(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)末梢血単核球(PBMCs)、(ii)リンパ球を含有する液、または(iii)リンパ球を含有する組織、を含有するサンプルから、ネガティブ選択によりヒトのFoxp3+ 制御性T細胞(Foxp3+ Treg細胞)を分離するための方法であって、以下の工程を含む方法:
(a) サンプルを抗CD49d抗体、および、抗CD127抗体で処理する工程;ならびに、
(b) Foxp3+ Treg細胞を分離する工程。
【請求項２】
工程(a)および(b)が同時に行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
工程(a)が、サンプルから非CD4+ T細胞を分離することを追加で含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
サンプルから非CD4+ T細胞を分離するために、サンプルから非CD4+ T細胞を特異的に枯渇させることができる一つまたは複数の抗体を使用する、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
工程(a)で使用される抗体の少なくとも一つが標識化または固定化される、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
(i)抗CD49d抗体によってCD49d+ 細胞を;および、
(ii)抗CD127抗体によってCD127+ 細胞を、
サンプルから枯渇させることによって工程(b)が行われる、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程(b)が、遠心分離、細胞水簸、磁力分離、蛍光励起細胞ソーティング、免疫学的分離、吸着、補体溶解またはフローサイトメトリーを使用して行われる、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程(b)が、磁力細胞分離、蛍光励起細胞ソーティング、またはカラムに基づく免疫学的分離を使用して行われる、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
抗CD45RO抗体が、工程(a)において追加の抗体として使用され、分離されるFoxp3+ Treg細胞がCD45RA+ T細胞である、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
抗CD45RA抗体が、工程(a)において追加の抗体として使用され、分離されるFoxp3+ Treg細胞がCD45RO+ T細胞である、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
抗CD49d抗体および抗CD127抗体を含む、ネガティブ選択によりヒトFoxp3+ Treg細胞を分離するためのキット。
【請求項１２】
抗CD127抗体と組み合わせた抗CD49d抗体、または、請求項11に記載のキットの、ネガティブ選択によりヒトFoxp3+ Treg細胞を分離するための使用方法。
【請求項１３】
遠心分離、細胞水簸、磁力分離、蛍光励起細胞ソーティング、免疫学的分離、吸着、補体溶解またはフローサイトメトリーによって、非制御性CD4+ T細胞を含むCD49d+ PBMCsをFoxp3+ Treg細胞から分離することにより、ヒトFoxp3+ Treg細胞の分離が達成されることを特徴とする、請求項12に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、(i)末梢血単核球(PBMCs)、(ii)リンパ球を含有する液、または(iii)リンパ球を含有する組織、を含有するサンプルから、ヒトのフォークヘッドボックスP3 (Foxp3+) CD4+ 制御性T細胞(ここではFoxp3+ Treg細胞と呼ぶ)を分離する方法、ヒトのFoxp3+ Treg細胞を分離するためのキット、および、ヒトのFoxp3+ Treg細胞を分離するための抗CD49d抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Foxp3+ 制御性(regulatory)T細胞、または「Tregs」は、他の免疫細胞の活性を迅速に抑制できることから、様々な免疫応答のコントロールにおいて基礎的な役割を担う。特に、自己抗原および非自己抗原に対する望ましくない免疫応答を下方制御することによりトレランス(tolerance)を維持する上で、Tregsは重要である (例えばFontenot, J. D. & Rudensky, A. Y. Nat Immunol 6, 331-7 (2005); Sakaguchi, S., Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)を参照のこと)。例えば、多発性硬化症(MS)、1型糖尿病(T1D)、乾癬、重症筋無力症(MG)、およびその他の自己免疫疾患の患者において、Tregの異常が発見されてきた(Baecher-Allan, C. & Hafler, D. A., Immunol Rev 212, 203-16 (2006))。アトピーおよびアレルギー性疾患においても同様の関連性が存在し得る(Robinson, D. S., Larche, M. & Durham, S. R., J Clin Invest 114, 1389-97 (2004))。これらの疾患の全てについて、患者のTreg細胞のインビトロ免疫抑制が低下していることを指摘する報告が存在する。このことにより、慢性感染症、自己免疫疾患、アレルギー、および、移植片拒絶反応や移植片対宿主病(GvHD)のような移植関連合併症を、治療または予防するための免疫療法において、Tregsを使用することの可能性に関心が高まってきている(概説としてはRoncarolo, M. G. & Battaglia, M., Nat Rev Immunol 7, 585-98 (2007)を参照のこと)。
【０００３】
ヒトおよびげっ歯類では、Treg細胞はCD4+ T細胞の約2-10%を占め、CD25、CTLA-4およびGITR、ならびに該細胞の発生および機能に関わる転写因子Foxp3を、恒常的に発現する。Treg細胞の特徴であるマーカーがFoxp3である。ヒトのFoxp3+ Treg細胞を分離する複数の方法が知られている。例えば、Hoffmann, P. et al. Biol Blood Marrow Transplant 12, 267-74 (2006)は、医薬品適正製造基準(GMP)条件下において2工程磁力細胞分離プロトコールを使用することにより、標準的な白血球分離の産物から、制御性機能を有するCD4+CD25+ T細胞を分離することを記述している。得られた細胞産物は、Foxp3+ Treg細胞を平均で49.5%含んでいた。また、例えばミルテニーバイオテクのCD4+CD25+ 制御性T細胞分離キットやインビトロジェンのDynal（登録商標）CD4+CD25+ Tregキットなどの、 市販のキットも入手可能である。
【０００４】
ここまで述べてきたヒトのFoxp3+ Treg細胞の分離方法は全て、Tregsの細胞表面マーカーを基にしてFoxp3+ Treg細胞をポジティブ選択(positive selection)することを利用している（例えばSeddiki, N. et al., J Exp Med 203, 1693-700 (2006)を参照のこと）。すなわち、Treg付随の細胞表面マーカー(主にCD25)に対する抗体により、Foxp3+ Treg細胞が分離される。しかし、CD4やCD25のようなTregsの細胞表面マーカーのほとんどは、Tregsに限定されているわけではない。例えば、よく利用されるCD25は、全てのFoxp3+ Treg細胞上に存在するわけではないし、また、エフェクターおよびメモリーCD4+ T細胞においても発現される(例えばBaecher-Allan, C., Brown, J. A., Freeman, G. J. & Hafler, D. A., J Immunol 167, 1245-53 (2001)を参照のこと)。従って、これらのポジティブ選択法では、Foxp3+ Treg細胞の大部分を捕らえて均一な細胞群として分離することができない。上で述べたように、Hoffmann, P. et al.は平均で49.5%のFoxp3+ Treg細胞を得た。
【０００５】
従来の方法のもう一つの欠点は、分離したTregサブセットにエフェクターT細胞が混入することである。後者は、IFN-γやIL 17のようなサイトカインを分泌することにより炎症促進性の免疫反応を誘導するため、有害反応を呈する危険性を本質的に含んでいる。CD25のようなマーカーを使用する場合には、分離されたCD4+ 細胞群の半分までもがエフェクターT細胞で占められることもあり得るため、これらの混入が顕著となり得る(Hoffmann, P. et al. Biol Blood Marrow Transplant 12, 267-74 (2006))。
【０００６】
Tregsの細胞表面マーカーを基にしたポジティブ選択により分離したFoxp3+ Treg細胞を細胞療法に適用することにも重大な問題がある。第一に、細胞表面マーカー、例えばCD25に基づくFoxp3+ Treg細胞の分離は、他の細胞、例えばCD4+エフェクター細胞(Treg抑制の主要なターゲットである)が、Foxp3+ Treg細胞群に多かれ少なかれ混入することに結びつく。従って、そのようなポジティブ選択されたFoxp3+ Treg細胞を細胞療法に適用するならば、治療を受けた患者において免疫系の致死的な活性化が起こるかも知れず、高い危険性が存在する。そのような致死的な免疫反応については、「ティジェネロ(Tegenero)」の試験失敗における最近の記述があり、そこでは、Treg細胞を拡張(expand)すると予測されていた抗体がエフェクター細胞の活性化を引き起こした(Suntharalingam, G. et al., N Engl J Med 355, 1018-28 (2006))。第二に、抗体が結合したポジティブ選択Foxp3+ Treg細胞は、機能減損を示すことがあり得る。例えば、抗体が結合した細胞は、事前活性化している(preactivated)可能性があり、補体媒介もしくは細胞媒介によって枯渇(depletion)されてしまうこともあり得、または、ホーミングパターンおよび移動パターンの変化を示すこともあり得る。従って、分離の段階で抗体の標的とされたFoxp3+ Treg細胞を治療目的に使用することが好ましくないのは、安全上の理由だけにはとどまらない。
【０００７】
ここで論じられたように、Foxp3+ Treg細胞の分離に関しては、上記の方法およびキットには大きな不都合がある。第一に、免疫抑制性Foxp3+ Treg細胞を分離するための従来の方法では、混入したCD4+ エフェクター細胞およびメモリーT細胞を効果的に除去することができない。これは、従来使用されている技術およびマーカー(例えばCD25を基にしたFoxp3+ Tregの分離)は、これらの混入したCD4+ エフェクターおよびメモリーT細胞を、免疫抑制性Foxp3+ Treg細胞から区別することができないからである。例えば、CD25は、これらの混入したCD4+ 細胞上にも存在するマーカーである。さらに、これら混入したCD4+細胞の少なくとも一部のものは、細胞内Foxp3染色法によって見分けることすらできない。これは、ヒトの活性化したCD4+ エフェクター細胞は一時的にFoxp3を発現することが知られているからである(Allan et al., Int Immunol. 19:345-54(2007))。結果として、従来方法により分離されたCD25highCD4+ T細胞群は、たとえ純度の高いものであっても、サイトカインを産生する炎症促進性のエフェクター細胞をかなりの分量で含み(Dieckmann et al., J. Exp Med. 193, 1303-1310 (2001))、すなわち、分離された当該Foxp3+ Treg細胞には、CD4+エフェクターおよびメモリーT細胞が著しく混入している。
【０００８】
その上、ネガティブ選択によりFoxp3+ Treg細胞を得ることができるような、すなわちFoxp3+ Treg細胞を標識/抗体にさらさずに済むような方法が、これまでのところ存在しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Fontenot, J. D. & Rudensky, A. Y. A well adapted regulatory contrivance: regulatory T cell development and the forkhead family transcription factor Foxp3. Nat Immunol 6, 331-7 (2005).
