫酸プロタミンは、微少溶液操作によって、ナノ粒子に低量（０．０１〜１％ｗ／ｗ）で組み入れられた。
【０４０６】
微少溶液操作乳化例：
超音波処理方法は、小規模で有効であり、ほとんどの場合、小さい粒子（＜２００ｎｍ）及び低ＰＤＩ（０．１〜０．３）が得られる。しかし、この方法を大規模調製に使用することはできない。本発明者らの目標は、繰り返しの細胞標識化及びＭＲＩ画像化のために、複数バッチの安定な乳濁液を調製することであった。示した研究によれば、高エネルギー方法が明らかに必要である。微少溶液操作は、高せん断力を利用して、調製乳濁液の液滴サイズを減少させ、低ＰＤＩを示した。
【０４０７】
ＰＦＰＥアミド１／Ｆ６８の微少溶液操作：
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８は、無毒のＦＤＡ認可された乳化剤である。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８は、代用血液製剤におけるパーフルオロカーボンの乳化のために、卵黄レシチンの存在下で認可された。Ｆ６８は、高分子量（８４００）を有し、Ｌ３５よりも高い安定性をＰＦＰＥナノエマルジョンに付与する。Ｆ６８は、微少溶液操作を用いた下記実施例の大部分で乳化剤として使用され、場合によっては超音波処理と組み合わせて使用される。
【０４０８】
１×  ＨＢＳＳ緩衝剤中のＦ６８溶液（６７ｍｇ／ｍＬ、４ｍＬ）と一緒にボルテックス撹拌し、続いて各１分間の３つの期間の超音波処理によって、ＰＦＰＥアミド１（１ｍＬ）を混合した。期間と期間の間に混合物を氷上で３０秒間冷却した。次いで、乳濁液を１×  ＨＢＳＳで２０ｍＬに希釈し、マイクロフルイダイザー（Ｍ−１１０Ｓ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）に使用空気圧４０ｐｓｉで通過させた。多量（４ｍＬ）のプレエマルジョンを通した超音波処理器先端からの低エネルギー移動効率のために、最初の超音波処理によって大粒子（約３４５ｎｍ）及び高ＰＤＩ（０．４）が得られた。マイクロフルイダイザーを１回通すと、最も劇的な効果があり、粒径は１００ｎｍ減少し、ＰＤＩは１／３に減少した。図１９に示すように、更に通過させても、粒径に大きな効果はなく、ＰＤＩは一定であった。ＰＦＰＥアミド１／Ｆ６８乳濁液をＤＬＳによって１週間モニターした。図２０に示すように、粒径及びＰＤＩはこの期間変化しなかった。図２１に示すように、ＰＦＰＥアミド１／Ｆ６８微少溶液操作乳濁液の粒径を電子顕微鏡法（ＥＭ）によって確認した。
【０４０９】
ＰＦＰＥアミド１／Ｌ３５及びＰＦＰＥアミド１／Ｌ６４の微少溶液操作：
ＰＦＰＥアミド１（６３７μＬ）、Ｌ３５（９μＬ）又はＬ６４（１３．８μＬ）を１×ＨＢＳＳ  １３．２ｍＬと一緒にボルテックス撹拌することによって混合し、マイクロフルイダイザーに使用圧力４０ｐｓｉで２回通した。乳濁液を再度ボルテックス撹拌し、容器中に密封し、１回目のＤＬＳ測定まで室温で４日間貯蔵した。
【０４１０】
乳濁液は、徐々に沈降したが、軽く振とうすると素早く均質化した。経過観察中、オイルの分離は観察されなかった。図２２に示すように、粒径及びＰＤＩは、６週間の試験にわたって一定であった。Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）を含まないＰＦＰＥアミド１を微少溶液操作すると、乳濁液は粒径が同じであったが、わずか２日間で劣化し、油滴が形成された。ＰＦＰＥアミド１の液滴を合体させないために少量のＰｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）が必要であることは明らかであった。ＰＦＰＥアミド１とＰｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）のモル比は１００：１であった。
【０４１１】
ＰＥＩを用いたＰＦＰＥアミド１／Ｆ６８の微少溶液操作
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、ＭＷ約４３０）は、ＰＦＰＥと直接カップリングしなかったが、処理中に乳濁液に取り込まれて、細胞内取り込みを促進することが知られている第一級及び第二級アミン基で粒子を被覆した。ＰＦＰＥジエチルアミド１（１０％ｗ／ｗ）をＦ６８を用いて水中で微少溶液操作によって乳化した。ＰＦＰＥ−ジエチルアミド１（１．５２ｇ、１ｍＬ）とＦ６８溶液（水溶液０．６８ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ）を混合し、水（６．７ｍＬ）中でボルテックス撹拌し、次いでＵｌｔｒａｔｕｒａｘ装置（Ｔｅｋｍａｒ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）を用いて室温で５分間処理した。ＰＥＩ（Ｍｎ約４３０）溶液（水溶液０．５２ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ）及び水６．７ｍＬを添加し、乳濁液を高で（ｏｎ  ｈｉｇｈ）２分間ボルテックス撹拌した。処理室を氷冷しながら、プレエマルジョンをマイクロフルイダイザーに通した。処理は、使用圧力５０ｐｓｉでの２回の連続通過を含んだ。対照乳濁液（ＰＦＰＥ−ジエチルアミド／Ｆ６８）をＰＥＩ溶液なしで同様に調製した。粒径は平均２００ｎｍであり、ＰＤＩは０．１〜０．２であった。ＰＥＩの存在は、粒径に影響しなかった。安定性をＤＬＳ測定によって４、２５及び３７℃で３週間試験した。ＰＦＰＥ／Ｆ６８乳濁液は３７℃で少なくとも２週間安定であり、ＰＦＰＥ／Ｆ６８／ＰＥＩ乳濁液は少なくとも３週間安定であった（図２３）。これらのデータは、異なる温度での粒径の連続測定である。乳濁液を初期濃度で貯蔵し、各ＤＬＳ測定前に１０倍希釈した。ＰＤＩに大きな変化は認められなかった。これら２種類の乳濁液をジャーカット細胞を用いた取り込み実験において比較した。図４１に示すように、ＰＥＩが存在すると、取り込みのかなりの増加が認められた。
【０４１２】
ＰＦＰＥ−オキシド／Ｆ６８／ＰＥＩ
ＰＦＰＥ−オキシド（１ａ）は、炭化水素末端基を持たない、より低い平均分子量（ＭＷ約１３００）を有する、ＰＦＰＥの類似体である。ＰＦＰＥ−オキシドは、ＰＥＧ−ＯＨの直接フッ素化によって特注合成されたポリマーの混合物であり（Ｅｘｆｌｕｏｒ，Ｒｏｕｎｄｒｏｃｋ，ＴＸ）、−９１．６ｐｐｍのその主ピークは３６フッ素スピンに対応する。図２４Ａに示すように、ＰＦＰＥ−オキシドは、ＰＦＰＥ−ジエチルアミドと同様に、Ｆ６８を用いた微少溶液操作によって乳化する。したがって、ＰＦＰＥ−オキシドは、ＰＦＰＥとターゲティング薬剤又は蛍光色素の更なる複合化が不要である細胞標識化適用例において、ＰＦＰＥジエチルアミドに取って代わることができる。さらに、ＰＦＰＥ−オキシド１ａは、ＰＦＰＥアミド１に極めて類似した諸物性を有し、新規ブレンドＰＦＰＥオイルナノエマルジョンの調製において、ＰＦＰＥアミド１及びＦＢＰＡと使用ブレンドされた（蛍光性ブレンドＰＦＰＥアミド）。ＰＦＰＥブレンド能力は、ナノエマルジョン調製に新しい方法を切り開き、安定性の高い蛍光性及び非蛍光性ＰＦＰＥナノエマルジョンをもたらした。
【０４１３】
