(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中に存在する場合のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の型を識別するための閉管法であって：
ａ）該サンプルに由来するＨＣＶゲノムの一部分を増幅して少なくとも１つのアンプリコンを生成させるステップ；
ｂ）単一のハイブリダイゼーション反応において、該アンプリコンを少なくとも第１プローブおよび第２プローブとハイブリダイズさせて、少なくとも２つの標的ハイブリダイゼーション複合体を形成させるステップであって、
ｉ）各プローブはＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列と相補的または部分的に相補的であり；
ii）該ＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列は少なくとも２つのＨＣＶ型の間で配列異質性を示し；
iii）該第１プローブと該ヌクレオチド配列とを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも２つのＨＣＶ型を区別するような温度依存的ハイブリダイゼーション特性を有し、ここで温度依存的ハイブリダイゼーション特性とは、あるＨＣＶ遺伝子型内の配列のばらつきにより生じる、識別可能な融点（Ｔｍ）範囲であり；また
iv）該第２プローブと該ヌクレオチド配列とを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも２つのＨＣＶ型を区別するような温度依存的ハイブリダイゼーション特性をもつが、ステップiv）の温度依存的ハイブリダイゼーション特性はステップiii）の温度依存的ハイブリダイゼーション特性と同じであり、また該第１プローブによって区別される少なくとも２つのウイルス型は該第２プローブによって区別される少なくとも２つのＨＣＶ型とは異なることを特徴とするステップ；
ｃ）該標的ハイブリダイゼーション複合体の温度依存的ハイブリダイゼーション特性を計測して、各ハイブリダイゼーション複合体に対応するハイブリダイゼーションプロファイルを生成させるステップであって、ある温度範囲で標的ハイブリダイゼーション複合体を検出することにより、標的ハイブリダイゼーション複合体のＴｍを決定することを含むステップ；
ｄ）該ハイブリダイゼーションプロファイルを多次元分析により互いに比較して複合プロファイルを生成させるステップ；および
ｅ）該複合プロファイルを少なくとも５つのＨＣＶ型のうちの１つと相関させ、該第１プローブおよび第２プローブを含むハイブリダイゼーション複合体を考慮することによりＨＣＶ型の帰属を行うようにするステップを含んでなり、且つ、
アンプリコンの蓄積速度をモニターし、そのアンプリコン蓄積速度をウイルス量と相関させることによってサンプル中のウイルス量を決定するステップをさらに含むとともに、
モニタリングステップはアンプリコン定量プローブの使用によって行われ、更に
前記第１及び第２プローブが、配列番号９〜５７のヌクレオチド配列より独立に選択されるヌクレオチド配列を含んでなる方法。
【請求項２】
ａ）前記ハイブリダイゼーションステップが、複数の、少なくとも３つの標的ハイブリダイゼーション複合体を形成させるべく、第１及び第２プローブに加えて、少なくとも１つの追加的なプローブを更に含んでなること；
ｂ）前記複数のハイブリダイゼーション複合体は区別し得るハイブリダイゼーション特性を有すること；及び
ｃ）前記相関ステップでのＨＣＶ型の帰属は、該複数の少なくとも３つのハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性を考慮して行われること
を特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
サンプル中に存在する場合のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の型を識別するための閉管法であって：
ａ）単一のハイブリダイゼーション反応において、該ＨＣＶに由来する核酸を少なくとも第１プローブおよび第２プローブとハイブリダイズさせて、少なくとも２つの標的ハイブリダイゼーション複合体を形成させるステップであって、
ｉ）各プローブはＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列と相補的または部分的に相補的であり；
ii）該ＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列は少なくとも２つのＨＣＶ型の間で配列異質性を示し；
iii）該第１プローブと該ヌクレオチド配列とを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも２つのＨＣＶ型を区別するような温度依存的ハイブリダイゼーション特性を有し、ここで温度依存的ハイブリダイゼーション特性とは、あるＨＣＶ遺伝子型内の配列のばらつきにより生じる、識別可能な融点（Ｔｍ）範囲であり；また
iv）該第２プローブと該ヌクレオチド配列とを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも２つのＨＣＶ型を区別するような温度依存的ハイブリダイゼーション特性をもつが、ステップiv）の温度依存的ハイブリダイゼーション特性はステップiii）の温度依存的ハイブリダイゼーション特性と同じであり、また該第１プローブによって区別される少なくとも２つのウイルス型は該第２プローブによって区別される少なくとも２つのＨＣＶ型とは異なることを特徴とするステップ；
ｂ）該標的ハイブリダイゼーション複合体の温度依存的ハイブリダイゼーション特性を計測して各ハイブリダイゼーション複合体に対応するハイブリダイゼーションプロファイルを生成させるステップであって、ある温度範囲で標的ハイブリダイゼーション複合体を検出することにより、標的ハイブリダイゼーション複合体のＴｍを決定することを含むステップ；
ｃ）該ハイブリダイゼーションプロファイルを多次元分析により互いに比較して複合プロファイルを生成させるステップ；および
ｄ）複合プロファイルを少なくとも５つのＨＣＶ型のうちの１つと相関させ、少なくとも該第１プローブおよび第２プローブを含むハイブリダイゼーション複合体を考慮することによりＨＣＶ型の帰属を行うようにするステップを含んでなり、
前記第１および第２プローブは、配列番号９〜５７のヌクレオチド配列より独立に選択されるヌクレオチド配列を含んでなる方法。
【請求項４】
複数のプローブを含む組成物であって、
ａ）各プローブはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノム内のヌクレオチド配列と相補的または部分的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、該ＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列は少なくとも２つのＨＣＶ型の間で配列異質性を示す；
ｂ）（ｉ）該複数のプローブのうちいずれか１つのプローブと（ii）少なくとも２つのＨＣＶ型に由来するヌクレオチド配列とを含むハイブリダイゼーション複合体は、少なくとも２つのＨＣＶ型の区別を可能にするような温度依存的ハイブリダイゼーション特性を有し、ここで温度依存的ハイブリダイゼーション特性とは、あるＨＣＶ遺伝子型内の配列のばらつきにより生じる、識別可能な融点（Ｔｍ）範囲である；
ｄ）該複数のプローブのうちいずれか１つのプローブによって区別される少なくとも２つのＨＣＶ型は、該複数のプローブのうち別の第２のプローブによって区別される少なくとも２つのＨＣＶ型とは異なる；
ｅ）該複数のプローブのうち少なくとも２つのプローブを含む各ハイブリダイゼーション複合体の温度依存的ハイブリダイゼーション特性は多次元分析において少なくとも５つのＨＣＶ型のうちの１つと相関しており、該ハイブリダイゼーション複合体の温度依存的ハイブリダイゼーション特性を考慮することによりＨＣＶ型の帰属が行われる；及び
ｆ）前記複数のプローブは配列番号９〜５７のヌクレオチド配列より独立に選択される
ことを特徴とする組成物。
【請求項５】
核酸をさらに含む請求項４に記載の組成物であって、該核酸は
ａ）該ＨＣＶアンプリコンの一方の鎖を生成しうる増幅プライマーであるか、または
ｂ）該ＨＣＶアンプリコンを生成しうる増幅プライマー対であり；
また該プライマーまたはプライマー対は熱安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、遊離デオキシリボヌクレオチド三リン酸および好適なＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝剤と混合されることを特徴とする組成物。
【請求項６】
サンプル中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の型を識別するための診断キットであって：
ａ）複数のＨＣＶ型識別プローブであって：
ｉ）各型識別プローブはＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列と相補的または部分的に相補的であるヌクレオチド配列を含む；
ii）該ＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列は少なくとも２つのＨＣＶ型の間で配列異質性を示す；
iii）（ｉ）該複数のプローブのうち任意の１つのプローブと（ii）少なくとも２つのＨＣＶ型に由来するヌクレオチド配列とを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも２つのウイルス型の区別を可能にするような温度依存的ハイブリダイゼーション特性を有し、ここで温度依存的ハイブリダイゼーション特性とは、あるＨＣＶ遺伝子型内の配列のばらつきにより生じる、識別可能な融点（Ｔｍ）範囲である；
iv）該複数のプローブのうちいずれか１つのプローブによって区別される少なくとも２つのＨＣＶ型は、該複数のプローブのうち別の第２のプローブによって区別される少なくとも２つのＨＣＶ型とは異なる；および
ｖ）該複数のプローブのうち少なくとも２つのプローブを含む各ハイブリダイゼーション複合体の温度依存的ハイブリダイゼーション特性は多次元分析において少なくとも５つのＨＣＶ型のうちの１つと相関しており、該ハイブリダイゼーション複合体の温度依存的ハイブリダイゼーション特性を考慮することによりＨＣＶ型の帰属が行われる；
ことを特徴とする複数のＨＣＶ型識別プローブ；および
ｂ）該複数の標的プローブのうちの一標的プローブを含むハイブリダイゼーション複合体の温度依存的ハイブリダイゼーション特性を計測するための説明書を含んでなるとともに、
前記複数のプローブが、配列番号９〜５７のヌクレオチド配列より独立に選択される、診断キット。
【請求項７】
ＨＣＶヌクレオチド配列を増幅するための増幅プライマー対を更に含んでなるとともに、前記プライマー対が配列番号５８及び５９のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項６に記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルス診断法に関する。本発明は特にC型肝炎ウイルス(HCV)の型判定(たとえば遺伝子型判定および亜型判定)に関する。本発明はサンプルたとえば患者由来サンプル中のHCVの型判定のための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
HCV感染は世界的に問題化している。HCV感染は一般に持続性であり、肝硬変や肝細胞がんなどの慢性肝疾患を誘発する。HCV感染は米国では肝移植の原因の筆頭である。全世界では毎年約100万の新規HCV感染例が報告されている。米国だけでも新規感染例は毎年3万にのぼり、また感染者数は推定400万人に達する。
【０００３】
現在、米国では年間8,000〜10,000人がHCVのために死亡している。診断法や治療法の改良が図られなければ、その数は向こう10〜20年で3倍に増加すると見込まれる(National Institute of Health Consensus Development Conference Panel (1997) National Institute of Health Consensus Development Conference Panel statement: “Management of Hepatitis C,” Hepatology 26 (Suppl. 1): 2S-10S)。
【０００４】
HCVゲノムは高度に多型性であり、多数の分離株(遺伝子型および亜型)が特性解析されてきた。異なるウイルス型は異なる疾患転帰に、また治療法への異なる反応性に、相関する。感染ウイルスの遺伝子型(および/または亜型)に関する知見は臨床医に、感染患者向けの至適治療方針を決定するための重要な指針を与えてくれる。しかし、数を増す一方の既知HCV型を判別しうるような診断方法の開発が課題となっている。
【０００５】
技術上必要なのは改良型HCV診断法の開発である。数を増す一方の既知HCV遺伝子型(および亜型)分離株を鑑別しうるような改良方法が必要である。さらに、サンプル中のHCVの遺伝子型判別と定量(たとえばウイルス量またはコピー数の決定)を同時に行えるような方法も必要である。本発明はこれらの必要を満たす新規な組成物および方法を、追加の効用と共に、提供する。
【０００６】
本発明の詳細な説明に先立って、HCVの命名法と生物学の関連部分について以下述べておく。それらは本発明の理解に必要な題材であり、HCVゲノム、HCV型命名法、HCV型判別の臨床的意義、およびHCV型判別の方法論などにわたる。
【０００７】
HCVゲノム
HCVのゲノム(図1参照)は鎖長約10kbのプラス一本鎖RNAであり、ペスチウイルスおよびフラビウイルス属のゲノムとの類似性が顕著である。最初のHCV分離株(HCV-1)のゲノムは約9.4kb であり、3'末端ポリAテールを含んでいた。Choo et al.(1991) “Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus” (C型肝炎ウイルス遺伝子の構成と多様性) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455。HCV-1のゲノム配列は341塩基の5'非翻訳領域(5'-UTR)、3,011アミノ酸からなるポリプロテインをコードする長い読み取り枠(ORF)、それに約27塩基の3'非翻訳領域(3'-UTR)を含んでいた。HCVゲノムおよびポリプロテインの略図(図1)を参照。
【０００８】
HCVのRNAゲノムは宿主の翻訳装置によって単一産物のポリプロテインとして翻訳され、該翻訳産物のタンパク質分解処理によりウイルスタンパク質が産生される。各遺伝子型のORFは長さが特徴的に異なる。ORFの長さはたとえば1型分離株では約9,400ヌクレオチドであり、2型分離株では一般に9,099ヌクレオチドであり、また3型分離株では一般に9,063ヌクレオチドである。Bukh et al. (1995) “Genetic heterogeneity of hepatitis C virus: quasispecies and genotypes(C型肝炎ウイルスの遺伝的異質性: 準種と遺伝子型)” Semin. Liver Dis., 15:41-63。
【０００９】
HCVのゲノム構造/構成はフラビウイルス科のそれに最も近い。ほとんどのフラビウイルスタンパク質の既知機能とも整合するが、HCVでもN末端タンパク質はC(キャプシド/コア)、E1およびE2(エンベロープ)を含めて構造タンパク質であり、C末端非構造タンパク質はNS2(メタロプロテアーゼ)、NS3(セリンプロテアーゼ/ヘリカーゼ)、NS4およびNS5(NS5B RNAポリメラーゼ)を含めて、ウイルスの複製に関与していると考えられる。図1はHCV RNAゲノムおよびコード化ポリペプチドの構成を示す略図である。
【００１０】
原型HCV分離株(現在の呼称はHCV-1a)の同定と特性解析に続いて、他の分離株も世界のあちこちで同定された(し、また同定され続けている)。HCVゲノムの全長にわたる配列比較により、これら独自の分離株は互いに異なること、そのヌクレオチド不一致率は最高で35%にも達することが判明した。Okamoto et al. (1992) Virology 188:331-334。配列変異性はHCVゲノムの全域で観測されるが、その度合いは領域によって異なる。たとえば5'-UTR領域では概して高い保存性の配列が観測されるが、逆にエンベロープ(E)領域などは超可変性の塩基配列を示す。
【００１１】
HCV型の命名法
本発明の論議に移るには予めHCV型命名法の理解が求められる。研究者たちはいくつかの分類体系/命名法を使用して種々のHCV分離株を解析してきたという経緯があるが、結果として学術文献に混乱が生じてしまった。今日では統一的なHCV遺伝子型/亜型命名法が採用されるに至った。Simmonds et al. (1994) Letter, Hepatology 19:1321-1324; Zein (2000) “Clinical Significance of Hepatitis C Virus Genotypes” (C型肝炎ウイルス遺伝子型の臨床的重要性) Clinical Microbiol. Reviews 13(2):223-235; Maertens and Stuyver (1997) “Genotypes and Genetic Variation of Hepatitis C Virus” (C型肝炎ウイルスの遺伝子型および遺伝子変化) p.182-233, in Harrison and Zuckerman (eds.), The Molecular Medicine of Viral Hepatitis, John Wiley and Sons, Ltd., Chichester, England。この分類法によれば、HCV分離株は塩基配列分散を基準にして主要遺伝子グループすなわち遺伝子型へと分類される。これらの遺伝子型には番号が(アラビア数字で)一般に発見順に付与される。ある遺伝子型の内部で互いに関連性の強いHCV株は亜型と命名され、アルファベットの小文字が一般に発見順に付与される。個別分離株の内部に見られる遺伝子変異体は準種という。HCVの準種は宿主内での複製時の突然変異の集積に由来すると推測される。
【００１２】
任意の2 HCV分離株間の関連性の度合いは、たとえば2ゲノム間のゲノム全長にわたる塩基一致率を求めることにより、定量することができる。この関連性分析の一例、およびウイルス分離株の関連性を表すための命名法使用例を図2 (出典: 前掲Zein (2000))に示す。前掲Simmonds et al. (1994)提案の命名法を使用すると、遺伝子型、亜型および準種の間の関連性の度合いの強まりを、ゲノム全長にわたる塩基配列一致率の点から、眺めることができる。図2の表に示される提案によれば、HCV分離株の間で関連性の度合いが最も強いのは準種であり、遺伝子型が同じなら同じ亜型の分離株が異なる亜型の分離株よりも配列一致率は高くなる。
【００１３】
あるいは、たとえば図3に示すように、比較的小さなゲノムドメインにわたるゲノム相同性を調べることによりHCV遺伝子型間の関連性を定量してもよい。この比較にはHCVのNS5 ORFに由来する222塩基の断片(原型HCV-1a分離株の塩基位置7975〜8196)を使用する。この配列相同性比較もまた、あるHCV亜型分離株は遺伝子型を異にする分離株に対するよりも同じ遺伝子型の他の亜型に対する関連性のほうが強いという前掲Simmonds et al. (1994)提案を支持する。
【００１４】
現在、全世界で11のHCV遺伝子型が確認されている。しかし異なる遺伝子型間の進化(系統)的関係を再吟味し、HCV分離株の分類/割り当て先としての確認済み遺伝子型の数を再検討するのがよいとの提言もなされている。HCV遺伝子型のサブセットには互いの関連性のほうが、類縁関係の遠い他の遺伝子型に対する関連性よりも強いものがあり、改良HCV命名法にはその点を反映させるのがよいとする報文もある。11の遺伝子型は6つのHCVクレードに再編することが可能ではないか提言されている。こうしたクレードへの再編は遺伝子型間の系統的関係を反映し、遺伝子型1、2、4および5はいずれも別個のクレードを構成するが、遺伝子型3および10は単一のクレード3に整理され、また遺伝子型6、7、8、9および11も単一のクレード6に整理される。Robertson et al. (1998) Arch. Virol., 143(12):2493-2505; 前掲Zein (2000)。
【００１５】
全世界では約78のHCV亜型が知られており、11の遺伝子型をすべて包含する。その一例をまとめたのが図4である。この表はいくつかの(すべてのではない)HCV型特に臨床分離株とよく見られそうな亜型のリストであり、公知の原型的および/または代表的分離株の名前も示す。
【００１６】
多数のHCV分離株のゲノム配列が完全に判明している。図5は臨床的に重要なHCV分離株の5'-UTRの33塩基ドメインのコンセンサス配列を示す表である。HCV-1aの塩基配列と同じである塩基位置はダッシュで示す。HCV-1aとは異なる塩基位置は塩基名で示す。
【００１７】
本明細書でのHCV遺伝子型、亜型および準種への言及はすべて前掲のSimmonds et al. (1994)、Zein (2000)およびMaertens and Stuyver (1997)で開示されている命名法に従う。
【００１８】
HCV型判別の臨床的重要性
患者のHCV感染の型判別は引き続き、該感染の悪性度に関する、また種々の治療方針への該感染の反応の可能性に関する、重要な予測因子である。HCV遺伝子型1はHCV遺伝子型2または3と比べて高感染性の株であり、またαインターフェロン(INF-α)療法(およびリバビリン併用療法)に反応しにくい株である。Nolte, “Hepatitis C Virus Genotyping: Clinical Implications and Methods” (C型肝炎ウイルスの遺伝子型判別: 臨床的な意義および方法) Molecular Diagnosis 6(4):265-277(2001); Dufour, “Hepatitis C: Laboratory Test for Diagnosis and Monitoring of Infection” (C型肝炎: 感染診断/監視のための臨床検査) Clinical Laboratory News, November 2002, p.10-14; Pawlotsky, “Use and Interpretation of Hepatitis C Virus Diagnostic Assays” (C型肝炎ウイルス診断アッセイの使用と解釈) Clinics in Liver Disease, Vol. 7, No. 1 (February 2003)。HCV感染の型判別の目標はしばしばHCV遺伝子型1に感染した患者の、他HCV型に感染した患者と対比する形での識別である。さらに、既知HCV亜型の数が増加しているため、複雑なHCV系統識別を可能にするような、臨床目的と研究目的を兼ねた単純なHCV型判別方法が技術上必要である。HCV負荷情報(たとえばコピー数およびHCVゲノム定量)を同時にもたらすようなHCV型判別方法もまた技術上必要である。
【００１９】
HCV型の分布にはかなりの地域差が存在する。HCV亜型1aおよび1bは米国と欧州で最も一般的な亜型である。日本では、亜型1bがHCV感染症例の最高73%を占める。HCV亜型2aおよび2bは北米や欧州、日本では割合一般的であるが、亜型2cは北イタリアで一般的に見られる。HCV-3aは欧州と米国の注射薬物乱用者の間で特に多い。HCV遺伝子型4は北米と中東に多い模様であり、また遺伝子型5および6は南アフリカと香港にそれぞれ限られるように見受けられる。HCV遺伝子型7、8および9はベトナム人患者だけから検出されており、また遺伝子型10および11はインドネシアからの患者で同定されている。前掲のNolte (2001); Pawlotsky (2003); Zein (2000)を参照。
【００２０】
個別HCV遺伝子型および亜型に地理的集積が見られるため、HCV型は特定集団内でのHCV感染の源を追跡する際の有用な疫学マーカーともなりうる。たとえばHCV型判別の使用により、一群のアイルランド人女性の間のHCV感染源を、汚染された抗D免疫グロブリン製剤と特定することができた。Power et al. (1995) “Molecular epidemiology of an outbreak of infection with hepatitis C virus in recipients of anti-D immunoglobulin” (抗D免疫グロブリン製剤の被投与者におけるHCV集団感染の分子疫学) Lancet 345:1211-1213。HCV型を疫学マーカーとして使用した例は他にも知られている。たとえばHohne et al. (1994) “Sequence variability in the env-coding region of hepatitis C virus isolated from patients infected during a single source outbreak (単一源集団感染時の感染患者から分離されたC型肝炎ウイルスのenvコード領域の配列変異性)” Arch. Virol., 137:25-34; およびBronowicki et al. (1997) “Patient-to-patient transmission of hepatitis C virus during colonoscopy(結腸内視鏡検査を介したC型肝炎の患者間伝染)” N. Engl. J. Med., 337:237-240を参照。
【００２１】
HCV型判別の方法論
任意の感染で見つかるHCV分離株は、地理的な株分布、疾患転帰および抗HCV療法への反応などの差異に応じて異なる。信頼性の高いHCV遺伝子型判別方法は重要な臨床検査法である。さらに、多数の、別々のHCV種が同定されているため、HCV型判別方法は多数のHCV型(遺伝子型および亜型)を識別しうることが重要である。たとえばHCV型判別検査法では5つ以上の遺伝子型を識別しうるのが有用である。あるいはHCV型判別検査法では5つ以上の亜型を識別しうるのが有用である。以下は核酸に基づくHCV型判別方法のまとめである。
【００２２】
・  塩基配列分析法
HCV遺伝子型および亜型判別の参照標準は(たとえば患者由来の臨床サンプルに由来する)HCVゲノムRNAのRT-PCRでHCVゲノムから得られたアンプリコンの塩基配列分析とそれに続く系統学的解析である。しかし、直接的な配列分析は(たとえ非放射性試薬を使用する自動配列分析装置を導入しても)能率が低いし、また専用装置が必要となるため、非現実的である。そのうえ、混合感染の症例では塩基配列分析による遺伝子型および亜型判別法を用いると、あいまいな結果に終わりかねない。
【００２３】
・  PCR法
型特異的PCRプライマーを使用するPCR再増幅法でHCV型を判別する場合もある。型判別は汎用コンセンサスプライマー(すなわちHCV型に関係なくHCVゲノムのアンプリコンを生成するプライマー)による1次PCR増幅とそれに続く型特異的プライマーたとえばコア領域内の型特異的プライマーによるネステッドPCRとによって行う。これらのアッセイでは遺伝子型/亜型判別を行うに足る量のアンプリコンを生成させるためには複数のPCRプライマーセットが必要となる。これら方法は、HCV型判別に複数のPCRプライマーセットを必要とし、またしばしば感度と特異性を欠くといった難点がある。Xavier and Bukh (1998) “Methods for determining the hepatitis C genotypes(C型肝炎ウイルス遺伝子型の判別方法)” Clinical Microbiol. Reviews 13(2):223-235; 前掲Zein (2000); Okamoto et al. (1992) “Typing hepatitis C virus by polymerase chain reaction with type-specific primers: application to clinical surveys and tracing infectious sources(型特異的プライマー使用のPCR法によるC型肝炎ウイルスの型判別: 臨床検査および感染源特定への応用)” J. Gen. Virol., 73:673-679; Widell et al. (1994) “Genotyping of hepatitis C virus isolates by a modified polymerase chain reaction assay using type-specific primers: epidemiological applications(型特異的プライマー使用の改良PCR法によるC型肝炎ウイルス分離株の遺伝子型判別: 疫学的応用)” J. Med. Virol., 44:272-279。
