(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量マーカーであって、イムノグロブリン結合ドメインを有する一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子がリンカーを介して複数個連結されたポリプロテインと、該ポリプロテインの発現宿主が前記リンカーを切断した分解生成物とを含有し、前記ポリプロテインはそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入され、該Ｃｙｓ残基同士がジスルフィド結合を介して結合していることを特徴とする分子量マーカー。
【請求項２】
請求項１に記載の分子量マーカーであって、前記ポリプロテインは前記一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子が２乃至７個連結していることを特徴とする分子量マーカー。
【請求項３】
請求項１又は２のいずれかに記載の分子量マーカーであって、前記イムノグロブリン結合ドメイン分子が、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡ由来の抗体結合ドメイン、ＧｒｏｕｐＧストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）Ｇ１４８のＧタンパク質（ＳｐＧ）由来のＢ１ドメイン、ファインゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ）由来のＬタンパク質よりなる群から選ばれたものである分子量マーカー。
【請求項４】
請求項３に記載の分子量マーカーであって、前記スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡ由来の抗体結合ドメインが、下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする分子量マーカー。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
【請求項５】
請求項３に記載の分子量マーカーであって、前記ＧｒｏｕｐＧストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）Ｇ１４８のＧタンパク質（ＳｐＧ）由来のＢ１ドメインが、下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする分子量マーカー。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
【請求項６】
請求項３に記載の分子量マーカーであって、前記ファインゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ）由来のＬタンパク質が、下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする分子量マーカー。
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
【請求項７】
請求項１に記載の分子量マーカーであって、以下の表に記載される分子量の単量体および二量体を有するものである、分子量マーカー。
0005645155.tif 000003
【請求項８】
分子量マーカーを作製する方法であって、
イムノグロブリン結合ドメインを有する一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子がリンカーを介して複数個連結されたポリプロテインを作成する工程と、
該ポリプロテインの発現宿主が前記リンカーを切断することにより複数の分子量を有する分子量マーカーを作製する工程と
を有し、前記ポリプロテインはそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入され、該Ｃｙｓ残基同士がジスルフィド結合を介して結合していることを特徴とする分子量マーカー作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノグロブリン結合ドメインを有するタンパク質を含有する分子量マーカー及びその作製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来のタンパク質の電気泳動には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥやｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥなどがある。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、タンパク質を変性剤で処理することにより、非天然の状態で分子量に依存した分離を行う方法である。この方法によれば、分子量マーカーは正確な分子移動度を示すことができる。一方、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥは、タンパク質を変性剤で処理せず、天然の状態で分離を行う方法である。この方法によれば、タンパク質を天然の状態で分離できるが、等電点により移動度が異なるため、正確な分子量に依存した移動度を示すことができないという欠点がある。
