(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、植物中で過剰発現させることを特徴とする、植物の生育を促進する方法。
【請求項２】
下記工程（ａ）および（ｂ）を含む、請求項1記載の方法：
（ａ）植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを保持するベクターを、植物の種子、受精卵、植物細胞またはカルスに導入する工程
（ｂ）該種子、受精卵、植物細胞、またはカルスから植物体を再生する工程。
【請求項３】
下記工程（ａ）から（ｃ）を含む、生育が促進された植物の製造方法：
（ａ）植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを保持するベクターを、植物の種子、受精卵、植物細胞またはカルスに導入する工程
（ｂ）該種子、受精卵、植物細胞、またはカルスから植物体を再生する工程
（ｃ）該植物体由来の繁殖材料（種子以外）から植物体を再生する工程。
【請求項４】
下記工程（ａ）から（ｃ）を含む、生育が促進された植物の製造方法：
（ａ）植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを保持するベクターを、植物の種子、受精卵、植物細胞またはカルスに導入する工程
（ｂ）該種子、受精卵、植物細胞、またはカルスから植物体を作出する工程
（ｃ）該植物体から得られた該ポリヌクレオチドを有する種子から、ZIMモチーフを有する遺伝子を過剰発現する植物を作出する工程。
【請求項５】
植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかである、請求項１から４のいずれかに記載の方法：
（ａ）配列番号：1，3，5，7，9，11，13，15，17，または19のいずれかに記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：2，4，6，8，10，12，14，16，18，または20のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）50％ホルムアミド、4×SSC、50mM HEPES (pH7.0)、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行い、その後、0.2xSSC、0.1% SDS、65℃で洗浄する条件下で、配列番号：1，3，5，7，9，11，13，15，17，または19のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号：2，4，6，8，10，12，14，16，18，または20のいずれかに記載のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項６】
植物の生育の促進が、草丈、根、または稈の伸長、種子胚乳肥大、花成・出穂の促進のいずれか１以上の促進である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
植物がイネ科、アブラナ科、ナス科、ウリ科、ヒルガオ科、ヤナギ科である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｄ）の単離されたポリヌクレオチドを過剰発現する形質転換細胞を含む、生育が促進された形質転換植物体：
（ａ）配列番号：1，3，5，7，9，11，13，15，17，または19のいずれかに記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：2，4，6，8，10，12，14，16，18，または20のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）50％ホルムアミド、4×SSC、50mM HEPES (pH7.0)、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行い、その後、0.2xSSC、0.1% SDS、65℃で洗浄する条件下で、配列番号：1，3，5，7，9，11，13，15，17，または19のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号：2，4，6，8，10，12，14，16，18，または20のいずれかに記載のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、生育が促進された形質転換植物体。
【請求項１０】
請求項８または９記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項１１】
植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含有する、植物の生育促進剤：
（ａ）配列番号：1，3，5，7，9，11，13，15，17，または19のいずれかに記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：2，4，6，8，10，12，14，16，18，または20のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）50％ホルムアミド、4×SSC、50mM HEPES (pH7.0)、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行い、その後、0.2xSSC、0.1% SDS、65℃で洗浄する条件下で、配列番号：1，3，5，7，9，11，13，15，17，または19のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号：2，4，6，8，10，12，14，16，18，または20のいずれかに記載のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１２】
植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含む、植物の生育促進用キット：
（ａ）配列番号：1，3，5，7，9，11，13，15，17，または19のいずれかに記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：2，4，6，8，10，12，14，16，18，または20のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）50％ホルムアミド、4×SSC、50mM HEPES (pH7.0)、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行い、その後、0.2xSSC、0.1% SDS、65℃で洗浄する条件下で、配列番号：1，3，5，7，9，11，13，15，17，または19のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号：2，4，6，8，10，12，14，16，18，または20のいずれかに記載のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネZIMモチーフ遺伝子ファミリーおよびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物のゲノム研究は、個々の遺伝子機能解析により、従来育種技術では困難な短期間の優良形質品種の作出を可能にし得る。そのため植物に有用形質を付与することができる遺伝子の探索が世界レベルで実施されている。
【０００３】
主要穀物であるイネについては、2004年にイネゲノムの全塩基配列の決定が完了した。さらに、イネの完全長cDNAの単離が進められ、単離された完全長cDNAクローンの情報はデータベース化され公開されている。しかし、全ての遺伝子の機能解析が終了したわけではなく、新規有用形質遺伝子の発見が期待されている。
【０００４】
ところで、シロイヌナズナ由来のZIMタンパク質は、GATA転写因子ファミリーに属するタンパク質として知られている（非特許文献1-3）。ZIM遺伝子をCaMV 35S プロモーターを用いてシロイヌナズナに過剰発現させたところ、胚軸および葉柄の伸長が認められたことが報告されている（非特許文献3）。ZIM遺伝子は、構造的特徴として、ZIMモチーフ、CCTモチーフ、およびGATA型のZinc Fingerドメインを有する（非特許文献1-3）。Zinc Fingerドメインは転写因子に多く見られる構造であるが、一方、ZIMモチーフとタンパク質機能との関係は全く知られていない。また、バレイショおよびタバコ（非特許文献４）、ポプラ（非特許文献５）においても、ZIMモチーフを持つ遺伝子が見つかったとの報告があるが、該遺伝子の機能は未知である。
【０００５】
【非特許文献１】Nishii et al. (2000) Biosci. Biotechnol. Biochem. 64: 1402-1409.
