(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの内部シトシン−グアニン（ＣＧ）ジヌクレオチドおよびキメラ骨格を有する、１６〜２４ヌクレオチド長の間の免疫刺激性核酸分子を含むオリゴヌクレオチドであって、該少なくとも２つの内部ＣＧジヌクレオチドがホスホジエステルヌクレオチド間連結を有し、
ここで、該オリゴヌクレオチドが、さらなる内部ＣＧジヌクレオチドを含む場合、該さらなる内部ＣＧジヌクレオチドがホスホジエステル、または安定化されたヌクレオチド間連結を有し、全ての他のヌクレオチド間連結が安定化され、該安定化されたヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって、該免疫刺激性核酸が、ホスホジエステルヌクレオチド間連結を有する複数の少なくとも３つの内部ＣＧジヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のオリゴヌクレオチドであって、あらゆる内部ＣＧジヌクレオチドが、ホスホジエステルヌクレオチド間連結を有する、オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記免疫刺激核酸分子がＢクラス免疫刺激核酸分子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記免疫刺激核酸分子がＣクラス免疫刺激核酸分子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記免疫刺激核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドでも、三重らせん形成オリゴヌクレオチドでも、リボザイムでもない、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
Ｎ１−Ｃ＿Ｇ−Ｎ２−Ｃ＿Ｇ−Ｎ３を含む、１６〜２４ヌクレオチド長の間のオリゴヌクレオチドであって、
Ｎ１およびＮ３が各々独立して、核酸配列であり、＿が内部ホスホジエステルヌクレオチド間連結を示し、Ｎ２が独立して核酸配列であり、ここで、ＣとＧとの間以外の全ての他のヌクレオチド間連結が安定化された連結であり、ここで、該安定化されたヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である、オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
Ｎ１−Ｃ＿Ｇ−Ｎ２−Ｃ＿Ｇ−Ｎ３を含む、１６〜２４ヌクレオチド長の間のオリゴヌクレオチドであって、
Ｎ１およびＮ３が各々独立して、核酸配列であり、＿が内部ホスホジエステルヌクレオチド間連結を示し、Ｎ２が独立して４〜２０ヌクレオチド長の核酸配列であり、ここで、ＣとＧとの間以外の全ての他のヌクレオチド間連結が安定化された連結であり、ここで、該安定化されたヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である、オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
Ｎ１−Ｃ＿Ｇ−Ｎ２−Ｃ＿Ｇ−Ｎ３を含む、１６〜２４ヌクレオチド長の間のオリゴヌクレオチドであって、
Ｎ１、Ｎ２およびＮ３が各々独立して、０〜２０ヌクレオチド長の核酸配列であり、＿が内部ホスホジエステルヌクレオチド間連結を示し、該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドでも、三重らせん形成オリゴヌクレオチドでも、リボザイムでもなく、全ての他のヌクレオチド間連結が安定化され、該安定化されたヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である、オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが、アジュバントもしくはサイトカインまたは抗原をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
免疫応答を調節するのに有効な量で、被験体に投与するために処方されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、免疫応答調節するための薬学的組成物。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドが被験体におけるガンを処置するために該被験体に送達するために処方されている、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが被験体における感染性疾患を処置するために該被験体に送達するために処方されている、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが被験体における自己免疫疾患を処置するために該被験体に送達するために処方されている、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドが被験体における気道再構築を処置するために該被験体に送達するために処方されている、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
抗原をさらに含む、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
被験体に対する治療プロトコールの一部としての投与のために処方されている、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記治療プロトコールが外科手術である、請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記治療プロトコールが放射線である、請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記治療プロトコールが医薬である、請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチドが処方される、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドが標的化分子に会合される、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドが、経口、経鼻、舌下、静脈内、皮下、粘膜、呼吸、直接注射および経皮的経路からなる群より選択される経路による送達のために処方されている、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記オリゴヌクレオチドが、サイトカイン発現を誘導するのに有効な量で前記被験体に送達するために処方されている、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記サイトカインがＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮγおよびＩＰ−１０からなる群より選択される、請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
前記オリゴヌクレオチドが、Ｔｈ２バイアス応答からＴｈ１バイアス応答に免疫応答を偏移するのに有効な量で前記被験体に送達するために処方されている、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、免疫応答を刺激するための薬学的組成物。
【請求項２８】
免疫応答を刺激するための請求項１〜１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの医薬を製造するための方法。
【請求項２９】
被験体における免疫応答を調節するための医薬の製造における請求項１〜１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項３０】
前記被験体がガンを有する、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記被験体が感染性疾患を有する、請求項２９に記載の使用。
【請求項３２】
前記医薬が、Ｔｈ２バイアス応答からＴｈ１バイアス応答に免疫応答を偏移する、請求項２９に記載の使用。
【請求項３３】
５’  Ｔ＊Ｃ_Ｇ＊Ｔ＊Ｃ_Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ_Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ_Ｇ＊Ｔ＊Ｔ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３１３）を含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドであって、ここで、ＣとＧとの間以外の全ての他のヌクレオチド間結合が安定化された結合である、免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は概して、免疫刺激性核酸、ならびに腎炎症作用の低下した免疫刺激性オリゴヌクレオチド、その組成物およびこの免疫刺激性核酸を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
細菌ＤＮＡは、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞を活性化する免疫刺激性効果を有するが、脊椎動物ＤＮＡは有さない（Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｔら、１９８８、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７９：６８２〜６８６；Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｔら、１９８４、ＪＮＣＩ  ７２：９５５〜９６２；Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｊ．Ｐ．ら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１７５９〜１７６４；そしてＫｒｉｅｇ，１９９８、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃ．Ａ．ＳｔｅｉｎおよびＡ．Ｍ．Ｋｒｉｅｇ（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，４３１〜４４８頁に概説される）。細菌ＤＮＡのこれらの免疫刺激効果は、細菌ＤＮＡにおいて一般的であるが、ただし脊椎動物ＤＮＡにおいてはメチル化されて十分提示されていない、特定の塩基の状況（ＣｐＧモチーフ）におけるメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドの存在の結果であることが現在理解されている（Ｋｒｉｅｇら，１９９５  Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６〜５４９；Ｋｒｉｅｇ，１９９９  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９３３２１：１〜１０）。細菌ＤＮＡの免疫刺激効果は、これらのＣｐＧモチーフを含む合成のオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を用いて模倣できる。このようなＣｐＧ  ＯＤＮは、ヒトおよびマウスの白血球に高度に刺激性の効果を有し、Ｂ細胞増殖；サイトカインおよび免疫グロブリンの分泌；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解活性およびＩＦＮ−γ分泌；ならびに同時刺激分子を発現してサイトカイン、特にＴｈ１様Ｔ細胞応答の発達を促進するのに重要なＴｈ１様サイトカインを分泌する樹状細胞（ＤＣ）および他の抗原提示細胞の活性化を誘導する。天然のホスホジエステル骨格ＣｐＧ  ＯＤＮのこれらの免疫刺激効果は、ＣｐＧモチーフがメチル化されて、ＣｐＧに変化されるか、さもなければ排除されるかまたは変更される場合、その効果が劇的に低下するという点で高度にＣｐＧ特異的である（Ｋｒｅｉｇら、１９９５  Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６〜５４９；Ｈａｒｔｍａｎｎら、１９９９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：９３０５〜１０）。
【０００３】
初期の研究では、免疫刺激性ＣｐＧモチーフは、プリン−プリン−ＣｐＧ−ピリミジン−ピリミジンという式に従うと考えられた（Ｋｒｉｅｇら、１９９５  Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６〜５４９；Ｐｉｓｅｔｓｋｙ，１９９６  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４２１〜４２３；Ｈａｃｋｅｒら，１９９８  ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：６２３０〜６２４０；Ｌｉｐｆｏｒｄら、１９９８  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：４９６〜５００）。しかし、マウスリンパ球がこの「式（ｆｏｒｍｕｌａ）」に従わないホスホジエステルＣｐＧモチーフに全く十分に応答すること（Ｙｉら、１９９８  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５８９８〜５９０６）、そして同じことがヒトＢ細胞および樹状細胞にもあてはまること（Ｈａｒｔｍａｎｎら，１９９９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：９３０５〜１０；Ｌｉａｎｇ，１９９６  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１１１９〜１１２９）が今や明確である。
【０００４】
いくつかの異なるクラスのＣｐＧ核酸が近年記載されている。１つのクラスはＢ細胞活性化について強力であるが、ＩＦＮ−αおよびＮＫ細胞活性化を誘導するのは比較的弱い；このクラスはＢクラスと命名されている。このＢクラスのＣｐＧ核酸は代表的には、十分に安定化されており、特定の好ましい塩基の状況ではメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含む。例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；同第６，２０７，６４６号；同第６，２１４，８０６号；同第６，２１８，３７１号；同第６，２３９，１１６号および同第６，３３９，０６８号を参照のこと。別のクラスのＣｐＧ核酸はＢ細胞およびＮＫ細胞を活性化して、ＩＦＮ−αを誘導する；このクラスはＣクラスと命名されている。ＣクラスのＣｐＧ核酸は、最初に特徴付けられたとおり、代表的には完全に安定化されており、Ｂクラスタイプの配列およびＧＣリッチ回文構造またはほぼ回文構造を含む。このクラスは、２００１年８月１７日に提出された同時継続の米国仮特許出願６０／３１３，２７３号、および２００２年８月１９日に提出されたＵＳ１０／２２４，５２３号に、そして国際公開番号（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ）ＷＯ０３／０１５７１１のもとで公開された関連のＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／２６４６８に記載されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
驚くべきことに、ＢクラスおよびＣクラスのＣｐＧ核酸および他の安定化された免疫刺激性核酸の免疫刺激特性は、特定のヌクレオチド間の１つ以上の非安定化連結の選択的包含によって維持されるかまたは改善さえされ得ることが発見された。安定化されていない連結は好ましくは天然の連結、すなわちホスホジエステル連結またはホスホジエステル様連結である。安定化されていない連結は代表的には、ただし必須ではないが、ヌクレアーゼ消化に対して比較的感受性である。本発明の免疫刺激核酸は、５’ピリミジン（Ｙ）と隣接する３’プリン（Ｚ）、好ましくはグアニン（Ｇ）との間に位置する少なくとも１つの安定化されていない連結であって、ここで５’Ｙおよび３’Ｚの両方とも内部ヌクレオチドである連結を含む。
【０００６】
完全に安定化された免疫刺激性核酸と同様に、本発明の免疫刺激核酸は、Ｔｈ１様免疫応答を誘導するのに有用である。従って、本発明の免疫刺激性核酸はワクチン接種のためのアジュバントとして有用であり、そしてそれらはガン、感染性疾患、アレルギーおよび喘息を含む疾患を処置するために有用である。それらは、任意の目的のために免疫刺激性核酸の長期または反復投与が求められる任意の条件において特定の用途があると考えられる。
【０００７】
完全に安定化された免疫刺激核酸が有用性を有する任意の目的のために有用であることに加えて、本発明の免疫刺激核酸はいくつかの実施形態において、完全に安定化された免疫刺激核酸を上回る利点、例えば力価の増大および毒性の低下を有する。
【０００８】
本発明は部分的には免疫刺激性ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドに関する。１つの局面では、本発明は式：
【０００９】
【化２３】
0005414961.tif 000002
【００１０】
を有するオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドにおいて、Ｎ１は０〜６ヌクレオチドであって、Ｎ２は０〜７ヌクレオチドである。＊という記号は、安定化されたヌクレオチド間連結の存在を示す。＊の印を付けられていないヌクレオチド間連結は、このオリゴヌクレオチドが少なくとも２つのホスホジエステルヌクレオチド間連結を含む限
り、安定化されてもされなくてもよい。安定化されたヌクレオチド間連結はホスホロチオエート連結であってもよい。いくつかの実施形態ではＮ１は０〜２ヌクレオチドである。好ましくはオリゴヌクレオチドは１６〜２４ヌクレオチド長である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドは以下の構造：
【００１２】
【化２４】
0005414961.tif 000003
【００１３】
のうちの１つを有する。＿という記号は、ホスホジエステルヌクレオチド間連結の存在を示す。
【００１４】
好ましくは、このオリゴヌクレオチドは、
【００１５】
【化２５】
0005414961.tif 000004
【００１６】
である。
【００１７】
本発明は、他の局面では、：
【００１８】
【化２６】
0005414961.tif 000005
【００１９】
を含むオリゴヌクレオチドに関する。Ｎ３は０〜４ヌクレオチドである。Ｎ４は１〜５ヌクレオチドである。Ｎ５は０〜７ヌクレオチドである。＊という記号は、安定化されたヌクレオチド間連結の存在を示す。＊の印を付けられていないヌクレオチド間連結は、このオリゴヌクレオチドが少なくとも２つのホスホジエステルヌクレオチド間連結を含む限り、安定化されてもされなくてもよい。安定化されたヌクレオチド間連結はホスホロチオエート連結であってもよい。いくつかの実施形態ではＮ４は１〜２ヌクレオチドである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは１６〜２４ヌクレオチド長である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、このオリゴヌクレオチドは以下の構造：
【００２１】
【化２７】
0005414961.tif 000006
【００２２】
のうちの１つを有する。
【００２３】
好ましくは、このオリゴヌクレオチドは、
【００２４】
【化２８】
0005414961.tif 000007
【００２５】
である。
【００２６】
他の局面によれば：
【００２７】
【化２９】
0005414961.tif 000008
【００２８】
を含むオリゴヌクレオチドが提供される。Ｎは任意のオリゴヌクレオチドである。＊という記号は、安定化されたヌクレオチド間連結の存在を示す。＊の印を付けられていないヌクレオチド間連結は、このオリゴヌクレオチドが少なくとも３つのホスホジエステルヌクレオチド間連結を含む限り、安定化されてもされなくてもよい。安定化されたヌクレオチド間連結はホスホロチオエート連結であってもよい。いくつかの実施形態ではこのオリゴヌクレオチドは、５つのホスホジエステルヌクレオチド間連結を含む。好ましくは、このオリゴヌクレオチドは１６〜２４ヌクレオチド長である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドは以下の配列：
【００３０】
【化３０】
0005414961.tif 000009
【００３１】
のうちの１つを有する。１つの実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、
【００３２】
【化３１】
0005414961.tif 000010
【００３３】
である。＿という記号はホスホジエステルヌクレオチド間連結の存在をいう。
【００３４】
他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドはホスホジエステルヌクレオチド間連結を有する少なくとも１つのＣ＿Ｇモチーフを含む。さらに他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルヌクレオチド間連結を有するいずれのＣ＿Ｇモチーフも含まない。
【００３５】
他の局面では、
【００３６】
【化３２】
0005414961.tif 000011
【００３７】
という構造を有するオリゴヌクレオチドが提供される。Ｎ６およびＮ７は独立して１〜５ヌクレオチド長であり、このオリゴヌクレオチドは１６〜４０ヌクレオチド長を有する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、Ｎ６はヌクレオチドであり、例えばＮ６はＴであってもＡであってもよい。いくつかの実施形態におけるＮ７は５ヌクレオチドであり、例えばＮ７は、５つのピリミジンまたはＴＴＴＴＧであってもよい。
【００３９】
いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドは：
【００４０】
【化３３】
0005414961.tif 000012
【００４１】
という構造を有する。
【００４２】
以下：
【００４３】
【化３４】
0005414961.tif 000013
【００４４】
という構造を有するオリゴヌクレオチドが、本発明の他の局面によって提供される。Ｎ８は４〜１０ヌクレオチド長であって、少なくとも１Ｃ＿Ｇモチーフを含む。Ｎ９は０〜３ヌクレオチド長である。このオリゴヌクレオチドは１５〜４０ヌクレオチドの長さを有する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、Ｎ８は、少なくとも２または３つのＣＧモチーフを含む。他の実施形態では、Ｎ８は、ＰｕＣＧＰｙＰｙＣＧまたはＰｕＣＧＰｙＰｙＣＧＣＧである。必要に応じて、Ｎ８はＡＣＧＴＴＣＧである。Ｎ９は少なくともＣＧモチーフ、例えばＣＣＧを含んでもよい。
【００４６】
いくつかの実施形態において、このオリゴヌクレオチドは：
【００４７】
【化３５】
0005414961.tif 000014
【００４８】
という構造を有する。
【００４９】
別の局面では、
【００５０】
【化３６】
0005414961.tif 000015
【００５１】
という式を有するオリゴヌクレオチドが提供される。Ｎ１０は４〜８ヌクレオチド長であり、少なくとも１つのＣ＿Ｇモチーフを含む。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は独立してＣまたはＧである。オリゴヌクレオチドは２４〜４０ヌクレオチドの長さを有する。
【００５２】
いくつかの実施形態において、Ｎ１０は少なくとも２つまたは３つのＣＧモチーフを含む。他の実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、以下の構造：
【００５３】
【化３７】
0005414961.tif 000016
【００５４】
のうちの１つを有する。
【００５５】
他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは：
【００５６】
【化３８】
0005414961.tif 000017
【００５７】
という構造を有する。
【００５８】
いくつかの局面において、ＯＤＮは、
【００５９】
【化３９】
0005414961.tif 000018
【００６０】
からなる群より選択される配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００６１】
別の局面において、本発明はホスホジエステルまたはホスホジエステル様ヌクレオチド間連結を有する少なくとも１つのＹＺジヌクレオチド、および少なくとも４つのＴヌクレオチドを含む八量体配列を含むオリゴヌクレオチドであり、ここでＹは、ピリミジンまた
は修飾ピリミジンであり、Ｚはグアノシンまたは修飾グアノシンであり、このオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの安定化されたヌクレオチド間連結を含む。
【００６２】
Ｙは、メチル化されていないＣであってもよい。Ｚはグアノシンであってもよい。いくつかの実施形態では、Ｙはシトシンであるか、または５−メチルシトシン、５−メチル−イソシトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ハロゲノシトシン、ウラシル、Ｎ４−エチルシトシン、５−フルオロ−ウラシルおよび水素からなる群より選択される修飾シトシン塩基である。他の実施形態では、Ｚは、グアニンであるか、または７−デアザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン（例えば、７−デアザ−７−（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルグアニン）、７−デアザ−８−置換グアニン、ヒポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、プリン、８−置換グアニン、例えば、８−ヒドロキシグアニンおよび６−チオグアニン、２−アミノプリンおよび水素からなる群より選択される修飾グアニン塩基である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、この八量体配列はＴＴＴＴモチーフを含む。他の実施形態では、八量体配列は２つのＹＺジヌクレオチドを含む。必要に応じて両方のＹＺジヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様ヌクレオチド間連結を有する。
【００６４】
いくつかの実施形態では、八量体配列は、
【００６５】
【化４０】
0005414961.tif 000019
【００６６】
からなる群より選択され、ここで＊は、安定化されたヌクレオチド間連結の存在を示し、＿はホスホジエステルヌクレオチド間の存在を示す。
【００６７】
他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは８〜４０ヌクレオチドの長さを有する。
【００６８】
ホスホジエステル様連結は、ボラノホスホネートまたはジアステレオマー的に純粋なＲｐホスホロチオエートであってもよい。必要に応じて、この安定化されたヌクレオチド間連結は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、およびそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【００６９】
オリゴヌクレオチドは１つまたは２つの接近可能な５’末端を有する３’−３’連結を有し得る。いくつかの好ましい実施形態では、このオリゴヌクレオチドは２つの接近可能な５’末端を有し、その各々が５’ＴＣＧである。
【００７０】
本発明の別の局面において、
【００７１】
【化４１】
0005414961.tif 000020
【００７２】
を含むオリゴヌクレオチドが提供される。少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドが、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様ヌクレオチド間連結を有し、そしてこのオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの安定化されたヌクレオチド間連結を含む。
【００７３】
他の局面では、本発明は、５’ＧＮＣ３’を含むオリゴヌクレオチドであって、Ｎは４〜１０ヌクレオチド長の核酸配列であり、少なくとも５０％のＴであり、ＣＧジヌクレオチドを含まず、そしてこのオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの安定化されたヌクレオチド間連結を含む。１つの実施形態では、ＮはＴＴＴＴモチーフを含む。他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊ＣおよびＧ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃからなる群より選択され、＊は安定化されたヌクレオチド間連結の存在を示す。
【００７４】
別の局面において、本発明は、少なくとも１つの内部ピリミジン−プリン（ＹＺ）ジヌクレオチドおよび必要に応じてピリミジン−グアノシン（ＹＧ）ジヌクレオチドおよびキメラ骨格を有する免疫刺激性核酸分子を提供するが、この少なくとも１つの内部ＹＺジヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結を有し、必要に応じて各々のさらなる内部ＹＺジヌクレオチドがホスホジエステル、ホスホジエステル様または安定化されたヌクレオチド間連結を有しており、全ての他のヌクレオチド間連結が安定化される。１つの実施形態において、この免疫刺激核酸は、複数の内部ＹＺジヌクレオチドを含み、この各々がホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結を有する。１つの実施形態において、あらゆる内部ＹＺジヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結を有する。
【００７５】
１つの実施形態において、免疫刺激性核酸分子は：
【００７６】
【化４２】
0005414961.tif 000021
【００７７】
【化４３】
0005414961.tif 000022
【００７８】
【化４４】
0005414961.tif 000023
【００７９】
【化４５】
0005414961.tif 000024
【００８０】
からなる群より選択され、ここで＊は、ホスホロチオエートであり、＿はホスホジエステルであり、Ｕは２’−デオキシウラシルであり、そして７は７−デアザグアニンである。
【００８１】
１つの実施形態において、この免疫刺激性核酸分子は：
【００８２】
【化４６】
0005414961.tif 000025
【００８３】
からなる群より選択され、ここで＊は、ホスホロチオエートであり、＿はホスホジエステルである。
【００８４】
別の局面において、本発明は、キメラ骨格および少なくとも１つの配列Ｎ１ＹＧＮ２を含む免疫刺激核酸分子を提供し、ここで各々の配列Ｎ１ＹＧＮ２について独立して、ＹＧは、内部ピリミジン−グアノシン（ＹＧ）ジヌクレオチドであり、Ｎ１およびＮ２は各々が他方と独立して、任意のヌクレオチドであり、ここで少なくとも１つの配列Ｎ１ＹＧＮ２についておよび必要に応じて各々のさらなる配列Ｎ１ＹＧＮ２について：このＹＧジヌクレオチドが、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結を有し、そしてＮ１およびＹは、Ｎ１が内部ヌクレオチドである場合、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結によって連結されるか、ＧおよびＮ２は、Ｎ２が内部ヌクレオチドである場合、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結によって連結されるか、あるいはＮ１およびＹは、Ｎ１が内部ヌクレオチドである場合、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結によって連結され、そしてＧおよびＮ２は、Ｎ２が内部ヌクレオチドである場合、ホスホジエステル
またはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結によって連結され、ここで全ての他のヌクレオチド間連結が安定化される。
【００８５】
１つの実施形態では、この免疫刺激核酸が複数の配列Ｎ１ＹＧＮ２を含み、ここで各々の配列Ｎ１ＹＧＮ２について：ＹＧジヌクレオチドが、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結を有し、そしてＮ１およびＹは、Ｎ１が内部ヌクレオチドである場合、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結によって連結されるか、ＧおよびＮ２は、Ｎ２が内部ヌクレオチドである場合、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結によって連結されるか、あるいはＮ１およびＹは、Ｎ１が内部ヌクレオチドである場合、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結によって連結され、そしてＧおよびＮ２は、Ｎ２が内部ヌクレオチドである場合、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結によって連結される。
【００８６】
１つの実施形態において、この免疫刺激性核酸分子は：
【００８７】
【化４７】
0005414961.tif 000026
【００８８】
【化４８】
0005414961.tif 000027
【００８９】
【化４９】
0005414961.tif 000028
【００９０】
【化５０】
0005414961.tif 000029
【００９１】
【化５１】
0005414961.tif 000030
【００９２】
からなる群より選択され、
ここで＊は、ホスホロチオエートであり、＿はホスホジエステルである。
【００９３】
１つの実施形態では、この免疫刺激性核酸分子は：
【００９４】
【化５２】
0005414961.tif 000031
【００９５】
からなる群より選択され、ここで＊は、ホスホロチオエートであり、＿はホスホジエステルである。
【００９６】
１つの実施形態において、この免疫刺激性核酸分子は：
【００９７】
【化５３】
0005414961.tif 000032
【００９８】
からなる群より選択され、
ここで＊は、ホスホロチオエートであり、＿はホスホジエステルである。
【００９９】
１つの実施形態では、この免疫刺激性核酸分子は：
【０１００】
【化５４】
0005414961.tif 000033
【０１０１】
からなる群より選択され、ここで＊は、ホスホロチオエートであり、＿はホスホジエステルである。
【０１０２】
１つの実施形態において、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様ヌクレオチド間連結を有する少なくとも１つの内部ＹＧジヌクレオチドはＣＧである。１つの実施形態では、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様ヌクレオチド間連結を有する少なくとも１つの内部ＹＧジヌクレオチドはＴＧである。
【０１０３】
１つの実施形態において、このホスホジエステルまたはホスホジエステル様ヌクレオチド間連結は、ホスホジエステルである。１つの実施形態では、ホスホジエステル様連結は、ボラノホスホネートまたはジアステレオマー的に純粋なＲｐホスホロチオエートである。
【０１０４】
１つの実施形態では、この安定化されたヌクレオチド間連結は：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。１つの実施形態では、安定化されたヌクレオチド間連結はホスホロチオエートである。
【０１０５】
１つの実施形態では、この免疫刺激性核酸分子は、Ｂクラス免疫刺激性核酸分子である
。１つの実施形態では、この免疫刺激性核酸分子はＣクラス免疫刺激性核酸分子である。
【０１０６】
１つの実施形態では、この免疫刺激性核酸分子は４〜１００ヌクレオチド長である。１つの実施形態において、この免疫刺激性核酸分子は６〜４０ヌクレオチド長である。１つの実施形態では、この免疫刺激性核酸分子は６〜１９ヌクレオチド長である。
【０１０７】
１つの実施形態では、この免疫刺激性核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドでも、三重らせん形成オリゴヌクレオチドでも、リボザイムでもない。
【０１０８】
別の局面では、本発明は、
Ｎ１−Ｃ＿Ｇ−Ｎ２−Ｃ＿Ｇ−Ｎ３
を含むオリゴヌクレオチドであって、
ここでＮ１およびＮ３が各々独立して、１〜２０ヌクレオチド長の核酸配列であり、＿が内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結を示し、Ｎ２が独立して０〜２０ヌクレオチド長の核酸配列であり、Ｇ−Ｎ２−Ｃが１または２つの安定化された連結を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１０９】
別の局面では、本発明は、
Ｎ１−Ｃ＿Ｇ−Ｎ２−Ｃ＿Ｇ−Ｎ３
を含むオリゴヌクレオチドであって、
ここでＮ１およびＮ３が各々独立して、１〜２０ヌクレオチド長の核酸配列であり、＿が内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結を示し、
Ｎ２が独立して４〜２０ヌクレオチド長の核酸配列であり、Ｇ−Ｎ２−Ｃが少なくとも５つの安定化された連結を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１１０】
別の局面では、本発明は、
Ｎ１−Ｃ＿Ｇ−Ｎ２−Ｃ＿Ｇ−Ｎ３
を含むオリゴヌクレオチドであって、
ここでＮ１、Ｎ２およびＮ３は各々独立して、０〜２０ヌクレオチド長の核酸配列であり、＿は内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結を示し、このオリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドでも、三重らせん形成オリゴヌクレオチドでも、リボザイムでもないオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１１１】
別の局面において、本発明は、Ｘ１−Ｎ１−（ＧＴＣＧＴＴ）ｎ−Ｎ２−Ｘ２（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８〜２０および５７）
を含むオリゴヌクレオチドであって、
ここでＮ１およびＮ２は各々独立して、０〜２０ヌクレオチド長の核酸配列であり、ｎ＝２またはｎ＝４〜６であり、Ｘ１およびＸ２が各々独立して３〜１０個のヌクレオチドのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を有する核酸配列であり、Ｎ１−（ＧＴＣＧＴＴ）ｎ−Ｎ２が、少なくとも１つのホスホジエステルヌクレオチド間連結を含み、そしてこのオリゴヌクレオチドの３’および５’ヌクレオチドがポリＧ、ポリＡ、ポリＴまたはポリＣの配列を含まない、オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１１２】
１つの実施形態では、核酸はデオキシリボースまたはリボースを含む骨格を有する。
【０１１３】
１つの実施形態では、このオリゴヌクレオチドはデオキシリボースまたはリボースを含む骨格を有する。
【０１１４】
１つの実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、薬学的に受容可能なキャリアを必要に応じて含む薬学的組成物にある。
【０１１５】
１つの実施形態では、このオリゴヌクレオチドはさらにアジュバントまたはサイトカインを含む。
【０１１６】
１つの実施形態では、このオリゴヌクレオチドはさらに抗原を含み、ここでこのオリゴヌクレオチドはワクチンアジュバントである。
【０１１７】
１つの実施形態では、この抗原は：ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生生物抗原および腫瘍抗原からなる群より選択される。１つの実施形態では、この抗原は核酸ベクターによってコードされる。１つの実施形態では、この抗原はペプチド抗原である。１つの実施形態ではこの抗原はオリゴヌクレオチドまたは免疫刺激性核酸分子に共有結合される。別の実施形態では、この抗原はオリゴヌクレオチドまたは免疫刺激性核酸分子に作動可能に連結されない。
【０１１８】
別の局面では、本発明は、比較的効力があるかまたは毒性の試験免疫刺激性核酸分子を同定するための方法を提供する。この方法は、参照配列、安定化された骨格および参照の免疫刺激性の効力または毒性を有する参照免疫刺激性核酸を選択する工程と；この参照配列を有する試験免疫刺激性核酸を選択する工程であって、この参照配列における少なくとも１つの内部ＹＮジヌクレオチドのＹとＮとの間の安定化連結の代わりが、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様の連結であって、Ｙがピリミジンであり、Ｎが任意のヌクレオチドであり、試験免疫刺激性力価または毒性を有する工程と；この参照免疫刺激性効力または毒性に対してこの試験免疫刺激性の効力または毒性を比較して、この試験免疫刺激性核酸分子の相対的な効力または毒性を同定する工程と、を包含する。
【０１１９】
１つの実施形態では、この免疫刺激性核酸分子は、参照免疫刺激性核酸よりも強力なＴＬＲ９シグナル伝達活性の誘導因子である。
【０１２０】
１つの実施形態では、この試験免疫刺激性核酸は参照の免疫刺激性核酸よりも強力な１型インターフェロンの誘導因子である。
【０１２１】
１つの実施形態では、この試験免疫刺激性核酸は、参照免疫刺激性核酸よりも強力なＩＰ−１０の誘導因子である。
【０１２２】
１つの実施形態では、ＹＮはＹＧである。１つの実施形態では、少なくとも１つの内部ＹＧジヌクレオチドがＣＧである。１つの実施形態では、少なくとも１つの内部ＹＧジヌクレオチドがＴＧである。
【０１２３】
１つの実施形態では、この試験免疫刺激性核酸は、各々がホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結を有する複数の内部ＹＧジヌクレオチドを含む。１つの実施形態では、この少なくとも１つの内部ＹＧジヌクレオチドはあらゆる内部ＹＧジヌクレオチドである。
【０１２４】
１つの実施形態において、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様の連結は、ホスホジエステルである。１つの実施形態では、このホスホジエステル様の連結はボラノホスホネートまたはジアステレオマー的に純粋なＲｐホスホロチオエートである。
【０１２５】
１つの実施形態では、この安定化された骨格は：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、複数のヌクレオチド間連結を含む。１つの実施形態では、この安定化された骨格は、複数のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。
【０１２６】
１つの実施形態では、この参照免疫刺激性核酸分子は、Ｂクラス免疫刺激性核酸分子である。１つの実施形態では、この参照免疫刺激性核酸分子はＣクラス免疫刺激性核酸分子である。
【０１２７】
１つの実施形態では、この参照免疫刺激性核酸分子は４〜１００ヌクレオチド長である。１つの実施形態において、この参照免疫刺激性核酸分子は６〜４０ヌクレオチド長である。１つの実施形態では、この参照免疫刺激性核酸分子は６〜１９ヌクレオチド長である。
【０１２８】
別の局面では、本発明は２０ヌクレオチド長未満の安定化された免疫刺激性核酸分子を設計するための方法を提供する。この方法は、６〜１９ヌクレオチド長の配列であって、少なくとも１つの内部ＣＧジヌクレオチドを含む配列を選択する工程と；少なくとも１つの内部ＣＧジヌクレオチドのＣとＧとの間のホスホジエステルまたはホスホジエステル様の連結を選択する工程と；各々のさらなる内部ＣＧジヌクレオチドのＣとＧとの間のホスホジエステル、ホスホジエステル様または安定化された連結を独立して選択する工程と；他の全てのヌクレオチド間連結について安定化された連結を選択する工程とを包含する。
【０１２９】
別の局面では、本発明は、アレルギーまたは喘息を処置または防止するための方法である。この方法は、アレルギーまたは喘息を処置または防止するのに有効な量で本明細書に記載の免疫刺激性ＣｐＧオリゴヌクレオチドを被験体に投与する工程によって行なわれる。１つの実施形態では、このオリゴヌクレオチドは粘膜表面に投与される。他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドはエアロゾル処方物において投与される。必要に応じてこのオリゴヌクレオチドは経鼻的に投与される。
【０１３０】
サイトカイン産生を誘導するための方法は、本発明の別の局面に従って提供される。この方法は、本明細書に記載の免疫刺激性ＣｐＧオリゴヌクレオチドをＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦ、ＩＦＮ−α、ケモカインおよびＩＦＮ−γからなる群より選択されるサイトカインを誘導するのに有効な量で被験体に投与することによって行なわれる。
【０１３１】
別の局面では、本発明は、抗原または他の治療化合物、例えば抗菌剤と組み合わせた本明細書に記載のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの組成物である。抗菌剤は、例えば、抗ウイルス剤、抗寄生生物剤、抗細菌剤または抗真菌剤であってもよい。
【０１３２】
本明細書に記載のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む徐放性デバイスの組成物は、本発明の別の局面に従って提供される。
【０１３３】
この組成物は必要に応じて、薬学的なキャリアを含んでもよいし、および／または送達デバイスで処方されてもよい。いくつかの実施形態において、この送達デバイスは、陽イオン性脂質、細胞浸透性タンパク質および徐放性デバイスからなる群より選択される。１つの実施形態において徐放性デバイスは、生分解性ポリマーまたは微小粒子である。
【０１３４】
本発明の別の局面によれば、免疫応答を刺激する方法が提供される。この方法は、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを、被験体において免疫応答を誘導するのに有効な量でこの被験体に投与する工程を包含する。好ましくは、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、経口的に、局所的に、徐放性デバイスで、粘膜に、全身に、非経口的に、または筋肉内に投与される。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドが粘膜表面に投与される場合、これは粘膜免疫応答または全身免疫応答を誘導するために有効な量で送達され得る。好ましい実施形態では、この粘膜表面は、口、鼻、直腸、膣および眼の表面からなる群より選
択される。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、この方法は、免疫応答が抗原特異的免疫応答である抗原に対して被験体を曝露させる工程を包含する。いくつかの実施形態では、この抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生生物抗原およびペプチド抗原からなる群より選択される。
【０１３６】
