(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラNDVであって、Fタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインと、C末端によってアンカーされているNDV以外の感染因子の感染防御抗原の外部ドメインの少なくとも1つのエピトープ、又は疾患と関連する抗原の少なくとも1つのエピトープとを有するF-融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むパッケージされたゲノムを含み、該F-融合タンパク質が該キメラNDV内に発現され、かつ組み込まれており、該抗原が、パラミキソウイルス抗原でない、前記キメラNDV。
【請求項２】
前記感染因子が、感染性病原体である、請求項1記載のキメラNDV。
【請求項３】
Fタンパク質が前記キメラNDV内に発現され、かつ組み込まれるように、前記ゲノムがFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項1又は2記載のキメラNDV。
【請求項４】
前記F-融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、NDV Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を置換し、かつ前記F-融合タンパク質が該Fタンパク質の機能を供給する、請求項1又は2記載のキメラNDV。
【請求項５】
キメラNDVであって、HNタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインと、N末端によってアンカーされているNDV以外の感染因子の感染防御抗原の外部ドメインの少なくとも1つのエピトープ、又は疾患と関連する抗原の少なくとも１つのエピトープとを有するHN-融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むパッケージされたゲノムを含み、該HN-融合タンパク質が該キメラNDV内に発現され、かつ組み込まれ、かつ、該抗原がパラミキソウイルス抗原でない、前記キメラNDV。
【請求項６】
HNタンパク質が前記キメラNDV内に発現され、かつ組み込まれるように、前記ゲノムがHNタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項5記載のキメラNDV。
【請求項７】
前記HN-融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、前記NDV HNタンパク質をコードするヌクレオチド配列を置換し、かつ前記HN-融合タンパク質が該HNタンパク質の機能を供給する、請求項5記載のキメラNDV。
【請求項８】
前記抗原が、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素抗原の外部ドメインである、請求項1〜4のいずれか1項記載のキメラNDV。
【請求項９】
前記抗原が、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ抗原の外部ドメインである、請求項5〜7のいずれか1項記載のキメラNDV。
【請求項１０】
前記インフルエンザウイルスが、トリインフルエンザウイルスである、請求項8記載のキメラNDV。
【請求項１１】
前記インフルエンザウイルスが、トリインフルエンザウイルスである、請求項9記載のキメラNDV。
【請求項１２】
前記F-融合タンパク質又はHN-融合タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインが、NDVのLaSota株由来のものである、請求項1〜11のいずれか1項記載のキメラNDV。
【請求項１３】
前記Fタンパク質は、融合活性が増加するように、切断部位で遺伝的に修飾されている、請求項1〜3又は5〜12のいずれか1項記載のキメラNDV。
【請求項１４】
前記遺伝的に修飾された切断部位が、複数の多塩基切断部位を含む、請求項13記載のキメラNDV。
【請求項１５】
前記HN-融合タンパク質が、前記HNタンパク質の外部ドメインのアミノ酸残基を含まず、若しくは前記HNタンパク質の外部ドメインの活性を保持しないHNタンパク質の外部ドメインの断片を含み；又は、前記F-融合タンパク質が、前記Fタンパク質の外部ドメインのアミノ酸残基を含まず、若しくは前記Fタンパク質の外部ドメインの活性を保持しないFタンパク質の外部ドメインの断片を含む、請求項1〜14のいずれか1項記載のキメラNDV。
【請求項１６】
前記HNタンパク質の外部ドメインの断片が、前記HNタンパク質の膜貫通ドメインにすぐに隣接するNDV HNタンパク質の外部ドメインの1〜15残基であり；又は、前記Fタンパク質の外部ドメインの断片が、前記Fタンパク質の膜貫通ドメインにすぐに隣接するNDV Fタンパク質の外部ドメインの1〜15残基である、請求項15記載のキメラNDV。
【請求項１７】
前記F-融合タンパク質が、前記Fタンパク質の外部ドメインのアミノ酸残基を含まない、請求項15記載のキメラNDV。
【請求項１８】
前記F-融合タンパク質が、前記Fタンパク質の外部ドメインの活性を保持しないFタンパク質の外部ドメインの断片を含む、請求項15記載のキメラNDV。
【請求項１９】
前記Fタンパク質の外部ドメインの断片が、前記Fタンパク質の膜貫通ドメインにすぐに隣接するNDV Fタンパク質の外部ドメインの1〜15残基である、請求項18記載のキメラNDV。
【請求項２０】
前記融合タンパク質をコードする配列が、NDVゲノムのP遺伝子からM遺伝子の間に挿入されている、請求項1〜19のいずれか1項記載のキメラNDV。
【請求項２１】
NDVのLaSota株のバックボーンを有する、請求項1〜20のいずれか1項記載のキメラNDV。
【請求項２２】
弱毒化されている、請求項1〜21のいずれか1項記載のキメラNDV。
【請求項２３】
免疫原性製剤を製造するための方法であって、該方法は：
（a）孵化鶏卵、又はNDV感染に感受性である株化細胞において請求項1〜22のいずれか1項のキメラNDVを増殖させること；及び、
（b）子孫ウイルスを収集すること、
を含み、
該ウイルスは、該子孫ウイルスが免疫原性製剤に使用するために適するように、十分な量で、かつ該ウイルスが汚染されない十分な条件下で培養される、前記方法。
【請求項２４】
NDV及びトリにおける抗原に対する免疫応答を誘導することにおける使用のための医薬の製造における、請求項1〜22のいずれか1項記載のキメラNDVの使用。
【請求項２５】
ヒトにおける抗原に対する免疫応答を誘導することにおける使用のための医薬の製造における、請求項1〜22のいずれか1項記載のキメラNDVの使用。
【請求項２６】
請求項1〜22のいずれか1項記載のキメラNDVを含む免疫原性製剤。
【請求項２７】
ウイルス感染に関連する疾患を予防することにおける使用のための、請求項26記載の免疫原性製剤。
【請求項２８】
前記ウイルス感染が、NDVのものである、請求項27記載の免疫原性製剤。
【請求項２９】
前記ウイルス感染が、インフルエンザウイルスのものである、請求項27又は28記載の免疫原性製剤。
【請求項３０】
NDV及びトリにおける抗原に対する免疫応答を誘導することにおける使用のための、請求項26記載の免疫原性製剤。
【請求項３１】
ヒトにおける抗原に対する免疫応答を誘導することにおける使用のための、請求項26記載の免疫原性製剤。
【請求項３２】
ウイルス感染に関連する疾患を予防することにおける使用のための医薬の製造における、請求項1〜22のいずれか1項記載のキメラNDVの使用。
【請求項３３】
前記ウイルス感染が、NDVのものである、請求項32記載の使用。
【請求項３４】
前記ウイルス感染が、インフルエンザウイルスのものである、請求項32又は33記載の使用。
【請求項３５】
請求項1〜22のいずれか1項記載のキメラNDVをコードする組換えDNA分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（1. 技術分野）
本発明は、対象、例えばトリを、本発明の単一のキメラウイルスを使用することによって2つの感染因子に対して免疫することができるキメラネガティブ鎖RNAウイルスを提供する。特に、本発明は、感染因子のタンパク質の外部ドメイン、並びにインフルエンザウイルスタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む融合タンパク質を該ウイルスのビリオン内に発現し、かつ組み込むように操作されたキメラインフルエンザウイルスを提供する。このようなキメラウイルスは、インフルエンザウイルス及び感染因子に対して免疫応答を誘導する。また、本発明は、感染因子のタンパク質の外部ドメイン、並びにNDVタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む融合タンパク質をこれらのビリオン内に発現し、かつ組み込むように操作されたキメラニューカッスル病ウイルス（NDV）を提供する。このようなキメラウイルスは、NDV及び感染因子に対して免疫応答を誘導する。
【背景技術】
【０００２】
（2.本発明の背景）
多くのDNAウイルスは、宿主細胞系（例えば、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなど）における異種のタンパク質の発現を指揮するように遺伝的に操作されてきた。最近では、同様の進歩が、ポジティブ鎖RNAウイルス（たとえば、ポリオウイルス）でなされた。これらの構築物、すなわち異種遺伝子産物又は異種遺伝子産物を発現するキメラウイルスは、ワクチン製剤（サブユニット又はウイルス全体ワクチンのいずれか）において潜在的に有用であると考えられる。ワクチンに使用するための組換えウイルス又はキメラウイルスを構築するためのワクシニアなどのウイルスの使用に対する1つの欠点は、その主要エピトープにバリエーションがないことである。ウイルス株におけるこのバリエーションの欠如は、キメラワクシニアの繰り返しの利用に対して厳しい制限を設け、複数回のワクチン接種は、株に対する宿主の抵抗性が生じさせ、その結果接種したウイルスが宿主感染することができない。従って、抵抗性を示す個体をキメラワクシニアで接種しても、免疫刺激を誘導しない。
【０００３】
対照的に、ネガティブ鎖RNAウイルスは、ワクチンに使用するためのキメラウイルスを構築するための魅力的な候補である。ネガティブ鎖RNAウイルス、たとえばインフルエンザは、その幅広い遺伝的多様性により、寛容性を発する危険なしに免疫を刺激する莫大なレパートリーのワクチン製剤を構築することができるので、望ましい。
【０００４】
（2.1 ネガティブ鎖RNAウイルス）
ネガティブ-センスゲノムの外被型一本鎖RNAを含むウイルスファミリーは、非セグメント化ゲノムを有する群（パラミキソウイルス科（Paramyxoviridae）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae））又はセグメント化ゲノムを有するもの（オルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）、ブニヤウイルス科（Bunyaviridae）及びアレナウイルス科（Arenaviridae））に分類されている。パラミキソウイルス科及びオルソミクソウイルス科は、下記に詳述してあり、本明細書の実施例に使用されている。パラミキソウイルス科には、ニューカッスル病ウイルス（NDV）、パラインフルエンザウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス5及びムンプスウイルスのウイルスを含む。オルソミクソウイルス科には、インフルエンザA、B及びC型ウイルス並びにトゴトウイルス及びドーリウイルス及び感染性サーモン貧血ウイルスのウイルスを含む。
【０００５】
（2.1.1 インフルエンザウイルス）
インフルエンザビリオンは、一本鎖RNAゲノムを含む内側リボ核タンパクコア（らせん状のヌクレオカプシド）及びマトリックスタンパク質（M1）によって内部が裏打ちされた外側のリポタンパク質外被を含む。インフルエンザA型ウイルスのセグメント化ゲノムは、RNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質（PB2、PB1及びPA）及びヌクレオカプシドを形成する核タンパク質（NP）；マトリックス膜タンパク質（M1、M2）；脂質を含む外被から突出する2つの表面糖タンパク質：赤血球凝集素（HA）及びノイラミニダーゼ（NA）；非構造タンパク質（NS1）及び核排除タンパク質（NEP）を含む、10個のポリペプチドをコードする直鎖状で負極性の一本鎖RNAの8分子からなる（インフルエンザC型では7分子）。ゲノムの転写及び複製は、核で起こり、構築は、原形質膜上の出芽を介して生じる。ウイルスは、混合感染の間に遺伝子を再類別（reassort）することができる。
【０００６】
インフルエンザウイルスは、細胞膜糖タンパク質及び糖脂質におけるシアリルオリゴ糖へのHA結合活性を介して細胞に吸着する。ビリオンのエンドサイトーシスに続いて、HA分子の高次構造変化が細胞エンドソームの中で生じ、これが膜融合を促進し、こうして脱殻をトリガーする。ヌクレオカプシドは、核に移動し、ここでウイルスmRNAが転写される。ウイルスmRNAは、ウイルスのエンドヌクレアーゼが細胞の異種mRNA由来のキャップ化5'末端を切断し、次いでこれがウイルスの転写酵素によるウイルスRNA鋳型の転写のためのプライマーとして役立つという、独特のメカニズムによって転写される。転写物は、これらの鋳型の末端から15〜22塩基の部位にて終結し、そこで、オリゴ（U）配列は、ポリ（A）束の付加のためのシグナルとして作用する。次いで、ウイルスのRNA転写物は、細胞膜に移動し、新たに転写された膜貫通ウイルスタンパク質と相互作用する。次いで、NAは、膜結合した糖タンパク質の炭化水素部分からシアル酸残基を切断して、子孫ウイルスのカプセル化及び細胞放出を生じる。このように産出された8つのウイルスRNA分子のうち6つは、HA、NA、NP及びウイルスのポリメラーゼタンパク質であるPB2、PB1及びPAに相当するタンパク質に直接翻訳されるモノシストロニックメッセージである。その他の2つの転写物は、スプライシングを受けて、それぞれ2つのmRNAを生じ、異なるリーディングフレームに翻訳されてM1、M2、NS1及びNEPを産生する。言い換えると、8つのウイルスRNAセグメントは、10個のタンパク質をコードし：9個は、構造的で、1つは非構造的である。インフルエンザウイルスの遺伝子及びこれらのタンパク質産物の概要は、下記の表1に示してある。
【０００７】
【表１】
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【０００８】
インフルエンザウイルスの病原性は、複数のウイルス及び宿主因子によって調節される。ウイルス感染と戦う宿主因子の中で、I型インターフェロン（IFNα/β）系は、真核生物の進化において比較的早く確立された、強力な抗ウイルスの先天な防衛機構を表す（Garcia-Sastreの論文、2002, Microbes Infect 4：647-55）。抗ウイルス性IFNα/β系は、以下の3つの主要な工程を含む：（i）ウイルス感染の検出及びIFNα/βの分泌、（ii）その受容体に対するIFNα/βの結合及びIFNα/βを刺激する遺伝子の転写誘導、及び（iii）抗ウイルス酵素及びタンパク質の合成。しかし、大部分のウイルスは、IFNα/βアンタゴニスト分子をコードする特異的な遺伝情報を有し、これが抗ウイルス性IFNα/β系の1つ以上の工程を効率的に遮断する。インフルエンザA型ウイルスは、感染細胞において非構造タンパク質であるNS1タンパク質（下に詳細に記述した）を発現し、これが細胞IFNα/β反応を中和する（Garcia-Sastreらの論文、1998, Virology 252：324-30）。
【０００９】
（2.1.1.1  高病原のトリインフルエンザ）
近年、高病原性トリインフルエンザ（HPAI）の大発生が、アジア及び欧州において報告された（Kawaokaらの論文、2005, Natl. Rev. Microbiol. 3:591-600；Koopmansらの論文、2004, Lancet 363：587-593）。インフルエンザA型、サブタイプH5N1又はH7N7ウイルスを含む大発生は、国内の家禽における致死感染及び限られた数の死のヒトの事例を生じた（Tweedらの論文、2004, Emerg. Infec. Dis. 10：2196-2199）。現在のH5N1型ウイルスは、近年中国内の家禽の間で流布しており（Chenらの論文、2005, Nature 436：191-192）、渡りトリがこれらのウイルスの主要な保有宿主であるとみなされる一方で、感染した家禽から渡りトリに逆に伝達することが、これらの地理的分布の増加に寄与していると考えられる。現在、H5N1型ウイルスは、アジアから出現し、欧州及びアフリカ中に広がっている（Enserinkの論文、2006, Science, 311：932）。家禽の大規模な（無差別の）除去は、1997年における香港及び2003年におけるオランダでのH5N1の大発生を根絶する際に、良好なストラテジーであることが示された（Lipatovらの論文、2004, J. Virol. 78：8951-8959）。最近のHPAI大発生のヒト犠牲者は、感染した家禽と密なる接触を有したので、トリインフルエンザウイルス（AIV）の種間伝染予防を、屠殺による家禽のAIVの根絶によって達成してもよい。しかし、経済的及び実用的理由のため、感染した家禽のみの駆除は、本症の制御における選択の方法とは、もはやみなされない。加えて、倫理的及び生態学的な理由のため、移動する猟トリを除去することは、容認できない習慣と考えられる。最近、OIE（世界動物保健機構）及びFAO（国連食糧農業機関）は、家禽のワクチン接種がAIVの制御のために考慮されるべきであることを推奨した。加えて、不活性化されたH5ワクチンによるニワトリのワクチン接種が、現地調査においてウイルス伝染の妨害において良好であったことが報告された（Ellisらの論文、2004, Avian Pathol. 33：405-412）。最近、中国は、これらのAIV制御プログラムの一部として、ワクチン接種を受諾した。
高度に病原性のH5N1株がヒト間で伝染性となり得る可能性は、世界的大流行病という観点で注目されており、世界的死亡率を見積もる気がないWHOは、H5N1型ウイルスをヒト型に組み換えるべきである。従って、大部分がヒトに対する伝染を生じたと考えられる農業資源におけるH5N1感染の管理の方法に対する必要性は、明らかである。
【００１０】
（2.1.2  ニューカッスル病ウイルス）
ニューカッスル病ウイルスは、直鎖状の一本鎖非セグメント化ネガティブセンスRNAゲノムを含む外被ウイルスである。ゲノムRNAは、3'-N-P-M-F-HN-Lの順に遺伝子を含み、下記にさらに詳述した。また、ゲノムRNAは、3'末端にリーダー配列を含む。
ビリオンの構造エレメントは、細胞原形質膜に由来する脂質二重層であるウイルス外被を含む。糖タンパク質であるヘマグルチニンノイラミニダーゼ（HN）は、外被から突出しており、赤血球凝集素（たとえば、受容体結合／膜融合）及びノイラミニダーゼ活性を提供する。融合糖タンパク質（F）もまたウイルスの膜と相互作用し、最初に不活性前駆体として産生され、次いで翻訳後に切断されて2つのジスルフィド連結されたポリペプチドを産生する。活性なFタンパク質は、ウイルス外被の宿主細胞原形質膜との融合を促進することによって、宿主細胞へのNDVの侵入に関与する。マトリックスタンパク質（M）は、ウイルスの構築に関与し、ウイルス膜並びにヌクレオカプシドタンパク質の両方と相互作用する。
【００１１】
ヌクレオカプシドの主要タンパク質サブユニットは、キャプシドにらせん状の対称性を与えるヌクレオカプシドタンパク質（N）である。ヌクレオカプシドとの会合の際には、P及びLタンパク質がある。リン酸化タンパク質（P）は、リン酸化に供されるが、転写における調節の役割を果たすと考えられており、メチル化、リン酸化及びポリアデニル化にも関与しうる。L遺伝子は、RNA依存性RNAポリメラーゼをコードし、Pタンパク質と共にウイルスRNA合成のために必要とされる。Lタンパク質は、ウイルスゲノムのコード容量のほぼ半分近くを占め、ウイルスタンパク質のうち最も大きく、転写及び複製の両方において重要な役割を果たす。
【００１２】
NDVを含む全てのネガティブ鎖RNAウイルスの複製は、RNAを複製するために必要な細胞装置がないことにより複雑である。加えて、ネガティブ鎖ゲノムは、直接タンパク質に翻訳されることができず、最初にポジティブ鎖コピー（mRNA）に転写されなければならない。従って、宿主細胞への侵入の際に、ウイルスは、必要とされるRNA依存性RNAポリメラーゼを合成することができない。L、P及びNタンパク質は、感染時にゲノムと共に細胞に入らなければならない。
また、NDV mRNAを転写するほとんど又は全てのウイルスタンパク質が、これらの複製を実行すると仮定される。タンパク質の同じ補群のもう一方の使用（すなわち、転写又は複製）を調節するメカニズムは、明らかに同定されていないが、ヌクレオカプシドタンパク質群、特にNの1つ以上の遊離型の存在量が関与すると思われる。ウイルスの侵入の直後に、鋳型としてヌクレオカプシドのネガティブ-センスRNAを使用して、Lタンパク質によって、転写が開始される。ウイルスRNA合成は、転写の間にモノシストロニックmRNAを産生するように調節される。
【００１３】
転写に続いて、ウイルスゲノムの複製は、ネガティブ鎖RNAウイルスによる感染における第2の必須イベントである。その他のネガティブ鎖RNAウイルスと同様に、ニューカッスル病ウイルス（NDV）におけるウイルスゲノムの複製は、ウイルス特異的タンパク質によって媒介される。複製RNA合成の最初の産物は、NDVゲノムRNA（cRNA）の相補コピー（すなわち、プラス極性）である。これらのプラス鎖コピー（反ゲノム(anti-genome)）は、これらの末端の構造がプラス鎖mRNA転写物とは異なる。mRNA転写物とは異なり、反ゲノムのcRNAsは、5'末端にキャップ化及びメチル化されておらず、3'末端にて切断及びポリアデニル化されていない。cRNAsは、これらのネガティブ鎖鋳型との末端共有し、相補的形態出それぞれのゲノムRNAセグメントの全ての遺伝情報を含む。cRNAsは、NDVネガティブ鎖ウイルスゲノム（vRNAs）の合成のための鋳型として役立つ。
NDVネガティブ鎖ゲノム（vRNAs）及び反ゲノム（cRNAs）は、両方ともヌクレオカプシドタンパク質によってキャプシド化され；唯一の非キャプシド化RNA種は、ウイルスmRNAである。NDVについては、細胞質がウイルスRNA複製の部位であり、まさにそれが転写のための部位である。ウイルス成分の構築は、宿主細胞原形質膜にて起こるようであり、成熟ウイルスは、出芽によって放出される。
【００１４】
（2.2 免疫原性製剤）
組換えDNA技術及び「リバースジェネティクス」の操作技術は、免疫原性製剤における使用のための、組換えウイルスの産生に対して独特のアプローチをもたらす。特に、本発明は、ネガティブ鎖RNAウイルスを、それが天然のウイルス抗原だけでなく、ウイルスタンパク質被膜内に組み込むように操作しデザインされ得る任意の抗原も発現又は提示するように操作する方法を提供する。インフルエンザ以外の感染生物に由来する抗原は、特に関心がもたれる。このように、単一ウイルスを、少なくとも2つの病原体に対して保護をもたらすであろう免疫応答を開始し、活性化し、又は誘導するのに有用な免疫原性化合物として操作してもよい。このようなキメラウイルスは、これらの病原性を修飾することが必要な時に、すなわちこれらが減弱され、又はさらに減弱されるように、さらに操作してもよい。減弱インフルエンザウイルスは、これらが免疫原性で、かつ複製可能だが、病原性がないために、有益である。
【００１５】
生ワクチンは、交差反応性の細胞媒介細胞障害、並びに体液性抗体反応の改善を誘導し、不活性化ワクチンよりも優れた保護を提供すると考えられる（Gorse and Belsheの論文、1990, J. Clin. Microbiol. 28：2539-2550；及びGorseらの論文、1995, J. Infect. Dis. 172：1-10）。第2に、ウイルス疾患に対する感染防御免疫は、従来の筋肉内投与ワクチンでは見られない、粘膜IgA反応に関与している可能性が高い（Nelsonらの論文、1998 Vaccine 16：1306-1313）。最後に、生ワクチンは、また、不活性化されたアジュバント混合ワクチンの筋内投与に時折付随する膨張及び筋痛を回避する鼻腔内投与という利点がある。これらの生ワクチンは、ホモタイプなインフルエンザウイルスに対する体液性反応だけでなく、交差反応性細胞媒介細胞障害も誘導することが報告されている。従って、本発明は、新規かつより有効な免疫製剤、例えばウイルス性及び非ウイルス性病原体の両方の診断、予防、管理又は治療のためのワクチン製剤の開発の可能性を提供する。
【発明の開示】
【００１６】
（3.発明の要旨）
本発明は、融合タンパク質を発現してビリオン内に組み込むように操作されたキメラネガティブ鎖RNAウイルス、このようなキメラウイルスを産生するための方法、及び免疫原性製剤における、又はインビトロアッセイ法におけるこのようなウイルスの、例えば免疫原としての使用を提供する。本発明のキメラウイルスは、ビリオン表面上に、ウイルスと関連する抗原だけでなく、融合タンパク質も示すことによって特徴づけられる。
【００１７】
本発明は、対象、例えばトリ又はヒトを、キメラインフルエンザウイルス又はキメラNDVを投与することによって2つの感染因子に対して免疫することができるキメラインフルエンザウイルス及びキメラNDVを提供する。一つの態様において、免疫応答を誘導するために単一ウイルスを使用することにより、免疫する製剤の投与の頻度が減少する。別の実施態様において、免疫応答を誘導するために単一ウイルスを使用することにより、免疫する対象の費用が減少する。対象を免疫する費用が低いほど、より多くの対象を免疫する余裕ができるであろうし、従って感染に苦しむ対象の治療に関連する保健医療費が減少する可能性が増加する。
【００１８】
また、本発明は、ヒト又は動物のための組成物（例えば、免疫原性製剤）における本発明のキメラウイルスの使用に関する。特に、本発明のキメラウイルスは、広範なウイルス及び／又は抗原に対するワクチンとして使用することができる。キメラウイルスは、ビリオン内に外来エピトープを発現するように操作されるので、本発明のキメラウイルスを含む組成物（例えば、ワクチン製剤）は、複数の株変異体、異なるウイルスに対する、又は完全に異なる感染因子若しくは疾患抗原（例えば、細菌、寄生虫、真菌又は腫瘍特異性抗原）に対する免疫化のためにデザインすることができる。多くの方法を使用して、生弱毒ウイルス製剤をヒト又は動物対象に導入し、免疫又は適切なサイトカイン反応を誘導してもよい。これらには、鼻腔内、気管内、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下の経路を含むが、限定されない。
【００１９】
本発明のキメラウイルスは、対象（例えばトリ）を、キメラウイルスを投与することによって2つの感染症に対して免疫することができる。具体的実施態様において、本発明のキメラウイルスは、トリを、本発明のキメラウイルスを投与することによってトリインフルエンザウイルス及びニューカッスル病ウイルスに対して免疫することができる。トリは、キメラウイルスをそれらに吹き付けるか、又はそれらが飲む水などの水溶液にキメラウイルスを投与することによって容易に免疫することができる。
【００２０】
本発明は、部分的には、ウイルスの少なくとも１つの必須糖タンパク質の細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインと第2の感染因子のタンパク質の外部ドメインとを含む融合タンパク質をそのビリオン内に発現し、かつ組み込むようにインフルエンザウイルスを操作し、融合タンパク質が機能的に必須糖タンパク質を置換することにより、2つの感染因子に対する有効な免疫応答を達成することができるという出願人の発見に基づいている。一つの態様において、ビリオンへの融合タンパク質の組み込みは、第2の感染因子の外部ドメインに対する免疫応答の増強を生じる。融合タンパク質内にウイルスの必須糖タンパク質の細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインを操作することにより、融合タンパク質をビリオン内に組み込むことができる。特定の実施態様において、必須糖タンパク質は、インフルエンザウイルスHA及び／若しくはNAタンパク質の一方又は両方である。別の実施態様において、必須糖タンパク質は、NDVのHN若しくはFタンパク質の一方又は両方である。ウイルスの少なくとも１つの必須糖タンパク質の機能的置換により、ウイルスゲノム（例えば、インフルエンザウイルスゲノム）におけるサイズ制限に対する懸念が排除される。特定の実施態様において、ウイルスの少なくとも１つの必須糖タンパク質の融合タンパク質との機能的置換により、対象におけるウイルス複製が減弱する。
【００２１】
本発明は、（ii）インフルエンザウイルスの必須遺伝子によってコードされる糖タンパク質の細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインに融合された（i）インフルエンザウイルス以外の感染因子の感染防御抗原の外部ドメインを有するキメラトリインフルエンザウイルスであって、融合タンパク質がトリインフルエンザウイルスに組み込まれており、必須遺伝子の機能が融合タンパク質によって、又はトリインフルエンザウイルスに天然の糖タンパク質によって供給される融合タンパク質を含む、前記キメラトリインフルエンザウイルスを提供する。特定の実施態様において、インフルエンザウイルスの必須遺伝子は、赤血球凝集素遺伝子である。その他の実施態様において、インフルエンザウイルスの必須遺伝子は、ノイラミニダーゼ（NA）遺伝子である。特定の実施態様において、キメラトリインフルエンザウイルスは、弱毒化されている。これらの実施態様によれば、キメラトリインフルエンザウイルスは、NS1遺伝子の突然変異によって弱毒化されていてもよい。
【００２２】
本発明は、（ii）インフルエンザウイルスNAタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに融合された（i）NDV HNタンパク質の外部ドメインを有するキメラトリインフルエンザウイルスであって、融合タンパク質がトリインフルエンザウイルスに組み込まれており、NAタンパク質の機能が融合タンパク質によって、又はトリインフルエンザウイルスに天然の糖タンパク質によって供給される融合タンパク質を含む、前記キメラトリインフルエンザウイルスを提供する。特定の実施態様において、キメラトリインフルエンザウイルスは、弱毒化されている。これらの実施態様によれば、キメラトリインフルエンザウイルスは、NS1遺伝子の突然変異によって弱毒化されていてもよい。本発明によれば、任意のトリインフルエンザウイルス型、サブタイプ又は株を使用してもよい。
【００２３】
本発明は、ノイラミニダーゼ融合タンパク質をコードするパッケージされたインフルエンザウイルスNAセグメントを含むキメラトリインフルエンザウイルスであって、NAオープンリーディングフレームは、NA外部ドメインをコードするヌクレオチドがN末端によってアンカーされているインフルエンザ以外の感染因子のノイラミニダーゼ抗原の外部ドメインをコードするヌクレオチドによって置換されるように修飾されており、その結果ノイラミニダーゼ融合タンパク質がキメラトリインフルエンザウイルス内に発現され、かつ組み込まれる、前記キメラトリインフルエンザウイルスを提供する。
【００２４】
本発明は、赤血球凝集素融合タンパク質をコードするパッケージされたインフルエンザウイルスHAセグメントを含むキメラトリインフルエンザウイルスであって、HAオープンリーディングフレームは、HA外部ドメインをコードするヌクレオチドがC末端によってアンカーされているインフルエンザ以外の感染因子の受容体結合／融合抗原の外部ドメインをコードするヌクレオチドによって置換されるように修飾されており、その結果赤血球凝集素融合タンパク質がキメラトリインフルエンザウイルス内に発現され、かつ組み込まれる、前記キメラトリインフルエンザウイルスを提供する。
【００２５】
本発明は、パッケージされたバイシストロニックインフルエンザウイルスHAセグメントを含むキメラトリインフルエンザウイルスであって：（a）トリインフルエンザウイルス赤血球凝集素タンパク質をコードする第1のオープンリーディングフレーム；及び（b）赤血球凝集素外部ドメインをコードするヌクレオチドが、C−末端によってアンカーされているインフルエンザ以外の感染因子の感染防御抗原の外部ドメインをコードするか、又は疾患抗原をコードするヌクレオチドによって置換されている赤血球凝集素融合タンパク質をコードする第2のオープンリーディングフレーム；を含み、その結果、インフルエンザ赤血球凝集素及び融合タンパク質の両方がキメラトリインフルエンザウイルス内に発現され、かつ組み込まれる、前記キメラトリインフルエンザウイルスを提供する。特定の実施態様において、キメラトリウイルスのHAセグメントの第1のオープンリーディングフレームは、赤血球凝集素多塩基切断部位を除去するように修飾されている。
【００２６】
本発明は、パッケージされたバイシストロニックインフルエンザウイルスNAセグメントを含むキメラトリインフルエンザウイルスであって：（a）トリインフルエンザウイルスノイラミニダーゼタンパク質をコードする第1のオープンリーディングフレーム、及び（b）ノイラミニダーゼ外部ドメインをコードするヌクレオチドが、N末端によってアンカーされているインフルエンザ以外の感染因子の感染防御抗原の外部ドメインをコードするか、又は疾患抗原をコードするヌクレオチドによって置換されているノイラミニダーゼ融合タンパク質をコードする第2のオープンリーディングフレーム；を含み、その結果、インフルエンザノイラミニダーゼ及び融合タンパク質の両方がキメラトリインフルエンザウイルス内に発現され、かつ組み込まれる、前記キメラトリインフルエンザウイルスを提供する。特定の実施態様において、キメラトリインフルエンザウイルスは、赤血球凝集素多塩基切断部位を除去するように修飾されたオープンリーディングフレームを有するHAセグメントを含む。
【００２７】
本発明は、ノイラミニダーゼ融合タンパク質をコードするパッケージされたインフルエンザウイルスNAセグメントを含むキメラトリインフルエンザウイルスであって、NAオープンリーディングフレームは、NA外部ドメインをコードするヌクレオチドが、NDVのHN抗原の外部ドメインをコードするヌクレオチドによって置換されるように修飾されており、その結果ノイラミニダーゼ融合タンパク質がキメラトリインフルエンザウイルス内に発現され、かつ組み込まれる、前記キメラトリインフルエンザウイルスを提供する。ノイラミニダーゼ融合タンパク質は、キメラトリインフルエンザウイルスに対してノイラミニダーゼ活性を供給する。
【００２８】
特定の実施態様において、本発明のキメラトリインフルエンザウイルスは、ウイルスの細胞インターフェロンアンタゴニスト活性を減少させる修飾されたNS1タンパク質をコードするパッケージされたNS1遺伝子セグメントを含む。修飾されたNS1タンパク質を生じるNS1遺伝子における突然変異の非限定的な例は、下の第5.1.2節に提供してある。
本発明は、本発明のキメラトリインフルエンザウイルスのNAセグメントをコードする組換え核酸分子（例えば、組換えDNA分子）を提供する。また、本発明は、本発明のキメラトリインフルエンザウイルスのHAセグメントをコードする組換え核酸分子（例えば、組換えDNA分子）を提供する。本発明は、更に、本発明のキメラトリインフルエンザウイルスのNAセグメント又はHAセグメントをコードする組換え核酸分子（例えば、組換えRNA分子）を提供する。
【００２９】
本発明は、孵化鶏卵又はトリインフルエンザウイルス感染に感受性である株化細胞において、キメラトリインフルエンザウイルスを培養することを含む、本発明のキメラトリインフルエンザウイルスを増殖するための方法を提供する。また、本発明は、免疫原性製剤を製造するための方法であって、該方法は：（a）孵化鶏卵又はトリインフルエンザウイルス感染に感受性である株化細胞において本発明のキメラトリインフルエンザウイルスを増殖させること；及び（b）子孫ウイルスを収集すること；を含み、ウイルスは、子孫ウイルスが免疫原性製剤、例えばワクチン製剤に使用するために適するように、十分な量で、かつウイルスが汚染されない十分な条件下で培養される、前記方法を提供する。
【００３０】
本発明は、（ii）インフルエンザウイルスの必須遺伝子によってコードされる糖タンパク質の細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインに融合された（i）インフルエンザウイルス以外の感染因子の感染防御抗原の外部ドメインを有する融合タンパク質を含む弱毒キメラインフルエンザウイルスであって、融合タンパク質は、弱毒インフルエンザウイルスに組み込まれており、必須遺伝子の機能は、融合タンパク質によって、又は弱毒インフルエンザウイルスに対して天然の糖タンパク質によって供給される融合タンパク質を含む、前記弱毒キメラインフルエンザウイルスを提供する。特定の実施態様において、インフルエンザウイルスの必須遺伝子は、赤血球凝集素（HA）遺伝子である。その他の実施態様において、インフルエンザウイルスの必須遺伝子は、ノイラミニダーゼ（NA）遺伝子である。弱毒キメラインフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルスの任意のタイプ、サブタイプ又は株であってもよい。例えば、弱毒キメラインフルエンザウイルスは、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス又はインフルエンザCウイルスであってもよい。
【００３１】
本発明は、ノイラミニダーゼ融合タンパク質をコードする、パッケージされたインフルエンザウイルスNAセグメントを含む弱毒キメラインフルエンザウイルスであって、NAオープンリーディングフレームは、NA外部ドメインをコードするヌクレオチドがN末端によってアンカーされているインフルエンザ以外の感染因子のノイラミニダーゼ抗原の外部ドメインをコードするヌクレオチドによって置換されるように修飾されており、その結果ノイラミニダーゼ融合タンパク質が弱毒キメラインフルエンザウイルス内に発現され、かつ組み込まれる、前記弱毒キメラインフルエンザウイルスを提供する。特定の実施態様において、本発明の弱毒キメラインフルエンザウイルスは、赤血球凝集素多塩基切断部位を除去するように修飾されたオープンリーディングフレームを有するHAセグメントを含む。
【００３２】
本発明は、赤血球凝集素融合タンパク質をコードする、パッケージされたインフルエンザウイルスHAセグメントを含む弱毒キメラインフルエンザウイルスであって、HAオープンリーディングフレームは、HA外部ドメインをコードするヌクレオチドが、C末端によってアンカーされているインフルエンザ以外の感染因子の受容体結合／融合抗原の外部ドメインをコードするヌクレオチドによって置換されるように修飾されており、その結果赤血球凝集素融合タンパク質が弱毒キメラインフルエンザウイルス内に発現され、かつ組み込まれる、前記弱毒キメラインフルエンザウイルスを提供する。
【００３３】
