(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の温度で水性組成物中のタンパク質の安定性を増大させる方法であって、  （ａ）  タンパク質が該所望の温度で安定性を有するｐＨを決定すること； （ｂ）  工程（ａ）のｐＨよりも少なくとも１単位大きいｐＫａを有する少なくとも１つの置換用バッファーおよび工程（ａ）のｐＨよりも少なくとも１単位小さいｐＫａを有する少なくとも１つの置換用バッファーを、該組成物に添加すること；ならびに、 （ｃ）  該組成物のｐＨを工程（ａ）のｐＨに調整すること；を含み、 該置換用バッファーの１つはベンゾエートであり、  該水性組成物が、工程（ａ）のｐＨの１単位内であるｐＫａを有する従来のバッファーを２ｍＭを超える濃度で含まない、該方法。
【請求項２】
該所望の温度が該タンパク質の保存温度である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該所望の温度が周囲温度である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該所望の温度が周囲温度より高い、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該水性組成物が水溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
置換用バッファーが１ｍＭから１Ｍの濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
置換用バッファーが５ｍＭから１００ｍＭの濃度である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該置換用バッファーのうちの少なくとも１つが工程（ａ）のｐＨよりも少なくとも２単位大きいかまたは小さいｐＫａを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）のｐＨよりも少なくとも２単位大きいｐＫａを有する少なくとも１つの置換用バッファーおよび工程（ａ）のｐＨよりも少なくとも２単位小さいｐＫａを有する少なくとも１つの置換用バッファーを、工程（ｂ）において該組成物に添加する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
各置換用バッファーが工程（ａ）のｐＨから、１単位から５単位の範囲であるｐＫａを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
各置換用バッファーが工程（ａ）のｐＨから、１単位から４単位の範囲であるｐＫａを有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも４０％のタンパク質活性を、該所望の温度で少なくとも１週間保持する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも４０％のタンパク質活性を、該所望の温度で少なくとも４週間保持する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質の構造的完全性の少なくとも４０％を、該所望の温度で少なくとも１週間保持する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質の構造的完全性の少なくとも４０％を、該所望の温度で少なくとも４週間保持する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの置換用バッファーが有機物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
該タンパク質がホルモンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
該タンパク質がインスリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
該タンパク質がヒト成長ホルモンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
該タンパク質がワクチン抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
該タンパク質が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
該タンパク質がインターフェロンである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
該タンパク質が血液凝固因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
該血液凝固因子が第ＶＩＩＩ因子である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ａ）のｐＨよりも少なくとも１単位大きいｐＫａを有する少なくとも１つの置換用バッファーが、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
該従来のバッファーを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
タンパク質および２つの置換用バッファーを含有する水性組成物であって、
第１の置換用バッファーが該組成物のｐＨより少なくとも１単位小さいｐＫａを有し、
第２の置換用バッファーが該組成物のｐＨより少なくとも１単位大きいｐＫａを有し、
該置換用バッファーの１つはベンゾエートであり、
ただし該組成物は、該組成物のｐＨの１ｐＨ単位以内であるｐＫａを有する従来のバッファーを２ｍＭを超える濃度で含まない、該水性組成物。
【請求項２８】
５．５〜６．５のｐＨを有する請求項２７に記載の水性組成物。
【請求項２９】
５．５〜６．５のｐＨを有する請求項２７に記載の水性組成物であって、少なくとも１つの置換用バッファーが、セリン、アルギニン、リジン、プリン、アスパラギン、メチオニン、スレオニン、チロシン、トリプトファン、アスパルテーム、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、トリエタノールアミン、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）グリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸、アンモニウムイオン、ホウ酸、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸、トリエタノールアミン、またはそれらの塩からなる群から選択される、該水性組成物。
【請求項３０】
５．５〜６．５のｐＨを有する請求項２７に記載の水性組成物であって；
該タンパク質が、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アプロチニン、コラゲナーゼ、ヒト成長ホルモン、ＤＮａｓｅ  Ｉ、インターロイキン１受容体アンタゴニスト、インターフェロンα；抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧ、ＴＮＦ結合ＩｇＧ、抗ＣＤ２０抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、または抗ＲＳＶ抗体から選択されるモノクローナル抗体；無細胞百日咳ワクチン、ジフテリアワクチン、ＨＰＶワクチン、ＴＢワクチン、またはそれらの前駆体もしくは誘導体からなる群から選択され；および
少なくとも１つの置換用バッファーが、セリン、アルギニン、リジン、プリン、アスパラギン、メチオニン、スレオニン、チロシン、トリプトファン、アスパルテーム、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、トリエタノールアミン、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）グリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸、アンモニウムイオン、ホウ酸、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸、トリエタノールアミン、またはそれらの塩からなる群から選択される、該水性組成物。
【請求項３１】
６〜７のｐＨを有する請求項２７に記載の水性組成物。
【請求項３２】
６〜７のｐＨを有する請求項２７に記載の水性組成物であって、少なくとも１つの置換用バッファーが、アスパラギン酸、セリン、アルギニン、リジン、プリン、アスパラギン、グルタミン酸、メチオニン、スレオニン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、グリシン、トリプトファン、アデニン、ｐ−アミノ安息香酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）グリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸、アンモニウムイオン、ホウ酸、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸、トリエタノールアミン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、パルミチン酸、またはそれらの塩からなる群から選択される、該水性組成物。
【請求項３３】
６〜７のｐＨを有する請求項２７に記載の水性組成物であって；
該タンパク質が、ＴＮＦ受容体、ダルベポエチンα、α−１−アンチトリプシンインヒビター、ナトリウム利尿ペプチド、プロテインＣ、卵胞刺激ホルモン、インスリン、インスリン様成長因子、骨形成タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、インターロイキン−２、インターフェロンγ、狂犬病ワクチン、ロタウイルスワクチン、破傷風トキソイド、またはそれらの前駆体もしくは誘導体からなる群から選択され；および
少なくとも１つの添加剤が、アスパラギン酸、セリン、アルギニン、リジン、プリン、アスパラギン、グルタミン酸、メチオニン、スレオニン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、グリシン、トリプトファン、アデニン、ｐ−アミノ安息香酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）グリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸、アンモニウムイオン、ホウ酸、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸、トリエタノールアミン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、パルミチン酸、またはそれらの塩からなる群から選択される、該水性組成物。
【請求項３４】
該組成物のｐＨよりも少なくとも１単位大きいｐＫａを有する該少なくとも１つの置換用バッファーが、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである、請求項２７に記載の水性組成物。
【請求項３５】
該従来のバッファーを含まない、請求項２７に記載の水性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の安定性、とりわけ、水系、例えば水溶液、水性ゲル形態の、または、遊離水または結合水が存在する固体状態などの非液体状態にある、例えば凍結状態にある、または乾燥もしくは凍結乾燥などにより水が部分的に除去された、タンパク質の安定性に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
多くのタンパク質、例えば、酵素、抗体、または治療用タンパク質は、不安定であり、とりわけ水溶液中に保存されている間の構造的分解およびその結果生じる活性の喪失を受けやすい。タンパク質の分解に関与するプロセスは、物理的なもの（すなわち、四次構造、三次構造、または二次構造の喪失、凝集、表面吸着などの、非共有結合性の相互作用に影響するプロセス）と、化学的なもの（すなわち、脱アミド、酸化、ジスルフィド移動反応（disulphide scrambling）などのような、共有結合性の変化を伴うプロセス）とに分けることができる。分解プロセスの速度は温度に比例する。したがって、タンパク質は通常、低温でさらに安定である。
【０００３】
通常、タンパク質は水の非存在下でさらに安定である。したがって、ほとんどの市販のタンパク質は凍結乾燥粉末として製剤されている。典型的な凍結乾燥された市販のタンパク質製剤は、常に、リン酸バッファーなどのバッファーおよび１つ以上の添加剤を含む。添加剤は、以下の１つ以上を含み得る。
・充填剤：典型的には、糖、またはソルビトールもしくはマンニトールなどの糖アルコール。
・安定剤：典型的には、凍結乾燥の際にタンパク質の構造を保護し得る、トレハロースまたはショ糖などの水置換用の糖。
・浸透圧調節剤：典型的には、無機塩およびアミノ酸（一般的にはグリシまたはアルギニン）。これらの賦形剤は、イオン強度を調節するために用いられる。イオン強度は、凍結乾燥プロセスの際および再構築した後のタンパク質の特定の利用の際の両方における、タンパク質製剤の重要なパラメーターであることが多い。
・サーファクタント：固体表面へのタンパク質の吸着、攪拌により誘発される凝集、および凍結乾燥の際の損傷を防ぐために効果的であり得る。
【０００４】
いくつかのタンパク質は溶液に製剤されることが知られている。歴史的に、これによって、低い安定性と引き換えに生産コストが大幅に減少する。タンパク質の水溶液は、タンパク質製品の初期段階の開発で製剤されることが多く、この間に要求される安定性は、最終製品について要求されるものほど厳しくはない。典型的には、タンパク質水溶液は、厳密に４℃で保存されなくてはならない。ほとんどのケースにおいて、構造の分解および活性の喪失は、この温度であっても保存期間にわたり生じる。水性製剤の安定性は凍結によって改善され得るが、いくつかのケースにおいて、凍結−解凍サイクルはタンパク質の損傷の原因となり得る。
【０００５】
典型的なタンパク質水溶液は、従来のバッファー、最も一般的にはｐＨ６．８〜７．３のリン酸バッファーにおいて製剤されるが、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、炭酸塩、またはクエン酸塩などの他のバッファーも用いられる。製剤はまた、以下の添加剤の１つ以上も含み得る。
・浸透圧調節剤：典型的には、無機塩およびアミノ酸（一般的にはグリシンまたはアルギニン）。これらの賦形剤は、タンパク質製剤の重要なパラメーターであるイオン強度を調節するために用いられる。
・サーファクタント：固体表面へのタンパク質の吸着、または攪拌により誘発される凝集を防ぐために効果的であり得る。
・安定剤：典型的には、トレハロースまたはショ糖などの水置換用の糖。これらは、タンパク質の融点に影響し、その結果、タンパク質の安定性を向上させ得ることが知られている。
【０００６】
上記に示したように、市販のタンパク質製剤における添加剤の性質は様々であり得る。しかし、乾燥型および水性型の両方における市販のタンパク質製剤の共通の特徴は、バッファーの存在である。バッファーは、製剤のｐＨを所与の値の近くに維持するためのものである。多くの市販のタンパク質は、７に近いｐＨのリン酸バッファー内に製剤されている。いくつかのケースにおいて、他のバッファーおよび他のｐＨを用いることができる。７から離れたｐＨでの製剤は、典型的には、タンパク質の溶解度を上げる必要性があるときに行われ、これは、タンパク質の等電点から離れたｐＨで達成され得るものである。
【０００７】
タンパク質を製剤するためのバッファーの選択は、酸塩基平衡およびブレンステッドローリーの酸塩基理論の明確なルールに従う。酸塩基平衡は、２つの化学種の間でのプロトン（Ｈ＋；水素カチオンとも呼ばれる）の交換に関するものである。プロトンを供与する種は酸と呼ばれ、プロトンを受容する種は塩基と呼ばれる。したがって、以下の可逆的なプロセスにおいて、
【数１】
0005541925.tif 000002
ＨＡは酸として作用し、Ｂ−は塩基として作用する。逆の方向では、ＨＢが酸として作用し、Ａ−が塩基として作用する。化合物がプロトンを供与または受容する能力は解離定数Ｋａにより表され、この定数は、以下のような、水溶液における化合物のプロトン化した形態および脱プロトン化した形態の間の平衡を記述するものである。
【数２】
0005541925.tif 000003
Ｋｅｑ＝［Ｈ３Ｏ＋］［Ｘ−］／［ＨＸ］［Ｈ２Ｏ］
［Ｈ２Ｏ］＝定数＝５５．５Ｍであるため：
Ｋａ＝Ｋｅｑ［Ｈ２Ｏ］＝［Ｈ３Ｏ＋］［Ｘ−］／［ＨＸ］
ｐＫａ＝−ｌｏｇＫａ
【０００８】
あらゆる種のｐＫａは温度の関数である。リン酸塩、クエン酸塩、または酢酸塩などの多くのケースにおいては温度依存は小さいが、いくつかのバッファー（ＴＲＩＳ／ＨＣｌなど）は、１℃毎に０．０３単位（unit）ものｐＫａの変化を示す。
【０００９】
所与のｐＫａ値での化学種のプロトン化の程度は、溶液のｐＨに依存する。ｐＨが対象の種のｐＫａに等しい場合、５０％の種がプロトン化した形態で存在し、残りの５０％が脱プロトン化した形態で存在する。ｐＨがｐＫａよりも１単位小さい場合、９０％の種がプロトン化した形態で存在し、１０％が脱プロトン化した形態で存在する。同様に、ｐＨがｐＫａよりも１単位大きい場合、１０％の種がプロトン化した形態で存在し、９０％が脱プロトン化した形態で存在する。プロトン化した形態および脱プロトン化した形態の化合物のパーセンテージは、ｐＨおよび温度が一定である限り一定のままであるが、これは、化合物と周囲の分子との間の力学的平衡の結果である。言い換えると、系における酸−塩基種の間のプロトンの連続的な力学的交換があり、一方で、溶液におけるそれぞれの種の全体的なプロトン化状態が一定に維持される。
