(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
原発不明転移の原発巣を同定する方法において、
ａ．転移性細胞を含むサンプル中におけるがんに関連するバイオマーカーを評価するステップであって、前記バイオマーカーは、マーカー遺伝子の発現量であり、前記マーカー遺伝子は、
ｉ．肺がんのマーカーである、ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦおよびＤＳＧ３；
ｉｉ．すい臓がんのマーカーである、Ｆ５およびＰＳＣＡ；
ｉｉｉ．結腸がんのマーカーである、ＣＤＨ１７；
ｉｖ．前立腺がんのマーカーである、ＫＬＫ３；
ｖ．乳がんのマーカーである、ＭＧおよびＰＤＥＦ；ならびに、
ｖｉ．卵巣がんのマーカーである、ＷＴ１；
からなる、
ステップと、
ｂ．前記バイオマーカーから得られたデータを組み合わせて、あるアルゴリズムにするステップであって、前記アルゴリズムは、
ｉ．前記バイオマーカーを基準に対して標準化し、
ｉｉ．各々のバイオマーカーの感受性および特異性を最適化するカットオフを課し、前記がんに係る罹患率を加重し、原発巣組織を選択する、
ステップと、
ｃ．前記アルゴリズムによって決定された最も高い確率に基づいて原発巣を決定するか、もしくは、前記がんが特定のがん群に由来しないことを決定するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
１またはそれ以上の、更なる別のがんに対し特異的なバイオマーカーを評価し、その追加されたバイオマーカーについて、前記ｂ．およびｃ．のステップを繰り返すことを更に含む、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法において、
遺伝子発現は、配列番号１１〜５８のうちの少なくとも１個の配列を用いて、評価される、方法。
【請求項４】
請求項１もしくは２に記載の方法において、
がんの原発巣を決定するために、転移部位を含む、更なる臨床情報をさらに得るステップ、
を含む、方法。
【請求項５】
請求項１もしくは２に記載の方法において、
前記サンプル中で構成的に発現した少なくとも１つの遺伝子の発現を評価することを更に含む、方法。
【請求項６】
バイオマーカーを発見する方法において、
特定の転移におけるマーカー遺伝子の発現量を決定することと、
前記マーカー遺伝子の発現を決定するために前記マーカー遺伝子に対するバイオマーカーを評価することと、
請求項１に記載の方法にしたがって、前記転移の原発巣を同定することと、
前記マーカー遺伝子が原発腫瘍に対して効果的に特異的であるかどうかを決定することと、
を含む、方法。
【請求項７】
プローブの使用において、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法において、配列番号１１〜５８から選ばれる、少なくとも１個の単離された配列を含む、プローブの使用。
【請求項８】
請求項１または２に記載の方法にしたがって解析を実施するためのキットにおいて、
請求項１または２に係るマーカー遺伝子に対しハイブリダイズする遺伝子を含む、キット。
【請求項９】
請求項８に記載のキットにおいて、
前記遺伝子が、ＲＮＡ，ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである、キット。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法における、請求項８または９に記載のキットの使用。
【請求項１１】
マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップにおいて、
請求項１または２に係るマーカー遺伝子に対しハイブリダイズする遺伝子を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法を実行するための、マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップ。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、原発不明がん(carcinoma of unknown primary origin)の原発巣を同定するための材料、方法、アルゴリズム、キット等を提供する。
【０００２】
〔発明の背景〕
原発不明がん（ＣＵＰ）は、異種の、生検によって確認される悪性腫瘍の群であり、転移性の疾患が、同定可能な原発腫瘍部位、すなわち原発巣組織(tissue of origin)（ＴｏＯ）なしで現れるものである。この問題は、すべてのがんのおよそ３〜５％に該当し、原発不明がんを七番目に一般的な悪性腫瘍にしている。Ghosh他（２００５年）；および、Mintzer他（２００４年）参照。患者の予後診断および治療方法は、原発腫瘍の原因次第であり、そのため、原発腫瘍部位を同定する必要性が強調されている。Greco他（２００４年）；Lembersky他（１９９６年）；および、Schlag他（１９９４年）参照。
【０００３】
さまざまな方法が、現在この問題を解決するために用いられている。以下に述べるいくつかの方法を、図１〜図２に示す。血清腫瘍マーカーは、鑑別診断に用いることができる。そのマーカーは十分な特異性を欠いているが、病理学上および臨床上の情報と組み合わせて用いることができる。Ghosh他（２００５年）参照。免疫組織化学的(immunohistochemical)（ＩＨＣ）方法は、腫瘍系統を同定するために用いることができるが、１００％特異的であるＩＨＣマーカーはほとんどない。それゆえに、病理学者はしばしばＩＨＣマーカーパネルを用いている。いくつかの研究が、４〜１４個のＩＨＣマーカーを用いて、６６〜８８％の確度を示してきた。Brown他（１９９７年）；De Young他（２０００年）；および、Dennis他（２００５年ａ）参照。さらに高額な精密診断としては、画像検査法［例えば、胸部Ｘ線、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン(computed tomographic scan)、および、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）スキャン(positron emission tomographic scan)］を含む。これらの方法の各々が、３０〜５０％の症例で原発腫瘍を同定できる。Ghosh他（２００５年）；および、Pavlidis他（２００３年）参照。これらの高度な技術にもかかわらず、ＣＵＰ症例を治療できるのは、死亡前に２０〜３０％のみである。Pavlidis他（２００３年）；および、Varadhachary他（２００４年）参照。
【０００４】
期待できる新しいアプローチは、腫瘍の原発巣を同定するための、ゲノム規模での遺伝子発現プロファイル解析(genome-wide gene expression profiling)の能力にある。Ma他（２００６年）；Dennis他（２００５年ｂ）；Su他（２００１年）；Ramaswamy他（２００１年）；Bloom他（２００４年）；Giordano他（２００１年）；および、米国特許出願公開第２００６００９４０３５号参照。これらの研究は、遺伝子発現プロファイルに基づいて原発巣組織を同定することの実現可能性を示した。これらの遺伝子発現プロファイル解析技術が臨床環境条件で役立つためには、２つの主な障害が克服されなければならない。第一に、遺伝子発現プロファイル解析はもっぱら原発組織(primary tissue)に対して実施されるため、遺伝子マーカー候補は、それらの組織特異的発現が転移で維持されるということ確かめるために、転移性組織(metastatic tissue)上で確認されなければならない。第二に、遺伝子発現プロファイル解析技術は、ホルマリン固定されパラフィン包埋された(formalin-fixed, paraffin-embedded)（ＦＦＰＥ）組織を利用することができなければならない。これは固定された組織サンプルが、現在の研究では標準的な材料であるからである。ホルマリン固定では結果的にＲＮＡの分解が起こるため［Lewis他（２００１年）；およびMasuda他（１９９９年）参照］、現行のマイクロアレイプロトコル(microarray protocols)は確実には機能しないであろう。Bibikova他（２００４年）参照。加えて、そのプロファイル解析技術は、強固で、再現性があり、そして容易に利用可能でなければならない。
【０００５】
定量ＲＴＰＣＲ（定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）法（ｑＲＴＰＣＲ）は、ＦＦＰＥ組織から信頼性の高い結果を生ずるということを示してきた。Abrahamsen他（２００３年）；Specht他（２００１年）；Godfrey他（２０００年）；Cronin他（２００４年）参照。そのため、より実際的なアプローチは、ゲノム規模の方法を発見手段として用い、より強固な技術に基づく診断分析を開発することであろう。Ramaswamy（２００４年）参照。しかし、このパラダイムには、より少ない数の遺伝子の群を開発することが必要である。Oienと同僚は、遺伝子発現連続分析（ＳＡＧＥ）法(serial analysis of gene expression)を用いて６１個の腫瘍マーカーを同定し、それらのマーカーから、５つの腫瘍の種類に対して１１個の遺伝子に基づくＲＴＰＣＲ法を開発した。Dennis他（２００２年）参照。ＳＡＧＥ法とｑＲＴＰＣＲ法を組み合わせたその他の研究では、４つの腫瘍の種類に対して５個の遺伝子のパネルを開発し、８１％の確度を達成した。Buckhaults他（２００３年）参照。より最近の研究では、マイクロアレイプロファイル解析をｑＲＴＰＣＲ法と組み合わせたものがあるが、７９個のマーカーが用いられた。Tothill他（２００５年）参照。
【０００６】
〔発明の概要〕
本発明は、原発不明転移(metastasis of unknown origin)の原発巣を同定する方法を提供する。その方法は、転移性細胞を含むサンプルを入手し；少なくとも２つの異なるがん(carcinoma)に関連するバイオマーカー(biomarker)を評価し；バイオマーカーから得られたデータを組み合わせて、あるアルゴリズムにして（そのアルゴリズムは、基準に対してバイオマーカーを標準化し；そして、各々のバイオマーカーの感受性と特異性を最適化させるカットオフを課し、それらのがんの罹患率を加重し、原発巣組織を選択する）；そのアルゴリズムによって決定された最も高い確率に基づいて原発巣を決定するか、もしくは、そのがんが特定のがん集団に由来しないことを決定し；そして、任意に、１個以上の更なる、異なるがんに特異的なバイオマーカーを評価し、必要に応じて更なるバイオマーカーに対してステップを反復する；ことによる。
【０００７】
〔図面の簡潔な説明〕
図１は、原発不明転移の原発巣を同定する先行技術方法の図である。
図２は、原発不明転移の原発巣を同定する先行技術方法の図である。
図３は、本発明に係るＣＵＰ診断アルゴリズムの図である。
図４は、組織パネルにおける２個の遺伝子の発現強度を示しているマイクロアレイデータの図である。（Ａ）前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、（Ｂ）凝固第５因子（Ｆ５）である。棒グラフは、Ｙ軸に強度、Ｘ軸に組織を表している。Panc Caはすい臓がん；Panc Nは正常なすい臓である。
図５は、Agilent Bioanalyzerから得られた電気泳動図である。ＲＮＡを、３時間（Ａ）、もしくは、１６時間（Ｂ）のタンパク質分解酵素Ｋの消化により、ＦＦＰＥ組織から単離した。サンプルＣ２２（赤色）は１年前のブロックであり、サンプルＣ２３（青色）は５年前のブロックである。大きさを示すラダー(size ladder)を緑色で示す。
【０００８】
図６は、異なる３つのｑＲＴＰＣＲ法から得られたＣｔ値の比較の図である。それらのｑＲＴＰＣＲ法とは、ｃＤＮＡを生成するｑＰＣＲが後に続く、逆転写におけるランダムヘキサマープライミング(random hexamer priming)（ＲＨ２段階）；ｃＤＮＡを生成するｑＰＣＲが後に続く、逆転写における遺伝子特異的（リバースプライマー）プライミング（ＧＳＰ２段階）；または、１段階反応の遺伝子特異的プライミングとｑＲＴＰＣＲ（ＧＳＰ１段階）；である。１１個のサンプル由来のＲＮＡを３つの方法に分割し、３個の遺伝子［βアクチン（Ａ）；ＨＵＭＳＰＢ（Ｂ）；および、ＴＴＦ（Ｃ）］に対するＲＮＡ量を測定した。各方法で得られたＣｔ値の中央値を実線で示す。
図７は、ＣＵＰ解析プレートの図である。
図８は、ＲＮＡ濃度範囲に渡る解析性能を示した一連のグラフである。
図９Ａは、実験作業の流れ（マーカー候補の指定および確認）の図である。
図９Ｂは、実験作業の流れ（解析の最適化、ならびに、予測アルゴリズムの構築および試験）の図解を示す。
図１０は、ＦＦＰＥ転移性がんおよび前立腺原発性腺がんにおける、選ばれた１０個の組織特異的遺伝子マーカー候補の発現の図である。各図表について、Ｘ軸は正規化マーカー発現値を表す。
【０００９】
図１１は、解析の最適化の図である。（Ａ）および（Ｂ）はAgilent Bioanalyzerから得られた電気泳動図である。ＲＮＡを、３時間（Ａ）、もしくは、１６時間（Ｂ）のタンパク質分解酵素Ｋの消化により、ＦＦＰＥ組織から単離した。サンプルＣ２２（赤色）は１年前のブロックであり、サンプルＣ２３（青色）は５年前のブロックである。大きさを示すラダーを緑色で示す。（Ｃ）および（Ｄ）は異なる３つのｑＲＴＰＣＲ法から得られたＣｔ値の比較の図である。それらのｑＲＴＰＣＲ法とは、ｃＤＮＡを生成するｑＰＣＲが後に続く、逆転写におけるランダムヘキサマープライミング（ＲＨ２段階）；ｃＤＮＡを生成するｑＰＣＲが後に続く、逆転写における遺伝子特異的（リバースプライマー）プライミング（ＧＳＰ２段階）；または、１段階反応の遺伝子特異的プライミングとｑＲＴＰＣＲ（ＧＳＰ１段階）；である。１１個のサンプル由来のＲＮＡを３つの方法に分割し、２個の遺伝子［βアクチン（Ｃ）；ＨＵＭＳＰＢ（Ｄ）］に対するＲＮＡ量を測定した。各方法で得られたＣｔ値の中央値を実線で示す。
図１２は、２３９個のサンプルに係る１０個のマーカーパネルの相対的な発現量を示すヒートマップである。赤色がより高い発現を表す。
【００１０】
〔詳細な説明〕
原発不明の転移性がん（ＣＵＰ）を有する患者の原発部位を同定することは、特異的な治療方法を提供することを可能にし、延命させるかもしれない。マーカー候補はそれから、特異性を決定するために、他のがんの種類から生じた転移で確認されたのと同様に、６つの組織から生じた２０５個のＦＦＰＥ転移性がんで、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(reverse transcriptase polymerase chain reaction)（ＲＴ−ＰＣＲ）によって確認された。１０個の遺伝子特性が選ばれ、これら６つのがんの種類に対する転移性がんの原発巣組織を予測した。次に、ＲＮＡ単離法およびｑＲＴＰＣＲ法はこれらの１０個のマーカーのために最適化され、そして、ｑＲＴＰＣＲ解析は２６０個の転移性腫瘍の群に適用され、全体では７８％の確度を得た。最終的に、４８個の転移性サンプルの独立した群が検査された。重要なことは、この群のうち３７個のサンプルが、既知の原発腫瘍もしくは最初にＣＵＰとして示されたもののどちらかであったが、その後解決され、その解析は７８％の確度を示した。
【００１１】
バイオマーカーとは、示されたマーカー遺伝子の発現量のあらゆるしるし（indicia）である。このしるしは、直接的もしくは間接的でありうるし、そして、生理学上のパラメータを考慮すれば、かつ、体内における対照、正常組織もしくは他のがんと比較して、遺伝子の過剰発現もしくは発現不足を評価することができる。バイオマーカーは、それに限定はされないが、核酸（過剰発現／発現不足および直接的／間接的の両方）を含む。核酸をバイオマーカーとして用いることには、本技術分野において既知のあらゆる方法を含むことができる。その方法とは、それらに限定はされないが、ＤＮＡ増幅、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ヘテロ接合性消失(loss of heterozygosity)（ＬＯＨ）、一塩基多型(single nucleotide polymorphisms)［ＳＮＰｓ、Brookes（１９９９年）参照］、マイクロサテライトＤＮＡ、ＤＮＡ低メチル化、もしくは、ＤＮＡ高メチル化(hypo- or hyper-methylation)を評価することを含む。タンパク質をバイオマーカーとして用いることには、本技術分野において既知のあらゆる方法を含む。その方法とは、それらに限定はされないが、量、活性、修飾［例えば、グリコシル化、リン酸化、ＡＤＰ−リボシル化(ADP-ribosylation)、ユビキチン化(ubiquitination)等］、もしくは、免疫組織化学的手法（ＩＨＣ）を評価することを含む。他のバイオマーカーには、造影マーカー、細胞計数マーカー、および、アポトーシスマーカーを含む。
【００１２】
本明細書において提供する、示された遺伝子は、特定の腫瘍もしくは組織の種類と関連している遺伝子である。１個のマーカー遺伝子は多くの種類のがんと関連しうるが、もしその遺伝子の発現が、本明細書に記載された特定の原発巣特異的なアルゴリズムを用いて同定される１つの腫瘍もしくは組織の種類と十分に関連するならば、その遺伝子を、原発不明がん（ＣＵＰ）の原発巣組織を決定するために、特許請求の範囲に記載された発明において用いることが可能である。本技術分野では、１個以上のがんと関連する数多くの遺伝子が知られている。本発明は、好ましいマーカー遺伝子、および、さらに好ましいマーカー遺伝子の組み合わせを提供する。このことは本明細書中に詳細に記載されている。
【００１３】
「原発巣組織(tissue of origin)」において言及される「原発巣(origin)」とは、特定の医学的状況に応じて、組織の種類（肺、結腸等）、もしくは、組織型［腺がん(adenocarcinoma)、扁平上皮がん(squamous cell carcinoma)、等］のいずれかを意味し、このことは当業者に理解されるであろう。
【００１４】
マーカー遺伝子は、配列を含む場合に、配列番号(SEQ ID NO)によって示されたその配列に対応する。遺伝子部分もしくは遺伝子断片(gene segment or fragment)は、その遺伝子の配列であることを識別するのに十分な、参照された配列もしくはその相補配列の一部分を含む場合に、このような遺伝子の配列に対応する。遺伝子発現産物は、そのＲＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくは、ｃＤＮＡがこのような配列を有する組成物（例えば、プローブ）とハイブリダイズする(hybridizes)場合に、または、ペプチドもしくはタンパク質の場合には、このようなｍＲＮＡによってコードされている場合に、このような配列に対応する。遺伝子発現産物の部分、もしくは、その断片は、その遺伝子もしくは遺伝子発現産物の配列であることを識別するのに十分な、参照された遺伝子発現産物もしくはその補完物の一部分を含む場合に、このような遺伝子もしくは遺伝子発現産物の配列に対応する。
【００１５】
本明細書で説明された、もしくは、特許請求の範囲に記載された、発明に係る方法、組成物、物品、および、キットは、１個以上のマーカー遺伝子を含む。「マーカー」もしくは「マーカー遺伝子」は、本明細書全体を通じて、過剰発現もしくは発現不足が腫瘍もしくは組織の種類と関連している遺伝子に対応する遺伝子、および、遺伝子発現産物について言及するために用いられる。好ましいマーカー遺伝子は、表１において、より詳細に説明されている。
【表１−１】
0005405110.tif 000002
【表１−２】
0005405110.tif 000003
【００１６】
本発明は、原発不明転移の原発巣を同定する方法を提供する。その方法は、転移性細胞を含むサンプルにおいて、少なくとも２つの異なるがんに関連するバイオマーカーを評価し；バイオマーカーから得られたデータを組み合わせ、あるアルゴリズムにして（そのアルゴリズムは、基準に対してバイオマーカーを標準化し；そして、各々のバイオマーカーの感受性と特異性を最適化させるカットオフを課し、それらのがんの罹患率を加重し、原発巣組織を選択する）；そのアルゴリズムによって決定された最も高い確率に基づいて原発巣を決定するか、もしくは、そのがんが特定のがん集団に由来しないことを決定し；そして、任意に、１個以上の更なる、異なるがんに特異的なバイオマーカーを評価し、必要に応じて更なるバイオマーカーに対してステップを反復する；ことによる。
【００１７】
本発明は、原発不明転移の原発巣を同定する方法を提供する。その方法は、転移性細胞を含むサンプルを入手し；少なくとも２つの異なるがんに関連するバイオマーカーを評価し；バイオマーカーから得られたデータを組み合わせ、あるアルゴリズムにして（そのアルゴリズムは、ｉ）バイオマーカーを基準に対して標準化し；ｉｉ）各々のバイオマーカーの感受性と特異性とを最適化させるカットオフを課し、それらのがんの罹患率を加重し、原発巣組織を選択する）；そのアルゴリズムによって決定された最も高い確率に基づいて原発巣を決定するか、もしくはそのがんが特定のがん集団に由来しないことを決定し；そして、任意に、１つ以上の更なる、異なるがんに特異的なバイオマーカーを評価し、その更なるバイオマーカーに対してｃ）およびｄ）のステップを反復する；ことによる。
