(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
R125MおよびR127Lの変異を有する変異型proBDNF遺伝子が導入され、proBDNFからBDNFへの変換が抑制され、行動異常を示す非ヒトノックイン動物。
【請求項２】
前記変異型proBDNF遺伝子が配列番号３で表される塩基配列又はその相補鎖を有する、請
求項１記載の非ヒトノックイン動物。
【請求項３】
前記行動異常が足のもつれもしくは歩行中の転倒である請求項１または２に記載の非ヒトノックイン動物。
【請求項４】
前記動物がマウスである、請求項１，２または３に記載の非ヒトノックイン動物。
【請求項５】
R125MおよびR127Lの変異を有する変異型proBDNF遺伝子の、行動異常を示す非ヒトノック
イン動物を作製するための使用。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の非ヒトノックイン動物に薬物候補物質を投与することを特徴とする、行動異常及び心的疾患からなる群から選ばれる少なくとも1種の疾患に対す
る薬物のスクリーニング方法。
【請求項７】
疾患が、小脳、前庭、内耳の異常、筋力の低下に基づく疾患、癲癇、学習障害，ＡＤＨＤ（注意欠陥／多動性障害）、高機能自閉症、強迫性障害、統合失調症、広汎性発達障害（PDD）、拒食症、認知症、睡眠障害、パニック障害、神経症、そう病、うつ病、双極性障
害、心身症、不安、緊張からなる群から選ばれる少なくとも1種である、請求項６に記載
の方法。
【請求項８】
proBDNF遺伝子変異に伴いその発現量が野生型動物に対して2倍以上増加又は減少する少なくとも1種の遺伝子の発現量が、薬物候補化合物の投与により野生型に近づくか否かを指
標として薬物候補化合物の有効性を判定することを特徴とする、請求項６又は７に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非ヒトノックイン動物、特に生体のプロテアーゼの切断によるBDNFの前躯体(proBDNF)から成熟型(BDNF)への変換が阻害／抑制された非ヒトノックイン動物、該動物
を製造する方法、該動物を製造するためのベクター、並びに行動異常、神経系疾患などに対する薬物をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経系には神経細胞の生存を促進する蛋白質「神経栄養因子」と神経細胞の死を促進する「神経細胞死促進因子」が存在している。前者の代表は神経栄養因子BDNF（Brain-derived neurotrophic factor）であり、１９９０年代から研究が進んでいる（例えば、特許
文献１参照）。しかしながら、後者についての研究は進んでいない。
【特許文献１】特開平05-328974号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者は、神経細胞死促進因子の機能を解明するために、神経細胞死促進因子が導入された非ヒトノックイン動物を提供することを目的とする。
【０００４】
また、該非ヒトノックイン動物を用いて、神経細胞死促進因子に起因した疾患を治療するための薬物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、神経栄養因子であるBDNFに変異を導入すると、proBDNFから成熟型BDNFへ
の変換（成熟）を抑制することができ、該変異型proBDNFが神経細胞死促進因子として機
能することを見出した。
【０００６】
この成熟型BDNFへの変換が抑制された変異型proBDNF遺伝子を導入した非ヒトノックイ
ン動物は、足のもつれや歩行中に転倒するなどの特徴的な行動異常、オープンフィールドにおける顕著な活動量の増大を示し、行動異常、心的疾患／神経系疾患を発症するモデル動物として有用であることを見出した。
【０００７】
本発明は、以下の非ヒトノックイン動物、該動物を製造するためのベクター、並びに薬物のスクリーニング方法に関する。
１．   proBDNF遺伝子に変異を有する非ヒトノックイン動物であって、該変異によってproBDNFからBDNFへの変換が抑制されている、非ヒトノックイン動物。
２．  変異を有する前記proBDNF遺伝子が、以下の(a)〜(c)のいずれかである、項1に記載の非ヒトノックイン動物：
(a)配列番号３で表される塩基配列又はその相補鎖からなるDNA
(b)配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつ、BDNFへの変換が抑制されたproBDNFをコードするDNA
