(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態の治療又は予防に使用するための、ＥｎｄｏＳポリペプチドを含む薬剤であって、
該ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態が自己免疫疾患、移植拒絶反応、術後治療又は後天性血友病であり；
該ＥｎｄｏＳポリペプチドが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１の１〜４０９番目までのアミノ酸配列を有し、全体として配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するそのバリアント、
又は
（ｃ）それらのいずれかの断片であって、すくなくとも配列番号１の１〜４０９番目までのアミノ酸配列を含み、その長さが９５５アミノ酸までの断片
を含む、薬剤。
【請求項２】
前記ポリペプチドが配列番号１に示す配列から成る、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記断片が、配列番号１の１〜４０９番目までのアミノ酸配列から成る請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
前記自己免疫疾患が、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、自己免疫性胃炎、自己免疫性難聴、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性副甲状腺機能低下症、自己免疫性下垂体炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ球増殖症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性多腺性内分泌不全症、ベーチェット病、類天疱瘡、心筋症、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、チャーグ・ストラウス症候群、セリアック病、クローン病、ＣＲＥＳＴ症候群、デゴス病、後天性表皮水疱症、本態性混合型クリオグロブリン血症、巨細胞性動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、突発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患、川崎病、メニエール症候群、混合性結合組織病、モーレン潰瘍、多発性硬化症、重症筋無力症、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多腺性自己免疫症候群１型（ＰＡＳ−１）、多腺性自己免疫症候群２型（ＰＡＳ−２）、多腺性自己免疫症候群３型（ＰＡＳ−３）、多発筋炎／皮膚筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー病、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、亜急性甲状腺炎、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、１型糖尿病、白班症、フォークト・小柳・原田症候群又はウェゲナー肉芽腫症である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項５】
前記自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項４に記載の薬剤。
【請求項６】
前記自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスである、請求項４に記載の薬剤。
【請求項７】
前記自己免疫疾患が突発性血小板減少性紫斑病である、請求項４に記載の薬剤。
【請求項８】
前記移植拒絶反応が同種移植片拒絶又は異種移植片拒絶である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項９】
ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態を罹患している患者から採取した血液を原材料として使用して、血液製剤をｅｘ  ｖｉｖｏで製造する方法であって、
該ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態が自己免疫疾患、移植拒絶反応、術後治療又は後天性血友病であり；
血液を請求項１〜８のいずれか一項に記載の薬剤と接触させるステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患、移植拒絶反応、術後治療及び後天性血友病などの、ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態を治療又は予防するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩｇＧは、ジスルフィド結合によって繋がれる重鎖２本及び軽鎖２本から成り、柔軟であるプロテアーゼ感受性のヒンジ領域によって分離される３個のタンパク質ドメインを形成しているヘテロテトラマーである。２個の同一のＦａｂ部は抗原に結合し、１個のＦｃ部は、補体因子Ｃ１ｑ及び白血球上のＦｃ受容体の結合及び活性化を含むエフェクター機能に関与する。
【０００３】
ポリペプチドの主鎖に加えてＦｃ部は、各重鎖でＡｓｎ−２９７に結合した保存されたグリカンを含有する。このオリゴ糖は、最深部のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に結合するコアフコースを有する複合バイアンテナ型である。これらのグリカンは、ＣＨ２ドメイン（重鎖の第２定常ドメイン）の間の境界に位置する。
【０００４】
ＥｎｄｏＳは、ヒト病原体化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）によって分泌されるエンドグリコシダーゼである。ＥｎｄｏＳは、ＩｇＧ上のアスパラギン結合グリカンを２個のコアＧｌｃＮＡｃ残基の間で特異的に加水分解する。糖タンパク質基質の変性を必要とするか又はそれにより増強される多数の関連するエンドグリコシダーゼとは対照的に、ＥｎｄｏＳは、未変性ＩｇＧだけを加水分解する。今日までにＥｎｄｏＳについて他の基質は見出されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、ＥｎｄｏＳがＩｇＧ抗体によって媒介される疾患の治療及び予防において有用であることを示している。具体的には本発明者らは、ＥｎｄｏＳがヒト血液中及びウサギｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＩｇＧを効果的に加水分解すること、ＥｎｄｏＳによるＩｇＧの脱グリコシル化がその関節炎誘発能をマウスにおいて抑制すること、並びにＥｎｄｏＳが致死性ＩｇＧ誘発性突発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）のマウスモデルにおいて保護効果を有することを示している。病原性抗体のＥｎｄｏＳ前処理は、この疾患の進行を阻止し、その酵素はまた、重症の血小板減少症及び皮下出血が進行している場合に、既に確立している疾患からマウスを救済する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明により、ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態の治療又は予防のための薬剤の製造における、ＥｎｄｏＳポリペプチド又はＥｎｄｏＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用が提供される。
【０００７】
本発明は、
ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態の治療又は予防のための方法で使用するための、ＥｎｄｏＳポリペプチド又はＥｎｄｏＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
必要とする対象において、ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態を治療する又は予防する方法であって、治療有効量のＥｎｄｏＳポリペプチド又はＥｎｄｏＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象に投与するステップを含む方法、及び
ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態を罹患している患者から採取する血液をｅｘ  ｖｉｖｏで処置する方法であって血液をＥｎｄｏＳポリペプチドと接触させるステップを含む方法
も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１Ａ．ヒトＩｇＧ１の構造モデルの図である。角括弧は、抗原結合Ｆａｂ部及びＩｇＧのＦｃエフェクター部を示す。矢印は、重鎖のＡｓｎ−２９７に結合した２個の保存グリカンを示す。図１Ｂ．完全に置換されたＩｇＧ重鎖グリカンを模式的に表す図である。Ｓ２は、完全にシアル化されたグリコフォームを示し、Ｇ０及び角括弧は、Ｇ０グリコフォームの範囲を示す。ＬＣＡは、レクチン実験において使用されるレンズマメ（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）アグルチニンの結合部位を示し、ＥｎｄｏＳは、酵素の切断部位を示す。
【図２】様々な化膿レンサ球菌血清型、Ｓ．エクイ（Ｓ．ｅｑｕｉ）及びＳ．ズーエピデミカス（Ｓ．ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）由来ＥｎｄｏＳ相同体のＣｌｕｓｔａｌＷアミノ酸配列アラインメントの図である。株名、種、及びＭ血清型を左に示す。アミノ酸同一性及び類似性は灰色で示し、共通配列はアラインメントの下に示されている。保存されたキチナーゼモチーフは囲み、活性に必須のグルタミン酸にはアラインメントの下に星印を付けている。
【図３】ＥｎｄｏＳ  α−ドメインとエリザベスキンギア・メニンゴセプチカ（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃａ）由来ＥｎｄｏＦ２及びヒツジ偽結核菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来ＣＰ４０とのＣｌｕｓｔａｌＷアミノ酸配列アラインメントの図である。タンパク質名は左に示されている。アミノ酸同一性及び類似性は灰色で示され、共通配列はアラインメントの下に示されている。保存されたキチナーゼモチーフは囲み、活性に必須のグルタミン酸にはアラインメントの下に星印を付けている。
【図４】ＥｎｄｏＳのドメイン構成を示す図である。全長ＥｎｄｏＳの９９５アミノ酸（配列番号２）の模式的表示。Ｓｓは、シグナルペプチドを表し、α−ドメイン中のキチナーゼファミリー１８活性部位モチーフを表示し、２個のドメインを生成するＳｅｐＢ切断部位を矢印で示す。
【図５】ヒト血液中でのＥｎｄｏＳ活性の分析を示す図及びグラフである。図５Ａは、濃度を上昇させた組換えＥｎｄｏＳ（ｒＥｎｄｏＳ）とインキュベートしたヒト血液由来の精製ＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図５Ｂは、濃度を上昇させたｒＥｎｄｏＳとインキュベートしたヒト全血液由来の精製ＩｇＧのＬＣＡレクチンブロット分析を示す。図５Ｃは、濃度を上昇させたｒＥｎｄｏＳとインキュベートしたヒト血液から精製したＩｇＧのレクチンブロットの濃度測定分析を示す。
【図６】ウサギにおけるＥｎｄｏＳのｉｎ  ｖｉｖｏ活性の分析を示す図である。図６Ａは、ｒＥｎｄｏＳ  ５００μｇの１回目静脈内注射後の表示時点にウサギから採取した血清試料由来の精製ＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（染色）及びレクチンブロット分析（ＬＣＡブロット）を示す。図６Ｂは、ｒＥｎｄｏＳの２回目投与後の表示時点にウサギから採取した血清試料由来の精製ＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（染色）及びレクチンブロット分析（ＬＣＡブロット）を示す。図６Ｃは、ｒＥｎｄｏＳの３回目投与後の表示時点にウサギから採取した血清試料由来の精製ＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（染色）及びレクチンブロット分析（ＬＣＡブロット）を示す。
【図７】図７Ａ．ｒＥｎｄｏＳへのウサギの抗体応答を示す図である。血清試料は、ｒＥｎｄｏＳの１回目、２回目及び３回目の注射後の表示時点にウサギから採取した。血清は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した精製ｒＥｎｄｏＳでの個々の膜片でのウエスタンブロットにおいて一次抗血清として使用した。図７Ｂ．ｒＥｎｄｏＳへのウサギの抗体応答を示すグラフ及び図である。血清試料は、図７Ａにおいてと同様である。挿入図：１回目注射後の血清試料を一次抗血清として使用する、図７Ａにおいてと同様のウエスタンブロット。主図：１回目、２回目及び３回目の注射後の血清試料を固定化ＥｎｄｏＳでのＥＬＩＳＡ実験における一次抗血清として使用した。１回目注射の前の濃度と比較して抗ＥｎｄｏＳ  ＩｇＧの濃度（ｎｇ／ｍｌ）の増大が示されている。１つの代表的実験が示されている。
