(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターに対する悪性細胞または新形成細胞の感受性を判定するためのインビトロでの方法であって、該インヒビターが、
【化３１】
0005603777.tif 000037
であるか、あるいは構造式（１．０）
【化３２−１】
0005603777.tif 000038
によって示されるか、あるいはこれらいずれかの薬学的に許容できる塩であって、Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、各々独立して、−ＣＨ＝、−Ｎ＝および−ＣＲ９＝からなる群から選択され；
ｚは、１〜３であり；
Ｑは：
【化３２−２】
0005603777.tif 000039
【化３２−３】
0005603777.tif 000040
からなる群から選択される置換基であり、
各Ｑ１は、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群から独立して選択される環を表し、ここで、該置換された環は、Ｒ１０部分からなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換されているが；但し、Ｑ１が、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであるとき、その環結合点における炭素原子は、置換されず；
Ｑ２は、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキルおよび置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される環を表し、ここで、該置換された環は、Ｒ１０部分からなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換され；
Ｚ１は、−（Ｃ（Ｒ２４）２）ｗ−を表し、ここで、各Ｒ２４は、Ｈ、アルキルおよびＦからなる群から独立して選択され、ｗは、１、２または３であり；
Ｚ２は、−Ｎ（Ｒ４４）−、−Ｏ−および−Ｃ（Ｒ４６）２−からなる群から選択され；
ｍは、１〜６であり；
ｎは、１〜６であり；
ｐは、０〜６であり；
ｔは、０、１または２であり；
Ｒ１は、
（１）−ＣＮ、
（２）−ＮＯ２、
（３）−ＯＲ１０、
（４）−ＳＲ１０、
（５）−Ｎ（Ｒ１０）２、
（６）Ｒ１０、
（７）−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、
（８）−（Ｃ（Ｒ３０）２）ｎ−ＮＲ３２−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１０、
（９）−（Ｃ（Ｒ３０）２）ｎ−ＮＲ３２−Ｓ（Ｏ）ｔ−Ｒ１０、
（１０）−（Ｃ（Ｒ３０）２）ｎ−ＮＲ３２−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ３２）−Ｒ１０、
（１１）
【化３２−４】
0005603777.tif 000041
（１２）−ＣＦ３、
（１３）−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、
（１４）アルケニル、
（１５）−ＮＲ３２−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１４、
（１６）
【化３２−５】
0005603777.tif 000042
（ここで、各Ｒ１０は、独立して選択される）、
（１７）
【化３２−６】
0005603777.tif 000043
（ここで、各Ｒ１０は、独立して選択される）、
（１８）
【化３２−７】
0005603777.tif 000044
（１９）−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ３２−（Ｃ（Ｒ３０）２）ｐ−ＯＲ１０、
（２０）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２（ここで、各Ｒ１０は、独立して選択される）、
（２１）−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ３２−（Ｃ（Ｒ３０）２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１０）２、
（２２）ヘテロシクロアルケニル、
（２３）
【化３２−８】
0005603777.tif 000045
および
（２４）アリールアルケニル−
からなる群から選択され；
Ｒ２は：
（１）Ｈ、
（２）−ＣＮ、
（３）ハロ、
（４）アルキル、
（５）置換アルキル（ここで、該置換アルキルは、（ａ）−ＯＨ、（ｂ）−Ｏ−アルキル、（ｃ）１〜３個のＦ原子で置換された−Ｏ−アルキル、および（ｄ）−Ｎ（Ｒ４０）２（ここで、各Ｒ４０は、（ｉ）Ｈ、（ｉｉ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、（ｉｉｉ）−ＣＦ３、および（ｅ）ハロからなる群から独立して選択される）からなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されている）、
（６）アルキニル、
（７）アルケニル、
（８）−（ＣＨ２）ｍＲ１１、
（９）−Ｎ（Ｒ２６）２、
（１０）−ＯＲ２３、
（１１）−Ｎ（Ｒ２６）Ｃ（Ｏ）Ｒ４２、
（１２）シクロアルキル、
（１３）シクロアルキルアルキル、
（１４）
【化３２−９】
0005603777.tif 000046
（１５）−Ｏ−（置換アルキル）（ここで、該置換アルキルは、１〜３個のＦ原子で置換されている）、
（１６）−Ｓ（Ｏ）ｔ−アルキル、
（１７）−Ｃ（Ｏ）−アルキル、
（１８）
【化３２−１０】
0005603777.tif 000047
（１９）
【化３２−１１】
0005603777.tif 000048
（ここで、各アルキルは、独立して選択される）、
（２０）
【化３２−１２】
0005603777.tif 000049
（各アルキルは、独立して選択される）、
（２１）
【化３２−１３】
0005603777.tif 000050
（ここで、各アルキルは、独立して選択される）、
（２２）−Ｎ（Ｒ４８）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ４８（ここで、各Ｒ４８は、Ｈおよびアルキルからなる群から独立して選択される）、および
（２３）−Ｃ（Ｏ）−アルキルからなる群から選択され；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の各々は、
（１）Ｈ、
（２）アルケニル、
（３）置換アルケニル、
（４）アルキル、
（５）置換アルキル、
（６）シクロアルキル、
（７）置換シクロアルキル、
（８）シクロアルキルアルキル−、
（９）置換シクロアルキルアルキル−、
（１０）ヘテロシクロアルキル、
（１１）置換ヘテロシクロアルキル、
（１２）ヘテロシクロアルキルアルキル−、
（１３）置換ヘテロシクロアルキルアルキル−、
（１４）−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、
（１５）アリールヘテロアリール−、
（１６）置換アリールヘテロアリール−、
（１７）ヘテロアリールアリール−、
（１８）置換ヘテロアリールアリール−、
（１９）アリール、
（２０）置換アリール、
（２１）ヘテロアリール、
（２２）置換ヘテロアリール、
（２３）ヘテロアリールヘテロアリール−、
（２４）置換ヘテロアリールヘテロアリール−、
（２５）アリールアミノヘテロアリール−、
（２６）置換アリールアミノヘテロアリール−、
（２７）アリールアルキニル−、
（２８）置換アリールアルキニル−、
（２９）ヘテロアリールアルキニル−、
（３０）置換ヘテロアリールアルキニル−
からなる群から独立して選択され、
ここで、該Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７で置換された基（７）、（９）、（１１）、（１３）、（１６）、（１８）、（２０）、（２２）、（２４）、（２６）、（２８）および（３０）は、−ＮＨ２、アルキル、アルケニル、ハロ、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ２８、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２８および−Ｃ（Ｏ）Ｒ２８からなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換され、
ここで、該Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７で置換された基（３）および（５）は、−ＮＨ２、ハロ、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ２８、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２８および−Ｃ（Ｏ）Ｒ２８からなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換され；
Ｒ５Ａは、ハロ、−ＯＨおよび−Ｏ−アルキルからなる群から選択され；
Ｒ８は、Ｈ、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ１０）２、−ＮＲ１０Ｃ（Ｏ）Ｒ１２およびアルキルからなる群から選択され；
各Ｒ９は、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１０、−ＳＲ１０、−Ｎ（Ｒ１０）２およびＲ１０からなる群から独立して選択され；
各Ｒ１０は、Ｈ、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、アルキルヘテロアリール−、アルキルアリール−、置換アルキル、置換アリール、置換アリールアルキル、置換ヘテロアリール、置換ヘテロアリールアルキル、置換シクロアルキル、置換シクロアルキルアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキルアルキル、置換アルキルヘテロアリール−、置換アルキルアリール−、ヘテロシクロアルケニルおよび置換ヘテロシクロアルケニルからなる群から独立して選択され、ここで、該Ｒ１０置換アルキルは、−ＮＨ２、−ＮＨＲ２０、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＯＲ２６、ハロ、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ２６、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２６および−Ｃ（Ｏ）Ｒ２６からなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換され、そして該Ｒ１０置換アリール、Ｒ１０置換アリールアルキル、Ｒ１０置換ヘテロアリール、Ｒ１０置換ヘテロアリールアルキル、Ｒ１０置換シクロアルキル、Ｒ１０置換シクロアルキルアルキル、Ｒ１０置換ヘテロシクロアルキル、Ｒ１０置換ヘテロシクロアルキルアルキル、Ｒ１０置換アルキルヘテロアリール−およびＲ１０置換アルキルアリール−は、（１）−ＮＨ２、（２）−ＮＯ２、（３）−ＣＮ、（４）−ＯＨ、（５）−ＯＲ２０、（６）−ＯＣＦ３、（７）独立して選択される１〜３個のハロ原子で置換されたアルキル、（８）−Ｃ（Ｏ）Ｒ３８、（９）アルキル、（１０）アルケニル、（１１）ハロ、（１２）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ２６、（１３）−Ｃ（Ｏ）ＯＲ３８、（１４）−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ３２−（Ｃ（Ｒ３０）２）ｎ−Ｎ（Ｒ３８）２、（１５）−Ｓ（Ｏ）ｔＲ３８、（１６）−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ３２−Ｒ３８、（１７）−ＮＲ３２−Ｃ（Ｏ）−Ｒ３８、
（１８）
【化３２−１４】
0005603777.tif 000051
（１９）−ＮＨＲ２０、および（２０）シクロアルキルからなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換され；
Ｒ１１は、Ｆ、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＯＲ１０、−ＮＨＮＲ１Ｒ１０、−ＳＲ１０およびヘテロアリールからなる群から選択され；
Ｒ１２は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルアルキルからなる群から選択され；
Ｒ１４は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル−、ヘテロシクロアルキル、アルキルヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル−、アルキルヘテロアリール−およびアルキルアリール−からなる群から選択され；
Ｒ１５は、Ｈ、−ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル−、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルアルキル−、アルキルヘテロアリール−およびアルキルアリール−からなる群から選択され；
Ｒ２０は、アルキルを表し；
Ｒ２３は、Ｈ、アルキル、アリール、シクロアルキルおよびシクロアルキルアルキル−からなる群から選択され；
各Ｒ２６は、Ｈおよびアルキルからなる群から独立して選択され；
Ｒ２８は、アルキルであり；
各Ｒ３０は、Ｈ、アルキルおよびＦからなる群から独立して選択され；
各Ｒ３２は、Ｈおよびアルキルからなる群から独立して選択され；
各Ｒ３５は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から独立して選択され；
Ｒ３６は、Ｈ、アルキルおよび−Ｏ−アルキルからなる群から選択され；
各Ｒ３８は、Ｈ、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、アルキルヘテロアリール−、アルキルアリール−、置換アルキル、置換アリール、置換アリールアルキル、置換ヘテロアリール、置換ヘテロアリールアルキル、置換シクロアルキル、置換シクロアルキルアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキルアルキル、置換アルキルヘテロアリール−および置換アルキルアリール−からなる群から独立して選択され、ここで、該Ｒ３８置換アルキルは、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＯＲ２６、ハロ、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ２８、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２８および−Ｃ（Ｏ）Ｒ２８からなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換され、そして
前記Ｒ３８置換アリール、置換アリールアルキル、置換ヘテロアリール、置換ヘテロアリールアルキル、置換シクロアルキル、置換シクロアルキルアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキルアルキル、置換アルキルヘテロアリール−および置換アルキルアリール−は、（１）−ＮＨ２、（２）−ＮＯ２、（３）−ＣＮ、（４）−ＯＨ、（５）−ＯＲ２０、（６）−ＯＣＦ３、（７）−ＣＦ３、（８）−Ｃ（Ｏ）Ｒ２６、（９）アルキル、（１０）アルケニル、（１１）ハロ、（１２）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ２６、（１３）−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２６、（１４）−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ３２−（Ｃ（Ｒ３０）２）ｎ−Ｎ（Ｒ２６）２、（１５）−Ｓ（Ｏ）ｔＲ２６、（１６）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３２）（Ｒ２６）、（１７）−ＮＲ３２Ｃ（Ｏ）Ｒ２６、
（１８）
【化３２−１５】
0005603777.tif 000052
および
（１９）−ＮＨＲ２０
からなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換され；
Ｒ４２は、アルキル、アリール、ヘテロアリールおよびシクロアルキルからなる群から選択され；
Ｒ４４は、Ｈ、アルキル、シクロアルキルおよびシクロアルキルアルキルからなる群から
選択され；そして
各Ｒ４６は、Ｈ、アルキル、シクロアルキルおよびシクロアルキルアルキルからなる群から独立して選択され、
該方法は、該細胞が、ホモ接合性もしくはヘテロ接合性のＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦ遺伝子型、またはホモ接合性もしくはヘテロ接合性のＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ遺伝子型を特徴とするか否かを判定する工程を包含し；ここで、該遺伝子型が検出された場合に、該細胞が感受性であると判定される、方法。
【請求項２】
前記悪性細胞または新形成細胞が、胃癌、腎癌、非固形癌、横紋筋肉腫、胆管癌、肺癌、膵癌、結腸癌、骨髄性白血病、甲状腺癌、骨髄異形成症候群、膀胱癌、上皮癌腫、黒色腫、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、脳癌、間葉系起源の癌、肉腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、ヘパトーム、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および未分化甲状腺癌からなる群から選択される病状を媒介する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インヒビターが、以下：
【化３３】
0005603777.tif 000053
【化３４】
0005603777.tif 000054
からなる群から選択される構造式によって表される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞がホモ接合性のＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦ遺伝子型を含むか否かが判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、インビトロの供給源から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、インビボの供給源由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
被験体からのサンプル中の１つ以上の悪性細胞または新形成細胞が、ホモ接合性もしくはヘテロ接合性のＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦ遺伝子型、またはホモ接合性もしくはヘテロ接合性のＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ遺伝子型を特徴とするか否かを判定する工程を包含し、ここで、該遺伝子型が該細胞において検出された場合に、該細胞が前記インヒビターに対して感受性であると判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記悪性細胞または新形成細胞が、胃癌、任意の腎癌、非固形癌、横紋筋肉腫、胆管癌、肺癌、膵癌、結腸癌、骨髄性白血病、甲状腺癌、骨髄異形成症候群、膀胱癌、上皮癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、脳癌、間葉系起源の癌、肉腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、ヘパトーム、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および未分化甲状腺癌からなる群から選択される病状を媒介する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターを用いて前記悪性細胞または新形成細胞を処置するために、該細胞を有する被験体を選択することを補助する方法であって、該方法は、請求項１に記載の方法によって、前記インヒビターに対する該悪性細胞または新形成細胞の感受性を判定する工程を包含し；ここで、該細胞が感受性であると判定された場合に、該被験体が選択される、方法。
【請求項１０】