本発明は、パッケージされたバイシストロニックインフルエンザウイルスHAセグメントを含む、弱毒キメラトリインフルエンザウイルスであって：（a）トリインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質をコードする第1のオープンリーディングフレーム；及び（b）赤血球凝集素外部ドメインをコードするヌクレオチドが、C末端によってアンカーされているインフルエンザ以外の感染因子の感染防御抗原の外部ドメインをコードするか、又は疾患抗原をコードするヌクレオチドによって置換されている赤血球凝集素融合タンパク質をコードする第2のオープンリーディングフレーム；を含み、その結果、インフルエンザ赤血球凝集素及び融合タンパク質の両方が弱毒キメラインフルエンザウイルス内に発現され、かつ組み込まれる、前記弱毒キメラインフルエンザウイルスを提供する。特定の実施態様において、弱毒キメラインフルエンザウイルスのHAセグメントの第1のオープンリーディングフレームは、赤血球凝集素多塩基切断部位を除去するように修飾されている。
【００３４】
本発明は、パッケージされたバイシストロニックインフルエンザウイルスNAセグメントを含む、弱毒キメラインフルエンザウイルスであって：（a）トリインフルエンザノイラミニダーゼタンパク質をコードする第1のオープンリーディングフレーム；及び（b）ノイラミニダーゼ外部ドメインをコードするヌクレオチドが、N末端によってアンカーされているインフルエンザ以外の感染因子の感染防御抗原の外部ドメインをコードするか、又は疾患抗原をコードするヌクレオチドによって置換されているノイラミニダーゼ融合タンパク質をコードする第2のオープンリーディングフレーム、を含み、その結果、インフルエンザノイラミニダーゼ及び融合タンパク質の両方が弱毒キメラインフルエンザウイルス内に発現され、かつ組み込まれる、前記弱毒キメラインフルエンザウイルスを提供する。特定の実施態様において、本発明の弱毒キメラインフルエンザウイルスは、赤血球凝集素多塩基切断部位を除去するように修飾されたオープンリーディングフレームを有するHAセグメントを含む。
【００３５】
特定の実施態様において、本発明の弱毒キメラインフルエンザウイルスは、ウイルスの細胞性インターフェロンアンタゴニスト活性を減少させる修飾されたNS1タンパク質をコードするパッケージされたNS1遺伝子セグメントを含む。
本発明は、本発明の弱毒キメラインフルエンザウイルスのNAセグメントをコードする組換え核酸分子（例えば、組換えDNA分子）を提供する。また、本発明は、本発明の弱毒キメラインフルエンザウイルスのHAセグメントをコードする組換え核酸分子（例えば、組換えDNA分子）を提供する。本発明は、更に、本発明の弱毒キメラインフルエンザウイルスのNAセグメント又はHAセグメントをコードする組換え核酸分子（例えば、組換えRNA分子）を提供する。
【００３６】
本発明は、孵化鶏卵又はインフルエンザウイルス感染に感受性の株化細胞において、弱毒キメラインフルエンザウイルスを培養することを含む、本発明の弱毒キメラインフルエンザウイルスを増殖させるための方法を提供する。また、本発明は、免疫原性製剤を産生するための方法であって、該方法は：（a）孵化鶏卵又は弱毒インフルエンザウイルス感染に感受性である株化細胞において本発明の弱毒キメラインフルエンザウイルスを増殖させること；及び（b）子孫ウイルスを収集すること；を含み、ウイルスは、子孫ウイルスが免疫原性製剤、例えばワクチン製剤に使用するために適するように、十分な量で、かつウイルスが汚染されない十分な条件下で培養される、前記方法を提供する。
【００３７】
また、本発明は、キメラNDVウイルスを提供する。特に、本発明は、（ii）NDVの必須遺伝子によってコードされる糖タンパク質の細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインに融合された（i）NDV以外の感染因子の感染防御抗原の外部ドメインを有するキメラNDVであって、融合タンパク質がNDVに組み込まれており、必須遺伝子の機能が融合タンパク質によって、又はNDVに対して天然の糖タンパク質によって供給される融合タンパク質を含むキメラNDVを提供する。特定の実施態様において、NDVの必須NDV遺伝子は、Fタンパク質をコードする遺伝子である。その他の実施態様において、NDVの必須NDV遺伝子は、HNタンパク質をコードする遺伝子である。本発明によれば、任意のNDVタイプ、サブタイプ又は株を使用することができる。
【００３８】
本発明は、Fタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン、並びにC末端によってアンカーされているNDV以外の感染因子の感染防御抗原の外部ドメイン又は疾患抗原を有するFタンパク質-融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むパッケージされたゲノムを含み、その結果Fタンパク質-融合タンパク質がキメラNDV内に発現され、かつ組み込まれる、キメラNDVを提供する。特定の実施態様において、キメラNDVのゲノムには、NDV Fタンパク質-融合タンパク質に加えて、Fタンパク質がキメラNDV内に発現されて、組み込まれるようにFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。その他の実施態様において、NDV Fタンパク質-融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、NDV Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を置換し、かつFタンパク質-融合タンパク質は、キメラNDVに対してFタンパク質の機能を供給する。
【００３９】
本発明は、HNタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン、並びにN末端によってアンカーされているNDV以外の感染因子の感染防御抗原の外部ドメイン又は疾患抗原とを有するHN融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むパッケージされたゲノムを含み、その結果HN融合タンパク質がキメラNDV内に発現され、かつ組み込まれる、キメラNDVを提供する。特定の実施態様において、キメラNDVのゲノムは、HNタンパク質を発現して、NDV HN融合タンパク質に加えてキメラNDVに組み込まれるように、HNタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。その他の実施態様において、HN融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、NDV HNタンパク質をコードするヌクレオチド配列を置換し、かつHN融合タンパク質は、キメラNDVに対してHNタンパク質の機能を供給する。本発明は、NDV HNタンパク質又はFタンパク質をコード化し、及び／又はコードする組換え核酸分子を提供する。
【００４０】
本発明は、孵化鶏卵又はNDV感染に感受性である株化細胞においてキメラNDVを培養することを含む、本発明のキメラNDVを増殖させるための方法を提供する。また、本発明は、免疫原性製剤を産生するための方法であって、該方法は：（a）孵化鶏卵又はNDV感染に感受性である株化細胞において本発明のキメラNDVを増殖させること；及び（b）子孫ウイルスを収集すること；を含み、ウイルスは、子孫ウイルスが免疫原性製剤、例えばワクチン製剤に使用するために適するように、十分な量で、かつウイルスが汚染されない十分な条件下で培養される、前記方法を提供する。
本発明は、本発明のキメラウイルスを含む孵化鶏卵を提供する。また、本発明は、本発明のキメラウイルスを含む株化細胞を提供する。本発明は、更に、本発明のキメラウイルスを含む免疫原性製剤を提供する。
【００４１】
本発明は、対象における1つ、2つ又はそれ以上の感染因子に対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明のキメラインフルエンザウイルスの有効量を投与することを含む、前記方法を提供する。特定の実施態様において、対象は、ヒト対象である。その他の実施態様において、対象は、非ヒト哺乳類（例えば、ブタ、ウマ、イヌ又はネコ）である。更にその他の実施態様において、対象は、トリ対象である。具体的実施態様において、本発明は、トリにおいて1つ、2つ又はそれ以上の感染因子に対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明のキメラトリインフルエンザウイルスの有効量を投与することを含む、前記方法を提供する。
【００４２】
本発明は、対象における1つ、2つ又はそれ以上の感染因子に対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に対して本発明のキメラNDVの有効量を投与することを含む、前記方法を提供する。特定の実施態様において、対象は、ヒト対象である。その他の実施態様において、対象は、非ヒト哺乳類（例えば、ブタ、ウマ、イヌ又はネコ）である。更にその他の実施態様において、対象は、トリ対象である。具体的実施態様において、本発明は、トリにおける1つ、2つ又はそれ以上の感染因子に対する免疫応答を誘導する方法であって、トリに対して本発明のキメラNDVの有効量を投与することを含む、前記方法を提供する。
【００４３】
本発明は、対象における1つ、2つ又はそれ以上の感染因子に対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に対して本発明の弱毒キメラインフルエンザウイルスの有効量を投与することを含む、前記方法を提供する。特定の実施態様において、対象は、ヒト対象である。その他の実施態様において、対象は、非ヒト哺乳類（例えば、ブタ、ウマ、イヌ又はネコ）である。更にその他の実施態様において、対象は、トリの対象である。具体的実施態様において、本発明は、ヒトにおける1つ、2つ又はそれ以上の感染因子に対する免疫応答を誘導する方法であって、その必要のあるヒトに対して本発明のキメラウイルスの有効量を投与することを含む、前記方法を提供する。
本発明は、疾患抗原に対する免疫応答を誘導するための方法であって、対象に対して本発明のキメラウイルスの有効量を投与することを含む、前記方法を提供する。特定の実施態様において、対象は、ヒトである。その他の実施態様において、対象は、トリである。
【００４４】
（3.1 用語法）
本明細書に使用される「動物」という用語には、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ及びネコ）、動物園動物、家畜（例えば、反芻動物、非反芻動物、家畜（livestock）及び家禽（fowl））、野生動物及び実験動物（例えば、ラット、マウス及びモルモットなどの齧歯類、並びにウサギ）、並びにクローン化され、又は遺伝的若しくはその他のいずれかの修飾された動物（例えば、トランスジェニック動物）を含むが、限定されない。
本明細書に使用される「約」又は「およそ」という用語は、数と組み合わせて使用されるときは、言及した数の1、5又は10%以内の任意の数をいう。
【００４５】
本明細書に使用されるNS1の「アミノ末端」という句は、インフルエンザウイルスNS1タンパク質のアミノ末端のアミノ酸残基（アミノ酸残基1）〜アミノ酸残基115、アミノ酸残基1〜100、アミノ酸残基1〜75、アミノ酸残基1〜50、アミノ酸残基1〜25又はアミノ酸残基1〜10のアミノ酸をいう。アミノ末端からの欠失は、NS1のアミノ末端からの5、好ましくは10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、73、75、80、85、90、95、99、100、105、110、115、120、125、126、130、135、140、145、150、155、160、165、170又は175アミノ酸残基からなる欠失を含み得る。
【００４６】
本明細書に使用される、NS1の「カルボキシ末端」という句は、NS1のアミノ末端がそれぞれインフルエンザウイルスNS1タンパク質のアミノ酸残基1〜アミノ酸残基115、アミノ酸残基1〜100、アミノ酸残基1〜75、アミノ酸残基1〜50又はアミノ酸残基1〜25であるときに、ウマインフルエンザウイルスのNS1タンパク質のアミノ酸残基116〜カルボキシ末端アミノ酸残基、アミノ酸残基101〜カルボキシ末端アミノ酸残基、アミノ酸残基76〜カルボキシ末端アミノ酸残基、アミノ酸残基51〜カルボキシ末端アミノ酸残基又はアミノ酸残基26〜カルボキシ末端アミノ酸残基をいう。カルボキシ末端からの欠失は、NS1のカルボキシ末端からの5、好ましくは10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、73、75、80、85、90、95、99、100、105、110、115、120、125、126、130、135、140、145、150、155、160、165、170又は175アミノ酸残基からなる欠失を含み得る。
【００４７】
本明細書に使用される「疾患」及び「障害」という用語は、対象における状態をいうために同義的に使用され、増殖性障害（例えば、白血病、線維症、癌腫（悪性、非悪性、転移性及び非転移性の癌腫を含む）及びリンパ腫）、及び感染因子（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫）による感染、又はこれらに関連した状態若しくは症候を包含するが、限定されない。
本明細書に使用される「エピトープ」という用語は、対象における抗原性又は免疫原性活性を有する分子（例えば、ポリペプチド又はタンパク質）の部位、断片又は領域をいう。免疫原性活性を有するエピトープは、対象における抗体反応を誘発する分子（例えば、ポリペプチド又はタンパク質）の部位、断片又は領域である。抗原性活性を有するエピトープは、当業者に周知の任意の方法によって、例えば免疫アッセイ法によって決定される、抗体が免疫特異的に結合する分子の部位、断片又は領域である。
【００４８】
本明細書に使用される「断片」という用語は、タンパク質性因子の文脈において、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも2つの隣接するアミノ酸残基、少なくとも5つの隣接するアミノ酸残基、少なくとも10個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも15個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも20個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも25個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも40個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも50個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも60個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも70個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも80個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも90個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも100個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも125個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも150個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも175個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも200個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも250個の隣接するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドをいう。一つの実施態様において、全長タンパク質の断片は、全長タンパク質の活性を保持する。別の実施態様において、全長タンパク質の断片は、全長タンパク質の活性を保持しない。
【００４９】
本明細書に使用される「断片」という用語は、ポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸の文脈において、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列の少なくとも2つの隣接するヌクレオチド、少なくとも5つの隣接するヌクレオチド、少なくとも10個の隣接するヌクレオチド、少なくとも15個の隣接するヌクレオチド、少なくとも20個の隣接するヌクレオチド、少なくとも25個の隣接するヌクレオチド、少なくとも30個の隣接するヌクレオチド、少なくとも35個の隣接するヌクレオチド、少なくとも40個の隣接するヌクレオチド、少なくとも50個の隣接するヌクレオチド、少なくとも60個の隣接するヌクレオチド、少なくとも70個の隣接するヌクレオチド、少なくとも隣接する80個のヌクレオチド、少なくとも90個の隣接するヌクレオチド、少なくとも100個の隣接するヌクレオチド、少なくとも125個の隣接するヌクレオチド、少なくとも150個の隣接するヌクレオチド、少なくとも175個の隣接するヌクレオチド、少なくとも200個の隣接するヌクレオチド、少なくとも250個の隣接するヌクレオチド、少なくとも300個の隣接するヌクレオチド、少なくとも350個の隣接するヌクレオチド又は少なくとも380個の隣接するヌクレオチドの核酸配列を含む核酸をいう。好ましい実施態様において、核酸の断片は、全長タンパク質の活性を保持するペプチド又はポリペプチドをコードする。好ましい実施態様において、核酸の断片は、全長タンパク質の活性を保持するペプチド又はポリペプチドをコードする。別の実施態様において、全長タンパク質の断片は、全長タンパク質の活性を保持しない。
【００５０】
本明細書に使用される「異種配列」という用語は、タンパク質性因子の文脈において、キメラウイルスバックボーン又は特にキメラウイルス糖タンパク質に関して、天然において見いだされない分子をいう。「異種配列」という用語は、核酸配列又は核酸分子の状況において、キメラウイルスバックボーンのゲノムに関して、天然において見いだされない分子をいう。
【００５１】
本明細書に使用される「抗原に免疫特異的に結合する」という用語及び類似の用語は、抗原と特異的に結合し、かつ別の分子と特異的に結合しない分子（例えば、修飾抗体（すなわち、修飾されたIgG（例えば、IgG1）定常ドメイン又はそのFcRn-結合断片（例えば、Fcドメイン又はヒンジ-Fcドメイン）を含む抗体））及び修飾されていない抗体（すなわち、修飾されたIgG（例えば、IgG1）定常ドメイン又はそのFcRn結合断片（例えば、Fc-ドメイン又はヒンジ-Fcドメイン）を含まない抗体）の両方を含む抗原特異的抗体）をいう。抗原に特異的に結合する分子は、関連した抗原と交差反応性であってもよい。好ましくは、1つの抗原に特異的に結合する分子は、その他の抗原と交差反応しない。抗原に特異的に結合する分子は、例えば免疫アッセイ法、BIAcore又は当業者に公知のその他の技術によって同定することができる。分子は、放射免疫アッセイ法（RIA）及び酵素結合抗体免疫吸着アッセイ法（ELISA）などの実験法を使用して決定すると、それが任意の交差反応性抗原に対するよりも高い親和性で前記抗原に結合するときに、抗原に特異的に結合する。抗体特異性に関する考察に関しては、例えばPaul編、基礎免疫学第二版、Raven出版、ニューヨークのページ332-336（Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York at pages 332-336）を参照されたい。
【００５２】
本明細書に使用される「組み合わせて」という用語は、対象に対する療法（療法群）の投与の文脈において、複数の療法（例えば、複数の予防薬及び／又は治療薬）の使用をいう。「組み合わせて」という用語の使用は、療法（例えば、予防薬及び／又は治療薬）が対象（例えば、インフルエンザウイルス感染及びNDV感染又はそれに関連した状態若しくは症候を伴う対象、又は別の感染（例えば、別のウイルス感染）を伴う対象）に投与される順序を制限しない。第1の療法（例えば、第1の予防薬又は治療薬）は、対象（例えば、インフルエンザウイルス感染及びNDV感染又はそれに関連した状態若しくは症候を伴う対象、又は別の感染（例えば、別のウイルス感染）を伴う対象）に対する第2の療法（例えば、第2の予防薬又は治療薬）の投与前に（例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週又は12週前に）、投与と同時に、又は投与後に（例えば5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週又は12週後に）投与することができる。
【００５３】
本明細書に使用されるタンパク質性因子の「インターフェロンアンタゴニスト活性」という句は、細胞のインターフェロン免疫応答を減少させ、又は阻害するタンパク質若しくはポリペプチド又はその断片、誘導体若しくは類似体をいう。特に、インターフェロンアンタゴニスト活性を有するタンパク質若しくはポリペプチド、又はその断片、誘導体若しくは類似体（例えば、インフルエンザウイルスNS1）は、インターフェロンの発現及び／若しくは活性を減少させ、又は阻害する。具体的実施態様において、「インターフェロンアンタゴニスト活性」という句は、細胞のインターフェロン免疫応答を減少し、又は阻害するウイルスタンパク質若しくはポリペプチド又はその断片、誘導体若しくは類似体（例えば、インフルエンザウイルスタンパク質）をいう。インターフェロンアンタゴニスト活性をもつウイルスタンパク質又はポリペプチドは、好ましくはインターフェロン（IFN）の1つ若しくは2つのタイプの発現及び／又は活性に影響を及ぼし得る。一つの実施態様において、IFN-αの発現及び／又は活性が影響を受ける。別の実施態様において、IFN-βの発現及び／又は活性が影響を受ける。別の特定の実施態様において、IFN-γの発現及び／又は活性が影響を受ける。特定の実施態様において、孵化鶏卵又は細胞におけるIFN-α、IFN-β及び／若しくはIFN-γの発現並びに／又は活性は、本明細書に記述されているか、又は当業者に公知の技術によって測定されるように、このようなタンパク質性因子を発現していないか、若しくは接触させていない対照孵化鶏卵又は細胞における、IFN-α、IFN-β及び／若しくはIFN-γの発現並びに／又は活性と比較して、インターフェロンアンタゴニスト活性をもつタンパク質性因子より、およそ1〜およそ100倍、およそ5〜およそ80倍、およそ20〜およそ80倍、およそ1〜およそ10倍、およそ1〜およそ5倍、およそ40〜およそ80倍又は1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95若しくは100倍減少される。
【００５４】
本明細書に使用される「IFN欠損した系」又は「IFN欠損した基質」という句は、1つ、2つ若しくはそれ以上のIFNのタイプを産生しないか、又はいずれのタイプのIFNも産生しないか、又は低レベルの1つ、2つ若しくはそれ以上のIFNのタイプを産生するか、又は低レベルの任意のIFNを産生するか（すなわち、同じ条件下におけるIFNコンピテントな系と比較して5〜10%、10〜20%、20〜30%、30〜40%、40〜50%、50〜60%、60〜70%、70〜80%、80〜90%、又はそれ以上の任意のIFN発現の減少）、1つ、2つ若しくはそれ以上のIFNのタイプに反応しないか、若しくはあまり効率的に反応しないか、又はIFNのいずれのタイプに対しても反応しないか、及び／又は1つ、2つ若しくはそれ以上のIFNによって誘導されるか、若しくはIFNのいずれのタイプによっても誘導される抗ウイルス遺伝子の活性が欠損している系、例えば細胞、株化細胞及びマウス、ニワトリ、シチメンチョウ、ウサギ、ラット、ウマなどの動物をいう。
【００５５】
本明細書に使用される「感染」、「インフルエンザ感染」、「トリインフルエンザ感染」及び「NDV感染」という用語は、対象における、インフルエンザウイルスの（トリインフルエンザウイルスの）、NDVの、又は別の感染因子の（例えば、別のウイルスの、又は細菌感染）ライフサイクルのすべての段階（細胞又は体組織における、インフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、NDV又はその他の感染因子による浸潤及び複製を含むが限定されない）、並びにインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス又はNDVによる浸潤及び複製によって生じている病理学的状態をいう。インフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、NDV又はその他の感染因子の浸潤及び増殖は、以下の工程を含むが、限定されない：細胞に対するウイルス（例えば、インフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス又はNDV粒子）のドッキング、細胞膜とウイルスの融合、細胞内へのウイルス遺伝子情報の導入、ウイルスタンパク質（例えば、インフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス又はNDVタンパク質）の発現、新たなウイルス粒子（すなわち、インフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス又はNDV粒子）の産生及び細胞からのウイルス（例えば、インフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス又はNDV粒子）の放出。呼吸器感染（例えば、インフルエンザウイルス又はNDV感染）は、上気道感染（URI）、下気道感染（LRI）又はこれらの組み合わせであってもよい。具体的実施態様において、感染は、一次感染（例えば、ウイルス性肺炎）の発病の後に顕在化する二次感染（例えば、続発性肺炎）である。二次感染は、一次感染又はそれと関連した症候若しくは状態により生じ、感染対象をこのような二次感染にさせる。具体的実施態様において、インフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス又はNDVによる浸潤及び複製により生じる病理状態は、急性のインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス又はNDV疾患である。呼吸器感染の急性期は、肺炎及び／又は細気管支炎として顕在化し得るし、このような症候には、低酸素、無呼吸、呼吸困難、迅速呼吸、喘鳴、チアノーゼなどを含むであろう。呼吸器感染（例えば、インフルエンザウイルス及びNDV感染）の急性期は、入院、酸素の投与、挿管及び／又は人工呼吸などの医療行為を罹患者に行うことが必要である。
【００５６】
本明細書に使用される「単離された」という用語は、ウイルスの文脈において、単一の親ウイルスに由来するウイルスをいう。ウイルスは、プラーク精製及び限界希釈に基づいたものを含むが、限定されない当業者に公知のルーチン法を使用して単離することができる。
本明細書に使用される「単離された」という用語は、核酸分子の文脈において、核酸分子の天然の供与源に存在するその他の核酸分子から分離された核酸分子をいう。更に、前駆体又はその他の化学物質を組換え技術によって、又は実質的に化学物質皆無にする化学的に合成されるときに産生するときに、「単離された」核酸分子（例えば、cDNA分子）はその他の細胞性物質又は培地で実質的になくなることができる。好ましい実施態様において、ウイルスタンパク質をコードする核酸分子は、単離されている。
【００５７】
本明細書に使用される「管理する」、「管理すること」及び「管理」という用語は、疾患（例えば、感染）の治癒を生じない、対象が療法（例えば、予防薬又は治療薬）から引き出す有益効果をいう。特定の実施態様において、対象には、感染の進行又は悪化を予防するために、インフルエンザウイルス感染、トリインフルエンザウイルス若しくはNDV感染、又は別の感染性因子での感染、その1つ以上の症候、又はインフルエンザウイルス感染若しくはNDV感染若しくは別の感染因子での感染に関連する状態、これらによって増強される状態、若しくはこれらを増強する状態を「管理する」ために、1つ以上の療法（例えば、本発明の抗体などの予防薬又は治療薬）が投与される。
【００５８】
本明細書に使用される「感染効率」又は「MOI」という句は、感染細胞あたりのウイルスの平均数である。MOIは、添加したウイルスの数（添加したml×Pfu）を添加した細胞の数（添加したml×細胞/ml）で割ることによって決定される。
本明細書に使用される「NS1遺伝子」という句は、インフルエンザの非構造タンパク質（NS1）をコードする遺伝子をいう。NS1は、インフルエンザA型及びその他のウイルスのセグメント化したゲノムによってコードされる8分子の1つのである。「NS1遺伝子産物」は、NS1遺伝子によってコードされる遺伝子産物（例えば、RNA又はタンパク質）をいう。タンパク質の場合、NS1遺伝子産物は、全長であり、野生型NS1活性（例えば、株A/WSN/33由来）を有する。
【００５９】
本明細書に使用される「核酸」、「ヌクレオチド配列」及び「核酸分子という用語」には、DNA分子（例えば、cDNA又はゲノムDNA）、RNA分子（例えば、mRNA）、DNA及びRNA分子の組み合わせ又はハイブリッドDNA／RNA分子、並びにDNA又はRNA分子の類似体を含む。このような類似体は、例えばイノシン又はトリチル化された塩基を含むが、限定されないヌクレオチド類似体を使用して産生することができる。また、このような類似体には、分子に有益な性状、例えばヌクレアーゼ耐性又は細胞膜を超える能力の増大などを与える修飾されたバックボーンを含むDNA又はRNA分子を含むことができる。核酸又はヌクレオチド配列は、一本鎖、二本鎖であることができ、一本鎖及び二本鎖部分を含んでいてもよく、かつ三本鎖部分を含んでいてもよいが、好ましくは二本鎖DNAである。
【００６０】
本明細書に使用される「予防する」、「予防すること」及び「予防」という用語は、療法（例えば、予防薬又は治療薬）の投与の結果として、対象における疾患（例えば、ウイルス感染又はその他の感染）の1つ以上の症候の再発若しくは発病の予防又は減少をいう。例えば、対象に対する感染のための療法の投与の状況において、「予防する」、「予防すること」及び「予防」は、療法（例えば、予防薬又は治療薬）の投与又は療法の組み合わせ（例えば、予防薬又は治療薬の組み合わせ）の投与により生じる、対象における感染（例えば、インフルエンザウイルス感染、NDV感染若しくはこれらと関連した状態又はインフルエンザウイルス若しくはNDV感染若しくはこれらと関連した状態以外の感染）の発症若しくは発病の阻害又は減少、或いは感染（例えば、インフルエンザウイルス感染、NDV感染若しくはこれらに関連した状態又はインフルエンザウイルス感染、NDV感染若しくはこれらと関連した状態以外の感染）の1つ以上の症候の再発、発病又は発症の予防をいう。
【００６１】
本明細書に使用される「感染防御抗原」という用語は、感染因子の文脈において、対象に投与されたときに、防御免疫応答を誘発することができ、感染因子に対して免疫応答が向けられる任意の分子を含む。
本明細書に使用される「予防薬」及び「予防薬類」という用語は、疾患（例えば、感染）の予防又はその症候（例えば、インフルエンザウイルス感染、NDV感染、若しくはこれらと関連した状態、若しくは症候又はNDV感染のインフルエンザウイルス以外の感染若しくはこれらと関連した状態若しくは症候）に使用することができる任意の薬剤をいう。好ましくは、予防薬は、疾患又はその症候（例えば、感染又はこれらと関連した状態若しくは症候）の発病、発症、進行及び／又は重症度を予防し、又は妨げるために有用であることが公知であるか、そのために使用されてきたか、又は現在使用されている薬剤である。
【００６２】
本明細書に使用される「精製された」という句は、ウイルスの文脈において、ウイルスが由来する細胞又は組織源からの細胞性物質及び培地を実質的に含まないウイルスをいう。「実質的に細胞性物質を含まない」という語は、ウイルスが、それが単離され、又は組換えで産生される細胞の細胞成分から分離されているウイルス標品を含む。従って、実質的に細胞性物質を含まないウイルスは、細胞タンパク質（また、本明細書において、「混入タンパク質」とも称される）の約30%、20%、10%又は5%（乾燥重量による）未満を有するタンパク質標品を含む。また、ウイルスは、培地を実質的に含まず、すなわち培地は、ウイルス標品の体積の約20%、10%又は5%未満ということになる。ウイルスは、クロマトグラフィー及び遠心分離を含むが、限定されない当業者に公知のルーチン法を使用して精製することができる。
【００６３】
本明細書に使用される「対象」又は「患者」という用語は、同義的に使用される。本明細書に使用される「対象」及び「対象群」という用語は、動物（例えば、トリ、爬虫類及び哺乳類）をいう。一部の実施態様において、対象は、非霊長類（例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ウマ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット及びマウス）及び霊長類（例えば、サル、チンパンジ及びヒト）を含む哺乳類である。一部の実施態様において、対象は、非ヒト哺乳類である。その他の実施態様において、対象は、ヒトである。特定の実施態様において、哺乳類（例えば、ヒト）は、0〜6月齢、6〜12月齢、1〜5歳、5〜10歳、10〜15歳、15〜20歳、20〜25歳、25〜30歳、30〜35歳、35〜40歳、40〜45歳、45〜50歳、50〜55歳、55〜60歳、60〜65歳、65〜70歳、70〜75歳、75〜80歳、80〜85歳、85〜90歳、90〜95歳又は95〜100歳である。具体的実施態様において、対象又は患者は、トリである。特定の実施態様において、トリは、0〜3月齢、3〜6月齢、6〜9月齢、9〜12月齢、12〜15月齢、15〜18月齢又は18〜24月齢である。
【００６４】
本明細書に使用される「相乗的」という用語は、投与又は結果若しくは療法の文脈において、任意の2つ以上の単一の療法（例えば、1つ以上の予防薬又は治療薬）の相加作用よりも有効な療法（例えば、予防薬又は治療薬）の組み合わせをいう。療法の組み合わせ（例えば、予防薬又は治療薬の組み合わせ）の相乗効果により、疾患（例えば、インフルエンザウイルス感染、NDV感染若しくはこれらに関連した状態若しくは症候又はインフルエンザウイルス感染、NDV感染以外の感染若しくはこれらに関連した状態若しくは症候）をもつ対象に対する1つ以上の療法（例えば、1つ以上の予防薬又は治療薬）のより低い投薬量及び／又は前記療法のより少ない頻度での投与の使用が可能になる。より低い投薬量の療法（例えば、予防薬又は治療薬）を利用し、及び／又はより少ない頻度で前記療法を投与する能力により、予防における前記療法の有効性又は疾患（例えば、インフルエンザウイルス感染若しくはこれに関連した状態若しくは症候又はインフルエンザウイルス感染、NDV感染以外の感染若しくはこれらに関連した状態若しくは症候）の治療を減少させることのなく、対象に対する前記療法の投与に付随した毒性が減少する。加えて、相乗効果により、疾患（例えば、インフルエンザウイルス感染、NDV感染若しくはこれに関連した状態若しくは症候、又はインフルエンザウイルス感染、NDV感染以外の感染若しくはこれに関連した状態若しくは症候）の予防、管理又は治療における療法（例えば、予防薬又は治療薬）の有効性の改善を生じることができる。最後に、療法（例えば、予防薬又は治療薬）の組み合わせの相乗効果により、任意の単一療法の使用に付随した有害若しくは望まれない副作用を回避し、又は減少させてもよい。
【００６５】
本明細書に使用される「療法類」及び「療法」という用語は、疾患（例えば、癌、インフルエンザウイルス感染、NDV感染若しくはこれに関連した状態若しくは症候又はインフルエンザウイルス感染若しくはNDV感染以外の感染若しくはこれに関連した状態若しくは症候）の予防、治療、管理又は寛解に使用することができる任意のプロトコル、方法及び／又は薬剤をいうことができる。特定の実施態様において、「療法類」及び「療法」という用語は、当業者に公知の、疾患、感染又はこれらに関連した状態若しくは症候の治療、管理、予防又は寛解に有用な生物学的療法、支持療法及び／又はその他の療法をいう
【００６６】
本明細書に使用される「治療薬」及び「治療薬類」という用語は、疾患（例えば感染又は症候（例えば、インフルエンザ感染、NDV感染若しくはこれに関連した状態若しくは症候、インフルエンザウイルス感染若しくはNDV感染以外の感染若しくはこれに関連した状態若しくは症候））の予防、治療、管理又は寛解に使用することができる任意の薬剤をいう。好ましくは、治療薬は、疾患又はこれに関連した状態若しくは症候（例えば、インフルエンザ感染、NDV感染又はこれらに関連した状態若しくは症候、及びインフルエンザウイルス感染、NDV感染以外の感染又はこれらに関連した状態若しくは症候）の予防、治療、管理又は寛解のために有用であることが公知であるか、使用されてきたか、又は現在使用されている薬剤である。
【００６７】
本明細書に使用される「治療する」、「治療」及び「治療すること」という用語は、対象に対する疾患のための療法の投与の文脈において、前記疾患の症候の根絶、減少又は寛解をいう。感染（例えば、インフルエンザウイルス又はNDVウイルス）に関して、治療は、感染因子（例えば、ウイルス）の複製、感染因子（例えば、ウイルス力価における減少）の数の減少、感染（例えば、インフルエンザ感染、NDV感染又はこれらに関連した状態若しくは症候、インフルエンザウイルス感染、NDV感染以外の感染又はこれに関連した状態若しくは症候）の進行、重症度及び／若しくは期間の減少又は寛解の1つ以上の療法の投与（1つ以上の予防薬又は治療薬の投与を含むが、限定されない）により生じる1つ以上の症候の寛解の根絶又は制御をいう。癌に関して、治療は、本発明の1つ以上の治療薬の投与により生じる、原発性、局所性又は転移性の癌組織の根絶、除去、修飾又は制御をいう。特定の実施態様において、このような用語は、このような疾患をもつ対象に対する本発明の1つ以上の治療薬の投与により生じる癌の増殖を最小化すること、又は遅延させることをいう。その他の実施態様において、このような用語は、疾患を生じさせる細胞の除去をいう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
（5. 発明の詳細な説明）
本発明は、融合タンパク質を発現してビリオンに組み込まれるように操作されたキメラネガティブ鎖RNAウイルス、このようなキメラウイルスを産生するための方法、及び免疫原性製剤における、又はインビトロアッセイ法におけるこのようなウイルスの、例えば免疫原としての使用を提供する。本発明のキメラウイルスは、ビリオン表面上に、ウイルスと関連する抗原だけでなく、融合タンパク質も示すことによって特徴づけられる。
【００６９】
