(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベータ-アミロイドのＣ−末端部分にインビボで選択的に結合する、ヒト化された、単離した一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体であって、
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．７の配列の可変軽鎖フラグメント（ＶＬ）配列、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１７の配列の可変重鎖フラグメント（ＶＨ）配列
を含む抗体。
【請求項２】
ベータ-アミロイドのオリゴマー化を阻止する；及び／または、ミクログリアによるフィブリル状ベータ-アミロイドの取込みを仲介する、請求項１に記載のｓｃＦｖ抗体。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．２４のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のｓｃＦｖ抗体。
【請求項４】
化学的に修飾された、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ抗体。
【請求項５】
療法薬に連結している、請求項１〜４のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ抗体。
【請求項６】
標識に連結している、請求項１〜５のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ抗体。
【請求項７】
６４Ｃｕに連結している、請求項１〜６のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ抗体。
【請求項８】
請求項１〜７に記載のｓｃＦｖ抗体を使用することを特徴とする、アミロイド症もしくはアルツ
ハイマー病についての対象のスクリーニングまたはアミロイド症もしくはアルツハイマー病の発症についての対象のリスクの判定を行うための方法。
【請求項９】
ＰＥＴイメージングにより作成された画像を用いる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
神経障害の治療、予防および／または進行遅延のための医薬組成物であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ抗体を含む組成物。
【請求項１１】
アルツハイマー病の治療、予防および／または進行遅延のための、ならびに／あるいはアルツハイマー病に対する受動免疫化のための医薬組成物であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ抗体を含む組成物。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の医薬組成物を製造する方法であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ抗体を少なくとも１種類の適切な医薬用キャリヤーと組み合わせる工程を含む方法。
【請求項１３】
鼻内、皮下、クモ膜下に髄液中へ、頭蓋内または静脈内投与に適切な、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ抗体をコードする核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１４に記載の核酸または請求項１５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ抗体を製造する方法であって：
（ｉ）請求項１６の宿主細胞をｓｃＦｖ抗体の合成が可能な条件下で培養し；
（ｉｉ）ｓｃＦｖ抗体を培養物から回収する
工程を含む方法。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ抗体を含む検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体技術の分野、より具体的にはベータ−アミロイドペプチドに対するヒト化抗体の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は加齢性神経変性障害であり、２００６年には２６６０万人に罹患した。予報では、２０５０年までに罹患率が４倍になり、その時点までに世界中で８５人に１人がこの疾患を伴う状態で生活するであろうと推定されている(Brookmeyer et al. (2007))。ＡＤは進行性の認知欠損、たとえば記憶喪失および精神能力衰退として現われる。
【０００３】
ＡＤの病因の中心は、脳におけるベータ−アミロイドペプチド（Ａｂｅｔａ）の蓄積である。Ａｂｅｔａはアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の開裂産物であり、これがアミロイド形成経路において、まずβ-セクレターゼにより、次いでγ-セクレターゼにより、順に開裂する。生成したＡｂｅｔａフラグメントは種々のサイズのものであるが、アミノ酸４０個のペプチド（Ａｂｅｔａ４０）が最も多量に存在する種であり、アミノ酸４２個のペプチド、いわゆるＡｂｅｔａ４２が最も有害な種であると考えられている。Ａｂｅｔａは脳の細胞外空間に蓄積する可能性があり、そこに多段階プロセスで凝集して神経毒性オリゴマーを形成し、最終的に他の物質と一緒にアミロイド斑を生成し、これがアルツハイマー病の典型的な特徴である。
【０００４】
アルツハイマー病の治療に有望な臨床免疫学的方法は受動免疫化であり、この方法ではＡｂｅｔａを脳から除去するためにＡｂｅｔａに対する抗体を対象に投与する。抗Ａｂｅｔａ抗体によるＡｂｅｔａクリアランスに関して３つの異なる機序が提唱されており、これらは相互排他的ではない：（１）フィブリル状Ａｂｅｔａをより毒性の低い形態に触媒変換する(Bard et al. (2000); Bacskai et al. (2001); Frenkel et al. (2000));（２）Ａｂｅｔａ沈着物をオプソニン化して、ミクログリア食作用へ誘導する(Bard et al. (2000); Bacskai et al. (2002); Frenkel et al. (2000);および（３）脳から循環へのＡｂｅｔａ流出を促進する(DeMattos et al. (2001))、いわゆる末梢シンク（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｓｉｎｋ）仮説。
【０００５】
チューリッヒ大学のMohajera et al. (2004)およびGaugler et al. (2005)はＡｂｅｔａに対するマウス抗体を作製し、モノクローナルネズミ抗Ａｂｅｔａ抗体の生物活性をインビボで調べた。
【０００６】
しかし、ネズミモノクローナル抗体はヒトに投与した場合にしばしば免疫原性を生じる。誘発された抗グロブリン応答は、ネズミ抗体の臨床有用性を制限する(Miller et al. (1983); Schroff et al. (1985))。
【０００７】
したがって、Ａｂｅｔａ関連障害、特にアルツハイマー病の治療および／または診断のための新規な非免疫原性である有効抗体が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Brookmeyer R, Johnson E, Ziegler-Graham K, Arrighi HM (2007): Forecasting the global burden of Alzheimer’s disease. Alzheimer's & Dementia: The Journal of the Alzheimer's Association (Vol. 3 (3))
【非特許文献２】Bard, F., Cannon, C., Barbour, R., Burke, R.L., Games, D., Grajeda, H., Guido, T., Hu, K., Huang, J., Johnson-Wood, K., Khan, K., Kholodenko, D., Lee, M., Lieberburg, I., Motter, R., Nguyen, M., Soriano, F., Vasquez, N., Weiss, K., Welch, B., Seubert, P., Schenk, D. and Yednock, T. (2000): Peripherally administered antibodies against amyloid beta-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease. Nat. Med. 6, 916-919
【非特許文献３】Bacskai, B.J., Kajdasz, S.T., Christie, R.H., Carter, C., Games, D., Seubert, P., Schenk, D. and Hyman, B.T. (2001): Imaging of amyloid-beta deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy. Nat. Med. 7, 369-372
【非特許文献４】Frenkel, D., Katz, O. and Solomon, B. (2000): Immunization against Alzheimer’s beta-amyloid plaques via EFRH phage administration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 11455-11459