前記悪性細胞または新形成細胞が、胃癌、任意の腎癌、非固形癌、横紋筋肉腫、胆管癌、肺癌、膵癌、結腸癌、骨髄性白血病、甲状腺癌、骨髄異形成症候群、膀胱癌、上皮癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、脳癌、間葉系起源の癌、肉腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、ヘパトーム、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および未分化甲状腺癌からなる群から選択される病状を媒介する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターに対して感受性である悪性細胞または新形成細胞を有する被験体を確認することを補助する方法であって、該方法は、請求項１に記載の方法によって該インヒビターに対する該悪性細胞または新形成細胞の感受性を判定する工程を包含し；ここで、該細胞が感受性であると判定された場合に、該被験体が確認される、方法。
【請求項１２】
前記悪性細胞または新形成細胞が、胃癌、任意の腎癌、非固形癌、横紋筋肉腫、胆管癌、肺癌、膵癌、結腸癌、骨髄性白血病、甲状腺癌、骨髄異形成症候群、膀胱癌、上皮癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、脳癌、間葉系起源の癌、肉腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、ヘパトーム、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および未分化甲状腺癌からなる群から選択される病状を媒介する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターを用いて、悪性細胞または新形成細胞によって媒介される病状を処置することを補助するための方法であって、該方法は、請求項１に記載の方法によって、該インヒビターに対する該悪性細胞または新形成細胞の感受性を判定する工程を包含し、ここで感受性の判定は、治療的に有効な用量の該インヒビターの該被験体への投与による、該インヒビターを用いた処置の継続または開始が行われるべきであることを示す、方法。
【請求項１４】
前記病状が、胃癌、任意の腎癌、非固形癌、横紋筋肉腫、胆管癌、肺癌、膵癌、結腸癌、骨髄性白血病、甲状腺癌、骨髄異形成症候群、膀胱癌、上皮癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、脳癌、間葉系起源の癌、肉腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、ヘパトーム、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および未分化甲状腺癌からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記悪性細胞または新形成細胞が、腫瘍内に存在する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記悪性細胞または新形成細胞が、非固形癌を媒介する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
悪性細胞または新形成細胞によって媒介される病状を有する被験体に対する治療を選択することを補助する方法であって、該方法は、請求項１に記載の方法によって、ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターに対する該細胞の感受性を判定する工程を包含し；ここで、該細胞が該インヒビターに対して感受性であると判定された場合に、該インヒビターが該治療として選択される、方法。
【請求項１８】
前記病状が、胃癌、任意の腎癌、非固形癌、横紋筋肉腫、胆管癌、肺癌、膵癌、結腸癌、骨髄性白血病、甲状腺癌、骨髄異形成症候群、膀胱癌、上皮癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、脳癌、間葉系起源の癌、肉腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、ヘパトーム、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および未分化甲状腺癌からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
悪性細胞または新形成細胞を処置するための処置レジメンにおいて、該細胞によって媒介される病状を有する被験体に投与されるべきＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターの用量を選択することを補助する方法であって、該方法は、請求項１に記載の方法によって該細胞の感受性を判定する工程を包含し；ここで、該細胞が感受性であると判定された場合は、該細胞が感受性でないと判定された場合に選択される用量よりも低用量が選択される、方法。
【請求項２０】
前記病状が、胃癌、任意の腎癌、非固形癌、横紋筋肉腫、胆管癌、肺癌、膵癌、結腸癌、骨髄性白血病、甲状腺癌、骨髄異形成症候群、膀胱癌、上皮癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、脳癌、間葉系起源の癌、肉腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、ヘパトーム、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および未分化甲状腺癌からなる群から選択
される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
各Ｒ３２はＨである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００７年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／９９１，３５１号、２００８年３月７日に出願された米国仮特許出願第６１／０３４，６１５号の利益を主張し、この米国仮特許出願の各々の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の分野は、概して、ＥＲＫ１（細胞外シグナル制御キナーゼ）インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターに対する所与の疾患の感受性を予測するための方法、ならびにそのような疾患の処置方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
腫瘍の成長、進行および転移に関与するプロセスは、癌細胞において活性化されるシグナル伝達経路によって媒介される。ＥＲＫ経路は、リガンドが結合した細胞表面チロシンキナーゼレセプター（例えば、ｅｒｂＢファミリーのメンバー、ＰＤＧＦレセプターチロシンキナーゼ、ＦＧＦレセプターチロシンキナーゼおよびＶＥＧＦレセプターチロシンキナーゼ）からの細胞外シグナルを中継することによって哺乳動物細胞の成長を制御する際に中心的役割を果たす。ＥＲＫ経路の活性化は、Ｒａｓの活性化から始まるリン酸化事象のカスケードを介する。Ｒａｓの活性化によって、セリン−トレオニンキナーゼであるＲａｆの動員および活性化がもたらされる。この経路のＲＡＦ成分は、セリン／トレオニンキナーゼであり、ＭＥＫ−ＥＲＫカスケードを活性化する３つのアイソフォーム（ＢＲＡＦ、ＡＲＡＦおよびＲＡＦ１）を有する。次いで、活性化されたＲａｆは、ＭＥＫ１／２をリン酸化し、そして活性化し、次いでそれにより、ＥＲＫ１／２がリン酸化され、活性化される。ＥＲＫ１／２は、活性化されると、細胞骨格の変化および転写の活性化をはじめとした多数の細胞性事象に関与するいくつかの下流の標的をリン酸化する。ＥＲＫ／ＭＡＰＫ経路は、細胞増殖にとって最も重要な経路の１つであり、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ経路は、しばしば多くの腫瘍において活性化されると考えられている。ＥＲＫ１／２の上流であるＲａｓ遺伝子は、結腸直腸腫瘍、メラノーマ腫瘍、乳房腫瘍および膵腫瘍を含むいくつかの癌において変異している。高いＲａｓ活性は、多くのヒト腫瘍において高いＥＲＫ活性を伴う。さらに、Ｒａｆファミリーのセリン−トレオニンキナーゼであるＢＲＡＦの変異は、キナーゼ活性の増加に関連する。これらの観察結果は、ＥＲＫ１／２シグナル伝達経路が、広範囲のヒト腫瘍における抗癌治療のための魅力的な経路であることを示唆している。
【０００４】
ＥＲＫ１およびＥＲＫ２のいくつかのインヒビターが知られており（例えば、特許文献１を参照のこと）、実際に、有効な抗癌剤であると証明されている。しかしながら、例えば個体の遺伝的変異性をはじめとした因子のせいで、特定の患者が所与の治療に対して非応答性になり得る。したがって、所与の治療に対する応答性についてバイオマーカーを使用することは、一連の処置を開始する前に、患者の応答性を迅速かつ便利に判定するための有用なツールである。所与の癌を早期に首尾よく処置することが、患者の臨床成績にとって重大であることが多い。バイオマーカーの使用は、所与の患者において有効である可能性のある処置の特定を迅速に助けること、および／または所与の患者において有効でない可能性のある処置の除外を助けることによって、このプロセスに役立ち得る。バイオマーカーの使用の別の利点は、患者のコンプライアンスに関する。所与のインヒビター治療が特定の腫瘍に対して有効である可能性があると保証された患者は、調合されたインヒビターベースのレジメンを長期にわたり継続する高い見込みを示すだろう。ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターベースの癌治療に対する癌の感受性を予測するためのバイオマーカーが、当該分野において必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００７／７０３９８号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫ（例えば、ＭＥＫ１またはＭＥＫ２）インヒビターに対する癌細胞の拡散、成長または生存の感受性を予測する際に有効なＢＲＡＦ遺伝的バイオマーカーを提供することによって、当該分野におけるこの必要性に取り組むものである。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）  ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターに対する悪性細胞または新形成細胞の感受性を評価するための方法であって、該細胞が、ホモ接合性もしくはヘテロ接合性のＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦ遺伝子型、またはホモ接合性もしくはヘテロ接合性のＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ遺伝子型、あるいはＢＲＡＦ機能獲得型表現型を特徴とする任意の遺伝子型を特徴とするか否かを判定する工程を包含し；ここで、前記遺伝子型が検出された場合に、前記細胞が感受性であると判定される、方法。
（項目２）  前記悪性細胞または新形成細胞が、胃癌、腎癌、非固形癌、横紋筋肉腫、胆管癌、肺癌、膵癌、結腸癌、骨髄性白血病、甲状腺癌、骨髄異形成症候群、膀胱癌、上皮癌腫、黒色腫、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、脳癌、間葉系起源の癌、肉腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、ヘパトーム、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および未分化甲状腺癌からなる群から選択される病状を媒介する、項目１に記載の方法。
（項目３）  前記インヒビターが、以下：
【化３１】
0005603777.tif 000002
【化３２】
0005603777.tif 000003
からなる群から選択される構造式によって表される、項目１に記載の方法。
（項目４）  前記細胞がホモ接合性のＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦ遺伝子型を含むか否かが判定される、項目１に記載の方法。
（項目５）  前記細胞が、インビトロの供給源から得られる、項目１に記載の方法。
（項目６）  前記細胞が、インビボの供給源から得られる、項目１に記載の方法。
（項目７）  （ａ）被験体の身体から１つ以上の悪性細胞または新形成細胞のサンプルを得る工程；
（ｂ）該悪性細胞または新形成細胞が、ホモ接合性もしくはヘテロ接合性のＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦ遺伝子型、またはホモ接合性もしくはヘテロ接合性のＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ遺伝子型、あるいは機能獲得型表現型で特徴付けられるＢＲＡＦの任意の遺伝子型を特徴とするか否かを判定する工程；
を包含し、ここで、該遺伝子型が該細胞において検出された場合に、該細胞が前記インヒビターに対して感受性であると判定される、項目１に記載の方法。
（項目８）  前記悪性細胞または新形成細胞が、胃癌、任意の腎癌、非固形癌、横紋筋肉腫、胆管癌、肺癌、膵癌、結腸癌、骨髄性白血病、甲状腺癌、骨髄異形成症候群、膀胱癌、上皮癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、脳癌、間葉系起源の癌、肉腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、ヘパトーム、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および未分化甲状腺癌からなる群から選択される病状を媒介する、項目７に記載の方法。
（項目９）  前記悪性細胞または新形成細胞が感受性であると判定された場合に、治療有効量のさらなる化学療法剤と必要に応じて併用して、治療有効量の前記インヒビターを前記被験体に投与することによって、該被験体における該細胞を処置する工程をさらに包含する、項目７に記載の方法。
（項目１０）  ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターを用いて前記悪性細胞または新形成細胞を処置するために、該細胞を有する被験体を選択するための方法であって、該方法は、項目１に記載の方法によって、前記インヒビターに対する該悪性細胞または新形成細胞の感受性を評価する工程を包含し；ここで、該細胞が感受性であると判定された場合に、該被験体が選択される、方法。
（項目１１）  前記悪性細胞または新形成細胞が、胃癌、任意の腎癌、非固形癌、横紋筋肉腫、胆管癌、肺癌、膵癌、結腸癌、骨髄性白血病、甲状腺癌、骨髄異形成症候群、膀胱癌、上皮癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、脳癌、間葉系起源の癌、肉腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、ヘパトーム、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および未分化甲状腺癌からなる群から選択される病状を媒介する、項目１０に記載の方法。
（項目１２）  治療有効量のさらなる化学療法剤と必要に応じて併用して、前記選択された被験体に治療有効量の前記インヒビターを投与することによって、該被験体における前記悪性細胞または新形成細胞を処置する工程をさらに包含する、項目１０に記載の方法。
（項目１３）  ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターに対して感受性である悪性細胞または新形成細胞を有する被験体を確認するための方法であって、該方法は、項目１に記載の方法によって該インヒビターに対する該悪性細胞または新形成細胞の感受性を評価する工程を包含し；ここで、該細胞が感受性であると判定された場合に、該被験体が確認される、方法。
（項目１４）  前記悪性細胞または新形成細胞が、胃癌、任意の腎癌、非固形癌、横紋筋肉腫、胆管癌、肺癌、膵癌、結腸癌、骨髄性白血病、甲状腺癌、骨髄異形成症候群、膀胱癌、上皮癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、脳癌、間葉系起源の癌、肉腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、ヘパトーム、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および未分化甲状腺癌からなる群から選択される病状を媒介する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）  前記被験体が確認された場合に、治療有効量のさらなる化学療法剤と必要に応じて併用して、治療有効量の前記インヒビターを該被験体に投与することによって、該被験体における前記悪性細胞または新形成細胞を処置する工程をさらに包含する、項目１３に記載の方法。
（項目１６）  ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターを用いて、悪性細胞または新形成細胞によって媒介される病状を処置するための方法であって、該方法は、項目１に記載の方法によって、該インヒビターに対する該悪性細胞または新形成細胞の感受性を評価する工程、および該細胞が感受性であると判定された場合に、治療的に有効な用量の該インヒビターを該被験体に投与することによって、該インヒビターを用いた処置を継続するかまたは開始する工程を包含する、方法。
（項目１７）  前記病状が、胃癌、任意の腎癌、非固形癌、横紋筋肉腫、胆管癌、肺癌、膵癌、結腸癌、骨髄性白血病、甲状腺癌、骨髄異形成症候群、膀胱癌、上皮癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、脳癌、間葉系起源の癌、肉腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、ヘパトーム、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および未分化甲状腺癌からなる群から選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）  前記悪性細胞または新形成細胞が、腫瘍内に存在する、項目１６に記載の方法。
（項目１９）  前記悪性細胞または新形成細胞が、非固形癌を媒介する、項目１６に記載の方法。
（項目２０）  悪性細胞または新形成細胞によって媒介される病状を有する被験体に対する治療を選択するための方法であって、該方法は、項目１に記載の方法によって、ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターに対する該細胞の感受性を評価する工程を包含し；ここで、該細胞が該インヒビターに対して感受性であると判定された場合に、該インヒビターが該治療として選択される、方法。
（項目２１）  前記病状が、胃癌、任意の腎癌、非固形癌、横紋筋肉腫、胆管癌、肺癌、膵癌、結腸癌、骨髄性白血病、甲状腺癌、骨髄異形成症候群、膀胱癌、上皮癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、脳癌、間葉系起源の癌、肉腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、ヘパトーム、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および未分化甲状腺癌からなる群から選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）  前記治療が選択された場合に、治療有効量のさらなる化学療法剤と必要に応じて併用して、治療有効量の前記インヒビターを前記被験体に投与することによって、該被験体における前記病状を処置する工程をさらに包含する、項目２０に記載の方法。
（項目２３）  悪性細胞または新形成細胞を処置するための処置レジメンにおいて、該細胞によって媒介される病状を有する被験体に投与されるべきＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターの用量を選択するための方法であって、該方法は、項目１に記載の方法によって該細胞の感受性を評価する工程を包含し；ここで、該細胞が感受性であると判定された場合は、該細胞が感受性でないと判定された場合に選択される用量よりも低用量が選択される、方法。
（項目２４）  前記病状が、胃癌、任意の腎癌、非固形癌、横紋筋肉腫、胆管癌、肺癌、膵癌、結腸癌、骨髄性白血病、甲状腺癌、骨髄異形成症候群、膀胱癌、上皮癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、脳癌、間葉系起源の癌、肉腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、ヘパトーム、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および未分化甲状腺癌からなる群から選択される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）  治療有効量のさらなる化学療法剤と必要に応じて併用して、前記選択された用量の前記インヒビターを前記被験体に投与する工程をさらに包含する、項目２３に記載の方法。
【０００７】