(c)配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が置換、付加
、欠失又は挿入され、かつ、proBDNFからBDNFへの変換が抑制されているアミノ酸配列を
コードするDNA
３．   前記動物がマウスである、項１記載の非ヒトノックイン動物。
4．  proBDNF遺伝子の125位及び/又は127位が変異されている項１から3のいずれかに記載の非ヒトノックイン動物。
5．  変異型proBDNFが、R125MおよびR127Lの変異を有する、項4に記載の非ヒトノックイ
ン動物。
6．  proBDNFからBDNFへの変換が抑制されている変異型proBDNF遺伝子の、非ヒトノック
イン動物を作製するための使用。
7．  proBDNFからBDNFへの変換が抑制された変異型proBDNF遺伝子を有する非ヒトノック
イン動物作製用ベクター。
8．  変異型proBDNF遺伝子がlongとshortに挟まれた位置に挿入されている項7に記載のベクター。
9．  項１〜5のいずれかに記載の非ヒトノックイン動物に薬物候補物質を投与することを特徴とする、行動異常及び心的疾患からなる群から選ばれる少なくとも1種の疾患に対す
る薬物のスクリーニング方法。
10．  疾患が、小脳、前庭、内耳の異常、筋力の低下に基づく疾患、癲癇、学習障害，ＡＤＨＤ（注意欠陥／多動性障害）、高機能自閉症、強迫性障害、統合失調症、広汎性発達障害（PDD）、拒食症、認知症、睡眠障害、パニック障害、神経症、そう病、うつ病、双
極性障害、心身症、不安、緊張からなる群から選ばれる少なくとも1種である、項9に記載の方法。
11．  proBDNF遺伝子変異に伴いその発現量が野生型動物に対して2倍以上増加又は減少する少なくとも1種の遺伝子の発現量が、薬物候補化合物の投与により野生型に近づくか否
かを指標として薬物候補化合物の有効性を判定することを特徴とする、項9又は10に記載
のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００８】
プロセッシングによる活性化を受けないproBDNF誘導体の遺伝子を導入した非ヒトノッ
クイン動物が、歩行しようとすると回転する、よろめいた歩行、ひっくり返って足をばたばたさせる、姿勢における下半身の低下などの特徴的な表現型を発現した。また、オープンフィールドにおいて、野生型マウスに対して顕著な過活動を示し、暗期（夜間）、特に明期から暗期に移行後数時間の活動量が増大した。さらに、テールサスペンジョンテストにおいて無動時間が野生型マウスに対して有意に延長され、抑鬱の心的異常を有することが明らかになった。
【０００９】
このような表現型に対する種々の薬物候補物質の影響を観察することで、小脳、前庭、内耳の異常、筋力の低下、癲癇、運動機能障害、強迫性障害、統合失調症、広汎性発達障害（PDD）、拒食症、認知症、睡眠障害、パニック障害、神経症、そう病、うつ病（うつ
状態、抑うつ神経症、意欲減退などを含む）、双極性障害、心身症、不安、緊張などの種々の疾患の治療薬のスクリーニングが可能になる。
【００１０】
さらに、本発明の非ヒトノックイン哺乳動物は、平衡感覚を失って転びやすいだけでなく、成長に伴って野生型動物と比較して運動量が著しく高く、落ち着きのない行動が見られ、例えばＬＤ（学習障害），ＡＤＨＤ（注意欠陥／多動性障害）、高機能自閉症、小脳、前庭、内耳の異常、筋力の低下、癲癇、運動機能障害、強迫性障害、統合失調症、広汎性発達障害（PDD）、拒食症、認知症、睡眠障害、パニック障害、神経症、そう病、うつ
病、双極性障害、心身症、不安、緊張などの全く新しいモデル動物としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、天然型のヒトproBDNF蛋白質の配列は配列番号１に示され、１２５位
のArgをMetに置換し(R125M)、かつ、１２７位のArgをLeuで置換した(R127L)非切断性proBDNF誘導体(以下、「proBDNF-ML」と略すことがある)蛋白質の配列を配列番号２に示す。
また、配列番号2に対応する遺伝子を配列番号3に示す。
【００１２】
配列番号２に示される非切断性proBDNF誘導体(BDNF-ML)は、コリン作動性神経細胞のファイバーの脱落の促進、低カリウム培地による小脳顆粒神経細胞の細胞死の促進などの神
経細胞に対する有害作用を有することが本発明者により明らかにされた。例えば、図8に
示されるように、変異型BDNFノックインマウスの小脳は、VIb葉とVII葉の間の溝と、IX葉の溝が消失する。本発明の非ヒトノックイン動物の特徴的な表現型は、変異型proBDNFの
このような作用に基づく可能性がある。
【００１３】
本発明の非ヒトノックイン動物の作製に使用される変異型proBDNFは、
