(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式（１）で表されるエピガロカテキンガレート誘導体、もしくはその異性体またはそれらの塩を含むことを特徴とするウイルスの膜融合を阻害する膜融合阻害剤。
【化１】
0005579449.tif 000013
前記化学式（１）において、
Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ水素原子、ハロゲン、ナトリウム、カリウムまたはリノレイル基もしくはリノレニル基であり、同一でも異なっていても良く、前記Ｒ１〜Ｒ６の少なくとも１つがリノレイル基もしくはリノレニル基であり、Ｒ７〜Ｒ１６は、水素原子、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであり、同一でも異なっていても良い。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６の少なくとも一つが、リノレイル基またはリノレニル基である、請求項１記載の膜融合阻害剤。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６の少なくとも一つが、リノレイル基またはリノレニル基であり、その他が、水素原子である、請求項１または２記載の膜融合阻害剤。
【請求項４】
Ｒ７〜Ｒ１６が、水素原子である、請求項１から３のいずれか一項に記載の膜融合阻害剤。
【請求項５】
前記膜融合阻害剤が、ノイラミニダーゼ欠損ウイルス、ノイラミニダーゼ阻害剤耐性ウイルス、Ｍ２欠損ウイルスおよびＭ２阻害剤耐性ウイルスからなる群から選択された少なくとも一つウイルスに対する膜融合阻害剤である、請求項１から４のいずれか一項に記載の膜融合阻害剤。
【請求項６】
前記膜融合阻害剤が、インフルエンザウイルスに対する膜融合阻害剤である、請求項１から５のいずれか一項に記載の膜阻害融合剤。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の膜融合阻害剤を含む、ウイルスのタンパク質の発現を阻害する発現阻害剤。
【請求項８】
前記タンパク質が、ヘマグルチニンタンパク質およびマトリックスタンパク質の少なくとも一方である、請求項７記載の発現阻害剤。
【請求項９】
請求項１から６のいずれか一項に記載の膜融合阻害剤を含む抗ウイルス剤。
【請求項１０】
さらに、ノイラミニダーゼ阻害剤およびＭ２阻害剤の少なくとも一方を含む、請求項９記載の抗ウイルス剤。
【請求項１１】
前記抗ウイルス剤が、ノイラミニダーゼ欠損ウイルス、ノイラミニダーゼ阻害剤耐性ウイルス、Ｍ２欠損ウイルスおよびＭ２阻害剤耐性ウイルスからなる群から選択された少なくとも一つのウイルスに対する抗ウイルス剤である、請求項９または１０記載の抗ウイルス剤。
【請求項１２】
前記抗ウイルス剤が、インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス剤である、請求項９から１１のいずれか一項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１３】
ウイルス感染を防止する方法であって、
ヒトを除く被検体に請求項１から６のいずれか一項に記載の膜融合阻害剤を投与することを特徴とする感染防止方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスの膜融合を阻害する阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスや肝炎ウイルス等の多種多様なウイルスによる感染症が問題視されており、様々な抗ウイルス剤が研究されている。ウイルスの増殖サイクルは、大きく、細胞への感染と、感染細胞内でのウイルスの増殖および感染細胞外への増殖ウイルスの放出とに分けられる。そして、これらの個々の工程に対するアプローチが行われている。【０００３】
ウイルスの増殖サイクルについて簡単に説明する。まず、エンベロープを有するウイルスは、細胞表面のシアル酸レセプターを認識して、これに結合する。すると、細胞の飲食作用（エンドサイトーシス）が始まり、ウイルスは細胞膜に包み込まれながら細胞内に取り込まれる。そして、ウイルスを包みこんだ食胞の内部が酸性化すると、エンベロープにある膜融合タンパク質（例えば、へマグルチニン（ＨＡ）等）の膜融合活性によって、食胞の膜（細胞由来）とウイルスのエンベロープ（ウイルスの膜）とが融合する。この膜融合が起こると、さらに、Ｍ２というタンパク質の作用により膜に穴があき（脱殻）、ウイルスのＲＮＡが細胞内に放出される。以上がウイルスの細胞への感染メカニズムである。続いて、感染細胞におけるウイルスの複製・放出メカニズムについて説明する。細胞内に放出されたウイルスのＲＮＡは、さらに感染細胞の細胞核に送り込まれ、これを元に感染細胞内で新たなウイルスの部品となるＲＮＡとタンパク質等とが大量に合成される。そして、感染細胞内で合成されたウイルスゲノムと一部のタンパク質とが、まとまってウイルスコアを形成し、細胞膜へと移動する。また、合成された膜融合タンパク質やノイラミニダーゼ（ＮＡ）も、細胞膜へ移動し、結合する。そして、細胞膜へ移動したウイルスは、膜融合タンパク質やＮＡを有する細胞膜にパッケージングされて、細胞膜表面に出芽する。この時点では、出芽したウイルスは、感染細胞の細胞膜表面にあるシアル酸レセプターに結合しているが、細胞膜のＮＡがシアル酸レセプターを切断することによって、出芽したウイルスが細胞外に放出される。このようにして、ウイルスの感染、複製および放出が行われ、放出されたウイルスによって、さらに未感染細胞が感染することとなる。【０００４】
抗ウイルス剤の具体例として、例えば、インフルエンザウイルスに対しては、細胞への感染工程にアプローチするＭ２阻害剤（非特許文献１および非特許文献２）や、増殖・放出工程にアプローチするＮＡ阻害剤（非特許文献３〜非特許文献５）が開発されている。前者は、ウイルスのエンベロープに埋め込まれたタンパク質Ｍ２の働きを阻害する薬剤であって、例えば、塩酸アマンタジンが知られている。これによれば、Ｍ２の働きが阻害されるため、感染細胞内のウイルスの脱殻が防止される。このため、ウイルス由来のＲＮＡが細胞核に送り込まれることがなく、ＲＮＡやタンパク質の合成自体をブロックすることができる。他方、後者は、ウイルスのエンベロープに存在するＮＡの働きを阻害する薬剤であり、例えば、ザナミビル（登録商標リレンザ）やオセルタミビル（リン酸オセルタミビル；登録商標タミフル）等が知られている。これによれば、ＮＡの働きが阻害されるため、感染細胞内でウイルスが複製されても、出芽したウイルスとシアル酸レセプターとの結合を切断できない。このため、出芽したウイルスは、感染細胞の膜表面から分離できなくなり、最終的には凝集してしまう。【０００５】
しかしながら、前者のＭ２阻害剤は、Ｂ型インフルエンザウイルスのようなＭ２を欠損するウイルスには効果がなく、副作用についても問題視されている。後者のＮＡ阻害剤は、薬価が高額であることや副作用について問題視されている。さらに、いずれの抗ウイルス剤についても、耐性ウイルスの発生が危惧されている。これらの事情から、ウイルス増殖サイクルにおいて従来とは異なるステップをターゲットとし、安全性にも優れる薬剤が求められている。【０００６】
［先行技術文献］
【非特許文献１】Zlydnikov,  D.M.  et  al,;  Study  of  rimantadine  in  the  USSR:  a  review  of  the  literature.  Rev.  Infect.  Dis.  3,  408-421,  (1981).
【非特許文献２】Duff  K.C.  &  Ashley  R.H.;  The  transmembrane  domain  of  influenza  A  M2  protein  forms  amantadine-sensitive  proton  channels  in  planar  lipid  bilayers.  Virology  190,485-489,  (1992).
【非特許文献３】Woods,  J.M.  et  al,；  4-guanidino-2,4-dideoxy-2,3-dehydro-N-acethylneuraminic  acid  is  a  highly  effective  inhibitor  both  of  the  sialidase  （neuraminidase）  and  of  growth  of  a  wide  range  of  influenza  A  and  B  viruses  in  vitro.Antimicrob.  Agents  Chemother.  37,  1473-1479,  (1993).
【非特許文献４】von  Itzstein  M.  et  al，；  Rational  design  of  potent  sialidase-based  inhibitors  of  influenza  virus  replication.  Nature  363,  418-423,  (1993).
【非特許文献５】Kim  C.U.  et  al,;  Influenza  neuraminidase  inhibitors  possessing  a  novel  hydrophobic  interaction  in  the  enzyme  active  site.  J.  Am.  Chem.  Soc.  119,  681-690,  (1997).
