(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明誘電体基板と、
金属薄膜と、
光増感剤を含む層（光増感層）と
をこの順番で含み、
前記光増感層が、一重項酸素発生剤を含み、且つ、
前記金属薄膜と前記光増感層との間に、誘電体からなる層を有する
プラズモン励起センサチップ。
【請求項２】
前記光増感層が、誘電体をさらに含む請求項１に記載のプラズモン励起センサチップ。
【請求項３】
前記請求項１〜２のいずれかに記載のプラズモン励起センサチップの、前記光増感層が存在する表面にリガンドが結合しているプラズモン励起センサ。
【請求項４】
前記リガンドが抗体である請求項３に記載のプラズモン励起センサ。
【請求項５】
下記工程（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とするアッセイ法：
工程（ａ）：前記請求項３〜４のいずれかに記載のプラズモン励起センサに検体を接触させて、検体固定プラズモン励起センサを得る工程；
工程（ｂ）：前記検体固定プラズモン励起センサに、第２のリガンドと化学発光分子とからなる化学発光分子修飾リガンド複合体を接触させ、これらを反応させて、化学発光分子固定プラズモン励起センサを得る工程；
工程（ｃ）：前記化学発光分子固定プラズモン励起センサに、前記透明誘電体基板の、前記金属薄膜とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された前記化学発光分子から発光された蛍光量を測定する工程；および、
工程（ｄ）：前記工程（ｃ）で得られた測定結果から、前記検体中に含まれるアナライトの量を算出する工程。
【請求項６】
前記化学発光分子が、一重項酸素存在下で化学発光を発する分子である請求項５に記載のアッセイ法。
【請求項７】
前記化学発光分子修飾リガンド複合体が、前記化学発光分子と前記第２のリガンドとにより修飾された微粒子である請求項５〜６のいずれかに記載のアッセイ法。
【請求項８】
前記検体が、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも１種の体液である請求項５〜７のいずれかに記載のアッセイ法。
【請求項９】
前記請求項１〜２のいずれかに記載のプラズモン励起センサチップ；
検体を溶解または希釈するための溶解液または希釈液；
該プラズモン励起センサチップと検体との反応の際に用いる溶液；および、
洗浄試薬
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中のアナライトを高感度に検出するアッセイ法に関する。より詳細には、検体を基板に接触させ、これにより固定化された検体中のアナライトを、プラズモン励起を利用した化学発光測定を用いて高感度に検出するアッセイ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）とは、照射したレーザ光が金薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ）する条件において、金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、照射したレーザ光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金属薄膜近傍の蛍光色素を効率良く励起させることによって、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる方法である。このため、バイオアッセイの高感度化を図るために、近年ＳＰＦＳに基づくセンサ及びアッセイ法の研究・開発が種々行われている。
【０００３】
一方、アナライトと蛍光色素との結合反応中にリアルタイムで測定を行うことが可能な測定法として、一重項酸素を利用した化学発光アッセイが知られている。その代表例として、デイド・ベーリング社（現シーメンス・ヘルスケア社）のウルマンらによって開発されたＬＯＣＩ法（Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay）が挙げられる。このＬＯＣＩ法は、光増感剤を有する粒子（センシビーズ）と化学発光性化合物を有する粒子（ケミビーズ）とを用いて、検体中のアナライトの存在を化学発光の有無によって検出しようとする方法である（特許文献１，非特許文献１）。このＬＯＣＩ法は、検体中のアナライトによってセンシビーズとケミビーズとを結合させ、入射光の照射によってセンシビーズ上の光増感剤を励起して一重項酸素を発生させ、この一重項酸素がケミビーズ上の化学発光性化合物と反応して化学発光性活性分子種を形成させ、これがより安定な基底状態にさらに移行する際に蛍光を発することに基づいている。このＬＯＣＩ法は、すでにパーキンエルマー社により実用システムとして具現化されており、このセンシビーズとケミビーズも市販されている。
【０００４】
また、このＬＯＣＩ法に基づくアッセイ系では、光増感剤の励起波長より短波長の領域で化学発光によるシグナルを検出する構成が取られており、例えば、６８０ｎｍの励起光照射により５２０〜６２０ｎｍの化学発光を検出する構成が採用されている。このことから、検出光として赤色〜近赤外領域の波長に限定されず、緑色領域の波長を採用することができるので、ＣＣＤなどの多種多様の光検出系を選択可能な利点がある。
【０００５】
また、一重項酸素の分子寿命により、ＬＯＣＩ法をはじめとする一重項酸素を利用した化学発光アッセイ法では、アナライトと化学発光性化合物を有する粒子との結合反応中にリアルタイムで化学発光の測定を行うことが可能とされている。ＬＯＣＩ法の場合、センシビーズとケミビーズとが近接（２００ｎｍ未満）したときにはじめて発光が生じるとされている。
【０００６】
また、ＬＯＣＩ法を適用可能な測定装置として、閉鎖キュベットを多数配置したアッセイ反応の混合装置、および光ファイバーを用いた光源と光電子増倍管を用いた受光系を有する測定装置が、特許文献２の図２などに開示されている。
【０００７】
ただ、上述したＬＯＣＩ法をはじめとする公知の一重項酸素を利用した化学発光アッセイ法は、いずれも溶液あるいは懸濁液中でのホモジニアス系で用いられており、現在のところ、平面基板への適用、あるいは、プラズモン励起によるシグナル増強との組み合わせについては知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第３８９２９１２号公報
【特許文献２】特表平９−５１０６５６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, pp. 5426-5430, June 1994 Biochemistry
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＳＰＦＳによるアッセイ法では、金属薄膜で生じた電場増強効果が金属薄膜表面から２００ｎｍ程度の範囲にまで及ぶことから、アナライトを介して金属薄膜表面に固定された蛍光色素のみならず、金属薄膜表面に固定されていない蛍光色素をも励起して蛍光発光を生じさせる。このため、金属薄膜表面に固定されたアナライトと蛍光色素との結合反応終了後、蛍光測定に先立ち、金属薄膜表面に固定されなかった未反応の蛍光色素を洗浄して除去する工程を要している。このため、ＳＰＦＳによるアッセイ法ではアナライトと蛍光色素との結合反応中にリアルタイムで測定を行うことが困難であるという欠点がある。また、アナライトと蛍光色素との結合反応後に洗浄を行うことから、金属薄膜表面に固定された蛍光色素量の減少による検出蛍光シグナルの低下につながるとともに、検出蛍光シグナルのばらつきをも生じさせる欠点がある。洗浄後の時点での蛍光シグナルしか検出することができないことは、検出結果の信頼性にも影響を与える。さらに、これらの問題点は、測定に一定の時間が掛かることをも意味する。また、検出波長の面から見ても、ＳＰＦＳによるアッセイ法では、多くの場合可視波長域に吸収を有する金を金属薄膜に用いている関係上、近赤外領域に検出波長を設定する必要がある場合が多く、その場合、化学発光検出部として使用できる検出装置の種類に制約がある。
【００１１】
このため、表面プラズモンの電場増強効果による高感度測定の利益を得ながらも、アナライトと蛍光色素との結合反応中にリアルタイムで測定を行うことが可能であり、且つ信頼性もより高いアッセイ法が望まれている。
【００１２】
また、ＬＯＣＩ法をはじめとする公知の一重項酸素を利用した化学発光アッセイ法では、発光強度が低いために、アッセイ法として用いたときに充分な検出感度を得ることが困難であるという欠点がある。ＬＯＣＩ法のように、ホモジニアス系で測定を行う場合、上記ケミビーズのうち化学発光検出部に向いている側の表面からの化学発光しか計測の対象とならず、発生した化学発光の検出効率に一定の限界がある。また、化学発光を検出する上で、光源からの入射光によるノイズを除去する必要があるが、多くの場合、光源からの入射光によるノイズをフィルター等を用いて完全に除去することは困難である。そのため、パーキンエルマー社により実用化されているシステムのように、時間分解測定を用いて入射光の照射を終了した後に化学発光を検出する必要があり、測定手順が複雑となるばかりでなく、検出感度の点でも不利となる問題点がある。また、ＬＯＣＩ法では、上記ケミビーズのみならず、上記センシビーズも樹脂等を材料とする粒子であることから、ケミビーズがセンシビーズと非特異吸着する場合があり、検出シグナルの精度に一定の限界がある。
【００１３】
本発明は、このような問題点を克服するため、一重項酸素を利用した化学発光アッセイ法に対して、表面プラズモン励起を利用したアッセイ方法を組み合わせることにより、高い感度および精度を有しながら、リアルタイム測定や、緑色光での検出も可能とするようなアッセイ法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記の問題を解決すべく鋭意研究した結果、表面プラズモン励起を利用したアッセイ法において、ＬＯＣＩ法のような化学発光に基づく測定原理を取り入れることにより表面プラズモン励起による電場増強効果の利益を有しつつも、一重項酸素を用いた化学発光の原理に基づくリアルタイム測定が可能という利益も得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明のプラズモン励起センサチップは、
透明誘電体基板と、
金属薄膜と、
光増感剤を含む層（光増感層）と
をこの順番で含み、
前記光増感層が、一重項酸素発生剤を含み、且つ、
前記金属薄膜と前記光増感層との間に、誘電体からなる層を有することを特徴とする。
【００１６】
本発明のプラズモン励起センサチップの１つの好ましい態様において、光増感層は、誘電体をさらに含んでいる。
【００１７】
また、本発明のプラズモン励起センサは、前記プラズモン励起センサチップの、前記光増感層が存在する表面にリガンドが結合していることを特徴としており、典型的には、このリガンドは抗体である。
【００１８】
また、本発明のアッセイ法は、
工程（ａ）：前記プラズモン励起センサに検体を接触させて、検体固定プラズモン励起センサを得る工程；
工程（ｂ）：前記検体固定プラズモン励起センサに、第２のリガンドと化学発光分子とからなる化学発光分子修飾リガンド複合体を接触させ、これらを反応させて、化学発光分子固定プラズモン励起センサを得る工程；
