(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのグリコシル化ポリペプチドを産生するための方法であって、
（ｉ）形質転換された微細藻類であって、前記微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、前記形質転換された微細藻類中で発現するグリコシル化ポリペプチドをコードする微細藻類を培養し、前記少なくとも１つのグリコシル化ポリペプチドの発現を得る工程、および
（ｉｉ）前記少なくとも１つのグリコシル化ポリペプチドのグリコシル化パターンを特定し、少なくとも１つのＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２〜Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するが、β（１，２）結合型キシロースおよび／もしくはα（１，３）結合型フコースを有しない前記少なくとも１つのグリコシル化ポリペプチドを選別することで、前記少なくとも１つのグリコシル化ポリペプチドを精製する工程、を含み、
前記微細藻類の形質転換は、
（ｉ）β（１，２）結合型キシロースおよび／もしくはα（１，３）結合型フコースをタンパク質Ｎ−グリカンに付加し、動物と構造が異なり、哺乳類において免疫原性である糖タンパク質をもたらす遺伝子、または
（ｉｉ）マンノースをグリカン構造に付加して高マンノシル化タンパク質をもたらす遺伝子、
に対応する免疫原性エピトープの付加に関与する遺伝子の抑制を含まない、方法。
【請求項２】
前記微細藻類は、緑藻類、紅藻類、クロムアルベオラータ、およびユーグレナ藻からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記微細藻類は、緑藻植物、ユーグレナ藻、ハプト藻、プラシノ藻および珪藻から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記微細藻類は、ハプト藻および珪藻から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記グリコシル化ポリペプチドは、ヒトのグリコシル化ポリペプチドの一次アミノ酸配列、非ヒトのグリコシル化ポリペプチドの一次アミノ酸配列、抗体もしくはその活性断片の一次アミノ酸配列、非哺乳類のグリコシル化ポリペプチドの一次アミノ酸配列を有するポリペプチド、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜４いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記グリコシル化ポリペプチドは、エリスロポエチン、サイトカイン、抗体、凝固因子、ホルモン、β−グルコセレブロシダーゼ、ペントラキシン−３、および抗ＴＮＦからなる群より選択される、請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記微細藻類は、前記微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列をさらに含み、前記ヌクレオチド配列は、前記形質転換された微細藻類中で発現するＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素  Ｉ（ＧｎｔＩ）をコードする、請求項１〜６いずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記微細藻類は、前記微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列をさらに含み、前記ヌクレオチド配列は、前記形質転換された微細藻類中で発現するマンノシダーゼ  ＩＩをコードする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記微細藻類は、前記微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列をさらに含み、前記ヌクレオチド配列は、前記形質転換された微細藻類中で発現するＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素  ＩＩをコードする、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記微細藻類は、前記微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列をさらに含み、前記ヌクレオチド配列は、前記形質転換された微細藻類中で発現するＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素  ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩから選択される少なくとも１つの酵素をコードする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記微細藻類は、前記微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列をさらに含み、前記ヌクレオチド配列は、前記形質転換された微細藻類中で発現するガラクトース転移酵素、フコシル基転移酵素およびシアル酸転移酵素から選択される少なくとも１つの糖転移酵素をコードする、請求項９または１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細藻類中のグリコシル化タンパク質（糖タンパク質）を産生するための方法に向けられ、当該グリコシル化ポリペプチドは、治療目的に適したグリコシル化のパターンを有する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡが転写され、タンパク質に翻訳された後、さらに翻訳後の工程が、糖残基の結合という、グリコシル化として知られる工程を引き起こす。異なる生物は、異なるグリコシル化酵素（グリコシル基転移酵素およびグリコシダーゼ）を産生し、異なる基質（ヌクレオチド糖）を利用するため、グリコシル化パターンおよび個々のオリゴ糖の組成は、同じタンパク質においてでさえも、特定のタンパク質が発現する宿主系に応じて異なる。通常、バクテリアは、タンパク質をグリコシル化せず、もしグリコシル化するとしても、非常に非特異的な様式によってグリコシル化するだけである。糸状菌および酵母などの下等真核生物は、主にマンノースおよびリン酸マンノース糖を付加する。生じたグリカンは、「ポリマンノース」型グリカンまたはマンナンとして知られる。
【０００３】
対照的に、ヒト、植物細胞および昆虫細胞などの高等真核生物では、新生オリゴ糖の側鎖は、いくつかのマンノース残基を除くようにトリミングされ、糸状菌および酵母などの下等真核生物のＮ−グリカン中では通常見出されない付加的な糖残基で伸張される可能性がある。この合成は、一連の逐次反応から始まり、この反応の工程において、タンパク質が宿主生物における分泌経路に沿って動く間に、糖残基が付加され、除かれる。しかし、宿主生物または細胞のゴルジ体に存在する酵素は、その特異性において異なり、従って、分泌されたタンパク質の、生じたグリコシル化パターンを決定する。従って、酵母、植物または昆虫などの真核生物の宿主細胞で発現するタンパク質の、生じたグリコシル化パターンは、ヒトおよび他の哺乳類で発現するタンパク質のグリコシル化パターンと実質的に異なる。
【０００４】
哺乳類のタンパク質のグリコシル化の初期段階は、少なくとも４つの異なる局面に分けることができる。
（ｉ）脂質結合型  Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２  オリゴ糖が、小胞体（ＥＲ）の膜での、逐次的な一連の反応によって構築される局面。
（ｉｉ）このオリゴ糖を、脂質アンカーであるドリコールピロリン酸から、新規合成されたタンパク質上へ転移する局面。特異的な転移の部位は、配列  Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ中のアスパラギン（Ａｓｎ）残基によって定まり、Ｘａａは、プロリンおよびアスパラギン酸以外のいずれかのアミノ酸であってもよい。
（ｉｉｉ）グルコシダーゼおよびマンノシダーゼによるさらなる工程が、ＥＲ中で、新生糖タンパク質がシス−ゴルジ体へ転移する前に生じ、付加的なマンノース残基が、ゴルジ特異的なα１，２−マンノシダーゼによって除かれる局面。
（ｉｖ）当該タンパク質がゴルジ体の中を進みながら、工程が続く局面。中期ゴルジ中で、いくつかの修飾酵素（Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素（ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶおよびＧｎＴＶ）、マンノシダーゼ  ＩＩおよびフコシル基転移酵素を含む）が、特定の糖残基を付加および除去する。最後に、トランスゴルジにおいて、ガラクトース転移酵素（ＧａｌＴ）およびシアル酸転移酵素（ＳＴ）が、当該ゴルジから放出される糖タンパク質構造を産生する。２本側鎖、３本側鎖および４本側鎖構造によって特徴付けられ、ガラクトース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび高い割合の末端シアル酸を含むこの構造が、糖タンパク質に、その哺乳類の特徴を与える。
【０００５】
ほぼ全ての真核生物において、糖タンパク質は、共通の脂質結合型オリゴ糖の前駆体である、Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２−ドリコールピロリン酸に由来する。小胞体内において、ドリコールピロリン酸結合型オリゴ糖の合成および処理は、全ての公知の真核生物の間で同一である。
【０００６】
しかし、真菌、植物または昆虫細胞によるコアオリゴ糖のさらなる処理は、コアオリゴ糖がＥＲを離れ、ゴルジに入るペプチドに一旦転移すると、コアオリゴ糖が分泌経路に沿って移動し、ゴルジ体中における、いくつかの生物特異的な糖の付加を伴うため、明らかにヒトと異なる。
【０００７】
ヒトまたは他の動物から単離されたタンパク質のかなりの割合はグリコシル化されている。治療的に使用されるタンパク質のうち、約７０％はグリコシル化されている。しかし、治療タンパク質が、宿主生物（酵母または真菌など）において産生され、内在性経路を利用してグリコシル化された場合、その治療効率は、通常、非常に低下する。このような糖タンパク質は、通常、ヒトにおいて免疫原性であり、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、投与後に減少した半減期を示す。ヒトおよび動物における特定の受容体は、末端マンノース残基を認識でき、血流からのタンパク質の迅速な除去を促進できる。余計な副作用は、タンパク質フォールディング、溶解度、プロテアーゼに対する感受性、輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）、輸送（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）、区画化、分泌、生物学的活性、他のタンパク質もしくは因子による認識、抗原性、またはアレルゲン性における変化を含む可能性がある。従って、グリコシル化のパターンが、ヒトまたは意図される受容種におけるものと同一または少なくとも類似するように、動物の宿主系中で治療糖タンパク質を産生する必要がある。ほとんどの場合、哺乳類の宿主系（哺乳類細胞の培養物など）が使用される。
【０００８】
適切なグリコフォームを有し、良好な治療効果を有する治療タンパク質を産生するために、動物または植物に基づく発現系が使用されている。利用できる系としては下記が挙げられる：
−  チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、マウス線維芽細胞およびマウス骨髄腫細胞、
−  遺伝子導入動物（例えば、ヤギ、ヒツジ、マウスなど）、
−  酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓなど）、バクテリア（Ｅ．Ｃｏｌｉなど）、真菌（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｔ．ｒｅｓｓｅｉなど）、
−  植物（例えば、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ、Ｍ．ｓａｔｉｖａなど）、
−  昆虫細胞（組み換えバキュロウイルス（鱗翅目の細胞を感染させるＡ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓなど）と組み合わせた、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ、など）。
【０００９】
上記の宿主系中で発現する組み換えヒトタンパク質には、非ヒト  グリコフォームをさらに含んでいてもよい。特に、Ｎ−グリカンの画分は、通常、ヒト  糖タンパク質において見出される末端シアル酸を欠く可能性がある。ヒトの形態と可能な限り構造が近い、または、例えば、治療タンパク質のターゲティングにおいて特に有用である可能性がある特定のグリコフォームを有するなどの他の治療上の利点を有する、糖タンパク質を得るための工程の開発に、相当な努力が向けられてきた。例えば、グリカン側鎖への１つ以上のシアル酸残基の付加は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、投与後の治療糖タンパク質の寿命を増加させる可能性がある。従って、哺乳類の宿主細胞は、細胞中で発現する糖タンパク質における末端シアル酸の範囲を増加させるように遺伝子改変されてもよい。あるいは、シアル酸は、シアル酸転移酵素および適切な基質を使用して、投与前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、対象となるタンパク質に結合させてもよい。さらに、増殖培地の組成、またはヒトのグリコシル化に伴う酵素の発現の変化は、ヒトの形態によりよく似た糖タンパク質を産生するために利用されてきた。あるいは、培養されたヒト細胞が使用されてもよい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、現存する系の全ては、重大な弱点を有する。特定の治療タンパク質のみが、動物または植物の系における発現に適している（例えば、いずれかの細胞毒性効果、または増殖に有害な他の効果を欠いているもの）。
【００１１】
動物および植物の細胞培養系は非常に遅い可能性があり、全ての有効量の対象となるタンパク質を産生するために、慎重に制御された条件下で、最長１週間の増殖を頻繁に必要とする。それにも関わらず、タンパク質の収量は、微生物の発酵工程におけるものと比較して好ましくない。さらに、動物の細胞培養系は、通常、複雑かつ高価な栄養素および補助因子（ウシ胎児血清など）を必要とする。さらに、増殖は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）によって制限される可能性がある。
【００１２】
さらに、動物細胞（特に、哺乳類細胞）は、ウイルス感染または汚染に対して、非常に感受性が高い。いくつかの場合では、ウイルスまたは他の感染病原体は、培養物の増殖を損なうだけのこともあるが、一方、他の場合では、この病原体は、治療タンパク質産物を、その用途について不適切にするヒト病原体である可能性もある。さらに多くの細胞培養の工程は、複雑な、温度感受性の、動物由来の増殖培地成分の使用を必要とし、これはウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）プリオンなどの病原体をもたらす可能性がある。このような病原体は、検出が困難であり、かつ／または、増殖培地を損なわずに除去もしくは滅菌することが困難である。いずれの場合においても、治療タンパク質を産生するための動物細胞の使用は、生成物の安全性を保証するために、高価な品質管理を必要とする。
【００１３】
遺伝子導入動物はまた、大量の治療タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、組織プラスミノーゲン活性化剤、モノクローナル抗体、ヘモグロビン、コラーゲン、フィブリノーゲンなど）を製造するために使用してもよい。遺伝子導入ヤギ、および他の遺伝子導入動物（マウス、ヒツジ、ウシなど）は、乳中において高濃度で治療タンパク質を産生するように遺伝子改変できる一方で、当該工程は、各バッチが厳密な品質管理を経なければならないため、高価である。動物は、様々な動物またはヒトの病原体（バクテリア、ウイルス、真菌、およびプリオンを含む）の宿主となる可能性がある。スクレイピーおよびウシ海綿状脳症の場合、検査は、感染を除外するのに約１年かかる可能性がある。従って、治療化合物の生成は、好ましくは、よく制御された滅菌環境、例えば、優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）の条件下で行われる。しかし、このような環境で動物を維持することは、一般的に可能ではない。さらに、発酵槽で増殖した細胞が、よく特徴付けられたマスターセルバンク（ＭＣＢ）由来のものである一方、遺伝子導入動物技術は、異なる動物に依存し、従って、本質的に不均一である。さらに、外因（異なる食品の摂取、疾病、および群内の均一性の欠如など）は、最終的な生成物のグリコシル化パターンに影響を及ぼす可能性がある。ヒトにおいては、例えば、異なる食生活は、異なるグリコシル化パターンをもたらすことが知られる。
【００１４】
遺伝子導入植物は、治療上の価値があるタンパク質を得るための有望な供給源として開発されてきた。しかし、植物中のタンパク質の高レベルの発現は、高発現するタンパク質についての遺伝子が、引き続く植物の世代において下方制御される機構である、遺伝子発現抑制を受ける。さらに、植物は、β（１，２）結合型キシロース、および／またはα（１，３）結合型フコースを、タンパク質Ｎ−グリカンに付加し、動物と構造が異なり、哺乳類において免疫原性である糖タンパク質をもたらす。さらに、滅菌環境またはＧＭＰ環境において植物を生育することは一般的に実用的ではなく、植物組織からのタンパク質の回収は、発酵性微生物からの回収よりも、より高価である。
【００１５】
遺伝子導入酵母または真菌の系はまた、マンノースをグリカン構造に付加し、高マンノシル化タンパク質をもたらすマンノシル基転移酵素遺伝子を発現するという弱点を示す。
【００１６】
要するに、上記の全ての異なる系は、産生されるグリコシル化タンパク質の免疫原性について重大な弱点を示す。
【００１７】
従って、本発明の対象は、治療目的に適したグリコシル化パターンを有する組み換え糖タンパク質を産生するための、代替の、かつ効果的な系を提供することである。
【００１８】
驚いたことに、出願人は、海洋性珪藻（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ））などの微細藻類が、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２〜Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２を有するポリペプチドを、その内在性のＮ−グリコシル化機構を介して産生できることを見出した。他の代表的な微細藻類由来のＮ−グリカンの分析もまた、そのタンパク質上の高マンノース型オリゴ糖の存在を明らかにした。従って、微細藻類は、植物または酵母などのようには免疫原性エピトープの付加に関与する遺伝子の抑制を必要とすることなく、特定のグリコシル化パターンを有するタンパク質の生成を可能にするという利点を示す。微細藻類は、植物のグリコシル化パターン、そして最終的には、酵母または真菌のグリコシル化パターンを有するタンパク質を産生すると考えられていたため、この発見は予想外だった。
【００１９】
この考えは、微細紅藻類（ｒｅｄ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ）中のグリコシル化されたＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の生成を開示し、下記によって、微細紅藻類中で合成された組み換え生成物のグリコシル化パターンを「ヒト化する」ことを示唆する（１６頁、第４〜８行）、国際公開第２００６／０１３５７２号パンフレットによって十分に示されている：
・  当該微細藻類中で、α−マンノシダーゼ  Ｉ、およびＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素を不活性化する（１６頁、第２９〜３３行）。これらの酵素は、酵母および真菌において、グリカン構造へのマンノースの付加に関連し、高マンノシル化タンパク質をもたらす。
・  α（１，３）−フコシル基転移酵素およびβ（１，２）キシロシル転移酵素を不活性化する（１７頁、第１６〜２２行、および第１〜５行）。これらの酵素は、植物において、タンパク質Ｎ−グリカンへのβ（１，２）結合型キシロースおよびα（１，３）結合型フコースの付加に関連する。
微細藻類はまた、閉鎖系光バイオリアクター（ｃｏｎｆｉｎｅｄ  ｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ）中で培養されるという利点を示し、従って、環境への遺伝子の散在（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ）の問題、および動物へのウイルス感染の問題を克服する。さらに、微細藻類の培養系は非常に早く、バイオマスにおいて優れた収量を与え、海水または淡水、栄養素、炭素および光しか必要としない。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、形質転換された微細藻類であって、当該微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、当該ヌクレオチド配列は当該形質転換された微細藻類中で発現するグリコシル化ポリペプチドをコードする形質転換された微細藻類に関する。
【００２１】
好ましい実施態様では、当該微細藻類は、β（１，２）結合型キシロース、および／もしくはα（１，３）結合型フコースをタンパク質Ｎ−グリカンに付加し、動物と構造が異なり、哺乳類において免疫原性である糖タンパク質をもたらす植物、またはマンノースをグリカン構造に付加し、高マンノシル化タンパク質をもたらすマンノシル基転移酵素遺伝子を発現する酵母などのようには免疫原性エピトープの付加に関与する遺伝子の抑制を必要とすることなく、動物において、治療目的に適したグリコシル化パターンを有するグリコシル化ポリペプチドの生成を可能にする。
【００２２】
好ましくは、当該微細藻類は、形質転換される前に、β（１，２）−キシロシル基転移酵素、および／またはα（１，３）フコシル基転移酵素の活性を全く共有しない。
【００２３】
好ましくは、当該微細藻類は、酵母および真菌において認められるグリカン構造への、マンノースの付加からもたらされる、高マンノシル化タンパク質をもたらすマンノシル基転移酵素活性を全く共有しない。
【００２４】
特に、当該形質転換された微細藻類中で発現するグリコシル化ポリペプチドは、治療目的に適したグリコシル化パターンを含む。
【００２５】
好ましい実施態様では、当該形質転換された微細藻類中で発現するグリコシル化ポリペプチドは、少なくとも１つのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を含む。
【００２６】
本発明の実施態様では、当該微細藻類は、緑藻類、紅藻類、クロムアルベオラータ（ｃｈｒｏｍａｌｖｅｏｌａｔｅｓ）、およびユーグレナ藻から選択される。好ましくは、当該微細藻類は、緑藻植物（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅｓ）、ユーグレナ藻、ハプト藻（Ｈａｐｔｏｐｈｙｔｅｓ）、プラシノ藻（Ｐｒａｓｉｎｏｐｈｙｔｅｓ）および珪藻から選択される。
【００２７】
本発明の別の実施態様では、当該グリコシル化ポリペプチドは、ヒトのグリコシル化ポリペプチドの一次アミノ酸配列、非ヒトのグリコシル化ポリペプチドの一次アミノ酸配列、抗体もしくはその活性断片の一次アミノ酸配列、および／または非哺乳類のグリコシル化ポリペプチドの一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを含む群から選択される。
【００２８】
本発明の好ましい実施態様では、当該グリコシル化ポリペプチドは、動物、哺乳類またはヒトのポリペプチドである。
【００２９】
