(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に周期構造を有するベース基板と、前記周期構造の上に形成された金属層と、前記金属層の上に形成された酸化亜鉛層とを有するバイオチップを用いて抗原抗体反応を検出する方法であって、
前記金属層が、１３５ｎｍ以上２００ｎｍ以下の厚さに形成された銀であり、
前記バイオチップの前記酸化亜鉛層の表面に、一端が酸化亜鉛を認識し、他端が抗原を認識する二重特異性抗体の前記一端を結合させる第１ステップと、
前記二重特異性抗体の前記他端に前記抗原を結合させる第２ステップと、
前記第２ステップ後のバイオチップに、光を入射して表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、発生した前記電場を励起場として用いて増強蛍光を検出する第３ステップとを含み、
前記第２ステップにおいて、前記二重特異性抗体の前記他端に前記抗原を結合させた後の前記バイオチップを、界面活性剤を含む燐酸緩衝液でリンスし、
前記抗原が蛍光標識されている場合には、前記第３ステップにおいて、発生した前記電場を前記抗原の励起場として用い、
前記抗原が蛍光標識されていない場合には、前記第２ステップが、前記抗原を認識する蛍光標識された二次抗体を前記抗原に結合させる第４ステップを含み、前記第３ステップにおいて、前記電場を前記二次抗体の励起場として用い、
前記第３ステップにおいて、６３３ｎｍの波長の前記光を前記酸化亜鉛層側から入射角度Ｙ°で入射し、前記酸化亜鉛層側から検出角度Ｘ°で前記増強蛍光を検出し、前記増強蛍光の強度がピークとなる際の前記入射角度Ｙ°および前記検出角度Ｘ°の関係が、
前記周期構造のピッチが、３００ｎｍ以上４２０ｎｍ以下または６３０ｎｍ以上８００ｎｍ以下の場合、Ｙ＋６−１≦Ｘ≦Ｙ＋６＋１であり、
前記周期構造のピッチが、４４０ｎｍ以上６３０ｎｍ未満の場合、Ｙ−６−１≦Ｘ≦Ｙ−６＋１であり、
前記周期構造のピッチが、４２０ｎｍより大きく４４０ｎｍ未満の場合、−Ｙ＋６−１≦Ｘ≦−Ｙ＋６＋１、且つ、Ｘ≧０であることを特徴とする抗原抗体反応の検出方法。
【請求項２】
表面に周期構造を有するベース基板と、前記周期構造の上に形成された金属層と、前記金属層の上に形成された酸化亜鉛層とを有するバイオチップを用いて抗原抗体反応を検出する方法であって、
前記金属層が、１０ｎｍ以上５０ｎｍ以下の厚さに形成された銀であり、
前記バイオチップの前記酸化亜鉛層の表面に、一端が酸化亜鉛を認識し、他端が抗原を認識する二重特異性抗体の前記一端を結合させる第１ステップと、
前記二重特異性抗体の前記他端に前記抗原を結合させる第２ステップと、
前記第２ステップ後のバイオチップに、光を入射して表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、発生した前記電場を励起場として用いて増強蛍光を検出する第３ステップとを含み、
前記第２ステップにおいて、前記二重特異性抗体の前記他端に前記抗原を結合させた後の前記バイオチップを、界面活性剤を含む燐酸緩衝液でリンスし、
前記抗原が蛍光標識されている場合には、前記第３ステップにおいて、発生した前記電場を前記抗原の励起場として用い、
前記抗原が蛍光標識されていない場合には、前記第２ステップが、前記抗原を認識する蛍光標識された二次抗体を前記抗原に結合させる第４ステップを含み、前記第３ステップにおいて、前記電場を前記二次抗体の励起場として用い、
前記第３ステップにおいて、６３３ｎｍの波長の前記光を前記ベース基板側から入射角度Ｚ°で入射し、前記酸化亜鉛層側から検出角度Ｘ°で前記増強蛍光を検出し、前記増強蛍光の強度がピークとなる際の前記入射角度Ｚ°および前記検出角度Ｘ°の関係が、
前記周期構造のピッチが、３００ｎｍ以上３８０ｎｍ以下または６６０ｎｍ以上７６０ｎｍ以下の場合、Ｚ＋１８−１≦Ｘ≦Ｚ＋１８＋１であり、
前記周期構造のピッチが、４４０ｎｍ以上５６０ｎｍ以下の場合、Ｚ−１８−１≦Ｘ≦Ｚ−１８＋１であり、
前記周期構造のピッチが、３８０ｎｍより大きく４４０ｎｍ未満の場合、−Ｚ＋１８−１≦Ｘ≦−Ｚ＋１８＋１、且つ、Ｘ≧０であり、
前記周期構造のピッチが、５６０ｎｍより大きく６６０ｎｍ未満の場合、−Ｚ＋６５−６≦Ｘ≦−Ｚ＋６５＋６、且つ、Ｘ≧０であることを特徴とする抗原抗体反応の検出方法。
【請求項３】
前記二重特異性抗体が、４Ｆ２−ＧＦＰ４ ＶＨＨダイマーであることを特徴とする請求項１または２に記載の抗原抗体反応の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance）によって発生する表面プラズモン共鳴光により蛍光物質を励起して蛍光を発生させ、表面プラズモン励起増強蛍光を検出することにより抗原抗体反応を検出できるバイオチップ、抗原抗体反応検出用キット、及び、それらを用いた抗原抗体反応の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子の相互作用を調べる技術であるバイオセンシングや、それに使用されるバイオチップの開発が成されている。生体分子の相互作用を調べる方法の一つに、表面プラズモン共鳴（以下ＳＰＲとも記す）を使用した分光分析法が知られている。例えば、下記特許文献１には、表面プラズモン共鳴測定及び蛍光測定によって得られた信号を個別に分析することによって、被検体の固相への結合を判定する装置及びその方法が開示されている。また、下記特許文献２には、抗原抗体反応などの生体分子相互作用を高精度で検出することができる装置および方法が開示されている。
【０００３】
また、下記特許文献３には、クレッチマン型のようにプリズムを使用する必要が無い、表面に周期構造を有するマイクロプレート、及びそれを用いた表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献２】特開２００６−２０８０６９号公報
