(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＢ型（ＧＣＹＨ−ＩＢ）ポリペプチドの結晶であって、前記ＧＣＹＨ−ＩＢポリペプチドが、配列番号８のアミノ酸配列を含有し、前記ＧＣＹＨ−ＩＢ結晶が、空間群Ｃ２２２１及び単位格子定数ａ＝９１．７Å；ｂ＝１００．３Å；ｃ＝１１４．１Åである、結晶。
【請求項２】
ＧＣＹＨ−ＩＢ・Ｍｎ２＋ポリペプチドの結晶であって、前記ＧＣＹＨ−ＩＢ・Ｍｎ２＋ポリペプチドが、配列番号８のアミノ酸配列を含有し、前記ＧＣＹＨ−ＩＢ・Ｍｎ２＋結晶が、空間群Ｃ２２２１及び単位格子定数ａ＝９２．２Å；ｂ＝１００．４Å；ｃ＝１１３．９Åである、結晶。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国政府の支援を受け、National Institutes of Healthによって授与された補助金交付第Ｒ０１  ＧＭ７０６４１−０１号、及びNational Science Foundationによって授与された賞金番号第ＭＣＢ−０５１６９４８号のもとで行われた。Stanford Synchrotron Research Laboratory Structural Molecular Biology Programは、Department of Energy、National Institutes of Health、及びNational Institute of General Medical Sciencesによる支援を受けている。政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は、２００７年７月２６日に出願された「Novel GTP Cyclohydrolase Type IB」と題される米国仮特許出願第６０／９３５，１２４号の優先権の利益に関連しているとともにそれを主張する。
【背景技術】
【０００３】
背景
細菌性疾患、例えば淋菌（Neisseria gonorrhoeae）及び黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）によって引き起こされる疾患は、重大な疾患及び健康上のリスクをもたらす。淋菌（N. gonorrhoeae）は、性感染症の淋病（性器、及び尿路の感染症）の原因病原体であり、年間１００万人の女性において骨盤内炎症性疾患及び不妊症の原因となっている。世界的には、新規症例が年間６２００万件と推定され、平均して２２００万件の症例が常にある。米国では、主に十代の若年女性及びアフリカ系アメリカ人において、毎年約８０万件の新規淋病感染症が報告され、治療及び関連費用に１１億ドル／年が費やされている。重要なことには、淋病感染症は、ヒト免疫不全ウイルス感染症に対する感染及び易罹患性を増加させる。そのうえ、淋病は、キノロン系（シプロフロキサシン）、テトラサイクリン系、ペニシリン系、及びスルホンアミド系抗菌薬による従来の治療に耐性を示すようになっている。現在、米国及び欧州で報告された淋病症例の２０％が、これらの薬物の全てに耐性を示し、同性愛男性において最も高い耐性が認められている。現在、淋病は超高用量のアジスロマイシンで治療することができるとはいえ、この抗生物質に対する耐性も現れ始めている。
【０００４】
細菌の黄色ブドウ球菌（S. aureus）は、現在、入院患者が発症する最も一般的で重篤な感染症の原因となっている。近年に至って、黄色ブドウ球菌（S. aureus）は抗生物質に耐性を示すようになっており（それにより、多剤耐性黄色ブドウ球菌（Multidrug-Resistant S. aureus）又はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Methicillin-Resistant S. aureus）、ＭＲＳＡと名付けられた）、米国及び世界において深刻な公衆衛生問題を引き起こしている。米国での集中治療室における感染症のうち６０％はＭＲＳＡが原因で、高い死亡率につながっている。ＭＲＳＡ「スーパーバグ」は血流中で極めて急激に増殖し、毒素性ショック症候群を引き起こしたり、及び／又は皮膚にせつ（furuncles）を引き起こしたりする。感染症は一度発症すると、特に免疫力が低下した患者及び高齢の患者では、既存の抗生物質による治療はほとんど不可能である。不治性のＭＲＳＡ感染が心臓に達すると、多くの場合に致死性の心内膜炎が引き起こされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、かかる細菌性病原体に対する代替的な治療法の必要性が高まっている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明の目的は、古細菌及び細菌は必要とするが、真核生物は必要としない特定の酵素を標的化することによって細菌性病原体に対抗するための新規手段を提供する。本発明の一実施形態は、新規の精製細菌酵素であるＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＢ型（ＧＣＹＨ−ＩＢ）を提示する。
【０００７】
別の実施形態は、ＧＣＹＨ−ＩＢの結晶構造を提供する。関連実施形態は、ＧＣＹＨ−ＩＢ結晶を提供する。さらに別の関連実施形態は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＢ型結晶構造の情報が記憶されたコンピュータ読取り可能媒体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図面の説明
【図１】ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ型（ＧＣＹＨ−Ｉ）によって触媒される反応、及びＨ２ＮＴＰの代謝運命の略図を示す。
【図２】ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＢ型（ＧＣＹＨ−ＩＢ）の全体構造を示す。パネル２Ａは、完全な生物学的四量体の側面図（左）及び上面図（右）を示すリボン図である。パネル２Ｂは、溶媒平滑化後に計算した、βシート領域におけるＦＯＭで重み付けした実験的電子密度図（分解能２．２Å、等高線レベル１．５σ）のステレオ図である。電子密度図は、精密化したモデルに重ね合わせている。図は、BobScriptソフトウェアで作成した。Esnouf, 55(4)Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 938-40 (1999)。
【図３】ＧＣＹＨ−ＩＢ単量体のトポロジー及び他のＴフォールド酵素との構造比較を図示する。パネル３Ａは、淋菌（N. gonorrhoeae）ＧＣＹＨ−ＩＢのトポロジー図を表す。パネル３Ｂは、黄色コウジ菌（A. flavus）尿酸オキシダーゼのトポロジー図を表す。パネル３Ｃは、大腸菌（E. coli）ＧＣＹＨ−ＩＡのトポロジー図を表す。Michalopoulos et al., 32 Nucleic Acids Res. D251-54 (2004)。２モジュール構成のコアＴフォールドのＮ末端及びＣ末端モジュールは、それぞれ灰色及び薄い灰色に色を付けている。ＧＣＹＨ−ＩＢのＮ末端モジュール（灰色）及びＣ末端モジュール（薄い灰色）のＣαトレースを対応する酵素と重ね合わせたものが、パネルＢおよびパネルＣに示される。２つのＧＣＹＨ−Ｉ酵素について二次構造命名法が示される。
【図４】共有Ｔフォールド領域におけるＧＣＹＨ−ＩＡ及びＧＣＹＨ−ＩＢの構造に基づく多重配列アラインメントを示す。明確にするため、各サブファミリーから４つの配列のみを示す。酵素サブファミリーＡ及びＢについて、それぞれ配列アラインメントの上及び下に残基ラベル及び（結晶構造からの）二次構造要素が示される。二次構造命名法は図３にあるとおりである。２つのサブファミリー間で保存されている残基は縦に輪郭線が引かれ、厳密に保存されている残基（基質結合性Ｇｌｕ及び亜鉛結合性Ｃｙｓ）は濃い灰色で強調表示されている。ＧＣＹＨ−ＩＢサブファミリー内の保存領域は枠で囲まれる。各サブファミリーの亜鉛イオン配位性側鎖には灰色の星印が付される。ＧＣＹＨ−ＩＢのＭｎ配位性側鎖には黒色の星印が付される。＃は、隣接するサブユニットからの亜鉛配位性側鎖を示す。Ｅｃ：大腸菌（Escherichia coli）、Ｔｔ：サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、Ｈｓ：ヒト（Homo sapiens）、Ｒｎ：ラット（Rattus norvegicus）、Ｔｍ：サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、Ｂｓ：枯草菌（Bacillus subtilis）、Ｓａ：黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、Ｎｇ：淋菌（Neisseria gonorrhoeae）。
【図５】ＧＣＹＨ−ＩＢにおける金属部位を図示する。パネルＡは、モデルに重ね合わせたアニールドＦｏ−Ｆｃ電子密度図（１５００Ｋ、２．２Å、２．５σ、Ｚｎ２＋及びそのリガンドを位相計算からオミットした）のステレオ図を示す。パネルＢは、ＧＣＹＨ−ＩＢ・Ｍｎ２＋複合体においてＭｎ２＋に占有された金属部位を示す。モデルに重ね合わせたアニールドオミットＦｏ−Ｆｃ電子密度図（１５００Ｋ、２．０４Å、２．５σ、Ｍｎ２＋及びそのリガンドを位相計算からオミットした）のステレオ図。金属イオン及び水分子は球として示される。ＧＣＹＨ−ＩＢの二次構造要素にはラベル名が付される。
【図６】活性部位領域におけるＧＣＹＨ−ＩＢ（標準字体ラベル）及びＴ．サーモフィラス（T. thermophilus）ＧＣＹＨ−ＩＡ（斜字体ラベル）の３Ｄアラインメントを表す。ＧＣＹＨ−ＩＢの金属結合ループにおける厳密に保存されたＣｙｓ１４９が示されるが、これは結合金属とは相互作用しない。
【図７】葉酸生合成遺伝子、例えば、ｆｏｌＫ、ｆｏｌＰ、及びｆｏｌＭ（選択的ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子）によるＧＣＹＨ−ＩＢ（ラベル名ＣＯＧ１４６９）コード遺伝子の物理クラスタリングを示す。Rebelo et al., 326(2)J. Mol. Biol. 503-16 (2003)。
【図８】枯草菌（B. subtilis）由来のＧＣＹＨ−ＩＢ遺伝子（ＢｓｆｏｌＥ２）及びＡ．バイリイ（A. baylyi）由来のＧＣＹＨ−ＩＢ遺伝子（ＡｃｆｏｌＥ２）を発現するｐＢＡＤ誘導体による大腸菌（E. coli）ｆｏｌＥ：：ＫａｎＲのＬＢにおけるｄＴ栄養要求性の様々な相補性データを図示する。パネルＣは、ＴＭ００３９（ＴｍｆｏｌＥ２）を発現するプラスミドによる大腸菌（E. coli）ｆｏｌＥ：：ＫａｎＲのｄＴの存在下でのＬＢにおける低成長の相補性を示す。対照はｐＢＡＤ２４によって形質転換したｆｏｌＥ：：ＫａｎＲである。プレートは３７℃で４８時間インキュベートした。パネルＤは、ｆｏｌＥ：：ＫａｎＲ対立遺伝子の存在を確認するためのＰＣＲ増幅（レーン２、４、６、及び８）、及びｐＢＡＤ誘導体における予想されたサイズの挿入断片の存在を確認するためのＰＣＲ増幅（レーン３、５、７、及び９）を、ＡｃｆｏｌＥ２を発現するプラスミド（レーン２及び３）、ＢｓｆｏｌＥ２を発現するプラスミド（レーン４及び５）、及びＴｍｆｏｌＥ２を発現するプラスミド（レーン６及び７）、並びにｐＢＡＤ２４対照（レーン８及び９）で形質転換したｆｏｌＥ：：ＫａｎＲ株において実施したことを表す。ｆｏｌＥ：：ＫａｎＲを検出するＰＣＲ産物の予想サイズは約３．５ｋｂであるのに対し、野生型株では同じプライマーが２．５ｋｂの産物を増幅する。ｐＢＡＤ２４にＡｃｆｏｌＥ２、ＢｓｆｏｌＥ２、又はＴｍｆｏｌＥ２があることによって得られるＰＣＲ産物のサイズは、それぞれ、１０７２ｂｐ、１１０５ｂｐ、及び９６０ｂｐである。