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、広範なスペクトルの免疫応答を引き起こすことができる。例えばこれらのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、Ｔｈ２からＴｈ１に免疫応答を向け直すために用いることができる。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、免疫細胞、例えば、リンパ球（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）、樹状細胞およびＮＫ細胞を活性化するために用いることができる。活性化は、インビボ、インビトロまたはエキソビボで、すなわち、被験体から免疫細胞を単離する工程と、この免疫細胞を活性化するのに有効な量のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドとこの免疫細胞とを接触させる工程と、この活性化された免疫細胞をこの被験体に再投与する工程によって行なうことができる。いくつかの実施形態では、樹状細胞は、ガン抗原を提示する。この樹状細胞は、エキソビボでガン抗原に曝露され得る。
【０１３７】
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドによって生成される免疫応答はまた、サイトカインの産生、例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦ、ＩＦＮ−α、ケモカインおよびＩＦＮ−γの産生の誘導を生じ得る。
【０１３８】
さらなる別の実施形態では、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドはガンを処置するために有用である。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、ガンを発症するリスクのある被験体においてガンを予防すること（例えば、ガンを発症するリスクを軽減すること）において、本発明の他の局面によって有用である。ガンは、胆管癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸癌、子宮内膜癌、胃癌、上皮内癌、リンパ腫、肝癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌および非小細胞肺癌）、黒色腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、甲状腺癌、および腎臓癌、ならびに他の癌腫および肉腫からなる群より選択され得る。いくつかの重要な実施形態において、ガンは骨癌、脳腫瘍およびＣＮＳ癌、結合組織癌、食道癌、眼の癌、ホジキンリンパ腫、喉頭癌、口腔癌、皮膚癌および精巣癌からなる群より選択される。
【０１３９】
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、必要に応じてこのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、抗ガン治療と組み合わせて投与される場合、ガン治療（例えば、抗ガン治療）に対するガン細胞の応答性を増大するために使用され得る。この抗ガン治療は化学療法であっても、ワクチン（例えば、インビトロでプライムされた樹状細胞ワクチンまたはガン抗原ワクチン）であってもまたは抗体ベースの治療であってもよい。この後者の治療はまた、例えばガン細胞の細胞表面抗原に特異的な抗体を投与する工程を含んでもよく、この免疫応答は抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を生じる。１つの実施形態では、この抗体は、リブタキシン（Ｒｉｂｕｔａｘｉｎ）、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、クオドラメット（Ｑｕａｄｒａｍｅｔ）、パノレックス（Ｐａｎｏｒｅｘ）、ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８、ＢＥＣ２、Ｃ２２５、オンコリム（Ｏｎｃｏｌｙｍ）、ＳＭＡＲＴ  Ｍ１９５、ＡＴＲＡＧＥＮ、Ｏｖａｒｅｘ，Ｂｅｘｘａｒ、ＬＤＰ−０３、ｉｏｒ  ｔ６、ＭＤＸ−２１０、ＭＤＸ−１１、ＭＤＸ−２２、ＯＶ１０３、３６２２Ｗ９４、抗ＶＥＧＦ、Ｚｅｎａｐａｘ、ＭＤＸ−２２０、ＭＤＸ−４４７、ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−２、ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−１、ＣＥＡＣＩＤＥ、Ｐｒｅｔａｒｇｅｔ、ＮｏｖｏＭＡｂ−Ｇ２、ＴＮＴ、Ｇｌｉｏｍａｂ−Ｈ、ＧＮＩ−２５０、ＥＭＤ−７２０００、ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ、ＣＭＡ６７６、Ｍｏｎｏｐｈａｒｍ−Ｃ、４Ｂ５、ｉｏｒ  ｅｇｆ．ｒ３、ｉｏｒ  ｃ５、ＢＡＢＳ、抗ＦＬＫ−２、ＭＤＸ−２６０、ＡＮＡ  Ａｂ、ＳＭＡＲＴ  １Ｄ１０Ａ
ｂ、ＳＭＡＲＴ  ＡＢＬ  ３６４  ＡｂおよびＩｍｍｕＲＡＩＴ−ＣＥＡからなる群より選択され得る。
【０１４０】
従って、本発明のいくつかの局面によれば、ガンを有するかまたはガンを有するリスクのある被験体に、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび抗癌療法を与える。いくつかの実施形態では、抗ガン療法は、化学療法剤、免疫療法剤およびガンワクチンからなる群より選択される。
【０１４１】
ガンを予防または処置することに関する方法のさらに別の実施形態において、この被験体はインターフェロンαをさらに投与され得る。
【０１４２】
本発明は他の局面では、被験体において疾患を予防するために方法に関する。本発明は、被験体に対して、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを定期的に投与して、この被験体における疾患を予防するための免疫系応答を促進する工程を包含する。本発明の予防的な方法を用いて予防されると考えられる疾患または状態の例としては、微生物感染（例えば、性感染症）および食物アレルギー由来のアナフィラキシーショックが挙げられる。
【０１４３】
他の局面では、本発明は、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを先天性の免疫応答を活性化するために有効な量で被験体に投与することによって先天性の免疫応答を誘導するための方法である。
【０１４４】
本発明の別の局面によれば、ウイルスまたはレトロウイルス感染を処置または予防するための方法が提供される。本発明は、ウイルスまたはレトロウイルス感染を有するかまたは有するリスクのある被験体に対して、このウイルスまたはレトロウイルス感染を処置または防止するために有効な量の本発明の任意の組成物を、投与する工程を包含する。いくつかの実施形態では、このウイルスは、肝炎ウイルス、例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス、またはパピローマウイルスによって生じる。
【０１４５】
細菌感染を処置または予防するための方法は、本発明の別の局面によって提供される。この方法は、細菌感染を有するかまたは有するリスクのある被験体に対して、この細菌感染を処置または予防するために有効な量の本発明の任意の組成物を投与する工程を包含する。１つの実施形態では、この細菌感染は、細胞内細菌に起因する。
【０１４６】
別の局面では、本発明は、寄生生物感染を有するかまたは有するリスクのある被験体に対して、この寄生生物感染を処置または予防するために有効な量の本発明の任意の組成物を投与する工程によってこの寄生生物感染を処置または予防するための方法である。１つの実施形態では、この寄生生物感染は、細胞内寄生生物に起因する。別の実施形態ではこの寄生生物感染は、非蠕虫寄生生物に起因する。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、この被験体はヒトであり、他の実施形態では、この被験体は、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、シチメンチョウ、ヤギ、魚、サル、ニワトリ、ラット、マウスおよびヒツジからなる群より選択される非ヒト脊椎動物である。
【０１４８】
別の局面では、本発明は、本発明の任意の組成物を、ＴＨ１免疫応答を生じるのに有効な量で被験体に投与することによってＴＨ１免疫応答を誘導するための方法に関する。
【０１４９】
別の局面において、本発明は５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｘ１＊Ｔ＊Ｔ３’という免疫刺激性オリゴヌクレオチドの有効量をその必要な被験体に投与することによって、免疫応答を誘導する方法に関するが、ここでＸ１は３〜３０ヌクレオチドであり、ここで＊は安定化されたヌクレオチド間連結の存在を示し、このオリゴヌクレオチドは少なくとも２つのホス
ホジエステルヌクレオチド間連結を誘導する。
【０１５０】
別の局面では、本発明は自己免疫疾患を有するかまたは有するリスクのある被験体に対して、この自己免疫疾患を処置または予防するために有効な量の本発明の任意の組成物を投与することによってこの自己免疫疾患を処置するための方法に関する。
【０１５１】
他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、この被験体に対してサイトカイン発現を誘導するのに有効な量で送達される。必要に応じて、このサイトカインは、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、およびＩＰ−１０からなる群より選択される。他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、Ｔｈ２バイアス応答からＴｈ１バイアス応答に免疫応答を偏移するのに有効な量で被験体に送達される。
【０１５２】
本発明は、いくつかの局面では、気道再構築を処置するための方法であって、この方法は：被験体における気道再構築を処置するために有効な量で、ＣＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドをこの被験体に投与する工程、を包含する。他の実施形態において、この被験体は喘息、慢性閉塞性肺疾患を有するか、または喫煙者である。他の実施形態では、この被験体は喘息の症状を有さない。
【０１５３】
免疫応答を刺激するための本発明のオリゴヌクレオチドの使用はまた、本発明の局面として提供される。
【０１５４】
免疫応答を刺激するための本発明のオリゴヌクレオチドの医薬を製造するための方法もまた提供される。
【０１５５】
別の局面において、本発明は、被験体に対して、少なくとも５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを、免疫応答を刺激するのに有効な量で投与することによって、免疫応答を刺激するための方法であって、このオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの免疫刺激性ジヌクレオチドモチーフを含み、このジヌクレオチドのヌクレオチドの間のヌクレオチド間連結がＲ鏡像異性を有し、このオリゴヌクレオチドの他のヌクレオチド間連結のうち少なくとも７０％がＳ鏡像異性を有する方法に関する。
【０１５６】
本発明の各々の限定は、本発明の種々の実施形態を包含し得る。従って、任意の１つのエレメントまたはエレメントの組み合わせを含む本発明の各々の限定は、本発明の各々の局面に包含され得ることが理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１５７】
（詳細な説明）
本発明によって柔軟性および半柔軟性の免疫刺激核酸が提供される。本明細書において記載される本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態において、同様のまたは増強された力価、腎臓、肝臓および脾臓に対する全身性曝露の低下を含む改善された特性を有し、そして注射部位での反応原性が低下し得る。出願人らはある機構に拘束されることはないが、これらの改善された特性は、この免疫刺激性オリゴヌクレオチドのホスホジエステルまたはホスホジエステル様の「ヌクレオチド間連結（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）」内の戦略上の位置に関連すると考えられる。本明細書に用いられるような「ヌクレオチド間連結（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）」という用語は、核酸分子における２つの隣接するヌクレオチドを接続する共有結合的骨格連結をいう。共有結合的な骨格連結は代表的には、修飾されるかまたは未修飾のリン酸連結であるが、他の修飾も可能である。従って、ｎヌクレオチド長の直鎖状オリゴヌクレオチドは、全部でｎ−１のヌクレオチド間連結を有する。これらの共有結合的な骨格連結は、本発明の教示による免疫刺激性オリゴヌクレオチドにおいて修飾されて
もされなくてもよい。
【０１５８】
詳細には、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様ヌクレオチド間連結は、「内部ジヌクレオチド（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」を含む。内部ジヌクレオチドは一般に、ヌクレオチド間連結によって接続される隣接するヌクレオチドの任意の対を意味するが、ここでヌクレオチドの対におけるどのヌクレオチドも末端ヌクレオチドではなく、すなわちヌクレオチドの対におけるどのヌクレオチドもオリゴヌクレオチドの５’または３’末端を規定するヌクレオチドではない。従って、ｎヌクレオチド長である直鎖状オリゴヌクレオチドは、全部でｎ−１のジヌクレオチドおよびわずかｎ−３の内部ジヌクレオチドを有する。内部ジヌクレオチドにおける各々のヌクレオチド間連結は内部ヌクレオチド間連結である。従って、ｎヌクレオチド長である直鎖状オリゴヌクレオチドは、全部でｎ−１のヌクレオチド間連結およびわずかｎ−３の内部ヌクレオチド間連結を有する。従って、戦略的に位置されるホスホジエステルまたはホスホジエステル様ヌクレオチド間連結とは、核酸配列におけるヌクレオチドの任意の対の間に位置するホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結をいう。いくつかの実施形態では、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結は、５’または３’末端に最も近いヌクレオチドのいずれか対の間にも位置しない。
【０１５９】
本発明は、本明細書に記載される柔軟性および半柔軟性の核酸が、多くの場合には、同じヌクレオチド配列を有する完全に安定化された相当する免疫刺激性オリゴヌクレオチドと少なくとも同じかまたは多くの場合にはそれよりも大きい免疫刺激性活性を有するという驚くべき発見に少なくともいくつかの局面では基づく。これは予期されなかったことである。なぜならホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは一般に、不安定化されたオリゴヌクレオチドよりも免疫刺激性であると考えられているからである。この結果は驚くべきことである。なぜなら、「柔軟性化（ｓｏｆｔｅｎｉｎｇ）」結合が重大な免疫刺激性モチーフ、すなわちＣＧの間に位置する場合、その核酸はインビボにおいて非ＣＧ含有フラグメントに容易に破壊されるために、活性が低下し得るということが予想されたからである。この予想に反して、これらの核酸の多くはインビトロおよびインビボで実質的に等価または良好な活性を有した。柔軟性および半柔軟性のオリゴヌクレオチドは、その完全に安定化された対応物より強力でないにしても少なくとも同じ程度強力であるという程度の強さであると考えられる；柔軟性および半柔軟性のオリゴヌクレオチドの正味の免疫刺激性効果は、活性と安定性との間のバランスに相当する。高濃度では、このバランスは活性を支持するようであり、すなわち、効力優勢である。低濃度では、このバランスは安定性を支持するようであり、すなわち、ヌクレアーゼ感受性に関連する相対的な不安定性が優勢である。
【０１６０】
本発明は、１つの局面において、柔軟性オリゴヌクレオチドに関する。柔軟性オリゴヌクレオチドは、部分的に安定化された骨格を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、ここではホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結は少なくとも１つの内部ピリミジン−プリンジヌクレオチド（ＹＺ）内でのみ、そしてそれに直に隣接して存在する。好ましくは、ＹＺは、ＹＧ、ピリミジン−グアノシン（ＹＧ）ジヌクレオチドである。少なくとも１つの内部ＹＺジヌクレオチド自体がホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結を有する。少なくとも１つの内部ＹＺジヌクレオチドに直に隣接して存在するホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結は、少なくとも１つの内部ＹＺジヌクレオチドに対して、５’、３’、または５’、および３’の両方であってもよい。好ましくは少なくとも１つの内部ＹＺジヌクレオチドに直に隣接して存在するホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結はそれ自体、内部ヌクレオチド間連結である。従って、配列Ｎ１ＹＺＮ２について、ここではＮ１およびＮ２は各々が、他と独立して、任意の単一のヌクレオチドであるが、ＹＺジヌクレオチドがホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連
結を有し、さらに（ａ）Ｎ１およびＹは、Ｎ１が内部ヌクレオチドである場合、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結によって連結されるか、（ｂ）ＺおよびＮ２は、Ｎ２が内部ヌクレオチドである場合、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結によって連結されるか、または（ｃ）Ｎ１およびＹは、Ｎ１が内部ヌクレオチドである場合、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結によって連結され、そしてＺおよびＮ２は、Ｎ２が内部ヌクレオチドである場合、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結によって連結される。
【０１６１】
柔軟性オリゴヌクレオチドの非限定的な例としては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５〜２３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３２〜２３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３５〜２３７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８〜２４０によって記載されるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１６２】
本発明による柔軟性のオリゴヌクレオチドは完全に安定化されたオリゴヌクレオチドに比較してヌクレアーゼ切断に対して比較的感受性であると考えられる。特定の理論または機構に束縛されることを意味しないが、本発明の柔軟性オリゴヌクレオチドは、全長の柔軟性オリゴヌクレオチドに対して低下した免疫刺激性活性を有するかまたは全く有さないフラグメントに切断可能であると考えられる。少なくとも１つのヌクレアーゼ感受性ヌクレオチド間連結の、詳細にはこのオリゴヌクレオチドの中央付近への組みこみによって、このオリゴヌクレオチドの薬物動態を変更する「オフスイッチ（ｏｆｆ  ｓｗｉｔｃｈ）」がもたらされ、それによってオリゴヌクレオチドの最大の免疫刺激性活性の期間の短縮がもたらされると考えられる。これは、慢性の局所的炎症または免疫刺激に関連する損傷を回避することが所望される、組織および臨床的適用、例えば腎臓において特に有用であり得る。
【０１６３】
本発明は別の局面では、半柔軟性のオリゴヌクレオチドに関する。半柔軟性のオリゴヌクレオチドは、特に安定化された骨格を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドであって、ここではホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結は、少なくとも１つのピリミジン−プリン（ＹＺ）ジヌクレオチド内にのみ存在する。半柔軟性のオリゴヌクレオチドは一般に、対応する完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドに対して免疫刺激性の力価が増大している。例えば、半柔軟性のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１の免疫刺激性力価は、全てホスホロチオエートのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２の効力の２〜５倍であるが、ここで２つのオリゴヌクレオチドは同じヌクレオチド配列を共有し、以下のような内部ＹＺヌクレオチド間連結のみが異なり、ここでは＊はホスホロチオエートを示し、＿はホスホジエステルを示す：
【０１６４】
【化５５】
0005414961.tif 000034
【０１６５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１は、ＣＧおよびＴＧ（両方ＹＺ）のジヌクレオチドの両方を含む内部ホスホジエステルヌクレオチド間連結を組み込む。半柔軟性オリゴヌクレオチドのさらに大きい力価のおかげで、半柔軟性オリゴヌクレオチドは、さらに低い有効濃度で用いることが可能であり、そして所望の生物学的効果を得るための有効用量は、従来の完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドよりも低い。
【０１６６】
完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、最大用量応答を示し得るが、本発明の半柔軟性オリゴヌクレオチドは、対応する完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌ
クレオチドについての至適濃度を超える高濃度まで延びる、単調に増大する用量応答曲線（ＴＬＲ９刺激によってアッセイされるような）を有すると考えられる。従って、本発明の半柔軟性オリゴヌクレオチドは、完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドよりも大きい免疫刺激性を誘導し得ると考えられる。
【０１６７】
弱い免疫刺激性の完全に安定化されたオリゴヌクレオチドの免疫刺激性活性は、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結を有する少なくとも１つの内部ＹＺジヌクレオチドの組みこみによって増大され得ることが本発明によって発見されている。従って、完全に安定化された骨格を有する弱い免疫刺激性のオリゴヌクレオチドで開始すること、および少なくとも１つの内部ＹＧジヌクレオチドの安定化されたヌクレオチド間連結をホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結に置換することによってその免疫刺激性活性を改善することが可能である。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：２４３は、その完全に安定化された対応物であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４４よりも大きい免疫刺激性活性を有するが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４４はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に比較して比較的弱い免疫刺激性オリゴヌクレオチドであることが見出された：
【０１６８】
【化５６】
0005414961.tif 000035
【０１６９】
２０ヌクレオチド長未満の完全に安定化された免疫刺激性核酸は、それより長い（例えば、２４ヌクレオチド長）完全に安定化されたオリゴヌクレオチドと比較して中度の免疫刺激性活性を有し得るが、１６ヌクレオチド長程度の短い半柔軟性オリゴヌクレオチドは２０ヌクレオチド長を超える完全に安定化されたオリゴヌクレオチドの免疫刺激性活性に少なくとも等しい免疫刺激性活性を有することが発見されている。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：２４５および５６０２（両方とも、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に対して部分的な配列類似性を有する１６マー）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２（２４マー）の免疫刺激性活性に匹敵する活性を示す。
【０１７０】
【化５７】
0005414961.tif 000036
【０１７１】
６マーのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが免疫刺激性活性を欠くと考えられるいくつかの場合には、ホスホロチオエート連結のまさに１つのホスホジエステル内部ＹＺヌクレオチド間連結での置換は、免疫刺激性活性を有する、対応する６マーを生じることが見出された。
【０１７２】
半柔軟性オリゴヌクレオチドの前述の特性が一般に増大し、これには内部ＹＺジヌクレオチドに関するホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結の「用量（ｄｏｓｅ）」の増大を伴うことがまた考えられる。従って、例えば、一般には５つの内部ＹＺジヌクレオチドを有する所定のオリゴヌクレオチド配列については、５つの内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のＹＺヌクレオチド間連結を有するオリゴヌクレオチドは、４つの内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のＹＧヌクレオチド間連結を有するオリゴヌクレオチドよりも免疫刺激性であり、この次に３つの内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のＹＺヌクレオチド間連結を有するオリゴヌクレオチドが免疫刺激性であり、この次に２つの内部ホスホジエステルまたはホスホジエステ
ル様のＹＺヌクレオチド間連結を有するオリゴヌクレオチドが免疫刺激性であり、この次に１つの内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のＹＺヌクレオチド間連結を有するオリゴヌクレオチドが免疫刺激性である。重要なことに、１つだけの内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のＹＺヌクレオチド間連結を含むことは、内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のＹＺヌクレオチド間連結を有さないよりも有利な利点を有すると考えられる。ホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部連結の数に加えて、核酸の長さにそった位置も効力に影響し得る。
【０１７３】
半柔軟性のオリゴヌクレオチドの非限定的な例としては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００〜１０４に記載されるものが挙げられる。
【０１７４】
本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、血清における急速な分解から一般に保護される。本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた一般に、この免疫刺激性オリゴヌクレオチドを分解し得る特定のまたは過剰なヌクレアーゼ活性を有する特定の組織を除いて、ほとんどの組織において急速な分解から保護される。これによって、その特定の組織において、分解耐性オリゴヌクレオチドを利用する長期治療から所望されない効果を蓄積がさもなければもたらし得る免疫刺激性オリゴヌクレオチドの減少が生じる。本発明のオリゴヌクレオチドは一般には、好ましい内部位置に加えて、分解に耐性である５’および３’末端で、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結を含む。このような分解耐性末端は、対応する未修飾の末端を上回るエキソヌクレアーゼ消化に対する耐性の増大を生じる任意の適切な修飾を含んでもよい。例えば、この５’末端および３’末端はこの骨格の少なくとも１つのリン酸塩修飾を含むことによって安定化され得る。好ましい実施形態では、各々の末端での骨格の少なくとも１つのリン酸塩修飾は独立して、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネートまたはメチルホスホロチオエートヌクレオチド間連結である。別の実施形態では、この分解耐性末端は、３’末端でペプチド結合またはアミド結合によって接続された１つ以上のヌクレオチド単位を含む。以下にさらに記載されるものが挙げられるがこれらに限定されない、さらに他の安定化末端が、本発明によって包含されることが意図される。
【０１７５】
上記のように、本発明のオリゴヌクレオチドは、内部ＹＧジヌクレオチド内にそして必要に応じてそれに隣接したホスホジエステルまたはホスホジエステル様連結を含む。このようなＹＧジヌクレオチドは頻繁に免疫刺激性モチーフの一部である。しかし、オリゴヌクレオチドがあらゆる免疫刺激性モチーフ内にホスホジエステルまたはホスホジエステル様の連結を含む必要はない。一例として、４つのＣｐＧジヌクレオチドを有する
【０１７６】
【化５８】
0005414961.tif 000037
【０１７７】
のようなオリゴヌクレオチドは、第二、第三または第四のＣｐＧジヌクレオチドのＣとＧの間のホスホジエステル連結、ならびにそれらの組み合わせを有し得る。さらなるホスホジエステルまたはホスホジエステル様の連結はまた、これらのさもなければ「安定化されたオリゴヌクレオチド（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」のさらに急速な腎臓消化のために維持されてもよい。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２はさらに、２つの内部ＴＧジヌクレオチドを含むがそのいずれかまたは両方は、単独でまたは内部ＣＧジヌクレオチドの任意の１つまたは組み合わせと組み合わせて、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結を有してもよい。
【０１７８】
ホスホジエステルヌクレオチド間連結は、自然に見出される核酸のこのタイプの連結特
徴である。図２０に示されるように、ホスホジエステルヌクレオチド間連結は、２つの架橋酸素原子に隣接し、そして一方は荷電され他方は荷電されていない２つのさらなる酸素原子によっても結合されるリン原子を含む。ホスホジエステルヌクレオチド間連結は、オリゴヌクレオチドの組織半減期を短縮させることが重要である場合、特に好ましい。
【０１７９】
ホスホジエステル様ヌクレオチド間連結は、化学的におよび／またはジアステレオマー的にホスホジエステルに類似であるリン含有架橋基である。ホスホジエステルに類似の指標としては、ヌクレアーゼ消化に対する感受性およびＲＮＡｓｅＨを活性化する能力が挙げられる。従って、例えば、ホスホジエステルについて、ただしホスホロチオエートについてではないが、オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ消化に感受性であり、一方ホスホジエステルおよびホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドは両方ともＲＮＡｓｅＨを活性化する。好ましい実施形態において、ホスホジエステル様ヌクレオチド間連結は、ボラノホスフェート（または等しくはボラノホスホネート）連結である。米国特許第５，１７７，１９８号；米国特許第５，８５９，２３１号；米国特許第６，１６０，１０９号；米国特許第６，２０７，８１９号；Ｓｅｒｇｕｅｅｖら（１９９８）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２０：９４１７〜２７。別の好ましい実施形態では、ホスホジエステル様ヌクレオチド間連結は、ジアステレオマー的に純粋なＲｐホスホロチオエートである。ジアステレオマー的に純粋なＲｐホスホロチオエートはヌクレアーゼ消化にさらに感受性であり、混合されるかまたはジアステレオマー的に純粋なＳｐホスホロチオエートよりもＲＮＡｓｅＨの活性化に良好であると考えられる。ＣｐＧオリゴヌクレオチドの立体異性体は、同時係属の１９９９年７月２７日出願、米国特許出願０９／３６１，５７５および公表されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７１００（ＷＯ  ００／０６５８８）の主題である。本発明の目的のためには、「ホスホジエステル様のヌクレオチド間連結（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ−ｌｉｋｅ  ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）」という用語は、詳細にはホスホロジチオエートおよびメチルホスホネートのヌクレオチド間連結を排除する。
【０１８０】
本発明の免疫刺激性核酸分子は、キメラ骨格を有する。本発明の目的に関しては、キメラ骨格とは部分的に安定化された骨格であって、少なくとも１つのヌクレオチド間連結がホスホジエステルまたはホスホジエステル様であって、少なくとも１つの他のヌクレオチド間連結が安定化されたヌクレオチド間連結であって、この少なくとも１つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様の連結および少なくとも１つの安定化された連結が異なる骨格をいう。ボラノホスホネート連結は、この骨格のキメラ的な性質の目的に関して、ホスホジエステル連結に比べて安定化されていることが報告されているので、ボラノホスホネート連結はその状況に応じて、ホスホジエステル様連結であるか、または安定化されている連結であるかのいずれかとして分類され得る。例えば、本発明によるキメラ骨格は、１つの実施形態では、少なくとも１つのホスホジエステル（ホスホジエステルまたはホスホジエステル様）連結および少なくとも１つのボラノホスホネート（安定化）連結を含む。別の実施形態では、本発明によるキメラ骨格は、ボラノホスホネート（ホスホジエステルまたはホスホジエステル様）連結およびホスホロチオエート（安定化）連結を含み得る。「安定化されたヌクレオチド間連結（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）」とは、ホスホジエステルヌクレオチド間連結に比べて、インビボの分解（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを介した）に比較的耐性であるヌクレオチド間連結を意味する。好ましい安定化されたヌクレオチド間連結としては、限定はしないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネートおよびメチルホスホロチオエートが挙げられる。他の安定化されたヌクレオチド間連結としては、限定はしないが、ペプチド、アルキル、デホスホおよび上記のその他が挙げられる。
【０１８１】
ホスホロチオエートのような修飾骨格は、ホスホラミダイトまたはＨホスホネート化学
のいずれかを用いる自動化技術を用いて合成され得る。アリールおよびアルキル−ホスホネートは、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号に記載のように作成できる；そしてアルキルホスホトリエステル（荷電された酸素部分は、米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第０９２，５７４号に記載のようにアルキル化される）は、市販の試薬を用いる自動化固相合成によって調製され得る。他のＤＮＡ骨格修飾および置換を作成するための方法は、記載されている。Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅら（１９９０）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９０：５４４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ  Ｊ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １：１６５。キメラオリゴヌクレオチドを調製するための方法も公知である。例えば、Ｕｈｌｍａｎｎらに発行された本特許は、このような技術を記載している。
【０１８２】
混合骨格修飾ＯＤＮは、市販のＤＮＡシンセサイザーおよび標準的なホスホラミダイト化学を用いて合成され得る（Ｆ．Ｅ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，１９９１，ならびにＭ．Ｄ．ＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＭ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２１，７１９（１９８０））。カップリング後、ＰＳ連結は、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（Ｒ．Ｐ．Ｉｙｅｒ，Ｗ．Ｅｇａｎ，Ｊ．Ｂ．ＲｅｇａｎおよびＳ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２，１２５３（１９９０））（０．０７５Ｍをアセトニトリルに含有）またはフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）を用いる硫化、続いて無水酢酸、２，６−ルチジンを含有するテトラヒドロフラン（１：１：８；ｖ：ｖ：ｖ）およびＮ−メチルイミダゾール（１６％をテトラヒドロフランに含有）を用いたキャッピングによって導入される。このキャッピング工程は、硫化反応後に行なって、ホスホロチオエート連結が位置すべき位置での所望されないホスホジエステル（ＰＯ）連結の形成を最小化する。例えば、ＣｐＧジヌクレオチドでのホスホジエステル連結の導入の場合、中間体のリン（ＩＩＩ）はヨウ素を含む水／ピリジンの溶液を用いた処理によって酸化される。濃アンモニアを用いた処置（５０℃で１５時間）による固体支持体からの切断および最終脱保護後に、ＮａＣｌ勾配（例えば、緩衝液Ａ：１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４を含むアセトニトリル／水＝１：４／ｖ：ｖ  ｐＨ６．８；緩衝液Ｂ：１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１．５Ｍ
ＮａＣｌを含有するアセトニトリル／水＝１：４／ｖ：ｖ；５〜６０％のＢ、１ｍｌ／分で３０分）を用いるＧｅｎ−Ｐａｋ  Ｆａｘカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｗａｔｅｒｓ）でのＨＰＬＣによって、またはキャピラリーゲル電気泳動によってＯＤＮを解析する。ＯＤＮは、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのＨＰＬＣまたはＦＰＬＣによって精製されてもよい。ＨＰＬＣの同種画分を合わせて、Ｃ１８カラムを介するかまたは超遠心によって脱塩する。ＯＤＮをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって解析して、算出された質量を確認した。
【０１８３】
本発明の核酸はまた他の修飾を含んでもよい。これらとしては非イオン性ＤＮＡアナログ、例えばアルキルおよびアリールリン酸（荷電されたホスホン酸酸素がアルキル基またはアリール基によって置換されている）、ホスホジエステルおよびアルキルホスホトリエステルであって、荷電された酸素部分がアルキル化されているものが挙げられる。末端のいずれかまたは両方において、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコールのようなジオールを含む核酸はまた、ヌクレアーゼ分解に実質的に耐性であることが示されている。
【０１８４】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドのサイズ（すなわち、核酸の長さに沿ったヌクレオチド残基の数）はまた、オリゴヌクレオチドの刺激性活性に寄与し得る。細胞への取り込みを促進するために、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは好ましくは最小の長さが６ヌクレオチド残基である。６ヌクレオチドより大きい（さらにはｋｂ長である）任意の大きさの核酸は、十分な免疫刺激性モチーフが存在する場合、本発明に従う免疫応答を誘導し得る。なぜなら、さらに大きい核酸は細胞の内側で分解されるからである。４ヌクレオチド長程度
の短い半柔軟性のオリゴヌクレオチドはまた、それらが細胞の内側に送達され得る場合、免疫刺激性であると本発明者は考える。本発明による特定の好ましい実施形態において、この免疫刺激性オリゴヌクレオチドは４〜１００ヌクレオチド長である。代表的な実施形態では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは６〜４０ヌクレオチド長である。本発明による特定の好ましい実施形態において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは６〜１９ヌクレオチド長である。
【０１８５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、免疫応答を排除することが見出された特定の配列を含む核酸である。免疫応答を排除するこれらの特定の配列は、「免疫刺激性モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆｓ）」と呼ばれ、免疫刺激性モチーフを含むオリゴヌクレオチドは、「免疫刺激性核酸分子（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ
ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」および同等に「免疫刺激性核酸（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」または「免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」と呼ばれる。従って、本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの免疫刺激性モチーフを含む。好ましい実施形態では、この免疫刺激性モチーフは、「内部免疫刺激性モチーフ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆ）」である。「内部免疫刺激性モチーフ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｉｍｍｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆ）」という用語は、この免疫刺激性モチーフ配列の５’末端および３’末端の両方に連結された少なくとも１つのヌクレオチドによって、このモチーフ配列よりも長い、さらに長い核酸配列内のモチーフ配列の位置をいう。
【０１８６】
本発明のいくつかの実施形態において、この免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、「ＣｐＧジヌクレオチド」である免疫刺激性モチーフを含む。ＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化されてもメチル化されなくてもよい。少なくとも１つのメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫刺激性核酸は、メチル化されていないシトシン−グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、メチル化されていない５’シチジン、続いて３’グアノシンそしてリン酸結合に連結される）を含み、そして免疫系を活性化させる核酸分子である；このような免疫刺激性核酸は、ＣｐＧ核酸である。ＣｐＧ核酸は、米国特許第６，１９４，３８８号；同第６，２０７，６４６号；同第６，２１４，８０６号；同第６，２１８，３７１号；同第６，２３９，１１６号；および同第６，３３９，０６８号を含む、多数の発行された特許、公開された特許出願および他の刊行物において記載されている。少なくとも１つのメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫刺激性核酸は、メチル化されたシトシン−グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、メチル化された５’シチジン、続いて３’グアノシンそしてリン酸結合に連結される）を含み、そして免疫系を活性化させる核酸である。他の実施形態では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドを含まず。ＣｐＧジヌクレオチドを含まないこれらのオリゴヌクレオチドは、非ＣｐＧオリゴヌクレオチドと呼ばれ、それらは非ＣｐＧ免疫刺激性モチーフを有する。従って、本発明はまた、メチル化されてもされていなくてもよいが、他のタイプの免疫刺激性モチーフを有する核酸を包含する。本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドはさらに、メチル化されたおよびメチル化されていないＣｐＧおよび非ＣｐＧ免疫刺激性モチーフの任意の組み合わせを含んでもよい。
【０１８７】
ＣｐＧ核酸に関しては、異なるクラスのＣｐＧ核酸が存在することが最近記載されている。１つのクラスはＢ細胞活性化について強力であるが、ＩＦＮ−αおよびＮＫ細胞の活性化を誘導するには比較的弱い；このクラスはＢクラスと命名されている。このＢクラスのＣｐＧ核酸は代表的には完全に安定化されて、特定の好ましい塩基の状態内ではメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含む。例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；同第６，２０７，６４６号；同第６，２１４，８０６号；同第６，２１８，３７１号；同第６，２３９，１１６号および同第６，３３９，０６８号を参照のこと。別のクラスが
ＩＦＮ−αおよびＮＫ細胞活性化を誘導するのに強力であるが、Ｂ細胞を刺激するには比較的弱い；このクラスはＡクラスと命名されている。このＡクラスＣｐＧ核酸は代表的には５’末端および３’末端で安定化されたポリＧ配列を、そして少なくとも６つのヌクレオチドの回文構造のホスホジエステルＣｐＧジヌクレオチド含有配列を有する。例えば、公開された特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２６５２７（ＷＯ０１／２２９９０）を参照のこと。ＣｐＧ核酸のさらに別のクラスはＢ細胞およびＮＫ細胞を活性化して、ＩＦＮ−αを誘導する；このクラスはＣクラスと呼ばれている。このＣクラスのＣｐＧ核酸は、最初に特徴付けられたように、代表的には完全に安定化されており、Ｂクラスタイプの配列およびＧＣリッチの回文構造またはほぼ回文構造を含む。このクラスは、その内容が全体として、参考として本明細書に援用される、２００１年８月１７日提出の同時係属の米国仮特許出願６０／３１３，２７３および２００２年８月１９日提出の米国特許第１０／２２４，５２３号に記載されている。Ｃクラス核酸のいくつかの非限定的な例としては：
【０１８８】
【化５９】
0005414961.tif 000038
【０１８９】
【化６０】
0005414961.tif 000039
【０１９０】
が挙げられる。
【０１９１】