(a)配列番号3で表される塩基配列又はその相補鎖からなるDNA
(b)配列番号3の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、BDNFへの変換が抑制されたproBDNFをコードするDNA
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入され、かつ、proBDNFからBDNFへの変換が抑制されているアミノ酸配列をコ
ードするDNA
を包含する。
【００１４】
上記アミノ酸配列の置換、付加、欠失又は挿入は、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)；同 100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105 (1986)〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸
アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801(1967)；同 91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett.,22, 1859 (1981)；同 24, 245 (1983)〕およびそれらの組合せなどにより行うことができる。置換、付加、欠失又は挿入
されるアミノ酸の個数としては、１又は複数個、好ましくは１から十数個、更に好ましくは１から数個程度が、本発明の非ヒトノックイン動物の表現型を発現するために好ましく例示される。また、配列番号２のタンパク質は、シグナルペプチドを含んでおり、該シグナルペプチドをさらに欠失させることもできる。
【００１５】
ストリンジェントな条件としては、プライマーまたはプローブとして用いられる通常の条件を挙げることができ、特に制限はされないが、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃の条件または０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃の条件を例示することができる。
【００１６】
天然型proBDNFの起源は特に限定されず、ヒト、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ヒツジ、ヤ
ギ、ウサギ、マウス、ラットなどの哺乳動物、ニワトリ、アヒルなどの鳥類、カエルなどの両生類、イモリなどの爬虫類等の動物が広く例示できる。天然型proBDNFは、成熟型BDNFへの変換(プロテアーゼ切断による)が抑制された変異型proBDNFの製造原料として使用できる。
【００１７】
本発明の非ヒトノックイン動物の作製は、特に限定されないが、例えば遺伝子構築物あるいはベクターを用いて相同組換えにより行うことができる。
【００１８】
以下に、ベクターを用いて非ヒトノックイン動物を作製する方法を例示する。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態において、非ヒトノックイン動物作製用のベクターは、図1
に示されるように、相同組換えを行うためのlong armおよびshort arm、組換え体の選抜
を行うためのマーカーを有している。
【００２０】
本発明で用いる変異型proBDNF遺伝子は、公知の天然型proBDNF遺伝子および適当なプライマーを用いて常法に従い製造することができる。得られた変異型proBDNF遺伝子は、図1のlong armとshort armの間に導入する。この際、ネオマイシン耐性遺伝子(neor)などの
薬剤耐性遺伝子を用いることにより、該遺伝子が導入された動物を選別(ネガティブセレ
クション)することができる。選抜のためのマーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子だけでも
良いが、ジフテリアトキシン(DT) 遺伝子をさらに連結してポジティブセレクションを行
うことで、選抜をさらに容易に行うことができる。
【００２１】
野生型の動物は、[long arm]−[proBDNF]−[short arm]の構造を有しているため、図1
のベクターを用いてES細胞において相同組換えを行うことで、変異型BDNF遺伝子が導入された本発明の非ヒトノックイン動物を得ることができる。
【００２２】
変異型proBDNFには、mycなどのタグを付けることもできる。例えばmycタグにより組織
レベルのproBDNFの局在などの解析を行うことができる。
【００２３】