本発明の別の実施態様では、当該形質転換された微細藻類は、当該微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列をさらに含み、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現するＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素  Ｉをコードする。
【００３０】
本発明の別の実施態様では、当該形質転換された微細藻類は、当該微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列をさらに含み、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現するマンノシダーゼ  ＩＩをコードする。
【００３１】
本発明の別の実施態様では、当該形質転換された微細藻類は、当該微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列をさらに含み、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現するＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素  ＩＩをコードする。
【００３２】
本発明の別の実施態様では、当該形質転換された微細藻類は、当該微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列をさらに含み、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現するＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素  ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩから選択される少なくとも１つの酵素をコードする。
【００３３】
本発明の別の実施態様では、当該形質転換された微細藻類は、当該微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列をさらに含み、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現する、ガラクトース転移酵素、フコシル基転移酵素およびシアル酸転移酵素から選択される、少なくとも１つのグリコシル基転移酵素をコードする。
【００３４】
本発明の別の実施態様では、当該ヌクレオチド配列は、当該微細藻類におけるＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素、マンノシダーゼ  ＩＩ、またはグリコシル基転移酵素の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結され、ＥＲおよびゴルジにおいて、５．１〜８のｐＨで最適な活性を有する酵素触媒ドメインを含み、このドメインは当該触媒ドメインと通常は関連していない細胞の標的シグナルに融合する。
【００３５】
本発明の別の対象は、形質転換された微細藻類であって、当該微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現するＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素  Ｉをコードする形質転換された微細藻類である。
【００３６】
本発明の実施態様では、当該微細藻類は、当該微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列をさらに含み、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現するマンノシダーゼ  ＩＩをコードする。
【００３７】
本発明の別の実施態様では、当該微細藻類は、当該微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列をさらに含み、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現するＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素  ＩＩをコードする。
【００３８】
本発明の別の実施態様では、当該微細藻類は、当該微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列をさらに含み、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現するＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素  ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩから選択される少なくとも１つの酵素をコードする。
【００３９】
本発明の別の実施態様では、当該微細藻類は、当該微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列をさらに含み、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現する、ガラクトース転移酵素、フコシル基転移酵素およびシアル酸転移酵素から選択される少なくとも１つのグリコシル基転移酵素をコードする。
【００４０】
本発明の別の実施態様では、当該ヌクレオチド配列は、当該微細藻類におけるＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素、マンノシダーゼ  ＩＩ、またはグリコシル基転移酵素の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結され、ＥＲおよびゴルジにおいて、５．１〜８のｐＨで最適な活性を有する酵素触媒ドメインを含み、このドメインは当該触媒ドメインと通常は関連していない細胞の標的シグナルに融合する。
【００４１】
本発明の別の実施態様では、当該微細藻類は、緑藻類、紅藻類、クロムアルベオラータ、およびユーグレナ藻から選択される。
【００４２】
本発明の別の対象は、少なくとも１つのグリコシル化ポリペプチドを産生するための方法であって、上記の微細藻類または形質転換された微細藻類を、当該微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列で形質転換する工程を含み、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現するグリコシル化ポリペプチドをコードする方法である。
【００４３】
別の実施態様では、当該方法は、形質転換された微細藻類のＥＲおよびゴルジ体を、組み換えグリコシル化ポリペプチドが通過した後、当該組み換えグリコシル化ポリペプチドを単離する工程を含む。
【００４４】
本発明の別の対象は、上記の形質転換された微細藻類を産生するための方法であって、当該微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列で当該微細藻類を形質転換する工程を含み、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現するＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素  Ｉをコードする方法である。
【００４５】
別の実施態様では、当該方法は、当該微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列で当該微細藻類を形質転換する工程をさらに含み、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現するマンノシダーゼ  ＩＩをコードする。
【００４６】
別の実施態様では、当該方法は、当該微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列で当該微細藻類を形質転換する工程をさらに含み、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現するＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素  ＩＩをコードする。
【００４７】
別の実施態様では、当該方法は、当該微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列で当該微細藻類を形質転換する工程をさらに含み、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現するＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素  ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩから選択される少なくとも１つの酵素をコードする。
【００４８】
別の実施態様では、当該方法は、当該微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列で当該微細藻類を形質転換する工程をさらに含み、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現する、ガラクトース転移酵素、フコシル基転移酵素およびシアル酸転移酵素から選択される少なくとも１つのグリコシル基転移酵素をコードする。
【００４９】
本発明の別の対象は、本発明の方法によって産生されたグリコシル化ポリペプチドである。
【００５０】
本発明の別の対象は、本発明の方法によって産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む医薬組成物である。
【００５１】
本発明の別の対象は、本発明の方法によって産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む動物用組成物である。
【００５２】
本発明の別の対象は、少なくとも１つのグリコシル化ポリペプチドを産生するための方法であって、
（ｉ）上記の微細藻類または形質転換された微細藻類を、当該微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列で形質転換する工程であって、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現するグリコシル化ポリペプチドをコードする工程、および
（ｉｉ）当該少なくとも１つのグリコシル化ポリペプチドを精製する工程であって、当該グリコシル化ポリペプチドは、少なくとも１つのＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２〜Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の構造を有する工程、を含む。
【００５３】
本発明のさらに別の対象は、少なくとも１つのＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２〜Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の構造を有するグリコシル化ポリペプチドを産生するための、上記の形質転換された微細藻類の使用である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ゲノムの生物情報学分析に基づく海洋性珪藻におけるＮ−グリコシル化経路。Ｎ−グリコシル化経路の海洋性珪藻のゲノムにおいて特定された推定配列に、このスキーム中で、太字および筆記体活字で番号を付けた。太字の高マンノース型  Ｎ−グリカンは、標準的な条件で増殖したＰ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  Ｐ．ｔ．１．８．６紡錘細胞株から単離されたタンパク質へＮ結合したオリゴ糖の構造解析によって特定された。
【図２】海洋性珪藻の糖タンパク質は、コンカナバリンＡによって認識されるＮ結合型のオリゴ糖を有する。（ａ）コンカナバリンＡを使用した親和性検出（ａｆｆｉｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）、ならびにｇｒｅｅｎ  ｏｉｇｎｏｎ（レーン１）、およびＰ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  Ｐ．ｔ．１．８．６紡錘細胞株（レーン２）から単離されたタンパク質の、コア  β１，２−キシロースおよびコア  α１，３−フコースのエピトープに対して産生された抗体を使用した免疫検出。（ｂ）エンドグリコシダーゼ  Ｈ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）およびペプチド  Ｎ−グリコシダーゼ  Ｆ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）によって処理された（または処理されていない）Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  Ｐｔ  １．８．６紡錘細胞株から単離されたタンパク質抽出物の、コンカナバリンＡによる親和性検出。
【図３】海洋性珪藻由来のＮ結合型グリカンは、高マンノース型構造である。標準的な条件で増殖したＰ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  Ｐｔ  １．８．６株から単離された糖タンパク質から放出され、２−アミノベンズアミドで標識されたＮ結合型グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ。
【図４】代表的な微細藻類からのＮ結合型グリカンは、高マンノース型構造である。（Ａ）ユーグレナ属、テトラセルミス属、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ）、ロデラ属由来のタンパク質の、コンカナバリンＡによる、高マンノース  Ｎ−グリカンの親和性検出。（Ｂ）スケレトネマ属（Ｓｋｅｕｌｅｔｏｎｅｍａ）、ヘテロカプサ属、アンフォラ属、キートセロス属、ナビクラ属、ナンノクロロプシス属（Ｎａｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）由来のタンパク質の、コンカナバリンＡによる、高マンノース  Ｎ−グリカンの親和性検出。（Ｃ）スケレトネマ属、ヘテロカプサ属、アンフォラ属、キートセロス属、ナビクラ属、ナンノクロロプシス属由来のタンパク質の、抗α−１，３  フコース抗体による親和性検出。（Ｄ）スケレトネマ属、ヘテロカプサ属、アンフォラ属、キートセロス属、ナビクラ属、ナンノクロロプシス属由来のタンパク質の抗β−１，２  キシロース抗体による親和性検出。
【図５】ｐＺＥＰＯおよびｐＺＥＰＯＨｉｓのコンストラクト。
【図６】ＰＣＲ（Ａ）およびＲＴ−ＰＣＲ（Ｂ）による、組み換えＥＰＯのＤＮＡおよび転写物の分析。
【図７】ウエスタンブロットによる組み換えＥＰＯタンパク質分析。
【図８】ヒト化されたＮ−グリコシル化経路。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
（Ｉ．定義）
本願明細書で使用される「グリコシル化ポリペプチド」は、Ｎ−グリコシル化されたポリペプチドを指す。
【００５６】
本願明細書で使用される用語「Ｎ−グリカン」は、Ｎ結合型オリゴ糖、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基への、アスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合によって結合したものを指す。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ」はマンノースを指す；「Ｇｌｃ」はグルコースを指す；「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを指す；ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを指す）の共通のペンタ糖コアを有する。Ｎ−グリカンに関連して使用される用語「トリマンノースコア」はまた、構造  Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）を指す。Ｎ−グリカンに関連して使用される用語「ペンタマンノースコア」または「マンノース−５  コア」は、構造  Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を指す。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３コア構造に結合した、末梢の糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、フコース、およびシアル酸）を含む分枝（アンテナ）の数について異なる。Ｎ−グリカンは、その分枝成分（例えば、高マンノース、複合型または混成型）に応じて分類される。
【００５７】
本願明細書で使用される「高マンノース」型Ｎ−グリカンは、５〜９のマンノース残基を有する。「ポリ−マンノース」型Ｎ−グリカンは、９よりも多いマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、通常、α１，３  マンノース腕に結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ、およびトリマンノースコアのα１，６マンノース腕に結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する。複合型Ｎ−グリカンはまた、シアル酸または誘導体（「ＮｅｕＡｃ」について、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を指し、「Ａｃ」はアセチルを指す）で任意に修飾されたガラクトース（「Ｇａｌ」）残基を有していてもよい。複合型Ｎ−グリカンは、通常、例えば、ＮｅｕＡｃ−；ＮｅｕＡｃα２−６ＧａｌＮＡｃα１−；ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌ  １−３ＧａｌＮＡｃα１−３；ＮｅｕＡｃα２−３／６Ｇａｌ１−４ＧｌｃＮＡｃ１−；ＧｌｃＮＡｃα１−４Ｇａｌ１−（ムチンのみ）；Ｆｕｃαｌ−２Ｇａｌ１−（血液型  Ｈ）などのオリゴ糖で終止する少なくとも１つの分枝を有する。硫酸エステルは、ガラクトース、ＧａｌＮＡｃ、およびＧｌｃＮＡｃ残基上で生じる可能性があり、リン酸エステルは、マンノース残基上で生じる可能性がある。ＮｅｕＡｃは、Ｏ−アセチル化されていても、または、ＮｅｕＧｃ（Ｎ−グリコリルノイラミン酸）によって置換されていてもよい。複合型Ｎグリカンはまた、「バイセクティング」ＧｌｃＮＡｃおよびコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内置換を有していてもよい。「混成型」のＮ−グリカンは、トリマンノースコアのα１，３  マンノース腕の末端上の少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ、およびトリマンノースコアのαｌ，６  マンノース腕上の０以上のマンノースを有する。
【００５８】
本願明細書で使用される「治療目的に適したグリコシル化パターン」は、少なくとも１つのＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２〜Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）の構造を有するポリペプチド、および上記の複合型Ｎ−グリカン構造を有するポリペプチドを指す。
【００５９】
Ｎ−グリカンの生成に関連して使用される用語「主な」または「主に」は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）によって検出される主要イオンを示す構造を指す。
【００６０】
本願明細書で使用される略称は、当該技術分野において一般的な用法のものであり、例えば、上記の糖の略称を参照。他の一般的な略称としては、「ＰＮＧａｓｅ」（これは、ペプチド  Ｎ−グリコシダーゼを指す）、「ＧｌｃＮＡｃ  Ｔ」または「ＧｎＴ」（これは、Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素を指す）が挙げられる。「ＮｅｕＡｃ」は、Ｎ−アセチルノイラミン酸を指す。
【００６１】
本願明細書で使用される「ヒト化糖タンパク質またはタンパク質」または「ヒト様糖タンパク質」はどちらも、４よりも少ないマンノース残基を有するＮ−グリカンに結合したタンパク質、および少なくとも５つのマンノース残基を有する合成糖タンパク質中間体（これもまた有用であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでさらに操作できる）を指す。好ましくは、本発明によって産生される糖タンパク質は、少なくとも３０ｍｏｌ％、好ましくは少なくとも４０ｍｏｌ％、より好ましくは５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍｏｌ％さえものＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２中間体を、少なくとも一過性に含む。これは、例えば、「よりよく」発現するように、すなわち、より効率的なグリコシル化経路によって、本発明の宿主細胞を操作することによって達成されてもよい。例えば、マンノシダーゼは、タンパク質がグリコシル化され、好ましくは、活性が所望である宿主細胞オルガネラへの酵素のターゲティングによって宿主細胞に導入される宿主細胞中の部位に存在する条件下で、最適な活性を有するように選択される。
【００６２】
用語「酵素」は、宿主細胞のグリコシル化の変化に関連して本願明細書で使用される場合、少なくとも１つの酵素活性を有する分子を指し、全長の酵素、触媒的に活性な断片、キメラ、複合体などを含む。酵素の「触媒的に活性な断片」は、検出可能なレベルの機能的（酵素的）活性を有するポリペプチドを指す。溶解細胞で測定可能な酵素活性と比較して、酵素活性のうち１０％未満が細胞の外側で測定可能である場合、酵素活性は、「実質的に細胞内」にある。
【００６３】
本願明細書で使用される用語「分泌経路」は、細胞質から、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体の区画、およびその最終目的地への新生ポリペプチド鎖の分子流に従った、脂質結合型オリゴ糖の前駆体およびＮ−グリカン基質が経時的に曝される様々なグリコシル化酵素の組立ライン（ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｌｉｎｅ）を指す。酵素は、この経路に沿って局在していると言える。酵素  Ｙの前に、脂質結合型グリカンまたはＮ−グリカンに作用する酵素  Ｘは、酵素  Ｙに対して「上流」である、または「上流」に作用すると言える。同様に、酵素  Ｙは、酵素  Ｘから「下流」である、または「下流」に作用する。
【００６４】
本願明細書で使用される用語「標的ペプチド」は、細胞内位置（例えば、オルガネラ）に関連する配列の局在（または保持）を媒介するアミノ酸配列を指す。
【００６５】
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、少なくとも１０塩基長の多量体型のヌクレオチドを指す。当該用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡまたは合成ＲＮＡ）、ならびに、非天然のヌクレオチド類似体、非自然のヌクレオシド間結合、もしくは両方を含む、ＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含む。核酸は、いずれの形態構造であってもよい。例えば、当該核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四本鎖、部分的に二本鎖、分枝、ヘアピン、環状、またはパドロック状の構造であってもよい。当該用語は、一本鎖および二本鎖の形態のＤＮＡを含む。本発明の核酸分子は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および上記の合成型および混合型のポリマーの、センス鎖ならびにアンチセンス鎖の両方を含んでいてもよい。これらは、当業者によって容易に理解されるように、化学的に、もしくは生化学的に修飾されていてもよく、または非天然の、または誘導体化されたヌクレオチドの塩基を含んでいてもよい。このような修飾としては、例えば、標識、メチル化、類似体と自然に存在するヌクレオチドとの１つ以上の置換、ヌクレオチド間の修飾（非電荷結合（例えば、メチルホスホン酸、ホスホトリエステル、ホスホロアミド酸、カルバミン酸など）、電荷結合（例えば、ホスホロチオエート、ジチオリン酸、など）、ペンダント部分（例えば、ポリペプチド）、介入物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤、および修飾結合（例えば、α  アノマー核酸など）など）が挙げられる。水素結合および他の化学的相互作用を介した、所定の配列への結合能について、ポリヌクレオチドを模倣する合成分子もまた、含まれる。このような分子は当該技術分野で公知であり、例えば、ペプチド結合が、当該分子の骨格中のリン酸結合と置き換わったものが挙げられる。
