(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびパルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）の混合物；
ｉｉ）式（Ｉｄ）または式（Ｉｆ）：
【化１６】
0005405307.tif 000013
により表される配列を有する、ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのポリペプチドアナログ；及び
ｉｉｉ）式（ＩＩａ）または（ＩＩｃ）：
【化１３】
0005405307.tif 000014
［式中、
該式（ＩＩａ）および（ＩＩｃ）のポリペプチドは、１および３３位における二つのＣｙｓ残基の間ならびに／または４および２７位における二つのＣｙｓ残基の間に分子内ジスルフィド結合を有するジスルフィド結合した分子の形態である]
により表される配列を有する、ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｂのポリペプチドアナログ、
を含む、再構成サーファクタント。
【請求項２】
ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのアナログおよびネイティブなサー
ファクタントタンパク質ＳＰ−Ｂのアナログが、一定の組み合わせで存在する、請求項１
記載の再構成サーファクタント。
【請求項３】
ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｂのアナログが、一般式（ＩＩａ）
【化１４】
0005405307.tif 000015
により表される、請求項１〜２のいずれか一項記載の再構成サーファクタント組成物。
【請求項４】
ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのアナログが、
【化１７】
0005405307.tif 000016
である、請求項３記載の再構成サーファクタント組成物。
【請求項５】
ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのポリペプチドアナログが、
【化１８】
0005405307.tif 000017
であり、ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｂのポリペプチドアナログが、
【化１９】
0005405307.tif 000018
である、請求項１記載の再構成サーファクタント。
【請求項６】
ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのポリペプチドアナログが、
【化２０】
0005405307.tif 000019
であり、ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｂのポリペプチドアナログが、
【化２１】
0005405307.tif 000020
である、請求項１記載の再構成サーファクタント。
【請求項７】
ＤＰＰＣおよびＰＯＰＧが、６８：３１の重量比である、請求項１〜６記載の再構成サーファクタント。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項記載の再構成サーファクタントを含む薬学的組成物。
【請求項９】
溶液、分散物、懸濁物または乾燥粉末の形態の、請求項８記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
水性懸濁物の形態の、請求項８記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
２〜１６０mg/mlに含まれる濃度の再構成サーファクタントを含む、請求項１０記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
再構成サーファクタントの濃度が２０〜８０mg/mlに含まれる、請求項１１記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
未熟児における呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）の処置もしくは予防のための、またはサーフ
ァクタントの欠乏もしくは機能不全に関係する他の疾患の処置もしくは予防のための、請求項８〜１２のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
サーファクタントの欠乏または機能不全に関係する疾患に、成人ＲＤＳ（ＡＲＤＳ）、
胎便吸引症候群（ＭＡＳ）、および気管支肺異形成症（ＢＰＤ）が含まれる、請求項１３記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質担体、およびネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃの特定のポリペプチドアナログとネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｂの特定のポリペプチドアナログの組み合わせを含む再構成サーファクタントに関する。
