(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベータ−ラクタマーゼの存在を検出するための方法であって、
（ａ）ｉ．検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と第１の細菌試料を接触させ、かつ
ｉｉ．検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびに基質特異性拡張型ベータ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）および元の基質特異性のベータ−ラクタマーゼ（ＯＳＢＬ）を阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と第２の細菌試料を接触させるステップであって、前記第１の細菌試料および前記第２の細菌試料は、同じ供給源由来である、ステップと、
（ｂ）前記第１の組成物および前記第２の組成物における基質の利用を検出するステップと
を含み、前記基質が前記第１の組成物および前記第２の組成物において利用された場合、ベータ−ラクタマーゼは検出され、前記ベータ−ラクタマーゼは、クラスＡセリンカルバペネマーゼまたはメタロ−ベータ−ラクタマーゼであることを特徴とする方法。
【請求項２】
ベータ−ラクタマーゼの存在を検出するための方法であって、
（ａ）ｉ．検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と第１の細菌試料を接触させ、
ｉｉ．検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と第２の細菌試料を接触させ、かつ
ｉｉｉ．検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤、ならびに金属キレート剤を含む第３の組成物と第３の細菌試料を接触させるステップであって、前記第１の細菌試料、前記第２の細菌試料、および前記第３の細菌試料は、同じ供給源由来である、ステップと、
（ｂ）前記第１の組成物、前記第２の組成物、および前記第３の組成物における基質の利用を検出するステップとを含み、
ｉ．前記第１の組成物、前記第２の組成物、および前記第３の組成物における基質が利用された場合、クラスＡセリンカルバペネマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出され、
ｉｉ．前記第１の組成物および前記第２の組成物における基質は利用されたが、前記第３の組成物における基質は利用されなかった場合、メタロ−ベータ−ラクタマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出されることを特徴とする方法。
【請求項３】
ベータ−ラクタマーゼを検出するための方法であって、
（ａ）ｉ．検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と第１の細菌試料を接触させ、
ｉｉ．検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と第２の細菌試料を接触させ、
ｉｉｉ．検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤、ならびに金属キレート剤を含む第３の組成物と第３の細菌試料を接触させ、かつ
ｉｖ．検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第４の組成物と第４の細菌試料を接触させるステップであって、前記第１の細菌試料、前記第２の細菌試料、前記第３の細菌試料、および前記第４の細菌試料は、同じ供給源由来である、ステップと、
（ｂ）前記第１の組成物、前記第２の組成物、前記第３の組成物、および前記第４の組成物における基質の利用を検出するステップとを含み、
ｉ．前記第１の組成物、前記第２の組成物、前記第３の組成物、および前記第４の組成物における基質が利用された場合、クラスＡセリンカルバペネマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出され、
ｉｉ．前記第１の組成物、前記第２の組成物、および前記第４の組成物における基質は利用されたが、前記第３の組成物における基質は利用されなかった場合、メタロ−ベータ−ラクタマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出され、
ｉｉｉ．前記第４の組成物における基質は利用されたが、前記第１の組成物、前記第２の組成物、および前記第３の組成物における基質は利用されなかった場合、ＡｍｐＣであるベータ−ラクタマーゼが検出されることを特徴とする方法。
【請求項４】
ベータ−ラクタマーゼの存在を検出するための方法であって、
（ａ）ｉ．検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と第１の細菌試料を接触させ、
ｉｉ．検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量のセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と第２の細菌試料を、
ｉｉｉ．検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、クラスＡセリンカルバペネマーゼではなくＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤、ならびに金属キレート剤を含む第３の組成物と第３の細菌試料を接触させ、
ｉｖ．検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第４の組成物と第４の細菌試料を接触させ、かつ
ｖ．検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＥＳＢＬ阻害剤を含む第５の組成物と第５の細菌試料を接触させるステップであって、前記第１の細菌試料、前記第２の細菌試料、前記第３の細菌試料、前記第４の細菌試料、および前記第５の細菌試料は、同じ供給源由来である、ステップと、
（ｂ）前記第１の組成物、前記第２の組成物、前記第３の組成物、前記第４の組成物、および前記第５の組成物における基質の利用を検出するステップと
を含み、
ｉ．前記第１の組成物における基質は利用されたが、前記第２の組成物、前記第３の組成物、前記第４の組成物、および前記第５の組成物における基質は利用されなかった場合、ＥＳＢＬであるベータ−ラクタマーゼが検出され、
ｉｉ．前記第４の組成物における基質は利用されたが、前記第１の組成物、前記第２の組成物、および前記第３の組成物における基質は利用されなかった場合、ＡｍｐＣであるベータ−ラクタマーゼが検出され、
ｉｉｉ．前記第１の組成物、前記第２の組成物、および前記第４の組成物における基質は利用されたが、前記第３の組成物における基質は利用されなかった場合、メタロ−ベータ−ラクタマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出され、
ｉｖ．前記第１の組成物、前記第２の組成物、前記第３の組成物、および前記第４の組成物における基質が利用された場合、クラスＡセリンカルバペネマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出されることを特徴とする方法。
【請求項５】
前記セリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤は、クラブラン酸、タゾバクタム、スルバクタム、またはそれらの塩形態であることを特徴とする請求項１、２、３、または４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記セリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤は、クラブラン酸またはその塩形態であることを特徴とする請求項１、２、３、または４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないクラブラン酸の量は、約０．０１ｍＭから約１００ｍＭであり、ここで、前記「約」とは修飾されている値のせいぜい２０％まで、上回る、または下回る値をいう、ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＡｍｐＣ阻害剤は、ｓｙｎ２１９０であることを特徴とする請求項１、２、３、または４のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ＡｍｐＣ阻害剤は、ボロン酸またはその誘導体であることを特徴とする請求項１、２、３、または４のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ＡｍｐＣ阻害剤は、クロキサシリンまたはその塩形態であることを特徴とする請求項１、２、３、または４のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
クロキサシリンは、約０．０１ｍＭから約１００ｍＭの濃度で存在し、ここで、前記「約」とは修飾されている値のせいぜい２０％まで、上回る、または下回る値をいう、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＥＳＢＬ阻害剤は、セフォタキシム、セフタジジム、またはそれらの塩形態であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記金属キレート剤は、ジピコリン酸（ＤＰＣ）、ジエチルジチオカルバメート（ＤＥＤＴＣ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラキス−（２−ピリジルメチル）−エチレンジアミン（ＴＰＥＮ）、ＥＤＴＡ、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）、または１，１０−フェナントロリンであることを特徴とする請求項２、３、または４のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記検出可能な基質は、ＰＡＤＡＣ（商標）、ＣＥＮＴＡ（商標）、またはＨＭＲＺ−８６であることを特徴とする請求項１、２、３、または４のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質は、ニトロセフィンであることを特徴とする請求項１、２、３、または４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ニトロセフィンは、約１μＭから約１ｍＭの濃度で存在し、ここで、前記「約」とは修飾されている値のせいぜい２０％まで、上回る、または下回る値をいうことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記基質の利用は、前記細菌試料と前記組成物を接触させた後の、約２分から約５時間以内に検出され、ここで、前記「約」とは修飾されている値のせいぜい２０％まで、上回る、または下回る値をいうことを特徴とする請求項１、２、３、または４のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記基質の利用は、前記細菌試料と前記組成物を接触させた後の、約２分から約１時間以内に検出され、ここで、前記「約」とは修飾されている値のせいぜい２０％まで、上回る、または下回る値をいうことを特徴とする請求項１、２、３、または４のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記基質の利用は、前記細菌試料と前記組成物を接触させた後の、約２分から約１０分以内に検出され、ここで、前記「約」とは修飾されている値のせいぜい２０％まで、上回る、または下回る値をいうことを特徴とする請求項１、２、３、または４のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記基質の利用は、前記組成物のスペクトル変化または蛍光変化を評価することによって検出されることを特徴とする請求項１、２、３、または４のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記細菌試料は、細菌感染症を有することが疑われるヒトから得られることを特徴とする請求項１、２、３、または４のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
各組成物は、溶解試薬を含むことを特徴とする請求項１、２、３、または４のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
各組成物は、溶解試薬および溶解試薬の安定化を促進する作用物質を含むことを特徴とする請求項１、２、３、または４のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
各組成物は、溶解試薬、溶解試薬の安定化を促進する作用物質、および溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質を含むことを特徴とする請求項１、２、３、または４のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
各組成物は、リゾチームおよびトレハロースを含むことを特徴とする請求項１、２、３、または４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
各組成物は、リゾチーム、トレハロース、およびＥＤＴＡを含むことを特徴とする請求項１、２、３、または４のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
各組成物は、異なる固体支持体上または固体支持体中で乾燥して、存在することを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
各組成物は、異なる固体支持体上または固体支持体中で乾燥して、存在することを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ベータ−ラクタマーゼの存在を検出するためのキットであって、１つまたは複数の容器中に、
（ａ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と、
（ｂ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物とを含むことを特徴とするキット。
【請求項３０】
検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤、ならびに金属キレート剤を含む第３の組成物をさらに含むことを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第４の組成物をさらに含むことを特徴とする請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第３の組成物をさらに含むことを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３３】
検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＥＳＢＬ阻害剤を含む第３の組成物をさらに含むことを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３４】
検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＥＳＢＬ阻害剤を含む第５の組成物をさらに含むことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
【請求項３５】
前記検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質は、ニトロセフィン、ＰＡＤＡＣ（商標）、ＣＥＮＴＡ（商標）、またはＨＭＴＺ−８６であることを特徴とする請求項２９、３０、３１、３２、３３、または３４のいずれかに記載のキット。
【請求項３６】
前記ＡｍｐＣ阻害剤は、クロキサシリン、クロキサシリンの塩形態、ｓｙｎ２１９０、ボロン酸、またはボロン酸誘導体であることを特徴とする請求項２９、３０、３１、３２、３３、または３４のいずれかに記載のキット。
【請求項３７】
前記セリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤は、クラブラン酸、タゾバクタム、スルバクタム、またはその塩形態であることを特徴とする請求項２９、３０、３１、３２、３３、または３４のいずれかに記載のキット。
【請求項３８】
前記ＥＳＢＬ阻害剤は、セフォタキシム、セフタジジム、またはそれらの塩形態であることを特徴とする請求項３３または３４に記載のキット。
【請求項３９】
前記金属キレート剤は、ＤＰＣ、ＤＥＤＴＣ、ＴＰＥＮ、ＥＤＴＡ、ＤＭＰＳ、または１，１０−フェナントロリンであることを特徴とする請求項３０、３１、または３４のいずれかに記載のキット。
【請求項４０】
各組成物は、溶解試薬を含むことを特徴とする請求項２９、３０、３１、３２、３３、または３４のいずれかに記載のキット。
【請求項４１】
各組成物は、溶解試薬および溶解試薬の安定化を促進する作用物質を含むことを特徴とする請求項２９、３０、３１、３２、３３、または３４のいずれかに記載のキット。
【請求項４２】
各組成物は、溶解試薬、溶解試薬の安定化を促進する作用物質、および溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質を含むことを特徴とする請求項２９、３０、３１、３２、３３、または３４のいずれかに記載のキット。
【請求項４３】
各組成物は、リゾチームおよびトレハロースを含むことを特徴とする請求項２９、３０、３１、３２、３３、または３４のいずれかに記載のキット。
【請求項４４】
各組成物は、リゾチーム、トレハロース、およびＥＤＴＡを含むことを特徴とする請求項２９、３０、３１、３２、３３、または３４のいずれかに記載のキット。
【請求項４５】
各組成物は、異なる固体支持体上または固体支持体中で乾燥して、存在することを特徴とする請求項２９、３０、３１、３２、３３、または３４のいずれかに記載のキット。
【請求項４６】
各組成物は、異なる固体支持体上または固体支持体中で乾燥して、存在することを特徴とする請求項４０に記載のキット。
【請求項４７】
各組成物は、異なる固体支持体上または固体支持体中で乾燥して、存在することを特徴とする請求項４１に記載のキット。
【請求項４８】
各組成物は、異なる固体支持体上または固体支持体中で乾燥して、存在することを特徴とする請求項４２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００７年１０月１９日に出願された米国特許仮出願第６０／９８１，１５６号明細書に対する米国特許法第１１９条（ｅ）の下の優先権を主張する。
【０００２】
クラスＡセリンカルバペネマーゼ、メタロ−ベータ−ラクタマーゼ、ＡｍｐＣベータ−ラクタマーゼ、および基質特異性拡張型ベータ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）を含む、特異的なベータ−ラクタマーゼの検出のための方法および組成物が本明細書に提示される。本明細書に提示される方法は、わずか２から１０分以内で、細菌試料における特異的なベータ−ラクタマーゼの存在の検出を可能にする方法を含む。
【背景技術】
【０００３】
ベータ−ラクタマーゼは、ベータ−ラクタム抗生物質薬のベータ−ラクタム環などのベータ−ラクタム環を加水分解する酵素のファミリーである。ベータ−ラクタマーゼは、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌において見つけられており、多くの細菌株の抗生物質耐性を担う。
【０００４】
ベータ−ラクタマーゼは、それらの一次構造に基づいて、４つの分子クラス、すなわちクラスＡからＤに分類することができる。クラスＡ、Ｃ、およびＤは、それらの活性部位にセリン残基を有し、クラスＢまたはメタロ−ベータ−ラクタマーゼは、それらの活性部位に亜鉛を有する。カルバペネマーゼは、クラスＡ、Ｂ、およびＤに属する酵素を含む、ベータ−ラクタマーゼの多様なグループである。クラスＡカルバペネマーゼは、ＫＰＣ−１、ＫＰＣ−２、ＫＰＣ−３、およびＫＰＣ−４を含む。クラスＢカルバペネマーゼは、ＩＭＰファミリー、ＶＩＭファミリー、ＧＩＭ−１、およびＳＰＭ−１ならびに他のものを含む。クラスＤカルバペネマーゼは、ＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−２４、ＯＸＡ−２５、ＯＸＡ−２６、ＯＸＡ−２７、ＯＸＡ−４０、およびＯＸＡ−４０ならびに他のものを含む。ＡｍｐＣベータ−ラクタマーゼは、クラスＣの酵素であり、染色体遺伝子によってコードすることができる、またはプラスミド由来のものとすることができる。ＡｍｐＣベータ−ラクタマーゼは、広域性セファロスポリンおよび広域スペクトルセファロスポリン（つまりセファマイシンおよびオキシイミノ−ベータ−ラクタム）を加水分解する。基質特異性拡張型ベータ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）は、オキシイミノ鎖を有するセファロスポリンを加水分解するベータ−ラクタマーゼである。ＥＳＢＬは、ＴＥＭファミリー、ＳＨＶファミリー、および他のものならびにＣＴＸ−Ｍファミリーを含み、これらは、クラスＡの酵素である。元の基質特異性のベータ−ラクタマーゼ（ＯＳＢＬ）は、クラスＡの酵素を含む。
【０００５】
細菌の間のベータ−ラクタマーゼの広がりは、ベータ−ラクタム薬剤に対する細菌の耐性を増加させてきた。それらの薬剤に対して耐性の細菌を有する患者へのベータ−ラクタム薬剤の投与は、それらの細菌を選択し、ベータ−ラクタマーゼの伝達の増加に至る。したがって、適切な治療計画が所与の患者に選択され、耐性の細菌の広がりの可能性が低下するように、特異的なベータ−ラクタマーゼを発現する細菌を迅速に検出する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，９２２，５９３号明細書
【特許文献２】米国意匠特許第４２１，４９８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，０９６，２７２号明細書
【特許文献４】米国特許第６，３７２，４８５号明細書
【特許文献５】米国特許第７，１１５，３８４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一態様において、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびある種のベータ−ラクタマーゼ阻害剤を使用する、特定のベータ−ラクタマーゼの迅速な検出のための方法が本明細書に提示される。例えば、セリンカルバペネマーゼ、メタロ−ベータ−ラクタマーゼ、ＡｍｐＣ、および基質特異性拡張型ベータ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）の迅速な検出のための方法が本明細書に提示される。本明細書に提示されるいくつかの方法は、細菌細胞抽出物の作製を必要とせず、本明細書に提示されるいくつかの方法は、少量の細菌試料を必要とするのみである（例えば１０10ＣＦＵ未満または１０8ＣＦＵ未満の細菌）。さらに、本明細書に提示される方法は、わずか２から１０分以内で、細菌試料におけるそのようなベータ−ラクタマーゼの存在の検出を可能にする。ベータ−ラクタマーゼの存在の検出により、細菌感染症を有する患者に、適切な治療計画の選択のための情報を提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書に提示される方法は、（ａ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質（例えばニトロセフィン）および１つまたは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む異なる組成物と、同じ供給源からの２つ以上の細菌試料を接触させるステップと、（ｂ）組成物における基質の利用を検出するステップとを含むことができ、組成物における基質の利用は、１つまたは複数の阻害剤の存在により、細菌供給源において存在する（１つまたは複数の）ベータ−ラクタマーゼが阻害されるかどうかを示す。異なる組成物の結果によって、細菌供給源におけるある種のベータ−ラクタマーゼの存在を決定することができ、他のベータ−ラクタマーゼの存在を除外することができる。検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数のベータラクタマーゼ阻害剤を含む異なる組成物は、同じ供給源からの細菌試料と同時にまたは順次、接触させることができる。組成物は、細菌試料との組成物の接触に続く基質利用の検出に適用可能な任意のタイプの携帯容器またはデバイスにおいて提供することができる。例えば、組成物は、寒天プレート、ペーパーディスク、ペーパーストリップ中に埋め込まれた液体組成物の形態で、またはウェルもしくはチューブ中の乾燥形態で提供することができる。特定の実施形態において、１つまたは複数の組成物中に含まれるベータ−ラクタマーゼ阻害剤は、セリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤、ＡｍｐＣ阻害剤、金属キレート剤、および／またはＥＳＢＬ阻害剤である。
【０００９】
本明細書に提示される方法および組成物は、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤の特定の濃度が、驚くべき予測不可能な方法で、異なるベータ−ラクタマーゼに対するその阻害能力に影響を与えることができるという発見に部分的に基づく。例えば、ある濃度のクラブラン酸は、クラスＡセリンカルバペネマーゼではなく、ＥＳＢＬおよび元の基質特異性のベータ−ラクタマーゼ（ＯＳＢＬ）を阻害する。発明者らは、例えば、細菌試料におけるクラスＡセリンカルバペネマーゼの存在を、ある濃度のクラブラン酸を使用することによって、細菌試料におけるＥＳＢＬおよびＯＳＢＬの存在と区別することができることを発見した。発明者らはまた、ある濃度のクロキサシリン阻害剤が、クラスＡベータ−ラクタマーゼおよびクラスＣベータ−ラクタマーゼを阻害することも発見した。
【００１０】
一実施形態において、ベータ−ラクタマーゼの存在を検出するための方法であって、（ａ）（ｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と第１の細菌試料を接触させ、かつ（ｉｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにクラスＡセリンカルバペネマーゼではなくＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量のセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と第２の細菌試料を接触させるステップであって、第１の細菌試料および第２の細菌試料は、同じ供給源由来である、ステップと、（ｂ）第１の組成物および第２の組成物における基質の利用を検出するステップとを含み、基質が第１の組成物および第２の組成物において利用された場合、クラスＡセリンカルバペネマーゼまたはメタロ−ベータ−ラクタマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出されるとする方法が本明細書に提示される。
【００１１】
セリンカルバペネマーゼおよびメタロベータ−ラクタマーゼの存在を区別するために、第１の細菌試料および第２の細菌試料と同じ供給源からの第３の細菌試料は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤、ならびに金属キレート剤を含む第３の組成物と接触させることができ、第３の組成物における基質の利用が検出される。第１の組成物および第２の組成物のみならず、第３の組成物における基質利用も検出される場合、クラスＡセリンカルバペネマーゼの存在が、細菌供給源において検出される。その一方で、第３の組成物において検出される基質利用はないが、第１の組成物および第２の組成物において検出される基質利用がある場合、メタロ−ベータ−ラクタマーゼの存在が、細菌供給源において検出される。基質利用が第３の組成物において検出されないが、第１の組成物および第２の組成物における基質利用が検出される場合、クラスＡセリンカルバペネマーゼの存在は、除外することができる。
【００１２】
他の実施形態において、ベータ−ラクタマーゼを検出するための方法であって、（ａ）（ｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を含む第１の組成物と第１の細菌試料を接触させ、かつ（ｉｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および金属キレート剤を含む第２の組成物と第２の細菌試料を接触させるステップであって、第１の細菌試料および第２の細菌試料は、同じ供給源由来である、ステップと、（ｂ）第１の組成物および第２の組成物における基質の利用を検出するステップとを含み、（ｉ）第１の組成物および第２の組成物における基質が利用された場合、メタロ−ベータ−ラクタマーゼ以外のベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｉ）第１の組成物における基質は利用されたが、第２の組成物における基質は利用されなかった場合、メタローベータ−ラクタマーゼであるベータ−ラクタマーゼガ検出される方法、が本明細書に提示される。さらに、第１の組成物による基質利用が検出されなければ、細菌供給源において存在するベータ−ラクタマーゼがないことを示す。
【００１３】
他の実施形態において、ベータ−ラクタマーゼを検出するための方法であって、（ａ）（ｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と第１の細菌試料を接触させ、（ｉｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と第２の細菌試料を接触させ、（ｉｉｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤、ならびに金属キレート剤を含む第３の組成物と第３の細菌試料を接触させ、かつ（ｉｖ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第４の組成物と第４の細菌試料を接触させるステップであって、第１の細菌試料、第２の細菌試料、第３の細菌試料、および第４の細菌試料は、同じ供給源由来である、ステップと、（ｂ）第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物、および第４の組成物における基質の利用を検出するステップとを含み、（ｉ）第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物、および第４の組成物における基質が利用された場合、クラスＡセリンカルバペネマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｉ）第１の組成物、第２の組成物、および第４の組成物における基質は利用されたが、第３の組成物における基質は利用されなかった場合、メタロ−ベータ−ラクタマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｉｉ）第４の組成物における基質は利用されたが、第１の組成物、第２の組成物、および第３の組成物における基質は利用されなかった場合、ＡｍｐＣベータ−ラクタマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出される方法、が本明細書に提示される。さらに、第１の組成物、第２の組成物、および第４の組成物における基質利用は検出されるが、第３の組成物における基質利用が検出されなければ、クラスＡセリンカルバペネマーゼが細菌供給源中に存在しないことを示す。さらに、第４の組成物における基質利用は検出されるが、第１の組成物、第２の組成物、および第３の組成物における基質利用が検出されなければ、クラスＡセリンカルバペネマーゼ、メタロ−ベータ−ラクタマーゼ、およびＥＳＢＬが細菌供給源中に存在しないことを示す。