【非特許文献２】Shikata et al. (2003) Biosci. Biotechnol. Biochem. 67: 2495-2497.
【非特許文献３】Shikata et al. (2004) J. Exp. Bot. 55: 631-639.
【非特許文献４】Katou et al. (2005) Plant Physiol. 139: 1914-1926.
【非特許文献５】Major and Constabel (2006) New Phytol. 172: 617-635.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記状況に鑑みて成されたものであり、本発明が解決しようとする課題は、植物に有用形質を付与しうる遺伝子およびその利用法の提供であり、より具体的には、作物の生育や花成の促進、種子肥大をもたらす遺伝子および生育が促進された植物を該遺伝子を用いて製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決すべく、本発明者等は鋭意研究を行った。本発明者等は、機能未知の遺伝子の中から有用形質をもたらす遺伝子を見出すため、Full-length cDNA Over-eXpressor gene hunting system（FOX hunting system）を利用した（Ichikawa, T., Nakazawa, M., Kawashima, M., Iizumi, H., Kuroda, H., Kondou, Y., Tsuhara, Y., Suzuki, K., Ishikawa, A., Seki, M., Fujita, M., Motohashi, R., Nagata, N., Takagi, T., Shinozaki, K. and Matsui, M. (2006) The FOX hunting system: an alternative gain-of-function gene hunting technique. Plant J. 48: 974-85.、WO2003/018808)。FOX hunting systemは、完全長cDNAを利用した高速かつゲノムワイドな遺伝子機能探索技術である。本発明者等はFOX hunting systemを利用してイネ完全長cDNAを形質転換したイネの中から、稈や根の伸長促進、花芽形成の促進、種子胚乳の肥大といった、有意な生育促進が観察される系統（AB323およびAG163）を見出した。このAB323およびAG163系統に導入されたcDNAを解析したところ、AB323およびAG163の双方に同一の完全長cDNA(アクセッション番号：AK067971)が導入されていたことが明らかになった。AK067971 cDNAは187アミノ酸からなるZIMモチーフタンパク質をコードする。ZIMモチーフは、シロイヌナズナZIM (Zinc-finger protein expressed in Inflorescence Meristem) タンパク質に最初に見出された機能未知のモチーフである。309アミノ酸からなるシロイヌナズナZIMタンパク質はZIMモチーフの他にGATA型Zinc FingerドメインおよびCCTモチーフを含むが、一方、AK067971遺伝子産物はGATA型Zinc Fingerドメインが存在せず、典型的なCCTモチーフ配列を含まない。そこで本発明者らはAK067971と同様の特徴を有する遺伝子を探索し、さらに該遺伝子でイネの形質転換を行い、その表現型を評価した。すると、AK067971と同様の特徴を有する遺伝子群は、AK067971と同様に、植物の生育促進効果を有することが明らかになった。したがって、AK067971およびその類縁遺伝子は植物の生育促進に利用することができる。すなわち本発明は、ZIMモチーフを含み、GATA型Zinc Fingerドメイン及び典型的CCTモチーフ配列を含まない遺伝子およびその利用に関し、具体的には、下記の発明を提供するものである。
【０００８】
（１）植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、植物中で過剰発現させることを特徴とする、植物の生育を促進する方法、
（２）下記工程（ａ）および（ｂ）を含む、上記（１）記載の方法
（ａ）植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを保持するベクターを、植物の種子、受精卵、植物細胞またはカルスに導入する工程
（ｂ）該種子、受精卵、植物細胞、またはカルスから植物体を再生する工程、
（３）下記工程（ａ）から（ｃ）を含む、生育が促進された植物の製造方法
（ａ）植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを保持するベクターを、植物の種子、受精卵、植物細胞またはカルスに導入する工程
（ｂ）該種子、受精卵、植物細胞、またはカルスから植物体を再生する工程
（ｃ）該植物体由来の繁殖材料（種子以外）から植物体を再生する工程、
（４）下記工程（ａ）から（ｃ）を含む、生育が促進された植物の製造方法
（ａ）植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを保持するベクターを、植物の種子、受精卵、植物細胞またはカルスに導入する工程
