(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性重合体の活性炭酸塩エステルを含む組成物を調製するための合成方法であって、
（ａ）任意に触媒または酸で中和された塩基の存在下で、ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩、ジスクシンイミジル炭酸塩、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、トリクロロフェニルクロロホルメート、ｐ−ニトリフェニルスクシンイミジル炭酸塩、ｐ−ニトロフェニル１−ベンゾトリアゾリル炭酸塩、ペンタフルオロフェニルクロロホルメートおよび１，１’−カルボニルジイミダゾールからなる群から選択される活性炭酸塩試薬を含む組成物と非プロトン溶媒およびアミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体を含む組成物を混合するステップであって、活性炭酸塩試薬を含む組成物が添加されることにより、活性炭酸塩試薬がアミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体に対して過剰になり、結果として、水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応の活性炭酸塩試薬を含む組成物となるステップと、
（ｂ）反応性分子を含む組成物を水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応活性炭酸塩試薬を含む組成物に添加するステップであって、反応性分子を含む組成物が添加されることにより、実質的に全ての未反応の活性炭酸塩試薬が実質的に使用されるステップと、を含み、
前記反応性分子は、水、低級アルキル一価アルコール、硫化水素および低級アルキル一塩基アミンからなる群から選択される、
合成方法。
【請求項２】
水溶性重合体の前記活性炭酸塩エステルは以下の式を有し、
ＰＯＬＹ−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ
式中、
ＰＯＬＹが水溶性重合体であり、
Ｒが有機ラジカルであり、
但し、ＰＯＬＹが線状メチルキャップポリ（エチレングリコール）の場合、線状メチルキャップポリエチレングリコールが少なくとも１０３の分子量である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非プロトン溶媒は、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、クロロホルム、ジクロロメタンおよびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
重合体試薬を調製するための合成方法であって、
（ａ）任意に触媒または酸で中和された塩基の存在下で、ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩、ジスクシンイミジル炭酸塩、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、トリクロロフェニルクロロホルメート、ｐ−ニトリフェニルスクシンイミジル炭酸塩、ｐ−ニトロフェニル１−ベンゾトリアゾリル炭酸塩、ペンタフルオロフェニルクロロホルメートおよび１，１’−カルボニルジイミダゾールからなる群から選択される活性炭酸塩試薬を含む組成物と非プロトン溶媒およびアミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体を含む組成物を混合するステップであって、活性炭酸塩試薬を含む組成物が添加されることにより、活性炭酸塩試薬がアミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体に対して過剰になり、結果として、水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応の活性炭酸塩試薬を含む組成物となるステップと、
（ｂ）反応性分子を含む組成物を水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応活性炭酸塩試薬を含む組成物に添加するステップであって、反応性分子を含む組成物が添加されることにより、実質的に全ての未反応の活性炭酸塩試薬が実質的に使用され、前記反応性分子は、水、低級アルキル一価アルコール、硫化水素および低級アルキル一塩基アミンからなる群から選択されるステップと、
（ｃ）重合体試薬を形成するために、一つ以上の反応で前記水溶性重合体の前記活性炭酸塩エステルを反応させることをさらに含む、方法。
【請求項５】
前記水溶性重合体の前記活性炭酸塩エステルは、溶媒を留去することにより分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記水溶性重合体の前記活性炭酸塩エステルは、イソプロピルアルコール、ヘキサン、エチルエーテルまたはその組み合わせの添加により沈殿して分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体は、アミンの末端基またはヒドロキシの末端基を有する水溶性重合体であり、前記水溶性重合体がポリ（アルキレングリコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカリド）、ポリ（α−ヒドロキシ酢酸）、ポリ（アクリル酸）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、およびポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記水溶性重合体はポリ（エチレングリコール）である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリ（エチレングリコール）は線状ポリ（エチレングリコール）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリ（エチレングリコール）は、分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリ（エチレングリコール）は、多腕ポリ（エチレングリコール）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリ（エチレングリコール）は、１００〜１００，０００ダルトンの分子量を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記アミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体は、アミン停止の水溶性重合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記アミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体は、ヒドロキシ停止の水溶性重合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記アミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体に対する前記活性炭酸塩試薬の前記過剰が少なくとも５モル％過剰を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記アミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体に対する前記活性炭酸塩試薬の前記過剰が少なくとも５０モル％過剰を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記アミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体に対する前記活性炭酸塩試薬の前記過剰が少なくとも２倍モル過剰を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記反応性分子は水である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
以下の構造
【化１】
0005544085.tif 000018
を有し、（ｎ）が２〜４０００の整数である水溶性重合体の活性炭酸塩エステルを含む組成物を調製するための合成方法であって、
（ａ）（ｎ）が２〜４０００の整数である以下の式
ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
を有するヒドロキシ停止の水溶性重合体と非プロトン溶媒を含む組成物をジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩を含む組成物と混合するステップであって、前記ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩を含む前記組成物が添加されることにより、ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩が前記ヒドロキシ停止の水溶性重合体に対して過剰になり、結果として、（ｎ）が２〜４０００の整数である、以下の構造
【化１】
0005544085.tif 000019
を有する前記水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩を含む組成物となるステップと、
（ｂ）反応性分子を含む組成物を水溶性重合体の前記活性炭酸塩エステルと未反応ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩を含む前記組成物に添加するステップであって、前記反応性分子を含む前記組成物が添加されることにより、実質的に全ての未反応ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩が実質的に使用されるステップと、
を含み、
前記反応性分子は、水、低級アルキル一価アルコール、硫化水素および低級アルキル一塩基アミンからなる群から選択される、
合成方法。
【請求項２０】
以下の構造
【化２】
0005544085.tif 000020
を有し、（ｎ）が２〜４０００の整数である水溶性重合体の活性炭酸塩エステルを含む組成物を調製するための合成方法であって、
（ａ）（ｎ）が２〜４０００の整数である以下の式
ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
を有するヒドロキシ停止の水溶性重合体と非プロトン溶媒を含む組成物をジスクシンイミジル炭酸塩を含む組成物と混合するステップであって、前記ジスクシンイミジル炭酸塩を含む前記組成物が添加されることにより、ジスクシンイミジル炭酸塩が前記ヒドロキシ停止の水溶性重合体に対して過剰になり、結果として、（ｎ）が２〜４０００の整数である、以下の構造
【化２】
0005544085.tif 000021
を有する前記水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応ジスクシンイミジル炭酸塩を含む組成物となるステップと、
（ｂ）反応性分子を含む組成物を前記水溶性重合体の前記活性炭酸塩エステルと未反応ジスクシンイミジル炭酸塩を含む前記組成物に添加するステップであって、前記反応性分子を含む前記組成物が添加されることにより、実質的に全ての未反応ジスクシンイミジル炭酸塩が実質的に使用されるステップと、
を含み、
前記反応性分子は、水、低級アルキル一価アルコール、硫化水素および低級アルキル一塩基アミンからなる群から選択される、
合成方法。
【請求項２１】
以下の構造
【化３】
0005544085.tif 000022
を有し、（ｎ）が２〜４０００の整数である水溶性重合体の活性炭酸塩エステルを含む組成物を調製するための合成方法であって、
（ａ）（ｎ）が２〜４０００の整数である以下の式
ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
を有するヒドロキシ停止の水溶性重合体と非プロトン溶媒を含む組成物をｐ−ニトロフェニルクロロホルメートを含む組成物と混合するステップであって、前記ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートを含む前記組成物が添加されることにより、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートが前記ヒドロキシ停止の水溶性重合体に対して過剰になり、結果として、（ｎ）が２〜４０００の整数である、以下の構造
【化３】
0005544085.tif 000023
を有する前記水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートを含む組成物となるステップと、
（ｂ）反応性分子を含む組成物を水溶性重合体の前記活性炭酸塩エステルと未反応ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートを含む前記組成物に添加するステップであって、前記反応性分子を含む前記組成物が添加されることにより、実質的に全ての未反応ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートが実質的に使用されるステップと、
を含み、
前記反応性分子は、水、低級アルキル一価アルコール、硫化水素および低級アルキル一塩基アミンからなる群から選択される、
合成方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１の方法のいずれかの方法を実施することにより得られる組成物。
【請求項２３】
水溶性重合体−活性剤結合体を調製するための合成方法であって、
水溶性重合体の活性炭酸塩エステルを、結合条件下で活性剤と反応させ、結果として水溶性重合体−活性剤結合体を得るステップを含み、前記水溶性重合体の活性炭酸塩エステルが、
（ｉ）任意に触媒または酸で中和された塩基の存在下で、非プロトン溶媒とアミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体を含む組成物をジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩、ジスクシンイミジル炭酸塩、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、トリクロロフェニルクロロホルメート、ｐ−ニトリフェニルスクシンイミジル炭酸塩、ｐ−ニトロフェニル１−ベンゾトリアゾリル炭酸塩、ペンタフルオロフェニルクロロホルメートおよび１，１’−カルボニルジイミダゾールからなる群から選択される活性炭酸塩試薬を含む組成物と混合し、前記活性炭酸塩試薬を含む前記組成物が添加されることにより、前記活性炭酸塩試薬が前記アミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体に対して過剰になり、結果として、前記水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応の活性炭酸塩試薬を含む組成物となるステップと、
（ｉｉ）反応性分子を含む組成物を前記水溶性重合体の前記活性炭酸塩エステルと未反応活性炭酸塩試薬を含む前記組成物に添加し、反応性分子を含む前記組成物が添加されることにより、実質的に全ての未反応活性炭酸塩試薬が実質的に使用されるステップにより調製され、
前記反応性分子は、水、低級アルキル一価アルコール、硫化水素および低級アルキル一塩基アミンからなる群から選択される、