また、タンパク質の機能分析の主要な方法にウェスタンブロット法がある。これは、目的タンパク質に特異的な抗体（１次抗体）と１次抗体に対する化学標識がされた抗体（２次抗体）を用いる手法である。しかし、ウェスタンブロット法では分子量マーカーの検出にも各々の多様な抗体が必要であり、有用な分子量マーカーが少ないのが現状である。
【０００３】
下記の特許文献１には、プロテインＡのＡＢドメインの遺伝子を１〜６個挿入したプラスミドをそれぞれ作製し、それらのプラスミドで形質転換した大腸菌ＪＭ１０９から得られるタンパク質を同量ずつ混合してウェスタンブロット用分子量マーカーを作製することが開示されている。
【０００４】
また、下記の特許文献２には、サルモネラ菌鞭毛線維タンパク質にギ酸を加えて溶解し、ＢｒＣＮ（ブロモシアン）のギ酸の溶液を加えて断片化反応を行い、この断片化反応によって得られた反応混合物から種々の分子量をもつタンパク質を得る分子量マーカー作製方法が開示されている。これは、一つの分子量を有するタンパク質が化学的又は酵素的に断片化されて得られる断片を、異なる分子量を持つマーカータンパク質として利用するものである。これによれば、複数のマーカータンパク質を個別に生成して混合する手間を省略することができ、コスト的にも優位性があるものである。
【０００５】
さらに、下記の特許文献３には、精製したＴｙｐｅＩ  ＣＡＴをスルホヒドリル基を有する化合物が存在しない酸化状態で約３０日間放置して、ＴｙｐｅＩ  ＣＡＴの会合体からなる分子量マーカーを作製することが開示されている。これは、同一サブユニットから構成される多量体タンパク質を用いることにより、サブユニット間の等電点を同一にし、天然の状態においても分子量に依存した移動度を示すことができるものである。
【特許文献１】特開平５−３２６９９
【特許文献２】特開平２−２５７４５
【特許文献３】特開平７−５３５８９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記の特許文献１乃至３に開示されている分子量マーカー作製方法では、タンパク質をそれぞれ精製することや精製後に種々の処理をしなければならず、調製のための設備や多くの時間と費用を必要とするという問題点がある。すなわち、上記特許文献１に開示された分子量マーカー作製方法では、６種類の分子量をもつタンパク質をそれぞれ精製することが必要であり、またそれらのタンパク質を混合することも必要となる。また、上記特許文献２に開示された分子量マーカー作製方法では、タンパク質の精製後にそのタンパク質を化学的又は酵素的に切断することが必要となる。さらに、上記特許文献３に開示された分子量マーカー作製方法では、タンパク質の精製後にサブユニットを会合させることが必要であり、それには約３０日間も要してしまう。
【０００７】
本発明は上記のような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は短時間で簡便に低コストで作製することが可能な分子量マーカー及びその作製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明による分子量マーカー及びその作製方法は、上記の目的の少なくとも一部を達成するために以下の手段をとった。
【０００９】
本発明の分子量マーカーは、イムノグロブリン結合ドメインを有する一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子がリンカーを介して複数個連結されたポリプロテインと、該ポリプロテインの発現宿主が前記リンカーを切断した分解生成物とを含有する、ことを要旨とする。
これにより、ポリプロテインとその分解生成物を同時に得ることができる。その結果、特別な精製方法を経ずに一回のクロマト精製を行うだけで異なった分子量をもつマーカータンパク質から構成された分子量マーカーを作製することができるので、短時間で簡便に低コストで分子量マーカーを作製することができる。また、分子量マーカーは一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子からなるので、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのように変性剤を用いるときだけでなく、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥのように変性剤を用いないときでも分子量に依存した移動度を示すことができる。さらに、マーカータンパク質はイムノグロブリン結合ドメインを有するので、ウェスタンブロット法において検出が可能である。また、分解されていないポリプロテインの濃度は大きいので太いバンドとして現れ、分解生成物の濃度は小さいので細いバンドとして現れるため、目的タンパク質の分子量が一見して分かるような分子量マーカーとしての優れた視認性を備えることができる。