ＰＦＰＥ−オキシド（１．７ｇ、１ｍＬ）、Ｆ６８（６８ｍｇ）及びＰＥＩ（５２ｍｇ）をマイクロフルイダイザーに圧力５０ｐｓｉで２回通して、水（１４ｍＬ）中で乳化させた。第２の乳濁液をＰＦＰＥ−ジエチルアミド１ｍＬを用いて調製し、両方の乳濁液をＤＬＳ測定によって比較した。粒径、ＰＤＩ及び計数は、実質的に同一であった（図２４Ａ）。ＰＦＰＥ−オキシド／Ｆ６８／ＰＥＩ乳濁液は、優れた安定性を示した。ＰＦＰＥ−オキシド／Ｆ６８／ＰＥＩ乳濁液をＤＬＳによって２５０日間モニターして、その安定性を３つの異なる温度４、２５及び３７℃で評価した。図２４Ｂに示すように、ＰＦＰＥ−オキシド乳濁液は、全３つの温度でこの時間経過にわたって粒径変化を示さなかった。ＰＦＰＥ−オキシド／Ｆ６８／ＰＥＩは、極めて低いＰＤＩ（＜０．１）を有する高安定性乳濁液である。図４２に示すように、この乳濁液は、ジャーカット細胞において、再現性のある用量依存的取り込みを示した。
【０４１４】
ＰＦＰＥジエチルアミド及びＰＦＰＥ−オキシド乳濁液の１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルを比較した（図２５）。これら２種類の材料の主ＰＦＰＥピークは、同じ化学シフト（−９１．０ｐｐｍ）にあり、したがって、ＰＦＰＥオキシド１ａは、１９Ｆ  ＭＲＩ画像化に対して、ＰＦＰＥ−ジエチルアミドと互換的に使用することができる。
【０４１５】
微少溶液操作による硫酸プロタミンを含むナノエマルジョン
ＰＦＰＥアミド１／Ｆ６８／硫酸プロタミン：
ＰＥＩは、細胞におけるはるかに改善された取り込みを与え、乳化プロセス中に超音波処理又は微少溶液操作によってナノエマルジョンに直接組み入れることができる。しかし、このポリアミンはヒトへの適用がＦＤＡによって認可されていない。したがって、硫酸プロタミンを微少溶液操作による高安定性ナノエマルジョンの調製に導入した。硫酸プロタミンをプレエマルジョン中の界面活性剤（Ｆ６８）とＰＦＰＥの混合物に水溶液として添加し、微少溶液操作処理中にナノエマルジョン液滴に組み入れる。硫酸プロタミンとＰＦＰＥの比は、０．０１％〜１％ｗ／ｗとすることができる。この量のＰＦＰＥは、ゼータ電位の符号を正に変えずに、かなりの取り込み増加をもたらす。
【０４１６】
ＰＦＰＥアミド及びＰＦＰＥオキシド（１ａ）を、硫酸プロタミンを用いた微少溶液操作によって乳化させた。目標は、処理中にプロタミン被覆粒子を調製すること、及びそれを細胞標識化に使用する前に乳濁液粒子をこの材料で被覆する余分なステップを回避することであった。ＰＦＰＥアミド１（３．４ｇ、２ｍＬ）を、Ｆ６８（水溶液１．３６ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ）及び硫酸プロタミン（水溶液０．５ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、ＰＦＰＥに対して０．０６％ｗ／ｗ）と一緒にボルテックス撹拌することによって混合した。水を添加し（５ｍＬ）、ボルテックス撹拌を１分間繰り返した。残りの水（１５ｍＬ）を添加し、乳濁液を微少溶液操作前に３０秒間再度ボルテックス撹拌した。処理室を氷冷しながら、２０〜４０パルスを用いて（液圧１２０００〜１６０００ｐｓｉに相当する）使用空気圧８０〜１００ｐｓｉで乳濁液を微少溶液操作した。各パルスは、処理室を１回通過することからなる。
【０４１７】
硫酸プロタミンを含む／含まないＰＦＰＥオキシド（１ａ）／Ｆ６８：
硫酸プロタミンを含むものと含まないものの２種類のＰＦＰＥ−オキシド乳濁液を調製した。ＰＦＰＥアミドに対して上述したのと同様に乳濁液を調製した。ＰＦＰＥオキシド１ａ（４ｍＬ）をＦ６８溶液（２．７２ｍＬ）と一緒に５０ｍＬ管に添加し、混合物を最高速度で１分間ボルテックス撹拌した。次いで、硫酸プロタミン溶液（１ｍＬ）を添加し、混合物を最高速度で１分間再度ボルテックス撹拌した。硫酸プロタミンを添加しない場合、脱イオン水１ｍＬをこの段階で添加した。次に、水１２ｍＬを添加し、溶液を最高速度で１分間再度ボルテックス撹拌した。次いで、乳濁液をマイクロフルイダイザーの試料採取室に移し、プランジャーで加圧し、空気圧８０〜９０ｐｓｉで正確に４０回パルスしながらプランジャーを堅く保持した。パルス数４０で生成物を放出した。この小さな規模では、配管及び処理室にデッドボリュームが存在した。水５ｍＬを添加し、残留生成物を徐々に流出させた。体積を最後に必要に応じて水２５ｍＬで調節した。この方法を１００ｍＬの規模に使用し、４つの２５ｍＬバッチを最後に混合した。バッチを、前処理なしで、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製０．２ｕｍ  ＰＴＦＥ膜を備えたシリンジフィルターに通してすぐにろ過した。ＰＦＰＥ−オキシド／Ｆ６８ナノエマルジョン及びＰＦＰＥ−オキシド／Ｆ６８／硫酸プロタミンナノエマルジョンの品質保持期間を図５４に示す。データは、２５０日間にわたって、前述したように、ＤＬＳによって３つの異なる温度で測定された直径及び多分散性である。両方の乳濁液は、４℃で安定なままであった。ＰＦＰＥ−オキシド／Ｆ６８乳濁液は、より高い温度ではるかに早く分解し始め、次いでＰＦＰＥ−オキシド／Ｆ６８／硫酸プロタミン（それぞれ図５４Ａ及び５４Ｂ）。
【０４１８】
硫酸プロタミンを含むＰＦＰＥオキシド１ａ乳濁液は、硫酸プロタミンを含まないＰＦＰＥオキシド１ａ／Ｆ６８乳濁液に比べて、ＤＣへの取り込みがかなり増加した（図５５）。
【０４１９】
血清安定性試験：
ｉｎ  ｖｉｖｏ作業のためのすべての大規模乳濁液調製物は、理想的には、栄養素、培地及び関連する血清内容物の存在下で安定性試験を受けるべきである。これらの試験は、再現性のある信頼できる細胞標識化をｉｎ  ｖｉｔｒｏで与える無毒で安定な乳濁液の開発にとって極めて重要である。乳濁液をＤＬＳ測定によって血清及び細胞培地栄養素の存在下で３７℃で試験した。乳濁液を、１０％ＦＢＳを含む細胞培養培地と細胞標識化濃度で混合し、３７℃で１、３及び２４時間インキュベートした。各時点後、乳濁液をＤＬＳによって試験した。図２６に示すように、粒径及びＰＤＩが最初に同じであっても、血清の存在下で、ＰＦＰＥオキシド１ａ乳濁液は、はるかにより安定であり、次いでＰＦＰＥアミド１乳濁液。
【０４２０】
高処理圧力における微少溶液操作による「ブレンド」ＰＦＰＥオイルからのナノエマルジョン
下記乳濁液調製物はすべて、ＰＦＰＥオキシド１ａと更にブレンドされた２又は３種類のＰＦＰＥ誘導体（ＰＦＰＥアミド、ＰＥＧ  ＰＦＰＥアミド又はＦＢＰＡ）を使用する。ＰＦＰＥオキシド１ａの添加によって、より良好な血清及びｉｎ  ｖｉｖｏ安定性が得られる。これはすべて、ＰＦＰＥがそれ自体と最も良く混ざり、それ自体のフッ化炭素オイル相を形成することに依拠する。ＰＦＰＥ類は比重が類似しており、１．５〜１．７ｇ／ｍＬの範囲であることも重要である。
【０４２１】
ブレンドＰＦＰＥオイル乳化を、まず、ＰＦＰＥアミド１とＰＦＰＥオキシド１ａをブレンドして１つのフッ素化オイル相にすることによって試験した。次いで、フッ素化オイル相を微少溶液操作によるナノエマルジョン調製に使用した。
【０４２２】
上記ＦＩＴＣ、ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ及びＡｌｅｘａ６４７色素を含むＦＢＰＡもＰＦＰＥオキシド１ａと混合し、微少溶液操作による蛍光性ナノエマルジョン調製に使用した。
【０４２３】