【００１８】
１つの実施例において、マーカー遺伝子は、ｉ）ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ、ＤＳＧ３、ＫＲＴ６Ｆ、ｐ７３Ｈ、もしくは、ＳＦＴＰＣ；ｉｉ）Ｆ５、ＰＳＣＡ、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、もしくは、ＦＫＢＰ１０；および／または、ｉｉｉ）ＣＤＨ１７、ＣＤＸ１、もしくは、ＦＡＢＰ１；から選択される。好ましくは、マーカー遺伝子は、ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ、ＤＳＧ３、ＫＲＴ６Ｆ、ｐ７３Ｈ、および／もしくは、ＳＦＴＰＣである。より好ましくは、マーカー遺伝子は、ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ、および／もしくは、ＤＳＧ３である。それらのマーカー遺伝子はさらに、ＫＲＴ６Ｆ、ｐ７３Ｈ、および／もしくは、ＳＦＴＰＣを含みうるか、または、ＫＲＴ６Ｆ、ｐ７３Ｈ、および／もしくは、ＳＦＴＰＣと置き換えてもよい。
【００１９】
１つの実施形態において、マーカー遺伝子は、Ｆ５、ＰＳＣＡ、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、および／もしくは、ＦＫＢＰ１０である。より好ましくは、マーカー遺伝子は、Ｆ５、および／もしくは、ＰＳＣＡである。好ましくは、それらのマーカー遺伝子は、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、および／もしくは、ＦＫＢＰ１０を含むことができ、または、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、および／もしくは、ＦＫＢＰ１０と置き換えることができる。
【００２０】
もう１つの実施形態において、マーカー遺伝子は、ＣＤＨ１７、ＣＤＸ１、および／もしくは、ＦＡＢＰ１であり、好ましくは、ＣＤＨ１７である。それらのマーカー遺伝子はさらに、ＣＤＸ１、および／もしくは、ＦＡＢＰ１を含むことができ、または、ＣＤＸ１、および／もしくは、ＦＡＢＰ１と置き換えることができる。
【００２１】
１つの実施形態において、配列番号１１〜５８のうち少なくとも１個の配列を用いて、遺伝子発現を評価する。
【００２２】
本発明はまた、配列番号１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、および／もしくは、５８の単位複製配列(amplicons)のうち、少なくとも１個を生成し、そして、それらを測定することによって、遺伝子発現を評価する方法を含む。
【００２３】
１つの実施形態において、マーカー遺伝子は、以下のマーカーのうち、少なくとも１個のマーカーから選択される性特異的マーカーから選ぶことができる。そのマーカーとは、ｉ）男性患者の場合、ＫＬＫ３、ＫＬＫ２、ＮＧＥＰ、もしくは、ＮＰＹであり；あるいは、ｉｉ）女性患者の場合、ＰＤＥＦ、ＭＧＢ、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−πであり；ならびに／または、ＷＴ１、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２である。好ましくは、マーカー遺伝子は、ＫＬＫ２、もしくは、ＫＬＫ３である。この実施形態において、それらのマーカー遺伝子は、ＮＧＥＰ、および／もしくは、ＮＰＹを含むことができ、または、ＮＧＥＰ、および／もしくは、ＮＰＹと置き換えることができる。１つの実施形態において、マーカー遺伝子は、ＰＤＥＦ、ＭＧＢ、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−πであり、好ましくは、ＰＤＥＦ、および、ＭＧＢである。この実施形態において、それらのマーカー遺伝子は、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−πを含むことができ、または、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−πと置き換えることができる。１つの実施形態において、マーカー遺伝子は、ＷＴ１、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２であり、好ましくは、ＷＴ１である。この実施形態において、それらのマーカー遺伝子は、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２を含むことができ、または、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２と置き換えることができる。
【００２４】
本発明は、以下の方法を提供する。その方法とは、がんの原発巣を決定するために、転移部位を含む、更なる臨床情報を得る方法であり；原発巣がわかっている転移を用いるステップと、その転移のためのバイオマーカーを決定するステップと、そのバイオマーカーを原発不明転移のバイオマーカーと比較するステップとを含む、がんに対して最適なバイオマーカー群を得る方法であり；原発不明転移の原発巣を決定することによって、および、それに対して適切な治療法を特定することによって、診療方針を提示する方法であり；ならびに、原発不明転移の原発巣を決定することによって、および、それに対して対応する予後を特定することによって、予後診断を提示する方法；である。
【００２５】
本発明はさらに、バイオマーカーを発見する方法を提供する。その方法とは、特定の転移におけるマーカー遺伝子の発現量を決定することによって；その発現を決定するためにマーカー遺伝子に対するバイオマーカーを評価することによって；本明細書において提供された方法のいずれか、もしくは、本技術分野において知られている方法のいずれかにしたがって、マーカー遺伝子の発現を分析することによって；および、マーカー遺伝子が原発巣腫瘍に対して効果的に特異的であるかどうか決定することによって；バイオマーカーを発見する方法である。
【００２６】
本発明はさらに、配列番号１１〜５８から選ばれる、少なくとも１個の単離された配列を含む組成物を提供する。本発明はさらに、本明細書において提供された方法にしたがって解析を実施するためのキットであって、バイオマーカー検出試薬(Biomarker detection reagents)をさらに含む、キットを提供する。
【００２７】
本発明はさらに、本明細書に記載された方法を実行するためのマイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップ(gene chips)を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、本明細書に記載されたような遺伝子の組み合わせに係る、単離された核酸配列、それらの相補配列、もしくは、それらの一部を含む、診断上の／予後上のポートフォリオ(portfolios)を提供する。この組み合わせは、異なるがん由来の細胞、もしくは、正常組織由来の細胞と比較して、転移性細胞を有する生物サンプルにおける、遺伝子発現を評価するために、または、その遺伝子発現を特徴付けるのに十分なものである。
【００２９】
本発明において説明されたあらゆる方法は、サンプルにおいて構成的に発現する、少なくとも１個の遺伝子の発現を評価することをさらに含むことができる。
【００３０】
好ましくは、すい臓がんのためのマーカーは、凝固第５因子(coagulation factor V)（Ｆ５）、前立腺幹細胞抗原(prostate stem cell antigen)（ＰＳＣＡ）、インテグリン(integrin)β６（ＩＴＧＢ６）、カリクレイン(kallikrein)１０（ＫＬＫ１０）、クラウジン(claudin)１８（ＣＬＤＮ１８）、トリオアイソフォーム(trio isoform)（ＴＲ１０）、および、ＦＫ５０６結合タンパク質と類似した仮想タンパク質ＦＬＪ２２０４１（ＦＫＢＰ１０）である。好ましくは、Ｆ５、および、ＰＳＣＡのバイオマーカーは、同時に評価する。ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、および、ＦＫＢＰ１０のバイオマーカーは、Ｆ５、および／もしくは、ＰＳＣＡに加えて、または、Ｆ５、および／もしくは、ＰＳＣＡの代わりに、評価することができる。Ｆ５は、例えば、米国特許出願公開第２００４００７６９５５号；同第２００４０００５５６３号；および、国際公開番号ＷＯ２００４０３１４１２号に記載されている。ＰＳＣＡは、例えば、国際公開番号ＷＯ１９９８０４０４０３号；米国特許出願公開第２００３０２３２３５０号；および、国際公開番号ＷＯ２００４０６３３５５号に記載されている。ＩＴＧＢ６は、例えば、国際公開番号ＷＯ２００４０１８９９９号；および、米国特許第６３３９１４８号に記載されている。ＫＬＫ１０は、例えば、国際公開番号ＷＯ２００４０７７０６０号；および、米国特許出願公開第２００３０２３５８２０号に記載されている。ＣＬＤＮ１８は、例えば、国際公開番号ＷＯ２００４０６３３５５号；および、同ＷＯ２００５００５６０１号に記載されている。ＴＲ１０は、例えば、米国特許出願公開第２００２００５５６２７号に記載されている。ＦＫＢＰ１０は、例えば、国際公開番号ＷＯ２００００５５３２０号に記載されている。
【００３１】
好ましくは、結腸がんのためのマーカー遺伝子は、腸管ペプチド関連トランスポーター(intestinal peptide-associated transporter)ＨＰＴ−１（ＣＤＨ１７）、コーダル型ホメオボックス転写因子(caudal type homeo box transcription factor)１（ＣＤＸ１）、および、脂肪酸結合タンパク質(fatty acid binding protein)１（ＦＡＢＰ１）である。好ましくは、ＣＤＨ１７のバイオマーカーは単独で評価される。ＣＤＸ１およびＦＡＢＰ１のバイオマーカーは、ＣＤＨ１７のバイオマーカーに加えて、もしくは、ＣＤＨ１７のバイオマーカーの代わりに評価されることができる。ＣＤＨ１７は、例えば、Takamura他（２００４年）；および、国際公開番号ＷＯ２００４０６３３５５号に記載されている。ＣＤＸ１は、例えば、Pilozzi他（２００４年）；米国特許出願公開第２００５００５９００８号；および、同第２００１００２９０２０号に記載されている。ＦＡＢＰ１は、例えば、Borchers他（１９９７年）；Chan他（１９８５年）；Chen他（１９８６年）；および、Lowe他（１９８５年）により記載されている。
【００３２】
好ましくは、肺がんのためのマーカー遺伝子は、サーファクタントタンパク質(surfactant protein)−Ｂ（ＳＰ−Ｂ）、甲状腺転写因子(thyroid transcription factor)（ＴＴＦ）、デスモグレイン(desmoglein)３（ＤＳＧ３）、ケラチン６アイソフォーム(keratin 6 isoform)６Ｆ（ＫＲＴ６Ｆ）、ｐ５３関連遺伝子（ｐ７３Ｈ）、および、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＦＴＰＣ）である。好ましくは、ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ、および、ＤＳＧ３のバイオマーカーは、同時に評価される。ＫＲＴ６Ｆ、ｐ７３Ｈ、および、ＳＦＴＰＣのバイオマーカーは、ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ、および／もしくは、ＤＳＧ３のバイオマーカーのいずれかに加えて、または、ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ、および／もしくは、ＤＳＧ３のバイオマーカーのいずれかの代わりに評価されることができる。ＳＰ−Ｂは、例えば、Pilot-Mathias他（１９８９年）；米国特許出願公開第２００３０２１９７６０号；および、同第２００３０２３２３５０号に記載されている。ＴＴＦは、例えば、Jones他（２００５年）；米国特許出願公開第２００４０２１９５７５号；国際公開番号ＷＯ１９９８０５６９５３号；同ＷＯ２００２０７３２０４号；米国特許出願公開第２００３０１３８７９３号；および、国際公開番号ＷＯ２００４０６３３５５号に記載されている。ＤＳＧ３は、例えば、Wan他（２００３年）；米国特許出願公開第２００３０２３２３５０号；国際公開番号ＷＯ２００４０３０６１５号；および、同ＷＯ２００２１０１３５７号に記載されている。ＫＲＴ６Ｆは、例えば、Takahashi他（１９９５年）；米国特許出願公開第２００４０１４６８６２号；および、米国特許出願第２００４０２１９５７２号に記載されている。ｐ７３Ｈは、例えば、Senoo他（１９９８年）；および、米国特許出願公開第２００３０１３８７９３号に記載されている。ＳＦＴＰＣは、例えば、Glasser他（１９８８年）により記載されている。
【００３３】
マーカー遺伝子はさらに、性特異的マーカーから選択されることができる。それらの性特異的マーカーとは、例えば、男性患者の場合、ＫＬＫ３、ＫＬＫ２、ＮＧＥＰ、もしくは、ＮＰＹであり；あるいは、女性患者の場合、ＰＤＥＦ、ＭＧＢ、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−π；ならびに／または、ＷＴ１、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２である。
【００３４】
好ましくは、乳がんのためのマーカー遺伝子は、前立腺由来上皮因子(prostate derived epithelial factor)（ＰＤＥＦ）、マンマグロビン(mammaglobin)（ＭＧ）、プロラクチン誘導タンパク質(prolactin-inducible protein)（ＰＩＰ）、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、および、ＧＡＢＡ−πである。好ましくは、ＰＤＥＦ、および、ＭＧのバイオマーカーは、同時に評価される。ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、および、ＧＡＢＡ−πのバイオマーカーは、ＰＤＥＦ、および／もしくは、ＭＧのバイオマーカーに加えて、もしくは、ＰＤＥＦおよび／もしくは、ＭＧのバイオマーカーの代わりに評価されることができる。ＰＤＥＦは、例えば、国際公開番号ＷＯ２００４０３０６１５号；同ＷＯ２０００００６５８９号；同ＷＯ２００１０７３０３２号；Wallace他（２００５年）；Feldman他（２００３年）；および、Oettgen他（２０００年）により記載されている。ＭＧは、例えば、国際公開番号ＷＯ２００４０３０６１５号；米国特許出願公開第２００３０１２４１２８号；Fleming他（２０００年）；Watson他（１９９６年、および、１９９８年）；および、米国特許第５６６８２６７号に記載されている。ＰＩＰは、例えば、Autiero他（２００２年）；Clark他（１９９９年）；Myal他（１９９１年）；および、Murphy他（１９８７年）により記載されている。Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、および、ＧＡＢＡ−πは、Reinholz他（２００５年）により記載されている。ＮＧＥＰは、例えば、Bera他（２００４年）により記載されている。
【００３５】
好ましくは、卵巣がんのためのマーカーは、ウィルムス腫(Wilm's tumor)１（ＷＴ１）、ＰＡＸ８、ステロイド産生急性調節タンパク質(steroidogenic acute regulatory protein)（ＳＴＡＲ）、および、ＥＭＸ２である。好ましくは、ＷＴ１のバイオマーカーを評価する。ＳＴＡＲ、および、ＥＭＸ２のバイオマーカーは、ＷＴ１のバイオマーカーに加えて、もしくは、ＷＴ１のバイオマーカーの代わりに評価されることができる。ＷＴ１は、例えば、米国特許第５３５０８４０号；同第６２３２０７３号；同第６２２５０５１号；米国特許出願公開第２００４０００５５６３号；および、Bentov他（２００３年）により記載されている。ＰＡＸ８は、例えば、米国特許出願公開第２００５００３７０１０号；Poleev他（１９９２年）；Di Palma他（２００３年）；Marques他（２００２年）；Cheung他（２００３年）；Goldstein他（２００２年）；Oji他（２００３年）；Rauscher他（１９９３年）；Zapata-Benavides他（２００２年）；および、Dwight他（２００３年）により記載されている。ＳＴＡＲは、例えば、Gradi他（１９９５年）；および、Kim他（２００３年）により記載されている。ＥＭＸ２は、例えば、Noonan他（２００１年）により記載されている。
【００３６】
好ましくは、前立腺がんのためのマーカーは、ＫＬＫ３、ＫＬＫ２、ＮＧＥＰ、および、ＮＰＹである。好ましくは、ＫＬＫ３のバイオマーカーを評価する。ＫＬＫ２、ＮＧＥＰ、および、ＮＰＹのバイオマーカーは、ＫＬＫ３に加えて、もしくは、ＫＬＫ３の代わりに評価されることができる。ＫＬＫ２、および、ＫＬＫ３は、例えば、Magklara他（２００２年）により記載されている。ＫＬＫ２は、例えば、米国特許出願公開第２００３０２１５８３５号；および、米国特許第５７８６１４８号に記載されている。ＫＬＫ３は、例えば、米国特許第６２６１７６６号に記載されている。
【００３７】
本方法はまた、がんの原発巣を決定するために、転移部位を含んだ、更なる臨床情報を得ることを含むことができる。フロー図を図３に示す。
【００３８】
本発明はさらに、原発巣がわかっている転移を用いることによって；その転移のためのバイオマーカーを決定することによって；および、そのバイオマーカーを原発不明転移のバイオマーカーと比較することによって；がんに対して最適なバイオマーカー群を得るための方法を提供する。
【００３９】
本発明はさらに、本明細書に記載された方法にしたがって、原発不明転移の原発巣を決定することによって、および、その原発巣に対する適切な治療を特定することによって、診療方針を提示するための方法を提供する。
【００４０】
本発明はさらに、本明細書に記載された方法にしたがって、原発不明転移の原発巣を決定することによって、および、その原発巣に対して対応する予後を特定することによって、予後診断を提示するため方法を提供する。
【００４１】
本発明はさらに、特定の転移におけるマーカー遺伝子の発現量を決定すること；そのマーカー遺伝子の発現を決定するためにマーカー遺伝子に対するバイオマーカーを評価すること；本明細書に記載された方法にしたがって、マーカー遺伝子の発現を分析すること；および、マーカー遺伝子が原発巣腫瘍に対して効果的に特異的であるかどうか決定すること；を含むバイオマーカーを発見する方法を提供する。
【００４２】
本発明はさらに、配列番号１１〜５８から選ばれる、少なくとも１個の単離された配列を含む組成物を提供する。
【００４３】
本発明はさらに、本明細書に記載された解析を実施するためのキット、物品、マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップ、診療上の／予後上のポートフォリオ、および、本方法によって得られた結果を報告するための患者報告を提供する。
【００４４】
特定の核酸配列が、組織サンプルに単に存在するかしないかということだけでは、診断上の、もしくは、予後上の価値を持つことはめったにわからなかった。一方、さまざまなタンパク質、ペプチド、もしくは、ｍＲＮＡの発現についての情報は、ますます重要なものとみなされている。ゲノムの中に、タンパク質、ペプチド、もしくは、ｍＲＮＡを発現する可能性を有する核酸配列（このような配列を「遺伝子」というが）が単に存在するということは、それだけでは、タンパク質、ペプチド、もしくは、ｍＲＮＡが所与の細胞において発現するかどうか、決定的なものではない。タンパク質、ペプチド、もしくは、ｍＲＮＡを発現することができる所与の遺伝子が発現するかどうかということ、および、たとえそうであっても、どの程度このような発現が起こるかということは、さまざまな複合的要因によって決定される。これらの要因を理解すること、および、判定することの難しさに関わりなく、遺伝子発現を解析することは、重要な事象（例えば、腫瘍形成、転移、アポトーシス、および、臨床上関連のあるその他の現象）の発生についての有用な情報を提供することができる。遺伝子が活性であるか、もしくは、不活性であるかの程度に係る相対的な指標は、遺伝子発現プロファイルに見出すことができる。本発明の遺伝子発現プロファイルは、ＣＵＰの患者に対して診断を提供するために、および、ＣＵＰの患者を治療するために用いられる。
【００４５】
サンプルの準備には、患者サンプルの収集が必要である。本発明の方法で用いられた患者サンプルは、組織の細針吸引(fine needle aspirate)（ＦＮＡ）により小節から採取された細胞のような、異常細胞を含む疑いがあるサンプルである。生検、もしくは、外科的な標本、および、レイザーキャプチャーマイクロダイセクション(laser capture microdissection)により得られた大量組織標本(bulk tissue preparation)も使用に適している。レイザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）技術は、研究用の細胞を選ぶ１つの方法であり、細胞の種類の不均一性によって生ずるばらつきを最小限にする。その結果、マーカー遺伝子発現における、正常もしくは良性細胞と悪性腫瘍細胞との間の、中程度の、もしくは、小さな変化が容易に検出できる。サンプルはまた、末梢血から抽出された循環系上皮細胞(circulating epithelial cells)も含みうる。これらは多くの方法にしたがって手に入れることができるが、最も好ましい方法は、米国特許第６１３６１８２号に記載された磁気分離法(magnetic separation technique)である。ひとたび目的の細胞を含むサンプルが得られれば、適切なポートフォリオにおける遺伝子のためのバイオマーカーを用いて、遺伝子発現プロファイルが手に入る。