【０００２】
本発明は、その薬学的組成物、ならびにＲＤＳおよび他の呼吸障害の処置または予防のためのその使用にもまた関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ヒトの肺は、血液と肺の気腔の間でガスが交換される、肺胞と呼ばれる多数の小さな気胞から構成される。健康な個体では、この交換は、呼気終末で肺が虚脱するのを防止するタンパク質含有サーファクタント複合体の存在によって仲介される。
【０００４】
肺サーファクタント複合体は、主に脂質から構成され、少量の各種タンパク質を含有する。この複合体が十分なレベルで存在しない結果として、肺の機能不全が生じる。この症候群は呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）と呼ばれ、通常、早期産児を冒す。
【０００５】
該症候群は、動物の肺から抽出された改変天然サーファクタント調製物で効果的に処置される。
【０００６】
市販の改変サーファクタント調製物は、例えば、ブタ肺由来のCurosurf、抽出された形態のウシ肺洗浄液であるInfasurf、および化学的に改変された天然ウシ肺抽出物であるSurvantaである。
【０００７】
これらのサーファクタント調製物の主成分は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）として一般に知られている１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）ならびに疎水性のサーファクタントタンパク質ＢおよびＣ（ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃ）である。
【０００８】
生産工程および滅菌工程の複雑さ、ならびに免疫反応を誘導する可能性などの、動物組織からサーファクタントを調製する欠点が原因で、改変天然サーファクタントの組成を模倣する合成サーファクタントが開発された。該合成サーファクタントは再構成サーファクタントとして知られている。
【０００９】
しかし、ネイティブな疎水性タンパク質が合成には大きすぎ、構造的に複雑で、純粋な形態では不安定なことから、臨床的に活性な再構成サーファクタントの開発は複雑であることが判明した。
【００１０】
該ネイティブな疎水性タンパク質に取って代わるために、その配列に部分的に対応するいくつかの合成ポリペプチドおよびそれらのアナログが従来技術に述べられており、例えば国際公開公報第８９／０６６５７号、第９２／２２３１５号、第９８／４９１９１号、第９５／３２９９２号、米国特許第６，６６０，８３３号、ＥＰ４１３，９５７および国際公開公報第９１／１８０１５号に開示されている。
【００１１】
国際公開公報第００／４７６２３号は、ｉ）５および６位のシステイン残基がＳｅｒ残基により置き換えられ；ｉｉ）ＳＰ−Ｃの「中心領域」のＶａｌ残基が、Ｌｅｕ、Ｉｌｅおよびノルロイシン（ｎＬ）からなる群より選択される他の中性疎水性残基に置換され；ｉｉｉ）ＳＰ−Ｃの「中心領域」に存在するいくつかの中性アミノ酸が、Ｌｙｓ、Ｔｒｙ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびオルニチンからなる群より選択されるかさ高い残基または極性残基により置き換えられている、ネイティブなタンパク質ＳＰ−Ｃのアナログである合成ポリペプチドを開示した。
【００１２】
該人工ポリペプチドは、ネイティブなタンパク質であるＳＰ−Ｃのようにフォールディングすることができることから、サーファクタントの脂質と適切に相互作用し、自己オリゴマー化を生じないことを特徴とする。
【００１３】
国際公開公報第００／７６５３５号は、一般にＳＰ−Ｂの少なくとも一つの改変をＳＰ−Ｃタンパク質の少なくとも一つの改変と共に含む肺サーファクタント調製物に関する。
【００１４】
Waring AJら（２００６年４月２９日〜５月２日にサンフランシスコで開催されたPaediatric Academy Societyの年次総会で発表された要旨）では、ＳＰ−Ｃ模倣体であるＳＰ−Ｃｆｆ（４および５位のシステインの代わりにフェニルアラニンを有する合成３４残基性ＳＰ−Ｃ）およびＳＰ−Ｂ模倣体であるＭｉｎｉ−Ｂから構成される合成サーファクタントの活性を検討するための研究が行われた。
【００１５】
しかし、入手できる文献によると、動物実験において再構成サーファクタントを用いた処置は、呼気終末に不十分な肺気量および肺胞開存度を生じることから、改変天然サーファクタントで達成されるものに匹敵するｉｎ  ｖｉｖｏ活性を達成するためには、呼気終末陽圧換気（ＰＥＥＰ）が必要である（Johansson J et al J Appl Physiol 2003, 95, 2055-2063; Davis AJ et al Am J Respir Crit Care Med 1998; 157, 553-559）。入手できる再構成サーファクタント調製物は、実際に呼気終末に安定なリン脂質フィルムを肺胞に形成することができない。