【特許文献３】特開２００８−２８６７７８号公報
【特許文献４】国際公開第２００８／０９９９６８号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nozomi Yokoo et al.,”Direct and Selective Immobilization of Proteins by Means of an Inorganic Material-Binding Peptide: Discussion on Functionalization in the Elongation to Material-Binding Peptide”, J. Phys. Chem. B 2010, 114, 480-486
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
バイオセンシングやバイオチップの開発においては、第１の課題として高感度検出が可能な装置の開発があり、第２の課題として特異的にターゲットを認識する抗体を高密度にチップ表面に配列させる技術の開発がある。しかし、現状ではこれらの課題は十分には達成できていない。
【０００７】
第２の課題に関しては、上記した特許文献４に、酸化亜鉛結合性ラクダ抗体によって抗体を酸化亜鉛に安定的に結合できることが開示されている。また、上記非特許文献１には、燐酸緩衝液を調整すれば、酸化亜鉛への任意のタンパク質の非特異吸着を抑制し、酸化亜鉛結合性ペプチドと融合させたＧＦＰを酸化亜鉛に特異吸着させることができることが開示されている。しかし、タンパク質の非特異吸着をより抑制し、特異的にターゲットを認識する抗体を、より高密度にチップ表面に配列させる手段が要望されている。
【０００８】
本発明は、上記の課題を解決すべく、高感度検出が可能であり、特異的にターゲットを認識する抗体を高密度にチップ表面に配列させることができるバイオチップ、抗原抗体反応検出用キット、及び抗原抗体反応の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決するために、本発明の第１のバイオチップは、
表面に周期構造を有するベース基板と、
前記周期構造の上に形成された金属層と、
前記金属層の上に形成された消光抑制層と、
前記消光抑制層の上に結合された二重特異性抗体とを備え、
前記金属層が、表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、
前記消光抑制層が酸化亜鉛で形成され、
前記二重特異性抗体が、一端が酸化亜鉛を認識し、他端が抗原を認識する抗体であり、
蛍光標識されている前記抗原が前記二重特異性抗体の前記他端に結合された状態、または、蛍光標識されていない前記抗原が前記二重特異性抗体の前記他端に結合され且つ前記抗原を認識する蛍光標識された二次抗体が前記抗原に結合された状態で、
光が入射されて表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、
発生した前記電場を、前記抗原が蛍光標識されている場合には前記抗原の励起場として、前記二次抗体が前記抗原に結合されている場合には前記二次抗体の励起場として増強蛍光が検出されることを特徴としている。
【００１０】
本発明の第２のバイオチップは、上記の第１のバイオチップにおいて、
前記二重特異性抗体が、４Ｆ２−ＧＦＰ４  ＶＨＨダイマーであることを特徴としている。
【００１１】
本発明の第３のバイオチップは、上記の第１又は第２のバイオチップにおいて、
前記金属層が、１３５ｎｍ以上２００ｎｍ以下の厚さに形成された銀であり、
前記消光抑制層側から前記光を入射し、前記消光抑制層側から前記増強蛍光を検出するときに使用されることを特徴としている。
【００１２】
本発明の第４のバイオチップは、上記の第１又は第２のバイオチップにおいて、
前記金属層が、１０ｎｍ以上５０ｎｍ以下の厚さに形成された銀であり、
前記ベース基板側から前記光を入射し、前記消光抑制層側から前記増強蛍光を検出するときに使用されることを特徴としている。
【００１３】
本発明の第１の抗原抗体反応検出用キットは、
表面に周期構造を有するベース基板、前記周期構造の上に形成された金属層、及び、前記金属層の上に形成された酸化亜鉛層を有するチップと、
一端が酸化亜鉛を認識し、他端が抗原を認識する二重特異性抗体を含む溶液とを備え、
前記溶液が前記酸化亜鉛層の表面に接触され、前記二重特異性抗体が前記酸化亜鉛層に結合し、結合した前記二重特異性抗体に蛍光標識された前記抗原が注入された後、あるいは、結合した前記二重特異性抗体に蛍光標識されていない前記抗原が注入され、且つ前記抗原を認識する蛍光標識された二次抗体が注入された後、表面プラズモン励起増強蛍光の検出に使用されることを特徴としている。
【００１４】
本発明の第２の抗原抗体反応検出用キットは、上記の第１の抗原抗体反応検出用キットにおいて、
前記二重特異性抗体が、４Ｆ２−ＧＦＰ４  ＶＨＨダイマーであることを特徴としている。
【００１５】
本発明の第１の抗原抗体反応の検出方法は、
表面に周期構造を有するベース基板と、前記周期構造の上に形成された金属層と、前記金属層の上に形成された酸化亜鉛層とを有するバイオチップを用いて抗原抗体反応を検出する方法であって、
前記バイオチップの前記酸化亜鉛層の表面に、一端が酸化亜鉛を認識し、他端が抗原を認識する二重特異性抗体の前記一端を結合させる第１ステップと、
前記二重特異性抗体の前記他端に前記抗原を結合させる第２ステップと、
前記第２ステップ後のバイオチップに、光を入射して表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、発生した前記電場を励起場として用いて増強蛍光を検出する第３ステップとを含み、
前記抗原が蛍光標識されている場合には、前記第３ステップにおいて、発生した前記電場を前記抗原の励起場として用い、