（ｂ）該種子、受精卵、植物細胞、またはカルスから植物体を作出する工程
（ｃ）該植物体から得られた該ポリヌクレオチドを有する種子から、ZIMモチーフを有する遺伝子を過剰発現する植物を作出する工程、
（５）植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかである、上記（１）から（４）のいずれかに記載の方法
（ａ）配列番号：1，3，5，7，9，11，13，15，17，または19のいずれかに記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：2，4，6，8，10，12，14，16，18，または20のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号：1，3，5，7，9，11，13，15，17，または19のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号：2，4，6，8，10，12，14，16，18，または20のいずれかに記載のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（６）植物の生育の促進が、草丈、根、または稈の伸長、種子胚乳肥大、花成・出穂の促進のいずれか１以上の促進である、上記（１）から（５）に記載の方法、
（７）植物がイネ科、アブラナ科、ナス科、ウリ科、ヒルガオ科、ヤナギ科である、上記（１）から（６）のいずれかに記載の方法、
（８）植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｄ）の単離されたポリヌクレオチド
（ａ）配列番号：1，3，5，7，9，11，13，15，17，または19のいずれかに記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：2，4，6，8，10，12，14，16，18，または20のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号：1，3，5，7，9，11，13，15，17，または19のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号：2，4，6，8，10，12，14，16，18，または20のいずれかに記載のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（９）上記（８）記載のポリヌクレオチドを過剰発現する形質転換植物細胞、
（１０）上記（９）に記載の形質転換細胞を含む、生育が促進された形質転換植物体、
（１１）上記（１０）に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、生育が促進された形質転換植物体、
（１２）上記（１０）または（１１）記載の形質転換植物体の繁殖材料、
（１３）下記（ａ）から（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含有する、植物の生育促進剤
（ａ）配列番号：1，3，5，7，9，11，13，15，17，または19のいずれかに記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：2，4，6，8，10，12，14，16，18，または20のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号：1，3，5，7，9，11，13，15，17，または19のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号：2，4，6，8，10，12，14，16，18，または20のいずれかに記載のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（１４）下記（ａ）から（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含む、植物の生育促進用キット
（ａ）配列番号：1，3，5，7，9，11，13，15，17，または19のいずれかに記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：2，4，6，8，10，12，14，16，18，または20のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号：1，3，5，7，9，11，13，15，17，または19のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号：2，4，6，8，10，12，14，16，18，または20のいずれかに記載のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、植物の生育促進効果を有する新規遺伝子および該遺伝子によって生育が促進された形質転換植物の製造方法が提供された。本発明の遺伝子を農業分野において利用した場合は、例えば、イネであれば、胚乳の肥大による多収性が見込まれる。また、根や稈の伸長促進、すなわちバイオマスの増大が見込まれる。また、花成誘導の促進効果が確認されており、わせ作物の作出も可能になると考えられる。さらに本発明の遺伝子は、イネのみならず他のイネ科植物（コムギ、オオムギ、トウモロコシ、サトウキビ、ソルガム等）に利用可能と考えられ、食糧問題の解決につながるものと期待される。農業分野以外の分野であれば、本発明の遺伝子を利用して植物工場による有用物質生産量の増大を図ることができる。重金属や有害ガスによる環境汚染の吸収・除去（環境修復）効果を向上させることができると考えられる。このように本発明は、農業分野への高い貢献が期待できるのみならず、その他の産業にも広く利用可能である。