合成方法。
【請求項２４】
水溶性重合体−活性剤結合体を調製するための合成方法であって、
重合体試薬を結合条件下で活性剤と反応させ、結果として水溶性重合体−活性剤結合体を得るステップを含み、前記重合体試薬が、
（ａ）任意に触媒または酸で中和された塩基の存在下で、非プロトン溶媒とアミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体を含む組成物をジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩、ジスクシンイミジル炭酸塩、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、トリクロロフェニルクロロホルメート、ｐ−ニトリフェニルスクシンイミジル炭酸塩、ｐ−ニトロフェニル１−ベンゾトリアゾリル炭酸塩、ペンタフルオロフェニルクロロホルメートおよび１，１’−カルボニルジイミダゾールからなる群から選択される活性炭酸塩試薬を含む組成物と混合し、前記活性炭酸塩試薬を含む前記組成物が添加されることにより、前記活性炭酸塩試薬が前記アミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体に対して過剰になり、結果として、前記水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応の活性炭酸塩試薬を含む組成物となるステップと、
（ｂ）反応性分子を含む組成物を前記水溶性重合体の前記活性炭酸塩エステルと未反応活性炭酸塩試薬を含む前記組成物に添加し、反応性分子を含む前記組成物が添加されることにより、実質的に全ての未反応活性炭酸塩試薬が実質的に使用されるステップと、
（ｃ）一つ以上の反応で前記水溶性重合体の前記活性炭酸塩エステルを反応させ、重合体試薬を形成するステップ
により調製され、
前記反応性分子は、水、低級アルキル一価アルコール、硫化水素および低級アルキル一塩基アミンからなる群から選択される、
合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、水溶性および非ペプチド系重合体（「重合体試薬」）だけでなく同様の水溶性の組成物、結合体、医薬組成物の調製方法および医薬組成物の投与方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
科学者および臨床医は、患者への供給に適した形態に活性剤を発展されるための試みにおいて多くの課題に直面する。例えば、タンパク質である活性剤は、しばしば、経口よりむしろ注入により供給される。この方法により、タンパク質は、胃のタンパク質分解の環境に曝露されることなく全身循環系に導入される。
【０００３】
しかし、タンパク質の注入には、いくつかの欠点がある。例えば、多くのタンパク質は、比較的短い半減期を有し、従って、繰り返し注入が必要であり、しばしば、不便で痛みを伴う。さらに、タンパク質によっては、一つ以上の免疫反応を発現させる可能性があり、結果として、患者の免疫システムが免疫原性のタンパク質を破壊または中和しようとする。もちろん、一度タンパク質が破壊または中和されると、タンパク質は意図する薬力学的作用を発揮することができない。従って、タンパク質などの活性剤の供給は、これらの薬剤が注入により投与されても、しばしば、問題になる。
【０００４】
注入を介して活性剤を供給する問題点の解決において、多少の成功を収めた。例えば、活性剤の水溶性重合体への結合は、削減された免疫原性および抗原性を有する重合体−活性剤結合を引き起こした。さらに、重合体−活性結合は、腎臓を介した排除の低下および／または全身循環系における酵素的分解の低下の結果として、非結合対応物と比較すると、しばしば、半減期を増大する。半減期の増大の結果、重合体−活性剤結合は頻繁に投与を必要とせず、結果として痛みを伴う注入および医療担当者への不便な訪問の回数を全体的に削減する。さらに、僅かに可溶性であった活性剤は、水溶性重合体と結合したとき、水溶性が著しく増加した。
【０００５】
文書化された安全性だけでなく局所および内部使用の双方に対するＦＤＡによる承認のため、ポリエチレングリコールは活性剤に結合される。活性剤が重合体またはポリエチレングリコールまたは「ＰＥＧ」に結合されると、結合された活性剤は、慣習的に「ペグ化」と呼ばれる。ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）ペグ化インターフェロンα−２ａ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）ペグ化インターフェロンα−２ｂ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｋｅｎｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ）およびＮＥＵＬＡＳＴＡＴＭＰＥＧ−フィルグラスチム（Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）などのペグ化活性剤の商業的成功は、活性剤の結合形態の投与が非結合対応物に対して著しい利点を有することを示す。ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（非特許文献１）およびフルオロウラシル（非特許文献２）などの小分子もペグ化されている。非特許文献３は、医薬品におけるペグ化の作用の見直しを提供している。非特許文献３。
【０００６】
一般的に、結合の形成は、活性剤と重合体試薬間の反応を伴う。少量の重合体試薬がＮｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓなどの市販供給源から入手可能だが、商業規模または生産規模の重合体試薬が必要な場合、懸念が生じる。特に、所望する結合の生成に使用される特定の重合体試薬（または所望する結合の生成に使用される重合体試薬の生成に役立つ中間生成物）が、潜在的に有害な不純物をほとんど含まず、適時に効率的で経済的な方法で合成できないという懸念がある。
【０００７】
例えば、重合体試薬だけでなく他の重合体試薬の調製に役立つ中間生成物に使用される活性エステルを有する重合体の従来の合成は、除去されなければならない過剰の低分子試薬（ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸など）を必要とする。複雑だが、低分子量試薬が他の分子と反応せず、これにより所望しない副反応および生成を引き起こし、結果として比較的に不純生成物および生産量の減少を生じるので、低分子量試薬の除去は不可欠である。
【０００８】
活性剤を有する重合体を調製するためのアプローチの一つとして、米国特許番号６，６２４，２４６は、ベンゾトリアゾール炭酸基を有するメトキシ（基）ポリ（エチレングリコール）（「ｍＰＥＧ−ＢＴＣ」）の合成を記述している。その記述によると、プロセスは、効果的なｍＰＥＧ−ＢＴＣ形成の後、ｍＰＥＧ−ＢＴＣ種を精製し、未反応のジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸および他の低分子量生産物（例えば、１−ベンゾトリアゾリル）を除去するためのｍＰＥＧ−ＢＴＣ精製を伴う。特許文献１に記述されるように、ｍＰＥＧ−ＢＴＣの精製は、複数の沈殿工程を伴う。工程の概要を以下に示す。
【０００９】
【化４】
0005544085.tif 000002
ポリ（エチレングリコール）の一部が約２０，０００ダルトンの重量平均分子量を有するｍＰＥＧ−ＢＴＣの製造において、全てのｍＰＥＧ−ＯＨのｍＰＥＧ−ＢＴＣへの１００％転化を達成するためには、８倍過剰のｄｉＢＴＣを使用する。比較的多量のｄｉＢＴＣが未反応に留まるが、さらなる合成工程を実行する前に除去されなければならない。さもなければ、残留のｄｉＢＴＣは、接触したあらゆる反応基（例えば、アルコール基、アミン基など）と反応し、所望しない不純物の導入および全体的な生産量の減少を引き起こす。
【００１０】
特許文献２に記述されるように、ｍＰＥＧ−ＢＴＣは、リジン（アミノ基２つとカルボン酸基一つを有する）と反応することによりｍＰＥＧ残基が各アミノ基に結合し、カルボン酸がさらなる官能化に使用される「リジン分枝状」構造を提供する。過剰のリジンを用いて過剰のｄｉＢＴＣを使用すると考えることができるが、そのようなアプローチには、少なくとも２つの理由による欠点がある。第一に、ｄｉＢＴＣとｍＰＥＧ−ＢＴＣが使用可能なリジンアミノ基を競うため、所望するリジン分枝状構造と単一ｍＰＥＧ残基、単一ＢＴＣ基および単一カルボン酸のみを有する他の種の混合物となる。第二に、本アプローチが成功したとしても、非リジン残基含有生産物が所望される状態を解決しない。
【００１１】
ｍＰＥＧ−ＢＴＣ精製中にｍＰＥＧ−ＢＴＣの形成から過剰ｄｉＢＴＣを破壊することのみにより、リジン反応中に過剰ｄｉＢＴＣの保有を避けてよい。イソプロピル（基）アルコール（ＩＰＡ、イソプロパノール）は、塩化メチレン溶液からｍＰＥＧ−ＢＴＣを沈殿させるためにエチルエーテルに置換されてよい［すなわち、例えば、上記概略図の工程Ｂ（ｃ）］。本変更が実施されると、ＩＰＡは、塩化メチレンとＩＰＡの混合物に可溶性であるイソプロピル（基）−ＢＴＣを形成するために過剰ｄｉＢＴＣと反応する。残念だが、大規模でのこのような操作において、イソプロピル（基）−ＢＴＣの一部は、ｍＰＥＧ−ＢＴＣ沈殿中に閉じ込められる。イソプロピル（基）−ＢＴＣは、リジンとの任意の反応でｍＰＥＧ−ＢＴＣと競うため、イソプロピル（基）−ＢＴＣは、製造を継続する前に除去されなければならない。閉じ込められたイソプロピル（基）−ＢＴＣを除去するために、イソプロピル（基）−ＢＴＣからｍＰＥＧ−ＢＴＣを分離するための追加の「再沈殿」工程が、１または２つ実行されなければならない。各細沈殿は、約８５〜９５％の個体のみが回収されるので、ｍＰＥＧ−ＢＴＣ生産物を多少失うため、本アプローチは、高価でさらなる時間を必要とする。
【００１２】
活性剤を有する重合体の別のアプローチにおいて、特許文献３は、スクシンイミド炭酸基（「ｍＰＥＧ−ＳＣ」）を有するメトキシ（基）ポリ（エチレングリコール）の合成を記述している。その記述によると、プロセスは、効果的なｍＰＥＧ−ＳＣの形成後、ｍＰＥＧ−ＳＣ種を精製し、未反応のジスクシンイミジルと他の低分子量生産物（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を除去するためのｍＰＥＧ−ＳＣ精製を伴う。特許文献３に記述されるように、ｍＰＥＧ−ＳＣの精製は、濾過および複数の沈殿工程を伴う。本プロセスの概略図を以下に示す。
【００１３】
【化５】
0005544085.tif 000003
ポリ（エチレングリコール）の一部が約６１００ダルトンの重量平均分子量を有するｍＰＥＧ−ＳＣの製造において、全てのｍＰＥＧ−ＯＨからｍＰＥＧ−ＳＣへの１００％転化を達成するために、２０倍過剰のＤＳＣが使用される。多量のＤＳＣは、ＭＰＥＧ−ＯＨのｍＰＥＧ−ＳＣへの最適な転化を確実にするが、比較的多量のＤＳＣが、未反応に留まり、さらなる合成工程を実行する前に除去されなければならない。さもなければ、残留ＤＳＣは、接触したらあらゆる反応基（例えば、アルコール基、アミン基など）と反応し、所望しない不純物の導入および全体的な生産量の減少を引き起こす。
【特許文献１】米国特許第６，６２４，２４６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９３２，４６２号明細書
【特許文献３】米国特許第５，２８１，６９８号明細書
【非特許文献１】Ｚａｌｉｐｓｋｙ（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．４（４）：２９６−２９９
【非特許文献２】Ｏｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．Ｄｉｓｃｏｖ．９（１）：９３−１０５
【非特許文献３】Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２（３）：２１４−２２１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、低分子量試薬が添加されることにより「ワンポット」反応を生じる同じ反応混合物からｄｉＢＴＣおよび／またはその反応性分解剤などの過剰低分子量試薬を除去するための効果的な方法の必要性が残る。本発明は、当該分野における本必要性およびその他の必要性を解決する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の要約
一つ以上の実施形態における合成方法を提供し、本方法は、
（ａ）任意に触媒または酸で中和された塩基の存在下で、活性炭酸塩試薬からなる組成物とアミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体からなる組成物を混合し、活性炭酸塩試薬からなる組成物が添加されることにより、活性炭酸塩試薬がアミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体に対して過剰になり、結果として、水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応の活性炭酸塩試薬からなる組成物を生じるステップと、
（ｂ）反応性分子からなる組成物を水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応活性炭酸塩試薬からなる組成物に添加し、反応性分子からなる組成物が添加されることにより、実質的に全ての未反応の活性炭酸塩試薬が実質的に使用されるステップと、を含む。
【００１６】
本発明の一つ以上の実施形態における合成方法を提供し、本方法は、
（ａ）（ｎ）が２〜約４０００の整数をもつ以下の構造
ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
を有するヒドロキシ停止の水溶性重合体からなる組成物をジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸と混合し、ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩からなる組成物が添加されることにより、ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩がヒドロキシ停止の水溶性重合体に対して過剰になり、結果として、（ｎ）が２〜約４０００の整数で未反応ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩である、以下の構造
【００１７】
【化６】
0005544085.tif 000004
を有する水溶性重合体の活性炭酸塩エステルからなる組成物を生じるステップと、
（ｂ）反応性分子からなる組成物を水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩からなる組成物に添加し、反応性化合物からなる組成物が添加されることにより、実質的に全ての未反応ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩が実質的に使用されるステップと、を含む。
【００１８】
本発明の一つ以上の実施形態における合成方法を提供し、本方法は、
（ａ）（ｎ）が２〜約４０００の整数をもつ以下の構造
ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
