(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己抗体のための結合試薬として、ＴＳＨ受容体キメラＡ、Ｂ、又はＣを使用する、患者サンプル中の、ＴＳＨ受容体（ＴＳＨ−Ｒ）に対する自己抗体の異なるタイプの判別測定のための方法であって、
前記キメラＡ、Ｂ、又はＣは、それぞれ、促進型自己抗体（キメラＡ）、遮断型自己抗体（キメラＢ）、その両方（キメラＣ）に結合するために十分なＴＳＨ受容体の配列が、自己抗体の個々のタイプの結合に影響しない他の受容体の各対応配列によって置き換えられたＴＳＨ受容体キメラであり、
（ａ）患者サンプルを、一次ＴＳＨ受容体キメラとして、固相に結合した完全なＴＳＨ受容体キメラＡ、Ｂ、又はＣと接触させることにより、自己抗体がその一方の抗原結合断片で前記一次ＴＳＨ受容体キメラに結合し、
（ｂ）二次ＴＳＨ受容体キメラとして、切り詰められた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＴＳＨ受容体キメラＡ、Ｂ、又はＣを添加することにより、前記自己抗体のもう一方の抗原結合断片が前記二次ＴＳＨ受容体キメラに結合し、ここで、前記の切り詰められたＴＳＨ受容体キメラＡ、Ｂ、又はＣは、前記ＴＳＨ受容体キメラＡ、Ｂ、又はＣの細胞外部分のみを含み、そして、その切り詰められたＴＳＨ受容体キメラＡ、Ｂ、又はＣは、そのＮ末端またはＣ末端に検出反応のために酵素または他の標識剤を有し、そして
（ｃ）自己抗体の検出を実施する
ことを特徴とする前記方法。
【請求項２】
前記の他の標識剤が、アクリジン又はルテニウム化合物又はフルオレセイン・イソチオシアネートである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素が、分泌型アルカリ・ホスファターゼ、ホタル若しくはガウシア・ルシフェラーゼ、又はペルオキシダーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記の標識剤が、検出に適した二次抗体で認識される免疫原性ペプチド配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記の一次ＴＳＨ受容体キメラが、そのＣ末端でペプチドと融合しており、前記ペプチドが、固相に結合・固定化される抗体に対するものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の技術分野】
【０００１】
本発明は、高い特異性を有する甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨ受容体）に対する異なる型の自己免疫抗体の検出方法、及びこの方法における結合試薬として利用可能な新規ＴＳＨ受容体キメラに関する。
【発明の背景】
【０００２】
ＴＳＨ受容体（ＴＳＨ−Ｒ）は甲状腺細胞の機能及び増殖において鍵となる役割を果たす。前記受容体はプロテインＧ結合糖タンパク質受容体のサブファミリーの一員であり、またそれは追加として特に黄体形成ホルモン／絨毛性ゴナドトロピン（ＬＨ／ＣＧＲ）及び卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨＲ）の受容体を含む。このサブファミリーの受容体は大きなＮ末端細胞外ドメインを有し、それはリガンド結合にとって必須の意義を持ち、（それにとって）それはシグナル伝達に関与していることが示されている。ＴＳＨＲシグナル伝達は主にアデニル酸シクラーゼの活性化を介してなされ、その結果細胞内ｃＡＭＰレベルの増加がもたらされる。
【０００３】
ＴＳＨ受容体の大きな興味の一部は、それが甲状腺自己免疫疾患の主要な自己抗原としての役割を果たしていることに帰し、この疾患はＴＳＨ受容体に対する自己抗体の出現を伴う。この様な甲状腺自己免疫疾患は特にバセドー氏病を含み、それは甲状腺機能亢進症をもたらす自己免疫疾患であって、最も多発するヒトの自己免疫疾患の一つである。バセドー氏病はアデニル酸シクラーゼの活性化及びその結果もたられるｃＡＭＰの増加により引き起こされる。その結果、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫、及び可能性としての目の変化がもたらされる。また、受容体に対する自己抗体は遮断性を有する可能性があり、それによりアデニル酸シクラーゼ及びｃＡＭＰを阻害する。この場合には甲状腺の機能低下にいたる。促進型及び遮断型の自己抗体が疾患をもつ患者に同時に起きることも同様に可能であり、その場合には促進型抗体部分が通常優勢になる。
【０００４】
この様な自己免疫抗体の検出のためには、これまでかなりの期間バイオアッセイ（生物学的検定法）が使用され、この方法ではｃＡＭＰ増加が測定される。前記測定方法は非常に時間を要する。更に、バイオアッセイは、擬陽性の結果を生じる可能性があるので、信頼性に欠ける。前記の記載の範囲において、前記の型の測定方法は、ＴＳＨ受容体に対する自己免疫抗体のｉｎ‐ｖｉｔｒｏ決定方法から、型を判別するためのバイオアッセイであると称することが可能であろう。市販の自己免疫抗体のｉｎ‐ｖｉｔｒｏ測定方法では、ブタ甲状腺膜由来のＴＳＨ受容体抽出物が用いられている（第一世代ｉｎ−ｖｉｔｒｏ方法）。ＴＳＨ受容体に対する自己免疫抗体の検出用の他のアッセイでは、完全なヒト組換えＴＳＨ受容体タンパク質（野生型）が競合アッセイで使用されている（第二世代ｉｎ−ｖｉｔｒｏ方法）。
【０００５】
Thyroid, Vol. 7 (1997) 867-877は、ＴＳＨ受容体における促進型及び遮断型抗体のエピトープを記載している。促進型抗体の機能性エピトープの大半は受容体タンパク質のアミノ酸８〜１６８の範囲に位置し、そして遮断型抗体の機能性エピトープの大半はアミノ酸２６１〜３７０の範囲に位置している。活性測定には前記のバイオアッセイが使用される。
【０００６】