【図９】ＧＣＹＨ−Ｉ活性アッセイのグラフを示す。パネル９Ａは、シクロヒドロラーゼアッセイの紫外可視スペクトルを示す。ラインａ、大腸菌（E. coli）ＦｏｌＥ；ラインｂ、淋菌（N. gonorrhoeae）由来のＧＣＹＨ−ＩＢタンパク質；ラインｃ、枯草菌（B. subtilis）由来のＧＣＹＨ−ＩＢタンパク質；ラインｄ、酵素なし。図９Ｂは、反応後脱リン酸化及び酸化した後の標準ネオプテリン及びシクロヒドロラーゼアッセイの蛍光スペクトルを示す。蛍光は、３６５ｎｍ励起により測定した。ラインａ、Ｔ．マリティマ（T. maritima）ＧＣＹＨ−ＩＢ；ラインｂ、枯草菌（B. subtilis）ＧＣＹＨ−ＩＢ；ラインｃ、大腸菌（E. coli）ＦｏｌＥ；ラインｄ、標準ネオプテリン；ラインｅ、淋菌（N. gonorrhoeae）ＧＣＹＨ−ＩＢ。パネル９Ｃは、標準ネオプテリン（ラインａ）と、大腸菌（E. coli）ＦｏｌＥ（ラインｂ）、標準ネオプテリンに添加した枯草菌（B. subtilis）ＧＣＹＨ−ＩＢ（ラインｃ）、及び枯草菌（B. subtilis）ＧＣＹＨ−ＩＢ単独（ラインｄ）を伴うシクロヒドロラーゼアッセイとのＨＰＬＣクロマトグラムを表す。酵素分析物は、反応後脱リン酸化及び酸化に供した。
【図１０】［Ｍｎ２＋］（○）又は［Ｚｎ２＋］（●）に対する枯草菌（B. subtilis）ＧＣＹＨ−ＩＢ酵素活性を示す。各データ点は、４セットの三重反復アッセイの平均値を表す。
【図１１】枯草菌（B. subtilis）ΔｆｏｌＥ突然変異株のＧＣＹＨ−ＩＢ依存相補性を示す。ＧＣＹＨ−Ｉのいずれかのタイプを発現する枯草菌（B. subtilis）の野生型（ＷＴ）株及び突然変異株の富栄養培地における増殖曲線。株及びそれらに対応する発現したＧＣＹＨ−Ｉアイソザイムが列挙される。
【図１２】ＧＣＹＨ−ＩＢ結晶中の結合金属のＸ線放射及び蛍光スキャンによるデータを示す。パネルＡは、亜鉛吸収端の近傍で測った結晶ＧＣＹＨ−ＩＢからの蛍光スペクトルを反映する。パネルＢおよびＣは、各々、マンガンＫ殻吸収端の近傍で測ったＧＣＹＨ−ＩＢ・Ｍｎ２＋結晶からの放射スキャン及び蛍光スペクトルである。蛍光スペクトルの変曲点が垂直線で示される。パネルＢの大きいピークは、主ビームからの散乱に相当する。
【図１３】細菌ゲノムにおけるｆｏｌＥ２の上流の候補Ｚｕｒ結合部位の表である。下流遺伝子の開始コドンに関連するヌクレオチドにおけるａ距離が示されている。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
詳細な説明
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬等に限定されず、従って異なり得ることは理解されなければならない。本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することを目的としているに過ぎず、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定する意図はない。
【００１０】
本明細書及び特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示されない限り、複数への言及及び当業者に公知の等価物を含む。演算例、又は特に指示される場合を除き、本明細書で使用される要素の量又は反応条件を表す数は全て、いずれの場合にも用語「約」によって修飾されるものとして理解されなければならない。
【００１１】
特定される全ての特許及び他の刊行物は、説明及び開示の目的上、参照により本明細書に援用され、例えば、かかる刊行物に記載される方法が本発明に関連して用いられ得るが、本明細書に示される用語の定義と矛盾する定義を提供するものではない。これらの刊行物は、本願の出願日に先行する開示についてのみ提供される。これに関して、先行する発明であることに基づき、又は任意の他の理由によって、本発明者がかかる開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されてはならない。これらの文献の日付に関する記載又は内容に関する表現は全て、本出願者に入手可能な情報に基づいており、これらの文献の日付又は内容の正しさに関してのいかなる承認もなすものではない。
【００１２】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明の関わる技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。タンパク質又は遺伝子ファミリーの文脈でＣＯＧ１４６９が使用されるとき、それは、ＧＣＹＨ−ＩＢタンパク質又は遺伝子ファミリーと同義である。
【００１３】
葉酸又は葉酸塩は、あらゆる生命形態に必須の代謝産物である。あらゆる細胞がこれを利用してプリン（ＤＮＡ及びＲＮＡの構成要素）、アミノ酸、及びビタミンを生合成する。葉酸の食事による補給を必要とするヒトと異なり、細菌及び酵母は葉酸をデノボ生合成する。結果として、細菌及び酵母における葉酸生合成は、抗菌療法の魅力的な標的となっている。例えば、スルホンアミド系抗菌薬は、広範な抗菌活性を有する最初に開発された合成薬物であり、細菌の葉酸生合成経路における後期段階を標的とする。既存の抗生物質に対する耐性の出現に促され、この経路に沿った新規のより有効な標的ポイントが探究されている。かかるポイントの１つが、葉酸生合成の第１段階：酵素ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＹＨ−Ｉ）によるＧＴＰの７，８−ジヒドロネオプテリン三リン酸への変換である。ヒトに相同酵素が存在するため（葉酸塩とは異なる別の代謝補因子であるビオプテリンの生成に必要とされる）、細菌性ＧＣＹＨ−Ｉの創薬標的としての開発は複雑となっていた。
【００１４】
本発明は、ＧＣＹＨ−ＩＢと称される、病原性細菌において同定された新規ＧＣＹＨ−Ｉ酵素ファミリーを提供する。この参照により本明細書に完全に援用されるEl Yacoubi et al., 281(49) J. Biol. Chem. 37586-93 (2006)。重要なことには、ＧＣＹＨ−ＩＢはヒトにはない。本発明は、病原性細菌の淋菌（N. gonorrhoeae）由来のＧＣＹＨ−ＩＢの生化学的特性及び結晶構造を同定する。このシクロヒドロラーゼの独自の活性中心構造及び新規の金属依存性は、カノニカルなＧＣＹＨ−Ｉとは異なる酵素機構を示唆している。ＧＣＹＨ−Ｉ酵素の２つのサブタイプの活性部位の構造及び酵素機構の違いは、細菌特異的酵素の選択的阻害薬の設計に利用することができる。かかる目標を実現することで、抗菌性医薬の治療標的としてのＧＣＹＨ−ＩＢの開発が可能となる。さらに、２つの臨床的に重要なヒト病原体である淋菌（N. gonorrhoeae）及び黄色ブドウ球菌（S. aureus）には、ＧＣＹＨ−ＩＢが唯一のＧＴＰシクロヒドロラーゼとして存在することから、抗生物質耐性型の淋病及びＭＲＳＡ感染症に対する有望な創薬標的としてこの酵素を調べることが可能となる。
【００１５】
より具体的には、葉酸生合成に関して、どの生物界においても、様々なテトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）誘導体の形態の葉酸が、プリン、チミジル酸、パントテン酸、グリシン、セリン及びメチオニンの合成における一炭素転移反応の補因子として働く。Nichol et al., 54 Ann. Rev. Biochem. 729-64 (1985)。細菌では、ＴＨＦはイニシエーターであるホルミルメチオニルｔＲＮＡの生合成にも関わる。Clark & Marker, 17(2) J. Mol. Biol. 394-406 (1966)。植物、真菌、及び多くの細菌は、ＴＨＦをＧＴＰ及びｐ−アミノ安息香酸（ｐＡＢＡ）からデノボ合成する。Green et al., in E. COLI & SALMONELLA, CELLULAR & MOLECULAR BIOL. 665-73 (Neidhart, ed., Am. Soc. Micro., Washington, DC, 1996)；Cossins & Chen, 45(3) Phytochem. 437-52 (1997)；Hanson & Gregory, 5(3) Curr. Opin. Plant Biol. 244-49 (2002)。動物には葉酸生合成経路の鍵酵素がなく、従って正常な成長及び発育には食事による葉酸塩の供給源を必要とする。Lucock, 71(1) Mol. Genet. Metab. 121-38 (2000)。
【００１６】
ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＹＨ−１；ＥＣ  ３．５．４．１６）は、デノボＴＨＦ経路の最初の酵素である（図１）。Nichol et al., 1985。これは大腸菌（E. coli）においてはｆｏｌＥ遺伝子によってコードされ（Katzenmeier et al., 372(11) Biol. Chem. Hoppe Seyler 991-97 (1991)；Schoedon et al., 210(2) Eur. J. Biochem. 561-68 (1992)）、且つ、プリン環がＣ８で加水分解により開環されることによるＮ−ホルミル中間体の生成から始まり、次にこれが第２の加水分解の部位になると同時にギ酸としてＣ８が失われる複合反応を触媒する。Yim & Brown 251(16) J. Biol. Chem. 5087-94 (1976)。この反応の次の段階では、リボシル部分の開環、及びアマドリ転位が起こり、続く環化によりＴＨＦのプテリン環が生成される（図１）。ＧＣＹＨ−１の産物である７，８−ジヒドロネオプテリン三リン酸（Ｈ２ＮＴＰ）は、続いて特異的及び非特異的の双方のホスファターゼによって脱リン酸化されて７，８−ジヒドロネオプテリンとなり（Klaus et al., 280(7) J. Biol. Chem. 5274-80 (2005)）、ｆｏｌＢＫＰＣＡ遺伝子（大腸菌（E. coli）においては）によってコードされる酵素により残りのＴＨＦ生合成が実行される。Green et al., 1996。
【００１７】
葉酸経路は、抗菌療法及び癌化学療法における重要な標的として語られてきた歴史をもつ。ジヒドロプテロイン酸合成酵素はスルホンアミド系抗菌薬の標的であり（Huovinen et al., 39(2) Antimicrobial Agents & Chemotherapeutics, 279-89 (1995)）、及びジヒドロ葉酸レダクターゼは、最初に開発された抗癌化学治療薬であるメトトレキサートの標的である。相同なＧＣＹＨ−Ｉは哺乳動物及び他の高等真核生物に存在するが、しかしながらそこではビオプテリン（ＢＨ４）経路（図１）の第１段階を触媒し、ビオプテリンは、チロシン並びにセロトニン及びＬ−ＤＯＰＡなどの神経伝達物質の生合成における芳香族アミノ酸酸化の必須補因子である。Thony et al., 347(1) Biochem. J. 1-16 (2000)；Bonafe et al., 69(2) Am. J. Human Genet. 269-77 (2001)。葉酸経路のいくつかの酵素は重要な抗菌標的であることが分かっているが（Huovinen et al., 1995）、ヒト及び細菌の双方に相同なＧＣＹＨ−Ｉ酵素が存在するため、実現可能な標的としてのＧＣＹＨ−Ｉの開発は不可能であった。
【００１８】
葉酸塩が必須補因子としての役割をもつことから、抗菌治療薬、駆虫性治療薬、及び抗癌治療薬の開発におけるこの経路の歴史的重要性と相まって（Hoffbrand & Weir, 113(3)Brit. J. Haematol 579-89 (2001)）、葉酸代謝は生物学のなかで特に特徴が明らかにされた分野となっている。本明細書に記載されるとおりの、広く分布している新規葉酸生合成酵素の発見は、遺伝子と機能とを関連付ける比較ゲノム学的手法の能力を実証するものである。デノボ葉酸経路の署名遺伝子であるｆｏｌＰ及びｆｏｌＫは、それぞれ、ジヒドロプテロイン酸合成酵素及び６−ヒドロメチル−７，８−ジヒドロプテリンピロホスホキナーゼをコードする。細菌では、７，８−ジヒドロプテリン三リン酸から７，８−ジヒドロ−ヒドロキシメチルプテリンピロリン酸への代謝中間体は、いずれも輸送されないため、これらの２つの遺伝子を有する生物体は全て、ｆｏｌＥ遺伝子のホモログを有するはずである。Skold, 3(3) Drug Resistance Update, 155-60 (2000)。