本発明は、ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターに対する悪性細胞または新形成細胞の感受性を評価するための方法を提供し、この方法は、前記細胞が、ホモ接合性もしくはヘテロ接合性のＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦ遺伝子型、またはホモ接合性もしくはヘテロ接合性のＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ遺伝子型、あるいは機能獲得型表現型を特徴とする任意のＢＲＡＦ遺伝子型を特徴とするか否かを判定する工程を包含し；ここで、前記遺伝子型が検出された場合に、前記細胞が感受性であると判定される。本発明の実施形態において、前記悪性細胞または新形成細胞は、胃癌、任意の腎癌、横紋筋肉腫、胆管癌、肺癌、膵癌、結腸癌、骨髄性白血病、甲状腺癌、骨髄異形成症候群、膀胱癌、上皮癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、脳癌、間葉系起源の癌、肉腫、奇形癌（ｔｅｔｒａｃａｒｃｉｎｏｍａ）、神経芽細胞腫、腎臓癌、ヘパトーム、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および未分化甲状腺癌からなる群から選択される病状を媒介する。本発明の実施形態において、前記ＥＲＫインヒビターまたはＭＥＫインヒビターは、
【０００８】
【化１】
0005603777.tif 000004
からなる群から選択される構造式によって表される。本発明の実施形態において、ホモ接合性のＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦ遺伝子型を特徴とする細胞が、感受性であると判定される。本発明の実施形態において、その細胞は、インビトロまたはインビボの供給源から得られる。例えば、本発明の実施形態において、本方法は、（ａ）被験体の身体から１つ以上の悪性細胞または新形成細胞のサンプルを得る工程；（ｂ）前記悪性細胞または新形成細胞が、ホモ接合性もしくはヘテロ接合性のＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦ遺伝子型、またはヘテロ接合性のＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ遺伝子型、あるいは機能獲得型表現型を特徴とする任意のＢＲＡＦ遺伝子型を特徴とするか否かを判定する工程を包含し；ここで、前記遺伝子型が前記細胞において検出された場合に、その細胞が前記インヒビターに対して感受性であると判定される。本発明の実施形態において、その方法は、悪性細胞または新形成細胞が感受性であると判定された場合に、治療有効量のさらなる化学療法剤（例えば、テモゾロミドまたはカルシトリオール）と必要に応じて併用して、治療有効量のそのインヒビターを被験体に投与することによって、その被験体における悪性細胞または新形成細胞を処置する工程をさらに包含する。
【０００９】
本発明は、ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターを用いて処置するための、悪性細胞または新形成細胞を有する被験体を選択するための方法も提供し、この方法は、本明細書中で述べられる方法によって前記インヒビターに対するその悪性細胞または新形成細胞の感受性を評価する工程を包含し；ここで、前記細胞が感受性であると判定された場合に、前記被験体が選択される。本発明の実施形態において、前記悪性細胞または新形成細胞は、胃癌、任意の腎癌、横紋筋肉腫、胆管癌、肺癌、膵癌、結腸癌、骨髄性白血病、甲状腺癌、骨髄異形成症候群、膀胱癌、上皮癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、脳癌、間葉系起源の癌、肉腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、ヘパトーム、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および未分化甲状腺癌からなる群から選択される病状を媒介する。本発明の実施形態において、その方法は、被験体が選択された場合に、治療有効量のさらなる化学療法剤（例えば、テモゾロミドまたはカルシトリオール）と必要に応じて併用して、治療有効量の上記インヒビターを前記被験体に投与することによって、その被験体における悪性細胞または新形成細胞を処置する工程をさらに包含する。
【００１０】
本発明は、ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターに対して感受性である悪性細胞または新形成細胞を有する被験体を確認するための方法を提供し、この方法は、本明細書中で述べられる方法によって前記インヒビターに対する悪性細胞または新形成細胞の感受性を評価する工程を包含し；ここで、前記細胞が感受性であると判定された場合に、前記被験体が確認される。本発明の実施形態において、悪性細胞または新形成細胞は、胃癌、任意の腎癌、横紋筋肉腫、胆管癌、肺癌、膵癌、結腸癌、骨髄性白血病、甲状腺癌、骨髄異形成症候群、膀胱癌、上皮癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、脳癌、間葉系起源の癌、肉腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、ヘパトーム、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および未分化甲状腺癌からなる群から選択される病状を媒介する。本発明の実施形態において、その方法は、被験体が確認された場合に、治療有効量のさらなる化学療法剤（例えば、テモゾロミドまたはカルシトリオール）と必要に応じて併用して、治療有効量の上記インヒビターを前記被験体に投与することによって、その被験体における悪性細胞または新形成細胞を処置する工程をさらに包含する。
【００１１】
本発明は、ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターを用いて、悪性細胞または新形成細胞によって媒介される病状を処置するための方法をさらに提供し、この方法は、本明細書中に示される方法によって、前記インヒビターに対するその悪性細胞または新形成細胞の感受性を評価する工程、および前記細胞が感受性であると判定された場合に、その被験体に治療的に有効な用量の上記インヒビターを投与することによる処置を継続するか、または開始する工程を包含する。本発明の実施形態において、病状は、胃癌、任意の腎癌、横紋筋肉腫、胆管癌、肺癌、膵癌、結腸癌、骨髄性白血病、甲状腺癌、骨髄異形成症候群、膀胱癌、上皮癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、脳癌、間葉系起源の癌、肉腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、ヘパトーム、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および未分化甲状腺癌からなる群から選択される。例えば、本発明の実施形態において、前記悪性細胞または新形成細胞は、腫瘍内に存在するか、または非固形癌を媒介する。
【００１２】
本発明の範囲は、悪性細胞または新形成細胞によって媒介される病状を有する患者に対する治療を選択するための方法も包含し、この方法は、本明細書中で述べられる方法によって、ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターに対するその細胞の感受性を評価する工程を包含し；ここで、前記細胞がそのインヒビターに対して感受性であると判定された場合に、前記インヒビターが治療薬として選択される。本発明の実施形態において、病状は、胃癌、任意の腎癌、横紋筋肉腫、胆管癌、肺癌、膵癌、結腸癌、骨髄性白血病、甲状腺癌、骨髄異形成症候群、膀胱癌、上皮癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、脳癌、間葉系起源の癌、肉腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、ヘパトーム、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および未分化甲状腺癌からなる群から選択される。本発明の実施形態において、その方法は、治療薬が選択された場合に、治療有効量のさらなる化学療法剤（例えば、テモゾロミドまたはカルシトリオール）と必要に応じて併用して、治療有効量の上記インヒビターを被験体に投与することによって、その被験体における病状を処置する工程をさらに包含する。
【００１３】
本発明の範囲は、悪性細胞または新形成細胞によって媒介される病状を有する被験体に投与されるべきＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターの用量を選択するための方法も包含し、この方法は、本明細書中に示される方法によって、その細胞の感受性を評価する工程を包含し；ここで、前記細胞が感受性であると判定された場合は、前記細胞が感受性であると判定されない場合に選択される用量よりも低用量が選択される。本発明の実施形態において、病状は、胃癌、任意の腎癌、横紋筋肉腫、胆管癌、肺癌、膵癌、結腸癌、骨髄性白血病、甲状腺癌、骨髄異形成症候群、膀胱癌、上皮癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、脳癌、間葉系起源の癌、肉腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、ヘパトーム、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および未分化甲状腺癌からなる群から選択される。本発明の実施形態において、その方法は、治療有効量のさらなる化学療法剤（例えば、テモゾロミドまたはカルシトリオール）と必要に応じて併用して、選択された用量の上記インヒビターを前記被験体に投与する工程をさらに包含する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
細胞、例えば細胞株のＢＲＡＦ遺伝子型の状態（ホモ接合性のＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦもしくはヘテロ接合性のＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦ、またはホモ接合性のＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦもしくはヘテロ接合性のＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ、あるいは機能獲得型表現型を特徴とする任意のＢＲＡＦ遺伝子型）は、ＥＲＫ１／２キナーゼインヒビターまたはＭＥＫキナーゼインヒビターに対する化合物感受性（例えば、患者における腫瘍内の細胞の化合物感受性）についての新規の予測的なバイオマーカーである。本発明の重要な特徴および利点は、Ｖ６００  ＢＲＡＦ変異遺伝子型の状態が、追加のＥＲＫ１／２インヒビター化合物またはＭＥＫインヒビター化合物に対する感受性についての予測的なバイオマーカーとして使用され得ること、ゆえに、黒色腫を含むヒトの癌に対する新規の化学療法薬の開発に役立ち得ることである。ＥＲＫ１／２インヒビター薬物応答またはＭＥＫインヒビター薬物応答と、認識されている癌遺伝子であるＢＲＡＦの変異状態との相関は、ヒト腫瘍組織、細胞株およびマウス異種移植片モデルにおいてＥＲＫ１／２化合物感受性プロファイルおよびＭＥＫ化合物感受性プロファイルを予測する、ＢＲＡＦに対する診断テストの開発を可能にする。
【００１５】
本発明の実施形態において、成長の阻害が、約１００ｎＭ以下のＩＣ５０値を特徴とする場合、一般に、細胞は、ＥＲＫ１インヒビターまたはＥＲＫ２インヒビターに対してより感受性であると考えられる。１００ｎＭを超えるＩＣ５０値は、一般に、抵抗性（すなわち、より低い感受性）と考えられる。
【００１６】
成長の阻害が、約１０ｎＭ以下のＩＣ５０値を特徴とする場合、一般に、細胞は、ＭＥＫインヒビターに対してより感受性であると考えられる。１０ｎＭを超えるＩＣ５０値は、一般に抵抗性（すなわち、より低い感受性）と考えられる。
【００１７】
通常、本明細書中に示されるようなＢＲＡＦ  Ｖ６００変異体遺伝子型と関連するＭＥＫインヒビターまたはＥＲＫインヒビター（例えば、本明細書中に示されるようなもの）の感受性は、以下の通りランクづけられる、ホモ接合体＞ヘテロ接合体＞野生型。
【００１８】
被験体には、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）などの動物を含む、任意の生物が包含される。
【００１９】
新形成細胞は、異常に高いレベルの増殖を示し、腫瘍または塊を形成し得る。新生物は、良性または悪性であり得る。一般に、悪性細胞および悪性腫瘍は、浸潤し得、近くの組織および器官を破壊し得、そして身体の他の部分に広がり得る。
【００２０】
本発明は、悪性細胞もしくは新形成細胞または病状を処置するための方法を提供する。そのような方法は、そのような細胞の成長、生存または拡散（例えば、転移）が任意の程度に阻害される実施形態を含む。
【００２１】
本発明の範囲は、固形腫瘍疾患および非固形腫瘍疾患が処置される実施形態も包含する。非固形腫瘍疾患は、その疾患が固形腫瘍または塊によって媒介されない実施形態、例えば、白血病などの血液癌を含む。
【００２２】
ＢＲＡＦに関する用語「機能獲得型」は、任意の当業者によって理解されるであろう（例えば、Ｈｏｅｆｌｉｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００６）６６（２）：９９９−１００６を参照のこと）。例えば、本発明の実施形態において、機能獲得型ＢＲＡＦ遺伝子型は、例えば、ＭＥＫ（例えば、ＭＥＫ１またはＭＥＫ２）の高いまたは構成的なリン酸化によって、例えば、細胞増殖の増加および／または形質転換された表現型をもたらし得る、高いまたは構成的なＢＲＡＦ媒介性細胞内シグナル伝達を促進する。
【００２３】
ＢＲＡＦ
用語ＢＲＡＦは、いかなるヒトＢＲＡＦ遺伝子またはタンパク質も包含する。ＢＲＡＦは、いくつかの名称によって知られており、それらとしては、例えば、Ｂ−Ｒａｆ癌原遺伝子セリン／トレオニン−タンパク質キナーゼ、９４ｋＤａ  Ｂ−ｒａｆタンパク質、およびｖ−Ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログＢ１が挙げられる。ＢＲＡＦのＶ６００ＥまたはＶ６００Ｄ変異体は、６００位におけるバリンの代わりにグルタミン酸またはアスパラギン酸を含む。本発明は、そのような変異体ＢＲＡＦポリペプチドおよびポリヌクレオチドならびにそれらの使用（例えば、本明細書中に説明されるような使用）を含む。
【００２４】
本発明の実施形態において、ＢＲＡＦは、以下のアミノ酸配列を含む：
【００２５】
【化２】
0005603777.tif 000005
Ｖ６００Ｅ変異体ではグルタミン酸に、またはＶ６００Ｄ変異体ではアスパラギン酸に、変異しているバリン６００は、下線が引かれており、太字のフォントで示されている。
【００２６】
本発明の実施形態において、ＢＲＡＦは、以下のポリヌクレオチドによってコードされる：
【００２７】
【化３】
0005603777.tif 000006
ＢＲＡＦにおけるＶ６００ＥまたはＶ６００Ｄ変異などの対立遺伝子の位置は、タンパク質翻訳のための開始コドン（ＡＴＧ）に対する、コンセンサス配列または参照配列における位置によって特定され得る。特定の対立遺伝子の位置が、コンセンサス配列または参照配列と比較される個体において１つ以上の挿入または欠失が存在することに起因して、目的の集団内の各個体では、その参照配列またはコンテクスト配列における位置と正確に同じ位置に見出されないことがあることを当業者は理解する。したがって、参照配列またはコンテクスト配列における特定の位置を参照することによって（またはそのような配列における開始コドンに関して）本明細書中に記載される任意の対立遺伝子の位置を特定することは、単に便利さのためであること、および文献上で明確に列挙される任意のヌクレオチド位置は、同じ対立遺伝子が、本明細書中に記載される遺伝子型同定方法（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）または当該分野で周知の他の遺伝子型同定方法のいずれかを用いて本発明のバイオマーカーの存在または非存在について試験されている任意の個体における同じ遺伝子座に実際に位置するどんなヌクレオチド位置も含むことを当業者は理解するだろう。
【００２８】
Ｖ６００Ｅ変異体ではグルタミン酸に、またはＶ６００Ｄ変異体ではアスパラギン酸に、変異しているバリン６００をコードするコドンは、下線が引かれており、太字のフォントで示されている。本発明は、そのコドンが、変異体対立遺伝子において、バリンをコードする任意のコドン（例えば、ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡまたはＧＴＧ）であるか、またはグルタミン酸をコードするコドンが、任意のそのようなコドン（例えば、ＧＡＡまたはＧＡＧ）であるか、またはアスパラギン酸をコードするコドンが、任意のそのようなコドン（例えば、ＧＡＴまたはＧＡＣ）である、実施形態を包含する。
【００２９】
本発明の実施形態において、Ｖ６００Ｄ変異は、ＴＧ１７９６−９７ＡＴというタンデム変異によって引き起こされる。
【００３０】
ＥＲＫおよびＭＥＫ
ｐ４４  ＭＡＰキナーゼおよびｐ４２  ＭＡＰキナーゼとも呼ばれる細胞外シグナル制御キナーゼ１および２（ＥＲＫ１およびＥＲＫ２）は、真核生物に見られるタンパク質のマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ファミリーのメンバーである。４４ｋＤａ  ＥＲＫ１および４２ｋＤａ  ＥＲＫ２は、高度に相同性であり、かつその両方が、同じタンパク質キナーゼカスケードにおいて機能するので、この２つのタンパク質は、ＥＲＫ１／２またはｐ４４／ｐ４２  ＭＡＰキナーゼと集合的に称されることが多い。ＥＲＫ１／２シグナル伝達カスケードは、細胞分化、細胞生理学および神経機能の決定的な制御因子であることが示されている。ＥＲＫ１／２活性の異常な調節は、癌および自己免疫疾患をはじめとした種々の病理学的状態に関わっている。
【００３１】
用語「ＥＲＫ１／２」および「ＥＲＫ」などは、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２のことを指す。用語「ＭＥＫ」および「ＭＥＫ１／２」などは、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２のことを指す。
【００３２】
ＥＲＫ１の正式名称は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ３である。本発明の実施形態において、ヒトＥＲＫ１は、以下のアミノ酸配列：
【００３３】
【化４】
0005603777.tif 000007
または以下のアミノ酸配列：
【００３４】
【化５】
0005603777.tif 000008
を含む。
【００３５】
本発明の実施形態において、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１；ｐ４０；ｐ４１；ＥＲＴ１；ＭＡＰＫ２；ＰＲＫＭ１；ＰＲＫＭ２；Ｐ４２ＭＡＰＫ；またはｐ４１ｍａｐｋとしても知られるヒトＥＲＫ２は、以下のアミノ酸配列：
【００３６】
【化６】
0005603777.tif 000009
または以下のアミノ酸配列：
【００３７】
【化７】
0005603777.tif 000010
を含む。
【００３８】
本発明の実施形態において、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＫＫ１；ＭＡＰＫＫ１；ＰＲＫＭＫ１としても知られるヒトＭＥＫ１は、以下のアミノ酸配列：
【００３９】
【化８】
0005603777.tif 000011
を含む。
【００４０】
本発明の実施形態において、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ２、ＭＡＰ２Ｋ２；ＭＡＰＫＫ２、ＭＫＫ２、ＰＲＫＭＫ２としても知られるヒトＭＥＫ２は、以下のアミノ酸配列を含む。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、ＭＡＰキナーゼキナーゼファミリーに属する二重特異性タンパク質キナーゼである。このキナーゼは、マイトジェン成長因子シグナル伝達において決定的な役割を果たすことが知られている。それは、ＭＡＰＫ１／ＥＲＫ２をリン酸化し、ゆえに活性化する。
【００４１】
【化９】
0005603777.tif 000012
ＥＲＫインヒビターおよびＭＥＫインヒビター
ＥＲＫ１／２インヒビターおよびＭＥＫインヒビターは、ＥＲＫ１（ｐ４４としても知られる）、ＥＲＫ２（ｐ４２としても知られる）またはＭＥＫ（ＭＥＫ１およびＭＥＫ２を含む）を任意の程度に阻害する任意のそのようなインヒビターを含む。一般に、ＥＲＫ１を阻害する物質は、ＥＲＫ２も阻害し、その逆もまた同じである。そのようなインヒビターは、ＥＲＫ１／２インヒビターまたはＥＲＫインヒビターと称されることがある。
【００４２】
本発明の実施形態において、ＥＲＫ１インヒビターまたはＥＲＫ２インヒビターは、公開されている国際特許出願番号ＷＯ２００７／０７０３９８に示されている任意のインヒビターである。