【００１０】
また、本発明の分子量マーカーにおいて、ポリプロテインのＣ末端にＣｙｓ残基が導入され、そのＣｙｓ残基同士がジスルフィド結合を介して結合した多量体を含有することを特徴とすることもできる。
これにより、ポリプロテイン同士をジスルフィド結合を介して結合させて、イムノグロブリン結合ドメインを倍数保有させた多量体を作製することができる。その結果、大きい分子量のマーカータンパク質を直接的に作製する必要をなくすことができる。ここで、Ｃｙｓ残基をポリプロテインのＣ末端に導入することで、ポリプロテイン同士をジスルフィド結合を介して結合させやすくすることができる。
【００１１】
また、本発明の分子量マーカーにおいて、ポリプロテインは一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子が２乃至７個連結していることを特徴とすることもできる。
これにより、多くの目的タンパク質に対して分子量マーカーとして利用することができる。
【００１２】
また、本発明の分子量マーカーにおいて、イムノグロブリン結合ドメイン分子が、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡ由来の抗体結合ドメイン、ＧｒｏｕｐＧストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）Ｇ１４８のＧタンパク質（ＳｐＧ）由来のＢ１ドメイン、ファインゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ）由来のＬタンパク質よりなる群から選ばれたものであるものとすることもできる。
【００１３】
また、本発明の分子量マーカーにおいて、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡ由来の抗体結合ドメインが、下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とすることもできる。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
【００１４】
また、本発明の分子量マーカーにおいて、ＧｒｏｕｐＧストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）Ｇ１４８のＧタンパク質（ＳｐＧ）由来のＢ１ドメインが、下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とすることもできる。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
【００１５】
また、本発明の分子量マーカーにおいて、ファインゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ）由来のＬタンパク質が、下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とすることもできる。
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
【００１６】
本発明の分子量マーカー作製方法は、イムノグロブリン結合ドメインを有する一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子をリンカーを介して複数個連結されたポリプロテインを作成し、ついで、該ポリプロテインの発現宿主が前記リンカーを切断することにより複数の分子量を有する分子量マーカーを作製する、ことを要旨とする。
これにより、ポリプロテインとその分解生成物を同時に得ることができる。その結果、特別な精製方法を経ずに一回のクロマト精製を行うだけで異なった分子量をもつマーカータンパク質から構成された分子量マーカーを作製することができるので、短時間で簡便に低コストで分子量マーカーを作製することができる。また、分子量マーカーは一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子からなるので、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのように変性剤を用いるときだけでなく、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥのように変性剤を用いないときでも分子量に依存した移動度を示すことができる。さらに、マーカータンパク質はイムノグロブリン結合ドメインを有するので、ウェスタンブロット法において検出が可能である。また、分解されていないポリプロテインの濃度は大きいので太いバンドとして現れ、分解生成物の濃度は小さいので細いバンドとして現れるため、目的タンパク質の分子量が一見して分かるような分子量マーカーとしての優れた視認性を備えることができる。
【発明の効果】
【００１７】