【００２４】
・  ハイブリダイゼーション法
HCV分離株の型判別は複数の型特異的ハイブリダイゼーションプローブを使用して行うこともできる。このウイルス型判別法では汎用プライマーによる1次PCR増幅とそれに続く型特異的プローブとのハイブリダイゼーションとを使用する。この型特異的プローブとのハイブリダイゼーションは固定ハイブリダイゼーション条件で行い、所与のハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーション複合体の存在または不存在を評価する。このアッセイ法では任意の1プローブでは複数の遺伝子型/亜型からの決定的な識別を行うことは不可能なので、遺伝子型/亜型を帰属させるには複数のプローブが必要となる。この方法はHCV型判別に複数のプローブを必要とするのが難点である。
【００２５】
HCV型特異的ハイブリダイゼーションアッセイ法の応用例にラインプローブアッセイ(LiPA)法がある。これはたとえば次のような文献で開示されている: Stuyver et al. (1993) “Typing of hepatitis C virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay(LiPA法の使用によるC型肝炎ウイルス分離型の型判別と新亜型の特性解析)” J. Gen. Virol., 74:1093-1102; Stuyver et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10134-10138; Andonov and Chaudhary (1995) Jour. Clin. Microbiol., 33(1):254-256; Stuyver et al. (1996) Jour. Clin. Microbiol., 34(9):2259-2266; Stuyver et al. (2000) Jour. Clin. Microbiol., 38(2): 702-707; また、前掲Maertens and Stuyver (1997)で概説されてもいる。この技術を組み込んだ業務用キットはInnogenetics(Zwijnaarde, Belgium)が生産している。次の文献を参照: 米国特許第6,548,244号(2003年4月15日Maertens らに対して付与;発明の名称 “PROCESS FOR TYPING HCV ISOLATES” (HCV分離株の型判別方法))明細書; 公開PCT国際出願第WO96/13590号(1996年5月9日にMaertens and Stuyverが公開; 発明の名称 “NEW SEQUENCES OF HEPATITIS C VIRUS GENOTYPES AND THEIR USE AS PROPHYLACTIC, THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC AGENTS”(C型肝炎ウイルス遺伝子型の新配列およびその予防/治療/診断薬としての使用)); および公開PCT国際出願第WO94/25601号(1994年11月10日にMaertens and Stuyverが公開; 発明の名称 “NEW SEQUENCES OF HEPATITIS C VIRUS GENOTYPES AND THEIR USE AS PROPHYLACTIC, THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC AGENTS”(C型肝炎ウイルス遺伝子型の新配列およびその治療/診断薬としての使用))。LiPA法は担体(テストストリップ)表面に固定した複数の(21もの)型特異的プローブを使用して行うドットブロット式またはスロットブロット式のアッセイである。臨床サンプルから抽出したHCV 5'-UTR領域に由来するHCVアンプリコンを固定ハイブリダイゼーション条件下に種々のプローブに対して同時にハイブリダイズさせ、得られたハイブリダイゼーション複合体パターンからウイルスの型を判別する。
【００２６】
このLiPA法の難点としては、任意の1プローブでは遺伝子型を帰属させることができないため、サンプル中のHCVの遺伝子型および/または亜型の判別には複数のプローブを(実に21ものプローブを)使用する必要がある。
【００２７】
いくつかの研究では、1プローブ(または少数のプローブ)を使用してHCV感染を少数の亜型のうちの1つに分類にするようなHCV型判別方法が使用されている。そこで使用されるプローブはハイブリダイゼーション条件の操作により複数の遺伝子型/亜型に対してハイブリダイズしうるという意味で「型特異的」ではない。しかし、報告されているその種のプローブでは識別しうる遺伝子型/亜型の数が限られる。たとえばSchroter et al. (2002) Jour. Clin. Microbiol., 40(6)2046-2050; Bullock et al., (2002) Clinical Chemistry 48(12):2147-2154を参照。
【００２８】
・  制限酵素切断(RFLP)法
HCVの型判別は従来の制限断片長多型(RFLP)アッセイ法の変法によっても試みられてきた。このHCVアッセイ法では、遺伝子型特異的切断部位を認識する制限酵素で汎用PCRアンプリコンを消化する。たとえばNakao et al. (1991) “Typing of hepatitis C virus genomes by restriction fragment length polymorphism(制限断片長多型によるC型肝炎ウイルスゲノムの型判別)” J. Gen. Virol., 72:2105-2112; Murphy et al. (1994) Letter, J. Infect. Dis., 169:473-475を参照。NS5および5'-UTRドメインには型特異的制限部位が存在することが分かっている。このアッセイ法の遺伝子型/亜型判別への使用は、制限部位の変化を招く結果となるような多型遺伝子座の数が限られるため、限定される。
【００２９】
HCV型判別の難しさ
サンプル中のHCVウイルス型の判別は重要な臨床手段である。HCV型判別手法の1つは、既知HCV型と試験用HCVサンプルを使用して、HCV型特異的プローブで形成されるハイブリダイゼーション複合体の融解温度を特性解析することである。理想的には、HCVゲノム配列(またはHCVゲノム配列の誘導体および/または部分)と複合体を形成するHCV型判別用プローブは個別HCV型に対応して固有のTm値を生じ、以ってその試験で計測されるTm値に基づいて特定のHCV型への帰属が行われるようにする。
【００３０】
しかし、既知HCV型の数が増し、また同定される準種も多くなるにつれ、単一プローブの使用によるHCV型判別はますます困難になる。これを図解したのが図8である。この図では、仮想HCV型判別プローブAがCHV遺伝子型1〜6と複合体を形成する。これらの複合体は各々、その特性としてある範囲のTm値をとり、単一の絶対値はとらない。このTm値範囲には多数の変数が寄与する。そうした変数の非限定的な例は(i)HCV配列変異体たとえば準種、(ii)特定の融解分析反応条件(たとえばハイブリダイゼーション条件中の塩濃度および核酸濃度)、および(iii)サーモサイクラーや検出器(たとえば分光光度計)などを含む融解分析装置の正確度と精密度である。図8に示すように、ある任意のHCV/プローブの組み合わせに対応するTm値範囲は同じプローブと別のHCV型との組み合わせに対応するTm値範囲と重なる(または識別しえない)という可能性がある。そのため、HCV型判別は確定不可能に、または曖昧になる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
本発明はHCV型判別のための組成物および方法を、特に技術上周知の他のHCV型判別方法に優るHCV型判別のための組成物および方法を提供する。本明細書で開示するHCV型判別のための組成物および方法は、図8に示すようなHCV型判別の限界を克服している。本発明はHCV分離型を型判別する方法を提供するが、該方法はHCV型判別用プローブの組み合わせによって個別HCV型に関する固有の、補完的な情報をもたらし、以って少なくとも5つのHCV型(遺伝子型および/または亜型)を識別しうるようにすることを特徴とする多次元分析法を使用する。この多次元型判別法はHCV型の特性解析のための多数のデータポイントを提供して、型判別の正確度とロバストネスを高めると同時に遺伝子型内差異に由来する食い違いの解決方法を提供する。さらに、本発明はサンプル中のHCVを型判別すると同時にサンプル中のHCV遺伝物質を定量する(たとえばウイルス量またはコピー数を決定する)ことができるような方法を提供する。本発明によって教示される組成物および方法はまた他の利点ももたらすが、それらは本明細書を読み進むうちに明らかになろう。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
発明の概要
本発明はHCVの型判別たとえば遺伝子型判別および/または亜型判別のための組成物および方法を提供する。本発明は特に、HCVサンプルを5つ以上のHCV型(たとえば遺伝子型1、2、3、4、5または6より、あるいは亜型1a/b/c、2a/c、2b、3a、4a、5aまたは6aより、選択されるHCV型)に帰属させるために使用しうるHCV型判別のための組成物および方法を提供する。これらの方法は多次元分析で複数のHCV型判別プローブから得られたハイブリダイゼーションデータを総合して試験サンプル中のHCVについてHCV型帰属を行う。本発明はまた、たとえばHCV型判別プローブやHCV型判別診断キットなどを含む関連組成物を提供する。
【００３３】
本発明は実施態様によっては、サンプル中のC型肝炎ウイルス(HCV)の型判別のための方法を提供する。これらの方法は一般に次のステップを含む: (a)該サンプルに由来するHCVゲノムの一部分を増幅して少なくとも1つのアンプリコンを生成させるステップ; (b)該アンプリコンを第1および第2型判別プローブとハイブリダイズさせて少なくとも2つの標的ハイブリダイゼーション複合体を形成させるステップであって、(i)各プローブはHCVゲノム内の塩基配列と相補的または部分的に相補的であり; (ii)相補的または部分的に相補的であるハイブリダイゼーション領域は少なくとも2つのHCV型の間で配列異質性を示し; (iii )第1プローブを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも2つのHCV型を区別するような特徴的ハイブリダイゼーション特性をもち; また(iv)第2プローブを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも2つのHCV型を区別するような特徴的ハイブリダイゼーション特性をもつが、第1プローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型は第2プローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型とは異なることを特徴とするステップ; (c)標的ハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性を計測するステップ; および(d)計測された特徴的ハイブリダイゼーション特性を少なくとも5つのHCV型のうちの1つと相関させ、HCV型判別用の第1および第2プローブを含むハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性を考慮することによりHCV型の帰属を行うようにするステップ。これらの方法を使用すると、HCV型を遺伝子型たとえば遺伝子型1、2、3、4、5または6より、あるいは遺伝子型1、2、3、4、5または6の亜型たとえば亜型1a、1b、1c、2a、2b、2c、3a、3b、4a、5aまたは6aより、選択することができる。しかし、本発明は本明細書に記載するHCV型に限定されるものではない。というのは本発明の組成物および方法は任意のHCV型に適用しうるからである。実施態様によっては、使用サンプルはヒト血液またはヒト血清を含む、または使用サンプルはヒト血液またはヒト血清に由来する。
【００３４】
実施態様によっては、増幅ステップは逆転写(RT)とポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を組み合わせた方法による。随意に、該PCR法は配列番号58および59の塩基配列を含むプライマー対を使用することができる。HCVアンプリコンの生成に使用されるPCRプライマーは複数のHCV型に由来するアンプリコンを生成しうるのが好ましい。
【００３５】
本開示によって教示される多次元HCV型分析は2つのHCV型判別プローブだけに限定されない。それどころか、分析には3つ以上のプローブを使用することができる。たとえばある種の実施態様では、本発明の方法は改変されて、(a)ハイブリダイゼーションステップが、第1および第2 HCV型判別プローブに加えて少なくとも1つの追加的な型判別プローブを含み、少なくとも3つの標的ハイブリダイゼーション複合体を形成し、(b)該複数のハイブリダイゼーション複合体は特徴的ハイブリダイゼーション特性をもち、また(c)相関ステップでのHCV型の帰属は該複数の、少なくとも3つの、ハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性を考慮して行われるようになる。
【００３６】
HCVとプローブのハイブリダイゼーション複合体は各々同じハイブリダイゼーション反応で形成することを意図してはいない。本発明の方法のある種の実施態様では、ハイブリダイゼーションステップは単一ハイブリダイゼーション反応からなるが、複数のハイブリダイゼーション反応からなってもよい。他の態様では、HCV型判別プローブは増幅ステップのときに存在してもよいし、存在していなくてもよい。型判別プローブは、増幅時に存在しない場合には、増幅後に反応混合液に添加してもよい。
【００３７】
実施態様によっては、HCV型判別プローブは随意に、HCVゲノムの5'-UTRまたはNS5 ORF内部の塩基配列と相補的または部分的に相補的である塩基配列を有する。たとえばHCV型判別プローブは、配列番号9〜57の塩基配列より独立に選択される塩基配列を有してもよい。随意に、第1および第2 HCV型判別プローブは、たとえば配列番号26および54、配列番号10および53、それに配列番号57および52より選択される塩基配列を含んでもよい。
【００３８】
実施態様によっては、HCV型判別プローブのうちの少なくとも1つはFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)供与体、FRET消光体、または両方を含んでよい。あるいは、少なくとも1つのHCV型判別プローブはFRET供与体を含み、ハイブリダイゼーションステップで可溶性FRET消光体たとえばチアジン色素を使用してもよい。実施態様によっては、第1、第2 HCV型判別プローブは共にFRET供与体を含むが、各FRET供与体の励起および発光スペクトルは異なる。複数の標識を使用する場合には、計測ステップは複数の波長で放射光を検出することによって行うことができる。随意に、2種類の標識システムを同時に使用する場合には、FRET供与体を含むHCV型判別プローブのうちの少なくとも1つはFRET消光体のをさらに含む。
【００３９】
HCV型判別プローブの化学構造は特に限定されない。プローブが多様な構造をもちうることは当業者には自明であろう。たとえばヌクレオチドオリゴマーHCV型判別プローブは天然型ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、1つまたは複数の天然型塩基、非天然型ヌクレオチド間結合、非天然型ヌクレオチド骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【００４０】
本発明の方法のいくつかの実施態様では、ハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性は温度依存的ハイブリダイゼーション特性たとえば融解温度(Tm)である。Tmを特徴的なハイブリダイゼーション特性として使用する場合には、計測ステップである温度範囲にわたり標的ハイブリダイゼーション複合体を検出し、以って標的ハイブリダイゼーション複合体のTmを決定するステップを含む。
【００４１】
これらのHCV型判別方法は相関ステップを含み、そこで標的ハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性が、各プローブと複数の既知HCV型とを含むハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性と比較される。
【００４２】
実施態様によっては、これらのHCV型判別方法はさらにウイルス定量ステップを含み、そこでウイルス型だけでなくウイルス量も決定される。これらの実施態様ではウイルス定量プローブは増幅反応溶液に混ぜる。すなわち、ウイルス判別方法を改良してサンプルからウイルス量情報もまた提供されるようにするが、そこでは増幅ステップは、アンプリコン蓄積のリアルタイム検出のための試薬を使用してアンプリコンの蓄積速度をモニターし、そのアンプリコン蓄積速度をウイルス量と相関させるステップをさらに含む。いくつかの態様では、アンプリコン蓄積のリアルタイム検出のための試薬はアンプリコン定量プローブたとえば配列番号60の塩基配列を含むプローブを含む。実施態様によっては、アンプリコン定量プローブはFRET供与体とFRET消光体を含み、また塩基対合が起こるような条件下でアンプリコンと定量用ハイブリダイゼーション複合体を形成する。これらの定量/型判別方法では、増幅ステップは該増幅ステップで定量プローブ由来の供与体を検出するステップをさらに含んでもよい。
【００４３】
本発明はまた、サンプル中のHCV型を判別する方法を提供するが、ただし該方法はHCV増幅ステップを使用しない。該方法は次のステップを使用する: (a)非増幅HCV核酸(またはHCVに対応または由来する非増幅核酸)を少なくとも第1および第2 HCV型判別プローブとハイブリダイズして少なくとも2つの標的ハイブリダイゼーション複合体を形成するステップであって、(i) 各プローブはHCVゲノム内の塩基配列と相補的または部分的に相補的であり; (ii)ハイブリダイゼーション複合体の相補性または部分的相補性領域は少なくとも2つのHCV型の間で配列異質性を示し; (iii)第1プローブを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも2つのHCV型を区別するような特徴的ハイブリダイゼーション特性をもち; また(iv) 第2プローブを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも2つのHCV型を区別するような特徴的ハイブリダイゼーション特性をもつが、第1プローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型は第2プローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型とは異なることを特徴とするステップ; (b)標的ハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性を計測するステップ; および(c)計測された特徴的ハイブリダイゼーション特性を少なくとも5つのHCV型のうちの1つと相関させ、HCV型判別用の第1および第2プローブを含むハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性を考慮することによりHCV型の帰属を行うようにするステップ。随意に、第1および第2型判別プローブは、配列番号9〜57の塩基配列より独立に選択される塩基配列を含んでもよい。型判別プローブ対は、たとえば配列番号26および54、配列番号10および53、それに配列番号57および52より選択される塩基配列を含んでもよい。
【００４４】
本発明はまた多様な組成物を提供する。たとえば、本発明は次の点を特徴とする複数のプローブを提供する: (a)各プローブはHCVゲノム内の塩基配列と相補的または部分的に相補的である塩基配列を含む; (b)該相補性または部分的相補性領域は少なくとも2つのHCV型の間で配列異質性を示す; (c)(i)複数のプローブのうちいずれか1つのプローブと(ii)少なくとも2つのHCV型に由来する塩基配列とを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも2つのHCV型の区別を可能にするような特徴的ハイブリダイゼーション特性をもつ; (d)複数のプローブのうちいずれか1つのプローブによって区別される少なくとも2つのHCV型は、複数のプローブのうち別の第2のプローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型とは異なる; および(e)複数のプローブのうち少なくとも2つのプローブを含む各ハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性は少なくとも5つのHCV型のうちの1つと相関しており、ハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性を考慮することによりHCV型の帰属が行われる。たとえば複数の型判別プローブは、配列番号9〜57の塩基配列より独立に選択される塩基配列を含んでもよい。随意に、複数の型判別プローブ対は、たとえば配列番号26および54、配列番号10および53、それに配列番号57および52より選択される塩基配列を含んでもよい。実施態様によっては、複数のハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性は融解温度(Tm)である。
【００４５】
複数のHCV型判別プローブを含む本発明の組成物は随意に、逆転写酵素とHCVゲノムの逆転写の開始に好適なプライマーとをさらに含んでよい。複数の型判別プローブを含む組成物はやはり随意に核酸を含んでもよいが、該核酸は(a)該複数のプローブのうちの少なくとも2つの型判別プローブ中の塩基配列と相補的または部分的に相補的である塩基配列を含むHCVアンプリコンであるか、または(b)該HCVアンプリコンを生成しうる増幅プライマーであるか、または(c) 該HCVアンプリコンを生成しうる増幅プライマー対であり、また該プライマーまたはプライマー対は熱安定性のDNA依存性DNAポリメラーゼ、遊離デオキシリボヌクレオチド三リン酸および好適なDNAポリメラーゼ反応緩衝液と混合されることを特徴とする。型判別プローブの組成物のさらに別の実施態様では、複数のプローブのうち少なくとも1つのプローブはFRET供与体を含み、また組成物は該FRET供与体を消光しうる可溶性FRET消光体を含む。
【００４６】
他態様では、本発明はキットを、たとえばサンプル中のC型肝炎ウイルス(HCV)の型判別用の、前述のような複数のHCV型判別プローブを含む診断キットを提供する。本発明の診断キットは実施態様によっては、たとえば構成要素(a)および(b)を、すなわち(a)複数のHCV型判別プローブであって、(i)各型判別プローブはHCVゲノム内部の塩基配列と相補的または部分的に相補的である塩基配列を含む; (ii)該相補性または部分的相補性領域は少なくとも2つのHCV型の間で配列異質性を示す; (iii)(i)複数のプローブのうちいずれか1つのプローブと(ii)少なくとも2つのHCV型に由来する塩基配列とを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも2つのHCV型の区別を可能にするような特徴的ハイブリダイゼーション特性をもつ; (iv)複数のプローブのうちいずれか1つのプローブによって区別される少なくとも2つのHCV型は、複数のプローブのうち別の第2のプローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型とは異なる; および(v)複数のプローブのうち少なくとも2つのプローブを含む各ハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性は少なくとも5つのHCV型のうちの1つと相関しており、ハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性を考慮することによりHCV型の帰属が行われることを特徴とする複数のHCV型判別プローブ; および(b)複数の標的プローブのうちの一標的プローブを含むハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性を計測するための説明書を、含む。本発明の診断キットは1つまたは複数の容器に包装してもよい。
【００４７】
随意に、診断キット中の複数の型判別プローブは配列番号9〜57の塩基配列より独立に選択される。たとえば、複数の型判別プローブが少なくとも2つの型判別プローブを含むような実施態様では、それらのプローブは配列番号26および54、配列番号10および53、それに配列番号57および52より選択される塩基配列を含んでもよい。随意に、診断キットはHCV塩基配列の増幅のための増幅プライマー対を、たとえば配列番号58および59の塩基配列を含むプライマー対を、含んでもよい。
【００４８】
実施態様によっては、診断キットはさらにウイルスの定量、即ち、サンプル中のHCVのウイルス量の決定にも有用である。この場合には、該キットは随意に定量用の試薬を含んでもよい。たとえば定量/型判別両用キットは次の構成要素をさらに含んでもよい: (c)HCVアンプリコンを生成させることができる増幅プライマー対であって、該アンプリコンは複数の型判別プローブのうち少なくとも2つの型判別プローブの内部の塩基配列と相補的または部分的に相補的である塩基配列を含むことを特徴とする増幅プライマー対、および(d)アンプリコン蓄積のリアルタイム検出のためのアンプリコン定量プローブであって、塩基対合が起こるような条件下で該アンプリコンと定量用ハイブリダイゼーション複合体を形成することを特徴とするアンプリコン定量プローブ。
【００４９】
実施態様によっては、本発明の診断キットは標識用または検出用試薬を含む。たとえば診断キット中の少なくとも1つの型判別プローブはFRET供与体を含んでもよいが、その場合、該キットは、該FRET供与体を消光することができるチアジン色素を含む少なくとも1つの可溶性FRET消光体を含む。また別の実施態様では、診断キットは任意数の追加の構成要素を(単独で、または組み合わせて)含んでもよいが、その非限定的な例は逆転写酵素、熱安定性のDNA依存性DNAポリメラーゼ、遊離デオキシリボヌクレオチド三リン酸、標準化サンプル、陽性対照サンプル、陰性対照サンプル、酵素反応用緩衝液、サンプル採集チューブ、増幅反応チューブ、およびマルチウェルプレートなどである。
【００５０】
実施態様によっては、本発明は本発明のHCV型判別方法の多様な側面を統合しその使用を容易にするようなシステムを提供する。本発明の統合システムにはHCVハイブリダイゼーション分析の実行に必要な試薬類(たとえば複数のHCV型判別プローブ)に加えて、たとえばHCV型判別を行うためのコンピューターハードウェア、ソフトウェア、または他の計測装置類を随意に含めてよい。本発明はたとえば、複数の信号の検出をHCV型と相関させるような、構成要素(a)、(b)を含むシステムすなわち(a)ハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性と相関する信号を検出するための検出器; および(b)該検出器により検出される信号を受信し、該受信信号を、複数の既知HCV型を含むハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性の検出時に観測される予想または既定信号と照合することによりHCV型と相関させるような、該検出器と作動可能に接続された相関モジュール; を含むシステムであって、該システムの作動時に、(i)HCV塩基配列と少なくとも第1および第2 HCV型判別プローブとを含むアンプリコンを含む複数のハイブリダイゼーション複合体から信号が生成する; (ii)該第1および第2 HCV型判別プローブの塩基配列はHCVゲノム内の塩基配列と相補的または部分的に相補的である; (iii)ハイブリダイゼーション複合体の相補性または部分的相補性領域は少なくとも2つのHCV型の間で配列異質性を示す; (iv)第1型判別プローブを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも2つのHCV型を区別するような特徴的ハイブリダイゼーション特性をもつ; (v) 第2型判別プローブを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも2つのHCV型を区別するような特徴的ハイブリダイゼーション特性をもつが、第1プローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型は第2プローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型とは異なる; および(vi)少なくとも2つのプローブの各々を含む各ハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性は少なくとも5つのHCV型のうちの1つと相関する、ことを特徴とするシステムを提供する。