工程（ｃ）：前記化学発光分子固定プラズモン励起センサに、前記透明誘電体基板の、前記金属薄膜とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された前記化学発光分子から発光された蛍光量を測定する工程；および、
工程（ｄ）：前記工程（ｃ）で得られた測定結果から、前記検体中に含まれるアナライトの量を算出する工程
を含むことを特徴とする。
【００１９】
本発明のアッセイ法において、化学発光分子は、通常、一重項酸素存在下で化学発光を発する分子である。
本発明のアッセイ法の望ましい態様では、化学発光分子修飾リガンド複合体は、化学発光分子と第２のリガンドとにより修飾された微粒子である。
【００２０】
本発明のアッセイ法においては、検体は、典型的には、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも１種の体液である。
また、本発明は、
プラズモン励起センサチップ；
検体を溶解または希釈するための溶解液または希釈液；
該プラズモン励起センサチップと検体との反応の際に用いる溶液；および、
洗浄試薬
を含むキットをも提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、表面プラズモン励起と化学発光とを組み合わせることにより、一重項酸素発生効率を高めることができ、通常ＳＰＦＳで用いられる測定系と同様の測定系を用いることができることから、極めて高感度のアッセイ法を提供することができる。また、ＳＰＦＳでは困難であった、リアルタイム測定や緑色領域での検出も可能となる。さらに、光増感剤の存在する担体表面にアビジン、ビオチンなどの複雑な表面修飾を施す必要がなくなり、光増感剤への化学発光分子の非特異吸着も抑えることができることから、従来のＬＯＣＩ法と比べて操作が簡便化された、より高精度のアッセイ法を提供することができる。
【００２２】
また、流路に送液を流しながら化学発光の測定を行うことができることから、送液中に含まれる酸素を、センサ上に形成された光増感層と充分に接触させることができ、これにより効率よく発生した一重項酸素を、センサ上に固定された化学発光分子に充分に接触させることができるので、さらに高感度の検出を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明に係るプラズモン励起センサおよびアッセイ法を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明について、図１を参照しながら具体的に説明する。
〔プラズモン励起センサ〕
本発明に係るプラズモン励起センサチップ１１は、透明誘電体基板１１１と、金属薄膜１１２と、光増感剤を含む層（以下、「光増感層」）１１３とをこの順番で含むことを特徴とする。
【００２５】
《透明誘電体基板》
本発明において、プラズモン励起センサチップ１１の構造を支持する誘電体基板として透明誘電体基板１１１が用いられる。本発明において、誘電体基板として透明誘電体基板１１１を用いるのは、後述する金属薄膜１１２への光照射をこの誘電体基板を通じて行うからである。
【００２６】
後述するように、この金属薄膜１１２は透明誘電体基板１１１の表面に形成されることから、本発明で用いられる透明誘電体基板１１１は、少なくとも金属薄膜形成用平面を有している。このような透明誘電体基板１１１の一例として、透明平面基板が挙げられる。また、本発明で用いられる透明誘電体基板１１１は、金属薄膜形成用平面に加えて、プリズム部、サンプル保持部などの他の構成要素をさらに含んでいてもよい。例えば、金属薄膜形成用平面、プリズム部およびサンプル保持部を含む一体化構造体ブロックであってもよい。
【００２７】
本発明で用いられる透明誘電体基板１１１について、本発明の目的が達せられる限り、材質に特に制限はない。例えば、この透明誘電体基板１１１が、ガラス製であってもよく、また、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などの光学樹脂製であってもよい。
また、透明誘電体基板１１１は、ｄ線（５８８ｎｍ）における屈折率〔ｎd〕が好ましくは１．４０〜２．２０である。
【００２８】
（１）透明平面基板
本発明で透明誘電体基板１１１として用いられる透明平面基板は、通常、ガラス製または、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などの光学樹脂製の透明平面基板である。
【００２９】
透明誘電体基板１１１としてガラス製の透明平面基板を用いる場合、市販品として、ＳＣＨＯＴＴ  ＡＧ社製のＢＫ７（屈折率〔ｎd〕１．５２）およびＬａＳＦＮ９（屈折率〔ｎd〕１．８５）、（株）住田光学ガラス製のＫ−ＰＳＦｎ３（屈折率〔ｎd〕１．８４）、Ｋ−ＬａＳＦｎ１７（屈折率〔ｎd〕１．８８）およびＫ−ＬａＳＦｎ２２（屈折率〔ｎd〕１．９０）、並びに（株）オハラ製のＳ−ＬＡＬ１０（屈折率〔ｎd〕１．７２）などが、光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。
【００３０】
プリズム部透明誘電体基板１１１として用いられる透明平面基板について、厚さが好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
【００３１】
透明誘電体基板１１１として用いられる透明平面基板は、その表面に金属薄膜１１２を形成する前に、その表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。
酸による洗浄処理としては、０．００１〜１Ｎの塩酸中に、１〜３時間浸漬することが好ましい。
プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製のＰＤＣ２００）中に、０．１〜３０分間浸漬させる方法が挙げられる。
【００３２】
（２）一体化構造体ブロック
本発明で透明誘電体基板１１１として用いられる一体化構造体ブロックは、金属薄膜形成用平面、プリズム部およびサンプル保持部を含む。この一体化構造体ブロックは、金属薄膜形成用平面とプリズム部とが一体化された構造を有しており、この金属薄膜形成用平面は、プリズム部における光反射面に位置する。また、一体化構造体ブロックは、この金属薄膜形成用平面を囲うように連続的に形成された側面構造を有しており、この側面構造と金属薄膜形成用平面とからなる凹部がサンプル保持部を構成している。すなわち、金属薄膜形成用平面はサンプル保持部の底面を構成し、側面構造はサンプル保持部の側面を構成する。本発明で透明誘電体基板１１１として一体化構造体ブロックを用いる利点としては、プラズモン励起センサチップの交換が容易となることから、アナライト検出のハイスループット化が可能となる点、および、金属薄膜形成用平面とプリズム部とが一体化された構造により金属薄膜形成用平面とプリズム部との界面における入射光の反射を抑制できる点にある。
【００３３】
この一体化構造体ブロックは、通常、ガラス製または樹脂製のブロックである。特に、価格、成形性、成形による光学特性低下の少なさなどの理由から、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などの光学樹脂製のブロックが、一体化構造体ブロックの用途に好適に用いられる。透明誘電体基板１１１として用いられる一体化構造体ブロックは、例えば、原料樹脂を射出成形することにより形成することができるし、日本ゼオン株式会社製  ＺＥＯＮＥＸ（登録商標）  ３３０Ｒ（屈折率１．５０）などの市販品を使用することもできる。なお、本発明で用いられる一体化構造体ブロックでは、金属薄膜形成用平面とプリズム部とが一体化されていることから大きさは特に限定されない。
【００３４】
なお、透明誘電体基板１１１として一体化構造体ブロックを用いる場合においても、その表面に金属薄膜１１２を形成する前に、その表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。酸による洗浄処理およびプラズマによる洗浄処理の条件は、透明誘電体基板１１１として透明平面基板を用いる場合と同様である。
【００３５】
《金属薄膜》
本発明に係るプラズモン励起センサチップ１１では、透明誘電体基板１１１の一方の表面に金属薄膜１１２が形成されている。この金属薄膜１１２は、光源からの照射光により表面プラズモン励起を生じさせる役割を有する。本発明においては、金属薄膜１１２で生じる表面プラズモン励起により、後述する光増感層１１３に含まれる光増感剤を励起させて活性分子を発生させ、この活性分子と後述する化学発光分子２２との反応を通じて化学発光を生じさせる。
【００３６】
透明誘電体基板１１１の一方の表面に形成される金属薄膜１１２としては、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、化学的安定性及び光学特性の面からは、金からなることがより好ましい。これらの金属については、その合金の形態であってもよく、また複数の金属を積層したものであってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる励起が大きくなることから好適である。
【００３７】
なお、透明誘電体基板１１１としてガラス製平面基板を用いる場合には、ガラスと上記金属薄膜１１２とをより強固に接着するため、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。
【００３８】
透明誘電体基板１１１上に金属薄膜１１２を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および／または金属薄膜１１２を形成することが好ましい。
【００３９】
金属薄膜１１２の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜２０ｎｍが好ましい。
【００４０】
電場増強効果の観点から、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜３ｎｍがより好ましい。
【００４１】
金属薄膜１１２の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜１１２であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
【００４２】
《光増感層》
本発明に係るプラズモン励起センサチップ１１では、前記金属薄膜１１２の表面に光増感層１１３が形成されている。この光増感層１１３は、光増感剤を含む層であり、光源からの照射光により前記金属薄膜１１２で生じた表面プラズモンを受けて、後述する化学発光分子２２を励起可能な活性分子４１を生じさせる役割を有する。
【００４３】
