(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検査対象であるリステリア菌が病原性のリステリア菌であるかどうかを推定する方法であって、
次の条件（１）又は（２）を満たす場合に、病原性のリステリア菌であると推定する方法。
（１）検査対象であるリステリア菌のｈｌｙＡ遺伝子の１３８３番目の塩基がＧであること
（２）同リステリア菌のｐｌｃＡ遺伝子の２７４番目の塩基がＣであり、７７０番目の塩基及び８３３番目の塩基がそれぞれＡであること
【請求項２】
検査対象であるリステリア菌が病原性のリステリア菌であるかどうかを推定する方法であって、
次の条件（１）及び（２）を満たす場合に、病原性のリステリア菌であると推定する方法。
（１）検査対象であるリステリア菌のｈｌｙＡ遺伝子の１３８３番目の塩基がＧであること
（２）同リステリア菌のｐｌｃＡ遺伝子の２７４番目の塩基がＣであり、７７０番目の塩基及び８３３番目の塩基がそれぞれＡであること
【請求項３】
検査対象であるリステリア菌が病原性のリステリア菌であるかどうかを推定する方法であって、
次の条件（３）又は（４）を満たす場合に、病原性のリステリア菌であると推定する方法。
（３）検査対象であるリステリア菌のｈｌｙＡ遺伝子の１２６３番目の塩基がＣであり、１３７７番目の塩基がＴであること
（４）検査対象であるリステリア菌のｃｌｐＣ遺伝子の５０８番目の塩基、６５４番目の塩基、９６１番目の塩基がそれぞれＡであり、かつ、５９４番目の塩基がＴであること
【請求項４】
検査対象であるリステリア菌が病原性のリステリア菌であるかどうかを推定する方法であって、
次の条件（３）及び（４）を満たす場合に、病原性のリステリア菌であると推定する方法。
（３）検査対象であるリステリア菌のｈｌｙＡ遺伝子の１２６３番目の塩基がＣであり、１３７７番目の塩基がＴであること
（４）検査対象であるリステリア菌のｃｌｐＣ遺伝子の５０８番目の塩基、６５４番目の塩基、９６１番目の塩基がそれぞれＡであり、かつ、５９４番目の塩基がＴであること
【請求項５】
さらに、次の条件（５）及び／又は（６）を満たす場合に、病原性のリステリア菌であると推定する請求項３又は４に記載の方法。
（５）検査対象であるリステリア菌のｉｎｌＡ遺伝子の１２７８番目の塩基、１３５０番目の塩基、１３５９番目の塩基、１３８３番目の塩基が何れもＴであること
（６）検査対象であるリステリア菌のｐｌｃＡ遺伝子の３７８番目の塩基がＣであり、８５９番目の塩基がＡであること
【請求項６】
病原性が推定されるリステリア菌の検出方法であって、
検査対象である分離されたリステリア菌から、検査対象であるリステリア菌のｈｌｙＡ遺伝子の１３８３番目の塩基を挟む領域を増幅するプライマーと配列番号３で示された塩基配列からなるサイクリングプロープを用いてＲＴ−ＰＣＲを適用した結果、前記サイクリングプローブとハイブリダイゼーションする前記ｈｌｙＡ遺伝子の増幅が認められた場合に病原性であると判断する検出方法。
【請求項７】
配列番号１及び配列番号２で示された塩基配列からなるプライマーを用いる請求項６に記載の検出方法。
【請求項８】
病原性が推定されるリステリア菌の検出方法で、次の（７）及び（８）の条件を満たす場合に病原性であると判断する検出方法。
（７）検査対象である分離されたリステリア菌から、検査対象であるリステリア菌のｃｌｐＣ遺伝子の５９４番目の塩基を挟む領域及び６５４番目の塩基を挟む領域を増幅するプライマーと配列番号６及び配列番号７で示された塩基配列からなるサイクリングプローブを用いてＲＴ−ＰＣＲを適用した結果、前記サイクリングプローブとハイブリダイゼーションする前記ｃｌｐＣ遺伝子の増幅が認められること
（８）検査対象である分離されたリステリア菌から、検査対象であるリステリア菌のｉｎｌＡ遺伝子の１３５９番目の塩基を挟む領域を増幅するプライマーと配列番号１０又は配列番号１１で示された塩基配列からなるサイクリングプローブを用いてＲＴ−ＰＣＲを適用した結果、前記サイクリングプローブとハイブリダイゼーションする前記ｉｎｌＡ遺伝子の増幅が認められること
【請求項９】
配列番号４及び配列番号５で示された塩基配列からなるプライマーを用いる請求項８に記載の検出方法。
【請求項１０】
配列番号８及び配列番号９で示された塩基配列からなるプライマーを用いる請求項８又は９に記載の検出方法。
【請求項１１】
請求項６の検出方法に用いられる検出用キットであって、
配列番号１及び配列番号２で示された塩基配列からなるプライマーセットと、
配列番号３で示された塩基配列からなるサイクリングプローブを有する検出用キット。
【請求項１２】
請求項８の検出方法に用いられる検出用キットであって、
配列番号４及び配列番号５で示された塩基配列からなるプライマーセットと、
配列番号６及び配列番号７で示された塩基配列からなるサイクリングプローブを有する検出用キット。
【請求項１３】
請求項８の検出方法に用いられる検出用キットであって、
配列番号８及び配列番号９で示された塩基配列からなるプライマーセットと、
配列番号１０で示された塩基配列からなるサイクリングプローブを有する検出用キット。
【請求項１４】
請求項８の検出方法に用いられる検出用キットであって、
配列番号８及び配列番号９で示された塩基配列からなるプライマーセットと、
配列番号１１で示された塩基配列からなるサイクリングプローブを有する検出用キット。
【請求項１５】
請求項８の検出方法に用いられる検出用キットであって、
配列番号４及び配列番号５で示された塩基配列からなるプライマーセットと、
配列番号８及び配列番号９で示された塩基配列からなるプライマーセットと、
配列番号６及び配列番号７で示された塩基配列からなるサイクリングプローブと、
配列番号１０又は配列番号１１で示された塩基配列からなるサイクリングプローブを有する検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リステリア  モノサイトゲネス菌（Listeria monocytogenes）の検出・同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リステリア菌は、動物や土壌などの環境中に広く常在しており、食肉や乳製品を中心とする様々な食品から高頻度に検出される。ところが、リステリア菌は低温増殖能や高食塩濃度耐性をもつため（五十君ら、2003）、食品の一次汚染はもちろん製造工程での二次汚染を防ぐことも困難である。食品が高濃度で本菌に汚染されていると、食品の低温保存中に増殖し、食中毒を引き起こす恐れがある。
【０００３】
分類学的にリステリア属には６菌種が知られているが、リステリア症の原因菌とされているのはL. monocytogenesの１菌種だけであり、敗血症、髄膜炎、伝染性単核症など人畜共通の重篤な症状を引き起こす（五十君ら、2003、2004）。その病原因子の１つとして、L. monocytogenesの産生する溶血毒listeriolysin Oがある。L. monocytogenesは、細胞内寄生性細菌であり、マクロファージに貧食されても食胞から細胞質へエスケープし、殺菌機構を逃れ増殖する。Listeriolysin Oは食胞からの脱出に関与しているが、構造遺伝子であるｈｌｙＡを欠失させると、マクロファージに貧食されても食胞膜を障害することができずに食胞内にとどまり、殺菌されてしまうことから、本菌の病原因子として最も重要であるとみなされている（櫻井ら、2002）。本菌に感染した場合、成人は抵抗力が強いため、無症状感染や保菌状態となるが、新生児、高齢者及び免疫不全者などのハイリスク群では多くのリステリア症の発症がみられ、重症化した場合の致命率は３０％と極めて高く、子宮内で胎児が感染すると死産や早産の原因となることが知られている（五十君ら、2003、2004）。