前記抗原が蛍光標識されていない場合には、前記第２ステップが、前記抗原を認識する蛍光標識された二次抗体を前記抗原に結合させる第４ステップを含み、前記第３ステップにおいて、前記電場を前記二次抗体の励起場として用いることを特徴としている。
【００１６】
本発明の第２の抗原抗体反応の検出方法は、上記の第１の抗原抗体反応の検出方法において、
前記二重特異性抗体が、４Ｆ２−ＧＦＰ４  ＶＨＨダイマーであることを特徴としている。
【００１７】
本発明の第３の抗原抗体反応の検出方法は、上記の第１又は第２の抗原抗体反応の検出方法において、
前記第２ステップにおいて、前記二重特異性抗体の前記他端に前記抗原を結合させた後の前記バイオチップを、界面活性剤を含む燐酸緩衝液でリンスすることを特徴としている。
【００１８】
本発明の第４の抗原抗体反応の検出方法は、上記の第１〜第３の抗原抗体反応の検出方法の何れかにおいて、
前記第３ステップにおいて、６３３ｎｍの波長の前記光を前記酸化亜鉛層側から共鳴角度Ｙ°の入射角度で入射し、前記酸化亜鉛層側から検出角度Ｘ°で前記増強蛍光を検出し、
前記周期構造のピッチが、３００ｎｍ以上４２０ｎｍ以下または６３０ｎｍ以上８００ｎｍ以下の場合、Ｙ＋６−１≦Ｘ≦Ｙ＋６＋１であり、
前記周期構造のピッチが、４４０ｎｍ以上６３０ｎｍ未満の場合、Ｙ−６−１≦Ｘ≦Ｙ−６＋１であり、
前記周期構造のピッチが、４２０ｎｍより大きく４４０ｎｍ未満の場合、−Ｙ＋６−１≦Ｘ≦−Ｙ＋６＋１、且つ、Ｘ≧０であることを特徴としている。
【００１９】
本発明の第５の抗原抗体反応の検出方法は、上記の第１〜第３の抗原抗体反応の検出方法の何れかにおいて、
前記第３ステップにおいて、６３３ｎｍの波長の前記光を前記ベース基板側から共鳴角度Ｚ°の入射角度で入射し、前記酸化亜鉛層側から検出角度Ｘ°で前記増強蛍光を検出し、
前記周期構造のピッチが、３００ｎｍ以上３８０ｎｍ以下または６６０ｎｍ以上７６０ｎｍ以下の場合、Ｚ＋１８−１≦Ｘ≦Ｚ＋１８＋１であり、
前記周期構造のピッチが、４４０ｎｍ以上５６０ｎｍ以下の場合、Ｚ−１８−１≦Ｘ≦Ｚ−１８＋１であり、
前記周期構造のピッチが、３８０ｎｍより大きく４４０ｎｍ未満の場合、−Ｚ＋１８−１≦Ｘ≦−Ｚ＋１８＋１、且つ、Ｘ≧０であり、
前記周期構造のピッチが、５６０ｎｍより大きく６６０ｎｍ未満の場合、−Ｚ＋６５−６≦Ｘ≦−Ｚ＋６５＋６、且つ、Ｘ≧０であることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、従来よりも高い検出感度で、増強蛍光を検出することができる。消光抑制層に酸化亜鉛を使用するので、ＳｉＯ２を使用する場合のように酸化されることがなく、安定して測定が可能である。
【００２１】
また、一端が酸化亜鉛に結合し他端が蛍光標識タンパク質に結合する二重特異性抗体を使用するので、検出対象である蛍光標識タンパク質を特異的に消光抑制層（酸化亜鉛）の近傍に位置させることができる。さらに、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）を含む燐酸緩衝液でリンスすることにより、消光抑制層（酸化亜鉛）へのタンパク質等の非特異吸着を抑制することができる。
【００２２】
具体的には、本発明によれば、正面照射系では、酸化亜鉛をコーティングしたガラス基板の３００倍以上の増強蛍光を検出することができる。さらに、光学系を最適化することにより１０００倍まで増強することも可能であり、ｐＭオーダーの抗原濃度まで計測することができる。本発明により蛍光標識タンパク質からの蛍光強度を計測した値と、二重特異性抗体を使わないで非特異吸着による蛍光標識タンパク質からの蛍光強度を計測した値との比であるＳａｍｐｌｅ／Ｃｔｒｌのシグナル比は、酸化亜鉛をコーティングしたガラス基板の数十倍以上向上する。
【００２３】
また、本発明によれば、背面照射系では、酸化亜鉛をコーティングしたガラス基板の３０倍以上の増強蛍光を検出することができる。さらに、光学系を最適化することにより１００倍以上の増強が可能である。Ｓａｍｐｌｅ／Ｃｔｒｌのシグナル比は、酸化亜鉛をコーティングしたガラス基板の１００倍に向上する。また、ｐＭオーダーの抗原濃度まで計測することができる。
【００２４】
また、本発明によれば、検査時間が短く迅速な検査が可能である。例えば、本発明によれば、２２ｐＭという非常に濃度の薄い試料に関して、約３０分の迅速な検査が可能である（実施例３参照）。また、これよりも濃度の高い試料であれば、約１０分というさらに迅速な検査が可能である。
【００２５】
さらに、消光抑制層としてＳｉＯ2を用いる場合と比較すると、本発明によれば、屈折率（誘電率）が大きいＺｎＯを使用することによって、抗原の結合位置での電場強度を大きくすることができ、二重特異性抗体を高密度に周期構造基板に結合させることができるので、実施例は省略するが、消光抑制層としてＳｉＯ2を用い、これに抗体（本発明の二重特異性抗体ではない）を化学修飾した周期構造基板を使用する場合よりも、蛍光標識タンパク質を、濃度が低い場合でも高感度に計測することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の実施の形態に係るバイオチップの概略構造を示す図である。
【図２】バイオチップに対する入射光の方向及び増光蛍光の検出方向を示す図である。
【図３】ベース基板表面の周期構造を示す断面図である。
【図４】スロープを有する周期構造を示す断面図である。
【図５】正面照射系において、励起光の波長が６３３ｎｍの場合に、周期構造のピッチに対する共鳴角（実線）および共鳴角で入射した場合の蛍光ピークが現れる検出角度（破線）の関係を示すグラフである。
【図６】背面照射系において、ベース基板がポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）あるいはＳｉＯ２（Ｇｌａｓｓ）であり、励起光の波長が６３３ｎｍの場合に、周期構造のピッチに対する共鳴角の関係を示すグラフである。