従って、本発明は１つの局面で、キメラ骨格を有する特定のサブクラスのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、免疫刺激効果を媒介するのに高度に有効であるという知見に関与する。これらのＣｐＧ核酸は、ガン、感染性疾患、アレルギー、喘息、自己免疫疾患および他の障害を処置すること、およびガンの化学療法後の日和見性の感染に対する防御を補助することのために免疫系を刺激するために治療上および予防的に有用である。ＣｐＧ刺激から生じる、この強力だがバランスのとれた細胞性および体液性の免疫応答は、侵入する病原体およびガン性の細胞に対する身体自体の天然の防御系を反映する。
【０１９２】
本発明は１つの局面では、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドのサブセットは免疫刺激性特性が改善されて、腎炎症の影響が低下されているという発見に関与する。いくつかの場合、完全にホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドを投与されている被験体において腎炎症が観察されている。本明細書において記載されるキメラ核酸は、完全にホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドよりも腎炎症を生じることが少ないと考えられる。さらに、これらのオリゴヌクレオチドは免疫応答を刺激するのに高度に効率的である。従って、この分子のホスホジエステル領域は、その有効性を低下させなかった。
【０１９３】
好ましいＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは以下の６つの一般式のうちの１つにおさまる：
【０１９４】
【化６１】
0005414961.tif 000040
【０１９５】
。
【０１９６】
これらの式において、Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｎ１は０〜６ヌクレオチドであり、Ｎ２は０〜７ヌクレオチドであり、Ｎ３は０〜４ヌクレオチドであり、Ｎ４は１〜５ヌクレオチドであり、Ｎ５は０〜７ヌクレオチドであり、Ｎ６およびＮ７は独立して１〜５ヌクレオチド長であり、Ｎ８は４〜１０ヌクレオチド長であり、Ｎ９は０〜３ヌクレオチド長であり、ここでＮ１０は４〜８ヌクレオチド長である。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は独立してＣまたはＧである。この式は、優れた免疫刺激特性を示すが、身体内での分解に対して完全にホスホロチオネート含有オリゴヌクレオチドよりもさらに感受性であるＣｐＧオリゴヌクレオチドのサブセットのクラスを規定する。この式において５’とはオリゴヌクレオチドの遊離の５’末端をいい、そして３’とはオリゴヌクレオチドの遊離の３’末端をいう。
【０１９７】
式で用いられる記号である＊は、安定化されたヌクレオチド間連結の存在を示す。＊の印を付けられていないヌクレオチド間連結は、このオリゴヌクレオチドが少なくとも２〜３のホスホジエステルヌクレオチド間連結を含む限り、安定化されても安定化されていなくてもよい。いくつかの実施形態において、このオリゴヌクレオチドは３〜６個のホスホジエステル連結を含むことが好ましい。いくつかの場合には、このＣＧモチーフ間の連結は、ホスホジエステルであり、そして他の場合にはそれらはホスホロチオエートまたは他の安定化された連結である。
【０１９８】
他の式としては５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＡＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ３’（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：３６８）が挙げられるが、ここで少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドがホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結を有し、そしてこのオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの安定化されたヌクレオチド間連結および５’ＧＮＣ３’を含み、ここでＮは４〜１０ヌクレオチド長の核酸配列であり、そして少なくとも５０％のＴであり、ＣＧジヌクレオチドは含まず、そしてこのオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの安定化されたヌクレオチド間連結を含む。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドは以下の配列のうちの１つを有する：
【０２００】
【化６２】
0005414961.tif 000041
【０２０１】
【化６３】
0005414961.tif 000042
【０２０２】
。
【０２０３】
これらの構造における＿の記号は、ホスホジエステルヌクレオチド間連結の存在をいう。
【０２０４】
この構造のいくつかの好ましい例としては、以下が挙げられる：
【０２０５】
【化６４】
0005414961.tif 000043
【０２０６】
。
【０２０７】
この免疫刺激性オリゴヌクレオチドは一般に、４〜１００の範囲の長さ、そしていくつかの実施形態では１０〜４０の範囲の長さを有する。この長さは１６〜２４ヌクレオチドの範囲であってもよい。
【０２０８】
「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」および「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語はまた、塩基および／または糖においてのような、置換または修飾を有する核酸またはオリゴヌクレオチドを包含する。例えば、それらは２’位置でヒドロキシル基以外の、そして５’位置でのリン酸基もしくはヒドロキシ基以外の低分子量有機基に共有結合される骨格糖を有する核酸を包含する。このように修飾された核酸は、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含んでもよい。さらに、修飾された核酸は、リボースの代わりにアラビノースまたは２’−フルオロアラビノースのような糖を含んでもよい。従って、核酸は骨格組成において異種であって、それによってペプチド核酸（これは核酸塩基を有するアミノ酸骨格を有する）などと一緒に連結されたポリマー単位の任意の可能な組み合わせを含んでもよい。
【０２０９】
核酸はまた、置換されたプリンおよびピリミジン、例えばＣ−５プロピンピリミジンおよび７−デアザ−７−置換プリンの修飾塩基を含む。Ｗａｇｎｅｒ  ＲＷら（１９９６）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：８４０〜４。プリンおよびピリミジンとしては、
アデニン、シトシン、グアニン、チミン、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシシトシン、５−フルオロシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、ならびに他の天然に存在する核酸塩基および天然には存在しない核酸塩基、置換された芳香族部分および置換されていない芳香族部分が挙げられるがこれらに限定されない。他のこのような修飾は当業者に周知である。
【０２１０】
本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルヌクレオチド間架橋、β−Ｄ−リボース単位および／または天然のヌクレオチド塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル）を含む天然のＲＮＡおよびＤＮＡに比較して、種々の化学的修飾および置換を含んでもよい。化学的修飾の例は、当業者に公知であり、そして例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅら（１９９０）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９０：５４３；「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ」Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｏｅｒｔｉｅｓ＆Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＵＳＡ  １９９３；Ｃｒｏｏｋｅ  ＳＴら（１９９６）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ３６：１０７〜１２９；ならびにＨｕｎｚｉｋｅｒ  Ｊら（１９９５）Ｍｏｄ  Ｓｙｎｔｈ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７：３３１〜４１７に記載されている。本発明によるオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾を有してもよく、各々の修飾は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡからなる同じ配列のオリゴヌクレオチドに比較して、特定のホスホジエステルヌクレオチド間架橋に、そして／または特定のβ−Ｄ−リボース単位に、そして／または特定の天然のヌクレオチド塩基位置に、位置する。
【０２１１】
例えば、本発明は、オリゴヌクレオチドであって、１つ以上の修飾を含んでもよく、そして各々の修飾が独立して：
ａ）修飾されたヌクレオチド間架橋による、ヌクレオチドの３’および／または５’末端に位置するホスホジエステルヌクレオチド間架橋の置換
ｂ）デホスホ架橋による、ヌクレオチドの３’および／または５’末端に位置するホスホジエステル架橋の置換、
ｃ）別の単位による、糖リン酸骨格からの糖リン酸単位の置換、
ｄ）修飾糖単位による、β−Ｄ−リボース単位の置換、ならびに
ｅ）修飾ヌクレオチド塩基による、天然のヌクレオチド塩基の置換、
から選択されるオリゴヌクレオチドに関する。
【０２１２】
オリゴヌクレオチドの化学的修飾のさらに詳細な例は以下である。
【０２１３】
ヌクレオチドの３’末端および／または５’末端に位置するホスホジエステルヌクレオチド間架橋は、修飾されたヌクレオチド間連結によって置換され得るが、ここでこの修飾されたヌクレオチド間架橋は例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ＮＲ１Ｒ２−ホスホラミダイト、ボラノホスフェート、α−ヒドロキシベンジルホスフェート、ホスフェート−（Ｃ１−Ｃ２１）−Ｏ−アルキルエステル、ホスフェート［（Ｃ６−Ｃ１２）アリール−（Ｃ１−Ｃ２１）−Ｏ−アルキル］エステル、（Ｃ１−Ｃ８）アルキルホスホネート、および／または（Ｃ６−Ｃ１２）アリールホスホネート架橋、（Ｃ７−Ｃ１２）−α−ヒドロキシメチル−アリール（例えば、ＷＯ９５／０１３６３に開示される）から選択されるが、ここで（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ２０）アリールおよび（Ｃ６−Ｃ１４）アリールは、水素、アルキル、アルコキシ、ニトロ、シアノで必要に応じて置換され、ここでＲ１およびＲ２は各々が独立して、水素、（Ｃ１−Ｃ１８）−アルキル、（Ｃ６−Ｃ２０）アリール、（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ８）−アルキルであり、好ましくは、水素、（Ｃ１−Ｃ８）−アルキル、好ましくは、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルおよび／またはメトキシエチルであるか、またはＲ１およびＲ２は、それらを担持する窒素原子と一緒になって、Ｏ、ＳおよびＮという群からのさらなるヘテロ原
子をさらに含み得る５−６−員の複素環を形成する。
【０２１４】
デホスホ架橋（デホスホ架橋は、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ  ＥおよびＰｅｙｍａｎ  Ａの「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第２０巻「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ」、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ  １９９３，第１６章、ｐｐ．３５５ｆｆに記載される）による、ヌクレオチドの３’末端および／または５’末端に位置するホスホジエステル架橋の置換、ここでデホスホ架橋は、例えば、デホスホ架橋ホルムアセタール、３’−チオホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム、メチレンジメチルヒドラゾ、ジメチレンスルホン、および／またはシリル基から選択される。
【０２１５】
糖リン酸骨格（すなわち、糖リン酸骨格は糖リン酸単位からなる）由来の糖リン酸単位（すなわち、一緒になって糖リン酸単位を形成するβ−Ｄ−リボースおよびホスホジエステルヌクレオチド間架橋）は、別の単位によって置換されてもよいが、ここで他の単位は、例えば、「モルホリノ−誘導体（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」オリゴマーを構築するのに適切であり（例えば、Ｓｔｉｒｃｈａｋ  ＥＰら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １７：６１２９〜４１に記載されるように）、すなわち、例えばモルホリノ誘導体単位による置換；またはポリアミド核酸を構築するのに適切である（「ＰＮＡ」；例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＰＥら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ５：３〜７において記載されるように）、すなわち例えば、２−アミノエチルグリシンによる、例えばＰＮＡ骨格単位による置換である。
【０２１６】
βリボース単位またはβ−Ｄ−２’−デオキシリボース単位は、修飾された糖単位によって置換されてもよいが、ここでこの修飾された糖単位とは例えば、β−Ｄ−２−リボース、α−Ｄ−２’−デオキシリボース、Ｌ−２’−デオキシリボース、２’Ｆ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−アラビノース、２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−リボースから選択され、好ましくは２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−リボースは、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル−リボース、２’−［Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル］−リボース、２’−ＮＨ２−２’−デオキシリボース、β−Ｄ−キシロフラノース、α−アラビノフラノース、２，４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ヘキソ−ピラノース、および炭素環式（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  Ｊ（１９９２）Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １１４：８３２０に記載される）、および／または開鎖糖アナログ（例えば、Ｖａｎｄｅｎｄｒｉｅｓｓｃｈｅら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：７２２３に記載される）、および／またはビシクロ糖アナログ（例えば、Ｔａｒｋｏｖ  Ｍら（１９９３）Ｈｅｌｖ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ７６：４８１に記載される）である。
【０２１７】
いくつかの好ましい実施形態では、糖は、詳細にはホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結に連結される１つまたは両方のヌクレオチドについて、２’−Ｏ−メチルリボースである。
【０２１８】
核酸はまた、置換されたプリンおよびピリミジン、例えばＣ−５プロピンピリミジンおよび７−デアザ−７−置換プリン修飾塩基を含む。Ｗａｇｎｅｒ  ＲＷら（１９９６）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：８４０〜４。プリンおよびピリミジンとしては、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミン、ならびに他の天然に存在するおよび天然には存在しない核酸塩基、置換されたおよび置換されていない芳香族部分が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２１９】
修飾された塩基は、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＡおよびＵのようなＤＮＡおよびＲＮＡに代表的に見
出される天然に存在する塩基とは化学的に別個であるが、これらの天然に存在する塩基と基本的な化学的構造を共有する任意の塩基である。この修飾されたヌクレオチド塩基は、例えば、ヒポキサンチン、ウラシル、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、２，４−ジアミノ−プリン、８−アザプリン、置換７−デアザプリン、好ましくは７−デアザ−７−置換および／または７−デアザ−８−置換プリン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン、例えばＮ４−エチルシトシン、５−ヒドロキシデオキシシチジン、５−ヒドロキシメチルデオキシシチジン、Ｎ４−アルキルデオキシシチジン、例えば、Ｎ４−エチルデオキシシチジン、６−チオデオキシグアノシン、およびニトロピロールのデオキシリボヌクレオチド、Ｃ５−プロピニルピリミジンおよびジアミノプリン、例えば、２，６−ジアミノプリン、イノシン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチンまたは天然のヌクレオチド塩基の他の修飾から選択され得る。この列挙は例示的であることを意味しており、限定されると解釈されるべきではない。
【０２２０】
本明細書に記載される特定の式では、１セットの修飾塩基が規定される。例えば、Ｙという文字を用いて、シトシンまたは修飾シトシンを含むヌクレオチドをいう。修飾シトシンとは本明細書において用いる場合、オリゴヌクレオチドの免疫刺激性活性を阻害しないこの塩基を置換し得るシトシンの天然に存在するかまたは天然には存在しないピリミジン塩基である。修飾シトシンとしては、５−置換シトシン（例えば、５−メチル−シトシン、５−フルオロ−シトシン、５−クロロシトシン、５−ブロモ−シトシン、５−ヨード−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシン、５−ジフルオロメチル−シトシンおよび未置換または置換５−アルキニル−シトシン）、６−置換シトシン、Ｎ４−置換シトシン（例えば、Ｎ４−エチル−シトシン）、５−アザ−シトシン、２−メルカプト−シトシン、イソシトシン、シュード−イソシトシン、縮合環系を有するシトシンアナログ（例えば、Ｎ，Ｎ’−プロピレンシトシンまたはフェノキサジン）、ならびにウラシルおよびその誘導体（例えば、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−ブロモビニル−ウラシル、４−チオウラシル、５−ヒドロキシ−ウラシル、５−プロピニル−ウラシル）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましいシトシンのうちのいくつかとしては、５−メチル−シトシン、５−フルオロ−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシンおよびＮ４−エチル−シトシンが挙げられる。本発明の別の実施形態では、シトシン塩基はユニバーサル塩基（例えば、３−ニトロピロール、Ｐ塩基）、芳香族環系（例えば、フルオロベンゼンまたはジフルオロベンゼン）、または水素原子（ｄＳｐａｃｅｒ）で置換される。
【０２２１】
Ｚという文字を用いて、グアニンまたは修飾グアニン塩基を示す。修飾グアニンとは、本明細書に用いられる場合、オリゴヌクレオチドの免疫刺激性活性を阻害することなくこの塩基を置換し得る、天然に存在するかまたは天然に存在しないグアニンのプリン塩基アナログである。修飾グアニンとしては、７−デアサグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン（例えば、７−デアザ−７−（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルグアニン）、７−デアザ−８−置換グアニン、ヒポキサンチン、Ｎ２−置換グアニン（例えば、Ｎ２−メチル−グアニン）、５−アミノ−３−メチル−３Ｈ，６Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７−ジオン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、プリン、インドール、アデニン、置換アデニン（例えば、Ｎ６−メチル−アデニン、８−オキソ−アデニン）８−置換グアニン（例えば、８−ヒドロキシグアニンおよび８−ブロモグアニン）、および６−チ
オグアニンが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の別の実施形態では、グアニン塩基は、ユニバーサル塩基（例えば、４−メチル−インドール、５−ニトロ−インドール、およびＫ塩基）、芳香族環系（例えば、ベンズイミダゾールまたはジクロロベンズイミダゾール、１−メチル−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−カルボン酸アミド）、または水素原子（ｄＳｐａｃｅｒ）で置換される。
【０２２２】
オリゴヌクレオチドは、１つ以上の接近可能な５’末端を有してもよい。２つのこのような５’末端を有する修飾されたオリゴヌクレオチドを作成することができる。これは、例えば、１つまたは２つの接近可能な５’末端を有するオリゴヌクレオチドを生成するために３’−３’連結を通じて２つのオリゴヌクレオチドを結合させることによって、達成できる。この３’３’連結は、ホスホジエステルであってもよく、ホスホロチオエートまたは任意の他の修飾されたヌクレオチド間架橋であってもよい。このような連結を達成するための方法は当該分野で公知である。例えば、このような連結はＳｅｌｉｇｅｒ，Ｈら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ３’−３’−ａｎｄ  ５’−５’−ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅｓ
ａｓ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９９１）、１０（１〜３）、４６９〜７７およびＪｉａｎｇら、Ｐｓｅｕｄｏ−ｃｙｃｌｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９）、７（１２）、２７２７〜２７３５に記載されている。
【０２２３】
さらに、３’末端のヌクレオチド間の連結がホスホジエステルでも、ホスホロチオエートでもまたは他の修飾架橋でもない３’３’連結核酸は、さらなるスペーサー、例えば、トリ−またはテトラ−エチレングリコールホスフェート部分を用いて調製され得る（Ｄｕｒａｎｄ，Ｍら、Ｔｒｉｐｌｅ−ｈｅｌｉｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｏｎｅ（ｄＡ）１２  ａｎｄ  ｔｗｏ（ｄＴ）１２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｒｉｄｇｅｄ  ｂｙ  ｔｗｏ  ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｃｈａｉｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９２），３１（３８），９１９７〜２０４、米国特許第５６５８７３８号および米国特許第５６６８２６５号）。あるいは、非ヌクレオチドリンカーは、標準的なホスホラミダイト化学を用いて、エタンジオール、プロパンジオールから誘導されても、または無塩基デオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）単位（Ｆｏｎｔａｎｅｌ、Ｍａｒｉｅ  Ｌａｕｒｅｎｃｅら、Ｓｔｅｒｉｃａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｋｉｎａｓｅ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｉｃ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ  ５’−ａｔｔａｃｈｅｄ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９４）、２２（１１）２０２２〜７）から誘導されてもよい。非ヌクレオチドのリンカーは、１回もしくは数回組み込まれてもよいし、またはお互いと組み合わされてもよく、これによって連結されるべき２つのＯＤＮの３’末端の間の任意の所望の距離が可能になる。
【０２２４】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様レセプター９（ＴＬＲ９）との相互作用を通じてその免疫刺激性効果を発揮するようであることが近年報告されている。Ｈｅｍｍｉ  Ｈら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：７４０〜５。従って、ＴＬＲ９シグナル伝達活性は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドまたは他の免疫刺激性核酸に対する応答において、ＮＦ−κＢ、ＮＦ−κＢ関連シグナル、ならびにＮＦ−κＢの適切な事象および中間の上流を測定することによって測定され得る。
【０２２５】
本発明における使用のために、本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野で周知の任意の多数の手順を用いて新規に合成され得る。例えば、ｂ−シアノエチルホスホラミダイト
法（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ．Ｈ．Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２２：１８５９，１９８１）；ヌクレオチドＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５１〜４０５４，１９８６；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１４：５３９９〜５４０７，１９８６；Ｇａｒｅｇｇら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５５〜４０５８，１９８６、Ｇａｆｆｎｅｙら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２９：２６１９〜２６２２，１９８８）。これらの化学は、市販されている種々の自動的な核酸シンセサイザーによって行なうことができる。これらのオリゴヌクレオチドは合成オリゴヌクレオチドと呼ばれる。単離されたオリゴヌクレオチドは一般に、正常には天然に関連する成分から分離されているオリゴヌクレオチドをいう。例えば、単離されたオリゴヌクレオチドとは、細胞から、核から、ミトコンドリアからまたはクロマチンから分離されているオリゴヌクレオチドであってもよい。
【０２２６】
オリゴヌクレオチドは部分的に、分解に耐性である（例えば、安定化される）。「安定化されたオリゴヌクレオチド分子（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」とは、インビボの分解（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを介して）に比較的耐性であるオリゴヌクレオチドを意味する。核酸安定化は、骨格修飾を介して達成され得る。ホスホロチオエート連結を有するオリゴヌクレオチドは、最大の活性を提供して、細胞内のエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼによる分解からこのオリゴヌクレオチドを保護する。他の修飾されたオリゴヌクレオチドとしては、ホスホジエステル修飾核酸、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートの核酸の組み合わせ、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホトジチオエート、ｐ−エトキシおよびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０２２７】
ホスホロチオエートのような修飾された骨格は、ホスホラミデートまたはＨ−ホスホネート化学のいずれかを使用する自動的技術を用いて合成され得る。アリールおよびアルキル−ホスホネートは、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号に記載されるように作製され得る；そしてアルキルホスホトリエステル（荷電された酸素部分が、米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第０９２，５７４号に記載のようにアルキル化される）は、市販の試薬を用いる自動化固相合成によって調製され得る。他のＤＮＡ骨格修飾および置換を作製するための方法は記載されている（例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ，Ａ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４４，１９９０；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１：１６５，１９９０）。
【０２２８】
他の安定化されたオリゴヌクレオチドとしては：非イオン性ＤＮＡアナログ、例えばアルキルおよびアリールホスフェート（荷電されたホスホン酸酸素がアルキル基またはアリール基で置換されている）、ホスホジエステルおよびアルキルホスホトリエステルであって、荷電された酸素部分がアルキル化されているもの、が挙げられる。いずれかの末端または両方の末端で、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコールのようなジオールを含む核酸がまた、ヌクレアーゼ分解に実質的に耐性であることが示されている。
【０２２９】
マウスでのＣｐＧ効果は十分特徴付けられているが、ヒトの系に関する情報は限られている。マウスの系において強力な刺激活性を有するＣｐＧホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ヒトおよび他の非げっ歯類免疫細胞で示す活性がさらに低い。この実施例において、強力なヒトＣｐＧモチーフの開発、ならびにヒトＰＢＭＣ、例えばＢ細胞およびＮＫ細胞に対するその効果および作用機序の特徴づけが記載されている。これらのＣｐＧモチーフおよび部分的に修飾された骨格を含むＤＮＡはヒト末梢血球を強力に刺激して、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＰ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γを生成する。ＩＦＮ−γはコントロールレベルを超えて増大される。ＮＫ細胞およびＴ細胞をまた誘導して、増大したレベルのＣＤ６９を発現した。
【０２３０】
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドのサブセットがヒト細胞、例えばＮＫ細胞に劇的な免疫刺激効果を有することが本発明によって発見されており、これによってこれらのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ヒトのワクチン接種、ガン免疫療法、喘息免疫療法、免疫機能の一般的増強、放射線または化学療法後の造血の回復の増強、自己免疫疾患および他の免疫調節の適用に有効な治療剤であることが示唆される。
【０２３１】
従ってＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、本発明のいくつかの局面において、アレルギーまたは喘息、感染性の生物体による感染、または特定のガン抗原が同定されているガンを発症するリスクのある被験体の処置のためのワクチンとして、有用である。このＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、感染、アレルギーまたはガンに対する保護のための抗原またはアレルゲンなしに与えられてもよく、そしてこの場合反復用量によって長期の保護が可能になり得る。リスクのある被験体とは、本明細書において用いられる場合、感染を生じる病原体もしくはガンまたはアレルゲンに対する曝露というなんらかのリスク、あるいはガン発症のリスクを有する被験体である。例えば、リスクのある患者とは、特定のタイプの感染性因子が見出されている地域に旅行する計画のある被験体であるかもしれないし、または感染性生物体を含み得る体液に、もしくはこの生物体に直接、生活様式もしくは医療手技が曝露される被験体、あるいはさらには感染性生物体もしくはアレルゲンが同定されている地域で暮らしている任意の被験体であるかもしれない。感染を発症するリスクのある被験体としてはまた、特定の感染性生物体抗原を用いたワクチン接種を医療機関が勧める一般的集団が挙げられる。抗原がアレルゲンであり、そして被験体がその特定の抗原に対するアレルギー応答を発症して、この被験体がこの抗原に暴露され得る場合、すなわち花粉の季節の間、その被験体は抗原にさらされるリスクがある。アレルギーまたは喘息を発症するリスクのある患者としては、アレルギーまたは喘息を有することが同定されているが、ただしＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチド処置の間には活性な疾患を有さない被験体、ならびに遺伝的または環境的な要因のせいでこれらの疾患を発症するリスクがあるとみなされる被験体が挙げられる。
【０２３２】
ガンを発症するリスクのある被験体とは、ガンを発症する確率の高い被験体である。これらの被験体としては、例えば、その存在がガンを発症する可能性が高いことと相関関係を有することが実証されている遺伝的異常性を有する被験体、ならびに、タバコ、アスベストもしくは他の化学的毒素のようなガン原因因子に曝露された被験体、またはガンについて以前に処置されて寛解を認めている被験体が挙げられる。ガンを発症するリスクのある被験体を、この被験体で発症するリスクのあるタイプのガンに特異的な抗原およびＣｐＧオリゴヌクレオチドで処置する場合、この被験体はそれらが発効するにつれてガン細胞を殺傷し得る。腫瘍が被験体において形成し始めれば、この被験体はこの腫瘍抗原に対して特異的な免疫応答を発達させる。
【０２３３】
予防的処置のためのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの使用に加えて、本発明はまた、感染、アレルギー、喘息またはガンを有する被験体の処置のためのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの使用を包含する。
【０２３４】
感染を有する被験体は、感染性病原体に曝露されている被験体であり、そして身体内にこの病原体の急性または慢性の検出可能なレベルを有する。このＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを、抗原とともにまたは抗原なしで用いて、感染性病原体のレベルを低下できるかまたは絶つことができる、抗原特異的な全身性または粘膜免疫応答を惹起することができる。感染性疾患とは、本明細書において用いる場合、身体内の外来の微生物の存在から生じる疾患である。病原体進入の主な部位である身体の粘膜表面を保護するために有効なワクチンストラテジーおよび処置を行なうことが特に重要である。
【０２３５】
アレルギーを有する被験体とは、アレルゲンに対する応答においてアレルギー性反応を有するかまたはそれを発症するリスクのある被験体である。アレルギーとは、ある物質（アレルゲン）に対して獲得された過敏性をいう。アレルギー状態とは、湿疹、アレルギー性鼻炎または鼻感冒、花粉症、結膜炎、気管支喘息、蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）（皮疹）（ｈｉｖｅｓ）および食物アレルギー、ならびに他のアトピー性状態が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２３６】
アレルギーは一般に、無害なアレルゲンに対するＩｇＥ抗体生成によって生じる。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの全身投与または粘膜投与によって誘導されるサイトカインは、主にＴｈ１と呼ばれるクラス（例えば、ＩＬ−１２、ＩＰ−１０、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γ）であり、これらが体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を誘導する。ＩＬ−４およびＩＬ−５サイトカインの産生に関連する他の主なタイプの免疫応答は、Ｔｈ２免疫応答と呼ばれる。一般に、アレルギー性疾患は、Ｔｈ２型の免疫応答によって媒介されると考えられる。優勢なＴｈ２（ＩｇＥ抗体およびアレルギーの生成に関連する）からバランスのとれたＴｈ２／Ｔｈ１応答（アレルギー応答に対して防御的）へ被験体における免疫応答を偏移させるＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの能力に基づいて、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの免疫応答を誘導するために有効な用量を被験体に投与して、喘息およびアレルギーを処置または予防することができる。
【０２３７】
従って、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、喘息のようなアレルギーおよび非アレルギー性の状態の処置において有意な治療有用性を有する。Ｔｈ２サイトカイン、特にＩＬ−４およびＩＬ−５は喘息の被験体の気道において上昇する。これらのサイトカインは、ＩｇＥアイソタイプ切替え、好酸球走化性および活性化ならびに肥満細胞増殖を含む、喘息炎症性応答の重要な局面を促進する。Ｔｈ１サイトカイン、特にＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２は、Ｔｈ２クローンの形成およびＴｈ２サイトカインの産生を抑制し得る。喘息とは、炎症、気道の狭窄および吸入される薬剤に対する気道の反応性の増大によって特徴付けされる呼吸器系の障害をいう。喘息は頻繁に、ただし排他的ではないが、アトピー性またはアレルギー性の症状を伴う。
【０２３８】
ガンを有する被験体とは、検出可能なガン細胞を有する被験体である。このガンは、悪性のガンであっても非悪性のガンであってもよい。ガンまたは腫瘍としては、胆管癌；脳腫瘍；乳癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；上皮内癌；リンパ腫；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）；黒色腫；神経芽細胞腫；口腔癌；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；肉腫；皮膚癌；精巣癌；甲状腺癌；および腎臓癌、ならびに他の癌腫および肉腫が挙げられるがこれに限定されない。１つの実施形態では、ガンは、毛様細胞白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、悪性黒色腫、扁平上皮癌、腎細胞癌腫、前立腺癌、膀胱細胞癌または結腸癌である。
【０２３９】
被験体とは、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ヒチメンチョウ、ニワトリ、霊長類、例えばサル、および魚類（水産養殖種）、例えば、サケを含むがこれらに限定されないヒトまたは脊椎動物を意味する。従って、本発明はまた、非ヒト被験体において、癌および腫瘍、感染およびアレルギー／喘息を処置するために用いることができる。ガンは、ペット（すなわち、ネコおよびイヌ）の死亡の原因をもたらす１つである。
【０２４０】
本明細書において用いる場合、処置（ｔｒｅａｔ）、処置される（ｔｒｅａｔｅｄ）、または処置する工程（ｔｒｅａｔｉｎｇ）という用語は、感染性疾患、癌、アレルギー、または喘息のような障害に関して用いられる場合、疾患の発達（例えば、病原体での感染）に対して被験体の抵抗性を増大させるか、または言い換えれば、被験体が疾患を発症する（例えば、病原体に感染する）確率を低下させる予防的な処置、ならびに疾患と戦う（
例えば、この感染を軽減するかまたは排除する）ためまたはこの疾患が悪化することを防ぐための、被験体がこの疾患を発症させた後の処置をいう。
【０２４１】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドが抗原とともに投与される場合、この被験体は抗原に曝露され得る。本明細書において用いる場合、〜に曝露されるという用語は、この被験体と抗原との接触の能動的工程か、またはインビボにおけるこの抗原に対する被験体の受動的曝露のいずれかをいう。ある抗原に対する被験体の能動的な曝露のための方法は当該分野で周知である。一般に、抗原は、静脈内投与、筋肉内投与、経口投与、経皮投与、粘膜投与、経鼻投与、気管内投与または皮下投与などの任意の方法によって被験体に直接投与される。この抗原は全身的に投与されても局所的に投与されてもよい。抗原およびＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを投与するための方法は以下にさらに詳細に記載される。被験体は、ある抗原が身体内の免疫細胞に対する曝露のために利用可能になる場合に、抗原に対して受動的に曝露される。被験体は、例えば、身体への外来病原体の進入によって、またはその表面に外来抗原を発現する腫瘍細胞の発達によって、抗原に対して受動的に曝露され得る。
【０２４２】
被験体が抗原に対して受動的に曝露される方法は、詳細にはＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの投与のタイミングに依存し得る。例えば、ガンまたは感染性疾患またはアレルギー性応答または喘息の応答を発症するリスクのある被験体において、そのリスクが最大であるとき、すなわち、アレルギーの季節に、またはガン発生因子に対する曝露後に、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドをこの被験体に定期的に投与してもよい。さらに、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、旅行者が感染性因子に対する曝露のリスクのある外国に旅行する前に、その旅行者に投与されてもよい。同様に、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、生物戦争に対する曝露のリスクのある兵士または一般市民に対して、この被験体が抗原に曝露される場合、その抗原に対する全身または粘膜の免疫応答を誘導するために投与されてもよい。
【０２４３】
抗原とは本明細書において用いる場合、免疫応答を誘発し得る分子である。抗原としては、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ポリサッカライド、ポリサッカライド結合体、ポリサッカライドおよび他の分子のペプチドおよび非ペプチド模倣物、低分子、脂質、糖脂質、炭水化物、ウイルスおよびウイルス抽出物および多細胞生物、例えば、寄生生物およびアレルゲンが挙げられるがこれらに限定されない。抗原という用語は、広義では、宿主免疫系によって外来であるとして認識される任意のタイプの分子を包含する。抗原としては、ガン抗原、微生物抗原およびアレルゲンが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２４４】
本明細書において用いる場合、ガン抗原とは、腫瘍またはガン細胞表面に会合するペプチドまたはタンパク質のような化合物であって、ＭＨＣ分子の状況において抗原提示細胞の表面で発現された場合に免疫応答を誘導し得る化合物である。ガン抗原は、例えば、Ｃｏｈｅｎら，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４：１０５５に記載されるように、ガン細胞の粗抽出物を調製することによって、抗原を部分的に精製することによって、組み換え技術によって、または公知の抗原の新規の合成によって、ガン細胞から調製され得る。ガン抗原としては、組み換え発現される抗原、腫瘍またはガンの免疫原性部分またはその全体が挙げられるがこれらに限定されない。このような抗原は、組み換え的にまたは当該分野で公知の他の任意の方法によって単離されるかまたは調製され得る。
【０２４５】
微生物抗原とは、本明細書において用いる場合、微生物の抗原であって、ウイルス、細菌、寄生生物および真菌が挙げられるがこれらに限定されない。このような抗原としてはインタクトな微生物、ならびに天然の単離物およびそのフラグメントまたは誘導体、そしてまた天然の微生物抗原に同一であるかもしくは類似であり、その微生物に特異的な免疫
応答を誘導する合成化合物が挙げられる。天然の微生物抗原に対する免疫応答（体液性および／または細胞性）をある化合物が誘導する場合、その化合物はその天然の微生物抗原に類似である。このような抗原は、当該分野で慣用的に用いられており、そして当業者に周知である。
【０２４６】
ヒトで見出されているウイルスの例としては：レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えばＨＩＶ−１（ＨＤＴＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶＥまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶまたはＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる；他の単離体、例えば、ＨＩＶ−ＬＰ；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（例えば、胃腸炎を生じる株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例えば、ハンタウイルス、ブニヤウイルス、フェレボウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；および未分類ウイルス（例えば、δ肝炎の因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトであると考えられる）、非Ａ非Ｂ型肝炎の因子（クラス１＝経口感染；クラス２＝非経口感染（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークおよび関連のウイルス、ならびにアストロウイルス）、が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２４７】
グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の両方とも脊椎動物における抗原として機能する。このようなグラム陽性の細菌としては、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ属、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属が挙げられるがこれらに限定されない。グラム陰性細菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属が挙げられるがこれらに限定されない。感染性細菌の特定の例としては、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ，Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉｌａｅ（Ｂ群連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ビリダンス群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（嫌気性種）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、病原性Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏ
ｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｐｉｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ，Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、およびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２４８】
真菌の例としては、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓが挙げられる。
【０２４９】
他の感染性生物体（すなわち、原生動物）としては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種、例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘおよびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉが挙げられる。血液由来のおよび／または組織の寄生生物としては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種、Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ種、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｍｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｇａｍｂｉｅｎｓｅおよびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ（アフリカ睡眠病）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ（シャーガス病）およびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉが挙げられる。
【０２５０】
他の医学的に関連する微生物は、文献に広範に記載されている。例えば、その全内容が参考として本明細書に援用されるＣ．Ｇ．Ａ  Ｔｈｏｍａｓ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ  Ｔｉｎｄａｌｌ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ
１９８３を参照のこと。
【０２５１】
アレルゲンとは、影響を受け易い被験体においてアレルギー応答または喘息性の応答を誘導し得る物質（抗原）をいう。アレルゲンの列挙は、膨大であって、これには、花粉、昆虫の毒液、動物皮膚あかの粉塵、菌類胞子および薬物（例えば、ペニシリン）を挙げることができる。天然の動物および植物のアレルゲンの例としては、以下の属：Ｃａｎｉｎｅ（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）；Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ（例えば、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ）；Ｆｅｌｉｓ（Ｆｅｌｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）；Ａｍｂｒｏｓｉａ（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｉｓｆｏｌｉａ；Ｌｏｌｉｕｍ（例えば、Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅまたはＬｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）；Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）；Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ）；Ａｌｄｅｒ；Ａｌｎｕｓ（Ａｌｎｕｓ  ｇｕｌｔｉｎｏａｓａ）；Ｂｅｔｕｌａ（Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）；Ｑｕｅｒｃｕｓ（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ａｌｂａ）；Ｏｌｅａ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａ）；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）；Ｐｌａｎｔａｇｏ（例えば、Ｐｌａｎｔａｇｏ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）；Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ（例えば、Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓまたはＰａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ）；Ｂｌａｔｔｅｌｌａ（例えば、Ｂｌａｔｔｅｌｌａ
ｇｅｒｍａｎｉｃａ）；Ａｐｉｓ（例えば、Ａｐｉｓ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）；Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ（例えば、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ａｒｉｚｏｎｉｃａおよびＣｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｍａｃｒｏｃａｒｐａ）；Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ（例えば、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓおよびＪｕｎｉｏｅｒｕｓ  ａｓｈｅｉ）；Ｔｈｕｙａ（例えば、Ｔｈｕｙａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ
）；Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ（例えば、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｏｂｔｕｓａ）；Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ（例えば、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）；Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ（例えば、Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｒｅｐｅｎｓ）；Ｓｅｃａｌｅ（例えば、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）；Ｔｒｉｔｉｃｕｍ（例えば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）；Ｄａｃｔｙｌｉｓ（例えば、Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ）；Ｆｅｓｔｕｃａ（例えば、Ｆｅｓｔｕｃａ  ｅｌａｔｉｏｒ）：Ｐｏａ（例えば、Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓまたはＰｏａ  ｃｏｍｐｒｅｓｓａ）；Ａｖｅｎａ（例えば、Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）；Ｈｏｌｃｕｓ（例えば、Ｈｏｌｃｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）；Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ（例えば、Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ  ｏｄｏｒａｔｕｍ）；Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ（例えば、Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ  ｅｌａｔｉｕｓ）；Ａｇｒｏｓｔｉｓ（例えば、Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ａｌｂａ）；Ｐｈｌｅｕｍ（例えば、Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）；Ｐｈａｌａｒｉｓ（例えば、Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）；Ｐａｓａｌｕｍ（例えば、Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ）；Ｓｏｒｇｈｕｍ（例えば、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｈａｌｅｐｅｎｓｉｓ）；およびＢｒｏｍｕｓ（例えば、Ｂｒｏｍｕｓ  ｉｎｅｒｍｉｓ）に特異的なタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２５２】
実質的に精製されたという用語は、本明細書において用いられる場合、天然に会合する他のタンパク質、脂質、炭水化物または他の物質を実質的に含まないポリペプチドをいう。当業者は、タンパク質精製のための標準的な技術を用いて、ウイルスまたは細菌のポリペプチドを精製することができる。実質的に純粋なポリペプチドはしばしば、非還元性のポリアクリルアミドゲル上で単一の主なバンドを生じる。部分的にグリコシル化されたポリペプチドまたはいくつかの開始コドンを有するポリペプチドの場合、非還元性ポリアクリルアミドゲルにはいくつかのバンドがあってもよいが、これらはそのポリペプチドについて独特のパターンを形成する。ウイルスまたは細菌のポリペプチドの純度はまた、アミノ末端のアミノ酸配列解析によって決定され得る。ポリサッカライド、低分子、模倣物などのような、核酸ベクターによってコードされない他のタイプの抗原が、本発明に包含される。
【０２５３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、抗細菌因子とともに被験体に投与されてもよい。抗微生物因子とは、本明細書において用いる場合、天然に存在する化合物または合成の化合物であって、感染性微生物を殺傷または阻害し得る化合物をいう。本発明に従って有用な抗微生物因子のタイプは、被験体に感染しているかまたは感染するリスクのある微生物のタイプに依存する。抗微生物因子としては、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤および抗寄生生物剤が挙げられるがこれらに限定されない。「抗感染因子（ａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）」、「抗細菌剤（ａｎｔｉ−ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｇｅｎｔ）」、「抗ウイルス剤（ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ  ａｇｅｎｔ）」、「抗真菌剤（ａｎｔｉ−ｆｕｎｇａｌ  ａｇｅｎｔ）」、「抗寄生生物剤（ａｎｔｉ−ｐａｒａｓｉｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）」および「殺寄生生物薬（ｐａｒａｓｉｔｉｃｉｄｅ）」のような句は、当業者に十分確立された意味を有し、そして標準的な医療テキストに規定されている。要するに、抗細菌剤は、細菌を殺傷するかまたは阻害し、これには抗生物質、および同様の機能を有する他の合成または天然の化合物が挙げられる。抗生物質は、微生物のような細胞による二次代謝物として生成される低分子量分子である。一般に、抗生物質は、微生物に特異的であって宿主細胞には存在しない１つ以上の細菌機能または構造を妨害する。抗ウイルス剤は、天然の供給源から単離されてもよいし、または合成されてもよく、そしてウイルスを殺傷または阻害するのに有用である。抗真菌剤は、表面的な真菌感染、ならびに日和見的なおよび原発性の全身性真菌感染を処置するために用いられる。抗寄生生物剤は寄生生物を殺傷または阻害する。
【０２５４】
抗寄生生物剤の例はまた、ヒト投与に有用な殺寄生生物薬とも呼ばれ、これにはアルベ
ンダゾール、アンホテリシンＢ、ベンジニダゾール、ビチオノール、クロロキンＨＣｌ、クロロキンホスフェート、クリンダマイシン、デヒドロエメチン、ジエチルカルバマジン、ジロキサニドフロエート、エフロルニチン、フラゾリドン、グルココルチコイド、ハロファントリン、ヨードキノール、イベルメクチン、メベンダゾール、メフロキン、メグルミンアンチモニエート、メラルソプロール、メトリホネート、メトロニダゾール、ニクロサミド、ニフルチモックス（ｎｉｆｕｒｔｉｍｏｘ）、オキサムニキン、パロモマイシン、ペンタミジンイセチオネート、ピペラジン、プラジカンテル、プリマキンホスフェート、プログアニル、ピランテルパモエート、ピリメタナミン−スルホナミド、ピリメタナミン−スルファドキシン、キナクリンＨＣｌ、硫酸キニーネ、グルコン酸キニジン、スピラマイシン、スチボグルコネートナトリウム（グルコン酸アンチモニルナトリウム）、スラミン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、チアベンダゾール、チニダゾール、トリメトロプリム−フルファメトキサゾール、およびトリパルサミドが挙げられるがこれらに限定されず、そのうちのいくつかは単独でまたは他と組み合わせて用いられる。
【０２５５】
抗菌剤は、細菌の増殖または機能を殺傷または阻害する。大きいクラスの抗菌剤は抗生物質である。広範な細菌を殺傷または阻害するのに有効である抗生物質は、広範なスペクトルの抗生物質を呼ばれる。他のタイプの抗生物質は、グラム陽性またはグラム陰性の細菌に対して主に有効である。これらのタイプの抗生物質は狭いスペクトルの抗生物質と呼ばれる。単一の生物体または疾患に対して有効であり、他のタイプの細菌に対して有効ではない他の抗生物質は、限定されたスペクトルの抗生物質を呼ばれる。抗菌剤は時に、その作用の主な様式に基づいて分類される。一般に、抗菌剤は細胞壁合成インヒビター、細胞膜インヒビター、タンパク質合成インヒビター、核酸合成または機能のインヒビター、および競合的インヒビターである。
【０２５６】
抗ウイルス剤は、ウイルスによる細胞の感染または細胞内のウイルスの複製を防止する化合物である。抗菌薬よりも抗ウイルス薬は少ない。なぜなら、ウイルス複製のプロセスは、宿主細胞内のＤＮＡ複製に密接に関連しており、非特異的な抗ウイルス剤は、しばしば宿主に毒性であるからである。ウイルス感染のプロセスにはいくつかのステージがあり、これが抗ウイルス剤によってブロックまたは阻害され得る。これらのステージとしては、宿主細胞へのウイルスの付着（免疫グロブリンまたは結合ペプチド）、ウイルスの脱殻（例えば、アマンタジン）、ウイルスｍＲＮＡの合成または翻訳（例えば、インターフェロン）、ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡの複製（例えば、ヌクレオチドアナログ）、新しいウイルスタンパク質の成熟（例えば、プロテアーゼインヒビター）、ならびにウイルスの出芽および放出が挙げられる。
【０２５７】
ヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドに類似であるが、完全または異常なデオキシリボースまたはリボース基を有する合成化合物である。一旦このヌクレオチドアナログが細胞にあれば、それらはホスホリル化され、三リン酸型を生成し、これがウイルスＤＮＡまたはＲＮＡへの組みこみについて正常なヌクレオチドと競合する。ヌクレオチドアナログの三リン酸型が増殖する核酸鎖に一旦組み込まれれば、これはウイルスポリメラーゼとの不可逆性の会合を生じ、これによって鎖の終止が生じる。ヌクレオチドアナログとしては、アシクロビル（単純ヘルペスウイルスおよび水疱瘡ウイルスの処置のために用いられる）、ガンシクロビル（サイトメガロウイルスの処置のために有用）、イドクスウリジン、リバビリン（呼吸器合胞体ウイルスの処置に有用）、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジン、ジドブジン（アジドチミジン）、イミキモド、およびレジミキモド（ｒｅｓｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２５８】
インターフェロンは、ウイルス感染細胞および免疫細胞によって分泌されるサイトカインである。感染した細胞に隣接する細胞上の特定のレセプターへの結合によってインターフェロンは機能して、その細胞における変化を生じ、ウイルスによる感染からこの細胞を
保護する。αおよびβインターフェロンはまた、感染した細胞の表面上のクラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子の発現を誘導し、これが宿主免疫細胞認識についての抗原提示の増大を生じる。αおよびβインターフェロンは組み換え型として利用可能であるが、慢性のＢ型肝炎およびＣ型肝炎の感染の処置のために用いられている。抗ウイルス治療のために有効な投与量では、インターフェロンは熱、倦怠感および体重低下のような重篤な副作用を有する。
【０２５９】
本発明において有用な抗ウイルス剤としては、免疫グロブリン、アマンタジン、インターフェロン、ヌクレオチドアナログおよびプロテアーゼインヒビターが挙げられるがこれらに限定されない。抗ウイルス薬の特定の例としては、アセマンナン；アシクロビル；アシクロビルナトリウム；アデフォビル（Ａｄｅｆｏｖｉｒ）；アロブジン（Ａｌｏｖｕｄｉｎｅ）；Ａｌｖｉｃｅｐｔ  Ｓｕｄｏｔｏｘ；塩酸アマンタジン；アラノチン（Ａｒａｎｏｔｉｎ）；アリルドン（Ａｒｉｌｄｏｎｅ）；メシル酸アテビリジン（Ａｔｅｖｉｒｄｉｎｅ  Ｍｅｓｙｌａｔｅ）；アビリジン；シドフォビル；シパンフィリン（Ｃｉｐａｍｆｙｌｌｉｎｅ）；塩酸シタラビン；メシル酸デラビルジン；デスシクロビル（Ｄｅｓｃｉｃｌｏｖｉｒ）；ジダノシン；ジソキサリル（Ｄｉｓｏｘａｒｉｌ）；エドクスジン（Ｅｄｏｘｕｄｉｎｅ）；エンビラジン（Ｅｎｖｉｒａｄｅｎｅ）；エンビロキシム（Ｅｎｖｉｒｏｘｉｍｅ）；ファンシクロビル（Ｆａｍｃｉｃｌｏｖｉｒ）；塩酸ファモチン（Ｆａｍｏｔｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；フィアシタビン（Ｆｉａｃｉｔａｂｉｎｅ）；フィアルリジン（Ｆｉａｌｕｒｉｄｉｎｅ）；フォサリレート（Ｆｏｓａｒｉｌａｔｅ）；フォスカーネットナトリウム；フォスホーネットナトリウム；ガンシクロビル；ガンシクロビルナトリウム；イドクスウリジン；ケトキサール（Ｋｅｔｈｏｘａｌ）；ラミブジン（Ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）；ロブカビル（Ｌｏｂｕｃａｖｉｒ）；塩酸メモチン；メチサゾン；ネビラピン；ペンシクロビル；ピロダビル；リバビリン；塩酸リマンタジン；メシル酸サキナビル；塩酸ソマンタジン；ソリブジン；スタトロン（Ｓｔａｔｏｌｏｎ）；スタブジン（Ｓｔａｖｕｄｉｎｅ）；塩酸チロロン（Ｔｉｌｏｒｏｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；トリフルリジン；塩酸バラシクロビル；ビダラビン；リン酸ビダラビン；ビダラビンリン酸ナトリウム；ビロキシム；ザルシタビン（Ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）；ジドブジン；およびジンビロキシム（Ｚｉｎｖｉｒｏｘｉｍｅ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２６０】
抗真菌剤は感染性真菌の処置および予防のために有用である。抗真菌剤は時に、その作用機序によって分類される。いくつかの抗真菌剤は、グルコースシンターゼを阻害することによって細胞壁インヒビターとして機能する。これらとしては、バシウギン（ｂａｓｉｕｎｇｉｎ）／ＥＣＢが挙げられるがこれらに限定されない。他の抗真菌剤は、膜の完全性を不安定化することによって機能する。これらとしては、イミダゾール、例えば、クロトリマゾール、セルタコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾールおよびボリコナコール、ならびにＦＫ  ４６３、アンホテリシンＢ、ＢＡＹ  ３８−９５０２、ＭＫ  ９９１、プラジミシン、ＵＫ２９２、ブテナフィンおよびテルビナフィンが挙げられるがこれらに限定されない。他の抗真菌剤は、キチン（例えば、キチナーゼ）または免疫抑制（５０１クリーム）を破壊することによって機能する。
【０２６１】
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、免疫応答を増強するアジュバントとして他の治療剤と組み合わされてもよい。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび他の治療剤は、同時にまたは連続して投与されてもよい。他の治療剤が同時に投与される場合、それらは、同じ処方物中で投与されても、または別の処方物中で投与されてもよいが、同時に投与される。他の治療剤およびＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの投与が時間的に別である場合、他の治療剤が、互いに、そしてＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドに引き続いて投与される。これらの化合物の投与の間の時点での間隔は、数分間であってもよいし、さらに長くてもよい。他の治療剤としては、アジュバント、サイトカイン、抗体、抗
原などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２６２】
本発明の組成物はまた、非核酸アジュバントとともに投与されてもよい。非核酸アジュバントは、体液性および／または細胞性の免疫応答を刺激し得る、本明細書に記載のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチド以外の任意の分子または化合物である。非核酸アジュバントとしては、例えば、デポ効果を生じるアジュバント、免疫刺激性アジュバント、ならびにデポ効果を生じて免疫系を刺激するアジュバントが挙げられる。
【０２６３】
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、粘膜のアジュバントとして有用である。全身および粘膜の両方の免疫はＣｐＧ核酸の粘膜送達によって誘導されることは以前に発見されている。従って、オリゴヌクレオチドは他の粘膜アジュバントと組み合わせて投与され得る。
【０２６４】
免疫応答はまた、サイトカイン（Ｂｕｅｌｅｒ＆Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９６；Ｃｈｏｗら、１９９７；Ｇｅｉｓｓｌｅｒら、１９９７；Ｉｗａｓａｋｉら，１９９７；Ｋｉｍら、１９９７）、またはＢ−７同時刺激性分子（Ｉｗａｓａｋｉら、１９９７；Ｔｓｕｊｉら、１９９７）とＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドとの同時投与もしくは同一時系列の発現によって、誘導または増強され得る。サイトカインという用語は、ナノ濃度〜ピコモル濃度で体液性調節因子として機能し、そして正常なまたは病原性の状態のもとで、個々の細胞および組織の機能的な活性を調節する、可溶性のタンパク質およびペプチドの多様な群についての一般名として用いられる。これらのタンパク質はまた、細胞の間の相互作用を直接媒介して、細胞外環境を生じるプロセスを調節する。サイトカインの例としては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（γ−ＩＦＮ）、ＩＦＮ−α、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＧＦ−β、ＦＬＴ−３リガンドおよびＣＤ４０リガンドが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２６５】
オリゴヌクレオチドはまた、Ｔｈ２免疫応答からＴｈ１免疫応答に免疫応答を再指向させるために有用である。これが比較的バランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２環境を生じる。Ｔｈ２からＴｈ１免疫応答への免疫応答の再指向は、核酸に応答して生成されるサイトカインのレベルを測定することによって評価できる（例えば、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦを含むＴｈ１サイトカインを生成するために単球および他の細胞を誘導することによって）。Ｔｈ２からＴｈ１応答への免疫応答の再指向または再バランスは詳細には、喘息の処置または予防のために特に有用である。例えば、喘息を処置するために有効な量は、喘息に関連するＴｈ２型の免疫応答からＴｈ１型の応答またはバランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２環境に再指向するために有用な量であり得る。Ｔｈ２サイトカイン、詳細にはＩＬ−４およびＩＬ−５は、喘息の被験体の気道で上昇される。本発明のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、免疫系を再バランスすることを補助するＴｈ１サイトカインの増大を生じて、主にＴｈ２免疫応答と関連する有害な効果を防止または軽減させる。
【０２６６】
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、気道再構築を処置するためにも有用であり得る。気道再構築によって気道における平滑筋細胞増殖および／または粘膜下肥厚が生じ、最終的には気道の狭窄を生じ、気流の制限が生じる。本発明のオリゴヌクレオチドは、さらなる再構築を防止し、可能性としてはさらに再構築プロセスから生じる組織構築を低下させる。
【０２６７】
オリゴヌクレオチドはまた樹状細胞の生存、分化、活性化、活性化および成熟を改善するのに有用である。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、樹状細胞の細胞生存、分化、活性化および成熟を促進する固有の能力を有する。
【０２６８】
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、ナチュラルキラー細胞の溶解性活性、および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増大する。ＡＤＣＣは、ガン細胞のような細胞標的に特異的な抗体と組み合わせてＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを用いて、行なうことができる。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドが抗体と組み合わせて被験体に投与される場合、この被験体の免疫系は腫瘍細胞を殺傷するように誘導される。ＡＤＣＣ手順に有用な抗体としては、身体の細胞と相互作用する抗体が挙げられる。細胞標的に特異的なこのような抗体の多くは、当該分野において記載されており、多くが市販されている。
【０２６９】
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、抗癌治療と組み合わせて投与され得る。抗癌治療としては、癌医薬、放射線および外科的処置が挙げられる。本明細書において用いる場合、「ガン医薬（ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）」とは、ガンを処置する目的で被験体に投与される因子をいう。本明細書において用いる場合、「ガンを処置する工程（ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）」とは、ガンの発症を防止する工程、ガンの症状を軽減する工程、および／または樹立されたガンの増殖を阻害する工程を包含する。他の局面では、ガン医薬は、ガンを発症するリスクを軽減させる目的で、ガンを発症するリスクのある被験体に投与される。ガンを処置するための種々のタイプの医薬が本明細書において記載される。本明細書の目的のために、ガン医薬は、化学療法剤、免疫治療剤、ガンワクチン、ホルモン療法および生物学的応答修飾因子として分類される。
【０２７０】
さらに、本発明の方法は、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドとともに２つ以上のガン医薬の使用を包含することを意図する。例えば、必要に応じて、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、化学療法剤および免疫治療剤の両方とともに投与されてもよい。あるいは、ガン医薬とは、免疫療法剤およびガンワクチン、を包含してもよいし、または化学療法剤およびガンワクチンまたは化学療法剤、免疫治療剤およびガンワクチンの全てが、ガンを有するかまたはガンを発症するリスクのある被験体を処置するためにその被験体に投与され得る。
【０２７１】
化学療法剤は、メトトレキセート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、クロロエチルニトロソウレアを含む非糖、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラギリン、メグラマインＧＬＡ、バルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、カルムスタイン（ｃａｒｍｕｓｔａｉｎｅ）、およびポリフェルポサン（ｐｏｌｉｆｅｒｐｏｓａｎ）、ＭＭＩ２７０、ＢＡＹ
１２−９５６６、ＲＡＳファメシルトランスフェラーゼインヒビター、ファメシルトランスフェラーゼインヒビター、ＭＭＰ、ＭＴＡ／ＬＹ２３１５１４、ＬＹ２６４６１８／ロメテキソール、グラモレック（Ｇｌａｍｏｌｅｃ）、ＣＩ−９９４、ＴＮＰ−４７０、ハイカムチン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）／トポテカン（Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ＰＫＣ４１２、バルスポダー（Ｖａｌｓｐｏｄａｒ）／ＰＳＣ８３３、ノバントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）／ミトロキサントロン（Ｍｉｔｒｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、メタレット（Ｍｅｒａｔｅｔ）／スラミン（Ｓｕｒａｍｉｎ）、バチスマスタット（Ｂａｔｉｍａｓｔａｔ）、Ｅ７０７０、ＢＣＨ−４５５６、ＣＳ−６８２、９−ＡＣ、ＡＧ３３４０、ＡＧ３４３３、Ｉｎｃｅｌ／ＶＸ−７１０、ＶＸ−８５３、ＺＤ０１０１、ＩＳＩ６４１、ＯＤＮ６９８、ＴＡ  ２５１６／Ｍａｒｍｉｓｔａｔ、ＢＢ２５１６／Ｍａｒｍｉｓｔａｔ、ＣＤＰ８４５、Ｄ２１６３、ＰＤ１８３８０５、ＤＸ８９５１ｆ、Ｌｅｍｏｎａｌ  ＤＰ２２０２、ＦＫ３１７、ピシバニル（Ｐｉｃｉｂａｎｉｌ）／ＯＫ−４３２、ＡＤ３２／バルビシン、メタストロン（Ｍｅｔａｓｔｒｏｎ）／ストロンチウム誘導体、Ｔｅｍｏｄａｌ／Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ、Ｅｖａｃｅｔ／リポソームドキソルビシン、Ｙｅｗｔａｘａｎ／パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、タキソール（Ｔａｘｏｌ）／パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、Ｘｅｌｏａｄ／Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ、フルツロン
（Ｆｕｒｔｕｌｏｎ）／ドキシフルリジン（Ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、シクロパックス（Ｃｙｃｌｏｐａｘ）／経口パクリタキセル、経口タキソイド（Ｔａｘｏｉｄ）、ＳＰＵ−０７７／シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ＨＭＲ  １２７５／フラボピリドール（Ｆｒａｖｏｐｉｒｉｄｏｌ）、ＣＰ−３５８（７７４）／ＥＧＦＲ、ＣＰ−６０９（７５４）／ＲＡＳオンコジーンインヒビター、ＢＭＳ−１８２７５１／経口白金、ＵＦＴ（テガフール（Ｔｅｇａｆｕｒ）／ウラシル（Ｕｒａｃｉｌ））、エルガミゾール（Ｅｒｇａｍｉｓｏｌ）／レバミゾール（Ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）、エニルウラシル（Ｅｎｉｌｕｒａｃｉｌ）／７７６Ｃ８５／５ＦＵエンハンサー、カンプト（Ｃａｍｐｔｏ）／レバミゾール（Ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）、カンプトゾール（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）／イリノテカン、ツモデックス（Ｔｕｍｏｄｅｘ）／ラリトレキシド（Ｒａｌｉｔｒｅｘｅｄ）、レウスタイン（Ｌｅｕｓｔａｉｎ）／クラドリビン（Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、パキセクス（Ｐａｘｅｘ）／パクリタキセル、ドキシル／リポソームドキソルビシン、Ｃａｅｌｙｘ／リポソームドキソルビシン、Ｆｌｕｄａｒａ／Ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ、Ｐｈａｒｍａｒｕｂｉｃｉｎ／Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ、ＤｅｐｏＣｙｔ、ＺＤ１８３９、ＬＵ７９５５３／Ｂｉｓ−Ｎａｐｈｔａｌｉｍｉｄｅ、ＬＵ１０３７９３／ドラスタイン（Ｄｏｌａｓｔａｉｎ）、Ｃａｅｔｙｘ／リポソームドキソルビシン、Ｇｅｍｚａｒ／Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ、ＺＤ０４７３／Ａｎｏｒｍｅｄ、ＹＭ１１６、ロジンシード（ｌｏｄｉｎｅ
ｓｅｅｄｓ）、ＣＤＫ４およびＣＤＫ２インヒビター、ＰＡＲＰインヒビター、Ｄ４８０９／Ｄｅｘｉｆｏｓａｍｉｄｅ、Ｉｆｅｓ／Ｍｅｓｎｅｘ／Ｉｆｏｓａｍｉｄｅ、Ｖｕｍｏｎ／Ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ、Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ／Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ、Ｐｌａｎｔｉｎｏｌ／ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、Ｖｅｐｅｓｉｄｅ／エトポシド、ＺＤ９３３１、タキソテール／ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサン（Ｔａｘａｎｅ）アナログ、ニトロソウレア、アルキル化剤、例えば、メルファランおよびシクロフォスファミド、アミノグルテチミド（Ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロロンブシル（Ｃｈｌｏｒｏｍｂｕｃｉｌ）、シタラビンＨＣｌ、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、フロクスリジン（Ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒドロキシウレア（ヒドロキシカルバミド）、イフォスファミド、インターフェロンα−２ａ、α−２ｂ、酢酸ロイプロイド（ＬＨＲＨ−放出因子アナログ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、塩酸メクロレタミン（Ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ  ＨＣｌ）（ナイトロジェン・マスタード）、メルカプトプリン、メスナ（Ｍｅｓｎａ）、ミトタン（Ｍｉｔｏｔａｎｅ）（ｏ．ｐ．’−ＤＤＤ）、塩酸ミトキサントロン、オクトレオチド、プリカマイシン（Ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、塩酸プロカルバジン、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、アムサクリン（Ａｍｓａｃｒｉｎｅ）（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、インターロイキン２、ミトグアゾン（Ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）（メチル−ＧＡＧ；メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、ペントスタチン（２’デオキシコフォルマイシン）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）および硫酸ビンデシンからなる群より選択されてもよいが、それに限定されない。
【０２７２】
免疫治療剤は、リブタキシン（Ｒｉｂｕｔａｘｉｎ）、ハーセプチン、クアドラメッツ（Ｑｕａｄｒａｍｅｔ）、パノレクス（Ｐａｎｏｒｅｘ）、ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８、ＢＥＣ２、Ｃ２２５、オンコリム（Ｏｎｃｏｌｙｍ）、ＳＭＡＲＴ  Ｍ１９５、ＡＴＲＡＧＥＮ、Ｏｖａｒｅｘ，Ｂｅｘｘａｒ，ＬＤＰ−０３、ｉｏｒ  ｔ６、ＭＤＸ−２１０、ＭＤＸ−１１、ＭＤＸ−２２、ＯＶ１０３、３６２２  Ｗ９４、抗ＶＥＧＦ、Ｚｅｎａｐａｘ，ＭＤＸ−２２０，ＭＤＸ−４４７、ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−２、ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−１、ＣＥＡＣＩＤＥ、Ｐｒｅｔａｒｇｅｔ、ＮｏｖｏＭＡｂ−Ｇ２、ＴＮＴ、Ｇｌｉｏｍａｂ−Ｈ、ＧＮＩ−２５０、ＥＭＤ−７２０００、ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ、ＣＭＡ  ６７６、Ｍｏｎｏｐｈａｒｍ−Ｃ、４Ｂ５、ｉｏｒ  ｅｇｆ．ｒ３、ｉｏｒ  ｃ５、ＢＡＢＳ、抗
ＦＬＫ−２、ＭＤＸ−２６０、ＡＮＡ  Ａｂ、ＳＭＡＲＴ  １Ｄ１０  Ａｂ、ＳＭＡＲＴ
ＡＢＬ  ３６４  ＡｂおよびＩｍｍｕＲＡＩＴ−ＣＥＡからなる群より選択されてもよいが、それに限定されない。
【０２７３】
ガンワクチンは、ＥＧＦ、抗イディオタイプガンワクチン、Ｇｐ７５抗原、ＧＭＫ黒色腫ワクチン、ＭＧＶガングリオシド結合体ワクチン、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｏｖａｒｅｘ、Ｍ−Ｖａｘ、Ｏ−Ｖａｘ、Ｌ−Ｖａｘ、ＳＴｎ−ＫＨＬテラトープ（ｔｈｅｒａｔｏｐｅ）、ＢＬＰ２５（ＭＵＣ−１）、リポソームイディオタイプワクチン、メラシン（Ｍｅｌａｃｉｎｅ）、ペプチド抗原ワクチン、毒素／抗原ワクチン、ＭＶＡ−ベースのワクチン、ＰＡＣＩＳ、ＢＣＧワクチン、ＴＡ−ＨＰＶ、ＴＡ−ＣＩＮ、ＤＩＳＣウイルスおよびＩｍｍｕＣｙｓｔ／ＴｈｅｒａＣｙｓからなる群より選択されてもよいが、それに限定されない。
【０２７４】
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドのモノクローナル抗体のような免疫治療剤と組み合わせた使用によって、ＡＤＣＣの有意な増強（上記のような）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化、およびＩＦＮαレベルの増大を含む多数の機構を通じて長期生存が向上し得る。モノクローナル抗体と組み合わせて用いられる場合、核酸は、生物学的な結果を得るために必要な抗体の用量を減らすように働く。
【０２７５】
本明細書において用いる場合、「ガン抗原（ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）」および「腫瘍抗原（ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）」という用語は、ガン細胞によって示差的に発現されて、それによってガン細胞を標的するように開発され得る抗原をいうために交換可能に用いられる。ガン抗原は、明らかに腫瘍特異的な免疫応答を潜在的に刺激し得る抗原である。これらの抗原のうちいくつかは正常細胞によってコードされているが、必ずしも発現される必要はない。これらの抗原は正常な細胞において正常にはサイレントである（すなわち、発現されない）抗原、分化の特定の段階でのみ発現される抗原、および胚性抗原および胎児性抗原のように一時的に発現される抗原として特徴付けられ得る。他のガン抗原は、変異細胞遺伝子、例えばオンコジーン（例えば、活性化されたｒａｓオンコジーン）、サプレッサー遺伝子（例えば、変異体ｐ５３）、内部欠失から生じる融合タンパク質または染色体転位によってコードされる。さらに他のガン抗原は、ＲＮＡおよびＤＮＡ腫瘍ウイルス上に担持されるようなウイルス遺伝子によってコードされ得る。
【０２７６】
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、自己免疫疾患を処置および予防するために有用である。自己免疫疾患とは、被験体自身の抗体が宿主組織と反応し、免疫エフェクターＴ細胞が内因性自己ペプチドに対して自己反応性であって組織の破壊を生じるという疾患のクラスである。従って、免疫応答は自己抗原と呼ばれる被験体自体の抗原に対して惹起される。自己免疫疾患としては、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性脳脊髄炎、筋無力症（ＭＧ）、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡（例えば、尋常性天疱瘡）、グレーヴス病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体による強皮症、混合結合組織疾患、多発性筋症、悪性貧血、突発性アジソン病、自己免疫関連不妊症、糸球体腎炎（例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、インスリン耐性、および自己免疫性糖尿病が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２７７】
「自己抗原（ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎ）」とは本明細書において用いる場合、正常な宿主組織の抗原をいう。正常な宿主組織は、癌細胞を含まない。従って自己抗原に対して惹起された免疫応答は、自己免疫疾患の状況では、所望されない免疫応答であって、正常な組織の破壊および障害に寄与するが、ガン抗原に対して惹起される免疫応答は所望される免疫応答であり、腫瘍またはガンの破壊に寄与する。従って、自己免疫障害を処置する
目的の本発明のいくつかの局面では、ＣｐＧ免疫刺激性核酸が、自己抗原、詳細にはこの自己免疫障害の標的である自己抗原とともに投与されることは推奨されない。
【０２７８】
他の場合、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、低用量の自己抗原とともに送達され得る。多数の動物研究によって、低用量の抗原の粘膜投与が免疫低応答または「寛容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」の状態を生じ得ることが実証されている。活性な機構は、Ｔｈ１から離れて、主にＴｈ２およびＴｈ３（すなわち、ＴＧＦ−β優勢）応答に向かうサイトカイン媒介性免疫偏移であると考えられる。低用量の抗原送達を用いる活性抑制はまた、無関係の免疫応答を抑制し得（バイスタンダー抑制）、これは自己免疫疾患、例えば、関節リウマチおよびＳＬＥの治療においてかなり興味深い。バイスタンダー抑制は、炎症誘発性およびＴｈ１サイトカインが抗原特異的または抗原非特異的様式のいずれかで放出される局所環境におけるＴｈ１カウンター調節性、サプレッサーサイトカインの分泌に関与する。「寛容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」とは本明細書において用いる場合、この現象をいう。実際、経口寛容は：実験性自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験性自己免疫性筋無力症、コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）およびインスリン依存性糖尿病を含む動物における多数の自己免疫疾患の処置に有用であった。これらのモデルでは、自己免疫疾患の予防および抑制は、Ｔｈ１からＴｈ２／Ｔｈ３応答への抗原特異的体液性および細胞性応答における偏移に関連している。
【０２７９】
本発明はまた、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを用いて感染性チャレンジに対する抗原非特異的先天性免疫活性化および広範なスペクトルの抵抗性を誘導するための方法を包含する。抗原非特異的先天性免疫活性化という用語は、本明細書において用いる場合、Ｂ細胞以外の免疫細胞の活性化をいうが、これには例えば、抗原非依存性の様式で応答し得るＮＫ細胞、Ｔ細胞もしくは他の免疫細胞、またはこれらの細胞のうちのいくつかの組み合わせの活性化を挙げることができる。感染性チャレンジに対する広範なスペクトルの抵抗性が誘導される。なぜなら、免疫細胞は活性型であり、そして任意の進入する化合物または微生物に対して応答するようにプライムされるからである。細胞は、特定の抗原に対して特にプライムされる必要はない。これは生物兵器、および旅行者のような上記の他の状況において特に有用である。
【０２８０】
本発明はまた、鏡像異性のヌクレオチド間連結を有するオリゴヌクレオチドに関する。上記のように、本発明の柔軟性および半柔軟性のオリゴヌクレオチドは、ＣとＧとの間にホスホジエステル様連結を有してもよい。ホスホジエステル様連結の１例は、Ｒｐ構造におけるホスホロチオエート連結である。
【０２８１】
少なくとも１つの研究によって、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの免疫刺激性効果に基づくｐ鏡像異性の効果が試験されている。Ｙｕらは、脾臓細胞増殖を誘導する能力についてステレオエンリッチ（ステレオピュアではない）ホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴヌクレオチドを比較した（Ｙｕら、２０００）。その研究では、単一のＣｐＧモチーフを含む１９マーの配列は、このオリゴヌクレオチドが無作為なｐ鏡像異性で合成されるかまたはＳｐヌクレオチド間連結が富化されるかの場合、高レベルのマウス脾臓細胞増殖を誘導するが、このオリゴヌクレオチドがＲｐヌクレオチド間連結について富化された場合、この増殖は著名に低下されたことが見出された（Ｙｕら、２０００）。しかし、その研究は、ＣｐＧジヌクレオチドでのｐ鏡像異性の特異的な役割を試験していないし、ＲｐＣｐＧオリゴヌクレオチドが短時間の刺激アッセイで活性を有するか否かについても決定していない。