【図８】ＥｎｄｏＳと共に、及びＥｎｄｏＳ無しでインキュベートし、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したＩｇＧモノクローナル抗体（ＣＩＩＣ１及びＭ２１３９）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（染色）及びレクチンブロット分析（Ｂｌｏｔ）を示す図である。ゲルは、クーマシーブルー染色（染色）によって、又はＧＮＬレクチン（Ｂｌｏｔ）で探索される膜にブロットすることによって分析された。ＣＩＩＣ１（ＩｇＧ２ａ）モノクローナル抗体はＥｎｄｏＳ（レーン１）と共に、及びＥｎｄｏＳ無しで（レーン２）インキュベートし；Ｍ２１３９（ＩｇＧ２ｂ）モノクローナル抗体はＥｎｄｏＳと共に（レーン３）、及びＥｎｄｏＳ無しで（レーン４）インキュベートした。
【図９】正常の及びＥｎｄｏＳ処理のＣＩＩ結合抗体：（ａ）Ｍ２１３９、（ｂ）Ｍ２１３９Ｄ、（ｃ）ＣＩＩＣ１、（ｄ）ＣＩＩＣ１Ｄ及び（ｅ）対照、で処置したラット由来の染色した関節切片（１０μｍ）を示す図である。拡大率は、×１０である。ＥｎｄｏＳを使用して脱グリコシル化した抗体を「Ｄ」と示す。１〜２日齢の新生ラットにＣＩＩ結合抗体（正常及びＥｎｄｏＳ処理の両方）１ｍｇをｉ．ｐ．注射した。抗体移植の２４時間後、足を切断し、イソペンタン及びドライアイスを使用してＯＣＴ化合物中にただちに凍結した。免疫組織化学的分析を、標準的手順を使用する検出系としてビオチン化抗マウスカッパ（１８７．１）抗体及びＨＲＰ複合２次抗体を使用して実施した。
【図１０】未処理又はＥｎｄｏＳ処理の抗ＣＩＩモノクローナル抗体を投与されたマウスにおける関節炎の発症率（ａ）及び重症度（ｂ）を示すグラフである。（ＢＡＬＢ／ｃ  Ｘ  Ｂ１０．Ｑ）Ｆ１マウス、オスの群に未処理（ｎ＝７）又はＥｎｄｏＳ処理（ｎ＝５）のいずれかの抗ＣＩＩモノクローナル抗体（Ｍ２１３９及びＣＩＩＣ１）９ｍｇを０日目に注射した。５日目に全てのマウスに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳ  ５０μｇをｉ．ｐ．注射した。全てのマウスを算定に含めた。エラーバーは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１１】未処理又はＥｎｄｏＳ処理の抗ＣＩＩモノクローナル抗体を投与されたマウスにおける関節炎の発症率（ａ）及び重症度（ｂ）を示すグラフである。Ｂ１０．ＲＩＩＩマウス、オスに未処理（ｎ＝１１）又はＥｎｄｏＳ処理（ｎ＝１２）のいずれかの抗ＣＩＩモノクローナル抗体（Ｍ２１３９及びＣＩＩＣ１）９ｍｇを０日目に注射した。５日目に全てのマウスに大腸菌ＬＰＳ  ５０μｇをｉ．ｐ．注射した。全てのマウスを算定に含めた。エラーバーは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１２】（ａ）様々な濃度の正常（ＢＡＬＢ／ｃ  ｘ  Ｂ１０．Ｑ）Ｆ１血清を使用するＣＩＩコート抗体結合プレート；及び（ｂ）０．２５％の正常（ＢＡＬＢ／ｃ  ｘ  Ｂ１０．Ｑ）Ｆ１血清で抗体を直接コートしたプレート：上の補体成分Ｃ１ｑの沈着を示すグラフである。エラーバーは、±ＳＤを示す。
【図１３】（ａ）様々な濃度の正常（ＢＡＬＢ／ｃ  ｘ  Ｂ１０．Ｑ）Ｆ１血清を使用するＣＩＩコート抗体結合プレート；及び（ｂ）０．１２５％の正常（ＢＡＬＢ／ｃ  ｘ  Ｂ１０．Ｑ）Ｆ１血清で抗体を直接コートしたプレート：上の補体成分Ｃ３ｂの沈着を示すグラフである。エラーバーは、±ＳＤを示す。
【図１４】好中球（ＰＭＮＬ）酸化バーストにおけるモノクローナル抗体の脱グリコシル化の効果を示すグラフである。正常（Ｍ２１３９又はＣＩＩＣ１）又は脱グリコシル化（Ｍ２１３９−Ｄ又はＣＩＩＣ１−Ｄ）モノクローナル抗体をカルボキシル化ポリスチレン微小粒子（１μｍ）にコートした。ヘパリン処理全血試料由来のＰＭＮＬの酸化バースト能は、それらを抗体コートビーズとインキュベートした後にＦＡＣＳを使用して決定した。結果は、各群のマウス５匹からの平均値である。３種の異なる遺伝子型を有するＢ１０．Ｑマウス（ＦｃｇＲ＋／＋、ＦｃｇＲ−／−及びＦｃｇＲ＋／−）を使用した。「培地」及び「ビーズ」群は、２種の異なる陰性対照群を構成する。ＰＭＡ群は、陽性対照であった。ＰＭＮＬは、ＲＢ６−ＡＰＣ複合物を使用して同定した。
【図１５】モノクローナル抗体混合物（Ｍ２１３９及びＣＩＩＣ１又はＭ２１３９Ｄ及びＣＩＩＣ１Ｄ）９ｍｇをｉ．ｖ．移植されたＢ１０．ＲＩＩＩマウス（１日目及び５日目）の血清中のＥＬＩＳＡで測定された抗ＣＩＩ抗体のレベルを示すグラフである。平均ユーロピウム蛍光単位は、マルチラベルカウンター（ＶＩＣＴＯＲ  １４２０、Ｗａｌｌａｃ）を使用して測定した。
【図１６】病原性ＩｇＧ抗体のＥｎｄｏＳ前処理が、マウスで抗体媒介性血小板減少症を阻止することを示すグラフである。パネルＡ：ＢＡＬＢ／ｃマウス、メス（ｎ＝３）はウサギ抗マウス血小板ＩｇＧ（αＰＬＴ−ＩｇＧ）を腹腔内注射された。血液試料は定期的に採取され、血小板数はフローサイトメトリーを使用して決定された。パネルＢ：ＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ（ｎ＝４）又はＧＳＴ（ｎ＝４）で前処理したαＰＬＴ−ＩｇＧを注射されたＢＡＬＢ／ｃマウスの生存プロット。パネルＣ：ＧＳＴ−ＥｎｄｏＳで前処理したαＰＬＴ−ＩｇＧを投与されたマウス由来の血液試料についてのフローサイトメトリーによって決定した経時的血小板数。
【図１７】ＥｎｄｏＳが致死性ＩｇＧ媒介性血小板減少症からマウスを救済することを示すグラフである。パネルＡ：αＰＬＴ−ＩｇＧを注射され、αＰＬＴ−ＩｇＧ投与の３時間後にＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ（ｎ＝８）又はＧＳＴ（ｎ＝８）での処置が続いたＢＡＬＢ／ｃマウスの生存プロット。パネルＢ：αＰＬＴ−ＩｇＧの注射後２４、４８又は７２（ＧＳＴ−ＥｎｄｏＳのみ）時間後のＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ又はＧＳＴ−処置マウスから精製されたＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（染色）及びＬＣＡレクチンブロット分析（ＬＣＡブロット）。パネルＣ：血液試料は定期的に採取され、血小板数はＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ処置を受けたマウスにおいてフローサイトメトリーを使用して決定された。パネルＤ：αＰＬＴ−ＩｇＧを注射され、腹腔内出血の明確な徴候の発現時（αＰＬＴ−ＩｇＧ投与の５〜７時間後）にＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ（ｎ＝７）又はＧＳＴ（ｎ＝７）での処置が続いたＢＡＬＢ／ｃマウスの生存プロット。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
配列の簡単な説明
配列番号１は、化膿レンサ球菌ＡＰ１から単離されたＥｎｄｏＳのアミノ酸配列である。
【００１０】
配列番号２は、シグナル配列を含む、化膿レンサ球菌ＡＰ１から単離されたＥｎｄｏＳのアミノ酸配列である。
【００１１】
配列番号３は、シグナル配列を含む、化膿レンサ球菌ＡＰ１から単離されたＥｎｄｏＳをコードする核酸配列である。
【００１２】
本発明は、ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態を治療する又は予防するための方法であって、ＥｎｄｏＳポリペプチド又はＥｎｄｏＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１３】
本発明者らは、ＥｎｄｏＳがヒト血液中及びウサギｉｎ  ｖｉｖｏでＩｇＧを加水分解すること、マウスにおいてＥｎｄｏＳによるＩｇＧの脱グリコシル化がその関節炎誘発能を抑制すること、並びにＥｎｄｏＳが致死性ＩｇＧ誘発性突発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）のマウスモデルにおいて保護効果を有することを見出している。病原性抗体のＥｎｄｏＳ前処理は、この疾患の進行を阻止し、本酵素は、重症の血小板減少症及び皮下出血が進行している場合に、既に確立している疾患からマウスを救済もする。したがって、ＥｎｄｏＳは、ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態を治療又は予防するために使用され得る。
【００１４】
ポリペプチド
ＥｎｄｏＳポリペプチドは、好ましくは化膿レンサ球菌ＥｎｄｏＳ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を保持している化膿レンサ球菌ＥｎｄｏＳのバリアント若しくは断片である。バリアントは、他の細菌など他の生物由来のＥｎｄｏＳポリペプチドでもあり得る。細菌は、好ましくはストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）又は、好ましくは化膿性レンサ球菌などであるレンサ球菌である。別法として、バリアントは、ヒツジ偽結核菌、例えばＣＰ４０タンパク質；エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、例えばＥｎｄｏＥタンパク質；又は、エリザベスキンギア・メニンゴセプチカ（以前はフラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ））、例えばＥｎｄｏＦ２タンパク質、由来であり得る。様々な化膿レンサ球菌血清型由来並びにＳ．エクイ及びＳ．ズーエピデミカス由来のＥｎｄｏＳバリアントの配列を図２に示す。図３は、ＥｎｄｏＳのα−ドメインとエリザベスキンギア・メニンゴセプチカ由来ＥｎｄｏＦ２及びヒツジ偽結核菌由来ＣＰ４０とのアラインメントを示す。
【００１５】
ＥｎｄｏＳポリペプチドは、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも５０％の同一性を有し、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するそのバリアント、又は
（ｃ）ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するそれらのいずれかの断片
を含み得る。
【００１６】
好ましくは、ポリペプチドは、配列番号１の配列を含むか、又は配列番号１の配列から成る。配列番号１は、シグナル配列が無いＥｎｄｏＳの成熟型の配列であり、配列番号２のアミノ酸３７から９９５に相当する。
【００１７】
ポリペプチドは、追加的にシグナル配列を含み得る。したがって、ＥｎｄｏＳポリペプチドは、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも５０％の同一性を有し、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するそのバリアント、又は
（ｃ）ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するそれらのいずれかの断片
を含み得る。
【００１８】
ＥｎｄｏＳポリペプチドは、配列番号２に示す配列から成ることができる。
【００１９】
バリアントポリペプチドは、アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号２におけるそれから変化しているが、しかし、ＥｎｄｏＳと同じ必須の特徴又は基本的機能を保持しているものである。したがって、バリアントポリペプチドは、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を示し得る。典型的には、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列と約５０％、５５％又は６５％を超える同一性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％及び特に好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドがタンパク質のバリアントと見なされる。その様なバリアントは、対立バリアント及び、ペプチドがＥｎｄｏＳの基本的機能を維持している限り、タンパク質配列内の単一のアミノ酸又はアミノ酸群の欠失、改変又は付加を含み得る。配列番号１又は配列番号２のバリアントの同一性は、配列番号１若しくは配列番号２に示す配列の、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０、少なくとも９００、少なくとも９５０、少なくとも９５５の若しくはより連続的なアミノ酸の領域にわたって、又はより好ましくは配列番号１若しくは配列番号２の全長にわたって測定され得る。
【００２０】