この光増感層１１３に含まれる光増感剤が発生させる活性分子４１は、化学発光分子２２と結合して化学発光性分子種を生成させることにより化学発光を生じさせる分子である。ただ、本発明においては、光増感剤が発生させる活性分子４１は、プラズモン励起センサチップ１１に固定化された化学発光分子２２を励起するが、溶液中に遊離状態で存在する化学発光分子修飾リガンド複合体２０に含まれる化学発光分子２２は励起させないような活性分子であることが求められ、このような活性分子として、一重項酸素など有限の分子寿命を有する準安定的な分子が挙げられる。このことから、本発明で用いられる光増感剤の典型例として、一重項酸素発生剤が挙げられる。一重項酸素発生剤として、フタロシアニン、ポリフィリン類、メチレンブルー（赤色官能性のもの）、ローズベンガル（緑色官能性のもの）、エンドペルオキシド、フラーレンＣ６０、ルブレン（黄色〜紫外線存在下で一重項酸素発生剤を発生させる。）などが挙げられ、このうち、本発明においては、フタロシアニン、メチレンブルー、ローズベンガルなどの色素が好適に用いられる。これらの色素分子の三重項状態は、一重項酸素と三重項酸素とのエネルギー差にほぼ等しい励起エネルギーを有している。そこで、光照射によりこれらの色素を光励起し、項間交差により三重項状態に移行させ、この三重項状態の色素分子と三重項酸素とを衝突させると、色素と酸素との間で電子およびエネルギーの交換が起こり、色素が基底状態に戻ると同時に、三重項酸素が一重項酸素に遷移する。このようにして、これらの色素への光照射により、一重項酸素が発生するのである。
【００４４】
本発明に係るプラズモン励起センサチップ１１はＳＰＦＳ用の測定システムを用いた系でのアッセイ法に用いられる。ここで、金属薄膜１１２として金が多用されることから、金による吸光の影響をすべく、通常６５０〜６８０ｎｍの入射光によるプラズモン励起によって一重項酸素を発生させる色素が好ましく用いられる。この点から、フタロシアニンが特に好適に用いられる。
【００４５】
本発明における光増感層１１３の厚さは、増強電場と金属消光の点から、通常、５ｎｍ以上５０ｎｍ以下である。
この光増感層１１３を形成する方法としては、金属薄膜１１２上に、光増感剤または光増感剤を含む適当な組成物を蒸着または塗布等する等の従来公知の方法が挙げられる。
【００４６】
《含誘電体層》
本発明に係るプラズモン励起センサチップ１１は、後述するリガンドをプラズモン励起センサチップ１１上に固定する土台を与えるとともに、プラズモン励起センサチップ１１表面に平滑性及び耐久性を付与するために、誘電体を含む層（以下、「含誘電体層」）を有していることが好ましい。
【００４７】
一つの態様において、含誘電体層は、誘電体を含む光増感層１１３（以下、「誘電体含有光増感層」）として存在している。この場合、プラズモン励起センサチップ１１において、光増感層１１３が、誘電体をさらに含んでいる。
【００４８】
また、別の態様において、含誘電体層は、光増感層１１３とは異なる層として存在していてもよい。ただ、一重項酸素などの活性分子４１は、通常、溶液中に含まれる前駆成分、例えば、三重項酸素として存在する溶存酸素が、光増感層１１３に含まれる光増感剤によって活性化されることにより発生することから、この光増感層１１３は、溶液と接触可能な位置に存在する必要がある。従って、含誘電体層が光増感層１１３とは異なる層として存在する場合、この含誘電体層は、光増感層１１３の機能を損ねないよう、通常の場合光増感層１１３の下、すなわち金属薄膜１１２と光増感層１１３との間に存在している（このような含誘電体層を「光増感層下含誘電体層」と称す。）。この光増感層下含誘電体層は、誘電体を含まない光増感層１１３と組み合わせて形成してもよいし、誘電体を含む光増感層１１３（すなわち、上記誘電体含有光増感層）と組み合わせて形成してもよい。光増感層下含誘電体層を設ける場合、光増感層の厚さや用いる誘電体の種類などにより厚さが変わるものの、通常５ｎｍ〜１０００ｎｍの厚さである。
【００４９】
さらに、上記誘電体含有光増感層と上記誘電体含有光増感層とを組み合わせた態様において、含誘電体層は、三次元網目状の骨格構造と三次元網目状の孔構造とを有する多孔質誘電体層に光増感剤が結合した形態を有する光増感層１１３（以下、「多孔質光増感誘電体層」と称す。）であってもよい。このような多孔質光増感誘電体層において、光増感剤は、例えば、多孔質誘電体層の表面、多孔質誘電体層が有する孔構造の内部、あるいはその両方に層状に存在している。含誘電体層がこのような多孔質光増感誘電体層である態様においては、含誘電体層が後述するリガンド１２を多数固定することができるので、高感度測定を行う上で有利である。また、含誘電体層が内部に流路類似構造を有するので、流路を通じて供給される溶液中の溶存酸素などを、層の表面に存在する光増感剤のみならず、この流路類似構造を通じて層の内部に含まれる光増感剤に対しても効率的に接触させることができ、それにより活性分子４１をより効率的に発生させることができるという利点もある。このような多孔質光増感誘電体層の厚さは、用いる誘電体の種類などにより変わるものの、４００ｎｍ〜２μｍであってもよく、４００ｎｍ〜１μｍであることがより好ましい。
【００５０】
このような含誘電体層を構成する誘電体として、チタニア、シリカなどの無機誘電体、および有機ポリマーなどの有機誘電体が挙げられる。プラズモン励起センサチップ１１をプラズモン励起センサ２０として用いたときに、測定シグナルにおけるノイズが少ない点から、無機誘電体、特にチタニア、シリカなどが好適に用いられる。なお、光増感層１１３が上記多孔質光増感誘電体層である場合には、多孔質構造を有する無機誘電体でもよいし、微粒子無機誘電体と、親水性ポリマー等からなるバインダー物質とからなる多孔質構造体でもよい。
【００５１】
この含誘電体層は、金属薄膜１１２の表面に光増感剤と誘電体とを含む適当な組成物を蒸着または塗布等することにより誘電体含有光増感層の形で形成することもできるし、あるいは、光増感層１１３を形成する前に、金属薄膜１１２の表面に誘電体を塗布等することにより光増感層下含誘電体層として形成することもできる。また、多孔質構造を有する無機誘電体を金属薄膜１１２の表面に形成させてなる基礎多孔質誘電体、あるいは、微粒子無機誘電体とバインダー物質との混合液を金属薄膜１１２の表面に塗布して得られる基礎多孔質誘電体に対して、光増感剤を含む溶液を接触等することにより多孔質光増感誘電体層として形成してもよい。いずれの場合にも、後述するリガンド１２をプラズモン励起センサチップ１１に固定するためのリガンド固定用結合基として、アミノ基、チオール基、カルボキシル基などの官能基をこの含誘電体層の表面に有していてもよい。
【００５２】
《プラズモン励起センサチップの製造方法》
本発明に係るプラズモン励起センサチップ１１は、透明誘電体基板１１１の表面に金属薄膜１１２を形成し、次いで、金属薄膜１１２の表面に光増感剤または光増感剤を含む適当な組成物を蒸着または塗布する等により光増感層１１３を形成することにより得られる。ここで、光増感剤を含む組成物として光増感剤と誘電体との混合物を用いることにより、誘電体を含む光増感層１１３（すなわち、誘電体含有光増感層）を有するプラズモン励起センサチップ１１を得ることができる。あるいは、光増感層１１３を形成する前に、金属薄膜１１２の表面に誘電体を塗布等することにより、上記光増感層下含誘電体層を有するプラズモン励起センサチップ１１を得ることもできる。
【００５３】
〔プラズモン励起センサ〕
本発明に係るプラズモン励起センサ１０は、前記プラズモン励起センサチップ１１の、前記光増感層１１３が存在する表面にリガンドが結合していることを特徴とする。
【００５４】
《リガンド》
本発明に係るプラズモン励起センサ１０では、上述したプラズモン励起センサチップ１１のうち、光増感層１１３を形成した側の表面にリガンド１２を結合させる。このリガンド１２は、プラズモン励起センサ１０に、検体中のアナライト３１を固定させる目的で用いられるものである。
【００５５】
本発明において、「リガンド」とは、検体中に含有されるアナライトを特異的に認識し（または、認識され）結合し得る分子または分子断片をいう。このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
「タンパク質」としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能）、抗ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体、抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体、抗ＰＳＡモノクローナル抗体などが挙げられる。
【００５７】
なお、本発明において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、遺伝子組換えにより得られる抗体、および抗体断片を包含する。
本発明においてリガンド１２として抗体が用いられる場合、化学発光分子２２をアナライト３１と結合させる目的で、後述するアッセイ法における工程（ｂ）においてもリガンドが用いられることがある。そのため、本発明においては、プラズモン励起センサ１０に予め固定されるリガンドを「第１のリガンド」と称し、後述する工程（ｂ）で用いられるリガンドを「第２のリガンド」と称することがある。
【００５８】
《リガンド固定態様》
本発明のプラズモン励起センサ１０において、プラズモン励起センサチップ１１への、リガンド１２の結合態様は特に限定されるものではない。
【００５９】
典型的な結合態様として、リガンド１２自体を前記光増感層１１３または前記含誘電体層の表面に結合させる態様が挙げられる。例えば、上記光増感層１１３または含誘電体層が上記リガンド固定用結合基をすでに有している場合、常法により、リガンド１２を光増感層１１３および含誘電体層の表面に直接結合させることができる。一方、上記含誘電体層が上記無機誘電体のみから形成されている場合など、上記含誘電体層が上記リガンド固定用結合基を有していない場合には、適当なリガンド固定用結合基を有するシランカップリング剤を作用させることにより、上記含誘電体層にリガンド固定用結合基を導入し、その後、このリガンド固定用結合基を介して常法によりリガンド１２を上記含誘電体層の表面に固定させてもよい。ここで導入されるリガンド固定用結合基は、上記含誘電体層の項で上述したリガンド固定用結合基と同様のものである。ただ、リガンド固定用結合基を有するシランカップリング剤を作用させる場合、必要により適宜シランカップリング剤の反応位置や濃度を調整することが好ましい。
【００６０】
〔アッセイ法〕
本発明に係るアッセイ法は、
工程（ａ）：プラズモン励起センサ１０に検体を接触させて、検体固定プラズモン励起センサを得る工程；
工程（ｂ）：前記検体固定プラズモン励起センサに、第２のリガンド２１と化学発光分子２２とからなる化学発光分子修飾リガンド複合体２０を接触させ、これらを反応させて、化学発光分子固定プラズモン励起センサを得る工程；
工程（ｃ）：前記化学発光分子固定プラズモン励起センサに、透明誘電体基板１１１の、金属薄膜１１２とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された化学発光分子２２から発光された蛍光量を測定する工程；および、
工程（ｄ）：前記工程（ｃ）で得られた測定結果から、前記検体中に含まれるアナライト３１の量を算出する工程
を含むことを特徴とする。
【００６１】
＜工程（ａ）＞
本発明のアッセイ方法において、工程（ａ）は、上述したプラズモン励起センサ１０に検体を接触させて、検体固定プラズモン励起センサを得る工程である。
【００６２】
本発明のアッセイ方法で測定対象とされるアナライト３１が検体中に含まれていると、図１に示すように、このアナライト３１がリガンド１２を介してプラズモン励起センサ１０に固定される。本発明では、このようにして検体中のアナライト３１が結合したプラズモン励起センサ１０を「検体固定プラズモン励起センサ」と称する。