【００１０】
種のｐＫａ付近のｐＨ範囲でプロトンを供与および受容することにより、種はバッファーとして作用する。したがって、バッファーの存在により、酸または塩基が溶液に加えられた場合のｐＨの変化が小さくなる。種は、ｐＨ＝ｐＫａの時に最大の緩衝能力を発揮し、ｐＨを維持するその能力は、ｐＨがｐＫａから離れるほど低下する。
【００１１】
適切なバッファーの選択は通常、所望のｐＨに依存する。一般に許容されるルールは、効果的なバッファーとして作用するためにはバッファーのｐＫａが所望のｐＨから１単位以上離れていないことが必要であるということである。しかし、好ましくは、種の緩衝能力を最大にするためには、ｐＫａは所望のｐＨから０．５単位以上離れていない。最も好ましくは、バッファーのｐＫａは溶液の所望のｐＨと等しい。このケースにおいて、バッファーのプロトン化した形態および脱プロトン化した形態の割合はそれぞれ５０％であり、その緩衝能力は存分に利用される。したがって、このような溶液は、酸性方向およびアルカリ性方向の両方へのｐＨの変化から最も効率的に保護される。
【００１２】
特許文献１は、ｐＨ７．１の、抗体およびヒスチジンを含む水性組成物を開示している。この組成物は、凝集に対して安定であると言われている。続く記載において、使用の際にはバッファーが加えられるべきであることが示唆されている。
【００１３】
特許文献２は、タンパク質および１つ以上の安定剤を含む水系を記載している。安定剤は、タンパク質および水の解離のイオン化生成物とのプロトンの交換が可能なイオン性基を有する。イオン性基には、プロトン化されるとプラスに帯電し脱プロトン化されると帯電しない第１の基と、プロトン化されると帯電せず脱プロトン化されるとマイナスに帯電する第２の基とが含まれる。組成物のｐＨは、ｐＨに対するタンパク質の最大の安定性の少なくとも５０％である、タンパク質の安定性の範囲内にある。あるいは、組成物のｐＨは、組成物がｐＨに対して最大の安定性を有するｐＨよりも０．５単位以上大きくも小さくもない。この開示は、組成物が比較的安定であるｐＨ値の範囲が常に存在するものの、特定の賦形剤の存在が望ましいという所見に基づくものである。バッファーを添加し得ることが述べられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】欧州特許第１３１４４３７号明細書
【特許文献２】国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００２４７０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかし、タンパク質水溶液の安定性を向上させる要求が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、ｐＨに対するタンパク質の安定性を考慮した場合、溶液のｐＨと同じかまたはそれに近いｐＫａを有するバッファーが望ましくないということの発見に基づくものである。むしろ、本発明の鍵は、適切なｐＨを選択して、イオンを交換するタンパク質の能力を最小にすることである。本発明の様々な態様が特許請求の範囲に規定されている。
【００１７】
一実施態様において、本発明は、所望の温度でタンパク質を含む水性組成物のタンパク質の安定性を増大させる方法であって、
ａ．所望の温度でタンパク質が安定性を有するｐＨを決定する工程；
ｂ．工程（ａ）のｐＨよりも少なくとも１単位大きいかまたは小さいｐＫａを有する少なくとも１つの置換バッファーを組成物に加える工程；および
ｃ．組成物のｐＨを工程（ａ）のｐＨに調節する工程
を含み、水性組成物は、従来のバッファーを約２ｍＭより高い濃度で含まず、従来のバッファーは、工程（ａ）のｐＨから１単位の範囲内であるｐＫａを有する方法を含む。
【００１８】
本発明の別の態様において、水系はタンパク質を含み、
（ｉ）水系は、従来のバッファー、すなわち、組成物の保存の所望の温度範囲で組成物のｐＨから１単位の範囲内であるｐＫａを有する化合物を実質的に有していないこと、
（ｉｉ）組成物のｐＨは、組成物がｐＨに対して最大の測定可能な安定性を有する値に設定されること
を特徴とする。
【００１９】
本発明の別の態様によると、水系は、タンパク質および１つ以上の添加剤を含み、
（ｉ）水系は、従来のバッファー、すなわち、組成物の保存の所望の温度範囲で組成物のｐＨから１単位の範囲内であるｐＫａを有する化合物を実質的に有していないこと、
（ｉｉ）組成物のｐＨは、組成物がｐＨに対して最大の測定可能な安定性を有する値に設定されること、
（ｉｉｉ）１つ以上の添加剤は、前記タンパク質とのプロトンの交換が可能であり、組成物の保存の所望の温度範囲で組成物のｐＨよりも少なくとも１単位大きいかまたは小さいｐＫａ値を有すること
を特徴とする。
【００２０】
従来のバッファーの非存在下で、測定可能な安定性が最大である値と同じかまたはそれに近い適切なｐＨにタンパク質を保つことにより、タンパク質の保存安定性が大幅に増大し得る。保存安定性は、通常、組成物の保存の所望の温度範囲で組成物のｐＨから１から５単位離れたｐＫａ値を有する添加剤を用いることでさらに高まり得、場合により大幅に高まり得る。これらの添加剤の存在は、製剤のｐＨ安定性も向上させ、通常好ましいものである。
【００２１】
本発明によると、タンパク質組成物は従来のバッファーを有意な量では含まない。言い換えると、タンパク質組成物は、有意な量より少ない量の従来のバッファーを含む。従来のバッファーは典型的には、２〜２００ｍＭの濃度、より典型的には５〜５０ｍＭ、および最も典型的には約２０ｍＭの濃度でタンパク質組成物に適用される。したがって、「従来のバッファー」という用語は、本明細書において、タンパク質に対する緩衝能力を有する組成物の保存の所望の保存温度範囲で測定された時に、組成物のｐＨから１単位以上離れていない、しかし好ましくは０．５単位以上離れていないｐＫａを有する、あらゆる化学種と定義される。「有意な量未満」という用語は、従来のバッファーが５ｍＭ未満、しかし好ましくは２ｍＭ未満の濃度で組成物内に存在することを意味している。
【００２２】
好ましくは、組成物は、組成物のｐＨから少なくとも１単位低いｐＫａ値および／または組成物のｐＨから少なくとも１単位高いｐＫａ値のいずれかを有する、酸塩基平衡に関与し得る１つ以上の添加剤を含む。本明細書において用いる場合、組成物のｐＨから１単位以上高いかまたは低いというのは、本明細書において、組成物のｐＨから１単位以上「離れている」とも言われる。このような添加剤は、酸性値の方向（ｐＫａが組成物のｐＨよりも低い場合）またはアルカリ性値の方向（ｐＫａが組成物のｐＨよりも高い場合）へのｐＨの著しい変化から組成物を保護し得る。一実施態様において、添加剤には、限定はしないが、本発明に従った「置換バッファー」が含まれる。
【００２３】
最も好ましくは、組成物は、組成物のｐＨよりも少なくとも１単位低いｐＫａ値および組成物のｐＨよりも少なくとも１単位高いｐＫａ値の両方での酸塩基平衡に関与し得る、１つ以上の添加剤を含む。このような添加剤は、酸性値およびアルカリ性値の方向へのｐＨの著しい変化から組成物を保護し得る。
【００２４】
このような添加剤は、各添加剤のモル濃度が少なくとも１ｍＭおよび／または１Ｍ未満、好ましくは２ｍＭから２００ｍＭ、最も好ましくは５ｍＭから１００ｍＭとなるような量で適切に存在する。一実施態様において、１つ以上の添加剤は好ましくは１ｍＭから約１Ｍの濃度で存在し；より好ましくは約２ｍＭから約２００ｍＭの濃度で存在し、さらに好ましくは約５ｍＭから約１００ｍＭの濃度で存在する。
【００２５】
前記タンパク質とのプロトンの交換が可能な添加剤とは別に、組成物は、製剤の所望の使用のための必要条件を満たすために他の賦形剤を含み得る。このような賦形剤の例には、イオン強度を調節するための無機塩、タンパク質の表面吸着を最小にするためのサーファクタント、組成物を無菌状態に維持するための防腐剤、金属を複合体化するキレート剤、または、タンパク質がサンプル内に存在するプロテアーゼ活性により緩やかに消化されないことを保証するプロテアーゼ阻害剤が含まれる。用い得る別の添加剤は、例えば少なくとも０．５％の濃度、典型的には最大５％（ｗ／ｗ）の濃度の、多価アルコールである。このような化合物の例は、ショ糖もしくはトレハロースなどの糖類、または、イノシトール、ラクチトール、マンニトール、もしくはキシリトールなどの糖アルコールである。
【００２６】
本発明に従って安定化されたタンパク質は、微生物学的に無菌の形態であり得、封止された無菌の容器、例えばバイアル、シリンジ、またはカプセル内に都合良く入れられるかまたは保存され、所望の温度で保存される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、組成物をｐＨ７に緩衝するための仮想系における従来のバッファー（Ａ）ならびに置換バッファー（displaced buffer）（Ｂ１およびＢ２）のバッファー種の相対的濃度を示すグラフである。ｐＫａ（Ａ）＝７、ｐＫａ（Ｂ１）＝５、ｐＫａ（Ｂ２）＝９である。点線は脱プロトン化した形態のバッファー（すなわち、酸性値へのｐＨの変化を防ぐことが可能な形態）の相対的濃度を示し、実線は、プロトン化した形態のバッファー（すなわち、アルカリ性値へのｐＨの変化を防ぐことが可能な形態）の相対的濃度を示す。
【図２】図２は、２０ｍＭの従来のバッファー（ｐＫａ７）、または共に２０ｍＭの濃度の２つの置換バッファー（ｐＫａ５およびｐＫａ９）のいずれかを含む組成物の滴定曲線である。酸滴定は水酸化物アニオンの負の添加（negative addition）として表される。
【図３】図３は、２０ｍＭの従来のバッファー（ｐＫａ７）、または共に１００ｍＭの濃度の２つの置換バッファー（ｐＫａ５およびｐＫａ９）のいずれかを含む組成物の滴定曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、タンパク質の安定性、とりわけ、水性環境、例えば水溶液、水性ゲル形態、および遊離水または結合水が存在する固体状態（または他の非液体状態）におけるタンパク質の安定性に関するものであり、タンパク質の保存安定性、例えば、周囲温度（約２０℃）以上での安定性を含む経時的な安定性に関するものであることが理解されよう。
【００２９】
「タンパク質」という用語は、本明細書において、単一のポリペプチドからなる分子または分子複合体、２つ以上のポリペプチドを含む分子または分子複合体、および、１つ以上のポリペプチドと、補欠分子族、補因子などのような１つ以上の非ポリペプチド部分とを含む分子または分子複合体を包含するように用いられる。「ポリペプチド」という用語は、グリコシル化されたポリペプチド、リポタンパク質などのような共有結合した非アミノ酸部分を含むポリペプチドを包含することを意図している。とりわけ、本発明は、１つ以上の目的の生物学的活性を有する分子に関するものであり、その１つまたは複数の活性は、分子または分子複合体の少なくとも重要な部分における特定のまたは天然の三次元構造の保持に非常に依存するものである。
【００３０】
本発明は、従来のバッファーを用いることなく、組成物の適切なｐＨを選択することにより、タンパク質の保存安定性を向上させることが可能である。「従来のバッファー」という用語は、本明細書において、ｐＨから１単位以上離れていないｐＫａ、しかし好ましくは０．５単位以上離れていないｐＫａ、最も好ましくはｐＨに等しいｐＫａを有する組成物内に存在する場合に緩衝能力を有するあらゆる化合物を包含するように用いられる。この定義において用いられるｐＫａ値およびｐＨ値は共に、タンパク質組成物の所望の保存の温度範囲で測定されたものである。
【００３１】
従来のバッファーは、典型的には、２〜２００ｍＭの濃度、より典型的には５〜５０ｍＭ、および最も典型的には約２０ｍＭの濃度でタンパク質組成物内に存在する。従来のバッファーのこのような濃度は、ｐＨの妥当な安定性を確実にし得るものであり、したがって、それらの緩衝作用に関して有意義な濃度であると言うことができる。したがって、そのｐＫａに関する上記の特定とは別に、「従来のバッファー」という用語は、妥当な緩衝作用に関して有意義な濃度で前記従来のバッファーが存在することを特徴とする「有意義な濃度」の側面もさらに含む。言い換えると、従来のバッファーの有意義な濃度は、従来のバッファーにより系の主要な緩衝メカニズムが得られる濃度である。
【００３２】
本発明は、タンパク質の安定性に対する、プロトンの交換が可能な化学種の影響を分析し、その後、タンパク質の良好な長期間の安定性を確実にする条件の選択を可能にするモデルを開発することに起因した。分析の結果、５０％近くがプロトン化した状態である酸塩基種の存在が、機能的アッセイまたは構造的アッセイにより決定される通りタンパク質の安定性に対して有害であることが明らかになった。当然のことながら、このことは、従来のバッファー、とりわけ高濃度の従来のバッファーの存在が、タンパク質の安定性に対して有害であり得ることを意味している。本発明より前に、タンパク質の保存安定性に対する従来のバッファーの悪影響は認められていなかったと考えられる。
【００３３】
ある程度限られた緩衝能力は、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびヒスチジンの側鎖により、タンパク質自体、とりわけ４．０から６．５のｐＨ範囲にあるタンパク質自体に由来し得る。いくつかのケースにおいて、とりわけ高いタンパク質濃度（＞２０ｍｇｍＬ−１）では、これは、所望のｐＨを維持するために、とりわけｐＨの自発的な変化が生じる可能性が低い無菌組成物において所望のｐＨを維持するために、十分なものであり得る。本発明に従って、１つ以上の賦形剤または添加剤を、所望のｐＨを維持するためまたはｐＨの変化を最小にするために用いることができる。これは、「置換バッファー化（displaced buffering）」と言うこともでき、従来の緩衝範囲外にあるｐＫａ値を有するタンパク質組成物への賦形剤の添加、好ましくは組成物のｐＨから約１から４単位高いかまたは低いｐＫａを有する賦形剤の添加に基づく。「置換バッファー化」では、従来のバッファーに匹敵する、所望のｐＨでの強い緩衝能力は確実なものとはならないが、所望の値から離れたｐＨの著しい変動を依然として防ぐことができる。従来の緩衝および置換バッファー化の間の違いを図１に示す。グラフは、ｐＨ７に緩衝された仮想系における従来のバッファー（Ａ）ならびに置換バッファー（Ｂ１およびＢ２）の緩衝種の相対的濃度を示す。点線は脱プロトン化した形態のバッファー（すなわち、酸性値へのｐＨの変化を防ぐことが可能な形態）の相対的濃度を示し；実線は、プロトン化した形態のバッファー（すなわち、アルカリ性値へのｐＨの変化を防ぐことが可能な形態）の相対的濃度を示す。酸性側およびアルカリ性側の両方での緩衝種の濃度は、バッファーの緩衝能力を反映する。従来のバッファー（このケースでは、化合物はｐＫａ＝７である）は、所望のｐＨ７を維持するために最も効果的である。２つの置換バッファー（displacement buffer）（このケースでは、化合物は、所望のｐＨから２単位高いおよび２単位低いｐＫａを有する）は、ｐＨ７で最小の緩衝能力を発揮するが、それらの緩衝能力は、ｐＨが変化して７から離れるほど増大する。したがって、これらの種は所望のｐＨ付近でのわずかな変動を防ぐことにかなり効率的ではないが、それらは、所望のｐＨから離れたさらに大きな変動を防ぐことができる。図１に示すように、置換バッファーがそれらの各々のｐＫａ値から離れたところにｐＨを維持する能力は、それらの濃度と共に増大する。
【００３４】
塩基（ＯＨ−）または酸（Ｈ３Ｏ＋）で滴定した組成物の滴定曲線を図２に示す。このモデル例において、標的ｐＨは７であり、滴定は、２０ｍＭの従来のバッファー（ｐＫａ７）と、それぞれ２０ｍＭの濃度の２つの置換バッファー（ｐＫａ５およびｐＫａ９）の組合せとを含む組成物のものが示されている。滴定曲線は、存在する種のｐＫａ値および濃度に基づき、そして組成物の他のいずれの構成要素も組成物の緩衝に寄与しないという仮定に基づく、理論的なものである。
【００３５】
標的ｐＨでは置換バッファーの緩衝能力が限られていることにより、従来のバッファーを含む組成物における標的ｐＨ（すなわち、このモデル例においては７）での滴定曲線の傾きは、置換バッファーの組合せを含む組成物と比較して著しく勾配の小さいものである。したがって、同量のＮａＯＨを加えると、従来のバッファーの存在下におけるｐＨの変化は、同じ濃度の置換バッファーの存在下におけるものと比較して異なったものとなる。したがって、図２に示すモデル例（ここでは、従来のバッファーのｐＫａは標的ｐＨである７と厳密に等しい）において、５ｍＭのＮａＯＨを加える（すなわち、ＮａＯＨを組成物に加えて、組成物におけるＮａ＋カチオンの濃度を５ｍＭ増大させる）と、従来のバッファー（２０ｍＭ）の存在下ではｐＨが７．０から７．４８に増大し、置換バッファー（共に２０ｍＭ）の存在下では８．５５に増大する。
【００３６】
しかし、当業者には、標的ｐＨでの置換バッファーの緩衝効率が置換バッファーの濃度の増大により増大し得るということが理解されよう。このことは、２０ｍＭの従来のバッファーならびに共に１００ｍＭの濃度の置換バッファー（ｐＫａ５およびｐＫａ９）の組合せについての図３に例示されている（２０ｍＭの置換バッファーについて同一の状況が例示されている図２との比較）。同様に、従来のバッファーの緩衝効率は、バッファーの濃度に比例する。
【００３７】
緩衝効率は、標的ｐＨでの滴定曲線の傾きに依存する。傾きが小さいほど、良好な緩衝効率が得られる。標的ｐＨ（すなわちｐＨ７）での上記のモデル例における滴定曲線の傾きはおよそ以下の通りである。
従来のバッファー（１００ｍＭ）のケースにおいて、
【数３】
0005541925.tif 000004
従来のバッファー（２０ｍＭ）のケースにおいて、