を有するヒドロキシ停止の水溶性重合体からなる組成物をジスクシンイミジル炭酸塩と混合し、ジスクシンイミジル炭酸塩からなる組成物が添加されることにより、ジスクシンイミジル炭酸塩がヒドロキシ停止の水溶性重合体に対して過剰になり、結果として、（ｎ）が２〜約４０００の整数で未反応ジスクシンイミジル炭酸塩である、以下の構造
【００１９】
【化７】
0005544085.tif 000005
を有する水溶性重合体の活性炭酸塩エステルからなる組成物を生じるステップと、
（ｂ）反応性分子からなる組成物を水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応ジスクシンイミジル炭酸塩からなる組成物に添加し、反応性化合物からなる組成物が添加されることにより、実質的に全ての未反応ジスクシンイミジル炭酸塩が実質的に使用されるステップと、を含む。
【００２０】
本発明の一つ以上の実施形態における合成方法を提供し、本方法は、
（ａ）（ｎ）が２〜約４０００の整数をもつ以下の構造
ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
を有するヒドロキシ停止の水溶性重合体からなる組成物をｐ−ニトロフェニルクロロホルメートからなる組成物と混合し、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートからなる組成物が添加されることにより、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートがヒドロキシ停止の水溶性重合体に対して過剰になり、結果として、（ｎ）が２〜約４０００の整数で未反応ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートである、以下の構造
【００２１】
【化８】
0005544085.tif 000006
を有する水溶性重合体の活性炭酸塩エステルからなる組成物を生じるステップと、
（ｂ）反応性分子からなる組成物を水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートからなる組成物に添加し、反応性化合物からなる組成物が添加されることにより、実質的に全ての未反応ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートが実質的に使用されるステップと、を含む。
【００２２】
本発明の一つ以上の実施形態における合成方法を提供し、本方法は、
（ｉ）任意に触媒または酸で中和された塩基の存在下で、アミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体からなる組成物を活性炭酸塩試薬からなる組成物と混合し、活性炭酸塩試薬からなる組成物が添加されることにより、活性炭酸塩試薬がアミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体に対して過剰になり、結果として、水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応の活性炭酸塩試薬からなる組成物を生じる、および
（ｉｉ）反応性分子からなる組成物を水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応活性炭酸塩試薬からなる組成物に添加し、反応性分子からなる組成物が添加されることにより、実質的に全ての未反応活性炭酸塩試薬が結合条件下で活性剤を用いることにより実質的に使用され、結果として水溶性重合体−活性剤結合となることにより、
調製される水溶性重合体の活性炭酸塩エステルを反応させるステップを含む。
【００２３】
一つ以上の反応において、重合体試薬は、
（ａ）任意に触媒または酸で中和された塩基の存在下で、アミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体からなる組成物を活性炭酸塩試薬からなる組成物と混合し、活性炭酸塩試薬からなる組成物が添加されることにより、活性炭酸塩試薬がアミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体に対して過剰になり、結果として、水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応の活性炭酸塩試薬からなる組成物を生じる、
（ｂ）反応性分子からなる組成物を水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応活性炭酸塩試薬からなる組成物に添加し、反応性分子からなる組成物が添加されることにより、実質的に全ての未反応活性炭酸塩試薬が実質的に使用される、および
（ｃ）重合体試薬を形成するために、一つ以上の反応で水溶性重合体の活性炭酸塩エステルを結合条件下で活性剤と反応させることにより、
結果として水溶性重合体−活性剤結合を生じることにより、
調製される。
【００２４】
本発明の一つ以上の実施形態における合成方法を提供し、本方法は、
（ａ）任意に触媒または酸で中和された塩基の存在下で、アミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体からなる組成物を活性炭酸塩試薬からなる組成物と混合し、活性炭酸塩試薬からなる組成物が添加されることにより、活性炭酸塩試薬がアミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体に対して過剰になり、結果として、水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応の活性炭酸塩試薬からなる組成物を生じる、
（ｂ）反応性分子からなる組成物を水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応活性炭酸塩試薬からなる組成物に添加し、反応性分子からなる組成物が添加されることにより、実質的に全ての未反応活性炭酸塩試薬が実質的に使用される、および
（ｃ）重合体試薬を形成するために、一つ以上の反応で水溶性重合体の活性炭酸塩エステルを結合条件下で活性剤と反応させることにより、結果として、水溶性重合体−活性剤結合を生じることにより、
調製される。
【００２５】
本発明の一つ以上の実施形態において、結合−含有組成物の調製方法が提供され、本方法は、本明細書で記述される合成方法に従って調製される水溶性重合体（またはそれから調製された重合体試薬）の活性炭酸塩エステルを活性剤と混合することにより結合−含有組成物を生じるステップを含む。
【００２６】
本発明の一つ以上の実施形態において、組成物結合−含有組成物が提供され、組成物は、本明細書で提供される結合−含有組成物の調製方法から得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の詳細な説明
本発明の一つ以上の実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、特定の重合体、試薬およびその等価物に制限されるものではなく、様々であってよいことを理解する。
【００２８】
本仕様および請求項で使用されるように、単一形態「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明確に表示されない限り、複数の対象を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「重合体」とは、単一重合体だけでなく２つ以上の同じまたは異なる重合体を含み、「活性炭酸塩試薬」は、単一活性炭酸塩試薬だけでなく２つ以上の同じまたは異なる活性炭酸塩試薬などを示す。
【００２９】
本発明の記述および請求項において、以下の用語が以下に提供される定義に基づき使用される。
【００３０】
本明細書で使用される「ＰＥＧ」、「ポリエチレングリコール」および「ポリ（エチレングリコール）」は、交換可能である。一般的に、本発明に基づくＰＥＧｓの使用は、（ｎ）が２〜４０００である、次の構造、「−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−」を含む。本明細書で使用されるように、ＰＥＧは、末端炭素が置換されるかされないかにかかわらず「−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−」および「−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ−」も含む。仕様および請求項を通して、用語「ＰＥＧ」は、様々な末端または「終端キャップ」基を有する構造を含むことを理解するべきである。用語「ＰＥＧ」は、大半の、つまり５０％，以上の−ＯＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−反復サブユニットを含む重合体も意味する。特定の形態において、ＰＥＧは、以下に詳細を記述するが、様々な数の分子量だけでなく、「分枝鎖状」、「線状状」、「分岐状」「多官能」などの構造または形状も取る。
【００３１】
用語「終端キャップ」および「末端キャップ」は、終端キャップ分子部分を有する重合体の末端またはエンドポイントを意味するために交換可能に使用される。一般的に、必要ではないが、終端キャップされた分子部分は、ヒドロキシまたはＣ１−２０アルコキシ基、より好ましくはＣ１−１０アルコキシ基、さらに好ましくはＣ１−５アルコキシ基を含む。従って、終端キャップされた分子部分の例は、アルコキシ（例えば、メトキシ（基）、エトキシおよびベンジルオキシ）だけでなく、アリール、ヘテロアリール、シクロ、ヘテロシクロなどを含む。終端キャップ分子部分は、重合体の末端単量体［例えば、ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−の終端キャップ分子部分「メトキシ（基）」］の一つ以上の原子を含んでよい。さらに、前記の各飽和、不飽和、置換および未置換形態が想定される。さらに、終端キャップ基は、シランでもよい。終端キャップ基は、有利に検出可能なラベルも含む。重合体が検出可能なラベルを含む終端キャップ基を有する場合、重合体が結合する重合体および／または分子部分（例えば、活性剤）の量または位置は、適切な検出器を使用して判断されてよい。そのようなラベルは、これに制限されないが、蛍光因子、化学発光物質、酵素ラベルに使用される分子部分、比色分子部分（例えば、染料）、金属イオン、放射活性部分などを含む。適切な検出器は、光測定器、フィルム、スペクトロメータなどを含む。終端キャップ基は、有利にリン脂質も含む。重合体がリン脂質を含む終端キャップ基をもつ場合、特有の性質が重合体に付与され、結合を生じる。例示的なリン脂質は、これに制限されないが、フォスファチジルコリンと呼ばれるリン脂質の類から選択されるものを含む。特定のリン脂質は、これに制限されないが、ジラウロリルフォスファチジルコリン、ジオレイルフォスファチジルコリン、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、ジステロイルフォスファチジルコリン、ベヘノイルフォスファチジルコリン、アラキドイルフォスファチジルコリンおよびレシチンからなる群から選択されるものを含む。
【００３２】
本明細書で記述される重合体に関する「非天然」は、その全体が自然界で発見されない重合体を意味する。しかし、非天然重合体は、全体的な重合体構造が自然界で発見されない限り、自然に起こる一つ以上の単量体または単量体の一部を含んでよい。
【００３３】
「水溶性重合体」の用語「水溶性」は、室温で水に溶解するあらゆる重合体である。一般的に、水溶性重合体は、濾過後同じ溶液により透過される光の少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９５％を透過する。重量基準において、水溶性重合体は、好ましくは、少なくとも約３５％（重量で）水に可溶、より好ましくは、少なくとも約５０％（重量で）水に可溶、さらに好ましくは、約７０％（重量で）水に可溶、さらにより好ましくは、約８５％（重量で）水に可溶である。しかし、最も好ましくは、水溶性重合体は、約９５％（重量で）水に可溶または完全に水に可溶である。
【００３４】
ＰＥＧなどの水溶性重合体の状況での分子量は、数平均分子量または重量平均分子量のいずれかにより表現される。記述がない限り、本明細書の分子量に関する全ての基準は、重量平均分子量を意味する。数平均分子量および重量平均分子量双方の分子量測定は、ゲル透過クロマトグラフィーまたは他の液体クロマトグラフィー技術を使用して測定されてよい。数平均分子量を判断するために末端基分析または束一的性質の測定（例えば、氷点降下、沸点上昇または浸透圧）の使用、または重量平均分子量を判断するために光散乱技術、超遠心分離または粘度測定法の使用など、分子量値測定の他の方法も使用されてよい。本発明の重合体は、一般的に、好ましくは約１．２未満、より好ましくは約１．１５未満、さらに好ましくは約１．１０未満、またさらに好ましくは約１．０５未満、最も好ましくは約１．０３未満の低多分散値を有する多分散（すなわち、重合体の数平均分子量および重量平均分子量が等しくない）である。本明細書で使用されるように、基準は、重量平均分子量または数平均分子量のいずれかを有する単一水溶性重合体にある時点で行われ、そのような基準は、単一水溶性重合体は、記載された分子量を有する水溶性重合体の組成物から得られたことを意味することを理解する。
【００３５】
特定の官能基と関連して使用される時、用語「活性」または「活性された」は、他の分子上の求電子または求核と容易に反応する活性官能基を意味する。これは、反応するために強い触媒または非常に実施不可能な反応条件を必要とする基（すなわち、「非反応性」または「非活性」基）と対照である。
【００３６】
本明細書で使用されるように、用語「官能基」またはそのあらゆる同意語は、その保護形態だけでなく非保護形態を包含することを意味する。
【００３７】
用語「スペーサ部分」、「リンク」または「リンカー」は、本明細書で重合体の末端と活性剤または活性剤の求電子または求核などの連続の分子部分を連結するために使用される原子または原子の集まりを意味するために使用される。スペーサ部分は、加水分解的に安定していてよい、または生理学的に加水分解性または酵素的に分解性リンクを含んでよい。
【００３８】
「アルキル」は、一般的に長さが約１〜１５原子の範囲の炭化水素鎖を意味する。そのような炭化水素鎖は、好ましくは、必ずしも飽和でなくてもよく、一般的に直鎖が好ましいが、分枝または直鎖であってよい。例示的なアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、１−メチルブチル、１−エチルプロピル、３−メチルペンチルなどを含む。本明細書で使用されるように、「アルキル」は、シクロアルキルだけでなくシクロアルキレン含有アルキルも含む。
【００３９】
「低級アルキル」は、１〜６個の炭素原子を含むアルキル基を意味し、直鎖または分枝であってよい。これに制限されないが、例示的な低級アルキルは、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチルおよびｔ−ブチルを含む。
【００４０】
「シクロアルキル」は、架橋、融合またはスピロ環状化合物を含む飽和または不飽和環状炭化水素鎖を意味し、好ましくは３〜約１２個の炭素原子、より好ましくは３〜８個の炭素原子からなる。「シクロアルキレン」は、環構造の任意の２個の炭素での鎖の結合によりアルキル鎖に挿入されるシクロアルキル基を意味する。
【００４１】
「アルコキシ」は、Ｒがアルキル、置換アルキル［好ましくはＣ１−６アルキル（例えば、メトキシ（基）、エトキシ、プロピルオキシなど）またはＣ１−６置換アルキル］、アリール、置換アリールである−Ｏ−Ｒ基を意味する。
【００４２】