【００６３】
検体
本発明において、「検体」とは、本発明のアッセイ法による測定対象となる種々の試料をいう。
【００６４】
「検体」としては、例えば、血液（血清・血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液が好ましい。これらは１種単独で用いてもよく、また、２種以上を併用してもよい。
なお、本発明の検出方法における検出対象となるアナライトが核酸等の場合には、後述する化学発光分子２２を予め導入した検体を上記「検体」として用いてもよい。
【００６５】
アナライト
本発明において「アナライト」は、上記光増感層１１３または含誘電体層の表面に固定化された第１のリガンド１２を特異的に認識され（または、認識し）結合し得る分子または分子断片を意味する。このような「分子」または「分子断片」として、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
【００６６】
接触
本発明において、「接触」とは、プラズモン励起センサのリガンド１２等が固定化されている面が送液中に浸漬されている状態で、この送液中に含まれる対象物をこのプラズモン励起センサと接触させることをいう。この「接触」によって、リガンド１２とアナライト３１とが結合したアナライト−リガンド複合体が形成される。工程（ａ）では、上記検体とプラズモン励起センサとの「接触」は、流路中に循環する送液に検体が含まれ、プラズモン励起センサのリガンドが固定化されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、プラズモン励起センサと検体とを接触させる態様が好ましい。
【００６７】
上記「流路」とは、微量な薬液の送達を効率的に行うことができ、反応促進を行うために送液速度を変化させたり、循環させたりすることができる直方体または管状のものである。ここで、この流路の形状として、プラズモン励起センサを設置する個所近傍は直方体構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は管状を有することが好ましい。
【００６８】
その材料としては、プラズモン励起センサ部ではメチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体；ポリエチレン等のポリオレフィンなどの光透過性の材質からなり、薬液送達部ではシリコーンゴム、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーを用いる。
【００６９】
ただし、プラズモン励起センサ部については、蛍光測定時に流路が一定の形状に保たれ、且つプラズモン励起により発生した蛍光の検出が妨げられない限り、必ずしもその流路構造の全てを光透過性の材質のみから構成する必要はない。すなわち、プラズモン励起センサ部の流路のうち、プラズモン励起により発生した蛍光を透過させて検出部に導くために必要な部分、具体的には蛍光の集光に必要な透光窓を含む部分については、光透過性の材質で構成する必要があるが、その他の部分については、その一部または全部を光透過性の材質以外の化学的に安定な材質で構成してもよい。プラズモン励起センサ部の流路が直方体構造を有する場合、光増感層１１３が表面に存在するプラズモン励起センサ２０の面を底面としたときに、例えば、この底面と対向する位置にある天井面を光透過性の材質で構成し、側面を光透過性の材質以外の化学的に安定な材質で構成してもよい。
【００７０】
ここで、前記その他の部分、例えば側面は、蛍光測定時に一定の形状が保たれる限り、必ずしも剛体である必要はなく、シール性を確保するために適度な弾性を有していてもよい。例えば、プラズモン励起センサ部の流路について、天井面をポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）で構成し、側面をシリコーンゴムで構成してもよい。
【００７１】
プラズモン励起センサ部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、プラズモン励起センサ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に１００ｎｍ〜１ｍｍ程度が好ましい。
【００７２】
流路において、薬物送達部からプラズモン励起センサ部に送液を導入する送液導入口、及びその送液をプラズモン励起センサ部から排出する送液排出口の位置は、いずれも、蛍光測定の妨げとならない限り特に限定されない。例えば、プラズモン励起センサ部の流路が直方体構造を有する場合、前記送液導入口及び送液排出口とも天井面に設けるのが流路の作成上簡便であるが、この送液導入口と送液排出口とのうちいずれか一方、あるいはその両方を側面に設けてもよい。
【００７３】
流路にプラズモン励起センサを固定する方法は、流路が一定の形状に保たれ、且つ蛍光測定が妨げられない限り特に限定されない。
このような固定方法の例としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、プラズモン励起センサの光増感層１１３が形成されている表面上に、一定の厚さを有するシリコーンゴム製シートまたはＯリングを載せることによって流路の側面構造を形成し、次いで、その上に送液導入口及び送液排出口を設けてある光透過性の天板（例えば、ＰＭＭＡ基板）を配置することによって流路の天井面を形成し、その後、これらを圧着して適当な留め具により固定する方法などが挙げられる。このとき、側面構造を構成する材料として、その中央部に任意の形状および大きさを有する穴を開けてある、適当な厚さを有するシリコーンゴム製シートを用いると、この穴の内周がプラズモン励起センサ部の流路の側面構造となることから、所要の形状および大きさを有する流路を容易に形成することができるので好ましい。例えば、まず、該プラズモン励起センサの光増感層１１３が形成されている表面に、流路高さ０．５ｍｍを有する穴あきポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを該プラズモン励起センサの光増感層１１３が形成されている部位を囲むようにして配置し、次いで、このポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートの上に、予め送液導入口及び送液排出口を設けてあるＰＭＭＡ基板を配置し、その後、該ＰＭＭＡ基板と該ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートと該プラズモン励起センサとを圧着し、ビス等の留め具により固定する方法が好ましい。また、プラズモン励起センサに、シリコーンゴム製シートまたはＯリングと光透過性の天板とを圧着し、固定するにあたっては、必要に応じて、シリコーンゴムまたはステンレスなどの材質でできた適当なスペーサーを併用してもよい。
【００７４】
また、工業的に製造される大ロット（工場レベル）では、流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品に直接金基板を形成するか或いは別途作製した金基板を固定し、金表面に誘電体層、ＳＡＭ層およびリガンド固定化を行った後、流路の天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。
【００７５】
なお、透明誘電体基板１１１として一体化構造体ブロックを用いる場合、サンプル保持部として側面構造がすでに形成されていることから、一体化構造体ブロックの上に送液導入口及び送液排出口を設けてある光透過性の天板（例えば、ＰＭＭＡ基板）を配置することによって流路の天井面を形成し、その後、これらを圧着して適当な留め具により固定することにより流路にプラズモン励起センサを固定することができる。
【００７６】
「送液」としては、検体を希釈した溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００７７】
送液を循環させる温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０〜４０℃×１〜６０分間、好ましくは３７℃×５〜１５分間である。
【００７８】
送液中の検体中に含有されるアナライトの初期濃度は、１００μｇ／ｍＬ〜０．０００１ｐｇ／ｍＬであってもよい。
送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常０．０００１〜２０ｍＬ、好ましくは０．０１〜１ｍＬである。
送液の流速は、通常１〜２,０００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは５〜５００μＬ／ｍｉｎである。
【００７９】
洗浄工程
洗浄工程とは、工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサの表面、および後述する工程（ｂ）を経て得られるプラズモン励起センサの表面のうち少なくともいずれか一方を洗浄する工程である。本発明に係るアッセイ法において、この洗浄工程が含まれていてもよい。
【００８０】
ただ、本発明に係るアッセイ法では、光増感層１１３から生じる活性分子４１の分子寿命のために、化学発光分子２２からの化学発光は、化学発光分子２２がプラズモン励起センサ１０の近傍に存在する場合にのみ生じる。したがって、化学発光分子２２からの化学発光は、実質上プラズモン励起センサ１０に固定された化学発光分子２２からの発光に限られ、溶液中に存在している化学発光分子修飾リガンド複合体２０からの発光は通常の場合考慮する必要がない。このことから、本発明に係るアッセイ法において、工程（ｂ）における洗浄工程は必須の工程ではなく、むしろ、リアルタイム測定を行うことができるよう、工程（ｂ）における洗浄工程が含まれないことが好ましい。
【００８１】
洗浄工程に使用される洗浄液としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を、工程（ａ）および（ｂ）の反応で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に溶解させ、好ましくは０．００００１〜１重量％含有するものが望ましい。
【００８２】
洗浄液を循環させる温度および流速は、工程（ａ）の「送液を循環させる温度および流速」と同じであることが好ましい。
洗浄液を循環させる時間は、通常０．５〜１８０分間、好ましくは５〜６０分間である。
【００８３】
＜工程（ｂ）＞
本発明の検出方法において、工程（ｂ）は、上述の工程（ａ）で得られた検体固定プラズモン励起センサに、第２のリガンド２１と化学発光分子２２とからなる化学発光分子修飾リガンド複合体２０を接触させ、これらを反応させて、化学発光分子固定プラズモン励起センサを得る工程である。図１を参照すると、この化学発光分子固定プラズモン励起センサにおいて、化学発光分子修飾リガンド複合体２０がアナライト３１を介してプラズモン励起センサ１０と結合している。これにより、後述する工程（ｃ）においてアナライト−リガンド複合体の生成量を化学発光の発光量の形で定量することが可能となる。
【００８４】
《化学発光分子修飾リガンド複合体》
本発明で用いられる化学発光分子修飾リガンド複合体２０は、第２のリガンド２１と化学発光分子２２とからなる。
【００８５】
第２のリガンド
