(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＰ１ポリペプチド−ナノ粒子複合体を含む組成物。
【請求項２】
前記ＳＰ１ポリペプチドが、天然のＳＰ１、金を結合するペプチドを含むＳＰ１変異体、及び珪素を結合するペプチドを含むＳＰ１変異体からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＳＰ１ポリペプチドが、配列番号８２〜８４及び配列番号９４〜１０３からなる群から選択されるペプチドを含む変異体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ナノ粒子が導電性分子又は半導電性分子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記導電性分子又は半導電性分子が、金属、半導体及び誘電体からなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
表面をナノ粒子で被覆する方法であって、前記表面を請求項１〜５のいずれかに記載の組成物で被覆し、それにより前記表面を前記ナノ粒子で被覆することを含む方法。
【請求項７】
溶媒における物質の分散性を高める方法であって、
（ａ）ナノ粒子をＳＰ１ポリペプチドと接触させ、ＳＰ１ポリペプチド−ナノ粒子複合体を含む組成物を形成すること；及び
（ｂ）前記ＳＰ１ポリペプチド−ナノ粒子複合体を前記溶媒と接触させ、それによって前記溶媒における前記ナノ粒子の分散性を高めること
を含む方法。
【請求項８】
前記溶媒が水性溶媒である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＳＰ１ポリペプチドが配列番号８２〜８４及び配列番号９４〜１０３からなる群から選択されるペプチドを含む変異体である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変性剤およびプロテアーゼに対して安定性を有するタンパク質、その変性された誘導体、および、それらの使用に関連する。より具体的には、本発明は、他の分子（リガンド）およびナノ構造体の複合体化、放出および送達のために設計された、変性剤に対して安定性を有するプロテアーゼ抵抗性の新規なホモオリゴマータンパク質（これはまた本明細書中では安定タンパク質（ＳＰ）として示される）およびその誘導体の使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
変性剤に対して安定性を有するプロテアーゼ抵抗性タンパク質
過酷な条件に対する並外れた抵抗性を有するストレス誘導されるシャペロン様タンパク質の特異なファミリーが近年、広範囲の多様な植物種において同定されている。アスペンのＳＰ１タンパク質（配列番号１）によって例示されるが、このファミリーのタンパク質は、煮沸、変性剤およびプロテアーゼに対する抵抗性、保存されたアミノ酸配列相同性の領域、特異な三次元立体配座、オリゴマー形成、ならびに、生物学的に活性なタンパク質に対する強い安定化作用によって特徴付けられる。
【０００３】
その特異な三次元構造との組合せにおいて、過酷な条件に対するこれらのストレス誘導のシャペロン様タンパク質の並外れた抵抗性は、極端な条件を、安定性を有するが、選択的に可逆的なリガンドとの複合体を作製するために適用することを可能にする。
【０００４】
ＳＰ１
アスペン植物（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）から単離されたＳＰ１は、塩分ストレス、低温ストレスおよび熱ストレスをはじめとする広範囲の様々な環境ストレスに応答し、また、ストレス回復時に蓄積する。有意な配列類似性が、既知のタンパク質ファミリーに関して何ら見出されておらず、また、様々なＳＰ１ホモログが、ゲノム配列またはＥＳＴのいずれかに由来する、機能が未知の仮想タンパク質として、数多くの植物種および細菌種において認められている。
【０００５】
Ｗａｎｇ他（米国特許出願第１０／２３３４０９号）は、アスペンのＳＰ１タンパク質（配列番号１）の単離、クローン化および特徴付けを行い、他の生物学的に活性なタンパク質を変性に対して安定化させることにおけるそのシャペロン様活性を発見している。Ｗａｎｇ他（米国特許出願第１０／２３３４０９号）はさらに、他の多様な植物種（トマト、マツ、イネ、トウモロコシおよびアラビドプシス）に由来する、煮沸および界面活性剤に対して安定性を有する他のタンパク質を開示した。これらのタンパク質は、類似した機能的特徴（具体的には、シャペロン様活性およびストレス関連性）を互いに有し、また、免疫交差反応性を互いに有し、また、アスペンＳＰ１に対する少なくとも６５％のアミノ酸相同性を有し、また、配列相同性の保存された領域を互いに有する。
【０００６】
Ｗａｎｇ他（米国特許出願第１０／２３３４０９号）は、結合性分子の結合特性を高めるために、また、融合された分子（例えば、酵素など）を安定化させるために、また、融合された分子の免疫学的性質を強化するか、もしくは変化させるために、他のタンパク質分子または非タンパク質分子に融合されたＳＰ１タンパク質を開示した。ＳＰ１融合タンパク質は、米国特許出願第１０／２３３４０９号によって教示されるように、遺伝子工学技術によって付加されたさらなるポリペプチド配列を有する組換えＳＰ１分子と、化学的手段（例えば、架橋など）によって付加されたさらなる非タンパク質成分を有するＳＰ１分子とを含む。Ｗａｎｇ他はさらに、皮膚、毛髪、爪などを強化するための、ＳＰ１タンパク質の治療的使用を開示している。しかしながら、米国特許出願第１０／２３３４０９号は、天然ＳＰ１またはＳＰ１変異体を、それらと可逆的に複合体化された薬剤（治療薬、化粧品、診断用薬、導電剤など）の制御された放出のためのキャリアとして、あるいは、そのような放出の手段として使用することを教示も、示唆もしていない。
【０００７】
薬物キャリア：
疾患を治療するために用いられる多くの薬物は、水溶液における溶解性が不十分であるか、または、治療的濃度において有害な副作用を有するかのいずれかである。従って、多くの医学的適用は、薬物の効果的な濃度を、治療を必要とする生物（例えば、哺乳動物）において標的細胞または標的組織に効率的に送達するための好適な方法がないことを欠点として有する。
【０００８】
薬物を効率的に使用するためのいくつかの考慮すべき事項には、下記が含まれる：
不十分な溶解性、これによって、疎水性の薬物が水性媒体では沈殿し得るので、好都合な薬学的形式を達成することにおける困難を引き起こす。しかしながら、可溶化のための賦形剤（例えば、Ｃｒｅｍｐｈｏｒ（タキソールにおけるパクリタキセルのための溶解剤）など）の使用にはまた、毒性が伴う。
【０００９】
標的組織についての選択性の欠如、これによって、正常な組織に対する毒性がもたらされ、ドキソルビシンの心臓毒性の場合のように、投与することができる薬物の量が厳しく制限される。標的組織における薬物の低い濃度はさらに、最適でない治療効果をもたらす。
【００１０】
好ましくない薬物動態学、例えば、インビボでの薬物の迅速な腎臓クリアランス、迅速な分解、または、生理学的条件での活性の欠損（例えば、生理学的ｐＨでのカンプトテシン類の活性の欠損）、これもまた、増大された服用または頻繁な投与療法をもたらし得る。
【００１１】
細胞の輸送体、解毒経路、または、アポトーシス伝達経路の阻害を誘導することによる標的組織（例えば、腫瘍など）における薬物抵抗性の発達。
【００１２】
組織損傷をもたらす細胞毒性薬物の管外遊出での組織損傷（すなわち、遊離パクリタキセルによって引き起こされる壊死）。
【００１３】
多くの方法により、これらの問題点のいくつかが特定の場合には解決されているが、今までのところ、薬物送達の問題に対する一般的な解決策は存在していない。これらの問題を解決するために存在する方法のいくつかの例には、（１）疎水性の薬物を水性媒体において界面活性剤から形成されるミセルに可溶化すること（ＷｉｅｄｍａｎｎおよびＫａｍｅｌ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、２００２、９１、１７４３；ＭａｃＧｒｅｇｏｒ他、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、１９９７、２５、３３）、（２）生分解性であり得るか、生物接着性の官能基またはリガンドを含有し得るナノメートルからマイクロメートルのサイズ範囲でのポリマーマトリックスで薬物をカプセル化すること（国際特許出願公開ＷＯ０２／１５８７７、同ＷＯ０２／４９６７６）、（３）親水性の薬物をリポソームでカプセル化すること（Ａｎｄｅｒｓｏｎ他、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、２００１、１８、３１６；国際特許出願公開ＷＯ９９／３３９４０）（この場合、リポソームはまた、生物接着性の官能基またはリガンドを呈示することができる）、（４）能動的輸送系のための基質である分子に薬物をコンジュゲート化すること（Ｋｒａｍｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４、２６９、１０６２１；国際特許出願公開ＷＯ０１／０９１６３；米国特許出願公開２００２／００９８９９９；米国特許出願公開２００６００７４２２５）、（５）活性な薬物成分（すなわち、プロドラッグ）の生理学的に選択的（ｐＨ、酵素的など）な放出を使用して標的化すること、（６）薬物をヒドロゲルと会合させること、および（７）分解、免疫認識または腎臓排出からタンパク質薬物を保護するためにタンパク質薬物を親水性ポリマーにより化学的に誘導体化すること（Ｂｅｌｃｈｅｖａ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、１９９９、１０、９３２；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、１９９５、６、１５０；米国特許第４００２５３１号；米国特許第４１７９３３７号）が含まれる。しかしながら、これらの方法はどれも、薬物送達問題のすべての場合についての一般的な解決策を提供していない。ミセル系、リポソーム系およびポリマーナノ粒子系における粒子サイズの制御は依然として重大な問題である。現在利用可能な薬物送達系が、送達のために要求される機能のすべてを１つの系に取り込むことができないことは、例えば、ミセル、ナノ粒子系および標的化系に関する別の問題である。なおさらに、放出速度および貯蔵寿命、特に、ミセルおよびリポソームの放出速度および貯蔵寿命は、制御することが困難で、予測不能であり、また、両親媒性成分は様々な毒性作用を生じさせ得る。
【００１４】
生物の細胞または組織への薬物送達のために用いられる他の系は類似する欠点を有する。従って、上記で示された問題を最小限に抑えるか、または克服する、薬物を送達するための方法が求められている。
【００１５】
本発明には、他の物質（例えば、小分子、ペプチド、核酸フラグメント、無機ナノ構造体および他の分子（リガンド）など）との分子的複合体を形成するためにＳＰ１およびＳＰ１変異体を使用するための方法が含まれる。加えて、本発明には、薬物の分子的複合体化のために、また、複合体化されたリガンドの送達ならびに制御放出のためにＳＰ１およびＳＰ１変異体を使用するための方法が含まれる。従って、上記の制限を有しない分子的複合体を形成することができるＳＰ１およびＳＰ１変異体が必要であることが広く認識されており、また、そのようなＳＰ１およびＳＰ１変異体を有することは非常に好都合である。
【発明の概要】
【００１６】
本発明の１つの態様によれば、ＳＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、このアミノ酸配列が、物質との可逆的な分子的会合の状態であるように変性される単離されたポリペプチドが提供される。
【００１７】
本発明のさらに別の態様によれば、配列番号２〜配列番号３０に示されるようなアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが提供される。
【００１８】
本発明のなおさらに別の態様によれば、配列番号２〜配列番号３０に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド、または、ＳＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、このアミノ酸配列が、物質との可逆的な分子的会合の状態であるように変性される単離されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００１９】
本発明の別の態様によれば、複数の自己集合した変性ＳＰ１モノマーを含む組成物が提供される。
【００２０】
本発明のさらに別の態様によれば、変性ＳＰ１ポリペプチドとの分子的会合の状態にある治療薬、診断用薬または化粧剤を含む単離された組成物が提供される。
【００２１】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＳＰ１分子は治療薬、診断用薬または化粧剤に翻訳融合される。
【００２２】
本発明のなおさらに別の態様によれば、治療薬、診断用薬または化粧剤との可逆的な分子的会合の状態でＳＰ１ポリペプチドを含む単離された組成物が提供される。
【００２３】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＳＰ１分子は治療薬、診断用薬または化粧剤に翻訳融合されない。
【００２４】
本発明のさらに別の態様によれば、変性ＳＰ１ポリペプチドとの分子的会合の状態にある導電性物質または半導電性物質を含む単離された組成物が提供される。
【００２５】
本発明のさらに別の態様によれば、導電性物質または半導電性物質との可逆的な分子的会合でのＳＰ１ポリペプチドを含む単離された組成物が提供される。
【００２６】
本発明のさらに別の態様によれば、治療薬、診断用薬または化粧剤をその必要性のある対象に送達する方法が提供され、この場合、この方法は、ＳＰ１ポリペプチドとの分子的会合の状態にある治療薬、診断用薬または化粧剤を含む組成物の治療効果的な量を対象に投与し、それにより、この治療薬、診断用薬または化粧剤をこの対象に送達することを含む。
【００２７】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＳＰ１ポリペプチドは、変性ＳＰ１ポリペプチドが可能である。
【００２８】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、分子的会合は可逆的な分子的会合であり、方法はさらに、この分子的会合を可逆化するための条件を提供することを含む。
【００２９】
本発明のさらに別の態様によれば、物質を安定化させる方法が提供され、この場合、この方法は、物質を、この物質との複合体を可逆的に形成するために変性ＳＰ１ポリペプチドと接触させ、その結果、複合体を形成させ、それにより、この物質を安定化させることを含む。
【００３０】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、安定性は、温度安定性、イオン強度安定性、プロテアーゼ安定性および触媒作用安定性からなる群から選択される特性を含む。
【００３１】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、方法はさらに、この複合体を溶媒と接触させ、その結果、溶液を形成する工程を含む。
【００３２】
本発明のさらに別の態様によれば、溶液における物質の溶解性を高める方法が提供される。この方法は、物質を、この物質との複合体を可逆的に形成することができるＳＰ１ポリペプチドと接触させ、その結果、複合体を形成すること、および、この複合体を、溶媒を用いて溶解し、その結果、溶液を形成することによって行われ、それにより、溶液における物質の溶解性を高める。溶媒は水性溶媒または有機溶媒が可能であり、物質は疎水性物質または親水性物質が可能である。
【００３３】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＳＰ１ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも６５％の相同性を有する、煮沸および界面活性剤に対して安定なタンパク質であって、シャペロン様活性を有し、安定なダイマーを形成することができるタンパク質である。
【００３４】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＳＰ１ポリペプチドは、１０．００のプルラリティー（ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）、４の閾値、１．００の平均加重、２．９１の平均マッチおよび−２．００の平均ミスマッチを使用してＧＣＧのＢｅｓｔ  Ｆｉｔアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ９．１）を使用して決定されたとき、少なくとも１つの保存されたアミノ酸配列を、配列番号１のアミノ酸９〜１１、アミノ酸４４〜４７および／またはアミノ酸６５〜７３に対応する少なくとも１つの領域に有する。
【００３５】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＳＰ１ポリペプチドはオリゴマー形成によって特徴付けられ、このＳＰ１オリゴマーは熱安定性でかつプロテアーゼ抵抗性のオリゴマーである。
【００３６】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＳＰ１ポリペプチドは、変性アミノ酸配列を有するＳＰ１ポリペプチドであり、変性は、ジスルフィド結合を形成することができる少なくとも１つのアミノ酸の付加を含む。
【００３７】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、変性は、配列番号１のアミノ酸残基２に対応する位置における少なくとも２つのヒスチジン残基の付加を含む。
【００３８】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、変性は、配列番号１のアミノ酸残基４０に対応する位置における、少なくとも１つのチオール基を有する少なくとも１つのアミノ酸の付加を含む。
【００３９】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、薬剤との分子的会合または複合体を形成することはレドックス依存的である。
【００４０】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、変性は、配列番号１のアミノ酸残基２またはアミノ酸残基４０に対応する位置におけるシステイン残基の付加である。
【００４１】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、物質は、治療薬、診断用薬または化粧剤である。なおさらに、治療薬、診断用薬または化粧剤は、ポリペプチド剤、核酸剤、脂質剤、炭水化物剤、小分子、および、それらの組合せからなる群から選択される。
【００４２】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、物質は、導電性または半導電性のイオン性物質である。導電性または半導電性のイオン性物質は、金属、半導体および誘電体のいずれかが可能である。
【００４３】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、変性アミノ酸配列は、配列番号２〜配列番号３０に示される通りである。
【００４４】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、このアミノ酸配列は、標的認識配列を含むように変性される。標的認識配列はガン細胞表面またはガン細胞血管系を認識する配列が可能である。標的認識配列は配列番号３１〜配列番号６２の配列のいずれかが可能である。標的認識配列は、配列番号６３〜配列番号８１からなる群から選択されるガン細胞血管系認識配列が可能である。ガン細胞血管認識配列はＣＲＧＤ配列が可能である。
【００４５】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、分子的会合は共有結合性の会合または非共有結合性の会合である。
【００４６】
本発明のさらに別の態様によれば、治療薬、診断用薬または化粧剤をその必要性のある対象に送達するための医薬品を製造するための、天然ＳＰ１ポリペプチドまたは変性ＳＰ１ポリペプチドとの分子的会合の状態にある治療薬、診断用薬または化粧剤を含む組成物の使用が提供される。
【００４７】
本発明のなおさらに別の態様によれば、治療薬、診断用薬または化粧剤をその必要性のある対象に送達するための医薬品の治療的製造物を送達するための、天然ＳＰ１ポリペプチドまたは変性ＳＰ１ポリペプチドとの分子的会合の状態にある治療薬、診断用薬または化粧剤を含む組成物が提供される。
【００４８】
本発明は、治療的適用、診断的適用、化粧的適用、ならびに薬物の送達、可溶化および安定化のようなナノ技術的適用における使用のための物質との分子的会合を形成することができる単離されたＳＰ１ポリペプチドおよびＳＰ１変異体ポリヌクレオチドを提供することによって、現在知られている構成の欠点に首尾よく対処する。
【００４９】
図面の簡単な記述
本発明は、添付図面を参照して、本明細書において例としてのみ記載されている。ここでこれらの図面を特に参照することによって、示されている詳細は、例としてのものであり、本発明の好ましい実施形態の例証的考察のみを目的としており、本発明の原理および概念的側面の最も有用かつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示されている。この点に関して、本発明の基本的理解に必要なもの以上に詳細に本発明の構造的詳細を示す試みはなされず、これらの図面を用いて行なわれる説明は、この発明のいくつかの形態がどのようにして実際に具体化されうるかを当業者に明らかにする。
【００５０】
図１は、ＳＰ１オリゴマーの陰染色された２Ｄ結晶の電子顕微鏡写真、および、その２Ｄ結晶性構造のグラフィック表示である。
図２ａ〜図２ｂは、ＮＴＡ−Ｎｉ金ナノ粒子が中心の空洞において６Ｈタグに結合することを示す組換えＳＰ１：６ＨＳＰ１の電子顕微鏡写真である。図２ａは透過電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）である。タンパク質−ナノゴールド−タンパク質−ナノゴールド．．．の交互配列に留意すること。図２ｂはナノゴールド−６ＨＳ−ＳＰ１コンジュゲートのグラフィック表示である。
図３は、２つのＳＰ１変異体がヘテロオリゴマーのＳＰ１複合体に自己集合することを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。組換えＨＩＳタグ化ＳＰ１（６Ｈ）およびＮ末端欠失ＳＰ１（ΔＮ）のモノマーが同時に電気溶出され（６ＨΔＮ）、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースで精製され、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）消化に供された。タンパク質サンプルをＳＤＳサンプル緩衝液においてＳＤＳ対サンプルの過剰な割合で調製し、このとき、５分間の煮沸（ｂ）または煮沸非処理（ｎｂ）のいずれかに供した。レーン１＝ＷＴ：野生型ＳＰ１。煮沸されたモノマー状のゲル精製形態の６ＨＳＰ１（レーン２）およびΔＮＳＰ１（レーン３）をクーマシーブルー染色によって可視化し、切り出し、１：１の比率（ｖ／ｖ）で混合した（レーン４およびレーン５）。タンパク質を、以前に記載されたように、電気溶出によって同時に溶出させた（Ｗａｎｇ（２００２））。ヘテロオリゴマー複合体をＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズで単離した（レーン６およびレーン７）。モノマーＳＰ１を消化するが、ＳＰ１複合体を消化しないプロテイナーゼＫを、６ＨＳＰ１およびΔＮＳＰ１のモノマー形態をＮｉ−ＮＴＡ精製タンパク質から除くために用いた（レーン８およびレーン９）。ヘテロオリゴマーＳＰ１の組成をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって求め、銀染色によって可視化した。