【０００４】
これまで、日本では、リステリア症の発生状況が十分に把握されていなかったため、その感染源や感染経路については不明である。ある調査結果の報告では年間８３件のリステリア症の発症が確認されているものの、欧米で問題視されているような食品を介した集団食中毒事例は確認されていなかった。しかし、２００１年北海道で発生したナチュラルチーズによる食中毒が本菌によるものであったと同定され、さらに、食品が世界的に流通していることから、今後日本でも欧米のような深刻な集団食中毒が発生する可能性が懸念されている。
【０００５】
現在、血清型によって菌株を分類することが疫学的解析の基盤となっているが、全てのL. monocytogenesの病原性が高いわけでもなく、ヒトの感染症例から検出されるのは血清型として１／２ａ型、１／２ｂ型及び４ｂ型がほとんどである（非特許文献１）。従って、血清型による分類によって病原性の有無を推定することもできる。
【０００６】
しかしながら、血清型が同じであるからと言って、必ずしもすべての菌が高い病原性を有しているとは限らない。このため、本菌による食中毒が発生した際、その原因食品を同定し、感染経路を解明するには、血清型による分類のみでは不十分であり、それ以上に菌株を詳細に分類する必要がある。
【０００７】
リステリア菌に感染した場合、発症までに長時間を要し、個人差があるため（五十君、2004）、頻発して起こるリステリア症が同一の食品を介して発生した集団食中毒であるかを判断することは困難である。また、菌株によっては血清型による分類ができない場合があり、血清型による分類のみでは病原性の有無の判定や追跡調査が十分にできない。このような観点からも詳細な分類が必要である。
【０００８】
このような状況下、例えばＲＦＬＰによる分類（非特許文献２参照）やＰＦＧＥによる分類（非特許文献３参照）が提案されているが、実験操作に熟練を必要とし、操作が煩雑で長時間を要する。また、簡易迅速検出法として、ｈｌｙＡ遺伝子をＰＣＲにより増幅するためのプライマーセットも報告されているが（非特許文献４）、ｈｌｙＡ遺伝子を有しない菌株には無効であり、１００％のL. monocytogenesを検出できるわけでは無い。これらの方法以外にも、ＰＣＲによりL. monocytogenesを検出したり、血清型を判定したりする試みが数々行われているが（特許文献１，２、非特許文献５，６、７など）、病原性の高い菌株との関連性については把握されていない。
【０００９】
このように、現在のところ、ヒトへの感染が心配される特に病原性の強い菌株の検出・同定のための方法も無いのが実情である。
【特許文献１】特開平６−２３３６９９号公報
【特許文献２】特開２００４−１５４１４１号公報
【非特許文献１】Nelson, KE. Et al., Whole genome comparisons of serotype 4b and 1/2a strains of the food-borne pathogen Listeria monocytogenes reveal new insights into the core genome components of this species, Nucleic Acids Res., 32(2004), 2386-95
【非特許文献２】Fukiko Ueda et al., Comparison of Genomic Structures in the Serovar 1/2a Listeria monocytogenes Isolated from Meats and Listeriosis Patients in Japan, Jpn. J. Infect. Dis., 58(2005), 289-293
【非特許文献３】Marc Yde, and Annie Genicot，Use of PFGE to characterize clonal relationships among Belgian clinical isolates of Listeria monocytogenes, J Med Microbiol, 53 (2004), 399-402
【非特許文献４】Lehner, et al., A rapid differentiation of Listeria monocytogenes by use of PCR-SSCP in the listeriolysin O (hlyA) locus, J. Microbiol. Med 34(1999), 165-171
【非特許文献５】Rodriguez-Lazaro, D. et al., Simultaneous quantitive detection of Listeria spp. and Listeria monocytogenes using a duplex real-time PCR-based assay, FEMS. Microbiol. Lett., 233(2004), 257-267
【非特許文献６】Thomas, E. J. G et al., Sensitive and Specific Detection of Listeria monocytogenes in Milk and Ground Beef with the Polymerase Chain Reaction, Appl. Environ. Microbiol., 57(1991), 2576-2580
【非特許文献７】Monica K. Borucki  and Douglas R. Call, Listeria monocytogenes Serotype Identification by PCR, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 41, No. 12(2003), 5537-5540
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記の背景技術に鑑みてなされたものであって、その目的は、リステリア菌、その中でも特に高い病原性を有するL. monocytogenesの菌株を迅速に検出、分類同定することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記目的を達成するため、種々の食品及び環境から分離されたL. monocytogenes及び臨床由来のL. monocytogenes菌株において、病原性に関係すると考えられている複数の遺伝子の塩基配列を決定し、これらの配列を比較することにより、臨床由来株に特異的な一塩基置換（塩基配列）を見いだした。そして、この一塩基置換を特異的に検出できるサイクリンブプローブ法（TaqMan（商標名）プローブ法）などの分子生物学的検出方法のためのプライマーセット及びプローブＤＮＡを用いてＰＣＲ（ＰＣＲ−ＲＴ）を行うことにより、上記課題を解決するに至った。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、遺伝子の一塩基多型を用いた分類によって、病原性が高いと推定されるリステリア菌の検出・同定が迅速にできる。また、特に病原性が強いと推定される血清型１／２ａ型及び血清型４ｂ型の遺伝型グループを特異的に検出、同定できるサイクリングプローブ法用のプライマーセット及びキメラプローブが提供される。このプライマーセット及びキメラプローブを用いたＳＮＰ検出法によるリアルタイムＰＣＲを行うことにより、検体、例えば各種の食品、生乳や生鮮魚介類、生肉その他のReady-To-Eat食品、飲料水や排水などの環境水から検出されるL.monocytogenes、その中でも病原性が高いと推定される臨床株と同じ遺伝型であるL.monocytogenes菌株を特異的に検出し、L.monocytogenes菌による汚染を簡便かつ迅速に判定できる。また、上記分類に従えば、感染源の特定、感染ルートの解明をより正確かつ迅速に行える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、病原性が高いと考えられるListeria monocytogenesを検出、同定するための方法に関し、その菌が有する特徴的な一塩基多型をＰＣＲによって検出するための核酸増幅用のプライマー及び検出用のプローブを提供する。