【００１０】
［発明の詳細な説明］
本発明は、植物の生育を促進する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを植物中で過剰発現させることにより、植物の生育を促進する方法を提供する。本発明者らは、イネの機能未知の遺伝子の全長cDNAを解析し、植物の生育を促進する活性を有するタンパク質の遺伝子を見出した。
【００１１】
本発明の方法で使用するポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」と称す）は、「植物の生育を促進する活性を有するタンパク質」をコードし、該タンパク質はアミノ酸配列中にZIMモチーフを含むが、GATA型Zinc Fingerドメイン及び典型的CCTモチーフ配列を含まない。
【００１２】
ZIMモチーフは、シロイヌナズナ由来のZIM遺伝子産物（あるいはZIMタンパク質）に見出された、機能未知のモチーフである。ZIMモチーフは、GATA型Zinc Fingerドメインや他のモチーフを含む転写因子に見られることが多い。シロイヌナズナのZIM遺伝子産物は、ZIMモチーフよりもC末端側にCCTモチーフおよびGATA型Zinc Fingerドメインを有する。ZIMモチーフにおいて最も高度に保存されたアミノ酸配列はTIFFXG（配列番号：31）またはTIFYXG（配列番号：32）で表される。ZIMモチーフに関する情報は、ドメインのデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）からアクセッション番号：pfam06200によって得ることができる。
【００１３】
CCTモチーフは植物タンパク質中によくみられる構造で、塩基性アミノ酸に富む。約45アミノ酸からなり、CCTモチーフの後半部分に仮想核局在シグナルが存在するとみられている。シロイヌナズナのCONSTANS（CO）タンパク質のCCTモチーフは、核局在に関与することが知られているが、さらなる機能を有することが見出されつつある。COタンパク質のCCTモチーフは、真核生物の種々のプロモーターに存在するCCAAT boxに結合する酵母HEME ACTIVATOR PROTEIN2（HAP2: HAP3およびHAP5と結合して機能）と相同性があり、シロイヌナズナの由来HAP3およびHAP5と相互作用する。CCTモチーフの後半には、DNAすなわちCCAAT boxと結合するHAP2のNF-YA2領域と相同性があることも知られている（Wenkel et al. (2006) Plant Cell 18: 2971-2984.）。CCTモチーフの情報は、上述のドメインのデータベースにおいてアクセッション番号：pfam06203で得ることができる。
【００１４】
本発明における「典型的CCTモチーフ」は、下記のアミノ酸配列で表すことができる。
RearvlRYreKrk-RkfeK-iRYasRKa-Ae-RpRvkGRFvkr （配列番号：33）
上記配列において、大文字で示したアミノ酸はCCT motifを有するタンパク質間で高度に保存されていることを示し、小文字は比較的保存性が高い領域を示す。また「-（ハイフン）」で示したか所は保存性が低いことを示す。すなわち、配列番号：33に記載されたアミノ酸配列において、第1、7-8、11、15、19、22-23、26-27、30、33、35、38-40位のアミノ酸は高度に保存され、第2-6、9-10、12-13、16-18、21、24-25、28、31、34、36-37、41-43位のアミノ酸は比較的保存性が高く、第14、20、29、32位のアミノ酸は保存性が低い。
【００１５】
またZinc Fingerドメインは、亜鉛原子の周りにポリペプチド鎖が折りたたまれることによって形成される構造ドメインで、転写因子等のDNA結合タンパク質中に頻繁にみられる。Zinc Fingerドメインは数種の型が知られており、TFIIIA型、GAL4型、GATA型のほか、植物に特有な型としてDof型およびWRKY型の存在が報告されている。GATA型はさらにサブタイプに分類され、C-X2-C-X17-C-X2-C（配列番号：34）モチーフを含むタイプ、C-X2-C-X18-C-X2-C（配列番号：35）モチーフを含むタイプ、C-X2-C-X19-C-X2-C（配列番号：36）モチーフを含むタイプ、C-X2-C-X20-C-X2-C（配列番号：37）モチーフを含むタイプが知られている。本発明におけるGATA型Zinc Fingerドメインは、上記のいずれであってもよいが、好ましくはC-X2-C-X20-C-X2-Cで表されるモチーフを含むタイプである。
【００１６】
ZIMモチーフを含むタンパク質として、シロイヌナズナ由来のZIMタンパク質が知られているが、ZIMタンパク質は、ZIMモチーフのほかにCCTモチーフおよびGATA型Zinc Fingerドメインを有し（図６Ａ）、本発明のポリヌクレオチドがコードするタンパク質とは明確に相違する。