例えば「置換アルキル」などの用語「置換」は、これに制限されないが、アルキル、例えば、シクロプロピル、シクロブチルなどのＣ３−８シクロアルキル、例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードなどのハロ、シアノ、アルコキシ、低級フェニル、置換フェニル、ニトロなどの一つ以上の非干渉置換基と置換される分子部分（たとえば、アルキル基）を意味する。「置換アリール」は、一つ以上の非干渉置換基を有するアリールである。フェニル環上の置換基において、置換基は、いずれの位置であってよい（例えば、オルト、メタまたはパラ）。
【００４３】
「非干渉置換基」は、一般的に、分子部分に存在するとき、分子内に含まれる他の官能基と反応しない基のことである。
【００４４】
「アリール」は、それぞれが５または６のコア炭素原子を有する一つ以上の芳香族環を意味する。アリールは、ナフチルの融合された、またはビフェニルの融合していない複数のアリール環を含む。アリール環は、一つ以上の環状炭化水素、ヘテロアリールまたは複素環式環と融合しても癒合しなくてもよい。本明細書で使用されるように、「アリール」は、ヘテロアリールを含む。
【００４５】
「ヘテロアリール」は、１〜４のヘテロ原子、好ましくは、硫黄、酸素または窒素あるいはその組み合わせを含むアリール基である。ヘテロアリール環は、一つ以上の環状炭化水素、複素環式、アリールまたはヘテロアリール環と融合してもよい。
【００４６】
「複素環」または「複素環式」は、不飽和または芳香族の性質をもったまたはもたない、炭素でない環原子を少なくとも一つ有する、一つ以上の５〜１２原子、好ましくは５〜７原子の環を意味する。好ましくは、ヘテロ原子は、硫黄、酸素および窒素を含む。
【００４７】
「置換へテロアリール」は、置換基として一つ以上の非干渉基を有するヘテロアリールである。
【００４８】
「置換複素環」は、非干渉置換基から形成される一つ以上の側鎖を有する複素環である。
【００４９】
本明細書で使用される「有機ラジカル」は、アルキル、置換アルキル、アリールおよび置換アリールを含んでよい。
【００５０】
「求電子」および「求電子基」は、求電子中心、すなわち、電子を探す、求核と反応可能な中心を有するイオン性であってよいイオンまたは原子または原子の集まりを意味する。
【００５１】
「求核」および「求核基」は、求核中心、すなわち、電子中心を探す、または求電子と反応可能な中心を有するイオン性であってよいイオンまたは原子または原子の集まりを意味する。
【００５２】
「生理学的に切断可能」または「加水分解」結合は、生理学的条件下で水と反応する結合（すなわち、加水分解）である。約３０分以下で２５°Ｃ、ｐＨ８で加水分解半減期をもつ結合が好ましい。水中で加水分解する結合傾向は、任意の２つの原子を結ぶリンクの一般型だけでなく、これらの２つの任意の原子に結合する置換基に依存する。適切な加水分解的に不安定で弱いリンクは、これに制限されないが、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物類、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルソエステル、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドを含む。
【００５３】
「酵素的に分解可能なリンク」は、一つ以上の酵素による分解を対象とするリンクを意味する。
【００５４】
「加水分解的に安定した」リンクまたは結合は、化学結合、一般的に、水中で実質的に安定している、つまり、長期間にわたり生理学的条件下で評価できるほどの度合で加水分解が行われない共有結合を意味する。加水分解的に安定したリンクの例は、これに制限されないが、次の炭素−炭素結合（例えば、脂肪鎖で）、エーテル類、アミン類、ウレタンなどを含む。一般的に、加水分解的に安定なリンクは、生理学的条件下で１日約１〜２％未満の加水分解速度を示すリンクである。典型的な化学結合の加水分解速度は、最も一般的な化学テキストに記載されている。
【００５５】
「医薬的に許容される賦形剤」は、任意に組成物に含まれ、患者に投与した時に著しい有害作用を生じない賦形剤を意味する。
【００５６】
本明細書で使用される「治療有効量」は、血流または標的組織で所望するレベルの結合（または対応する非結合活性剤）を提供するために必要とされる結合量を意味する。正確な量は、多数の要素、例えば、特定の活性剤、治療組成物の成分および物理的性質、対象患者群、供給方法、患者の考えなどに依存し、当業者はこれを容易に決定することができる。
【００５７】
「多官能」は、官能基が同じまたは異なる、そこに含まれる３つ以上の官能基を有する重合体を意味する。多官能重合体試薬は、一般的に、約３〜１００の官能基、３〜５０の官能基または３〜２５の官能基または３〜１５の官能基または３〜１０の官能基を含む、あるいは重合体骨格内に３、４、５、６、７、８、９、１０の官能基を含む。
【００５８】
「任意」または「任意に」は、後述する状況が起こっても起こらなくてもよいことを意味する、従って、記述は、状況が起こる例と状況が起こらない例を含む。
【００５９】
「実質的に」（別稿の特定の文脈で特に定義または明確に記述されない限り）は、ほとんど完全または完全を意味し、例えば、次の一つ以上、条件の５０％より大きい、５１％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上および９５％以上を満たす。
【００６０】
語句「実質的に非水溶性」は、（ｉ）１０，０００ｐ．ｐ．ｍ未満の水（１％未満）、より好ましくは、１，０００ｐ．ｐ．ｍ．未満の水（０．１％未満）、さらにより好ましくは、１００ｐ．ｐ．ｍ未満の水（０．０１％未満）、さらにより好ましくは、１０ｐ．ｐ．ｍ未満の水（０．００１％未満）を有する、組成物または反応媒体を意味する。好ましくは、必然ではないが、実質的に非水溶性条件は、不活性環境を含む。
【００６１】
本明細書で使用される用語「使用される」は、化学プロセスで未反応の活性炭素試薬の全てまたはほとんどを破壊するために、任意に樹脂またはカラム上での分子部分結合であってよい反応性分子を使用して未反応活性炭素試薬［ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸など］を中和することを意味する。
【００６２】
ワンポット合成方法のように、「ワンポット」は、前の反応からの生産物が次の反応を実施する前に分離を必要としないことを意味する。
【００６３】
特に記述されない限り、合成方法の一部として２つ以上の組成物を一緒に「混合」するとあるように、用語「混合」は、添加の順序に関して制限されるものではない。
【００６４】
「活性炭酸塩」は、ｄｉＢＴＣだけでなく、一つ以上の化合物は真の「炭酸塩」ではないが（ハロは、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードからなる群から選択される）、ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩（ＢＴＣ）、ジスクシンイミジル炭酸塩（「ＤＳＣ」）、ｐ−ニトロフェニルハロホルメート、ジスクシンイミジルオキサレートおよびトリホスゲン、およびｄｉＢＴＣ内のベンゾトリアゾリル分子部分の一つまたは両方のアルコキシ置換も含む。しかし、活性炭酸塩は、アミン停止、ヒドロキシ停止またはチオール停止の水溶性重合体との反応時に活性ウレタン−、炭酸塩−またはチオ炭酸塩停止の水溶性重合体を生じなければならない。活性ウレタン−、炭酸塩−またはチオ炭酸塩停止の水溶性重合体は、逆に、活性基停止の水溶性重合体を生じるためにタンパク質または試薬のいずれかと反応するウレタン−、炭酸塩−またはチオ炭酸塩停止の水溶性重合体である。
【００６５】
文脈に明確に記述されない限り、用語「約」が数値に先行する場合、数値は記述される数値の±１０％を意味することを理解する。
【００６６】
合成方法の工程
合成方法は、以下の工程を含む。
【００６７】
（ａ）任意に触媒または酸で中和された塩基の存在下で、活性炭酸塩試薬からなる組成物とアミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体からなる組成物を混合し、活性炭酸塩試薬からなる組成物が添加されることにより、活性炭酸塩試薬がアミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体に対して過剰になり、結果として、水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応の活性炭酸塩試薬からなる組成物を生じるステップ。
【００６８】
（ｂ）反応性分子からなる組成物を水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応活性炭酸塩試薬からなる組成物に添加し、反応性分子からなる組成物が添加されることにより、実質的に全ての未反応の活性炭酸塩試薬が実質的に使用されるステップ。
【００６９】
混合ステップは、特に、活性ウレタン−、炭酸塩−またはチオ停止の水溶性重合体の形成を生じる。ウレタン停止の水溶性重合体は、アミン停止の水溶性重合体からなる組成物が使用されるとき形成される。炭酸塩停止の水溶性重合体は、ヒドロキシ停止の水溶性重合体からなる組成物が使用されるとき形成される。チオ炭酸塩停止の水溶性重合体は、チオ停止の水溶性重合体が使用されるとき形成される。本明細書で提供される方法の一部として調製される、これらの形成された各水溶性重合体（すなわち、ウレタン停止の水溶性重合体、炭酸塩停止の水溶性重合体およびチオ炭酸塩停止の水溶性重合体）は、水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと呼ぶ。
【００７０】
本発明の方法を概略的に以下に示すが、ヒドロキシ停止の水溶性重合体ｍＰＥＧ−ＯＨからなる組成物が使用されるとき、活性炭酸塩試薬は、ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩であり、活性炭酸塩エステルはｍＰＥＧ−ＢＴＣ、そして活性分子は水となる。
【００７１】
【化９】
0005544085.tif 000007
従って、例示的なアプローチにおいて、本方法は、
ａ）式中、ＰＯＬＹが水溶性重合体、Ｘが（存在する場合）任意のスペーサ分子、（ａ）がゼロまたは１［好ましくは、ＰＯＬＹ−（Ｘ）ａ−ＯＨがＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨである］のいずれかである、次の構造ＰＯＬＹ−（Ｘ）ａ−ＯＨを有するヒドロキシ停止の水溶性重合体からなる組成物をジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩からなる組成物と混合し、ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩からなる組成物が添加されることにより、ヒドロキシ停止の水溶性重合体に対してジ（１−ベンゾトリアゾリル）が過剰となり、結果として、（ｎ）が２〜約４０００の整数で未反応ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩（および解放されたヒドロキシベンゾトリアゾリル）である以下の構造
【００７２】
【化１０】
0005544085.tif 000008
を有する水溶性重合体の活性炭酸塩エステルからなる組成物を生じるステップと、
ｂ）水を水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩からなる組成物に添加し、水が添加されることにより、実質的に全ての未反応の活性炭酸塩試薬が実質的に使用されるステップとを含む。
【００７３】
本方法は、有利に「ワンポット」合成により実施される。さらに、本方法は、米国特許番号６，６２４，２４６に開示される方法で必要とされる活性炭酸塩試薬の除去のために沈殿工程を必要としない。しかし、本活性炭酸塩試薬が所望する試薬なら、沈殿により分離されてよい。
【００７４】
任意で、本方法は、異なる重合体試薬を形成するために一つ以上の反応で水溶性重合体（ｍＰＥＧ−ＢＴＣなど）の活性炭酸塩エステルを反応させることをさらに含む。重合体試薬を形成することにより、結合条件下で重合体試薬を活性剤と反応させることを可能にし、水溶性重合体−活性剤結合を生じる。水溶性重合体（ｍＰＥＧ−ＢＴＣなど）の活性炭酸塩エステルは、重合体試薬の形成で中間体として使用されてよいが、結合反応で重合体試薬として活性炭酸塩エステル（ｍＰＥＧ−ＢＴＣなど）自体を使用することも可能である。
【００７５】
水溶性重合体の活性炭酸塩エステルを回復するために、一般的に、過剰の非溶媒を添加する。非溶媒の例は、イソプロピル（基）アルコール、ジエチルエーテル、ＭＴＢＥ、ヘプタン、ＴＨＦ、ヘキサンおよびその組み合わせを含む。
【００７６】
本発明の一つ以上の実施形態において、水溶性重合体の活性炭酸塩エステルは、以下の構造式をもち、
ＰＯＬＹ−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ
式中、
ＰＯＬＹは、水溶性重合体、
Ｒは、有機ラジカルであり、
ＰＯＬＹは、線状メチルキャップポリ（エチレングリコール）であるときは、線状メチルキャップポリエチレングリコールは、少なくとも１０３の分子量をもつ。
【００７７】
本方法で使用する例示的な活性分子は、水、低級アルキル一価アルコール（メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノールなど）、低級アルキル一塩基アミン、および（例えば、Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ａ−７アミンゲルなどのアミンゲルを介して）結合活性カルボキシレート、ヒドロキシ、チオールまたはアミン基を有する樹脂などの求核性分子を含む。有利に、そのような樹脂は、「活性分子からなる組成物を水溶性重合体の活性炭酸塩エステルと未反応活性炭酸塩試薬からなる組成物に添加」するステップをもたらすために、未反応活性炭酸塩試薬が移動できるカラムの一部を形成する。しかし、活性分子が水であることが好ましい。水は直接添加されてよい。さらに、水は、水和塩などの水を解放する分子部分を介して添加されてよい。
【００７８】
本方法の一つ以上の実施形態において、二酸化炭素の形成は、未反応活性炭酸塩試薬が実質的に使用されるとき生じる。
【００７９】
混合工程は、アミン停止、ヒドロキシ停止またはチオール停止の水溶性重合体からなる組成物として必要である。本明細書で使用されるように、「アミン停止、ヒドロキシ停止またはチオール停止の水溶性重合体」は、アミン基、ヒドロキシ基またはチオール基が実際に水溶性重合体の末端に位置しているかどうかに関わらず、少なくとも１つのアミン基（「−ＮＨ２」）またはヒドロキシ基（「−ＯＨ」）またはチオール基（「−ＳＨ」）を有するあらゆる水溶性重合体である。実際、アミノ基（−ＮＨ２）またはヒドロキシ基（「ＯＨ」）チオール基（「−ＳＨ」）は、芳香族基に結合されてよい。
【００８０】
混合工程は、活性炭酸塩試薬からなる組成物も必要とする。本方法に使用する活性炭酸塩は、必要ではないが、ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩（ＢＴＣ）、ジスクシンイミジル炭酸塩（「ＤＳＣ」）、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、トリクロロフェニルクロロホルメート、ｐ−ニトロフェニルスクシンイミジル炭酸塩、ｐ−ニトロフェニル１−ベンゾトリアゾリル炭酸塩、ペンタフルオロフェニルクロロホルメート、１，１’−カルボニルジイミダゾール、ジスクシンイミジルオキサレートおよびトリホスゲンからなる群から選択される。特定の場合において、活性炭酸塩試薬は、次の構造式、Ｒ−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ；Ｒ−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ’およびＲ−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｘの一つをもち、式中、Ｒは有機ラジカル、Ｒ’はＲと異なる有機ラジカル、およびＸはＣｌ、ＢｒまたはＩである。