ＷＯ０１／２７６３４Ａ１は、異なる特異性を有する自己免疫抗体の同時的な検出に関する定量的方法を最初に提供し、それは迅速な再現及び高精度での実行が可能である。この目的のために、ＴＳＨ受容体キメラが使用され、それは自己免疫抗体が結合する個々の配列が、プロテインＧ結合受容体のクラスに由来する他の受容体のそれぞれの配列と置換している、という点で野生型受容体とは異なる。ＴＳＨ受容体キメラは完全なＴＳＨ受容体タンパク質に基づいている。しかし、測定には多大の努力が必要である。遠心による分離は前記方法を通常的に使用するには余りに面倒である。また、ＴＳＨ受容体キメラが非常に安定であるとは言えないので、前記アッセイは氷浴又は４℃で行わなければならない。個々の技術はＷＯ０１／６３２９６Ａ１に教示されており、その中でサンドイッチの技術の検出への使用が示唆されている。しかし、ここで示唆されているアッセイ材料を用いたのでは、非特異的結合が通常あまりに高いことが明らかになった。前記の二つの特許出願に記載されている発見に基づく自己免疫抗体の検出アッセイは、市販用には用いることができない。
【０００７】
前記の目的のために、競合アッセイにおいて全く変化していないＴＳＨ受容体を使用した、これまでかなりの期間市販されている自己免疫抗体検出のための測定方法は、第二世代検出方法と称することができよう。前記アッセイはバセドー氏病の検出に向いている。しかしながら、促進型、遮断型及び中間型を区別できないという欠点を持っている。更に、置き換えたＴＳＨは促進型及び遮断型の自己抗体のエピトープの３０〜４０％にしか結合しないので、必ずしも全てのサブタイプ（亜類型）が同定できるわけではない。
【発明の要約】
【０００８】
本発明の基礎となる目的は、前記本技術分野から出発して、ＷＯ０１／２７６３４Ａ１からの公知の方法を、前記方法の正確性及び表現力を増強し、そしてこのような方法を自動化に使用できるように更に修飾することである。
【０００９】
前記目的は、ＴＳＨ受容体キメラを結合試薬として使用することで患者サンプルのＴＳＨ受容体に対する自己抗体の異なるタイプを判別して測定する方法により解決され、ここでは促進型及び／又は遮断型自己抗体に結合するのに十分な受容体の配列が、他の受容体の個々の配列と置き換えられ、それは自己抗体の個々のタイプのいかなる結合にも、次の処理：
（ａ）患者サンプルの、固定相に結合した一次ＴＳＨ受容体キメラとの接触、ここで、抗原結合断片を有する自己免疫抗体が前記一次ＴＳＨ受容体キメラと結合し、
（ｂ）二次Ｃ末端修飾型受容体キメラの混合、ここで、自己免疫抗体の他の抗原結合断片は前記二次Ｃ末端修飾型受容体キメラに結合し、そして最後に
（ｃ）前記二次受容体キメラの修飾型C末端エピトープに対する標識二次抗体の混合、ここで、前記抗体は前記二次受容体キメラの修飾型Ｃ末端エピトープに結合し、そして検出可能な事象の引き金を引くか、又は、
前記キメラの検出が公知の検出方法により可能になるように標識した二次受容体キメラの使用、
により影響を与えない。
【００１０】
更なる実施態様によれば、本発明の基礎となる目的は、
（ａ）患者サンプルと固定相に吸着した結合剤との接触、ここで結合剤はプロテインＡ、プロテインＧ及び抗ＩｇＧから選択され、それは患者由来の自己免疫抗体を前記結合剤に結合させるためであり、
（ｂ）固定相に吸着した結合剤及び患者サンプル混合物へのＴＳＨ受容体キメラの混合、それは自己免疫抗体を前記ＴＳＨ受容体キメラへ結合させるためであり、
（ｃ）前記で得られた反応混合物への標識二次抗体（Ｆ（ａｂ）ｓ）の混合、それは前記自己免疫抗体が結合しているエピトープ以外のエピトープで前記二次抗体が受容体キメラに結合させるためであり、そしてここでは前記二次抗体は、固相に吸着した結合剤（Ｆａｂ領域のみ）には結合しないように修飾してあり、又は、
一般的な検出を行うための標識されたＴＳＨ受容体キメラの、段階（ｂ）における使用、
により解決できる。
【００１１】
更に、本発明の課題はＴＳＨ受容体キメラであり、これは促進型及び／又は遮断型自己抗体に結合するのに十分な受容体の配列が、他の受容体の個々の配列と置き換えられたものであり、それは自己抗体の個々のタイプのいかなる結合にも影響を与えず、そして前期ＴＳＨ受容体キメラは切り詰められている（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）のでＴＳＨ受容体タンパク質の膜部分又は細胞内部分のいずれも含まない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に記載の手順を図式的に示す図である。
【図２】本発明に記載の更なる手順を図式的に示す図である。
【図３】本発明に記載の更なる手順を図式的に示す図である。
【図４】本発明に記載の更なる手順を図式的に示す図である。
【図５】本発明に記載の更なる手順を図式的に示す図である。
【図６】本発明の方法により得られたＴＳＨ自己免疫抗体のＮＩＢＳＣ（ＷＨＯ）標準溶液による標準曲線を示す図である。
【図７】一アッセイ当たり３回の測定から、ｎ＝５における９０／６７２のＷＨＯ標準で得られたアッセイ間の精度分析結果を示す図である。
【図８】本発明記載の方法といわゆる第二世代のアッセイによる患者血清で得られた測定結果の比較を示す図である。
【好ましい実施態様の記載】
【００１３】
配列番号１は分泌性アルカリ・ホスファターゼと融合し切り詰められた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＴＳＨ受容体キメラＢ（細胞外部分）のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２は分泌性アルカリ・ホスファターゼと融合し切り詰められたＴＳＨ受容体キメラＢ（細胞外部分）のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は免疫原性を有するエピトープと融合し切り詰められたＴＳＨ受容体キメラＢ（細胞外部分）由来の融合タンパク質のヌクレオチド配列を示す。