【００５１】
随意に、本発明のシステムでは、特徴的ハイブリダイゼーション特性は融解温度(Tm)であり、また相関モジュールは少なくとも第1および第2型判別プローブと複数の既知HCV型のうちの各HCV型とを含むハイブリダイゼーション複合体に対応する予想されたおよび実験的に決定されたTm値のデータセットを含むが、該データセットはコンピューター可読形式である。
【００５２】
一実施態様では、本発明はサンプル中に(存在する場合の)C型肝炎ウイルス(HCV)の型を判別するための、次のステップを含む方法を提供する: a)該サンプルに由来するHCVゲノムの一部分を増幅し、以って少なくとも1つのアンプリコンを生成させるステップ; b)該アンプリコンを少なくとも第1プローブおよび第2プローブとハイブリダイズさせて少なくとも2つの標的ハイブリダイゼーション複合体を形成させるステップであって、i)各プローブはHCVゲノム内部の塩基配列と相補的または部分的に相補的である; ii)HCV内部の該塩基配列は少なくとも2つのHCV型の間で配列異質性を示す; iii)第1プローブと該塩基配列とを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも2つのHCV型を区別するような特徴的ハイブリダイゼーション特性をもつ; またiv) 第2プローブと該塩基配列とを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも2つのHCV型を区別するような特徴的ハイブリダイゼーション特性をもつが、ステップiv)の特徴的ハイブリダイゼーション特性はステップiii)の特徴的ハイブリダイゼーション特性と同じであり、また第1プローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型は第2プローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型とは異なることを特徴とするステップ; c) 標的ハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性を計測して各ハイブリダイゼーション複合体に対応するハイブリダイゼーションプロファイルを生成させるステップ; d)ハイブリダイゼーションプロファイルを互いに比較して複合プロファイルを生成させるステップ; およびe)複合プロファイルを少なくとも5つのHCV型のうちの1つと相関させ、第1および第2プローブを含むハイブリダイゼーション複合体を考慮することによりHCV型の帰属を行うステップ。
【００５３】
別の実施態様では、本発明はサンプル中に(存在する場合の)C型肝炎ウイルス(HCV)の型を判別するための、次のステップを含む方法を提供する: a)該HCVに由来する核酸を少なくとも第1プローブおよび第2プローブとハイブリダイズさせて少なくとも2つの標的ハイブリダイゼーション複合体を形成させるステップであって、i)各プローブはHCVゲノム内部の塩基配列と相補的または部分的に相補的である; ii)該HCV内部の該塩基配列は少なくとも2つのHCV型の間で配列異質性を示す; iii)第1プローブと該塩基配列とを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも2つのHCV型を区別するような特徴的ハイブリダイゼーション特性をもつ; またiv) 第2プローブと該塩基配列とを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも2つのHCV型を区別するような特徴的ハイブリダイゼーション特性をもつが、ステップiv)の特徴的ハイブリダイゼーション特性はステップiii)の特徴的ハイブリダイゼーション特性と同じであり、また第1プローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型は第2プローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型とは異なることを特徴とするステップ; b) 標的ハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性を計測して各ハイブリダイゼーション複合体に対応するハイブリダイゼーションプロファイルを生成させるステップ; c)ハイブリダイゼーションプロファイルを互いに比較して複合プロファイルを生成させるステップ; およびd)複合プロファイルを少なくとも5つのHCV型のうちの1つと相関させ、第1および第2プローブを含むハイブリダイゼーション複合体を考慮することによりHCV型の帰属を行うステップ。
【００５４】
別の実施態様では、本発明は複数のプローブを含む組成物であって、a)各プローブはC型肝炎ウイルス(HCV)ゲノム内部の塩基配列と相補的または部分的に相補的である塩基配列を含むが、該HCVゲノム内部の塩基配列は少なくとも2つのHCV型の間で配列異質性を示す; b)(i)複数のプローブのうちいずれか1つのプローブと(ii)少なくとも2つのHCV型に由来する塩基配列とを含むハイブリダイゼーション複合体は、少なくとも2つのHCV型の区別を可能にするような特徴的ハイブリダイゼーション特性をもつ; d)複数のプローブのうちいずれか1つのプローブによって区別される少なくとも2つのHCV型は複数のプローブのうち別の第2のプローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型とは異なる; およびe)複数のプローブのうち少なくとも2つのプローブを含む各ハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性は少なくとも5つのHCV型のうちの1つと相関しており、ハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性を考慮することによりHCV型の帰属が行われる; ことを特徴とする組成物を提供する。
【００５５】
別の実施態様では、本発明はサンプル中に(存在する場合の)C型肝炎ウイルス(HCV)の型を判別するための、次の構成要素を含む診断キットを提供する: a)複数のHCV型判別プローブであって、i)各型判別プローブはHCVゲノム内部の塩基配列と相補的または部分的に相補的である塩基配列を含む; ii)該相補性または部分的相補性領域は少なくとも2つのHCV型の間で配列異質性を示す; iii)(i)複数のプローブのうちいずれか1つのプローブと(ii)少なくとも2つのHCV型に由来する塩基配列とを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも2つのHCV型の区別を可能にするような特徴的ハイブリダイゼーション特性をもつ; iv)複数のプローブのうちいずれか1つのプローブによって区別される少なくとも2つのHCV型は、複数のプローブのうち別の第2のプローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型とは異なる; およびv)複数のプローブのうち少なくとも2つのプローブを含む各ハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性は少なくとも5つのHCV型のうちの1つと相関しており、ハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性を考慮することによりHCV型の帰属が行われることを特徴とする複数のHCV型判別プローブ; およびb)複数の標的プローブのうちの一標的プローブを含むハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性を計測するための説明書。
【００５６】
別の実施態様では、本発明は複数の信号の検出をHCV型と相関させるような、構成要素a)、b)を含むシステムすなわちa)ハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性と相関する信号を検出するための検出器; およびb)該検出器により検出される信号を受信し、該受信信号を、複数の既知HCV型を含むハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性の検出時に観測される予想または既定信号と照合することによりHCV型と相関させるような、該検出器と作動可能に接続された相関モジュール; を含むシステムであって、該システムの作動時に、i)HCV塩基配列と少なくとも第1および第2プローブとを含む複数のハイブリダイゼーション複合体から信号が生成する; ii)該第1および第2プローブの塩基配列はHCVゲノム内部の塩基配列と相補的または部分的に相補的である; iii)該HCVゲノム内部の塩基配列は少なくとも2つのHCV型の間で配列異質性を示す; iv)第1プローブと該塩基配列とを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも2つのHCV型を区別するような特徴的ハイブリダイゼーション特性をもつ; またv) 第2プローブと該塩基配列とを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも2つのHCV型を区別するような特徴的ハイブリダイゼーション特性をもつが、ステップiv)の特徴的ハイブリダイゼーション特性はステップv)の特徴的ハイブリダイゼーション特性と同じであり、また第1プローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型は第2プローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型とは異なる; ことを特徴するシステムを提供する。
【００５７】
別の実施態様では、本発明は配列番号9〜57より選択される塩基配列を含む単離オリゴヌクレオチドを提供する。
【００５８】
用語の定義
本発明の詳細な説明に移る前に、本発明は、種々変化しうる特定の実施態様に当然ながら限定されないものとする。また当然ながら、本明細書で使用する用語は専ら特定の実施態様の説明を目的としており、範囲を限定するものではない。本明細書および添付の特許請求の範囲では、単数および単数形の用語たとえば「ある」、「一(つの)」、「該」は文脈上明らかに無理な場合を除いて複数形を包含する。従って、たとえば「(単数形の)核酸」は複数の核酸分子を包含するし、また用語「プローブ」は実際問題として多数のプローブ分子を包含する。
【００５９】
特に断らない限り、核酸は左から右へ、5'→3'方向に表記し、またアミノ酸は左から右へ、アミノ基(N末端)→カルボキシル基(C末端)方向に表記する。本明細書に記載の数値域は該数値域の上限値と下限値を含み、また数値域内の任意の各整数と任意の非整数分数を包含する。
【００６０】
特に断らない限り、本明細書で使用する諸々の専門および学術用語は当業者が通常理解している意味をもつ。本発明の試験のための実施には本明細書で開示するものと類似または同等の方法および材料を使用することができるが、本明細書では好ましい材料および方法を開示している。本発明の明細書と特許請求の範囲で使用する用語の意味は次のとおりである。
【００６１】
用語「塩基」は、含窒素複素環部分であって、相補的な塩基または塩基類似体との対合に際してワトソン・クリック型水素結合を形成しうるものをいう。多数の天然型および合成(非天然)型の塩基、塩基類似体および塩基誘導体が知られている。塩基の例はプリン、ピリミジンおよびそれらの修飾体である。天然型塩基の非限定的な例はアデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、ウラシル(U)およびチミン(T)である。本発明は天然型塩基に限定されるものではない。本発明に使用可能な多数の非天然型塩基およびそれぞれの非天然型ヌクレオチドは技術上周知である。そうした非天然型塩基の例は下記のとおりである。
【００６２】
用語「ヌクレオシド」は塩基を糖たとえばリボースまたはデオキシリボースのC-1'炭素に結合させてなる化合物をいう。
【００６３】
用語「ヌクレオチド」は、モノマー単位としてのまたはポリヌクレオチド内のヌクレオシドのリン酸エステルをいう。「ヌクレオチド5'-三リン酸」は糖5' 位炭素に三リン酸エステル基を付加したヌクレオチドをいい、ときには「NTP」または「dNTP」および「ddNTP」として表記される。修飾ヌクレオチドは化学修飾(一般に塩基部分の修飾)を受けた任意のヌクレオチドをいう(たとえばATP、TTP、GTP、CTPなど)。修飾ヌクレオチドの非限定的な例はメチルシトシン、6-メルカプトプリン、5-フルオロウラシル、5-ヨード-2'-デオキシウリジンおよび6-チオグアニンである。用語「ヌクレオチド類似体」は任意の非天然型ヌクレオチドをいう。
【００６４】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、「オリゴマー」、「オリゴ」または同等の用語は、ヌクレオチド塩基たとえばDNA、RNA、ペプチド核酸などの配列に対応させることができるモノマーのポリマー体をいう。ポリヌクレオチドは1本鎖でも2本鎖でもよいし、またたとえばある遺伝子配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖と相補的でもよい。ポリヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドの相補部分とハイブリダイズして2本鎖を形成することができるが、該2本鎖はホモ2本鎖、ヘテロ2本鎖のいずれでもよい。ポリヌクレオチドの鎖長は何ら制限されない。ヌクレオチド間の結合はヌクレオチド間タイプのホスホジエステル結合でも、任意の他タイプの結合でもよい。「ポリヌクレオチド配列」はポリマー鎖としてのヌクレオチドモノマー配列をいう。用語「ポリヌクレオチド」は任意の鎖長のポリマー形ヌクレオチドをいうため、「ポリヌクレオチド」は特定の鎖長または範囲のヌクレオチド配列に限定されない。ポリヌクレオチドは生物学的な手段によって(たとえば酵素的に)産生させることも、無酵素システムを使用して合成することも、可能である。ポリヌクレオチドは酵素的に伸長可能でも酵素的に伸長不可能でもよい。
【００６５】
3'-5'ホスホジエステル結合によって形成されるポリヌクレオチドは5'末端および3'末端をもつと言う。それは、ポリヌクレオチドを形成する素となるヌクレオチドモノマーの連結のされ方によって、あるモノヌクレオチドペントース環の5'リン酸基が隣接ペントース環の3'(ヒドロキシル)酸素と一方向に、ホスホジエステル結合を介して結合されるからである。従って、あるポリヌクレオチド分子の5'末端はヌクレオチドペントース環の5'位に遊離リン酸基またはヒドロキシル基をもつが、該ポリヌクレオチド分子の3'末端はペントース環の3'位に遊離リン酸基またはヒドロキシル基をもつ。ポリヌクレオチド分子の内部では、ある位置または配列が別の位置または配列に対して5'方向側にあれば「上流(側)」に位置すると言い、またある位置が別の位置に対して3'方向側にあれば「下流(側)」にあると言う。この用語は、ポリメラーゼが鋳型鎖に沿って5'→3'方向に進みながらポリヌクレオチド鎖を伸長していくという事実を反映している。特に断らない限り、ポリヌクレオチド配列の表示では常に、塩基を5'→3'方向に左から右へ並べるものとする。
【００６６】
用語「ポリヌクレオチド」は天然型ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド構造、天然型骨格、または天然型ヌクレオチド間結合に限定されないものとする。本発明に使用してもよい多様なポリヌクレオチド類似体、非天然型ヌクレオチド、非天然型ホスホジエステル結合、およびヌクレオチド間結合類似体は技術上周知である。そうした非天然型構造の非限定的な例は非リボース糖骨格、3'-5'および2’-5’ホスホジエステル結合、ヌクレオチド間逆結合(たとえば3'-3'および5'-5')、および分枝構造である。さらに、非天然型構造には非天然型ヌクレオチド間結合類似体たとえばペプチド核酸(PNA)、ロックト核酸(LNA)、C1〜C4アルキルホスホナート結合(メチルホスホナート、ホスホルアミダート、C1〜C6アルキル-ホスホトリエステル、ホスホロチオアートおよびホスホロジチオアート・ヌクレオチド間結合など)を含む。さらに、ポリヌクレオチドは専ら単一タイプのモノマーサブユニットとあるタイプの結合からなってもよいし、また種々のタイプのサブユニットと種々のタイプの結合の混合または組み合わせからなってもよい(ポリヌクレオチドはキメラ分子でもよい)。ポリヌクレオチド類似体は天然型ポリヌクレオチドと同様に標的の1本鎖核酸とハイブリダイズするという意味で、天然型ポリヌクレオチドの根本的な性質を保持している。
【００６７】
用語「ポリヌクレオチドの配列」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド配列」または同等および類似の語句はポリヌクレオチド中のヌクレオチドの順序をいう。場合によっては、「配列」は特にヌクレオチドに各々結合している塩基の順序と相同性をいう。配列は一般に5'→3'方向に読み込まれる(書き出される)。特に断らない限り、本発明の特定のポリヌクレオチド配列は随意に、明示の配列に加えて、相補配列を包含する。
【００６８】
用語「増幅」、「増幅ステップ」などは一般に、ある分子の、または関連分子集合の、コピー数の増加という結果をもたらす方法をいう。増幅はポリヌクレオチド分子との関連では、ポリヌクレオチド分子の、またはポリヌクレオチド分子の一部分の、一般に少量のポリヌクレオチド(たとえばウイルスゲノム)を出発物質とする、複数コピーの生成をいい、増幅物質(たとえばウイルス性PCRアンプリコン)は一般に検出可能である。ポリヌクレオチドの増幅は多様な化学的および酵素的増幅法を包含する。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、strand displacement amplification(SAD)反応、nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)反応またはリガーゼ連鎖反応(LCR)による、1コピーまたは数コピーの鋳型DNA分子からの複数DNAコピーの生成などは一種の増幅である。増幅は出発分子の厳密な複製に限定されない。たとえばRT-PCR法によるサンプル中の少量のウイルスRNAからの複数cDNA分子の生成は増幅の一種である。また転写過程での単一DNA分子からの複数RNA分子の生成もまた増幅の一種である。
【００６９】
実施態様によっては随意に、増幅ステップの後に標識、配列分析、精製、単離、ハイブリダイゼーション、サイズ分離、発現、検出および/またはクローニングを非限定的に含むステップを追加する。
【００７０】
用語「ポリメラーゼ連鎖反応」(PCR)はサンプル中の標的ポリヌクレオチドの断片の濃度を高めるための技術上周知の増幅法をいい、サンプルは単一ポリヌクレオチド種でも、複数ポリヌクレオチド種でもよい。一般に、PCR法はモル過剰の2以上の伸長可能オリゴヌクレオチドプライマーを、所望の標的配列を含む反応混合液中に導入するステップからなるが、該プライマーは2本鎖標的配列の相補対と相補的である。該反応混合液をDNAポリメラーゼの存在下にサーマルサイクリング・プログラムにかけると、DNAプライマーに挟まれた所望の標的配列が増幅される結果となる。逆転写酵素PCR(RT-PCR)はRNA鋳型と逆転写酵素(または逆転写酵素活性をもつ酵素)とを使用して、まず1本鎖DNA分子を生成させてから複数サイクルのDNA依存性DNAポリメラーゼプライマー伸長を行うPCR法である。多重PCRは、一般に単一反応に複数のプライマーを導入することにより、単一反応で複数の増幅産物を生成させるPCR法である。多様なPCR応用方法が技術上周知であり、また多数の文献たとえばAusubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Section 15, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994)で開示されている。
【００７１】
「非対称PCR」は、プライマー対を構成するプライマーのモル濃度を不均等になるよう調節することによる、DNA標的の一方の分子鎖の選択的PCR増幅をいう。非対称PCR法は主に1本鎖産物を、比較的少量の2本鎖産物と共に、生成する。非対称PCRの進行に伴い、低濃度のプライマーは2本鎖DNAアンプリコンへと定量的に組み込まれるが、高濃度プライマーのほうはDNA合成をプライミングし続けるため、結果として1本鎖産物が蓄積し続ける。
【００７２】
用語「DNA依存性DNAポリメラーゼ」はデオキシリボ核酸(DNA)を鋳型として使用して相補性の逆平行DNA鎖を合成するDNAポリメラーゼ酵素をいう。熱安定性のDNA依存性DNAポリメラーゼはPCR法に使用される。DNA依存性DNAポリメラーゼのための、さらには任意のポリメラーゼ酵素のための、好適な反応条件(および反応緩衝液)は、技術上周知であり、また多数の文献たとえばAusubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1-4, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994; supplemented through September 2004)で開示されている。DNA依存性DNAポリメラーゼ酵素のための反応緩衝液はたとえば遊離デオキシリボヌクレオチド三リン酸、塩類および緩衝剤を含んでもよい。
【００７３】
用語「DNA依存性RNAポリメラーゼ」はデオキシリボ核酸(DNA)を鋳型として使用してRNA鎖を合成するRNAポリメラーゼ酵素をいう。DNA依存性RNAポリメラーゼに仲介されるこの過程は一般に「転写」という。
【００７４】
用語「RNA依存性DNAポリメラーゼ」はリボ核酸(RNA)を鋳型として使用して相補性の逆平行DNA鎖を合成するDNAポリメラーゼ酵素をいう。RNA分子のDNAコピーを生成するこの過程は一般に「逆転写」または「RT」といい、またそれを行う酵素は「逆転写酵素」である。ある種の天然型および変異型DNAポリメラーゼもまた逆転者活性をもつ。
【００７５】
用語「熱安定性(の)」は酵素に関しては、高温でも(たとえば55℃以上でも)生物学的活性を維持するまたは過熱/冷却サイクルの反復後も生物学的活性を維持する酵素をいう。熱安定性のDNAポリメラーゼは特にPCR法への使用に適する。
【００７６】
用語「プライマー」は酵素的に伸長可能なオリゴヌクレオチドであって、一般に定義済みの配列を有し、相補性の、プライマー特異的な標的配列部分と逆並行的にハイブリダイズするよう設計されたオリゴヌクレオチドをいう。さらに、プライマーはヌクレオチドの鋳型依存的な重合を開始させて、標的ポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチドを生成させるようにすることができる。標的とアニーリングしたプライマーの伸長には、好適なDNAまたはRNAポリメラーゼを好適な反応条件下に使用する。当業者には自明であるが、必要な重合反応条件および試薬は技術上確立されており、また種々の文献で開示されている。
【００７７】
プライマー伸長が起きるには、プライマー核酸の、鋳型の部分配列との相補性が100%である必要はない。相補性が100%未満のプライマーでもハイブリダイゼーションやポリメラーゼ伸長は十分に起こりうる。望むなら、プライマー核酸を標識するのは随意である。プライマーに使用する標識は任意好適の標識でよいし、またたとえば分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的等の検出手段で検出してもよい。
【００７８】
「増幅プライマー」は、一般に標的ポリヌクレオチドに対してモル過剰であるプライマーであって、1本鎖アンプリコンを生成するために鋳型依存性の酵素的DNA合成および標的配列の増幅をプライミングするプライマーをいう。
【００７９】
「増幅プライマー対」は、一般に標的ポリヌクレオチドに対してモル過剰である2つのプライマーからなるプライマーセットであって、2本鎖アンプリコンを生成するために鋳型依存性の酵素的DNA合成および標的配列の増幅をプライミングするプライマーセットをいう。
【００８０】
「アンプリコン」は特定の標的核酸の増幅によって生成されるポリヌクレオチド分子(または分子の集合)をいう。アンプリコンの生成に使用する増幅方法は任意好適の方法でよいが、最も一般的にはたとえばPCR法である。アンプリコンは一般的にはDNAアンプリコンであるが、必ずしもそうとは限らない。アンプリコンは1本鎖、2本鎖いずれでもよいし、またそれらの、任意の濃度比の混合物でもよい。
【００８１】
「アンプリコン蓄積のリアルタイム検出」は、特定アンプリコンの、増幅の完了に続く検出または定量ステップを必要としない、 (一般にPCR法による)生成と平行した検出特に定量をいう。用語「リアルタイムPCR」または「キネティックPCR」はPCRで生成されるアンプリコンのリアルタイム検出および/定量をいう。
【００８２】
アンプリコン蓄積の一般的なリアルタイム検出方法は5'ヌクレアーゼアッセイまたは蛍光5'ヌクレアーゼアッセイたとえばTaqMan(商標)分析である。Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280 (1991); およびHeid et al., Genome Research 6:986-994 (1996)を参照。TaqMan PCR法では、2つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用してPCR反応特異的なアンプリコンを生成させる。両PCRプライマーの間に位置するアンプリコン内のヌクレオチド配列とハイブリダイズさせるための第3のオリゴヌクレオチド(TaqManプローブ)を設計する。該プローブは、PCR反応に使用されるDNAポリメラーゼによる伸長を不可能にするような構造的特徴を備えてもよいし、また(常にとは限らないが)一般に、互いに近接した蛍光レポーター色素と消光体で共標識される。レポーター色素からの発光は、該蛍光体および消光体がプローブ上にある場合のように近接しているときは、消光体によって消光される。場合によっては、プローブは蛍光レポーター色素または別の検出可能体だけで標識してもよい。
【００８３】
TaqMan PCR法は5'-3'ヌクレアーゼ活性をもつ熱安定性のDNA依存性DNAポリメラーゼを使用する。PCR増幅反応に際しては、DNAポリメラーゼはその5'-3'ヌクレアーゼ活性により、アンプリコンと鋳型依存的にハイブリダイズした標識プローブを切断する。切断により生じるプローブ断片はプライマー/鋳型複合体から解離するため、レポーター色素は消光体の消光作用を受けなくなる。合成される各新アンプリコン分子につき約1個のレポーター色素分子が消光作用から解放されるため、解放される蛍光レポーター色素の量はアンプリコン鋳型の量に正比例し、非消光レポーター色素の検出はデータの定量的解釈のための基礎を与えくれる。
【００８４】
TaqManアッセイデータの1つの尺度は一般に閾値サイクル数(CT)で表される。蛍光レベルは各PCRサイクルで記録されるが、それは増幅反応のCTポイントまでは増幅産物の量に比例する。閾値サイクル数(CT)は蛍光信号が統計的に有意として初めて記録されたときの、または蛍光信号が何か他の任意レベル(たとえば任意蛍光レベルまたはAFL)を超えた場合の、サイクル数である。
【００８５】
5'ヌクレアーゼアッセイのためのプロトコールおよび試薬は技術上周知であり、また種々の文献で開示されている。たとえば5'ヌクレアーゼ反応およびプローブは次の文献で開示されている: 米国特許第6,214,979号(2001年4月10日にGelfandらに付与; 発明の名称“HOMOGENEOUS ASSAY SYSTEM”(ホモジニアスアッセイ系))明細書; 米国特許第5,804,375号(1998年9月8日にGelfandらに付与; 発明の名称“REACTION MIXTURES FOR DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACIDS”(標的核酸検出用の反応混合液))明細書; 米国特許第5,487,972号(1996年1月30日にGelfandらに付与; 発明の名称“NUCLEIC ACID DETECTION BY THE 5’-3’ EXONUCLEASE ACTIVITY OF POLYMERASES ACTING ON ADJACENTLY HYBRIDIZED OLIGO-NUCLEOTIDES”(隣接的にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドに作用するポリメラーゼの5’-3’エキソヌクレアーゼ活性による核酸検出))明細書; および米国特許第5,210,015号(1993年5月11日にGelfandらに付与; 発明の名称“HOMOGENEOUS ASSAY SYSTEM USING THE NUCLEASE ACTIVITY OF A NUCLEIC ACID POLYMERASE”(核酸ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性を使用するホモジニアスアッセイ系))明細書。
