(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
HCVレプリコン複製細胞を作製する方法であって、
HCVレプリコン配列および選択マーカー遺伝子配列を含んでいるRNAを、Li23細胞またはLi23細胞に由来する治癒細胞に導入する工程を包含し、
該HCVレプリコン配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列においてQ1112R、K1609EおよびS2200R、またはQ1112R、P1115LおよびS2200Rのアミノ酸置換を生じているアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでいることを特徴とする作製方法。
【請求項２】
上記HCVレプリコン配列が、配列番号３または５に示されることを特徴とする請求項１に記載の作製方法。
【請求項３】
全長HCVゲノム配列および選択マーカー遺伝子配列を含んでいるRNAを、Li23細胞に由来する治癒細胞に導入する工程を包含することを特徴とする全長HCV RNA複製細胞を作製する方法であって、
該Li23細胞に由来する治癒細胞が、
（i）HCVレプリコン配列および選択マーカー遺伝子配列を含んでいるRNAを、Li23細胞またはLi23細胞に由来する治癒細胞に導入してHCVレプリコン複製細胞を作製する工程であって、該HCVレプリコン配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列においてQ1112R、K1609EおよびS2200R、またはQ1112R、P1115LおよびS2200Rのアミノ酸置換を生じているアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでいることを特徴とする工程、及び
（ii）得られたHCVレプリコン複製細胞を、抗ウイルス作用を有する薬剤を含む培地中で培養する工程
を包含する方法により得られる治癒細胞である、作製方法。
【請求項４】
上記全長HCVゲノム配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列におけるQ1112R、K1609EおよびS2200R、またはQ1112R、P1115LおよびS2200Rのアミノ酸置換を生じているアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでいることを特徴とする請求項３に記載の作製方法。
【請求項５】
上記塩基配列が、配列番号７または９に示されることを特徴とする請求項４に記載の作製方法。
【請求項６】
上記全長HCVゲノム配列が、配列番号１１または１３に示される塩基配列を含んでいることを特徴とする請求項３に記載の作製方法。
【請求項７】
上記RNAがレポーター遺伝子配列をさらに含んでいることを特徴とする請求項３〜６のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項８】
上記RNAが、外因性のインターナルリボソーマルエントリーサイト（ＩＲＥＳ）配列をさらに含んでいることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項９】
抗HCV作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法によって作製された細胞を候補因子とともにインキュベートする工程；および
HCV遺伝子産物のレベルを測定する工程
を包含することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１０】
抗HCV作用を有する物質をスクリーニングするためのキットであって、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法によって作製された細胞；および
HCV遺伝子産物のレベルを測定するための試薬
を備えていることを特徴とするキット。
【請求項１１】
抗HCV作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、
請求項７に記載の方法によって作製された細胞を候補因子とともにインキュベートする工程；および
レポーター遺伝子産物のレベルを測定する工程
を包含することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１２】
抗HCV作用を有する物質をスクリーニングするためのキットであって、
請求項７に記載の方法によって作製された細胞；および
レポーター遺伝子産物のレベルを測定するための試薬
を備えていることを特徴とするキット。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によって作製された細胞を、抗ウイルス作用を有する薬剤を含む培地中で培養する工程を包含することを特徴とするLi23細胞に由来する治癒細胞の作製方法。
【請求項１４】
感染性HCV粒子を生産する方法であって、
請求項１３に記載の方法によって作製された治癒細胞を、感染性HCV RNAとともにインキュベートする工程を包含することを特徴とする産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規HCVレプリコン複製細胞および全長HCV RNA複製細胞、ならびにこれらの利用に関するものであり、より詳細には、新規HCVレプリコン複製細胞および全長HCV RNA複製細胞を用いた新規HCV RNA複製システムおよび新規HCV粒子産生システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（以下「HCV」と記載する）は非Ａ非Ｂ型肝炎の原因ウイルスとして１９８９年に発見同定されたフラビウイルス科に属するRNAウイルスである。HCVは持続感染を成立させるウイルスであることから、HCV感染により引き起こされる肝炎（Ｃ型肝炎）は高率に慢性肝炎に移行する。その後、二十数年の経過のなかで肝硬変、そして最終的に肝細胞癌発症に至ることが明らかになっている。【０００３】
HCV感染者は日本国内で約２００万人、世界で約２億人いると推定されている。最近の社会的問題にもなっているフィブリノゲン製剤によるHCV感染という事態からもわかるように、HCVに感染していることを自覚していないいわゆる無症候性キャリアーも多数存在している。現在、日本国内における肝細胞癌による犠牲者は年間約３．５万人となっており、その８割はHCV感染によるものである。また、その前段階である肝硬変においても年間約２万人が犠牲となっている。したがって、HCVは深刻な感染症を引き起こすウイルスであると言える。【０００４】
HCVが増殖し、その感染、複製、粒子産生、再感染が繰り返される状態（すなわちHCVの生活環）が再現されるシステムを得ることは、抗HCV技術の開発に非常に有用である。HCVの発見以後、多くの培養細胞や動物を用いて人工増殖システムの開発が試みられたが、実用的なものは得られなかった。また、HCV感染のモデル動物はチンパンジーのみであり、これに代わる動物は未だ見つかっていない。チンパンジーを薬剤のスクリーニングに用いることは希少性および経済性の観点から現実的でない。【０００５】
１９９９年に、上記の問題点をある程度クリアする新しい実験システムとしてHCVレプリコンシステムが登場した（非特許文献１参照）。HCVレプリコンはHCVの構造タンパク質をコードする遺伝子を除いたHCV遺伝子（非構造タンパク質ＮＳ３〜ＮＳ５Ｂまで）である。このシステムでは、HCVゲノムの複製に必須のＮＳ３〜ＮＳ５Ｂ領域とゲノムの両末端からなるHCVサブゲノムが細胞内で複製するようになっており、１細胞あたりのHCVサブゲノムのコピー数は数千というレベルに達する。その後、いくつかの異なるHCV株由来のサブゲノミックHCVレプリコン細胞が樹立されている（例えば、非特許文献２参照）。Ｃ型肝炎治療薬の開発においては、多数のモデル動物（チンパンジー）を用いた薬理試験を実施することができないため、上記サブゲノミックHCVレプリコンシステムを用いた薬効評価が必須となっている。【０００６】
上記サブゲノミックHCVレプリコンシステムでは、HCV構造タンパク質の影響を評価し得ない。このような問題を解決するために、全長HCVゲノムの複製システムが開発され、これまでに、３種類のHCV株（Ｎ株、Ｃｏｎ−１株およびＨ７７株）の全長ゲノムを複製できる細胞（全長HCV RNA複製システム）の樹立が報告されている（非特許文献３〜５を参照）。また、レポーター遺伝子を含む、HCVゲノムの複製レベルをモニタリングし得るアッセイ系（非特許文献６、特許文献１）が開発された。さらに、２ａ遺伝子型に属するJFH１株HCVを用いた感染性HCV粒子産生細胞（HuH-7細胞由来のクローン化細胞）も樹立された（非特許文献７）。【０００７】
以上の技術（HCVレプリコン複製細胞、全長HCV RNA複製細胞、JFH１株HCVを用いたHCV粒子産生細胞）を用いてHCVに対する特異的抗ウイルス剤の開発に向けた取り組みが世界的に行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】日本国公開特許公報「特開２００６−３２５５８２号公報（公開日：平成１８年１２月７日）」
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Lohmann et al., Science 285: 110-113 (1999)
【非特許文献２】Kato et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 306: 756-766 (2003)
【非特許文献３】Blight et al., J. Virol. 77: 3181-3190 (2003)
【非特許文献４】Ikeda et al., J. Virol. 76: 2997-3006 (2002)
【非特許文献５】Pietschmann et al., J. Virol. 76: 4008-4021 (2002)
【非特許文献６】Ikeda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 329: 1350-1359 (2005)
【非特許文献７】Wakita et al., Nat. Med. 11: 791-796 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
HCVの生活環が再現される細胞としてこれまでに使用されているのは、HuH-7と呼ばれるヒト肝癌細胞株由来の特殊なクローン化細胞のみである。HuH-7細胞の中でも、HCVゲノムの複製を許容できるのはごくわずかな細胞クローンであることも判明している。HuH-7由来の細胞をベースにしてこれまでに得られている成果を検証するためにも、様々な細胞株でのHCV生活環再現システムの開発が必要である。しかし、HuH-7細胞以外に由来する細胞では、HCVレプリコンや全長HCV RNAの複製レベルがHuH-7細胞由来のものと比較して非常に低く、実用レベルではない。【００１１】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、HuH-7細胞株由来のHCV生活環再現システムに匹敵する能力を有する、HuH-7細胞株以外の細胞株に由来するHCV生活環再現システムを構築することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、特許文献１にて開示したHuH-7細胞ベースの技術を構築する際に用いたものとは異なる特定のHCVレプリコンRNAを使用することにより、HuH-7細胞とは異なる特定の細胞においてRNAの複製が首尾よく生じることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１３】
本発明に係るHCVレプリコン複製細胞を作製する方法は、HCVレプリコン配列および選択マーカー遺伝子配列を含んでいるRNAを、Li23細胞またはLi23細胞に由来する治癒細胞に導入する工程を包含し、該HCVレプリコン配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列におけるQ1112R、K1609EおよびS2200R、またはQ1112R、P1115LおよびS2200Rのアミノ酸置換を生じているアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでいることを特徴としている。【００１４】
本発明に係る全長HCV RNA複製細胞を作製する方法は、全長HCVゲノム配列および選択マーカー遺伝子配列を含んでいるRNAを、Li23細胞に由来する治癒細胞に導入する工程を包含することを特徴としている。上記全長HCVゲノム配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列におけるQ1112R、K1609EおよびS2200R、またはQ1112R、P1115LおよびS2200Rのアミノ酸置換を生じているアミノ酸配列をコードする塩基配列であってもよく、この場合、該塩基配列は、配列番号７または９に示される配列であることが好ましい。また、上記全長HCVゲノム配列は、配列番号１１または１３に示される塩基配列であってもよい。【００１５】
本発明に係る全長HCV RNA複製細胞を作製する方法において、上記RNAは、レポーター遺伝子配列をさらに含んでいることが好ましく、外因性のインターナルリボソーマルエントリーサイト（ＩＲＥＳ）配列をさらに含んでいることが好ましい。【００１６】
本発明に係るスクリーニング方法は、抗HCV作用を有する物質をスクリーニングするために、上記のいずれかの方法によって作製された細胞を候補因子とともにインキュベートする工程を包含し、HCV遺伝子産物のレベルを測定する工程、またはレポーター遺伝子産物のレベルを測定する工程をさらに包含することを特徴としている。【００１７】
本発明に係る治癒細胞の作製方法は、上記の方法によって作製された細胞を、抗ウイルス作用を有する薬剤を含む培地中で培養する工程を包含することを特徴としている。【００１８】
本発明に係る感染性HCV粒子の生産方法は、上記の治癒細胞を、感染性HCV RNAとともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１９】
本発明を用いれば、HCVレプリコンまたは全長HCVゲノムを複製し得る細胞を作製し得る。さらに、本発明を用いれば、HCVの感染も許容し得る細胞を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１（ａ）】HCV-O株（1b遺伝子型）のＨＣＶゲノムの構成を示す。
【図１（ｂ）】NS3領域の２種類の適応変異（Q1112RおよびK1609E）とNS5A領域のS2200R適応変異が導入された、HCV-O株由来のHCVレプリコンRNA（ON/3-5B/QR,KE,SR）の構成を示す。
【図１（ｃ）】図１（ｂ）のEMCVのIRESとNS3の間に、HCV-O株由来のC（コア）〜NS2を挿入した、全長HCV RNA（ON/C-5B/QR,KE,SR）の構成を示す。
【図１（ｄ）】図１（ｃ）のHCV IRESとNeoR遺伝子の間にRL遺伝子を挿入し、融合タンパク質として産生されるように改変したRNA（ORN/C-5B/QR,KE,SR）の構成を示す。
【図１（ｅ）】本来のHCVゲノムの構造を有している、劇症肝炎患者由来のJFH-1株(2a遺伝子型)由来の感染性HCV RNA（JFH1）の構成を示す。
【図２】HCVレプリコン複製細胞および全長HCV RNA複製細胞を作製する手順を示す図である。
【図３（ａ）】HCVレプリコン複製細胞におけるHCVタンパク質の発現を示す図である。
【図３（ｂ）】HCVレプリコン複製細胞におけるHCV-0株レプリコンの複製に対する抗HCV剤の効果を示す図である。
【図４】Li23細胞由来の全長HCV RNA複製細胞における全長HCV RNAを定量した結果を示す図である。
【図５】Li23細胞由来の全長HCV RNA複製細胞におけるHCVタンパク質の発現を示す図である。
【図６】OL8細胞、陽性コントロールとしてのO細胞、陰性コントロールとしてのLi23細胞について、抗dsRNA抗体を用いた免疫蛍光法によって、HCV RNAの複製中間体である二本鎖RNA（dsRNA）を検出した結果を示す図である。
【図７】Li23細胞由来の全長HCV RNA複製細胞における全長HCV RNAの複製に対するIFN−αの効果を示す図である。
【図８】Li23細胞由来の全長HCV RNA複製細胞内で複製しているHCVの遺伝子解析の結果を示す図である。
【図９】レポーター遺伝子を有する、Li23細胞由来のHCVレプリコン複製細胞および全長HCV RNA複製細胞の作製手順および結果を示す図である。
【図１０（ａ）】クローン化したORL８細胞における全長HCV RNAを定量した結果を示す図である。
【図１０（ｂ）】クローン化したORL11細胞における全長HCV RNAを定量した結果を示す図である。
【図１１】ORL8細胞内で複製しているHCVの遺伝子解析の結果を示す図である。
【図１２】ORL11細胞内で複製しているHCVの遺伝子解析の結果を示す図である。
【図１３】ORL8細胞およびORL11細胞におけるHCVタンパク質の発現を示す図である。
【図１４】ORL8細胞およびORL11細胞におけるルシフェラーゼ活性とHCV RNA量との相関を示す図である。
【図１５】ORL8細胞およびORL11細胞を用いた、IFN−αの経時的な抗HCV活性を示す図である。
【図１６】ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、IFN−αの抗HCV活性の比較を示す図である。
【図１７】sORL8(pool)細胞およびsORL11(pool)細胞を用いた、IFN−αの抗HCV活性の比較を示す図である。
【図１８】ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、IFN−βの抗HCV活性の比較を示す図である。
【図１９】ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、IFN−γの抗HCV活性の比較を示す図である。
【図２０】ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、シクロスポリンＡ（CsA）の抗HCV活性の比較を示す図である。