【発明の開示】
【０００７】
そこで、本発明は、安全性に優れ、且つ、ウイルスの増殖サイクルにおいて、新たな工程をターゲットとする、抗ウイルス剤への利用が可能な薬剤の提供を目的とする。
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明は、ウイルスの膜融合を阻害する膜融合阻害剤であって、下記化学式（１）で表されるエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の誘導体、もしくはその異性体またはそれらの塩を含むことを特徴とする。
【化１】
0005579449.tif 000002
前記化学式（１）中、
Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ水素原子、ハロゲン、ナトリウム、カリウムまたは直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和アシル基であり、同一でも異なっていても良く、前記アシル基は、さらに１または複数の置換基で置換されていても良く、前記Ｒ１〜Ｒ６の少なくとも１つが前記アシル基であり、Ｒ７〜Ｒ１６は、水素原子、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであり、同一でも異なっていても良い。
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ＥＧＣＧおよびＥＧＣＧ誘導体が、前記Ｍ２阻害剤やＮＡ阻害剤とは異なり、膜融合タンパク質による膜融合を阻害することを見出し、本発明に到った。本発明の膜融合阻害剤によれば、前述のウイルス増殖サイクルの感染工程において、ウイルスを包み込んだ食胞の膜（細胞由来）とウイルスのエンベロープ（ウイルスの膜）との膜融合を阻害できる。このように、膜融合自体が阻害されることから、下流のステップ、すなわち、脱殻や複製自体をブロックすることができる。また、ウイルスの増殖サイクルにおいて、従来の抗ウイルス剤とは異なるステップをターゲットとしていることから、本発明の膜融合阻害剤によれば、例えば、前述のＭ２阻害剤やＮＡ阻害剤ではブロックできなかったウイルス感染を阻害することも可能となる。さらに、本発明のＥＧＣＧ誘導体において、基本骨格のＥＧＣＧは、例えば、お茶等に含まれるカテキンであって、安全性に優れることは十分に知られており、また、Ｒ１〜Ｒ６のアシル基も、安全性に優れるものである。したがって、本発明の膜融合阻害剤は、安全性にも優れる薬剤といえる。
【００１０】
なお、本発明において、ＥＧＣＧ誘導体がウイルスの膜融合タンパク質による膜融合を阻害するメカニズムは、不明であるが、ＥＧＣＧ誘導体におけるアシル基が、膜融合タンパク質の膜融合ドメイン付近にＥＧＣＧをデリバリーすることで、膜結合タンパク質による膜融合を阻害すると推測される。なお、本発明は、この推測したメカニズムに何ら制限されない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施例１において、ＥＧＣＧ誘導体の濃度とプラーク形成との関係を示すグラフである。
【図２】本発明の前記実施例１において、ＥＧＣＧ誘導体の濃度とプラーク形成との関係を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例２において、ＥＧＣＧ誘導体存在下での血球凝集アッセイの結果を示す写真である。
【図４】本発明の実施例３において、ＥＧＣＧ誘導体の濃度とプラーク形成との関係を示すグラフである。
【図５】本発明の前記実施例３において、ＥＧＣＧ誘導体の濃度とプラーク形成との関係を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例４において、ＥＧＣＧ誘導体の濃度とプラーク形成との関係を示すグラフである。
【図７】本発明の実施例５において、ウイルス感染後のマウスの体重の経時的変化を示すグラフである。
【図８】本発明の実施例６において、マウスミクロソーム由来グルクロン酸代謝酵素存在下におけるＥＧＣＧ誘導体の残存率を示すグラフである。
【図９】本発明の実施例７において、ＥＧＣＧ誘導体の濃度とプラーク形成との関係を示すグラフである。
【図１０】本発明の実施例８において、ＥＧＣＧ誘導体の濃度とプラーク形成との関係を示すグラフである。
【図１１】本発明の前記実施例８において、ＥＧＣＧ誘導体の濃度とプラーク形成との関係を示すグラフである。
【図１２】本発明の実施例９において、ＥＧＣＧ誘導体存在下での発育鶏卵の生存率を示すグラフである。
【図１３】本発明の前記実施例９において、ＥＧＣＧ誘導体存在下での発育鶏卵の生存率を示すグラフである。
【図１４】本発明の実施例１０において、ＥＧＣＧ誘導体の濃度とプラーク形成との関係を示すグラフである。
【図１５】本発明の実施例１１において、ＥＧＣＧ誘導体存在下でのＨＡタンパク質の発現の有無を示す写真である。
【図１６】本発明の前記実施例１１において、ＥＧＣＧ誘導体存在下でのＭＩタンパク質の発現の有無を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の膜融合阻害剤は、前述のように、ウイルスの膜融合を阻害する膜融合阻害剤であって、下記化学式（１）で表されるエピガロカテキンガレートの誘導体、もしくはその異性体またはそれらの塩を含むことを特徴とする。
【化２】
0005579449.tif 000003
前記化学式（１）中、
Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ水素原子、ハロゲン、ナトリウム、カリウムまたは直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和アシル基であり、同一でも異なっていても良く、前記アシル基は、さらに１または複数の置換基で置換されていても良く、前記Ｒ１〜Ｒ６の少なくとも１つが前記アシル基であり、Ｒ７〜Ｒ１６は、水素原子、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであり、同一でも異なっていても良い。【００１３】
なお、前記化学式（１）において、「Ａ〜Ｄ」は、エピガロカテキンガレートにおける各環の表記である。本発明において、以下、エピガロカテキンガレート、は「ＥＧＣＧ」といい、ＥＧＣＧの誘導体は、「ＥＧＣＧ誘導体」という。【００１４】
本発明において、ＥＧＣＧ誘導体には、例えば、前記化学式（１）で表される化合物の塩、互変異性体、立体異性体、光学異性体、幾何異性体等の異性体、異性体混合物も含まれる。前記塩とは、特に制限されず、例えば、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性または塩基性アミノ酸塩等があげられる。前記異性体は、例えば、各種クロマトグラフィー等の従来公知の分離方法により、精製することも可能である。また、本発明において、前記ＥＧＣＧ誘導体は、例えば、前記化学式（１）で表される化合物を、酸化、還元、加水分解、抱合等の代謝をうけて、生成する化合物も含む。【００１５】
Ｒ１〜Ｒ６において、前記アシル基の主鎖長は、特に制限されないが、例えば、カルボニル炭素を含み原子数２〜２０であり、好ましくは４〜２０であり、より好ましくは８〜１８であり、さらに好ましくは１２〜１６である。なお、前記アシル基の主鎖長とは、アシル基において最も長い鎖の原子数をいい、例えば、炭素原子の他に、窒素原子、硫黄原子、リン原子、酸素原子、ホウ素原子、ハロゲン原子、等を含んでもよい。【００１６】
Ｒ１〜Ｒ６において、前記アシル基の炭素原子数は、特に制限されないが、例えば、カルボニル炭素を含み２〜２０であり、好ましくは４〜２０、より好ましくは８〜１８、さらに好ましくは、１２〜１６である。また、前記炭素原子数は、例えば、より好ましくは、４、８、１２、１６または２０であり、さらに好ましくは８、１２または１６であり、特に好ましくは１２または１６である。なお、前記アシル基が、さらに前記置換基で置換されている場合、前記炭素原子数は、例えば、前記置換基の炭素原子数を含まない数であることが好ましい。また、前記不飽和アシル基は、例えば、シスでもトランスでもよい。【００１７】
前記アシル基としては、特に限定されないが、例えば、ホルミル基（Ｃ１）、アセチル基（Ｃ２）、プロピオニル基（Ｃ３）、ブチリル基（Ｃ４）、イソブチリル基（Ｃ４）、バレリル基（Ｃ５）、イソバレリル基（Ｃ５）、ピバロイル基（Ｃ５）、ヘキサノイル基（Ｃ６）、オクタノイル基（Ｃ８）、ゲラノイル基（３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエノイル基）（Ｃ１０）、トランス−８−メチル−６−ノネノイル基（Ｃ１０）、ウンデカノイル基（Ｃ１１）、ラウロイル基（ドデカノイル基）（Ｃ１２）、トリデカノイル基（Ｃ１３）、１２−（ジメチルアミノ）ラウロイル基（１２−（ジメチルアミノ）ドデカノイル基）（Ｃ１４）、ファルネソイル基（３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエノイル基（Ｃ１５）、パルミトイル基（ヘキサデカノイル基）（Ｃ１６）、ヘプタデカノイル基（Ｃ１７）、ステアロイル基（オクタデカノイル基）（Ｃ１８）、リノレイル基（Ｃ１８）、リノレニル基（Ｃ１８）、ノナデカノイル基（Ｃ１９）、エイコサノイル基（イコサノイル基）（Ｃ２０）等があげられる。なお、列挙したアシル基のかっこ内の「Ｃ」は、カルボニル炭素を含む炭素数を示す。【００１８】
前記アシル基の中でも、例えば、下記化学式に示すアシル基等が特に好ましい。なお、不飽和結合の位置は、これらには制限されない。具体例として、トランス−８−メチル−ノネノイル基（Ｃ１０）の不飽和結合（二重結合）は、以下に示す６位には制限されず、例えば、２〜５位および７位のいずれであってもよい。
【化３】
0005579449.tif 000004
【化４】
0005579449.tif 000005
【００１９】
