(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水膨潤性ラポナイトを水に分散してゲル化させたクレイヒドロゲルからなる細胞培養基材において、
前記クレイヒドロゲル中の水膨潤性ラポナイトの含有量が、水に対する質量比で０．０１〜０．３の範囲であり、且つ
前記クレイヒドロゲル中に、アルブミン、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸の配列からなるトリペプチド、ヒアルロン酸、ヘパリン及びコラーゲンの中から選択される一種の水溶性有機化合物を含有することを特徴とする細胞培養基材。
【請求項２】
厚み１０ｍｍでの波長６００ｎｍの光の透過率が、８０％以上である請求項１記載の細胞培養基材。
【請求項３】
前記水膨潤性ラポナイトが、一次粒子径が５００ｎｍ以下の合成ラポナイトである請求項１又は２のいずれかに記載の細胞培養基材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水膨潤性ヘクトライトを水に分散してゲル化させたクレイヒドロゲルからなる細胞培養基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、動物組織等の細胞培養基材としては、プラスチック（例：ポリスチレン）やガラスの容器が使用されてきた。これら容器は、細胞培養を有効に行わせるために、その表面にプラズマ処理や、シリコンや細胞接着因子等のコーティングなどの表面処理が施されている。従って、これら細胞培養容器を培養基材として用いた場合には、培養・増殖した細胞が表面処理された容器表面に接着しており、細胞を単離・回収するためには、トリプシン等のタンパク質加水分解酵素や化学薬品を用いて、容器表面から剥離する必要があった。このような酵素や化学薬品により細胞を剥離する操作は工程が煩雑であるほか、雑菌やＤＮＡあるいはＲＮＡ等の不純物が混入する恐れがあった。さらに培養細胞をさらに利用するには損傷を受けない細胞剥離を行う必要があったが、酵素や化学薬品による剥離では、細胞自身が損傷を受けてしまう問題があった。
【０００３】
また、細胞培養容器の表面に温度応答性ポリマーを極薄くコーティングした基材を使用して、細胞培養温度でポリマーを疎水性状態に保持して細胞を接着させ、培養後にポリマーを低温処理して親水性状態にすることにより、細胞とポリマーとの接着性を低下させ、細胞を加水分解酵素や化学薬品を使用することなしに基材から細胞をシート状に剥離するという技術が報告されている（例えば特許文献２及び３参照）。しかしながら、上記基材はポリマーを親水性にするために長時間を要する問題があり、且つ、その間、細胞も低温状態に曝される問題があった。
【０００４】
一方、培養した細胞を細胞培養基材から剥離する際には、基材表面が親水性の状態であると剥離が容易となるため、細胞培養に用いられるプラスチック容器に様々な有機ポリマーや無機化合物を溶液状態またはゲル状態で賦型したものが細胞培養基材として検討されている。しかし、一般に細胞培養基材表面が親水性の表面であると、細胞培養特性、特に動物組織細胞培養の特性が十分に得らない傾向があった。なかでも、特許文献１では、合成無機高分子として合成サポナイトを用いた人工培地が提案されているが、動物組織細胞の培養特性は十分でなかった。また人工培地の透明性が、培養中に顕微鏡観察により、培養細胞の状態を観察するためには不十分であった。
【０００５】
【特許文献１】特開平９−３２７２８６公報
【特許文献２】特公平６−１０４０６１公報
