(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨細胞が脱分化して得られる脱分化型軟骨細胞を二次元培養により軟骨細胞へ再分化誘導する軟骨細胞再分化誘導用基材であって、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれる１または２以上のゲルからなる、前記軟骨細胞再分化誘導用基材；
（ａ）電荷を有する繰り返し単位からなる第一網目構造および電気的に中性な繰り返し単位からなる第二網目構造を有する相互侵入網目構造ハイドロゲル、
（ｂ）構成高分子の繰り返し単位総数に対し電荷を有する繰り返し単位数の割合が２０％以下であり、かつ（ａ）を除くハイドロゲル、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）を除く電気的に中性なゲル。
【請求項２】
構成高分子の繰り返し単位総数に対し電荷を有する繰り返し単位数の割合が２０％以下であり、かつ（ａ）を除くハイドロゲルが、電気的に中性な繰り返し単位からなるハイドロゲルおよび／または電気的に中性な繰り返し単位と電荷を有する繰り返し単位とからなる共重合体であって、次式で表されるモル比（Ｆ）がＦ≦０．２のハイドロゲルよりなる群から選ばれる１または２以上のハイドロゲルである、請求項１に記載の軟骨細胞再分化誘導用基材；
Ｆ＝［電荷を有する繰り返し単位を構成するモノマーのモル濃度］／［電荷を有する繰り返し単位を構成するモノマーのモル濃度＋電気的に中性な繰り返し単位を構成するモノマーのモル濃度］。
【請求項３】
電気的に中性な繰り返し単位が、アクリルアミド（ＡＡｍ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡｍ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル（２−ヒドロキシエチルメタクリレート；２−ＨＥＭＡ）およびアクリル酸２−ヒドロキシエチル（２−ヒドロキシエチルアクリレート；２−ＨＥＡ）よりなる群から選ばれるモノマーから構成される１または２以上の繰り返し単位である、請求項２に記載の軟骨細胞再分化誘導用基材。
【請求項４】
電気的に中性な繰り返し単位からなるハイドロゲルが、ポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）（ＰＤＭＡＡｍ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリメタクリル酸２−ヒドロキシエチル（ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート；ＰＨＥＭＡ）およびポリアクリル酸２−ヒドロキシエチル（ポリ−２−ヒドロキシエチルアクリレート；ＰＨＥＡ）よりなる群から選ばれる１または２以上のハイドロゲルである、請求項２に記載の軟骨細胞再分化誘導用基材。
【請求項５】
電荷を有する繰り返し単位が、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、スチレンスルホン酸、アクリル酸およびメタクリル酸よりなる群から選ばれるモノマーまたはそれらの塩から構成される１または２以上の繰り返し単位である、請求項１から請求項４のいずれかに記載の軟骨細胞再分化誘導用基材。
【請求項６】
（ａ）および（ｂ）を除く電気的に中性なゲルがアガロースである、請求項１から請求項５のいずれかに記載の軟骨細胞再分化誘導用基材。
【請求項７】
軟骨細胞が脱分化して得られる脱分化型軟骨細胞を軟骨細胞へ再分化誘導する因子を添加せずに、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選  ばれる１または２以上のゲルからなる基材表面上において二次元培養により前記脱分化型軟骨細胞を培養して軟骨細胞へ再分化誘導する工程を含む、軟骨細胞の製造方法；
（ａ）電荷を有する繰り返し単位からなる第一網目構造および電気的に中性な繰り返し単位からなる第二網目構造を有する相互侵入網目構造ハイドロゲル、
（ｂ）構成高分子の繰り返し単位総数に対し電荷を有する繰り返し単位数の割合が２０％以下であり、かつ（ａ）を除くハイドロゲル、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）を除く電気的に中性なゲル。
【請求項８】
構成高分子の繰り返し単位総数に対し電荷を有する繰り返し単位数の割合が２０％以下であり、かつ（ａ）を除くハイドロゲルが、電気的に中性な繰り返し単位からなるハイドロゲルおよび／または電気的に中性な繰り返し単位と電荷を有する繰り返し単位とからなる共重合体であって、次式で表されるモル比（Ｆ）がＦ≦０．２のハイドロゲルよりなる群から選ばれる１または２以上のハイドロゲルである、請求項７に記載の軟骨細胞の製造方法；
Ｆ＝［電荷を有する繰り返し単位を構成するモノマーのモル濃度］／［電荷を有する繰り返し単位を構成するモノマーのモル濃度＋電気的に中性な繰り返し単位を構成するモノマーのモル濃度］。
【請求項９】
電気的に中性な繰り返し単位が、アクリルアミド（ＡＡｍ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡｍ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル（２−ヒドロキシエチルメタクリレート；２−ＨＥＭＡ）およびアクリル酸２−ヒドロキシエチル（２−ヒドロキシエチルアクリレート；２−ＨＥＡ）よりなる群から選ばれるモノマーから構成される１または２以上の繰り返し単位である、請求項８に記載の軟骨細胞の製造方法。
【請求項１０】
電気的に中性な繰り返し単位からなるハイドロゲルが、ポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）（ＰＤＭＡＡｍ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリメタクリル酸２−ヒドロキシエチル（ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート；ＰＨＥＭＡ）およびポリアクリル酸２−ヒドロキシエチル（ポリ−２−ヒドロキシエチルアクリレート；ＰＨＥＡ）よりなる群から選ばれる１または２以上のハイドロゲルである、請求項８に記載の軟骨細胞の製造方法。
【請求項１１】
電荷を有する繰り返し単位が、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、スチレンスルホン酸、アクリル酸およびメタクリル酸よりなる群から選ばれるモノマーまたはそれらの塩から構成される１または２以上の繰り返し単位である、請求項７から請求項１０のいずれかに記載の軟骨細胞の製造方法。
【請求項１２】
（ａ）および（ｂ）を除く電気的に中性なゲルがアガロースである、請求項７から請求項１１のいずれかに記載の軟骨細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨細胞が脱分化して得られる脱分化型軟骨細胞を軟骨細胞へ再分化誘導する軟骨細胞再分化誘導用基材およびこれを用いた軟骨細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨組織は、軟骨細胞とこれを取り囲む基質からなる支持組織であり、骨相互間に生じる摩擦を緩和して衝撃を吸収する役割を果たしている。軟骨組織には血液やリンパ液が浸潤せず、再生力に乏しい組織であるため、一度損傷を受けると、約７０％にもなる含水率が低下してその機能の維持が困難となり、変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＯＡ）が発症する。この変形性関節症が進行すると、軟骨の損傷、骨の露出、あるいは関節の変形などを生じることにより関節本来の滑らかな動きができなくなり、運動痛などを生じる他、可動域制限による起立制限や歩行制限を余儀なくされ、著しい患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ）の低下をもたらしている。なお、我が国における変形性関節症の患者数は、自覚症状を有する患者数で約１０００万人、Ｘ線診断による潜在的な患者数で約３０００万人と推定されている。
【０００３】
軟骨組織の代表的な治療技術として人工関節置換術を挙げることができるが、人工関節は摩耗などにより１０年以上の長期使用は困難である他、接着箇所の緩み、脱臼、感染症などを生じ得るため、適用の限界がある。そこで、自家培養軟骨細胞移植術により軟骨損傷部位を補い、修復して軟骨を再生させる再生医療の研究が盛んに行われている。すなわち、正常軟骨部位より軟骨組織を一部切り出して軟骨細胞を取り出し、取り出した軟骨細胞を適当な手法により培養して細胞数を相当量増殖させた後、元の患者の軟骨損傷部位に戻すことにより治癒を図るものである（非特許文献１）。
【０００４】
しかしながら、一般に軟骨細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで単層培養あるいは平板培養すると、いわゆる脱分化を生じ、軟骨細胞本来の形質を一部消失した脱分化型軟骨細胞となることが知られている。そこで、この脱分化型軟骨細胞を再分化させるため、様々な試みがなされており、例えば、アルギン酸ゲル中に脱分化型軟骨細胞を封入する方法（特許文献１）や、トランスフォーミング成長因子−βファミリー（ＴＧＦ−β）などを含む無血清培地に骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を加えたものを用いて、低酸素条件下で脱分化型軟骨細胞を平板培養する方法（特許文献２）、ヒト自家血清を含むＨＥＰＥＳ緩衝化細胞培地中に酸性コラーゲンを含む三次元ゲル状バイオマトリックスに脱分化型軟骨細胞を植え込んで立体培養する方法（特許文献３）、ポリ（シラン化ヒドロキシエチルセルロース）（ＰＨＥＣ）またはポリ（シラン化ヒドロキシプロピルメチルセルロース）（ＰＨＰＭＣ）からなる三次元ゲル状マトリックスに脱分化型軟骨細胞を植え込んで立体生体外培養する方法（特許文献４）、インスリン、ＢＭＰ−２および甲状腺ホルモンであるトリヨードサイロニン（Ｔ３）を含む脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地（特許文献５）などが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−０７８４８４号公報