配列番号４は免疫原性を有するエピトープと融合し切り詰められたＴＳＨ受容体キメラＢ（細胞外部分）由来の融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号５は分泌性アルカリ・ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の分泌性シグナル・ペプチド及びＳＥＡＰと融合し切り詰められたＴＳＨ受容体キメラＡ（細胞外部分）由来の融合タンパク質のヌクレオチド配列を示す。
配列番号６はＳＥＡＰの分泌性シグナル・ペプチド及びＳＥＡＰと融合し切り詰められたＴＳＨ受容体キメラＡ（細胞外部分）由来の融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号７はポリクローナル抗体に対して高い免疫原性を有するエピトープと融合し切り詰められたＴＳＨ受容体キメラＡ（細胞外部分）由来の融合タンパク質のヌクレオチド配列を示す。
配列番号８はポリクローナル抗体に対して高い免疫原性を有するエピトープと融合し切り詰められたＴＳＨ受容体キメラＡ（細胞外部分）由来の融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号９はｇＬＵＣシグナル・ペプチド配列及びガウシア・ルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）配列と融合し切り詰められたＴＳＨ受容体キメラＢ（細胞外部分）由来の融合タンパク質のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１０はｇＬＵＣシグナル・ペプチド配列及びガウシア・ルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）配列と融合し切り詰められたＴＳＨ受容体キメラＢ（細胞外部分）由来の融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００１４】
本発明に使用されたＴＳＨ受容体キメラは、そのアミノ酸配列の一部が、ＴＳＨ受容体自己免疫抗体に対する異なる結合挙動を有する他の受容体の同等の配列、特に非結合型配列、と置き換えられたものである。このような同等の配列は、例えば、ラットのＬＧ−ＣＧ受容体配列であっても良い。従って、本発明により使用される受容体キメラにおけるこれらの促進型及び／又は遮断型自己免疫抗体の結合するエピトープが、置き換えられた。従って、中間型の自己免疫抗体の結合するＴＳＨ受容体キメラについては、促進型及び遮断型の自己免疫抗体のエピトープが、置き換えられた。前記受容体キメラは、Biochem. Biophys. Res. Comun. (1991), 179:70-77又はＷＯ０１／２７６３４により構築することができる。両方の文献は本発明の開示の目的で引用文献に取り込まれている。
【００１５】
従って、本発明ではＴＳＨ受容体キメラＡ，Ｂ及びＣは区別することが可能である。キメラＡでは、好ましくはＴＳＨ受容体のアミノ酸８〜１６５は実質的に同等のＬＨ−ＣＧＲのアミノ酸１０〜１６６と置き換えることができる。キメラＢでは、好ましくはＴＳＨ受容体のアミノ酸２６１〜３７０は実質的に対応するラットのＬＨ−ＣＧＲのアミノ酸２６１〜３２９と置き換えることができる。キメラＣでは、好ましくはＴＳＨ受容体のアミノ酸８〜１６５並びにアミノ酸２６１〜３７０はそれぞれ対応するＬＨ−ＣＧＲのアミノ酸と置き換えることができる。
【００１６】
ＴＳＨ受容体キメラＡにより遮断型自己免疫抗体が、キメラＢにより促進型自己免疫抗体が、及びキメラＣにより中間型自己免疫抗体が、患者サンプルから検出される。
【００１７】
ＴＳＨ受容体は、細胞質ゾルから細胞膜を通り細胞外空間へと達している。受容体タンパク質の細胞外部分はＴＳＨ及び自己免疫抗体との結合部位を有している。驚くべきことに、実質的にＴＳＨ受容体タンパク質の細胞外のみを有する、切り詰められたＴＳＨ受容体ペプチドは、ＴＳＨとの結合能を失うことなく安定に貯蔵することが可能であることが知られている。また、同様のことは、その自己免疫抗体との結合能についても知られている。
【００１８】
好ましくは、本発明で使用されるＴＳＨ受容体キメラＡ、Ｂ、又はＣは、それぞれのＴＳＨ受容体キメラ（切り詰められたＴＳＨ受容体キメラ）の細胞外部分のみを有する。これは、本発明で使用されるいわゆる第一次ＴＳＨ受容体キメラ並びにいわゆる第二次として追加使用されるＴＳＨ受容体キメラに当てはまる。ＴＳＨ受容体キメラの前記細胞外部分は、実質的にアミノ酸１〜４１８のペプチドを含むことができる。これは野生型ＴＳＨ受容体の細胞外部分のアミノ酸１〜４１８に相当する。従って、好ましい形で用いられた、切り詰められたＴＳＨ受容体キメラＡ、Ｂ、及びＣは実質的に既知ＴＳＨ受容体キメラの細胞質ゾル及び膜部分を欠損している。本発明の検出方法における切り詰められたＴＳＨ受容体キメラの使用は、これまで知られている完全なＴＳＨ受容体キメラの使用よりも、実質的により簡素化されている。
【００１９】
好ましくは、本発明に記載のＴＳＨ受容体キメラＡ、Ｂ、及びＣは、従って、野生型ＴＳＨ受容体の細胞質ゾル及び実質的に膜の部分を欠損したものである。野生型ＴＳＨ受容体の細胞外部分は、これらの場合では前記のようなキメラＡ、Ｂ、又はＣを形成する。
【００２０】
前記の切り詰められたＴＳＨ受容体キメラにおいて、特に有利には、組換え細胞におけるその製造に際して前記の切り詰められたＴＳＨ受容体キメラＡ、Ｂ、又はＣは細胞外の空間に分泌され、この場合例えばアルカリ・ホスファターゼ又はトランスサイレチンのシグナル・ペプチド又は対応する塩基配列のそれぞれがＴＳＨ受容体キメラの塩基配列上流に挿入されている。この場合には、細胞の消化はＴＳＨ受容体キメラＡ、Ｂ、又はＣを得るためには必要とされない。特に好ましいものは、トランスサイレチン酵素のシグナル・ペプチドである。本発明の記載において、シグナル・ペプチドとは、細胞から切り詰められた受容体キメラの分泌に必要なアミノ酸を少なくとも有するペプチド残基を意味する。
【００２１】
更に好ましい実施態様では、シグナル・ペプチドはＴＳＨ受容体キメラの一部を構成し、そして更に、検出の目的に有効な、それ自身の分泌型シグナル・ペプチド配列を有する酵素をＴＳＨ受容体キメラに含むことが可能である。