本発明の非ヒトノックイン動物は、遺伝子型としてヘテロとホモのいずれも有用である。ホモは、転びやすい、多動性、落ち着きのなさ、低体重、サイズが小さいなどの特徴が強く表れ、ヘテロはその中間的な表現型を有している。これは、これらの表現型が、非切断性proBDNFと密接に関係していることを示唆している。
【００２４】
非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、サルなどの哺乳動物、あるいはは虫類、両生類などが挙げられる。
【００２５】
なお、Neoなどの薬剤耐性遺伝子(マーカー)は、Creマウス（B6.Cg-Tg(CAG-cre)CZ-MO2Osb）と交配して、除いてもよい。
【００２６】
さらに、変異型proBDNFを導入した非ヒトノックインマウスと野生型マウスについてDNAアレイを用いて遺伝子発現レベルを測定した。結果は、野生型マウスに対して発現量が0.5倍以下に減少(第1表)、2.0倍以上に増加(第2表)、0.5倍以下に減少し且つ発現量の多い
遺伝子(第３表)、2.0倍以上に増加し且つ発現量の多い遺伝子(第４表)に示す。
第1表
【００２７】
【表１】
0005414012.tif 000002
【００２８】
【表２】
0005414012.tif 000003
【００２９】
【表３】
0005414012.tif 000004
【００３０】
【表４】
0005414012.tif 000005
【００３１】
【表５】
0005414012.tif 000006
【００３２】
【表６】
0005414012.tif 000007
【００３３】
【表７】
0005414012.tif 000008
【００３４】
【表８】
0005414012.tif 000009
【００３５】
【表９】
0005414012.tif 000010
【００３６】
【表１０】
0005414012.tif 000011
【００３７】
【表１１】
0005414012.tif 000012
【００３８】
【表１２】
0005414012.tif 000013
【００３９】
【表１３】
0005414012.tif 000014
【００４０】
【表１４】
0005414012.tif 000015
【００４１】
【表１５】
0005414012.tif 000016
【００４２】
第２表
【００４３】
【表１６】
0005414012.tif 000017
【００４４】
【表１７】
0005414012.tif 000018
【００４５】
【表１８】
0005414012.tif 000019
【００４６】
【表１９】
0005414012.tif 000020
【００４７】
【表２０】
0005414012.tif 000021
【００４８】
【表２１】
0005414012.tif 000022
【００４９】
【表２２】
0005414012.tif 000023
【００５０】
【表２３】
0005414012.tif 000024
【００５１】
【表２４】
0005414012.tif 000025
【００５２】
【表２５】
0005414012.tif 000026
【００５３】
【表２６】
0005414012.tif 000027
【００５４】
【表２７】
0005414012.tif 000028
【００５５】
【表２８】
0005414012.tif 000029
【００５６】
【表２９】
0005414012.tif 000030
【００５７】
【表３０】
0005414012.tif 000031
【００５８】
【表３１】
0005414012.tif 000032
【００５９】
【表３２】
0005414012.tif 000033
【００６０】
第３表
【００６１】
【表３３】
0005414012.tif 000034
【００６２】
第４表
【００６３】
【表３４】
0005414012.tif 000035
【００６４】
上記の遺伝子において、例えば第3、4表に記載のkinesin family member 5B(GenBankNo. BI328541)、cysteine-rich hydrophobic domain 1 (GenBankNo. BG065782)、solute carrier family 1 (glial high affinity glutamate transporter), member 2 (GenBank No. AV328280)は、行動異常や心的疾患に関係すると予測される遺伝子である。
【００６５】
本発明のスクリーニング方法において、薬物候補化合物を投与することで、上記第1表
〜第4表に列挙され、かつ、神経細胞の機能、行動異常や心的疾患と密接に結びつくと予