【００１４】
Listeria monocytogenes（以下「リステリア菌」と称する。）の病原因子としては溶血毒listeriolysin Oの構造遺伝子であるｈｌｙＡ以外に、ｈｌｙＡと同じ病原遺伝子座ｐｒｆＡにコードされている病原遺伝子の転写促進に関係するｐｒｆＡ、細胞内の殺菌機構から逃れるために重要な酵素であるホスファチジルイノシトール特異的ホスフォリパーゼＣをコードするｐｌｃＣ、ホスフォリパーゼＣの活性化に必要な金属プロテアーゼをコードするｍｐｌ、細胞からの脱出に必要なアクチンとの会合に必要なタンパク質をコードするａｓｚｃｔＡ、ホスファチジルコリン特異的ホスフォリパーゼＣをコードするｐｌｃＢ、さらに、細胞内への侵入に必要なinternalinＡ分子をコードするｉｎｌＡ、ペプチドグリカンの分解酵素をコードするｉａｐ、ストレス耐性に重要な役割を示すClaC ATPaseをコードしているｃｌｐＣなどがある。
【００１５】
リステリア菌は、血清型分類によれば１／２ａ型、１／２ｂ型、１／２ｃ型、３ａ型、３ｂ型、３ｃ型、４ｂ型、４ｅ型などの菌株が存在するが、上記したようにヒトの感染症例から検出されるのは１／２ａ型、１／２ｂ型及び４ｂ型がほとんどである。ところで、本発明者らは、臨床由来株及び食品環境由来株について、上記病原因子の塩基配列を詳細に調べたところ、ｈｌｙＡ遺伝子、ｃｌｐＣ遺伝子、ｉｎｌＡ遺伝子、ｐｌｃＡ遺伝子において詳細な分類を可能とする特徴的な一塩基置換（一塩基多型：ＳＮＰ）を見いだした。病原性の有無は血清型による分類のみでは判別できず、この特徴的な一塩基置換を分類することによってはじめてリステリア菌の病原性を推測することが可能となった。
【００１６】
すなわち、本発明は、ｈｌｙＡ遺伝子、ｃｌｐＣ遺伝子、ｉｎｌＡ遺伝子、ｐｌｃＡ遺伝子において、臨床株に特徴的な一塩基置換を検出することにより、検出対象であるリステリア菌が臨床株と同様の高い病原性を有することの判定を可能としている。また、病原性が高いと推定される臨床株において、たとえ同じ血清型に属していたとしても、これらの遺伝子の塩基配列が部分的に異なる多型が存在する。このため、正確な感染ルートを定めるためにはこれらの多型をも分析する必要があり、本発明はこれらの多型を考慮した判定を可能にしている。そして、本発明は、この判定に用いられる核酸増幅用のプライマーセット及び検出用のプローブを提供する。
【００１７】
一塩基置換部位は各遺伝子において異なり、一塩基置換部位によってグループ化される。図５〜１８に、各遺伝子において見出された一塩基置換部位を含む遺伝子領域をグループ毎に示した。例えば、ｈｌｙＡ遺伝子においては、ｈｌｙＡ遺伝子の開始コドンから１１２６−１５２７塩基の間に一塩基置換がみられ、この間の一塩基置換は図１及び図５に示すようにグループ１〜９の９グループ（９グループの一塩基多型：多型グループという）にグループ化される。ｃｌｐＣ遺伝子においては、ｃｌｐＣ遺伝子の４８９−１１２４塩基の間に一塩基置換が見られ、この間の一塩基置換は図２及び図６〜８に示すようにグループ１〜１４の１４グループ（１４グループの多型グループ）にグループ化される。ｉｎｌＡ遺伝子においては、ｉｎｌＡ遺伝子の１１９２−１７９９塩基の間に一塩基置換がみられ、この間の一塩基置換は図３及び図９〜１１に示すようにグループ１〜１７の１７グループ（１７グループの多型グループ）にグループ化される。ｐｌｃＡ遺伝子においては、ｐｌｃＡ遺伝子の開始コドンから１５３−８６５塩基の間に一塩基置換がみられ、この間の一塩基置換は図４及び図１２〜１４に示すようにグループ１〜２１の２１グループ（２１グループの多型グループ）にグループ化される。これらの塩基配列をそれぞれ配列番号２０〜８０に示す。配列番号２０〜２８はｈｌｙＡ遺伝子の１１２６−１５２７塩基部分を、配列番号２９〜４２はｃｌｐＣ遺伝子の４８９−１１２４塩基部分を、配列番号４３〜５９はｉｎｌＡ遺伝子の１１９２−１７９９塩基部分を、配列番号６０〜８０はｐｌｃＡ遺伝子の１５３−８６５塩基部分を示している。なお、各遺伝子とも、多型グループ順に示されている。
【００１８】
病原性が高いと推定される臨床株は、遺伝子ごとにいずれかのグループに分類される。本発明者らの研究によれば、４つの遺伝子内の一塩基多型による分類では、表１に示すように、臨床株はＡ〜Ｌまでの１２グループに分類される。この表から理解されるように同じ血清型であっても、属するグループが異なり、血清型の判別だけでは不十分なことが理解される。一方、４つの遺伝子において同じ一塩基多型に分類される菌株も存在し、グループＤやグループＩに見られるようにこれらのグループに属する菌株と同一の遺伝子配列を有するものは臨床例が多く、病原性が高いものとして着目すべきである。また、ｈｌｙＡとｐｌｃＡの２つの遺伝子に着目すれば、これらの遺伝子内の多型分類と血清型分類はほぼ一致していることも理解される。例えば、ｈｌｙＡ内の多型グループ５やｐｌｃＡ内の多型グループ１６は血清型１／２ａ型であり、ｈｌｙＡ内の多型グループ３はほぼ血清型で４ｂであると言える。この表から、血清型が１／２ａ型であってｈｌｙＡ遺伝子が多型グループ５又はｐｌｃＡ遺伝子が多型グループ１６に分類される菌株や、血清型が４ｂ型であってｈｌｙＡ遺伝子が多型グループ３に分類される菌株は、他の多型群に比べるとより病原性が高いとも言える。このように、血清型と特定の遺伝子における多型との組み合わせからも、病原性を推定できる。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
一方、ｈｌｙＡ遺伝子とｃｌｐＣ遺伝子に着目すれば、血清型が異なっているとは言え、２つの遺伝子において同一の多型グループに属するグループＡ〜Ｅ群も、検出された症例数が多く、病原性が高いとも推定される。また、これらの多型分類に血清型を加えて考慮すれば、ｈｌｙＡ遺伝子及びｃｌｐＣ遺伝子における一塩基多型並びに血清型で一致するＤ及びＥ群は、さらに病原性が高いとも言える。次に、ｈｌｙＡ遺伝子及びｐｌｃＡ遺伝子に着目すれば、グループＩ〜Ｌ群は同じ多型グループに属し、検出された症例数も多いのでこれらも病原性が高いと推定できる。もっとも、グループＩ〜Ｌ群はいずれも血清型１／２ａ型ではあるが、ｈｌｙＡ遺伝子の多型グループが５でありｐｌｃＡ遺伝子の多型グループが１６であると判断されれば血清型を考慮するまでもなく、病原性が高いと推定される。
【００２１】
このように、検査対象となる菌株について、それが属する多型グループを知ることにより、当該菌株の病原性を推定できる。つまり、食品中から検出された菌株が、例えばｈｌｙＡ遺伝子における多型グループが３であり、ｃｌｐＣにおける多型グループが１３であるならば、これまで臨床的に検出されていなくても、ある程度病原性が高いものと判断しうる。特に、血清型をも考慮して判定した場合には、より病原性の推定が高まり、１の一塩基多型（あるいは２以上の一塩基多型）との組み合わせによって簡便に病原性の推定ができるようになる。また、表１に示すグループＤやＩに属する菌株を特異的に検出できるプローブを用いれば、特に病原性が高いと着目すべき菌株のみを選択的に検出することも可能となる。こうして、病原性が高い菌株が検出されると、リステリア菌による食中毒が発生する可能性が判断される。その一方、血清型１／２ａ型や４ｂ型であることが検出されたとしても、これらの遺伝子型でなければ、食中毒の原因菌でない可能性も考えられる。そして、多型グループやそれに血清型を加えた分類を用いれば、より詳細な菌の同定が行える結果、正確な感染源や感染ルートの追跡が行える。