【００１９】
ＳＥＥＤデータベースにおいて配列決定されている生物体のなかでのｆｏｌＥ／ｆｏｌＥ２遺伝子の分布（２６個の古細菌、３６３個の細菌、及び２９個の真核生物のほぼ完全なゲノム）を分析した。真核生物ゲノムではＦｏｌＥ２ホモログは同定されなかったとともに、ＦｏｌＥ／ＦｏｌＥ２遺伝子の分布には細菌間で大きな差があった。ｆｏｌＫＰホモログを有する全ての配列決定されているゲノムのなかでのｆｏｌＥ遺伝子の分布の分析により、ｆｏｌＥホモログをもたない大規模な生物体クラスが明らかとなったことから（表１）、こうした生物体においてはｆｏｌＥが「局所的に欠損」していることが示唆された。Koonin et al., 12(9) Trends Genet. 334-36 (1996)；JBC Onlineで利用可能なEl Yacoubi et al., 2006の補足データもまた参照のこと。
【００２０】
【表１】
0005405476.tif 000002
【００２１】
定義された系統発生的分布プロファイルに従うタンパク質ファミリーの同定が可能なＳＥＥＤツールを使用して、ｆｏｌＥホモログをもたない生物体（表１、太字）に存在し、且つ大腸菌（E. coli）にはないタンパク質ファミリーについて、利用可能なゲノムの検索を行った。５つのタンパク質ファミリーがこれらの系統発生的基準を満たし、そのうちの１つＣＯＧ１４６９は、機能が未知であった。このファミリーのメンバーをいくつかの生物体において葉酸代謝遺伝子により物理的にクラスタリングした。系統発生的分布及びクラスタリングを併せると、ＣＯＧ１４６９ファミリーは欠損しているＧＣＹＨ−Ｉ酵素をコードする可能性があることが示唆された。
【００２２】
さらに分布の差異に関して、大腸菌（E. coli）を含む最大の第１群は、ｆｏｌＥホモログのみを有する。黄色ブドウ球菌（S. aureus）及び淋菌（N. gonorrhoeae）を含む第２群は、ｆｏｌＥ２ホモログのみを有する。枯草菌（B. subtilis）及びＡ．バイリイ（A. baylyi）を含む第３群は、各遺伝子のホモログを有し、一方、第４群は２つの遺伝子の複数のコピーを有し得る（例えば、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）は、２つのｆｏｌＥ遺伝子と１つのｆｏｌＥ２遺伝子とを有する）。多くの生物体がＩ型シクロヒドロラーゼ酵素をコードするいくつかの遺伝子を必要とすることは、特定の環境条件又は葉酸生合成以外の経路におけるそれらの関与に基づく発現差異に起因し得る：例えば、ＧＴＰシクロヒドロラーゼは、７−デアザグアノシン誘導体、例えば、修飾ｔＲＮＡヌクレオシドのキューオシン（Kuchino et al., 3 Nucl. Acids. Res. 393-98 (1976)）、並びに二次代謝産物のトヨカマイシン及びツベルシジンの生合成に関与するとされている。Suhadolnik & Uematsu, 245(17) J. Biol. Chem. 4365-71 (1970)；Smulson & Suhadolnik, 242(12) J. Biol. Chem. 2872-76 (1967)。枯草菌（B. subtilis）ではｙｃｉＡ遺伝子は必須でないことが示されており（Gaballa et al., 184 J. Bacteriol. 6508-14 (2002)）、これは、この生物体にはｆｏｌＥ遺伝子（ｍｔｒＡ）も存在するためである。Yakhin & Babitze, 64(3) Appl. Microbiol. Biotech. 382-86 (2004)。同定されている別のｆｏｌＥ遺伝子を有しない細菌では、ｆｏｌＥ２の欠失はない；しかし、対応する黄色ブドウ球菌（S. aureus）突然変異体の構築は可能である。
【００２３】
ほとんどの古細菌ゲノムが、ｆｏｌＥ又はｆｏｌＥ２のいずれかのホモログを有する。El Yacoubi et al., 2006, Suppl. Dataを参照のこと。好塩菌及びスルホロビイ（Sulfolobii）における葉酸塩（White, 170(10) J. Bacteriol. 4608-12 (1988)）、メタン産生菌におけるテトラヒドロメタノプテリン（Graham et al., 41(50) Biochem. 15074-84 (2002)）、及び古細菌ｔＲＮＡの大半に見られる７−デアザグアノシンｔＲＮＡ修飾ヌクレオシドのアーケオシン（Gregson et al., 268(14) J. Biol. Chem. 10076-86 (1993)）を含め、いくつかのＧＴＰ由来代謝産物が古細菌で合成される。古細菌ｆｏｌＥ／ｆｏｌＥ２遺伝子は、それらの生合成経路の１つ又は複数に関与し得る。
【００２４】
上述のとおり、本明細書に記載される技術を用いて、多種多様な細菌でＧＣＹＨ−ＩＢが同定されている。表２は、この分布のいくつかを示す。
【００２５】
【表２】
0005405476.tif 000003
【００２６】
重要なことには、黄色ブドウ球菌（S. aureus）及び淋菌（N. gonorrhoeae）に加え、ＧＣＹＨ−ＩＢを有するがＧＣＹＨ−ＩＡを有しない重要な病原体があり、表３に示すとおりである。
【００２７】
【表３】
0005405476.tif 000004
【００２８】
ＧＣＹＨ−ＩＢタンパク質の一次構造は、他の公知のタンパク質ファミリーのいずれとも相同性を示さない。ＧＣＹＨ−ＩＢ配列とＧＣＹＨ−ＩＡ配列とを直接アラインメントしても、検出可能な類似性は得られない。しかしながら、一次元及び三次元配列プロファイルを使用したタンパク質フォールド認識解析は、二次構造及び溶媒和ポテンシャル情報と併せると（英国Imperial CollegeのStructural Bioinformatics Groupからオンラインで利用可能な3D-PSSMサーバーを使用；Kelley et al., 299(2) J. Mol. Biol. 499-520 (2000)）、ＧＣＹＨ−ＩＡを含む構造上の酵素スーパーファミリーである、２つのトンネルフォールド（Ｔフォールド）酵素を有する三次元構造上の相同性の可能性を示す。Colloc’h et al., 39(2)Proteins 142-54 (2000)。Ｔフォールド酵素は平面状のプリン及びプテリン様基質を結合するが、異なる反応を触媒し（同上）、及び特徴として低い配列相同性を示すものの、それらの三次構造相同性は極めて高い。
【００２９】
淋菌（N. gonorrhoeae）配列をベイト（ｂａｉｔ）として使用すると、予測される三次構造において、ＧＣＹＨ−ＩＢのＮ末端半分は７，８−ジヒドロネオプテリン三リン酸エピメラーゼ（Protein Data Bankコード１Ｂ９Ｌ（４４）、ＰＳＳＭ  Ｅ値０．３９）に最も類似しており、一方、Ｃ末端半分は７，８−ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ（ＤＨＮＡ；Protein Data Bankコード１ＮＢＵ（４５）、ＰＳＳＭ  Ｅ値０．３）に類似している。これら以外には、Ｅ値が条件を満たす（すなわち、検出閾値のＥ値である１．００未満である）ＰＳＳＭヒットはなかった。双方のヒットとも、ホモ八量体構造を有する葉酸生合成酵素である。ＧＣＹＨ−ＩＢタンパク質のサイズ（２５０〜３００アミノ酸）と、それらの配列に２つのＴフォールドドメインを検出することができるという事実との双方から、ＧＣＹＨ−ＩＢメンバーが、尿酸オキシダーゼ（Colloc’h et al., 4(11) Nat. Struct’l Biol. 947-52 (1997)）、植物ＧＣＹＨ−ＩＡ酵素（Basset et al., 99(19) PNAS 12489-94 (2002)）、及び最近になって報告された新規ニトリルオキシドレダクターゼ（クラス２；例えば大腸菌（E. coli）由来のＹｑｃＤ）を含む、Ｔフォールドスーパーファミリーのなかの２モジュール構成のサブファミリーに属することが示唆される。Van Lanen et al., 102(2) PNAS 4264-69 (2005)。淋菌（N. gonorrhoeae）ＧＣＹＨ−ＩＢの予備的な沈降速度及び結晶解析からは、三量体又は四量体のいずれかの四次構造が示唆される。
【００３０】
葉酸生合成及びビオプテリン生合成に関与する酵素のなかでも、ＧＴＰからＨ２ＮＴＰへの変換に固有のその機構上の複雑性から、ＧＣＹＨ−ＩＡには特に関心が集まっている（Nar et al., 1995；Tanaka et al., 138(3) J. Biochem. (Tokyo) 263-75 (2005)；Schramek et al., 316(3) J. Mol. Biol. 829-38 (2002)；Bracher et al., 273(43) J. Biol. Chem. 28132-141 (1998)；Wolf & Brown, 192(3) Biochem. Biophys. Acta 468-78 (1969)）。ＧＣＹＨ−ＩＡ活性は触媒のＺｎ２＋原子に依存し（Auerbach et al., 97(25) PNAS 13567-72 (2000)）、Ｚｎ２＋原子は、反応の最初の加水分解段階でＧＴＰのＣ−８に求核攻撃するよう水分子を活性化させるときのルイス酸として機能する。Ｚｎ２＋はさらに、得られたアミドカルボニルを分極することによって第２の水分子の求核攻撃を促進するよう働く。ＧＣＹＨ−ＩＡの亜鉛結合部位は、Ｃｙｓ１１０、Ｈｉｓ１１３、及びＣｙｓ１８１（大腸菌（E. coli）の番号系）から構成され、水が第４の配位部位を占有する。
【００３１】
従って、ＧＣＹＨ−ＩＢは、淋菌（N. gonorrhoeae）及び黄色ブドウ球菌（S. aureus）などのいくつかの臨床的に重要な病原体を含め、カノニカルなＧＣＹＨ−Ｉ（ＧＣＹＨ−ＩＡと改名）をコードしない微生物（細菌の２０％及びほとんどの古細菌）において発見された。El Yacoubi et al., 2006。重要なことには、ＧＣＹＨ−ＩＢは、ヒトを含めた真核生物に存在しない。ＧＣＹＨ−ＩＢの３Ｄ構造の予測からは、ＧＣＹＨ−ＩＡと同じく、ＧＣＹＨ−ＩＢ酵素もトンネルフォールド（Ｔフォールド）構造スーパーファミリーのメンバーであることが示された。Ｔ．マリティマ（T. maritima）、淋菌（N. gonorrhoeae）、及び枯草菌（B. subtilis）由来のＧＣＹＨ−ＩＢ酵素はクローニングされ、機能についてインビトロで特徴付けられている。ＧＣＹＨ−ＩＢの金属依存性をインビトロで分析すると、選好的な金属補因子としてはマンガンであり、ＧＣＹＨ−ＩＡの金属依存性とは異なることが分かった。淋菌（N. gonorrhoeae）酵素のマンガン選好性は、女性の泌尿生殖器管の自然免疫応答によって課される高い酸化的ストレス環境で複製するために、この病原体がマンガンに基づく独自の複雑な細胞機構を進化させた事実と整合的である。Seib et al., 70(2) Bio. Reviews 344-61 (2006)。酸化的ストレスに対して淋菌（N. gonorrhoeae）が用いる一次防御としては、ＭｎｔＡＢＣ輸送系によるマンガンの細胞内蓄積及びマンガン依存性カタラーゼ及びペルオキシダーゼの異常な高活性が挙げられる。淋菌（N. gonorrhoeae）におけるマンガン依存性葉酸生合成酵素の発見は、抗淋病抗生物質の開発に向けた葉酸生合成経路の標的化における新しい手法に道を開くものである。
【００３２】