【非特許文献２】Sakaguchi, S. Naturally arising CD4+ regulatory t cells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses. Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004).
【非特許文献３】Baecher-Allan, C. & Hafler, D. A. Human regulatory T cells and their role in autoimmune disease. Immunol Rev 212, 203-16 (2006)
【非特許文献４】Robinson, D. S., Larche, M. & Durham, S. R. Tregs and allergic disease. J Clin Invest 114, 1389-97 (2004)
【非特許文献５】Roncarolo, M. G. & Battaglia, M. Regulatory T-cell immunotherapy for tolerance to self antigens and alloantigens in humans. Nat Rev Immunol 7, 585-98 (2007)
【非特許文献６】Hoffmann, P. et al. Isolation of CD4+CD25+ regulatory T cells for clinical trials. Biol Blood Marrow Transplant 12, 267-74 (2006)
【非特許文献７】Seddiki, N. et al. Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells. J Exp Med 203, 1693-700 (2006)
【非特許文献８】Baecher-Allan, C., Brown, J. A., Freeman, G. J. & Hafler, D. A. CD4+CD25high regulatory cells in human peripheral blood. J Immunol 167, 1245-53 (2001).
【非特許文献９】Suntharalingam, G. et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med 355, 1018-28 (2006)
【非特許文献１０】Liu, W. et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med 203, 1701-11 (2006).
【非特許文献１１】Hori, S., Nomura, T. & Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science 299, 1057-61 (2003)
【非特許文献１２】Mutis, T. et al. Human regulatory T cells control xenogeneic graft-versus-host disease induced by autologous T cells in RAG2-/-gammac-/- immunodeficient mice. Clin Cancer Res 12, 5520-5 (2006)
【非特許文献１３】Sharpe, A. H. & Abbas, A. K. T-cell costimulation--biology, therapeutic potential, and challenges. N  Engl J Med 355, 973-5 (2006)
【非特許文献１４】Thornton, A. M., Donovan, E. E., Piccirillo, C. A. & Shevach, E. M. Cutting edge: IL-2 is critically required for the in vitro activation of CD4+CD25+ T cell suppressor function. J Immunol 172, 6519-23 (2004).
【非特許文献１５】Fontenot, J. D., Rasmussen, J. P., Gavin, M. A. & Rudensky, A. Y. A function for interleukin 2 in Foxp3-expressing regulatory T cells. Nat Immunol 6, 1142-51 (2005).
【非特許文献１６】Kohm, A. P. et al. Cutting Edge: Anti-CD25 monoclonal antibody injection results in the functional inactivation, not depletion, of CD4+CD25+ T regulatory cells. J Immunol 176, 3301-5 (2006).
【非特許文献１７】McNeill, A., Spittle, E. & Backstrom, B. T. Partial depletion of CD69low-expressing natural regulatory T cells with the anti-CD25 monoclonal antibody PC61. Scand J Immunol 65, 63-9 (2007).
【非特許文献１８】Barnard, A. L., Igakura, T., Tanaka, Y., Taylor, G. P. & Bangham, C. R. Engagement of specific T-cell surface molecules regulates cytoskeletal polarization in HTLV-1-infected lymphocytes. Blood 106, 988-95 (2005).
【非特許文献１９】von Bonin, A., Huhn, J. & Fleischer, B. Dipeptidyl-peptidase IV/CD26 on T cells: analysis of an alternative T-cell activation pathway. Immunol Rev 161, 43-53 (1998).
【非特許文献２０】Randolph, D. A. & Fathman, C. G. Cd4+Cd25+ regulatory T cells and their therapeutic potential. Annu Rev Med 57, 381-402 (2006).
【非特許文献２１】Tang, Q. & Bluestone, J. A. Regulatory T-cell physiology and application to treat autoimmunity. Immunol Rev 212, 217-37 (2006).
【非特許文献２２】Masteller, E. L. et al. Expansion of functional endogenous antigen-specific CD4+CD25+ regulatory T cells from nonobese diabetic mice. J Immunol 175, 3053-9 (2005).
【非特許文献２３】Waldmann, H. et al. Regulatory T cells and organ transplantation. Semin Immunol 16, 119-26 (2004).
【非特許文献２４】Fontenot, J. D. et al. Regulatory T cell lineage specification by the forkhead transcription factor foxp3. Immunity 22, 329-41 (2005).
【非特許文献２５】Kleinewietfeld, M. et al. CCR6 expression defines regulatory effector/memory-like cells within the CD25(+)CD4+ T-cell subset. Blood 105, 2877-86 (2005).
【非特許文献２６】Ebert, L. M. & McColl, S. R. Coregulation of CXC chemokine receptor and CD4 expression on T lymphocytes during allogeneic activation. J Immunol 166, 4870-8 (2001).
【非特許文献２７】P.T. Sharpe, Methods of Cell Separation, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 18, ELSEVIER (1988)
【非特許文献２８】D. Fisher, G. E. Francis, D. Rickwood (Eds.) ,Cell Separation: A Practical Approach, Oxford University Press (1999)
【非特許文献２９】Allan SE, Crome SQ, Crellin NK, et al. Activation-induced FOXP3 in human T effector cells does not suppress proliferation or cytokine production. Int Immunol. 2007;19:345-354.
【非特許文献３０】Dieckmann D et al. Ex vivo isolation and characterization of CD4(+)CD25(+) T cells with regulatory properties from human blood. J Exp Med. 193, 1303-10 (2001).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上で述べたことから、CD4+ エフェクターおよびメモリーT細胞の混入を実質的に伴わずにFoxp3+ Treg細胞を分離することに役立つ方法およびキット/組成物に対する、特別なニーズが存在することとなる。Foxp3+ Treg細胞のポジティブ選択を必要としない方法に対する特別なニーズもある。
【００１１】
