(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
元素硫黄をアリシン含有植物抽出物に添加するステップを含み、そしてこのように産生された混合物を加熱するステップをさらに含む、ポリスルフィドを産生する方法。
【請求項２】
前記植物抽出物がネギ属の抽出物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記混合物が少なくとも６０℃に加熱される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記混合物が少なくとも７０℃に加熱される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
硫黄が少なくとも０．１％（ｗ／ｗ）の濃度まで添加される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
硫黄が少なくとも１％（ｗ／ｗ）の濃度まで添加される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法を含み、このように産生された混合物のｐＨがｐＨ４．０未満に調整されることを特徴とする、鎖長が長いポリスルフィドを産生する方法。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法を含み、アミンの添加を特徴とする、鎖長が短いポリスルフィドを産生する方法。
【請求項９】
前記アミンがジブチルアミンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アミンがアミノ酸である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法を含み、このように産生された混合物のｐＨがｐＨ８超まで調整されることを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネギ属、特にニンニクからの抽出物を処理してその中に含有されるポリスルフィドの濃度およびスペクトルを操作する方法に関する。本発明はまた、このように産生された生成物と、特に作物保護剤および治療用調製物としてのその工業用途とに関する。
【背景技術】
【０００２】
ネギ属の植物、特にニンニクは、微生物による組織損傷および草食動物による食害に対する防御用薬剤としての、各種の硫黄含有分子を使用するために進化してきた。
【０００３】
ニンニクの植物としての主な化学的防御手段は、植物の硫黄含有構成成分であるアリインのアリナーゼによる変換を必要とする。本相互作用の結果は、２つの硫黄分子を含有する不安定な生物活性分子であるアリシンの放出である。アリシンは次に、硫黄のさらに還元された形、たとえばメチルまたはアリル官能基のどちらかが硫黄鎖の両方の端に結合したポリスルフィドへ変換される。
【０００４】
硫黄鎖長がより短い分子、たとえばジアリルジスルフィド、ジメチルジスルフィドおよびジメチルスルフィドは非常に安定で、水溶性が制限されており、合成手段によって非常に高い純度で産生することができる。非常に多くの文献がこれらの短い硫黄鎖長分子による、駆散性、殺虫効果、植物に対する生理学的効果、真菌胞子発芽に対する促進効果を含む一連の生物学的効果と、おそらく抗生物質活性および抗癌活性を含む、ヒトにおける広範囲の治療的効果とを確認している。
【０００５】
より長い硫黄鎖長（Ｓ≧３、すなわち３個以上の硫黄原子を含有する）ポリスルフィド分子も非常に活性であり、非常に広範囲の生物活性（殺虫、殺線虫、殺軟体動物、駆散、抗癌、抗生物質および殺真菌）の証拠が増加している。多くのグループが、ジアリルトリスルフィドおよびジアリルテトラスルフィドの作用部位に特に重点を置いて、より長い鎖長のポリスルフィドの生化学作用について調査を開始している。公知かつ潜在的なポリスルフィド活性の最近の総説は、この領域について概説している。Ｍｕｎｃｈｂｅｒｇ，Ｕ．ら「Ｐｏｌｙｓｕｌｆｉｄｅｓ  ａｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  ｏｆ  ｇａｒｌｉｃ」、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７，５，１５０５−１５１８。
【０００６】