本発明の方法に従って操作され得るウイルスは、任意の外被ウイルスであることができる。具体的実施態様において、本発明の方法に従って操作され得るウイルスは、セグメント化又は非セグメント化ゲノム、一本鎖又は二本鎖ゲノムを有し、かつビリアルエンベロープに組み込まれた少なくとも１つの必須糖タンパク質（例えば、NA、HA、HN又はF）を発現する。本発明の方法に従って使用するためのウイルスは、天然に存在する株、変異体又は突然変異体；変異誘発されたウイルス（例えば、UV照射に対する曝露、変異誘発物質及び／又は継代による）；再類別（セグメント化ゲノムをもつウイルスについて）；及び／又は遺伝的に操作されたウイルスから選択することができる。例えば、突然変異体ウイルスは、自然変異、UV照射に対する曝露、化学的突然変異原に対する曝露によって、非許容宿主における継代によって、再類別によって（すなわち、所望の抗原を有する別の株と弱毒セグメント化ウイルスの同時感染によって）、及び／又は遺伝子工学によって（例えば「リバースジェネティクス」を使用して）産生することができる。本発明の方法に従って使用するためのセグメント化ゲノムをもつウイルスの非限定的な例には、オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）、ブニヤウイルス科（例えば、ブニアムウェラ（Bunyamwera））、レオウイルス科及びアレナウイルス科（例えば、ラッサ熱）由来ウイルスを含む。本発明の方法に従って使用するための非セグメント化ゲノムをもつウイルスの非限定的な例には、コロナウイルス科（例えば、ヒトコロナウイルス（SARS））、ヘパドナウイルス科（例えば、A、B又はC型肝炎ウイルス）、ヘルペスウイルス科（例えば、単純ヘルペスウイルス）ポックスウイルス科（例えば、天然痘）、ラブドウイルス科（例えば、小胞性口内炎ウイルス（VSV）、センダイウイルス及び狂犬病）、パラミキソウイルス科（例えば、麻疹及び呼吸器合胞体ウイルス）及びフィロウイルス科（マールブルク及びエボラウイルス）を含む。特定の実施態様において、セグメント化ウイルスは、インフルエンザウイルスである。その他の実施態様において、非セグメント化ウイルスは、NDVである。
【００７０】
特定の実施態様において、本発明に使用するために選択されるウイルスは、IFNアンタゴニスト活性が減弱され、及び／又は欠陥がある；すなわち、これらは感染性であり、かつインビボにおいて複製することができるが、低力価を生じて、非病原性である無症状性レベルの感染を生じるだけである。ウイルスは、当該技術分野において公知の、及び／又は本明細書において例証した任意の方法、例えばウイルスを、NS1遺伝子に突然変異を含むように、又はHAタンパク質の切断部位の前に多塩基アミノ酸配列に修飾を含むように操作することによって弱毒化してもよい。従って、本発明に従って操作されるこのような弱毒ウイルスは、免疫原性製剤、例えば生ウイルスワクチンのための理想的な候補である。対象に投与されるときに、弱毒化された本発明のキメラウイルスは、免疫応答を生じて、ウイルスに対する、及び非天然又は融合タンパク質の両方に対する免疫を誘発することができる。一部の実施態様において、非天然タンパク質は、病原体に由来する。そして更に、対象に対するこのようなキメラウイルスの投与は、ウイルスに加えて前記病原体に対する免疫応答及び／又は免疫を生じる。
【００７１】
また、本発明は、ヒト又は動物（例えば、トリ）のための組成物（例えば、免疫原性製剤）における本発明のキメラウイルスの使用に関する。特に、弱毒キメラウイルスは、広範囲のウイルス及び／又は疾患に対するワクチンとして使用することができる。キメラウイルスは、ビリオンに外来エピトープを発現するように操作されるので、本発明のキメラウイルスを含む組成物（例えば、ワクチン製剤）は、複数の株変異体、異なるウイルスに対する、又は完全に異なる感染因子若しくは疾患抗原（例えば、細菌、寄生虫、真菌又は腫瘍特異性抗原）に対する免疫化のためにデザインすることができる。多くの方法を使用して、生弱毒ウイルス製剤をヒト又は動物対象に導入し、免疫又は適切なサイトカイン反応を誘導してもよい。これらには、鼻腔内、気管内、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下の経路を含むが、限定されない。
【００７２】
（5.1 キメラインフルエンザウイルス）
（5.1.1. そのビリオンに組み込まれた融合タンパク質を含むキメラトリインフルエンザウイルス）
本発明は、融合タンパク質がゲノムによってコードされ、かつ発現されたときに、ビリオンに組み込まれるようにトリインフルエンザウイルスを操作することを包含する。融合タンパク質をトリインフルエンザビリオンに発現し、かつ組み込むように操作することができる、天然に存在する株、変異体又は突然変異体、変異誘発されたウイルス、再類別及び／又は遺伝的に操作されたウイルスを含むが、限定されない任意のトリインフルエンザウイルスタイプ、サブタイプ又は株を選択すること、及び本発明に従って使用することができる。具体的実施態様において、本発明のトリインフルエンザウイルスは、天然に存在するウイルスではない。別の特定の実施態様において、本発明のトリインフルエンザウイルスは、遺伝的に操作されたウイルスである。トリインフルエンザウイルスの非限定的な例には、インフルエンザAサブタイプH5N1、H6N2、H7N3、H9N2及びH10N7を含む。
【００７３】
インフルエンザウイルスの遺伝子操作は、ウイルスゲノムを含む8つのウイルスRNAセグメントの少なくとも1つを操作することが必要である。ゲノムの突然変異誘発は、「リバースエンジニアリング」技術を介して達成してもよい（第5.4節を参照されたい）。しかし、インフルエンザゲノムの可塑性により、ウイルスに安定に組み込まれるであろうセグメントの数の、及びセグメントの長さの両方が制限される。長い挿入物の全体的な安定性は、未知であり、このような挿入物又はその一部を含むセグメントは、数世代後のウイルス分類により、失われるかもしれない。従って、本発明の好ましい実施態様において、トリインフルエンザウイルスは、その2つの主要表面タンパク質の1つが融合タンパク質によって置換されるように操作される。
【００７４】
従って、本発明は、インフルエンザウイルス以外の感染因子のタンパク質の外部ドメイン（ED）と少なくとも１つの必須インフルエンザウイルス糖タンパク質の細胞質（CT）ドメイン及び膜貫通（TM）ドメイン又は膜貫通（TM）ドメインとを含む少なくとも１つの融合タンパク質を含むキメラトリインフルエンザウイルスであって、少なくとも１つの融合タンパク質が機能的に少なくとも１つの必須トリインフルエンザウイルス糖タンパク質を置換する、前記キメラトリインフルエンザウイルスを提供する。言い換えると、トリインフルエンザウイルスは、必須トリインフルエンザウイルス糖タンパク質の代わりに、融合タンパク質をそのビリオン内に発現し、かつ組み込まれるように操作させる「バックボーン」として役立つ。融合タンパク質によって機能的に置換される必須トリインフルエンザウイルス糖タンパク質に対応するインフルエンザウイルス糖タンパク質のTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインの包含により、トリインフルエンザウイルスのビリオン内に融合タンパク質を組み込むことができる。融合タンパク質のTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインは、融合タンパク質をトリインフルエンザウイルスバックボーンのビリオン内に組み込むことができる任意のインフルエンザウイルスに対応していても、又は由来してもよい。
【００７５】
特定の実施態様において、融合タンパク質のTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインは、バックボーントリインフルエンザウイルスとは異なるタイプ、サブタイプ又は株のトリインフルエンザウイルスのTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインに対応する。その他の実施態様において、融合タンパク質のTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインは、トリインフルエンザウイルス以外のインフルエンザウイルスのTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインに対応する。その他の実施態様において、融合タンパク質のTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインは、トリインフルエンザウイルスバックボーンのTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインに対応する。
【００７６】
トリインフルエンザビリオンは、2つの主要表面糖タンパク質、赤血球凝集素（HA）及びノイラミニダーゼ（N）を含み、その両方が細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン及び外部ドメインを含む。従って、特定の実施態様において、融合タンパク質のTMドメイン及びCTドメインは、インフルエンザウイルスのHAタンパク質又はNAタンパク質のいずれかのTMドメイン及びCTドメインに対応する。HA又はNAのCTドメインは、トリインフルエンザウイルスビリオンへの融合タンパク質の組み込みのために必要ではないであろうため、一部の実施態様において、融合タンパク質は、HA又はNAのTMドメインのみを含むように操作される。例えば、NAのCTドメインは、インフルエンザA型ウイルスのエンベロープへのこのタンパク質の適切なパッケージングのために不必要なことが示された（Garcia-Sastreらの論文、1995、Virus Res. 37：37-47、これは、その全体が引用として本明細書に組み込まれる）。従って、NAタンパク質のものに対応する構造ドメインが、融合タンパク質の作製に使用される場合、本発明は、インフルエンザウイルスNAタンパク質に対応するTMドメインのみを含むように融合タンパク質を操作することを包含する。従って、本発明の一つの実施態様において、融合タンパク質は、TMドメインのみを含むように操作され、該TMドメインは、インフルエンザウイルスNAタンパク質のTMドメインに対応する。
【００７７】
インフルエンザウイルスHA及びNAタンパク質のTMドメイン及びCTドメインは、ドメインがHAタンパク質のC末端及びNAタンパク質のN末端に位置するという点で、構造的に異なる。表面糖タンパク質のそれぞれのクラスにおける2つのドメインが異なる向きであることとは別に、HA及びCT構造ドメインは、ポリペプチド鎖内の更にこれらの相対的配置に機能的に依存的な未知の相違を含み得る。従って、融合タンパク質をトリインフルエンザウイルス内に操作するようにデザインするときに、インフルエンザウイルス糖タンパク質のTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインに融合される感染因子の外部ドメインの向きは、TMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインの選択を誘導する。例えば、感染因子の外部ドメインが、N末端によってアンカーされているところで、インフルエンザウイルスNAタンパク質のTMドメイン及びCTドメインを使用してもよい。
【００７８】
HA及びNAは、それぞれウイルスの感染力及び増殖のために必要である細胞の融合及び放出に関して競合活性を示す。HAは、細胞表面においてN-アセチルノイラミン酸（NeuNAc；シアル酸）に結合して、宿主細胞によるウイルスの取り込みを引き起こし、一方で、NAは、細胞表面からシアル酸部分を切断して、感染細胞からの子孫ウイルスの放出を引き起こす。これらの活性のいずれの破壊によっても、機能しないウイルスが生じる。従って、ウイルスの応答能を維持するために、表面糖タンパク質が置換される場合、キメラウイルスにおけるその機能は、融合タンパク質によって供給されなければならない。本発明の一つの実施態様において、キメラトリインフルエンザウイルスは、ノイラミニダーゼ活性を示す融合タンパク質を含む。本発明の別の実施態様において、キメラトリインフルエンザウイルスは、受容体結合活性を示す融合タンパク質を含む。本発明の更に別の実施態様において、キメラトリインフルエンザウイルスは、2つの融合タンパク質を含み、その一方は、ノイラミニダーゼ活性を示し、その他方は、受容体結合活性を示す。更にその他の実施態様において、キメラトリインフルエンザウイルスは、異種感染因子のエピトープを含む融合タンパク質を含み、該融合タンパク質は、ノイラミニダーゼ活性又は受容体結合活性を示す。本発明の別の実施態様において、キメラトリインフルエンザウイルスは、受容体結合活性を示す融合タンパク質を含む。特定の実施態様において、キメラトリインフルエンザウイルスは、ニューカッスル病ウイルス（NDV）のHNタンパク質を含む表面タンパク質、並びにインフルエンザA/WSN/33のNAタンパク質のTMドメイン及びCTドメインの外部ドメインを含み、該HN外部ドメインは、ノイラミニダーゼ活性を示す。その他の実施態様において、キメラトリインフルエンザウイルスは、異種インフルエンザウイルスのHAタンパク質（例えば、H7 HAタンパク質又はH9 HAタンパク質）の外部ドメインを含む表面タンパク質を含む。HA及びNAは、ウイルスゲノムの別々のセグメントによってコードされ、未変性タンパク質の全てのコード領域の置換により、導入されたタンパク質をコードする配列に対する大部分の長さ制約を除く。
【００７９】
特定の実施態様において、融合タンパク質は、膜貫通ドメインに加えて必須インフルエンザウイルス糖タンパク質の外部ドメインの1〜15、1〜10、1〜5、1〜3、2つ又は1つのすぐ隣接する残基を含む。例えば、具体的実施態様において、融合タンパク質は、融合タンパク質がNAタンパク質の機能を機能的に置換することができるように、インフルエンザウイルスNAタンパク質の膜貫通ドメイン、インフルエンザウイルスNAタンパク質の外部ドメインの1〜15、1〜10、1〜5、1〜3、2つ又は1つのすぐ隣接する残基、並びにインフルエンザウイルス以外の感染因子の外部ドメイン又はこれらの断片を含む。別の特定の実施態様において、融合タンパク質は、融合タンパク質がNAタンパク質を機能的に置換することができるように、インフルエンザウイルスNAタンパク質の細胞質ドメイン及び膜貫通ドメイン、インフルエンザウイルスNAタンパク質の膜貫通ドメインにすぐ隣接するインフルエンザウイルスNAタンパク質の外部ドメインの1〜15、1〜10、1〜5、1〜3、2つ又は1つの残基、並びにインフルエンザウイルス以外の感染因子の外部ドメイン又はこれらの断片を含む。別の実施態様において、融合タンパク質は、融合タンパク質がNAタンパク質の機能を機能的に置換することができるように、NAタンパク質の膜貫通ドメイン又は細胞質ドメイン及び膜貫通ドメイン、その球状頭部に先行するNAタンパク質の完全な軸（stalk）ドメイン又はこれらの断片、並びにインフルエンザウイルス以外の感染因子の外部ドメイン又はこれらの断片を含む。別の特定の実施態様において、融合タンパク質は、融合タンパク質がHAタンパク質の機能を機能的に置換することができるように、インフルエンザウイルスHAタンパク質の膜貫通ドメイン、インフルエンザウイルスHAタンパク質の外部ドメインの1〜15、1〜10、1〜5、1〜3、2つ又は1つのすぐに隣接する残基及びインフルエンザウイルス以外の感染因子の外部ドメイン又はこれらの断片を含む。別の特定の実施態様において、融合タンパク質は、融合タンパク質がHAタンパク質を機能的に置換することができるように、インフルエンザウイルスHAタンパク質の細胞質ドメイン及び膜貫通のドメイン、インフルエンザウイルスHAタンパク質の膜貫通ドメインとすぐに隣接するインフルエンザウイルスHAタンパク質の外部ドメインの1〜15、1〜10、1〜5、1〜3、2又は1つの残基、並びにインフルエンザウイルス以外の感染因子の外部ドメイン又はこれらの断片を含む。
【００８０】
特定の実施態様において、本発明のキメラトリインフルエンザウイルスの少なくとも１つの融合タンパク質は、異種タンパク質の完全な外部ドメインを含まず（例えば、異種感染因子のタンパク質の外部ドメインの抗原性断片を含む）、天然の必須糖タンパク質の外部ドメインの1つ以上の断片を更に含んでいても、又は含まなくてもよい。従って、特定の実施態様において、融合タンパク質の外部ドメインには、異種感染因子のタンパク質の外部ドメインの断片を含んでいてもよい。その他の実施態様において、融合タンパク質の外部ドメインには、天然の必須糖タンパク質及び異種感染因子のタンパク質の断片の両方を含んでいてもよい。融合タンパク質が必須表面糖タンパク質を置換する実施態様において、表面糖タンパク質の機能は、融合タンパク質によって供給されなければならず、すなわち融合タンパク質は、それが置換される表面糖タンパク質の機能を示さなければならない。
【００８１】
本発明は、この第5.1.1節に記述した融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（すなわち、組換えセグメント）を包含する。好ましい実施態様において、第5.1.1節に記述した融合タンパク質をコードする核酸を含む組換えセグメントには、vRNAの適切な複製、転写及びパッケージングのために必要とされる3'及び5'組み込みシグナルを含む（Fujiiらの論文、2003、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100：2002〜2007；Zhengらの論文、1996、Virology 217：242-251、これらの両方が、本明細書に引用としてその全体が組み込まれる）。本発明の好ましい実施態様において、本発明の組換えセグメントは、従って、バックボーントリインフルエンザウイルスと同じウイルスタイプ又は株内のウイルスのセグメントの3'及び5'非コード配列及び／又は非翻訳配列を使用する。具体的実施態様において、組換えセグメントは、インフルエンザウイルスNA vRNAの3'非翻訳領域、NAタンパク質のCTドメイン及びTMドメインに対応するNAコード領域、インフルエンザウイルスNAタンパク質の膜貫通ドメインとすぐに隣接するインフルエンザウイルスNAタンパク質の外部ドメインの1〜15、1〜10、1〜5、1〜3、2つ又は1つの残基、NAタンパク質リーディングフレームの非翻訳領域、並びにNA vRNAの5'非コード領域を含む、この第5.1.1節に記述した融合タンパク質をコードする核酸を含む。
【００８２】
トリインフルエンザウイルスのNA又はHAタンパク質の置換の代わりに、「リバースジェネティック」及びバイシストロニック技術を使用して、インフルエンザウイルス以外の感染因子のタンパク質の外部ドメイン又はこれらの断片、並びにインフルエンザウイルスのTMドメイン及び／又はCTドメインを含むキメラインフルエンザウイルスを産生してもよい。例えば、米国特許第6,887,699号、米国特許第6,001,634号、米国特許第5,854,037号及び米国特許第5,820,871号を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体が引用として本明細書に組み込まれる。バイシストロニックアプローチには、ウイルスの必要なタンパク質のオープンリーディングフレーム及びその終止コドン内に融合タンパク質のコード領域を挿入することを含む。挿入物は、IRES及び挿入される必要なタンパク質の任意の非翻訳シグナル配列に隣接させ、必要なウイルスタンパク質のオープンリーディングフレーム、パッケージングシグナル、ポリアデニル化又は転写プロモーターを崩壊させてはならない。当該技術分野に周知であるか、又は本明細書に記述した任意のIRESを本発明に従って使用してもよい（例えば、BiP遺伝子のIRES、GenBankデータベース登録HUMGRP78ヌクレオチド372〜592；又は脳心筋炎ウイルス（EMCV）のIRES、GenBankデータベース登録CQ867238のヌクレオチド1430〜2115）。HA又はNAの機能は、バイシストロニックアプローチが使用されるときに置換されることはないので、融合タンパク質の外部ドメイン部分は、置換されたHA又はNAタンパク質の機能を提供するタンパク質に限定されない。このような融合タンパク質の外部ドメインは、任意の異種分子に対応していてもよく、又は抗原、疾患抗原及び感染因子の任意のタンパク質に由来する抗原（例えばウイルス、細菌又は寄生性感染因子と関連する任意の感染防御抗原）を含むが、限定されない任意の異種分子の断片を含んでいてもよい。本発明の方法に従って使用するための感染因子に由来し、又は関連した抗原の非限定の例は、下記の第5.3節に提供してある。
【００８３】
必要なバックボーンウイルスの表面タンパク質の置換又はウイルスゲノムへの組換えセグメントの導入は、生じるキメラウイルスを弱毒化するであろうし、すなわちキメラウイルスは、野生型と比較して複製の障害を示すであろう。本発明の特定の実施態様において、キメラウイルスの弱毒化は、キメラウイルスが少なくとも部分的に感染性のままであり、かつインビボにおいて複製することができるが、低力価を生じて、非病原性である無症状性レベルの感染を生じるだけであることが望まれる。このような弱毒キメラウイルスは、特にウイルスが免疫原、例えば生ワクチンとして作用するように対象に投与される本発明の実施態様のために適する。ウイルスは、当該技術分野において公知の、及び／又は本明細書に例証した任意の方法、例えばウイルスを、NS1遺伝子に突然変異を含むように、又はHAタンパク質の切断部位の前の多塩基アミノ酸配列に修飾を含むように操作することによって弱毒化してもよい（米国特許第6,468,544号；米国特許第6,669,943号；Liらの論文、1999、J. Infect. Dis. 179：1132-1138を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体が引用として本明細書に組み込まれる）。
【００８４】
一つの実施態様において、本発明の弱毒キメラトリインフルエンザウイルスは、その他のインフルエンザウイルスにおいて、NS1遺伝子産物が細胞のインターフェロン反応をアンタゴナイズする能力を減弱させることが公知であるトリインフルエンザバックボーンウイルスのNS1遺伝子に突然変異を含むゲノムを含む。別の実施態様において、本発明の弱毒キメラトリインフルエンザウイルスは、その他のインフルエンザウイルスにおいて、細胞プロテアーゼがタンパク質をその活性型に切断する能力を減弱し、又は除去し、これによりHAで誘導される融合及び感染性を減少させ、又は除去することが公知であるトリインフルエンザバックボーンウイルスのHA遺伝子に突然変異を含むゲノムを含む。更に別の実施態様において、本発明の弱毒キメラトリインフルエンザウイルスは、その他のインフルエンザウイルスにおいて、別々に又は組み合わせたときにウイルス活性を減少させ、又は減弱させることが公知である、トリインフルエンザバックボーンウイルスのHA遺伝子及びNS1遺伝子の両方に突然変異を含むゲノムを含む。弱毒キメラトリインフルエンザウイルス及び野生型トリインフルエンザウイルス力価は、当該技術分野において周知の任意の、又は本明細書に記述した技術（例えば、赤血球凝集アッセイ法、プラークアッセイ法、卵子感染用量（EID50）、組織培養感染用量（TCID50）など）を利用して決定することができることができ、かつウイルスは、本明細書に記述され、又は当該技術分野において周知の条件下で（例えば、CEF細胞、MDCK細胞（例えば、MEM、10%v/vウシ胎児血清（FCS）、1%ペニシリン／ストレプトマイシンにおいて37℃にて5%のCO2加湿したインキュベーターにおいて）又は孵化鶏卵において（例えば、静置インキュベーターにおいて37℃にて55%の相対湿度で）増殖させることができる。或いは、ウイルスは、無血清又は血清減少（例えば、TPCKトリプシン）培地において培養される細胞（例えば、CEF細胞、MDCK細胞など）において増殖させることができる。
【００８５】
（5.1.2 そのビリオンに組み込まれた融合タンパク質を含むキメラ弱毒インフルエンザウイルス）
本発明は、融合タンパク質がゲノムによってコードされ、かつ発現されたときに、ビリオンに組み込まれるようにトリインフルエンザウイルスを操作することを包含する。言い換えると、本発明は、融合タンパク質をそのビリオンに発現し、かつ組み込むように操作される「バックボーン」としての、弱毒インフルエンザウイルス（親ウイルス）の使用を包含する。天然に存在する株、変異体又は突然変異体、変異誘発されたウイルス、再類別及び／又は遺伝子改変ウイルスを含むが、限定されない任意の弱毒インフルエンザウイルスタイプ又は株を、融合タンパク質をそのビリオンに発現し、かつ組み込むように操作されるバックボーンとして使用してもよい。具体的実施態様において、本発明に従って使用するための親インフルエンザウイルスは、天然に存在するウイルスではない。別の特定の実施態様において、本発明に従って使用するための親インフルエンザウイルスは、遺伝的に操作されたウイルスである。
【００８６】
本発明に従ったバックボーンウイルスとして使用するためのインフルエンザウイルスは、弱毒表現型を天然に有していてもよく、又は弱毒表現型と関連する突然変異を含むように操作されてもよく、このような突然変異は、当該技術分野において公知であるか、又は本明細書に記述されている（例えば、ウイルスNS1タンパク質又はウイルスHAタンパク質の突然変異）。具体的実施態様において、弱毒ウイルスは、インフルエンザA型である。その他の実施態様において、弱毒ウイルスは、インフルエンザB型である。更にその他の実施態様において、弱毒ウイルスは、インフルエンザC型である。本発明に従って操作され得るインフルエンザウイルスの非限定の例には、インフルエンザA型サブタイプH10N4、サブタイプH10N5、サブタイプH10N7、サブタイプH10N8、サブタイプH10N9、サブタイプH11Nl、サブタイプH11N13、サブタイプH11N2、サブタイプH11N4、サブタイプH11N6、サブタイプH11N8、サブタイプH11N9、サブタイプH12N1、サブタイプH12N4、サブタイプH12N5、サブタイプH12N8、サブタイプH13N2、サブタイプH13N3、サブタイプH13N6、サブタイプH13N7、サブタイプH14N5、サブタイプH14N6、サブタイプH15N8、サブタイプH15N9、サブタイプH16N3、サブタイプH1N1、サブタイプH1N2、サブタイプH1N3、サブタイプH1N6、サブタイプH1N9、サブタイプH2N1、サブタイプH2N2、サブタイプH2N3、サブタイプH2N5、サブタイプH2N7、サブタイプH2N8、サブタイプH2N9、サブタイプH3N1、サブタイプH3N2、サブタイプH3N3、サブタイプH3N4、サブタイプH3N5、サブタイプH3N6、サブタイプH3N8、サブタイプH3N9、サブタイプH4N1、サブタイプH4N2、サブタイプH4N3、サブタイプH4N4、サブタイプH4N5、サブタイプH4N6、サブタイプH4N8、サブタイプH4N9、サブタイプH5N1、サブタイプH5N2、サブタイプH5N3、サブタイプH5N4、サブタイプH5N6、サブタイプH5N7、サブタイプH5N8、サブタイプH5N9、サブタイプH6N1、サブタイプH6N2、サブタイプH6N3、サブタイプH6N4、サブタイプH6N5、サブタイプH6N6、サブタイプH6N7、サブタイプH6N8、サブタイプH6N9、サブタイプH7N1サブタイプH7N2、サブタイプH7N3、サブタイプH7N4、サブタイプH7N5、サブタイプH7N7、サブタイプH7N8、サブタイプH7N9、サブタイプH8N4、サブタイプH8N5、サブタイプH9N1、サブタイプH9N2、サブタイプH9N3、サブタイプH9N5、サブタイプH9N6、サブタイプH9N7、サブタイプH9N8又はサブタイプH9N9；インフルエンザBアイチ株/5/88、アキタ株/27/2001、アキタ株/5/2001、アラスカ株/16/2000、アラスカ株/1777/2005、アルゼンチン株/69/2001、アリゾナ株/146/2005、アリゾナ株/148/2005、バンコク株/163/90、バンコク株/34/99、バンコク株/460/03、バンコク株/54/99、バルセロナ株/215/03、ペキン株/15/84、ペキン株/184/93、ペキン株/243/97、ペキン株/43/75、ペキン株/5/76、ペキン株/76/98、ベルギー株/WV106/2002、ベルギー株/WV107/2002、ベルギー株/WV109/2002、ベルギー株/WV114/2002、ベルギー株/WV122/2002、ボン株/43、ブラジル株/952/2001、ブカレスト株/795/03、ブエノスアイレス株/161/00)、ブエノスアイレス株/9/95、ブエノスアイレス株/SW16/97、ブエノスアイレス株/VL518/99、カナダ株/464/2001、カナダ株/464/2002、チャコ株/366/00、チャコ株/R113/00、チェジュト株/303/03、チバ株/447/98、チョンチン株/3/2000、臨床分離SA1タイ株/2002、臨床分離SA10タイ株/2002、臨床分離SA1OO フィリピン株/2002、臨床分離SA101フィリピン株/2002、臨床分離SA110株フィリピン/2002)、臨床分離SA112フィリピン株/2002、臨床分離SA113株フィリピン/2002、臨床分離SA114フィリピン株/2002、臨床分離SA2タイ株/2002、臨床分離SA20タイ株/2002、臨床分離SA38フィリピン株/2002、臨床分離SA39タイ株/2002、臨床分離SA99フィリピン株/2002、CNIC株/27/2001、コロラド株/2597/2004、コルドバ株/VA418/99、チェコスロバキア株/16/89、チェコスロバキア株/69/90、ダエク株/10/97、ダエク株/45/97、ダエク株/47/97、ダエク株/9/97、B/Du株/4/78、B/ダーバン株/39/98、ダーバン株/43/98、ダーバン株/44/98、B/ダーバン株/52/98、ダーバン株/55/98、ダーバン株/56/98、イギリス株/1716/2005、イギリス株/2054/2005)、イギリス株/23/04、フィンランド株/154/2002、フィンランド株/159/2002、フィンランド株/160/2002、フィンランド株/161/2002、フィンランド株/162/03、フィンランド株/162/2002、フィンランド株/162/91、フィンランド株/164/2003、フィンランド株/172/91、フィンランド株/173/2003、フィンランド株/176/2003、フィンランド株/184/91、フィンランド株/188/2003、フィンランド株/190/2003、フィンランド株/220/2003、フィンランド株/WV5/2002、フーチエン株/36/82、ジュネーブ株/5079/03、ジェノバ株/11/02、ジェノバ株/2/02、ジェノバ株/21/02、ジェノバ株/54/02、ジェノバ株/55/02、カントン株/05/94、カントン株/08/93、カントン株/5/94、カントン株/55/89、カントン株/8/93、コワンチョウ株/7/97、コワンチョウ株/86/92、コワンチョウ株/87/92、ギョンギ株/592/2005、ハノーバー株/2/90、ハルビン株/07/94、ハワイ株/10/2001、ハワイ株/1990/2004、ハワイ株/38/2001、ハワイ株/9/2001、ホーベイ株/19/94、ホーベイ株/3/94)、ホーナン株/22/97、ヒロシマ株/23/2001、ホンコン株/110/99、ホンコン株/1115/2002、ホンコン株/112/2001、ホンコン株/123/2001、ホンコン株/1351/2002、ホンコン株/1434/2002、ホンコン株/147/99、ホンコン株/156/99、ホンコン株/157/99、ホンコン株/22/2001、ホンコン株/22/89、ホンコン株/336/2001、ホンコン株/666/2001、ホンコン株/9/89、ヒューストン株/1/91、ヒューストン株/1/96、ヒューストン株/2/96、フーナン株/4/72、イバラキ株/2/85、ヌシェオン（ncheon）株/297/2005、インド株/3/89、インド株/77276/2001、イスラエル株/95/03、イスラエル株/WV187/2002、ニホン株/1224/2005、チヤンス株/10/03、ヨハネスバーグ株/1/99、ヨハネスバーグ株/96/01、カドマ株/1076/99、カドマ株/122/99、カゴシマ株/15/94、カンザス株/22992/99、ハズコフ（Khazkov）株/224/91、コウベ株/1/2002、コウチ株/193/99、ラーツィオ株/1/02、リー株/40、レニングラード株/129/91、リサボン（Lissabon）株/2/90)、ロサンジェルス株/1/02、ルサカ株/270/99、リヨン/1271/96、マレーシア株/83077/2001、マプート株/1/99、マール・デル・プラタ株/595/99、メリーランド株/1/01、メンフィス株/1/01、メンフィス株/12/97-MA、ミシガン株/22572/99、ミエ株/1/93、ミラノ株/1/01、ミンスク株/318/90、モスクワ株/3/03、ナゴヤ株/20/99、ナンチャン株/1/00、ナッシュビル株/107/93、ナッシュビル株/45/91、ネブラスカ株/2/01、オランダ株/801/90、オランダ株/429/98、ニューヨーク株/1/2002、NIB/48/90、ニンシヤ株/45/83、ノルウェー株/1/84、オマーン株/16299/2001、オオサカ株/1059/97、オオサカ株/983/97-V2、オスロ株/1329/2002、オスロ株/1846/2002、パナマ株/45/90、パリ株/329/90、パルマ株/23/02、パース株/211/2001、ペルー株/1364/2004、フィリピン株/5072/2001、プサン株/270/99、ケベック株/173/98、ケベック株/465/98、ケベック株/7/01、ローマ株/1/03、サガ株/S172/99、ソウル株/13/95、ソウル株/37/91���シャントウ株/7/97、シャンハイ株/361/2002)、シガ株/T30/98、スーチョワン株/379/99、シンガポール株/222/79、スペイン株/WV27/2002、ストックホルム株/10/90、スイス株/5441/90、タイワン株/0409/00、タイワン株/0722/02、タイワン株/97271/2001、テヘラン株/80/02、トウキョウ株/6/98、トリエステ株/28/02、ウランウデ株/4/02、イギリス連合王国株/34304/99、USSR株/100/83、ビクトリア株/103/89、ウィーン株/1/99、ウーハン株/356/2000、WV194株/2002、シユエンウーフー株/23/82、ヤマガタ株/1311/2003、ヤマガタ株/K500/2001、アラスカ株/12/96、GA株/86、ナガサキ株/1/87、トウキョウ株/942/96又はロチェスター株/02/2001；インフルエンザC型アイチ株/1/81、アンアーバー株/1/50、アオモリ株/74、カリフォルニア株/78、イギリス株/83、ギリシア株/79、ヒロシマ株/246/2000、ヒロシマ株/252/2000、ヒョウゴ株/1/83、ヨハネスバーグ株/66、カナガワ株/1/76、キョウト株/1/79、ミシシッピ株/80、ミヤギ株/1/97、ミヤギ株/5/2000、ミヤギ株/9/96、ナラ株/2/85、ニュージャージー株/76、ブタ/ペキン株115/81、サイタマ株/3/2000)、シズオカ株/79、ヤマガタ株/2/98、ヤマガタ株/6/2000、ヤマガタ株/9/96ベルリン株/1/85、イギリス株/892/8、グレートレイク（GREAT LAKES）株/1167/54、JJ/50株、ブタ/ペキン株/10/81、ブタ/ペキン株/439/82）、テーラー（TAYLOR）株/1233/47又は系統C/ヤマガタ株/10/81。
【００８７】
一つの実施態様において、本発明によって使用される弱毒インフルエンザウイルス（親ウイルス）は、細胞インターフェロン（IFN）をアンタゴナイズする能力が障害されている。具体的実施態様において、本発明によって使用される弱毒インフルエンザウイルス（親ウイルス）は、ウイルスが細胞インターフェロン反応をアンタゴナイズする能力の障害を生じるNS1遺伝子の突然変異を含むインフルエンザウイルスタイプ又は株である。インフルエンザウイルスNS1遺伝子に導入することができる突然変異のタイプの例には、欠失、置換、挿入及びこれらの組み合わせを含む。1つ以上の突然変異をNS1遺伝子の全体にわたって（例えば、N末端、C末端又は間のどこか）及び／又はNS1遺伝子の調節エレメントどこにでも導入することができる。具体的実施態様において、本発明によって使用される弱毒インフルエンザウイルス（親ウイルス）は、N末端に突然変異をもつインフルエンザウイルスNS1遺伝子を有するゲノムを含む。別の実施態様において、弱毒インフルエンザウイルス（親ウイルス）は、C末端に突然変異をもつインフルエンザウイルスNS1遺伝子を有するゲノムを含む。別の実施態様において、本発明によって使用される弱毒インフルエンザウイルス（親ウイルス）は、NS1のC末端から5、好ましくは10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、75、80、85、90、95、99、100、105、110、115、120、125、126、130、135、140、145、150、155、160、165、170又は175アミノ酸残基からなる欠失又はC末端から5〜170、25〜170、50〜170、100〜170、100〜160又は105〜160アミノ酸残基間の欠失を生じるインフルエンザウイルスNS1遺伝子の突然変異を有するゲノムを含む。別の実施態様において、本発明によって使用される弱毒インフルエンザウイルス（親ウイルス）は、アミノ酸残基1〜126、アミノ酸残基1〜120、アミノ酸残基1〜115、アミノ酸残基1〜110、アミノ酸残基1〜100、アミノ酸残基1〜99、アミノ酸残基1〜95、アミノ酸残基1〜85、アミノ酸残基1〜80、アミノ酸残基1〜75、アミノ酸残基1〜73、アミノ酸残基1〜70、アミノ酸残基1〜65又はアミノ酸残基1〜60を除いて全てのアミノ酸残基の欠失を生じるインフルエンザウイルスNS1遺伝子の突然変異を有するゲノム（N末端アミノ酸は、番号1である）を含む。
【００８８】
一つの実施態様において、本発明の弱毒インフルエンザウイルスは、NS1遺伝子が細胞インターフェロン反応をアンタゴナイズする能力を減弱し、弱毒ウイルスを0.0005〜0.001、0.001〜0.01、0.01〜0.1若しくは0.1〜1の感染効率（MOI）又は0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5又は6.0のMOIにて、同じ条件下で増殖させたときに感染後およそ2〜10日、3〜7日、3〜5日又は2、3、4、5、6、7、8、9、10日に決定される、細胞（例えば、ヒト、マウス、ラット、ブタ、イヌ、ウマ又はトリ起源（例えば、HEp-2、A549、293T、Madin-Darbyイヌ腎臓細胞（MDCK）又はニワトリ胚線維芽細胞（CEF）の細胞））における野生型インフルエンザウイルスよりもおよそ1〜およそ100倍、およそ5〜およそ80倍、およそ20〜およそ80倍、およそ40〜およそ80倍、およそ1〜およそ10倍、およそ1〜およそ5倍、およそ1〜およそ4倍、およそ1〜およそ3倍、およそ1〜およそ2倍又はおよそ、1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95若しくは100倍低い力価に培養することができるインフルエンザウイルスバックボーンのNS1遺伝子の突然変異を含むゲノムを含む。減弱インフルエンザウイルス及び野生型インフルエンザウイルス力価は、当該技術分野において周知の、又は本明細書に記述した任意の技術（例えば、赤血球凝集アッセイ法、プラークアッセイ法、卵子感染用量（EID50）、組織培養感染用量（TCID50）など）を利用して決定することができ、ウイルスは、本明細書に記述され、又は当該技術分野において周知の条件下で（例えば、CEF細胞、MDCK細胞（例えば、MEM、10%v/vウシ胎児血清（FCS）、1%ペニシリン／ストレプトマイシンにおいて37℃にて5%のCO2加湿したインキュベーターにおいて）又は孵化鶏卵において（例えば、静置インキュベーターにおいて37℃にて55%の相対湿度で）増殖させることができる。或いは、ウイルスは、無血清又は血清減少（例えば、TPCKトリプシン）培地において培養される細胞（例えば、CEF細胞、MDCK細胞など）において増殖させることができる。