前記アシル基の種類は、特に制限されず、前述のように、不飽和のアシル基、飽和のアシル基のいずれであってもよい。細胞へのウイルス感染予防に使用する場合、例えば、主鎖長が同じアシル基の中では、不飽和アシル基が好ましく、不飽和結合の数が多いことが好ましい。前記アシル基における不飽和結合の数は、特に制限されないが、例えば、１〜３であり、好ましくは２〜３である。また、細胞への感染前のウイルスに使用する場合、例えば、主鎖長が同じアシル基の中では、飽和アシル基が好ましい。【００２０】
Ｒ１〜Ｒ６において、前記置換基は、特に制限されないが、例えば、アルキル基、アミノ基、アルキルアミノ基およびジアルキルアミノ基等があげられる。【００２１】
前記アルキル基としては、例えば、炭素原子数１〜６の直鎖もしくは分枝アルキル基があげられ、好ましくはメチル基である。また、前記アルキルアミノ基におけるアルキル基としては、例えば、炭素原子数１〜６の直鎖もしくは分枝アルキル基があげられ、好ましくはメチルアミノ基である。前記ジアルキルアミノ基におけるアルキル基としては、例えば、炭素原子数１〜６の直鎖もしくは分枝アルキル基があげられ、好ましくはジメチルアミノ基である。これらは、同一でも異なっていても良い。【００２２】
前記化学式（１）において、Ｒ１〜Ｒ６のうち二カ所以上が前記アシル基であってもよいし、いずれか一カ所のみがアシル基であってもよい。前者の場合、各部位におけるアシル基は、例えば、同じであってもよいし、異なってもよい。本発明においては、Ｒ１〜Ｒ６のうちいずれか一カ所のみがアシル基であることが好ましく、この際、他のＲは、特に制限されないが、例えば、水素原子であることが好ましい。【００２３】
前記化学式（１）において、Ｒ１〜Ｒ６のうちアシル基の部位は、特に制限されないが、例えば、Ｂ環のＲ１およびＲ２ならびにＤ環のＲ５およびＲ６のうち少なくとも一カ所が前記アシル基を有することが好ましく、特に、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６のうちいずれか一カ所が前記アシル基を有することが好ましい。この際、他のＲは、特に制限されないが、例えば、水素原子であることが好ましい。【００２４】
また、前記化学式（１）において、Ｂ環のＲ１、Ｒ２およびＲ３のうち少なくとも一カ所がアシル基であることが好ましく、より好ましくは、Ｂ環のＲ１、Ｒ２およびＲ３のうち一カ所のみがアシル基であることが好ましい。Ｂ環が修飾されたＥＧＣＧ誘導体は、例えば、代謝安定性により優れるためである。【００２５】
前記化学式（１）において、Ｒ７〜Ｒ１６は、前述のように、水素原子、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであり、同一でも異なっていても良いが、好ましくは、下記化学式（２）に示すように、水素原子であることが好ましい。下記式（２）において、例えば、Ｒ１〜Ｒ６のいずれが前記アシル基であってもよい。具体例として、例えば、Ｒ１〜Ｒ６のうち少なくとも一カ所、または、いずれか一カ所が、前述したアシル基であることが好ましく、より好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６のうち少なくとも一カ所、または、いずれか一カ所が、前述したアシル基であることが好ましく、前記アシル基の中でも、例えば、ブチリル基、オクタノイル基、トランス−８−メチル−６−ノネノイル基、ゲラノイル基、ラウロイル基、１２−（ジメチルアミノ）ラウロイル基、ファルネソイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、リノレイル基、リノレニル基、または、エイコサノイル基が好ましい。
【化５】
0005579449.tif 000006
【００２６】
本発明において、「ハロゲン」とは、任意のハロゲン元素を指す。前記ハロゲンとしては、例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素があげられる。また、本発明において、「アルキル基」とは、特に限定されない。前記アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ‐プロピル基、イソプロピル基、n‐ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ‐ブチル基、ｔｅｒｔ‐ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基等があげられる。アルキル基を構造中に含む基またはアルキル基から誘導される基（アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、カルボキシアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、アルコキシアルキル基、アルケノキシアルキル基等）についても同様である。【００２７】
置換基等が、鎖状構造を有する基（例えば、アルキル基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、カルボキシアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、アルコキシアルキル基、アルケノキシアルキル基等）である場合、特に制限しない限り、直鎖状でも分枝状でも良い。置換基等の一部に鎖状構造を含む場合、例えば、置換アルキル基や置換アリール基等における置換基が鎖状構造を含む場合も同様とする。置換基等に異性体が存在する場合は、特に制限がない限り、どの異性体でも良い。例えば、単に「プロピル基」という場合は、n‐プロピル基およびイソプロピル基のどちらでも良い。単に「ブチル基」という場合は、n‐ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ‐ブチル基およびｔｅｒｔ‐ブチル基のいずれでも良い。単に「ナフチル基」という場合は、１‐ナフチル基および２-ナフチル基のどちらでも良い。【００２８】
本発明におけるＥＧＣＧ誘導体は、例えば、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。例えば、Ｒ１〜Ｒ６のうち異なる部位にアシル基を有する二種類以上のＥＧＣＧ誘導体であってもよいし、異なるアシル基を有する二種類以上のＥＧＣＧ誘導体であってもよい。具体例として、Ｂ環のＲ１が前記アシル基であるＥＧＣＧ誘導体、Ｒ２が前記アシル基であるＥＧＣＧ誘導体、Ｒ３が前記アシル基であるＥＧＣＧ誘導体のうち、いずれか二種類以上、または、三種類全てを含む混合物であってもよく、Ｄ環のＲ４が前記アシル基であるＥＧＣＧ誘導体、Ｒ５が前記アシル基であるＥＧＣＧ誘導体、Ｒ６が前記アシル基であるＥＧＣＧ誘導体のうち、いずれか二種類以上、または、三種類全てを含む混合物であってもよい。また、Ｂ環のＲ１〜Ｒ３の少なくともいずれかが前記アシル基であるＥＧＣＧ誘導体と、Ｄ環のＲ４〜Ｒ６の少なくともいずれかが前記アシル基であるＥＧＣＧ誘導体との混合物であってもよい。【００２９】
本発明の膜融合阻害剤を適用するウイルスは、特に制限されないが、例えば、インフルエンザウイルス、Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ、ＨＩＶ−１等があげられる。ウイルスの型も、特に制限されず、例えば、インフルエンザのＡ型、Ｂ型、Ｃ型があげられる。Ａ型のインフルエンザウイルスとしては、特に制限されないが、例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ２等があげられる。また、Ｂ型のインフルエンザウイルスとしては、例えば、ＩｎｆｌｕｅｎｚａＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８等があげられる。また、前記インフルエンザウイルスとしては、例えば、哺乳類感染性インフルエンザウイルスや、鳥類感染性インフルエンザウイルス等があげられる。本発明におけるＥＧＣＧ誘導体は、前述のように、従来のＮＡやＭ２をターゲットとする抗ウイルス剤とは異なり、細胞内に取り込まれたウイルスが細胞と膜融合することを阻止する膜融合阻害剤である。このため、特にＮＡを欠損するウイルス（例えば、Ｃ型インフルエンザウイルス等）、ＮＡ阻害剤に対して耐性を示すウイルス、Ｍ２欠損ウイルス（例えば、Ｂ型インフルエンザウイルス等）、アマンタジンのようなＭ２阻害剤に対して耐性を示すウイルス等に、特に有効である。【００３０】
本発明の膜融合阻害剤は、前記ＥＧＣＧ誘導体を含んでいればよく、その形態は何ら制限されない。前記形態としては、例えば、溶液や分散液等の液体、固体、粉末等があげられる。また、剤形は、特に制限されず、例えば、投与方法に応じて適宜設定でき、液剤、カプセル剤、錠剤、粒剤（細粒剤）、散剤等があげられる。前記投与方法としては、特に制限されず、経口投与、非経口投与があげられる。非経口投与としては、例えば、経皮投与、腹腔内投与、静脈注射等の静脈内投与、筋肉投与、皮下注射等の皮下投与、直腸投与等があげられ、好ましくは、経皮投与である。本発明の膜融合阻害剤は、例えば、これらの投与形態に応じて、例えば、前記ＥＧＣＧ誘導体を含む内服薬、舌下剤、点鼻薬、うがい薬、塗り薬等として投与でき、また、ＥＧＣＧ誘導体やそれを含む溶液または分散液として、注射、ネブライザー、吸引器等を用いて投与できる。また、前記ＥＧＣＧ誘導体やそれを含む粉末として、例えば、ネブライザー、吸引器等を用いて投与できる。また、本発明の膜融合阻害剤は、ウイルスの感染能力を低下できることから、例えば、前記ＥＧＣＧ誘導体を含む、手洗い剤、ふき取り剤等の洗浄剤の形態もあげられる。このような本発明の膜融合阻害剤によって、例えば、手や机等、ウイルスが存在すると思われる箇所を処理することで、存在するウイルスの感染能力を低下させ、ウイルス感染の予防を図ることも可能である。また、本発明の膜融合阻害剤をマスクに担持させてもよい。【００３１】
本発明の膜融合阻害剤は、例えば、ウイルス感染の予防ならびにウイルス感染の治療に使用することができる。本発明の膜融合阻害剤を投与する対象は、例えば、ヒト、ブタ、フェレット、ラット、マウス、ウシ等の哺乳類、アヒル、ニワトリ等の鳥類等があげられる。【００３２】