【００２２】
本発明の一つの実施態様では、固相に結合している第一次ＴＳＨ受容体キメラは、そのＣ末端でペプチドと融合することが可能である。前記ペプチドは、例えば、高い免疫原性を有するサイロスティムリン・ペプチド又はＴＳＨ受容体のＣ末端由来の部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）である。この場合、固相で第一次ＴＳＨ受容体キメラを固定化する抗体は、前記ペプチドに対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり、例えば、サイロスティムリンに対する抗体である。
【００２３】
本発明の更なる実施態様では、第一次ＴＳＨ受容体キメラが既にそのＣ末端で結合している固定化抗体に対して第二次ＴＳＨ受容体キメラが特異的に結合することを排除されるように、いわゆる第二次ＴＳＨ受容体キメラのＣ末端を修飾することが可能である。従って、架橋アッセイで起こりえる非特異的結合の様な問題が抑制される。この様に修飾された前記第二次受容体キメラの使用は前記方法の特異性及び感度を更に高めるのに役立つ。
【００２４】
更なる実施態様では、前記の修飾型第二次ＴＳＨ受容体キメラは、そのＣ末端で高い免疫原性を有するペプチドと融合することが可能である。その様なペプチドは、サイロスティムリン又はＴＳＨ受容体のＣ末端の部分配列から選択することができる。その様な部分配列は、例えば、ヌクレオチド７４３〜７６３でコードされるＴＳＨ受容体の細胞質ゾル部分から得ることができる。また、この様にして得られた二次ＴＳＨ受容体キメラは、第一次ＴＳＨ受容体キメラが既にそのＣ末端で結合している固定化抗体に対して第二次ＴＳＨ受容体キメラが結合することを排除するという利点を有する。高い免疫原性を有するペプチド残基の存在により二次標識抗体は簡単に、そして特異的に結合することが可能である。サイロスティムリン・ペプチドの部分配列の融合は同様の有利さをもたらす。高い免疫原性を有するペプチド配列に対する抗体は高い結合親和性を示す。重要なことに、非特異的結合が大部分減少する一方で、高い結合特異性が達成される。
【００２５】
本発明に使用される一次又は二次のＴＳＨ受容体キメラは検出用に修飾することができる。前記修飾は検出のための標識又は免疫原性を有するペプチド配列による標識であり、これは適切な検出のための二次抗体により検出される。
【００２６】
本発明に記載の方法では、いわゆる一次ＴＳＨ受容体キメラＡ、Ｂ、及びＣは、固相に結合させることができる。この場合、固相へのＴＳＨ受容体キメラの結合は固定化抗体を介して行なうことが可能で、それは例えば、ＴＳＨ受容体キメラのＣ末端エピトープに向けられている。その様な抗体はポリクローナル又はモノクローナル抗体で良い。
【００２７】
ＴＳＨ受容体キメラＡ、Ｂ、又はＣの一つに対する自己免疫抗体の結合の検出には、二次抗体を使用することができる。前記二次抗体は固定化抗体に付け加えて存在させることができる。それはモノクローナル又はポリクローナル抗体であって良い。本発明による方法の前記の実施態様においては、自己免疫抗体はプロテインＡ、Ｇ、又は抗ＩｇＧに結合し、アッセイの特異性及び感受性を高めるために二次抗体のＦｃ部分は除かれることになろう。従って、前記二次抗体のプロテインＡ、Ｇ、又は抗ＩｇＧへの結合は排除される。この様な抗体の調製は既知であり、例えば、Journal of Immunological Methods, 138 (1991), 111-119に記載されている。抗体のＦｃ部分の分離用としては、イムノピュアー（商標）Ｆ（ａｂ’）S（ImmunoPure（商標） F(ab’)s）、ピアス・バイオテクノロジー社（Ｒｏｃｋｆｏｒｔ，Ｉｌ．６１１０５／ＵＳ）の調製用キットが市販されている。前記方法では、固定化したペプシンが抗体のＦｃ部分の分離に使用される。その後の５，５−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）との反応に引き続きペプチドとの融合を行うが、これはプロテインＡ又はプロテインＧのいずれにも結合しない。この様な融合は、例えば、Science 241 (1988), 1353に記載されている。前記文献は本発明を記載する目的で、引用文献に取り込まれている。
【００２８】
本発明に用いられる、一次又は二次ＴＳＨ受容体キメラである、ＴＳＨ受容体キメラは、希望するアッセイ・デザインに依存して標識することができる。本発明の意味における直接標識とは、ＴＳＨ受容体キメラの標識を意味する。本発明の意味における間接標識とは二次標識抗体の使用を意味する。標識は、それにより検出可能なシグナルを直接的又は間接的に提供するようなものであることができる。
【００２９】
標識方法は、融合又は化学結合によるＴＳＨ受容体キメラ又は二次抗体との連結であって良い。好ましくは、標識方法はそれと連結するＴＳＨ受容体キメラのＮ末端へ向けられていることである。
【００３０】
適切な標識は、例えば、酵素、例えばアルカリ・ホスファターゼ（ＡＰ）、分泌性アルカリ・ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ホタルのルシフェラーゼ及びパーオキシダーゼ、又は色素、例えばアクリジン色素、蛍光物質、又は生物／化学発光物質を用いて行われる。前記の酵素の場合には、これらをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、ＴＳＨ受容体キメラのヌクレオチド配列と融合している。適切な標識は、更に、例えばＦＩＴＣ、ビオチン化及びストレプトアビジンで行われる。
【００３１】
本発明の方法の更なる実施態様では、プロテインＡ又はＧ、又は抗ＩｇＧを自己免疫抗体の結合のために固相に固定化することができる。
【００３２】
適切な固相は、プラスチック体、例えばプラスチック・チューブ、プラスチック板及び、磁性及び非磁性プラスチック顆粒である。本発明で使用される固相に適切なプラスチックは、化学的又は物理学的反応によりタンパク質の結合を可能とするものである。これらは顆粒、マイクロタイター・プレート（微量定量板）及びチューブを含み、ポリスチレン、ポリエチレン又は他の公知のポリマー材料からなることが可能である。この様な固相は当業者には既知であり、市販されている。