【図２１】ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、フルバスタチン（FLV）の抗HCV活性の比較を示す図である。
【図２２】ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、フルバスタチン（FLV）の抗HCV活性の比較を示す図である。
【図２３】ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、シンバスタチン（SMV）の抗HCV活性の比較を示す図である。
【図２４】ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、ローバスタチン（LOV）の抗HCV活性の比較を示す図である。
【図２５】ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、ピタバスタチン（PTV）の抗HCV活性の比較を示す図である。
【図２６】ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、リバビリン（RBV）の抗HCV活性の比較を示す図である。
【図２７】ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、ミゾリビンの抗HCV活性の比較を示す図である。
【図２８】ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、ゲルダナマイシンの抗HCV活性の比較を示す図である。
【図２９】ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、ミリオシンの抗HCV活性の比較を示す図である。
【図３０】ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、アセチルサリチル酸（ASA）の抗HCV活性の比較を示す図である。
【図３１】ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、IFN−αとCsAとの併用による抗HCV活性の比較を示す図である。
【図３２】ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、IFN−αとFLVとの併用による抗HCV活性の比較を示す図である。
【図３３】ORL8細胞およびOR6細胞を用いた、IFN−αとFLVとの併用による抗HCV活性の比較を示す図である。
【図３４】ORL11細胞およびOR6細胞を用いた、IFN−αとFLVとの併用による抗HCV活性の比較を示す図である。
【図３５】ORL8細胞およびORL11細胞を用いた、IFN−αとFLVとの併用による抗HCV活性の比較を示す図である。
【図３６】ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、IFN−αとFLVとの併用による抗HCV活性の比較を示す図である。
【図３７】ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、IFN−αとリバビリン（RBV）との併用による抗HCV活性の比較を示す図である。
【図３８】JFH1株HCV RNAを導入したLi23細胞、OL8c細胞およびOL11c細胞内でのHCVコアタンパク質の発現を調べた結果を示す図である。
【図３９】Li23細胞およびOL8c細胞に対するJFH1株HCVの感染実験の結果を示す図である。
【図４０】クローン化した各種OL治癒細胞に対するJFH1株HCVの感染実験の結果を示す図である。
【図４１】JFH1株HCVを感染させたOL8c細胞およびOL11c細胞からの、感染性HCV粒子の産生を調べた結果を示す図である。
【図４２】JFH1株HCVを感染させたOL8c細胞からの、感染性HCV粒子の産生を調べた結果を示す図である。
【図４３】OL8c細胞およびOL11c細胞に対するIFN−γ処理による治癒細胞の作製手順および結果を示す図である。
【図４４】JFH1株HCVを感染させたORL8c細胞およびORL11c細胞からの、感染性HCV粒子の産生を調べた結果を示す図である。
【図４５】ORL8c細胞、陽性コントロールとしてのJFH-1株HCV感染RSc細胞、陰性コントロールとしてのMock infection ORL8c細胞について、抗dsRNA抗体を用いた免疫蛍光法によって、HCV RNAの複製中間体である二本鎖RNA（dsRNA）を検出した結果を示す図である。
【図４６（ａ）】JFH-1株HCVを感染させたORL8c細胞およびRSc細胞の培養上清中に放出されるHCVコアタンパク質の分泌量をELISA法により測定した結果を示す図である。
【図４６（ｂ）】JFH-1株HCVを感染させたORL8c細胞およびRSc細胞におけるHCV RNA量をリアルタイムLightCycler PCRによって定量した結果を示す図である。
【図４７（ａ）】HuH-7細胞、RSc細胞、Li23細胞、ORL8c細胞およびORL11c細胞におけるHCV受容体のmRNAの発現レベルを定性的に比較した結果を示す図である。
【図４７（ｂ）】HuH-7細胞、RSc細胞、Li23細胞、ORL8c細胞およびORL11c細胞におけるHCV受容体のmRNAの発現レベルを定量的に比較した結果を示す図である。
【図４８（ａ）】HCV-O株以外のHCV株に由来する全長HCV RNAを複製し得る細胞株の樹立を確認した結果を示す図であり、1B-4株のコアタンパク質およびNS5Aタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した結果である。
【図４８（ｂ）】HCV-O株以外のHCV株に由来する全長HCV RNAを複製し得る細胞株の樹立を確認した結果を示す図であり、KAH5株のコアタンパク質およびNS5Aタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した結果である。
【図４９】HCV-O株以外のHCV株に由来する全長HCV RNAを複製し得る細胞株における、ルシフェラーゼ活性とHCV RNA量との相関を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
〔１〕HCVレプリコン複製細胞
本発明は、HCVレプリコン複製細胞を提供する。本発明に係るHCVレプリコン複製細胞は、特定の適応変異を有するHCVレプリコンRNAが特定の細胞に導入されていることを特徴としている。なお、本明細書中で使用される場合、「HCVレプリコン」は、「サブゲノミックHCVレプリコン」と交換可能に用いられ、HCVゲノム配列のNS3〜NS5Bの領域（「HCVレプリコン配列」）から構成される構造遺伝子が意図される。
【００２２】
HCV ORF中に変異を有することにより、細胞内でのHCVゲノムの複製効率が向上する場合があり、このような効果が得られる変異は「適応変異」として知られている。HCVについて多くの適応変異が知られているが、どのような適応変異がどのような条件に適しているのかは知られていない。本発明者らは、HuH-7細胞株に由来するHCV生活環再現システムを既に完成させている（特許文献１等参照）。HuH-7細胞株以外の細胞株に由来するHCV生活環再現システムを構築するために、HuH-7細胞株以外の種々の細胞株（例えば、ヒト肝癌細胞株、ヒト不死化肝細胞株、ヒト胆管癌細胞株など）にHCVレプリコンRNAの導入を試みたが、所望の形質転換体を得ることができなかった。しかし、本発明者らは、独自の観点と試行錯誤の結果、HCVゲノムにおけるNS3〜NS5B領域を含み、かつNS3領域における特定の適応変異（Q1112RおよびK1609E、またはQ1112RおよびP1115L）およびNS5A領域における特定の適応変異（S2200R）を有しているHCVレプリコン配列を用いれば、ヒト肝癌細胞株であるLi23細胞に目的のRNAを導入し得ることを見出した。本発明に利用され得る適応変異は、「Q1112R、K1609EおよびS2200R」の組合せ、または「Q1112R、P1115LおよびS2200R」の組合せである。これらの組合せにおける２種類の変異だけを用いた場合や、異なる組合せ（例えば「P1115L、K1609EおよびS2200R」、「Q1112R、E1202GおよびS2200R」、「E1202G、K1609EおよびS2200R」など）では本発明はうまく実現され得なかった。また、このような特定の組合せの適応変異を有したHCVレプリコン配列を用いても、Li23細胞以外の細胞に目的のRNAを導入することはできなかった。
【００２３】
一実施形態において、本発明に係るHCVレプリコン複製細胞は、ヒト肝癌細胞株であるLi23細胞が親細胞であり、このような細胞株に対して、HCVレプリコン配列（Q1112R、K1609EおよびS2200R、またはQ1112R、P1115LおよびS2200Rの適応変異を有している）と選択マーカー遺伝子配列とを含んでいるRNAが導入されていることを特徴としている。
【００２４】
本発明に係る細胞に導入されているRNAは、選択マーカー遺伝子配列およびHCVレプリコン配列を含むものであればよい。選択マーカー遺伝子としては、特に限定されないが、簡便性の観点から薬剤耐性遺伝子が好ましい。薬剤耐性遺伝子としては、特に限定されず、形質転換細胞の選択に使用可能な公知の薬剤耐性遺伝子から適宜選択すればよい。具体的には、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などを挙げることができる。HCVレプリコン配列としては、配列番号３または５に示される塩基配列が好ましいが、さらなる変異を有していてもよく、この場合の変異は適応変異に限定されない。
【００２５】
本発明に係る細胞に導入されているRNAにおける各配列の順序は、選択マーカー遺伝子産物およびHCVレプリコン配列がコードするタンパク質が発現し得る順序であれば特に限定されない。また、このRNAには、選択マーカー遺伝子を翻訳するためのIRESと、HCVのORFを翻訳するためのIRESとの２つのIRESが含まれることが好ましい。これにより、翻訳されるタンパク質を高レベルに維持できるという効果が得られる。２つのIRESは、いずれもHCV由来のIRESであってもよいが、少なくとも１つは外来性のIRESであることが好ましい。外来性のIRESを用いることにより、HCVゲノムの複製様式が維持されるという効果が得られる。外来性のIRESとしては、特に限定されず、例えばencephalomyocarditis virus（EMCV）由来のIRES、牛ウイルス性下痢ウイルス（Bovine viral diarrhea virus：BVDV）のIRES、ポリオウイルスのIRESなどを挙げることができるが、活性が高く頻用されているという理由で、EMCV由来のIRESが好ましい。
【００２６】
本発明に係る細胞に導入されているRNAに含まれる各配列の順序の一例としては、５’末端から、HCVのIRES配列、選択マーカー遺伝子配列、外来性IRES配列、HCV ORF配列、HCV３’非翻訳配列の順序を挙げることができるが、これに限定されない。なお、HCVのIRESは５’非翻訳領域およびコアの５’側の一部とからなるRNAである。例えば、実施例において、配列番号１に示されるHCV-O株の塩基配列の第１位〜第３７７位（第１位〜第３４１位が５’非翻訳領域）が用いられているが、これに限定されない。
【００２７】
本発明に係る細胞に導入されているRNAに含まれるHCVゲノム配列は、HCVに由来するものであればよい。HCVには、Ｃ型肝炎を引き起こすことができる病原株のみでなく、弱毒株および変異株も含まれる。また、HCVには多数の遺伝子型が存在しているが、いずれの遺伝子型のHCVに由来するものであってもよく、日本国内のＣ型肝炎患者の約７０％が１ｂ型のHCVに感染しているという観点から、１ｂであることが好ましい。
【００２８】
遺伝子型１ｂのHCV株としては、HCV-O株、Ｎ株、Ｃｏｎ−１株、ＪＴ株などが知られている。本発明者らは、HCV-O株のゲノムRNAを用いて本発明に係る細胞を作製しているが、これに限定されない。なお、HCV-O株の塩基配列を配列番号１、アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２９】
他の実施形態において、本発明に係るHCVレプリコン複製細胞は、Li23細胞に由来する全長HCV RNA複製細胞（後述）の治癒細胞が親細胞であり、このような細胞株に対して、HCVレプリコン配列（Q1112R、K1609EおよびS2200R、またはQ1112R、P1115LおよびS2200Rの適応変異を有している）と選択マーカー遺伝子配列とを含んでいるRNAが導入されていることを特徴としている。本明細書中で使用される場合、「Li23細胞に由来する」細胞株は「Li23由来」細胞株と交換可能に用いられ、Li23細胞に由来するHCVレプリコン複製細胞または全長HCV RNA複製細胞、あるいはこれらの治癒細胞が意図される。本実施形態において用いられる親細胞としては、後述するOLc細胞（図２参照）が好ましく、OL8c細胞、OL11c細胞またはOL14c細胞がより好ましい。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「治癒細胞」は、サブゲノミックHCVレプリコンを複製する細胞または全長HCVゲノムを複製する細胞を、抗ウイルス作用を有する薬剤の存在下で培養して得られる細胞であり、サブゲノミックHCVレプリコンが完全に排除された細胞または全長HCVゲノムが完全に排除された細胞が意図される。「完全に排除された」は、細胞中にHCV RNAおよび／またはHCVタンパク質が発現していないことが意図される。当業者は、細胞中にHCV由来のRNAが含まれているか否かを、RT-PCR法、ノーザンブロット法などによって容易に確認し得、HCVタンパク質が発現しているか否かを、ウエスタンブロット法などによって容易に確認し得る。このような治癒細胞は、図２において「sOLc」、「OLc」および「ORLc」として示され、本明細書中において「Li23細胞に由来する治癒細胞」といわれ、特に「OLc」および「ORLc」は「Li23細胞に由来する全長HCV RNA複製細胞の治癒細胞」ともいわれる。
【００３１】
抗ウイルス作用を有する薬剤としては、培地に添加することで治癒細胞を得られるものであれば特に限定されないが、抗HCV作用を有する薬剤が好ましい。より好ましくは、IFN、シクロスポリンＡ（CsA）などであり得、特に好ましくはIFNである。IFNとしては、IFN−α、IFN−β、IFN−γなどが挙げられる。IFNを用いた細胞の処理方法の一例としては、IFN−αを500 IU/mlの濃度で含む培地中で細胞を２週間培養する方法を挙げることができる。ただし、処理濃度、処理期間は、所望の治癒細胞が得られたか否かを確認しながら、適宜変更すればよい。
【００３２】
本発明はまた、HCVレプリコン複製細胞の製造方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る製造方法は、HCVレプリコン配列（Q1112R、K1609EおよびS2200R、またはQ1112R、P1115LおよびS2200Rの適応変異を有している）と選択マーカー遺伝子配列とを含んでいるRNAを、Li23細胞に導入する工程を包含することを特徴としている。他の実施形態において、本発明に係る製造方法は、HCVレプリコン配列（Q1112R、K1609EおよびS2200R、またはQ1112R、P1115LおよびS2200Rの適応変異を有している）と選択マーカー遺伝子配列とを含んでいるRNAを、Li23細胞に由来する治癒細胞に導入する工程を包含することを特徴としている。
【００３３】
なお、本発明者らが作製した細胞は、岡山大学寄託機関である国立大学法人岡山大学知的財産本部（岡山市津島中一丁目１番１号）に寄託されており、その寄託番号は以下の通りである。
【００３４】
【表１】
0005535073.tif 000002
【００３５】
また、これらの細胞は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（305-8566  茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター中央第６）に平成２０年７月３１日に受託され、かつ平成２１年７月３０日に国際移管の申請が受領されており、その受領番号は以下の通りである。
【表２】
0005535073.tif 000003
【００３６】
〔２〕全長HCV RNA複製細胞
本発明は、全長HCV RNA複製細胞を提供する。本発明に係る全長HCV RNA複製細胞は、全長HCVゲノムが特定の細胞に導入されていることを特徴としている。本明細書中で使用される場合、「全長HCVゲノム」は、図１（ａ）に示されるHCVゲノムの全領域（C領域〜NS5B領域）が含まれているRNAが意図され、「全長HCV RNA」と交換可能に用いられる。
【００３７】
本発明に係る全長HCV RNA複製細胞に導入されているRNAは、選択マーカー遺伝子配列および全長HCV RNA配列を含むものであればよいが、レポーター遺伝子をさらに含むことが好ましい。これにより、簡便かつ高感度にレポーターアッセイを行うことができる。選択マーカー遺伝子としては、特に限定されないが、簡便性の観点から薬剤耐性遺伝子が好ましい。薬剤耐性遺伝子としては、特に限定されず、形質転換細胞の選択に使用可能な公知の薬剤耐性遺伝子から適宜選択すればよい。具体的には、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などを挙げることができる。全長HCV RNA配列としては、配列番号１、７、９、１１または１３に示される塩基配列が好ましいが、さらなる変異を有していてもよく、この場合の変異は適応変異に限定されない。
【００３８】
本発明に係る全長HCV RNA複製細胞に導入されているRNAに必要に応じて含まれるレポーター遺伝子としては、特に限定されず、ルシフェラーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられ、ルシフェラーゼ遺伝子が好ましい。ルシフェラーゼ遺伝子としては、一般にホタル由来ルシフェラーゼ遺伝子またはウミシイタケ由来ルシフェラーゼ遺伝子が使用されているが、いずれが用いられてもよく、遺伝子の長さがより短いという点で、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼ遺伝子が好ましい。
【００３９】