【００８９】
別の実施態様において、本発明に従って使用される弱毒インフルエンザウイルス（親ウイルス）は、細胞プロテアーゼがタンパク質をその活性型に切断する能力を減弱し、又は除去するインフルエンザバックボーンウイルスのHA遺伝子の突然変異を含むゲノムを含む。インフルエンザHA遺伝子に導入してもよい突然変異のタイプの例には、欠失、置換、挿入又はこれらの組み合わせを含む。1つ以上の突然変異が、好ましくはHA切断部位（例えば、GenBank登録AY818135のヌクレオチド1013〜1039）に導入される。一般に、CEFにおいて標準的方法によって決定されるHAタンパク質の切断性を減少させる突然変異は、インビボアッセイ法における病原性の減少と相関する（Horimoto及びKawaokaの論文、1994、68：3120-3128；これは、その全体が引用により本明細書に組み込まれる）。具体的実施態様において、本発明に従って使用される弱毒インフルエンザウイルス（親ウイルス）は、ヌクレオチド1026〜1038の単一ヌクレオチドチミンでの置換を生じるインフルエンザウイルスHA遺伝子の突然変異を有するゲノムを含む。別の実施態様において、本発明の弱毒インフルエンザウイルスは、細胞プロテアーゼをその活性型に切断して、弱毒ウイルスを0.0005〜0.001、0.001〜0.01、0.01〜0.1若しくは0.1〜1の感染効率（MOI）又は0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5又は6.0のMOIにて、同じ条件下で増殖させたときに感染後およそ2〜10日、3〜7日、3〜5日又は2、3、4、5、6、7、8、9、10日に決定される、細胞（例えば、ヒト、マウス、ラット、ブタ、イヌ、ウマ又はトリ起源（例えば、HEp-2、A549、293T、Madin-Darbyイヌ腎臓細胞（MDCK）又はニワトリ胚線維芽細胞（CEF）の細胞）における野生型インフルエンザウイルスよりもおよそ1〜およそ100倍、およそ5〜およそ80倍、およそ20〜およそ80倍、およそ40〜およそ80倍、およそ1〜およそ10倍、およそ1〜およそ5倍、およそ1〜およそ4倍、およそ1〜およそ3倍、およそ1〜およそ2倍又はおよそ、1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95若しくは100倍低い力価に培養することができる、インフルエンザウイルスのHA遺伝子の突然変異を含む。このような突然変異を含むHAタンパク質は、野生型親HAタンパク質と抗原性が異ならず、すなわち、野生型HAタンパク質に対して生じた全ての抗体は、変異されたHAタンパク質と交差反応するであろうし、変異されたHAタンパク質に対して生じた全ての抗体は、野生型HAタンパク質と交差反応するであろう。減弱インフルエンザウイルス及び野生型インフルエンザウイルス力価は、当該技術分野において周知の、又は本明細書に記述した任意の技術（例えば、赤血球凝集アッセイ法、プラークアッセイ法、卵子感染用量（EID50）、組織培養感染用量（TCID50）など）を利用して決定することができ、ウイルスは、本明細書に記述され、又は当該技術分野において周知の条件下で（例えば、CEF細胞、MDCK細胞（例えば、MEM、10%v/vウシ胎児血清（FCS）、1%ペニシリン／ストレプトマイシンにおいて37℃にて5%のCO2加湿したインキュベーターにおいて）又は孵化鶏卵において（例えば、静置インキュベーターにおいて37℃にて55%の相対湿度で）増殖させることができる。或いは、ウイルスは、無血清又は血清減少（例えば、TPCK��リプシン）培地において培養される細胞（例えば、CEF細胞、MDCK細胞など）において増殖させることができる。
【００９０】
別の実施態様において、本発明に従って使用される弱毒インフルエンザウイルス（親ウイルス）は：（i）細胞プロテアーゼがタンパク質をその活性型に切断する能力を減弱させ、又は除去するインフルエンザバックボーンウイルスのHA遺伝子の突然変異、及び（ii）ウイルスが細胞インターフェロン反応をアンタゴナイズする能力の障害を生じるNS1遺伝子の突然変異を含むゲノムを含む。別の実施態様において、本発明の弱毒インフルエンザウイルスは、弱毒ウイルスを0.0005〜0.001、0.001〜0.01、0.01〜0.1若しくは0.1〜1の感染効率（MOI）又は0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5又は6.0のMOIにて、同じ条件下で増殖させたときに感染後およそ2〜10日、3〜7日、3〜5日又は2、3、4、5、6、7、8、9、10日に決定される、細胞（例えば、ヒト、マウス、ラット、ブタ、イヌ、ウマ又はトリ起源（例えば、HEp-2、A549、293T、Madin-Darbyイヌ腎臓細胞（MDCK）又はニワトリ胚線維芽細胞（CEF）の細胞）における野生型インフルエンザウイルスよりもおよそ1〜およそ100倍、およそ5〜およそ80倍、およそ20〜およそ80倍、およそ40〜およそ80倍、およそ1〜およそ10倍、およそ1〜およそ5倍、およそ1〜およそ4倍、およそ1〜およそ3倍、およそ1〜およそ2倍又はおよそ、1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95若しくは100倍低い力価に培養することができる、インフルエンザバックボーンウイルスのHA遺伝子及びNS1遺伝子の両方の突然変異を含む。
【００９１】
本発明は、インフルエンザウイルス以外の感染因子の外部ドメイン（ED）又はその断片、並びに必須インフルエンザウイルス糖タンパク質の細胞質（CT）ドメイン及び膜貫通（TM）ドメイン又は膜貫通ドメインを有する少なくとも１つの融合タンパク質を含むキメラ弱毒インフルエンザウイルスであって、少なくとも１つの融合タンパク質は、少なくとも１つの必須インフルエンザウイルス糖タンパク質を機能的に置換する、前記キメラ弱毒インフルエンザウイルスを提供する。言い換えると、弱毒インフルエンザウイルスは、必須インフルエンザウイルス糖タンパク質の代わりに、少なくとも１つの融合タンパク質をそのビリオンに発現し、かつ組み込むように操作される「バックボーン」として役立つ。融合タンパク質によって機能的に置換される必須インフルエンザウイルス糖タンパク質に対応するインフルエンザウイルス糖タンパク質のTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインの包含により、融合タンパク質を弱毒インフルエンザウイルスのビリオンに組み込むことができる。融合タンパク質のTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインは、融合タンパク質を弱毒インフルエンザウイルスバックボーンのビリオンに組み込むことができる任意のインフルエンザウイルスに対応しても、又は由来してもよい。
【００９２】
特定の実施態様において、融合タンパク質のTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインは、バックボーン弱毒インフルエンザウイルスとは異なるタイプ、サブタイプ又は株のTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインに対応する。その他の実施態様において、融合タンパク質のTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインは、バックボーン弱毒インフルエンザウイルス以外の種のTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインに対応する。好ましい実施態様において、融合タンパク質のTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインは、弱毒インフルエンザウイルスバックボーンのTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインに対応する。
特定の実施態様において、融合タンパク質のTMドメイン及びCTドメインは、インフルエンザウイルスのHAタンパク質又はNAタンパク質のいずれかのTMドメイン及びCTドメインに対応する。HA又はNAのCTドメインは、トリインフルエンザウイルスビリオンへの融合タンパク質の組み込みのために必要ではないであろうため、一部の実施態様において、融合タンパク質は、HA又はNAのTMドメインのみを含むように操作される。
【００９３】
インフルエンザウイルスHA及びNAタンパク質のTMドメイン並びにCTドメインは、該ドメインがHAタンパク質のC末端及びNAタンパク質のN末端に位置するという点で構造的に異なる。表面糖タンパク質のそれぞれのクラスにおける2つのドメインが異なる向きであることとは別に、HA及びCT構造ドメインは、ポリペプチド鎖内の更にこれらの相対的配置に機能的に依存的な未知の相違を含み得る。従って、融合タンパク質を弱毒インフルエンザウイルス内に操作するようにデザインするときに、インフルエンザウイルス糖タンパク質のTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインに融合される感染因子の外部ドメインの向きにより、TMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインの選択を誘導する。
【００９４】
ウイルスの応答能を維持するために、表面糖タンパク質が置換される場合、キメラウイルスにおけるその機能は、融合タンパク質によって供給されなければならない。本発明の一つの実施態様において、キメラ弱毒インフルエンザウイルスは、ノイラミニダーゼ活性を示す融合タンパク質を含む。本発明の別の実施態様において、キメラ弱毒インフルエンザウイルスは、受容体結合活性を示す融合タンパク質を含む。本発明の別の実施態様において、キメラ弱毒ウイルスは、2つの融合タンパク質を含み、その一方は、ノイラミニダーゼ活性を示し、その他方は、受容体結合活性を示す。本発明の更に他の実施態様において、キメラ弱毒インフルエンザウイルスは、異種感染因子のエピトープを含む融合タンパク質を含み、該融合タンパク質は、ノイラミニダーゼ活性又は受容体結合活性を示す。具体的実施態様において、キメラ弱毒インフルエンザウイルスは、ニューカッスル病ウイルス（NDV）のHNタンパク質、並びにインフルエンザA/WSN/33のNAタンパク質のTMドメイン及びCTドメインの外部ドメインを含む表面タンパク質を含み、該HN外部ドメインは、ノイラミニダーゼ活性を示す。その他の実施態様において、キメラ弱毒インフルエンザウイルスは、異種インフルエンザウイルスのHAタンパク質（例えば、H7 HAタンパク質又はH9 HAタンパク質）の外部ドメインを含む表面タンパク質を含む。
【００９５】
特定の実施態様において、本発明のキメラ弱毒インフルエンザウイルスの少なくとも１つの融合タンパク質は、異種タンパク質（例えば、異種感染因子のタンパク質の外部ドメインの抗原性又は保護断片を含む）の完全な外部ドメインを含まず、天然の必須糖タンパク質の外部ドメインの1つ以上の断片を更に含んでいても、又は含まなくてもよい。従って、特定の実施態様において、融合タンパク質の外部ドメインは、異種感染因子のタンパク質の外部ドメインの断片を含んでいてもよい。その他の実施態様において、融合タンパク質の外部ドメインは、天然の必須糖タンパク質及び異種感染因子のタンパク質の両方の断片を含んでいてもよい。融合タンパク質が必須表面糖タンパク質を置換する実施態様において、表面糖タンパク質の機能は、融合タンパク質によって供給されなければならず、すなわち融合タンパク質は、それが置換される表面糖タンパク質の機能を示さなければならない。
この第5.1.2節に記述した融合タンパク質の外部ドメインは、感染因子（ウイルス、細菌及び寄生性感染因子を含む）の任意の糖タンパク質若しくはその断片に対応しても、又は由来してもよい。感染因子糖タンパク質の非限定的な例は、下記の第5.3節に提供してある。
【００９６】
特定の実施態様において、融合タンパク質は、膜貫通ドメインに加えて必須インフルエンザウイルス糖タンパク質の外部ドメインの1〜15、1〜10、1〜5、1〜3、2つ又は1つのすぐに隣接する残基を含む。具体的実施態様において、融合タンパク質は、融合タンパク質がNAタンパク質の機能を機能的に置換することができるように、インフルエンザウイルスNAタンパク質の膜貫通ドメイン、インフルエンザウイルスNAタンパク質の外部ドメインの1〜15、1〜10、1〜5、1〜3、2つ又は1つのすぐに隣接する残基及びインフルエンザウイルス以外の感染因子の外部ドメイン又はこれらの断片を含む。別の特定の実施態様において、融合タンパク質は、融合タンパク質がNAタンパク質を機能的に置換することができるように、インフルエンザウイルスNAタンパク質の細胞質ドメイン及び膜貫通ドメイン、インフルエンザウイルスNAタンパク質の膜貫通ドメインにすぐ隣接するインフルエンザウイルスNAタンパク質の外部ドメインの1〜15、1〜10、1〜5、1〜3、2又は1つの残基、並びにインフルエンザウイルス以外の感染因子の外部ドメイン又はこれらの断片を含む。別の実施態様において、融合タンパク質は、融合タンパク質がNAタンパク質の機能を機能的に置換することができるように、NAタンパク質の膜貫通ドメイン又は細胞質ドメイン及び膜貫通ドメイン、その球状頭部に先行するNAタンパク質の完全な軸ドメイン又はこれらの断片、並びにインフルエンザウイルス以外の感染因子の外部ドメイン又はこれらの断片を含む。別の具体的実施態様において、融合タンパク質は、融合タンパク質がHAタンパク質の機能を機能的に置換することができるように、インフルエンザウイルスHAタンパク質の膜貫通ドメイン、インフルエンザウイルスHAタンパク質の外部ドメインの1〜15、1〜10、1〜5、1〜3、2つ又は1つのすぐに隣接する残基及びインフルエンザウイルス以外の感染因子の外部ドメイン又はこれらの断片を含む。別の特定の実施態様において、融合タンパク質は、融合タンパク質がHAタンパク質を機能的に置換することができるように、インフルエンザウイルスHAタンパク質の細胞質ドメイン及び膜貫通ドメイン、インフルエンザウイルスHAタンパク質の膜貫通ドメインとすぐに隣接するインフルエンザウイルスHAタンパク質の外部ドメインの1〜15、1〜10、1〜5、1〜3、2又は1つの残基、並びにインフルエンザウイルス以外の感染因子の外部ドメイン又はこれらの断片を含む。
【００９７】
本発明は、この第5.1.2節に記述した融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（すなわち、組換えセグメント）を包含する。好ましい実施態様において、第5.1.2節に記述した融合タンパク質をコードする核酸を含む組換えセグメントは、vRNAの適切な複製、転写及びパッケージングのために必要とされる3'及び5'組み込みシグナルを含む（Fujiiらの論文、2003、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100：2002〜2007；Zhengらの論文、1996、Virology 217：242-251、これらの両方が、本明細書に引用としてその全体が組み込まれる）。本発明の好ましい実施態様において、本発明の組換えセグメントは、従って、バックボーン弱毒インフルエンザウイルスと同じウイルスタイプ又は株のウイルスのセグメントの3'及び5'非コード配列及び／又は非翻訳配列を使用する。具体的実施態様において、組換えセグメントは、インフルエンザウイルスNA vRNAの3'非翻訳領域、NAタンパク質のCTドメイン及びTMドメインに対応するNAコード領域、インフルエンザウイルスNAタンパク質の膜貫通ドメインとすぐに隣接するインフルエンザウイルスNAタンパク質の外部ドメインの1〜15、1〜10、1〜5、1〜3、2つ又は1つの残基、NAタンパク質リーディングフレームの非翻訳領域、並びにNA vRNAの5'非コード領域を含む、この第5.1.2節に記述した融合タンパク質をコードする核酸を含む。特定の実施態様において、組換えセグメントは、その球状頭部に先行するNAタンパク質の完全な軸ドメイン又はこれらの断片を含む第5.1.2節に記述した融合タンパク質をコードする核酸を含む。
【００９８】
弱毒トリインフルエンザウイルスのNA又はHAタンパク質の置換の代わりに、「リバースジェネティック」及びバイシストロニック技術を使用して、インフルエンザウイルス以外の感染因子のタンパク質の外部ドメイン又はこれらの断片、並びにインフルエンザウイルスのTMドメイン及び／又はCTドメインを含むキメラインフルエンザウイルスを産生してもよい。例えば、米国特許第6,887,699号、米国特許第6,001,634号、米国特許第5,854,037号及び米国特許第5,820,871号を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体が引用として本明細書に組み込まれる。本発明の方法に従って使用してもよい疾患抗原及び感染因子に由来する抗原（例えば、疾患又はウイルスタンパク質に関連した抗原）などの異種分子の非限定的な例は、下記の第5.3節に提供してある。
【００９９】
（5.1.3 ニューカッスル病ウイルスのHNタンパク質の外部ドメインを含むキメラトリインフルエンザウイルス）
本発明は、ニューカッスル病ウイルスのHNタンパク質の外部ドメインを含む融合タンパク質がゲノムによってコードされ、かつ発現されるときにビリオンに組み込まれるようにトリインフルエンザウイルスを操作することを包含する。融合タンパク質をトリインフルエンザビリオンに発現させ、かつ組み込まれるように操作することができる任意のトリインフルエンザウイルスタイプ又は株は、本発明に従って選択及び使用することができ、天然に存在する株、変異体又は突然変異体、変異誘発したウイルス、再類別及び／又は遺伝的に操作されたウイルスを含むが、限定されないウイルスを含む。トリインフルエンザウイルスの非限定的な例には、インフルエンザAサブタイプH5N1、H6N2、H7N3、H9N2又はH10N7を含む。
【０１００】
本発明は、ニューカッスル病ウイルス（NDV）HNタンパク質の外部ドメイン（ED）と細インフルエンザウイルスNAタンパク質の細胞質（CT）及び膜貫通（TM）ドメイン又は膜貫通ドメインとを有する融合タンパク質を含むキメラトリインフルエンザウイルスであって、該融合タンパク質は、トリインフルエンザウイルスNAタンパク質を機能的に置換する、前記キメラトリインフルエンザウイルスを提供する。言い換えると、トリインフルエンザウイルスは、トリインフルエンザウイルスNAタンパク質の代わりに、融合タンパク質をそのビリオンに発現し、かつ組み込むように操作される「バックボーン」として役立つ。融合タンパク質におけるインフルエンザウイルスNAタンパク質のTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインの包含により、融合タンパク質をトリインフルエンザウイルスのビリオンに組み込むことができる。融合タンパク質のTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインは、融合タンパク質をトリインフルエンザウイルスバックボーンのビリオンに組み込むことができる任意のインフルエンザウイルスに対応していても、又は由来してもよい。
【０１０１】
本発明に従って使用するためのTMドメイン及びCTドメインのコード配列は、任意のインフルエンザ株又はサブタイプ由来の任意のNAタンパク質の公開された配列（例えば、GenBank登録AY651447、A/ベトナム株/1203/2004（H5Nl）由来；GenBank登録AY96877、A/トルコ株/カナダ/63（H6N2）由来；GenBank登録AY706954、A/アヒル株/ハイナン/4/2004（H6N2）由来；GenBank登録AY646080、A／ニワトリ株／ブリティッシュコロンビア／GSC_ヒト_B／04（H7N3）由来；又はGenBank登録DQ064434、A/ニワトリ株/ペキン/8/98（H9N2）由来）から得ても、又は由来してもよい。特定の実施態様において、融合タンパク質のTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインは、バックボーントリインフルエンザウイルス以外のトリインフルエンザウイルスの異なるタイプ又は株のTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインに対応する。その他の実施態様において、融合タンパク質のTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインは、トリインフルエンザウイルス以外のインフルエンザウイルスのTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインに対応する。好ましい実施態様において、融合タンパク質のTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインは、トリインフルエンザウイルスバックボーンのTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインに対応する。具体的実施態様において、融合タンパク質のTMドメイン及びCTドメインは、インフルエンザA/WSN/33のNAタンパク質のTMドメイン及びCTドメインに対応する。
【０１０２】
特定の実施態様において、融合タンパク質は、インフルエンザウイルスNAタンパク質の膜貫通ドメイン、インフルエンザウイルスNAタンパク質の外部ドメインの1〜15、1〜10、1〜5、1〜3、2つ又は1つのすぐに隣接する残基及びNDV HNタンパク質の外部ドメインを含む。別の特定の実施態様において、融合タンパク質は、インフルエンザウイルスNAタンパク質の細胞質ドメイン及び膜貫通ドメイン、並びにインフルエンザウイルスNAタンパク質の膜貫通ドメインとすぐに隣接する、インフルエンザウイルスNAタンパク質の外部ドメインの1〜15、1〜10、1〜5、1〜3、2又は1つの残基及びNDV HNタンパク質の外部ドメインを含む。別の具体的実施態様において、融合タンパク質は、その球状頭部に先行するNAタンパク質の完全な軸ドメイン又はこれらの断片、並びにNDV HNタンパク質の外部ドメインを含む。その他の具体的実施態様において、融合タンパク質は、NAタンパク質の膜貫通ドメイン又は細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインを含み、かつNDV HNタンパク質のその球状頭部及び外部ドメインに先行するNAタンパク質の完全な軸ドメイン又はこれらの断片を更に含む。
【０１０３】
トリインフルエンザウイルスのNAタンパク質の置換の代わりに、「リバースジェネティック」及びバイシストロニック技術を使用して、NDV HNタンパク質の外部ドメイン並びにインフルエンザウイルスのTMドメイン及び／又はCTドメインを含むキメラトリインフルエンザウイルスを産生してもよい。例えば、米国特許第6,887,699号、米国特許第6,001,634号、米国特許第5,854,037号及び米国特許第5,820,871号を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体が引用として本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
本発明は、この第5.1.3節に記述した融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（すなわち、組換えセグメント）を包含する。好ましい実施態様において、第5.1.3節に記述した融合タンパク質をコードする核酸を含む組換えセグメントは、vRNAの適切な複製、転写及びパッケージングのために必要とされる3'及び5'組み込みシグナルを含む（Fujiiらの論文、2003、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100：2002〜2007；Zhengらの論文、1996、Virology 217：242-251、これらの両方が、本明細書に引用としてその全体が組み込まれる）。好ましい実施態様において、本発明の組換えセグメントは、従って、バックボーントリインフルエンザウイルスと同じウイルスタイプ又は株のウイルスのセグメントの3'及び5'非コード配列及び／又は非翻訳配列を使用する。具体的実施態様において、この第5.1.3節に記述した融合タンパク質をコードする核酸を含む組換えセグメントは、インフルエンザウイルスNA vRNAの3'非翻訳領域、NAタンパク質のCTドメイン及びTMドメインに対応するNAコード領域、インフルエンザウイルスNAタンパク質の膜貫通ドメインとすぐに隣接するインフルエンザウイルスNAタンパク質の外部ドメインの1〜15、1〜10、1〜5、1〜3、2つ又は1つの残基、NAタンパク質リーディングフレームの非翻訳領域及びNA vRNAの5'非コード領域を含む。別の特定の実施態様において、組換えセグメントは、3'から5'の順に、WSN NA vRNAの3'非翻訳領域（19ヌクレオチド）、NAコード領域のアミノ酸残基1〜36をコードするヌクレオチド（108ヌクレオチド）、NDV B1 HNタンパク質のアミノ酸残基51〜568をコードするヌクレオチド、2つの連続した終止コドン、WSN NA非翻訳のリーディングフレームの157ヌクレオチド及びの5'非翻訳領域WSN vRNA（28ヌクレオチド）を含む。図1を参照されたい。
【０１０５】
バックボーンインフルエンザウイルスのNAタンパク質の置換又はウイルスゲノムへの組換えセグメントの導入は、生じるキメラウイルスを弱毒化するであろうし、すなわちキメラウイルスは、野生型と比較して複製の障害を示すであろう。本発明の特定の実施態様において、キメラウイルスの弱毒化は、キメラウイルスが少なくとも部分的に感染性のままであり、かつインビボにおいて複製することができるが、低力価を生じて、非病原性である無症状性レベルの感染を生じるだけであることが望まれる。このような弱毒キメラウイルスは、特にウイルスが免疫原、例えば生ワクチンとして作用するように対象に投与される本発明の実施態様のために適する。ウイルスは、当該技術分野において公知の、及び／又は本明細書に例証した任意の方法、例えばウイルスを、NS1遺伝子に突然変異を含むように、又はHAタンパク質の切断部位の前に多塩基アミノ酸配列に修飾を含むように操作することによって弱毒化してもよい（米国特許第6,468,544号；米国特許第6,669,943号；Liらの論文、1999、J. Infect. Dis. 179：1132-1138を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体が引用として本明細書に組み込まれる）。
【０１０６】
一つの実施態様において、本発明の弱毒キメラトリインフルエンザウイルスは、その他のインフルエンザウイルスにおいてNS1遺伝子産物が細胞のインターフェロン反応をアンタゴナイズする能力を減弱させることが公知であるトリインフルエンザバックボーンウイルスのNS1遺伝子に突然変異を含むゲノムを含む。別の実施態様において、本発明の弱毒キメラトリインフルエンザウイルスは、その他のインフルエンザウイルスにおいて、細胞プロテアーゼがタンパク質をその活性型に切断する能力を減弱し、又は除去し、これによりHAで誘導される融合及び感染性を減少させ、又は除去することが公知であるトリインフルエンザバックボーンウイルスのHA遺伝子に突然変異を含むゲノムを含む。更に別の実施態様において、本発明の弱毒キメラトリインフルエンザウイルスは、その他のインフルエンザウイルスにおいて別々に又は組み合わせたときにウイルスの活性を減少させ、又は減弱させることが公知である、トリインフルエンザバックボーンウイルスのHA遺伝子及びNS1遺伝子の両方に突然変異を含むゲノムを含む。弱毒キメラトリインフルエンザウイルス及び野生型トリインフルエンザウイルス力価は、当該技術分野において周知の任意の、又は本明細書に記述した技術（例えば、赤血球凝集アッセイ法、プラークアッセイ法、卵子感染用量（EID50）、組織培養感染用量（TCID50）など）を利用して決定することができることができ、ウイルスは、本明細書に記述され、又は当該技術分野において周知の条件下で（例えば、CEF細胞、MDCK細胞（例えば、MEM、10%v/vウシ胎児血清（FCS）、1%ペニシリン／ストレプトマイシンにおいて37℃にて5%のCO2加湿したインキュベーターにおいて）又は孵化鶏卵において（例えば、静置インキュベーターにおいて37℃にて55%の相対湿度で）増殖させることができる。或いは、ウイルスは、無血清又は血清減少（例えば、TPCKトリプシン）培地において培養される細胞（例えば、CEF細胞、MDCK細胞など）において増殖させることができる。
【０１０７】
（5.2 キメラニューカッスル病ウイルス）
本発明は、少なくとも１つの融合タンパク質がゲノムによってコードされ、かつ発現されるときにビリオンに組み込まれるように、ニューカッスル病ウイルス（「NSV」）を操作することを包含する。天然に存在する株、変異体又は突然変異体、変異誘発したウイルス、再類別及び／又は遺伝的に操作されたウイルスを含むが、限定されない、少なくとも１つの融合タンパク質をNDVビリオンに発現し、かつ組み込むように操作することができる任意のNDVタイプ又は株を選択し、本発明に従って使用することができる。具体的実施態様において、NDVは、天然に存在するウイルスである。別の特定の実施態様において、NDVは、遺伝的に操作されたウイルスである。例えば、本明細書に記述したように、Fタンパク質の切断部位が1つ又は2つの余分のアルギニン残基を含むもので置換されており、突然変異体切断部位をfurinファミリーの遍在性に発現されるプロテアーゼによって活性化させることができる組換えNDVの突然変異株である、rNDV／F2aa及びrNDV／F3aaは、本発明の方法に従って使用することができる。本発明の方法に従って使用してもよいNDVの非限定的な例には、B1、LaSota、YG97、MET95及びF48E9を含む。具体的実施態様において、本発明のキメラNDV又はrNDVは、インフルエンザHAタンパク質の外部ドメインを含む融合タンパク質を含み；この実施態様に従った具体例において、インフルエンザHAタンパク質は、インフルエンザH7由来のHAタンパク質である。
【０１０８】
本発明は、NDVタンパク質以外の感染因子のタンパク質の外部ドメイン（ED）又はその断片、並びに必須NDV糖タンパク質の細胞質（CT）ドメイン及び／又は膜貫通（TM）ドメインを有する少なくとも１つの融合タンパク質を含むキメラNDVを提供する。また、本発明は、ED又はその断片、NDV糖タンパク質以外の感染因子のタンパク質のTMドメイン及び必須NDV糖タンパク質のCTを有する少なくとも１つの融合タンパク質を含むキメラNDVを提供する。本発明は、NDV糖タンパク質以外の感染因子のタンパク質のED又はこれらの断片及びCTドメイン、並びに必須NDV糖タンパク質のTMドメインを有する融合タンパク質を含むキメラNDVを更に提供する。言い換えると、NDVウイルスは、融合タンパク質をそのビリオンに発現し、かつ組み込むように操作される「バックボーン」として役立つ。融合タンパク質における必須NDV糖タンパク質のTMドメイン及び／又はCTドメインの包含により、融合タンパク質をNDVのビリオンに組み込むことができる。融合タンパク質のTMドメイン及び／又はCTドメインは、融合タンパク質をNDVバックボーンのビリオンに組み込むことができる任意のNDVに対応しても、又は由来してもよい。
【０１０９】
特定の実施態様において、融合タンパク質のTMドメイン及び／又はCTドメインは、バックボーンNDV以外のNDVとは異なるタイプ又は株のTMドメイン及び／又はCTドメインに対応する。好ましい実施態様において、融合タンパク質のTMドメイン及び／又はCTドメインは、NDVバックボーンのTMドメイン及び／又はCTドメインに対応する。
NDVビリオンは、2つの主要な表面糖タンパク質：融合タンパク質（F）及び赤血球凝集素-ノイラミニダーゼ（HN）を含み、これらは両方とも、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン及び外部ドメインを含む。従って、特定の実施態様において、融合タンパク質のTMドメイン及び／又はCTドメインは、NDVのFタンパク質又はHNタンパク質のいずれかのTMドメイン及び／又はCTドメインに対応する。
NDV F及びHNタンパク質のTMドメインとCTドメインとは、該ドメインがFタンパク質のC末端及びHNタンパク質のN末端にて位置するという点で構造的に異なる。従って、融合タンパク質をNDV内に操作するようにデザインするときに、NDV糖タンパク質のTMドメイン及び／又はCTドメインに融合される感染因子の外部ドメインの向きにより、TMドメイン及び／又はCTドメインの選択を誘導する。
【０１１０】
特定の実施態様において、キメラNDVの少なくとも１つの融合タンパク質には、必須NDV糖タンパク質のTMドメイン及び外部ドメインの1〜15、1〜10、1〜5、1〜3、2又は1つのすぐに隣接する残基を含む。例えば、具体的実施態様において、融合タンパク質は、融合タンパク質がFタンパク質の機能を機能的に置換することができるように、NDV Fタンパク質の膜貫通ドメイン、NDV Fタンパク質の外部ドメインの1〜15、1〜10、1〜5、1〜3、2又は1つのすぐに隣接する残基、並びにNDV以外の感染因子の外部ドメイン又はこれらの断片を含む。別の具体的実施態様において、融合タンパク質は、融合タンパク質がFタンパク質を機能的に置換することができるように、NDV Fタンパク質の細胞質ドメイン及び膜貫通ドメイン、NDV Fタンパク質の膜貫通ドメインにすぐ隣接するNDV Fタンパク質の外部ドメインの1〜15、1〜10、1〜5、1〜3、2又は1つの残基及びNDV以外の感染因子の外部ドメイン又はこれらの断片を含む。別の具体的実施態様において、融合タンパク質は、融合タンパク質がHNタンパク質の機能を機能的に置換することができるように、NDV HNタンパク質の膜貫通ドメイン、NDV HNタンパク質の外部ドメインの1〜15、1〜10、1〜5、1〜3、2又は1つの残基及びNDV以外の感染因子の外部ドメイン又はこれらの断片を含む。別の具体的実施態様において、融合タンパク質は、融合タンパク質がHNタンパク質を機能的に置換することができるように、NDV HNタンパク質の細胞質ドメイン及び膜貫通ドメイン、NDV HNタンパク質の膜貫通ドメインにすぐ隣接するNDV HNタンパク質の外部ドメインの1〜15、1〜10、1〜5、1〜3、2又は1つの残基、並びにNDV以外の感染因子の外部ドメイン又はこれらの断片を含む。
【０１１１】
特定の実施態様において、NDV表面糖タンパク質（すなわち、HN又はFタンパク質）は、NDV糖タンパク質の必要とされる機能を供給する融合タンパク質によって置換される。これらの実施態様によれば、融合タンパク質の外部ドメインは、それが置換されたNDV糖タンパク質の必要とされる機能を供給するように選択されなければならない。その他の実施態様において、融合タンパク質は、天然のNDV表面糖タンパク質に加えて、NDVのビリオン内に発現され、かつ組み込まれる。
【０１１２】
特定の実施態様において、本発明のキメラNDVの少なくとも１つの融合タンパク質は、異種タンパク質の完全な外部ドメインを含まず（例えば、異種感染因子のタンパク質の外部ドメインの抗原性断片を含む）、天然の必須糖タンパク質の外部ドメインの1つ以上の断片を更に含んでいても、又は含まなくてもよい。従って、特定の実施態様において、融合タンパク質の外部ドメインは、異種感染因子のタンパク質の外部ドメインの断片を含んでいてもよい。その他の実施態様において、融合タンパク質の外部ドメインは、天然の必須糖タンパク質及び異種の感染因子のタンパク質の両方の断片を含んでいてもよい。融合タンパク質が必須表面糖タンパク質を置換する実施態様において、表面糖タンパク質の機能は、融合タンパク質によって供給されなければならず、すなわち、融合タンパクは、それが置換する表面糖タンパク質の機能を示さなければならない。
【０１１３】
この第5.2節に記述した融合タンパク質は、必要なウイルス糖タンパク質の機能を置換する必要がないことを条件として、融合タンパク質の外部ドメインは、任意の感染因子抗原（ウイルス、細菌及び寄生虫感染因子抗原を含む）及び任意の疾患抗原を含むが、限定されない任意の異種分子に対応しても、又は由来してもよい。感染因子抗原及び／又は疾患抗原の非限定的な例は、第5.3節、上記に提供してある。
本発明は、この第5.2節に記述された融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。具体的実施態様において、ヌクレオチド配列は、コザック配列をコードする核酸、続いて遺伝子末端、シストロン間ヌクレオチド（T）及びNDV のFタンパク質の遺伝子開始配列、続いてH7N2のHAタンパク質の5'非翻訳領域及びORFを含む。
【０１１４】
好ましい実施態様において、本発明によって使用されるNDVの株は、ウイルスの長潜伏期株、すなわち典型的にはトリにおいて低病原性又は無症状感染を示す株、例えばB1株、LaSota株又はMet95株である。また、本発明は、当該技術分野において公知の、又は本明細書において例証した方法を使用して遺伝的組換えによって修飾された、NDVの高度に病原性の株、例えばYG97又はF48E9若しくはNDV株の使用を包含する。具体的実施態様において、本発明は、NDV Fタンパク質が切断部位にて、膜融合活性を増大するように遺伝子改変されたNDVの使用を包含する。本発明に従った具体例において、修飾されたFタンパク質は、F切断部位にて2〜3個のアミノ酸突然変異を含む。バックボーンウイルスの必要な表面タンパク質の置換又は融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列のウイルスゲノムへの導入により弱毒化してもよく、又は更に生じるキメラウイルスを弱毒化してもよく、すなわちキメラウイルスは、野生型と比較してして複製の障害を示すであろう。本発明の特定の実施態様において、キメラウイルスの弱毒化又は更なる弱毒化は、キメラウイルスが少なくとも部分的に感染性のままであり、かつインビボにおいて複製することができるが、低力価を生じて、非病原性である無症状性レベルの感染を生じるだけであることが望まれる。このような弱毒キメラウイルスは、特にウイルスが免疫原、例えば生ワクチンとして作用するように対象に投与される本発明の実施態様のために適する。ウイルスは、当該技術分野において公知の任意の方法によって減弱させていてもよい。
【０１１５】
（5.3 本発明のキメラウイルスと同様に操作してもよい抗原）
本発明によれば、任意の異種分子を、前記分子に対する免疫応答を誘発するように、ウイルスバックボーン内に操作することができる。具体的実施態様において、免疫応答を誘発することができる、任意の感染性病原体の任意の抗原又は任意の疾患に関連した任意の抗原をNDV及び／又はインフルエンザウイルスバックボーン内に操作してもよい。具体的実施態様において、抗原は、糖タンパク質である。特定の好ましい実施例において、抗原は、インフルエンザウイルス及び／又はNDVの必須糖タンパク質を機能的に置換することができる。具体的実施態様において、抗原は、ノイラミニダーゼ又は赤血球凝集素（例えば、受容体結合／膜融合）活性を示す。抗原を発現するためのウイルスのバックボーンを選択する際に、抗原をコードするヌクレオチドの向きが考慮される。例えば、抗原が天然においてそのアミノ末端を介してアンカーされる場合、融合タンパク質を操作するために使用するためのTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインは、バックボーンウイルス又は関連したウイルスの必要なウイルスタンパク質（これはまた、そのアミノ末端を介して天然にアンカーされる）、例えばインフルエンザのNタンパク質又はNDVのHNタンパク質のTMドメイン及びCTドメイン又はTMドメインに対応するであろう。