図４は、腫瘍特異的ペプチドのＣＲＧＤおよびＲＧＤＣのＳＰ１表面での多重呈示を示す。これらのペプチドをＳＰ１のＮ末端に挿入した。ＣＲＧＤ変異体（レーン１〜レーン３）およびＲＧＤ−Ｃ変異体（レーン５〜レーン７）はともに高分子量の複合体を形成することに留意すること（レーン３およびレーン７）。タンパク質が還元剤の存在下でサンプル適用緩衝液において煮沸されるとき、複合体はより低分子量の化学種（モノマーおよびダイマーなど）に解離する。還元剤が存在しない場合（レーン１およびレーン５）、および、（還元剤が存在しない）酸化状態下での煮沸では、より大きいレベルのダイマーが認められる（レーン２）。レーン４＝分子量マーカー。
図５ａおよび図５ｂは、組換え変異体ＳＰ１の発現、精製およびリフォールディングを示すＰＡＧＥ分析の写真である。Ｃｙｓ２ｌｏｏｐ１ＲＧｄ  ＳＰ１変異体は発現時に可溶性タンパク質を形成せず（封入体（ＩＢ）に見出され）、フレンチプレスによって抽出され、遠心分離（２０分、１７０００ｘｇ）によって沈降した。可溶性ＳＰ１を含有しない上清（図５ａ、レーン１）を集め、ＳＰ１のＩＢを含有するペレット（図５ａ、レーン２）を薄い尿素で洗浄し、５Ｍの尿素および１０ｍＭのＤＴＴにおいて可溶化し、遠心分離した（３０分、２００００ｘｇ）。ペレット（図５ａ、レーン３）を捨て、上清を集め、２ｍＭのＤＴＴを含む緩衝液に対して４日間にわたって透析した（図５ａ、レーン４）。透析された変異体ＳＰ１を低温で３週間保存し（図５ｂ、レーン１およびレーン２）、ＳＰ１モノマー、ならびに、非特異的なタンパク質を３０分間の熱処理によって除き、プロテアーゼ（アルカラーゼ、１００００の希釈度）によって消化し（図５ｂ）、透析した（図５ｂ、レーン４）。ＭＷ＝分子量マーカー（上方バンド＝ＳＰ１複合体、下方バンド＝ＳＰ１モノマー）。複合体化していないより低分子量の形態（図５ａ、レーン２およびレーン４；図５ｂ、レーン１およびレーン２）から、より高分子量のオリゴマー形態（図５ｂ、レーン３およびレーン４）への変化に留意すること。
図６ａ〜図６ｃは、イオン交換クロマトグラフィー（図６ａ）および疎水性相互作用クロマトグラフィー（図６ｂ）の両方を使用する、組換え細胞の粗製の耐熱性抽出物の組換えＳＰ１の精製を示す。図６ｃは、Ｓｏｕｒｃｅ−Ｑ疎水性相互作用カラムでの分離の精製された生成物と比較したときの、粗製の組換え細胞抽出物（レーン１）および耐熱性画分（レーン２）のＰＡＧＥ分析である。
図７は、ゲルろ過ＨＰＬＣ（ＴＳＫ３００カラム）（上段）および逆相ＨＰＬＣ（Ｃ−１８カラム）（下段）の両方で単一ピークとして溶出する純粋なＳＰ１の特徴付けを示す。
図８ａ〜図８ｃは、Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体による薬物複合体形成および制御された放出の仮想的なモデルを例示するグラフィック表示である。図８ａは、遊離チオールと、ジスルフィド結合との間での動的平衡に依存する、Ｃｙｓ２変異体の中心の空洞のレドックス依存的な開放および閉鎖についてのモデルを示す（還元剤は平衡を遊離チオールの方向に変化させ、酸化剤は平衡をジスルフィド結合の方向に変化させる）。図８ａは、Ｃｙｓ２  ＳＰ１モノマーが還元状態（ＬＳＢ＋２％ｂ−メルカプトエタノールにおける１０分間の煮沸）のもとで優勢であること（レーン１）、および、Ｃｙｓ  ＳＰ１ダイマーが非還元性の条件のもとで優勢であること（レーン２）を例示するＳＤＳ−ＰＡＧＥである。図８ｃは、Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体によるレドックス依存的な薬物複合体形成を例示するグラフィック表示である。
図９は、Ｃｙｓ２  ＳＰ１による小分子とのレドックス依存的な複合体形成を示すヒストグラムである。純粋なＣｙｓ２変異体（リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ｐＨ＝７．５）（ＰＢＳ）において１．５ｍｇ／ｍｌ）を、グルタチオン（還元型形態、ＧＳＨ、３ｍＭ）の存在下または非存在下、１ｍＭのフルオレセイン−アミンと室温で２時間インキュベーションした。結合反応を、過酸化水素（０．０１％）を加えることによって停止させ、続いて、限外ろ過（３０ｋＤのカットオフフィルターを使用する）および徹底的な洗浄を行った。吸収分析を２７８ｎｍおよび４９２ｎｍの両方で行い、結果が４９２／２７８の比率として表された。還元剤（ＧＳＨ）が存在しない場合、フルオレセイン−アミンの保持が無視できるほどであることに留意すること。
図１０は、組換えＳＰ１と比較したときの、Ｃｙｓ２  ＳＰ１によるレドックス依存的なフルオレセインアミン複合体形成のグラフィック表示である。フルオレセイン−アミンを、ＤＴＴ（１０ｍＭ）の非存在下または存在下、純粋なＳＰ１またはＣｙｓ２  ＳＰ１変異体（ＰＢＳ（ｐＨ＝７．５）において１．５ｍｇ／ｍｌ）とインキュベーションした。結合反応を、過酸化水素（０．０１％）を加えることによって停止させ、続いて、限外ろ過（３０ｋＤのカットオフフィルターを使用する）および徹底的な洗浄を行った。サンプルをゲルろ過ＨＰＬＣによって分析し、２２８ｎｍおよび４９０ｎｍの両方で検出した。計算されたデータが右側に示される。Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体による還元状態（１０ｍＭ  ＤＴＴ）下でのフルオレセイン−アミンの優れた保持に留意すること。
図１１は、Ｃｙｓ２  ＳＰ１によるフルオレセイン−アミンとの濃度依存的な複合体形成を例示するヒストグラムである。フルオレセイン−アミン（１０ｍＭ、３３ｍＭ、１００ｍＭまたは３３３ｍＭ）を、１０ｍＭのＤＴＴの存在下、Ｃｙｓ２  ＳＰ１または純粋な野生型ＳＰ１とインキュベーションし、結合画分および非結合画分を図１０でのように限外ろ過およびＨＰＬＣによって分析した。高濃度のＣｙｓ２  ＳＰ１のＣｙｓ２  ＳＰ１による優れた結合に留意すること。
図１２は、Ｃｙｓ２  ＳＰ１によるドキソルビシンとの優れたレドックス依存的な複合体形成を示すヒストグラムである。純粋な野生型ＳＰ１またはＣｙｓ２  ＳＰ１変異体（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝化（ｐＨ＝６．８）における１．５ｍｇ／ｍｌ）を、穏やかに回転しながら、ＤＴＴ（１０ｍＭ）の存在下、ＤＯＸ（１ｍｇ／ｍｌ）と室温で一晩インキュベーションした。結合反応を、過酸化水素（０．０１％）を加えることによって停止させ、続いて、限外ろ過（３０ｋＤのカットオフフィルターを使用する）および徹底的な洗浄を、流出が無色になるまで行った。光学密度を、ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して２７８ｎｍおよび４７７ｎｍの両方で測定した。野生型ＳＰ１に対する効果がないことと比較して、Ｃｙｓ２  ＳＰ１による薬物結合に対する還元剤の劇的な効果には留意すること。
図１３は、Ｃｙｓ２  ＳＰ１によるドキソルビシンのドックス依存的な放出を示すヒストグラムである。ドキソルビシン（ＤＯＸ）を上記の図９〜図１２に記載されるようにＣｙｓ２  ＳＰ１内に複合体化した。０ｍＭ、２ｍＭおよび２０ｍＭのＧＳＨの存在下での薬物の放出を限外ろ過およびサイズ排除ＨＰＬＣ分析（２２８ｎｍおよび４７５ｎｍでの検出）によって測定した。
図１４は、Ｃｙｓ２  ＳＰ１によるＤＯＸ複合体形成に対する酸化の影響を例示するヒストグラムである。ドキソルビシン（ＤＯＸ）を上記の図９〜図１３に記載されるようにＣｙｓ２  ＳＰ１および野生型ＳＰ１と反応させた。酸化されたタンパク質は、ＧＳＨによる処理に先立って、過剰なＨ２Ｏ２への暴露を示す。ＤＯＸ複合体形成を限外ろ過およびサイズ排除ＨＰＬＣ分析（２２８ｎｍおよび４７５ｎｍでの検出）によって測定した。右側パネルは、４７７ｎｍで測定されるＲＰ−ＨＰＬＣでの結合ＤＯＸおよび遊離ＤＯＸの検出を示す。１＝保持物；２＝流出；および３＝ＤＯＸ標準物（２０μｇ／ｍｌ）。
図１５は、ＳＰ１−ＤＯＸ複合体を特徴付けるＳＤＳ  ＰＡＧＥ蛍光分析の写真である。ＤＯＸを標準的な条件（図１１を参照のこと）のもとでＣｙｓ２  ＳＰ１変異体と複合体化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、固定し、洗浄し、ＤＯＸを、緑色フィルターを使用して、４７３ｎｍでの蛍光画像化装置（ＦＵＪＩＦＩＬＭ  ＦＬＡ−５００、ＦＵＪＩ、日本）による走査によって可視化した。クーマシー染色を、サンプルのタンパク質含有量を比較するために使用した。ＤＯＸが、極端な条件（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル）のもとでさえ、Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体のすべての形態（複合体、ダイマーおよびモノマー）との堅固な複合体を形成し続けたことに留意すること。
図１６は、熱、還元および血清にさらされたときのＤＯＸ−ＳＰ１複合体の安定性を例示する蛍光ＰＡＧＥ分析の写真である。ＳＰ１およびＤＯＸを上記の図９〜図１４に記載されるように反応させて、複合体を形成させた。サンプルは、熱処理（８０℃で３０分）（レーン１〜レーン４）、プロテアーゼ処理（１：１０００で希釈されたアルカラーゼ、４５℃で３０分間）（レーン１〜レーン３およびレーン５）のいずれかを、希釈されたマウス血清（１：１０）（レーン１およびレーン２）の存在下または非存在下で受けた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために、すべてのサンプルを、２％β−メルカプトエタノールを含む緩衝液（ＬＳＢ）において１０分間煮沸した。変性条件およびタンパク質分解条件に対するＳＰ１−ＤＯＸ複合体の優れた抵抗性に留意すること。
図１７は、Ｃｙｓ２タンパク質およびＳＰ１融合タンパク質によるＤＯＸとの効果的な複合体形成を例示する蛍光ＰＡＧＥ分析の写真である。組換え野生型（レーン１およびレーン２）、Ｃｙｓ２（レーン３およびレーン４）、および、Ｎ末端のさらなる腫瘍特異的ペプチドＲＧＤ（ＣＲＧＤ）を有するＳＰ１融合タンパク質（レーン５およびレーン６）、または、逆順序でのＲＧＤ（ＲＧＤＣ）を有するＳＰ１融合タンパク質（レーン７およびレーン８）を、上記の図９〜図１４に記載されるようにＤＯＸと反応させて、複合体を形成させ、その後、ＬＳＢにおける煮沸による変性を伴って（レーン２、レーン４、レーン６およびレーン８）、または、伴うことなく（レーン１、レーン３、レーン５およびレーン７）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。高分子量の複合体における強い蛍光に留意すること（非煮沸サンプル、レーン１、レーン３、レーン５およびレーン７）。これは、すべての変異体ＳＰ１による薬物の効果的な結合、および、はるかにより低い程度ではあるが、野生型による薬物の効果的な結合を示している。
図１８は、有機溶媒に対するＳＰ１の高分子量オリゴマー複合体の抵抗性を示す写真である。野生型ＳＰ１（レーン１〜レーン３）またはＣｙｓ２  ＳＰ１（レーン４〜レーン６）（１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）における１ｍｇ／ｍｌ）を凍結乾燥し、緩衝液（レーン１およびレーン４）または溶媒（１０分のインキュベーション時間）（レーン２およびレーン５＝メタノール；レーン３およびレーン６＝ヘキサン）に再懸濁した。サンプルを水に再懸濁し、高分子量オリゴマー複合体の存在についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。オリゴマー複合体がすべての条件のもとで持続すること、および、Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体が野生型よりも一層大きい抵抗性を有することに留意すること。
図１９は、ＳＰ１との複合体によるパクリタキセル（ＰＴＸ）の可溶化を示すＨＰＬＣ分析である。精製された組換えの凍結乾燥された野生型ＳＰ１をパクリタキセル溶液（０．１ｍｌ、アセトン：ヘキサン（１：２）に溶解、０．２５ｍｇ／ｍｌ）と混合し、２０分間にわたって超音波処理し、溶媒をスピードバキュームによってエバポレーションした。水に溶解し、さらなる超音波処理およびボルテックス混合を行った後、５０μｌのサンプルをＲＰ  ＨＰＬＣによって分析した。上段パネルはＨＰＬＣピーク（２２５ｎｍ）を示す（ＳＰ１＝黒色；ＳＰ１−ＰＴＸ＝赤色；ＰＴＸ＝青色；ＰＴＸ／Ｈ２Ｏ＝マゼンタ色）。下段パネルは、複合体化されたＳＰ１−ＰＴＸの（３０ｋＤでの）限外ろ過の結果を示す。高い割合のＰＴＸがＳＰ１−ＰＴＸ複合体によって溶液中に保持されることに留意すること。
図２０は、ＳＰ１−ＰＴＸ複合体からのＰＴＸの効率的なエタノール抽出を示すＨＰＬＣ分析である。上記の図１９でのように調製されたＳＰ１−ＰＴＸ複合体を沈殿させ（赤色線）、その後、８０％エタノールにより抽出し（黄色線）（−２０℃で２時間）、その後、ＨＰＬＣで分析した（下段パネル）（青色＝処理されていない複合体）。タンパク質沈殿によるＰＴＸの欠損、および、抽出されたサンプルにおけるＰＴＸの出現に留意すること。
図２１は、ＰＴＸ抽出に対する還元状態の影響を示すＨＰＬＣ分析である。上記の図１９でのように調製されたＳＰ１−ＰＴＸ複合体を、１０ｍＭ  ＧＳＨの存在下（中塗り四角−マゼンタ色）または非存在下（中塗り三角、青色）、（タンパク質沈殿を引き起こさない条件のもとで）０％〜６０％のエタノールにより抽出し、その後、ＨＰＬＣで分析した。酸化された複合体によるＰＴＸの優れた保持に留意すること。
図２２は、ＳＰ１によるＰＴＸ結合に対する還元状態の影響を示すＨＰＬＣ分析である。ＳＰ１−ＰＴＸ複合体を還元状態（ｂ−メルカプトエタノール、ｍＭ）の非存在下または存在下で図１９でのように調製し、上記で記載されたように限外ろ過（無菌の０．２２μｍフィルター）およびＨＰＬＣによって分離した。還元状態下で形成された複合体の優れた水溶性に留意すること。
図２３は、ＳＰ１に対する薬物（ビンブラスチン）の複合体形成を示すグラフである。左側パネル−純粋なＳＰ１（ＭＥＳにおける４８μＭ）の放射スペクトル（励起波長＝２８６．００ｎｍ）を、蛍光計を使用して求めた。未変性ＳＰ１（左側の曲線）およびアンフォールディング（６ＭグアニジニウムＨＣｌ）による変性ＳＰ１（右側の曲線）の両方を調べた。未変性タンパク質のトリプトファンの蛍光に対するビンブラスチンの正味の影響を、変性タンパク質による相対的な消光をそれぞれの最大放射波長（それぞれ、３４０ｎｍおよび３２１ｎｍ）において未変性タンパク質の相対的な消光から引くことによって計算した。折り畳まれたＳＰ１タンパク質およびアンフォールディングによる変性ＳＰ１タンパク質の両方のトリプトファンの蛍光がビンブラスチンの複合体化によって消光され、しかし、折り畳まれたタンパク質の場合、赤方移動もまた伴うことに留意すること。
図２４ａおよび図２４ｂは、ＳＰ１−ＤＯＸ複合体のインビボトロ細胞毒性効果を例示するグラフである。図２４ａ−９６ウエルマイクロタイタープレートで培養されたＨＴ−２９細胞を、非複合体化ＤＯＸ（中塗り長円、マゼンタ色）、または、図９〜図１５に記載されるように調製されたＳＰ１−ＤＯＸ複合体（中塗り三角、青色）に、示された濃度でさらした。図２４ｂ−ＨＴ−２９細胞を、非複合体化ＳＰ１（ＤＯＸ非含有）（中塗りひし形、青色）またはＳＰ１−ＤＯＸ複合体（中塗り三角、黄色）に、示された濃度でさらした。生細胞の割合をＭＩＴアッセイによって求め、ＩＣ５０を計算した。非複合体化ＳＰ−１には細胞毒性がないこと（図２４ｂ）、ならびに、遊離ＤＯＸおよびＳＰ１複合体化ＤＯＣについてのＩＣ５０値が同等であることに留意すること。
図２５ａ〜図２５ｂは、遊離ＰＴＸと比較して、ＳＰ１−ＰＴＸ複合体のインビトロ細胞毒性を示すグラフである。ＳＰ１−ＰＴＸ複合体を上記の図１９〜図２２に従って調製した。ＨＴ−２９細胞を上記の図２４でのように調製した。図２５ａは、ＳＰ１−ＰＴＸおよび遊離ＰＴＸ（ＤＭＳＯ中）にさらされたＨＴ−２９細胞のＩＣ５０を示す。細胞を、遊離ＰＴＸ（中塗り円、緑色）またはＳＰ１−ＰＴＸ複合体（中塗り三角、赤色）に、示された濃度でさらした。図２５ｂは、示された濃度で非複合体化ＳＰ１（中塗り三角、青色）またはＳＰ１−ＰＴＸ複合体（中塗り三角、赤色）にさらされたＨＴ−２９細胞のＩＣ５０を示す。非複合体化ＳＰ−１には細胞毒性がないこと、ならびに、遊離ＰＴＸおよびＳＰ１−ＰＴＸ複合体の両方についてのＩＣ５０値が類似することに留意すること。
図２６は、ＳＰ１複合体の優れた薬力学および標的化を例示する免疫ブロット分析である。Ｂ１６−Ｆ１０（Ｂ１６）メラノーマ腫瘍細胞を有するＣ５７Ｂ１のオスのマウスを３つの群に分けた：Ａ群−１回の注射（フルオレセインアミン−ＳＰ１コンジュゲート（１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｌ／マウス）によるｉｖ）、ｎ＝５匹のマウス；Ｂ群−非コンジュゲート化フルオレセインアミンの溶液（ＰＢＳにおける３４ｍＭ、０．１ｍｌ／動物）による１回の注射、ｎ＝５匹のマウス；および、Ｃ群は処置を受けなかった（ｎ＝２匹のマウス）。内臓器官を注射後２４時間で集め、−７０℃で保存した。血液を集め、室温で放置して凝固させた。腫瘍抽出物および血清サンプルをＳＤＳ  ＰＡＧＥで分析し、タンパク質をニトロセルロースにブロッティングした。ＳＰ１の免疫検出を、ウサギ抗ＳＰ１抗体およびＨＲＰコンジュゲート化二次抗体を用いて行った。ＳＰ１が注射後２４時間で腫瘍および血清の両方に多量に存在することに留意すること。
図２７ａおよび図２７ｂは、非複合体化ＤＯＸと比較して、ＳＰ１複合体化ＤＯＸの優れた抗腫瘍効果を示すヒストグラムである。ヒトＬＳ１４７Ｔ結腸ガン（動物一匹あたり１００万個の細胞）の皮下異種移植された腫瘍を有するＣＤ１ヌードマウスを２つの群に分け（ｎ＝６）、これらに、ＳＰ１−Ｄｏｘ（ＰＢＳにおいて５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ＫｇのＤＯＸ相当量）またはＰＢＳ（図２７ａ）、あるいは、非複合体化ＤＯＸ（３ｍｇ／Ｋｇ）またはＰＢＳ（図２７ｂ）のいずれかを単独で、尾静脈内への静脈内注射により、１週間に２回、４週間にわたって与えた。腫瘍を移植後３５日で取り出し、重量測定した。遊離ＤＯＸと比較したとき、複合体化されたＳＰ１−ＤＯＸの著しくより大きい抗腫瘍有効性に留意すること。
図２８ａおよび図２８ｂは、遊離ＤＯＸと比較して、ＳＰ１複合体化ＤＯＸの処置による副作用の著しい減少を示すヒストグラムである。ｓ．ｃ．異種移植されたヒトＬＳ１４７Ｔ結腸ガン腫瘍を有するＣＤ１ヌードマウスを、本明細書中上記の図２７ａおよび図２７ｂに記載されるように静脈内ＳＰ１複合体化ＤＯＣ（図２８ａ）または遊離非複合体化ＤＯＣ（図２８ｂ）により処置した。ＰＢＳをコントロールに注射した。動物を屠殺前に重量測定した（腫瘍注入後３５日）。ＳＰ１複合体化ＤＯＸを受けたマウスにおける無視できるほどの体重減少と比較して、複合体化されていない遊離ＤＯＸによる重度の体重減少に留意すること。
図２９は、サイズ排除ＨＰＬＣ分析によるＳＰ１−ＤＯＸ複合体の検出を示すグラフである。ＳＰ１−ＤＯＸ複合体が２７８ｎｍ（ＳＰ１について特徴的）および４７５ｎｍ（ＤＯＸについて特徴的）の両方で検出可能である。
図３０は、２７８ｎｍにおけるサイズ排除クロマトグラフィー（サイズ排除ＨＰＬＣ）での典型的なＳＰ１標準曲線を示す。ＳＰ１がカラム（ＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ、Ｔｏｓｏｈａａｓ）から７分後に溶出され、２７８ｎｍにおいて検出されるだけである。挿入図は、ＳＰ１が所定の濃度範囲にわたって定量的に検出されることを示す。
図３１は、４９０ｎｍでのＦＡ標準物プロフィルのサイズ排除クロマトグラフィー（サイズ排除ＨＰＬＣ）のクロマトグラムを示す。区別可能なピークでカラムから溶出される遊離ＦＡとは対照的に、ＤＯＸは区別可能なピークで溶出されない（図２９）。挿入図は、ＦＡが所定の濃度範囲にわたって定量的に検出されることを示す。
図３２は、ＲＰ−ＨＰＬＣでの（２７８ｎｍ（左側パネル）および２２５ｎｍ（右側パネル）の両方で求められる）Ｃｙｓ２  ＳＰ１の標準物プロフィルを示す。挿入図は、Ｃｙｓ２  ＳＰ１が所定の濃度範囲にわたって定量的に検出されることを示す。
図３３は、ＲＰ−ＨＰＬＣでの（４７７ｎｍで求められる）ＤＯＸの標準物プロフィルを示す。挿入図は、ＤＯＸが所定の濃度範囲にわたって定量的に検出されることを示す。
図３４は、ＲＰ−ＨＰＬＣでの（２２５ｎｍで求められる）ＰＴＸの標準物プロフィルを示す。挿入図は、ＰＴＸが所定の濃度範囲にわたって定量的に検出されることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明は、ナノ粒子のために、また、物質の選択的な複合体化および放出のために使用することができる分子的複合体を形成することができるＳＰ１ポリペプチドおよびＳＰ１変異体ポリヌクレオチド、ならびに、それらをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００５２】
具体的には、本発明は、治療薬、診断用薬、化粧剤、導電性薬剤および半導電性薬剤などを送達、安定化および可溶化するために使用することができる。本発明のＳＰ１ポリペプチドおよびＳＰ１変異体ポリヌクレオチドに特徴的なホモオリゴマー複合体形成およびヘテロオリゴマー複合体形成はまた、操作された自己集合性のナノ粒子およびナノ構造体を提供するために使用することができる。さらに、広範囲の様々な複合体形成性の変性（例えば、ジスルフィド連結および他のペプチド連結、炭水化物、核酸など、ならびに、それらの組合せなど）を有する様々なＳＰ１変異体を設計することができ、これにより、ヘテロオリゴマーＳＰ１構造体およびホモオリゴマーＳＰ１構造体の制御された複合体および解離についての広い様々な可能性がもたらされ、また、小分子、薬物、薬剤およびナノ粒子などとのＳＰ１ポリペプチド複合体形成、ならびに、小分子、薬物、薬剤およびナノ粒子などの放出の広い様々な可能性がもたらされる。本発明のさらなる態様および適用が下記においてさらに議論される。
【００５３】
本発明の原理および操作は、図面および添付の説明を参照して、よりよく理解することができる。
【００５４】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用が、次の記載において示されているか、または実施例によって例示されている詳細に限定されないことを理解すべきである。本発明は、ほかの実施態様も可能であるし、または様々な方法で実行または実施することができる。同様に、本明細書において用いられている表現および用語法は、説明を目的としており、限定的なものとみなすべきでないことも理解すべきである。
【００５５】
ＳＰ１ポリペプチドは、熱およびほとんどの化学的変性剤による変性に対して抵抗性があり、プロテアーゼ消化に対して抵抗性があり、また、分子相互作用を安定化させることができ、三次元構造体を形成することができるヘテロオリゴマーおよびホモオリゴマーを形成する並外れて安定なポリペプチドである（Ｄｇａｎｙ他、ＪＢＣ、２００４、２７９：５１５１６〜２３；米国特許出願第１０／２３３４０９号（Ｗａｎｇ他））。
【００５６】
本発明者らは、結合性分子の結合特性を強化するために、また、融合された分子（例えば、酵素など）を安定化させるために、また、融合された分子の免疫学的性質を強化するか、または変化させるために、他のタンパク質分子または非タンパク質分子に融合されたＳＰ１タンパク質を以前に発見している（米国特許出願第１０／２３３４０９号（Ｗａｎｇ他））。ＳＰ１融合タンパク質は、米国特許出願第１０／２３３４０９号に開示されるように、遺伝子工学技術によって付加されたさらなるポリペプチド配列を有する組換えＳＰ１分子と、化学的手段（例えば、架橋など）によって付加されたさらなる非タンパク質成分を有するＳＰ１分子とを含む。本発明者らは、皮膚、毛髪、爪などを強化するためのＳＰ１タンパク質の治療的使用をさらに開示している。
【００５７】