【００２２】
ところで、各遺伝子内の一塩基置換が、分類された各グループにおいて唯一のものであるならば、当該一塩基置換を検出することにより上記目的が達成される。すなわち、特定の一塩基置換のみを検出して各グループに分類できれば、当該一塩基置換を検出するだけで、病原性が高いと簡単に判断できる。図１５〜１９に、各遺伝子の塩基配列から一塩基置換部位のみを取り出してまとめた。図１５はｈｌｙＡ遺伝子について、図１６はｃｌｐＣ遺伝子について、図１７はｉｎｌＡ遺伝子について、図１８、１９はｐｌｃ遺伝子について示している。なお、各図の行は多型グループを示し、各図の列は図５〜１４に示した塩基配列における冒頭からの塩基番号を示している（なお、以下において示した「塩基番号」は、ここにいう塩基番号を意味する。）。
【００２３】
ここで、上記において病原性が高いと推定された臨床株グループＩ〜Ｌ群（血清型１／２ａ型）を判定する場合を例にとって説明する。このグループは、ｈｌｙＡ遺伝子による多型グループ５及びｐｌｃＡ遺伝子による多型グループ１６に属するが、他の臨床株には当該グループに属する多型グループは存在しない。従って、ｈｌｙＡ遺伝子においてグループ５又はｐｌｃＡ遺伝子においてグループ１６に属することが検出できれば、当該菌株は病原性が高いと推定できる。そこで、図１５に示す一塩基置換部位を見ると、塩基番号２５８番目の塩基（Ｇ）は他の多型グループの塩基と異なり、このグループに特異的である。従って、この塩基が一塩基置換部位として検出されると、臨床株グループＩ〜Ｌ群に属すると判断される。すなわち、この２５８番目の塩基（Ｇ）は、ｈｌｙＡ遺伝子の一塩基多型グループ５に特異的な一塩基置換であると言える。また、当該塩基以外にも、塩基番号１５３番目の塩基（Ｃ）や同じく３１８番目の塩基（Ｇ）も多型グループ５に特異的な一塩基置換であって、これらの一塩基置換を検出することにより、臨床株グループＩ〜Ｌ群（血清型１／２ａ型）の検出が可能となる。このようにして、いずれかのグループのみを検出可能にする一塩基置換部分が選択される。
【００２４】
多型グループを判定するには、同じ遺伝子上にある複数箇所の一塩基置換の組み合わせによってもよい。例えば、ｐｌｃＡ遺伝子の塩基番号３７番目の塩基（Ｔ）と同塩基番号１００番目の（Ａ）、２２６番目の（Ｃ）の３つの塩基を検出すれば、ｐｌｃＡ遺伝子の多型グループ１０であることが判別できる。このように同一遺伝子上にある２以上の一塩基置換部位を組み合わせて、目的とする多型グループを検出することもできる。
【００２５】
次に、病原性が高いと推定された臨床株グループＤ群を判定する場合について考える。このグループは、ｈｌｙＡ遺伝子における多型グループ３、ｃｌｐＣ遺伝子における多型グループ１３及びｉｎｌＡ遺伝子における多型グループ１４並びにｐｌｃＡ遺伝子における多型グループ８に属する。ところが、図１６に示すｃｌｐＣ遺伝子の一塩基置換部位を見ると、多型グループ１３に特異的な一塩基置換を見出すことができない。そこで、出来る限り、ｃｌｐＣ遺伝子における多型グループ１３のみを検出できる組み合わせを考えると、図１６に示す一塩基置換部位から、ｃｌｐＣ遺伝子の塩基番号１０６番目の塩基（Ｔ）を検出するとともに塩基番号１６６番目の塩基（Ａ）を検出すれば、多型グループ１０，１１、１３のみを検出することができる。次に、図１８，１９に示す一塩基置換部位を見ると、例えば、ｐｌｃＡ遺伝子の塩基番号２２６番目の塩基（Ｃ）を検出すれば、グループ８を検出できることが理解される。従って、これら３つの一塩基置換すべてを検出すれば、臨床株グループＤに属することを検出できる。
【００２６】
また、表１から理解されるように、ｐｌｃＡ遺伝子において多型グループ８を検知するとともに、ｉｎｌＡにおいて多型グループ１４を検知するようにしてもよい。このためには、ｉｎｌＡ遺伝子塩基番号２２６番目の塩基（Ｃ）を検出するとともに、ｉｎｌＡ遺伝子の塩基番号１５９番目の塩基（Ｔ）を検出するようにすればよい。このように、複数の遺伝子内にある特定の一塩基置換部分を組み合わせて検出するようにしてもよい。
【００２７】
あるいは、次のようにして検出すべき塩基を見つけ出すことも考えられる。表１に基づくと、臨床株グループＤの血清型は４ｂ型である。一方、ｃｌｐＣ遺伝子における多型グループ１３の中には、血清型が１／２ｂ型である菌株が多数含まれることが分かっている（下記の表３参照）。従って、ｃｌｐＣ遺伝子における多型グループ１３を含むグループを上記方法にて検出し、ｃｌｐＣ遺伝子を除く他の遺伝子において、血清型が１／２ｂ型を含まないような多型グループを検出可能な一塩基置換を検出するようにしてもよい。
【００２８】
表２〜５は、本発明者らが分類した全てのリステリア菌の多型グループと血清型による分類表である。これらの表から、１／２ｂ型は、ｈｌｙＡ遺伝子内の多型グループ１，４に、ｉｎｌＡ遺伝子の多型グループ１０，１２に、ｐｌｃＡ遺伝子の多型グループ８，９に多く見られる。これらのうちで、臨床株をできるだけ含まないようにするには、表４からｉｎｌＡ遺伝子における多型グループ１０，１２を検出せず、ｉｎｌＡ遺伝子における多型グループ１４を検出できるような一塩基置換部位を検出すればよい。このためには、ｉｎｌＡ遺伝子の塩基番号配列１６８番目の塩基（Ｔ）又は１５９番目の塩基（Ｔ）を検出すればよいことが分かる。このように、血清型による分類と多型グループによる分類との組み合わせから、目的とする臨床株と同一である多型グループを検出可能な一塩基置換部位を決定するとともに、その結果検出されることとなる菌株から他の血清型である菌株を最大限除外できる一塩基多型部位を決定するようにしてもよい。
【００２９】
【表２】
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【００３０】
【表３】
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【００３１】
【表４】
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【００３２】
【表５】
0005613971.tif 000006
【００３３】
上記説明では、特定の一塩基置換部位について陽性として検出する場合について示したが、陰性となるような検出方法を組み合わせてもよい。すなわち、目的とする多型グループを含む複数の多型グループを検出する一塩基置換部位に着目する一方で、目的とする多型グループを除く他の多型グループでのみ検出可能な一塩基置換部位をターゲットにしてもよい。例えば、ｉｎｌＡ遺伝子の塩基番号１２３番目の塩基（Ｇ）を検出する一方で、同遺伝子の塩基番号３１番目の（Ｔ）を検出する。これによると、１２３番目の塩基（Ｇ）の検出により多型グループ１０〜１７のいずれかであることが判別されるが、多型グループ１７は３１番目の塩基（Ｔ）は陰性に判断される。従って、この方法で多型グループ１７に属することが判別される。このように、本発明においては、陽性となる検出方法と陰性となる検出方法の組み合わせにより、属する多型グループを特定する一塩基多型部位を決定しても差し支えない。
【００３４】
次に検出対象が特定された一塩基置換部位は、公知のＳＮＰ分析により検出される。すなわち、当該検出すべき一塩基部位を含むＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド）を増幅し、増幅されたＤＮＡ部分をサイクリングプローブ法（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標名）プローブ法）などによって検出すればよい。