アミノ酸の同一性は任意の適切なアルゴリズムを使用して算出できる。例えばＵＷＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅは、相同性を算出するために使用できる（例えばその初期設定で使用される）ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，３８７〜３９５）。ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０〜３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆら（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３〜１０に記載されている様に、（典型的には初期設定で）（見分ける必要のある、もしくは対応する配列のような）塩基配列の相同性を計算したり、配列を整列するために使用出来る。
【００２１】
ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインされた場合に、ある正の値の閾値スコアＴに一致するか又はそれを満たす検索配列中の長さＷの短いワードを同定することによって高スコア配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することに関与している。Ｔは文字列スコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）。これらの初期文字列ヒットは、それらを含むＨＳＰを見出すための検索を開始するための種子として働く。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大できる限り、各配列に沿って両方向に伸長される。各方向へのワードヒットの伸長は：累積アラインメントスコアが、その最大達成値より数量Ｘだけ低下する；１つ又は複数の負のスコアである残基のアラインメントの蓄積によって、累積スコアがゼロ以下になる；又は、いずれかの配列の末端に達する、場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、初期設定としてワード長（Ｗ）は１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５〜１０９１９を参照されたい）アラインメント（Ｂ）は５０、期待値（Ｅ）は１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４及び両鎖の比較を使用する。
【００２２】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間での類似性の統計的分析を実施する、例えばＫａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの基準は、２つのポリヌクレオチド又はアミノ酸の配列の間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、第１の配列と第２の配列との比較において最小合計確率が約１より少ない、好ましくは約０．１より少ない、より好ましくは約０．０１より少ない及び最も好ましくは約０．００１より少ない場合に、ある配列は他の配列と類似であると見なされる。
【００２３】
バリアント配列は、典型的には少なくとも１、２、３、５、１０、２０、３０、５０、１００又はそれ以上の変異（アミノ酸の置換、欠失又は挿入であり得る）で異なる。例えば、１から１００、２から５０、３から３０又は５から２０アミノ酸の置換、欠失又は挿入が作製され得る。改変ポリペプチドは、一般にＩｇＧ特異的エンドグリコシダーゼとしての活性を保持する。置換は、好ましくは、例えば以下の表による、保存的置換である。第２列の同じブロック、好ましくは第３列の同じ行のアミノ酸は、互いに置換され得る。
【表１】
0005414532.tif 000002
【００２４】
配列番号１のアミノ酸配列のバリアントは、好ましくは、配列番号１の１９１から１９９残基、すなわち配列番号１のＬｅｕ−１９１、Ａｓｐ−１９２、Ｇｌｙ−１９３、Ｌｅｕ−１９４、Ａｓｐ−１９５、Ｖａｌ−１９６、Ａｓｐ−１９７、Ｖａｌ−１９８及びＧｌｕ−１９９（配列番号２の２２７から２３５残基、すなわち配列番号２のＬｅｕ−２２７、Ａｓｐ−２２８、Ｇｌｙ−２２９、Ｌｅｕ−２３０、Ａｓｐ−２３１、Ｖａｌ−２３２、Ａｓｐ−２３３、Ｖａｌ−２３４及びＧｌｕ−２３５に相当する）を含む。これらのアミノ酸は、完全なキチナーゼファミリー１８活性部位を構成し、グルタミン酸で終わっている。キチナーゼの活性部位のグルタミン酸は、酵素活性のために必須である。したがって最も好ましくは、配列番号１のバリアントは、配列番号１のＧｌｕ−１９９を含み、配列番号２のバリアントは配列番号２のＧｌｕ−２３５を含む。配列番号１のバリアントは、バリアントが配列番号１のＧｌｕ−１９９を含むという条件で、１つ又は複数の保存的置換を有する配列番号１の１９１から１９９残基を含むことができる。別法として、配列番号２のバリアントは、バリアントが配列番号２のＧｌｕ−２３５を含むという条件で、１つ又は複数の保存的置換を有する配列番号２の２２７から２３５残基を含むことができる。
【００２５】
本発明で使用されるＥｎｄｏＳポリペプチドの断片は、典型的には、ＥｎｄｏＳのＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を保持する限り、少なくとも１０、例えば少なくとも２０、３０、４０、５０又はそれを超える長さのアミノ酸、１００、２００、２５０、３００、５００、７５０、８００、８５０、９００、９５０又は９５５までの長さのアミノ酸である。好ましくは、本発明で使用されるＥｎｄｏＳポリペプチドの断片は、配列番号１の１９１から１９９残基、すなわち配列番号１のＬｅｕ−１９１、Ａｓｐ−１９２、Ｇｌｙ−１９３、Ｌｅｕ−１９４、Ａｓｐ−１９５、Ｖａｌ−１９６、Ａｓｐ−１９７、Ｖａｌ−１９８及びＧｌｕ−１９９（配列番号２の２２７から２３５残基、すなわち配列番号２のＬｅｕ−２２７、Ａｓｐ−２２８、Ｇｌｙ−２２９、Ｌｅｕ−２３０、Ａｓｐ−２３１、Ｖａｌ−２３２、Ａｓｐ−２３３、Ｖａｌ−２３４及びＧｌｕ−２３５）を包含する。配列番号２の好ましい断片は、シグナルペプチドの除去後に化膿レンサ球菌から分泌されるＥｎｄｏＳの形態に相当する、配列番号２のアミノ酸３７から９９５、すなわち配列番号１から成る。本発明の他の好ましい断片は、配列番号１のアミノ酸１から４０９（配列番号２のアミノ酸３７から４４５）から成り、レンサ球菌システインプロテイナーゼＳｐｅＢによる切断によって生成されるＥｎｄｏＳの酵素的に活性なα−ドメインに相当する。
【００２６】
本発明において使用されるポリペプチドは、化学的に修飾、例えば翻訳後に修飾されても良い。例えばそれらは、グリコシル化され得る、リン酸化され得る又は修飾されたアミノ酸残基を含み得る。それらは、その精製を助けるためのヒスチジン残基の付加によって、又は細胞膜への挿入を促進するためのシグナル配列の付加によって改変され得る。その様な改変ポリペプチドは、本明細書において使用する用語「ポリペプチド」の範囲に含まれる。
【００２７】
典型的には、本発明における使用のためのポリペプチドは、免疫グロブリンエンドグリコシダーゼ活性、具体的にはＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を示す。好ましくは、ポリペプチドは、ＩｇＧのアスパラギン結合グリカンのβ−１，４−ジ−Ｎ−アセチルキトビオースコアを加水分解する。好ましくは、活性はＩｇＧに特異的である。エンドグリコシダーゼ活性は、適切なアッセイによって決定され得る。例えば、検査ポリペプチドは、３７℃などの適切な温度でＩｇＧとインキュベートされ得る。出発物質及び反応産物は、次いでＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析され得る。典型的には、検査ポリペプチドがＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有する場合、ＩｇＧ重鎖の分子質量は、約３ｋＤａ減少する。検査ポリペプチドがＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するかどうかを決定するための他のアッセイは、レンズマメアグルチニンレクチン（ＬＣＡ）を使用し、任意選択で西洋ワサビペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ基質を使用するグリコシル化ＩｇＧの検出による。典型的には、検査ポリペプチドがＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有する場合、糖質シグナルが減少する。検査ポリペプチドがＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するかどうかを決定するための他のアッセイは、検査ポリペプチドと精製ＩｇＧ  Ｆｃ断片とのインキュベーションに続く１０ｍＭ  ジチオスレイトールでの試料の還元及び質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）での分析による。典型的には、検査ポリペプチドがＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有する場合、単量体ＩｇＧ  Ｆｃの質量は、１４１７±１４Ｄａだけ減少する。
【００２８】
ポリペプチドのエンドグリコシダーゼ活性は、阻害研究によってさらに特徴付けられ得る。
【００２９】
ポリペプチドのエンドグリコシダーゼ活性は、一般にＩｇＧ特異的であり、ポリペプチドは、ＩｇＧの切断を可能にする条件下で他のクラスのＩｇすなわちＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥとインキュベートされる場合に、これらの免疫グロブリンを分解しない場合がある。ＥｎｄｏＳポリペプチドは、治療される対象において存在するＩｇＧ分子を加水分解することができる。したがって、対象がヒトである場合、ＥｎｄｏＳポリペプチドは、ヒトＩｇＧを加水分解することができる。ＥｎｄｏＳは、４つ全てのサブクラスのヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１−４）を加水分解できる。好ましい実施形態において、ＥｎｄｏＳポリペプチドは、ヒト、アカゲザル、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、イヌ及びブタＩｇＧを加水分解する能力を有する。
【００３０】
本発明における使用のためのポリペプチドは、実質的に単離された形態であり得る。ポリペプチドは、ポリペプチドの使用目的に干渉しない担体又は希釈剤と混合することができ、且つそれでも実質的に単離されていると見なされ得ることは、理解される。本発明における使用のためのポリペプチドは、実質的に精製された形態でもあり得、一般に、調製物中のポリペプチドの重量で、５０％を超えて、例えば８０％、９０％、９５％又は９９％を超えて調製物中にポリペプチドを含む場合が、本発明のポリペプチドである。
【００３１】
本発明における使用のためのポリペプチドは、ＥｎｄｏＳポリペプチド又はＥｎｄｏＳポリペプチドのバリアントを発現する任意の適切な生物から単離され得る。典型的にはＥｎｄｏＳポリペプチドは、ＥｎｄｏＳを発現するレンサ球菌の適切な株、好ましくは化膿レンサ球菌の株から単離される。適切な生物及び株は、多くの技術によって同定され得る。例えば化膿レンサ球菌株は、最初にｎｄｏＳ遺伝子の存在について検査され得る。ポリヌクレオチドプライマー又はプローブは、例えば配列番号１、２又は３に基づいて設計され得る。次いでｎｄｏＳ遺伝子の存在は、その様なプライマーを使用するＰＣＲによって、又は化膿レンサ球菌株のゲノムＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションによって確認できる。
【００３２】
活性ＥｎｄｏＳ又はそのバリアントを発現しているレンサ球菌株は、培養上清中のＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性についてアッセイすることによって又はＥｎｄｏＳに対する抗体を使用する免疫検出によって同定され得る。活性ＥｎｄｏＳを発現していると確認されているレンサ球菌株は、化膿レンサ球菌Ｍ１血清型ＡＰ１及びＳＦ３７０株、Ｓ．エクイ４０４７株及びＳ．ズーエピデミカスＨ７０株である。追加的にｎｄｏＳ遺伝子は以下の化膿レンサ球菌株において見出される：Ｍ１血清型ＳＳＩ−１及びＭＧＡＳ５００５株、Ｍ２血清型ＭＧＡＳ１０２７０株、Ｍ３血清型ＭＧＡＳ３１５株、Ｍ４血清型ＭＧＡＳ１０７５０株、Ｍ５血清型Ｍａｎｆｒｅｄｏ株、Ｍ６血清型ＭＧＡＳ１０３９４株、Ｍ１２血清型ＭＧＡＳ９４２９株、Ｍ１８血清型ＭＧＡＳ８２３２株、Ｍ２８血清型ＭＧＡＳ６１８０株及びＭ４９血清型５９１株。
【００３３】