本発明に係る全長HCV RNA複製細胞に導入されているRNAには、選択マーカー遺伝子を翻訳するためのIRESと、HCVのORFを翻訳するためのIRESとの２つのIRESが含まれることが好ましい。これにより、翻訳されるタンパク質を高レベルに維持できるという効果が得られる。２つのIRESは、いずれもHCV由来のIRESであってもよいが、少なくとも１つは外来性のIRESであることが好ましい。外来性のIRESを用いることにより、全長ゲノムの複製様式が維持されるという効果が得られる。外来性のIRESとしては、特に限定されず、例えばencephalomyocarditis virus（EMCV）由来のIRES、牛ウイルス性下痢ウイルス（Bovine viral diarrhea virus：BVDV）のIRES、ポリオウイルスのIRESなどを挙げることができるが、活性が高く頻用されているという理由で、EMCV由来のIRESが好ましい。
【００４０】
本発明に係る全長HCV RNA複製細胞に導入されているRNAに含まれる各配列の順序の一例としては、５’末端から、HCVのIRES配列、（必要に応じて）レポーター遺伝子配列、選択マーカー遺伝子配列、外来性IRES配列、HCV ORF配列、HCV３’非翻訳配列の順序を挙げることができるが、これに限定されない。
【００４１】
一実施形態において、本発明に係る全長HCV RNA複製細胞は、全長HCVゲノムがsOLc細胞に導入されている。sOLc細胞は、HCVレプリコン配列（Q1112R、K1609EおよびS2200Rの適応変異を有している）と選択マーカー遺伝子配列とを含んでいるRNAが、Li23細胞に導入されて作製されたHCVレプリコン複製細胞（sOL細胞）を、抗ウイルス作用を有する薬剤の存在下で培養して得られた細胞である（図２参照）。本実施形態に係る全長HCV RNA複製細胞は図２に示されるOL細胞であり、OL1細胞〜OL14細胞が好ましく、OL8細胞、OL11細胞およびOL14細胞がより好ましい。
【００４２】
他の実施形態において、本発明に係る全長HCV RNA複製細胞は、全長HCVゲノムがOLc細胞に導入されている。OLc細胞は、OL細胞を、抗ウイルス作用を有する薬剤の存在下で培養して得られた細胞である（図２参照）。本実施形態に係る全長HCV RNA複製細胞は、全長HCVゲノム配列と選択マーカー遺伝子配列とを含んでいるRNAが導入されており、図２に示されるORL細胞（Q1112R、K1609EおよびS2200Rの適応変異を有している）が好ましく、ORL8-1細胞〜ORL8-9細胞およびORL11-1細胞〜ORL11-16細胞がより好ましく、ORL8-9細胞（以下、ORL8細胞と称する。）およびORL11-5細胞（以下、ORL11細胞と称する。）がさらに好ましい。
【００４３】
別の実施形態において、本発明に係る全長HCV RNA複製細胞は、全長HCVゲノムがORLc細胞に導入されている。ORLc細胞は、ORL細胞を、抗ウイルス作用を有する薬剤の存在下で培養して得られた細胞である（図２参照）。本実施形態に係る全長HCV RNA複製細胞は、全長HCVゲノム配列と選択マーカー遺伝子配列とを含んでいるRNAが導入されている。本実施形態に係る全長HCV RNA複製細胞は、感染性JFH１株HCVだけでなく新しいHCV株のHCV RNA複製（特にルシフェラーゼ遺伝子を有するような長いRNA（12 kb）の複製）を許容し得る細胞である。すなわち、本実施形態において用いられる全長HCVゲノム配列は、HCVのあらゆる株に由来してもよい。用いられるHCV株は、HCV-O株、1B-4株、KAH5株が好ましく、本実施形態に係る全長HCV RNA複製細胞は、1B-4RL8細胞およびKAH5RL8細胞が好ましい。なお、HCVの1B-4株の塩基配列（配列番号１１）およびアミノ酸配列（配列番号１２）、ならびにKAH5株の塩基配列（配列番号１３）およびアミノ酸配列（配列番号１４）、それぞれGenBankにACCESSION AB442219およびAB442220として登録されている。
【００４４】
本発明に係る全長HCV RNA複製細胞は、全長HCVゲノムを複製し、必要に応じてレポーター遺伝子産物を発現することができる。本発明に係る全長HCV RNA複製細胞は、選択マーカー遺伝子配列および全長HCVゲノム配列（必要に応じて、さらにレポーター遺伝子配列）を含むRNAが導入された細胞で、全長HCVゲノムを複製し得るものであればよく、好ましくはレポーター遺伝子産物を発現し得るものであればよい。上記RNAがレポーター遺伝子配列を含む場合、本発明に係る全長HCV RNA複製細胞においては、レポーター遺伝子産物の発現量とHCV RNAの複製量は非常によく相関するので、レポーター遺伝子産物を定量することにより、全長HCVゲノムの複製レベルを簡便にモニタリングすることができる。また、サブゲノミックHCVレプリコンでは不可能である、構造タンパク質の影響を含めたHCVの機能解析に非常に有用である。すなわち、本発明に係る全長HCV RNA複製細胞を用いることにより、HCVの機能解析、抗HCV作用を有する物質のスクリーニングなどを簡便かつ迅速に行うことが可能となる。
【００４５】
本発明はまた、全長HCV RNA複製細胞の製造方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る製造方法は、sOLc細胞に、全長HCVゲノム配列と選択マーカー遺伝子配列とを含んでいるRNAを導入する工程を包含することを特徴としている。上記RNAはレポーター遺伝子配列をさらに含んでいてもよい。他の実施形態において、本発明に係る製造方法は、OLc細胞に、全長HCVゲノム配列と選択マーカー遺伝子配列とを含んでいるRNAを導入する工程を包含することを特徴としている。上記RNAはレポーター遺伝子配列をさらに含んでいてもよい。別の実施形態において、本発明に係る製造方法は、ORLc細胞に、全長HCVゲノム配列と選択マーカー遺伝子配列とを含んでいるRNAを導入する工程を包含することを特徴としている。上記RNAはレポーター遺伝子配列をさらに含んでいてもよい。
【００４６】
〔３〕スクリーニング方法
本発明は、抗HCV作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明に係るスクリーニング方法は、上述した本発明に係る細胞を候補因子とともにインキュベートする工程を包含するものであればよい。上記細胞に導入されたRNAがレポーター遺伝子配列を含んでいる場合は、レポーター遺伝子産物のレベルを測定する工程をさらに包含すればよく、上記細胞に導入されたRNAがレポーター遺伝子配列を含んでいない場合は、HCV遺伝子産物のレベルを測定する工程をさらに包含すればよい。測定したレベルは予め設けた基準値と比較されてもよいが、細胞を候補因子とともにインキュベートしない場合のレポーター遺伝子産物のレベルまたはHCV遺伝子産物のレベルを測定し、対応するレベルと比較することが好ましい。このようなスクリーニング方法を用いることにより、多数の被検物質を、簡便かつ迅速にスクリーニングすることができる。
【００４７】
本発明に係るスクリーニング方法においては、抗HCV作用は、全長HCVゲノムの複製を抑制する作用である。すなわち、本発明に係るスクリーニング方法は、全長HCVゲノムの複製を抑制する作用を有している物質をスクリーニングする方法ともいえる。
【００４８】
また、本発明に係るスクリーニング方法を用いれば、HCVに近縁のウイルスやHCVと同様の複製形式をとるウイルスの複製を抑制する物質のスクリーニングが可能である。HCVに近縁のウイルスとしては、フラビウイルス科のフラビウイルス属およびペスチウイルス属に属するウイルスを挙げることができる。フラビウイルス属に属するウイルスには日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルスなどが属し、ペスチウイルス属にはブタコレラウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルスなどが属する。
【００４９】
さらに、本発明に係るスクリーニング方法を用いれば、HCVと同様の複製形式をとるウイルスの複製を抑制する物質のスクリーニングが可能である。HCVの複製の特徴は、細胞質内で複製が全て行われ、ウイルスゲノムが核内に存在することはないことである。したがって、本発明に係るスクリーニング方法により、このような複製形式をとるウイルスの複製を抑制する物質をスクリーニングすることができる。
【００５０】
被検物質と細胞との接触は、被検物質を培地に溶解または懸濁することで行うことができる。したがって、被検物質は、培地に溶解または懸濁可能なものであればよい。
【００５１】
レポーター遺伝子産物のレベル測定は、用いるレポーター遺伝子に応じて公知の方法から選択すればよい。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合には、細胞を界面活性剤を含む緩衝液等で溶解した細胞溶解液を試料として、ルミノメーター等の機器を用いて発光量を測定すればよい。また、この際、市販のルシフェラーゼ測定用試薬やルシフェラーゼ測定用キットを好適に用いることができる。
【００５２】
上記により測定したレポーター遺伝子産物のレベルを、被検物質を接触させていない細胞のレポーター遺伝子産物のレベルと比較することにより、この被検物質が抗HCV作用を有するか否かを判定することができる。なお、細胞増殖能を低下させない被検物質濃度において、被検物質を接触させていない細胞のレポーター遺伝子産物のレベルより低ければ抗HCV作用を有すると判定でき、好ましくは、少なくとも５０％以下、より好ましくは１０％以下であるときに抗HCV作用を有すると判定する。
【００５３】
さらに好ましい判定基準としては、現在のＣ型慢性肝炎治療の標準的な方法であるIFN−αを本発明に係るスクリーニング方法に適用したときのレベル、またはIFN−αとリバビリンとを併用して本発明に係るスクリーニング方法に適用したときのレベルを判定基準とすることである。現在の標準的なＣ型肝炎治療法に用いられている薬剤よりHCVの複製レベルが低ければ、非常に有用なＣ型肝炎治療薬を見出すことができる。
【００５４】
本発明に係るスクリーニング方法により、少なくともＣ型肝炎治療薬の有効成分の候補物質を選択することができる。また、HCV感染モデル動物はチンパンジーのみであるため、現在の状況では多数の動物を用いた薬理試験の実施は不可能であり、本発明に係るスクリーニング方法がＣ型肝炎治療薬の開発における薬効評価に必須な方法になることが期待される。
【００５５】
〔４〕スクリーニングキット
本発明は、抗HCV作用を有する物質をスクリーニングするためのスクリーニングキットを提供する。本発明に係るスクリーニングキットは、上述した本発明に係る細胞を備えていればよい。上記細胞に導入されたRNAがレポーター遺伝子配列を含んでいる場合は、レポーター遺伝子産物のレベルを測定するための試薬をさらに備えていればよく、上記細胞に導入されたRNAがレポーター遺伝子配列を含んでいない場合は、HCV遺伝子産物のレベルを測定するための試薬がさらに備えられていればよい。このようなスクリーニングキットを用いることにより、簡便かつ効率的に上記本発明に係るスクリーニング方法を実施することができる。
【００５６】
本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは特定の材料を使用するための使用説明書を備える。使用説明書は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、CD-ROMなどのような電子媒体に付されてもよい。
【００５７】
本発明に係るスクリーニングキットには、上述した本発明に係る細胞以外のものが備えられていてもよい。このような細胞以外の具体的な構成については特に限定されず、必要な試薬や器具等が適宜選択されてキットの構成となり得る。
【００５８】
本発明に係るスクリーニングキットの使用方法は、上述した本発明に係るスクリーニング方法の使用形態に準じればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００５９】
〔５〕感染性HCV粒子の生産方法
本発明は、感染性HCV粒子の生産方法を提供する。本発明に係る感染性HCV粒子の生産方法は、上述した本発明に係る細胞を、抗ウイルス作用を有する薬剤を含む培地中で培養して得られた細胞（「Li23細胞に由来する治癒細胞」）に感染性HCV RNAを導入する工程、または感染性HCVとともにインキュベートする工程を包含していればよい。本方法において用いられる細胞は、ORL8c細胞およびORL11c細胞が好ましいがこれらに限定されない。
【実施例】
【００６０】
〔１：試薬および手順〕
〔使用試薬〕
フルバスタチンはCalbiochem社およびLKT Laboratories社より購入した。IFN−α、IFN−β、IFN−γはSigma社より購入した。シクロスポリンＡ（CsA）、ミリオシン、アセチルサリチル酸はSigma社より購入した。プラバスタチン、シンバスタチン、ローバスタチン、ゲルダナマイシンはWako chemical社より購入した。ピタバスタチンはTronto Research 社より購入した。リバビリンはYamasa 社から供与された。ミゾリビンは旭化成 社から供与された。【００６１】
〔Li23細胞〕
ヒト肝癌細胞株であるLi23細胞の培養には、
F-12 medium (Invitrogen 11765-054)      500 ml
D-MEM medium (Sigma D5796)              500 ml 
の合計１Ｌに対して
[添加物質（Ａ群）]                    [最終濃度]
EGF (Toyobo EGF-201)                   50 ng/ml  
Insulin (Sigma I-6634)                 10 μg/ml   
Hydrocortison (Sigma H-0888)           0.36 μg/ml  
Transferrin (Sigma T-2252)              5 μg/ml  
Linoleic acid (Sigma L-1012)            5 μg/ml   
Selenium (Sigma S-9133)                20 ng/ml  
Prolactin (Sigma L6520)                10 ng/ml  
FBS (Biological Industries 04-001-1A)    1% (v/v)  
[添加物質（Ｂ群）]                    [最終濃度]
Gentamycin (Invitrogen 15750-060)      10 μg/ml  
Kanamycun-monosulfate (Sigma K-4000)   0.2 mg/ml
Fungizone (IBL 33605)                  0.5 μg/ml
を添加して用いた。なお、FBSは５６℃で３０分間インキュベートしたものを使用した。Li23細胞はEGF依存性の増殖を示し、HCV複製モデルに汎用されているHuH-7細胞の培地条件(10% Fetal Bovine Serum(FBS))での増殖は難しい細胞株である。HCVのサブゲノミックレプリコンまたは全長HCVゲノムを含むLi23細胞株を、0.3 mg/mlの濃度のG418(Invitrogen社)を含む培地で維持した。また、後述する治癒細胞は、G418を含まないことを除いて、同じ培養液を用いた。【００６２】
なお、Li23細胞がHuH-7細胞と同じく肝細胞の特徴を有していることを以下のように確認した。Li23細胞において、肝細胞に特異的に発現しているかまたは肝細胞にて発現量が多いと報告されている１１個の遺伝子（Aly HH et al., J. Hepatology, 46:26-36,2007）の発現を標準的なRT-PCR法によって調べ、ヒト肝癌細胞株であるHuH-7細胞、あるいはヒト子宮頸癌細胞（HeLa細胞）またはヒト胚腎臓（HEK293細胞）と比較した。その結果、Li23細胞における各遺伝子の発現レベルはHuH-7細胞とほぼ同程度であり、HeLa細胞およびHEK293細胞では各遺伝子を検出することができなかった（結果は示さず）。【００６３】
〔ノーザンブロット分析〕
RNeasy Mini Kit (Qiagen社)を用いて、添付の実験説明書に従い、対象の細胞からトータルRNAを抽出した。波長260nmの吸光度測定により抽出したRNAを定量した。4μgのRNAを用いてHCV RNAおよびβ-actin RNAの検出を行った。すなわち、Northern Max Kit (Ambion社)を用いて、添付の実験説明書に従いRNAの特異的検出を行った。RNAサンプルを電気泳動し、ゲルをHybond-N+ ナイロンメンブレン (Amersham-Pharmacia Biotech社)にブロティングした。UVクロスリンク (Stratagene社)を行ってRNAをメンブレンに固定化し、メンブレン上の28S rRNA部分をエチジウムブロマイドで染色した。28S rRNA バンドの約1cm下でメンブレンをカットした。カットしたメンブレンの上部にはHCV RNAが含まれ、下部にはβ-actin mRNA が含まれる。HCV RNAの特異的検出のために、digoxigenine labeing kit (Roche社)を用いて、添付の実験説明書に従い、digoxigenineで標識したHCV NS5B領域に相補的なマイナス鎖リボプローブを合成して用いた。HCV RNAに特異的に結合したリボプローブの検出はアルカリホスファターゼ標識抗digoxigenine抗体を用いた。CSPD（Roche社）で反応させた後、Ｘ線フィルムに感光し、特異的なHCV RNAの検出を行った。β-actin RNAの検出も同様に行った。【００６４】
〔ウエスタンブロット分析〕