【００４６】
遺伝子発現プロファイルを確立するための好ましい方法は、タンパク質、もしくは、ペプチドをコードしうる遺伝子によって生成されるＲＮＡ量を決定することを含む。このことは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(reverse transcriptase PCR)（ＲＴ−ＰＣＲ）、競合ＲＴ−ＰＣＲ(competitive RT-PCR)、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ディファレンシャルディスプレイＲＴ−ＰＣＲ(differential display RT-PCR)、ノザンブロット分析(Northern Blot analysis)、および、その他の関係した検査法によって達成される。個々のＰＣＲ反応を用いてこれらの技術を実施することが可能であるが、ｍＲＮＡから生成される相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、もしくは、相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を増幅すること、および、マイクロアレイによって分析することが最善である。多くの異なるアレイ配置(array configuration)、および、それらを作製する方法が当業者に知られており、例えば、米国特許第５４４５９３４号；同第５５３２１２８号；同第５５５６７５２号；同第５２４２９７４号；同第５３８４２６１号；同第５４０５７８３号；同第５４１２０８７号；同第５４２４１８６号；同第５４２９８０７号；同第５４３６３２７号；同第５４７２６７２号；同第５５２７６８１号；同第５５２９７５６号；同第５５４５５３１号；同第５５５４５０１号；同第５５６１０７１号；同第５５７１６３９号；同第５５９３８３９号；同第５５９９６９５号；同第５６２４７１１号；同第５６５８７３４号；および、同第５７００６３７号に記載されている。
【００４７】
マイクロアレイ技術は、何千個もの遺伝子の定常状態ｍＲＮＡ量を同時に評価することができ、制御されていない細胞の増殖の開始、停止、あるいは、調節といった効果を特定するための強力な手法を提供することができる。２つのマイクロアレイ技術、すなわち、ｃＤＮＡアレイおよびオリゴヌクレオチドアレイが、現在広く使われている。これらのチップの構造にはちがいがあるけれども、本質的に、すべての下流データの解析、および、それらの出力は同一のものである。これらの解析の成果は、通常、標識プローブから受信されるシグナルの強度の測定値である。標識プローブは、マイクロアレイ上の既知の位置にある核酸配列にハイブリダイズするサンプル由来のｃＤＮＡ配列を検出するために用いられる。通常、シグナルの強度は、サンプル細胞において発現されたｃＤＮＡ、および、ひいてはｍＲＮＡの量に比例する。大変多くのこのような技術が利用可能であり、有用である。遺伝子発現を決定するための好ましい方法は、米国特許第６２７１００２号；同第６２１８１２２号；同第６２１８１１４号；および、同第６００４７５５号に見出すことができる。
【００４８】
発現量の分析は、このようなシグナル強度を比較することによって実施される。このことは、対照サンプルの発現強度に対する試験サンプルでの遺伝子の発現強度の比率行列を生成することによって、最もよく行われる。例えば、罹患組織由来の遺伝子発現強度は、同じ種類の良性組織、もしくは、正常組織から生じた発現強度と比べることができる。これらの発現強度の比率は、試験サンプルと対照サンプルとの間で、遺伝子発現において、倍の変化（fold-change）があることを示している。
【００４９】
選択は統計的検定に基づくことができる。この統計的検定は、腫瘍のもともとの原発巣部位に関係する因子間において、各遺伝子が差異のある発現をすることに対する有意性の証拠と関係した順位付けされた一覧を提出する。このような検定の例には、分散分析(ＡＮＯＶＡ)、および、クラスカル・ウォリス検定(Kruskal-Wallis)が含まれる。順位付けは、このような、カットオフ(cutoff)までの重みの総計を、他の分類以上に１つの分類の利益になるような証拠の優越として解釈するように設計されたモデルにおいて、重みづけ（weightings）として用いることができる。文献に記載されたような従来の証拠も、その重みづけを調整するために用いてもよい。
【００５０】
本発明において、６つの腫瘍の種類間で差異のある発現の有意な証拠を示した１０個のマーカーが選択された。選択過程には、統計的検定、平均分散最適化(mean-variance optimization)、および、専門知識のアドホックな(ad-hoc)収集が含まれた。他の実施形態では、特徴抽出法は、教師あり学習法(supervised learning approaches)を通じて、マーカーの選択および試験をするように自動化することができた。データベースが蓄積されるにつれ、データベースの任意の所与の状態において可能である最も高度な診断確度を生み出すべく、マーカーの選択をくり返すことができる。
【００５１】
好ましい実施形態は、安定した対照群を同定し、この集合をすべてのサンプルにわたってゼロ分散に設定することによって、各測定を標準化することである。解析における系統誤差によって作用され、かつ、この誤差から独立して変化することが知られていない、あらゆる単一の内因性転写産物、もしくは、そのようなあらゆる内因性転写産物の集合として、この対照群は定義される。すべてのマーカーは、対照群のあらゆる記述的統計値（例えば、平均値、もしくは、中央値）に対するゼロ分散、または、直接測定に対するゼロ分散を生ずるサンプル特異的な因子によって調整される。あるいは、系統誤差にのみ関係する対照の分散の前提が真ではなく、しかし標準化が行われた場合に、生ずる分類誤差がより小さくなる場合、対照群はなお、前述のとおり用いられるであろう。非内因性のスパイクコントロール(spike control)もまた役に立ったが、好ましいものではない。
【００５２】
マーカーの選択につづいて、これらの選択された変数は、できるかぎり高度な分類確度を生成するために設計された分類器(classifier)において用いられる。１０個の入力値から原発巣組織を予測するモデルを構築するために、入力測定値の群を予測物（predictors）の出力群と関係させるよう設計された教師あり学習アルゴリズムを用いることができる。その問題は次のように定められる。所与の訓練データ
0005405110.tif 000004
は、分類器
0005405110.tif 000005
を生成する。その分類器は、
0005405110.tif 000006
であるサンプルを、その原発巣組織のラベル
0005405110.tif 000007
へ位置付けする（maps）。予測は以前に解決された症例に基づく。その症例は、データベースに含まれており、ゆえに、訓練群を構成する。
【００５３】
教師あり学習アルゴリズムは、期待される分類誤差を最小にするような、入力変数の既知の出力に対する関係に基づいたパラメータを発見しなければならない。これらのパラメータはそれから、新しいサンプルの入力から原発巣組織を予測するために用いることができる。これらのアルゴリズムの例には、線形分類モデル、二次式分類器(quadratic classifier)、樹状法(tree-based methods)、ニューラルネットワーク(neural networks)、および、プロトタイプ法(prototype methods)［例えば、ｋ近傍法分類器(k-nearest neighbor classifier)、もしくは、学習ベクトル量子化アルゴリズム(learning vector quantization algorithms)］が含まれる。
【００５４】
１０個の標準化されたマーカーをモデル化するための、１つの特異的な実施形態は、デフォルトのパラメータを用いたＬＤＡ法である。このことはVenablesとRipley（２００２年）に記載されている。この方法は、フィッシャーの線形判別分析(Fisher's linear discriminant analysis)に基づいており、ｙ分類ラベル０および１に対する平均値
0005405110.tif 000008
、および、共分散Σｙ＝０、Σｙ＝１が与えられる場合に、平均値
0005405110.tif 000009
、および、分散
0005405110.tif 000010
を有するであろう、
0005405110.tif 000011
の線形的な組み合わせを探す方法である。この分散は、分類群内の分散に対する分類群間の分散の割合を最大にするであろうものである。すなわち、
0005405110.tif 000012
を満たす。
【００５５】
ＬＤＡ法は、重分類判別分析(multiple class discriminant analysis)に一般化することができる。この分析は、ｙが、わずか２つではなく、Ｎ個の可能な状態を有するものである。分類平均および分散は、選ばれたマーカーに対するデータベース中に含まれる値から推定される。好ましい実施形態では、共分散行列は、以下の方法に基づいて、各々の腫瘍の種類の等価な事前確率によって加重される。男性患者は、女性の各生殖器官腫瘍群に対する事前確率は０であるというモデルによって予測される。同様に、女性患者は、男性の生殖器官腫瘍群に対する事前確率は０であるというモデルによって予測される。本発明において、事前確率は、女性に対する試験について、前立腺がんに関しては０であり、男性に対する試験について、乳がんおよび卵巣がんに関しては０である。さらに、分類ラベルと同一のバックグラウンドを有するサンプルは、特定の分類ラベルに関して、事前確率が０であるモデルによって試験される。
【００５６】
以上の問題は、一般化された固有値問題として取り扱われるレイリー商の最大化とみなされる。減少した部分空間は、選ばれた部分空間における重心までの各々のサンプルの距離を計算することによって、分類に用いられる。このモデルは最大尤度によって適合させることができ、そして、事後確率はベイズの定理を用いて計算される。
【００５７】
他の方法は、分類ラベル群に対するｎ次元の特徴空間のマップを発見することが、特徴空間を領域に分割し、その後、各領域へ分類を割り当てることを伴うであろうということを含んでもよい。ここで、ｎは用いられた変数の数である。これらの最近傍型アルゴリズムの値は、決定境界間の距離と関係し、そして、必ずしも分類確率には転換されない。
【００５８】
もし選ぶ分散が非常に多く、それらの多くがランダムノイズ(random noise)であるならば、その時、変数の選択およびモデル化は問題の過剰適合（over-fitting）を招く恐れがある。それゆえ、さまざまなカットオフで順位付けされた一覧は、しばしば変数の数を限定するための入力値として用いられる。遺伝的アルゴリズムのような探索アルゴリズムもまた、費用関数を試験する際の変数の部分集合を選択するために用いることができる。シミュレートされたアニーリングは、費用関数を極小で捉える危険性を限定するために試みることができる。それにもかかわらず、これらの手順は、選択およびモデル形成過程と独立なサンプルで確認されなければならない。
【００５９】
潜在変数アプローチもまた用いてよい。高次元空間から低次元の集合体を推定するあらゆる教師なし学習アルゴリズム(unsupervised learning algorithm)は、入力変数間の関係、および、どのようによく、その変数が潜在変数のより小さな集合に適合するかを発見するために用いることができる。変数を減ずる効果についての推論は主観的なものであるけれども、教師ありアルゴリズムは、分類確度を推定するために、減らされた変数の集合に適用することができる。このように分類器は、潜在変数から構築することができるが、また潜在変数と有意に相関する変数の集団からも構築することができる。このことの例は、あらゆる教師あり分類モデルへの入力値として、主成分分析(principle component analysis)に基づいて、主成分と相関する変数を用いることを含むであろう。
【００６０】
このようなアルゴリズムは、変数を入力し；サンプルを関数で訓練し；モデルに基づいてサンプルを試験し；かつ、コンソールに結果を出力するための方法を有する、あらゆるソフトウェアコード(software code)で実行することができる。Ｒ、Octave、Ｃ、Ｃ＋＋、Fortran、Java、Perl、および、Pythonはすべて、前記の関数の多くを実施するために、オープンソースライセンス(open source license)で手に入るライブラリ(libraries)を有する。Ｓ＋、および、Matlabのような商業用パッケージにも、これらの方法の多くが同包されている。
【００６１】
そのコードは、以下のステップを以下の順番で、インストールされたＭＡＳＳ［Venables他（２００２年）参照］ライブラリとともに、Ｒ  ２．２．１版(http://www.r-project.org)を用いて実行する。用語ＬＤＡとは、ＭＡＳＳ名前空間におけるｌｄａ関数を言う。
【００６２】
１）１０個のマーカー遺伝子、および、２個の対照に対するＣＴ値は、利用可能なすべての訓練群のサンプルのために、ハードドライブに蓄積される。
２）各サンプルに対して、各マーカーから対照サンプル特異的な平均を差し引くことにより、１０個のマーカー遺伝子に係る値を標準化する。
３）訓練データ群は、原発巣部位がわかっている転移から構成され、各サンプルは標的マーカーのうち少なくとも１つ有する。この標的マーカーは、ラベルされた原発巣組織に特異的であり、ＣＴ値が５未満に標準化されている。
４）ＬＤＡ法は（３）における訓練データから、２つのＬＤＡモデルについての４つの群を構築する。各群において、１つのモデルは男性特異的なものであり、乳がん、および、卵巣がんに対して０に設定された事前確率（prior odds）を有し、同時に、前立腺がんに対しては、他の分類ラベルの事前確率と等価に設定された事前確率を有する。各対の他方のモデルは女性特異的なものであり、前立腺がんに対して０に設定された事前確率を有し、乳がん、および、卵巣がんに対しては、他の分類ラベルで見られた等価の事前確率に設定された事前確率を有する。
ａ．１番目の群は、結腸で見つかったＣＵＰサンプルを試験するために用いられ、結腸がんに対する事前確率は０に設定されており、そして、他の非生殖的な分類ラベルはすべて、等価の事前確率に設定されている。
ｂ．２番目のモデル群は、卵巣で見つかったＣＵＰに特異的であり、卵巣がんに対して０に設定された事前確率を有し、そして、他の非生殖的な分類ラベルはすべて、等価の事前確率に設定されている。
ｃ．３番目の群は、肺で見つかったＣＵＰのためのものであり、肺がんに対して０に設定された事前確率を有する。他の非生殖的な分類ラベルはすべて、等価な事前確率を有する。
ｄ．一般的なモデルは他のすべてのバックグラウンド組織に対して用いられる。すべての事前確率は、４において規定された群である生殖特異的な分類ラベルを除いて、等価に設定される。
【００６３】
サンプルを試験するために、以下のことを実行するＲプログラムを実行した。
【００６４】
１）試験データ群を読み込む。
２）両方の対照に係るサンプル特異的平均を生成する。
３）各サンプルに対して、各マーカーから差し引くために、サンプル特異的平均を用いる。
４）４０の原ＣＴ値から生成された、すべての標準化ＣＴ値を、１２で置換する。
５）試験群における各サンプルに対して、以下のことを試験する。
ａ．両方の対照に係る平均が３４より大きい場合、その後、そのサンプルは事後確率が０である「CTR_FAILURE」とラベルされる。
ｂ．バックグラウンドを、結腸、卵巣、もしくは、肺について調べる。もし一致が見られれば、それから性に対しても同様に調べる。バックグラウンドおよび性特異的なモデルは、それからサンプルを評価するために用いられる。
ｃ．乳がん、すい臓がん、肺ＳＣＣ（lungSCC）、もしくは、前立腺がんが、バックグラウンドラベルとして見出された場合、そのサンプルには「FAILURE_ineligible_sample」のラベルを付し、事後確率をすべて０に設定する。
ｄ．男性もしくは女性のどちらかのための一般的モデルは、他のすべてのサンプルに対して用いられる。
【００６５】
結果は、フォーマット化され、ファイルに書き込まれる。
【００６６】
本発明は、本過程から得られた遺伝子発現ポートフォリオを含む。
【００６７】
遺伝子発現プロファイルは、多くのやり方で表示することができる。最も一般的な方法は、未加工の蛍光強度もしくは比率行列を、縦に試験サンプルを、横に遺伝子を示した図形的な系統樹上に配置することである。データは、類似の発現プロファイルを有する遺伝子が互いに近位にあるように配置される。各遺伝子の発現率は、色として視覚化される。例えば、１未満の発現率［ダウンレギュレーション(down-regulation)］は、スペクトルの青色部分に現れ、１を超える発現率［アップレギュレーション(up-regulation)］は、スペクトルの赤色部分に現れる。「GeneSpring」（Silicon Genetics, Inc.）、ならびに、「Discovery」および「Infer」（Partek, Inc.）を含む、市販のコンピュータソフトウェアプログラムは、このようなデータを表示するために利用できる。
【００６８】
多数の独自のＲＮＡ種の測定値は、原発腫瘍、もしくは、原因のわかっている原発腫瘍由来の転移性腫瘍から収集される。臨床記録［それらに限定されないが、患者の年齢、性別、原発腫瘍の原発巣部位、および、（もし適用できるなら）転移部位を含む］に沿ったこれらの示度は、関係のあるデータベースを生成するために用いられる。データベースは、ＲＮＡ転写物、および、臨床上の因子を選択するために用いられる。これらのＲＮＡ転写物、および、臨床上の因子は、転移性腫瘍の原発巣を予測するためのマーカー変数として用いることができるものである。
【００６９】
遺伝子発現を決定するためにタンパク質量を測定する場合、もしそれが結果的に適切な特異性および感受性をもたらすならば、本技術分野において知られているあらゆる方法が適当である。例えば、タンパク質量は、そのタンパク質特異的な抗体、もしくは、抗体断片へ結合することによって、および、抗体結合タンパク質の量を測定することによって、測定することができる。抗体は、検出を容易にするために、放射性試薬、蛍光性試薬、もしくは、他の検出可能な試薬で標識することができる。検出方法は、それらに限定されないが、酵素免疫測定法(enzyme-linked immunosorbent assay)（ＥＬＩＳＡ）、および、免疫ブロット(immunoblot)法を含む。
【００７０】
本発明に係る方法で用いられる調節された遺伝子は、実施例中で説明される。差異のある発現をする遺伝子は、特定の原発巣のがんを有する患者では、異なる原発巣由来のがんを有する者と比べて、アップレギュレートされるか、またはダウンレギュレートされる。アップレギュレーション、および、ダウンレギュレーションとは、いくつかの基準と比較して、遺伝子発現量において（その測定に用いられたシステムにおけるノイズが寄与する以上に）検出可能な差異が見られることを意味する相対的な用語である。この場合、基準はアルゴリズムに基づいて決定される。異常細胞(diseased cells)における目的遺伝子はしたがって、同一の測定方法を用いた基準レベルと比較して、アップレギュレートされるか、もしくは、ダウンレギュレートされるかのどちらかである。本明細書の内容において、異常な(diseased)とは、制御されない細胞増殖とともに起こるような、身体的機能の適切な作動を中断する（すなわち、阻害する）身体の状態変化、もしくは、その適切な作動を阻害する可能性がある身体の状態変化を言う。ある人間の遺伝子型もしくは表現型のいくつかの観点が病気の存在と一致する場合に、その人間は、その病気であると診断される。しかしながら、診断もしくは予後診断を実施するという行為には、再発の可能性、治療の種類、および、治療観察を決定するといった、病気／状態に係る課題の決定を含んでいてもよい。治療観察においては、遺伝子発現プロファイルが正常組織とより矛盾のないパターンに変化したかどうか、もしくは、変化しつつあるかどうかを決定するために、時間をかけて遺伝子発現を比較することによって、所与の一連の治療の効果について、臨床上の判断がなされる。
【００７１】
遺伝子は、グループ化することができる。このため、そのグループの遺伝子群について得られた情報が、診断、予後、もしくは、治療選択のような臨床上関連のある判断を行うためのしっかりした基準を提供する。これらの遺伝子群は、本発明のポートフォリオを作り上げる。大部分の診断マーカーと同様に、正しい医療上の判断を行うのに十分なほどの最も少ない数のマーカーを用いることが、しばしば望ましい。このことは、時間および資源の非生産的な使用を防止すると同時に、更なる分析の間の治療の遅延を防止する。
【００７２】