しかしながら、Ｗａｎｇ他は、分子的会合状態での薬剤（治療薬、化粧剤、診断用薬、導電性薬剤など）の制御された放出が可能である天然ＳＰ１ポリペプチドまたはＳＰ１変異体ポリペプチド、あるいは、キャリアとしてのそれらの使用、あるいは、ナノ構造体を製造するための自己集合性ＳＰ１モノマーの使用を教示も、暗示もしていない。
【００５８】
本発明を実施に移しているとき、新規なＳＰ１変異体が、ヘテロオリゴマーおよびホモオリゴマーの形成、ならびに、様々な物質および分子との可逆的な分子的複合体の形成を可能にする入念な実験および薬物設計によって作製された。本発明のＳＰ１の分子的複合体の制御可能性は、ＳＰ１ポリペプチドを、薬物、化粧品、導電体および他の小分子のためのキャリアとして並外れて有用なものにする。さらに、様々な特異的成分を、標的認識能をＳＰ１ポリペプチドに加えるために取り込むことができ、これにより、薬物キャリアとしてのＳＰ１の特異性および効力を高めることができる。さらに、本発明を実施に移しているとき、驚くべきことに、天然ＳＰ１および変性ＳＰ１変異体が、制御された所定の様式で自己集合して、規定されたナノ構造体をもたらすことができることが発見された。そのようなナノ構造体は、工学的適用、電気的適用および他のナノ技術的適用のために使用することができる。
【００５９】
従って、本発明の１つの態様によれば、ＳＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、そのアミノ酸配列が、物質との可逆的な分子的会合の状態であるように変性される単離されたポリペプチドが提供される。
【００６０】
本明細書中で使用される表現「分子的会合」は、分子レベルで起こる化学的会合または物理的会合または両者を示す。例えば、会合は、共有結合性の結合、非共有結合性の結合、疎水性相互作用などが可能である。
【００６１】
「可逆的な会合」は、本明細書中で定義される場合、その成分が、特定の条件に依存して、元の会合前の状態に戻ることができ、また、再会合することができる会合である。好ましくは、そのような会合および再会合はペプチド結合の形成および切断を含まない。例えば、本発明のＳＰ１−治療薬複合体の成分の可逆的な会合は解離することができ、それにより、元の別個の治療薬成分およびＳＰ１ポリペプチド成分に戻ることができる。
【００６２】
本発明における使用のために好適である可逆的な分子的会合のタイプには、静電的結合、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用またはドナー／アクセプタ結合からなる群から選択される会合が挙げられる。可逆的な会合は、物質と、ＳＰ１ポリペプチドとの間での１つ以上の会合によって媒介され得る。例えば、可逆的な会合は、複合体化する物質と、ＳＰ１ポリペプチドとの間での水素結合およびイオン性結合の組合せを含むことができる。加えて、または、代替として、可逆的な会合は、例えば、成分間（例えば、物質と、ＳＰ１ポリペプチドとの間など）での共有結合性の相互作用または他の非共有結合性の相互作用との組合せが可能である。
【００６３】
本明細書中で使用される表現「ＳＰ１ポリペプチド」は、アスペンおよび他の植物に由来し、ＳＰ１タンパク質およびＳＰ１様タンパク質（配列番号１２３〜配列番号１４８を参照のこと）のファミリーに属する、下記の特徴的な性質の少なくとも１つを有するタンパク質を示す：煮沸安定性、プロテアーゼ安定性またはシャペロン様活性。
【００６４】
ＳＰ１ポリペプチドは、下記の区別可能な性質の少なくとも１つによって特徴付けられる：安定性、シャペロン様活性、および、変性因子に対する優れた抵抗性。ＳＰ１ポリペプチドはまた、保存された配列相同性のいくつかの領域を互いに有する。ＳＰ１ファミリーのメンバーは、好ましくは、配列番号１に対して少なくとも６５％の相同性を有する、煮沸および界面活性剤に対して安定なタンパク質であって、シャペロン様活性を有し、安定なダイマーを形成することができるタンパク質である。一層より好ましくは、ＳＰ１ポリペプチドは、１０．００のプルラリティー、４の閾値、１．００の平均加重、２．９１の平均マッチおよび−２．００の平均ミスマッチを使用してＧＣＧのＢｅｓｔ  Ｆｉｔアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ９．１）を使用して決定されたとき、少なくとも１つの保存されたアミノ酸配列を、配列番号１のアミノ酸９〜１１、アミノ酸４４〜４６および／またはアミノ酸６５〜７３に対応する少なくとも１つの領域に有する。最も好ましくは、ＳＰ１ポリペプチドは、「ＨＡＦＥＳＴＦＥＳ」（６５〜７３、配列番号１）、「ＶＫＨ」（９〜１１、配列番号１）および「ＫＳＦ」（４４〜４６、配列番号１）の保存されたコンセンサス配列を有する。最も好ましくは、「野生型」ＳＰ１は、Ｗａｎｇ他（ＰＣＴ  ＩＬ０２／００１７４（２００２年３月５日出願）の一部継続出願である米国特許出願第１０／２３３４０９号（２００２年９月４日出願）、これらはともに、全体が本明細書中に示されているものとして参考として組み込まれる）によって開示されるように、アスペンから得られるストレス関連のＳＰ１タンパク質（配列番号１）である。
【００６５】
好ましい実施形態において、ＳＰ１タンパク質は、配列番号１に対して７０％の相同性、より好ましくは７５％の相同性、さらにより好ましくは８０％の相同性、より好ましくは８５％の相同性、より好ましくは９０％の相同性、好ましくは９５％の相同性、最も好ましくは１００％の相同性を有する。
【００６６】
本明細書において用いられているような「変性剤安定」という語句は、水溶液中での変性処理後の大きい（５０％以上）構造オリゴマー安定性のことを言う。変性処理は、煮沸、および化学的変性剤、例えば界面活性剤（例えばＳＤＳ）、尿素、またはグアニジン−ＨＣｌへの暴露を含むことがある。
【００６７】
本明細書において用いられているような「煮沸安定」という語句は、サイズ分画アッセイによって決定された場合、実質的に１００℃で水溶液中で、少なくとも１０分間の処理後、大きい（５０％以上）構造オリゴマー安定性のことを言う。
【００６８】
本明細書において用いられているような「界面活性剤安定」という語句は、サイズ分画アッセイによって決定された場合、１／２，０００モル比（モノマー：ＳＤＳ）を含有する水溶液中の処理後のオリゴマータンパク質の大きい（５０％以上）構造オリゴマー安定性のことを言う。
【００６９】
本明細書および特許請求の範囲のセクションにおいて用いられているような「プロテアーゼ耐性」という語句は、３７℃で少なくとも６０分間、５０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含有する水溶液中での処理後の大きい（５０％以上）安定性のことを言う。
【００７０】
本明細書において用いられているような「シャペロン様活性」という語句は、タンパク質のネイティブ折りたたみ、およびネイティブオリゴマー化を仲介し、不正確なタンパク質構造の形成を防ぎ、現存の不正確なタンパク質構造をもとの状態に戻し、部分的に変性されたタンパク質またはこれらのドメイン間に発生しうる不正確な相互作用を阻害することによって、ストレス関連損傷を制限する能力のことを言う。
【００７１】
本明細書中上記で述べられたように、本発明の単離されたポリペプチドのアミノ酸配列は、そのアミノ酸配列を、他の分子との可逆的な分子的会合を形成することが可能であるようにするために変性される。興味深いことに、また、驚くべきことに、本発明のこの態様のポリペプチドは、天然ＳＰ１ポリペプチドの上記で述べられた活性（例えば、熱に対して安定であり、また、変性剤およびプロテアーゼに対して抵抗性があるオリゴマーを形成する能力など）を保持する（本明細書中下記における実施例２、図４〜図６を参照のこと）。
【００７２】
本発明の変性ＳＰ１ポリペプチドは、野生型ＳＰ１において特徴とならない目的とする新規な活性（例えば、物質との可逆的な会合、細胞認識など）を有し、一方で、上記のＳＰ１活性の少なくとも１つを依然として維持するように設計される。そのようなポリペプチドを試験するための様々なアッセイが本明細書中上記に記載される。
【００７３】
本明細書中で使用される用語「変性アミノ酸配列」は、本明細書中上記で記載されるような天然ＳＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列からの何らかの偏差を有するアミノ酸配列を示す。ＳＰ１ポリペプチドの変性には、アミノ酸の置換、アミノ酸の付加、アミノ酸の欠失、ＳＰ１ポリペプチドへのジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチドの付加、アミノ酸配列の１つの部分からその配列の別の部分への１つ以上のアミノ酸の入れ換え、存在するアミノ酸の変化（例えば、側鎖の架橋または一部分の除去など）、リンカーの付加、アミノ酸配列の短縮化、非ペプチド成分（例えば、炭水化物、脂質および核酸など）の付加、磁気性質を有する物質の導入などが含まれるが、これらに限定されない。具体的な変性の様々な例が本明細書中下記に詳しく記載される。
【００７４】
変性ＳＰ１変異体ポリペプチドは、特定の性質をＳＰ１変異体に付与し、それにより、他の物質との分子的複合体化および他の物質の放出をより効率的および制御可能にし、また、特定の条件に対して適合可能にするために変性することができる。従って、例えば、チオール（Ｓ−Ｈ）基の付加は、レドックス感受性の分子的複合体の形成を有するＳＰ１変異体を、ＳＰ１および複合体化する物質の間で、また、ＳＰ１のモノマー、ダイマー、トリマーなどの間でもたらすことができる。これは、服用および薬物療法の特異性を改善する薬物キャリアを設計するために有用であり得る。さらに、無機分子（例えば、金属および他のイオンなど）と可逆的に結合することができるオリゴペプチド配列またはポリペプチド配列の付加によるＳＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列の変性は、導電性組成物を形成し、ＳＰ１ポリペプチドによって形成される分子的複合体の磁気的性質を変化させるために有用であり得る。オリゴマーサブユニット間の相互作用（例えば、ダイマー・ダイマーまたはモノマー・モノマーの相互作用など）を変化させるＳＰ１アミノ酸配列の変性は、オリゴマーの立体配座を安定化または脱安定化させ、これにより、ＳＰ１変異体を化学的環境に対して潜在的により抵抗性にするために、または、潜在的にあまり抵抗性にしないようにするために役立ち得る。そのような増大した安定性または低下した安定性は、キャリア（例えば、薬物キャリア）としての変性ＳＰ１変異体の性質に影響を及ぼすように設計することができる。ＳＰ１変異体のサブユニット・サブユニットの相互作用におけるそのような変性はまた、ＳＰ１に基づくナノ構造体の性質を設計および制御するために使用することができる。
【００７５】
ＳＰ１−複合体形成はまた、２つの隣接するサブユニットの間を架橋するための分子間架橋機構に基づき得ることが理解される。例には、チオール、アミン、カルボキシルおよびヒドロキシルの反応性架橋試薬が含まれる。そのような場合において、制御された放出機構はまた、切断可能な架橋剤を使用することによるのと同様に、酵素活性による架橋の切断に基づくことができる。
【００７６】
上記で述べられたように、ＳＰ１アミノ酸配列は、さらなるペプチド成分を含むように変性することができる。従って、代替として、また、加えて、ＳＰ１ポリペプチドは、少なくとも１つの認識配列を含むように変性することができる。そのような認識配列には、標的認識配列（例えば、細胞表面認識配列など）、特異的なリガンド（例えば、受容体結合リガンド、抗体またはその一部分（例えば、抗体結合部位など））、器官および組織に特異的な認識配列、発達段階に特異的な認識配列、種および性に特異的な認識配列、ならびに、特定の疾患または状態と相関する認識配列が含まれるが、これらに限定されない。好適な認識配列の非限定的な列挙には、下記の腫瘍表面特異的ペプチドが含まれる：
0005450693.tif 000002
0005450693.tif 000003
本発明の変性ＳＰ１ポリペプチドとともに使用される好適な腫瘍血管ペプチドには、下記のペプチドが含まれるが、それらに限定されない：
0005450693.tif 000004
【００７７】
本明細書中上記で述べられたように、本発明のＳＰ１ポリペプチドは、物質との可逆的な分子的会合を形成するように変性することができる。本発明のポリペプチドとの可逆的な複合体を設計するために好適な物質には、治療薬、診断用薬または化粧剤が含まれるが、これらに限定されない。好適な治療薬、診断用薬または化粧剤には、ポリペプチド剤、核酸剤、脂質剤、炭水化物剤および小分子が含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
本発明のポリペプチドとともに使用するために好適な治療薬として、限定されるものではないが、抗炎症薬物および抗癌（腫瘍）薬物のような薬物および生物学的に活性な分子が挙げられる。本発明のＳＰ１と会合する分子に複合されることができる抗炎症薬物として、限定されるものではないが、アルクロフェナック；アルクロメタゾンジプロピオン酸塩；アルゲストンアセトニド；アルファアミラーゼ；アムシナファール；アムシナフィド；アムフェナックナトリウム；アミプリローズ塩酸塩；アナキンラ；アニロラック；アニトラザフェン；アパゾン；バルサラジド二ナトリウム；ベンダザック；ベノキサプロフェン；ベンジダミン塩酸塩；ブロメライン；ブロペラモール；ブデソニド；カルプロフェン；シクロプロフェン；シンタゾン；クリプロフェン；クロベタゾールプロピオン酸塩；クロベタゾン酪酸塩；クロピラック；クロチカゾンプロピオン酸塩；コルメタゾン酢酸塩；コルトドキソン；デフラザコルト；デソニド；デソキシメタゾン；デキサメタゾン二プロピオン酸塩；ジクロフェナックカリウム；ジクロフェナックナトリウム；ジフロラゾン二酢酸塩；ジフルミドンナトリウム；ジフルニザール；ジフルプレドネート；ジフタロン；ジメチルスルホキシド；ドロシノニド；エンドリゾン；エンリモマブ；エノリカムナトリウム；エピリゾール；エトドラック；エトフェナメート；フェルビナック；フェナモール；フェンブフェン；フェンクロフェナック；フェンクロラック；フェンドザール；フェンピパロン；フェンチアザック；フラザロン；フルアザコルト；フルフェナム酸；フルミゾール；フルニゾリド酢酸塩；フルニキシン；フルニキシンメグルミン；フルオコルチンブチル；フルオロメトロン酢酸塩；フルクアゾン；フルルビプロフェン；フルレトフェン；フルチカゾンプロピオン酸塩；フラプロフェン；フルブフェン；ハルシノニド；ハロベタゾールプロピオン酸塩；ハロプレドン酢酸塩；イブフェナック；イブプロフェン；イブプロフェンアルミニウム；イブプロフェンピコノール；イロニダップ；インドメタシン；インドメタシンナトリウム；ヨードプロフェン；インドキソール；イントラゾール；イソフルプレドン酢酸塩；イソキセパック；イソキシカム；ケトプロフェン；ロフェミゾール塩酸塩；ロモキシカム；ロテプレドノールエタボネート；メクロフェナメートナトリウム；メクロフェナム酸；メクロリゾン二酪酸塩；メフェナム酸；メサラミン；メセクラゾン；メチルプレドニゾロンスレプタネート；モミフルメート；ナブメトン；ナプロキセン；ナプロキセンナトリウム；ナプロキソール；ニマゾン；オルサラジンナトリウム；オルゴテイン；オルパノキシン；オキサプロジン；オキシフェンブタゾン；パラニリン塩酸塩；ペントザンポリサルフェートナトリウム；フェンブタゾンナトリウムグリセレート；ピルフェニドン；ピロキシカム；ピロキシカムシンナメート；ピロキシカムオラミン；ピルプロフェン；プレドナゼート；プリフェロン；プロドリン酸；プロカゾン；プロキサゾール；プロキサゾールクエン酸塩；リメキソロン；ロマザリット；サルコレックス；サルナセジン；サルサレート；サンギナリウム塩化物；セクラゾン；セルメタシン；スドキシカム；スリンダック；スプロフェン；タルメタシン；タルニフルメート；タロサレート；テブフェロン；テニダップ；テニダップナトリウム；テノキシカム；テシカム；テシミド；テトリダミン；チオピナック；チキソコルトールピバリン酸塩；トルメチン；トルメチンナトリウム；トリクロニド；トリフルミデート；ジドメタシン；ゾメピラックナトリウムが挙げられる。
【００７９】
本発明のポリペプチドと複合されかつそれとともに使用されるために好適な抗癌薬物として、限定されるものではないが、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドリアマイシン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；アメタントロン酢酸塩；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビスアントレン塩酸塩；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；ブレオマイシン硫酸塩；ブレキナールナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴル；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシレート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；デザグアニンメシレート；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；ドロロキシフェンクエン酸；ドロモスタノロンプロピオン酸塩；ドゥアゾマイシン；エダトレキセート；エフロルニチン塩酸塩；エルサニトルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾル；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；エトポシドリン酸塩；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスリジン；フルダラビンリン酸塩；フルオロウラシル；フルロシタビン；フォスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イフォスファミド；イルモフォシン；インターフェロンα−２ａ；インターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα−ｎ１；インターフェロンα−ｎ３；インターフェロンβ−Ｉａ；インターフェロンγ−Ｉｂ；イプロプラチン；イリノテカン塩酸塩；ランレオチド酢酸塩；レトロゾール；ロイプロリド酢酸塩；リアゾゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；メゲストロール酢酸塩；メレンゲストロール酢酸塩；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキセート；メトトレキセートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；マイトカルシン；マイトクロミン；マイトギリン；マイトマルシン；マイトマイシン；マイトスペール；マイトタン；マイトキサントロン塩酸塩；マイコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペプロマイシン硫酸塩；ペルフォスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィメールナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォセートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌール；タリソマイシン；タキソール；テコガランナトリウム；テガフール；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフイリン；チラパザミン；トポテカン塩酸塩；トレミフエンクエン酸；トレストロン酢酸塩；トリシリビンリン酸塩；トリメトレキサート；トリメトレキサートグルクロン酸塩；トリプトレシン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン硫酸塩；ビングリシネート硫酸塩；ビンロイロシン硫酸塩；ビノレルビン酒石酸塩；ビンロシジン硫酸塩；ビンゾリジン硫酸塩；ベロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩が挙げられる。さらなる抗新生物剤として、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎの「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｅｉｇｈｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｈｅａｌｔｈ  Ｂｒｏｆｅｓｓｉｏｎｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）のＣｈａｐｔｅｒ  ５２，Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ（Ｐａｕｌ  ＣａｌａｂｒｅｓｉおよびＢｒｕｃｅ  Ａ．Ｃｈａｂｎｅｒ）、およびそれに対する緒言、１２０２−１２６３に開示されたものが挙げられる。
【００８０】
本発明のＳＰ１ポリペプチドとともに使用することができる診断用物質には、放射性物質、発光物質、高周波送信物質および高周波受信物質、磁気物質、着色物質、化学的に活性な物質（例えば、酸化剤、還元剤、架橋剤など）、ＦＲＥＴ対、量子ドット、分子認識ができる生化学的物質（例えば、核酸、抗体など）、生物学的に活性な物質（例えば、酵素など）などが含まれるが、これらに限定されない。
【００８１】
本発明の別の態様によれば、物質は導電性薬剤または半導電性薬剤である。本明細書中で使用される「導電性薬剤」は、電気的に帯電した粒子を伝導媒体により移動させることができる薬剤を示す。導電性薬剤の例には、金属および多くのイオン性物質が含まれる。本明細書中で使用される「半導電性薬剤」は、所与の条件のもとでは、電気的に帯電した粒子を伝導媒体により移動させることができる、絶縁性の性質を有する薬剤を示す。半導電性薬剤は、非常に低い温度では絶縁体として挙動し、室温では、導体よりもはるかに低い伝導性であるが、感知できる電気伝導性を有する。一般に使用される半導電性物質は、ケイ素、ゲルマニウム、ヒ化ガリウム、リン化インジウムおよびテルル化水銀カドミウムである。
【００８２】
導電性薬剤（例えば、金属および他の無機のイオン性物質など）との複合体形成のために好適であることが示された変性には、ニッケルイオンおよび他の金属イオンとの複合体形成のための６Ｈｈｉｓタグ（配列番号１２２）が含まれる。本明細書中下記の表１は、ＳＰ１ポリペプチドの変性のために好適である無機のイオン性物質との複合体を形成するさらなるペプチドの非限定的な列挙である（Ｓａｒｉｋａｙａ他、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ、２００４、３４：３７３〜４０８からの改編）。
【００８３】
0005450693.tif 000005
0005450693.tif 000006
【００８４】
従って、例えば、本発明の変性ＳＰ１ポリペプチドは、様々な治療用物質、化粧用物質、診断用物質、導電性物質などとの可逆的な分子的会合の状態であり得る。
【００８５】
本明細書中上記で述べられたように、変性ＳＰ１変異体ポリペプチドは、特定の性質をＳＰ１変異体に付与し、それにより、他の物質との分子的複合体化および他の物質の放出をより効率的および制御可能にし、また、特定の条件に対して適合可能にするために変性することができる。ＳＰ１ポリペプチド複合体およびＳＰ１オリゴマー複合体の性質に対する集中した研究を通して、ＳＰ１ポリペプチドの特定の配列がＳＰ１ファミリーに特徴的な性質の１つ以上と関連していることが理解される（例えば、Ｄｇａｎｙ他、ＪＢＣ、２００４、２７９：５１５１６〜５２３を参照のこと）。従って、ＳＰ１ポリペプチドの特定の領域における変性を導入することができ、そのような変性は、その結果として、ＳＰ１変異体の性質（例えば、分子的会合の様式、オリゴマー形成など）における所望される変化をもたらすことができる。Ｄｇａｎｙ他（ＪＢＣ、２００４、２７９：５１５１６〜５２３）はＳＰ１ポリペプチドにおける数多くの構造的に重要な領域を特定している。