【００８１】
アミン停止またはヒドロキシ停止の水溶性重合体に対する活性炭酸塩試薬の過剰は、以下の一つ以上を表す。少なくとも約５モル％過剰、少なくとも約５０モル％過剰、少なくとも約２モル過剰、少なくとも約４モル過剰および少なくとも約８モル過剰。
【００８２】
水溶性重合体の活性炭酸塩エステルの調製方法は、例えば、米国特許番号６，６２４，２４６および５，９３２，４６２に記述されるように、特に、重合体試薬の形成に役立つ中間体を提供する有用性をもつ。
【００８３】
混合工程は、一般的に、実質的に非水溶性条件下で実行される。さらに、非プロトン性溶媒系組成物は、合成方法で使用される。また、合成アプローチ全体は、しばしば、アルゴンなどの不活性環境下で実行される。
【００８４】
本方法の工程の一つ以上は、有機溶媒中で実行される。あらゆる有機溶媒が使用されてよいが、本発明は、これに制限されないが、ハロゲン化脂肪族炭化水素、アルコール類、芳香族炭化水素、ハロゲン化芳香族炭化水素、エーテル、環状エーテルおよびその組み合わせからなる群から選択されるこれらの溶媒を含む。好適な溶媒の例は、塩化メチレン（ジクロロメタン）、クロロホルム、オクタノール、トルエン、メチルｔ−ブチルエーテル、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジエチル炭酸、アセトン、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ジメチルアセトアミド、Ｎ−シクロヘキシルアセトアミド、シクロヘキサンおよびその組み合わせからなる群から選択されるそれらを含む。
【００８５】
結合体含有組成物の調製方法
本発明の一つ以上の実施形態において、結合体含有組成物の調製方法を提供するが、本方法は、活性剤を水溶性重合体の活性炭酸塩エステル（または水溶性重合体のそのような活性炭酸塩エステルを使用して調製された重合体試薬）と混合することを含み、これにより、結合体含有組成物を生じる。従って、結合体含有組成物の調製方法は、本発明内に含まれる。
【００８６】
結合体含有組成物
本発明の一つ以上の実施形態において、結合体含有組成物を提供するが、本明細書に提供するように、本方法から得る組成物は、活性剤を水溶性重合体の活性炭酸塩エステル（または水溶性重合体のそのような活性炭酸塩エステルを使用して調製された重合体試薬）と混合することを含む。
【００８７】
従って、結合体含有組成物は、本発明内に含まれる。組成物（結合体組成物および試薬組成物の双方）は、既存の方法より純度が高く、より効率的に調製されると考えられる。
【００８８】
水溶性重合体（「ＰＯＬＹ」）
本明細書で使用されるように、用語「水溶性重合体」は、生体許容および非免疫原性である水溶性重合体を含み、特定的に、生体許容および非免疫原性でないあらゆる水溶性重合体部分を除外する。生体許容に関して、物質のみまたは生組織（例えば、患者への投与）に関する他の物質（例えば活性剤）を用いた物質の使用に関する有益作用が、例えば、医師などの臨床医により評価されるようなあらゆる有害作用を上回る場合、物質は生体許容と考えられる。非免疫原性に関して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの物質の使用目的が所望しない免疫反応（例えば、抗体の形成）を生じない場合、または免疫反応が生じてもそのような反応が臨床医により評価されるような臨床的に有意または重要と見なされない場合、物質は非免疫原性と考えられる。本明細書に記載される水溶性ポリマーの一部および結合体は、生体許容かつ非免疫原性であることが特に望ましい。
【００８９】
重合体を示すとき、重合体は、本発明での使用に適切であると本明細書に記述されるそれらなど、あらゆる数の水溶性および非ペプチド重合体であってよい。好ましくは、ポリ（エチレングリコール）（すなわち、ＰＥＧ）は、重合体である。用語ＰＥＧは、線状形状、分枝状または多腕形状（例えば、分岐状ＰＥＧまたはポリオールコアに結合するＰＥＧ）、ペンダント状ＰＥＧ、または分解性リンクを伴うＰＥＧを含むあらゆる数の幾何学構造または形状のポリ（エチレングリコール）を含むが、以下により完全に記述される。
【００９０】
重合体により保持される官能基の数と官能基の位置は変動する。一般的に、重合体は、１〜約２５の官能基、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の官能基を含む。ＰＥＧ重合体などの直状重合体は、一般的に、重合体鎖の末端に位置する１つまたは２つの官能基を含む。ＰＥＧ重合体が単官基（すなわち、ｍＰＥＧ）の場合、重合体は、官能基を１つ含む。ＰＥＧ重合体が二官能基の場合、重合体は、重合体鎖の各末端に２つの独立して選択される官能基を含んでよい。理解されるように、多腕または分枝重合体は、多数の官能基を含んでよい。
【００９１】
参照によりその全体が本明細書に記載されているものとみなす米国特許番号５，９３２，４６２に記述されるものなど、多腕または分枝ＰＥＧ分子も、ＰＥＧ重合体として使用されてよい。一般的に、多腕または分枝重合体は、分岐点の中心から伸びる２つ以上重合体「腕」を有する。例えば、例示的な分枝ＰＥＧ重合体は、
【００９２】
【化１１】
0005544085.tif 000009
の構造を有し、
式中、ＰＥＧ１およびＰＥＧ２が本明細書で記述されるいずれかの形状または幾何学構造のＰＥＧ重合体で、同じまたは異なってよく、Ｌ’は、加水分解的に安定したリンクである。例示的な分枝ＰＥＧは、
【００９３】
【化１２】
0005544085.tif 000010
の構造を有し、
式中、ｐｏｌｙａおよびｐｏｌｙｂは、メトキシ（基）ポリ（エチレングリコール）などのＰＥＧ骨格、Ｒ”は、Ｈ、メチルまたはＰＥＧ骨格などの非反応性分子部分、およびＰおよびＱは、非反応性リンクである。好適な実施形態において、分枝ＰＥＧ重合体は、メトキシ（基）ポリ（エチレングリコール）二置換リジンである。本明細書の目的のため、多腕構造は、３つ以上の分枝を含むが、分枝構造は、２分枝のみを含む。
【００９４】
分枝ＰＥＧ構造は、以下に示すように、第三低重合体または重合体鎖に結合されてよく、
【００９５】
【化１３】
0005544085.tif 000011
式中、ＰＥＧ３は、ＰＥＧ１およびＰＥＧ２と同じまたは異なってよい第三ＰＥＧ低重合体または重合体鎖である。
【００９６】
ＰＥＧ重合体は、代わりに、分岐ＰＥＧを含んでよい。一般的に、分岐構造を有する重合体は、重合体の加水分解的に安定した分岐点から伸びる共有結合を介して２つ以上の官能基に結合する重合体鎖を有するのが特徴である。分岐ＰＥＧの例は、ＰＥＧ−ＹＣＨＺ２により示され、式中、Ｙは結合基で、Ｚは、生物活性物質に共有結合するための活性末端基である。Ｚ基は、定義された長さの原子鎖によりＣＨに結合される。米国特許番号６，３６２，２５４は、本発明で使用可能な様々な分岐ＰＥＧ構造を開示している。Ｚ官能基（例えば、ヒドロキシ基）を分枝炭素原子に結合する原子鎖は、連結基として使用され、例えば、アルキル鎖、エーテルリンク、エステルリンク、アミドリンクまたはその組み合わせを含んでよい。
【００９７】
ＰＥＧ重合体は、ＰＥＧ鎖の末端でなくＰＥＧ骨格の長さに沿って共有結合される反応基（例えば、ヒドロキシ基）を有するペンダント状分子を含む。ペンダント状反応基は、アルキレン基など、直接または結合分子部分を介してＰＥＧ骨格に結合されてよい。
【００９８】
上述のＰＥＧ形状に加え、重合体は、上述のあらゆる重合体を含む重合体の骨格に一つ以上の加水分解的に安定したまたは分解性リンクを用いて調製されてもよい。例えば、ＰＥＧは、加水分解の対象である重合体の骨格でエステルリンクを用いて調製されてよい。以下に示すように、加水分解は、重合体の切断により低分子量の分解物を生じる。
【００９９】
【化１４】
0005544085.tif 000012
重合体の骨格内の分解性リンクとして役立つ、他の加水分解的分解性リンクは、炭酸塩リンク、アミンとアルデヒドの反応から生じるイミンリンク（例えば、Ｏｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ，３８（１）：５８２−３（１９９７）を参照）、例えば、アルコールをリン酸基と反応させることにより形成されるリン酸エステルリンク、一般的にヒドラジドとアルデヒドの反応により形成されるヒドラゾンリンク、一般的にアルデヒドとアルコール間の反応により形成されるアセタールリンク、例えば、酸誘導体とアルコール間の反応により形成されるオルソエステルリンク、および、例えば、重合体の末端のホスホラミダイト基とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシ基により形成されるオリゴヌクレオチドリンクを含む。上述の多くの分解性リンクの使用は、アミノ基との不安定なリンクの多くが求核反応をもつため、あまり好ましくない。
【０１００】
用語ポリ（エチレングリコール）またはＰＥＧが、上のＰＥＧ形状の全てを示すまたは含むことは、当業者にとって明らかである。
【０１０１】
他の非ペプチドおよび水溶性重合体鎖を含むあらゆる他の様々な重合体も、本発明で使用されてよい。重合体は線状であってよく、上述のいかなる形状（例えば、分枝、分岐など）であってよい。適切な重合体の例は、これに制限されないが、米国特許番号５，６２９，３８４に記述される他のポリ（アルキレングリコール）、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（サッカリド）、ポリ（α−ヒドロキシ酢酸）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）および共重合体、ターポリマーおよびその混合物を含む。
【０１０２】
水溶性重合体の分子量は所望の実施形態、重合体構造、分枝の程度などの構成により変動する可能性があるが、分子量は以下の値の一つ以上を満たす。１００ダルトン以上、２００ダルトン以上、４００ダルトン以上、５００ダルトン以上、７５０ダルトン以上、９００ダルトン以上、１，０００ダルトン以上、１，４００ダルトン以上、１，５００ダルトン以上、１，９００ダルトン以上、２，０００ダルトン以上、２，２００ダルトン以上、２，５００ダルトン以上、３，０００ダルトン以上、４，０００ダルトン以上、４，９００ダルトン以上、５，０００ダルトン以上、６，０００ダルトン以上、７，０００ダルトン以上、７，５００ダルトン以上、９，０００ダルトン以上、１０，０００ダルトン以上、１１，０００ダルトン以上、１４，０００ダルトン以上、１５，０００ダルトン以上、１６，０００ダルトン以上、１９，０００ダルトン以上、２０，０００ダルトン以上、２１，０００ダルトン以上、２２，０００ダルトン以上、２５，０００ダルトン以上、３０，０００ダルトン以上。本明細書で有用な対象の水溶性重合体部分の分子量の最大限度は、約３００，０００ダルトン未満である。
【０１０３】
重合体の分子量は、一般的に、少なくとも以下の範囲内の一つに収まる。約１００ダルトン〜約１００，０００ダルトン、約２００ダルトン〜約６０，０００ダルトン、約３００ダルトン〜約４０，０００ダルトン。
【０１０４】
水溶性重合体部分の例示的な分子量は、約１００ダルトン、約２００ダルトン、約３００ダルトン、約３５０ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、約５５０ダルトン、約６００ダルトン、約７００ダルトン、約７５０ダルトン、約８００ダルトン、約９００ダルトン、約１，０００ダルトン、約２，０００ダルトン、約２，２００ダルトン、約２，５００ダルトン、約３，０００ダルトン、約４，０００ダルトン、約４，４００ダルトン、約５，０００ダルトン、約６，０００ダルトン、約７，０００ダルトン、約７，５００ダルトン、約８，０００ダルトン、約９，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約１１，０００ダルトン、約１２，０００ダルトン、約１３，０００ダルトン、約１４，０００ダルトン、約１５，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン、約２２，５００ダルトン、約２５，０００ダルトン、約３０，０００ダルトン、約３５，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約５０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトンおよび約７５，０００ダルトンを含む。
【０１０５】
分枝状重合体に関して、重合体の全分子量における適切なサイズの例示的な範囲（基本的に２つの水溶性重合体の一部の合計量に基づく）は、以下を含む。約２００ダルトン〜約１００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約８０，０００ダルトン、約２，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトン、約４，０００ダルトン〜約２５，０００ダルトンおよび約１０，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトン。より特定的に、本発明の分枝状重合体の全重量平均分子量は、以下の一つに対応する。４００；１，０００；１，５００；２，０００；３０００；４，０００；１０，０００；１５，０００；２０，０００；３０，０００；４０，０００；５０，０００；６０，０００；または８０，０００。
【０１０６】
ＰＥＧに関して、「−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−」または「−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ」などの反復エチレン酸化物単量体を含む構造が提供されるとき、（ｎ）の好適な値は、約３〜約３，０００、約１０〜約３，０００、約１５〜約３，０００、約２０〜約３，０００、約２５〜約３，０００、約３０〜約３，０００、約４０〜約３，０００、約５０〜約３，０００、約５５〜約３，０００、約７５〜約３，０００、約１００〜約３，０００および約２２５〜約３，０００を含む。
【０１０７】
スペーサー分子部分（「Ｘ」）
任意に、スペーサー分子部分は水溶性重合体に含まれ、他の構造を本明細書に提供する。例示的なスペーサー分子部分は、以下の−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−［ＣＨ２］０−６−（ＯＣＨ２ＣＨ２）０−２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、二価シクロアルキル基、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−［ＣＨ２］ｆ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−および前述の任意の２つ以上の組み合わせを含み、式中、（ｆ）は０〜６、（ｎ）は０〜２０（好ましくは、０〜１０、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、より好ましくは４）である。さらに、前述の炭素含有スペーサー分子部分は、それに結合する分枝状アルキル基を有することができる。二価のシクロアルキル（例えば、シクロアルキレン）基の非制限の例は、シクロプロパジイル（例えば１，１−、シス−１１，２−、またはトランス−１，２−シクロプロピレン）、シクロブタジイル、シクロペンタジイル、シクロヘキサジイルおよびシクロヘプタジイルの様々な異性体などのＣ３−８シクロアルキルを含む。シクロアルキレン基は、一つ以上のアルキル基、好ましくは、Ｃ１−Ｃ６アルキル基と置換されてよい。