【００１４】
他の実施形態において、ベータ−ラクタマーゼの存在を検出するための方法であって、（ａ）（ｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と第１の細菌試料を接触させ、（ｉｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と第２の細菌試料を接触させ、（ｉｉｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤、ならびに金属キレート剤を含む第３の組成物と第３の細菌試料を接触させ、（ｉｖ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第４の組成物と第４の細菌試料を接触させ、かつ（ｖ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＥＳＢＬ阻害剤を含む第５の組成物と第５の細菌試料を接触させるステップであって、第１の細菌試料、第２の細菌試料、第３の細菌試料、第４の細菌試料、および第５の細菌試料は、同じ供給源由来である、ステップと、（ｂ）第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物、第４の組成物、および第５の組成物における基質の利用を検出するステップとを含み、（ｉ）第１の組成物における基質は利用されたが、第２の組成物、第３の組成物、第４の組成物、および第５の組成物における基質は利用されなかった場合、ＥＳＢＬであるベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｉ）第４の組成物における基質は利用されたが、第１の組成物、第２の組成物、および第３の組成物における基質は利用されなかった場合、ＡｍｐＣベータ−ラクタマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｉｉ）第１の組成物、第２の組成物、および第４の組成物における基質は利用されたが、第３の組成物における基質は利用されなかった場合、メタロ−ベータ−ラクタマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｖ）第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物、および第４の組成物における基質が利用された場合、クラスＡセリンカルバペネマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出される方法、が本明細書に提示される。さらに、第１の組成物における基質利用は検出されるが、第２の組成物、第３の組成物、第４の組成物、および第５の組成物の基質利用が検出されなければ、クラスＡセリンカルバペネマーゼ、メタロ−ベータ−ラクタマーゼ、およびＡｍｐＣベータ−ラクタマーゼが細菌供給源中に存在しないことを示す。さらに、第１の組成物、第２の組成物、および第４の組成物における基質利用は検出されるが、第３の組成物における基質利用が検出されなければ、クラスＡセリンカルバペネマーゼが細菌供給源中に存在しないことを示す。さらに、第４の組成物における基質利用は検出されるが、第１の組成物、第２の組成物、および第３の組成物における基質利用が検出されなければ、クラスＡセリンカルバペネマーゼ、メタロ−ベータ−ラクタマーゼ、およびＥＳＢＬが細菌供給源中に存在しないことを示す。
【００１５】
ある実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、溶解試薬を含む。溶解試薬（例えば緩衝液中の溶解試薬）は、当業者に知られている。特定の実施形態において、溶解試薬は、細菌細胞を溶解するまたはその溶解を促進するが、ベータ−ラクタマーゼ基質の加水分解または１つもしくは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤の活性またはその両方に干渉しない。一実施形態において、溶解試薬は、細菌細胞の溶解を促進する酵素または他の作用物質である。そのような酵素の非限定的な例は、リゾチーム、ラビアーゼ、リソスタフィン、アクロモペプチダーゼ、およびムタノリシンを含む。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、リゾチームを含む。
【００１６】
ある実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、溶解試薬および溶解試薬の安定化を促進する作用物質を含む。一実施形態において、溶解試薬の安定化を促進する作用物質は、熱安定性である。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、溶解試薬および炭水化物、例えば単糖、二糖、多糖、オリゴ糖、またはポリオールを含む。炭水化物の特定の例は、マンニトール、リボース、グルコース、フルクトース、マンノース、スクロース、ラクトース、グリセロール、キサンタンガム、トレハロース、およびグリコール（例えばプロピレングリコール）を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、リゾチームおよびトレハロースを含む。
【００１７】
ある実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、溶解試薬、溶解試薬の安定化を促進する作用物質、およびさらなる作用物質、例えば、溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質（例えば金属キレート剤）を含む。特定の実施形態において、さらなる作用物質は、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡである。特定の実施形態において、メタロ−ベータ−ラクタマーゼが検出されるまたは検出され得る場合、ＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡまたはその両方は、利用されない。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、リゾチーム、トレハロース、およびＥＤＴＡを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、液体組成物、寒天プレート、ペーパーストリップ、ペーパーディスク、タブレット、ウェル中の乾燥形態、または１つもしくは複数のチューブ、例えばチューブのアレイ中の乾燥形態をしている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、プレート、トレイ、カセット、もしくはパネルのウェル、ペーパーストリップ、ペーパーディスク、またはチューブ（例えば試験管もしくはＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ）などの固体支持体上または固体支持体中で乾燥して、存在する。ある実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、パネル、カセット、トレイ、またはプレート（例えばマイクロタイマープレート）のウェル中で乾燥して、存在する。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）  Ｐａｎｅｌ（ＢＤ、ＵＳＡ）のウェルまたはＢＢＬ（商標）  Ｃｒｙｓｔａｌ（商標）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ、ＵＤＡ）からのパネルのウェル中で乾燥して、存在する。他の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、Ｖｉｔｅｋ（登録商標）  ｃａｒｄ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ＵＳＡ）のウェル中で乾燥して、存在する。他の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、ＭｉｃｒｏＳｃａｎ  ｐａｎｅｌ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ、ＵＳＡ）のウェル中で乾燥して、存在する。他の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、ＡＰＩ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｓｔ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ＵＳＡ）のチューブ中で乾燥して、存在する。他の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、Ｒｅｍｅｌ  ＲａｐＩＤ（商標）  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｅｍｅｌ、ＵＳＡ）のパネルのウェル中で乾燥して、存在する。
【００１９】
他の態様において、特定のベータ−ラクタマーゼの存在を検出するためのキットが、本明細書に提示される。一実施形態において、キットは、１つまたは複数の容器中に、（ａ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と、（ｂ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物とを含む。いくつかの実施形態において、キットは、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤、ならびに金属キレート剤を含む第３の組成物をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第４の組成物をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＥＳＢＬ阻害剤を含む第５の組成物をさらに含む。
【００２０】
他の実施形態において、キットは、１つまたは複数の容器中に、（ａ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と、（ｂ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と、（ｃ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第３の組成物とを含む。他の実施形態において、キットは、１つまたは複数の容器中に、（ａ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と、（ｂ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と、（ｃ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＥＳＢＬ阻害剤を含む第３の組成物とを含む。いくつかの実施形態において、キットは、１つまたは複数の容器中に、（ａ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を含む第１の組成物と（ｂ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および金属キレート剤を含む第２の組成物とを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のキットは、溶解試薬を含む組成物を含む。ある実施形態において、ベータ−ラクタマーゼ基質に加えて、いくつかの実施形態では１つまたは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤に加えて、本明細書に記載のキット中の組成物は、溶解試薬を含む。特定の実施形態において、溶解試薬は、細菌細胞を溶解するが、ベータ−ラクタマーゼ基質の加水分解または１つもしくは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤の活性またはその両方に干渉しない。一実施形態において、溶解試薬は、マイルドな非変性界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００またはＣＨＡＰＳ）などの界面活性剤である。他の実施形態において、溶解試薬は、細菌細胞の溶解を促進する酵素または他の作用物質である。そのような酵素の非限定的な例は、リゾチーム、ラビアーゼ、リソスタフィン、アクロモペプチダーゼ、およびムタノリシンを含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のキットは、溶解試薬および溶解試薬の安定化を促進する作用物質を含む組成物を含有する。ある実施形態において、ベータ−ラクタマーゼ基質に加えて、いくつかの実施形態では１つまたは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤に加えて、本明細書に記載のキット中の組成物は、溶解試薬および溶解試薬の安定化を促進する作用物質を含む。一実施形態において、溶解試薬の安定化を促進する作用物質は、熱安定性である。
【００２３】
特定の実施形態において、本明細書に記載のキットは、溶解試薬および炭水化物、例えば単糖、二糖、多糖、オリゴ糖、またはポリオールを含む組成物を含有する。炭水化物の特定の例は、マンニトール、リボース、グルコース、フルクトース、マンノース、スクロース、ラクトース、グリセロール、キサンタンガム、トレハロース、およびグリコール（例えばプロピレングリコール）を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に記載のキット中の組成物は、リゾチームおよびトレハロースを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のキットは、溶解試薬、溶解試薬の安定化を促進する作用物質、およびさらなる作用物質、例えば、溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質（例えば金属キレート剤）を含む組成物を含有する。特定の実施形態において、さらなる作用物質は、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡである。特定の実施形態において、メタロ−ベータ−ラクタマーゼが検出されるまたは検出され得る場合、ＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡまたはその両方は利用されない。特定の実施形態において、本明細書に記載のキット中の組成物は、リゾチーム、トレハロース、およびＥＤＴＡを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のキット中の組成物は、液体組成物、寒天プレート、ペーパーストリップ、ペーパーディスク、タブレット、ウェル中の乾燥形態、または１つもしくは複数のチューブ、例えばチューブのアレイ中の乾燥形態をしている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、プレート、トレイ、カセット、もしくはパネルのウェル、ペーパーストリップ、ペーパーディスク、またはチューブ（例えば試験管もしくはＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ）などの固体支持体上または固体支持体中で乾燥して、存在する。ある実施形態において、本明細書に記載のキット中の組成物は、パネル、トレイ、カセット、またはプレート（例えばマイクロタイタープレート）のウェル中で乾燥して、存在する。特定の実施形態において、本明細書に記載のキット中の組成物は、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）  Ｐａｎｅｌ（ＢＤ、ＵＳＡ）のウェルまたはＢＢＬ（商標）  Ｃｒｙｓｔａｌ（商標）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ、ＵＤＡ）からのパネルのウェル中で乾燥して、存在する。他の実施形態において、本明細書に記載のキット中の組成物は、Ｖｉｔｅｋ（登録商標）  ｃａｒｄ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ＵＳＡ）のウェル中で乾燥して、存在する。他の実施形態において、本明細書に記載のキット中の組成物は、ＭｉｃｒｏＳｃａｎ  ｐａｎｅｌ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ、ＵＳＡ）のウェル中で乾燥して、存在する。他の実施形態において、本明細書に記載のキット中の組成物は、ＡＰＩ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｓｔ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ＵＳＡ）のチューブ中で乾燥して、存在する。他の実施形態において、本明細書に記載のキット中の組成物は、Ｒｅｍｅｌ  ＲａｐＩＤ（商標）  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｅｍｅｌ、ＵＳＡ）のパネルのウェル中で乾燥される。
【００２６】
３．１  定義
本明細書において使用されるように、用語「約」および「およそ」は、他に示されない限り、用語によって修飾されている値のせいぜい２０％まで、上回る、または下回る値を指す。
【００２７】
本明細書において使用されるように、用語「溶解試薬の安定化を促進する作用物質」および「溶解試薬の安定化を促進する作用物質」は、約５０℃よりも高い温度への曝露の後の、細菌細胞を溶解するための溶解試薬の能力の損失を予防する作用物質を指す。特定の実施形態において、作用物質は、約５０℃から約１２０℃、約５０℃から約１００℃、約５０℃から約８５℃、約５０℃から約８０℃、または約６０℃から約７５℃の温度への曝露の後の、細菌細胞を溶解するための溶解試薬の能力の損失を予防する。他の特定の実施形態において、作用物質は、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４５分間、少なくとも１時間、少なくとも１．５時間、または少なくとも２時間の間、約５０℃から約１２０℃、約５０℃から約１００℃、約５０℃から約８５℃、約５０℃から約８０℃、または約６０℃から約７５℃の温度への曝露の後の、細菌細胞を溶解するための溶解試薬の能力の損失を予防する。他の特定の実施形態において、作用物質は、約２分から約３時間、約２分から約２時間、約２分から約１時間、約２分から約３０分間、約２分から約１５分間、約１５分から約２時間、約１５分から約１．５時間、約１５分から約１時間、約１５分から約４５分間、または約１５分から約３０分間の間、約５０℃から約１２０℃、約５０℃から約１００℃、約５０℃から約８５℃、約５０℃から約８０℃、または約６０℃から約７５℃の温度への曝露の後の、細菌細胞を溶解するための溶解試薬の能力の損失を予防する。
【００２８】
本明細書において使用されるように、用語「純粋な細菌試料」は、細菌を含有する生物学的試料を寒天含有培地に画線することから生じる同じ供給源からの１つまたは複数の細菌コロニーから収集される試料を意味する。試料が１つを超えるコロニー由来である場合、一般に、すべてのコロニーは、同じ種由来である。
【００２９】
本明細書において使用されるように、細菌試料との関連における用語「同じ供給源」は、同じ実体（例えばヒト対象）からの（１つまたは複数の）生物学的試料から単離される、得られる、またはそれに由来する２つ以上の細菌試料を意味する。例えば、２つ以上の細菌試料は、１つの対象からの１、２つ、またはそれ以上の組織、器官、または分泌物から得ることができる。
【００３０】
本明細書において使用されるように、用語「対象」および「患者」は、動物対象を指すために区別なく使用される。特定の実施形態において、対象は哺乳動物である。他の実施形態において、対象は非ヒトである。好ましい実施形態において、対象はヒトである。
【００３１】
ベータ−ラクタマーゼに関して、本明細書において使用されるように、用語「基質利用」は、ベータ−ラクタマーゼによる基質の加水分解を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
４．１  ベータ−ラクタマーゼアッセイ
検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む組成物を使用する、特定のベータ−ラクタマーゼの迅速な検出のための方法が本明細書に提示される。本明細書に提示される方法は、（ａ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質（例えばニトロセフィン）および１つまたは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む異なる組成物と、同じ供給源からの２つ以上の細菌試料を接触させるステップと、（ｂ）組成物における基質の利用を検出するステップとを含むことができ、組成物における基質の利用は、１つまたは複数の阻害剤の存在により、細菌試料において存在する（１つまたは複数の）ベータ−ラクタマーゼが阻害されるかどうかを示す。異なる組成物の結果によって、細菌供給源におけるある種のベータ−ラクタマーゼの存在を決定することができ、かつ／または他のベータ−ラクタマーゼの存在を除外することができる。
【００３３】
本明細書に提示される方法は、例えば、（ａ）（ｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第１の組成物と第１の細菌試料を接触させ、かつ（ｉｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と第２の細菌試料を接触させるステップであって、少なくとも１つのそのようなベータ−ラクタマーゼ阻害剤は、第１の組成物における１つまたは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤と異なり、第１の細菌試料および第２の細菌試料は、同じ供給源由来である、ステップと、（ｂ）第１の組成物および第２の組成物における基質の利用を検出するステップとを含んでいてもよく、第１の組成物および／または第２の組成物における基質利用は、細菌供給源における１つまたは複数の特定のベータ−ラクタマーゼの存在、および場合によって１つまたは複数の特定のベータ−ラクタマーゼの欠如を示す。特定の実施形態において、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を含み、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含まない対照組成物もまた、他の組成物と同じ供給源からの細菌試料と接触させる。この対照組成物における基質利用の検出により、ベータ−ラクタマーゼが細菌供給源において存在することを確証する。いくつかの実施形態において、１つもしくは複数のベータ−ラクタマーゼを発現することが知られている細菌試料を含む陽性対照および／または１つもしくは複数の特定のベータ−ラクタマーゼを発現しないことが知られている細菌試料を含む陰性対照が、本明細書に提示される方法において含まれる。
【００３４】
ある実施形態において、先の段落において記載された第１の組成物、第２の組成物、および対照組成物は、溶解試薬を含む。特定の実施形態において、先の段落において記載された第１の組成物、第２の組成物、および対照組成物は、溶解試薬および溶解試薬の安定化を促進する作用物質を含む。他の実施形態において、先の段落において記載された第１の組成物、第２の組成物、および対照組成物は、溶解試薬、溶解試薬の安定化を促進する作用物質、および溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質を含む。
【００３５】
下記の表１は、細菌試料における特定のベータ−ラクタマーゼの存在を検出するために使用することができ、異なる組成物における基質利用の検出に基づいて検出することができるベータ−ラクタマーゼを同定する組成物の例示的な表を提供する。同じ供給源からの細菌試料を異なる組成物と接触させた場合に、基質利用を比較することによって、特定のベータ−ラクタマーゼの存在を、検出することができ、場合によって、特定のベータ−ラクタマーゼの存在を、除外することができる。
【００３６】
いくつかの実施形態において、１、２、３、４、５、またはすべての、下記の表１における組成物は、細菌供給源における特定のベータ−ラクタマーゼの存在を検出するために使用される。例えば、ある実施形態において、同じ供給源からの第１の細菌試料、第２の細菌試料、および第３の細菌試料は、下記の表１における組成物＃１、組成物＃４、および組成物＃５とそれぞれ接触させ、組成物における基質の利用が検出される。基質利用は、組成物＃１および組成物＃４において検出されるが、組成物＃５における基質利用は、検出されない場合、メタロ−ベータ−ラクタマーゼが、細菌供給源において存在する。基質利用が、３つの組成物すべてにおいて検出される場合、クラスＡセリンカルバペネマーゼが、細菌供給源において存在し、検出される。基質利用は、組成物＃１において検出されるが、基質利用は、組成物＃４および＃５において検出されない場合、クラスＡセリンカルバペネマーゼおよびメタロ−ベータ−ラクタマーゼ以外のベータ−ラクタマーゼが、細菌供給源において存在する。
【００３７】
【表１】
0005628677.tif 000002
【００３８】
【表２】
0005628677.tif 000003
【００３９】
一実施形態において、セリンカルバペネマーゼまたはメタロ−ベータ−ラクタマーゼの存在を検出するための方法は、（ａ）（ｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と第１の細菌試料を接触させ、かつ（ｉｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびに基質特異性拡張型ベータ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）および元の基質特異性のベータ−ラクタマーゼ（ＯＳＢＬ）を阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と第２の細菌試料を接触させるステップであって、第１の細菌試料および第２の細菌試料は、同じ供給源由来であるステップと、（ｂ）第１の組成物および第２の組成物における基質の利用を検出するステップとを含み、基質が第１の組成物および第２の組成物において利用された場合、クラスＡセリンカルバペネマーゼまたはメタロ−ベータ−ラクタマーゼは検出される。セリンカルバペネマーゼおよびメタロ−ベータ−ラクタマーゼの存在を区別するために、第１の細菌試料および第２の細菌試料と同じ供給源からの第３の細菌試料は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤、ならびに金属キレート剤を含む第３の組成物と接触させることができ、第３の組成物における基質の利用が検出される。第３の組成物ならびに第１の組成物および第２の組成物における基質利用が検出される場合、クラスＡセリンカルバペネマーゼの存在が、細菌供給源において検出される。その一方で、第３の組成物において検出される基質利用はないが、第１の組成物および第２の組成物において検出される基質利用がある場合、メタロ−ベータ−ラクタマーゼの存在が、細菌供給源において検出される。さらに、基質利用が、第３の組成物において検出されないが、第１の組成物および第２の組成物における基質利用が検出される場合、クラスＡセリンカルバペネマーゼの存在は、除外することができる。下記の表２は、クラスＡセリンカルバペネマーゼまたはメタロ−ベータ−ラクタマーゼを含有する細菌試料を、本段落において記載される組成物と接触させた場合の結果を要約する。
【００４０】
【表３】
0005628677.tif 000004
【００４１】
特定の実施形態において、ベータ−ラクタマーゼの存在を検出するための方法は、（ａ）（ｉ）発色ベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と第１の細菌試料を接触させ、かつ（ｉｉ）発色ベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と第２の細菌試料を接触させるステップであって、第１の細菌試料および第２の細菌試料は、同じ供給源由来である、ステップと、（ｂ）第１の組成物および第２の組成物の色を検出するステップを含み、第１の組成物および第２の組成物の色が基質利用を示すように変化した場合、ベータ−ラクタマーゼが検出され、ベータ−ラクタマーゼは、クラスＡセリンカルバペネマーゼまたはメタロ−ベータ−ラクタマーゼである。一実施形態において、ＡｍｐＣ阻害剤は、クロキサシリンである。他の実施形態において、セリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤は、クラブラン酸である。先の実施形態において記載された第１の組成物および第２の組成物は、当業者が十分に理解するように、独立してまたは様々な組合せにおいてともに使用することができる。他の実施形態において、発色ベータ−ラクタマーゼ基質は、ニトロセフィンである。特定の実施形態において、第１の組成物は、２０μＭから２００μＭのニトロセフィン、２０μＭから５ｍＭのクロキサシリン、および０．０５Ｍから１Ｍリン酸緩衝液またはＭＥＳ緩衝液を含む。他の実施形態において、第２の組成物は、２０μＭから２００μＭのニトロセフィン、２０μＭから５ｍＭのクロキサシリン、１μＭから１．５ｍＭのクラブラン酸、および０．０５Ｍから１Ｍのリン酸緩衝液またはＭＥＳ緩衝液を含む。他の実施形態において、各組成物は、ｐＨ５からｐＨ７である。特定の実施形態において、組成物において使用される阻害剤の濃度は、組成物におけるベータ−ラクタマーゼ基質の濃度に依存する。
【００４２】