【数４】
0005541925.tif 000005
従来のバッファー（５ｍＭ）のケースにおいて、
【数５】
0005541925.tif 000006
置換バッファー（それぞれ１００ｍＭ）のケースにおいて、
【数６】
0005541925.tif 000007
置換バッファー（それぞれ２０ｍＭ）のケースにおいて、
【数７】
0005541925.tif 000008
置換バッファー（それぞれ５ｍＭ）のケースにおいて、
【数８】
0005541925.tif 000009
【００３８】
したがって、通常、置換バッファーの緩衝効率は、従来のバッファーの緩衝効率と比較して、置換バッファーのケースにおいて著しく低いが、それは、置換バッファーの濃度を上げることで相殺することができる。例えば、１００ｍＭの濃度の置換バッファー（ｐＫａ５および９）の緩衝効率では、５ｍＭの濃度の従来のバッファー（ｐＫａ７）で得られるものと比較してさらに良好な緩衝効率が得られる。
【００３９】
本発明の１つの実施形態には、置換バッファーにより「本質的に偏位されている」タンパク質組成物が含まれる。このことは、組成物のｐＨから少なくとも１単位離れたｐＫａを有する組成物の全てのイオン性基によりもたらされる、組成物の保存ｐＨでの滴定曲線（
【数９】
0005541925.tif 000010
）の傾きが、組成物のｐＨから１単位以上離れていないｐＫａを有する組成物の全てのイオン性基によりもたらされるものよりも大幅に低いことを意味している。このことは、置換バッファーが従来のバッファーよりも、組成物のｐＨ緩衝に実質的に大きく寄与することを意味している。組成物のｐＨから少なくとも１単位離れたｐＫａを有する組成物の全てのイオン性基によりもたらされる、組成物の保存ｐＨでの滴定曲線（
【数１０】
0005541925.tif 000011
）の傾きは、組成物のｐＨから１単位以上離れていないｐＫａを有する組成物の全てのイオン性基によりもたらされるものよりも少なくとも２倍小さいはずであり、好ましくは５倍小さく、最も好ましくは１０倍小さいはずである。
【００４０】
当業者であれば、組成物における全てのイオン性基の濃度およびそれらのｐＫａのいずれかに基づいて理論的に滴定曲線の傾きを決定することが可能であろう。あるいは、滴定曲線の傾きは、組成物のｐＨから１単位以上離れていないｐＫａを有するイオン性基を有する化合物と、組成物のｐＨから１単位超離れているｐＫａを有するイオン性基を有する化合物とが分離している、２つの組成物における滴定曲線を測定することにより、実験的に確認することができる。
【００４１】
したがって、一実施態様において、本発明のタンパク質組成物は、所望の温度で組成物のｐＨより少なくとも１単位大きいｐＫａを有する少なくとも１つの置換バッファーと、所望の温度で組成物のｐＨより少なくとも１単位小さいｐＫａを有する少なくとも１つの置換バッファーとを含む、２つの置換バッファーを含む。一実施態様において、本発明のタンパク質組成物は、所望の温度で組成物のｐＨより少なくとも１．５単位大きいｐＫａを有する少なくとも１つの置換バッファーと、所望の温度で組成物のｐＨより少なくとも１．５単位小さいｐＫａを有する少なくとも１つの置換バッファーとを含む、２つの置換バッファーを含む。一実施態様において、本発明のタンパク質組成物は、所望の温度で組成物のｐＨより少なくとも２単位大きいｐＫａを有する少なくとも１つの置換バッファーと、所望の温度で組成物のｐＨより少なくとも２単位小さいｐＫａを有する少なくとも１つの置換バッファーとを含む、２つの置換バッファーを含む。
【００４２】
一実施態様において、本発明のタンパク質組成物は、それぞれの置換バッファーが、所望の温度でタンパク質が安定性を有するｐＨから約１単位から約５単位離れている、２つの置換バッファーを含む。一実施態様において、本発明のタンパク質組成物は、それぞれの置換バッファーが、所望の温度でタンパク質が安定性を有するｐＨから約１単位から約４単位離れている、２つの置換バッファーを含む。ｐＨ緩衝への寄与とは別に、置換バッファーの存在は、多くのケースにおいて、タンパク質の安定性に対して有利な効果を有することが示された。例えば、一実施態様において、本発明に従った組成物のタンパク質のタンパク質活性は、所望の温度（例えば、周囲温度またはそれ以上）で、少なくとも１週間、好ましくは少なくとも４週間にわたって、その活性の少なくとも４０％を保持する。別の実施形態において、本発明に従った組成物のタンパク質のタンパク質活性は、所望の温度で少なくとも１週間、好ましくは所望の温度（例えば、周囲温度またはそれ以上）で少なくとも４週間にわたって、その活性の少なくとも５０％を保持する。別の実施形態において、本発明に従った組成物内に存在するタンパク質の、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％のタンパク質の構造活性は、所望の温度で、少なくとも１週間、好ましくは少なくとも４週間にわたって保持される。
【００４３】
置換バッファーとして用いることのできる化合物は、有機および無機の両方であり得る。それらは、モノマーおよびポリマーの性質の両方であり得る。
【００４４】
添加剤としてタンパク質組成物内に有効に組み込まれ得、かつ置換バッファーとしても機能する可能性を有し得る化合物のいくつかの例は知られており、限定はしないが、ヒスチジン、マレイン酸、亜硫酸、シクラミン酸、硫酸水素、セリン、アルギニン、リジン、アスパラギン、メチオニン、スレオニン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、グリシン、トリプトファン、ゲンチジン酸、サリチル酸、グリオキシル酸、アスパルテーム、グルクロン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、酒石酸、グルコン酸、乳酸、グリコール酸、アデニン、コハク酸、アスコルビン酸、安息香酸、酢酸フェニル、没食子酸、シトシン、ｐ−アミノ安息香酸、ソルビン酸、酢酸、プロピオン酸、アルギン酸、尿酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、重炭酸、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−イミノ二酢酸、２−［（２−アミノ−２−オキソエチル）アミノ］エタンスルホン酸、ピペラジン、N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)、リン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−2-アミノエタンスルホン酸、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、トリエタノールアミン、ピペラジン−Ｎ,Ｎ'−ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、N-トリス(ヒドロキシメチル)グリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸、アンモニウムイオン、ホウ酸、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、パルミチン酸、クレアチン、クレアチニン、およびそれらの塩が挙げられる。
【００４５】
化合物の特定の選択は、組成物のｐＨに依存する。したがって、例えば、プリン（ｐＫａ＝９．０）はｐＨ７．０（この場合、ｐＫａ−ｐＨ＝２．０）では組成物における適切な添加剤であるが、ｐＨ８．８（この場合、ｐＫａ−ｐＨ＝０．２であり、したがってプリンは従来のバッファーとなる）の組成物においてはそうではない。当然のことながら、当業者には、特定のタンパク質に特異的な態様が考慮されなくてはならないことが理解されよう。例えば、選択された添加剤がタンパク質活性を阻害しないことを確実にすることが重要である。提案される添加剤の多くは、ＧＲＡＳ（一般的に安全とみなされる（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｇａｒｄｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ））であるかまたは医薬品における認可された成分である。これらの添加剤は、医薬組成物におけるタンパク質の安定化にとりわけ適している。診断キットにおけるタンパク質などの、安全性が主な懸案事項ではない他の応用では、ＧＲＡＳカテゴリー外の化合物を用いることができる。
【００４６】
一実施態様において、本発明は、タンパク質と、組成物のｐＨから少なくとも１単位大きいかまたは１単位小さいｐＫａを有する１つ以上の置換バッファーとを含む水性組成物を含み、このような組成物は、１つ以上の置換バッファーによって本質的に緩衝されている。系の主な緩衝メカニズムをもたらす濃度で１つ以上の置換バッファーが存在する場合、組成物は、このような置換バッファーによって「本質的に緩衝」されている。
【００４７】
ｐＨに影響する特定の物質の存在が可能であることに加えて、組成物は、置換バッファーまたは添加物の構成要素以外の構成要素を含み得る。例えば、組成物は、無機塩、例えば、組成物のイオン強度を調節するための無機塩、糖もしくは糖アルコール、防腐剤、プロテアーゼ阻害剤、キレート剤、イオン性洗浄剤または非イオン性洗浄剤を含み得る。本発明において用いられる組成物のｐＨと「置換バッファー」のｐＫとの間の差は少なくとも１単位であり、好ましくは少なくとも１．５単位、例えば少なくとも２単位で最大５単位であるかまたはそれ以上である。
【００４８】
置換バッファーが、系の主な緩衝メカニズム、すなわち系の緩衝能力の少なくとも５０％、しかし好ましくは少なくとも８０％を付与する限り、従来のバッファー、すなわち置換バッファーの定義に適合しないバッファーを用い得ることを理解されたい。
【００４９】
理論に縛られることなく、タンパク質の安定性に対する本発明の有利な効果は、５０％または約５０％がプロトン化した状態で、酸塩基種が、タンパク質表面のいくつかのアミノ酸などの周囲の酸塩基種とプロトンを交換する可能性が最も高いという事実によるものであると考えられる。このような交換は、以下の理由から、タンパク質に対して有害となり得る。
・  それぞれのプロトン交換により、結合の形成または結合の切断が生じる。このようなプロセスは、タンパク質と周囲の種との間のエネルギーの交換（例えば、関与する種の並進運動エネルギー）、およびタンパク質におけるプロトンが交換される部分の電荷の特徴における変化を伴う。したがって、タンパク質がその水性環境と平衡している場合に生じる連続的なプロトンの交換は、タンパク質の構造の変動およびその結果生じるタンパク質の物理的不安定性の原因である可能性が非常に高い。
・  脱アミドなどの、タンパク質の安定性に影響する様々な化学的プロセスは、プロトンの交換を伴う。したがって、これらのプロセスの速度を最小化することにより、タンパク質が安定し得る。
【００５０】
本発明は、水溶液内に自由に溶解されたタンパク質もしくは水性ゲル形態のタンパク質、または分散液もしくは懸濁液として水系内に存在しているタンパク質、および、疎水性相互作用、イオン性相互作用、もしくはリガンド交換による相互作用によってワクチンアジュバントもしくは細胞膜のような固形物基質に付着しているタンパク質に応用可能である。本発明はまた、遊離水または結合水が依然として存在している、乾燥または凍結乾燥によって水溶液から部分的にまたは完全に水が除去された固体状態のタンパク質にも応用可能である。
【００５１】
本発明は、単離または発現、精製、運搬、および保存を含むタンパク質の製品寿命を通しての、タンパク質の安定化に応用可能である。
【００５２】
二次構造の観点において、本発明は、アルファヘリックス、ベータシート、およびランダムコイルをどのような比率で含むタンパク質にも応用可能である。
【００５３】
三次構造の観点において、本発明は、球状タンパク質および繊維状タンパク質の両方に応用可能である。本発明は、非共有結合性の相互作用のみによって三次構造が維持されているタンパク質、ならびに非共有結合性の相互作用および１つ以上のジスルフィド架橋の組合せによって三次構造が維持されているタンパク質に応用可能である。
【００５４】
四次構造の観点において、本発明は、モノマータンパク質、および２つ、３つ、４つ以上のサブユニットから構成されるタンパク質に応用可能である。本発明はまた、タンパク質複合体にも応用可能である。
【００５５】
非タンパク質性の構造成分の観点において、本発明は、いずれの非ペプチド性の構成要素も含まないタンパク質、ならびに、糖タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、金属タンパク質、および、タンパク質が全質量の少なくとも１０％を占める複合体を含む他のタンパク質に応用可能である。本発明は、機能するために補因子を必要としないタンパク質、および、機能するために補因子、補欠分子族、または活性化因子を必要とするタンパク質に応用可能である。
【００５６】
タンパク質は、天然のもの、または組換えられたもの、グリコシル化されたもの、またはグリコシル化されていないもの、自己分解性のもの、または自己分解性でないものであり得る。本発明はとりわけ、以下のタンパク質のグループに応用可能である。
【００５７】
タンパク質ホルモンまたはペプチドホルモンおよび成長因子
タンパク質ホルモンまたはペプチドホルモンおよび成長因子の機能は、特異的受容体に結合するそれらの能力に依存する。このような結合の事象はタンパク質の立体配座に密接に関連している。したがって、タンパク質の三次元構造の保持、または少なくとも、主要なドメインの３Ｄ構造の保持は、それらの機能にとって極めて重要である。構造的特徴および機能的特徴の保持も、タンパク質治療の規制認可にとって最も重要なものである。治療用のタンパク質ホルモンまたはペプチドホルモンの例には、
インスリン（糖尿病の治療）
グルカゴン（糖尿病の治療）
ヒト成長ホルモン
ゴナドトロピン
ヒト甲状腺刺激ホルモン（甲状腺癌の治療）
顆粒球コロニー刺激因子（化学療法の一部として用いられる）
が含まれる。
【００５８】
治療用酵素
治療用酵素の機能は、それらの分子構造および立体配座に直接的に依存する。不可逆的な立体配座の変化および不可逆的な凝集により、治療用酵素が不活性化する。タンパク質の構造的特徴の保持も、規制認可の必須の必要条件である。治療用のタンパク質ホルモンまたはペプチドホルモンの例には、
ストレプトキナーゼ（虚血性脳卒中の治療における血栓溶解剤）
アスパラギナーゼ
尿酸オキシダーゼ
パパイン（組織のデブリードマン）
が含まれる。
【００５９】
ワクチン
タンパク質ワクチンの免疫原活性は、とりわけ立体配座エピトープに関する、主要なタンパク質抗原の構造的完全性に（大部分）依存する（この場合、抗体は、天然のフォールディングによって一緒にされたポリペプチド鎖の異なる領域に結合することが求められる）。不可逆的な立体配座の変化および不可逆的な凝集により、ワクチンが不活性化する。それぞれのタンパク質分子のかなりの領域が依然として溶媒水と完全に相互作用している場合、アルミナ粒子などの粒子上、または他の（粒子ではない）表面上に吸着したタンパク質にも、同様の考察が当てはまる。これは、一部は実用上のまたは事業計画上の制限をにより、また一部はコストによりコールドチェーンの維持が非常に困難であるかまたは不可能である第三世界におけるワクチンの流通において、とりわけ重要なものである。本発明は、組換えタンパク質ワクチンおよび弱毒化ウイルスワクチンまたは全細胞ワクチンに応用することができ、ポリペプチド鎖からなる主要な抗原を提供することができる。このようなワクチンの例には、
Ｂ型肝炎ワクチン
マラリアワクチン
ヒトパピローマワクチン
Ａ型髄膜炎ワクチン
Ｃ型髄膜炎ワクチン
百日咳ワクチン
ポリオワクチン
が含まれる。
【００６０】
治療用抗体
治療用抗体の機能は、標的抗原とのそれらの特異的な相互作用に基づく。したがって、治療用抗体の機能を維持するためには、それらの有効期間の間にわたる三次元構造の保持が必須である。免疫グロブリンのフォールディング部分またはドメインが、固有の、強固な、安定な構造であるため、抗体は、通常は周囲温度で非常に安定であるが、保存時のそれらの安定性をさらに向上させることで本発明の利益を享受し得る。例えば癌治療において使用することのできる、治療用抗体の例には、
抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）モノクローナル抗体
抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（乳癌の治療）
抗ＣＤ５２モノクローナル抗体（慢性リンパ性白血病の治療）
抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（侵攻性リンパ腫の治療）
が含まれる。
【００６１】
インターフェロン
インターフェロンは、例えば多発性硬化症の治療に用いられる、治療上重要な、かなり不安定なポリペプチドである。本発明を応用することにより、インターフェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγを含むインターフェロンの有効期間およびコストパフォーマンスが向上し得る。
【００６２】
他の治療用タンパク質
以下のものは、とりわけ水溶液において、コストパフォーマンスおよび向上した有効期間の観点において本発明の応用の利益を享受し得る、他の治療用タンパク質の例である。
エリスロポエチン（赤血球の産生を刺激する）
ダルベポエチンアルファ（赤血球の産生を刺激する）
血液凝固因子、主に第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子（血友病の治療および制御）
免疫抑制剤（喘息、アレルギー性鼻炎、または多発性硬化症などの様々な症状の治療）
ヒトアルブミン
プロテインＣ（抗血栓剤）
【００６３】
診断用タンパク質および工業用タンパク質
