(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
結節周囲への注射または吸入により投与することができ、変性疾患または自己免疫疾患の治療用および／または免疫調節性物質として使用することができる水溶液を製造する方法であって、  −第１段階において、アルコール溶媒中でショウノウを水酸化アンモニウムと反応させ；  −第２段階において、第１段階で得られた生成物を塩化ナトリウム水溶液に懸濁させ；得られた懸濁液を激しく振って攪拌し；そして  −第３段階において、所望の中性ｐＨ溶液を得るために、第２段階で得られた懸濁液のｐＨを硝酸で中和することを特徴とする方法。
【請求項２】
−第１段階において、エチルアルコール０．９ｍｌ中のショウノウ１０８ｍｇを水酸化アンモニウム５．２ｍｌと反応させ；  −第２段階において、第１段階で得られた生成物を水７９ｍｌと塩化ナトリウム０．９ｇを含む溶液に十分に溶解させ；そして  −第３段階において、Ｎ／６濃度の硝酸１４．９ｍｌを加えることにより、ｐＨを７に調整することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第３段階で得られた中性ｐＨ溶液をミリポアフィルターを通してろ過する請求項１、または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本発明は、結節周囲への注射または吸入により投与することができ、変性疾患または自己免疫疾患治療に、および／または免疫調節性物質として使用できる水溶液に関するものである。
【０００２】  本発明はまた当溶液の製造法にも関する。
この製造法は以下を特徴とする：
第１段階として、ショウノウを水酸化アンモニウムと反応させる。
【０００３】  第２段階として、第１段階で得られた生成物を塩化ナトリウム水溶液に懸濁させる；そして
第３段階として、第２段階で得られた懸濁液のｐＨを硝酸で中和し、所望の水溶液を得る。
【０００４】  上述の方法で得られた本発明による水溶液を十分に検査し、変性疾患または自己免疫疾患治療に、および／または免疫調節性物質として有効となる医薬的特性を持つことが証明された。
【０００５】  以上のように当溶液がヒトのサイトカインを模倣することに注目した。したがって当溶液は単球に作用してマクロファージへと変化させ、そのマクロファージが今度は２種類の炎症誘発性サイトカインすなわちインターロイキン１ベータ、６、８αおよび腫瘍壊死因子ＴＮＦアルファを分泌する。模倣するサイトカインファミリーによって、単球をマクロファージへと変化させたり、あるいは免疫システムを麻痺させる分子をブロックしたりする。双方の場合とも免疫システムの刺激および腫瘍壊死因子（これも免疫刺激性因子に分類されている）の増加が引き起こされる。この因子はまた、ウイルス感染またはその他の感染、および腫瘍の発生に対するホストの防御機構における役割を担っていることが知られている。
【０００６】  動物で行った試験に基づくと、本発明のよる溶液はヒトの治療にも２１日間で体重１ポンド当たり０．０７５ｍｌ、すなわち１シリーズ当たり総量１０．５ｍｌ使用することにより適用できるだろう。この値は１４０ポンドの体重のヒトに対しての１日当たり０．５ｍｌに相当する。投与は、結節周囲への注射または超音波噴霧器を用いての吸入により行うことができる。
【０００７】  １４０から１９０ポンドのヒトに対して、１回目のシリーズは以下の計画による段階的方法で投与するべきであろう：
１日目    ０．１ｍｌ  注射
２日目    ０．２ｍｌ  注射
３日目    ０．３ｍｌ  注射
４日目    ０．４ｍｌ  注射
５日目    ０．５ｍｌ  注射
これ以外の注射ではすべて当製造物を等量（０．５ｍｌ）含むようにするものとする。
【０００８】  ２回目以降のシリーズでは各注射で０．５ｍｌずつを２１日間使用することになる。
必要な場合は各サイクルの間に２日の休止期間をおいて、サイクルを繰り返すことができる。
【０００９】  本発明による水溶液中の活性因子の構造はまだ詳細には確立されていない。添付の図１のように同定されている反応図で明らかなように、ショウノウはアンモニアと可逆的に反応してヘミアミナル（hemiaminal）誘導体を生成する。このショウノウのヘミアミナル誘導体は、それ自体がアンモニアと水の存在下で可逆的に変化し得る多数の形をとる傾向があり、赤外線分光高度測定による同定はまだできていない。しかし、単球に作用してＩＬ−１ベータ、６、８およびＴＮＦアルファの産生を刺激することが知られているβファミリーサイトカインの構造を、この誘導体の構造が効果的に模倣している限り、当水溶液のおそらく活性因子となるのは、第２段階で得られたこのショウノウのヘミアミナル誘導体の塩化物の中和生成物であると考察する。この誘導体の塩化物の正式な化学名はトリメチル−１，７，７アミノ−２ヒドロキシ−２−ビシクロ［１，２，２］ヘプタンクロリドである。