【００４３】
本発明の実施形態において、ＥＲＫ１／２インヒビターは、以下：
【００４４】
【化１０】
0005603777.tif 000013
のうちのいずれかもしくは他の任意の小分子ＥＲＫ１／２インヒビターであるか、あるいはＥＲＫ１もしくはＥＲＫ２に特異的に結合し、いかなる程度でもそのような酵素の活性を阻害する抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【００４５】
本発明の実施形態において、ＭＥＫインヒビターは、以下：
【００４６】
【化１１】
0005603777.tif 000014
のうちのいずれか；または他の任意の小分子ＭＥＫインヒビターであるか、ＭＥＫに特異的に結合し、いかなる程度でもそのような酵素の活性を阻害する任意の抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。
【００４７】
本発明の実施形態において、ＥＲＫ１またはＥＲＫ２インヒビターは、以下の構造式（１．０）：
【００４８】
【化１２】
0005603777.tif 000015
またはその任意の薬学的に許容できる塩によって表され、ここで、
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、各々独立して、−ＣＨ＝、−Ｎ＝および−ＣＲ９＝からなる群から選択され；
ｚは、１〜３であり；
Ｑは：
【００４９】
【化１３】
0005603777.tif 000016
【００５０】
【化１４】
0005603777.tif 000017
からなる群から選択される置換基であり、
各Ｑ１は、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群から独立して選択される環を表し、ここで、前記置換された環は、Ｒ１０部分からなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換されているが；但し、Ｑ１が、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであるとき、その環結合点における炭素原子は、置換されず；
Ｑ２は、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキルおよび置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される環を表し、ここで、前記置換された環は、Ｒ１０部分からなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換され；
Ｚ１は、−（Ｃ（Ｒ２４）２）ｗ−を表し、ここで、各Ｒ２４は、Ｈ、アルキルおよびＦからなる群から独立して選択され、ｗは、１、２または３であり；
Ｚ２は、−Ｎ（Ｒ４４）−、−Ｏ−および−Ｃ（Ｒ４６）２−からなる群から選択され；
ｍは、１〜６であり；
ｎは、１〜６であり；
ｐは、０〜６であり；
ｔは、０、１または２であり；
Ｒ１は、
（１）−ＣＮ、
（２）−ＮＯ２、
（３）−ＯＲ１０、
（４）−ＳＲ１０、
（５）−Ｎ（Ｒ１０）２、
（６）Ｒ１０、
（７）−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、
（８）−（Ｃ（Ｒ３０）２）ｎ−ＮＲ３２−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１０、
（９）−（Ｃ（Ｒ３０）２）ｎ−ＮＲ３２−Ｓ（Ｏ）ｔ−Ｒ１０、
（１０）−（Ｃ（Ｒ３０）２）ｎ−ＮＲ３２−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ３２）−Ｒ１０、
（１１）
【００５１】
【化１５】
0005603777.tif 000018
（１２）−ＣＦ３、
（１３）−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、
（１４）−（Ｃ（Ｒ３０）２）ｎＲ１３（例えば、−（ＣＨ２）ｎＲ１３）、
（１５）アルケニル、
（１６）−ＮＲ３２−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１４、
（１７）
【００５２】
【化１６】
0005603777.tif 000019
（ここで、各Ｒ１０は、独立して選択される）、
（１８）
【００５３】
【化１７】
0005603777.tif 000020
（ここで、各Ｒ１０は、独立して選択される）、
（１９）
【００５４】
【化１８】
0005603777.tif 000021
（２０）−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ３２−（Ｃ（Ｒ３０）２）ｐ−ＯＲ１０、
（２１）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２（ここで、各Ｒ１０は、独立して選択される）、
（２２）−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ３２−Ｃ（Ｒ１８）３、
（２３）−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ３２−（Ｃ（Ｒ３０）２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１０）２、
（２４）ヘテロシクロアルケニル、
（２５）
【００５５】
【化１９】
0005603777.tif 000022
および
（２６）アリールアルケニル−
からなる群から選択され；
Ｒ２は：
（１）Ｈ、
（２）−ＣＮ、
（３）ハロ、
（４）アルキル、
（５）置換アルキル（ここで、前記置換アルキルは、（ａ）−ＯＨ、（ｂ）−Ｏ−アルキル（例えば、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ３アルキル）、（ｃ）１〜３個のＦ原子で置換された−Ｏ−アルキル、および（ｄ）−Ｎ（Ｒ４０）２（ここで、各Ｒ４０は、（ｉ）Ｈ、（ｉｉ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、（ｉｉｉ）−ＣＦ３、および（ｅ）ハロからなる群から独立して選択される）からなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されている）、
（６）アルキニル、
（７）アルケニル、
（８）−（ＣＨ２）ｍＲ１１、
（９）−Ｎ（Ｒ２６）２、
（１０）−ＯＲ２３、
（１１）−Ｎ（Ｒ２６）Ｃ（Ｏ）Ｒ４２、
（１２）シクロアルキル、
（１３）シクロアルキルアルキル、
（１４）
【００５６】
【化２０】
0005603777.tif 000023
（１５）−Ｏ−（置換アルキル）（ここで、前記置換アルキルは、１〜３個のＦ原子で置換されている）、
（１６）−Ｓ（Ｏ）ｔ−アルキル、
（１７）−Ｃ（Ｏ）−アルキル、
（１８）
【００５７】
【化２１】
0005603777.tif 000024
（１９）
【００５８】
【化２２】
0005603777.tif 000025
（ここで、各アルキルは、独立して選択される）、
（２０）
【００５９】
【化２３】
0005603777.tif 000026
（各アルキルは、独立して選択される）、
（２１）
【００６０】
【化２４】
0005603777.tif 000027
（ここで、各アルキルは、独立して選択される）、
（２２）−Ｎ（Ｒ４８）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ４８（ここで、各Ｒ４８は、Ｈおよびアルキルからなる群から独立して選択される）、および
（２３）−Ｃ（Ｏ）−アルキル、例えば、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）など、例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３など、
からなる群から選択され；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の各々は、
（１）Ｈ、
（２）アルケニル、
（３）置換アルケニル、
（４）アルキル、
（５）置換アルキル、
（６）シクロアルキル、
（７）置換シクロアルキル、
（８）シクロアルキルアルキル−、
（９）置換シクロアルキルアルキル−、
（１０）ヘテロシクロアルキル、
（１１）置換ヘテロシクロアルキル、
（１２）ヘテロシクロアルキルアルキル−、
（１３）置換ヘテロシクロアルキルアルキル−、
（１４）−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、
（１５）アリールヘテロアリール−、
（１６）置換アリールヘテロアリール−、
（１７）ヘテロアリールアリール−、
（１８）置換ヘテロアリールアリール−、
（１９）アリール、
（２０）置換アリール、
（２１）ヘテロアリール、
（２２）置換ヘテロアリール、
（２３）ヘテロアリールヘテロアリール−、
（２４）置換ヘテロアリールヘテロアリール−、
（２５）アリールアミノヘテロアリール−、
（２６）置換アリールアミノヘテロアリール−、
（２７）アリールアルキニル−、
（２８）置換アリールアルキニル−、
（２９）ヘテロアリールアルキニル−、
（３０）置換ヘテロアリールアルキニル−
からなる群から独立して選択され、
ここで、前記Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７で置換された基（７）、（９）、（１１）、（１３）、（１６）、（１８）、（２０）、（２２）、（２４）、（２６）、（２８）および（３０）は、−ＮＨ２、アルキル、アルケニル、ハロ、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ２８、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２８および−Ｃ（Ｏ）Ｒ２８からなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換され、
ここで、前記Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７で置換された基（３）および（５）は、−ＮＨ２、ハロ（例えば、Ｆ、ＣｌおよびＢｒ、ならびに別の例ではＦ）、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ２８（例えば、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ３）、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２８（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＯＣ２Ｈ５）および−Ｃ（Ｏ）Ｒ２８（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）からなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換され；
Ｒ５Ａは、ハロ、−ＯＨおよび−Ｏ−アルキルからなる群から選択され；
Ｒ８は、Ｈ、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ１０）２、−ＮＲ１０Ｃ（Ｏ）Ｒ１２およびアルキルからなる群から選択され；
各Ｒ９は、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１０、−ＳＲ１０、−Ｎ（Ｒ１０）２およびＲ１０からなる群から独立して選択され；
各Ｒ１０は、Ｈ、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、アルキルヘテロアリール−、アルキルアリール−、置換アルキル、置換アリール、置換アリールアルキル、置換ヘテロアリール、置換ヘテロアリールアルキル、置換シクロアルキル、置換シクロアルキルアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキルアルキル、置換アルキルヘテロアリール−、置換アルキルアリール−、ヘテロシクロアルケニルおよび置換ヘテロシクロアルケニルからなる群から独立して選択され、ここで、
前記Ｒ１０置換アルキルは、−ＮＨ２、−ＮＨＲ２０、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＯＲ２６、ハロ、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ２６、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２６および−Ｃ（Ｏ）Ｒ２６からなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換され、そして
前記Ｒ１０置換アリール、Ｒ１０置換アリールアルキル、Ｒ１０置換ヘテロアリール、Ｒ１０置換ヘテロアリールアルキル、Ｒ１０置換シクロアルキル、Ｒ１０置換シクロアルキルアルキル、Ｒ１０置換ヘテロシクロアルキル、Ｒ１０置換ヘテロシクロアルキルアルキル、Ｒ１０置換アルキルヘテロアリール−およびＲ１０置換アルキルアリール−は、（１）−ＮＨ２、（２）−ＮＯ２、（３）−ＣＮ、（４）−ＯＨ、（５）−ＯＲ２０、（６）−ＯＣＦ３、（７）独立して選択される１〜３個のハロ原子で置換されたアルキル、（８）−Ｃ（Ｏ）Ｒ３８、（９）アルキル、（１０）アルケニル、（１１）ハロ、（１２）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ２６、（１３）−Ｃ（Ｏ）ＯＲ３８、（１４）−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ３２−（Ｃ（Ｒ３０）２）ｎ−Ｎ（Ｒ３８）２、（１５）−Ｓ（Ｏ）ｔＲ３８、（１６）−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ３２−Ｒ３８、（１７）−ＮＲ３２−Ｃ（Ｏ）−Ｒ３８、
（１８）
【００６１】
【化２５】
0005603777.tif 000028
（１９）−ＮＨＲ２０、および（２０）シクロアルキルからなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換され；
Ｒ１１は、Ｆ、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＯＲ１０、−ＮＨＮＲ１Ｒ１０、−ＳＲ１０およびヘテロアリールからなる群から選択され；
Ｒ１２は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルアルキルからなる群から選択され；
Ｒ１４は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル−、ヘテロシクロアルキル、アルキルヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル−、アルキルヘテロアリール−およびアルキルアリール−からなる群から選択され；
Ｒ１５は、Ｈ、−ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル−、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルアルキル−、アルキルヘテロアリール−およびアルキルアリール−からなる群から選択され；
Ｒ２０は、アルキルを表し；
Ｒ２３は、Ｈ、アルキル、アリール、シクロアルキルおよびシクロアルキルアルキル−からなる群から選択され；
各Ｒ２６は、Ｈおよびアルキルからなる群から独立して選択され；
Ｒ２８は、アルキルであり；
各Ｒ３０は、Ｈ、アルキルおよびＦからなる群から独立して選択され；
各Ｒ３２は、Ｈおよびアルキルからなる群から独立して選択され、ここで、各Ｒ３２は、通常Ｈであり；
各Ｒ３５は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から独立して選択され；
Ｒ３６は、Ｈ、アルキルおよび−Ｏ−アルキルからなる群から選択され；
各Ｒ３８は、Ｈ、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、アルキルヘテロアリール−、アルキルアリール−、置換アルキル、置換アリール、置換アリールアルキル、置換ヘテロアリール、置換ヘテロアリールアルキル、置換シクロアルキル、置換シクロアルキルアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキルアルキル、置換アルキルヘテロアリール−および置換アルキルアリール−からなる群から独立して選択され、ここで、
前記Ｒ３８置換アルキルは、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＯＲ２６、ハロ、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ２８、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２８および−Ｃ（Ｏ）Ｒ２８からなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換され、そして
前記Ｒ３８置換アリール、置換アリールアルキル、置換ヘテロアリール、置換ヘテロアリールアルキル、置換シクロアルキル、置換シクロアルキルアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキルアルキル、置換アルキルヘテロアリール−および置換アルキルアリール−は、（１）−ＮＨ２、（２）−ＮＯ２、（３）−ＣＮ、（４）−ＯＨ、（５）−ＯＲ２０、（６）−ＯＣＦ３、（７）−ＣＦ３、（８）−Ｃ（Ｏ）Ｒ２６、（９）アルキル、（１０）アルケニル、（１１）ハロ、（１２）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ２６、（１３）−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２６、（１４）−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ３２−（Ｃ（Ｒ３０）２）ｎ−Ｎ（Ｒ２６）２、（１５）−Ｓ（Ｏ）ｔＲ２６、（１６）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３２）（Ｒ２６）、（１７）−ＮＲ３２Ｃ（Ｏ）Ｒ２６、
（１８）
【００６２】
【化２６】
0005603777.tif 000029
および
（１９）−ＮＨＲ２０
からなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換され；
Ｒ４２は、アルキル、アリール、ヘテロアリールおよびシクロアルキルからなる群から選択され；
Ｒ４４は、Ｈ、アルキル、シクロアルキルおよびシクロアルキルアルキルからなる群から選択され；そして
各Ｒ４６は、Ｈ、アルキル、シクロアルキルおよびシクロアルキルアルキルからなる群から独立して選択される。
【００６３】
本明細書中で使用されるとき、別途明記されない限り、以下の用語は、以下の意味を有し、別途明記されない限り、用語が個別に、または別の用語の構成要素として、使用されるとき、その各用語（すなわち、部分または置換基）の定義が適用される（例えば、アリールの定義は、アリールに対する定義およびアリールアルキル、アルキルアリール、アリールアルキニルなどのアリール部に対する定義と同じである）：
「アシル」とは、Ｈ−Ｃ（Ｏ）−、アルキル−Ｃ（Ｏ）−、アルケニル−Ｃ（Ｏ）−、アルキニル−Ｃ（Ｏ）−、シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−、シクロアルケニル−Ｃ（Ｏ）−またはシクロアルキニル−Ｃ（Ｏ）−基のことを意味し、ここで、その様々な基は、以下に定義されるとおりであり（そしてアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニルおよびシクロアルキニル部分は、以下に定義されるように置換され得る）；親部分に対する結合は、カルボニルを介し；好ましいアシルは、低級アルキルを含み；適当なアシル基の非限定的な例としては、ホルミル、アセチル、プロパノイル、２−メチルプロパノイル、ブタノイルおよびシクロヘキサノイルが挙げられ；
「アルケニル」とは、炭素と炭素との二重結合を少なくとも１つ含む脂肪族炭化水素基（鎖）のことを意味し、ここで、その鎖は、直鎖または分枝鎖であり得、前記基は、約２〜約１５個の炭素原子を含み；好ましいアルケニル基は、その鎖内に約２〜約１２個の炭素原子；より好ましくは、その鎖内に約２〜約６個の炭素原子を含み；分枝鎖とは、１つ以上の低級アルキル基（例えば、メチル、エチルまたはプロピル）またはアルケニル基が、線状アルケニル鎖に結合されていることを意味し；「低級アルケニル」とは、その鎖内に約２〜約６個の炭素原子を含むアルケニル基のことを意味し、その鎖は、直鎖または分枝鎖であり得；用語「置換アルケニル」とは、アルケニル基が、独立して選択される１つ以上の置換基によって置換されていることを意味し、各置換基は、ハロ、アルキル、アリール、シクロアルキル、シアノ、アルコキシおよび−Ｓ（アルキル）からなる群から独立して選択され；適当なアルケニル基の非限定的な例としては、エテニル、プロペニル、ｎ−ブテニル、３−メチルブタ−２−エニル、ｎ−ペンテニル、オクテニルおよびデセニルが挙げられ；