他の特定の実施形態において、ベータ−ラクタマーゼの存在を検出するための方法は、（ａ）（ｉ）発色ベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と第１の細菌試料を接触させ、（ｉｉ）発色ベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と第２の細菌試料を接触させ、かつ（ｉｉｉ）発色ベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤、ならびに金属キレート剤を含む第３の組成物と第３の細菌試料を接触させるステップであって、第１の細菌試料、第２の細菌試料、および第３の細菌試料は、同じ供給源由来である、ステップと、（ｂ）第１の組成物、第２の組成物、および第３の組成物の色を検出するステップを含み、（ｉ）第１の組成物、第２の組成物、および第３の組成物の色が基質利用を示すように変化した場合、クラスＡセリンカルバペネマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｉ）第１の組成物および第２の組成物の色は基質利用を示すように変化したが、第３の組成物の色は基質利用を示すように変化しなかった場合、メタロ−ベータ−ラクタマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出される。一実施形態において、ＡｍｐＣ阻害剤は、クロキサシリンである。他の実施形態において、セリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤は、クラブラン酸である。他の実施形態において、金属キレート剤は、ジピコリン酸またはジエチルジチオカルバメートである。他の実施形態において、発色ベータ−ラクタマーゼ基質は、ニトロセフィンである。特定の実施形態において、第１の組成物は、２０μＭから２００μＭのニトロセフィン、２０μＭから５ｍＭのクロキサシリン、および０．０５Ｍから１Ｍリン酸緩衝液またはＭＥＳ緩衝液を含む。他の実施形態において、第２の組成物は、２０μＭから２００μＭのニトロセフィン、２０μＭから５ｍＭのクロキサシリン、０．１μＭから１．５ｍＭのクラブラン酸、および０．０５Ｍから１Ｍリン酸緩衝液またはＭＥＳ緩衝液を含む。他の実施形態において、第３の組成物は、２０μＭから２００μＭのニトロセフィン、２０μＭから５ｍＭのクロキサシリン、０．１μＭから１．５ｍＭのクラブラン酸、０．５ｍＭから１．５ｍＭのジピコリン酸（ＤＰＣ）または１ｍＭから２０ｍＭのジエチルジチオカルバメート（ＤＥＤＴＣ）、および０．０５Ｍから１Ｍリン酸緩衝液またはＭＥＳ緩衝液を含む。先の実施形態において記載された第１の組成物、第２の組成物、および第３の組成物は、当業者が十分に理解するように、独立してまたは様々な組合せにおいてともに使用することができる。他の実施形態において、各組成物は、ｐＨ５からｐＨ７である。特定の実施形態において、組成物において使用される阻害剤の濃度は、組成物におけるベータ−ラクタマーゼ基質の濃度に依存する。
【００４３】
他の実施形態において、ベータ−ラクタマーゼを検出するための方法であって、（ａ）（ｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を含む第１の組成物と第１の細菌試料を接触させ、かつ（ｉｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および金属キレート剤を含む第２の組成物と第２の細菌試料を接触させるステップであって、第１の細菌試料および第２の細菌試料は、同じ供給源由来である、ステップと、（ｂ）第１の組成物および第２の組成物における基質の利用を検出するステップとを含み、（ｉ）第１の組成物および第２の組成物における基質が利用された場合、メタロ−ベータ−ラクタマーゼ以外のベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｉ）第１の組成物における基質は利用されたが、第２の組成物における基質は利用されなかった場合、メタロ−ベータ−ラクタマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出される方法が本明細書に提示される。さらに、第１の組成物および第２の組成物による基質利用が検出されなければ、細菌供給源において存在するベータ−ラクタマーゼがないことを示す。下記の表３は、メタロ−ベータ−ラクタマーゼまたは金属ベータ−ラクタマーゼ以外のベータ−ラクタマーゼを含有する細菌試料を、本段落において記載される組成物と接触させた場合の結果を要約する。
【００４４】
【表４】
0005628677.tif 000005
【００４５】
他の特定の実施形態において、ベータ−ラクタマーゼの存在を検出するための方法であって、（ａ）（ｉ）発色ベータ−ラクタマーゼ基質を含む第１の組成物と第１の細菌試料を接触させ、かつ（ｉｉ）発色ベータ−ラクタマーゼ基質および金属キレート剤を含む第２の組成物と第２の細菌試料を接触させるステップであって、第１の試料および第２の試料は、同じ供給源由来である、ステップと、（ｂ）第１の組成物および第２の組成物の色を検出するステップとを含み、（ｉ）第１の組成物および第２の組成物の色が基質利用を示すように変化した場合、メタロ−ベータ−ラクタマーゼ以外のベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｉ）第１の組成物の色は基質利用を示すように変化したが、第２の組成物の色は基質利用を示すように変化しなかった場合、メタロ−ベータ−ラクタマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出される。一実施形態において、発色ベータ−ラクタマーゼ基質は、ニトロセフィンである。他の実施形態において、金属キレート剤は、ジピコリン酸（ＤＰＣ）またはジエチルジチオカルバメート（ＤＥＤＴＣ）である。特定の実施形態において、第１の組成物は、２０μＭから２００μＭのニトロセフィンおよび０．０５Ｍから１Ｍのリン酸緩衝液またはＭＥＳ緩衝液を含む。他の実施形態において、第２の組成物は、２０μＭから２００μＭのニトロセフィンおよび０．５ｍＭから１０ｍＭのジピコリン酸（ＤＰＣ）または１ｍＭから２０ｍＭのジエチルジチオカルバメート（ＤＥＤＴＣ）および０．０５Ｍから１Ｍのリン酸緩衝液またはＭＥＳ緩衝液を含む。先の実施形態において記載された第１の組成物および第２の組成物は、当業者が十分に理解するように、独立してまたは様々な組合せにおいてともに使用することができる。他の実施形態において、各組成物は、ｐＨ５からｐＨ７である。特定の実施形態において、組成物において使用される阻害剤の濃度は、組成物におけるベータ−ラクタマーゼ基質の濃度に依存する。
【００４６】
他の実施形態において、ベータ−ラクタマーゼを検出するための方法は、（ａ）（ｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と第１の細菌試料を接触させ、（ｉｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と第２の細菌試料を接触させ、（ｉｉｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤、ならびに金属キレート剤を含む第３の組成物と第３の細菌試料を接触させ、かつ（ｉｖ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第４の組成物と第４の細菌試料を接触させるステップであって、第１の細菌試料、第２の細菌試料、第３の細菌試料、および第４の細菌試料は、同じ供給源由来である、ステップと、（ｂ）第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物、および第４の組成物における基質の利用を検出するステップとを含み、（ｉ）第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物、および第４の組成物における基質が利用された場合、クラスＡセリンカルバペネマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｉ）第１の組成物、第２の組成物、および第４の組成物における基質は利用されたが、第３の組成物における基質は利用されなかった場合、メタロ−ベータ−ラクタマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｉｉ）第４の組成物における基質は利用されたが、第１の組成物、第２の組成物、および第３の組成物における基質は利用されなかった場合、ＡｍｐＣベータ−ラクタマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出される。さらに、第１の組成物、第２の組成物、および第４の組成物における基質利用は検出されるが、第３の組成物における基質利用が検出されなければ、クラスＡセリンカルバペネマーゼが、細菌供給源中に存在しないことを示す。さらに、第４の組成物における基質利用は検出されるが、第１の組成物、第２の組成物、および第３の組成物における基質利用が検出されなければ、クラスＡセリンカルバペネマーゼ、メタロ−ベータ−ラクタマーゼ、およびＥＳＢＬが、細菌供給源中に存在しないことを示す。下記の表４は、クラスＡセリンカルバペネマーゼ、メタロ−ベータ−ラクタマーゼ、またはＡｍｐＣベータ−ラクタマーゼを含有する細菌試料を、本段落において記載される組成物と接触させた場合の結果を要約する。
【００４７】
【表５】
0005628677.tif 000006
【００４８】
特定の実施形態において、ベータ−ラクタマーゼを検出するための方法は、（ａ）（ｉ）発色ベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と第１の細菌試料を接触させ、（ｉｉ）発色ベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と第２の細菌試料を接触させ、（ｉｉｉ）発色ベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤、ならびに金属キレート剤を含む第３の組成物と第３の細菌試料を接触させ、かつ（ｉｖ）発色ベータ−ラクタマーゼ基質ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第４の組成物と第４の細菌試料を接触させるステップであって、第１の細菌試料、第２の細菌試料、第３の細菌試料、および第４の細菌試料は、同じ供給源由来である、ステップと、（ｂ）第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物、および第４の組成物の色を検出するステップとを含み、（ｉ）第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物、および第４の組成物の色が基質利用を示すように変化した場合、クラスＡセリンカルバペネマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｉ）第１の組成物、第２の組成物、および第４の組成物の色は基質利用を示すように変化したが、第３の組成物の色は基質利用を示すように変化しなかった場合、メタロ−ベータ−ラクタマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｉｉ）第４の組成物の色は基質利用を示すように変化したが、第１の組成物、第２の組成物、および第３の組成物の色は基質利用を示すように変化しなかった場合、ＡｍｐＣベータ−ラクタマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出される。一実施形態において、ＡｍｐＣ阻害剤は、クロキサシリンである。他の実施形態において、セリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤は、クラブラン酸である。他の実施形態において、金属キレート剤は、ＤＰＣまたはＤＥＤＴＣである。他の実施形態において、色素形成基質は、ニトロセフィンである。特定の実施形態において、第１の組成物は、２０μＭから２００μＭのニトロセフィン、２０μＭから５ｍＭのクロキサシリン、および０．０５Ｍから１Ｍのリン酸緩衝液またはＭＥＳ緩衝液を含む。他の実施形態において、第２の組成物は、２０μＭから２００μＭのニトロセフィン、２０μＭから５ｍＭのクロキサシリン、１μＭから１．５ｍＭのクラブラン酸、および０．０５Ｍから１Ｍのリン酸緩衝液またはＭＥＳ緩衝液を含む。他の実施形態において、第３の組成物は、２０μＭから２００μＭのニトロセフィン、２０μＭから５ｍＭのクロキサシリン、１μＭから１．５ｍＭのクラブラン酸、０．５ｍＭから１０ｍＭのＤＰＣまたは１ｍＭから２０ｍＭ  ＤＥＤＴＣ、および緩衝液中の０．０５Ｍから１Ｍのリン酸またはＭＥＳを含む。他の実施形態において、第４の組成物は、２０μＭから２００μＭのニトロセフィン、１μＭから１．５ｍＭのクラブラン酸、および０．０５Ｍから１Ｍのリン酸緩衝液またはＭＥＳ緩衝液を含む。先の実施形態において記載された第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物、および第４の組成物は、当業者が十分に理解するように、独立してまたは様々な組合せにおいてともに使用することができる。他の実施形態において、各組成物は、ｐＨ５からｐＨ７である。特定の実施形態において、組成物において使用される阻害剤の濃度は、組成物におけるベータ−ラクタマーゼ基質の濃度に依存する。
【００４９】
他の実施形態において、ベータ−ラクタマーゼの存在を検出するための方法は、（ａ）（ｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と第１の細菌試料を接触させ、（ｉｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と第２の細菌試料を接触させ、（ｉｉｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤、ならびに金属キレート剤を含む第３の組成物と第３の細菌試料を接触させ、（ｉｖ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第４の組成物と第４の細菌試料を接触させ、かつ（ｖ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＥＳＢＬ阻害剤を含む第５の組成物と第５の細菌試料を接触させるステップであって、第１の細菌試料、第２の細菌試料、第３の細菌試料、第４の細菌試料、および第５の細菌試料は、同じ供給源由来である、ステップと、（ｂ）第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物、第４の組成物、および第５の組成物における基質の利用を検出するステップとを含み、（ｉ）第１の組成物における基質は利用されたが、第２の組成物、第３の組成物、第４の組成物、および第５の組成物における基質は利用されなかった場合、ＥＳＢＬであるベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｉ）第４の組成物における基質は利用されたが、第１の組成物、第２の組成物、および第３の組成物における基質は利用されなかった場合、ＡｍｐＣベータ−ラクタマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｉｉ）第１の組成物、第２の組成物、および第４の組成物における基質は利用されたが、第３の組成物における基質は利用されなかった場合、メタロ−ベータ−ラクタマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｖ）第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物、および第４の組成物における基質が、利用された場合、クラスＡセリンカルバペネマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出される。さらに、第１の組成物における基質利用は検出されるが、第２の組成物、第３の組成物、第４の組成物、および第５の組成物の基質利用が検出されなければ、クラスＡセリンカルバペネマーゼ、メタロ−ベータ−ラクタマーゼ、およびＡｍｐＣベータ−ラクタマーゼが試料中に存在しないことを示す。さらに、第１の組成物、第２の組成物、および第４の組成物における基質利用は検出されるが、第３の組成物における基質利用が検出されなければ、クラスＡセリンカルバペネマーゼが、細菌供給源中に存在しないことを示す。さらに、第４の組成物における基質利用は検出されるが、第１の組成物、第２の組成物、および第３の組成物における基質利用が検出されなければ、クラスＡセリンカルバペネマーゼ、メタロ−ベータ−ラクタマーゼ、およびＥＳＢＬが、細菌供給源中に存在しないことを示す。下記の表５は、セリンカルバペネマーゼ、メタロ−ベータ−ラクタマーゼ、ＡｍｐＣ、またはＥＳＢＬを含有する細菌試料を、本段落において記載される組成物と接触させた場合の結果を要約する。
【００５０】
他の実施形態において、ベータ−ラクタマーゼの存在を検出するための方法は、（ａ）（ｉ）発色ベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と第１の細菌試料を接触させ、（ｉｉ）発色ベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と第２の細菌試料を接触させ、（ｉｉｉ）発色ベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤、ならびに金属キレート剤を含む第３の組成物と第３の細菌試料を接触させ、（ｉｖ）発色ベータ−ラクタマーゼ基質ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第４の組成物と第４の細菌試料を接触させ、かつ（ｖ）発色ベータ−ラクタマーゼ基質およびＥＳＢＬ阻害剤を含む第５の組成物と第５の細菌試料を接触させるステップであって、第１の細菌試料、第２の細菌試料、第３の細菌試料、第４の細菌試料、および第５の細菌試料は、同じ供給源由来である、ステップと、（ｂ）第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物、第４の組成物、および第５の組成物の色を検出するステップとを含み、（ｉ）第１の組成物の色は基質利用を示すように変化したが、第２の組成物、第３の組成物、第４の組成物、および第５の組成物の色は基質利用を示すように変化しなかった場合、ＥＳＢＬであるベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｉ）第４の組成物の色は基質利用を示すように変化したが、第１の組成物、第２の組成物、および第３の組成物の色は基質利用を示すように変化しなかった場合、ＡｍｐＣベータ−ラクタマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｉｉ）第１の組成物、第２の組成物、および第４の組成物の色は基質利用を示すように変化したが、第３の組成物の色は基質利用を示すように変化しなかった場合、メタロ−ベータ−ラクタマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｖ）第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物、および第４の組成物の色が基質利用を示すように変化した場合、クラスＡセリンカルバペネマーゼであるベータ−ラクタマーゼが検出される。一実施形態において、ＡｍｐＣ阻害剤は、クロキサシリンである。他の実施形態において、セリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤は、クラブラン酸である。他の実施形態において、金属キレート剤は、ＤＥＤＴＣまたはＤＰＣである。他の実施形態において、ＥＳＢＬ阻害剤は、セフォタキシムまたはセフタジジムである。他の実施形態において、色素基質は、ニトロセフィンである。特定の実施形態において、第１の組成物は、２０μＭから２００μＭのニトロセフィン、２０μＭから５ｍＭのクロキサシリン、および０．０５Ｍから１Ｍのリン酸緩衝液またはＭＥＳ緩衝液を含む。他の実施形態において、第２の組成物は、２０μＭから２００μＭのニトロセフィン、２０μＭから５ｍＭのクロキサシリン、０．５ｍＭから１．５ｍＭのクラブラン酸、および０．０５Ｍから１Ｍのリン酸緩衝液またはＭＥＳ緩衝液を含む。他の実施形態において、第３の組成物は、２０μＭから２００μＭのニトロセフィン、２０μＭから５ｍＭのクロキサシリン、０．１μＭから１．５ｍＭのクラブラン酸、０．５ｍＭから１０ｍＭのＤＰＣまたは１ｍＭから２０ｍＭのＤＥＤＴＣ、および０．０５Ｍから１Ｍのリン酸緩衝液またはＭＥＳ緩衝液を含む。他の実施形態において、第４の組成物は、２０μＭから２００μＭのニトロセフィン、０．１μＭから１．５ｍＭのクラブラン酸、および０．０５Ｍから１Ｍのリン酸緩衝液またはＭＥＳ緩衝液を含む。他の実施形態において、第５の組成物は、２０μＭから２００μＭのニトロセフィン、１ｍＭから１０ｍＭのセフォタキシムまたはセフタジジム、および０．０５Ｍから１Ｍのリン酸緩衝液またはＭＥＳ緩衝液を含む。先の実施形態において記載された第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物、第４の組成物、および第５の組成物は、当業者が十分に理解するように、独立してまたは様々な組合せにおいてともに使用することができる。他の実施形態において、各組成物は、ｐＨ５からｐＨ７である。特定の実施形態において、組成物において使用される阻害剤の濃度は、組成物におけるベータ−ラクタマーゼ基質の濃度に依存する。
【００５１】
【表６】
0005628677.tif 000007
【００５２】
他の実施形態において、（１つまたは複数の）ベータ−ラクタマーゼの存在を検出するための方法は、（ａ）（ｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と第１の細菌試料を接触させ、（ｉｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質ならびにクラスＡセリンカルバペネマーゼではなくＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量のセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と第２の細菌試料を接触させ、かつ（ｉｉｉ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにクラスＡセリンカルバペネマーゼではなくＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量のセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第３の組成物と第３の細菌試料を接触させるステップであって、第１の細菌試料、第２の細菌試料、および第３の細菌試料は、同じ供給源由来である、ステップと、（ｂ）第１の組成物、第２の組成物、および第３の組成物における基質の利用を検出するステップとを含み、（ｉ）第１の組成物および第２の組成物における基質は利用されたが、第３の組成物における基質は利用されなかった場合、ＡｍｐＣおよびＥＳＢＬであるベータ−ラクタマーゼ、またはＡｍｐＣおよびＯＳＢＬであるベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｉ）第２の組成物における基質は利用されたが、第１の組成物および第３の組成物における基質は利用されなかった場合、ＡｍｐＣであるベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｉｉ）第１の組成物における基質は利用されたが、第２の組成物および第３の組成物における基質は利用されなかった場合、ＥＳＢＬおよび／またはＯＳＢＬであるベータ−ラクタマーゼが検出される。さらに、第２の組成物における基質利用は検出されるが、第１の組成物および第３の組成物における基質利用が検出されなければ、ＥＳＢＬおよび／またはＯＳＢＬが、細菌供給源中に存在しないことを示す。下記の表６は、ＡｍｐＣ、ＥＳＢＬ、および／またはＯＳＢＬを含有する細菌試料を、本段落において記載される組成物と接触させた場合の結果を要約する。
【００５３】
【表７】
0005628677.tif 000008
【００５４】
他の実施形態において、ベータ−ラクタマーゼの存在を検出するための方法は、（ａ）（ｉ）発色ベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と第１の細菌試料を接触させ、（ｉｉ）発色ベータ−ラクタマーゼ基質ならびにクラスＡセリンカルバペネマーゼではなくＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量のセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と第２の細菌試料を接触させ、かつ（ｉｉｉ）発色ベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにクラスＡセリンカルバペネマーゼではなくＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量のセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第３の組成物と第３の細菌試料を接触させるステップであって、第１の細菌試料、第２の細菌試料、および第３の細菌試料は、同じ供給源由来である、ステップと、（ｂ）第１の組成物、第２の組成物、および第３の組成物の色を検出するステップとを含み、（ｉ）第１の組成物および第２の組成物の色は基質利用を示すように変化したが、第３の組成物の色は基質利用を示すように変化しなかった場合、ＡｍｐＣおよびＥＳＢＬ、またはＡｍｐＣおよびＯＳＢＬであるベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｉ）第２の組成物の色は基質利用を示すように変化したが、第１の組成物および第３の組成物の色は基質利用を示すように変化しなかった場合、ＡｍｐＣであるベータ−ラクタマーゼが検出され、（ｉｉｉ）第１の組成物の色は基質利用を示すように変化したが、第２の組成物および第３の組成物の色は基質利用を示すように変化しなかった場合、ＥＳＢＬおよび／またはＯＳＢＬであるベータ−ラクタマーゼが検出される。一実施形態において、ＡｍｐＣ阻害剤は、クロキサシリンである。他の実施形態において、セリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤は、クラブラン酸である。他の実施形態において、色素基質は、ニトロセフィンである。特定の実施形態において、第１の組成物は、２０μＭから２００μＭのニトロセフィン、２０μＭから５ｍＭのクロキサシリン、および０．０５Ｍから１Ｍのリン酸緩衝液またはＭＥＳ緩衝液を含む。他の実施形態において、第２の組成物は、２０μＭから２００μＭのニトロセフィン、１μＭから１．５ｍＭのクラブラン酸、および０．０５Ｍから１Ｍのリン酸緩衝液またはＭＥＳ緩衝液を含む。他の実施形態において、第３の組成物は、２０μＭから２００μＭのニトロセフィン、２０μＭから５ｍＭのクロキサシリン、１μＭから１．５ｍＭのクラブラン酸、および０．０５Ｍから１Ｍのリン酸緩衝液またはＭＥＳ緩衝液を含む。他の実施形態において、各組成物は、ｐＨ５からｐＨ７である。他の実施形態において、第４の組成物は、２０μＭから２００μＭのニトロセフィン、１μＭから１．５ｍＭのクラブラン酸、および０．０５Ｍから１Ｍのリン酸緩衝液またはＭＥＳ緩衝液を含む。先の実施形態において記載された第１の組成物、第２の組成物、および第３の組成物は、当業者が十分に理解するように、独立してまたはともに使用することができる。他の実施形態において、各組成物は、ｐＨ５からｐＨ７である。特定の実施形態において、組成物において使用される阻害剤の濃度は、組成物におけるベータ−ラクタマーゼ基質の濃度に依���する。
【００５５】
ある実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、溶解試薬を含む。溶解試薬（例えば溶解緩衝液中の溶解試薬）は、当業者に知られている。特定の実施形態において、溶解試薬は、細菌細胞を溶解するが、ベータ−ラクタマーゼ基質の加水分解または１つもしくは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤の活性またはその両方に干渉しない。一実施形態において、溶解試薬は、マイルドな非変性界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００またはＣＨＡＰＳ）などの界面活性剤である。他の実施形態において、溶解試薬は、細菌細胞の溶解を促進する酵素または他の作用物質である。そのような酵素の非限定的な例は、リゾチーム、ラビアーゼ、リソスタフィン、アクロモペプチダーゼ、およびムタノリシンを含む。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、または約５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの、細菌細胞の溶解を促進する酵素または他の作用物質を含む。他の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約８ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約６ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、または約３ｍｇ／ｍｌの、細菌細胞の溶解を促進する酵素または他の作用物質を含む。
【００５６】
特定の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、リゾチームを含む。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、または約５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む。他の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約８ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約６ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、または約３ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む。
【００５７】
ある実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、溶解試薬（例えばリゾチーム、ラビアーゼ、リソスタフィン、アクロモペプチダーゼ、またはムタノリシン）および溶解試薬の安定化を促進する作用物質を含む。特定の実施形態において、溶解試薬の安定化を促進する作用物質は、ベータ−ラクタマーゼ基質の加水分解または１つもしくは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤の活性またはその両方に干渉しない。一実施形態において、溶解試薬の安定化を促進する作用物質は、熱安定性である。特定の実施形態において、溶解試薬の安定化を促進する作用物質は、約６０℃またはそれ以上、約５０℃から約１００℃、約６０℃から約９０℃、約６０℃から約８５℃、約６０℃から約７５℃、または約６０℃から約７０℃の温度で安定性である。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、約０．１％から約１０％、約１％から約１０％、約２％から約１０％、約４％から約１０％、約１％から約８％、約２％から約８％、約２％から約６％、または約２％から約４％の、溶解試薬の安定化を促進する作用物質を含む。
【００５８】
特定の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、溶解試薬および炭水化物、例えば単糖、二糖、多糖、オリゴ糖、またはポリオールを含む。炭水化物の特定の例は、マンニトール、リボース、グルコース、フルクトース、マンノース、スクロース、ラクトース、グリセロール、キサンタンガム、トレハロース、およびグリコール（例えばプロピレングリコール）を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、炭水化物は、トレハロースである。
【００５９】