【図７】２次元周期構造を示す平面図である。
【図８】部分的に周期構造を形成したマイクロプレートの構成を示す断面図および平面図である。
【図９】本発明のバイオチップ（Ａｇ膜厚１３９ｎｍ）を用いて正面照射系で測定した反射率を示すグラフである。
【図１０】本発明のバイオチップ（Ａｇ膜厚１３９ｎｍ）を用いて正面照射系で測定した蛍光強度を示すグラフである。
【図１１】本発明のバイオチップ（Ａｇ膜厚１３５ｎｍ）を用いて正面照射系で測定した蛍光強度を示すグラフである。
【図１２】本発明のバイオチップ（Ａｇ膜厚１３５ｎｍ）を用いて正面照射系で３種類の入射角度について検出角度を変化させて測定した蛍光強度を示すグラフである。
【図１３】本発明のバイオチップ（Ａｇ膜厚３９ｎｍ）を用いて背面照射系で測定した反射率を示すグラフである。
【図１４】本発明のバイオチップ（Ａｇ膜厚３９ｎｍ）を用いて背面照射系で測定した蛍光強度を示すグラフである。
【図１５】本発明のバイオチップ（Ａｇ膜厚３９ｎｍ）を用いて背面照射系で測定した反射率および蛍光強度を示すグラフである。
【図１６】本発明のバイオチップ（Ａｇ膜厚３９ｎｍ）を用いて背面照射系で５種類の入射角度について検出角度を変化させて測定した蛍光強度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下に、添付の図面を参照して本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００２８】
図１は、本発明の実施の形態に係るバイオチップの概略構造を示す断面図である。図１に示したバイオチップ１は、ベース基板２と、ベース基板２の表面に形成された第１接着層３、金属層４、第２接着層５、及び消光抑制層６とを備えて構成されている。本バイオチップ１が使用されるとき、消光抑制層６の表面に二重特異性抗体７を含む溶液が滴下され、消光抑制層６の表面に二重特異性抗体７が結合する。図１は、消光抑制層６の表面に二重特異性抗体７が結合している状態を示す。二重特異性抗体７は、一方の端部７ａが消光抑制層６に結合（以下「認識」とも記す）し、他方の端部７ｂが特定の生体分子に結合する。
【００２９】
本バイオチップ１は、消光抑制層６の表面に二重特異性抗体７が結合した状態で、検出対象を含む溶液を搭載し、二重特異性抗体７の消光抑制層６に結合していない端部７ｂを、対象の生体分子と結合させた状態で、図２に示したように、バイオチップ１の正面または背面から所定波長の光Ｌin1、Ｌin2が照射される。これによって、表面プラズモン共鳴が発生し、対象の生体分子に結合された例えば蛍光標識タンパク質８からの増強された蛍光Ｌpを検出することができる。
【００３０】
ベース基板２は、表面に周期的構造である格子が形成されている。ベース基板２は、入射光および放射される蛍光に対して透明な材質、例えばガラス、プラスチックなどで形成されていれば、正面および背面の何れからの照射においても使用できる。光の照射と検出を同じ側から行うのであれば、ベース基板２は透明である必要はない。
【００３１】
周期構造は、例えば一方向に沿ってほぼ等間隔に配置された複数の溝を有する形状であり、溝は、例えば鋸歯状溝、正弦波状溝、矩形状溝である。上記した特許文献３に開示されたマイクロプレートと同様に形成することができる。ナノスケールの周期構造をもつ周期構造は、例えば、特許第３３５０７１１号公報、特許第２８３２３３７号公報、特開２００４−１１７８１０号公報などに開示されている方法を使用して形成することができる。プラスチックであれば、型を用いたプレス成型や、光硬化樹脂を用いてナノインプリントによって形成することもできる。
【００３２】
具体的には、ベース基板２の表面の周期構造は、断面形状が図３に示した矩形状である。周期構造の周期（ピッチとも記す）、即ち隣接する溝の間隔（Ｍ＋Ｖ）は、観察に使用する波長以下、例えば１０〜１０００ｎｍ（ナノメートル）であり、好ましくは１００〜６００ｎｍである。周期構造の高さｄ（溝の深さ）は４〜４００ｎｍ、アスペクト比ｄ／Ｖは０．００５〜１０である。周期に対する凸部の長さの割合をＭ％、周期に対する凹部の長さの割合をＶ％として、Ｍ／（Ｍ＋Ｖ）でデューティ比を定義する。望ましい溝の深さｄは２０〜４０ｎｍであり、望ましいデューティ比は０．５である。
【００３３】
第１接着増３は、ベース基板２と金属層４を接着するための層であり、ベース基板２が安定して金属層４と固着する材質であれば省略することができる。例えば、膜厚０．１〜３ｎｍの薄膜として形成される。
【００３４】
金属層４は、金、銀、銅、プラチナ、ニッケルなどの遷移金属であることが好ましく、例えばスパッタによって形成される。金属層４の膜厚は、１０〜５００ｎｍが好ましく、より好ましくは５０〜２００ｎｍである。しかし、金属層４は、遷移金属に限定されず、表面プラズモンを発生可能な金属であればよく、その場合にも膜厚は１０〜５００ｎｍが好ましく、より好ましくは５０〜２００ｎｍである。
【００３５】
ベース基板２の表面に、スパッタなどによって金属層４を形成した場合、図４に示すように周期構造の段差部分に対応する部分が傾斜（以下、この部分をスロープＳＬという）して、金属層４は山（Ｍ％）、谷（Ｖ％）、スロープ（ＳＬ％）から構成される。図４において、第１接着増３は省略している。また、後述する金属層４の上の消光抑制層６も同様の形状に形成される。
【００３６】
第２接着増５は、金属層４と消光抑制層６を接着するための層であり、金属層４が消光抑制層６と安定して固着する材質であれば省略することができる。例えば、膜厚０．１〜３ｎｍの薄膜として形成される。
【００３７】