【００３５】
検出すべき一塩基置換部位を挟むＤＮＡ断片を増幅するためのプローブとしては、この目的が達成できる限りにおいて、特に制限されるものではない。ＰＣＲ増幅の効率の点からは通常１０ｂｐ程度から１５０ｂｐ以下の長さとなるように設計される。なお、このとき、マルチプレックスＰＣＲ（異なるプライマーとプローブを用いるＰＣＲ反応を同じ温度と時間条件で行うＰＣＲ）化が必要な場合には、アニーリング温度が同じになるようなＧＣ含量の塩基配列部分を利用して設計するのが好ましい。本発明においては、例えば、ｈｌｙＡ遺伝子の２５８番目の塩基（Ｇ）を目的とする場合には、配列番号１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（Forwardプライマー）及び配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（Reverseプライマー）が例示される。これらのプライマーは、ｈｌｙＡ遺伝子における多型グループ５のうち、塩基配列の２５８番目の塩基（Ｇ）の置換部分を挟む領域を増幅するものであって、塩基配列の１９９−２１７塩基部分及び２７９−２９７塩基部分からなる。もちろん、このためのプライマーは、このグループ５に特異的な２５８番目の塩基（Ｇ）の置換部分を挟む領域を増幅できれば、他の配列でもよい。
【００３６】
増幅されたＤＮＡ断片を検出するためのサイクリングプローブとしては、検出すべき一塩基置換部位を挟む領域とハイブリダイズする塩基配列を有するものであれば、特に制限されるものではない。このとき、当該一塩基置換部位のデオキシリボヌクレオチドはリボヌクレオチドに置換される。また、リボヌクレオチドに置換される位置は、検出すべき一塩基置換部位でなくてもよく、その隣接する位置やその位置を含む数塩基をリボヌクレオチドに置換してもよい。このとき、一塩基置換部位が（Ｔ）や（Ｃ）である場合には、隣接するアデニンデオキシリボヌクレオチド（Ａ）又はグアニンデオキシリボヌクレオチド（Ｇ）を、アデニンリボヌクレオチド又はグアニンリボヌクレオチドに置換するのがよい。一塩基置換部位が（Ａ）や（Ｇ）のプリン塩基である場合の方がＲＮａｓｅで確実に切断される傾向にあり、またＲＮＡ自体が安定になるからである。また、サイクリングプローブの５´末端はＦＡＭなどの公知の蛍光物質で標識され、３´はクエンチング物質で標識されている。これらの標識により、ハイブリダイズされたＲＮＡ部分がＲＮａｓｅＨにより切断され、強い蛍光を発するようになる。そして、この蛍光強度を測定することで、目的とする一塩基置換部位を有することが検出される。なお、サイクリングプローブは、検出すべき一塩基置換部位を含む領域とハイブリダイズできればよく、順鎖又はその逆鎖のいずれであっても差し支えない。また、一塩基置換部位が（Ｔ）や（Ｃ）の場合、逆鎖の配列では一塩基置換部位は（Ａ）又は（Ｇ）となるので、逆鎖の配列でサイクリングプローブを作成するのが好ましい。
【００３７】
これらのサイクリングプローブとして、塩基番号２５８番目の塩基（Ｇ）の置換部分を挟む領域を増幅した場合には、配列番号３に示す塩基配列を有するキメラプローブが例示される。このキメラプローブは、当該塩基（Ｇ）の置換部分を挟む領域、２５０−２７３番目の塩基部分で設計し、この塩基（Ｇ）のグアニンデオキシヌクレオチドをグアニンリボヌクレオチドに置換して作製される。
【００３８】
また、臨床株グループＤ群を検知する場合には、ｃｌｐＣ遺伝子の塩基番号１０６番目の塩基（Ｔ）を挟む領域及び１６６番目の塩基（Ａ）の双方を挟む領域を増幅することにしてもよく、この場合には、配列番号４に示す塩基配列を有するプローブ（Forwardプライマー）及び配列番号５に示す塩基配列を有するプローブ（Reverseプライマー）が例示される。このForwardプライマーはｃｌｐＣ遺伝子の塩基番号の６５−８３塩基部分から、また、Reverseプライマーは同塩基番号１７９−１５９塩基部分から設計される。そしてこの塩基（Ｔ）を検出するためのサイクリングプローブとして、配列番号６に示す塩基配列を有するキメラプローブが例示される。このキメラプローブは、当該塩基（Ｔ）の置換部分を挟む領域、塩基番号１０５−１１６番目の塩基部分で設計し、この塩基（Ｔ）に隣接するアデニンデオキシリボヌクレオチドをアデニンリボヌクレオチドに置換して作製される。そして、ｉｎｌＡ遺伝子の１６６番目の塩基（Ａ）を検出するためのサイクリングプローブとして、配列番号７に示す塩基配列を有するキメラプローブが例示される。このキメラプローブは、当該塩基（Ａ）の置換部分を挟む領域、１６４−１７４番目の塩基部分で設計し、この塩基（Ａ）のアデニンデオキシヌクレオチドをアデニンリボヌクレオチドに置換して作製される。
【００３９】
次に、ｉｎｌＡ遺伝子内の塩基番号１６８番目の塩基（Ｔ）を挟む領域を増幅するためのプローブとして、例えば配列番号８に示す塩基配列を有するプローブ（Forwardプライマー）及び配列番号９に示す塩基配列を有するプローブ（Reverseプライマー）が例示される。このForwardプライマーは、ｉｎｌＡ遺伝子内の塩基番号１００−１１８塩基部分から、また、Reverseプライマーは塩基番号１９７−２０６塩基部分から設計される。そして塩基配列１６８番目の塩基（Ｔ）を検出するためのサイクリングプローブとして、配列番号１０に示す塩基配列を有するキメラプローブが例示される。このキメラプローブは、当該塩基（Ｔ）の置換部分を挟む領域、ｉｎｌＡ遺伝子１６０−１７０番目の塩基部分の逆鎖配列で設計し、この塩基（Ｔ）の逆鎖となるアデニンデオキシヌクレオチド（Ａ）をアデニンリボヌクレオチド（Ａ）に置換して作製される。
【００４０】
また、上記したように１６８番目の塩基（Ｔ）の代わりに、１５９番目の塩基（Ｔ）を検出するようにしても、同様に臨床株グループＤ群の菌株を検出できる。このためには、上記の配列番号８に示す塩基配列を有するプローブ及び配列番号９に示す塩基配列を有するプローブを用いて増幅し、その後、配列番号１１に示す塩基配列（5’- cc(A)ccatcgcct -3’：(A)はリボヌクレオチド）を有するキメラプローブによって一塩基置換部位を検出すればよい。このキメラプローブは、ｉｎｌＡ遺伝子１５１−１６１番目の塩基部分の逆鎖配列で設計し、この塩基（Ｔ）の逆鎖となるアデニンデオキシヌクレオチド（Ａ）をアデニンリボヌクレオチドに置換して作製される。
【００４１】
もっとも、本発明においては、これらのプライマーやプローブに限定されるものではなく、検出したい一塩基置換部分を挟む領域を増幅可能なプライマー及び当該一塩基置換部位を挟む領域とハイブリダイズ可能な塩基配列を有するキメラプローブであればよく、また、上記例示した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドに置換、挿入、欠失がある塩基配列も含まれる。
【００４２】
このようにして、ｈｌｙＡ遺伝子、ｃｌｐＣ遺伝子、ｉｎｌＡ遺伝子及びｐｌｃＡ遺伝子内の一塩基多型を検出するための核酸増幅用のプローブ及び検出用のサイクリングプローブが設計、作製される。こうして得られたプローブ及びサイクリングプローブを用いてＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法を試料に適用することによって、菌の分類、病原性の有無が判別される。
【００４３】