本発明は、淋菌（N. gonorrhoeae）ＧＣＹＨ−ＩＢ及びマンガン再メタル化形態の酵素の結晶構造を提供する。本発明の態様は、この酵素の、カノニカルな酵素のものとは異なる金属結合部位を含めた活性中心を明らかにする。金属結合部位の違いを含め、活性中心におけるヒトＧＣＹＨ−ＩＡと細菌ＧＣＹＨ−ＩＢとの構造の違いから、異なる酵素機構が示唆される。こうした差異により、ヒト酵素を阻害しない細菌酵素（ＧＣＹＨ−ＩＢ）に特異的な阻害薬を設計及び試験する独自の機会が提供される。
【００３３】
上述のとおり、Ｚｎ２＋依存性酵素ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＹＨ−Ｉ；ＥＣ  ３．５．４．１６）は、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）のデノボ生合成経路の最初の酵素である（図１）。Nichol et al., 54 Ann. Rev. Biochem. 729-64 (1985)。ＴＨＦは、あらゆる生物界の、プリン、チミジル酸、パントテン酸、グリシン、セリン、及びメチオニンの合成、並びに細菌のホルミルメチオニルｔＲＮＡの合成における一炭素転移反応の必須補因子である（同上）。Clark & Marcker, 17 J. Mol. Biol. 394-406 (1966)。ＧＣＹＨ−Ｉは、大腸菌（E. coli）ではｆｏｌＥ遺伝子によりコードされ（Katzenmeier et al., 372 Biol Chem. Hoppe Seyler 991−97 (1991)）、且つＧＴＰから７，８−ジヒドロネオプテリン三リン酸への変換を触媒し、この変換は、ＧＴＰのＣ−８でプリン環が加水分解により開環されることによるＮ−ホルミル中間体の生成から始まり、脱ホルミル化が続き、次にリボシル部分が転位及び環化されてＴＨＦのプテリン環が生成される複合反応である（図１）。Yim & Brown, 251 J. Biol. Chem. 5087-94 (1976)。活性部位Ｚｎ２＋は、反応の第１段階でＣ−８に求核攻撃するよう水分子を活性化する。
【００３４】
微生物におけるｆｏｌＥ（遺伝子産物は改名されたＧＣＹＨ−ＩＡ）及びｆｏｌＥ２（ＧＣＹＨ−ＩＢ）の分布は様々である。El Yacoubi et al, 326 J. Mol. Biol. 503-516 (2006)。生物体の多くは、ｆｏｌＥ遺伝子（６５％、例えば大腸菌（E. coli））又はｆｏｌＥ２遺伝子（１４％、例えば淋菌（N. gonorrhoeae））のいずれかを有する。相当数（１２％、例えば枯草菌（B. subtilis））が双方の遺伝子を有し（５０細菌種のサブセットが図１３に示される）、及び９％がいずれの遺伝子ももたないが、後者の群のメンバーは、主に細胞内細菌か、又は葉酸塩を外部供給源に依存する共生細菌である。
【００３５】
【表４】
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【００３６】
ｆｏｌＥ２枯草菌（B. subtilis）遺伝子ｙｃｉＡの発現は、Ｚｎ依存性Ｚｕｒリプレッサーによって調節され、従ってＺｎ制限条件下では上方制御されるはずである。Gaballa et al., 184 J. Bacteriol. 6508-14 (2002)。それゆえ、ＧＣＹＨ−ＩＢファミリーがＺｎ制限環境で増殖可能であるためには、Ｚｎ以外の金属を利用している可能性がある。枯草菌（B. subtilis）ＧＣＹＨ−ＩＢのインビトロ及びインビボでの金属依存性を調査したところ、枯草菌（B. subtilis）のように双方のアイソザイムを含む生物体では、Ｚｎが制限された状態とならない限り、Ｚｎ依存性酵素しか発現しないことが明らかとなった。ＧＣＹＨ−ＩＢの金属依存性についての構造的理解を得るため、Ｚｎ２＋及びＭｎ２＋メタル化形態の淋菌（N. gonorrhoeae）オルソログの高分解能結晶構造を決定した。この結果は、種々の金属環境に曝露される生物体における葉酸生合成の調節についての解明につながるとともに、この調節の構造的理解を提供するものである。
【００３７】
ＧＣＹＨ−ＩＢとＧＣＹＨ−ＩＡとはインビトロで異なる金属要件を有する。ＧＣＹＨ−ＩＡは活性に、結合性Ｚｎ２＋イオンを利用することが十分に確立されている。Nichol et al., 1985。ＧＣＹＨ−ＩＢの金属依存性を調べるため、精製した組換え枯草菌（B. subtilis）酵素について、様々な金属イオン又はＥＤＴＡの存在下で活性をアッセイした。ＥＤＴＡの存在下では活性は認められなかったが、いくつかの金属イオンが存在すると、触媒作用が促進された。様々な金属イオンの触媒活性に対する効果に関して明確な定量データを得るため、初めに酵素をＥＤＴＡ／Chelex含有緩衝液に対して透析することにより脱メタル化してアポ酵素を生成し、次にそれを特定の金属イオンの存在下で幅広い濃度範囲にわたりアッセイした。表５に示されるとおり、触媒作用は金属イオンＭｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｏ２＋、Ｚｎ２＋、及びＮｉ２＋によって促進され、逆にＣａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ３＋、及びＦｅ３＋は活性を促進しなかった。
【００３８】
【表５】
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【００３９】
特に、Ｚｎ２＋の存在下で酵素は何らかの活性を示すが、Ｍｎ２＋の存在下では触媒作用が著しく高くなり、Ｆｅ２＋及びＭｇ２＋の存在下ではその程度は低くなる。興味深いことに、触媒作用に必要とされる最適な金属濃度は、Ｚｎ２＋についてＭｎ２＋のおよそ１０分の１の低さであり（図１０、表５）、Ｍｎ２＋は触媒作用の促進により有効だが、結合の親和性はＺｎ２＋より低いことが示唆される。
【００４０】
反応アッセイにおいてＺｎ２＋及びＭｎ２＋の双方が存在すると、結果として活性が減少する（すなわち、Ｚｎ２＋はＭｎ２＋に対する阻害物質である、表６）。金属は全て、酵素と低親和性で結合し、従ってタンパク質をＧ−２５カラムに通すか、又は金属フリー緩衝液に対して透析すると、タンパク質結合金属は除去された。
【００４１】
【表６】
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【００４２】
ＧＣＹＨ−ＩＢの独自の金属要件の構造的基礎を理解するため、２つの形態−１つは、添加金属を含まない溶液中で精製した組換え酵素（ＧＣＹＨ−ＩＢ、ＰＤＢ  ＩＤ  ３Ｄ１Ｔ）、及び１つは、マンガンで再メタル化したアポ酵素（ＧＣＹＨ−ＩＢ・Ｍｎ、ＰＤＢ  ＩＤ  ３Ｄ２Ｏ）の結晶構造を決定した。枯草菌（B. subtilis）及び淋菌（N. gonorrhoeae）の双方に由来する酵素について結晶化を目指したが、淋菌（N. gonorrhoeae）オルソログのみが回折結晶を生成した。２つのオルソログは、配列が６４％の類似性及び３５％の同一性を示し、且つインビトロで類似した生化学的特性を有する。
【００４３】
ＧＣＹＨ−ＩＢの結晶構造をセレノ−ＭＡＤ法によって決定した（図２、表７及び表９）。２つの単量体Ａ及びＢは非対称ユニットで同定された。最終的な構造は、各単量体の合計２５７アミノ酸のうち単量体Ａについて残基１〜１３が、及び単量体Ｂについて残基１〜１４が欠損しているとともに、２個のＺｎ２＋イオン及び１個の酢酸分子を含む。酵素の生物学的状態に相当するホモ四量体複合体（El Yacoubi et al., 281 J. Biol. Chem. 37586-93 (2006)）は、非対称ユニット二量体から結晶学的な２回回転操作によって生成することができた（図２Ａ）。（単量体の全表面積の３２％がホモ四量体のなかに埋まる）。単量体は、９本のβストランドと６本のαへリックスとからなる球形のサブユニットであり（図３Ａ）、そのうち８本の連続した逆平行βストランド（β１〜β６、β８及びβ９）と４本の逆平行αへリックス（α１、α２、α４及びα６）とが、２モジュール構成のプテリン及びプリン結合酵素を特徴とする古典的なトンネリングフォールド（Ｔフォールド）構造を有するコアを形成する。Colloc’h et al., 39 Proteins 142-54 (2000)。このコアでは、極度にねじれた８本のストランドからなるβシートが、その凹面側で４本の逆平行αへリックスと重なっている。非対称ユニットの二量体は、２つの単量体からの８本のストランドからなるβシートが２つ環状配置されることによって構成され、１６本のストランドからなる逆平行βバレルを形成する。生物学的ホモ四量体では、２つのβバレルが頭−頭で一体につながって長さ６０Å及び直径１７Åの中心トンネルを形成する（図２Ａ）。
【００４４】
ＤＡＬＩ検索エンジン及びＦＳＳＰデータベース（構造に基づくフォールド分類−タンパク質の構造アラインメント）を使用して、類似の構造について検索を行った。Holm & Sander 233 J. Mol. Biol. 123-38 (1993)。数個の２モジュール構成Ｔフォールド酵素、並びに単モジュール構成Ｔフォールド酵素であるＧＣＹＨ−ＩＡ（図３Ｃ）が同定された。類似したβ８α４トポロジーに従う黄色コウジ菌（A. flavus）尿酸オキシダーゼ（Retailleau et al., 60 Acta Crystallogr. D 453-62 (2004)）（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＵＯＸ、１９７個のＣα原子に対するｒ．ｍ．ｓ．ｄ．が３．４Å、図３Ｂ）に対するフィットが最良であった。
【００４５】
ＧＣＹＨ−ＩＡとＧＣＹＨ−ＩＢとの構造比較から、ＧＣＹＨ−ＩＢが２モジュール構成のβ８α４Ｔフォールドコアの周囲に構築されたホモ四量体であり、ＧＣＹＨ−ＩＡが、ホモ十量体のβ４α２単モジュール構成Ｔフォールド酵素であることが示される。DaliLiteサーバーを使用したＧＣＹＨ−ＩＢと大腸菌（E. coli）ＧＣＹＨ−ＩＡ（Rebelo et al., 326 J. Mol. Biol. 503-16 (2003)）（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＦＢＸ）との単量体サブユニットのペアワイズ構造比較から（Holm & Park, 16 Bioinform. 566-67 (2000)）、Ｔフォールドの４本のβストランド及び２本のαへリックス（ＧＣＹＨ−ＩＡのβ２、β３、β６、β７、α６、α７、及びＧＣＹＨ−ＩＢのβ５、β６、β８、β９、α４、α６）において厳密なアラインメントを得た（９４個のＣα原子に対するｒ．ｍ．ｓ．ｄ．が３．２Å、図３Ｃ）。このアラインメントに基づき、共有コア領域における２つの酵素サブファミリーの多重配列アラインメントを作成した（各１５本の配列、図４）。双方のサブファミリーにおいて金属結合に関与する保存されたシステイン（ＧＣＹＨ−ＩＢにおけるＣｙｓ１４７）を除き、この新規アラインメントは、これまでに報告されている配列情報及び予測三次構造に基づくアラインメントと大きく異なる。
【００４６】
本アラインメントでは、２つのサブファミリーの示す配列類似性は２８％で、不変残基は、金属配位残基Ｃｙｓ１４７と基質配位残基Ｇｌｕ２１６（淋菌（N. gonorrhoeae）の番号系）との２つのみであった。一般にＴフォールド酵素間で７％〜１７％の同一性及び３９％〜５３％の類似性があることと比較して、これは異常に低い一次構造相同性であり、これは、ゲノムデータベースにおけるＧＣＹＨ−ＩＢ遺伝子のアノテーションが不適当であり、配列に基づくホモロジーモデリングによって三次構造のモデルを作成しようとする先行の試みにおける成功が限定的であることの説明となる（El Yacoubi et al, 2006）。
【００４７】