【０１１６】
具体的実施態様において、ウイルス抗原は、NDV又はインフルエンザウイルスバックボーン内に操作される。ウイルス抗原の非限定的な例には、以下に由来の抗原を含む：アデノウイルス科（adenoviridae）（例えば、マストアデノウイルス及びアビアデノウイルス）、ヘルペスウイルス科（herpesviridae）（例えば、単純ヘルペスウイルス1、単純ヘルペスウイルス2、単純ヘルペスウイルス5及び単純ヘルペスウイルス6）、レビウイルス科（leviviridae）（例えば、レビウイルス、腸内細菌相MS2、アロレビウイルス）、ポックスウイルス科（poxviridae）（例えば、脊椎動物ポックスウイルス亜科（chordopoxvirinae）、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス（leporiipoxvirus）、スイポックスウイルス、軟体動物ポックスウイルス（molluscipoxvirus）及び昆虫ポックスウイルス（entomopoxvirinae））、パポバウイルス科（papovaviridae）（例えば、ポリオーマウイルス及び乳頭腫ウイルス）、パラミキソウイルス科（例えば、パラミキソウイルス、パラインフルエンザウイルス１、モビリウイルス（mobillivirus）（例えば、麻疹ウイルス）、ルブラウイルス（rubulavirus）（例えば、ムンプスウイルス）、ニューモウイルス科（pneumonovirinae）（例えば、ニューモウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス）及びメタニューモウイルス（例えば、トリニューモウイルス及びヒトメタニューモウイルス））、ピコルナウイルス科（picornaviridae）（例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス（例えば、ヒトA型肝炎ウイルス）、カルジオウイルス及びアプトウイルス（apthovirus））、レオウイルス科（reoviridae）（例えば、オルトレオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス、シポウイルス（cypovirus）、フィジーウイルス、フィトレオウイルス及びオリザウイルス）、レトロウイルス科（retroviridae）（例えば、レトロウイルス、トリC型レトロウイルス、D型レトロウイルス群、BLV-HTLVレトロウイルス、レンチウイルス（例えば、ヒト免疫不全症ウイルス1及びヒト免疫不全症ウイルス2）スプマウイルス）、フラビウイルス科（flaviviridae）（例えば、C型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス）、ヘパドナウイルス科（hepadnaviridae）（例えば、B型肝炎ウイルス）、トガウイルス科（togaviridae）（例えば、アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルス）及びルビウイルス（例えば、風疹ウイルス））、ラブドウイルス科（例えば、ベシクロウイルス、リサウイルス、エフェメロウイルス、サイトラブドウイルス及びヌクレオラブドウイルス）、アレナウイルス科（例えば、アレナウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イピーウイルス（Ippy virus）及びラッサウイルス（lassa virus））並びにコロナウイルス科（coronaviridae）（例えば、コロナウイルス及びトロウイルス）。具体的実施態様において、ウイルス抗原は、HIV gp120、HIVネフ、RSV F糖タンパク質、RSV G糖タンパク質、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、インフルエンザウイルス血球凝集素、HTLV tax、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（例えば、gB、gC、gD及びgE）若しくはB型肝炎表面抗原、C型肝炎ウイルスEタンパク質又はコロナウイルススパイクタンパク質である。特定の実施態様において、ウイルス抗原は、gp 41ではない。特定の実施態様において、ウイルス抗原は、パラミキソウイルスに由来する。その他の代わりの実施態様において、ウイルス抗原は、パラミキソウイルスに由来しない。特定の実施態様において、ウイルス抗原は、ヒトパラインフルエンザウイルス1型、ヒトパラインフルエンザウイルス型3、RSVに、又はセンダイウイルスに由来する。その他の代わりの実施態様において、ウイルス抗原は、ヒトパラインフルエンザウイルス1型、パラインフルエンザウイルス3型、RSVに、又はセンダイウイルスに由来しない。具体的実施態様において、ウイルスバックボーンは、インフルエンザウイルスであり、かつインフルエンザウイルスバックボーン内に操作される抗原は、インフルエンザ抗原ではない。その他の具体的実施態様において、ウイルスバックボーンは、NDVであり、かつNDVバックボーン内に操作される抗原は、NDV抗原でない。
【０１１７】
別の実施態様において、細菌性抗原（例えば、細菌コートタンパク質又は前記細菌と関連する感染防御抗原）が、NDV又はインフルエンザウイルスバックボーン内に操作される。細菌性抗原の非限定的な例には、以下の細菌由来の抗原を含む：アクワスピリルム科、アゾスピリルム科、アゾトバクター科、バクテロイデス科、バルトネラ属（Bartonella）種、ブデロビブリオ科、カンピロバクター属（Campylobacter）種、クラミジア属（Chlamydia）種（例えば、クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae））、クロストリジウム属（Clostridium）、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）（例えば、シトロバクター属（Citrobacter）種、エドバルシエラ属（Edwardsiella）、アエロゲネス菌（Enterobacter aerogenes）、エルウィニア属種、大腸菌（Escherichia coli）、ハフニア属種、クレブシエラ属（Klebsiella）種、モルガネラ属（Morganella）種、尋常変形菌（Proteus vulgaris）、プロビデンシア属（Providencia）、サルモネラ（Salmonella）種、霊菌（Serratia marcescens）及びシゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri））、ガルジネラ（Gardinella）科、インフルエンザ桿菌（Haemophilus influenzae）、ハロバクテリウム科、ヘリコバクター（Helicobacter）科、レジオネラ科、リステリア（Listeria）種、メチロコッカス科、マイコバクテリア（例えば、結核菌（Mycobacterium tuberculosis））、ナイセリア科、海洋らせん菌（Oceanospirillum）科、パスツレラ科（Pasteurellaceae）、ニューモシスチス属（Pneumococcus）種、シュードモナス属（Pseudomonas）種、リゾビウム科、スピリルム科、スピロソマ（Spirosomaceae）科、ブドウ球菌（Staphylococcus）（例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）及びスタフィロコッカス・ピロジェニス（Staphylococcus pyrogenes）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）（例えば、腸炎連鎖球菌（Streptococcus enteritidis）、ストレプトコッカス・ファスシエ（Streptococcus fasciae）及び肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、バムピロビブル・ヘリコバクター（Vampirovibr Helicobacter）科、エルシニア（Yersinia）科、バシラス・アントラシス（Bacillus antracis）及びバンピオビルリオ（Vampirovibrio）科。
その他の実施態様において、寄生虫と関連した感染防御抗原（例えば、原虫）は、NDV又はインフルエンザウイルスバックボーン内に操作される。寄生虫又は寄生虫（例えば、原生動物）の感染防御抗原と関連する任意の抗原を本発明の方法に従って使用してもよい。寄生虫抗原の非限定的な例には、寄生虫（例えば、アメーバ、マラリア病原虫、プラスモディウム属、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）由来の抗原を含む。
【０１１８】
別の実施態様において、真菌抗原は、NDV又はインフルエンザウイルスバックボーン内に操作される。真菌抗原の非限定的な例には、以下の真菌由来の抗原を含む：アブシディア属種（例えば、アブシディア・コリムビフェラ（Absidia corymbifera）及びアブシディア・ラモサ（Absidia ramosa））、アスペルギルス種（例えば、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、偽巣性コウジ菌（Aspergillus nidulans）、クロカビ（Aspergillus niger）及びアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus））、バシディオボールス・ラナルム（Basidiobolus ranarum）、ブラストミセスデルマティティディス（Blastomyces dermatitidis）、カンジダ属（Candida）種（例えば、鵞口瘡カンジダ（Candida albicans）、カンディダ・グラブラータ（Candida glabrata）、カンディダ・ケール（Candida kerr）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、カンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）、カンディダ・プソイドトロピカリス（Candida pseudotropicalis）、カンディダ・クイレルモンジ（Candida quillermondii）、カンディダ・ルゴサ（Candida rugosa）、カンディダ・ステラトイデ（Candida stellatoidea）及びカンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis））、コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）、コニディオボルス属（Conidiobolus）種、クリプトコックス・ネオホルムス（Cryptococcus neoforms）、クンニンハメラ属（Cunninghamella）種、皮膚糸状菌（dermatophytes）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、石膏状小胞子菌（Microsporum gypseum）、ケカビ（Mucor pusillus）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンジス（Paracoccidioides brasiliensis）、シューダルエシェリア・ボイディイ（Pseudallescheria boydii）、リノスポリジウム・セーベリ（Rhinosporidium seeberi）、ニューモシステイス・カリニ（Pneumocystis carinii）、リゾプス属（Rhizopus）種（例えば、リゾープス・アリズス（Rhizopus arrhizus）リゾープス・オリゼ（Rhizopus oryzae）及びリゾープス・ミクロスポルス（Rhizopus microsporus））、サッカロミセス族（Saccharomyces）種、スポロトリックス・シェンキイ（Sporothrix schenckii）、接合菌（zygomycetes）、並びに接合菌綱（Zygomycetes）、子嚢菌綱（Ascomycetes）、担子菌綱（Basidiomycetes）、不完全菌綱（Deuteromycetes）及び卵菌綱（Oomycetes）などのクラス。
【０１１９】
別の実施態様において、腫瘍関連抗原は、NDV又はインフルエンザウイルスバックボーン内に操作される。当該技術分野において公知の任意の腫瘍関連抗原を本発明の方法に従って使用してもよい。腫瘍関連抗原の非限定的な例には、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、N-アセチルグルコサミン転移酵素-V、p-15、MART-1/MelanA、TRP-1（gp75）、チロシナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ4、β-カテニン、MUM-1、CDK4、HER-2/neuヒトアピローマウイルス-E6、ヒト乳頭腫ウイルスE7、MUC-1、カスパーゼ-8、CD5、CD20、CEA、mucin-1、Lewisx、CA-125、上皮成長因子受容体、p185HER2、IL-2R、Fap-α、テネイシン、メタロプロテイナーゼ関連抗原及びCAMPATH-1を含む。
【０１２０】
（5.4 本発明のキメラウイルスの構築及び増殖）
本発明のキメラウイルスは、リバースジェネティクス技術を使用して産生することができる。リバースジェネティクス技術は、ネガティブ鎖（ウイルスのポリメラーゼによる認識のために、及び成熟ウイルス粒子を発生するために必要なパッケージングシグナルのために必須であるウイルスRNA）の非コード領域を含む合成組換えウイルスRNAの調製を含む。組換えRNAを組換えDNA鋳型から合成し、インビトロにおいて精製したウイルスのポリメラーゼ複合体で再構成して、組換えリボ核タンパク（RNP）を形成し、これを、細胞をトランスフェクトするために使用することができる。より効率的なトランスフェクションは、ウイルスポリメラーゼタンパク質がインビトロ又はインビボのいずれかでの合成RNAの転写の間に存在する場合に達成される。合成組換えRNPは、感染性ウイルス粒子内に救出することができる。前述の技術は、1992年11月24日に発行された米国特許第5,166,057号；1998年12月29日を発行された米国特許第5,854,037号；1996年2月20日に公開された欧州特許出願公開EP 0702085A1；米国特許出願公開第09/152845号に；1997年4月3日に公開された国際出願公開PCT WO97/12032；1996年11月7日に公開されたWO 96/34625；欧州特許出願公開EP A780475に；1999年1月21日に公開されたWO 99/02657号；1998年11月26日に公開されたWO 98/53078；1998年1月22日に公開されたWO 98/02530 ；1999年4月1日に公開されたWO 99/15672；1998年4月2日に公開されたWO 98/13501；1997年2月20日に公開されたWO 97/06270；及び1997年6月25日に公開されたEPO 780 475A1に記述されており、これらのそれぞれが、その全体が引用として本明細書に組み込まれる。
【０１２１】
また、ヘルパーを含まないプラスミド技術を、本発明のキメラウイルスを操作するために利用することができる。簡潔には、インフルエンザウイルスに関して、ウイルスセグメントの全長cDNAを独特の制限部位を含むプライマーでのPCRを使用して増幅し、これにより、プラスミドベクター内にPCR産物を挿入することができる（Flandorferらの論文、2003、J. Virol. 77：9116-9123；Nakayaらの論文、2001、J. Virol. 75：11868-1 1873；これらの両方は、その全体が引用として本明細書に組み込まれる）。プラスミドベクターは、切断されたヒトRNAポリメラーゼIプロモーターとデルタ型肝炎ウイルスリボザイム配列との間にPCR産物が位置するようにデザインされ、その結果、正確なネガティブ（vRNAセンス）転写物が、ポリメラーゼIプロモーターから産生される。別々の、それぞれのウイルスのセグメントを含むプラスミドベクター並びに必要なウイルスタンパク質を含む発現ベクターを細胞にトランスフェクトして組換えウイルス粒子の産生に至る。ヘルパーを含まないプラスミド技術の詳細な説明については、例えば、国際公開番号WO 01/04333；米国特許第6,649,372号；Fodorらの論文、1999、J. Virol. 73：9679-9682；Hoffmannらの論文、2000、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97：6108-6113；及びNeumannらの論文、1999、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96：9345-9350を参照されたい。これらは、その全体が引用として本明細書に組み込まれる。同様に、NDVの単一セグメントゲノムに関して、Hitchner B1株の完全cDNAを構築し、プラスミドベクターに挿入して、PとM遺伝子との間に独特の制限部位を含むように操作した。次いで、本発明に従って操作された融合タンパク質をウイルスゲノム内に独特の制限部位にて挿入してもよい。単一セグメントは、T7ポリメラーゼから正確なネガティブ転写物を産生するように、T7プロモーターとデルタ型肝炎ウイルスリボザイムとの間に位置させた。プラスミドベクター及び必要なウイルスタンパク質を含む発現ベクターを細胞にトランスフェクトして、組換えウイルス粒子の産生に至る（Swayneらの論文、2003、Avian Dis. 47：1047-1050及びSwayneらの論文、2001、J. Virol. 11868-11873を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体が引用として組み込まれる）。
【０１２２】
本発明のキメラインフルエンザウイルスは、バイシストロニックであるRNAセグメントを含むように操作することができる。バイシストロニック技術では、IRES配列を使用することにより、単一mRNA内に複数のタンパク質のコード配列を操作することをできる。IRES配列は、RNA分子へのリボソームの内部補充を指揮し、キャップ非依存的様式で下流の翻訳が可能である。簡潔には、1つのタンパク質のコード領域を第2のタンパク質のORFに挿入させる。挿入は、IRES並びに適当な発現及び／また機能のために必要な任意の非翻訳シグナル配列に隣接させる。挿入は、第2のタンパク質のオープンリーディングフレーム、ポリアデニル化又は転写プロモーターを崩壊させない（例えば、Garcfa-Sastreらの論文、1994、J. Virol. 68：6254-6261 及びGarcia-Sastreらの論文、1994、Dev. Biol. Stand. 82：237-246を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体が引用として本明細書に組み込まれる。
【０１２３】
（5.4.1 キメラウイルスの増殖）
本発明のキメラインフルエンザウイルスは、ウイルスを本明細書に記述されたキメラウイルスの使用を可能にする力価まで培養することができる任意の基質内で増殖させることができる。一つの実施態様において、基質は、キメラウイルスを対応する野生株ウイルスについて決定したものと同等の力価まで培養することができる。具体的実施態様において、本発明の弱毒キメラインフルエンザウイルスは、IFN欠損した基質において増殖される。
【０１２４】
本発明のキメラウイルスは、ウイルス、孵化鶏卵又は動物（例えば、トリ類）による感染に感受性である細胞（例えば、トリ細胞、ニワトリ細胞など）において培養してもよい。このような方法は、当業者には周知である。具体的実施態様において、インターフェロンアンタゴニスト活性が減少した弱毒インフルエンザウイルスを増殖するために使用される細胞は、IFNを欠損する。一つの実施態様において、本発明のキメラトリウイルスは、ニワトリ細胞又は孵化鶏卵において増殖される。代表的なニワトリ細胞には、ニワトリ胚線維芽細胞又はニワトリ胚腎臓細胞を含むが、限定されない。
【０１２５】
本発明のキメラウイルスは、例えば6〜14日齢の孵化鶏卵において増殖させてもよい。若い、又は未成熟の孵化鶏卵を使用して、本発明の弱毒キメラインフルエンザウイルスを増殖させることができる。未成熟孵化鶏卵は、INF欠損である10日齢よりも若い、例えば6〜9日齢の卵子を包含する。また、未成熟孵化鶏卵には、IFN系が10〜12日齢の卵子と比較して完全に発達しないように、培養条件の変化、例えば培養温度の変化；薬物での処理；又は発生が遅れた卵子を生じるその他の任意の変化の結果として、10日齢までの、しかしより若い未成熟卵を人工的に模倣する卵子を包含する。本発明のキメラウイルスは、孵化鶏卵の種々の位置、例えば尿膜腔において増殖させることができる。培養及び増殖ウイルス、特にインターフェロンアンタゴニスト活性が減少した弱毒インフルエンザウイルスについての詳細な考察については、例えば米国特許第6,852,522号及び米国特許第6,852,522号を参照されたい。これらの両方は、その全体が引用として本明細書に組み込まれる。
ウイルス単離のためには、キメラウイルスを培養細胞から除去し、典型的には例えば勾配遠心分離及びカラムクロマトグラフィなどの周知の清澄手順によって細胞成分から分離し、当業者に周知の手順、例えばプラークアッセイ法を使用して及び所望のとおりに更に精製してもよい。
【０１２６】
（5.5 キメラウイルスの使用）
本発明のキメラウイルスは、対象における能動免疫に使用することができる。一つの態様において、本発明のキメラウイルスは、1つ以上の疾患を予防し、管理し、及び又は治療するために使用することができる。具体的態様において、本発明のキメラウイルスは、2つの感染因子による感染を予防し、管理し、及び／又は治療するために使用することができる。免疫原性製剤及び対象における免疫応答を誘導するためのこれらの製剤の使用についての記述は、第5.5.1.節を参照されたい。また、本発明のキメラウイルスを使用して、診断免疫アッセイ法、受動免疫療法及び抗イディオタイプ抗体の産生に使用することができる抗体を産生することができる。例えば、インフルエンザウイルス以外の感染因子の外部ドメインを有する融合タンパク質を含むキメラインフルエンザウイルスを対象（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウマ、ロバ、トリ類又はヒト）に投与してインフルエンザバックボーン及び感染因子の両方に対する抗体を産生し、次いでこれを単離して、診断アッセイ法、受動免疫療法及び抗イディオタイプの抗体の産生に使用することができる。産生された抗体は、当該技術分野において公知の標準的な技術（例えば、免疫親和性クロマトグラフィー、遠心分離、沈澱など）によって単離して、診断免疫アッセイ法、受動免疫療法及び抗イディオタイプ抗体の産生に使用してもよい。受動免疫療法に使用する前に単離された抗体を修飾してもよく、例えば抗体をキメラ化又はヒト化してもよい。キメラ抗体及びヒト化抗体の産生についての総説については、例えば米国特許第4,444,887号及び第4,716,111号；及び国際公開番号WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735及びWO 91/10741を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体が引用として本明細書に組み込まれる。
【０１２７】
受動免疫治療に使用するためにキメラウイルスによって産生される抗体について、対象に投与される投薬量は、典型的には患者の体重の0.0001mg/kg〜100mg/kgである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、対象の体重の0.0001mg/kg〜20mg/kg、0.0001mg/kg〜10mg/kg、0.0001mg/kg〜5mg/kg、0.0001〜2mg/kg、0.0001〜1mg/kg、0.0001mg/kg〜0.75mg/kg、0.0001mg/kg〜0.5mg/kg、0.0001mg/kg〜0.25mg/kg、0.0001〜0.15mg/kg、0.0001〜0.10mg/kg、0.001〜0.5mg/kg、0.01〜0.25mg/kg又は0.01〜0.10mg/kgの間である。本発明によって包含される抗体は、再度の免疫化又は感染症若しくは状態又はその症候の治療、管理又は予防のためのその他の予防法又は治療組成物と共に投与してもよい。本発明の投与抗体の投与は、ボーラス注射によるか、又はIVによってよりゆっくりと（例えば、約5分、約15分、約30分、約45分、約1時間、約2時間、約4時間又は約6時間にわたって）提供してもよい。また、本発明の抗体の投薬量は、治療の期間（例えば、2週、1ヵ月、2ヵ月、4ヵ月、6ヵ月、8ヵ月、10ヵ月、12ヵ月、16ヵ月、20ヵ月又は24ヵ月以上）にわたって（例えば、毎日、2日毎に、3日毎に、毎週、2週毎に、3週毎に、6週毎に、9週毎に、12週毎に、4ヵ月毎に、6ヵ月毎に、12ヵ月毎に、18ヵ月毎に又は2年毎に）繰り返してもよい。特定の実施態様において、本発明のキメラウイルスによって産生される抗体は、非経口的に、例えば静脈内、筋肉内又は皮下に投与してもよく、又は代わりに、経口的に、又は経鼻的に投与される。また、本発明に包含される抗体は、持効性製剤として投与してもよい。
【０１２８】
また、本発明のキメラウイルスが投与された対象から単離された抗体は、治療及び／又は疾患進行をモニターするために使用してもよい。放射免疫アッセイ法、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」免疫アッセイ法、沈降反応法、ゲル拡散沈降反応法、免疫拡散法アッセイ法、凝集アッセイ法、補体結合アッセイ法、免疫放射線アッセイ法、蛍光免疫法、プロテインA免疫アッセイ法及び免疫電気泳動法アッセイ法などの技術を使用する競合的及び非競合的アッセイ系を含むが、限定されない当該技術分野において公知の任意の免疫アッセイ系を本目的のために使用してもよい。
【０１２９】
また、本発明のキメラウイルスによって産生される抗体は、抗イディオタイプの抗体の産生に使用することができる。次いで、抗イディオタイプ抗体を、次に免疫化のために使用してキメラインフルエンザの初期抗原に結合する抗体の亜集団を産生することができる（Jerneの論文、1974、Ann. Immunol. （Paris）125c：373；Jerneらの論文、1982、EMBO J. 1：234）。
免疫化手順において、使用される免疫原の量及び免疫化スケジュールは、当業者によって決定されるであろうし、対象の免疫応答及び抗体価を参照することによって投与されるであろう。
【０１３０】
（5.5.1 免疫原性製剤）
また、本発明は、免疫原性製剤、例えばワクチン製剤における本発明のキメラウイルスの使用を包含する。免疫原性製剤がキメラインフルエンザウイルスを含む場合、製剤は、インフルエンザウイルス感染、並びに／又は別の感染因子及び／若しくは疾患による感染を予防し、管理し、中和し、治療し、及び／又は寛解させる方法に使用してもよい。免疫原性製剤がキメラNDVを含む場合、製剤は、NDV感染、別の感染因子及び／又は疾患による感染を予防し、管理し、中和し、治療し、及び／又は寛解させる方法に使用してもよい。
【０１３１】
免疫原性製剤には、本発明の生又は不活性化キメラウイルスを含んでいてもよい。キメラウイルスは、当業者に周知の方法によって不活性化することができる。一般的方法では、不活性化のためにホルマリン及び熱を使用する。例えば米国特許第6,635,246号を参照されたい。これは、その全体が本明細書に引用として組み込まれる。その他の方法は、米国特許第5,891,705号；第5,106,619号及び第4,693,981号に記述されたものを含み、これらの全体が引用として本明細書に組み込まれる。
【０１３２】
生免疫原性製剤は、対象における増殖により自然感染において生じるものと同種及び同程度の刺激の延長を引き起こし、従って実質的に持続性免疫を与えるので、好ましい。このような生組換え免疫原性製剤の産生は、培養細胞における、又は精製によって続かれる孵化鶏卵（例えば、孵化鶏卵）におけるキメラウイルスの増殖を含む従来法を使用して達成してもよい。更に、キメラウイルスは、インビボにおいてその他の生物学的結果を有する強いIFN反応を誘導することができ、その後の感染に対する保護をもたらす。
【０１３３】
好ましい実施態様において、本発明の免疫原性製剤は、本発明のキメラウイルスの有効量及び医薬として許容し得る担体を含む。「医薬として許容し得る」という用語は、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認されたこと、又は動物に、及び特にヒト使用するための米国薬局方又はその他の一般に認識された薬局方に収載されたことを意味する。「担体」という用語は、希釈剤、アジュバント、賦形剤又は医薬組成物（例えば、免疫原性製剤又はワクチン製剤）が投与される媒体をいう。また、食塩水溶液、並びにデキストロース及びグリセロール水溶液を液体担体として、特に注射用溶液のために使用することができる。適切な賦形剤には、デンプン、グルコース、乳糖、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。適切な薬剤担体の例は、E.W . Martin.によって「レミントンの医薬品科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」に記述されている。製剤は、投与様式に合わせるべきである。また、特定の製剤は、キメラウイルスが生きているか、又は不活性化されているかどうかに依存し得る。
【０１３４】
本発明の免疫原性製剤は、ナイーブ対象、すなわち疾患を有しないか、又は一方若しくは両方の感染因子に感染したことがなく、現在も感染していない対象に投与してもよい。一つの実施態様において、免疫原性製剤は、ナイーブ対象、すなわち疾患を有しないか、又は一方若しくは両方の感染因子に感染したことがなく、現在も感染していないが、このような疾患（例えば、ウイルス感染）を得るリスクがある対象に投与される。一つの実施態様において、本発明の免疫原性製剤は、疾患を有しないか、又はキメラウイルスが免疫応答を誘導する感染因子に感染しておらず、かつ感染していない対象に投与される。別の実施態様において、本発明の免疫原性製剤は、キメラウイルスが免疫応答を誘導する感染因子の両方に感染したことがなく、かつ感染していない対象に投与される。また、本発明の免疫原性製剤は、キメラウイルスが免疫応答を誘導する感染因子又は別のタイプ、サブタイプ若しくは株の因子の一方又は両方の因子に感染している、及び／又は感染した対象に、投与してもよい。
【０１３５】
多くの方法を使用して、免疫原性製剤、例えば上記のワクチン製剤を導入してもよく、これらには、鼻腔内、気管内、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、結膜及び皮下の経路を含むが、限定されない。トリにおいて、本方法には、後鼻孔接種を更に含んでいてもよい。非経口投与に代わるものとして、本発明は、水を飲むこと経て、又はスプレーでなど農業目的のための大量投与の経路も包含する。野生株ウイルスの天然の感染経路を介してキメラインフルエンザウイルス免疫原性製剤を導入することが、好ましいであろう。或いは、融合タンパク質が誘導される因子の天然の感染経路を介して本発明のキメラウイルスを導入することが、好ましいであろう。キメラウイルスが活発な分泌性免疫反応及び細胞性免疫反応を誘導する能力を都合よく使用することができる。例えば、キメラウイルスによる気道感染は、例えば泌尿生殖系において、特定の疾患原因因子に対する保護と同時に、強力な分泌性免疫応答を誘導し得る。加えて、好ましい実施態様において、任意の適切な経路によって本発明の医薬品製剤を肺に導入することが望ましいであろう。また、肺投与は、例えば吸入器又は噴霧器及びスプレーとしての使用のためのエアロゾル化剤とともに製剤を使用することにより、使用することができる。
【０１３６】
特定の実施態様において、本発明の免疫原性製剤により、感染（例えば、ウイルス感染又は非ウイルス感染因子による感染）から完全な保護を生じないが、無処置対象と比較してより低力価を生じるか、又は病原体（例えば、ウイルス）の数が減少される。特定の実施態様において、本発明の免疫原性製剤の投与は、無処置対象と比較して病原体の力価の0.5倍、1倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍又は1,000倍以上の減少を生じる。病原体の力価、数又は総付加の減少の利益には、感染の症候の重症度がより低いこと及び感染に関連した疾患又は状態の長さが減少することを含むが、限定されない。
【０１３７】
特定の実施態様において、本発明の免疫原性製剤は、ナイーブ対象において疾患（例えば、感染）から守るために使用される。具体的実施態様において、本発明の免疫原性製剤は、インフルエンザウイルス及び／又はインフルエンザウイルスではない少なくとも１つのその他の感染因子による感染に対する保護及び／又はナイーブ対象における感染に関連した疾患若しくは症候に対する保護に使用される。その他の実施態様において、本発明の免疫原性製剤は、NDV及び／又は少なくとも１つのその他の感染因子による感染に対する保護及び／又はナイーブ対象における感染に関連した疾患若しくは症候に対する保護に使用される。このようなその他の感染因子の非限定的な例は、パピローマウイルス（ヘルペスウイルス、レトロウイルス（例えば、HIV）肝炎ウイルス、ライノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、NDV、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、クロストリジウム（Clostridia）種、サルモネラ（Salmonella）種、ブドウ球菌（Staphylococcus）種、エンテロコッカス（Enterococcus）種、ビブリオ属（Vibrio）種、大腸菌（E. coli）、ストレプトコッカス・イクイ（Streptococcus equi）、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）及び緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）及びデルマトフィルス・コンゴレンシス（Dermatophilus congolensis）又はアメーバ（amobea）、マラリア病原虫又はクルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）などの原生動物である。
【０１３８】
本発明の免疫原性製剤の予防効果及び／又は治療効果は、部分的には、免疫応答（例えば、体液性免疫応答）を達成すること、又は誘導することに基づいている。一つの態様において、免疫原性製剤は、対象又はその動物モデル（例えば、マウス、ラット又はイヌモデル）のいずれかにおけるキメラウイルスの抗原に対する抗体の検出可能な血清力価を誘導する。抗体の血清力価は、当業者に公知の技術、例えばELISAなどの免疫アッセイ法を使用して決定することができる。一つの実施態様において、抗体は、キメラウイルスのバックボーンの抗原に特異的に結合する。その他の実施態様において、抗体は、少なくとも１つの融合タンパク質の抗原、すなわち感染因子又は疾患に関連した導入タンパク質の外部ドメインの抗原に特異的に結合する。具体的実施態様において、本発明の免疫原性製剤を投与することによって産生される抗体は、中和抗体である。
【０１３９】
一つの実施態様において、対象又はその動物モデルに対する本発明のキメラウイルスの投与により、キメラウイルスのバックボーンの抗原に特異的に結合する抗体の約1μg/ml、約2μg/ml、約5μg/ml、約6μg/ml、約10μg/ml、約15μg/ml、約20μg/ml、約25μg/ml、約50mg/ml、約75mg/ml、約100mg/ml、約125mg/ml、約150mg/ml、約175mg/ml、約200mg/ml、約225mg/ml、約250mg/ml、約275mg/ml又は約300mg/ml以上の血清力価を生じる。その他の実施態様において、対象又はその動物モデルに対する本発明のキメラウイルスの投与により、融合タンパク質の抗原（すなわち、疾患に関連した導入タンパク質の外部ドメインの抗原）に特異的に結合する抗体の約1μg/ml、約2μg/ml、約5μg/ml、約6μg/ml、約10μg/ml、約15μg/ml、約20μg/ml、約25μg/ml、約50mg/ml、約75mg/ml、約100mg/ml、約125mg/ml、約150mg/ml、約175mg/ml、約200mg/ml、約225mg/ml、約250mg/ml、約275mg/ml又は約300mg/ml以上の血清力価を生じる。好ましくは、このような抗体の約1μg/ml、約2μg/ml、約5μg/ml、約6μg/ml、約10μg/ml、約15μg/ml、約20μg/ml、約25μg/ml、約50mg/ml、約100mg/ml、約150mg/ml又は約300mg/ml以上の血清力価が、本発明の免疫原性製剤の最初の用量の投与のおよそ20日（好ましくは25、30、35又は40日）後に、任意のその他の用量の製剤の投与なしで達成される。免疫応答は、対象において、又は動物モデルにおいて決定してもよく、次いでその反応を対象、例えばヒトにおいて予測される反応に相関させ、又は推定する。
【０１４０】
一つの実施態様において、本発明は、対象における少なくとも１つの疾患（例えば、インフルエンザ感染及び／又はインフルエンザではない別の感染因子による感染）を予防するための方法であって、本発明のキメラインフルエンザウイルスを含む免疫原性製剤の有効量の第1の用量を前記対象に投与することを含み、該キメラウイルスは、異種配列（例えば、疾患抗原）の融合タンパク質を含み、該有効量は、第1の投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に、及び任意のその後の投与の前に、キメラウイルスのバックボーンの抗原又はエピトープに免疫特異的に結合する抗体の、約10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml以上の血清力価を生じる量である、前記方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、対象における少なくとも１つの疾患（例えば、インフルエンザ感染及び／又はインフルエンザではない別の感染因子による感染）を予防するための方法であって、本発明のキメラインフルエンザウイルスを含む免疫原性製剤の有効量の第1の用量を前記対象に投与することを含み、該キメラウイルスは、異種配列（例えば、疾患抗原）の融合タンパク質を含み、該有効量は、第1の投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に、及び任意のその後の投与の前に、融合タンパク質の抗原（すなわち、疾患に関連した導入タンパク質の外部ドメインの抗原）に免疫特異的に結合する、約10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml以上の血清力価を生じる量である、前記方法を提供する。免疫応答は、対象において、又は動物モデルにおいて決定してもよく、次いでその反応を対象、例えばヒトにおいて予測される反応に相関させ、又は推定する。一つの実施態様において、本発明は、トリにおけるトリインフルエンザ感染及び／又はトリインフルエンザではない別の感染因子による感染を予防するための方法であって、本発明のキメラトリウイルスの有効量の、本発明のキメラトリインフルエンザウイルス（該キメラトリインフルエンザウイルスは、異種タンパク質配列を含む融合タンパク質を含む）を含む免疫原性製剤の第1の用量を、前記対象に対して、投与することを含み、該有効量は、第1の投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に、及び任意のその後の投与の前に、キメラウイルスの抗原に免疫特異的に結合する抗体及び／又は融合タンパク質の抗原に免疫特異的に結合する抗体の約10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml以上の血清力価を生じる量である、前記方法を提供する。一部の実施態様において、対象又は動物モデルに投与されるキメラインフルエンザウイルスの用量は、102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011又は1012pfuである。