ＰＦＰＥオイル、ＦＢＰＡ又はＰＦＰＥアミド及びＰＦＰＥオキシド１ａを、最高速度で５分間連続ボルテックス撹拌し、続いてＦ６８及びＰＥＩ（又は硫酸プロタミン）水溶液と混合し、次いで微少溶液操作することによってまずブレンドした。マイクロフルイダイザーの相互作用チャンバー内に加えられた高い力学的エネルギーによって、ＰＦＰＥ疎水性油が水中に分散し、単分散ナノエマルジョンが生成する。ＰＦＰＥオキシド１ａとＰＦＰＥアミド１を比９／１ｖ／ｖで混合することによって、非蛍光性ＰＦＰＥナノエマルジョンを調製した。蛍光性ナノエマルジョンをＰＦＰＥオキシド１ａとＦＢＰＡから９／１ｖ／ｖ比で調製した。すべてのナノエマルジョンをフィルター滅菌し（ＰＴＦＥフィルター、孔径０．２２ｍｍ）、細胞標識化のために使用するまで４℃で貯蔵した。液圧約１５０００〜２００００ｐｓｉ（作用空気圧８０〜１００ｐｓｉ）で作動するマイクロフルイダイザー（登録商標）Ｍ１１０Ｓ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）を「ブレンド」ＰＦＰＥオイルナノエマルジョン調製に使用した。ＰＦＰＥオイル（ＦＢＰＡ又はＰＦＰＥアミド１及びＰＦＰＥオキシド１ａ）をＦ６８濃縮水溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）と高速で２分間ボルテックス撹拌することによってまず混合し、次いでポリエチレンイミン（ＰＥＩ）水溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）と２分間ボルテックス撹拌することによって混合した。混合物を水で２５ｍＬに希釈し、続いて微少溶液操作した。２０〜４０パルス後、最終ナノエマルジョン生成物を収集容器に流出させ、室温で２０分間静置し、続いてＰＴＦＥ（０．２μｍ）フィルターを用いて滅菌した。乳濁液を使用まで４℃で貯蔵した。
【０４２４】
蛍光性ブレンドＰＦＰＥナノエマルジョンＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ  ＰＦＰＥアミド／ＰＦＰＥオキシド１ａ／Ｆ６８／ＰＥＩを使用して、一次Ｔ細胞を標識した。図５６に、標識されたＴ細胞の共焦点顕微鏡法を示す。ＦＩＴＣ  ＰＦＰＥアミド／ＰＦＰＥオキシド１ａ／Ｆ６８／ＰＥＩナノエマルジョンも細胞標識化のために使用した。図５８に、標識されたＤＣを示す。緑色蛍光は、ＦＩＴＣ  ＰＦＰＥナノエマルジョンの細胞質局在を示す。さらに、ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ  ＰＦＰＥで標識されたジャーカット細胞は、蛍光と１９Ｆ  ＮＭＲ信号の線形相関を示す（図５７）。
【０４２５】
ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ  ＰＦＰＥナノエマルジョン調製物：
ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ  ＰＦＰＥアミドオイル（０．２０ｍＬ）とＰＦＰＥオキシド１ａ（１．８０ｍＬ）を、高で５分間ボルテックス撹拌することによってまず混合して、ブレンドＰＦＰＥオイル中のＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ色素の最終濃度０．４６ｍＭを得た。次いで、蛍光標識されたＰＦＰＥオイルをＦ６８水溶液（１．３６ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ）と混合し、２分間ボルテックス撹拌した。この混合物に、ＰＥＩ水溶液（１．０４ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ）を添加し、ボルテックス撹拌を最高速度で２分間繰り返した。水を最終体積２５ｍＬに添加し、短時間ボルテックス撹拌後、混合物をマイクロフルイダイザーの試料室に装填した。２０パルス後、最終乳濁液を流出させた。調製したナノエマルジョンを使用まで４℃で貯蔵した。
【０４２６】
Ａｌｅｘａ６４７  ＰＦＰＥ及びＦＩＴＣ  ＰＦＰＥナノエマルジョン調製物：
同じ手順に従って、Ａｌｅｘａ６４７  ＰＦＰＥアミド及びＦＩＴＣ  ＰＦＰＥアミドを蛍光性ナノエマルジョン調製物のために使用した。各場合において、処理の残りの部分を上記ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ  ＰＦＰＥアミドと同様に実施しながら、同体積のＦＢＰＡ（０．２ｍＬ）をＰＦＰＥオキシド１ａ（１．８ｍＬ）と一緒にボルテックス撹拌することによって混合した。
【０４２７】
ＰＦＰＥアミド１／ＰＦＰＥオキシド１ａナノエマルジョン調製物：
上記と同じ手順に従って、ＰＦＰＥアミド１とＰＦＰＥオキシド１ａをボルテックス撹拌によってブレンドし、次いで微少溶液操作による乳濁液調製のために使用した。
【０４２８】
ナノエマルジョン液滴直径（Ｚ平均）及び多分散性（ＰＤＩ）を動的光散乱（ＤＬＳ）測定によって経時的にモニターすることによって、すべての蛍光性及び非蛍光性「ブレンド」ＰＦＰＥオイルナノエマルジョンを３つの温度（４、２５及び３７℃）で安定性試験した。粒径は、ＰＦＰＥアミド１／ＰＦＰＥオキシド１ａブレンドナノエマルジョンでわずか１４０ｎｍと最低であり、蛍光性バージョンは、色素（ＦＩＴＣ、ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ又はＡｌｅｘａ６４７）にかかわらず、平均液滴サイズ１６０〜１９０ｎｍであった。すべての乳濁液は、首尾よく無菌ろ過され、３７℃で少なくとも３か月、４及び２５℃で少なくとも６か月、安定であった。血清安定性は、これらの乳濁液調製物のために使用されたブレンドＰＦＰＥオイル中のＰＦＰＥアミド１及びＦＢＰＡの存在によって影響されず、ＰＦＰＥオキシド１ａ単体を用いて調製した乳濁液の血清安定性と実質的に同じであった。
【０４２９】
一緒にブレンドされた線状ＰＦＰＥオイルとペルフルオロ−１５−クラウン５エーテルを用いて微少溶液操作によって調製されたブレンドＰＦＰＥオイルナノエマルジョン
上述したように、複数のＰＦＰＥオイルをブレンドすることは、多数の利点がある。ＰＦＰＥアミド１、ＦＢＰＡ及びＰＦＰＥオキシド１ａは、互いに容易に混ざり、ナノエマルジョン調製物において慎重なフッ素化オイル相として振る舞う。これらの乳濁液は、安定性が高く、小さい平均液滴サイズ及びＰＤＩを有する。ペルフルオロ−１５−クラウン５エーテルは、−９１．５から−９２．０ｐｐｍにおいて線状ＰＦＰＥ主ピークのＣＦ２ＣＦ２Ｏ繰り返し共鳴と重複する単一の共鳴を与える２０個の等価なフッ素核を有する化学的に極めて安定であり生物学的に不活性な大環状分子である。線状ＰＦＰＥオキシド１ａにかなり類似した密度、わずかに低い粘度を有するこの透明なオイル。更なる化学修飾及び複合化をすることができない、線状ＰＦＰＥ誘導体（例えば、ＦＢＰＡ及びＰＦＰＥアミド）をペルフルオロ−１５−クラウン５エーテルとブレンドすることによって製造されるナノエマルジョンを検討した。この手法によって、蛍光性ペルフルオロ−１５−クラウン５エーテル乳濁液を利用することができる。ある実施形態においては、ナノエマルジョン液滴の大多数は、線状ＰＦＰＥ誘導体に比べてクラウンエーテルを含む（例えば、ナノエマルジョン液滴は、線状ＰＦＰＥ誘導体に比べてクラウンエーテル７５％〜９５％を含む。）。
【０４３０】
ブレンド線状ＰＦＰＥ及びクラウンエーテルナノエマルジョンの一般的手順：