【００３３】
本発明の切り詰められたＴＳＨ受容体キメラは凍結乾燥して貯蔵できる。これらはモノクローナル又はポリクローナル抗体を介して固相に結合し、凍結乾燥の形で貯蔵できる。検出反応に際しては、凍結乾燥した成分をアッセイ用の緩衝液に溶かして再構成を行う。
【００３４】
本発明の切り詰められたＴＳＨ受容体キメラは、溶解した形で高い安定性を示す。これらは、４℃で４〜７日間、２４℃で３〜６日間、及び３７℃で２４時間、安定に維持される。また、前記条件は本発明の検出方法を自動化で実施する際に適切であり、その際に成分は４℃で貯蔵され、一方試験反応は問題なく３７℃で行うことができる。対照的に、完全なＴＳＨ受容体キメラは、４℃で３〜６日間、２４℃で２４〜４８時間、及び３７℃で僅か３時間安定に維持されるにすぎない。
【００３５】
本発明の方法によるバセドー氏病患者の血清のＴＳＨ自己抗体の測定では、アッセイ間変動係数が４〜１２％という良好な測定値を得ることができた。アッセイ内変動係数は明確に１０％より低い。本発明の方法は患者サンプルの自己免疫抗体の自動化検出に非常に良く適合している。本発明の方法を実施するに当たり、三つのTSH 受容体 キメラの一つを一人の患者のサンプルにそれぞれ添加し、次いでサンプルはそれぞれの自己免疫抗体について検査される。
【００３６】
本発明の方法の典型的な実施態様は、次に図に準拠して記載されている。
【００３７】
図１は本発明の方法の一つの実施態様を示し、ここでは固相に結合した切り詰められたＴＳＨ受容体キメラを患者サンプルと接触させた。自己免疫抗体は対応するＴＳＨ受容体キメラの反応性エピトープに結合した。次いで、高い免疫原性を有するペプチドでＣ末端を修飾した二次受容体キメラは、反応混合物に混ぜた。患者の二次自己免疫抗体のＦａｂ部分のまだ遊離しているエピトープは、次いで、二次受容体キメラと結合する。自己免疫抗体の検出は、二次ＴＳＨ受容体キメラのＣ末端の高い免疫原性を有するペプチドに結合する二次標識抗体により実施される。
【００３８】
図２の実施態様では、Ｃ末端が標識法により修飾された、この様な切り詰められた二次ＴＳＨ受容体キメラが使用される。この場合、二次標識抗体は不要である。
【００３９】
図３は、固定化抗体がサイロスティムリン・ペプチドに対する抗体である方法を示す。一次ＴＳＨ受容体キメラは切り詰められた受容体キメラであり、そのＣ末端はサイロスティムリン・ペプチドと融合している。二次受容体キメラは同様に受容体キメラの細胞外部分のみを含み、そしてそのＣ末端が標識されている。自己免疫抗体は一次並びに二次のＴＳＨ受容体キメラに結合する。
【００４０】
図４は本発明の方法の一つの方法を示し、ここではプロテインＡ、Ｇ又は抗ＩｇＧが固相に結合し、そして患者サンプルと接触していた。患者の自己免疫抗体はそのＦｃ部分でプロテインＡ、Ｇ又は抗ＩｇＧと結合する。続くＴＳＨ受容体キメラの添加で、患者の自己免疫抗体はそのＦａｂ部分でＴＳＨ受容体キメラの対応するエピトープに結合する。結合の検出に際しては、二次標識抗体が使用され、それは，プロテインＡ、Ｇ又は抗ＩｇＧへの結合を抑制するためにＦｃ部分を有していない。
【００４１】
図５に示すように、代替として、ＴＳＨ受容体キメラのＣ末端に標識することも可能である。従って、自己免疫抗体はＴＳＨ受容体キメラによる個々の検出反応により検出することができる。
【００４２】
また、患者サンプルをいくつかのＴＳＨ自己免疫抗体の存否についてアッセイすることも可能である。この目的に際しては、例えば、まずキメラＡ又はＣを用いて遮断型又は中間型ＴＳＨ自己免疫抗体のいずれであるか、検出することが可能である。更なるアッセイでは、キメラＢを同一の患者サンプルに混合し、本発明の方法が実施される。
【００４３】
次に、本発明による典型的なＴＳＨ受容体キメラＢ及びＡを説明する。
【００４４】
配列番号１及び２において、それぞれ（ＴＳＨ受容体キメラＢ）は、
−ヌクレオチド１〜５１（アミノ酸１〜１７）はＳＥＡＰシグナル・ペプチド配列を表し、
−ヌクレオチド５２〜１５５７（アミノ酸１８〜５１９）はＳＥＡＰ配列を表し、
−ヌクレオチド１５５８〜２２８０（アミノ酸５２０〜７６０）はキメラのアミノ酸２１〜２６１のＴＳＨＲ配列を表し、
−ヌクレオチド２２８１〜２２９８（アミノ酸７６０〜７６６）はキメラのアミノ酸２６１〜２６６のＬＨＲ配列を表し、
−ヌクレオチド２２９９〜２３１６（アミノ酸７６７〜７７２）は６ヒスチジン及びＴＡＡ終止コドンを表す。
【００４５】
配列番号３及び４において、それぞれ（ＴＳＨ受容体キメラＢ）は、
−ヌクレオチド１〜６０（アミノ酸１〜２０）はＴＳＨＲシグナル・ペプチド配列を表し、
−ヌクレオチド６１〜７８３（アミノ酸２１〜２６１）はキメラのアミノ酸２１〜２６１のＴＳＨＲ配列を表し、
−ヌクレオチド７８４〜８４６（アミノ酸２６２〜２８３）は高い免疫原性を有するエピトープを表す。
【００４６】
配列番号５及び６において、それぞれ（ＴＳＨ受容体キメラＡ）は、
−ヌクレオチド１〜５１（アミノ酸１〜１７）はＳＥＡＰシグナル・ペプチド配列を表し、
−ヌクレオチド５２〜１５５７（アミノ酸１８〜５１９）はＳＥＡＰ配列を表し、
−ヌクレオチド１５６１〜１９９８（アミノ酸５２１〜６８６）はキメラのＬＨＲ配列のアミノ酸２１〜１６６を表し、
−ヌクレオチド１９９９〜２２８３（アミノ酸６８７〜７８１）はＴＳＨＲ配列のアミノ酸１６６〜３７０（エピトープＡ及びＢの間）を表し、
−ヌクレオチド２２８４〜２５５３（アミノ酸７８２〜８９１）はキメラのエピトープのアミノ酸２６１〜３７０を表し、ここでＴＳＨ自己免疫抗体の結合を遮断する。
【００４７】
配列番号７及び８においては、それぞれ、
−ヌクレオチド１〜６０（アミノ酸１〜２０）はＴＳＨＲ／ＬＨＲシグナル・ペプチド配列を表し、
−ヌクレオチド６１〜４９８（アミノ酸２１〜１６６）はＬＨＲ配列のアミノ酸２１〜１６６を表し、