【００６６】
用語「形質転換された微細藻類」は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列が、形質転換の従来の方法（例えば、微粒子銃、電気穿孔、ガラスビーズ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、炭化ケイ素ホイスカー、またはウイルスもしくはアグロバクテリウムの使用）によって、当該微細藻類の核中で核酸分子を発現するように導入される微細藻類を指す。
【００６７】
「単離された」もしくは「実質的に純粋な」核酸またはポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合型ポリマー）は、自然の宿主細胞中の自然のポリヌクレオチドを自然に伴う他の細胞成分（例えば、当該核酸またはポリヌクレオチドが自然に関連するリボソーム、ポリメラーゼ、およびゲノム配列）から実質的に分離されたものである。当該用語は、（１）その自然に存在する環境から除去された核酸もしくはポリヌクレオチド、（２）「単離されたポリヌクレオチド」が自然で見出される、ポリヌクレオチドの全てもしくは一部と関連しない核酸またはポリヌクレオチド、（３）自然では結合しないポリヌクレオチドに作動可能に連結された核酸もしくはポリヌクレオチド、または（４）自然には生じない核酸またはポリヌクレオチドを包含する。用語「単離された」または「実質的に純粋な」はまた、組み換えの、もしくはクローン化されたＤＮＡ単離物、化学合成されたポリヌクレオチド類似体、または異種の系によって生物学的に合成されるポリヌクレオチド類似体に対する言及において使用できる。
【００６８】
本願明細書で使用される語句、参照核酸配列の「縮重変異体」は、標準的な遺伝コードに従って翻訳され、参照核酸配列から翻訳されたアミノ酸配列と同一のものを与える可能性がある核酸配列を包含する。
【００６９】
核酸配列と関連する用語「パーセント配列同一性」または「同一の」は、最大の一致で整列した場合、同一である２つの配列中の残基を指す。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用できる、当該技術分野で公知のいくつかの異なるアルゴリズムがある。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ、またはＢｅｓｔｆｉｔを使用して比較でき、これらは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（ウィスコンシン州、マディソン））中のプログラムである。ＦＡＳＴＡは、問い合わせ配列と、検索配列（ｓｅａｒｃｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）との間の最良の重複部分の領域の配列比較およびパーセント配列同一性を与える。
【００７０】
用語「実質的な相同性」または「実質的な類似性」は、核酸またはその断片について言及する場合、適切なヌクレオチドの挿入または欠損を別の核酸（またはその相補鎖）とともに最適に整列した場合、上記の、配列同一性のいずれかの周知のアルゴリズム（ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐなど）によって測定されるように、ヌクレオチドの塩基のうち少なくとも約５０％、より好ましくは６０％、ヌクレオチドの塩基のうち、通常は少なくとも約７０％、さらに通常は少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。
【００７１】
あるいは、実質的な相同性または類似性は、核酸またはその断片が、別の核酸、別の核酸鎖、またはその相補鎖に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合に存在する。核酸ハイブリダイゼーション実験に関連する「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントな洗浄条件」は、いくつかの異なる物理的パラメータに依存する。核酸ハイブリダイゼーションは、当業者によって容易に理解されるように、このような条件（塩濃度、温度、溶剤、ハイブリッド種の塩基組成、相補的領域の長さ、およびハイブリッド核酸間のヌクレオチド塩基のミスマッチの数など）によって影響される。当業者ならば、ハイブリダイゼーションの特異的なストリンジェンシーを達成するために、これらのパラメータを変化させる方法を知っているだろう。通常は、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、熱融点（Ｔｍ、ｔｈｅｒｍａｌ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）未満の約２５℃で、特定の一連の条件下での特異的なＤＮＡハイブリッドのために行われる。「ストリンジェントな洗浄」は、Ｔｍよりも約５℃低い温度で、特定の一連の条件下での特異的なＤＮＡハイブリッドのために行われる。Ｔｍは、標的配列の５０％が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。例えば、「高ストリンジェンシー条件」は、液相ハイブリダイゼーションについて、６Ｘ  ＳＳＣ（２０Ｘ  ＳＳＣは、３．０Ｍ  ＮａＣｌおよび０．３Ｍ  クエン酸ナトリウムを含む）、１％  ＳＤＳ中の、６５℃、８−１２時間での、水性（ａｑｕｅｏｕｓ）ハイブリダイゼーション（すなわち、ホルムアミドがない）、次いで、０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中の、６５℃、２０分間での２回の洗浄として定義できる。６５℃でのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズする配列の長さおよびパーセント同一性を含む、いくつかの要因に依存し、異なる速度で生じることが、当業者によって認識されるだろう。
【００７２】
用語「変異した」は、核酸配列について使用された場合、核酸配列中のヌクレオチドが、参照核酸配列と比較して、挿入、欠損または変化した可能性があることを意味する。１つの変化が座位で生じていてもよく（点変異）、または、複数のヌクレオチドが１つの座位で挿入、欠損、または変化していてもよい。さらに、１つ以上の変化が、核酸配列内の多数の座位で生じていてもよい。核酸配列は、「エラープローンＰＣＲ」（高い割合の点変異がＰＣＲ産物の全長に沿って得られるように、ＤＮＡポリメラーゼの複製忠実度が低い条件下で、ＰＣＲを行うための工程）などの変異原性技術などを含む（しかしこれに限定されない）当該技術分野で公知のいずれかの方法によって変異されてもよい。
【００７３】
本願明細書で使用される用語「ベクター」は、これが結合される別の核酸を輸送できる核酸分子を指すように意図される。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは、付加的なＤＮＡ分節が連結される可能性がある環状二本鎖ＤＮＡループを指す。他のベクターとしては、コスミド、バクテリアの人工染色体（ＢＡＣ）および酵母の人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられる。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡ分節が、ウイルスゲノムに連結される可能性がある（下記で詳述する）。いくつかのベクターは、これらが導入される宿主細胞中で自己複製できる（例えば、宿主細胞中で機能する複製開始点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよく、従って、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定の好ましいベクターは、これらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本願明細書において、「組み換え発現ベクター」（または単に、「発現ベクター」）と呼ばれる。
【００７４】
「作動可能に連結された」発現制御配列は、発現制御配列が、対象となる遺伝子を制御するために、対象となる遺伝子と近接する連鎖、および対象となる遺伝子を制御するために、トランスに、または離れて作用する発現制御配列を指す。
【００７５】
本願明細書で使用される用語「発現制御配列」は、これが作動可能に連結されるコード配列の発現に影響するために必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後の事象および翻訳を制御する配列である。発現制御配列として、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル（スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなど）；細胞質のｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質の安定性を増強する配列；および、所望であれば、タンパク質の分泌を増強する配列が挙げられる。このような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。原核生物においては、このような制御配列は、一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、最小限、その存在が発現に必須である全ての構成要素を含むことが意図され、その存在が有利であるさらなる構成要素（例えば、リーダー配列および融合パートナー配列）もまた、含むことができる。
【００７６】
本願明細書で使用される用語「組み換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、核酸（組み換えベクターなど）が導入される細胞を指すように意図される。このような用語は、特定の対象の細胞だけではなく、このような細胞の後代も指すように意図されることが理解されるはずである。特定の修飾が、変異または環境の影響のいずれかによって、その後の世代において生じる可能性があるため、このような後代は、親細胞と実際に同一でなくてもよいが、本願明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。組み換え宿主細胞は、培養液中で増殖した単離された細胞もしくは細胞株であってもよく、または、生体組織もしくは生物中に存在する細胞であってもよい。
【００７７】
本願明細書で使用される用語「ペプチド」は、短いポリペプチド、例えば、通常、約５０アミノ酸長未満、より典型的には約３０アミノ酸長未満のものを指す。本願明細書で使用される当該用語は、構造的機能、従って、生物学的機能を模倣する類似体および模倣剤を包含する。
【００７８】
本願明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、自然に存在するタンパク質および自然に存在しないタンパク質の両方、ならびにその断片、変異体、誘導体および類似体を包含する。ポリペプチドは、モノマーまたはポリマーであってもよい。さらに、ポリペプチドは、それぞれが１つ以上の異なる活性を有するいくつかの異なるドメインを含んでいてもよい。
【００７９】
用語「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」とは、その由来または誘導の供給源によって、（１）その自然状態において付随する、自然に関連する成分と関連せず、（２）それが自然において見出せない純度で存在する場合、他の細胞物質の存在について純度を調整でき（例えば、同種由来の他のタンパク質を含まない）、（３）異なる種由来の細胞によって発現し、または（４）自然において生じないタンパク質もしくはポリペプチド（例えば、それは自然において見出されるポリペプチドの断片であり、あるいは自然において見出されないアミノ酸類似体もしくは誘導体、または標準的なペプチド結合以外の連鎖を含む）である。従って、ポリペプチドであって、化学合成された、または当該ポリペプチドを自然に生じる細胞と異なる細胞系において合成されたポリペプチドは、その自然に関連する成分から「単離される」。ポリペプチドまたはタンパク質はまた、単離によって、当該技術分野で周知のタンパク質精製技術を使用して、自然に関連する成分を実質的に含まないように与えられてもよい。このように定義されるように、「単離された」とは、上記のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドが、その自然環境から物理的に除去されることを必ずしも必要としない。
【００８０】
本願明細書で使用される用語「ポリペプチド断片」は、断片のアミノ酸配列が、自然に生じる配列において対応する位置と同一である近接配列を指す。通常、断片は、少なくとも５、６、７、８、９または１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１２、１４、１６または１８アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２５、３０、３５、４０または４５アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも５０または６０アミノ酸長、さらにより好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。
【００８１】
「修飾された誘導体」は、一次構造配列が実質的に相同であるポリペプチドまたはその断片を指すが、これは、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの化学修飾および生化学修飾を含み、あるいは、これは、自然のポリペプチドにおいては見出されないアミノ酸を包含する。当業者によって容易に理解されるように、このような修飾としては、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、（例えば、放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）による）標識化、および様々な酵素修飾が挙げられる。ポリペプチドを標識するための様々な方法、およびこのような目的のために有用な置換基または標識は、当該技術分野で周知であり、放射性同位元素（１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、および３Ｈなど）、標識されたアンチリガンド（ａｎｔｉｌｉｇａｎｄ）（例えば、抗体）に結合するリガンド、フルオロフォア、化学発光剤、酵素、および標識されたリガンドについての特異的な結合対のメンバーとして機能できるアンチリガンドが挙げられる。標識の選択は、要求される感度、プライマーとの結合の容易さ、要求される安定性、および利用できる計測手段に依存する。ポリペプチドを標識するための方法は、当該技術分野で周知である。
【００８２】
「ポリペプチド変異体」または「ムテイン」は、配列が、自然または野生型のタンパク質のアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸の挿入、重複、欠損、再編成または置換を含むポリペプチドを指す。ムテインは、１つの位置の１つのアミノ酸が別のアミノ酸に変化する、１つ以上のアミノ酸の点置換、自然に生じるタンパク質の配列に１つ以上のアミノ酸が挿入、もしくは欠損する、それぞれ、１つ以上の挿入および／もしくは欠損、ならびに／または、アミノもしくはカルボキシ終端のいずれかまたは両方に、アミノ酸配列の切断部を有していてもよい。ムテインは、自然に生じるタンパク質と比較して、同様の生物学的活性を有していてもよいが、好ましくは、異なる生物学的活性を有する。ムテインは、その野生型の対応物に対して、少なくとも７０％の全体の配列相同性を有する。野生型タンパク質に対して、８０％、８５％または９０％の全体の配列相同性を有するムテインがさらに好ましい。さらにより好ましい実施態様では、ムテインは、９５％の配列同一性、さらにより好ましくは９７％、さらにより好ましくは９８％、さらにより好ましくは９９％の全体の配列同一性を示す。配列相同性は、いずれかの共通配列解析アルゴリズム（ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔなど）によって測定してもよい。好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させるもの、（２）酸化に対する感受性を減少させるもの、（３）タンパク質複合体を形成する結合親和性を変化させるもの、（４）結合親和性または酵素活性を変化させるもの、および（５）このような類似体の他の物理化学的または機能的特性を与え、または改変させるもの、である。本願明細書で使用される、２０の従来のアミノ酸およびその略称は、従来の用法に従う。
【００８３】
タンパク質は、当該タンパク質をコードする核酸配列が、第２のタンパク質をコードする核酸配列に対する類似配列を有する場合、第２のタンパク質に対して「相同性」を有し、またはこれと「相同」である。あるいは、２つのタンパク質が「類似する」アミノ酸配列を有する場合、タンパク質は、第２のタンパク質に対して相同性を有する（従って、用語「相同タンパク質」は、２つのタンパク質が類似するアミノ酸配列を有することを意味するように定義される）。好ましい実施態様では、相同タンパク質は、野生型のタンパク質に対して、６０％の配列相同性、より好ましくは７０％の配列相同性を示すものである。野生型のタンパク質に対して、８０％、８５％または９０％の配列相同性を示す相同タンパク質がさらに好ましい。さらにより好ましい実施態様では、相同タンパク質は、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示す。本願明細書で使用される（特に、予想される構造的類似性についての）アミノ酸配列の２つの領域間の相同性は、機能における類似性を意味するものとして解釈される。
【００８４】
タンパク質またはペプチドに関連して「相同の」が使用される場合、同一ではない残基の位置は、保存的なアミノ酸置換によってしばしば異なることが理解される。「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似する化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を持つ側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。通常は、保存的なアミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、パーセント配列同一性または相同性の程度は、置換の保存的な性質を補正するように、上方に調整してもよい。この調整をなすための手段は、当業者に周知である。下記の６群は、それぞれ、互いに保存的な置換であるアミノ酸を含む：１）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。ポリペプチドの配列相同性は、パーセント配列同一性とも呼ばれ、通常、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。
【００８５】
用語「融合タンパク質」は、異種のアミノ酸配列に結合したポリペプチドまたは断片を含むポリペプチドを指す。２つ以上の異なるタンパク質から、２つ以上の所望の機能的因子を含むように構築できるため、融合タンパク質は有用である。融合タンパク質は、対象となるポリペプチドから、少なくとも１０の近接するアミノ酸、より好ましくは少なくとも２０または３０アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも４０、５０または６０アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも７５、１００または１２５アミノ酸を含む。融合タンパク質は、異なるタンパク質もしくはペプチドをコードする核酸配列とともにインフレームのポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列を構築し、次いで、当該融合タンパク質を発現することによって、組み換え的に産生できる。あるいは、融合タンパク質は、ポリペプチドまたはその断片を別のタンパク質に架橋することによって化学的に産生できる。
【００８６】
本願明細書で使用される用語「領域」は、生体分子の一次構造の物理的に近接する部分を指す。タンパク質の場合、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の近接する部分によって定められる。
【００８７】
本願明細書で使用される用語「ドメイン」は、生体分子の公知の、または疑われる機能に寄与する生体分子の構造を指す。ドメインは、領域またはその一部と同一の広がりを持っていてもよい。ドメインはまた、生体分子の離れた、非近接領域を含んでいてもよい。タンパク質ドメインの例としては、Ｉｇドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、触媒ドメイン、および細胞質ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
本願明細書で使用される用語「分子」は、全ての化合物を意味し、小分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質などが挙げられるがこれらに限定されず、このような化合物は天然または合成であってもよい。
【００８９】
（ＩＩ．本発明）
本発明は、Ｎ−グリコシル化ポリペプチドを産生するための新たな系を提供することを目的とする。グリコシル化は、グリコシル化ポリペプチドを産生するために選択される宿主細胞に存在する内在性の機構に依存する。
【００９０】
驚いたことに、出願人は、微細藻類が、その内在性のＮ−グリコシル化機構を介して、高収量で、動物において治療目的に適したグリコシル化パターンを有するグリコシル化ポリペプチドを産生できることを見出した。
【００９１】
従って、本発明の１つの態様は、微細藻類中にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２〜Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２を有するポリペプチドの生成であり、本発明の別の態様は、改変された微細藻類中での複合型Ｎ−グリカンの生成である。
【００９２】
本発明の対象は、形質転換された微細藻類であって、当該微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現するグリコシル化ポリペプチドをコードする形質転換された微細藻類である。
【００９３】
本願明細書で使用される微細藻類は、下記を含む水生の単細胞の光合成生物である：