【００１７】
上記「アミノ酸配列中にZIMモチーフを含むが、GATA型Zinc Fingerドメイン及び典型的CCTモチーフ配列を含まない」配列の例は、データベースに登録されている（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/lexington/lexington.cgi?cmd=cdd&uid=46091）。2007年4月5日現在において、79配列が登録されている。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドは上記特徴を有する限り、由来は特に問わないが、好ましくは植物由来である。実施例に記載したように、本発明のポリヌクレオチドはイネ（イネ科）のほか、シロイヌナズナ（アブラナ科）、バレイショ（ナス科）、ベンサミアナタバコ（ナス科）、キュウリ（ウリ科）、アサガオ（ヒルガオ科）、トマト（ナス科）にも存在し、植物界に広く分布すると考えられる。したがって本発明のポリヌクレオチドの由来となる植物は特に種類は問わないが、好ましくは単子葉植物由来であり、より好ましくはイネ科由来である。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドの具体例として、配列番号：1，3，5，7，9，11，13，15，17，または19に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチドを挙げることができる。実施例に示すとおり、上記ポリヌクレオチドの過剰発現によって植物の生育が促進されることが、本発明者らによって確認された。
配列番号：1は、アクセッション番号：AK067971としてデータベース上で公開されている。配列番号：１がコードする推定アミノ酸配列を配列番号：2に示す。また配列番号:2記載のアミノ酸配列におけるZIMモチーフの配列を配列番号：21に示す。
配列番号：3は、アクセッション番号：AK061602としてデータベース上で公開されている。配列番号：3がコードする推定アミノ酸配列を配列番号：4に示す。また配列番号:4記載のアミノ酸配列におけるZIMモチーフの配列を配列番号：22に示す。
配列番号：5は、アクセッション番号：AK107854としてデータベース上で公開されている。配列番号：5がコードする推定アミノ酸配列を配列番号：6に示す。また配列番号:6記載のアミノ酸配列におけるZIMモチーフの配列を配列番号：23に示す。
配列番号：7は、アクセッション番号：AK070649としてデータベース上で公開されている。配列番号：7がコードする推定アミノ酸配列を配列番号：8に示す。また配列番号:4記載のアミノ酸配列におけるZIMモチーフの配列を配列番号：24に示す。
配列番号：9は、アクセッション番号：AK073589としてデータベース上で公開されている。配列番号：9がコードする推定アミノ酸配列を配列番号：10に示す。また配列番号:10記載のアミノ酸配列におけるZIMモチーフの配列を配列番号：25に示す。
配列番号：11は、アクセッション番号：AK108738としてデータベース上で公開されている。配列番号：11がコードする推定アミノ酸配列を配列番号：12に示す。また配列番号:12記載のアミノ酸配列におけるZIMモチーフの配列を配列番号：26に示す。
配列番号：13は、アクセッション番号：AK068566としてデータベース上で公開されている。配列番号：13がコードする推定アミノ酸配列を配列番号：14に示す。また配列番号:14記載のアミノ酸配列におけるZIMモチーフの配列を配列番号：27に示す。
配列番号：15は、アクセッション番号：AK099557としてデータベース上で公開されている。配列番号：15がコードする推定アミノ酸配列を配列番号：16に示す。また配列番号:16記載のアミノ酸配列におけるZIMモチーフの配列を配列番号：28に示す。
配列番号：17は、アクセッション番号：AK107750としてデータベース上で公開されている。配列番号：17がコードする推定アミノ酸配列を配列番号：18に示す。また配列番号:18記載のアミノ酸配列におけるZIMモチーフの配列を配列番号：29に示す。
配列番号：19は、アクセッション番号：AK069326としてデータベース上で公開されている。配列番号：19がコードする推定アミノ酸配列を配列番号：20に示す。また配列番号:20記載のアミノ酸配列におけるZIMモチーフの配列を配列番号：30に示す。
【００２０】
上記配列番号に記載のポリヌクレオチドは、公知技術によって調製することができる。例えば、イネ組織抽出物からtotal mRNAを調製し、上記配列番号に記載の塩基配列をもとにプライマーを設計し、RACE法等を行って上記配列番号の完全長cDNAを得ることができる。またはイネ組織抽出物からcDNAライブラリーを作製し、上記配列番号に記載の塩基配列をもとにプローブを設計し、ハイブリダイゼーション法によって得ることもできる。さらには、上記配列番号に記載の塩基配列をもとに、人工的に合成してもよい。
【００２１】