ＧＣＹＨ−ＩＡに見られるＮ末端及びＣ末端ドメインがＧＣＹＨ−ＩＢには存在しないことに加え（図３Ａ及び図３Ｃ）、Ｔフォールドドメイン、特に活性部位に、以下の機能的に重要な違いが見られる：（ａ）ＧＣＹＨ−ＩＢにおける、共通Ｔフォールドβシートの最初の２つのストランド（β５及びβ６）の間の２ターンのαへリックス（α３）の挿入（図３Ａ、図３Ｃ及び図４）。この変化の結果、Ｃｙｓを除き、ＧＣＹＨ−ＩＡに見られるＺｎ２＋結合ループＣ１１０ＥＨＨ１１３が失われる（図４）；（ｂ）ＧＣＹＨ−ＩＢにおける、Ｔフォールドの２つのαへリックス（α４及びα６）の間のβストランド（β７）及びαへリックス（α５）の挿入（図３Ａ、図３Ｃ及び図４）。β７及びα５は、活性部位を保有するサブユニット間インタフェースの一部である。重要なことには、α５はＧＣＹＨ−ＩＢにおいて、活性部位の金属イオンに対するカルボン酸リガンドとして厳密に保存されたＧｌｕ２０１を提供する；及び（ｃ）ＧＣＹＨ−ＩＢにおける、ＧＣＹＨ−ＩＡのＴフォールドドメインに見られるへリックスα８の欠失（図３Ａ、図３Ｃ、及び図４）。重要なことには、α８はＧＣＹＨ−ＩＡにおいて、Ｚｎ２＋に対する第２のＣｙｓリガンドを含む。このＣｙｓはＧＣＹＨ−ＩＢには欠損しており、へリックスは、厳密に保存されたＧｌｕ２４３、Ｈｉｓ２４６及びＨｉｓ２４８を含むβターンに置き換わっている。
【００４８】
ＧＣＹＨ−ＩＡにあるとおり金属結合部位を転位させてＭｎ２＋を受け入れると、ＧＣＹＨ−ＩＢの活性部位は３つのサブユニット間のインタフェースに位置する。ＧＣＹＨ−ＩＢホモ四量体のなかの４つの活性部位のうち２つは、結晶において部分的に無秩序となっている。活性部位は、金属結合部位と、全てのＴフォールドタンパク質に特有の特徴である、基質グアニン部分を固定するよう働く保存されたＧｌｕ２１６による推定上のＧＴＰ結合ポケットとを包含する（Colloc’h et al, 2000）。
【００４９】
ＧＣＹＨ−ＩＢ結晶（結晶化緩衝液中で追加的なＺｎなしに成長させた）に結合したＺｎ２＋が存在することが、Ｚｎ吸収端近傍でのＸ線蛍光スキャン（図１２Ａを参照）及びオミットＦｏ−Ｆｃマップ（図５Ａ）によって確認された。Ｚｎ２＋は三方両錐構造で結合し、エカトリアルリガンドとして、Ｃｙｓ１４７のチオール基、隣接するサブユニットからのＧｌｕ２０１の側鎖酸素原子、及び結合した酢酸分子からの酸素原子（タンパク質試料中に５０ｍＭで存在）、並びに下側及び上側のアキシアルリガンドとして、それぞれＨｉｓ１５９のＮε及び水分子によって配位される（図５Ａ及び図６）。Ｚｎ２＋からリガンドまでの平均距離は２．４Åである。この今の位置では、酢酸分子は、基質グアノシン環の開環に続くシクロヒドロラーゼ反応遷移状態の１つを模倣し得る。配位性側鎖、Ｚｎ２＋配位圏におけるそれらの位置、及びそれらが位置するタンパク質二次構造要素は、ＧＣＹＨ−ＩＡに見られるものとは異なる（図４、図６）。Ｔ．サーモフィラス（T. thermophilus）及び大腸菌（E. coli）ＧＣＹＨ−ＩＡ（ＰＤＢ−ＩＤ  １ＷＭ９、Rebelo et al., 326 J. Mol. Biol. 503-516 (2003)；Tanaka et al., 138 J. Biochem. 263-275 (2005)）において、Ｚｎ２＋は、２つのチオール基及びヒスチジン側鎖（大腸菌（E. coli）残基番号におけるＣｙｓ１１０、Ｃｙｓ１８１、Ｈｉｓ１１３）によって配位され、これらは全て同じサブユニットのものである。これらの側鎖は、Ｔフォールドの最初の２つのβストランド（Ｅｃ−ＧＣＹＨ−ＩＡ命名法におけるβ２及びβ３）の間のループ及び短いαへリックス（α８）からもたらされる（図４）。ＧＣＹＨ−ＩＢでは、金属結合部位はＴフォールドの最初の２つのβストランド（β５及びβ６）の間のへリックス−ループの挿入（α３）及び隣接するサブユニットからのへリックスの挿入α５によって形成される。
【００５０】
Ｚｎフリー試薬を使用してＭｎ２＋で再メタル化したＧＣＹＨ−ＩＢの結晶（ＧＣＹＨ−ＩＢ・Ｍｎ）を成長させた。金属フリー溶液における結晶の洗浄及び１時間の再浸漬後、Ｍｎ吸収端近傍のＸ線放射スペクトル及び蛍光スキャンにより結合したＭｎ２＋の存在を確認した（図１２Ｂ及び図１２Ｃを参照）。Ｚｎ２＋メタル化構造からのモデル位相を用いた差フーリエ法によって結晶構造を決定した（表７及び表９）。２つの構造は類似しており、４８６個のＣα原子に対するｒ．ｍ．ｓ．ｄ．が０．３Åで重なり合う。Ｍｎ２＋に対するエカトリアルリガンドとして酢酸塩がアジド（結晶化前に酢酸塩を含まないタンパク質試料に１２ｍＭの濃度で添加したもの）に置き換わっていることを除き、金属配位及び距離もまた類似している（図５Ｂ）。
【００５１】
ｆｏｌＥ２のＺｕｒ依存性調節は、細菌種間で保存されている。枯草菌（B. subtilis）及び淋菌（N. gonorrhoeae）ＧＣＹＨ−ＩＢの生化学的及び構造的分析から、このシクロヒドロラーゼファミリーにとってＺｎは生理的金属ではないことが示唆される。枯草菌（B. subtilis）におけるＧＣＹＨ−ＩＢの発現は、Ｚｎ依存性Ｚｕｒリプレッサーによって調節され、従ってＺｎ制限条件下では上方制御される。Gelfand et al., 1 Brief Bioinform 357-71 (2000)。他の細菌のｆｏｌＥ２のオルソログも同様にＺｕｒ媒介性の調節を受けるかどうかを調べるため、比較ゲノム学的手法を用いて細菌のレギュロンを分析した。Gelfand et al, 2000；Rodionov, 107 Chem. Rev. 3467-97 (2007)。利用可能なゲノムにおけるｆｏｌＥ及びｆｏｌＥ２遺伝子のアノテーションは既に実施されている。グラム陽性菌及びグラム陰性菌の既知のＺｕｒ結合部位について２つの位置特異的重み行列（ＰＷＭ）を作成し（Panina et al., 100 Proc Natl Acad Sci U S A 9912-17 (2003)）、それらを用いて、細菌ゲノムにおけるｆｏｌＥ２の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の候補Ｚｕｒ結合部位及び隣接遺伝子をスキャンした。可能性のあるオペロン構造を説明するため、そのゲノムにおいてｆｏｌＥ２の直ちに上流に位置する遺伝子のＵＴＲもまた分析した。
【００５２】
２１個の細菌ゲノムにおいて、ｆｏｌＥ２遺伝子の上流に強力なＺｕｒオペレーター部位が同定された（表４、図１３）。この独自の調節機構は、１５個のγプロテオバクテリア（シュードモナス目（Pseudomonadales）、キサントモナス目（Xanthomonadales）、いくつかの腸内細菌、及び他の系統）、３個のβプロテオバクテリア（いくつかのバークホルデリア目（Burkholderiales））、及び３個のバチルス・スピーシーズ（Bacillus sp.）における例を含め、門間で保存されている。特に、Ｚｕｒによる調節性のｆｏｌＥ２遺伝子を有する生物体は全て、ｆｏｌＥのコピーも含む（例えば、枯草菌（B. subtilis））。同様に、Ｚｎ依存性ＧＣＹＨ−ＩＡアイソザイムをもたないこれらの生物体では、ｆｏｌＥ２遺伝子の上流にＺｕｒ調節性部位は認められなかった（例えば、淋菌（N. gonorrhoeae））。これらの結果は、ＺｕｒのＧＣＹＨ−ＩＢ調節が広範であることを示しており、且つ細菌によっては、Ｚｎ制限条件下ではＧＣＹＨ−ＩＢアイソザイムが発現することによりＺｎ依存性ＧＣＹＨ−ＩＡに置き換わることを示唆している。
【００５３】
ｆｏｌＥ及びｆｏｌＥ２の双方の遺伝子（それぞれ、ｍｔｒＡ及びｙｃｉＡとしても公知）を有する枯草菌（B. subtilis）では、ＧＣＹＨ−ＩＢは機能的にＧＣＹＨ−ＩＡに置き換わることができる。ＧＣＹＨ−ＩＢが機能的にＧＣＹＨ−ＩＡに置き換わることができるかどうかを決定するため、枯草菌（B. subtilis）ΔｆｏｌＥ突然変異株を構築し、そのＧＣＹＨ−ＩＢとの相補性を調べた。野生型枯草菌（B. subtilis）は富栄養（ＬＢ）培地中でよく増殖する（図１１、菱形）。既に報告されているとおり（Babitzke et al., 174 J. Bacteriol. 2059-64 (1992)）、ＧＣＹＨ−ＩＢのみを発現するΔｆｏｌＥ突然変異株は、チミジン（ｄＴ）栄養要求株である。これはｄＴがないと、富栄養培地において再現性のある遅滞を伴うことでしか増殖しない（図１１、四角形）。対数期におけるΔｆｏｌＥ突然変異株の低増殖性は、これらの条件下でのＧＣＹＨ−ＩＢ発現の抑制と整合する。増殖は静止期に始まり、これは、細胞がＺｎ不足となってＺｕｒ抑制が解除されると、ＧＣＹＨ−ＩＢは抑制を脱することを示している。実際に、ＧＣＹＨ−ＩＢが構成的に発現するΔｚｕｒ  ΔｆｏｌＥ二重突然変異体におけるようにｚｕｒ遺伝子を欠失させると、富栄養培地における増殖の遅滞はなくなる（図１１、三角形）。予想されるとおり、ＧＣＹＨ−Ｉを発現しないΔｆｏｌＥ  Δｚｕｒ  ΔｆｏｌＥ２三重突然変異株は増殖できず（図１１、黒丸）、ΔｆｏｌＥ  ΔｆｏｌＥ２二重突然変異株もまた増殖はできない。いずれの株についても、ｄＴ（図１１、白丸）又はあらゆる葉酸由来代謝産物を添加することによって回復させることのできる増殖は、部分的に過ぎない。これらの２つの突然変異株のｄＴレスキューがかなり弱いことは、ホルミル化が不十分なメチオニン生合成に起因し得る。これらの結果は、枯草菌（B. subtilis）においてＺｎ制限条件下ではＧＣＹＨ−ＩＢが機能的にＧＣＹＨ−ＩＡに置き換わることを示している。
【００５４】
配列保存は、金属依存性触媒作用が一般にＧＣＹＨ−ＩＢ酵素ファミリーの特性であることを示しており、インビトロで選好する金属は、Ｚｎ２＋ではなくＭｎ２＋であると思われる。実際に、淋菌（N. gonorrhoeae）及びＴ．マリティマ（T. maritima）（Grochowski et al., 46 Biochem. 6658-67 (2007)）由来、並びにＦｅ２＋の存在下で最適な活性を呈するＭ．ジャナスキイ（M.jannaschii）由来のＧＣＹＨ−ＩＢオルソログで金属触媒作用が認められている。活性部位領域におけるＧＣＹＨ−ＩＡとＧＣＹＨ−ＩＢとの酵素間の構造的違いは、ＧＣＹＨ−ＩＢに新規の金属機能を生じさせることに寄与する。例えば、ＧＣＹＨ−ＩＢの金属部位に酸性側鎖（Ｇｌｕ２０１）を導入すると、Ｚｎ２＋より酸素リガンドに有利なＭｎ２＋を受け入れることが可能となる。さらに、隣接するサブユニットが金属部位に寄与していることから、ＤＨＮＡに見られるような、金属によって誘導されるオリゴマー形成による翻訳後調節の可能性が示唆される。Goulding et al., 349 J. Mol. Biol. 61-72 (2005)。金属イオンは、ＧＣＹＨ−ＩＡにおけるように、反応の第１段階で求核剤の水分子を活性化し、ホルミル中間体を安定化させる働きをするものと思われる。Tanaka et al, 2005。
【００５５】
ＧＣＹＨ−ＩＡとＧＣＹＨ−ＩＢとの間の活性部位構造及びそれに関連する金属依存性の違いは、これらの２つの酵素ファミリーの触媒戦略の違いを反映したものであり得る。Ｚｎ２＋及びＭｎ２＋メタル化酵素構造に外因性金属リガンドとしてそれぞれ酢酸塩及びアジドが存在するのは、試料調製条件を受けた結果であり、金属タイプに対する特異性を反映したものではない。酢酸リガンドは、反応のホルミル中間体又はギ酸を脱離基として模倣し得る。アジドリガンドは、より後期の段階、例えば、グアニン及びリボース開環後に起こるアマドリ転位中に現れる遷移状態中間体のなかの一部分に相当し得る。
【００５６】