測される少なくとも1種の遺伝子の増減を評価することによって、薬物のスクリーニング
を行うことができる。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。
参考例1：非切断型proBDNFのDNA断片
NCBIのSNPデータベースに基づいて、proBDNFのプロドメインの切断部分（矢印↓）の近傍に存在する2個のR（Lys、125位と127位）をM(Met,125位)とL(Leu 127位)に変異を導入
するための遺伝子組換え実験を行った。
【００６７】
ヒトの血液から調整したDNAを用いて図２のアミノ酸配列部分（配列番号１）に相当す
るDNA断片をPCR反応で増幅しTAベクター（インビトロジェン）にクローニングした。 2個のR（Lys、太文字、125位と127位）をMとLに変異させた遺伝子を得るために、GCAAACATGTCCATGATGGTCCTGCGCCACTCTGACCC（プライマー１，配列番号4）とGGGTCAGAGTGGCGCAGGACCATCATGGACATGTTTGC（プライマー２，配列番号5）の配列のプライマーと、Quick-change XL site-directed mutagenesis kit (Strategene)を用いて目的とする非切断性proBDNF(BDNF-ML)遺伝子を得た。
実施例1
（材料および方法）
ノックインベクターの構築およびノックインマウス の作製
ノックインベクター（図１）のlong armとshort armのDNA断片を単離するために、129
／Svマウス系統由来のES細胞D3から調整したgenomicDNAのラムダDASHII（Stratagene、CA）ゲノムライブラリーを鋳型としたPCR反応を行った。
【００６８】
long arm（DNA data base No. AY057907: 49015-54460）はプライマー１ gtcgaccttccacactcctactagg（配列番号６）とプライマー２  atcgatcactcttctcacctggtgg（配列番号７）を用いてPCR反応で増幅しＴＡベクター（インビトロジェン）にクローニングした。
【００６９】
short arm（DNA data base No. AY057907: 49015-54460）はプライマー３ttaattaatggatttatgttgtatagattatattgag（配列番号８）とプライマー４  ggcgcgcccagcggcttggcagccgtcacgg （配列番号９）を用いて同様にクローニングした。  
【００７０】
非切断型proBDNFのDNA断片（参考例1）のC末端にmycタグ配列を付加するためにプライ
マー５ atcgatcactcttctcacctggtgg （配列番号10）とプライマー６gcggccgcctatcttccccttttaatgg （配列番号11）を用いてPCR反応を行いＴＡベクター（インビトロジェン）に
クローニングした（図１のmutant BDNF）。
【００７１】
以上のlong arm のSalI−ClaI断片（配列番号10：SalIとClaIサイトはそれぞれプライ
マー１，２に付加している）、short armのPacI-AscI断片（配列番号11：PacIとAscIサイトはそれぞれプライマー３，４に付加している）および非切断型proBDNFをコードするClaI-NotI断片をターゲティングベクターpMulti-ND 1.0（Inoue et al., Nature, vol. 434,
234-237, 2005）に導入し、これをBDNFの前躯体フォーム（proBDNF）を発現するマウス
作製のノックインベクターとした（図１）。
【００７２】
ノックインマウス は以前に記載した方法に準じて作製した（Inoue et al., Nature, vol. 434, 234-237, 2005）。つまり、構築したベクターを用い、BDNFゲノムに変異のあるES細胞を樹立し、公知の方法に準じて、変異遺伝子をヘテロおよびホモに含むマウスの作製に用いた。即ち、導入遺伝子を電気穿孔法によりES細胞（129/Sv由来ES cell line,  D3）に導入し、遺伝子を導入したES細胞は、１００μg／mLのネオマイシン存在下でネオマイシン耐性遺伝子（図１：neor）によるネガティブセレクションとジフテリアトキシン（図１：DT）によるポジティブセレクションのダブルセレクションによって樹立した。C57BL/6系統のマウスより胚盤胞を採取し、マイクロインジェクション法により、遺伝子導入