【００８６】
ＳＰ１モノマータンパク質は、３つのα−らせん、すなわち、Ｈ１（残基２３〜３９）、Ｈ２ａ（残基７４〜８１）およびＨ２ｂ（残基８４〜９３）を伴うα型およびβ型の折り畳みと、４つの逆平行のβ鎖、すなわち、Ｂ３（残基９〜１７）、Ｂ１（残基４５〜５０）、Ｂ２（残基６５〜７１）およびＢ４（残基９７〜１０８）によって形成されるβ−シートとを有する。Ｎ末端セグメントが溶媒の方を向き、可動性である。長い、大部分が構造化されていないループが、ダイマー接触に関与し得る残基５１〜６４によって形成される。Ｈ１およびＨ２のらせんにより、向き合うβ−シートとともに中心の空洞を形成する外側の凸型表面が規定される。従って、例えば、この長いループの内部での変性は、ダイマー・ダイマーの接触の安定性に影響を及ぼし（強化または低下）、また、オリゴマー形成に影響を及ぼし、これにより、例えば、投与後のより長い半減期または短くなった半減期を有するＳＰ１変異体薬物キャリアをもたらすことができる。
【００８７】
ダイマーは、最小の安定なＳＰ１ユニットであると考えられる。ダイマーにおける２つの分子は、らせんＨ１ならびにβ−シートのＢ３およびＢ４に対して平行な２回軸によって関連づけられる。２つの分子のβ−シートの外側表面により、中心の空洞を規定するβバレル様構造が形成される。ＳＰ１ポリペプチドのこの領域の変性は内部の疎水性の分子環境に影響を及ぼすことがあり、その結果として、疎水性分子との複合体を形成する能力の増強または低下のいずれかをもたらし得る。
【００８８】
オリゴマー状のドデカマーにおいて、ダイマー間の接触は主に親水性側鎖および荷電基を伴うか、または、水分子によって媒介される。これらの接触は主として、Ｂ１、Ｈ１およびＮ末端テールに沿って生じる。表２には、Ｄｇａｎｙ他（ＪＢＣ、２００４、２７９：５１５１６〜５２３）によって記載されるＳＰ１ポリペプチドの特定の領域における変性を含めて、変性アミノ酸配列を有する作製された新規なＳＰ１変異体の非限定的な列挙が示される。
【００８９】
0005450693.tif 000007
ＮＤ  測定されず；ＮＡ  適用不能
１．変異についての標準名称法（最初のメチオニン残基を含む野生型配列を使用するアミノ酸位置）
２．２位でのＣｙｓ残基の挿入および１９位でのグリシン残基の挿入  Ｋ１８Ｒ（Ｃｙｓ２ｌｏｏｐ１ＲＧｄ）
３．サンプルを適用緩衝液において煮沸しない場合の、ＳＤＳＰＡＧＥによる試験。いくつかのＳＰ１変異体は発現時に可溶性タンパク質を形成することができず、封入体（ＩＢ）を形成する。このようなＩＢは０．５Ｍ尿素によりアンフォールドされ、透析によってリフォールドされた。
４．ＳＰ１モノマーならびにほとんどの他のタンパク質が分解する条件であるプロテイナーゼＫ処理（５０ｕｇ／ｍｌ；３０分；℃）またはアルカラーゼ処理（１／１０００の希釈度、６０分；４５℃）のいずれかの後におけるＳＤＳ  ＰＡＧＥによる試験。
５．２ＭのＧＨＣｌでのインキュベーション（室温で１時間）の後での複合体安定性がＳＤＳ  ＰＡＧＥによって試験された。
６．熱安定性タンパク質は、１００℃での１０分間のインキュベーションまたは８５℃での３０分のインキュベーションの熱処理後で沈殿しないタンパク質として定義される。
７．タンパク質の融点がＤＳＣによって調べられた。
８．サンプルがｂ−メルカプトエタノールの非存在下または存在下で適用緩衝液において１０分間煮沸される際の、ダイマー形成がＳＤＳ  ＰＡＧＥによって試験される。
９．封入体（ＩＢ）のリフォールディングは調べられなかった。
１０．複合体をＩＢのリフォールディングの後で形成する。複合体の集合が、プロテイナーゼ消化を使用してモノマー形態を除くことによって確認された。
【００９０】
表２に示されるように、例えば、チオール基を有するアミノ酸の付加を含む変性は、特徴的には、レドックス依存的（β−ＭＥ）なダイマー形成を有し、また、ポリペプチドのＮ末端部分のアミノ酸配列における変性は、典型的には、オリゴマー複合体を形成する能力、プロテアーゼ消化に対する抵抗性、熱安定性、および、グアニジニウムＨＣｌ変性に対する抵抗性を保持する。
【００９１】
変性ＳＰ１変異体の様々な例、例えば、ＳＰ１  ６Ｈ（配列番号７）、ＳＰ１  ΔＮ（配列番号２）、Ｃｙｓ２  ＳＰ１（配列番号３）、ＣＲＧＤ  ＳＰ１（配列番号５）およびＲＧＤＣ  ＳＰ１（配列番号６）などが、特徴的な安定性および抵抗性を示したホモオリゴマー複合体およびヘテロオリゴマー複合体を形成した。
【００９２】
従って、本発明を実施に移しているとき、いくつかの変性ＳＰ１変異体が、煮沸およびプロテアーゼに対して安定性を有する複合体を形成する一方で、他の変性ＳＰ１変異体がオリゴマー複合体を脱安定化させることが発見された。Ｎ末端短縮化（ΔＮ）ＳＰ１変異体（配列番号２）および６Ｈヒスチジンタグ化ＳＰ１変異体（配列番号７）は、安定なオリゴマー複合体形成を保持した（図３、実施例２）。他方で、他の置換は、複合体形成の脱安定化をもたらし、また、組換えタンパク質の溶解性を低下させた（図５、実施例３を参照のこと）。
【００９３】
さらに、変性ＳＰ１変異体は、オリゴマーの高分子量複合体を形成する能力を保持していた。６Ｈタグ化型（配列番号７）およびＮ末端短縮化型（配列番号２）は、極端な条件によってモノマーに解離させたとき、オリゴマー形態をホモオリゴマー（ΔＮ−ΔＮ、および、６Ｈ  ６Ｈ）およびヘテロオリゴマー（ΔＮ  ６Ｈ）の両方の立体配座で回復した（図５、実施例３）。
【００９４】
ＳＰポリペプチドアミノ酸配列の変性を、化学的手段、組換え手段または他の手段によって導入することができる。１つの実施形態において、ＳＰ１のアミノ酸配列の変性は化学的修飾であり、例えば、カルボジイミドによるコンジュゲート化、グルタルアルデヒドによるコンジュゲート化、ＳＰＤＰによるコンジュゲート化、アシル化、グリコシル化、官能基の変化、アミノ酸の架橋、および、欠失などである。アミノ酸配列を、非ペプチド分子（例えば、脂質、核酸および炭水化物など）の（通常的には、共有結合での）付加によって変性することができる。ペプチド変性の他の例が本明細書中に詳しく記載される。
【００９５】
本明細書中で使用される用語「ペプチド」には、天然のペプチド（分解産物または合成的に合成されたペプチドまたは組換えペプチドのいずれか）、ペプチド模倣体（典型的には合成的に合成されたペプチド）そしてペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドが含まれ、これらは、例えば、ペプチドを体内でより安定化させる修飾、またはペプチドの細胞浸透能力を高める修飾を有し得る。そのような修飾には、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合の修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない）、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣体化合物を調製するための方法はこの分野では十分に知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に具体的に記載される（これは、全体が本明細書中に示されるように参考として組み込まれる）。これに関するさらなる詳細が本明細書中下記に示される。
【００９６】
本明細書中で意図されるＳＰ１ポリペプチドでは、側鎖に対する修飾、ペプチド合成時における非天然アミノ酸および／またはその誘導体の取り込み、ならびに、立体配座の制約をペプチドまたはそのアナログに負わす架橋剤および他の方法の使用が含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
本発明によって意図される側鎖修飾の例には、アミノ基の修飾、例えば、アルデヒドとの反応、それに続く、ＮａＢＨ４を用いた還元による還元的アルキル化などによるアミノ基の修飾；メチルアセトイミダートによるアミジン化；無水酢酸によるアシル化；シアネートによるアミノ基のカルバモイル化；２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化；ならびに、ピリドキサール−５’−リン酸によるリシンのピリドキシル化、それに続く、ＮａＢＨ４を用いた還元が含まれる。
【００９８】
アルギニン残基のグアニジン基を、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサールなどの試薬による複素環縮合生成物の形成によって修飾することができる。
【００９９】
カルボキシル基を、Ｏ−アシルイソウレア形成によるカルボジイミド活性化、それに続く、例えば、対応するアミドへのその後の誘導体化によって修飾することができる。
【０１００】
スルフヒドリル基を、様々な方法によって、例えば、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応；４−クロロメルクリベンゾアート、４−クロロメルクリフェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノールおよび他の水銀化合物を使用する水銀誘導体の形成；アルカリ性ｐＨでのシアネートによるカルバモイル化などによって修飾することができる。
【０１０１】
トリプトファン残基を、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミドによる酸化、あるいは、２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミドまたはスルフェニルハリドによるインドール環のアルキル化によって修飾することができる。他方で、チロシン残基を、３−ニトロチロシン誘導体を形成するためのテトラニトロメタンによるニトロ化によって変化させることができる。
【０１０２】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾を、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化、または、ジエチルピロカルボネートによるＮ−カルボエトキシル化によって達成することができる。
【０１０３】
ペプチド合成時に非天然アミノ酸および誘導体を取り込む例としては、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプトン酸、２−チエニルアラニン、および／または、アミノ酸のＤ−異性体の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル（例えば、メチル）である）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子において自然界で示される「通常」の側鎖である）によって置換することができる。
【０１０５】
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合の任意のところに存在させることができ、そして同時に数カ所（２カ所〜３カ所）においてさえ存在させることができる。
【０１０６】
天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）は、ＴＩＣ、ナフチレンアミン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成された非天然型の酸に置換することができる。
【０１０７】
上述のことに加えて、本発明のペプチドは一以上の修飾されたアミノ酸または一以上の非アミノ酸モノマー（例えば脂肪酸、複合体炭水化物など）も含むことができる。
【０１０８】
用語「アミノ酸」には、２０個の天然に存在するアミノ酸；インビボで多くの場合には翻訳後修飾されたそのようなアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを含む）；および他の非通常型アミノ酸（２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むが、これらに限定されない）が含まれることが理解される。さらに、用語「アミノ酸」には、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方が含まれる。
【０１０９】
下記の表３および表４は、全ての天然に存在するアミノ酸（表３）および非通常型アミノ酸または修飾型アミノ酸（表４）を列挙する。
【０１１０】
0005450693.tif 000008
【０１１１】
0005450693.tif 000009
0005450693.tif 000010
0005450693.tif 000011
【０１１２】
本発明のペプチドは線状形態で利用されることができるが、環化がペプチドの特性をひどく妨害しない場合、ペプチドの環状形態もまた利用できることが理解される。
【０１１３】
本発明のペプチドは、ペプチド合成の分野における当業者に既知の任意の技術によって合成することができる。固相ペプチド合成については、その多くの技術の要約が、Ｊ．Ｍ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、１９６３）に、また、Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、Ｈｏｒｍｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（第２巻、４６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９７３）に見出され得る。古典的な溶液合成については、Ｇ．ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＫ．Ｌｕｐｋｅ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（第１巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９６５）を参照のこと。
【０１１４】
一般に、これらの方法は、１つ以上のアミノ酸または好適に保護されたアミノ酸を成長中のペプチド鎖に逐次付加することを含む。通常、最初のアミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかが好適な保護基によって保護される。保護または誘導体化されたアミノ酸は、その後、好適に保護された相補的な（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列内の次のアミノ酸を、アミド連結を形成するために好適な条件のもとで加えることによって、不活性な固体担体に結合することできるか、または、溶液中で利用することができる。その後、保護基が、この新しく付加されたアミノ酸残基から除かれ、その後、次のアミノ酸（好適に保護されたアミノ酸）が加えられ、以降、同様に繰り返される。所望されるアミノ酸のすべてが適切な配列で連結された後、いずれかの残留する保護基（および何らかの固体担体）が、最終的なペプチド化合物を得るために、逐次的または同時に除かれる。この一般的な手順の簡便な変性によって、２つ以上のアミノ酸を一度に、例えば、保護されたトリペプチドを適切に保護されたジペプチドに（キラル中心をラセミ化させない条件のもとで）カップリングして、脱保護後にペンタペプチドを形成することなどによって、成長中の鎖に付加することが可能である。ペプチド合成のさらなる記載が米国特許第６４７２５０５号に開示される。
【０１１５】
本発明のペプチド化合物を調製する１つの方法では、固相ペプチド合成が伴う。大規模なペプチド合成がＡｎｄｅｒｓｓｏｎ（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２０００、５５（３）：２２７〜５０）によって記載される。
【０１１６】
別の方法として、または加えて、様々な変性を、核酸コード配列を変性し（置換、欠失、挿入など）、その配列を、形質転換された細胞または生物において発現し、それにより、変性組換えＳＰ１変異体ポリペプチドを作製することによる遺伝子的方法によってＳＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列に導入することができる。遺伝子レベルでの変性方法には、部位特異的変異誘発およびランダム変異誘発が含まれるが、これらに限定されない。組換えポリペプチドの翻訳後修飾（例えば、グリコシル化など）のためのシグナルもまたコード配列に導入することができる。
【０１１７】
従って、本発明の別の態様によれば、配列番号２〜配列番号３０のいずれかで示されるようなアミノ酸配列を有する変性ＳＰ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【０１１８】
本発明のポリヌクレオチドは宿主生物における組換え発現のためのベクターに導入することができることが理解される。本発明の別の態様によれば、本明細書中に記載される単離された核酸を含む核酸構築物が提供される。
【０１１９】
好ましい実施形態によれば、本発明のこの態様による核酸構築物はさらに、センス配向でのポリヌクレオチドの発現を調節するためのプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、その下流側に存在する配列を転写するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと結合するために役立つように転写のために要求されるシス作用の配列エレメントであることが知られている。
【０１２０】
本明細書中に記載されるポリヌクレオチドは本発明の不可欠な要素であり、様々な状況で使用することができる。本発明のポリヌクレオチドと併せて使用されるのに最適なプロモーターは二次的に重要であり、任意の好適なプロモーターを含む。しかしながら、転写開始部位がオープンリーディングフレームの上流側に確実に配置されるようにすることが必要であることが当業者によって理解される。本発明の好ましい実施形態において、選択されるプロモーターは、宿主細胞が細菌、酵母、あるいは、植物または動物の高等細胞であっても、目的とする特定の宿主細胞において活性があるエレメントを含む。
【０１２１】
本発明による構築物は、好ましくは、適切な選択マーカーをさらに含む。本発明によるより好ましい実施形態において、構築物はさらに複製起点を含む。本発明による別の最も好ましい実施形態において、構築物はシャトルベクターであり、この場合、シャトルベクターは、大腸菌（この場合、構築物は適切な選択マーカーおよび複製起点を含む）において増殖することができ、選ばれた生物の細胞における増殖、または、選ばれた生物のゲノムにおける組み込みのための適合性を有することができる。本発明のこの態様による構築物は、例えば、プラスミド、バクミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体が可能である。
【０１２２】
本発明の構築物は、それによってコードされるポリペプチドを、細菌（例えば、大腸菌など）、酵母細胞から、高等細胞（例えば、植物の細胞など）にまで及ぶ様々な種において発現させるために使用することができる。発現は、安定的または一過性であるように選択することができる。
【０１２３】
植物の形質転換を行うために、プロリンの産生を触媒することができる酵素をコードする外因性ポリヌクレオチドが、好ましくは、植物細胞または植物組織へのそのような外因性ポリヌクレオチドの導入および植物における酵素の発現を容易にするために役立つ核酸構築物（１つ以上）に含まれる。
【０１２４】
本発明のポリペプチドは、（本明細書中上記で述べられたような）そのＳＰ−１活性を保持するので、本明細書中下記においてさらに記載されるように、以前に記載され、また、現時点で想定されるような無数の適用において使用することができる。望ましい場合、天然ＳＰ−１ポリペプチドもまた本発明に従って使用され得ることが理解される。
【０１２５】
本発明の１つの態様によれば、治療薬、診断用薬または化粧剤をその必要性のある対象に送達する方法が提供され、この場合、この方法は、そのような薬剤との分子的会合の状態で本発明のＳＰ−１ポリペプチドを含む組成物の治療効果的な量、化粧効果的な量または診断効果的な量を対象に投与することを含む。好ましい実施形態において、ＳＰ１ポリペプチドは、変性ＳＰ１ポリペプチドである。別の実施形態において、薬剤との分子的会合は可逆的な会合である。
【０１２６】
本明細書中で使用される表現「治療薬」は、その投与が所与の状態の何らかの態様における改善を引き起こすことができる任意の薬剤を示す。治療薬は症状的に効果的であってもよく、部分的に効果的であってもよく、治療薬が投与される任意の状態の治癒、治療、軽減、そのような状態の進行の防止、そのような状態についての予後の改善などをもたらすことができる。治療薬は単独で効果的であり得るか、または、他の薬剤に対する補助物として効果的であり得る。治療薬は短期間および／または長期間で効果的であり得るし、また、広範囲の様々な状態において幅広く効果的であり得るか、または、その有効性において狭く、特異的であり得る。
【０１２７】
本明細書中で使用される表現「診断用薬」は、患者における何らかの疾患または状態の存在または非存在を診断するための方法に関連して使用される任意の薬剤を示す。例示的な診断用薬には、例えば、患者の超音波診断、磁気共鳴画像化またはコンピューター断層撮影法に関連して使用される造影剤が含まれる。
【０１２８】
本明細書中で使用される用語「化粧剤」は、美的効果のためにヒトの皮膚に局所的に適用することができ、また、好ましくは刺激を引き起こさない任意の薬剤（例えば、顔料または香料など）を示す。様々な化粧剤がこの分野では広く知られており、皮膚または局所的に適用することができる、口紅、アイシャドウ、口紅、ファンデーションおよび他の形態の「化粧品」、クリーム、ペースト、ローション、香膏、スプレー、ゲル、フォームなどのような製造物に含められる（例えば、クリーム（例えば、グリースクリームまたはドライクリーム）など）。
【０１２９】
本明細書中で使用される表現「その必要性のある対象」は、本発明の組成物の投与からの利益を得ることができる任意の対象を示す。そのような対象は、例えば、組成物の投与が治療的効果または有益な効果を有し得る特定の状態を有する対象、または、そのような状態を有する危険性がある対象が可能である。
【０１３０】
本発明の組成物は、それ自体で、あるいは、本発明の組成物が好適なキャリアまたは賦形剤と混合される医薬組成物で生物に投与することができる。
【０１３１】
本発明の組成物は、医薬組成物であることができる。本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
【０１３２】
本明細書中において、用語「有効成分（活性成分）」は、ＳＰ１またはＳＰ１変異体単独、または生物学的効果を担う物質または薬剤と分子的会合状態にあるＳＰ１またはＳＰ１変異体を示す。
【０１３３】
以降、交換可能に使用されうる表現「医薬的に許容され得るキャリア」および表現「生理学的に許容され得るキャリア」は、生物に対する著しい刺激を生じさせず、投与された化合物の生物学的な活性および性質を阻害しないキャリアまたは希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に含まれる。
【０１３４】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１３５】
薬物の配合および投与のための様々な技術が“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出され得る（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１３６】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれ得る。
【０１３７】
あるいは、例えば、患者の組織部位に直接的に医薬組成物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に医薬組成物を投与しうる。
【０１３８】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【０１３９】