亜鉛は、様々なタンパク質の必須補因子である。細菌及び真核生物では、細胞のＺｎ２＋レベルが特異的転写因子（枯草菌（B. subtilis）及び大腸菌（E. coli）におけるリプレッサーＺｕｒ、出芽酵母（S. cerevisiae）におけるアクチベータＺａｐ１ｐ）によって感知される。Hantke, 8 Curr. Opin. Microbiol. 196-202 (2005)；Lyons et al., 97 Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 7957-62 (2000)；Moore & Helmann, 8 Curr. Opin. Microbiol. 188-195 (2005)。低Ｚｎ２＋条件に対する細胞応答は、ＺｎｕＡＢＣなどの高親和性Ｚｎ２＋輸送体の発現の増加、及びＺｎ２＋依存性酵素の、この金属イオンに依存しない補因子としての代替的アイソザイムとの置換を含む。後者の戦略の例としては、酵母におけるアルコールデヒドロゲナーゼアイソザイムＡＤＨ４（Lyons et al., 2000）、並びに枯草菌（B. subtilis）及びストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）におけるリボソームタンパク質のパラログ（例えば、Ｌ３１及びＬ３３）のＺｎ２＋依存性調節が挙げられる。Nanamiya et al., 52 Mol. Microbiol. 273-83 (2004)；Panina et al, 2003；Shin et al., 189 J. Bacteriol. 4070-77 (2007)。
【００５７】
同様に、本明細書に提示される研究の結果から、Ｚｎ２＋が低いときの枯草菌（B. subtilis）ＧＣＹＨ−ＩＢの上方制御の働きにより、葉酸合成にＺｎ２＋以外の金属イオンを利用することが可能となることが示される。他方で、淋菌（N. gonorrhoeae）（及び他のいくつかの病原体）は、Ｚｎ依存性ＧＣＹＨ−ＩＡアイソザイムを保有せず、代わりに葉酸合成はＧＣＹＨ−ＩＢだけに依存する。一貫してこれらは、ｆｏｌＥ２遺伝子の上流にＺｕｒ調節性部位を有しない。淋菌（N. gonorrhoeae）は、宿主の免疫反応によって作り出される高度に酸化された環境で生存し、この厳しい環境下で生き残るため、活性酸素種（ＲＯＳ）の有効なスカベンジャーであるマンガンをミリモルレベルで細胞質に蓄積する。Seib et al., 70 Microbiol. Mol. Biol. Rev. 344-61 (2006)。放射線被曝の結果起こるＲＯＳ障害に対処するための同様のＭｎ利用が、Ｄ．ラディオデュランス（D. radiodurans）において行われる。Daly et al., 306 Science 1025-28 (2004)。おそらく、これらの生物体にとってはＭｎ２＋が利用し易いため、Ｍｎ依存性葉酸生合成経路がより有利となっているものと思われる。
【００５８】
さらに、最近の報告では、マウスの自然免疫系が、好中球由来タンパク質のカルプロテクチンによるＭｎ２＋及びＺｎ２＋のキレート化を介して細菌から必須栄養素を奪うことで、組織膿瘍における微生物の増殖を阻害し、それにより黄色ブドウ球菌（S. aureus）感染症に抵抗することが示されている。Corbin et al., 319 Science 962-65 (2008)。葉酸合成をＧＣＹＨ−ＩＢのみに依存し、ＧＣＹＨ−ＩＡをもたない生物体である黄色ブドウ球菌（S. aureus）においては、この防御戦略の標的は、他の細胞過程のなかでも特に、葉酸合成である可能性がある（図１３）。それゆえ、ＧＣＹＨ−ＩＢの異なる構造及び金属依存性並びにヒトにおけるその不在により、ＧＣＹＨ−ＩＢは新規抗生物質製剤の開発の魅力的な標的となり得る。
【実施例】
【００５９】
実施例１．バイオインフォマティクス
ＳＥＥＤデータベースにおいて、ＳＥＥＤバージョンｃｖｓ．１１４４９２５１４１（２００６年４月１３日０５：４５：４１）（インターネット上で、例えば、National Microbial Pathogen Data Resource（ＮＭＰＤＲ）の「.org」サイトにて利用可能）で葉酸サブシステムの解析を実施した（Overbeek et al., 33(17)Nucl. Acids Res. 5691-5702 (2005)）。結果は、公的に利用可能なサーバー上の「Folate Biosynthesis Subsystem」において利用可能となっている（インターネット上で、University of ChicagoのSEED citeにおいて利用可能）。ＮＭＰＤＲウェブサイト上のＳＥＥＤサーバーで系統発生パターン検索を実施した。
【００６０】
実施例２．ＧＣＹＨ−ＩＢタンパク質発現のためのサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、及び枯草菌（Bacillus subtilis）ＣＯＧ１４６９遺伝子のクローニング
Ｔ．マリティマ（T. maritima）（ＴＭ００３９；GenBank（登録商標）受託番号ｇｉ｜１５６４２８１４）、淋菌（N. gonorrhoeae）（ｎｇｏ０３８７；GenBank（登録商標）受託番号ｇｉ｜５９８００８３１）、及び枯草菌（B. subtilis）（ｙｃｉＡ；GenBank（登録商標）受託番号ｇｉ｜２６３２６２０）由来のＣＯＧ１４６９遺伝子を、それぞれの生物体のゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。プライマーは米国仮特許出願第６０／９３５，１２４号に掲載されているとともに、El Yacoubi et al., 2006に公表されている。
【００６１】
ＰＣＲ液は、５００ｎｇのゲノムＤＮＡ、２００μＭのｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌのセンス及びアンチセンスプライマー、１×  Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ緩衝液（製造者によって供給されるもの）、及び２．５単位のＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ  ＤＮＡポリメラーゼを、最終容量５０μｌ中に含んだ。３段階ＰＣＲ熱サイクルプロトコルを利用した：（１）９４℃で１分間；（２）９４℃で１分間の変性、５０℃で２分間のアニーリング、及び７２℃で１分間の伸長を３０サイクル；（３）７２℃で４分間。Qiagen Inc.のＰＣＲ精製キットを使用して臭化エチジウムを含有する１％アガロースゲルからＰＣＲ産物を精製し、直鎖化したｐＥＴ−３０  Ｘａ／ＬＩＣ発現ベクター（Novagen）にクローニングした。得られたコンストラクトｐＳＡＢ−７−１８９（Ｔ．マリティマ（T. maritima））、ｐＳＡＢ−８−１４２（淋菌（N. gonorrhoeae））、及びｐＳＡＢ−９−６１（枯草菌（B. subtilis））の一次構造を配列決定により確認した。
【００６２】
実施例３．相補性のためのＴ．マリティマ（T. maritima）、アシネトバクター・バイリイ（Acinetobacter baylyi）、及び枯草菌（B. subtilis）ＣＯＧ１４６９遺伝子のクローニング
ＰＢＡＤ制御下でＴＭ００３９遺伝子を発現するｐＴＭ００３９（Klock et al., 6(2-3) J. Struct. Genomics 89-94 (2005)）は、Joint Center for Structural Genomics（La Jolla, CA）から供与された。枯草菌（B. subtilis）（ｙｃｉＡ）及びＡ．バイリイ（A. baylyi）（ＡＣＩＡＤ１７４０  ｇｉ｜５００８４８９２）のＣＯＧ１４６９遺伝子をｐＢＡＤ２４にクローニングした。Guzman et al., 177(14) J. Bact. 4121-30 (1995)。プライマーは米国仮特許出願第６０／９３５，１２４号に掲載されているとともに、El Yacoubi et al., 2006に公表されている。上記のとおりＰＣＲ産物を得て精製し、次にＮｃｏＩ／ＸｂａＩで消化した後、同じエンドヌクレアーゼで消化したプラスミドｐＢＡＤ２４にライゲートし（Guzman et al., 1995）、Topo 10細胞（Invitrogen）に形質転換した。得られたコンストラクトｐＢＹ１４２．１（Ａ．バイリイ（A. baylyi）ＡＣＩＡＤ１７４０を発現する）及びｐＢＹ１４３．１（枯草菌（B. subtilis）ｙｃｉＡを発現する）の一次構造を配列決定により確認した。
【００６３】
これらのプラスミド、並びにｐＢＡＤ２４及びｐＴＭ００３９を、大腸菌（E. coli）ｆｏｌＥ：：ＫａｎＲ株に形質転換した。Klaus et al., 280(46) J. Biol. Chem. 38457-63 (2005)。ｄＴ、アンピシリン及びカナマイシンを添加したＬＢに形質転換体を植菌し、様々な濃度のアラビノースの存在下でｄＴを含まないＬＢ上での増殖能力についてスクリーニングした。形質転換体におけるｆｏｌＥ：：ＫａｎＲ対立遺伝子及びｐＢＡＤ誘導体の存在を確認するため、米国仮特許出願第６０／９３５，１２４号に記載され、El Yacoubi et al., 2006に公表されるとおり、ｆｏｌＥ遺伝子及びＣｈｋＤｆｏｌＥ−ｏｌ２より上流及び下流に位置するか、又はｐＢＡＤ誘導体のポリリンカー及びｐＢＡＤｏｌ５より上流及び下流に位置するオリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲによりコロニーを分析した。
【００６４】
実施例４．組換えＴ．マリティマ（T. maritima）、淋菌（N. gonorrhoeae）、及び枯草菌（B. subtilis）ＧＣＹＨ−ＩＢタンパク質の精製及び過剰発現
Ｈｉｓ６  ｔａｇ融合タンパク質を発現させるため、プラスミドｐＳＡＢ−７−１８９、ｐＳＡＢ−８−１４２、及びｐＳＡＢ−９−６１を大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。形質転換細胞の培養物を３７℃で振盪しながら（２５０ｒｐｍ）、Ａ６００が０．９に達するまで増殖させた。イソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシドを最終濃度０．１ｍＭまで添加し、培養物をさらに４時間、３７℃で振盪しながら（２５０ｒｐｍ）インキュベートした。細胞を４℃で１０分間、５０００×ｇで遠心することにより回収した。細胞ペーストは液体窒素で急速冷凍し、必要になるまで−８０℃で保管した。
【００６５】
凍結細胞ペーストを解凍し、溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス酢酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＫＣｌ、及び１ｍＭのメルカプトエタノール）に２５０ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁した。リゾチーム及びＤＮａｓｅを、それぞれ０．２５ｍｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加することにより、細胞を溶解した。溶解生成物を４℃で３０分間、１５，０００×ｇで遠心し、得られた上清をろ過した（低いタンパク質結合性、０．４５μｍ）。細胞を含まない抽出物を、緩衝液Ａ（１００ｍＭのトリス酢酸（ｐＨ８．０）、３００ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％Triton X-100、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、及び１０％グリセロール）と平衡させたＮｉ２＋−ニトリロ三酢酸−アガロースカラム（Qiagen）に負荷した。カラムは、５カラム容量の緩衝液Ａ、５カラム容量の緩衝液Ｂ（１００ｍＭのトリス酢酸（ｐＨ８．０）、３００ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％Triton X-100、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、１０％グリセロール、及び２０ｍＭのイミダゾール）、及び最後に５カラム容量の緩衝液Ｃ（１００ｍＭのトリス酢酸（ｐＨ８．０）、３００ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのメルカプトエタノール、１０％グリセロール、及び２０ｍＭのイミダゾール）で洗浄した。２５０ｍＭのイミダゾールを含有する１０カラム容量の緩衝液Ｃで、カラムからタンパク質を溶出した。Centricon YM-10超遠心機でタンパク質を濃縮し、５０ｍＭのトリス酢酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＫＣｌ、及び４ｍＭのジチオスレイトールに対して４℃で透析した。