消光抑制層６は、抗体と結合する抗体結合層でもあり、酸化亜鉛（ＺｎＯ）で形成されている。酸化亜鉛は、通常観察に使用される入射光や発生する蛍光の波長領域で吸収を持たず（若しくは吸収の少ない）、透明な薄膜として形成することができる。例えば、スパッタによって形成する。表面プラズモン励起増強蛍光法の特徴である増強蛍光は、蛍光分子と金属との距離が近いと、強い励起場で励起された蛍光も金属表面にエネルギー移動して消光されてしまう。従って、試料を金属層４から所定距離だけ離隔させて消光を抑制することが必要である。また、表面プラズモン共鳴による励起場は近接場であるために、金属表面から離れるにしたがってその電場強度は減衰するため、金属表面からおよそ１００ｎｍ以内に存在する蛍光分子のみが効率よく励起される。そのために、消光抑制層６の膜厚は、約１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲で金属層４の種類、消光抑制層６の屈折率、光の波長などに応じて決定される。酸化亜鉛は屈折率がＳｉＯ２より大きく、消光抑制層の最適な膜厚はＳｉＯ２より薄くなることが期待できる。たとえば、膜厚の最適値は、金属層４が銀で消光抑制層６が酸化亜鉛で、６３３ｎｍの波長の励起光を用いた場合１０〜５０ｎｍであり、より好ましくは１０〜３０ｎｍである。
【００３８】
通常、試料を含む水溶液（燐酸緩衝液など）をバイオチップ１上に搭載して観測する。従って、金属層４に銀を使用する場合には、水中で非常に不安定な銀を保護するために、ベース基板２と銀との間および銀と消光抑制層６（ＺｎＯ）との間に、酸化を防止する層（酸化防止層）を形成することが望ましい。なお、酸化防止層は、少なくとも銀と消光抑制層６との間にあればよい。酸化防止層を別途に形成する代わりに、第２接着層５に酸化防止層としての機能を持たせてもよい。第１接着層３及び第２接着層５を、例えばクロム（Ｃｒ）、アルミニウム、チタン、パラジウムなどで形成すれば、銀を保護できる。
【００３９】
上記のように形成された、バイオチップ１を用いて生体分子の相互作用を検出する場合、消光抑制層６であるＺｎＯの表面に二重特異性抗体７を結合させ、さらに蛍光標識タンパク質８で修飾した生体分子（図示せず）の蛍光標識タンパク質８を二重特異性抗体７に結合させる。例えば、ＺｎＯの表面に、二重特異性抗体７を含む溶液を滴下し、さらに蛍光標識タンパク質８を含む溶液を滴下する。なお、本明細書では、「蛍光標識タンパク質」とは、蛍光試薬で標識されていない蛍光タンパク質をも意味する。また、蛍光標識タンパク質８の代わりに、二重特異性抗体７に抗原を結合させ、さらにこの抗原に蛍光標識された二次抗体を結合させてもよい。
【００４０】
蛍光標識タンパク質８は、例えばＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）である。その場合、二重特異性抗体７には、例えば、酸化亜鉛結合性ラクダ抗体４Ｆ２と抗ＧＦＰラクダ抗体ｃＡｂＧＦＰ４を融合させた二重特異性抗体４Ｆ２−ＧＦＰ４  ＶＨＨダイマーを使用する（特許文献４参照）。これはＺｎＯとＧＦＰを認識する部位をもつ二重特異性抗体である。分子量は３１５６２、吸光係数は４３１００である。ＧＦＰを二重特異性抗体７に結合させた後に、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）を含む燐酸緩衝溶液でリンスすることによって、ＧＦＰのＺｎＯへの非特異吸着を抑制することができる。これは、燐酸緩衝溶液中では、ＧＦＰはＺｎＯに殆ど吸着しないからである。
【００４１】
本バイオチップ１は、光の入射および検出方向によって、望ましい条件が異なる。具体的には、Ｃｒの第１接着層３は膜厚１ｎｍ以下、Ｃｒの第２接着層５は膜厚約１ｎｍ、Ａｇの金属層４は膜厚１０〜５００ｎｍであり、正面照射系（消光抑制層側から光を入射）ではＡｇの膜厚約１５０ｎｍ以上が望ましく、背面照射系（ベース基板側から光を入射）ではＡｇの膜厚約３０〜４０ｎｍが望ましい。ＺｎＯの消光抑制層６は、抗体結合層でもあり、膜厚は約１０〜２０ｎｍが望ましい。
【００４２】
また、後述するように、本バイオチップ１を使用する場合、適切な入射角度θin及び検出角度θoutで蛍光を検出することが望ましい。適切な入射角度θin及び検出角度θoutは分散曲線、ドルーデモデルを用いて、ある範囲で予想できるが、正確な角度は反射率の入射角依存性の計測および蛍光強度の検出角依存性の計測によって求めることができる。ピッチ４８０ｎｍのチップでＨｅ−Ｎｅレーザー光（波長６３３ｎｍ）を正面照射系で使用する場合には、例えば入射角度θin1は約１０°〜１６°が望ましく、約１４°が最も望ましい。また、検出角度θoutは約５〜９°が望ましく、約７°が最も望ましい。ピッチ４８０ｎｍのチップで上記と同じ波長の入射光を背面照射系で使用する場合には、例えば入射角度θin2（図２参照）は約１２〜３０°が望ましく、約２３°が最も望ましい。また、検出角度θoutは約５〜９°が望ましく、約７°が最も望ましい。
【００４３】
望ましい入射角度θin及び検出角度θoutは、本バイオチップ１のピッチと入射光の波長とに依存するが、ピッチ４８０ｎｍ、波長６３３ｎｍ以外の場合には、次のように決定することができる。励起光の波長より４０ｎｍ程度長波長側で蛍光検出をする場合において、検出角度θoutは正面照射系でみられる共鳴角Ｙ°の＋６±１°か−６±１°に設定するとよい。たとえば、６３３ｎｍの光で励起する場合、約３００〜約４３０ｎｍあるいは約６３０〜約８００ｎｍのピッチをもつ本周期構造では、正面照射系の共鳴角＋６±１°（Ｙ＋６−１≦θout≦Ｙ＋６＋１）に、約４３０〜約６３０ｎｍのピッチをもつ本周期構造では、正面照射系の共鳴角−６±１°（Ｙ−６−１≦θout≦Ｙ−６＋１）に検出角を設定すればよい。なお、４３０ｎｍのピッチ付近、より正確には約４２０〜約４４０ｎｍのピッチでは、正面照射系の共鳴角Ｙと検出角度θoutとの和が６±１°になるように、検出角度を設定することが望ましい（Ｙ＋θout＝６±１）。したがって、正面照射系の共鳴角Ｙに対して、−Ｙ＋６−１≦θout≦−Ｙ＋６＋１、およびθout≧０を満たすように、検出角度θoutを設定することが望ましい。
【００４４】