また本願発明の方法は、上記配列番号に記載の塩基配列と類似する配列であって、上記配列番号に記載の塩基配列と同等の機能、すなわち、植物の生育を促進する活性を有するポリヌクレオチドを使用することもできる。したがって本発明のポリヌクレオチドは、上記配列番号に記載の塩基配列と類似する配列であって、植物の生育を促進する活性を有するポリヌクレオチドを包含する。このようなポリヌクレオチドは、植物の生育を促進する活性を有する限り、天然から調製されたものでも人工的に調製されたものでもよい。例えば、上記配列番号のオーソログ、ホモログ、人工的に変異をいれたものであってもよい。このようなポリヌクレオチドの例として、「配列番号：1，3，5，7，9，11，13，15，17，または19のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」および「配列番号：2，4，6，8，10，12，14，16，18，または20のいずれかに記載のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド」を挙げることができる。
【００２２】
上記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者であれば、適宜選択することができる。一例を示せば、25％ホルムアミド、より厳しい条件では50％ホルムアミド、4×SSC、50mM HEPES (pH7.0)、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するポリヌクレオチドの単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２３】
このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離されるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、通常、上記配列番号に示されたアミノ酸配列と高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも40％以上、好ましくは60％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、さらに好ましくは少なくとも95％以上、さらに好ましくは少なくとも97％以上（例えば、98から99％）の配列の相同性を指す。アミノ酸配列の同一性は、例えば、Karlin and Altschul によるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえば score = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
【００２４】
また上記変異を導入されたポリヌクレオチドは、上記配列番号記載の塩基配列に、PCRによる変異導入法やカセット変異法などの当業者に周知の遺伝子改変方法を施し、部位特異的にまたはランダムに変異を導入することによって調製することができる。または上記配列番号記載の塩基配列に変異を導入した配列を、市販の核酸合成装置によって合成することも可能である。上記変異は、該ポリヌクレオチドを植物で過剰発現することにより植物の生育を促進する活性を有している限り、どの位置に導入されてもよい。好ましくは、変異はZIMモチーフ以外の位置に導入され、この場合、ZIMモチーフ配列は該ポリヌクレオチド中にそのまま維持される。
【００２５】
上記のようにして調製したポリヌクレオチドを植物で過剰発現することにより植物の生育を促進する活性を有しているかどうかの確認は、該調製したポリヌクレオチドを植物に導入して栽培し、コントロールと比較して草丈、根、または稈の伸長、種子肥大、花成誘導、出穂の促進が観察されるかどうかを評価すればよい。具体的には実施例２に記載の方法によって行うことができる。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドを植物内で過剰発現させるには、本発明のポリヌクレオチドを適当なプロモーターの下流に機能的に連結し、該プロモーターと連結した本発明のポリヌクレオチドをエレクトロポーレーション法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム感染法等の公知方法によって植物細胞、種子、配偶子、受精卵、またはカルスに導入すればよい。
【００２７】
上記プロモーターは、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター、イネのアクチンプロモーターやElongation factor 1βプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーターなどを挙げることができるが、これらに限定されない。また、特定器官について特に生育を促進させたい場合は、組織特異的に発現するプロモーターを用いることもできる。例えば、花器官特異的遺伝子のプロモーターを用いれば、本発明のポリヌクレオチドの生育促進効果を多収性に集中させることも可能と考えられる。
【００２８】