【非特許文献５】Bacskai, B.J., Kajdasz, S.T., McLellan, M.E., Games, D., Seubert, P., Schenk, D. and Hyman, B.T. (2002): Non-Fcmediated mechanisms are involved in clearance of amyloid-beta in vivo by immunotherapy. J. Neurosci. 22, 7873-7878
【非特許文献６】DeMattos, R.B., Bales, K.R., Cummins, D.J., Dodart, J.C., Paul, S.M. and Holtzman, D.M. (2001): Peripheral anti-Abeta antibody alters CNS and plasma Abeta clearance and decreases brain Abeta burden in a mouse model of Alzheimer’s disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 8850-8855
【非特許文献７】Mohajeri, M.H., Gaugler, M., Martinez, J., Tracy, J., Li, H., Crameri, A., Kuehnle, K., Wollmer, Am.A. and Nitsch, R.M. (2004): Assessment of the bioactivity of Antibodies against beta-amyloid peptide in vitro and in vivo. Neurodegenerative dis. 1, pp. 160-167
【非特許文献８】Gaugler, M., Tracy, J., Kuhnle, K., Crameri, A., Nitsch, R.M. and Mohajeri, M.H. (2005): Modulation of Alzheimer’s pathology by cerebro-ventricular grafting of hybridoma cells expressing antibodies against Abeta in vivo. FEBS Letters 579, pp. 753-756
【非特許文献９】Miller, R. et al. (1983): Monoclonal antibody therapeutic trials in seven patients with T-cell lymphoma. Blood 62:988-995
【非特許文献１０】Schroff, R. et al. (1985): Human anti-murine immunoglobulin responses in patients receiving monoclonal antibody therapy. Cancer Research 45:879-885
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の一般的な目的は、Ａｂｅｔａに、特にＡｂｅｔａのＣ−末端部分に特異的に結合し、かつヒトの免疫系が十分に耐容する抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１観点において、本発明は、ＡｂｅｔａのＣ−末端領域、特にアミノ酸３０〜４０の間（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２６）に選択的に結合する、ヒト化された、または完全ヒト型の、単離した抗体を提供する。この抗体は、Ａｂｅｔａ４２およびＡｂｅｔａ４０の両方に対して高い親和性を示し、さらに、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をインビボで実質的に認識しない。
【００１１】
いわゆるヒト化抗体の利点は、それらがヒトの免疫系の応答を誘発する能力が一般的には最小限であるかまたは無く、したがってヒトに適用した際に免疫原性が低いかまたは無いとみなしうることである。したがって、ネズミ抗体と異なってヒト化抗体は療法目的および臨床適用に適切である。
【００１２】
用語”ヒト化”は、異種抗体の免疫原性を低下させる十分に確立された技術を表わす。ヒト化抗体は、ヒト以外の構造が可能な限り少なく存在するように遺伝子工学的に操作される。１方法は、異種抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトのアクセプター枠組み構造の可変軽鎖ＶＬおよび可変重鎖ＶＨにグラフトさせることに基づく。他の方法では、異種抗体の枠組み構造をヒトの枠組み構造に向けて変異させる。両方の場合とも、抗原結合部分の機能性の維持が必須である。その目的のために、親配列および種々の仮説的なヒト化生成物の三次元モデルを、たとえば当業者に周知の分子モデリングのためのコンピュータープログラムを用いて分析する。この分析により−特に−抗原結合に直接または間接的に関与すると思われる枠組み構造残基を同定することができる。しばしば、抗原結合には少数のドナー枠組み構造残基が重要である；それらが抗原と直接接触するか、またはそれらが特定のＣＤＲのコンホメーションに影響を及ぼすからである(Davies et al (1990); Chothia et al (1987))。したがって、既に存在しない場合には、対応するアクセプター枠組み構造残基を、抗原結合のために重要であると同定されたこれらのドナー枠組み構造残基に向けて変異させることが望ましい。ヒト化抗体は、ヒトの生殖系列レパートリーにもインビボでみられず、ドナーＣＤＲ中またはさらにドナー枠組み構造中にもみられない残基を含むこともできる。
【００１３】
抗体のヒト化の程度は、ヒト化抗体の作製に使用したヒトライブラリーから入手できる元のヒトアクセプター枠組み構造に対する、ヒト化抗体の枠組み構造の配列同一性のパーセントを計算することにより示すことができる。好ましくは、本発明の抗体は、入手できるヒトライブラリーの枠組み構造に対して少なくとも６０％の同一性、より好ましくは（下記の順に）少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、最も好ましくは９５％、またはさらには１００％の同一性をもつ枠組み構造を含む。本発明の概念において、用語”相補性決定領域”または”ＣＤＲ”は、Kabat et al. (1991)が定義したように抗体の抗原結合ループからなる相補性決定領域を表わす。本発明のＣＤＲおよび枠組み構造残基は、Kabatの定義(Kabat et al. (1987)に従って決定される。
【００１４】
本明細書中で用いる用語”抗体”は、全長抗体、たとえばモノクローナル抗体、およびそのいずれかの抗原結合フラグメントまたは一本鎖であって選択した抗原に対して十分な結合能をもつものを表わす。本発明に含まれる抗原結合フラグメントの例には、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント；単一ドメインまたはｄＡｂフラグメント、単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）；場合により合成リンカーによって連結していてもよい２以上の単離したＣＤＲの組合わせ、および一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が含まれる。”全長抗体”にはキメラ抗体が含まれ、それらにおいては、ある由来の抗原結合性可変ドメインが異なる由来の定常ドメインに結合している；たとえば、ネズミ抗体の可変ドメインＦｖがヒト抗体の定常ドメインＦｃに結合している。
【００１５】
前記に挙げた抗体フラグメントは当業者に既知の常法を用いて得られ、それらのフラグメントは無傷抗体と同じ方法で有用性がスクリーニングされる。
本発明において、ＣＤＲはモノクローナルマウス抗体２２Ｃ４に由来する(Mohajeri et al. (2002), J. Biol. Chem. 277, pp. 33012-33017、およびNeurodegenerative Dis. 1 (2004), pp. 160-167)。このネズミ抗体はＡｂｅｔａのＣ−末端部分、より具体的にはアミノ酸３０〜４０内のエピトープ（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２６）に対するものである。
【００１６】
好ましい態様において、抗体は、Ａｂｅｔａ、特にＡｂｅｔａ４０および／またはＡｂｅｔａ４２のターゲットに結合することによりそれらのオリゴマー化を阻止する。
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．１、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．２、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．３、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．４、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．５およびＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．６からなる群の配列に対して少なくとも８０％の同一性をもつ１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む抗体を提供する。
【００１７】