特定の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、リゾチームおよびトレハロースを含む。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、または約５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、および約０．１％から約１０％、約１％から約１０％、約２％から約１０％、約４％から約１０％、約１％から約８％、約２％から約８％、約２％から約６％、または約２％から約４％のトレハロースを含む。他の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約８ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約６ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、または約３ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、および約０．１％から約１０％、約１％から約１０％、約２％から約１０％、約４％から約１０％、約１％から約８％、約２％から約８％、約２％から約６％、または約２％から約４％のトレハロースを含む。
【００６０】
ある実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、溶解試薬（例えばリゾチーム、ラビアーゼ、リソスタフィン、アクロモペプチダーゼ、またはムタノリシン）およびさらなる作用物質、例えば、溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質（例えば金属キレート剤）を含む。ある実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、溶解試薬（例えばリゾチーム、ラビアーゼ、リソスタフィン、アクロモペプチダーゼ、またはムタノリシン）、溶解試薬の安定化を促進する作用物質、およびさらなる作用物質、例えば、溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質（例えば金属キレート剤）を含む。特定の実施形態において、溶解試薬の安定化を促進する作用物質は、ベータ−ラクタマーゼ基質の加水分解または１つもしくは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤の活性またはその両方に干渉しない。特定の実施形態において、溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質は、溶解試薬が作用物質の非存在下において細菌細胞を溶解する速度に比べて、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、または約７５％、溶解試薬が細菌細胞を溶解する速度を増加させる。他の実施形態において、溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質は、溶解試薬が作用物質の非存在下において細菌細胞を溶解する速度に比べて、約１０％から約５０％、約１０％から約７５％、約２５％から約７５％、約２５％から約５０％、約２５％から約４０％、約２５％から約３０％、または約５０％もしくは約７５％、溶解試薬が細菌細胞を溶解する速度を増加させる。ある実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、約０．１ｍＭから約５ｍＭ、約１ｍＭから約４ｍＭ、約１ｍＭから約３ｍＭ、約２ｍＭから約３ｍＭ、または約０．１から約２ｍＭの、溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質を含む。
【００６１】
特定の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、溶解試薬、溶解試薬の安定化を促進する作用物質、およびＥＤＴＡまたはＥＧＴＡを含む。特定の実施形態において、メタロ−ベータ−ラクタマーゼが検出される場合、または検出され得る場合、ＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡまたはその両方は、利用されない。
【００６２】
特定の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、リゾチーム、トレハロース、およびＥＤＴＡを含む。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、または約５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、約０．１％から約１０％、約１％から約１０％、約２％から約１０％、約４％から約１０％、約１％から約８％、約２％から約８％、約２％から約６％、または約２％から約４％のトレハロース、および約０．１ｍＭから約５ｍＭ、約１ｍＭから約４ｍＭ、約１ｍＭから約３ｍＭ、約２ｍＭから約３ｍＭ、または約０．１から約２ｍＭのＥＤＴＡを含む。他の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約８ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約６ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、または約３ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、約０．１％から約１０％、約１％から約１０％、約２％から約１０％、約４％から約１０％、約１％から約８％、約２％から約８％、約２％から約６％、または約２％から約４％のトレハロース、および約０．１ｍＭから約５ｍＭ、約１ｍＭから約４ｍＭ、約１ｍＭから約３ｍＭ、約２ｍＭから約３ｍＭ、または約０．１から約２ｍＭのＥＤＴＡを含む。
【００６３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、液体組成物、寒天プレート、ペーパーストリップ、ペーパーディスク、タブレットの形態、ウェル中の乾燥形態、または１つもしくは複数のチューブ、例えばチューブのアレイ中の乾燥形態をしている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、プレート、パネル、カセット、もしくはトレイのウェル、ペーパーストリップ、ペーパーディスク、またはチューブなどの固体支持体上または固体支持体中で乾燥して、存在する。本明細書において使用されるように、本明細書に記載の組成物の形態との関連における用語「固体支持体」は、本明細書に記載の組成物を乾燥または付着させてもよい固体表面であり、本明細書に提示される方法に従うベータ−ラクタマーゼの検出に適した固体表面を指す。固体支持体の非限定的な例は、シリカゲル、樹脂、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、およびポリスチレンビーズを含む。
【００６４】
ある実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、例えば５０℃から１００℃、５０℃から８５℃、５０℃から７５℃、６０℃から７５℃、または６０℃から７０℃の温度の熱を使用して、固体支持体上または固体支持体中で乾燥させる。一実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、例えば５０℃から１００℃、５０℃から８５℃、５０℃から７５℃、６０℃から７５℃、または６０℃から７０℃の温度の、強制空気条件または真空条件下の熱を使用して、固体支持体上または固体支持体中で乾燥させる。他の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、凍結乾燥技術を使用して、固体支持体上または固体支持体中で乾燥させる。他の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、噴霧乾燥技術を使用して、固体支持体上または固体支持体中で乾燥させる。
【００６５】
ある実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、パネル、トレイ、カセット、またはプレート（例えばマイクロタイタープレート）のウェル中であらかじめ混合し、乾燥させる。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）  Ｐａｎｅｌ（ＢＤ、ＵＳＡ）のウェル、ＢＢＬ（商標）  Ｃｒｙｓｔａｌ（商標）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ、ＵＳＡ）のパネルのウェル、Ｖｉｔｅｋ（登録商標）  ｃａｒｄ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ＵＳＡ）、ＭｉｃｒｏＳｃａｎ  ｐａｎｅｌ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ、ＵＳＡ）のウェル、またはＲｅｍｅｌ  ＲａｐＩＤ（商標）  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｅｍｅｌ、ＵＳＡ）のパネルのウェルなどの、トレイ、カセット、マイクロタイマープレート、またはパネルのウェル中であらかじめ混合し、乾燥させる。本明細書に記載の組成物を、例えば、例えば５０℃から１００℃、５０℃から８５℃、５０℃から７５℃、６０℃から７５℃、または６０℃から７０℃の温度の熱を使用して、その中でまたはその上で乾燥させてもよいウェルを有するパネルの説明のために、例えば、特許文献１および特許文献２（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。他の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、チューブ、例えば試験管またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中であらかじめ混合し、乾燥させる。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、ＡＰＩ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｓｔ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ＵＳＡ）のためにチューブ中であらかじめ混合し、乾燥させる。
【００６６】
特定の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）  Ｐａｎｅｌ（ＢＤ、ＵＳＡ）のウェル中で乾燥して存在し、ＢＤ  Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ、ＵＳＡ）などの自動化システムは、基質利用を検出するために使用される。基質利用の検出のための自動化システムの説明のために、例えば、特許文献１、特許文献３、特許文献４、および特許文献５（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。特定の実施形態において、生理食塩水緩衝液またはブロス（例えばＡＳＴブロスもしくはＩＤブロス（ＢＤ、ＵＳＡ））において再懸濁された純粋な細菌試料は、本明細書に記載の組成物を含む個々のウェルを有するＰｈｏｅｎｉｘ（商標）  ｐａｎｅｌ（ＢＤ、ＵＳＡ）に添加され、パネルは、ＢＤ  Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ、ＵＳＡ）において、ある期間、インキュベートされ、基質利用は、異なる時点で検出される。
【００６７】
他の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、ＢＢＬ（商標）  Ｃｒｙｓｔａｌ（商標）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ、ＵＳＡ）のパネルのウェル中で乾燥して存在し、ＢＢＬ（商標）  Ｃｒｙｓｔａｌ（商標）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ、ＵＳＡ）などの自動化システムは、基質利用を検出するために使用される。他の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、Ｖｉｔｅｋ（登録商標）  ｃａｒｄ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ＵＳＡ）のウェル中で乾燥して存在し、Ｖｉｔｅｋ（登録商標）  ｓｙｓｔｅｍ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ＵＳＡ）などの自動化システムは、基質利用を検出するために使用される。他の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、ＭｉｃｒｏＳｃａｎ  ｐａｎｅｌ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ、ＵＳＡ）のウェル中で乾燥して存在し、ＭｉｃｒｏＳｃａｎ  Ｗａｌｋ−Ａｗａｙ（登録商標）  ｓｙｓｔｅｍ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ、ＵＳＡ）などの自動化システムは、基質利用を検出するために使用される。
【００６８】
他の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、タブレットの形態をしている。タブレットおよび細菌細胞懸濁液は、任意のタイプの適した容器（例えばマイクロタイタープレートのウェル、試験管、またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ）中で組み合わせることができ、基質利用は、選ばれる基質に依存して変わるであろう適切な技術またはデバイスによって検出することができる。
【００６９】
他の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、乾燥パウダーの形態をしている。乾燥パウダーおよび細菌細胞懸濁液は、任意のタイプの適した容器（例えばマイクロタイタープレートのウェル、試験管、またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ）中で組み合わせることができ、基質利用は、選ばれる基質に依存して変わるであろう適切な技術またはデバイスによって検出することができる。
【００７０】
特定のベータ−ラクタマーゼの存在の検出における使用のための異なる組成物は、同じ供給源からの細菌試料と同時にまたは順次に接触させることができる。特定の実施形態において、異なる組成物（例えば第１の組成物および第２の組成物）は、互いに、約１分間から約１５分、約１分間から約１０分、約１分間から約５分、約２秒間から約６０秒、約２秒間から約４５秒、約２秒間から約３０秒、約５秒間から約６０秒、または約５秒間から約３０秒以内で同じ供給源からの細菌試料と接触させる。他の実施形態において、異なる組成物（例えば第１の組成物および第２の組成物）は、互いに、約１５分、約１０分、約５分、約４分、約２分、または約１分以内で、同じ供給源からの細菌試料と接触させる。
【００７１】
いくつかの実施形態において、特定のベータ−ラクタマーゼの存在について試験される細菌試料に加えて、１つまたは複数の特定のベータ−ラクタマーゼを発現することが知られている細菌試料（つまり陽性対照）が、本明細書に提示される方法に含まれる。他の実施形態において、特定のベータ−ラクタマーゼの存在について試験される細菌試料に加えて、１つまたは複数の特定のベータ−ラクタマーゼを発現しないことが知られている細菌試料（つまり陰性対照）が、本明細書に提示される方法に含まれる。他の実施形態において、特定のベータ−ラクタマーゼの存在について試験される細菌試料に加えて、１つまたは複数の特定のベータ−ラクタマーゼを発現することが知られている細菌試料（つまり陽性対照）および１つまたは複数の特定のベータ−ラクタマーゼを発現しないことが知られている細菌試料（つまり陰性対照）が、本明細書に提示される方法に含まれる。例えば、ＡｍｐＣベータ−ラクタマーゼの陽性対照は、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７００６０３とすることができ、陰性対照は、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２５９２２とすることができる。配列決定などの分子的および／または生化学的方法を使用して、本明細書に記載のアッセイのための陽性対照および陰性対照を同定して、特定の細菌株による特定のベータ−ラクタマーゼの発現を決定することができる。
【００７２】
一般に、本明細書に提示される方法の一部として利用される異なる組成物と接触させた細菌試料は、同じ供給源由来である。いくつかの実施形態において、本明細書に提示される方法に従って組成物と接触させた細菌試料は、純粋な細菌試料である。ある他の実施形態において、本明細書に提示される方法に従って組成物と接触させた細菌試料は、細菌培養物からの試料であり、これは、患者標本などの特定の供給源からの試料が接種され、細菌が増殖することを可能にするために、ある期間、インキュベートされたものである。一実施形態において、細菌試料は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質の基質利用を検出するのに必要とされる細菌の最小量を少なくとも含有する。特定の実施形態において、細菌試料は、少なくとも１０3コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌ、好ましくは少なくとも１０5ＣＦＵ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１０6、および最も好ましくは少なくとも１０7ＣＦＵ／ｍｌの細菌を含む。他の実施形態において、細菌試料は、約１０3ＣＦＵ／ｍｌから約１０12ＣＦＵ／ｍｌ、約１０5ＣＦＵ／ｍｌから約１０12ＣＦＵ／ｍｌ、約１０6ＣＦＵ／ｍｌから約１０12ＣＦＵ／ｍｌ、または約１０7ＣＦＵ／ｍｌから約１０12ＣＦＵ／ｍｌの細菌を含む。特定の実施形態において、細菌試料は、約１０7ＣＦＵ／ｍｌから約１０10ＣＦＵ／ｍｌの細菌を含む。一実施形態において、およそ同じ数の細菌が、それぞれの組成物と接触させる各細菌試料中にある。特定の実施形態において、およそ同じ量のＣＦＵを、それぞれの組成物と接触させる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、細菌試料は、細胞懸濁液を作製するために緩衝液、滅菌水、生理食塩水、またはブロス（例えばＡＳＴブロスもしくはＩＤブロス（ＢＤ、ＵＳＡ））に添加される、細菌の試料である。一実施形態において、同じ量の細胞懸濁液は、それぞれの組成物と接触させる。特定の実施形態において、各組成物と接触させる細胞懸濁液の混濁度は、利用されるデバイスが基質利用を検出する、許容できる範囲内にある。他の実施形態において、それぞれの組成物と接触させる細胞懸濁液の混濁度は、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ  ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ  ｒｅａｄｅｒによって測定されるように、約０．１から約３、約０．２から約２．５、または約０．２から約２である。他の実施形態において、それぞれの組成物と接触させる細胞懸濁液の混濁度は、ＰｈｏｅｎｉｘＳｐｅｃによって測定されるように、約０．１から約４、約０．２から約５、または約０．２５から約４ＭａｃＦａｒｌａｎｄである。他の実施形態において、それぞれの組成物と接触させる細胞懸濁液の混濁度は、約５から１０倍希釈した後にＰｈｏｅｎｉｘＳｐｅｃによって測定されるように、約０．１から約５、約０．１から約４、約０．２から約５、または約０．２５から約４ＭａｃＦａｒｌａｎｄである。他の実施形態において、それぞれの組成物と接触させる細胞懸濁液の混濁度は、ＰｈｏｅｎｉｘＳｐｅｃ（ＢＤ、ＵＳＡ）によって測定されるように、約０．４から約０．８、約０．５から約０．７、または約０．５から約０．６ＭａｃＦａｒｌａｎｄである。
【００７４】
特定の実施形態において、１つを超える、２つを超える、またはそれ以上の組成物において存在する同じ阻害剤の濃度は、同じまたは類似している（互いに約１０％以内で）。他において、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質の濃度は、すべての組成物において、同じまたは類似している（つまり互いに約１０％以内で）。他の実施形態において、本明細書に提示される任意の方法において利用される各組成物は、約ｐＨ５から約ｐＨ８、好ましくは約ｐＨ５．５から約ｐＨ７．５、およびより好ましくはｐＨ６から約ｐＨ７である。特定の実施形態において、各組成物は、同じまたは類似したｐＨを有する（つまり互いに約１０％または約５％以内で）。
【００７５】
特定の実施形態において、本明細書に提示される方法の接触ステップは、約２０℃から約４２℃、より好ましくは約２５℃から約４０℃、および最も好ましくは約３７℃で行われる。他の実施形態において、それぞれの組成物は、同じまたはおよそ同じ（つまり５℃以内で）温度で、本明細書に提示される方法に従って同じ供給源からの細菌試料と接触させる。
【００７６】
本明細書に提示される方法の検出ステップは、特定の検出可能な基質のための標準的な方法（例えば発色ベータ−ラクタマーゼ基質の目視観察および／または分光光度法）による検出を可能にするために、ベータ−ラクタマーゼについて陽性な細菌試料によって利用されるのに十分な基質について、必要とされる最小量の時間、実行することができる。
【００７７】
特定の実施形態において、本明細書に提示される方法の検出ステップは、接触ステップの後に、約２分から約６０分間、好ましくは約２分から約４５分間または約２分から約３０分間、より好ましくは約２分から約１５分間、および最も好ましくは約２分から約１０分間、実行される。他の実施形態において、本明細書に提示される方法の検出ステップは、接触ステップの後に、約１５分から約５時間、約３０分から約５時間、約３０分から約４時間、約３０分から約５時間、約１時間から約２時間、約１時間から約３時間、約１時間から約４時間、約１時間から約５時間、約２時間から約４時間、約２時間から約５時間、または約２時間から約６時間、実行される。他の実施形態において、本明細書に提示される方法の検出ステップは、約２４時間、約２０時間、約１８時間、約１６時間、約１２時間、約８時間、約４時間、約２時間、または約１時間にわたり、異なる時点で実行される。特定の実施形態において、検出ステップは、同じ供給源からの各細菌試料を、同じ量の時間、各組成物と接触させた後に、実行される。
【００７８】
いくつかの実施形態において、同じ供給源からの細菌試料を異なる組成物と接触させた場合の基質利用の速度が比較される。特定の実施形態において、基質利用の速度を計算するためのソフトウェアを有する分光光度計が使用される。異なるベータ−ラクタマーゼの酵素活性は、組成物中に含まれる検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質の濃度、組成物中に含まれる阻害剤の濃度およびタイプ、組成物のｐＨ、ならびに接触ステップが行われる温度によって異なって影響を与えられてもよい。例えば、セリンカルバペネマーゼは、クロキサシリンおよびクラブラン酸を含む組成物において存在するベータ−ラクタマーゼ基質と類似した速度で、クロキサシリンを含む組成物において存在するベータ−ラクタマーゼ基質を利用することができる。その一方で、メタロ−ベータ−ラクタマーゼは、それが、ベータ−ラクタマーゼ基質および金属キレート剤を含む組成物において存在するベータ−ラクタマーゼ基質を利用することができるよりも速く、ベータ−ラクタマーゼ基質を利用することができる。
【００７９】
いくつかの実施形態において、基質利用を決定する場合、組成物の間の質的差異が比較される。例えば、ニトロセフィンなどの発色ベータ−ラクタマーゼ基質が組成物において使用される場合、組成物が、特定の色（例えばニトロセフィンについては赤色）に変わるかどうかが評価されてもよい。他の実施形態において、基質利用を決定する場合、組成物の間の量的差異が比較される。例えば、ニトロセフィン、発色ベータ−ラクタマーゼ基質が組成物において使用される場合、赤色に変わる基質の割合を評価することができる。
【００８０】
基質利用を評価するために使用される特定の技術は、選ばれる基質に依存して変わるであろう。例えば、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質が、色素基質（例えばニトロセフィンまたはＰＡＤＡＣ（登録商標））である場合、基質利用は、目視観察または分光光度法によって評価することができる（例えばニトロセフィンについて４９２ｎｍまたは３９０ｎｍの波長で）。特に、ニトロセフィンの加水分解は、例えば、黄色から赤色に変わる基質の色を視覚的に観察することによって検出することができる。ＰＡＤＡＣ（登録商標）の加水分解は、紫色から黄色に変わる基質の色を視覚的に観察することによって検出することができる。検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質が蛍光基質である場合、基質利用は、基質の蛍光を測定することによって検出することができる。異なる抗生物質は、異なる波長を有し、細菌種による、基質としての抗生物質の使用は、組成物の波長の変化をもたらすであろう。したがって、いくつかの実施形態において、分光光度計は、ベータ−ラクタマーゼ基質として抗生物質を含む組成物の波長の変化をモニターするために使用される。
【００８１】
特定の実施形態において、ＢＤ  Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ、ＵＳＡ）が、基質利用を評価するために使用される。他の実施形態において、Ｖｉｔｅｋ（登録商標）２  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ＵＳＡ）が、基質利用を評価するために使用される。他の実施形態において、ＭｉｃｒｏＳｃａｎ  Ｗａｌｋ−Ａｗａｙ（登録商標）  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ、ＵＳＡ）が、基質利用を評価するために使用される。
【００８２】
４．２  ベータ−ラクタマーゼアッセイにおける使用のための組成物
特定のベータ−ラクタマーゼの検出における使用のための組成物は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を含むことができる。容易に検出可能な任意のベータ−ラクタマーゼ基質は、本明細書に提示される組成物において使用することができる。検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質の非限定的な例は、色素基質、蛍光基質、および抗生物質を含む。発色ベータ−ラクタマーゼ基質は、ニトロセフィン（３−［２，４−ジニトロスチリル］−７−（２−チエニルアセトアミド］３−セフェム−４−カルボン酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））、ＰＡＤＡＣ（登録商標）（ピリジニウム−２−アゾ−ｐ−ジメチルアニリン発色団（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））、ＣＥＮＴＡ（商標）（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＨＭＲＺ−８６（（７Ｒ）−７［２−アミノチアゾール−４−イル］−（ｚ）−２−（１−カルボキシ−１−メチルエトキシイミノ）アセトアミド）−３−（２，４−ジニトロスチリル）−（３−セフェム−４−カルボン酸トリフルオロアセテート、Ｅ−異性体（関東化学株式会社  東京、日本）、およびセフェゾンを含むが、これらに限定されない。蛍光基質は、Ｆｌｕｏｒｃｉｌｌｉｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４９５／５２５およびＦｌｕｏｒｏｃｉｌｌｉｎ  Ｇｒｅｅｎ  ３４５／３５０  ＬＩＶＥ  ＢＬＡＺＥＲ（商標）−ＦＲＥＴ  Ｂ／Ｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含むが、これらに限定されない。抗生物質は、ベータ−ラクタム、ペニシリン、アモキシシリンなどを含む。特定の実施形態において、分光光度法および目視観察などの、当業者に知られている技術によって検出されるような基質利用を示す基質の濃度は、本明細書に提示される組成物において使用される。
【００８３】
特定の実施形態において、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質は、ニトロセフィンである。特定の実施形態において、ニトロセフィンは、約１μＭから約１ｍＭ、約１μＭから約７５０μＭ、約１μＭから約５００μＭ、または約１μＭから約２５０μＭの濃度で、本明細書に記載の組成物において存在する。他の実施形態において、ニトロセフィンは、約２０μＭから約２００μＭの濃度で、本明細書に記載の組成物において存在する。
【００８４】
他の実施形態において、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質は、ＣＥＮＴＡ（商標）である。特定の実施形態において、ＣＥＮＴＡ（商標）は、約１μＭから約１ｍＭ、約１μＭから約７５０μＭ、約１μＭから約５００μＭ、または約１μＭから約２５０μＭの濃度で、本明細書に記載の組成物において存在する。他の実施形態において、ＣＥＮＴＡ（商標）は、約２０μＭから約２００μＭの濃度で、本明細書に記載の組成物において存在する。
【００８５】
他の実施形態において、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質は、ＨＭＲＺ−８６である。特定の実施形態において、ＨＭＲＺ−８６は、約１μＭから約１ｍＭ、約１μＭから約７５０μＭ、約１μＭから約５００μＭ、または約１μＭから約２５０μＭの濃度で、本明細書に記載の組成物において存在する。他の実施形態において、ＨＭＲＺ−８６は、約２０μＭから約２００μＭの濃度で、本明細書に記載の組成物において存在する。
【００８６】
検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質に加えて、本明細書に提示される方法における使用のための組成物は、以下のベータ−ラクタマーゼ阻害剤のうちの１、２つ、またはそれ以上を含んでいてもよい。すなわち、ＡｍｐＣ阻害剤、セリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤、金属キレート剤、およびＥＳＢＬ阻害剤である。特定の実施形態において、組成物は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む。他の実施形態において、組成物は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む。他の実施形態において、組成物は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤、ならびに金属キレート剤を含む。他の実施形態において、組成物は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む。他の実施形態において、組成物は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および金属キレート剤を含む。他の実施形態において、組成物は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＥＳＢＬ阻害剤を含む。当業者が十分に理解するように、細菌の濃度および検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質の濃度は、組成物に添加される阻害剤の濃度に影響を与えるであろう。さらに、当業者は、各組成物が、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および／または阻害剤の異なる組合せを含む異なる組成物と陽性対照細菌試料（および最適には陰性対照細菌試料）を接触させることによって、経験的に、組成物において使用するための阻害剤の濃度範囲をルーチン的に決定することができるであろう。