−  緑藻類：緑藻植物（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍａｒｉｎａ（例えば、ＣＣＭＰ２３３３）、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ（例えば、ＵＴＥＸ１６６３）、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．（ＣＣＭＰ２２５１）、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓなど）、ナンノクロロプシス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓａｌｉｎａ（例えば、ＣＣＡＰ８４９／２）、およびＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇｏｄｉｔａｎａ（例えば、ＣＣＡＰ８４９／５）など）、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｔｅｓ、Ｕｌｖｏｐｈｙｔｅｓ、プラシノ藻（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａ（例えば、ＣＣＭＰ９０４）、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｍａｒｉｎａ（例えば、ＣＣＭＰ８９８）、Ｐｒａｓｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（例えば、ＣＣＭＰ１１９２）、Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ  ｒｏｔｕｎｄａ（例えば、ＵＴＥＸＬＢ９９６）、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ、およびＭｅｓｏｓｔｉｇｍａなど）、
−  紅藻類：Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔｉｎａ（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ（例えば、ＣＣＡＰ１３２０／３およびＣＣＭＰ６７５）またはＲｈｏｄｅｌｌａ  ｖｉｏｌａｃｅａ（例えば、ＳＡＧ−１１５．７９）など）、ＣｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｔｅｓおよびＧｌａｕｃｏｐｈｙｔｅｓ
−  クロムアルベオラータ：Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ（Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ  ｔｒｉｑｕｅｔｒａ（例えば、ＣＣＭＰ４４８）、Ｏｘｙｈｒｒｉｓ、Ｐｅｒｋｉｎｓｕｓなど）、珪藻（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ（例えば、ＣＣＭＰ１３３５）、海洋性珪藻（例えば、ＣＣＡＰ１０５２／１Ａ、Ｐ．ｔ．１．８．６、およびｅｔ  ＣＣＭＰ６３２）、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、ＣＣＭＰ３４４）、Ｓｋｅｌｅｌｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍ（ＣＣＭＰ１３３２）、Ｃｈａｅｏｔｏｃｅｒｏｓ  ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ（例えば、ＣＣＭＰ１３１５）、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｐｕｎｃｔａｔａ（例えば、ＣＣＭＰ５６１）、Ａｍｐｈｏｒａ  ｃｏｆｆｅａｅｆｏｒｍｉｓ（例えば、ＣＣＭＰ１２７）、Ｏｄｏｎｔｅｌｌａ  ａｕｒｉｔａ（例えば、ＣＣＭＰ１４５）、およびナビクラ属など）、Ｒａｐｈｉｄｉｏｐｈｙｔｅｓ、Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔｅｓ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｌｕｔｈｅｒｉ（例えば、ＣＣＭＰ１３２５）など）、Ｐｈａｅｏｐｈｙｔｅｓ、Ｂｏｌｉｄｏｐｈｙｔｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｐｈｒｙｉｄｓ、Ｔｈｒａｕｓｔｒｏｃｈｙｔｒｉｄｓ；ハプト藻（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ（例えば、ＣＣＡＰ９２７／１４）、Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅｓ、およびクリプト藻類など）、
−  ユーグレナ藻（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ（例えば、ＣＣＭＰ１５９４）など）。
【００９４】
好ましくは、当該微細藻類は、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．の一部ではなく、最も好ましくは、当該微細藻類は、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉまたはＯｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｃｅａｎｉｃａではない。
【００９５】
好ましくは、当該微細藻類は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓの一部ではない。
【００９６】
当該微細藻類は、形質転換される前に、β（１，２）−キシロシル基転移酵素、および／またはα（１，３）フコシル基転移酵素の活性を全く共有していない。実際に、そして驚くべきことに、発明者らは、微細藻類は、植物と比較して、β（１，２）結合型キシロース、および／またはα（１，３）結合型フコースを、哺乳類において免疫原性であるタンパク質Ｎ−グリカンに付加しないことを証明した。従って、植物と比較して、微細藻類中で、β（１，２）結合型キシロース、および／またはα（１，３）結合型フコースを含まない治療糖タンパク質を産生するために、β（１，２）−キシロシル基転移酵素、および／またはα  フコシル基転移酵素を不活性化する必要がない。
【００９７】
当業者は、周知の方法（実施例で記載される後述の方法など）によって形質転換される前に、β（１，２）−キシロシル基転移酵素、および／またはα（１，３）フコシル基転移酵素の活性を全く共有していない微細藻類を容易に同定できる。
【００９８】
例えば、当業者は、ＡＧＲＩＳＥＲＡ製の抗体  抗α（１，３）フコース（ｒｅｆ：ＡＳ０７２６８）および抗β（１，２）キシロース（ｒｅｆ：ＡＳ０７２６７）を使用して、β（１，２）−キシロシル基転移酵素、および／またはα（１，３）フコシル基転移酵素の活性を全く共有していない微細藻類を容易に同定できる。
【００９９】
有利には、当該微細藻類は、β（１，２）結合型キシロース、および／もしくはα（１，３）結合型フコースをタンパク質Ｎ−グリカンに付加し、動物と構造が異なり、哺乳類において免疫原性である糖タンパク質をもたらす植物、またはマンノースをグリカン構造に付加し、高マンノシル化タンパク質をもたらすマンノシル基転移酵素遺伝子を発現する酵母などのようには免疫原性エピトープの付加に関与する遺伝子の抑制を必要とすることなく、動物において、治療目的に適したグリコシル化パターンを有するグリコシル化ポリペプチドの生成を可能にする。
【０１００】
実際に、形質転換された微細藻類中で発現するグリコシル化ポリペプチドは、形質転換される前に、β（１，２）結合型フコース、および／またはα（１，３）結合型フコースを含まず、当該微細藻類は、β（１，２）−キシロシル基転移酵素、および／または、α  フコシル基転移酵素の活性を全く共有しない。
【０１０１】
また、当該微細藻類は、酵母および真菌において認められるグリカン構造へのマンノースの付加から生じる、高マンノシル化タンパク質をもたらすマンノシル基転移酵素活性を全く共有しない。
【０１０２】
本発明の好ましい実施態様では、当該微細藻類は、珪藻、ユーグレナ藻、ハプト藻、プラシノ藻および緑藻植物から選択される。
【０１０３】
本発明の好ましい実施態様では、当該微細藻類は、緑藻植物およびプラシノ藻から選択される。
【０１０４】
本発明の好ましい実施態様では、当該微細藻類は、珪藻およびハプト藻から選択される。
【０１０５】
本発明の好ましい実施態様では、当該微細藻類は、ユーグレナ藻から選択される。
【０１０６】
形質転換された微細藻類中で産生されるグリコシル化タンパク質は、動物（特に哺乳類、さらにはヒト）において治療的に使用されてもよい。
【０１０７】
本発明の１つの実施態様では、当該グリコシル化ポリペプチドは、ヒトのグリコシル化ポリペプチドの一次アミノ酸配列、非ヒト哺乳類のグリコシル化ポリペプチドの一次アミノ酸配列、抗体もしくはその活性断片の一次アミノ酸配列、および／または非哺乳類のグリコシル化ポリペプチドの一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを含む群から選択される。
【０１０８】
本発明の好ましい実施態様では、当該グリコシル化ポリペプチドは、動物のポリペプチドである。
【０１０９】
本発明の好ましい実施態様では、当該グリコシル化ポリペプチドは、哺乳類のポリペプチドである。
【０１１０】
本発明のより好ましい実施態様では、当該グリコシル化ポリペプチドは、ヒトのポリペプチドである。
【０１１１】
適したグリコシル化タンパク質の例としては、エリスロポエチン、サイトカイン（インターフェロンなど）、抗体、凝固因子、ホルモン、β−グルコセレブロシダーゼ、ペントラキシン−３、抗ＴＮＦが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
微細藻類中の組み換えタンパク質の発現を駆動するプロモーターの例としては、核プロモーター（表１で開示されたものなど）；葉緑体のプロモーター（コナミドリムシ由来のｒｂｃｌ遺伝子（リブロース  二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ  主要サブユニット）およびａｔｐＡ遺伝子（λ−ＡＴＰシンターゼサブユニット）のプロモーター、またはｒｒｎ遺伝子、ａｔｐＢ遺伝子、ｐｓｂＡ遺伝子、ｐｓｂＤ遺伝子の５’ＵＴＲなど）；ならびに植物または動物のプロモーター、が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
【表１】
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【０１１４】
本発明の好ましい実施態様では、形質転換された微細藻類中で発現するグリコシル化ポリペプチドは、治療目的に適したグリコシル化パターン、特に、動物のグリコシル化パターン、好ましくは哺乳類のグリコシル化パターン、より好ましくはヒト様グリコシル化パターンを含む。
【０１１５】
より好ましい実施態様では、形質転換された微細藻類中で発現するグリコシル化ポリペプチドは、少なくとも１つのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を含む。
【０１１６】
本発明の実施態様では、少なくとも１つのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するグリコシル化ポリペプチドは、形質転換された微細藻類からのその単離後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの少なくとも１つのさらなるグリコシル化反応にさらに曝される。
【０１１７】
本発明はまた、複合型Ｎ−グリカンを産生できる形質転換された微細藻類を提供することを目的とする。
【０１１８】
従って、本発明の別の対象は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に付加し、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を産生できるＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素  Ｉ（ＧｎＴ  Ｉ）をさらに発現する、上記の形質転換された微細藻類に関する。Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素  Ｉ（ＧｎＴ  Ｉ）は当業者に周知であり、マンノシド  アセチルグルコサミニル転移酵素  １（ＭＧＡＴｌ）としても知られる。ＧｎＴＩの例として、マウス由来のＧｎＴＩ（配列番号：１８、受入番号  ＮＰ＿０３４９２４）、またはヒト由来のＧｎＴＩ（配列番号：１９、受入番号  ＮＰ＿００２３９７）を引用することができる。好ましくは、当該Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素  Ｉ（ＧｎＴ  Ｉ）は、配列番号：１９（受入番号  ＮＰ＿００２３９７）と一致する。
【０１１９】
本発明の別の対象はまた、Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素（ＧｎＴ  Ｉ、ＧｎＴ  ＩＩ、ＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩ）、マンノシダーゼ  ＩＩおよびフコシル基転移酵素、ガラクトース転移酵素（ＧａｌＴ）またはシアル酸転移酵素（ＳＴ）をさらに発現し、複合型Ｎ−グリカンを産生する上記の形質転換された微細藻類に関する。
【０１２０】
ＧｎＴ  Ｉ、ＧｎＴ  ＩＩ、ＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩ、マンノシダーゼ  ＩＩ、フコシル基転移酵素、ガラクトース転移酵素（ＧａｌＴ）およびシアル酸転移酵素（ＳＴ）は、当業者に周知である。
【０１２１】
ＧｎＴ  ＩＩ（マンノシル（α−１，６−）−糖タンパク質  β−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素（ＭＧＡＴ２）としても知られる）の例としては、マウス由来のＧｎＴ  ＩＩ（配列番号：２０、受入番号  ＮＰ＿６６６１４７）、またはヒト由来のＧｎＴ  ＩＩ（配列番号：２１、受入番号  ＮＰ＿００２３９９）が挙げられる。好ましくは、当該Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素  ＩＩ（ＧｎＴ  ＩＩ）は、配列番号：２１（受入番号  ＮＰ＿００２３９９）と一致する。
【０１２２】
ＧｎＴ  ＩＩＩ（マンノシル（β−１，４−）−糖タンパク質  β−ｌ，４−Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素（ＭＧＡＴ３）としても知られる）の例としては、マウス由来のＧｎＴ  ＩＩＩ（配列番号：２２、受入番号  ＮＰ＿０３４９２５）、またはヒト由来のＧｎＴ  ＩＩＩ（配列番号：２３、受入番号  ＮＰ＿００２４００）が挙げられる。好ましくは、当該Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素  ＩＩＩ（ＧｎＴ  ＩＩＩ）は、配列番号：２２（受入番号  ＮＰ＿００２４００）と一致する。
【０１２３】
ＧｎＴ  ＩＶ（マンノシル（α−１，３−）−糖タンパク質  β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素（ＭＧＡＴ４）としても知られる）の例としては、マウス由来のＧｎＴ  ＩＶ  アイソザイムＡ（配列番号：２４、受入番号  ＮＰ＿７７６２９５）、マウス由来のアイソザイムＢ（配列番号：２５、受入番号  ＮＰ＿６６６０３８）、マウス由来のアイソザイムＣ（配列番号：２６、受入番号  ＮＰ＿０８０５１９）、ヒト由来のＧｎＴ  ＩＶ  アイソザイムＡ（配列番号：２７、受入番号  ＮＰ＿０３６３４６）、ヒト由来のＧｎＴ  ＩＶ  アイソザイムＢ（アイソフォーム１、配列番号：２８、受入番号  ＮＰ＿０５５０９０、またはアイソフォーム２、配列番号：２９、受入番号  ＮＰ＿４６３４５９）またはヒト由来のＧｎＴ  ＩＶ  アイソザイムＣ（配列番号：３０、受入番号  ＮＰ＿０３７３７６）が挙げられる。
【０１２４】
ＧｎＴ  Ｖの例としては、マウス由来のＧｎＴ  Ｖ（配列番号：３１、受入番号  ＮＰ＿６６０１１０）、マウス由来のＧｎＴ  Ｖ  アイソザイムＢ（配列番号：３２、受入番号  ＮＰ＿７６６５３６）、ヒト由来のＧｎＴ  Ｖ（配列番号：３３、受入番号  ＮＰ＿００２４０１）、ヒト由来のＧｎＴ  Ｖ  アイソザイムＢ（アイソフォーム１、配列番号：３４、受入番号  ＮＰ＿６５３２７８、またはアイソフォーム２、配列番号：３５、受入番号  ＮＰ＿９４５１９３）が挙げられる。
【０１２５】
ＧｎＴ  ＶＩの例としては、ニワトリ由来のＧｎＴ  ＶＩ（配列番号：３６、受入番号  ＮＰ＿９９００１２）が挙げられる。
【０１２６】
マンノシダーゼ  ＩＩ（ＭＡＮ  ＩＩ）（マンノシダーゼ  ２、α１（ＭＡＮ２Ａ１）としても知られる）の例としては、マウス由来のＭＡＮ  ＩＩ（配列番号：３７、受入番号  ＮＰ＿０３２５７５）、またはヒト由来のＭＡＮ  ＩＩ（配列番号：３８、受入番号  ＮＰ＿００２３６３）が挙げられる。好ましくは、当該マンノシダーゼ  ＩＩ（ＭＡＮ  ＩＩ）は、配列番号：３８（受入番号  ＮＰ＿００２３６３）と一致する。
【０１２７】
フコシル基転移酵素は当業者に周知であり、例として、α（１，６）フコシル基転移酵素（フコシル基転移酵素  ８（ＦＵＴ８））（マウス由来のＦＵＴ８（配列番号：３９、受入番号  ＮＰ＿０５８５８９）、またはヒト由来のＦＵＴ８（配列番号：４０、受入番号  Ｑ９ＢＹＣ５）など）が挙げられる。好ましくは、当該フコシル基転移酵素は、配列番号：４０（受入番号  Ｑ９ＢＹＣ５）と一致する。
【０１２８】
ガラクトース転移酵素は当業者に周知であり、例として、１β（ｌ，４）ガラクトース転移酵素（Ｂ４ＧＡＬＴ１）（ヒト由来のＢ４ＧＡＬＴ１（配列番号：６６、受入番号  ＮＰ＿００１４８８）、またはマウス由来のＢ４ＧＡＬＴ１（配列番号：６７、受入番号  ＣＡＭ１４７８２）など）が挙げられる。好ましくは、当該ガラクトース転移酵素は、配列番号：６６（受入番号  ＮＰ＿００１４８８）と一致する。
【０１２９】
シアル酸転移酵素は当業者に周知であり、例として、α２，６  シアル酸転移酵素（ＳＴ６  β−ガラクトサミド  α−２，６−シアル酸転移酵素  １（ＳＴ６ＧＡＬ１）、またはβ  ガラクトシド  α２，６  シアル酸転移酵素  ２（ＳＴ６ＧＡＬ２））（マウス由来のＳＴ６ＧＡＬ２（配列番号：４１、受入番号  ＮＰ＿７６６４１７）、またはヒト由来のＳＴ６ＧＡＬ１（アイソフォームａ、配列番号：４２、受入番号  ＮＰ＿７７５３２３、またはアイソフォームｂ、配列番号：４３、受入番号  ＮＰ＿７７５３２４）など）、またはα２，３  シアル酸転移酵素（ＳＴ３  β−ガラクトシド  α−２，３−シアル酸転移酵素  ６（ＳＴ３ＧＡＬ６）、ＳＴ３  β−ガラクトシド  α−２，３−シアル酸転移酵素  １（ＳＴ３ＧＡＬ１）、ＳＴ３  β−ガラクトシド  α−２，３−シアル酸転移酵素  ２（ＳＴ３ＧＡＬ２）、ＳＴ３  β−ガラクトシド  α−２，３−シアル酸転移酵素  ３（ＳＴ３ＧＡＬ３）（マウス由来のＳＴ３ＧＡＬ１（配列番号：４４、受入番号  ＮＰ＿０３３２０３）、またはヒト由来のＳＴ３ＧＡＬ１（配列番号：４５、受入番号  ＮＰ＿００３０２４）、ヒト由来のＳＴ３ＧＡＬ２（配列番号：４６  受入番号  ＮＰ＿００８８５８）、ヒト由来のＳＴ３ＧＡＬ３（アイソフォームａ、配列番号：４７、受入番号  ＮＰ＿７７７６２３、アイソフォームｂ、配列番号：４８、受入番号  ＮＰ＿７７７６２４、アイソフォームｃ、配列番号：４９、受入番号  ＮＰ＿７７７６２５、アイソフォームｆ、配列番号：５０、受入番号  ＮＰ＿７７７６２８、アイソフォームｊ、配列番号：５１、受入番号  ＮＰ＿００６２７０、アイソフォームｄ、配列番号：５２、受入番号  ＮＰ＿７７７６２６、アイソフォームｅ、配列番号：５３、受入番号  ＮＰ＿７７７６２７、アイソフォームｉ、配列番号：５４、受入番号  ＮＰ＿７７７６３１、アイソフォームｇ、配列番号：５５、受入番号  ＮＰ＿７７７６２９、アイソフォームｈ、配列番号：５６、受入番号  ＮＰ＿７７７６３０）など）、またはヒト由来のＳＴ３ＧＡＬ６（配列番号：５７、受入番号  ＮＰ＿００６０９１）が挙げられる。
【０１３０】
本発明の別の対象は、ＧｎＴ  Ｉ酵素、およびα−１，３／α−１，６−マンノシダーゼ活性（ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２をトリミングし、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を産生できるマンノシダーゼ  ＩＩなど）をさらに発現する、上記の形質転換された微細藻類に関する。
【０１３１】
本発明の別の対象は、ＧｎＴ  Ｉ酵素、α−１，３／α−１，６−マンノシダーゼ活性（マンノシダーゼ  ＩＩなど）、および、β１，２−ＧｌｃＮＡｃを基質上に転移し、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を産生できるＧｎＴ  ＩＩ酵素をさらに発現する、上記の形質転換された微細藻類に関する。
【０１３２】
本発明の別の対象は、ＧｎＴ  Ｉ酵素、α−１，３／α−１，６−マンノシダーゼ活性（マンノシダーゼ  ＩＩなど）、および、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを受容できる基質上にβ１，４−ＧｌｃＮＡｃを転移し、バイセクトされたＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を産生できるＧｎＴ  ＩＩＩ酵素をさらに発現する、上記の形質転換された微細藻類に関する。
【０１３３】
本発明の別の対象は、ＧｎＴ  Ｉ酵素、α−１，３／α−１，６−マンノシダーゼ活性（マンノシダーゼ  ＩＩなど）、ＧｎＴ  ＩＩおよびＧｎＴ  ＩＩＩ酵素をさらに発現し、バイセクトされたＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を産生する、上記の形質転換された微細藻類に関する。
【０１３４】
本発明の別の対象は、ＧｎＴ  Ｉ酵素、α−１，３／α−１，６−マンノシダーゼ活性（マンノシダーゼ  ＩＩなど）、ならびにＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  ＶおよびＧｎＴ  ＶＩのうち１つ以上のグリコシル化酵素をさらに発現し、３本側鎖または４本側鎖  Ｎ結合型グリカンを産生する、上記の形質転換された微細藻類に関する。
【０１３５】
本発明の別の対象は、ＧｎＴ  Ｉ酵素、α−１，３／α−１，６−マンノシダーゼ活性（マンノシダーゼ  ＩＩなど）、ＧｎＴ  ＩＩ酵素、およびフコシル基転移酵素、ガラクトース転移酵素またはシアル酸転移酵素から選択される１つ以上のグリコシル基転移酵素をさらに発現する、上記の形質転換された微細藻類に関する。
【０１３６】
ＤＮＡ配列情報があれば、当業者は、ＧｎＴ活性をコードするＤＮＡ分子をクローン化できる。当該技術分野で周知の標準的な技術を使用すれば、ＧｎＴ  Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、もしくはＶＩ、マンノシダーゼ  ＩＩ、またはグリコシル基転移酵素（フコシル基転移酵素、ガラクトース転移酵素またはシアル酸転移酵素など）をコードする核酸分子（またはその触媒的に活性な断片をコードする核酸分子）を、これらの酵素のうちの１つ以上が当該微細藻類中で活発に発現できるように、選択された微細藻類における転写を駆動できるプロモーターおよび他の発現制御配列の転写制御下で、適切な発現ベクターに挿入できる。
【０１３７】
好ましくは、当該酵素はヒト由来であるが、他の動物、哺乳類、植物または微細藻類の酵素もまた、有用である。
【０１３８】
本発明の１つの実施態様では、遺伝子が切断され、酵素の触媒ドメインをコードする断片を与える。内在性の標的配列を除くことにより、当該酵素は、再指令され（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）、他の細胞局在において発現する可能性がある。このような触媒ドメインの選択は、触媒ドメインがその後に活性となる特定の条件に関する知識によって導かれてもよい。例えば、特定のグリコシル化酵素が後期ゴルジにおいて活性となり、後期ゴルジにおける宿主生物の全ての公知の酵素が特定の最適ｐＨを有する場合、触媒ドメインは、そのｐＨで適切な活性を示すものが選択される。次いで、酵素の触媒的に活性な断片をコードするＤＮＡを、シグナルペプチドをコードするＤＮＡに結合し、ＥＲ、ゴルジ、またはトランスゴルジネットワーク内に酵素を局在化させる。これらのシグナル配列は、宿主生物、および他の関連する生物または無関係の生物から選択されてもよい。ＥＲまたはゴルジの膜結合型タンパク質は、通常、例えば、サイトゾル側末端（ｃｔ）、膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）、および幹領域（ｓｒ）をコードするＮ末端配列を含んでいてもよい。ｃｔ、ｔｍｄ、およびｓｒ配列は、個々に、またはオルガネラの内（内腔）膜のアンカータンパク質と合わせて十分なものである。シグナル配列の別の供給源としては、想起シグナルペプチド（例えば、テトラペプチド  ＨＤＥＬ、ＫＤＥＬ、ＤＤＥＬ）、またはいずれかの同等の想起シグナルが挙げられ、これらは、通常、ＥＲまたはゴルジへの逆行輸送を誘導するタンパク質のＣ末端で見出される。