遺伝子発現ポートフォリオを確立する１つの方法は、株式ポートフォリオを確立するのに広く用いられている、平均分散アルゴリズムのような最適化アルゴリズムを使用することである。この方法は、米国特許出願公開第２００３０１９４７３４号に詳細に記載されている。本質的には、その方法は、収益の変動を最小化すると同時にその収益を使用するために、受け取る収益（例えば、生成されたシグナル）を最適化するであろう入力群（金融応用における株式、本明細書においては、強度によって評価されるような発現）の確立を要求する。多くの市販のソフトウェアプログラムが、このような作業を実行するために利用可能である。本明細書全体を通じて「Wagner Software」と言われる「Wagner Associates Mean-Variance Optimization Application」は、好ましいものである。このソフトウェアは、有効フロンティアを決定するために、「Wagner Associates Mean-Variance Optimization Library」からの関数を用い、マーコウィッツの意味（Markowitz sense）における最適ポートフォリオが好ましい。Markowitz（１９５２年）参照。この種のソフトウェアを用いるには、そのソフトウェアを意図された金融分析の目的で用いる場合に株式収益および危険率評価が用いられるように、マイクロアレイデータを入力として扱うことを可能にするために、そのマイクロアレイデータを変換することが必要である。
【００７３】
ポートフォリオを選択する過程はまた、ヒューリスティクスな(heuristic)ルールの適用を含むことができる。好ましくは、このようなルールは、生物学、および、臨床上の結果を生むために用いられた技術への理解に基づいて公式化される。より好ましくは、それらは最適化法からの出力に適用される。例えば、ポートフォリオ選択における平均分散法は、がん患者において差異のある発現をする多くの遺伝子に対するマイクロアレイデータに適用することができる。この方法からの出力は、罹患組織におけるのと同様に、末梢血においても発現された、いくつかの遺伝子を含みうる最適化された遺伝子群であるであろう。もし試験方法において用いられたサンプルが末梢血から得られ、がんの例において差異がある発現をする特定の遺伝子がまた、末梢血においても差異がある発現をすることがあるならば、ヒューリスティクスなルールを適用することができる。そのヒューリスティクスなルールにおいて、ポートフォリオは、末梢血において差異がある発現をするものを除いた有効フロンティアから選択される。もちろん、そのルールは、例えば、データの事前選択の間にそのルールを適用することによって、有効フロンティア形成に先立って適用することができる。
【００７４】
必ずしも問題の生物学と関連がある必要がない他のヒューリスティクスなルールが適用されうる。例えば、所定の割合のポートフォリオのみが、特定の遺伝子もしくは遺伝子群によって示されうる、というルールを適用することができる。Wagner Softwareのような市販のソフトウェアは、容易にこれらのタイプのヒューリスティクスと適合する。このことは、例えば、確度および精度以外の要因（例えば、期待されたライセンス料）が１個以上の遺伝子を含むことの望ましさに対して影響力がある場合、有用でありうる。
【００７５】
本発明の遺伝子発現プロファイルはまた、がんの診断、予後、もしくは、治療観察において有用な、他の非遺伝子的診断法とともに用いられることが可能である。例えば、いくつかの状況下では、前記の遺伝子発現に基づいた方法の診断力を、血清タンパク質マーカー［例えば、がん抗原２７．２９(Cancer Antigen 27.29)（「ＣＡ２７．２９」）］のようなよく用いられるマーカーからのデータと組み合わせることが有用である。このようなマーカーの範囲は、ＣＡ２７．２９のような分析物を含んで存在する。１つのこのような方法において、血液は治療される患者から定期的に採取され、それから前記の血清マーカーのうちの１つに対する酵素免疫測定を受ける。マーカーの濃度が、腫瘍の再発もしくは治療の失敗を示唆する場合、遺伝発現分析を受けることが可能なサンプル源を採取する。疑わしい腫瘤（suspicious mass）が存在する場合、細針吸引法（ＦＮＡ）を採り、それから腫瘤から採取した細胞の遺伝子発現プロファイルを前記のように分析する。あるいは、組織サンプルは、以前に腫瘍を除去した組織に近い領域から採取されてもよい。このアプローチは、他の試験があいまいな結果を示すときに特に有用である。
【００７６】
本発明にしたがって作られたキットは、遺伝子発現プロファイルを決定するためにフォーマット化された解析を含む。これらは、バイオマーカーを解析する試薬および指示書、ならびに、媒体のような、解析を実施するのに必要な材料のうちすべて、もしくは、一部を含むことができる。
【００７７】
本発明に係る物品は、病気を治療し、診断し、予示し、判定するために有用な遺伝子発現プロファイルの説明（representations）を含む。これらのプロファイルの説明は、コンピュータが読み込み可能な媒体（磁気的、光学的、および、同様の媒体）のような、自動的に機械によって読み込み可能な媒体へ変換される。この物品はまた、このような媒体における遺伝子発現プロファイルを判定するための命令を含むことができる。例えば、この物品は、前記遺伝子に係るポートフォリオの遺伝子発現プロファイルを比較するためのコンピュータ命令を有するＣＤ−ＲＯＭを含んでもよい。物品はまた、患者サンプル由来の遺伝子発現データと比較することができるように、電子的に記録された遺伝子発現プロファイルを有してもよい。あるいは、プロファイルを、別の表現フォーマットで記録することができる。図示された記録はそのようなフォーマットの１つである。前述のPartek, Inc.の「DISCOVERY」および「INFER」ソフトウェアに組み込まれたアルゴリズムのようなクラスタリングアルゴリズム(clustering algorithms)は、このようなデータを視覚化することにおいて、最もよい支援になりうる。
【００７８】
本発明にしたがった別の種類の製品は、遺伝子発現プロファイルを明らかにするために用いられる媒体、もしくは、フォーマット化された解析である。これらは、例えば、相補配列もしくはプローブが、目的遺伝子を示す配列が結合したマトリックスに対して貼り付けられたマイクロアレイを含むことができ、それらの存在の読み取り可能な決定要因を生み出す。あるいは、本発明に係る物品は、がんを検出するための目的遺伝子の発現量を示すハイブリダイゼーション、増幅、および、シグナル生成を実施するための試薬キットへと作られることができる。
【００７９】
以下の実施例は、特許請求の範囲に記載された発明について説明するために提供されたものであるが、その発明を限定するものではない。本明細書に引用されたあらゆる参照文献は、参照により本明細書中に組み入れる。
【００８０】
〔実施例１〕
材料と方法
＜すい臓がんマーカー遺伝子の発見＞
ＲＮＡを、すい臓腫瘍、正常すい臓組織、肺組織、結腸組織、乳房組織、および卵巣組織から、トリゾールを用いて単離した。そのＲＮＡは、増幅され、標識されたＲＮＡを生成するために用いられ［Lipshutz他（１９９９年）参照］、それから、その標識ＲＮＡをAffymetrix U133A array上にハイブリダイズさせた。それから、そのデータは２つの方法で分析された。
【００８１】
１番目の方法では、このデータ群は、データ群全体にわたり、少なくとも２つの存在コール(present calls)を有する遺伝子のみを保有するように、ふるいにかけられた。このようなふるいにかけた結果、１４，５４７個の遺伝子が残った。２，７３６個の遺伝子は、すい臓がんにおいて正常すい臓に対して０．０５未満のｐ値で過剰発現していることがわかった。その２，７３６個の遺伝子のうち４５個の遺伝子はまた、肺および結腸組織で見られた最大強度と比して、少なくとも２倍過剰発現されていた。最終的に、６個のプローブ群が見出され、そのプローブ群は、肺組織、結腸組織、乳房組織、および、卵巣組織で観察された最大強度と比べて、少なくとも２倍過剰発現されていた。
【００８２】
２番目の方法では、このデータ群は、乳房組織、結腸組織、肺組織、および、卵巣組織において、わずか２つの存在コールしか有さない遺伝子のみを保有するように、ふるいにかけられた。このようなふるいにかけた結果、４，６５４個の遺伝子が残った。この４，６５４個の遺伝子のうち１６０個の遺伝子が、すい臓の（正常な、および、がん）組織において、少なくとも２つの存在コールを有することがわかった。最終的に、８個のプローブ群が選択され、そのプローブ群は、すい臓がん組織とすい臓正常組織との間で、最も差異のある発現を示した。
【００８３】
＜組織サンプル＞
全体で２６０個のＦＦＰＥ転移性組織および原発組織が、さまざまな業者から入手された。試験されたサンプルには、３０個の乳がん転移、３０個の結腸直腸がん転移、５６個の肺がん転移、４９個の卵巣がん転移、４３個のすい臓がん転移、１８個の前立腺原発腫瘍、および、２個の前立腺がん転移、ならびに、３２個のその他の原発巣（６個の胃がん、６個の腎臓がん、３個の喉頭がん、２個の肝臓がん、１個の食道がん、１個の咽頭がん、１個の胆管がん、１個の胸膜がん、３個の膀胱がん、５個のメラノーマ、３個のリンパ腫）を含んだ。
【００８４】
＜ＲＮＡ抽出＞
パラフィン組織切片からのＲＮＡ単離は、以下の修正を伴うHigh Pure RNA Paraffin Kit manual（Roche）に記載された方法、および、試薬に基づいた。パラフィン包埋組織サンプルは、包埋された転移の大きさにしたがって切断され（大きさが２〜５ｍｍであれば９×１０μｍ、６〜８ｍｍであれば６×１０μｍ、８〜１０ｍｍ以上であれば３×１０μｍ）、１．５ｍＬエッペンドルフチューブ(Eppendorf tubes)中のＲＮＡ分解酵素／ＤＮＡ分解酵素の中に静置した。切片は、１０〜２０秒撹拌した後、室温で２〜５分間、１ｍＬのキシレン中でインキュベーション(incubation)することで、脱パラフィン化した。その後、チューブを遠心分離し、上澄みを除去し、そして、脱パラフィン化のステップをくり返した。上澄みを除去した後、１ｍＬのエタノールを加え、サンプルを１分間撹拌し遠心分離し、上澄みを除去した。この過程をもう一度くり返した。残存しているエタノールを除去し、ペレット(pellet)を５５℃のオーブンで５〜１０分間乾燥させ、１００μＬの組織溶解バッファー(tissue lysis buffer)、１６μＬの１０％ＳＤＳ、および、８０μＬのタンパク質分解酵素Ｋに再懸濁させた。サンプルを、４００回転／分に設定したサーモミキサー(thermomixer)内で、５５℃で２時間にわたり撹拌およびインキュベートした。３２５μＬの結合バッファー(binding buffer)、および、３２５μＬのエタノールを各々のサンプルに加え、そのサンプルをかき混ぜ、遠心分離し、そして、上澄みをフィルターカラムに加えた。フィルターカラムを収集チューブとともに、８０００回転／分で１分間遠心分離し、流出物（flow through）を廃棄した。一連の洗浄を行った［５００μＬの洗浄バッファー(wash buffer)Ｉ→５００μＬの洗浄バッファーＩＩ→３００μＬの洗浄バッファーＩＩ］。その洗浄では、各々の溶液をカラムに加え、遠心分離し、そして、流出物を廃棄した。カラムをその後、最大速度で２分間遠心分離し、新しい１．５ｍＬチューブ中に入れ、そして、９０μＬの溶出バッファー(elution buffer)を加えた。ＲＮＡは、室温で１分間のインキュベーション、および、その後の８０００回転／分で１分間の遠心分離を行った後に得られた。サンプルは、１０μＬのＤＮＡ分解酵素インキュベーションバッファー(DNase incubation buffer)、２μＬのＤＮＡ分解酵素Ｉを加えることによって、ＤＮＡ分解酵素処理され、そして３７℃で３０分間インキュベートされた。ＤＮＡ分解酵素は、２０μＬの組織溶解バッファー、１８μＬの１０％ＳＤＳおよび４０μＬのタンパク質分解酵素Ｋを加えた後に、不活化された。再び、３２５μＬの結合バッファー、および、３２５μＬのエタノールを各々のサンプルに加え、そのサンプルをかき混ぜ、遠心分離し、そして、上澄みをフィルターカラムに加えた。一連の洗浄、および、ＲＮＡの溶出は、ＲＮＡを溶出するために５０μＬの溶出バッファーが用いられたことを除いては、前述のとおり行われた。カラムから持ち越されるガラス繊維による汚染を排除するために、ＲＮＡを最大速度で２分間遠心分離し、上澄みを新しい１．５ｍＬエッペンドルフチューブ中に移した。サンプルを、分光光度計によって得られたＯＤ  ２６０／２８０の示度により定量し、５０ｎｇ／μＬに希釈した。単離されたＲＮＡを、使用するまでＲＮＡ分解酵素の含ま��ない水中に−８０℃で保管した。
【００８５】
＜TaqManプライマーおよびプローブ設計＞
適当なｍＲＮＡ参照配列アクセッション番号(mRNA reference sequence accession numbers)が、Oligo 6.0とともに、TaqMan（登録商標）ＣＵＰ解析［肺がんマーカー：ヒト肺サーファクタント関連タンパク質B(human surfactant, pulmonary-associated protein B)（ＨＵＭＰＳＰＢＡ）、甲状腺転写因子１（ＴＴＦ１）、デスモグレイン３（ＤＳＧ３）、結腸直腸がんマーカー：カドヘリン１７（ＣＨＤ１７）、乳がんマーカー：マンマグロビン（ＭＧ）、前立腺由来ets転写因子（ＰＤＥＦ）、卵巣がんマーカー：ウィルムス腫１（ＷＴ１）、すい臓がんマーカー：前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、凝固第５因子（Ｆ５）、前立腺マーカー：カリクレイン３（ＫＬＫ３）］、および、ハウスキーピング解析（housekeeping assays）［βアクチン、ハイドロキシメチルビラン合成酵素(hydroxymethylbilane synthase)（ＰＢＧＤ）］を開発するために用いられた。各解析のためのプライマー、および、加水分解プローブは、表２に列記されている。エキソン−イントロンスプライシング部位周辺に解析を設計することで、ゲノムＤＮＡ増幅を除去した。加水分解プローブは、５’末端のヌクレオチドにおいてＦＡＭ（レポーター染料）で、３’末端のヌクレオチドにおいてＢＨＱ１−ＴＴ［インターナルクエンチング染料(internal quenching dye)］で標識された。
【００８６】
＜定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応＞
遺伝子特異的ＲＮＡの定量は、ABI Prism 7900HT配列検知システム（Applied Biosystems）の３８４ウェルプレート(well plate)において、実行された。各サーモサイクラー(thermo-cycler)の実行のために、キャリブレーターおよび標準曲線を増幅した。各マーカーためのキャリブレーターは、生体外転写産物中の標的遺伝子からなり、それらはラットの腎臓由来のキャリアＲＮＡ(carrier RNA)中で１×１０５コピーで希釈したものであった。ハウスキーピングマーカーための標準曲線は、生体外転写産物中の標的遺伝子からなり、それらはラットの腎臓由来のキャリアＲＮＡ中で１×１０７、１×１０５、１×１０３コピーで連続希釈したものであった。標的遺伝子がない対照（No target controls）も、周囲の汚染（environmental contamination）がないことを確かめるために、各解析の実行に含まれた。すべてのサンプルおよび対照は繰り返して実行された。ｑＲＴＰＣＲは、１０μＬの反応物（10μl reaction）中で一般的な研究室で用いられる試薬で実行された。その１０μＬの反応物には、ＲＴ−ＰＣＲバッファー［５０ｎＭビシン／水酸化カリウムｐＨ８．２、１１５ｎＭ酢酸カリウム、８％グリセロール、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、３．５ｍＭ硫酸マンガン、各０．５ｍＭのデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）］、添加物［２ｍＭトリス塩酸バッファー(Tris-Cl)ｐＨ８、０．２ｍＭウシアルブミン、１５０ｍＭトレハロース、０．００２％ Tween20］、酵素混合液［２Ｕ  Ｔｔｈ（Roche）、０．４ｍｇ／μＬ  Ａｂ  ＴＰ６−２５］、プライマーおよびプローブ混合液（０．２μＭプローブ、０．５μＭプライマー）を含んだ。その後のサイクリングパラメータ(cycling parameter)は、９５℃、１分間を１サイクル；５５℃、２分間を１サイクル；温度上昇（Ramp）５％；７０℃、２分間を１サイクル；９５℃、１５秒間、５８℃、３０秒間を４０サイクル；であった。ＰＣＲ反応が完了した後、基準および閾値をABI 7900HT Prism softwareで設定し、計算したＣｔ値をMicrosoft Excelに取り込んだ。
【００８７】
＜１段階反応対２段階反応＞
第一鎖合成は、１反応あたり、１００ｎｇのランダムヘキサマー、もしくは、遺伝子特異的プライマーのいずれかを用いて実行した。第１段階目では、１１．５μＬの混合液１（プライマー、および、１μｇの全ＲＮＡ）を６５℃まで５分間加熱し、その後、氷上で冷却した。８．５μＬの混合液２［１×バッファー、０．０１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、各０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを混合したもの）、０．２５Ｕ／μＬ RNasin（登録商標）、１０Ｕ／μＬ Superscript III］を混合液１に添加し、５０℃で、６０分間インキュベートした後、９５℃で、５分間インキュベートした。ｃＤＮＡを、使える状態になるまで、−２０℃で保管した。２段階反応の第２段階目のｑＲＴＰＣＲは、サイクリングパラメータ、９５℃、１分間を１サイクル；９５℃、１５秒間、５８℃、３０秒間を４０サイクルで、前述のとおり実行した。１段階反応のためのｑＲＴＰＣＲは、前の段落に記載のとおり正確に実行された。１段階および２段階反応はともに、１００ｎｇの鋳型（ＲＮＡ／ｃＤＮＡ）に対して実行された。ＰＣＲ反応が完了した後、基準および閾値をABI 7900HT Prism softwareで設定し、計算したＣｔ値をMicrosoft Excelに取り込んだ。
【００８８】
＜ヒートマップ(heatmap)の生成＞
各サンプルのΔＣｔは、各々のＣＵＰマーカーのＣｔ値の平均値をとり、平均のハウスキーピングマーカーのＣｔ値の平均値を引くことにより計算された［ΔＣｔ＝Ｃｔ（ＣＵＰマーカー）−Ｃｔ（平均のハウスキーピングマーカー）］。各々の原発巣組織（肺、乳、前立腺、結腸、卵巣、すい臓）マーカー群の最小のΔＣｔを、サンプルごとに決定した。全体の最小ΔＣｔを有する原発巣組織には得点１を与え、他のすべての原発巣組織には得点０を与える。データを病理学上の診断にしたがって分類した。Partek Proには修正された実現可能性データを投入し、強度プロット(intensity plot)を生成した。
【００８９】
結果
＜新規のすい臓原発巣腫瘍およびがん状況マーカーの発見＞
まず、５つのすい臓マーカー候補が解析された。それらのマーカー候補は、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、セリンプロテイナーゼ阻害剤(serine proteinase inhibitor)、クレードＡメンバー１(clade A member 1)（ＳＥＲＰＩＮＡ１）、サイトケラチン(cytokeratin)７（ＫＲＴ７）、マトリックスメタロプロテアーゼ(matrix meralloprotease)１１（ＭＭＰ１１）、および、ムチン(mucin)４（ＭＵＣ４）［Varadhachary他（２００４年）；Fukushima他（２００４年）；Argani他（２００１年）；Jones他（２００４年）；Prasad他（２００５年）；および、Moniaux他（２００４年）参照］であり、ＤＮＡマイクロアレイ、ならびに、１３個のすい臓管腺がん、５個の正常すい臓組織、および、９８個のサンプル（乳房腫瘍、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、および、卵巣腫瘍に由来する）に係るパネルを用いて解析された。ＰＳＣＡのみが、適度な感受性（１３個中６個、すなわち、すい臓腫瘍のうち４６％を検出した）を、高い特異性（９８個のサンプル中９１個、すなわち、９３％が、すい臓が原発巣でないと正確に同定された）で示した（図４Ａ）。これに対して、ＫＲＴ７、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＭＭＰ１１、および、ＭＵＣ４は、それぞれ３８％、３１％、８５％および３１％の感受性を、それぞれ６６％、９１％、８２％および８１％の特異性で示した。これらのデータは、２７個のすい臓原発巣の転移、および、３９個の非すい臓原発巣の転移で、ＭＭＰ１１を除くすべてのマーカーについて実行したｑＲＴＰＣＲと十分一致した。ＭＭＰ１１は、ｑＲＴＰＣＲおよび転移に対して、より低い感受性とより低い特異性を示した。結論として、急速冷凍した原発組織におけるマイクロアレイデータは、ＦＦＰＥ転移がすい臓原発巣であることをｑＲＴＰＣＲによって同定することのできるマーカーの能力に対する良い指標として役立つ。しかし、更なるマーカーが最適な効果のために有用であるかもしれない。
【００９０】