【特許文献３】特開平５−１９２１３８公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、高い透明性と優れた細胞培養特性を有し、且つ基材を混入させず、細胞に損傷を与えない条件下での培養細胞の分離回収が可能な細胞培養基材、及び培養した細胞の回収が容易な細胞培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明においては、水膨潤性ヘクトライトを水に分散してゲル化させたクレイヒドロゲルであって前記クレイヒドロゲル中の水膨潤性ヘクトライトの含有量が、水に対する質量比で０．０１〜０．３の範囲であるクレイヒドロゲルが、親水性の培養表面を有しながらも、良好な細胞培養特性と高い透明性を実現できることを見出し、上記課題を解決した。
【発明の効果】
【０００８】
本発明において使用する細胞培養基材は、その表面が細胞培養に好適な状態であるため、優れた細胞培養特性を示す。また透明性が高いことにより、培養中の細胞観察を容易に行うことが出来る。さらに、培養・増殖させた細胞を長時間低温に曝したり、酵素や化学薬品による培養細胞の剥離工程を行うことによる培養細胞の破損や、薬品の混入を生じることなく、容易かつ迅速に剥離回収することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の細胞培養基材は、水膨潤性ヘクトライトを水に分散してゲル化させたクレイヒドロゲルからなるものである。
【００１０】
本発明の細胞培養基材に用いられる水膨潤性ヘクトライトは、水又は水溶液中で層間が膨潤する性質を有する合成無機粘土鉱物である。該水膨潤性ヘクトライトは水中に分散した状態を保持することによりゲル化し、クレイヒドロゲルとなる。該クレイヒドロゲルは、少なくとも一部が水中で層状に剥離して分散した状態のものが好ましく、更に好ましくは水中で１ないし１０層以内の厚みに、特に好ましくは水中で１ないし３層以内の厚みに層状に剥離して均一分散したものが用いられる。
【００１１】
本発明に用いられる水膨潤性ヘクトライトは、特にその製法や、大きさに特に限定はされないが、一般に合成ヘクトライトは天然ヘクトライトよりも純度が高く、また一次粒子径も比較的均一であるため、好ましく用いられる。また該水膨潤性ヘクトライトの一次粒子径は、クレイヒドロゲルを形成し、細胞培養基材として利用できるものであれば特に限定されないが、好ましくは５００ｎｍ以下、より好ましくは３００ｎｍ以下、さらに好ましくは１００ｎｍ以下のものが用いられる。一次粒子径が５００ｎｍ以下であれば、水に対する分散性が良好であることから、透明性の高いクレイヒドロゲルが得られ、また細胞培養特性も良好なものとなる。
【００１２】
本発明において細胞培養基材に用いられるクレイヒドロゲルは水を含有する。該水は口述する水溶性有機化合物が溶解したものであってよい。水の量は、一般にクレイヒドロゲルを形成できる量であればよく、目的に応じて適宜調整すればよい。なかでも、合成ヘクトライトの溶媒に対する質量比が０．０１〜０．３のものは、細胞培養に適した優れたゲルの安定性と、高い透明性を有するため好ましく、０．０２〜０．２のものはさらに好ましい。
【００１３】
本発明に用いられるクレイヒドロゲルは、細胞培養を行う際に、顕微鏡観察により細胞の接着・伸展程度を観察するために、可視光透過性の高いことが求められる。その程度は、顕微鏡による観察で細胞の状態を確認できれば特に規定されないが、好ましくは、波長６００ｎｍの可視光に対する透過率が８０％以上であるものが用いられ、より好ましくは９０％以上のものが用いられる。波長６００ｎｍの可視光に対する透過率が８０％以上であると、顕微鏡観察における細胞の状態の確認が容易となる。
【００１４】
また、本発明の細胞培養基材に用いられるクレイヒドロゲルには、水溶性有機化合物を含有させることが出来る。水溶性有機化合物の種類としては、クレイヒドロゲルを形成し、細胞培養特性を阻害しない限り特に限定されるものではないが、例としては、細胞増殖因子やアルブミン等のタンパク質、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸の配列からなるトリペプチド等のペプチド類、ヒアルロン酸やヘパリン等の糖類及び多糖類、コラーゲン等の糖タンパク質などが挙げられる。これらの有機化合物は、特にクレイヒドロゲル中の濃度が制限されることはなく、クレイヒドロゲルが高い光透過率を保つ範囲において、クレイヒドロゲル中に含有させることが出来る。