【００１０】  以下に示す合成の実施例および今日までに行ったアッセイの詳細な記述を読むことで、本発明をより理解することができるだろう。
実施例
密閉容器中でエチルアルコール（Ｃ2Ｈ5Ｏ）０．９ｍｌにショウノウ（Ｃ10Ｈ16Ｏ）１０８ｍｇを加えて、完全に溶かす。次に、得られたアルコール溶液を水酸化アンモニウム（ＮＨ4ＯＨ）５．２ｍｌに加える。得られた混合液を振って攪拌する。
【００１１】  別の三角フラスコで滅菌したパイロジェン除去水７９ｍｌに塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）０．９ｇを溶かす。この三角フラスコの溶液を先に調整した混合液に加える。得られた新しい混合液を激しく振って攪拌する。
【００１２】  このように調整した水溶液中にはふわふわした沈殿物と上清が認められる。室温にて毎日振って攪拌し３日後、沈殿物が完全に溶解する。
この水溶液は透明な液体の状態で、アンモニア臭とアルカリ性の臭いがあり、ｐＨは１０．４である。その後、硝酸（ＨＮＯ3）／Ｎ6を１４．９ｍｌ加えてｐＨを７に調整する。
【００１３】  得られた最終溶液を次に０．２ミクロンのミリポアフィルターを通してろ過する。
使用するおよび前述の基本的な化学薬品がＵ．Ｓ．Ｐ．基準を満たしており、完全な無菌状態で操作することは言うまでもない。
【００１４】 生物学的特性
先の実施例で述べたように製造された溶液の生物学的特性は以下のとおりである：
１）in vitroで単球に作用する。
【００１５】  ２）in vitroで単球を成熟したマクロファージに変化させる。
３）再びin vitroで、変化したマクロファージが刺激されて以下の炎症誘発性サイトカインを分泌する。
【００１６】  （ａ）炎症過程および免疫反応に関与する細胞の分化および機能に非常に多様な影響を及ぼすことが知られているインターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１ベータ）；および
（ｂ）免疫刺激性物質としても分類されており、感染および腫瘍の発生に対するホストの防御機構における役割を担っていることが知られているＩＬ−６、８アルファおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦアルファ）。
【００１７】  細胞の免疫反応は、正常な細胞の多数の機能における役割を担っている低分子量タンパク質のホルモンである《サイトカイン》という比較的小さな分子のファミリーにより制御、調節されていることが知られている。サイトカインの機能は抗腫瘍、抗ウイルス、抗細菌活性を包含し、それらは免疫細胞の成長、分化、活性化、走化性、接着および免疫抑制を誘発する。
【００１８】  この免疫調節性物質のファミリーは近年発見された。７０以上の異なる分子が同定されているが、ファミリーは２００種以上を含むものと思われる。言葉を換えれば、今日までにサイトカインの一部だけが公知され特徴を明らかにされたに過ぎないのである。
【００１９】  公知のサイトカインはそれらの構造に基づき２つのグループ、アルファとベータに分類されている。アルファサイトカインはインターロイキン、インターフェロン、および免疫細胞の増殖をコントロールするその他の成長因子を含む。ベータサイトカインはＭＩＰ（マクロファージ炎症性タンパク質）、ＭＣＰ（単球遊走因子）、ＲＡＮＴＥＳ、および免疫細胞を感染部位または腫瘍部位に誘引することで免疫システムの活性を強化するその他のタンパク質を含む。各サイトカイン分子は非常に特異的で、リンパ球の小さなサブ集団をターゲットとするだけである。さらに３から７個のアミノ酸程度の小さなサイトカインフラグメントがリンパ球に結合して、完全長のサイトカイン分子の活性を部分的に模倣したりブロックしたりすることができる。