【０２８２】
オリゴヌクレオチドｐ鏡像異性は、活性が測定される時点に依存して、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの免疫活性に明確に反対の影響を有し得るということが本発明によって発見されている。４０分という初期時点で、ホスホロチオエートＣｐＧオリゴヌクレオチドのＲ
ｐステレオアイソマーは、マウス脾臓細胞においてＪＮＫリン酸化を誘導するがＳｐステレオアイソマーは誘導しない（実施例において考察している）。対照的に、４４時間という後期時点でアッセイした場合、Ｓｐは脾臓細胞増殖を刺激するのに活性であるが、Ｒｐは活性ではない。本発明者らは、ＲｐおよびＳｐのステレオアイソマーのこの動態および生物活性における相違が細胞取り込みにおけるなんらかの相違から生じるのではなく、ｐ鏡像異性の２つの対立する生物学的役割に起因する可能性が高いということを実証した。第一に、初期の時点で免疫細胞を刺激することについてＳｐと比較したＲｐステレオアイソマーの活性の増強によって、ＣｐＧレセプターであるＴＬＲ９と相互作用すること、または下流のシグナル伝達経路を誘導するために、Ｒｐがさらに効果的であり得ることが示される。他方では、Ｓｐに比較したＲｐ  ＰＳオリゴヌクレオチドのさらにはやい分解によって、シグナル伝達の期間がかなり短くなり、その結果Ｓｐ  ＰＳオリゴヌクレオチドは、後期の時点で試験した場合にさらに生物学的に活性であるらしい。
【０２８３】
本発明はいくつかの局面において、Ｒｐ  ＰＳオリゴによる免疫刺激の以前に報告された相対的な欠失がそのヌクレアーゼ不安定性のみに起因し、ＣｐＧレセプターおよび下流の経路を刺激することが生来不能であることには起因しないという新規な知見に基づく。ＪＮＫホスホリル化を刺激する能力を試験した場合、これはその分裂促進因子の活性化がタンパク質キナーゼ経路を活性化したことを示すのだが、Ｒｐオリゴヌクレオチドが最も活性であり、続いてステレオ−ランダム（ｓｔｅｒｅｏ−ｒａｎｄｏｍ）オリゴであり、Ｓｐオリゴヌクレオチドの検出可能な活性はないと考えられた。しかし、これらのオリゴヌクレオチドを、ＮＦ−κＢ経路を活性化するその能力について比較した場合、阻害性タンパク質ＩκＢ−αの分解によって測定されるとおり、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの全てが活性であるが、非ＣｐＧコントロールはＩκＢ−α分解を誘導できなかった。従って、Ｓｐオリゴヌクレオチドはさらに生物学的に活性である。ＪＮＫ経路は、ＪＮＫおよびＮＦ−κＢ経路の活性化の動態における相違に関連し得ると推論することはできないが、試験に利用可能なステレオ特異的オリゴヌクレオチドの限られた量に起因して、本発明者らは、この仮説を確認できなかった。
【０２８４】
本実施例に記載された実験では、ＣｐＧジヌクレオチド自体でのｐ鏡像異性の驚くべき強い効果が明らかになった。ステレオ−ランダムＣｐＧオリゴヌクレオチドに比較して、単一のＣｐＧジヌクレオチドがＲｐに連結されている同族は、それよりわずかに活性であるが、Ｓｐ連結を含む同族は、脾臓細胞増殖を誘導するのにほぼ不活性であった。Ｓｐ同族の活性の損失によって、ＴＬＲ９レセプターはＣｐＧジヌクレオチドが相互作用するＤＮＡにおけるＣｐＧジヌクレオチドの鏡像異性に無関係ではないかもしれないが、Ｒｐスレレオアイソマーによって現実的にはさらに刺激され得るという本発明者らの仮説が支持される。従って、ステレオ−ランダムオリゴの刺激性効果はおそらく、分解を遅らせる５０％Ｓｐ連結の存在にのみ起因するのではなく、またオリゴ分子の半分が、免疫刺激性効果を増強すると考えられるＣｐＧジヌクレオチドでＲｐ鏡像異性を有するという事実にも起因する。
【０２８５】
ＲｐＰＳ連結のヌクレアーゼ感受性は、ヒトまたは動物におけるＰＳオリゴの薬物動態（ＰＫ）および代謝研究の解釈に重要な意味を有する。優勢な血清ヌクレアーゼ活性は、３’エキソヌクレアーゼであることが公知である。代表的にはステレオ−ランダムなＰＳオリゴ溶液では、最後の３’ヌクレオチド間連結は、その分子の半分でＲｐ鏡像異性であることが期待される。従って、ＰＳ−オリゴ分子のうちこれらの５０％では、末端の３’塩基はＩＶ注入後にかなり急速に切断される。末端の３’ヌクレオチド間連結から２番目は、これらの分子の半分においてＲｐ鏡像異性であるはずであり、従って最初のＰＳ−オリゴ分子のうち２５％では３’末端は２塩基ずつ比較的急速に短縮されると予想され得る。このインビボにおける塩基クリッピングプロセスは、３’Ｒｐヌクレオチド間連結に関与しており、３’ヌクレオチド間連結がＳｐ構成であるまで継続されると期待され得る。
従って、Ｓｐ３’末端連結を有するようにＰＳ−オリゴを合成した場合、それらはステレオ−ランダムＰＳオリゴに比較して、かなり遅い分解、および異なるＰＫプロフィールを有するはずである。これによって、インビボ適用のためにいくらか短いオリゴヌクレオチドを使用することが可能になるはずである。アンチセンス適用のために至適のオリゴを設計することにおいて、Ｒｐステレオアイソマーの増強したＲＮＡ結合によって、Ｒｐ構成にできるだけ多くのオリゴヌクレオチドの内部コアを有することが望ましいことが指摘される。他方では、免疫刺激性適用のために最適のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧを除いて全てのヌクレオチド間連結がＳｐ鏡像異性であるものであってもよい。
【０２８６】
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、被験体に直接投与されてもよいし、または核酸送達複合体と組み合わせて投与されてもよい。核酸送達複合体は、標的手段（例えば標的細胞に対してさらに高い親和性を生じる分子）と会合する（例えば、イオン的にもしくは共有結合的に結合した；または内部にカプセル化されて）核酸分子を意味する。核酸送達複合体の例としては、ステロール（例えば、コレステロ−ル）、脂質（例えば、陽イオン性脂質、ビロソームまたはリポソーム）、または標的細胞特異的結合因子（例えば、標的細胞特異的レセプターによって認識されるリガンド）と会合する核酸が挙げられる。好ましい複合体は、インビボで十分に安定であって、標的細胞による内在化の前に重大な脱共役を妨げ得る。しかし、この複合体は、細胞内の適切な条件下で切断可能であり得、それによってオリゴヌクレオチドは機能的形態で遊離される。
【０２８７】
表面に対して抗原およびオリゴヌクレオチドを送達するための送達ビヒクルまたは送達デバイスが記載されている。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／または抗原および／または他の治療剤は、単独で（例えば、生理食塩水または緩衝液中で）、または当該分野で公知の任意の送達ビヒクルを用いて投与されてもよい。例えば、以下の送達ビヒクルが記載されている：蝸牛状物（Ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ）（Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅら、１９９４，１９９６）；エマルソーム（Ｅｍｕｌｓｏｍｅｓ）（Ｖａｎｃｏｔｔら、１９９８，Ｌｏｗｅｌｌら、１９９７）；ＩＳＣＯＭｓ（Ｍｏｗａｔら、１９９３，Ｃａｒｌｓｓｏｎら、１９９１、Ｈｕら、１９９８、Ｍｏｒｅｉｎら，１９９９）；リポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）（Ｃｈｉｌｄｅｒｓら，１９９９、Ｍｉｃｈａｌｅｋら、１９８９，１９９２、ｄｅ  Ｈａａｎ  １９９５ａ、１９９５ｂ）；生菌ベクター（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｍａｔｔｅ−ｇｕｅｒｉｎ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（Ｈｏｎｅら、１９９６、Ｐｏｕｗｅｌｓら、１９９８，Ｃｈａｔｆｉｅｌｄら、１９９３，Ｓｔｏｖｅｒら、１９９１、Ｎｕｇｅｎｔら、１９９８）；生ウイルスベクター（Ｌｉｖｅ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ）（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、単純ヘルペス）（Ｇａｌｌｉｃｈａｎら、１９９３，１９９５、Ｍｏｓｓら、１９９６、Ｎｕｇｅｎｔら、１９９８、Ｆｌｅｘｎｅｒら、１９８８、Ｍｏｒｒｏｗら、１９９９）；ミクロスフェア（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）（Ｇｕｐｔａら、１９９８、Ｊｏｎｅｓら、１９９６、Ｍａｌｏｙら、１９９４、Ｍｏｏｒｅら、１９９５、Ｏ’Ｈａｇａｎら、１９９４、Ｅｌｄｒｉｄｇｅら、１９８９）；核酸ワクチン（Ｆｙｎａｎら、１９９３、Ｋｕｋｌｉｎら、１９９７、Ｓａｓａｋｉら、１９９８、Ｏｋａｄａら、１９９７、Ｉｓｈｉｉら、１９９７）；ポリマー（例えば、カルボキシメチルセルロース、キトサン）（Ｈａｍａｊｉｍａら、１９９８、Ｊａｂｂａｌ−Ｇｉｌｌら、１９９８）；ポリマー環（Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｒｉｎｇｓ）（Ｗｙａｔｔら、１９９８）；プロテオソーム（Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅｓ）（Ｖａｎｃｏｔｔら、１９９８、Ｌｏｗｅｌｌら、１９８８、１９９６、１９９７）；フッ化ナトリウム（Ｈａｓｈｉら、１９９８）；トランスジェニック植物（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｓ  ｐｌａｎｔｓ）（Ｔａｃｋｅｔら、１９９８、Ｍａｓｏｎら、１９９８、Ｈａｑら、１９９５）；ビロソーム（Ｖｉｒｏｓｏｍｅｓ）（Ｇｌｕｃｋら、１９９２、Ｍｅｎｇｉａｒｄｉら、１９９５、Ｃｒｙｚら、１９９８）；ウイルス様粒子（Ｊｉａｎｇら、１９９９、Ｌｅｉｂｌら、１９９８）。他の送達ビヒクルが、当該分野で公知であり
、いくつかのさらなる例がベクターの考察で以下に示されている。
【０２８８】
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの有効量という用語は、所望の生物学的効果を実現するために必要かまたは十分な量をいう。例えば、粘膜免疫を誘導するために抗原とともに投与されるＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの有効量は、抗原に対する曝露の際のこの抗原に応答するＩｇＡの発達を生じるのに必要な量であるが、全身の免疫を誘導するのに必要な量は、抗原に対する曝露の際のこの抗原に応答するＩｇＧの発達を生じるのに必要な量である。本明細書で提供される教示と組み合わせて、種々の活性化合物および重み付け因子、例えば、力価、相対的なバイオアベイラビリティー、患者体重、有害な副作用の重篤度および好ましい投与様式のなかから選択することによって、実質的な毒性を生じないが特定の被験体を処置するのに全く有効である、有効な予防的または治療的な処置レジメンを計画してもよい。任意の特定の適用のための有効量は、処置されている疾患または状態、投与される特定のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチド、被験体のサイズ、または疾患もしくは状態の重篤度のような因子に依存して変化し得る。当業者は、有効量の特定のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチド、および／または抗原、および／または他の治療因子を、過度の実験を要することなく経験的に決定することができる。
【０２８９】
粘膜または局所の送達のために本明細書に記載される化合物の対象用量は代表的には、１投与あたり約０．１μｇ〜１０ｍｇにおよび、適用に応じて、毎日、毎週、または毎月、そしてその間の他の任意の頻度で投与されてもよい。さらに代表的には、粘膜または局所の用量範囲は１投与あたり約１０μｇ〜５ｍｇ、そして最も代表的には約１００μｇ〜１ｍｇにおよび、数日または数週の間隔で２〜４回投与される。さらに代表的には、免疫刺激用量は、１投与あたり１μｇ〜１０ｍｇ、最も代表的には１０μｇ〜１ｍｇにおよび、毎日または毎週投与される。この化合物の対象用量は、抗原特異的免疫応答を誘導する目的のための非経口的送達について本明細書に記載されており、ここでこの化合物は、ワクチンアジュバントまたは免疫刺激性適用のための有効な粘膜用量よりも代表的には５〜１０，０００倍高い、そしてより代表的には１０〜１，０００倍高い、そして最も代表的には２０〜１００倍高い抗原とともに送達されるが、別の治療剤とは送達されない。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドが他の治療剤と組み合わせて、または専用の送達ビヒクル中で投与される場合、生得の免疫応答を誘導する目的、またはＡＤＣＣを増大するため、または抗原特異的免疫応答を誘導するための非経口的送達のための、本明細書に記載される化合物の用量は、代表的には１投与あたり０．１μｇ〜１０ｍｇにおよび、これは適用に依存して、毎日、毎週、または毎月、そしてその間の任意の他の間隔で投与されてもよい。さらに代表的には、これらの目的のための非経口用量は、１投与あたり約１０μｇ〜５ｍｇにおよび、そして最も代表的には約１００μｇ〜１ｍｇにおよび、数日または数週の間隔で２〜４回投与される。しかし、いくつかの実施形態では、これらの目的のための非経口用量は、上記のような代表的な用量よりも５〜１０，０００倍高い範囲で用いられ得る。
【０２９０】
本明細書に記載される任意の化合物について、治療上有効な量は、動物モデルから最初に決定され得る。治療上有効な用量はまた、ヒトで試験されている（ヒトの臨床試験が開始されている）ＣｐＧオリゴヌクレオチドについての、そして類似の薬理学的活性を示すことが公知である化合物、例えば、他のアジュバント、例えばＬＴおよびワクチン接種目的のための他の抗原についてのヒトデータから決定されてもよい。非経口投与にはさらに高用量が必要とされ得る。適用される用量は、投与される化合物の相対的なバイオアベイラビリティーおよび力価に基づいて調節され得る。上記の方法および当該分野で周知の他の方法に基づいて最大効力を達成するために用量を調節することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２９１】
本発明の処方物は、薬学的に受容可能な溶液中で投与され、これは慣用的に、塩、緩衝
剤、防腐剤、適合性のキャリア、アジュバントおよび必要に応じて他の治療成分の薬学的に受容可能な濃度を含み得る。
【０２９２】
治療における使用のために、所望の表面、例えば、粘膜、全身に対してＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを送達する任意の様式によって、有効量のこの免疫刺激性オリゴヌクレオチドを被験体に投与してもよい。本発明の薬学的組成物を投与することは、当業者に公知の任意の手段によって達成され得る。投与の好ましい経路としては、経口、非経口、筋肉内、経鼻、口腔内、気管内、吸入、眼、膣、および直腸が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２９３】
経口投与については、化合物（すなわち、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチド、抗原および他の治療因子）は、活性化合物（単数または複数）と当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアとを合わせることによって容易に処方され得る。このようなキャリアによって本発明の化合物は、処置されるべき被験体による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などとして処方することが可能になる。経口使用のための薬学的調製は、固体賦形剤として得ることが可能で、所望の場合、錠剤または糖衣錠コアを得るために、必要に応じて、適切な補助剤を添加した後に、得られた混合物を粉砕して、顆粒のこの混合物を処理する。適切な賦形剤とは、詳細には、充填剤、例えば、糖であり、これにはラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトール；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカント（ｇｕｍ  ｔｒａｇａｃａｎｔｈ）、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などが挙げられる。必要に応じて、崩壊剤、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸、またはそれらの塩、例えばアルギン酸ナトリウムが添加されてもよい。必要に応じて、経口処方物はまた、内部の酸状態を中和するために、生理食塩水または緩衝液、すなわち、ＥＤＴＡに処方されてもよいし、またはなんらキャリアなしで投与されてもよい。
【０２９４】
また特に意図されるのは、上記の成分（単数または複数）の経口投薬形態である。この成分（単数または複数）は、誘導体の経口送達が有効であるように化学的に修飾されてもよい。一般に、意図される化学的修飾は、成分の分子自体への少なくとも１つの部分の結合であり、ここでこの部分によって（ａ）タンパク質分解の阻害；および（ｂ）胃または腸からの血流への取り込み、が可能になる。また所望されるのは、成分（単数または複数）の全体的な安定性の増大、および身体内での循環時間の延長である。このような部分の例としては：ポリエチレングリコール、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリン、が挙げられる。ＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉおよびＤａｖｉｓ、１９８１、「Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ」Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ，Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ３６７〜３８３；Ｎｅｗｍａｒｋら、１９８２，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５〜１８９。用いることができる他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソラン、およびポリ−１，３，６−チオキソカン（ｔｉｏｘｏｃａｎｅ）である。薬学的用途のために好ましいのは、上記で示されるように、ポリエチレングリコール部分である。
【０２９５】
成分（または誘導体）について、放出の位置は胃であっても、小腸（十二指腸、空腸または回腸）であっても、または大腸であってもよい。当業者は、胃に溶けないが、十二指腸または腸のいずれかにおいて物質を放出する、利用可能な処方物を有する。好ましくは、この放出は、オリゴヌクレオチド（または誘導体）の保護によって、または腸内のような胃の環境をこえる生物学的に活性な物質の放出によって、胃の環境の有害な影響を回避
する。
【０２９６】
完全な胃の耐性を確保するために、少なくともｐＨ５．０までの不浸透性のコーティングが必須である。腸溶性のコーティングとして用いられるさらに一般的な不活性成分の例は、トリメリテート酸酢酸セルロース（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ  ５０、ＨＰＭＣＰ  ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ、およびＳｈｅｌｌａｃである。これらのコーティングは混合フィルムとして用いられてもよい。
【０２９７】
コーティングまたはコーティングの混合物はまた、胃に対する保護に関しては意図してない錠剤上に用いられてもよい。これには、糖コーティング、または嚥下することが容易な錠剤を作るコーティングを挙げることができる。カプセルは、乾燥した治療剤、すなわち粉末の送達のための硬性の殻（例えば、ゼラチン）から構成され得る；液体形態のためには、軟性のゼラチン殻を用いてもよい。カプセル（ｃａｃｈｅｔｓ）の殻の材料は、粘性のデンプンであっても、または他の食用の紙であってもよい。丸剤、トローチ、成形錠剤または錠剤粉薬については、モイストマッシング（ｍｏｉｓｔ  ｍａｓｓｉｎｇ）技術を用いてもよい。
【０２９８】
治療剤は、顆粒または約１ｍｍサイズの粒子のペレットの形態で、微細な多数の微粒子（ｍｕｌｔｉ−ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ）として処方物に含まれてもよい。カプセル投与のための物質の処方物はまた、粉末として、軽く圧縮されたプラグ、またはさらに錠剤であってもよい。治療剤は、圧縮によって調製されてもよい。
【０２９９】
着色剤および着香料は、全て含まれてもよい。例えば、オリゴヌクレオチド（または誘導体）は、処方されてもよく（例えば、リポソームまたは微粒子カプセル化によって）、次いでさらに、着色剤および着香料を含む冷蔵飲料のような食品に含まれてもよい。
【０３００】
不活性物質を用いて治療剤の容積を希釈してもよいし、または増大してもよい。これらの希釈物としては、炭水化物、特にマンニトール、ａ−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストランおよびデンプンを挙げることができる。特定の無機塩がまた、充填物として用いられ得るが、これには三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムが挙げられる。いくつかの市販の希釈物は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ，Ｅｍｄｅｘ，ＳＴＡ−Ｒｘ  １５００、ＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓおよびＡｖｉｃｅｌｌである。
【０３０１】
錠剤分解物質は、固体投薬形態への治療剤の処方物に含まれてもよい。錠剤分解物質として用いられる物質としては、デンプンに基づく市販の錠剤崩壊物質であるＥｘｐｌｏｔａｂを含む、デンプンが挙げられるがこれらに限定されない。デンプングリコール酸ナトリウム、アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラマイロペクチン（ｕｌｔｒａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸性カルボキシメチルセルロース、海綿およびベントナイトは全て用いることができる。錠剤分解物質の別の形態は、不溶性の陽イオン交換樹脂である。粉末化ゴムは、錠剤分解物質として、そして結合剤として用いられ得、そしてこれらとしては、寒天、カラヤゴム（Ｋａｒａｙａ）またはトラガカントのような粉末化ゴムを挙げることができる。アルギン酸およびそのナトリウム塩はまた、錠剤分解物質として有用である。
【０３０２】
結合剤は、治療剤を一緒に保持して硬性の錠剤を形成するために用いられ得、そしてこれには、アカシア、トラガカント、デンプンおよびゼラチンのような天然物質由来の物質
が挙げられる。他には、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）、およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げられる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は両方とも、治療剤を粒化するためにアルコール溶液中で用いることができる。
【０３０３】
抗摩擦剤は、処方プロセスの間の固着を防止するために治療剤の処方物に含まれてもよい。潤滑剤は、治療剤とダイ壁との間の層として用いられ得、そしてこれらとしては、ステアリン酸マグネシウムおよびカルシウムの塩を含むステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油およびワックスが挙げられるがこれらに限定されない。可溶性の潤滑剤、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ  ４０００および６０００も用いることができる。
【０３０４】
処方の間の薬物の流動特性を改善し、そして圧縮の間の再配列を補助し得る流動促進剤を添加してもよい。流動促進剤としては、デンプン、滑石、発熱性シリカおよび水和アルミン酸ケイ素を挙げることができる。
【０３０５】
水性の環境への治療剤の溶解を補助するために、サーファクタントを、湿潤剤として添加してもよい。サーファクタントとしては、陰イオン性界面活性剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルフォン酸ジオクチルナトリウムを挙げることができる。陽イオン性界面活性剤を用いてもよいし、これには塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトミウムを挙げることができる。サーファクタントとして処方物に含まれ得る潜在的な非イオン性界面活性剤の列挙は、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレン硬化キャスターオイル１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５および８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースである。これらのサーファクタントは、オリゴヌクレオチドまたは誘導体のいずれか単独の処方物に、または異なる比の混合物として存在し得る。
【０３０６】
経口的に用いられ得る薬学的調製物としては、ゼラチンからなる押込み嵌めカプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤、例えばグリセロールまたはソルビトールからなる軟性の密閉カプセルが挙げられる。押込み嵌めカプセルは、充填剤、例えば、ラクトース、結合剤、例えばデンプン、および／または潤滑剤、例えば滑石またはステアリン酸マグネシウム、および必要に応じて安定化剤と混合されて活性成分を含んでもよい。軟性のカプセルでは、この活性化合物は、適切な液体、例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールに溶解されてもよいし、または懸濁されてもよい。さらに、安定化剤が添加されてもよい。経口投与のために処方されたマイクロスフェアも用いられ得る。このようなマイクロスフェアは、当該分野で十分に規定されている。経口投与のための全ての処方物は、このような投与に適切な投薬物中になければならない。
【０３０７】
口腔内投与のために、この組成物は従来の様式で処方される錠剤またはトローチ剤の形態をとってもよい。
【０３０８】
吸入による投与のために、本発明による使用のための化合物は、適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスの使用を用いて、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾル噴霧提示の形態で都合よく送達され得る。加圧されたエアロゾルの場合、この投薬単位は、定量を送達するバルブを設けることによって決定できる。例えば、吸入器（ｉｎｈａｌｅｒまたはｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）における使用のためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物の粉末混合物および適切な粉末基剤、例えばラクト
ースまたはデンプンを含んで処方されてもよい。
【０３０９】
本明細書においてまた意図されるのは、オリゴヌクレオチド（またはその誘導体）の肺送達である。オリゴヌクレオチド（または誘導体）は、吸入の間に哺乳動物の肺に送達され、肺上皮を横切って血流に入る。吸入された分子の他の報告としては、Ａｄｊｅｉら、１９９０、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７：５６５〜５６９；Ａｄｊｅｉら、１９９０、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，６３：１３５〜１４４（酢酸ロイプロリド）；Ｂｒａｑｕｅｔら、１９８９、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１３（補遺．５）：１４３〜１４６（エンドセリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄら、１９８９、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第ＩＩＩ巻、２０６〜２１２頁（ａ１−アンチトリプシン）；Ｓｍｉｔｈら、１９８９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１１４５〜１１４６（ａ−１−プロテイナーゼ）；Ｏｓｗｅｉｎら，１９９０、「Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＩＩ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，Ｍａｒｃｈ，（組み換えヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓら，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３４８２〜３４８８（インターフェロン−ｇおよび腫瘍壊死因子α）およびＰｌａｔｚら、米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）が挙げられる。全身性の効果のための薬物の肺送達のための方法および組成物は、Ｗｏｎｇらの１９９５年９月１９日刊行の米国特許第５，４５１，５６９号に記載されている。
【０３１０】
本発明の実施における使用について意図されるのは、全て当業者に周知である、ネブライザー、定量吸入器、および粉末吸入器が挙げられるがこれらに限定されない、治療製品の肺送達のために設計された広範な機構的デバイスである。
【０３１１】
本発明の実施に適切な市販のデバイスのいくつかの特定の例は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉによって製造された、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー；Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏによって製造されたＡｃｏｒｎ  ＩＩネブライザー；Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａによって製造されたＶｅｎｔｏｌｉｎ定量インヘラー；ならびにＦｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓによって製造されたＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末インヘイラーである。
【０３１２】
このようなデバイスの全てが、オリゴヌクレオチド（または誘導体）の分配のために適切な処方物の使用を要する。代表的には、各々の処方物は、使用されるデバイスのタイプに特異的であり、そして治療において有用な希釈剤、アジュバントおよび／またはキャリアに加えて、適切な噴霧剤物質の使用に関与し得る。また、リポソーム、マイクロカプセルまたはマイクロスフェア、包接錯体または他のタイプのキャリアの使用が考慮される。化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドはまた、化学的修飾のタイプまたは使用されるデバイスのタイプに依存して異なる処方物において調製されてもよい。
【０３１３】
ジェットまたは超音波のいずれかのネブライザーを用いた使用に適切な処方物は代表的には、溶液１ｍＬあたり約０．１〜２５ｍｇの濃度で生物学的に活性なオリゴヌクレオチドで、水に溶解されたオリゴヌクレオチド（または誘導体）を含む。この処方物はまた、緩衝液および単糖を含んでもよい（例えば、オリゴヌクレオチド安定化、および浸透圧の調節のため）。ネブライザー処方物はまた、エアロゾルを形成するのにおいて溶液の微粒化によって生じるオリゴヌクレオチドの表面誘導凝集を軽減または防止するためにサーファクタントを含んでもよい。
【０３１４】
定量インヘイラーデバイスでの使用のための処方物は一般に、サーファクタントの補助により噴霧剤に懸濁されたオリゴヌクレオチド（または誘導体）を含む微細に粉砕された粉末を含む。噴霧剤は、この目的のために使用される任意の従来の物質、例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、または炭化水素であり得、これにはトリクロロフルオロメタン、ジクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および１，１，１，２−テトラフルオロエタン、またはそれらの組み合わせが挙げられる。適切なサーファクタントとしては、ソルビタントリオレエートおよびダイズレシチンが挙げられる。オレイン酸もサーファクタントとして有用であり得る。
【０３１５】
粉末インヘイラーデバイスから分配するための処方物は、オリゴヌクレオチド（または誘導体）を含む、微細に粉砕された乾燥粉末を含み、そしてまたバルク剤、例えばラクトース、ソルビトール、スクロース、またはマンニトールを、デバイスからのこの粉末の分配を容易にする量、たとえば処方物の５０〜９０重量％の量で含んでもよい。オリゴヌクレオチド（または誘導体）は、肺先端への最も有効な送達のために、１０ｍｍ（またはミクロン）未満、最も好ましくは０．５〜５ｍｍの平均粒子サイズを有する粒子形態で最も有利に調製されるはずである。
【０３１６】
本発明の薬学的組成物の経鼻送達もまた考慮される。経鼻送達によって、鼻へこの治療剤製品を投与した後、肺にこの製品が沈着する必要なしに、本発明の薬学的組成物の血流への直接の通過が可能になる。経鼻送達のための処方物としては、デキストランまたはシクロデキストランを含む処方物が挙げられる。
【０３１７】
経鼻投与のために、有用なデバイスは、一定用量のスプレーが装着される、小さい硬性のボトルである。１つの実施形態では、この定用量は、規定の容積のチャンバへ本発明の溶液の薬学的組成物を吸引することによって送達されるが、このチャンバとは、このチャンバ中の液体が加圧される場合、噴霧を形成することによってエアロゾル化して処方物を噴霧するように寸法決めされた開口部を有する。このチャンバは本発明の薬学的組成物を投与するように加圧される。特定の実施形態では、このチャンバはピストン構成である。このようなデバイスは市販されている。
【０３１８】
あるいは、圧搾される場合に、噴霧を形成することによってエアロゾル処方物をエアロゾル化するように寸法決めされた開口部または開口を有するプラスチックスクイーズボトルが用いられる。この開口は一般にボトルの頂部に見出され、この頂部は一般に、エアロゾル処方物の効率的な投与のための経鼻経路において部分的にフィットするように傾斜付けされる。好ましくは、経鼻インヘイラーは、この薬物の一定用量の投与のためのエアロゾル処方物の一定量を提供する。
【０３１９】
この化合物は、全身に送達することが所望される場合に、注射による、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために処方され得る。注射のための処方物は、単位用量形態で、例えば、アンプルまたは複数回投与（マルチドーズ）容器で、防腐剤を添加されて、与えられ得る。この組成物は、油性または水性のビヒクルにおいて、懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態をとってもよいし、懸濁物、安定化剤、および／または分散剤のような処方剤を含んでもよい。
【０３２０】
非経口投与のための薬学的組成物としては、活性化合物の水溶液を含む水溶性形態が挙げられる。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油状注射懸濁液として調製され得る。適切な脂肪親和性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪酸例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド、またはリポソームが挙
げられる。水性注射懸濁液は、懸濁物の粘性を増大させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含んでもよい。必要に応じて、この懸濁物はまた、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするように化合物の溶解度を増大する、適切な安定化剤または因子を含んでもよい。
【０３２１】
あるいは、活性な化合物は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、無菌の発熱物質を含まない水との構成のために粉末形態にされてもよい。
【０３２２】
この化合物はまた、直腸または膣の組成物、例えば、坐剤または保持浣腸剤に処方されてもよいが、これは例えば、ココアバターまたは他のグリセリドのような従来の坐薬基剤を含む。
【０３２３】
以前に記載された処方物に加えて、この化合物はまた、デポ調製物として処方され得る。このような長時間作用性の処方物は、適切なポリマー材料または疎水性材料（例えば、受容可能なオイルにおけるエマルジョンとして）、もしくはイオン交換樹脂とともに、または溶解性の劣る誘導体として、例えば、溶解性の劣る塩として処方されてもよい。
【０３２４】
薬学的組成物はまた、適切な固体またはゲル相のキャリアまたは賦形剤を含んでもよい。このようなキャリアまたは賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリマー、例えばポリエチレングリコールが挙げられるがこれらに限定されない。
【０３２５】
適切な液体または固体の薬学的調製物形態は、例えば、吸入のための水溶液または生理食塩水であるか、マイクロカプセル化されるか、エンコヒレートされ（ｅｎｃｏｃｈｌｅａｔｅｄ）るか、顕微鏡的金粒子上にコーティングされるか、リポソームに含まれるか、噴霧されるか、エアロゾルであるか、皮膚への移植のためのペレットであるか、または皮膚を傷付ける先鋭な物体上に乾燥される。この薬学的組成物としてまた、顆粒、粉末、錠剤、コーティングされた錠剤、マイクロ（カプセル）、坐剤、シロップ、エマルジョン、懸濁物、クリーム、ドロップまたは活性化合物の放出を長引かせる調製物が挙げられ、その調製物では、賦形剤および添加物および／または補助剤、例えば、錠剤分解物質、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、潤滑剤、香味料、甘味料または安定化剤が、上記のように習慣的に用いられる。この薬学的組成物は、種々の薬物送達システムにおける使用のために適切である。薬物送達のための方法の簡略な概説については、参考として本明細書に援用される、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３，１９９０を参照のこと。
【０３２６】
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび必要に応じて他の治療剤および／または抗原は、それ自体（そのまま（ｎｅａｔ））で投与されても、または薬学的に受容可能な塩の形態で投与されてもよい。医薬で用いる場合、この塩は薬理学的に受容可能でなければならないが、その薬理学的に受容可能な塩を調製するために、薬理学的に受容可能でない塩が都合よく用いられ得る。このような塩としては、以下の酸から調製される塩が挙げられるがこれらに限定されない：塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルフォン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルフォン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルフォン酸、およびベンゼンスルフォン酸。またこのような塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、例えば、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩として調製されてもよい。
【０３２７】
適切な緩衝剤としては、酢酸および塩（１〜２％  ｗ／ｖ）；クエン酸および塩（１〜３％  ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％  ｗ／ｖ）；およびリン酸および塩（０．８〜２％  ｗ／ｖ）：が挙げられる。適切な防腐剤としては、塩化ベンザルコニウ
ム（０．００３〜０．０３％  ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％  ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％  ｗ／ｖ）およびチメロサール（０．００４〜０．０２％  ｗ／ｖ）が挙げられる。
【０３２８】
本発明の薬学的組成物は、有効量のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび必要に応じて抗原および／または他の治療抗原を含むが、これは必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアに含まれる。薬学的に受容可能なキャリアという用語は、ヒトまたは他の脊椎動物への投与に適切である、１つ以上の適合性固体または液体充填剤、希釈物またはカプセル化物質を意味する。キャリアという用語は、有機または無機の成分、天然のまたは合成の成分を意味し、ここでこの活性成分は適用を容易にするために組み合わされる。薬学的組成物の成分はまた、本発明の化合物と、そしてお互いに、所望の薬学的有効性を実質的に障害する相互作用の存在しない方式で、混合され得る。
【０３２９】
本発明はさらに、以下の実施例によって例示されるが、これは決してさらなる限定と解釈されるべきではない。この出願を通じて引用される全ての参考文献（引用文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属の特許出願を含む）の全内容は本明細書において参考として明確に援用される。
【実施例】
【０３３０】
材料および方法：
オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）
全てのＯＤＮは、ｂｉｏｓｐｒｉｎｇ（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＳｉｇｍａ−Ａｒｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入して、Ｃｏｌｅｙ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＧｍｂＨ（Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって同一性および純度を管理した。ＯＤＮをリン酸緩衝化生理食塩水（Ｓｉｇｍａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で希釈して、−２０℃で保管した。全ての希釈は、発熱物質を含まない試薬を用いて行なった。
【０３３１】
細胞精製
健常な男性および女性のヒトドナーからの末梢血バフィーコート調製物をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｌｆ（Ｇｅｒｍａｎｙ）の血液バンク（Ｂｌｏｏｄ
Ｂａｎｋ）から入手して、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）での遠心分離によってそれからＰＢＭＣを精製した。精製したＰＢＭＣを新鮮に用いるか（ほとんどのアッセイについて）、または凍結培地中に懸濁して−７０℃で保管した。必要に応じてこれらの細胞のアリコートを解凍して、洗浄し、５％（ｖ／ｖ）の熱不活性化ヒトＡＢ血清（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｂｅｌｇｉｕｍ）または１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を補充した、ＲＰＭＩ１６４０培養培地（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）に再懸濁した。
【０３３２】
サイトカイン検出
解凍したＰＢＭＣまたは新鮮なＰＢＭＣを４８ウェルの平底プレートに、または９６ウェル丸底プレートに播種して、加湿したインキュベーター中において３７℃で示したとおりの濃度のＯＤＮとともにインキュベートした。培養上清を収集して、直ちに用いられない場合には、必要になるまで−２０℃で凍結させた。市販のＥＬＩＳＡキット（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，ＵＳＡ）か、または市販の抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ／ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎまたはＰＢＬから）を用いて発色させた自社製のＥＬＩＳＡを用いて、上清中のサイトカインの量を評価した。
【０３３３】
ＮＫ細胞活性化のフローサイトメトリー解析のための培養物
ＣＤ３（Ｔ細胞マーカー）、ＣＤ５６（ＮＫ細胞マーカー）およびＣＤ６９（ＮＫ細胞およびＴ細胞における初期活性化マーカー）に対する蛍光色素結合体化モノクローナル抗体をＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから購入した。９６ウェル丸底プレート中に種々の濃度のＯＤＮを添加するかまたは添加せずに、ＰＢＭＣを２４時間インキュベートした。ＮＫ細胞をフローサイトメトリーによってＣＤ５６陽性細胞およびＣＤ３陰性細胞として同定した。フローサイトメトリーデータは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で得た。コンピュータープログラム  ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてデータを解析した。
【０３３４】
細胞表面活性マーカーのフローサイトメトリー解析
Ｂ細胞上の活性化マーカーとして同時刺激分子ＣＤ８６の発現の測定のために、ＰＢＭＣを示した濃度でのＯＤＮとともに４８時間インキュベートさせて、細胞をＣＤ１９およびＣＤ８６（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）についてｍＡｂを用いて染色した。ＣＤ１９陽性Ｂ細胞でのＣＤ８６発現をフローサイトメトリーによって測定した。
【０３３５】
単球上の活性化マーカーとして同時刺激分子ＣＤ８０の発現の測定のために、ＰＢＭＣを示した濃度のＯＤＮとともに４８時間インキュベートさせて、細胞をＣＤ１４、ＣＤ１９およびＣＤ８０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）についてｍＡｂを用いて染色した。ＣＤ１４陽性ＣＤ１９陰性単球でのＣＤ８０発現をフローサイトメトリーによって測定した。両方の測定の結果はＭｅａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＭＦＩ）として得る。
【０３３６】
実施例１：