【００６６】
融合タンパク質（２０ｍｇ）、Factor Xaプロテアーゼ（２０μｇ）、５０ｍＭのトリス酢酸（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２を含有する最終容量が１ｍｌの反応液において、Ｔ．マリティマ（T. maritima）、淋菌（N. gonorrhoeae）、及び枯草菌（B. subtilis）ＧＣＹＨ−ＩＢタンパク質からＨｉｓ６  ｔａｇを切断した。反応液は、室温で２０時間インキュベートした後、緩衝液Ａに平衡化した２ｍｌのＮｉ２＋−ニトリロ三酢酸−アガロースを含有するカラムに負荷した。１０カラム容量の緩衝液Ａを含むカラムから野生型タンパク質が溶出した。タンパク質を濃縮し、５０ｍＭのトリス酢酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＫＣｌ、及び１０％グリセロールに対して透析した。
【００６７】
実施例５．ＣＯＧ１４６９遺伝子に相補的な大腸菌（E. coli）ｆｏｌＥ突然変異体
ほとんどの細菌において葉酸は輸送されないため（Skold et al., 2000）、葉酸を培地に供給することによっては葉酸栄養要求株の増殖を可能とすることはできない。しかしながら、富栄養培地には、ｄＴを除く全ての葉酸由来代謝産物が十分な量で存在するため、ｆｏｌＥ突然変異体をＬＢ／ｄＴに維持することができる。Klaus et al., 2005；Yakhin & Babitzke, 2004。それにもかかわらず、大腸菌（E. coli）ｆｏｌＥ：：ＫａｎＲ株はＬＢ／ｄＴで低成長表現型を有し（３７℃でコロニーを形成するのに、１日ではなく２日かかる）、これはおそらく、イニシエーターｔＲＮＡのホルミル化が起こらないことに起因するものと思われる。Ｔ．マリティマ（T. maritima）由来のＣＯＧ１４６９ホモログ（ＴＭ００３９）を発現するｐＢＡＤ誘導体で、ｆｏｌＥ：：ＫａｎＲ株を形質転換した。
【００６８】
ｄＴ栄養要求性及び低成長表現型の双方の相補性が認められたが（図８Ｃ）、それらはロバストでなく、高レベルのアラビノースに依存した。Ｔ．マリティマ（T. maritima）は高温菌であり、高温菌の酵素の多くが３７℃では低活性を示すことから、これは意外ではない。より良好な相補性を実現するため、中温菌の枯草菌（B. subtilis）及びＡ．バイリイ（A. baylyi）（正式にはアシネトバクター・スピーシーズ（Acinetobacter sp.）ADP1として公知）由来のＣＯＧ１４６９オルソログをクローニングし、大腸菌（E. coli）ｆｏｌＥ：：ＫａｎＲ株に形質転換した。これらのコンストラクトではｄＴ栄養要求性（図８Ａ）及び低増殖性（図８Ｂ）のロバストな相補性が認められたが、これはＧＣＹＨ−Ｉ活性を触媒するＧＣＹＨ−ＩＢファミリータンパク質と一致する。
【００６９】
実施例６．ＧＣＹＨ−ＩＢタンパク質はインビトロでＧＣＹＨ−Ｉ活性を有する。
インビボ実験と平行して、ＣＯＧ１４６９遺伝子をタンパク質発現ベクターにクローニングし、精製タンパク質のインビトロ酵素アッセイにより推定上のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ活性を直接調べることによって触媒機能の明確な割り当てを可能とした。このように、Ｔ．マリティマ（T. maritima）、淋菌（N. gonorrhoeae）、及び枯草菌（B. subtilis）由来のＧＣＹＨ−ＩＢタンパク質をコードする遺伝子をゲノムＤＮＡからｐＥＴ３０系にクローニングし、組換えＨｉｓ６融合タンパク質を過剰産生して精製した。３つの組換えタンパク質全てが、可溶性の活性酵素としてＨｉｓ６融合型及び切断野生型の双方で得られた。
【００７０】
ＧＣＹＨ−ＩＢタンパク質の各々を、陽性対照としての大腸菌（E. coli）ＦｏｌＥと共に［８−１４Ｃ］ＧＴＰを使用した放射化学アッセイ（Yim et al., 1976）にかけると、各アッセイで［１４Ｃ］ギ酸塩が放出されたとともに、その生成が時間及び酵素の双方に依存していたことが示され、これはＧＴＰのＣ−８における酵素触媒による加水分解開環及び脱ホルミル化と一致していた。これらのデータから、ＧＣＹＨ−ＩＢタンパク質についての比活性は２．３分−１ｍｇ−１〜５．３ｎｍｏｌ分−１ｍｇ−１と計算され、ＦｏｌＥについて報告されたもの（Bracher et al., 274 J. Biol. Chem. 16727-35 (1999)；Kolinsky & Gross, 279(39) J. Biol. Chem. 40677-82 (2004)；Rebelo et al., 326(2) J. Mol. Biol. 503-16 (2003)）及びＦｏｌＥ対照よりおよそ一桁低かった。ＧＣＹＨ−ＩＢ触媒反応の産物が実際に７，８−ジヒドロネオプテリン三リン酸であることを確認するため、酵素分析物を紫外可視分光法（Bracher et al., 40(26) Biochem. 7896-902 (2001)）及び蛍光分光法で分析した。（Hatakeyama & Yoneyama, 100 Methods Mol. Biol. 265-72 (1998)）。図９Ａは、標準ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩアッセイ条件下での大腸菌（E. coli）ＦｏｌＥ及びＧＣＹＨ−ＩＢタンパク質の酵素分析物についての紫外可視スペクトルを示す。スペクトルは本質的に同じであり、ＧＴＰに特有の吸収スペクトルがＨ２ＮＴＰの吸収スペクトルに置き換わっている。Bracher et al., 2001。酵素分析物を反応後脱リン酸化及び酸化に供することにより、酵素的に産生された推定Ｈ２ＮＴＰを蛍光ネオプテリンに変換すると、ＧＣＹＨ−ＩＢ分析物からの蛍光スペクトルは、大腸菌（E. coli）ＦｏｌＥ分析物のスペクトル（図９Ｂ）及び標準ネオプテリンのスペクトルと同一であった。Hatakeyama & Yoneyama, 1998。
【００７１】
さらに、脱リン酸化後の酵素分析物のＨＰＬＣ分析から、各酵素触媒による反応からの産物は、標準ネオプテリンと同じ滞留時間を（ジヒドロネオプテリンが酸化されてネオプテリンになる分析条件下で）有することが示された（図９Ｃ）。最後に、大腸菌（E. coli）ＦｏｌＥ及び淋菌（N. gonorrhoeae）ＧＣＹＨ−ＩＢ反応液の質量分光分析から、ＧＴＰ（ｍ／ｚ５２２、Ｍ−Ｈ−；ｍ／ｚ５４４、Ｍ−２Ｈ−＋Ｎａ＋；ｍ／ｚ５６６、Ｍ−３Ｈ−＋２Ｎａ＋）、ネオプテリン三リン酸（ｍ／ｚ４９２、Ｍ−Ｈ−；ジヒドロネオプテリンが酸化されてネオプテリンになる分析条件下）、及びネオプテリン環状一リン酸（ｍ／ｚ３１４、Ｍ−Ｈ−；アルカリ性のワークアップ条件下でネオプテリン三リン酸が環状一リン酸に変換されることが既に報告されている）に対応するイオンと同一の構成成分が明らかとなった。Basset et al., 99(19) PNAS 12489-94 (2002)；Cone & Guroff, 246(4) J. Biol. Chem. 979-85 (1971)；Plowman et al., 249(17) J. Biol. Chem. 5559-64 (1974)。
【００７２】
まとめると、データはＧＣＹＨ−ＩＢタンパク質がＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ活性を触媒することを明確に実証しており、従ってこれは、ヒト及び大腸菌（E. coli）ＦｏｌＥによって例示されるカノニカルなＧＣＹＨ−Ｉ酵素とは異なる、新規構造クラスのＧＴＰシクロヒドロラーゼ酵素に相当する。これらの２つのシクロヒドロラーゼファミリーを区別するため、カノニカルなＩ型シクロヒドロラーゼをＧＣＹＨ−ＩＡと改名してもよく、ＣＯＧ１４６９ファミリーはＧＣＹＨ−ＩＢと命名され、及びそれらに対応する遺伝子はそれぞれ、ｆｏｌＥ及びｆｏｌＥ２と表記される。
【００７３】
実施例７．セレノメチオニン（ＳｅＭｅｔ）標識淋菌（N. gonorrhoeae）ＧＣＹＨ−ＩＢ（Ｎｇ−ＧＣＹＨ−ＩＢ）の過剰発現及び精製
先述のとおり、Ｎｇ−ＧＣＹＨ−ＩＢをｐＥＴ−３０  Ｘａ／ＬＩＣ発現ベクター（Novagen, San Diego, CA）にクローニングした。El Yacoubi et al., 2006。ＳｅＭｅｔ標識したＮｇ−ＧＣＹＨ−ＩＢを、大腸菌（E. coli）メチオニン栄養要求株Ｂ８３４（ＤＥ３）（Novagen）において標準方法に従い過剰発現させた。Hendrickson et al., 9(5) Eur. Mole. Biol. Org. J. 1665-72 (1990)。Ｈｉｓ６タグを有するタンパク質をＮｉ−ＮＴＡ樹脂で精製し（トリス酢酸（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）、ＫＣｌ（３００ｍＭ）、β−メルカプトエタノール（２ｍＭ）、グリセロール（１０％）、及びイミダゾール（２０ｍＭ）で洗浄）、２５０ｍＭイミダゾールを含有する同じ緩衝液で溶出した。濃縮、及びトリス酢酸（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）、ＫＣｌ（５０ｍＭ）、及びジチオスレイトール（４ｍＭ）に対する透析後、先述のとおりＨｉｓ６タグをFactor Xaで酵素から切断し（El Yacoubi et al., 2006）、ＳｅＭｅｔ標識野生型Ｎｇ−ＧＣＹＨ−ＩＢをＮｉ−ＮＴＡカラムでさらに精製して、１０カラム容量のトリス酢酸（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）、ＫＣｌ（３００ｍＭ）、β−メルカプトエタノール（２ｍＭ）、Triton X-100（１％）、フッ化フェニルメチルスルホニル（１ｍＭ）、及びグリセロール（１０％）で溶出した。５．５ｍｇ／ｍＬまで濃縮した後、トリス酢酸（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）、ＫＣｌ（１００ｍＭ）及びβ−メルカプトエタノール（５ｍＭ）に対してタンパク質を透析し、９ｍｇ／ｍＬまでさらに濃縮した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を用いた質量分析法によりセレン置換を確認した。
【００７４】
実施例８．結晶化及びＸ線データ収集
ＳｅＭｅｔ標識ＧＣＹＨ−ＩＢを、酵素（５０ｍＭのトリス酢酸、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＢＭＥ、ｐＨ８．０のなかの９ｍｇ／ｍＬ）、ポリエチレングリコール６０００（１０〜１６％）、ＬｉＣｌ（１〜１．４Ｍ）、トリス（５０ｍＭ、ｐＨ９．０）及びトリス塩酸（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）を含有する２μＬのシッティングドロップでの蒸気拡散により、２０℃で結晶化した。同様の条件だが、金属フリー試薬（Chelex-100前処理Milli-Q水及びHampton, Inc.からの超純粋試薬）を用い、結晶化前にタンパク質溶液に１〜１０ｍＭのＭｎＣｌ２及び１２ｍＭのナトリウムアジド（防腐剤として）を添加して、Ｍｎ再構成酵素（５０ｍＭのトリス塩酸、５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０のなかの１０ｍｇ／ｍＬ）を結晶化した。
【００７５】