【００８７】
本明細書において使用されるように、用語「ＡｍｐＣ阻害剤」は、セリンカルバペネマーゼ、メタロ−ベータ−ラクタマーゼ、ＯＳＢＬ、およびＥＳＢＬの酵素活性ではなく、特定の濃度でＡｍｐＣの酵素活性を阻害する作用物質を指す。ＡｍｐＣ阻害剤の非限定的な例は、クロキサシリン（ＶＷＲ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡ）、クロキサシリンの塩形態、ｓｙｎ２１９０（ＮＡＥＪＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．、Ｅｄｍｏｎｔｏｎ、Ａｌｂｅｒｔａ、Ｃａｎａｄａ）、クロキサシリンの塩形態（クロキサシリンのナトリウム塩形態またはカリウム塩形態など）、アズトレオナム（ＶＷＲ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）、ならびにボロン酸およびその誘導体（Ｆｏｃｕｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＬＬＣ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ならびにその組合せを含む。一実施形態において、ＡｍｐＣ阻害剤は、クロキサシリンである。特定の実施形態において、ＡｍｐＣ阻害剤を含む組成物は、約１μＭから約１００ｍＭ、約１μＭから約７５ｍＭ、約１μＭから約５０ｍＭ、約１μＭから約２５ｍＭ、約１μＭから約１０ｍＭ、または約１μＭから約５ｍＭのＡｍｐＣ阻害剤を含有する。他の実施形態において、ＡｍｐＣ阻害剤を含む組成物は、約１００μＭから約４ｍＭ、約２００μＭから約４ｍＭ、５００μＭから約４ｍＭ、約７５０μＭから約４ｍＭ、または約１ｍＭから約４ｍＭのＡｍｐＣ阻害剤を含有する。他の実施形態において、ＡｍｐＣ阻害剤を含む組成物は、約５００μＭから約３ｍＭ、約１ｍＭから約３ｍＭ、約１．５ｍＭから約３ｍＭ、または約２ｍＭから約３ｍＭのＡｍｐＣ阻害剤を含有する。特定の実施形態において、ＡｍｐＣ阻害剤は、クロキサシリンである。特定の実施形態において、組成物は、約２０μＭから約５ｍＭのクロキサシリンまたはその塩形態を含む。
【００８８】
本明細書において使用されるように、用語「セリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤」は、クラスＡセリンカルバペネマーゼおよびＡｍｐＣではなく、特定の濃度で、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬの酵素活性を阻害する作用物質を指す。セリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤の非限定的な例は、クラブラン酸（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、ＵＫ）、クラブラン酸の塩形態（クラブラン酸のナトリウム塩形態など）、タゾバクタム（Ｗｙｅｔｈ  Ａｙｅｒｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）、スルバクタム（Ｐｆｉｚｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）、およびその組合せを含む。一実施形態において、セリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤は、クラブラン酸である。特定の実施形態において、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないクラブラン酸またはその塩形態を含む組成物は、約１０μＭから約１００ｍＭ、約１０μＭから約７５ｍＭ、約１０μＭから約５０ｍＭ、約１０μＭから約２５ｍＭ、約１０μＭから約１０ｍＭ、または約１０μＭから約５ｍＭのクラブラン酸またはその塩形態を含有する。他の実施形態において、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないクラブラン酸またはその塩形態を含む組成物は、約１０μＭから約２ｍＭ、約２５μＭから約２ｍＭ、５０μＭから約２ｍＭ、約７５μＭから約２ｍＭ、または約１００μＭから約２ｍＭのクラブラン酸またはその塩形態を含有する。他の実施形態において、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないクラブラン酸またはその塩形態を含む組成物は、約２００μＭから約２ｍＭ、約２５０μＭから約２ｍＭ、約３００μＭから約２ｍＭ、約４００μＭから約２ｍＭ、または約５００μＭから約２ｍＭのクラブラン酸またはその塩形態を含有する。他の実施形態において、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないクラブラン酸またはその塩形態を含む組成物は、約１μＭから約２ｍＭ、約１μＭから約１．５ｍＭ、約１μＭから約１ｍＭ、約１μＭから約７５０μＭ、約１μＭから約５００μＭ、約１μＭから約２５０μＭ、または約１μＭから５０μＭのクラブラン酸またはその塩形態を含有する。特定の実施形態において、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量のだがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないクラブラン酸またはその塩形態を含む組成物は、約５００μＭから約１．５ｍＭのクラブラン酸またはその塩形態を含有する。一実施形態において、セリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤は、タゾバクタムである。特定の実施形態において、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないタゾバクタムまたはその塩形態を含む組成物は、約１００μＭから約１ｍＭ、約１００μＭから約７５０μＭ、約１００μＭから約５００μＭ、または約１００μＭから約２５０μＭのタゾバクタムまたはその塩形態を含有する。他の実施形態において、セリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤は、スルバクタムである。特定の実施形態において、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないスルバクタムまたはその塩形態を含む組成物は、約１００μＭから約５ｍＭ、約１００μＭから約４ｍＭ、約１００μＭから約３ｍＭ、約１００μＭから約２ｍＭ、または約１００μＭから約１ｍＭのスルバクタムまたはその塩形態を含有する。他の実施形態において、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないスルバクタムまたはその塩形態を含む組成物は、約１００μＭから約７５０μＭ、約１００μＭから約５００μＭ、１００μＭから約２５０μＭ、約１００μＭから約２００ｍＭ、または約１００μＭから約１５０μＭのスルバクタムまたはその塩形態を含有する。
【００８９】
金属キレート剤の非限定的な例は、ジピコリン酸（ＤＰＣ）、ジエチルジチオカルバメート（ＤＥＤＴＣ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス−（２−ピリジルメチル）−エチレンジアミン（ＴＰＥＮ）（ＶＷＲ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）、ＥＤＴＡ（ＶＷＲ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）、および１，１０−フェナントロリン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を含む。特定の実施形態において、金属キレート剤は、亜鉛特異的である。ＴＰＥＮは、亜鉛特異的金属キレート剤の非限定的な例である。代替的実施形態において、金属キレート剤は、亜鉛に結合することができるが、亜鉛特異的ではない。ＤＭＰＳ、ＥＤＴＡ、１，１０−フェナントロリン、ＤＰＣ、およびＤＥＤＴＣは、亜鉛特異的ではない金属キレート剤の非限定的な例である。好ましい実施形態において、金属キレート剤は、膜浸透性である。いくつかの実施形態において、組成物は、約０．５ｍＭから約２００ｍＭ、約１ｍＭから約１００ｍＭ、または約１ｍＭから約５０ｍＭの濃度のＥＤＴＡ、ＤＭＰＳ、１，１０−フェナントロリン、ＤＰＣ、ＤＥＤＴＣ、またはＴＰＥＮを含む。特定の実施形態において、組成物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭ、約０．５ｍＭから約７ｍＭ、約０．５ｍＭから約５ｍＭ、約０．５ｍＭから約２ｍＭ、または約０．５ｍＭから約１ｍＭの濃度のＤＰＣを含む。他の実施形態において、組成物は、約１ｍＭから約２０ｍＭ、約１ｍＭから約１５ｍＭ、約１ｍＭから約１０ｍＭ、約１ｍＭから約７ｍＭ、約１ｍＭから約５ｍＭ、または約１ｍＭから約２ｍＭの濃度のＤＥＤＴＣを含む。
【００９０】
本明細書において使用されるように、用語「ＥＳＢＬ阻害剤」は、ＯＳＢＬの酵素活性ではなく、特定の濃度で、ＥＳＢＬの酵素活性を阻害する作用物質を指す。ＥＳＢＬ阻害剤の非限定的な例は、セフタジジム（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、ＵＫ）、セフタジジムの塩形態、セフォタキシム（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）、セフォタキシムの塩形態、およびその組合せを含む。一実施形態において、ＥＳＢＬ阻害剤は、セフタジジムである。特定の実施形態において、組成物は、約１ｍＭから約２０ｍＭ、約１ｍＭから約１５ｍＭ、約１ｍＭから約１０ｍＭ、約１ｍＭから約７ｍＭ、約１ｍＭから約５ｍＭ、または約１ｍＭから約２ｍＭの濃度のセフタジジムまたはその塩形態を含む。他の実施形態において、ＥＳＢＬ阻害剤は、セフォタキシムまたはその塩形態である。特定の実施形態において、組成物は、約１ｍＭから約２０ｍＭ、約１ｍＭから約１５ｍＭ、約１ｍＭから約１０ｍＭ、約１ｍＭから約７ｍＭ、約１ｍＭから約５ｍＭ、または約１ｍＭから約２ｍＭの濃度のセフォタキシムまたはその塩形態を含む。他の実施形態において、ＥＳＢＬ阻害剤は、セフタジジムおよびセフォタキシムの組合せである。特定の実施形態において、組成物は、約１ｍＭから約２０ｍＭ、約１ｍＭから約１５ｍＭ、約１ｍＭから約１０ｍＭ、約１ｍＭから約７ｍＭ、約１ｍＭから約５ｍＭ、または約１ｍＭから約２ｍＭの濃度のセフタジジムまたはその塩形態およびセフォタキシムまたはその塩形態の組合せを含む。
【００９１】
検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤に加えて、１つまたは複数のベータ−ラクタマーゼの検出における使用のための組成物は、緩衝液を含んでいてもよい。組成物のｐＨの維持を助け、ベータ−ラクタマーゼ基質の加水分解または１つもしくは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤の活性またはその両方に干渉しない任意の緩衝液を、使用することができる。緩衝液の非限定的な例は、リン酸ＭＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、ＭＤＰＳ緩衝液、およびＨＥＰＥＳ緩衝液を含む。特定の実施形態において、組成物は、０．０５から１ｍｌのリン酸緩衝液またはＭＥＳ緩衝液を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態において、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤に加えて、組成物は、細菌の細胞壁の破裂を容易にするために酵素、非イオン性界面活性剤、またはＥＤＴＡなどの作用物質を含む。当業者が十分に理解するように、本明細書に提示される組成物におけるＥＤＴＡの使用は、濃度に依存して、メタロ−ベータ−ラクタマーゼを阻害し得る。したがって、当業者は、本明細書に提示される組成物にＥＤＴＡを添加する前にこれを考慮するべきである。好ましい実施形態において、組成物は、細菌の細胞壁の破裂を容易にするさらなる作用物質を含まない。
【００９３】
ある実施形態において、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤に加えて、本明細書に記載の組成物は、溶解試薬を含む。溶解試薬は、当業者に知られている。特定の実施形態において、溶解試薬は、細菌細胞を溶解するが、ベータ−ラクタマーゼ基質の加水分解または１つもしくは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤の活性またはその両方に干渉しない。一実施形態において、溶解試薬は、マイルドな非変性界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００またはＣＨＡＰＳ）などの界面活性剤である。他の実施形態において、溶解試薬は、細菌細胞の溶解を促進する酵素または他の作用物質である。そのような酵素の非限定的な例は、リゾチーム、ラビアーゼ、リソスタフィン、アクロモペプチダーゼ、およびムタノリシンを含む。特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、または約５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの、細菌細胞の溶解を促進する酵素または他の作用物質を含む。他の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約８ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約６ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、または約３ｍｇ／ｍｌの、細菌細胞の溶解を促進する酵素または他の作用物質を含む。
【００９４】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、リゾチームを含む。特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、または約５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む。他の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約８ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約６ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、または約３ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む。
【００９５】
ある実施形態において、本明細書に記載の組成物は、溶解試薬（例えばリゾチーム、ラビアーゼ、リソスタフィン、アクロモペプチダーゼ、またはムタノリシン）および溶解試薬の安定化を促進する作用物質を含む。特定の実施形態において、溶解試薬の安定化を促進する作用物質は、ベータ−ラクタマーゼ基質の加水分解または１つもしくは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤の活性またはその両方に干渉しない。一実施形態において、溶解試薬の安定化を促進する作用物質は、熱安定性である。特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、約０．１％から約１０％、約１％から約１０％、約２％から約１０％、約４％から約１０％、約１％から約８％、約２％から約８％、約２％から約６％、または約２％から約４％の、溶解試薬の安定化を促進する作用物質を含む。
【００９６】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、溶解試薬および炭水化物、例えば単糖、二糖、多糖、オリゴ糖、またはポリオールを含む。炭水化物の特定の例は、マンニトール、リボース、グルコース、フルクトース、マンノース、スクロース、ラクトース、グリセロール、キサンタンガム、トレハロース、およびグリコール（例えばプロピレングリコール）を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、炭水化物は、トレハロースである。
【００９７】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、リゾチームおよびトレハロースを含む。特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、または約５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、および約０．１％から約１０％、約１％から約１０％、約２％から約１０％、約４％から約１０％、約１％から約８％、約２％から約８％、約２％から約６％、または約２％から約４％のトレハロースを含む。他の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約８ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約６ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、または約３ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、および約０．１％から約１０％、約１％から約１０％、約２％から約１０％、約４％から約１０％、約１％から約８％、約２％から約８％、約２％から約６％、または約２％から約４％のトレハロースを含む。
【００９８】
ある実施形態において、本明細書に記載の組成物は、溶解試薬（例えばリゾチーム、ラビアーゼ、リソスタフィン、アクロモペプチダーゼ、またはムタノリシン）およびさらなる作用物質、例えば、溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質（例えば金属キレート剤）を含む。ある実施形態において、本明細書に記載の組成物は、溶解試薬（例えばリゾチーム、ラビアーゼ、リソスタフィン、アクロモペプチダーゼ、またはムタノリシン）、溶解試薬の安定化を促進する作用物質、およびさらなる作用物質、例えば、溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質（例えば金属キレート剤）を含む。特定の実施形態において、溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質は、ベータ−ラクタマーゼ基質の加水分解または１つもしくは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤の活性またはその両方に干渉しない。特定の実施形態において、溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質は、溶解試薬が作用物質の非存在下において細菌細胞を溶解する速度に比べて、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、または約７５％、溶解試薬が細菌細胞を溶解する速度を増加させる。他の実施形態において、溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質は、溶解試薬が作用物質の非存在下において細菌細胞を溶解する速度に比べて、約１０％から約５０％、約１０％から約７５％、約２５％から約７５％、約２５％から約５０％、約２５％から約４０％、約２５％から約３０％、または約５０％もしくは約７５％、溶解試薬が細菌細胞を溶解する速度を増加させる。一実施形態において、本明細書に記載の組成物は、約０．１ｍＭから約５ｍＭ、約１ｍＭから約４ｍＭ、約１ｍＭから約３ｍＭ、約２ｍＭから約３ｍＭ、または約０．１から約２ｍＭの、溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質を含む。
【００９９】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、溶解試薬（例えばリゾチーム、ラビアーゼ、リソスタフィン、アクロモペプチダーゼ、またはムタノリシン）、溶解試薬の安定化を促進する作用物質、およびＥＤＴＡまたはＥＧＴＡを含む。特定の実施形態において、メタロ−ベータ−ラクタマーゼが検出されるか、または検出され得る場合、ＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡまたはその両方は、利用されない。
【０１００】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、リゾチーム、トレハロース、およびＥＤＴＡを含む。特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、または約５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、約０．１％から約１０％、約１％から約１０％、約２％から約１０％、約４％から約１０％、約１％から約８％、約２％から約８％、約２％から約６％、または約２％から約４％のトレハロース、および約０．１ｍＭから約５ｍＭ、約１ｍＭから約４ｍＭ、約１ｍＭから約３ｍＭ、約２ｍＭから約３ｍＭ、または約０．１から約２ｍＭのＥＤＴＡを含む。他の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約８ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約６ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、または約３ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、約０．１％から約１０％、約１％から約１０％、約２％から約１０％、約４％から約１０％、約１％から約８％、約２％から約８％、約２％から約６％、または約２％から約４％のトレハロース、および約０．１ｍＭから約５ｍＭ、約１ｍＭから約４ｍＭ、約１ｍＭから約３ｍＭ、約２ｍＭから約３ｍＭ、または約０．１から約２ｍＭのＥＤＴＡを含む。
【０１０１】
組成物は、細菌試料との組成物の接触に続いて、基質利用の検出に適用可能な任意の形態とすることができる。例えば、組成物は、寒天プレート、ペーパーディスク、ペーパーストリップ中に埋め込まれた液体組成物、タブレットの形態、ウェル中の乾燥形態、または１つもしくは複数のチューブ中の乾燥形態をしていてもよい。特定の実施形態において、組成物は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数の異なるベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む液体組成物をそれぞれ有する液体組成物である。液体組成物の使用は、以下の第６節において提供される実施例において例示される。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、組成物は、プレート、パネル、カセット、もしくはトレイのウェル、ペーパーストリップ、ペーパーディスク、またはチューブなどの固体支持体上または固体支持体中で乾燥して、存在する。ある実施形態において、組成物は、例えば５０℃から１００℃、５０℃から８５℃、５０℃から７５℃、６０℃から７５℃、または６０℃から７０℃の温度の熱を使用して、固体支持体上または固体支持体中で乾燥させる。一実施形態において、組成物は、例えば５０℃から１００℃、５０℃から８５℃、５０℃から７５℃、６０℃から７５℃、または６０℃から７０℃の温度の、強制空気条件または真空条件下の熱を使用して、固体支持体上または固体支持体中で乾燥させる。他の実施形態において、組成物は、凍結乾燥技術を使用して、固体支持体上または固体支持体中で乾燥させる。他の実施形態において、組成物は、噴霧乾燥技術を使用して、固体支持体上または固体支持体中で乾燥させる。
【０１０３】
他の実施形態において、組成物は、異なる区分に分割され、それぞれの区分が異なる組成物を含む１つの寒天プレートの一部である。例えば、寒天プレートは、３つの区分を含み、それぞれの区分は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数の異なるベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む組成物を含むことができる。他の実施形態において、寒天プレート当たり１つの組成物だけが存在する。言い換えれば、それぞれの寒天プレートは、１つの組成物だけを含み、その結果、異なる組成物を含む２つ以上の寒天プレートが、本明細書に提示される方法において利用される。
【０１０４】
他の実施形態において、組成物は、異なる区分に分割され、それぞれの区分が異なる組成物を含むペーパーディスクまたはペーパーストリップの一部である。例えば、ペーパーディスクまたはペーパーストリップは、３つの区分を含み、それぞれの区分は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数の異なるベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む組成物を含むことができる。他の実施形態において、ペーパーディスクまたはペーパーストリップ当たり１つの組成物だけが存在する。言い換えれば、それぞれのペーパーディスクまたはペーパーストリップは１つの組成物だけを含み、その結果、異なる組成物を含む２つ以上のペーパーディスクまたはペーパーストリップが、本明細書に提示される方法において利用される。特定の実施形態において、ペーパーディスクまたはペーパーストリップは、ろ紙である。他の特定の実施形態において、組成物は、ＢＢＬ（商標）  Ｄｒｙｓｌｉｄｅ（商標）  ニトロセフィン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）に類似する形態で提供される。
【０１０５】
ある実施形態において、本明細書に記載の組成物は、パネル、トレイ、カセット、またはプレート（例えばマイクロタイタープレート）のウェル中で乾燥して、存在する。特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）  Ｐａｎｅｌ（ＢＤ、ＵＳＡ）のウェル、ＢＢＬ（商標）  Ｃｒｙｓｔａｌ（商標）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ、ＵＳＡ）のパネルのウェル、Ｖｉｔｅｋ（登録商標）  ｃａｒｄ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ＵＳＡ）、ＭｉｃｒｏＳｃａｎ  ｐａｎｅｌ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ、ＵＳＡ）のウェル、またはＲｅｍｅｌ  ＲａｐＩＤ（商標）  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｅｍｅｌ、ＵＳＡ）のパネルのウェルなどの、トレイまたはパネルのウェル中で乾燥して、存在する。本明細書に記載の組成物を、例えば熱でまたはその熱を使用して乾燥させてもよいウェルを有するパネルの説明のために、例えば、特許文献１および特許文献２（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、ＡＰＩ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｓｔ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ＵＳＡ）のためのチューブなどのチューブ中で乾燥して、存在する。
【０１０６】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）  Ｐａｎｅｌ（ＢＤ、ＵＳＡ）のウェル中で乾燥して存在し、ＢＤ  Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ、ＵＳＡ）などの自動化システムは、基質利用を検出するために使用される。基質利用の検出のための自動化システムの説明のために、例えば、特許文献１、特許文献４、特許文献３、および特許文献５（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、ＢＢＬ（商標）  Ｃｒｙｓｔａｌ（商標）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ、ＵＳＡ）のパネルのウェル中で乾燥して存在し、ＢＤ  ＢＢＬ（商標）  Ｃｒｙｓｔａｌ（商標）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ、ＵＳＡ）などの自動化システムは、基質利用を検出するために使用される。
【０１０７】
他の実施形態において、組成物は、Ｖｉｔｅｋ（登録商標）（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ＵＳＡ）のウェル中で乾燥して存在し、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  Ｖｉｔｅｋ（登録商標）  ｓｙｓｔｅｍ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ＵＳＡ）などの自動化システムは、基質利用を検出するために使用される。他の実施形態において、組成物は、ＭｉｃｒｏＳｃａｎ  ｐａｎｅｌ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ、ＵＳＡ）のウェル中で乾燥して存在し、ＭｉｃｒｏＳｃａｎ  Ｗａｌｋ−Ａｗａｙ（登録商標）  ｓｙｓｔｅｍなどの自動化システムは、基質利用を検出するために使用される（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ、ＵＳＡ）。
【０１０８】
ある実施形態において、本明細書に記載の組成物は、タブレットの形態をしている。タブレットおよび細菌細胞懸濁液は、任意のタイプの容器（例えばマイクロタイタープレートのウェル、試験管、またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ）中で組み合わせることができ、基質利用は、選ばれる基質に依存して変わるであろう適切な技術またはデバイスによって検出することができる。
【０１０９】
ある実施形態において、本明細書に記載の組成物は、乾燥パウダーの形態をしている。乾燥パウダーおよび細菌細胞懸濁液は、任意のタイプの容器（例えばマイクロタイタープレートのウェル、試験管、またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ）中で組み合わせることができ、基質利用は、選ばれる基質に依存して変わるであろう適切な技術またはデバイスによって検出することができる。
【０１１０】
４．３  細菌試料