−ヌクレオチド４９９〜７８３（アミノ酸１６７〜２６１）はＴＳＨ受容体のアミノ酸１６６〜３７０を表し、
−ヌクレオチド７８４〜１１１３（アミノ酸２６２〜３７１）はキメラのエピトープのアミノ酸２６１〜３７０を表し、ここでＴＳＨ自己免疫抗体の結合を遮断し、
−ヌクレオチド１１１４〜１１７６（アミノ酸３７２〜３９２）はＴＳＨ受容体の細胞質ゾル部分由来の高い免疫原性を有するエピトープを表す（ＴＳＨ受容体のヌクレオチド７４３〜７６３でコードされる）。
【００４８】
配列番号９及び１０においては、それぞれ、
−ヌクレオチド１〜５３（アミノ酸１〜１８）はｇＬＵＣシグナル・ペプチド配列を表し、
−ヌクレオチド５４〜５６１（アミノ酸１９〜１８７）はガウシア・ルシフェラーゼ配列を表し、
−ヌクレオチド５６２〜１２８１（アミノ酸１８８〜４２７）はＴＳＨ受容体のアミノ酸２１〜２６１を表し、
−ヌクレオチド１２８２〜１３０２（アミノ酸４２８〜４３４）は受容体キメラのＬＨＲ配列のアミノ酸２６１〜２６６を、及び残りのヌクレオチドは６ヒスチジン及び終止コドンを表す。
【００４９】
本発明は次の実施例により更に説明されよう。
【実施例】
【００５０】
材料
プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｒＬＨＲ（Ｂ９）はＤ．Ｌ．Ｓｅｇａｌｏｆｆ博士（アイオワ大学、米国）により提供された。プラスミドｐＳＰ−ｌｕｃ−ＮＦはプロメガＧｍｂＨ（有限会社）（ハイデルベルグ、ドイツ）より得た。ＥＣＬウェスタン・ブロット・キット及びｃＡＭＰ  ＲＩＡキットとして、アマシャムＧｍｂＨ（ブラオンシュヴァイク、ドイツ）のキットが使用された。
【００５１】
次のものが使用された：クローンテク・ラボラトリー社、パル・アルト、ＣＡ、米国のｐＩＲＥＳｎｅｏ発現ベクターｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ、Ｐ．Ｊ．Ｋ．ＧｍｂＨ、クラインビッタードルフ、ドイツのガウシア・ルシフェラーゼ、ラボラトリー・フォーア・モノクロナーレ・アンティストッフェン（ＬＭＡ）、ヴァーゲニンゲン、オランダの大腸菌アルカリ・ホスファターゼ、シンセティック・ジーン、ブリティッシュ・バイオテクノロジー社、イギリスのアルモラシア・ルスティシアナ（Ａｒｍｏｒａｃｉａ  ｒｕｓｔｉｃｉａｎａ）の西洋ワサビペルオキシダーゼ、ｈ−サイロスティムリン： Nakabayashi et al., “Thyrostimulin, a heterodimer of two new human glycol-protein hormone subunits, activates the thyroid-stimulation hormone receptor”, J. Clin. 109 (11), 1445-1452.
【００５２】
ＤＮＡプライマー
Ｐ１（５´−ＧＴＣＡＴＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＡＧＴＧ−３´）
Ｐ２（５´−ＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＴＴＡＴＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＴＣＡＣＡＧ−３´）
Ｐ３（５´−ＧＴＣＣＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡ−３´）
Ｐ４（５´−ＡＴＣＧＡＧＣＴＣＴＴＣＡＴＴＣＴＣＣＴＣＡＡＡＧＡＴＧＧＣ−３´）
Ｐ５（５´−ＴＡＣＧＡＴＡＴＣＧＧＡＡＴＧＧＧＧＴＧＴＴＣＧＴＣＴ−３´）
Ｐ６（５´−ＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＴＴＴ−３´）
Ｐ７（５´−ＴＡＣＧＡＴＡＴＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣ−３´）
Ｐ８（５´−ＴＡＣＡＧＣＧＣＴＴＧＴＣＴＧＣＴＣＧＡＡＧＣＧＧＣＣ−３´）
はインターアクティーヴァ社（ウルム、ドイツ）より得た。
【００５３】
細胞培養
ＨＥＫ２９３細胞は１０％の胎児牛血清で補ったダルベッコ変法イーグル培地で培養した。前記細胞は５％ＣＯ２の気相にて３７℃で培養した。
【００５４】
ＴＳＨＲ／ＬＨ−ＣＧＲ  キメラの構築
部分配列が対応するラットのＬＨ−ＣＧＲと置き換えられた、三つの異なるヒトＴＳＨＲのキメラが、Biochem. Biophys. Res. Commun. (1991), 179: 70-77、の記載に従って構築された。今後“キメラＡ”と呼ぶキメラの一つでは、ＴＳＨＲアミノ酸８〜１６５が相当するＬＨ−ＣＧＲのアミノ酸１０〜１６６と置き換えられた；“キメラＢ”では、ＴＳＨＲアミノ酸２６１〜３７０は相当するラットＬＨ−ＣＧＲのアミノ酸２６１〜３２９で置き換えられ、一方“キメラＣ”の場合では、アミノ酸８〜１６５並びにアミノ酸２６１〜３７０は相当するＬＨ−ＣＧＲアミノ酸と置き換えられた。
【００５５】
特に、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｒＬＨＲ（Ｂ９）は、ラットＬＨ−ＣＧＲ受容体の配列を含む主成分として用いられた。アミノ酸１０〜１６５並びに２６１〜３２９をコードするＤＮＡ配列は、ＰＣＲ技術によりそれぞれＰ１−Ｐ２及びＰ３−Ｐ４の対のプライマーを用いて増幅されたが、このプライマーはそれぞれＮｓｉＩ、ＡａｔＩＩ、ＢｆｒＩ又はＳａｃＩ制限酵素認識部位を含み、これによりそれぞれＮｓｉＩ／ＡａｔＩＩ又はＢｆｒＩ／ＳａｃＩ−ＰＣＲ断片が得られた。これと並行して、pTM1-TSHR-FLAG-6HIS プラスミドが、DE 196 45 729、又はExp. Clin. Endocrinol. Diabe-tes 5: 282-290 (1997)に従って得られ、これは、ＰｓｔＩ−ＡａｔＩ又はＢｆｒＩ−ＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化された。ここで作製された断片は除去され、ラットＬＨ−ＣＧ受容体から得られたＰＣＲ断片と置き換えられ、これにより異なるＴＳＨＲ／ＬＨ−ＣＧＲキメラＡ、Ｂ、及びＣのｃＤＮＡ配列が得られる。