また、背面照射系の場合、検出角度θoutは共鳴角Ｚ°とすると、たとえば、ベース基板にポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）を使用し、６３３ｎｍの光で励起する場合、約３００〜約３８０ｎｍあるいは約６６０〜約７６０ｎｍのピッチをもつ本周期構造では、背面照射系の共鳴角＋１８±１°（Ｚ＋１８−１≦θout≦Ｚ＋１８＋１）に、約４４０〜約５６０ｎｍのピッチをもつ本周期構造では、背面照射系の共鳴角−１８±１°（Ｚ−１８−１≦θout≦Ｚ−１８＋１）に検出角を設定すればよい。約３８０〜約４４０ｎｍのピッチでは、背面照射系の共鳴角Ｚと検出角度θoutとの和が１８±１°になるように、検出角度を設定する（Ｚ＋θout＝１８±１）。したがって、背面照射系の共鳴角Ｚに対して、−Ｚ＋１８−１≦θout≦−Ｚ＋１８＋１、およびθout≧０を満たすように、検出角度θoutを設定する。約５６０〜約６６０ｎｍのピッチでは、背面照射系の共鳴角Ｚと検出角度θoutとの和が６５±６°になるように、検出角度を設定する（Ｚ＋θout＝６５±５）。したがって、背面照射系の共鳴角Ｚに対して、−Ｚ＋６５−６≦θout≦−Ｚ＋６５＋６、およびθout≧０を満たすように、検出角度θoutを設定する。
【００４５】
図５に、正面照射系において、励起光の波長が６３３ｎｍの場合に周期構造のピッチに対する共鳴角および蛍光ピークが現れる検出角度の関係を示す。図５において、シミュレーション結果を曲線で表し、共鳴角の実験値を黒点とエラーバーで表している。実線が共鳴角を表し、破線が蛍光ピークが現れる検出角度を表す。図５のグラフから、上記の正面照射系における角度条件が適切であることが分かる。
【００４６】
また、図６に、背面照射系において、ベース基板がＰＭＭＡとＳｉＯ２の場合を示しており、励起光の波長が６３３ｎｍの場合に周期構造のピッチに対する共鳴角の関係を示す。図６においても、シミュレーション結果を曲線で表し、共鳴角の実験値を黒点とエラーバーで表している。近接する２本の点線のうち、左側はベース基板がＰＭＭＡの場合を表し、右側はベース基板がＳｉＯ２の場合を表す。なお、検出角は図５の破線に従う。図６の近接する２本の点線のうち左側の点線と、図５の破線とから、上記の背面照射系における角度条件が適切であることが分かる。
【００４７】
以上、本発明の実施の形態を説明したが、本発明は上記の実施の形態に限定されず、種々変更して実施することができる。例えば、周期構造の形状は、上記した一方向に溝を有する形状に限定されず、ベース基板の表面に交差する２方向に溝を形成した２次元周期構造や円形（フレネル）の周期構造であってもよい。図７は、２次元周期構造が形成されたベース基板２’の平面図である。ベース基板５’の表面には、複数の溝部９が直交する２方向に、即ち凸部１０が直交する２方向に配列している。溝９を形成する２方向は、直交していなくてもよく、斜めであってもよい。
【００４８】
また、図８（上側は縦断面図、下側は平面図）に示したように、ベース基板２”の表面上の、アレイ状に配置された複数の領域１１に周期構造を形成した後、ベース基板２”の上に金属層４’、消光抑制層６’を順に形成すればよい。このとき、全ての領域１１において周期構造の溝を同じ方向になるように形成することが望ましい。蛍光マイクロプレートリーダーで観測する場合、これらの複数の領域１１の上に微量の試料をスポッティングして観測する。
【００４９】
また、図８では、ベース基板２”の表面全体に金属層４’および消光抑制層６’を形成しているが、これに限定されず、少なくとも周期構造が形成された領域１１の上に金属層４’および消光抑制層６’が形成されていればよい。また、各領域１１に、図７に示した２次元周期構造を形成してもよい。
【００５０】
また、本バイオチップ１と、二重特異性抗体７を含む溶液を封入したカプセルとを、少なくとも含むキットとして提供してもよい。その場合、カプセルの溶液をバイオチップ１の消光抑制層６の表面に滴下させて、二重特異性抗体７を消光抑制層６の表面に結合させて、抗原抗体反応の検出に使用すればよい。
【実施例１】
【００５１】
以下に、実施例を示し、本発明の特徴をさらに明らかにする。
【００５２】
ベース基板にナノインプリントによる光硬化性樹脂を用いて周期構造を形成し、その上に、Ｃｒ（第１接着層）／Ａｇ（金属層）／Ｃｒ（第２接着層）／ＺｎＯ（消光抑制層）の４層を成膜した。周期構造は、周期（Ｍ＋Ｎ）が約４８０ｎｍ、デューティ比（Ｍ／（Ｍ＋Ｖ））が約０．６である。第１接着層の厚さは１ｎｍ未満、第２接着層の厚さは１ｎｍ、消光抑制層（ＺｎＯ）の厚さは１８ｎｍである。そして、Ａｇの厚さを変えて実験した。
【００５３】
実験に使用した試料は次のとおりである。
抗原として、ＧＦＰを用い、ＧＦＰ  ２．２μＭ（１ｍｇ／ｍＬを１００ｍＬ＋Ｃｙ５  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔで反応後カラムを通して１．１ｍＬ×２本（２：１で）回収）（分子量２６７９５／吸光係数１８７００）を１０倍希釈したものを標準試料（Ｔｗｅｅｎ入り緩衝溶液で調製）とした。
抗体として、上記した二重特異性抗体４Ｆ２−ＧＦＰ４  ＶＨＨダイマー（分子量３１５６２／吸光係数４３１００）１μＭを用いた。
緩衝溶液は、１０ｍＭのｐｈｏｓｐａｈｔｅ（ｐＨ７．５）／２００ｍＭのＮａＣｌの混合溶液を用いた。ＧＦＰ注入からは、１０ｍＭのｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．５）／２００ｍＭのＮａＣｌ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（Polyoxyethylene(20) sorbitan monolaurate）：界面活性剤）の混合溶液を用いた。
【００５４】
ＳＰＲ−ＳＰＦＳ（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）計測プロセスは、次のステップ１〜ステップ５の順序で行った。