既に述べたように、本発明のＣＤＲ、すなわちＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．１、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．２、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．３、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．４、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．５およびＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．６を適切なアクセプター枠組み構造中にグラフトさせることができる。用語”枠組み構造”は、より多様性のあるＣＤＲ領域間に存在する、抗体可変部の当技術分野で認識されている部分を表わす。そのような枠組み構造領域は、一般に枠組み構造１〜４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）と呼ばれ、三次元空間で抗体の重鎖および軽鎖可変部中にある３つのＣＤＲを保持するための足場を提供し、これによりＣＤＲは抗原結合表面を形成することができる。適切なアクセプター枠組み構造は、好ましくは当技術分野で周知の免疫グロブリン由来の抗原結合ポリペプチドの枠組み構造であり、下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ＶｈＨドメイン、Ｖ-ＮＡＲドメイン、Ｖｈドメイン、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ビス-ｓｃＦｖ、ラクダ（Ｃａｍｅｌ）ＩＧ、ＩｆＮＡＲ、ＩｇＧ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ディアボディー類（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、トリアボディー類（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）およびテトラボディー類（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）(参照：Holliger, P. and Hudson, P. (2005), Nat. Biotechnol. 23(9), pp. 1126-1136)。枠組み構造配列は、ヒトのコンセンサス配列であってもよい。
【００１８】
抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥならびにイソ型を含めたいずれかのクラスの免疫グロブリンから選択され、１より多いクラスまたはイソ型の配列を含むことができる。
【００１９】
好ましくは、抗体は、入手できるヒトライブラリーの枠組み構造に対して少なくとも６０％の同一性、より好ましくは（下記の順に）少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、最も好ましくは９５％、またはさらには１００％の同一性をもつ枠組み構造を含む。
【００２０】
ＣＤＲをヒトの枠組み構造にグラフトさせることができ、得られる抗体はヒト以外のＣＤＲおよびヒトまたは本質的にヒトの枠組み構造を含むので、本発明の抗体は組換え分子である。あるいは、抗体をヒト以外の抗体から誘導し、その枠組み構造をヒト抗体に向けて変異させる。両方の別形態が”入手できるヒトライブラリー”という用語に含まれる。
【００２１】
本発明の１態様において、抗体はｓｃＦｖ抗体である。ｓｃＦｖは、短いリンカーペプチド、たとえば配列ＧＧＧＧＳの１〜４回反復を含むリンカー、好ましくは（ＧＧＧＧＳ）４ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５）、またはAlfthan et al. (1995) Protein Eng. 8:725-731に開示されたリンカーにより連結されたＶＬおよびＶＨドメインを含む全長ｓｃＦｖであってもよく、あるいは単に選択した抗原に対して十分な結合能をもつＶＬまたはＶＨドメインであってもよい。ＶＬとＶＨの連結は、ＶＬ−リンカー−ＶＨまたはＶＨ−リンカー−ＶＬのいずれの配向であってもよい。
【００２２】
１態様において、ｓｃＦｖの枠組み構造は還元性環境で安定かつ可溶性である。これらの特性はＷＯ０１／４８０１７に開示されるいわゆる品質管理システムにより確認できる。それらの抗体の安定性は、好ましくは特に安定なラムダグラフトの安定性の少なくとも半分程度良好であり、より好ましくは少なくともラムダグラフトと同程度に良好であり、最も好ましくはラムダグラフトより良好である。Woern et al. (2000)は、ラムダグラフトの変性の開始がほぼ２．０Ｍ  ＧｄｎＨＣｌであると記載している。品質管理システムにおいて良好な性能を示すｓｃＦｖは酸化条件下でも安定かつ可溶性であることが示された。好ましい態様において、Atha and Ingham (1981)の方法に従って測定した本発明の抗体の溶解度は、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも２０ｍｇ／ｍｌである。
【００２３】
他の好ましい態様において、抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．７、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．８、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１０、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１１、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１２、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１３、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１４、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１５およびＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１６からなる群の配列に含まれる枠組み構造配列と同一であるか、またはそれから誘導される、可変軽鎖フラグメント（ＶＬ）枠組み構造を含む。誘導配列の場合、その配列は、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．７、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．８、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１０、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１１、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１２、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１３、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１４、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１５およびＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１６からなる群の配列に対して少なくとも６０％の同一性、より好ましくは（下記の順に）少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、最も好ましくは９５％、またはさらに１００％の同一性を示す。
【００２４】
他の好ましい態様において、抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１７、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１８、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．２０、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．２１、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．２２およびＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．２３からなる群の配列に含まれる枠組み構造配列と同一であるか、またはそれから誘導される、可変重鎖フラグメント（ＶＨ）枠組み構造を含む。誘導配列の場合、その配列は、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１７、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１８、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．２０、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．２１、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．２２およびＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．２３からなる群の配列に対して少なくとも６０％の同一性、より好ましくは（下記の順に）少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、最も好ましくは９５％、またはさらに１００％の同一性を示す。
【００２５】