「アルコキシ」とは、アルキル−Ｏ−基（すなわち、親部分への結合は、エーテル酸素を介する）のことを意味し、ここで、そのアルキル基は、非置換であるか、または以下に記載されるように置換され；適当なアルコキシ基の非限定的な例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシおよびヘプトキシが挙げられ；
「アルコキシカルボニル」とは、アルキル−Ｏ−ＣＯ−基（すなわち、親部分への結合は、カルボニルを介する）のことを意味し、ここで、そのアルキル基は、非置換であるか、または前に定義されたように置換され；適当なアルコキシカルボニル基の非限定的な例としては、メトキシカルボニルおよびエトキシカルボニルが挙げられ；
「アルキル」（トリフルオロアルキルおよびアルキルオキシなどの他の部分のアルキル部を含む）とは、直鎖または分枝鎖であり得る脂肪族炭化水素基（鎖）のことを意味し、ここで、前記基は、その鎖内に約１〜約２０個の炭素原子を含み；好ましいアルキル基は、その鎖内に約１〜約１２個の炭素原子を含み；より好ましいアルキル基は、その鎖内に約１〜約６個の炭素原子を含み；分枝鎖とは、１つ以上の低級アルキル基（例えば、メチル、エチルまたはプロピル）が、線状アルキル鎖に結合されていることを意味し；「低級アルキル」とは、その鎖内に約１〜約６個の炭素原子を含む基のことを意味し、前記鎖は、直鎖または分枝鎖であり得；用語「置換アルキル」とは、アルキル基が、独立して選択される１つ以上の置換基によって置換されていることを意味し、ここで、各置換基は：ハロ、アリール、シクロアルキル、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、−ＮＨ（アルキル）、−ＮＨ（シクロアルキル）、−Ｎ（アルキル）２、カルボキシ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキルおよび−Ｓ（アルキル）からなる群から独立して選択され；適当なアルキル基の非限定的な例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ヘプチル、ノニル、デシル、フルオロメチル、トリフルオロメチルおよびシクロプロピルメチルが挙げられ；
「アルキルアリール」（またはアルカリール（ａｌｋａｒｙｌ））とは、アルキル−アリール−基（すなわち、親部分への結合は、アリール基を介する）のことを意味し、ここで、そのアルキル基は、非置換であるか、または上で定義されたように置換され、そのアリール基は、非置換であるか、または以下に定義されるように置換され；好ましいアルキルアリールは、低級アルキル基を含み；適当なアルキルアリール基の非限定的な例としては、ｏ−トリル、ｐ−トリルおよびキシリルが挙げられ；
「アルキルヘテロアリール」とは、アルキル−ヘテロアリール−基（すなわち、親部分への結合は、ヘテロアリール基を介する）のことを意味し、ここで、そのアルキルは、非置換であるか、または上で定義されたように置換され、そのヘテロアリール基は、非置換であるか、または以下に定義されるように置換され；
「アルキルスルフィニル」とは、アルキル−Ｓ（Ｏ）−基（すなわち、親部分への結合は、スルフィニルを介する）のことを意味し、ここで、そのアルキル基は、非置換であるか、または前に定義されたように置換され；好ましい基は、アルキル基が低級アルキルである基であり；
「アルキルスルホニル」とは、アルキル−Ｓ（Ｏ２）−基（すなわち、親部分への結合は、スルホニルを介する）のことを意味し、ここで、そのアルキル基は、非置換であるか、または前に定義されたように置換され；好ましい基は、アルキル基が低級アルキルである基であり；
「アルキルチオ」とは、アルキル−Ｓ−基（すなわち、親部分への結合は、硫黄を介する）のことを意味し、ここで、そのアルキル基は、非置換であるか、または前に記載されたように置換され；適当なアルキルチオ基の非限定的な例としては、メチルチオ、エチルチオ、ｉ−プロピルチオおよびヘプチルチオが挙げられ；
「アルキニル」とは、炭素と炭素との三重結合を少なくとも１つ含む脂肪族炭化水素基（鎖）のことを意味し、ここで、その鎖は、直鎖または分枝鎖であり得、そしてその基は、中に約２〜約１５個の炭素原子を含み；好ましいアルキニル基は、その鎖内に約２〜約１２個の炭素原子；より好ましくは、その鎖内に約２〜約４個の炭素原子を含み；分枝鎖とは、１つ以上の低級アルキル基（例えば、メチル、エチルまたはプロピル）が線状アルキニル鎖に結合されていることを意味し；「低級アルキニル」とは、その鎖内に約２〜約６個の炭素原子を含むアルキニル基のことを意味し、その鎖は、直鎖または分枝鎖であり得；適当なアルキニル基の非限定的な例としては、エチニル、プロピニル、２−ブチニル、３−メチルブチニル、ｎ−ペンチニルおよびデシニルが挙げられ；用語「置換アルキニル」とは、そのアルキニル基が、独立して選択される１つ以上の置換基によって置換されていることを意味し、そして各置換基が、アルキル；アリールおよびシクロアルキルからなる群から独立して選択され；
「アミノとは、−ＮＨ２基のことを意味し；
「アラルケニル」（またはアリールアルケニル）とは、アリール−アルケニル−基（すなわち、親部分への結合は、アルケニル基を介する）のことを意味し、ここで、そのアリール基は、非置換であるか、または以下に定義されるように置換され、そのアルケニル基は、非置換であるか、または上で定義されたように置換され；好ましいアラルケニルは、低級アルケニル基を含み；適当なアラルケニル基の非限定的な例としては、２−フェネテニルおよび２−ナフチルエテニルが挙げられ；
「アラルキル」（またはアリールアルキル）とは、アリール−アルキル−基（すなわち、親部分への結合は、アルキル基を介する）のことを意味し、ここで、そのアリールは、非置換であるか、または以下に定義されるように置換され、そのアルキルは、非置換であるか、または上で定義されたように置換され；好ましいアラルキルは、低級アルキル基を含み；適当なアラルキル基の非限定的な例としては、ベンジル、２−フェネチルおよびナフタレニルメチルが挙げられ；
「アラルキルオキシ」（またはアリールアルキルオキシ）とは、アラルキル−Ｏ−基（すなわち、親部分への結合は、エーテル酸素を介する）のことを意味し、ここで、そのアラルキル基は、非置換であるか、または前に記載されたように置換され；適当なアラルキルオキシ基の非限定的な例としては、ベンジルオキシおよび１−または２−ナフタレンメトキシが挙げられ；
「アラルコキシカルボニル」とは、アラルキル−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−基（すなわち、親部分への結合は、カルボニルを介する）のことを意味し、ここで、そのアラルキル基は、非置換であるか、または前に定義されたように置換され；適当なアラルコキシカルボニル基の非限定的な例は、ベンジルオキシカルボニルであり；
「アラルキルチオ」とは、アラルキル−Ｓ−基（すなわち、親部分への結合は、硫黄を介する）のことを意味し、ここで、そのアラルキル基は、非置換であるか、または前に記載されたように置換され；適当なアラルキルチオ基の非限定的な例は、ベンジルチオであり；
「アロイル」とは、アリール−Ｃ（Ｏ）−基（すなわち、親部分への結合は、カルボニルを介する）のことを意味し、ここで、そのアリール基は、非置換であるか、または以下に定義されるように置換され；適当な基の非限定的な例としては、ベンゾイルならびに１−および２−ナフトイルが挙げられ；
「アリール」（時折、「ａｒ」と省略される）とは、約６〜約１４個の炭素原子、好ましくは、約６〜約１０個の炭素原子を含む芳香族の単環式または多環式（ｍｕｌｔｉｃｙｃｌｉｃ）の環系のことを意味し；そのアリール基は、独立して選択される１つ以上の「環系置換基」（以下で定義される）で必要に応じて置換され得る。適当なアリール基の非限定的な例としては、フェニルおよびナフチルが挙げられ；
「アリールアルキニル」とは、アリール−アルキニル−基（すなわち、親部分への結合は、アルキニル基を介する）のことを意味し、ここで、そのアリール基は、非置換であるか、または上で定義されたように置換され、そのアルキニル基は、非置換であるか、または上で定義されたように置換され；
「アリールアミノヘテロアリール」とは、アリール−アミノ−ヘテロアリール基（すなわち、親部分への結合は、ヘテロアリール基を介する）のことを意味し、ここで、そのアリール基は、非置換であるか、または上で定義されたように置換され、そのアミノ基は、上で定義されたとおり（すなわち、ここでは−ＮＨ−）であり、そのヘテロアリール基は、非置換であるか、または以下に定義されるように置換され；
「アリールヘテロアリール」とは、アリール−ヘテロアリール基−（すなわち、親部分への結合は、ヘテロアリール基を介する）のことを意味し、ここで、そのアリール基は、非置換であるか、または上で定義されたように置換され、そのヘテロアリール基は、非置換であるか、または以下に定義されるように置換され；
「アリールオキシ」とは、アリール−Ｏ−基（すなわち、親部分への結合は、エーテル酸素を介する）のことを意味し、ここで、そのアリール基は、非置換であるか、または上で定義されたように置換され；適当なアリールオキシ基の非限定的な例としては、フェノキシおよびナフトキシが挙げられ；
「アリールオキシカルボニル」とは、アリール−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−基（すなわち、親部分への結合は、カルボニルを介する）のことを意味し、ここで、そのアリール基は、非置換であるか、または前に定義されたように置換され；適当なアリールオキシカルボニル基の非限定的な例としては、フェノキシカルボニルおよびナフトキシカルボニルが挙げられ；
「アリールスルフィニル」とは、アリール−Ｓ（Ｏ）−基（すなわち、親部分への結合は、スルフィニルを介する）のことを意味し、ここで、アリールは、非置換であるか、または前に定義されたように置換され；
「アリールスルホニル」とは、アリール−Ｓ（Ｏ２）−基（すなわち、親部分への結合は、スルホニルを介する）のことを意味し、ここで、アリールは、非置換であるか、または前に定義されたように置換され；
「アリールチオ」とは、アリール−Ｓ−基（すなわち、親部分への結合は、硫黄を介する）のことを意味し、ここで、そのアリール基は、非置換であるか、または前に記載されたように置換され；適当なアリールチオ基の非限定的な例としては、フェニルチオおよびナフチルチオが挙げられ；
「シクロアルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含み、約３〜約１０個の炭素原子、好ましくは、約５〜約１０個の炭素原子を含む非芳香族の単環式または多環式の環系のことを意味し；好ましいシクロアルケニル環は、約５〜約７個の環原子を含み；そのシクロアルケニルは、独立して選択される１つ以上の「環系置換基」（以下で定義される）で必要に応じて置換され得；適当な単環式シクロアルケニルの非限定的な例としては、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニルなどが挙げられ；適当な多環式シクロアルケニルの非限定的な例は、ノルボルニレニルであり；
「シクロアルキル」とは、約３〜約７個の炭素原子、好ましくは、約３〜約６個の炭素原子を含む非芳香族の単環式または多環式の環系のことを意味し；そのシクロアルキルは、独立して選択される１つ以上の「環系置換基」（以下で定義される）で必要に応じて置換され得；適当な単環式シクロアルキルの非限定的な例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなどが挙げられ；適当な多環式シクロアルキルの非限定的な例としては、１−デカリン、ノルボルニル、アダマンチルなどが挙げられ；
「シクロアルキルアルキル」とは、シクロアルキル−アルキル−基（すなわち、親部分への結合は、アルキル基を介する）のことを意味し、ここで、そのシクロアルキル部分は、非置換であるか、または上で定義されたように置換され、そのアルキル部分は、非置換であるか、または上で定義されたように置換され；
「ハロ」とは、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード基のことを意味し；好ましいハロは、フルオロ、クロロまたはブロモであり、より好ましいのは、フルオロおよびクロロであり；
「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素のことを意味し；好ましいハロゲンは、フッ素、塩素および臭素であり；
「ハロアルキル」とは、そのアルキル上の１つ以上の水素原子が上で定義されたようなハロ基で置換されている、上で定義されたようなアルキルのことを意味し；
「ヘテロアラルケニル」とは、ヘテロアリール−アルケニル−基（すなわち、親部分への結合は、アルケニル基を介する）のことを意味し、ここで、そのヘテロアリール基は、非置換であるか、または以下に定義されるように置換され、そのアルケニル基は、非置換であるか、または上で定義されたように置換され；
「ヘテロアラルキル」（またはヘテロアリールアルキル）とは、ヘテロアリール−アルキル−基（すなわち、親部分への結合は、アルキル基を介する）のことを意味し、ここで、そのヘテロアリールは、非置換であるか、または以下に定義されるように置換され、そのアルキル基は、非置換であるか、または上で定義されたように置換され；好ましいヘテロアラルキルは、低級アルキル基であるアルキル基を含み；適当なアラルキル基の非限定的な例としては、ピリジルメチル、２−（フラン−３−イル）エチルおよびキノリン−３−イルメチルが挙げられ；
「ヘテロアラルキルチオ」とは、ヘテロアラルキル−Ｓ−基のことを意味し、ここで、そのヘテロアラルキル基は、非置換であるか、または上で定義されたように置換され；
「ヘテロアリール」とは、約５〜約１４個の環原子、好ましくは、約５〜約１０個の環原子を含む芳香族の単環式または多環式の環系のことを意味し、ここで、その環原子のうちの１つ以上は、単独で、または組み合わせて、炭素以外の元素、例えば、窒素、酸素または硫黄であり；好ましいヘテロアリールは、約５〜約６個の環原子を含み；「ヘテロアリール」は、独立して選択される１つ以上の「環系置換基」（以下で定義される）によって必要に応じて置換され得；ヘテロアリールの語根（ｒｏｏｔ  ｎａｍｅ）の前の接頭辞アザ、オキサまたはチアとは、それぞれ少なくとも窒素、酸素または硫黄原子が、環原子として存在していることを意味し；ヘテロアリールの窒素原子は、必要に応じて、対応するＮ−オキシドに酸化され得；適当なヘテロアリールの非限定的な例としては、ピリジル、ピラジニル、フラニル、チエニル、ピリミジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ピラゾリル、フラザニル、ピロリル、ピラゾリル、トリアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、キノキサリニル、フタラジニル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニル、イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾリル、ベンゾフラザニル、インドリル、アザインドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチエニル、キノリニル、イミダゾリル、チエノピリジル、キナゾリニル、チエノピリミジル、ピロロピリジル、イミダゾピリジル、イソキノリニル、ベンゾアザインドリル、１，２，４−トリアジニル、ベンゾチアゾリルなどが挙げられ；
「ヘテロアリールアルキニル」（またはヘテロアラルキニル）とは、ヘテロアリール−アルキニル−基（すなわち、親部分への結合は、アルキニル基を介する）のことを意味し、ここで、そのヘテロアリール基は、非置換であるか、または上で定義されたように置換され、そのアルキニル基は、非置換であるか、または上で定義されたように置換され；
「ヘテロアリールアリール」（またはヘテロアラリール（ｈｅｔｅｒｏａｒａｒｙｌ））とは、ヘテロアリール−アリール−基（すなわち、親部分への結合は、アリール基を介する）のことを意味し、ここで、そのヘテロアリール基は、非置換であるか、または上で定義されたように置換され、そのアリール基は、非置換であるか、または上で定義されたように置換され；
「ヘテロアリールヘテロアリールアリール」とは、ヘテロアリール−ヘテロアリール−基（すなわち、親部分への結合は、最後のヘテロアリール基を介する）のことを意味し、ここで、各ヘテロアリール基は、独立して、非置換であるか、または上で定義されたように置換され；
「ヘテロアリールスルフィニル」とは、ヘテロアリール−ＳＯ−基のことを意味し、ここで、そのヘテロアリール基は、非置換であるか、または上で定義されたように置換され；
「ヘテロアリールスルホニル」とは、ヘテロアリール−ＳＯ２−基のことを意味し、ここで、そのヘテロアリール基は、非置換であるか、または上で定義されたように置換され；
「ヘテロアリールチオ」とは、ヘテロアリール−Ｓ−基のことを意味し、ここで、そのヘテロアリール基は、非置換であるか、または上で定義されたように置換され；
「ヘテロシクレニル」（またはヘテロシクロアルケニル）とは、約３〜約１０個の環原子、好ましくは、約５〜約１０個の環原子を含む非芳香族の単環式または多環式の環系のことを意味し、ここで、その環系内の原子のうちの１つ以上は、炭素以外の元素（例えば、窒素、酸素および硫黄原子からなる群から独立して選択される１つ以上のヘテロ原子）であり、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含み；その環系内に存在する酸素および／または硫黄原子は、隣接せず；好ましいヘテロシクレニル環は、約５〜約６個の環原子を含み；ヘテロシクレニルの語根の前の接頭辞アザ、オキサまたはチアとは、それぞれ少なくとも窒素、酸素または硫黄原子が環原子として存在することを意味し；ヘテロシクレニルは、独立して選択される１つ以上の「環系置換基」（以下で定義される）によって必要に応じて置換され得；ヘテロシクレニルの窒素または硫黄原子は、必要に応じて、対応するＮ−オキシド、Ｓ−オキシドまたはＳ，Ｓ−ジオキシドに酸化され得；適当な単環式アザヘテロシクレニル基の非限定的な例としては、１，２，３，４−テトラヒドロピリジン、１，２−ジヒドロピリジル、１，４−ジヒドロピリジル、１，２，３，６−テトラヒドロピリジン、１，４，５，６−テトラヒドロピリミジン、２−ピロリニル、３−ピロリニル、２−イミダゾリニル、２−ピラゾリニルなどが挙げられ；適当なオキサヘテロシクレニル基の非限定的な例としては、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン、ジヒドロフラニル、フルオロジヒドロフラニルなどが挙げられ；適当な多環式オキサヘテロシクレニル基の非限定的な例は、７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプテニルであり；適当な単環式チアヘテロシクレニル環の非限定的な例としては、ジヒドロチオフェニル、ジヒドロチオピラニルなどが挙げられ；
「ヘテロシクロアルキルアルキル」（またはヘテロシクリルアルキル）とは、ヘテロシクロアルキル−アルキル−基（すなわち、親部分への結合は、アルキル基を介する）のことを意味し、ここで、そのヘテロシクロアルキル基（すなわち、ヘテロシクリル基）は、非置換であるか、または以下に定義されるように置換され、そのアルキル基は、非置換であるか、または上で定義されたように置換され；
「ヘテロシクリル」（またはヘテロシクロアルキル）とは、約３〜約１０個の環原子、好ましくは、約５〜約１０個の環原子を含む非芳香族の飽和の単環式または多環式の環系のことを意味し、ここで、その環系内の原子のうちの１つ以上は、単独で、または組み合わせて、炭素以外の元素、例えば、窒素、酸素または硫黄であり；その環系内に存在する酸素および／または硫黄原子は、隣接せず；好ましいヘテロシクリルは、約５〜約６個の環原子を含み；ヘテロシクリルの語根の前の接頭辞アザ、オキサまたはチアとは、それぞれ少なくとも窒素、酸素または硫黄原子が、環原子として存在することを意味し；ヘテロシクリルは、独立して選択される１つ以上の「環系置換基」（以下で定義される）によって必要に応じて置換され得；ヘテロシクリルの窒素または硫黄原子は、必要に応じて、対応するＮ−オキシド、Ｓ−オキシドまたはＳ，Ｓ−ジオキシドに酸化され得；適当な単環式ヘテロシクリル環の非限定的な例としては、ピペリジル、ピロリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリジニル、１，３−ジオキソラニル、１，４−ジオキサニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどが挙げられ；
「ヒドロキシアルキル」とは、ＨＯ−アルキル−基のことを意味し、ここで、そのアルキル基は、上で定義されたように、置換されるか、または非置換であり；好ましいヒドロキシアルキルは、低級アルキルを含み；適当なヒドロキシアルキル基の非限定的な例としては、ヒドロキシメチルおよび２−ヒドロキシエチルが挙げられ；そして