ニンニクに由来するポリスルフィドが多くの形のヒトの癌に対する主要な新しい治療生成物のための新たな群の活性成分を与えるというコンセンサスが生じている。これらの分子の作物保護剤としての可能性について同様の見解も急速に生じている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ポリスルフィドを最初から化学合成することは可能であるが、（たとえばニンニク抽出物中の）親植物材料に由来するポリスルフィドの使用から、かなりの利点が生まれる。第１に、植物由来マトリクス中の化合物の使用により、ポリスルフィドのスペクトルに多少の安定性が与えられる。さらにこれらの化合物の化学合成は複雑であり、著しく危険な物質の取扱いを伴う。植物由来物質は、いずれの製造環境に対して、および一般に環境に対して著しく低い負荷を与える。したがってニンニクおよび他のネギ由来抽出物、ならびに実際に任意のアリシン含有植物抽出物、たとえばニンニク、タマネギ、リーキ、チャイブ、エシャロットまたはキャベツからの抽出物を処理する方法の操作、制御および最適化を補助する技術への要求がある。本発明の目的の中には、これらの問題の一部の解決を試みることがある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって本発明は、第１の広範な態様において、アリシン含有植物抽出物に元素硫黄を添加するステップを含む、ポリスルフィドを産生する方法を提供する。
【０００９】
大半の植物において、アリシン（２−プロペン−１−スルフィノチオ酸Ｓ−２−プロペニルエステル）は、基質アリイン（（２Ｒ）−２−アミノ−３−［（Ｒ）−プロパ−２−エニルスルフィニル］プロパン酸）に対する酵素アリナーゼ（Ｓ−アルキル（アルケニル）−Ｌ−システインスルホキシドリアーゼ）の作用によって産生される。アリインおよびアリナーゼは植物中で別個の区画内に存在しており、酵素的変換は植物組織の破壊後にのみ発生する。したがって「抽出物」という用語は、本変換を生じさせるために機械的に処理した、処理済みの植物物質を含む。適切な機械的処理としては、植物材料の切断、粉砕または切り刻みが挙げられる。特に好ましい方法は、市販の「ブレンダー」を使用して超微粒子粉砕を実施する液化工程である。抽出物は、生成物の安定性を改善するために水除去段階も受けることがある（たとえばＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１２９０を参照）。
【００１０】
特に好ましい実施形態において、元素硫黄はアモルファスの粉末化硫黄（「硫黄華」）を含む。しかし硫黄の他の同素体、または溶融硫黄も利用できることが想定される。
【００１１】
好ましくは、第２の態様において、上記植物抽出物は、ネギ属の抽出物、特にニンニク、Ａｌｌｉｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ  Ｌ．の抽出物である。
【００１２】
いずれの方法において、第３の態様において、方法がこのように産生された混合物を加熱するステップをさらに含むことが特に好ましい；好ましくは、第４の態様において、上記混合物は少なくとも６０℃まで加熱され、さらに好ましくは、第５の態様において、上記混合物は少なくとも７０℃まで加熱される。
【００１３】
いずれの方法においても、第６の態様において、硫黄は、少なくとも０．１％（ｗ／ｗ）の濃度まで、さらに好ましくは少なくとも０．２％（ｗ／ｗ）の濃度まで、なおさらに好ましくは少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）の濃度まで添加されることが特に好ましい；最も好ましくは、第７の態様において、硫黄は少なくとも１％（ｗ／ｗ）の濃度まで添加される。
【００１４】
本発明はまた、上述した方法を含み、このように産生された混合物のｐＨがｐＨ４．０未満に調整されることを特徴とする、鎖長が長いポリスルフィドを産生する方法も提供する。このようなｐＨ調整はクエン酸、酢酸または乳酸などの有機酸を用いて行われることが特に好ましい。無機酸、たとえば塩酸、特に硫酸も特に好ましい。
【００１５】
本発明はまた、第１から第７の態様の方法による方法を含み、アミンの添加を特徴とする、鎖長が短いポリスルフィドを産生する方法も提供する。孤立電子対のある窒素原子を有する化合物が特に好ましく、特にジブチルアミン、またはアミノ酸である。側鎖上に窒素原子をさらに有するアミノ酸が特に好ましい。好ましくは、このような方法は、このように産生された混合物のｐＨがｐＨ８超まで調整されることをさらに特徴とする。
【００１６】
本発明の範囲内には、実質的に本明細書に記載されるポリスルフィドを産生する方法が含まれる。