【０１４１】
一つの実施態様において、本発明は、対象における少なくとも１つの疾患（例えば、インフルエンザ感染及び／又はインフルエンザではない別の感染因子による感染）を治療するための方法であって、本発明のキメラインフルエンザウイルスを含む免疫原性製剤の有効量の第1の用量を前記対象に投与することを含み、該キメラウイルスは、異種配列（例えば、疾患抗原）の融合タンパク質を含み、該有効量は、第1の投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に、及び任意のその後の投与の前に、キメラウイルスのバックボーンの抗原又はエピトープに免疫特異的に結合する抗体の約10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml以上の血清力価を生じる量である、前記方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、対象における少なくとも１つの疾患（例えば、インフルエンザ感染及び／又はインフルエンザではない別の感染因子による感染）を治療するための方法であって、本発明のキメラインフルエンザウイルスを含む免疫原性製剤の有効量の第1の用量を前記対象に投与することを含み、該キメラウイルスは、異種配列（例えば、疾患抗原）の融合タンパク質を含み、該有効量は、第1の投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に、及び任意のその後の投与の前に、融合タンパク質の抗原（すなわち、疾患に関連した導入タンパク質の外部ドメインの抗原）に免疫特異的に結合する抗体の約10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml以上の血清力価を生じる量である、前記方法を提供する。免疫応答は、対象において、又は動物モデルにおいて決定してもよく、次いでその反応を対象、例えばヒトにおいて予測される反応に相関させ、又は推定する。一つの実施態様において、本発明は、トリにおけるトリインフルエンザ感染及び／又はトリインフルエンザではない別の感染因子による感染を治療するための方法であって、本発明のキメラトリウイルスの有効量の、本発明のキメラトリインフルエンザウイルス（該キメラトリインフルエンザウイルスは、異種タンパク質配列を含む融合タンパク質を含む）を含む免疫原性製剤の第1の用量を、前記対象に対して、投与することを含み、該有効量は、第1の投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に、及び任意のその後の投与の前に、キメラウイルスの抗原に免疫特異的に結合する抗体及び／又は融合タンパク質の抗原に免疫特異的に結合する抗体の約10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml以上の血清力価を生じる量である、前記方法を提供する。一部の実施態様において、対象又は動物モデルに投与されるキメラインフルエンザウイルスの用量は、102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011又は1012 pfuである。
【０１４２】
一つの実施態様において、本発明は、対象における少なくとも１つの疾患（例えば、インフルエンザ感染及び／又はインフルエンザではない別の感染因子による感染）を管理し、及び／又は寛解させるための方法であって、本発明のキメラインフルエンザウイルスを含む免疫原性製剤の有効量の第1の用量を前記対象に投与することを含み、該キメラウイルスは、異種配列（例えば、疾患抗原）の融合タンパク質を含み、該有効量は、第1の投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に、及び任意のその後の投与の前に、キメラウイルスのバックボーンの抗原又はエピトープに免疫特異的に結合する抗体の約10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml以上の血清力価を生じる量である、前記方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、対象における少なくとも１つの疾患（例えば、インフルエンザ感染及び／又はインフルエンザではない別の感染因子による感染）を管理し、及び／又は寛解させるための方法であって、本発明のキメラインフルエンザウイルスを含む免疫原性製剤の有効量の第1の用量を前記対象に投与することを含み、該キメラウイルスは、異種配列（例えば、疾患抗原）の融合タンパク質を含み、該有効量は、第1の投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に、及び任意のその後の投与の前に、融合タンパク質の抗原（すなわち、疾患に関連した導入タンパク質の外部ドメインの抗原）に免疫特異的に結合する抗体の約10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml以上の血清力価を生じる量である、前記方法を提供する。免疫応答は、対象において、又は動物モデルにおいて決定してもよく、次いでその反応を対象、例えばヒトにおいて予測される反応に相関させ、又は推定する。一つの実施態様において、本発明は、トリにおけるトリインフルエンザ感染及び／又はトリインフルエンザではない別の感染因子による感染を管理し、及び／又は寛解させるための方法であって、本発明のキメラトリウイルスの有効量の、本発明のキメラトリインフルエンザウイルス（該キメラトリインフルエンザウイルスは、異種タンパク質配列を含む融合タンパク質を含む）を含む免疫原性製剤の第1の用量を、前記対象に対して、投与することを含み、該有効量は、第1の投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に、及び任意のその後の投与の前に、キメラウイルスの抗原に免疫特異的に結合する抗体及び／又は融合タンパク質の抗原に免疫特異的に結合する抗体の約10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml以上の血清力価を生じる量である、前記方法を提供する。一部の実施態様において、対象又は動物モデルに投与されるキメラインフルエンザウイルスの用量は、102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011又はl012 pfuである。
【０１４３】
一つの実施態様において、本発明は、対象における少なくとも１つの疾患（例えば、NDV感染及び／又はNDVではない別の感染因子による感染）を予防するための方法であって、本発明のキメラNDVを含む免疫原性製剤の有効量の第1の用量を前記対象に投与することを含み、該キメラウイルスは、異種配列（例えば、疾患抗原）の融合タンパク質を含み、該有効量は、第1の投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に、及び任意のその後の投与の前に、キメラウイルスのバックボーンの抗原又はエピトープに免疫特異的に結合する抗体の、約10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml以上の血清力価を生じる量である、前記方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、対象における少なくとも１つの疾患（例えば、NDV感染及び／又はNDVではない別の感染因子による感染）を予防するための方法であって、本発明のキメラNDVを含む免疫原性製剤の有効量の第1の用量を前記対象に投与することを含み、該キメラウイルスは、異種配列（例えば、疾患抗原）の融合タンパク質を含み、該有効量は、第1の投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に、及び任意のその後の投与の前に、融合タンパク質の抗原（すなわち、疾患に関連した導入タンパク質の外部ドメインの抗原）に免疫特異的に結合する、約10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml以上の血清力価を生じる量である、前記方法を提供する。免疫応答は、対象において、又は動物モデルにおいて決定してもよく、次いでその反応を対象、例えばヒトにおいて予測される反応に相関させ、又は推定する。一つの実施態様において、本発明は、トリにおけるNDV感染及び／又はNDVではない別の感染因子による感染を予防するための方法であって、本発明のキメラウイルスの有効量の、本発明のキメラNDV（該キメラNDVは、異種タンパク質配列を含む融合タンパク質を含む）を含む免疫原性製剤の第1の用量を、前記対象に対して、投与することを含み、該有効量は、第1の投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に、及び任意のその後の投与の前に、キメラウイルスの抗原に免疫特異的に結合する抗体及び／又は融合タンパク質の抗原に免疫特異的に結合する抗体の約10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml以上の血清力価を生じる量である、前記方法を提供する。一部の実施態様において、対象又は動物モデルに投与されるキメラインフルエンザウイルスの用量は、102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011又は1012pfuである。
【０１４４】
一つの実施態様において、本発明は、対象における少なくとも１つの疾患（例えば、NDV感染及び／又はNDVではない別の感染因子による感染）を治療するための方法であって、本発明のキメラNDVを含む免疫原性製剤の有効量の第1の用量を前記対象に投与することを含み、該キメラウイルスは、異種配列（例えば、疾患抗原）の融合タンパク質を含み、該有効量は、第1の投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に、及び任意のその後の投与の前に、キメラウイルスのバックボーンの抗原又はエピトープに免疫特異的に結合する抗体の、約10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml以上の血清力価を生じる量である、前記方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、対象における少なくとも１つの疾患（例えば、NDV感染及び／又はNDVではない別の感染因子による感染）を治療するための方法であって、本発明のキメラNDVを含む免疫原性製剤の有効量の第1の用量を前記対象に投与することを含み、該キメラウイルスは、異種配列（例えば、疾患抗原）の融合タンパク質を含み、該有効量は、第1の投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に、及び任意のその後の投与の前に、融合タンパク質の抗原（すなわち、疾患に関連した導入タンパク質の外部ドメインの抗原）に免疫特異的に結合する、約10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml以上の血清力価を生じる量である、前記方法を提供する。免疫応答は、対象において、又は動物モデルにおいて決定してもよく、次いでその反応を対象、例えばヒトにおいて予測される反応に相関させ、又は推定する。一つの実施態様において、本発明は、トリにおけるNDV感染及び／又はNDVではない別の感染因子による感染を治療するための方法であって、本発明のキメラウイルスの有効量の、本発明のキメラNDV（該キメラNDVは、異種タンパク質配列を含む融合タンパク質を含む）を含む免疫原性製剤の第1の用量を、前記対象に対して、投与することを含み、該有効量は、第1の投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に、及び任意のその後の投与の前に、キメラウイルスの抗原に免疫特異的に結合する抗体及び／又は融合タンパク質の抗原に免疫特異的に結合する抗体の約10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml以上の血清力価を生じる量である、前記方法を提供する。一部の実施態様において、対象又は動物モデルに投与されるキメラインフルエンザウイルスの用量は、102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011又は1012pfuである。
【０１４５】
一つの実施態様において、本発明は、対象における少なくとも１つの疾患（例えば、NDV感染及び／又はNDVではない別の感染因子による感染）を管理し、及び／又は寛解させるための方法であって、本発明のキメラNDVを含む免疫原性製剤の有効量の第1の用量を前記対象に投与することを含み、該キメラウイルスは、異種配列（例えば、疾患抗原）の融合タンパク質を含み、該有効量は、第1の投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に、及び任意のその後の投与の前に、キメラウイルスのバックボーンの抗原又はエピトープに免疫特異的に結合する抗体の、約10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml以上の血清力価を生じる量である、前記方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、対象における少なくとも１つの疾患（例えば、NDV感染及び／又はNDVではない別の感染因子による感染）を管理し、及び／又は寛解させるための方法であって、本発明のキメラNDVを含む免疫原性製剤の有効量の第1の用量を前記対象に投与することを含み、該キメラウイルスは、異種配列（例えば、疾患抗原）の融合タンパク質を含み、該有効量は、第1の投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に、及び任意のその後の投与の前に、融合タンパク質の抗原（すなわち、疾患に関連した導入タンパク質の外部ドメインの抗原）に免疫特異的に結合する、約10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml以上の血清力価を生じる量である、前記方法を提供する。免疫応答は、対象において、又は動物モデルにおいて決定してもよく、次いでその反応を対象、例えばヒトにおいて予測される反応に相関させ、又は推定する。一つの実施態様において、本発明は、トリにおけるNDV感染及び／又はNDVではない別の感染因子による感染を管理し、及び／又は寛解させるための方法であって、本発明のキメラウイルスの有効量の、本発明のキメラNDV（該キメラNDVは、異種タンパク質配列を含む融合タンパク質を含む）を含む免疫原性製剤の第1の用量を、前記対象に対して、投与することを含み、該有効量は、第1の投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に、及び任意のその後の投与の前に、キメラウイルスの抗原に免疫特異的に結合する抗体及び／又は融合タンパク質の抗原に免疫特異的に結合する抗体の約10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml以上の血清力価を生じる量である、前記方法を提供する。一部の実施態様において、対象又は動物モデルに投与されるキメラインフルエンザウイルスの用量は、102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011又は1012pfuである。
【０１４６】
また、本発明は、少なくとも１つの疾患を予防し、治療し、及び／又は管理するための方法であって、本発明のキメラインフルエンザウイルスを含む免疫原性製剤の有効量を前記対象に投与することを含み、該有効量は、本発明の免疫原性製剤が投与されていない対象と比較して死亡率の減少、入院の減少、疾患の重症度の減少及び／又は疾患の臨床症状の減少を生じる量である、前記方法を提供する。特定の実施態様において、対象は、ヒトである。一部の実施態様において、対象に投与されるキメラインフルエンザウイルスの用量は、102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011又は1012pfuである。
【０１４７】
別の実施態様において、本発明は、対象（好ましくは、トリ）における少なくとも１つの疾患（例えば、トリインフルエンザ感染及び／又はトリインフルエンザではない別の感染因子による感染）を予防し、治療し、及び／又は管理するための方法であって、本発明のキメラトリインフルエンザウイルスを含む免疫原性製剤の有効量を前記対象に投与することを含み、該有効量は、本発明の免疫原性製剤が投与されていない対象と比較して感染因子の力価又は数の減少、死亡率の減少、入院の減少、感染の重症度の減少及び／又は感染の臨床症状の減少を生じる量である、前記方法を提供する。一部の実施態様において、対象に投与されるキメラトリインフルエンザウイルスの用量は、102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011又は1012pfuである。特定の実施態様において、本発明の免疫原性製剤の投与により、当該技術分野において公知の任意の、又は本明細書において例証した（例えば、ウイルス力価の決定）方法による前記投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に決定すると、本発明の免疫原性製剤が投与されていない対象と比較して、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%又は80%以上の減少を生じる。その他の実施態様において、本発明の免疫原性製剤の投与により、当該技術分野において公知の任意の、又は本明細書において例証した（例えば、ウイルス力価又は細菌負荷及び／又は濃度の決定）方法による前記投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に決定すると、本発明の免疫原性製剤が投与されていない対象と比較して、感染因子の複製又は感染因子の負荷の1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75、又は100倍の減少を生じる。
【０１４８】
別の実施態様において、本発明は、対象（例えば、トリ）における少なくとも１つの疾患（例えば、NDV感染及び／又はNDVではない別の感染因子による感染）を予防し、治療し、及び／又は管理するための方法であって、本発明のキメラNDVウイルスを含む免疫原性製剤の有効量を前記対象に投与することを含み、該有効量は、本発明の免疫原性製剤が投与されていない対象と比較して感染因子の力価又は数の減少、死亡率の減少、入院の減少、感染の重症度の減少及び／又は感染の臨床症状の減少を生じる量である、前記方法を提供する。一部の実施態様において、対象に投与されるキメラNDVウイルスの用量は、102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011又は1012pfuである。特定の実施態様において、本発明の免疫原性製剤の投与により、当該技術分野において公知の任意の、又は本明細書において例証した（例えば、ウイルス力価の決定）方法による前記投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に決定すると、本発明の免疫原性製剤が投与されていない対象と比較して、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%又は80%以上の減少を生じる。その他の実施態様において、本発明の免疫原性製剤の投与により、当該技術分野において公知の任意の、又は本明細書において例証した（例えば、ウイルス力価の決定）方法による前記投与の2日、5日、10日、15日、20日又は好ましくは30日後に決定すると、本発明の免疫原性製剤が投与されていない対象と比較して、感染因子の複製又は感染因子の負荷の1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75、又は100倍の減少を生じる。
【０１４９】
特定の疾患（例えば、ウイルス感染）の治療、予防及び／又は寛解に有効である本発明の免疫原性製剤の量は、疾患の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定することができる。加えて、最適な用量範囲を同定するのを補助するために、インビトロアッセイ法を任意に使用してもよい。また、製剤に使用される正確な用量は、投与の経路及び感染又は障害の重症度に依存し、開業医及びそれぞれの対象の環境の判断に従って決定されるべきである。しかし、投与のための適切な用量範囲は、一般に約102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011又は1012 pfu及び最も好ましくは約104〜約1012であり、対象に対して1回、2回、3回以上、必要である程度の間隔で投与することができる。有効な用量は、インビトロ又は動物モデル試験系に由来する用量反応曲線から推定してもよい。
【０１５０】
種々の実施態様において、本発明の免疫原性製剤又は本発明のキメラウイルスによって産生される抗体は、対象に対して、少なくとも1つの疾患（例えば、インフルエンザ感染及び／又はインフルエンザウイルスではない別の感染因子による感染）の予防のための1つ以上の療法（例えば、抗ウイルス療法又は免疫調節療法）と共に投与される。その他の実施態様において、本発明の免疫原性製剤又は本発明のキメラウイルスによって産生される抗体は、対象に対して、少なくとも１つの疾患（例えば、インフルエンザ感染及び／又はインフルエンザウイルスではない別の感染因子による感染）の治療のための1つ以上のその他の療法（例えば、抗ウイルス療法又は免疫調節療法）と組み合わせて投与される。更にその他の実施態様において、本発明の免疫原性製剤又は本発明のキメラウイルスによって産生される抗体は、対象に対して少なくとも１つの疾患（例えば、インフルエンザ感染及び／又はインフルエンザウイルスではない別の感染因子による感染）の管理及び／又は寛解のための1つ以上のその他の療法（例えば、抗ウイルス療法又は免疫調節療法）と組み合わせて投与される。具体的実施態様において、本発明の免疫原性製剤又は本発明のキメラウイルスによって産生される抗体は、対象に対して、トリインフルエンザ感染及び／又はトリインフルエンザウイルスではない別の感染因子による感染の予防のための1つ以上のその他の療法（例えば、抗ウイルス療法又は免疫調節療法）と組み合わせて投与される。別の特定の実施態様において、本発明の免疫原性製剤又は本発明のキメラウイルスによって産生される抗体は、対象に対して、トリインフルエンザ感染及び／又はトリインフルエンザウイルスではない別の感染因子による感染の治療のための1つ以上のその他の療法（例えば、抗ウイルス療法又は免疫調節療法）と組み合わせて投与される。更にその他の実施態様において、本発明の免疫原性製剤又は本発明のキメラウイルスによって産生される抗体は、対象に対して、NDV感染及び／又はNDVではない別の感染因子による感染の予防のための1つ以上のその他の療法（例えば、抗ウイルス療法又は免疫調節療法）と組み合わせて投与される。更に他の実施態様において、本発明の免疫原性製剤又は本発明のキメラウイルスによって産生される抗体は、対象に対して、NDV感染及び／又はNDVではない別の感染因子による感染の治療のための1つ以上のその他の療法（例えば、抗ウイルス療法又は免疫調節療法）と組み合わせて投与される。特定の実施態様において、療法（例えば、予防薬又は治療薬）は、5分未満間隔、30分未満間隔、1時間間隔、約1時間間隔で、約1〜約2時間間隔で、約2時間〜約3時間間隔で、約3時間〜約4時間間隔で、約4時間〜約5時間間隔で、約5時間〜約6時間間隔で、約6時間〜約7時間間隔で、約7時間〜約8時間間隔で、約8時間〜約9時間間隔で、約97時間〜約10時間間隔で、約10時間〜約11時間間隔で、約11時間〜約12時間間隔で、約12時間〜18時間間隔で、18時間〜24時間間隔で、24時間〜36時間間隔で、36時間〜48時間間隔で、48時間〜52時間間隔で、52時間〜60時間間隔で、60時間〜72時間間隔で、72時間〜84時間間隔で、84時間〜96時間間隔で、又は96時間120時間間隔で投与される。好ましい実施態様において、2つ���上療法が、同じ特許来診内で投与される。
【０１５１】
当業者に周知の任意の抗ウイルス薬を、本発明の製剤（例えば、ワクチン製剤）及び方法に使用することができる。抗ウイルス薬の非限定的な例には、その受容体に対するウイルスの付着、細胞へのウイルスの内部移行、ウイルスの複製若しくは細胞からのウイルスの放出を阻害し、及び／又は減少させるタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質抗体、核酸分子、有機分子、無機分子、並びに小分子を含む。特に、抗ウイルス薬には、ヌクレオシド類似体（例えば、ジドブジン、アシクロビル、ガングシクロビル（gangcyclovir）、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン及びリバビリン）、フォスカーネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、リトナビル、αインターフェロン及びその他のインターフェロン、並びにAZTを含むが、限定されない。
【０１５２】
具体的実施態様において、抗ウイルス薬は、ウイルス抗原に対して免疫特異的である免疫調節薬である。本明細書に使用される「ウイルス抗原」という用語は、免疫応答を誘発することができる任意のウイルスペプチド、ポリペプチド及びタンパク質（例えば、HIV gp120、HIV nef、RSV F糖タンパク質、RSV G糖タンパク質、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、インフルエンザウイルス血球凝集素、HTLV tax、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（例えば、gB、gC、gD及びgE）及びB型肝炎表面抗原）を含むが、限定されない。ウイルス感染症の治療のための本発明に有用な抗体には、例として、かつ限定でなく以下を含む病原ウイルスの抗原に対する抗体を含むが、限定されない：アデノウイルス科（adenovirdiae）（例えば、マストアデノウイルス及びアビアデノウイルス）、ヘルペスウイルス科（herpesviridae）（例えば、単純ヘルペスウイルス1、単純ヘルペスウイルス2、単純ヘルペスウイルス5及び単純ヘルペスウイルス6）、レビウイルス科（leviviridae）（例えば、レビウイルス、腸内細菌相MS2、アロレビウイルス）、ポックスウイルス科（poxviridae）（例えば、脊椎動物ポックスウイルス亜科（chordopoxvirinae）、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス（leporiipoxvirus）、スイポックスウイルス、軟体動物ポックスウイルス（molluscipoxvirus）及び昆虫ポックスウイルス（entomopoxvirinae））、パポバウイルス科（papovaviridae）（例えば、ポリオーマウイルス及び乳頭腫ウイルス）、パラミキソウイルス科（例えば、パラミキソウイルス、パラインフルエンザウイルス１、モビリウイルス（mobillivirus）（例えば、麻疹ウイルス）、ルブラウイルス（rubulavirus）（例えば、ムンプスウイルス）、ニューモウイルス科（pneumonovirinae）（例えば、ニューモウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス）及びメタニューモウイルス（例えば、トリニューモウイルス及びヒトメタニューモウイルス））、ピコルナウイルス科（picornaviridae）（例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス（例えば、ヒトA型肝炎ウイルス）、カルジオウイルス及びアプトウイルス（apthovirus））、レオウイルス科（reoviridae）（例えば、オルトレオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス、シポウイルス（cypovirus）、フィジーウイルス、フィトレオウイルス及びオリザウイルス）、レトロウイルス科（retroviridae）（例えば、レトロウイルス、トリC型レトロウイルス、D型レトロウイルス群、BLV-HTLVレトロウイルス、レンチウイルス（例えば、ヒト免疫不全症ウイルス1及びヒト免疫不全症ウイルス2）スプマウイルス）、フラビウイルス科（flaviviridae）（例えば、C型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス）、ヘパドナウイルス科（hepadnaviridae）（例えば、B型肝炎ウイルス）、トガウイルス科（togaviridae）（例えば、アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルス）及びルビウイルス（例えば、風疹ウイルス））、ラブドウイルス科（例えば、ベシクロウイルス、リサウイルス、エフェメロウイルス、サイトラブドウイルス及びヌクレオラブドウイルス）、アレナウイルス科（例えば、アレナウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イピーウイルス（Ippy virus）及びラッサウイルス（lassa virus））並び���コロナウイルス科（coronaviridae）（例えば、コロナウイルス及びトロウイルス）。
【０１５３】
細菌感染の予防、治療、管理又は寛解のために当業者に周知の抗細菌薬及び療法は、本発明の組成物（例えば、免疫原性製剤）及び方法に使用することができる。抗細菌薬の非限定の例には、その他の対象に対する細菌感染を阻害し、若しくは減少させる、細菌の複製を阻害し、若しくは減少させる、又は細菌の増殖を阻害し、若しくは減少させるタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、抗体、核酸分子、有機分子、無機分子、並びに小分子を含む。特に、抗細菌薬の例には、ペニシリン、セファロスポリン、イミペネム、アクストレオナム（axtreonam）、バンコマイシン、サイクロセリン、バシトラシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン、トリメトプリム、ノルフロキサシン、リファンピン、ポリミキシン、アンフォテリシンB、ニスタチン、ケトコナゾール、イソニアジド、メトロニダゾール及びペンタミジンを含むが、限定されない。抗細菌療法及びこれらの投薬量、投与の経路及び推奨される使用法は、当該技術分野において公知であり、医師向け机上参考書（Physician's Desk Reference）（第56版、2002）などの文献に記述されている。呼吸器感染及び抗細菌療法についての更なる情報は、セシル医薬の教科書（Cecil Textbook of Medicine）（第18版、1988）において利用できる。
【０１５４】
真菌感染又はその1つ以上の症候（例えば、真菌呼吸器感染）の予防、管理、治療及び／又は寛解のために当業者に周知の抗真菌薬及び療法は、本発明の組成物（例えば、免疫原性製剤）及び方法に使用することができる。抗真菌薬の非限定的な例には、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、抗体、核酸分子、有機分子、無機の分子及びその他の対象に対する真菌感染を阻害し、及び／又は減少させ、真菌の複製を阻害し、及び／又は減少させ、又は真菌の増殖を阻害し、及び／又は減少させる小分子を含む。抗真菌薬の具体例には、アゾール薬物（例えば、ミコナゾール、ケトコナゾール（ニゾラル（NIZORAL）（登録商標））、カスポファンギンアセテート（カンシダス（CANCIDAS）（登録商標））、イミダゾール、トリアゾール（例えば、フルコナゾール（ジフルカン（DIFLUCAN）（登録商標））及びイトラコナゾール（スポラノクス（SPORANOX）（登録商標））、ポリエン（例えば、ニスタチン、アンフォテリシンB（フンギゾン（FUNGIZONE）（登録商標））、アンフォテリシンB脂質複合体（「ABLC」）（アベルセト(ABELCET)（登録商標））、アンフォテリシンBコロイド分散（「ABCD」）（アンホテック（AMPHOTEC）（登録商標））、リポソームアンフォテリシンB（アンビソン（AMBISONE）（登録商標）））、ヨウ化カリウム（KI）、ピリミジン（例えば、フルシトシン（アンコボン（ANCOBON）（登録商標））及びボリコナゾール（ブフェンド（VFEND）（登録商標））を含むが、限定されない。抗真菌療法及びこれらの投薬量、投与の経路及び推奨される使用法は、当該技術分野において公知であり、Doddsらの論文、2000 Pharmacotherapy 20（11）1335-1355、医師向け机上参考書（Physician's Desk Reference）（第57版、2003）並びに診断及び治療のメルクマニュアル（Merk Manual of Diagnosis and Therapy）（第17版、1999）などの文献に記述されている。
【０１５５】
特定の実施態様において、本発明の免疫原性製剤は、単一用量として対象に投与され、続いて3〜6週後に2回目の用量が投与される。これらの実施態様によれば、ブースター接種は、2回目の接種後6〜12ヶ月の間隔で対象に投与してもよい。一つの実施態様において、対象は、哺乳類である。別の実施態様において、対象は、トリ類である。更に別の実施態様において、対象は、ヒトである。より好ましい実施態様において、対象は、NDV又はトリインフルエンザウイルス感染を受けるリスクのあるニワトリである。
特定の実施態様において、本発明の同じ免疫原性製剤の投与は、繰り返してもよく、投与は、少なくとも1日、2日、3日、5日、10日、15日、30日、45日、2ヶ月、75日、3ヶ月又は少なくとも6ヶ月まで離してもよい。
【０１５６】
（5.6 生物学的アッセイ法）
（5.6.1 インビトロアッセイ法）
本発明のキメラウイルスの増殖は、当該技術分野において公知の、又は本明細書に記述した任意の方法（細胞培養（例えば、ニワトリ胚性腎臓培養細胞又はニワトリ胚性線維芽細胞（CEF）の培養）によって評価することができことができる。本発明の弱毒キメラウイルスの増殖は、IFNコンピテント及びIFN欠損した細胞において評価することができる。具体的実施態様において、CEF細胞には、0.0005〜0.001、0.001〜0.01、0.01〜0.1、0.1〜1若しくは1〜10のMOI又は0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5若しくは10のMOIにて感染させて、5%の尿膜腔液を補った無血清培地でインキュベートする。ウイルス力価は、後述するようにCEF細胞においてプラーク形成した（plaqued）HAにより、上清において決定する。ウイルス力価を評価することができるその他の細胞は、EFK-2細胞、Vero細胞、初代ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）、H292ヒト上皮株化細胞及びHeLa細胞を含むが、限定されない。
【０１５７】
本発明のキメラウイルスのビリオンへの融合タンパク質の組み込みは、当該技術分野において公知の、又は本明細書に記述した任意の方法（例えば、培養細胞において、動物モデル又は孵化鶏卵におけるウイルス培養）によって評価することができる。例えば、孵化鶏卵の尿膜腔液の培養細胞由来のウイルス粒子は、スクロースクッションを介して遠心分離によって精製して、その後当該技術分野に周知の方法を使用するウエスタンブロット法によって融合タンパク質発現について解析することができる。
【０１５８】
ウイルスアッセイ法は、当該技術分野において周知方法を使用してインビトロで培養した細胞において、ウイルス複製の変化（例えば、プラーク形成によって決定されるもの）又はウイルスタンパク質（例えば、ウエスタンブロット解析によって決定されるもの）若しくはウイルスRNA（例えば、RT-PCR又はノーザンブロット解析によって決定されるもの）の産生を測定するものを含む。
【０１５９】
本発明のキメラウイルス又はその断片によって産生される抗体は、当業者に周知の種々の方法（例えば、ELISA法、表面プラスモン共鳴ディスプレイ法（BIAcore）、ウエスタンブロット法、免疫蛍光法、免疫染色法及び／又はマイクロ中和アッセイ法）で特徴づけてもよい。特に、本発明のキメラウイルス又はその断片によって産生される抗体は、キメラバックボーンウイルスの抗原又は融合タンパク質の抗原若しくはエピトープに免疫特異的に結合する能力についてアッセイしてもよい。このようなアッセイ法は、溶液において（例えば、Houghtenの論文、1992、Bio/Techniques 13:412-421）、ビーズで（Lamの論文、1991、Nature 354:82-84）、チップで（Fodorの論文、1993、Nature 364:555-556）、細菌で（米国特許第5,223,409号）、胞子（spore）で（米国特許第5,571,698号；5,403,484；及び5,223,409）、プラスミドで（Cullらの論文、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869）又はファージで（Scotto及びSmithの論文、1990, Science 249:386-390；Cwirlaraらの論文、1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382;；及びFeliciの論文、1991, J. Mol. Biol. 222:301-310）（これらの参照のそれぞれは、その全体が引用として本明細書に組み込まれる）。次いで、キメラバックボーンウイルスの抗原又は融合タンパク質の抗原若しくはエピトープに免疫特異的に結合することが同定された本発明のキメラウイルスによって産生される抗体又はその断片は、前記抗原に対するこれらの特異性についてアッセイすることができる。
【０１６０】