【０１３９】
本発明の実施態様では、ＧｎＴ  Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、もしくはＶＩ、マンノシダーゼ  ＩＩ、またはグリコシル基転移酵素（フコシル基転移酵素、ガラクトース転移酵素またはシアル酸転移酵素など）の発現を微細藻類中で駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列は、当該ＥＲおよびゴルジにおいて、５．１〜８のｐＨで最適な活性を有する酵素触媒ドメインを含み、このドメインは通常は当該触媒ドメインと関連していない細胞の標的シグナルに融合する。
【０１４０】
グリコシル基転移酵素がゴルジ体中で十分に機能するために、当該酵素は、新生糖タンパク質に付加された糖部分の高エネルギー供与体である、十分な濃度の適切なヌクレオチド糖を与えられる必要がある。ヒトにおいて、全範囲のヌクレオチド糖前駆体は、一般的に、サイトゾル中で合成され、ゴルジ体に輸送され、ゴルジ体において、ヌクレオチド糖前駆体は、グリコシル基転移酵素によって、コアオリゴ糖に結合する。
【０１４１】
出願人は、微細藻類中で、十分な濃度のＧｌｃＮＡｃ、マンノース、フコースおよびガラクトースを認めたが、シアル酸は認めなかった。
【０１４２】
従って、シアル酸転移酵素がゴルジ体中で十分に機能するために、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ  ２−エピメラーゼ、ＧｌｃＮＡｃ  ２−エピメラーゼ、ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ  ２−エピメラーゼ、ＮｅｕＡｃ  シンターゼ、ＮｅｕＡｃ−９Ｐ  シンターゼ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ  シンターゼ、およびＣＭＰ−シアル酸輸送体のうち、シアル酸合成、その活性化、およびゴルジ体内でのその輸送に必要とされる１つ以上の酵素を微細藻類中で発現する必要がある（例えば、Ｍｉｓａｋｉ  Ｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００６年１月２７日；３３９（４）：１１８４−９；Ｐａｃｃａｌｅｔ  Ｔら、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．２００７年１月；５（１）：１６−２５、における植物の研究を参照）。
【０１４３】
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ  ２−エピメラーゼ（これは、グルコサミン（ＵＤＰ−Ｎ−アセチル）−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ  （ＧＮＥ）としても知られる）は、当業者に周知であり、例として、マウス由来のＧＮＥ（配列番号：５８、受入番号  ＮＰ＿０５６６４３）、またはヒト由来のＧＮＥ（配列番号：５９、受入番号  ＮＰ＿００５４６７）を含む。好ましくは、当該ＧＮＥは、配列番号：５９（受入番号  ＮＰ＿００５４６７）と一致する。
【０１４４】
ＧｌｃＮＡｃ  ２−エピメラーゼは、当業者に周知であり、例として、ヒト由来のレニン結合タンパク質（ＲＥＮＢＰ）（配列番号：６０、受入番号  ＮＰ＿００２９０１）を含む。
【０１４５】
ＮｅｕＡｃ−９Ｐ  シンターゼ（Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ（ＮＡＮＳ）とも呼ばれる）は、当業者に周知であり、例として、ヒト由来のＮＡＮＳ（配列番号：６１、受入番号  ＮＰ＿０６１８１９）を含む。
【０１４６】
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ  シンターゼ（シチジンモノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ＣＭＡＳ）としても知られる）は、当業者に周知であり、例として、マウス由来のＣＭＡＳ（配列番号：６２、受入番号  ＮＰ＿０３４０３８）またはヒト由来のＣＭＡＳ（配列番号：６３、受入番号  ＮＰ＿０６１１５６）を含む。好ましくは、当該ＣＭＡＳは、配列番号：６３（受入番号  ＮＰ＿０６１１５６）と一致する。
【０１４７】
ＣＭＰ−シアル酸輸送体もまた当業者に周知であり、例として、マウス由来の、溶質輸送体ファミリー  ３５（ＣＭＰ−シアル酸輸送体）、メンバー  Ａ１（ＳＬＣ３５Ａ１）（配列番号：６４、受入番号  ＮＰ＿０３６０２５）またはヒト由来のもの（配列番号：６５、受入番号  ＮＰ  ００６４０７）が挙げられる。好ましくは、当該ＣＭＰ−シアル酸輸送体は、ヒト由来のＳＬＣ３５Ａ１（配列番号：６５、受入番号  ＮＰ＿００６４０７）と一致する。
【０１４８】
付加された輸送体タンパク質は、ヌクレオチド糖を、サイトゾルから、ゴルジ体へ輸送し、ゴルジ体において、ヌクレオチド糖は、グリコシル基転移酵素によって反応し、例えば、Ｎ−グリカンを伸長する可能性がある。当該反応は、ヌクレオシド二リン酸またはヌクレオシド一リン酸（例えばＵＤＰ、ＧＤＰ、またはＣＭＰ）を遊離する。ヌクレオシド二リン酸の蓄積は、グリコシル基転移酵素のさらなる活性を阻害するため、ヌクレオチドジホスファターゼをコードする遺伝子が発現されたコピーを与えることもまた、しばしば好ましい。ジホスファターゼ（必要に応じて、ＵＤＰまたはＧＤＰに対して特異的である）は、ヌクレオシド二リン酸を加水分解し、ヌクレオシド一リン酸および無機リン酸をもたらす。ヌクレオシド一リン酸は、グリコシル基転移酵素を阻害せず、どのような場合でも、ゴルジから、内在性の細胞系によって輸送される。
【０１４９】
本発明の１つの対象は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に付加し、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を産生できるＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素  Ｉ（ＧｎＴ  Ｉ）を発現する、形質転換された微細藻類である。
【０１５０】
本発明の別の対象は、Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素（ＧｎＴ  Ｉ、ＧｎＴ  ＩＩ、ＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩ）、マンノシダーゼ  ＩＩおよびフコシル基転移酵素、ガラクトース転移酵素（ＧａｌＴ）またはシアル酸転移酵素（ＳＴ）を発現し、複合型Ｎ−グリカンを産生する形質転換された微細藻類である。
【０１５１】
従って、本発明の１つの対象は、ＧｎＴ  Ｉ酵素およびα−１，３／α−１，６−マンノシダーゼ活性（ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２をトリミングし、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を産生できるマンノシダーゼ  ＩＩなど）を発現する、形質転換された微細藻類である。
【０１５２】
本発明の別の対象は、ＧｎＴ  Ｉ酵素、α−１，３／α−１，６−マンノシダーゼ活性（マンノシダーゼ  ＩＩなど）、およびβ１，２−ＧｌｃＮＡｃを基質上に転移し、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を産生できるＧｎＴ  ＩＩ酵素を発現する形質転換された微細藻類である。
【０１５３】
本発明の別の対象は、ＧｎＴ  Ｉ酵素、α−１，３／α−１，６−マンノシダーゼ活性（マンノシダーゼ  ＩＩなど）、およびバイセクティングＧｌｃＮＡｃを受容できる基質上にβ１，４−ＧｌｃＮＡｃを転移し、バイセクトされたＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を産生できるＧｎＴ  ＩＩＩ酵素を発現する形質転換された微細藻類である。
【０１５４】
本発明の別の対象は、ＧｎＴ  Ｉ酵素、α−１，３／α−１，６−マンノシダーゼ活性（マンノシダーゼ  ＩＩなど）、ＧｎＴ  ＩＩおよびＧｎＴ  ＩＩＩ酵素を発現し、バイセクトされたＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を産生する、形質転換された微細藻類である。
【０１５５】
本発明の別の対象は、ＧｎＴ  Ｉ酵素、α−１，３／α−１，６−マンノシダーゼ活性（マンノシダーゼ  ＩＩなど）、ならびにＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  ＶおよびＧｎＴ  ＶＩのうちの１つ以上のグリコシル化酵素をさらに発現し、３本側鎖または４本側鎖糖タンパク質を産生する、形質転換された微細藻類である。
【０１５６】
本発明の別の対象は、ＧｎＴ  Ｉ酵素、α−１，３／α−１，６−マンノシダーゼ活性（マンノシダーゼ  ＩＩなど）、ＧｎＴ  ＩＩ酵素、およびフコシル基転移酵素、ガラクトース転移酵素またはシアル酸転移酵素から選択される１つ以上のグリコシル基転移酵素を発現する形質転換された微細藻類である。
【０１５７】
本発明の別の対象は、ＧｎＴ  Ｉ酵素、α−１，３／α−１，６−マンノシダーゼ活性（マンノシダーゼ  ＩＩなど）、ＧｎＴ  ＩＩ酵素、およびフコシル基転移酵素、ガラクトース転移酵素またはシアル酸転移酵素から選択される１つ以上のグリコシル基転移酵素を発現する形質転換された微細藻類であるが、ただし、選択されたグリコシル基転移酵素がシアル酸転移酵素である場合、形質転換された微細藻類は、シアル酸合成、その活性化、およびゴルジ体内でのその輸送に必要とされる、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ  ２−エピメラーゼ、ＧｌｃＮＡｃ  ２−エピメラーゼ、ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ  ２−エピメラーゼ、ＮｅｕＡｃ  シンターゼ、ＮｅｕＡｃ−９Ｐ  シンターゼ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ  シンターゼ、およびＣＭＰ−シアル酸輸送体のうちの１つ以上の酵素をさらに発現する。
【０１５８】
本発明の実施態様では、ＧｎＴ  Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、もしくはＶＩ、マンノシダーゼ  ＩＩ、またはグリコシル基転移酵素（フコシル基転移酵素、ガラクトース転移酵素またはシアル酸転移酵素など）の発現を、微細藻類の細胞中で駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列は、当該ＥＲおよびゴルジにおいて、５．１〜８のｐＨで最適な活性を有する酵素触媒ドメインを含み、このドメインは通常は当該触媒ドメインと関連していない細胞の標的シグナルに融合する。
【０１５９】
本発明の別の実施態様では、当該微細藻類の細胞は、緑藻類、紅藻類、クロムアルベオラータ、およびユーグレナ藻から選択される。
【０１６０】
本発明の１つの対象は、下記の工程を含む、少なくとも１つのグリコシル化ポリペプチドを産生するための方法である：
（ｉ）上記の形質転換された微細藻類を培養し、当該少なくとも１つのグリコシル化ポリペプチドの発現を得る工程、および
（ｉｉ）当該少なくとも１つのグリコシル化ポリペプチドを精製する工程。
【０１６１】
有利には、本発明の方法は、上記の微細藻類を得るために、工程（ｉ）の前に微細藻類を形質転換する工程をさらに含む。
【０１６２】
有利には、少なくとも１つのグリコシル化ポリペプチドは、動物において、治療目的に適したグリコシル化パターンを示し、β（１，２）結合型キシロース、および／もしくはα（１，３）結合型フコースを、タンパク質Ｎ−グリカンに付加し、動物と構造が異なり、哺乳類において免疫原性である糖タンパク質を生じる植物、または、マンノースをグリカン構造に付加し、高マンノシル化タンパク質をもたらすマンノシル基転移酵素遺伝子を発現する酵母などのようには免疫原性エピトープの付加に関与する遺伝子の抑制を当該形質転換された微細藻類において必要とすることなく、当該形質転換された微細藻類によって産生される。
【０１６３】
従って、当該少なくとも１つのグリコシル化ポリペプチドは、β（１，２）結合型フコース、および／またはα（１，３）結合型フコースを含まず、当該微細藻類は、形質転換される前に、β（１，２）−キシロシル基転移酵素、および／またはα  フコシル基転移酵素の活性を全く共有しない。
【０１６４】
さらに、当該微細藻類は、酵母および真菌において認められるグリカン構造へのマンノースの付加から生じる高マンノシル化タンパク質をもたらすマンノシル基転移酵素活性を全く共有しない。
【０１６５】
好ましい実施態様では、当該形質転換された微細藻類は、ＧｎＴ  Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、もしくはＶＩ、マンノシダーゼ  ＩＩ、またはグリコシル基転移酵素（フコシル基転移酵素、ガラクトース転移酵素またはシアル酸転移酵素など）から選択される少なくとも１つの酵素を、当該微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列とともに発現し、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現するグリコシル化ポリペプチドをコードする。
【０１６６】
好ましい実施態様では、当該方法によって産生されるグリコシル化ポリペプチドは、治療目的に適したグリコシル化パターン、特に、動物のグリコシル化パターン、好ましくは哺乳類のグリコシル化パターン、より好ましくはヒト様グリコシル化パターンを含む。
【０１６７】
治療目的に適したグリコシル化パターンを有するグリコシル化ポリペプチドを精製するために、本発明の方法は、当該少なくとも１つのグリコシル化ポリペプチドのグリコシル化パターンを特定する工程を含む。
【０１６８】
このグリコシル化パターンは、当業者に周知の方法によって特定できる。
【０１６９】
例として、組み換え糖タンパク質のＮ−グリコシル化についての予備情報は、レクチン（ＣＯＮ  Ａ；ＥＣＡ；ＳＮＡ；ＭＡＡなど）、および特異的なＮ−グリカン抗体（抗β１，２−キシロース；抗α−１，３−フコース；抗Ｎｅｕ５Ｇｃ、抗ルイスなど）などの特異的なプローブを使用して、親和性ブロット分析および免疫ブロット分析によって得ることができる。これは、ＦＩＴＣＨＥＴＴＥら（Ｐｌａｎｔ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第３５５巻、３１７−３４２頁、２００７）に従ってなされ、脱グリコシル化分析によって完了することができる。
【０１７０】
組み換えタンパク質の詳細なＮ−グリカンの特性を検討するため、Ｎ結合型オリゴ糖を、酵素消化または化学処理を使用して、非特異的な様式で、タンパク質から放出した（ＦＩＴＣＨＥＴＴＥら、上記、２００７；ＳＥＶＥＮＯら、Ｐｌａｎｔ  Ｎ−ｇｌｙｃａｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｎｕｔｅ  ａｍｏｕｎｔｓ  ｏｆ  ｍａｔｅｒｉａｌ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第３７９（１）巻、６６−７２頁、２００８）。還元オリゴ糖の得られた混合物は、ＨＰＬＣおよび／または質量分析のアプローチ（基本的に、ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＢＡＲＤＯＲら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ  ｐｌａｎｔ  Ｎ−ｇｌｙｃａｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｅｘｔ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ−ｍａｄｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．、第１６（５）巻、５７６−５８３頁、２００６、ＳＥＶＥＮＯら、上記、２００８）によって、特性付けることができる。これらの戦略は、エキソグリコシダーゼ消化と合わせ、Ｎ−グリカンの同定および定量化を可能にする（Ｓｅｖｅｎｏら、２００８）。
【０１７１】
組み換えタンパク質のＮ−グリコシル化の特性を検討するための別の選択肢は、ＢＡＲＤＯＲら（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｃ５−１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｌｆａｌｆａ  ｐｌａｎｔｓ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ａ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｄ  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｇｌｙｃｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎｔｏ  ｈｕｍａｎ−ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．、第１（６）巻、４５１−４６２頁、２００３）によって開示されたように、当該タンパク質のプロテアーゼ消化、糖ペプチドの精製および質量分析後に、その糖ペプチドについて直接的に研究することである。
【０１７２】
さらに、治療目的に適したグリコシル化パターンを有するグリコシル化ポリペプチドを精製するために、本発明の方法は、治療目的に適したグリコシル化パターン（β（１，２）結合型フコース、および／またはα（ｌ，３）結合型フコースを含まないグリコシル化パターンなど）を共有する少なくとも１つのグリコシル化ポリペプチドを選択する工程を含む。より好ましくは、当該少なくとも１つのグリコシル化ポリペプチドは、少なくとも１つのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を含む。
【０１７３】
別の好ましい実施態様では、上記の方法において使用される微細藻類は、緑藻類、紅藻類、クロムアルベオラータ、およびユーグレナ藻から選択され、好ましくは、珪藻、ユーグレナ藻、ハプト藻、プラシノ藻および緑藻植物から選択される。
【０１７４】
本発明の好ましい実施態様では、当該方法によって産生されるグリコシル化ポリペプチドは、ヒトのグリコシル化ポリペプチドの一次アミノ酸配列、非ヒト哺乳類のグリコシル化ポリペプチドの一次アミノ酸配列、抗体もしくはその活性断片の一次アミノ酸配列、および／または非哺乳類のグリコシル化ポリペプチドの一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを含む群から選択される。
【０１７５】
より好ましい実施態様では、当該形質転換された微細藻類中で発現するグリコシル化ポリペプチドの例として、エリスロポエチン、サイトカイン（インターフェロンなど）、抗体、凝固因子、ホルモン、β−グルコセレブロシダーゼ、ペントラキシン−３、抗ＴＮＦが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７６】
本発明の別の実施態様では、当該方法は、当該形質転換された微細藻類のＥＲおよびゴルジ体を、組み換えグリコシル化ポリペプチドが通過した後に、当該組み換えグリコシル化ポリペプチドを単離する工程を含む。
【０１７７】
本発明の１つの対象は、形質転換された微細藻類を産生するための方法であって、当該微細藻類を、当該微細藻類中の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列で形質転換する工程を含み、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現するＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素  Ｉをコードする方法である。
【０１７８】
本発明の実施態様では、当該方法は、当該微細藻類を、当該微細藻類中での発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列で形質転換する工程をさらに含み、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現する、Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素  Ｉおよびマンノシダーゼ  ＩＩをコードする。
【０１７９】
本発明の別の実施態様では、当該方法は、当該微細藻類を、当該微細藻類中での発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列で形質転換する工程をさらに含み、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現する、Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素  Ｉ、マンノシダーゼ  ＩＩおよびＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素  ＩＩをコードする。
【０１８０】
本発明の別の実施態様では、当該方法は、当該微細藻類を、当該微細藻類中での発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列で形質転換する工程をさらに含み、当該ヌクレオチド配列は、当該形質転換された微細藻類中で発現する、Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素  Ｉ、マンノシダーゼ  ＩＩ、ならびにＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素  ＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩから選択される少なくとも１つの酵素をコードする。
【０１８１】
本発明の別の実施態様では、当該方法は、当該微細藻類を、当該微細藻類中での発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列で形質転換する工程をさらに含み、当該ヌクレオチド配列は、当該微細藻類中で発現する、Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素  Ｉ、マンノシダーゼ  ＩＩ、ならびにＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素  ＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩから選択される少なくとも１つの酵素、ならびに当該形質転換された微細藻類中で発現する、ガラクトース転移酵素、フコシル基転移酵素およびシアル酸転移酵素から選択される少なくとも１つのグリコシル基転移酵素をコードする。
【０１８２】
シアル酸転移酵素が当該形質転換された微細藻類中で発現する場合、当該微細藻類はまた、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ  ２−エピメラーゼ、ＧｌｃＮＡｃ  ２−エピメラーゼ、ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ  ２−エピメラーゼ、ＮｅｕＡｃ  シンターゼ、ＮｅｕＡｃ−９Ｐ  シンターゼ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ  シンターゼおよびＣＭＰ−シアル酸輸送体のうちの、シアル酸合成、その活性化、およびゴルジ体内でのその輸送に必要とされる１つ以上の酵素をコードするヌクレオチド配列で形質転換される。
【０１８３】
本発明の好ましい実施態様では、当該微細藻類中のＮ−アセチルグルコサミニル転移酵素、マンノシダーゼ  ＩＩまたはグリコシル基転移酵素の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列は、ＥＲおよびゴルジにおいて５．１〜８のｐＨで最適な活性を有する酵素触媒ドメインを含み、このドメインは当該触媒ドメインと通常は関連していない細胞の標的シグナルに融合する。