【００１６】
前述の文書の全ては、呼気終末での肺胞開存の問題およびその開示された調製物の効果について指摘していない。
【００１７】
したがって、肺コンプライアンスに関して改善された性質を有する再構成サーファクタントの、まだ満たされていない必要性がある。
【００１８】
特に、肺胞の安定性を保証する故に、ＰＥＥＰを用いた換気の必要なしに呼気終末に肺胞開存を維持することができる再構成サーファクタント調製物の必要性がある。
【００１９】
肺コンプライアンスに関して改善された性質を有し、特に呼気終末にＰＥＥＰを用いた換気の必要なしに肺胞開存を効果的に維持する能力を有する再構成サーファクタント調製物を提供するために、ネイティブなＳＰ−Ｃタンパク質の特定のアナログおよび好ましくは国際公開公報第００／４７６２３号のポリペプチドを、ネイティブなタンパク質ＳＰ−Ｂの特定のアナログと好都合に組み合わせることができることが今回見出されたが、これが本発明の目的である。
【００２０】
特に、未熟新生児がＰＥＥＰの適用なしに外因性サーファクタント調製物を用いて処置されたＲＤＳのモデルにおいて、タンパク質ＳＰ−ＣおよびＳＰ−Ｂの該特定のアナログの組み合わせが肺気量（呼気終末の肺胞開存の指標）に作用することが見出された。
【発明の概要】
【００２１】
本発明は、脂質担体、およびネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃの特定のポリペプチドアナログとネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｂの特定のポリペプチドアナログの組み合わせを含む再構成サーファクタントに関する。
【００２２】
特に、本発明は、以下を含む再構成サーファクタントに関するものである：
ａ）脂質担体；
ｂ）一般式（Ｉ）
【００２３】
【化１】
0005405307.tif 000002
【００２４】
［式中、
Ｘは、Ｉ、Ｌ、およびｎＬからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｂは、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｗ、Ｆ、Ｙ、およびＯｒｎからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｓは、エステル結合により側鎖に結合した、１２〜２２個の炭素原子、好ましくは１６個の炭素原子を含むアシル基で場合により置換されていてもよく；
Ωは、Ｍまたは硫黄原子が酸化されたＭ、Ｉ、Ｌ１およびｎＬからなる群より選択されるアミノ酸であり；
ａは、１〜８に含まれる値を有する整数であり；
ｂは、１〜１９に含まれる値を有する整数であり；
ｃは、３から８より独立して選択される値を有する整数であり；
ｅ、ｆ、ｇおよびｐは、０または１の値を有する整数であり；
ｎは、０〜３に含まれる値を有する整数であり；そして
ＸaＢＸb（ＢＸc）nは、最大２２個のアミノ酸を有する配列であることを条件とする］
により表される配列を有する、少なくとも２０個で最大４０個のアミノ酸残基のポリペプチド；
ｃ）一般式（ＩＩ）
【００２５】
【化２】
0005405307.tif 000003
【００２６】
［式中、
Δは、ＷおよびＬからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ωは、Ｍ、Ｉ、ＬおよびｎＬからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Φは、ＲおよびＴ、好ましくはＲからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；そして
ｆは、０または１の値を有する整数である］
により表されるポリペプチド。
【００２７】
本発明には、該ポリペプチドの薬学的に許容され得る塩、ならびに例えばアセチル化およびアミド化により遮断されたそれらのＮおよび／またはＣ末端誘導体もまた含まれる。
【００２８】
本発明は、その薬学的組成物ならびに呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）および他の呼吸障害の予防および／または処置のためのそれらの使用にもまた関する。
【００２９】
本発明は、さらに、呼気終末での肺胞開存を改善するための再構成サーファクタントを調製するために、一般式（ＩＩ）のポリペプチドを使用することに関する。
【００３０】
最終的に、本発明は、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）および他の呼吸障害の予防および／または処置のための方法を提供し、該方法は、そのような処置を必要とする患者に、脂質担体、一般式（Ｉ）のポリペプチド、および一般式（ＩＩ）のポリペプチドを含む再構成サーファクタントの治療有効量を投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ヒトタンパク質ＳＰ−Ｃの配列を示す図である。ネイティブなＳＰ−ＣのＣｙｓ残基はパルミトイル化されている。