【００８６】
リアルタイムのアンプリコン検出法の変法、特に5'ヌクレアーゼプローブの代わりに2本鎖DNAインターカレーティング色素を使用して、増幅反応系中に存在する2本鎖アンプリコンの量に依存した蛍光が得られる結果となるようにした変法もまた周知である。たとえば米国特許第6,171,785号(2001年1月9日にHiguchiに付与; 発明の名称“METHODS AND DEVICES FOR HOMOGENOUS NUCLEIC ACID AMPLIFICATION AND DETECTION”(ホモジニアスな核酸増幅/検出のための方法および装置))明細書; および米国特許第5,994,056号(1999年11月30日にHiguchiに付与; 発明の名称“HOMOGENOUS METHODS FOR NUCLEIC ACID AMPLIFICATION AND DETECTION”(ホモジニアスな核酸増幅/検出方法))明細書を参照。
【００８７】
TaqMan(商標) PCRは市販のキットおよび装置たとえばABI PRISM(商標) 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA)またはLightCycler (商標)(Roche Applied Sciences, Mannheim, Germany)を使用して実行することができる。好ましい実施態様では、5'ヌクレアーゼアッセイはリアルタイム定量PCR装置たとえばABI PRISM(商標) 7700 Sequence Detection Systemを使用して行う。該システムはサーモサイクラー、レーザー、電化結合素子(CCD)、カメラおよびコンピューターからなる。該システムはサーモサイクラーにセットした96ウェルマイクロタイタープレート中でサンプルを増幅する。増幅時には、全96ウェルについて光ファイバーケーブルでレーザー誘起蛍光信号をリアルタイムで捕集し、CCDカメラで検出する。該システムは装置を運用しデータを分析するためのソフトウェアが含まれる。このABI PRISMシステムには温度を実に20℃までの温度下方調節機能があるため、融解曲線分析が可能になるという利点もある。
【００８８】
同じ反応容器から2つの異なるチャンネルで発光を励起し検出することができる装置を本発明に使用してもよい。たとえば本明細書の実施例ではRoche Molecular DiagnosticsのCOBAS(商標) TaqMan(商標) 48 Analyzer(Roche Molecular Systems, Inc., Pleasanton, CA)を使用している。本発明は特定の装置の使用に限定されるものではない。
【００８９】
用語「ハイブリダイゼーション」と「アニーリング」は互換的に使用しており、あるポリヌクレオチドと別のポリヌクレオチド(一般に逆平行ポリヌクレオチド)との塩基対合相互作用をいうが、これは一般にハイブリダイゼーション複合体という2本鎖または他の高次構造を形成する結果となる。逆平行ポリヌクレオチド分子間の一次相互作用は(たとえばA/TおよびG/C塩基対の形成など) 一般に塩基特異的であり、ワトソン/クリック型および/またはフーグステン型水素結合による。ハイブリダイゼーションの実現では2つのポリヌクレオチドがその全長にわたって100%相補性を有する必要はない。態様よっては、ハイブリダイゼーション複合体は分子間相互作用から形成されても、あるいは分子内相互作用から形成されてもよい。
【００９０】
「特異的にハイブリダイズする」、「特異的ハイブリダイゼーション」などの表現は複合体の形成に至るハイブリダイゼーションであって、アニーリング対が相補性を示しかつハイブリダイゼーション反応系内の他の潜在的結合相手を排除する形で選択的に相互結合することを特徴とするハイブリダイゼーションをいう。用語「特異的にハイブリダイズする」は、形成されるハイブリダイゼーション複合体が100%相補性を有することを求めるものではない。ミスマッチのあるハイブリダイゼーション複合体もまた特異的にハイブリダイズしてハイブリダイゼーション複合体を形成しうるからである。ハイブリダイゼーションの特異性の度合いは特徴的ハイブリダイゼーション特性たとえばハイブリダイゼーション複合体の融解温度(Tm)を使用して計測することができる。
【００９１】
語句「塩基対合が起こるような条件」は相補的なポリヌクレオチドまたは部分的に相補的なポリヌクレオチドに安定したハイブリダイゼーション複合体の形成を許容するような任意のハイブリダイゼーション条件をいう。
【００９２】
「ストリンジェント(な)」、「ストリンジェントな条件」「高ストリンジェンシー」などの表現は技術上周知のように、一般に低イオン強度・高温度のハイブリダイゼーション条件を示す。たとえばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., ed., J. Wiley & Sons Inc., New York, 1997)を参照; 両文献は引用により開示される。一般にストリンジェントな条件は指定配列を含むハイブリダイゼーション複合体に対応する熱融解点(Tm)を、規定イオン強度およびpHで、約5〜30℃下回るように設定される。あるいは、ストリンジェントな条件は指定配列に関するTmを、規定イオン強度およびpHで、約5〜15℃下回るように設定される。Tmは(規定のイオン強度、pHおよび核酸濃度の下で)相補的(または部分的に相補的)なポリヌクレオチドを含むハイブリダイゼーション複合体の50%が解離する温度である。
【００９３】
「低ストリンジェンシー」は、一般に高イオン強度・低温度のハイブリダイゼーション条件を示す。低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の下では、不完全相補性のポリヌクレオチドがハイブリダイゼーション複合体を形成しやすくなる。
【００９４】
「相補(的な)」または「相補性」はワトソン・クリック型およびフーグステン型塩基対合則によって関連付けられるポリヌクレオチドの逆平行鎖についていう。たとえば配列5'-AGTTC-3'は配列5'-GAACT-3'と相補的である。「完全(に)相補(的な)」または「100%相補(的な)」などの用語は、逆平行鎖間に完全なワトソン・クリック型塩基対合をもつ(2本鎖ポリヌクレオチドにミスマッチがない)相補配列についていう。しかし相補性は完全である必要はなく、たとえば安定した2本鎖でもミスマッチ塩基対またはアンマッチ塩基を含む場合がある。「部分的相補性」、「部分的に相補的(な)」、「不完全相補性」または「不完全に相補的(な)」などの用語は逆平行ポリヌクレオチド鎖間の塩基アラインメントの一致率が100%未満の(たとえば2本鎖ポリヌクレオチドにミスマッチ塩基またはアンマッチ塩基が少なくとも1つ存在する)場合をいう。たとえば逆平行ポリヌクレオチド鎖間の塩基アラインメントの一致率は少なくとも99%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%または50%、あるいはこの範囲内の任意の値とすることができる。
【００９５】
さらに、標的ポリヌクレオチドの「相補体」は該標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部分と逆並行型の会合で一体化(たとえばハイブリダイズ)しうるポリヌクレオチドをいう。この逆並行型の会合は分子内のそれ(たとえば核酸分子内部のヘアピンループの形をとった逆並行型の会合)でも、分子間のそれ(たとえば複数の1本鎖核酸分子が互いにハイブリダイズする場合の逆並行型の会合)でもよい。
【００９６】
「標的」、「標的ポリヌクレオチド」および「標的配列」などは、相補的ポリヌクレオチドたとえば標識プローブまたはDNAポリメラーゼプライマーとのハイブリダイゼーションの対象となる特定のポリヌクレオチド配列をいう。ポリヌクレオチドと標的とのアニーリングの結果として形成されるハイブリダイゼーション複合体は「標的ハイブリダイゼーション複合体」という。該ハイブリダイゼーション複合体は溶液の形をとることもできるし(したがって可溶性であり)、またハイブリダイゼーション複合体の1つまたは複数の構成要素を固相に(たとえばドットブロットに、標的ハイブリダイゼーション複合体の除去または単離を容易にする目的でビーズ系に、またはマイクロアレイに)付着させることもできる。標的配列の構造は限定されず、DNA、RNA、その類似体またはそれらの組み合わせからなってもよいし、また1本鎖、2本鎖いずれでもよい。標的ポリヌクレオチドは由来源が任意であり、たとえば(原核生物、真核生物、植物、動物およびウイルスなどを非限定的に含む)任意の生体またはかつての生体でもよいし、また合成および/または組み換え標的配列でもよい。たとえば本明細書で開示するように、ウイルスのゲノム配列に由来するPCRアンプリコンは標的となりうる。
【００９７】
態様によっては、ハイブリダイゼーション複合体中の標的ポリヌクレオチドは「鋳型」として機能する。その場合、伸長可能なポリヌクレオチドプライマーが該鋳型に結合し、該鋳型の塩基配列を相補的ポリヌクレオチド合成の雛形にしてヌクレオチド重合を開始する。
【００９８】
用語「プローブ」は一般に、関心を寄せている標的核酸にハイブリダイズしうるポリヌクレオチドをいう。一般に、ただしその限りではないが、プローブは好適な標識またはレポーターと会合させて、(その標的と共に)検出、視覚化、計測および/または定量しうるようにする。標識プローブ検出システムの検出対象の非限定的な例は蛍光発光、蛍光消光(たとえばFRETペア検出システムを使用する場合など)、酵素活性、吸光度、分子質量、放射能、ルミネセンス、または(レポーターが抗体である場合などに)レポーターの特異的結合を可能にするような結合特性などである。実施態様によっては、プローブはポリヌクレオチドではなく抗体であってもよいが、該抗体は関心を寄せている核酸ヌクレオチド配列に対する結合特異性をもつ。本発明は特定のプローブ標識またはプローブ検出システムに限定されるものではない。プローブに使用するポリヌクレオチドは由来源が限定されないし、非酵素的システムで合成してもよい。また生物学的(たとえば酵素的)システムを使用して(たとえば細菌細胞中で)産生されるポリヌクレオチドでもよい。
【００９９】
一般にプローブは、核酸内の特定標的配列に対し、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件などを非限定的に含む特定のハイブリダイゼーション条件下で該標的配列と安定したハイブリダイゼーション複合体を形成するに足る相補性をもつ。該プローブを使用して十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションアッセイを行えば、特定標的配列の選択的検出が可能になる。
【０１００】
用語「標識」または「レポーター」は、最も広い意味で、検出可能な、またはその会合相手の検出を可能にする、任意の部分または特性をいう。たとえば標識を含むポリヌクレオチドは検出可能であ(り、態様によってはプローブとされ)る。理想的には、標識ポリヌクレオチドは該ポリヌクレオチドを含むハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にする。態様によっては、標識はたとえば(共有または非共有結合により)ポリヌクレオチドに付加される。種々の態様では、標識は次の機能を択一的または重複的に果たすことができる: (i)検出可能な信号をもたらす; (ii)第2の標識と相互作用して、該第2標識によってもたらされる検出可能信号を変化させる(たとえばFRET); (iii)ハイブリダイゼーションを安定化する(たとえば2本鎖の形成); (iv)捕捉機能を付与する(たとえば疎水性アフィニティー、抗体/抗原、イオン吸着); または(v)物理的特性(電気泳動移動度、疎水性、親水性、溶解度またはクロマトグラフィー挙動など)を変化させる。標識の構造や作用機構はきわめて多様である。
【０１０１】
標識の非限定的な例は蛍光標識(消光体や吸光体などを含む)、非蛍光標識、発色標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、質量変性基、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン、酵素(ペルオキシダーゼ、ホスファターゼなどを含む)である。蛍光標識のさらなる例としては、負の電荷をもつ色素たとえばフルオレセイン系色素、中性電荷をもつ色素たとえばローダミン系色素、または正の電荷をもつ色素たとえばシアニン系色素などがある。フルオレセイン系色素の例はFAMやHEX、TET、JOE、NAN、ZOEなどである。ローダミン系色素の例はTexas RedやROX、R110、R6G、TAMRAなどである。FAMやHEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G、TAMRAはたとえばPerkin-Elmer, Inc. (Wellesley, MA, USA)などから、またTexas RedはMolecular Probes, Inc. (Eugene, OR)などから、それぞれ商業的に入手可能である。シアニン系色素の例はCy2、Cy3、Cy4、Cy5、Cy5.5、Cy7などであり、たとえばAmersham Biosciences Corp. (Piscataway, NJ, USA)などから商業的に入手可能である。
【０１０２】
「FRET」(蛍光共鳴エネルギー移動)および同等の用語は一般に、供与体分子から受容体分子への、供与体分子からの光子の放出を伴わないエネルギー移動が起こることを特徴とする、2色素分子の電子状態の間のダイナミックな距離依存性相互作用をいう。FRETは効率が色素間の分子間距離の逆数に依存するため、生体高分子の寸法に相当する距離にわたって有用となる。一般に、FRETは通常の光学顕微鏡法の限界を超える空間分解能での、共局在分子または単一分子内の高次構造変化の画像化、速度論的分析および/または定量を可能にする。一般にFRETの必要条件は次のとおりである: (a)供与体分子と受容体分子は近接していなければならない(その間隔は一般に、たとえば1 0〜100Å); (b)受容体の吸収スペクトルは供与体の蛍光発光スペクトルとオーバーラップしなければならない; および(c)供与体と受容体の遷移双極子配向はほぼ平行でなければならない。
【０１０３】
ほとんどのFRET適用技術では供与体色素と受容体色素は異なるが、その場合FRETの検出は受容体の増感蛍光の見掛けによって、または供与体蛍光の消光によって、行うことができる。場合によっては、供与体と受容体は同じであり、FRETの検出はそれに伴う蛍光の脱分極によって検出することができる。FRETシステムへの単一供与体/受容体分子の使用はたとえば米国特許出願第2004/0096926号(出願人:Packard and Komoriya; 2004年5月20日公開; 発明の名称 “COMPOSITIONS FOR THE DETECTION OF ENZYME ACTIVITY IN BIOLOGICAL SAMPLES AND METHODS OF USE THEREOF”(生体サンプル中の酵素活性を検出するための組成物およびその使用方法))で開示されている。
【０１０４】
FRETは分子近接の変化を特徴とする多様な生命現象を研究するための重要な手法となってきた。FRET法は多数の生物学研究室に普及しており、また多様な生体システムに使用できるよう適合が図られてきた。その非限定的な例は核酸ハイブリダイゼーションの検出、リアルタイムPCRアッセイおよびSNP検出、タンパク質の構造および高次構造、タンパク質複合体の空間分布およびタンパク質複合体の空間分布および形成、受容体/リガンド相互作用、イムノアッセイ、単一分子の相互作用のプロービング、核酸の構造および高次構造、突然変異検出用のプライマー伸長アッセイ、自動化DNA配列分析、脂質の分布および輸送、膜融合アッセイ(脂質混合による膜融合アッセイ)、膜電位検知、蛍光発光プロテアーゼ基質、蛍光性プロテアーゼ基質、およびサイクリックAMPおよび亜鉛の指標などである。
【０１０５】
用語「FRET供与体」は一般に、十分に近接している好適なFRET受容体へと移動しうる放射たとえば蛍光または発光放射の検出可能な放出を生じる部分をいう。「FRET供与体」は「FRET標識」または「FRET標識体」と互換的に使用可能である。
【０１０６】
「消光体」、「受容体」および「発光調節体」、および類似/同等の用語は一般に、蛍光または発光放射を非限定的な例とする放射の検出可能な放出を弱めるおよび/または弱めうる部分をいう(該放射は本来なら該放射を放出したはずの放出源に由来する)。一般に、消光体は発光を弱めうる任意の部分をいう。消光度自体は、消光作用が任意の使用検出装置によって最小限検出可能である限り、限定されない。態様によっては、消光体は該放出源によって放出される検出可能な放射を少なくとも50%、あるいは少なくとも80%、またあるいは、そしてもっとも好ましくは少なくとも90%弱める。
【０１０７】
実施態様によっては、消光体は供与体からの蛍光発光を減少させる結果となり、供与体/消光体はFRETペアを形成することになる。そこで消光体は「FRET消光体」または「FRET受容体」ともいい、また供与体は「FRET供与体」ともいう。
【０１０８】
用語「消光体」は「FRET消光体」に限定されないものとする。たとえば消光は光電子移動、プロトン共役電子移動、近接フルオロフォア間の二量体形成、過渡励起状態相互作用、非蛍光基底状態種の形成などを非限定的に含む任意のエネルギー移動を伴うことができる。実施態様によっては、消光体は発光を弱めうる分子をいう。フルオロフォアと消光体の間のスペクトルオーバーラップに関する要件はない。「消光」は任意のタイプの消光をいい、動的消光(フェルスター・デキスター型エネルギー移動など)と静的消光(基底状態複合体)を含む。あるいは、消光体は蛍光色素から吸収したエネルギーを光以外の形で、たとえば熱として、消散させることができる。
【０１０９】
実施態様によっては、消光体はFRET供与体から吸収したエネルギーを、該FRET供与体からの放出とは識別可能な波長または信号タイプで、また該消光体に特徴的である波長または信号タイプで、再放出することができる。その意味では消光体は標識ともなりうる。
【０１１０】
蛍光プローブシステムの使用法は、Joseph R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Publishing Corporation, 2nd edition (July 1, 1999)およびRichard P. Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, 6th edition (1996)などを参照。
【０１１１】
「可溶性受容体」、「可溶性消光体」、「可溶性発光調節体」などの表現は、他の任意の分子に付着していない受容体であって、概して可溶性である、または他の形で他の任意の分子または固相に結合していない、受容体分子をいう。たとえばある種のチアジン色素たとえば新メチレンブルーは可溶性消光体として使用することができる。実施態様によっては、可溶性消光体は可溶性FRET消光体であり、該可溶性FRET消光体はFRET供与体と機能的FRETペアを形成する。
【０１１２】
「チアジン(thiazineまたはthiazin。意味は同じであり、両方が使用されている)色素」は硫黄原子1個、窒素原子1個および炭素原子4個からなる環をもつ任意の種類の有機化合物をいう。可溶性消光体として使用しうるチアジン色素の例はメチレンブルー(C16H18ClN3S)、メチレングリーン(C16H17ClN4O2S)、チオニン(C12H10ClN3S)、sym-ジメチルチオニン、トルイジンブルーO (C15H16N3SCl)、新メチレンブルー(C18H22ClN3S)、メチレンバイオレットベルントゼン、アズーレA (C14H14ClN3S)、アズーレB (C15H16ClN3S)、アズーレC、1,9-ジメチルメチレンブルー、トルイジンブルーOおよびメチレンバイオレットベルントゼンなどである。これらの化合物のうちのいくつかについて、図7に構造を示す。
【０１１３】
「FRETペア」および類似/同等の表現はFRET供与体とFRET受容体のペアであって、該供与体および受容体が互いに適度に近接しているとFRETが観測されることを特徴とするペアをいう。一般に、ただしその限りではないが、該供与体および受容体は種々の注目の分子(たとえばポリヌクレオチドプローブ)に付着する。
【０１１４】
多様な色素、蛍光体、消光体および蛍光タンパク質、それに他の試薬および検出/画像化装置がFRET分析用に開発されており、また広く商業的に入手可能である。特定の分析への使用に適したFRETプロトコール、試薬および装置は当業者には自明である。
【０１１５】
FRETに常用される分子の非限定的な例はフルオレセイン、FAM、JOE、ローダミン、R6G、TAMRA、ROX、DABCYLおよびEDANSである。蛍光色素が標識であるか消光体であるかは、その励起および発光スペクトルによって決まり、またペアとなる蛍光色素によっても決まる。たとえばFAMは波長488nmの光で最も効率的に励起され、波長500〜650nmの光を放出する(最大蛍光波長525nm)。FAMは、たとえば消光体としてのTAMRA (最大励起波長512m)との併用に適した供与体標識である。蛍光色素から吸収したエネルギーを消散させる非蛍光消光体(ダーククエンチャー)の例はBlack Hole Quenchers(商標)(Biosearch Technologies, Inc., Novato, CA, USA)である。このBlack Hole Quenchers(商標)は、置換または非置換アリールまたはヘテロアリール化合物またはその組み合わせから選択される少なくとも3つの遊離基を含む構造であって、うち少なくとも2つの残基が環外ジアゾ結合で連結されている。たとえば国際公開第WO 01/86001号(発明の名称 “DARK QUENCHERS FOR DONOR-ACCEPTOR ENERGY TRANSFER”(供与体-受容体エネルギー移動のためのダーククエンチャー); 2001年11月15日にCookらにより公開)を参照。消光体の例はたとえば米国特許第6,465,175号(発明の名称 “OLIGONUCLEOTIDE PROBES BEARING QUENCHABLE FLUORESCENT LABELS, AND METHODS OF USE THEREOF”(消光可能な蛍光標識を有するオリゴヌクレオチドプローブ、およびその使用方法); 2002年10月15日にHornらに交付)でも開示されている。
【０１１６】
「部分」または「基」は、より大きな分子または複合体の部分または構成部分をいう。たとえばオリゴヌクレオチドプローブは標識部分を含む場合がある。
【０１１７】
「特徴的ハイブリダイゼーション特性」はハイブリダイゼーション複合体の任意の特性であって、ある複合体をもう1つの、または任意数の、別の複合体から区別するために使える特性をいう。1つの1本鎖核酸分子はきわめて多数のハイブリダイゼーション複合体を多様な標的分子と形成することができるが、そこではヌクレオチド塩基のミスマッチがもしもあった場合、その数、位置およびタイプは異なる。これらの複合体の区別には多数の方法が使用しうるが、その非限定的な例は融解分析(たとえばTm分析)、HMA(ヘテロ2本鎖移動度分析; White et al., J Clin Microbiol, 2000, 38:477-482)、DHPLC(変性HPLC)、CFLP(制限断片長多型; Marshall et al., J Clin Microbiol, 1997, 35:3156-3162)、TGCE(熱勾配キャピラリー電気泳動)、SURVEYOR(商標)ヌクレアーゼ変異検出キット、SSCP(1本鎖高次構造多型)などである。
【０１１８】
「温度依存的ハイブリダイゼーション特性」はハイブリダイゼーション複合体の任意の定量的な温度依存的特性をいう。たとえば融解温度(Tm)は温度依存的な特徴的ハイブリダイゼーション特性である。しかし、温度依存的ハイブリダイゼーション特性はTmに限定されない。たとえばホモ2本鎖またはヘテロ2本鎖の2本鎖ポリヌクレオチドまたは核酸塩基オリゴマー(たとえばハイブリダイゼーション複合体)集団の25%が解離して1本鎖となる温度(T25)もまた該ハイブリダイゼーション複合体の決定的な特徴である。同様に、ホモ2本鎖またはヘテロ2本鎖の2本鎖ポリヌクレオチドまたは核酸塩基オリゴマー(たとえばハイブリダイゼーション複合体)集団の75%が解離して1本鎖となる温度(T75)もまた該ハイブリダイゼーション複合体の決定的な特徴である。あるいは任意の特定温度でのハイブリダイゼーション複合体の解離率が定量的な温度依存的ハイブリダイゼーション特性となる。さらにまた、(融解曲線ではなく)「アニーリング曲線」をハイブリダイゼーション複合体の特徴付けに使用してもよい。アニーリング曲線分析では、標的とプローブのポリヌクレオチド鎖の挙動を(融解曲線分析の場合の逓増温度条件とは対照的に)逓減温度条件下に観測する。ハイブリダイゼーション複合体の解離またはアニーリングの度合いを計測する方法は技術上周知である。
【０１１９】
用語「Tm」は「融解温度」をいう。融解温度はホモ2本鎖またはヘテロ2本鎖の2本鎖ポリヌクレオチドまたは核酸塩基オリゴマー(たとえばハイブリダイゼーション複合体)集団の半分が解離して1本鎖となる温度である。2本鎖ポリヌクレオチドのTmの予測では塩基配列や他の因子たとえば構造および配列特性、オリゴマー結合の性質などが考慮される。Tmを予測したり実験的に求めたりする方法は技術上周知である。たとえばTmは伝統的に融解曲線によって求められるが、それは2本鎖核酸分子を温度制御プログラムに従って加熱し、2本鎖構造を構成する2本の単一鎖の会合/解離状態を、2本の単一鎖が完全に解離する温度に到達するまで、モニターし、プロットしていき、得られた融解曲線からTmを読み取るという方法である。あるいは、アニーリング曲線からTmを求めてもよい。それは2本鎖核酸分子を2本の単一鎖が完全に解離する温度に到達するまで加熱し、そこから温度制御プログラムに従って温度を下げていき、2本鎖構造を構成する2本の単一鎖の会合/解離状態を、2本の単一鎖が完全にアニールする温度に到達するまで、モニターし、プロットしていき、得られたアニーリング曲線からTmを読み取るという方法である。
【０１２０】
用語「サンプル」は任意の被検試料をいう。用語「サンプル」は一般に任意の生物由来試料たとえば任意の動物または植物由来試料をいう。サンプルはたとえば任意の液体または組織たとえば血液または血清でもよいし、さらにはヒト血液またはヒト血清でもよい。サンプルは培養細胞または組織、微生物(原核生物または真核生物)培養物、または生物試料(生体またはかつての生体)に由来する任意の断片または生成物でもよい。随意に、サンプルは精製体、部分精製体、非精製体、濃縮体または増殖体でもよい。サンプルは、精製体または濃縮体である場合には、主に一成分たとえば核酸を含んでもよい。精製または濃縮サンプルは特に、全細胞RNA、全細胞mRNA、cDNA、cRNA、またはそれらに由来する増幅生成物を含んでもよい。
【０１２１】
本発明の方法に使用するサンプルは由来源が任意であり、限定されない。そうしたサンプルは単数または複数の個体から分離されたある量の組織または液体でもよいが、その非限定的な例は皮膚、血漿、血清、全血、血液生成物、髄液、唾液、腹水、リンパ液、眼房水または硝子体液、滑液、尿、涙、血液細胞、血液生成物、精子、精液、膣液、肺浸出液、漿膜液、臓器、気管支肺胞洗浄液、腫瘍、パラフィン包埋組織などである。サンプルは細胞培養培地中での細胞増殖に由来する培養培地、組み換え細胞、細胞構成要素などを非限定的な例とするin vitro細胞培養の成分および構成要素を含んでもよい。
【０１２２】
用語「ゲノム」は(ウイルスなどを含む)生物がもつ全遺伝情報または遺伝物質、すなわち生物またはウイルスの全遺伝子セットをいう。ゲノムのサイズは一般にヌクレオチドの総数かまたは塩基(1本鎖ゲノムの場合)または塩基対(2本鎖ゲノムの場合)の総数で表す。ゲノムはRNAまたはDNAを含む。ゲノムは線状、環状のいずれでも、および/または染色体のような不連続単位上に存在しても、よい。
【０１２３】
「配列異質性」は由来源を異にする2つ以上の相同ヌクレオチド配列間の配列分散をいう。配列分散は塩基対の不適合(ミスマッチ)、ギャップ、挿入、および/またはゲノム再編成という形をとりうる。本明細書では、1つのHCVゲノムまたは該ゲノムの一部分を第2の(またはもっと多くの)HCVゲノムとのアラインメントにより配列異質性を分析することができる。たとえば一群のウイルスゲノムは、全体として、ある特定ドメインたとえば5'-UTRで、または5'-UTRの一部分で、配列分散を示す場合には、配列異質性を示すことになる。
【０１２４】