６ウエルの細胞培養プレートで培養した細胞に、SDSを含むサンプルバッファー100μlを加えて、細胞溶解液を回収した。10分間超音波破砕機にてソニケイションを行った後、各サンプルに10μlの2-メルカプトエタノールを加え100℃で３分間処理した。10〜20μlのサンプルを10％のSDS-PAGEに供し、これをメンブレン（PVDF膜）に転写した。５％のスキムミルクを含む0.1% トリス緩衝液(10mM Tris (pH7.5), 150mM NaCl, 0.1% Tween20)で６０分間、タンパク質を転写したメンブレンをブロッキングした。その後、各HCVタンパク質に対する抗体およびβ-actinタンパク質に対する抗体を0.1% トリス緩衝液で１０００倍希釈した溶液と前記のメンブレンとを接触させ、６０分間反応を行った。メンブレンを0.1% トリス緩衝液にて５分×３回洗浄後、１０００倍希釈したHRP標識マウス二次抗体を加えた0.1% トリス緩衝液と接触させ、６０分間反応を行った。メンブレンを0.1% トリス緩衝液にて２０分×３回洗浄した。ルネッサンスTMルミノールウエスタンブロット化学発光検出試薬プラス（NEN Life Science）にて化学発光させ、Ｘ線フィルム（KODAK BioMax）で感光した。【００６５】
今回の実験で用いた抗体は、抗Core抗体（Institute of Immunology社）、抗E1抗体(東京都臨床研究所、小原博士より供与)、抗E2抗体（参考文献：Microbiol.Immunolo. 42,875-877,1998を参照）、抗NS3抗体（Novocastera Laboratories社）、抗NS4A抗体（大阪大学、高見沢博士より供与）、抗NS5A抗体（大阪大学、高見沢博士より供与）、抗NS5B抗体(東京都臨床研究所、小原博士より供与)、抗β-actin抗体(Sigma社)である。【００６６】
〔プラスミドの構築〕
プラスミドpON/C-5B は、HCVのIRES（Internal ribosomal entry site）の下流にネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ（Neo）、およびEncephalomyocarditis virus（EMCV）のIRESの下流に全長HCV-Oタンパク質をコードする配列を含む。【００６７】
最初に、HCV陽性血清より遺伝子型１b型のHCV-O全長cDNAを含むプラスミドpHCV-Oを、２つのフラグメントを用いて構築した。２つのフラグメントとは、参考文献（Kato et al. J.Gen.Virol.79: 1859-1869(1998)）に記載のpBR322/16-6に由来するEcoR I−Mlu Iフラグメント（HCVゲノムの45位−2528位に相当）および血清1Β−2のPCR産物由来のMlu I−Spe Iフラグメント（HCVゲノムの2528位−3420位に相当）である。これらを、1Β−2R1配列を有するpNSS1RZ2RU（非特許文献２を参照）のEcoR I−Spe I サイトにライゲートし、pHCV-Oを構築した。【００６８】
pON/C-5Bを構築するためのフラグメントを得るために、オーバーラッピングPCRを用いて、EMCVのIRESとコアタンパク質をコードする配列とを融合した。得られたDNAをRsr IIおよびCla I で消化し、これをpNSS1RZ2RUのXba I−Rsr IIフラグメントと共に、pHCV-OのCla I−Xba I サイトにライゲートすることで、pON/C-5Bを構築した。【００６９】
プラスミドpON/3-5Bの構築は、非特許文献２に詳細に記載されている。すなわち、sO細胞より抽出したRNAを非特許文献２に記載されているように、HCV-O遺伝子の3474位-9185位に相当する領域をRT-PCR法で増幅しこれをpNSS1RZ2RUのSpe I-Bsiw Iサイトにライゲートして、pON/3-5Bを構築した。【００７０】
さらに、Ikedaらの方法（非特許文献４を参照）に従い、QuickChange mutagenesis（Stratagene）を用いて、pON/3-5BにQ1112R、K1609EおよびS2200Rの変異またはQ1112R、P1115LおよびS2200Rの変異を導入し、pON/3-5B/QR,KE,SRまたはpON/3-5B/QR,PL,SRを構築した。さらに、pON/C-5B にそれぞれQ1112R、K1609EおよびS2200Rの変異またはQ1112R、P1115LおよびS2200Rの変異を導入し、pON/C-5B/QR,KE,SRまたはpON/C-5B/QR,PL,SRを構築した。また、プラスミドpORN/C-5B/ QR,KE,SRは、Renilla （ウミシイタケ）luciferase遺伝子 (Promega)のPCR産物を、pON/C-5B/ QR,KE,SRにおけるNeo遺伝子の上流のAsc Iサイトに導入することにより構築した。なお、上記各プラスミドは、挿入遺伝子の5’側にT7プロモーター配列を含んでいる。【００７１】
〔RNA合成〕
プラスミドDNAをXba I で切断して線状化し、T7 MEGAscript Kit (Ambion社)を用いて、添付の実験説明書に従い、RNAの合成を行った。塩化リチウムで沈澱させた後、RNAを75％エタノールで洗浄し、RNaseフリー水で溶解した。【００７２】
〔HCV RNAの定量〕
HCV RNA複製細胞から、RNeasy Mini Kit (Qiagen社)を用いて、添付の実験説明書に従い、トータルRNAを抽出した。はじめに、２μgのRNAを鋳型として、SuperScriptTMII 逆転写酵素 (Invitrogen社)および下記のプライマー319Rを用いて添付の実験説明書に従い、逆転写反応（RT）を行った。得られたcDNAを鋳型としてリアルタイムLightCycler PCRによるHCV RNAの定量を行った。リアルタイムLightCycler PCRは、下記のプライマー104および197Rを用いて、本発明者らが以前に報告した方法（参考文献：Acta Med. Okayama 56,107-110,2002）に基づいて実施した。
319R: 5'-TGCTCATGGTGCACGGTCTA-3'（配列番号１５）
104:  5'-AGAGCCATAGTGGTCTGCGG-3'（配列番号１６）
197R: 5'-CTTTCGCGACCCAACACTAC-3'（配列番号１７）。【００７３】
〔ルシフェラーゼレポーターアッセイ〕
Renilla Luciferase Assay System (Promega社)を用い、添付の実験説明書に従って細胞を回収し、ウミシイタケルシフェラーゼの定量を行った。【００７４】
〔２：HCVゲノム〕
図１は、ＨＣＶゲノムの構成、サブゲノミックＨＣＶレプリコン細胞に導入されるＲＮＡの構成、全長ＨＣＶゲノム複製細胞に導入されるＲＮＡの構成、およびルシフェラーゼ遺伝子産物を発現する全長ＨＣＶゲノム複製細胞に導入されるＲＮＡの構成を示す模式図である。【００７５】
図１（ａ）に、HCV-O株（1b遺伝子型）を示す。HCVゲノムは約9.6kbからなる＋鎖の一本鎖RNA（配列番号１）であり、全体の90%は１つの大きなORFを有しており、約3,000アミノ酸からなるポリプロテイン（配列番号２）を産生する構造になっている。このポリプロテインは宿主のプロテアーゼによりp7までの前半部がプロセッシングを受け、残りの部分はNS2とNS3にコードされている２種類のプロテアーゼによりプロセッシングを受け、少なくとも10種類のウイルスタンパク質が最終的に産生される。E2までの領域はウイルス粒子を形成する構造領域、NS2〜NS5Bについては非構造領域と呼ばれている。HCV RNAの複製に必須の領域はコアの最初の12アミノ酸をコードする領域を含んだ5’非翻訳領域（HCV IRES）とNS3〜NS5Bまでの領域および3’末端領域であることがわかっている。HCV-O株は国内の患者の７０％程度を占める1b遺伝子型に属するHCV株であり、ヘルシーキャリアー（HCVに感染しているが、肝機能が正常）から単離されたものである。【００７６】
本発明において使用したRNAを図１（ｂ）〜図１（ｅ）に示す。図１（ｂ）に、NS3領域の２種類の適応変異（Q1112RおよびK1609E）とNS5A領域のS2200R適応変異が導入された、HCV-O株由来のHCVレプリコンRNA（ON/3-5B/QR,KE,SR）を示す。また、K1609Eの代わりにP1115Lの適応変異を導入されたHCV-O株由来のHCVレプリンコンRNA（ON/3-5B/QR,PL,SR）もこの構造を有している。図１（ｃ）に示す全長HCV RNA（ON/C-5B/QR,KE,SR）は、レプリコン（ON/3-5B/QR,KE,SR（図１（ｂ））のEncephalomyocarditis virus(以下EMCV) のInternal ribosomal entry site (以下IRES)とNS3の間に、HCV-O株由来のC（コア）〜NS2までを挿入したものであり、本来のHCVゲノムより1.4 kb長い構造（全長11kb）を有している。また、図１（ｄ）に示すRNA（ORN/C-5B/QR,KE,SR）は、全長HCV RNA（ON/C-5B/QR,KE,SR（図１（ｃ））のHCV IRESとNeoR遺伝子の間にRenilla（ウミシイタケ）ルシフェラーゼ遺伝子（RL遺伝子）を挿入し、融合タンパク質として産生されるように改変したものであり、本来のHCVゲノムより2.4 kb長い構造（全長12kb）を有している。RL遺伝子を有していることにより、RL活性を測定することによってHCV RNAの複製レベルを定量することができる（この測定をレポーターアッセイと称する。）。図１（ｅ）に示すHCV RNA（JFH1）は，本来のHCVゲノムの構造を有しており、劇症肝炎患者由来のJFH-1株(2a遺伝子型)由来の感染性HCV RNAである。【００７７】
以上の５種類のRNAを、これらRNA配列を含むプラスミド(pON/3-5B/QR,KE,SR; pON/3-5B/QR,PL,SR; pON/C-5B/QR,KE,SR; pORN/C-5B/QR,KE,SR; pJFH1)を制限酵素XbaIで切断して直鎖状にした後、T7 MEGAscript (Ambion)を用いたin vitro合成によって得た。なお、全長JFH1のcDNAを含むプラスミドとして、財団法人東京都医学研究機構より研究材料提供契約書に基づいて供与されたものを用いた。【００７８】
〔３：HCVレプリコン複製細胞株〕
〔３−１〕細胞株の作製
pON/3-5B/QR,KE,SRまたはpON/3-5B/QR,PL,SRからin vitroにて合成したRNA 10μgを、非特許文献２に記載の方法に従ってLi23細胞（8 x 106 個）に導入した。導入２日後に、G418(0.3mg/ml)およびNaHCO3(0.15%)を含む培地に交換した。その後、４日ごとに培地交換を行い、３週間培養した後に、レプリコンRNAの複製が持続的に高いレベルを示す細胞をG418耐性コロニーとして得た。得られたコロニーの一部（プレート１枚）を Coomassie brilliant blue (CBB)にて染色した。なお、同様のレプリコンRNA導入実験を、他のヒト肝癌細胞株（HuH-6, Li21, Li24）、ヒト不死化肝細胞株（PH5CH, OUMS29, IHH10.3, IHH12）、ヒト胆管癌細胞株（HuH28）などを用いて行ったが、G418耐性の細胞コロニーを全く得ることができなかった（結果は示さず）。また、RNAを導入しない場合のLi23細胞は培地に含まれるG418により完全に死滅した（結果は示さず）。【００７９】
得られたG418耐性細胞内におけるHCVタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した。NS5A抗体とNS5B抗体を用いて、それぞれNS5AとNS5Bタンパク質を常法に従って、検出した。非特許文献２にて本発明者らが報告したsO細胞（HCV-O株由来のレプリコンRNAが効率よく複製している、HuH-7細胞由来細胞）を比較のため用いた。解析に用いたタンパク質量を知るために、β−アクチン抗体によりβ−アクチンの検出も並行して行った。図３（ａ）は、ON/3-5B/QR,KE,SRのRNAを導入して得られた細胞がON/3-5B/QR,PL,SRのRNAを導入して得られた細胞より圧倒的にNS5AやNS5Bタンパク質の発現レベルが高いことを示す。また、ON/3-5B/QR,KE,SRの場合、クローン化した細胞よりもコロニーをプールした細胞の方の発現量が高いことが分った。全長HCV RNA複製細胞株を樹立することが目的であることから、この段階では細胞クローンの選択は行わず、プールした細胞（ON/3-5B/QR,KE,SR(pool)）をsOL細胞として次のステップに使用した。【００８０】
〔３−２〕細胞株の薬剤感受性
HuH-7細胞由来の細胞を用いた場合に抗HCV活性があると報告されている薬剤に対して、sOL細胞内のHCVレプリコンが感受性を示すかどうかを調べた。また、これらの薬剤で処理することにより全長HCV RNA複製細胞を作製する際に必要と考えられるsOL細胞の治癒細胞（HCV RNAの複製に適した細胞内環境を有する事が期待される細胞）を作製することが可能かどうかを合わせて検討した。なお、HuH-7細胞由来のsO細胞を、sOL細胞における効果と比較するために実験に用いた。【００８１】
６ウエルプレートに1 x 105個の細胞を播種し、24時間後に各種薬剤を添加した。IFN−α, IFN−β,およびIFN−γについてはそれぞれ20 IU/ml、フルバスタチン（ＦＬＶ）は5μM、シクロスポリンＡ（CsA）は0.5μg/mlの終濃度になるように添加した。添加５日後にそれぞれの細胞内のNS5Bタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した。図３（ｂ）に示すように、sOL細胞は各種抗HCV剤に対してsO細胞とほぼ同程度の感受性を示すことが分った。従って、これらの薬剤で処理することによりsOL細胞の治癒細胞が得られるものと考えられた。【００８２】
〔４：全長HCV RNA複製細胞株〕
〔４−１〕細胞株の作製
G418非存在下でsOL細胞にIFN−γ(103 IU/ml)を4日ごとに５回添加し、細胞内からHCV-O株レプリコンRNAを排除した治癒細胞sOLcを得た。なお、HCV RNAが存在していないこと、およびHCV ゲノムがコードするタンパク質が発現していないことによって、治癒細胞であることを確認した。【００８３】
pON/C-5B/QR,KE,SRからin vitroにて合成したRNA 2 μgまたは4 μgを、非特許文献２に記載の方法に従ってsOLc細胞（8 x 106 個）に導入した。導入２日後に、G418(0.3mg/μl)およびNaHCO3(0.15%)を含む培地に交換した。その後、４日ごとに培地交換を行い、３週間培養した。いずれのRNA量の場合もG418耐性コロニーが得られた（結果は示さず）。得られたコロニーの一部（プレート１枚）をCBBにて染色した。染色されたコロニーの数を測定して1μg RNAあたりのコロニー形成率を算出した結果、約100コロニー/μg RNAと計算された。G418による薬剤選択が完全でない可能性とわずかな量のHCV-O株レプリコンが残存している細胞が存在している可能性があるため、クローン化のために大きなコロニーを選択し、全長HCV RNAの複製が持続的に高いレベルを示す細胞をG418耐性コロニーとして得た（OL1〜OL14）。LightCycler PCRによる細胞内HCV RNAの定量比較により、上位３クローン（OL8細胞、OL11細胞およびOL14細胞）を選択し、これらのクローンを用いてHCVタンパク質の検出やHCVの遺伝子解析を行った（図４）。残りのコロニーは200個ほどであったので、これらのコロニーは混ぜて、OL(pool)細胞として以後の解析に使用した。なお、OL細胞内で11 kbの全長HCV RNAが複製しており、8 kbのレプリコンRNAが残存していないことを、全てのOL細胞クローンおよびOL(pool)細胞にて確認した（結果は示さず）。また、各種HCVタンパク質に対するウエスタンブロットの結果より、OL8, OL11およびOL14細胞では、O細胞より低いものの、種々な実験に使用するのは十分と思われる程度のタンパク質を発現していることを確認した（図５）。なお、OL14細胞では、OL8細胞またはOL11細胞よりもHCVタンパク質の発現レベルが低かった。また、HCV 5’UTRについてのＰＣＲを行うことによって、OL8細胞、OL11細胞およびOL14細胞にはHCVゲノムが宿主DNAに組み込まれていないことも確認した（結果は示さず）。【００８４】
続いて、全長HCV RNAを複製するOL8細胞においてHCV RNAの複製中間体である二本鎖RNA（dsRNA）を検出するために、抗dsRNA抗体を用いた免疫蛍光法によってOL8細胞を観察した。陽性コントロールとしてO細胞、陰性コントロールとしてLi23細胞を用いた。【００８５】
コラーゲンコートしたカバースリップ上に播種した後４日間培養した細胞を、3%パラホルムアルデヒドを含むPBS溶液にて室温で固定し、さらに0.1% Triton X-100で処理して透過性を有する細胞を作製した。1% (v/v)牛血清アルブミン（BSA）で処理した後、細胞を抗dsRNA抗体（K1:English and Scientific Consulting社；１次抗体）、引き続いてCy2-conjugated 抗マウス抗体（Jackson Immuno Research, West Grove社；２次抗体）で処理した。細胞の核を、4’,6-diamidino-2-phenylindole（シグマ社）で染色した。カバースリップをPermaFluor Aqueous Mountant（ThermoFisher社）を用いてグラススライド上に配置し、共焦点レーザー走査顕微鏡（LSM510;Carl Zeiss社）下で観察し、そして撮影した。結果を図６に示す（図中、バーの長さは20μmである。）。【００８６】
観察の結果、図に示すように、OL8細胞とO細胞において、細胞質全体に散在する小さなドット状の蛍光が観察されたが、Li23細胞ではこのような蛍光は全く観察されなかった。OL8細胞において、O細胞と同様に、複製中間体である二本鎖RNAが検出されたことは、OL8細胞内でHCV RNAが効率良く複製している証拠であると考えられる。【００８７】
〔４−２〕細胞株の薬剤感受性
OL8細胞、OL11細胞およびOL14細胞における全長HCV RNAの複製がIFN−αにより抑制されるかどうかをコロニーアッセイ法により調べた。外径10 cm のディッシュに1 x 104個の細胞を播種し、IFN−α (0, 50, 100または200 IU/ml)を４日ごとに添加しながら、２５日間G418 (0.3 mg/ml)存在下で培養した。G418抵抗性として出現したコロニーをCBB溶液にて染色した（図７）。OL8細胞やOL11細胞ではいくらかG418耐性を示す細胞コロニーが得られたが、コントロールとして用いたO細胞の場合と同じくらいであった。OL14細胞からはG418耐性の細胞コロニーは得られなかった。以上の結果、OL8細胞、OL11細胞およびOL14細胞内での全長HCV RNAの複製はO細胞の場合と同様にIFN−αに高感受性を示すことが示された。【００８８】