本発明のリステリア菌の検出キットは、このような一塩基多型を検出可能な核酸増殖用プローブ及び一塩基置換を検出するためのサイクリングプローブを含むものであり、必要に応じて、核酸増殖用のための各種酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼなど）やハイブリダイズしたＲＮＡ部分を消化するＲＮａｓｅ、緩衝液などが付加されることもある。
【００４４】
また、検出キットは、上記したごとく特定の多型グループを検出するために、１種の増殖用プライマー（通常は、ForwardプライマーとReverseプライマーとのプライマーセットとして用いられる）と一塩基置換検出用のサイクリングプローブがセットとして提供される場合や、２種以上の増殖用プローブとサイクリングプローブがセットとして、あるいは１の増殖用プローブに対して２以上のサイクリングプローブがセットして提供される場合がある。例えば、血清型１／２ａ型中の高病原性菌（臨床株グループＩ〜Ｌ群）の検出には、配列番号１及び配列番号２の増殖用プライマーセットと配列番号３のサイクリングプローブが組み合わされる。また、血清型４ｂ型中の高病原性菌（臨床株グループＤ群）の検出には、配列番号４，５，８，９の増殖用プライマーセットと配列番号６，７，１０のサイクリングプローブが組み合わされる。
【００４５】
もちろん、本発明は上記の検出用キットに限られるものではない。これ以外にも、臨床株として分離された菌株と同じグループに属すると判断されたならば、病原性があるものと推定される。例えば、表１に示すＣ群と同じ菌株（菌Ｎｏ.１２２）を検出することが考えられる。このためには、血清型が１／２ｂ型で、ｐｌｃＡ遺伝子は多型グループ１１に属することが検出できればよい。従って、血清型での分類を行った上で、ｐｌｃＡ遺伝子の塩基２０４番目の（Ａ）を挟む領域を増幅できる核酸増幅用のプローブ及び当該塩基（Ａ）を検出するためのサイクリングプローブを用いて、ｐｌｃＡ遺伝子が多型グループ１１であることを検出すればよい。なお、本発明においては、病原性が疑われる菌種（臨床株）だけでなく、今まで環境や食品中でしか検出されなかった菌株と同一の遺伝子多型を有する菌株についても、同様な手法にて同定・検出ができる。
【００４６】
さらに配列番号２０〜８０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのみならずこれらの塩基配列から翻訳されるオリゴペプチドも本発明に含まれる。これらのアミノ酸配列を、マルチプルアライメント解析（例えば、Clustal Wプログラムの使用）すれば、塩基配列の場合と同様にしてリステリア菌の同定、分類を行うことが可能である。この結果、一塩基置換によってアミノ酸配列が変化し、病原性が高いと推定される臨床株においては、各遺伝子部分から翻訳されたタンパク質の活性が大きく異なることが推定される。その活性の有無を調べることにより分類同定が可能となる。また、これらの翻訳されたタンパク質を抗原として、それに対する抗体を作製することによって、病原性の高い菌株の検出や同定を行うこともできる。翻訳されるタンパク質の作製、抗体の作製、抗原・抗体の検出方法には、種々の公知方法が用いられる。さらに、配列番号２０〜８０に示される塩基配列から、停止コドンとなっているコドンを探し出すことにより、低病原性である菌株の検出、同定も可能になる。
【００４７】
このように、本発明によれば、リステリア菌の同定や検出、特に病原性が高いと推定されるリステリア菌（Listeria monocytogenes）の検出や感染源、感染ルートの特定を迅速かつ簡単に行える。この一塩基置換部位を検出する方法では血清型よりも詳細な菌情報が把握できるので、より精度の高い特定が行える。
【００４８】
本発明の検出方法は、例えば生乳及びその加工品（飲用乳、チーズ、ヨーグルトなどの乳製品）、複合調理食品（弁当類、調理パン）、魚介類及びその加工品、野菜サラダ、肉及びその加工品（ハム、ソーセージ、サラミなど）、その他のReady-To-Eat食品など種々の食品、水や清涼飲料水などの飲料水、排水や糞尿などリステリア菌の存在が疑われるあらゆる試料に適用される。
次に、実施例に基づき、本発明についてさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００４９】
〔サイクリングプローブ法ＰＣＲ用プライマーセット及びプローブの設計〕
（１）ｈｌｙＡ、ｃｌｐＣ、ｉｎｌＡ及びｐｌｃＡ遺伝子の塩基配列の決定
まず、食品及び環境並びに臨床から分離されたL. monocytogenesについて、各遺伝子の塩基配列を決定した。決定には、食品・環境中からの分離株１１１株及び臨床からの分離株１５株が用いられた。これらの血清型別分類を表６に示した。
【００５０】
【表６】
0005613971.tif 000007
【００５１】
（ｉ）プライマーの設計と塩基配列
ｈｌｙＡ、ｃｌｐＣ、ｉｎｌＡ及びｐｌｃＡ遺伝子の内部塩基配列用のプライマーセットを、塩基配列既知のL. monocytogenesであるＥＤＧ−ｅ株（血清型１／２ａ）及びＦ２３６５株（血清型４ｂ）で共通の配列部分をもとに設計した。
（ａ）ｈｌｙＡプライマーセット（ｈｌｙＡ遺伝子の１０７０−１５５８ｂｐ部分を増幅する）
Forward・・・AAATCATCGACGGCAACCT（配列番号１２）
Reverse・・・ATTTCGGATAAAGCGTGGTG（配列番号１３）
（ｂ）ｃｌｐＣプライマーセット（ｃｌｐＣ遺伝子の３７８−１２１０ｂｐ部分を増幅する）
Forward ・・・TCTTGGTATTAGTTTGAATAAAGCTC（配列番号１４）
Reverse ・・・TCAAACGTACTTTAGAACCAGATT（配列番号１５）
（ｃ）ｉｎｌＡプライマーセット（ｉｎｌＡ遺伝子の１０９９−１９１８ｂｐ部分を増幅する）
Forward・・・TTTTTCTATAATAACAAGGTAAGTGAC（配列番号１６）
Reverse・・・CTGTATAGCTATTGGCGCTAT（配列番号１７）
（ｄ）ｐｌｃＡプライマーセット（ｐｌｃＡ遺伝子の１０１−９２０ｂｐ部分を増幅する）
Forward・・・ACTGGAATAAGCCAATAAAGAACTC（配列番号１８）
Reverse・・・ATTGTTTGTTTTTCGGGGAAGT（配列番号１９）
【００５２】
（ii）ゲノムＤＮＡの調製
各菌株の純粋培養液から、DNA Tissue Kit（QIAGEN社製）を用いて調製した。
【００５３】
（iii）ＰＣＲ
以下の反応液組成でＰＣＲ反応を行った。
１０×buffer for Taq DNA polymerase（TaKaRa社製）       ３μｌ
１ｍＭ dNTPs（TaKaRa社製）                          ０．６μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌプライマー（Forward）             ０．６μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌプライマー（Reverse）             ０．６μｌ
鋳型ＤＮＡ                                              ２μｌ
５Ｕ／μｌTaKaRa ExTaq（TaKaRa社）                ０．１５μｌ
上記反応液を０．２ｍｌマイクロチューブ中で調製し，全量が３０μｌになるように滅菌水を加え、TaKaRa PCR Thermal Cycler若しくはThermo HyBaid PCR Expressを用いて以下の条件でＰＣＲを行った。
<反応条件>
ＤＮＡの変性：        ９４℃、３０ｓｅｃ
アニーリング：        ６０℃、３０ｓｅｃ
伸長反応：            ７２℃、１ｍｉｎ
９４℃で３分間加熱後、上記反応を３０サイクル行った。