【０１０８】
水溶性重合体の活性炭酸塩エステルが形成されると、水溶性重合体の活性炭酸塩エステルは、活性剤との結合反応に役立つ重合体試薬として「そのまま」使用されるか、または任意で、異なる反応基を有する異なる重合体を形成するためにさらに誘導されてよい。好適な反応基は、求電子物質および求核物質の群から選択される。
【０１０９】
【化１５】
0005544085.tif 000013
好適な反応基の特定例は、アミン、カルボン酸、エステル、アルデヒド、アセタール、スクシンイミドおよびマレイミドを含む。
【０１１０】
【化１６】
0005544085.tif 000014
例えば、水溶性重合体の活性炭酸塩エステルは、アミノ酸ン誘導体を形成するためにアミノ酸と反応してよい。従って、例えば、ｍＰＥＧ−ＢＴＣエステルは、重合体リジン誘導体を形成するためにリジンと反応してよい。例えば、そのようなリジン［例えば、Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）４ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ２Ｈ・ＨＣｌ］誘導体は、二重にペグ化されたリジンであり、式中、２つのＰＥＧは、以下に示すように（ｎは、２〜約４０００である）、カルバメート結合によりリジンアミンに結合される。
【０１１１】
【化１７】
0005544085.tif 000015
そのようなリジンのＰＥＧ誘導体は、タンパク質のＰＥＧ誘導体を調製するための試薬として役立つ。それらのＰＥＧ誘導体は、しばしば、ｉｎ  ｖｉｖｏでのより長い循環寿命、タンパク質分解速度の減少および低免疫原性など、非ペグ化タンパク質に対してメリットがある。他の側面において、ＰＥＧ  ＢＴＣ誘導体は、カルバメート結合を通してＰＥＧをタンパク質に直接結合するのに使用され、しばしば、リジンＰＥＧ誘導体で記述したのと同様のメリットがある。
【０１１２】
従って、例えば、上の「ＰＥＧ２酸」は、ＰＥＧ２酸のＰＥＧ２活性エステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を形成するために、ジシクロヘキシルカルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応してよい。次に、後続の反応で、ＰＥＧ２活性エステルは、第三アミン塩基の存在下で、タンパク質、生体工学された生体分子および他の重要な治療分子上でチオール基と反応可能なマレイミド基を有する重合体試薬を形成するために、３−Ｎ−マレイミドプロピオン酸のエチレンジアミンモノアミドのトリフルオロ酢酸塩と反応させてよい。
【０１１３】
【化１８】
0005544085.tif 000016
マレイミド基を有する重合体試薬（式中、ｎは、２〜４０００の整数）
結合反応条件下で、マレイミド基を有する上の重合体試薬をチオール含有活性剤［システイン含有ポリペプチド、タンパク質または他のチオール含有生体分子などの「（活性剤）−ＨＳ」］と反応させることにより、以下の構造を有する結合が形成される。
【０１１４】
【化１９】
0005544085.tif 000017
結合［式中、ｎは２〜４０００の整数で、「Ｓ−（活性剤）」はチオール含有活性剤の残留物である。
【０１１５】
生物学的に活性の結合体
あらゆる対象の重合体において、上述の方法は、重合体をさらに変形する能力（あらゆる脱保護工程の前または後のいずれか）を有利に提供するため、特定の反応基を有する。従って、当該分野で周知の技術を使用して、重合体は、反応基（例えば、活性エステル、チオール、マレイミド、アルデヒド、ケトンなど）を含むために官能化されてよい。
【０１１６】
例えば、重合体が反応基としてカルボン酸を有するとき、対応するエステルは、従来の技術を使用して形成されてよい。例えば、カルボン酸はアルコールを用いて酸触媒型縮合が行われることにより、対応するエステルを提供する。これを達成するためのアプローチの一つは、一般的にＦｉｓｃｈｅｒエステル化反応と呼ばれる方法を使用することである。所望するエステルを形成するための他の技術は、当事者に周知である。
【０１１７】
例えば、重合体が反応基としてカルボン酸を有するとき、対応するエステルは、従来の技術を使用して形成されてよい。例えば、カルボン酸は、アルコールを用いて酸触媒型縮合が行われることにより、対応するエステルを提供する。これを達成するためのアプローチの一つは、一般的にＦｉｓｃｈｅｒエステル化反応と呼ばれる方法を使用することである。所望するエステルを形成するための他の技術は、当該分野の者に周知である。
【０１１８】
さらに、カルボン酸を有する重合体は、エステル以外の有用な反応基を形成するために変形されてよい。例えば、カルボン酸は、アシルアシルハライド、アシルシアニド、アシルイソシアネートおよびアジドなどのアシル擬ハライド、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム、ナトリウムおよびバリウム塩）などの中性塩、エステル、無水物類、アミド、イミド、ヒドラジド類などを形成するためにさらに誘導されてよい。好適な実施形態において、カルボン酸は、Ｎ−スクシンイミジルエステル、ｏ−、ｍ−またはｐ−ニトロフェニルエステル、１−ベンゾトリアゾリルエステル、イミダゾリルエステルまたはＮ−スルホスクシンイミジルエステルを形成するためにエステル化される。例えば、カルボン酸は、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドの存在下でカルボン酸をジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはジイソプロピル（基）カルボジイミド（ＤＩＣ）と反応させることにより、対応するＮ−スクシンイミジルエステルに変換されてよい。
【０１１９】
上述の合成方法の工程は適切な溶媒中で実施される。当該分野の者は、あらゆる特定の溶媒があらゆる任意の反応に適切かどうかを判断できる。しかし、一般的に、溶媒は、非極性溶媒または極性の非プロトン溶媒である。非極性溶媒の非制限の例は、ベンゼン、キシレン、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびトルエンを含む。例示的な極性の非プロトン溶媒は、これに制限されないが、アセトニトリル、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＨＭＰＡ（ヘキサメチルリン酸アミド）、ＤＭＡ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＡ（ジメチルアセトアミド）およびＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリジノン）を含む。
【０１２０】
重合体の調製方法は、形成された後、任意で、追加工程の重合体の分離および回復を含む。既知の方法は、重合体を分離するために使用されてよいが、特に、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーの使用が好ましい。代わりにまたはさらに、本方法は、形成された後、重合体を精製する工程を含む。これも、標準の当該分野で既知の精製方法が重合体を精製するために使用されてよい。水溶性重合体の活性炭酸塩エステルの分離は、当該分野で既知の方法を使用して溶媒を蒸留することにより達成されてもよい。
【０１２１】
本発明の重合体は、アルゴンまたは窒素下などの不活性環境で保存されてよい。これにより、潜在的に、例えば大気酸素などによる分解プロセスが減少または完全に避けられる。場合によっては、酸化的分解を避けるために、ブチル化ヒドロキシルトルエン（ＢＨＴ）などの抗酸化剤が、保存前に最終産物に添加されてよい。さらに、水に関連する反応の潜在的な破損を削減するために、保存状態に関する水分量を最小限にすることが望ましい。さらに、光に関する特定の分解プロセスを避けるために、保存状態を暗く保つことが望ましい。従って、好適な保存状態は、以下の一つ以上を含む。乾燥したアルゴンまたは別の不活性ガス下で保存、約−１５ｏＣ以下の温度で保存、光遮断下で保存およびＢＨＴなどの適切な抗酸化剤量（例えば、約５０〜５００ｐ．ｐ．ｍ．）で保存。
【０１２２】
上述の重合体は、重合体上の反応基との反応に適切な少なくとも一つの基を含む生物学的活性剤または表面への結合に有用である。例えば、活性剤または表面上のアミノ基（例えば、第一級アミン）、ヒドラジン、ヒドラジドおよびアルコールは、重合体上のカルボン酸基と反応する。さらに、重合体のより「活性的」なカルボン酸が生物学的活性剤または表面への反応性を強化するために調製されてよい。カルボン酸の活性方法は、当該分野において周知であり、例えば、上述の活性エステルの形成方法を含む。カルボン酸を活性するための他のアプローチは、当該分野の者に周知である。
【０１２３】
一般的に、重合体は、等モル量（反応基と反応するのに適切な所望する数の基に関して）またはモル過剰量で活性剤または表面に添加される。例えば、例えば、重合体は、約１：１（重合体：活性剤）、１．５：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、８：１または１０：１のモル比で、標的の活性剤に添加されてよい。結合反応は、実質的に結合が起こらなくなるまで進むことを可能にし、これは、一般的に、時間中、反応の進行を監視することにより判断される。反応の進行は、様々な時間点で反応混合物からアリコートを取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法または他の適切な分析方法にて反応混合物を分析することにより監視されてよい。プラトが、形成された結合量と残留未結合の重合体量に関して達成されると、反応は、完了したとみなされる。一般的に、結合反応は、１分〜数時間（例えば、５分〜２４時間以上）の範囲で起こる。得られた生成混合物は、好ましくは、必要ではないが、過剰試薬、未結合反応物質（例えば、活性剤）、所望しない多結合種および遊離または未反応重合体を分離するために精製される。得られた結合は、次に、ＭＡＬＤＩ、細管電気泳動、ゲル電気泳動および／またはクロマトグラフィーなどの分析方法を使用してさらに特性化される。
【０１２４】
重合体−活性剤結合に関して、結合は、異なる結合種を得る／分離するために精製される。低分子量（例えば、約２０キロダルトン未満、より好ましくは、約１０キロダルトン未満）重合体における代替的、そして好まししくは、精製混合物は、活性剤につき水溶性重合体部分の分布を得るために精製されてよい。例えば、精製混合物は、活性剤につき（例えば、タンパク質）１〜５ＰＥＧｓの範囲の平均、一般的には、活性剤（例えば、タンパク質）につき約３ＰＥＧｓの範囲の平均を得るために精製されてよい。最終結合反応混合物の精製方法は、例えば、使用された重合体の分子量、特定の活性剤、所望する用量法および個々の結合の残活性およびｉｎ  ｖｉｖｏ性質を含む多くの要因に依存する。
【０１２５】
所望する場合、異なる分子量を有する結合は、ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して分離されてよい。つまり、ゲル濾過クロマトグラフィーは、異なる分子量（差異が実質的に水溶性重合体部分の平均分子量に対応する）の基準で、異なる数の重合体：活性剤比（例えば、「１−ｍｅｒ」が１重合体：活性剤を示す、「２−ｍｅｒ」が２重合体：活性剤を示す、１−ｍｅｒ、２−ｍｅｒ、３−ｍｅｒなど）を分別するために使用される。例えば、１００ｋＤａのタンパク質が約２０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧアルカン酸にランダムに結合される例示的反応において、得られる反応混合物は、未改質のタンパク質（ＭＷ１００ｋＤａ）、モノペグ化タンパク質（ＭＷ１２０ｋＤａ）、ジペグ化タンパク質（ＭＷ１４０ｋＤａ）などを含む可能性がある。本アプローチは、ＰＥＧと異なる分子量を有する他の重合体結合を分離するために使用されてよいが、本アプローチは、一般的に、タンパク質内の異なる重合体結合部をもつ位置異性体を分離するのに有効性がない。例えば、各回復したＰＥＧ−ｍｅｒ組成物は、活性剤内の異なる反応性アミノ基（リジン残留物）に結合されるＰＥＧｓを含むが、ゲル濾過クロマトグラフィーが、ＰＥＧ１−ｍｅｒｓ、２−ｍｅｒｓ、３−ｍｅｒｓなどの混合物を分離するために使用されてよい。
【０１２６】
このタイプの分離に適したゲル濾過カラムは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能なＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭおよびＳｅｐｈａｄｅｘＴＭカラムを含む。特定のカラムの選択は、所望する分布範囲に依存する。溶出は、一般的に、リン酸塩、アセテートなどの適切な緩衝液を使用して実行される。回収された部分は、例えば、（ｉ）タンパク質含量に対して２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）、（ｉｉ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質分析、（ｉｉｉ）ＰＥＧ含量に対するヨード試験［Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０７：６０−６３］および（ｉｖ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）後、ヨウ化バリウムを用いての染色など、多くの異なる方法で分析されてよい。
【０１２７】
位置異性体の分離は、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）Ｃ１８カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓまたはＶｙｄａｃ）を使用した逆相クロマトグラフィーにより、または例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭイオン交換カラムなど、イオン交換カラムを使用したイオン交換クロマトグラフィーにより実行されてよい。いずれのアプローチも、同じ分子量を有する重合体−活性剤異性体（位置異性体）を分離するために使用されてよい。
【０１２８】
結合および任意でさらなる分離工程後、結合混合物は、濃縮、無菌濾過され、低温、一般的に、約−２０ｏＣ〜−８０ｏＣで保存される。代替的に、結合は、残留緩衝液とともに、またはなしで凍結乾燥され、凍結乾燥粉末として保存される。場合によって、酢酸ナトリウムなど、結合に使用された緩衝液を凍結乾燥中に容易に除去できる炭酸アンモニウムまたは酢酸アンモニウムなどの非揮発性緩衝液に交換することが好ましい。これにより、凍結乾燥粉末は、残留緩衝液を含まない。代替的に、緩衝液交換工程は、調合緩衝液を使用して使用されてよい。これにより、凍結乾燥された結合は、調合緩衝液に再調製に、および最終敵に哺乳類への投与に適した形態になる。
【０１２９】