本発明の膜融合阻害剤において、前記ＥＧＣＧ誘導体の含有量は、特に制限されず、例えば、投与の目的や投与方法に応じて適宜決定できる。本発明の膜融合阻害剤がうがい薬の場合、例えば、一回あたり２０〜２０００ｎｍｏｌ／ＬのＥＧＣＧ誘導体を含むことが好ましい。また、本発明の膜融合阻害剤が点鼻薬の場合、例えば、一回あたり２０〜２０００ｎｍｏｌ／ＬのＥＧＣＧ誘導体を含むことが好ましい。【００３３】
本発明の膜融合阻害剤は、例えば、その剤形や投与方法に応じて、適宜、添加剤や基剤等をさらに含んでもよい。前記添加剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤、吸収促進剤等があげられる。これらの添加割合は、特に制限されず、前記ＥＧＣＧ誘導体の効果を損なわない範囲で添加することができる。【００３４】
つぎに、本発明の発現阻害剤は、ウイルスのタンパク質の発現を阻害する発現阻害剤であり、前述のＥＧＣＧ誘導体を含むことを特徴とする。本発明の発現阻害剤は、前記ＥＧＣＧ誘導体を含むことが特徴であり、その他の構成、形態、使用方法等は、制限されず、前述の膜融合阻害剤と同様である。本発明のＥＧＣＧ誘導体によれば、例えば、ウイルスが細胞に感染した際に、前記細胞内におけるウイルスのタンパク質の発現を抑制することができる。このため、ウイルスが感染細胞内で増殖する前段階を阻害できる。なお、本発明の発現阻害剤においては、発現阻害効果を示すメカニズムは、特に制限されず、例えば、前述のような膜融合阻害のメカニズムには限定されない。【００３５】
つぎに、本発明の抗ウイルス剤は、本発明の膜融合阻害剤を含むことを特徴とする。本発明の抗ウイルス剤は、本発明の膜融合阻害剤を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の抗ウイルス剤の形態や使用方法も、前述と同様である。また、本発明の抗ウイルス剤は、前記ＥＧＣＧ誘導体を含んでいればよく、抗ウイルス効果を示すメカニズムも特に制限されず、例えば、前述のような膜融合阻害のメカニズムには限定されない。【００３６】
本発明の抗ウイルス剤を適用するウイルスは、特に制限されず、前述と同様のウイルスが例示できる。中でも、同様の理由から、ＮＡ欠損ウイルス、ＮＡ阻害剤耐性ウイルス、Ｍ２欠損ウイルス、Ｍ２阻害剤耐性ウイルス等に適用することが好ましい。【００３７】
本発明の抗ウイルス剤は、さらに、Ｍ２阻害剤を含んでもよい。本発明の膜融合阻害剤とＭ２阻害剤は、ウイルス感染において関与するメカニズムが異なる。このため、本発明の抗ウイルス剤が、本発明の膜融合阻害剤とＭ２阻害剤とを含む場合、前者によって、ウイルスの膜融合を阻害し、且つ、膜融合が生じても、後者によって脱殻をブロックすることで、２段階でウイルス感染を阻害することができる。また、本発明の抗ウイルス剤は、さらに、ＮＡ阻害剤を含んでもよい。本発明の抗ウイルス剤が、本発明の膜融合阻害剤とＮＡ阻害剤を含む場合、前者によって、ウイルスの膜融合を阻害して複製をブロックし、且つ、ウイルスが複製されたとしても、さらに、後者によって、その複製ウイルス放出をブロックすることで、ウイルス感染および複製ウイルスの放出の２段階を阻害することが可能となる。【００３８】
本発明におけるＥＧＣＧ誘導体の製造方法は、特に制限されない。前記方法としては、例えば、有機合成法、酵素等を利用する化学合成法等、従来公知の方法が採用できる。前記酵素を利用する化学合成法としては、特に制限されないが、例えば、ＷＯ２００７／１０５２８０に開示された、リパーゼを利用する方法があげられる。すなわち、有機溶媒中、ＥＧＣＧとアシル基供与体とを基質としてリパーゼにより酵素反応を行い、ＥＧＣＧをアシル化する方法である。この方法によれば、例えば、ＥＧＣＧを選択的にアシル化することができる。なお、以下に、一例として、リパーゼを使用する方法を例示するが、本発明は、ＥＧＣＧ誘導体の製造方法には、何ら制限されない。【００３９】
前記リパーゼとしては、例えば、ＩＵＢ  Ｎｏ．３．１．１．３．のリパーゼが使用できる。具体例として、Aspergillus niger等のAspergillus属由来リパーゼ；Candida rugosa、Candida cylindracea、Candida antarctica等のCandida属由来リパーゼ；Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas cepacia、Pseudomonas stutzeri等のPseudomonas属由来リパーゼ；Alcaligenes属由来リパーゼ；Burkholderia cepacia等のBurkholderia属由来リパーゼ；ブタ膵臓由来のリパーゼ等があげられる。これらは、従来公知の方法により調製することもできるが、例えば、Lipase  AS“AMANO”、Lipase  AYS“AMANO”、Lipase  PS“AMANO”、Lipase  AK“AMANO”20、Lipase  AH“AMANO”（全て商品名：天野エンザイム社製）、Lipase  MY、Lipase  OF、Lipase  PL、Lipase  PLC、Lipase  PLG、Lipase  QLM、Lipase  QLC、Lipase  QLG、Lipase  SL、Lipase  TL（全て商品名：名糖産業社製）、Lipase  PPL、L4777  Lipase  acrylic  resin  from  Candida  Antarctica、L3126  Lipase  from  porcine  pancreas（全て商品名：シグマアルドリッチ社製）等の市販品も使用できる。なお、各市販品の物理化学的性質は、それぞれの商品説明書に記載の通りであり、同様の物理化学的性質を示す酵素も同様に使用できる。【００４０】
また、以下に示すような（１）〜（８）の何れかの物理化学的特性および酵素学的特性を有するリパーゼであってもよい。
（１）分子量３５，０００、等電点４．１０（例えば、Aspergillus niger由来）
（２）分子量６４，０００、等電点４．３０、８０℃１０分間の処理で不活性化（例えば、Candida rugosa由来）
（３）至適ｐＨ８、至適温度６０℃、ｐＨ４〜１０の範囲で特に安定、７０℃以下で特に安定（例えば、Pseudomonas fluorescens由来）
（４）分子量６０，０００、至適ｐＨ６〜７、ｐＨ安定性３〜８、至適温度４０〜５０℃、３７℃以下において溶液状態で特に安定（例えば、Candida cylindracea由来、Candida rugosa由来）
（５）分子量３０，０００、等電点４．５、至適ｐＨ８〜９．５、ｐＨ安定性７〜１０、至適温度５０℃、４０℃以下において特に安定（例えば、Alcaligenes属由来）
（６）分子量３１，０００、等電点４．９、至適ｐＨ７〜９、ｐＨ安定性６〜１０、至適温度６５〜７０℃、５０℃以下において特に安定（例えば、Alcaligenes属由来）
（７）分子量３１，０００、等電点５．２、至適ｐＨ７〜９、ｐＨ安定性６〜１０、至適温度６５〜７０℃、６０℃以下において特に安定（例えば、Pseudomonas cepacia由来、Burkholderia cepacia由来）
（８）分子量２７，０００、等電点６．６、至適ｐＨ７〜８、ｐＨ安定性６〜９、至適温度５０℃、４０℃以下において特に安定（例えば、Pseudomonas stutzeri由来）【００４１】
前記有機溶媒としては、特に制限されず、例えば、アセトニトリル、アセトン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等が使用できる。また、例えば、疎水性を示すパラメータ（ｌｏｇＰ値）が−０．３５〜０．２８の範囲の有機溶媒でもよく、このような有機溶媒としては、前述のアセトニトリル（ｌｏｇＰ値：−０．４５〜０．１９）、アセトン（ｌｏｇＰ値：−０．１６〜０．１９）、ＤＭＦ（ｌｏｇＰ値：−１．０１〜０．２８）、ＤＭＳＯ（ｌｏｇＰ値：−１．３５〜０．２８）があげられる。これらの他にも、前記パラメータを満たす従来公知の溶媒が使用できる。前記ｌｏｇＰは、溶媒固有の値であるため、当該技術分野における当業者であれば、前記パラメータを満たす溶媒を選択することが可能である。なお、ｌｏｇＰとは、目的物質をオクタノールと水との混合溶液に添加し、平衡に達した時のオクタノール層と水層とにおける前記目的物質の濃度比を常用対数で表示したものであり、前述のように、物質の疎水性を示すパラメータとして一般的である。【００４２】
本発明において、アシル基（Ｒ−ＣＯ−）供与体としては、例えば、カルボン酸ビニルエステル（Ｒ−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨ２）があげられる。なお、前記アシル基としては、前述のような直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和アシル基があげられる。【００４３】
前記酵素反応溶液にＤＭＦを用いた場合、ＥＧＣＧの添加割合は、特に制限されないが、例えば、０．２〜１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌである。アシル基供与体の添加割合は、特に制限されず、例えば、反応液におけるＥＧＣＧの添加割合に応じて適宜決定できる。具体例として、ＥＧＣＧとアシル基供与体との添加割合（モル比）は、例えば、１：１〜１：１０であり、好ましくは１：１〜１：５、より好ましくは１：１〜１：３である。また、反応液におけるリパーゼの添加割合は、例えば、ＥＧＣＧやアシル基供与体の添加割合、リパーゼの比活性等に応じて適宜決定でき、特に制限されないが、例えば、ＥＧＣＧ１ｍｍｏｌ／Ｌに対して、例えば、５００〜５０,０００Ｕ／Ｌであり、好ましくは５００〜５,０００Ｕ／Ｌ、より好ましくは１,０００〜２,５００Ｕ／Ｌである。【００４４】
酵素反応の条件は特に制限されないが、反応温度は、例えば、４５〜７５℃の範囲である。前記反応時間は、例えば、基質や酵素の量によって適宜決定でき、特に制限されないが、例えば、３０分〜２４時間（１４４０分）であり、好ましくは１時間（６０分）〜３時間（１８０分）、より好ましくは１．５時間（９０分）〜３時間（１８０分）である。【００４５】