【００１７】
本発明の範囲内には、本明細書に記載したいずれかの方法によって産生された作物保護剤も含まれる。
【００１８】
本発明の範囲内には、本明細書に記載したいずれかの方法によって産生された製薬組成物または治療用組成物も含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の各種の実施形態の例証として、ニンニク抽出物のポリスルフィド組成物を操作する方法の例を説明する。
【００２０】
フェーズ１実験
アリシン濃縮ニンニク抽出物のサンプル（「標準溶液」は、Ｎｅｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ、Ｃａｒｄｉｆｆ、ＣＦ１４６ＨＲ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍより入手した。サンプル中のアリシン濃度は約１０，０００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）であった。
【００２１】
このようなアリシン濃縮サンプルは分析を簡単にするために使用したが、後述する実施例および本明細書に記載する方法は、非濃縮アリシン含有植物抽出物によっても同様に使用できる。適切な開始物質は、ネギ属の、特にニンニク、Ａｌｌｉｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ  Ｌ．からの鱗茎の機械的処理によって産生できる。
【００２２】
アリシン濃縮物質の２つのサブサンプルを使用し、サブサンプルの一方を６０℃の試験で使用して、一方を７０℃の試験で使用した。
【００２３】
各温度において、次の反応条件を生じさせて、１時間にわたって維持した：
（１）加熱した標準溶液（５ｇ）。
（２）元素硫黄５０ｍｇを添加して、次に加熱した標準溶液（５ｇ）。
（３）元素硫黄５ｍｇを添加して、次に加熱した標準溶液（５ｇ）。
（４）元素硫黄５ｍｇおよびジブチルアミン２０ｍｇを添加して、次に加熱した標準溶液（５ｇ）。
【００２４】
使用した硫黄は、市販の粉末硫黄（「硫黄華」）の形であった。
【００２５】
どちらの温度試験も、試験溶液が加熱されていたのと同じ１時間の期間にわたって冷蔵庫内で保持したサンプルに対照させた。
【００２６】
加熱フェーズの完了後に、溶液を迅速に冷却して、次にＨＰＬＣによって２、３時間後に分析した。
【００２７】
表１は、（１時間冷蔵した）対照サンプル中で見出されたポリスルフィドの濃度を詳細に示す。
【表１】
0005414529.tif 000002
【００２８】
分析した分子は次の通りである。
ＤＡＳ：ジアリルスルフィド
ＤＡＳ２：ジアリルジスルフィド
ＤＡＳ３：ジアリルトリスルフィド
ＤＡＳ４：ジアリルテトラスルフィド
ＤＡＳ５：ジアリルペンタスルフィド
ＤＡＳ６：ジアリルヘキサスルフィド
反応条件（１）：本サンプルを６０℃または７０℃まで加熱して、その温度で１時間保持した。本処理から得られる生成物の分析の結果を表２に示す（上と同じ命名法）。
【００２９】
【表２】
0005414529.tif 000003
反応条件（２）：本サンプルは、サンプル５ｇに対する元素硫黄５０ｍｇの添加によって処理して、総濃度１％（ｗ／ｗ）を与えた。サンプルを激しく振とうすることによって混合して、６０℃または７０℃にて維持した。本処理から得られる生成物の分析の結果を表３に示す（上と同じ命名法）。
【００３０】
【表３】
0005414529.tif 000004
反応条件（３）：本サンプルは、サンプル５ｇに対する元素硫黄５ｍｇの添加によって処理して、総濃度０．１％（ｗ／ｗ）を与えた。サンプルを激しく振とうすることによって混合して、６０℃または７０℃で維持した。本処理から得られる生成物の分析の結果を表４に示す（上と同じ命名法）。
【００３１】
【表４】
0005414529.tif 000005
反応条件（４）：本サンプルは、サンプル５ｇに対する元素硫黄５ｍｇの添加によって（総濃度０．１％（ｗ／ｗ）硫黄を与える）、またジブチルアミン２０ｍｇの添加によって（濃度０．４％ｗ／ｖを与える）処理した。サンプルを激しく振とうすることによって混合して、６０℃または７０℃で維持した。本処理から生じる生成物の分析の結果を表５に示す（上と同じ命名法）。
【００３２】
【表５】
0005414529.tif 000006
【００３３】
２つの「アリシン濃縮サンプル」の初期ポリスルフィド濃度にはかなりの実質的な差があるが、データは熱、硫黄および塩基アミンの添加に対する両方の溶液の反応性に明らかな一貫性を示している。