発現している化膿レンサ球菌培養物から又はＥｎｄｏＳを発現している他の細胞の培養物からのＥｎｄｏＳの単離及び精製は、典型的にはＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性に基づく。好ましくは精製方法は、硫酸アンモニウム沈澱ステップ及びイオン交換クロマトグラフィーステップを含む。１つの方法において培養培地は、硫酸アンモニウムの量を増やしながら加えることによって分画される。硫酸アンモニウムの量は、１０から８０％であり得る。好ましくは培養培地は、５０％硫酸アンモニウムで分画され、得られた上清をさらに７０％硫酸アンモニウムで沈澱させる。次いでペレット状のポリペプチドは、例えばＭｏｎｏ  ＱカラムでのＦＰＬＣによって、イオン交換クロマトグラフィーに供され得る。溶出画分をＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性についてアッセイすることができ、ピーク活性画分をプールすることができる。画分は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析することができる。画分は、−８０℃で保存することができる。ＥｎｄｏＳを精製するための別法において、シグナルペプチドを有さない（すなわち配列番号１の配列を有する）ＥｎｄｏＳは大腸菌でＧＳＴ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）を使用して発現される。ｎｄｏＳ配列の３０４から３２３２塩基にわたる２９２９塩基対のＰＣＲ産物は化膿レンサ球菌ゲノムＤＮＡから、ＢａｍＨＩ部位（下線）を有するプライマー５’−ＡＣＴ−ＧＧＧ−ＡＴＣ−ＣＣＧ−ＧＡＧ−ＧＡＧ−ＡＡＧ−ＡＣＴ−３’及びＸｈｏＩ部位（下線）を有する５’−ＴＴＡ−ＡＴＣ−ＴＣＧ−ＡＧＧ−ＴＴＧ−ＣＴＡ−ＴＣＴ−ＡＡＧ−３’を使用して増幅される。断片は、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化され、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３に連結され、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓを形質転換するために使用されるプラスミドｐＧＥＸｎｄｏＳを生成する。ｐＧＥＸｎｄｏＳ／ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓは、０．１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドで誘導される。誘導後、細菌は、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して溶菌され、ＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ融合タンパク質は、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）で精製される。ＧＳＴタグは、手順書（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に従って第Ｘａ因子を使用して除去され、残存第Ｘａ因子は、Ｘａｒｒｅｓｔ（商標）−アガロース（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して除去される。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥｎｄｏＳ特異的抗体を使用するウエスタンブロットによって均一であると評価される組換えＥｎｄｏＳ（ｒＥｎｄｏＳ）の調製物をもたらす。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験の前に、タンパク質試料は０．２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して滅菌ろ過される。精製されたＥｎｄｏＳタンパク質は、−８０℃で、リン酸緩衝食塩水中に保存される。
【００３４】
本発明における使用のためのポリペプチドは、その様に単離されたポリペプチドの断片として調製され得る。さらに、ＥｎｄｏＳポリペプチドは、合成的に又は組換え手段によっても作製され得る。例えば、組換えＥｎｄｏＳポリペプチドは、適切な調節配列に作動的に連結された、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで培養中の哺乳類細胞をトランスフェクトするステップ、細胞を培養するステップ、細胞によって生成されたＥｎｄｏＳポリペプチドを抽出及び精製するステップによって生成され得る。
【００３５】
本発明における使用のためのポリペプチドのアミノ酸配列は、非天然アミノ酸を含むように又は化合物の安定性を増大させるために改変され得る。ポリペプチドが合成手段によって生成される場合、その様なアミノ酸は生成中に導入され得る。ポリペプチドは、合成又は組換え生成のいずれに続いても改変され得る。
【００３６】
本発明における使用のためのポリペプチドは、Ｄ−アミノ酸を使用しても生成され得る。その様な場合アミノ酸は、ＣからＮへの方向で逆向き配列で結合される。これは、その様なポリペプチドを生成する当技術分野において慣用である。
【００３７】
多数の側鎖修飾が当技術分野において既知であり、ポリペプチドがＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を保持することを条件として、ＥｎｄｏＳポリペプチドの側鎖にもなされ得る。
【００３８】
ポリヌクレオチド
ＥｎｄｏＳポリペプチド又はバリアントをコードするポリヌクレオチドは、病原性ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態を治療又は予防するために使用され得る。具体的にはポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号３のコード配列、（ｂ）（ａ）で定義された配列に対して遺伝暗号の結果として縮重している配列、（ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）で定義された配列に少なくとも６０％の同一性を有し、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列、又は（ｄ）ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、（ａ）、（ｂ）若しくは（ｃ）で定義された配列のいずれか１つの断片を含み得るか又はそれから成る。
【００３９】
典型的には、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。しかし、ポリヌクレオチドはＲＮＡポリヌクレオチドでもあり得る。ポリヌクレオチドは、１本鎖又は２本鎖であり得、且つその中に合成又は修飾ヌクレオチドを含み得る。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドは、典型的には配列番号３のコード配列又はコード配列の相補体に、バックグラウンドを顕著に超えるレベルでハイブリダイズできる。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えばＤＮＡライブラリー中に存在する他のＤＮＡによって生じ得る。本発明のポリヌクレオチドと配列番号３のコード配列又はコード配列の相補体との間の相互作用によって生じるシグナルレベルは、典型的には他のポリヌクレオチドと配列番号３のコード配列との間の相互作用の少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍強い。相互作用の強さは、例えばプローブを放射線標識すること（例えば３２Ｐで）によって測定され得る。選択的ハイブリダイゼーションは、典型的には中程度から高いストリンジェンシーの条件を使用して達成され得る。しかし、その様なハイブリダイゼーションは、当技術分野において既知の任意の適切な条件下で実施され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒｅｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８９を参照されたい）。例えば高いストリンジェンシーが必要な場合、適切な条件は、６０℃から６５℃までの０．１から０．２×ＳＳＣを含む。低いストリンジェンシーが必要な場合、適切な条件は、６０℃での２×ＳＳＣを含む。
【００４１】
配列番号３のコード配列は、例えば１、２又は３から１０、２５、５０、１００、２００、５００又は７５０個の置換である、ヌクレオチド置換によって改変され得る。配列番号３のポリヌクレオチドは、１つ又は複数の挿入及び／若しくは欠失によって並びに／又はいずれか若しくは両方の末端の伸長によって、代替的に又は追加的に改変され得る。シグナル配列などの追加的配列も含まれ得る。改変ポリヌクレオチドは、一般にＩｇＧ特異的エンドグリコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。縮重置換を行うことができ、且つ／又は例えば上記の表に示す通り、改変配列が翻訳された場合に保存的アミノ酸置換を生じる置換を行うことができる。
【００４２】
配列番号３のＤＮＡコード配列の相補体に選択的にハイブリダイズできるヌクレオチド配列は、一般に少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を配列番号３のコード配列に対して、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、例えば少なくとも４０、少なくとも６０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、より好ましくは少なくとも７５０の連続したヌクレオチドの領域にわたって、又は最も好ましくは配列番号３の全長若しくは配列番号１若しくは２に示す配列を有するポリペプチドをコードする配列番号３の長さにわたって有する。配列同一性は、例えば上に記載の、任意の適切な方法によって決定され得る。
【００４３】
配列同一性の上記で挙げた程度と最小長との任意の組合せは、本発明のポリヌクレオチドを定義するために使用することができ、よりストリンジェントな組合せ（すなわちより長い長さにわたるより高い配列同一性）が好ましい。したがって、例えば、６０ヌクレオチドにわたる、好ましくは１００ヌクレオチドにわたる少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドは、５００ヌクレオチドにわたる少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドと同様に本発明の一態様を形成する。
【００４４】
ポリヌクレオチド断片は、長さが好ましくは少なくとも２０、例えば少なくとも２５、少なくとも３０又は少なくとも５０ヌクレオチドである。それらは、典型的には長さで、１００、１５０、２５０又は５００ヌクレオチドまでである。断片は、長さで５００ヌクレオチドより長くても良く、例えば長さで６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００又は３０００ヌクレオチドまでであって良く、又は最大で配列番号３のコード配列より、５、１０若しくは１５ヌクレオチドなど数ヌクレオチド短くても良い。
【００４５】
本発明における使用のためのポリヌクレオチドは、組換え的、合成的又は当業者に使用可能な任意の手段によって生成され得る。それらは、標準的技術によってクローン化され得る。ポリヌクレオチドは、典型的には単離された及び／又は精製された形態で提供される。
【００４６】
一般に、短いポリヌクレオチドは、一度に１つのヌクレオチドの目的核酸配列の段階的製造を含む合成的手段によって生成される。自動化技術を使用するこれに付随する技術は、当技術分野において容易に利用可能である。
【００４７】
より長いポリヌクレオチドは、一般に例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を使用する組換え手段を使用して生成される。これは、クローン化しようとするｎｄｏＳ遺伝子の領域への一対のプライマー（例えば約１５〜３０ヌクレオチド）を作製するステップ、プライマーを細菌細胞から得たＤＮＡと接触させるステップ、目的領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実施するステップ、増幅された断片を（例えばアガロースゲルで反応混合物を精製するステップによって）単離するステップ及び増幅されたＤＮＡを回収するステップを含む。プライマーは、増幅されたＤＮＡが適切なクローニングベクターにクローン化され得るように、適切な制限酵素認識部位を含有するように設計され得る。
【００４８】
その様な技術は、本明細書に記載のｎｄｏＳ遺伝子配列の全て又は一部を得るために使用され得る。一般に、本明細書において述べる技術は、当技術分野において十分に周知であり、具体的にはＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）は参照され得る。
【００４９】
本明細書に記載のＥｎｄｏＳポリヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏにおいて実施され得る、本発明における使用のためのポリペプチドの生成において有用性を有する。ポリヌクレオチドは、それ自体で治療薬として使用することができ、又は組換えタンパク質合成に関与し得る。
【００５０】
本発明における使用のためのポリヌクレオチドは、典型的には複製可能な組換えベクターに組み込まれる。ベクターは、適合可能な宿主細胞において核酸を複製するために使用され得る。したがって、本発明における使用のためのポリヌクレオチドは、ＥｎｄｏＳポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入するステップ、ベクターを適合可能な宿主細胞に導入するステップ及びベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させるステップによって作製され得る。宿主細胞は、例えば大腸菌細胞であり得る。