されたES細胞を胚盤胞に注入した。精管結紮を行ったマウスとの交配によって得られた偽妊娠マウス（ＩＣＲ系統）の子宮に、ＥＳ細胞を注入した胚盤胞を移植した。偽妊娠マウスの出仔によってヘテロマウスを得た。ターゲティングベクターpMulti-ND 1.0のNeo遺伝子の両端にはCre-lox RecombinaseがNeo遺伝子を除去するためのlox配列が付加されてい
る。ヘテロマウスとCre-lox Recombinaseの発現マウスB6.Cg-Tg(CAG-cre)CZ-MO2Osbの交
配によりNeo遺伝子が除去されたヘテロマウスを第１世代とし、このヘテロマウスどうし
の交配により第2世代のホモ接合型マウスを得た。マウスの遺伝子型はPCRおよびサザンブロット分析によって同定した。得られたノックインマウスの受精卵は、２００５年１２月２１日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに「受託番号FERM P-20742」で寄託した。
【００７３】
（作製したノックインマウス の分析）
得られたノックインマウス の遺伝子型
ヘテロ接合型交配に由来する子孫の遺伝子型を第5表に示す。
【００７４】
【表３５】
0005414012.tif 000036
【００７５】
新生マウスの各遺伝子型（+/+，野生型ホモ接合体；+/−，ヘテロ接合体；および−/−，ノックインホモ接合体）の数を示す。括弧内には各遺伝子型の頻度（％）を示している。
【００７６】
変異型BDNFのノックインホモ接合体の生後2週から3週には、野生型ホモ接合体には見られない特に次のフェノタイプが観察された。１、歩行しようとすると回転してしまう、２、よろめいた歩行、３、ひっくり返って足をばたばたさせる、４、姿勢における下半身の低下である。また、ヘテロ接合体はノックインホモ接合体と野生型ホモ接合体の中間的フェノタイプをしめす傾向にあった。
【００７７】
ノックインホモマウスに関し、12日目は、よちよちしながらも平衡感覚を失いよく転んだ。18日目になると、運動量が増え、クルクルと回転しては転ぶという動作を繰り返した。21日目では、目も開いて自分でえさを食べるようになった。しかし、野生型マウスやヘテロにくらべて、ノックインホモマウスは運動量が異常に高く、落ち着きがなく、走っては転び走っては転びを繰りかえすようになった。
【００７８】
ノックインホモ接合体のこのようなフェノタイプは、小脳、前庭、内耳の異常、筋力の低下、癲癇、  運動機能障害、ＬＤ（学習障害），ＡＤＨＤ（注意欠陥／多動性障害）、高機能自閉症などを示唆している。
【００７９】
このような異常がありながらもノックインホモマウスが致死ではなく体重増加を伴いながら成長することは（図３）、このマウスの心的疾患の原因が神経系の機能的変調や構造的異常にあることを示唆する。
【００８０】
変異型BDNF遺伝子ノックインマウスの行動異常について定量的解析を行った。マウスの情動の変化は新規環境に入ったときのマウスの活動量や行動パターンに反映される。全く経験のない円形フィールド（フィールドの直径50センチ、壁の高さ40センチ）の新規環境に25分から30分いれて、その間の活動量を野生型ホモ接合体（Wild）とノックインホモ接合体（Mutant）の間で比較した。マウスは、実験前の30分間円形フィールドの設置された部屋に入れ、マウスは紙箱を使って円形フィールドに静かに入れた。円形フィールドにおけるマウスの活動測定は、室町機械のDV-Trackビデオ・トラッキング・システムを用いて行った。図４は、オープンフィールドへ入れた5分間のマウスの行動の代表的トレースで
あるが、MutantマウスはWildマウスに比べて顕著な活動量を示している。
【００８１】
新規環境に入ったマウスは探索行動によって時間とともにその環境に順応していく。WildマウスとMutantマウスについてオープンフィールドへの投入後25分間について５分毎の活動量をプロットしたのが図５である。野生型マウス（Wild）は円形フィールドに順応し次第にその行動距離を短くするが、変異マウス（mutant）にはそのような順応性が見られ
ず活動が続いた。したがって、変異型BDNF遺伝子ノックインマウスは著しく新規環境に順応しにくい。
【００８２】
しかし、このような障害は抗不安薬Etizolamの投与により改善されることがわかった（図６）。Etizolamは短期作用型GABA 神経伝達亢進剤である（文献：Elder C.A. et al.: Drug Metab. Dispos., vol. 23, 776, 1995）。実験では、Etizolamを含むデパス錠（三
菱ウェルファーマ）をPBSに溶かしその上清をEtizolam溶液として用いた。プロトコール