【特許文献２】特開２００３−１２５７８７号公報
【特許文献３】特表２００３−５３４７９２号公報
【特許文献４】特表２００７−５１０４１０号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ２００６／０２２２６３号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇ Ｍ．ら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌ．３３１、Ｎｏ．１４、８８９−８９５（１９９４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１、特許文献３および特許文献４に開示された方法は、脱分化型軟骨細胞を三次元的な培養により再分化させるための方法であり、特許文献２および特許文献５に開示された方法ないし培地は、脱分化型軟骨細胞を再分化誘導する因子を添加して、平板培養などの二次元的な培養により再分化させるための方法ないし培地であることから、脱分化型軟骨細胞を二次元的な培養により再分化させることができる、より安定した素材からなる基材や、再分化誘導する因子を添加せずに脱分化型軟骨細胞を再分化させることができる方法が求められている。
【０００８】
本発明は、前記問題点を解決するためになされたものであって、軟骨細胞が脱分化して得られる脱分化型軟骨細胞を軟骨細胞へ再分化誘導する軟骨細胞再分化誘導用基材および脱分化型軟骨細胞を軟骨細胞へ再分化誘導する因子を添加せずにこれを用いた軟骨細胞の製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、脱分化型軟骨細胞を軟骨細胞へ再分化誘導する因子を添加せずに、電荷を有する繰り返し単位からなる第一網目構造および電気的に中性な繰り返し単位からなる第二網目構造を有する相互侵入網目構造ハイドロゲル、構成高分子の繰り返し単位総数に対し電荷を有する繰り返し単位数の割合が２０％以下であるその他のハイドロゲル、あるいはこれらを除く電荷を帯びていない電気的に中性なゲル上で培養することにより、軟骨細胞へ再分化誘導できることを見いだし、下記の各発明を完成した。
【００１０】
（１）軟骨細胞が脱分化して得られる脱分化型軟骨細胞を軟骨細胞へ再分化誘導する軟骨細胞再分化誘導用基材であって、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれる１または２以上のゲルからなる、前記軟骨細胞再分化誘導用基材；
（ａ）電荷を有する繰り返し単位からなる第一網目構造および電気的に中性な繰り返し単位からなる第二網目構造を有する相互侵入網目構造ハイドロゲル、
（ｂ）構成高分子の繰り返し単位総数に対し電荷を有する繰り返し単位数の割合が２０％以下であり、かつ（ａ）を除くハイドロゲル、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）を除く電気的に中性なゲル。
【００１１】
（２）構成高分子の繰り返し単位総数に対し電荷を有する繰り返し単位数の割合が２０％以下であり、かつ（ａ）を除くハイドロゲルが、電気的に中性な繰り返し単位からなるハイドロゲルおよび／または電気的に中性な繰り返し単位と電荷を有する繰り返し単位とからなる共重合体であって、次式で表されるモル比（Ｆ）がＦ≦０．２のハイドロゲルよりなる群から選ばれる１または２以上のゲルである、（１）に記載の軟骨細胞再分化誘導用基材；
Ｆ＝［電荷を有する繰り返し単位を構成するモノマーのモル濃度］／［電荷を有する繰り返し単位を構成するモノマーのモル濃度＋電気的に中性な繰り返し単位を構成するモノマーのモル濃度］。
【００１２】
（３）電気的に中性な繰り返し単位が、アクリルアミド（ＡＡｍ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡｍ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル（２−ヒドロキシエチルメタクリレート；２−ＨＥＭＡ）およびアクリル酸２−ヒドロキシエチル（２−ヒドロキシエチルアクリレート；２−ＨＥＡ）よりなる群から選ばれるモノマーから構成される１または２以上の繰り返し単位である、（２）に記載の軟骨細胞再分化誘導用基材。
【００１３】
（４）電気的に中性な繰り返し単位からなるハイドロゲルが、ポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）（ＰＤＭＡＡｍ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリメタクリル酸２−ヒドロキシエチル（ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート；ＰＨＥＭＡ）およびポリアクリル酸２−ヒドロキシエチル（ポリ−２−ヒドロキシエチルアクリレート；ＰＨＥＡ）よりなる群から選ばれる１または２以上のハイドロゲルである、（２）に記載の軟骨細胞再分化誘導用基材。
【００１４】
（５）電荷を有する繰り返し単位が、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、スチレンスルホン酸、アクリル酸およびメタクリル酸よりなる群から選ばれるモノマーまたはそれらの塩から構成される１または２以上の繰り返し単位である、（１）から（４）のいずれかに記載の軟骨細胞再分化誘導用基材。
【００１５】
（６）（ａ）および（ｂ）を除く電気的に中性なゲルがアガロースである、（１）から（５）のいずれかに記載の軟骨細胞再分化誘導用基材。
【００１６】
（７）軟骨細胞が脱分化して得られる脱分化型軟骨細胞を軟骨細胞へ再分化誘導する因子を添加せずに、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれる１または２以上のゲルからなる基材表面上において前記脱分化型細胞を培養して軟骨細胞へ再分化誘導する工程を含む、軟骨細胞の製造方法；
（ａ）電荷を有する繰り返し単位からなる第一網目構造および電気的に中性な繰り返し単位からなる第二網目構造を有する相互侵入網目構造ハイドロゲル、
（ｂ）構成高分子の繰り返し単位総数に対し電荷を有する繰り返し単位数の割合が２０％以下であり、かつ（ａ）を除くハイドロゲル、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）を除く電気的に中性なゲル。
【００１７】
（８）構成高分子の繰り返し単位総数に対し電荷を有する繰り返し単位数の割合が２０％以下であり、かつ（ａ）を除くハイドロゲルが、電気的に中性な繰り返し単位からなるハイドロゲルおよび／または電気的に中性な繰り返し単位と電荷を有する繰り返し単位とからなる共重合体であって、次式で表されるモル比（Ｆ）がＦ≦０．２のハイドロゲルよりなる群から選ばれる１または２以上のゲルである、（７）に記載の軟骨細胞の製造方法；
Ｆ＝［電荷を有する繰り返し単位を構成するモノマーのモル濃度］／［電荷を有する繰り返し単位を構成するモノマーのモル濃度＋電気的に中性な繰り返し単位を構成するモノマーのモル濃度］。
【００１８】
（９）電気的に中性な繰り返し単位が、アクリルアミド（ＡＡｍ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡｍ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル（２−ヒドロキシエチルメタクリレート；２−ＨＥＭＡ）およびアクリル酸２−ヒドロキシエチル（２−ヒドロキシエチルアクリレート；２−ＨＥＡ）よりなる群から選ばれるモノマーから構成される１または２以上の繰り返し単位である、（８）に記載の軟骨細胞の製造方法。
【００１９】
（１０）電気的に中性な繰り返し単位からなるハイドロゲルが、ポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）（ＰＤＭＡＡｍ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリメタクリル酸２−ヒドロキシエチル（ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート；ＰＨＥＭＡ）およびポリアクリル酸２−ヒドロキシエチル（ポリ−２−ヒドロキシエチルアクリレート；ＰＨＥＡ）よりなる群から選ばれる１または２以上のハイドロゲルである、（８）に記載の軟骨細胞の製造方法。
【００２０】
（１１）電荷を有する繰り返し単位が、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、スチレンスルホン酸、アクリル酸およびメタクリル酸よりなる群から選ばれるモノマーまたはそれらの塩から構成される１または２以上の繰り返し単位である、（７）から（１０）のいずれかに記載の軟骨細胞の製造方法。
【００２１】
（１２）（ａ）および（ｂ）を除く電気的に中性なゲルがアガロースである、（７）から（１１）のいずれかに記載の軟骨細胞の製造方法。
【００２２】
（１３）（７）から（１２）のいずれかに記載の方法によって製造された軟骨細胞。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、脱分化型軟骨細胞を軟骨細胞へ再分化誘導する因子を添加せずに二次元的な培養により脱分化型軟骨細胞を軟骨細胞へ再分化させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＰＳ上で作製した第６代継代細胞および第７代継代細胞、Ｆ値が０の共重合体Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ハイドロゲルディスク（すなわち、ＰＤＭＡＡｍゲルディスク）上で作製した第７代継代細胞、ならびにＦ値が０．２および０．６の共重合体Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ハイドロゲルディスクの上で作製した第７代継代細胞を、それぞれ位相差顕微鏡を用いて形態を観察した図である。
【図２】ＰＳ上で作製した第６代継代細胞および第７代継代細胞、Ｆ値が０の共重合体Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ハイドロゲルディスク（すなわち、ＰＤＭＡＡｍゲルディスク）、ならびにＦ値が０．２および０．６の共重合体Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ハイドロゲルディスクの上で各々作製した第７代継代細胞における、軟骨細胞分化マーカー遺伝子であるＡｇｇｒｅｃａｎ、ＣｏｌｌａｇｅｎIIおよびＳｏｘ９の発現量をそれぞれ示す図である。図中、縦軸はそれぞれの遺伝子発現量（相対値）を示す。