線状ＰＦＰＥオイル、ＦＢＰＡ又はＰＦＰＥアミド又はＰＦＰＥオキシド１ａを、最高速度で５分間連続ボルテックス撹拌し、続いてＦ６８及びＰＥＩ（又は硫酸プロタミン）水溶液と混合し、次いで微少溶液操作することによって、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと一緒にまずブレンドする。高い疎水性及び疎油性のために、線状及び大環状ＰＦＰＥは、１つのフッ化炭素相として一緒に留まる。線状ＰＦＰＥとクラウンＰＦＰＥの比は（９９：１から７５：２５）である。線状ＰＦＰＥは、さもなければ不可能なこのブレンドオイル中のＰＦＰＥクラウンエーテルに官能基（蛍光色素）を導入する。同じ手法を使用して、脂質、ｃｒｅｍａｐｈｏｒオイル、又は別のタイプのイオン及び非イオン界面活性剤を用いて調製されたペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルナノエマルジョンに蛍光色素を導入することができる。ブレンドオイルの調製は、ＦＢＰＡ乳濁液に対して上述したのと同じ方法に従って容易に拡大縮小できる。
【０４３１】
ブレンドＰＦＰＥアミド１及びペルフルオロ−１５−クラウンエーテルを用いて調製されたナノエマルジョンの例。ＰＦＰＥアミド１オイル（０．２０ｍＬ、１．２５％ｗ／ｗ）とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテル（１．８０ｍＬ、１２．７５％ｗ／ｗ）を高で５分間ボルテックス撹拌によってまず混合して、２種類のオイルの均一なブレンドを得た。次いで、ブレンドオイルをＦ６８水溶液（１．３６ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ）と混合し、２分間ボルテックス撹拌した。この混合物に、硫酸プロタミン水溶液（０．５３ｍＬ、１８．７５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、ボルテックス撹拌を最高速度で２分間繰り返した。水を最終体積２５ｍＬに添加し、短時間ボルテックス撹拌後、混合物をマイクロフルイダイザーの試料室に装填した。乳濁液を使用空気圧８０ｐｓｉで微少溶液操作した。３０パルス後、最終乳濁液を流出させた。調製したナノエマルジョンを、ナイロンフィルターを通したろ過によって滅菌し、使用まで４℃で貯蔵した。この乳濁液の粒径は１６０ｎｍであった。乳濁液は血清添加培地の存在下で３７℃で３時間安定であった。この乳濁液の非食細胞への取り込みは、本文で先に報告したＰＦＰＥオキシド１ａ／Ｆ６８／硫酸プロタミンナノエマルジョンの場合と同じであった。
【０４３２】
低エネルギー乳化例：
先の例は、ＰＦＰＥアミド１又はＰＦＰＥオキシド（１ａ）を水性媒体中で脂質又はＰｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）の存在下で乳化するときに高エネルギーが必要であることを示した。これらの例では、本発明者らは、単純なＰＦＰＥ末端基修飾によって、超音波処理又は微少溶液操作なしでＰＦＰＥ乳化が可能であることを示した。目標は、親油性又は親水性部分をＰＦＰＥ末端基上に導入することによって、乳化剤の存在下又は非存在下で自己乳化を促進するＰＦＰＥ誘導体を開発することであった。低エネルギー乳化方法は、より大きい規模の製造に容易に利用することができ、乳化処理コストを削減することができる。２種類のかかるＰＦＰＥ誘導体は、ほえるを示す。
【０４３３】
薄膜法によるＰＦＰＥ−チラミド６／Ｆ６８乳濁液：
ＰＦＰＥ−チラミド６（５０ｍｇ）及びＦ６８（８．５ｍｇ）をトリフルオロエタノール（０．５ｍＬ）に溶解させ、ボルテックス撹拌した。溶液を丸底ガラス管中で乾燥させて薄膜にし、減圧下に１５分間置いた。フィルムを水１ｍＬと一緒にボルテックス撹拌し、６０℃で１５分間加熱し、次いで高でボルテックス撹拌しながら室温に冷却した。段階希釈がなされ、範囲は水中で１／１から１／３２を形成し、ＤＬＳは実施された測定であった。臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、光散乱強度及び粒径をＰＦＰＥチラミド６濃度の関数としてプロットすることによって、この系のＰＦＰＥチラミド６では４．５ｍｇと推定された（図２７）。ＰＦＰＥ−チラミド６／Ｆ６８のモル比は２４：１であった。この乳濁液をＤＬＳによって３週間モニターして、安定性を試験した。乳濁液を室温で保持し、光及び空気から保護した。図２８に示すように、粒径及びＰＤＩは、３週間一定であった。
【０４３４】
ＰＦＰＥ（２−ヒドロキシル）エチルオキシエチルアミド２／Ｆ６８乳濁液：
ＰＦＰＥ（２−ヒドロキシル）エチルオキシエチルアミド２をＰＦＰＥ−チラミド誘導体の代替として検討した。２−ヒドロキシル）エチルオキシエチルアミド末端基の存在は、低エネルギー条件下でＰＦＰＥ自己乳化を促進するものであった。この誘導体は、水中でＰｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）の存在下で低温で容易に乳化することが見いだされた。ＰＦＰＥアミド誘導体２（５０ｍｇ）及びＦ６８（８．５ｍｇ）をトリフルオロエタノールに溶解させ、アルゴン気流によって乾燥させて薄膜にした。ボルテックス撹拌しながら、水又は１×  ＨＢＳＳ（１ｍＬ）を添加した。次いで、乳濁液を２分割し、一方を６０℃で１５分間インキュベートし、他方を室温で放置した。Ｆ６８を用いた乳化に対する緩衝剤及び温度の効果をＤＬＳ測定によって検討した。ＰＦＰＥアミド誘導体２は、適用した方法によってＦ６８なしで乳濁液を形成することができなかった。図２９に示すように、温度は、粒径にもＰＤＩにも影響しなかった。しかし、１×  ＨＢＳＳ緩衝剤中の塩の存在は、粒径を増加させた。この例は、構造及び組成が低エネルギー乳化方法によってＰＦＰＥの乳化性をもたらすことを説明する。ＰＦＰＥ乳化に影響する因子としては、例えば、ＰＦＰＥ末端基の性質（すなわち、親油性又は親水性）、乳化剤、外相、及び緩衝剤中の塩の存在が挙げられる。
【０４３５】
全体として、多面的なＭＲＩ／ＭＲＳ細胞標識化試薬を提供するために、単純で有効な化学修飾が開発された。ＰＦＰＥは、二重蛍光性１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳ試薬、自己送達性ＰＦＰＥナノ粒子、及び食細胞と非食細胞の両方のタイプにおいて効率の高い取り込みを示すナノ粒子を含めて、種々のナノ粒子のための用途の広い出発材料であることが判明した。ＰＦＰＥ−ＰＥＧ誘導体は、細胞内取り込みが不要であり長期の循環安定性が必要である直接注射実験に使用することができる。ＰＦＰＥ−ＰＥＩ、ＰＦＰＥ−硫酸プロタミンなどを効率的な細胞の標識化に使用することができる。微少溶液操作は、ＰＦＰＥナノ粒子調製のための極めて有効な方法であり、乳濁液の大規模製造（＞１Ｌ）が可能である。製造された乳濁液は、典型的な貯蔵温度（４及び２５℃）及び体温（３７℃）で極めて安定であった。乳化プロセスの単純な変更、及びＰＦＰＥ末端基の単純な化学修飾によって、具体的な細胞型及び用途に対してナノ粒子の諸性質を微調整することができる。
【０４３６】
ブレンドＦＢＰＡ（ＦＩＴＣ又はＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ  ＰＦＰＥアミド）及びペルフルオロ−１５−クラウンエーテルを用いて調製されたナノエマルジョンの例：