このように、本発明の分子量マーカー及びその作製方法によれば、ポリプロテインとその分解生成物を同時に得ることができるので、複雑な設備・プロセスを用いることなく短時間で簡便に低コストで分子量マーカーを作製することができる。また、分子量マーカーは一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子からなるので、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのように変性剤を用いるときだけでなく、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥのように変性剤を用いないときでも分子量に依存した移動度を示すことができる。さらに、マーカータンパク質はイムノグロブリン結合ドメインを有するので、ウェスタンブロット法において検出が可能である。また、分解されていないポリプロテインの濃度は大きいので太いバンドとして現れ、分解生成物の濃度は小さいので細いバンドとして現れるため、目的タンパク質の分子量が一見して分かるような分子量マーカーとしての優れた視認性を備えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の分子量マーカーの単量体のマーカータンパク質を示した図である。
【図２】本発明の分子量マーカーの二量体のマーカータンパク質を示した図である。
【図３】本発明の分子量マーカーをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そのゲルをＣＢＢ染色した図である。
【図４】本発明の分子量マーカーのうち特に汎用性が高いと思われるＺｈ（５）Ｃｙｓ、Ｚｈ（６）Ｃｙｓ、Ｚｈ（７）Ｃｙｓを用いてウエスタンブロット法を行った図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の分子量マーカーは、異なる分子量をもつマーカータンパク質から構成させるものである。そして、それぞれのマーカータンパク質は、イムノグロブリン結合ドメインを有するイムノグロブリン結合ドメイン分子を複数タンデムに連結させたポリプロテイン、そのポリプロテインの分解生成物、又はそれらがジスルフィド結合を介して結合した多量体である。さらに、イムノグロブリン結合ドメイン分子同士はリンカーを介して連結されている。なお、ポロプロテインには倍数体を形成する為のＣｙｓを導入することができる。
【００２０】
イムノグロブリン結合ドメイン分子とは、イムノグロブリンを結合することができる領域を含む分子をいう。たとえば、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡ由来の抗体結合ドメイン、Ｇｒｏｕｐ  Ｇ  ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）Ｇ１４８由来Ｇタンパク質（ＳｐＧ）のＢ１ドメイン（ＳｐＧ−Ｂ）、ファインゴルディア・マグナ（ペプトストレプトコッカス・マグナス）（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓ））由来のＬタンパク質等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
配列番号１はプロテインＡ由来の抗体結合ドメイン（Ｚドメイン）、配列番号２はストレプトコッカスＧ１４８由来Ｇタンパク質のＢ１ドメイン、配列番号３はファインゴルディア・マグナ（ペプトストレプトコッカス・マグナス）由来のＬタンパク質を示す。本明細書において、イムノグロブリン結合ドメイン分子には、上記特定のアミノ酸配列で示されるタンパク質だけでなく、これらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが包含される。すなわち、上記アミノ酸配列との相同性が、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。
図１に、一個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質（Ｚｈ（１）Ｃｙｓ）、二個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質（Ｚｈ（２）Ｃｙｓ）、三個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質（Ｚｈ（３）Ｃｙｓ）、四個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質（Ｚｈ（４）Ｃｙｓ）、五個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質（Ｚｈ（５）Ｃｙｓ）、六個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質（Ｚｈ（６）Ｃｙｓ）、ポリプロテインすなわち七個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質（Ｚｈ（７Ｃｙｓ））を示す。