本発明のアッセイ法において、第２のリガンド２１は、アナライト３１に化学発光分子２２による標識化を行う目的で用いられるリガンドであり、前記第１のリガンド１２と同じでもよいし、異なっていてもよい。ただし、第１のリガンド１２として用いる１次抗体がポリクローナル抗体である場合、第２のリガンド２１として用いる２次抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、該１次抗体がモノクローナル抗体である場合、２次抗体は、該１次抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。
【００８６】
化学発光分子
本発明において、「化学発光分子」とは、本発明において、一重項酸素等の活性分子との化学反応により励起することによって発光を生じる分子を意味する。
【００８７】
本発明で用いられる化学発光分子２２は、光増感層１１３で発生した活性分子と反応することにより化学発光を生じる分子であり、典型的には、一重項酸素存在下で化学発光を生じさせる分子である。この化学発光分子２２は、通常、電子豊富な化合物であり、一重項酸素と接触すると、化学発光分子２２と一重項酸素との間で化学反応が生じ、励起状態の中間分子種を形成する。その後、この中間分子種が、より安定な分子にさらに変化する際に、そのエネルギー差に対応する波長の蛍光を発生する。本発明においては、５００〜６２０ｎｍの波長範囲で発光を示すような化学発光分子が好ましく用いられる。このように入射光の波長より短波長側に離れた波長領域で検出を行うことにより、化学発光シグナルに対するノイズの影響を抑えることもできる。また、このような波長領域であれば、光電子増倍管以外にも、ＣＣＤなど多種多様の受光系を用いた検出を行うことが可能となる。このような分子として、ビスインドリルマレイミド、ルミノール、ルシゲニンル、ウミホタル・ルシフェリン、９−アルキリデンアクリダン類、エノールエーテル類、エナミン類および９−アルキリデンキサンタン類等の化合物が用いられる。
【００８８】
複合体の態様
本発明において、化学発光分子修飾リガンド複合体２０は、第２のリガンド２１と化学発光分子２２とからなるものであれば、その結合態様については特に限定されるものではない。ただ、プラズモン励起センサ１０上に固定されたアナライト３１に可能な限り多くの化学発光分子２２を結合させることにより高感度測定を可能とする観点からは、化学発光分子修飾リガンド複合体２０が、化学発光分子２２と第２のリガンド２１とにより修飾された微粒子であることが望ましい。
【００８９】
このような修飾微粒子の材料となる微粒子（以下、「基礎微粒子」）は、上記送液中で沈殿することなく懸濁可能な微粒子である。このような基礎微粒子として、ラテックス粒子など内部が疎水性で疎水性物質を内包可能な疎水性微粒子及びリポソームなど内水層内に親水性物質を内包可能な微粒子が挙げられる。
【００９０】
このうち、本発明で用いられるラテックス粒子は、水に懸濁可能且つ水に不溶性の粒状重合体物質であり、従来公知の方法により得ることができる。本発明においては、このラテックス粒子は、３０ｎｍ以上１００ｎｍの粒径を有することが好ましい。粒径が大きいほど、化学発光分子２２を多く固定することができ、発光シグナルが増大する利点があるものの、粒径が大きくなりすぎると、送液の中で抵抗を受けやすくなるおそれがある。
【００９１】
本発明で用いられるラテックス粒子は、予め化学発光分子２２を組み込んだ状態で得ることができる。例えば、特許第４２７７４７９号公報に開示されている方法のように、重合性エチレン性不飽和二重結合を有するビニルモノマーのラジカル重合によって得られたポリマーと化学発光分子２２とを有機溶剤中に溶解（或いは分散）し、水中で乳化後有機溶剤を除去する方法により、化学発光分子２２を含有するラテックス粒子として製造することができる。ここで用いられる重合性エチレン性不飽和二重結合を有するビニルモノマーとして、酢酸ビニル、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸ｔ−ブチル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸イソノニル、アクリル酸ドデシル、アクリル酸オクタデシル、２−フェノキシエチルアクリレート、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸オクタデシル、メタクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸ステアリル、メタクリル酸ベンジル、メタクリル酸グリシジル、メタクリル酸フェニル、スチレン、α−メチルスチレン、アクリロニトリル等、アセトアセトキシエチルメタクリレート、メタクリル酸グリシジルの大豆油脂肪酸変性品（ブレンマーＧ−ＦＡ：日本油脂社製）等が挙げられる。ここで、アミノ基、カルボキシル基等の適当な官能基を有するモノマーを上記重合性エチレン性不飽和二重結合を有するビニルモノマーに混合して用いることにより、ラテックス粒子に、第２のリガンド２１の固定化に用いられる官能基を導入することができる。
【００９２】
一方、本発明で用いられるリポソームは、ある体積の水または水溶液を包囲する両親媒性二重層からなる外殻を有し、且つ、通常１０ｎｍ以上１００μｍ以下の粒径を有している。ここで用いられる両親媒性二重層は、通常、リン脂質などの混合脂質成分からなるものである。
【００９３】
このようなリポソームを製造する方法は特に限定されないものの、リポソーム表面に効率的な修飾が可能となる点からは、例えば、膜乳化法、撹拌乳化法、液滴法、接触法孔膜等を用いた２段階乳化法を用いることができ、膜乳化法を用いた２段階乳化法にあっては、マイクロチャネル乳化法およびシラス多孔質ガラス膜（以下、「ＳＰＧ膜」）を用いた乳化法が好適に用いられる。典型的な手順としては、
（i）一次乳化工程において、水と混和しにくい適当な有機溶媒（Ｏ）に、混合脂質成分を含む第１の水相（Ｗ１）を分散させることによりＷ１／Ｏエマルションを形成させ、
（ii）引き続く二次乳化工程において、このＷ１／Ｏエマルションを、第２の混合脂質成分存在下適当な乳化方法を用いて第２の水相（Ｗ２）に分散させることによりＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを形成させ、
（iii）その後、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションに含まれる有機溶媒（Ｏ）を除去する
ことにより、リポソームを形成することができる。例えば、膜乳化法が用いられる場合には、二次乳化工程で例えば所要の孔径を有するマイクロチャネルまたはＳＰＧ膜を用いることにより、Ｗ１／Ｏエマルションを第２の水相（Ｗ２）に分散させることができる。
【００９４】
リポソームの製造に用いられる混合脂質成分の配合組成は特に限定されるものではないが、一般的にはリン脂質（動植物由来のレシチン；ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸またはそれらの脂肪酸エステルであるグリセロリン脂質；スフィンゴリン脂質；これらの誘導体等）と、脂質膜の安定化に寄与するステロール類（コレステロール、フィトステロール、エルゴステロール、これらの誘導体等）とを中心に構成され、さらに糖脂質、グリコール、脂肪族アミン、長鎖脂肪酸（オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸等）、その他各種の機能性を賦与する化合物が配合されていてもよい。本発明では、上記リン脂質としてジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）等の中性リン脂質が慣用される。混合脂質成分の配合比は、脂質膜の安定性やリポソームの生体内での挙動などの性状を考慮しながら、用途に応じて適切に調整すればよい。
【００９５】
また、第２の混合脂質成分は、一次乳化工程で用いられる混合脂質成分と同様の成分を用いることができ、一次乳化工程で用いられる混合脂質成分と同一の組成であっても、異なる組成であってもよい。ここで、本発明では、この第２の混合脂質成分に、アミノ基、カルボキシル基等の適当な官能基を有する脂質成分を含ませることにより、第２のリガンド２１及び化学発光分子２２を固定可能な官能基をリポソーム表面に導入することが好ましい。このような適当な官能基を有する脂質成分として、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）等が挙げられ、また、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨのようにＰＥＧ基等のリンカー部分を介して官能基が導入されているものであってもよい。また、リポソームの表面をプルラン等の多糖類で被覆し、さらに置換したアミノエチルカルバミルメチル基にγ−マレイミドブチルオキシサクシニミジルを介して抗体フラグメントを結合させる方法も知られている。
【００９６】
なお、二次乳化工程において、第２の水相（Ｗ２）が、タンパク質、多糖類および非イオン性界面活性剤などの分散剤を含んでいてもよい。
このようにして得られたラテックス粒子およびリポソームなどの基礎微粒子に対しては、従来公知のカップリング法を用いて、第２のリガンド２１及び化学発光分子２２を固定化させることができる。例えば、活性エステル法、アミンカップリング、ヨードアセトアミドとチオール基との反応に基づくカップリング法、および、ビオチン−ストレプトアビジン結合などの親和性を利用した方法などの常法を用いて固定化することができる。なお、化学発光分子２２を含有するラテックス粒子などのように、基礎微粒子を製造する際に化学発光分子２２が導入されている微粒子に対しては、第２のリガンド２１のみを同様の方法により固定化させてもよい。
【００９７】
このように作製された化学発光分子修飾リガンド複合体２０の送液中の濃度は、０.００１〜１０,０００μｇ／ｍＬが好ましく、１〜１,０００μｇ／ｍＬがより好ましい。
【００９８】
＜工程（ｃ）＞
本発明の検出方法において、工程（ｃ）は、工程（ｂ）で得られた化学発光分子固定プラズモン励起センサに、透明誘電体基板１１１の、金属薄膜１１２とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された前記化学発光分子２２から発光された蛍光量を測定する工程である。
【００９９】
工程（ｃ）は、通常、化学発光分子修飾リガンド複合体２０に結合した化学発光分子２２からの蛍光発光（本発明において「化学発光」と呼ぶことがある。）を検出することにより行われ、具体的には、工程（ｂ）により得られたプラズモン励起センサについて、透明誘電体基板１１１の、金属薄膜１１２とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、表面プラズモン共鳴を通じて励起された光増感層１１３から活性分子４１を発生させ、この活性分子４１との反応によって化学発光分子２２から発光された蛍光量（本発明において「化学発光量」と呼ぶことがある。）を測定することにより行われる。
【０１００】