ＦＢＰＡ（ＦＩＴＣ  ＰＦＰＥアミド又はＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ  ＰＦＰＥアミド）オイル（０．２０ｍＬ、１．２５％ｗ／ｗ）とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテル（１．８０ｍＬ、１２．７５％ｗ／ｗ）を高で５分間ボルテックス撹拌によってまず混合して、２種類のオイルの均一なブレンドを得た。次いで、ブレンドオイルをＦ６８水溶液（１．３６ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ）と混合し、２分間ボルテックス撹拌した。この混合物に、硫酸プロタミン水溶液（０．５３ｍＬ、１８．７５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、ボルテックス撹拌を最高速度で２分間繰り返した。水を最終体積２５ｍＬに添加し、短時間ボルテックス撹拌後、混合物をマイクロフルイダイザーの試料室に装填した。乳濁液を使用空気圧８０ｐｓｉで微少溶液操作した。３０パルス後、最終乳濁液を流出させた。調製したナノエマルジョンを、ナイロンフィルターを通したろ過によって滅菌し、使用まで４℃で貯蔵した。この乳濁液の粒径は１６５ｎｍであり、ＰＤＩは０．０６であった。乳濁液は血清添加培地の存在下で３７℃で３時間安定であった。乳濁液は貯蔵温度３７℃で５か月間安定であり、サイズもＰＤＩも変化しなかった。非食細胞の標識化効率（９Ｌ、ラット神経こう腫細胞系）は、上記ＰＦＰＥオキシド１ａ／Ｆ６８／硫酸プロタミンナノエマルジョンと同じであった。非食９Ｌ細胞の標識化を図６０に示す。
【０４３７】
混合ミセル及びＰＦＰＥを用いて微少溶液操作によって調製された製剤
マクロファージ及び他の食作用性免疫細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で特異的に標識するように以下の乳濁液を設計した。濃縮ＰＥＧ含有ナノエマルジョン液滴表面は、食作用能力を欠く細胞におけるナノエマルジョン取り込みを防止した。ＰＥＧが濃縮された表面は、当分野で周知である２種類の界面活性剤ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ１０５及びＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬによって導入された。Ｐ１０５及びＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬを用いて混合ミセル溶液をまず調製し、微少溶液操作中に高せん断力によってＰＦＰＥブレンドオイルをミセルに組み入れた。生成した乳濁液は、高い安定性を示し、ＲＡＷ  ２６４．１マクロファージ細胞系に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで極めて特異的な標識化活性を示した。
【０４３８】
ブレンドＦＢＰＡ（ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ  ＰＦＰＥアミド）又はＰＦＰＥアミド１、及びＰＥＧ濃縮表面を有するペルフルオロ−１５−クラウンエーテルを用いて調製されたナノエマルジョンの例：
Ｐ１０５  ｐｌｕｒｏｎｉｃとＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬを２／３ｗ／ｗ比で含む無菌食塩水中で混合ミセル溶液をまず調製した。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ１０５（４ｇ）を室温で低速撹拌することによって規定無菌食塩水（０．９％ＮａＣｌ）１００ｍＬに溶解させて、最終濃度４％ｗ／ｖにした。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（６ｇ）を室温で撹拌することによって規定無菌食塩水１００ｍＬに溶解させて、最終濃度６％ｗ／ｖにした。４５℃に予熱した水バッチに入れた丸底フラスコ中で２つの溶液を室温で１／１ｖ／ｖ比で混合し、低速回転させながら１５分間インキュベートした。次いで、溶液を５〜１０分間氷冷した。調製した混合ミセル溶液は、平均サイズ１２．３ｎｍ及びＰＤＩ  ０．１７のミセル粒子を含んだ。この混合ミセル溶液を以下のようにＰＦＰＥナノエマルジョンの調製に使用した。
【０４３９】
ＰＦＰＥアミド１又はＦＢＰＡ（ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ  ＰＦＰＥアミド）オイル（０．２０ｍＬ、１．２５％ｗ／ｗ）とペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテル（１．８０ｍＬ、１２．７５％ｗ／ｗ）を高で５分間ボルテックス撹拌によってまず混合して、２種類のオイルの均一なブレンドを得た。次いで、ブレンドオイルを、高速で２〜３分間ボルテックス撹拌することによって混合ミセル溶液１１．５ｍＬと混合した。食塩水を添加し（１１．５ｍＬ）、短時間ボルテックス撹拌後、混合物をマイクロフルイダイザーの試料室に装填した。処理室を氷／水浴上で冷却しながら、乳濁液を使用空気圧８０ｐｓｉで微少溶液操作した。２０パルス後、最終乳濁液を流出させ、使用まで４℃で貯蔵した。平均液滴サイズは１３０〜１５０ｎｍであり、ＰＤＩは０．０５〜０．１であった。乳濁液は血清添加培地の存在下で３７℃で２４時間まで安定であった。保存安定性試験によれば、サイズ及びＰＤＩは、貯蔵温度４℃で３か月間不変であった。乳濁液を使用して、２４時間の共インキュベーションによって、ＲＡＷ２６４．１細胞（ラットマクロファージ由来細胞系）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで標識した。細胞生存率は８０％以上であった。ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ  ＰＦＰＥアミドＰ１０５／Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ乳濁液を用いたＲＡＷ２６４．１細胞の用量依存的標識化を図６１に示す。標識されたＲＡＷ細胞のフッ素ＮＭＲスペクトルを図６２に示す。
【０４４０】
ＰＦＰＥ／Ｐ１０５／Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ乳濁液の示した２つの例は、非食細胞を標識せず、マクロファージを特異的に標識した（データ示さず）。これは、細胞膜とナノエマルジョン液滴の相互作用を立体的に束縛した粒子表面の高密度のＰＥＧモノマーのためであった。この立体障害（ｈｉｎｄｅｒｅｎｃｅ）のために、マクロファージの細胞標識化は２４時間かかり、より長く、次いで先に示した例における。
【０４４１】
化合物４２を用いて調製されたナノエマルジョンの例：
混合ミセル溶液を以下のように調製した：Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ１０５（５ｇ）を水１００ｍＬに室温で低速撹拌することによって溶解させて、最終濃度５％ｗ／ｖにした。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（５ｇ）を室温で撹拌することによって水１００ｍＬに溶解させて、最終濃度５％ｗ／ｖにした。４５℃に予熱した水浴に入れた丸底フラスコ中で２つの溶液を室温で１／１ｖ／ｖ比で混合し、低速回転させながら２０分間インキュベートした。次いで、溶液を５〜１５分間氷冷し、使用まで室温で貯蔵した。混合ミセル溶液の最終濃度は５％ｗ／ｖであった。２．５％ｗ／ｖはＰ１０５であり、２．５％ｗ／ｖはＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬであり、１／１ｗ／ｗ比であった。混合ミセル溶液を、超音波処理による化合物４２ナノエマルジョン調製に使用した。