任意の供給源からの生物学的試料から単離される、得られる、またはそれに由来する細菌試料は、本明細書に提示される方法において使用することができる。一実施形態において、細菌試料は、対象、例えばヒト対象から得られる生物学的試料から単離される、得られる、またはそれに由来する。そのような生物学的試料が本明細書に提示される方法に従って得られ、利用されてもよい対象の例は、無症状の対象、感染症の１、２、３、４、またはそれ以上の症状を現すまたは示す対象、感染症を有するとして臨床的に診断された対象、感染症に罹患しやすい対象（例えば感染症に対する遺伝的素因を有する対象および対象を感染症に罹患しやすくする、または感染症にかかる可能性を増加させる生活習慣を送る対象）、感染症を有すると疑われる対象、感染症のための療法を受けている対象、感染症および少なくとも１つの他の状態を有する対象（例えば２、３、４、５、またはそれ以上の状態を有する対象）、感染症のための療法を受けていない対象、ならびに感染症と診断されたことがない対象を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、感染症は、グラム陰性細菌感染症である。他の実施形態において、感染症は、グラム陽性細菌感染症である。細菌感染症を引き起こす細菌の非限定的な例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）［例えば肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびクレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）］、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）［例えば黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）］、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）［例えば肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）］、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）［例えば緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）］、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ならびにアシネトバクター  バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）を含むが、これらに限定されない。
【０１１１】
一実施形態において、対象は、非霊長動物（例えば雌ウシ、イヌ、ブタ、ネコ、イヌ、ウマなど）および霊長動物（例えばヒト）などの哺乳動物である。他の実施形態において、対象は、トリ、爬虫類動物、および非ヒト哺乳動物などの非ヒト動物である。他の実施形態において、対象は、家畜（例えばブタ、ウマ、もしくは雌ウシ）、ペット（例えばモルモット、イヌ、もしくはネコ）、および／または実験動物（例えばラットもしくはマウス）である。好ましい実施形態において、対象は、ヒトである。
【０１１２】
生物学的試料は、対象の任意の組織もしくは器官、または対象からの分泌物から得ることができる。対象からの代表的な生物学的試料は、限定を伴うことなく、鼻スワブ、咽頭スワブ、糞便、皮膚スワブ、血液（血液培養物を含む）、痰、サルビア（ｓａｌｖｉａ）、気管支肺胞上皮洗浄液、気管支吸引液、肺組織、脊髄体液、滑液、および尿を含む。いくつかの実施形態において、２、３、またはそれ以上の生物学的試料が、対象から得られる。特定の実施形態において、２つ以上の生物学的試料は、対象からの２つ以上の組織、器官、および／または分泌物から得られる。対象から生物学的試料を得ることに加えて、生物学的試料は、食物、飲料、電話、カウンターなどから得ることができる。生物学的試料を収集するための技術は、当業者らに知られている。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、生物学的試料は、使用の前に保存される。例えば、対象からの生物学的試料は、４℃、−３０℃、または−７０℃で保存することができる。生物学的試料を保存するための技術は、当業者に知られている。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、生物学的試料が得られた後に、生物学的試料は、純粋な細菌試料が得られるように処理することができる、または生物学的試料は、当業者に知られている技術を使用して処理する前に保存することができる。当業者に知られている任意の技術は、純粋な細菌試料を得るために使用することができる。一般に、生物学的試料は、生物学的試料において存在する細菌集団を個々のコロニーとして成長する個々の細胞に分離するために、固体寒天含有培地上に画線される。選ばれる培地ならびに成長条件（例えば環境の温度および気体）は、選択されている細菌に依存するであろう。例えば、１８時間３５℃でインキュベートされた、５％ヒツジ血液を有するＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ（商標）Ｓｏｙ  Ａｇａｒ（ＢＤ、ＵＳＡ）は、個々の細菌コロニーを得るために使用することができる。ある実施形態において、純粋な細菌試料は、細菌試料として２４時間以内に使用される。いくつかの実施形態において、純粋な細菌試料は、使用の前に保存される（例えば４℃または−７０℃で）。細菌試料を保存するための技術は、当業者に知られている。いくつかの実施形態において、純粋な細菌試料のアリコートまたは接種材料は、細菌試料として使用される。他の実施形態において、純粋な細菌試料のアリコートまたは接種材料は、溶解され、産生される細菌細胞抽出物は、細菌試料として使用される。いくつかの実施形態において、細菌細胞抽出物は、使用の前に保存される。
【０１１５】
他の実施形態において、生物学的試料を得た後に、生物学的試料は、培地に接種するために使用することができ、接種された培地は、試料において存在する任意の細菌が増殖することを可能にするために一定の期間、インキュベートされる。選ばれる培地ならびに成長条件（例えば温度は、収集されている細菌に依存するであろう）。例えば、１８時間３５℃でインキュベートされた、５％ヒツジ血液を有するＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ（商標）Ｓｏｙ  Ａｇａｒ（ＢＤ、ＵＳＡ）を使用することができる。いくつかの実施形態において、細菌培養物は、使用の前に保存される（例えば４℃または−７０℃で）。細菌培養物を保存するための技術は、当業者に知られている。いくつかの実施形態において、培養物中の細菌のアリコートまたは接種材料は、細菌試料として使用される。他の実施形態において、培養物中の細菌のアリコートまたは接種材料は、溶解され、産生される細菌細胞抽出物は、細菌試料として使用される。いくつかの実施形態において、細菌細胞抽出物は、使用の前に保存される。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、細菌試料は使用の前に保存される。例えば、細菌試料は、４℃で保存される。
【０１１７】
ある実施形態において、任意の供給源からの生物学的試料から単離される、得られる、またはそれに由来する細菌の試料は、細胞懸濁液を作製するために緩衝液に添加され、細胞懸濁液のアリコートは、細菌試料として使用される。いくつかの実施形態において、任意の供給源からの生物学的試料から単離される、得られる、またはそれに由来する細菌の試料は、細胞懸濁液を作製するために滅菌水に添加され、細胞懸濁液のアリコートは、細菌試料として使用される。特定の実施形態において、任意の供給源からの生物学的試料から単離される、得られる、またはそれに由来する細菌の試料は、細胞懸濁液を作製するために、生理食塩水緩衝液またはブロス（例えば、ＢＤ  Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ、ＵＳＡ）のキットの一部として販売されるＡＳＴブロスまたはＩＤブロス）に添加され、細胞懸濁液のアリコートは、細菌試料として使用される。
【０１１８】
ある実施形態において、純粋な細菌試料は、細胞懸濁液を作製するために緩衝液に添加され、細胞懸濁液のアリコートは、細菌試料として使用される。いくつかの実施形態において、純粋な細菌試料は、細胞懸濁液を作製するために滅菌水に添加され、細胞懸濁液のアリコートは、細菌試料として使用される。特定の実施形態において、純粋な生物学的試料は、細胞懸濁液を作製するために、生理食塩水緩衝液またはブロス（例えば、ＢＤ  Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ、ＵＳＡ）のキットの一部として販売されるＡＳＴブロスまたはＩＤブロス）に添加され、細胞懸濁液のアリコートは、細菌試料として使用される。特定の実施形態において、純粋な細菌試料は、純粋な細菌試料の生成の２４時間またはそれ未満以内に緩衝液、滅菌水、またはブロスに添加される。
【０１１９】
特定の実施形態において、任意の供給源からの生物学的試料から単離される、得られる、またはそれに由来する細菌の試料は、溶解され、産生される細菌細胞抽出物のアリコートは、細菌試料として使用される。細菌を溶解するための技術は、当業者に知られている。細菌を溶解するための技術の非限定的な例は、機械的破壊技術、凍結／解凍技術、および溶解緩衝液技術を含む。例えば、細菌は、例えばブレンダーまたはグラインダーなどの機械的な力を利用して溶解されてもよい。試料容量が小さい場合、液体のホモジナイズ（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）処理または超音波処理が、細菌を溶解するために使用することができる。マイルドな非変性界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００またはＣＨＡＰＳ）などの１つまたは複数の界面活性剤を含む溶解緩衝液もまた、細菌を溶解するために使用することができる。１つもしくは複数の酵素（例えばリゾチーム、ラビアーゼ、リソスタフィン、アクロモペプチダーゼ、もしくはムタノリシン）または細菌細胞溶解を促進する他の作用物質を含む溶解緩衝液が、細菌を溶解するために使用することができる。特定の実施形態において、リゾチームおよび金属キレート剤（例えばＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）を含む溶解緩衝液が、細菌を溶解するために使用することができる。他の実施形態において、リゾチームおよび溶解試薬の安定化を促進する作用物質を含む溶解緩衝液が、細菌を溶解するために使用することができる。他の実施形態において、リゾチーム、溶解試薬の安定化を促進する作用物質、および金属キレート剤（例えばＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）を含む溶解緩衝液が、細菌を溶解するために使用することができる。いくつかの実施形態において、細菌細胞抽出物は、使用の前に保存される。
【０１２０】
４．４  細菌の特性評価
本明細書に提示されるベータ−ラクタマーゼアッセイに加えてまたはそれとの関連において、細菌試料は、当業者に知られている技術を使用して特性評価できる。例えば、細菌試料は、細菌の形態について観察することもでき、および／または異なる染色反応を実行することもできる。形態的な特徴および染色反応は、細菌の同定を助けることができる。特定の実施形態において、グラム染色は、当業者に知られている技術を使用して実行される。ある実施形態において、グラム染色は、本明細書に提示されるベータ−ラクタマーゼアッセイの前に実行される。他の実施形態において、細菌の種を同定するためのアッセイは、当業者に知られている技術を使用して実行される。特定の実施形態において、ＢＤ  Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＩＤ／ＡＳＴ  Ｓｙｓｔｅｍなどの自動化抗生物質感受性機器上で実行されるＩＤは、細菌の種を同定するために実行される。
【０１２１】
４．５  療法の選択
本明細書に提示される方法を利用する特定のベータ−ラクタマーゼの存在の検出は、細菌感染症と診断された患者のための適切な治療計画の選択のための情報を提供することができる。例えば、細菌供給源における特定のベータ−ラクタマーゼの存在の検出は、細菌によって引き起こされる感染症を治療するためにどのような抗生物質が使用されるべきではないかを示してもよく、代替療法、例えば、細菌が耐性ではない他のベータラクタム薬剤または非ベータラクタム薬剤を示唆してもよい。患者のための適切な治療計画を容易にすることに加えて、細菌供給源における特定のベータ−ラクタマーゼの存在の検出は、他の細菌へのベータ−ラクタマーゼの伝達の低下を助けることもでき、かつ／またはベータラクタム耐性細菌の広がりを低下させることもできる。
【０１２２】
４．６  キット
特定のベータ−ラクタマーゼの存在を検出するためのキットが、本明細書に提示される。本明細書に提示されるキットは、本明細書に記載の１つまたは複数の組成物を含むことができる。一実施形態において、キットは、１つまたは複数の容器中に、（ａ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と、（ｂ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物とを含む。いくつかの実施形態において、キットは、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤ならびに金属キレート剤を含む、第３の組成物をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第４の組成物をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＥＳＢＬ阻害剤を含む第５の組成物をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を含み、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含まない第６の組成物をさらに含む。ある実施形態において、これらの組成物はそれぞれ、溶解試薬をさらに含み、場合により溶解試薬の安定化を促進する作用物質および／または溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質をさらに含む。
【０１２３】
他の実施形態において、キットは、１つまたは複数の容器中に、（ａ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と、（ｂ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と、（ｃ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第３の組成物とを含む。いくつかの実施形態において、キットは、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を含み、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含まない第４の組成物をさらに含む。ある実施形態において、これらの組成物はそれぞれ、溶解試薬をさらに含み、場合により溶解試薬の安定化を促進する作用物質および／または溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質をさらに含む。
【０１２４】
他の実施形態において、キットは、１つまたは複数の容器中に、（ａ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と、（ｂ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と、（ｃ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＥＳＢＬ阻害剤を含む第３の組成物とを含む。いくつかの実施形態においてキットは、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を含み、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含まない第４の組成物をさらに含む。ある実施形態において、これらの組成物は、それぞれ溶解試薬をさらに含み、場合により溶解試薬の安定化を促進する作用物質および／または溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質をさらに含む。
【０１２５】
他の実施形態において、キットは、１つまたは複数の容器中に、（ａ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と、（ｂ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と、（ｃ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤ならびに金属キレート剤を含む第３の組成物とを含む。いくつかの実施形態において、キットは、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を含み、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含まない第４の組成物をさらに含む。ある実施形態において、これらの組成物はそれぞれ、溶解試薬をさらに含み、場合により溶解試薬の安定化を促進する作用物質および／または溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質をさらに含む。
【０１２６】
他の実施形態において、キットは、１つまたは複数の容器中に、（ａ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と、（ｂ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と、（ｃ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤および金属キレート剤を含む第３の組成物と、（ｄ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第４の組成物とを含む。いくつかの実施形態において、キットは、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を含み、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含まない第５の組成物をさらに含む。ある実施形態において、これらの組成物はそれぞれ、溶解試薬をさらに含み、場合により溶解試薬の安定化を促進する作用物質および／または溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質をさらに含む。
【０１２７】
他の実施形態において、キットは、１つまたは複数の容器中に、（ａ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＡｍｐＣ阻害剤を含む第１の組成物と、（ｂ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第２の組成物と、（ｃ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、ＡｍｐＣ阻害剤、ＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤ならびに金属キレート剤を含む第３の組成物と、（ｄ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質ならびにＥＳＢＬおよびＯＳＢＬを阻害するのに十分な量だがクラスＡセリンカルバペネマーゼを阻害するのには十分な量ではないセリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む第４の組成物と、（ｅ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質およびＥＳＢＬ阻害剤を含む第５の組成物とを含む。いくつかの実施形態において、キットは、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を含み、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含まない第６の組成物をさらに含む。ある実施形態において、これらの組成物はそれぞれ、溶解試薬をさらに含み、場合により溶解試薬の安定化を促進する作用物質および／または溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質をさらに含む。
【０１２８】
他の実施形態において、キットは、１つまたは複数の容器中に、（ａ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を含む第１の組成物と、（ｂ）検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および金属キレート剤を含む第２の組成物とを含む。ある実施形態において、これらの組成物はそれぞれ、溶解試薬をさらに含み、場合により溶解試薬の安定化を促進する作用物質および／または溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質をさらに含む。
【０１２９】
本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、容易に検出可能な任意のベータ−ラクタマーゼ基質を含むことができる。検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質の非限定的な例は、発色基質、蛍光発生基質および抗生物質を含むが、これらに限定されない。発色ベータ−ラクタマーゼ基質は、ニトロセフィン（３−［２，４−ジニトロスチリル］−７−（２−チエニルアセトアミド］３−セフェム−４−カルボン酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＰＡＤＡＣ（登録商標）（ピリジニウム−２−アゾ−ｐ−ジメチルアニリン発色団（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））、ＣＥＮＴＡ（商標）（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＨＭＲＺ−８６（（７Ｒ）−７［２−アミノチアゾール−４−イル］−（ｚ）−２−（１−カルボキシ−１−メチルエトキシイミノ）アセトアミド）−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸トリフルオロアセテート、Ｅ−異性体（Ｋａｎｔｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ））およびセフェゾンを含む。蛍光発生基質は、Ｆｌｕｏｒｃｉｌｌｉｎ  Ｇｒｅｅｎ４９５／５２５およびＦｌｕｏｒｏｃｉｌｌｉｎ  Ｇｒｅｅｎ３４５／３５０  ＬｉｖｅＢｌａｚｅｒ（商標）−ＦＲＥＴ  Ｂ／Ｇ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、（ＣＡ））を含む。抗生物質は、ベータ−ラクタム、ペニシリン、アモキシシリンなどを含む。
【０１３０】
一実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物はそれぞれ、同じ検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を含有する。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物はそれぞれ、同じまたは類似の（全般に、互いに約１０％以内で）の濃度の、同じ検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書に提示されるキットは、希釈し、組成物に加えることができる、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質の濃縮溶液、例えば、２ｘ、５ｘまたは１０ｘ溶液を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提示されるキットは、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を凍結試薬として含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットは、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を乾燥試薬として含む。
【０１３１】
特定の実施形態において、本明細書に提示されるキットの組成物に含まれる検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質は、発色基質である。より特定の実施形態において、本明細書に提示されるキットの組成物に含まれる検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質は、ニトロセフィンである。特定の実施形態において、ニトロセフィンは、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物中に、約１μＭから約１ｍＭ、約１μＭから約７５０μＭ、約１μＭから約５００μＭまたは約１μＭから約２５０μＭの濃度で存在する。他の実施形態において、ニトロセフィンは、本明細書に記載の組成物中に約２０μＭから約２００μＭの濃度で存在する。
【０１３２】
他の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質は、ＣＥＮＴＡ（商標）である。特定の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、ＣＥＮＴＡ（商標）を、約１μＭから約１ｍＭ、約１μＭから約７５０μＭ、約１μＭから約５００μＭまたは約１μＭから約２５０μＭの濃度で含む。他の実施形態において、ＣＥＮＴＡ（商標）は、本明細書に記載の組成物中に約２０μＭから約２００μＭの濃度で存在する。
【０１３３】
他の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質は、ＨＭＲＺ−８６である。特定の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、ＨＭＲＺ−８６を、約１μＭから約１ｍＭ、約１μＭから約７５０μＭ、約１μＭから約５００μＭまたは約１μＭから約２５０μＭの濃度で含む。他の実施形態において、ＨＭＲＺ−８６は、本明細書に記載の組成物中に約２０μＭから約２００μＭの濃度で存在する。
【０１３４】
一実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる１つまたは複数の組成物は、１つまたは複数の阻害剤を含有する。他の実施形態において、１つまたは複数の同じ阻害剤を含む、本明細書に提示されるキット中の組成物それぞれに関して、それらの阻害剤の濃度は、同じまたは類似（全般に、互いに約１０％以内で）である。いくつかの実施形態において、本明細書に提示されるキットは、希釈し、組成物に加えることができる阻害剤の濃縮溶液、例えば、２ｘ、５ｘまたは１０ｘ溶液を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提示されるキットは、阻害剤を凍結試薬として含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットは、阻害剤を乾燥試薬として含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提示されるキットは、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数の阻害剤を、細菌が、本明細書に提示される方法に従った組成物と接触できるような形態で含む組成物を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提示されるキットは、キットの様々な組成物を作製するために使用できるすべての要素を含む。
【０１３５】
一実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、ＡｍｐＣ阻害剤を、約１μＭから約１００ｍＭ、約１μＭから約７５ｍＭ、約１μＭから約５０ｍＭ、約１μＭから約２５ｍＭ、約１μＭから約１０ｍＭの濃度で含み、または約１μＭから約５ｍＭのＡｍｐＣ阻害剤を含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、ＡｍｐＣ阻害剤を、約１００μＭから約４ｍＭ、約２００μＭから約４ｍＭ、５００μＭから約４ｍＭ、約７５０μＭから約４ｍＭの濃度で含み、または約１ｍＭから約４ｍＭのＡｍｐＣ阻害剤を含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、ＡｍｐＣ阻害剤を、約５００μＭから約３ｍＭ、約１ｍＭから約３ｍＭ、約１．５ｍＭから約３ｍＭの濃度で含み、または約２ｍＭから約３ｍＭのＡｍｐＣ阻害剤を含む。
【０１３６】
特定の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、クロキサシリン、クロキサシリンの塩形態、ｓｙｎ２１９０（ＮＡＥＪＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，  Ｉｎｃ．、Ｅｄｍｏｎｔｏｎ、Ａｌｂｅｒｔａ、Ｃａｎａｄａ）もしくはボロン酸またはそれらの誘導体（Ｆｏｃｕｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＬＬＣ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、ＡｍｐＣ阻害剤として含む。特定の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、クロキサシリンまたはその塩形態を、ＡｍｐＣ阻害剤として含む。特定の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、約２０μＭから約５ｍＭのクロキサシリンまたはその塩形態を含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、約２０μＭから約４ｍＭ、約２０μＭから約３ｍＭ、約２０μＭから約２ｍＭ、約２０μＭから約１ｍＭ、約２０μＭから約７５０μＭ、約２０μＭから約５００μＭ、約２０μＭから約２５０μＭまたは約２０μＭから約７５μＭのクロキサシリンまたはその塩形態を含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、約５００μＭから約５ｍＭ、約５００μＭから約４ｍＭ、約５００μＭから約３ｍＭ、約５００μＭから約２ｍＭまたは約５００μＭから約１ｍＭのクロキサシリンまたはその塩形態を含む。他の実施形態において、組成物は、約１ｍＭから約５ｍＭ、約２ｍＭから約５ｍＭ、約１ｍＭから約４ｍＭ、約２ｍＭから約４ｍＭ、約１ｍＭから約３ｍＭまたは約１ｍＭから約２ｍＭのクロキサシリンまたはその塩形態を含む。
【０１３７】