図２に、Ｚｈ（１）Ｃｙｓ二量体のマーカータンパク質、Ｚｈ（２）Ｃｙｓ二量体のマーカータンパク質、Ｚｈ（３）Ｃｙｓ二量体のマーカータンパク質、Ｚｈ（４）Ｃｙｓ二量体のマーカータンパク質、Ｚｈ（５）Ｃｙｓ二量体のマーカータンパク質、Ｚｈ（６）Ｃｙｓ二量体のマーカータンパク質、Ｚｈ（７）Ｃｙｓ二量体のマーカータンパク質を示す。なお、ここでは、二量体を示すが、二量体に限定されず三量体以上の多量体でもよい。
【００２１】
ここで、リンカーとは、イムノグロブリン結合ドメイン分子同士を連結させるペプチドであり、発現宿主に存在するプロテアーゼによって切断可能なペプチドであり、５〜３０個のアミノ酸残基好ましくは５〜１０個のアミノ酸残基を有するペプチドである。たとえば、ＧＰＧＰを含んだ配列にＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）を組み合わせた配列や、（Ｇ４Ｓ）が１〜４回繰り返された配列（（Ｇ４Ｓ）１〜（Ｇ４Ｓ）３）や、ＧＰＧＰが繰り返された配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。なお、リンカーは切断認識部位以外は特に限定されない。切断部位は、通常ＧＰＧＰと考えられるが、その他の部位が少量混在していても良い。また、連結されるイムノグロブリン結合ドメイン分子は好ましくは７個であり、これにより分子量の範囲を７．２ｋＤａ〜１０２．０ｋＤａまでカバーすることができる。さらに、連結されるイムノグロブリン結合ドメイン分子を増やすことで、より広い分子量の範囲をカバーすることができる。
【００２２】
ここで、発現宿主とは導入された遺伝子に基づいてタンパク質を発現するものをいう。たとえば、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＤＨ５アルファ株、ＪＭ１０９株、ＸＬ−１Ｂｌｕｅ株などのタンパク質発現が可能な原核生物（枯草菌、乳酸菌など）や、酵母などのタンパク質発現系が確立できている真核生物（酵母、培養細胞）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、化学的又は酵素的にもポリプロテインを低分子量化できるのはもちろんであるが、発現宿主を利用すれば、発現宿主に遺伝子を導入するだけで発現宿主がポリプロテインを様々なリンカーで切断することができる
【実施例】
【００２３】
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２４】
実施例１：
イムノグロブリン結合ドメイン分子をタンデムに繋いだ遺伝子の構築
下記の方法により、イムノグロブリン結合ドメイン分子としてスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡ由来の抗体結合ドメインであるＺドメイン（Ｚｈ）を採用し、それをクローニングした。具体的にはタンパク質のＣ末端にＣｙｓを導入する為に、大腸菌のＣｙｓのコドンに最適化するようにＴＧＣの塩基配列を含んだオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＺドメインにＣｙｓを導入した。用いたプライマーは配列番号４のセンスプライマーおよび配列番号５のアンチセンスプライマーであり、これらの合成オリゴを作製し、アニールさせた後にｐＣＲ２．１ベクターに導入し、大腸菌ＤＨ５アルファに一般的なリン酸カルシウム法によって形質転換させた。さらにベクターに存在する薬剤耐性マーカーであるアンピシリンによってスクリーニングを行い、目的の遺伝子導入クローンを選択し、Ｚドメインのクローニングを完了した。塩基配列を確認後、配列番号６のセンスプライマーおよび配列番号７のアンチセンスプライマーの合成オリゴを作製し、ＰＣＲで増幅し、制限酵素ＮｃｏＩ、ＸｈｏＩで処理した後にｐＥＴ−２１ｄベクターのＮｃｏＩ、ＸｈｏＩ部位に再度クローニング（サブクローニング）を行い、一個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質をコードする遺伝子（ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（１）Ｃｙｓ）の構築を完了した。
次に、配列番号８のアンチセンスプライマーの合成オリゴを作製し、先に合成した配列番号６のセンスプライマーとの組み合わせで、複数個遺伝子的に連結した形（タンデム）に挿入するＺドメイン遺伝子をＰＣＲで増幅し、ＮｃｏＩ、ＰｃｉＩで処理した後に、ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（１）ＣｙｓのＮｃｏＩ部位にクローニングし、塩基配列を確認して、二個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質をコードする遺伝子（ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（２）Ｃｙｓ）の構築を完了させた。