従って、上で述べた先行技術の不都合を回避するような方法を提供することが、本発明の一つの課題である。特に、CD25に基づく従来のTreg調製物に混入するサイトカイン産生性CD4+ 細胞(Foxp3を一時的に発現するCD4+ エフェクター細胞を含む)を効果的に除去できるような、免疫抑制性Foxp3+ Treg細胞の分離方法を提供することが、本発明の一つの課題である。それに加えて、Foxp3+ Treg細胞を分離するためのキットを提供することも、本発明のもう一つの課題である。さらに、サイトカイン産生性エフェクターT細胞をFoxp3+ Treg細胞から区別することができる新規のマーカーを導入することにより、本発明の方法およびキットは、Treg調製物の品質を他の方法で得られるものよりも改善させる(特にサイトカイン産生性エフェクターT細胞が除去されることによる)ための新しいアプローチを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、Foxp3+ Treg細胞の特定の細胞表面マーカーと非制御性CD4+ T細胞の細胞表面マーカーとの相関についての調査結果に基づいている。特に、細胞表面マーカーCD49dが調査された。本発明のコンテクスト中の実験において、ほとんどのFoxp3+ Treg細胞は表面マーカーCD49dを欠いていることを示すことができた。本発明のコンテクストの中で、CD49dに対する抗体を使用することによってヒトのFoxp3+ Treg細胞を分離できる、ということを示すことができた。それに加え、当該分離されたFoxp3+ Treg細胞に抑制性活性(suppressor activity)があることも、本発明のコンテクスト中の実験により確認した。当該分離されたFoxp3+ Treg細胞は、抑制(suppression)アッセイにおいて、エフェクターT細胞の増殖を抑制することができ、リンパ球混合培養反応(MLR)をインビトロで強く阻害し、Rag2-/- γc-/- マウスに基づくGvHDモデルにおいて、移植したヒトPBMCによる致死的な攻撃をインビボで防止した。
【００１３】
本発明の第一の態様においては、(i)末梢血単核球、すなわち「PBMCs」、(ii)リンパ球を含有する液、または(iii)リンパ球を含有する組織、を含有するサンプルからヒトのFoxp3+ Treg細胞を分離する方法により、本発明の課題の一つが解決され、当該方法は以下の工程を含む:
【００１４】
(a) サンプルを抗CD49d抗体で処理すること;
(b) Foxp3+ Treg細胞を分離すること。
【００１５】
本発明において使用される「サンプルを処理する」という用語は、当該サンプルに含まれる細胞を、抗体と直接物理的に接触させ、当該抗体が標的の細胞と相互作用できるようにすることを、特に意味する。言い換えれば、本発明による方法においては、末梢血単核球(PBMCs)、リンパ球含有液、またはリンパ液含有組織を抗CD49d抗体と接触させ、Foxp3+ Treg細胞を分離する。
【００１６】
本発明において使用される「分離(separating)」という用語は、物理的な手段により、一つの種類の細胞、例えばFoxp3+ Treg細胞を、他の種類の細胞、例えばCD4+ エフェクター細胞から選り分けること、または、全ての非制御性CD4+ T細胞をFoxp3+ Treg細胞から取り除くこと、のいずれかにより、純度の増した(enriched) Foxp3+ Treg細胞群を残すことを指す。当該分離は単一の工程または複数の工程において実行され得ることにも注意すべきであり、当該複数の工程は連続的に行うこともできる(すなわち、サンプルを一つまたは複数の抗体で最初に処理した後に最初の分離を行い、そして当該最初の分離の結果得られたサンプルに一つまたは複数の抗体による第二の処理を施してから第二の分離を行う、など)。分離技術についてのさらに詳しい記述については、P.T. Sharpe, Methods of Cell Separation, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 18, ELSEVIER (1988)、およびD. Fisher, G. E. Francis, D. Rickwood (Eds.), Cell Separation: A Practical Approach, Oxford University Press (1999)を参照のこと。
【００１７】
本発明において使用される「サンプル」という用語は、末梢血単核球、すなわち「PBMCs」、またはリンパ球を含有する、体液または組織のことを指す。
【００１８】
本発明において使用される「リンパ球含有液」という用語は、例えば滑液のような、リンパ球を含有するあらゆる液のことを指す。本発明において使用される「リンパ球含有組織」という用語は、例えば脾臓、胸腺、リンパ節、骨髄、パイエル板、および扁桃腺のような、リンパ球を含有するあらゆる組織のことを指す。
【００１９】
上で概説されたことを言い換えれば、当該発明は、シンプルで、高い信頼性と再現性を有するFoxp3+ Treg細胞分離方法により、上述の技術的な問題を解決する。特に、上で述べられたように、先行技術の方法は、例えばCD25のような、Foxp3+ Treg細胞の細胞表面マーカーに依存する。しかしながら、既に説明されたように、当該方法によるFoxp3+ Treg細胞の分離では、CD4+ エフェクターおよびメモリーT細胞が著しく混入したものしか得られなかった。その上、従来の方法は全てCD25に基づくものなので、分離されたFoxp3+ Treg細胞は全て標識化されている、すなわち、Foxp3+ Treg細胞の細胞表面マーカーの一つに対する抗体が結合していることとなる。さらに、上記の方法は少なくとも2つの分離工程を要した:(i)非CD4細胞の枯渇化(depletion);(ii)ポジティブ・ソーティング(sorting)によるCD25+ 細胞の分離、である。これとは対照的に、本発明の方法では、まず第一に、単一の工程でFoxp3+ Tregを分離することができる。これは、本発明の方法は、エフェクターT細胞とFoxp3+ Treg細胞とを区別することができるCD49dをマーカーとして利用するからである。CD49dは、CD4+ エフェクターおよびメモリーT細胞の大部分に存在するが、免疫抑制性Foxp3+ Treg細胞上には不在である。従ってそれは、例えばサイトカイン産生性エフェクターT細胞のような混入細胞を、Foxp3+ Treg調製物から除去するために、利用することができる。CD49d+ 細胞の枯渇化は、サイトカイン産生性CD4+ 細胞(Foxp3を一時的に発現するエフェクター細胞を含む)を実質的に全て取り除くが、CD25に基づくTreg調製におてはこれらの細胞が混入する。このことは全CD4+ 細胞の場合にも当てはまるが、最も注意を引くのは、通常のCD25+ 細胞調製物にもこのことが当てはまるということである。
【００２０】
従って、本発明による方法を使用したFoxp3+ Treg細胞の分離は、より迅速で、より容易であり、そして何よりも、サンプルが含有するFoxp3+ Treg細胞のほとんどを捕らえて均一な細胞群として分離するという点において、より効果的である。言い換えれば、本発明の方法を利用したFoxp3+ Treg細胞の分離は、CD4+ エフェクターおよびメモリーT細胞が実質的に混入していない免疫抑制性Foxp3+ Treg細胞群を産出する。最後に、本発明の方法は自動化することも可能であり、これにより当該方法の適用容易性はさらに増大する。
【００２１】
好ましくは、本発明によるFoxp3+ Treg細胞の分離方法は以下のことを含む:(a) Foxp3+ Treg細胞を含有するサンプルを抗CD49d抗体で処理すること;および(b) 当該抗CD49d抗体を介して、サンプルからCD49d+ 細胞を枯渇(depleting)させ、それによりFoxp3+ 制御性T細胞を分離すること。ここで、当該サンプルは、(i)末梢血単核球、すなわち「PBMCs」、(ii)リンパ球を含有する液、または(iii)リンパ球を含有する組織である。
【００２２】
本発明によって得られた結果の中でも最も有望なのは、本発明による方法において、CD127とCD49dという、Foxp3発現と逆相関する二つの細胞表面マーカーを標的とする、抗CD49d抗体と抗CD127抗体とを組合せて使用(すなわち、連続的または同時的に使用)することによって、手付かず(untouched)でもあるFoxp3+ Treg細胞を高い純度で(すなわち、CD4+ エフェクターおよびメモリーT細胞の混入を実質的に伴わずに)得ることができる、という発見であった。本発明の方法により分離されるFoxp3+ Treg細胞は、リンパ球混合培養反応をインビトロで阻害する能力、および、致死的な異種間GvHD反応をインビボで防止する能力で示されるように、完全に機能的である。今までは、分離されるFoxp3+ Treg細胞中に非制御性CD4+ 細胞(例えばエフェクターおよびメモリーCD4+ 細胞)が混入することが、Foxp3+ Treg細胞の分離方法における主要な欠点であった。Tregsの細胞表面マーカーに基づくポジティブ選択により分離されたFoxp3+ Treg細胞群には、かなりの量の非制御性CD4+ 細胞が含まれる。例えば、Hoffmann, P. et al. Biol Blood Marrow Transplant 12, 267-74 (2006)において、GMP条件下でポジティブ選択を使用して分離したFoxp3+ Treg細胞群は、平均すると50%を超える細胞が非制御性CD4+ 細胞であった。当然のことながら、望ましくない非制御性CD4+ 細胞がそれほどの量で含まれていることは、上でも述べたように、例えば免疫療法においてそのようなFoxp3+ Treg細胞群を使用することの妨げとなる。
【００２３】
好ましくは、本発明の方法において工程(a)および(b)は同時に行うことができる。加えて、工程(a)および(b)は繰り返して行うこともでき、すなわち、最初の工程(a)および最初の工程(b)を行った後に、2回目の工程(a)および2回目の工程(b)を行い、続いて任意で3回目、4回目等の工程(a)および(b)をそれぞれ行っていくことができる。注意すべきことに、もし工程(a)および(b)が繰り返して行われるならば、後に続くそれぞれの工程(すなわち、2回目の工程(a)または(b)、3回目の工程(a)または(b)、等々)についてのサンプルは、他のサンプルとは別個、独立に処理され分離される。従って、例えば、もし最初の工程(a)において抗CD49dでサンプルを処理した後、Foxp3+ Treg細胞を分離する最初の工程(b)(例えば、遠心分離、細胞水簸(cell elutriation)、磁力分離、蛍光励起細胞ソーティング、免疫学的分離、吸着(adhesion)、補体溶解(complement lysis)、または蛍光励起細胞ソーティングから選択される、一般的に知られた分離方法の使用による)を行うとしたら、最初の工程(b)で得られたこれらのFoxp3+ Treg細胞は、2回目の工程(a)においては例えば抗CD25抗体および/または抗CD127抗体で処理し、次いで2回目の分離工程(b)(例えば磁力細胞分離法を使用して)を行って、CD25+Foxp3+ Treg 細胞を分離することができる。