すい臓管腺がんは、（大部分が腺房状細胞および膵島細胞である）すべてのすい臓細胞のうちのほんのわずかな割合を含む管上皮細胞から発達するため、および、すい臓腺がん組織は隣接する正常組織のうち相当量を含むため［Prasad他（２００５年）；および、Ishikawa他（２００５年）］、器官群からこの器官を識別することもできるすい臓がんマーカー（すなわち、がんにおいてアップレギュレートされたマーカー）を同定することは難しいことであった。ＣＵＰパネルにおける使用のために、このような識別は必要なことである。第１のクエリ方法(query method)（材料と方法参照）によって、６つのプローブ群が得られた。そのプローブ群は、凝固第５因子（Ｆ５）、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１０）と類似した仮想タンパク質ＦＬＪ２２０４１、β６インテグリン（ＩＴＧＢ６）、トランスグルタミナーゼ(transglutaminase)２（ＴＧＭ２）、異質核内リボ核タンパク質(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein)Ａ０（ＨＮＲＰ０）、および、ＢＡＸデルタ（ＢＡＸ）であった。第２のクエリ方法（材料と方法参照）によって、８つのプローブ群が得られた。そのプローブ群は、Ｆ５、ＴＧＭ２、ペアードライクホメオドメイン転写因子(paired-like homeodomain transcription factor)１（ＰＩＴＸ１）、トリオアイソフォームｍＲＮＡ（ＴＲＩＯ）、ｐ７３ＨのためのｍＲＮＡ（ｐ７３）、ＭＧＣ：１０２６４に対する未知のタンパク質（ＳＣＤ）、および、クラウジン１８に対する２つのプローブ群であった。Ｆ５、および、ＴＧＭ２はクエリ結果の両方に存在し、この２つのうち、Ｆ５が最も有望なもののように思われた（図４Ｂ参照）。
【００９１】
＜ＦＦＰＥ組織を用いたサンプル準備およびｑＲＴＰＣＲの最適化＞
次に、マーカーパネル性能を検査する前に、固定組織を用いて、ＲＮＡ単離法、および、ｑＲＴＰＣＲ法を最適化した。まず、タンパク質分解酵素Ｋのインキュベーション時間を１６時間から３時間に短縮した効果を分析した。収率にはまったく変化はなかった。しかし、いくつかのサンプルで、より短い時間のタンパク質分解酵素Ｋステップを用いたときに、より長いＲＮＡ断片を示すものがあった（図５）。例えば、ＲＮＡを１年前の組織ブロック（Ｃ２２）から単離したとき、電気泳動図にはまったくちがいは見られなかった。しかし、ＲＮＡを５年前の組織ブロック（Ｃ２３）から単離したときには、より短い時間のタンパク質分解酵素Ｋ消化を用いた場合に、肩のこぶ（hump in the shoulder）によって解析されると、より高分子量のＲＮＡの区画がより多く観察された。この傾向は一般的に、ＦＦＰＥ転移の原発巣器官にかかわらず、他のサンプルを処理する際にも保持された。結論として、タンパク質分解酵素Ｋ消化時間の短縮は、ＲＮＡ収量を犠牲にしないし、そして、より長く、あまり分解されていないＲＮＡを単離する助けになるかもしれない。
【００９２】
次に、３つの異なる逆転写法を比較した。その３つの方法とは、ｑＰＣＲが後に続く、ランダムヘキサマーによる逆転写（２段階）；ｑＰＣＲが後に続く、遺伝子特異的プライマーによる逆転写（２段階）；遺伝子特異的プライマーを用いた１段階のｑＲＴＰＣＲ；である。ＲＮＡは１１個の転移から単離され、この３つの方法すべてにわたって、βアクチン、ヒトサーファクタントタンパク質Ｂ（ＨＵＭＳＰＢ）、および、甲状腺転写因子（ＴＴＦ）（図６）に対するＣｔ値を比較した。すべての比較において、統計的に有意な差（ｐ＜０．００１）があった。３個の遺伝子すべてについて、ｑＰＣＲが後に続くランダムヘキサマーによる逆転写（２段階反応）が最も高いＣｔ値を示し、一方、ｑＰＣＲが後に続く遺伝子特異的プライマーによる逆転写（２段階反応）は、対応する１段階反応よりも、わずかに（しかし統計的には有意な）低いＣｔ値を示した。しかし、遺伝子特異的プライマーを用いた２段階のＲＴＰＣＲは、より長い逆転写段階を有した。各サンプルについて、ＨＵＭＳＰＢおよびＴＴＦのＣｔ値を、対応するβアクチンの値に対して標準化した場合、３つの方法すべてにわたって、標準化されたＣｔ値には、まったくちがいが見られなかった。結論として、ＲＴＰＣＲ反応条件の最適化により、より低いＣｔ値を生じることができ、これは、より古いパラフィンブロックを分析する手助けになるかもしれない［Cronin他（２００４年）参照］。そして、遺伝子特異的プライマーを用いた、１段階のＲＴＰＣＲ反応は、対応する２段階反応において生ずるＣｔ値に匹敵するＣｔ値を生ずることができる。
【００９３】
＜ＣＵＰ−ｑＲＴＰＣＲ解析の診断能＞
次に、１２個のｑＲＴＰＣＲ反応（１０個のマーカー、および、２個のハウスキーピング遺伝子）を２３９個のＦＦＰＥ転移に対して実行した。その解析に用いられたマーカーを表２に示す。肺がんマーカーは、ヒト肺サーファクタント関連タンパク質Ｂ（ＨＵＭＰＳＰＢ）、甲状腺転写因子１（ＴＴＦ１）、および、デスモグレイン３（ＤＳＧ３）であった。結腸直腸がんマーカーは、カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）であった。乳がんマーカーは、マンマグロビン（ＭＧ）、および前立腺由来Ｅｔｓ転写因子（ＰＤＥＦ）であった。卵巣がんマーカーは、ウィルムス腫１（ＷＴ１）であった。すい臓がんマーカーは、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、および、凝固第５因子（Ｆ５）であり、前立腺マーカーは、カリクレイン３（ＫＬＫ３）であった。遺伝子の説明については、表３１参照のこと。
【表２−１】
0005405110.tif 000013
【表２−２】
0005405110.tif 000014
【００９４】
ヒートマップにおける標準化されたＣｔ値の分析は、乳がんマーカー、および、前立腺がんマーカーの高い特異性、結腸がんマーカー、肺がんマーカー、および、卵巣がんマーカーの中程度の特異性、ならびに、すい臓がんマーカーの幾分より低い特異性を明らかにした。標準化されたｑＲＴＰＣＲデータをコンピュータによる修正（refinement）と組み合わせることにより、マーカーパネルの性能が改良される。アルゴリズムと組み合わされた標準化されたｑＲＴＰＣＲデータから結果が得られ、ｑＲＴＰＣＲ解析の確度が決定された。
【００９５】
議論
本実施例において、マイクロアレイに基づいた発現プロファイル解析は、転移に用いるための候補マーカーを同定するために、原発腫瘍に対して用いられる。転移に対する原発巣腫瘍マーカーを発見するために原発腫瘍を用いることができるという事実は、最近のいくつかの発見と一致する。例えば、Weigeltと同僚は、原発性乳房腫瘍の遺伝子発現プロファイルは、遠隔転移においても維持されるということを示した。Weigelt他（２００３年）参照。Italianoと共同研究者は、ＩＨＣによって判定されるＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）の状態が、８０個の原発性結腸直腸がん腫瘍、および、８０個の関係する転移においても同様であることを発見した。Italiano他（２００５年）参照。その８０個のうち５個のみが、ＥＧＦＲの状態において不一致を示した。Italiano他（２００５年）参照。Backusと同僚は、乳房組織およびその他の組織のゲノム規模遺伝子発現解析を用いて、乳がん転移を検出するための推測上のマーカーを同定し、そして、マンマグロビンおよびＣＫ１９が、９０％の感受性と９４％の特異性で、乳房センチネルリンパ節における臨床上有効な転移（clinically acctionable metastasis）を検出したことを明らかにした。Backus他（２００５年）参照。
【００９６】
マイクロアレイに基づいた原発組織の研究は、既知のマーカーの特異性および感受性を確認した。結果として、Ｆ５は例外であるが、用いられたマーカーすべてが、本発明で調べられた組織に対して高い特異性を有する。Argani他（２００１年）；Backus他（２００５年）；Cunha他（２００５年）；Borgono他（２００４年）；McCarthy他（２００３年）；Hwang他（２００４年）；Fleming他（２０００年）；Nakamura他（２００２年）；および、Khoor他（１９９７年）参照。最近の研究は、ＩＨＣを用いると、ＰＳＣＡは前立腺がん転移において過剰発現されることを明らかにした。Lam他（２００５年）参照。Dennis他（２００２年）はまた、ＰＳＣＡがすい臓がんおよび前立腺がんに対する原発巣腫瘍マーカーとして用いられることができることを明らかにした。本明細書において示すように、ＰＳＣＡの強い発現は、いくつかの前立腺組織においても、ＲＮＡレベルで見出されるが、その解析にＰＳＡ（前立腺特異抗原）を含むことによって、前立腺がんとすい臓がんとを直ちに分離することができる。本発明で新規に発見されたことは、すい臓原発巣組織の（ＰＳＣＡに対して）補足的なマーカーとして、Ｆ５を用いるということである。原発組織のマイクロアレイデータ群、および、ＦＦＰＥ転移を用いたｑＲＴＰＣＲデータ群両方において、Ｆ５はＰＳＣＡを補足した（図４および表３）。
【表３】
0005405110.tif 000015
【００９７】
従来の研究者たちは、ＩＨＣ、もしくは、マイクロアレイを用いたＣＵＰ解析を生み出してきた。Su他（２００１年）；Ramaswamy他（２００１年）；および、Bloom他（２００４年）参照。さらに最近では、ＳＡＧＥ法が、小規模のｑＲＴＰＣＲマーカーパネルと組み合わされてきた。Dennis（２００２年）；および、Buckhaults他（２００３年）参照。本研究は、マイクロアレイに基づいた発現プロファイル解析を、ｑＲＴＰＣＲ解析の小規模のパネルと組み合わせた最初のものである。原発組織に対するマイクロアレイ研究は、これまでにＳＡＧＥ法によって同定されたのと同一の原発巣組織マーカーのうちのすべてではないが、一部を同定した。いくつかの研究は、ＳＡＧＥ法に基づいたプロファイル解析データとＤＮＡマイクロアレイに基づいたプロファイル解析データとが適度に一致することを示してきたし、そして、その相互関係がより高い発現量を伴う遺伝子に対して向上することを示してきた。van Ruissen他（２００５年）；および、Kim（２００３年）参照。例えば、Dennisと同僚は、ＰＳＡ、ＭＧ、ＰＳＣＡ、および、ＨＵＭＳＰＢを同定し、一方Buckhaultsと共同研究者［Dennis他（２００２年）参照］はＰＤＥＦを同定した。ｑＲＴＰＣＲを用いたＣＵＰ解析の実施は、それが強固な技術であるために、そして、ＩＨＣ以上の性能優位性を有するかもしれないために、好まれている。Al-Mulla他（２００５年）；および、Haas他（２００５年）参照。本明細書に示したように、ｑＲＴＰＣＲプロトコルは、１段階反応において遺伝子特異的プライマーを用いることにより改良された。このことは、遺伝子特異的プライマーを、ＦＦＰＥ組織での１段階ｑＲＴＰＣＲ反応に用いた最初の例である。他の研究者は、２段階ｑＲＴＰＣＲ（ｑＰＣＲが後に続く１反応でのｃＤＮＡ合成）を行ったか、または、ランダムヘキサマーもしくは先端を切った遺伝子特異的プライマー（truncated gene-specific primers）を用いたかのいずれかである。Abrahamsen他（２００３年）；Specht他（２００１年）；Godfrey他（２０００年）；Cronin他（２００４年）；および、Mikhitarian他（２００４年）参照。
【００９８】
〔実施例２〕
ＣＵＰ−ＦＦＰＥ全ＲＮＡ単離プロトコル
（Highpure kitカタログ番号３２７０２８９）
目的：
ＦＦＰＥ組織からの全ＲＮＡの単離
【００９９】
手順：
＜希釈標準溶液(working solution)の準備＞
１．キットのタンパク質分解酵素Ｋ（ＰＫ）
凍結乾燥物(lyophilizate)を４．５ｍＬの溶出バッファーに溶解する。等分し、−２０℃で保管すれば、１２ヶ月間安定である。
ＰＫ  −  ４×２５０ｍｇ（カタログ番号３１１５８５２）
凍結乾燥物を１２．５ｍＬの溶出バッファー［１×ＴＥバッファー（ｐＨ７．４〜７）］に溶解する。
等分し、−２０℃で保管する。
２．洗浄バッファーＩ
洗浄バッファーＩに、６０ｍＬの無水エタノールを加え、室温で保管する。
３．洗浄バッファーＩＩ
洗浄バッファーＩＩに２００ｍＬの無水エタノールを加え、室温で保管する。
４．ＤＮＡ分解酵素Ｉ
凍結乾燥物を４００μＬの溶出バッファーに溶解する。等分して、−２０℃で保管すれば、１２ヶ月間安定である。
【０１００】
＜パラフィンブロックを１２個のブロックに切り出す（１２ブロック×２チューブ＝２４チューブ）  〜３０〜４５分間＞
ブロックから切り取られた切片は、ＲＮＡ抽出のために即座に処理されなければならない。
１．ミクロトーム(Microtome)上の清潔で鋭利なかみそり刃を用い、切り出された組織ブロック（３〜４×５〜１０ｍｍのサイズ）から６×１０ミクロン厚さの切片を切り出す。
注意：新たなブロック‐組織切片が得られるまでワックス切片を廃棄する。使用されたブロック‐最初の３個の組織切片を廃棄する。
２．切られた組織をすぐさま１．５ｍＬのマイクロ遠心機のチューブに入れ、水分を最小限にするためにかたくふたを閉める。
３．表４に示すように、腫瘍の大きさに基づいて切片数を採取することを薦める。
【表４】
0005405110.tif 000016
【０１０１】
＜脱パラフィン化  〜３０〜４５分間＞
１．１．０ｍＬのキシレンを各サンプルに加え、１０〜２０秒間激しく撹拌し、室温で２〜５分インキュベートする。最大速度で２分間遠心分離する。上澄みを注意深く取り除く。
注意：もし組織が浮かんでくるようであれば、さらに２分間遠心分離する。
２．ステップ１をくり返す。
３．最大速度で２分間遠心分離する。上澄みを取り除く。
４．１ｍＬの無水エタノールを加え、１分間激しく撹拌する。最大速度で２分間遠心分離する。上澄みを取り除く。
５．ステップ４をくり返す。
６．チューブを一時的にペーパータオルの上に並べ（blot）、残りのエタノールを除去する。
７．組織ペレットを５５℃のオーブンで５〜１０分間乾燥させる。
注意：エタノールは完全に取り除き、ペレットを十分に乾燥させることが重要である。残留したエタノールはＰＫによる消化を阻害する可能性がある。
注意：もしＰＫが−２０℃中にあるならば、室温で２０〜３０分間あたためる。
【０１０２】
＜ＲＮＡ抽出  〜２．５〜３時間＞
１．１つの組織ペレットに、１００μＬの組織溶解バッファー、１６μＬの１０％ＳＤＳ、および、８０μＬのタンパク質分解酵素Ｋ希釈標準溶液を加え、適当な間隔で簡単に撹拌し、そして、４００回転／分で振り混ぜながら５５℃で２時間インキュベートする。
２．３２５μＬの結合バッファーと３２５μＬの無水エタノールを加える。ピペッティングで上下させることによりやさしく混和する。
３．溶解物を最大速度で２分間遠心分離する。
４．フィルターチューブと収集チューブ（１２チューブ分）を組み合わせ、溶解物の上澄みをフィルターにピペットで入れる。
５．８０００回転／分で３０秒間遠心分離し、流出物を廃棄する。
注意：もしＲＮＡをさらに２つの組織ペレット準備物から集める必要がある場合、ステップ４〜５をくり返すことができる。
６．８０００回転／分で３０秒間の遠心分離を繰り返し、フィルターを乾燥させる。
７．５００μＬの洗浄バッファーＩ希釈標準溶液をカラムに加え、８０００回転／分で１５〜３０秒間遠心分離し、流出物は廃棄する。
８．５００μＬの洗浄バッファーＩＩ希釈標準溶液を加える。８０００回転／分で１５〜３０秒間遠心分離し、流出物は廃棄する。
９．３００μＬの洗浄バッファーＩＩ希釈標準溶液を加え、８０００回転／分で１５〜３０秒間遠心分離し、流出物は廃棄する。
１０．High Pure filterを最大速度で２分間遠心分離する。
１１．High Pure filterを新しい１．５ｍＬチューブの中に入れ、９０μＬの溶出バッファーを加える。室温で１〜２分インキュベートする。８０００回転／分で１分間遠心分離する。
【０１０３】
＜ＤＮＡ分解酵素Ｉ処理  〜１．５時間＞
１２．溶出物に１０μＬの１０×ＤＮＡ分解酵素インキュベーションバッファー(DNase incubation buffer)、および、１．０μＬのＤＮＡ分解酵素Ｉ希釈標準溶液を加え、混和する。３７℃で４５分間（２．０μＬのＤＮＡ分解酵素Ｉに対しては、３０分間）インキュベートする。
１３．２０μＬの組織溶解バッファー、１８μＬの１０％ＳＤＳ、および、４０μＬのタンパク質分解酵素Ｋ希釈標準溶液を加える。軽く撹拌する。５５℃で３０分間（３０〜６０分間）インキュベートする。
１４．３２５μＬの結合バッファー、および、３２５μＬの無水エタノールを加える。混和し、収集チューブと組み合わせた新しいHigh Pure filter tubeにピペットで入れる（１２チューブ分）。
１５．８０００回転／分で３０秒間遠心分離し、流出物を廃棄する。
１６．８０００回転／分で３０秒間の遠心分離を繰り返し、フィルターを乾燥させる。
１７．カラムに５００μＬの洗浄バッファーＩ希釈標準溶液を加える。８０００回転／分で１５秒間遠心分離し、流出物を廃棄する。
１８．５００μＬの洗浄バッファーＩＩ希釈標準溶液を加える。８０００回転／分で１５秒間遠心分離し、流出物を廃棄する。
１９．３００μＬの洗浄バッファーＩＩ希釈標準溶液を加える。８０００回転／分で１５秒間遠心分離し、流出物を廃棄する。
２０．High Pure filterを最大速度で２分間遠心分離する。
２１．High Pure filterチューブを新しい１．５ｍＬチューブ中に入れる。５０μＬの溶出バッファーを加え；室温で１〜２分間インキュベートする。８０００回転／分で１分間遠心分離し、溶出されたＲＮＡを収集する。
２２．溶出物を最大速度で２分間遠心分離し、底にあるガラス繊維をかき乱すことなしに、上澄みを新しいチューブに移す。
２３．ＯＤ２６０／２８０の示度を採り、５０ｎｇ／μＬに希釈する。−８０℃で保管する。
【０１０４】
＜ＣＵＰ−ＡＳＲ分析プロトコル（ＡＢＩ７９００）＞
目的：ＣＵＰサンプルの原発巣組織を決定するためにｑＲＴＰＣＲを用いる。
対照設定：
１．陽性対照（表５、および、図７中プレート設定におけるプレートＣを参照。）
【表５】
0005405110.tif 000017
【０１０５】
２．標準曲線（表６、および、図７中プレート設定におけるプレートＣを参照。）
ステップ１：標準曲線は、表６に示すように正確に設定された。
【表６】
0005405110.tif 000018
【０１０６】
酵素混合液；
１．原混合液(master mix)：酵素（Ｔｔｈ）／抗体（ＴＰ６−２５）。表７参照のこと。
【表７】
0005405110.tif 000019
【０１０７】
ＣＵＰ原混合液：
１．２．５×ＣＵＰ原混合液（表８〜１１）：
【表８】
0005405110.tif 000020
【０１０８】
【表９】
0005405110.tif 000021
【０１０９】
【表１０】
0005405110.tif 000022
【０１１０】
【表１１】
0005405110.tif 000023
【０１１１】
プライマーおよびプローブ混合液：
チューブ当たり２５０μＬの分割量、−２０℃で凍結させる。
【０１１２】
反応混合液：
１．ＣＵＰ原混合液(CUP Master Mix)（ＣＭＭ）：（表１２〜１４、および、図７中プレート設定におけるプレートＡを参照。）
【表１２】
0005405110.tif 000024
好ましくは、プレート当たりの各実行数は、３５６反応のみである。すなわち、１２個のマーカーを伴う１２個のサンプル（各々２回で２８８反応）、２回の１０個の標準曲線対照(std curve control)（２０反応）＋各マーカーの２個の陽性対照および２個の陰性対照（４×１２＝４８反応）である。
【０１１３】
最大で４．３μＬのサンプルになるように、サンプル容量の水を調整して、よく混和する。
【表１３】
0005405110.tif 000025
【０１１４】
２．ＴｏＯマーカー：よく混和する。
【表１４】
0005405110.tif 000026
【０１１５】
３．βアクチンおよびＰＢＧＤマーカー：よく混和する。
サンプル設定：
【表１５】
0005405110.tif 000027
【０１１６】
１．ＣＵＰサンプル：９６ウェルプレートに１２サンプル：Ａ１〜Ａ１２（表１６、および、図７中プレート設定におけるプレートＢを参照。）；５０ｎｇ／μＬのものを５０μＬの分割量（２μＬ／ｒｘｎ）。
プレートへの充填：
１．３８４ウェルプレート設定：（図７のプレート設定におけるプレートＤを参照。）
２μＬのサンプルおよび８μＬのＣＭＭをプレートに充填する（サンプル＝５０ｎｇ／μＬ）。
４μＬのサンプルおよび６μＬのＣＭＭをプレートに充填する（サンプル＝２５ｎｇ／μＬ）。
プレートは封をして、ラベルをはる。２０００回転／分で１分間遠心分離する。
【０１１７】
ABI 7900 HT設定：ABI 7900の中に置く。プログラム「CUP384」を選び、スタートボタンを押す。
【表１６】
0005405110.tif 000028
データを分析し、Ｃｔ値を抽出し、アルゴリズムに挿入する。
【０１１８】
〔実施例３〕
ＣＵＰアルゴリズム
ＨＰＴ、ＭＧＢ、ＰＤＥＦ、ＰＳＡ、ＳＰ−Ｂ、ＴＦＦ、ＤＳＧ、ＷＴ１、ＰＳＣＡ、および、Ｆ５に対してΔＣｔ値を標準化したアクチンを、もともと選ばれた原発巣組織に基づいた６つの群の中に置く。定数９．００、１１．００、７．５０、５．００、１０．００、９．５０、６．５０、８．００、９．００、および、８．００のそれぞれが、各々のΔＣｔから差し引かれた。それから、各サンプルに対して、６つの群（ＨＰＴ；ＭＧＢ、もしくは、ＰＤＥＦの最小値；ＰＳＡ；ＳＰ−Ｂ、ＴＦＦ、もしくは、ＤＳＧの最小値；ＷＴ１；および、ＰＳＣＡ、もしくは、Ｆ５の最小値）のそれぞれからの最小のＣＴ値が、そのグループの代表的な変数として選択される。
【０１１９】