得られたＰＣＲ産物の確認はアガロースゲル電気泳動により行った。
【００５４】
（iv）ＰＣＲ産物の精製
上記ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物をQIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を用い、付属のプロトコールに従って精製した。
【００５５】
（ｖ）ＰＣＲ産物の塩基配列決定
精製後のＰＣＲ産物の塩基配列解析は、サンガー法により行った。
【００５６】
（vi）塩基配列分析
各遺伝子毎に決定した菌株の塩基配列のマルチプルアライメントをClustalWプログラムにより作成し、系統樹を近隣結合法により作成した。
各遺伝子の系統樹は図１〜４に示したとおりであり、塩基配列のマルチプルアライメントは図５〜図１４に示したとおりである。また、各菌株における系統樹と血清型との関係は表２〜５に示したとおりである。
【００５７】
ｈｌｙＡ遺伝子の約１１００−１５００塩基部分の配列比較より、本菌は９群に分類された。臨床１／２ａ型５株は約１／３の同血清型食品株と同一群に、また臨床４ｂ型６株と臨床１／２ｂ型２株は全ての食品４ｂ型株と同一群に分類された。
【００５８】
ｃｌｐＣ遺伝子の約５００−１１００塩基部分の分析結果では、本菌は１４群に分類された。臨床１／２ａ型３株は食品株とは異なる３群に分類され、臨床４ｂ型のうち１株は、ほとんどの食品１／２ｂ型株と同一群に、５株は約２５％の食品１／２ｂ及び約２５％の食品４ｂ型株と同一群に分類された。
【００５９】
ｉｎｌＡ遺伝子の約１１００−１８００塩基部分の配列比較により、本菌は１７群に分類された。臨床４ｂ型４株はほとんどの食品４ｂ型株と同一群に分類されたが、他の臨床４ｂ型３株は、食品４ｂ型株とは異なるそれぞれ独立した単一の群に分かれた。
【００６０】
ｐｌｃＡ遺伝子の約１００−８００塩基部分の配列比較から供試菌株は２１群に分類された。臨床１／２ａ型５株は約２５％の食品１／２ａ型株と同一群に分類された。臨床４ｂ型株のうち３株は約３０％の食品４ｂ型と、２株は約７０％の食品４ｂ型株とそれぞれ同一群に分かれた。
【００６１】
これらの結果、ｈｌｙＡ遺伝子では、臨床株、環境株すべてを含めて計２２の群に、ｃｌｐＣ遺伝子では計２９の群に、ｉｎｌＡ遺伝子では計２７の群に、ｐｌｃＡ遺伝子では計３０の群に分類された。
【００６２】
また、今回供試された全てのリステリア菌（L. monocytogenes）はｈｌｙＡ、ｃｌｐＣ、ｉｎｌＡ及びｐｌｃＡ遺伝子を有していると考えられたが、菌株によってその内部塩基配列が異なるため、同一血清型でも異なる遺伝子型に分類される場合があった。これは特に食品・環境由来の１／２ａ型株において顕著で、４〜８群の遺伝子型に分かれた。また、食品・環境由来の１／２ｂ型及び４ｂ型株はそれぞれ大きく２群の遺伝子型に分類された。
【００６３】
（２）Single nucleotide polymorphic 分析による高病原性株の特異的検出法
配列解析の結果、同一グループには食品環境由来株では、１／３の血清型１／２ａ型株と１株の３ａ型、１株の３ｃ型、２株の血清型別不能株が含まれたが、臨床由来の血清型１／２ａ型５株は全てｈｌｙＡ内多型グループ５に分類された。このグループを特異的に検出するために、決定した配列中の特定の一塩基置換部分を含む配列をＰＣＲにより増幅し、蛍光標識キメラプローブを用いて検出する方法を開発した。
【００６４】
（ａ）サイクリングプローブ法ＰＣＲ用プライマーセット及びキメラプローブの設計
（ｉ）臨床由来高病原性株（血清型１／２ａ型：臨床株Ｉ〜Ｌグループ）の検出用キット
このグループに特異的な塩基置換、すなわち、ｈｌｙＡ遺伝子グループ５の決定された塩基配列（図５参照）の２５８番目の塩基（Ｇ）の置換部分を挟む領域を選択し、この配列に基づきプライマーを設計した。具体的には、塩基番号の１９９−２１７塩基部分でForwardプライマーを、２７９−２９７塩基部分でReverseプライマーを設計、作製した。
【００６５】
検出用のサイクリングプローブ（キメラプローブ）には、この２５８番目の塩基（Ｇ）の置換部分を挟む領域として２５０−２７３番目の塩基部分を選択し、この塩基配列に基づき、２５８番目の塩基Ｇ（グアニンデオキシヌクレオチド）をグアニンリボヌクレオチドに置き換えて、配列番号３の塩基配列を有するプローブを作製した。そして、プローブの５´末端はＦＡＭで蛍光標識し、３´末端はクエンチングのためにEclipseで標識した。
【００６６】        臨床株Ｉ〜Ｌグループを検出するためのｈｌｙＡ遺伝子内塩基置換検出用プライマーとプローブを表７に示す。表中（）内の塩基は、リボヌクレオチドであることを示している。
【表７】
0005613971.tif 000008
【００６７】
（ii）臨床由来高病原性株（臨床株Ｄグループ）の検出用キット
プライマーには、このグループに特異的な塩基置換、すなわちｃｌｐＣ遺伝子の多型グループ１３の１０６番目の塩基（Ｔ）部分を挟む領域及び同多型グループ１３の１６６番目の塩基（Ａ）部分を挟む領域を選択し、この配列に基づきプローブを設計し、まずｃｌｐＣ遺伝子多型グループ１０，１１，１３を検出することとした。
【００６８】
多型グループ１３には環境食品由来の血清型１／２ｂ株もその２５％程度が含まれるので、これらと区別するために、ｉｎｌＡ遺伝子多型グループ１４に特異的な塩基置換、すなわちｉｎｌＡ遺伝子の多型グループ１４の１６８番目の塩基（Ｔ）部分を挟む領域を選択し、この配列に基づきプローブを設計した。
【００６９】
具体的には、ｃｌｐＣ遺伝子の塩基番号６５−８３塩基部分でｃｌｐＣ Forwardプライマー（配列番号４）を、１７９−１５９塩基部分でｃｌｐＣ Reverseプライマー（配列番号５）を作製した。ｃｌｐＣ遺伝子内の塩基置換検出用サイクリングプローブ（キメラプローブ）としては、ｃｌｐＣ遺伝子の１０６番目の塩基（Ｔ）置換部分を検出するｃｌｐＣプローブ１として、塩基番号１０５−１１６番目の塩基部分から設計し、塩基置換部分１０６番目の塩基Ｔ（チミンデオキシヌクレオチド）をチミンリボヌクレオチドに置き換えるかわりに１０７番目のＡ（アデニンデオキシヌクレオチド）をアデニンリボヌクレオチドに置き換えたプローブ（配列番号６）を作製した。また、ｃｌｐＣ遺伝子の１６６番目の塩基（Ｔ）置換部分を検出するｃｌｐＣプローブ２として、塩基番号１６４−１７４番目の塩基部分から設計し、塩基置換部分１６６番目の塩基Ａ（アデニンデオキシヌクレオチド）をアデニンリボヌクレオチドに置き換えたプローブ（配列番号７）を作製した。そして、プローブの５´末端はＦＡＭで蛍光標識し、３´末端はクエンチングのためにEclipseで標識した。
【００７０】
次に、ｉｎｌＡ遺伝子の一塩基置換を検出するために、その塩基番号１００−１１８塩基部分でｉｎｌＡ Forwardプライマー（配列番号８）を、１９７−２０６塩基部分でｉｎｌＡ Reverseプライマー（配列番号９）を作製した。また、ｉｎｌＡ遺伝子内の塩基置換検出用サイクリングプローブ（キメラプローブ）は、１６０−１７０番目の塩基部分の逆鎖配列で設計し、当該配列の一塩基置換部分１６８番目の塩基Ｔの逆鎖である塩基Ａ(アデニンデオキシヌクレオチド)をアデニンリボヌクレオチドに置き換えたプローブ（配列番号１０）を作製した。プローブの５´末端はＦＡＭで蛍光標識し、３´末端はクエンチングのためにEclipseで標識した。
【００７１】
臨床株Ｄグループを検出するために特異的なｃｌｐＣ及びｉｎｌＡ遺伝子内塩基置換検出用プライマーとプローブを表８及び表９に示す。表中（）内の塩基は、リボヌクレオチドであることを示している。
【表８】
0005613971.tif 000009
【表９】
0005613971.tif 000010