配列ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．８、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１０、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１１、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１２、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１３、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１４、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１５、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１６、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．２０、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．２１、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．２２およびＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．２３は、ＷＯ０３／０９７６９７に開示されている。これらの枠組み構造配列はヒト免疫グロブリン起源に由来し、還元性条件下でのそれらの溶解度および安定性の特性はＷＯ０１／４８０１７に開示されるいわゆる品質管理システムで証明された。
【００２６】
より好ましくは、抗体はＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．７のＶＨフラグメントおよびＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１７のＶＬ配列を含む。
最も好ましくは、抗体はＳｅｑ．ＩＤ．Ｎｏ．２４に対して少なくとも６０％同一、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％同一である配列をもつ。最も好ましい態様において、本発明の抗体の構造はＳｅｑ．ＩＤ．Ｎｏ．２４により定められる。この抗体においては、ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．７とＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１７が（ＧＧＧＧＳ）４リンカーにより連結されている。得られたｓｃＦｖ抗体をＥＳＢＡ２１２と命名した。
【００２７】
ＡｂｅｔａのＣ−末端部分への選択的な結合能力を維持した状態で、本明細書に開示する配列とアミノ酸配列が異なるように本発明の配列を変更しうることは、当業者に理解されるであろう。したがって、ヒト化抗体の枠組み構造もＣＤＲ領域も、ドナーＣＤＲまたはアクセプター枠組み構造と厳密に一致する必要はない。それらにおける変更は、１以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を、標準的な技術、たとえば部位特異的変異誘発およびＰＣＲ仲介変異誘発により抗体のヌクレオチド配列に導入することによって形成できる。そのような変異は、種々の目的で、たとえば抗体の結合性、溶解度または安定性の特性を改善するために導入することができる。本発明の抗体は、１以上の非必須アミノ酸残基における保存的アミノ酸置換を含むこともできる。他の態様においては、コード配列全体または一部に、たとえば飽和変異誘発によって変異をランダムに導入し、得られる変異体をそれらが目的ターゲットを結合する能力についてスクリーニングすることができる。
【００２８】
２配列間の同一性パーセントは、２配列の最適アラインメントを得るために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、それらの配列が共有する同一位置の数の関数である。２配列間の配列の比較および同一性パーセントの判定は、数学的アルゴリズムを用いて達成でき、これは当業者に周知である。本明細書中で述べる同一性は、インターネットでアクセスしうるＢＬＡＳＴプログラム(Basic Local Alignment Search Tools;参照：Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410)を用いて判定されるものである。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、言語長さ＝３を用いて、アミノ酸配列を本発明のタンパク質分子と比較することにより実施できる。比較のためのギャップ付きアラインメントを得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されるＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用できる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（たとえばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用できる。
【００２９】
本発明のタンパク質配列を、さらに”質問配列”として用いて公開データベースと対比した検索を実施して、たとえば関連配列を同定することができる。そのような検索は、前記のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実施できる。
【００３０】
本発明に含まれるヒト化された、または完全ヒト型の抗体は下記の特性を示す：
（ｉ）ＡｂｅｔａのＣ−末端に結合し、したがってＡｂｅｔａ４０およびＡｂｅｔａ４２の両方に、高くかつ実質的に等しい親和性で結合する；
（ｉｉ）オリゴマー形およびモノマー形のＡｂｅｔａに対して高い親和性を示す；
（ｉｉｉ）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をインビボで実質的に認識しない；
（ｉｖ）少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも２０ｍｇ／ｍｌの溶解度を有する；ならびに
（ｖ）ヒトに適用した際に低い免疫原性を示すか、または免疫原性を示さない。
【００３１】
さらに、本発明の抗体は好ましくは下記の特性のうち少なくとも１つ、より好ましくは１より多く、最も好ましくはすべてを示す：
（ｖｉ）ミクログリアによるフィブリル状Ａｂｅｔａの取込みを仲介する；
（ｖｉ）ベータ−アミロイド斑を結合する；
（ｖｉｉ）脳のベータ−アミロイド斑を除去し、および／または脳におけるアミロイド斑の形成を阻止する；
（ｖｉｉｉ）発作により生じる、Ａｂｅｔａ毒性、および毒性促進事象に関連するニューロンの易損性（ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ）を軽減する；
（ｉｘ）血液脳関門を越える；ならびに／あるいは
（ｘ）正常な行動を実質的に回復させる；
（ｘｉ）脳のベータ−アミロイドフィブリルを除去し、および／または脳におけるアミロイドフィブリルの形成を阻止する。
【００３２】
本発明の抗体は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をインビボで実質的に認識しない。好ましくは、Ａｂｅｔａに対する結合親和性は、ＡＰＰに対する結合親和性と比較した場合、少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、よりさらに好ましくは少なくとも１０倍、特に好ましくは少なくとも５０倍、最も好ましくは少なくとも１００倍高い。
【００３３】
したがって、本発明の抗体を対象に投与した際、ＡＰＰは結合に対してＡｂｅｔａと競合せず、この抗体は未開裂ＡＰＰの生物学的性質を妨害しない。この特徴は、たとえば中枢神経系における異常なＡｂｅｔａ蓄積および／または沈着に関連する神経障害の診断目的および／または医療処置のために特に興味深い。
【００３４】
本明細書中で用いる用語”神経障害”には下記のものが含まれる−ただし、これらに限定されない−アルツハイマー病、軽度認知障害、失語症、前頭側頭認知症、レーヴィ小体疾患、パーキンソン病、ピック病、ビンスワンゲル病、脳アミロイド血管障害、ダウン症候群、多発梗塞性認知症、ハンチントン病、クロイツフェルト-ヤコブ病、エイズ認知症合併症、うつ病、不安障害、恐怖症、ベル麻痺、てんかん、脳炎、多発性硬化症；神経筋障害、神経腫瘍障害、脳腫瘍、神経血管障害；卒中を含む、神経免疫障害、神経耳科疾患、神経外傷：脊髄損傷を含む、疼痛：神経障害性疼痛を含む、小児神経障害および神経精神障害、睡眠障害、トゥーレット症状群、軽度認知損傷、血管性認知症、多発梗塞性認知症、嚢胞性線維症、ゴーシェ病その他の運動障害、緑内障、ならびに中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患全般。より好ましくは、本発明の抗体はアルツハイマー病、卒中、神経外傷および緑内障の治療、予防、進行遅延または診断に用いられる。
【００３５】
他の観点においては、本発明の抗体を化学的に修飾する。化学修飾により、抗体の特性、たとえば安定性、溶解度、抗原結合特異性または親和性、インビボ半減期、細胞毒性、および組織透過能を変化させることができる。化学修飾は当業者に周知である。本発明の抗体の好ましい化学修飾はＰＥＧ化である。
【００３６】