「環系置換基」とは、例えば、環系上の利用可能な水素を置換する、芳香族または非芳香族の環系に結合された置換基のことを意味し；環系置換基は、各々独立して：アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アルキルアリール、アラルケニル、ヘテロアラルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロアラルケニル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アシル、アロイル、ハロ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アルキルスルフィニル、アリールスルフィニル、ヘテロアリールスルフィニル、アルキルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アラルキルチオ、ヘテロアラルキルチオ、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクレニル、Ｒ６０Ｒ６５Ｎ−、Ｒ６０Ｒ６５Ｎ−アルキル−、Ｒ６０Ｒ６５ＮＣ（Ｏ）−およびＲ６０Ｒ６５ＮＳＯ２−からなる群から選択され、ここで、Ｒ６０およびＲ６５は、各々独立して：水素、アルキル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され；「環系置換基」とは、３〜７個の環原子の環式環のことも意味し、ここで、１〜２個の環原子は、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたはヘテロシクレニル環上の２つの環水素原子を同時に置換することによって、前記アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたはヘテロシクレニル環に結合されたヘテロ原子であり得；非限定的な例としては：
【００６４】
【化２７】
0005603777.tif 000030
などが挙げられる。
【００６５】
環の中に引かれる線は、示される結合が、置換可能な環炭素原子のいずれかに結合され得ることを意味する。
【００６６】
本明細書中の本文、スキーム、実施例、構造式および任意の表における満たされていない原子価を有する任意の炭素またはヘテロ原子は、水素原子またはその原子価を満たす原子を有すると想定される。
【００６７】
本発明の１つ以上の化合物は、溶媒和物としても存在し得るか、または必要に応じて溶媒和物に変換され得る。溶媒和物の調製方法は、一般に知られている。したがって、例えば、Ｍ．Ｃａｉｒａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉ．，９３（３），６０１−６１１（２００４）には、水からの調製方法と同様に、酢酸エチル中の抗真菌性フルコナゾールの溶媒和物の調製方法が記載されている。溶媒和物、半溶媒和物（ｈｅｍｉｓｏｌｖａｔｅ）、水和物などの同様の調製方法は、Ｅ．Ｃ．ｖａｎ  Ｔｏｎｄｅｒら、ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ．，５（１），ａｒｔｉｃｌｅ  １２（２００４）；およびＡ．Ｌ．Ｂｉｎｇｈａｍら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，６０３−６０４（２００１）によって記載されている。代表的で非限定的なプロセスは、外界温度よりも高い温度においてインヒビター化合物を所望量の所望の溶媒（有機溶媒もしくは水またはそれらの混合物）に溶解する工程、およびその溶液を、結晶を形成するのに十分な速度で冷却し、次いで、標準的な方法によって単離する工程を包含する。例えば、Ｉ．Ｒ．分光法などの分析技術によって、溶媒和物（または水和物）としての結晶内の溶媒（または水）の存在が示される。
【００６８】
治療方法および投与
本明細書中に示されるＥＲＫ１インヒビターおよびＥＲＫ２インヒビターならびにＭＥＫインヒビターは、癌などの任意の過剰増殖性障害を処置するために使用され得る。本明細書中に示されるインヒビターを用いて処置可能な癌としては、例えば、胆管癌（ｃｈｏｌｏａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肺癌、膵癌、結腸癌、骨髄性白血病、甲状腺癌、骨髄異形成症候群、膀胱癌、上皮癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、脳癌、間葉系起源の癌、肉腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、ヘパトーム、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および未分化甲状腺癌が挙げられる。
【００６９】
本明細書中で述べられるＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターの投与によって処置可能な黒色腫は、任意のステージまたはタイプのその疾患を含む。それらのインヒビターは、被験体の身体の任意の部分における黒色腫を処置するために使用され得る。例えば、本明細書中で述べられるインヒビターは、悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫および末端部黒子型黒色腫を処置するために使用され得る。
【００７０】
本明細書中で述べられるＥＲＫ１インヒビターおよびＥＲＫ２インヒビターもしくはＭＥＫインヒビターならびに／または薬学的に許容できるその塩の投与の量および頻度は、患者の年齢、状態およびサイズならびに処置される症状の重症度などの因子を考慮して、主治医の判断に従って制御される。経口投与用の代表的な治療的に有効な１日投与レジメンは、約０．０４ｍｇ／日〜約４０００ｍｇ／日の範囲であり得る。
【００７１】
代表的には、任意の薬剤（例えば、本明細書中で述べられるようなさらなる化学療法剤）の投与および投薬は、可能であれば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ２００３（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５７ｔｈ  Ｅｄ）；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ；ＩＳＢＮ：１５６３６３４４５７；５７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００２年１１月）における、承認された薬剤の製品情報シートに列挙されているスケジュールならびに当該分野で公知の治療プロトコルに従って行われる。
【００７２】
実際に使用される投薬量は、患者の必要条件および処置される状態の重症度に応じて変動し得る。特定の状況に対する適正な投与レジメンの決定は、当該分野の技術範囲内である。便宜上、１日総投薬量は、必要に応じていくらかに分割されて、その日中に分けて投与され得る。
【００７３】
本明細書中に記載されている化合物から薬学的組成物を調製する場合、不活性で薬学的に許容できるキャリアは、固体または液体であり得る。固体の形態の調製物としては、散剤、錠剤、分散性顆粒剤、カプセル剤、カシェ剤および坐剤が挙げられる。散剤および錠剤は、約５〜約９５パーセントの活性成分を含み得る。適当な固体キャリアは、当該分野で公知であり、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖またはラクトースである。錠剤、散剤、カシェ剤およびカプセル剤は、経口投与に適した固体剤形として使用され得る。調合に関する全般的な情報については、例えば、Ｇｉｌｍａｎら、（ｅｄｓ．）（１９９０），Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９９０），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ．；Ａｖｉｓら、（ｅｄｓ．）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＬｉｅｂｅｒｍａｎら、（ｅｄｓ．）（１９９０），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ａ．Ｗａｌｔｅｒｓ（ｅｄ．）（２００２）Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），Ｖｏｌ  １１９，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒを参照のこと。
【００７４】
液体の形態の調製物としては、溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。例として、非経口注射のための水または水−プロピレングリコール溶液、または経口用の溶液、懸濁液およびエマルジョンのための甘味料および乳白剤の添加は、本発明の一部を形成する。液体の形態の調製物には、鼻腔内投与用の溶液も含まれ得る。
【００７５】
吸入に適したエアロゾル調製物としては、溶液および粉末の形態の固体が挙げられ得、それらは、不活性な圧縮ガス、例えば、窒素などの薬学的に許容できるキャリアと組み合わすことができる。
【００７６】
使用の直前に、経口投与または非経口投与のための液体の形態の調製物に変換されることを目的としている固体の形態の調製剤もまた含まれる。そのような液体の形態としては、溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。
【００７７】
本明細書中で述べられるＥＲＫ１インヒビターおよびＥＲＫ２インヒビターならびにＭＥＫインヒビターは、経皮的に送達可能でもあり得る。経皮的組成物は、クリーム、ローション、エアロゾルおよび／またはエマルジョンの形状をとり得、それは、この目的のために、当該分野において従来の通りのマトリックスタイプまたはレザバタイプの経皮パッチ内に含めることができる。
【００７８】
本発明の実施形態において、インヒビターは、経口的に投与される。
【００７９】
本発明の実施形態において、薬学的調製物は、単位剤形である。そのような形態では、調製物は、適切な量、例えば、所望の目的を達成するのに有効な量の活性成分を含む適当なサイズの単位用量に小分けされる。
【００８０】
調製物の単位用量における活性な化合物の量は、特定の適用法に応じて、約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは、約０．０１ｍｇ〜約７５０ｍｇ、より好ましくは、約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ、最も好ましくは、約０．０１ｍｇ〜約２５０ｍｇで変動し得るか、または調整され得る。
【００８１】
さらなる化学療法剤
本発明の実施形態は、ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターを、任意のさらなる化学療法剤（例えば、抗癌治療剤）または治療的な手技（例えば、抗癌放射線治療または外科的な腫瘍摘出術）と併用して投与することによって、癌などの病状を処置する方法を包含する。
【００８２】
さらなる化学療法剤としては、例えば、微小管作用剤（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、アルキル化剤、代謝拮抗物質、天然物およびそれらの誘導体、ホルモンおよびステロイド（合成アナログを含む）ならびに合成物が挙げられる。
【００８３】
アルキル化剤（ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素およびトリアゼンを含む）の例としては：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレン−メラミン、トリエチレンチオホスホラミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｎｅ）、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジンおよびテモゾロミドが挙げられる。
【００８４】
代謝拮抗物質（葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼインヒビターを含む）の例としては、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチンおよびゲムシタビンが挙げられる。
【００８５】
天然物およびそれらの誘導体（ビンカアルカロイド、抗腫瘍抗生物質、酵素、リンフォカインおよびエピポドフィロトキシンを含む）の例としては：ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、パクリタキセル（パクリタキセルは、微小管作用剤であり、Ｔａｘｏｌ（登録商標）として市販されている）、パクリタキセル誘導体（例えば、タキソテール）、ミトラマイシン、デオキシコ−ホルマイシン、マイトマイシン−Ｃ、Ｌ−アスパラギナーゼ、インターフェロン（特に、ＩＦＮ−ａ）、エトポシドおよびテニポシドが挙げられる。
【００８６】
ホルモンおよびステロイド（合成アナログを含む）の例としては：１７α−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、酢酸メゲストロール、タモキシフェン、メチルプレドニゾロン、メチル−テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド、トレミフェンおよびゾラデックス（Ｚｏｌａｄｅｘ）が挙げられる。
【００８７】
合成物（白金配位錯体などの無機錯体を含む）の例：シスプラチン、カルボプラチン、ヒドロキシ尿素、アムサクリン、プロカルバジン、ミトタン、ミトキサントロン、レバミゾールおよびヘキサメチルメラミン。
【００８８】
他の化学療法薬の例としては、ナベルベン（Ｎａｖｅｌｂｅｎｅ）、ＣＰＴ−１１、アナストラゾール（Ａｎａｓｔｒａｚｏｌｅ）、レトラゾール（Ｌｅｔｒａｚｏｌｅ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｂｅ）、レロキサフィン（Ｒｅｌｏｘａｆｉｎｅ）およびドロロキサフィン（Ｄｒｏｌｏｘａｆｉｎｅ）が挙げられる。
【００８９】
微小管作用剤（例えば、パクリタキセル、パクリタキセル誘導体またはパクリタキセル様化合物）は、本明細書中で使用されるとき、微小管の形成および／または脱重合および／または作用に影響する化合物を含む。そのような薬剤は、例えば、微小管安定化剤または微小管形成を妨害する薬剤であり得る。
【００９０】
本発明の方法において有用である微小管作用剤は、当業者に周知であり、それらとしてはは、アロコルヒチン（Ａｌｌｏｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）（ＮＳＣ４０６０４２）、ハリコンドリンＢ（ＮＳＣ６０９３９５）、コルヒチン（ＮＳＣ７５７）、コルヒチン誘導体（例えば、ＮＳＣ３３４１０）、ドラスタチン１０（ＮＳＣ３７６１２８）、マイタンシン（ＮＳＣ１５３８５８）、リゾキシン（ＮＳＣ３３２５９８）、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標）、ＮＳＣ１２５９７３）、パクリタキセル誘導体（例えば、タキソテール、ＮＳＣ６０８８３２）、チオコルヒチン（ＮＳＣ３６１７９２）、トリチルシステイン（ＮＳＣ８３２６５）、ビンブラスチンサルフェート（ＮＳＣ４９８４２）、ビンクリスチンサルフェート（ＮＳＣ６７５７４）、エポチロンＡ、エポチロン、ディスコデルモリド（Ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅ）（Ｓｅｒｖｉｃｅ，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：２００９を参照のこと）、エストラムスチン、ノコダゾール、ＭＡＰ４などが挙げられるが、これらに限定されない。そのような薬剤の例は、例えば、Ｂｕｌｉｎｓｋｉ（１９９７）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１０：３０５５−３０６４，Ｐａｎｄａ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１０５６０−１０５６４，Ｍｕｈｌｒａｄｔ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：３３４４−３３４６，Ｎｉｃｏｌａｏｕ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：２６８−２７２，Ｖａｓｑｕｅｚ（１９９７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．８：９７３−９８５およびＰａｎｄａ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２９８０７−２９８１２に記載されている。
【００９１】
パクリタキセル様活性を有する化学療法剤としては、パクリタキセルならびにパクリタキセル誘導体（パクリタキセル様化合物）およびパクリタキセルアナログが挙げられるが、これらに限定されない。パクリタキセルおよびその誘導体（例えば、タキソールおよびタキソテール）は、市販されている。さらに、パクリタキセルならびにパクリタキセルの誘導体およびアナログを生成する方法は、当業者に周知である（例えば、米国特許第５，５６９，７２９号；同第５，５６５，４７８号；同第５，５３０，０２０号；同第５，５２７，９２４号；同第５，５０８，４４７号；同第５，４８９，５８９号；同第５，４８８，１１６号；同第５，４８４，８０９号；同第５，４７８，８５４号；同第５，４７８，７３６号；同第５，４７５，１２０号；同第５，４６８，７６９号；同第５，４６１，１６９号；同第５，４４０，０５７号；同第５，４２２，３６４号；同第５，４１１，９８４号；同第５，４０５，９７２号；および同第５，２９６，５０６号を参照のこと）。
【００９２】
より詳細には、用語「パクリタキセル」とは、本明細書中で使用されるとき、Ｔａｘｏｌ（登録商標）（ＮＳＣ番号：１２５９７３）として市販されている薬物のことを指す。Ｔａｘｏｌ（登録商標）は、チューブリン部分が、有糸分裂に対して適正な構造に再編成することができない安定化した微小管束に重合することを増加させることによって、真核生物細胞の複製を阻害する。多くの利用可能な化学療法薬のうち、パクリタキセルは、薬剤不応性腫瘍（卵巣腫瘍および乳腺腫瘍を含む）に対する臨床試験において有効であったので、関心が寄せられている（Ｈａｗｋｉｎｓ（１９９２）Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，６：１７−２３，Ｈｏｒｗｉｔｚ（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１３：１３４−１４６，Ｒｏｗｉｎｓｋｙ（１９９０）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．８２：１２４７−１２５９）。
【００９３】
追加の微小管作用剤は、当該分野で公知の多くのそのようなアッセイ（例えば、パクリタキセルアナログのチューブリン重合活性を測定する半自動化アッセイ）の１つを、細胞の有糸分裂を阻止するこれらの化合物の能力を測定する細胞アッセイと組み合わせて用いることにより、評価され得る（Ｌｏｐｅｓ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：３７−４７を参照のこと）。
【００９４】
他のさらなる化学療法剤としては、セツキシマブ、エルロチニブおよびゲフィチニブが挙げられる。
【００９５】
用語「と併用して（ｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ）」は、本発明の組成物の成分が、同時送達のための単一組成物に製剤化され得ること、または２つ以上の組成物（例えば、キット）に別々に製剤化され得ることを示す。さらに、各成分は、他の成分が投与される時点とは異なる時点で被験体に投与され得る；例えば、各投与は、所与の期間にわたっていくつかの間隔において同時でなく（例えば、別々に、または順次）投与され得る。さらに、別個の成分は、同じ経路または異なる経路によって被験体に投与され得る。
【００９６】
感受性を予測するバイオマーカーの使用
本発明は、例えば、ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターに対する悪性細胞または新形成細胞の感受性を評価するための方法を提供し、この方法は、前記細胞がＶ６００ＥもしくはＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ対立遺伝子または機能獲得型表現型を特徴とする任意のＢＲＡＦ対立遺伝子（例えば、前記対立遺伝子に対してヘテロ接合性またはホモ接合性を有するもの）を含むか否かを判定する工程を包含し；ここで、前記遺伝子型が検出された場合に、前記細胞が感受性であると判定される。
【００９７】
本発明は、細胞がＶ６００ＥまたはＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ対立遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性である実施形態を提供する。ホモ接合性のＶ６００ＥまたはＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ遺伝子型を有する細胞は、ＭＥＫインヒビターまたはＥＲＫ１／２インヒビターに対して特に感受性である。
【００９８】