【００２４】
工程(a)および(b)を同時に行うことの利点は、Foxp3+ Treg細胞の分離がより楽な仕事となり、シンプルになり、迅速になり、また、よりコスト効率的にもなる、ということである。工程(a)および(b)を繰り返して行うことの利点は、異なる複数のマーカー(例えばCD4、CD25のようなポジティブマーカー、またはCD127のようなネガティブマーカー)を分離のために使用することができ、これら特定のマーカーを帯びた細胞を後続の工程において分離または除去していける、ということである。このようにして、特定の性質(例えば、特定の細胞表面受容体)を有する独特な細胞群を分離することができる。
【００２５】
本発明による方法においては、工程(a)は抗CD25抗体でサンプルを処理することを追加で含むことができる。好ましくは、抗CD49d抗体を用いて分離されたFoxp3+ Treg細胞を、抗CD25抗体で処理し、次いでCD25+ Foxp3+ Treg細胞を分離する。
【００２６】
好ましくは、本発明によるFoxp3+ Treg細胞の分離方法は以下のことを含む:(a) Foxp3+ Treg細胞を含有するサンプルを抗CD49d抗体および抗CD25抗体で処理すること;および(b)当該抗CD49d抗体を介して、サンプルからCD49d+ 細胞を枯渇させ、それによりFoxp3+ 制御性T細胞を分離すること。ここで、当該サンプルは、(i)末梢血単核球、すなわち「PBMCs」、(ii)リンパ球を含有する液、または(iii)リンパ球を含有する組織である。任意で、工程(b)は、抗CD25抗体を介したCD25+ 細胞のポジティブ選択を、追加で含む。
【００２７】
本発明において使用される「ポジティブ選択」という用語は、所望の細胞を標識/捕獲することにより、細胞のレパートリーの中から当該所望の細胞を選り出し、所望でない細胞を(非標識のまま)取り残すこと、を意味する。
【００２８】
さらに、本発明による方法においては、工程(a)は抗CD127抗体でサンプルを処理することを追加で含むことができる。
【００２９】
好ましくは、本発明によるFoxp3+ Treg細胞の分離方法は以下のことを含む:(a) Foxp3+ Treg細胞を含有するサンプルを抗CD49d抗体および抗CD127抗体で処理すること;および(b) 当該抗CD49d抗体またはを抗CD127抗体を介して、サンプルからCD49d+CD127+ 細胞を枯渇させ、それによりFoxp3+ 制御性T細胞を分離すること。ここで、当該サンプルは、(i)末梢血単核球、すなわち「PBMCs」、(ii)リンパ球を含有する液、または(iii)リンパ球を含有する組織である。
【００３０】
さらに、本発明による方法においては、工程(a)は非CD4+ T細胞をサンプルから取り除くことを追加で含むことができる。
【００３１】
追加で非CD4+ T細胞をサンプルから取り除くことの利点は、非CD4+ T細胞の除去の効率がより高まり、結果として、得られる細胞群の純度がより高まることである。
【００３２】
本発明による方法においては、抗CD4抗体を使用したポジティブ選択により、非CD4+ T細胞をサンプルから取り除くことができる。
【００３３】
さらに、本発明による方法においては、ネガティブ選択により非CD4+ T細胞をサンプルから取り除くために、非CD4+ T細胞をサンプルから特異的に枯渇させることを可能にするような一つまたは複数の抗体を使用することができる。
【００３４】
本発明において使用される「ネガティブ選択」という用語は、所望でない細胞を標識/捕獲することにより、細胞のレパートリーの中から当該所望でない細胞を除去し、所望の細胞を(非標識のまま)残すこと、を意味する。
【００３５】
非CD4+ T細胞をサンプルから枯渇させることの利点は、CD4+ T細胞が手付かずでクリーンなまま残るということである。
【００３６】
本発明において好ましいとされる一方法では、サンプルから非CD4+ T細胞を特異的に枯渇させるために使用する抗体(単数または複数)は、抗CD8抗体、抗CD10抗体、抗CD14抗体、抗CD15抗体、抗CD16抗体、抗CD19抗体、抗CD35抗体、抗CD36抗体、抗CD49b抗体、抗CD56抗体、抗CD66a抗体、抗CD66b抗体、抗CD66c抗体、抗CD66d抗体、抗CD89抗体、抗CDw92抗体、抗CD93抗体、抗CD111抗体、抗CD112抗体、抗CD123抗体、抗CD141抗体、抗CD156a抗体、抗CD170抗体、抗TCRg/d抗体、抗CD235a抗体、抗CD282抗体、および抗CDw329抗体、抗β7-インテグリン抗体またはその混合物、を含む群から選択することができる。
【００３７】
本発明の好ましい場合においては、サンプルから非CD4+ T細胞を特異的に枯渇させるために、抗CD14抗体、抗CD15抗体、抗CD16抗体、および/または抗CD66b抗体を使用できる。
【００３８】
非CD4+ T細胞を特異的に枯渇させるために、抗CD14抗体、抗CD15抗体、抗CD16抗体、および抗CD66b抗体から選択される一つまたは複数の抗体を使用することの利点は、この抗体のサブセットは市販されているサブセットに比べれば小さいものであるということである。
【００３９】
本発明のさらに好ましい方法においては、サンプルから非CD4+ T細胞を特異的に枯渇させるために、抗CD14抗体および/または抗CD16抗体および/または抗CD66b抗体を使用できる。
【００４０】
さらに、本発明において好ましいとされる一方法では、工程(a)で使用される抗体の少なくとも一つが標識化されるか、または固定化される。
【００４１】
本発明において使用される「標識化」という用語は、分子(例えば抗体)が、標識(label)に結合(conjugated)していることを意味する。抗体に結合させることができる多くの異なる標識が当業者に知られている。例えば、32P、35Sまたは3Hのような放射性同位体;フルオレセイン(FITC)、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン(PE)、アロフィコシアニン、6-カルボキシフルオセイン(6-FAM)、2',7'-ジメトキシ-4',5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオセイン(JOE)、6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、6-カルボキシ-2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、5-カルボキシフルオセイン(5-FAM)またはN,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)のような蛍光または発光マーカー;F(ab)2フラグメントのような抗体または抗体フラグメント;ビオチン、アビジン、アガロース、骨形成タンパク質(BMP)、結合マトリックス(matrix bound)、ハプテンのようなアフィニティー標識;ならびにアルカリホスファターゼ(AP)および西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)のような酵素または酵素基質。
【００４２】
本発明において使用される「固定化(immobilized)」という用語は、抗体が活性を維持したまま結合することができる何らかのサポート(support)のことを指す。好ましくは、当該サポートは、例えばナイロンマトリックスのようなマトリックスの表面;マイクロタイタープレートまたは類似の固いプラスチックのサポート;アガロースまたは磁力ビーズのようなビーズ、であり得る。固定化された抗体は、例えばUS 4,615,985およびそこで引用されている参考文献中に記述されている。
【００４３】
標識化または固定化された抗体を使用することの利点は、それらは非標識の抗体と比較して、標準的な設備でより容易に使用することができ、また、標準的な分離技術に適合させることも楽であるということである。
【００４４】
本発明によれば、工程(a)で使用される抗体の少なくとも一つが固定化されているのが好ましい。
【００４５】
好ましくは、本発明の方法においては、工程(a)で使用される抗体の少なくとも一つが、ナイロンマトリックス上に固定化されている。
【００４６】
抗体をナイロンマトリックスに固定化することの利点は、ナイロンマトリックスへの固定化は非常に効率的であり、また、融通が利き、容易で、迅速で、シンプルで、安価な、カラムに基づく細胞分離法が可能になるということである。ナイロンマトリックスへの固定化は、例えばUS 4,615,985に記述されている。
【００４７】
本発明のさらに好ましい方法においては、工程(a)で使用される抗体が均一に標識化され得る。
【００４８】
抗体を均一に標識化することの利点は、当該抗体を全て一度に検出できるということである。
【００４９】
好ましくは、本発明の方法においては、放射性同位体、蛍光または発光マーカー、抗体または抗体フラグメント、アフィニティー標識、および酵素または酵素基質を含む群から標識が選択され得る。
【００５０】
本発明の好ましい方法においては、抗CD25抗体をビオチン、フルオレセイン(FITC)、またはフィコエリトリン(PE)で標識化できる。
【００５１】
本発明の好ましい方法においては、抗CD127抗体をビオチン、フルオレセイン(FITC)、またはフィコエリトリン(PE)で標識化できる。
【００５２】
本発明の好ましい方法においては、抗CD49d抗体をビオチン、フルオレセイン(FITC)、またはフィコエリトリン(PE)で標識化できる。
【００５３】
本発明の好ましい方法においては、工程(b)を、遠心分離、特に、密度勾配遠心分離、細胞水簸、磁力分離、蛍光励起細胞ソーティング、免疫学的分離、吸着、補体溶解またはフローサイトメトリーを使用して行うことができる。
【００５４】
本発明の好ましい方法においては、工程(b)を、磁力細胞分離、蛍光励起細胞ソーティング、またはカラムに基づく免疫学的分離を使用して行うことができる。
【００５５】
「カラムに基づく免疫学的分離」という用語は、細胞を選別する一つのやり方を指し、そこでは、本発明による方法で使用される抗体をクロマトグラフィーカラムの樹脂に付着させ、その特異的な抗体に認識される抗原を有する細胞を結合させるために使用することができる。