本明細書に記載されるＣｐＧオリゴヌクレオチドに対するヒトＰＢＭＣの細胞の曝露後にこれらのヒトＰＢＭＣから分泌されるインターフェロン（ＩＦＮ−α）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−６およびＴＨＦ−αのレベルは、添付の図１〜５に示される。試験された試験オリゴヌクレオチドを、この図に黒三角で示す。陽性コントロールオリゴヌクレオチドとして働くオリゴヌクレオチドを、黒四角として示した。図１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａおよび５Ａに示される試験オリゴヌクレオチドとしては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２４が挙げられる。図１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂおよび５Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドとしては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２７、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２８が挙げられる。特定のデータポイントを得るために用いられるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸にそって示す（μＭ）。このグラフの下には、陰性（培地）、そしてある場合にはＬＰＳで処置した細胞によって分泌されるサイトカインのレベルを各々の実験について挙げている。
【０３３７】
図１〜５に実証されるとおり、このアッセイで試験されるオリゴヌクレオチドは、完全にホスホロチオエート骨格を有する陽性コントロールオリゴヌクレオチドとほぼ等しいかまたはそれを超えるレベルでサイトカイン分泌を行なうことができた。陰性コントロールによって生じたサイトカインの産生は有意に少なかった。
【０３３８】
実施例２：
試験オリゴヌクレオチド対コントロールオリゴヌクレオチドを用いた処置に応答するＮＫ細胞でのＣＤ６９発現（ＭＦＩ）のレベルを検査した。ＣＤ６９発現は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞活性化の指標である。図６に黒三角で示される試験オリゴヌクレオチド対黒四角で示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドに対して細胞を曝露した。図６Ａに示される試験オリゴヌクレオチドとしては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２４が挙げられる。図６Ｂに示される試験オリ
ゴヌクレオチドとしては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２８が挙げられる。これらの研究で用いられる陽性コントロールオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９である。以下のグラフは、陰性コントロール（培地）およびＬＰＳを用いて処置したＴ細胞およびＮＫ細胞上のＣＤ６９発現のレベルを各々の実験について列挙する。
【０３３９】
図６に実証されるように、このアッセイで試験されたオリゴヌクレオチドは、完全にホスホロチオエート骨格を有する陽性コントロールオリゴヌクレオチドにほぼ等しいかまたはそれより大きいレベルでＣＤ６９発現を誘導することができた。陰性コントロールが生じたＣＤ６９の産生は有意に少なかった。
【０３４０】
実施例３：
本明細書に記載されるＣｐＧオリゴヌクレオチドに対するヒトＰＢＭＣの細胞の曝露後に、これらのヒトＰＢＭＣによって生成されたインターフェロンα（ＩＦＮ−α）およびＩＬ−１０のレベルは、添付の図７〜１２および１７に示される。試験される試験オリゴヌクレオチドは、この図に黒四角で示される。陽性コントロールオリゴヌクレオチドとして機能するオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２を黒丸で示す。陰性コントロールオリゴヌクレオチドとして機能するオリゴヌクレオチドは（黒菱形）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３０で示す。図７Ａおよび図７Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３である。図８Ａおよび図８Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１４である。図９Ａおよび図９Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１９である。図１０Ａおよび図１０Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１６である。図１１Ａおよび図１１Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１７である。図１２Ａおよび図１２Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０である。図１７Ａおよび図１７Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２１である。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸にそって示す（μＭ）。
【０３４１】
図７〜１２および図１７に示されるように、このアッセイで試験したオリゴヌクレオチドの各々は、異なるレベルおよびパターンのサイトカイン分泌を生じることができた。例えば、ほとんどの試験されたＯＤＮはほぼ等価であるかまたは低い濃度で、完全にホスホロチオエート骨格を有する陽性コントロールオリゴヌクレオチドよりも１つ以上のサイトカインのさらに大きい誘導を生じた。陰性コントロールが生じたサイトカインの生成は有意に少なかった。
【０３４２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３を用いたインキュベーションの際に、ＰＢＭＣは、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：２４２とのインキュベーション後と同様のレベルのインターフェロンα（ＩＦＮα）およびインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を分泌する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１４は、ヒトＰＢＭＣから分泌されるＩＬ−１０の量に対してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２と同様の効果を有するが、ＩＦＮαの分泌は強力に増大される。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２と対照的に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１９がヒトＰＢＭＣから誘導するＩＦＮα分泌のレベルはごく低いレベルであるが、分泌されるＩＬ−１０の量は２つのオリゴヌクレオチドの間で匹敵する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１６が誘導できたヒトＰＢＭＣからのＩＦＮαのレベルはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２よりも数倍高かった。分泌されたＩＬ−１０の総量の増大も観察された。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１６に対して類似の特性を示したが、ここではＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に比較して、ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮα分泌の強力な増大を伴った。ＩＬ−１０分泌のレベルはわずかに上昇した。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０は、ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮαおよびＩＬ−１０の誘導を生じたが、この誘導はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２による誘導より
も少なかった。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２１は、ヒトＰＢＭＣからＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２よりも１０倍高いレベルのＩＦＮαを誘導することができる（図１７Ａ）。ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：２４２に比較して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２１によって誘導されるヒトＰＢＭＣからのＩＬ−１０分泌は、このオリゴヌクレオチドのさらに高濃度でわずかに増大される（図１７Ｂ）。
【０３４３】
実施例４：
本明細書に記載されるＣｐＧオリゴヌクレオチドに対するこれらの細胞の曝露後のＢ細胞および単球の活性化のレベルは、添付の図１３〜１５、１６および１８〜２０に示される。検査された試験オリゴヌクレオチドを、この図において黒四角によって示す。陽性コントロールオリゴヌクレオチドとして役立つオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２は、黒丸で示した。陰性コントロールオリゴヌクレオチドとして役立つオリゴヌクレオチドは、（黒菱形）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３０で示した。図１３Ａおよび図１３Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３である。図１４Ａおよび１４Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１４である。図１５Ａおよび図１５Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１９である。図１６Ａおよび図１６Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１６である。図１８Ａおよび図１８Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２１である。図１９Ａおよび図１９Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１７である。図２０Ａおよび図２０Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０である。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸にそって示す（μＭ）。
【０３４４】
図１３〜１５、１６および図１８〜２０に示されるように、このアッセイで試験したオリゴヌクレオチドの各々は、異なるレベルおよびパターンの細胞表面マーカー発現を生じることができた。例えば、ほとんどの試験されたＯＤＮはほぼ等価であるかまたは低い濃度で、完全にホスホロチオエートの骨格を有する陽性コントロールオリゴヌクレオチドよりも細胞表面マーカーのさらに大きい誘導を生じた。
【０３４５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３によって誘導される単球でのＢ細胞およびＣＤ８０の発現に対するＣＤ８６発現のレベルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に匹敵する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２と対照的に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に比較して低い濃度で細胞を刺激し、このことは力価の増大を示唆する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１４によって誘導されるＢ細胞上のＣＤ８６発現および単球上のＣＤ８０発現のレベルは、匹敵する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１４の効果は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に比べて低い濃度のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１４を用いて観察され、これによってＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１４の力価の増大が示される。Ｂ細胞では、ＣＤ８６の表面発現は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１９を用いて強力に上方制御され、これはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に匹敵するシグナル強度である。単球では、ごくわずかに上昇したレベルのＣＤ８０発現がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１９を用いて検出できる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１９がＢ細胞上でＣＤ８６上方制御を誘導する力価は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に比較してわずかに低下している。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に比較して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１６は、Ｂ細胞上で活性化マーカーＣＤ８６を（図１６Ａ）、そして単球上で活性化マーカーＣＤ８０（図１６Ｂ）をさらに高レベルで誘導する。Ｂ細胞は、ＣＤ８６発現によって示されるようにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２１とのヒトＰＢＭＣのインキュベーションの際に強力に活性化した（図１８Ａ）。ＣＤ８６のレベルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２によって誘導されるレベルよりも高い。また、ＣＤ８０発現によって決定されるとおり、単球の活性化はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２を用いるよりもＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２１を用いる方が強い（図１８Ｂ）。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１７は、ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：２４２と匹敵するレベルでＢ細胞上のＣＤ８６発現を誘導する（図１９Ａ）が、
単球上の活性化マーカーＣＤ８０の発現は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に比較して増大される（図１９Ｂ）。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０は、Ｂ細胞上のＣＤ８６発現をＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：２４２６と同じ程度まで誘導する（図２０Ａ）。
【０３４６】
実施例５．半柔軟性オリゴヌクレオチドはインビトロでヒトＰＢＭＣについて免疫刺激性である。
【０３４７】
本実施例では、半柔軟性のオリゴヌクレオチドをそれがインビトロでサイトカインおよびケモカインを誘導する能力について評価した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を３例の健常なヒトドナーから入手して、種々の濃度（０．０５、０．１、０．２、０．５、１．０および５．０μＭ）の完全に安定化されたＣｐＧ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２または半柔軟性のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１の存在下で培養した。６時間、１６時間または４８時間後、培養上清を収集して、種々のサイトカイン（ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０）およびケモカインＩＰ−１０を含む上清をＥＬＩＳＡによって測定した。半柔軟性および完全に安定化されたオリゴヌクレオチドは、低濃度のオリゴヌクレオチドでも、ＩＦＮ−αを培養の１６時間または４８時間後に同じ程度まで誘導した。しかし、ＯＤＮ５４７６を用いたＩＦＮ−αの最大誘導は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に必要なオリゴヌクレオチド濃度の約半分で達した。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２は、中間濃度でＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：２４１よりも多くのＩＦＮ−αを誘導し、高濃度ではＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２もＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１も多くのＩＦＮ−αを誘導しなかった。ケモカインＩＰ−１０は、半柔軟性および完全に安定化されたオリゴヌクレオチドによって同じ程度まで、そして同様の濃度依存で刺激された。両方の場合とも、低濃度のオリゴヌクレオチドで約７００ｐｇ／ｍＬのＩＰ−１０が観察され、そして高濃度のオリゴヌクレオチドで誘導されたＩＰ−１０は少なかった。半柔軟性オリゴヌクレオチドは０．０５μＭで有意な量のＩＬ−１０を誘導したが、完全に安定化されたオリゴヌクレオチドは０．０５μＭでＩＬ−１０をほとんど誘導しないかまたは全く誘導しなかったこと以外は、サイトカインＩＬ−１０で、ＩＰ−１０のパターンに類似のパターンが観察された。半柔軟性および完全に安定化されたオリゴヌクレオチドは、それがＴＮＦ−αを誘導する能力において同様であった。すなわち、両方のタイプのオリゴヌクレオチドとも、特に高濃度ではＴＮＦ−αを強力に誘導した。
【０３４８】
表１．オリゴヌクレオチド（μＭ）によって誘導されるサイトカインおよびケモカイン（ｐｇ／ｍＬ）１
【０３４９】
【表１】
0005414961.tif 000044
【０３５０】
１値は平均として示す（標準偏差）
実施例６．半柔軟性ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１対完全に安定化されたＯＤＮによるイ
ンビトロでのマウスマクロファージの刺激
マウスマクロファージ細胞株（ＲＡＷ２６４）を、半柔軟性オリゴヌクレオチドＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：２４１、完全に安定化されたオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２、完全に安定化されたＯＤＮ１８２６、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）またはＰＢＳとともに１６時間インキュベートした。半柔軟性および完全に安定化されたＯＤＮを０．０２、０．０５および０．１μＭの濃度で検査した。上清を収集して、ＩＬ−１２のｐ４０サブユニット（ＩＬ−１２ｐ４０，ｐｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡによって測定した。結果は表２に示される。半柔軟性オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１は、いずれの完全に安定化されたＯＤＮよりもＩＬ−１２ｐ４０を分泌するためのマクロファージを誘導するのに有意に強力であった。
【０３５１】
表２．半柔軟性オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１によって刺激されるマウスマクロファージによるＩＬ−１２ｐ４０分泌
【０３５２】
【表２】
0005414961.tif 000045
【０３５３】
実施例７．ヒト免疫細胞の刺激に最適である配列を有する半柔軟性Ｂクラスオリゴヌクレオチドは、マウス免疫細胞の強力な免疫刺激因子である。
【０３５４】
ヒトおよびマウス免疫細胞は異なるＣｐＧＯＤＮに応答することが報告されている。完全に安定化されたＣｐＧＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２は、ヒト免疫細胞を刺激するのに「最適（ｏｐｔｉｍａｌ）」であると考えられていたが、マウス免疫細胞を刺激するためには「最適」とは考えられていなかった。逆に、完全に安定化されたＣｐＧ  ＯＤＮ５８９０（５’Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ３’）は、マウス免疫細胞を刺激するのに「最適（ｏｐｔｉｍａｌ）」であると考えられていたが、ヒト免疫細胞を刺激するためには「最適」とは考えられていなかった。ヒトおよびマウスの両方のＢ細胞がＴＬＲ９を発現することが報告されている。ＴＬＲ−９発現ＨＥＫ２９３マウス脾臓細胞を、種々の濃度の完全に安定化されたＣｐＧ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２、完全に安定化されたＣｐＧ  ＯＤＮ５８９０、または半柔軟性のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１の存在下で培養して、ＴＬＲ９活性化を以下のとおり測定した。このアッセイについて用いた細胞は、マウスＴＬＲ９を発現して、レポーター遺伝子構築物を含んだ。細胞をＯＤＮとともに加湿したインキュベーター中で３７℃で１６時間インキュベートした。各々のデータポイントを三連で行なった。細胞を溶解してレポーター遺伝子活性についてアッセイした。ＯＤＮの添加なしの培地のレポーター遺伝子活性を参照して刺激指数を算出した。半柔軟性オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１および完全に安定化されたオリゴヌクレオチドＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：２４２は、同一の塩基配列を有する。結果を表３に示す。最低濃度では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２が有する免疫刺激効果は最小であった。しかし濃度が１４ｎＭ以上に増大するにつれて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２よりも明らかに免疫刺激性になった。本実験で研究した最高濃度では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１は、マウスの最適に完全に安定化されたオ
リゴヌクレオチドＯＤＮ５８９０と少なくとも同じ程度の刺激性であった。
【０３５５】
表３．ヒト細胞について最適化された配列を有する半柔軟性ＯＤＮによる、マウスＴＬＲ９発現ＨＥＫ２９３細胞の刺激指数
【０３５６】
【表３】
0005414961.tif 000046
【０３５７】
実施例８〜９．半柔軟性オリゴヌクレオチドはＮＫ細胞活性化を誘導する。
【０３５８】
半柔軟性および完全に安定化されたオリゴヌクレオチドをまた、ＮＫ細胞活性化を刺激する能力に関して比較した。標準的なクロム遊離アッセイを用いて、１０×１０６ＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞を、１０％ＦＢＳ（６５℃３０分で熱不活性化）、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌグルタミン酸を補充した２ｍＬ  ＲＰＭＩ中で、半柔軟性ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１または完全に安定化したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２の有無で、各々のＯＤＮを最終濃度１、３または１０μｇ／ｍＬまで添加して、４８時間培養した。細胞を洗浄して、次いで２つのＮＫ感受性標的細胞株であるＹＡＣ−１および２Ｃ１１を用いる短時間５１Ｃｒ遊離アッセイにおいてエフェクター細胞として用いた（Ｂａｌｌａｓ  ＺＫら（１９９３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５０：１７〜３０）。０．２ｍＬのＶ底マイクロタイタープレート中の１０４ ５１Ｃｒ標的細胞に種々の濃度でエフェクター細胞を添加して、５％  ＣＯ２中で３７℃で４時間インキュベートした。研究したエフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は、６．２５：１、２５：１、５０：１および１００：１であった。次いでプレートを遠心分離して、上清のアリコートを放射能についてカウントした。エフェクター細胞の存在下で遊離された５１Ｃｒマイナス標的細胞を単独で培養した場合に遊離された５１Ｃｒを、２％酢酸における細胞溶解（１００％溶解）後に遊離された総カウントマイナス細胞を単独で培養する場合に遊離された５１Ｃｒ  ｃｐｍで割った比を算出することによって溶解比パーセントを決定した。結果を以下の表５に示す。まとめると、半柔軟性オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１および完全に安定化されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２は、試験した全てのＯＤＮ濃度およびＥ：Ｔ比を超えるＮＫ細胞活性化の本質的に匹敵するレベルを誘導した。
【０３５９】
表５．ＮＫ細胞媒介性溶解比
【０３６０】
【表４】
0005414961.tif 000047
【０３６１】
実施例１０．半柔軟性オリゴヌクレオチドは一般に、同じまたは類似の配列の全てホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドよりも免疫刺激性である。
【０３６２】
全ての試験した半柔軟性バージョンは、対応する均一なホスホロチオエート分子よりもヒトＴＬＲ９アッセイにおいて活性であった（表６）。４つの濃度（０．１μＭ、０．５μＭ、２μＭおよび８μＭ）のデータポイントから平均の刺激指数を算出した。この表では、Ｕは２’−デオキシウラシルに相当する。
【０３６３】
表６．半柔軟性オリゴヌクレオチド対同じまたは類似の配列の全てホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドの相対的平均刺激指数
【０３６４】
【表５】
0005414961.tif 000048
【０３６５】
【表６】
0005414961.tif 000049
【０３６６】
【表７】
0005414961.tif 000050
【０３６７】
実施例１１．弱い免疫刺激性の完全に安定化されたオリゴヌクレオチドの半柔軟性のバージョンの改善されたインビトロ力価
以下：
【０３６８】
【化６５】
0005414961.tif 000051
【０３６９】
は、完全に安定化された、全のホスホロチオエートのＣｐＧオリゴヌクレオチドであって、これはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に比較して低い免疫刺激性力価を有する。関連の半柔軟性オリゴヌクレオチドである
【０３７０】
【化６６】
0005414961.tif 000052
【０３７１】
は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４４よりも何倍も強力であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２よりもさらに強力である。
【０３７２】
【化６７】
0005414961.tif 000053
【０３７３】
表７．完全に安定化された、ただし弱い免疫刺激性のオリゴヌクレオチドの半柔軟性改変体による改善された免疫刺激
【０３７４】
【表８】
0005414961.tif 000054
【０３７５】
実施例１２．長さの短縮された半柔軟性オリゴヌクレオチドは、インビトロで免疫刺激性である。
【０３７６】
半柔軟性１６マー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８３、１６マー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４５、１７マー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８４、および２４マー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１を、それがＴＬＲ９シグナル伝達を刺激する能力について、完全に安定化されたＯＤＮ２４マーのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２および１８マーのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８５と比較した。各々のオリゴヌクレオチドを、ヒトＴＬＲ９およびレポーター遺伝子構築物を用いてトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に１、６、１２または２４μｇ／ｍｌの濃度で加えて、ＴＬＲ９活性化を上記のとおり測定した。
【０３７７】
【化６８】
0005414961.tif 000055
【０３７８】
１８マーの完全に安定化されたオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８５は、２４マーの完全に安定化されたオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２よりも試験した全ての濃度で免疫刺激性が低かったが、１６マーおよび１７マーの半柔軟性オリゴヌクレオチドは、６μｇ／ｍＬ以上の濃度で２４マーのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２と少なくとも同じ刺激性であった。さらに、１６マーおよび１７マーの半柔軟性オリゴヌクレオチドは、２４マーの半柔軟性オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１とほぼ同じ免疫刺激性であった。
【０３７９】
表８．短いおよび長い完全に安定化された、および半柔軟性のオリゴヌクレオチドと比較した短い半柔軟性オリゴヌクレオチドの免疫刺激性活性
【０３８０】
【表９】
0005414961.tif 000056
【０３８１】
実施例１３．半柔軟性オリゴヌクレオチドは、インビボで免疫刺激性である。
【０３８２】
ＢＡＬＢ／ｃマウスを群に分けて、皮下に４００μｇの半柔軟性オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１、完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２、完全に安定化された陰性コントロールオリゴヌクレオチド（ＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＣＴＴ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８６）、または等容積のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を投与した。注射の３時間後に動物から採血して、ＩＰ−１０、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの血清レベルを適切なサイトカイン特異的ＥＬＩＳＡを用いて決定した。血清ＩＰ−１０は、完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２（３，５００〜８，０００ｐｇ／ｍＬ）よりも半柔軟性のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１（８，０００〜１２，０００ｐｇ／ｍＬ）を投与された動物において約２倍高かった。コントロールＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８６を投与される動物における血清ＩＰ−１０は、ＰＢＳを投与された動物と同じ低いレベルのＩＰ−１０を有した。半柔軟性オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１および完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２は、同様の量のＩＦＮ−γの約１５０ｐｇ／ｍＬを誘導した。半柔軟性のオリゴヌクレオチドＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：２４１は、完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２よりも３０〜４５パーセント多いＴＮＦ−αを誘導した（１つの実験では、約１，５５０ｐｇ／ｍＬ対約１，１７５ｐｇ／ｍＬ、そして別の実験では、約７１０ｐｇ／ｍＬ対約４９０ｐｇ／ｍＬ。
【０３８３】
別のセットのインビボの実験では、半柔軟性および完全に安定化されたオリゴヌクレオチドを、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける腫瘍を処置する能力について検査した。ＢＡＬＢ／ｃマウスの３つの群に、樹立された腫瘍モデルを用いて、自然な起源（Ｒｅｎｃａ）の細胞のマウス腎臓腺癌を腹腔内注射した。Ｓａｌｕｐ  ＲＲら（１９８５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７：４１７〜３６。マウスの各々の群にまた、１００ｍｇ半柔軟性オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１、１００ｍｇの完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２、または等価な容積のＰＢＳを投与した。マウスを生存について、および死亡時の腫瘍サイズについて追跡した。ＰＢＳを用いたニセの処置を受けたマウスは、４４日の平均生存であって、５０日では２０パーセントの生存であった。対照的に、半柔軟性オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１を投与されたマウスは、５０日で８０パーセントの生存であって、完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２を投与されたマウスは、５０日で７０パーセントの生存を有した。腫瘍サイズ（立方ミリメートル）に関して、ＰＢＳを投与されたマウスは５２日後にほぼ１２００ｍｍ３の腫瘍容積を有したが、半柔軟性オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１または完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２を投与されたマウスは、それぞれ約２５０ｍｍ３および１８０ｍｍ３の腫瘍を有した。従って、半柔軟性オリゴヌクレオチドおよび完全に安定化されたオリゴヌクレオチドは、腫瘍負荷を軽減するのにおいて、およびこのモデルの実験における生存の延長においての両方に高度に有効であった。
【０３８４】
実施例１４．柔軟性または半柔軟性のオリゴヌクレオチドは腎毒性が低下している。
【０３８５】
サルに対する完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドの投与は、糸球体腎炎、すなわち、腎臓の炎症の発症に関連し得るということが観察されている。糸球体腎炎は、糸球体濾過速度の低下（高窒素血症）、水および塩の保持、高血圧および浮腫をしばしば伴う、尿中の赤血球およびタンパク質の存在によって診断およびモニターできる。正常には、尿は本質的に血球および血漿タンパク質を含まない。診断はまた、腎臓組織の組織学的検査によって行なうことができる。腎臓組織は、完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドよりも柔軟性のオリゴヌクレオチドにおいてより活性であることが期待されるヌクレアーゼが豊富であることが報告されている。
【０３８６】
サルを２つの群に分けて、１つの群に柔軟性のオリゴヌクレオチドを投与して、他の群に完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドを投与した。この柔軟性のオリゴヌクレオチドおよび完全に安定化された免疫刺激性のオリゴヌクレオチドは、配列が同一であり、ヌクレオチド間連結でのみ異なる。両方の群のサルが同じ用量の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを投与される。処理前（ベースライン）および定期的な処置時測定は、糸球体濾過速度の存在について評価するために有用な少なくとも１つのパラメーターから判断するが、これには例えば、尿タンパク質および／または血尿の存在についてのディップスティック尿検査、赤血球および／または赤血球円柱の存在についての顕微鏡的尿解析、尿タンパク質濃度、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、血清クレアチニン、血圧、体重ならびに光学顕微鏡的および／または電子顕微鏡的組織解析による腎臓生検が挙げられる。臨床的知見は、各々のサルに投与した免疫刺激性オリゴヌクレオチドのタイプと関連しており、そして結果を統計学的な有意性について群間で比較する。
【０３８７】
必要に応じて、柔軟性もしくは半柔軟性のオリゴヌクレオチドまたは完全に安定化され
た免疫刺激性オリゴヌクレオチドを上記のように、ただしさらに高いまたは低いオリゴヌクレオチド用量（単数または複数）を用いて投与したサルの対になった群を、オリゴヌクレオチド用量の関数としてのさらなる結果を評価するために包含する。
【０３８８】
柔軟性オリゴヌクレオチドを投与したサルは、完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドを投与されたサルよりも糸球体腎炎を発症する傾向が有意に低い。
【０３８９】
実施例１５．柔軟性オリゴヌクレオチドは、高濃度で免疫刺激性の力価が増大している。
【０３９０】
柔軟性オリゴヌクレオチドを、ＴＬＲ９活性を誘導する能力についてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２と比較した。柔軟性ＯＤＮおよびコントロールＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２を、各々の４つの濃度１μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、１２μｇ／ｍｌおよび２４μｇ／ｍｌで比較した。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２による活性化と比較した、各々の柔軟性オリゴヌクレオチドによる活性化の各々の濃度での比を以下の表９に示す。これらの結果によって、柔軟性オリゴヌクレオチドが、調べられたより高い濃度でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２よりも免疫刺激性であることが示される。
【０３９１】
【化６９】
0005414961.tif 000057
【０３９２】
表９．各々の濃度においてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２と比較した柔軟性オリゴヌクレオチドの相対的力価
【０３９３】
【表１０】
0005414961.tif 000058
【０３９４】
実施例１６．血清および組織におけるオリゴヌクレオチドの安定性
マウスに、２５ｍｇ／ｋｇの半柔軟性オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１、柔軟性オリゴヌクレオチド
【０３９５】
【化７０】
0005414961.tif 000059
【０３９６】
、または完全に安定化されたオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２を皮下注射した。組織および血清サンプルを選択した時間後に得て、インタクトなオリゴヌクレオチドおよびそのフラグメントについて解析した。
【０３９７】
組織または血清サンプルを既知の量の内部標準ＯＤＮ（１．２５μｇ  ポリＴ）を用いてスパイクして、下記の固相抽出（ＳＰＥ）法によってＯＤＮを組織および血漿のサンプルから単離した。解析物、代謝物および内部標準を含む得られた溶液を、これも下記のキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法によって解析した。ＣＧＥによって解析した、腎臓、肝臓、脾臓および血清のサンプルから回収されたＯＤＮの総量（すなわち、解析物に加えて代謝物）を規定した。標準偏差を算出した。総ピーク面積の相対量の割合を各々の代謝物に対して割り当てた。
【０３９８】
ＳＰＥ．血清からのＯＤＮの単離のために、１００μｇのサンプルを１．２５μｇの内部標準ＯＤＮでスパイクして、混合して５ｍｌ  ＳＡＸ−緩衝液に溶解した。この溶液を陰イオン交換カラム（ＳＡＸ、Ａｇｉｌｅｎｔ）に加えて、このカラムを洗浄して、増大した陰イオン性強度の緩衝液を用いてＯＤＮを溶出した。逆相（ＲＰ）カラム（Ｇｌｅｎ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ）またはそれに匹敵するカラム（ＨＬＢ、Ｗａｔｅｒｓ）を用いて、得られた溶出物を脱塩した。水およびアセトニトリルのみを含む、ＲＰカラムからの溶出物を乾燥させて、同じチューブで６０μｌの脱イオン水に溶解した。このサンプルのさらなる脱塩のために、膜透析を行なった。キャピラリーゲル電気泳動によってサンプルを直接解析した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳについて、サンプルを希釈しないかまたは濃縮して用いた。すなわち５０μｌのＯＤＮサンプルを減圧下で乾燥して、脱イオン水に溶解し、以下に記載のとおりアッセイした。
【０３９９】
組織からのＯＤＮを、同様のＳＰＥプロトコールに従って単離した。１００ｍｇの組織をＦａｓｔＰｒｅｐデバイスを用いてホモジナイズした。プロテイナーゼＫを添加してタンパク質を２時間、加水分解した。上記のＳＰＥ方法において水可溶化分画を進める前にフェノール抽出を行なった。
【０４００】
ＣＧＥ。解析物、その代謝物および規定の量の内部標準ＯＤＮを含む脱塩サンプルを、ゲル充填キャピラリー（中性、３０ｃｍ、ｅＣＡＰ  ＤＮＡキャピラリー、Ｂｅｃｋｍａｎ＃４７７４７７）中に、水を事前に注射したサンプル側に電気運動学的に注射した。検出を２６０ｎｍでモニターしながら、３００Ｖ／ｃｍの電圧を印加した。７Ｍ尿素を含むＴｒｉｓ／ホウ酸／ＥＤＴＡ緩衝液中で２５℃で分離を行なった。この解析物を、同様に調製して同時に解析する標準物の移動時間に比較したその解析物の相対的移動時間（ＭＴＯｌｉｇｏ／ＭＴＩｎｔＳｔｄ．）によって同定した。相対的な移動時間および任意の電気運動学的ピークの相対面積の割合であって３×シグナル：ノイズ（Ｓ：Ｎ）比より大きいものを記録した。３×シグナル：ノイズと１０×シグナル：ノイズとの間のピーク高さは定量化できないとして記録した。
【０４０１】
オリゴ（％）＝（ピーク面積／総ピーク面積＞３×Ｓ：Ｎ）×１００（％）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ。解析物およびその代謝物を含む脱塩サンプルを、遅延抽出源、３３７ｎｍ波長の窒素レーザーおよび１．２メートルの飛行管を備える、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で解析した。装置の設定は以下のとおりであった：電圧２５ｋＶ；グリッド電圧９５．４％；ガイドワイア０．１％；遅延時間１２００ｎｓｅｃ。同様に、マトリックス３−ヒドロキシピコリン酸含有クエン酸ジ
アンモニウムを用いた。ＯＤＮサンプルのスペクトルを、既知の分子量の標準ＯＤＮのセットを用いて同一の条件下で同じプレート上に外面上に較正した。
【０４０２】
４８時間で得た結果を図２０に示す。図２０によって、腎臓では半柔軟性ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：２４１および柔軟性ＯＤＮ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９４が、全てホスホロチオエートのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に比較して劇的に低下した（それぞれ９３％までおよび８７％まで）ことが示される。
【０４０３】
実施例１７．Ｃオリゴヌクレオチドは、インビトロで免疫刺激性である。
【０４０４】
５’非回文構造部分（ＯＤＮ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５５）、３’回文構造部分（ＯＤＮ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５１）内、ならびに５’非回文構造部分および３’回文構造部分（ＯＤＮ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９５）の両方にホスホジエステル連結を持つ半柔軟性Ｃクラスオリゴヌクレオチドを調製した。さらに、ＯＤＮ ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５２を、３’回文構造部分（以下に下線で示す）を構成するヌクレオチドにおいて、ＯＤＮ ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９５のような連結を用いて、ただし２’−Ｏ−Ｍｅリボース糖を用いて調製した。次いで、これらのオリゴヌクレオチドを上記のＴＬＲ９アッセイを用いて評価した。
【０４０５】
【化７１】
0005414961.tif 000060
【０４０６】
完全に安定化された骨格を有するＣクラスのオリゴヌクレオチドは一般に、Ｂクラスオリゴヌクレオチドに比較して相対的に低いＴＬＲ９活性を示す。以下の表１０に示されるように、ちょうど５’非回文構造部分における半柔軟性配列の組み込み（ＯＤＮ  ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：２５５）は、ちょうど３’非回文構造部分における半柔軟性配列の組み込み（ＯＤＮ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５１）に比較してＴＬＲ９活性を有意に増強した。５’非回文構造部分および３’回文構造部分の両方における半柔軟性配列の組みこみ（ＯＤＮ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９５）によって、ちょうど３’回文構造部分での半柔軟性配列の組みこみ（ＯＤＮ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５１）に比較して増大したＴＬＲ９活性が得られた。
【０４０７】
表１０．半柔軟性ＣクラスオリゴヌクレオチドによるＴＬＲ９刺激
【０４０８】
【表１１】
0005414961.tif 000061
【０４０９】
半柔軟性Ｃクラスオリゴヌクレオチドは、ヒトＰＢＭＣによるＩＦＮαを誘導する能力を保持しているだけでなく、低濃度でも有意に強力である。増強された力価は、５’非回文構造部分において半柔軟性配列を含んだそれらのＣクラスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５５およびＯＤＮ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９５）において最
も顕著であった。ＯＤＮ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９５をＥＬＩＳＡによって評価して、これらの３つの半柔軟性オリゴヌクレオチドのうち完全に安定化された形態であって、ＩＦＮ−αの強力なＣクラスオリゴヌクレオチド誘導因子であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２と比較した。結果を表１１に示す。
【０４１０】