本発明のアッセイ法においては、一重項酸素などのように分子寿命の短い活性分子４１を介在させて化学発光を生じさせていることから、プラズモン励起センサ１０に固定されている化学発光分子２２だけが化学発光することになり、工程（ｃ）での測定に際して未反応の化学発光分子修飾リガンド複合体２０を洗浄により除去する必要がない。このことから、本発明のアッセイ法では、工程（ｃ）を工程（ｂ）と同時に行うリアルタイム測定を行うことが可能である。リアルタイム測定が可能であるということは、反応開始からの化学発光量の増加速度から反応終了時における化学発光量を推測することが可能であることを意味し、短時間測定を行う上で有利な点である。また、ＳＰＦＳに基づくアッセイ法では未反応の蛍光色素などを除去するために行う必要のあった工程（ｂ）と工程（ｃ）との間の洗浄工程も不要であるということから、短時間測定が可能となる利点がある。
【０１０１】
光学系
本発明で用いる光源は、前記金属薄膜１１２にプラズモン励起を生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザ光を光源として用いることが好ましい。レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
【０１０２】
レーザ光の照射により、全反射減衰条件（ＡＴＲ）において、金属薄膜１１２の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十〜数百倍に増えたフォトンにより光増感層１１３に含まれる光増感剤を励起し、一重項酸素等の活性分子４１を発生させる。そして、この活性分子４１が化学発光分子２２と化学反応を起こして励起状態の中間分子種を形成し、この中間分子種がさらに、より安定な状態の反応生成物に変化する際にそのエネルギー差に対応する波長の蛍光を生じさせる。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、透明誘電体基板１１１の屈折率、金属薄膜１１２の金属種および膜厚に依存するが、通常、金では約１０〜２０倍の増加量となる。
【０１０３】
「レーザ光」としては、例えば、波長２００〜９００ｎｍ、０.００１〜１,０００ｍＷのＬＤ（laser diode）レーザ、波長２３０〜８００ｎｍ（金属薄膜１１２に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。）、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザなどが挙げられる。
【０１０４】
「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン励起センサに効率よく入射することを目的としており、屈折率が透明誘電体基板１１１と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明平面基板」の市販品と同様のものが挙げられる。なお、プリズムは、一体化構造体ブロックのプリズム部として上記透明誘電体基板１１１に組み込まれていてもよい。
【０１０５】
「光学フィルタ」としては、例えば、減光（ＮＤ）フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。「減光（ＮＤ）フィルタ」（または、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
【０１０６】
「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）、酵素蛍光基質の自家蛍光、などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
【０１０７】
「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製またはオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【０１０８】
「化学発光検出部」としては、ＳＰＦＳの検出に通常用いられる検出系を用いることができ、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適である。本発明に係るアッセイ法では、検出される化学発光の波長が通常入射光の波長よりも短く、緑色付近の波長領域になるような検出波長を選択することも可能であることから、ＣＣＤイメージセンサなどの多種多様な受光系を用いた検出を行うことが容易となる利点がある。
【０１０９】
また、本発明のアッセイ法では、ＳＰＦＳに基づくアッセイ法と同様、化学発光検出部に対してプラズモン励起センサ１０の反対側に光源が位置し、且つ全反射条件で測定が行われる。したがって、化学発光の検出にあたっては、ＬＯＣＩ法等プラズモン励起を利用しない化学発光アッセイ系のように、時間分解測定を行う等、入射光によるノイズを排除するための特別な手段を別途要しない。
【０１１０】
駆動装置
本発明において、上記光学系は「駆動装置」の形で統合されていてもよい。本発明の駆動装置は、上記プラズモン励起センサを用いて、本発明を実施するためのものである。
【０１１１】
「駆動装置」としては、少なくとも光源、各種光学フィルタ、プリズム、カットフィルタ、集光レンズおよび化学発光検出部を含むものとする。なお、検体液、洗浄液などを取り扱う際に、プラズモン励起センサと組み合った送液系を有することが好ましい。送液系としては、本発明の目的が達せられる限り、その種類を問わない。例えば、液ポンプと連結したマイクロ流路デバイスなどでもよい。
【０１１２】
また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出部、すなわちＳＰＲ専用の受光センサとしてのフォトダイオード、ＳＰＲおよびＳＰＦＳの最適角度を調製するための角度可変部（サーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、３０〜８５°の角度変更を可能とする。分解能は０．０１°以上が好ましい。）、化学発光検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。
【０１１３】
光源、光学フィルタ、カットフィルタ、集光レンズおよび化学発光検出部の好ましい態様は上述したものと同様である。
「送液ポンプ」としては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ、送り精度が高く脈動が少なく好ましいが循環することができないシリンジポンプ、簡易で取り扱い性に優れるが微量送液が困難な場合があるチューブポンプなどが挙げられる。
【０１１４】
＜工程（ｄ）＞
本発明の検出方法において、工程（ｄ）は、工程（ｃ）で得られた測定結果から検体中に含まれるアナライト３１の量を算出する工程である。
【０１１５】
より具体的には、既知濃度の標的抗原もしくは標的抗体での測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中の標的抗原量もしくは標的抗体量を測定シグナルから算出する工程である。
【０１１６】
アッセイＳ／Ｎ比
さらに、工程（ｄ）においては、上記工程（ａ）の前に測定した“ブランク発光シグナル”、上記工程（ｃ）で得られた“アッセイ発光シグナル”、および何も修飾していない金属基板を流路に固定し、超純水を流しながらＳＰＦＳを測定して得られたシグナルを“初期ノイズ”としたとき、下記式（１ａ）で表されるアッセイＳ／Ｎ比を算出することができる：
アッセイＳ／Ｎ比＝｜Ｉa／Ｉo｜／Ｉn        （１ａ）
（上記式（１ａ）において、Ｉaはアッセイ発光シグナル、Ｉoはブランク発光シグナル、Ｉnは初期ノイズである）。
【０１１７】
ただし、アッセイＳ／Ｎ比を算出するにあたっては、実用上、上記式（１ａ）に代えて、検体中に含まれるアナライト３１の濃度が０の場合における"アッセイノイズシグナル"を基準として、下記式（１ｂ）にしたがって算出してもよい：
アッセイＳ／Ｎ比＝｜Ｉa｜／｜Ｉan｜        （１ｂ）
（上記式（１ｂ）において、Ｉanはアッセイノイズシグナル、Ｉaは上記式（１ａ）の場合と同様にアッセイ発光シグナルである）。
【０１１８】
〔キット〕
本発明のキットは、本発明のアッセイ法に用いられることを特徴とするものであって、本発明のアッセイ法を実施するにあたり、第１のリガンド１２と化学発光分子修飾リガンド複合体２０と検体とを除き必要とされるすべてのもの、例えば、１次抗体、抗原などのリガンド（すなわち、検体中に含まれるアナライト３１は、抗原とは限らず、抗体であってもよい。）と検体と２次抗体とを除き必要とされるすべてのものを含むことが好ましい。
【０１１９】
例えば、本発明のキットと、検体として血液または血清と、特定の腫瘍マーカーに対する抗体とを用いることによって、特定の腫瘍マーカーの含有量を、高感度かつ高精度で検出することができる。この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。
【０１２０】
具体的には、上記プラズモン励起センサチップ２０；検体を溶解または希釈するための溶解液または希釈液；プラズモン励起センサチップ２０と検体との反応の際に用いる溶液；および、洗浄試薬を含み、さらに、本発明のアッセイ法を実施するために必要とされる各種器材または資材や上記「駆動装置」を含めることもできる。
【０１２１】
さらに、キット要素として、検量線作成用の標準物質、説明書、多数検体の同時処理ができるマイクロタイタープレートなどの必要な器材一式などを含んでもよい。
【実施例】
【０１２２】
［光増感剤の調整方法］
（R-1：光増感層塗布液の調整）
丸底フラスコに湯浴を付し、酢酸エチル５００ｇを加熱還流し、さらにステアリルメタクリレート２０ｇ、メチルメタクリレート５０ｇ及び２−アセトアセトキシエチルメタクリレート３０ｇ、Ｎ，Ｎ′−アゾビスイソバレロニトリル０．１ｇを各々溶解した混合液を２時間かけて滴下し、同温度にて１０時間反応させてポリマーの酢酸エチル溶液を得た。
この樹脂溶液を５ｍｌ計量し、更に銅フタロシアニンを１ｍｇ加えて撹拌し、光増感剤塗布液R-1を調整した。
【０１２３】
（R-2：光増感層塗布液の調整）
ポリビニルブチラールBL-S（積水化学社製）１００ｇを５００ｍｌの酢酸エチルに溶解した溶液を５ｍｌ計量し、更に銅フタロシアニンを１ｍｇ加えて撹拌し、光増感剤塗布液R-2を調整した。
【０１２４】
［標識抗体微粒子の調整方法］
〈ポリマーの合成〉
３リットルの四つ口フラスコに滴下装置、温度計、窒素ガス導入管、撹拌装置及び還流冷却管を付し、酢酸エチル１０００ｇを加熱還流した。更にスチレン６０ｇ、ラウリルメタクリレート１０ｇ、ステアリルメタクリレート１０ｇ、アセトアセトキシエチルメタクリレート１０ｇ、メタクリル酸１０ｇ、更にＮ，Ｎ’−アゾビスイソバレロニトリル４ｇを前記モノマーに加えた混合液を２時間かけて滴下し、７０℃にて５時間反応させた後、ポリマー溶液を得た。
【０１２５】
〈ルミネッセンス化合物微粒子の製造〉
クレアミックスＣＬＭ−０．８Ｓ（エムテクニク（株）社製）のポットに、ルミノール１５ｇ、前記ポリマー溶液２０ｇ、ポリビニルブチラールＢＬ−Ｓ（積水化学社製）１０ｇ及び酢酸エチル１４０ｇを入れ、攪拌を行った。純水２４５ｇにアクアロンＫＨ−０５（第一工業製薬社製）１５ｇを加え、これを染料溶液に添加後、回転数２００００ｒｐｍで５分間乳化した。その後、減圧下で酢酸エチルを除去し、ルミネッセンス化合物微粒子の分散液を得た。
【０１２６】
〈ルミネッセンス標識抗体の調整〉