【図３】ＰＳ上で作製した第７代継代細胞、Ｆ値が０の共重合体Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ハイドロゲルディスク（すなわち、ＰＤＭＡＡｍゲルディスク）上で作製した第７代継代細胞、ならびにＦ値が０．２、０．４および１の共重合体Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ハイドロゲルディスクの上で作製した第７代継代細胞を、それぞれＣｏｌｌａｇｅｎII免疫染色をした結果を示す写真である。図中、上段と下段の写真において蛍光緑色の広がりをもって染色されている部分がＣｏｌｌａｇｅｎIIを、中段と下段の写真において黄色の点状に染色されている部分が核をそれぞれ表し、下段の写真は上段の写真と中段の写真との結合である。
【図４】ＰＳ上で作製した第７代継代細胞、Ｆ値が０の共重合体Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ハイドロゲルディスク（すなわち、ＰＤＭＡＡｍゲルディスク）上で作製した第７代継代細胞、ならびにＦ値が０．２、０．４および１の共重合体Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ハイドロゲルディスクの上で作製した第７代継代細胞を、それぞれアルシアンブルー染色をした結果を示す写真である。図中、水色に染色されている部分が硫酸基を有するグリコサミノグリカン（主にコンドロイチン硫酸）すなわち再分化誘導された軟骨細胞を、褐色の部分が脱分化型軟骨細胞をそれぞれ表す。
【図５】ＰＳ上で作製した第７代継代細胞、ならびにＰＡＡｍハイドロゲルディスク、ＰＤＭＡＡｍハイドロゲルディスク、ＰＶＡハイドロゲルディスク、アガロースゲルディスク、ＰＮａＡＭＰＳハイドロゲルディスク、ＰＮａＳＳハイドロゲルディスクおよびＮａＡＭＰＳからなる第一網目構造（Ｆ値が１）およびＡＡｍからなる第二網目構造（Ｆ値が０）を有するＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）相互侵入網目構造ハイドロゲルディスク（Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）ＤＮ）の上で作製した第７代継代細胞を、それぞれ位相差顕微鏡を用いて形態を観察した図である。
【図６】ＰＳ上で作製した第３代継代細胞、第６代継代細胞および第７代継代細胞、ならびにＰＡＡｍハイドロゲルディスク、ＰＤＭＡＡｍハイドロゲルディスク、ＰＶＡハイドロゲルディスク、アガロースゲルディスク、ＰＮａＳＳハイドロゲルディスク、ＰＮａＡＭＰＳハイドロゲルディスクおよびＮａＡＭＰＳからなる第一網目構造（Ｆ値が１）およびＡＡｍからなる第二網目構造（Ｆ値が０）を有するＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）相互侵入網目構造ハイドロゲルディスク（Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）ＤＮ）の上で作製した第７代継代細胞における、軟骨細胞分化マーカー遺伝子であるＡｇｇｒｅｃａｎ、ＣｏｌｌａｇｅｎIIおよびＳｏｘ９の発現量をそれぞれ示す図である。図中、縦軸はそれぞれの遺伝子発現量（相対値）を示す。
【図７】ＰＳ上で作製した第３代継代細胞、第６代継代細胞および第７代継代細胞、ならびにＰＡＡｍハイドロゲルディスク、ＰＤＭＡＡｍハイドロゲルディスク、ＰＶＡハイドロゲルディスク、アガロースゲルディスク、ＰＮａＳＳハイドロゲルディスク、ＰＮａＡＭＰＳハイドロゲルディスクおよびＮａＡＭＰＳからなる第一網目構造（Ｆ値が１）およびＡＡｍからなる第二網目構造（Ｆ値が０）を有するＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）相互侵入網目構造ハイドロゲルディスク（Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）ＤＮ）の上で作製した第７代継代細胞における、軟骨細胞脱分化マーカー遺伝子であるＣｏｌｌａｇｅｎIの発現量をそれぞれ示す図である。図中、縦軸はＣｏｌｌａｇｅｎIの遺伝子発現量（相対値）を示す。
【図８】ＰＡＡｍハイドロゲルディスク、ＰＤＭＡＡｍハイドロゲルディスク、ＰＶＡハイドロゲルディスクおよびアガロースゲルディスクの上で作製した第７代継代細胞についての細胞回収率を示す図である。図中、縦軸は培養開始時の細胞数と培養開始から７日後にそれぞれのゲルディスク上に残った細胞数から算出された細胞回収率（％）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明に係る軟骨細胞再分化誘導用基材およびこれを用いた軟骨細胞の製造方法について詳細に説明する。本発明に係る軟骨細胞再分化誘導用基材は、「（ａ）電荷を有する繰り返し単位からなる第一網目構造および電気的に中性な繰り返し単位からなる第二網目構造を有する相互侵入網目構造ハイドロゲル」、「（ｂ）構成高分子の繰り返し単位総数に対し電荷を有する繰り返し単位数の割合が２０％以下であり、かつ（ａ）を除くハイドロゲル」、「（ｃ）（ａ）および（ｂ）を除く電気的に中性なゲル」の、以上（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれる１または２以上のゲルからなり、軟骨細胞が脱分化して得られる脱分化型軟骨細胞を軟骨細胞へ再分化誘導する。
【００２６】
本発明に係る軟骨細胞再分化誘導用基材は、いわゆる三次元培養用の材料ではなく、二次元（平板、単層）培養用の基材である。すなわち、再分化誘導の対象である脱分化型軟骨細胞をそっくり包み込むような形態を有するのではなく、その周囲の一部、すなわちその周囲３６０°未満、好ましくは周囲２７０°以下、より好ましくは周囲１８０°以下、さらに好ましくは周囲９０°以下と接触する（担持する）形態を有する。そのような形態としては、例えば、壺状、馬蹄形状、略Ｕ字状、くぼみ状、平板状（細胞が沈み込むものを含む）を挙げることができる。なお、本発明において「基材」は、前記の趣意の下、「基板」、「担体」、「足場」、「足場基材」、「足場材料」、「スキャフォールド」、「スカフォールド」あるいは「装置」と交換可能に用いられる。
【００２７】
本発明において「再分化誘導」とは、分化細胞である軟骨細胞が脱分化して得られる脱分化型軟骨細胞を、再び軟骨細胞へ導くことをいう。再分化誘導して得られる軟骨細胞は、丸い形態をとり、コロニーを形成する傾向にあるが、特徴づけはこれに限定されず、軟骨細胞の分化マーカー（マーカー遺伝子）の少なくとも一つの発現が確認されることによって、一般に特徴づけられる。このような軟骨細胞の分化マーカー（マーカー遺伝子）としては、例えば、ＣｏｌｌａｇｅｎII、ＣｏｌｌａｇｅｎX、Ａｇｇｒｅｃａｎ、Ｓｏｘ９、ＭＧＰ（Ｍａｔｒｉｘ Ｇｌａ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を挙げることができる。
【００２８】
また、本発明において「脱分化型軟骨細胞」とは、継代培養によって、分化細胞である軟骨細胞が脱分化した細胞をいい、通常、第６代継代細胞や第７代継代細胞は脱分化型軟骨細胞に該当する。脱分化型軟骨細胞は、形態上、繊維芽細胞状となる傾向にあるが、特徴づけはこれに限定されず、軟骨細胞の分化マーカーの少なくとも一つの発現の欠失、または軟骨細胞の脱分化マーカーの少なくとも一つの発現が確認されることによって、一般に特徴づけられる。このような軟骨細胞の脱分化マーカーとしては、例えば、ＣｏｌｌａｇｅｎIを挙げることができる。
【００２９】
本発明におけるハイドロゲルは、「（ａ）電荷を有する繰り返し単位からなる第一網目構造および電気的に中性な繰り返し単位からなる第二網目構造を有する相互侵入網目構造ハイドロゲル」、「（ｂ）構成高分子の繰り返し単位総数に対し電荷を有する繰り返し単位数の割合が２０％以下であり、かつ（ａ）を除くハイドロゲル」、「（ｃ）（ａ）および（ｂ）を除く電気的に中性なゲル」の、以上（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれる１または２以上のゲルであれば特に限定されない。例えば共重合体の場合、電気的に中性な繰り返し単位と電荷を有する繰り返し単位とからなる共重合体であって、次式で表されるモル比（Ｆ）がＦ≦０．２のハイドロゲルを挙げることができる；
Ｆ＝［電荷を有する繰り返し単位を構成するモノマーのモル濃度］／［電荷を有する繰り返し単位を構成するモノマーのモル濃度＋電気的に中性な繰り返し単位を構成するモノマーのモル濃度］。
【００３０】
本発明における共重合体としては、例えば、ランダム共重合体、交互共重合体、周期的共重合体、ブロック共重合体、グラフト共重合体を挙げることができる。
【００３１】
本発明における「（ａ）電荷を有する繰り返し単位からなる第一網目構造および電気的に中性な繰り返し単位からなる第二網目構造を有する相互侵入網目構造ハイドロゲル」、「（ｃ）（ａ）および（ｂ）を除く電気的に中性なゲル」および「電気的に中性な繰り返し単位からなるハイドロゲル」とは、表面電荷を有していないゲル、いわゆる非イオンポリマーをいい、「（ａ）電荷を有する繰り返し単位からなる第一網目構造および電気的に中性な繰り返し単位からなる第二網目構造を有する相互侵入網目構造ハイドロゲル」および「電気的に中性な繰り返し単位からなるハイドロゲル」としては、合成高分子ハイドロゲルを挙げることができ、「（ｃ）（ａ）および（ｂ）を除く電気的に中性なゲル」としては、アガロースゲルなどの天然ゲルを挙げることができる。なお、合成高分子ハイドロゲルは、親水性を有する高分子網目を作製し、これに含水させたものでもよい。
【００３２】
アガロースゲルは、１→３結合β−Ｄ−ガラクトースと、１→４結合３，６−アンヒドロ−α−Ｌ−ガラクトースとの交互結合からなる、電気的に中性なポリマーであり、以下の構造式I（化１）で示すことができる。
【化１】
0005544635.tif 000002
【００３３】
このアガロースゲルは、アガーを生理食塩水に溶解した後、冷やし固めるなど、当業者により適宜選択可能な公知の方法によって調製することができる。