このようにＺドメインの挿入を繰り返すことで、三個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質をコードする遺伝子（ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（３）Ｃｙｓ）、四個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質をコードする遺伝子（ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（４）Ｃｙｓ）、五個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質をコードする遺伝子（ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（５）Ｃｙｓ）、六個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質をコードする遺伝子（ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（６）Ｃｙｓ）、七個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質をコードする遺伝子（ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（７）Ｃｙｓ）を構築した。
これらのイムノグロブリン結合ドメイン分子の連結を担っているリンカーはＧＰＧＰＧＨからなるアミノ酸配列であり、本配列が大腸菌に存在するプロテアーゼによって特異的に認識され、部分分解を起こすことができる。
【００２５】
実施例２：
Ｚｈ（７）Ｃｙｓの製造
ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（７）Ｃｙｓの構築完了後、タンパク質発現大腸菌株であるＢＬ２１（ＤＥ３）に再度、リン酸カルシウム法によって形質転換させ、アンピシリンによってスクリーニング後、ポリプロテインであるＺｈ（７）Ｃｙｓの発現コンストラクトを構築した。Ｚｈ（７）Ｃｙｓの発現としてはｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（７）Ｃｙｓを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）株のフリーズストックから１０μｌを一般的なＬＢ−アンピシリン含有培地１００ｍｌに植菌し、３７℃一昼夜、前培養した。つづいて２５０ｍｌのＬＢ−アンピシリン培地４本に植えつぎ（Ｔｏｔａｌ  １Ｌ）、３７℃で１．５時間培養した。この時点で吸光度測定装置を使って濁度ＯＤ  ６００  ｎｍを測定し、ＯＤ  ＝  ０．４から０．６であることを確認し、最終濃度が１ｍＭになるようにイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えて、３７℃で一昼夜培養し、タンパク質の発現誘導を行なった。これにより、ポリプロテインに導入されているＣｙｓ残基同士がジスルフィド結合を介して結合した多量体のマーカータンパク質を得ることができた。ここで、ＢＬ２１（ＤＥ３）株にタンパク質の発現を誘導し、またポリプロテインに導入されているＣｙｓ残基同士がジスルフィド結合を介して結合するためには、実験温度を３０℃〜３７℃好ましくは３７℃にすることが必要である。発現誘導後、菌体と培養上清を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、培養上清を０．４５μｍのフィルターで濾過したものを粗精製サンプルとした。
精製法としてはＩｇＧセファロース樹脂（ＧＥヘルスケア社）１０ｍｌをオープンカラムに詰めて精製カラムを用意した。カラムの平衡化溶液としてカラム容量の２〜３倍量のＴＳＴ緩衝液（ｐＨ  ８．０）でｐＨが８．０になるまで平衡化し、次にカラム容量の２〜３倍量の０．５Ｍ酢酸溶液（ｐＨ  ３．５）を流し、ｐＨが３．５になるまで平衡化し、このステップを二回繰り返し、最終的にＴＳＴ緩衝液（ｐＨ８．０）でｐＨが８．０になるまで平衡化した（ＴＳＴ→酢酸→ＴＳＴ→酢酸→ＴＳＴ）。粗精製サンプルを自然落下、もしくはペリスタポンプ等でカラムに通し、アフィニティークロマトグラフィーを実施した。
粗精製サンプルのクロマト展開後、１０倍量のＴＳＴ緩衝液（ｐＨ  ８．０）で洗浄し、次に２倍量の０．５Ｍ酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ  ５．５）で洗浄した。洗浄後、溶出緩衝液（０．５  Ｍ酢酸溶液（ｐＨ  ３．５）を用いて５０ｍｌで溶出した。精製過程で各々分取している培養上清、素通り画分、洗浄画分、溶出画分を１５％アクリルアミド濃度ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。電気泳動後のＣＢＢ染色によって、タンパク質の発現様相を確認し、溶出画分にＺｈ（７）Ｃｙｓの発現が確認出来た後で限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４、３０Ｋ）にて濃縮し、ＰＢＳで置換した。ＰＩＥＲＣＥ社のＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）試薬を用いたＢＣＡ法により定量したところ、Ｚｈ（７）Ｃｙｓ融合タンパク質の濃度は８．１８ｍｇ／ｍｌであり、１Ｌの培養から回収できる総タンパク質量は８．１８ｍｇとなった。