【０１８４】
本発明の１つの実施態様では、微細藻類の形質転換の前に、当該ヌクレオチド配列は、１ラウンド以上の遺伝子シャッフリング、エラープローンＰＣＲ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏの変異原性に曝されてもよい。
【０１８５】
微細藻類の形質転換は、従来の方法（微粒子銃、電気穿孔、ガラスビーズ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、炭化ケイ素ホイスカー、またはウイルスもしくはアグロバクテリウムの使用など）によって行うことができる。
【０１８６】
本発明の実施態様では、ヌクレオチド配列は、プラスミド、ウイルス配列、二本鎖または一本鎖のＤＮＡ、環状ＤＮＡまたは直鎖ＤＮＡを介して、微細藻類中に導入されてもよい。
【０１８７】
本発明の別の実施態様では、各ヌクレオチド配列またはベクターに、少なくとも１つの選択可能なマーカーを入れ、安定的に形質転換された微細藻類の選択を可能にすることが一般的に好ましい。このようなマーカーの例は、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）に対する抵抗性を可能にするｓｈ  ｂｌｅ遺伝子、ノーセオトリシンに対する抵抗性を可能にするｎａｔまたはｓａｔ−１遺伝子、グルホシネートに対する抵抗性を可能にするｂａｒ遺伝子などの抗生物質抵抗性遺伝子である。
【０１８８】
微細藻類の形質転換後、所望のグリコシル化の表現型を示すタンパク質を表わす形質転換体が選択される。選択は、下記を含む１つ以上の従来の方法によって行うことができる：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ  クロマトグラフィーなどの質量分析、蛍光活性化細胞選別機を使用した細胞の特徴付け、分光光度計、蛍光光度計、またはシンチレーションカウンタ；所望のオリゴ糖部分に対する特異的親和性を有するレクチンまたは抗体への細胞の曝露；糖、抗体およびレクチンからなる群から選択される細胞障害性または放射性の分子への細胞の曝露。
【０１８９】
本発明の対象は、少なくとも１つのグリコシル化ポリペプチドを産生するための、上記の形質転換された微細藻類の使用である。
【０１９０】
当該微細藻類および少なくとも１つのグリコシル化ポリペプチドは、上記の通りである。
【０１９１】
有利には、当該微細藻類は、β（１，２）結合型キシロース、および／もしくはα（１，３）結合型フコースをタンパク質Ｎ−グリカンに付加し、動物と構造が異なり、哺乳類において免疫原性である糖タンパク質をもたらす植物、またはマンノースをグリカン構造に付加し、高マンノシル化タンパク質をもたらすマンノシル基転移酵素遺伝子を発現する酵母などのようには、当該微細藻類において免疫原性エピトープの付加に関与する遺伝子の抑制を必要とすることなく、動物において、治療目的に適したグリコシル化パターンを有するグリコシル化ポリペプチドの生成を可能にする。
【０１９２】
実際に、当該少なくとも１つのグリコシル化ポリペプチドは、形質転換される前に、β（１，２）結合型フコース、および／またはα（１，３）結合型フコースを含まず、当該微細藻類は、β（１，２）−キシロシル基転移酵素、および／またはα（１，３）フコシル基転移酵素の活性を全く共有しない。
【０１９３】
従って、当該微細藻類は、酵母および真菌において認められるグリカン構造へのマンノースの付加から生じる高マンノシル化タンパク質をもたらす、マンノシル基転移酵素活性を全く共有しない。
【０１９４】
さらに有利には、当該少なくとも１つのグリコシル化ポリペプチドは、少なくとも１つのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を含む。
【０１９５】
本発明の対象は、上記の方法によって産生されるグリコシル化ポリペプチドである。
【０１９６】
本発明の別の対象は、上記の方法によって産生される少なくとも１つのグリコシル化ポリペプチドを含む医薬組成物である。
【０１９７】
本発明の別の対象は、本発明の方法によって産生されるグリコシル化ポリペプチドを含む動物用組成物である。
【実施例】
【０１９８】
下記において、詳細な手順が示されていない全ての実験は、標準的な手順に従って行った。
【０１９９】
下記の実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すように包含される。当業者によって、下記の実施例中で開示された技術が、本発明の実行においてよく機能すると発明者らによって発見された技術を表わし、従って、その実行について好ましい様式を構成すると考えることができることが理解されるはずである。しかし、本願明細書の開示を考慮すれば、当業者ならば、開示される特定の実施態様において多くの改変を行うことができることを理解し、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、似た結果または類似する結果を依然として得るはずである。
【０２００】
（材料および方法）
（イン・シリコ  ゲノム解析）
海洋性珪藻のゲノム中の遺伝子の同定は、ヒト、マウス、シロイヌナズナ、キイロショウジョウバエ、出芽酵母、ヒメツリガネゴケ、タルウマゴヤシ、トウモロコシ、およびアルファルファに特異的な遺伝子（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／Ｐｈａｔｒ２／Ｐｈａｔｒ２．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）を使用して、ＢＬＡＳＴ分析によって行った。成熟した推定上のタンパク質のシグナルペプチドおよび細胞局在／ターゲティングの検討を、ＳｉｇｎａｌＰ（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ）およびＴａｒｇｅｔＰ（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴａｒｇｅｔＰ）を使用して行った。予想される膜貫通ドメインの存在、および特定のｐｆａｍドメインについての検討を、それぞれ、ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／、およびｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅによって行った。
【０２０１】
（海洋性珪藻およびＴｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａの標準的な培養条件）
この研究で使用した株は、海洋性珪藻  ＣＣＡＰ  １０５２／１Ａ、海洋性珪藻のクローン  Ｐ．ｔ．１．８．６、およびプラシノ藻  Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａ  ＣＣＭＰ９０４だった。
【０２０２】
微細藻類を、２０℃で、連続照明（２８０−３５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ２ｓ−１）下で、０．２２μｍ濾過によって滅菌した、天然の沿岸海水（フランス、サン・マロ由来）中で培養した。珪藻について、この海水をシリカ（４０ｇ／Ｌのメタケイ酸ナトリウム；１ｍｌ／Ｌ）を添加したＣｏｎｗａｙ栄養培地（Ｗａｌｎｅ、１９６６）で強化した。大量（２リットル〜３００リットル）培養のために、７．５−８．１の範囲のｐＨを維持するために、２％  ＣＯ２／空気  混合物で曝気した。
【０２０３】
遺伝子形質転換のため、微細藻類を、１％の寒天を含むゲロース（ｇｅｌｏｓｅ）上に広げた。遠心分離による濃縮後、当該微細藻類をペトリ皿上に広げ、密封し、２０℃で一定の照明下でインキュベーションした。培養物の濃度を、ルゴール液で微細藻類を固定した後に、Ｍａｌｌａｓｓｅｚ細胞計測で評価した。
【０２０４】
（クロレラの標準的な培養条件）
この研究で使用した株は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａだった。
【０２０５】
微細藻類を、２８℃で、連続照明（２８０−３５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ２ｓ−１）下で、Ｋｕｈｌ培地（ＫｕｈｌおよびＬｏｒｅｎｚｅｎ、１９６４）中で培養した。大量（２リットル〜３００リットル）培養のために、７．５−８．１の範囲のｐＨを維持するために、２％  ＣＯ２／空気  混合物で曝気した。
【０２０６】
遺伝子形質転換のため、微細藻類を、１．０％の寒天を含むゲロース上で広げた。遠心分離による濃縮後、当該微細藻類を、ペトリ皿上で広げ、密封し、２８℃で一定の照明下でインキュベーションした。培養物の濃度を、ルゴール液で微細藻類を固定した後に、Ｍａｌｌａｓｓｅｚ細胞計測で評価した。
【０２０７】
（Ｎ−グリコシル化分析のための海洋性珪藻からのタンパク質の抽出）
濃縮した培養物（２０．１０６細胞／Ｌ）を、５，０００ｇ、２０分間、４℃で、最初の遠心分離をした。次いで、そのペレットを凍結乾燥した。２ｇの凍結乾燥された微細藻類を、乳鉢中で、砂の存在下で、１５％（ｗ／ｖ）のショ糖、２％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノールおよび１ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含む７５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ８）バッファーを使用して粉砕し、次いで、３０分間、１１，５００ｇ、４℃で遠心分離した。次いで、上清からのタンパク質を９０％  硫酸アンモニウムによって、２時間、室温（ＲＴ）で、撹拌中に沈殿させ、３０分間、１１，５００ｇで遠心分離した。そのペレットを水中で可溶化し、次いで、水で、一晩、４℃で透析した。最後に、当該総タンパク質抽出物を、３０，０００ｇ、１時間、４℃で超遠心分離し、最小量の水で再懸濁し、その後、タンパク質の定量化およびさらなる分析を行った。
【０２０８】
（タンパク質の定量化）
タンパク質の定量化を、海洋性珪藻由来の総タンパク質抽出物について、製造者の取扱説明書に従い、ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ピアース製）を使用して行った。
【０２０９】
（免疫ブロットおよび親和性ブロットの分析）
微細藻類から抽出した５０μｇの総タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、１２％  ポリアクリルアミドゲルを使用して分離した。分離されたタンパク質をニトロセルロース膜上にトランスファーし、トランスファー効率を制御するために、ポンソーレッド（Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｒｅｄ）で染色した。ニトロセルロース膜を、一晩、室温で、０．１％  ツイーン  ２０を含むトリス−緩衝食塩水（ＴＢＳ）（ＴＢＳ−Ｔ）とともに、親和性検出のためにブロッキングし、一晩、ＴＢＳ中に溶解した３％  ゼラチン中で、免疫検出のためにブロッキングした。次いで、免疫検出を、自家製の特異的なコア−β１，２−キシロース、およびコア−α１，３−フコース抗体（１％のゼラチンを含むＴＢＳ中で１：３０００）を使用して、２時間、室温で行った。ＴＢＳ−Ｔで洗浄した後（６回、５分間）、抗体の結合を、１：３，０００で、１％  ゼラチンを含むＴＢＳ中に希釈された、西洋わさびペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体を使用して、１．５時間、室温で検出した（バイオ・ラッド）。当該ブロットの最終的な現像は、既に述べられた通り（Ｆｉｔｃｈｅｔｔｅら、２００７）、４−クロロ  １−ナフトールを使用して行った。コンカナバリンＡを使用した親和性検出を、２５μｇ／ｍＬのレクチンとともに、２時間、室温で、１ｍＭ  ＣａＣｌ２および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２で補ったＴＢＳ−Ｔ中でのインキュベーションによって行った。ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２で補ったＴＢＳ−Ｔで洗浄した後（６回、５分間）、このレクチンの結合を、５０μｇ／ｍＬに希釈した西洋わさびペルオキシダーゼを使用して、１時間、室温で、１ｍＭ  ＣａＣｌ２および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を補ったＴＢＳ−Ｔ中で検出した。同じＴＢＳ−Ｔ、次いでＴＢＳで洗浄した後に、ブロットの最終的な現像を、既に述べられた通り（Ｆｉｔｃｈｅｔｔｅら、２００７）、４−クロロ−１−ナフトールを使用することによって行った。ビオチン化された植物性血球凝集素  ＥおよびＬ（ＰＨＡ−ＥおよびＬ）、ビオチン化されたデイゴマメレクチン（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ  Ｃｒｉｓｔａ  Ｇａｌｌｉ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＥＣＡ）、およびビオチン化されたピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）を使用した親和性検出を、それぞれ、ＰＨＡ−ＥおよびＬについてはＴＢＳ−Ｔ、ならびに０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２で補ったＴＢＳ−Ｔ中で、２０μｇ／ｍＬのこれらのレクチンのインキュベーションによって行った。適切なＴＢＳ−Ｔで洗浄後、これらのレクチンの結合を、１／３，０００で希釈した西洋わさびペルオキシダーゼを結合させたストレプトアビジンを使用して、４５分間、室温で、適切なＴＢＳ−Ｔ中で検出した。当該ブロットの最終的な現像は、コンカナバリンＡの親和性検出について行った。糖タンパク質のグリカン部分の酸化を、ブロット上で、過ヨウ素酸ナトリウムを使用して、Ｆｉｔｃｈｅｔｔｅ−Ｌａｉｎｅら（１９９８）に従って行った。
【０２１０】
（ＰＮＧａｓｅ  ＦまたはＥｎｄｏ  Ｈによる脱グリコシル化）
Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍから単離されたペプチド  Ｎ−グリコシダーゼ  Ｆ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）を使用して、またはエンドグリコシダーゼ  Ｈ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）を使用して、総タンパク質抽出物について、脱グリコシル化分析を行った。１ｍｇの総タンパク質を、０．１％  ＳＤＳを含む、２ｍｌの０．１Ｍ  トリス−ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ  ７．５）中に、最初に溶解させた。当該試料を、５分間、１００℃で、タンパク質の変性のために加熱した。冷却後、０．５％  ノニデット  Ｐ−４０を含む、２ｍｌの０．１Ｍ  トリス−ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ  ７．５）、および１０ユニットのＰＮＧａｓｅ  Ｆを、当該試料に加えた。当該消化物を２４時間、３７℃でインキュベーションした。消化後、タンパク質を、４倍量のエタノールによって、２４時間、−２０℃で沈殿させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離、ブロッティング、コンカナバリンＡによる親和性検出を行った。
【０２１１】
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのガラクトシル化）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのガラクトシル化を、５０μｇの総タンパク質抽出物を、１ｍｌの１００ｍＭ  カコジル酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ６．４）中の、５０ｍＵの、牛乳由来のβ（１，４）ガラクトース転移酵素（Ｆｌｕｋａ）によって、５μｍｏｌのＵＤＰ−ガラクトース、および５μｍｏｌのＭｎＣｌ２の存在下で、３７℃で２４時間処理することで行った（Ｂａｒｄｏｒら、２００３）。当該試料を凍結乾燥した。次いで、タンパク質および糖タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ゲルをニトロセルロース上にエレクトロブロットした。タンパク質を、ビオチン化されたＥＣＡレクチンを使用して、上記の通り、親和性検出した。
【０２１２】
（単糖組成）
総タンパク質抽出物を、８０℃で、５００μＬの１Ｍ  塩化水素メタノールを使用して、１６時間のメタノリシスにさらした。エバポレーションおよびメタノールを使用したさらなる洗浄工程の後、当該試料を、２００μＬのメタノール中で、２０μＬの無水酢酸および２０μＬのピリジンを添加することによって、再度アセチル化した。生じたＮ−アセチルメチルグリコシド（メチルエステル）を乾燥させ、次いで、そのトリメチルシリル誘導体に変換し、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分離した。当該ガスクロマトグラフは、水素炎イオン化検出器、固定相としてＣＰ−Ｓｉｌ  ５  ＣＰ、ガスベクター（ｇａｓ  ｖｅｃｔｏｒ）としてヘリウムを用いるＷＣＯＴ  フューズドシリカキャピラリーカラム（長さ  ２５ｍ、内径  ０．２５ｍｍ）を備えていた。オーブンの温度のプログラムは下記の通りだった：１２０℃で２分間、１０℃／分で１６０℃まで、１．５℃／分で２２０℃まで、次いで２０℃／分で２８０℃まで。糖の定量化を、標品の単糖で確立した応答因子を使用して、ピークの積分および対応するモル値の決定によって行った。電子衝撃質量分析（ＧＣ−ＥＩ  ＭＳ）に連結したガスクロマトグラフィーを、Ｏｐｕｓ  ３．１  データ  システムを備える、ＥＢＥ構成（ＥＢＥ  ｇｅｏｍｅｔｒｙ）のＡｕｔｏｓｐｅｃ  質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、英国、マンチェスター）と連結した、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  シリーズ  ガス  クロマトグラフィーを使用して行った。クロマトグラフィー分離を、ポリジメチルシロキサンでコーティングした、ＣＰ−Ｓｉｌ  ５ＣＢ（２５ｍ、内径  ０．２５ｍｍ、膜厚  ０．２５μｍ、Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ）シリカキャピラリーカラムを使用して得た。ヘリウムはキャリアガスであり、流量は０．８ｍＬ・分−１だった。オーブンの温度を下記のようにプログラムした：最初に、１２０℃で２分間に設定し、１０℃・分−１の割合で１６０℃まで昇温し、次いで、１．５℃・分−１の割合で２２０℃まで昇温し、最後に１５℃・分−１の割合で２８０℃まで昇温する。注入口、インターフェース、およびラインの温度は２５０℃だった。０．５μＬの注入を５のスプリット比（ｓｐｌｉｔ  ｒａｔｉｏ）で行った。電子衝撃質量スペクトルを、７０ｅＶの電子エネルギー、８ｋＶの加速電圧、および１，０００の分解能を使用して記録した。トラップ電流（ｔｒａｐ  ｃｕｒｒｅｎｔ）は２００μＡであり、磁気走査（ｍａｇｎｅｔ  ｓｃａｎ）の速度は、８００−４０００の範囲のｍ／ｚで、１秒／ｄｅｃａｄｅだった。イオン源の温度は２５０℃だった。
【０２１３】
（シアル酸分析）
総タンパク質抽出物からの結合シアル酸を、２Ｍ  酢酸の加水分解（３時間、８０℃）を使用して放出させた（ＶａｒｋｉおよびＤｉａｚ、１９８４）。放出されたシアル酸を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）ＹＭ−１０（フィッシャー  サイエンティフィック）に通した後に、ＤＭＢ誘導体化した。ＤＭＢ誘導体化は、Ｈａｒａら（１９８９）に従って行った。次いで、異なる分画からのＤＭＢ−シアル酸誘導体を、高速液体クロマトグラフィーによって、Ｃ１８  カラム（Ｃ１８モノメリック  Ｓ／Ｎ  Ｅ０００９３０−１０−２）、および以前に報告された溶出条件（Ｋｌｅｉｎら、１９９７）を使用して分析した。溶出物を蛍光によってモニターした。生じた誘導体を回収し、乾燥し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって、上記のように分析した。
【０２１４】
（Ｎ結合型グリカンの単離）
総タンパク質を、ペプシンおよびＰＮＧａｓｅ  Ａによる連続処理によって、Ｆｉｔｃｈｅｔｔｅら（２００７）が以前に記載したように消化した。手短に言えば、４ｍｇのタンパク質を、２ｍｌの１０ｍＭ  ＨＣｌ（ｐＨ  ２．２）中の６ｍｇのペプシンを用いて、３７℃、４８時間消化した。１Ｍ  水酸化アンモニウムによる中和後、当該溶液を、５分間、１００℃で加熱し、凍結乾燥した。次いで、糖ペプチドを、一晩、３７℃で、１００ｍＭ  酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ５．０）中のＰＮＧａｓｅ  Ａ（１０ｍＵ、ベーリンガー・マンハイム）とともに、脱グリコシル化した。Ｎ−グリカンを、ＡＧ  ５０Ｗ−Ｘ２  カラム（バイオ・ラッド）およびＣ１８  カートリッジ（バリアン）を通した連続溶出によって精製した。
【０２１５】
（２−ＡＢ  オリゴ糖の調製およびエキソグリコシダーゼ消化）
精製されたＮ−グリカンを、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）によって、Ｂｉｇｇｅら（１９９５）が記載した、最適化された手順を使用して標識した。手短に言えば、Ｎ−グリカンを、１Ｍシアノ水素化ホウ素ナトリウムを含む、ジメチルスルホキシド−氷酢酸（７：３  ｖ／ｖ）中の、１０μＬの０．３５Ｍ  ２−ＡＢ中に溶解させた。６０℃、２時間のインキュベーション後、当該混合物を、一片のクロマトグラフィー紙（ワットマン  ３ＭＭ、長さ  １０ｃｍ；幅  ３ｃｍ）に載せた。上行性ペーパークロマトグラフィーを、ｎ−ブタノール／エタノール／水（４／１／１  ｖ／ｖ／ｖ）を使用して、室温で、４５分間、ガラス容器中で行った。移動後、ヘアドライヤーを使用して、この紙を乾燥させた。次いで、標識されたＮ−グリカンを、ＵＶ光を使用して検出し、水を使用して溶出し、次いで、凍結乾燥した。エキソグリコシダーゼ消化のため、２００ミリユニットのタチナタマメ  α−マンノシダーゼ（シグマ  アルドリッチ）を、限外濾過によって脱塩し、一晩、３７℃で、約５０ｐｍｏｌの２−ＡＢ標識されたＮ−グリカン混合物とともにインキュベーションした。次いで、消化物を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析によって、下記条件を使用して、直接的に分析した。
【０２１６】
（２−ＡＢ標識されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  質量分析）
２−ＡＢ標識されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  質量スペクトルを、３３７ｎｍ  窒素レーザーを備えるＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−Ｐｒｏ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  装置（アプライドバイオシステムズ、米国）で得た。質量スペクトルを、リフレクター遅延引き出し様式（ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ  ｄｅｌａｙｅｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｅ）で、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（シグマ  アルドリッチ）をマトリックスとして使用して行った。当該マトリックスを、７０：３０  アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ中に５ｍｇ／ｍＬとなるように新たに溶解させ、水で可溶化させたオリゴ糖とともに、１：１（ｖ／ｖ）の比率で混合した。これらのスペクトルを、２０，０００Ｖの加速電圧を使用し、１００ｎｓの遅延時間で、ポジティブモードで記録した。これらを１度スムージングし、ペプチドおよびタンパク質の市販の混合物を使用して外部較正した（アプライドバイオシステムズ）。この研究において、当該スペクトルを、ｄｅｓ−Ａｒｇ１−ブラジキニン（９０４．４６８１Ｄａ）、アンジオテンシン  Ｉ（１２９６．６８５３）、Ｇｌｕ１−フィブリノペプチド  Ｂ（１５７０．６７７４Ｄａ）、ＡＣＴＨ１８−３９（２４６５．１９８９Ｄａ）、およびウシ  インスリン（５７３０．６０８７Ｄａ）を使用して外部較正した。レーザーショットを、各スペクトルについて、許容できるシグナル・ノイズ比を得るために積算した。