本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用され得る調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の医薬的に許容され得るキャリアを使用して従来の様式で配合することできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０１４０】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な生理的食塩緩衝液など）において配合することができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０１４１】
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物をこの分野で広く知られている医薬的に許容され得るキャリアと組み合わせることによって容易に配合され得る。そのようなキャリアは、医薬組成物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物を、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し錠剤または糖衣錠コアを得るために、所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤には、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーがある。所望する場合には、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【０１４２】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料を、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えることができる。
【０１４３】
経口使用され得る医薬組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分を好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。また、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０１４４】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１４５】
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位が、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定され得る。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを配合することができる。
【０１４６】
本明細書中に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合することができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供され得る。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、また、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０１４７】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態での活性調製物の水溶液が含まれる。また、有効成分の懸濁物を適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０１４８】
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン非含有水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態にすることができる。
【０１４９】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。
【０１５０】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物には、有効成分が、その意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療効果的な量は、治療されている対象の病状（例えば、虚血）を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、治療されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分（核酸構築物）の量を意味する。
【０１５１】
治療効果的な量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な説明に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１５２】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療効果的な量または用量は、最初はインビトロでアッセイおよび細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、用量は所望の濃度または滴定量を得るために動物モデルにおいて配合することが可能である。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０１５３】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物における、インビトロで標準的な薬学的手法によって、明らかにすることができる。これらのインビトロでの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に対する投薬量範囲を決定するために使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ  ａｌ，（１９７５年）「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１ｐ．１参照）。
【０１５４】
投薬量および投薬間隔は、血漿または脳に、生物学的活性を誘導または抑制するために十分であるレベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）の有効成分を与えるために個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は、個体の特徴、および、投与経路に依存する。様々な検出アッセイを、血漿中濃度を求めるために使用することができる。
【０１５５】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行うことができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０１５６】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている患者、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存する。
【０１５７】
本発明の組成物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパックなど）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用キャリアに配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、上でさらに詳述されたように、適応される状態を処置するために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
【０１５８】
本発明を実施に移しているとき、ＳＰ１アミノ酸配列内へのジスルフィド架橋の導入は、特異な性質を有する変異体ＳＰ１ポリペプチドをもたらすことが発見された。Ｎ末端のシステイン残基（Ｃｙｓ２  Ｐ１変異体、配列番号３）は変異体ＳＰ１ポリペプチドをレドックス状態に対して感受性にする（図８ｂ、実施例４）。従って、変性ＳＰ１は薬剤または物質の複合体化および放出の特異的な制御を示す（図８、図９、図１０および図１１、実施例４）（この場合、標識用物質ＦＡ）。実際、ＳＰ１−薬物複合体（例えば、Ｃｙｓ２  ＳＰ１−ＤＯＸなど）からの薬物分子の放出、および、Ｃｙｓ２  ＳＰ１−ＦＡ複合体からの蛍光性標識の放出が、レドックス状態に対して感受性があることが示された（図９〜図１１、図１４、図１６、実施例４）。以前には達成することができなかった、複合体形成のこのような制御は、変性ＳＰ１ポリペプチドの薬物キャリア、診断ツール、ナノ構造体などを設計することにおいて好都合であり得ることが理解される。例えば、治療薬、化粧剤、芳香剤、診断用薬などの物質とのＳＰ１複合体は、還元状態にさらすことによって形成するように誘導することができ、また、その後の時点で、チオールを有する残基についての競合によって放出するように誘導することができる（図８ａ〜図８ｃの概略図を参照のこと）。
【０１５９】
本発明を実施に移しているとき、特異的な腫瘍血管系認識ペプチドにより変性ＳＰ１は、特徴的なオリゴマー複合体形成、熱安定性およびプロテアーゼ抵抗性を示した（図４、実施例２）。従って、ＳＰ１は、標的認識配列または標的認識成分を含むように変性することができ、また、物質（治療薬、診断用薬、導電性薬剤など）との可逆的な複合体を形成するようにさらに変性することができる。従って、そのような変性ＳＰ１ポリペプチドは、物質の送達をＳＰ１との可逆的な複合体で標的化するために使用することができる。
【０１６０】
ナノ粒子（例えば、ＳＰ１オリゴマーなど）に対する細胞毒性薬物の複合体化もまた、腫瘍への受動的な標的化を助けることができることが理解される。いくつかのモデル腫瘍系が現在、正常な組織と比較して、増大した血管透過性を示すことが知られており、そのような増大した血管透過性は、それらの選択的な標的化を、高分子の薬物キャリアを使用して可能にする。予備的な臨床観察では、増大した血管透過性はいくつかのタイプのヒトガンに特徴的であることが示唆され、従って、これは、細胞毒性薬物、抗体標的化および遺伝子治療のためのＤＮＡの送達をはじめとする様々な高分子薬物治療を容易にすることにおけるキャリア（例えば、ＳＰ１など）の使用のための重要な意味あいを有するかもしれない。
【０１６１】
本発明の変性ＳＰ１ポリペプチドは、物質を安定化させるために使用することができる。本明細書中で使用される用語「安定化する」は、分子、組成物、化合物などの化学的安定性、物理的安定性または生化学的安定性を増大させることを示す。安定性はさらに、特定の性質に関連して定義することができる。好ましい実施形態において、安定性は、温度安定性、イオン強度安定性、プロテアーゼ安定性および触媒作用安定性がある。そのような安定性を測定するためのアッセイの様々な例が本明細書中下記において詳しく記載される。
【０１６２】
本発明を実施に移しているとき、ＳＰ１との分子の複合体化は溶液における溶解性および安定性を大きく高めたことが示された。本明細書中で使用される用語「溶解性」は、溶媒および溶質を含む溶液を形成するために、溶質が溶媒に均一に分散および溶解することができることを示す。すべての溶質は理論上、すべての溶媒に可溶であることが理解される。しかしながら、溶解性が不良であるか、または無視できるほどである溶質（非混和性溶質）は所与の溶媒との任意の有意な濃度の溶液を形成しない。
【０１６３】
従って、本明細書中で使用される「溶液における物質の溶解性を高める」は、溶媒との溶液において溶質としてのこの物質の濃度を増大させることを示す。好ましい実施形態において、物質は疎水性物質（これは典型的には、水に不溶性または難溶性である）であり、溶媒は水性溶媒である。
【０１６４】
有機溶媒に対する、変性されていないＳＰ１ポリペプチドオリゴマー複合体および変性ＳＰ１ポリペプチドオリゴマー複合体の安定性が本明細書中下記において図１８に示された。有機溶媒において疎水性分子（例えば、ＰＴＸなど）と一緒にされ、乾燥され、水性溶媒において再構成されたとき、ＳＰ１と、疎水性分子との間での分子的会合および複合体形成は、ＰＴＸを水溶性にした（図１９および図２０）。従って、ＳＰ１を、溶液における物質の溶解性を高めるために使用することができる。好ましい実施形態において、物質は疎水性物質であり、溶液は水溶液である。そのような物質（例えば、疎水性の薬物、揮発性エステルおよび他の分子、芳香分子、化粧用分子、オイル、顔料、ビタミン、有機分子など）を、水および水性溶媒と混合するために可溶化することができる。さらに、本発明を実施に移しているとき、凍結乾燥されたＳＰ−ＰＴＸ複合体が再構成後も安定したままであることが示された（本明細書中下記の実施例５を参照のこと）。従って、ＳＰ１および変性ＳＰ１変異体との分子的会合および複合体形成を、疎水性分子、揮発性分子、不安定な分子など（例えば、ＰＴＸなど）のより効果的な保存のために使用することができる。
【０１６５】
本明細書中上記で述べられたように、本発明の変性ＳＰ１ポリペプチドは２つ以上の変性をアミノ酸配列に有することができる。従って、例えば、無機分子（例えば、金属イオン；本明細書中上記の表１を参照のこと）と複合体化することができる変性ＳＰ１ポリペプチドは、第２の物質との可逆的な分子的会合を形成するためにさらに変性することができ、また、無機分子を含む任意の表面に第２の物質を送達するために使用することができる。そのような会合はナノテクノロジー適用および固体工学適用において有用であり得る。この場合、変性ＳＰ１複合体は、均一かつ所定の分子厚さの第２の物質の層を堆積させるために使用することができる。例えば、ドープ物質または絶縁性物質のそのような送達方法は、平らでない表面を覆う使用のためには特に好都合である。
【０１６６】
本発明の変性ＳＰ１ポリペプチドは、生体模倣適用における無機分子の制御された送達および放出のために使用することができる。ＳＰ１は、アミノ酸配列の変性によって変化させることができる整列した幾何学的立体配座で自己集合することが示されている（図１および図２を参照のこと）。キャリア能力（例えば、無機分子の可逆的な結合など）を提供するためのさらなる変性は、生体模倣プロセス（例えば、制御された結晶形成など）における分子キャリアとして役立つように変性ＳＰ１分子をもたらすことができる。そのような変性ＳＰ１ポリペプチドは、例えば、無機分子の正確な送達および放出のために、また、制御されない凝集をナノスケールプロセスにおいて防止するために、また、十分に規定された制御可能な性質を有するカップリング分子として有用であり得る（生体模倣技術の主題の最近の総説については、Ｓａｒｉｋａｙａ他、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ、２００４、３４：３７３〜４０８を参照のこと）。
【０１６７】
本発明のＳＰ１ポリペプチドは、ナノスケールの構造体およびデバイスを作製および操作するために使用することができる。結合性のペプチドおよびタンパク質が、分子レベルで、また、遺伝学によって選択および設計され、これにより、可能な限り小さい寸法スケールでの制御が可能になるので、様々なポリペプチドがナノスケール技術において利点を有する。また、そのようなタンパク質は、合成された実体（ナノ粒子、機能的ポリマー、あるいは、他のナノ構造体または分子テンプレートを含む）をつなぐためのリンカーまたは「分子エレクター・セット」として使用することができる。さらに、生物学的分子は、整列したナノ構造体に自己集合および共集合し、従って、これは、自然界に見出される構造体に類似する複雑なナノ構造体、および、場合によると、階層的な構造体を構築するための強固な組み立てプロセスを保証する。
【０１６８】
本明細書中上記で述べられたように、本発明のＳＰ１ポリペプチドは自己集合して、規則的かつ予測可能なナノスケール構造体を形成することができる。従って、例えば、分子リンカーおよび複雑なナノ構造体として有用な多数の自己集合した変性ＳＰ１モノマーを含む組成物が提供される。
【０１６９】
本発明のＳＰ１ポリペプチドはさらに、（特異的な融合ペプチドまたは融合ポリペプチドを介した）リガンド分子およびリガンド結合分子の親和性結合、ＳＰ１オリゴマーとの分子的会合および複合体化が可能である任意の化合物および／または分子の表面被覆、ＳＰ１オリゴマーとの分子的会合での導電性分子または半導体の制御された会合によるナノ回路設計、ＳＰ１オリゴマーと会合した磁性粒子または磁性ナノ粒子、任意の生物学的に活性な分子（例えば、除草剤、殺虫剤、揮発性化合物および芳香性化合物など）の制御された会合および放出、ナノコンピューティング、導電性インクによるリトグラフィーおよび印刷、三次元ナノ構造体の制御された会合および解離によるナノ構築のために使用することができる。なおさらに、本発明のＳＰ１ポリペプチドは導電性デバイス（例えば、電子工学デバイスなど）の構成要素として組み込むことができる。
【０１７０】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０１７１】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【０１７２】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ    ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｍｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９９４年、第３版；Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号および５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃ���ｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１７３】
材料および実験方法
組換えＳＰ１の発現
５６７ｂｐのｃＤＮＡクローンを、抗ＳＰ１抗体を使用して、水ストレスを与えたアスペンシュートに由来するラムダ発現ライブラリーからの７ｘ１０５個の組換えファージプラークをスクリーニングすることによって単離した（Ｗａｎｇ他、米国特許出願第１０／２３３４０９号）。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、ｓｐ１遺伝子を有するプラスミド（ｐＥＴ２９ａ、カナマイシン耐性が付与される）により形質転換した（Ｗａｎｇ他、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ、２００２、１３０：８６５〜７５）。野生型ＳＰ１ならびにその変異体を大腸菌において作製および発現させた：さらなるタグを何ら有しない全長ＳＰ１（これはＳＰ１（配列番号１）と呼ばれる）；６個のヒスチジンのタグをＳＰ１のＮ末端に導入して、６ＨＳＰ１（配列番号７）を作製し、システイン残基をＳＰ１の２１位に導入して、Ｃｙｓ２  ＳＰ１（配列番号３）を作製し、ΔＮＳＰ１（配列番号２）をＳＰ１のＮ末端におけるアミノ酸２〜６の欠失によって作製した。これらの組換えＳＰ１タンパク質の発現は、Ｗａｎｇ他（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓ、２００３、Ｄ５９：５１２〜１４）に記載されるように、標準的な組換え手法に従った。
【０１７４】
タンパク質精製
組換えＳＰ１を、Ｗａｎｇ他（２００３）に記載されるように、大腸菌から製造した。６ＨＳＰ１を、溶出緩衝液が４００ｍＭのイミダゾールを含有したということを除いて、供給者のプロトコルに従ってＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（Ｐ−６６１１、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＩ）でさらに精製した。ΔＮＳＰ１の煮沸安定性の画分を、アニオン交換カラムＳＯＵＲＣＥ−１５Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国）への準備として、１５ｍＭ〜２０ｍＭのピペラジン（ｐＨ５．９）の２０体積に対して透析した（２回）。移動相における緩衝液Ａは２０ｍＭピペラジン（ｐＨ５．１）であり、１ＭのＮａＣｌを含む同じ緩衝液を緩衝液Ｂとして使用した。ΔＮＳＰ１を２３％〜２５％の緩衝液Ｂによって溶出した。１Ｍの最終濃度での硫酸アンモニウム、および、７．５のｐＨへのＮａＯＨを、精製されたΔＮＳＰ１に加え、その後、１Ｍ硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）により予備洗浄されたＨｉＴｒａｐフェニルセファロースＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国）に負荷した。ΔＮＳＰ１を４７％〜４８％の５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．５）（緩衝液Ｂ）において溶出した。その後、ΔＮＳＰ１を、２５ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．５）を使用して３０ｋＤａカットオフの限外ろ過濃縮装置によって濃縮および透析ろ過した。
【０１７５】
分析超遠心分離
平衡沈降研究を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｏｐｔｉｍａ（登録商標）ＸＬ−１分析超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＩＮＣ．）を使用して行った。アスペンＳＰ１を２００倍の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で一晩透析した。その後、サンプルを透析液により希釈して、約２０２μＭ、１５２μＭ、６８μＭ、２２．５μＭおよび６．５μＭのタンパク質溶液を作製した。サンプルを６セクターセルにおいて、６０００ｒｐｍおよび７０００ｒｐｍのローター速度で２０℃において遠心分離した。データを、２８０ｎｍ、２２０ｎｍおよび２５４ｎｍで集め、下記の式を使用して分析した：Ｍ＝［２ＲＴ／（１−ν）ρω２］［ｄ（ｌｎ（ｃ））／ｄｒ２）］、ただし、典型的なν＝０．７３ｃｍ３ｇ−１およびρ＝０．９９９４ｇｃｍ−１。
【０１７６】
透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）研究
ＳＰ１（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を、グロー放電処理された、カーボンおよびニトロセルロースにより被覆された銅の４００メッシュのグリッドに塗布し、２％酢酸ウラニルにより染色した。画像をＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ−１２顕微鏡により得て、Ｋｏｄａｋ  Ｓ０１６３フィルムまたはＭｅｇａｖｉｅｗＩＩＩデジタルカメラ（Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｕｎｓｔｅｒ、ドイツ）で記録した。顕微鏡写真をＩｍａｃｏｎ  ＦｌｅｘｔｉｇｈｔＩＩスキャナーによりデジタル化した。上面の野生型ＳＰ１粒子を平均化するための画像処理をＳＰＩＤＥＲプログラム群（Ｆｒａｎｋ他、１９９６）により行い、この画像処理は、最初の無参照アラインメント（並進および回転）、その後、参照に基づいた３回のアラインメントからなっていた。ＳＰ１の低温陰染色画像を４μｌのＳＰ１（１ｍｇ／ｍｌ）をレース状グリッド（ＳＰＩ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）に置き、１６％モリブデン酸アンモニウムを加え（Ａｄｒｉａｎ他、１９９８）、液体エタンに沈めることによって調製した。低用量の低温条件のもとでの画像化を、ＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｆ２０顕微鏡で行い、ＴＶＩＰＳ（Ｇａｕｔｉｎｇ、ドイツ）１ｋＸ１ｋ  Ｂｉｏｃａｍカメラで記録した。