【００５５】
ステップ１：緩衝溶液を注入後に測定（バックグラウンドの計測）
ステップ２：１μＭの二重特異性抗体３０μｌを注入し、二重特異性抗体が基板に結合した後（１０分から２０分インキュベーション）に測定
ステップ３：１０ｍＭの緩衝溶液（二重特異性抗体Ｒｉｎｓｅ）４０μｌを注入し、基板に結合しなかった二重特異性抗体を除去した後に測定
ステップ４：２２０ｎＭのＣｙ５標識ＧＦＰ  ３０μｌを注入し抗原抗体相互作用が十分に平衡状態になった１０分経過後に測定
ステップ５：Ｔｗｅｅｎ入り緩衝溶液（ＧＦＰ  Ｒｉｎｓｅ）４０ｍｌを注入し、基板に結合しなかったＧＦＰを除去後に測定
上記の条件で作製したバイオチップを正面照射系で用い、波長６３３ｎｍの光を入射して測定した。図９は、Ａｇの厚さを１３９ｎｍにしたときの、反射率Ｒ（％）を示すグラフである。Ａｉｒは界面が空気での測定値であり、Ｂｕｆｆｅｒは界面が緩衝溶液の測定値である。
【００５６】
図１０は、図９と同じチップを使用して、２２０ｎＭのＣｙ５標識ＧＦＰ（Ｃｙ５−ＧＦＰ）をＲｉｎｓｅ（ステップ５）後に測定した蛍光強度を示すグラフである。入射方向と検出方向の成す角度（入射角度θin1と検出角度θoutの和）を５５°にして測定した。「Grating chip」は、図９と同じチップを使用した結果である。「ZnO-coated Glass slide」は、周期構造を形成していない平板ガラス上にＺｎＯを形成したものを使用した結果である。
【００５７】
図１１は、Ａｇを厚さ１３５ｎｍに形成したチップを使用し、図１０と同様に測定したときの、蛍光強度を示すグラフである。最大ピークの入射角度は１４°であるので、このときの検出角度は４１°である。
【００５８】
図１２は、図１１と同じチップを使用して、３種類の入射角度（図１１において下向きの矢印で示す１４°、１８°、２０°）に対して検出角度を変化させて測定した結果を示すグラフである。図１１のピーク値は、図１２の白丸で示した値に対応する。図１２から、何れの入射角度の場合にも、検出角度が７°のときに蛍光強度が最大となることが分かる。これは、蛍光がプラズモンと再結合することによって増強する結果を利用するものである。また、検出される蛍光強度のピーク値は、入射角度に依存するが、検出角度にはほとんど依存しないことが分かる。入射角度が１４°、検出角度が７°の場合に最大の検出感度が得られる。
【００５９】
同様に、Ａｇの厚さを変えたチップを用いて蛍光強度を測定した結果を表１に示す。
【００６０】
【表１】
0005544653.tif 000002
【００６１】
表１において、周期構造「あり」は、本発明のチップを使用した場合であり、周期構造「なしは」平板ガラスを用いた場合である。全てＺｎＯをコーティングしている。抗体「あり」は、上記の二重特異性抗体を使用し、ステップ１〜５を全て行った場合であり、抗体「なし」は、上記の二重特異性抗体を使用しなかった場合、即ちステップ２及び３を行わなかった場合である。蛍光強度１は、入射角度を１４°、検出角度を４１°にして測定した結果であり、蛍光強度２は、入射レーザーの強度を蛍光強度１の場合の４倍にし、入射角度を１４°、検出角度を７°にして測定した結果である。なお、同等に作製したチップを用いても測定した日によって値が±２０％以内で変動するので、同日の測定結果を比較できるように、異なる日に測定した結果に下線を引いている。
【００６２】
表１の、第１行〜第５行から、溶液中では光とのカップリングは大きくない（３０%）が、銀の膜厚が大きいほどＣｙ５−ＧＦＰの蛍光強度が高くなった。
【００６３】
一方、Ａｇの厚さが同等である本発明のチップを用いた結果である第５行（上段の値）と第６行の値とを比較すると、蛍光強度が約７０倍増大している。これは、二重特異性抗体による特異結合をプラズモン増強により高感度検出する効果であるが、第７行と第９行の比較および第１０行（上段の値）と第１１行の比較では約６倍しか増大していないことを考慮すると、二重特異性抗体と本発明の周期構造を有するチップとの相乗効果と言える。
【００６４】
また、第４行と第１０行（上段の値）とを比較すると、蛍光強度が約７０〜８５倍増大している。これは、本発明のチップによる効果、即ち周期構造、Ａｇ及び二重特異性抗体の効果である。
【００６５】
また、第４行と第１０行の蛍光強度２を比較すると、約３００倍増大している。蛍光強度１が７０〜８５倍程度の増強であるのに比べ、大きく増大しているのは、本発明のチップの効果（周期構造、最適なＡｇの膜厚、及び二重特異性抗体の効果）、及び検出角度を７°にすることによる蛍光とプラズモンの再結合の効果である。従って、本発明のチップを使用し観測条件を最適化すれば、蛍光強度を１０００倍に増大させることも可能である。
【実施例２】
【００６６】
実施例１と同様にチップを作製し、背面照射系で、上記のステップ１〜５でＳＰＲ−ＳＰＦＳ計測プロセスを行った。
【００６７】
図１３は、Ａｇの厚さを３９ｎｍ（ＺｎＯの厚さ、周期構造の周期は実施例１と同じ）にしたときの、反射率Ｒ（％）を示すグラフである。図１４は、図１３と同じチップを使用して、Ｃｙ５−ＧＦＰをＲｉｎｓｅ（ステップ５）後に測定した蛍光強度を示すグラフである。検出角度θoutを０°に固定し、入射角度θin2を変化させて測定した。
【００６８】
Ａｇの厚さを変えたチップを用いて蛍光強度を測定した結果を表２に示す。
【００６９】
【表２】
0005544653.tif 000003
【００７０】
表２において、周期構造、抗体の「あり」「なし」の意味は、表１と同じである。
【００７１】
蛍光強度３は、入射角度を２４°、検出角度を０°にして測定した結果である。なお、第１行〜第３行の括弧を付した値は、入射角度を１２．５°として測定した値である（後述する図１５に示す蛍光強度のグラフにある低角側のピーク値に対応）。
【００７２】
表２の、第１行〜第３行から、銀膜厚が小さいほどＣｙ５−ＧＦＰの蛍光強度が大きくなった。