【００２６】
実施例３：Ｚｈ（７）Ｃｙｓの分子量の確認
発現精製したポリプロテインであるＺｈ（７）ＣｙｓをＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行った結果、Ｚｈ（１）ＣｙｓからＺｈ（７）Ｃｙｓ、及びそれらのＣｙｓ残基がジスルフィド結合により結合した各二量体が存在していることを確認した。具体的には、１５％アクリルアミド濃度ＳＤＳ−ＰＡＧＥにＺｈ（７）Ｃｙｓを２μｇ／レーンの濃度でアプライし、電気泳動後ＣＢＢ染色を行った結果、下記の表１に示す分子量をもつタンパク質の存在が確認できた。
【００２７】
【表１】
0005645155.tif 000002
【００２８】
上記の表１から分かるように、単量体については、Ｚｈ（１）Ｃｙｓの分子量である７．２ｋＤａ、Ｚｈ（２）Ｃｙｓの分子量である１４．５ｋＤａ、Ｚｈ（３）Ｃｙｓの分子量である２１．７ｋＤａ、Ｚｈ（４）Ｃｙｓの分子量である２９．０ｋＤａ、Ｚｈ（５）Ｃｙｓの分子量である３６．３ｋＤａ、Ｚｈ（６）Ｃｙｓの分子量である４３．５ｋＤａ、Ｚｈ（７）Ｃｙｓの分子量である５０．８ｋＤａのタンパク質の存在が確認できた。さらに、Ｚｈ（１）ＣｙｓからＺｈ（７）ＣｙｓのＣｙｓ残基がジスルフィド結合により結合した各二量体については、Ｚｈ（１）Ｃｙｓ二量体の分子量である１４．５ｋＤａ、Ｚｈ（２）Ｃｙｓ二量体の分子量である２９．０ｋＤａ、Ｚｈ（３）Ｃｙｓ二量体の分子量である４３．５ｋＤａ、Ｚｈ（４）Ｃｙｓ二量体の分子量である５８．０ｋＤａ、Ｚｈ（５）Ｃｙｓ二量体の分子量である７２．６ｋＤａ、Ｚｈ（６）Ｃｙｓ二量体の分子量である８７．０ｋＤａ、Ｚｈ（７）Ｃｙｓ二量体の分子量である１０２．０ｋＤａのタンパク質の存在が確認できた。
【００２９】
図３は、同様にして作製したＺｈ（１）ＣｙｓからＺｈ（７）Ｃｙｓまでの分子量マーカーをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そのゲルをＣＢＢ染色した図面である。ここでは、Ｚｈ（１）ＣｙｓからＺｈ（７）Ｃｙｓまでの分子量マーカーを２μｇずつ１２．５％アクリルアミドゲルに供与して電気泳動を行った後、染色している。各レーンはそれぞれ次のものを示す。すなわち、レーンＭはＢｉｏ−Ｒａｄ社の分子量マーカーを、レーン１はＺｈ（１）Ｃｙｓを、レーン２はＺｈ（２）Ｃｙｓを、レーン３はＺｈ（３）Ｃｙｓを、レーン４はＺｈ（４）Ｃｙｓを、レーン５はＺｈ（５）Ｃｙｓを、レーン６はＺｈ（６）Ｃｙｓを、レーン７はＺｈ（７）Ｃｙｓをそれぞれ示す。各レーンにおける実線で囲まれたバンドは、単量体のマーカータンパク質を示す。また、各レーンにおける点線で囲まれたバンドは、二量体のマーカータンパク質を示す。そして、単量体と二量体のマーカータンパク質を示すバンド以外のバンドは、単量体又は二量体のマーカータンパク質に存在するリンカーに部分切断が起きることにより生じた分解生成物を示す。また、図面の左側に指標となる分子量を示す。
【００３０】
実施例４：
Ｚｈ（７）Ｃｙｓのイムノグロブリン結合ドメインの機能確認
発現精製したポリプロテインであるＺｈ（７）ＣｙｓをＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、アクリルアミドゲルをＰｏｌｙＶｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ＤｉＦｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＶＤＦ）膜に転写後にウエスタンブロットによってＺｈ（７）Ｃｙｓのイムノグロブリン結合ドメインの機能を確認した。すなわち、１５％アクリルアミド濃度ＳＤＳ−ＰＡＧＥにＺｈ（７）Ｃｙｓを２μｇ／レーンの濃度でアプライし、電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に泳動ゲルを電気的に転写させた。転写の条件としてはＡＴＴＯ社のＥｚＢｌｏｔ試薬を用いて１００ｍＡ一定、１時間で反応させた。転写後のＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）で１０分間の洗浄を三回繰り返し、さらにＰＢＳで１０分間の洗浄を三回行う。引き続いて１０％のスキンミルクを室温で１時間反応させることでブロッキング反応を行う。この作業により非特異的な抗体の結合を押さえる。ブロッキング反応後、ＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで１０分間の洗浄を三回繰り返し、さらにＰＢＳで１０分間の洗浄を三回行う。続いてＨＲＰ標識イムノグロブリンを適切な希釈倍率（例えば４０００倍）に３％スキンミルク溶液を用いて調製を行い、室温で３０分間浸透させて反応させる。その後、ＰＢＳＴで１０分間の洗浄を三回繰り返し、さらにＰＢＳで１０分間の洗浄を三回行う。化学発光ＨＲＰ基質を用いてＸ線フィルムに適切な時間で感光させる。イムノグロブリン結合能があれば、各種分子量のバンドがシグナルとして検出され、ウエスタンブロット法におけるマーカーとして機能することが分かる。