本発明は、例えば、表２（以下を参照のこと）において明記されているような所与の腫瘍タイプ由来の細胞が、表２に明記されているような対応する遺伝子型を含む場合に、その腫瘍タイプが、その腫瘍タイプの細胞株において観察されるものと少なくとも同程度の（例えば、正確に同程度、またはほぼ同程度の）ＥＲＫまたはＭＥＫインヒビター感受性（例えば、ＩＣ５０として表現される）を含むと判定される実施形態を含む。例えば、本発明の実施形態において、Ｍａｌｍｅ３Ｍ細胞株に関連して観察されたようなＶ６００Ｅホモ接合性遺伝子型を含む黒色腫は、ＥＲＫインヒビターまたはＭＥＫインヒビターに対して感受性であると判定される。本発明は、所与の腫瘍タイプの細胞が、１コピーの所与の対立遺伝子のＶ６００ＤまたはＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦ変異の観察結果に基づいて感受性であると判定された場合、次は、Ｖ６００ＤまたはＶ６００Ｅ変異（例えば、ホモ接合性のＶ６００Ｅ、ホモ接合性のＶ６００Ｄまたはヘテロ接合性のＶ６００Ｅ／ヘテロ接合性のＶ６００Ｄ）のさらなるコピーを含むその腫瘍タイプの他の細胞が、同様に感受性であると判定され得る、実施形態も含む。
【００９９】
本発明の実施形態において、非小細胞肺癌の腫瘍は、１つ以上のＢＲＡＦ  Ｖ６００ＤまたはＶ６００Ｅ対立遺伝子を含む場合に、ＥＲＫまたはＭＥＫインヒビター感受性であると判定される。本発明の実施形態において、胆管癌の腫瘍は、１つ以上のＶ６００ＤまたはＶ６００Ｅ対立遺伝子を含む場合に、ＭＥＫまたはＥＲＫインヒビター感受性であると判定される。
【０１００】
遺伝子型は、例えば本明細書中で述べられる方法を含む当該分野で公知の標準的な方法を用いて判定され得る。例えば、ピロシーケンスまたはリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法、例えば、Ｔａｑｍａｎアッセイが、遺伝子型検出のために使用され得る。
【０１０１】
感受性がそのような方法を用いて評価され得る細胞は、任意の供給源から得られ得る。例えば、細胞は、被験体内の固形腫瘍から、例えば、生検から、または血液、血清もしくは血漿サンプルによる非固形癌（例えば、白血病）から、得られ得る。あるいは、細胞は、インビトロの供給源、例えば、細胞培養物（例えば、ＡＴＣＣ）から得られ得る。
【０１０２】
例えば、ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターに対する細胞の感受性を評価するための方法は、（ａ）被験体の身体から１つ以上の悪性細胞または新形成細胞のサンプル（例えば、血液癌を有する被験体由来の血液サンプルの固形腫瘍からの細胞の生検）を得る工程；（ｂ）前記悪性細胞または新形成細胞が、Ｖ６００ＥもしくはＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ対立遺伝子または機能獲得型表現型を特徴とする任意のＢＲＡＦ対立遺伝子（例えば、ホモ接合性またはヘテロ接合性の遺伝子型）を含むか否かを判定する工程を包含し；ここで、前記遺伝子型が前記細胞において検出される場合に、その細胞が、前記インヒビターに対して感受性であると判定される。
【０１０３】
本発明はまた、患者から採取された細胞（例えば、腫瘍細胞）の感受性を評価するための方法も提供し、ここで、細胞が採取された患者の非存在下において工程が行われる。例えば、そのような方法は、（ａ）被験体の身体から１つ以上の悪性細胞または新形成細胞のサンプルを得る工程（例えば、血液癌を有する被験体由来の血液サンプルの固形腫瘍からの細胞の生検）；（ｂ）前記悪性細胞または新形成細胞がＶ６００ＥまたはＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ対立遺伝子を含むか否かを判定するために、研究室または他の適当な試験施設または第３者（例えば、検査技師）にそのサンプルを送付する工程；および（ｃ）そのサンプル中の細胞がそのような対立遺伝子を含むか否かを判定する工程（例えば、患者の非存在下において）を包含し得；ここで、前記遺伝子型が前記細胞において検出される場合に、その細胞が、前記インヒビターに対して感受性であると判定される。あるいは、本発明は、感受性を判定する工程が、いかなる患者からも独立して行われる方法を提供する。例えば、本発明は、前記悪性細胞または新形成細胞（例えば、任意の供給源から得られるそれらの細胞）がＶ６００ＥまたはＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ対立遺伝子を含むか否かを判定する工程を包含するそのような方法を提供し；ここで、前記遺伝子型が前記細胞において検出される場合に、その細胞が、前記インヒビターに対して感受性であると判定される。
【０１０４】
ＥＲＫ１／２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターに対する悪性細胞または新形成細胞の感受性を評価するための方法は、いくつかの有用な適用のいずれかにおいて使用され得る。例えば、その方法は、被験体の癌を処置するためのＥＲＫ１／２インヒビターもしくはＭＥＫインヒビターの受取り（ｒｅｃｅｉｐｔ）の候補である被験体の選択；前記インヒビターに対して感受性である悪性細胞もしくは新形成細胞を有する被験体の確認；悪性細胞または新形成細胞を有する被験体にとって適切もしくは有益であり得る治療の選択；または前記インヒビターの適切な投薬量の選択に役立ち得る。
【０１０５】
本発明の実施形態において、被験体の悪性細胞または新形成細胞が、本明細書中に示される方法によって（解析した細胞におけるＶ６００ＥまたはＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ対立遺伝子の同定によって）感受性であると判定された場合に、その被験体が、そのインヒビターを用いる処置に対して選択される。本発明の実施形態において、被験体が選択された場合に、処置が開始され得；ここで、その被験体は、治療的に許容できる用量または治療的に有効な用量のインヒビターを、さらなる化学療法（例えば、抗癌）剤および／または治療的な（例えば、抗癌）手技と必要に応じて併用して、投与される。
【０１０６】
本発明の実施形態において、本明細書中で述べられるようなＥＲＫ１／２またはＭＥＫインヒビター感受性を評価するための方法を用いて、ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターに対して感受性である悪性細胞または新形成細胞を有する被験体を確認することができる。そのような方法では、解析された細胞が、解析された細胞におけるＶ６００ＥまたはＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ対立遺伝子の同定によるなどで評価された場合に、その被験体は、感受性の細胞を有すると確認される。
【０１０７】
ＥＲＫ１／２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターに対する悪性細胞または新形成細胞の感受性を評価するための方法は、前記細胞を有する被験体に対して適切な治療を選択するための基準としても使用され得る。被験体の細胞が、そのインヒビターに対して感受性であると判定された場合に（解析された細胞におけるＶ６００ＥまたはＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ対立遺伝子の同定によって）、そのインヒビターが、治療薬として選択される。
【０１０８】
本発明は、ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターを用いて腫瘍または癌性状態を処置するための方法も提供し、この方法は、前記腫瘍内に存在するかまたは前記癌性状態を媒介する悪性細胞または新形成細胞の、前記インヒビターに対する感受性を評価する工程、およびその細胞が感受性であると判定された場合に（解析された細胞におけるＶ６００ＥまたはＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ対立遺伝子の同定によって）、その被験体に、治療的に有効な用量のそのインヒビターを投与することによる処置を継続するか、または開始する工程を包含する。
【０１０９】
さらに、本発明は、腫瘍または癌性状態を有する被験体に投与されるべきＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターの用量を選択するための方法を提供し、この方法は、腫瘍内に存在するかまたは癌性状態を媒介する悪性細胞または新形成細胞の感受性を評価する工程（そのインヒビターに対するそれらの細胞の感受性を評価する工程を含む）を包含し；ここで、前記細胞が感受性であると判定された場合は（解析された細胞におけるＶ６００ＥまたはＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ対立遺伝子の同定によって）、低用量が選択され、そして前記細胞がより低い感受性であると判定された場合は、高用量（例えば、本明細書中に示される０．０４ｍｇ／日〜４０００ｍｇ／日の用量の範囲の上半分）が選択される。処置される細胞が、そのインヒビターに対して高度に感受性である場合、細胞が感受性でない場合または細胞が低感受性を示した場合に必要とされるよりも少ないそのインヒビター（例えば、本明細書中に示される０．０４ｍｇ／日〜４０００ｍｇ／日の用量範囲の下半分）で同じ治療的結果を達成することができる。正確な投薬量の調整は、被験体時間の必要性（ｎｅｅｄｓ  ｏｆ  ｓｕｂｊｅｃｔ  ｔｉｍｅ）、ならびに被験体の特定の特徴、他の医薬、医学的な背景、特定の状況に対する必要性および緊急性に基づいて、処置する医師または臨床医によって行われ得る。
【０１１０】
本発明は、ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターあるいは薬学的に許容できるその組成物、あるいは前記インヒビターまたは組成物の投与を含む治療レジメンを広告する方法も提供し、この方法は、Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ対立遺伝子を含む悪性細胞または新形成細胞によって媒介される腫瘍または癌性状態を有する患者または患者集団を処置するためのそのインヒビターまたは組成物の使用を目的の大衆（ｔａｒｇｅｔ  ａｕｄｉｅｎｃｅ）に宣伝促進する工程を包含する。広告は、例えば、印刷物、音声、電子媒体または視覚的媒体をはじめとした任意の形態をとり得る。
【０１１１】
本発明は、ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターあるいは薬学的に許容できるキャリアを含むその薬学的組成物；およびそのインヒビターまたは薬学的組成物が、悪性細胞もしくは新形成細胞を含む腫瘍、またはＶ６００ＥもしくはＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ対立遺伝子を含む悪性細胞もしくは新形成細胞によって媒介される癌性状態を有する患者を処置するために必要であることを述べているラベルを一緒に包装されて含んでいる製造品をさらに提供する。ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビター、あるいは薬学的に許容できるキャリアを含むその薬学的組成物を製造するための方法もまた提供され、前記方法は、そのインヒビターまたは組成物；およびそのインヒビターまたは組成物が、悪性細胞もしくは新形成細胞を含む腫瘍を有するかまたはＶ６００ＥもしくはＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ対立遺伝子を含む悪性細胞もしくは新形成細胞によって媒介される癌性状態を有する患者を処置するために必要であることを表すラベルまたは添付文書を、包装内において組み合わせる工程を包含する。その添付文書は、任意の許容できる媒体、例えば、印刷された紙の挿入物であり得る。例えば、薬物動態、薬力学、臨床研究、有効性パラメータ、適応症および用法、禁忌、警告、注意、有害反応、過量、適正な投薬量および投与、どのように供給されるか、適正な保存条件、参考文献ならびに特許情報に関する情報をはじめとした、他の関連情報もまた、そのような添付文書の中に含められ得る。
【０１１２】
本発明は、ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターに対する、患者から採取された細胞（例えば、腫瘍細胞）の感受性を予測するためのキットをさらに含み、そのキットは、そのインヒビター、およびその細胞の遺伝子型がホモ接合性もしくはヘテロ接合性のＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦ遺伝子型、またはホモ接合性もしくはヘテロ接合性のＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ遺伝子型、あるいは機能獲得型表現型を特徴とする任意のＢＲＡＦ遺伝子型を含むか否かを判定するための試薬セットを備える。例えば、対立遺伝子判定に有用なＰＣＲプライマーが、そのようなキットの中に含められ得る（例えば、以下のＶ６００ＥまたはＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ対立遺伝子の解析および判定という項に示される対立遺伝子の検出方法を行うために有用なプライマーまたは他の試薬）。
【０１１３】
上で述べたように、本方法は、ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターに対する、インビトロにおける細胞もしくは細胞株または異種移植片内の細胞（例えば、マウスモデルにおけるヒト細胞）の感受性を予測するために使用され得る。例えば、インビトロにおける細胞またはマウス異種移植片モデルに加えられる細胞の遺伝子型は、例えば、本明細書中で述べられる方法のいずれかを用いて判定され得る。遺伝子型判定の後、例えば、任意のＥＲＫインヒビターまたはＭＥＫインヒビター（本明細書中に示される任意のインヒビターが挙げられるがこれらに限定されない）に関するその細胞の真の感受性レベル（例えば、ＩＣ５０）が、測定され得る。
【０１１４】
Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ対立遺伝子の解析および判定
本発明の局面は、被験体の遺伝子型が、特定の対立遺伝子のＢＲＡＦ（Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｄ）を含むか否かを判定することを含む。遺伝子型は、当該分野で公知の数多くの方法のいずれかによって、例えば、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドライゲーション、配列決定、Ｔａｑｍａｎ解析およびピロシーケンスによって、被験体において判定され得る。
【０１１５】
ＡＳＯ（対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション）としても知られる対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションによって、１塩基だけ異なる２つのＤＮＡ分子を識別することに依存する。探している多型をコードし、そして固体基材に固定化しているプライマーへのハイブリダイゼーションによって、サンプルＤＮＡを調べる。ＳＮＰの存在について評価するサンプルＤＮＡを、変性し、そしてオリゴヌクレオチド／固体支持体にハイブリダイズさせる。固定化したオリゴヌクレオチドにアニールしたサンプルＤＮＡの一部は、そのＳＮＰもコードする。そのサンプルＤＮＡ／オリゴヌクレオチド／固体支持体複合体は、必要に応じて洗浄され、検出可能なプローブが、サンプルＤＮＡのアニールしていない隣接部分にアニールされる。その複合体上のプローブの存在は、そのサンプルＤＮＡ中のＳＮＰの存在を示す。いくつかの検出可能なプローブが、当該分野で公知である。例えば、Ｂａｏら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２００５）３３（２）：ｅ１５）は、金ナノ粒子プローブの使用を開示している。
【０１１６】
プライマー伸長法は、ＰＣＲによって標的領域を増幅した後、１塩基が欠けている多型部位にアニールするプライマーを用いて一塩基シーケンシング反応を行う工程を含む。通常、プライマー伸長は、まずＳＮＰヌクレオチドのすぐ上流の塩基へのプローブのハイブリダイゼーションと、その後の、「ミニシーケンシング」反応（ここで、ＤＮＡポリメラーゼが、ＳＮＰヌクレオチドに相補的な塩基を付加することによって、ハイブリダイズされたプライマーを伸長する）を含む２段階のプロセスである。この組み込まれた塩基が、検出され、そしてＳＮＰ対立遺伝子を判定する。プライマー伸長が、高度に正確なＤＮＡポリメラーゼ酵素に基づくので、この方法は、一般に、非常に信頼性が高い。通常、蛍光標識されたジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）または蛍光標識されたデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）のいずれかの組み込みを使用する主要なアプローチが２つある。ｄｄＮＴＰプライマー伸長法を用いるとき、オリゴヌクレオチドプローブは、ＳＮＰヌクレオチドのすぐ上流の標的ＤＮＡにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼが添加されると、ＳＮＰ対立遺伝子に相補的な単一のｄｄＮＴＰが、プローブの３’末端に付加される（デデオキシヌクレオチド（ｄｅｄｉｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）中の欠損した３’−ヒドロキシルが、さらなるヌクレオチドの付加を妨げる）。各ｄｄＮＴＰは、異なる蛍光シグナルで標識されている。したがって、特定の蛍光シグナルを有する伸長産物の検出は、１つのｄｄＮＴＰまたは別のものが、そのプライマーの３’末端に付加されたことを示唆する。言い換えると、これは、どのヌクレオチドが目的の位置に存在するかを示唆する。
【０１１７】
ｄＮＴＰプライマー伸長法を用いるとき、調べられているＳＮＰ対立遺伝子の各々に相補的な３’塩基を有する対立遺伝子特異的プローブが、使用される。標的ＤＮＡが、そのプローブの３’塩基に相補的な対立遺伝子を含む場合、その標的ＤＮＡは、そのプローブに完全にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼがそのプローブの３’末端から伸長することが可能になる。伸長は、そのプローブの末端上への蛍光標識されたｄＮＴＰの組み込みによって検出される。標的ＤＮＡが、そのプローブの３’塩基に相補的な対立遺伝子を含まない場合、その標的ＤＮＡは、そのプローブの３’末端においてミスマッチを生じ、ＤＮＡポリメラーゼは、そのプローブの３’末端から伸長することができない。
【０１１８】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドライゲーションは、ＤＮＡリガーゼが、直接隣接するＤＮＡフラグメントの５’末端への、ＤＮＡフラグメントの３’末端のライゲーションを触媒する能力に依存する。この機序を用い、ＳＮＰ多型部位に対して直接２つのプローブをハイブリダイズすることによって、ＳＮＰを調べることができるが、そこでは、プローブが標的ＤＮＡと同一である場合にライゲーションが生じ得る。オリゴヌクレオチドリガーゼアッセイでは、２つのプローブが設計される；標的ＤＮＡにハイブリダイズして、その３’塩基がＳＮＰヌクレオチドに対して直接位置する対立遺伝子特異的プローブ、およびライゲーション反応用の５’末端をもたらすＳＮＰ多型部位の上流にハイブリダイズする第２のプローブ。対立遺伝子特異的プローブが、標的ＤＮＡにマッチする場合、そのプローブは、標的ＤＮＡに十分にハイブリダイズし、ライゲーションが生じ得る。ミスマッチの３’塩基が存在するときは、ライゲーションは、通常生じない。ライゲーションされた産物またはライゲーションされていない産物は、例えば、ゲル電気泳動、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析またはキャピラリー電気泳動によって検出され得る。
【０１１９】
配列決定は、ＳＮＰ検出のための一般的な方法である。配列決定の最も一般的な形態は、ａ）色素−プライマーおよび非標識ターミネーター、またはｂ）非標識プライマーおよび色素−ターミネーターのいずれかを用いるプライマー伸長に基づくものである。次いで、その反応産物は、キャピラリー電気泳動またはスラブゲルのいずれかを使用する電気泳動を用いて分離される。
【０１２０】
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性が、ＳＮＰ遺伝子型同定のためのＴａｑｍａｎアッセイにおいて使用される。Ｔａｑｍａｎアッセイは、ＰＣＲ反応と同時に行われ、結果は、ＰＣＲ反応の進行とともにリアルタイムに読み出され得る。このアッセイには、ＳＮＰ多型部位を含む領域を増幅する順方向および逆方向のＰＣＲプライマーが必要である。対立遺伝子の識別は、ＳＮＰ多型部位にハイブリダイズする１つまたは２つの対立遺伝子特異的プローブと組み合わされるＦＲＥＴを用いて達成される。そのプローブは、５’末端に結合されたフルオロフォアおよびその３’末端に結合されたクエンチャー分子を有する。そのプローブがそのまま（ｉｎｔａｃｔ）である間は、クエンチャーは、フルオロフォアに近位のままであり、フルオロフォアのシグナルを排除する。ＰＣＲ増幅工程の間、対立遺伝子特異的プローブが、ＳＮＰ対立遺伝子に完全に相補的である場合、その対立遺伝子特異的プローブは、標的ＤＮＡ鎖に結合し、次いで、ＴａｑポリメラーゼがＰＣＲプライマーからそのＤＮＡを伸長するにつれて、そのＴａｑポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性によって分解される。プローブの分解によって、クエンチャー分子からフルオロフォアが分離し、その結果、検出可能なシグナルが生成される。対立遺伝子特異的プローブが完全に相補的でない場合、そのプローブは、より低い融解温度を有し、そして効率的に結合しない。これにより、ヌクレアーゼがプローブ上で作用することが妨げられる（ＭｃＧｕｉｇａｎら、Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ．Ｇｅｎｅｔ．（２００２）１２（３）：１３３−１３６）。