【００５６】
ベクターｐＴＭ１−ＴＳＨＲ−ＦＬＡＧ−６ＨＩＳ、又はこれから得られたＴＳＨＲ／ＬＨ−ＣＧＲのＤＮＡ（ＰＴＭ１−ＴＳＨＲ／ＬＨ−ＣＧＲ）を含む新しいベクターは、ＡｖａＩで直鎖とし、その「付着」末端はクレノー・ポリメラーゼを用いて満たした（平滑末端とした）。ベクターｐＩＲＥＳｎｅｏはＣｌａＩを用いて直鎖とし、「付着」末端はクレノー・ポリメラーゼを用いて満たした。ＴＳＨＲ又はＴＳＨＲ／ＬＨ−ＣＧＲ断片は発現に使用する目的で、それぞれＢａｍＨＩを用いて切断し、発現ベクターｐＩＲＥＳｎｅｏのＣｌａＩ（満たされた部位）／ＢａｍＩ部位にサブクローニングした。この結果、細胞のトランスフェクション及び種々のＴＳＨ受容体キメラ及びまたキメラの修飾のために用いる、発現ベクターｐＩＲＥＳｎｅｏ−ＴＳＨＲ、又はｐＩＲＥＳｎｅｏ−ＴＳＨＲ／ＬＨ−ＣＧＲがそれぞれ得られた。
【００５７】
ＴＳＨ受容体キメラの細胞外部分の調製
発現ベクターｐＩＲＥＳｎｅｏにクローン化したＴＳＨ受容体キメラＢ（野生型）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＴＳＨ受容体キメラＢの細胞外部分に対するヌクレオチド配列の調製及び増幅のための鋳型として使用される。ＰＣＲに必要な二つのプライマーは次のヌクレオチド配列を含む：プライマーＶは制限酵素ＥｃｏＲＶの６ヌクレオチド配列及びシグナル・ペプチドを含まないキメラＢのＮ−末端ペプチド配列に対する１８ヌクレオチド配列、を含む。プライマー６は、ＢａｍＨ１に対する６ヌクレオチド配列と共に、アミノ酸２６１〜２６６のヌクレオチド配列を含む。
【００５８】
ＴＳＨ受容体キメラＢヌクレオチド配列（細胞外部分のみ）の発現ベクターへの挿入
得られたＰＣＲ産物はアミノ酸２１〜２６６をコードするヌクレオチドを含む。前記配列は、ＥｃｏＲＶ及びＢａｍＩの接合部分を介してｐＩＲＥＳｎｅｏへ挿入される。
【００５９】
細胞外ＴＳＨ受容体キメラＢ及び酵素ＳＥＡＰのヌクレオチド配列の融合
まず、引き続いて行われるｐＳＥＡＰ−２との融合のための前提条件として、次の二つのプライマーが調製された。プライマー７は、ＳＥＡＰのＮ末端アミノ酸配列に対するヌクレオチド及びＥｃｏＲＶに対するヌクレオチドを含む。プライマー８は、ＳＥＡＰのＣ末端アミノ酸配列に対するヌクレオチドと共にＥｃｏ  ４７ＩＩＩに対するヌクレオチドを含む。この様にして、この鋳型の増幅はポリメラーゼ連鎖反応により行われる。
【００６０】
挿入
次に、ＥｃｏＲ  Ｖ接合部分で分割した後に、融合したヌクレオチド配列のｐＩＲＥＳｎｅｏ−ｃｈｉｍＢへの挿入が行われる。ＥｃｏＲ  Ｖ及びＢａｍ  ＨＩによる制限酵素分析を用いて、融合ヌクレオチド配列を有するクローンが選択される（確率として、クローンＳＥＡＰ  の５０％が誤った方向をとる可能性があり、それは、制限酵素分析において長さが短いことで正しい融合ヌクレオチド配列と区別される）。
【００６１】
分泌型シグナル・ペプチド 配列の取り込み
この方法は、前記で記載したのと同様の融合及び挿入による遺伝子操作技術方法で行われる。ここで、特に、トランスサイレチンのシグナル・ペプチド配列が使用されるが、その理由は、それが高分子グロブリンであるトランスサイレチンに対して高い分泌能を発揮するからである。
【００６２】
細胞抽出物としての、融合タンパク質ＴＳＨＲ−ＳＥＡＰ及びＴＳＨＲ／ＬＨ−ＣＧＲ−ＳＥＡＰそれぞれの発現及び回収
シート状になった（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）安定なＨＥＫ２９３細胞は１０〜２０  ７５ｃｍ2プレート（約２０ｘ１０６細胞）で培養する。削り取った後に、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に移し、２５００ｒｐｍの遠心分離でＰＢＳにより四回洗浄する。得られた細胞は、０．３ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭヘペス−ＫＯＨ；ｐＨ７．５；５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１％トライトンＸ１００；１０％グリセロール）中で凍結融解により溶解した。得られた懸濁液は３０，０００Ｇで１時間遠心分離し、上清（総タンパク質約８ｍｇ／ｍｌ）は回収し−７０℃で貯蔵した。
【００６３】
この様にして得られた上清（抽出物）は、それぞれＴＳＨＲ−ＳＥＡＰ又はＴＳＨＲ／ＬＨ−ＣＧＲ−ＳＥＡＰの測定方法で使用することができる。
【００６４】
細胞分画の調製
ＨＥＫ１９３細胞は１，２００ｒｐｍでの遠心分離でペレット化した。得られた細胞ペレットは、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ中にｐＨ７．６、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール並びにプロテアーゼ阻害剤混合物を含む０．３ｍｌの緩衝液に再度懸濁した。前記懸濁液は、次いで４℃にてガラス・テフロンホモジナイザー中で２０ストロークの運動で均一化（homogenize）し、そして８００Ｇで１５分間、続けて３０，０００Ｇで１時間遠心分離した。上清(細胞質分画)は回収した。膜ペレットは、それを４℃にて１％トライトンＸ１００を含む０．３ｍｌの同一緩衝液中でガラス・テフロンホモジナイザーにより２０ストロークの運動で均一化することで処理し、次いでそれを３０，０００Ｇで１時間遠心分離した。上清（トライトンＸ１００膜抽出物）は回収し、−７０℃で貯蔵した。
【００６５】
選択された細胞外融合ＴＳＨＲキメラの回収
切り詰められた融合ＴＳＨ−Ｒキメラの細胞外ドメインは、それを発現する細胞により培養上清に分泌される。分泌された受容体タンパク質はアッセイ用の緩衝液中で特定の希釈の形でアッセイに直接使用される。例えば、５ｍｌの培養上清から得られた１０μｌの細胞外ＳＥＡＰ−ＴＳＨ−ＲキメラＢは測定当たり最終希釈１：１０で使用された。