本発明のキメラウイルス又はその断片によって産生される抗体は、当該技術分野において公知の任意の方法によって、本発明のキメラウイルスの抗原（例えば、キメラウイルスバックボーンの抗原又は融合タンパク質の抗原若しくはエピトープ（例えば、疾患に関連した抗原）に対する免疫特異的結合及びその他の抗原又はエピトープとの交差反応性についてアッセイしてもよい。免疫特異的結合及び交差反応性を解析するために使用することができる免疫アッセイ法には、少しだが名前を挙げると、ウエスタンブロット法、放射免疫アッセイ法、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」免疫アッセイ法、免疫沈降アッセイ法、沈降反応法、ゲル拡散沈降反応法、免疫拡散法アッセイ法、凝集アッセイ法、補体結合アッセイ法、免疫放射線アッセイ法、蛍光免疫法、プロテインA免疫アッセイ法などの技術を使用する競合的及び非競合的なアッセイ法系を含むが、限定されない。このようなアッセイ法は、当該技術分野においてルーチンかつ周知である（例えば、Ausubelらの文献、編、1994、分子生物学の現在のプロトコル、第1巻、John Wiley and Sons社、ニューヨーク（Ausubel et al, eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York）を参照されたい。これは、その全体が本明細書に引用として組み込まれる）。例示的免疫アッセイ法は、簡単に下記に記述してある（しかし、限定することは意図されない）。
【０１６１】
免疫沈降プロトコルには、一般に、プロテインホスファターゼ及び／又はプロテアーゼ阻害剤｛例えば、EDTA、PMSF、アプロチニン、バナジウム酸ナトリウム）を補ったRIPA緩衝液（1% NP-40又はTriton X-100、1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、0.15M NaCl、pH 7.2の0.01Mリン酸ナトリウム、1%トラジロール）などの溶解緩衝液に細胞集団を溶解すること、細胞可溶化物に関心対象の抗体を添加すること、しばらくの間（例えば、1〜4時間）40℃にてインキュベートすること、細胞可溶化物にプロテインA及び／又はタンパク質Gセファロースビーズを添加すること、40℃にて約1時間以上の間インキュベートすること、溶解緩衝液中でビーズを洗浄すること、及びSDS／試料緩衝液中にビーズを再懸濁することを含む。関心対象の抗体が特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えばウエスタンブロット解析によって評価することができる。当業者であれば、抗原に対する抗体の結合を増大させ、かつバックグランドを減少させるために修正することができるパラメーターに関して知っているだろう（例えば、セファロースビーズでの細胞可溶化物の事前の洗浄）。免疫沈降に関する更なる考察については、例えば、Ausubelら編、1994、分子生物学の現在のプロトコル、第1巻の10.16.1、John Wiley and Sons社、ニューヨーク（Ausubel et al, eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York）を参照されたい。
【０１６２】
ウエスタンブロット解析は、一般にタンパク質試料を調製すること、ポリアクリルアミドゲルにおけるタンパク質試料の電気泳動法（例えば、抗原の分子量に応じて8%〜20% SDS-PAGE）、ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、PVDF又はナイロンなどの膜へのタンパク質試料を転写すること、ブロッキング溶液（例えば、3% BSAを含むPBS又は脱脂乳）中で膜をインキュベートすること、洗浄緩衝液（例えば、PBS-Tween 20）中で膜を洗浄すること、ブロッキング緩衝液中に希釈した一次抗体（関心対象の抗体）と共に膜をインキュベートすること、洗浄液緩衝液中で膜を洗浄すること、ブロッキング緩衝液中に希釈した、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）又は放射性分子（例えば、32P又は125I）に抱合した二次抗体（これは、一次抗体を認識する、例えば抗ヒト抗体）と共に膜をインキュベートすること、洗浄液緩衝液中で膜を洗浄すること、及び抗原の存在を検出することを含む。当業者であれば、検出されるシグナルを増大させ、かつバックグラウンドノイズを減少させるために修正することができるパラメーターに関して知っているだろう。ウエスタンブロットに関する更なる考察については、例えば、Ausubelら編、1994、分子生物学の現在のプロトコル、第1巻の10.8.1、John Wiley and Sons社、ニューヨーク（Ausubel et al, eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York）を参照されたい。
【０１６３】
ELISAには、抗原を調製すること、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングすること、ウェルに酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物に抱合された関心対象の抗体を添加すること、及びしばらくの間インキュベートして抗原の存在を検出することを含む。関心対象の抗体が検出可能な化合物に抱合されていないELISAでは；その代わりに、検出可能な化合物に抱合された二次抗体（これは、関心対象の抗体を認識する）をウェルに添加してもよい。更に、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体をウェルに被覆させてもよい。この場合、検出可能な化合物に抱合された二次抗体は、被覆ウェルへの関心対象の抗原の添加後に、添加してもよい。当業者であれば、検出されるシグナルを増大するために修正することができるパラメーター、並びに当該技術分野において公知のELISAのその他の変更に関しては知っているだろう。好ましい実施態様において、ELISAは、高結合96ウェルマイクロタイタープレート（Costar社）を2μg/mlのrhu-IL-9のPBS溶液で一晩コーティングすることによって行ってものよい。PBSでの3回の洗浄後、プレートをFabの3倍段階希釈と共に25℃にて1時間インキュベートする。PBSでの更に3回の洗浄後、1μg/mlの抗ヒトκ-アルカリホスファターゼ抱合体を添加して、プレートを25℃にて1時間インキュベートする。PBSTで3回の洗浄後、アルカリホスファターゼ活性を50μl/AMP/PPMP基質中で決定する。反応を止めて、560nmでの吸光度をVMAXマイクロプレートリーダーで決定する。ELISAに関する更なる考察については、例えば、Ausubelら編、1994、分子生物学の現在のプロトコル、第1巻、John Wiley and Sons社、ニューヨークの11.2.1（Ausubel et al, eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1）を参照されたい。
【０１６４】
抗原に対する抗体の結合親和性及び抗体-抗原相互作用の解離速度は、競合結合アッセイ法によって決定することができる。競合結合アッセイ法の１つの例は、非標識抗原の存在量を増加させて、関心対象の抗体と共に標識抗原（例えば、3H又は125I）をインキュベーションすること、及び標識抗原に結合した抗体の検出することを含む放射免疫アッセイ法である。本発明の抗体又はこれらの断片のIL-9ポリペプチドに対する親和性及び結合解離速度は、スキャッチャードプロット解析によってデータから決定することができる。また、第二抗体との競合も放射免疫アッセイ法を使用して決定することができる。この場合、IL-9ポリペプチドを非標識二次抗体の存在量を増加させて、標識化合物（例えば、3H又は125I）に抱合した本発明の抗体と共にインキュベートさせる。
【０１６５】
好ましい実施態様において、BIAcore動力学解析は、本発明のキメラウイルスの抗原（例えば、キメラウイルスバックボーンの抗原若しくはエピトープ又は融合タンパク質（例えば、疾患に関連した抗原）の抗原若しくはエピトープ）に対する本発明の抗体の結合オン及びオフ速度を決定するために使用される。BIAcore動力学解析は、されたその表面上に本発明のキメラウイルスによって産生される抗体を固定したチップからの、関心対照の抗原を含むポリペプチドの結合及び解離を解析することを含む。典型的なBIAcore動力学研究には、抗原が固定されたセンサチップ表面上で、0.005% Tween-20を含むHBS緩衝液の濃度を変化させて、250μLの抗体試薬（mAb、Fab）を注射することを含む。流速は、75μL／分に一定に維持する。解離データは、必要に応じて少なくとも15分収集する。それぞれの注射／解離サイクル後、結合したmAbを、簡単な希酸、典型的には10〜100mM HClの1分のパルスを使用して抗原表面から除去するが、環境が保証する場合はその他の再生剤が使用される。より具体的には、会合速度kon及び解離速度koffの測定のためには、抗原を含むポリペプチドを、標準的なアミン結合化学、すなわちEDC／NHS法（EDC= N-ジエチルアミノプロピル)-カルボジイミド）を使用することによってセンサチップ表面上に直接固定させる。簡潔には、10mM NaOAc、pH4又はpH5中に抗原を含むポリペプチドの5〜100nMの溶液を調製し、抗原の30〜50RU値が固定されるまで、EDC/NHS-活性化した表面上を通過させる。これに続いて、反応していない活性エステルを1M Et-NH2の注射で「キャプを」はずす。抗原を含まなない空の表面を、参照目的のために同一の固定化条件下で調製する。一旦適切な表面が調製されると、抗体試薬のそれぞれの適切な段階希釈をHBS／Tween-20中に調製し、連続して接続された抗原セル表面及び参照セル表面の両方を通過させる。調製される抗体濃度の範囲は、見積もられる平衡結合定数KDに応じて、変化させる。上述の通り、結合した抗体は、適切な再生剤を使用して、それぞれの注射／解離サイクルの後に除去する。
【０１６６】
また、本発明のキメラウイルス又はその断片によって産生される抗体は、当業者に公知の技術を使用して、これらが、宿主細胞受容体に対する本発明のキメラウイルス抗原（例えば、キメラウイルスバックボーンの抗原又はエピトープ又は融合タンパク質（例えば、疾患に関連した抗原）の抗原若しくはエピトープ）の結合を阻害する能力についてアッセイすることができる。例えば、前記抗原に結合することが公知の受容体を発現する細胞を、本発明のキメラウイルス又はこれらの断片によって産生される抗体の有無において抗原よ接触させることができ、抗体又はこれらの断片が抗原の結合を阻害する能力を、例えばフローサイトメトリー又はシンチレーションアッセイ法によって測定することができる。抗原又は抗体若しくは抗体断片は、検出可能な放射性標識（例えば、32P、35S及び125I）又は蛍光標識（例えば、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタアルデヒド（o-phthaldehyde）及びフルオレサミン）で標識することができ、抗原と細胞受容体との間の相互作用を検出することができる。或いは、本発明のキメラウイルス又はその断片によって産生される抗体が、受容体に対する結合により本発明のキメラウイルス抗原（例えば、キメラウイルスバックボーンの抗原若しくはエピトープ又は融合タンパク質（例えば、疾患に関連した抗原）の抗原若しくはエピトープ）を阻害する能力は、無細胞アッセイ法において決定することができる。例えば、抗原を含むポリペプチドを、抗体又はこれらの断片と接触させることができ、抗体又は抗体断片が細胞受容体に対する結合によりポリペプチドを阻害する能力を決定することができる。好ましくは、抗体又は抗体断片は、固体支持体上に固定されており、ポリペプチドは、検出可能な化合物で標識されている。或いは、抗原を含むポリペプチドは、固体支持体上に固定されており、抗体又はこれらの断片は、検出可能な化合物で標識されている。
【０１６７】
（5.6.2 インビボアッセイ法）
本発明のキメラウイルスの病原性は、対象において、特にトリにおいて、又はその動物モデルにおいて、評価することができる。一例において、ウイルス感染の動物モデルにおいて肺病変を誘導し、及び感染を生じさせる能力を野生株ウイルス及びモックウイルスと比較する。肺病変は、視覚検査により、健康である肺裂片の割合として評価することができる。動物をペントバルビタールの静脈内投与により5日のp.i.で安楽死させ、これらの肺を全部取り出す。巨視的病変による影響を受けたそれぞれの肺葉の表面の割合を視覚的に見積もる。割合を平均して、それぞれの動物の7つの肺葉についての平均値を得る。その他のアッセイ法において、ウイルス負荷又は力価を決定するために経鼻スワブを試験することができる。経鼻スワブは、感染後のウイルス負荷を決定するための剖検の間に行うことができる。
【０１６８】
組織試料におけるウイルスの定量化のためには、組織試料をリン酸塩緩衝食塩水（PBS）中でホモジナイズし、透明になったホモジネートの希釈物を細胞（例えば、CEF又はMDCK細胞）の単層上へ37℃にて1時間吸着させる。次いで、感染させた単層を、0.1%ウシ血清アルブミン（BSA）、0.01% DEAE-デキストラン、0.1% NaHCO3及び1%寒天を含む最小必須培地の溶液で覆う。プレートは、プラークを視覚化することができるまで、2〜3日インキュベートさせる。PR8感染させた試料からのウイルスを滴定するための組織培養感染用量（TCID）アッセイ法は、以下の通りに実施する。96-ウェルプレートの細胞（例えば、CEF又はMDCK細胞）のコンフルエントな単層を、培地中の透明な組織ホモジネートの対数希釈物と共にインキュベートする。接種の2〜3日後に、それぞれのウェルからの0.05mlの一定分量を、赤血球凝集アッセイ法（HAアッセイ法）によってウイルス増殖について評価する。
【０１６９】
更にその他のアッセイ法において、組織病理学的評価を感染後に行う。鼻甲介及び気管を、上皮変化及び上皮下炎症について調べてもよい。肺を、細気管支の上皮変化、並びに大、中及び小又は末端細気管支における細気管支周囲炎症について調べてもよい。また、肺胞を、炎症性変化についても評価する。中細気管支は、以下の通りに0〜3+のスケールで類別される：0（正常：繊毛性尖端境界及び基底偽重層核を伴う中位から高い円柱状の上皮細胞によって裏打ちされる；最小の炎症）；1+（円柱状及び更にわずかにのみ増殖が増加した輪郭の上皮層；多くの細胞上でなおも目に見える繊毛）；2+（減弱から顕著な増殖までの範囲の上皮層における顕著な変化；破壊された細胞及び管腔境界において不規則な層輪郭）；3+（内腔における目に見える壊死細胞と共に著しく崩壊し、及び破壊された上皮層；いくらかの細気管支の減弱及び顕著な反応性増殖のその他）。
【０１７０】
気管は、以下の通りに0〜2.5+のスケールで類別される：0（正常：繊毛性尖端境界、基底核及び偽重層を伴う中位から高い円柱状の上皮細胞によって裏打ちされる。尖端境界と核との間に明らかな細胞質。扁平細胞を伴う時々の小さな増殖巣）；1+（上皮層の限局的扁平上皮化生）；2+（上皮層の多くの扁平上皮化生が拡散し、繊毛は、限局的に明らかであろう）；2.5+（明らかな極めて少ない繊毛を伴う散在性の扁平上皮化生）。
【０１７１】
ウイルス免疫組織化学は、ウイルス特異的モノクローナル抗体（例えば、NP-、N-又はHN-特異的モノクローナル抗体）を使用して行われる。染色は、以下の通り0〜3+に類別される：0（感染細胞なし）；0.5+（ほとんど感染細胞なし）；1+（ほとんど感染細胞なし、広く分離した個々の細胞）；1.5+（ほとんど感染細胞なし、広く分離された単体として、及び小さなクラスターで）；2+（通常、上皮層裏打ち細気管支の一部の、又は肺胞における小さな小葉下の病巣の、隣接細胞のクラスターに影響を及ぼす、適度な数の感染細胞）；3+（細気管支における大部分の上皮性の層に影響を及ぼしている、又は肺胞における大きな小葉下の病巣において広範囲にわたっている、多数の感染細胞）。
【０１７２】
（5.6.3 ウイルス力価を決定）
ウイルス力価は、キメラウイルスの段階希釈を培養細胞（例えば、CEF又はMDCK）、ニワトリ胚又は生きている動物（例えば、トリ）に接種することによって決定される。規定時間の間のウイルスのインキュベーション後、標準的な方法を使用してウイルスを単離する。
HAアッセイは、V-底96-ウェルプレートにおいて実施する。PBS中のそれぞれの試料の段階2倍希釈物を、同体積のPBS中のニワトリ赤血球の0.5% 懸濁液と共に氷上で1時間インキュベートする。陽性ウェルには、赤血球の粘着性の均一な層を含む；陰性ウェルには、非粘着性ペレットを含む。
ウイルス力価の物理的定量化は、ウイルスの上清に適用されるPCR（Quinn & Trevorの論文、1997；Morganらの論文、1990）、赤血球凝集アッセイ法、組織培養感染用量（TCID50）又は卵子感染用量（EID50）を使用して行うことができる。
【０１７３】
（5.6.4 毒性研究）
本発明の組成物（例えば、免疫原性製剤）の毒性及び／又は有効性は、例えばLD50（集団の50%に対する致死用量）及びED50（集団の50%に治療的に有効用量）を決定するための培養細胞又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性と治療有効性との間の用量比が治療係数であり、これは、LD50／ED50比として表すことができる。大きな治療インデクスを示す療法が好ましい。毒性副作用を示す療法を使用してもよいが、非感染細胞に対する潜在的損傷を最小化し、及びこれにより副作用を減少させるために、このような薬剤を患部組織の部位にターゲットする送達系デザインするように注意が払われるべきである。
【０１７４】
細胞培養アッセイ法及び動物試験から得られるデータは、対象に使用するための療法の投薬量の範囲を示す際に使用することができる。このような薬剤の投薬量は、好ましくはほとんど又は全く毒性を伴わないED50を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、使用される剤形及び利用される投与の経路に応じてこの範囲内で変更してもよい。本発明の方法に使用される任意の療法について、治療的に有効な用量は、最初に細胞培養アッセイ法から見積もることができる。用量を動物モデルにおいて処方して、培養細胞において決定したように、IC50（すなわち、症候の最大半減の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成してもよい。このような情報は、対象（例えば、ウマ）における有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿におけるレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【０１７５】
更に、当業者に公知の任意のアッセイ法を使用して、ウイルス感染又はこれに関連した状態若しくは症候、ウイルス感染又はこれに関連した状態若しくは症候以外の感染、若しくは本発明の弱毒キメラウイルスが該状態に関連した抗原に対する免疫応答を誘導するベクターとして使用される状態のための、組成物（例えば、ワクチン製剤）、本明細書に開示した併用療法の予防的及び／又は治療的有用性を評価することができる。
【０１７６】
（5.7 本発明の具体的実施態様）
本発明は、
（i）異種ペプチド配列を含む外部ドメインであって、該異種配列は、インフルエンザ以外の感染因子の、又は疾患に関連した抗原の感染防御抗原の少なくとも1つのエピトープを含む、前記外部ドメインを有し、（ii）インフルエンザウイルスの必須遺伝子によってコードされる糖タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン、に融合されている、  融合タンパク質を含むキメラトリインフルエンザウイルスであって、
該融合タンパク質は、トリインフルエンザウイルスに組み込まれ、該必須遺伝子の機能は、前記融合タンパク質によって、又は天然の糖タンパク質によってトリインフルエンザウイルスに供給される、前記キメラトリインフルエンザウイルスを提供する。特定の実施態様において、インフルエンザウイルスの必須遺伝子は、赤血球凝集素(HA)遺伝子である。その他の実施態様において、インフルエンザウイルスの必須遺伝子は、ノイラミニダーゼ（NA）遺伝子である。特定の実施態様において、キメラトリインフルエンザウイルスは、弱毒化される。これらの実施態様によれば、キメラトリインフルエンザウイルスは、NS1遺伝子における突然変異によって弱毒化されていてもよい。
【０１７７】
本発明は、
（i）NDV HNタンパク質の外部ドメインを有し、（ii）インフルエンザウイルスNAタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン、に融合されている、融合タンパク質を含むキメラトリインフルエンザウイルスであって、該融合タンパク質は、トリインフルエンザウイルスに組み込まれ、該NAタンパク質の機能は、前記融合タンパク質によって、又は天然の糖タンパク質によってトリインフルエンザウイルスに供給される、前記キメラトリインフルエンザウイルスを提供する。特定の実施態様において、キメラトリインフルエンザウイルスは、弱毒化されている。これらの実施態様によれば、キメラトリインフルエンザウイルスは、NS1遺伝子における突然変異によって弱毒化されていてもよい。
【０１７８】
本発明は、
（i）異種ペプチド配列を含む外部ドメインであって、該異種配列は、インフルエンザ以外の感染因子の、又はインフルエンザ以外の感染因子の感染防御抗原の疾患に関連した抗原の感染防御抗原の少なくとも1つのエピトープを含む、前記外部ドメインを有し、（ii）インフルエンザウイルスの必須遺伝子によってコードされる糖タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン、に融合されている、融合タンパク質を含む弱毒キメラインフルエンザウイルスであって、
該融合タンパク質は、弱毒インフルエンザウイルスに組み込まれ、該必須遺伝子の機能は、前記融合タンパク質によって、又は天然の糖タンパク質によって弱毒インフルエンザウイルスに供給される、前記弱毒キメラインフルエンザウイルスを提供する。特定の実施態様において、インフルエンザウイルスの必須遺伝子は、赤血球凝集素（HA）遺伝子である。その他の実施態様において、インフルエンザウイルスの必須遺伝子は、ノイラミニダーゼ（NA）遺伝子である。
【０１７９】
本発明は、
（i）異種ペプチド配列を含む外部ドメインであって、該異種配列は、NDV以外の感染因子の感染防御抗原の、又は疾患に関連した抗原の少なくとも1つエピトープを含む、前記外部ドメインを有し、（ii）NDVの必須遺伝子によってコードされる糖タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン、に融合されている、融合タンパク質を含むキメラNDVであって、
該融合タンパク質は、NDVに組み込まれ、該必須遺伝子の機能は、前記融合タンパク質によって、又は天然の糖タンパク質によって前記NDVに供給される、前記キメラNDVを提供する。
【０１８０】
本発明は、ノイラミニダーゼ融合タンパク質をコードするパッケージされたインフルエンザウイルスNAセグメントを含むキメラトリインフルエンザウイルスであって、該NAオープンリーディングフレームは、該NA外部ドメインをコードするヌクレオチドがN末端によってアンカーされているインフルエンザ以外の感染因子のノイラミニダーゼ抗原の外部ドメインをコードするヌクレオチドによって置換され、その結果該ノイラミニダーゼ融合タンパク質が該キメラトリインフルエンザウイルス内に発現され、かつ組み込まれるように修飾されている、前記キメラトリインフルエンザウイルスを提供する。
【０１８１】
本発明は、赤血球凝集素融合タンパク質をコードするパッケージされたインフルエンザウイルスHAセグメントを含むキメラトリインフルエンザウイルスであって、該HAオープンリーディングフレームは、該HA外部ドメインをコードするヌクレオチドがC末端によってアンカーされているインフルエンザ以外の感染因子の赤血球凝集素抗原の外部ドメインをコードするヌクレオチドによって置換され、その結果赤血該球凝集素融合タンパク質が該キメラトリインフルエンザウイルス内に発現され、かつ組み込まれるように修飾されている、前記キメラトリインフルエンザウイルスを提供する。
【０１８２】
本発明は、パッケージされたバイシストロニックインフルエンザウイルスHAセグメントを含むキメラトリインフルエンザウイルスであって：
（a）トリインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質をコードする第1のオープンリーディングフレーム、及び、
（b）赤血球凝集素融合タンパク質をコードする第2のオープンリーディングフレームであって、該赤血球凝集素外部ドメインをコードするヌクレオチドは、異種ペプチド配列をコードするヌクレオチドによって置換されており、該異種配列は、C末端によってアンカーされているインフルエンザ以外の感染因子の感染防御抗原の、又は疾患に関連した抗原の少なくとも1つエピトープを含む、第2のオープンリーディングフレーム、
を含み、
その結果、該インフルエンザ赤血球凝集素及び該融合タンパク質の両者がキメラトリインフルエンザウイルス内に発現され、かつ組み込まれる、前記キメラトリインフルエンザウイルスを提供する。
【０１８３】
本発明は、パッケージされたバイシストロニックインフルエンザウイルスNAセグメントを含むキメラトリインフルエンザウイルスであって：
（a）トリインフルエンザノイラミニダーゼタンパク質をコードする第1のオープンリーディングフレーム、及び、
（b）ノイラミニダーゼ融合タンパク質をコードする第2のオープンリーディングフレームであって、該ノイラミニダーゼ外部ドメインをコードするヌクレオチドは、異種ペプチド配列をコードするヌクレオチドによって置換され、該異種配列は、N末端によってアンカーされているインフルエンザ以外の感染因子の感染防御抗原の、又は疾患に関連した抗原の少なくとも１つのエピトープを含む、第2のオープンリーディングフレーム、
を含み、
その結果該インフルエンザノイラミニダーゼ及び該融合タンパク質の両者が該キメラトリインフルエンザウイルス内に発現され、かつ組み込まれる、前記キメラトリインフルエンザウイルスを提供する。
【０１８４】
本発明は、ノイラミニダーゼ融合タンパク質をコードするパッケージされたインフルエンザウイルスNAセグメントを含むキメラトリインフルエンザウイルスであって、該NAオープンリーディングフレームは、該NA外部ドメインをコードするヌクレオチドがNDVのHN抗原の外部ドメインをコードするヌクレオチドによって置換され、その結果該ノイラミニダーゼ融合タンパク質が該キメラトリインフルエンザウイルス内に発現され、かつ組み込まれるように修飾されている、前記キメラトリインフルエンザウイルスを提供する。
【０１８５】
特定の実施態様において、ウイルスの細胞インターフェロンアンタゴニスト活性を減少させる修飾されたNS1タンパク質をコードするパッケージされたNS1遺伝子セグメントを含む段落[0176]-[0178]及び[0180]-[0184]のキメラトリインフルエンザウイルス。その他の実施態様において、赤血球凝集素多塩基切断部位を除去するように修飾されたオープンリーディングフレームを有するHAセグメントを含む段落[0176]-[0178]及び[0180]-[0184]のキメラトリインフルエンザウイルス。更にその他の実施態様において、第1のオープンリーディングフレームが赤血球凝集素多塩基切断部位を除去するように修飾された段落[0182]のキメラトリインフルエンザウイルス。
本発明は、段落[0180]及び[0183]のNAセグメントをコードする組換え核酸分子（例えば、組換えDNA分子）を提供する。また、本発明は、段落[0181]-[0182]のHAセグメントをコードする組換え核酸分子（例えば、組換えDNA分子）を提供する。
【０１８６】
本発明は、段落[0176]-[0178]及び[0180]-[0185]のキメラトリインフルエンザウイルスを増殖させるための方法であって、孵化鶏卵又はトリインフルエンザウイルス感染に感受性である株化細胞においてキメラトリインフルエンザウイルスを培養することを含む、前記方法を提供する。また、本発明は、免疫原性製剤を産生するための方法であって：
（a）トリインフルエンザウイルス感染に感受性である孵化鶏卵又は株化細胞において段落[0176]-[0178]及び[0180]-[0185]のキメラトリインフルエンザウイルスを増殖させること；及び、
（b）子孫ウイルスを収集すること、
を含み、
該ウイルスは、免疫原性製剤、例えばワクチン製剤に使用するために適するように、十分な量で、かつウイルスが汚染されない十分な条件下で培養される、前記方法を提供する。
【０１８７】
本発明は、ノイラミニダーゼ融合タンパク質をコードするパッケージされたインフルエンザウイルスNAセグメントを含む弱毒キメラインフルエンザウイルスであって、該NAオープンリーディングフレームは、該NA外部ドメインをコードするヌクレオチドがN末端によってアンカーされるインフルエンザ以外の感染因子のノイラミニダーゼ抗原の外部ドメインをコードするヌクレオチドによって置換されるように修飾されており、その結果該ノイラミニダーゼ融合タンパク質が該弱毒キメラトリインフルエンザウイルス内に発現され、かつ組み込まれる、前記弱毒キメラインフルエンザウイルスを提供する。
【０１８８】
本発明は、赤血球凝集素融合タンパク質をコードするパッケージされたインフルエンザウイルスHAセグメントを含む弱毒キメラインフルエンザウイルスであって、該HAオープンリーディングフレームは、該HA外部ドメインをコードするヌクレオチドがC末端によってアンカーされるインフルエンザ以外の感染因子の赤血球凝集素抗原の外部ドメインをコードするヌクレオチドによって置換されており、その結果該赤血球凝集素融合タンパク質が該弱毒キメラインフルエンザウイルス内に発現され、かつ組み込まれるように修飾されている、前記弱毒キメラインフルエンザウイルスを提供する。
【０１８９】
本発明は、パッケージされたバイシストロニックインフルエンザウイルスHAセグメントを含む弱毒キメラトリインフルエンザウイルスであって：
（a）トリインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質をコードする第1のオープンリーディングフレーム、及び、
（b）赤血球凝集素融合タンパク質をコードする第2のオープンリーディングフレームであって、該赤血球凝集素外部ドメインをコードするヌクレオチドは、異種タンパク質をコードするヌクレオチドによって置換され、前記タンパク質は、インフルエンザ以外の感染因子の感染防御抗原の、又は疾患に関連した抗原の外部ドメインのエピトープを含み、前記融合タンパク質は、C末端によってアンカーされる、第2のオープンリーディングフレームを含み、
その結果、該インフルエンザ赤血球凝集素及び該融合タンパク質の両方が該弱毒キメラインフルエンザウイルス内に発現され、かつ組み込まれる、前記弱毒キメラインフルエンザウイルスを提供する。
【０１９０】
本発明は、パッケージされたバイシストロニックインフルエンザウイルスNAセグメントを含む弱毒キメラインフルエンザウイルスであって、
（a）トリインフルエンザノイラミニダーゼタンパク質をコードする第1のオープンリーディングフレーム、及び、
（b）ノイラミニダーゼ融合タンパク質をコードする第2のオープンリーディングフレームであって、該ノイラミニダーゼ外部ドメインをコードするヌクレオチドは、異種タンパク質をコードするヌクレオチドによって置換され、前記タンパク質は、インフルエンザ以外の感染因子の感染防御抗原の、又は疾患に関連した抗原の外部ドメインのエピトープ、前記融合タンパク質は、N末端によってアンカーされる、第2のオープンリーディングフレーム、
を含み、
その結果該インフルエンザノイラミニダーゼ及び該融合タンパク質の両方が該弱毒キメラインフルエンザウイルス内に発現され、かつ組み込まれる、前記弱毒キメラインフルエンザウイルスを提供する。
【０１９１】
特定の実施態様において、ウイルスの細胞のインターフェロンアンタゴニスト活性を減少させる修飾されたNS1タンパク質をコードするパッケージされたNS1遺伝子セグメントを含む段落[0187]-[0190]の弱毒キメラインフルエンザウイルス。特定のその他の実施態様において、赤血球凝集素多塩基切断部位を除去するために修飾されたオープンリーディングフレームを有するHAセグメントを含む段落[0187]-[0190]の弱毒キメラインフルエンザウイルス。その他の実施態様において、第1のオープンリーディングフレームが赤血球凝集素多塩基切断部位を除去するように修飾された段落[0189]の弱毒キメラインフルエンザウイルス。
本発明は、段落[0187]-[0190]のNAセグメントをコードする組換えDNA分子を提供する。また、本発明は、段落[0188]-[0189]のHAセグメントをコードする組換えDNA分子を提供する。
【０１９２】
本発明は、段落[0187]-[0191]の弱毒キメラインフルエンザウイルスを増殖させるための方法であって、トリインフルエンザウイルスに感受性の孵化鶏卵又は株化細胞において弱毒キメラインフルエンザウイルスを培養することを含む、前記方法を提供する。また、本発明は、免疫原性製剤を産生するための方法であって、
（a）弱毒インフルエンザウイルス感染に感受性である孵化鶏卵又は細胞において段落[0178]及び[0187]-[0191]の弱毒キメラインフルエンザウイルスを増殖させること；及び
（b）子孫ウイルスを収集すること、
を含み、
該子孫ウイルスは、免疫原性製剤、例えばワクチン製剤に使用するために適するように、十分な量で、かつウイルスが汚染されない十分な条件下で培養される、前記方法を提供する。
【０１９３】
本発明は、Fタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインとC末端によってアンカーされるNDV以外の感染因子の抗原の外部ドメインとを有するFタンパク質-融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むパッケージされたゲノムを含み、その結果該Fタンパク質-融合タンパク質がキメラNDV内に発現され、かつ組み込まれる、キメラNDVを提供する。
本発明は、HNタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインとN末端によってアンカーされたNDV以外の感染因子の抗原の外部ドメインとを有するHN融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むパッケージされたゲノムを含み、その結果該HN融合タンパク質がキメラNDV内に発現され、かつ組み込まれる、キメラNDVを提供する。
【０１９４】
特定の実施態様において、段落[0180]及び［0193］のキメラNDVのゲノムは、Fタンパク質が発現されて、Fタンパク質-融合タンパク質に加えてキメラNDVに組み込まれるように、Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。その他の実施態様において、NDV Fタンパク質-融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、NDV Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を置換し、かつFタンパク質-融合タンパク質は、段落［0193］のキメラNDVに対してFタンパク質の機能を供給する。
【０１９５】
特定の実施態様において、段落[0179]及び[0189]-[0190]のキメラNDVのゲノムは、HNタンパク質がキメラNDV内に発現され、かつ組み込まれるように、HNタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。その他の実施態様において、HN融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、NDV HNタンパク質をコードするヌクレオチド配列を置換し、かつHN融合タンパク質は、段落［0193］のキメラNDVに対してHNタンパク質の機能を供給する。
【０１９６】
本発明は、段落[0179]及び［0193］のキメラNDVを増殖させるための方法であって、NDV感染に感受性の孵化鶏卵又は株化細胞においてキメラNDVを培養することを含む、前記方法を提供する。また、本発明は、免疫原性製剤を産生するための方法であって、
（a）孵化鶏卵又は細胞において段落[0179]及び［0193］のキメラNDVを増殖させること、及び、
（b）子孫ウイルスを収集すること、
を含み、
該子孫ウイルスは、免疫原性製剤、例えばワクチン製剤に使用するために適するように、十分な量で、かつウイルスが汚染されない十分な条件下で培養される、前記方法を提供する。
【０１９７】
本発明は、段落[0176]-[0177]、[0179]-[0185]及び［0193］のキメラウイルスを含む孵化鶏卵を提供する。また、本発明は、段落[0176]-[0177]、[0179]-[0185]及び［0193］のキメラウイルスを含む株化細胞を提供する。更に、本発明は、段落[0176]-[0177]、[0179]-[0185]及び［0193］のキメラウイルスを含む免疫原性製剤を提供する。
本発明は、段落[0178]及び[0187]-[0191]の弱毒キメラウイルスを含む孵化鶏卵を提供する。また、本発明は、段落[0178]及び[0187]-[0191]の弱毒キメラウイルスを含む株化細胞を提供する。更に、本発明は、段落[0178]及び[0187]-[0191]の弱毒キメラウイルスを含む免疫原性製剤を提供する。
【０１９８】
本発明は、トリにおいて2つの感染因子の免疫応答を誘導する方法であって、段落[0176]-[0177]及び[0180]-[0185]のキメラトリインフルエンザウイルスの有効量を投与することを含む、前記方法を提供する。また、本発明は、トリにおいて2つの感染因子の免疫応答を誘導する方法であって、段落[0179]及び［0193］のキメラNDVの有効量を投与することを含む、前記方法を提供する。更に、本発明は、トリにおいて2つの感染因子の免疫応答を誘導する方法であって、段落[0178]及び[0187]-[0191]の弱毒キメラインフルエンザウイルスの有効量を対象に投与することを含む、前記方法を提供する。特定の実施態様において、対象は、ヒト対象である。その他の実施態様において、対象は、非ヒト哺乳類（例えば、ブタ、ウマ、イヌ又はウシ、ネコ）である。更にその他の実施態様において、対象は、トリ対象である。
【実施例】
【０１９９】
（6. 実施例）
（6.1 ニューカッスル病ウイルスエピトープを示すキメラトリインフルエンザウイルスの操作）
以下の実施例は、例示的なキメラトリインフルエンザウイルスの産生を記述する。
特に、実施例は、トリインフルエンザウイルス、インフルエンザA型/ベトナム株/1203/04（H5N1）を操作して、トリインフルエンザウイルスNAタンパク質の細胞質ドメイン及び膜貫通ドメイン、並びにNDV HNタンパク質の外部ドメインを含む融合タンパク質をそのビリオン内に発現し、かつ組み込むことを記述している。融合タンパク質は、トリインフルエンザウイルスNAタンパク質を機能的に置換する。
【０２００】
（6.1.1 材料及び方法）
（6.1.1.1 プラスミドの構築）