【０２１７】
（ＥＰＯｍについての発現コンストラクト）
Ｚａｖｌａｓｋａｉａら（２０００）によって構築されたクローニングベクター  ｐＰＨＡ−Ｔ１は、Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのプロモーター  ｆｃｐＡおよびｆｃｐＢ（フコキサンチン−クロロフィル  ａ／ｃ結合タンパク質ＡおよびＢ）の配列、ならびにｆｃｐＡのターミネーターを含む。これは、ｓｈｅ  ｂｌｅ遺伝子、およびｆｃｐＡ  プロモーターに隣接しているＭＣＳを有する選択カセットを含む。マウスのエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、６００ｐｂの遺伝子（ヌクレオチド配列  配列番号１）によってコードされる。プラスミド  ｐＣＭＶ−ＥＰＯ（Ｂ．Ｐｉｔａｒｄ、Ｉｎｓｅｒｍ  ＵＭＲ５３３（フランス、ナント）によって提供された）は、サイトメガロウイルスプロモーターの下流のＥＰＯ遺伝子の配列を含む。ＥＰＯ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、鋳型としてｐＣＭＶ−ＥＰＯ、およびプライマー  ＦＥ１ｅｐｏ、ＲＨ３ｅｐｏまたはＲＨ３Ｈｉｓ６ｅｐｏ（ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの制限部位を付加できる）を使用して増幅した。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる消化後、挿入断片をｐＰＨＡ−Ｔ１  ベクターに導入した。
【０２１８】
【表２】
0005628689.tif 000003
【０２１９】
（ヒト  ＰＴＸ３の発現コンストラクト）
Ｚａｖｌａｓｋａｉａら（２０００）によって構築されたクローニングベクター  ｐＰＨＡ−Ｔ１は、Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  プロモーター  ｆｃｐＡおよびｆｃｐＢ（フコキサンチン−クロロフィル  ａ／ｃ結合タンパク質  ＡおよびＢ）の配列ならびにｆｃｐＡのターミネーターを含む。これは、ｓｈｅ  ｂｌｅ遺伝子、およびｆｃｐＡ  プロモーターに隣接しているＭＣＳを有する選択カセットを含む。ヒト  ペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）は、１１４６ｐｂの遺伝子（ヌクレオチド配列の配列番号５  ＣＣＤＳ３１８０．１）によってコードされる。プラスミド  ｐＰＴＸ３（ｃＤＮＡ）を、ＲＰＤＺ（ドイツの会社）から購入した。ＰＴＸ３遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、鋳型としてｐＰＴＸ３、およびＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩの制限部位を付加できる下記のプライマーを使用して増幅した。ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩによる消化後、挿入断片をｐＰＨＡ−Ｔ１ベクターに導入した。
【０２２０】
【表３】
0005628689.tif 000004
【０２２１】
（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの形質転換のためのコンストラクト、Ｎ−グリカン合成経路の改変）
３つのベクターを、Ｎ−グリコシル化経路のヒト遺伝子を、Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍに導入するために設計した。
【０２２２】
これらのベクターの骨格（ｓｑｕｅｌｅｔｔｏｎ）は、ｐＰＨＡ−Ｔ１である。
【０２２３】
第１のベクターは、ｐＧ１である。このベクターは下記を含む：
サイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）およびｆｃｐＡターミネーターの制御下の、ネコ遺伝子（クロラムフェニコール抵抗性を与えるクロラムフェニコールアセチル転移酵素）：［ｐＣＭＶ−ネコ−ｔｆｃｐＡ］
カリフラワーモザイクウイルス（ｐ３５Ｓ）プロモーター、およびｆｃｐＡターミネーターによって囲まれたマルチクローニング部位：［ｐ３５Ｓ−ＭＣＳ−ｔｆｃｐＡ］。
【０２２４】
ベクター  ｐＧ２は、下記を含む：
サイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）およびｆｃｐＡターミネーターの制御下の、ｎａｔ遺伝子（ノーセオトリシン抵抗性）：［ｐＣＭＶ−ｎａｔ−ｔｆｃｐＡ］
カリフラワーモザイクウイルス（ｐ３５Ｓ）プロモーターおよびｆｃｐＡターミネーターによって囲まれたマルチクローニング部位：［ｐ３５Ｓ−ＭＣＳ−ｔｆｃｐＡ］。
【０２２５】
第３のベクターであるｐＧ３は、カリフラワーモザイクウイルス（ｐ３５Ｓ）プロモーターおよびｆｃｐＡターミネーターによって囲まれたマルチクローニング部位［ｐ３５Ｓ−ＭＣＳ−ｔｆｃｐＡ］を含む。
【０２２６】
グリコシル化経路における下記のヒト遺伝子を、ベクター  ｐＧ１、ｐＧ２またはｐＧ３のＭＣＳに挿入した。
ヒト  ＧＮＴＩ（配列番号：１９、ヒト遺伝子ＩＤ：４２４５）をｐＧ１に挿入した。
次いで、このベクターをｐＧ１ＧＮＴＩと名付けた。
ヒト  マンノシダーゼ  ＩＩ（配列番号：３８、ヒト遺伝子ＩＤ：４１２４）をＰＧ３に挿入した。次いで、このベクターをｐＧ３ＭａｎＩＩと名付けた。
ヒト  ＧＮＴＩＩ（配列番号：２１、ヒト遺伝子ＩＤ：４２４７）を、ｐＧ２に挿入した。次いで、このベクターをｐＧ２ＧＮＴＩＩと名付けた。
ヒト  α１，６  フコシル基転移酵素（配列番号：４０、ヒト遺伝子ＩＤ：２５３０）を、ｐＧ３に挿入した。次いで、このベクターを、ｐＧ３ＦｕｃＴｒａｎｓｆと名付けた。
【０２２７】
（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａ、およびＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ中のｓｈ  ｂｌｅの発現のためのコンストラクト）
ベクター  ｐ３５ＳｓｈｂｌｅＴｎｏｓを、ＰＢＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＩＦＲＥＭＥＲ）で、ｐＵＣ１９  プラスミドを使用して構築した。これは、カリフラワーモザイクウイルスのプロモーター（ｐ３５Ｓ）、ゼオシン抵抗性を与えるｓｈ  ｂｌｅ遺伝子、およびノパリンシンターゼのターミネーター（Ｔｎｏｓ）を含む。ベクター  ｐＵｂｉｌｂａｒＴｎｏｓを、ＰＢＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＩＦＲＥＭＥＲ）で、ｐＵＣ１９  プラスミドを使用して構築した。これは、トウモロコシ由来のプロモーター  ユビキチン  １（Ｕｂｉ１）、グルホシネート抵抗性を与えるｂａｒ遺伝子、およびノパリンシンターゼのターミネーター（Ｔｎｏｓ）を含む。
【０２２８】
（遺伝子形質転換）
形質転換を、Ｔｈｏｍａｓら（２００１）に従って、微粒子銃によって、ＢＩＯＲＡＤ  ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  装置を使用して行った。指数関数的な増殖段階にある微細藻類（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  ｃｃａｐ１０５２／１Ａ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａ  ｃｃｍｐ９０４、またはＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）の培養物を、遠心分離（１０分間、２１５０ｇ、２０℃）によって濃縮し、滅菌水（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍおよびＴ．ｓｕｅｃｉｃａについては海水、Ｃ．ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａについては蒸留水）で希釈し、ゲロース上に、ディッシュあたり１０８の細胞を広げた。マイクロキャリアは、金粒子だった（直径  ０．６μｍ）。マイクロキャリアを、供給者（バイオ・ラッド）の手順に従って調製した。シューティング（ｓｈｏｏｔｉｎｇ）のために使用したパラメータは下記の通りである：
−  長いノズルの使用、
−  最大の穴を有するストッピングリング（ｓｔｏｐｐｉｎｇ  ｒｉｎｇ）の使用、
−  ストッピングリングと、標的（微細藻類の細胞）との間は１５ｃｍ、
−  １．２５Ｍ  ＣａＣｌ２および２０ｍＭ  スペルミジンによるＤＮＡの沈殿、
−  ショット（ｓｈｏｔ）あたり、０．７５ｍｇの金粒子に対して、１．２５μｇのＤＮＡの比率、
−  微細藻類（海洋性珪藻）については、９００ｐｓｉ（約６．１９ＭＰａ）のラプチャーディスク、０．２ｃｍの退避距離（ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｅｓｃａｐｅ）、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａについては、ｐｓｉのラプチャーディスク、０．４ｃｍの退避距離、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａについては、６５０ｐｓｉ（約４．４７ＭＰａ）のラプチャーディスク、０．１ｃｍの退避距離。
−  ３０Ｈｇの真空、ならびに
−  ペトリ皿あたり、４ショット。
微細藻類を４８時間インキュベーションした後、抗生物質ゼオシンを添加し（海洋性珪藻に対して１００μｇ／ｍｌ、またはＴｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａに対して５００μｇ／ｍｌ、またはＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａに対して２００μｇ／ｍｌ）、または、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａに対してグルホシネートを添加し（１ｍｇ／ｍｌ）、次いで、一定の照明下で、２０℃（または、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａに対して２８℃）に維持した。
【０２２９】
（微細藻類のＤＮＡ抽出）
５．１０８の微細藻類の細胞を、遠心分離（２１５０ｇ、１５分間、４℃）によってペレットにした。微細藻類の細胞を、一晩、４℃で、４ｍＬのＴＥ  ＮａＣｌ  １×バッファー（０．１Ｍ  トリス−ＨＣｌ、０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ８）とともにインキュベーションした。次いで、１％  ＳＤＳ、１％  サルコシルおよび０．４ｍｇ・ｍＬ−１のプロテイナーゼ  Ｋを試料に加え、次いで、９０分間のインキュベーションを４０℃で行った。第１のフェノール−クロロホルム  イソアミルアルコール抽出を、核酸を含む水層を抽出するために行った。試料中に存在するＲＮＡを、ＲＮａｓｅ（１μｇ・ｍＬ−１）の存在下で、６０℃、１時間のインキュベーションによって除去した。第２のフェノール−クロロホルム抽出を行い、次いでエタノールによって沈殿させた。最後に、ペレットを乾燥させ、２００μＬの高純度滅菌水中で可溶化した。ＤＮＡの定量化を分光測定（２６０ｎｍ）によって行い、電気泳動によって分析した。
【０２３０】
（ＲＮＡ抽出）
１０７の細胞を、増殖の対数期に、遠心分離（２１５０ｇ、１０分間、４℃）によって培養物からペレットにし、当該ペレットを液体窒素で凍結し、ＲＮＡ抽出をキット（Ｇｅｎ  ＥＬｕｔｅ（商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（シグマ））を使用して行った。
【０２３１】
（逆転写およびＰＣＲによる組み換えＲＮＡの検出）
ＲＴ−ＰＣＲを、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｖｉａｎ  ＲＴ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（シグマ）によって、製造者の取扱説明書に従い、ポリｄＴ  プライマーおよび下記の特異的なプライマーを使用して行った。
【０２３２】
【表４】
0005628689.tif 000005
【０２３３】
（ＥＰＯまたはＰＴＸ３の検出のための微細藻類の粗抽出物の調製）
１０７の細胞を、増殖の対数期に、遠心分離（２１５０ｇ、１０分間、４℃）によって、培養物からペレットにした。バッファー  ＴＢＳ  １×で洗浄後、細胞を液体窒素中で凍結させ、次いで、１ｍＬのＴＢＳバッファーで再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、３０分間、４℃で超音波処理し、４５００ｇ、５分間、４℃で遠心分離した。最後に、上清を回収し、これを微細藻類の粗抽出物とした。いくつかの場合では、粗抽出物由来のタンパク質を、９０％  硫酸アンモニウム（ＮＨ４）２ＳＯ４によって、４℃で、撹拌しながら、２時間３０分インキュベーションする間に沈殿させた。９０００ｇ、４℃、３０分間の遠心分離後、当該溶液をミリＱ水に懸濁させ、ホモジナイズしてから、一晩、４℃で、水で透析した。当該試料のタンパク質濃度を、製造者の取扱説明書に従い、「ＢＣＡ（商標）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」（ピアース）を使用して測定した。タンパク質の電気泳動的分離を、１５％  ポリアクリルアミドゲル上で行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、免疫検出を、マウス抗マウスＥＰＯ抗体、抗ヒトＰＴＸ３抗体、または抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｒ＆Ｄ  システムズ）を使用して行った。
【０２３４】
（ＥＬＩＳＡアッセイ）
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）によるタンパク質試料の分析を、粗細胞抽出物について行った。アッセイは、ＥＬＩＳＡ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ  ＥＰＯ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  システムズ）、またはＨｕｍａｎ  Ｐｅｎｔｒａｘｉｎ  ３／ＴＳＧ−１４  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  システムズ）を使用して、製造者の取扱説明書に従って行った。
【０２３５】
（Ｈｉｓタグした組み換えタンパク質の精製）
１ｍｌの樹脂（Ｎｉ−ＮＴＡ  ビーズ、Ｈｉ−Ｔｒａｐ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰ、アマシャム  バイオサイエンス）を、０．１Ｍ  イミダゾールを含む水溶液中で、２時間、室温で、撹拌しながら混合した。凍結乾燥されたタンパク質試料を、０．１Ｍ  イミダゾールを含む少量のバッファー（３０ｍＭ  トリス（ｐＨ  ７．６）、２０％  グリセロール、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  β−メルカプトエタノール）中で混合した。次いで、樹脂および試料を混合し、撹拌しながら２時間、４℃でインキュベーションした。１０分間の遠心分離（４０００ｇ、４℃）の後、その上清を捨て、２０ｍｌの洗浄バッファー（０．２５０Ｍ  イミダゾールを含む、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２０％  グリセロール、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  β−メルカプトエタノール）を加えた。穏やかに混合し、遠心分離（１０分間、４０００ｇ、４℃）した後、ペレットを、１Ｍ  イミダゾールを含む、３ｍｌの溶出バッファー（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２０％  グリセロール、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  β−メルカプトエタノール）で再懸濁した。次いで、当該試料を、撹拌しながら、２時間、４℃でインキュベーションした。１０分間の遠心分離（４０００ｇ、４℃）後、上清を回収し、次いで、製造者の取扱説明書に従い、３ｋＤａ  ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ｃｏｌｕｍｎｓ（ミリポア）を使用して、当該試料からイミダゾールを除いた。
【０２３６】
（ＥＰＯ  バイオアッセイ）
海洋性珪藻中で産生された組み換えＥＰＯのバイオアッセイを、ヒト  赤白血病細胞株  ＴＦ−１（ＡＴＣＣから購入した）を使用して行った。ＥＰＯとともに培養した場合、ＴＦ−１細胞は、ヘモグロビンの産生によって分化する。
【０２３７】
細胞を、１０％  ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン、および５ｎｇ／ｍＬ  顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を補ったＲＰＭＩ  １６４０中で培養した（３７℃、５％  ＣＯ２）。ＥＰＯバイオアッセイの２４時間前に、ＧＭ−ＣＳＦを細胞培養培地から除いた。次いで、細胞を、０．１−１０ｎｇ／ｍＬの組み換えマウスＥＰＯ（陽性対照）、または０．１−１０ｎｇ／ｍＬの海洋性珪藻  組み換えマウスＥＰＯ（ＥＬＩＳＡの定量化に基づく）とともに、３日間インキュベーションした。細胞をまた、陰性対照として、同様の量の非形質転換体の海洋性珪藻の抽出物（プラスミド  ｐＰＨＡ−Ｔ１によって形質転換した海洋性珪藻）とともにインキュベーションした。３日目に、ヘモグロビンを産生する分化細胞を、Ｍａｔｓｕｂａｒａら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２８４（６）巻、３４８０−３４８７頁、２００９）が記載したベンジジン法を使用して染色した。青−褐色に染色された細胞質（ｂｌｕｅ−ｂｒｏｗｎ−ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）を有する細胞を、ヘモグロビンを発現した細胞として計測した。細胞生存率をまた、トリパンブルーを使用して評価した。各分析で２００の細胞を計数し、実験を３回繰り返した。結果は、分化細胞および生細胞のパーセンテージ（＋／−ＳＥＭ）として表わした。
【０２３８】
（結果）
（海洋性珪藻のゲノムのイン・シリコ解析）
Ｎ−グリカンの生合成経路は、真核生物において、３つの段階に分けることができる：（１）ドリコールピロリン酸結合型オリゴ糖供与体  Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌの合成、および粗面小胞体の内腔に入る新生ポリペプチドのアスパラギン残基上への、オリゴ糖転移酵素（ＯＳＴ）による、その転移、（２）適切な折り畳みおよびオリゴマー化に関与するシャペロンとの相互作用を可能にする、小胞体（ＥＲ）中の前駆体  Ｎ−グリカンの脱グルコシル化／再グルコシル化、および最後に、（３）高マンノース型のＮ結合型のオリゴ糖、次いで、複合型Ｎ−グリカンへのゴルジ体中の成熟。真核生物における、これらの異なる段階をコードする遺伝子との配列相同性に基づき、発明者らは、海洋性珪藻のゲノムにおいて、Ｎ−グリカン生合成、および高マンノース型  Ｎ−グリカンへの成熟の段階についての、一連の推定順序を同定した（図１および表２を参照）。これらの特定された遺伝子のほとんどは、ＥＳＴサポート（ｓｕｐｐｏｒｔ）を有する（図１、表２）。
【０２３９】
【表５】
0005628689.tif 000006
【０２４０】
（ドリコールピロリン酸結合型オリゴ糖の生合成および転移）
サイトゾル面上、およびＥＲの内腔中の、ドリコールピロリン酸結合型オリゴ糖の生合成に関与する全ての酵素を、海洋性珪藻のゲノム中で同定した。予想されるタンパク質のこれらの配列および形態は、他の真核生物について記載された、対応するアスパラギン結合型グリコシル化（ａｌｇ）相同体と、強力な相同性を共有する。ドリコールによって活性化されたマンノースおよびグルコースの形成を触媒できる推定上の転移酵素もまた、予想される。それらの２つの活性化された糖は、ＥＲ内腔中で生じる伸張工程に必要とされる。ドリコールピロリン酸結合型オリゴ糖の生合成に関与する配列に加え、オリゴ糖転移酵素（ＯＳＴ）多サブユニット複合体のＳＴＴ３触媒サブユニットと相同な、２つの推定上の遺伝子を、Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのゲノム中で同定した（表２）。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａおよびヒト  ＳＴＴ３  サブユニットと、それぞれ３４％および３７％の同一性を有する、これらの多スパン（ｍｕｌｔｉ  ｓｐａｎｎｅｄ）の配列は、ａｓｎ残基上への前駆体の転移に必要とされる、保存されたＷＷＤＹＧドメインを含む。
【０２４１】
（ＥＲ中のタンパク質の品質管理）
α−グルコシダーゼ  ＩＩのαおよびβ  サブユニットをコードする推定配列のみが、Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのゲノム中で見出された。当該αおよびβ  サブユニットは、マンノース結合に関与する、特徴的なＤＭＮＥ配列およびＣ型レクチンドメインを有する。推定上のＵＤＰ−グルコース：糖タンパク質グルコシル転移酵素（ＵＧＧＴ）およびカルレティキュリン（ＥＲ中におけるタンパク質の品質管理を確実にする２つの分子）もまた予想される。カルレティキュリンは、不正確に、または不完全に折り畳まれたタンパク質の保持に関与するＥＲ内腔の主要なＣａ２＋結合タンパク質である、可溶性タンパク質である。Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  カルレティキュリンは、公知のカルレティキュリンと大きさが類似し（約４００アミノ酸）、下記由来のそれぞれのタンパク質と５０％超の同一性を示す：Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ（５６％）、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）（５６％）、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（５４％）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（５３％）。構造的に、Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  カルレティキュリンは、その生物学的機能に必要とされる３つの特定のドメインを含む：約１８０のアミノ酸のＮ末端ドメイン、低容量（ｌｏｗ−ｃａｐａｃｉｔｙ）かつ高親和性のＣａ２＋結合に関与する酸性の１７のアミノ酸モチーフの３つの反復を含む約７０残基の中央ドメイン、および高容量（ｈｉｇｈ−ｃａｐａｃｉｔｙ）だが低親和性でＣａ２＋に結合できる酸性残基およびリジン残基に富むＣ末端ドメイン。Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  カルレティキュリンはまた、ＥＲ中におけるその保持を確実にできる、予想されるシグナルペプチド、およびＣ末端  ＹＤＥＦテトラペプチドを有する。
【０２４２】
（ゴルジ体中のＮ結合型グリカンの成熟）