【０４４２】
すべてのナノエマルジョンを超音波処理によって調製した。超音波処理中に、化合物４２は混合ミセルのコアに仕込まれた。最適な細胞標識化に必要な界面活性剤量を最適化した。表１に示すように、一連のナノエマルジョンを調製した。手短に述べると、無色透明オイルより重い次いで水である化合物４２を超音波処理管にまず添加し、続いて種々の量のミセル溶液及び水を添加し、短時間ボルテックス撹拌し、次いで室温で超音波処理した。フッ化炭素量は２２．３％一定に維持され、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ及びｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ１０５の各量は、乳濁液Ａ１における４％ｗ／ｖから乳濁液Ａ４における１％まで変動した。表１に示すように、界面活性剤量が増加すると、ナノエマルジョンの液滴サイズが減少した。
【０４４３】
【表１】
0005645658.tif 000086
３．蛍光性及び非蛍光性ＰＦＰＥナノエマルジョンを用いた細胞標識化実験
ナノエマルジョンを用いた細胞標識化は、胎児の皮膚由来のマウスＤＣ系を用いた食細胞と、一次Ｔ細胞及びジャーカット細胞を含めた非食細胞の両方で実証された。試験したすべての細胞型において、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＲＩに適切なレベルの乳濁液取り込み（すなわち、＞１０１１）が、適度な３時間のインキュベーション時間で達成された。ナノ粒子の細胞内局在を蛍光顕微鏡法によって可視化した。ナノエマルジョン液滴の細胞内取り込みを、溶解細胞ペレットの蛍光測定及び１９Ｆ  ＮＭＲ分光法によって定量化した。取り込みを１９Ｆ  ＮＭＲによって試験した。ＰＦＰＥ標識された細胞は、−９１．５８ｐｐｍに主要なピークを示し、−７６．００ｐｐｍピークは、溶解細胞ペレットに添加されたＴＦＡ基準に由来する。これら２つのピーク下の積分面積を使用して、１０１１〜１０１３の範囲であることが多い平均１９Ｆ／細胞（実験の項参照）を計算することができる。同じ手法を使用して、試験したすべての細胞型における取り込みを評価した。
【０４４４】
細胞数及び生存度：
ＰＦＰＥ標識化後の細胞生存率は、種々の因子に依存し得る。例えば、これらとしては、使用するＰＦＰＥ誘導体、乳濁液調製に使用する界面活性剤、脂質の存在、粒径、乳濁液の血清安定性、及び洗浄効率を挙げることができる。フッ化炭素標識された細胞の細胞数及び生存度のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、当分野で周知である。
【０４４５】
下記例においては、商業的アッセイＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞数を推定した。アッセイの実施は容易であり、再現性が高い。各標識化実験に対して実験当日に同じ細胞培養物を用いて相関曲線を作成した。標識化後生存度を試験するときには、少量の試料（５０μＬ）を標識細胞懸濁液から取り、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ試薬と３つ組で混合した。発光を１０分以内に測定し、実験当日に用意した線形相関曲線から生細胞数を推定した。
【０４４６】
良好なＤＬＳプロファイル（すなわち、小粒径及び低ＰＤＩ）に加えて、毒性及び血清不安定性は、新規開発したＰＦＰＥ製剤の重要なスクリーニング判定基準であることが多い。ＰＦＰＥ／ＣＴＡＢ／Ｌ３５乳濁液は、高毒性のために更なる開発が中止された例であった。毒性は、細胞が標識化後１時間以内に分離した最低用量でも、主にＣＴＡＢに起因した。安全な乳濁液用量は低すぎて、有用な標識化を与えることができなかった。
【０４４７】
ＰＦＰＥ／Ｌ３５及びＰＦＰＥ／Ｆ６８の各組合せは、有用な細胞標識化製剤の例であった。Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）Ｌ３５及びＦ６８は、細胞に単独で投与すると無毒であった。ポリアミン、ＰＥＩ又は硫酸プロタミンと一緒に、さらに、ポリアミン、ＰＥＩ又は硫酸プロタミンなしで、Ｌ３５又はＦ６８  Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）を用いて、種々のＰＦＰＥ誘導体の細胞標識化効率を試験した。
【０４４８】
ＰＦＰＥ標識された細胞を９６ウェルプレートに未処理対照と同じ密度で再度蒔き、その生存度をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏによって毎日試験することによって、標識された細胞を５日間追跡して、標識された細胞の長期生存度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。成長曲線を作成した。標識された細胞と非標識細胞は、同じ成長プロファイルを有し、ＰＦＰＥ標識が無毒であることが確認された。図３７に、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏによって測定され、３つ組で実施された、幾つかの異なるＰＦＰＥ製剤で標識されたジャーカット細胞の成長を示す。
【０４４９】
３．１．付着細胞のＰＦＰＥ標識化
公表された方法に軽微な変更を加えて、マウス樹状細胞の標識化を実施した３５。樹状細胞を６ウェルプレートに１〜２×１０６／ウェルで蒔き、終夜付着させた。ＰＦＰＥジエチルアミド１／Ｌ３５乳濁液を無血清培地０．３ｍＬと混合し、室温で３０分間インキュベートし、次いで細胞に添加した。３７℃で３時間インキュベーション後、細胞標識化媒体を除去し、細胞を１×  ＰＢＳで３回洗浄し、トリプシン処理によって分離させ、洗浄し、１０％ＦＢＳを含む完全培地０．５ｍＬに再懸濁させた。細胞懸濁液（１／１０）の一部をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏによる細胞数推定に使用した。細胞をペレット化し、１９Ｆ  ＮＭＲ測定用媒体０．１ｍＬに再懸濁させて、細胞負荷を評価した。
【０４５０】
１９Ｆ  ＮＭＲによるＰＦＰＥ取り込み測定：
樹状細胞を使用するときには、細胞懸濁液（０．１ｍＬ）を較正済み１９Ｆ基準としてグリセロール中の１％ＴＦＡ溶液１００ｕｌと混合した。２つの溶液を十分混合し、５ｍｍ  ＮＭＲ管に移した。細胞取り込みを−９１．５ｐｐｍのピーク（ＰＦＰＥ主ピーク）と−７６ｐｐｍのＴＦＡ内部標準ピーク下の相対面積から計算した。細胞内取り込み（すなわち、パラメータＦｃ）を単一生細胞１個当たりの平均フッ素原子数として計算した。
【０４５１】
ＰＦＰＥ／Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）乳濁液の取り込み：