本発明の重合体は、共有結合的または非共有結合的に、フィルム、化学分離および精製表面、個体担持体、金、チタニウム、タンタル、ニオビウム、アルミニウム、スチールおよびその酸化物などの金属表面、シリコン酸化物、マクロ分子（例えば、タンパク質、ポリペプチドなど）および小分子を含む多くの物質に結合されてよい。さらに、重合体は、生化学センサー、生体電子スイッチおよびゲートに使用されてもよい。重合体は、アフィニティー分配のための重合体−リガンド結合の調製のため、架橋または非架橋ヒドロゲルの調製のため、およびバイオリアクターの重合体−補助因子付加体の調製のために、ペプチド合成、重合体被覆表面の調製および重合体グラフトの担体として使用されてもよい。
【０１３０】
本明細書に提示されるような重合体への結合に使用される生物学的活性剤は、以下の任意の一つ以上であってよい。催眠剤および鎮静剤、抗抑鬱薬、精神安定剤、呼吸作用薬、抗痙攣薬、筋弛緩薬、抗パーキンソン病薬（ドーパミン拮抗薬）、鎮痛薬、抗炎症薬、抗不安薬（不安緩解薬）、食欲抑制剤、抗片頭痛薬、筋肉萎縮、抗感染症薬（抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、ワクチン）、抗関節炎、抗マラリア薬、鎮吐薬、ａｎｅｐｉｌｅｐｔｉｃｓ、気管支拡張薬、サイトカイン、成長因子、抗癌剤、抗血栓剤、降圧薬、新血管治療薬、抗不整脈薬、抗酸化剤、抗喘息薬、避妊薬などのホルモン剤、交感神経模倣薬、利尿薬、脂質調節剤、抗アンドロゲン剤、抗寄生虫薬、抗凝血剤、抗腫瘍薬、抗悪性腫瘍薬、血糖降下薬、栄養剤および栄養補助剤、増殖補助剤、抗腸炎剤、ワクチン、抗生物質、診断剤および造影剤。
【０１３１】
本発明の反応性重合体への共有結合の使用に適切な活性剤の例は、これに制限されないが、カルシトニン、エリスオポエチン（ＥＰＯ）、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、セレデース、セレザイム、シクロスポリン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、α−１プロテアーゼ阻害剤、エルカトニン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、成長ホルモン、ひと成長ホルモン（ＨＧＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ヘパリン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン−１受容体、インターロイキン−２、インターロイキン−１受容体拮抗剤、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、黄体ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、ＩＸ因子インスリン、プロインスリン、インスリン類似体（例えば、米国特許番号５，９２２，６７５に記述されるモノアシル化インスリン）、アミリン、Ｃ−ペプチド、ソマトスタチン、オクトレオチドを含むソマトスタチン類似体、バソプレッシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリントロピン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、組織増殖因子、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、グリア成長因子（ＧＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、内皮成長因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、グルカゴン様ペプチドチモシンα１、ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、α−１抗トリプシン、リン酸ジエストラーゼ（ＰＤＥ）化合物、ＶＬＡ−４阻害剤、ビスホスホネート、呼吸器合胞体ウイルス抗体、嚢胞性繊維症膜透過性調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子、デオキシリボヌクレアーゼ（Ｄｎａｓｅ）、殺菌性／透過性増大タンパク質（ＢＰＩ）、抗ＣＭＶ抗体、１３−シスレチノインサン、エリスロマイシン、オレアンドマイシン、トロレアンドマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、ダベルシン（ｄａｖｅｒｃｉｎ）、アジスロマイシン、フルリスロマイシン、ジリスロマイシン、ジョサマイシン、スピロマイシン、ミデカマイシン、ロイコマイシン、ミオカマイシン、ロキタマイシン、アンドアジスロマイシンおよびスイノライドＡ（ｓｗｉｎｏｌｉｄｅＡ）などのマクロライド、シプロフロキサン、オフロキサシン、レボフロキサシン、トロバフロキサシン、アラトロフロキサシン、モキシフロキサン、ノルフロキサシン、エノキサシン、グレパフロキサシン、ガチフロキサシン、ロメフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、ペフロキサシン、アミフロキサシン、フレロキサシン、トスフロキサシン、プルリフロキサシン、イルロキサシン、パズフロキサシン、クリナフロキサシンおよびシタフロキサンなどのフルオロキノロン、ゲンタマイシン、ネチルマイシン、パラメシン、トブラマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびストレプトマイシンなどのアミノグリコシド、バンコマイシン、テイコプラニン、ランポラニン、ミデプラニン、コリスチン、ダプトマイシン、グラミシジン、コリスチメタート、ポリミキシンＢ、カプレオマイシン、バシトラシン、ペネムなどのポリミキシン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶのようなペニシリナーゼ感受性剤を含むペニシリン、メチリシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フロキサシリン、ナフシリン、のようなペニシリナーゼ抵抗性剤、アンピシリン、アモキシシリンおよびヘタシリン、シリンおよびガランピシリンのようなグラム陰性菌活性剤、カルベニシリン、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリンおよびピペラシリンのような抗緑膿菌剤ペニシリン、セスポドキシム、セフプロジル、セフチブテン、セフチドキシム、セフトリアキソン、セファロチン、セファピリン、セファレキシン、セフラジン、セフォキシチン、セファマンドール、セファゾリン、セファロリジン、セファクロル、セファドロキシル、セファログリシン、セフロキシム、セフォラニド、セフォタキシム、セファトリジン、セファセトリル、セフェピム、セフィキシム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォテタン、セフメタゾール、セフタジジム、ロラカルベフおよびモキサラクサムのようなセファロスポリン、アズトレオナムのようなモノバクタム、およびイミペネム、メロペネム、イセチオン酸ペンタミジン、硫酸アルブテロール、リドカイン、硫酸メタプロテレノール、ベクロメタゾンジプレピオネート、トリアムシノロンアセトアミド、プデソニド、アセトニトリル、フルチカゾン、臭化イプラトロピウム、フルニソリド、クロモグリク酸ナトリウム、酒石酸エルゴタミンのようなカルバペネム、および該当する場合、上の類似体、受容体、拮抗剤、阻害剤および医薬的に許容される塩の形を含む。ペプチドおよびタンパク質において、本発明は、合成、未変性、グリコシル化、非グリコシル化、ペグ化の形およびその生物学的に活性の断片および類似体を含むものとする。
【０１３２】
本発明は、本明細書で提供されるように、医薬賦形剤と組み合わせて、結合体を含む医薬的製剤も含む。一般的に、結合体自体は、個体または液状形態のいずれかの適切な医薬賦形剤と組み合わせられる個体形態（例えば、沈殿物）である。
【０１３３】
例示的な賦形剤は、これに制限されないが、炭水化物、無機塩、抗菌剤、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝液、酸類、塩類およびその組み合わせからなる群から選択されるものを含む。
【０１３４】
砂糖などの炭水化物、アルジトールなどの誘導化砂糖、アルドン酸、エステル化砂糖および／または砂糖重合体は、賦形剤として存在してよい。特定の炭水化物賦形剤は、例えば、果糖、麦芽糖、ガラクトース、ブドウ糖、Ｄ−マンノース、ソルボースなどのモノサッカリド、乳糖、ショ糖、トレハロース、セロビオースなどのジサッカリド、ラフィノース、メレチトース、マルトデキソトリン、デキストラン、デンプンなどのポリサッカリド、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトールなどのアルジトールを含む。
【０１３５】
賦形剤は、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝石、第一リン酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウムおよびその組み合わせなど無機塩または緩衝液も含む。
【０１３６】
調剤は、細菌の成長を防止または阻止するために抗菌剤も含んでよい。本発明に適切な抗菌剤の例は、これに制限されないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セシルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チマーゾル（ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）およびその組み合わせを含む。
【０１３７】
抗酸化剤も調剤に含まれてよい。抗酸化剤は、酸化を防止するために使用されるため、調剤の結合体または他の成分の変質を防止する。本発明に使用される適切な抗酸化剤は、例えば、アスコルピン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、プロピルガラート、亜硫酸水素ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウムおよびその組み合わせを含む。
【０１３８】
界面活性剤が賦形剤として含まれてよい。例示的な界面活性剤は、「Ｔｗｅｅｎ２０」および「Ｔｗｅｅｎ８０」などのポリソルベート、Ｆ６８およびＦ８８（双方ともＢＡＳＦ，Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙから入手可能）などのプルロニック、ソルビタンエステル、レシチンおよび他のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン（リポソーム形態は好ましくないが、）、脂肪酸および脂肪エステルなどのリン脂質などの脂質、コレステロールなどのステロイドおよびＥＤＴＡ、亜鉛および他の適切なカチオンなどのキレート化剤を含む。
【０１３９】
酸類および塩類は、調剤に賦形剤として含まれてよい。使用されてよい酸類の例はこれに制限されないが、塩化水素酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、蟻酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸およびその組み合わせからなる群から選択されるものを含む。適切な塩類の例は、これに制限されないが、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、蟻酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウムおよびその組み合わせからなる群から選択されるものを含む。
【０１４０】
医薬製剤は、全てのタイプの調製を含み、特に、例えば、再構成可能な粉末だけでなく懸濁液または水溶液などの注入に適したものを含む。組成物中の結合体（すなわち、本明細書で記述される活性剤と重合体間で形成された結合体）の量は、多くの要因により変動するが、最適には、組成物が単回用量容器（例えば、バイアル）に保存される場合、医薬的に有効な量である。さらに、医薬製剤は、シリンジに保存されてよい。医薬的に有効な量は、どの用量が臨床的に所望するエンドポイントを生み出すかを判断するために、結合体の量の増加を繰り返し投与することにより実験的に判断されてよい。
【０１４１】
組成物中のあらゆる個々の賦形剤の量は、賦形剤の活性および組成物の特定の必要性により変動する。一般的に、最適なあらゆる個々の賦形剤の量は、日常的な実験、すなわち、異なる量の賦形剤（少量〜高量の範囲）を含む組成物の調製、組成物の安定性および他のパラメータの調査、そして次に最適な性能が著しい副作用なしに達成される範囲の判断を通して判断される。
【０１４２】
しかし、一般的に、賦形剤は、賦形剤の約１〜約９９重量％、好ましくは約５〜９８重量％、さらに好ましくは約１５〜９５重量％の量で組成物に含まれるが、３０重量％未満の濃度が最も好まれる。
【０１４３】
他の賦形剤と共に前述の医薬的賦形剤は、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（１９９５）、ｔｈｅ”Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”，５２ｎｄ  ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ（１９９８）およびＫｉｂｂｅ，Ａ．Ｈ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２０００に記述されている。
【０１４４】
本発明の医薬製剤は、一般的に、必要ではないが、注入により投与され、従って、一般的に、投与前直前には液状溶液または懸濁液である。医薬製剤は、シロップ、クリーム、軟膏、錠剤、粉末などの他の形状をとってもよい。他の投与方法は、肺、直腸、経皮、経粘膜、経口、クモ膜下、皮下、動脈内などを含んでよい。
【０１４５】
上述のように、結合体は、静脈内投与により、またはあまり好ましくないが、筋肉内または皮下投与により非経口的に投与される。経口的投与の適切な製剤タイプは、すぐに注入できる溶液、使用前に溶媒と混合される乾燥粉末、すぐに注入できる懸濁液、使用前にビヒクルと混合される乾燥不溶性組成物、および投与前に稀釈される乳濁液および液状濃縮物を含む。
【０１４６】
本発明は、結合体の治療に反応する状態を患う患者に、本明細書で提供される結合体を投与する方法も提供する。本方法は、一般的に、医薬的に有効な量の結合体（好ましくは、医薬製剤の一部として提供される）注入による投与を含む。投与方法は、特定の結合体の投与により改善または防止されるあらゆる状態を治療するために使用されてよい。当該分野の者は、結合体がどの状態を効果的に治療できるかを理解する。投与される実際の量は、患者の年齢、体重および全身状態だけでなく治療される状態の重度、医療従事者の判断および投与される結合体により変動する。医薬的な有効量は、当該分野の者に既知である／または適切な参考テキストおよび文献に記述されている。一般的に、医薬的な有効量は、約０．００１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲、好ましくは、０．０１ｍｇ／日〜７５ｍｇ／日の用量、より好ましくは、０．１０ｍｇ／日〜５０ｍｇ／日の用量である。
【０１４７】