推定上のゴルジ  α（１，２）−マンノシダーゼ  Ｉをコードする１つの配列を、ゲノム中で同定した（表２）。このグリコシダーゼは、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２を、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換できる。
【０２４３】
（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍタンパク質の糖組成およびウエスタンブロット分析）
紡錘状（ｆｕｓｉｆｏｒｍ）のＰｔ  １．８．６株から単離されたＰ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍタンパク質の糖組成を、Ｎ−グリカンに特異的な単糖の存在を検討するために特定した。タンパク質を加水分解し、生じた単糖を、１−Ｏ−メチルペルシリル（ｍｅｔｈｙｌｐｅｒｓｉｌｙｌ）誘導体に変換し、電子衝撃質量分析（ＧＣ−ＥＩ  ＭＳ）に連結したガスクロマトグラフィーによって分析した。表３に示されるように、マンノースおよびＮ−アセチルグルコサミン（Ｎ結合型グリカンを構成する２つのモノマー）を、Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍタンパク質抽出物中で同定した。ラムノース、キシロース、フコース、グルコースおよびガラクトースなどの他の単糖を同定した。しかし、これらのモノマーが、混入した多糖由来のタンパク質結合型グリカンから生じるかどうかは結論付けられない。対照的に、Ｎ−アセチルノイラミン酸も、その前駆体  Ｎ−アセチルマンノサミンも、検出されなかった。Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍタンパク質中のシアリル化経路の不存在を確かめるため、Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍタンパク質を弱酸加水分解にかけた。その加水分解産物を、１，２  ジアミノ−４，５−メチレンジオキシベンゼン（ＤＭＢ）と結合させ、生じた誘導体を、以前に報告したように液体クロマトグラフィーによって分析した。蛍光によって検出されたピークを回収し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）によって分析した。シアル酸は同定されず、この珪藻における、検出可能なシアリル化経路の不存在を確かめた（図示せず）。
【０２４４】
【表６】
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【０２４５】
次いで、Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍタンパク質にＮ結合したグリカンの構造解析を、ウエスタンブロット分析によって、総タンパク質抽出物について、グリカンエピトープに特異的なプローブを使用して検討した。図２ａに示されるように、Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍタンパク質を、コンカナバリンＡ（高マンノース配列に特異的なレクチン）によって親和性検出した。この親和性検出は、Ｅｎｄｏ  ＨまたはＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｎ−グリカンを切断できる２つの酵素）による処理時に抑制され、従って、このレクチンが、Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍタンパク質にＮ結合したグリカン配列を認識することを確認した（図２ｂ）。対照的に、ＥＣＡおよびＰＨＡ（複合型のＮ結合型グリカンエピトープに対して特異的な２つのレクチン）による親和性検出は、陰性だった（図示せず）。次いで、植物グリコエピトープに対して産生された抗体を使用する免疫検出を行った。Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２共通コアに結合したコア−α（１，３）−フコース、またはコア  β（１，２）−キシロースエピトープに特異的な抗体は、Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ由来のタンパク質を全く検出しなかった（図２ａ）。複合型Ｎ−グリカンは、ＧｎＴ  Ｉの作用によるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への末端ＧｌｃＮＡｃの付加、およびそれに続くこのオリゴ糖の成熟からもたらされる。Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍタンパク質中の複合型グリカンの存在を検討するため、発明者らはタンパク質抽出物を、ガラクトース転移酵素（ガラクトース残基を末端ＧｌｃＮＡｃユニットに転移できる酵素）で処理し、次いで、生じたタンパク質の調製物を、ＥＣＡ（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ配列に結合するレクチン）で分析した。この処理後に、シグナルは検出されず、従って、Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍタンパク質は、検出可能な様式で末端ＧｌｃＮＡｃを全く表わさないことを示した。
【０２４６】
（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのＮ結合型グリカンの構造同定）
Ｎ−グリカンは、植物から単離されたタンパク質について以前に報告されたように、ＰＮＧａｓｅ  Ａ処理によって、Ｐｔ  １．８．６株から単離されたＰ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのタンパク質から放出された。この脱グリコシル化酵素は、様々なＮ結合型のオリゴ糖（近位グルコサミン残基にα（１，３）結合したフコースを有するグリカンを含む）を放出できるため、ＰＮＧａｓｅ  Ａは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆよりも好ましかった。次いで、生じたＮ−グリカンを、その検出および質量分析による分析を促進するために２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）に結合させた。標識されたＮ−グリカンの生じたプールのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを図３に示す。主要イオンは、ヘキソース５−９ＧｌｃＮａｃ２の２−ＡＢ誘導体の（Ｍ＋Ｎａ）＋イオンに相当する。次いで、グリカンプールをエキソグリコシダーゼ消化にかけた。α結合型マンノース残基の存在に対応し、タチナタマメ  α−マンノシダーゼによる処理時に、オリゴ糖混合物は、ヘキソース２ＧｌｃＮＡｃ２〜ヘキソース４ＧｌｃＮＡｃ２に変換された（図示せず）。結果として、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおいて検出されたイオンは、他の真核生物において以前に報告されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２におよぶ高マンノース  Ｎ−グリカンに帰属された。
【０２４７】
まとめると、Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ由来のＮ結合型グリカンの生化学分析は、この生物由来のタンパク質が、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２におよぶ高マンノース型  Ｎ−グリカンを有することを示した。これらの分析は、植物  Ｎ−グリカンエピトープ、すなわち、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  共通コアに結合したコア−α（１，３）−フコースまたはコア  β（１，２）−キシロースエピトープの存在を明らかにしなかった。これらのエピトープは、ヒトにおいて高度に免疫原性であることが知られ、ヒトの治療における植物由来のタンパク質のいずれかの使用の前に、対応する遺伝子のノックアウト戦略の開発を必要とする。
【０２４８】
（主要な門の代表的な微細藻類に由来するタンパク質のＮ−グリコシル化分析）
主要な門の代表的な微細藻類から単離されたタンパク質のＮ−グリコシル化を、ウエスタンブロットによって、グリカン特異的なプローブを使用して分析した（図４）。テトラセルミス属、ロデラ属、ユーグレナ属およびパブロバ属由来のタンパク質（図４Ａ）、スケレトネマ属、ヘテロカプサ属、アンフォラ属、キートセロス属（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）、ナビクラ属、ナンノクロロプシス属由来のタンパク質（図４Ｂ、Ｃ、Ｄ）、ならびにクロレラ、Ｎａｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓａｌｉｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｐｕｎｃｔａｔａ、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ、Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ  ｔｒｉｑｕｅｔｒａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ由来のタンパク質（データは示していない）は、コンカナバリンＡによって親和性検出されるが、他のプローブ（植物複合型Ｎ−グリカンに対して特異的な、α（ｌ，３）−フコースおよびβ（ｌ，２）−キシロースエピトープに対して産生された抗体など）によっては親和性検出されないことが示された。親和性検出は、Ｅｎｄｏ  Ｈ処理後に消失し、従って、コンカナバリンＡ陽性のシグナルは、Ｎ結合型グリカンから生じることを確認した。結果として、Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおいて認められたように、発明者らは、試験された下記の代表的な微細藻類は、本研究において、そのタンパク質上に高マンノース型  Ｎ−グリカンを有し、α（１，３）−フコース、およびβ（１，２）−キシロースエピトープを有さないと結論付けた：
−  緑藻類：テトラセルミス属（プラシノ藻）、ナンノクロロプシス属（例えば、Ｎａｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓａｌｉｎａ）、およびクロレラ（緑藻植物；例えば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）、
−  紅藻類：ロデラ属およびＰｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔｉｎａ）、
−  クロムアルベオラータ：パブロバ属（Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔｅｓ）、スケレトネマ属、アンフォラ属、キートセロス属（例えば、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ）、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｐｕｎｃｔａｔａ、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ、ナビクラ属（珪藻）、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ（ハプト藻）、Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ  ｔｒｉｑｕｅｔｒａ（Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ）、
−  ユーグレナ藻：ユーグレナ属。
【０２４９】
（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ中の組み換えマウスＥＰＯの発現）
Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ株  ＣＣＡＰ  １０５２／１Ａを、粒子銃によって、プラスミド  ｐＺＥＰＯまたはｐＺＥＰＯＨｉｓで形質転換した（図５）。ゼオシンに対して抵抗性の形質転換体のうち、（各コンストラクトについて）８０クローンを、対象となる遺伝子であるＥＰＯの存在について試験した。ＥＰＯ遺伝子の存在を、下記のプライマーを使用して、ＰＣＲによって確認した：導入遺伝子に特異的なプライマー対、ならびに、ベクター  ｐＰＨＡ−Ｔ１内の導入遺伝子の上流および下流にハイブリダイズするプライマー対  ＦｐＺおよびＲｐＺ。
【０２５０】
【表７】
0005628689.tif 000008
【０２５１】
ｐＺＥＰＯによって形質転換されたＰ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのクローンを、Ｅ１〜Ｅ８０と名付け、ｐＺＥＰＯＨｉｓによる形質転換から得たものをＨ１〜Ｈ８０と呼んだ。図６Ａにおいて、プライマー  ＦｐＺおよびＲｐＺ（それぞれ、ｆｃｐＡ  プロモーターの５’末端、およびｆｃｐＡの終結の３’上にハイブリダイズする）で増幅を行い、ｐＰＨＡ−Ｔ１のＭＣＳ中に挿入された導入遺伝子を増幅できた。試料Ｅ３およびＨ６は、ＥＰＯ導入遺伝子の大きさに対応する、約６００ｐｂの増幅を示す。図６Ｂは、ＥＰＯの特異的なプライマーで行われたＰＣＲの生成物を示す。ＰＣＲの陽性対照（ベクター  ｐＺＥＰＯで実現した）は、約６００ｐｂでの増幅のバンドを示す。試料Ｅ３、Ｅ５、Ｈ６、Ｈ７は、ＥＰＯの大きさに対応する約６００ｐｂの増幅を示す。Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの全てのゼオシン抵抗性クローンのうち、約９０％が、そのゲノム中にＥＰＯ導入遺伝子を組み込んでいた。ＲＮＡレベルでの導入遺伝子の発現もまた分析した。図６Ｃは、試料Ｅ１、Ｅ２、Ｈ１およびＨ２が、ＥＰＯ転写物に対応する約３８５ｐｂの増幅を示すことを示す。Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの全てのゼオシン抵抗性クローンのうち、約７６％がＥＰＯ転写物を発現した。
【０２５２】
次いで、ＥＰＯ  タンパク質の存在を分析した。組み換えマウスＥＰＯの存在を、粗抽出物について、ＥＬＩＳＡアッセイによって試験した。組み換えマウスＥＰＯを、試験されたクローンのうち６０％で検出した。
【０２５３】
細胞中のＥＰＯタンパク質の量を増やすため、ｆｃｐＡ  プロモーターの導入を行った。微細藻類を、３６時間、暗所でインキュベーションし、次いで、明所に置いた（Ｔ０）。試料を、Ｔ３、Ｔ６、Ｔ９、Ｔ１２およびＴ１５時間で回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。抗ＥＰＯ抗体を使用した免疫検出による分析は、ＥＰＯ組み換えタンパク質が、微細藻類の細胞中で産生されることを示した（図７）。
【０２５４】
非グリコシル化ＥＰＯタンパク質の分子量は約１８ｋＤａであるため、ウエスタンブロットによって検出される組み換えＥＰＯは、グリカン構造の存在と矛盾のない電気泳動的移動性（約２５ｋＤａ）を示す（図７）。ＣＨＯ細胞中で産生された組み換えＥＰＯ（図７のカラムＥＰＯ）は、複合型グリカンの存在により、約３０．１ｋＤａの電気泳動的移動性を示す。発明者らは、海洋性珪藻の細胞が、Ｍａｎ５〜Ｍａｎ９をそのタンパク質に導入することを示したため、発明者らは、このようなグリカン構造は、組み換えＥＰＯに結合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで認められた電気泳動移動度の減少に関与すると仮定した。この仮説を検証するため、発明者らは、Ｎ−グリカン欠損  α−（１，３）結合型コアフコースを特異的に切断するＰＮＧａｓｅ  Ｆによって、組み換えＥＰＯを消化した。発明者らは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化の前後の、試料およびＣＨＯ中で産生された組み換えマウスＥＰＯをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。抗ＥＰＯ抗体による免疫検出後、発明者らは、電気泳動特性を比較することができる。全ての消化された試料は約１８−１９ｋＤａであり、Ｎ−グリコシル化の効果的な消化と一致する、グリコシル化されていない約１８ｋＤａのタンパク質を与える。この実験法は、あるＮ−グリコシル化が、海洋性珪藻によって産生された組み換えマウスＥＰＯ上に存在することを示し、当該ＥＰＯが、α−（１，３）結合型コアフコースを含まないことを確証させた。
【０２５５】
Ｎ−グリカン構造をさらに特徴付けるため、発明者らは、海洋性珪藻によって産生された、この組み換えマウスＥＰＯのＮ−グリコシル化特性を、質量分析によって分析した。組み換えＥＰＯに対する活性分析を行った。
【０２５６】
（ＥＰＯ  バイオアッセイ）
進行中の実験からの予備的な結果は、ＴＦ−１細胞を、プラスミド  ｐＺＥＰＯを有する海洋性珪藻由来のマウスＥＰＯとともにインキュベーションした場合の、ｐＰＨＡ−Ｔ１  プラスミドを有するＰ．Ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ由来のエキスとともにインキュベーションした細胞と比較した、ヘモグロビンの生成を明らかにした。細胞生存率は、実験全体を通して、似たようなもののままだった。
【０２５７】
これらの結果は、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍから産生された組み換えマウスＥＰＯが、ＴＦ−１の細胞分化の誘導能として測定される、その生物学的活性を保持することを明らかにした。
【０２５８】
（ＥＰＯ  免疫原性）
Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ中で産生されたＥＰＯの活性および免疫原性を、ｉｎ  ｖｉｖｏで、マウス中で分析した。組み換えＥＰＯの注射後、赤血球の量を、ＥＰＯ活性を特定するために分析した。さらに、当該組み換えＥＰＯが、医療用途についての不適合性を全く示さないことを特定するために、免疫応答を分析した。
【０２５９】
（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  Ｎ−グリコシル化経路の形質転換）
Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの２つの株を、いくつかのヒト遺伝子で形質転換した：野生型、およびマウスＥＰＯを発現する組み換え藻類。これらの微細藻類を２回で形質転換した。第１に、海洋性珪藻細胞を下記の２つのベクターによって同時形質転換した：（ヒト  ＧＮＴＩ遺伝子とともに）ｐＧ１ＧＮＴＩ（これは、クロラムフェニコールに対する抵抗性を与える）、および（ヒト  マンノシダーゼＩＩ  遺伝子とともに）ベクター  ｐＧ３ＭａｎＩＩ。クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｌｐｈｅｎｉｃｏｌ）による形質転換体の選択後、藻類のグリコシル化経路を分析した。組み換えＥＰＯを精製し、Ｎ−グリコシル化を質量分析によって分析した。ＧＮＴＩおよびＭａｎＩＩの活性を示す藻類を単離し、（ヒト  ＧＮＴＩＩ遺伝子とともに）ｐＧ２ＧＮＴＩＩ（これは、ノーセオトリシン抵抗性を与える）、および（ヒト  α１，６  フコシル基転移酵素とともに）ベクター  ｐＧ３Ｆｕｃｔｒａｎｓｆで、再度同時形質転換した。形質転換された微細藻類をノーセオトリシンで選択し、組み換えＥＰＯのＮ−グリコシル化を質量分析によって分析した。発明者らは、現在、Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのＮ−グリカンの「ヒト化」をさらに進めるために、他の遺伝子を導入する前に、これらの実験を仕上げている。
【０２６０】
（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおける組み換えヒト  ＰＴＸ３の発現）
Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ株  ＣＣＡＰ  １０５２／１Ａを、粒子銃によって、プラスミド  ｐＺＰＴＸ３で形質転換した。ゼオシン抵抗性の形質転換体のうち、５０クローンを対象となる遺伝子である、ＰＴＸ３の存在について試験した。ＰＴＸ３遺伝子の存在を、下記のプライマーを使用して、ＰＣＲによって確認した：導入遺伝子に特異的なプライマー対、ならびにベクター  ｐＰＨＡ−Ｔ１内の導入遺伝子の上流および下流にハイブリダイズする、プライマー対  ＦｐＺおよびＲｐＺ。
【０２６１】
【表８】
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【０２６２】
Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの全てのゼオシン抵抗性クローンのうち、約９０％は、ＰＴＸ３導入遺伝子をそのゲノム中に組み込んでいた。Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのゼオシン抵抗性クローン中のＰＴＸ３転写物およびタンパク質の存在の分析は、現在検討中である。
【０２６３】
（プラシノ藻  Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａの形質転換）
Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａ  ｃｃｍｐ９０４を、粒子銃によって、コンストラクト  ｐ３５ＳｓｈｂｌｅＮｏｓで形質転換した。発明者らは、Ｓｈ  ｂｌｅタンパク質が微細藻類中で発現することを示している、ゼオシン抵抗性のクローンを得た。Ｓｈ  ｂｌｅはグリコシル化タンパク質ではないという事実にも関わらず、この実験法は、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａ中で組み換えタンパク質を産生する可能性を示す。Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａは、内在性タンパク質をＮ−グリコシル化できるため、発明者らは、Ｎ−グリコシル化部位を示すポリペプチドは、この微細藻類中で発現している場合、Ｎ−グリカン構造を示すだろうと仮定できる。
【０２６４】
（緑藻植物  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａの形質転換）
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ  ＵＴＥＸ  １３３０を、粒子銃によって、コンストラクト  ｐ３５ＳｓｈｂｌｅＴｎｏｓおよびｐＵｂｉｌｂａｒＴＮｏｓで形質転換した。発明者らは、Ｓｈ  ｂｌｅタンパク質が微細藻類中で発現することを示すゼオシン抵抗性のクローン、およびｂａｒ遺伝子が微細藻類中で発現することを示すグルホシネート抵抗性のクローンを得た。これは、発明者らが、緑藻植物  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａを形質転換するための手段、特に、機能的プロモーターを有するベクターを有するという事実を強調する。
【０２６５】
Ｓｈ  ｂｌｅはグリコシル化タンパク質ではないという事実にも関わらず、この実験法は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ中で組み換えタンパク質を産生する可能性を示す。この藻類は、内在性タンパク質をＮ−グリコシル化できるため（データは示していない）、発明者らは、Ｎ−グリコシル化部位を示すポリペプチドは、この微細藻類中で発現している場合、Ｎ−グリカン構造を示すだろうと仮定できる。
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【図１（ｐａｒｔ１）】
0005628689.tif 000011
【図１（ｐａｒｔ２）】
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【図２（ａ）】
0005628689.tif 000013
【図２（ｂ）】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【配列表】
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