アグロバクテリウム法を行う際は、バイナリーベクターまたは中間ベクターを用いることができる。バイナリーベクターの具体例として、pBI系ベクター（例えば、実施例で使用したpRiceFOX）、pPZP系（Hajdukiewicz, P., Svab, Z. and Maliga, P. (1994) The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology 25(6): 989-94.）、pCAMBIA系（ベクター骨格：pPZPベクター; URL: http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vectors/585.html）、pSMA系（Igasaki, T., Mohri, T., Ichikawa, H. and Shinohara, K. (2000) Plant Cell Reports 19: 448-453.）を挙げることができるが、これらに限定されない。使用するベクターは、ハイグロマイシン耐性やカナマイシン耐性等の選抜マーカーが搭載されていてもよい。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドが導入された植物は、該ポリヌクレオチドの過剰発現により生育が促進されるため、本発明のポリヌクレオチドは生育が促進された植物の製造に利用できる。生育促進は、草丈、根、または稈の伸長、種子肥大、花成誘導、出穂の促進といった形質で確認できる。該導入当代から得た繁殖材料（例えば、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）から植物を再生することにより、生育が促進された植物を大量生産することが可能になる。またこの形質は後代に安定に伝達されることが確認されていることから、形質転換当代を交配させて得られた種子からも、生育が促進された植物を生産することができる。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドは、使用説明書とともに適切な容器に梱包し、植物の生育促進剤または生育促進用キットとして加工し流通させることも可能である。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］ イネFOX hunting systemによるトランスジェニック植物の作出
遺伝子過剰発現用バイナリーベクター pRiceFOX上のトウモロコシ由来ユビキチン1遺伝子プロモーター（PUbi1）の下流に多種多様な完全長cDNAを接続し、該プラスミド混合物をアグロバクテリウムに導入し、イネcDNAアグロバクテリウム・ライブラリーを作製した。pRiceFOXベクターは選抜マーカーとしてP35S-HPT（CaMV 35Sプロモーターの発現制御下にあるハイグロマイシン耐性遺伝子）を有する。pRiceFOXベクターの構造を図1に示す。該ライブラリーを迅速形質転換法（WO 2005/092082、Toki, S., Hara, N., Ono, K., Onodera, H., Tagiri, A., Oka, S. and Tanaka, H. (2006) Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation of rice. Plant J. 47: 969-976.）によりイネ（日本晴）に形質転換し、ハイグロマイシン剤に耐性を示す多数のFOXイネ系統（本明細書において、遺伝子を導入した形質転換カルスから再分化したイネ（形質転換当代）をT1と称する）を作出した。
上記FOXイネ系統の表現型を観察したところ、有意に生育が促進された系統（AB323およびAG163）の出現を確認した（図２）。AB323およびAG163イネ系統に導入されたcDNAをゲノミックPCRおよびダイレクトシークエンシング法を用いて解析したところ、両系統に同一のcDNA（アクセッション番号AK067971）が導入されていたことが判明した。AK067971は、187アミノ酸からなるタンパク質をコードし、ZIMモチーフを有する。AK067971の塩基配列を配列番号：１に示す。配列番号：１のうち、ORFは第108位から第671位である。
【００３２】
［実施例２］ AK067971過剰発現イネ系統の表現型解析
過剰発現型AK067971 cDNAが導入されたAB323およびAG163系統の後代の特性をさらに解析した。AB323系統（T3）における表現型を図３に示す。播種後12日目のAB323系統幼植物体では、根の伸長促進が観察された。種子では特に胚乳の肥大が認められ、この表現型は後代に安定に伝達された（図３、表１）。また、草丈、稈長、種子重量、個体当たりの収量についても、コントロールと比較して有意に高い値が得られた（図４）。
【００３３】
【表１】
0005544594.tif 000002
（表１  AB323系統とコントロールの種子重量の比較）
【００３４】
また、AB323およびAG163系統以外に、pRiceFOXベクターにAK067971を個別導入したプラスミド（AK067971-FOX）を野生型イネに再導入して、AK067971-FOXイネ系統をさらに取得した。これら新規AK067971-FOXイネ系統の表現型を調査したところ、AB323およびAG163系統と同様の生育促進形質が再現された。また新規系統の出穂日についても、AB323およびAG163系統と同様、野生型（非組換え体）に比べて約10日間早くなることが判明した（図５）。
【００３５】
［実施例３］ AK067971遺伝子ホモログ導入系統の表現型解析