構造的特徴の保持は、診断用タンパク質、とりわけ酵素および抗体の機能にとって極めて重要である。とりわけ、アッセイを較正しＱＣを行うために用いる、キットにおける分析物の標準品は、厳密に安定化されていなければならず、それは、標準品の完全性におけるあらゆるずれが、キット全体の精度における結果的に生じるずれの原因となるからである。不正確な動作により、誤った結果またはパフォーマンスの低下（例えば、手順の進行の滞り）が生じ得る。したがって、製品寿命を通しての診断用タンパク質の機能的活性の安定性は最も重要なものである。診断用製品の製造では、処理の実質的な障害の原因となるコストの高い凍結乾燥を排除するアプローチおよび製剤を見い出すことが望まれている。診断用タンパク質の例には、
モノクローナル抗体
ポリクローナル抗体
抗体−酵素複合体
グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼなどのオキシダーゼ
ペルオキシダーゼ
アルカリホスファターゼ
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼなどのデヒドロゲナーゼ
インベルターゼなどのイソメラーゼ
トリプシンまたはキモトリプシンなどの加水分解酵素
ホルモン、成長因子、微生物タンパク質、代謝性タンパク質、可溶性形態の構造タンパク質などのような、キットの形態で供給される統合的アッセイの標準品
が含まれる。
【００６４】
工業用タンパク質の例には、
アミラーゼ
プロテアーゼ
リパーゼ
が含まれる。
【００６５】
治療用タンパク質、ワクチンおよび診断法の国際標準品
治療用または診断用タンパク質の標準品は、治療方法および診断方法の標準化において極めて重要である。標準品の安定性が根本的に重要である。それ故に、様々なタンパク質ベースの標準品が、本発明の理想的な標的である。
【００６６】
一実施態様において、本発明は水性タンパク質組成物を含み、ここで、該タンパク質は目的の温度でpH6を有し、該タンパク質組成物は7以上のpKaを有する少なくとも１つの置換バッファーを含有し、好ましくは、該置換バッファーはTRIS、プリンおよびシトシンから選択される。別の実施態様において、本発明は水性タンパク質組成物を含み、ここで、該タンパク質は目的の温度でpH6を有し、該タンパク質組成物は5以下のpKaを有する少なくとも１つの置換バッファーを含有し、好ましくは、該置換バッファーは乳酸塩である。
【００６７】
一実施態様において、本発明は、好ましくは所望の温度でB型肝炎ワクチンを含有する該タンパク質のpHが5であり、好ましくは少なくとも１つの置換バッファーが6以上のpKaを有するか、少なくとも１つの置換バッファーが4以下のpKaを有しており、あるいはそのような置換バッファーのいずれかの組み合わせが該組成物に存在し、ここで好ましくは該１以上の置換バッファーがTRISおよびヒスチジンから選択される、B型肝炎ワクチンである水性タンパク質組成物を含む。
【００６８】
一実施態様において、該水性タンパク質組成物は所望の温度でpH5を有するグルコースオキシダーゼを含有し、該タンパク質組成物は6以上のpKaを有する少なくとも１つの置換バッファー（ここで該置換バッファーとして、限定はされないが、TRISが挙げられる）をさらに含有する。別の実施態様において、該水性タンパク質組成物は所望の温度でpH5を有するグルコースオキシダーゼを含有し、該タンパク質組成物は4以下のpKaを有する少なくとも１つの置換バッファー（ここで該置換バッファーとして、限定はされないが、乳酸塩が挙げられる）をさらに含有する。
【００６９】
一実施態様において、該水性タンパク質組成物は所望の温度でpH6.7を有するカタラーゼを含有し、該タンパク質組成物は7.7以上のpKaを有する少なくとも１つの置換バッファー（ここで該置換バッファーとして、限定はされないが、TRISおよびリジンが挙げられる）をさらに含有する。別の実施態様において、該水性タンパク質組成物は所望の温度でpH6.7を有するカタラーゼを含有し、該タンパク質組成物は5.7以下のpKaを有する少なくとも１つの置換バッファー（ここで該置換バッファーとして、限定はされないが、乳酸塩およびリジンが挙げられる）をさらに含有する。
【００７０】
一実施態様において、該水性タンパク質組成物は所望の温度でpH8.6を有するウリカーゼを含有し、該タンパク質組成物は9.6以上のpKaを有する少なくとも１つの置換バッファー（ここで該置換バッファーとして、限定はされないが、グリシンおよびシトシンが挙げられる）をさらに含有する。別の実施態様において、該水性タンパク質組成物は所望の温度でpH8.6を有するウリカーゼを含有し、該タンパク質組成物は7.3以下のpKaを有する少なくとも１つの置換バッファー（ここで該置換バッファーとして、限定はされないが、コハク酸塩、グリシンおよびシトシンが挙げられる）をさらに含有する。
【００７１】
一実施態様において、本発明は、タンパク質および１以上の置換バッファーを含有する水性組成物を提供する（ここで、各置換バッファーは該組成物のpHよりも少なくとも1単位大きいかまたは小さいpKa、より好ましくは該組成物のpHよりも少なくとも2単位大きいかまたは小さいpKaを有するが、但し該組成物は該組成物のpHのpKaを有する従来のバッファーを実質的に含まず、また該組成物は好ましくは約1mMより少ない従来のバッファーを含有し、そして該組成物は該タンパク質および該組成物の安定化に適したさらなる賦形剤（限定はされないが、安定化剤、プロテアーゼインヒビター、キレート化剤、保存剤、糖および洗浄剤が含まれる）をさらに含有し得る）。
【００７２】
一実施態様において、本発明は、約5のpHを有し、グルコースオキシダーゼ、およびTRISおよび乳酸塩からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供する。別の実施態様において、本発明は、約6.7のpHを有し、カタラーゼ、ならびにTRIS、リジンおよび乳酸塩からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供する。さらに別の実施態様において、本発明は、約8.3のpHを有し、ウリカーゼ、ならびにコハク酸塩、リジンおよび乳酸塩からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供する。別の実施態様において、本発明は、約5のpHを有し、B型肝炎抗原、ならびにTRIS、ヒスチジンおよび乳酸塩からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供する。さらに別の実施態様において、本発明は、約6のpHを有し、ヒト成長ホルモン、ならびにTRIS、シトシン、プリンおよび乳酸塩からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供する。
【００７３】
別の実施態様において、本発明は、pH4〜5に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない、タンパク質および少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供し、ここで、少なくとも１つの添加剤は、ヒスチジン、マレイン酸、亜硫酸、シクラミン酸、硫酸水素、セリン、アルギニン、リジン、プリン、アスパラギン、メチオニン、スレオニン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、グリシン、トリプトファン、ゲンチジン酸、サリチル酸またはそれらの塩からなる群から選択される。
【００７４】
別の実施態様において、本発明は、pH4〜5に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない、タンパク質および少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供し、ここで、少なくとも１つの添加剤は、マレイン酸、亜硫酸、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸、炭酸水素、ヒスチジン、ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン、N-(2-アセトアミド)-2-イミノ二酢酸、2-[(2-アミノ-2-オキソエチル)アミノ]エタンスルホン酸、ピペラジン、N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)、リン酸、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸、3-[N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、トリエタノールアミン、ピペラジン-N,N'-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)またはそれらの塩からなる群から選択される。
【００７５】
別の実施態様において、本発明は、pH4.5〜5.5に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない、タンパク質および少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供し、ここで、少なくとも１つの添加剤は、ヒスチジン、マレイン酸、亜硫酸、シクラミン酸、硫酸水素、セリン、アルギニン、リジン、プリン、アスパラギン、メチオニン、スレオニン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、グリシン、トリプトファン、ゲンチジン酸、サリチル酸、グリオキシル酸、アスパルテーム、グルクロン酸またはそれらの塩からなる群から選択される。
【００７６】
さらに別の実施態様において、本発明は、pH4.5〜5.5に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない、タンパク質および少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供し、ここで、少なくとも１つの添加剤は、亜硫酸、アスパルテーム、ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン、N-(2-アセトアミド)-2-イミノ二酢酸、2-[(2-アミノ-2-オキソエチル)アミノ]エタンスルホン酸、ピペラジン、N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)、リン酸、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸、3-[N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、トリエタノールアミン、ピペラジン-N,N'-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、N-トリス(ヒドロキシメチル)グリシン、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸またはそれらの塩からなる群から選択される。
【００７７】
一実施態様において、本発明は、pH4.5〜5.5に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない組成物であって:
a.インターフェロンβ、顆粒球コロニー刺激因子、B型肝炎抗原、A型肝炎およびC型肝炎ワクチンまたはそれらの前駆体もしくは誘導体からなる群から選択されるタンパク質、
b.亜硫酸、アスパルテーム、ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン、N-(2-アセトアミド)-2-イミノ二酢酸、2-[(2-アミノ-2-オキソエチル)アミノ]エタンスルホン酸、ピペラジン、N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)、リン酸、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸、3-[N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、トリエタノールアミン、ピペラジン-N,N'-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、N-トリス(ヒドロキシメチル)グリシン、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤;および、
c.ヒスチジン、マレイン酸、亜硫酸、シクラミン酸、硫酸水素、セリン、アルギニン、リジン、プリン、アスパラギン、メチオニン、スレオニン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、グリシン、トリプトファン、ゲンチジン酸、サリチル酸、グリオキシル酸、アスパルテーム、グルクロン酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤、
を含有する水性組成物を提供する。
【００７８】
さらに別の実施態様において、本発明は、pH5〜6に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない、タンパク質および少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供し、ここで、少なくとも１つの添加剤は、アスパラギン酸、セリン、アルギニン、プリン、リジン、アスパラギン、メチオニン、スレオニン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、グリシン、トリプトファン、ゲンチジン酸、サリチル酸、グリオキシル酸、アスパルテーム、グルクロン酸、グルコン酸、乳酸、グリコール酸またはそれらの塩からなる群から選択される。
【００７９】
別の実施態様において、本発明は、pH5〜6に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない、タンパク質および少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供し、ここで、少なくとも１つの添加剤は、亜硫酸、アルギニン、プリン、アスパラギン、スレオニン、アスパルテーム、リン酸、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸、3-[N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、トリエタノールアミン、ピペラジン-N,N'-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、N-トリス(ヒドロキシメチル)グリシン、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸またはそれらの塩からなる群から選択される。
【００８０】
さらに別の実施態様において、本発明は、pH5〜6に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない組成物であって:
a.ヒルジン、イズロニダーゼまたはそれらの前駆体もしくは誘導体からなる群から選択されるタンパク質;
b.アスパラギン酸、セリン、アルギニン、プリン、リジン、アスパラギン、メチオニン、スレオニン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、グリシン、トリプトファン、ゲンチジン酸、サリチル酸、グリオキシル酸、アスパルテーム、グルクロン酸、グルコン酸、乳酸、グリコール酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤;および、
c.亜硫酸、アルギニン、プリン、アスパラギン、スレオニン、アスパルテーム、リン酸、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸、3-[N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、トリエタノールアミン、ピペラジン-N,N'-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、N-トリス(ヒドロキシメチル)グリシン、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤、
を含む水性組成物を提供する。
【００８１】
さらに別の実施態様において、本発明は、pH5.5〜6.5に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない、タンパク質および少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供し、ここで、少なくとも１つの添加剤は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ゲンチジン酸、酒石酸、サリチル酸、グリオキシル酸、アスパルテーム、グルクロン酸、グルコン酸、乳酸、グリコール酸、アデニン、コハク酸、アスコルビン酸、安息香酸、フェニル酢酸、没食子酸、シトシンまたはそれらの塩からなる群から選択される。
【００８２】