１態様においては、抗体を療法薬、たとえば毒素または化学療法用化合物にコンジュゲートさせる。抗体を放射性同位体、たとえば−これらに限定されない−２１２Ｂｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１２Ａｔ、２１１Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄおよび１８８Ｒｅに、たとえば免疫療法のためにコンジュゲートさせることができる。
【００３７】
さらに他の態様においては、本発明の抗体を標識に連結させることができる。その標識は抗体の比色検出を可能にすることができる。あるいは、抗体を放射性標識する。最も好ましくは、放射性標識は６４Ｃｕである。
【００３８】
本発明の他の目的は、本明細書に開示する抗体を含む診断用ツールまたは科学的ツールを提供することである。
本発明の抗体は、アミロイド症もしくはアルツハイマー病について対象を診断もしくはスクリーニングする際に、またはアミロイド症もしくはアルツハイマー病の発症に対する対象のリスクを判定する際に使用できる。
【００３９】
さらに他の態様において、本発明にはさらに、有効量の本発明の抗体を対象、好ましくは哺乳動物に投与する段階を含む診断法が含まれる。この方法にはさらに、標識を検出する段階が含まれる。
【００４０】
さらに他の態様において、本発明には、本明細書に記載する抗体を含むイムノアッセイが含まれ、その際、アッセイはインビボまたはインビトロのいずれのイムノアッセイであってもよい。抗体を、液相で、または固相に結合させて使用できる。そのようなイムノアッセイの例には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フローサイトメトリー、ウェスタンブロットおよびマイクロアレイが含まれる。
【００４１】
さらに、本発明には本明細書に開示する抗体を含む検査キットが含まれる。
好ましい態様において、本発明の抗体はミクログリアによるフィブリル状Ａｂｅｔａの取込みを仲介し、これによりインビボでのＡｂｅｔａレベルを低下させる。
【００４２】
さらに他の好ましい態様において、本発明の抗体は、アルツハイマー病を伴う対象において有効量を投与すると認知行動を改善し、未成熟ニューロン数を減少させる。
さらに本発明には、中枢神経系におけるＡｂｅｔａの異常な蓄積および／または沈着を特徴とする神経障害またはアミロイド症、特にアルツハイマー病を治療、予防および／または進行遅延するための、本明細書に開示する抗体を含む医薬組成物が含まれる。
【００４３】
さらに他の態様において、本発明は、前記の神経障害、好ましくはアルツハイマー病の治療、予防および／または進行遅延のための、ならびに／あるいはアルツハイマー病に対する受動免疫化のための医薬組成物を製造する方法であって、本明細書に開示する抗体を少なくとも１種類の適切な医薬用キャリヤーと組み合わせる工程を含む方法を提供する。
【００４４】
好ましくは、本明細書に開示する医薬組成物は、対象の脳におけるＡｂｅｔａ蓄積の影響を阻止および／または軽減する。
本発明の抗体は、医薬的に許容できるキャリヤーと組み合わせて、または１種類以上の他の有効薬剤と組み合わせて投与することができる。有効薬剤は、有機低分子および／または抗Ａｂｅｔａ抗体であってもよい。
【００４５】
本明細書に開示する抗体および／または医薬組成物は、種々の方法で、たとえば静脈内、腹腔内、鼻内、皮下、筋肉内、局所または皮内、頭蓋内、クモ膜下に髄液中へ投与することができる。好ましい適用の種類は、（この順に）鼻内、皮下、静脈内、クモ膜下に髄液中へ、および頭蓋内への投与である。
【００４６】
一般的に用いられる製剤は当業者に既知である。たとえばエアゾール製剤、たとえば鼻スプレー製剤には、保存剤および等張化剤を含む有効薬剤の精製水溶液その他の溶液が含まれる。そのような製剤は、好ましくは鼻粘膜に適合するｐＨおよび等張状態に調整される。
【００４７】
さらに、他の薬剤の同時投与または逐次投与が望ましい。好ましくは、本発明の抗体はアルツハイマー病の症例において正常な行動および／または認知特性を回復させるのに十分な量で存在する。
【００４８】
さらに他の態様において、本発明は、前記に述べた神経疾患の治療、予防および／または進行遅延のための方法であって、その必要がある対象に有効量の本発明の抗体を投与する段階を含む方法を提供する。
【００４９】
本発明の他の目的は、哺乳動物の受動免疫化のための方法であって、本明細書に開示する抗体を哺乳動物に投与する段階を含む方法を提供することである。好ましくは、受動免疫化は抗Ａｂｅｔａ免疫療法の範囲内で実施される。
【００５０】
他の態様において、本発明は、本発明に含まれるアミノ酸配列をコードする配列を含む、単離した核酸配列を特徴とする。そのような核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。
【００５１】
さらに本発明は、本発明のポリペプチド、最も好ましくは抗体をコードするＤＮＡ配列を含む、クローニングベクターまたは発現ベクターを提供する。
さらに、本明細書に開示するアミノ酸配列をコードする配列を含むベクターおよび／または核酸配列を宿した、適切な宿主細胞が提供される。これは原核細胞または真核細胞、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、植物、昆虫または哺乳動物の細胞であってもよい。
【００５２】
本発明の抗体は、組換え分子生物学の分野における日常的な技術を用いて作製できる。ポリペプチドの配列が分かれば、当業者はそれらのポリペプチドをコードする対応するｃＤＮＡを遺伝子合成により作製できる。
【００５３】
他の態様においては、本発明の抗体を製造する方法であって、該抗体をコードするＤＮＡで形質転換した宿主細胞を該抗体の合成が可能な条件下で培養し、そしてその分子を培養物から回収することを含む方法が提供される。好ましくは、この方法は、大腸菌封入体から、または用いたｓｃＦｖ構築体がポリペプチドをペリプラズムへ向かわせるシグナル配列を含む場合には大腸菌ペリプラズムから精製したｓｃＦｖ抗体を提供する。抗体をリフォールディングさせて機能性分子にするための復元工程を含むことが必要な場合がある。
【００５４】
さらに他の態様において、本発明は、その必要がある対象に療法有効量の本明細書に記載するポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を投与する段階を含む処置方法を提供する。
【００５５】
第２観点において、本発明は、下記の段階を含む診断法を提供する：
（ｉ）抗体を標識し；
（ｉｉ）有効量の該抗体を対象に鼻内投与または全身投与し；そして
（ｉｉｉ）対象の身体部分における標識抗体の濃度および／または存在を検出する。
【００５６】
抗体は、Ａｂｅｔａのアミノ酸３０〜４０内に形成されているエピトープに対する本発明のヒト化抗体、好ましくは一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。好ましい態様においては、抗体を陽電子放射性同位体、最も好ましくは６４Ｃｕで標識する。
【００５７】
本明細書中で用いる用語”有効量”は、目的とする効果、たとえば検出可能な信号に達するかまたは少なくとも部分的に達するのに十分な量を表わす。この用途に有効な量は、標識の検出強度、対象の体重、および検査すべき領域の広さに依存するであろう。
【００５８】
好ましくは、対象は哺乳動物である；より好ましくは、対象はヒトである。
身体部分の三次元画像を作成する医療用イメージング技術である陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）は、陽電子放射による放射線の検出に基づく。一般に、生体分子を放射性標識する；たとえばそれに放射性トレーサー同位体を取り込ませる。この標識した生体分子を一般に血液循環中への注入により対象に投与すると、放射性標識した生体分子は目的とする組織に濃縮される。次いで対象をイメージングスキャナーに入れ、これにより陽電子の放射を検出する。
【００５９】
１態様においては、６４Ｃｕ標識抗体を対象に投与し、そして対象をイメージングスキャナーに入れて陽電子放射を検出することにより段階ｉｉｉ）を実施する。
したがって本発明には、本発明の６４Ｃｕ標識抗体を対象に投与する段階を含む、ＰＥＴイメージングのための方法が含まれる。
【００６０】
本発明の配列は下記のものである：
【００６１】
【化１】
0005500730.tif 000002
【００６２】
【化２】
0005500730.tif 000003
【００６３】
【化３】
0005500730.tif 000004
【００６４】
【化４】
0005500730.tif 000005
【００６５】
別途定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語および科学用語は本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解しているものと同じ意味をもつ。本明細書に記載するものと類似または均等な方法および材料を本発明の実施または試験に使用できるが、適切な方法および材料を以下に記載する。矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が支配するであろう。さらに、それらの材料、方法および例は例示のためのものにすぎず、限定のためのものではない。
【００６６】
種々の態様、好ましい形態および範囲を任意に組み合わせうると理解される。さらに、具体的態様によっては、選択した定義、態様または範囲が適用されない場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
以下の詳細な本発明の記述を考慮すると、本発明がより良く理解され、前記に述べたもの以外の目的が明らかになるであろう。そのような記述には添付の図面を参照する。
【図１】図１は、ＥＳＢＡ２１２の軽鎖可変部と、２２Ｃ４由来のＡｂｅｔａ特異的ＣＤＲをグラフトさせたＥＳＢＡＴｅｃｈの枠組み構造２．３のＶＬとの配列比較を示す。