前記反応液には、さらに、塩基性触媒を添加してもよい。前記塩基性触媒としては、例えば、トリエチルアミン等の３級アミン、ピリジン等があげられる。反応液における塩基性触媒の添加割合は、特に制限されないが、例えば、５〜７２０ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは１２〜２４０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１２〜４８ｍｍｏｌ／Ｌである。【００４６】
ＥＧＣＧにおいて前記アシル基が導入される位置は、例えば、使用するリパーゼの種類によって選択できる。また、ＥＧＣＧに導入するアシル基の数は、例えば、使用する有機溶媒の種類や反応時間によって決定することが可能である。例えば、有機溶媒の疎水性が相対的に高い程（親水性が相対的に低い程）、導入されるアシル基の数を相対的に低減でき、有機溶媒の親水性が相対的に高い程（疎水性が相対的に低い程）、導入されるアシル基の数を相対的に増加できる。また、二種類以上の有機溶媒を混合して用いることによっても、導入されるアシル基の数を調節することができる。具体例としては、例えば、１個のアシル基を導入する際には、アセトニトリル等を使用することが好ましく、例えば、１〜２個のアシル基を導入する際には、アセトン、アセトニトリル等を使用することが好ましく、例えば、３〜５個のアシル基を導入する際には、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ等を使用することが好ましい。【００４７】
さらに、同じ有機溶媒を用いる場合でも、温度時間や反応温度の制御と組合せること等によって、導入するアシル基数を調節することもできる。以下にその例を示すが、これには限定されない。ＤＭＦを使用する場合、例えば、反応温度を約５７℃〜約７０℃の範囲に設定し、反応温度を長くする（例えば、約３〜５時間）ことによって、ＥＧＣＧに２個のアシル基が選択的に導入された誘導体を優先的に得ることができ、他方、反応温度を低下させ（例えば、５７℃から約５℃低い温度）、反応時間を短くする（例えば、約１〜３時間）ことによって、１個のアシル基を選択的に導入することができる。また、アセトンとＤＭＦを同量（質量）混合した混合溶媒を使用することによっても、ＥＧＣＧに１個のアシル基を選択的に導入することができる。【００４８】
また、導入するアシル基の数は、反応液に前述の塩基性触媒を添加することによって増加させることができる。この場合、ＥＧＣＧにおけるどの部位にアシル基がさらに導入されるかは、例えば、リパーゼの位置選択性に依存する。【００４９】
前記酵素反応によるＥＧＣＧ誘導体の収率は、例えば、反応温度を相対的に高く設定することによって、相対的に向上させることができる。反応温度は、通常、前述のように、４５〜７５℃であるが、収率向上の点から、好ましくは５７〜７５℃であり、より好ましくは５７〜７０℃である。特に、反応温度が、５７〜７０℃の場合、前記ＥＧＣＧアシル化誘導体の収率は、約３５〜４５％を実現することが可能である。なお、前記収率とは、反応に使用したＥＧＣＧを１００％とした場合のＥＧＣＧアシル化誘導体（例えば、全モノアシル化誘導体）の割合（変換効率）を意味する。【００５０】
本発明において、ＥＧＣＧ誘導体は、例えば、前述のように、いずれか一種類を用いてもよいし、二種類以上の混合物を用いてもよい。前記混合物から一種類のＥＧＣＧ誘導体を単離する場合は、例えば、クロマトグラフィー等を用いる従来公知の方法により、調製可能である。【００５１】
つぎに、本発明の感染防止方法は、ウイルス感染を防止する方法であって、被検体に前述のＥＧＣＧ誘導体を投与することを特徴とする。本発明においては、前記ＥＧＣＧ誘導体を使用することが特徴であって、その他の構成や条件等は、何ら制限されない。前記ＥＧＣＧ誘導体やその使用方法等は、例えば、前述と同様である。また、本発明においては、前記ＥＧＣＧ誘導体として、例えば、本発明の膜融合阻害剤、発現阻害剤または抗ウイルス剤等を投与してもよい。【００５２】
本発明において、被検体とは、何ら制限されず、例えば、ヒト、ブタ、フェレット、ラット、マウス、ウシ等の哺乳類、アヒル、ニワトリ等の鳥類等があげられる。また、前記被検体は、例えば、生体そのものでもよいし、生体から採取した細胞や組織、それらの培養物でもよい。【００５３】
前記被検体が生体の場合、前記投与方法としては、特に制限されず、例えば、非経口投与および経口投与があげられる。非経口投与としては、例えば、経皮投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉投与、皮下投与、直腸投与等があげられ、好ましくは、経皮投与である。前記非経口投与の場合、例えば、前記ＥＧＣＧ誘導体を、内服、点鼻、うがい、注射、ネブライザーや吸引器等を用いて投与できる。また、経皮投与の方法としては、例えば、ＥＧＣＧ誘導体を含む洗浄剤による手洗い、ＥＧＣＧ誘導体を含む拭き取り剤等による拭き取り等も含まれる。【００５４】
また、前記被検体が生体から採取した細胞や組織等の場合、前記投与方法としては、特に制限されず、例えば、培地等への添加があげられる。【００５５】
前記被検体に対する前記ＥＧＣＧ誘導体の投与時期は、特に制限されないが、例えば、ウイルス感染前でもよいし、ウイルス感染後でもよい。前述のように、ＥＧＣＧ誘導体は、例えば、感染細胞におけるウイルスタンパク質の増殖や、ウイルス由来の膜融合タンパク質を介した膜融合を阻害して、ウイルス感染の初期段階をブロックすることができる。このため、本発明は、例えば、感染細胞におけるウイルスタンパク質の発現阻害方法、または、ウイルスの膜融合の阻害方法ということもできる。
【実施例】
【００５６】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。【００５７】
［実施例１］
（１）ＥＧＣＧ誘導体の調製
膜融合阻害剤として、下記方法によりＥＧＣＧ誘導体を調製した。【００５８】
ＤＭＦ１００ｍＬに、ＥＧＣＧ１ｇ、以下に示すアシル基供与体９２７ｍｇおよびリパーゼ（商品名Ｌｉｐａｓｅ  ＰＬ、名糖産業社製）５００００Ｕを混合し、５７℃で２時間インキュベートして酵素反応を行った。【００５９】
【表１】
0005579449.tif 000007
【００６０】
そして、インキュベート後の反応液をろ過、濃縮後、カラムクロマトグラフィー（球状、中性、４０−５０μｍ、商品名Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌＮ６０、関東化学株式会社製）に供し、不純物である未反応アシル基供与体を除去した。得られた反応生成物についてエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を行った結果、ＥＧＣＧのＢ環のＲ１もしくはＲ２、または、Ｄ環のＲ５もしくはＲ６に、エステル結合によって前記表１に示すアシル基が１個導入されたことが確認できた。【００６１】
さらに、ＥＧＣＧのどの位置がエステル化されたかを確認するため、前記反応生成物をプロトン核磁気共鳴（Ｈ１  ＮＭＲ）で分析した。この結果を下記表に示す。【００６２】
【表２】
0005579449.tif 000008
【００６３】
前記Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１０のアシル基が導入されたＥＧＣＧ誘導体を、以下、それぞれ、ＥＧＣＧ−Ｃ４（ＥＧＣＧ−Ｂｕｔ）、ＥＧＣＧ−Ｃ８（ＥＧＣＧ−Ｏｃｔ）、ＥＧＣＧ−Ｃ１２（ＥＧＣＧ−Ｌａｕ）、ＥＧＣＧ−Ｃ１６（ＥＧＣＧ−Ｐａｌ）、ＥＧＣＧ−Ｃ１８（ＥＧＣＧ−Ｓｔｅ）、ＥＧＣＧ−Ｃ２０（ＥＧＣＧ−Ｅｉｃ）、ＥＧＣＧ−Ｃ１８−ＤＥ（ＥＧＣＧ−ｌｉｎｏｌｅｙｌ）、ＥＧＣＧ−Ｃ１８−ＴＥ（ＥＧＣＧ−ｌｉｎｏｌｅｎｏｙｌ）、ＥＧＣＧ−Ｃ１５−Ｆａｒ（ＥＧＣＧ−Ｆａｒ）、ＥＧＣＧ−Ｃ１０−Ｔｒａｎｓ（ＥＧＣＧ−Ｔｒａｎｓ）という。これらのＥＧＣＧ誘導体は、前記化学式（２）に示すＥＧＣＧ誘導体であり、前記各部位（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５またはＲ６）が表２に示す構造式のアシル基である。これらのＥＧＣＧ誘導体を用いて、以下の実験を行った。【００６４】
（２）細胞のウイルス感染予防
前記各ＥＧＣＧ誘導体を、所定濃度０〜１２８μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）となるように、それぞれＯｐｔｉＭＥＭ（０．２％ＤＭＳＯ）に溶解し、各種サンプル溶液を調製した（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１０）。他方、イヌ腎臓培養細胞（ＭＤＣＫ）を、培養液を入れた６ウェルプレートでＣｏｎｆｌｕｅｎｔになるまで培養した（約８時間）。前記プレートから培養液を除去し、培養した細胞シートをＤ−ＰＢＳで洗浄した後、前記サンプル溶液１．２ｍＬをアプライし、ＣＯ２存在下、３７℃で２時間インキュベートした。前記サンプル溶液を除去し、Ｄ−ＰＢＳで細胞シートを洗浄した後、ＤＭＥＭ（０．２％ＢＳＡ）で懸濁したインフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ８／３４／Ｈ１Ｎ１）を、ＭＯＩ＝２．５×１０−４になるように前記細胞シートにアプライした。そして、室温下で１時間インキュベートした後、６．０×１０−４％  Ｔｒｙｐｓｉｎおよび０．２％ＢＳＡを含有する０．８％アガロースゲルを前記細胞シートに重層した。さらに、ＣＯ２存在下、３７℃で５２−６０時間インキュベートした後、前記細胞シートに現れたプラーク数をカウントした。そして、ＥＧＣＧ誘導体無添加（０μｍｏｌ／Ｌ）のプラーク数を１００として、プラーク形成比（％）を算出した。比較例としては、ＥＧＣＧ誘導体に代えてアシル基未導入であるＥＧＣＧを使用し、同様の処理を行った。Ｎｏ．１〜Ｎｏ．６のＥＧＣＧ誘導体およびＥＧＣＧの結果を図１に示す。図１は、ＥＧＣＧ誘導体の濃度とプラーク形成比との関係を示すグラフである。同図において、プラーク形成比は、ＥＧＣＧ誘導体無添加（０μｍｏｌ／Ｌ）でのプラーク数を１００％とした相対値（％）で表した(以下、同様)。また、Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１０のＥＧＣＧ誘導体およびＥＧＣＧについて、抗ウイルス活性（ＥＣ５０）、細胞毒性（ＣＣ５０）およびＳＩを下記表に示す。【００６５】