〔４−３〕細胞株におけるHCVの遺伝子解析
さらに、OL8細胞、OL11細胞およびOL14細胞内で複製している全長HCV RNAは導入した３種類の適応変異（Q1112R, K1609EおよびS2200R）以外に新たな適応変異が生じているかどうかを調べた。各細胞からTotal RNAを調製して、非特許文献７に記載のRT-PCR法に従って、全長HCV RNAを増幅した（5’UTR〜NS2までの前半部5.1 kbとNS3〜NS5Bまでの後半部6 kb）。前半部の増幅におけるRT primerは290ROKを、PCRには21XとNS3RXOKのprimer setを使用した。後半部の増幅におけるRT primerは386Rを、PCRにはNS2XOKと9388RXのprimer set を使用した。RTにはPrimscript (Takara)、PCRにはKOD-plus DNA polymerase (Toyobo)を用いた。増幅産物をプラスミドベクター(pBR322MC)に挿入し、挿入部分の塩基配列を決定して、最初に細胞に導入したON/C-5B/QR,KE,SRの塩基配列と比較した（図８）。【００８９】
その結果、以下の点が明らかとなった。なお、図には示していないが、解析した９クローンの5’UTR(341塩基)の塩基配列には変異は認められなかった。
（１）最初に導入されていたQ1112R、K1609EおよびS2200Rの変異は解析した計９クローン（各細胞３クローンずつ）内に保存されていた。
（２）HCV RNAの複製に必須なNS3〜NS5B領域に各細胞由来の３クローンに保存されたアミノ酸置換を伴う新たな変異は１カ所もなかった。すべてクローン特異的に生じた変異であった。NS3〜NS5B領域の１クローンあたりの変異数はOL8細胞で１カ所、OL11細胞で1.3カ所、OL14細胞で2.6カ所と低値であった。NS3〜NS5B領域で検出されたクローン特異的変異(Q1067R, K1397R, I1612M, V1864A, V1929L, E1937D, C1968W, T1989S, T2169A, L2171P, P2322L, T2332A, S2380PおよびW2404R)はこれまで報告されている適応変異には該当しなかったが、OL14細胞のclone3において検出されたQ2933Rは弱い適応変異（1.6倍複製レベルが上昇）であることが以前の報告(Lohmann et al., JVI, 77:3007-3019,2003)で示されている。従って、OL細胞における全長HCV RNAの複製にはQ1112R、K1609EおよびS2200Rの変異が必要であり、新たな適応変異は必要ないと考えられた。
（３）一方、コア〜NS2領域においては、比較的多くの変異が観察された。OL11細胞では３クローンに共通のアミノ酸置換を伴う変異(V333A)がE1領域に検出された。OL8細胞では３クローンに共通の変異は検出されなかったが、３クローン中２クローンで検出された変異が４カ所（E1領域のA351PとS362P、E2領域の462VとV709A）認められた。コア〜NS2領域の１クローンあたりの変異数はOL8細胞で5.3カ所、OL11細胞で4カ所、OL14細胞で4カ所とNS3〜NS5B領域と比較すると高値であった。従って、この領域はHCV RNAの複製に必須ではないことが示唆された。【００９０】
さらに、OL8細胞、OL11細胞およびOL14細胞由来のそれぞれ３クローンについてHCV polyprotein内の塩基配列およびアミノ酸配列を使用してGENETYX-MAC (Software Development)にてNeighbour-joining解析を行い、親クローンであるON/C-5B/QR,KE,SRを基にした遺伝的系統樹を作成した（結果は示さず）。塩基配列およびアミノ酸配列のどちらのレベルにおいても似たような系統樹となったが、OL14細胞は、遺伝的にも独立したクラスターを形成しなかった。上述したように、OL14細胞では、HCVタンパク質の発現レベルが他の２種類の細胞よりかなり低かったので、以後の解析にはOL8細胞とOL11細胞を使用した。【００９１】
〔５：レポーター遺伝子を有するHCVレプリコンRNAまたは全長HCV RNAを複製し得る細胞株〕
〔５−１〕細胞株の作製
JFH-1株HCV感染実験に使用するために必要な治癒細胞を、OL細胞の上記３クローン（OL8細胞、OL11細胞およびOL14細胞）とともに、３クローン以外のいくつかのクローン（OL細胞）に対して、G418非存在下でIFN−γ(103IU/ml)を4日ごとに５回添加して治癒細胞OLcを作製した。4-5x105個程度のOL8細胞およびOL11細胞を外径10 cmのディッシュに播種し、IFN−γ(103IU/ml)を４日ごとに４回添加した。細胞がディッシュに一杯になった場合には適時継代した。４回目のIFN−γ添加後の継代時に細胞を２群のディッシュに分け、１群には培地にG418 (0.3 mg/ml)およびNaHCO3(0.15%)を添加した。もう一群には培地のみで培養を継続した。その後、両群にIFN−γを一回添加し、４日以上培養を続けた後CBB染色を行った。その結果、G418を添加しない培地で培養を続けた細胞はディッシュ一杯に増殖した。しかし、G418を添加した培地で培養を続けた場合は、細胞が完全に死滅した（結果は示さず）。【００９２】
さらに、OL8c細胞またはOL11c細胞を用いて、レポーター遺伝子を有するHCV RNA（レプリコンまたは全長）を複製し得る細胞株を作製した。pORN/3-5B/QR,KE,SRおよびpORN/C-5B/QR,KE,SRからin vitroにて合成したRNA 10 μg (ORN/3-5B/QR,KE,SR)または20 μg (ORN/C-5B/QR,KE,SR) を、非特許文献２に記載の方法に従ってOL8c細胞またはOL11c細胞（それぞれ8 x 106 個）に導入した。導入２日後に、G418 (0.3 mg/ml)およびNaHCO3(0.15%)を含む培地に交換した。その後、４日ごとに培地交換を行い、２〜３週間培養した。【００９３】
ORN/3-5B/QR,KE,SR（レプリコンRNA）を導入した場合、OL8cおよびOL11c細胞ではG418耐性細胞によってディッシュが２週間で一杯になった（図９）。全体では数万種類のコロニーからなるものと推定されたため、クローン化することなくG418耐性細胞をそれぞれ混合して、レポーター遺伝子を有するレプリコン複製細胞（それぞれsORL8(pool)細胞およびsORL11(pool)細胞）とした。これらの細胞におけるルシフェラーゼ活性を測定すると、2 x 105個あたりの実測値として8 x 105と15 x 105の値が得られた（Promega社のアッセイキット）。これにより、いずれの細胞も抗HCV剤の活性評価に十分使えるレベルであることが分った。また、通常の継代用培地（G418存在下）を用いた場合の細胞の倍加時間は53時間と40時間と算定された。さらに、これらの細胞に存在するレプリコンRNAの宿主DNAへの組み込みはないことを確認した（結果は示さず）。【００９４】
ORN/C-5B/QR,KE,SR（全長HCV RNA）を導入した場合、導入後３週間程度たってもG418耐性コロニーの出現数は少なく、OL8c細胞からは約30個程度、OL11c細胞では約400個程度のコロニーが得られた。OL8c細胞からは９個の細胞コロニーをクローン化（ORL8-1〜ORL8-9）し、OL11c細胞からは16個の細胞コロニーをクローン化(ORL11-1〜ORL11-16)した（図９）。OL11c細胞におけるクローン化していない残りの細胞コロニーを混合してORL11(pool)細胞とした。ORL11(pool)細胞におけるルシフェラーゼ活性を測定すると、7 x 105という値が得られた（Promega社のアッセイキット）。これにより、この細胞も抗HCV剤の活性評価に十分使えるレベルであることが分った。また、通常の継代用培地（G418存在下）を用いた場合の細胞の倍加時間は44時間と算定された。さらに、この細胞に存在するHCVゲノムの宿主DNAへの組み込みはないことを確認した（結果は示さず）。【００９５】
さらに、ウエスタンブロットによって、ORL11(pool)細胞におけるHCVのコアタンパク質の発現レベルを調べたところ、ORL11(pool)細胞におけるコアタンパク質はOR6細胞と比較するとその発現レベルはかなり低いということが示唆された。この結果から、発現量の高いクローン細胞の選択が必要であると考えられた。【００９６】
RL遺伝子を有する全長HCV RNAの複製が持続的に高いレベルを示す細胞をG418耐性コロニーとして得た（図１０（ａ）および図１０（ｂ））。具体的には、LightCycler PCRによる細胞内HCV RNAの定量比較により、上位クローン（ORL8-9細胞およびORL11-5細胞）を選択した（それぞれ、ORL8細胞およびORL11細胞と称する。）。このような両細胞のルシフェラーゼレポーターアッセイは各種抗HCV剤の探索評価に有用と考えられる。【００９７】
〔５−２〕細胞株におけるHCVの遺伝子解析
先ず、ORL8細胞内で複製しているレポーター遺伝子を含む全長HCV RNAに最初から導入されている３種類の適応変異（Q1112R, K1609EおよびS2200R）以外に新たな適応変異が生じているかどうかを調べた。ORL8細胞からTotal RNAを調製して、非特許文献７に記載のRT-PCR法に従って、全長HCV RNAを増幅した（5’UTR〜NS2までの前半部6.2kbとNS3〜NS5Bまでの後半部6.1 kb）。前半部の増幅におけるRT primerは290ROKを、PCRには21XとNS3RXOKのprimer setを使用した。後半部の増幅におけるRT primerは386Rを、PCRにはNS2XOKと9388RXのprimer set を使用した。RTにはPrimscript(Takara)、PCRにはKOD-plus DNA polymerase(Toyobo)を用いた。増幅産物をプラスミドベクター(pBR322MC)に組み込み、挿入部分の塩基配列を決定し、最初に細胞に導入したORN/C-5B/QR,KE,SRの配列との比較した（図１１）。その結果、以下の点が明らかとなった。
（１）最初から導入されていたQ1112R、K1609EおよびS2200Rの変異は、解析した３クローン内に保存されていた。
（２）塩基配列を決定した5’UTRからNS5B領域までにおいて、３クローンに保存されたアミノ酸置換を伴う新たな変異は検出されなかった。アミノ酸置換を伴う新たな変異（clone 1で４カ所；clone 2で８カ所；clone 3で４カ所）はすべて解析したクローン特異的なものであった。従って、ORL8細胞におけるレポーター遺伝子を有する全長HCV RNAの複製にはQ1112R、K1609EおよびS2200Rの変異が必要であり、新たな適応変異は必要ないものと考えられた。
（３）アミノ酸置換を伴う変異はNS3〜NS5B領域と比較してコア〜NS2領域において多くなっていた。この現象は、全長HCV RNA複製細胞であるOL8細胞、OL11細胞およびOL14細胞の結果と同じ傾向であった。
（４）NS3〜NS5B領域で検出されたクローン特異的変異のW1558RとL2335Mはこれまで報告されている適応変異には該当しなかった。【００９８】
次に、ORL11細胞内で複製しているレポーター遺伝子を含む全長HCV RNAに最初から導入されている３種類の適応変異（Q1112R, K1609EおよびS2200R）以外に新たな適応変異が生じているかどうかを、ORL8細胞の場合と同様に調べた（図１２）。その結果、以下の点が明らかとなった。
（１）ORL8細胞の場合と同じく。最初から導入されていたQ1112R、K1609EおよびS2200Rの変異は、解析した３クローン内に保存されていた。
（２）塩基配列を決定した5’UTR〜NS5B領域までにおいて、３クローンに保存されたアミノ酸置換を伴う新たな変異は検出されなかった。アミノ酸置換を伴う新たな変異（clone 1で４カ所；clone 2で６カ所；clone 3で４カ所）はすべて解析したクローン特異的なものであった。従って、ORL11細胞におけるレポーター遺伝子を有する全長HCV RNAの複製にもQ1112R、K1609EおよびS2200Rの変異が必要であり、新たな適応変異は必要ないものと考えられた。
（３）アミノ酸置換を伴う変異はNS3〜NS5B領域と比較してコア〜NS2領域において多くなっていた。この現象は、ORL8細胞や全長HCVRNA複製細胞であるOL8細胞、OL11細胞およびOL14細胞の結果と同じ傾向であった。
（４）NS3〜NS5B領域で検出されたクローン特異的変異のG1041S、I1842MおよびL2347Iはこれまで報告されている適応変異には該当しなかった。【００９９】
〔５−３〕細胞株の性状解析
ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞を24ウエルプレートのそれぞれ３ウエルに2 x 104個ずつ播種し（培地1ml：G418、FungizoneおよびNaHCO3を加えていないアッセイ用培地）、４日間培養した後、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、ORL8細胞では平均1 x 106、ORL11細胞では平均 2 x 106、OR6細胞では平均 2 x 106の実測値が得られた（結果は示さず）。このレベルの値が得られたことから、抗HCV剤添加後の効果を調べる実験に十分な値と考えられた。コントロールとして用いたOL8c細胞およびOL11c細胞では100程度の数値であった。【０１００】
細胞の倍加時間を調べるために、ルシフェラーゼ活性を測定する上記アッセイ系と同じ条件下で細胞を播種し、24、48、72および96時間後の細胞数をトリパンブルー染色法にて測定した。各点、３ウエルずつ測定してその平均値を算出し、対数増殖期における倍加時間を測定した。比較対照のため、OR6細胞についても同様の方法により細胞数を調べ、その結果、細胞の倍加時間としてORL8細胞では23時間、ORL11細胞では26時間、OR6細胞では34時間という結果を得た（結果は示さず）。【０１０１】
ウエスタンブロット解析によって、ORL8細胞およびORL11細胞における各種HCVタンパク質（コア、E1、E2、NS3、NS4A、NS5AおよびNS5B）の発現レベルをOR6細胞のものと比較した（図１３）。コントロールとして、治癒細胞であるOL8c細胞、OL11c細胞、ORL8c細胞およびORL11c細胞についても同時に解析した。解析に用いたタンパク質量を確認するために、β−アクチン抗体によりβ−アクチンの検出も行った。ORL8細胞およびORL11細胞では、各種HCVタンパク質の発現レベルがOR6よりもかなり低いレベルであったが、各種解析に用いるには十分の発現量であると判断された。OR6細胞より発現レベルが低いという結果は、ORL8やORL11細胞内のHCV RNA量もOR6細胞（＞1x 107 copies/mg total RNA）より低い値であったこと（図１０の（ａ）および（ｂ））と一致する結果であった。【０１０２】
〔５−４〕細胞株の薬剤感受性
ORL8およびORL11細胞が、OR6細胞（特許文献１参照）と同様に、薬剤の効果を簡便に評価できる細胞系であるかどうかを解析した。OR6細胞は、特許文献１に示したように、細胞由来のルシフェラーゼ活性値がHCV RNA量と相関していて、薬剤の効果を簡便に評価できる細胞系である。【０１０３】
結果を図１４に示す。左は、ORL8細胞およびORL11細胞（それぞれ2 x 104個の細胞を24ウエルプレートに播種して１日間培養）にIFN−α 0, 1, 10, 100 IU/mlを添加して24時間後にルシフェラーゼ活性を測定したものである。各点に関して少なくとも３ウエル実施し、SD値を図に付加した。100%の実測値として、ORL8細胞では40万、ORL11細胞では50 万という値を得た。右は、ORL8細胞およびORL11細胞（それぞれ2 x 105個の細胞を6ウエルプレートに播種し２日間培養）にIFN−α 0, 1, 10, 100 IU/mlを添加して24時間後にHCV RNAをLightCyclerPCRにより定量的に測定したものである。各点に関して少なくとも３ウエル実施し、SD値を図に付加した。図に示すように、ルシフェラーゼ活性とHCV RNA量とはIFN−αの濃度に依存して減少し、両測定法による結果は、OR6細胞で得られた結果と同様に良好な相関性を示していた。このように、ORL8細胞およびORL11細胞は、簡便なルシフェラーゼアッセイを用いてHCV RNAの複製レベルを定量できる有用な細胞であることが示された。【０１０４】
OR6細胞において、経時的なウイルス効果が確認されている（Naka et al., BBRC,330:871-879,2005）。ORL8細胞およびORL11細胞についても同様のウイルス効果が確認される否かを検討した（図１５）。2 x 104個の細胞を24 ウエルプレートに播種し、24時間後に所定量のIFN−α（0, 1, 10, 100 IU/ml）を添加し、それぞれについて24時間、48時間および72時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。IFN−αの希釈には、別途調製した10% FBSを含むLi23細胞用培地を用いた。また、各点について３サンプルからの結果に基づいてSD値を算出した。【０１０５】
IFN−αを添加してから24時間後のルシフェラーゼの値をそれぞれ100とすると、1 IU/mlのIFN−αを添加した場合は、48時間後までは変動がなく72時間後ではORL8細胞ではやや上昇、ORL11細胞では明らかな再上昇が認められた。この結果は、これらの細胞内でのHCV RNAの複製レベルが高いことを示している。しかし、10 IU/mlや100 IU/mlのIFN−αで処理した場合、72時間後も明らかな再上昇は認められなかった。また、図には示していないが、IFN−α添加24時間後においても、すでにルシフェラーゼ活性が低下しており、IFN−αの強い抗HCV効果が認められた。ルシフェラーゼ活性の実測値としてORL8細胞では380,000（IFN−α無添加の場合）、113,000（1 IU/mlのIFN−α添加）、36,000（10 IU/mlのIFN−α添加）、19,000（100 IU/mlのIFN−α添加）の値が得られた。1 IU/mlのIFN−αを添加した72時間後のルシフェラーゼ活性は無添加の場合の50%以下となっているので、EC50（50%になる有効薬剤濃度）は1 IU/ml以下と推定される。ORL11細胞の場合もORL8細胞と同じように、IFN−α無添加の場合は750,000、1 IU/mlのIFN−α添加の場合は300,000、10 IU/mlのIFN−α添加の場合は76,000、100 IU/mlのIFN−α添加の場合は27,000という値が得られ、この場合も1 IU/mlのIFN−αを添加した72時間後のルシフェラーゼ活性は無添加の場合の50 %以下となっているので、EC50（50%になる有効薬剤濃度）は1 IU/ml以下と推定される。【０１０６】