これらの変数および転移部位は、線形判別式を用いてサンプルを分類するために用いられる。２つの異なるモデル（１つは男性のためのもので、１つは女性のためのものであるが）が、ＭＡＳＳライブラリ関数「ｌｄａ」［Ｒ（２．０．１版）におけるVenables他（２００２年）参照］を用いた訓練データから構築されるべきである。各ＴｏＯに対する事後確率はそれから、男性のモデル、もしくは、女性のモデルのいずれかのための「予測」関数を用いて計算される。
【０１２０】
男性のためのモデルにおいて用いられる変数は、ＨＰＴ；ＰＳＡ；（「ＳＰ−Ｂ」、「ＴＦＦ」、「ＤＳＧ３」）の最小値；（「ＰＳＣＡ」、「Ｆ５」）の最小値；および、転移部位である。転移部位カテゴリーは、結腸、肺、卵巣、および、他のすべての組織に対応する４つの水準を有する。女性のためのモデルでは、その変数は、ＨＰＴ；（「ＭＧＢ」、「ＰＤＥＦ」）の最小値；（「ＳＰ−Ｂ」、「ＴＦＦ」、「ＤＳＧ３」）の最小値；ＷＴ１；（「ＰＳＣＡ」、「Ｆ５」）の最小値；および、転移部位である。
【０１２１】
Ｒコードの例は、以下のとおりである。
0005405110.tif 000029
このコードを実行するためには、CUP.MIN.NORMと呼ばれるデータフレームが、前記のように各原発巣組織群に対して計算された最小値を持つ訓練データを含むことが必要である。
【０１２２】
Classは原発巣組織に対応し、backgroundは前記の転移部位に対応する。
【０１２３】
試験データをCUP2.MIN.NORM.TESTの中に含むことができ、列ｉにおける特異的サンプルを、予測関数を用いることで試験することができる。また、試験データは、訓練群と同じフォーマットでなければならず、同様に、それに適用された最小値調整を有さなければならない。
【０１２４】
〔実施例４〕
ＣＵＰが解決されたサンプル
ＣＵＰが解決されたか、もしくは、解決されなかった４８個のサンプルが、真のＣＵＰサンプルに対する相関を決定するために比較された。用いられた方法は、実施例１〜３に記載の方法であった。得られた結果を表１７に示す。解決されなかったＣＵＰのうち、１１個のサンプルが試験され、８個のサンプルで診断がなされ、３個のサンプルは他のカテゴリーであった。
【表１７】
0005405110.tif 000030
【０１２５】
〔実施例５〕
ＣＵＰ解析の限界範囲
図８は、ＣＵＰ解析の限界範囲（limits）を決定するために、実施例１〜３において記載された方法を用いて得られた結果について示している。解析性能は、ＲＮＡ濃度の範囲にわたって試験され、ＣＵＰ解析は１００〜１２．５ｎｇのＲＮＡの範囲で効果的であることがわかった。
【０１２６】
〔実施例６〕
ｑＲＴＰＣＲ解析
材料と方法
＜マイクロアレイ解析のための凍結組織サンプル＞
全体で７００個のヒト凍結原発組織が、遺伝子発現マイクロアレイプロファイル解析のために用いられた。サンプルは、さまざまな学術機関［Washington University（米国ミズーリ州セントルイス）、Erasmus Medical Center（オランダ国ロッテルダム）を含む］および、民間の組織バンク会社［Genomics Collaborative, Inc（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）、Asterand（米国ミシガン州デトロイト）、Oncomatrix（米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ）、Clinomics Biosciences（米国マサチューセッツ州ピッツフィールド）を含む］から入手された。各々の標本に対して、患者の人口学上の情報、臨床上の情報、および、病理学上の情報も同様に収集された。各々のサンプルの組織病理学的特徴は、診断を確認するために、ならびに、サンプルの保存状態、および、腫瘍の内容を推定するために再検査された。
【０１２７】
＜ＲＮＡ抽出およびAffymetrix Gene Chipハイブリダイゼーション＞
７０％を超える腫瘍細胞、良性サンプル、および、正常サンプルを有する凍結がんサンプルを細断し、トリゾール試薬（Invitrogen、米国カリフォルニア州カールズバッド）中で、機械的なホモジェナイザー(homogenizer)（UltraTurrex T8、ドイツ国）によって均質化した。組織は、凍結組織からＲＮＡを単離するための標準的なトリゾールプロトコルに従ってトリゾール試薬中で均質化された（Invitrogen、米国カリフォルニア州カールズバッド）。遠心分離後、上液相を収集し、−２０℃でイソプロピルアルコールによって全ＲＮＡを沈降させた。ＲＮＡペレットを７５％エタノールで洗浄し、水中に再び溶解して、使用するまで−８０℃で保管した。
【０１２８】
ＲＮＡの品質を、Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano Assay（Agilent Technologies、米国カリフォルニア州パロアルト）によって検査した。標識されたｃＲＮＡを準備し、全体で２２，０００個のプローブ群を含む高密度オリゴヌクレオチドアレイHu133A Gene Chip（Affymetrix、米国カリフォルニア州サンタクララ）により、メーカー標準プロトコルにしたがって、ハイブリダイズさせた。アレイは、Affymetrixプロトコルおよびスキャナーを用いてスキャンされた。その後の解析のため、各プローブ群は、別々の遺伝子であると考えられた。各遺伝子の発現量は、Affymetrix Gene Chip analysis software MAS 5.0を用いて計算された。すべてのチップは、以下の３つの品質管理基準を満たした。すなわち、アレイに対する「存在」コールの割合が３５％を超え；広範囲の標的強度を６００としたときにスケール係数は１２未満であり；平均のバックグラウンドレベルは１５０未満であった。
【０１２９】
＜マーカー候補の選択＞
肺組織、結腸組織、乳房組織、卵巣組織、および、前立腺組織に対する原発巣組織（ＴｏＯ）マーカー候補を選択するために、全体で６８２個の、乳房、結腸、肺、卵巣、前立腺由来の正常組織、良性組織、および、がん性組織に及ぶＲＮＡサンプルにおいて、プローブ群の発現量が測定された。組織特異的マーカー候補は、統計的クエリの数に基づいて選択された。
【０１３０】
すい臓がんマーカー候補を生むために、１３個の原発性すい臓管腺がん、５個の正常すい臓組織、ならびに、９８個の肺がん標本、結腸がん標本、乳がん標本、および、卵巣がん標本における遺伝子発現プロファイルが用いられ、すい臓腺がんマーカーが選択された。２つのクエリを実行した。第１のクエリでは、すい臓サンプルにおいて、少なくとも２個の「存在」コールを有する１４５４７個の遺伝子を含むデータ群が作り上げられた。正常組織と比較して、すい臓がんにおいて過剰発現していることがＴ検定（ｐ＜０．０５）によって特定された、全体で２７３６遺伝子が同定された。１１パーセンタイルのすい臓がんにおいて最小の発現が、結腸がん、および、肺がんにおける最大値よりも、少なくとも２倍である遺伝子を選択し、４５個のプローブ群を作った。最終ステップとして、結腸がん、肺がん、乳がん、および、卵巣がんにおける最大発現よりも、少なくとも２倍の最大発現する６個の遺伝子が選ばれた。第２のクエリでは、すべての乳房標本、結腸標本、肺標本、および、卵巣標本において、多くとも２個の「存在」コールを有する４６５４個のプローブ群のデータ群が作り出された。すい臓正常サンプル、および、すい臓がんサンプルにおいて、少なくとも２個の「存在」コールを有する、全体で１６０個の遺伝子が選択された。１６０個の遺伝子のうち１０個の遺伝子が、すい臓がん組織と正常組織との間での発現量のちがいを比較した後に選択された。２つのすい臓に対するクエリ両方を結合した。
【０１３１】
遺伝子発現プロファイル解析に加えて、いくつかのマーカーが文献から選択された。すべてのクエリの結果は、各々の組織の種類に対するＴｏＯマーカー候補の簡単な一覧を作成するために組み合わせられた。各マーカーの感受性および特異性が推定された。組織をその原発巣によって識別する最も高い能力を示したマーカーが、マーカーの重複およびその相補性に基づいたＲＴ−ＰＣＲ試験のために指定された。
【０１３２】
＜原発巣のわかっているＦＦＰE転移性がん、およびＣＵＰ組織＞
全体で３８６個の原発巣のわかっているＦＦＰＥ転移性がん（ステージＩＩＩ〜ＩＶ）、および、２４個のＦＦＰＥ原発性前立腺腺がんを、さまざまな業者［Proteogenex（米国カリフォルニア州ロサンゼルス）、Genomic Collaborative, Inc.（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）、Asterand（米国ミシガン州デトロイト）、Ardais（米国マサチューセッツ州レキシントン）、および、Oncomatrix（米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ）を含む］から入手した。４８個の原発腫瘍のわかっている転移性腺がん、および、ＣＵＰ組織の独立した群については、Albany Medical College（米国ニューヨーク州オールバニー）から手に入れた。各々の標本に対して、患者の人口学上の情報、臨床上の情報、および病理学上の情報が収集された。各々のサンプルの組織病理学的特徴は、診断を確認するために、ならびに、サンプルの保存状態、および、腫瘍の内容を推定するために再検査された。転移サンプルに対する転移性がんおよびＴｏＯの診断は、患者の病歴、および、転移性がんを対応する原発腫瘍と比較することによる組織学的な評価に基づいて、明確に確立された。
【０１３３】
＜ＦＦＰＥサンプルからのＲＮＡ単離＞
パラフィン組織切片からのＲＮＡ単離は、以下の修正を伴うHigh Pure RNA Paraffin Kit manual（Roche）に記載されたようにした。パラフィン包埋組織サンプルは、包埋された転移の大きさにしたがって切断された（大きさが２〜５ｍｍであれば９×１０μｍ、６〜８ｍｍであれば６×１０μｍ、８〜１０ｍｍ以上であれば３×１０μｍ）。切片をキットマニュアルに記載のように脱パラフィン化し、組織ペレットを５５℃のオーブンで５〜１０分間乾燥させ、１００μＬの組織溶解バッファー、１６μＬの１０％ＳＤＳ、および、８０μＬのタンパク質分解酵素Ｋ中に再懸濁した。サンプルを５５℃、４００回転／分、２時間に設定したサーモミキサー内で、撹拌およびインキュベートした。その後のサンプル処理を、High Pure RNA Paraffin Kit manualにしたがって実行した。サンプルを、分光光度計によって得られたＯＤ  ２６０／２８０示度により定量し、５０ｎｇ／μＬに希釈した。単離されたＲＮＡを、使用するまでＲＮＡ分解酵素の含まれない水中に−８０℃で保管した。
【０１３４】
＜マーカー候補のプレスクリーニングのためのｑＲＴＰＣＲ＞
各サンプル由来の１μｇの全ＲＮＡを、業者（Invitrogen、米国カリフォルニア州カールズバッド）の取扱説明書にしたがって、Superscript II逆転写酵素を用いて、ランダムヘキサマーで逆転写した。試験される遺伝子マーカー候補、および、対照遺伝子ＡＣＴＢのためのプライマーおよびＭＧＢ−プローブは、Primer Express software（Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて設計し、ABI Assay-on-Demand（Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ）も用いられた。社内で設計されたプライマー、および、プローブはいずれも、９０％を超える最適な増幅効率で試験された。ＲＴ−ＰＣＲ増幅は、２０ｍＬの反応混合液［２００ｎｇの鋳型ｃＤＮＡ、２×TaqMan（登録商標）universal PCR master mix（１０ｍＬ）（Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ）、５００ｎＭフォワードプライマー、および、リバースプライマー、ならびに、２５０ｎＭプローブを含む］中で実行された。反応はABI PRISM 7900HT Sequence Detection System（Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ）上で行われた。サイクリング条件は、５０℃、２分間のAmpErase UNGの活性化；９５℃、１０分のポリメラーゼの活性化；ならびに９５℃、１５秒間、および、アニーリング温度（６０℃）、６０秒間を５０サイクル；である。各々の解析において、「鋳型のない（no-template）」対照が、鋳型ｃＤＮＡとともに、目的の遺伝子と対照遺伝子両方に対して、２個ずつ含まれた。各標的遺伝子の相対的な発現は、標的遺伝子のＣｔ値から対照遺伝子（ＡＣＴＢ）のＣｔ値を差し引いた値に等しいΔＣｔとして表された。
【０１３５】
＜最適化された１段階ｑＲＴＰＣＲ＞
適当なｍＲＮＡ参照配列アクセッション番号が、Oligo 6.0とともに、TaqMan（登録商標）ＣＵＰ解析［肺がんマーカー：ヒト肺サーファクタント関連タンパク質Ｂ（ＨＵＭＰＳＰＢＡ）、甲状腺転写因子１（ＴＴＦ１）、デスモグレイン３（ＤＳＧ３）、結腸直腸がんマーカー：カドヘリン１７（ＣＨＤ１７）、乳がんマーカー：マンマグロビン（ＭＧ）、前立腺由来ets転写因子（ＰＤＥＦ）、卵巣がんマーカー：ウィルムス腫１（ＷＴ１）、すい臓がんマーカー：前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、凝固第５因子（Ｆ５）、前立腺マーカー：カリクレイン３（ＫＬＫ３）］、および、ハウスキーピング解析［βアクチン（β−Ａｃｔｉｎ）、ハイドロキシメチルビラン合成酵素（ＰＢＧＤ）］を開発するために用いられた。最適化された１段階ｑＲＴ−ＰＣＲ解析のための、遺伝子特異的プライマー、および、加水分解酵素プローブは、表２（配列番号１１〜５８）に列記されている。エキソン−イントロンスプライシング部位周辺に解析を設計することで、ゲノムＤＮＡ増幅を除外した。加水分解プローブは、５’末端のヌクレオチドにおいてＦＡＭ（レポーター染料）で、３’末端のヌクレオチドにおいてＢＨＱ１−ＴＴ［インターナルクエンチング染料］で標識された。
【０１３６】
遺伝子特異的ＲＮＡの定量は、ABI Prism 7900HT sequence detection system（Applied Biosystems）の３８４ウェルプレートにおいて、実行された。各サーモサイクラーの実行のために、キャリブレーターおよび標準曲線を増幅した。各マーカーためのキャリブレーターは、生体外転写産物中の標的遺伝子からなり、それらはラットの腎臓由来のキャリアＲＮＡ中、１×１０５コピーで希釈したものであった。ハウスキーピングマーカーための標準曲線は、生体外転写産物中の標的遺伝子からなり、それらはラットの腎臓由来のキャリアＲＮＡ中、１×１０７、１×１０５、１×１０３コピーで連続希釈したものであった。標的遺伝子がない対照も、周囲の汚染がないことを確かめるために、各解析の実行中に含まれた。すべてのサンプルおよび対照は繰り返して実行された。ｑＲＴＰＣＲは、１０μＬの反応物中で一般的な研究室で用いられる試薬で実行された。その１０μＬの反応物には、ＲＴ−ＰＣＲバッファー（５０ｎＭビシン／水酸化カリウムｐＨ８．２、１１５ｎＭ酢酸カリウム、８％グリセロール、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、３．５ｍＭ硫酸マンガン、各０．５ｍＭのｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、添加物（２ｍＭトリス塩酸バッファーｐＨ８、０．２ｍＭウシアルブミン、１５０ｍＭトレハロース、０．００２％ Tween20）、酵素混合液［２Ｕ  Ｔｔｈ（Roche）、０．４ｍｇ／μＬ  Ａｂ  ＴＰ６−２５］、プライマーおよびプローブ混合液（０．２μＭプローブ、０．５μＭプライマー）を含んだ。その後のサイクリングパラメータは、９５℃、１分間を１サイクル；５５℃、２分間を１サイクル；温度上昇５％；７０℃、２分間を１サイクル；９５℃、１５秒間、５８℃、３０秒間を４０サイクル；であった。ＰＣＲ反応が完了した後、基準および閾値をABI 7900HT Prism softwareで設定し、計算したＣｔ値をMicrosoft Excelに取り込んだ。
【０１３７】
＜１段階反応対２段階反応＞
２段階反応を１段階反応のＲＴ−ＰＣＲと比較するために、２段階反応の第一鎖合成は、１反応あたり、１００ｎｇのランダムヘキサマー、もしくは、遺伝子特異的プライマーのいずれかを用いて実行した。第１段階目では、１１．５μＬの混合液１（プライマー、および、１μｇの全ＲＮＡ）を６５℃まで５分間加熱し、その後、氷上で冷却した。８．５μＬの混合液２［１×バッファー、０．０１ｍＭ  ＤＴＴ、各０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．２５Ｕ／μＬ RNasin（登録商標）、１０Ｕ／μＬ Superscript III］を混合液１に添加し、５０℃で、６０分間インキュベートした後、９５℃で、５分間インキュベートした。ｃＤＮＡを、使用できる状態になるまで、−２０℃で保管した。２段階反応の第２段階目のｑＲＴＰＣＲは、以下のサイクリングパラメータを用いて前述のとおり実行された：９５℃、１分間を１サイクル；９５℃、１５秒間、５８℃、３０秒間を４０サイクル。１段階反応のためのｑＲＴＰＣＲは、前の段落に記載のとおり正確に実行された。１段階および２段階反応はともに、１００ｎｇの鋳型（ＲＮＡ／ｃＤＮＡ）に対して実行された。ＰＣＲ反応が完了した後、基準および閾値をABI 7900HT Prism softwareで設定し、計算したＣｔ値をMicrosoft Excelに取り込んだ。
【０１３８】
＜アルゴリズム開発＞
線形判別器は、Ｒ言語（２．１．１版）におけるＭＡＳＳ（VenablesおよびRipley）ライブラリ関数「ｌｄａ」を用いて構築された。用いられたモデルは、患者の性別に依存するのと同様に、転移が抽出された組織に依存する。肺の転移部位、結腸の転移部位、もしくは、卵巣の転移部位に遭遇する場合、その分類の事前確率は、転移部位に対して同等である分類に対して、０に設定される。さらに、男性患者においては、乳房分類および卵巣分類に対する事前確率は０に設定され、一方、女性患者においては、前立腺分類の事前確率は０に設定される。このモデルで用いられる他の事前確率はすべて等価である。さらに、各サンプルに対する分類分けは、各分類に対するモデルによって決定される最も高い事後確率に基づいている。モデル性能を推定するために、１つ取って置き交差検定(leave-one-out cross-validation)を行った。このことに加えて、データ群は、各分類間の比例関係を維持しながら、ランダムに半分に分けられ訓練群と試験群とされた。このランダムな分割を３回くり返した。
【０１３９】
結果
本発明の最終目的は、転移性がん原発巣組織を予測するためのｑＲＴＰＣＲ解析を開発することである。実験的な作業は２つの主要な部分から成った。１番目の部分は、組織特異的なマーカー候補の指定、ＦＦＰＥ転移性がん組織上でのそれら候補の確認、および、解析のための１０個のマーカーの選択を含んだ（図９Ａ）。２番目の部分は、ｑＲＴＰＣＲ解析の最適化の後に、ＦＦＰＥ転移性がんの他の群に対する解析の実行、予測アルゴリズムの構築、そのアルゴリズムの交差検定、および、独立したサンプル群に対する確認を含んだ（図９Ｂ）。
【０１４０】
＜サンプルの特徴＞
全体で７００個の凍結原発組織サンプル由来のＲＮＡが、遺伝子発現プロファイル解析、および、組織の種類特異的な遺伝子の同定に用いられた。サンプルには、５４５個の原発がん（２９個の肺がん、１３個のすい臓がん、３１５個の乳がん、１２８個の結腸直腸がん、３８個の前立腺がん、２２個の卵巣がん）、３７個の良性病変（１個の肺病変、４個の結腸直腸病変、６個の乳房病変、２６個の前立腺病変）、および、１１８個の正常組織（３６個の肺組織、５個のすい臓組織、３６個の結腸直腸組織、１４個の乳房組織、３個の前立腺組織、２４個の卵巣組織）が含まれた。
【０１４１】
本研究において、全体で３７５個の原発巣がわかっている転移性がん（ステージＩＩＩ〜ＩＶ）、および、２６個の前立腺原発性腺がんのサンプルが用いられた。転移性がんは、肺がん、すい臓がん、結腸直腸がん、卵巣がん、前立腺がんから生じ、同様に、他のがんからも生じた。「その他」のサンプルカテゴリーは、肺、すい臓、結腸、乳房、卵巣および前立腺以外の組織由来の転移から成った。患者の特徴は表１８にまとめられている。
【表１８】
0005405110.tif 000031
【０１４２】
サンプルを２つの群に分けた。それらは、マーカー候補の組織特異的な差異のある発現を確認するために用いられる確認群（２０５個の標本）、および、最適化された１段階ｑＲＴＰＣＲ手法を試験し、予測アルゴリズムを訓練するために用いられる訓練群（２６０個の標本）である。２０５個のサンプルからなる１番目の群は、２５個の肺がん、４１個のすい臓がん、３１個の結腸直腸がん、３３個の乳がん、３３個の卵巣がん、１個の前立腺がん、２３個のその他のがんの転移、および、１８個の前立腺原発性がんを含んだ。２６０個のサンプルからなる２番目の群は、５６個の肺がん、４３個のすい臓がん、３０個の結腸直腸がん、３０個の乳がん、４９個の卵巣がん、３２個のその他のがんの転移、および、２０個の前立腺原発性がんを含んだ。１６個の肺がん、２１個のすい臓がん、１５個のその他の転移性がん、および、１２個の前立腺原発性がんを含む６４の標本が、両方の群において同一の患者由来であった。
【０１４３】