【図２】ヒトタンパク質ＳＰ−Ｂの配列を示す図である。
【図３】肺気量（ml/kg）で表した結果を示す図である。
【図４】一回換気量（ml/kg）を時間／圧力の関数として表した結果を示す図である。
【００３２】
定義
外因性サーファクタント調製物を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ処置後の呼吸機能決定は、以下の二つのパラメータを測定することによって行う：
ｉ）肺コンプライアンスの指標である一回換気量、および
ｉｉ）呼気終末での肺胞気のエクスパンションまたは開存の指標である故に、呼気終末に肺胞に安定なリン脂質フィルムを形成する能力の指標である肺気量。
【００３３】
本出願において、「再構成サーファクタント」という用語は、リコンビナント技法または合成法によって作られた、サーファクタントタンパク質のポリペプチドアナログが添加された脂質担体を意味する。
【００３４】
「脂質担体」という用語は、リン脂質と、所望によりさらなる脂質成分、例えばトリアシルグリセロールなどの中性脂質、遊離脂肪酸および／またはコレステロールなどの中性脂質の混合物を意味する。
【００３５】
「ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのポリペプチドアナログ」という用語には、脂質担体との混合物中のポリペプチドが肺サーファクタント活性を示す限りにおいて、ネイティブなタンパク質に比べて一つまたは複数のアミノ酸が欠如しているか、または他のアミノ酸により置き換えられたアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。
【００３６】
「ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｂのポリペプチドアナログ」という用語には、脂質担体と混合されたポリペプチドが肺サーファクタント活性を示す限りにおいて、ネイティブなタンパク質に比べて一つまたは複数のアミノ酸が欠如しているアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。
【００３７】
「ｍｉｎｉ−Ｂ」という用語は、構造が、California NanoSystems Instituteのウェブサイトから引用された説明に初めて一般に開示されたネイティブなＳＰ−Ｂタンパク質のＮ末端残基８〜２５およびＣ末端残基６３〜７８に基づく残基３４個のポリペプチドを意味する。その完全配列は、その後RCSB Protein Data Bankに開示された。
【００３８】
Waring AJ et al J Peptide Res 2005, 66, 364-374に、その構造および活性に関するさらに多くの情報が報告された。
【００３９】
「変異体」という用語は、脂質担体との混合物中のポリペプチドがＭｉｎｉ−Ｂの活性を保持する限りにおいて、一つまたは複数のアミノ酸が他のアミノ酸により置き換えられたアミノ酸配列を有するＭｉｎｉ−Ｂペプチドのポリペプチドアナログを意味する。
【００４０】
アミノ酸配列は、左端に遊離アミノ基を有するアミノ酸（アミノ末端）および右端に遊離カルボキシル基を有するアミノ酸（カルボキシ末端）と共に三文字コードにしたがって示す。
【００４１】
「相乗的」という用語は、二つのポリペプチドの有効性が、所与のアッセイにおけるそれらの個別の有効性をそれぞれ合計することによって予測されるものよりも大きいことを意味する。
【００４２】
本明細書において確認された全てのアミノ酸残基は、自然のＬ−配置にあり、本明細書において確認された配列は、以下の対応表に示されるアミノ酸残基についての標準的な略語にしたがって記録する。
【００４３】
【表１】
0005405307.tif 000004
【００４４】
発明の詳細な説明
本発明は、脂質担体、ならびにネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃの特定のポリペプチドアナログと、Ｍｉｎｉ−Ｂペプチドおよびその変異体を含めた、ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｂの特定のポリペプチドアナログの組み合わせを含む再構成サーファクタントに関する。
【００４５】
本発明者らは、未熟新生児がＰＥＥＰを適用されずに外因性サーファクタント調製物で処置されたＲＤＳのモデルにおいて、一般式（Ｉ）のポリペプチドと一般式（ＩＩ）のポリペプチドの組み合わせが肺コンプライアンスにポジティブに作用することを実際に見出した。
【００４６】
特に、二つのポリペプチドの組み合わせは、呼気終末での肺胞開存の指標である肺気量に相乗的に作用することが見出された。
【００４７】
該結果は、本発明の再構成サーファクタントが、タンパク質ＳＰ−Ｃのアナログのみ、またはタンパク質ＳＰ−Ｂのアナログのみを含む再構成物よりも良好に呼気終末での肺胞のリン脂質フィルムを安定化することができることを実証している。
【００４８】
さらに、請求された再構成サーファクタント調製物は、一回換気量により表現される呼吸機能を、改変天然サーファクタントの投与後に達成されるものに匹敵するか、またはそれよりもやや良好でさえある程度まで改善することが判明した。