一実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、セリンベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む。特定の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、タゾバクタムまたはその塩形態を含む。特定の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、約１００μＭから約１ｍＭ、約１００μＭから約７５０μＭ、約１００μＭから約５００μＭまたは約１００μＭから約２５０μＭのタゾバクタムまたはその塩形態を含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、スルバクタムまたはその塩形態を含む。特定の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、約１００μＭから約５ｍＭ、約１００μＭから約４ｍＭ、約１００μＭから約３ｍＭ、約１００μＭから約２ｍＭまたは約１００μＭから約１ｍＭのスルバクタムまたはその塩形態を含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、約１００μＭから約７５０μＭ、約１００μＭから約５００μＭ、１００μＭから約２５０μＭ、約１００μＭから約２００ｍＭまたは約１００μＭから約１５０μＭのスルバクタムまたはその塩形態を含む。
【０１３８】
一実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、クラブラン酸またはその塩形態を含む。特定の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、約１０μＭから約１００ｍＭ、約１０μＭから約７５ｍＭ、約１０μＭから約５０ｍＭ、約１０μＭから約２５ｍＭ、約１０μＭから約１０ｍＭもしくは約１０μＭから約５ｍＭのクラブラン酸またはその塩形態を含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、約１０μＭから約２ｍＭ、約２５μＭから約２ｍＭ、５０μＭから約２ｍＭ、約７５μＭから約２ｍＭもしくは約１００μＭから約２ｍＭのクラブラン酸またはその塩形態を含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、約２００μＭから約２ｍＭ、約２５０から約２ｍＭ、約３００μＭから約２ｍＭ、約４００μＭから約２ｍＭもしくは約５００μＭから約２ｍＭのクラブラン酸またはその塩形態を含む。特定の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、約５００μＭから約１．５ｍＭのクラブラン酸またはその塩形態を含む。
【０１３９】
特定の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、ＴＰＥＮなどの亜鉛特異的金属キレート剤を含む。代替的実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、ＤＭＰＳ、ＥＤＴＡ、１，１０−フェナントロリン、ＤＰＣまたはＤＥＤＴＣなどの、亜鉛に結合できるが、亜鉛特異的ではない金属キレート剤を含む。好ましい実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、膜透過性である金属キレート剤を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＥＤＴＡ、ＤＭＰＳ、１，１０−フェナントロリン、ＤＥＤＴＣ、ＴＰＥＮまたはＤＰＣを、約０．５ｍＭから約２００ｍＭ、約１ｍＭから約１００ｍＭまたは約１ｍＭから約５０ｍＭの濃度で含む。
【０１４０】
特定の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、ＤＰＣを、約０．５ｍＭから約１０ｍＭ、約０．５ｍＭから約７ｍＭ、約０．５ｍＭから約５ｍＭ、約０．５ｍＭから約２ｍＭまたは約０．５ｍＭから約１ｍＭの濃度で含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、ＤＥＤＴＣを、約１ｍＭから約２０ｍＭ、約１ｍＭから約１５ｍＭ、約１ｍＭから約１０ｍＭ、約１ｍＭから約７ｍＭ、約１ｍＭから約５ｍＭまたは約１ｍＭから約２ｍＭの濃度で含む。
【０１４１】
一実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、ＥＳＢＬ阻害剤を含む。一実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、セフタジジムまたはその塩形態を含む。特定の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、セフタジジムを、約１ｍＭから約２０ｍＭ、約１ｍＭから約１５ｍＭ、約１ｍＭから約１０ｍＭ、約１ｍＭから約７ｍＭ、約１ｍＭから約５ｍＭまたは約１ｍＭから約２ｍＭの濃度で含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、セフォタキシムまたはその塩形態を含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、セフォタキシムを、約１ｍＭから約２０ｍＭ、から約１５ｍＭ、約１ｍＭから約１０ｍＭ、約１ｍＭから約７ｍＭ、約１ｍＭから約５ｍＭまたは約１ｍＭから約２ｍＭの濃度で含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、セフタジジムおよびセフォタキシムの組合せを含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、セフタジジムおよびセフォタキシムの組合せまたはそれらの塩形態を、約１ｍＭから約２０ｍＭ、約１ｍＭから約１５ｍＭ、約１ｍＭから約１０ｍＭ、約１ｍＭから約７ｍＭ、約１ｍＭから約５ｍＭまたは約１ｍＭから約２ｍＭの濃度で含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のキットは、溶解試薬を含む組成物を含有する。ある実施形態において、ベータ−ラクタマーゼ基質に加えて、いくつかの実施形態では１つまたは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤に加えて、本明細書に記載のキット中の組成物は溶解試薬を含む。特定の実施形態において、溶解試薬は細菌細胞を溶解するが、ベータ−ラクタマーゼ基質の加水分解または１つもしくは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤の活性、またはその両方に干渉しない。一実施形態において、溶解試薬は、穏やかな非変性界面活性剤などの（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００またはＣＨＡＰＳ）界面活性剤である。他の実施形態において、溶解試薬は、酵素または細菌細胞の溶解を促進する他の作用物質である。このような酵素の非限定的な例は、リゾチーム、ラビアーゼ、リゾスタフィン、アクロモペプチダーゼまたはムタノリシンを含む。特定の実施形態において、本明細書に記載のキットは、約０．１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌまたは約５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの溶解試薬（例えば、リゾチーム）を含む組成物を含有する。他の実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用される組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約８ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約６ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌまたは約３ｍｇ／ｍｌの溶解試薬（例えば、リゾチーム）を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載のキットは、リゾチームを含む組成物を含有する。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のキットは、溶解試薬および溶解試薬の安定化を促進する作用物質を含む組成物を含有する。ある実施形態において、ベータ−ラクタマーゼ基質に加えて、いくつかの実施形態では１つまたは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤に加えて、本明細書に記載のキット中の組成物は、溶解試薬および溶解試薬の安定化を促進する作用物質を含む。一実施形態において、溶解試薬の安定化を促進する作用物質は熱安定性である。特定の実施形態において、本明細書に記載のキットは、約０．１％から約１０％、約１％から約１０％、約２％から約１０％、約４％から約１０％、約１％から約８％、約２％から約８％、約２％から約６％または約２％から約４％の、溶解試薬の安定化を促進する作用物質を含む組成物を含有する。
【０１４４】
一実施形態において、本明細書に記載のキットは、溶解試薬および炭水化物、例えば単糖類、二糖類、多糖類、オリゴ糖またはポリオールを含む組成物を含有する。炭水化物の具体例は、限定するものではないが、マンニトール、リボース、グルコース、フルクトース、マンノース、スクロース、ラクトース、グリセロール、キサンタンガム、トレハロースおよびグリコール（例えば、プロピレングリコール）を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載のキットは、リゾチームおよびトレハロースを含む組成物を含有する。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のキットは、溶解試薬、溶解試薬の安定化を促進する作用物質およびさらなる作用物質、例えば、溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質（例えば、金属キレート剤）を含む組成物を含有する。一実施形態において、本明細書に記載のキットは、約０．１ｍＭから約５ｍＭ、約１ｍＭから約４ｍＭ、約１ｍＭから約３ｍＭ、約２ｍＭから約３ｍＭまたは約０．１から約２ｍＭの、溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質を含む組成物を含有する。
【０１４６】
特定の実施形態において、本明細書に記載のキットは、溶解試薬、溶解試薬の安定化を促進する作用物質およびＥＤＴＡまたはＥＧＴＡを含む組成物を含有する。特定の実施形態において、メタロ−ベータ−ラクタマーゼが検出されるまたは検出され得る場合、ＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡ、またはその両方は利用されない。特定の実施形態において、本明細書に記載のキットは、リゾチーム、トレハロースおよびＥＤＴＡを含む組成物を含有する。
【０１４７】
特定の実施形態において、１つまたは複数の同じ溶解試薬（および場合により、溶解試薬の安定化を促進する作用物質および／または細菌の細胞壁の分解を促進する作用物質）を含む、本明細書に提示されるキット中の組成物それぞれに関して、それらの試薬（および作用物質）の濃度は同じまたは類似である（全般に、互いに約１０％以内で）。いくつかの実施形態において、本明細書に提示されるキットは、希釈し、組成物に加えることができる、溶解試薬の濃縮溶液、例えば、２ｘ、５ｘまたは１０ｘ溶液を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提示されるキットは、希釈し、組成物に加えることができる、溶解試薬を安定化する作用物質の濃縮溶液、例えば、２ｘ、５ｘまたは１０ｘ溶液を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提示されるキットは、希釈し、組成物に加えることができる、細菌の細胞壁の分解を促進する作用物質の濃縮溶液、例えば、２ｘ、５ｘまたは１０ｘ溶液を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提示されるキットは、以下を凍結試薬または作用物質として含む：凍結試薬または作用物質としての、溶解試薬、溶解試薬の安定化を促進する作用物質および細菌の細胞壁の分解を促進する作用物質。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットは、以下のうち１種、２種またはすべてを乾燥試薬または作用物質として含む：溶解試薬、溶解試薬の安定化を促進する作用物質および溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質。
【０１４８】
特定の実施形態において、本明細書に提示されるキットは、細菌が、本明細書に提示される方法に従った組成物と接触できるような形態の組成物を含む。一実施形態において、組成物は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、溶解試薬を含み、場合により１つまたは複数の阻害剤、溶解試薬の安定化を促進する作用物質および／または溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質を含む。他の実施形態において、組成物は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、溶解試薬および１つまたは複数の阻害剤を含み、場合により溶解試薬の安定化を促進する作用物質および／または溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質またはその両方を含む。他の実施形態において、組成物は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、溶解試薬および１つまたは複数の阻害剤、溶解試薬の安定化を促進する作用物質を含み、場合により溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質を含む。
【０１４９】
検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤に加えて、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、緩衝液を含むことができる。組成物のｐＨの維持を助け、ベータ−ラクタマーゼ基質の加水分解に干渉しない任意の緩衝液を使用することができる。特定の実施形態において、緩衝液はベータ−ラクタマーゼ基質の加水分解または１つもしくは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤の活性、またはその両方に干渉しない。緩衝液の非限定的な例は、リン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液およびＨＥＰＥＳ緩衝液を含む。一実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物はそれぞれ、同じ緩衝液を含有する。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物はそれぞれ、同じまたは類似の（すなわち、互いに約１０％以内で）濃度の同じ緩衝液を含有する。特定の実施形態において、組成物は、０．０５から１ｍｌのリン酸緩衝液またはＭＥＳ緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提示されるキットは、希釈し、組成物に加えることができる、緩衝液の濃縮溶液、例えば、２ｘ、５ｘまたは１０ｘ溶液を含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、本明細書に提示されるキットは、食塩緩衝液またはブロスを含むことができる。ベータ−ラクタマーゼ基質の加水分解または１つもしくは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤の活性、またはその両方に干渉しない、任意のブロスを使用することができる。特定の実施形態において、ＢＤ  Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）Ｐａｎｅｌ（ＢＤ、ＵＳＡ）と共に利用されるＡＳＴブロスおよび／またはＩＤブロスが、本明細書に提示されるキットに含まれる。いくつかの実施形態において、本明細書に提示されるキットは、使用前に希釈できるブロスの濃縮溶液、例えば、２ｘ、５ｘまたは１０ｘ溶液を含む。
【０１５１】
特定の実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物はそれぞれ、同じまたは類似の（すなわち、互いに約１０％または約５％以内で）のｐＨを有する。一実施形態において、組成物は、約ｐＨ５からｐＨ８、好ましくは約ｐＨ５．５から約ｐＨ７．５およびより好ましくは約ｐＨ６から約ｐＨ７のｐＨを有する。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、本明細書に提示されるキットは、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を含む容器、１つまたは複数の阻害剤を含む１つまたは複数の他の容器を含み、場合により指示書を含む。ある実施形態において、本明細書に提示されるキットは、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を含む第１の容器、溶解試薬を含む組成物を含む第２の容器、１つまたは複数の阻害剤を含む１つまたは複数の他の容器を含み、場合により指示書を含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットは、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を含む第１の容器、溶解試薬および溶解試薬の安定化を促進する作用物質を含む組成物を含む第２の容器、１つまたは複数の阻害剤を含む１つまたは複数の他の容器を含み、場合により指示書を含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットは、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を含む第１の容器、溶解試薬、溶解試薬の安定化を促進する作用物質および溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質を含む組成物を含む第２の容器、１つまたは複数の阻害剤を含む１つまたは複数の他の容器を含み、場合により指示書を含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットは、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を含む第１の容器、溶解試薬を含む組成物を含む第２の容器、溶解試薬の安定化を促進する作用物質を含む第３の容器、１つまたは複数の阻害剤を含む１つまたは複数の他の容器を含み、場合により指示書を含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットは、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質を含む第１の容器、溶解試薬を含む組成物を含む第２の容器、溶解試薬の安定化を促進する作用物質を含む第３の容器、溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質を含む第４の容器、１つまたは複数の阻害剤を含む１つまたは複数の他の容器を含み、場合により指示書を含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、本明細書に提示されるキットは組成物および場合により指示書を含む容器を含み、組成物は検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数の阻害剤を含む。ある実施形態において、本明細書に提示されるキットは組成物および場合により指示書を含む容器を含み、組成物は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、１つまたは複数の阻害剤および溶解試薬を含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットは組成物および場合により指示書を含む容器を含み、組成物は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、１つまたは複数の阻害剤および溶解試薬ならびに溶解試薬の安定化を促進する作用物質を含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットは組成物および場合により指示書を含む容器を含み、組成物は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質、１つまたは複数の阻害剤、溶解試薬、溶解試薬の安定化を促進する作用物質および溶解試薬による細菌細胞の溶解を亢進する作用物質を含む。
【０１５４】
キットに含まれ得る指示書は、キットのユーザーに、特定のベータ−ラクタマーゼを検出できるような本明細書に記載の組成物などの特定の組成物の作製方法を指示できる。例えば、指示書は、キットのユーザーに、特定濃度の緩衝液を作製し、組成物に加えること、および組成物に加える検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数の阻害剤の濃度の情報を与えることができる。いくつかの実施形態において、キットに含まれる検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質は、使用前に希釈が必要である。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の阻害剤は、使用前に希釈が必要である。いくつかの実施形態において、本明細書に提示されるキットに含まれる組成物は、細菌試料に接触する準備のできた形態である。
【０１５５】
キットに含まれる組成物は、組成物と細菌試料の接触後の基質利用を検出しやすい任意の形態であってよい。例えば、キットに含まれる組成物は、液体組成物、寒天プレート、ペーパーディスク、ペーパーストリップ、タブレット、またはウェル中の乾燥形態の形態であってよい。特定の実施形態において、組成物は、キットに含まれる液体組成物であり、それぞれの液体組成物は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数の様々なベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む。他の実施形態において、キットに含まれる組成物は、凍結されている。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のキットに含まれる組成物を乾燥されて、プレート、パネル、カセットまたはトレイのウェル、ペーパーストリップ、ペーパーディスクまたはチューブなどの固体支持体上または固体支持体中に存在する。ある実施形態において、組成物は固体支持体上または固体支持体中で、例えば５０℃から１００℃、５０℃から８５℃、５０℃から７５℃、６０℃から７５℃または６０℃から７０℃の熱を使用して乾燥させる。一実施形態において、組成物は、固体支持体上または固体支持体中に、強制換気または真空条件下で、例えば５０℃から１００℃、５０℃から８５℃、５０℃から７５℃、６０℃から７５℃または６０℃から７０℃の熱を使用して乾燥させる。他の実施形態において、組成物は、凍結乾燥技術を使用して、固体支持体上または固体支持体中で乾燥させる。他の実施形態において、組成物は、噴霧乾燥技術を使用して、固体支持体上または固体支持体中で乾燥させる。
【０１５７】
他の実施形態において、キットに含まれる組成物は、異なる区分に分割され、それぞれの区分が異なる組成物を含む１つの寒天プレートの一部である。例えば、寒天プレートは３つの区分を含み、それぞれの区分は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数の異なるベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む組成物を含むことができる。他の実施形態において、寒天プレート当たり１つの組成物だけが存在する。言い換えれば、それぞれの寒天プレートは１つの組成物だけを含み、その結果、異なる組成物を含む２つ以上の寒天プレートが、本明細書に提示される方法に利用される。
【０１５８】
他の実施形態において、キットに含まれる組成物は、異なる区分に分割され、それぞれの区分が異なる組成物を含むペーパーディスクまたはペーパーストリップの一部である。例えば、ペーパーディスクまたはペーパーストリップは３つの区分を含み、それぞれの区分は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数の異なるベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む組成物を含むことができる。他の実施形態において、ペーパーディスクまたはペーパーストリップごとに１つの組成物だけが存在する。言い換えれば、それぞれのペーパーディスクまたはペーパーストリップは１つの組成物だけを含み、その結果、異なる組成物を含む２つ以上のペーパーディスクまたはペーパーストリップが、本明細書に提示される方法に利用される。特定の実施形態において、ペーパーディスクまたはペーパーストリップはろ紙である。使用できるろ紙の型の非限定的な例は、Ｗｈａｔｍａｎ紙（ＶＷＲ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を含む。他の実施形態において、キットに含まれる組成物は、使用前に水和される乾燥ウェルの中である。特定の実施形態において、キットに含まれる組成物は、ＢＢＬ（商標）Ｄｒｙｓｌｉｄｅ（商標）ニトロセフィン（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）と類似の形態である。いくつかの実施形態において、キットに含まれる組成物がペーパーディスクまたはペーパーストリップまたは乾燥ウェルの形態である場合、基質利用は、目視検査により検出される。
【０１５９】
ある実施形態において、キットに含まれる組成物は乾燥して、パネル、トレイ、カセットまたはプレート（例えば、マイクロタイタープレート）のウェル中に存在する。特定の実施形態において、キットに含まれる組成物は乾燥して、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）Ｐａｎｅｌ（ＢＤ、ＵＳＡ）、Ｖｉｔｅｋ（登録商標）ｃａｒｄ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ＵＳＡ）、ＢＢＬ（商標）Ｃｒｙｓｔａｌ（商標）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ、ＵＳＡ）用パネル、Ｒｅｍｅｌ  ＲａｐＩＤ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｅｍｅｌ、ＵＳＡ）用パネルまたはＭｉｃｒｏＳｃａｎ  ｐａｎｅｌ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ、ＵＳＡ）などのトレイ、カセットまたはパネルのウェル中に存在する。キットに含まれる組成物が、例えば熱を使用してウェル上またはウェル中に乾燥され得るところのウェルを有するパネルの説明に関して、例えば、特許文献１および特許文献２（これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。いくつかの実施形態において、キットに含まれる組成物は乾燥して、ＡＰＩ生物化学試験（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ＵＳＡ）用のチューブ中に存在する。
【０１６０】
特定の実施形態において、キットに含まれる組成物は乾燥して、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）Ｐａｎｅｌ（ＢＤ、ＵＳＡ）のウェルおよびＢＤ  Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ、ＵＳＡ）などの自動システム中に存在し、基質利用の検出に使用される。基質利用の検出用自動システムの説明に関して、例えば特許文献１、特許文献４、特許文献３および特許文献５（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。他の実施形態において、キットに含まれる組成物は乾燥して、ＢＢＬ（商標）Ｃｒｙｓｔａｌ（商標）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ、ＵＳＡ）用パネルのウェル中に存在し、ＢＢＬ（商標）Ｃｒｙｓｔａｌ（商標）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ、ＵＳＡ）などの自動システムが、基質利用の検出に使用される。他の実施形態において、キットに含まれる組成物は乾燥して、Ｖｉｔｅｋ（登録商標）ｃａｒｄ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ＵＳＡ）のウェル中に存在し、Ｖｉｔｅｋ（登録商標）システム（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ＵＳＡ）などの自動システムが基質利用の検出に使用される。他の実施形態において、キットに含まれる組成物は乾燥し、ＭｉｃｒｏＳｃａｎ  ｐａｎｅｌ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ、ＵＳＡ）のウェルおよびＭｉｃｒｏＳｃａｎ  Ｗａｌｋ−Ａｗａｙ（登録商標）システムなどの自動システム中に存在し、基質利用の検出に使用される。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、キットに含まれる組成物は、保存のために、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および／または阻害剤を安定化させる、不活性成分を含む。例えば、キット中の組成物は、保存のために、組成物の安定化を促進するためのスクロースを含むことができる。
【０１６２】
組成物に加えて、本明細書に提示されるキットは、このキットを使用し、特定のベータ−ラクタマーゼを検出するための指示書を含むことができる。特定の実施形態において、指示書は、陽性対照および陰性対照を、試験試料と並行して操作することを推奨する。いくつかの実施形態において、本明細書に提示されるキットは、１つまたは複数の特定のベータ−ラクタマーゼを発現しないことが知られている細菌試料（すなわち、陰性対照）を含む。他の実施形態において、本明細書に提示されるキットは、１つまたは複数の特定のベータ−ラクタマーゼを発現することが知られている細菌試料（すなわち、陽性対照）を含む。さらに他の実施形態において、本明細書に提示されるキットは、１つまたは複数の特定のベータ−ラクタマーゼを発現することが知られている細菌試料（すなわち、陽性対照）および１つまたは複数の特定のベータ−ラクタマーゼを発現しないことが知られている細菌試料（すなわち、陰性対照）を含む。いくつかの実施形態において、（１つまたは複数の）細菌対照は、凍結乾燥されている。
【０１６３】
４．７  システム