別の実施態様において、本発明は、pH5.5〜6.5に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない、タンパク質および少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供し、ここで、少なくとも１つの添加剤は、セリン、アルギニン、リジン、プリン、アスパラギン、メチオニン、スレオニン、チロシン、トリプトファン、アスパルテーム、3-[N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、トリエタノールアミン、ピペラジン-N,N'-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、N-トリス(ヒドロキシメチル)グリシン、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸、アンモニウムイオン、ホウ酸、2-(N-シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸,トリエタノールアミンまたはそれらの塩からなる群から選択される。
【００８３】
別の実施態様において、本発明は、pH5.5〜6.5に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない組成物であって:
a.ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アプロチニン、コラゲナーゼ、ヒト成長ホルモン、DNase I、インターロイキン1受容体アンタゴニスト、インターフェロンα、モノクローナル抗体（例えば、抗EGFR IgG、TNF結合IgG、抗CD20抗体、抗VEGF抗体、抗RSV抗体）、無細胞百日咳ワクチン、ジフテリア（Dyptheria）ワクチン、HPVワクチン、TBワクチンまたはそれらの前駆体もしくは誘導体からなる群から選択されるタンパク質;
b.アスパラギン酸、グルタミン酸、ゲンチジン酸、酒石酸、サリチル酸、グリオキシル酸、アスパルテーム、グルクロン酸、グルコン酸、乳酸、グリコール酸、アデニン、コハク酸、アスコルビン酸、安息香酸、フェニル酢酸、没食子酸、シトシンまたはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤;および、
c.セリン、アルギニン、リジン、プリン、アスパラギン、メチオニン、スレオニン、チロシン、トリプトファン、アスパルテーム、3-[N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、トリエタノールアミン、ピペラジン-N,N'-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、N-トリス(ヒドロキシメチル)グリシン、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸、アンモニウムイオン、ホウ酸、2-(N-シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸、トリエタノールアミンまたはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤、
を含有する水性組成物を提供する。
【００８４】
さらに別の実施態様において、本発明は、pH6〜7に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない、タンパク質および少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供し、ここで、少なくとも１つの添加剤は、アスパラギン酸、グルタミン酸、酒石酸、サリチル酸、フマル酸、グリオキシル酸、グルクロン酸、グルコン酸、乳酸塩、グリコール酸、アデニン、コハク酸、アスコルビン酸、安息香酸、フェニル酢酸、没食子酸、シトシン、p-アミノ安息香酸、ソルビン酸、酢酸、プロピオン酸、アルギン酸またはそれらの塩からなる群から選択される。
【００８５】
別の実施態様において、本発明は、pH6〜7に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない、タンパク質および少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供し、ここで、少なくとも１つの添加剤は、アスパラギン酸、セリン、アルギニン、リジン、プリン、アスパラギン、グルタミン酸、メチオニン、スレオニン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、グリシン、トリプトファン、アデニン、p-アミノ安息香酸、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、N-トリス(ヒドロキシメチル)グリシン、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸、アンモニウムイオン、ホウ酸、2-(N-シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸、トリエタノールアミン、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、パルミチン酸またはそれらの塩からなる群から選択される。
【００８６】
さらに別の実施態様において、本発明は、pH6〜7に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない組成物であって:
a.TNF受容体、ダルベポエチン（darbepoietin）α、α1アンチトリプシンインヒビター、ナトリウム利尿ペプチド、プロテインC、卵胞刺激ホルモン、インスリン、インスリン様成長因子、骨形成タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、インターロイキン-2、インターフェロン（Intergeron）γ、狂犬病ワクチン、ロタウイルスワクチン、破傷風トキソイドまたはそれらの前駆体もしくは誘導体からなる群から選択されるタンパク質;
b.アスパラギン酸、グルタミン酸、酒石酸、サリチル酸、フマル酸、グリオキシル酸、グルクロン酸、グルコン酸、乳酸、グリコール酸、アデニン、コハク酸、アスコルビン酸、安息香酸、フェニル酢酸、没食子酸、シトシン、p-アミノ安息香酸、ソルビン酸、酢酸、プロピオン酸、アルギン酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤;および、
c.アスパラギン酸、セリン、アルギニン、リジン、プリン、アスパラギン、グルタミン酸、メチオニン、スレオニン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、グリシン、トリプトファン、アデニン、p-アミノ安息香酸、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、N-トリス(ヒドロキシメチル)グリシン、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸、アンモニウムイオン、ホウ酸、2-(N-シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸、トリエタノールアミン、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、パルミチン酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤、
を含有する水性組成物を提供する。
【００８７】
さらに別の実施態様において、本発明は、pH6.5〜7.5に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない、タンパク質および少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供し、ここで、少なくとも１つの添加剤は、アスパラギン酸、グルタミン酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸、乳酸、グリコール酸、アデニン、コハク酸、アスコルビン酸、安息香酸、フェニル酢酸、グルタル酸、没食子酸、シトシン、p-アミノ安息香酸、ソルビン酸、酢酸、プロピオン酸、アルギン酸、尿酸またはそれらの塩からなる群から選択される。
【００８８】
別の実施態様において、本発明は、pH6.5〜7.5に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まないタンパク質および少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供し、ここで、少なくとも１つの添加剤は、アスパラギン酸、セリン、アルギニン、リジン、プリン、アスパラギン、グルタミン酸、メチオニン、スレオニン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、グリシン、トリプトファン、アデニン、p-アミノ安息香酸、アンモニウムイオン、ホウ酸、2-(N-シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸、トリエタノールアミン、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、パルミチン酸、クレアチニンまたはそれらの塩からなる群から選択される。
【００８９】
さらに別の実施態様において、本発明は、pH6.5〜7.5に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない組成物であって:
a.アルファセプト（Alfacept）、アルテプラーゼ、ボツリヌス毒素、副甲状腺ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、甲状腺刺激ホルモン、カルシトニン、エリスロポエチン、ヘモフィルスbワクチン、日本脳炎ワクチン、ブドウ球菌ワクチン、マラリアワクチンまたはそれらの前駆体もしくは誘導体からなる群から選択されるタンパク質;
b.アスパラギン酸、グルタミン酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸、乳酸、グリコール酸、アデニン、コハク酸、アスコルビン酸、安息香酸、フェニル酢酸、グルタル酸、没食子酸、シトシン、p-アミノ安息香酸、ソルビン酸、酢酸、プロピオン酸、アルギン酸、尿酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤;および、
c.アスパラギン酸、セリン、アルギニン、リジン、プリン、アスパラギン、グルタミン酸、メチオニン、スレオニン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、グリシン、トリプトファン、アデニン、p-アミノ安息香酸、アンモニウムイオン、ホウ酸、2-(N-シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸、トリエタノールアミン、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、パルミチン酸、クレアチニンまたはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤、
を含む水性組成物を提供する。
【００９０】
さらに別の実施態様において、本発明は、pH7〜8に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない、タンパク質および少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供し、ここで、少なくとも１つの添加剤は、グルタミン酸、マロン酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、アデニン、コハク酸、アスコルビン酸、安息香酸、フェニル酢酸、グルタル酸、没食子酸、シトシン、ソルビン酸、酢酸、プロピオン酸、アルギン酸、尿酸またはそれらの塩からなる群から選択される。
【００９１】
さらに別の実施態様において、本発明は、pH7〜8に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない、タンパク質および少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供し、ここで、少なくとも１つの添加剤は、アスパラギン酸、セリン、アルギニン、リジン、グルタミン酸、メチオニン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、グリシン、トリプトファン、アデニン、アンモニウムイオン、ホウ酸、2-(N-シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸、トリエタノールアミン、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、パルミチン酸、クレアチニンまたはそれらの塩からなる群から選択される。
【００９２】
さらに別の実施態様において、本発明は、pH7〜8に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない組成物であって:
a.尿酸オキシダーゼ、活性化凝固第VII因子、活性化凝固第VIII因子、活性化凝固第IX因子、アンチトロンビン、セクレチン、黄体形成ホルモン、カリクレインインヒビター、インターロイキン-11またはそれらの前駆体もしくは誘導体からなる群から選択されるタンパク質;
b.グルタミン酸、マロン酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、アデニン、コハク酸、アスコルビン酸、安息香酸、フェニル酢酸、グルタル酸、没食子酸、シトシン、ソルビン酸、酢酸、プロピオン酸、アルギン酸、尿酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤;および、
c.アスパラギン酸、セリン、アルギニン、リジン、グルタミン酸、メチオニン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、グリシン、トリプトファン、アデニン、アンモニウムイオン、ホウ酸、2-(N-シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸、トリエタノールアミン、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、パルミチン酸、クレアチニンまたはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤、
を含む水性組成物を提供する。
【００９３】
さらに別の実施態様において、本発明は、pH7.5〜8.5に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない、タンパク質および少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供し、ここで、少なくとも１つの添加剤は、マレイン酸、マロン酸、フマル酸、クエン酸、マレイン酸、グルタル酸、シトシン、ソルビン酸、酢酸、プロピオン酸、アルギン酸、尿酸、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸、炭酸水素、ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタンまたはそれらの塩からなる群から選択される。
【００９４】
さらに別の実施態様において、本発明は、pH7.5〜8.5に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない、タンパク質および少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供し、ここで、少なくとも１つの添加剤は、アスパラギン酸、グルタミン酸、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、グリシン、アデニン、尿酸、トリエタノールアミン、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、パルミチン酸、クレアチニン、クレアチンまたはそれらの塩からなる群から選択される。
【００９５】
さらに別の実施態様において、本発明は、pH7.5〜8.5に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない組成物であって:
a.ストレプトキナーゼ、炭疽菌リコンビナント致死因子、インフルエンザワクチンまたはそれらの前駆体もしくは誘導体からなる群から選択されるタンパク質;
b.マレイン酸、マロン酸、フマル酸、クエン酸、マレイン酸、グルタル酸、シトシン、ソルビン酸、酢酸、プロピオン酸、アルギン酸、尿酸、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸、炭酸水素、ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタンまたはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤;および、
c.アスパラギン酸、グルタミン酸、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、グリシン、アデニン、尿酸、トリエタノールアミン、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、パルミチン酸、クレアチニン、クレアチンまたはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤、
を含む水性組成物を提供する。
【００９６】