【００５１】
好ましくは、ベクターは、ＥｎｄｏＳポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターである。その様な発現ベクターは、分子生物学の当技術分野において日常的に構築されており、プラスミドＤＮＡ並びに必要な場合があり、且つタンパク質の発現を実施するために正しい方向で位置付けられる、しかるべきイニシエーター、プロモーター、エンハンサー及び例えばポリアデニル化シグナルなどの他の要素の使用を例えば含み得る。他の適切なベクターは、当業者に明らかである。この点におけるさらなる例として、我々はＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）を参照する。
【００５２】
好ましくは、ベクター中の本発明における使用のためのポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現を提供できる調節配列に作動的に連結される、すなわちベクターは、発現ベクターである。用語「作動的に連結される」は、記載した構成成分が、意図される形で機能することを可能にする関係となるように並列することである。コード配列に「作動的に連結される」プロモーターなどの調節配列は、コード配列の発現が調節配列と適合する条件下で達成されるように位置付けられる。
【００５３】
例えばベクターは、複製開始点、任意選択で前記ポリヌクレオチドの発現ためのプロモーター及び任意選択でプロモーターの調節因子を備えるプラスミド、ウイルス又はファージベクターであり得る。ベクターは、典型的にはｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に適合する。
【００５４】
プロモーター及び他の発現調節シグナルは、そのために発現が設計された宿主細胞に適合可能であるように選択され得る。β−アクチンプロモーターなどの哺乳類プロモーターは、使用され得る。組織特異的プロモーターは、特に好ましい。ウイルスプロモーターも使用され得る、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス末端反復配列（ＭＭＬＶ  ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター、アデノウイルス、ＨＳＶプロモーター（ＨＳＶ  ＩＥプロモーターなど）、又はＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）。ウイルスプロモーターは、当技術分野において容易に利用可能である。
【００５５】
ベクターは、真核生物のゲノム配列に、好ましくは哺乳類のゲノム配列に相同な配列を含むポリヌクレオチドを生じる、ポリヌクレオチドに隣接する配列をさらに含み得る。これは、相同組換えによる真核生物のゲノムへの本発明のポリヌクレオチドの導入を可能にする。具体的には、ウイルス配列に隣接する発現カセットを含むプラスミドベクターは、本発明のポリヌクレオチドを哺乳類細胞に送達するために適切なウイルスベクターを調製するために使用され得る。適切なウイルスベクターの他の例として、単純ヘルペスウイルスベクター並びに、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及びＨＰＶウイルスを含むレトロウイルスが挙げられる。これらのウイルスを使用する遺伝子導入技術は、当業者に周知である。例えばレトロウイルスベクターは、ポリヌクレオチドを生じるポリヌクレオチドを宿主ゲノムに安定にインテグレートするために使用され得る。対照的に複製欠陥アデノウイルスベクターはエピソーム性に留まり、したがって一過性発現を可能にする。
【００５６】
疾患及び状態
ＥｎｄｏＳポリペプチド、又はポリヌクレオチドは、病原性ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態を治療又は予防するために使用され得る。ＩｇＧ抗体が多数の異なる疾患及び状態の病変形成に関与していることは、当技術分野において十分に周知である。本発明者らは、その様な疾患における病原性ＩｇＧ抗体の役割はＥｎｄｏＳポリペプチド又はポリヌクレオチドを使用して阻害され得ることを見出した。
【００５７】
疾患又は状態は、自己免疫疾患であり得る。その様な疾患として、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、自己免疫性胃炎、自己免疫性難聴、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性副甲状腺機能低下症、自己免疫性下垂体炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ球増殖症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性多腺性内分泌不全症、ベーチェット病、類天疱瘡、心筋症、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、チャーグ・ストラウス症候群、セリアック病、クローン病、ＣＲＥＳＴ症候群、デゴス病、後天性表皮水疱症、本態性混合型クリオグロブリン血症、巨細胞性動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、突発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患、川崎病、メニエール症候群、混合性結合組織病、モーレン潰瘍、多発性硬化症、重症筋無力症、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多腺性自己免疫症候群１型（ＰＡＳ−１）、多腺性自己免疫症候群２型（ＰＡＳ−２）、多腺性自己免疫症候群３型（ＰＡＳ−３）、多発筋炎／皮膚筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー病、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、亜急性甲状腺炎、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、１型糖尿病、白班症、フォークト・小柳・原田症候群又はウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。好ましくは、自己免疫疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリトマトーデス又は突発性血小板減少性紫斑病である。
【００５８】
疾患又は状態は喘息であり得る。喘息は急性又は慢性喘息であり得る。
【００５９】
ＩｇＧは、補体系の古典的な経路を活性化する。ＥｎｄｏＳポリペプチド及びポリヌクレオチドは、したがって補体活性化が患者に有害である疾患及び状態を治療するために使用され得る。例えばＥｎｄｏＳポリペプチド及びポリヌクレオチドは、移植に由来する障害、例えば移植拒絶反応（急性又は慢性の同種移植片拒絶又は異種移植片拒絶など）及び移植片対宿主病を治療するために使用され得る。移植に由来する障害は、患者での組織又は臓器の移植に起因して生じ得る。
【００６０】
ＥｎｄｏＳポリペプチド及びポリヌクレオチドは、術後治療において、例えば心臓バイパス手術を受けた患者の治療において、有用である。
【００６１】
さらに、ＥｎｄｏＳポリペプチド及びポリヌクレオチドは、後天性血友病の治療のために、すなわち凝固因子に対する自己抗体が生じている血友病患者においてＩｇＧを除去するために使用され得る。
【００６２】
対象は、典型的には、マウス、ラット又は霊長類（例えばマーモセット又はサル）などの哺乳類対象である。対象は、ヒトであるか又はヒト以外の動物であって良い。対象がマウス、ラット又は霊長類などの実験動物である場合、動物は、病原性ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態を誘発するために処置され得る。例えば、Ｎａｎｄａｋｕｍａｒら、（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６３（５）：１８２７〜１８３７，２００３）によって記載されたマウス抗ＣＩＩ抗体誘発関節炎（ＣＡＩＡ）モデル、又はこのモデルの修正バージョンは、使用され得る。
【００６３】
治療及び予防
本発明は、病原性ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態を治療又は予防するためのＥｎｄｏＳポリペプチド及びポリヌクレオチドの使用を提供する。処置は、治療的又は予防的であり得る。
【００６４】
ＥｎｄｏＳポリペプチド又はポリヌクレオチドは、疾患又は状態の１つ又は複数の症状の発症を予防するために個体に投与され得る。本実施形態において、対象は無徴候性であり得る。対象は、疾患に遺伝的素因を有し得る。予防有効量のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、その様な個体に投与される。予防有効量は、疾患又は状態の１つ又は複数の症状の発症を予防する量である。
【００６５】
ＥｎｄｏＳポリペプチド又はポリヌクレオチドの治療有効量は、疾患又は状態の１つ又は複数の症状を改善するために有効な量である。好ましくは、治療される個体は、ヒトである。
【００６６】
ＥｎｄｏＳポリペプチド又はポリヌクレオチドは、任意の適切な手段によって対象に投与され得る。ポリペプチド及びポリヌクレオチドは、経口、頬側、肛門、肺、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、関節内、局所又は他の適切な投与経路を介するなどの経腸的又は非経口的経路によって投与され得る。
【００６７】
ＥｎｄｏＳポリペプチド又はポリヌクレオチドは、特定の部位への治療を標的とするように対象に投与され得る。例えば、ＥｎｄｏＳポリペプチドは、移植された臓器の部位に直接投与され得る。ＥｎｄｏＳポリペプチドは、例えば関節内に又は１つ若しくは複数の関節に、局所的に注射され得る。ＥｎｄｏＳの関節への局所投与は、関節リウマチ（ＲＡ）の予防又は治療のために特に好ましい。ＥｎｄｏＳポリペプチドは、軟骨に特異的に結合する試薬と結合され得る。ＥｎｄｏＳポリヌクレオチドについては、ＥｎｄｏＳポリペプチドをコードする発現ベクターは、例えば組織特異的プロモーター又はＲＮＡｉを使用することによって、特定の組織へのＥｎｄｏＳの直接発現のために使用され得る。
【００６８】
本明細書に挙げた任意のポリペプチド及びポリヌクレオチドの処方は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの性質及び治療される状態などの要因に依存する。ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、種々の投薬形態で投与され得る。それは、経口（例えば錠剤、トローチ、ローゼンジ、水性若しくは油性懸濁剤、分散性粉剤又は顆粒）、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、経皮で又は点滴術によって投与され得る。ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、座薬としても投与され得る。医師は、個々の具体的な患者について必要な投与経路を決定できる。
【００６９】
典型的にはポリペプチド又はポリヌクレオチドは、薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に使用のために処方され、これは薬学分野における日常的方法を使用して実施され得る。薬学的担体又は希釈剤は、例えば等張液であり得る。例えば、固体経口形態は、活性化合物と共に、希釈剤（例えば乳糖、ブドウ糖、ショ糖、セルロース、コーンスターチ若しくはジャガイモデンプン）；潤滑剤（例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム若しくはステアリン酸カルシウム、及び／又はポリエチレングリコール）；結合剤（例えばデンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース若しくはポリビニルピロリドン）；脱凝集剤（例えばデンプン、アルギン酸、アルギン酸塩又はグリコールデンプンナトリウム）；発泡性混合物；染料；甘味料；レシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸などの湿潤剤；及び一般に、医薬製剤において使用される非毒性で薬学的に不活性な物質を含有できる。その様な医薬調製物は、既知の手段、例えば混合、顆粒化、錠剤化、糖衣又はフィルムコーティング工程の手段によって製造され得る。
【００７０】
経口投与用の液状分散剤は、シロップ、乳剤及び懸濁剤であり得る。シロップは、担体として例えばショ糖又は、グリセリン及び／若しくはマンニトール及び／若しくはソルビトールを伴うショ糖を含有し得る。
【００７１】
懸濁剤及び乳剤は、担体として例えば天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又はポリビニルアルコールを含有し得る。筋肉内注射のための懸濁剤又は溶液は、活性化合物と共に薬学的に許容される担体、例えば滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール類（例えばプロピレングリコール）及び所望により適切な量の塩酸リドカインを含有し得る。