表１１．Ｃクラスオリゴヌクレオチドの半柔軟性バージョンによるＩＦＮ−α誘導（ｐｇ／ｍＬ）
【０４１１】
【表１２】
0005414961.tif 000062
【０４１２】
実施例１８：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３の生理化学的特徴
方法：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３の粉末Ｘ線回折によって、非晶相の特徴であるハロー（ｈａｌｏ）が示された。水蒸気収着解析によって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３が高度に吸湿性であることが示された。薬物が湿度を交換する傾向によって、環境の湿度に依存して湿度の量が変化し得る。この化合物は、高い水溶性（＞１００ｍｇ／ｍＬ）を示し、従って、使用されるｐＨ範囲にわたって十分な溶解度を有する。上昇した温度でのこの薬物の水溶液の解析によって、この薬物は軽度に酸性から酸性の環境で急速に分解するが、ｐＨ６を超える緩衝化溶液は十分な溶液安定性を有すると思われることが示される。
【０４１３】
結果：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３は、実質的に非結晶性であって高度に吸湿性であることが見出された。この化合物は高い水溶性を示し（＞１００ｍｇ／ｍＬ）、従って使用されるｐＨ範囲にわたって十分な溶解度を有する。ＯＤＮは軽度に酸性から酸性の環境で急速に分解する。ｐＨ６を超える緩衝化溶液は十分な溶液安定性を有すると思われる。
【０４１４】
実施例１９：インビトロでのＴＬＲ９でトランスフェクトされた細胞の刺激
方法：
ヒトＴＬＲ９でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９を用いて１６時間インキュベートさせた。ルシフェラーゼ読み取りによってシグナルを決定した。
【０４１５】
結果
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９に比較して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３は、標的レセプターＴＬＲ９のさらに強力な刺激因子であった。
【０４１６】
実施例２０：インビトロでのヒト免疫細胞の刺激
方法：
６人のドナー由来のヒト末梢血単核球をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９を用いて２４時間または４８時間インキュベートさせた。サイトカインの分泌を測定した。
【０４１７】
結果
この結果を図２３に示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９に比較して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３は、ＴＬＲ９関連サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮαおよびＩＰ−１０の誘導因子として、増大するか、または少なくとも同様の有効性および／または効力を示した。
【０４１８】
実施例２１：インビトロでのマウス脾臓細胞の刺激
方法：
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）脾臓細胞をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９とともに４８時間インキュベートした。サイトカインおよびＩＰ−１０の分泌を測定した。
【０４１９】
結果
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９に比較して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３は、サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＦＮα、ＴＮＦαおよびＩＰ−１０の誘導因子として、増大するか、または少なくとも同様の有効性および／または力価を示した。データを図２４に示す。このデータによって、マウス免疫細胞でのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３の活性はヒト細胞（上記）での活性に匹敵すること、およびＴＬＲ９を介した活性化と同様に一致することが示される。
【０４２０】
実施例２２：インビボでのマウスにおけるサイトカイン遺伝子誘導
方法：
この研究によって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３を気道へ投与した後のマウス肺におけるサイトカインの発現を評価した。腎臓曝露を検討するため、この器官における同じサイトカインの誘導（実施例１０および２１に記載される）をまた評価した。マウス（雄性、ＢＡＬＢ／ｃ）に、経鼻滴下またはボーラス静脈内注射のいずれかによってＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：３１３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９を投与した（各々１ｍｇ／ｋｇ）。肺および腎臓を投与後８時間または１５時間で取り出した。ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡの標的フラグメントを増幅してリアルタイムＰＣＲ（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ検出法を用いるＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）によって検出した。ＲｏｃｈｅのＬＣ  ＰＲＯＢＥ  ＤＥＳＩＧＮソフトウェア（Ｒｏｃｈｅカタログ番号３１３９１７４のバージョン１．０）を用いてＧＡＰＤＨ、ＩＦＮγ、ＩＬ−６、ＩＰ−１０およびＴＮＦαのためのプライマーを設計した。ＩＦＮαのためのプライマーをＰＲＩＭＥＲ
３ソフトウェアを用いて設計した。収率をコントロール遺伝子（ＧＡＰＤＨ）発現の比として正規化した。
【０４２１】
結果
気道への投与の後、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３は肺においてＴＬＲ９関連遺伝子（ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、およびＩＰ−１０）の発現を誘導した。結果を図２５に示す。しかし、ＩＰ−１０の発現によって、これらの遺伝子は、この経路によって投与されたマウスの腎臓では発現されなかった。ＩＰ−１０は代表的にインターフェロンによって誘導されるので、このケモカインの発現は、インターフェロンの肺から全身循環への分泌の結果として間接的に生じ得る。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３が静脈内に投与された後、これらの遺伝子の各々はＩＦＮγを除いて、腎臓で誘導された。従って、気道への投与後のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３の腎臓への影響の欠失は、低い前身暴露に起因する可能性が高かった。
【０４２２】
ＣｐＧ  ＯＤＮは、多数の機構を通じて腎臓への影響を生じ得る。ＴＬＲ９依存性機構によって生じる急性の腎臓肉芽腫性炎症は、ある程度のＣｐＧ  ＯＤＮに対する全身曝露
後に観察されている。本発明者らの結果によって、気道に投与されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３への全身曝露が腎臓においてＴＬＲ９関連遺伝子を直接誘導するのに十分でないということが示唆される。
【０４２３】
実施例２３：インビボでのマウスにおける抗原誘導性リンパ節発達に対する影響
方法：
本研究によって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３がマウスの排出リンパ節におけるＴｈ２型応答から離れて免疫偏移を誘導する能力を検討した。マウス（雄性、ＢＡＬＢ／ｃ）を、抗原（オボアルブミン、１００μｇ）を含む完全フロイントアジュバントを用いて右後足蹠への注射によって感作させた。マウスに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３またはＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：３２９（１．５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（生理食塩水）を用いて同じ足蹠に同時に注射した。足蹠注射後６日で、排出膝窩リンパ節を取り出した。Ｔ細胞（ＣＤ３＋）およびＢ細胞（Ｂ２２０＋）をフローサイトメトリーによってカウントした。エキソビボ抗原想起アッセイ（ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃａｌｌ  ａｓｓａｙ）を、オボアルブミン（１００μｇ／ｍｌ）または希釈物のいずれかを含む、２２０μｌの培地ＲＰＭＩ
１６４０＋１０％ウシ胎仔血清中で、１×１０６個の細胞（排出膝窩リンパ節から）をインキュベートして、行なった。３６時間の培養後に、培地を取り出して、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの濃度を、ＬＩＮＣＯ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．１４  ｒｅｓｅａｒｃｈＰａｒｋ  Ｄｒｉｖｅ，ｓｔ  ｃｈａｒｌｅｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  ６３３０４のキットを用いて測定して、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスシステム（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，１２２１２  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ  ７８７２７〜６１１５）で解析した。
【０４２４】
結果
（膝窩リンパ節における細胞数）感作によって、排出膝窩リンパ節におけるＴ細胞およびＢ細胞の蓄積が生じた。これらの抗原誘導性蓄積は、これもＣｐＧ  ＯＤＮを受けたマウスにおいてさらに有意に増大はされなかった。しかし、未感作のマウスに対する各々のＣｐＧ  ＯＤＮのみの注射でＴ細胞およびＢ細胞の両方の蓄積を生じた。このデータを図２６に示す。
【０４２５】
（抗原想起アッセイ）抗原感作したマウスから採取した排出リンパ節細胞は、エキソビボで抗原を用いて再刺激した場合、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮγを分泌した。これもＣｐＧ  ＯＤＮを投与された感作されたマウスでは、Ｔｈ２型のサイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０の分泌は低下したが、Ｔｈ１型のサイトカインＩＦＮγの分泌は増大した。図２７に示す本発明者らのデータによって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９と同様に抗原感作に対するＴｈ２応答を抑制するという仮説が支持される。結果は平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝９〜１０）である。＊Ｐ＜０．０５は、感作された、ビヒクル処置群と比較（クラスカル・ワリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）多重比較検定）。
【０４２６】
実施例２４：インビボでのマウスにおける抗原誘導性ＩｇＥ産生に対する影響
方法：
水酸化アルミニウムアジュバントとともに抗原（オボアルブミン、１００μｇ、ｉ．ｐ．）を用いて研究の０日および７日にマウス（雄性ＢＡＬＢ／ｃ）を感作した。各々の感作の２日前および各々の感作の日に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３（０．１５または１．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７（１．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）をマウスに投与した。血清を研究の１８日目に収集した。抗原（オボアルブミン）特異的ＩｇＥおよびＩｇＧ２ａの力価をＥＬＩＳＡによって測定した。プロトコールのまとめを表１２に示す。
【０４２７】
【表１３】
0005414961.tif 000063
【０４２８】
結果
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９を用いて処置したマウスでは、抗原特異的ＩｇＥの産生は完全に予防された。対照的に、ＩｇＧ２ａの産生は増大した。ＩｇＥおよびＩｇＧ２ａの産生は、それぞれＴｈ２型およびＴｈ１型の応答の特徴であるので、この影響は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３が抗原感作に対するＴｈ２型応答を抑制し得るというさらなる証拠である。あるいは、ＣｐＧ  ＯＤＮはＴ−β発現およびＢ細胞におけるＩｇＥからのクラス切り替えを直接誘導し得る。このデータを図２８に示す。結果は平均±ｓ．ｅ．ｍ．である（ｎ＝１０〜１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９群についての５を除いて）。＊Ｐ＜０．０５は、感作された、ビヒクル処置群と比較（クラスカル・ワリス多重比較検定）。
【０４２９】
実施例２５：インビボでのマウスにおける抗原誘導性気道炎症に対する効果
方法：
水酸化アルミニウムアジュバントとともに抗原（オボアルブミン、１００μｇ、ｉ．ｐ．）を用いて研究の０日および７日にマウス（雄性ＢＡＬＢ／ｃ）を感作した。２週間連続して各週２回、吸入オボアルブミンエアロゾルに対する曝露によってマウスを抗原チャレンジした。１回目のチャレンジは２１日目であった。第一回の抗原チャレンジの週の２日前に、各週に１回、経鼻的滴下によって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３（０．１〜１０００μｇ／ｋｇ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９（１〜１０００μｇ／ｋｇ）またはビヒクル（生理食塩水、２０μｌ）を気道に投与した。最後の抗原チャレンジの４８時間後に終点を評価した。気管支肺胞洗浄によって気道の細胞を回収して、示差的な細胞カウントを行なった。肺組織における好酸球の数（好酸球密度）および肺組織における粘膜分泌（ＰＡＳ染色）を組織病理学的評価によって決定した。そのプロトコールを表１３にまとめる。
【０４３０】
【表１４】
0005414961.tif 000064
【０４３１】
結果
抗原チャレンジは、気道の管腔において、白血球主に好酸球の総数の増大を生じた。データを図２９に示す。好酸球は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９によって用量に関連した様式で有意に抑制された。好酸球に対するＥＤ５０値は：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３：２３μｇ／ｋｇ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９：４７μｇ／ｋｇであった。チャレンジはまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３によって有意に抑制されたＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞）の蓄積を生じた。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３はまた、肺組織における抗原誘導性好酸球蓄積および上皮粘液分泌を有意に抑制した。図２９の結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である（ｎ＝１５）。＊Ｐ＜０．０５は、チャレンジされた、ビヒクル処置群との比較（クラスカル・ワリス多重比較検定）。図３０の結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である（ｎ＝６）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１は、チャレンジされた、ビヒクル処置群との比較（ＡＮＯＶＡ、ダネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）多重比較検定）。
【０４３２】
実施例２６：インビボでのマウスにおける抗原誘導性気道反応性亢進に対する効果
方法：
水酸化アルミニウムアジュバントとともに抗原（オボアルブミン、１００μｇ、ｉ．ｐ．）を用いて研究の０日および７日にマウス（雄性ＢＡＬＢ／ｃ）を感作した。２週間連続して各週２回、吸入オボアルブミンエアロゾルに対する曝露によってマウスを抗原チャレンジした。１回目のチャレンジは１９日目であった。第一回の抗原チャレンジの週の２日前に、各週に１回、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３（１０〜１０００μｇ／ｋｇ）、またはビヒクル（生理食塩水、２０μｌ）を経鼻的に投与した。静脈内メタコリンに対する気管狭窄（気道抵抗性の増大）を測定することによって最後の抗原チャレンジの２４時間後に気道反応性亢進を評価した。各動物について、メタコリンに対する用量応答曲線を得て、気道反応性を曲線下面積として定量した。そのプロトコールを表１４にまとめる。
【０４３３】
【表１５】
0005414961.tif 000065
【０４３４】
結果
抗原チャレンジは、気道の反応性亢進を生じた。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３は、用量に関連した様式で抗原誘導性の気道反応亢進性の発達を抑制した。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３（１０００μｇ／ｋｇ）の効果を示すメタコリンに対するサンプルの用量応答曲線としてデータを図３１および３２に示す。メタコリンに対する用量応答曲線を曲線下面積として定量する。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である（ｎ＝６〜８）。＊Ｐ＜０．０５は、チャレンジされた、ビヒクル処置群との比較（クラスカル・ワリス多重比較検定）。
【０４３５】
抗原チャレンジされ、ビヒクルで処置されたマウスと、抗原チャレンジされて、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：３１３で処置されたそれぞれのマウスの各々との間の完全な用量応答（Ｒ
Ｌ）曲線の解析を、反復測定ＭＡＮＯＶＡを用いて行なった。１００μｇ／ｋｇと１０００μｇ／ｋｇのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３を用いた処置群の用量応答曲線の間には有意な相違（Ｐ＜０．０５）が存在したが、抗原チャレンジして、ビヒクルで処置されたマウスと、同様に処置された、１０μｇ／ｋｇのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３を投与された動物との間に有意な相違はなかった。
【０４３６】
実施例２７：ラットにおけるインビボの薬物動態（ＰＫ）研究
ラットにおいてＰＫ研究を行なって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３に対して塩基配列において同一である完全にホスホチオエートのＯＤＮであるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９よりもはやい速度で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３、「半柔軟性（ｓｅｍｉ−ｓｏｆｔ）」ＯＤＮが、血漿および組織から、詳細には腎臓から排除されるか否かを決定した。
【０４３７】
方法
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９の５ｍｇ／ｋｇ（ＩＶおよびＩＴの両方について）を静脈内（ＩＶ）および気管内（ＩＴ）経路によって、５６匹のラットに投与した。血漿、肺、腎臓を収集した。研究は５日間続続け、１用量群あたり１４の時点を用いた。ＩＶ群（総計＝４２匹）については１時点あたり３匹のラット、そしてＩＴ群については１時点あたり４匹のラットを用いた。
【０４３８】
結果
図３３は、５ｍｇ／ｋｇのＩＶおよびＩＴ投与後のラット血漿におけるＯＤＮ濃度を示す。血漿データによって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３は、ＩＶおよびＩＴの両方の投与後のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９に比較して血漿からさらに急速に排除されることが示される。
【０４３９】
図３４は、５ｍｇ／ｋｇのＩＶおよびＩＴ投与後のラット肺におけるＯＤＮ濃度を示す。同じ用量レベルでのＩＶ投与後に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３の肺濃度は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９の濃度よりも低い。ＩＴ投与後の相違はそれほど顕著でない。ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：３２９についての肺データは投与後４８時間までしか利用できない。
【０４４０】
図３５は、５ｍｇ／ｋｇのＩＶおよびＩＴ投与後のラット腎臓におけるＯＤＮ濃度を示す。この腎臓データによって、腎臓におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３の絶対的レベルが、ＩＶ投与およびＩＴ投与の両方の後の対応するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９濃度よりも低いことが示される。詳細にはＩＴ投与後のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３に対する腎臓曝露は、同じ用量レベルのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９に対する曝露に比較して顕著に低下する。これは、図３６および３７においてさらに明確に示され得る。
【０４４１】
図３６は、５ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与後のラット腎臓におけるＯＤＮ濃度を示す。図３７は、５ｍｇ／ｋｇのＩＴ投与後のラット腎臓におけるＯＤＮ濃度を示す。ＩＴ投与後、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９の両方は、投与後１時間まで腎臓において定量の下限（０．４〜０．６μｇ／ｇ）より低い。１時間後、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９は、研究期間（４８時間）の間収集された全ての腎臓サンプルにおいて検出され得る。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３は一方で、投与後７時間まで測定可能なレベルでのみ存在する。
【０４４２】
表１５．５ｍｇ／ｋｇの投与レベルでのラットへのＩＶ投与およびＩＴ投与後のＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：３１３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９についての平均ＰＫパラメーターのまとめ
【０４４３】
【表１６】
0005414961.tif 000066
【０４４４】
ｎａ−適用不能
ｎｃ−算出不能。研究期間の間には到達しない終末相または終末排出相においてデータポイントが不十分であることに起因して正確に推定できない。
＊−４８時間前最終測定可能濃度の場合の、ＡＵＣ０−４８ｈまたはＡＵＣ０−ＬＡＳＴ。
＊＊−極めて近似的な推定値（終末相における２つのデータポイントのみに基づく）。
１０−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３
１７−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９
表１６（ａ）−（ｃ）：５ｍｇ／ｋｇの投与レベルでのラットに対するＩＴおよびＩＶ投与後のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９に対する全身的および組織曝露。
【０４４５】
【表１７】
0005414961.tif 000067
【０４４６】
【表１８】
0005414961.tif 000068
【０４４７】
静脈（ＩＶ）経路または気管内（ＩＴ）経路のいずれかによる２つのＯＤＮの投与後、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３の全身的および腎臓の曝露は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９に対する曝露よりもかなり低いことが見出された。
【０４４８】
５ｍｇ／ｋｇのＩＴ投与後のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３についての血漿ＡＵＣは２．７ｈｒ・μｇ／ｍｌであった。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９についての対応する値は９．０ｈｒ・μｇ／ｍｌであった。従って、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３に対する全身曝露は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９でみられた全身曝露の３分の１である。
【０４４９】
５ｍｇ／ｋｇのＩＴ投与後のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３についての腎臓ＡＵＣは２．３５ｈｒ．μｇ／ｍｌであった。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９についての対応する値は１３４ｈｒ．μｇ／ｍｌであった。従って、同じ用量レベルについて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３に対する腎臓曝露は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９でみられた曝露のわずか約２％である。
【０４５０】
血漿および腎臓での場合と異なり、ＩＴ投与後のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３に対する肺曝露は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９に対する暴露に比較した場合のような大きい程度まで低下された。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３についての肺ＡＵＣは、同じ用量レベルでＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９について肺ＡＵＣのほぼ７０〜８０％であった。肺は標的組織であるので、肺からのＯＤＮの排出は血漿および腎臓から同じ程度まで増大されないことが有利である。
【０４５１】
図３８は、５ｍｇ／ｋｇのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３のＩＶ投与後のラット腎臓におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３およびその８マーの代謝物（単数または複数）の濃度を示す。
【０４５２】
図３９は、５ｍｇ／ｋｇのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３のＩＴ投与後のラット腎臓におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３およびその８マーの代謝物（単数または複数）の濃度を示す。方法論的な問題点に起因して、血漿および組織におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３の８マー代謝物についてのデータは不完全である。しかし、８−マーデータは、ＩＶのいくつかおよびＩＴ腎臓サンプルの全てについて利用可能である。このデータによって、８マー濃度が首尾よく測定されている腎臓サンプルのほとんどにおいて、代謝物のレベルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３のレベルを超えることが示され、このことによってエンドヌクレアーゼ活性は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３についての代謝物の重要な経路であることが示される。
【０４５３】
完全にホスホロチオエートの骨格（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９）への多数のホスホロチオエート連結の導入（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３）によって、ＯＤＮの分解速度の増大があって、詳細には腎臓からさらに急速な排出を生じると考えられる。
【０４５４】
実施例２８：完全にホスホロチオエートのＯＤＮと比較した半柔軟性ＯＤＮを用いるＴＬＲ９の活性化
方法
ヒトＴＬＲ９を発現する安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は前に記載さ
れた［Ｂａｕｅｒら；ＰＮＡＳ；２００１］。要するに、ＨＥＫ２９３細胞を、ヒトＴＬＲ９および６×ＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポータープラスミドを発現するベクターを用いたエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。安定なトランスフェクト体（３×１０４細胞／ウェル）を、加湿されたインキュベーター中において３７℃で１６時間ＯＤＮと共にインキュベートした。各々のデータポイントを三連で行なった。細胞を溶解して、ルシフェラーゼ遺伝子活性について（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｕｅｂｅｒｌｉｎｇｅｎ，ＧｅｒｍａｎｙのＢｒｉｇｈｔｌｉｔｅキットを用いて）アッセイした。ＯＤＮの添加なしに培地のレポーター遺伝子活性に関して、刺激指数を算出した。
【０４５５】
結果
最適の免疫刺激性ＣｐＧ配列を含むＯＤＮによって、ＴＬＲ９は容易に活性化される。本発明者らは、半柔軟性ＯＤＮのパネル、および半柔軟性のＯＤＮと同じＯＤＮ配列を有する完全にホスホロチオエートＯＤＮのパネルを用いて、ヒトＴＬＲ９を安定に発現するヒトＴＬＲ９細胞株をインキュベートした。結果を図４０に示す。
【０４５６】
この結果によって、以下の表に示される半柔軟性ＯＤＮの各々である、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、２４１は、それぞれ、完全にホスホロチオエートの骨格を有する同じ配列ＯＤＮ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７７、３７９、３８１、３８３、３８５および２４２よりも高いレベルのＴＬＲ９を活性化したことが実証される。
【０４５７】
【表１９】
0005414961.tif 000069
【０４５８】
【表２０】
0005414961.tif 000070
【０４５９】
実施例２９：半柔軟性オリゴヌクレオチドにおけるホスホジエステル様連結としてのＲｐヌクレオチド間連結
方法
細胞培養条件および試薬
Ｂ細胞増殖アッセイのために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜１８週齢）由来の脾臓細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート中でＲＰＭＩ中において、２〜５×１０５〜１０６細胞／ｍｌで４４時間培養して、次いで回収の前に１μＣｉの３Ｈチミジンで４〜６時間パルスして、前に記載されたように（Ｋｒｉｅｇら、１９９５）シンチレーションカウ
ンティングによってｃｐｍを決定した。ウェスタンブロットのために、ＷＥＨＩ−２３１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で３７℃で培養して、１０％熱不活性化ＦＣＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、１．５ｍＭ  Ｌグルタミン、５０μＭ  ２−ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で維持した。
【０４６０】
オリゴヌクレオチド
オリゴデオキシヌクレオチド（ＰＯ−オリゴ）およびステレオ−ランダム（ｓｔｅｒｅｏ−ｒａｎｄｏｍ）オリゴ（デオキシヌクレオシドホスホロチオエート）［Ｍｉｘ−ＰＳ］−オリゴは、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）から購入して、標準的ホスホラミダイト法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，１９８５）（Ｓｔｅｃら，１９８４）によって調製した。オリゴヌクレオチド［Ｍｉｘ−ＰＳ］−ｄ（ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ）（［Ｍｉｘ−ＰＳ］−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８６）を陽性コントロールとして用いた。なぜなら、これは、マウス細胞に対して強力な免疫刺激性効果を有することが以前に見出されているからである（Ｙｉら、１９９６）。最小の刺激モチーフを有するＣｐＧ  ＰＳ−オリゴについては、ＣｐＧ  ＤＮＡの広範なファミリーに代表的な広範な免疫刺激効果を有する代表的なＣｐＧモチーフとして、研究のために配列ＰＳ−ｄ（ＴＣＡＡＣＧＴＴ）−２０６６を選択した。この配列は、ステレオ−ランダムな骨格で作成された場合［Ｍｉｘ−ＰＳ］−２０６６と呼ばれた。この八量体配列が完全または部分的に立体規定された骨格で作製された場合、ＰＳ−オリゴは、［Ａｌｌ−Ｒｐ−ＰＳ］−２０６６と呼ばれるか、もしくはこの全体的骨格が立体規定される場合［Ａｌｌ−Ｓｐ−ＰＳ］−２０６６と呼ばれ、またはＣｐＧジヌクレオチドが立体規定された場合、［ＣＧ−Ｒｐ−ＰＳ］−２０６６もしくは［ＣＧ−Ｓｐ−ＰＳ］−２０６６と呼ばれる。用いられる他のＰＳ−オリゴは、ＣｐＧ  ＰＳ−ｄ（ＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡ）（［Ｍｉｘ−ＰＳ］−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８７）およびそのＡｌｌ−Ｒｐ−およびＡｌｌ−Ｓｐ−ステレオ−規定対応物、ならびにコントロールの非ＣｐＧ  ＰＳ−ｄ（ＴＣＡＡＧＣＴＴＧＡ）［Ｍｉｘ−ＰＳ］−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８８を含んだ。
【０４６１】
立体規定されたホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは、記載された（Ｓｔｅｃら、１９９５）（Ｓｔｅｃら、１９９８）ようなオキサチアホスホラン（ｏｘａｔｈｉａｐｈｏｓｐｈｏｌａｎｅ）法によって調製された。この合成は手動で行なった。３’末端から最初のヌクレオシド単位を、ＤＢＵ耐性サルコシニルリンカーによって固体支持体に結合させた（Ｂｒｏｗｎら、１９８９）。３’−Ｏ−（２−チオ−「ｓｐｉｒｏ」−４，４−ペンタメチレン−１，３，２−オキサチアホスホラン）部分を保有する適切に保護されたデオキシヌクレオシジルモノマーを合成して、クロマトグラフィー的に純粋なＰ−ジアステレオマーに分離した。［ＣＧ−Ｒｐ−ＰＳ］−２０６６および［ＣＧ−Ｓｐ−ＰＳ］−２０６６の合成のために、両方のＰ−ジアステレオマーの未分離の混合物（Ｒｐ：Ｓｐ比が約１：１）（Ｓｔｅｃら、１９９８）をＰ原子のランダムな構成のヌクレオチド間連結のアセンブリのために用いた。２工程のＲＰ−ＨＰＬＣ：ＤＭＴ−ｏｎ（２３〜２４分におよぶ保持時間）およびＤＭＴ−ｏｆｆ（保持時間１４〜１６分）；クロマトグラフィーシステム：ＯＤＳ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  カラム、５μｍ、２４０×４．６ｍｍ、０〜４０％  ＣＨ３ＣＮを含む０．１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７．５、勾配１％／分によって、全ての合成されたオリゴマーを精製した。それらの純度をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって評価した。
【０４６２】
ＰＳ−オリゴ取り込みの研究のために、フルオレセイン結合体化立体規則性ＰＳ−オリゴを手動で合成した立体規定ＰＳオリゴマーの固相伸長化によって調製した。脱トリチル化工程後に、フルオレセインホスホラミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ；作業濃度１２５ｍｇ／ｍＬ）および１−Ｈ−テトラゾールを慣用的に添加して（カップリング時間１２０ｓ）、続いて、Ｓ−Ｔｅｔｒａ試薬を用いる硫化を続けた（Ｓｔｅｃら、１９９３）。濃水酸化アンモニウムを用いて、それぞれ室温で１時間および５５℃で４時間、支持体からの切断および脱保護を行なった。得られたオリゴマーを、１工程ＲＰ−ＨＰＬＣ（上記参照）によって精製した。フルオレセイン部分の顕著な疎水性のせいで、Ｒｐ−およびＳｐ−オリゴマーは、それぞれ、１４．５、１４．８および１４．７、１５．０分の保持時間で、すなわち失敗した配列の終わりに、溶出された。両方の場合とも、２つのＰ−ジアステレオマーは、フルオレセインモノマーを用いた伸長のホスホラミダイト／硫化法の非立体特異性に起因して溶出された。
【０４６３】
ウエスタンブロット解析
細胞を回収して、２＊１０６細胞／ｍｌの濃度で新鮮な培地に再懸濁した。細胞を４０分の刺激の前に４時間休止させた。細胞を回収して冷ＰＢＳを用いて３回洗浄した。細胞を０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、０．００１Ｍ  Ｎａ３  ＶＯ４、０．０１Ｍ  ＮａＦ、４．３ｍｇ／ｍｌ  β−グリセロホスフェート、０．００２Ｍ  ＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦ、１２．５μｇ／ｍｌアンチパイン、１２．５μｇ／ｍｌアプロチニン、１２．５μｇ／ｍｌロイペプチン、１．２５μｇ／ｍｌペプスタチン、１９μｇ／ｍｌ  ベスタチン、１０μｇ／ｍｌホスホラミドン、１２．５μｇ／ｍｌトリプシンインヒビターに溶解して、凍結融解して、続いて氷上で３０分インキュベーションした。次いで、サンプルを４℃で１０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清をさらなる解析のための全細胞溶解物として保存した。等量の全細胞溶解物（２０μｇ）をＳＤＳサンプル緩衝液中で５分間煮沸して、その後に１１％変性ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動に供した。電気泳動後に、半乾燥吸い取り紙（Ｓｅｍｉ−ｄｒｙ  ｂｌｏｔｔｅｒ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いてタンパク質をニトロセルロース膜に移した。ホスホ−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ＩκＢ−αおよびＪＮＫ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）とのハイブリダイゼーションの前に５％脱脂乳を用いてブロットをブロックした。製造業者のプロトコールに従って、増感化学発光試薬（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いてブロットを可視化した。
【０４６４】
結果
ＣｐＧ  ＰＳオリゴのＳｐステレオアイソマーによる脾臓細胞３Ｈチミジン取り込みの誘導。ＣｐＧ  ＤＮＡの免疫刺激性効果の立体特異性を決定するために、ＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞を、全てのヌクレオチド間連結が表１７に示される濃度でＲｐまたはＳｐ構成のいずれかである立体規定オクタヌクレオチドＰＳ−ｄ（ＴＣＡＡＣＧＴＴ）−２０６６とともに培養した。この細胞を４８時間培養して、これによってＢ細胞を十分な時間誘導してＣｐＧモチーフによる増殖を可能にさせる（Ｋｒｉｅｇら、１９９５）。ＣｐＧモチーフを保有するステレオ−ランダム［Ｍｉｘ−ＰＳ］−２０６６は、強力な用量依存性の脾臓細胞増殖を誘導した（表１７）。Ｓｐアイソマーはまた、増殖を誘導して、［Ｍｉｘ−ＰＳ］−２０６６よりもわずかに強力であると考えられた。対照的に、Ｒｐステレオアイソマーは、なんら検出可能な増殖を誘導せず、これはＹｕら（Ｙｕら、２０００）の知見と一致した。
【０４６５】
表１７．ＣｐＧ八量体のＳｐステレオアイソマーによる脾臓細胞増殖の誘導
【０４６６】
【表２１】
0005414961.tif 000071
【０４６７】
ＳＩ＝培地コントロールに比較した刺激指数
１２つのＰＳオリゴの各々を培養の開始時点で、示した濃度に添加した。
【０４６８】
本発明者らの以前の研究では、十量体ＣｐＧ  ＰＳ−オリゴは最初の実験において用いられる八量体に比較して改善された免疫刺激効果を有することが実証されていた。従って、ステレオ−ランダム［Ｍｉｘ−ＰＳ］−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８７として、またはＡｌｌ−Ｒｐ−もしくはＡｌｌ−Ｓｐ−型として合成された、構築物ＰＳ−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８７を用いてこれらの実験を繰り返した。ここでも、［Ｍｉｘ−ＰＳ］−ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：３８７および［Ａｌｌ−Ｓｐ−ＰＳ］−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８７の両方が、用量依存性の様式で強力な３Ｈチミジン取り込みを誘導した。しかし、この場合、［Ａｌｌ−Ｒｐ−ＰＳ］−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８７はまた、最高濃度で細胞増殖の実質的な増大を誘導することが可能であって、このことはこれが少なくとも部分的な刺激活性を保持していたことを示す。
【０４６９】
（八量体ＰＳオリゴにおけるＣｐＧジヌクレオチドでのＲｐ鏡像異性の優先度）最初の実験でのＳｐステレオアイソマーのための明確な優先度がＣＧジヌクレオチド自体の中の効果から生じたか、またはこの効果がＣＧの外側であり得るかは依然として明らかではなかった。これを決定するために、骨格が中央のＣＧの間での連結について以外はステレオ−ランダムであって、ＳｐまたはＲｐのいずれかとして規定された、２つの八量体ＰＳ−２０６６を合成した。驚くべき事に、この実験によってＰＳオリゴを用いるものから反対の結果が得られるようであり、ここでは全体の骨格が立体規則的であった。なぜなら、［ＣＧ−Ｒｐ−ＰＳ］−２００６は、コントロールのステレオランダムＰＳ−オリゴと同じ脾臓細胞３Ｈチミジン取り込みにおける強力な増大を生じたからである。対照的に、ＰＳ−オリゴ［ＣＧ−Ｓｐ−ＰＳ］−２０６６は本質的に不活性であった。
【０４７０】
（ＣｐＧ  ＰＳ−オリゴのＲステレオアイソマーによる脾臓細胞３Ｈチミジン取り込みの阻害）Ｒｐステレオアイソマーを用いて処置したウェルにおける３Ｈチミジン取り込みのレベルは、コントロールウェルよりも低かった。このことは潜在的な阻害活性を示唆するが、細胞の顕微鏡的検査においては細胞傷害性は明白になかった。実際、細胞を［Ｍｉｘ−ＰＳ］−２０６６およびＡｌｌ−Ｒｐステレオアイソマーの等モル混合物とともに培養した場合、［Ｍｉｘ−ＰＳ］−２０６６のみを用いて培養した細胞に比較して３Ｈチミジン取り込みのレベルの約５０％の低下が存在した（表１７）。
【０４７１】
（初期の時点での［Ｒｐ−ＰＳ］−オリゴによる優先的な免疫刺激）前述の実験において行なった３Ｈチミジン取り込みアッセイは、ＰＳ−オリゴ分解から生じるアーチファクトに対して脆弱であり、その取り込みを人為的に抑制する、標識された物質と競合する冷チミジンの遊離を伴う（Ｍａｔｓｏｎら、１９９２）。先の研究によって、［Ｒｐ−ＰＳ］−オリゴは、Ｓｐ対応物よりもヌクレアーゼ分解にかなり感受性であることが実証されている。従って、本発明者らの３Ｈチミジン取り込みアッセイにおける［Ｒｐ−ＰＳ］−オリゴの刺激性効果の明白な欠失は、［Ｒｐ−ＰＳ］−オリゴの真の効果に影響しないという誤った人為現象であったかもしれないという可能性があった。初期の時点で［Ｒｐ−ＰＳ］−オリゴの刺激性効果を検出するために、ＰＳ−オリゴが分解され得る前に、そしてＣｐＧ誘導性刺激のための独立した生物学的アッセイとして、本発明者らは、これらのＰＳ−オリゴが調節性分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼであるＪＮＫの急速なリン酸化を誘導する能力を試験した。驚くべき事に、本発明者らは、ＣｐＧ配列ＰＳ−ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：３８６およびＰＳ−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８７を用いた処置の際、４０分内のＪＮＫリン酸化が強力に、［Ｓｐ−ＰＳ］アイソマーによってではなく、ステレオランダム［Ｍｉｘ−ＰＳ］−によっておよび［Ｒｐ−ＰＳ］アイソマーによってのみ誘導されたことを見出した。コントロールの非ＣｐＧ［Ｍｉｘ−ＰＳ］−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８８は、検出可能なＪＮＫリン酸化を誘導しなかった。全てのサンプルが匹敵する量の総ＪＮＫタンパク質を含んだ。
【０４７２】
ＪＮＫリン酸化アッセイにおいて、ＣｐＧ［Ｓｐ−ＰＳ］−オリゴの効果は検出できなかったが、このオリゴはこの実験では生物学的に活性であった。なぜなら、阻害性タンパク質ＩκＢ−αのレベルは、ステレオアイソマーにかかわらず、全てのＣｐＧ  ＰＳ−オリゴによって低下したが、コントロールの非ＣｐＧ  ＰＳ−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８８によっては低下しなかったからである。
【０４７３】
（ＰＳ−オリゴ細胞表面結合および取り込みの立体−依存性）。ＰＳ−オリゴステレオアイソマーの生物活性において観察された相違に寄与し得る１つの可能性のある説明は、ＰＳ−オリゴの細胞結合または取り込みが、ステレオ依存性であり得るということである。この可能性を試験するために、Ｐ−立体規定したＰＳ−オリゴを、蛍光タグを用いて合成して、細胞とともにインキュベートした。過去の研究の結果と一致して、ＰＳ−オリゴは、細胞取り込みの濃度依存性および温度依存性のパターンを示した。とりわけ、ＲｐまたはＳｐ  ＰＳ−オリゴの結合または取り込みにおいて検出可能な相違はなかった。
【０４７４】
実施例３０：半柔軟性ＣクラスオリゴヌクレオチドＯＤＮ３１６および半柔軟性ＢクラスオリゴヌクレオチドＯＤＮ３１３は、インビボにおいて抗原誘導性の気道炎症を軽減する。
【０４７５】
この研究によって、抗原誘導性気道炎症のマウスモデルにおけるＯＤＮ３１６のインビボ効果を評価した。ＢクラスＯＤＮ３１３を比較のために研究に含んだ。
【０４７６】
方法。水酸化アルミニウムアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ  Ａｌｕｍ）とともに抗原（オ