AK067971の他にZIMモチーフを持つ遺伝子が存在するかどうか、塩基配列データベースを検索した。その結果、複数のイネ遺伝子にZIMモチーフが存在することが判明した（表２）。さらに、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、バレイショ（Solanum tuberosum）、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）、キュウリ（Cucumis sativus）、アサガオ（Ipomoea nil）、トマト（Lycopersicon esculentum）、ゼニゴケ（Marchantia polymorpha）にもZIMモチーフを持つ遺伝子が見出された（表２）。ZIMモチーフを有する遺伝子群は、主としてZIMモチーフを有するが、GATA型Zinc Fingerドメインが存在せず、CCTモチーフと高い相同性を有する領域を持たない1型と、ZIMモチーフ、CCTモチーフおよびGATA型Zinc Fingerドメインの３つの構造を有する2型に大別される。AK067971遺伝子は1型に属する（図６Ａ）。これらのZIMモチーフ遺伝子ファミリーメンバーを植物に過剰発現させた場合も、AK067971-FOXイネで観察された効果と同様の効果が期待された。
そこで、AK067971以外でZIMモチーフを持つことが確認されたイネ遺伝子のうち、9種のホモログ（AK107854, AK070649, AK061602, AK073589, AK068566, AK099557, AK108738, AK069326, AK107750）についてAK067971との相同性を比較したところ、アミノ酸レベルでの相同性は、AK107854: 45.3%, AK070649: 39.0%, AK061602: 44.0%, AK073589: 41.4%, AK068566: 20.5%, AK099557: 24.5%, AK108738: 26.7%, AK069326: 21.1%, AK107750: 27.2%であった（図６Ｂ）。相同性の高い順にpRiceFoxベクターに組み込み、イネに形質転換した。4種のホモログAK107854、AK070649、 AK061602、AK073589を導入したT1再分化当代植物群は、草丈、稈長、種子重量とも、AK067971導入系統と同等またはそれ以上の値を示した（図７）。これらのことから、ZIMモチーフ遺伝子を有するAK067971近縁遺伝子においても、過剰発現により植物の生育促進をもたらすことが明らかになった。
【００３６】
【表２】
0005544594.tif 000003
（表２  ZIMモチーフを有する遺伝子群）
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】イネ完全長cDNA過剰発現用バイナリーベクター ｐRiceFOXの構造を示す図である。
【図２】AK067971 cDNAの過剰発現により生長および花成促進を示したAB323およびAG163系統を示す写真である。（A）：鉢上げ後14週目におけるAB323系統（T1再分化当代）の生育状況。コントロールと比較して草丈が高く出穂が観察され、わせ形質が付与されたことがわかる。（B）：収穫期におけるAG163系統（T1）の形態を示す写真である。稈が長く、種子胚乳の肥大が穂重の増加につながった。
【図３】AB323系統（T3）における表現型を示す写真である。（A）：播種後12日目のAB323系統幼植物体では、コントロールに比べて根の伸長促進が見られた。（B）：AB323種子における胚乳の肥大を示す写真である。この表現型は後代に安定に伝達された。
【図４】AB323およびAG163系統における生育促進形質を示すグラフである。いずれの実験にもT2後代イネを供した。ABOV1およびAG0V4は、空ベクターを導入したトランスジェニックコントロールである。個体数はそれぞれ、AB323: n=7、AG163: n=4、AB0V1: n=5、AG0V4: n=7である。
【図５】（A）AK067971cDNA再導入個体（T1世代）の鉢上げ後14週目における生育および出穂の促進を示す写真である。植物は長日条件（14L/10D）のもと栽培された。（B）AK067971 cDNA再導入個体の生育曲線（草丈）を示すグラフである。（C）再導入個体の平均出穂日を示すグラフである。コントロール（n=13）の平均出穂日は100.7日、再導入系統（n=24）の平均出穂日は90.1日である。
【図６】（A）ZIMモチーフを有する遺伝子群の構造を模式的に示す図である。ZIMモチーフを有するが、GATA型Zinc Fingerドメインが存在せず、CCTモチーフと高い相同性を有する領域を持たない1型と、ZIMモチーフ、CCTモチーフおよびGATA型Zinc Fingerドメインの３つの構造を有する2型に大別される。（B）AK067971アミノ酸配列に高い相同性を示した1型ZIM遺伝子ファミリーの系統樹を示す図である。AKで始まるアクセッション番号の遺伝子産物はイネ由来である。
【図７】1型ZIM遺伝子ファミリーのcDNAを過剰発現するイネ（T1世代）の表現型比較を示すグラフである。各イネは長日条件のもと栽培された（14L/10D）。
【図１】
0005544594.tif 000004
【図４】
0005544594.tif 000005
【図６】
0005544594.tif 000006
【図７】
0005544594.tif 000007
【図２】
0005544594.tif 000008
【図３】
0005544594.tif 000009
【図５】
0005544594.tif 000010
【配列表】
0005544594000001.app