【００７２】
静脈内又は点滴のための溶液は、担体として、例えば滅菌水を含有し得るか、又は好ましくはそれらは、滅菌、水性、等張食塩水の形態であり得る。
【００７３】
座薬用に、伝統的な結合剤及び担体として、例えばポリアルキレングリコール又はトリグリセリドが挙げられ得る；その様な座薬は、０．５％から１０％、好ましくは１％から２％の範囲の活性成分を含有する混合物から形成され得る。
【００７４】
経口製剤は、例えば医薬用品質のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される様な賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性製剤又は粉剤の形態であり、１０％から９５％、好ましくは２５％から７０％の活性成分を含有する。医薬組成物が凍結乾燥される場合、凍結乾燥された物質は、投与の前に再構成され得る（例えば懸濁液）。再構成は、好ましくは緩衝液中で行われる。
【００７５】
例えばＥｕｄｒａｇｉｔ「Ｓ」、Ｅｕｄｒａｇｉｔ「Ｌ」、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース又はヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む腸溶コーティングを有する、患者への経口投与のためのカプセル、錠剤及び丸剤が提供され得る。
【００７６】
無針注入、例えば経皮による送達に適する医薬組成物も使用され得る。
【００７７】
治療有効量のポリペプチド又はポリヌクレオチドを投与する。投与量は、種々のパラメーターに応じて、特に使用されるポリペプチド又はポリヌクレオチド；治療される患者の年齢、体重及び状態；投与経路；及び必要とされる投与計画に応じて決定され得る。再び、医師は、任意の具体的な患者について必要な投与経路及び投与量を決定できる。典型的な日用量は、具体的な阻害剤の活性、治療される対象の年齢、体重及び状態、疾患の型及び重症度並びに投与の頻度及び経路に応じて、体重１ｋｇ当たり約０．１から５０ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇである。好ましくは日用量レベルは、５ｍｇから２ｇである。
【００７８】
上に記載のＥｎｄｏＳヌクレオチド配列及びその様な配列を含有する発現ベクターは、上記で概略を述べた通り医薬製剤としても使用され得る。好ましくは、ＲＮＡ又はＤＮＡなどの核酸、具体的にはＤＮＡは、治療される個体の細胞で発現され得る発現ベクターの形態で提供される。ワクチンは、ヌクレオチド配列をそれだけで、又は陽イオン性脂質、ポリマー、若しくは標的化系との組合せで含み得る。ワクチンは、任意の利用可能な技術によって送達され得る。例えば、核酸は、針での注射によって、好ましくは皮内、皮下又は筋肉内に導入され得る。別法として核酸は、粒子媒介遺伝子送達などの核酸送達デバイスを使用して直接皮膚を通じて送達され得る。核酸は、皮膚に又は、例えば鼻腔内、口腔、膣内若しくは直腸内投与によって粘膜表面に局所的に投与され得る。
【００７９】
核酸構築物の取り込みは、例えばトランスフェクション剤の使用を含む、幾つかの既知のトランスフェクション技術によって促進することができる。これらの薬剤の例として、陽イオン性薬剤、例えばリン酸カルシウム及びＤＥＡＥ−デキストラン、並びにリポフェクタント、例えばリポフェクタム（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍ）及びトランスフェクタム（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）が挙げられる。投与される核酸の用量は、変更され得る。典型的には核酸は、粒子媒介遺伝子送達については核酸１ｐｇから１ｍｇ、好ましくは１ｐｇから１０μｇの範囲で、及び他の経路については１０μｇから１ｍｇの範囲で投与される。
【００８０】
本発明は、病原性ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態を罹患している患者から採取する血液をｅｘ  ｖｉｖｏで処置する方法であって、血液をＥｎｄｏＳポリペプチドと接触させるステップを含む方法も提供する。したがって、ＥｎｄｏＳは、血液の体外処置のために使用され得る。ＥｎｄｏＳは、血漿又は血清などの血液の１つ又は複数の成分を処置するために使用され得る。本明細書に記載のｅｘ  ｖｉｖｏ法は、患者の身体から既に採取されている血液について実施され得る。血液及び血液製剤は、ＥｎｄｏＳポリペプチドと接触させた後に任意選択で患者に戻すことができる。
【実施例】
【００８１】
以下の実施例は本発明を例示する：
【００８２】
（実施例１）ＥｎｄｏＳはヒト血液においてＩｇＧを効果的に加水分解する。
病原性ＩｇＧに対して治療薬として有効であるために、ＥｎｄｏＳは、ヒト全血環境における低濃度で活性である必要がある。これを調査するために、シグナル配列を有さない組換えＥｎｄｏＳ（ｒＥｎｄｏＳ）（すなわち配列番号１の配列を有する）を以前記載された通り生成及び精製した（Ｃｏｌｌｉｎ  ＆  Ｏｌｓｅｎ，２００１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：７１８７〜７１８９）。ｒＥｎｄｏＳの最終濃度を上昇させて（０、０．３１、０．６３、１．２５、２．５、５、１０及び２０μｇ／ｍｌ）、健常人由来のヘパリン処置ヒト血液５００μｌ中で、転倒回転させて３７℃、１時間インキュベートした。試料を７２０×ｇ、１０分間、４℃で遠心分離し、続いて製造者の手順書（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）に従ってプロテインＧセファロースを使用して血漿中のＩｇＧを精製した。完全にグリコシル化されたＩｇＧとＥｎｄｏＳ処理ＩｇＧの間のプロテインＧへの結合効率に差異は無かった、これは、ＩｇＧ結合タンパク質、プロテインＨ（化膿レンサ球菌由来）及びプロテインＡ（黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来）についての以前の知見と一致する（Ｃｏｌｌｉｎ  ＆  Ｏｌｓｅｎ，２００１，ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：３０４６〜３０５５）。精製したＩｇＧを、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーで染色するか又はＰＶＤＦ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）にエレクトロブロットした。グリコシル化ＩｇＧをビオチン化レンズマメアグルチニンレクチン（ＬＣＡ）５μｇ／ｍｌ及びストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）１μｌ／ｍｌ並びにＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏペルオキシダーゼ基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して検出した。膜は、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ  ＸＲＳ画像化システム及びＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ画像分析ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して分析した。
【００８３】
これらの実験は、ＥｎｄｏＳの濃度を増大させるとＩｇＧ重鎖が約３ｋＤａ小さな見かけの分子質量に徐々に移動し、ｒＥｎｄｏＳ  ２．５〜５μｇ／ｍｌ以上の濃度では完全な大きさの重鎖は、ほとんど見られなかったことを示した（図５Ａ）。同じ試料でのＬＣＡレクチンブロット実験は、ｒＥｎｄｏＳの濃度を増大させると糖質シグナルの低下が生じ、ｒＥｎｄｏＳ濃度２．５〜５μｇ／ｍｌ以上では事実上シグナルは、無いことを示した（図５Ｂ）。レクチンシグナルの欠如は、質量分析法によって分析されたＩｇＧグリカンの完全加水分解に良く対応することは、以前から示されている（Ｃｏｌｌｉｎ  ＆  Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，２００４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２２５５８〜２２５７０）。さらに、ピーク濃度分析は、ｒＥｎｄｏＳ濃度５μｇ／ｍｌ付近でバックグラウンドレベルで平らになった用量依存曲線を示している（図５Ｃ）。
【００８４】
これらの結果は、ｒＥｎｄｏＳ  ５μｇ／ｍｌ、１時間はヒト血液中のＩｇＧプールを完全に加水分解することを示す。ＩｇＧ血漿濃度を１０ｍｇ／ｍｌと仮定すると、これは、ｒＥｎｄｏＳ対ＩｇＧの比１：２０００、１時間でのＩｇＧの完全加水分解を意味する。したがって、ｒＥｎｄｏＳは、ヒト血液の様な複雑な環境において、機能的に重要なＩｇＧグリカンの著しく効果的な加水分解を示す。
【００８５】
（実施例２）ＥｎｄｏＳはウサギにおいてＩｇＧを効果的に加水分解する。
治療薬としてのＥｎｄｏＳの使用をさらに実証するために、生きた動物の循環におけるＥｎｄｏＳのＩｇＧグリカン加水分解活性を調査した。体重約３ｋｇのスウェーデンループウサギに、ｒＥｎｄｏＳが血液中だけに分布すると考えるとｒＥｎｄｏＳ対ＩｇＧの比が約１：２０００に相当する、ｒＥｎｄｏＳ  １ｍｇを静脈内注射した。動物は、疾患の徴候を示さなかった。血清試料を０、１、２、４、６、８及び１２時間で並びに１、２、３、４、５、６、８及び１０日目に採取した。血清ＩｇＧをグリコシル化状態について、ヒト血液について上に記載の通りＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びレクチンブロット分析を使用して分析した。
【００８６】
これらの実験は、注射の前には、ＩｇＧの重鎖の見かけの分子質量が、完全にグリコシル化された未処置のウサギＩｇＧと同程度であったことを示した（図６Ａ、染色、０時間、及びＩｇＧ）。対照的に、ｒＥｎｄｏＳ注射の１時間後には、約３ｋＤａ小さなタンパク質バンドへのＩｇＧ重鎖の部分的移動が既にあった。ｒＥｎｄｏＳの注射の４時間後、ＩｇＧ重鎖は、低い見かけの分子質量の形態に完全に移動し、これは、注射後１０日の最終試料まで維持された（図６Ａ、染色、４時間から１０日目）。同じ試料のレクチンブロット分析は、ＩｇＧ重鎖糖質シグナルは、ｒＥｎｄｏＳの注射の６〜８時間後にほとんど無くなっており、これが、レクチンシグナルにわずかな増大があった１０日目まで維持されたことを明らかにした（図６Ａ、ＬＣＡブロット）。
【００８７】
酵素に既にさらされたことがある動物内で、ｒＥｎｄｏＳが活性であるかを観察するために、最初の注射の３５日後にｒＥｎｄｏＳ  １ｍｇの２回目の注射を実施した。再び、動物は、注射による影響を受けていない様であり、上記の通り血清試料を採取及び分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、２回目の注射の前にＩｇＧ重鎖が完全にグリコシル化された対照のウサギＩｇＧ重鎖と同様に移動したことを明らかにした（図６Ｂ、０時間、ＩｇＧ）。１時間後にＩｇＧ重鎖は、３ｋＤａ低い見かけの分子質量に部分的に移動しており、６〜８時間後にＩｇＧ重鎖は完全に移動し、この移動はこの２回目投与に続く１０〜１４日目まで維持された（図６Ｂ、染色、１時間から１４日目）レクチンブロット分析は、ＩｇＧ重鎖糖質シグナルがｒＥｎｄｏＳ注射の１〜２日後にほとんど消失し、これがレクチンシグナルのわずかな増大があった８日目まで、１０日目と１４日目の間にわずかなさらなる増大を伴って維持されたことを明らかにした（図６Ｂ、ＬＣＡブロット、１〜１４日目）。
【００８８】
ｒＥｎｄｏＳに静脈内で２回さらされたことがある動物中においてｒＥｎｄｏＳがまだ活性を有するかどうかを調査するために、ｒＥｎｄｏＳ  １ｍｇでの３回目の注射を、最初の注射の１３０日後に実施した。再び、動物は、注射による影響を受けず、上記の通り血清試料を採取及び分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、３回目の注射の前にＩｇＧ重鎖が完全にグリコシル化された対照のウサギＩｇＧ重鎖と同様に移動したことを明らかにした（図６Ｃ、０時間、ＩｇＧ）。１時間後、ＩｇＧ重鎖は、３ｋＤａ低い分子質量に部分的に移動しており、この移動は、この３回目投与に続く８〜１０日目まで維持された（図６Ｃ、染色、１時間から１４日目）。レクチンブロット分析は、ＩｇＧ重鎖糖質シグナルが３回目のｒＥｎｄｏＳ注射の１時間後に消失し、これが、レクチンシグナルのわずかな増大があった５日目まで、６日目と１４日目の間にさらなる増大を伴って維持されたことを明らかにした（図６Ｃ、ＬＣＡブロット、１〜１４日目）。
【００８９】
総合するとこれらの結果は、低濃度のＥｎｄｏＳは、ｉｎ  ｖｉｖｏでウサギＩｇＧの全プールで重鎖グリカンを効果的に加水分解することを示す。さらに、それ以前のＥｎｄｏＳへの静脈内曝露は、ＥｎｄｏＳのｉｎ  ｖｉｖｏ酵素活性に顕著に影響しなかった。
【００９０】
（実施例３）ＥｎｄｏＳは、酵素に対する抗体にも関わらずウサギにおいて活性である。