【００５６】
本発明の好ましい方法においては、工程(a)において、抗CD45RO抗体を追加的な抗体として使用することができ、そこで分離されたFoxp3+ Treg細胞はCD45RA+ T細胞である。
【００５７】
工程(a)において、追加的な抗体として抗CD45RO抗体を使用することの利点は、Foxp3+ Treg細胞の特定のサブセット、すなわちCD45RA+ T細胞を、高度に効率的な形で非常に高い純度において分離することができるということである。
【００５８】
本発明の好ましい方法においては、工程(a)において、抗CD45RA抗体を追加的な抗体として使用することができ、そこで分離されたFoxp3+ Treg細胞はCD45RO+ T細胞である。
【００５９】
工程(a)において、追加的な抗体として抗CD45RA抗体を使用することの利点は、Foxp3+ Treg細胞の特定のサブセット、すなわちCD45RO+ T細胞を、高度に効率的な形で非常に高い純度において分離することができるということである。
【００６０】
本発明の第二の態様においては、抗CD49d抗体および抗CD25抗体、または、抗CD49d抗体および抗CD127抗体を含む、ヒトのFoxp3+ Treg細胞を分離するためのキットにより、本発明の課題の一つが解決される。
【００６１】
さらに、本発明によるキットは、抗CD49d抗体、抗CD25抗体、および抗CD127抗体を含み得る。
【００６２】
好ましくは、本発明によるキットは、抗CD8抗体、抗CD10抗体、抗CD14抗体、抗CD15抗体、抗CD16抗体、抗CD19抗体、抗CD35抗体、抗CD36抗体、抗CD49b抗体、抗CD56抗体、抗CD66a抗体、抗CD66b抗体、抗CD66c抗体、抗CD66d抗体、抗CD89抗体、抗CDw92抗体、抗CD93抗体、抗CD111抗体、抗CD112抗体、抗CD123抗体、抗CD141抗体、抗CD156a抗体、抗CD170抗体、抗TCRg/d抗体、抗CD235a抗体、抗CD282抗体、および抗CDw329抗体、抗β7-インテグリン抗体またはその混合物を含む群から選択される一つまたは複数の抗体を追加的に含み得る。
【００６３】
さらに、本発明のキットは、固定化された抗体を少なくとも一つ含み得る。
【００６４】
さらに、本発明によるキットは、標識化された抗体を少なくとも一つ含み得る。
【００６５】
好ましくは、本発明のキットは、均一に標識化された抗体を含み得る。
【００６６】
好ましくは、本発明によるキットは、標識化された抗体を含み得、当該標識は、放射性同位体、蛍光または発光マーカー、抗体または抗体フラグメント、アフィニティー標識、および酵素または酵素基質を含む群から選択される得る。
【００６７】
好ましくは、当該キットは抗CD127抗体、抗CD25抗体、および/または抗CD49d抗体を含み得、その抗体はビオチン、FITC、またはPEで標識化し得る。
【００６８】
本発明の第三の態様においては、(i)抗CD49d抗体、(ii)抗CD25抗体および/もしくは抗CD127抗体と組み合わされた抗CD49d抗体、または(iii)ヒトのFoxp3+ Treg細胞を分離するための本発明のキット、の使用により、本発明の課題の一つが解決される。特に、抗CD49d抗体;抗CD25抗体および/もしくは抗CD127抗体と組み合わされた抗CD49d抗体;または本発明によるキットは、(i)末梢血単核球(PBMCs)、(ii)リンパ球を含有する液、または(iii)リンパ球を含有する組織、を含有するサンプルからヒトのFoxp3+ Treg細胞を分離するために使用することができる。
【００６９】
好ましくは、本発明による当該使用は、遠心分離、細胞水簸、磁力分離、蛍光励起細胞ソーティング、免疫学的分離、吸着、補体溶解またはフローサイトメトリーを通じて、非制御性CD4+ T細胞を含むCD49d+ PBMCsをFoxp3+ Treg細胞から取り除くことによりヒトFoxp3+ Treg細胞の分離を達成することができる、という点で特徴づけられ得る。
【００７０】
さらに、本発明による当該使用は、抗CD8抗体、抗CD10抗体、抗CD14抗体、抗CD15抗体、抗CD16抗体、抗CD19抗体、抗CD35抗体、抗CD36抗体、抗CD49b抗体、抗CD56抗体、抗CD66a抗体、抗CD66b抗体、抗CD66c抗体、抗CD66d抗体、抗CD89抗体、抗CDw92抗体、抗CD93抗体、抗CD111抗体、抗CD112抗体、抗CD123抗体、抗CD141抗体、抗CD156a抗体、抗CD170抗体、抗TCRg/d抗体、抗CD235a抗体、抗CD282抗体、および抗CDw329抗体、抗β7-インテグリン抗体またはその混合物を含む群から選択される少なくとも一つの抗体を使用して、サンプルからの非CD4+ T細胞の枯渇化を行うことができる、という点で特徴づけられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】CD127およびCD49dの、Foxp3発現に対する逆相関。ヒトPBMCを、CD4、CD25、CD127、CD49dおよびFoxp3について染色し、FACSで解析した。a. CD4およびCD25についての、ヒトPBMCの二重染色。全PBMC中のCD4+ 細胞のパーセンテージが示されている。b. CD25、CD127およびCD49dの、Foxp3発現に対する相関。ヒトPBMCを、CD4、CD25、CD127、CD49dおよびFoxp3について染色し、FACSで解析した。図1aにおいてゲートをかけた(gated) CD4+ 細胞についての、CD25(左パネル)、CD127(中央パネル)およびCD49dと、Foxp3との同時染色を示す。数字は、4分区画の各々における細胞のパーセンテージを示す。
【００７２】
【図２】CD49dはFoxp3-CD127- 細胞からFoxp3+ Treg細胞を区別する。a. CD4+ T細胞中の、CD127/CD49dについての各サブセットにおけるFoxp3発現。ヒトPBMCを、CD4、CD25、CD127、CD49dおよびFoxp3について染色し、CD4+ 細胞にゲートをかけた。上部パネル:CD49dとCD127の同時染色。3つの主だった細胞群のゲートおよびパーセンテージを示す。下部パネル:CD127+ 細胞(左パネル)、CD49d-CD127- 細胞(中央パネル)およびCD49d+CD127- 細胞(右パネル)における、CD25とFoxp3の同時染色。パーセンテージは、表示された4分区画におけるCD25+Foxp3+ Treg細胞の数を表す。b. FACSソーティングによる、CD49d-CD127- およびCD49d+CD127- 細胞の分離。市販のMACS枯渇化キットを用いてPBMCから分離された手付かずのCD4+ 細胞を、α-CD49dおよびα-CD127(左パネル)で染色し、FACSによりCD49d-CD127- (中央パネル)およびCD49d+CD127- サブセット(右パネル)にソーティングした。数字は、4分区画の各々における細胞の割合を示す。c. 抑制能力。図3bに示すようなFACSに基づく抑制アッセイにおいて、分離された二つの細胞サブセットによる増殖応答の阻害を測定した。CD4+ 細胞の増殖はα-CD3抗体により誘導され、抑制細胞は1:2の比で加えられた。抑制は「%阻害」として表され、α-CD3で刺激されただけのCD4+ 細胞と比べた場合の分裂細胞の相対的な割合として計算した。
【００７３】
【図３】MACSによる、手付かずのFoxp3+ Treg細胞のCD4+ T細胞からの分離。市販のCD4分離キットを用いたMACSにより分離したヒトPBMCの手付かずのCD4+ 細胞から、第二の工程のMACSにより、CD127/CD49d発現細胞を枯渇させた。a. 枯渇後の細胞のFACS解析。枯渇前(左パネル)のCD4+ 細胞群、および、CD49d/CD127枯渇化の後に残った細胞(右パネル)のFACSプロットを示す。CD49d vs. CD127の染色(上部パネル)およびCD25 vs. Foxp3の染色(下部パネル)についてのデータを示す。パーセンテージは、4分区画の各々における細胞の数について示す。b. 抑制能力。CD49d/CD127+ 細胞が枯渇したCD4+ T細胞を、FACSに基づくインビトロアッセイにおいて抑制細胞(Treg)として使用した。枯渇化により取り除かれたCD4+ エフェクター細胞をCFDAで標識し、レスポンダー細胞として使用した。これらのパネルは、刺激を加えないCD4+ 細胞(上部パネル)、α-CD3とともにインキュベーションした後のCD4+ 細胞(中央パネル)、または、手付かずTreg細胞が1:1の比で存在している中でα-CD3とともにインキュベーションした後のCD4+ 細胞(下部パネル)の、CFDA染色を示す。数字は、分裂しているCD4エフェクター細胞のパーセンテージを表す。
【００７４】
【図４】手付かずのTreg細胞のPBMCからの分離。Treg細胞をMACS枯渇化により全PBMCから分離した。a. α-CD49d/α-CD127のみによる枯渇。純化した(purified) CD4+ 細胞の代わりに全PBMCを使用したことを除いては図3の記述と同じようにして、α-CD49dおよびα-CD127を用いてヒトPBMCの枯渇処理を行った。b. α-CD49d/α-CD127をCD4+ T細胞分離キットと組み合せて用いた単一工程枯渇処理。純度を向上させるため、市販のCD4+ T細胞分離キットの抗体ミックスにα-CD127およびα-CD49dを加えた。枯渇処理前のPBMC(左パネル群)、および、枯渇処理後に得られた、ビーズに付かなかった(bead-negative)分画(右パネル群)についての、CD49d vs. CD127、およびCD25 vs. Foxp3の染色を示す。数字は、4分区画の各々における細胞のパーセンテージを示す。
【００７５】
【図５】インビトロのリンパ球混合培養反応(MLR)の阻害、およびインビボのGvHDの防止。図4に記述されたように、単一工程CD127/CD49d枯渇化によりヒトPBMCから手付かずのTreg細胞を分離した。a. MLRの阻害。3人の異なるドナーについてのMLR反応を示す。それぞれの反応において、105個のPBMCを、同じ数の、ハプロタイプ不一致(haplotype-mismatched)の別のドナーの照射済みPBMC(アロジェン(allogen))と共にインキュベートした。当該反応を、単一工程MACS枯渇処理で分離した2.5 x 104の自己(autologous) Treg細胞を加えることによって、阻害した(アロジェン & Treg)。増殖は、3H-チミジンの取り込みにより測定し、「分あたりのカウント数」(cpm)で表した。b. 急性GvHDの防止。30 x 106のCD25枯渇ヒトPBMC (CD25- PBMC)を、Rag2 -/- γc -/- マウスに養子移植することにより、急性の異種間GvHD(xeno-GvHD)を誘導した。病気の進行は、体重減少を測定することにより記録した(左パネル)。一つのグループはCD25- PBMCのみを受け(黒丸)、もう一つのグループはCD25- PBMCと共に0.5 x 106の手付かずの自己Treg細胞を同時移植により受けた(白丸)。6匹のマウスのグループを使用した。実験開始時との比較により相対的な平均体重を決定し、「パーセント体重減少」として表す。臨床的な徴候(毛並みの乱れ(ruffled fur)、姿勢の屈曲(hunched posture)および動作の欠如(immobility))および死亡の頻度を右パネルに示す。