【００３４】
本発明における「電気的に中性な繰り返し単位」を構成するモノマーとしては、例えば、ジメチルシロキサン、スチレン（Ｓｔ）、アクリルアミド（ＡＡｍ）、メタクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡｍ）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）、Ｎ−ビニルホルムアルデヒド、Ｎ−ビニルメチルアセトアミド、ジメチルヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、メタクリル酸メチル（メチルメタクリレート；ＭＭＡ）、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル（２−ヒドロキシエチルメタクリレート；ＨＥＭＡ）、アクリル酸２−ヒドロキシエチル（２−ヒドロキシエチルアクリレート；ＨＥＡ）、アクリル酸ヒドロキシプロピル（ヒドロキシプロピルアクリレート）、メタクリル酸ヒドロキシプロピル（ヒドロキシプロピルメタクリレート）、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、ビニルピリジン、ビニル酢酸エステル、アクリロニトリル、アクリル酸２−エチルヘキシル（２−エチルヘキシルアクリレート）、フッ素含有不飽和モノマー｛例えば、アクリル酸トリフルオロエチル（トリフルオロエチルアクリレート；ＴＦＥ）｝を挙げることができる。
【００３５】
本発明における「電気的に中性な繰り返し単位からなるハイドロゲル」としては、例えば、アクリルアミド（ＡＡｍ）、メタクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡｍ）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）、Ｎ−ビニルホルムアルデヒド、Ｎ−ビニルメチルアセトアミド、ジメチルヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル（２−ヒドロキシエチルメタクリレート；ＨＥＭＡ）、アクリル酸２−ヒドロキシエチル（２−ヒドロキシエチルアクリレート；ＨＥＡ）、ヒドロキシプロピルアクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、ビニル酢酸エステル、アクリロニトリル、２−エチルヘキシルアクリレートから選ばれるモノマーから構成される１または２以上の繰り返し単位からなるハイドロゲルおよびポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を挙げることができる。
【００３６】
「電気的に中性な１の繰り返し単位からなるハイドロゲル」としては、例えば、ポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）、ポリメタクリルアミド、ポリ（Ｎ−メチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）（ＰＤＭＡＡｍ）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ（Ｎ−ビニルホルムアルデヒド）、ポリ（Ｎ−ビニルメチルアセトアミド）、ポリジメチルヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、ポリメタクリル酸２−ヒドロキシエチル（ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート；ＰＨＥＭＡ）、ポリアクリル酸２−ヒドロキシエチル（ポリ−２−ヒドロキシエチルアクリレート；ＰＨＥＡ）、ポリヒドロキシプロピルアクリレート、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリ（Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−メチロールアクリルアミド）、ポリビニル酢酸エステル、ポリアクリロニトリル、ポリ−２−エチルヘキシルアクリレートを挙げることができる。
【００３７】
ここで、ＡＡｍは、以下の構造式II（化２）で示すことができる、電気的に中性な不飽和モノマーであり、ＰＡＡｍは以下の構造式III（化３）で示すことができる、電気的に中性なポリマーである。
【化２】
0005544635.tif 000003
【化３】
0005544635.tif 000004
【００３８】
ＤＭＡＡｍは、以下の構造式IV（化４）で示すことができる、電気的に中性な不飽和モノマーであり、ＰＤＭＡＡｍは以下の構造式V（化５）で示すことができる、電気的に中性なポリマーである。
【化４】
0005544635.tif 000005
【化５】
0005544635.tif 000006
【００３９】
また、ＰＶＡは、以下の構造式VI（化６）で示すことができる、電気的に中性なポリマーである。
【化６】
0005544635.tif 000007
【００４０】
ＰＡＡｍ、ポリメタクリルアミド、ポリ（Ｎ−メチルアクリルアミド）、ＰＤＭＡＡｍ、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド）、ＰＮＩＰＡＡｍ、ポリ（Ｎ−ビニルホルムアルデヒド）、ポリ（Ｎ−ビニルメチルアセトアミド）、ポリジメチルヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、ＰＨＥＭＡ、ＰＨＥＡ、ポリヒドロキシプロピルアクリレート、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリ（Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−メチロールアクリルアミド）、ポリビニル酢酸エステル、ポリアクリロニトリル、ポリ−２−エチルヘキシルアクリレートは、当業者により適宜選択可能な公知の方法によって調製することができる。例えば、Ｃｈｅｎ Ｙ．Ｍ．らの方法｛Chen Y. M., Shiraishi N., Satokawa H., Kakugo K., Narita T., Gong J. P., Osada Y., Yamamoto K., Ando J., Biomaterials 26：4588-4596（2005）｝に従い、それぞれのモノマー溶液に適当なラジカル開始剤と架橋剤とを加え、ラジカル重合させることによって調製することができる。これらラジカル開始剤および架橋剤は、これらのゲルが調製できれば特に限定されないが、例えば、ラジカル開始剤としてα−ケトグルタル酸を利用することができ、また、架橋剤としてＮ，Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓ−ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ＭＢＡＡ）を利用することができる。また、ラジカル重合反応の条件は適宜選択することができ、例えば、前記Ｃｈｅｎ Ｙ．Ｍ．らの方法における反応条件に従うことができる。具体的には、反応温度を２０℃〜３０℃、反応時間を６〜１０時間、前記ＵＶ開始剤の添加量を０．１ｍｏｌ％、架橋剤の添加量を２ｍｏｌ％〜１０ｍｏｌ％の各範囲から適宜選択することができる。なお、ラジカル重合反応を行うに際し、不活性化ガスを用いたバブリングなどによってそれぞれのモノマー溶液の溶存酸素を不活性化ガスに置換することが好ましい。
【００４１】
また、ＰＶＡゲルは、酢酸ビニルを重合して得たポリ酢酸ビニルを加水分解（けん化）するなど、当業者により適宜選択可能な公知の方法によって調製することができる。
【００４２】
本発明における「電荷を有する繰り返し単位」を構成するモノマーまたはその塩としては、酸性基（例えば、カルボキシル基、リン酸基およびスルホン酸基）や塩基性基（例えば、アミノ基）を有する不飽和モノマーを、例えば、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）、スチレンスルホン酸（ＳＳ）、アクリル酸、メタクリル酸およびそれらの塩を挙げることができる。
【００４３】
本発明における「電荷を有する繰り返し単位からなる第一網目構造および電気的に中性な繰り返し単位からなる第二網目構造を有する相互侵入網目構造ハイドロゲル」は、例えば、本発明者らによる発明に係るＰＣＴ／ＪＰ２００３／４５５６、ＰＣＴ／ＪＰ２００５／１１４６９、特願２００６−３５０５２６などに記載されており、これらの内容は本明細書に包含される。なお、相互侵入網目構造ハイドロゲルの表面電荷は、構成高分子の第二網目構造の繰り返し単位の電気的性質に依存することが知られており、本発明における相互侵入網目構造ハイドロゲルは電気的に中性なハイドロゲルである。
【００４４】
また、「電気的に中性な繰り返し単位と電荷を有する繰り返し単位とからなる共重合体（ハイドロゲル）は、例えば、Ｃｈｅｎ Ｙ．Ｍ．らの方法｛Chen Y. M., Gong J. P., Tanaka M., Yasuda K., Yamamoto S., Shimomura M., et al. J Biomed. Mater. Res. A. 88（1）: 74-83（2009）｝に従って調製することができる。
【００４５】
前述のように調製した「（ａ）電荷を有する繰り返し単位からなる第一網目構造および電気的に中性な繰り返し単位からなる第二網目構造を有する相互侵入網目構造ハイドロゲル」、「（ｂ）構成高分子の繰り返し単位総数に対し電荷を有する繰り返し単位数の割合が２０％以下であり、かつ（ａ）を除くハイドロゲル」、「（ｃ）（ａ）および（ｂ）を除く電気的に中性なゲル」の、以上（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれる１または２以上のゲルは、そのまま、脱分化型軟骨細胞を培養して軟骨細胞へ再分化誘導する基材として用いることができ、その特徴を損なわない限り、あらゆる構成とともにキットなどとして用いることもできるが、ハイドロゲルの場合、脱分化型軟骨細胞の培養に適当な緩衝液または細胞培養液の中でハイドロゲルを膨潤させ、ゲル中の溶媒を交換して用いるのが好ましい。好適な緩衝液としては、実施例で使用される４−（−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）緩衝液やウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ゼラチン水溶液の他、ＰＢＳなどを挙げることができる。また、好適な細胞培養液の種類および組成は、脱分化型軟骨細胞に応じて適宜選択することができる。