【００４９】
好都合には、ネイティブなタンパク質ＳＰ−Ｃのアナログは、一般式（Ｉ）
【００５０】
【化３】
0005405307.tif 000005
【００５１】
［式中、
Ｘは、Ｉ、Ｌ、およびｎＬからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｂは、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｗ、Ｆ、Ｙ、およびＯｒｎからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｓは、エステル結合により側鎖に結合した、１２〜２２個の炭素原子、好ましくは１６個の炭素原子を有するアシル基により置換されていてもよく；
Ωは、Ｍまたは硫黄原子が酸化されたそれ、Ｉ、Ｌ、およびｎＬからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
ａは、１〜８に含まれる値を有する整数であり；
ｂは、１〜１９に含まれる値を有する整数であり；
ｃは、３〜８より独立して選択される整数であり；
ｅ、ｆ、ｇおよびｐは、０または１の値を有する整数であり；
ｎは、０〜３に含まれる値を有する整数であり；そして
ＸaＢＸb（ＢＸc）nは最大２２個のアミノ酸を有する配列であって、好ましくは１０〜２２個のアミノ酸を含む配列であることを条件とする］
により表される配列を有する、少なくとも２０個で最大４０個のアミノ酸残基のポリペプチドである。
【００５２】
好ましくは、一般式（Ｉ）のポリペプチドは、少なくとも３０個で最大３５個、さらに好ましくは最大３３個のアミノ酸からなる。
【００５３】
特定の態様では、一般式（Ｉ）のポリペプチドは、３０または３３または３５個のアミノ酸からなる。
【００５４】
好ましくは、ＳＰ−Ｃタンパク質のポリペプチドアナログは、ｅおよびｎが０であり、ｇが１である一般式（Ｉａ）
【００５５】
【化４】
0005405307.tif 000006
【００５６】
［式中、
Ｘ、ＢおよびΩは、上記の通りであり；
ａは１〜８、好ましくは１〜３、さらに好ましくは１であり；
ｂは１〜１９、好ましくは５〜１５、さらに好ましくは１４であり；
ｆおよびｐは０または１である］
により表される。
【００５７】
さらに好ましくは、ＳＰ−Ｃタンパク質のポリペプチドアナログは、ｆが１である一般式（Ｉｂ）
【００５８】
【化５】
0005405307.tif 000007
【００５９】
［式中、
Ｘ、Ｂ、Ω、ａおよびｂは、上に定義する通りであり；
ｐは０または１である］
により表される。
【００６０】
なおさらに好ましくは、Ｐ−Ｃタンパク質のポリペプチドアナログは、一般式（Ｉｃ）
【００６１】
【化６】
0005405307.tif 000008
【００６２】
［式中、
Ωは上に定義する通りであり；
ｐは０または１である］
により表される。
【００６３】
式（Ｉｃ）のポリペプチドの例を下記：
【００６４】
【化７】
0005405307.tif 000009
【００６５】
に示す。
【００６６】
ポリペプチド（Ｉｄ）は、従来技術においてＳＰ−Ｃ３３ともまた呼ばれた。
【００６７】
最も好ましくは、ＳＰ−Ｃアナログは、式（Ｉｅ）、（Ｉｆ）、（Ｉｇ）および（Ｉｈ）を有するポリペプチドの群より選択されるポリペプチドである。
【００６８】
本発明の好ましい態様では、一般式（Ｉ）のポリペプチドは、以後ＳＰ−Ｃ３３（Ｌｅｕ）31と呼ばれるポリペプチド（Ｉｆ）である。
【００６９】
好都合には、ネイティブなタンパク質ＳＰ−Ｂのアナログは、ネイティブなＳＰ−Ｂタンパク質またはその変異体のＮ末端残基８〜２５およびＣ末端部６３〜７８に対応する二つの部分（Ｍｉｎｉ−Ｂペプチドと呼ぶ）からなる。
【００７０】
さらに好都合には、ネイティブなタンパク質ＳＰ−Ｂのアナログは、以下の一般式（ＩＩ）
【００７１】
【化８】
0005405307.tif 000010
【００７２】
［式中、
Δは、ＷおよびＬからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
Ωは、Ｍ、Ｉ、Ｌ、およびｎＬからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Φは、ＲおよびＴ、好ましくはＲからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；そして
ｆは、０または１の値を有する整数である］
により表されるポリペプチドである。
【００７３】
本発明の特定の態様では、ＳＰ−Ｂアナログは、式（ＩＩａ）
【００７４】
【化９】
0005405307.tif 000011
【００７５】
により表されるポリペプチドである。
【００７６】
本発明の別の態様では、ＳＰ−Ｂアナログは、以下の式
【００７７】
【化１０】
0005405307.tif 000012
【００７８】
を有するものより選択される。
【００７９】