母液にエチレングリコール（２５％）を加えた中に結晶を凍結保護し、液体窒素で瞬間冷却した。ＳｅＭｅｔ標識酵素については、Advanced Light Source（ＡＬＳ, Berkeley, CA）ビームライン８．２．２で三波長のセレンデータセットを収集した。ＧＣＹＨ−ＩＢ・Ｍｎ２＋複合体については、結晶を金属フリー貯蔵溶液中に１時間にわたり再び浸漬した後、凍結保護し、Stanford Synchrotron Radiation Laboratory（ＳＳＲＬ、Stanford, CA）ビームライン７−１で単結晶から単一波長のデータセットを収集した。Ｘ線データはHKL2000で処理した。Otwinowski, Z. & Minor, W. 276 Methods Enzymol., 307-326 (1997)。
【００７６】
実施例９．構造決定
異常散乱体としてセレンを使用する多波長異常分散（ＭＡＤ）法により、Ｎｇ−ＧＣＹＨ−ＩＢの結晶構造を決定した。１５個のセレン部位からなる重原子の初期下部構造を、Phenix-hyssプログラムを使用して同定した。Adams et al., 11 J. Synchrotron Rad. 53-55 (2004)。次に、ＳＨＡＲＰ最尤プログラム（Maximum-likelihood heavy atom parameter refinement in the MIR and MAD methods, METHODS IN ENZYMOLOGY所収（de La Fortelle & Bricogne, eds., Acad. Press, San Diego, CA, 1997））で重原子位置、占有率、及び原子転位パラメータを精密化し、全てのＳｅ部位を使用して初期位相を計算した。分解能範囲が５０Å〜２．２Å及び溶媒含量が４７％のデータを使用して、ＣＣＰ４スイート（Collaborative Computational Proj., N.4, D50 Acta Crystallographica 760-63 (1994)）のＤＭ（Cowtan, 31 Joint CCP4 & ESF-EACBM Newslett. Protein Crystallography, 34-38 (1994)）、及びＳＯＬＯＭＯＮ（Abrahams & Leslie, 52 Acta Crystallographica 30-42 (1996)）による密度改良で位相を改善した。
【００７７】
溶媒平滑化により平均フィギュア・オブ・メリットが０．３４から０．８５に上昇した。２．２ÅのＦｏＦＯＭマップを計算してＡＲＰ／ｗＡＲＰで自動的にトレースしたところ（Perrakis et al., 6 Nature Structural Bio. 458-63 (1999)）、非対称ユニットにおける５１４個の残基のうち４１８個が作成された。モデルを手動で完成させ、２回非結晶学的対称性（ＮＣＳ）の関係を利用してＣＯＯＴで部分的に作成し直した（Emsley & Cowtan, D60 Acta Crystallographica 2126-32 (2004)）。続いてPhenix-refineにより（Adams et al., 11 J. Synchr. Radiat., 53-55 (2004)）、ＮＣＳ制約及び単量体当たり３個のドメインを含むTwin Lattice Symmetryパラメータ化を用いて結晶学的な精密化を行った。（モデルの無秩序な部分に等方性温度因子群（Isotropic B-group）の拘束条件を適用した）。最後に、Phenixでｆ’及びｆ”を精密化すると、ピーク波長、変曲波長、及び遠隔波長の最終的な値は、それぞれ−６．４及び５．６、−５．４及び４．９、並びに−５．６及び３．５となった。溶媒分子及びイオンを加え、ＮＣＳ制約を外した後にCrystallography and NMR Systems（ＣＮＳ、Adams et al., 8(5) Curr. Opin. Struct. Biol. 606-11 (1998)）で構造をさらに精密化し、Procheckソフトウェアを使用して確認した。Vaguine et al., 55 Acta Crystallographica D, 191-205 (1999)。単量体Ａの残基１４６〜１６０及び１８８〜２１０の電子密度は、精密化後の温度因子（B-factor）＞６０Åと弱かったが、これは、この領域が無秩序化していることを示す。
【００７８】
Ｚｎ２＋メタル化酵素の結晶構造に基づくタンパク質モデルを使用して位相を計算する直接的な差フーリエ計算により、ＧＣＹＨ−ＩＢ・Ｍｎ２＋複合体の結晶構造を決定した。構造は、ＣＮＳで精密化し、次にＮＣＳ制約及び溶媒平滑化を適用しながら、ＣＣＰ４のプログラムrefmacで精密化した（Michalopoulos, et al. 32 Nucl. Acids Res., 251-54 (2004)）剛体模型であった。２回目のrefmac実行ではＮＣＳ制約は外した。リガンド及び溶媒分子をＣｏｏｔでモデル化し（Emsley & Cowtan, 60 Acta Crystallogr. Biol. Crystallogr. D, 2126-32 (2004)）、refmacで最終精密化を行った。
【００７９】
【表７】
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【００８０】
【表８】
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【００８１】
【表９】
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【００８２】
実施例１０．ＧＣＹＨ−ＩＢの金属依存性
酵素活性アッセイ：化学物質は全て、Sigma又はFisherからの分析用の金属フリー級であった。全ての溶液をMilli-Q水（１８．２ＭΩ）で調製し、Chelex-100（BioRad）で処理することにより混入金属を除去した。ガラス器具は硝酸（１０％）、次にＥＤＴＡ（５ｍＭ）に浸漬し、使用前にChelexで処理したMilli-Q水で十分にすすぎ流した。様々な濃度の金属又はＥＤＴＡ（５ｍＭ）のいずれか、及び０．１ｍＭのＧＴＰを使用して、既述のとおり（El Yacoubi et al, 2006）活性アッセイを行った。
【００８３】
アポ酵素調製物：精製した組換えタンパク質（０．５ｍｌ）をＥＤＴＡ（５ｍＭ、１時間、２１℃）と共にインキュベートし、続いて、トリス塩酸（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）、ＫＣｌ（５０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（５ｍＭ）及び数グラムのChelex-100の４リットルの溶液に対して３回透析することによって、枯草菌（B. subtilis）及び淋菌（N. gonorrhoeae）ＧＣＹＨ−ＩＢから金属イオンを除去した。得られたアポ酵素は、活性アッセイ前に、トリス塩酸（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）、ＫＣｌ（５０ｍＭ）、及びChelex-100の３Ｌに対して３回透析してＥＤＴＡを除去し、Chelex-100樹脂（３ｍｌ樹脂に対して５ｍｌタンパク質溶液）に通した。タンパク質濃度を分光測定によって決定した。
【００８４】
金属活性化研究：枯草菌（B. subtilis）アポ酵素（２μＭ）を、様々な濃度（０．１μＭ〜４ｍＭ）の金属塩化物（ＭｎＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＮｉＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＣｄＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＣｕＣｌ２、ＣｏＣｌ３、ＦｅＣｌ３）又はＦｅ（ＳＯ４）と共に、標準緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＫＣｌ）中、３７℃で１０分間インキュベートし、上記のとおり活性をアッセイした。Ｆｅ２＋の関わる全てのアッセイは、脱気及びＮ２パージした緩衝液を有する嫌気性チャンバで行った。
【００８５】
淋菌（N. gonorrhoeae）ＧＣＹＨ−ＩＢのＭｎとの再構成：アポ酵素を、２〜７モル当量のＭｎＣｌ２の存在下で、２ｍＭのＤＴＴを含有する標準緩衝液中において２５℃で６０分間インキュベートした。トリス塩酸（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）、ＫＣｌ（５０ｍＭ）及びＤＴＴ（１ｍＭ）に対する４℃で４時間の２回の透析、Sephadex G-25カラムでのろ過、又はAmicon超遠心機における緩衝液での広範囲な洗浄のいずれかにより、結合の弱い金属を除去した。酵素は上記のとおり活性についてアッセイし、ＩＣＰ−ＭＳにより金属含量を分析した。
【００８６】
実施例１１．ＧＣＹＨ−ＩＢの亜鉛依存性調節
バイオインフォマティクス：ＳＥＥＤアノテーション環境を用いてｆｏｌＥ／ｆｏｌＥ２遺伝子分布の解析を実施した。結果は、http://theseed.uchicago.edu/FIG/index.cgi.の「Folate biosynthesis」サブシステムにおいて利用可能となっている。Genome Explorerソフトウェア（Mironov et al., 2000)を使用して、プロテオバクテリア及びファーミキューテスにおける既知のＺｕｒ結合部位の２つの異なるセットからなるトレーニングセットを用いて構築した２つのＰＷＭで細菌ゲノムをスキャンすることにより、候補Ｚｕｒ結合部位を同定した。Panina et al., 100 Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 9912-17 (2003)。
【００８７】
枯草菌（B. subtilis）株の構築及び増殖条件：全ての株は枯草菌（B. subtilis）１６８  ｔｒｐｃ２ａｔｔＳＰβ野生型株のＣＵ１０６５に由来し、ＬＢで増殖させた。Bioscreen CMBRシステムを用い、２４時間にわたり１０分ごとにＯＤ６００を測定して増殖曲線をとった。抗生物質を含む一晩培養液を使用して前培養を開始し、これは対数期中期に、１００ウェルハニカムマイクロタイタープレートの容量２００μｌにおいて正規化したＯＤ６００が０．０１となるまで希釈し、その時点で増殖曲線を開始した。培養液は２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。選択のため、以下の濃度で抗生物質を添加した：エリスロマイシン（１μｇ／ｍｌ）及びリンコマイシン（２５μｇ／ｍｌ）（マクロライド−リンコサミド−ストレプトグラミンＢ耐性についての選択用）、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）。
【００８８】
既に記載されているとおり（Butcher & Helmann, 2006）ロング−フランキング−ホモロジーポリメラーゼ連鎖反応（ＬＦＨ−ＰＣＲ）を使用して、ｆｏｌＥ、ｆｏｌＥ２及びｚｕｒについての突然変異体を構築した。ＬＦＨ−ＰＣＲ及び染色体ＤＮＡ形質転換を使用して様々な組み合わせのＧＣＹＨ−Ｉ酵素を発現する株を産生した。具体的には、株ＨＢ６７８８（ＣＵ１０６５  ｆｏｌＥ：：ｍｌｓ）はＧＣＹＨ−ＩＡをもたず、一方そのＧＣＹＨ−ＩＢは抑制されているが、その遺伝子はなお存在する（ΔｆｏｌＥと表記される）。この株を使用して他の株を構築した。株ＨＢ６７９１（ＣＵ１０６５  ｆｏｌＥ：：ｍｌｓ  ｚｕｒ：：ｋａｎ）はＧＣＹＨ−ＩＢのみを発現する（ΔｆｏｌＥ  Δｚｕｒと表記される）。株ＨＢ６８５２（ＣＵ１０６５  ｆｏｌＥ：：ｍｌｓ  ｚｕｒ：：ｋａｎ  ｆｏｌＥ２：：ｓｐｃ）にはいずれのＧＣＹＨ−Ｉアイソザイムもない（ΔｆｏｌＥ  Δｚｕｒ  ΔｆｏｌＥ２と表記される）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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