【００４６】
細胞培養液としては、ブレットキットＣＧＭ（三光純薬社）などの市販の培地や、個々の成分の正確な組成に従った既知の培地を使用してもよく、そのような培地としては、例えば、ＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ (Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ)、ＲＰＭＩ１６４０ 、ＡＩＭ−Ｖ、ＡＤＣ、ＬＰＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０、Ｈａｍ’ｓＦ１２、ＤＣＣＭ１、ＤＣＣＭ２、ＢＧＪ、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｌ−１５（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ−１５）、ＭｃＣｏｙ５Ａ、Ｍ１９９、Ｆｉｓｈｅｒ、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒなどを挙げることができる。さらに、必要に応じて、公知の構成の培地成分や、アール平衡塩溶液、ハンクス平衡塩溶液、ダルベッコＰＢＳ、スピナー塩溶液などの公知の平衡塩類組成成分、再分化誘導する因子ではない抗生物質やビタミン類、ホルモン類、ｐＨ調整剤、血清、その他生物由来成分などを加えることができる。
【００４７】
なお、脱分化型軟骨細胞の培養に際し、ＵＶ滅菌やオートクレーブ滅菌などによりハイドロゲルを滅菌しておくことが好ましい。
【００４８】
前述のように調製した「（ａ）電荷を有する繰り返し単位からなる第一網目構造および電気的に中性な繰り返し単位からなる第二網目構造を有する相互侵入網目構造ハイドロゲル」、「（ｂ）構成高分子の繰り返し単位総数に対し電荷を有する繰り返し単位数の割合が２０％以下であり、かつ（ａ）を除くハイドロゲル」、「（ｃ）（ａ）および（ｂ）を除く電気的に中性なゲル」の、以上（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれる１または２以上のゲル上での脱分化型軟骨細胞の培養は、シャーレなどの適当な容器に置いたこれらのゲルに、適当な個数の脱分化型軟骨細胞を含む細胞懸濁液を加えることで行うことができる。例えば、ゲル単位面積（ｃｍ２）当たり１×１０５〜１×１０６個の脱分化型軟骨細胞を播種し、標準的な脱分化型軟骨細胞の培養条件下にこのゲルを置くことで行うことができる。例えば、培養条件は、２０℃ 〜 ４０℃の培養温度、１％ 〜１０％のＣＯ２雰囲気、２４時間〜１６８時間／１代当たりの培養時間から適宜選択することができる。
【００４９】
本発明においては、脱分化型軟骨細胞が軟骨細胞へ再分化誘導されたか否かの判断を、細胞の形態観察やリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いて行っている。また、細胞の形態観察は、ゲルディスク上の細胞を適当な倍率の顕微鏡を用いて観察し、細胞の形態やコロニー形成の有無などを確認するものである。
【００５０】
ＲＴ−ＰＣＲ法は、通常の実験書の記載に従って行うことができ、そのような実験書として、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、２００１年版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を挙げることができる。
【００５１】
本発明に用いることのできるＲＴ−ＰＣＲ法は、例えば、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（Ｒ） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（商品コード；ＴＰ８００、タカラバイオ社）、Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ II（Ｃｅｐｈｅｉｄ社）、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴ Ｋｉｔ（ＡＢＩ社）、ＭａｓｔｅｒＡｍｐ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）、ＱＩＡａｍｐ ＲＮＡ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）、Ｃｏｎｃｅｒｔ Ｐｌａｎｔ ＲＮＡ Ｒｅｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社）、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ ＦｉｄｅｌｉｔｙＰＬＵＳ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｒｏｃｈｅ社）、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ (タカラバイオ社)、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ 、ＰＬＡＴＩＵＭ ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ（いずれもＧｉｂｃｏ社)、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７０００、同７９００（いずれもＡＢＩ社）、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ III Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などのシステムやキットを用いて行うことができる。
【００５２】
さらに、脱分化型軟骨細胞が軟骨細胞へ再分化誘導されたか否かの判断は、軟骨細胞の分化マーカーや脱分化マーカーを抗原として、それら抗原の発現を標識抗体の検出などのイムノアッセイにより確認、定量することにより行ってもよい。
【００５３】
次に、本発明に係る軟骨細胞の製造方法は、軟骨細胞が脱分化して得られる脱分化型軟骨細胞を軟骨細胞へ再分化誘導する因子を添加せずに、「（ａ）電荷を有する繰り返し単位からなる第一網目構造および電気的に中性な繰り返し単位からなる第二網目構造を有する相互侵入網目構造ハイドロゲル」、「（ｂ）構成高分子の繰り返し単位総数に対し電荷を有する繰り返し単位数の割合が２０％以下であり、かつ（ａ）を除くハイドロゲル」、「（ｃ）（ａ）および（ｂ）を除く電気的に中性なゲル」の、以上（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれる１または２以上のゲルからなる基材表面上において前記脱分化型細胞を培養して軟骨細胞へ再分化誘導する工程を含んでいる。
【００５４】
本発明における「軟骨細胞が脱分化して得られる脱分化型軟骨細胞を軟骨細胞へ再分化誘導する因子」とは、いわゆる分化誘導因子を挙げることができ、本発明に用いることができる分化誘導因子としては、例えば、デキサメタゾンなどのグルココルチコイド、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ（インスリン様成長因子類）、トランスフォーミング成長因子−βファミリーと呼ばれる因子（ＴＧＦ−β）、例えば骨形態形成タンパク質（望ましくはＢＭＰ−２あるいはＢＭＰ−４）、神経成長因子（ＮＧＦ）や脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）などの神経栄養因子、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インヒビンＡあるいは軟骨形成刺激活性因子（ＣＳＡ）、ＩＬ−２などのサイトカインなど、Ｉ型コラーゲン（とりわけゲル形態にあるもの）などのコラーゲン性細胞外基質、およびレチノイン酸などのビタミンＡ類似体、ビタミンＢ１２、トコフェロール、脂溶性ビタミン類のひとつである還元型コエンザイムＱ１０および酸化型コエンザイムＱ１０などの脂溶性ビタミンあるいはアスコルビン酸やニコチンアミドなど水溶性ビタミンなどを挙げることができる。
【００５５】
また「基材表面上」とは、いわゆる三次元培養のように、再分化誘導の対象である脱分化型軟骨細胞の周囲３６０°を基材が取り囲む態様ではなく、その周囲の一部、すなわちその周囲３６０°未満、好ましくは周囲２７０°以下、より好ましくは周囲１８０°以下、さらに好ましくは周囲９０°以下と接触する（担持する）二次元（平板、単層）培養の態様を意味する。
【００５６】
以下、本発明に係る軟骨細胞再分化誘導用基材およびこれを用いた軟骨細胞の製造方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００５７】
＜実施例１＞弱電荷を有するハイドロゲル（共重合体）ディスクの調製
（１）Ｆ＝０．２の共重合体ポリ｛（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム）−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）｝｛Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）｝ゲルディスクの調製
【００５８】
［１−１］Ｆ＝０．２のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルの調製
Ｃｈｅｎ Ｙ．Ｍ．らの方法｛Chen Y. M., Gong J. P., Tanaka M., Yasuda K., Yamamoto S., Shimomura M., et al. J Biomed. Mater. Res. A. 88（1）: 74-83（2009）｝に従い、Ｆ（モル比）＝［ＮａＡＭＰＳモノマーのモル濃度］／［ＤＭＡＡｍモノマーのモル濃度＋ＮａＡＭＰＳモノマーのモル濃度］と定義し、このＦ値が０．２であって架橋度が４ｍｏｌ％のポリ｛（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム）−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）｝｛Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）｝ゲルを調製した。