好ましい態様では、ポリペプチド（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）および（ＩＩｄ）は、分子間ジスルフィド結合が１および３３位の二つのＣｙｓ残基の間ならびに／または４および２７位の二つのＣｙｓ残基の間の、ジスルフィド結合した分子の形態である。
【００８０】
ジスルフィド結合したポリペプチド（ＩＩａ）は、当技術分野において酸化Ｍｉｎｉ−Ｂ（ｏｘ  Ｍｉｎｉ−Ｂ）と呼ばれてきた。
【００８１】
ポリペプチド（ＩＩｃ）は、以下にＭｉｎｉ−Ｂ（Ｌｌｅｕ）と呼ばれ、そのジスルフィド結合形態はｏｘ  Ｍｉｎｉ−Ｂ（Ｌｅｕ）と呼ばれる。
【００８２】
一般式（Ｉ）および（ＩＩ）のポリペプチドは、当業者に周知の合成法またはリコンビナント技法により調製してもよい。
【００８３】
利用できる多数の技法の優れた概要は、固相ペプチド合成に関してはJ. M. Steward and J. D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969およびJ. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides", Vol.2, p. 46, Academic Press (New York), 1983に、古典的液相合成に関してはE. Schroder and K. Kubke, "The Peptides", Vol.1, Academic Press (New York), 1965に見出すことができる。本発明のポリペプチドは、Merrifield（J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963)）により最初に記載された固相合成技法を使用して調製することもまたできる。他のポリペプチド合成技法は、例えばM. Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2d Ed., (1976)および当業者に公知の他の参考研究に見出すことができる。
【００８４】
このような合成に使用するための適切な保護基は、上記文書およびJ.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, NY (1973)に見出されよう。
【００８５】
例えば、一般式（Ｉ）のポリペプチドは、国際公開公報第００／４７６２３号に開示された方法により調製してもよいが、一般式（ＩＩ）のポリペプチドは、Waring AJ et al J Peptide Res 2005, 66, 364-374に報告された方法により調製してもよい。
【００８６】
本発明には、一般式（Ｉ）および（ＩＩ）のポリペプチドの薬学的に許容される塩ならびに例えばアセチル化およびアミド化により遮断されたそれらのＮおよび／またはＣ末端誘導体もまた含まれる。
【００８７】
薬学的に許容され得る塩には、例えば塩酸、酢酸、およびトリフルオロ酢酸の塩が含まれる。
【００８８】
本発明の再構成サーファクタントは、一般式（Ｉ）および（ＩＩ）のポリペプチドならびに脂質の溶液または懸濁物を混合し、続いてその混合物を乾燥することによって調製してもよいし、別のやり方では、凍結乾燥または噴霧乾燥によって調製してもよい。
【００８９】
好ましくは、一般式（Ｉ）のポリペプチドおよび一般式（ＩＩ）のポリペプチドは、本発明の再構成サーファクタント中に一定量で、一定の組み合わせとして定量的な比で存在する。
【００９０】
再構成サーファクタントに対する一般式（Ｉ）および（ＩＩ）のポリペプチドの比率は変動しうる。好都合には、各ポリペプチドは、サーファクタントの重量に対して０．５〜１０％(w/w)、好ましくは１〜５％、最も好ましくは１〜３％に含まれる量で存在しうる。
【００９１】
好ましい態様では、再構成サーファクタントは、ポリペプチド（Ｉｆ）を１〜３重量％および好ましくは酸化された形態のポリペプチド（ＩＩａ）を１〜３重量％含む。
【００９２】
別の好ましい態様では、再構成サーファクタントは、ポリペプチド（Ｉｆ）を１〜３重量％および好ましくは酸化された形態のポリペプチド（ＩＩｃ）を１〜３重量％含む。
【００９３】
好都合には、脂質担体は、天然肺サーファクタント調製物に含有されるリン脂質、例えばジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびパルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）などのホスファチジルコリン（ＰＣ）、ならびにパルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）およびジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）などのホスファチジルグリセロール（ＰＧ）を含む。
【００９４】
好都合に使用することのできる他のリン脂質は、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリンおよびスフィンゴミエリン（ＳＭ）である。
【００９５】