前記ルミネッセンス化合物微粒子１０ｍｇを秤量し、２５ｍＭ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）バッファー （pH 6.0） 1 mLに溶解後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ：(株)同人化学研究所製）50 mM、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ：Thermo Scientific社製）50 mMによりルミネッセンス化合物微粒子のカルボキシル基を活性化させた。1.4 mg/mL 抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（６Ｄ２、ミクリ免疫研究所（株）製）、100 uLに添加し（10当量）、室温で1時間反応させて微粒子に反応させた。 反応後、遠心式限外ろ過（Millipore社製）により精製することで、ルミネッセンス化合物微粒子標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液を得た。得られた抗体溶液はタンパク質、蛍光色素濃度を吸光度測定器により定量後、４℃で保存した。
【０１２７】
［比較標識抗体の調整方法］
（標識二次抗体１：「Alexa Fluor 647」標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体の調製）
抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（６Ｄ２、２．５ｍｇ／ｍＬ、ミクリ免疫研究所（株）製）を、市販のAlexa Fluor647ラベリングキット（Molecular Probes社製）により調製し、Alexa Fluor 647標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液（比較標識抗体１）を得た。得られた抗体溶液はタンパク質、蛍光色素濃度を吸光度測定器により定量後、４℃で保存した。
【０１２８】
［参考例１］光増感剤をデキストラン層に含有するセンサー基板
（工程１：金属膜の形成）
厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板「S-LAL 10」（(株)オハラ製。屈折率〔ｎd〕＝１．７２）を、プラズマドライクリーナーでプラズマ洗浄した。プラズマ洗浄された基板表面に金膜をスパッタリング法により形成した。金膜の厚さは４８ｎｍであった。
【０１２９】
（工程２：固定化膜の形成）
前記工程１により得られた透明基板を、１０−アミノ−１−デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に１２時間以上浸漬し、金属膜の基板側ではない片面にＳＡＭ（Ｓｅｌｆ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜）を形成した。この基板を、前記エタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールでそれぞれ洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。得られた基板をカルボキシメチルデキストラン（名糖産業（株）製、分子量５００万、置換度１．０８）１ｍｇ／ｍＬ水溶液に浸漬した。更に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ：(株)同人化学研究所製）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ：Thermo Scientific社製）をそれぞれ０．５ｍＭになるように加え１．５時間室温で反応させ、ＳＡＭのアミノ基末端とカルボキシメチルデキストランのカルボキシル基とのアミドカップリングを行うことによりカルボキシメチルデキストランを固定化させた。 反応終了後、１ N水酸化ナトリウム水溶液を基板表面に滴下し、室温で３０分反応させることにより、活性化したカルボキシル基をカルボン酸に変換した。このようにして、カルボキシメチルデキストランが表面に固定化されたプラズモン励起センサチップが得られた。
【０１３０】
（工程３：一次抗体固定化）
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ：(株)同人化学研究所製）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ：Thermo Scientific社製）それぞれ１００ｍＭを含む２５ｍＭ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）  バッファー、 １０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）混合液を、前記工程２により得られたプラズモン励起センサチップに滴下し、２０分室温で反応させ、当該センサチップに組み込まれているカルボキシメチルデキストランを活性エステル化した。
【０１３１】
続いて3,7-ビス（アミノエチルアミノ）フェノチアジニウムクロリド（光増感剤）０．１ ｍＭ（２５ ｍＭ MESバッファー、１０ ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０））を滴下し室温で３０分反応させ、光増感剤をカルボキシメチルデキストランに固定した。
【０１３２】
その後、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、１．８ｍｇ／ｍＬ、ミクリ免疫研究所（株）製）（第一のリガンド）を、当該抗体が５０μｇ／ｍＬとなるよう２５ｍＭ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）  バッファー、 １０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）にて希釈して得られた溶液を、前記基板に滴下し、室温で３０分反応させ、当該第一のリガンドを前記カルボキシメチルデキストランに連結した。反応終了後、１ Nの水酸化ナトリウムを基板表面に滴下し、室温で３０分反応させることにより、活性エステル化されていたカルボキシル基をカルボン酸に変換した。
最後に、１％ＢＳＡ−ＴＢＳバッファー（ｐＨ７．４）溶液を基板に滴下し、４０分間室温で反応させることによってブロッキング処理をし、プラズモン励起センサを得た。
【０１３３】
（工程４：流路の構築）
工程３で得られたプラズモン励起センサのうちの抗体が結合された側の面に、測定領域を形成するための、流路長７ｍｍ、幅２ｍｍの厚さ２ｍｍのポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製流路を載せた。このＰＭＭＡ製流路には、送液導入用の穴（送液導入口）および送液排出用の穴（送液排出口）が形成されている。これらセンサ基板、およびＰＭＭＡ製流路の積層物を外周部で圧着してビスで固定し、プラズモン励起センサ部を構築した。
【０１３４】
このプラズモン励起センサ部の送液導入口および送液排出口に、シリコーンゴム製のチューブおよびペリスタポンプを連結した（以下、特に記載しない限り、各種流体の送液および循環をすべてこのようなチューブおよびペリスタポンプを用いて行った）。
【０１３５】
（工程５：シグナルの測定）
前記工程１〜４により製造されたプラズモン励起センサに、まず、ＡＦＰ（２．０ｍｇ／ｍＬ溶液、Acris Antibodies GmbH社）が０．１ｎｇ／ｍＬとなるようＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を、５０００μＬ／ｍｉｎにて２５分間フローさせた。
【０１３６】
つづいて、前述のようにして調製したルミネッセンス化合物微粒子標識二次抗体抗ＡＦＰモノクローナル抗体（蛍光色素前駆体修飾リガンド複合体）が１０μｇ／ｍＬとなるよう１％ＢＳＡ−ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を、５０００μＬ／ｍｉｎにて５分間フローさせ、第二のリガンドが固定されたプラズモン励起センサを得た。
【０１３７】
このようにして得られたプラズモン励起センサについての発光シグナルを、ＳＰＦＳ測定用の装置を用いて測定した。第二のリガンドが固定された表面プラズモン励起センサの裏側からプリズムを経由してレーザー光（６４０ｎｍ、４０μＷ）を照射し、センサ表面から発せられる蛍光量をＣＣＤで測定した。この測定値を「アッセイ発光シグナル」とした。
【０１３８】
一方、参考例１の前記工程１〜４より同様に製造された別のプラズモン励起センサについて、上記工程５の最初のステップでＡＦＰ（２．０ｍｇ／ｍＬ溶液、Acris Antibodies GmbH社）が０．１ｎｇ／ｍＬとなるようＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液のかわりに、ＡＦＰを全く含まない（０ｎｇ／ｍＬ）１％ＢＳＡ−ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）をフローさせた以外は上記と同じ手順で蛍光量を測定し、その測定値を「アッセイノイズシグナル」とした。
【０１３９】
［実施例２］
参考例１において、工程１〜３を下記のように変更した以外は参考例１と同様にしてプラズモン励起センサチップおよびプラズモン励起センサを製造し、アッセイ発光シグナルおよびアッセイノイズシグナルを測定した。
【０１４０】
（工程１：金属膜の形成）
厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板「S-LAL 10」（(株)オハラ製。屈折率〔ｎd〕＝１．７２）を、プラズマドライクリーナーでプラズマ洗浄した。プラズマ洗浄された基板表面に金膜をスパッタリング法により形成した。金膜の厚さは５０ｎｍであった。更に酸化チタンを直接スパッタリング法により堆積させて、金膜表面に膜厚１０nmの酸化チタン層を形成した。
【０１４１】
（工程２：光増感層の形成）
前記工程１により得られた透明基板に、スピンコータを用いて上記光増感層塗布液R-1を塗布し乾燥膜厚１０nmの光増感層を形成した。この光増感層の表面に０．１N水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、光増感層の最表面のエステル結合を加水分解してカルボキシル基を形成させた。更に０．０２ｇの１,４−ジアミノブタンと０．１ｇのジシクロヘキシルカルボジイミドを溶解した酢酸エチル溶液５ｍｌを作用させて基板表面にアミノ基を導入した。基板をカルボキシメチルデキストラン（名糖産業（株）製、分子量５００万、置換度１．０８）１ｍｇ／ｍＬ水溶液に浸漬した。更に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ：(株)同人化学研究所製）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ：Thermo Scientific社製）をそれぞれ０．５ｍＭになるように加え１．５時間室温で反応させ、アミノ基末端のＳＡＭとデキストランのカルボキシル基とのアミドカップリングを行うことによりカルボキシメチルデキストランを固定化させた。 反応終了後、１ N水酸化ナトリウム水溶液を基板表面に滴下し、室温で３０分反応させることにより、活性化したカルボキシル基をカルボン酸に変換した。このようにして、カルボキシメチルデキストランが表面に固定化されたプラズモン励起センサチップが得られた。