【０１７７】
ＳＰ１の化学的架橋および質量分析
ＳＰ１（１ｍｇ／ｍｌ）を５０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．５）における０．２５％グルタルアルデヒド（ＧＡ）と室温でインキュベーションした（７２時間）。非架橋ＳＰ１生成物および架橋ＳＰ１生成物を質量分析法による分析に供した。マトリックス支援レーザー脱離飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）をＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＴｏｆＳｐｅｃ  ２Ｅリフレクトロン質量分析計（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｔｅｃｈｎｉｏｎ、Ｈａｉｆａ、イスラエル）で行った。
【０１７８】
ＳＤＳへの曝露およびＳＰ１加熱後のＳＰ１の安定性
ＳＰ１（２０μｇ）を種々のＳＰ１モノマー：ＳＤＳモル比でＳＤＳサンプル緩衝液において調製し、煮沸し（５分間）（または、煮沸することなく）、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。ＳＰ１オリゴマー（１０μｇ）の熱安定性をＳＰ１モノマー：ＳＤＳ＝１：１７３３で同じ緩衝液において調べ、異なる温度で１分間〜１０分間加熱した。
【０１７９】
ＳＰ１のプロテアーゼ感受性試験
Ｖ８プロテアーゼ緩衝液（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、０．５％ＳＤＳ）または標準的緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）のいずれかにおいて調製されたＳＰ１（１０μｇ）を２分間煮沸し、または、煮沸することなく、その後、プロテアーゼ（黄色ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼ、トリプシン、プロテイナーゼＫ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．、イスラエル）を加えた。プロテアーゼを５０μｇ／ｍｌの最終濃度に加えた（ＳＰ１：プロテアーゼは１：２０（ｗ／ｗ）に等しい）。消化を３７℃で１時間行った。その後、サンプルをＳＤＳサンプル緩衝液において調製し、煮沸し、または、煮沸することなく、その後、１７％トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
【０１８０】
煮沸およびタンパク質分解によるＳＰ１の精製
植物の総可溶性タンパク質または濃縮された煮沸可溶性の総タンパク質を５０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫとインキュベーションした（３７℃、１時間）。類似した手順を総組換え細菌タンパク質に対して適用した。ＰＫを煮沸（１０分間）によって不活性化し、その後、遠心分離した（１５０００ｘｇ、１０分間）。ＳＰ１を限外ろ過（１０ｋＤａカットオフ、ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ、Ｂｉｎｂｒｏｏｋ  Ｌｉｎｃｏｌｎ、英国）によって濃縮した。
【０１８１】
ＳＰ１複合体へのジスルフィド架橋の操作
Ｃｙｓ２ＳＰ１遺伝子を、Ｎ末端のアラニンをシステインに部位特異的に変異誘発することによって構築した。野生型およびＣｙｓ２  ＳＰ１（配列番号３）の両方（２ｍｇ／ｍｌ）を１０ｍＭ  ＤＴＴの存在下または非存在下で一晩インキュベーションし、２％ＳＤＳサンプル緩衝液と事前に煮沸し、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。
【０１８２】
様々な有機溶媒に対するＳＰ１複合体の抵抗性
１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）における１ｍｇ／ｍｌのサンプルの１５０ｕｌを一晩凍結乾燥し、１５０μｌの有機溶媒に１０分間、再懸濁した。３０分のスピードｖａｃ処理の後、サンプルを１５０μｌの水に再懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１８３】
ＳＰ１ヘテロオリゴマーの再集合
精製された６ＨＳＰ１およびΔＮＳＰ１を最初に、これらのタンパク質をＳＤＳサンプル緩衝液において煮沸することによってモノマー形態に変性した。その後、変性させたタンパク質を調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーブルー染色によって可視化した。２つの組換えタンパク質バンドのモノマー形態を切り出した。６ＨＳＰ１（配列番号７）およびΔＮＳＰ１（配列番号２）のモノマー形態を有するゲル片を１：１の比率（ｖ／ｖ）で混合した。表面／体積の比率を高めるために、ゲル片を、乳棒および乳鉢を液体窒素の存在下で使用して粉砕した。その後、タンパク質を、以前に記載されたように、電気溶出によって同時溶出した（Ｗａｎｇ他、２００２）。ヘテロオリゴマー複合体を、溶出されたタンパク質をＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズに供することによって単離し、結合したタンパク質を、標準的な手順（Ｐ６６１１についてのＳｉｇｍａプロトコル）を使用して４００ｍＭイミダゾールによって溶出した。プロテイナーゼＫ（これはモノマーＳＰ１を消化するが、ＳＰ１複合体は消化しない）（この論文に記載される）を用いて、６ＨＳＰ１（配列番号７）およびΔＮＳＰ１（配列番号２）のモノマー形態をＮｉ−ＮＴＡ精製タンパク質から除いた。ヘテロオリゴマーＳＰ１の組成をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって求め、銀染色によって可視化した。
【０１８４】
限外ろ過
区別可能な吸収特性を有し、分光学的測定によって測定することができる水溶性リガンドのＦＡおよびＤＯＸとの複合体形成の検出のために限外ろ過を使用した。遊離ＦＡおよびＤＯＸはＳＰ１よりもはるかに小さい（それぞれ、０．３５ｋＤａおよび０．５８ｋＤａ対１５０ｋＤａ）：遊離ＦＡおよびＤＯＸは３０ｋＤａの分子量カットオフメンブランを通過する（流出画分）一方で、遊離ＳＰ１およびＳＰ１複合体はともにメンブランの上に保持される（保持画分）。数回のさらなる洗浄サイクルにより、残留する遊離ＦＡおよびＤＯＸが除かれ、リガンド−ＳＰ１複合体が保持画分に残留する。
【０１８５】
サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィーは、異なるサイズの分子を穏和な条件のもとで分離するための一般的な方法であり、これを用いて、穏和な条件のもとでのＦＡ複合体形成およびＤＯＸ複合体形成を調べた。ＳＰ１が７分後にカラムから溶出され、２７８ｎｍにおいて検出されるだけであり、遊離ＦＡが１６分後にカラム（ＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ、Ｔｏｓｏｈａａｓ）から溶出され、４９０ｎｍにおいて検出される。ＳＰ１−ＦＡ複合体およびＳＰ１−ＤＯＸ複合体もまた、同じ時間で溶出したが、これらはそれぞれ、４９０ｎｍおよび４７５ｎｍでも検出される。ＳＰ１が７分後にカラムから溶出され、２７８ｎｍにおいて検出されるだけである。ＤＯＸ／ＳＰ１の比率が、溶液で得られる標準曲線から求められる。
【０１８６】
Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣ
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析では、遊離ＤＯＸ、ＰＴＸおよびＳＰ１が分離される。両方の化合物が樹脂（Ｃ−１８）に結合し、異なるアセトニトリル濃度で溶出され、２７８ｎｍと、２２５ｎｍ（ＳＰ１）、２２５ｎｍ（ＰＴＸ）および４７７ｎｍ（ＤＯＸ）との両方で検出される。
【０１８７】
ＳＰ１−ＤＯＸ複合体は、複合体化していないＳＰ１とともに、２７８ｎｍだけでなく、４７７ｎｍにおいて検出される。ＳＰ１−ＤＯＸおよび遊離ＤＯＸの定量値が４７７ｎｍでのそれらのピークにおける吸光度から直接に計算される。しかしながら、ＳＰ１−ＤＯＸピークにおけるタンパク質の量を推定するために、２７８ｎｍにおける吸収が下記の式に従ってＤＯＸについて補正される（ＯＤ２７８−０．７７＊ＯＤ４７７）。ＦＡおよびＤＯＸとは対照的には、複合体化したＰＴＸは検出することができないが、遊離ＰＴＸと同じ溶出において検出される。
【０１８８】
ＤＯＸ化合物およびＰＴＸ化合物のＣ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ分離および検出が下記に概略される。溶媒Ａ＝水＋０．１％ＴＦＡ。溶媒Ｂ＝アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ。プログラムは、０分〜５分が７５％Ａ、０％Ｂであり、５分〜１５分が２５％〜７５％Ｂであった。ＳＰ１が２２５ｎｍおよび／または２７８ｎｍで検出され、ＤＯＸが４７７ｎｍおよび／または２７８ｎｍで検出され、ＰＴＸが２２５ｎｍで検出された。
【０１８９】
ＤＯＸ−ＳＰ１複合体
２０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．７）におけるパイロジェン非含有のＣｙｓ２  ＳＰ１変異体（配列番号３）（最終濃度、２ｍｇ／ｍｌ）をＤＯＸ溶液（Ｔｅｖａ、イスラエル）により１：２の希釈で希釈した（最終濃度、１ｍｇ／ｍｌ）。示された場合、ＧＳＨを加えた。溶液を一晩混合する。示された場合（酸化された場合）、Ｈ２Ｏ２を０．１％に加え、緩衝液を加えて、３倍の体積にし、溶液を超音波処理する（２２秒を３回、３％の振幅での１：１のパルス／中断、０．５分の中断、Ｖｉｂｒａ−Ｃｅｌｌ  ７５０Ｗ超音波処理機を使用する）。
【０１９０】
遊離ＤＯＸのエタノール沈殿
エタノールにより５倍（Ｖ：Ｖ）に希釈された溶液を−２０℃で３時間インキュベーションし、１２５０Ｘｇで３０分間、室温で遠心分離した。ペレット化物を洗浄し、冷エタノールに再懸濁し、再びペレット化し、再懸濁して、ＨＰＬＣによって分析した。
【０１９１】
非結合ＤＯＸの除去
ＳＰ１−ＤＯＸ溶液を３０Ｋカットオフのミクロコンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ  Ｌｔｄ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）での限外ろ過によって洗浄し、その後、リン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．７）およびＰＢＳにより、流出が無色になるまで洗浄した。
【０１９２】
ＳＰ１−ＰＴＸ複合体
３ｍｇのＳＰ１（２５ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳにおける１２０ｕｌ）を６時間、１５ｍｌのプラスチックチューブにおいて凍結乾燥した。３００ｕｌのＰＴＸ（乾燥アセトン／ヘキサン（１：１）＋０．１％β−メルカプトエタノールにおける１ｍｇ／ｍｌ）を加え、アセトン／ヘキサン＋０．１％β−メルカプトエタノールを加えて４ｍｌの最終体積にした。混合物を超音波処理した（１秒のパルス、３秒の中断、４５”の超音波処理時間、合計で３分、３５％の強度、氷上で）。有機溶媒を乾燥によって一晩エバポレーションし、０．４ｍｌのＰＢＳを加え、混合物を超音波処理した（１秒のパルス、３秒の中断、３０”のサニテーション時間、合計で２．５分、３５％の強度、氷上で）。破片を遠心分離（５分、１４０００ＲＰＭ）によってペレット化した。組織培養実験のために、アリコートをろ過した。
【０１９３】
細胞成長条件
ヒト結腸腺ガン（ＨＴ−２９）細胞。細胞を、１０％ウシ胎児血清、１％グルタミンおよび１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｉｃｏｔｉｃ溶液（Ｂｉｏｌａｂ、イスラエル）が補充されたＤＭＥＭ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｔ  Ｈａｅｍｅｋ）を含有する５０ｍｌのフラスコで成長させた。細胞をトリプシン処理し、５ｘ１０４個の細胞を含有する２ｍｌの培地を６ウエルプレートのそれぞれのウエルに入れた。ＳＰ１、薬物、または、薬物と複合体化されたＳＰ１を示された濃度で加えた。細胞を、５％ＣＯ２を含有する加湿された大気において３７℃でインキュベーションした。４８時間後、薬物の存在または非存在の培地を、成分および薬物の絶え間ない供給を維持するために、それぞれのウエルにおいてそれぞれ交換した。４日後、培地を除き、培養における生細胞の数を顕微鏡観察によって求めた。
【０１９４】
Ｂ１６メラノーマモデル（Ｂ１６−Ｆ１０（Ｂ１６）メラノーマ腫瘍）におけるＳＰ１−ＤＯＸおよびＳＰ１−ＰＴＸのインビボでの影響
Ｂ１６−Ｆ１０（Ｂ１６）メラノーマ腫瘍を有するＣ５７Ｂ１のオスのマウスを、Ｋａｌｅｃｈｍａｎ（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、２０００、８６：２８１〜８）によって記載されるように調製し、世話をした。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞（マウスあたり５ｘ１０５個または５ｘ１０６個の細胞）をマウスの側方尾静脈に注入し、ガン腫瘍の存在をマウスの全体的な様子および／または組織病理学検査によってメラノーマ細胞注入後１４日目で評価した。マウスを３つの群に分けた：Ａ群−１回の注射（フルオレセインアミン−ＳＰ１複合体溶液によるｉｖ）（ＳＰ１−ＦＡコンジュゲート、ＰＢＳにおける１０ｍｇ／ｍｌ；０．１ｍｌ／動物）、Ｎ＝５匹のマウス。Ｂ群には、ＦＡが１週において１回与えられた（Ｎ＝５匹のマウス）。Ｃ群は注射を受けなかった（Ｎ＝２匹のマウス）。注射後２４時間で内臓器官を集め、−７０℃で保存した。血液を集め、室温で凝固させ、血清を分離し、凍結した。
【０１９５】
器官および腫瘍を均質化し、抽出し、希釈し（ＰＢＳで３倍）、血清を熱処理し（８５℃で３０分間）、ＳＤＳ  ＰＡＧＥで分離した。免疫検出のために、分離されたタンパク質をゲルからニトロセルロースペーパーに電気ブロッティングによって転写した。ニトロセルロースブロットを、３％のスキムミルクを含有するＴｒｉｓ緩衝化生理的食塩水＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．７）（ＴＢＳＴ）に浸けることによってブロッキング処理した。スキムミルクをＴＢＳＴにより洗浄した後、ニトロセルロースブロットをＴＢＳＴにおける一次のウサギ抗ＳＰ１抗体に浸けた。一次抗体をＴＢＳＴにより洗浄した後、ニトロセルロースブロットをＴＢＳＴにおける二次のヤギ抗ウサギ抗体ＨＲＰコンジュゲートに浸けた。過剰な二次抗体をＴＢＳＴにより洗浄した後、ニトロセルロースブロットをＨＲＰ化学発光基質（ＥＣＬ）と接触させた。
【０１９６】
写真フィルムを、ラップで包んだニトロセルロースペーパーにさらして感光させ、その後、現像し、固定する。
【０１９７】
腫瘍サイズに対する遊離ＤＯＸおよびＳＰ１−ＤＯＸのインビボでの影響
ヒトＬＳ１４７Ｔ結腸ガン（動物一匹あたり１００万個の細胞）をＣＤ１ヌードマウス（３週齢〜４週齢、１８ｇ〜２０ｇ）に皮下移植した（Ｍｅｙｅｒ他、１９９５、Ａｍ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｐａｔｈ、１７：３６８〜７３）。８日後、３ｍｍ〜１０ｍｍの腫瘍が注入点に現れた。この時点で、動物を２つの群に分けた（それぞれにおいて６匹の動物）。平均腫瘍サイズおよび動物の体重は類似していた。
【０１９８】
腫瘍移植後８日で、ＳＰ１−ＤＯＸ（ＰＢＳにおける５０ｍｇ／Ｋｇ、約１ｍｇ／ＫｇのＤＯＸ相当量）、遊離ＤＯＸ（ＰＢＳにおける３ｍｇ／Ｋｇ）またはＰＢＳ単独を、それぞれの群における６匹のマウスに、１週間に２回、４週間にわたって尾静脈にｉｖ注射した。腫瘍の大きさを標準的な式（Ｋａｌｅｃｈｍａｎ他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、２０００、８２６：２８１〜８）によってカリパス測定により求めた。腫瘍移植後３５日で、動物を屠殺した。腫瘍を取り出し、その重量を測定した。
【０１９９】
実験結果
（実施例１：）
ＳＰ１タンパク質の構造
天然ＳＰ１およびその組換え形態の両方のＳＤＳゲル電気泳動分析では、ＳＰ１が２つの形態で出現することが示される：サンプルがＳＤＳの存在下でのゲル適用緩衝液において煮沸されるときに現れるモノマー（１２．４ｋＤａ）、および、ＳＰ１がＰＡＧＥでの適用に先だって煮沸されないときに現れるオリゴマー形態（１１６ｋＤａのタンパク質）（Ｗａｎｇ他、２００２；Ｄｇａｎｙ、２００４；Ｗａｎｇ他、２００６；米国特許出願第１０／４４３２０９号を参照のこと）。いくつかの方法を用いて、溶液中のＳＰ１が、１５０ｋＤａの分子量を有するドデカマーを形成することが明らかにされている。平衡状態での分析超遠心分離を用いて、ＳＰ１のオリゴマー状態を分析した。ＳＰ１の濃度がゼロに近づくにつれ、溶液におけるＳＰ１粒子の測定された分子量（５．６μＭのモノマー濃度において１４４ｋＤａ）が、ドデカマーについて計算された値（１４８ｋＤａ）に近づいた。
【０２００】
ＳＰ１をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供した。データから、１２個のタンパク質ピークが明らかにされ、そのうちの最初のピーク（１２３３８Ｄａ）はモノマーの予測された分子量（１２３６９Ｄａ）に近かった。それ以外のピークは、約１２．４ｋＤａの分子間隔で、ＳＰ１ダイマーからドデカマーにまで対応した。架橋されたＳＰ１のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析では、モノマーからドデカマーまで対応する、１２９９８Ｄａから１５４７０６Ｄａにまで及ぶ分子量を有する１２個の明瞭なピークが明らかにされた。ＴＳＫ３０００カラムを使用するゲルろ過ＨＰＬＣ分析でもまた、ＳＰ１がドデカマーを形成することが示される。このオリゴマー形態はさらに、約９．８分での単一ピークとして現れた電気溶出された高分子量ＳＰ１（１１６ｋＤ）について推定された。このピークは、標準曲線から計算されたとき、１４４．９±１．５４ｋＤの分子量に対応した。これはＳＰ１モノマー（１２．３６９ｋＤ）の１１．７倍（約１２ユニット）である。
【０２０１】
本発明を実施に移していること、ＳＰ１の電子顕微鏡研究が着手された。電子顕微鏡観察研究では、ＳＰ１が、中心の空洞を伴う環状タンパク質であることが示された。
【０２０２】
ＳＰ１が２次元結晶を形成する条件を明らかにするために、ＳＰ１をリン脂質（ヘキサンクロロホルムにおけるＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＣ、１：１、ｗ／ｗ）と混合した。図１は、リン脂質により誘導された２次元のＳＰ１結晶単層のＴＥＭ像を示し、ＳＰ１の２次元結晶を形成することができることを示している。従って、粒子が種々の様式で配列することができ、ＳＰ１がより高次の構造に自己集合し得ることを示している。
【０２０３】
ＳＰ１モノマー
Ｘ線結晶学研究（Ｄｇａｎｙ他（２００４）を参照のこと）では、ＳＰ１鎖が、３つのα−らせん、すなわち、Ｈ１（残基２３〜３９）、Ｈ２ａ（残基７４〜８１）およびＨ２ｂ（残基８４〜９３）を伴うα型およびβ型の折り畳みと、４つの逆平行のβ鎖、すなわち、Ｂ３（残基９〜１７）、Ｂ１（残基４５〜５０）、Ｂ２（残基６５〜７１）およびＢ４（残基９７〜１０８）によって形成されるβ−シートとを有することが示された。Ｎ末端セグメントは溶媒の方を向き、また、最初の２つの残基について、説明できる電子密度の欠如及びＴｈｒ−３およびＬｙｓ−４についての温度因子の大きさによって立証されるように可動性である。残基５１〜６４によって形成される長いループは大部分が構造化されていない。このループは分子から突き出ており、ダイマー接触に関与する。Ｈ１およびＨ２のらせんにより、数多くの親水性側鎖および酸性側鎖が溶媒の方を向く外側の凸型表面が規定される。
【０２０４】
この表面の内側および向き合うβ−シートが、芳香族残基および疎水性残基が多い疎水性の中心の空洞を取り囲む。ＳＰ１分子におけるフェニルアラニンのほとんどがこの空洞を占める（Ｐｈｅ−１７、Ｐｈｅ−４６、Ｐｈｅ−６７、Ｐｈｅ−７１、Ｐｈｅ−８９およびＰｈｅ−９３）。Ｔｒｐ−４８およびＴｙｒ−３３、Ｔｙｒ−６３およびＴｙｒ−８０、ならびに、２つのヒスチジン（Ｈｉｓ−１１およびＨｉｓ−６５）、および、Ａｒｇ−１００により、空洞への溶媒の接近が阻止される。１つだけの仮説に限定されることを望まないが、本発明者らは、この空洞が小さい疎水性分子のための結合部位として役立ち得ると考えている。
【０２０５】
ＳＰ１の構造が、Ｘ線結晶学およびＮＭＲの両方によって解明されるようなそのシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）アナログ（遺伝子座Ａｔ３ｇ１７２１０５０、アクセション番号：ＡＹ０６４６７３、配列番号１５０）の構造（Ｂｉｎｇｍａｎ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ、２００４、５７：２１８〜２０；Ｌｙｔｌｅ他、Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  ＮＭＲ、２８：３９７〜４００）に類似することには留意しなければならない。
【０２０６】
ＳＰ１タンパク質の精製が、熱処理による部分的抽出を可能にするその並外れた安定性のために可能である（本明細書中上記の方法を参照のこと）。得られた耐熱性画分は３０％純粋である（図６、レーン１およびレーン２）。さらなる精製により、ＳＰ１のクロマトグラフィー的に純粋な調製物が得られ、これは逆相ＨＰＬＣおよびサイズ排除クロマトグラフィーで単一ピークとして検出することができる（図６のレーン３、図７および図３０）。
【０２０７】
ＳＰ１ドデカマー
ダイマー・ダイマーの接触は主に親水性側鎖および荷電基を伴うか、または、水分子によって媒介される。これらの接触は主として、Ｂ１、Ｈ１およびＮ末端テールに沿って生じる（Ｄｇａｎｙ（２００４）を参照のこと）。ダイマー間の相互作用の結果として、６個のダイマーにより、環状構造が擬６回軸のまわりに作られる。ドデカマーの環状構造は外径が約５０Åであり、内径が約１５Åである。それぞれのダイマーにおける残基１８〜２２を含むループが溶媒の方に突き出ており、これに対して、Ｎ末端のアームが環状構造の内側部分に向かって伸びている。隣接するダイマーにおける等価な分子の間での接触は同一ではないので（Ｄｇａｎｙ、２００４）、６回対称性が破れる。
【０２０８】
（実施例２）
ＳＰ１は、煮沸および変性に対して安定性を有するプロテアーゼ抵抗性の分子である
ＳＤＳの存在下でのＳＰ１複合体の安定性を、精製されたＳＰ１を種々のモル比でのＳＤＳと種々の温度でインキュベーションすることによって調べた。モノマーへのＳＰ１複合体の解離には、ゲルへの負荷の前に煮沸することが付随して、６００：１（ＳＤＳ：ＳＰ１モノマー）を超えるモル比が必要であった。煮沸がない場合、３４６７対１の比率でさえ、ＳＰ１はＳＤＳ−ＰＡＧＥで複合体として持続した。８０℃以下の温度での１７３４倍のＳＤＳ（１％）とのＳＰ１のインキュベーションは、複合体の著しい解離を引き起こさなかった（Ｗａｎｇ、２００６）。
【０２０９】
ＳＰ１タンパク質は並外れた熱安定性を示し、そのため、そのような熱安定性により、本明細書中上記の実施例１において述べられたように、熱処理による粗細胞調製物の部分抽出が可能である。図６には、熱処理によって達成された純度が示される。
【０２１０】
ＳＰ１の示差走査熱分析研究では、１０７℃のＴｍがＳＰ１について示される。これらの結果はさらに、ＳＰ１が煮沸に対して安定性を有するタンパク質であり、また、その高オリゴマー形態は、２％ＳＤＳの存在下で煮沸したときにだけ解離するという本発明者らの以前の知見（Ｄｇａｎｙ、２００４）を支持している。さらに、不溶性ＳＰ１を含む封入体のフォールディングおよびリフォールディング、ならびに、アンフォールディングされた変性タンパク質の熱安定性は、無傷のモノマーが、オリゴマーと同様に、耐熱性があることを示している（図５）。