【０１２１】
本発明の実施形態において、所与の遺伝子型の存在について評価される細胞は、任意の合理的な様式で被験体から得られ得る。本発明の実施形態は、外科生検（例えば、内視鏡生検、切除生検または切開生検、穿刺吸引（ＦＮＡ）生検）によって、細胞を被験体の身体から得る実施形態を含む。例えば、皮膚生検は、黒色腫であると疑われるかまたは黒色腫であると知られている皮膚サンプルの外科的切除、薄片生検またはパンチ生検によって採取され得る。特に、関与する疾患が白血病などの非固形腫瘍疾患である、そのようなサンプルは、前記被験体から血液、血清もしくは血漿サンプルを採取することによって、または患者の骨髄のサンプルを採取する（例えば、胸骨または腸骨稜寛骨から）ことによってもまた、得られ得る。遺伝子型の判定のために、その後のそのような生検サンプルの処理は、当該分野で公知の方法を用いて行われ得る。
【０１２２】
ピロシーケンシングもまた、細胞内のＶ６００変異の存在を判定するために使用され得る（Ｓｐｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（２００７）９（４）：４６４−４７１）。ピロシーケンシングは、当該分野で周知の手法である。簡潔には、ピロシーケンシングは、検出可能に標識されたヌクレオチドを用いる、目的の染色体位置の周囲の小領域の配列決定を含む。ＢＲＡＦのコドン６００を配列決定するための市販のキットが、販売されていることがある（例えば、ＰｙｒｏｍａｒｋＴＭ  ＢＲＡＦ，Ｂｉｏｔａｇｅ，ＡＢ；Ｉｓｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓを参照のこと）。
【実施例】
【０１２３】
本発明では、本発明を例示することを意図し、その限定を意図するものではない。以下に開示される任意の方法または組成物は、本発明の範囲に含まれる。
【０１２４】
実施例１：ＢＲＡＦバイオマーカーの同定および評価
この実施例では、ＢＲＡＦ  Ｖ６００バイオマーカーを同定し、それが、ＥＲＫ１インヒビターもしくはＥＲＫ２インヒビターまたはＭＥＫインヒビターに対する細胞の感受性の正確な予測子であると判定した。
【０１２５】
結果
本発明者らは、野生型ＢＲＡＦ、ヘテロ接合性のＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦ変異、ホモ接合性のＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦ変異または異種性Ｖ６００Ｄ  ＢＲＡＦ変異を含む細胞株を同定するために、４１個の腫瘍細胞株についてＢＲＡＦ遺伝子型の状態を判定した。さらに、ＥＲＫ１／２キナーゼインヒビター（化合物ａ）およびＭＥＫキナーゼインヒビター（化合物ｂ）に対する細胞増殖ＩＣ５０値も決定した。
【０１２６】
細胞株のＢＲＡＦ遺伝子型の状態を、ＥＲＫ１／２インヒビター化合物ａまたはＭＥＫインヒビター化合物ｂに対する細胞増殖ＩＣ５０値と比較したとき、Ｖ６００Ｅ  ＢＲＡＦホモ接合性細胞株遺伝子型と、ＥＲＫ１／２キナーゼインヒビター化合物ａまたはＭＥＫキナーゼインヒビター化合物ｂに対する高いＩＣ５０感受性との間に強い相関が見られた（表２）。ホモ接合性のＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦ変異を含む細胞株は、ヘテロ接合体Ｖ６００Ｅ  ＢＲＡＦ変異または野生型ＢＲＡＦ遺伝子型を含む細胞株と比べて高い感受性を有した（これは、化合物ａまたは化合物ｂに対する比較的低い細胞増殖ＩＣ５０値によって測定される）（表２）。試験された９個のＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦホモ接合性の遺伝子型細胞株のうちの９個が、ＥＲＫ１／２キナーゼインヒビター化合物ａに対して＜１００ｎＭのＩＣ５０値を有する（表２）。試験された９個のＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦホモ接合性遺伝子型細胞株のうちの８個が、ＭＥＫキナーゼインヒビター化合物ｂに対して≦１０ｎＭのＩＣ５０値を有する（表２）。ヘテロ接合体Ｖ６００Ｅ  ＢＲＡＦ変異または野生型ＢＲＡＦ遺伝子型を有する細胞株は、ＥＲＫ１／２キナーゼインヒビター化合物ａ（試験された３２個の細胞株のうち２５個が＞１００ｎＭのＩＣ５０値を有した）またはＭＥＫキナーゼインヒビター化合物ｂ（試験された３２個の細胞株のうち２３個が、＞１０ｎＭのＩＣ５０を有した）に対してより低い感受性だった（表２）。ヘテロ接合性のＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦ変異を含む２つの細胞株（ＷＭ−２６６−４およびＷＭ−１５５）は、ＥＲＫ１／２インヒビター化合物ａまたはＭＥＫインヒビター化合物ｂの両方に対して高い感受性を有した（化合物ａに対して＜１００ｎＭというＩＣ５０値および化合物ｂに対して＜１０ｎＭというＩＣ５０値）（表２）。
【０１２７】
材料および方法
ＢＲＡＦ保存キナーゼドメイン領域（エキソン１１〜１８）内またはＢＲＡＦのＶ６００アミノ酸を含むＢＲＡＦエキソン１５内の一塩基多型を同定するために、表２に列挙された腫瘍細胞株からの細胞株ＤＮＡサンプルを配列決定した。ＢＲＡＦキナーゼドメイン領域（アクセッション番号ＮＭ＿００４３３３）ＵＣＳＣヒト染色体領域ｃｈｒ７：１４０，０８０，７５３〜１４０，２７１，０３２（ＢＲＡＦエキソン１１〜１８を含む）を、以下のＰＣＲアッセイおよびＰＣＲプライマーを用いて配列決定した。
【０１２８】
ＢＲＡＦエキソン塩基対の位置。各ＢＲＡＦエキソンに対するＵＳＣＳヒト７番染色体ロケーション７ｑ３４位を以下に示す。
エキソン１：１４０，０８０，７５３〜１４０，０８１，０３８、エキソン２：１４０，０８６，０８０〜１４０，０８６，２１４、エキソン３：１４０，０９５，５５５〜１４０，０９５，６８６、エキソン４：１４０，０９９，５４３〜１４０，０９９，６６１、エキソン５：１４０，１００，４５５〜１４０，１００，５０１、エキソン６：１４０，１２３，１８０〜１４０，１２３，３５６、エキソン７：１４０，１２４，２５９〜１４０，１２４，３４３、エキソン８：１４０，１２７，８４４〜１４０，１２７，９６１、エキソン９：１４０，１２９，２８９〜１４０，１２９，４２５、エキソン１０：１４０，１３３，８１６〜１４０，１３３，８５２、エキソン１１：１４０，１４０，５７６〜１４０，１４０，７３５、エキソン１２：１４０，１４６，６３０〜１４０，１４６，７４９、エキソン１３：１４０，１４７，６８０〜１４０，１４７，８２８、エキソン１４：１４０，１５４，２２８〜１４０，１５４，３３０、エキソン１５：１４０，１５５，１６０〜１４０，１５５，２６３、エキソン１６：１４０，１８０，８７７〜１４０，１８１，１４０、エキソン１７：１４０，１９６，３７９〜１４０，１９６，４８０、エキソン１８：１４０，２７０，８３４〜１４０，２７１，０３２。
【０１２９】
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（ＵＣＳＣ）におけるＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＣＢＳＥ）内の複数部門にまたがるチームであるＧｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐによって、ＵＣＳＣゲノムブラウザが開発され、維持されている。
【０１３０】
ＢＲＡＦ  ＰＣＲアッセイ。いくつかのポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、関連性のあるＢＲＡＦエキソンを配列決定した。これらの反応を以下に要約する。
【０１３１】
名称（アッセイ番号＿順方向プライマー名＿逆方向プライマー名）
【０１３２】
【化２８】
0005603777.tif 000031
ＰＣＲプライマー。上で述べた各ポリメラーゼ連鎖反応において使用されたプライマーセットは、以下のとおりである：
【０１３３】
【化２９】
0005603777.tif 000032
ゲノムＤＮＡの単離。製造者の指示書（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に従ってＱｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを利用して、腫瘍細胞株からＤＮＡを得た。
【０１３４】
ポリメラーゼ連鎖反応。Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェア（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｃｇｉを参照のこと）を用いて、ＢＲＡＦのエキソンＬ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒを増幅するためのＰＣＲプライマーを設計した。順方向および逆方向プライマーを、ユニバーサルシーケンシングプライマー（それぞれ、−２１Ｍ１３：５’ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ（配列番号１９）およびＭ１３ＲＥＶ：ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ（配列番号２０））で５’テイル化した。腫瘍細胞株ゲノムＤＮＡ（１２ｎｇ）を含むＰＣＲ反応物を、製造者の指示書に従ってＦｉｄｅｌｉＴａｑＴＭ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（２×）（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）またはＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてＰＣＲ増幅した。
【０１３５】
ＤＮＡシーケンシングおよび解析。ＤＮＡ増幅後、ＰＣＲ反応物を、０．２５μｌのＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を含むＰＣＲ緩衝液中２０μｌに希釈し、そして３７℃で１５分間インキュベートした後、８０℃で１５分間、酵素を失活させた。製造者の指示書に従ってＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅターミネーターｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、順方向および逆方向におけるサイクルシーケンシングを行った。簡潔には、１μｌの各ＰＣＲ産物を鋳型として使用し、そして５ｐｍｏｌのＭ１３シーケンシングプライマー（−２１Ｍ１３またはＭ１３Ｒｅｖ）、０．５×シーケンシング緩衝液および０．２５μｌのＢＤＴｖ３．１混合物を含む４μｌのシーケンシング反応混合物と併せた。シーケンシング反応物を９６℃で１分間変性した後、９６℃１０秒間、５０℃５秒間および６０℃４分間を２５サイクル行った。シーケンシング反応物を、Ｍｏｎｔａｇｅ  ＳＥＱ３８４プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．；Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いる濾過によって精製し、２５μｌの脱イオン水に溶解し、そしてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７３０ＸＬ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒにおけるキャピラリーゲル電気泳動によって分離した。クロマトグラムをＵｎｉｘ（登録商標）ワークステーション（ＤＥＣ  ａｌｐｈａ，Ｃｏｍｐａｑ  Ｃｏｒｐ）に移し、Ｐｈｒｅｄ（バージョン０．９９０７２２．ｇ）を用いて塩基を呼び出し、Ｐｈｒａｐ（バージョン３．０１）を用いてアセンブルし、Ｐｏｌｙｐｈｒｅｄ（バージョン３．５）｛Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，１９９７  ＃３３｝でスキャンし、そして結果を、Ｃｏｎｓｅｄ（バージョン９．０）（Ｐｈｒｅｄ、ＰｈｒａｐおよびＣｏｎｓｅｄは、ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕにおいて入手可能であり、ＰｏｌｙＰｈｒｅｄは、ｄｒｏｏｇ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕにおいて入手可能である）を用いて考察した。解析パラメータはすべて、個別のソフトウェアのデフォルトの設定に維持した。
【０１３６】
ＢＲＡＦアミノ酸配列を以下のとおり示す。本明細書中で述べられる研究において配列決定されたＢＲＡＦ領域を以下に太字で下線が引かれたフォントで示す。
【０１３７】
【化３０】
0005603777.tif 000033
ＩＣ５０細胞増殖測定。ＥＲＫ１／２インヒビター化合物ａまたはＭＥＫインヒビター化合物ｂ（ＰＤ０３２５９０１）のいずれかに連続的に曝露した４日後に、細胞増殖を、表２に示される４１個の腫瘍細胞株においてＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて評価した。ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙは、安定型のルシフェラーゼを用いて生細胞の指標としてＡＴＰを測定する、細胞増殖をアッセイするための感度の高い方法である。この試薬は、ＡＴＰの定量によって細胞数を決定する均一な方法を可能にする。生成されるルシフェラーゼ発光シグナルは、培養物中に存在する生細胞の数に比例する。
【０１３８】
各化合物の８個の希釈物を含む１０００×化合物の用量反応曲線を９６ウェルプレート上に調製した。化合物を、以下の（１０００×）濃度（複数）まで１００％ＤＭＳＯ中に希釈した：化合物ｂ：１０００μＭ、３３３μＭ、１１１μＭ、３７μＭ、１２μＭ、４．１μＭ、１．４μＭおよび０．５μＭ；化合物ａ：３０００μＭ、１０００μＭ、３３３μＭ、１１１μＭ、３７μＭ、１２μＭ、４．１μＭおよび１．４μＭ。この化合物供給源プレートを密閉し、使用しない間は凍結し続けた。
【０１３９】
細胞を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミンおよび非必須アミノ酸が補充されたＲＰＭＩ  １６４０培地中または同じ補充物を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で増殖させた。０日目に、細胞をトリプシン処理し、計数し、そして５０μｌの完全培地中、１５００〜２０００細胞／ウェルという密度で９６ウェルＷａｌｌａｃ  ＴＣ  Ｉｓｏｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のウェルにプレーティングした。同じ密度の細胞の追加の６〜８個の複製ウェルを、別のＷａｌｌａｃ  ＴＣ  Ｉｓｏｐｌａｔｅ上にプレーティングした。このプレートを１日目に発光させる（ｄｅｖｅｌｏｐ）ことにより、細胞−増殖ベースラインを決定した。
【０１４０】
処理の１日目に、化合物を培地中に２×に希釈し、そして以下のとおり、直ちに細胞に加えた：１ｍｌの培地を深ウェル９６ウェルプレートの各ウェルに加え、そして２μｌの１０００×化合物を混合しながら加えることにより、培地中に２×化合物を調製した。各ウェルに対する最終濃度が表１に概説されるとおりになるように２つ組の点において、２×化合物を含む５０μｌの培地を細胞プレートに加えた。次いで、そのプレートを３７℃の恒温器に戻し、そして４日間静置した。１日目（ベースライン）のプレートを、まず５０μｌの培地（化合物を含まない）を加えることにより、各ウェル内の体積を１００μｌにし、次いで、１００μｌのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ試薬を加える（以下のとおり）ことによって発光させた。
【０１４１】
処理の４日後に、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（ＣＴＧ）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてプレートを発光させた。製品の挿入物に記載されているように、試薬を再構成した。１００μｌの試薬をすべての処理ウェルおよびコンロールウェルに加え、そのプレートを５分間穏やかに振盪し、次いで、さらに５分間インキュベートした後、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅの設定を用いてＡｎａｌｙｓｔ  ＡＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で読み出した。
【０１４２】
解析
ＸＬｆｉｔ４．２、当てはめ（ｆｉｔ）モデル＃２０５（Ｄｏｓｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｏｎｅ  Ｓｉｔｅ）を用いるＥｘｃｅｌにおいてデータを解析した。
当てはめ方程式：当てはめ＝（Ａ＋（（Ｂ−Ａ）／（１＋（（Ｃ／ｘ）＾Ｄ））））
ここで：Ａ＝ベースライン（１日目）ＣＴＧ読み取り値
Ｂ＝４日の増殖ＣＴＧ読み取り値
Ｃ＝ＩＣ５０
Ｄ＝Ｈｉｌｌ勾配。
【０１４３】
ｘ＝化合物のＬｏｇ濃度（ｎＭ）
１日目から倍加した細胞の数もまた計算した（細胞の倍加が２．０未満の場合は結果を使用しなかった）。
使用した材料は、以下のとおりであった：
ＲＰＭＩ−１６４０培地      Ｇｉｂｃｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１１８７５
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地        Ｇｉｂｃｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン  Ｇｉｂｃｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２５０３０
ＭＥＭ非必須アミノ酸    Ｇｉｂｃｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１１１４０
ウシ胎仔血清              Ｇｉｂｃｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１００８２−１４７
トリプシン                  Ｇｉｂｃｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２５２００
Ｉｓｏｐｌａｔｅ  ＴＣ      Ｗａｌｌａｃ                    １４５０−５１６
ＤＭＳＯ                    Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ      ２７６８５５−１００
Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ７５７１
【０１４４】
【表１】
0005603777.tif 000034
【０１４５】
【表２−１】
0005603777.tif 000035
【０１４６】
【表２−２】
0005603777.tif 000036
上で述べられたように、本発明の実施形態において、増殖阻害が、約１００ｎＭ以下のＩＣ５０値を特徴とする場合、細胞は、通常、ＥＲＫ１インヒビターまたはＥＲＫ２インヒビターに対してより感受性であると考えられる。１００ｎＭを超えるＩＣ５０値は、通常、抵抗性（すなわち、より低い感受性）と考えられる。ＭＥＫインヒビターの増殖阻害が約１０ｎＭ以下のＩＣ５０値を特徴とする場合、細胞は、通常、ＭＥＫインヒビターに対してより感受性であると考えられる。１０ｎＭを超えるＩＣ５０値は、通常、抵抗性（すなわち、より低い感受性）であると考えられる。
【０１４７】
本発明は、本明細書中に記載された特定の実施形態によって範囲を限定されるべきでない。実際に、本発明の範囲は、本明細書中に明確に示される実施形態および本明細書中に明確に示されない他の実施形態を含む；本明細書中に明確に示される実施形態は、必ずしも網羅的であると意図されない。本明細書中に記載されたものに加えて、本発明の様々な改変が、前記の説明から当業者には明らかになるだろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
【０１４８】
特許、特許出願、刊行物、製品の説明およびプロトコルが、本願全体にわたって引用され、それらの開示は、すべての目的のためにそれらの全体が本明細書中で参考として援用される。
【配列表】
0005603777000001.app