任意の結合体（好ましくは、医薬製剤の一部として提供される）の単回用量は、医療従事者の判断、患者の必要性などにより、様々な投与スケジュールで投与されてよい。特定の投与スケジュールは、当該分野の者に既知である、または日常的な方法を使用して実験的に判断されてよい。例示的な投与スケジュールは、これに制限されないが、１日５回、１日４回、１日３回、１日２回、１日１回、週に３回、週に２回、週に１回、月に２回、月に１回、およびそのあらゆる組み合わせを含む。臨床的エンドポイントが達成されたら、組成物の投与は停止される。
【０１４８】
本発明はその好ましい特定の実施形態と共に記述されるが、面術の説明だけでなく以下の実施例は、本発明を図示しその範囲を制限するものではないことを理解する。本発明の範囲内の他の側面、利点および修正は、本発明が付随する分野の者に明らかである。特定の用語が本明細書で使用されるが、これらは一般的な記述的意味のみに使用され、目的を制限するものではない。
【０１４９】
実験
本発明の実施は、記述されない限り、当該分野内の有機合成、生化学、タンパク質精製などの従来の技術を使用する。このような技術は、文献に詳細に説明される。例えば、上記のＪ．Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２）を参照。
【０１５０】
以下の実施例において、使用される数値（例えば、用量、温度など）に関して、正確性を保つ努力がなされたが、実験的エラーおよびズレが考慮されるべきである。明示されない限り、温度は摂氏温度であり、圧力は海面気圧またはその近くである。以下の実施例のそれぞれは、当該分野の者に、本明細書で記述される一つ以上の実施形態を実行するための説明である。
【実施例】
【０１５１】
実施例１
ｍＰＥＧ（５，０００Ｄａ）−ＢＴＣの調製
アセトニトリル（３０ｍｌ）中のｍＰＥＧ（５，０００Ｄａ）−ＯＨ（ＭＷ５，０００，１５ｇ，０．００３モル）、ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩（４．０ｇの７０％混合物，０．０００９４５モル）およびピリジン（２．２ｍｌ）の溶液を一晩、窒素下、室温で攪拌した。ＮＭＲ分析は、得られたｍＰＥＧ（５，０００Ｄａ）−ＢＴＣは１００％置換され、反応混合物は０．００１２モルの残留ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩を含んでいることを示した。計算された量の精製水（０．０２５ｇ、ｄｉＢＴＣに対して過剰量を提供するように計算された）を添加し、混合物を３時間攪拌した。後続のＮＭＲ分析は、ｍＰＥＧ（５，０００Ｄａ）−ＢＴＣはまた１００％置換されたが、残留ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩は、完全に加水分解された。溶媒は、蒸留により除去され、残留物は真空下、室温で乾燥し、１Ｈ  ＮＭＲ分析により１００％置換を示す１４．８ｇの産物を得た。予想１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：３．２３ｐｐｍ（ｓ、−ＯＣＨ３，３Ｈ）、３．５１ｐｐｍ（ｓ、重合体骨格）、４．６２ｐｐｍ（ｍ、ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＯＣＯ２−、２Ｈ）、７．４１〜８．２１ｐｐｍ（複合マルチ、ベンゾトリアゾリルプロトン、４Ｈ）。
【０１５２】
実施例２
ｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−ＢＴＣの調製
アセトニトリル（４０ｍｌ）中のｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−ＯＨ（ＭＷ２０，０００、２０ｇ、０．００１モル）、ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩（３．４ｇの７０％混合物、０．００８０３モル）およびピリジン（３．０ｍｌ）の溶液を一晩、窒素下、室温で攪拌した。ＮＭＲ分析は、得られたｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−ＢＴＣは１００％置換され、反応混合物は０．００２７モルの残留ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩を含んでいることを示した。計算された量の精製水（０．０５０ｇ、ｄｉＢＴＣに対して過剰量を提供するように計算された）を添加し、混合物を３時間攪拌した。後続のＮＭＲ分析は、ｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−ＢＴＣはまた１００％置換されたが、残留ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩は、完全に加水分解された。得られた混合物は、直接、ｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−アミンの調製のために使用された。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：３．２３ｐｐｍ（ｓ、−ＯＣＨ３、３Ｈ）、３．５１ｐｐｍ（ｓ、重合体骨格）、４．６２ｐｐｍ（ｍ、ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＯＣＯ２−、２Ｈ）、７．４１〜８．２１ｐｐｍ（複合マルチ、ベンゾトリアゾリルプロトン、４Ｈ）。
【０１５３】
実施例３
ｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−ＢＴＣからのｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−アミンの調製
実施例２で調製されたアセトニトリル（４０ｍｌ）中のｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−ベンゾトリアゾリル炭酸塩（２０．０ｇ、０．００１モル）の溶液を滴下で２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；ＦＷ＝１４８．２１、３ｇ、０．０２０モル）に添加し、反応混合物は、窒素下、室温で２時間、攪拌された。次に、溶媒を蒸発乾固した。粗生成物は塩化メチレンに溶解され、イソプロピル（基）アルコールで沈殿させた。湿産物は、減圧下で乾燥させた。収量１８．２ｇ。予想１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：２．６４ｐｐｍ（ｔ、−ＣＨ２−アミン−、２Ｈ）、３．１１ｐｐｍ（ｑ、−ＣＨ２−ＮＨ−，）、３．２３ｐｐｍ（ｓ、−ＯＣＨ３、３Ｈ）、３．５１ｐｐｍ（ｓ、ＰＥＧ骨格）、４．０４ｐｐｍ（ｍ、−ＣＨ２−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、２Ｈ）、７．１１ｐｐｍ（ｔ、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、１Ｈ）。カチオン交換クロマトグラフィー：ｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−アミン９７．７％。
【０１５４】
実施例４
ｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−スクシニジヂル炭酸塩の調製
アセトニトリル（３００ｍｌ）中のｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−ＯＨ（ＭＷ２０，０００、６０ｇ、０．００３モル）、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル炭酸塩（２．４ｇ、０．００９３７モル）およびピリジン（６．５ｍｌ）の溶液を一晩、窒素下、室温で攪拌した。ＮＭＲ分析は、得られたｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）ジスクシンイミジル炭酸塩は１００％置換され、反応混合物は０．００３４モルの残留Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル炭酸塩を含んでいることを示した。計算された量の精製水（０．０９７ｇ、ｄｉＢＴＣに対して過剰量を提供するように計算された）を添加し、混合物を４時間攪拌した。後続のＮＭＲ分析は、またｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−スクシンイミジル炭酸塩は１００％置換されたが、残留Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル炭酸塩は、完全に加水分解された。溶媒は蒸発乾固され、残留物は、真空下で乾燥し、１Ｈ  ＮＭＲにより１００％置換を示す５６．８ｇの産物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：２．８０ｐｐｍ（ｓ、スクシンイミド、４Ｈ）、３．２３ｐｐｍ（ｓ、−ＯＣＨ３、３Ｈ）、３．５１ｐｐｍ（ｓ、重合体骨格）、４．６２ｐｐｍ（ｍ、ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＯＣＯ２−、２Ｈ）。
【０１５５】
実施例５
ｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−ＮＰＣの調製
アセトニトリル（３００ｍｌ）中のｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−ＯＨ（ＭＷ２０，０００Ｄａ、６０ｇ、０．００３モル）、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（ＮＰＣ）（１．９ｇ、０．００９４３モル）およびピリジン（６．５ｍｌ）の溶液を一晩、窒素下、室温で攪拌した。ＮＭＲ分析は、得られたｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−ＮＰＣは１００％置換され、反応混合物は０．００３４モルの残留ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートを含んでいることを示した。反応混合物を、小分子を循環させるが大部分の重合体種を除去するゲルカラム（ＤｕｏｌｉｔｅＡ−７アミンゲル）に通した。後続のＮＭＲ分析は、ｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−ＮＰＣはまた１００％置換されたが、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートの残留はなかった。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：３．３９ｐｐｍ（ｓ、−ＯＣＨ３、３Ｈ）、３．５８ｐｐｍ（ｓ、重合体骨格）、４．３７ｐｐｍ（ｍ、ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＯＣＯ２−、２Ｈ）、７．４４ｐｐｍ（ｍ、芳香族プロトン、２Ｈ）、８．２７ｐｐｍ（ｍ、芳香族プロトン、２Ｈ）。
【０１５６】
実施例６
ｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−ＮＰＣからのｍＰＥＧ（２２，０００Ｄａ）−プロピオン酸の調製
アセトニトリル中のｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−ＮＰＣ（実施例５からの６０．０ｇ、０．００３０モル）溶液に、ＰＥＧ（２，０００Ｄａ）−ａ−アミノ−ｗ−プロピオン酸（６．６ｇ、０．００３３モル）およびトリエチルアミン（１．８ｍｌ）を添加し、反応混合物をアルゴン環境下、室温で６時間攪拌した。次に、混合物を濾過し、溶媒を蒸発乾固した。粗生成物は、塩化メチレンに溶解され、イソプロピル（基）アルコールで沈殿させた。湿産物は、減圧下で乾燥させた。収量５４．３ｇ。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：２．４４ｐｐｍ（ｔ、−ＣＨ２−ＣＯＯ−、２Ｈ）、３．１１ｐｐｍ（ｑ、−ＣＨ２−ＮＨ−、２Ｈ）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、−ＯＣＨ３）、３．５１ｐｐｍ（ｓ、ＰＥＧ骨格）、４．０４ｐｐｍ（ｍ、−ＣＨ２−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、２Ｈ）、７．１１ｐｐｍ（ｔ、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、１Ｈ）。アニオン交換クロマトグラフィー：Ｍ−ＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−プロピオン酸９６．５％．
実施例７
ｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−ＢＴＣの調製
大規模合成
ｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−ＯＨ（２８ｋｇ）をアルゴン環境下で無水アセトニトリル（９３ｋｇ）に溶解した。混合物を分子ふるいカートリッジに通し、次に、カートリッジを５０Ｌのアセトニトリルで洗浄した。乾燥プロセスは、含水量が１００ｐｐｍ未満になるまで繰り返された。次に、事前に調製された混合物にアルゴン下で添加された泥状物を形成するために、別の管でジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩（１２８５ｇの４２％混合物）を約２０００ｍＬのアセトニトリルと混合した。別の管は、定量的な移行を強化するためにアセトニトリル（約２００ｍＬ）で２回洗浄した。ピリジン（２００ｍＬ）を次にアルゴン下で添加した後、３１ｏＣ±３ｏＣで１２時間、混合した。アセトニトリル（１Ｌ）で稀釈された水（約２０ｍＬ）を添加し、全反応混合物を３１ｏＣ±３ｏＣで６０分間、混合した。その後、反応混合物は減圧下で蒸留され、産物は回収され、冷却された。低含水量のイソプロパノール（５５１ｋｇ）を次に添加した。イソプロパノールの添加が完了した後、得られた沈殿物を最低３０分間混合した。その後、アルゴン下で、沈殿物を分離し、イソプロパノール（約９０ｋｇ）で洗浄した。最後に、沈殿物を真空下で乾燥させた。収率および産物合計量は、２２ｋｇ（７９％収量）であった。ＮＭＲ分析は、９８．６％の所望するｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−ＢＴＣと１．４％の開始ｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−ＯＨを含んでいることを示した。イソプロピル（基）ベンゾトリアゾリル炭酸塩は、検出されなかった。
【０１５７】
比較実施例８
ｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−ＢＴＣの調製
水処理をしない大規模の合成
実施例７に記述されるｍＰＥＧ（２０，０００Ｄａ）−ＢＴＣの大規模合成が繰り返されるが、水は残留ジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸塩を加水分解するために反応混合物に添加されない。ＮＭＲ分析は、最終産物が４４モル％のイソプロピル（基）ベンゾトリアゾリル炭酸塩を含んでいることを示した。従って、本実験は、活性炭酸塩試薬を分離および除去するための必要性を伴う大規模生産が可能であることを示す。しかし、沈殿物の損失は比較実験に基づき、１０〜２０％と予測される。