【表３】
0005579449.tif 000009
【００６６】
図１に示すように、細胞に予めＥＧＣＧ誘導体を添加することによって、ＥＧＣＧ添加（◆）よりも、プラーク形成が減少され、中でも、ＥＧＣＧ−１６、ＥＧＣＧ−Ｃ１２において、顕著な現象が確認された。また、前記表に示すように、細胞に予めＥＧＣＧ誘導体を添加することによって、比較例のＥＧＣＧよりも、優れた抗ウイルス効果が得られた。なお、細胞毒性についても、問題はなかった。特に、ＥＧＣＧ−１２、ＥＧＣＧ−Ｃ１５−Ｆａｒ、ＥＧＣＧ−１６、ＥＣＧＣ−Ｃ１８−ＤＥ、ＥＧＣＧ−Ｃ１８ＴＥは、それぞれＥＣ５０が３〜７の範囲であり、ＥＧＣＧのＥＣ５０（９４．６０）と比較して、極めて高い抗ウイルス効果を示した。中でも、ＥＧＣＧ−Ｃ１８−ＤＥは、ＥＣ５０が低く、ＣＣ５０が高いことから、低濃度で優れた抗ウイルス効果を示し、且つ、毒性も極めて低いことがわかった。また、ＥＧＣＧ-Ｃ１８-ＴＥは、極めて低い濃度で、優れた抗ウイルス効果を示すことがわかった。さらに、主鎖長が同じ長さ（１２）であるＥＧＣＧ−Ｃ１２とＥＧＣＧ−Ｃ１５−Ｆａｒを比較した結果、不飽和結合を有する方が、抗ウイルス効果が高いことが示された。また、同様に、主鎖長が同じ長さ（１８）であるＥＧＣＧ−Ｃ１８とＥＧＣＧ−Ｃ１８−ＤＥとＥＧＣＧ−Ｃ１８−ＴＥとを比較した結果、不飽和結合を有し、且つ、不飽和結合の数が多い程、抗ウイルス効果が高いことが示された。以上のように、予め細胞にＥＧＣＧ誘導体を添加することによって、優れた抗ウイルス効果を示していることから、本発明の膜融合阻害剤は、ウイルス感染の予防剤として使用可能といえる。【００６７】
（３）ウイルスの感染能力の阻害
ＯｐｔｉＭＥＭ（０．２％  ＤＭＳＯ）に、所定濃度（０〜１００００ｎｍｏｌ／Ｌ）となるように各種ＥＧＣＧ誘導体を溶解し、さらに、インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ８／３４／Ｈ１Ｎ１）を添加して、室温で３０分インキュベートした。イヌ腎臓培養細胞（ＭＤＣＫ）を、培養液を入れた６ウェルプレートでＣｏｎｆｌｕｅｎｔになるまで培養した（約８時間）。前記プレートから培養液を除去し、培養した細胞シートをＤ−ＰＢＳで洗浄した後、前述のＥＧＣＧ誘導体とインフルエンザウイルスとを含むサンプル溶液を、インフルエンザウイルスがＭＯＩ＝２．５×１０−４となるようにアプライした。そして、室温下で１時間インキュベートした後、６．０×１０−４％  Ｔｒｙｐｓｉｎおよび０．２％ＢＳＡを含有する０．８％アガロースゲルを前記細胞シートに重層した。さらに、ＣＯ２存在下、３７℃で５２〜６０時間インキュベートした後、前記細胞シートに現れたプラーク数をカウントした。そして、ＥＧＣＧ誘導体無添加（０μｍｏｌ／Ｌ）のプラーク数を１００として、プラーク形成比（％）を算出した。比較例としては、ＥＧＣＧ誘導体に代えてアシル基未導入であるＥＧＣＧを使用し、同様の処理を行った。この結果を図２に示す。図２は、ＥＧＣＧ誘導体の濃度とプラーク形成比との関係を示すグラフである。また、ＥＧＣＧ誘導体およびＥＧＣＧについて、抗ウイルス効果（ＥＣ５０）およびＳＩを下記表に示す。【００６８】
【表４】
0005579449.tif 000010
【００６９】
図２に示すように、インフルエンザウイルスに予めＥＧＣＧ誘導体を添加することによって、ＥＧＣＧ添加（◇）よりも、プラーク形成の顕著な減少が確認できた。また、前記表に示すように、インフルエンザウイルスに予めＥＧＣＧ誘導体を添加することによって、比較例のＥＧＣＧよりも、優れた抗ウイルス効果が得られた。特に、ＥＧＣＧ−Ｃ１２、ＥＧＣＧ−Ｃ１６、ＥＧＣＧ−Ｃ１８、ＥＧＣＧ−Ｃ１８−ＤＥ、ＥＧＣＧ−Ｃ１８−ＴＥは、それぞれＥＣ５０が０．０２〜０．１１８であり、ＥＧＣＧのＥＣ５０（０．３９１）と比較して、極めて高い抗ウイルス効果を示した。中でも、ＥＧＣＧ−Ｃ１８は、抗ウイルス効果と毒性との比を示すＳＩが極めて高いことから、低濃度で優れた抗ウイルス効果を示し、且つ、毒性も極めて低いことがわかった。この結果から、ＥＧＣＧ誘導体によれば、ウイルスの細胞に対する感染能力を阻害できるといえ、ウイルスを直接不活性する効果を示すということもできる。また、予めウイルスにＥＧＣＧ誘導体を添加していることから、本発明の膜融合阻害剤が、ウイルス感染の予防剤として使用できることがわかった。【００７０】
［実施例２］
本発明におけるＥＧＣＧ誘導体が、ＮＡではなく、ＨＡによる膜融合をターゲットとすることを、血球凝集により確認した。【００７１】
赤血球凝集アッセイ
実施例１で作製したＥＧＣＧ−Ｃ１６（ＥＧＣＧ−Ｐａｌ）を、Ｄ−ＰＢＳ（０．２％ＤＭＳＯ）に溶解し、所定濃度のサンプル溶液を調製した。ＥＧＣＧ−Ｃ１６の濃度は、後述する処理時の終濃度が、それぞれ０、０．２５、０．５、１、２、４、８、１６μｍｏｌ／Ｌとなるように設定した。前記サンプル溶液２５μＬを９６ウェルプレートにアプライした。さらに、Ｄ−ＰＢＳで懸濁したインフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ８／３４／Ｈ１Ｎ１）懸濁液（６．５×１０５ＴＣＩＤ５０）２５μＬを前記プレートにアプライした。前記プレートを室温で３０分インキュベートした後、Ｄ−ＰＢＳで１／２００に希釈したニワトリ赤血球の凝集液５０μＬをアプライした。前記プレートを４℃で１時間インキュベートした後、赤血球の凝集度合いを観察し、ＥＧＣＧ−Ｃ１６の凝集阻害効果を評価した。コントロールとして、インフルエンザウイルス懸濁液に代えてＤ−ＰＢＳを使用し、同様に評価を行った。また、比較例としては、ＥＧＣＧ−Ｃ１６に代えてＥＧＣＧを使用した。【００７２】
この結果を図３に示す。同図は、ＥＧＣＧ存在下での赤血球の凝集を示す写真である。同図において、上から１−２列がＥＧＣＧ−Ｃ１６を使用した結果（Ｖｉｒｕｓ）、３−４列がＥＧＣＧ−Ｃ１６に対するコントロールの結果（Ｎｏ  Ｖｉｒｕｓ）、５−６列がＥＧＣＧを使用した結果（Ｖｉｒｕｓ）、７−８列がＥＧＣＧに対するコントロールの結果（Ｎｏ  Ｖｉｒｕｓ）である。また、横のレーンは、ＥＧＣＧ誘導体の濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を変化させた結果である。【００７３】
同図に示すように、ウイルス存在下で、ＥＧＣＧ−Ｃ１６無添加（０μｍｏｌ／Ｌ）の場合、赤血球の凝集が確認されたが、ＥＧＣＧ−Ｃ１６の濃度が増加するに伴って、赤血球の凝集が抑制された（４、８、１６μｍｏｌ／Ｌ）。これらの結果から、ＥＧＣＧ−Ｃ１６が、ＨＡによる膜融合を阻害することがわかった。これに対して、比較例のＥＧＣＧは、終濃度を１６μｍｏｌ／Ｌまで増加させても、赤血球の凝集抑制が確認できなかった。なお、他のＥＧＣＧ誘導体についても、同様の結果が得られた。以上の結果から、前述の実施例と同様に、ＥＧＣＧ誘導体によれば、効率よく膜融合を阻害することによって、ウイルス感染を防止できるといえる。【００７４】
［実施例３］
ＥＧＣＧ誘導体と、抗ウイルス作用のメカニズムが異なるザナミビル（登録商標リレンザ）およびリン酸オセルタミビル（登録商標タミフル）とについて、細胞のウイルス感染予防効果およびウイルスの感染能力阻害効果を比較した。【００７５】
実施例１と同様にして、ウイルス感染予防効果と感染能力の阻害とを評価した。また、比較例は、ＥＧＣＧ誘導体に代えて、ザナミビル、リン酸オセルタミビルまたはＥＧＣＧを使用した以外は、同様の処理を行った。【００７６】
ウイルス感染予防効果の結果を、図４および下記表５に示す。図４は、ＥＧＣＧ−Ｃ１６の濃度とプラーク形成比との関係を示すグラフである。図４に示すように、細胞に予めＥＧＣＧ−Ｃ１６を添加することによって、比較例よりも、極めて効果的にプラーク形成を減少することができた。なお、他のＥＧＣＧ誘導体についても同様の効果が得られた。また、下記表５に示すように、細胞に予めＥＧＣＧ誘導体を添加することで、比較例よりも、極めて優れたウイルス感染予防効果を示した。具体的に、ＥＧＣＧ誘導体は、ザナミビルの約５．４〜１２．７倍、リン酸オセルタミビルの約８．３〜１９．３倍、ＥＧＣＧの約１３．５〜３１．６倍の効果を示した。【００７７】
【表５】
0005579449.tif 000011
【００７８】
つぎに、ウイルスの感染能力阻害の結果を、図５および下記表６に示す。図５は、ＥＧＣＧ−Ｃ１６の濃度とプラーク形成比との関係を示すグラフである。図５に示すように、ウイルスに予めＥＧＣＧ−Ｃ１６を添加することによって、比較例よりも、効果的にプラーク形成を減少することができた。なお、他のＥＧＣＧ誘導体についても同様の結果が得られた。また、下記表６に示すように、ウイルスに予めＥＧＣＧ誘導体を添加することで、比較例よりも、優れたウイルスの感染能力を阻害することができた。具体的に、ＥＧＣＧ誘導体は、ザナミビルの約２１〜３１５倍、リン酸オセルタミビルの約１８７〜２８１０倍、ＥＧＣＧの約１．３〜２０倍を示した。
【表６】
0005579449.tif 000012
【００７９】
以上の結果から、ＥＧＣＧ誘導体によれば、ＥＧＣＧや、従来の抗ウイルス効果と比較して、効率よくウイルス感染を防止できることがわかった。【００８０】
［実施例４］
ウイルス感染細胞に対するＥＧＣＧ−Ｃ１６の治療効果を確認した。【００８１】