【００７３】
また、Ａｇの厚さが近似する本発明のチップを用いた結果である第１行と第５行とを比較すると、蛍光強度が約５０倍増大している。これは、二重特異性抗体による効果であるが、第６行と第７行との比較、第８行と第９行との比較では約２倍しか増大していないことを考慮すると、二重特異性抗体と本発明の周期構造を有するチップとの相乗効果と言える。
【００７４】
また、第１行と第８行とを比較すると、蛍光強度が約２４倍増大している。これは、本発明のチップによる効果、即ち周期構造、Ａｇ及び二重特異性抗体の効果である。
【実施例３】
【００７５】
実施例２と同様にチップを作製し、背面照射系で、上記のステップ１〜５と同様にＳＰＲ−ＳＰＦＳ計測プロセスを行った。但し、ステップ４において、Ｃｙ５標識ＧＦＰ  ３０μｌを注入してから測定するまでの時間、即ち抗原抗体相互作用が十分に平衡状態に達するまでの待ち時間は、２．２ｎＭ、２２ｎＭまたは２２０ｎＭのＣｙ５標識ＧＦＰを注入した場合には１０分とし、２２ｐＭまたは２２０ｐＭのＣｙ５標識ＧＦＰを注入した場合には３０分とした。
【００７６】
図１５は、Ａｇの厚さを３９ｎｍ（ＺｎＯの厚さ、周期構造の周期は実施例１、２と同じ）にしたときの、反射率Ｒ（％）及び蛍光強度（cps）を示すグラフである。検出角度θoutを０°に固定し、入射角度θin2を変化させて測定した。蛍光強度は、Ｃｙ５−ＧＦＰをＲｉｎｓｅ（ステップ５）後に測定した結果であり、Ｂｕｆｆｅｒは、図１３のＢｕｆｆｅｒと同じデータである。
【００７７】
図１５の蛍光強度のグラフには２つのピークがある。図１５の左側のピークは、ＡｇとＺｎＯとの界面でのＳＰＲによるものであり、右側のピークは、ベース基板とＡｇとの界面でのＳＰＲによるものである。Ａｇの両側のベース基板とＺｎＯとの屈折率が異なるために、ダブルディップのグラフになっている。また、Ａｇの厚さが厚くなると、１つのピークになる。これは、下側（ベース基板とＡｇとの界面）で生じたＳＰＲの影響が表に出てこないからである。１２．５度での左側のピークには、溶液中に浮遊している物質からの光が含まれている可能性があるので、このような影響を受ける可能性がある場合には検出角２３°で検出することが望ましい。
【００７８】
図１６は、図１５と同じチップを使用して、Ｃｙ５−ＧＦＰをＲｉｎｓｅ（ステップ５）後に測定した蛍光強度を示すグラフである。５種類の入射角度θin2（図１５において下向きの矢印で示す１０°、２０°、２４°、３０°、４０°）で検出角度θoutを正負の方向に変化させて測定した。負の角度は、図２において、バイオチップ１の法線よりも左側で蛍光Ｌpを検出することを意味する。図１６において、Ｓ１０、Ｓ２０、Ｓ２４、Ｓ３０、Ｓ４０は、入射角度１０°、２０°、２４°、３０°、４０°に対応する。
【００７９】
図１６では、蛍光強度は検出角度０°を挟んでほぼ対称なグラフになっている。入射角度２０°又は２４°の場合、検出角度の正負によらず約７°で蛍光強度が最大になっている。図１６において下向きの矢印で示した値を比較すると、検出角度７°の値は、検出角度０°の値の約４．５倍増大している。従って、実施例２の表２の結果（検出角度０°）では、本発明のバイオチップを使用すればスライドガラスと比較して約２４倍に増強された蛍光を検出することができたので、検出角度７°で検出すれば、スライドガラスと比較して１００倍に増強された蛍光を検出することができる。
【実施例４】
【００８０】
Ａｇの厚さが３７ｎｍのチップ（ＺｎＯの厚さ、周期構造の周期は実施例１、２と同じ）を作製し、背面照射系で、検出角を６°あるいは７°に設定し、ＧＦＰの濃度を変えてステップ１〜５でＳＰＲ−ＳＰＦＳ計測プロセスを行った。その結果を表３に示す。*を付した列は、最適な検出角にセットし、６３３ｎｍの波長の光を透過させず、６４０ｎｍ以上の光を透過するようなフィルターを挿入したときの結果である。
【００８１】
【表３】
0005544653.tif 000004
【００８２】
第３行と第４行の値を比較すると、２２０ｎＭのＧＦＰ濃度で、検出された蛍光強度に有意な差が見られない。従って、ＺｎＯをコーティングしただけで周期構造を有しない基板では、２２０ｎＭ以下の濃度では特異的結合を検出できない。
【００８３】
これに対して、第１行と第２行の値を比較すると、何れの濃度においても検出感度に数十倍から百倍の違いがある。即ち、本発明の周期構造を有する基板では、２２ｐＭの低濃度まで特異的結合を区別できる。このことから、本発明が、低濃度の抗原の特異的結合を検出する上で有効であることがわかる。
【符号の説明】
【００８４】
１    バイオチップ
２、２’、２”  ベース基板
３    第１接着層
４、４’  金属層
５  第２接着層
６、６’  消光抑制層
７    二重特異性抗体
８    蛍光標識タンパク質
９    溝部
１０  凸部
１１  周期構造が形成された領域
Ｌin1、Ｌin2  照明光
Ｌp    プラズモン励起増強蛍光
【図１】
0005544653.tif 000005
【図２】
0005544653.tif 000006
【図３】
0005544653.tif 000007
【図４】
0005544653.tif 000008
【図５】
0005544653.tif 000009
【図６】
0005544653.tif 000010
【図７】
0005544653.tif 000011
【図８】
0005544653.tif 000012
【図９】
0005544653.tif 000013
【図１０】
0005544653.tif 000014
【図１１】
0005544653.tif 000015
【図１２】
0005544653.tif 000016
【図１３】
0005544653.tif 000017
【図１４】
0005544653.tif 000018
【図１５】
0005544653.tif 000019
【図１６】
0005544653.tif 000020