【図２】図２は、ＥＳＢＡ２１２の重鎖可変部ＶＨと、ＥＳＢＡＴｅｃｈの枠組み構造２．３のＶＨとの配列比較を示す。
【図３】図３は、ＥＳＢＡ２１２のＶＨと、マウス２２Ｃ４抗体由来の原ＶＨとの配列アラインメントを示す。
【図４】図４は、ＥＳＢＡ２１２、２２Ｃ４および枠組み構造のＶＨの配列アラインメントを示す。
【図５】図５は、ＡＤマウスモデルにおける斑をＥＳＢＡ２１２によりエクスビボ標識した結果を示す。パラフィン切片または凍結切片（未固定および固定後）のいずれかを用いた。図５Ａ：マウスモデルＳｗｅＰＳ１、パラフィン切片；図５Ｂ：マウスモデルＳｗｅＰＳ１、凍結切片；図５Ｃ：マウスモデルＳｗｅＡｒｃ、パラフィン切片；図５Ｄ：マウスモデルＳｗｅＡｒｃ、凍結切片。
【図６】図６は、ヒトＡＤ脳における斑をＥＳＢＡ２１２によりエクスビボ標識した結果を示す。パラフィン切片または凍結切片（未固定および固定後）のいずれかを用いた。図６Ａ：パラフィン切片；図６Ｂ：凍結、アセトン固定；図６Ｃ：凍結、非処理；図６Ｄ：凍結；アセトン固定、クエン酸緩衝液中で１０分間煮沸。
【図７】図７は、ＳｗｅＰＳ１マウスの脳切片におけるアミロイド斑をＥＳＢＡ２１２（図７Ａ）およびチオフラビンＳ（図７Ｂ）によりエクスビボ染色した結果を示す。
【図８】図８は、ＦＩＴＣ標識したＡｂｅｔａ４２モノマーに結合したＥＳＢＡ２１２のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示し（図８Ａ）、図８Ｂには、枠組み構造ＦＷ２．３を、ＦＩＴＣ標識したＡｂｅｔａ４２モノマーと共にインキュベートした対照を示す。
【図９】図９は、抗原としてトランスジェニックＳｗｅＰＳ１マウスの脳ホモジェネート（図９Ａ；列１：ＥＳＢＡ２１２、列２：６Ｅ１０）およびＡＤＤＬ（図９Ｂ；列１：Ｆｗ２．３、列２：ＥＳＢＡ２１２、列３：６Ｅ１０）を用いた２つのＡｂｅｔａ４２イムノブロットを示す。ＥＳＢＡ２１２は主にモノマーを認識し、トリマーをより弱く認識する。
【図１０】図１０は、ＥＬＩＳＡによるＥＳＢＡ２１２の親和性の測定を示す（図１０Ａ：Ａｂｅｔａ４０に対して；親和定数：６．２６ｎＭ；および図１０Ｂ：Ａｂｅｔａ４２に対して；親和定数：６．３１ｎＭ）。
【図１１】図１１は、ＥＳＢＡ２１２の質量分析を示す。
【図１２】図１２は、ＦＴ-ＩＲスペクトルを表わし、２５〜９５℃の範囲の種々の温度におけるＥＳＢＡ２１２のアンフォールディングのパーセントを示す。
【図１３】図１３は、マウス脳ホモジェネートの存在下（列１）または不存在下（列２）でインキュベートしたＥＳＢＡ２１２の安定性を示すウェスタンブロットである。
【図１４】図１４は、チオフラビンＴアッセイの結果であり、ＥＳＢＡ２１２がＡｂｅｔａ４２のオリゴマー化をインビトロで阻害することを示す。
【図１５】図１５は、静脈内または腹腔内への１回注射後の経時ＥＳＢＡ２１２平均血清濃度を示す。
【図１６】図１６は、鼻内（図１６Ａ）または静脈内（図１６Ｂ）投与後の結合ＥＳＢＡ２１２の検出を示す。ＥＳＢＡ２１２は、選択した投与経路に関係なく脳内のアミロイド斑に結合する。
【図１７】図１７は、鼻内投与後（図１７Ａ）およびチオフラビンＳ染色後（図１７Ａ）のＳｗｅＰＳ１マウスの脳における結合ＥＳＢＡ２１２の検出を示し、ＥＳＢＡ２１２がアミロイド斑に結合することが確認される。
【図１８】図１８は、ＥＳＢＡ２１２（図１８ＡおよびＣ）と比較した６４Ｃｕ-ＥＳＢＡ２１２（図１８ＢおよびＤ）によるアミロイド斑のエクスビボ標識である。図１８ＡおよびＢはパラフィン切片を示し、一方、図１８ＣおよびＤは凍結切片を示す。
【図１９】図１９は、鼻内投与の２４時間および４８時間後のマウス（ＳｗｅＰＳ１）脳切片に結合したＥＳＢＡ２１２およびＣｕ-ＥＳＢＡ２１２の検出を示す。図１９Ａ：２４時間後のＥＳＢＡ２１２；図１９Ｂ：４８時間後のＥＳＢＡ２１２；図１９Ｃ：２４時間後のＣｕ-ＥＳＢＡ２１２；および図１９Ｄ：４８時間後のＣｕ-ＥＳＢＡ２１２。
【図２０】図２０は、静脈内ＥＳＢＡ２１２注射後の腎臓におけるＥＳＢＡ２１２の検出を示す。
【図２１】図２１は、図１６Ａと同様なさらに他の鼻内投与であり、２００μｇのＥＳＢＡ２１２で鼻内処理した後に１時間潅流した動物の固定ＳｗｅＰＳ１マウス脳切片におけるＡβ染色を示す；  図２１Ａ：抗Ｈｉｓ抗体で染色；  図２１Ｂ：６Ｅ１０で染色した対照；  図２１Ｃ：抗ウサギＣｙ３で染色した陰性対照；  図２１Ｄ：２２ｃ４  ＩｇＧで染色した対照。
【図２２】図２２は、ＰＢＳ、２２ｃ４  ＩｇＧおよびＥＳＢＡ２１２で３カ月間処理したＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ΔＥ９マウスにおける脳のＡβ４０および４２のレベルを示す。図２２Ａ：可溶性画分（ＴＢＳ）；図２２Ｂ：不溶性画分（ＧｕＨＣｌ）；図２２Ｃ：膜結合画分（ＴＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ）。
【図２３】図２３は、処理したＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ΔＥ９マウスのパラフィン切片を６Ｅ１０で染色し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアにより評価したものを示す；図２３Ａ：斑の数；図２３Ｂ：斑の面積。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６８】
実施例１：ＥＳＢＡ２１２の作製
一本鎖抗体ＥＳＢＡ２１２の抗原結合部位はネズミ抗体２２Ｃ４から得られたものであり、チューリッヒ大学により同定された。Ａｂｅｔａ特異的マウスＩｇＧ抗体２２Ｃ４はマウスをＡｂｅｔａ３０−４２で免疫化することにより形成され、したがってＡｂｅｔａのＣ−末端に対するものである。ＶＬおよびＶＨドメインのクローニングはＲＴ-ＰＣＲにより、Burmester and Plueckthun (2001)に従って実施された。要約すると、そのｍＲＮＡは抗体２２Ｃ４を産生するハイブリドーマ細胞から得られた。Burmester and Plueckthunが記載したプライマーを用いるＲＴ-ＰＣＲを実施して、ＶＬおよびＶＨドメインを増幅させた。これら２ドメインをＳＯＥ-ＰＣＲ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ；オーバーラップ延長によるスプライシング）により組み立てた。次いでこの増幅した一本鎖可変部フラグメント（ｓｃＦｖ）をＳｆｉＩにより消化し、適切な発現ベクター中へクローニングし、配列決定した。こうして、Ａｂｅｔａ４２に対するそれの特異性を維持したマウスｓｃＦｖフラグメントが得られた。このｓｃＦｖをヒト化して、一本鎖抗体ＥＳＢＡ２１２を得た（配列比較については図１〜４を参照。図１および２は、ＥＳＢＡ２１２と、２２Ｃ４由来のＡｂｅｔａ特異的ＣＤＲがグラフトした枠組み構造２．３とのアラインメントを示す）。
【００６９】
ＥＳＢＡ２１２をコードするプラスミドを適切な大腸菌菌株（たとえばＢＬ２１）に導入し、封入体として発現させた。封入体のリフォールディング、およびそれに続くゲル濾過による精製により、機能性一本鎖抗体が得られた。
【００７０】
実施例２：組織切片上のアミロイド斑への結合
ｓｃＦｖ  ＥＳＢＡ２１２がＡｂｅｔａを認識しうるかを試験するために、アミロイド斑を含む脳組織のエクスビボ免疫染色を実施した。このために、ヒトＡＰＰを発現してＡｂｅｔａ斑を形成する種々のトランスジェニックマウス（ＳｗｅＡｒｃ、ＳｗｅＰＳ１）からの脳組織切片、およびヒトのアルツハイマー病患者からの脳切片を用いた。
【００７１】
ＥＳＢＡ２１２は、用いたアルツハイマー病マウスモデルに関係なく、マウスからの凍結切片およびパラフィン切片の両方において、アミロイド斑と反応した（図５）。ＥＳＢＡ２１２は、固定したヒトのアルツハイマー病組織上の斑をも染色した（図６Ａ）。特に血管の周囲では、アミロイド血管障害として知られる強い染色が見られた。アミロイド血管障害は、大脳皮質および軟膜の小血管および中間サイズの血管におけるベータ−アミロイドの沈着を表わす。しかし、ＥＳＢＡ２１２はヒトの凍結切片上のアミロイド斑には、未固定（図６Ｂ）または固定後（図６Ｃ、Ｄ）いずれの切片においても結合しない。
【００７２】
ヒトとげっ歯類の切片間のこれらの異なる結果は、トランスジェニックマウスはヒトＡＰＰを過剰発現するので種々の斑種の量がヒトと比較して異なるという可能性において説明できる。Guentert et al. (2006)は、トランスジェニックマウスモデルとヒトＡＤの脳における散在斑間に超微細構造上の差があると記載している。マウスの脳では、種々のサイズの緻密な斑が大部分を占める。ヒトＡＤ患者の皮質および海馬では、このタイプの斑は１０％に生じるにすぎず、これに対し有芯斑が優位を占める（約９０％）(Guentert et al., 2006)。観察されたこれらの相異のため、トランスジェニックマウスの脳ではＣ−末端に到達できるが、ＡＤ患者の脳では到達できない可能性がある。ヒトの脳組織の固定は、そうしなければ埋め込まれていたＣ−末端エピトープを露出させてＥＳＢＡ２１２が到達できるように、アミロイド斑のコンホメーションを変化させた可能性がある。
【００７３】
図７は、ＳｗｅＰＳ１の脳切片上のアミロイド斑へのＥＳＢＡ２１２の特異的結合を、アミロイドタンパク質沈着物に特異的に結合する標準的な蛍光色素であるチオフラビンＳのパターンと一致するＥＳＢＡ２１２染色パターンとして示す。
【００７４】
実施例３：Ａｂｅｔａ４２モノマーへの結合
ＥＳＢＡ２１２がＦＩＴＣ標識Ａｂｅｔａ４２に結合することをサイズ排除クロマトグラフィーにより示すことができた。ＥＳＢＡ２１２をＦＩＴＣ−Ａｂｅｔａ４２と共にインキュベートし、カラムに装填した。ＥＳＢＡ２１２およびＦＩＴＣ−Ａｂｅｔａ４２は、ＥＳＢＡ２１２に対するピークおよびＦＩＴＣ−Ａｂｅｔａ４２に対するピークとして厳密に重なって一緒に溶出し（図８Ａ）、ＥＳＢＡ２１２単独と比較して５ｋＤａのサイズシフトをも示し（データを示していない）、したがって、結合したＦＩＴＣ−Ａｂｅｔａ４２（５ｋＤａ）であることを表わす。しかし、ＥＳＢＡ２１２と同じ枠組み構造領域を含むけれどもＡｂｅｔａ特異的ＣＤＲを含まない枠組み構造ＦＷ２．３と共にＦＩＴＣ−Ａｂｅｔａ４２をインキュベートした場合、ｓｃＦｖに対するピークおよびＦＩＴＣ−Ａｂｅｔａ４２に対する第２のピークという２つの明瞭に識別されるピークが見られた（図８Ｂ）。