別の実施態様において、本発明は、pH8〜9に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない、タンパク質および少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供し、ここで、少なくとも１つの添加剤は、マレイン酸、マロン酸、クエン酸、マレイン酸、グルタル酸、没食子酸、アルギン酸、尿酸、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸、炭酸水素、ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン、N-(2-アセトアミド)-2-イミノ二酢酸、2-[(2-アミノ-2-オキソエチル)アミノ]エタンスルホン酸、ピペラジン、N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)またはそれらの塩からなる群から選択される。
【００９７】
さらに別の実施態様において、本発明は、pH8〜9に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない、タンパク質および少なくとも１つの添加剤を含有する水性組成物を提供し、ここで、少なくとも１つの添加剤は、アスコルビン酸、尿酸、クレアチニン、クレアチン、チロシン、アラニンまたはそれらの塩からなる群から選択される。
【００９８】
さらに別の実施態様において、本発明は、pH8〜9に調整され、該pHの１pH単位内のpKaを有するバッファーを実質的に含まない組成物であって:
a.尿酸オキシダーゼまたは炭疽菌リコンビナント感染防御抗原またはそれらの前駆体もしくは誘導体からなる群から選択されるタンパク質;
b.マレイン酸、マロン酸、クエン酸、マレイン酸、グルタル酸、没食子酸、アルギン酸、尿酸、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸、炭酸水素、ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン、N-(2-アセトアミド)-2-イミノ二酢酸、2-[(2-アミノ-2-オキソエチル)アミノ]エタンスルホン酸、ピペラジン、N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤;および、
c.アスコルビン酸、尿酸、クレアチニン、クレアチン、チロシン、アラニンまたはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤、
を含む水性組成物を提供する。
【００９９】
本発明は、タンパク質を含有し、 
a.系が、有意な量の従来のバッファー、すなわち、該組成物の保存における所望の温度範囲で、該組成物のpHに近いpKaを有する化合物を含有せず;および、
b.該組成物のpHが、pHに関して該組成物が最大の測定可能な安定性を有する値である
を特徴とする水溶液系をさらに包含する。
【０１００】
一実施態様において、本発明に記載の系は、±0.5 pH単位の範囲内、好ましくはpHに関して該組成物が最大の測定可能な安定性を有するpHの±1 pH単位の範囲内であるpHを含有することが好ましい。
【０１０１】
本発明の系は好ましくは、500 μMより高い濃度での保存における所望の温度範囲で該組成物のpHから0.3単位内のpKaを有するいずれの化合物も含有しない。別の実施態様において、本発明の系は好ましくは、2 mMより高い濃度での保存における所望の温度範囲で該組成物のpHから0.3単位内のpKaを有するいずれの化合物も含有しない。本発明のさらに別の実施態様において、本発明の系は、5 mMより高い濃度での保存における所望の温度範囲で該組成物のpHから0.3単位内のpKaを有するいずれの化合物も含有しない。本発明のさらに別の実施態様において、該系は、500 μMより高い濃度での保存における所望の温度範囲で該組成物のpHから0.6単位内のpKaを有するいずれの化合物も含有しない。本発明のさらに別の実施態様において、本発明の系は、2 mMより高い濃度での保存における所望の温度範囲で該組成物のpHから0.6単位内のpKaを有するいずれの化合物も含有しない。本発明のさらに別の実施態様において、本発明の系は、5 mMより高い濃度での保存における所望の温度範囲で該組成物のpHから0.6単位内のpKaを有するいずれの化合物も含有しない。本発明の別の実施態様において、本発明の系は、500 μMより高い濃度での保存における所望の温度範囲で該組成物のpHから1単位内のpKaを有するいずれの化合物も含有しない。本発明のさらに別の実施態様において、本発明の系は、2 mMより高い濃度での保存における所望の温度範囲で該組成物のpHから1単位内のpKaを有するいずれの化合物も含有しない。本発明のさらに別の実施態様において、本発明の系は、5 mMより高い濃度での保存における所望の温度範囲で該組成物のpHから1単位内のpKaを有するいずれの化合物も含有しない。
【０１０２】
本発明によると、本発明の系は:多価アルコール（好ましくはおよそ少なくとも0.5％(w/w)で）; 無機塩; 保存剤; プロテアーゼインヒビター、サーファクタント; キレート化剤またはそれらのいずれかの組み合わせをさらに含有し得る。
【０１０３】
一実施態様において、本発明の系は、好ましくはその天然状態であるタンパク質を含有する。別の実施態様において、本発明の系は、ホルモンまたは増殖因子、酵素、抗体、インターフェロン、免疫原性タンパク質、あるいはそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質を含有する。さらに別の実施態様において、本発明の系は、好ましくは水溶液、懸濁液または分散液である。一実施態様において、本発明の系は固体吸着剤を含有する。ある好ましい実施態様において、本発明の系は固体吸着剤を含有し、ここで、該固体吸着剤としては、限定はされないが、アルミナのようなワクチンアジュバントが挙げられる。
【０１０４】
別の実施態様において、本発明は、タンパク質、および該組成物のpHよりも少なくとも1単位大きいかまたは小さいpKaを有する少なくとも１つの酸または塩基を含有する組成物を提供し、ここで、該酸または塩基のプロトン化または非プロトン化形態の濃度のどちらか低い方が、該組成物のpHの少なくとも１単位以上でも以下でもないpKを有する組成物におけるいずれか他の酸または塩基の対応するプロトン化形態または脱プロトン化形態の濃度より高い。
【０１０５】
本発明のさらに別の実施態様において、本発明はタンパク質および１以上の添加剤を含有する水性組成物を提供し、ここで、pHに影響を及ぼす添加物は、該組成物のpHよりも少なくとも1単位高いかまたは低いpKaを有する酸または塩基から本質的に成るが、但し、１以上の添加剤がヒスチジンを含有する場合、該タンパク質は抗体でない。本発明のさらに別の実施態様において、本発明は、タンパク質および１以上の添加剤を含有する水性組成物を提供し、ここで、pHに影響を及ぼす添加剤は、該組成物のpHよりも少なくとも1.5単位高いまたは低いpKaを有する酸または塩基から本質的に成る。
【０１０６】
別の実施態様において、本発明はタンパク質を含有する水性組成物を提供し、ここで、該組成物のpHは、該組成物のpHよりも少なくとも1単位大きいかまたは小さいpKaを有する酸または塩基により本質的に緩衝されるが、但し、１以上の添加剤がヒスチジンを含有する場合、該タンパク質は抗体でない。
【０１０７】
本発明によると、本発明の系または組成物または方法は、ヒトまたは動物の体に施す治療または診断に用いるのに適している。
【０１０８】
別の態様において、本発明は、本発明に従って系または組成物を含有する密閉容器を提供する。
【０１０９】
以下の非限定的な例により、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【０１１０】
以下の実施例は本発明を例示するものである。
【０１１１】
材料
ホウ酸（Ｆｌｕｋａ、Ｃｏｄｅ  １５６６０）
カタラーゼ（ウシ肝臓由来、Ｓｉｇｍａ  Ｃ９３２２、２３８０Ｕ／固形物ｍｇ）
クエン酸（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃｏｄｅ  Ｃ／６２００／５３）
シトシン（Ｓｉｇｍａ、Ｃｏｄｅ  Ｃ３５０６）
脱イオン水（伝導度＜１０μＳｃｍ−１；分析試薬グレード、Ｆｉｓｈｅｒ、またはＳａｎｙｏ  Ｆｉｓｔｒｅｅｍ  ＭｕｌｔｉＰｕｒｅのいずれか）
オルトリン酸水素二ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃｏｄｅ  Ｓ／４５２０／５３）
マレイン酸二ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｃｏｄｅ  Ｍ９００９）
リンゴ酸二ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃｏｄｅ  ２３３９３５）
ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｄｅ１５４９３８−５００）
グルコース（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃｏｄｅ  Ｇ０５００６１）
グルコースオキシダーゼ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  Ｇ５７５Ｐ  約１５０Ｕ／固形物ｍｇ）
Ｂ型肝炎組換えワクチン（Ｓｈａｎｔｈａ）
ヒト成長ホルモン（ソマトロピン）標準品は、国立生物学的製剤研究所（Ｐｏｔｔｅｒｓ  Ｂａｒ、ＵＫ）から供給されたものであった。実験のためのさらなるサンプルは、地域の一般診療所の処方箋で得たものであった。
塩酸（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃｏｄｅ  Ｊ／４３１０／１７）
過酸化水素（Ｓｉｇｍａ、Ｃｏｄｅ  Ｈ１００９）
Ｄ，Ｌ−乳酸（Ｆｌｕｋａ、Ｃｏｄｅ  １０７７１４１）
ラクトペルオキシダーゼ（牛乳由来、ＤＭＶ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ：ＡＢＴＳ法で１０５０単位ｍｇ−１、ｐＨ５．０）
リジン（Ｓｉｇｍａ、Ｃｏｄｅ  Ｌ５５０１）
ニコチン酸（Ｓｉｇｍａ、Ｃｏｄｅ  Ｎ４１２６）
ＰＢＳ−リン酸緩衝生理食塩水（Ｓｉｇｍａ  Ｄ１４０８）
ヨウ化カリウム（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃｏｄｅ  ５８８０／５３）
塩化ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃｏｄｅ  Ｃ／３１６０／６３）
クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｃｏｄｅ  Ｓ１８０４）
水酸化ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃｏｄｅ  Ｊ／７８００／１５）
オルトリン酸二水素ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃｏｄｅ  Ｓ／３７６０／６０）
乳酸ナトリウム（Ｆｌｕｋａ、Ｃｏｄｅ  ７１７２３）
尿酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｃｏｄｅ  Ｕ２８７５）
デンプン（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｃｏｄｅ  １７７１３２５００）
コハク酸（Ｆｌｕｋａ、Ｃｏｄｅ  １４０７９）
ＴＭＢ−テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ  Ｔ−２８８５）
ＴＲＩＳ塩基−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｃｏｄｅ  ＢＰＥ１５２−１）
ウリカーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｃｏｄｅ  Ｕ０８８０）
【０１１２】
別段の記載がない限り、この作業において用いる所与の濃度およびｐＨ（ＸｍＭ、ｐＨＹ）のリン酸バッファーは、所望のｐＨＹとなるようにオルトリン酸水素二ナトリウム（ＸｍＭ）とオルトリン酸二水素ナトリウム（ＸｍＭ）とを混合することで調製した。
【０１１３】
別段の記載がない限り、この作業において用いる所与の濃度およびｐＨ（ＸｍＭ、ｐＨＹ）のクエン酸／リン酸バッファーは、所望のｐＨＹとなるようにオルトリン酸水素二ナトリウム（ＸｍＭ）とクエン酸（ＸｍＭ）とを混合することで調製した。
【０１１４】
全般的な実験計画
各実施例において、所与の酵素の水溶液は、選択された添加剤と共に２ｍＬのガラスバイアル内に調製した。それぞれの溶液をタンパク質活性または構造的完全性についてアッセイした。次にバイアルを封止し、所与の温度で所与の時間にわたりインキュベートした。次に溶液を再びアッセイし、活性または構造的完全性の回復を元の（すなわちプレインキュベーションの）結果のパーセンテージとして表した。周囲よりも高い温度を用いて、周囲温度での作業よりも厳しいものとし、タンパク質の安定性の指標がさらに早く得られるようにした。
【実施例１】
【０１１５】
５９℃でのグルコースオキシダーゼ（アオカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）由来）
グルコースオキシダーゼの安定性を、３５０μｇｍＬ−１の濃度の水溶液において試験した。安定性を、従来のバッファーの存在下および非存在下の両方ならびに置換バッファーの存在下において調製した溶液間で比較した。それぞれのケースにおいて、製剤のｐＨは、その特定の製剤におけるグルコースオキシダーゼの安定性に対して最適であった。安定性は以下の製剤において比較した。
・１０ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ５．４）；クエン酸ナトリウム（１０ｍＭ）とクエン酸（１０ｍＭ）とを混合することで調製し、所望のｐＨとした；グルコースオキシダーゼをこの製剤に加えて３５０μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをグルコースオキシダーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で５．４に調節した。
・１０ｍＭのニコチン酸塩（ｐＨ５．２）；ニコチン酸（１０ｍＭ）を水に溶解し、水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；グルコースオキシダーゼをこの製剤に加えて３５０μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをグルコースオキシダーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で５．２に調節した。
・１０ｍＭの乳酸塩（ｐＨ５．０）；乳酸ナトリウム（１０ｍＭ）と乳酸（１０ｍＭ）とを混合することで調製し、所望のｐＨとした；グルコースオキシダーゼをこの製剤に加えて３５０μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをグルコースオキシダーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で５．０に調節した。
・１０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ５．３）；トリス塩基（１０ｍＭ）を水に溶解し、塩酸（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；グルコースオキシダーゼをこの製剤に加えて３５０μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをグルコースオキシダーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で５．３に調節した。
・１０ｍＭの乳酸塩＋１０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ５．０）；乳酸（１０ｍＭ）およびトリス塩基（１０ｍＭ）を水に溶解し、塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；グルコースオキシダーゼをこの製剤に加えて３５０μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをグルコースオキシダーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で５．０に調節した。
・ニートのタンパク質（ｐＨ４．９）；グルコースオキシダーゼ（３５０μｇｍＬ−１）を水に直接溶解し、塩酸（１０ｍＭ）でｐＨを調節することで調製した。
【０１１６】
溶液を５９℃で２２時間インキュベートし、次に、残っているグルコースオキシダーゼ活性についてアッセイした。これは、以下の手順に従って実施した：５０μＬのサンプル（３５０μｇｍＬ−１のグルコースオキシダーゼを含む）を５０ｍＬの脱イオン水に加えた。次に、以下の試薬を加えた：１０ｍＬの試薬混合物（ｐＨ６の０．１Ｍオルトリン酸二水素ナトリウムを５．５部、および２％ｗ／ｗのデンプンを４部、および１ｍｇ／ｍＬのラクトペルオキシダーゼ酵素を０．５部）；１００ｍＭのヨウ化カリウムを５ｍＬおよび２０％ｗ／ｗのグルコース溶液を５ｍＬ。これらを共に素早く混合した。時間＝０はグルコースの添加からカウントした。５分後、５Ｍの塩酸を１ｍｌ加えて反応を停止させた。次にＵｎｉｃａｍ  ＵＶ可視分光光度計を用いて、吸光度を６３０ｎｍで読み取った。色の強さが、正確な読み取りを可能にするには強すぎる場合、サンプルを所定の容量の脱イオン水で希釈し、色度をスケール上に戻した。結果は、新鮮なサンプルで（すなわち、増大させた温度でのインキュベーションの前）測定した吸光度を基準にしたパーセンテージの回復で表した。