本明細書に提示されるキットまたはキットの（１つまたは複数の）構成要素を含むシステムおよびコンピュータシステムと組み合わせて使用するためのコンピュータプログラム製品が本明細書に提示される。このようなシステムにおいて、コンピュータプログラム製品は、コンピュータにより読み取り可能な記憶媒体およびそこに内蔵されたコンピュータプログラム機構を含むことができる。コンピュータプログラム機構は、１つまたは複数の細菌試料中に、クラスＡセリンカルバペネマーゼ、メタロ−ベータ−ラクタマーゼ、ＡｍｐＣベータ−ラクタマーゼおよび／またはＥＳＢＬを含む、特定のベータ−ラクタマーゼの存在を評価するための命令を含むことができる。いくつかの実施形態において、コンピュータプログラムは、以下：クラスＡセリンカルバペネマーゼ、メタロ−ベータ−ラクタマーゼ、ＡｍｐＣベータ−ラクタマーゼおよび／またはＥＳＢＬの、１種、２種、３種またはそれ以上の存在を評価するための命令を含む。
【０１６４】
特定の実施形態において、本明細書に記載のベータ−ラクタマーゼの存在を評価するために使用するシステムは、ＢＤ  Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ、ＵＳＡ）と同じまたは類似である。例えば、このような自動システムの説明に関して、特許文献１、特許文献４、特許文献３および特許文献５（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。他の実施形態において、本明細書に記載のベータ−ラクタマーゼの存在を評価するためのシステムは、ＢＢＬ（商標）Ｃｒｙｓｔａｌ（商標）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ、ＵＳＡ）と同じまたは類似である。他の実施形態において、本明細書に記載のベータ−ラクタマーゼの存在を評価するために使用するシステムは、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘによるＶｉｔｅｋ（登録商標）自動システムと同じまたは類似である。他の実施形態において、本明細書に記載のベータ−ラクタマーゼの存在を評価するために使用するシステムは、Ｄａｄｅ  ＢｅｈｒｉｎｇによるＭｉｃｒｏＳｃａｎ  Ｗａｌｋ−Ａｗａｙ（登録商標）自動システムと同じまたは類似である。
【０１６５】
本明細書に提示されるいくつかのシステムは、キットまたは本明細書に提示されるキットの１つまたは複数の構成要素、中央処理装置および中央処理装置に接続したメモリを有するコンピュータを含む。本明細書に提示されるいくつかのシステムは、キットまたは本明細書に提示されるキットの１つまたは複数の構成要素、コンピュータにより読み取り可能な媒体［ハンドヘルド（ｈａｎｄｈｅｌｄ）の蛍光光度計または分光光度計など］、中央処理装置および中央処理装置に接続したメモリを有するコンピュータを含む。メモリは、クラスＡセリンカルバペネマーゼ、メタロ−ベータ−ラクタマーゼ、ＡｍｐＣベータ−ラクタマーゼおよびＥＳＢＬを含む、特定のベータ−ラクタマーゼの存在を評価するための命令を格納する。特定の実施形態において、メモリは、以下：クラスＡセリンカルバペネマーゼ、メタロ−ベータ−ラクタマーゼ、ＡｍｐＣベータ−ラクタマーゼおよびＥＳＢＬの、１種、２種、３種またはそれ以上の存在を評価するための命令を格納する。いくつかの実施形態において、メモリは、本明細書に提示される方法の結果をリモートコンピュータに送信するための命令を含み、リモートコンピュータは１種、２種、３種またはそれ以上のベータ−ラクタマーゼの存在を評価するための命令を含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のように、クラスＡセリンカルバペネマーゼ、メタロ−ベータ−ラクタマーゼ、ＡｍｐＣベータ−ラクタマーゼおよび／またはＥＳＢＬを含む、特定のベータ−ラクタマーゼの存在の評価結果を含む、コンピュータにより読み取り可能な媒体を含むコンピュータシステムが本明細書に提示される。いくつかの実施形態において、本明細書に提示されるコンピュータシステムは：
中央処理装置；
不揮発性主記憶装置、例えば、ソフトウェアおよびデータの格納用ハードディスクドライブ、記憶装置コントローラによりコントロールされる記憶装置；
システムコントロールプログラム、データ、ならびにアプリケーションプログラムを格納するための、不揮発性記憶装置からロードされたプログラムおよびデータを含む、高速ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）などのシステムメモリ［読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）もまた含むことができる。］、；
１つまたは複数のインプット装置（例えば、キーボード）およびディスプレイまたは他のアウトプット装置を含むユーザーインターフェイス；
任意の有線または無線の通信網（例えば、インターネットなどの広域ネットワーク）に接続するためのネットワークインターフェイスカード；
システムの前述の要素を相互に接続するための内部バス、及び前述の要素に電力を供給するための電源；
を含む。
コンピュータの動作は、中央処理装置により実行されるオペレーティングシステムにより主にコントロールされ得る。オペレーティングシステムは、システムメモリに格納できる。オペレーティングシステムに加えて、実行システムは、本明細書に提示される様々なファイルおよびデータ構造へのアクセスをコントロールするためのファイルシステム；本明細書に提示される方法に従った、１つまたは複数の決定則の構築において使用するための訓練データセット；訓練データの処理および決定則の構築のためのデータ分析アルゴリズムモジュール；１つまたは複数の決定則；ベータ−ラクタマーゼが存在するかどうかを決定するためのプロファイル評価モジュール；を含むことができる。
【０１６７】
コンピュータは、ソフトウェアプログラムモジュールおよびデータ構造を含むことができる。データ構造はそれぞれ、限定するものではないが、フラットＡＳＣＩＩまたはバイナリファイル、Ｅｘｃｅｌスプレッドシート、リレーショナルデータベース（例えば、ＳＱＬ）またはオンライン分析処理（ＯＬＡＰ）データベース（例えば、ＭＤＸおよび／またはそれらの変形）を含む、データ記憶システムの任意の形態を含むことができる。いくつかの実施形態において、このようなデータ構造は、それぞれ、階層構造［例えば、スタースキーマ（ｓｔａｒ  ｓｃｈｅｍａ）］を含む、１つまたは複数のデータベースの形態である。いくつかの実施形態において、このようなデータ構造はそれぞれ、明確な階層を有さないデータベース（例えば、階層的に配置されないディメンション表）の形態である。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、記憶されたデータ構造またはコンピュータシステムにアクセス可能なデータ構造はそれぞれ、単一のデータ構造である。他の実施形態において、実際にこのようなデータ構造は、同じコンピュータがホストになることができる、または全くなれない複数のデータ構造（例えば、データベース、ファイル、アーカイブ）を含む。例えば、いくつかの実施形態において、訓練データセットは、コンピュータおよび／または広域ネットワークにわたるコンピュータによりアドレス可能な（複数の）コンピュータのどちらかに記憶された、複数のＥｘｃｅｌスプレッドシートを含むことができる。他の例において、訓練セットは、コンピュータに記憶されたデータベース、または広域ネットワークにわたるコンピュータによりアドレス可能な１つもしくは複数のコンピュータにわたって分布するデータベースのどちらかを含むことができる。
【０１６９】
上記のモジュールおよびデータ構造の多くが１つまたは複数のリモートコンピュータに配置できることが、認識されるであろう。例えば、いくつかの実施形態において、ウェブサービス型の実現が使用される。このような実施形態において、評価モジュールは、ネットワークを介してコンピュータと通信したクライアントのコンピュータに常駐することができる。いくつかの実施形態において、プロファイル評価モジュールは対話型ウェブページである。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、訓練データセットおよび／または決定則は単一のコンピュータ上にあり、他の実施形態において、このようなデータ構造およびモジュールの１つまたは複数は、１つまたは複数のリモートコンピュータをホストとする。１つまたは複数のコンピュータ上のデータ構造およびソフトウェアモジュールの任意の配置は、これらのデータ構造およびソフトウェアモジュールが、ネットワークにわたってまたは他の電子的手段によって相互にアドレス可能である限り、本明細書に提示されるシステムの範囲内である。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、搬送波に組み込まれたデジタル信号は、本明細書に提示される方法に関するデータを含む。いくつかの実施形態において、搬送波に組み込まれたデジタル信号は、細菌供給源中に特定のベータ−ラクタマーゼが存在するかどうかについての決定を含む。いくつかの実施形態において、グラフィカルユーザーインターフェイスが、細菌供給源中に特定のベータ−ラクタマーゼが存在するかどうかの決定のために提供される。グラフィカルユーザーインターフェイスは、リモートコンピュータから受け取る搬送波に組み込まれたデジタル信号にコードされた結果を表示するための、ディスプレイフィールドを含むことができる。
【０１７２】
５．実施例
本明細書に提示される実施例は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤を使用して、特定のベータ−ラクタマーゼの存在を検出することの正確さおよび効率を実証する。
【０１７３】
５．１カルバペネマーゼの検出
この実施例は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む組成物が、試料中のカルバペネマーゼの存在を検出するために使用できることを実証する。
【０１７４】
５．１．１  材料および方法
発色ベータ−ラクタマーゼ・アッセイ
代表的大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）の細菌株をそれぞれ、５％ヒツジ血液を含むＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ（商標）Ｓｏｙ  Ａｇａｒの寒天プレート上に画線し、プレートを３５℃において１８時間インキュベートした。その後、それぞれのプレートからの試料を、Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ濁度リーダーによって測定して濁度が約１．６になるまでＢＤ  ２０５４  Ｆａｌｃｏｎチューブ中の１ｍｌの滅菌水に加えた。５０μｌの細胞懸濁液を１５０μｌの以下の組成物それぞれに加え、各組成物中の最終濃度を以下のようにした：（ｉ）組成物１は、５０μＭのニトロセフィン、２ｍＭのクロキサシリンおよび７５ｍＭのｐＨ７．０リン酸緩衝液を含み、（ｉｉ）組成物２は、５０μＭのニトロセフィン、２ｍＭのクロキサシリン、１ｍＭのクラブラン酸および７５ｍＭのｐＨ７．０リン酸緩衝液を含む。ニトロセフィンの色は、［クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）株に関して］１０分後または（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に関して）１時間後に視覚的に評価した。ベータ−ラクタマーゼによるニトロセフィンの加水分解が、組成物の色を黄色から赤に変化させる。
【０１７５】
イミペニムのＭＩＣアッセイ
イミペニムのＭＩＣアッセイを、ＣＬＳＩ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の標準に従ったマイクロブロス希釈法により実施した。
【０１７６】
５．１．２  結果
代表的大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に関する発色ベータ−ラクタマーゼアッセイの結果を以下の表７に要約する。下記の表８は、本明細書に記載のベータ−ラクタマーゼアッセイに基づく結論と、表７の同じ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に関する、イミペニムのＭＩＣアッセイならびに等電点分離法（ＩＥＦ）およびＰＣＲ試験によりあらかじめ決定されたベータ−ラクタマーゼプロファイルにより得られた結果とを比較する。発色ベータ−ラクタマーゼアッセイの結果に基づく結論は、カルバペネマーゼの存在の検出に関するイミペニムのＭＩＣ、ＩＥＦおよびＰＣＲの結果に基づく結論と一致する。
【０１７７】
【表８】
0005628677.tif 000009
【０１７８】
【表９】
0005628677.tif 000010
【０１７９】
代表的肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株に関する発色ベータ−ラクタマーゼアッセイの結果を以下の表９に要約する。下記の表１０は、本明細書に記載のベータ−ラクタマーゼアッセイに基づく結論と、表９の同じ肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株に関する、イミペニムのＭＩＣアッセイならびに等電点分離法（ＩＥＦ）およびＰＣＲ試験によりあらかじめ決定されたベータ−ラクタマーゼプロファイルにより得られた結果とを比較する。発色ベータ−ラクタマーゼアッセイの結果に基づく結論は、カルバペネマーゼの存在の検出に関する、イミペニムのＭＩＣ、ＩＥＦおよびＰＣＲの結果に基づく結論と一致する。
【０１８０】
【表１０】
0005628677.tif 000011
【０１８１】
【表１１】
0005628677.tif 000012
【０１８２】
代表的クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）株に関する発色ベータ−ラクタマーゼアッセイの結果を以下の表１１に要約する。下記の表１２は、本明細書に記載のベータ−ラクタマーゼアッセイに基づく結論と、イミペニムのＭＩＣアッセイならびに表１１の同じクレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）株に関する等電点分離法（ＩＥＦ）およびＰＣＲ試験によりあらかじめ決定されたベータ−ラクタマーゼのプロファイルにより得られた結果とを比較する。発色ベータ−ラクタマーゼアッセイの結果に基づく結論は、カルバペネマーゼの存在の検出に関するイミペニムのＭＩＣ、ＩＥＦおよびＰＣＲの結果に基づく結論と一致する。
【０１８３】
【表１２】
0005628677.tif 000013
【０１８４】
【表１３】
0005628677.tif 000014
【０１８５】
５．２  メタロ−ベータ−ラクタマーゼの検出
この実施例は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む組成物が、試料中のメタロ−ベータ−ラクタマーゼの存在を検出するために使用できることを実証する。
【０１８６】
５．２．１  材料および方法
発色ベータ−ラクタマーゼアッセイ
代表的肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株をそれぞれ、５％ヒツジ血液を含むＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ（商標）Ｓｏｙ  Ａｇａｒの寒天プレート上に画線し、プレートを３５℃において１８時間インキュベートした。その後、それぞれのプレートからの肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の試料を、Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ濁度リーダーによって測定して濁度が約１．６になるまで、ＢＤ  ２０５４  Ｆａｌｃｏｎチューブ中の１ｍｌの滅菌水に加えた。５０μｌの細胞懸濁液を、以下の１５０μｌの組成物それぞれに加え、各組成物中の最終濃度を以下のようにした：（ｉ）組成物１は、５０μＭのニトロセフィン、２．５ｍＭのクロキサシリンおよび５０ｍＭのｐＨ７．０リン酸緩衝液を含み、（ｉｉ）組成物２は、５０μＭのニトロセフィン、２．５ｍＭのクロキサシリン、１ｍＭのクラブラン酸および５０ｍＭのｐＨ７．０リン酸緩衝液を含み、ならびに（ｉｉｉ）組成物３は、５０μＭのニトロセフィン、２．５ｍＭのクロキサシリン、１ｍＭのクラブラン酸、５ｍＭもしくは１５ｍＭの濃度のＤＥＤＴＣ、１．５ｍＭもしくは４．５ｍＭの濃度のＤＰＣまたは９ｍＭの濃度のＴＰＥＮおよび５０ｍＭのｐＨ７．０リン酸緩衝液を含む。ニトロセフィンの色は、３０分後または１時間後に視覚的に評価した。ベータ−ラクタマーゼによるニトロセフィンの加水分解が、組成物の色を黄色から赤に変化させる。
【０１８７】
イミペニムのＭＩＣアッセイ
イミペニムのＭＩＣアッセイを、ＣＬＳＩ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の標準に従ったマイクロブロス希釈法により実施した。
【０１８８】
５．２．２  結果
代表的肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株に関する発色ベータ−ラクタマーゼアッセイの結果を以下の表１３に要約する。アッセイにおいて、２種の異なる金属キレート剤の影響を、２種の異なる濃度で評価した。各組成物を、代表的菌株と共に３０分間インキュベートし、その後目視検査によりアッセイの結果を評価した。以下の表１４は、本明細書に記載の発色ベータ−ラクタマーゼアッセイに基づく結論と、表１３の同じ肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株に関する、イミペニムのＭＩＣアッセイならびに等電点分離法（ＩＥＦ）およびＰＣＲ試験によりあらかじめ決定されたベータ−ラクタマーゼのプロファイルにより得られた結果とを比較する。発色ベータ−ラクタマーゼアッセイの結果に基づく結論は、試料中のメタロ−ベータ−ラクタマーゼの存在の検出に関する、イミペニムのＭＩＣ、ＩＥＦおよびＰＣＲの結果に基づく結論と一致する。
【０１８９】
【表１４】
0005628677.tif 000015
【０１９０】
【表１５】
0005628677.tif 000016
【０１９１】
代表的肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＫＬＥＰＮＥＰ）株および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＳＥＡＥＲ）株に関する発色ベータ−ラクタマーゼアッセイの結果を、以下の表１５に要約する。アッセイにおいて、２種の異なる金属キレート剤の影響を評価した。各組成物を、代表的菌株と共に６０分間インキュベートし、その後目視検査によりアッセイの結果を評価した。以下の表１６は、本明細書に記載のベータ−ラクタマーゼアッセイに基づく結論と、表１５の同じ細菌株に関する、イミペニムのＭＩＣアッセイならびに等電点分離法（ＩＥＦ）およびＰＣＲ試験によりあらかじめ決定されたベータ−ラクタマーゼのプロファイルにより得られた結果とを比較する。発色ベータ−ラクタマーゼアッセイの結果に基づく結論は、試料中のメタロ−ベータ−ラクタマーゼまたはセリンカルバペネマーゼの存在の検出に関する、イミペニムのＭＩＣ、ＩＥＦおよびＰＣＲの結果に基づく結論と一致する。
【０１９２】
【表１６】
0005628677.tif 000017
【０１９３】
【表１７】
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【０１９４】
５．３  ＡＭＰＣベータ−ラクタマーゼの検出
この実施例は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む組成物が、ＡｍｐＣの存在を検出するために使用できることを実証する。
【０１９５】
５．３．１  材料および方法
発色ベータ−ラクタマーゼアッセイ
代表的大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）株をそれぞれ、５％ヒツジ血液を含むＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ（商標）Ｓｏｙ  Ａｇａｒの寒天プレート上に画線し、プレートを３５℃において１８時間インキュベートした。その後、それぞれのプレートからの大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）の試料を、Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ濁度リーダーによって測定して濁度が約１．６になるまで、ＢＤ  ２０５４  Ｆａｌｃｏｎチューブ中の１ｍｌの滅菌水に加えた。５０μｌの細胞懸濁液を１５０μｌの以下の組成物それぞれに加え、各組成物中の濃度を以下のようにした：（ｉ）組成物１は、５０μＭのニトロセフィンおよび５０ｍＭのｐＨ７．０リン酸緩衝液を含み、（ｉｉ）組成物２は、５０μＭのニトロセフィン、５ｍＭのクロキサシリン、および５０ｍＭのｐＨ７．０リン酸緩衝液を含み、（ｉｉｉ）組成物３は、５０μＭのニトロセフィン、１ｍＭのクラブラン酸および５０ｍＭのｐＨ７．０リン酸緩衝液を含み、ならびに（ｉｖ）組成物４は、５０μＭのニトロセフィン、５ｍＭのクロキサシリン、１ｍＭのクラブラン酸および５０ｍＭのｐＨ７．０リン酸緩衝液を含む。ニトロセフィンの色は、６０分後に視覚的に評価した。ベータ−ラクタマーゼによるニトロセフィンの加水分解が、組成物の色を黄色から赤に変化させる。
【０１９６】
セフォキシチンのＭＩＣアッセイ
セフォキシチンのＭＩＣアッセイを、ＣＬＳＩ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の標準に従ったマイクロブロス希釈法により実施した。
【０１９７】
５．３．２  結果
代表的大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に関する発色ベータ−ラクタマーゼアッセイの結果を以下の表１７に要約する。下記の表１８は、本明細書に記載のベータ−ラクタマーゼアッセイに基づく結論と、表１７の同じ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を使用した、セフォキシチンのＭＩＣアッセイならびに等電点分離法（ＩＥＦ）およびＰＣＲ試験によりあらかじめ決定されたベータ−ラクタマーゼプロファイルにより得られた結果とを比較する。発色ベータ−ラクタマーゼアッセイの結果に基づく結論は、試料中のＡｍｐＣの存在の検出に関するセフォキシチンのＭＩＣ、ＩＥＦおよびＰＣＲの結果に基づく結論と一致する。
【０１９８】
【表１８】
0005628677.tif 000019
【０１９９】
【表１９】
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【０２００】
５．４  ＥＳＢＬの検出
この実施例は、検出可能なベータ−ラクタマーゼ基質および１つまたは複数のベータ−ラクタマーゼ阻害剤を含む組成物が、ＥＳＢＬの存在を検出するために使用できることを実証する。
【０２０１】
５．４．１  材料および方法
発色ベータ−ラクタマーゼアッセイ
ＢＤコレクションからの代表的大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）株および肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株をそれぞれ、５％ヒツジ血液を含むＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ（商標）Ｓｏｙ  Ａｇａｒの寒天プレート上に画線し、プレートを３５℃において１８時間インキュベートした。その後、それぞれのプレートからの大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）または肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の試料を、Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ濁度リーダーによって測定して、所望の濁度（試料２〜５、８〜１０は測定値１．５、試料１〜２は測定値１．０、試料６〜７は測定値０．５）になるまで、ＢＤ  ２０５４  Ｆａｌｃｏｎチューブ中の１ｍｌの滅菌水に加えた。５０μｌの細胞懸濁液を１５０μｌの以下の組成物それぞれに加え、各組成物中の最終濃度を以下のようにした：（ｉ）組成物１は、５０μＭのニトロセフィンおよび５０ｍＭのｐＨ７．０リン酸緩衝液を含み、（ｉｉ）組成物２は、５０μＭのニトロセフィン、０．１ｍＭのクラブラン酸および５０ｍＭのｐＨ７．０リン酸緩衝液を含み、（ｉｉｉ）組成物３は、５０μＭのニトロセフィン、２５ｍＭのセフォタキシムおよび５０ｍＭのｐＨ７．０リン酸緩衝液を含み、ならびに（ｉｖ）組成物４は、５０μＭのニトロセフィン、１．２５ｍＭのセフトリアキソン（Ｔｏｋｕ−Ｅ、Ｊａｐａｎ）および５０ｍＭのｐＨ７．０リン酸緩衝液を含む。ニトロセフィンの色は、２０分後または６０分後に視覚的に評価した。ベータ−ラクタマーゼによるニトロセフィンの加水分解が、組成物の色を黄色から赤に変化させる。
【０２０２】
ＭＩＣアッセイ
ＣＴＸ（セフォタキシム）、ＣＡＺ（セフォタキシム／クラブラン酸）、ＣＡＺ（セフタジジム）およびＣＣＺ（セフタジジム／クラブラン酸）のＭＩＣアッセイを、ＣＬＳＩ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の標準に従ったマイクロブロス希釈法により実施した。
【０２０３】
５．４．２  結果
代表的大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＳＣＣＯＬ）株および肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＫＬＥＰＮＥＰ）株に関する発色ベータ−ラクタマーゼアッセイの結果を、以下の表１９に要約する。以下の表２０は、本明細書に記載のベータ−ラクタマーゼアッセイに基づく結論と、表１９の同じ菌株を使用した、セフォキシチンのＭＩＣアッセイならびに等電点分離法（ＩＥＦ）およびＰＣＲ試験によりあらかじめ決定されたベータ−ラクタマーゼのプロファイルにより得られた結果とを比較する。発色ベータ−ラクタマーゼアッセイの結果に基づく結論は、試料中のＥＳＢＬの存在の検出に関する、セフォキシチンのＭＩＣ、ＩＥＦおよびＰＣＲの結果に基づく結論と一致する。
【０２０４】
【表２０】
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【０２０５】
【表２１】
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【０２０６】
５．５  溶解試薬の存在下におけるベータ−ラクタマーゼの検出
この実施例は、ｉｎ  ｓｉｔｕでの細菌細胞の溶解およびベータ−ラクタマーゼの検出が、ベータ−ラクタマーゼアッセイの高レベルの感度を提供し、特定の細菌型（例えば、グラム陰性菌）により発現された、特定のベータ−ラクタマーゼを検出する場合、このことが特に有利であり得ることを実証する。
【０２０７】
５．５．１  材料および方法
パネルの作製。ニトロセフィン、トレハロース、および／または細菌細胞を溶解するために使用する試薬を含むストック溶液を、ｐＨ６のＭＥＳ緩衝液中に調製し、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ｐａｎｅｌ（ＢＤ、ＵＳＡ）の底部のウェルに、１種のストック溶液を１つのウェルに分注した。その後、パネルを、オーブンでおよそ３０分間およそ７０℃において乾燥させた。その後、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｐａｎｅｌの上部に底部を取り付け、接種準備のできたパネルシステムを形成した。Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｐａｎｅｌへの接種後の、再水和の後の試薬濃度は、０．１ＭのｐＨ６  ＭＥＳ緩衝液中に３ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１％トレハロースであった。
【０２０８】
接種および溶解試験。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などの細菌の代表的菌株を、それぞれ、５％ヒツジ血液を含むＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ（商標）Ｓｏｙ  Ａｇａｒの寒天プレート（ＢＤ、ＵＳＡ）上に画線し、プレートを３５℃において１８時間インキュベートした。その後、各プレートの純粋培養由来のコロニーをＢＤ  Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＩＤブロス（ＢＤ、ＵＳＡ）に接種し、所望の濁度の約０．５ＭａｃＦａｒｌａｎｄに調節した。次いで、細菌細胞懸濁液を、細胞溶解試験のために特に作製したＰｈｏｅｎｉｘ  ｐａｎｅｌのＩＤ側に注いだ。接種したら、パネルを、Ｐｈｏｅｎｉｘの計器にかけ、ニトロセフィンの加水分解率を比色シグナルの変化により、２０分ごとに１６時間モニターした。
【０２０９】
微生物。本明細書において試験した菌株中のベータ−ラクタマーゼの存在を、等電点分離（ＩＥＦ）ゲル電気泳動、ＰＣＲ試験またはＭＩＣアッセイにより、あらかじめ特徴づけ、これらはＣＬＳＩ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の標準に従ったマイクロブロス希釈法により実施した。
【０２１０】
５．５．２  結果
以下の表２１に示すように、細胞内ベータ−ラクタマーゼを包含するいくつかの菌株は、溶解試薬の不在下で、ニトロセフィン活性が比較的低い（＜＝４  Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｐａｎｅｌにおいて１０時間以内）。Ｐｈｏｅｎｉｘのウェルに溶解試薬を加えると、それらの細胞によるニトロセフィンの加水分解率が有意に改善された。いくつかの菌株は、溶解試薬の不在下でも比較的高いニトロセフィン活性を示した（＞４  Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｐａｎｅｌにおいて１０時間以内）。それらの菌株に関して、溶解試薬の存在は変化をもたらさないか、またはニトロセフィン活性にわずかな改善をもたらすだけであった。溶解試薬は、細菌株により発現されたベータ−ラクタマーゼのニトロセフィン活性を阻害しなかった。リゾチームまたはＥＤＴＡは、単独または組合せでも、ニトロセフィンを加水分解しなかった。任意の理論に縛られるものではないが、ニトロセフィンの加水分解率における改善は、より多くのベータ−ラクタマーゼが細胞膜周辺腔から多く放出され、したがって、より多くのベータ−ラクタマーゼが、基質であるニトロセフィンにアクセス可能になることが主な原因であると考えられる。
【０２１１】
【表２２】
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【０２１２】
【表２３】
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【０２１３】
均等物
当業者らは、日常的な実験を使用するだけで、本明細書において記載される、本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【０２１４】
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の各刊行物、特許、または特許出願が、参照により本明細書に組み込まれるように、明確に、個々に示されるのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１５】
本明細書における参考文献の引用または論述は、そのようなものが本発明に対する先行技術であるということを認めるものとして解釈されないものとする。