このように、少なくともIFN−αに関して、ORL8細胞およびORL11細胞はOR6細胞と同様に、薬剤添加72時間後のルシフェラーゼ活性を測定するだけでHCV RNA複製レベルをモニタリングし得る簡便なアッセイ系になり得ることが示唆された。【０１０７】
〔５−５〕各種薬剤による抗HCV効果
これまでに抗HCV活性が報告されている薬剤について、ORL8細胞またはORL11細胞のアッセイ系を用いた評価を行った。コントロールとしてOR6細胞のアッセイ系を用いた。なお、化合物によっては溶剤としてDMSOまたはエタノールを用いる必要があるが、DMSOは０．５％以下、エタノールは０．２〜０．２５％の濃度であれば上記アッセイ系に影響が出ないことを予め確認した（データは示さず）。【０１０８】
(A) IFN−α
各細胞にIFN−α（0, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 10 IU/ml：Sigma社,I2396）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ0.13 IU/ml、O.30 IU/mlおよび0.40 IU/mlと算定された。同様の実験をさらに３回行ったが、ほぼ同じような値が得られ再現性は良好であった。IFN−αについては、ORL8細胞の感受性が高く、ORL11細胞、OR6細胞の順であった。代表的な結果を図１６に示す。【０１０９】
なお、IFN−αの添加により生じるルシフェラーゼ活性の減少が、IFN−αによる細胞の増殖抑制、または細胞毒性によるものではないことを確認するために、ルシフェラーゼアッセイと同じ条件にて細胞を培養して、トリパンブルー染色法にて細胞数を測定した。それぞれの細胞で得られたEC50値に相当する濃度のIFN−αの添加効果を調べた。その結果、いずれの細胞においても、コントロール細胞と比較して95%以上であり、IFN−αによる細胞毒性もほとんど認められなかった。【０１１０】
sORL8(pool)細胞およびsORL11(pool)細胞を用いて同様の実験を行った。解析の結果、sORL8(pool)細胞およびsORL11(pool)細胞におけるEC50はそれぞれ0.14 IU/mlおよび0.25 IU/mlと算定され、これはORL8細胞およびORL11細胞における結果（それぞれ0.13 IU/mlおよび0.30 IU/ml）とほぼ同程度の値であった。このことは、IFN−αがHCVレプリコンRNAと全長HCV RNAの複製に与える影響にほとんど差がないことを示唆する。代表的な結果を図１７に示す。【０１１１】
(B) IFN−β
各細胞にIFN−β（0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 10 IU/ml：東レ社より供与）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ0.10 IU/ml、O.18 IU/mlおよび0.35 IU/mlと算定された。代表的な結果を図１８に示す。IFN−βについても、IFN−αの場合と同じような傾向となりORL8細胞で最も感受性が高かった。【０１１２】
(C) IFN−γ
各細胞にIFN−γ（0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 10 IU/ml ：Sigma社 I1520）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ0.077 IU/ml、O.13 IU/mlおよび0.21 IU/mlと算定された。代表的な結果を図１９に示す。IFN−γについても、IFN−αやIFN−βの場合と同じような傾向となりORL8細胞で最も感受性が高かった。【０１１３】
なお、IFN−γの添加により生じるルシフェラーゼ活性の減少が、IFN−γによる細胞の増殖抑制、または細胞毒性によるものではないことを確認するために、ルシフェラーゼアッセイと同じ条件にて細胞を培養して、トリパンブルー染色法にて細胞数を測定した。それぞれの細胞で得られたEC50値に相当する濃度のIFN−γの添加効果を調べた。その結果、いずれの細胞においても、コントロール細胞と比較して90%以上であり、IFN−γによる細胞毒性もほとんど認められなかった。【０１１４】
(D) シクロスポリンＡ (CsA) 
各細胞にCsA（0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 1 μg/ml：Sigma社 C3662）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ0.15μg/ml、O.12μg/mlおよび0.17μg/mlと算定された。代表的な結果を図２０に示す。CsAについてはIFN−α、IFN−βまたはIFN−γとは異なり、ORL11細胞が他の細胞より若干感受性がよい結果となったが、３者における差はIFNで観察された差より小さいものであった。【０１１５】
なお、CsAの添加により生じるルシフェラーゼ活性の減少が、CsAによる細胞の増殖抑制、または細胞毒性によるものではないことを確認するために、ルシフェラーゼアッセイと同じ条件にて細胞を培養して、トリパンブルー染色法にて細胞数を測定した。それぞれの細胞で得られたEC50値に相当する濃度のCsAの添加効果を調べた。その結果、いずれの細胞においても、コントロール細胞と比較して87%以上であり、CsAによる細胞毒性もほとんど認められなかった。【０１１６】
(E) フルバスタチン (FLV)
各細胞にFLV（0, 0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 3 μM ：Calbiochem社 344095）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50は0.28 μM、0.32 μMおよび1.22 μMと算定された。代表的な結果を図２１に示す。【０１１７】
FLVの抗HCV効果はOR6細胞を用いたアッセイにより見出された（特許文献１参照）。ORL8細胞およびORL11細胞において示されたEC50値（0.28 μMおよびO.32 μM）は、OR6細胞において示されたEC50値（1.22 μM）と比較してはるかに低い。現在、PEG-IFN＋リバビリン併用療法にFLVをさらに追加する臨床試験が拡大の傾向にあり、よい結果も得られてきている（瀬崎 et al. 肝臓, 49:22-24, 2008）。臨床試験におけるFLVの有効性は、ORL8細胞およびORL11細胞を用いた細胞アッセイ系で得られたFLVのEC50値の信憑性を裏付け、ORL8細胞およびORL11細胞を用いた細胞アッセイ系の有用性を支持する。【０１１８】
なお、FLVの添加により生じるルシフェラーゼ活性の減少が、FLVによる細胞の増殖抑制、または細胞毒性によるものではないことを確認するために、ルシフェラーゼアッセイと同じ条件にて細胞を培養して、トリパンブルー染色法にて細胞数を測定した。それぞれの細胞で得られたEC50値に相当する濃度のFLVの添加効果を調べた。その結果、いずれの細胞においても、コントロール細胞と比較して97%以上であり、FLVによる細胞毒性もほとんど認められなかった。【０１１９】
さらに、異なる製造元のFLV（LKT laboratories Inc.,F4482、純度99.5%）を用いて、同様の実験を行い、EC50を算出した。その結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ0.31μM、0.11μMおよび1.44μMと算定された（図２２）。先に得られた結果と比較すると、ORL8細胞ではほぼ同じ値を示したが、ORL11細胞では、後者の方が効果が強く、OR6細胞では前者の方の効果が少し強かった。特に、注目されるのは、ORL11細胞でのEC50値が0.11μMという値であり、このアッセイ系においては、FLVの効果が最大限発揮されることを示している。別途行った実験においても、0.14μMというEC50値を得たことから、その再現性も確認することができた（結果は示さず）。【０１２０】
(F) プラバスタチン
各細胞にプラバスタチン（0, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 5, 10μM）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。OR6細胞を用いた細胞アッセイ系では、プラバスタチンによる抗HCV効果は確認できなかったことを以前に報告している。今回もまた、ORL8細胞およびORL11細胞において、OR6細胞と同様にプラバスタチンによる抗HCV効果は確認できなかった。この点においては、HuH-7細胞系及びLi23細胞系において大きな差は認められなかったといえる（結果は示さず）。【０１２１】
(G) シンバスタチン (SMV)
各細胞にSMV（0, 0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 3 μM ：Wako chemical社 193-12051）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ0.28 μM、0.15 μMおよび1.42 μMと算定された。代表的な結果を図２３に示す。【０１２２】
SMVの抗HCV効果はOR6細胞を用いたアッセイにより見出された（Ikeda et al., Hepatology 44:117-125 (2006)参照）。ORL8細胞およびORL11細胞において示されたEC50値（0.28 μMおよび0.15 μM）は、OR6細胞において示されたEC50値（1.42 μM）と比較してはるかに低い。このことは、SMVもC型肝炎患者の治療に使用できる可能性を示唆する。ORL8細胞ではSMVがFLVと同等の活性が得られ、ORL11細胞ではSMVがFLVより強い抗HCV活性を示した点に注目すべきである。OR6細胞を用いた場合、抗HCV活性はFLV、SMVの順であったが、ORL11細胞を用いた場合、抗HCV活性はSMV、FLVの順である。このことは、OR6細胞だけでなく、ORL8細胞またはORL11細胞も使用して総合的に判定する必要性が示唆されるとともに、ORL8細胞およびORL11細胞を用いた細胞アッセイ系の有用性が支持される。【０１２３】
(H) ローバスタチン (LOV) 
各細胞にLOV（0, 0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 μM ：Wako chemical社 125-04581）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ1.49 μM、1.04 μMおよび3.0 μMと算定された。代表的な結果を図２４に示す。【０１２４】
LOVは、他の報告でもレプリコンアッセイでのEC50値が高く（すなわち抗HCV活性が弱く）、臨床治療には適さないと指摘されている。しかし、これらの報告は全てHuH-7細胞由来の細胞アッセイ系を使用したものである。今回の結果は、Li23細胞系由来の細胞アッセイ系を用いることにより、従来の細胞アッセイ系では抗HCV活性が認められないまたは抗HCV活性が弱いとされていた薬剤に抗HCV活性があることを見出し得る可能性を示す。【０１２５】
(I)ピタバスタチン（PTV）
各細胞にPTV（0, 0.032, 0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2 μM ：Tronto Research Inc社 P531005のPTV lactone (prodrug)を使用）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ0.45 μM、0.16 μMおよび0.46 μMと算定された。代表的な結果を図２５に示す。【０１２６】
なお、PTVの添加により生じるルシフェラーゼ活性の減少が、PTVによる細胞の増殖抑制、または細胞毒性によるものではないことを確認するために、ルシフェラーゼアッセイと同じ条件にて細胞を培養して、トリパンブルー染色法にて細胞数を測定した。それぞれの細胞で得られたEC50値に相当する濃度のPTVの添加効果を調べた。その結果、いずれの細胞においても、コントロール細胞と比較して80%以上であり、PTVによる細胞毒性もほとんど認められなかった。【０１２７】
(J) リバビリン
各細胞にリバビリン（0, 3.13, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 μM ：Yamasaより供与、純度＞99.0%）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ10.1μM、15.9 μMおよび119 μMと算定された。代表的な結果を図２６に示す。【０１２８】
リバビリンは、現在PEG-IFNと併用して用いられており、貧血などの副作用があるのもかかわらず、PEG-IFN単独より治療効果が良いことから、標準的治療法として使用されている。しかし、リバビリンの抗HCV効果が何に起因するのかは、これまで明らかになっていない。本発明者らが作製したOR6細胞アッセイ系で測定すると、リバビリンに抗HCV効果が認められるもののそのEC50値は高値（76 μM）である（Naka et al., BBRC, 330; 871-879, 2005）。リバビリンの抗HCV効果について、主に４つの可能性が提唱されている：（１）リバビリンがRNA変異誘導活性を有していてHCVゲノムに変異を入れる（100 μM以上だとエラーカタストロフィーを引き起こす）；（２）HCVのRNA依存性RNAポリメラーゼ(NS5B)の阻害による効果；（３）細胞免疫を増強させる効果。IFN−γの産生促進による効果；（４）イノシン酸デヒドロゲナーゼ(IMPDH)の阻害効果。【０１２９】
ORL8細胞またはORL11細胞を用いたアッセイの結果、予想外の結果が得られた。OR6細胞を用いたアッセイでのEC50（119 μM）と比較して、ORL8細胞またはORL11細胞を用いたアッセイでは、驚くことにEC50がそれぞれ10.1 μMと 15.9 μMという非常に低かった。【０１３０】
なお、リバビリンの添加により生じるルシフェラーゼ活性の減少が、リバビリンによる細胞の増殖抑制、または細胞毒性によるものではないことを確認するために、ルシフェラーゼアッセイと同じ条件にて細胞を培養して、トリパンブルー染色法にて細胞数を測定した。それぞれの細胞で得られたEC50値に相当する濃度のリバビリンの添加効果を調べた。その結果、いずれの細胞においても、コントロール細胞と比較して98%以上であり、リバビリンによる細胞毒性もほとんど認められなかった。また、リバビリンによる細胞毒性も12.5 μMの濃度では認められなかった（結果は示さず）。【０１３１】
10 μMというEC50値からは抗HCV効果が強いとは言えないが、リバビリン治療を受けている患者の血中濃度は10〜14 μM程度であり、この濃度が、PEG-IFNと併用すると十分抗HCV効果を増強する濃度であることが判明した。従来のHuH-7細胞系を用いた実験結果から、投与された患者におけるリバビリンの血中濃度ではHCV RNAの複製を抑えないと信じられてきたが、今回の結果から、リバビリンはHCV RNA複製阻害剤としての活性を有することがわかった。なお、ORL8細胞およびORL11細胞については、リバビリンによるルシフェラーゼ活性の低下に相関して、HCVタンパク質の量も低下していることをウエスタンブロット法によって確認している（データは示さず）。従来の細胞アッセイ系では抗HCV活性が認められないか、あるいは抗体HCV活性が弱いとみなされていた薬剤が、実際は抗HCV活性を有しているということを見出すことができることを示している。このような範疇に入る抗HCV剤を見出し得るという点においても、本アッセイ系は有用なアッセイシステムになると言える。【０１３２】
(K) ミゾリビン
各細胞にミゾリビン（0, 3.13, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 μM）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。解析の結果、ORL8細胞およびORL11細胞におけるEC50はそれぞれ58.8μMおよび76.5μMと算定された。また、OR6細胞を用いたアッセイ系では200 μMでも50%以下にならなかった。代表的な結果を図２７に示す。【０１３３】
(L) ゲルダナマイシン
各細胞にゲルダナマイシン（0, 0.63, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 nM ：Wako chemical社 077-04571）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。ゲルダナマイシン（heat shock protein (Hsp90) inhibitor）については、HCV レプリコンアッセイ(HuH-7細胞由来の細胞使用)を用いた他の研究室からの論文（Nakagawa et al., BBRC 353;882-888,2007）が報告されており、EC50値（薬剤添加72時間後に解析）はCon1株では5.5 nM、N株では7.8 nMと算定されているので、今回の実験では、これらの値が薬剤濃度範囲の中央部に来るようにしてアッセイを行った。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ2.57 nM、3.31 nMおよび2.10 nMと算定された。代表的な結果を図２８に示す。【０１３４】
このように、今回のアッセイ系でもゲルダナマイシンの抗HCV活性が確認された。HCV-O株の全長HCV RNAの複製に関しては、報告されている値より低い値が得られたが、細胞の種類による違いはほとんどなかった。【０１３５】