【００３１】
図４は、本発明の分子量マーカーのうち特に汎用性が高いと思われるＺｈ（５）Ｃｙｓ、Ｚｈ（６）Ｃｙｓ、Ｚｈ（７）Ｃｙｓを用いてウエスタンブロット法を行った図面である。ここでは、Ｚｈ（５）ＣｙｓからＺｈ（７）Ｃｙｓまでのタンパク質を２μｇずつ１２．５％アクリルアミドゲルに供与し、電気泳動を行った後、アクリルアミドゲルをＰＶＤＦ膜に転写後、１０％スキンミルクで非特異的な検出を抑えるためのブロッキング反応を行った後、検出抗体としてＨＲＰ標識ＧｏａｔＩｇＧ
またはＨＲＰ標識ｍｏｕｓｅＩｇＧを用いて室温で約３０分間反応させた。その後、余分な抗体を洗浄後、化学蛍光基質と反応させ、Ｘ線フィルムに適切な時間露光させたものである。各レーンはそれぞれ次のものを示す。すなわち、レーンＭはＢｉｏ−Ｒａｄ社の分子量マーカーを、レーン１はＺｈ（５）Ｃｙｓを、レーン２はＺｈ（６）Ｃｙｓを、レーン３はＺｈ（７）Ｃｙｓ、レーンＤはオリエンタル酵母社の分子量マーカーをそれぞれ示す。また、図面の左側及び右側に指標となる分子量を示す。
【００３２】
また、上記実施例では一種類の遺伝子（ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（７）Ｃｙｓ）を発現宿主に導入しているが、複数種類の遺伝子（たとえば、ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（３）ＣｙｓとｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（７）Ｃｙｓ）を発現宿主に導入することもできる。
【００３３】
上記結果から分かるように、本発明の分子量マーカー及びその作製方法によれば、ポリプロテインとその分解生成物を同時に得ることができるので、複雑な設備・プロセスを用いることなく短時間で簡便に低コストで分子量マーカーを作製することができる。また、分子量マーカーは一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子からなるので、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのように変性剤を用いるときだけでなく、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥのように変性剤を用いないときでも分子量に依存した移動度を示すことができる。さらに、マーカータンパク質はイムノグロブリン結合ドメインを有するので、ウェスタンブロット法において検出が可能である。また、分解されていないポリプロテインの濃度は大きいので太いバンドとして現れ、分解生成物の濃度は小さいので細いバンドとして現れるため、目的タンパク質の分子量が一見して分かるような分子量マーカーとしての優れた視認性を備えることができる。
なお、本発明の分子量マーカーにおいてポリプロテインにＣｙｓ残基を導入すれば、ポリプロテイン同士をジスルフィド結合を介して結合させて、イムノグロブリン結合ドメインを倍数保有させた多量体を作製することができ、大きい分子量のタンパク質を直接的に作製する必要をなくすこともできる。ここで、Ｃｙｓ残基をポリプロテインのＣ末端に導入すれば、ポリプロテイン同士をジスルフィド結合を介して結合させやすくすることができる。
さらに、本発明の分子量マーカーにおいてポリプロテインを一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子が２乃至７個連結しているものとすれば、多くの目的タンパク質に対して分子量マーカーとして利用することもできる。
また、複数種類の遺伝子（たとえば、ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（６）ＣｙｓとｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（７）Ｃｙｓ）を発現宿主に導入すれば、マーカータンパク質の濃度、すなわちバンドの太さを調節することもできる。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の分子量マーカーの用途としては、たとえば、タンパク質の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）やウエスタンブロット解析としての用途等が挙げられる。等電点に影響されずに分子量に依存した移動度が実現できるので、ＳＤＳ等の変性在中では崩壊してしまうようなタンパク質及び多量体形成タンパク質の正確な分子量解析にも適用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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