【０１１７】
全ての製剤は、グルコースオキシダーゼの安定性に対するそれらの最適なｐＨで試験した。ニコチン酸塩（ｐＫａ＝４．９０）およびクエン酸塩（ｐＫａ１＝３．１４、ｐＫａ２＝４．７８、ｐＫａ３＝６．３９）を従来のバッファーとして試験し、それらは、５９℃で２２時間のインキュベーションの後に２５％（クエン酸塩）および２３％（ニコチン酸塩）のグルコースオキシダーゼ活性の回復を示した。大幅に高い回復が従来のバッファーの非存在下で見られた。ｐＨ４．９に調節した純水内でタンパク質をインキュベートした場合、回復は約５４％であった。さらに良好な回復が、組成物のｐＨよりも少なくとも１単位高いｐＫａを有する１つの構成要素の存在下で見られた。ＴＲＩＳ（ｐＫａ＝８．３０）の存在下では６８％の回復が得られ、プリン（ｐＫａ＝８．９０）の存在下では７２％の回復が得られた。同様に、良好な安定性が、組成物のｐＨより少なくとも１単位低いｐＫａを有する１つの構成要素の存在下で得られ、乳酸塩（ｐＫａ＝３．８５）の存在下では６９％の回復が得られた。乳酸塩（ｐＫａ＝３．８５）およびＴＲＩＳ（ｐＫａ＝８．３０）を含む、２つの構成要素からなる置換バッファー混合物においては７３％の回復が得られた。したがって、それにより酵素の最良の安定性が得られ、組成物のｐＨの酸性側およびアルカリ性側の両方での緩衝効果によって良好なｐＨの安定性が確実となったことから、２つの構成要素からなる置換バッファー製剤が最適であった。
【実施例２】
【０１１８】
４０℃でのグルコースオキシダーゼ（アオカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）由来）
グルコースオキシダーゼの安定性を、３５０μｇｍＬ−１の濃度の水溶液において試験した。安定性を、従来のバッファーの存在下および非存在下の両方ならびに置換バッファーの存在下において調製した溶液間で比較した。それぞれのケースにおいて、製剤のｐＨは、その特定の製剤におけるグルコースオキシダーゼの安定性に対して最適であった。安定性は以下の製剤において比較した。
・１０ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ５．２）；クエン酸ナトリウム（１０ｍＭ）とクエン酸（１０ｍＭ）とを混合することで調製し、所望のｐＨとした；グルコースオキシダーゼをこの製剤に加えて３５０μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをグルコースオキシダーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で５．２に調節した。
・２００ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ５．０）；クエン酸ナトリウム（２００ｍＭ）とクエン酸（２００ｍＭ）とを混合することで調製し、所望のｐＨとした；グルコースオキシダーゼをこの製剤に加えて３５０μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをグルコースオキシダーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で５．０に調節した。
・１０ｍＭのコハク酸塩（ｐＨ５．２）；コハク酸（１０ｍＭ）を水に溶解し、水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；グルコースオキシダーゼをこの製剤に加えて３５０μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをグルコースオキシダーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で５．２に調節した。
・２００ｍＭのコハク酸塩（ｐＨ５．２）；コハク酸（２００ｍＭ）を水に溶解し、水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；グルコースオキシダーゼをこの製剤に加えて３５０μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをグルコースオキシダーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で５．２に調節した。
・１０ｍＭのニコチン酸塩（ｐＨ５．２）；ニコチン酸（１０ｍＭ）を水に溶解し、水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；グルコースオキシダーゼをこの製剤に加えて３５０μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをグルコースオキシダーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で５．２に調節した。
・１０ｍＭの乳酸塩（ｐＨ４．７）；乳酸ナトリウム（１０ｍＭ）と乳酸（１０ｍＭ）とを混合することで調製し、所望のｐＨとした；グルコースオキシダーゼをこの製剤に加えて３５０μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをグルコースオキシダーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で４．７に調節した。
・２００ｍＭの乳酸塩（ｐＨ４．７）；乳酸ナトリウム（２００ｍＭ）と乳酸（２００ｍＭ）とを混合することで調製し、所望のｐＨとした；グルコースオキシダーゼをこの製剤に加えて３５０μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをグルコースオキシダーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で４．７に調節した。
・１０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ５．０）；トリス塩基（１０ｍＭ）を水に溶解し、塩酸（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；グルコースオキシダーゼをこの製剤に加えて３５０μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをグルコースオキシダーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で５．０に調節した。
・２００ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ５．５）；トリス塩基（２００ｍＭ）を水に溶解し、塩酸（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；グルコースオキシダーゼをこの製剤に加えて３５０μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをグルコースオキシダーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で５．５に調節した。
・１０ｍＭの乳酸塩＋１０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ４．７）；乳酸（１０ｍＭ）およびトリス塩基（１０ｍＭ）を水に溶解し、塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；グルコースオキシダーゼをこの製剤に加えて３５０μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをグルコースオキシダーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で４．７に調節した。
・２００ｍＭの乳酸塩＋２００ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ５．３）；乳酸（２００ｍＭ）およびトリス塩基（２００ｍＭ）を水に溶解し、塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；グルコースオキシダーゼをこの製剤に加えて３５０μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをグルコースオキシダーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で５．３に調節した。
【０１１９】
溶液を４０℃で２６週間インキュベートし、次に、残っているグルコースオキシダーゼ活性についてアッセイした。これは、実施例１に記載した手順に従って実施した。
【０１２０】
全ての製剤は、グルコースオキシダーゼの安定性に対するそれらの最適なｐＨで試験した。ニコチン酸塩（ｐＫａ＝４．９０）、クエン酸塩（ｐＫａ１＝３．１４、ｐＫａ２＝４．７８、ｐＫａ３＝６．３９）、およびコハク酸塩（ｐＫａ１＝４．１６、ｐＫａ２＝５．６１）を従来のバッファーとして試験し、それらは、１０ｍＭの濃度で、４０℃で２６週間のインキュベーションの後に０％（１０ｍＭのクエン酸塩）、５２％（１０ｍＭのニコチン酸塩）、および４７％（１０ｍＭのコハク酸塩）のグルコースオキシダーゼ活性の回復を示した。グルコースオキシダーゼ活性の大幅に高い回復が、従来のバッファーの非存在下および少なくとも１つの置換バッファーの存在下で見られた。回復は、１０ｍＭの乳酸塩（ｐＫａ＝３．８５）の存在下では９１％であり、１０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＫａ＝８．３０）の存在下では７０％であった。ＴＲＩＳ（１０ｍＭ）および乳酸塩（１０ｍＭ）の両方の存在により、９０％の回復が得られた。２００ｍＭの濃度の従来のバッファーでは、回復は以下の通りであった：クエン酸では４６％、コハク酸では５５％。２００ｍＭの置換バッファーでは、回復は以下の通りであった：乳酸塩では７６％、ＴＲＩＳでは９１％、ＴＲＩＳおよび乳酸塩では９２％。したがって、それにより試験した両方の濃度で酵素の最良の安定性が得られ、組成物のｐＨの酸性側およびアルカリ性側の両方での緩衝効果によって良好なｐＨの安定性が確実となったことから、２つの構成要素からなる置換バッファー製剤が最適であった。
【実施例３】
【０１２１】
５２℃でのカタラーゼ（ウシの肝臓由来）
カタラーゼの安定性を、１００μｇｍＬ−１の濃度の水溶液において試験した。安定性を、従来のバッファーの存在下および非存在下の両方ならびに置換バッファーの存在下において調製した溶液間で比較した。それぞれのケースにおいて、製剤のｐＨは、その特定の製剤におけるカタラーゼの安定性に対して最適であった。安定性は以下の製剤において比較した。
・１０ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ６．４）；クエン酸ナトリウム（１０ｍＭ）とクエン酸（１０ｍＭ）とを混合することで調製し、所望のｐＨとした；カタラーゼをこの製剤に加えて１００μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをカタラーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で６．４に調節した。
・１０ｍＭのマレイン酸塩（ｐＨ６．５）；マレイン酸ナトリウム（１０ｍＭ）を水に溶解し、塩酸（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；カタラーゼをこの製剤に加えて１００μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをカタラーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で６．５に調節した。
・１０ｍＭの乳酸塩（ｐＨ６．４）；乳酸ナトリウム（１０ｍＭ）と乳酸（１０ｍＭ）を混合することで調製し、所望のｐＨとした；カタラーゼをこの製剤に加えて１００μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをカタラーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で６．４に調節した。
・１０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ６．７）；トリス塩基（１０ｍＭ）を水に溶解し、塩酸（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；カタラーゼをこの製剤に加えて１００μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをカタラーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で６．７に調節した。
・１０ｍＭの乳酸塩＋１０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ６．９）；乳酸（１０ｍＭ）およびトリス塩基（１０ｍＭ）を水に溶解し、塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；カタラーゼをこの製剤に加えて１００μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをカタラーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で６．９に調節した。
・ニートのタンパク質（ｐＨ６．８）；カタラーゼ（１００μｇｍＬ−１）を水に直接溶解し、塩酸（１０ｍＭ）でｐＨを調節することで調製した。
【０１２２】
溶液を５２℃で４２時間インキュベートし、次に、残っているカタラーゼ活性についてアッセイした。これは、以下の手順に従って実施した：２ｍＬの過酸化水素（水中で３０ｍＭ）を、１２５ｍＬのポリプロピレン製の容器内における１８ｍＬのＰＢＳに加えた。１００μＬのサンプル（１００μｇｍＬ−１のカタラーゼを含む）を加え、混合した。得られた混合物を室温で正確に３０分間インキュベートした。一方、以下の試薬をプラスチック製のキュベット内で混合し、分光光度測定を行った。
・２．７３ｍＬのクエン酸／リン酸バッファー（０．１Ｍ、ｐＨ５．０）
・１００μＬのＴＭＢ（３ｍｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ内に溶解）
・１００μＬのラクトペルオキシダーゼ
【０１２３】
３０分間のインキュベーション時間の後、７０μＬのカタラーゼ含有混合物をキュベットに加え、吸光度を約３０秒で読み取った。結果は、新鮮なサンプルで（すなわち、増大させた温度でのインキュベーションの前）測定した吸光度を基準にしたパーセンテージの回復で表した。
【０１２４】
クエン酸塩（ｐＫａ１＝３．１４、ｐＫａ２＝４．７８、ｐＫａ３＝６．３９）およびマレイン酸塩（ｐＫａ１＝１．８３、ｐＫａ２＝６．２０）を従来のバッファーとして試験し、それらは、５２℃で４２時間のインキュベーションの後に１２％（クエン酸塩）および１３％（マレイン酸塩）のカタラーゼ活性の回復を示した。大幅に向上した安定性が従来のバッファーの非存在下で見られた。ｐＨ６．８に調節したｐＨを有する純水内でタンパク質をインキュベートした場合、回復は約４８％であった。同様の回復が、組成物のｐＨよりも少なくとも１単位高いかまたは１単位低いｐＫａを有する構成要素の存在下で見られた。回復は以下の通りであった：ＴＲＩＳ（ｐＫａ＝８．３０）の存在下では４５％、乳酸塩（ｐＫａ＝３．８５）の存在下では４４％、プリン（ｐＫａ＝８．９％）の存在下では３９％、ＴＲＩＳ（ｐＫａ＝８．３０）および乳酸塩（ｐＫａ＝３．８５）の両方の存在下では４７％。回復は、賦形剤を有さない製剤（すなわち、ｐＨの調節のみを行った水）と置換バッファーを含む製剤との間で同程度であったが、置換バッファーの存在下においてｐＨの制御がより良好であるため、置換バッファーの利用がさらに好ましい。
【実施例４】
【０１２５】
４０℃でのカタラーゼ（ウシ肝臓由来）
カタラーゼの安定性を、１００μｇｍＬ−１の濃度の水溶液において試験した。安定性を、従来のバッファーの存在下および非存在下の両方ならびに置換バッファーの存在下において調製した溶液間で比較した。それぞれのケースにおいて、製剤のｐＨは、その特定の製剤におけるカタラーゼの安定性に対して最適であった。安定性は以下の製剤において比較した（全ての製剤は、酵素の溶解度を向上させるために２００ｍＭのＮａＣｌを含むものであった）：
・１０ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ６．８）；クエン酸ナトリウム（１０ｍＭ）とクエン酸（１０ｍＭ）とを混合することで調製し、所望のｐＨとした；カタラーゼをこの製剤に加えて１００μｇｍＬ−１の濃度とし、塩化ナトリウムを加えて２００ｍＭの濃度とした；ｐＨをカタラーゼおよび塩化ナトリウムの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で６．８に調節した。
・１０ｍＭのマレイン酸塩（ｐＨ６．８）；マレイン酸ナトリウム（１０ｍＭ）を水に溶解し、塩酸（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；カタラーゼをこの製剤に加えて１００μｇｍＬ−１の濃度とし、塩化ナトリウムを加えて２００ｍＭの濃度とした；ｐＨをカタラーゼおよび塩化ナトリウムの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で６．８に調節した。