【００３４】
表１から５に示す初期データは、硫黄の存在下でのアリシンのポリスルフィドへの変換のパターンが２つの温度において非常に類似していることを明瞭に示し、インキュベーション温度が上昇するについて、ＤＡＳ４、ＤＡＳ５およびＤＡＳ６などの高級ポリスルフィドの濃度が上昇する兆候はなかった。
【００３５】
硫黄を５０ｍｇ／５ｇ（１％ｗ／ｗ）で添加したときに、両方の温度で高級ポリスルフィドの濃度に明らかな上昇があった。ＤＡＳ４の濃度は両方の温度で２倍になった。ＤＡＳ５の濃度は７０℃で５倍に上昇して、ＤＡＳ６は６０℃および７０℃の両方で初めて出現した。
【００３６】
５ｍｇ／５ｇ（０．１％ｗ／ｗ）のより低レベルの硫黄添加では、高級ポリスルフィドで５０ｍｇの添加で見られたのと同様の増加があるが、最も重要なのは、７０℃にてＤＡＳ４になお大きい相対的な増加があり、この増加はＤＡＳ５およびＤＡＳ６の相対濃度の低下によって補償されるように思われる。ＤＡＳ４は、作物保護に関連して特に重要なポリスルフィドである。
【００３７】
これらの結果はＤＡＳ４濃度に基づいて、硫黄添加および軽い加熱の組み合せによってＤＡＳ４の濃度を上昇させるためにニンニク抽出物を増強する、注目に値する範囲があることを明瞭に示している。
【００３８】
最初の分析では、アリシン濃縮溶液が次に７０℃まで１時間加熱される場合には、０．１％ｗ／ｗ（約１ｋｇ／トン）での硫黄添加はＤＡＳ４濃度を３倍にすることができる。
【００３９】
最後の実験組み合せはジブチルアミンと硫黄５ｍｇとの添加を含んでおり、これは硫黄のみの添加とは全く異なるパターンのポリスルフィド蓄積を生じた。アミノの添加は、高級ポリスルフィドの分解を触媒して、インキュベーション温度に関連する２つの結果を生じた：より低温では、０．１％ｗ／ｗ硫黄の存在下でのジブチルアミンの触媒作用は、低温インキュベーション対照と比較したときに、ＤＡＳ４濃度を３倍にするように思われる。これは、７０℃のインキュベーション温度で観察されたＤＡＳ４濃度の実質的な低下と対照をなした。さらにジブチルアミン（窒素孤立電子対）も、反応順序のいずれかでこの分子が初めて出現したときに、ジアリルスルフィドＤＡＳの生成を触媒した。
【００４０】
本実験群は、ニンニクなどの植物源から得られるポリスルフィド含有組成物の産生を向上させるための注目に値する範囲を明らかに特定する。このような向上は、顕著な費用および有効性結果を有することができる。
【００４１】
フェーズ２実験
さらなる一連の実験において、ニンニク抽出物のポリスルフィド組成物の操作を、新たに調製した抽出物に、および約３ヶ月間凍結状態で貯蔵されていた抽出物にも対して実施して、このような天然産物で観察されることが多い代表的な生物学的変動による結果であり得る、そのバックグラウンドマトリクスにおける変動を有するサンプルに対する技法の適用性を証明した。サンプルは異なる外観（異なる色）を有し、このことはアリシンが見出される植物由来マトリクス間での違いを示している。
【００４２】
Ｎｅｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄより再度供給された、アリシン約１０，０００ｐｐｍを含有するサンプルは、凍結状態で貯蔵した。サブサンプルを解凍して、秤量して１０ｇの分割量として、元素硫黄を用いた各種の改変を続けた。
【００４３】
次にすべてのサンプルを周期的に激しく振とうしながら７０℃にて１時間加熱して、氷水で急冷した。
【００４４】
冷却後、反応した上清のサンプル１００ｍｇを純エタノール１０ｍｌに添加して、得られた溶液を次に混合して、サブサンプルを濾過して、ＨＰＬＣで分析した。
【００４５】
サンプルは、熟成サンプルの場合には「Ｎｏｖ０６」と符号化されて、色が明るいオレンジ色であった。未成熟サンプルは「Ｍａｒ０７」と符号化して、色は明瞭に緑色であった；どちらも新たに粉砕したニンニクと同様の臭いを有していた。
【００４６】
硫黄との反応は、硫黄を添加せずに加熱したサブサンプルと、硫黄を添加せずに冷蔵庫に入れたサブサンプルとに対照させた。１時間後、すべての実験溶液を処理して、ＨＰＬＣによって群として分析した。次の結果が得られた：
【００４７】
【表６】
0005414529.tif 000007
ＤＡＳ、ＤＡＳ２などの命名法は上の通りである。ＤＡＳ７はジアリルヘプタスルフィドである。
【００４８】