【０１４２】
（工程３：一次抗体固定化）
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ：(株)同人化学研究所製）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ：Thermo Scientific社製）それぞれ１００ｍＭを含む２５ｍＭ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）  バッファー、 １０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）混合液を、前記工程２により得られたプラズモン励起センサチップに滴下し、２０分室温で反応させ、当該センサチップに組み込まれているカルボキシメチルデキストランを活性エステル化した。
【０１４３】
続いて、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、１．８ｍｇ／ｍＬ、ミクリ免疫研究所（株）製）（第一のリガンド）を、当該抗体が５０μｇ／ｍＬとなるよう２５ｍＭ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）  バッファー、 １０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）にて希釈して得られた溶液を、前記基板に滴下し、室温で３０分反応させ、当該第一のリガンドを前記カルボキシメチルデキストランに連結した。
最後に、１％ＢＳＡ−ＴＢＳバッファー（ｐＨ７．４）溶液を基板に滴下し、４０分間室温で反応させることによってブロッキング処理をし、プラズモン励起センサを得た。
【０１４４】
［実施例３］
実施例２において、工程２で光増感層の形成に用いられる光増感層塗布液として光増感層塗布液R-1に代えて光増感層塗布液R-2を用いたことを除き、実施例２と同様にして表面プラズモン励起センサを製造し、アッセイ発光シグナルおよびアッセイノイズシグナルを測定した。
【０１４５】
[比較例１]
参考例１において、工程３〜５を下記のように変更した以外は参考例１と同様にしてプラズモン励起センサを製造し、アッセイ発光シグナルおよびアッセイノイズシグナルを測定した。
【０１４６】
（工程３：一次抗体固定化）
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ：(株)同人化学研究所製）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ：Thermo Scientific社製）それぞれ１００ｍＭを含む２５ｍＭ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）  バッファー、 １０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）混合液を、工程２により得られたプラズモン励起センサチップに滴下し、２０分室温で反応させ、当該センサチップに組み込まれているカルボキシメチルデキストランを活性エステル化した。
【０１４７】
続いて、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、１．８ｍｇ／ｍＬ、ミクリ免疫研究所（株）製）（第一のリガンド）を、当該抗体が５０μｇ／ｍＬとなるよう２５ｍＭ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）  バッファー、 １０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）にて希釈して得られた溶液を、前記基板に滴下し、室温で３０分反応させ、当該第一のリガンドを前記カルボキシメチルデキストランに連結した。
【０１４８】
最後に、１％ＢＳＡ−ＴＢＳバッファー（ｐＨ７．４）溶液を基板に滴下し、４０分間室温で反応させることによってブロッキング処理をし、表面プラズモン励起センサを得た。
【０１４９】
（工程４：流路の構築）
工程３で得られたプラズモン励起センサのうちの抗体が結合された側の面に、測定領域を形成するための、流路長７ｍｍ、幅２ｍｍの厚さ２ｍｍのポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製流路を載せた。このＰＭＭＡ製流路には、送液導入用の穴（送液導入口）および送液排出用の穴（送液排出口）が形成されている。これらセンサ基板、およびＰＭＭＡ製流路の積層物を外周部で圧着してビスで固定し、プラズモン励起センサ部を構築した。
【０１５０】
このプラズモン励起センサ部の送液導入口および送液排出口に、シリコーンゴム製のチューブおよびペリスタポンプを連結した（以下、特に記載しない限り、各種流体の送液および循環をすべてこのようなチューブおよびペリスタポンプを用いて行った）。
【０１５１】
（工程５：シグナルの測定）
前記工程１〜４により製造されたプラズモン励起センサに、まず、ＡＦＰ（２．０ｍｇ／ｍＬ溶液、Acris Antibodies GmbH社）が０．１ｎｇ／ｍＬとなるようＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を、５０００μＬ／ｍｉｎにて２５分間フローさせた。洗浄工程として、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだＴＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を５０００μＬ／ｍｉｎにて２分間フローさせた。
【０１５２】
つづいて、前述のようにして調製した標識二次抗体１：「Alexa Fluor 647」標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体（第二のリガンド）が２．５μｇ／ｍＬとなるよう１％ＢＳＡ−ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を、５０００μＬ／ｍｉｎにて５分間フローさせた。洗浄工程として、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだＴＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を５０００μＬ／ｍｉｎにて２分間フローさせ、第二のリガンドが固定されたプラズモン励起センサを得た。
【０１５３】
このようにして得られたプラズモン励起センサについての発光シグナルを、ＳＰＦＳ測定用の装置を用いて測定した。第二のリガンドが固定されたプラズモン励起センサの裏側からプリズムを経由してレーザー光（６４０ｎｍ、４０μＷ）を照射し、センサ表面から発せられる蛍光量をＣＣＤで測定した。この測定値を「アッセイ発光シグナル」とした。
【０１５４】
一方、比較例１の前記工程１〜４より同様に製造された別の表面プラズモン励起センサについて、上記工程５の最初のステップでＡＦＰ（２．０ｍｇ／ｍＬ溶液、Acris Antibodies GmbH社）が０．１ｎｇ／ｍＬとなるようＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液のかわりに、ＡＦＰを全く含まない（０ｎｇ／ｍＬ）１％ＢＳＡ−ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）をフローさせた以外は上記と同じ手順で蛍光量を測定し、その測定値を「アッセイノイズシグナル」とした。
【０１５５】
［比較例２］
工程５を下記のようにした以外は、比較例１と同様にしてプラズモン励起センサチップおよびプラズモン励起センサを製造し、アッセイ発光シグナルおよびアッセイノイズシグナルを測定した。本比較例２ではサンドイッチアッセイの後に洗浄を行わずに短時間処理を試みたものである。
【０１５６】
（工程５：シグナルの測定）
前記工程１〜４により製造されたプラズモン励起センサに、まず、ＡＦＰ（２．０ｍｇ／ｍＬ溶液、Acris Antibodies GmbH社）が０．１ｎｇ／ｍＬとなるようＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を、５０００μＬ／ｍｉｎにて２５分間フローさせた。
【０１５７】
つづいて、前述のようにして調製した標識二次抗体１：「Alexa Fluor 647」標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体（第二のリガンド）が２．５μｇ／ｍＬとなるよう１％ＢＳＡ−ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を、５０００μＬ／ｍｉｎにて５分間フローさせた。
【０１５８】
その後、第二のリガンドが固定されたプラズモン励起センサの裏側からプリズムを経由してレーザー光（６４０ｎｍ、４０μＷ）を照射し、センサ表面から発せられる蛍光量をＣＣＤで測定した。この測定値を「アッセイ発光シグナル」とした。
【０１５９】
一方、前記工程１〜４により製造された別のプラズモン励起センサについて、上記最初のステップでＡＦＰを全く含まない（０ｎｇ／ｍＬ）１％ＢＳＡ−ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）をフローさせた以外は上記と同じ手順で蛍光量を測定し、その測定値を「アッセイノイズシグナル」とした。
以上の実施例および比較例それぞれについて、アッセイシグナルおよびブランクシグナルから下記式によりＳ／Ｎ比を算出した。
Ｓ／Ｎ比＝｜（アッセイ発光シグナル）｜／｜（アッセイノイズシグナル）｜
【０１６０】
【表１】
0005541003.tif 000002
表１の結果から明らかなように、従来の通常サンドイッチイムノアッセイを行った比較例１及び比較例2のアッセイ中（３分経過）のアッセイ発光シグナルは高いが、アッセイノイズシグナルも高いことから、これは流路中の標識抗体の蛍光（非特異吸着分）も検出されているためであり、結果S/Nは取れず有意な検出精度は得られない。比較例１のようにアッセイ終了後、洗浄工程を行わなければ有意な検出精度は得られない。一方、本発明の参考例１及び実施例２では、アッセイノイズシグナルから分かるように、アッセイ中に蛍光色素前駆体と顕色剤は物理的に十分引き離されているため流路中の標識抗体の蛍光（非特異吸着分）が検出されることはほとんどない。AFPの補足量に応じたシグナルが得られており、S/Nも高いことが分かる。また、S/Nの弁別が取れているので、アッセイ終了後まで反応を行わなくても、例えば、実施例２および３、並びに参考例１では、アッセイは３分間であっても有意なS/Nを得る事が出来、短時間でAFP量が計測できることが分かる。
【符号の説明】
【０１６１】
１０・・・プラズモン励起センサ
１１・・・プラズモン励起センサチップ
１１１・・・透明誘電体基板
１１２・・・金属薄膜
１１３・・・光増感層
１２・・・第１のリガンド
２０・・・化学発光分子修飾リガンド複合体
２１・・・第２のリガンド
２２・・・化学発光分子
３１・・・アナライト
４１・・・活性分子
【図１】
0005541003.tif 000003