【００７６】
【図６】α-CD49d枯渇によるCD25+ Treg細胞の純化。a. サイトカイン分泌についてのCD49d発現細胞の分配(Segregation)。サイトカイン分泌CD4+ 細胞はCD49dを発現する。PMA/イオノマイシンを用いてCD4+ T細胞をインビトロで刺激し、6時間後にFACSにより解析した。全CD4+ 細胞(上部パネル)およびFoxp3+CD4+ 細胞(下部パネル)の、CD49d vs. IL-17 (左上パネル)またはCD49d vs. IFN-γ(右上パネル)についての染色を示す。全CD4+ 細胞におけるパーセンテージは、各4分区画あたりの細胞数を表す。Foxp3でゲートをかけたCD4+ 細胞におけるパーセンテージは、CD49d+ もしくはCD49d- 細胞の割合を指し、点線のゲート中のサイトカイン分泌細胞のパーセンテージはCD49d+ の細胞数に対するものである。b. CD49dは、CD25high Treg調製物からTh1様細胞およびTh17様(Th17-like)細胞を除去する。ヒトのTreg細胞はCD25high発現により特徴付けられる。PBMCをα-CD4、α-CD25およびα-CD49dで染色し、FACSにより、CD4+ 細胞をCD49d+CD25highおよびCD49d-CD25highのサブセットにソーティングした。ソーティングされた細胞サブセットを、PMA/イオノマイシンで活性化し、 IFN-γおよびIL-17について細胞内染色した。パーセンテージは、示された4分区画における細胞数について表す。
【００７７】
【図７】ヒトCD4+ T細胞からのCD49d+ 細胞の枯渇によるFoxp3+ Tregの純化(Enrichment)。ヒトのCD4+ 細胞をCD49dについて枯渇処理し、CD25およびFoxp3の発現についてFACSで解析した。左パネル:全CD4+ 細胞、右パネル:CD49d枯渇後CD4+ 細胞。CD25 vs. Foxp3(上列)およびFoxp3 vs. CD49d(下列)についての染色を示す。数字は、各ゲート中の細胞のパーセンテージを示す。
【００７８】
【図８】CD127- Treg調製物からのサイトカイン産生性エフェクター細胞の除去。サイトカイン産生を測定するために、純化されたCD4+ T細胞サブセットをソーティング後にPMA/イオノマイシンで刺激したことを除いては、図2aと同様にして、実験を行った。細胞をα-IFN-γおよびα-IL-17で細胞内染色したことを除いては、図2aと同様にして、FACS解析を行った。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
本発明は、これより下、添付の図面に関する以下の実施例によってさらに説明されるが、それらのみに限定されるわけではない。本発明の目的のために、ここで引用される全ての引用文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、ボランティアから得られた生物学的試料についてなされた、科学的な実験に基づくものであることを付記する。本発明で開示される研究のために当該試料を使用することについては、ボランティアの同意が得られている。
【実施例】
【００８０】
実施例において使用される特定の方法および材料:
【００８１】
抗体および試薬
CD4 (RPA-T4)、CD25 (MA251)、およびCD127 (hIL-7R-M21)に特異的な抗体はBDバイオサイエンスから購入した。抗IFN-γはミルテニーバイオテク(45-15)から購入した。抗CD49d (BU49)はイミュノツールから得た。α-CD3 (UCHT-1)はMDCにおいて作製された。αFoxp3 (PCH101)およびα-IL-17 (eBio64CAP17)はeバイオサイエンスから購入し、細胞内染色は製造会社が推奨するやり方に従って行った。CFDAはモレキュラープローブズから、3H-チミジンはGEヘルスケアから得た。
【００８２】
フローサイトメトリーおよび細胞調製
ヒトPBMCは健康なボランティアから得た。単核細胞はフィコール勾配遠心分離(GEヘルスケア)により分離した。FACS解析は、FACSCaliburまたはLSR II装置(BDバイオサイエンス)において行った。データは、FACSDivaソフトウェア(BDバイオサイエンス)、CellQuest(BDバイオサイエンス)、またはFlowjoソフトウェア(ツリースター)により解析した。
【００８３】
サイトカイン検出
PMAおよびイオノマイシンで細胞を4〜6時間刺激し、最後の3〜4時間にはブレフェルジンAを添加した。サイトカイン分泌は、MACSまたはFACSソーティングされたCD4+ T細胞サブセットを用いたα-IL-17およびα-IFN-γ細胞内染色により測定した。細胞は、採取してすぐに使用したか、または、50U/mlのIL-2で補完されたRPMI中で一晩維持した後に刺激した。
【００８４】
Treg分離
磁力細胞ソーティングはMACSシステム(ミルテニーバイオテク)を使用して行い、FACSソーティングはFACSAria装置(BDバイオサイエンス)を用いて行った。A) CD49d枯渇化によるTreg純化:MACSソーティング(hCD4分離キットII/ミルテニーバイオテク)された細胞を、4〜8℃において10分間、α-CD49d-FITCとともにインキュベートした。4〜8℃で10分間、MACSバッファーで洗浄した後、107 細胞あたり10 μl のα-FITC-マグネットビーズ(ミルテニーバイオテク)とともに、4〜8℃で15分間、細胞をインキュベートした。MACSバッファーで洗浄した後、LD-カラム(ミルテニーバイオテク)を使用して細胞を分離した。 B) 手付かず(Untouched)の2工程MACSの手順:hCD4分離キットII(ミルテニーバイオテク)を使用して、手付かずのヒトCD4+ T細胞を最初にPBMCから分離した。第二の工程において、当該細胞をα-CD49d-FITCおよびα-CD127-ビオチンとともに4〜8℃で10分間、インキュベートした。4〜8℃で10分間、MACSバッファーで洗浄した後、107細胞あたり10 μl のα-FITC- および20 μl のα-ビオチン-マグネットビーズ(ミルテニーバイオテク)とともに、4〜8℃で15分間、細胞をインキュベートした。MACSバッファーで洗浄した後、LD-カラム(ミルテニーバイオテク)を使用して細胞を分離した。C) 手付かずの単一工程MACSの手順:FITC-標識α-CD49d、ビオチン標識α-CD127、および、ヒトCD4+ T細胞分離キットIIのビオチン標識抗体ミックスとともに、4〜8℃で10分間、ヒトPBMCをインキュベートした。MACSバッファーで洗浄した後、107細胞あたり10μl のα-FITC- および25 μlのα-ビオチン マグネットビーズとともに、4〜8℃で15分間、細胞をインキュベートした。MACSバッファーで洗浄した後、LD-カラムを使用して細胞を分離した。D) 手付かずの単一工程MACSの手順(CD49dおよびCD127枯渇化のみ):FITC-標識α-CD49d、ビオチン標識α-CD127とともに4〜8℃で10分間、ヒトPBMCをインキュベートした。MACSバッファーで洗浄した後、107細胞あたり15 μl のα-FITC- および20 μl のα-ビオチン マグネットビーズとともに、4〜8℃で15分間、細胞をインキュベートした。MACSバッファーで洗浄した後、LD-カラムを使用して細胞を分離した。E) FACSソーティング:ヒトCD4+ T細胞分離キットII(ミルテニーバイオテク)を使用して、ヒトPBMCから手付かずのCD4+ T細胞を得た。4〜8℃において10分間、α-CD49d-FITCおよびα-CD127-PEで細胞を染色した。MACSバッファーで洗浄した後、細胞をMACSバッファーに再懸濁し、細胞ソーターでソーティングした。CD49d-CD127- 細胞のソーティングゲートを使って、手付かずのTreg細胞を得た。CD25+ 細胞のFACSソーティングに関しては、α-CD49d、α-CD4およびα-CD25で、4〜8℃において10分間、ヒトPBMCを染色した。MACSバッファーで洗浄した後、細胞をMACSバッファーに再懸濁し、細胞ソーターで、CD4+CD25highCD49d+ またはCD4+CD25highCD49d- 細胞のソーティングゲートを使ってソーティングした。死んだ細胞はヨウ化プロピジウム(シグマ)により排除した。
【００８５】
CFDAに基づく増殖アッセイ
以前に記述されたやり方で(Kleinewietfeld, M. et al. Blood 105, 2877-86 (2005))、CD4+ エフェクター細胞を0.5 μMのカルボキシフルオセイン二酢酸(CFDA;モレキュラープローブズ)で標識した。CD4+ エフェクターT細胞 (25,000 細胞/ウェル)を、照射済みCD4枯渇PBMC(50,000 細胞/ウェル; 3000ラド)および10 μg/mlの抗CD3 (UCHT-1)とともに、96ウェルV底プレート(コースター)中で3〜4日間、インキュベートした。T細胞抑制においては、示された比率でTreg細胞を加えた。CD4+ T細胞の増殖はFACSで解析した。
【００８６】
リンパ球混合培養反応(MLR)
ヒトPBMCを用いたMLRは、以前の記述の通りに行った(Ebert, L. M. & McColl, S. R. J Immunol 166, 4870-8 (2001))。ヒトPBMC (100,000細胞/ウェル)を、照射済み(3,000ラド)同種異系PBMC(100,000細胞/ウェル)とともに、RPMI/10% FCS (インビトロジェン)中で5日間、インキュベートした。増殖抑制においては、分離された自己Treg細胞を、示された比率で加えた。増殖は、10〜15時間さらに培養する間の3H-チミジンの取り込み(1 μCi/ウェル)によりモニターし、ベータ・プレートリーダー(ウォーラック)を使用して測定した。
【００８７】
異種間(Xenogeneic)の移植片対宿主病(x-GvHD)