【００１５】
本発明の細胞培養基材に用いられるクレイヒドロゲルに対する水溶性有機化合物の導入方法としては、特に限定はされないが、好ましくはクレイヒドロゲルを形成後、表面から水溶性有機化合物を含浸又は吸着によりクレイヒドロゲルの上部のみに導入させることが挙げられる。
【００１６】
本発明の細胞培養基材を使用して培養を行うことが可能な細胞は、ヒト及び動物の組織細胞であれば特に制限はなく、例えば、血管細胞、繊維芽細胞、筋肉細胞、神経細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、肝細胞、膵臓細胞、角膜細胞などが挙げられる。これらのうち、血管内皮細胞、皮膚繊維芽細胞、肝実質細胞、肝ガン細胞、軟骨細胞等好ましく用いられる。
【００１７】
本発明の細胞培養基材の製造方法としては、例えば、合成ヘクトライトを水中に撹拌しながら加えることで、均一分散液を得ることが出来る。撹拌は、特に温度の制限はなく、例えば０℃〜１００℃の範囲に設定して行うことが出来る。得られた均一分散液をポリスチレン製の組織培養ディッシュ等に賦型することにより、組織培養ディッシュ内に層状のクレイヒドロゲルを得ることが出来、そのままで細胞培養基材として使用することができる。
【００１８】
本発明の細胞培養基材は、得られたクレイヒドロゲル材料を慣用の方法で乾燥し、溶媒の一部もしくは全部を除去して乾燥物として得ることもできる。かかる乾燥物は、そのまま培養基材として使用することが可能である。また、クレイヒドロゲルの乾燥物に水または水と混和する有機溶媒などの溶媒を再び含ませることにより、可逆的に細胞培養基材としてのクレイヒドロゲルを再生することが出来る。
【００１９】
また、本発明の細胞培養基材に用いられるクレイヒドロゲルには、本発明の効果を損なわない範囲で添加剤として、無機化合物等の高分子化合物または低分子化合物を含有させたものが含まれる。例えば、ヒドロキシアパタイト粒子やシリカ粒子などを添加することができる。
【００２０】
本発明の細胞培養基材は、親水性の高い表面で細胞培養を行うことが特徴であり、そのため培養細胞の培養基材への接着性は強固ではない。このため、該クレイヒドロゲルからなる細胞培養基材は細胞を培養した後、培養した細胞の破壊や不純物の混入を生じることなく、培養した細胞を容易かつ迅速に剥離回収することができる。培養細胞の培養基材からの剥離は、培養基材表面上の培地を掬い取って、また培養基材に戻すというピペッティング操作を繰り返したり、培養基材に対して、細胞培養後、軽く振動を与え、クレイヒドロゲルの構造を崩してしまう方法などによって、剥離用の酵素や化学薬品等を使用することなく容易に行うことが出来る。これら剥離の際には、低温処理等の必要が無いため、細胞の生存に適した温度下で剥離することが可能である。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲がこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００２２】
（比較例１）
粘土鉱物として、［Ｍｇ５．３４Ｌｉ０．６６Ｓｉ８Ｏ２０（ＯＨ）４］Ｎａ＋０．６６の組成を有する水膨潤性合成ヘクトライト（Ｒｏｃｋｗｏｏｄ  Ｌｔｄ．製「ラポナイトＸＬＧ」）を真空乾燥して用いた。超純水は、全て微粒子除去用フィルターを通した高純度窒素をあらかじめ充分にバブリングさせ、含有酸素を除去してから使用した。
【００２３】