【００２０】  ベータサイトカインのＣ末端の最後の３個のアミノ酸は、正の電荷を帯びている窒素−酸素であることも知られている。したがって本発明による水溶液はその製造法の結果として、ベータサイトカインファミリーの３個のアミノ酸配列に類似しこれを模倣する少量の窒素−酸素分子を含み得るために、複数のサイトカインを分泌する刺激効果を与えることができる可能性がある。必要とされるサイトカインの活性に応じて、本発明による溶液は単球から活性なマクロファージへの変化を活性化したり、あるいは免疫システムを麻痺させるその他の分子の活動をブロックしたりすることができる。いずれの場合もその結果、免疫システムと自然の防御機能を強化することができ、腫瘍細胞の破壊を増加させることになる。
【００２１】 実施したアッセイの結果
以下に述べる様々なアッセイおよび試験は、前述の実施例により製造された水溶液を満たしたバイアルにて行った。
【００２２】  １）溶液のコントロール試験：
本発明により製造された水溶液の検査を行った。当溶液は実際には透明、揮発性で、１ｍｌ当たり６３ｍｇの乾燥抽出物が残った。
【００２３】  ２）無菌アッセイ：
ランダムに選択した１０個のバイアルを３７度で４８時間インキュベーションした。その後、各バイアル中の液体を以下のように培養液に植えた：
ａ）チオグリコラート培地（Difco）を含む２本の６０ｍｌ試験管、およびサブロー（Sabouraud）液体培地（Difco）を含む１本の６０ｍｌ試験管に各々１ｍｌの当該溶液を加えた。
【００２４】  ｂ）チオグリコラート培地（Difco）を含む２本の６０ｍｌ試験管、およびサブロー（Sabouraud）液体培地（Difco）を含む１本の６０ｍｌ試験管に各々０．２５ｍｌの当該溶液を加えた。
【００２５】  ｃ）グループＡのチオグリコラートの試験管の１本、およびグループＢのチオグリコラートの試験管の１本を３５度で１０日間インキュベーションし、他の試験管はすべて１０日間室温（約２０度）に保持した。
【００２６】  植えつけた試験管はすべて無菌のままであった。
３）毒性アッセイ：
健康な動物に行った医薬的アッセイで、非常に多量の投与でも毒性のないことが示された。
【００２７】  当アッセイでは、９ポンドのウサギに当製造物１ｍｌを静注したが、好ましくない反応は認められなかった。同様の投与法で複数のネコに体重１ポンド当たり当製造物０．２ｍｌを、そして複数のイヌに体重１ポンド当たり当製造物０．３ｍｌを注射したが、好ましくない反応は認められなかった。
【００２８】  リンパ系を介しての投与により１０から１２ポンドの複数のネコに、体重を１４０から１９０ポンドとしてのヒトの治療に処方する総投与量の２倍量までを注射したが、好ましくない反応は認められなかった。
【００２９】  ４）治療アッセイ：
当製造物の治療活性については、ウイルス感染および細菌感染と同様、様々な変性病変のある２６頭のネコおよび２０頭のイヌにおいて約３年間観察を行った。
【００３０】  １回の注射の投与量は、ヒトの治療について先に提示した総投与量までとし、２０分の1量ずつ変えて様々に設定した。
当製造物の治療活性は治療２日目から直ぐに全症例で観察することができた。この活性は腫瘍もしくはリンパ結節の大きさの後退、または感染疾患後のバイタル機能の回復および満足できる全身状態への回復という形で表れた。
【００３１】  最適の結果は、２１日間の１サイクルで体重１ポンド当たり０．０７５ｍｌとする薬量で記録されたが、これは前述のヒトの治療への適用可能な薬量として定めることを認めた値である。
【００３２】  ５）医薬的アッセイ：
先に示したように本発明による水溶液は腫瘍性細胞に作用して、それらが白血球や生体内の食作用に関与する他の物質の走化性を負の状態に誘導する物質を分泌するのを阻止する。
【００３３】  この分泌の抑制により免疫システムは腫瘍形成を非自己とみなし、これを破壊することができる。動物試験では溶解された腫瘍塊の除去が排出器官を通して行われることが示された。このように排出される癌細胞はいかなる細胞分裂もできない細胞核が破壊された状態にある。これらの排出される細胞は膨大な量の様々な非常に活性な白血球に取り囲まれることになる。
【００３４】  動物試験ではまた、治療した動物の血液学的定数が治療の第１週目から直ぐに標準値に達することが示された。
本発明による水溶液をこのように、好ましくはリンパ系を介しての投与により使用することができる。
【００３５】  実施上の観点から、本溶液を殺菌灯の光線（例えば２５３７オングストロームの光線）に暴露させることはできないことは注意に値する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ショウノウとアンモニアの反応図である。
【図１】
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