・１０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ６．８）；リン酸二水素ナトリウム（１０ｍＭ）を水に溶解し、水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；カタラーゼをこの製剤に加えて１００μｇｍＬ−１の濃度とし、塩化ナトリウムを加えて２００ｍＭの濃度とした；ｐＨをカタラーゼおよび塩化ナトリウムの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で６．８に調節した。
・１０ｍＭの乳酸塩（ｐＨ６．４）；乳酸ナトリウム（１０ｍＭ）と乳酸（１０ｍＭ）とを混合することで調製し、所望のｐＨとした；カタラーゼをこの製剤に加えて１００μｇｍＬ−１の濃度とし、塩化ナトリウムを加えて２００ｍＭの濃度とした；ｐＨをカタラーゼおよび塩化ナトリウムの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で６．４に調節した。
・１０ｍＭのプリン（ｐＨ６．４）；プリン（１０ｍＭ）を水に溶解し、塩酸（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；カタラーゼをこの製剤に加えて１００μｇｍＬ−１の濃度とし、塩化ナトリウムを加えて２００ｍＭの濃度とした；ｐＨをカタラーゼおよび塩化ナトリウムの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で６．４に調節した。
・１０ｍＭのリジン（ｐＨ６．６）；リジン（１０ｍＭ）を水に溶解し、塩酸（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；カタラーゼをこの製剤に加えて１００μｇｍＬ−１の濃度とし、塩化ナトリウムを加えて２００ｍＭの濃度とした；ｐＨをカタラーゼおよび塩化ナトリウムの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で６．６に調節した。
・１０ｍＭの乳酸塩＋１０ｍＭのプリン（ｐＨ７．０）；乳酸（１０ｍＭ）およびプリン（１０ｍＭ）を水に溶解し、塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；カタラーゼをこの製剤に加えて１００μｇｍＬ−１の濃度とし、塩化ナトリウムを加えて２００ｍＭの濃度とした；ｐＨをカタラーゼおよび塩化ナトリウムの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で７．０に調節した。
・ニートのタンパク質（ｐＨ６．４）；カタラーゼ（１００μｇｍＬ−１）を２００ｍＭの塩化ナトリウムに直接溶解し、塩酸（１０ｍＭ）でｐＨを調節することで調製した。
【０１２６】
溶液を４０℃で７日間インキュベートし、次に、残っているカタラーゼ活性についてアッセイした。これは、実施例３に記載した手順に従って実施した。
【０１２７】
クエン酸塩（ｐＫａ１＝３．１４、ｐＫａ２＝４．７８、ｐＫａ３＝６．３９）、マレイン酸塩（ｐＫａ１＝１．８３、ｐＫａ２＝６．２０）、およびリン酸塩（ｐＫａ１＝２．１６、ｐＫａ２＝７．１０）を従来のバッファーとして試験し、それらは、４０℃で７日間のインキュベーションの後に４％（クエン酸塩またはマレイン酸塩）および２％（リン酸塩）のカタラーゼ活性の回復を示した。カタラーゼ活性の回復は、従来のバッファーの非存在下（すなわち、ｐＨ６．４に調節した塩化ナトリウム溶液）においても同様に低かった（３％）。大幅に向上した安定性が置換バッファー製剤において見られた。回復は、リジン（ｐＫａ１＝２．２５、ｐＫａ２＝９．２、ｐＫａ３＝１０．８）の存在下では１１％、乳酸塩（ｐＫａ＝３．８５）の存在下では５８％、プリン（ｐＫａ＝８．９０）の存在下では６３％、ならびに乳酸塩およびプリンの両方の存在下では６１％であった。したがって、置換バッファー製剤は、カタラーゼの安定性を確実なものとするための最良の選択肢である。
【実施例５】
【０１２８】
ウリカーゼ
ウリカーゼの安定性を、２５０μｇｍＬ−１の水溶液において試験した。安定性を、従来のバッファーの存在下および非存在下の両方ならびに置換バッファーの存在下において調製した溶液間で比較した。それぞれのケースにおいて、製剤のｐＨは、その特定の製剤におけるウリカーゼの安定性に対して最適であった。安定性は以下の製剤において比較した：
・２０ｍＭのホウ酸塩（ｐＨ８．６）；ホウ酸（boric）（２０ｍＭ）を水に溶解し、水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；ウリカーゼをこの製剤に加えて２５０μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをウリカーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で８．６に調節した。
・２０ｍＭのプリン（ｐＨ８．６）；プリン（２０ｍＭ）を水に溶解し、水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；ウリカーゼをこの製剤に加えて２５０μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをウリカーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で８．６に調節した。
・２０ｍＭのコハク酸塩（ｐＨ８．６）；コハク酸（２０ｍＭ）を水に溶解し、水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；ウリカーゼをこの製剤に加えて２５０μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをウリカーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で８．６に調節した。
・２０ｍＭのシトシン（ｐＨ９．０）；シトシン（２０ｍＭ）を水に溶解し、水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；ウリカーゼをこの製剤に加えて２５０μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをウリカーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で９．０に調節した。
・２０ｍＭのグリシン（ｐＨ９．０）；グリシン（２０ｍＭ）を水に溶解し、塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；ウリカーゼをこの製剤に加えて２５０μｇｍＬ−１の濃度とし、ｐＨをウリカーゼの添加の後に確認し、必要であれば塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）で９．０に調節した。
【０１２９】
溶液を６０℃で１８時間インキュベートし、次に、残っているウリカーゼ活性についてアッセイした。これは、以下の手順に従って実施した：以下の溶液： 
・１．５ｍＬのホウ酸バッファー（２５ｍＭ、ｐＨ８．５）；水酸化ナトリウム（５Ｍ）を用いて２５ｍＭのホウ酸のｐＨを調節することで調製した
・０．８ｍＬの尿酸ナトリウム（２ｍＭ）
を１ｃｍのキュベット内で混合した。
【０１３０】
４０μＬのサンプル（２５０μｇｍＬ−１のウリカーゼを含む）を加え、素早く混合した。時間０＝はウリカーゼの添加からカウントした。５分後、以下の試薬：
・０．８ｍＬのクエン酸／リン酸バッファー（０．５Ｍ、ｐＨ４．０）；０．５Ｍのクエン酸と０．５Ｍのリン酸水素二ナトリウムとを混合して調製し、所望のｐＨとした
・１００μＬのＴＭＢ（３ｍｇｍＬ−１、ＤＭＳＯ内に溶解）
・１００μＬのラクトペルオキシダーゼ（１ｍｇｍＬ−１、水に溶解）
をこの特定の順序で加えた（最初の試薬はちょうど５分の時点で加えられるべきであり、他の試薬の添加のタイミングはそれほど重要なものではない）。
【０１３１】
得られた溶液を完全に混合し、Ｕｎｉｃａｍ  ＵＶ可視分光光度計（タイプ：Ｈｅｌｉｏｓガンマ）を用いて吸光度を６３０ｎｍで読み取った。結果は、新鮮なサンプルで（すなわち、増大させた温度でのインキュベーションの前）測定した吸光度を基準にしたパーセンテージの回復で表した。
【０１３２】
ホウ酸塩（ｐＫａ＝９．２７）およびプリン（ｐＫａ＝８．９０）を従来のバッファーとして試験し、それらは、６０℃で１８時間のインキュベーションの後に４８％（ホウ酸塩）および５２％（プリン）のウリカーゼの最大の回復を示した。ウリカーゼの良好な安定性が従来のバッファーの非存在下および置換バッファーの存在下で見られた。回復は、コハク酸塩（ｐＫａ１＝４．１６、ｐＫａ２＝５．５１）の存在下では７２％であり、グリシン（ｐＫａ１＝２．４３、ｐＫａ２＝９．８４）の存在下では６４％であり、シトシン（ｐＫａ１＝４．５、ｐＫａ２＝１２．２）の存在下では７８％であった。したがって、置換バッファーの使用は、ウリカーゼの安定性を確実なものとするために最適である。
【実施例６】
【０１３３】
Ｂ型肝炎組換えワクチン
Ｂ型肝炎組換えワクチンの安定性を、適切なアジュバント（水酸化アルミニウム懸濁液）の存在下で、２０μｇｍＬ−１のタンパク質および０．５ｍｇｍＬ−１の水酸化アルミニウムの水溶液において試験した。これらの濃度は、市販のワクチン製品におけるものと同一である。安定性を、従来のバッファーの存在下および置換バッファーの存在下において調製した溶液間で比較した。それぞれのケースにおいて、製剤のｐＨは、その特定の製剤におけるＢ型肝炎抗原の安定性に対して最適であった。安定性は以下の製剤において比較した（全ての製剤は、アルミナへのワクチンの最適な結合を確実にするために４０ｍＭのリン酸ナトリウムを含むものであった）：
・４０ｍＭのコハク酸塩（ｐＨ５．０）；コハク酸（４０ｍＭ）とリン酸二水素ナトリウム（４０ｍＭ）とを水に溶解し、塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；水酸化アルミニウムアジュバントに吸着したＢ型肝炎抗原を製剤に加えて、製剤において２０μｇｍＬ−１のタンパク質および０．５ｍｇｍＬ−１の水酸化アルミニウムとした。
・１０ｍＭのリンゴ酸塩（ｐＨ５．０）；リンゴ酸ナトリウム（４０ｍＭ）とリン酸二水素ナトリウム（４０ｍＭ）とを水に溶解し、塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；水酸化アルミニウムアジュバントに吸着したＢ型肝炎抗原を製剤に加えて、製剤において２０μｇｍＬ−１のタンパク質および０．５ｍｇｍＬ−１の水酸化アルミニウムとした。
・４０ｍＭの乳酸塩（ｐＨ５．０）；乳酸ナトリウム（４０ｍＭ）およびリン酸二水素ナトリウム（４０ｍＭ）を水に溶解し、塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；水酸化アルミニウムアジュバントに吸着したＢ型肝炎抗原を製剤に加えて、製剤において２０μｇｍＬ−１のタンパク質および０．５ｍｇｍＬ−１の水酸化アルミニウムとした。
・４０ｍＭの乳酸塩＋４０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ５．０）；乳酸（４０ｍＭ）、トリス塩基（４０ｍＭ）、およびリン酸二水素ナトリウム（４０ｍＭ）を水に溶解し、塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；水酸化アルミニウムアジュバントに吸着したＢ型肝炎抗原を製剤に加えて、製剤において２０μｇｍＬ−１のタンパク質および０．５ｍｇｍＬ−１の水酸化アルミニウムとした。
・４０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ５．０）；ヒスチジン（４０ｍＭ）およびリン酸二水素ナトリウム（４０ｍＭ）を水に溶解し、塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；水酸化アルミニウムアジュバントに吸着したＢ型肝炎抗原を製剤に加えて、製剤において２０μｇｍＬ−１のタンパク質および０．５ｍｇｍＬ−１の水酸化アルミニウムとした。
【０１３４】
溶液を５５℃で４週間インキュベートし、次に、残っている抗原活性についてアッセイした。Ｂ型肝炎ワクチンの抗原活性は、ＡＵＳＺＹＭＥモノクローナル診断キット（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ｃａｔ  ｎｏ．１９８０−６４）を用いて測定した。抗原活性は、全ワクチンおよび遠心分離（１３０００ＲＰＭ、５分間）の後の上清の両方において測定した。抗原活性は、未処理の冷蔵保存したワクチンの測定値を基準にしたパーセンテージとして表した。
【０１３５】
コハク酸塩（ｐＫａ１＝４．１６、ｐＫａ２＝５．５１）およびリンゴ酸塩（ｐＫａ１＝３．４０、ｐＫａ２＝５．１１）を従来のバッファーとして試験し、それらは、５５℃で４週間のインキュベーションの後に６４％（コハク酸塩）および５７％（リンゴ酸塩）のＢ型肝炎抗原の最大の回復を示した。非常に良好な安定性が置換バッファーの存在下で見られ、ＴＲＩＳ（ｐＫａ＝８．１０）の存在下では８８％、乳酸塩（ｐＫａ＝３．８５）の存在下では９１％、ＴＲＩＳおよび乳酸塩の組み合わされた存在下では９３％、ならびに、ヒスチジン（ｐＫａ１＝１．７８、ｐＫａ２＝６．１０、ｐＫａ３＝９．２６）の存在下では９８％であった。
【実施例７】
【０１３６】
ヒト成長ホルモン
ヒト成長ホルモンの安定性を、１．２５ｍｇｍＬ−１の水溶液において試験した。安定性を、従来のバッファーの存在下および置換バッファーの存在下の両方において調製した溶液間で比較した。それぞれのケースにおいて、製剤のｐＨは、その特定の製剤におけるヒト成長ホルモンの安定性に対して最適であった。安定性は以下の製剤において比較した。
・２０ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ６．０）；クエン酸（２０ｍＭ）とクエン酸ナトリウムとを混合することで調製し、所望のｐＨとした；ヒト成長ホルモンをこの製剤に加えて１．２５ｍｇｍＬ−１の濃度とした。
・２０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ６．０）；トリス塩基（２０ｍＭ）を水に溶解し、塩酸（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；ヒト成長ホルモンをこの製剤に加えて１．２５ｍｇｍＬ−１の濃度とした。
・２０ｍＭの乳酸塩（ｐＨ６．０）；乳酸ナトリウム（１０ｍＭ）と乳酸（１０ｍＭ）とを混合することで調製し、所望のｐＨとした；ヒト成長ホルモンをこの製剤に加えて１．２５ｍｇｍＬ−１の濃度とした。
・２０ｍＭの乳酸塩＋２０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ６．０）；乳酸（２０ｍＭ）およびトリス塩基（２０ｍＭ）を水に溶解し、塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；ヒト成長ホルモンをこの製剤に加えて１．２５ｍｇｍＬ−１の濃度とした。
・２０ｍＭのシトシン（ｐＨ６．０）；シトシン（２０ｍＭ）を水に溶解し、水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；ヒト成長ホルモンをこの製剤に加えて１．２５ｍｇｍＬ−１の濃度とした。
・２０ｍＭのプリン（ｐＨ６．０）；プリン（２０ｍＭ）を水に溶解し、塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；ヒト成長ホルモンをこの製剤に加えて１．２５ｍｇｍＬ−１の濃度とした。
・１０ｍＭのシトシン＋１０ｍＭのプリン（ｐＨ６．０）；シトシン（１０ｍＭ）およびプリン（１０ｍＭ）を共溶解し、水酸化ナトリウム（５Ｍ）でｐＨを調節することで調製した；ヒト成長ホルモンをこの製剤に加えて１．２５ｍｇｍＬ−１の濃度とした。
【０１３７】
溶液を４０℃で５週間インキュベートし、次に、残っている無傷タンパク質について、以下の逆相ＨＰＬＣ法を用いてアッセイした：移動相は、７１部（容積で）のＴＲＩＳ溶液（塩酸でｐＨ７．５に調節した水中で０．０５Ｍ）および２９部（容積で）のｎ−プロピルアルコールを混合することにより調製した。移動相は使用する前に濾過した。液体クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ）は、２１４ｎｍの検出器、および４５℃に維持された、５μｍの粒度と３０ｎｍの細孔とを有するブチルシリルシリカゲルが充填された４．６×２５０ｍｍのカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ００Ｇ−４１６７−Ｅ０）を備えているものであった。流量は０．５ｍＬ分−１に維持した。１５μＬのヒト成長ホルモンの水性サンプル（典型的には１〜２．５ｍｇｍＬ−１）を注入した。
【０１３８】
クエン酸塩（ｐＫａ１＝３．１４、ｐＫａ２＝４．７８、ｐＫａ３＝６．３９）を従来のバッファーとして試験し、それは、４０℃で５週間のインキュベーションの後に５％のヒト成長ホルモンの構造の回復を示した。ヒト成長ホルモンの非常に良好な回復が置換バッファーの存在下で見られ、ＴＲＩＳ（ｐＫａ＝８．１０）の存在下では３９．８％、乳酸塩（ｐＫａ＝３．８５）の存在下では３８．２％、ＴＲＩＳおよび乳酸塩の存在下では４２．２％、シトシン（ｐＫａ１＝４．５、ｐＫａ２＝１２．２）の存在下では５１．３％、プリン（ｐＫａ＝８．９０）の存在下では４９．１％、ならびに、プリンおよびシトシンの存在下では４８．１％であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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