【００６６】
標準検量線の作成
標準曲線の作成では、自己免疫抗体の標準化された濃度のＷＨＯ  ９０／６７２標準溶液が使用された。最初の標準溶液は１００ＩＵ／ｌを含み、これは標準カーブの作成の目的で希釈された。ゼロ値として、ＴＸＢＷ緩衝液中の自己免疫抗体を含まない被験者の血清が使用された。
【００６７】
使用されるＴＳＨ受容体キメラＢは、抗体を介してマイクロタイター・プレートに固定化された凍結乾燥状態で貯蔵され、その使用前にタンパク質安定化剤を含む緩衝液で再構成される。トライトンＸ１００洗浄緩衝液（ＴＸＷＢ）は、０．１％ＴＸ−１００、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む。血清希釈用緩衝液はＴＸＷＢ中に５％グルコース及び５％粉ミルクを含む。
【００６８】
穴当たり５０μｌのサンプル溶液（標準の希釈及びゼロサンプル）は希釈緩衝液で１：２に希釈し、マイクロタイター・プレートにて室温で（約２２℃）９０分間インキュベートした。それぞれ３００μｌのＴＸＷＢで、四回洗浄を行った。次いで、直径１０ｃｍの培養皿の酵素ＳＥＡＰと融合したＴＳＨ受容体キメラを含む上清５ｍｌ由来の１：１００希釈液１０μｌを、９０μｌのＴＸＷＢへ加える。続いて、３７℃で３０分間かき混ぜながら（３００〜４００ｒｐｍ）、インキュベーションする。次いで、３００μｌのＴＸＷＢで四回洗浄する。生物／化学発光は、ベルトホルトＧｍｂＨ、バート・ヴィルトバート、シュヴァルツヴァルト、ドイツのセントロール（商標）（Ｃｅｎｔｒｏｌ（商標））ＩＡ・ＬＢ・２９６マイクロタイター・プレート測定装置によりアプライド・バイオシステム、フォスター・シティー、ＣＡ、米国のトロピクス（商標）（Ｔｒｏｐｉｘ（商標））（ＥＣＬ（活性化化学発光）の試薬）を用いて測定する。
【００６９】
検出限界は約０．２ＩＵ／ｌである。相対的光単位（ＲＬＵ）及び少なくとも４０ＩＵ／ｌの範囲までの促進性自己抗体の標準濃度の間には多項式関数が存在する。
【００７０】
図６には、自己免疫抗体（Ｂ０）が無い時のゼロ値に対する、それぞれのＴＳＨ受容体に対する標準自己抗体の一連の希釈サンプルで測定された、相対的光単位（ＲＬＵ）であるＲＬＵ（Ｂ＝結合）がＹ軸にＢ／Ｂ０として示されている。Ｘ軸には、標準サンプルの希釈が示されている。二回の測定の平均である測定値が次の表に示されている。
【表１】
0005405111.tif 000002
【００７１】
本発明によるアッセイと「第二世代」の競合アッセイの比較
血清又は血漿サンプルは３時間以内に静脈血より抽出する。貯蔵は、４℃では７日間にわたり、又は−２０℃では１〜２年間可能である。二次抗体（前記参照）は−２０℃で貯蔵し、アッセイにそれを使用する前に室温にて融解する。ＴＳＨ受容体キメラはマイクロタイター・プレート上に凍結乾燥した状態で貯蔵し、その使用前にタンパク質安定剤入りの緩衝液で再構成される。トライトンＸ１００洗浄用緩衝液（ＴＸＷＢ）は、０．１％ＴＸ−１００、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１００ｍｌ  ＮａＣｌを含む。血清希釈用緩衝液は、ＴＸＷＢ中に５％グルコース及び５％粉ミルクを含む。
【００７２】
穴当たり５０μｌの血清又は血漿はＴＸＷＢ緩衝液で１：２に希釈され、マイクロタイター・プレート上で室温（約２２℃）にて９０分間インキュベートする。次いで、酵素ＳＥＡＰと融合したＴＳＨ受容体キメラを含む、１：１０に希釈した直径１０ｃｍの培養皿の５ｍｌの培養上清中の１０μｌを、９０μｌのＴＸＷＢに加える。続いて、攪拌しながら（３００〜４００ｒｐｍ）インキュベーションを３７℃で３０分間行う。次いで、３００μｌのＴＸＷＢで四回洗浄する。生物／化学発光はセントロール（商標）（Ｃｅｎｔｒｏｌ（商標））ＩＡ・ＬＢ２９６マイクロタイター・プレート測定装置でトロピクス（商標）（Ｔｒｏｐｉｘ（商標））を用いて測定される。
【００７３】
図８は、本発明による方法により患者血清でなされた測定結果と、いわゆる第二世代のアッセイを使用してなされた測定結果、の比較様式を示す。第二世代のアッセイでは、完全なＴＳＨ受容体‐非受容体キメラ‐が競合アッセイに使用された。このために、ＴＳＨ受容体は固相に固定化され、サンプル血清及び標識ＴＳＨと接触させた。使用されたＴＳＨの濃度は変化させた。自己免疫抗体が受容体でＴＳＨと置き換わる。この置き換えによるシグナル変化が測定値として使用される。
【００７４】
本発明によるアッセイの分析デザインは図２に示された。競合アッセイの実施は、使用された競合アッセイ・キットである、Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ．ＡＧ、１６７６１ヘンニグスドルフ（Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ）、ドイツのトラック（商標）（ＴＲＡＫ（商標））の使用説明書に従ってなされた。
【００７５】
図８には、本発明により測定されたリットル当たりの国際単位がＹ軸に記載され、第二世代の方法によるリットル当たりの国際単位が図のＸ軸に記載されている。この分析は、合計４１人の患者血清について、１４のケースでｓＴＲＡｂ値はＴＲＡＫ値より低く１９ケースで高いことを示す。
【００７６】
本発明は特定の実施態様との関連で前記に記載されたが、当業者にとり自明であり本請求項により決められた特許の範囲を超えない変更及び修飾は可能である。
【図１】
0005405111.tif 000003
【図２】
0005405111.tif 000004
【図３】
0005405111.tif 000005
【図４】
0005405111.tif 000006
【図５】
0005405111.tif 000007
【図６】
0005405111.tif 000008
【図７】
0005405111.tif 000009
【図８】
0005405111.tif 000010
【配列表】
0005405111000001.app