【００７５】
実施例４：異なるＡｂｅｔａ４２コンホメーションへの結合
ＥＳＢＡ２１２の特異性をさらに解明するために、Ａｂｅｔａ４２イムノブロットを実施した。このために、ＳｗｅＰＳ１マウスの脳ホモジェネートおよびインビトロ作製したＡＤＤＬ（ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ-ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｉｆｆｕｓｉｂｌｅ  ｌｉｇａｎｄ；アミロイドベータ由来の拡散性リガンド類；Kleinによるプロトコル）をＳＤＳゲル上で分離し、メンブレンに移した。ＥＳＢＡ２１２および６Ｅ１０（対照としてのＡｂｅｔａ特異的ＩｇＧ）を用いてＡｂｅｔａを検出した。対照抗体６Ｅ１０は、Ａｂｅｔａ４２モノマー、ベータ片（ｂｅｔａ-ｓｔｕｂｓ）、トリマー、および全長ＡＰＰをも認識した。しかし、ＥＳＢＡ２１２は主にＡｂｅｔａ４２を認識した（図９）。
【００７６】
実施例５：インビトロでの親和性の解明
Ａｂｅｔａ４０およびＡｂｅｔａ４２をそれぞれ抗原として用いるＥＬＩＳＡにおいてＥＳＢＡ２１２の結合特性を調べた。９６ウェルプレートを希釈用緩衝液（ＰＢＳ／０．０１％  ＢＳＡ／０．２％  Ｔｗｅｅｎ-２０）中５ｕｇ／ｍｌのニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）でコーティングし、４℃で一夜インキュベートした。次いでプレートをＴＢＳ／０．００５％  Ｔｗｅｅｎ-２０で３回洗浄した。ビオチニル化したＡｂｅｔａ４０またはＡｂｅｔａ４２（希釈用緩衝液中１ｕｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加し、プレートを室温で１５分間インキュベートした。プレートを前記に従って洗浄し、非特異的結合部位を希釈用緩衝液の添加により遮断した。プレートをさらに１．５時間、室温で振とうしながらインキュベートした。洗浄後、０〜５００ｎＭに調製したＥＳＢＡ２１２希釈液を三重試験法でウェルに添加し、室温（ＲＴ）で１時間振とうしながらインキュベートした。プレートを洗浄し、ＥＳＢＡ２１２を精製ウサギポリクローナル抗ＥＳＢＡ２１２抗体（希釈用緩衝液中１：１００００）により室温で１時間検出した。洗浄後、先に結合したウサギ抗体を検出するために西洋わさびペルオキシダーゼ標識した抗ウサギＩｇＧ（希釈用緩衝液中１：４０００）を用い、基質としてＰＯＤを用いた。１Ｍ  ＨＣｌの添加により反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
【００７７】
測定したＥＳＢＡ２１２の曲線からＥＣ５０を計算することができた。ＥＳＢＡ２１２について、ＥＣ５０はＡｂｅｔａ４０およびＡｂｅｔａ４２のいずれに対しても１〜１５ｎＭの範囲であると判定された（図１０）。
【００７８】
実施例６：質量測定
ＥＳＢＡ２１２の正確な質量をエレクトロスプレー質量分析により測定した。そのために、ＥＳＢＡ２１２を精製し、５０％アセトニトリル／０．２％ギ酸（ｐＨ２）中で測定した。ＭａｘＥｎｔ１ソフトウェアを用いて質量スペクトル（中性質量）をデコンボリューションした。
【００７９】
ＥＳＢＡ２１２の質量は２６５１７Ｄａと判定された（図１１）。
実施例７：ＰＥＧ沈降による溶解度測定
ＥＳＢＡ２１２の見掛け溶解度をポリエチレングリコール３０００（ＰＥＧ３０００）の存在下でAtha and Ingham (1981)の方法に従って測定した。ＥＳＢＡ２１２（２０ｍｇ／ｍｌ）を、種々の濃度のＰＥＧ３０００（３０〜５０％）を含有する等体積の緩衝液と共にインキュベートして、最終タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌおよび最終ＰＥＧ濃度１５〜２５％にした。室温で３０分間のインキュベーション後、試料を遠心分離し、２８０ｎｍにおける吸光度から上清中のタンパク質濃度を測定した。ＰＥＧ濃度を、上清中で測定したタンパク質濃度の対数に対してプロットすることにより、見掛け溶解度を計算した。溶解度は０％ＰＥＧに外挿することにより判定された。
【００８０】
ＥＳＢＡ２１２の溶解度は約２０ｍｇ／ｍｌと判定された。
実施例８：熱安定性の測定
ＥＳＢＡ２１２の熱安定性は、温度を２５℃から９５℃まで上昇させるのに伴うフーリエ変換−赤外（ＦＴ−ＩＲ）スペクトルをＢｒｕｋｅｒ  Ｔｅｎｓｏｒ  ２７分光計で測定することにより判定された。スペクトルを測定する前に、ＥＳＢＡ２１２を各温度で１〜２分間放置して平衡化させた。
【００８１】
ＥＳＢＡ２１２（タンパク質のアンフォールディング５０％）の融解温度は６２．８℃と判定された。ただし、ＥＳＢＡ２１２のアンフォールディングは既に約４０℃で開始する（図１２）。
【００８２】
実施例９：インビトロでのＡｂｅｔａ凝集の阻止
ＥＳＢＡ２１２がＡｂｅｔａ４２のオリゴマー化の形成を阻止できるかを調べた。そのために、チオフラビンＴアッセイを溶液中で実施した。チオフラビンＴは凝集したＡｂｅｔａフィブリルと速やかに会合して、遊離色素の４４５ｎｍと異なり４８２ｎｍでの発光を増強させる。モノマーまたはダイマー状のペプチドは反応しないので、この変化は凝集状態のＡｂｅｔａに依存する（LeVine III, 1993）。
【００８３】
２．５μＭのＡｂｅｔａ４２を、２．２７μＭのＥＳＢＡ２１２と共に、またはＥＳＢＡ２１２なしに、チオフラビンＴおよび５００ｍＭのＮａＣｌの存在下でインキュベートした。図１４に明らかに見られるように、４８２ｎｍで測定した蛍光が増大しないので、ＥＳＢＡ２１２の存在はＡｂｅｔａのオリゴマー化をインビトロで３時間以上、明らかに阻止する。これに対し、ＥＳＢＡ２１２を溶液に添加しない場合はより高い値の蛍光が測定され、これはＡｂｅｔａ凝集物の形成の指標となる。
【００８４】
実施例１０：薬物動態のインビボ解明
ＥＳＢＡ２１２の薬物動態を判定するために、ＡＰＰ−トランスジェニックマウスおよび非トランスジェニック同腹仔をＥＳＢＡ２１２の静脈内または腹腔内１回注射により処理した。注射後の予め定めた時点で血液を眼窩後方において採取し、血清中のＥＳＢＡ２１２の量を定量ＥＬＩＳＡにより測定し、データをＰＫ−Ｓｕｍｍｉｔソフトウェアにより分析した。
【００８５】
動物：薬物動態実験のために、Prof. Dr. R. Nitsch (チューリッヒ大学)が作製したアルツハイマー病マウスモデルを用いた。これらのマウス（ＰｒＰ−ＡＰＰ  Ｓｗ／Ａｒｃ  １０＋）は、ＳｗｅｄｉｓｈおよびＡｒｃｔｉｃ両方の変異を含むヒトＡＰＰ６９５を、単一構築体中でプリオンタンパク質プロモーターの制御下に過剰発現する(Knobloch et al, 2006)。これらのマウスをＣ５７ＢＬ／６およびＤＢＡ／２のハイブリッドバックグラウンドで繁殖させて、健康および繁殖上の問題が発生するのを防いだ。この系統の特徴は下記の点である：ｉ）認知機能障害に関連する初期細胞内Ａｂｅｔａ沈着物を６カ月齢から形成する；ｉｉ）斑の形成が７カ月齢から開始し、その後数カ月間にわたって著しく増大する。このベータ−アミロイド斑の発生は、重篤な脳アミロイド血管障害（ＣＡＡ）と一致する(Knobloch et al. 2006)。
【００８６】
薬物動態試験に用いたマウスは６カ月齢であった。
実験方法：ＥＳＢＡ２１２の静脈内または腹腔内注射後、薬物動態パラメーターを判定した。静脈内処理の場合、ＡＰＰ−トランスジェニックマウスおよび非トランスジェニック同腹仔を用いた。２匹の動物７グループに、ＰＢＳ（ｐＨ６．５）中１５ｍｇ／ｋｇのＥＳＢＡ２１２を１回、静脈内注射した。予め定めた時点で（１０および３０分、１、２、４、８、１２および２４時間目）、各時点につき４つの試料を採取する方法で眼窩後方において血液を採取した（例外：１０分および２４時間目には２つの試料のみ）。血清中のＥＳＢＡ２１２濃度を定量ＥＬＩＳＡにより測定した。
【００８７】
ＥＳＢＡ２１２の腹腔内適用の場合、ＡＰＰ−トランスジェニックマウスのみを用いた。２匹の動物７グループに、ＰＢＳ（ｐＨ６．５）中２０ｍｇ／ｋｇのＥＳＢＡ２１２を１回、腹腔内注射した。静脈内処理について前記に述べたと同様に血液試料を採集した。
【００８８】
結果：ＥＳＢＡ２１２の静脈内注射後、全身薬物動態は２相クリアランスに従った。注射すると、明瞭な分布期（α−排出、０〜１時間）および終末排出期（β−排出、８〜１２時間）が見られた（図１５）。トランスジェニックマウスと非トランスジェニックマウスの間で、それぞれα−排出半減期（０．２６時間−対−０．２３時間）および終末半減期（８．７９時間−対−７．１１時間）に有意差はなかった（表１）。計算した他の薬物動態値もトランスジェニックマウスと非トランスジェニックマウスにおいて同等であった。しかし、観察された分布容量（Ｖｄ）はかなり高い（７７．６９および７６．７２ｍｌ）。これは、ＥＳＢＡ２１２がきわめて良好かつ速やかに組織内へ透過することを示唆すると思われる。これに対し、ＥＳＢＡ２１２を腹腔内適用した場合は薬物動態に差が見られた。注射後、１時間目にピークＥＳＢＡ２１２血清濃度を伴う明瞭な吸収期を検出できた。次いで、分布半減期は静脈内適用後より約５倍長かった；これは、腹腔内経路で注射した場合は貯留作用が生じることの指標になると思われる。しかし、計算した終末半減期は、静脈内注射より腹腔内注射後の方がわずかに短かかった。生体内におけるＥＳＢＡ２１２の平均滞留時間（ＭＲＴ）においても明瞭な差が検出され、これはｓｃＦｖを静脈内ではなく腹腔内に注射した場合は約３倍長かった。静脈内注射経路と腹腔内注射経路の間でＡＵＣ（曲線下面積）、分布容量（Ｖｄ）およびクリアランス（ＣＬ）において観察された差は、腹腔内処理した動物にはより多量のＥＳＢＡ２１２を投与した（１５ｍｇ／ｋｇではなく２０ｍｇ／ｋｇ）という事実により説明できる。２０ｍｇ／ｋｇについて得られた数値に基づいて１５ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与量についての薬物動態パラメーターを計算すると、下記のパラメーターが得られた：吸収、分布および排出の半減期ならびにＭＲＴにおいては変化がない。ただし、その際、ＡＵＣ（７９．１２４ｕｇ−ｈ／ｍｌ）、Ｖｄ（６７．５２ｍｌ）およびＣＬ（７．８４ｍｌ／ｈ）は静脈内注射後に得られた数値と同等であった。