以前記述されたやり方で、Rag2-/- γc-/- マウス(タコニックから購入)において急性型のGvHDを誘導した。手短に述べると、α-CD25マイクロビーズ(ミルテニーバイオテク)とともにLDカラム(ミルテニーバイオテク)を使用して、PBMCを枯渇処理した。Treg細胞は、健康なドナーのPBMCから、単一工程の手順を用いて得た。移植の一日前、0.2 mlのクロドロネート含有リポソームをマウスに静脈注入した。細胞の移植の4時間前、マウスは照射された(350ラド)。30 x 106のCD25枯渇PBMCを、PBS/0.1%ヒト血清アルブミン中、単独で、または0.5 x 106 のTreg細胞と混合して、静脈注射した。当該マウスの体重および臨床的症状を実験期間全体に渡って調べた;当該病気の臨床的な徴候は、毛並みの乱れ、姿勢の屈曲、および動作の障害であった。
【実施例１】
【００８８】
CD127およびCD49dはFoxp3と逆相関する。
ドナーにもよるが、ヒトPBMCの約30-60%がCD4+ T細胞であり(図1a)、これらの内、おおよそ3-10%がTreg細胞である。ほとんどのヒトTreg細胞はIL-2受容体α鎖 CD25を高レベルで発現するが(CD25high)、マウスの場合と比較して、このマーカーはTreg細胞群を非制御性CD4+ 細胞からそれほど明確に分離しない。また、エフェクターおよびメモリーCD4+ 細胞の中には、より低量のCD25を発現するものもあり(CD25low)、よってそれらの細胞群はCD25high Tregサブセットと部分的にオーバーラップする(Baecher-Allan, C., Brown, J. A., Freeman, G. J. & Hafler, D. A., J Immunol 167, 1245-53 (2001))。従って、このマーカーに基づくTreg分離は、これらの細胞が混入するという根本的な危険性を伴う。Treg細胞におけるCD25の発現は、他のいくつかの遺伝子と同じく、Foxp3によって直接誘導される(Hori, S., Nomura, T. & Sakaguchi, S., Science 299, 1057-61 (2003))。従って、Foxp3の対比染色はCD25high細胞においてほぼ直線的な相関を示し、Foxp3を最も強く発現する細胞がCD25についても最も強く染色する(図1b、左パネル)。
【００８９】
CD25とは対照的に、IL-7受容体のα鎖(CD127)はFoxp3発現と逆相関する(Liu, W. et al., J Exp Med 203, 1701-11 (2006); Seddiki, N. et al., J Exp Med 203, 1693-700 (2006)) (図1b、中央パネル)。ここにおいても相関はほぼ直線的であるが、Foxp3の発現レベルが最も高い細胞においてCD127の発現レベルが最も低いこととなる。しかしながら、これによる細胞の分配は完全ではない。図1b(中央パネル)に示される例においては、CD127- 細胞の約2/3がFoxp3- であった。従って、Treg細胞を評価することにおいては、CD127はCD25と組み合わせて使うのが常である(Liu, W. et al., J Exp Med 203, 1701-11 (2006); Seddiki, N. et al., J Exp Med 203, 1693-700 (2006))。
【００９０】
我々独自の研究により、ほとんどのTreg細胞に不在である第2の表面マーカーが見出された。CD49dは、インテグリンVLA-4 (α4β1)のα鎖である。ここにおいても、分配は不完全である(図1b、右パネル)。しかし、CD127で見られるような、Foxp3に対する直線的な逆相関は存在しないようである。Foxp3+ 細胞においては、Foxp3の発現レベルとは無関係に、CD49dが欠如していることが、二重染色により明らかになった。
【実施例２】
【００９１】
CD49dはFoxp3- CD127- 細胞からFoxp3+ Treg細胞を区別する。
CD127およびCD49dはどちらもTreg細胞についての分配が不完全であったが、これらのマーカーを組み合わせて使えば、お互いを補完することができる。α-CD127およびα-CD49dを用いた二重染色により、CD4+ 細胞群を3つの主要な細胞群に分割することができた:すなわちCD127+、CD49d+CD127-、およびCD49d-CD127- 細胞である(図2a、上部パネル)。α-CD25およびα-Foxp3を用いた染色により、CD127+ 細胞の大多数は非制御性CD25-Foxp3- 細胞であることが確認された(図2a、左下パネル)。より重要なことに、CD127- サブセットは、CD49dにより、ほとんど同等の大きさを持つ2つのさらなる細胞群に分割された。CD49d+CD127- 細胞は、大部分がFoxp3-であり、CD25+Foxp3+ であったのは18%にも満たなかった(図2a、右下パネル)。それに対し、CD49d-CD127- 細胞群は、ほとんど完全にFoxp3+ 細胞から成っていた。83%を超える細胞が、Foxp3を高いレベルで発現するCD25+Foxp3+ Tregであった(図2a、下中央パネル)
【００９２】
CD49d-CD127- 表現型が抑制性能力と相関することを確認するために、FACSソーティングによりCD49d+CD127- およびCD49d-CD127- 細胞をCD4+ PBMCから分離した(図2b)。CD49d+CD127- サブセットにおいてはほとんど抑制が観察されなかった(図2c)。それに対し、CD49dおよびCD127の欠如だけに基づいてソーティングしたCD4+ 細胞は、活性化されたCD25-CD4+ 細胞の増殖を効果的に防止した。従って、CD49dを使用することにより、非抑制性のCD127- 細胞を機能的なFoxp3+ Treg細胞から区別することができる。
【実施例３】
【００９３】
MACSによる、手付かずのFoxp3+ Treg細胞の純化。
FACSソーティング実験の結果は、α-CD127およびα-CD49dを組み合わせてMACSにより CD4+ T細胞を枯渇処理すれば、手付かずのTregの純粋な細胞群が得られるはずだということを示した。このアプローチの適用性を検証するために、あらかじめヒトPBMCから分離した手付かずのCD4+ 細胞をα-CD127およびα-CD49d で標識し、通常のマグネットビーズ標識抗体を用いたMACSにより枯渇処理した(図3)。当該枯渇処理により、>95%の純度のCD49d-CD127- 細胞群が得られたことが、FACS解析で明らかになった(図3a上部パネル)。CD25およびFoxp3の染色により、これらの細胞のうち92%を超えるものがCD25+Foxp+ 細胞であり、別の2%がCD25-Foxp3+ であることが確認された(図3a、下部パネル)。分離されたTreg細胞の機能性を確認するため、FACSに基づくインビトロ抑制アッセイにおいて当該細胞を試験した(図3b)。CD4+ エフェクター細胞は増殖をモニターするためにCFDAで標識化された。いかなる刺激も与えない場合には細胞は分裂しなかったが(図3b、上部パネル)、α-CD3による刺激により、CFDA蛍光の減弱で示される増殖応答が、約45%の細胞において引き起こされた(図3b、中央パネル)。MACSで純化したTreg細胞を加えると、増殖が14%までに抑えられ、細胞分裂は一度の複製サイクルの後に既にほとんど止まっていた(図3b、下部パネル)。従って、α-CD127およびα-CD49dを用いたMACS枯渇処理により分離された手付かずのTreg細胞は、自己CD4+ エフェクター細胞をインビトロで抑制する能力を完全に有している。
【実施例４】
【００９４】
単一工程のMACSによる、手付かずのFoxp3+ Treg細胞のPBMCからの純化
CD49dの選択性は、あらかじめ純化されたCD4+ 細胞ではなく全PBMCを使用する場合において、特に際立つ(図4)。PBMCのほとんど半分において不在であるCD127とは対照的に、CD49dは非CD4+ T細胞の大多数において発現されている(図4左パネル)。全PBMCの中で、40-50%がCD49d+CD127-であり、CD49d-CD127- 細胞は約2-4%しか残らなかった。従って、CD49d+/CD127+ 細胞を直接PBMCから枯渇させることだけでも既に、手付かずのFoxp3+ 細胞を>75%の純度で得るのに十分であった(11.8% CD25-Foxp3+、64.3% CD25+Foxp3+;図4a)。市販のCD4+ T細胞分離キットの抗体ミックスにα-CD49d/α-CD127を加えた場合には、純度をさらに上げることができた(図4b)。ここでは、枯渇処理後のPBMC分画の>90 %がFoxp3+ 細胞であることが(76.2% CD25+Foxp3+、14.1% CD25-Foxp3+)、FACS解析で明らかになった。従って、単一工程PBMC枯渇処理により得られた細胞の純度は、事前に分離されたCD4+ T細胞を用いた場合の純度に匹敵していた(図3を比較のこと)。
【実施例５】
【００９５】
自己/異種間反応の、インビトロおよびインビボの抑制。
PBMCの直接的な枯渇処理により分離されたTreg細胞の機能性および生存性(viability)を確認するために、リンパ球混合培養反応(MLR)における抑制能力を試験した。MLRはインビトロでGvHDと対応するものである。それは、「外来の(foreign)」MHC分子による、T細胞の同種異系間活性化(allogeneic activation)に基づくものであり、異なる2ドナーのPBMCを混ぜた後に明白となるものである。Treg細胞が同種異系反応性の応答を制御することができるかを調べるために、照射しない自己PBMCとハプロタイプ不一致ドナーの照射済みPBMCとの混合の中に当該Treg細胞を加えた(図5a)。実施例4(図4b)に従ってPBMCから純化したTreg細胞は、同種異系応答を強力に抑制することが、これらの実験において明らかとなった。異なる3人のドナーについて示されているように、Treg細胞の存在により、自己PBMCの増殖が強力に抑制された。従って、手付かずのPBMC由来Foxp3+ 細胞は、インビトロで同種異系免疫応答を制御することができる、完全に機能的なTreg細胞である。
【００９６】