２回目及び３回目に注射された場合にＥｎｄｏＳが完全な活性を有したことから、これが酵素に対して免疫応答が無いか若しくは低いことによるものであるかどうかを、又は酵素活性を妨げないＥｎｄｏＳに対する特異的抗体があるかどうかを決定することは重要であった。健康な個体及び化膿レンサ球菌に感染した個体の両方がＥｎｄｏＳに対する抗体を有することが既知であることから、これは、特に重要であった（Ａｋｅｓｓｏｎら、２００４，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８９：７９７〜８０４）。
【００９１】
このことを調査するために、精製ｒＥｎｄｏＳを１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ上にエレクトロブロットし、１．５ｍｍ条片に切断した。条片を１回目、２回目及び３回目の注射由来の全ての血清試料の１：５００希釈液とインキュベートし、続いてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）とインキュベートした。条片を、レクチンブロットについて上に記載の通り化学発光を使用して発色させた。
【００９２】
この実験は、１回目の注射の前にｒＥｎｄｏＳと反応する抗体が既にあったことを明らかにした（図７Ａ、１回目注射、０時間）。注射の１０日後にｒＥｎｄｏＳに対する反応性にわずかな増大があったが（図７Ａ、１回目注射及び図７Ｂ挿入図）、注射後６時間と８時間の間の反応性に隔たりがあった（図７Ａ、１回目注射）。この発見に対して考え得る１つの理由は、ｒＥｎｄｏＳに結合する特異的抗体は、複合体となり、細網内皮系によって循環から除去されたことである。ｒＥｎｄｏＳの２回目の注射の直前のｒＥｎｄｏＳに対する反応性は、１回目の注射の前と同程度であるか又はわずかに高く、反応性は注射後の最初の３日間は増大しなかった（図７Ａ、２回目注射、０時間〜３日目）。２回目の注射後の４から１４日後、ｒＥｎｄｏＳに対する反応性は徐々に増大した（図７Ａ、２回目注射、４〜１４日目）。ｒＥｎｄｏＳの３回目の注射の前、ｒＥｎｄｏＳに対する反応性は、２回目の注射の前よりわずかに高く、反応性は注射後の１日目の間は増大しなかった（図７Ａ、３回目注射、０時間〜１日目）。３回目の注射後の２から１４日後、高いシグナルレベルがレベルの増大の判定を困難にしてはいるが、ｒＥｎｄｏＳに対する反応性は増大した（図７Ａ、３回目注射、２〜１４日目）。
【００９３】
２回目及び３回目の注射の後に得た試料からのウエスタンブロットにおける非常に高いシグナルレベルを考慮して、３回全ての注射の前後の試料をＥＬＩＳＡでも分析した。ＥＬＩＳＡ実験のために、ＥｎｄｏＳ  ２μｇをマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，デンマーク）をコートするために使用し、続いてＰＢＳ中のウシ血清アルブミン２０ｍｇ／ｍｌでブロッキングした。ＥｎｄｏＳ注射前及び注射後０．５、１、５及び１０日目の動物由来の血清を１：１００から１：２０００００の系列希釈で一次抗血清として使用した。ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を２次抗体として使用し、且つＡＢＴＳ（Ｒｏｃｈｅ，ＩＮ）をペルオキシダーゼ基質として使用した。ウサギＩｇＧに対する標準曲線は、ポリクローナルウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）の系列希釈液で上記の通りマイクロタイタープレートをコートするステップ及び２次抗体としてのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体によって作成した。プレートは、４０５ｎｍでＶｉｃｔｏｒ３マルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ．Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＳ）において分析した。
【００９４】
ＥＬＩＳＡ実験は、ＥｎｄｏＳの２回目の注射の直前に、ＥｎｄｏＳに対する反応性は、１回目の注射の前と同程度であるか又はわずかに高く、反応性は注射後の５日目でまだ増大していなかったことを確認した（図７Ｂ、１回目及び２回目注射）。２回目の注射の５から１０日後、ＥｎｄｏＳに対する反応性は、徐々に増大した（図７Ｂ、２回目注射、５〜１０日目）。ＥｎｄｏＳの３回目の注射の前、ＥＬＩＳＡデータは、ＥｎｄｏＳに対する反応性は２回目の注射の前よりわずかに高く、反応性は注射後１日目の間は増大しなかったことを確認した（図７Ｂ、３回目注射、０〜１日目）。３回目の注射の５から１０日後、ＥＬＩＳＡデータは、ＥｎｄｏＳに対する反応性が劇的に増大したことを明らかにした（図７Ｂ、３回目注射、５〜１０日目）。
【００９５】
これらの結果は、未曝露の動物においてＥｎｄｏＳに対する抗体があり、ｒＥｎｄｏＳは、反復の静脈内曝露でウサギにおいて免疫応答を引き起こすことを示す。しかし、これらの抗体は、３回の連続的投与の間、循環におけるｒＥｎｄｏＳの活性を妨げない。さらに、反復の投与は、ウサギ血清試料からのＥｎｄｏＳの免疫沈降及びウエスタンウブロット分析によって分析される通り、酵素の約１２時間の循環時間（ＥｎｄｏＳを検出する能力として定義される）に影響しない。
【００９６】
（実施例４）ＥｎｄｏＳはＣＩＩ特異的モノクローナル抗体を切断する。
ＥｎｄｏＳと共に又はＥｎｄｏＳ無しでインキュベートし、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したＩｇＧモノクローナル抗体（ＣＩＩＣ１及びＭ２１３９）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びレクチンブロット分析を実施した、結果を図８に示す。
【００９７】
ＥｎｄｏＳは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）のアスパラギン結合グリカンのβ−１，４−ジ−Ｎ−アセチルキトビオースコアを特異的に加水分解する。ＥｎｄｏＳを使用する糖質側鎖の除去後、ＩｇＧ分子量は低下する。γ−鎖の大きさの違いは、染色したゲルの写真で、ＥｎｄｏＳで処理したＩｇＧ試料と未処理ＩｇＧとの間に明らかに見られる。
【００９８】
ＩｇＧの大きさの変化がＥｎｄｏＳ活性によって引き起こされ、タンパク質分解ではなくγ鎖上のグリカン部分の除去を生じたことを確認するために、レクチンブロット分析を実施した。スノードロップ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ）（ＧＮＬ）由来レクチンは、γ−鎖上のバイアンテナグリカンに見出されるα−１，３マンノース残基を優先的に認識する。ＧＮＬレクチンでの同じ試料のレクチンブロット分析は、ＥｎｄｏＳとインキュベートした場合に顕著に低下したシグナルを明らかにした。対照的に、ＥｎｄｏＳ無しでインキュベートした場合、γ−鎖は、グリコシル化されたままであった。これらのデータは、ＥｎｄｏＳは、マウスＩｇＧのγ−鎖からα−１，３マンノースを含有する構造を除去する能力を有することを示している。
【００９９】
（実施例５）脱グリコシル化抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで軟骨に結合する。
この実験は、ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）特異的ＩｇＧモノクローナル抗体（ｍＡｂ）由来の糖質部分の除去が、そのｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＩ型コラーゲンへの結合能に影響するかどうかを理解するために実施した。
【０１００】
１〜２日齢新生ラットにＣＩＩ結合抗体（正常及びＥｎｄｏＳ処理の両方）１ｍｇをｉ．ｐ．注射した。抗体移植の２４時間後、足を切断し、イソペンタン及びドライアイスを使用してＯＣＴ化合物中にただちに凍結した。免疫組織化学的分析を、標準的手順を使用する検出系としてビオチン化抗マウスカッパ（１８７．１）抗体及びＨＲＰ複合２次抗体を使用して実施した。結果を図９に示す。ＥｎｄｏＳ処理及び未処理の抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの関節軟骨への結合パターンに差異は無かった。
【０１０１】
（実施例６）抗ＣＩＩモノクローナル抗体の脱グリコシル化による関節炎誘発性の消失
ＣＩＩ特異的モノクローナル抗体は、マウスで急性型の関節炎、いわゆる、Ｎａｎｄａｋｕｍａｒら（２００３）に記載のコラーゲン抗体誘発関節炎（ＣＡＩＡ）を誘発する。ＣＡＩＡは、免疫応答の初回刺激相を含まない関節炎のエフェクター相に類似している。この抗体媒介性関節炎は、補体成分ＦｃγＲ、エフェクターサイトカインＴＮＦ−α及びＩＬ−１β並びに好中球及びマクロファージによる。ＣＡＩＡを、ＥｎｄｏＳ処理によるＩｇＧの脱グリコシル化の重要性を理解するために本研究において使用する。２つの抗体：Ｊ１エピトープ（５５１〜５６４；ＧＥＲＧＡＡＧＩＡＧＰＫ）に結合するＭ２１３９ｍＡｂ（ＩｇＧ２ｂ）、及びＩＩ型コラーゲンのＣ１Ｉ（３５９〜３６３；ＡＲＧＬＴ）に結合するＣＩＩＣ１（ＩｇＧ２ａ）、を含有するモノクローナル抗体混合物を急性型の関節炎、ＣＡＩＡを誘発するために使用した。
【０１０２】
糖質側鎖の除去がＩＩ型コラーゲンに対する病原性モノクローナル抗体の関節炎誘発能に影響するかどうかを決定するために、ＥｎｄｏＳ処理及び未処理のこのモノクローナル抗体混合物をマウスに注射した。オス、（ＢＡＬＢ／ｃ  Ｘ  Ｂ１０．Ｑ）Ｆ１マウスの群に、未処理（ｎ＝７）又はＥｎｄｏＳ処理（ｎ＝５）の抗ＣＩＩモノクローナル抗体（Ｍ２１３９及びＣＩＩＣ１）のいずれかを９ｍｇ、０日目に注射した。５日目に全てのマウスに大腸菌ＬＰＳを５０μｇ、ｉ．ｐ．注射した。関節炎発症率（ａ）及び平均関節炎スコア（ｂ）を図１０に示す。
【０１０３】
図１０ａ及び１０ｂから理解される通り、コラーゲン抗体誘発関節炎（ＣＡＩＣ）に非常に罹り易いと以前に示された（ＢＡＬＢ／ｃ  Ｘ  Ｂ１０．Ｑ）Ｆ１マウスにおいて臨床的関節炎の完全な阻止があった。したがって、ＥｎｄｏＳによるＩｇＧのγ鎖からの糖質の除去がその関節炎誘発能（関節炎誘発性）を抑制することは明白である。
【０１０４】
ＩｇＧの糖質側鎖の除去によるモノクローナル抗体の関節炎誘発性の消失を確認するために、他の遺伝的背景Ｂ１０．ＲＩＩＩを有するマウスでＣＡＩＡを誘発した。
【０１０５】
オスＢ１０．ＲＩＩＩマウスに、未処理（ｎ＝１１）又はＥｎｄｏＳ処理（ｎ＝１２）の抗ＣＩＩモノクローナル抗体（Ｍ２１３９及びＣＩＩＣ１）のいずれかを９ｍｇ、０日目に注射した。５日目に全てのマウスに大腸菌ＬＰＳを５０μｇ、ｉ．ｐ．注射した。関節炎発症率（ａ）及び平均関節炎スコア（ｂ）を図１１に示す。図１１から理解される通り、Ｂ１０．ＲＩＩＩマウスにおいて、未処理ｍＡｂの混合物と比較してＥｎｄｏＳ処理ｍＡｂ混合物によって誘発される関節炎の発症率及び重症度が顕著に減少した。
【０１０６】
（実施例７）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＩＩ反応性モノクローナル抗体による補体の活性化
ＩｇＧのγ鎖からの糖質の除去がなぜｍＡｂの臨床的関節炎誘発能を低減又は消失させるのかを理解するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を、ＥｎｄｏＳ処理及び未処理抗体でそれらの補体活性化を誘発する能力を評価するために実施した。
【０１０７】
図１２は、ＩＩ型コラーゲンに（ａ）又は直接プラスチックの表面に（ｂ）結合したｍＡｂへの第１補体成分Ｃ１ｑの沈着を示す。ＥｎｄｏＳ処理（Ｍ２１３９Ｄ）及び未処理（Ｍ２１３９）抗体による補体系の活性化に差異は無かった。ＣＩＩＣ１（ＥｎｄｏＳ処理及び未処理の両方の）ｍＡｂは、補体を全く活性化しなかった。Ｇ１１（ＩｇＧ２ｂ）及びＬ２４３（ＩｇＧ２ａ）は、無関係の抗原に結合する対照モノクローナル抗体である。
【０１０８】
図１３は、ＩＩ型コラーゲンに（ａ）又は直接プラスチックの表面に（ｂ）結合したｍＡｂへの補体成分Ｃ３の切断産物（Ｃ３ｂ）の沈着を示す。ＥｎｄｏＳ処理（Ｍ２１３９Ｄ）及び未処理（Ｍ２１３９）抗体による補体系の活性化に差異は無かった。ＣＩＩＣ１（ＥｎｄｏＳ処理及び未処理の両方の）ｍＡｂは、補体を全く活性化しなかった。Ｇ１１（ＩｇＧ２ｂ）及びＬ２４３（ＩｇＧ２ａ）は、無関係の抗原に結合する対照モノクローナル抗体である。
【０１０９】
（実施例８）好中球（ＰＭＮＬ）酸化バーストへのＣＩＩ特異的モノクローナル抗体の脱グリコシル化の効果
多形核白血球、ＰＭＮＬ（好中球）による酸化バースト誘発においてグリコシル化及び脱グリコシル化抗体の能力に機能的差異があるかどうかを決定するために、ポリスチレン微小粒子をＥｎｄｏＳ処理及び未処理の抗体でコートし、３つの異なる遺伝型（ＦｃｇＲ＋／＋、ＦｃｇＲ−／−及びＦｃｇＲ＋／−）を有するマウス由来の全血とインキュベートした。次いで、酸化バーストアッセイをＦＡＣＳ（蛍光標識細胞分取）分析を使用して実施した。ＰＭＮＬはＲＢ６抗体を使用して同定した。
【０１１０】
結果を図１４に示す。グリコシル化と脱グリコシル化抗体との間に酸化バーストの活性における差異は無かった。
【０１１１】
（実施例９）マウス足の組織検査
グリコシル化又はＥｎｄｏＳ処理ｍＡｂを投与されたマウス足由来の関節の組織学的状態を検査するために、標準的ヘマトキシリン−エオシン染色を使用して、未処理、脱グリコシル化又は未処理抗体とＥｎｄｏＳ処理抗体混合物との等量混合物９ｍｇを注射した（ＢＡＬＢ／ｃ  ｘ  Ｂ１０．Ｑ）Ｆ１マウス（ｎ＝３〜４）由来のホルマリン固定脱灰関節の６μｍ切片を染色した。