異なるＰＦＰＥ誘導体が、Ｌ３５と同様に処方されたときに細胞取り込みに影響を及ぼす仕方の例を図３２Ｂに示す。例えば、ＰＦＰＥエステルの非加水分解性アミド（モルホリノ又はジエチルアミド）への改変は、両方の細胞内取り込みを明らかに改善し、より低毒性であり、次いでＰＦＰＥ−エステル／Ｌ３５乳濁液。
【０４５２】
食細胞において硫酸プロタミンによって促進されるＰＦＰＥの取り込み：
樹状細胞における取り込みを更に改善するために、本発明者らは硫酸プロタミンを使用した。硫酸プロタミン溶液を、無血清培地で希釈された調製乳濁液と混合した。室温で３０分間インキュベーション後、細胞をこの混合物で３時間処理した。硫酸プロタミンを希釈乳濁液に添加すると、乳濁液粒径はわずかに増加したが（図１８）、液滴表面の正に帯電したアミノ基の存在が細胞内取り込みを容易にした。図３３に示すように、ＰＦＰＥアミド／Ｌ３５とＢＯＤＩＰｙ−ＰＦＰＥアミド／Ｌ３５の両方の乳濁液取り込みは、硫酸プロタミンを使用すると数倍改善された。細胞生存率は優れており、標識された細胞対非標識細胞の形態学的変化は光学顕微鏡法では認められなかった。
【０４５３】
ＰＦＰＥ−チラミドは取り込みを容易にした：
ＰＦＰＥ−チラミドは、細胞内取り込みを促進するように設計された新規ＰＦＰＥ誘導体である。ＰＦＰＥ−チラミドは、Ｆ６８を用いて上記低エネルギー方法によって容易に乳化する。ＰＦＰＥチラミドは、種々の用量で無毒であり、１９Ｆ  ＮＭＲによって測定された取り込みは、図３４に示すように、線形の用量依存を示した（Ｒ２＝０．９３）。取り込みは、硫酸プロタミンを用いて促進された細胞標識化実験と類似した。これは、小分子とのＰＦＰＥ複合化によって標的細胞に自己送達可能であるように設計された第１のＰＦＰＥ誘導体である。ＰＦＰＥ−チラミドは、多数の追加の複合化製剤の基盤としても役立ち、ＰＦＰＥは、小分子及びペプチドによって培養中又は体内の特定の細胞型に向けることができ、ＰＦＰＥターゲティングの実行可能性を示している。
【０４５４】
４．懸濁状態の細胞のＰＦＰＥ標識化
ＰＦＰＥアミド１及びＰＦＰＥオキシド１ａの各乳濁液を使用して、懸濁状態の細胞を標識した。これらの乳濁液は、１９Ｆ  ＮＭＲによって測定して、用量依存的な標識化を示した。例えば、大部分の免疫細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養すると、懸濁状態で成長する。懸濁状態の細胞標識化を成功させるためには、粒子多分散性が重要である。細胞を乳濁液液滴と混合し、サイズ及びＰＤＩが小さいときには、混合は均一であり、均一な細胞標識化が容易である。微少溶液操作によって調製されたＰＦＰＥアミド１及びＰＦＰＥオキシド１ａの各乳濁液は、これらの判定基準を満たした。
【０４５５】
ジャーカット細胞：
ジャーカット細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）をモデル細胞系として使用して、懸濁状態の細胞のフッ化炭素標識化を評価した。これらの細胞は、ＡＴＣＣプロトコルに従って維持された。無血清培地中で調製された乳濁液希釈物と混合することによって、懸濁細胞を２０％ＦＢＳ培地１ｍＬ中で１〜２×１０６細胞／ｍＬで標識した。３７℃で３時間インキュベーション後、細胞を１２００ｒｐｍで遠心沈降させ、培地で２回洗浄した。細胞を培地０．５ｍＬに再懸濁させる。細胞懸濁液（１／９）の一部をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏによる細胞数推定に使用した。次いで、細胞懸濁液を遠心沈降させ、トリプシンのＰＢＳ溶液０．２ｍＬに再懸濁させ、室温で２時間インキュベートし、１９Ｆ  ＮＭＲ測定に使用した。溶解細胞懸濁液（０．２ｍＬ）を、５ｍｍ  ＮＭＲ管中でＰＢＳ中の基準ＴＦＡ溶液（０．２％ｖ／ｖ）と混合した。
【０４５６】
ＰＦＰＥアミド１、ＰＦＰＥオキシド１ａ及びブレンドＰＦＰＥナノエマルジョンの取り込みは、非食細胞においてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）によって促進された：
非食細胞における取り込みを更に改善するために、ＰＥＩをＰＦＰＥ微少溶液操作乳濁液調製物に使用した。乳濁液に添加された少量のＰＥＩは、ゼータ電位を負から正に逆転するには不十分であった。ゼータ電位は、ＰＥＩの存在下で−２６ｍＶであった。ゼータ電位の値は、乳濁液の細胞取り込み能力を予測するものではない。しかし、ＰＦＰＥ乳濁液液滴表面の第一級アミンの存在は、細胞取り込みをかなり増進させる。図４１に示すように、ＰＦＰＥ取り込みに対するＰＥＩのかなりの効果がジャーカット細胞において認められた。ＰＦＰＥ−ＰＥＩ乳濁液は、１９Ｆ／細胞と、優れた生存度プロファイルを有する媒体中の乳濁液の標識化用量との線形相関を示した（図４２）。
【０４５７】
一次Ｔ細胞：
国際公開第２００５０７２７８０号に記載のように、一次Ｔ細胞をマウスひ臓から単離した。フッ化炭素標識化前に、細胞をＩＬ−２によって３日間活性化した。Ｔ細胞を懸濁状態で標識し、ＰＢＳで３回洗浄し、１９Ｆ  ＮＭＲ測定のために再懸濁させた。非標識Ｔ細胞を用いて作成された相関曲線を用いて、生存度をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏによって評価した。標識化時のＰＦＰＥで標識されたＴ細胞の生存度は＞６０％であった。標識された細胞を蒔き、４８時間追跡すると、生存度は、非標識対照細胞の生存度に類似した。
【０４５８】
５．１．ＢＯＤＩＰｙ−ＰＦＰＥアミド／Ｌ３５標識された細胞における蛍光と１９Ｆ  ＮＭＲ信号の相関
ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ色素の導入は、親水性Ｃｙ色素を上回る幾つかの利点を有した。最も重要なことは、ＰＦＰＥとのカップリングの容易さであった。第一級アミンハンドルを有するＢＯＤＩＰｙ−ＴＲは、ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲカダベリンとして（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲから）市販されている。このアミンとＰＦＰＥのカップリングは容易であり、効率が高かった。その化学的安定性、並びにＦＩＴＣ又はローダミン標識抗体を用いた同時標識化が可能であり、細胞タイプ及び機能の表現型確認が可能である蛍光性のために、ＢＯＤＩＰｙ−ＴＲ色素を選択した。
【０４５９】
改善されたＢＯＤＩＰｙ−ＰＦＰＥ標識は、Ｔ細胞及びＤＣの標識化に首尾よく使用された。Ｆ６８及びＰＥＩを用いて微少溶液操作によって乳化されたブレンドＢＯＤＩＰｙ−ＰＦＰＥアミド１６、ＰＦＰＥアミド１及びＰＦＰＥオキシド１ａは、３時間のインキュベーション後、ＤＣとＴ細胞の両方において明確な細胞内局在を示す（それぞれ、図５６及び５７）。
【０４６０】
５．２．ＢＯＤＩＰｙ−ＰＦＰＥ「ブレンド」オイルナノエマルジョンで標識されたジャーカット細胞における蛍光と１９Ｆ  ＮＭＲ信号の相関
ＢＯＤＩＰｙ−ＰＦＰＥブレンドナノエマルジョンで標識されたジャーカット細胞は、蛍光信号と１９Ｆ  ＮＭＲによって測定された取り込みとの線形相関を示した。これは、蛍光色素と複合化されたＰＦＰＥで標識された細胞の蛍光測定を使用して、高価なＮＭＲ測定なしで取り込みを推定することができ、又はＮＭＲ測定を確認する第２の独立した技術として役立ち得ることを明瞭に示している。蛍光とＮＭＲによって測定された取り込みは一貫し、類似していた（図５８）。