「C型肝炎ウイルス型」はC型肝炎ウイルス(HCV)の、ゲノム構成(たとえば系統発生分析)に基づく分類型をいう。HCV分離株の特定分類型への分類は、他HCV分離株とのゲノム上の類縁関係の深浅を反映する。本明細書で使用するHCV型命名法はSimmonds et al (1994) Letter, Hepatology 19:131-1324によって提唱され広く採用されている命名法に従う。またZein (2000) “Clinical Significance of Hepatitis C Virus Genotypes(C型肝炎ウイルス遺伝子型の臨床的重要性)” Clinical Microbiol Reviews 13(2):223-235; Maertens and Stuyver (1997) “Genotypes and Genetic Variation of Hepatitis C Virus(C型肝炎ウイルスの遺伝子型および遺伝子変化)” p.182-233, in Harrison and Zuckerman (eds.), The Molecular Medicine of Viral Hepatitis, John Wiley and Sons, Ltd., Chichester, Englandなどをも参照。Simmonds et al (1994)は既知HCV分離株を11のHCV遺伝子型すなわち遺伝子型1〜11に分類する。各遺伝子型は下位区分の亜型へとさらに細分されるが、亜型は遺伝子型を同じくする分離株間の類縁関係を反映する。HCV亜型は遺伝子型を表す数字にアルファベットの小文字を添えて、たとえば亜型1a、亜型1c、亜型6aなどのように表記する。個別分離株の内部に見られる遺伝子変異体は準種という。11の遺伝子型をすべて包摂する約78のHCV亜型は世界中で通用するが、亜型の数は固定的なものではない。研究され配列分析されるHCV分離株の数が多くなると、追加の亜型(およびおそらく遺伝子型)が認知される可能性が出てくるためである。
【０１２５】
用語「ウイルス型」は遺伝子型、亜型いずれかをいう。周知のように用語「HCV型」は本明細書の場合と同様にHCV遺伝子型またはHCV亜型を意味する。本明細書では、「HCV型判別」は実験(たとえば未知の型の)HCVを既知の遺伝子型(たとえば1、2、3、4、5または6、またはそのサブセット)に帰属させることを、または実験HCVを既知の亜型(たとえば1a、1b、1c、2a、2b、2cなど、またはそのサブセット)に、帰属させることを意味する。一方、やはり周知のように、慣用の用語「HCV遺伝子型判別」は最も一般的にはHCVを任意のHCV亜型のうちの1つに、最も一般的には亜型1a、1b、1c、2a、2b、2cなどに、帰属させることを意味する。しかし、本明細書では用語「遺伝子型判別」は専ら遺伝子型1、2、3、4、5または6への帰属をいう。
【０１２６】
ある種のHCV遺伝子型には互いの関連性のほうが、類縁関係の遠い他の遺伝子型に対する関連性よりも強いものがあるので、ウイルスのゲノム構成は、その点を反映させクレードという概念を導入して分類するのが最良ではないかと提言する報文もある。この分類システムでは、クレード1、2、4および5は遺伝子型1、2、4および5に対応するが、クレード3は遺伝子型3および10に対応し、クレード6は遺伝子型6、7、8、9および11に対応する。本発明の開示ではこのクレード命名法は使用しない。
【０１２７】
「に由来する」という表現は、特定のサンプル、分子、生物、または該特定サンプルまたは生物からの情報から分離した、またはそれらを使用して作製した、構成要素についていう。たとえばC型肝炎ウイルスに由来する核酸分子はHCVゲノムの分子でも、HCVゲノムの転写産物でもよい。
【０１２８】
用語「ウイルス量」、「ウイルス負荷」、「ウイルスコピー数」、および同等または類似の表現はサンプル中のウイルスゲノムの定量的評価をいう。ウイルス量はサンプル容積単位あたりのウイルス粒子(ビリオン)数で表すことができる。あるいはウイルス量はサンプル容積単位あたりのウイルスゲノム粒子数で表してもよい。たとえばサンプル中のHCVのウイルス量はサンプル容積単位あたりのRNAゲノム分子数で表すことができる。
【０１２９】
用語「部分配列」、「断片」、「部分」などは、より大きな配列(たとえばポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列)の、完全配列を上限とする、任意の部分をいう。部分配列の最小鎖長は一般に設けない。ただし、最小鎖長の設定が所期の機能に照らして有用である場合はその限りとしない。たとえばポリヌクレオチドの一部分をウイルスゲノムから増幅してアンプリコンを生成することができるが、該アンプリコンはポリヌクレオチドプローブを含むハイブリダイゼーション反応系に使用することができる。従ってこの場合には、増幅部分はポリヌクレオチドプローブと特異的にハイブリダイズするに足る鎖長であるのがよい。ポリヌクレオチドの部分は任意の鎖長たとえば5、10、15、20、25、30、40、50、75、100、150または200ヌクレオチド以上でもよい。
【０１３０】
用語「モニターする」は定期的または連続的な監視、検査、データ収集および/または定量をいう。モニタリングは自動化してもよいし、モニタリングで収集した情報(たとえばデータセット)はプリントしても、またコンピューター可読形式および/またはコンピューター保存可能形式に編集してもよい。
【０１３１】
用語「相関する、相関させる」は複数の変数、数値または実体間の関連付けをいう。2変数が相関する場合、一方の変数の特定を他方の変数の値の決定に使用することができる。
【０１３２】
用語「キット」は、サンプルのプロセス、方法、アッセイ、分析または操作を容易にする一組の物品をいう。キットはキットの使用説明書(たとえば本発明の方法の説明書)、該方法に必要とされる試薬または酵素、プライマーおよびプローブ、その他任意の構成要素を含んでもよい。実施態様によっては、本発明はRT-PCR使用の「閉管法」によるHCV型判別のためのキットを提供する。これらのキットはたとえばサンプル採取(たとえば血液サンプル採取)用試薬、血液からのRNA抽出および精製用の試薬、逆転写酵素、HCVアンプリコンを生成するための逆転写および第1鎖および第2鎖cDNA合成に適したプライマー、熱安定性のDNA依存性DNAポリメラーゼ、および遊離デオキシリボヌクレオチド三リン酸を非限定的に含んでもよい。実施態様によっては、逆転写酵素活性と熱安定性のDNA依存性DNAポリメラーゼ活性とを含む酵素は同じ酵素たとえばThermus sp. ZO5ポリメラーゼまたはThermus thermophilusポリメラーゼである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１３３】
発明の詳細な説明
HCV分離株(たとえば患者由来のサンプル中のHCV分離株)の型判別は適切な治療方針を決定するうえで貴重な臨床ツールである。感染したHCVの型(遺伝子型および/または亜型)判別は疫学的分析(たとえば特定HCV集団感染の感染源および/または広がりの決定)などにも有益である。
【０１３４】
現在のHCV型判別方法は前述のように種々の限界に見舞われている。現在の技術的限界を克服しまだ満たされていない必要性を満たすような改良型のHCV型判別方法を提供することを目的に、本願はHCV型判別分析のための新規な組成物および方法を提供するが、該方法は一組のプローブを使用してHCV型の帰属を行い、少なくとも5つのHCV型(遺伝子型または亜型)を区別しうることを特徴とする。一組のプローブは1回の型判別分析で同時に使用することができる。本発明の組成物および方法は多数のHCV型を区別しうるし、また将来新しいHCV型および準種が同定されたときにも、容易に適応を図れる。加えて、このHCV型判別方法はHCV定量分析と同時併用することにより、ウイルスコピー数を評価することができるが、その場合、そうした定量分析用の試薬はHCV型判別分析と同じ反応系に混合される。
【０１３５】
多次元プローブ分析によるHCV型判別
本発明はHCV型判別のための組成物と方法を提供するが、該方法は複数の型判別プローブを使用し、また該複数の型判別プローブから相補的な情報を使用してHCV遺伝子型または亜型の帰属を行う。本発明の組成物と方法は(たとえばHCV遺伝子型1、2、3、4、5または6; または亜型1a/b/c、2a/b/c、3a、3b、4a、5aまたは6aより選択される)少なくとも5つのHCV型を区別するために使用することができる。本発明の方法はまた、混合HCV感染の場合にも使用可能であり、サンプル中に存在する各HCV種をHCV型(遺伝子型または亜型)に帰属させることができる。
【０１３６】
図8に示すように、異なるHCV型に対応するTm値が類似したりオーバーラップしたりすると、HCV型の帰属は困難になりかねない。実際、任意の一HCV型に対応するTm値特性は、遺伝的変異性および/または装置分解能の限界のため、しばしばある範囲のTm値である。本発明はこの問題を、図9に解説する要領で、解決する。図9に示すように、任意の一プローブ(たとえばプローブAまたはプローブB)は任意の一組のHCV型(この場合は仮想上の型1〜6)に対応した異なるTm値パターンを示す。図からわかるように、プローブA、プローブBのどちらかだけに依存しても型判別は問題含みである。プローブAは型1、3、5および6を区別できるが、型2と型4の区別ができない。同様に、プローブBは型1、2、3および5を区別できるが、型4と型6の区別ができない。しかし、プローブAとプローブBに由来するデータを2次元データ空間内で同時に考察すると、型2は型4から、また型4は型6から、それぞれ分離可能になる。この2次元データ空間内では、型2、4および6に対応するTm値は各々、他の任意のHCV型の位置とはオーバーラップしない固有の位置を占める。
【０１３７】
図9は、Tm値を量的形質として使用して種々のハイブリダイゼーション複合体を特性解析する2次元分析の図解である。しかし、本発明は種々のハイブリダイゼーション複合体の特性解析にTm値だけを使用することに限定されるものではない。後述のように、他の特徴的ハイブリダイゼーション特性をも計測し使用することができるからである。
【０１３８】
図9に示すように、仮想上のプローブAまたはプローブBは単独で複数のHCV型を区別しうる必要はない。ただ、プローブAとプローブBが各々単独で少なくとも2つのHCV型を区別しうる必要があるだけである。本発明は、多次元分析に使用される任意の一プローブが3つ以上のHCV型を区別しうること求めるものではない。ただし実施態様によっては、多次元分析に使用されるプローブが3つ、4つ、5つまたは6つ以上のHCV型を区別しうることもあろう。
【０１３９】
多次元分析に使用されるプローブがたとえ複数のHCV型を区別する能力を備えるとしても、多次元分析の使用は単一プローブを使用してHCV型の帰属を行うよりも有利である。遺伝子型間差異のある多数の臨床材料を扱う場合には、多次元分析は型の帰属をよりロバストで、誤りにくくする。多次元HCV型判別分析時に収集された情報の層の編集もまた型の帰属を、ウイルスコピー数のばらつきに起因する再現性の小幅変動をこうむりにくいものにする。多数の分離株を表現するデータベースに保存されたデータは多次元パターン比較による正確なHCV型の帰属に使用することができる。各遺伝子型/亜型判別は複数のプローブからの結果の組み合わせによって行うが、そうした組み合わせは各HCV遺伝子型/亜型に対応する固有の特徴をもたらし、各型判別の信頼水準を大幅に高めてくれる。
【０１４０】
図9は2プローブに対応する状況と2次元データ空間の図解である。しかしこの手法は、2つのHCV型判別プローブだけを使用する分析に限定されないものとする。データ空間は多次元で、たとえば3つのプローブからのデータを3次元データ空間に取り込む、または4次元データ空間で4つのプローブを使用するなどでもよい。それどころか、HCV型判別が学術文献の中で複雑化の様相をますます強めるにつれて、多次元分析の必要も強まり、使用される型判別プローブの数も増える一方となる。
【０１４１】
ある種の実施態様では、閉管RT-PCRおよび融解分析システムを好適なサーモサイクラーにセットすることができる。そこではRT-PCR、ハイブリダイゼーションおよびTm融解曲線分析の進行が、単に反応容器温度の制御により、反応および分析の種々の段階に応じて反応容器を移動させる必要もなく、制御される。実施態様によっては、サーモサイクラーは好適な蛍光分光光度計と連結して一体化することができる。
【０１４２】
本発明の1つの利点は、開示の方法が随意に閉管システムに使用しうることである。本発明の閉管システムでは反応開始(たとえばRT-PCRおよび融解分析の開始)後の追加試薬の添加が一切不要であり、必要な試薬はすべて分析開始時に揃っている。たとえば閉管システムを使用する場合、RT-PCRおよび融解分析に必要な試薬はHCV RNAサンプル、汎用RT-PCRプライマー、DNAポリメラーゼ(好ましくはRT活性を有するもの)およびデオキシリボヌクレオチドなどを含めてすべて、反応容器に入っている。
【０１４３】
さらに、多次元分析に使用する各HCV型判別プローブは閉管反応系に含めることができる。閉管反応系に複数の型判別プローブを含める場合には、固有の発光スペクトルを有する異なる標識たとえばFRET標識のFAMおよびHEXを各プローブに付けて、異なるチャンネルで蛍光を読み取るようにすることができる。マルチチャンネル発光モニタリングを使用する閉管システムには複数の型判別プローブを随意に使用することができるものの、そうしたプローブを閉管システムに使用する必要は必ずしもない。たとえば各型判別プローブは、標識が同じか異なるかを問わず、別々の独立した反応系に使用して、後でデータ(たとえば融解分析データ)を多次元データ空間用に編集し分析に回してもよい。
【０１４４】
HCV型判別情報だけでなくHCVゲノム定量データも得るほうがしばしば有利である。本発明の別の態様では、閉管システムは随意に、RT-PCRステップでHCVアンプリコンの蓄積をモニターするためのHCV定量試薬たとえばTaqManタイプのプローブを含んでもよい。
【０１４５】
一般に、一態様では本発明の多次元HCV型判別方法は次のステップを含む:
【０１４６】
(A)  随意に、サンプルからHCVゲノムの一部分を増幅するステップ
実施態様によっては、未知の型のC型肝炎ウイルスを含むサンプルが型判別分析に直接(増幅ステップを介する必要もなく)使用される。この場合には、該サンプルから、たとえば任意好適の核酸単離手法を使用して、HCVゲノム物質またはHCV転写産物を単離することができる。その単離物質はその後の分析に使用することができる。ごく少ないコピー数の核酸を分析する手法(たとえば蛍光検出法)は技術上周知であり、本発明に使用することができる。たとえばMirkin et al., “PCR-Less detection of genomic DNA with nanoparticle probes”(ナノ粒子プローブによるゲノムDNAの無PCR法検出), Abstract Papers, 222nd ACS National Meeting, Chicago, IL, United States (August 26-30, 2001)を参照。
【０１４７】
実施態様によっては、型判別分析の前にHCV増幅ステップを随意に設けてもよい。この増幅は一般に非対称RT-PCR反応であり、増幅領域は少なくとも2つのHCV型(遺伝子型または亜型)間の変動が十分に大きなドメインを包摂するが、該ドメインの変動の大きさは該2 HCV型に対応する独特の、他HCV型にはない、ヌクレオチド配列が存在するほどである。該増幅領域は特に限定されず、ウイルスゲノムの任意好適の部分に由来してよい。該増幅領域は高保存領域(たとえば5'-UTR領域)内にあってもよいし超可変領域(たとえばHCVポリメラーゼをコード化するNS5B領域)内にあってもよい。あるいは、コアまたはE1領域を使用してもよい。実施態様によっては、HCVアンプリコンの生成に使用されるPCRプライマーはHCV遺伝子型または亜型に関係なくアンプリコンを生成するような、「汎用プライマー」である。汎用HCVアンプリコンの生成に適した汎用タイプのHCVプライマー(およびHCV特異的PCRキット)は広く知れており、また商業的にも入手可能である。たとえばRoche COBAS AMPLICOR (商標) HCV MONITORテストキット (Roche Molecular Systems, Inc., Pleasanton, CA)を参照。他の実施態様では、2つ以上のプライマーセットを使用してもよい。
【０１４８】
PCR反応に使用するDNAポリメラーゼは特に限定されない。PCRアンプリコンをHCV RNAゲノム物質から生成させるときのPCR反応は、ワンステップ逆転写(RT)PCR反応でもよいが、それにはやはりRT活性を有する熱安定性ポリメラーゼ(たとえばThermus sp.株ZO5; Roche Molecular Systems)を使用する。あるいは該RT-PCRは逐次反応でもよいが、その場合はcDNAを生成させる逆転写ステップ用と増幅ステップ用の2つの異なる酵素を使用する。ある種の実施態様では、PCR増幅プライマーの一方はHCV cDNA第1鎖を生成させるためのRT活性を誘発する機能も果たす。PCRおよびRT-PCR試薬および方法は技術上周知である。
【０１４９】
RT-PCR反応系は随意にdTTPの代わりにdUTPを、しかも他のデオキシリボヌクレオチド類よりも高モル濃度で、含んでもよい。これは含dUTPアンプリコン(外来性DNAによるPCRの交差汚染の防止に有用である)の生成に使用することができる。含dUTPアンプリコンを使用する系では、HCV逆転写および増幅の前の、ウラシルN-グリコシラーゼ(UNG)ヌクレアーゼ消化とそれに続くUNA不活化により、他の含dUTPポリヌクレオチドからの交差汚染を解消することができる。そうした系は技術上常用されているし、また種々の販売元から入手可能である(たとえばRoche Diagnostics AmpErase(商標))。
【０１５０】
一態様では、サンプルはHCV感染が証明されている/またはHCV感染が疑われている患者(人間)に由来する血液または血液生成物(血漿、血清など)である。一般に、ただし必須ではないが、HCVゲノム物質を含むサンプルは、該サンプルのRNA成分を濃縮するために、少なくとも部分的に精製してある。RNA精製方法は任意好適のものが使用可能であり、また全RNA精製でもポリA RNA精製でもよい。RNAの濃縮に使用する方法は理想的には高効率法またはロボットシステムへの応用が可能な迅速方法であり、たとえばQIAamp(商標) Viral RNA Mini Kit (Qiagen N.V., Venlo, the Netherlands)およびHigh Pure RNA Isolation Kit (Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN)などである。
【０１５１】
(B)  HCV物質を複数のHCV型判別プローブとハイブリダイズして標的ハイブリダイゼーション複合体を形成するステップ
次にHCV物質(たとえばサンプル物質、またはRT-PCR増幅で生成されたHCVアンプリコンなど)を複数のHCV型判別プローブとのハイブリダイゼーション反応に使用してハイブリダイゼーション複合体を形成する。HCV型判別プローブの設計では次の点などを含めて種々の事項が配慮される: (i)プローブの配列はHCVアンプリコン内部のヌクレオチド配列と少なくとも部分的に相補的であり、そこには少なくとも非ストリンジェント条件の下でのハイブリダイゼーションを可能にするに足る相補性が存在する; (ii)ハイブリダイゼーション複合体の相補性領域は少なくとも2つのHCV型(遺伝子型または亜型)間で配列異質性を示す; (iii)各型判別プローブと少なくとも2つのHCV型とを含むハイブリダイゼーション複合体は各々を他の型から区別するような特徴的ハイブリダイゼーション特性を有する。使用される複数の型判別プローブのヌクレオチド配列は同一ではないが、HCVゲノムの同じ領域にハイブリダイズするような、重複ヌクレオチド配列を、または同じヌクレオチド配列の修飾を、有してもよい。複数の型判別プローブとのハイブリダイゼーション反応は単一の反応混合液中で起きても別個の独立した反応混合液中で起きてもよい。原則として、ハイブリダイゼーションステップは単一のハイブリダイゼーション反応系で起きても、あるいは複数のハイブリダイゼーションステップにまたがってもよい。
【０１５２】
本明細書では、用語「ハイブリダイゼーション」は可溶性相ハイブリダイゼーションに限定されないものとする。当業者には明らかであろうが、本発明には多様な代替ハイブリダイゼーション法が使用可能である。たとえば固相ハイブリダイゼーション法は膜、ろ紙、ビーズ、ゲルなどのような多様な表面上で行える。ハイブリダイゼーションプローブは固相表面に共有結合しても非共有結合してもよい。あるいは、キャプチャーオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションプローブのうちのHCVハイブリダイゼーション複合体の形成に関与しない部分とハイブリダイズしてもよいし、またそうしたハイブリダイゼーションプローブ部分に対して特異的なキャプチャー抗体を固相に結合させてもよい。
【０１５３】
プローブが特定HCV遺伝子型または亜型とハイブリダイゼーション複合体を形成するとき、形成されるハイブリダイゼーション複合体はその特定遺伝子型または亜型に特徴的であり、他の遺伝子型または亜型と形成しうるハイブリダイゼーション複合体の特性とは異なる、固有の特性を有する。
【０１５４】
実施態様によっては、特徴的ハイブリダイゼーション特性は融解温度(Tm)である。Tmのin silico予測および実験的決定のため方法は技術上周知である。しかし、本発明は唯一の特徴的ハイブリダイゼーション特性としてのTm値の使用には限定されないものとする。ハイブリダイゼーション複合体の間の差異の特徴付けには他の方法を使用してもよい。たとえば特徴的ハイブリダイゼーション特性はT25またはT75でもよい。他の実施態様では、HCV型判別プローブを含む種々のハイブリダイゼーション複合体は、ヘテロ2本鎖移動度分析(HMA)、変性HPLC (DHPLC)、制限断片長多型(CFLP)、熱勾配キャピラリー電気泳動(TGCE)などを使用することにより、互いに他から区別することができる。加えて、種々の特徴的ハイブリダイゼーション特性を組み合わせてハイブリダイゼーション複合体の区別を強めることもできる。
【０１５５】
本発明への使用が可能なHCV型判別プローブの例は図6に示すとおりである。多次元分析に使用するプローブの組み合わせの選択は、多次元データ空間(図9を参照)に相互補完情報をもたらしてくれるプローブの組み合わせによって決まる。たとえば、あるプローブがHCV型1、2、3および4を区別するが、型5または6は区別しないとすれば、好適な相互補完的プローブは型および/または6を型1、2、3および4から区別しうるような任意のプローブであろう。多次元分析用の効果的なプローブ対の組み合わせ例はプローブAG0307M(配列番号26)とAG0308K(配列番号54); プローブAG0203A-FAM(配列番号10)とAG0308J(配列番号53);およびプローブAG0308AA(配列番号57)とAG0308H(配列番号52)などである。
【０１５６】
同様にして、3つ以上の型判別プローブの組み合わせもまた多次元分析に同じように使用できる。たとえばHCV型1、2、3だけを区別するあるプローブ、型3、4だけを区別するもう1つのプローブ、それに型5、6だけを区別するさらに別のプローブは3プローブ多次元分析で有効な組み合わせとなる。
【０１５７】
態様によっては、他の検討事項が多次元HCV型判別分析に使用するプローブの選択を左右する。これら事項は、本明細書で開示している他のプローブ選択アプローチと必ずしも互いに相容れないものではない。というよりも、態様によっては多数の因子が同時に検討される。たとえば少なくとも1つのHCV型に関してプローブごとに異なるデータポイントがもたらされるように一組のプローブを選択することができる。このアプローチでは、アフィニティーを異にする複数のプローブによるHCV配列についての同時問い合わせが焦点である。結果として最終的に可能になるものは配列検知戦略とでも言えよう。そこではデータパターン(たとえば融解温度に基づくデータパターン)によってHCV型(たとえばHCV遺伝子型)が特徴付けられ、他のHCV型とは容易に区別される。各々のHCV型が独自の特徴をもつためであるが、それはプローブの組み合わせの選択によって可能となる。前述のように、このアプローチの利点は組み合わせに含まれる任意の1プローブが問題のHCV型をすべて(たとえば5つ以上のHCV遺伝子型)を区別する必要はないことである。
【０１５８】
本発明への使用が可能なHCV型判別プローブは図6に記載のプローブに限定されないものとする。明細書を読めば、本発明への使用が可能な追加のプローブを導き出す方法は当業者には自明であろう。また、図6および実施例6に記載のプローブ配列は配列の一部として種々の蛍光標識も示している。たとえば図6の記号Fは標識FAMを、また記号HはHEXを、それぞれ示す。しかし、これらのプローブの塩基配列は特定の標識FAMまたはHEXに限定されないものとする。当業者には自明であろうが、これらのプローブの塩基配列には技術上周知の多様な標識のうち任意のものが使用可能である。
【０１５９】
前述のように、本発明のハイブリダイゼーション反応系は多次元HCV型判別分析のための少なくとも2つのHCV型判別プローブを含む。実施態様によっては、これら型判別プローブの各々(または部分集合)は随意に単一ハイブリダイゼーション反応系に含まれ、また型判別プローブの各々は該プローブをHCVゲノム(たとえばRT-PCRで生成させたHCVアンプリコン)内の同じ標的領域へと誘導するためのポリヌクレオチド配列を備える。思いがけないことに、同じ標的領域を探ることを目的に設計された、ただし単一ハイブリダイゼーション反応系における熱力学的安定性を異にする、複数のプローブの存在は何らの競合も、またはいかなる結合妨害も、互いに引き起こさないことが観測された。言い換えると、プローブが同じ標的特異性を有するにもかかわらず、反応系内の各プローブが生み出す結合プロファイルおよび解離曲線は反応系内の他のHCV型判別プローブの存在によって左右されることがなかった。マルチプローブ反応系内の各プローブはあたかも反応系内の唯一のプローブであるかのように振舞った。これはたとえばAG0203A-FAMおよびAF0308J(HEX)プローブを多次元HCV型判別分析へと選択的に使用したときに観測された(そこではこれらのプローブをまず別個の融解曲線ハイブリダイゼーション反応系に単独で使用し、次いで同じ反応系へと組み合わせて使用した)。さらに、少なくとも第1および第2プローブは増幅ステップ時に存在しているかまたは増幅ステップの後で追加される。
【０１６０】
(C)  ハイブリダイゼーション複合体のハイブリダイゼーション特性を計測するステップ
【０１６１】
HCV物質とHCV型判別プローブの間でひとたびハイブリダイゼーション複合体が形成されたら、特徴的ハイブリダイゼーション特性を計測する。一態様では、ハイブリダイゼーション特性前述のようにTmであり、従ってTm融解曲線分析が行われる。しかし、本発明は特徴的特性としてのTmの使用に限定されないものとする。それどころか他の特性の単独での、または組み合わせでの使用(すなわち計測)のほうが、特に高効率用途などでは、有利な場合もある。
【０１６２】
実施態様によっては(たとえばTmを特徴的特性として使用する場合には)、RT-PCR反応、プローブ/標的ハイブリダイゼーション反応およびTmの計測を単一「閉管」システム内で行う。その場合にはRT-PCR反応開始後に追加試薬を添加する必要がない。この閉管システムでは、各ステップで必要とされる諸々の試薬が最初から反応容器内に存在している。実施態様によっては、閉管RT-PCRおよびTmシステムはたとえばHCV RNAサンプル、汎用RT-PCRプライマー、DNAポリメラーゼ(好ましくはRT活性を有するもの)、デオキシリボヌクレオチド、好適なHCV型判別プローブ(プローブは随意に1つまたは複数の好適なFRET成分で標識する)および随意に可溶性FRET消光体などを含む。ある種の実施態様では、閉管RT-PCRおよびTmシステムを好適なサーモサイクラーにセットすることができる。そこではRT-PCR、ハイブリダイゼーションおよびTm融解曲線分析の進行が、単に反応容器温度の制御により、反応および分析の種々の段階に応じて反応容器を移動させる必要もなく、制御される。同様にして、実施態様によっては、サーモサイクラーを好適な蛍光分光光度計と連結することにより、反応容器を移動させず融解分析のための蛍光モニタリングを行うことができる。
【０１６３】