ボアルブミン、１０μｇ、ｉ．ｐ．）を用いて研究の０日および７日にマウス（雄性ＢＡＬＢ／ｃ）を感作した。
【０４７７】
２週間連続して各週２回、吸入オボアルブミンエアロゾルに対する曝露によってマウスを抗原チャレンジした。１回目のチャレンジは研究の２１日目であった。ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ  Ｕｌｔｒａｎｅｂネブライザーを用いて、オボアルブミン１％を含むＰＢＳ溶液からエアロゾルを１時間生成した。別のマウスを未チャレンジのコントロールとして用いた。
【０４７８】
第一回の抗原チャレンジの週の２日前に、ＯＤＮ３１６またはＯＤＮ３１３（１〜１００μｇ／ｋｇ）またはビヒクル（生理食塩水、２０μｌ）を各週に１回経鼻投与した。
【０４７９】
研究の３３日（すなわち、最後の抗原チャレンジの４８時間後）に終点を評価した。気道の細胞を気管支肺胞洗浄によって回収した。Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ株を用いて染色された細胞遠心分離調製物において細胞を可視的にカウントすることによりチェックしたランダムなサンプルを用いてＡｄｖｉａ自動細胞カウンターによって種々の細胞カウントを行なった。ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞）の数をフローサイトメトリーによってカウントした。結果を各々の群について平均±ＳＥＭとして表した。クラスカル・ワリス多重比較検定を用いて有意差を測定した。
【０４８０】
結果。抗原チャレンジによって、気道管腔における白血球の総数の増大を生じた。この増大は主に好酸球の蓄積に起因した（例えば、抗原チャレンジした、ビヒクル処置したマウスでの３×１０５個の好酸球／ｍｌ対未チャレンジのマウスにおける＜１×１０４個の好酸球／ｍｌ）。ＯＤＮ３１６またはＯＤＮ３１３によって好酸球は有意に抑制された（例えば、抗原チャレンジした、１００μｇ／ｍｌのいずれかのＯＤＮで処置したマウスで約５×１０４個の好酸球／ｍｌ（Ｐ＜０．０５））。
【０４８１】
抗原チャレンジはまた、ＣＤ４＋Ｔ細胞の蓄積を生じ、これはいずれかのＯＤＮによって有意に抑制された（例えば、抗原チャレンジした、１００μｇ／ｍｌのいずれかのＯＤＮで処置したマウスでの約２×１０４個のＣＤ４＋Ｔ細胞／ｍｌ対、抗原チャレンジした、ビヒクル処置したマウスでの約１．３×１０５個のＣＤ４＋Ｔ細胞／ｍｌ（Ｐ＜０．０５））。
【０４８２】
結論。各々の半柔軟性ＣクラスＯＤＮ３１６および半柔軟性ＢクラスオリゴヌクレオチドＯＤＮ３１３は、抗原誘導性気道好酸球およびインビボでのＣＤ４＋Ｔ細胞の蓄積を抑制した。
【０４８３】
実施例３１：半柔軟性Ｂ、ＣおよびＴクラスＯＤＮの比較：インビトロでのマウス脾臓細胞からのサイトカイン分泌の誘導
本研究によって、半柔軟性Ｂ、ＣおよびＴクラスＯＤＮがインビトロでマウス脾臓細胞からのサイトカイン分泌を誘導する能力を検討した。
【０４８４】
方法。ＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓細胞を回収してプールした。４８ウェル培養プレート中で、個々のＯＤＮ（０、０．００１、０．０１、０．１、１または１０μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ  １６４０  １ｍｌ＋１０％ウシ胎仔血清において、１×１０７個の細胞で脾臓細胞をインキュベートした。試験したＯＤＮは、半柔軟性ＢクラスＯＤＮ２０６７４、半柔軟性ＣクラスＯＤＮ３１６およびＯＤＮ３１７、ならびに半柔軟性ＴクラスＯＤＮ３１９およびＯＤＮ３２０を含んだ。
【０４８５】
４８時間のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、培養培地を取り出して、Ｉ
Ｌ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦαの濃度を、Ｌｕｍｉｎｅｘサイトカイン多重システムを用いて測定した。ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＦＮ−αおよびＩＰ−１０の濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。正確な検出可能性の下限は３．２〜１０ｐｇ／ｍｌであった。フローサイトメトリーによってＣＤ３＋およびＢ２２０＋細胞上でＣＤ４０、ＣＤ６９およびＣＤ８６の発現を測定することによって、細胞の活性化状態を評価した。
【０４８６】
結果。各々のＯＤＮは、ＣＤ４０、ＣＤ６９およびＣＤ８６の発現の増大によって測定されるようなＢ細胞（Ｂ２２０＋細胞）の活性化、ならびにＣＤ６９の発現の増大によって測定されるようなＴ細胞（ＣＤ３＋細胞）の活性化を誘導した。
【０４８７】
ＯＤＮは、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＦＮ−α、ＴＦＮ−αおよびＩＰ−１０の分泌を誘導した。測定された他のサイトカインの力価は増大しなかった。例えば、１μｇ／ｍｌのＯＤＮ濃度では、サイトカイン分泌レベルは、以下のとおりであることが見出された（全てｐｇ／ｍｌで表す）：
表１８．半柔軟性Ｂ、ＣおよびＴクラスのＯＤＮに応答するインビトロサイトカイン分泌
【０４８８】
【表２２】
0005414961.tif 000072
【０４８９】
ｎｄ−検出しなかった
半柔軟性ＢクラスＯＤＮ３１３と比較した場合、２つの半柔軟性ＣクラスＯＤＮは、さらに高い力価のＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＦＮ−α、ＴＦＮ−αおよびＩＰ−１０を誘導したが、さらに顕著なＢ細胞活性化は生じなかった。この２つの半柔軟性ＴクラスＯＤＮは、サイトカイン誘導因子として、半柔軟性のＢおよびＣクラスのＯＤＮよりも有効性が劣るようであった。
【０４９０】
結論：各々のＢクラスおよびＣクラスのＯＤＮは、ＴＬＲ９の活性化と一致したサイトカイン誘導のプロフィールを誘導して、各々がＢ細胞の活性化を生じた。ＴクラスのＯＤＮは有効性の劣るサイトカイン誘導因子であった。
【０４９１】
半柔軟性ＢクラスＯＤＮ３１３と比較した場合、半柔軟性ＣクラスＯＤＮ３１６および３１７は各々が、さらに高濃度の免疫修飾サイトカインを誘導したが、さらにＢ細胞活性化を誘導することはなかった。このデータによって、ＣクラスＯＤＮの治療上の利点が示唆される。
【０４９２】
実施例３２：ＣｐＧ  ＯＤＮに対応するインビボでのサイトカイン、抗体およびＣＴＬの誘導
サイトカイン測定：ＢＡＬＢ／ｃマウスに４００ｍｇ  ＯＤＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９４（柔軟性）、２４１（半柔軟性）、２４２、および２８６）をＳＣ注射によって投与した。動物を注射後３時間で採血して、血漿中のＩＰ−１０、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。この結果を示す  この結果を図４１ＡおよびＢ（ＩＰ−１０）、Ｃ（ＩＦＮ）、およびＤおよびＥ（ＴＮＦ）に示す。
【０４９３】
抗体応答：ＩＭ注射によって、１ｍｇ  ＨＢｓＡｇ単独でか、またはＣｐＧ  ＯＤＮと組み合わせて、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。初回免疫後４週間で動物をブースト（追加免疫）した。終点ＥＬＩＳＡによって抗体力価を測定した。終点ＥＬＩＳＡによってブーストの２週後にＩｇＧアイソタイプ力価を測定した。この結果を図４２ＡおよびＢに示す。
【０４９４】
細胞傷害性Ｔリンパ球応答：ＩＭ注射によって、１ｍｇ  ＨＢｓＡｇ単独でか、またはＣｐＧ  ＯＤＮと組み合わせて、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。初回免疫後４週間で動物をブーストした。５１Ｃｒ放出アッセイによってブーストの４週後にＣＴＬ活性を測定した。この結果を図４２Ｃに示す。
【０４９５】
従って、柔軟性および半柔軟性のＯＤＮは、インビトロおよびインビボ研究の両方によって示されるとおり、マウス免疫系を活性化するのにおいて同様であるかまたはそれより良好であり、そして抗原特異的免疫応答を増強し得る。
【０４９６】
実施例３３：インビボでの抗ガン治療におけるＣｐＧ  ＯＤＮの使用
本発明のＯＤＮを、単独療法として３つのガンモデルで有効性について試験した。最初にＯＤＮを腎細胞癌腫（ｒｅｎｃａ）を有するマウスに投与した。この方法は以下のとおり行なった：０日目にマウスの左脇腹に２×１０５個のｒｅｎｃａ細胞をＳＣ注射することによって腫瘍を誘導した。処置には、腫瘍細胞注射後１０日で開始して５週間の間に毎週、ＰＢＳ、ＣｐＧ  ＯＤＮ２４１または２４２の含まれるＳＣ注射を続けた。結果を図４３ＡおよびＢに示す。
【０４９７】
試験した第二のモデルは、マウス非小細胞肺癌（Ｌｅｗｉｓ肺癌腫）であった。２×１０６個のＬｅｗｉｓ肺癌腫細胞を０日目にマウスの左脇腹にＳＣ注射することによって腫瘍を誘導した。処置を続け、これには２ヶ月間、１、３、７日目および毎週にＰＢＳ、１００ｍｇＣｐＧ  ＯＤＮ２４１または２４２のＳＣ注射を含んだ。結果を図４３ＥおよびＦに示す。
【０４９８】
試験した第三のモデルは、マウス神経芽細胞腫であった。１×１０６個のＮｅｕｒｏ２ａ細胞を０日目に左脇腹にＳＣ注射した。ＰＢＳ、１００ｍｇ  ＣｐＧ  ＯＤＮ２４１または２４２のＳＣ注射を１０日から１５日まで毎日行なった。結果を図４３ＣおよびＤに示す。
【０４９９】
従って、半柔軟性ＯＤＮは、ガン（マウスｒｅｎｃａ、ＬＬＣ、神経芽細胞腫）の増殖を制御して、これらのガンを保有するマウスの生存を向上させることができる。
【０５００】
実施例３４：ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＴＬＲ−９ノックアウトマウスにおける柔軟性、半柔軟性および硬性のＯＤＮの投与から得られる腎周囲の炎症
腎周囲の炎症をＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＴＬＲ−９ノックアウトマウスにおいて評価した。結果をそれぞれ表１９および２０に示す。半柔軟性ＯＤＮ（２４１）は、注射の部位で誘導する腎周囲の炎症が少ないか、誘導しないか（１００ｍｇ用量）、またはほとんどなく（２５０ｍｇ用量）、そして複数回のＯＤＮの投与後も良好に耐容された。
【０５０１】
【表２３】
0005414961.tif 000073
【０５０２】
【表２４】
0005414961.tif 000074
【０５０３】
前述の明細書は、当業者が本発明を実施できるために十分であると考えられる。本発明は、示した実施例によって限定されない。なぜなら、この実施例は本発明の１つの局面の単一の例示として意図されており、他の機能的に等価な実施形態は、本発明の範囲内であるからである。本明細書に示され記載されるものに加えて本発明の種々の改変が、前述の説明から当業者に明白であり、そして添付の特許請求の範囲内におさまる。本発明の利点および目的は、本発明の各々の実施形態に包含される必要はない。
【図面の簡単な説明】
【０５０４】
【図１Ａ】図１は、このグラフのＸ軸の上に示した数字によって示されかつ、黒三角によって示されるオリゴヌクレオチド対、黒四角によって示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドに対するヒトＰＢＭＣの曝露後の、このヒトＰＢＭＣから分泌されたインターフェロンαのレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す１セットのグラフである。図１Ａに示される試験オリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２４を含み、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２である。図１Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２７、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２８）であって、陽性コントロールオリゴヌクレオチドは５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９）である。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。このデータは６つのドナーの平均を示す。グラフの下には、陰性コントロール（培地）で処置した細胞によって分泌されるインターフェロンαのレベル（ｐｇ／ｍｌ）を各実験について挙げている。
【図１Ｂ】図１は、このグラフのＸ軸の上に示した数字によって示されかつ、黒三角によって示されるオリゴヌクレオチド対、黒四角によって示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドに対するヒトＰＢＭＣの曝露後の、このヒトＰＢＭＣから分泌されたインターフェロンαのレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す１セットのグラフである。図１Ａに示される試験オリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２４を含み、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２である。図１Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２７、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２８）であって、陽性コントロールオリゴヌクレオチドは５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９）である。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。このデータは６つのドナーの平均を示す。グラフの下には、陰性コントロール（培地）で処置した細胞によって分泌されるインターフェロンαのレベル（ｐｇ／ｍｌ）を各実験について挙げている。
【図２Ａ】図２は、このグラフのＸ軸の上に示した数字によって示されかつ、黒三角によって示されるオリゴヌクレオチド対、黒四角によって示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドに対するヒトＰＢＭＣの曝露後の、このヒトＰＢＭＣから分泌されたＩＬ−１０のレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す１セットのグラフである。図２Ａに示される試験オリゴヌクレオチドは（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２２）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２４を含み、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２である。図２Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２７、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２８を含み、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９である。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。このデータは６つのドナーの平均を示す。グラフの下には、陰性コントロール（培地）で処置した細胞によって分泌されるＩＬ−１０のレベル（ｐｇ／ｍｌ）を各実験について挙げている。
【図２Ｂ】図２は、このグラフのＸ軸の上に示した数字によって示されかつ、黒三角によって示されるオリゴヌクレオチド対、黒四角によって示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドに対するヒトＰＢＭＣの曝露後の、このヒトＰＢＭＣから分泌されたＩＬ−１０のレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す１セットのグラフである。図２Ａに示される試験オリゴヌクレオチドは（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２２）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２４を含み、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２である。図２Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２７、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２８を含み、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９である。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。このデータは６つのドナーの平均を示す。グラフの下には、陰性コントロール（培地）で処置した細胞によって分泌されるＩＬ−１０のレベル（ｐｇ／ｍｌ）を各実験について挙げている。
【図３Ａ】図３は、このグラフのＸ軸の上に示した数字によって示されかつ、黒三角によって示されるオリゴヌクレオチド対、黒四角によって示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドに対するヒトＰＢＭＣの曝露後の、このヒトＰＢＭＣから分泌されたＴＮＦ−αのレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す１セットのグラフである。図３Ａに示される試験オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２４を含み、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９である。図３Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２７、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２８を含み、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９である。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。このデータは６つのドナーの平均を示す。グラフの下には、陰性コントロール（培地）およびＬＰＳで処置した細胞によって分泌されるＴＮＦ−αのレベル（ｐｇ／ｍｌ）を各実験について挙げている。
【図３Ｂ】図３は、このグラフのＸ軸の上に示した数字によって示されかつ、黒三角によって示されるオリゴヌクレオチド対、黒四角によって示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドに対するヒトＰＢＭＣの曝露後の、このヒトＰＢＭＣから分泌されたＴＮＦ−αのレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す１セットのグラフである。図３Ａに示される試験オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２４を含み、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９である。図３Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２７、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２８を含み、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９である。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。このデータは６つのドナーの平均を示す。グラフの下には、陰性コントロール（培地）およびＬＰＳで処置した細胞によって分泌されるＴＮＦ−αのレベル（ｐｇ／ｍｌ）を各実験について挙げている。
【図４Ａ】図４は、このグラフのＸ軸の上に示した数字によって示されかつ、黒三角によって示されるオリゴヌクレオチド対、黒四角によって示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドに対するヒトＰＢＭＣの曝露後の、このヒトＰＢＭＣから分泌されたＩＬ−６のレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す１セットのグラフである。図４Ａに示される試験オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２４を含み、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９である（完全にホスホロチオエートの修飾された骨格を有する）。図４Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２７、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２８を含み、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９である。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。このデータは３つのドナーの平均を示す。グラフの下には、陰性コントロール（培地）およびＬＰＳで処置した細胞によって分泌されるＩＬ−６のレベル（ｐｇ／ｍｌ）を各実験について挙げている。
【図４Ｂ】図４は、このグラフのＸ軸の上に示した数字によって示されかつ、黒三角によって示されるオリゴヌクレオチド対、黒四角によって示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドに対するヒトＰＢＭＣの曝露後の、このヒトＰＢＭＣから分泌されたＩＬ−６のレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す１セットのグラフである。図４Ａに示される試験オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２４を含み、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９である（完全にホスホロチオエートの修飾された骨格を有する）。図４Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２７、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２８を含み、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９である。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。このデータは３つのドナーの平均を示す。グラフの下には、陰性コントロール（培地）およびＬＰＳで処置した細胞によって分泌されるＩＬ−６のレベル（ｐｇ／ｍｌ）を各実験について挙げている。
【図５Ａ】図５は、このグラフのＸ軸の上に示した数字によって示されかつ、黒三角によって示されるオリゴヌクレオチド対、黒四角によって示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドに対するヒトＰＢＭＣの曝露後の、このヒトＰＢＭＣから分泌されたインターフェロンγのレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す１セットのグラフである。図５Ａに示される試験オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２４を含み、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９である。図５Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２７、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２８を含み、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９である。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。このデータは３つのドナーの平均を示す。グラフの下には、陰性コントロール（培地）およびＬＰＳで処置した細胞によって分泌されるインターフェロンγのレベル（ｐｇ／ｍｌ）を各実験について挙げている。
【図５Ｂ】図５は、このグラフのＸ軸の上に示した数字によって示されかつ、黒三角によって示されるオリゴヌクレオチド対、黒四角によって示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドに対するヒトＰＢＭＣの曝露後の、このヒトＰＢＭＣから分泌されたインターフェロンγのレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す１セットのグラフである。図５Ａに示される試験オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２４を含み、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９である。図５Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２７、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２８を含み、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９である。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。このデータは３つのドナーの平均を示す。グラフの下には、陰性コントロール（培地）およびＬＰＳで処置した細胞によって分泌されるインターフェロンγのレベル（ｐｇ／ｍｌ）を各実験について挙げている。
【図６Ａ】図６は、このグラフのＸ軸の上に示した数字によって示されかつ、黒三角によって示されるオリゴヌクレオチド対、黒四角によって示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドに対するＮＫ細胞の曝露後の、ＮＫ細胞活性化の誘導因子としてのＮＫ細胞でのＣＤ６９発現（ＭＦＩ）のレベルを示す１セットのグラフである。図６Ａに示される試験オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２４を含み、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９である。図６Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２７、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２８であって、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９である。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。このデータは３つのドナーの平均を示す。グラフの下には、陰性コントロール（培地）およびＬＰＳで処置したＮＫ細胞でのＣＤ６９発現のレベルを各実験について挙げている。
【図６Ｂ】図６は、このグラフのＸ軸の上に示した数字によって示されかつ、黒三角によって示されるオリゴヌクレオチド対、黒四角によって示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドに対するＮＫ細胞の曝露後の、ＮＫ細胞活性化の誘導因子としてのＮＫ細胞でのＣＤ６９発現（ＭＦＩ）のレベルを示す１セットのグラフである。図６Ａに示される試験オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２４を含み、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９である。図６Ｂに示される試験オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２７、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２８であって、この陽性コントロールオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９である。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。このデータは３つのドナーの平均を示す。グラフの下には、陰性コントロール（培地）およびＬＰＳで処置したＮＫ細胞でのＣＤ６９発現のレベルを各実験について挙げている。
【図７】図７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３および黒四角によって示されるオリゴヌクレオチド対、黒丸によって示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に対するヒトＰＢＭＣの曝露後の、このヒトＰＢＭＣによって産生されたインターフェロンα（ＩＦＮ−α）（７Ａ）およびＩＬ−１０（７Ｂ）のレベルを示す１セットのグラフである。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。
【図８】図８は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１４および黒四角によって示されるオリゴヌクレオチド対、黒丸によって示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に対するヒトＰＢＭＣの曝露後の、このヒトＰＢＭＣによって産生されたインターフェロンα（ＩＦＮ−α）（８Ａ）およびＩＬ−１０（８Ｂ）のレベルを示す１セットのグラフである。陰性コントロールＯＤＮは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３０：ｔｃｃａｇｇａｃｔｔｃｔｃｔｃａｇｇｔｔである。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。
【図９】図９は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１９および黒四角によって示されるオリゴヌクレオチド対、黒丸によって示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に対するヒトＰＢＭＣの曝露後の、このヒトＰＢＭＣによって産生されたインターフェロンα（ＩＦＮ−α）（９Ａ）およびＩＬ−１０（９Ｂ）のレベルを示す１セットのグラフである。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。
【図１０】図１０は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１６および黒四角によって示されるオリゴヌクレオチド対、黒丸によって示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に対するヒトＰＢＭＣの曝露後の、このヒトＰＢＭＣによって産生されたインターフェロンα（ＩＦＮ−α）（１０Ａ）およびＩＬ−１０（１０Ｂ）のレベルを示す１セットのグラフである。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。
【図１１】図１１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１７および黒四角によって示されるオリゴヌクレオチド対、黒丸によって示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に対するヒトＰＢＭＣの曝露後の、このヒトＰＢＭＣによって産生されたインターフェロンα（ＩＦＮ−α）（１１Ａ）およびＩＬ−１０（１１Ｂ）のレベルを示す１セットのグラフである。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。
【図１２】図１２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０および黒四角によって示されるオリゴヌクレオチド対、黒丸によって示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に対するヒトＰＢＭＣの曝露後の、このヒトＰＢＭＣによって産生されたインターフェロンα（ＩＦＮ−α）（１２Ａ）およびＩＬ−１０（１２Ｂ）のレベルを示す１セットのグラフである。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。
【図１３】図１３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３および黒四角によって示されるオリゴヌクレオチド対、黒丸によって示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に対するＢ細胞および単球の曝露後の、このＢ細胞でのＣＤ８６発現（１３Ａ）および単球でのＣＤ８０発現（１３Ｂ）のレベルを示す１セットのグラフである。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。
【図１４】図１４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１４および黒四角によって示されるオリゴヌクレオチド対、黒丸によって示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に対するＢ細胞および単球の曝露後の、このＢ細胞でのＣＤ８６発現（１４Ａ）および単球でのＣＤ８０発現（１４Ｂ）のレベルを示す１セットのグラフである。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。
【図１５】図１５は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１９および黒四角によって示されるオリゴヌクレオチド対、黒丸によって示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に対するＢ細胞および単球の曝露後の、このＢ細胞でのＣＤ８６発現（１５Ａ）および単球でのＣＤ８０発現（１５Ｂ）のレベルを示す１セットのグラフである。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。
【図１６】図１６は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１６に対しておよび陽性コントロールオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２およびオリゴヌクレオチド５’ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＡＣＴ  ＴＣＴ  ＣＴＣ  ＡＧＧ  ＴＴ３’）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３０と比較したＢ細胞および単球の曝露後の、このＢ細胞でのＣＤ８６発現（１６Ａ）および単球でのＣＤ８０発現（１６Ｂ）のレベルを示す１セットのグラフである。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。
【図１７】図１７は、コントロールのオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に比較してオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２１に対する、そしてオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３０に対するヒトＰＢＭＣ細胞の曝露後の、このヒトＰＢＭＣ細胞によって産生されたインターフェロンα（ＩＦＮ−α）（１７Ａ）およびＩＬ−１０（１７Ｂ）のレベルを示す１セットのグラフである。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。
【図１８】図１８は、オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２１に対するそして陽性コントロールのオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に比較して、そしてオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３０に対するＢ細胞または単球の曝露後の、このＢ細胞でのＣＤ８６発現（１８Ａ）および単球でのＣＤ８０発現（１８Ｂ）のレベルを示す１セットのグラフである。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。
【図１９】図１９は、オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１７に対する、そして陽性コントロールのオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に比較した、そしてオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３０に対するＢ細胞または単球の曝露後の、このＢ細胞でのＣＤ８６発現（１９Ａ）および単球でのＣＤ８０発現（１９Ｂ）のレベルを示す１セットのグラフである。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。
【図２０】図２０は、オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０に対する、そして陽性コントロールのオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２に比較した、そしてオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３０に対するＢ細胞または単球の曝露後の、このＢ細胞でのＣＤ８６発現（２０Ａ）および単球でのＣＤ８０発現（２０Ｂ）のレベルを示す１セットのグラフである。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をＸ軸に沿って示す（μＭ）。
【図２１】図２１は、構造的特徴を示す核酸分子の一部の図示であり、これには塩基（Ｂ）、糖、および５’シチジンと３’グアノシンとの間のホスホジエステル連結（輪で示した）および隣接するホスホロチオエート連結を有する骨格を含む。
【図２２】図２２は、マウスへの皮下注射後４８時間の腎臓、脾臓および肝臓におけるホスホロチオエート（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２）、柔軟性（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９４）および半柔軟性（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１）のオリゴヌクレオチドの相対的な組織量を示す棒グラフである。オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１は、同一の塩基配列を有し、その骨格組成において異なる。
【図２３】図２３は、サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮαおよびＩＰ−１０の誘導によるインビトロでのヒト免疫細胞の刺激を示す。
【図２４】図２４は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５またはＧＭ−ＣＳＦの検出可能な分泌のない、ＴＬＲ−９関連サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＦＮα、ＴＮＦαおよびＩＰ−１０の誘導因子として、有効性および／または効力の増大によって、インビトロでのマウス脾臓細胞の刺激を示す。
【図２５Ａ】図２５は、本発明のＯＤＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３）による肺におけるＴＬＲ９関連遺伝子（ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮγおよびＩＰ−１０）の誘導された発現を示す。
【図２５Ｂ−１】図２５は、本発明のＯＤＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３）による肺におけるＴＬＲ９関連遺伝子（ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮγおよびＩＰ−１０）の誘導された発現を示す。
【図２５Ｂ−２】図２５は、本発明のＯＤＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３）による肺におけるＴＬＲ９関連遺伝子（ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮγおよびＩＰ−１０）の誘導された発現を示す。
【図２６】図２６は、インビボでのマウスにおける抗原誘導性リンパ節発達に対するＣｐＧ  ＯＤＮの効果を示す。
【図２７】図２７は、ＣｐＧ  ＯＤＮが抗原感作に対するＴｈ２応答を抑制することを実証する。
【図２８】図２８は、インビボでのマウスにおける抗原誘導性ＩｇＥ産生に対する効果を示す。
【図２９】図２９は、抗原チャレンジが気道管腔において白血球、主に好酸球の総数を増大させたことを示す。
【図３０】図３０および図３２は、抗原チャレンジが気道管腔において白血球、主に好酸球の総数を増大させたこと、そしてこれが本発明のＯＤＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３）によって用量依存性の様式で抑制されたことを示す。
【図３１】図３１は、抗原チャレンジが気道反応性亢進を生じたこと、そしてこれが本発明のＯＤＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３）によって用量依存性の様式で抑制されたことを示す。
【図３２】図３２は、抗原チャレンジが気道反応性亢進を生じたこと、そしてこれが本発明のＯＤＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３）によって用量依存性の様式で抑制されたことを示す。
【図３３】図３３は、５ｍｇ／ｋｇのＩＶおよびＩＴ投与の後のラット血漿におけるＯＤＮ濃度を示す。この血漿データによって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３がＩＶおよびＩＴの両方の投与後ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９に比べて血漿から急速に排出されることを示す。
【図３４】図３４は、５ｍｇ／ｋｇのＩＶおよびＩＴ投与の後のラット肺におけるＯＤＮ濃度を示す。同じ用量レベルでのＩＶ投与後、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３の肺濃度は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９の濃度より低い。ＩＴ投与後の相違は顕著ではない。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９の肺データは投与後４８時間までしか入手できない。
【図３５】図３５は、５ｍｇ／ｋｇのＩＶおよびＩＴ投与の後のラット腎臓におけるＯＤＮ濃度を示す。腎臓のデータによって、腎臓でのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３の絶対的レベルは、ＩＶおよびＩＴの両方の投与後ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９の濃度に相当するレベルよりも低いことが示される。
【０５０５】
ＩＴ投与後のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３に対する腎臓曝露は詳細には、同じ用量レベルのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９に対する曝露に比較して顕著に低下される。
【図３６】図３６は、５ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与後のラット腎臓におけるＯＤＮ濃度を示す。
【図３７】図３７は、５ｍｇ／ｋｇのＩＴ投与後のラット腎臓におけるＯＤＮ濃度を示す。
【図３８】図３８は、５ｍｇ／ｋｇのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３のＩＶ投与後のラット腎臓におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３およびその８マー代謝物（単数または複数）の濃度を示す。
【図３９】図３９は、５ｍｇ／ｋｇのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３のＩＴ投与後のラット腎臓におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３およびその８マー代謝物（単数または複数）の濃度を示す。
【図４０】図４０は、同じ配列を有する完全にホスホロチオエートのＯＤＮと比較した半柔軟性ＯＤＮのセットの刺激指数を示すグラフである。
【図４１】図４１は、柔軟性（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９４）、半柔軟性（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１）および完全にホスホロチオエートの（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２）のＯＤＮの投与に対する応答における、サイトカイン誘導Ａ＆Ｂ（ＩＰ−１０）、Ｃ（ＩＦＮ）およびＤ＆Ｅ（ＴＮＦ）を示す１セットの棒グラフである。
【図４２】図４２は、柔軟性（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９４）、半柔軟性（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１）および完全にホスホロチオエートの（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２）のＯＤＮの投与に対する応答における、抗体および細胞傷害性Ｔリンパ球活性を示す１セットのグラフである。
【図４３】図４３は、半柔軟性（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１）または完全にホスホロチオエートの（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２）のＯＤＮを用いるマウスにおける抗腫瘍治療を示す１セットのグラフである。図４３Ａおよび図４３Ｂは、腎臓細胞癌腫モデルにおける結果を示す。図４３Ｃおよび図４３Ｄは、マウス神経芽細胞腫モデルにおける結果を示す。図４３Ｅおよび図４３Ｆは、マウス非小細胞肺癌モデルにおける結果を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ−１】
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【図２５Ｂ−２】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【配列表】
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