組換えウイルスのプラスミドのみの救出に使用するための全てのプラスミド構築物は、同じストラテジーを使用してクローニングした。ウイルスのセグメントの全長cDNAを、SapI制限酵素部位を含んだプライマーでPCRを使用して増幅し、これにより、PCR産物をpPolI-SapI-RbプラスミドのSapI部位への挿入を可能とした（Flandorferらの論文、2003, J. Virol. 77：9116-9123；Nakayaらの論文、2001, J. Virol. 75：11868-1 1873；この両方は、その全体が引用として本明細書に組み込まれる）。全てのPCR挿入物の配列を確認し（Mount Sinai DNA sequencing facility, NY）、PCRによって導入されたヌクレオチドの変化は、QuickChange XL部位特異的変異誘発キット（Stragene社, La Jolla, CA）を使用して、適切なときは修正した。インフルエンザA型/ベトナム株/1203/04（H5N1）、インフルエンザA型/WSN/33（WSN）及びNDVのためのGenBank配列を表2に提供してある。
【０２０１】
【表２】
0005603012.tif 000003
【０２０２】
（6.1.1.2 キメラウイルスセグメントの構築）
NDV B1 HN外部ドメイン、並びにインフルエンザA型/WSN/33（A/ベトナム/1203/04-A/WSN/33 NA(CT+TM) -NDV B1 HN(ecto)）のノイラミニダーゼ（NA）の細胞質尾部（CT）及び膜貫通（TM）ドメインをコードするcDNAは、当該技術分野において周知の組換え技術を使用して構築した。構築物は、WSN NA vRNAの3'非翻訳領域の19ヌクレオチド、NAタンパク質の細胞質尾部及び膜貫通ドメイン更にNA外部ドメインの最初のアミノ酸に相当するNAコード領域のアミノ酸1〜36（108ヌクレオチド）、続いてNDV B1 HNタンパク質のアミノ酸51〜568（HN外部ドメイン）をコードするヌクレオチド、2つの連続した終止コドン、WSN NAリーディングフレームの157個の非翻訳のヌクレオチド及びWSN vRNAの5'非翻訳領域をコードする（図1）。
【０２０３】
（6.1.1.3 キメラH5N1-NDVをコードするプラスミド構築物の構築）
プラスミドのみの救出によって、NDV表面糖タンパク質を提示するように操作されたH5N1（宿主ウイルス）に基づいたキメラウイルスを産生するために、プラスミド構築物を作製した。表面糖タンパク質NAをコードするH5N1のセグメントは、NAタンパク質のCTドメイン及びTMドメイン更にA/WSN/33のNA外部ドメイン及びNDV-B1のHNタンパク質の外部ドメインの最初のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含む組換えセグメントで置換されるように選択した。融合タンパク質、A/ベトナム/1203/04-A/WSN/33 NA(CT+TM)-NDV B1 HN(ecto)は、キメラトリインフルエンザウイルスに対するノイラミニダーゼ活性を供給する。キメラセグメントの模型図のために、図1を参照されたい。
【０２０４】
表2に収載されたH5N1の残りの7つのセグメント（NS、M、NP、HA、PA、PB1及びPB2）をpPol1にクローニングして、それぞれpPol1VN1203-NS、pPol1VN1203-M、pPol1VN1203-NP、pPol1VN1203-HA、pPol1VN1203-PA、pPol1VN1203-PB1及びpPol1VN1203-PB2を産生した。キメラH5N1ウイルスの減弱を保証するために、H5N1 HAをコードするセグメントを変化させて、HA切断部位の直前の天然の多塩基アミノ酸配列（H5N1 HAをコードする配列のヌクレオチド1013〜1039）を非病原性トリ株のインフルエンザA型H5に基づいたコンセンサス配列に変換した。この領域のアミノ酸配列は、QRERRRKKRG（配列番号11；配列番号14のアミノ酸2〜11）からQRETRG（配列番号12；配列番号16のアミノ酸2〜7）に変化させて、下線を引いたアミノ酸をスレオニンに置換した（図2）。この領域のコドン選択性を更に変化させて、ポリメラーゼスリッパーゼによるこの配列におけるアデノシン残基の再導入の機会及びHA切断部位への塩基性アミノ酸残基の導入が生じるのを最小にするために、アデノシン残基の数を減少させた。同義の突然変異のみを非病原性HA配列に導入した（図3）。低病原性トリインフルエンザA型株に対応する変化させたHA糖タンパク質をコードする生じるセグメントを、前述したようにpPol1プラスミド中にクローン化した（pPol1VN1203-HALO）。PB1及びPB2を除いて、H5N1のセグメントによってコードされる遺伝子産物は、genbank配列から変更しなかった。PB1及びPB2の配列は、SapI制限酵素部位の導入の結果として変化させた。PB1のコード配列の位置32におけるヌクレオチドグアニンとの非同義的置換により、リジンからアルギニンへの突然変異を生じ；PB2のコード配列の位置1393におけるヌクレオチドチミンとの非同義的置換により、プロリンからセリンへの突然変異を生じた。H5N1の全ての遺伝子産物は、vRNAの位置4にアデノシン残基を有する。
【０２０５】
野生型H5N1 NS、pPol1VN1203-NSをコードするプラスミド構築物に加えて、H5N1 NS遺伝子セグメントの異なって切断されたバージョンをコードする3つのpPol1構築物も産出した。NSセグメントの変化させたバージョンをコードする更なる構築物は、生じるキメラウイルスを更に減弱させる際に使用してもよい（例えば、米国特許大6,669,943号を参照されたい。これは、その全体が引用として本明細書に組み込まれる）。3つの構築物は、プラスミド構築物によって発現されるNS1タンパク質のアミノ酸の数（アミノ末端から）に変更を加えた。従って、pPol1VN1203 NS1-126、pPol1VN1203 NS1-99及びpPol1VN1203 NS1-73は、それぞれ野生型NS1タンパク質のアミノ末端から数えて、最初の126のみのアミノ酸、最初の99のみのアミノ酸及び最初の73のみのアミノ酸をコードする。切断された構築物を産生するための突然変異誘発は、NEPのオープンリーディングフレームに影響を及ぼさなかった（図4）。
【０２０６】
（6.1.1.4 プラスミド構築物からの感染性ウイルスの救出）
本発明の組換えキメラウイルスは、本明細書に記述され、又は当該技術分野において公知の任意の手段によって救出される。例えば、293T細胞、HEp-2細胞又はA549細胞には、8つの記述したpPol1プラスミドをトランスフェクトして、所望のレベルのウイルスの減弱を達成し、その結果全ての8つのセグメントが示されるように選択してもよく、すなわち、細胞には、pPol1VN WSN-NA(CT+TM)-NDV B1 HN(ecto）；pPol1VN1203-HA又はpPol1VN1203-HALO；pPol1VN1203-NS、pPol1VN1203 NS1-126、pPol1VN1203 NS1-99又はpPol1VN1203 NS1-73；pPol1VN1203-M；pPol1VN1203-NP；pPol1VN1203-PA；pPol1VN1203-PB1及びpPol1VN1203-PB2をトランスフェクトする。細胞には、vRNAsの複製及び転写のために必要とされるNA、PA、PB1及びPB2をコードする真核生物発現プラスミドを更にトランスフェクトする。一晩インキュベーション後、トランスフェクトされた細胞をニワトリ胚線維芽細胞と共に共培養して、産生されたウイルスを増幅させてもよい。更なる2〜3日のインキュベーション後、共培養の上清を、増殖のための9〜10日齢の孵化鶏卵の尿膜腔に注射してもよい。弱毒ウイルスについては、免疫応答を起こし得るインターフェロン系を有していない7日齢の卵を使用してもよい。ウイルスの増殖は、当該技術分野において公知の標準的プロトコルに従って、赤血球凝集のために回収した尿膜腔液をアッセイすることによって確認してもよい。
【０２０７】
（6.2 外来エピトープを提示するキメラニューカッスル病ウイルスの操作）
以下の実施例は、例示的なキメラNDVの産生を記述する。特に、本実施例は、キメラNDVを操作して、NDVの必須タンパク質の細胞質ドメイン及び膜貫通ドメイン、並びにトリインフルエンザウイルスの外部ドメインを含む融合タンパク質をそのビリオン内に発現し、かつ組み込むことを記述する。本実施例は、そのようなキメラウイルスがインフルエンザウイルス及びNDVの両方によるその後の感染に対する保護を誘導することを証明する。
また、実施例は、例示的NDVを操作して、NDV Fタンパク質の細胞質ドメイン並びにヒトケラチノサイト成長因子受容体（KGFR）の外部ドメイン及び膜貫通ドメインを含む融合タンパク質をそのビリオン内に発現し、かつ組み込むことを記述する。
【０２０８】
（6.2.1 材料及び方法）
（6.2.1.1 株化細胞）
MDCK、HEp-2及びA549細胞は、10%のウシ胎児血清及び1%のペニシリン／ストレプトマイシンを補ったダルベッコ修飾イーグル培地（DMEM）において培養した。NDVのHitchner B1株の全長cDNAは、genbankアクセッション番号AF375823の元で公開しされている（Nakayaらの論文、2001, J. Virol. 75：11868-11873、これは、その全体が引用として本明細書に組み込まれる）。
【０２０９】
（6.2.1.2 プラスミドの構築）
外来タンパク質をコードするためのNDVの組換えcDNAの操作を記述した（Nakayaらの論文、2001, J. Virol. 75：11868-11873）。簡潔には、NDVの全長cDNAをT7プロモーターとデルタ型肝炎ウイルス（HDV）リボザイムとT7ターミネーターとの間のプラスミドに導入して、pNDV/B1を作製する。NDV cDNAは、P遺伝子とM遺伝子との間に操作されたXbaII部位を有し、これによりNDVゲノムへの外部転写ユニットとして外来配列を導入することができる（図5）。全ての挿入された遺伝子は、連続して遺伝子末端；5'-TTAGAAAAAA-3'（配列番号：18）；シストロン間ヌクレオチドT；及び遺伝子開始配列；5'-ACGGGTAGAA-3'（配列番号：19）（GE/GS配列）を含むように操作する。
【０２１０】
rNDV/B1-KGFR、rNDV/B1-KGFR/F-CT及びrNDV/B1-H7HA/F-TMCTウイルスは、NDV Hitchner B1株に由来する全長cDNAコピーからのリバースジェネティクスによって産出した。これらのウイルスを構築するためには、KGFR又はH7 HA（インフルエンザA型サブタイプH7N2由来のHAタンパク質）ORFを、その他のORFについて記述したように、NDV/B1 cDNAのP遺伝子とM遺伝子の間に外部転写ユニットとしてクローン化した（Nakayaらの論文、2001, J. Virol. 75：11868-11873及びNakayaらの論文、2004, J. Virol. 78：9366-9375、これらの両方が、引用としてその全体が本明細書に組み込まれる）。KGFR及びH7 HAは、両方とも膜貫通型タンパク質であり、それぞれTMドメイン及びCTドメインを含んでいる。KGFR/F-CT構築物では、KGFRタンパク質のCTドメインをNDVのFタンパク質のものに置換した。H7 HA/F-TMCT構築物では、H7 HAタンパク質のTMドメイン及びCTドメインをNDVのFタンパク質のものに置換した。組換えNDVウイルスをcDNAから救出して、当該技術分野において公知の標準的技術を使用して増殖させた（例えば、Swayneらの論文、2003, Avian Dis. 47：1047-1053及びNakayaらの論文、2001を参照されたい。これらの両方が、引用としてその全体が本明細書に組み込まれる）。組換えウイルスにおける新たな転写ユニットの挿入は、逆転写PCD、続くシーケンシング解析によって確認した。
【０２１１】
例えば、H5 HA遺伝子の外部ドメイン（ECTO）は、以下のプライマーを使用するPCRによって産生した（これには、GE/GS配列を含む）：NheI-H5HA P, 5'-CG GCT AGC TTAGAAAAAA T ACGGTAGAA GTGAA ACTAGT CC GCC ACC ATG GAA AGA ATA GTG ATT GCC TTT GCA-3'（配列番号：20）及びHpaI-H5HA P, 5'-CG GTT AAC CTG ATA AGC CCC CAT TGA TTC TAA T-3'（配列番号：21）。H5 HAecto PCR断片は、NheI及びHpaIで消化して、pSL1180（Amersham Pharmacia Biotech社）にクローン化した（pSLH5HAecto）。また、NDV F遺伝子のTM及びCTは、以下のプライマーを使用するPCRによって増幅した。HpaI-NDVF(TM+CYTO)P, 5'-CG GTT AAC CTC ATT ACC TAT ATC GTT TTG ACT-3'（配列番号：22）、SacI-NheI-NDVF(TM+CYTO)M, 5'-CG GAG CTC AA GCT AGC TTA TCA CAT TTT TGT AGT GGC TCT CAT CTG-3'（配列番号：23）。H5 HAectoとの融合のためには、NDV F遺伝子のTM及びCTをHpaI及びSacIで消化して、次いでハイブリッド融合遺伝子を得るために、pSLH5HAectoにクローン化した。最後に、ハイブリッドH5 HA遺伝子を含むプラスミドをNheIで消化して、rNDV cDNAのP遺伝子とM遺伝子との間にクローニングした。
【０２１２】
（6.2.1.3 ウエスタンブロット及び生物学的解析）
細胞又は尿膜の抽出物からのウイルスを30%のスクロースクッションを介して超遠心によって精製した。組み込まれたタンパク質のレベルは、特異抗体を使用するウエスタンブロット解析及びルーチン技術によってモニターした。
キメラNDVがインビボで非ウイルスタンパク質KGFRを提示する能力は、3×lO7 pfuのキメラウイルスをBALB/cマウスに腹腔内に免疫し、続いて3週後に同じ用量を使用して追加免疫することによって決定した。2回目の免疫の2週後に、接種した動物からの血清を、KGFRをコードするプラスミドをトランスフェクトしたMDCK細胞を免疫染色することにより、KGFRに対する抗体の存在について試験した。
【０２１３】
インビボ系は、ハイブリッドH7 HA/F-TMCTを含むrNDVでの免疫がH7又はNDVによるその後の感染に対する保護をもたらすことができるかどうかを評価するようにデザインした。2週齢のヒヨコを、100μlの3つのワクチン、rNDV、rNDV-H7 HA/F-TMCT及び偽物での、点眼法によって免疫した。4週齢にて、HP AIV（A/Steele/ACC-10/59[H7N7])の105.1の平均胚感染性用量を含む100μlを、後鼻孔のスリットを介して投与した。トリをHP AIV感染の徴候及び病変について観察した。死亡率を記録し、全ての生存したトリを、6週齢にてペントバルビタールナトリウム（100 mg/kg）によって安楽死させた。
【０２１４】
（6.2.2 結果）
（6.2.2.1  KGFR又はKGFR/F-CTを発現するキメラNDVによるKGFRの提示）
キメラウイルスrNDV/B1-KGFR及びrNDV/B1-KGFR/F-CTを10日齢の孵化鶏卵の尿膜腔において培養した。精製ウイルスを、マウス抗KGFR抗体を使用するウエスタンブロット解析によって、KGFD又はKGFR/F-CTの存在について試験した。陽性反応は、rNDV/B1-KGFR/F-CTを接種した播種した卵から単離した試料において検出されたが、rNDV/B1-KGFRでは検出されなかった（図6）。
【０２１５】
また、これらのキメラウイルスの各々もそれぞれを使用して、3匹のBALB/cマウスを免疫した。免疫した動物からの血清を、KGFR抗体の存在についてアッセイした。rNDV/B1-KGFRウイルスで免疫した動物は、このアッセイ法を使用して、KGFR抗体の検出可能なレベルを生じなかった。対照的に、rNDV/B1-KGFR/F-CTウイルスで免疫した全3匹の動物は、このアッセイ法により、KGFR抗体の存在について陽性であった。
【０２１６】
（6.2.2.2 rNDV-H7 HA/F-TMCTでの免疫によるH7感染に対する保護）
野生型H7 HAのTMドメイン及びCTドメインをNDV Fタンパク質のTMドメイン及びCTドメインに置換して、ハイブリッドHAタンパク質H7HAecto-NDV/F(TM+ CT)を産生した。ウエスタンブロット解析において、H7 HAの完全なORFを発現する対照rNDVであるrNDV-H7HA及びハイブリッドH7HA ecto-NDV/F(TM+CT)を発現するキメラrNDVであるrNDV- H7HA ecto-NDV/F(TM+CT)の両方は、H7抗体に対する陽性反応を生じたが；しかし、rNDV-H7HAecto-NDV/ F(TM+CT)からのシグナルは、目にみえて数倍強力であった（図7）。rNDV- H7HA ecto-NDV/F(TM+CT)で一度を免疫したヒヨコを、その後致死量のH7インフルエンザで抗原投与したときは、免疫したヒヨコのうちの10羽のうち9羽（90%）が生存した。rNDV- H7HA ecto-NDV/F(TM+CT)で一度を免疫したヒヨコを、その後致死量のNDVで抗原投与したときは、免疫したヒヨコのうちの10羽のうち10羽（100%）が生存した。
【０２１７】
（6.3 外来エピトープを提示するキメラニューカッスル病ウイルスの操作）
以下の実施例は、キメラ修飾されたNDVの産生を記述する。特に、本実施例6.2に使用したNDVバックボーンの病原性を改善するために、組換えNDVを産生した。また、本実施例は、rNDVの改善された病原性により、rNDVに基づいたキメラウイルスを含む免疫原性製剤の免疫原性が改善したことを証明する。
【０２１８】
（6.3.1 材料及び方法）
特に明記しない限り、この節に記述した全ての材料及び方法は、上記実施例6.2に記述され、及び例証されたものと同一である。
【０２１９】
（6.3.1.1 それらのFタンパク質に修飾された切断部位を有するrNDVの産生）
NDV Hitchner B1株のF切断部位に2つ又は3つのアミノ酸変異を有する組換えNDVウイルスrNDV/F2aa及びrNDV/F3aaウイルスは、リバースジェネティクスによって産生した。簡潔には、rNDV/F2aaを産生するために、フォワードプライマー：F2aa-1（+）5'-GGA TCC CGG TTG GCG CCC TCC AGG（配列番号：24）及びリバースプライマーF2aa-1（-）5'-AAG GCG CCt CTG TCT CCg CCC TCC AGA TGT AGT CAC AG-3'（配列番号：25）、並びに鋳型としての全長NDV B1クローン、プラスミドpT7NDV/B1を使用することにより、PCR断片を産生した。次のPCR断片を、フォワードプライマーF2aa-2（+）5'-GGc GGA GAC AGa GGC GCC TTA TAG GCG CCA TTA TTG G-3'（配列番号：26）及びリバースプライマーF2aa-2（-）5'-CCA TAT TCC CAC CAG CTA GAT TGT-3'（配列番号：27）、並びに鋳型としてpT7NDV/B1を使用することにより産生した。小文字で示したヌクレオチドを突然変異させて、Fタンパク質の切断部位のアミノ酸配列を、NDV/B1株のもの
【化１】
0005603012.tif 000004
から
【化２】
0005603012.tif 000005
に修飾する。これらの2つの重複PCR断片（重複は、プライマー配列において下線を引いてある）を、プライマー、F2aa-1（+）及びF2aa-2（-）を使用するPCRによって合わせた。F遺伝子全体を含む生じるPCR断片をpSL1180（Amersham Pharmacia Biotech社）にクローン化して、pSLF2aaと名付けた。pSLF2aaのStuI-NotI断片（ヌクレオチド4646〜4952）を削除して、pT7NDV/B1プラスミドの対応する断片を置換し、pT7NDV/F2aaプラスミドの形成を生じさせて、これを使用して、リバースジェネティクスによってrNDV/F2aaウイルスを産生した。rNDV/F3aaの産生については、PCR突然変異誘発は、フォワードプライマーF3aa-1（+）5'-GGA TCC CGG TTG GCG CCC TCC AGG-3'（配列番号：28）、リバースプライマーF3aa-1（-）5'-AAa GCG CCt CTG TCT CCg CCC TCC AGA TGT AGT CAC AG-3'（配列番号：29）、フォワードプライマーF3aa-2（+）5'.-GGc GGA GAC AGa GGC GCt TTA TAG GCG CCA TTA TTG G-3'（配列番号：30）；リバースプライマーF3aa-2（-）5'-CCA TAT TCC CAC CAG CTA GAT TGT-3'（配列番号：31）（変異されたヌクレオチドは、小文字で示してある）、及び鋳型としてのpT7NDV/B1を使用して、上に記載したものと同じストラテジーによって行った。これらの2つの重複PCR断片（重複領域は、プライマー配列に下線を引いてある）を、プライマーF3aa-1（+）及びF3aa-2（-）を使用するPCRによって合わせ、
【化３】
0005603012.tif 000006
から
【化４】
0005603012.tif 000007
への切断部位の修飾を生じさせた。pSLF3aaのStuI-NotI断片（ヌクレオチド4646〜4952）を削除して、pT7NDV/B1プラスミドに対応する断片を置換し、pT7NDV/F3aaプラスミドの形成を生じさせ、これを使用してrNDV/F3aaウイルスを産生した。
【０２２０】
（6.3.1.2 キメラH7 HAタンパク質を発現する融合rNDVベクターの産生）
rNDV/F3aaゲノムの外部転写ユニットとしてキメラH7 HA遺伝子を構築するために、NDV F遺伝子の膜貫通（TM）及び細胞質尾部（CYTO）を含む断片を、プライマー、HpaNDVF(TM+CYTO)P, 5'-cgGT TAA CCT CAT TAC CTA TAT CGT TTT GAC T-3'（配列番号：32）及びSacNheNDVF(TM+CYTO)M, 5'-cg GAG CTC AAG CTA GCT TAT CAC ATT TTT GTA GTG GCT CTC ATC TG-3'（配列番号：33）、並びに鋳型としてNDV F遺伝子を含むプラスミドを使用するPCRによって、最初に産生した。このPCR産物をSac I及びHpa Iで消化して、次いで、遺伝子終末及びNDVの遺伝子開始シグナルを有するプラスミドpNhe-NDV-GE/GSにクローン化し、pNhe-NDV-GE/GS-NDVF(TM+CYTO)の形成を生じた。次の工程として、NDV FのTM及びCYTO領域の断片をH7 HA外部ドメインを含む断片と結合させるために、プライマー、SpeH7(ECTO)P, 5'-cgACT AGT CCG CCA CCA TGA ACA CTC AAA TTC TGG CAT TCA T-5'（配列番号：34）、HpaH7(ECT0)M, 5'-cgG TTA ACG TCT TTG TAT CCA CTA CTC AAT TTC AC-3'）（配列番号：35）、及び鋳型としてのA/ニワトリ/NY/13142-5/94(H7N2)からのプラスミドを含むH7 HA遺伝子を使用するPCRによって、H7HA外部ドメインを産生した。このPCR産物をSpe I及びHpa Iで消化し、次いで、カセットプラスミドpNhe-NDV-GE/GS-NDVF(TM+CYTO)に挿入した。最終工程において、カセットプラスミドpNhe-NDV-GE/GS-NDV F(TM+CYTO)をNhe Iで消化し、キメラH7 HA遺伝子を切り出した。この断片DNAをpT7NDV/F3aaのP遺伝子とM遺伝子との間にクローン化し、pT7NDV/F3aa-chimericH7を形成した。次いで、キメラH7 HAタンパク質を発現するrNDV/F3aaウイルスを、上に記載した方法を使用して、pT7NDV/F3aa-chimericH7から救出した。
【０２２１】
（6.3.1.3 ウイルス増殖速度論）
rNDV/B1、rNDV/F2aa、rNDVF3aa、rNDVB1-H7又はrNDV/F3aa-chimericH7ウイルス（100 PFU/卵）を10日齢の孵化鶏卵に接種した。尿膜腔液を収集し、種々の時点（24時間、48時間及び72時間）にてウイルス力価を決定した。尿膜腔液に存在するそれぞれのウイルスの50%組織培養感染用量（TCID50）を免疫蛍光アッセイ法（IFA）によって決定した。この目的のためには、Vero細胞を含む96ウェルプレートを試料の段階10倍希釈物に感染させ、NDVタンパク質又はキメラH7 HAタンパク質の存在をIFAによって決定した。
【０２２２】
（6.3.2 免疫蛍光アッセイ法）
(6.3.2.1 免疫蛍光アッセイ法）
形質移入体インフルエンザウイルスを感染させたMDCK細胞を氷冷メタノールで固定して、透過化した。ウイルス抗原を抗NDV HNモノクローナル抗体（7B1）、抗インフルエンザHl HAモノクローナル抗体（2G9）及び抗インフルエンザH5 HAポリクローナル血清で検出した。NDVの増殖及びウイルスタンパク質発現の解析のためには、コンフルエントVero細胞を組換えウイルスに感染させ、種々の時点（24、48及び72時間）にて収集した。感染細胞を0.1%のTriton X-100を含む2.5%のホルムアルデヒドで固定した。固定した細胞を抗ウサギNDVポリクローナル抗体又は抗トリAIV H7ポリクローナル血清で処理し、洗浄し、AIV H7 HAタンパク質についてはフルオレセインイソチオシアネート（FITC）抱合抗ニワトリ免疫グロブリン（DAKO社）又はNDVウイルスタンパク質についてはテキサスレッド抱合抗ウサギ免疫グロブリン（Molecular Probe社）で染色した。ウイルスタンパク質の発現は、蛍光顕微鏡によって調べた。
【０２２３】
（6.3.2.2 平均死滅時間）
孵化鶏卵における組換えウイルスの病原性を調べるために、平均死滅時間（MDT）を決定した。簡潔には、5〜10日齢の孵化鶏卵を、ウイルスの段階10倍希釈物で感染させた。卵を37℃にてインキュベートして、毎日2回7日間モニターした。胚が死滅する時間を記録した。全ての胚が死滅した最高の希釈は、最小致死量であると決定した。MDTは、胚が死滅する最小致死量についての平均時間として算出した。
【０２２４】
（6.3.2.3 ニワトリの免疫及びチャレンジ）
白色レグホンニワトリを2及び4週齢にて105.7-6.1の平均トリ胚感染用量（EID50）のrNDV/F3aa-chimericH7で、結膜嚢における点眼液によって一度若しくは二度、又は105.7-6.3のEID50の親NDV/B1（pNDV）で二度、又は滅菌した組織培養培地（偽薬）で二度ワクチン接種した。6週齢にて、ニワトリを速現性（velogenic）NDV（vvNDV）のフォンタナ株（105.1 EID50/トリ）又はA/ヒト/Steele/59 (H7N7)HPAI（105.1 EID50/トリ）で鼻腔内にチャレンジした。生存したトリを抗原投与後14日に採血し、安楽死させた。赤血球凝集阻止（HI）の血清学的力価は、標準的方法を使用して決定した。
【０２２５】
（6.3.3 結果）
（6.3.3.1 融合rNDV変異体の産生）
rNDVバックボーンの融合特徴を改善するために、Fタンパク質の切断部位を2つの多様な多塩基切断部位の1つと置換されており、かつ広範に発現されるプロテアーゼ（例えば、furinプロテアーゼ）によって活性化することができる2つのrNDV変異体、rNDV/F2aa及びrNDV/F3aaウイルスを開発した（図8A）。rNDV/F2aa及びrNDV/F3aaでのニワトリ胚線維芽細胞（CEF）の感染により、外から添加したプロテアーゼの非存在下で合胞体の形成が生じたが、rNDV/B1では生じなかった（図8B）。加えて、rNDV/F3aaは、CEF細胞においてrNDV/F2aaよりも迅速に合胞体を誘導した。従って、免疫動物におけるウイルスの改善された伝播が、挿入された外来タンパク質に対する免疫原性を増強し得ると仮定された。従って、融合rNDV/F3aaを、家禽をAIV及びNDVから保護するようにデザインされた二価ワクチンを開発するためのバックボーンベクターとして選択した。
【０２２６】
（6.3.3.2孵化鶏卵におけるrNDVプラットフォームベクターの平均死滅時間解析）
NDVは、トリに対するその病原性に関して、高度に病原性（速現性）、中間（亜病原性）又は非病原性（長潜伏期性）として分類することができる。多塩基切断部位を有するFタンパク質の存在が、NDVの病原性因子であることが公知であるので、本発明者らは、10日齢の孵化鶏卵において、修飾されたFタンパク質を有するrNDVの病原性を評価した。NDVに感染させたニワトリ胚の平均死滅時間（MDT）は、インビボでの病原性と相関する。長潜伏期性株（トリ類において無症候性感染を生じさせる）は、90時間を超えるMDTによって特徴づけられ、亜病原性株（トリ類において呼吸器疾患を生じさせる）は、60〜90時間の間のMDTを有し、速現性株（トリ類において重篤な疾患を生じさせる）は、60時間以下のMDTを有する。rNDV/F2aaのMDTは、長潜伏期性株のものを示しており、一方で、rNDV/F3aaのものは、亜病原性株に典型的であった。これらの株はどちらも高度に病原性（速現性）株の典型的なMDTを有さなかった（表3）。
【０２２７】
【表３】
0005603012.tif 000008
【０２２８】
これらのデータに基づいて、rNDV/F3aaベクターは、トリ類に対する脅威を示さないであろうし、従って、AIV及びNDVに対する家禽の保護のための二価ワクチンを開発するバックボーンとして適切である。
【０２２９】
（6.3.3.3 AIV HAタンパク質の外部ドメインを発現する融合rNDVベクターの産生）
A/ニワトリ/NY/13142-5/94（H7N2）由来のH7 HAタンパク質をコードする遺伝子を、上記したように、rNDV/F3aaベクターに組み込み、rNDV/F3aa-chimericH7の形成を生じた（図9A）。孵化鶏卵におけるrNDV/F3aa-chimericH7での増殖速度論を、親rNDV/F3aaのものと比較した（図9B）。キメラH7 HAタンパク質を発現するウイルスは、挿入のないウイルスよりもゆっくりと増殖し、最大力価は、およそ一桁（a log）低かった。面白いことに、このウイルスのMDTは、長潜伏期性株のもの（128〜140時間）であった（表3）。rNDV/F3aa-chimericH7からのキメラH7 HAタンパク質の発現は、感染後36時間の感染Vero細胞のウエスタンブロッティングによって確認した（図9C）。
【０２３０】
（6.3.3.4 rNDVビリオンへのAIV H7 HAタンパク質の組み込みの改善）
NDV Fタンパク質の異種膜貫通領域及び細胞質尾部領域を含むキメラH7 HAタンパク質の発現がrNDVビリオンへの組み込みの増強と関連するであろうかどうかを決定するために、rNDV／B1-H7及びrNDV/F3aa-chimericH7ビリオンを、6.3節に記述したように精製した。H7 HAタンパク質又はrNDV/B1-H7又はrNDV/F3aa-chimericH7からのNDVウイルスタンパク質の量を、抗-トリAIV H7ポリクローナル抗体又は抗-ウサギNDVポリクローナル血清を使用するウエスタンブロッティングによって測定した。予想通り、rNDVビリオンへのキメラH7 HAタンパク質の組み込みは、野生型H7 HAタンパク質のものと比較して有意に増加した（図9D）。このデータは、NDV Fタンパク質の膜貫通領域及び細胞質尾部領域が、ウイルス表面への外来タンパク質の組み込みの改善において主要な役割を果たすことを示唆する。
【０２３１】
（6.3.3.5 ニワトリの免疫及びチャレンジ）
rNDV/F3aa-chimericH7での1又は2回のワクチン接種後に、50〜80%のニワトリは、H7 AIVに対する赤血球凝集阻止（HI）力価を有し、90〜100%のニワトリは、NDVに対してHI力価を有した（表4A及びB）。親NDV/B1（pNDV）で2回免疫した全てのニワトリが、NDVに対してHI力価を有したが、いずれもH7 AIVに対して力価を有さなかった。滅菌した組織培養培地（偽薬）を感染させた全てのトリは、いずれのウイルスに対するHI力価も欠いていた。vvNDVでチャレンジしたときは、rNDV/F3aa-chimericH7及びpNDVで免疫したニワトリの100%が保護された。対照的に、rNDV/F3aa-chimericH7をワクチン接種したニワトリの90%は、HPAI H7ウイルスから保護されたが、pNDVをワクチン接種したニワトリは、いずれもHPAI H7ウイルスから保護されなかった。対照的に、偽薬感染させたトリの100%及び70%は、それぞれvvNDV及びHPAI H7ウイルスによってチャレンジしたときに死滅した。生存したものは、感染したという血清学的証拠を有さなかった偽薬HPAI H7ウイルスチャレンジ群の3匹の生存以外、それぞれのチャレンジウイルスについて、HI力価における4倍又はそれ以上の上昇として明白な健忘反応を開始した。
【０２３２】
【表４Ａ】
0005603012.tif 000009
【０２３３】
【表４Ｂ】
0005603012.tif 000010
【０２３４】
（6.4 均等物）
本発明は、記述した具体的実施態様による範囲に限定されず、本発明の個々の態様の単一の例証として意図され、機能的に均等な方法及び成分構成成分は、本発明の範囲内にある。実際に、本明細書に示され、及び記載されたものに加えて、本発明の種々の修正が、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかであろう。このような修正は、添付の請求の範囲内に入ることが意図される。
この出願の全体にわたって、種々の刊行物を引用してある。これらの内容は、全ての目的のために、本出願によりその全体が引用として本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
（4. 図の記述）
【図１】ハイブリッドNAf-HN構築物の概略図  構築物は、WSN NA vRNAの3'非翻訳領域、細胞質尾部に対応するNAコード領域及びNAタンパク質の膜貫通ドメイン更にNA外部ドメインの最初のアミノ酸のヌクレオチド、NDV B1 NHタンパク質（外部ドメインのみ）のコード領域、2つの連続した終止コドン、WSN NAリーディングフレームの非翻訳ヌクレオチド、並びにWSN vRNAの5'非翻訳領域をコードする。
【０２３６】
【図２】HAの多塩基アミノ酸配列の変化の概略図  H5N1 HAとして同定されたヌクレオチド配列は、インフルエンザA型／ベトナム/1203/04（H5N1）のHA表面糖タンパク質のオープンリーディングフレームのヌクレオチド1013〜1045（配列番号：13；アミノ酸配列配列番号：14）を表す。ヌクレオチド1026〜1038は、切除PCR（excise PCR）を使用する単一ヌクレオチドシトシン及び非病原性HAのヌクレオチド配列を生じる部位定方向突然変異誘発によって置換した（配列番号：15；アミノ酸配列配列番号：16）。配列変化は、5アミノ酸の多塩基配列の単一アミノ酸スレオニンでの置換に対応する。
【０２３７】
【図３】HAの核酸配列における変化の概略図  非病原性HAとして同定された配列は、非病原性インフルエンザA型／ベトナム／1203/04（H5N1）のHAタンパク質のコンセンサス配列に基づいた、HA表面糖タンパク質のオープンリーディングフレームのヌクレオチド1013〜1033を表す（配列番号：15；アミノ酸配列配列番号：16）。下線を引いたアデノシン残基は、突然変異がヌクレオチド配列配列番号：17及びアミノ酸配列配列番号：16を生じるのと同義となるように置換した。
【０２３８】
【図４】図4A-D  pPol1VN1203 NS切断突然変異体の模式図  A. H5N1のNS遺伝子セグメントのコード領域は、833ヌクレオチドである。B. pPol1VN1203 NS1-126構築物は、NS遺伝子のコード領域のヌクレオチド379〜456の欠失、3つの終止コドン及びBglII制限部位の挿入を有する。C. pPol1VN1203 NS1-99構築物は、NS遺伝子のコード領域のヌクレオチド298〜456の欠失、4つの終止コドン、BglII制限部位及びPacI制限部位の挿入を有する。D. pPol1VN1203 NS1-73構築物は、NS遺伝子のコード領域のヌクレオチド219〜456の欠失、4つの終止コドン、BglII制限部位及びPacI制限部位の挿入を有する。
【０２３９】
【図５】pNDV／B1の模型図  示した配列は、3'末端にてT7プロモーターに隣接し、かつ5'末端にてHDVリボザイム及びT7ターミネーターに隣接する。PとM遺伝子との間の挿入部位は、唯一のXbaI制限部位含む。
【図６】キメラrNDVウイルスにおけるKGFR発現のウエスタンブロット解析  キメラウイルスrNDV（レーン1）、rNDV-KGFR（レーン2）及びrNDV-KGFR／F-CT（レーン3）を10日齢の胚形成した卵において培養した。精製ウイルスは、一次及び二次抗体としてそれぞれマウス抗KGFR及び抗マウスHRPOを使用するウエスタンブロット解析に供した。
【０２４０】
【図７】キメラrNDVウイルスにおけるH7HA発現のウエスタンブロット解析  キメラウイルスrNDV（レーン1）、rNDV-KGFR（レーン2）及びrNDV-KGFR／F-CT（レーン3）を10日齢の胚形成した卵において培養した。精製ウイルスは、一次及び二次抗体としてそれぞれマウス抗KGFR及び抗マウスHRPOを使用してウエスタンブロット解析に供した。
【０２４１】
【図８】rNDVのFタンパク質の切断部位の修飾  （A）これらのFタンパク質の切断部位に2つ又は3つのアミノ酸変化をもつrNDV／B1ゲノムの概略図。Fタンパク質において切断されるペプチド結合は、スラッシュで示してある。（B）修飾されたFタンパク質を伴うrNDVsによって感染したCEF細胞におけるシンシチウム形成。CEF細胞には、rNDV／B1、rNDV／F2aa及びrNDV／F3aaウイルスを0.001の感染効率で感染した。ウイルス増殖は、免疫蛍光検定によって24時間毎にモニターした。
【０２４２】
【図９】融合性HPAI H7 HAタンパク質を発現するrNDVベクターの構築及び特徴付け  （A）GE／GS、コザック配列及び示した部分的H7 HA配列（配列番号：36）をもつ、rNDV／F3aaキメラH7 cDNA構築物の模式図。（B）ウイルスの増殖動態、接種後の対数TCID対時間（時間）の比較。正方形、rNDV／B1；三角形、rNDV／F3aa；太字体アステリスク、rNDV／B1-H7；アステリスク、rNDV/F3aa-キメラH7。（C）WT H7 HAタンパク質又はrNDVsに感染した細胞におけるキメラH7HAタンパク質の発現。レーン1、感染モック；レーン2、rNDV／F3aa；レーン3、rNDV／B1-H7；レーン4、rNDV／F3aa-キメラH7。列1α-トリH7；列2、α-NDV。（D）rNDVビリオンにおけるキメラH7HAタンパク質の組み込みは、WT H7 HAタンパク質のものと比較して増加した。レーン1、rNDV／B1l-H7；rNDV／F3aa-キメラH7。列1α-トリH7；列2、α-NDV。
【図１】
0005603012.tif 000011
【図２】
0005603012.tif 000012
【図３】
0005603012.tif 000013
【図４】
0005603012.tif 000014
【図５】
0005603012.tif 000015
【図６】
0005603012.tif 000016
【図７】
0005603012.tif 000017
【図８Ａ】
0005603012.tif 000018
【図８Ｂ】
0005603012.tif 000019
【図９Ａ】
0005603012.tif 000020
【図９Ｂ】
0005603012.tif 000021
【図９Ｃ】
0005603012.tif 000022
【図９Ｄ】
0005603012.tif 000023
【配列表】
0005603012000001.app