Albany Medical Collegeから入手した独立のサンプル群は、３３個のＣＵＰ標本（うち２２個が原発腫瘍が示唆された）、および、１５個の原発巣のわかっている転移性がんから構成された。示唆された原発腫瘍を有するＣＵＰに対して、形態学上の特徴、および／もしくは、ＩＨＣマーカーパネルで試験された結果に基づいて診断がなされた。患者の人口学上の特徴、臨床上の特徴、および、病理学上の特徴は表１８に示されている。
【０１４４】
＜マーカー候補の選択＞
５つの原発組織の種類（肺、結腸、乳房、卵巣、前立腺）の遺伝子発現プロファイルの分析の結果、ｑＲＴＰＣＲ試験のための１３個の組織特異的マーカー候補が指定された。上位の候補は限局された場所での（in situ）従来のがん研究において同定されてきたものであった。Argani他（２００１年）；Backus他（２００５年）；Cunha他（２００５年）；Borgono他（２００４年）；McCarthy他（２００３年）；Hwang他（２００４年）；Fleming他（２０００年）；Nakamura他（２００２年）；および、Khoor他（１９９７年）参照。マイクロアレイデータの分析に加えて、２個のマーカーが文献から選択された。それらには、補足的な肺扁平上皮がん(lung squamous cell carcinoma)マーカーＤＳＧ３、および、乳がんマーカーＰＤＥＦを含む。Backus他（２００５年）参照。マイクロアレイデータにより、これらのマーカーの高い感受性、および、特異性が確認された。
【０１４５】
特別なアプローチがすい臓特異的なマーカーを同定するために用いられた。まず、５つのすい臓マーカー候補が解析された。それらのマーカー候補は、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、セリンプロテイナーゼ阻害剤、クレードＡメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）、サイトケラチン７（ＫＲＴ７）、マトリックスメタロプロテアーゼ１１（ＭＭＰ１１）、および、ムチン４（ＭＵＣ４）［Varadhachary他（２００４年）；Argani他（２００１年）；Jones他（２００４年）；Prasad他（２００５年）；および、Moniaux他（２００４年）参照］であり、ＤＮＡマイクロアレイ、ならびに、１３個のすい臓管腺がん、５個の正常すい臓組織、および、９８個のサンプル（乳房腫瘍、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、および、卵巣腫瘍に由来する）に係るパネルを用いて解析された。ＰＳＣＡのみが、適度な感受性（１３個中６個、すなわち、すい臓腫瘍のうち４６％を検出した）を、高い特異性（９８個のサンプル中９１個、すなわち、９３％が、すい臓が原発巣でないと正確に同定された）で示した。これに対して、ＫＲＴ７、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＭＭＰ１１、および、ＭＵＣ４は、それぞれ３８％、３１％、８５％および３１％の感受性を、それぞれ６６％、９１％、８２％および８１％の特異性で示した。これらのデータは、２７個のすい臓原発巣の転移、および、３９個の非すい臓原発巣の転移で、ＭＭＰ１１を除くすべてのマーカーについて実行したｑＲＴＰＣＲと十分一致した。ＭＭＰ１１は、ｑＲＴＰＣＲおよび転移に対して、より低い感受性とより低い特異性を示した。結論として、急速冷凍した原発組織におけるマイクロアレイデータは、ＦＦＰＥ転移がすい臓原発であることをｑＲＴＰＣＲによって同定することのできるマーカーの能力に対する良い指標として役立つ。しかし、更なるマーカーが最適な効果のために有用であるかもしれない。
【０１４６】
すい臓管腺がんは、正常なすい臓において、（大部分が腺房状細胞および膵島細胞である）すべてのすい臓細胞のうちの、ほんのわずかな割合を含む管上皮細胞から発生する。さらに、すい臓腺がん組織は、隣接する正常組織の相当量を含む［Prasad他（２００５年）；および、Ishikawa他（２００５年）］。このため、候補すい臓がんマーカーは、すい臓腺がんにおいて、正常なすい臓細胞と比較して遺伝子が増加しているため、濃縮されていた。第１のクエリ方法によって、６つのプローブ群が得られた。そのプローブ群は、凝固第５因子（Ｆ５）、ＦＫ５０６結合タンパク質と類似した仮想タンパク質ＦＬＪ２２０４１（ＦＫＢＰ１０）、β６インテグリン（ＩＴＧＢ６）、トランスグルタミナーゼ２（ＴＧＭ２）、異質核内リボ核タンパク質Ａ０（ＨＮＲＰ０）、および、ＢＡＸデルタ（ＢＡＸ）であった。第２のクエリ方法（詳しくは、材料と方法の節を参照）によって、８つのプローブ群が得られた。そのプローブ群は、Ｆ５、ＴＧＭ２、ペアードライクホメオドメイン転写因子１（ＰＩＴＸ１）、トリオアイソフォームｍＲＮＡ（ＴＲ１０）、ｐ７３ＨのためのｍＲＮＡ（ｐ７３）、ＭＧＣ：１０２６４に対する未知のタンパク質（ＳＣＤ）、および、クラウジン１８に対する２つのプローブ群であった。
【０１４７】
全体で２３個の組織特異的なマーカー候補が、転移性がんＦＦＰＥ組織上の更なるＲＴ−ＰＣＲ確認のために、ｑＲＴ−ＰＣＲによって選ばれた。マーカー候補は、肺、すい臓、結腸、乳房、卵巣、前立腺、および、前立腺原発性がん由来の２０５個のＦＦＰＥ転移性がんに対して試験された。表１９はＲＴ−ＰＣＲ確認のために選ばれた組織特異的マーカーの遺伝子記号を提供し、そしてまた、これらのマーカーで実行された試験結果をまとめている。
【表１９】
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【０１４８】
２３個の試験マーカーのうち、１３個が、それらの交差反応性、対応する転移性組織における低い発現量、もしくは、重複に基づいて棄却された。１０個のマーカーが最終的な解析のために選ばれた。肺がんマーカーは、ヒト肺サーファクタント関連タンパク質Ｂ（ＨＵＭＰＳＰＢ）、甲状腺転写因子１（ＴＴＦ１）、および、デスモグレイン３（ＤＳＧ３）であった。すい臓がんマーカーは、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、および、凝固第５因子（Ｆ５）、そして、前立腺がんマーカーは、カリクレイン３（ＫＬＫ３）であった。結腸直腸がんマーカーは、カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）であった。乳がんマーカーは、マンマグロビン（ＭＧ）、および、前立腺由来Ｅｔｓ転写因子（ＰＤＥＦ）であった。卵巣がんマーカーは、ウィルムス腫１（ＷＴ１）であった。異なる転移性組織において選択されたマーカーの、相対的な発現値を標準化した平均値を図１０に示している。
【０１４９】
＜ＦＦＰＥ組織を用いたサンプル準備およびｑＲＴ−ＰＣＲの最適化＞
次に、マーカーパネルの性能を検査する前に、固定組織を用いて、ＲＮＡ単離法、および、ｑＲＴＰＣＲ法を最適化した。まず、タンパク質分解酵素Ｋのインキュベーション時間を１６時間から３時間に短縮した効果を分析した。収率にはまったく変化はなかった。しかし、いくつかのサンプルで、より短い時間のタンパク質分解酵素Ｋステップを用いたときに、より長いＲＮＡ断片を示すものがあった（図１１Ａ、図１１Ｂ）。例えば、ＲＮＡを１年前の組織ブロック（Ｃ２２）から単離したとき、電気泳動図にはまったくちがいは見られなかった。しかし、ＲＮＡを５年前の組織ブロック（Ｃ２３）から単離したときには、より短い時間のタンパク質分解酵素Ｋ消化を用いた場合に、肩のこぶによって解析されると、より高分子量のＲＮＡの区画がより多く観察された。この傾向は一般的に、ＦＦＰＥ転移の原発巣器官にかかわらず、他のサンプルを処理する際にも保持された。結論として、タンパク質分解酵素Ｋ消化時間の短縮は、ＲＮＡ収量を犠牲にしないし、そして、より長く、あまり分解されていないＲＮＡを単離する助けになるかもしれない。
【０１５０】
次に、３つの異なる逆転写法を比較した。その３つの方法とは、ｑＰＣＲが後に続く、ランダムヘキサマーによる逆転写（２段階）；ｑＰＣＲが後に続く、遺伝子特異的プライマーによる逆転写（２段階）；遺伝子特異的プライマーを用いた１段階のｑＲＴＰＣＲ；である。ＲＮＡは１１個の転移から単離され、この３つの方法すべてにわたって、βアクチン、ＨＵＭＳＰＢ（図１１Ｃ、図１１Ｄ）、および、ＴＴＦに対するＣｔ値を比較した。その結果は、すべての比較において、統計的に有意な差（ｐ＜０．００１）を示した。両方の遺伝子について、ｑＰＣＲが後に続くランダムヘキサマーによる逆転写（２段階反応）が最も高いＣｔ値を示し、一方、ｑＰＣＲが後に続く遺伝子特異的プライマーによる逆転写（２段階反応）は、対応する１段階反応よりも、わずかに（しかし統計的には有意な）低いＣｔ値を示した。しかし、遺伝子特異的プライマーを用いた２段階のＲＴＰＣＲは、より長い逆転写段階を有した。各サンプルについて、ＨＵＭＳＰＢのＣｔ値を、対応するβアクチンの値に対して標準化した場合、３つの方法すべてにわたって、標準化されたＣｔ値には、まったくちがいが見られなかった。結論として、ＲＴＰＣＲ反応条件の最適化により、より低いＣｔ値を生じることができ、これは、より古いパラフィン組織ブロックを分析する助けになる［Cronin他（２００４年）参照］。そして、遺伝子特異的プライマーを用いた、１段階のＲＴＰＣＲ反応は、対応する２段階反応において生ずるＣｔ値に匹敵するＣｔ値を生ずることができる。
【０１５１】
＜最適化されたｑＲＴＰＣＲ解析の診断能＞
１２個のｑＲＴＰＣＲ反応（１０個のマーカー、および、２個のハウスキーピング遺伝子）を２６０個のＦＦＰＥ転移の新たな群に対して実行した。２１個のサンプルがハウスキーピング遺伝子に対して高いＣｔ値を示したため、２３９個のサンプルのみが、ヒートマップ分析に用いられた。ヒートマップにおける標準化されたＣｔ値の分析は、乳がんマーカー、および、前立腺がんマーカーの高い特異性、結腸がんマーカー、肺がんマーカー、および、卵巣がんマーカーの中程度の特異性、ならびに、すい臓がんマーカーの幾分より低い特異性を明らかにした（図１２）。標準化されたｑＲＴＰＣＲデータをコンピュータによる修正と組み合わせることにより、マーカーパネルの性能が改良される。
【０１５２】
２個のハウスキーピング遺伝子の発現の平均に対して標準化された発現値を用いて、転移性原発巣組織を予測するためのアルゴリズムが、標準化されたｑＲＴＰＣＲデータをそのアルゴリズムと組み合わせることによって開発された。そして、そのアルゴリズムは、１つ取って置き交差検定（ＬＯＯＣＶ）を実行することによって、ｑＲＴＰＣＲ解析の確度を決定した。解析に含まれる６つの組織の種類に対して、サンプルが、解析に含まれるその他の腫瘍の種類（例えば、すい臓がんを結腸がん）として誤って推測される場合の偽陽性コール（false-positive calls）の数、および、サンプルが解析組織の種類（その他）に含まれるものとして予測されなかった回数の両方が、別々に推定された。ＬＯＯＣＶの結果を表２０に示す。
【表２０】
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【０１５３】
原発巣組織は、２６０個の試験サンプル中２０４個に対して、全体で７８％の確度でもって、正しく予測された。偽陽性コールのかなりの部分は、組織学的に同質な組織におけるマーカーの交差反応性のためである。例えば、咽頭、喉頭、および、食道から生じる３つの扁平上皮転移がんは、それらの組織におけるＤＳＧ３の発現のために、肺がんとして誤って予測された。胃およびすい臓を含む、結腸ＧＩがん以外におけるＣＤＨ１７の陽性発現によって、試験した６個の胃がんのうちの４個、そして、試験した４３個のすい臓がん転移のうちの３個が、結腸がんとして誤って分類分けされた。
【０１５４】
ＬＯＯＣＶ検定に加えて、データを３つの別々の訓練群および試験群の対に、ランダムに分割した。各々の分割には、各分類からのサンプルのうち約５０％のサンプルが含まれた。３つの別々の訓練群および試験群の対における等分の分割（50/50 splits）において、解析全体の分類確度は、７７％、７１％、および、７５％であり、このことは解析能の安定性を確認している。
【０１５５】
最後に、原発巣のわかった転移性がん、ＩＨＣを含む病理学的な評価によって原発巣組織診断がなされたＣＵＰ標本、および、ＩＨＣ試験後もＣＵＰのままであるＣＵＰ標本を含んだ、４８個のＦＦＰＥ転移性がんの別の独立した群を試験した。原発巣組織の予測確度は、サンプルカテゴリーごとに個別に推定された。表２１にその解析結果をまとめる。
【表２１】
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【０１５６】
原発巣組織の予測は、ほんのわずかな例外を除いて、既知の原発巣、もしくは、ＩＨＣを含む臨床的／病理学的な評価によって判定された原発巣組織診断と一致した。訓練群と同様に、その解析は、異なる原因から生じる扁平上皮がんを識別することができず、そして、それらを肺がんとして誤って予測をした。
【０１５７】
解析はまた、標準的な診断試験の後にＣＵＰのままであった１１個のサンプルのうち８個に対して、推定上の原発巣組織診断をした。ＣＵＰ症例のうちの１個は、特に興味深いものであった。前立腺がんの病歴を持つ男性患者が、肺および胸膜における転移性がんと診断された。血清ＰＳＡ検査、および、転移性組織上へのＰＳＡ抗体によるＩＨＣは陰性であり、そのため、病理学者の診断は、胃腸腫瘍の傾向があるＣＵＰというものであった。その解析は強く（事後確率０．９９で）その原発巣組織は結腸であると予測した。
【０１５８】
議論
本研究において、原発腫瘍におけるマイクロアレイに基づいた発現プロファイル解析は、転移に用いるための候補マーカーを同定するために用いられた。転移に対する原発巣腫瘍マーカーを発見するために、原発腫瘍を用いることができるという事実は、最近のいくつかの発見と一致する。例えば、Weigeltと同僚は、原発性乳房腫瘍の遺伝子発現プロファイルは、遠隔転移においても維持されるということを示した。Weigelt他（２００３年）参照。Backusと同僚は、乳房組織およびその他の組織のゲノム規模遺伝子発現解析を用いて、乳がん転移を検出するための推測上のマーカーを同定し、そして、マンマグロビンおよびＣＫ１９が、９０％の感受性と９４％の特異性で、乳房センチネルリンパ節における臨床上有効な転移を検出したことを明らかにした。Backus他（２００５年）参照。
【０１５９】
本解析の開発中、選択は、ＣＵＰの中で最も一般的な肺がん、すい臓がん、および、結腸がん［Ghosh他（２００５年）；および、Pavlidis他（２００５年）］、ならびに、治療が患者にとって最も有益である可能性がある乳がん、卵巣がん、および、前立腺がんを含む、６つのがんの種類に焦点を当ててきた。Ghosh他（２００５年）参照。しかし、解析の全体の確度に欠陥が生じない限り、そして、もし適用可能ならば、ＲＴＰＣＲ反応のロジスティクスが妨げられない限り、更なる組織の種類、および、マーカーをパネルに追加することができる。
【０１６０】
マイクロアレイに基づいた原発組織の研究は、既知のマーカーの特異性および感受性を確認した。結果として、組織特異的マーカーの大部分が、本発明で調べられた組織に対して高い特異性を有する。最近の研究では、ＩＨＣを用いると、ＰＳＣＡは前立腺がん転移において過剰発現されることがわかった。Lam他（２００５年）参照。Dennis他（２００２年）はまた、ＰＳＣＡがすい臓がんおよび前立腺がんに対する原発腫瘍マーカーとして用いることができることを明らかにした。ＰＳＣＡの強い発現は、一部の前立腺組織において、ＲＮＡレベルで見出されるが、その解析にＰＳＡを含むために、前立腺がんとすい臓がんとを直ちに分離することができる。本研究で新規に発見されたことは、すい臓原発巣組織の（ＰＳＣＡに対して）補足的なマーカーとして、Ｆ５を用いるということである。原発組織のマイクロアレイデータ群、および、ＦＦＰＥ転移のｑＲＴＰＣＲデータ群両方において、Ｆ５はＰＳＣＡを補足することが見出された。
【０１６１】
従来の研究者たちは、ＩＨＣ［Brown他（１９９７年）；De Young他（２０００年）；および、Dennis他（２００５年ａ）参照］、もしくは、マイクロアレイ［Su他（２００１年）；Ramswamy他（２００１年）；および、Bloom他（２００４年）参照］を用いたＣＵＰ解析を生み出してきた。さらに最近では、ＳＡＧＥ法が、小規模のｑＲＴＰＣＲマーカーパネルと組み合わされてきた。Dennis他（２００２年）；および、Buckhaults他（２００３年）参照。本研究は、マイクロアレイに基づいた発現プロファイル解析を、ｑＲＴＰＣＲ解析の小規模のパネルと組み合わせた最初のものである。原発組織に対するマイクロアレイ研究は、これまでにＳＡＧＥ法によって同定されたのと同一の原発巣組織マーカーのうちのすべてではないが、一部を同定した。所与の研究は、ＳＡＧＥ法に基づいたプロファイル解析データとＤＮＡマイクロアレイに基づいたプロファイル解析データとが適度に一致すること、およびその相互関係が、より高い発現量を伴う遺伝子に対して向上することを示してきた研究を考慮すれば、この発見は驚くほどのことではない。van Ruissen他（２００５年）；および、Kim他（２００３年）参照。例えば、Dennisと同僚は、ＰＳＡ、ＭＧ、ＰＳＣＡ、および、ＨＵＭＳＰＢを同定し、一方、Buckhaultsと共同研究者［Buckhaults他（２００２年）参照］はＰＤＥＦを同定した。
【０１６２】
ＣＵＰ解析の実施はｑＲＴＰＣＲによるものであるのが好ましい。というのは、それが強固な技術であり、ＩＨＣ以上の性能優位性を有するかもしれないからである。Al-Mulla他（２００５年）；および、Haas他（２００５年）参照。さらに、本明細書に示したように、ｑＲＴＰＣＲプロトコルは、１段階反応において遺伝子特異的プライマーを用いることにより改良されてきた。このことは、遺伝子特異的プライマーを、ＦＦＰＥ組織での１段階ｑＲＴＰＣＲ反応に用いた最初の例である。他の研究者は、２段階ｑＲＴＰＣＲ（ｑＰＣＲが後に続く１反応でのｃＤＮＡ合成）を行ったか、または、ランダムヘキサマーもしくは先端を切った遺伝子特異的プライマーを用いたかのいずれかである。Abrahamsen他（２００３年）；Specht他（２００１年）；Godfrey他（２０００年）；Cronin他（２００４年）；および、Mikhitarian他（２００４年）参照。
【０１６３】
要約すると、６つの組織の種類に対する７８％の総体的解析確度は、他の研究と比較して優れている。Brown他（１９９７年）；De Young他（２０００年）；Dennis他（２００５年ａ）；Su他（２００１年）；Ramaswamy他（２００１年）；および、Bloom他（２００４年）参照。
【０１６４】
〔実施例７〕
本研究において、遺伝子マーカーポートフォリオを用いる分類器は、平均分散最適化（ＭＶＯ）から選ぶことによって、ならびに、原発巣組織、および、乳がん、結腸がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がんを含む５つの主要ながんの種類に対するがんの状態を予測するためにこの分類器を用いることによって構築された。３７８個の原発がん、２３個の良性増殖上皮病変、および、１０３個の急速冷凍された正常なヒト組織標本が、Affymetrix human U133A GeneChipを用いて分析された。白血球サンプルもまた、白血球バックグラウンド細胞における共発現によって、潜在的に隠される遺伝子発現を差し引くために分析された。新規のＭＶＯに基づくバイオインフォマティクスの手法は、原発巣組織およびがんの状態に対する遺伝子マーカーポートフォリオを選択するために開発された。そのデータによって、２６個の遺伝子のパネルを、５つのがんの種類間の原発巣組織、および、がんの状態を正確に予測するための分類器として用いることができるということがわかった。このように、さまざまながんの分類法を、かなり少ない数の遺伝子マーカーの遺伝子発現プロファイルを決定することによって得ることができる。
【０１６５】
表２２は、指定された原発巣組織について同定されたマーカーを示している。遺伝子の説明については表３１を参照のこと。
【表２２】
0005405110.tif 000035
【０１６６】
サンプル群は、全体で２９９個の転移性結腸がん、転移性乳がん、転移性すい臓がん、転移性卵巣がん、転移性前立腺がん、転移性肺がん、および、その他のがん、ならびに、原発性前立腺がんのサンプルを含んだ。組織学的な評価、対照遺伝子βアクチンのＲＮＡ収量、および、その発現に基づく性質確認（ＱＣ）が行われた。他のサンプルカテゴリーは、胃がん（５個）、腎臓がん（６個）、胆管／胆のうがん（４個）、肝臓がん（２個）、頭頸部がん（４個）、回腸がん（１個）から生じた転移、および、１個の中皮種を含んだ。結果を表２３にまとめる。
【表２３】
0005405110.tif 000036
【０１６７】
上記サンプルを試験することによって、結果的に表２４のマーカー群にまで削減された。その結果を表２５に示す。
【表２４】
0005405110.tif 000037
【０１６８】
【表２５】
0005405110.tif 000038
【０１６９】
その結果は、表２６のように、２０５個のパラフィン包埋転移性腫瘍のうち；１６６個のサンプル（８１％）が最終的な分析結果を有したということを示した。
【表２６】
0005405110.tif 000039
【０１７０】
偽陽性結果のうち、表２７のように、多くの誤り（false）が、組織学的および発生学的に類似の組織に由来した。
【表２７】
0005405110.tif 000040
【０１７１】
以下のパラメータが、モデル開発のために検討された。
【０１７２】