【００５９】
０．２ｍｏｌ／ＬのＮａＡＭＰＳ、０．８ｍｏｌ／ＬのＤＭＡＡｍ、ＮａＡＭＰＳとＤＭＡＡｍとの合計モル濃度（１ｍｏｌ／Ｌ）に対し４ｍｏｌ％のＮ，Ｎ’メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＡ）およびＮａＡＭＰＳとＤＭＡＡｍとの合計モル濃度（１ｍｏｌ／Ｌ）に対し０．１ｍｏｌ％のα−ケトグルタル酸を含む水溶液にＵＶ（波長３６５ｎｍ、照射エネルギー密度：１．５ｍＷ／ｃｍ２）を常温（２５℃）で６時間照射して重合させることにより、Ｆ値が０．２であって架橋度が４ｍｏｌ％のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルを得た。
【００６０】
鋳型からＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルを取り出し、１Ｌの蒸留水を一日ごと交換することにより一週間膨潤させた後、Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍゲルを１５．５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１４０ｍＭのＮａＣｌを含む５ｍＭの４−（−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．４）を一日ごとに交換することにより一週間浸漬してＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍゲルの溶媒交換を行った。
【００６１】
［１−２］Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクの調製
本実施例（１）［１−１］で調製したＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルをシャーレに移し、１２０℃ 、２０分間、オートクレーブにて滅菌後、直径１５ｍｍ、厚さ１〜３ｍｍ、Ｆ＝０．２であって架橋密度が４ｍｏｌ％のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクを調製した。続いて、調製したＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）を培養培地ブレットキットＣＧＭ（三光純薬社）に浸漬し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内に置き、一晩インキュベートした。
【００６２】
＜実施例２＞電気的に中性なゲルディスクの調製
（１）ポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）ゲルディスクの調製
［１−１］ＰＡＡｍゲルの調製
モノマーである１Ｍのアクリルアミド（ＡＡｍ）、架橋剤である４ｍｏｌ％のＮ，Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ＭＢＡＡ）およびラジカル開始剤である０．１ｍｏｌ％のα−ケトグルタル酸を含む水溶液２０ｍＬを調製し、窒素バブリングによって溶存酸素を窒素置換した。１０×１０ｍｍ四方の２枚のガラス基板で１．５ｍｍのシリコンスペーサーを挟むことにより形成された鋳型に窒素置換後の水溶液を流し込んだ後、波長３６５ｎｍ、照射エネルギー密度：１．５ｍＷ／ｃｍ２のＵＶランプを用いて紫外線を室温で６時間照射して重合させることにより、架橋密度が４ｍｏｌ％であるポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）ゲルを得た。
【００６３】
鋳型からＰＡＡｍゲルを取り出し、１Ｌの蒸留水を一日ごと交換することにより一週間膨潤させた後、ＰＡＡｍゲルを１５．５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１４０ｍＭのＮａＣｌを含む５ｍＭの４−（−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．４）を一日ごとに交換することにより一週間浸漬してＰＡＡｍゲルの溶媒交換を行った。
【００６４】
［１−２］ＰＡＡｍゲルディスクの調製
本実施例（１）［１−１］で調製したＰＡＡｍゲルをシャーレに移し、１２０℃ 、２０分間、オートクレーブにて滅菌後、直径１５ｍｍ、厚さ１〜２ｍｍ、架橋密度が４ｍｏｌ％のＰＡＡｍゲルディスクを調製した。
【００６５】
（２）ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）（ＰＤＭＡＡｍ）ゲルディスクの調製
架橋密度が４ｍｏｌ％のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）（ＰＤＭＡＡｍ）ゲルからなる直径１５ｍｍ、厚さ１〜２ｍｍのディスクを、本実施例（１）［１−１］に記載の方法に従って調製した。
【００６６】
（３）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）ゲルディスクの調製
ＰＶＡ粉末（重合度２，０００、分子量約９０，０００）を１０重量％になるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と水の混合溶媒（ＤＭＳＯと水との重量比３：１）に９０℃で溶解した溶液を、本実施例（１）［１−１］と記載の方法に従ってガラスの型に流し込み、−４０℃で１６時間凍結した後に室温で解凍してゲルを形成させた。ガラス基板からゲルを取り出し、１Ｌの蒸留水を一日ごとに交換することにより一週間膨潤させた後、ゲルを１５．５ｍＭのＮａＨＣＯ３および１４０ｍＭのＮａＣｌを含む５ｍＭの４−（−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．４）を一日ごとに交換することにより一週間浸漬して溶媒交換を行い、１０％ＰＶＡゲルディスクを調製した。調製したＰＶＡゲルディスクの滅菌は、７０％エタノールに浸漬し、波長３６５ｎｍ、照射エネルギー密度が１．５ｍＷ／ｃｍ２のＵＶランプを一晩照射することにより行った。
【００６７】
（４）ＮａＡＭＰＳからなる第一網目構造の繰り返し単位（Ｆ値が１）およびＡＡｍからなる第二網目構造の繰り返し単位（Ｆ値が０）とする電気的に中性なＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）相互侵入網目構造ハイドロゲルディスク｛Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）ＤＮゲルディスク｝の調製
Ｃｈｅｎ Ｙ．Ｍ．らの方法（｛Chen Y. M., Shiraishi N., Satokawa H., Kakugo K., Narita T., Gong J. P., Osada Y., Yamamoto K., Ando J., Biomaterials 26：4588-4596（2005）｝）に従い、Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）ＤＮゲルディスクを作製した。
【００６８】
［４−１］シングルネットワーク型ゲルの作製
面積１００ｍｍ×１００ｍｍ、厚さ２ｍｍのシリコン板からカッターで外辺長８０ｍｍ×８０ｍｍ、幅５ｍｍの枠を切りだし、枠の１箇所１．５ｍｍの溝を空けた。このシリコン枠を２枚の１００ｍｍ×１００ｍｍ、厚さ１．５ｍｍのガラス板に挟み、重合容器を組み立てた。続いて、１ｍｏｌ／ＬのＮａＡＭＰＳ、ＮａＡＭＰＳに対し５ｍｏｌ％のＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＡ）およびＮａＡＭＰＳに対し０．１ｍｏｌ％のα−ケトグルタル酸を含む水溶液を調製し、この水溶液を窒素バブリングによって溶存酸素を窒素置換した。この脱酸素水溶液を前記重合容器の一方のガラス板に置かれたシリコン板の開口部に流し込み、シリコン板上に他方のガラス板を重ねて前記開口部周辺をシールした後、波長３６５ｎｍ、照射エネルギー密度：１．５ｍＷ／ｃｍ２のＵＶランプを用いて紫外線を常温で６時間照射して重合させることにより、架橋度が４ｍｏｌ％のＮａＡＭＰＳゲル（第一の網目構造）を得た。
【００６９】
［４−２］ダブルネットワーク型ゲルの作製
２ｍｏｌ／ＬのＡＡｍおよびＡＡｍに対し０．０１ｍｏｌ％のα−ケトグルタル酸を含む大過剰の水溶液（ＡＡｍ浸漬溶液）を調製し、このＡＡｍ浸漬溶液を窒素バブリングによって溶存酸素を窒素置換した。この脱酸素浸漬溶液に前記作製したＮａＡＭＰＳゲルを１日以上浸漬し、ＡＡｍ浸漬水溶液で膨潤したＰＮａＡＭＰＳゲルを取り出し、波長３６５ｎｍ、照射エネルギー密度：１．５ｍＷ／ｃｍ２のＵＶランプを用いて紫外線を常温で６時間照射して重合させることにより、Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）ＤＮゲルを得た。鋳型からＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）ＤＮゲルを取り出し、１Ｌの蒸留水を一日ごと交換することにより一週間膨潤させた後、Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）ＤＮゲルを１５．５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１４０ｍＭのＮａＣｌを含む５ｍＭの４−（−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．４）に一週間浸漬してＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）ＤＮゲルの溶媒交換を行った。
【００７０】
［４−３］Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）ＤＮゲルディスクの調製
本実施例（４）［４−２］で調製したＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）ＤＮゲルをシャーレに移し、１２０℃ 、２０分間、オートクレーブにて滅菌後、直径１５ｍｍ、厚さ１〜３ｍｍ、架橋密度が５ｍｏｌ％のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）ＤＮゲルディスクを調製した。