(M) ミリオシン
各細胞にミリオシン（0, 0.63, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 nM ：Sigma社 M1177）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。ミリオシン（セリンパルミトイルトランスフェラーゼインヒビター）については、HCV レプリコンアッセイ (HuH-7細胞由来の細胞使用)を用いた他の研究室からの論文（Umehara et al., BBRC 346;67-73,2006）が報告されており、EC50値（薬剤添加72時間後に解析）はCon1株では5.8 nMと算定されているので、今回の実験では、これらの値が薬剤濃度範囲の中央部に来るようにしてアッセイを行った。解析の結果、ORL8細胞およびORL11細胞におけるEC50はそれぞれ5.16 nMおよび3.62 nMと算定された。これは、Con-1株のHCV レプリコンアッセイにより得られた値とほぼ同様の結果が得られたが、HuH-7細胞由来のOR6細胞を用いたアッセイでは、5 nM〜40 nMでも60 % 弱の活性が維持され、50 % 以下にならなかったため、EC50値を算出することができなかった。このような結果が得られた理由は明らかではないが、HuH-7細胞系の細胞で認められた現象を示さないLi23細胞系のORL8細胞およびORL11細胞は、ミリオシン関連の薬剤の評価をするのに適した細胞アッセイ系であると言える。代表的な結果を図２９に示す。【０１３６】
なお、ミリオシンの添加により生じるルシフェラーゼ活性の減少が、ミリオシンによる細胞の増殖抑制、または細胞毒性によるものではないことを確認するために、ルシフェラーゼアッセイと同じ条件にて細胞を培養して、トリパンブルー染色法にて細胞数を測定した。それぞれの細胞で得られたEC50値に相当する濃度のミリオシンの添加効果を調べた。その結果、ORL8細胞の細胞数は、コントロール細胞と比較すると若干低い83.5%であったが、他の細胞では91%以上であった。これらの結果から、ルシフェラーゼの活性低下はミリオシンの抗HCV活性によるものであると考えられた。【０１３７】
(N) アセチルサリチル酸（ASA）
最近、Con1株HCV レプリコンを用いた実験によりASAに抗HCV活性があるという報告がなされた（Trujillo-Murillo K et al., Hepatology 47:1462-1472 (2008)）。そこで、ASAの抗HCV活性を本アッセイシステムで検討し、EC50を算出した。【０１３８】
各細胞にミリオシン（0, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 mM）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した（上記報告ではASAのEC50値は4 mMとされている。）。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ1.33 mM、1.17 mMおよび2.16 mMと算定された。これらの値はCon-1株のHCV レプリコンアッセイにより得られた値より少し低い濃度であり、みかけ上はASAの抗HCV活性が確認されたような結果となった。しかし、２mMの濃度で処理した場合の細胞数の減少が明らかであったことから、細胞増殖に与える影響を調べたところ、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞を上記濃度のASAで処理すると、コントロール細胞と比較して、細胞数が53%、72%および51%に低下していた。代表的な結果を図３０に示す。これらの結果は、少なくともORL8細胞とOR6細胞におけるルシフェラーゼ活性の減少分はほぼすべて細胞増殖抑制分であることを示唆する。上記報告では、ASAの細胞増殖抑制効果が全く調べてられていないが、ASA本体に抗HCV活性があるという結論は得られないと考えられる。このように、アッセイに用いた薬剤濃度範囲で明らかな細胞数の減少が認められた場合には、細胞数を測定して比較して、ルシフェラーゼ活性の低下が細胞数の低下によるものであるかどうかの検定を行う必要がある。【０１３９】
〔５−６〕各種薬剤の併用による抗HCV効果
OR6細胞（特許文献１参照）を用いたアッセイ系では薬剤とIFN−αとの併用効果も測定可能である。よって、ORL8細胞およびORL11細胞を用いた本アッセイ系において、併用効果を測定し得るかどうかを検証した。なお、用いた薬剤の濃度は、上記EC50値に基づいた。【０１４０】
(i) IFN−αとCsAとの併用
結果を図３１に示す。IFN−α単剤処理後のルシフェラーゼ活性は50% (ORL8)、41% (ORL11)、67% (OR6)、CsAについては、35% (ORL8)、48% (ORL11)、73% (OR6)であった。OR6細胞で予想(50%)より若干活性が低いが、併用効果の測定には支障がない。薬剤併用後のルシフェラーゼ活性は14% (ORL8)、13% (ORL11)、33% (OR6)に低下していた。単剤処理の結果から併用による相加効果の場合の予想値は18% (ORL8)、20% (ORL11)、49% (OR6)であった。各細胞アッセイ系において得られた実測値は予想値よりも、22% (ORL8)、35% (ORL11)、33% (OR6)低い値を示したことから、IFN−αとCsAとの併用は若干の相乗効果を示すことがわかった。IFN−αとCsAとの併用における相乗効果（OR6細胞アッセイ系）については、特許文献１に示している。このように、ORL8細胞およびORL11細胞のアッセイ系もまた、OR6細胞のアッセイ系と同様にIFN−αとCsAとの併用効果を調べるアッセイに使用可能である。【０１４１】
(ii) IFN−αとFLVとの併用
FLV（Calbiochem社 344095）を用いた。結果を図３２に示す。IFN−α単剤処理後のルシフェラーゼ活性は50% (ORL8)、41% (ORL11)、67% (OR6)、FLVについては、59% (ORL8)、51% (ORL11)、55% (OR6)であった。薬剤併用後のルシフェラーゼ活性は29% (ORL8)、20% (ORL11)、37% (OR6)に低下していた。単剤処理の結果から併用による相加効果の場合の予想値は30% (ORL8)、21% (ORL11)、37% (OR6)であり、実測値とよく一致していることから相加効果であると考えられる。ただし、細胞数における確認から、薬剤単剤ではほとんど細胞増殖抑制を示さなかったが、併用により細胞増殖が抑制されるという傾向が認められた。【０１４２】
IFN−αとFLVとの併用効果について各薬剤の濃度を変化させてアッセイを行った。図３３にはORL8細胞およびOR6細胞におけるアッセイ結果を示した。IFN−αは0, 0.1, 0.2および0.4 IU/mlの終濃度になるように添加し、FLVは0, 0.3, 0.6および1.2 μMの終濃度になるように添加した。添加72時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、それぞれ単剤で添加した場合の結果から予想されていたものに近い結果が得られた。この結果からは、IFN−αとFLVとの併用効果は相加効果と考えられるが、ORL8細胞アッセイ系はOR6細胞アッセイ系に比べて感度が優れていると考えられる。【０１４３】
図３４にはORL11細胞とOR6細胞におけるアッセイ結果を示した。得られた結果は、それぞれ単剤処理の結果から予想されていたものに近く、ルシフェラーゼ活性は、ORL11細胞とほぼ同じような濃度依存的減弱パターンとなった。この結果からも、ORL11細胞アッセイ系はOR6細胞アッセイ系に比べて感度が優れていると考えられる。【０１４４】
図３５にはORL8細胞とORL11細胞におけるアッセイ結果を示した。両アッセイ系におけるルシフェラーゼ活性の減弱曲線はオーバーラップしており、IFN−αに関しては、若干ORL8細胞系の方の感受性が高いようであるが、併用効果における感度の面において両アッセイ系の感受性はほぼ同等であることがわかった。【０１４５】
(iii) IFN−αとPTVとの併用
PTV（PTV lactone (prodrug)を使用）を用いた。結果を図３６に示す。IFN−α単剤処理後のルシフェラーゼ活性は50% (ORL8)、41% (ORL11)、67% (OR6)、PTVについては、43% (ORL8)、49% (ORL11)、56% (OR6)であり、薬剤併用後のルシフェラーゼ活性は24% (ORL8)、19% (ORL11)、31% (OR6)に低下していた。単剤処理の結果から併用による相加効果の場合の予想値は22% (ORL8)、20% (ORL11)、38% (OR6)であった。OR6細胞アッセイ系では予想値より20%弱低い値であったが、他の細胞アッセイ系の結果を合わせて考えると相加効果であると考えられた。【０１４６】
(iv) IFN−αとリバビリンとの併用
結果を図３７に示す。ただし、IFN−αについては0.25 IU/ml (ORL8細胞では35%、ORL11細胞では55%、OR6細胞では70%に低下すると予想される濃度)、リバビリンについては12.5 μM (ORL8細胞では40%、ORL11細胞では60%に低下し、OR6細胞では低下しないと予想される濃度)と固定した条件下にて併用効果を検討した。その結果、IFN−α単剤処理後のルシフェラーゼ活性は26% (ORL8)、48% (ORL11)、75% (OR6)、リバビリンについては、35% (ORL8)、49% (ORL11)、97% (OR6)であり、薬剤併用後のルシフェラーゼ活性は11% (ORL8)、28% (ORL11)、80% (OR6)に低下していた。単剤処理の結果から併用による相加効果の場合の予想値は9% (ORL8)、24% (ORL11)、73% (OR6)であった。これらの細胞アッセイ系での測定値は予想値より若干（9〜18%）高い値であったが、相加効果であると考えられた。【０１４７】
〔６：感染性HCV粒子産生細胞株〕
〔６−１〕OL治癒細胞へのHCV感染
HuH-7細胞由来の細胞を用いた場合において、HCVの生活環を再現し得るのはHCV 2a型由来のJFH1株HCVのみである。今回得られたLi23細胞由来の細胞にHCV生活環の再現を引き起こす能力があるかどうかを検討した。まず、全長HCV RNA複製細胞として得られたOL8細胞およびOL11細胞から作製した治癒細胞において、JFH1株HCV RNAの複製が起こるかどうかを調べた。【０１４８】
2x106個のLi23細胞（親株）、OL8c細胞および OL11c細胞に、JFH1株 HCV RNA 20μgをエレクトロポレーション法にて導入した。導入後、細胞を6 ウエルプレートに移し（それぞれ約４x105個）、24, 48, 72および96時間後に、各細胞内（それぞれのウエル内の細胞の1/20を解析に使用）でのコアタンパク質の発現レベルをWestern blot法により解析した（図３８）。Li23細胞にてコアタンパク質は全く認められなかったが、OL8c細胞にてコアタンパク質は導入24時間後に認められ、48時間後にはさらに発現レベルの増強が観察された。OL11c細胞では導入24時間後には検出されなかったが、48時間以降にコアタンパク質の発現が認められた。このことより、OL8c細胞およびOL11c細胞において、JFH1株のHCV RNAが複製増殖したために起こったことが示唆されており、OL8c細胞およびOL11c細胞はHCV-O株だけでなくJFH1株のHCV RNAの複製を許容し得る細胞であることが示された。【０１４９】
RSc細胞にJFH1株HCVを感染させ、145日間経過した後の上清をウイルス液として用いた。このウイルス液は、1mlあたり105.3TCID50の感染性HCV粒子を含むと予想される。RSc細胞HuH-7細胞由来のクローン化細胞であり、JFH1株HCV RNAを細胞内に導入することにより、効率よくかつ持続的に感染性HCV粒子を産生する（Ariumi et al., JVI 81:13922-13926,2007）。【０１５０】
ウイルス液を、Li23細胞（2 x 104細胞/24ウエル）およびOL8c細胞（2 x 104細胞/24ウエル）に添加し、２時間後に培地を交換した。感染後８日目にそれぞれの細胞内でのコアタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により調べた。培養液を用いたMock実験も並行して行った。アッセイには2 x 104細胞相当を用いた。Li23細胞を用いた場合、コアタンパク質は全く検出されなかったが、OL8c細胞を用いた場合、コアタンパク質の強い発現が認められた（図３９）。このことより、OL8c細胞はJFH1株HCV RNAの複製だけでなくJFH1株HCVの感染も許容し得る細胞であることが示された。【０１５１】
OL8c細胞以外の治癒細胞についてもJFH1株HCVの感染性および増殖性を検討した。Li23、ならびに各種クローン化OL細胞から作製した治癒細胞（OL1c細胞, OL2c細胞, OL3c細胞, OL4c細胞, OL8c細胞, OL11c細胞およびOL14c細胞）を用いて、JFH1株HCVの感染実験を行った。感染後１６日目の各細胞内におけるコアタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により調べた。Li23細胞を用いた場合、コアタンパク質は全く検出されなかったが、OL8c細胞を用いた場合、感染後１６日目においてもコアタンパク質の強い発現が認められた（図４０）。このことは、感染後の細胞内で持続的なHCV RNAの複製が起こっていることを示唆する。OL8c細胞以外では、OL2c細胞、OL3c細胞およびOL11c細胞でOL8c細胞と同程度のコアタンパク質の発現が認められ、OL14c細胞では弱い発現が確認された。しかしながら、OL1c細胞およびOL4c細胞ではコアタンパク質はまったく検出されなかった。このような細胞クローンによる違いは、細胞内の全長HCV RNAの量（HCV-O株のHCV RNAの複製レベル）との相関がないことから、HCVの感染のstepにおける許容性の違いか、またはHCV株の違いに基づく複製効率の違いかによる可能性がある。【０１５２】
〔６−２〕OL治癒細胞からの感染性HCV粒子の産生
JFH1株HCVを感染させたOL8c細胞およびOL11c細胞から感染性HCV粒子が産生されているかどうかを検討した。なお、細胞へのウイルス液の添加２時間後に培地交換することによって感染を行った（図４１）。【０１５３】
感染７日後のOL8c細胞およびOL11c細胞（それぞれ2 x 104細胞／24ウエル）の培養上清（それぞれ 100 μl：図のIF1）をOL8c細胞およびOL11c細胞（それぞれ2 x 104細胞／24ウエル）に感染させた。感染後８日目の各細胞（図のIF2d8）について、細胞内のコアタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した。結果をレーン１〜４に示す。OL8c細胞およびOL11c細胞内にコアタンパク質は検出されず、OL8c細胞およびOL11c細胞からの感染性HCV粒子の産生は確認されなかった。【０１５４】
さらに、感染７日後のOL8c細胞およびOL11c細胞（それぞれ2 x 104細胞／24ウエル）の培養上清（それぞれ 100 μl：図のIF1）をRSc細胞（2 x 104細胞／24ウエル）に感染させた。感染後７日目の培養上清（100 μl：図のIF2）を別途調製したOL8c細胞およびOL11c細胞(それぞれ2 x 104細胞／24ウエル) に感染させた。感染後８日目の各細胞（図のIF3d8）について、細胞内のコアタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した。結果をレーン５〜８に示した。OL8c細胞およびOL11c細胞内にコアタンパク質が検出された。この結果から、わずかではあるがOL8c細胞およびOL11c細胞から感染性HCV粒子が産生され、RSc細胞を介して、感染性HCV粒子の産生増幅が起こったことが示唆された。【０１５５】
わずかではあるがOL8c細胞およびOL11c細胞から感染性HCV粒子が産生されていることが示唆されたことから、HCV感染させた後２７日間培養を継続させた後にウエスタンブロット解析を行った。【０１５６】
感染７日後のOL8c細胞およびOL11c細胞（それぞれ2 x 104細胞／24ウエル）の培養上清（それぞれ 100 μl：図のIF1）をOL8c細胞およびOL11c細胞（それぞれ2 x 104細胞／24ウエル）に感染させた。HCV産生細胞のコントロールとしてLi23細胞上清または培養液を用いたMock実験も同時に行った（図４２）。感染後２７日目の各細胞（図のIF2d27）について、細胞内のコアタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した。JFH1株HCVを感染させたOL8c細胞およびOL11c細胞の培養上清をRSc細胞に感染させた場合、細胞内のコアタンパク質の発現レベルは非常に多くなることがわかった。このことから、RSc細胞を介して感染性HCV粒子が増殖していると考えられる。【０１５７】
また、JFH1株HCVを感染させたORL8c細胞由来の培養上清をOL8c細胞に再度感染させた場合にのみ、感染２７日後にコアタンパク質がウエスタンブロット解析で検出されるレベルに蓄積した。この事実は、JFH1株HCVがOL8c細胞に感染して複製増殖後に感染性粒子として再び産生され、その感染性粒子が再びOL8c細胞に感染して細胞内で複製増殖を起こすという、いわゆるHCVの生活環がOL8c細胞で達成されたことを示す。【０１５８】
〔６−３〕ORL治癒細胞株の作製
OL8c細胞はHCVの生活環の再現を引き起こす能力のある細胞であることが示されたが、RSc細胞などと比較するとその能力は非常に弱い。また、実用面において、実験に時間を要するという難点がある。そこで、HCV RNAの複製環境という点でOL8c細胞またはOL11c細胞より優れていると考えられるORL8c細胞またはORL11c細胞を、ORL8細胞およびORL11細胞に対してG418非存在下でIFN−γ(103IU/μl)を添加して作製した。【０１５９】