【００８９】
【表１】
0005500730.tif 000006
【００９０】
実施例１１：インビボでの斑の標識
静脈内または鼻内に適用した場合にＥＳＢＡ２１２がアミロイド斑に結合しうるかを調べた。
【００９１】
そのために、トランスジェニックＳｗｅＰＳ１マウスを２４時間毎に３回、２１０μｇのＥＳＢＡ２１２で静脈内または鼻内のいずれかの適用経路により処理した。初回適用の７２時間後に動物にＰＢＳを潅流し、脳をＥＳＢＡ２１２の存在について分析した。ＥＳＢＡ２１２は、ｓｃＦｖの静脈内または鼻内の両方の適用後に脳のアミロイド斑に結合した（図１６）。チオフラビンＳ染色により、ＥＳＢＡ２１２が実際にアミロイド斑に結合したことが確認された。ＥＳＢＡ２１２で鼻内処理したＳｗｅＰＳ１マウスの連続脳切片は、ＥＳＢＡ２１２とチオフラビンＳについて同じ染色パターンを示した（図１７）。
【００９２】
実施例１２：６４Ｃｕ標識ＥＳＢＡ２１２についてのＰＥＴイメージング
ＥＳＢＡ２１２の６４Ｃｕ標識：ＥＳＢＡ２１２を、同位体に結合するＣＰＴＡキレーター（４個のＮ原子を含む約２００Ｄａの大環状化合物）に結合させた（６４Ｃｕの半減期は１２．７時間である）。このキレーターをＥＳＢＡ２１２内のリジン残基に結合させた。この結合は緩和なので、必ずしもすべてのリジンが標識されたわけではない。各ＥＳＢＡ２１２分子に平均２個のＣＰＴＡ分子が結合したことが質量測定により示された。
【００９３】
実施例１３：６４Ｃｕ-ＥＳＢＡ２１２による斑のエクスビボ標識
６４Ｃｕ-ＥＳＢＡ２１２がなおアミロイド斑に結合しうるかを判定するために、固定または非固定ＳｗｅＰＳ１マウス脳切片について免疫組織化学的染色を行なった。６４Ｃｕ-ＥＳＢＡ２１２は固定および非固定脳切片上のアミロイド斑になお結合し得たので、６４Ｃｕ標識はＥＳＢＡ２１２の結合特性を変化させなかった（図１８）。
【００９４】
実施例１４：６４Ｃｕ-ＥＳＢＡ２１２による斑のインビボ標識
トランスジェニックＳｗｅＰＳ１マウスを用いて、非放射性標識Ｃｕ-ＥＳＢＡ２１２の結合特性をインビボで調べた。マウスに２１０ｕｇのＥＳＢＡ２１２または１００ｕｇのＣｕ-ＥＳＢＡ２１２のいずれかを鼻内適用した。適用の２４または４８時間後に動物を屠殺し、脳をアミロイド斑へのＥＳＢＡ２１２およびＣｕ-ＥＳＢＡ２１２の結合についてそれぞれ分析した。
【００９５】
図１９に見られるように、適用の２４および４８時間後にＥＳＢＡ２１２を検出できた。Ｃｕ標識ＥＳＢＡ２１２についても同じ結果が見られた。したがって、Ｃｕ-ＥＳＢＡ２１２の結合特性は、エクスビボ標識について既に証明されたように、インビボでＥＳＢＡ２１２と比較して変化しなかった。
【００９６】
実施例１５：腎臓による排出
ＥＳＢＡ２１２の排出経路について何らかの情報を得るために、ｓｃＦｖをマウスに静脈内注射した。動物をその短時間後に屠殺し、腎臓を免疫組織化学的方法で分析した。
【００９７】
ＥＳＢＡ２１２は腎臓において初期尿中へ濾過され、近位尿細管において再吸収され、ここでリゾソーム経路により分解される可能性が最も高い（図２０）。
実施例１６：インビボでの斑の標識
実施例１１で実施した試験と同様なさらに他の試験を鼻内投与により行なった。
【００９８】
トランスジェニックＳｗｅＰＳ１マウスを２００μｇのＥＳＢＡ２１２で鼻内処理した。鼻内処理後１時間、動物を潅流した。下記のように、固定したＳｗｅＰＳ１マウス脳切片のＡβ染色を行ない、記録した：
抗Ｈｉｓ抗体で染色（図２１Ａ）；
６Ｅ１０で染色した対照（図２１Ｂ）；
抗ウサギＣｙ３で染色した陰性対照（図２１Ｃ）；
２２ｃ４  ＩｇＧで染色した対照（図２１Ｄ）。
【００９９】
実施例１７：
ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ΔＥ９マウスを、３カ月間、ＰＢＳ、２２ｃ４  ＩｇＧでそれぞれ週１回、ＥＳＢＡ２１２で週２回、処理した。処理が終了した時点でマウスを潅流し、脳を摘出し、２部分に分けた。一方の部分をホモジナイズし、数個の抽出物を調製し、脳Ａβ４０および４２のレベルを市販のＥＬＩＳＡテスト（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ）により測定した。Ａβ４０および４２のレベルは可溶性画分（ＴＢＳ）中で上昇し、不溶性画分（ＧｕＨＣｌ）中で低下することが認められた。膜結合画分（ＴＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ）中では、Ａβ４０レベルは変化しないのに対し、Ａβ４２レベルは上昇した（図２２を参照）。これは、不溶性画分から可溶性画分へのＡβ再分布を指摘する。
【０１００】
他方の部分を組織検査に用いた。処理したＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ΔＥ９マウスのパラフィン切片を６Ｅ１０で染色した。斑の数および面積をＩｍａｇｅＪソフトウェアにより評価した。
【０１０１】
この実験により、ＥＳＢＡ２１２で処理した動物は有意のアミロイド斑の数の減少およびサイズの縮小を示すことが明らかになった（図２３を参照）。これは、ＥＳＢＡ２１２がＡβフィブリルに結合した後にそれらをモノマーまたは低オリゴマーに分解し、これが平衡を可溶性Ａβプールの方へ移行させるという考えをさらに支持する。
【０１０２】
以上に示した結果は、ＥＳＢＡ２１２が静脈内および鼻内適用後にトランスジェニックマウスの脳に進入し、皮質および海馬のＡｂｅｔａ斑に結合するという所見を支持する。さらに、ｓｃＦｖで鼻内処理したＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ΔＥ９マウスは、皮質のアミロイド斑の数の減少および平均サイズの縮小、ならびに脳抽出物の不溶性画分におけるＡβ４２レベルの低下を示した。
【０１０３】
現在好ましい本発明の態様を提示および記載したが、本発明はそれらに限定されず、特許請求の範囲に記載の範囲内において他の多様な態様および実施が可能であることを明確に理解すべきである。
【０１０４】
参考文献
【０１０５】
【表２】
0005500730.tif 000007
【０１０６】
【表３】
0005500730.tif 000008
【０１０７】
【表４】
0005500730.tif 000009
【図１】
0005500730.tif 000010
【図２】
0005500730.tif 000011
【図３】
0005500730.tif 000012
【図４】
0005500730.tif 000013
【図５Ａ】
0005500730.tif 000014
【図５Ｂ】
0005500730.tif 000015
【図５Ｃ】
0005500730.tif 000016
【図５Ｄ】
0005500730.tif 000017
【図６Ａ】
0005500730.tif 000018
【図６Ｂ】
0005500730.tif 000019
【図６Ｃ】
0005500730.tif 000020
【図６Ｄ】
0005500730.tif 000021
【図７Ａ】
0005500730.tif 000022
【図７Ｂ】
0005500730.tif 000023
【図８Ａ】
0005500730.tif 000024
【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
0005500730.tif 000028
【図１０Ｂ】
0005500730.tif 000029
【図１１】
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【図１２】
0005500730.tif 000031
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
0005500730.tif 000034
【図１６Ａ】
0005500730.tif 000035
【図１６Ｂ】
0005500730.tif 000036
【図１７Ａ】
0005500730.tif 000037
【図１７Ｂ】
0005500730.tif 000038
【図１８Ａ】
0005500730.tif 000039
【図１８Ｂ】
0005500730.tif 000040
【図１８Ｃ】
0005500730.tif 000041
【図１８Ｄ】
0005500730.tif 000042
【図１９Ａ】
0005500730.tif 000043
【図１９Ｂ】
0005500730.tif 000044
【図１９Ｃ】
0005500730.tif 000045
【図１９Ｄ】
0005500730.tif 000046
【図２０】
0005500730.tif 000047
【図２１Ａ】
0005500730.tif 000048
【図２１Ｂ】
0005500730.tif 000049
【図２１Ｃ】
0005500730.tif 000050
【図２１Ｄ】
0005500730.tif 000051
【図２２】
0005500730.tif 000052
【図２３】
0005500730.tif 000053
【配列表】
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