【実施例２】
【００７２】
〔リステリア菌の検出〕
次に、実施例１で作成したＰＣＲ用プライマーセット及びサイクリングプローブを用いて、菌株の同定、検出を行った。
【００７３】
（１）臨床株グループＩ〜Ｌの検出
ｈｌｙＡ遺伝子型９グループの各グループの菌株から調製したＤＮＡを鋳型として、上記で作製したプライマーセット及びサイクリングプローブを用いて菌株の同定を行った。その結果を図２０に示す。なお、同定条件は次のとおりである。
（ｉ）ゲノムＤＮＡの調整
各菌株の純粋培養液から、DNA Tissue Kit (QIAGEN社)を用いて調製した。
（ii）リアルタイムＰＣＲによる検出
Cycleave PCR core kitを用いて、以下の反応液組成でＰＣＲ反応を行った。
（反応液組成）
１０×Cycleave PCR buffer（TaKaRa社）             １μｌ
２．５ｍＭ dNTP Mixture（TaKaRa社）           １．２μｌ
２５ｍＭ  Ｍｇ溶液                            ２．０μｌ
２０μＭ Forward primer                       ０．１μｌ
２０μＭ Reverse primer                       ０．１μｌ
サイクリンブプローブ（５μＭ）                ０．４μｌ
TaKaRa ExTaq HS（５Ｕ／μｌ）                 ０．１μｌ
Tli RNase ＨII  （２００Ｕ／μｌ）            ０．２μｌ
鋳型ＤＮＡ                                    ０．４μｌ
水                                            ４．５μｌ
合  計                                          １０μｌ
上記反応液を０．２ｍｌマイクロチューブ中に調製し、Stratagene社製リアルタイムＰＣＲ装置MP3000を用いて以下の条件でリアルタイムＰＣＲにより検出を行った。
＜反応条件＞
ＤＮＡの変性：          ９５℃、  ５ｓｅｃ
アニーリング：          ５０℃、１５ｓｅｃ
伸長反応：              ７２℃、２０ｓｅｃ
９５℃で３０ｓｅｃ加熱後、上記反応を４０サイクル行った。
【００７４】
この結果、グループ５の菌株のみを本方法で検出できた。本方法で陽性となったのは、表２から理解されるように、食品由来の血清型１／２ａ型（８／２４株）、食品由来の血清型３ａ型（１／２株）、食品由来の血清型３ｃ型（１／１株）、食品由来の血清型別不能株（２／６株）、臨床由来の血清型１／２ａ型株（５／５株）であった。臨床由来の１／２ａ型株と同じ遺伝型に分類されるL. monocytogenes菌株は、環境及び食品から分離されたものであっても、同血清型の他の菌株と比べて病原性が高いことが推定される。
【００７５】
（２）臨床株グループＤの検出
ｃｌｐＣ遺伝子型１４グループの各グループの菌株から調製したＤＮＡを鋳型として、上記で作製したｃｌｐＣ遺伝子内塩基置換検出用サイクリングプローブ法による検出結果を図２１（プローブ１による）及び図２２（プローブ２による）に示す。また、ｉｎｌＡ遺伝子型１７グループの各グループの菌株から調製したＤＮＡを鋳型として、上記で作製したｉｎｌＡ遺伝子内塩基置換検出用サイクリングプローブ法による検出結果を図２３に示す。検出条件は上記と同様である。
【００７６】
ｉｎｌＡ遺伝子型グループ１５及び１７のリステリア菌では、鋳型として使用した精製したゲノムＤＮＡ濃度が低かったため、蛍光強度の上がるサイクル数がグループ８、４に比べて遅かったが、２９サイクル目から蛍光強度が増加し、塩基置換のないこれら４つのグループ以外のL.monocytogenesとは明らかに異なる結果が得られ、最終判断として他のグループと区別できた。
【００７７】
ｃｌｐＣ及びｉｎｌＡ遺伝子領域で、３箇所全ての特異的な塩基置換を持ち、サイクリングプローブ法による検出で全て陽性となったのは、食品由来の血清型４ｂ型（７／２２株、菌株番号３，６，７，１４，１５，１６，２８）、食品由来の血清型４ｅ型（１／２２株、菌株番号２４）、臨床由来の血清型１／２ｂ型（１／３３株、菌株番号１２２）、臨床由来の血清型４ｂ型（３／７株、菌株番号１２５，１２９，１３１）であった。これにより検出されたこれらの菌株は、臨床由来の血清型４ｂ型とほぼ同じ病原遺伝子を有し、病原性が高いと推定された。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明によれば、病原性が低い菌株には存在せず、高病原性の菌株に特異的である一塩基置換を検出し、これによりあるいは血清型との組み合わせにより高病原性の菌株を検出することができる。また、菌株の分類、同定を精度よく検出できるので、食中毒発生時における感染ルートの特定や汚染源の特定を迅速に行うことができる。そして、食品分離株の迅速な病原性評価、疫学的調査への利用並びに環境中における高病原株の分布調査とその排除（主に二次汚染防止）にも利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】ｈｌｙＡ遺伝子内の塩基配列に基づくListeria monocytogenesの分類系統樹を示す図である。
【図２】ｃｌｐＣ遺伝子内の塩基配列に基づくListeria monocytogenesの分類系統樹を示す図である。
【図３】ｉｎｌＡ遺伝子内の塩基配列に基づくListeria monocytogenesの分類系統樹を示す図である。
【図４】ｐｌｃＡ遺伝子内の塩基配列に基づくListeria monocytogenesの分類系統樹を示す図である。
【図５】ｈｌｙＡ遺伝子の１１２６−１５２７（４０２ｂｐ）塩基部分のCLUSTAL W multiple sequence alignmentを示す図である。
【図６】ｃｌｐＣ遺伝子の４８９−１１２４（６３６ｂｐ）塩基部分のCLUSTAL W multiple sequence alignmentの一部を示す図である。
【図７】図６の続図である。
【図８】図７の続図である。
【図９】ｉｎｌＡ遺伝子の１１９２−１７９９（６０８ｂｐ）塩基部分のCLUSTAL W multiple sequence alignmentの一部を示す図である。
【図１０】図９の続図である。
【図１１】図１０の続図である。
【図１２】ｐｌｃＡ遺伝子の１５３−８６５（７１３ｂｐ）塩基部分のCLUSTAL W multiple sequence alignmentの一部を示す図である。
【図１３】図１２の続図である。
【図１４】図１３の続図である。
【図１５】ｈｌｙＡ遺伝子内の一塩基置換部位を取り出した図である。
【図１６】ｃｌｐＣ遺伝子内の一塩基置換部位を取り出した図である。
【図１７】ｉｎｌＡ遺伝子内の一塩基置換部位を取り出した図である。
【図１８】ｐｌｃＡ遺伝子内の一塩基置換部位を取り出した図である。
【図１９】図１８の続図である。
【図２０】ｈｌｙＡ遺伝子内の一塩基置換を、配列番号３に示すプローブで検出した検出結果を示す図である。
【図２１】ｃｌｐＣ遺伝子内の一塩基置換を、配列番号６に示すプローブで検出した検出結果を示す図である。
【図２２】ｃｌｐＣ遺伝子内の一塩基置換を、配列番号７に示すプローブで検出した検出結果を示す図である。
【図２３】ｉｎｌＡ遺伝子内の一塩基置換を、配列番号１０に示すプローブで検出した検出結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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