データは、一部のポリスルフィドが最初にサンプル中に存在しており、両方のサンプルが実験開始時にある程度の類似性を有していたことを明瞭に示している。熱の影響は明らかであり、両方のサンプルＮｏｖ０６およびＭａｒ０７はＤＡＳ３およびＤＡＳ４濃度の明確な上昇を示している。Ｎｏｖ０６サンプルは、Ｍａｒ０７サンプルの９９％に対して２４７％という、最大の相対的増加を示している。同様のパターンは、ＤＡＳ４における増加でも明白である（２５９％対１０７％）。
【００４９】
２０ｍｇ／試験細胞での硫黄の包含は明らかに、ＤＡＳ３の減少と思われることでＤＡＳ５の出現を誘発する。ＤＡＳ７も出現するが、ＤＡＳ７と元素硫黄の同時溶離の可能性があるため、このことはまだ確認されていない。
【００５０】
硫黄を５０ｍｇ／試験細胞まで添加すると、ＤＡＳ３を越えるすべてのポリスルフィドが全般的に増加して、Ｎｏｖ０６サンプルのＤＡＳ２と、Ｎｏｖ０６およびＭａｒ０７サンプルの両方のＤＡＳ６が出現する。
【００５１】
データは一般に、アリシン濃縮物質の異なる供給源が熱に対して異なる反応性を示し、Ｎｏｖ０６サンプルが比較的さらに多くのアリシンをＤＡＳ３およびＤＡＳ４に変換することを確認するように思われる。このこととは対照的に、Ｍａｒ０７サンプルが、ＤＡＳ３を含む反応であると思われる反応において、より多くの元素硫黄を高級ポリスルフィド（ＤＡＳ５およびＤＡＳ６）に変換するように思われるのは、高級ポリスルフィドが増加するにつれて、この分子の濃度が明らかに低下するためである。
【００５２】
これらのデータは、（上述したような）Ｎｏｖ０６サンプルについての他の試験と併せて、担体マトリクスの状態が、熱のみによって、または熱と添加された硫黄によって、アリシン−ポリスルフィド変換工程に影響を及ぼすという強力な証拠を与える。
【００５３】
フェーズ１およびフェーズ２試験はどちらも、硫黄濃度の上昇がＤＡＳ６を出現させることを示している。２つの試験は、中間レベルの硫黄添加がＤＡＳ６を出現させずに、ＤＡＳ５を生成させることも示している。
【００５４】
ＤＡＳ４も、硫黄の添加が増加するにつれて濃度の上昇を示しており、硫黄を５０ｍｇ／１０ｇの比で添加したときに、Ｎｏｖ０６およびＭａｒ０７サンプルの両方で最大４倍の濃度上昇が認められた。
【００５５】
２つのアリシン源の「反応性」の相対的な差とは無関係に、熱と硫黄添加の組み合せに対する明確で一般的な結果がある。
【００５６】
熱はアリシンをＤＡＳ３に変換して、硫黄の増加はＤＡＳ３をＤＡＳ４、ＤＡＳ５およびＤＡＳ６に変換し、その相対的な増加はマトリクスおよび硫黄濃度によって影響されるように思われる。Ｎｏｖ０６物質に対する第１の実験（フェーズ１）も、塩基（たとえばジブチルアミン）の導入が高級ポリスルフィド、特にジアリルテトラスルフィドおよびジアリルペンタスルフィドの分解に触媒効果を有し、ジアリルスルフィドを出現させることを明確に示していた。
【００５７】
（全体の観察結果）
上のフェーズ１およびフェーズ２実験は、アリシンのポリスルフィドへの変換において高度の全体的な予測性を示している。熱は、硫黄の増加と併せて、高級ポリスルフィドＤＡＳ３、ＤＡＳ４、ＤＡＳ５およびＤＡＳ６の蓄積を必然的に引き起こす。
【００５８】
変換工程の終点は硫黄の相対濃度に影響されやすく、ＤＡＳ３、ＤＡＳ４、ＤＡＳ５およびＤＡＳ６の濃度関係が工程制御の変更によって操作できることが示唆されている。
【００５９】
フェーズ１試験より、マトリクスのｐＨ（それゆえ、たとえば内在性および添加されたアミンの窒素孤立対のプロトン化の状態）が、たとえばＤＡＳ４およびＤＡＳ５の蓄積に重大な影響を有するという多少の証拠もある。
【００６０】
したがって、アリシンを含む「代表的な」ニンニク汁抽出物で作用する２つの対立する効果があると思われる。第１の効果は、元素硫黄の添加および熱の印加の結果としての、高級ポリスルフィドの予測可能な増加および蓄積である。第２の効果は、非プロトン化アミンの存在下での、これらの高級ポリスルフィドのＤＡＳおよびＤＡＳ２への迅速な触媒的分解である。したがってこれらの２つの効果によって、当業者はポリスルフィドのスペクトルの操作に取り組んで所望の生成物を産生することができる。
【００６１】
ワークアップ前のマトリクスの適切な操作、たとえばｐＨの操作およびアミノ酸含有量の調節によって、ＤＡＳ４、ＤＡＳ５およびＤＡＳ６の実質的な生成条件を加熱および硫黄添加前に生じさせることができる。熱と硫黄との間の相互関係の操作によって、ＤＡＳ３、ＤＡＳ４、ＤＡＳ５およびＤＡＳ６の実際の、相対的な濃度のほぼ実質的な相違を製造工程に要因として含めることができる。