ＥＧＣＧ−Ｃ１６を、所定濃度（０、２、８、３２、６４、１２８ｎｍｏｌ／Ｌ）となるようにＯｐｔｉＭＥＭ（０．２％ＤＭＳＯ）に溶解し、サンプル溶液を調製した。イヌ腎臓培養細胞（ＭＤＣＫ）を６ウェルプレートにＣｏｎｆｌｕｅｎｔになるまで培養した。前記プレートから培養液を除去し、培養した細胞シートをＤ−ＰＢＳで洗浄した後、ＤＭＥＭ（０．２％ＢＳＡ）で懸濁したインフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ８／３４／Ｈ１Ｎ１）液７００μＬを、ＭＯＩ＝２．５×１０−４になるように前記細胞シートにアプライした。そして、室温下で１時間インキュベートした後、Ｄ−ＰＢＳで前記細胞シートを洗浄した。前記ＥＧＣＧ−Ｃ１６のサンプル溶液７００μＬをアプライし、ＣＯ２存在下、３７℃で２時間インキュベートした。前記サンプル溶液を除去し、Ｄ−ＰＢＳで細胞シートを洗浄した後、６．０×１０−４％  Ｔｒｙｐｓｉｎおよび０．２％ＢＳＡを含有する０．８％アガロースゲルを前記細胞シートに重層した。さらに、ＣＯ２存在下、３７℃で５２〜６０時間インキュベートした後、前記細胞シートに現れたプラーク数をカウントした。そして、ＥＧＣＧ誘導体無添加（０μｍｏｌ／Ｌ）のプラーク数を１００として、プラーク形成比（％）を算出することによって、ＥＧＣＧ誘導体のウイルス感染予防効果を評価した。比較例としては、ＥＧＣＧ誘導体に代えてアシル基未導入であるＥＧＣＧを使用し、同様の処理を行った。これらの結果を図６に示す。図６は、ＥＧＣＧ誘導体の濃度とプラーク形成比との関係を示すグラフである。【００８２】
図６に示すように、ウイルスに感染した細胞にＥＧＣＧ誘導体を添加することによって、ＥＧＣＧを添加した場合よりも、プラーク形成の顕著な減少が確認できた。なお、他のＥＧＣＧ誘導体についても同様の結果が得られた。この結果から、すでにウイルスに感染した細胞が存在する場合であっても、感染細胞からのウイルスの放出を抑制できることがわかった。これによって、感染細胞から放出されるウイルスによるさらなる感染を防止することができるといえる。【００８３】
［実施例５］
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＥＧＣＧ誘導体の感染予防効果を確認した。【００８４】
マウス（Ｂｕｌｂ／Ｃ、メス、６週齢）を５匹ずつＡ〜Ｄの４群にわけ、それぞれ別個のゲージに入れた。各群のマウスについて、条件をかえて、以下に示す処理を行った。
Ａ群：ＥＧＣＧ−Ｃ１６投与（−）／インフルエンザウイルス感染（−）
Ｂ群：ＥＧＣＧ−Ｃ１６投与（＋）／インフルエンザウイルス感染（−）
Ｃ群：ＥＧＣＧ−Ｃ１６投与（−）／インフルエンザウイルス感染（＋）
Ｄ群：ＥＧＣＧ−Ｃ１６投与（＋）／インフルエンザウイルス感染（＋）【００８５】
各マウスにエーテル麻酔を行い、Ａ群およびＣ群のマウスには、Ｄ−ＰＢＳ（２％ＤＭＳＯ）を、Ｂ群およびＤ群のマウスには、７１８μｍｏｌ／ＬのＥＧＣＧ−Ｃ１６を含むＤ−ＰＢＳ（２％ＤＭＳＯ）溶液２０μＬを、それぞれ経鼻接種した。２時間後、１０％ネンブタール液の腹腔内注射によって麻酔した前記マウスに対して、５×１０６  ＴＣＩＤ５０／ｍＬのインフルエンザウイルス（Ａ／ＦＭ１／Ｈ１Ｎ１）を２０μＬ経鼻接種した。ウイルスの経鼻接種後、１日おきにマウスの体重を測定し、体重変化と生存率の評価を行った。これらの結果を図７に示す。同図は、ウイルス感染後のマウスについて、体重の経時変化を示すグラフである。【００８６】
コントロールである、インフルエンザウイルスを感染させていないＡ群およびＢ群においては、体重変化は見られなかった。ＥＧＣＧ誘導体を未投与のＣ群は、インフルエンザウイルスの感染によって、体重が激減した。これに対して、予めＥＧＣＧ誘導体を投与したＤ群は、約１週間体重は若干減少したが、その後、急激に増加した。このように、ＥＧＣＧ誘導体を予め投与することによって、ウイルス感染による体重低下を抑制できることから、本発明におけるＥＧＣＧ誘導体によれば、インフルエンザウイルス感染後の病態の重篤化を予防できるといえる。【００８７】
［実施例６］
Ｄ環にアシル基を有するＥＧＣＧ誘導体と、Ｂ環にアシル基を有するＥＧＣＧ誘導体について、抗ウイルス効果を確認した。【００８８】
実施例１と同様にして、ＥＧＣＧ−Ｃ１６を作製した。前記ＥＧＣＧ−Ｃ１６としては、前記化学式（２）中、Ｂ環の３位（Ｒ１）がパルミトイル基（Ｃ１６）である誘導体と４位（Ｒ２）がパルミトイル基である誘導体との混合物（以下、「Ｂ環誘導体」という）、および、Ｄ環の４位（Ｒ５）がパルミトイル基（Ｃ１６）である誘導体と６位（Ｒ６）がパルミトイル基である誘導体との混合物（以下、「Ｄ環誘導体」という）を使用した。なお、化学式（２）において、前述したＲ以外のＲは、全て水素原子である。【００８９】
１．２５μＬの１０ｍｇ／ｍＬマウスミクロソーム（日本チャールズ・リバー株式会社）と、０．２５μＬの１％  ３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ、Ｄｏｊｉｎｄｏ社）水溶液を、８．５μＬの０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．４）に溶解した。この溶液を、氷上で３０分インキュベートすることにより、前記ミクロソーム中のグルクロン酸代謝酵素を溶出させた。これを反応液Ａとする。次に、１０μＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＧＣＧ−Ｃ１６、５．０μＬの１０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−α−リゾフォスファチジルコリン（Ｗａｋｏ社）、および、２０μＬの３０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＵＤＰ−グルクロン酸三ナトリウム（ＵＤＰ−Ｇｌｃ;ナカライ社）を、それぞれ１５５μＬの反応バッファー（１．０ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）：０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２：Ｈ２Ｏ＝２：１：１３）に溶解させた。これらを、それぞれ反応液Ｂとする。続いて、３７℃の湯浴中、前記反応液Ａと反応液Ｂとを混合することで、ＥＧＣＧ−Ｃ１６のグルクロン酸抱合化反応を行った。所定時間（０、０．５、１、１．５、３、６、１２、２４分）反応させた後、代謝反応の停止のために、２００μＬの反応液に対して、２００μＬのアセトニトリル（ＨＰＬＣ  ｇｒａｄｅ；関東化学株式会社）を添加した。続いて、前記反応液を０．４５μｍ  ＰＴＦＥ製ジスミックフィルター（Ｅｋｉｃｒｏｄｉｓｃ  １３ＣＲ；Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）でろ過した後、約４０μＬを下記条件でＨＰＬＣ分析に供した。【００９０】
ＨＰＬＣ分析システム（日本分光株式会社）にＷＰ３００−Ｃ４カラム（５μｍ，４．６×１５０ｍｍ，ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を搭載し、ＥＧＣＧ−Ｃ１６の代謝反応液を波長２６５ｎｍで解析した。ＨＰＬＣ分析の移動相には、０．１％トリフルオロ酢酸（ＨＰＬＣ  ｇｒａｄｅ；Ｗａｋｏ社）を含む蒸留水（ＨＰＬＣ  ｇｒａｄｅ；関東化学株式会社）をＡ液、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル（ＨＰＬＣ  ｇｒａｄｅ；関東化学株式会社）をＢ液として使用した。そして、Ｂ液が全体（Ａ液＋Ｂ液）において占める体積百分率を、溶出時間０、３、１０、２２、２６、２８、３０分において、それぞれ、０、０、２５、１００、１００、０、０％となるようにグラジエント設定し、流速１．５ｍＬ／ｍｉｎで分析を行った。そして、未反応の反応液におけるＥＧＣＧ−Ｃ１６のピーク面積を１００％として、所定時間の反応液におけるＥＧＣＧ−Ｃ１６のピーク面積の割合を、ＥＧＣＧ−Ｃ１６の残存率％として求めた。比較例としては、ＥＧＣＧ誘導体に代えてアシル基未導入であるＥＧＣＧを使用し、同様の処理を行った。これらの結果を図８に示す。同図は、ＥＧＣＧ−Ｃ１６の反応時間とＥＧＣＧ−Ｃ１６残存率との関係を示すグラフである。同図において、Ｄ−ｒｉｎｇは、Ｄ環誘導体であり、Ｂ−ｒｉｎｇは、Ｂ環誘導体を意味する。【００９１】
同図に示すように、２４分経過時において、Ｄ環誘導体は、ピーク面積が開始時の０．５％に減少していたが、Ｂ環誘導体は、４４％が残存しており、より代謝安定性に優れることがわかった。【００９２】
［実施例７］
Ｄ環にアシル基を有するＥＧＣＧ−Ｃ１６と、Ｂ環にアシル基を有するＥＧＣＧ−Ｃ１６とについて、ウイルス感染予防効果を確認した。【００９３】
実施例１と同様にして、前記実施例６におけるＢ環誘導体またはＤ環誘導体を予め細胞に添加して、ウイルス感染予防効果を確認した。これらの結果を図９に示す。同図は、Ｂ環誘導体およびＤ環誘導体の濃度とプラーク形成比との関係を示すグラフである。同図に示すように、Ｂ環誘導体とＤ環誘導体については、抗ウイルス効果に差は見られず、同様に優れた効果を示すことがわかった。また、Ｂ環誘導体について、３位（Ｒ１）がパルミトイル基（Ｃ１６）である誘導体と４位（Ｒ２）がパルミトイル基である誘導体とに分離し、同様にして抗ウイルス効果を確認したところ、異性体間で効果に差は見られず、同様に優れた効果を示すことがわかった。また、Ｄ環誘導体についても、４位（Ｒ５）がパルミトイル基（Ｃ１６）である誘導体と６位（Ｒ６）がパルミトイル基である誘導体とに分離し、同様にして抗ウイルス効果を確認したところ、異性体間で効果に差は見られず、同様に優れた効果を示すことがわかった。なお、なお、ＥＧＣＧ−Ｃ１６以外のＥＧＣＧ誘導体についても同様の結果が得られた。【００９４】
［実施例８］
同じ主鎖長のアシル基を有するＥＧＣＧ誘導体について、抗ウイルス効果を確認した。【００９５】
実施例１で作成したＥＧＣＧ−Ｃ１８、ＥＧＣＧ−Ｃ１８−ＤＥおよびＥＧＣＧ−Ｃ１８−ＴＥについて、ウイルス感染予防効果およびウイルスの感染能力阻害効果を確認した。これらのＥＧＣＧ誘導体は、それぞれ、アシル基の主鎖長が１８である。【００９６】
まず、実施例１と同様にして、前記各ＥＧＣＧ誘導体を予め細胞に添加して、ウイルス感染予防効果を確認した。なお、比較例として、ＥＧＣＧについても同様にしてウイルス感染予防効果を確認した。これらの結果を図１０に示す。同図は、各ＥＧＣＧ誘導体の濃度とプラーク形成比との関係を示すグラフである。同図に示すように、いずれもＥＧＣＧ誘導体も、ＥＧＣＧと比較して、低濃度でのプラーク形成の減少が確認できた。中でも、アシル基に不飽和結合を有するＥＧＣＧ−Ｃ１８−ＤＥ（ＥＧＣＧ−ＤＥ）およびＥＧＣＧ−Ｃ１８−ＴＥ（ＥＧＣＧ−ＴＥ）は、極めて低濃度で効率よくプラーク形成を減少でき、特に、ＥＧＣＧ−Ｃ１８−ＴＥの効果は、顕著であった。これらの結果から、アシル基の主鎖長が同じ場合、不飽和結合を有する方が、高いウイルス感染予防効果を示し、さらに、不飽和結合の数が多い程、高いウイルス感染予防効果を示すことがわかった。【００９７】