本発明はTmの決定について特定の方法に限定されない。Tmの実験的決定については多様な方法が技術上周知であり、また種々の文献でも開示されている。たとえばLiew et al., “Genotyping of Single-Nucleotide Polymorphism by High-Resolution Melting of Small Amplicons,”(小アンプリコンの高分解能融解曲線分析による一塩基多型の遺伝子型判別) Clinical Chemistry 50(7):1156-1164 (2004); Reed and Wittwer “Sensitivity and Specificity of Single-Nucleotide Polymorphism Scanning by High-Resolution Melting Analysis,”(高分解能融解曲線分析による一塩基多型スキャニングの感度と特異度) Clinical Chemistry 50(10):1748-1754 (2004); Zhou et al., “Closed-Tube Genotyping with Unlabeled Oligonucleotide Probes and a Saturating DNA Dye,”(非標識オリゴヌクレオチドプライマーと飽和性DNA色素の使用による閉管式遺伝子型判別)Clinical Chemistry 50(8):1328-1335 (2004); Zhou et al., “High-resolution DNA melting curve analysis to establish HLA genotypic identity,”(高分解能DNA融解曲線分析によるHLA遺伝子型の同定) Tissue Antigens 64:156-164 (2004)などを参照。融解曲線分析装置は種々のメーカーから市販されている。当然、装置が異なれば感度も異なる可能性がある。たとえばTm分解能が±0.5℃の装置もあれば、±0.1℃の装置もあろう。従って、各HCV型のTm値を0.2℃まで区別して出しうるようなHCV型判別プローブは、Tm装置の製造元やモデルによってはうまく使えても、感度の異なる別の装置にはうまく使えないかもしれない。
【０１６４】
(D)   計測したハイブリダイゼーション特性(Tmなど)をHCV型と相関させるステップ
ひとたびステップ(C)に記載の要領で複数のプローブを使用してハイブリダイゼーション特性を計測したら、計測したハイブリダイゼーション特性値に基づいてHCV型をサンプル中のHCVに帰属させる。たとえばTmがハイブリダイゼーション特性の計測値であるとき、試験サンプルの分析に先立ち、複数の型判別プローブについて既知HCV型分離株を使用して標準化Tm値テーブルを作成する。この標準化Tm値テーブルは各型判別プローブに対応する、および各HCV遺伝型または亜型に対応する、試験サンプルの分析に使用した同じハイブリダイズ条件下での既定Tm値  からなろう。ひとたび試験サンプルに対応するTm値が計測されたら、それらの値を標準化テーブルTm値と比較し、図9に記載のものと類似する分析を行う。標準化および試験サンプルに対応する値が同一であるかまたは同一に近ければ、既知の型と実験の型は一致することになる。
【０１６５】
あるいは、各HCV遺伝子型または亜型の標準化サンプルを試験サンプルと平行して分析し、このアッセイで計測した実験値と標準値(たとえばTm値)の比較に基づいてHCV型の帰属を行うこともできる。
【０１６６】
実施態様によっては、HCV型判別方法をHCV定量方法と連結する。HCVの定性(型判別)分析と定量(ウイルス濃度)分析を同じアッセイで同時に行うこの方法は患者の治療に当たる臨床医には大いに有益である。HCV定量法は技術上周知であり、たとえばCOBAS AMPLICOR (商標) HCV MONITORキット(Roche Molecular Systems, Inc., Pleasanton, CA)などがある。これらの市販システムは一般にPCR反応にTaqManタイプのプローブを使用して、RT-PCR反応系内の汎用HCVアンプリコンの蓄積をリアルタイムでモニターする。
【０１６７】
TaqManプローブの蛍光値によってモニターされるPCRアンプリコンの蓄積速度はサンプル中のRNAゲノム出発材料の量に正比例する。RT-PCR反応系に適正なHCV濃度標準を含めることにより、出発反応系内のHCVゲノム分子数を求めることができる。その知見から、試験サンプル中のHCVゲノム粒子の濃度を外挿することができる。
【０１６８】
実施態様によっては、TaqManタイプのプローブをRT-PCR反応混合液に含めておき、PCRアンプリコンのリアルタイム蓄積をモニターする。その情報から、サンプル中のHCVゲノム濃度を計算する。ある種の実施態様では、閉管システムとしてHCV定量をHCV型判別と連結する。TaqManタイプのプローブは、RT-PCR増幅とハイブリダイゼーション特性分析(たとえば融解曲線分析)のための諸々の試薬を入れた反応混合液に含まれる。HCV定量をHCV型判別と連結するとき、一般にRT-PCR増幅反応に非対称PCR反応を使用する。その場合には、TaqManタイプの検出プローブは限定的なアンプリコン鎖に対して相補的であるよう設計し、HCV型判別プローブは豊富な、過剰量のアンプリコン鎖に対して相補的であるよう設計する。さらにTaqMan定量プローブはHCVアンプリコンの保存領域とハイブリダイズするように設計して、該プローブが任意のHCV型のゲノムとハイブリダイズするようにする。ある種の実施態様では、定量プローブは等しいアフィニティーですべてのHCV型アンプリコン配列とハイブリダイズする。ウイルス量は蛍光導関数プロット(たとえば1次および2次導関数プロット)を使用して定量することができる。
【０１６９】
本発明のHCV型判別プローブの設計
一般に、本発明のHCV型判別プローブは次の指針に従って設計する。
【０１７０】
1)  少なくとも2つのHCV型(遺伝子型または亜型)HCVゲノム中の配列を特定する
ハイブリダイゼーションの標的となるHCVゲノム中の配列は特に限定されない。プローブは、HCVゲノム内の十分な異質性を備えた比較的高保存ドメイン(たとえば5’-UTR)と、または比較的可変性のドメイン内にある比較的高保存ドメインと、ハイブリダイズする。好適なプローブ標的が特定されたら、適切な汎用増幅プライマーの使用も検討する。その場合、生成されるHCVアンプリコンは型判別プローブ配列を含まなければならないし、またプローブ標的配列の上流側および下流側配列は保存性が十分に高く、HCV型に関係なくHCVアンプリコンを生成するような汎用PCRプライマーの使用を可能にするほどでなければならない。候補HCV型判別プローブは異質性領域にハイブリダイズするように設計する。
【０１７１】
ハイブリダイゼーションプローブの設計には種々の市販プログラムが広く得られる。そうした市販プログラムの例はOMP (DNA Software, Inc., Ann Arbor, MI)やTmユーティリティーツール(Idaho Technology, Inc., Salt Lake City, UT)などである。本発明はプローブ配列の設計について特定ソフトウェアの使用に限定されないものとする。
【０１７２】
本発明のHCV型判別プローブは、任意の一HCV型と同一(100%相補的)であるヌクレオチド配列を備える必要はない。本発明のHCV型判別プローブは、各HCV型ゲノムとの相補性が意図的に100%未満であるヌクレオチド配列を備えてもよい。それが望ましいかもしれないのは、複数のHCV型の区別を可能にするような望ましいハイブリダイゼーション特性を該プローブに付与しようとする場合である。たとえば生成するハイブリダイゼーション複合体のTmを変化させるために、わざとミスマッチを組み込んだプローブを設計する場合がある。HCV型判別プローブの例は図6に示す。
【０１７３】
2)  候補型判別プローブ配列をin silicoで試験する
候補プローブ配列が特定されたら、その配列を随意にin silicoで試験して、既知HCV型配列とハイブリダイズしたときに弁別特性を示す能力の有無を調べる。たとえば候補プローブ配列が特定されたら、in silicoモデリングを使用して、そのプローブと各既知HCV型の標的相補鎖からなる仮想ハイブリダイゼーション複合体のTmを予測することができる。プローブ候補は有効であるためには、各HCV型とのハイブリダイゼーションで十分に特徴的な特性(たとえばTm)を示さなければならない。
【０１７４】
特定ハイブリダイゼーション複合体のTmの予測には種々の市販プログラムが広く得られる。たとえばOMP (DNA Software, Inc., Ann Arbor, MI)やTmユーティリティーツール(Idaho Technology, Inc., Salt Lake City, UT)などである。本発明はTmの予測では特定ソフトウェアの使用に限定されないものとする。
【０１７５】
候補HCV型判別プローブの随意in silico試験は有効プローブを無効プローブとの関係で特定するための手がかりとなる。このin silicoスクリーニングはHCV型判別プローブのハイブリダイゼーション特性の実験的試験および計測ステップへと進む前の必須のステップというわけではない。さらに、Tm値のin silico予測は概算にすぎず、実験による観測と確認が求められるのは当然である。
【０１７６】
3)  候補プローブをin vitroで試験するステップ
プローブ設計の最終ステップとして、型判別プローブをin vitro試験にかけ、各HCV型を区別する能力の有無を少なくとも1つの試験方法により調べる。プローブ挙動のin silico予測は100%の精度ではないので、その予測結果を確認するにはこの試験ステップが必要である。ここでは2つの試験方法を示すが、他の同等の試験方法を採用してもよい。
【０１７７】
A. 化学的に合成されたHCV標的
Tm値を求めるような実施態様では、プローブは、各HCV型に対応するヌクレオチド配列(図5)をもつ人工合成(化学合成)HCV標的と共に、融解曲線分析に使用する。型判別プローブと各HCV合成鋳型とを含む各ハイブリダイゼーション複合体のTmは実験的決定する。これらのアッセイではHCVアンプリコンを生成するRT-PCR反応は不要である。有効なプローブは、少なくとも2つのHCV型(遺伝子型または亜型)について異なる、識別可能なTm値をもたらすプローブである。
【０１７８】
B. 酵素的に合成されたHCV標的
あるいは、または化学合成標的に加えて、合成(たとえばin vitro転写法で酵素的に合成した)HCV転写産物を使用してTm値融解曲線検証を行うこともできる。この検証試験には、既知遺伝子型または亜型のHCVインサートを導入したプラスミドからin vitro転写法で生成した転写産物を使用することができる(実施例2を参照)。
【０１７９】
プローブとプライマーの合成
本発明はまた多数のプローブとプライマーたとえばHCV型判別プローブ、HCV定量(TaqManタイプ)プローブおよびHCV増幅プライマー(RT-PCR用)を提供する。これらのプローブおよびプライマーの作製方法は何ら限定されないものとする。当業者はプローブおよびプライマー作製のための多様な化学合成技術および試薬を熟知している。
【０１８０】
また、本発明のTCV型判別プローブおよびプライマーは天然型ヌクレオチド構造または天然型塩基(たとえばアデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル)に限定されないものとする。本発明には、核酸中に一般に見られる天然型複素環塩基に加えて非天然核酸アナログもまた使用可能である。非天然アナログの例には非天然型複素環塩基または他の修飾塩基をもつものが含まれる。特に、多数の非天然型塩基はたとえばSeela et al. (1991) Helv. Chim. Acta 74:1790; Grein et al. (1994) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:971-976; およびSeela et al. (1999) Helv. Chim. Acta 82:1640などで開示されている。さらに例示すると、ヌクレオチド中に使用されていて融解温度(Tm)調節物質として作用するある種の塩基もまた随意に含まれる。たとえば7-デアザプリン(7-デアザグアニン、7-デアザアデニンなど)、ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、プロピニル-dN (たとえばプロピニル-dU、プロピニル-dCなど)がその一例である。米国特許第5,990,303号(1999年11月23日にSeelaに交付; 発明の名称 “SYNTHESIS OF 7-DEAZA-2’-DEOXYGUANOSINE NUCLEOTIDES”(7-デアザ-2'-デオキシグアノシンヌクレオチドの合成))明細書を参照。他の代表的な複素環塩基の例はたとえばヒポキサンチン、イノシン、キサンチン; 2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの8-アザ誘導体; アデニン、グアニン、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの7-デアザ-8-アザ誘導体; 6-アザシトシン; 5-フルオロシトシン; 5-クロロシトシン; 5-ヨードシトシン; 5-ブロモシトシン; 5-メチルシトシン; 5-プロピニルシトシン; 5-ブロモビニルウラシル; 5-フルオロウラシル; 5-クロロウラシル; 5-ヨードウラシル; 5-ブロモウラシル; 5-トリフルオロメチルウラシル; 5-メトキシメチルウラシル; 5-エチニルウラシル; 5-プロピニルウラシル、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメルチアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメルチアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルキュェオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、7-デアザアデニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、7-デアザグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルキュェオシン、5’-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュェシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、2,6-ジアミノプリン、および5-プロピニルピリミジンなどである。さらに例示すると、他の修飾オリゴヌクレオチドの例には、1つまたは複数のロックト核酸(LNA(商標))モノマーをもつもの(Exiqon A/S, Vedbaek, Denmarkからのライセンスに基づき、たとえばLink Technologies, Ltd., Lanarkshire, Scotlandなどから市販されているLNA(商標)モノマーを含むオリゴヌク���オチド)も含まれる。そうしたヌクレオチドアナログは以下の文献などでも開示されている: 米国特許第6,639,059号(2003年10月28日にKochkineらに交付; 発明の名称 “SYNTHESIS OF [2.2.1]BICYCLO NUCLEOSIDES”([2.2.1]ビシクロヌクレオシドの合成))明細書; 米国特許第6,303,315号(2001年10月16日にSkouvに交付; 発明の名称 “ONE STEP SAMPLE PREPARATION AND DETECTION OF NUCLEIC ACIDS IN COMPLEX BIOLOGICAL SAMPLES”(ワンステップのサンプル調製および複雑な生体サンプル中の核酸の検出))明細書; 米国特許出願公開第2003/0092905号(発明者:Kochkine et al.; 2003年5月15日公開; 発明の名称 SYNTHESIS OF [2.2.1]BICYCLO NUCLEOSIDES”([2.2.1]ビシクロヌクレオシドの合成))明細書。
【０１８１】
オリゴヌクレオチドのプローブおよびプライマーは記述上周知の方法で作製することができる。ある種の実施態様では、オリゴヌクレオチドのプローブおよびプライマーはたとえばBeaucage and Caruthers (1981) Tetrahedron Lett. 22(20): 1859-1862で開示されている固相ホスホルアミダイト法などを含む任意の核酸合成法により化学的に合成される。オリゴヌクレオチドはトリエステル法でも合成可能である。たとえばCapaldi et al. (2000) “Highly efficient solid phase synthesis of oligonucleotide analogs containing phosphorodithioate linkages”(ホスホロジチオアート結合を含むオリゴヌクレオチドアナログの高能率固相合成) Nucleic Acids Res. 28(9):e40; およびEldrup et al. (1994) “Preparation of oligodeoxyribonucleoside phosphorodithioates by a triester method”(オリゴデオキシリボヌクレオシド・ホスホロジチオアートのトリエステル法による合成) Nucleic Acids Res. 22(10): 1797-1804を参照。技術上周知の他の合成法も、Needham-VanDevanter et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(10): 6159-6168で開示されているような自動合成機の使用などを含めて、使用可能である。多様な自動オリゴヌクレオチド合成装置が市販されている。マルチヌクレオチド合成法(たとえば取りヌクレオチド合成法)も随意に使用される。さらに、プライマー核酸は随意に種々の修飾を含む。たとえばある種の実施態様では、プライマーは後続のアンプリコンクローニングなどを容易にするための制限部位リンカーを含む。またプライマーは随意に、増幅反応の特異性を高めるための修飾を受ける。米国特許第6,001,611号(1999年12月14日にWillに交付; 発明の名称 “MODIFIED NUCLEIC ACID AMPLIFICATION PRIMER”(修飾された核酸増幅プライマー))明細書を参照。プライマーおよびプローブはまた、本明細書で開示するように、または技術上周知のように、他のさまざまな修飾を加えた形で合成することができる。
【０１８２】
本発明の反応混合液、方法および他の態様に使用するプローブは一般にプローブ-標的ハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にするための標識を付ける。標識は技術上周知の多様な方法によりオリゴヌクレオチドに直接付けても間接的に付けてもよい。たとえば、標識は使用する標識の種類次第で末端(オリゴヌクレオチドプライマーおよび/またはプローブの5'または3'末端)ヌクレオチドに付けても、非末端ヌクレオチドに付けてもよいし、また種々のサイズおよび組成のリンカーまたはスペーサーアームを介して間接的に付けてもよい。市販のホスホルアミダイト試薬を使用すると、適切に保護されたホスホルアミダイトを介して5'末端または3'末端のいずれかに官能基(チオールまたは1級アミンなど)を含むオリゴヌクレオチドを生成させ、そうしたオリゴヌクレオチドに、たとえば参照により開示されるInnis et al. (Eds.) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Elsevier Science & Technology Books (1990) (Innis)に記載のプロトコールに従い、標識することができる。
【０１８３】
基本的に、任意の(標準または非標準、標識または非標識)核酸を多様な供給元のうちの任意の1社たとえばMidland Certified Reagent Company (Midland, TX)、Operon Technologies Inc. (Huntsville, AL)、Proligo LLC (Boulder, CO)などに特別または標準注文することができる。
【０１８４】
標識
本発明はまた、本発明に使用する多数のプローブたとえばHCV型判別プローブやHCV定量(TaqManタイプ)プローブを提供する。これらのプローブ分子は一般に好適な標識を含む。標識、標識検出システムまたは標識検出および定量装置は何ら限定されないものとする。当業者は好適に標識したポリヌクレオチドを生成するための多様な標識技術および試薬を熟知している。
【０１８５】
標識は次の機能を択一的または重複的に果たすことができる: (i)検出可能な信号をもたらす; (ii)第2の標識と相互作用して、該第2標識によってもたらされる検出可能信号を変化させる(たとえばFRET); (iii)ハイブリダイゼーションを安定化する(たとえば2本鎖の形成); (iv)捕捉機能を付与する(たとえば疎水性アフィニティー、抗体/抗原、イオン吸着); または(v)物理的特性(電気泳動移動度、疎水性、親水性、溶解度またはクロマトグラフィー挙動など)を変化させる。標識付けは既知の標識、結合、結合基、試薬、反応条件、分析および精製法を使用する非常に数多くの手法のうち任意のものを用いて行うことができる。標識の例には検出可能な蛍光、化学発光、または生物発光信号を生成または消滅させる発光または吸光化合物が含まれる(Kricka, L. in Nonisotpic DNA Probe Techniques (1992), Academic Press, San Diego, pp. 3-28)。
【０１８６】
基本的に、技術上周知の方法により、任意の標識部分を随意に利用して、プローブおよび/またはプライマーに標識することができる。実施態様によっては、標識はたとえば蛍光色素(たとえばローダミン系色素。例: R6G、R110、TAMRA 、ROX など。米国特許第5,366,860号; 第5,847,162号; 第5,936,087号; 第6,051,719号; 第6,191,278号の各明細書を参照)、フルオレセイン系色素(例: JOE、VIC、TET、HEX、FAMなど; 6-カルボキシフルオロセイン; 2',4',1,4-テトラクロロフルオロセイン; および2',4',5',7',1,4-ヘキサクロロフルオロセイン; 米国特許第5,188,934号; 第6,008,379号; 第6,020,581号の各明細書を参照); ベンゾヘノキサジン(米国特許第6,140,500号明細書)、ハロフルオロセイン色素、シアニン系色素(例: Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7など; Kubistaによる公開国際出願第WO97/45539号を参照)、BODIPY(商標)色素(例: FL、530/550、TR、TMRなど)、ALEXA FLUOR(商標)色素(例: 488、532、546、568、594、555、653、647、660、680など)、ジクロロローダミン色素、エネルギー移動色素(例: BIGDYE(商標) v 1色素、BIGDYE(商標) v 2色素、BIGDYE(商標) v 3色素など)、ルシファー色素(例: ルシファーイエローなど)、CASCADE BLUE(商標)、オレゴングリーンなどである。Haugland, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Ninth Ed. (2003)およびその最新版(各々参照により開示される)には蛍光色素の追加例が開示されている。蛍光色素は一般に、Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR)、Amersham Biosciences Corp. (Piscataway, NJ)、Applied Biosystems (Foster City, CA)などを含む種々の供給元から容易に得られる。
【０１８７】
FRET標識法はリアルタイムアンプリコン定量と核酸プローブハイブリダイゼーションの両方で常用される。いくつかの好ましい実施態様では、本発明のプローブにFRET標識システムを使用する。本発明は特定のFRETペアシステムに限定されないものとする。当業者は本発明のプローブに使用しうる広範囲のFRET標識を認知する。供与体と受容体という蛍光エネルギー移動色素ペアは米国特許第5,863,727号、第5,800,996号、第5,945,526号の各明細書で開示されているものや、検出可能信号を生成しうる他の任意の蛍光標識を含む。
【０１８８】
ある蛍光色素が標識であるか消光体であるかは一般に、その励起および発光スペクトル、ならびにペアの相手となる蛍光色素によって決まる。プローブおよびプライマーに消光体として常用される蛍光分子の例はフルオレセイン、FAM、JOE、ローダミン、RG6、TAMRA、ROX、DABCYL、EDANSなどである。これらの化合物は前記の供給元から得られる。蛍光色素から吸収したエネルギーを消散させる非蛍光消光体(ダーククエンチャー)の例はBlack Hole Quenchers(商標)またはBHQ(商標)であり、Biosearch Technologies, Inc.(Novato, CA, USA)から市販されている。他にIowa Blackクエンチャー(Iowa Black FQ(商標)およびIowa Black RQ(商標)など)やEclipse(商標) Dark Quenchers (Epoch Biosciences, Inc, Bothell, WA)などの消光体がある。
【０１８９】
本明細書の実施例では、FRET供与体で標識し可溶性消光体と共に使用するHCV型判別プローブを開示している。特に、第1および第2プローブはFRET供与体を含むが、各FRET供与体の励起および発光スペクトルは異なる。しかし、本発明はこれらのタイプのプローブに限定されないものとする。たとえば本発明のHCV型判別プローブは技術上周知のような、供与体と消光体を共に含む分子ビーコン・タイプのプローブでもよい。あるいは本発明のHCV型判別プローブはTaqManタイプのプローブでもよい。このタイプのプローブもまた供与体と消光体を共に含むが、必ずしもステム構造を介在させず、またエキソヌクレアーゼ活性をもつポリメラーゼによる切断を受けない。
【０１９０】
あるいは、可溶性消光体の代わりに消光体標識アンカープローブを本発明の供与体標識HCV型判別プローブと共に使用してもよい。この場合、アンカープローブはHCV型判別プローブに隣接する保存HCV接領域にハイブリダイズするように設計し、また好適な消光体で標識する。両プローブをそれぞれの標的にハイブリダイズさせるときは、FRET供与体の消光が起きる。融解曲線分析時の条件下では、HCV型判別プローブはいずれ標的プローブから解離し、供与体の蛍光を強める結果となろう。アンカープローブFRETシステムは技術上周知であり、またSchroter et al. (2002) Jour. Clin. Microbiol., 40(6): 2046-2050などでも開示されている。
【０１９１】
標識の例はほかにも、たとえばビオチン、弱蛍光性標識(Yin et al. (2003) Appl Environ Microbiol. 69(7):3938; Babedure et al. (2003) Anal. Biochem. 317(1):1; およびJankowiak et al. (2003) Chem Res Toxicol. 16(3):304)、非蛍光標識、発色標識、化学発光標識(Wilson et al. (2003) Analyst. 128(5):480およびRoda et al. (2003) Luminescence 18(2):72)、ラマン標識、電気化学標識、生物発光標識(Kitayama et al. (2003) Photochem Photobiol. 77(3): 333; Arakawa et al. Anal. Biochem. 314(2):206; およびMaeda (2003) J. Pharm. Biomed. Anal. 30(6):1725)、およびアルファ-メチル-PEG標識試薬(2003年11月21日提出の米国特許出願第107/719,257号明細書を参照)などがある。
【０１９２】
別種の標識として、2本鎖のハイブリダイゼーションを強化、安定化または左右するハイブリダイゼーション安定化物質たとえばインターカレーター、副溝結合分子(minor groove binders)、架橋官能基などがある。Blackburn, G. and Gait, M. Eds. “DNA and RNA structure” in Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 2.sup.nd Edition, (1996) Oxford University Press, pp. 15-81.
【０１９３】
さらに別種の標識はビオチン、ジゴキシゲニンおよび他のハプテンなどのように、特異的または非特異的捕捉による分子の分離または固定化を行う。Andrus, “Chemical methods for 5’ non-isotopic labelling for PCR probes and primers”(PCRプローブおよびプライマーの5’非放射性標識のための化学的方法) (1995) in PCR 2: A Practical Approach, Oxford University Press, pp. 39-54.