【００７１】
（５）アガロースゲルディスクの調製
精製アガー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を純水（滅菌水）に２ｗ／ｗ％の濃度となるように加え、９０℃、１５分間攪拌しながら溶解して溶液を調製した後、ガラス製のセルに注ぎ込み、４℃、３０分間冷却して、直径１５ｍｍ、厚さ１〜３ｍｍのアガロースゲルディスクを調製した。調製したアガロースゲルディスクの滅菌は、本実施例（３）に記載の方法に従って行った。
【００７２】
＜比較例１＞構成高分子の繰り返し単位総数に対し電荷を有する繰り返し単位数の割合が２０％より大であって相互侵入網目構造ハイドロゲルではないハイドロゲルディスクの調製
（１）ポリ（スチレンスルホン酸ナトリウム）（ＰＮａＳＳ）ゲルディスクの調製
実施例２（１）に記載の方法に従い、架橋密度が４ｍｏｌ％のポリ（スチレンスルホン酸ナトリウム）（ＰＮａＳＳ）ゲルからなる直径１５ｍｍ、厚さ１〜３ｍｍのディスクを調製した。
【００７３】
なお、ＮａＳＳは、以下の構造式VII（化７）で示すことができる、マイナス電荷を有する不飽和モノマーであり、これをモノマー単位とするポリ（スチレンスルホン酸ナトリウム）（ＰＮａＳＳ）は以下の構造式IIX（化８）で示すことができる、マイナス電荷を有するポリマーである。
【化７】
0005544635.tif 000008
【化８】
0005544635.tif 000009
【００７４】
（２）ポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム）（ＰＮａＡＭＰＳ）ゲルディスクの調製
実施例２（１）に記載の方法に従い、架橋密度が４ｍｏｌ％のポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム）（ＰＮａＡＭＰＳ）ゲルからなる直径１５ｍｍ、厚さ１〜２ｍｍのディスクを調製した。
【００７５】
なお、ＮａＡＭＰＳは、以下の構造式IX（化９）で示すことができる、マイナス電荷を有する不飽和モノマーであり、これをモノマー単位とするポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸）（ＰＮａＡＭＰＳ）は以下の構造式X（化１０）で示すことができる、マイナス電荷を有するポリマーである。
【化９】
0005544635.tif 000010
【化１０】
0005544635.tif 000011
【００７６】
（３）Ｆ＝０．４および０．６のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクの調製
Ｆ値に応じたＮａＡＭＰＳおよびＤＭＡＡｍを用いた他は、実施例１（１）に記載の方法に従って、直径１５ｍｍ、厚さ１〜３ｍｍ、Ｆ＝０．４および０．６であって架橋密度が４ｍｏｌ％のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクを調製した。
【００７７】
＜試験例＞
（１）ポリスチレン（ＰＳ）上での継代培養による継代細胞の作製
培養培地ブレットキットＣＧＭ（三光純薬社）に、正常ヒト膝関節軟骨細胞（三光純薬社）を約６×１０４個／ｃｍ２となるよう加え、懸濁液とした。これをポリスチレン（ＰＳ）製の細胞培養フラスコに加え、３７℃ 、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内に置き、培地を４８時間ごとに交換しながら、正常ヒト膝関節軟骨細胞を培養した。７日経過ごとに細胞を採取して植え継ぎを行うことにより継代培養を行い、正常ヒト膝関節軟骨細胞の第２代〜第６代継代細胞（以下、単に第６代継代細胞などという）を作製した後、前記第６代継代細胞から細胞を採取して７日間培養を行うことにより第７代継代細胞を作製した。
【００７８】
（２）ゲルディスク上での継代培養による第７代継代細胞の作製
本試験例（１）に記載の方法に従って第６代継代細胞を作製した後、ＰＳ製の細胞培養フラスコに代えて、実施例１、実施例２および試験例１で調製したＦ値が０のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクすなわちＰＡＡｍゲルディスク、Ｆ値がそれぞれ０．２、０．４および０．６のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスク、ＰＡＡｍゲルディスク、ＰＤＭＡＡｍゲルディスク、ＰＶＡゲルディスク、アガロースゲルディスク、Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）ＤＮゲルディスク、ＰＮａＡＭＰＳゲルディスク、ならびにＰＮａＳＳゲルディスクの上に各々植え継ぎ、７日間培養を行うことにより第７代継代細胞を作製した。
【００７９】
（３）Ｆ値の異なるＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクの上で作製した第７代継代細胞の解析
［３−１］形態観察
本試験例（２）のＦ値が０のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスク、すなわちＰＤＭＡＡｍゲルディスク上で作製した第７代継代細胞および本試験例（２）のＦ値が０．２のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクの上で作製した第７代継代細胞の形態を、本試験例（１）のＰＳ上で作製した第６代継代細胞および第７代継代細胞、ならびに本試験例（２）のＦ値が０．６のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクの上で作製した第７代継代細胞の形態と比較することにより観察した。第６代継代細胞についてはその培養開始から７日後に、それぞれの第７代継代細胞についてはその培養開始から７日後に、各々、位相差顕微鏡を用いて観察した。その結果を図１に示す。
【００８０】
図１に示すように、Ｆ値が０のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクすなわちＰＤＭＡＡｍゲルディスク、および０．２のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクの上でそれぞれ作製した第７代継代細胞は丸い形態をしており、コロニーを形成した。一方、Ｆ値が０．６のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスク上で作製した第７代継代細胞は、ＰＳ上で作製した第６代継代細胞および第７代継代細胞と同様、脱分化状態を示す繊維芽細胞状の細長い形態をしており、コロニーを形成しなかった。
【００８１】
［３−２］軟骨細胞分化マーカー遺伝子発現の定量
本試験例（１）のＰＳ上で作製した第６代継代細胞および第７代継代細胞、本試験例（２）のＦ値が０のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクすなわちＰＤＭＡＡｍゲルディスク、ならびにＦ値が０．２および０．６のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクの上でそれぞれ作製した第７代継代細胞からそれぞれの鋳型サンプルを調製し、軟骨細胞分化マーカー遺伝子であるＡｇｇｒｅｃａｎ、ＣｏｌｌａｇｅｎIIおよびＳｏｘ９の発現量を、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（Ｒ） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（商品コード；ＴＰ８００、タカラバイオ社）を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより調べた。使用したプライマーを下記に、その結果を図２に各々示す。
【００８２】
Ａｇｇｒｅｃａｎ：
フォワードプライマー；５’−ＣＧＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣＴＧＣＴＡ−３’
リバースプライマー  ；５’−ＣＴＣＣＡＴＧＴＣＡＧＧＣＣＡＧＧＴＣＡ−３’
ＣｏｌｌａｇｅｎII：
フォワードプライマー；５’−ＣＣＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＣＡＡＧＧＴＣＣＴＣ−３’
リバースプライマー  ；５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＴＴＡＣ−３’
Ｓｏｘ９：
フォワードプライマー；５’−ＡＡＣＧＣＣＧＡＧＣＴＣＡＧＣＡＡＧＡ−３’
リバースプライマー  ；５’−ＣＣＧＣＧＧＣＴＧＧＴＡＣＴＴＧＴＡＡＴＣ−３’
【００８３】
図２に示すように、軟骨細胞分化マーカー遺伝子であるＡｇｇｒｅｃａｎ、ＣｏｌｌａｇｅｎIIおよびＳｏｘ９の発現量は、Ｆ値が０のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクすなわちＰＤＭＡＡｍゲルディスク上で作製した第７代継代細胞において最も多いことが示された。一方、Ｆ値が０．２のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスク上で作製した第７代継代細胞においては、ＰＳ上で作製した第７代継代細胞と比較して、ＣｏｌｌａｇｅｎIIおよびＳｏｘ９の発現量が多いことが示されたが、Ｆ値が０．６のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスク上で作製した第７代継代細胞においては、ＰＳ上で作製した第７代継代細胞と比較して、ＣｏｌｌａｇｅｎIIの発現量が若干多く、ＡｇｇｒｅｃａｎおよびＳｏｘ９の発現量が少ないことが示された。
【００８４】
［３−３］ＣｏｌｌａｇｅｎIIに対する免疫染色