また、実施例１と同様にして、前記各ＥＧＣＧ誘導体を予めウイルスに添加して、ウイルスの感染能力阻害効果を確認した。なお、比較例として、ＥＧＣＧについても同様に感染能力阻害効果を確認した。これらの結果を図１１に示す。同図は、各ＥＧＣＧ誘導体の濃度とプラーク形成比との関係を示すグラフである。同図に示すように、いずれのＥＧＣＧ誘導体も、ＥＧＣＧと比較して、低濃度でのプラーク形成の減少が確認できた。中でも、アシル基が飽和脂肪酸であるＥＧＣＧ−Ｃ１８が、極めて低濃度で効率よくプラーク形成を減少できた。これらの結果から、アシル基の主鎖長が同じ場合、飽和脂肪酸の方が、高い感染能力阻害効果を示すことがわかった。【００９８】
［実施例９］
発育鶏卵における、ＥＧＣＧ誘導体によるウイルス感染阻害効果を確認した。【００９９】
ＥＧＣＧ−Ｃ１６とＡ型インフルエンザウイルス（Ａ／Ｈ５Ｎ１）とを含む、０．２％ＤＭＳＯを含むＯｐｔｉＭＥＭ溶液を調製した。前記溶液において、ＥＧＣＧ−Ｃ１６は、１．２５μｍｏｌ／Ｌ、前記インフルエンザウイルスは、１００  ＴＣＩＤ５０／ｅｇｇとなるように調製した。このカテキンとウイルス混合溶液を20℃で30分インキュベートした後、１００μＬを、１２日齢の発育鶏卵に接種した（ｎ＝８）。そして、前記発育鶏卵を３７℃で３０分インキュベートした後、経時的な生存率（％）を確認した。また、比較例として、前記ＥＧＣＧ誘導体に代えて、タミフル、ＥＧＣＧを接種して、同様に生存率を確認した。また、コントロールとして、ＥＧＣＧ誘導体を接種せずに、インフルエンザウイルスのみを接種した発育鶏卵についても、同様に生存率を確認した。【０１００】
これらの結果を、図１２に示す。同図は、発育鶏卵の経時的な生存率を示すグラフである。同図において、生存率は、８個の発育鶏卵のうち、全てが生存している状態を１００％とした相対値（％）である。同図に示すように、ＥＧＣＧ誘導体無添加（◆）、ＥＧＣＧ（▲）およびタミフル（□）では、全て同様の挙動を示し、３２時間で全てが致死であった。これに対して、ＥＧＣＧ−Ｃ１６（○）によれば、長時間生存が維持できることがわかった。【０１０１】
また、所定濃度（０．５、１、５、１０μｍｏｌ／ＬのＥＧＣＧ−Ｃ１６を含むＤ−ＰＢＳ（２％ＤＭＳＯ）溶液を使用し、発育鶏卵に対するインフルエンザウイルスの接種条件を、０．１、１．０または１０ＴＣＩＤ５０／ｅｇｇとした以外は、前述と同様にして、インフルエンザウイルス接種から２４時間後の生存率を確認した（ｎ＝８）。【０１０２】
これらの結果を、図１３に示す。同図は、ＥＧＣＧ誘導体の各濃度における発育鶏卵の生存率を示すグラフである。同図において、生存率は、８個の発育鶏卵のうち、全てが生存している状態を１とした、相対値である。同図に示すように、インフルエンザウイルスの接種濃度を増加させても、ＥＧＣＧ誘導体の濃度の増加によって、生存率の低下を十分に防止することができた。【０１０３】
［実施例１０］
種々のウイルスに対するＥＧＣＧ誘導体の感染能力阻害効果を確認した。【０１０４】
ウイルスとして、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）およびＩｎｆｌｕｅｎｚａＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８を使用し、ＥＧＣＧ誘導体として、ＥＧＣＧ−Ｃ１６を使用した。前記ＥＧＣＧ誘導体を予め各種ウイルスに添加した以外は、前記実施例１と同様にして感染能力阻害効果を確認した。なお、比較例として、ＥＧＣＧについても同様にして感染能力阻害効果を確認した。【０１０５】
これらの結果を図１４（Ａ）〜（Ｃ）に示す。同図（Ａ）は、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５（Ｈ１Ｎ１）によるプラーク形成比を示すグラフであり、同図（Ｂ）は、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）によるプラーク形成比を示すグラフであり、同図（Ｃ）は、ＩｎｆｌｕｅｎｚａＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８によるプラーク形成比を示すグラフである。各図に示すように、いずれのウイルスに対しても、ＥＧＣＧと比較して、ＥＧＣＧ−Ｃ１６は、プラーク形成の顕著な減少を示した。このように、本発明のＥＧＣＧ誘導体は、様々なウイルスに対して優れた効果を示すことがわかった。【０１０６】
［実施例１１］
予めＥＧＣＧ誘導体を添加したウイルスを細胞に感染させ、ウイルスタンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）およびマトリックスタンパク質（ＭＩ）の発現の有無を確認した。【０１０７】
ＯｐｔｉＭＥＭ（０．２％  ＤＭＳＯ）に、所定濃度（２０ｎｍｏｌ／Ｌ）となるようにＥＧＣＧ−Ｃ１６を溶解し、さらに、インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ８／３４／Ｈ１Ｎ１）を添加して、サンプル溶液を調製した。このサンプル溶液を室温で３０分インキュベートした。他方、イヌ腎臓培養細胞（ＭＤＣＫ）を、培養液を入れた６ウェルプレートでＣｏｎｆｌｕｅｎｔになるまで培養した（約８時間）。前記プレートから培養液を除去し、培養した細胞シートをＤ−ＰＢＳで洗浄した後、前記インキュベート後のサンプル溶液を、インフルエンザウイルスがＭＯＩ＝０．１５となるようにアプライした。そして、室温下で１時間インキュベートした後、６．０×１０−４％  Ｔｒｙｐｓｉｎおよび０．２％ＢＳＡを含有する０．８％アガロースゲルを前記細胞シートに重層した。さらに、ＣＯ２存在下、３７℃で所定時間（６、８、１０時間）インキュベートした。所定時間培養した細胞をメタノールで固定化し、一次抗体および二次抗体を用いて、ＨＡおよびＭＩの検出を行った。前記一次抗体としては、抗ＨＡ抗体（製品名Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｅ：Ａｂｃａｍ社製、希釈率１:１０００、希釈液２％ｍｉｌｋ  ｉｎ  ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ）または抗ＭＩ抗体（製品名Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｍａｔｒｉｘ：ＡｂＤ社製、希釈率１：１０００、希釈液２％ｍｉｌｋ  ｉｎ  ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ）を使用し、二次抗体としては、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  標識抗体(製品名Ａｎｔｉ−ＩｇＧ  Ｍｏｕｓｅ−Ｇｏａｔ  Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ：フナコシ社製、希釈率１：１０００、希釈液２％ｍｉｌｋ  ｉｎ  ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ)を使用した。また、ネガティブコントロールとして、前記ＥＧＣＧ−Ｃ１６を含むサンプル溶液に代えて、ＥＧＣＧ誘導体無添加のＯｐｔｉＭＥＭ（０．２％  ＤＭＳＯ）を前記培養細胞に添加して、同様に、ＨＡおよびＭＩの検出を行った。【０１０８】
これらの結果を図１５および図１６に示す。図１５は、培養細胞におけるＨＡの発現を示す写真であり、図１６は、培養細胞におけるＭＩの発現を示す写真である。前記両図において、上段は、ネガティブコントロールの結果、下段は、ＥＧＣＧ−Ｃ１６を添加した結果であり、「ｈ」は、インキュベート時間を示す。前記両図の上段に示すように、ＥＧＣＧ誘導体無添加の場合、８時間以上の培養で、ＨＡおよびＭＩの発現が確認された。これに対して、前記両図の下段に示すように、ＥＧＣＧ誘導体を予めウイルスに添加することによって、１０時間以上の培養によっても、ＨＡおよびＭＩは確認されなかった。この結果から、ＥＧＣＧ誘導体により、細胞内におけるウイルス由来のＨＡおよびＭＩの発現が抑制されたことがわかる。このように、ＥＧＣＧ誘導体によれば、ウイルスタンパク質が感染細胞内で増殖する前段階を阻害することが可能となる。また、ウイルスタンパク質が感染細胞内で増殖する前段階を阻害することから、例えば、従来のＭ２阻害剤、ならびに、ザナミビル（登録商標リレンザ）およびオセルタミビル（リン酸オセルタミビル；登録商標タミフル）等のＮＡ阻害剤と併用することで、二段階でのブロックが可能になることは明らかである。また、Ｍ２阻害剤やＮＡ阻害剤に耐性のウイルスに対しても、有効であることは明らかである。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明によれば、ウイルス増殖サイクルの感染工程において、ウイルスを包み込んだ食胞の膜（細胞由来）とウイルスのエンベロープ（ウイルスの膜）との膜融合を阻害できる。このように、膜融合自体が阻害されることから、下流のステップ、すなわち、脱殻や複製自体をブロックすることができる。また、従来の抗ウイルス剤とは異なるステップをターゲットとしていることから、本発明の膜融合阻害剤によれば、例えば、従来のＭ２阻害剤やＮＡ阻害剤ではブロックできなかったウイルスの感染阻害も可能となる。さらに、本発明において、ＥＧＣＧ誘導体の基本骨格のＥＧＣＧは、例えば、お茶等に含まれるカテキンであって、安全性に優れることは十分に知られており、また、Ｒ１〜Ｒ６のアシル基も、安全性に優れるものである。したがって、本発明の膜融合阻害剤は、さらに、安全性にも優れる薬剤といえる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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