２０℃の恒温室において、平底ガラス容器に超純水５０ｇとテフロン（登録商標）製攪拌子を入れ、攪拌しながら１．２ｇのラポナイトＸＬＧを加え、無色透明の分散液を調製した。その分散液をポリスチレン製細胞培養用ディッシュ（ベクトン・ディッキンソン・ラブウェア社製「ファルコン３００３」）２枚の中に移し替えてから蓋をして３７℃で静置した。また残りの分散液を１辺が１ｃｍの透明なプラスチック製キュベットに移し替え、蓋をしてから３７℃で静置した。なお、これらの操作は全てクリーンベンチ内にて行った。静置してから１０時間後に、２枚のポリスチレン製ディッシュ内、及びプラスチック製キュベット内にほぼ無色透明で均一なクレイヒドロゲル（Ａ）が得られた。
【００２４】
プラスチック製キュベットに生成したクレイヒドロゲル（Ａ）について、紫外可視分光光度計（日本分光株式会社製Ｖ−５３０）を用いて光透過率測定を行った。その結果、６００ｎｍ波長で９７％という高い光透過率であることが確認された。
【００２５】
このようにしてクレイヒドロゲル（Ａ）が生成したポリスチレン製ディッシュ（以下細胞培養基材（Ａ）とする）２枚を用いて、細胞の培養を行った。培養する細胞は、ヒト肝上皮細胞由来のガン細胞ＨｅｐＧ２細胞株（大日本製薬株式会社製）を使用した。培養は、ウシ胎児血清（ＩＣＮ製）を１０％含有するミニマム・エッセンシャル・イーグル培地（ＳＩＧＭＡ製）（ピルビン酸（ＩＣＮ製）及び非必須アミノ酸（ＩＣＮ製）を添加剤として含有）を使用して、５％二酸化炭素含有３７℃恒温器内で行った。また、２枚のディッシュには全く同じ条件で細胞の播種を行った。細胞を含む培地の播種量は１０ｍｌとした。播種してから１週間後、これらの細胞培養基材（Ａ）の表面を光学顕微鏡にて観察したところ、細胞が細胞培養基材（Ａ）上に接着して、また十分に増殖していた様子が鮮明に確認することが出来た。この培養を行った１枚の細胞培養基材（Ａ）に、あらかじめ３７℃に加温しておいた、ウシ胎児血清を１０％含有するミニマム・エッセンシャル・イーグル培地を１０ｍｌ加え、プラスチック製ピペットで、ディッシュ内の培地を少量掬い取ってからまたディッシュに戻す操作（ピペッティング）を数回繰り返すことにより、細胞培養基材（Ａ）上に増殖した細胞が徐々に剥離して、培地中に浮遊するようになった。このように、酵素や化学薬品等を使用せず、また、細胞を低温状態に長時間曝したり、細胞を損傷させたりすることなく、細胞培養基材（Ａ）から分離することができた。この時、分離した細胞にはクレイ等の付着物は見られなかった。また、もう１枚のディッシュで培養した細胞について、トリプシン−ＥＤＴＡ処理を行うことにより、各細胞を個々の状態に分離した後、トリパンブルー染色を行うことによって、生細胞数を計測したところ、培養開始時には２．０×１０６個であった細胞数が、培養後は３．８×１０７個に増加したことが確認された。
【００２６】
（比較例２）
添加するラポナイトＸＬＧの量を１．６ｇとすること以外は、比較例１と同様にして、クレイヒドロゲル（Ｂ）を得た。このクレイヒドロゲル（Ｂ）の光透過率を比較例１と同様の方法で測定したところ、９５％という高い光透過率であることが確認された。
【００２７】
このようにして得られたクレイヒドロゲル（Ｂ）を含む細胞培養基材（Ｂ）を用いて、比較例１と同様の方法で細胞培養実験を行った。培養開始から１週間後に比較例１と同様の方法で細胞の剥離を行ったところ、比較例１と全く同じように、細胞培養基材（Ｂ）から、細胞を分離することが可能であった。また比較例１と同様の方法で、培養した細胞数の計測を行ったところ、培養開始時には２．０×１０６個であった細胞数が、培養後は３．１×１０７個に増加したことが確認された。
【００２８】
（実施例１）