【０１１２】
結果は、グリコシル化抗体を注射したマウス由来の関節において、細胞の広範囲な浸潤並びに軟骨及び骨のびらんがあったことを示した。対照的にＥｎｄｏＳ処理抗体を注射したマウスの足は軽度の骨のびらんを示しただけで、広範囲の細胞浸潤は無かった。軟骨は、これらのマウスにおいて正常と思われた。
【０１１３】
（実施例１０）正常及び脱グリコシル化抗体のｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス
脱グリコシル化抗体の関節炎誘発性の低下が、グリコシル化抗体と比較して、早く且つ亢進されたこれらの抗体のマウスからのクリアランスによるものであったかどうかを決定するために、ＩＩ型コラーゲン結合抗体のＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）による分析を、１日目及び５日目にＢ１０．ＲＩＩＩマウスから採取した血清を使用して実施した。結果を図１５に示す。グリコシル化及びＥｎｄｏＳ処理ｍＡｂを注射したマウスの血清中において存在する抗体のレベルの間に差異は無く、脱グリコシル化抗体のマウスからの正常なクリアランスレベルを示唆している。
【０１１４】
（実施例１１）脱グリコシル化抗体による免疫複合体形成
我々は、グリコシル化抗体とＥｎｄｏＳ処理抗体との間に、ＦｃγＲ分子への結合の差異とは別の何か明らかな違いが存在するかどうかを決定したいと考えた。抗体移行関節炎モデルにおける事象誘発の最初のステップは、軟骨表面又は滑膜でのコラーゲン−ＩｇＧ免疫複合体の形成である可能性が最も高い。コラーゲンエピトープは、軟骨表面に形成された反復構造に位置し、したがって２つの異なる抗体が関節表面で多量体複合体を形成でき、最適な補体活性化又はＦｃγＲを有する細胞に結合することのいずれかによって関節炎誘発性を補助するという可能性がある。
【０１１５】
安定免疫複合体形成の課題を調査するために、抗体の単純免疫拡散をアガロース上で実施した。ラットＣＩＩを１％アガロース（低ゲル化温度アガロース２６〜３０℃）ゲルに０．０５％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍｌで浸透させた。１ウェル当たり１ｍｇ／ｍｌの濃度の抗体２５μｌを添加した。ゲルはクーマシーブルーで染色した。結果は、脱グリコシル化抗体がグリコシル化ｍＡｂと比較して安定免疫複合体を形成しなかったことを示した。この安定免疫複合体の形成不能は、脱グリコシル化抗体の関節炎誘発性の消失に対する別の説明になり得る。
【０１１６】
（実施例１２）ＥｎｄｏＳは致死性の抗体媒介性血小板減少症からマウスを救済する。
ＥｎｄｏＳが、ｉｎ  ｖｉｖｏでＩｇＧグリカンを効果的に加水分解すること、及び動物が酵素の投与を許容したことが確立され、我々は、重症ＩｇＧ媒介性疾患を治療するためのＥｎｄｏＳの使用を調査した。選択した疾患モデルは、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）のマウスモデルであった。このモデルにおいてマウス血小板に対するポリクローナルウサギＩｇＧ（αＰＬＴ−ＩｇＧ）を腹腔内に注射し、重症の血小板減少症、出血及びＩｇＧのより高い用量で最終的には致死を生じさせた。
【０１１７】
マウス血小板に対するウサギ抗血清をＩｎｔｅｒ−Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｊｕｐｉｔｅｒ，ＦＬ）から購入した。ＩｇＧ画分をこの血清からプロテインＧセファロースを使用して単離した。タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認し、タンパク質濃度をＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）を使用して決定した。処理済ＩｇＧを使用する実験のために、精製ウサギ抗マウス血小板ＩｇＧ（αＰＬＴ−ＩｇＧ）を精製ＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ又はＧＳＴと共に、酵素対基質の比、１：５００で３７℃、２４時間インキュベートし、続いてグルタチオン−セファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ及びＧＳＴを除去した。ＩｇＧグリカンの加水分解をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＬＣＡを使用するレクチンブロットによって上に記載の通り確認した。ＢＡＬＢ／ｃマウス、メス（体重約２０ｇ）を標準的な光及び温度の条件下で飼育し、標準飼料及び水を自由摂取させた。ＰＢＳ  ０．２５ｍｌ中の抗マウス血小板ＩｇＧ（未処理、ＥｎｄｏＳ処理、又はＧＳＴ処理）の１．２ｍｇを腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によって動物に投与した。動物を皮膚粘膜出血、身体活動性、群からの分離についてモニターし、生存期間を記録した。
【０１１８】
ウサギ抗マウス血小板ＩｇＧの注射の直前及び実験の過程で定期的に、血液試料をマウスから採取した。予め暖めた尾部血管から全血５μｌを、ＰＢＳ中の０．１Ｍクエン酸ナトリウム／クエン酸（ｐＨ６．５）、４５μｌを含むチューブに採取した。これらの血液試料中の血小板集団をフローサイトメトリーで同定した。試料は、ハムスター抗マウスＣＤ−６１  ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で１０分間、室温で標識した。ＳＰＨＥＲＯａ  Ｒａｉｎｂｏｗ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１０μｌを、計数を可能にするために各チューブに加えた。赤血球集団をＵｔｉｌｓｅａ（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，デンマーク）を使用して溶解し、試料をＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の対数モードで分析した。赤血球の溶解後の血液試料中の血小板数をＮｅｕｂａｕｅｒチャンバー中で手動計測で計測した。
【０１１９】
予備実験において、ＢＡＬＢ／ｃマウス、メス３匹にαＰＬＴ−ＩｇＧ  １．２ｍｇを注射し、上に記載の通り血小板数をフローサイトメトリー及び顕微鏡を使用して経時的に追跡した。これは、３匹全てのマウスが急速に血小板減少症を発症し、αＰＬＴ−ＩｇＧ投与の２４時間以内に死に至ったことを明らかにした（図１６Ａ）。
【０１２０】
次いで我々は、マウスへの投与の前に、ＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ又は対照としてのＧＳＴでのαＰＬＴ−ＩｇＧの前処理が、疾患の発症及び生存率に何らかの影響を有するかどうかを検査した。ＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ処理αＰＬＴ−ＩｇＧを注射した全ての動物（ｎ＝４）が、疾患のいかなる徴候も発症することなく生存した、一方でＧＳＴ処理αＰＬＴ−Ｉｇを注射した全ての動物（ｎ＝４）は、重症の皮下出血を発症し、２４時間以内に死んだ（図１６Ｂ）。これは、２つの群の動物の間の統計的有意差を表している（ｐ＝０．００８２）。さらに、フローサイトメトリーによる毎日の血小板数計測分析は、ＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ処理αＰＬＴ−ＩｇＧは、マウス血小板数に顕著な影響を有さない一方で、ＧＳＴ処理αＰＬＴ−ＩｇＧは血小板数の急速な低下を引き起こすことを明らかにした（図１６Ｃ）。これらの実験は、ｅｘ  ｖｉｖｏのαＰＬＴ−ＩｇＧのＥｎｄｏＳ処理がＩｇＧ抗体の病原性を抑制することを示し、ＥｎｄｏＳのｉｎ  ｖｉｖｏ活性との組合せでの結果は、我々を、ＥｎｄｏＳが疾患の発症後にも致死性血小板減少症の発症を予防するためにマウスに投与できるかどうかを調査するように促した。マウス（１群当たりｎ＝８）にαＰＬＴ−ＩｇＧ  １．２ｍｇを注射し、続いてαＰＬＴ−ＩｇＧの投与の３時間後にＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ又はＧＳＴ  １００μｇを腹腔内注射した。ＧＳＴで処置した全ての動物（８／８）は、２日以内に死んだが、一方ＧＳＴ−ＥｎｄｏＳで処置した動物は２／８だけが死んだ（図１７Ａ）。これは、群の間の生存率における統計的有意差を表している（ｐ＝０．００３）。ＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ又はＧＳＴ処理マウス由来の全ＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びレクチンブロット分析は、ＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ処置動物では、αＰＬＴ−ＩｇＧ処置の２４、４８及び７２時間後に重鎖グリカンが完全に加水分解された一方で、ＧＳＴ処置動物のＩｇＧは、２４時間で死を生じるまで完全にグリコシル化されていたことを示した（図１７Ｂ）。さらに、フローサイトメトリーで分析した血小板数は、αＰＬＴ−ＩｇＧの投与は、血小板数の急速な低下を誘導するが、ＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ処置マウスでは、血小板数は着実に上昇し始め２〜３日後に正常値に達したことを示した（図１７Ｃ）。
【０１２１】
我々の仮説をさらに試すために、我々はＩＴＰ患者の臨床状況を模倣することを試みた。これらの患者が医師の診察を受ける場合、血小板数はしばしば非常に低く、且つ皮下及び他の出血合併症が既に明らかである。したがって我々は、αＰＬＴ−ＩｇＧでマウス（ｎ＝４）に疾患を誘発したが、しかし動物がαＰＬＴ−ＩｇＧの注射後５〜７時間に明らかに観察される皮膚血腫を示すまでＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ又はＧＳＴでの処置を開始しなかった。これらの実験において、ＧＳＴ−ＥｎｄｏＳで処置した５／７のマウスは生存し、且つ回復したが、一方ＧＳＴで処置した全てのマウス（７／７）は、２日以内に死に、再び２つの群の間の生存率に統計的有意差を示している（ｐ＝０．００１５）（図１７Ｄ）。全てを含めると我々の結果は、αＰＬＴ−ＩｇＧのマウスにおける病原的特性は、抗体のグリコシル化状態に依存すること、並びにＥｎｄｏＳは、ｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で抗血小板ＩｇＧ抗体の病原性を徹底的に低減させることを示す。要約すると、病原性抗体を酵素で前処理した場合及びＥｎｄｏＳを疾患の過程の初期又は後期に投与した場合の両方でＥｎｄｏＳは、血小板数及び生存に劇的な正の影響を有した。本発明者らの知る限りでは、ＩｇＧグリカンのｉｎ  ｖｉｖｏ加水分解が自己免疫疾患の実験的治療として使用されるのは、これが初めてである。
【０１２２】
本発明者らは、ＩｇＧのＥｎｄｏＳ加水分解が、ＦｃＲへの結合から全てのサブクラスのＩｇＧを阻害し、且つ補体活性化をも低減させることを以前に見出していることから、ＥｎｄｏＳの正の影響の基となる機序は、理論的観点からほぼ明白である。特に重要なことは、ＥｎｄｏＳがＦｃＲへの結合からＩｇＧを阻害するだけでなく、重鎖グリカンの加水分解によって既にＦｃＲが結合したＩｇＧも遊離できることである。他のものの様に、影響されないＩｇＧ−ＦｃＲのある相互作用が存在すると思われることにも留意されたい；ＥｎｄｏＳで加水分解されたＩｇＧは、特定の環境下でヒトＦｃＲ１１ｂに、加水分解されていないＩｇＧよりも良く結合する（データ未記載）。ＩｇＧのＦｃＲ１１ｂとの相互作用が、自己免疫状態の治療に使用される免疫グロブリン静脈注射（ＩＶＩＧ）の抗炎症活性について重要であると示されていることから、抗炎症活性との関連において、これは妥当である。いかなる仮説にも制約されることなく、本発明者らは、特定の条件下でＥｎｄｏＳは、病原性ＩｇＧの活性化ＦｃＲへの結合を直接阻害すること及びＦｃＲ１１ｂを介して調節される阻害作用に移行することによって二重の抗炎症活性を有し得ることを提言する。
【０１２３】
特に、ＩｇＧグリカンをＩｇＧエフェクター調節への鍵として証明した幾つかの近年の研究の観点から、ＥｎｄｏＳの特性は、それを病原性抗体が関与する状態の現在の治療への魅力的な代替えにする。このことは、このグリカンのＥｎｄｏＳ加水分解が古典的経路を介した補体活性化をほとんど消失させ、白血球上のＦｃ受容体への結合を低減するとの本発明者ら自身の発見を含む。本発明者らの観察に基づいて、ＥｎｄｏＳは、ＩＴＰによってここで例示される自己免疫疾患、及び急性抗体媒介性臓器同種移植片拒絶を含む、ＩｇＧ抗体が病原的役割を演じる状態を治療するために使用できることが示される。
【０１２４】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図９ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２】
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【配列表】
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