は、(I)オープンフィールドにおけるマウスをいれて30分間の総活動距離を測定し、(II)PBSあるいはEtizolam溶液（0.5mg/kg）を腹腔投与する。(III)5分後に再度オープンフィールドにもどし活動量を30分間測定する。使用マウスは、４週から５週齢の同腹の野生型マウス（Wild）と変異マウス（mutant）であり、使用匹数は4-5匹/実験群である。図６の実験結果をまとめる。(I)、変異マウスの３０分間の総行動距離はWild群に比べて７倍から
１０倍長い（p<0.001）。(II)、このような変異マウスの異常行動は抗不安薬 Etizolam 
（E）の投与により著しく抑制される（Mutant群のE; p<0.001）。しかし、Etizolamの溶
媒のPBS（P） は効かない（p=0.58）。(III)、野生型マウスに対してもEtizolamは確かに効果的であるが（p<0.05）、PBS（P）は効かない（p=0.13）。これらの結果は、変異型BDNF遺伝子ノックインマウスの行動異常の原因には精神不安が含まれることを示唆する。従って、本発明の非ヒトノックイン動物は、精神不安が関与する疾患のモデル動物として有用であり、このような疾患のスクリーニングに好ましく使用できる。
【００８３】
変異型BDNF遺伝子ノックインマウスの行動異常は、円形フィールドのような新規環境だけでなくホームケージにおいても顕著であった。赤外線センサーを応用した自発運動量測定装置（室町機械：スーパーメックス）を飼育ケージの上に設置し、約5日間のホームケ
ージにおける自発活動量を測定した（図７）。活動量は任意単位（A.U.）で表現している。 図７から、(i)変異マウスの活動量が野生型マウスに比べて高いこと、(ii)測定期間全体の活動量（A.U.）は、変異マウスが野生型マウスに比べて約3倍高いこと、（iii）、変異マウスの暗期における活動量は野生型マウスに比べてさらに４倍以上高いことが見出された。以上の結果から、ノックインホモマウスは新規環境と同様に通常の飼育環境においても落ち着きがないという神経症状をもつことは明らかである。
【００８４】
幼若期によく観察される転倒や回転は小脳の構造的異常による可能性が考えられる。３週齢のノックインホモマウス・ヘテロマウス・野生型マウスについて、小脳のMid sagital sectionをクレシルバイオレット染色し小脳形態を比較した（図８）。その結果、変異
型BDNF遺伝子ノックインマウスのホモマウスではVIb葉とVII葉の間の溝（白の矢印）とIX葉の溝（黒の矢印）が消失していた。つまり、マウスの行動異常と脳構造の変化の関係が示唆される。
【００８５】
続いて、このようなマウスの異常に関する分子基盤を理解するために、変異型BDNF遺伝子ノックインマウスの脳遺伝子発現のDNAアレイ解析を行った（http://www.affymetrix.com）。5週齢の野生型マウスとホモマウスの全脳を取り出しRNAを抽出した。アレイ解析は、GeneChipアレイ（Affmetrix社）を用いた１色法を採用した。その結果、野生型マウス
に比べてホモマウスにおいて2倍以上増加あるいは0.5倍以下に減少している遺伝子が第1
表から第4表のように見出された。アレイ解析の結果は、変異型BDNF遺伝子ノックインマ
ウスの神経疾患を説明できる分子メカニズムの存在を示唆し、このマウスから解明される神経疾患の病因の研究、治療の研究、創薬研究、薬物スクリーニングに役立つデータベースと考えられる。
【００８６】
なお、本発明のノックインマウスは、以下のスキームのgenotypingによって確認できる。  
【００８７】
Genomic DNAの精製は、生まれたマウスの尻尾0.5 cmを切り取りDNeasy Tissue Kit (Quagen)により行う。精製DNAは200μlの滅菌水に溶解する。ノックインマウスの確認は、次の配列をもつ合成プライマーを用いたPCRによって行う。
プライマー配列
primer #1 ATGACCATCCTTTTCCTTAC(配列番号12)
primer #2 CTAATACTGTCACACACGC(配列番号13)
PCR反応  精製DNA 0.5μl, Ex Taq(タカラ) 1μl, Ex Taq専用10×バッファー(タカラ) 2μl, dNTPsmixture  （タカラ）1.6μl, 100μM primer #1 溶液0.1μl, 100μM primer #2 溶液0.1μlを含む反応液 20μl について、94℃, 1 minの後、94℃ 30 sec, 60℃ 30 sec, 72℃ 30 secのPCRサイクルを30回繰り返し、最後に72℃ 2minを行う。このPCR反応
は、ノックイン配列由来のDNA 435 bp、マウス由来のDNA 440 bpを同時に増幅する。しかし、マウス由来のDNAは制限酵素SmaIによって283bpと157bpに分断される。このSmaI反応