MLR実験は、分離されたTreg細胞のインビトロの抑制性能力を、明確に実証した。しかしながら、将来的に治療に応用することを考えると、手付かずのTreg細胞が、破壊的な(destructive)免疫反応をインビボでも抑制することができることを実証することが重要である。この目的のために、CD25枯渇ヒトPBMCをRag2 -/- γc -/- マウスに移植することに基づいた(Mutis, T. et al., Clin Cancer Res 12, 5520-5 (2006))、急性GvHDインビボモデルを使用した。移植する細胞群からTreg細胞を除去すると、とりわけ激しい様態の疾患が擬似され、それはしばしば当該動物の死につながる。PBMCからTreg細胞を枯渇させる処理は、α-CD25マイクロビーズを使ったMACSにより行い、それとは別に、手付かずのTreg細胞を、α-CD127/α-CD49dを市販のCD4+ 分離キットと組み合わせて使用することにより、単一工程で分離した(実施例4、図4bに従った)。30 x 106のCD25枯渇PBMCを受けたマウスは全て、実験の初めの数日内で、程度に多少の違いはあるものの明白な体重減少を示した(図5b)。6匹中4匹のマウスが臨床的な症状を発症し、これらの内2匹は実験期間中に死亡した。自己Treg細胞を同時移植した場合には、以前論文で発表されたのと同じように、PBMC誘導GvHDの重症度が軽減した(Mutis, T. et al., Clin Cancer Res 12, 5520-5 (2006))。この場合、0.5 x 106の手付かずのTreg細胞が、体重減少を抑止するのに十分であり、処置グループのマウスは全て、実験期間全体に渡って症状を発症しないままであった。従って、CD127/CD49d枯渇により分離した手付かずのTreg細胞は、破壊的な免疫反応をインビトロおよびインビボの両方において制御できる、強力な抑制性細胞である。
【実施例６】
【００９７】
CD25high Treg調製物からの混入エフェクター細胞の分離。
CD25はTreg細胞において大量に発現されている(CD25high)。このマーカーはしかしながら、ヒトにおいては、エフェクターおよびメモリーCD4+ T細胞を含む炎症促進性細胞(Baecher-Allan et al., J Immunol. 167:1245-53 (2001))、および、一時的にFoxp3を発現する活性型 CD4+ T細胞(Allan et al., Int Immunol. 19:345-54(2007))によっても、少量発現される。Treg細胞とは対照的に、これらのエフェクター細胞はIFN-γやIL-17のような炎症促進性サイトカインを分泌することができる。図6aに示されるように、CD49dの発現はサイトカインの分泌能力とともに分配される。このことは、全CD4+ 細胞、およびFoxp3+ 細胞のサブセットの両方について当てはまる。よって、CD25分離に基づくTreg 調製物から、混入しているサイトカイン分泌性エフェクター細胞を取り除くために、CD49dを使用することができる。FACSソーティング(図6b)の場合は、CD49d-CD25highCD4+ サブセットにゲートをかけることによって純粋なTreg細胞を得ることができ、MACSソーティングについては、細胞をまずα-CD49dで枯渇処理した後に、α-CD25を用いたポジティブ分離に関するソーティングの手順を行う。
【実施例７】
【００９８】
CD49dの枯渇だけで、Treg含有率が向上した(enriched) CD4細胞調製物が得られる。
CD49dは、大部分のFoxp3+ Treg細胞には不在なため、これらの細胞の含有率は、全CD4+ T細胞からCD49d+ 細胞を枯渇させることにより有意に向上する。MACSによりヒトCD4+ T細胞から全てのCD49d+ 細胞を枯渇させ、Foxp3発現を解析して全CD4+ T細胞の場合と比較した。図7に示されるように、ヒトCD4+ T細胞からCD49d+ 細胞を枯渇させるだけで、Foxp3+ Tregの含有率を既に4-5倍も増加させることができる。さらに重要なことに、サイトカイン分泌はこのマーカーとともに分配されるため(図6a)、サイトカイン産生性細胞のほとんどは当該サブセットから除去されている。
【実施例８】
【００９９】
CD49d+ 細胞の枯渇化は、CD127- Treg調製物に混入するサイトカイン産生性CD4+ エフェクター細胞を除去する。
CD127との組合せにより、CD49dは手付かずのTreg細胞の分離を可能にする(図2)。さらに、CD49dがサイトカイン産生に伴って分配するということにより、Foxp3- 細胞だけでなく、Th1様細胞やTh17様細胞のCD127- Treg調製物への混入も取り除くことができる。図8に示されるように、CD49dおよびCD127の発現に基づいてソーティングしたCD4+ 細胞を活性化させる実験により、IFN-gまたはIL-17を産生する細胞はCD49d-CD127- サブセット中には不在であるがCD49d+CD127- サブセット中には存在することが明白である。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明による方法は、次のような利点を有する:
【０１０１】
1)安全性。
ヒトの治療に使用される試薬に対する規制は大変厳しい。このことは、治療中に投与される化合物(compound)について特に当てはまる。ポジティブソーティングにより得られる細胞は、その表面に外来の抗体を有している。抗体固有の危険性は判定するのが難しく、また最近起こったスーパーアゴニストα-CD28の劇的な失敗例により実証されたように、「ヒト化(humanization)」も必ずしも有害作用を防止しない(Suntharalingam, G. et al., N Engl J Med 355, 1018-28 (2006); Sharpe, A. H. & Abbas, A. K., N Engl J Med 355, 973-5 (2006))。枯渇用抗体のみを用いて純化された手付かずのTreg細胞を使用すれば、この危険性は避けられる。さらに、CD49dは、危険性を秘めたサイトカイン分泌性エフェクターT細胞上には存在するが、Foxp3+ Treg細胞上には不在である。よって、従来の方法により得られたTreg細胞についても、CD49d+ 細胞を除去することにより安全性を向上させることができる。
【０１０２】
2)細胞の生存性および機能状態。
ポジティブソーティングされた細胞と比べて手付かずの細胞が有するもう一つの利点は、インビボにおける生存性である。抗体が結合した細胞は枯渇してしまう傾向がある。細胞表面上における抗体は補体と結合し得るし、または抗体のサブタイプによっては、NK細胞もしくはマクロファージの表面のFc受容体に結合し得る。この相互作用は、補体媒介の溶解による細胞死、または「抗体依存性細胞傷害」(ADCC)という結果になることがしばしばである。抗体でコートされたビーズの結合も、より大きな細胞塊の形成をもたらし、レシピエントの非特異的な取り込み機構により除去され得る。結果として、移植された細胞のかなりの部分が、有益な効果を発揮できる前に除去されてしまうことになり得る。さらに、純化処理中に細胞表面受容体に抗体が結合することは、機能状態をも変化させ得る。Treg細胞のポジティブソーティングにおいて標的となる分子はCD25である。IL-2受容体のα鎖として、CD25はTreg細胞の生存および機能に不可欠である。それをブロックすることは増殖および抑制性機能の阻害になり得るし(Thornton, A. M., Donovan, E. E., Piccirillo, C. A. & Shevach, E. M., J Immunol 172, 6519-23 (2004); Fontenot, J. D., Rasmussen, J. P., Gavin, M. A. & Rudensky, A. Y., Nat Immunol 6, 1142-51 (2005); Kohm, A. P. et al., J Immunol 176, 3301-5 (2006); McNeill, A., Spittle, E. & Backstrom, B. T., Scand J Immunol 65, 63-9 (2007))、またその一方で、抗体によるIL-2受容体のクロスリンク化は早まった(premature)活性化を引き起こすことにもなり得るが(Barnard, A. L., Igakura, T., Tanaka, Y., Taylor, G. P. & Bangham, C. R., Blood 106, 988-95 (2005); von Bonin, A., Huhn, J. & Fleischer, B., Immunol Rev 161, 43-53 (1998))、これらの潜在的な合併症は手付かずのTreg細胞を使用すれば簡単に回避できる。
【０１０３】
3)時間およびコスト。
標準的な方法と比較して、当該新規のアプローチは費用効率が高く迅速である。CD49d/CD127は全ての一般的な分離方法に適用できる。例えば、当該方法は、単一のMACSカラムのみを使って行うことができる。従って、分離は高価な設備を必要とせず、MACSに基づく従来の方法よりも迅速で簡便である。
【０１０４】
4)純度およびGMP適合性。
フローサイトメトリーに基づく細胞ソーターは、現在のところ、「医薬品適正製造基準」(GMP)に認可されていない。臨床試験のためには、ドナー細胞の分離はマグネットビーズ技術によって行わなければならない。しかし、GMP条件下でTreg細胞を分離する最初の試みでは、得られた純度の平均は50%を下回っていた(Hoffmann, P. et al., Biol Blood Marrow Transplant 12, 267-74 (2006))。そのMACS純化はCD25+ 細胞のポジティブ選択に基づくものであったため、混入した細胞はほとんどCD4+CD25lowエフェクターおよびメモリー細胞であり、免疫が欠乏した患者に移植するとGvHDを引き起こす危険性を根本的にはらんでいた。当該新規のアプローチは、MACSに基づく方法であるため、GMPに適合する。Treg細胞は有意により高い純度(>70%、>80%、>90%、>95%、または>98%にすら達し得る)で得られ、CD4+ エフェクター細胞の混入を実質的に伴わない。その上、Treg細胞は手付かずの状態で分離され、そのことにより当該手順のGMPへの適合性がさらに改善される。
【０１０５】
従って、本願発明の方法は、ヒトのFoxp3+ Treg細胞を分離するための、シンプルで費用効率の高い一つのやり方を提供する。それに加えて、細胞が「手付かず」の状態であること、高い純度が得られること、およびGMPに適合することにより、当該方法は異なる場面において広く応用可能である。従って、当該新規の方法は、研究開発や診断のために「手付かず」のヒトTreg細胞を得ることに利用することができ、また、免疫療法用の医薬を製造するためにTreg細胞をルーチンで使用することについて新たな視野を切り開く。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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