5x105個程度のORL8細胞およびORL11細胞を外径10 cmのディッシュに播種し、IFN−γ (1000 IU/ml)を４日ごとに３回添加した。細胞がディッシュに一杯になった場合には適時継代した。３回目のIFN−γ添加後の継代時に細胞を２群のディッシュに分け、１群には培地にG418 (0.3 mg/ml)およびNaHCO3(0.15%)を添加した。もう１群のシャーレには培地のみで培養を継続した。その後、必要に応じて継代しながら、両群にIFN−γをさらに３回添加した後、CBB染色を行った。その結果、G418を添加しない培地で培養した細胞はディッシュ一杯に増殖した（治癒細胞）。しかし、G418を加えた培地で培養を続けた場合は、細胞が完全に死滅した（図４３）。【０１６０】
〔６−４〕ORL治癒細胞からの感染性HCV粒子の産生
作製した治癒細胞（ORL8c細胞またはORL11c細胞）をJFH1株HCVの感染実験に使用し、HCV粒子産生能力を検討した。上述したように、コントロールに用いたRSc細胞は、HuH-7細胞由来のクローン化細胞であり、JFH1株HCV RNAを細胞内に導入することにより、効率よくかつ持続的に感染性HCV粒子を産生する（Ariumi et al., JVI 81:13922-13926,2007）。【０１６１】
感染７日後のRSc細胞、ORL8c細胞およびORL11c細胞（それぞれ2 x 104細胞（ORL11c細胞のみ3 x 104細胞）／24ウエル）の培養上清（それぞれ 100 μl）を、別途調製したRSc細胞（2 x 104細胞／24ウエル）に感染させた。培養液を用いたMock実験も同時に行った。感染７日目および１４日目の細胞（それぞれ、図のIF2d7およびIF2d14）について、細胞内のコアタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した（図４４のレーン１〜４）。コアタンパク質の発現レベルは、レーン２、３および４でほぼ同程度であることがわかった。このように、JFH1株HCVを感染させたRSc、ORL8cおよびORL11c細胞から産生される感染性HCV量はほぼ同じであり、ORL8c細胞およびORL11c細胞はOL8c細胞およびOL11c細胞よりも感染性HCVの産生能力が高く、HuH-7細胞由来のRSc細胞に匹敵することがわかった。【０１６２】
感染７日後のRSc細胞およびORL8c細胞（それぞれ2 x 104細胞／24ウエル）の培養上清（それぞれ 100 μl）を、別途調製したORL8c細胞（2 x 104細胞／24ウエル）に感染させた。培養液を用いたMock実験も同時に行った。感染７日目、１４日目、２１日目および３０日目の細胞（それぞれ、図のIF2d7、IF2d14、IF2d21およびIF2d30）について、細胞内のコアタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した（図４４のレーン５〜７）。RSc細胞から産生されたHCVを感染させたORL8c細胞にて生成されるコアタンパク質量は、感染後７日目で最大となり、２１日目まではある程度維持されるが、３０日目で低下してしまうことがわかった（レーン６）。一方、ORL8c細胞から産生されたHCVを感染させたORL8c細胞にて生成されるコアタンパク質量は、感染後７日目でかなりのレベルの発現が認められ、この発現レベルは経時的に上昇し、３０日目においても７日目よりも高いレベルで維持されていることがわかった（レーン７）。これらの結果から、ORL8c細胞で産生されたHCVは、ORL8c細胞に再感染して少なくとも１ヶ月間はHCVの産生が維持されていることが示唆される。ORL8c細胞の親細胞にあたるOL8c細胞と比較して、ORL8c細胞は、感染性HCV粒子産生能において格段に優れていることが明らかとなり、ORL8c細胞はHuH-7細胞由来のRSc細胞と比較しても遜色ないHCV産生能を有することがわかった。【０１６３】
感染７日後のRSc細胞およびORL11c細胞（それぞれ2 x 104細胞または3 x 104細胞／24ウエル）の培養上清（それぞれ 100 μl）を、別途調製したORL11c細胞（3 x 104細胞／24ウエル）に感染させた。培養液を用いたMock実験も同時に行った。感染７日目、１４日目、２１日目および３０日目の細胞（それぞれ、図のIF2d7、IF2d14、IF2d21およびIF2d30）について、細胞内のコアタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した（図４４のレーン８〜１０）。RSc細胞から産生されたHCVを感染させたORL11c細胞にて生成されるコアタンパク質量は、ORL8c細胞にて生成させた場合と同様に、感染後７日目で最大となり、２１日目まではある程度維持されるが、３０日目で低下してしまうことがわかった（レーン９）。一方、ORL11c細胞から産生されたHCVを感染させたORL11c細胞において、コアタンパク質は生成されなかった（レーン１０）。これらの結果から、ORL11c細胞はORL8c細胞と異なり、RSc細胞から産生されるHCVの感染および増殖は許容するものの、ORL11c細胞から産生されるHCVのORL11c細胞への再感染および増殖を許容し得ないことがわかった。【０１６４】
〔６−５〕ORL治癒細胞におけるHCV RNAの複製レベル
続いて、JFH-1株HCVが感染したORL8c細胞（IF2d7）においてHCV RNAの複製中間体である二本鎖RNA（dsRNA）を検出するために、上述した手順に従って、抗dsRNA抗体を用いた免疫蛍光法によってORL8c細胞を観察した。陽性コントロールとしてJFH-1株HCV感染RSc細胞、陰性コントロールとして模擬感染（Mock infection）させたORL8c細胞を用いた。共焦点レーザー走査顕微鏡を用いた観察結果を図４５に示す（図中、バーの長さは20μmである。）。【０１６５】
図に示すようにHCV感染したORL8c細胞とRSc細胞の細胞質にドット状の蛍光が散在していることがわかった。このような蛍光は、模擬感染させたORL8c細胞内には全く観察されなかった。これらのことより、ORL8c細胞においてdsRNA（HCV RNAの複製中間体）が特異的に検出されたと考えられる。なお、ORL8c細胞内で観察された蛍光強度はRSc細胞のものに匹敵することから、図４６（ｂ）にて示すようにORL8c細胞内におけるHCV RNAの複製レベルはRSc細胞とほとんど変わらないことが示唆された。【０１６６】
さらに、ORL8c細胞およびRSc細胞におけるHCV複製レベルを比較した。図４４と同時期（感染７日目、１４日目、２１日目および３０日目（それぞれ、図のIF2d7、IF2d14、IF2d21およびIF2d30））におけるORL8c細胞およびRSc細胞の培養上清中に放出されるHCV粒子を検出／定量するために、JFH-1株HCVを感染させたORL8c細胞とRSc細胞の培養上清中（IF2d7、IF2d14、IF2d22）のHCVコアタンパク質の分泌量をELISA法により測定した（三菱ビーシーエルにて測定）。実験はそれぞれ３回行い、上清１mlを測定に用いた（図４６（ａ））。【０１６７】
図に示すように、培養上清中に放出されるHCV粒子の量は、RSc細胞の場合、感染７日目で105fmol/L以上に達し、それ以降は変化なしまたはやや減少であった。一方、ORL8c細胞の場合、感染７日目では102 fmol/Lと低かったが、感染１４日目には104fmol/Lとなり、その後感染２２日目までそのレベルを維持した。全体としては、ORL8c細胞におけるHCV粒子産生能力はRSc細胞よりも１桁低いことが判明したが、種々のウイルスの性状解析に用いるには充分なレベルであることがわかった。【０１６８】
さらに、これらの細胞について、上述したリアルタイムLightCycler PCRの手順に従ってHCV RNAの定量を行った。実験をそれぞれ３回行った（図４６（ｂ））。RSc細胞の場合は、培養上清中へのコアタンパク質の放出レベルと同様に、感染７日目で１０８コピー／μｇ総RNAに達し、それ以降感染２２日目までほぼ同レベルに維持された。一方、ORL8c細胞では感染７日目では５×１０５コピー／μｇ総RNA程度であったが、感染１４日目では５×１０７コピー／μｇ総RNA程度に達し、２２日目までそのレベルは維持されていた。これらの結果から、両方の細胞内においてHCV RNAの高い複製レベルが維持されていることがわかった。【０１６９】
〔６−６〕HCV受容体の発現レベルとHCV粒子産生能力との相関性
続いて、種々の細胞におけるHCV受容体の発現レベルを比較するために、mRNAの発現レベルをRT-PCR法および定量的RT-PCR法を行った。【０１７０】
HuH-7細胞、RSc細胞、Li23細胞、ORL8c細胞およびORL11c細胞を10cmプレート（培地10ml）にて培養した。これらの細胞から、RNeasy Mini Kit（Qiagen社）を用いて、添付の実験説明書に従って総RNAを抽出した。２μｇのRNAを鋳型として、SuperScriptTMII逆転写酵素（Invitrogen社）およびオリゴdT（Invitrogen社）を用いて、添付の実験説明書に従って逆転写反応（RT）を行った。得られたcDNAを鋳型として、表３に示すプライマーセットを用いてPCRを行い、3%アガロースゲル電気泳動後のエチジウムブロマイド染色によりPCR増幅産物を検出した。【０１７１】
【表３】
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【０１７２】
その結果、検出したバンドには多少の濃淡があるものの、HCV受容体と報告されているCD81、SR-B1、CLDN1(Claudin-1) およびOCLN（Occludin）が、内部コントロールとしてのGAPDHとともに、いずれの細胞にも発現されていることが確認された（図４７（ａ））。なお、これらのHCV受容体については、Burlone M.E. and Budkowska A. Hepatitis C virus cell entry: role of lipoproteins and cellular receptor. Journal of General Virology 90, 1055-1070 (2009)を参照のこと。【０１７３】
また、上記cDNAを用いて、上述したリアルタイムLightCycler PCRの手順に従ってHCV RNAの定量を行った。その結果、図４７（ａ）に示した定性実験の結果と同様に、いずれの細胞においてもHCV受容体の発現が認められ、RSc細胞と比較してもORL8c細胞でのみ発現レベルが低くなっているHCV受容体は存在しないこと、さらには、CLDN1やOCLNではORL8c細胞での発現レベルがRSc細胞と比較して高くなっていることがわかった（図４７（ｂ））。【０１７４】
〔６−７〕HCV-0株以外のHCV株に由来する全長HCV RNA複製細胞株の樹立
ORL8c細胞は、ルシフェラーゼ遺伝子を有するHCV-O株由来全長HCV RNAを複製し得る細胞を、IFN−γで処理してHCV RNAを排除した治癒細胞である。よって、ORL8c細胞を用いれば、HCV-O株以外のHCV株に由来する全長HCV RNAを複製し得る細胞株を樹立し得る可能性がある。【０１７５】
HCVキャリアー株である1B-4（1b遺伝子型）および急性肝炎患者由来のHCV株であるKAH5（1b遺伝子型）から作製したplasmid (それぞれp1B-4RN/C-5BおよびpKAH5RN/C-5B)をそれぞれ鋳型としてin vitroで合成した、ルシフェラーゼ遺伝子を有する全長HCV RNA（10 μg）を、2 x 106個のORL8c細胞にエレクロトポレーション法により導入した。p1B-4RN/C-5Bには２カ所の変異（Q1067RおよびS2200R）が導入されており、pKAH5RN/C-5Bには４カ所の変異（Ins2040K（HCVポリプロテインの2040番目にリジンが挿入されている）、R2328Q、E2401G、V2416A）が導入されている。S2200RおよびIns2040Kは適応変異として知られている。RNA導入２日後から、4日ごとにG418(0.3 mg/ml)を含む培地と交換して、３週間程度培養した。ルシフェラーゼ遺伝子を有する全長HCV RNAの複製が持続的に高いレベルにあると考えられる細胞をG418耐性コロニー（クローン）として得た。これらのクローンからHCV RNAの複製レベルが高い細胞クローンを選択する目的で、コアタンパク質およびNS5Aタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した（図４８）。陽性コントロール（図中のPC）としてHCV-O株由来の全長HCV RNA（４種類の適応変異を有する）が効率よく複製しているOR6c細胞由来の細胞を用いた。【０１７６】
図４８（ａ）に示すように、1B-4株については、クローン＃２においてHCVタンパク質が最も多く発現していた。この細胞クローン＃２を増殖させかつ株化した（1B-4RL8細胞と称する。）。図４８（ｂ）に示すように、KAH5株については、クローン＃１１においてHCVタンパク質が最も多く発現していた。この細胞クローン＃１１を増殖させかつ株化した（KAH5RL8細胞と称する。）。【０１７７】
得られた1B-4RL8細胞およびKAH5RL8細胞において、ルシフェラーゼ活性とHCV RNA量との間に相関関係があるかどうかを検討した（図４９）。左は、1B-4RL8細胞およびKAH5RL8細胞（それぞれ2 x 104個の細胞を24ウエルプレートに播種して２日間培養）にIFN−α 0, 1, 10, 100 IU/mlを添加して24時間後にルシフェラーゼ活性を測定したものである。各点に関して少なくとも３ウエル実施し、SD値を図に付加した。100%の実測値として、1B-4RL8細胞およびKAH5RL8細胞の両方で30 万という値を得た。ORL8細胞およびORL11細胞（図１４）と比較すると若干低い値ではあるが、薬剤の抗HCV効果を解析するに十分な値である。右は、1B-4RL8細胞およびKAH5RL8細胞（それぞれ2 x 105個の細胞を6ウエルプレートに播種し２日間培養）にIFN−α 0, 1, 10, 100 IU/mlを添加して24時間後にHCV RNAをLightCyclerPCRにより定量的に測定したものである。各点に関して少なくとも３ウエル実施し、SD値を図に付加した。図に示すように、ルシフェラーゼ活性とHCV RNA量とはIFN−αの濃度に依存して減少した。【０１７８】
両測定法による結果は、OR6細胞で得られた結果と同様に良好な相関性を示していた。このように、1B-4RL8細胞およびKAH5RL8細胞は、簡便なルシフェラーゼアッセイを用いてHCV RNAの複製レベルを定量できる有用な細胞であり、それぞれ1B-4株HCVおよびKAH5株HCVに対する抗HCV剤の活性評価を行うための良いアッセイ系となり得ることが示された。すなわち、ORL8c細胞は感染性JFH１株HCVの産生能力ばかりでなく、新しいHCV株のHCV RNA複製（特にルシフェラーゼ遺伝子を有するような12 kb と本来のHCV RNA (9.6 kb)より長いRNAの複製）を許容し得る細胞といえる。【０１７９】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。【０１８０】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１８１】
本発明を用いれば、HuH-7細胞株以外の細胞株に由来するHCV生活環再現システムを構築することができる。また、既知のHuH-7細胞株に由来するHCV生活環再現システムと組み合わせて用いることにより、これまで抗HCV作用を有する物質として知られていたものを検証するだけでなく、抗HCV作用を有していないと考えられていた物質の抗HCV作用を見出すことができる。このように、本発明を用いれば、抗HCV作用を有する物質のスクリーニング方法、さらにＣ型肝炎治療薬を提供できるので、試薬産業、医薬品産業などの発展に貢献することができる。
【図１（ａ）】
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【図１（ｂ）】
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【図１（ｃ）】
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【図１（ｄ）】
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【図１（ｅ）】
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【図２】
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【図４】
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【図８】
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【図１０（ａ）】
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【図１０（ｂ）】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図４６（ａ）】
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【図４６（ｂ）】
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【図４７（ｂ）】
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【図４９】
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【図３（ａ）】
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【図３（ｂ）】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１３】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４７（ａ）】
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【図４８（ａ）】
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【図４８（ｂ）】
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【配列表】
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