は、上記PCR反応液5μl, Tバッファー（タカラ）1μl, 0.1% BSA 1μl, SmaI （タカラ）
1μlを含む反応液 10μlを37℃で2 hrs静置し2%アガロースゲルで電気泳動を行うことによって図９のように判定される。
【００８８】
変異型BDNF導入マウスの抑うつ行動
変異型BDNF導入マウスの心的異常は、テールサスペンジョンテストにおいても顕著であった。マウスを尾で宙吊りにしたとき、通常逃れようとしてマウスはもがく。しかし、次第に逃れることができないことを認識して無動を呈するようになる。この無動が大半を占めるときを抑うつ状態と定義し、これに至る経過を測定する。赤外線センサーを応用した自発運動量測定装置（室町機械：スーパーメックス）をテールサスペンジョン実験装置（室町機械）の前に設置し、この経過を図１０のように測定した。実験は、文献（What’s wring with my mouse?, Jacqueline N. Crawley著、Crawley）に従って行った。
【００８９】
図１０Ａは、変異マウスとコントロールマウスの無動時間の代表的推移である。テールサスペンジョン装置でマウスを宙吊りにしたあとすぐに測定を開始し６分間無動時間を計測した。縦軸は各セッションの無動時間を表す。
【００９０】
図１０Ｂは、各マウス8匹を用いて6分間の無動時間を測定し統計的に解析した結果である。変異マウスはワイルドマウスに比べて有意差のある無動時間を示すこと（t-検定：P<0.0001）、その無動時間はワイルドマウスに比べて約5倍長いことが見出された。以上の
結果から、変異型BDNF導入マウスは顕著な抑うつの心的異常をもつことが見出された。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ターゲッティングベクターの概要図
【図２】proBDNF（全配列）とmatureBDNF（下線部分）のアミノ酸配列を示す。↓は切断部位を示す。
【図３】変異型BDNF遺伝子ノックインマウスの写真と体重の変化。(A)生後5週同腹の野生型マウス(右)と変異型BDNF導入ホモマウス。(B)変異マウスは週齢とともに体重増加し成長する。WT:野生型、ht：ヘテロ、hm：ホモ。
【図４】オープンフィールドにおける5分間の活動量の比較。円形フィールドにおける5分間の活動パターンをトレースした。変異マウス(Mutant)は野生型マウス(Wild)に比べて活動量が顕著であった。
【図５】オープンフィールド25分間の行動パターン。野生型マウス（Wild）と変異マウス（mutant）各4匹について、円形フィールドにおける5分間の活動距離をプロットした。野生型マウスはオープンフィールドの新規環境に順応し次第に行動距離を短くした。しかし、変異マウスにはそのような順応性が見られず活動状態が続いた。
【図６】変異型BDNF遺伝子ノックインマウスの行動異常の抗不安薬(Etizolam)による抑制。P：PBS投与、Ｅ：Etizolam投与。有意差検定はt-testによる。
【図７】変異型BDNF遺伝子ノックインマウス(Mutant)と野生型マウス(Wild)の約5日間のホームケージにおける自発活動の測定結果。横軸において、黒は暗期(12時間)、白は明期(12時間)。ノックインマウス(Mutant)は自発活動量が顕著である。
【図８】変異型BDNF遺伝子ノックインホモマウスの小脳形態の異常。変異型BDNF遺伝子ノックインホモマウス(Homo)ではVIb葉とVII葉の間の溝（上側の矢印）とIX葉の溝（左側の矢印）が消失していたが、変異型BDNF遺伝子ノックインヘテロマウス(Hetero)と野生型マウス(Wild)では、該溝は存在した。
【図９】Genotypingの電気泳動パターン
【図１０】変異型BDNF導入マウスのうつ状態を測定するためのテールサスペンジョンテストの結果（A） テールサスペンジョンテストにおける代表的無動時間の推移  生後６−７週のワイルドマウス（灰色の丸）と変異型BDNF導入マウスホモマウス（黒色の丸）  テールサスペンジョン装置でマウスを宙吊りにしたあと、すぐに測定を開始し６分間無動時間を計測した。縦軸は各セッションの無動時間を表す。（B）各ジェノタイプのマウス8匹（生後６−７週）の６分間の無動時間のグラフ  t-検定 p<０．０００１  変異マウスの無動時間はワイルドマウスの無動時間よりはるかに長いため、このマウスがうつ行動をとることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図８】
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【配列表】
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