特定の態様では、脂質担体は、さらなる成分、例えばトリアシルグリセロールなどの中性脂質、遊離脂肪酸および／またはコレステロールを含んでもよい。
【００９６】
好都合には、本発明に記載の再構成サーファクタントは、脂質担体を９０〜９９重量％、好ましくは９２〜９８％、さらに好ましくは９４〜９６％、および両者のペプチドの総量を１〜１０重量％、好ましくは２〜８％、さらに好ましくは４〜６％含む。
【００９７】
本発明の態様の一つでは、再構成サーファクタントは、脂質担体を９６重量％、一般式（Ｉ）のポリペプチドを２重量％および一般式（ＩＩ）のポリペプチドを２重量％含む。
【００９８】
特定の態様では、脂質担体は、リン脂質のみから、さらに好ましくはＤＰＰＣとパルミトイルオレイルリン脂質の、９５：５〜５０：５０、好ましくは８０：２０〜６０：４０の範囲の重量比の混合物のみからなり、このパルミトイルオレイルリン脂質は、ＰＯＰＧまたはそれとＰＯＰＣの混合物より選択される。
【００９９】
ＤＰＰＣとＰＯＰＧの重量比は、好ましくは７５：２５〜６５：３５の範囲であり、さらに好ましくは６８：３１である。ＤＰＰＣ：ＰＯＰＧ：ＰＯＰＣの混合物の場合、リン脂質は好ましくは６０：２０：２０または６８：１５：１６の重量比で使用される。
【０１００】
別の態様では、脂質担体は、ＤＰＰＣ、ＤＰＰＧおよびコレステロールからなってもよい。
【０１０１】
本発明の好ましい態様では、再構成サーファクタントは、一般式（Ｉａ）のポリペプチドの一つを１〜５重量％、一般式（ＩＩ）のポリペプチドの一つを１〜５重量％、ならびに重量比６８：３１のＤＰＰＣとＰＯＰＧの混合物を含む。
【０１０２】
本発明の再構成サーファクタントの投与は、好ましくは気管支内設置（注入またはボーラス）または噴霧により、当業者に公知の方法で実施される。
【０１０３】
本発明は、本発明の再構成サーファクタントを含む薬学的組成物にもまた関するものである。該組成物は、好都合には、溶液、分散物、懸濁物または乾燥粉末の形態で投与される。好ましくは、該組成物は、適切な溶媒または再懸濁媒に溶解または懸濁された再構成サーファクタントを含む。
【０１０４】
好ましくは、該薬学的組成物は、１回使用型ガラスバイアルに入れた緩衝生理食塩水中の懸濁液として供給される。好都合には、再構成サーファクタントの濃度（リン脂質の含量として表す）は、約２〜約１６０mg/ml、好ましくは１０〜１００mg/ml、さらに好ましくは２０〜８０mg/mlのサーファクタントの範囲である。
【０１０５】
該組成物は、カルシウム塩、マグネシウム塩および／またはナトリウム塩、好ましくは塩化カルシウムなどの電解質をさらに含んでもよい。
【０１０６】
本発明による薬学的組成物は、未熟児における呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、または成人ＲＤＳ（ＡＲＤＳ）、胎便吸引症候群（ＭＡＳ）、および気管支肺異形成症（ＢＰＤ）を含めたサーファクタントの欠乏もしくは機能不全に関係する他の疾患の予防および／または処置に適する。
【０１０７】
これらは、肺炎、気管支炎、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、喘息、および嚢胞性線維症などの他の呼吸障害の予防および／または処置に、ならびに漿液性中耳炎（膠耳）の処置にもまた有用でありうる。
【０１０８】
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に例示する。
【０１０９】
実施例
実施例１  −  ポリペプチドＳＰ−Ｃ３３（Ｌｅｕ）31およびＳＰ−Ｃ３３の合成および精製
ポリペプチドＳＰ−Ｃ３３（Ｌｅｕ）31は、Ｆｍｏｃ化学反応および連続するＴＦＡ切断に基づく標準的ＳＰＰＳ（固相ペプチド合成）法により調製した。
【０１１０】
合計１８６．０ｇの粗ＳＰ−Ｃ３３（Ｌｅｕ）31を得た。
【０１１１】
二相溶媒系としてＨ2Ｏ／ｎ−ＢｕＯＨ／ＡｃＯＥｔ／ＡｃＯＨ（４：１：４：１）を使用してこの材料を向流分配（ＣＣＤ）に供することによって、このポリペプチドを精製した。
【０１１２】
この精製により、７８．９ｇのＳＰ−Ｃ３３（Ｌｅｕ）31を純度＞６０％で回収した。
【０１１３】
最終精製は、５０×３００mmのスチールカラム中に固定相としてＰＬＲＰ−Ｓを使用し、７５分間に２５％Ｂから１００％Ｂに直線勾配をかけた調製用ＨＰＬＣにより実施した。移動相は、緩衝液Ａ＝ＡＣＮ／Ｈ2Ｏ（１：４）中の０．１％ＴＦＡおよび緩衝液Ｂ＝ＩＰＡ中の０．１％ＴＦＡからなった。
【０１１４】
精製ポリペプチドを９０％ＡｃＯＨに溶解し、Dowexイオン交換樹脂（酢酸塩型）を充填したカラムを通過させ、凍結乾燥後に最終産物５．８ｇ（＝５．４％）を酢酸塩として供給した。
【０１１５】
ポリペプチドＳＰ−Ｃ３３を同様に調製した。
【０１１６】
凡例
ＡＣＮ                アセトニトリル
ＡｃＯＥｔ            酢酸エチル
ＡｃＯＨ              酢酸
Ｂｏｃ                ｔ−ブチルオキシカルボニル
ｎ−ＢｕＯＨ          ｎ−ブタノール