比較例１と同様の方法で得られたクレイヒドロゲル（Ａ）の入った細胞培養基材（Ａ）に対して、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸の配列を持つトリペプチド（ＲＧＤ、株式会社ペプチド研究所製）水溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）を２ｍｌ静かに滴下して、そのままクリーンベンチ内に静置した。２４時間後に細胞培養基材（Ａ）がＲＧＤ水溶液をすべて吸収して、ＲＧＤ含有ヒドロゲルからなる細胞培養基材（Ａ’）を得た。得られた細胞培養基材（Ａ’）の光透過率は、上記水溶液の滴下前後で変化は無かった。この細胞培養基材（Ａ’）を使用して、実施例１と同様の方法を用いて細胞培養実験を行った。培養開始から１週間後に比較例１と同様の方法で細胞の剥離を行ったところ、比較例１と全く同じように、細胞培養基材（Ａ’）から、細胞を分離することが可能であった。また比較例１と同様の方法で、培養した細胞数の計測を行ったところ、培養開始時には２．０×１０６個であった細胞数が、培養後は８．８×１０７個に増加したことが確認された。
【００２９】
（比較例３）
細胞培養用ディッシュ「ファルコン３００３」を何も表面処理を行わずに使用して、細胞培養を行った。細胞及び培地、培養条件は比較例１と同様にして行った。培養開始から１週間後にディッシュ表面を光学顕微鏡にて観察したところ、細胞が接着して増殖していることが確認された。この培養を行ったディッシュを２０℃の恒温槽に入れて、１０分間静置した。培養後、培養した細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ処理を行うことにより、各細胞を個々の状態に分離した後、トリパンブルー染色を行うことによって、生細胞数を計測したところ、培養開始時には２．０×１０６個であった細胞数が、培養後は４．０×１０７個に増加していることが確認されたが、該酵素を使用しない比較例１と同様の剥離方法によっては、ディッシュ上の細胞は全く剥離しなかった。
【００３０】
（比較例４）
粘土鉱物として、合成サポナイト（クニミネ工業（株）製「スメクトンＳＡ」）を０．９６ｇ用いる他は、比較例１と同様にしてクレイヒドロゲル（Ｃ）を作成した。平底ガラス内に得られたやや白色がかったクレイヒドロゲル（Ｃ）の光透過率を比較例１と同様の方法で測定したところ、６４％であった。次に、このクレイヒドロゲル（Ｃ）の入った細胞培養基材（Ｃ）１枚を用いて、比較例１と同様の方法で細胞培養を行った。培養開始から１週間後、これらの細胞培養基材（Ｃ）の表面を光学顕微鏡にて観察したところ、透明性が不十分で細胞が細胞培養基材（Ｃ）上に接着・増殖していることを確認するのは困難であった。また、もう１枚のディッシュで培養した細胞について、トリプシン−ＥＤＴＡ処理を行うことにより、各細胞を個々の状態に分離した後、トリパンブルー染色を行うことによって、生細胞数を計測したところ、培養開始時には２．０×１０６個であった細胞数が、培養後は２．９×１０６個とほとんど増加は認められなかった。
【００３１】
（比較例５）
粘土鉱物として、スメクトンＳＡを１．６ｇ添加すること以外は比較例１と同様にしてクレイヒドロゲル（Ｄ）を作成した。この時、撹拌中にかなりスメクトンＳＡの分散液が増粘し、撹拌を十分に行うことが出来なかった。その結果、平底ガラス内にはかなり白色がかったクレイヒドロゲル（Ｄ）が得られた。このクレイヒドロゲル（Ｄ）の光透過率を比較例１と同様の方法で測定したところ、３８％であった。次に、このクレイヒドロゲル（Ｄ）の入った細胞培養基材（Ｄ）１枚を用いて、比較例１と同様の方法で細胞培養を行った。培養開始から１週間後、これらの細胞培養基材（Ｄ）の表面を光学顕微鏡にて観察したところ、透明性が不十分で細胞が細胞培養基材（Ｄ）上に接着・増殖していることを確認するのは困難であった。また、もう１枚のディッシュで培養した細胞について、トリプシン−ＥＤＴＡ処理を行うことにより、各細胞を個々の状態に分離した後、トリパンブルー染色を行うことによって、生細胞数を計測したところ、培養開始時には２．０×１０６個であった細胞数が、培養後はほとんど存在が確認されなかった。
【００３２】
【表１】
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