【０４６１】
蛍光と１９Ｆ  ＮＭＲ信号を相関させるために、蛍光強度とＢＯＤＩＰｙ−ＰＦＰＥで標識された細胞数の間に線形相関があると仮定した。蛍光信号及びＮＭＲ信号は、生細胞数によって正規化された。相関は線形であり、Ｒ２＝０．９７７６であった（図３９及び５８Ａ）。蛍光顕微鏡法によって、ＦＩＴＣ  ＰＦＰＥブレンドナノエマルジョン（図５６Ａ〜Ｂ）とＢＯＤＩＰｙ−ＰＦＰＥブレンドナノエマルジョン（図５６Ｃ〜Ｄ）の両方を用いた効率的で均一な樹状細胞の標識化が確認された。さらに、ＢＯＤＩＰｙ−ＰＦＰＥアミド／Ｌ３５乳濁液を硫酸プロタミンと組み合わせると、高レベルの均一な標識化が認められた（図４０）。どちらの場合も、ナノエマルジョンは、細胞質に局在し、細胞外又は細胞表面上には乳濁液液滴は観察されなかった。
【０４６２】
６．化合物４２を用いて調製されたナノエマルジョンの取り込み：
化合物４２の乳濁液（表１参照）を樹状細胞における細胞内取り込みについて試験した（図６３）。界面活性剤量が増加すると、１９Ｆ  ＮＭＲによって測定して、３時間のインキュベーション後の細胞取り込みが減少した。細胞生存率は、すべての試験化合物４２ナノエマルジョンに曝露しても不変であった。ナノエマルジョンＡ４を、ＤＣにおける用量依存的取り込みについて検討した（図６４）。
【０４６３】
ナノエマルジョンＡ４を使用して、骨髄由来の未成熟マウスＤＣも標識した。これらの細胞をナノエマルジョンＡ４と一緒に４時間インキュベートし、洗浄し、標識された細胞の１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルを分析した（図６５）。標識された細胞は、ＰＦＰＥの主ピーク（−９１．６ｐｐｍ）から大きく離れた−７２．５ｐｐｍにおける共鳴を示した。
【０４６４】
参照による援用
本明細書に記載のすべての刊行物及び特許は、個々の刊行物又は特許が参照により援用されるように具体的かつ個々に示されたごとく、参照によりその全体が本明細書に援用される。矛盾が生じた場合には、本明細書のあらゆる定義を含めて、本願を基準とする。
【０４６５】
【化５６】
0005645658.tif 000087
【０４６６】
【化５７】
0005645658.tif 000088
【０４６７】
【化５８】
0005645658.tif 000089
均等形態
本発明の具体的実施形態を本明細書に明示的に開示するが、上記明細書は説明のためのものであって、限定的なものではない。本明細書及び下記特許請求の範囲を検討することによって、本発明の多数の変形が当業者に明白になるであろう。本発明の全範囲は、特許請求の範囲とその包括的な等価物、及び本明細書とかかる変形を参照することによって決定されるべきである。
【図１】
0005645658.tif 000145
【図２】
0005645658.tif 000146
【図３】
0005645658.tif 000147
【図４】
0005645658.tif 000148
【図５】
0005645658.tif 000149
【図６】
0005645658.tif 000150
【図７】
0005645658.tif 000151
【図８】
0005645658.tif 000152
【図９】
0005645658.tif 000153
【図１０】
0005645658.tif 000154
【図１１】
0005645658.tif 000155
【図１２】
0005645658.tif 000156
【図１３】
0005645658.tif 000157
【図１４】
0005645658.tif 000158
【図１５】
0005645658.tif 000159
【図１６】
0005645658.tif 000160
【図１７】
0005645658.tif 000161
【図１８】
0005645658.tif 000162
【図１９】
0005645658.tif 000163
【図２０】
0005645658.tif 000164
【図２１】
0005645658.tif 000165
【図２２】
0005645658.tif 000166
【図２３】
0005645658.tif 000167
【図２４】
0005645658.tif 000168
【図２５】
0005645658.tif 000169
【図２６】
0005645658.tif 000170
【図２７】
0005645658.tif 000171
【図２８】
0005645658.tif 000172
【図２９】
0005645658.tif 000173
【図３０】
0005645658.tif 000174
【図３１】
0005645658.tif 000175
【図３２】
0005645658.tif 000176
【図３３】
0005645658.tif 000177
【図３４】
0005645658.tif 000178
【図３５】
0005645658.tif 000179
【図３６】
0005645658.tif 000180
【図３７】
0005645658.tif 000181
【図３８】
0005645658.tif 000182
【図３９】
0005645658.tif 000183
【図４０Ａ】
0005645658.tif 000184
【図４０Ｂ】
0005645658.tif 000185
【図４０Ｃ】
0005645658.tif 000186
【図４０Ｄ】
0005645658.tif 000187
【図４１】
0005645658.tif 000188
【図４２】
0005645658.tif 000189
【図４３】
0005645658.tif 000190
【図４４−１】
0005645658.tif 000191
【図４４−２】
0005645658.tif 000192
【図４５】
0005645658.tif 000193
【図４６】
0005645658.tif 000194
【図４７】
0005645658.tif 000195
【図４８】
0005645658.tif 000196
【図４９】
0005645658.tif 000197
【図５０】
0005645658.tif 000198
【図５１】
0005645658.tif 000199
【図５２】
0005645658.tif 000200
【図５３】
0005645658.tif 000201
【図５４】
0005645658.tif 000202
【図５５】
0005645658.tif 000203
【図５６Ａ】
0005645658.tif 000204
【図５６Ｂ】
0005645658.tif 000205
【図５６Ｃ】
0005645658.tif 000206
【図５７】
0005645658.tif 000207
【図５８Ａ】
0005645658.tif 000208
【図５８Ｂ】
0005645658.tif 000209
【図５８Ｃ】
0005645658.tif 000210
【図５８Ｄ】
0005645658.tif 000211
【図５９】
0005645658.tif 000212
【図６０】
0005645658.tif 000213
【図６１】
0005645658.tif 000214
【図６２】
0005645658.tif 000215
【図６３】
0005645658.tif 000216
【図６４】
0005645658.tif 000217
【図６５】
0005645658.tif 000218