Ｆｍｏｃ              ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＩＰＡ                イソプロピルアルコール
ＴＦＡ                トリフルオロ酢酸
【０１１７】
実施例２  −  ポリペプチドｏｘ  Ｍｉｎｉ−Ｂ（Ｌｅｕ）およびｏｘ−Ｍｉｎｉ−Ｂの合成および精製
ポリペプチドｏｘ−Ｍｉｎｉ−Ｂ（Ｌｅｕ）は、Ｆｍｏｃ化学反応および連続するＴＦＡ切断に基づく標準的ＳＰＰＳ（固相ペプチド合成）法により調製した。
【０１１８】
粗ポリペプチドは、ＴＦＡ系を使用した調製用ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥により単離した。
【０１１９】
精製ペプチドの空気酸化により、Ｃｙｓ1とＣｙｓ33の間にジスルフィド結合を有する単環性配列を回収した。この単環性ペプチドはＴＦＡ系を使用した調製用ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥により単離した。
【０１２０】
Ｃｙｓ4とＣｙｓ27の間の第２のジスルフィド架橋は、ヨウ素を使用して形成させた。
【０１２１】
酸化後に、産物はＴＦＡ系を使用した調製用ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥により単離した。最終化合物１．１２ｇ（＝１．７％）を純度＞８９％で単離した。
【０１２２】
ポリペプチドｏｘ  Ｍｉｎｉ−Ｂは同様にして調製した。
【０１２３】
実施例３  −  ｏｘ  Ｍｉｎｉ−ＢおよびＳＰ−Ｃ３３に基づく再構成サーファクタントを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ実験
在胎２７日での子宮摘出により得た未熟新生ウサギでサーファクタント調製物をアッセイした。呼気終末陽圧（ＰＥＥＰ）を適用せずに実験を行った。
【０１２４】
ＳＰ−Ｃアナログとして、実施例１に準じて調製したＳＰ−Ｃ３３と呼ばれるポリペプチドを使用した。
【０１２５】
タンパク質ＳＰ−Ｂのアナログとして、実施例２に準じて調製した酸化Ｍｉｎｉ−Ｂ（ｏｘ  Ｍｉｎｉ−Ｂ）を使用した。
【０１２６】
動物は、誕生時に、脂質担体としてリン脂質混合物ＤＰＰＣ：ＰＯＰＧを６８：３１w/wの比で含有する再構成サーファクタント調製物で処置した。リン脂質は、２または４％w/wのＳＰＣ−３３、２％w/wのｏｘ  Ｍｉｎｉ−Ｂまたは２％w/wのＳＰＣ−３３および２％w/wのｏｘ  Ｍｉｎｉ−Ｂと混合した。
【０１２７】
同用量のCurosurf（登録商標）を投与されている動物を陽性対照として、無処置同腹仔を陰性対照として供した。
【０１２８】
全てのサーファクタント調製物を濃度８０mg/mlおよび基準用量２．５ml/kgで投与した。
【０１２９】
未熟新生ウサギを標準化された順序のピーク吸気圧で並行して換気した。肺を拡張させるために、圧は最初３５cm Ｈ2Ｏに１分間設定した。このリクルートメント方法の後に、圧を２５cm Ｈ2Ｏに１５分間、さらに２０、そして１５cm Ｈ2Ｏに下げた。最後に、圧を再び２５cm Ｈ2Ｏに５分間上げ、その後、肺を窒素で追加的に５分間換気し、次に気量測定のために切除した。
【０１３０】
肺気量および一回換気量の両方をml/kgとして表して測定し、中央値として示した結果をそれぞれ図３および４に記録する。
【０１３１】
図３より、２％w/wのｏｘ  Ｍｉｎｉ−Ｂを含有する再構成サーファクタント調製物で処置された動物は、２％w/wのＳＰ−Ｃ３３を投与された動物よりも低い肺気量を有した（約２ml/kg対約４ml/kg）と認めることができる。
【０１３２】
ＳＰ−Ｃ３３サーファクタントへの２％w/wのｏｘ  Ｍｉｎｉ−Ｂの添加は、いずれかのペプチド単独よりも有意に大きな肺気量の増加を生じた（８ml/kg対約６ml/kg）。
【０１３３】
図４に示すように、一回換気量に関して同様の傾向が観察され、ペプチドを組み合わせて投与した後に、Curosurf（登録商標）の投与後に達成されたものに匹敵するか、またはそれよりもわずかに良好でさえある改善が観察された。
【０１３４】
ＳＰ−Ｃ３３含量を２から４％w/wに増加させても肺気量は増加しなかったこともまた見出されたが、これは、呼気終末での肺胞のリン脂質フィルムの安定化効果がｏｘ  Ｍｉｎｉ−Ｂの添加に起因することを示している。
【０１３５】
該結果は、本発明の再構成サーファクタントが、タンパク質ＳＰ−Ｃのアナログまたはタンパク質ＳＰ−Ｂのアナログのみを含む再構成物よりも良好に呼気終末での肺胞のリン脂質フィルムを安定化することができることを実証している。
【０１３６】
さらに、請求された再構成サーファクタント調製物は、一回換気量により表される呼吸機能を、改変天然サーファクタントの投与後に達成されたものに匹敵するか、またはそれよりもやや良好でさえある程度まで改善することが判明した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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