【０１９４】
非放射性標識の方法、技術および試薬については概説書として Non-Radioactive Labelling, A Practical Introduction, Garman, A.J. (1997) Academic Press, San Diegoがある。
【０１９５】
実施態様によっては、本発明に使用される2タイプのプローブすなわちHCV型判別プローブとHCV定量プローブは同じ標識たとえばフルオレセイン標識を使用する。これには、HCV定量アッセイとHCV型判別アッセイが同じ検出装置たとえば蛍光分光光度計で読み取れるため、種々の利点がある。しかし、本発明はそうしたタイプの形態に限定されないものとする。たとえば2つの異なるプローブには発光スペクトルを異にするような2つの異なる標識を(さらには蛍光標識と非蛍光標識というように異なる標識システムを)使用してもよい。
【０１９６】
可溶性消光体技術の使用
実施態様によっては、本発明のプローブたとえばTaqManタイプのプローブおよびHCV定量プローブにFRET標識システムを使用する。しかし、本発明はFRET供与体/消光体システムの使用に限定されないものとする。それどころか、FRETシステムは本発明に使用しうるエネルギー移動システムの一例にすぎないし(非蛍光エネルギー移動システムは技術上周知である)、また本発明は特定のFRETペアシステムに限定されない。実施態様によってはFRETシステムに可溶性消光体を使用する。好ましいのは、少なくとも1つの供与体がFRET供与体を含み、またハイブリダイゼーションステップが可溶性FRET消光体と混合するステップを含むような実施態様である。
【０１９７】
「可溶性受容体」または「可溶性消光体」などの用語は、他の分子には付着していない受容体であって、ほぼ可溶性である、または他の理由で他の分子または固相には結合していない分子をいう。実施態様によっては、可溶性消光体はFRETペアの一方をなしてもよいが、その場合、該可溶性消光体はFRET消光体であり、機能的なFRETペアとしてFRET供与体と相互作用することができる。たとえば、臭化エチジウムとある種のチアジン色素たとえばメチレンブルー、アズーレA、アズーレB、アズーレC、チオニンおよび新メチレンブルーは可溶性消光体として使用することができる。
【０１９８】
チアジン色素の可溶性消光体は2本鎖核酸に結合することにより機能するが、1本鎖核酸に対するアフィニティーは低い。特定の理論にはこだわらないが、その支配的な結合形態はインターカレーションによる結合であるものの、副溝および主溝結合もまた配列コンテクストおよびハイブリダイゼーション条件次第で可能であると考えられる。Rohs et al. (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:2860-2866; およびTuite et al. (1994) J. Am. Chem. Soc., 116:7548-7556を参照。従って、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーション複合体を形成するプローブに付けられた蛍光標識は、2本鎖核酸に対してアフィニティーを有するインターカレーティング可溶性消光体による消光作用を受ける。これはプローブ上の供与体に対する該消光体の近接性のためである。ハイブリダイゼーション複合体を含む溶液を(融解曲線分析やTm決定の場合のように)加熱すると、プローブはやがて標的ポリヌクレオチドから解離し、それによって該核酸に対するアフィニティーを弱め、結果として供与体に対する可溶性消光体の近接性を弱め、供与体からの蛍光を強めることになる。従って、可溶性FRET消光体を有するFRETシステムを使用すれば、反応系内のハイブリダイゼーション複合体の形成/解離をモニターすることができる。
【０１９９】
特定のHCV型判別反応系に使用する可溶性消光体の濃度は限定されないが、有効濃度の範囲当業者には自明であろう。たとえばチアジン色素の可溶性消光体を使用するようないくつかの実施態様では、5μg/mL〜100μg/mLの範囲が見込まれる。実施態様によっては、好ましい範囲は10〜50μg/mLであるか、あるいは10〜25μg/mLである。あるいはまた、濃度25μg/mLのチアジン色素可溶性消光体を使用する。
【０２００】
閉鎖システム対開放システム型判別アッセイ
本発明はHCV型判別のための方法を提供し、またHCV型判別とHCV定量の同時並行のための方法を提供する。ある種の実施態様では、HCV型判別およびHCV型判別/定量のための反応系は「閉管」システムである(実施例2を参照)。
【０２０１】
この閉管システムでは、各ステップに必要な試薬はすべて分析開始時に揃っている。それに対して「開管」システムではHCV型判別分析の開始後に試薬または追加成分の添加が必要となる。閉管システムは開管システムに比べてある種の利点がある。閉管システムでは操作者による介入の必要が少なくなり、また高度に並行的な迅速処理が可能になるからである。閉管システムはまた、業務用として「キット」などにするうえで、はるかに好ましい。キット・ユーザー向け説明書がより簡素になり、ステップも少なく、ユーザーによる操作ミスやコンタミネーションの可能性も少なくなるためである。実施態様によっては、開管システムのほうが、たとえば相性の悪い試薬でも使用可能になるなど、有利である。
【０２０２】
実施態様によっては、たとえばHCV型判別とHCV定量を閉管システムで同時並行的に行う。そうしたシステムでは、反応チューブ(反応ウェルまたは反応容器)は当初からたとえばRNA試薬、HCVアンプリコンを生成させるための汎用RT-PCRプライマー、RT活性をもつDNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド、HCVアンプリコン定量用のTaqMan(商標)タイプのプローブ、好適なHCV型判別プローブ(随意に好適なFRET供与体でプローブを標識する)、可溶性FRET消光体などを含むことになろう。これらの試薬が反応チューブ内に入っていれば、HCVアンプリコンの生成、HCVアンプリコンの蓄積のリアルタイムモニタリングおよびHCV型判別のためのHCV融解曲線分析に必要な諸々の構成要素が反応系には揃っていることになる。
【０２０３】
キットおよび製造品
本発明は製造品たとえばキットを、特に診断キットおよびHCV遺伝子型判別キットを、提供する。これらのキットは、開示の方法を使用してHCV感染の型判別を行うための必要な資材を備える。これらのキットは臨床医には有用である。臨床医は、診療場面でHCV型判別情報を利用し、ウイルスの型(遺伝子型または亜型)に基づいて種々の治療に対する特定HCV感染の反応性を予測することができる。本発明は、本発明の方法特にサンプル中のHCVの型判別のための方法を容易にするキットを提供する。これらの方法を実行するための資材と試薬はキットとして提供し、方法の実行を容易にすることができる。
【０２０４】
実施態様によっては、キットは診断キットであり、該キットによって可能となる方法の実行から得られる情報を使用して、患者から採取したサンプルからHCV感染の型が特定される。
【０２０５】
ある種の実施態様では、本発明は、本明細書で開示する要領でのRT-PCRによる「閉管」HCV遺伝型判別に適したキットを提供する。他の実施態様では、本発明はRT-PCRによる閉管HCV型判別およびHCV定量のためのキットを提供する。
【０２０６】
本発明のキットは開示の方法に使用される任意のまたはすべての合成オリゴヌクレオチドを提供することができる。たとえば該キットはHCV cDNAの生成を目的としたHCV RNA分子からの逆転写を開始させるためのオリゴヌクレオチドプライマーを提供することができる。該キットはHCVゲノムの任意好適の部分たとえば5'-UTRドメイン内の配列の増幅に適した増幅プライマーを提供することができる。本発明は、本発明のキットに含めることができる好適なHCV増幅プライマーを提供する。本発明は開示のプライマーに限定されないものとする。他の任意好適の増幅プライマーもまた本発明に役立つためである。
【０２０７】
本発明のキットにはHCV型判別のための融解曲線分析に適したオリゴヌクレオチドプローブを含めてもよい。本発明は多数の好適なプローブたとえば図6に記載のプローブを提供する。しかし、本発明のキットは図6に記載のプローブに限定されないものとする。追加プローブの特定と合成のための指針もまた本発明は提供しているからである。本発明のキットに含まれるプローブは標識、無標識いずれでもよい。随意に、本発明のキットに含まれるプローブは、技術上周知の好適なFRET供与体で標識してもよい。随意に、本発明のキットに含まれるプローブは、供与体と消光体(この場合、可溶性消光体は必要ない)の両方を含むTaqManタイプのプローブでもよい。随意に、本発明のキットは好適な可溶性消光体たとえば新メチレンブルーなどのようなチアジン色素を含んでもよい。随意に、本発明のキットには任意好適のFRETペアシステムを含めてもよい。
【０２０８】
実施態様によっては、本発明のキットはHCVアンプリコンの定量に適したオリゴヌクレオチドプローブを、たとえばHCVアンプリコン内部に位置するHCV塩基配列に対して特異的なTaqManタイプのプローブを含んでもよい。たとえば、本発明は配列番号60のHCV定量プローブを提供する。しかし、本発明のキットはこの定量プローブ1つに限定されるものではない。本発明(および本発明のキット)が任意好適の定量プローブを含みうることは当業者には自明であろう。
【０２０９】
加えて、本発明のキットはたとえばサンプル採取および/またはサンプル精製(たとえば血液サンプルからのRNAの単離)用の装置および試薬、サンプルチューブ、ホルダー、トレイ、ラック、ディッシュ、プレート、キット・ユーザー向け説明書、溶液、緩衝液または他の試薬、標準化や正規化に使用される好適なサンプルおよび/または対照サンプル(陽性対照、陰性対照または校正用対照)を非限定的に含んでもよい。本発明のキットはまた、保管および輸送に好都合なように、たとえば蓋付きの包装容器に詰めてもよい。該キットの構成要素はキット内に1つまたは複数の容器に入れて納めてよいし、また別々の容器に包装しても、任意の形に混合してもよい。実施態様によっては、本発明のキットは複数サンプルの高効率分析を容易にするような資材たとえば好適な蛍光分光光度計で読み取ることができるマルチウェルプレートなどを含んでもよい。
【０２１０】
本発明の検出／相関システム
実施態様によっては、本発明は信号の検出をC型肝炎ウイルスの型に相関させるための総合システムを提供する。該システムは、特にHCV型を導き出すための手段がアルゴリズムおよび/または電子的に記憶された情報(たとえば収集した蛍光データ、所定のHCV型相関関係など)を含む場合には、収集データを解釈し分析するための装置と手段を含んでもよい。該総合システムの各部分は機能的に相互接続されており、場合によっては物理的に接続されている。実施態様によっては、該総合システムは自動化されていて、HCV型判別分析の開始後は操作者がサンプルや装置を操作する必要は一切ない。
【０２１１】
本発明のシステムは装置類を含んでもよい。たとえば本発明は蛍光検出器(例: 蛍光分光光度計)などのような検出器を含んでもよい。検出器は本発明では(Tmを求める融解曲線分析で)HCV型判別プローブのHCV標的アンプリコンとのハイブリダイゼーションをモニター/計測するために、また随意にHCV定量ステップでHCVアンプリコンの蓄積を(たとえばTaqManタイプのプローブを使用して)計測するために、使用することができる。検出器はHCV型判別アッセイの効率処理を容易にするためのマルチウェルプレートリーダーでもよい。実施態様によっては、蛍光分光光度計は励起および発光スペクトルの複数チャンネルでの検出を可能にするマルチチャンネル分光光度計である。
【０２１２】
実施態様によっては、該総合システムは、たとえばRT-PCR反応の諸段階で、またはTmを求める融解曲線分析の際に、反応温度を制御するためのサーマルサイクリング装置またはサーモサイクラーを含む。いくかの実施態様では、サーマルサイクリング装置と検出器は一体化されていて、サーマルサイクリングと発光検出(とえば蛍光検出)が同じ装置内で行われる。
【０２１３】
検出器は、たとえば蛍光分光光度計演算パラメーター(たとえば励起波長および/または検出発光波長など)を制御するための、および/または検出器からの収集データ(融解曲線分析の際の蛍光計測値など)を記憶するためのコンピューターに接続してもよい。該コンピューターもまたサーマルサイクリング装置に作動可能に接続して、システム内の温度、タイミングおよび/または温度変化速度を制御するようにしてもよい。
【０２１４】
該統合コンピューターはまた、検出器から収集したデータを分析してサンプルのHCV型を(電子的に)決定するような「相関モジュール」を含んでもよい。実施態様によっては、該相関モジュールは検出器からの蛍光値を基にTmを計算し、またさらに蛍光およびTmデータに基づいて未知サンプルのHCV型を導き出すための、コンピュータープログラムを含む。実施態様によっては、該相関モジュールは未知サンプルのハイブリダイゼーション特性(Tmなど)を既知HCV型の数値データベース(またはテーブル)と比較して、未知サンプルのハイブリダイゼーション特性と未知サンプルのHCV型とを相関させる。
【０２１５】
実施態様によっては、該システムの相関モジュールはHCVの型を判別するが、該HCV型は5つの遺伝子型のうちの1つまたは6つの亜型のうちの1つから選択される。相関モジュールは、既知HCV型を含むハイブリダイゼーション複合体のハイブリダイゼーション特性に関する実験的に決定された数値を、他の特性値と共に含んでもよいし、また既知HCV型を含むハイブリダイゼーション複合体のハイブリダイゼーション特性に関する予想値を含んでもよい。あるいは該相関モジュールは、未知の型のHCVを含む試験サンプルと同時に得られる既知HCV型を含むハイブリダイゼーション複合体のハイブリダイゼーション特性に関する実験的に決定された数値に依存してもよい。
【０２１６】
好適な相関モジュールと好適なプローブがあれば、本発明のシステムはサンプル中のHCVに、ある型を帰属させることができるが、その型は6つ以上の遺伝子型から、また好ましくは11以上の遺伝子型から、選択される。たとえば使用装置にもよるが、特定ハイブリダイゼーション複合体のTmは種々の精度で決定することができる。たとえばあるメーカーのあるTm装置(サーマルサイクリング装置+蛍光分光光度計)は温度分解能が±1.0℃であるが、別のメーカーの別の装置は温度分解能が±0.1℃である。Tm値が密集するような場合には、より感度の高い装置を使用すれば、より多くのHCV型の区別が可能になる。同様に、相応の感度の装置を使用すれば、HCV型を6よりもはるかに多くの亜型に帰属させうる場合には、既知HCV亜型が78以上も存在するため、サンプル中のHCVの型を判別しうる可能性が出てくる。
【０２１７】
本発明のシステムはハイブリダイゼーション複合体の唯一の特徴的ハイブリダイゼーション特性としてのTmの使用には限定されない。たとえばHMA(ヘテロ2本鎖移動度分析)、DHPLC(変性HPLC)、CFLP(制限断片長多型)、TGCE(熱勾配キャピラリー電気泳動)、SURVEYOR(商標)ヌクレアーゼ変異検出キット、およびSSCP(1本鎖高次構造多型)などはどれも特性の異なるハイブリダイゼーション複合体の識別に使用可能であり、従って1つまたは複数の型名をHCVサンプルに帰属させるために使用することができる。
【０２１８】
本発明の一般的なシステムは、2つ以上のHCV型判別プローブ(たとえば図6に記載のプローブ)、1つまたは複数のHCV定量プローブ(たとえば配列番号60の定量プローブ)、HCV増幅用プライマー(たとえば配列番号58および59のプライマー対)、好適な検出器(随意に+総合サーマルサイクリング装置)、コンピューター+相関モジュール、およびキットユーザー向け(電子または印刷)説明書を含んでもよい。一般に、該システムは一組のHCV型判別プローブおよび/またはHCV定量プローブからの1つまたは複数の信号出力を検出するよう設定する。実施態様によっては、HCV型判別プローブとHCV定量プローブは同じ信号出力を生じる(ので、同じ検出器を使用することができる)。実施態様によっては、該システムはHCV型判別またはHCV型判別/定量分析に使用する試薬をさらに含む。そうした試薬の非限定的な例はRT活性をもつ1つまたは複数のDNAポリメラーゼ、好適な緩衝液、コンタミネーション防除試薬(dUTPおよび/またはUNGヌクレアーゼなど)、安定化剤、dNTP、可溶性消光体などである。キットは本発明の1つまたは複数のシステムに使えるものを供給することができる。
【０２１９】
信号検出には、光電子増倍管、分光光度計、CCDアレイ、走査型検出器、光電管および光ダイオード、顕微鏡ステーション、ガルボスキャン(galvo-scans)、マイクロ流体核酸増幅検出装置などを含む多様な装置が使用可能である。検出器の厳密な設定はHCV型判別および/または定量プローブに使用する標識のタイプなどにも依存しよう。蛍光、りん光、放射能、pH、電荷、吸光度、ルミネセンス、温度、磁性などを検出する検出器が使用可能である。一般的な検出器の実施態様には光(たとえば蛍光)検出器または放射能検出器などがある。たとえば発光(たとえば蛍光発光)または他のプローブ標識の検出はマーカー対立遺伝子の存在または非存在を告げる。蛍光検出は増幅核酸の検出に常用される(ただしアンプリコンを対象に上流側および/または下流側操作も行うことができるが、その場合は他の検出方法も絡む可能性がある)。一般に、検出器はプローブ標識からの1つまたは複数の標識放出(たとえば発光)を検出する。
【０２２０】
検出器は随意に増幅反応からの1つまたは複数の信号をモニターする。たとえば検出器は、HCV定量(TaqManタイプ)プローブの場合のような、「リアルタイム」増幅アッセイ結果に対応する光信号をモニターすることができる。
【０２２１】
検出信号をHCV型(たとえば遺伝子型または亜型)と相関させるシステム命令もまた本発明の特色である。たとえば該命令は検出信号とHCV型との相関関係を収めた少なくとも1つのルックアップテーブルを含んでもよい。該命令の厳密な形態はシステムの構成要素に応じて変化しうる。たとえば1つまたは複数の統合システムユニット(たとえばマイクロプロセッサー、コンピューター、またはコンピューター可読媒体)に納めたシステムソフトウェアとして存在してもよいし、また検出器に作動可能に接続された1つまたは複数のユニット(たとえばコンピューターまたはコンピューター可読媒体)の中に存在してもよい。前述のように、1つの一般的な実施態様では、システム命令は検出信号とHCV型との相関関係を収めた少なくとも1つのルックアップテーブルを含む。該命令はまた一般に、システムとのユーザーインターフェースを提供して、たとえばユーザーによるサンプル分析結果の閲覧やシステムへのパラメーター入力を可能にするための命令を含む。
【０２２２】
該システムは一般に、本発明の方法によって検出されるコンピューター可読データを記憶または伝送するための、たとえば自動化システム内の、構成要素を含む。コンピューター可読媒体の例はコンピューターコード記憶用のキャッシュ、メイン、ストレージの各メモリおよび/または他の電子データ記憶装置部品(ハードドライブ、フロッピー（登録商標）ドライブ、ストレージドライブなど)である。本発明の方法によるHCV型表示データはまた、コンピューターデータ信号として通信媒体を介してイントラネットまたはインターネットまたは両者の複合などのネットワーク上を電子的、光学的または磁気的に伝送することもできる。該システムは追加的に、あるいは択一的に、無線、赤外線、または他の通信媒体を介して伝送することができる。
【０２２３】
該システムは運用時には一般に、分析対象のサンプルたとえば患者由来の血液または血液生成物を含む。サンプルを含む物質は単離し、または部分精製し、または精製することができる。態様によっては、サンプル物質はRNA、ポリA RNA、cRNA、全RNA、cDNA、増幅cDNAなどを含む。
【０２２４】
「相関させるシステム」という語句は本明細書では、コンピューターへの入力データが該コンピューターにとって外部的な物体、プロセスまたは特性たとえばC型肝炎ウイルスに対応するシステム、および入力信号を別の出力信号へと変換させるコンピューター内部のプロセスをいう。言い換えると、入力データたとえば融解曲線からの蛍光値は出力データたとえばHCV型(遺伝子型または亜型)へと変換される。コンピューター内部のプロセスは命令集合または「プログラム」であり、それにより正の増幅またはハイブリダイゼーション信号が統合システムによって認識され、HCV型としての個別サンプルに帰せられる。追加のプログラムは個別サンプルの識別名を表現値と相関させる(たとえば統計的方法)。加えて、関連HCV型判別またはHCV定量相関を収めたルックアップテーブルを作成するための多数のコンピューティング・プログラムたとえばC/C++、Delphiおよび/またはJava（登録商標）のGUIプログラム、および生産性向上ツール(Microsoft Excelおよび/またはSigmaPlotなど)がある。本発明の統合システムとの関連で有用な他のソフトウェアツールはSAS、Genstat、Matlab、Mathematica、S-Plusなどの統計パッケージ、およびQU-GENEなどのような遺伝子モデリング・パッケージなどである。さらに、Visual Basicなどのような追加のプログラミング言語もまた本発明の統合システムに好適に使用される。
【０２２５】
たとえば特定HCV型に帰属されるHCV型判別プローブTm値はコンピューター可読媒体に記録し、以ってTmを固有のHCV型(またはHCV型の亜型)に対応させたデータベースを確立していくことができる。データをコンピューター可読媒体に記録するのに適した任意のファイルまたはホルダーは、特注、市販(OracleまたはSybase製品)のいずれであれ、本発明ではデータベースとして受け入れることができる。開示のHCV型判別分析に関するデータも同様に、コンピューターアクセス可能なデータベースに記録することができる。随意に、HCV型判別に使用されるアッセイの1つまたは複数の側面を自動化する統合システムを使用してHCV型判別データを得てもよい。そうしたシステムでは、HCV型に対応する入力データを検出器たとえばアレイ、スキャナー、CCDまたは他の検出装置から、CPUがアクセスしうるコンピューター可読媒体中のファイルへと直接送ることができる。次に、Tm値とHCV型の間の相関関係を特定するべく、Tm値とHCV型の間の相関関係をコード化する(一般に1つまたは複数のプログラムに具体化された)システム命令集合を計算手段によって実行することができる。
【０２２６】
一般に、該システムはまた、たとえばファイル選択、データ検索、テーブルの再検討などを行うためのキーボード、マウス、タッチスクリーンといったユーザー入力装置、および統計分析の結果を閲覧または回収するための出力装置(モニター、プリンターなど)を含む。
【０２２７】
こうして本発明は一態様では、既定または実験Tm値に対応する少なくとも1つのデータ集合を納めたファイル集合および/またはデータベースを含むコンピューターまたはコンピューター可読媒体を含む統合システムを提供する。該システムはまた、これらのうち1つまたは複数のデータベースのユーザーによる選択的閲覧を可能にするためのユーザーインターフェースを含む。さらにワードプロセッシングソフトウェア(たとえば Microsoft Word(商標)またはCorel WordPerfect(商標))およびデータベースソフトウェア(たとえば Microsoft Access(商標)またはParadox(商標))またはスプレッドシートソフトウェア(たとえばMicrosoft Excel(商標)、Corel Quattro Pro(商標))などのような標準テキスト処理ソフトウェアをユーザーインターフェース(たとえばWindows（登録商標）、Macintosh（登録商標）、Unix（登録商標）またはLinux（登録商標）といった標準OSのGUI)と併用すれば、データベースの対立遺伝子または他項目に対応する文字列を処理することができる。
【０２２８】
該システムは随意に、サンプル操作用の構成要素たとえばロボット装置を含む。たとえば溶液(サンプルなど)を移送元から移送先へと(たとえばマイクロタイタープレートからアレイ基板へと)移送するためのロボット液体制御アーマチュアが随意に、デジタルコンピューターへと(または統合システム内の追加のコンピューターへと)作動可能に接続される。統合システムには該デジタルコンピューターにデータを入力するための入力装置を組み込んでもよいが、入力されるのはロボット液体制御アーマチュアによる高効率液体移送を制御し、また随意に該アーマチュアによる該固相担体への移送を制御するためのデータである。そうした流体ハンドリング自動化ロボットシステムは販売されているものも多い。たとえば種々の自動化システムがCaliper Technologies (Hopkinton, MA)から出ているが、それには一般にロボットと液体ハンドリングモジュールを含む種々のZymateシステムが利用されている。同様に、マイクロタイタートレイ操作用などの多様な研究用システムに使用されている一般的なORCA(商標)ロボットもまた、たとえばBeckman Coulter, Inc. (Fullerton, CA)から出ている。通常ロボットに代わるものとしては、流体ハンドリングおよび検出用のマイクロ流体システムが今日では、たとえばCaliper Technologies (Hopkinton, MA)やAgilent Technologies (Palo Alto, CA)など多方面から出ている。
【０２２９】
本発明のHCV型判別システムはこうして、デジタルコンピューターおよび1つまたは複数の高効率液体制御ソフトウェア、サーモサイクラー制御ソフトウェア、マーカー標識からのデータを分析するための画像解析ソフトウェア、データ解析ソフトウェア、溶液を移送元からデジタルコンピューターに作動可能に接続された移送先へと移送するためのロボット液体制御アーマチュア、ロボット液体制御アーマチュアによる高効率液体移送を制御しまた随意に該アーマチュアによる該固相担体への移送を制御するためのデータを該デジタルコンピューターに入力するための入力装置、および随意に、標識プローブからの標識信号をデジタル化するためのイメージスキャナーを含んでもよい。イメージスキャナーは画像解析ソフトウェアと連動して、たとえばHCV増幅時またはHCV融解曲線分析時の核酸プローブ標識強度の計測値をもたらすが、そのプローブ標識強度計測値をデータ解析ソフトウェアで解析して、標識プローブが標的とハイブリダイズするかどうか、またどの程度ハイブリダイズするかを示す。そのようにして得られたデータを次にサンプルの識別名と相関させて、特定サンプル中のHCVを判別し、また随意にサンプル中のHCVの量(たとえば濃度)を決定する。
【０２３０】
以下の実施例は本発明の限定ではなく例示が目的である。当業者には自明であろうが、変更してもよい非決定的パラメーターおよび本発明の特許請求の範囲から逸脱することなく使用することができる代替試薬が種々存在する。
【実施例１】
【０２３１】
マルチプローブ/デュアルチャンネルHCV型判別分析用のHCV型判別プローブ
一組のHCV型判別プローブを設計し、化学的に合成した。これらのプローブは図6に記載している。各プローブはHCVゲノムの5'-UTR内部の、少なくとも2つの異なるHCV型間で配列異質性を示す領域とハイブリダイズする(図5参照)。図6に記載の各プローブは、該プローブを含むハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性に基づいて少なくとも2つのHCV型を単独で区別しうるという基準を満たす。この場合には、図6に記載の各プローブにより、該プローブを含むハイブリダイゼーション複合体のTm値に基づいて、少なくとも2つのHCV型を区別することができる。
【０２３２】
図6に記載のプローブにはたとえば6-カルボキシ-フルオレセイン(FAM)、2',4,4',5',7,7'-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、またはローダミン誘導体JA270などの標識(米国特許第6,184,379号(2001年2月6日にJoselらに交付)明細書を参照)を含むものがある。実施態様によっては、励起および発光スペクトルを異にする2つの異なる標識をもつプローブの組み合わせを、多次元HCV型判別分析に使用することができる。たとえば、実施態様によってはFAM標識プローブをHEX標識プローブと組み合わせて同じ閉管反応系に使用することができ、また2つの異なるプローブを逐次励起させ、それらの発光を、2つの異なる波長で発光を検出しうる装置により、検出することができる。FAM蛍光の計測では中心波長485nm、バンド幅20nmの励起フィルターと中心波長520nm、バンド幅10nmの発光フィルターを使用する。HEX蛍光の計測では中心波長540nm、バンド幅10nmの励起フィルターと中心波長575nm、バンド幅25nmの発光フィルターを使用する。
【０２３３】
図6のプローブにはAG0303A(配列番号14)などのように、標識をまったく共有結合させていないものもある。この場合は、無標識プローブには好適な核酸用色素たとえば蛍光色素SYBR(商標) Greenまたは臭化エチジウムを使用することができる(AG0303A-SYBR; 配列番号24)。実施態様によっては、図6に示すように、同じプローブ配列を異なる形態(たとえば異なる共結合標識の有無、または3'リン酸基の有無)で使用することもできる。たとえばプローブAG0203Aには共有結合標識の変異や末端リン酸基の有無などを含め多種多様な形態がある(配列番号9〜13)。またたとえば、プローブAG0303A(配列番号14)はプローブAG0303A-SYBR(配列番号24)と配列が同じであり、違いは配列番号24のプローブにSYBR(商標) Greenの使用を見込んでいる点だけである。
【０２３４】
図6のプローブ配列は、配列の長さを変えるか、または修飾塩基(たとえば5-プロピニル-dU、5-Me-dCまたは2'-O-メチル塩基)を付加することにより、またプローブ配列を入れ替えるまたは修飾することにより、相対融解挙動が(また結果としてTm値を)調節されるように設計してある。
【実施例２】
【０２３５】
単一反応系にプローブAG0307MおよびAG0308Kを使用する多次元Tm分析によるHCV型判別
本例では、単一RT-PCRおよびTm分析反応系への2つのHCV型判別プローブの使用によるデュアルプローブ、デュアルチャンネルの閉管融解曲線分析(Tm決定)を説明する。この反応系は「閉管」システムであり、RT-PCR反応の開始後は外的なサーモサイクリング条件の変更以外に反応混合液への一切の操作が不要である。分析対象の各HCV型は2つのプローブに対応する融解曲線分析データ(Tm)の組み合わせに基づいて他の諸々のHCV型から区別される。本例では、少なくとも5つの、さらには6以上のHCV型を区別するうえでのマルチプローブ(すなわち多次元)分析の有効性を説明する。
【０２３６】
RT-PCRでHCVアンプリコンを生成させるための鋳型RNAをin vitro転写により、HCV型1a、2a、3a、4a、5aおよび6aに対応するHCVゲノム物質インサートを導入したプラスミドから得た。これらのインサートの配列は図5に記載のそれぞれの型の(ただし型2aを除く)各々のコンセンサス配列に対応する。HCV型2aのクローン化インサートは型2aの準種変異体であり、HCV型判別プローブの標的である5'-UTRドメイン内に一塩基が変異している。図5にはこの型2a変異体の5'-UTR配列(配列番号8)の関連部分も示している。HCVゲノム配列の単離に使用した試料は患者由来のサンプルである。in vitro転写の後、RNAをオリゴ-dT-セファロース・クロマトグラフィーで精製し、定量した。各プラスミドHCVインサートの遺伝子型/亜型は配列決定を含めて他のアッセイ法を使用して予め確認しておいた。