本試験例（１）のＰＳ上で作製した第７代継代細胞、本試験例（２）のＦ値が０のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクすなわちＰＤＭＡＡｍゲルディスク、Ｆ値が０．２および０．４のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスク、ならびにＦ値が１のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクすなわちＰＮａＡＭＰＳゲルディスクの上でそれぞれ作製した第７代継代細胞について、Ｋｕｍａｇａｉら（Ｋｕｍａｇａｉら、Ｊ．Ａｎａｔ．、１９９４年、第１８５巻、第２７９−２８４頁）の方法に従って、ＣｏｌｌａｇｅｎIIに対する免疫染色を行った。具体的には、これらの第７代継代細胞を脱パラフィン、脱水、水洗後、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを用いて室温で６分間処理した後、ＰＢＳで洗浄し、１％過酸化水素メタノールに３０分間浸漬し、ＰＢＳで洗浄後、５０倍稀釈した一次抗体（ウサギ抗ヒトコラーゲンII型抗体；Ａｂｃａｎ社）を用いて室温で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで再洗浄し、二次抗体（ＦＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＧヤギポリクロナール抗体；Ａｂｃａｎ社）を用いて室温で３０分間インキュベートして、ＣｏｌｌａｇｅｎIIを免疫染色した。同時に、２’−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２，５’−ｂｉ−１Ｈ−ベンズイミダゾール，三塩酸塩 水溶液（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８；同仁化学研究所）を用いて、室温で１分間インキュベートすることにより核染色した。これらの染色により、ＣｏｌｌａｇｅｎIIは緑色に染まり、核は黄色に染色される。その結果を図３に示す。
【００８５】
図３に示すように、ＰＳ上で作製した第７代継代細胞では、ＣｏｌｌａｇｅｎIIの染色がほとんどみられないが、Ｆ値が０のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクすなわちＰＤＭＡＡｍゲルディスク、Ｆ値が０．２および０．４のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスク、ならびにＦ値が１のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクすなわちＰＮａＡＭＰＳゲルディスクの上でそれぞれ作製した第７代継代細胞では、ＣｏｌｌａｇｅｎIIの染色が確認された。
【００８６】
［３−４］硫酸基を有するグリコサミノグリカン（主にコンドロイチン硫酸）に対するアルシアンブルー染色
本試験例（１）のＰＳ上で作製した第７代継代細胞、本試験例（２）のＦ値が０のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクすなわちＰＤＭＡＡｍゲルディスク、Ｆ値が０．２および０．４のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスク、ならびにＦ値が１のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクすなわちＰＮａＡＭＰＳゲルディスクの上でそれぞれ作製した第７代継代細胞について、アルシアンブルー８ＧＸ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて硫酸基を有するグリコサミノグリカン（主にコンドロイチン硫酸）に対する染色を行い、Ａｇｇｒｅｃａｎの発現を確認した。具体的には、付属の実験書に従い、これらの第７代継代細胞をＰＢＳで洗浄、脱パラフィン、脱水、水洗後、０．１Ｎ塩酸溶液に５分間浸漬し、アルシアンブルー８ＧＸ塩酸溶液（ｐＨ１．０）に３０分〜２時間様子を見ながら染色し、０．１Ｎ塩酸溶液で十分に洗浄後、流水で５分間洗浄、脱水、キシレンで透徹させた。この染色により、硫酸基を有するグリコサミノグリカン（主にコンドロイチン硫酸）は水色に染まる。その結果を図４に示す。
【００８７】
図４に示すように、Ｆ値が０のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクすなわちＰＤＭＡＡｍゲルディスク、Ｆ値が０．２および０．４のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスク、ならびにＦ値が１のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクすなわちＰＮａＡＭＰＳゲルディスクの上でそれぞれ作製した第７代継代細胞では、硫酸基を有するグリコサミノグリカン（主にコンドロイチン硫酸）の染色が確認され、Ａｇｇｒｅｃａｎの発現が示された。特に、Ｆ値が０のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクすなわちＰＤＭＡＡｍゲルディスクおよびＦ値が０．２のＰ（ＮａＡＭＰＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）ゲルディスクの上でそれぞれ作製した第７代継代細胞では、硫酸基を有するグリコサミノグリカン（主にコンドロイチン硫酸）の、透徹した鮮やかな水色の染色が確認され、Ａｇｇｒｅｃａｎの発現が顕著であることが示唆された。
【００８８】
（４）ＰＡＡｍゲルディスク、ＰＤＭＡＡｍゲルディスク、ＰＶＡゲルディスク、アガロースゲルディスク、Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）ＤＮゲルディスク、ＰＮａＡＭＰＳゲルディスクおよびＰＮａＳＳゲルディスクの上で作製した第７代継代細胞の解析
［４−１］形態観察
本試験例（３）［３−１］に記載の方法に従い、本試験例（２）のＰＡＡｍゲルディスク、ＰＤＭＡＡｍゲルディスク、ＰＶＡゲルディスク、アガロースゲルディスク、Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）ＤＮゲルディスク、ＰＮａＡＭＰＳゲルディスクおよびＰＮａＳＳゲルディスクの上で作製した第７代継代細胞の形態を、本試験例（１）のＰＳ上で作製した第７代継代細胞の形態と比較することにより観察した。その結果を図５に示す。
【００８９】
図５に示すように、ＰＡＡｍゲルディスク、ＰＤＭＡＡｍゲルディスク、ＰＶＡゲルディスク、アガロースゲルディスク、Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）ＤＮゲルディスク、ＰＮａＡＭＰＳゲルディスクおよびＰＮａＳＳゲルディスクの上で作製した第７代継代細胞はコロニーを形成した。一方、ＰＮａＡＭＰＳゲルディスクおよびＰＮａＳＳゲルディスクの上で作製した第７代継代細胞は、ＰＳ上で作製した第７代継代細胞と同様、脱分化状態を示す繊維芽細胞状の細長い形態をしており、コロニーを形成しなかった。
【００９０】
［４−２］軟骨細胞分化マーカー遺伝子および軟骨細胞脱分化マーカー遺伝子発現の定量
本試験例（１）のＰＳ上で作製した第３代継代細胞、第６代継代細胞および第７代継代細胞、ならびに本試験例（２）のＰＡＡｍゲルディスク、ＰＤＭＡＡｍゲルディスク、ＰＶＡゲルディスク、アガロースゲルディスク、Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）ＤＮゲルディスク、ＰＮａＡＭＰＳゲルディスクおよびＰＮａＳＳゲルディスクの上で作製した第７代継代細胞からそれぞれの鋳型サンプルを調製し、本試験例（３）［３−２］に記載の方法に従って、軟骨細胞分化マーカー遺伝子であるＡｇｇｒｅｃａｎ、ＣｏｌｌａｇｅｎIIおよびＳｏｘ９の他、軟骨細胞脱分化マーカー遺伝子であるＣｏｌｌａｇｅｎIの発現量を調べた。その結果を図６および図７に示す。なお、ＣｏｌｌａｇｅｎIの発現解析に使用したプライマーは以下の通りである。
【００９１】
ＣｏｌｌａｇｅｎI：
フォワードプライマー；５’−ＣＴＧＣＴＧＧＡＣＧＴＣＣＴＧＧＴＧＡＡ−３’
リバースプライマー  ；５’−ＡＣＧＣＴＧＴＣＣＡＧＣＡＡＴＡＣＣＴＴＧＡＧ−３’
【００９２】
図６に示すように、ＰＡＡｍゲルディスク、ＰＤＭＡＡｍゲルディスク、ＰＶＡゲルディスク、アガロースゲルディスクおよびＰ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）ＤＮゲルディスクの上で作製した第７代継代細胞においては、ＰＳ上で作製した第７代継代細胞と比較して、軟骨細胞分化マーカー遺伝子であるＡｇｇｒｅｃａｎ、ＣｏｌｌａｇｅｎIIおよびＳｏｘ９の発現量が多いことが示された。一方、ＰＮａＳＳゲルディスクの上で作製した第７代継代細胞においては、ＰＳ上で作製した第７代継代細胞と比較して、Ａｇｇｒｅｃａｎ、ＣｏｌｌａｇｅｎIIおよびＳｏｘ９の発現量が少ないか、ほぼ同量であることが、ＰＮａＡＭＰＳゲルディスクの上で作製した第７代継代細胞においては、ＰＳ上で作製した第７代継代細胞と比較して、Ａｇｇｒｅｃａｎ、ＣｏｌｌａｇｅｎIIおよびＳｏｘ９の発現量が若干多いか、ほぼ同量であることが示された。
【００９３】
また、図７に示すように、ＰＡＡｍゲルディスク、ＰＤＭＡＡｍゲルディスク、ＰＶＡゲルディスク、アガロースゲルディスク、Ｐ（ＮａＡＭＰＳ−ＡＡｍ）ＤＮゲルディスク、ＰＮａＡＭＰＳゲルディスクおよびＰＮａＳＳゲルディスクの上で作製した第７代継代細胞においては、ＰＳ上で作製した第７代継代細胞と比較して、軟骨細胞脱分化マーカー遺伝子であるＣｏｌｌａｇｅｎIの発現量が少ないことが示された。
【００９４】
［４−３］ＰＡＡｍゲルディスク、ＰＤＭＡＡｍゲルディスク、ＰＶＡゲルディスクおよびアガロースゲルディスクの上で作製した第７代継代細胞の回収率の検討
本試験例（２）のＰＡＡｍゲルディスク、ＰＤＭＡＡｍゲルディスク、ＰＶＡゲルディスクおよびアガロースゲルディスクの上で作製した第７代継代細胞について、培養開始時の細胞数をあらかじめ調べておき、その培養開始から７日後にそれぞれを掻き取り、再度細胞数を調べた。続いて、これらの比率からそれぞれのゲルディスクにおける細胞回収率を算出した。その結果を図８に示す。
【００９５】
図８に示すように、ＰＡＡｍゲルディスク上で作製した第７代継代細胞の回収率が最も高く、続いてＰＤＭＡＡｍゲルディスク上で作製した第７代継代細胞の回収率が高いことが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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