【０２１１】
ＳＰ１は、そのモノマー形態（０．５％ＳＤＳにおいて煮沸されたとき、または、溶解された封入体）に解離したとき、Ｖ８プロテアーゼまたはズブチリシン（アルカラーゼ、Ｎｏｖｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）による消化を受けやすい。しかしながら、Ｖ８プロテアーゼは無傷のオリゴマーを消化することができなかった（図５を参照のこと）。オリゴマー−プロテアーゼの混合物をＳＤＳサンプル緩衝液においてさらに煮沸したとき、ＳＰ１モノマーのみがゲル上に観察され、ペプチドフラグメントは検出されなかった。同じ混合物を、煮沸することなく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供したとき、無傷の複合体が観察された。類似する結果が、トリプシンおよびプロテイナーゼＫおよびズブチリシンを用いて得られた。これは、広範囲の様々なプロテアーゼに対するＳＰ１複合体の優れた抵抗性を示している（Ｗａｎｇ、２００２；Ｗａｎｇ、２００６）。従って、正しく折り畳まれたＳＰ１タンパク質はプロテアーゼ抵抗性があるが、アンフォールディングされた変性タンパク質はプロテアーゼに対して感受性があり、プロテアーゼおよび熱処理によって除くことができる（図５）。
【０２１２】
ＳＰ１およびＳＰ１オリゴマー複合体の安定性をさらに調べるために、野生型ＳＰ１およびＳＰ１変異体のＣｙｓ２  ＳＰ１を緩衝液に溶解し、有機溶媒のメタノールおよびヘキサンにさらし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図１８）。主に高分子量のオリゴマー複合体形態が、処理されたすべてのサンプルで検出された（図１８、レーン１〜レーン３）。これは、ＳＰ１複合体が、有機溶媒による変性に対して抵抗性があることを示している。
【０２１３】
従って、ＳＰ１複合体は、温度および界面活性剤による変性、有機溶媒、ならびに、タンパク質分解的分解に対する驚くほど強い抵抗性を示す。
【０２１４】
（実施例３）
ＳＰ１変異体
ＳＰ１変異体を、オリゴマー化および／または結合および／または他の分子との複合体化のための能力、ならびに／あるいは、サブユニット間のジスルフィド結合を形成する能力、および／または、中心の空洞の大きさを変化させる能力を高めるために、あるいは、そうでない場合には、ＳＰ１の安定性を変化させるために構築することができる。数多くのＳＰ１変異体タンパク質を、ＳＰ１の性質に対する特定の変化の影響を調べるために構築した。
【０２１５】
Ｎ末端セグメントは溶媒の方に向き、外見的にはタンパク質の折り畳みおよび安定性に関与していない。従って、Ｎ末端の変異はタンパク質の構造またはその安定性を変化させないことが予測された。この予測と一致して、Ｎ末端全体の欠失を有する変異体タンパク質（Δ２−６）を含むＮ末端変異体のすべてが安定な複合体に会合した（図３）。さらには、驚くべきことに、腫瘍認識ペプチドのＣＲＧＤ（配列番号５）およびＲＧＤＣ（配列番号６）ならびにＲＧＤループ（配列番号１０）がＳＰ１のＮ末端に挿入されたとき、融合タンパク質は、煮沸に対して安定性を有するプロテアーゼ抵抗性のドデカマーを形成したことが発見された（図４）。
【０２１６】
Ｎ末端の局在性を確認するために、システイン残基をＳＰ１の２位に挿入した（Ｃｙｓ２変異体、配列番号３）（野生型ＳＰ１はＣｙｓ残基を全く含有しない）。このＣｙｓ２変異体のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析では、Ｃｙｓ２変異体が複合体内で分子間ジスルフィド結合を容易に形成することが示される。Ｃｙｓ２挿入の特異性を確認するために、本発明者らは、中心の空洞に向かってこれらもまた露出するループ２（４０〜４４）（配列番号１８）およびループ４（７２〜７３）（配列番号２０）の両方に位置する２つのシステイン残基を置換した。表１は、Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体とは対照的に、これらの変異体タンパク質はジスルフィド結合を（類似する条件のもとで）形成することができないことを示す。いくつかの組換えＳＰ１変異体は可溶性タンパク質を発現時に形成することができず、封入体（ＩＢ）を形成することに留意しなければならない。しかしながら、これらの封入体は０．５Ｍの尿素によりアンフォールディングされ、透析によってリフォールディングされ得ることが発見された。
【０２１７】
Ｘ線結晶学研究（Ｄｇａｎｙ他（２００４）を参照のこと）では、多くの推定されるモノマー・モノマー相互作用およびダイマー・ダイマー相互作用が複合体を安定化させることが示された。従って、１つのアミノ酸置換がタンパク質を劇的に脱安定化させるとは考えられない。部位特異的変異誘発を、ダイマー・ダイマー相互作用およびモノマー・モノマー相互作用の脱安定化のための最も重要な残基を見出すために行った。本明細書中上記の表１は、ほとんどの置換がタンパク質を脱安定化させなかったことを示す。しかしながら、Ｉ３０Ａ（配列番号１４）、Ｎ３１Ａ／Ｔ３４Ａ（配列番号３０）、Ｆ１０６Ａ（配列番号２３）およびＹ１０８Ａ（配列番号２４）の残基（これらは表１では強調される）（これらの残基はタンパク質の３次元構造において互いに非常に接近している）が、タンパク質の安定化に関与するホットスポットとして特定された。
【０２１８】
ループ１（残基１８〜２２）（配列番号６）およびＬ８１Ｃ（配列番号２２）は、リングの外周に向かって露出しており、タンパク質・タンパク質相互作用、ならびに、他の分子または表面との相互作用に関与する特定のペプチドの多重提示のための良好な候補である。
【０２１９】
Ｎ末端の変性はタンパク質の構造または安定性（例えば、ダイマー形成）に影響を及ぼさなかったが、これらの変性は、ＳＰ１変異体の結合特性および複合体化特性（例えば、金属および金属会合粒子との複合体形成、ならびに、レドックス依存的な小分子複合体形成など）における変化を生じさせるための機会を提供した（表１の「Ｎ末端の変異」を参照のこと）。
【０２２０】
いくつかのループ２変性（Δ２−６Ｉ４０Ｃを参照のこと）を、分子の抵抗性を著しく変化させることなく、中心の空洞におけるチオール基を介した金ナノ粒子の結合のために使用することができる（表１）。
【０２２１】
従って、１つだけの仮定に限定されることは望まないが、本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、特異的な変化した性質を有するＳＰ１分子をもたらすＳＰ１分子の変性の位置およびタイプを発見したと考えている。
【０２２２】
ＳＰ１変異体はヘテロダイマーに集合することができる
種々の変異体ＳＰ１モノマーが自己集合して、機能的なオリゴマー複合体を形成することができるかどうかを明らかにするために、変異体の間でのヘテロダイマー形成を調べた。
【０２２３】
ヘテロダイマーを作製するために、ＳＰ１のモノマー形態を、２つの方法によって、すなわち、ＳＤＳ  ＰＡＧＥからの電気溶出、および、封入体を溶解することによって単離した。
【０２２４】
ＳＰ１変異体のＣｙｓ２ｌｏｏｐ１ＲＧｄが組換え細菌において発現させられるとき、組換えタンパク質が不溶性のタンパク質性封入体に見出される。ＳＰ１変異体Ｃｙｓ２ｌｏｏｐ１ＲＧｄの封入体を５Ｍ尿素によって可溶化することにより、可溶性モノマーの放出がもたらされ（図５ａのレーン１〜レーン４を参照のこと）、この可溶性モノマーは高オリゴマー形態に自発的に再集合することができる（図５ｂ、レーン１〜レーン４）。
【０２２５】
ＳＰ１がヘテロオリゴマー複合体に集合することができることはまた、類似した方法を使用して明らかにされた。２つの変異体組換えＳＰ１ポリペプチドを発現させた（６個のヒスチジンのＮ末端タグ化ＳＰ１（６Ｈｉｓ２、配列番号７）およびＮ末端欠失ＳＰ１（ΔＮＳＰ１、配列番号２））。これら２つのＳＰ１変異体のモノマーを、２つのＳＰ１変異体をＳＤＳの存在下で煮沸し、調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離することによって作製した（図３、レーン２およびレーン３）。ゲルから電気溶出されたモノマーを混合して、ヘテロオリゴマーの形成を容易にした（図３、レーン４およびレーン５）。自己集合したヘテロ複合体におけるこれら２つのＳＰ１変異体の存在を確認するために、同時に電気溶出されたタンパク質混合物をさらに、ニッケル親和性カラム精製に供した（図３、レーン６およびレーン７）。ヒスチジンタグ化タンパク質およびその会合タンパク質のみが単離された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、６ＨＳＰ１複合体がＳＰ１の２つの変異体を含有することが示された（図３のレーン５およびレーン７を参照のこと）。ヘテロオリゴマーの集合が、最終的には、プロテイナーゼＫ消化を使用してモノマー形態を除くことによって確認された（オリゴマー形態のみがＰＫ消化に対する耐性を有する）（図４、レーン８およびレーン９）。
【０２２６】
これらの結果から、２つのＳＰ１変異体のモノマーが実際に、ヘテロオリゴマー複合体形態に自己集合する能力を保持し得ることが明瞭に示される。
【０２２７】
（実施例４）
ＳＰ１変異体の結合特性
ＳＰ１変異体の結合特性を明らかにするために、また、ＳＰ１および変異体が、それらに複合体化された分子を安定化させる能力を調べるために、野生型ＳＰ１および変異体ＳＰ１を様々な生物学的に活性な薬剤にさらし、得られた複合体を、複合体化された薬剤の活性、安定性および生物学的利用能について調べた。
【０２２８】
Ｃｙｓ２−ＳＰ１変異体
ＳＰ１に対する薬剤の複合体化を変性および制御する能力を明らかにするために、Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体は、ＳＰ１の２位に挿入されたシステイン残基（野生型ＳＰ１はＣｙｓ残基を全く含有しない）を、中心の空洞に面するＮ末端に有する（Ｃｙｓ２変異体）。Ｃｙｓ２変異体（これはサンプル適用緩衝液と混合され、２％β−メルカプトエタノールの存在下または非存在下での１０分間の煮沸に供された）のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析では、Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体がジスルフィド結合を形成することが示される（図８ｂ）。還元されたＣｙｓ２  ＳＰ１変異体（これは１０ｍＭのＤＴＴにより処理された）は、還元剤を除いたとき、容易に酸化される（図８ｂ）。Ｃｙｓ−２  ＳＰ１におけるジスルフィド結合の特異性がさらに、Ｃｙｓ−２  ＳＰ１が、遊離スルフヒドリルに特異的な試薬（例えば、５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢまたはエルマン試薬）およびフルオレセインマレイミドなど）と反応しないことによって証明される（データ示さず）。
【０２２９】
従って、Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体のモノマーにおける反応性スルフィドの利用能をレドックス条件における変化によって制御することができる。薬剤および他のリガンドとの複合体形成に対するレドックス依存的な変化の影響を明らかにするために、Ｃｙｓ２  ＳＰ１がそのような薬剤と複合体化する動力学を調べた。図８には、レドックス依存的なリガンド複合体化およびリガンド放出についての１つの可能なモデルが示される。１つの仮定に限定されることは望まないが、還元剤（例えば、グルタチオンの還元型形態（ＧＳＨ）、ＤＴＴまたはβ−メルカプトエタノールなど）はジスルフィド結合を切断することができ、Ｃｙｓ２−ＳＰ１をリガンドとの複合体のために利用可能にすることが提案される。複合体化したリガンドは酸化によって結合することができ、還元されたときには解離することができる（図１８ｂおよび下記）。これは特に重要である。なぜなら、固形腫瘍は低酸素によって特徴付けられ、また、細胞の還元性等価体を多量に蓄積するからである（Ｋｉｍ、２００３）。さらに、高いＧＳＨ濃度が薬物抵抗性に関与することが示唆された。従って、図８ｂおよび図８ｃに例示されるように、酸化のもとでＣｙｓ２−ＳＰ１と複合体化した治療薬または他の薬剤を、それらが標的部位に到達するまで、ＳＰ１変異体によって安定化させ、輸送することができ、それらが標的部位に到達したとき、還元性等価体により、薬剤の放出が高められる。
【０２３０】
Ｃｙｓ２  Ｓｐ１変異体による薬剤およびリガンドの制御された複合体化および放出を、水溶性マーカーリガンドとしてのフルオレセインアミン蛍光団（ＦＡ）の複合体化、ならびに、水溶性治療薬および水不溶性治療薬についてのモデルとしてのそれぞれ、ドキソルビシン（ＤＯＸ）およびパクリタキセル（ＰＴＸ）の複合体化を使用して調べた。限外ろ過、サイズ排除クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣ分析（本明細書中上記の方法を参照のこと）を使用して、薬剤−ＳＰ１変異体の複合体化および放出を下記の検討事項に関して明らかにした：
１．野生型と比較した場合の、Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体によるリガンド複合体化の効率。
２．タンパク質の還元は、野生型ＳＰ１の複合体化ではなく、Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体によるリガンド複合体形成を増大させることができるか。
３．Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体の酸化は、リガンドを添加する前では、リガンドの複合体化を打ち消すことができるか。
４．Ｃｙｓ２  ＳＰ１−リガンド複合体の還元はリガンドの解離を増大させることができるか。
５．複合体化したリガンドをＣｙｓ２  ＳＰ１との会合によって安定化させることができるか。
【０２３１】
フルオレセインアミン（ＦＡ）
ＦＡの吸収ピークは、４９０ｎｍ、および、はるかにより低い程度ではあるが、２７８ｎｍにある（所与のＦＡ濃度について、ＯＤ２７８／ＯＤ４９０＝０．１９）（図３１を参照のこと）。一方、ＳＰ１の吸収ピークは２７８ｎｍにあり（図３０を参照のこと）、ＳＰ１は４９０ｎｍでは検出されない。Ｃｙｓ２  ＳＰ１は吸収ピークを２２５ｎｍおよび２７８ｎｍに有する（図３２を参照のこと）。ＦＡがＣｙｓ２  Ｓｐ１変異体と複合体化することが、ＦＡおよびＣｙｓ２  ＳＰ１変異体をＧＳＨの非存在下または存在下でインキュベーションし、続いて、タンパク質の酸化、限外ろ過（３０ｋＤａのカットオフ）、および、保持画分のＧＳＨ含有ＰＢＳまたはＧＳＨ非含有ＰＢＳによる徹底的な洗浄の後で明らかにされた。２７８ｎｍおよび４９０ｎｍの両方での吸収分析（図９）では、ＧＳＨによるタンパク質の還元はＦＡおよびＣｙｓ２  ＳＰ１の複合体化を増大させること、また、ＦＡ−Ｃｙｓ２  ＳＰ１複合体の還元はＦＡの解離を増大させることが示される。
【０２３２】
サイズ排除クロマトグラフィー（本明細書中上記の方法を参照のこと）を使用して、Ｃｙｓ  ＳＰ１変異体および野生型ＳＰ１とのレドックス依存的なＦＡ複合体化を比較した。図１０は、野生型ＳＰ１が還元剤の存在下または非存在下でＦＡマーカーとの複合体をほとんど形成しないことを示す。対照的に、Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体は、還元剤の存在下で、３倍を超える効率でＦＡマーカーと複合体化する（図１０）。
【０２３３】
Ｃｙｓ２  ＳＰ１とのＦＡ複合体化の優れた制御が図１１に示される。低いリガンド濃度（１０μＭ）において、識別可能なＦＡ複合体化が野生型ＳＰ１については検出されず、これに対して、Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体は効率的な複合体化を示した。より大きい濃度（１００μＭ以上）において、Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体は、野生型ＳＰ１の効率の３倍を超える効率でＦＡマーカーと複合体形成する。これらの結果から、Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体は、野生型と比較して、リガンドおよび薬剤と効率的に複合体化することができること、また、タンパク質の還元は、野生型ＳＰ１ではなく、Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体によるリガンド複合体形成を増大させることが示される。
【０２３４】
ＳＰ１の複合体形成および共有結合性変性
小分子とともにＳＰの化学的変性は、２つのタイプの新しい複合体の作製を可能にする。小分子は、分子的会合のための新しい部位をもたらすことによって、タンパク質との共有結合性の結合、または、非共有結合性の結合をもたらすことができる。
【０２３５】
カルボン酸残基修飾試薬の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を共有結合性の反応基として使用してＳＰ１と複合体化するフルレオセインアミンを用いて、これが示された（表５、本明細書中下記）。天然ＳＰ１と類似して、ＳＰ１−ＦＡ複合体は高い温度に対して抵抗性がある。非共有結合的に結合したＦＡが、ＳＤＳの存在下で煮沸したときにだけ、タンパク質から解離する。表５は、ＳＰ１と結合したＦＡの蛍光強度に対する熱処理およびプロテアーゼ処理の影響を示しており、フルオレセインアミンの約８０％が非共有結合性の会合によってタンパク質と会合することが示される。複合体化したＳＰ１−ＦＡは野生型ＳＰ１の特徴的な熱安定性およびプロテアーゼ抵抗性を保持することもまた示される。
【０２３６】
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【０２３７】
ドキソルビシン（ＤＯＸ）
アントラサイクリン系抗生物質のドキソルビシンは最も有用な抗新生物剤の１つであり、血液学的悪性腫瘍だけでなく、いくつかの固形腫瘍に対して活性がある。ドキソルビシンは、様々な新生物状態（例えば、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、軟組織および骨の肉腫、乳ガン、卵巣ガン、移行細胞膀胱ガン、甲状腺ガン、胃ガン、ホジキン病、悪性リンパ腫および気管支原性ガンなど）を治療するために使用される。さらに、ドキソルビシンの多くのコロイド状キャリア（例えば、リポソームおよびポリマーナノ粒子など）が、心臓毒性を軽減すること、および、治療的効力を改善することを目指して研究されている。
【０２３８】
ＳＰ１がＤＯＸとの複合体を形成することができることを明らかにするために、両方のＳＰ１ならびにＳＰ１−ＤＯＸ複合体（保持画分における）および遊離ＤＯＸ（流出画分における）の濃度を４７７ｎｍおよび２７８ｎｍの両方で分光光学的に求めた。ＤＯＸは特異な光学的性質を有しており、その吸収ピークが、４７７ｎｍ、および、より低い程度ではあるが、２７８ｎｍにあり（所与のＤＯＸ濃度について、ＯＤ２７８／ＤＯ４７７＝０．７７）（図２９を参照のこと）、一方、ＳＰ１の吸収ピークは２７８ｎｍにあり、ＳＰ１は４７７ｎｍでは検出されない（図３０および図３２）。
【０２３９】
野生型ＳＰ１およびＣｙｓ２  ＳＰ１変異体を、限外ろ過によって明らかにされるように、ＤＴＴの存在下および非存在下でＤＯＸと複合体化するその能力について調べた。図１２は、ＤＯＸが、ＤＴＴにより処理された野生型ＳＰ１よりもはるかに大きな程度に、ＤＤＴにより還元されたＣｙｓ２  ＳＰ１変異体との複合体を形成すること、および、ＤＴＴにさらされたとき、Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体によるＤＯＸ複合体が大きく高まることを示す。ＤＴＴの代わりに、グルタチオン（還元型形態）による還元は、Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体によるＤＯＸ複合体化を改善する（データ示さず）。
【０２４０】
Ｃｙｓ２  ＳＰ１の化学的環境のレドックス状態の他の操作がＤＯＸ複合体化のさらなる制御をもたらしたかどうかを明らかにするために、酸化剤の存在下または非存在下での野生型ＳＰ１およびＣｙｓ２変異体ＳＰ１に対するＤＯＸ複合体化を評価した。図１４は、Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体をＤＯＸ添加前に酸化することにより、ＤＯＸの複合体化が打ち消されることを明瞭に示す。従って、１つだけの仮定に限定されることは望まないが、ＤＯＸ−Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体の複合体形成の酸化依存的な阻害により、Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体におけるジスルフィド結合の還元がＤＯＸ複合体形成を促進させることが示され得る。
【０２４１】
Ｃｙｓ２  ＳＰ１−ＤＯＸ複合体化の特徴をさらに明らかにするために、ＤＯＸとのＣｙｓ２  ＳＰ１複合体形成をサイズ排除クロマトグラフィーによって４７５ｎｍおよび２７８ｎｍの両方で求めた。図１３は、Ｃｙｓ２  ＳＰ１−ＤＯＸのピークが７分で溶出し、２７８ｎｍおよび４７５ｎｍの両方で検出されることを示す。ＰＢＳによる徹底的な洗浄は、還元剤が添加されていないとき（図１３、ＧＳＨなし）、Ｃｙｓ２  ＳＰ１−ＤＯＸ複合体を破壊しない。しかしながら、還元剤（ＧＳＨ）の添加は、Ｃｙｓ２  ＳＰ１タンパク質のピーク（２７８ｎｍ）の何らかの欠損を伴うことなく、ＤＯＸピーク（４７５ｎｍ）の欠損をもたらす。１つだけの仮定によって限定されることは望まないが、これは、ＤＯＸが大きい親和性をＳＰ１複合体に対して示し、（低い遊離リガンド濃度において）徹底的な洗浄のときにだけ、複合体から解離させられることを意味すると理解することができる。ＤＯＸがＳＰ１に強固に結合するという証拠はまた、ＤＯＸが（酸化状態下における）室温での７日間のインキュベーションの後でもＳＰ１−ＤＯＸ複合体から解離しないという観察結果によって提供された（データ示さず）。ＳＰ１−ＤＯＸ複合体が、エタノール沈殿の後でさえ、無傷のままであることには留意しなければならない（図３５を参照のこと）。これは、複合体の安定性が大きいこと、ならびに、遊離ＤＯＸの除去および複合体化したＳＰ１−ＤＯＸの精製が容易であることを示している。
【０２４２】
逆相ＨＰＬＣ分析によるＣｙｓ２  ＳＰ１−ＤＯＸ複合体の分析を、結合した化学種を異なるアセトニトリル濃度で樹脂（Ｃ−１８、Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）から溶出し、吸収を４７７ｎｍおよび２７８ｎｍの両方で測定することによって達成することができる。Ｃｙｓ２  ＳＰ１とＤＯＸとの複合体化に対するレドックス状態のさらなる操作の影響を調べるために、野生型ＳＰ１およびＣｙｓ２  ＳＰ１変異体を、還元状態（ＧＳＨ、還元されたタンパク質）または酸化状態（過酸化物、酸化されたタンパク質）のもとでＤＯＸと複合体化するそれらの能力について調べた。図１４は、酸化されたＣｙｓ２  ＳＰ１変異体ではなく、還元されたＣｙｓ２  ＳＰ１変異体がＤＯＸとの複合体を形成すること、また、複合体が、野生型ＳＰ１と、ＤＯＸとの間では形成されないことを示す。
【０２４３】
図１４はさらに、遊離の複合体化していないＤＯＸが特定の条件のもとではＳＰ１タンパク質との会合状態で見出され得ることを示す。サンプルはカラムへの適用の前に限外ろ過によって徹底的に洗浄されたが、遊離ＤＯＸの著しい割合が、還元（ＤＴＴ処理）されたＣｙｓ２  ＳＰ１サンプルでは認められる。これは、一部のＤＯＸがＣｙｓ２  ＳＰ１と会合したままであることを示しており、そのようなＤＯＸは、過酷な条件（７５％アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ）にさらされたときにタンパク質から解離させることができる。
【０２４４】
Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体とのＤＯＸの会合を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析および蛍光画像化によってさらに調べた。図１５は、ＤＯＸが、過酷な（還元および煮沸）条件のもとでさえ、Ｃｙｓ２  ＳＰ１のすべての形態（１１６ｋＤａの複合体、１２．４ｋＤａのモノマーおよび２４．８ｋＤａのダイマー）と会合したままであることを示す。さらに、還元剤の存在下または非存在下で検出された遊離ＤＯＸの比較（図１５、レーン２およびレーン４）では、複合体の還元が、Ｃｙｓ２  ＳＰ１−ＤＯＸ複合体から放出されるＤＯＸを刺激することが示される。このゲルにおけるバンドの相対的な強度は、おそらくは自己消光現象のために、ＤＯＸの絶対量を必ずしも反映しないことは特筆される。さらなるＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析では、Ｃｙｓ２  ＳＰ１−ＤＯＸ複合体は、プロテアーゼ処理（レーン１〜レーン３、レーン５）、熱処理（８５℃／３０分）（図１６、レーン１〜レーン４）、および、血清中でのインキュベーション（３７℃／２４時間）（図１６、レーン１およびレーン２）に対して抵抗性があることが発見された。過酷な条件における解離に対するＣｙｓ２  ＳＰ１−ＤＯＸ複合体の優れた抵抗性は、ＳＰ１−薬物複合体の貯蔵、精製、インビボ寿命および他の使用のために重要である。
【０２４５】
パクリタキセル（タキソール、ＰＴＸ）
臨床使用における１つの共通する問題が、多くの薬物の不良な溶解性である。Ｄｇａｎｙ他（Ｄｇａｎｙ、２００４）によって示されるように、ＳＰ１についてのＸ線結晶学データから、Ｈ１およびＨ２のらせんが、数多くの親水性側鎖および酸性側鎖が溶媒の方を向く外側の凸側表面を規定することが予測される。この表面の内側および向き合うβ−シートが、芳香族残基および疎水性残基が多い疎水性の中心の空洞を取り囲む。これにより、小さい疎水性分子の可溶化が達成されるかどうかを明らかにするために、ＳＰ１をパクリタキセルと複合体化させた。
【０２４６】
ジテルペノイド誘導体のパクリタキセルは幅広い抗新生物活性（卵巣ガン、乳ガン、非小細胞肺ガン、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫）を有し、また、チューブリンから微小管への重合および安定化を促進する特異な作用機構を有する。パクリタキセルを使用することの大きな臨床上の問題の１つが、その極めて大きい疎水性のために、水におけるその溶解性が非常に低いことである。パクリタキセルの溶解性を高めるために、５０：５０のＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（ＣｒＥＬ、ポリオキシエチル化ひまし油）およびエタノールの混合物が現在の臨床配合では使用されるが、重篤な副作用が、治療された患者の２５％〜３０％については伴う。
【０２４７】
これらの問題を回避するために、多大の努力が、高まった循環時間を有する、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒを含まない新しい全身用のパクリタキセル配合物を開発することに向けられている。しかしながら、現在の配合物はどれもこれらの問題を克服していない。
【０２４８】
ＳＰ１複合体の有機溶媒中での安定性を明らかにするために、ＳＰ１およびＣｙｓ２  ＳＰ１変異体（配列番号３）を有機溶媒に溶解し、乾燥し、水性溶媒により再構成し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。図１８は、高分子量のオリゴマー複合体が水性溶媒（リン酸ナトリウム、レーン１およびレーン４）および有機溶媒（レーン２、レーン３、レーン５およびレーン６）の両方において持続することを示す。さらに、ヘキサン処理されたＳＰ１またはＣｙｓ２  ＳＰ１変異体はプロテアーゼ処理に対して抵抗性がある（データ示さず）。
【０２４９】
次に、難溶性のＰＴＸを、凍結乾燥されたＳＰ１と、還元剤の存在下、有機溶媒中で混合した。有機溶媒をエバポレーションした後、ＰＴＸ−ＳＰ１複合体を水性溶媒における溶解性について調べた。図１９には、遊離ＰＴＸ（ＤＭＳＯ中）および複合体化されていないＳＰ１と比較したとき、ＳＰ１−ＰＴＸの高まった溶解性のＲＰ  ＨＰＬＣ分析が示される。このＨＰＬＣ結果は水におけるＰＴＸの難溶性（マゼンタ色）を強調しており、ＳＰ１−ＰＴＸ複合体（赤色）がＳＰ１およびＰＴＸのピークとして（それぞれ、１５．８分および１７．４分で）現れている。ＳＰ１−ＰＴＸ複合体の（３０ｋＤａの分子量カットオフメンブランによる）限外ろ過は、複合体化したＰＴＸがメンブランの上に保持されることを示す。これはＳＰ１との強い複合体化を示している。
【０２５０】
ＰＴＸは特有の吸収スペクトルを有しておらず、結合したＰＴＸを検出することができない。ＰＴＸは、高いアセトニトリル濃度の存在下でＳＰ１−ＰＴＸ複合体から解離し、従って、遊離ＰＴＸと同じ溶出において検出することができる。すべてのＰＴＸがカラム上のＳＰ１−ＰＴＸ複合体から溶出されることを明らかにするために、ＰＴＸを、８０％エタノールを使用して複合体から抽出し（図２０）、ＳＰ１タンパク質を沈殿させた。図２０は、すべてのＰＴＸが、（類似する条件のもとで沈殿するＳＰ１−ＤＯＸ複合体とは対照的に）溶液中に回収され得ることを示す。より低いエタノール濃度において、ＰＴＸと同様に抽出することができ、これから、複合体化したＳＰ１−ＰＴＸおよび遊離ＰＴＸの限外ろ過による分離が可能である（図２０および図２１、下段のプロット）。
【０２５１】
難溶性分子とのＣｙｓ２  ＳＰ１変異体の複合体形成の効力、および、ＰＴＸ−Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体複合体の形成に対する還元状態の影響を明らかにするために、ＰＴＸを、エタノールの増大する濃度において、１０ｍＭのＧＳＨの存在下または非存在下でＣｙｓ２  ＳＰ１変異体−ＰＴＸ複合体から抽出した。図２１は、還元剤がＰＴＸ抽出をより低いエタノール濃度で誘導することを示す。複合体形成に対する還元の影響もまた調べた。図２２は、還元剤β−ＭＥ（１２ｍＭ）の存在はＣｙｓ２  ＳＰ１−ＰＴＸ複合体形成を著しく高めることを示す。予想外ではあったが、Ｃｙｓ２  ＳＰ１と会合したＰＴＸが還元剤の非存在下で検出されるが、そのような会合したＰＴＸはろ過によって除かれた。
【０２５２】
これらの結果から、ＳＰ１およびＳＰ１変異体が、水性溶媒だけでなく、有機溶媒において、安定なオリゴマー複合体を形成すること、また、ＳＰ１およびＳＰ１変異体は難溶性分子との複合体を形成することができること、また、難溶性分子（例えば、ＰＴＸなど）の溶解性がＳＰ１およびＳＰ１変異体との会合によって著しく高められることが明瞭に示される。ＳＰ１のそのような可溶化能は、ＳＰ１およびＳＰ１変異体の臨床的適用および他の適用のために、例えば、薬物送達のために非常に重要である。
【０２５３】
ビンブラスチン
ビンブラスチンはビンカアルカロイドであり、ホジキン病、リンパ性リンパ腫、組織球性リンパ腫、進行性精巣ガン、進行性乳ガン、カポジ肉腫を治療するために主に有用である。ＳＰ１に対するビンブラスチンの結合を内因性トリプトファンの蛍光測定によって求めた。
【０２５４】
ＳＰ１は１個のトリプトファン残基（Ｔｒｐ４８）を有するだけである。Ｔｒｐ４８の最大励起波長および最大放射波長はそれぞれ、２８６ｎｍおよび３２１ｎｍである。６ＭのグアニジニウムＨＣｌにおけるタンパク質のアンフォールディングのとき、最大放射波長が３２１ｎｍから３４０ｎｍに変化する。図２３は、ビンブラスチンとのＳＰ１の会合が、赤方移動が付随した蛍光の消光を引き起こしたことを示す（８０μＭのビンブラスチンを加えたとき、その最大放射波長が３５６ｎｍに変化する）。アンフォールディングされた変性タンパク質の蛍光はまた、ビンブラスチンによっても消光され（図２３）、しかし、天然タンパク質とは異なり、それには、赤方移動が付随しない。従って、折り畳まれたＳＰ１−ビンブラスチンの会合をその内因性トリプトファンの蛍光における変化によって検出および定量することができる。
【０２５５】
（実施例５）
ＳＰ１会合薬物の高まった生物学的活性
薬物送達剤または薬物送達キャリアとしてのＳＰ１の効力を評価するために、ＳＰ１およびＳＰ１変異体と複合体化された薬物分子の生物学的活性を求めた。従って、ＳＰ１と複合体化された薬物分子およびマーカー分子を新生物成長のインビトロモデルおよび動物モデルにおいて調べた。
【０２５６】
結腸直腸ガン細胞株におけるＳＰ１−ＤＯＸ
ヒト結腸直腸腺ガン細胞株のＨＴ−２９を使用して、ＳＰ１−ＤＯＸ複合体の生物学的活性を、遊離薬物および複合体化されていないＳＰ１タンパク質の生物学的活性と比較して評価した。遊離ドキソルビシンおよびＳＰ１−ＤＯＸ複合体（これは限外ろ過またはエタノール沈殿のいずれかによって調製された）についての５０％阻害濃度（ＩＣ５０）（これは、細胞成長の５０％を阻害した化合物の用量として定義される）は類似しており（図２４ａ、０．６ｕｇ／ｍｌ）、一方、複合体化されていないタンパク質は不活性であった。従って、ＳＰ１−ＤＯＸ複合体は、遊離ＤＯＸと少なくとも同じくらいに生物学的に活性がある。
【０２５７】
遊離ＰＴＸ（ＤＭＳＯ中）およびＳＰ１−ＰＴＸ複合体についてのＩＣ５０値を比較したとき、両方の調製物についての値は類似しており（０．０１ｕｇ／ｍｌ、図２５）、一方、負荷されていないタンパク質（これはＰＴＸ−ＳＰ１と並行して調製された）は不活性であった（図２５）。しかしながら、ＳＰ１−ＰＴＸ複合体は、水溶液における少なくとも３週間の貯蔵（すなわち、遊離ＰＴＸが不活性になる条件）の後でさえ、生物学的に活性のままであった。従って、ＳＰ１とのＰＴＸの複合体化は、薬物の生物学的活性の安定性を明らかに増大させる。
【０２５８】
ＳＰ１−ＰＴＸの細胞毒性がＳＰ１の膜横断輸送に関連するかどうかを明らかにするために、細胞を、１０倍過剰な複合体化されていないＳＰ１とともに、遊離ＰＴＸおよびＳＰ１複合体化ＰＴＸの両方にさらした。競合がいずれの場合においても何ら認められなかった（データ示さず）。１つだけの仮定によって限定されることは望まないが、競合がないことから、細胞によるＳＰ１−薬物複合体の取り込みが非常に速いこと、または、薬物が細胞外で複合体から解離し、その細胞毒性作用を複合体化されていない様式で発揮することのいずれかが示され得ることが強調される。後者の説明には、高い細胞外ＧＳＨ濃度、これにより、そのすぐ後に続く細胞環境のレドックス状態が影響を受けることが関連し得る。
【０２５９】
インビボにおけるＳＰ１の生体分布
投与されたＳＰ１複合体化分子の循環からの腫瘍での蓄積速度およびクリアランスを追跡するために、フルオレセインおよびＳＰ１−フルオレセイン複合体を、Ｂ１６−Ｆ１０（Ｂ１６）メラノーマ腫瘍を有するＣ５７Ｂ１のオスのマウスに注射した。ＳＰ１−フルオレセインの注射後２４時間で、マウスから採血し、動物を屠殺し、腫瘍を取り出し、緩衝液中で均質化し、組織抽出物を熱処理して、非特異的なタンパク質を除いた。標的組織におけるＳＰ１−ＦＡ複合体の蓄積を検出するために、サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、および、抗ＳＰ１抗体による免疫ブロット検出に供した。図２６は、注射されたＳＰ１複合体の約２％〜５％が腫瘍に見出され、注射されたＳＰ１複合体の約３％〜１５％が注射後２４時間で循環に留まったままであり、一方、遊離フルオレセインアミンは迅速に排出されることを示す。
【０２６０】
野生型マウスへのＳＰ１の反復した注射を、ＳＰ１が何らかの著しい免疫学的応答または毒性を誘導しないことを明らかにするために行った。３５ｍｇ／ＫｇのＳＰ１またはＰＢＳコントロールを、Ｃ５７Ｂ１のオスのマウスに、０日目、９日目、１６日目、２３日目、３７日目および５３日目にｉｖ（尾静脈）注射した（ＳＰ１群およびＰＢＳ群においてそれぞれ、６匹および５匹の動物）。最初の注射の後の５５日で、動物を屠殺し、その肝臓を組織病理学分析に供した。６匹中４匹のＳＰ１処置動物は、５５日まで実験中を通して何らかの病理学的応答を示さなかった。組織病理学分析では、両群からのすべての動物の肝臓が正常そうであったことが明らかにされた。６匹中２匹の動物が原因不明で１７日後に死亡した。５匹中５匹のＰＢＳ処置動物もまた、実験期間中を通して病理学的応答を何ら示さなかった。肝臓の組織学的検査では、病変の何らかの徴候は示されなかった。
【０２６１】
ＳＰ１の免疫原性の程度を明らかにするために、ＰＢＳ処置動物およびＳＰ１処置動物の両方における抗ＳＰ１抗体の産生を、直接に免疫化されたＳＰ１抗体またはウサギ抗ＳＰ１抗体のいずれかを使用して、ＥＬＩＳＡを使用して検出した（二次抗体はＨＲＰコンジュゲート化抗マウスＩｇＧであった）。ＰＢＳ処置動物およびＳＰ１処置動物の両方から得られた血清は無視できるほどの抗ＳＰ１抗体反応を有し、これら２つの群の間には差がなかった。ウサギ抗ＳＰ１は、たとえ動物がＳＰ１複合体に対して免疫化されたとしても、ＳＰ１オリゴマー複合体よりも著しく良好にモノマーと反応することに留意しなければならない。
【０２６２】
従って、これらの結果から、ＳＰ１の生体分布がキャリア適用および薬物送達適用のために極めて良く適すること、ならびに、インビボにおけるＳＰ１タンパク質の驚くほど非毒性および非免疫原性の性質が明瞭に示される。
【０２６３】
ＳＰ１−薬物複合体のインビボ抗腫瘍活性
ＤＯＸの抗腫瘍活性に対するＳＰ１複合体化の影響を、ＣＤ１ヌードマウスにおけるＬＳ１４７（ヒト結腸ガン）モデル（Ｍｅｙｅｒ、１９９５）を使用してインビボで明らかにした。ＳＰ１−ＤＯＸ複合体または遊離ＤＯＸ（それぞれ、０．５ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇのＤＯＸ、１週間に２回の尾静脈へのｉｖ）を受けている動物の腫瘍成長速度を比較した（図２７ａおよび図２７ｂ）。遊離ＤＯＸのこの用量（３ｍｇ／Ｋｇ）はマウスにおける最大耐量に匹敵する。腫瘍移植後３５日で、動物を屠殺し、腫瘍を取り出し、その重量を記録した（図２７ａおよび図２７ｂ）。体重減少はＤＯＸの共通する副作用であるので、動物の体重もまた測定した（図２８ａおよび図２８ｂ）。
【０２６４】
遊離ＤＯＸの用量はＳＰ１−ＤＯＸ複合体の用量よりも６倍大きかったが、ＳＰ１−ＤＯＸ複合体による腫瘍成長の阻害が、遊離ＤＯＸよりも６倍低い濃度でさえ、比較可能なほどに著しかった。両方の場合において、実験終了時での平均腫瘍サイズはＰＢＳ処置動物での場合よりもはるかに小さかった。そのうえ、腫瘍の組織学的検査では、広範囲の壊死が、ＤＯＸにより処置された動物およびＳＰ１−ＤＯＸ複合体により処置された動物において示された。
【０２６５】
しかしながら、ＤＯＸにより処置された動物は、１６％を超える体重減少において現れた重篤な副作用に悩まされた。驚くべきことに、ＳＰ１−ＤＯＸ複合体により処置された動物は体重減少を何ら示さなかった。
【０２６６】
従って、本明細書中上記においてもたらされた結果から、薬物をＳＰ１と複合体化することにより、薬物の有効性の様々な重要な側面（例えば、溶液における溶解性および安定性など）が高められ、また、投薬量および望ましくない副作用における軽減が、有効性を同時に低下させることなく可能であり得ることが明瞭に示される。
【０２６７】
（実施例６）
遊離分子およびＳＰ１複合体化分子のＲＰ−ＨＰＬＣおよびサイズ排除ＨＰＬＣのプロフィル
逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣおよびサイズ排除ＨＰＬＣを、ＳＰ１およびＳＰ１変異体と複合体化している分子（例えば、ＤＯＸ、ＰＸＴおよびＦＡなど）を検出および定量するために使用した。
【０２６８】
サイズ排除クロマトグラフィーは、異なるサイズの分子を穏和な条件のもとで分離するための一般的な方法であり、ＳＰ１と複合体化しているＦＡおよびＤＯＸを穏和な条件のもとで調べるために用いた。ＳＰ１が７分後にカラムから溶出され、２７８ｎｍにおいて検出されるだけであり（図３０）、遊離ＦＡが１６分後にカラムから溶出され、４９０ｎｍにおいて検出される（図３１）。ＳＰ１−ＦＡ複合体およびＳＰ１−ＤＯＸ複合体もまた、同じ時間で溶出されたが、４９０ｎｍおよび４７５ｎｍにおいてそれぞれ検出された（図２９および図３１）。図３２は、２７８ｎｍにおけるサイズ排除クロマトグラフィーでの典型的なＳＰ１標準曲線を示す。ＳＰ１が７分後にカラム（ＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ、Ｔｏｓｏｈａａｓ）から溶出され、２７８ｎｍにおいて検出されるだけである。図３１は、４９０ｎｍにおけるＦＡ標準物プロフィルのサイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。区別可能なピークでカラムから溶出される遊離ＦＡとは対照的に、ＤＯＸは区別可能なピークで溶出されない（図２９）。ＤＯＸの標準曲線は吸収ピークを４７７ｎｍにおいて示すが、これは実際には検出に利用できない。ＤＯＸ／ＳＰ１の比率を溶液におけるそれらの標準曲線から求めることができる。
【０２６９】
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析でもまた、遊離リガンドおよびＳＰ１が分離される（図１０、図１１、図１３を参照のこと）。この方法を使用して、ドキソルビシンおよび水不溶性薬物のパクリタキセル（ＰＴＸ）の複合体化を調べた。この場合、両方の複合体化された化合物が樹脂（Ｃ−１８）に結合し、異なるアセトニトリル濃度で溶出された。図３２は、（２７８ｎｍおよび２２５ｎｍの両方で測定された）Ｃｙｓ２  ＳＰ１の標準物プロフィルを示す。図３３は、（４７７ｎｍで測定された）ＤＯＸの標準物プロフィルを示す。図３４は、（２２５ｎｍで測定された）ＰＴＸの標準物プロフィルを示す。
【０２７０】
サイズ排除クロマトグラフィーを使用する結果と類似して、ＳＰ１−ＤＯＸ複合体もまた、負荷されていないＳＰ１と同じ時間で溶出され、２７８ｎｍだけでなく、４７７ｎｍでもまた検出される。複合体化していないＳＰ１はこの波長で光を吸収しないので、ＳＰ１結合ＤＯＸならびに遊離ＤＯＸの定量を４７７ｎｍでのそれらのピークにおける吸光度から直接に計算することができる。２７８ｎｍでのＳＰ１−ＤＯＸのピークにおけるタンパク質の量の推定は、下記の式に従って、２７８ｎｍでのＤＯＸの吸収について補正することができる：（ＯＤ２７８−０．７７＊ＯＤ４７７）。ＦＡおよびＤＯＸとは対照的に、ＰＴＸは特有の吸収特性を示さず、複合体化したＰＴＸを検出することができない。明らかに、ＰＴＸは高いアセトニトリル濃度の存在下でＳＰ１−ＰＴＸ複合体から解離し、従って、遊離ＰＴＸと同じ溶出において検出することができる。
【０２７１】
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０２７２】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許および特許願はすべて、個々の刊行物、特許および特許願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用又は確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０２７３】
【図１】ＳＰ１オリゴマーの陰染色された２Ｄ結晶の電子顕微鏡写真、および、その２Ｄ結晶性構造のグラフィック表示である。
【図２】ＮＴＡ−Ｎｉ金ナノ粒子が中心の空洞において６Ｈタグに結合することを示す組換えＳＰ１：６ＨＳＰ１の電子顕微鏡写真である。
【図３】２つのＳＰ１変異体がヘテロオリゴマーのＳＰ１複合体に自己集合することを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図４】腫瘍特異的ペプチドのＣＲＧＤおよびＲＧＤＣのＳＰ１表面での多重呈示を示す。
【図５】組換え変異体ＳＰ１の発現、精製およびリフォールディングを示すＰＡＧＥ分析の写真である。
【図６】イオン交換クロマトグラフィー（図６ａ）および疎水性相互作用クロマトグラフィー（図６ｂ）の両方を使用する、組換え細胞の粗製の耐熱性抽出物の組換えＳＰ１の精製を示す。図６ｃは、Ｓｏｕｒｃｅ−Ｑ疎水性相互作用カラムでの分離の精製された生成物と比較したときの、粗製の組換え細胞抽出物（レーン１）および耐熱性画分（レーン２）のＰＡＧＥ分析である。
【図７】ゲルろ過ＨＰＬＣ（ＴＳＫ３００カラム）（上段）および逆相ＨＰＬＣ（Ｃ−１８カラム）（下段）の両方で単一ピークとして溶出する純粋なＳＰ１の特徴付けを示す。
【図８】Ｃｙｓ２  ＳＰ１変異体による薬物複合体形成および制御された放出の仮想的なモデルを例示するグラフィック表示である。
【図９】Ｃｙｓ２  ＳＰ１による小分子とのレドックス依存的な複合体形成を示すヒストグラムである。
【図１０】組換えＳＰ１と比較したときの、Ｃｙｓ２  ＳＰ１によるレドックス依存的なフルオレセインアミン複合体形成のグラフィック表示である。
【図１１】Ｃｙｓ２  ＳＰ１によるフルオレセイン−アミンとの濃度依存的な複合体形成を例示するヒストグラムである。
【図１２】Ｃｙｓ２  ＳＰ１によるドキソルビシンとの優れたレドックス依存的な複合体形成を示すヒストグラムである。
【図１３】Ｃｙｓ２  ＳＰ１によるドキソルビシンのドックス依存的な放出を示すヒストグラムである。
【図１４】Ｃｙｓ２  ＳＰ１によるＤＯＸ複合体形成に対する酸化の影響を例示するヒストグラムである。
【図１５】ＳＰ１−ＤＯＸ複合体を特徴付けるＳＤＳ  ＰＡＧＥ蛍光分析の写真である。
【図１６】熱、還元および血清にさらされたときのＤＯＸ−ＳＰ１複合体の安定性を例示する蛍光ＰＡＧＥ分析の写真である。
【図１７】Ｃｙｓ２タンパク質およびＳＰ１融合タンパク質によるＤＯＸとの効果的な複合体形成を例示する蛍光ＰＡＧＥ分析の写真である。
【図１８】有機溶媒に対するＳＰ１の高分子量オリゴマー複合体の抵抗性を示す写真である。
【図１９】ＳＰ１との複合体によるパクリタキセル（ＰＴＸ）の可溶化を示すＨＰＬＣ分析である。
【図２０】ＳＰ１−ＰＴＸ複合体からのＰＴＸの効率的なエタノール抽出を示すＨＰＬＣ分析である。
【図２１】ＰＴＸ抽出に対する還元状態の影響を示すＨＰＬＣ分析である。
【図２２】ＳＰ１によるＰＴＸ結合に対する還元状態の影響を示すＨＰＬＣ分析である。
【図２３】ＳＰ１に対する薬物（ビンブラスチン）の複合体形成を示すグラフである。
【図２４】ＳＰ１−ＤＯＸ複合体のインビボトロ細胞毒性効果を例示するグラフである。
【図２５】遊離ＰＴＸと比較して、ＳＰ１−ＰＴＸ複合体のインビトロ細胞毒性を示すグラフである。
【図２６】ＳＰ１複合体の優れた薬力学および標的化を例示する免疫ブロット分析である。
【図２７】非複合体化ＤＯＸと比較して、ＳＰ１複合体化ＤＯＸの優れた抗腫瘍効果を示すヒストグラムである。
【図２８】遊離ＤＯＸと比較して、ＳＰ１複合体化ＤＯＸの処置による副作用の著しい減少を示すヒストグラムである。
【図２９】サイズ排除ＨＰＬＣ分析によるＳＰ１−ＤＯＸ複合体の検出を示すグラフである。
【図３０】２７８ｎｍにおけるサイズ排除クロマトグラフィー（サイズ排除ＨＰＬＣ）での典型的なＳＰ１標準曲線を示す。
【図３１】４９０ｎｍでのＦＡ標準物プロフィルのサイズ排除クロマトグラフィー（サイズ排除ＨＰＬＣ）のクロマトグラムを示す。
【図３２】ＲＰ−ＨＰＬＣでの（２７８ｎｍ（左側パネル）および２２５ｎｍ（右側パネル）の両方で求められる）Ｃｙｓ２  ＳＰ１の標準物プロフィルを示す。
【図３３】ＲＰ−ＨＰＬＣでの（４７７ｎｍで求められる）ＤＯＸの標準物プロフィルを示す。
【図３４】ＲＰ−ＨＰＬＣでの（２２５ｎｍで求められる）ＰＴＸの標準物プロフィルを示す。
【配列表フリーテキスト】
【０２７４】
配列番号２〜３０は、Ｓｐ１突然変異体の変異体の配列である。
配列番号３１〜６２は、腫瘍表面特異的ペプチドの配列である。
配列番号６３〜８１は、腫瘍脈管ペプチドの配列である。
配列番号８２〜１２１は、ファージディスプレー（ＰＤ）及び細胞表面ディスプレー（ＳＣＤ）によって選択された無機結合ポリペプチドの配列である。
配列番号１２２は、６ＸＨｉｓタグの配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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