女性群、および、男性群におけるマーカーを分離し、ならびに、男性患者、および、女性患者についてのＣＵＰ確率を別々に計算する。男性群には、ＳＰ＿Ｂ、ＴＴＦ１、ＤＳＧ３、ＰＳＣＡ、Ｆ５、ＰＳＡ、ＨＰＴ１を含み；女性群には、ＳＰ＿Ｂ、ＴＴＦ１、ＤＳＧ３、ＰＳＣＡ、Ｆ５、ＨＰＴ１、ＭＧＢ、ＰＤＥＦ、ＷＴ１を含んだ。バックグラウンドの発現（すなわち、肺：ＳＰ＿Ｂ、ＴＴＦ１、ＤＳＧ３；卵巣：ＷＴ１、および、結腸：ＨＰＴ１）は、解析結果から除外された。
【０１７３】
ＣＵＰモデルは、そのＣＵＰの罹患率（％）（すなわち、肺がん２３％、すい臓がん１６％、結腸直腸がん９％、乳がん３％、卵巣がん４％、前立腺がん２％、その他のがん４３％）に調整された。乳がんおよび卵巣がんに対する罹患率は、男性患者については０％に調整され、そして、前立腺がんの罹患率は、女性患者については０％に調整された。
【０１７４】
以下のステップが採用された。
マーカーを同様の尺度上に置き；最小値を各組織特異的な群から選択することにより、変数の数を１２個から８個に減らし；１個のサンプルを除き；残りのサンプルからモデルを構築し；除いたサンプルをテストし；１００％のサンプルが試験されるまで繰り返し；ランダムにサンプルのうち〜５０％（組織当たり〜５０％）を除き；残りのサンプルからモデルを構築し；サンプルのうち〜５０％のサンプルについて試験し；それから、３つの異なるランダムな分割群について反復する。
【０１７５】
分類確度は、がんの種類の罹患率に調整された。結果は表２８にまとめられ、原データを表２９に示す。
【表２８】
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【０１７６】
【表２９−１】
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【表２９−２】
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【０１７７】
〔実施例８〕
原発巣組織を予測するための原発部位不明転移性がんＣＵＰの予想される遺伝子特徴についての研究
本研究の具体的なねらいは、１０個の遺伝子特徴の能力、すなわち、原発不明がん（ＣＵＰ）を有する患者における転移性がんの原発巣組織を予測する能力を決定することであった。
【０１７８】
第１の目標：ＣＵＰを有する継続患者のコア生検サンプルに由来する遺伝子解析の実現可能性を確認する。
【０１７９】
第２の目標：１０個の遺伝子特徴のＲＴ−ＰＣＲ解析の結果と、M. D. Anderson Cancer Center（ＭＤＡＣＣ）においてなされた診断上の精密検査とを相関させる。
【０１８０】
第３の目標：解析により予測された６つのがんの種類の罹患率と、文献およびＭＤＡＣＣ実験に由来する罹患率とを相関させる。
【０１８１】
本明細書に記載された方法は、７００個の凍結原発がん、良性標本、および正常標本のマイクロアレイ遺伝子発現解析を実行するために用いられ、そして、肺がん、すい臓がん、結腸がん、乳がん、前立腺がん、および、卵巣がんに特異的な遺伝子マーカー候補を同定した。遺伝子マーカー候補は、肺、すい臓、結腸、乳房、卵巣、および前立腺から生じた転移性がん（ステージＩＩＩ〜ＩＶ）ならびに特異性対照のための他のがんの種類から生じた転移の、ホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）２０５個の標本のＲＴ−ＰＣＲによって試験された。他の転移性がんの種類には、胃がん、腎臓細胞がん、肝細胞性がん、胆管／胆のうがん、および、頭頸部がんを含んだ。結果により、転移性がんの原発巣組織を予測し、全体で７６％の確度を示した１０個の遺伝子特徴を選ぶことができた。ＲＴ−ＰＣＲ実験におけるくり返された測定の平均のＣＶ値は、４つの複製デートポイント(4 replicate date points)に基づいて計算した結果、１．５％であった。βアクチン（ＡＣＴＢ）はハウスキーピング遺伝子として用いられ、その中位の発現（median expression）は異なる原発巣を有する転移性サンプルと同様であった（ＣＶ＝５．６％）。
【０１８２】
本研究に係る具体的なねらいは、１０個の遺伝子特徴の能力、すなわち、ＣＵＰ患者における転移性がん原発巣組織を予測する能力を、総合的な診断上の精密検査と比較して確認することであった。
【０１８３】
＜患者適格＞
ＥＣＯＧ一般状態０〜２を有する、少なくとも１８歳の患者でなければならない。腺がん、もしくは、若干分化したがんを有すると診断された患者が採用された。腺がん患者のグループには、高分化の腫瘍、中分化の腫瘍、および、低分化の腫瘍を含む。
【０１８４】
患者はＣＵＰの基準を満たしていた。すなわち、完全な評価後にまったく原発腫瘍が検出されなかった。この評価とは、完全な病歴および身体的な検査、詳細な臨床検査、造影研究、ならびに、侵襲的研究を導く兆候もしくはサインとして定義される。本研究では、治療が行われていない患者のみが採用された。
【０１８５】
もし患者が化学療法、もしくは、放射腺で治療されているならば、本研究への参加は、１０年以内に採取されたブロックとして（治療）以前の組織が手に入るのであれば、認められた。
【０１８６】
本研究への参加のために、患者からは書面による承諾／許可を提出した。
【０１８７】
＜研究設計＞
本研究において、ＣＵＰと診断された患者が採用された。これらの患者は最も利用可能な転移性病変のコアニードル生検、もしくは切除生検を経験してきた者たちである。ＦＮＡ生検が行われた患者のみが適切ではなかった。試験対象患者基準に合致し、かつ、研究に同意した、最初の６０名の継続患者が登録された。再度の生検がＭＤＡＣＣにおいて治療のための診断の目的で必要である場合、患者から同意が得られれば、更なる組織が本発明のために入手された。すべての参加者が、institutional Protocol Data Management System（ＰＤＭＳ）におけるプロトコルに登録された。
【０１８８】
臨床上および病理学上の判定を含む完全な診断上の精密検査が、すべての登録された患者に対してＭＤＡＣＣ基準にしたがって実行された。診断上の精密検査における病理学的な部分は、ＣＫ−７、ＣＫ−２０、ＴＴＦ−１、および病理学者によって指示されたとみなされるような他のものを含むマーカーによる、免疫組織化学的（ＩＨＣ）解析を含んでもよかった。これは、ＣＵＰが存在するすべての患者の日常の精密検査の部分である。
【０１８９】
＜組織サンプル収集＞
本研究には、ＣＵＰ患者から収集したホルマリン固定されパラフィン包埋された転移性がん標本を含んだ。
【０１９０】
６個の１０μｍ切片がＲＮＡ単離のために用いられたが、より小さな組織標本については、９個の１０μｍの切片が必要であろう。組織病理学的診断、および、腫瘍内容物は、ヘマトキシリン(hematoxylin)およびエオジン(eosin)（HE）で染色された更なる切片上で、ＲＮＡ単離のために用いられたサンプルごとに確認された。腫瘍サンプルはＨＥ切片において３０％を超える腫瘍内容物を有するべきであった。
【０１９１】
臨床データは匿名でVeridexへ提供され、そのデータは患者の年齢、性別、光学顕微鏡による腫瘍組織構造、腫瘍段階（分化）、転移部位、標本収集日、個々の患者に対して行われた診断上の精密検査の説明を含む。
【０１９２】
＜組織処理およびＲＴ−ＰＣＲ実験＞
全ＲＮＡが、前記のプロトコルを用いて各組織サンプルから抽出された。標準量の組織から１μｇを超える全ＲＮＡを生ずるサンプルのみが、その後のＲＴ−ＰＣＲ試験のために用いられた。ＲＮＡ収量のあまりないサンプルは劣化していると考えられ、その後の実験からは除外された。ハウスキーピング発現に基づくＲＮＡの完全性対照(integrity control)は、標準のVeridexの方法にしたがって、劣化したＲＮＡを有するサンプルを除外するために行われた。
【０１９３】
１０個の遺伝子、および、１〜２個の対照遺伝子のパネルを含むＲＴ−ＰＣＲ解析は、ＲＮＡサンプルの解析のために用いられた。逆転写解析、および、ＰＣＲ解析は、前記のプロトコルを用いて達成された。
【０１９４】
ΔＣｔとして表される各々の試験された遺伝子の相対的な発現値が計算され、原発巣組織の予測のために用いられた。ΔＣｔとは、標的遺伝子のＣｔから対照遺伝子のＣｔを差し引いた値と等しい。
【０１９５】
＜サンプルの大きさおよびデータ解釈＞
６０人の患者の限定されたサンプル大きさは、予備的研究の診査の本質のために研究された。これまでに、２２人の患者が試験された。ある患者サンプルはＲＴ−ＰＣＲ試験のための十分なＲＮＡを生成することができず、そして、３個のサンプルが対照遺伝子によるＲＴ−ＰＣＲによって判定されたＱＣ対照を通過できなかった。全体で１８人の患者が、患者の転移性病変の確率を決定するために用いられた。
【０１９６】
統計モデルは、以下の７つのカテゴリーの転移性がん原発巣組織の確率を決定するために用いられた。そのカテゴリーとは、肺がん、すい臓がん、結腸がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、および、非試験（その他）であった。それぞれのサンプルに対する、各カテゴリーの確率は、線形的な分類モデルから計算される。解析結果を表３０にまとめる。
【０１９７】
（既知の原発巣を有する）患者の転移性病変が、これらの６つの部位（結腸、すい臓、肺、前立腺、卵巣、乳房）の１つに由来する確率は、約７６％である。この数は、さまざまながんの発症率、および、転移する可能性について記載された文献、および、M. D. Andersonにおける腫瘍登録から生じた未発表のデータから引き出される。試験されたサンプルについては、６つの部位の罹患率は６７％（１８個の試験されたサンプルのうち１２個）であり、従来の観察結果と非常によく一致した。
【表３０】
0005405110.tif 000044
【０１９８】
本発明は、理解を明確にする目的で、図および実施例の形である程度詳細に説明したが、その説明および実施例を、発明の範囲を限定するものとして解釈するべきではない。
【０１９９】
【表３１】
0005405110.tif 000045
【０２００】
〔実施の態様〕
（１）原発不明転移の原発巣を同定する方法において、
ａ．転移性細胞を含むサンプルを入手するステップと、
ｂ．少なくとも２つの異なるがんに関連するバイオマーカーを評価するステップと、
ｃ．前記バイオマーカーから得られたデータを組み合わせて、あるアルゴリズムにするステップであって、前記アルゴリズムは、
ｉ．前記バイオマーカーを基準に対して標準化し、
ｉｉ．各々のバイオマーカーの感受性および特異性を最適化するカットオフを課し、前記がんに係る罹患率を加重し、原発巣組織を選択する、
ステップと、
ｄ．前記アルゴリズムによって決定された最も高い確率に基づいて原発巣を決定するか、もしくは、前記がんが特定のがん群に由来しないことを決定するステップと、
ｅ．任意に、１個以上の更なる、異なるがんに特異的なバイオマーカーを評価し、前記更なるバイオマーカーに対してｃ）およびｄ）のステップを反復するステップと、
を含む、方法。
（２）実施態様１に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、
ｉ．ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ、ＤＳＧ３、ＫＲＴ６Ｆ、ｐ７３Ｈ、もしくは、ＳＦＴＰＣ；
ｉｉ．Ｆ５、ＰＳＣＡ、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、もしくは、ＦＫＢＰ１０；または、
ｉｉｉ．ＣＤＨ１７、ＣＤＸ１、もしくは、ＦＡＢＰ１；
に対応する群のうち少なくとも１つから選ばれる、方法。
（３）実施態様２に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ、ＤＳＧ３、ＫＲＴ６Ｆ、ｐ７３Ｈ、もしくは、ＳＦＴＰＣである、方法。
（４）実施態様３に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ、および、ＤＳＧ３である、方法。
（５）実施態様４に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＫＲＴ６Ｆ、ｐ７３Ｈ、および／もしくは、ＳＦＴＰＣをさらに含むか、または、ＫＲＴ６Ｆ、ｐ７３Ｈ、および／もしくは、ＳＦＴＰＣによって置き換えられる、方法。
（６）実施態様２に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、Ｆ５、ＰＳＣＡ、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、もしくは、ＦＫＢＰ１０である、方法。
（７）実施態様６に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、Ｆ５、および、ＰＳＣＡである、方法。
（８）実施態様７に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、および／もしくは、ＦＫＢＰ１０をさらに含むか、または、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、および／もしくは、ＦＫＢＰ１０によって置き換えられる、方法。
（９）実施態様１に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＣＤＨ１７、ＣＤＸ１、もしくは、ＦＡＢＰ１である、方法。
（１０）実施態様９に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＣＤＨ１７である、方法。
【０２０１】
（１１）実施態様１０に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＣＤＸ１、および／もしくは、ＦＡＢＰ１をさらに含むか、または、ＣＤＸ１、および／もしくは、ＦＡＢＰ１によって置き換えられる、方法。
（１２）実施態様１〜１１のいずれかに記載の方法において、
遺伝子発現は、配列番号１１〜５８のうちの少なくとも１個の配列を用いて、評価される、方法。
（１３）実施態様２に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、性特異的マーカーからさらに選ばれ、
前記性特異的マーカーは、
ｉ．男性患者の場合、ＫＬＫ３、ＫＬＫ２、ＮＧＥＰ、もしくは、ＮＰＹ；あるいは、
ｉｉ．女性患者の場合、ＰＤＥＦ、ＭＧＢ、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−π；および／または、ＷＴ１、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２；
のうちの少なくとも１個から選ばれる、方法。
（１４）実施態様１３に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＫＬＫ２である、方法。
（１５）実施態様１４に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＫＬＫ３である、方法。
（１６）実施態様１５に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＮＧＥＰ、および／もしくは、ＮＰＹをさらに含むか、または、ＮＧＥＰ、および／もしくは、ＮＰＹによって置き換えられる、方法。
（１７）実施態様１３に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＰＤＥＦ、ＭＧＢ、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−πである、方法。
（１８）実施態様１７に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＰＤＥＦ、および、ＭＧＢである、方法。
（１９）実施態様１８に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−πをさらに含むか、または、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−πによって置き換えられる、方法。
（２０）実施態様１３に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＷＴ１、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２である、方法。
【０２０２】
（２１）実施態様２０に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＷＴ１である、方法。
（２２）実施態様２１に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２をさらに含むか、または、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２によって置き換えられる、方法。
（２３）実施態様１３〜２２のいずれかに記載の方法において、
遺伝子発現は、配列番号１１〜５８のうちの少なくとも１個の配列を用いて、評価される、方法。
（２４）実施態様１もしくは２に記載の方法において、
がんの原発巣を決定するために、転移部位を含む、更なる臨床情報をさらに得るステップ、
を含む、方法。
（２５）がんに対する最適なバイオマーカー群を得る方法において、
原発巣がわかっている転移を用いるステップと、
前記転移に対するバイオマーカーを決定するステップと、
前記バイオマーカーを原発不明転移のバイオマーカーと比較するステップと、
を含む、方法。
（２６）治療方針を提示する方法において、
実施態様１〜３のいずれかにしたがって、原発不明転移の原発巣を決定すること、および、前記原発巣に対して適切な治療法を特定することによって、治療方針を提示する、方法。
（２７）予後診断を提示する方法において、
実施態様１〜３のいずれかにしたがって、原発不明転移の原発巣を決定すること、および、前記原発巣に対して対応する予後を特定することによって、予後診断を提示する、方法。
（２８）バイオマーカーを発見する方法において、
特定の転移におけるマーカー遺伝子の発現量を決定することと、
前記マーカー遺伝子の発現を決定するために前記マーカー遺伝子に対するバイオマーカーを評価することと、
実施態様１にしたがって、前記マーカー遺伝子の前記発現を分析することと、
前記マーカー遺伝子が原発腫瘍に対して効果的に特異的であるかどうかを決定するステップと、
を含む、方法。
（２９）組成物において、
配列番号１１〜５８から選ばれる、少なくとも１個の単離された配列を含む、組成物。
（３０）実施態様１〜３のいずれかにしたがって解析を実施するためのキットにおいて、
バイオマーカー検出試薬、
を含む、キット。
【０２０３】
（３１）マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップにおいて、
実施態様１〜３のいずれかに記載の方法を実行するための、マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップ。
（３２）診断上の／予後上のポートフォリオにおいて、
実施態様２〜１１もしくは１３〜２２のいずれかにしたがった遺伝子の組み合わせに係る、単離された核酸配列、前記核酸配列の相補配列、もしくは、前記核酸配列の部分配列、
を含み、
前記遺伝子の組み合わせは、異なるがん由来の細胞、もしくは、正常組織由来の細胞と比較して、転移性細胞を有する生物学的サンプルにおける遺伝子発現を評価するために十分であるか、もしくは、前記遺伝子発現を特徴付けるために十分である、診断上の／予後上のポートフォリオ。
（３３）実施態様２〜１１もしくは１３〜２２のいずれかに記載の方法において、
前記サンプルにおいて構成的に発現する、少なくとも１個の遺伝子の発現を評価すること、
をさらに含む、方法。
【０２０４】
〔参照文献〕
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0005405110.tif 000048
0005405110.tif 000049
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【図面の簡単な説明】
【０２０５】
【図１】原発不明転移の原発巣を同定する先行技術方法の図である。
【図２】原発不明転移の原発巣を同定する先行技術方法の図である。
【図３】本発明に係るＣＵＰ診断アルゴリズムの図である。
【図４】組織パネルにおける２個の遺伝子の発現強度を示しているマイクロアレイデータの図である。
【図５】Agilent Bioanalyzerから得られた電気泳動図である。
【図６】異なる３つのｑＲＴＰＣＲ法から得られたＣｔ値の比較の図である。
【図７】ＣＵＰ解析プレートの図である。
【図８】ＲＮＡ濃度範囲に渡る解析性能を示した一連のグラフである。
【図９Ａ】実験作業の流れ（マーカー候補の指定および確認）の図である。
【図９Ｂ】実験作業の流れ（解析の最適化、ならびに、予測アルゴリズムの構築および試験）の図解を示す。
【図１０】ＦＦＰＥ転移性がんおよび前立腺原発性腺がんにおける、選ばれた１０個の組織特異的遺伝子マーカー候補の発現の図である。
【図１１】解析の最適化の図である。
【図１２】２３９個のサンプルに係る１０個のマーカーパネルの相対的な発現量を示すヒートマップである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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