【０２３７】
6つの異なるHCV RNA標的(6つの異なるHCV型に対応する)を択一的に、6つのRT-PCR/Tm分析反応系に使用した。これらのRT-PCR/融解曲線分析は追加試薬を一切不要とする単一反応系で行った。従って、たとえばRT-PCR増幅後にHCV型判別プローブを添加する必要はなかった。
【０２３８】
このマルチプローブ分析には2つのHCV型判別プローブを使用した。すなわちAG0307Mプローブ(配列番号26; FAMで標識)とAG0308K (配列番号54; HEXで標識)である。6つのRT-PCR/Tm分析反応系は各々、両プローブを含んだ。これらの反応混合液の成分組成は次のとおりであった：
【表１】
0005405715.tif 000002
【表２】
0005405715.tif 000003
【０２３９】
6つの異なるHCV標的を使用し、また前記組成の反応混合液を使用して、図10に示すサーマルサイクリング条件により6つの別個の非対称RT-PCR反応を実行した。このサーマルサイクリングプログラムによりHCV転写産物RT-PCR増幅が実現し、HCVアンプリコンが生成した。この反応では、まずdUを含むポリヌクレオチドによるキャリーオーバーコンタミネーションを解消するための50℃でのUNGデコンタミネーションステップが来る。次に59℃で逆転写反応を行うが、そこではPCRプライマーのうちの1つが逆転写の開始にも与る。このRT-PCR反応は非対称反応であり、PCRプライマー対の一方が他方のプライマーに対して5倍過剰に存在するため、結果的にHCV型判別プローブにハイブリダイズするHCVゲノム鎖の増幅が過多となる。表示のプライマーによる増幅で約200塩基のアンプリコンが生成する。
【０２４０】
PCRアンプリコンの生成後、サーマルサイクリングプログラムは融解曲線分析へと直進する。この融解分析では、種々のハイブリダイゼーション混合液を95℃に2分間加熱し、次いで20〜25℃へと冷却して、アニーリングとハイブリダイゼーション複合体の形成を導く。次に、ハイブリダイゼーション複合体を含む反応混合液を約50×1分間サイクル(1サイクル=30秒間の昇温+30秒間の保持ステップ)にわたり、サイクルごとに温度を1℃上昇させながら、加熱する。Tm分析では、可溶性消光体エネルギー移動システムを使用してハイブリダイゼーション複合体の形成/解離をモニターした。供与体を発光させるのはそれぞれの供与体に共有結合したFAMおよびHEX標識である。消光作用をもたらすのは可溶性消光体の新メチレンブルーである(図7参照)。新メチレンブルーはチアジン色素構造可溶性消光体の一種であり、2本鎖DNAに対する結合アフィニティーがあるため、プローブが標的と2本鎖構造を形成しているときにはプローブ上の蛍光標識と近接するため消光作用を及ぼす結果となる。しかし、可溶性消光体は1本鎖DNAに対しては低アフィニティーである。そのため、プローブを含むハイブリダイゼーション複合体を溶液として加熱し解離させると、該消光体の核酸に対するアフィニティーは低下し、蛍光が強まる結果となる。新メチレンブルーの可溶性消光体は一般に10〜25 μg/mLの範囲内の種々の濃度で使用した。その至適濃度は経験的に求めた。重要なことに、Tm値分解能(すなわち種々のHCV型間のTm値を分別する能力)は、ある種のHCV型判別プローブでは、可溶性消光体の濃度の加減によって向上させうることが判明した。
【０２４１】
融解分析では、FAMおよびHEX蛍光値を2つの異なるチャンネルで、各30秒間保持ステップの終わりに50ミリ秒間計測した。融解反応は96ウェルのマイクロタイタープレートで行い、Roche Molecular DiagnosticsのCOBAS(商標) TaqMan(商標) 48 Analyzer (Roche Molecular Systems, Inc., Pleasanton, CA)を使用して2チャンネルの蛍光をモニターした。FAMチャンネルの蛍光は中心波長485nm、バンド幅20nmの励起フィルターと中心波長520nm、バンド幅10nmの発光フィルターを使用して測定した。HEX蛍光チャンネルのモニタリングには中心波長540nm、バンド幅10nmの励起フィルターと中心波長575nm、バンド幅25nmの発光フィルターを使用した。
【０２４２】
FAMおよびHEX蛍光データは別々にプロットした。AG0307Mプローブに対応する収集FAMデータを図11に、温度の関数としての生の蛍光値のグラフとして示す。6つの別々の(各HCV型に対応する)分析の結果を同じグラフ上にオーバーレイして、型特有の融解プロファイルを示すようにした。示されているのは一組の代表データである。
【０２４３】
図11のデータは同じデータの2次導関数プロットの使用により解析(および定量)がさらに容易になる。図12は図11のデータを2次導関数プロットとして示している。各曲線のY軸上のゼロ値との交点はそれらの特定ハイブリダイゼーション条件でのハイブリダイゼーション複合体のTm値を表す。図で明らかなように、AG0307Mプローブを使用すると、HCV型1a、2a、4a、5aおよび6aに対応するTm値はグラフ上で容易に区別しうる。しかし、型3aに対応するTm値は使用装置の40℃という検出能を下回るため観測できない。
【０２４４】
同様にして、プローブAG0308Kに対応するHEXチャンネルの蛍光を図13に、温度の関数としての生の蛍光値のグラフとして示す。6つの別々の(各HCV型に対応する)分析の結果を同じグラフ上にオーバーレイした。示されているのは一組の代表データである。
【０２４５】
図13のデータもまた、図14に示すように、2次導関数プロットとなる。各曲線のY軸上のゼロ値との交点はそれらの特定ハイブリダイゼーション条件でのハイブリダイゼーション複合体のTm値を表す。図で明らかなように、AG0308Kプローブを使用すると、HCV型3aに対応するTm値を型4aからも、他の残りの遺伝子型からも、区別しうる。
【０２４６】
図15は、図12および14のデータを相互補完的に使用すれば遺伝子型の帰属が確実に行えることを示す。プローブAG0307M (FAMチャンネル)の使用による型3aの帰属は曖昧なままであったが、そうした帰属情報はHEXチャンネルのプローブAG0308Kから得ることができる。プローブAG0308Kは型3aおよび4aへの確実な帰属を行うことができる。従って、2つのデータセットは相互補完的であり、HCV型を型1a、2a、3a、4a、5aまたは6aに帰属させるための十分な情報を与えてくれる。この手法を使えば、2つのプローブからのデータセットの組み合わせを使用して区別しうるHCV型の数が、いずれか一方のプローブだけを使用して確実に同定しうるHCV型の数よりも多くなる。
【実施例３】
【０２４７】
単一反応系にプローブAG0203AおよびAG0308Jを使用する多次元Tm分析によるHCV型判別
追加のプローブ対を前記実施例2の要領で試験し、それらのプローブ対がHCV型判別のための相互補完的なデータセットをもたらしうるかどうか調べた。プローブ対の試験はどれもデュアルプローブ、デュアルチャンネルの「閉管」システムで行ったが、該システムでは各プローブ対を蛍光体FAM、HEXで標識する。2つの発光チャンネルを使用して各プローブについて別々にTmを決定する。本例もまた5つの、さらには6以上のHCV型を区別するうえでの多次元分析の有効性を示す。
【０２４８】
実施例2の場合と同様に、RT-PCRでHCVアンプリコンを生成させるための鋳型RNAをin vitro転写により、HCV型1a、2a、3a、4a、5aおよび6aに対応するHCVゲノム物質インサートを導入したプラスミドから得た。in vitro転写の後、HCV RNAをRT-PCR/Tm値分析に使用した。RT-PCRおよび融解曲線分析は、追加試薬を一切不要とする単一反応系で行った。本実施例では2つのHCV型判別プローブを使用した。すなわちAG0203Aプローブ(配列番号10; FAMで標識)とAG0308J (配列番号53; HEXで標識)である。RT-PCR/Tm分析反応系の混合液組成は実施例2の場合と同じである。このRT-PCR/融解分析では図10に記載のサーマルサイクリング条件を使用した。
【０２４９】
融解分析では、FAMおよびHEX蛍光値を2つの異なるチャンネルで計測し、FAMおよびHEX蛍光データは別々にプロットした。AG0203Aプローブに対応する収集FAMデータを図16に、温度の関数としての生の蛍光値のグラフとして示す。6つの別々の(各HCV型に対応する)分析の結果を同じグラフ上にオーバーレイして、型特有の融解プロファイルを示すようにした。示されているのは一組の代表データである。
【０２５０】
図16のデータは同じデータの2次導関数プロットの使用により解析がさらに容易になる。図17は図16のデータを2次導関数プロットとして示している。各曲線のY軸上のゼロ値との交点はそれらの特定ハイブリダイゼーション条件でのハイブリダイゼーション複合体のTm値を表す。図で明らかなように、AG0203Aプローブを使用すると、HCV型1a、6a、4aおよび5a に対応するTm値はグラフ上で容易に区別しうる。しかし、型2aおよび3aはこのプローブでは報告されない。40℃を下回る融解温度はこの場合の特定装置の実際的な検出限界を下回るためである。
【０２５１】
同様にして、プローブAG0308Jに対応するHEXチャンネルの蛍光を図18に、温度の関数としての生の蛍光値のグラフとして示す。6つの別々の(各HCV型に対応する)分析の結果を同じグラフ上にオーバーレイした。示されているのは一組の代表データである。
【０２５２】
図18のデータもまた、図19に示すように、2次導関数プロットとなる。各曲線のY軸上のゼロ値との交点はそれらの特定ハイブリダイゼーション条件でのハイブリダイゼーション複合体のTm値を表す。図で明らかなように、AG0308Kプローブを使用すると、HCV型2aおよび5aに対応するTm値を、いずれも40℃付近または未満に融解温度をもつ型1a、3a、4aおよび6aから区別することができる。
【０２５３】
図20は、図17および19のデータを相互補完的に使用すれば遺伝子型の帰属が確実に行えることを示す。プローブAG0203A (FAMチャンネル)の使用による型2aおよび3aの帰属は曖昧なままであったが、そうした帰属情報はHEXチャンネルのプローブAG0308Jから得ることができる。プローブAG0308Jは型2aおよび5aへの確実な帰属を行うことができる。従って、2つのデータセットは相互補完的であり、HCV型を型1a、2a、3a、4a、5aまたは6aに帰属させるための十分な情報を与えてくれる。この手法を使えば、2つのプローブからのデータセットの組み合わせを使用して区別しうるHCV型の数が、いずれか一方のプローブだけを使用して確実に同定しうるHCV型の数よりも多くなる。
【実施例４】
【０２５４】
単一反応系にプローブAG0308AAおよびAG0308Hを使用する多次元Tm分析によるHCV型判別
第3のプローブ対を前記実施例2の要領で試験し、それらのプローブ対がHCV型判別のための相互補完的なデータセットをもたらしうるかどうか調べた。このプローブ対もまたデュアルチャンネルシステムで蛍光体FAMおよびHEXを使用した。このペアもまた、5つの、さらには6以上のHCV型を区別するうえでの多次元分析の有効性を示す。
【０２５５】
このプローブ対は実施例2の要領で使用した。RT-PCRでHCVアンプリコンを生成させるための鋳型RNAをin vitro転写により、HCV型1a、2a、3a、4a、5aおよび6aに対応するHCVゲノム物質インサートを導入したプラスミドから得た。得られたHCV RNAをRT-PCR/Tm値分析に使用した。RT-PCRおよび融解曲線分析は、プローブAG0308AA (配列番号57; FAMで標識)とAG0308H(配列番号52; HEXで標識)を含む単一反応混合液中で行った。このRT-PCR/Tm分析は実施例2に記載の要領で行った。
【０２５６】
AG0308AAプローブに対応する収集FAMデータを図21に、温度の関数としての生の蛍光値のグラフとして示す。6つの別々の(各HCV型に対応する)分析の結果を同じグラフ上にオーバーレイして、型特有の融解プロファイルを示すようにした。示されているのは一組の代表データである。
【０２５７】
図21のデータは同じデータの2次導関数プロットの使用により解析がさらに容易になる。図22は図21のデータを2次導関数プロットとして示している。各曲線のY軸上のゼロ値との交点はそれらの特定ハイブリダイゼーション条件でのハイブリダイゼーション複合体のTm値を表す。図で明らかなように、AG0308AAプローブを使用すると、HCV型1a、4a、3aおよび2a に対応するTm値はグラフ上で容易に区別しうる。しかし、型6aおよび5aに対応するTm値は互いに区別がつかない。
【０２５８】
同様にして、プローブAG0308Hに対応するHEXチャンネルの蛍光を図23に、温度の関数としての生の蛍光値のグラフとして示す。6つの別々の(各HCV型に対応する)分析の結果を同じグラフ上にオーバーレイした。示されているのは一組の代表データである。
【０２５９】
図23のデータもまた、図24に示すように、2次導関数プロットとなる。各曲線のY軸上のゼロ値との交点はそれらの特定ハイブリダイゼーション条件でのハイブリダイゼーション複合体のTm値を表す。図で明らかなように、AG030HKプローブを使用すると、HCV型4a、5aおよび3aに対応するTm値を、型1a、2aおよび6aから区別することができる。
【０２６０】
図25は、図22および24のデータを相互補完的に使用すれば遺伝子型の帰属が確実に行えることを示す。プローブAG0308AA (FAMチャンネル)の使用による型6aおよび5aの帰属は曖昧なままであったが、そうした帰属情報はHEXチャンネルのプローブAG0308Hから得ることができる。プローブAG0308Hは型4a、5aおよび3aへの確実な帰属を行うことができる。従って、2つのデータセットは相互補完的であり、HCV型を型1a、2a、3a、4a、5aまたは6aに帰属させるための十分な情報を与えてくれる。この手法を使えば、2つのプローブからのデータセットの組み合わせを使用して区別しうるHCV型の数が、いずれか一方のプローブだけを使用して確実に同定しうるHCV型の数よりも多くなる。
【実施例５】
【０２６１】
閉管反応系による多次元HCV型判別およびウイルス定量
この実施例では閉管定量/型判別反応系によるHCV型判別およびHCVウイルス量(HCV定量)の同時決定法を開示する。定量と型判別反応を一体化したこの閉管システムでは精製ステップも反応混合液調製後の追加成分の添加も不要である。
【０２６２】
FCV定量は好適な定量プローブを添加して行う。HCV定量は、RT-PCRステップでのHCVアンプリコン蓄積のリアルタイムモニタリングに適したプローブを添加することにより、型判別分析と同じ反応混合液中で行う。これらの反応では、TaqManプローブST650AAFBHQ2(配列番号60)を反応混合液に加える。CTとウイルス定量は、サーマルサイクリングプログラムのRT-PCR増幅段階での蛍光プロファイルから計算する。
【０２６３】
HCV型判別は実施例2で開示の反応条件に準じて、すなわちRT-PCR反応による5'-UTR HCVアンプリコンの生成とそれに続く融解曲線分析により、行った。この多次元分析では2つのHCV型判別プローブを使用したが、一方のプローブはFAMで、他方のプローブはHEXで、それぞれ標識した。これらのプローブとの反応は別個の反応容器で行った。ただし、単一反応容器に両プローブを使用して行う実験も可能である。この分析に使用したプローブは図6に記載のAG0203A-FAMプローブ(FAMで標識; 配列番号10)とAG0308Kプローブ(HEXで標識; 配列番号54)である。2つの蛍光発光を(2つの異なる反応容器内の)それぞれのFAMおよびHEXチャンネルで計測した。
【０２６４】
ハイブリダイゼーション反応液は、HCV型1a、5aまたは6a、あるいはHCV型3aまたは4aに対応するin vitro転写RNA鋳型を含んだ。これらの鋳型の濃度は1,000(103)〜1,000,000(106)コピー/反応液の範囲であった。異なるRNA鋳型の各濃度を別々の反応液で試した。RT-PCR/Tm/定量反応液は各々、HCV型判別プローブおよび定量プローブST650AAFBHQ2を含んだ。これらの閉管反応液の成分組成は基本的に次のとおりであった：
【表３】
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【表４】
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【０２６５】
前記組成の反応混合液を使用して、図10に示すサーマルサイクリング条件により、非対称RT-PCR反応を実行した。58℃段階の50サイクルにわたるPCR増幅の各サイクルでTaqMan定量プローブからの蛍光を50秒間計測した。CT分析は図26および27に示す。図26および27に示す分析の一部は、切断されたTaqManプローブからの蛍光の検出にFAMチャンネルを使用する該サイクリングプログラムのRT-PCR増幅部分だけを含む。蛍光データはサイクル数の関数としての正規化FAM蛍光のグラフとして表示している。各HCV型および各濃度に対応するPCR増幅プロファイルを同じグラフ上にオーバーレイしてある。示されているのは一組の代表データである。
【０２６６】
図26および27は、閉管反応系を使用してウイルス量情報を得るためにHCV定量プローブをHCV RT-PCT増幅および融解曲線分析に首尾よく組み込めることを示している。さらに、ここに示すCT分析は反応混合液に使用したウイルス濃度の1,000倍の変化を区別することができる。これは試験した各HCV遺伝子型について言える。
【０２６７】
RT-PCR増幅後、この同じ反応混合液を融解分析に使用する。図28は、AG0203A-FAMプローブに対応する融解分析からの収集FAMデータ(FAMチャンネルで収集)を、温度の関数としての生の蛍光値のグラフとして示す。多重分析(各HCV型および各濃度に対応する)の結果を同じグラフ上にオーバーレイした。示されているのは一組の代表データである。
【０２６８】
図28のデータは同じデータの2次導関数プロットの使用により解析がさらに容易になる。図29はこの2次導関数プロットである。各曲線のY軸上のゼロ値との交点はそれらの特定ハイブリダイゼーション条件でのハイブリダイゼーション複合体のTm値を表す。図で明らかなように、AG0203A-FAMプローブを使用すると、HCV型1a、5aおよび6aに対応するTm値はグラフ上で容易に区別しうる。
【０２６９】
同様にして、プローブAG0308Kに対応する、融解曲線分析時のHEXチャンネルの蛍光を図30に、温度の関数としての生の蛍光値のグラフとして示す。多重分析(各HCV型および各濃度に対応する)の結果を同じグラフ上にオーバーレイした。示されているのは一組の代表データである。
【０２７０】
図30の蛍光データもまた、図31に示すように、2次導関数プロットとなる。各曲線のY軸上のゼロ値との交点はそれらの特定ハイブリダイゼーション条件でのハイブリダイゼーション複合体のTm値を表す。図31で明らかなように、AG0308Kプローブを使用すると、HCV型3aおよび4aに対応するTm値を容易に区別しうる。
【０２７１】
このように、図29および31のデータを組み合わせれば、遺伝子型の帰属を確実に行える。プローブAG0203A (FAMチャンネル)はHCVサンプルを型1a、5aまたは6aに帰属させることができるのに対して、プローブAG0308K(HEXチャンネル)は型3aまたは4aにHCV型を帰属させることができる。従って、2つのデータセットは相互補完的であり、HCV型を型1a、3a、4a、5aまたは6aに帰属させるための十分な情報を与えてくれる。
【０２７２】
この実施例で明らかなように、閉管システム中で多次元HCV型判別分析をHCV定量と一体化して、RT-PCR、定量(TaqMan)分析およびHCV型判別(融解分析)に必要な諸々の試薬を、修正(たとえば精製ステップまたは追加成分)の必要がない単一の反応混合液に含めるようにすることが可能である。HCV定量分析およびHCV融解(Tm)分析の進行はサーマルサイクリングプログラムによって調節する。
【実施例６】
【０２７３】
ヌクレオチド配列
この実施例では本発明の説明に使用したヌクレオチド配列を示す。次表に記載の配列はあくまでも例示であり、本発明が次表に記載の配列に限定されることを意味しない。
【０２７４】
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【０２７５】
以上、明解を期すために本発明をかなり詳しく説明したが、この開示を読めば当業者には、本発明の真の範囲から逸脱することなく形態や詳細の多様な変更を加えうることは自明であろう。たとえば開示の諸々の技術や装置は様々に組み合わせて使用することができる。本願で引用した諸々の出版物、特許、特許出願、および/または他の文献は、個別にその旨を断っていない場合でも、参照によりその全体が開示される。
【図面の簡単な説明】
【０２７６】
【図１】図1はHCVゲノムと対応する遺伝子コード化ポリペプチドの略図である。完全長ゲノムとORFのおおよその長さを示す。ポリプロテイン切断部位も示している。種々のゲノムドメインの正確なサイズはHCV遺伝子型および亜型によって変化しよう。
【図２】図2はHCV型命名法を解説した表である。
【図３】図3は原型HCVウイルスゲノムの位置7975〜8196のNS5領域に由来する222ヌクレオチド断片の、種々のHCV亜型間のヌクレオチド配列一致率を示す表である。
【図４】図4は種々のHCV亜型と既知分離株の例を示す表である。
【図５】図5は種々のHCV型、およびそれぞれの亜型の各5'-UTR領域内の33ヌクレオチドドメインのコンセンサス配列を示す表である。
【図６】図6はHCV型判別プローブの例、その鎖長(単位: ヌクレオチド)、およびそれぞれの塩基配列を示す表である。末尾の凡例で非標準ヌクレオチドおよび標識を示す記号の説明をしている。
【図６−２】図6-2はHCV型判別プローブの例、その鎖長(単位: ヌクレオチド)、およびそれぞれの塩基配列を示す表である。末尾の凡例で非標準ヌクレオチドおよび標識を示す記号の説明をしている。
【図７】図7は可溶性消光体のチアジン色素の構造例である。
【図８】図8は単一の仮想HCV型判別プローブ「プローブA」を使用した場合の、仮想上の遺伝子型間Tm分散および型帰属の曖昧性を示す図である。
【図９】図9は2つの仮想HCV型判別プローブ「プローブAおよびプローブB」を使用した場合の、仮想上のHCV型帰属を示す図である。
【図１０】図10は閉管RT-PCRおよびHCV型判別(融解曲線)実験反応に使用したサーモサイクリング条件の詳細を示す図解である。リアルタイムPCR定量用TaqMan試薬の随意使用も示す。
【図１１】図11は閉管、デュアルプローブ、デュアルチャンネルRT-PCRおよびHCV型判別融解曲線分析の結果を示すグラフであり、融解曲線の生の蛍光値を温度の関数として示している。RT-PCR反応は表示の各遺伝子型から5'-UTRアンプリコンを生成した。この分析のための反応混合液はAG0307Mプローブ+FAM標識とAG0308Kプローブ+HEX標識とを共に含んでいた。2つの蛍光発光計測値を2つの異なるチャンネルでとった。図のデータはAG0307Mプローブに対応するFAMチャンネルに由来した。6つのHCV型に対応する6つの別々の実験の結果を同じグラフ上にオーバーレイした。示されているのは一組の代表データである。
【図１２】図12は図11の閉管RT-PCRおよびHCV型判別(融解曲線)デュアルプローブ分析の、FAMチャンネル上の結果の、2次導関数プロットの使用によるグラフである。
【図１３】図13はやはり図11の閉管RT-PCRおよびHCV型判別(融解曲線)分析の結果を示すグラフであるが、蛍光はAG0308Kプローブに対応するHEXチャンネルで計測している。グラフは融解曲線の生の蛍光値を温度の関数として示している。6つのHCV型に対応する6つの別々の実験の結果を同じグラフ上に重ねて示す。示されているのは一組の代表データである。
【図１４】図14は図13の閉管RT-PCRおよびHCV型判別(融解曲線)デュアルプローブ分析の結果の、2次導関数プロットの使用によるグラフである。
【図１５】図15は、それぞれFAMチャンネル、HEXチャンネル上の結果に関する図12と図14の2次導関数プロットの並置比較である。グラフでは各プローブと各HCV型の組み合わせに対応するTm値が示されている。
【図１６】図16は閉管、デュアルプローブ、デュアルチャンネルRT-PCRおよびHCV型判別融解曲線分析の結果を示すグラフであり、融解曲線の生の蛍光値を温度の関数として示している。RT-PCR反応は表示の各遺伝子型から5'-UTRアンプリコンを生成した。この分析のための反応混合液はAG0203Aプローブ+FAM標識とAG0308Jプローブ+HEX標識とを共に含んでいた。2つの蛍光発光計測値を2つの異なるチャンネルでとった。図のデータは専らAG0203Aプローブに対応するFAMチャンネルに由来した。6つのHCV型に対応する6つの別々の実験の結果を同じグラフ上にオーバーレイした。示されているのは一組の代表データである。
【図１７】図17は図16の閉管RT-PCRおよびHCV型判別(融解曲線)デュアルプローブ分析の結果の、2次導関数プロットの使用によるグラフである。
【図１８】図18はやはり図16の閉管RT-PCRおよびHCV型判別(融解曲線)分析の結果を示すグラフであるが、蛍光は専らAG0308Jプローブに対応するHEXチャンネルで計測している。6つのHCV型に対応する6つの別々の実験の結果を同じグラフ上にオーバーレイした。示されているのは一組の代表データである。
【図１９】図19は図18の閉管RT-PCRおよびHCV型判別(融解曲線)デュアルプローブ分析の結果の、2次導関数プロットの使用によるグラフである。
【図２０】図20は、それぞれFAMチャンネル、HEXチャンネル上の結果に関する図17と図19の2次導関数プロットの並置比較である。グラフでは各プローブと各HCV型の組み合わせに対応するTm値が示されている。
【図２１】図21は閉管、デュアルプローブ、デュアルチャンネルRT-PCRおよびHCV型判別融解曲線分析の結果を示すグラフであり、融解曲線の生の蛍光値を温度の関数として示している。RT-PCR反応は表示の各遺伝子型から5'-UTRアンプリコンを生成した。この分析のための反応混合液はAG0308AAプローブ+FAM標識とAG0308Hプローブ+HEX標識とを共に含んでいた。2つの蛍光発光計測値を2つの異なるチャンネルでとった。図のデータは専らAG0308AAプローブに対応するFAMチャンネルに由来した。6つのHCV型に対応する6つの別々の実験の結果を同じグラフ上にオーバーレイした。示されているのは一組の代表データである。
【図２２】図22は図21の閉管RT-PCRおよびHCV型判別(融解曲線)デュアルプローブ分析の結果の、2次導関数プロットの使用によるグラフである。
【図２３】図23はやはり図21の閉管RT-PCRおよびHCV型判別(融解曲線)分析の結果を示すグラフであるが、蛍光は専らAG0308Hプローブに対応するHEXチャンネルで計測している。6つのHCV型に対応する6つの別々の実験の結果を同じグラフ上にオーバーレイした。示されているのは一組の代表データである。
【図２４】図24は図23の閉管RT-PCRおよびHCV型判別(融解曲線)デュアルプローブ分析の結果の、2次導関数プロットの使用によるグラフである。
【図２５】図25は、それぞれFAMチャンネル、HEXチャンネル上の結果に関する図22と図24の2次導関数プロットの並置比較である。グラフでは各プローブと各HCV型の組み合わせに対応するTm値が示されている。
【図２６】図26は閉管RT-PCRおよびHCV型判別(融解曲線)分析の結果を示すグラフであるが、FAM-BHQ標識TaqManプローブ(ST650AAFBFQ2)の使用によるHCV定量結果も併記している。このグラフはサーモサイクリングのPCR増幅期におけるサイクル数の関数としての正規化蛍光値の上昇のオーバーレイを示す。HCV型1a、5aおよび6aからのHCV RNA転写産物各々1,000、10,000、100,000、1,000,000コピーを(2連で)分析した。各反応混合液には、定量プローブに加えて、遺伝子型判定用のAG0203A-FAMプローブも含めた。この図に示した分析部分に含まれるのはサイクリングプログラムの、FAMチャンネルだけを使用するRT-PCR増幅部分だけに限られる。蛍光データは正規化FAM蛍光値をサイクル数の関数としてプロットで表示した。各HCV型および濃度に対応するPCR増幅プロファイルを同じグラフ上にオーバーレイした。代表的なデータセットが示されている。CTとウイルス定量はこの蛍光プロファイル部分から計算した。示されているのは一組の代表データである。
【図２７】図27は閉管RT-PCRおよびHCV型判別(融解曲線)分析の結果を示すグラフであるが、FAM標識TaqManプローブ(ST650AAFBFQ2)の使用によるHCV定量結果も併記している。条件は図26の場合と同じである。RT-PCR反応はHCV型3aおよび4aから5'-UTRアンプリコンを生成した。生成したアンプリコンは図に示すような種々の濃度で使用した。Tm分析のための反応混合液はAG0308K(HEX)プローブを含んでいた。この図に示した分析部分に含まれるのはサイクリングプログラムの、FAMチャンネルだけを使用するRT-PCR増幅部分だけに限られる。蛍光データはサイクル数の関数としての正規化FAM蛍光値のプロットとして表示している。各HCV型および濃度に対応するPCR増幅プロファイルを同じグラフ上にオーバーレイした。代表的なデータセットが示されている。CTとウイルス定量はこの蛍光プロファイル部分から計算した。示されているのは一組の代表データである。
【図２８】図28は図27の閉管RT-PCR、HCV定量、HCV型判別(融解曲線)分析の結果を示すグラフである。図に示す蛍光データはAG0203A-FAMプローブに対応するFAMチャンネルでモニターした、サイクリングプログラムのHCV遺伝子型判別(融解曲線)部分をカバーしている。グラフは融解曲線の生のFAM蛍光値を温度の関数として示している。各HCV型および濃度に対応する融解曲線プロファイルを同じグラフ上にオーバーレイした。示されているのは一組の代表データである。
【図２９】図29は図28の閉管RT-PCR、HCV定量、HCV型判別(融解曲線)分析の結果を示すグラフであり、同じデータを、2次導関数プロットを使用して表している。グラフは融解曲線の生のFAM蛍光値を温度の関数として示している。各HCV型および濃度に対応する融解曲線プロファイルを同じグラフ上にオーバーレイした。示されているのは一組の代表データである。
【図３０】図30は図27の閉管RT-PCR、HCV定量、HCV型判別(融解曲線)分析の結果を示すグラフである。図に示す蛍光データはAG0308K(HEX)プローブに対応するHEXチャンネルでモニターした、サイクリングプログラムのHCV遺伝子型判別(融解曲線)部分をカバーしている。グラフは融解曲線の生のHEX蛍光値を温度の関数として示している。各HCV型および濃度に対応する融解曲線プロファイルを同じグラフ上にオーバーレイした。示されているのは一組の代表データである。
【図３１】図31は図30の閉管RT-PCR、HCV定量、HCV型判別(融解曲線)分析の結果を示すグラフであり、同じデータを、2次導関数プロットを使用して表している。グラフは融解曲線の生のFAM蛍光値を温度の関数として示している。各HCV型および濃度に対応する融解曲線プロファイルを同じグラフ上にオーバーレイした。示されているのは一組の代表データである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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