(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離したクロノジェニック成人歯髄幹細胞の培養物であって、該幹細胞が脂肪細胞分化性（adipogenic）でなく、象牙芽細胞に分化し得る、該培養物。
【請求項２】
幹細胞がイン・ビボ（in vivo)において象牙質／歯髄構造を再生し得る請求項１記載の培養物。
【請求項３】
細胞が骨シアロタンパク質を産生しない請求項１記載の培養物。
【請求項４】
請求項１記載の培養物をヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウムと混合することにより得られる細胞であって、哺乳動物に移植することによりヒト象牙質／歯髄組織を再生するための細胞。
【請求項５】
請求項１記載の培養物をヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウムと混合することにより得られる細胞であって、哺乳動物に移植することによりヒト象牙質／歯髄組織を作り出すための細胞。
【請求項６】
ヒト歯髄をＩ型コラゲナーゼおよびディスパーゼ中で消化して、単一細胞懸濁液を形成させ；
単一細胞懸濁液を、子ウシ胎児血清を補充したイーグル培地の修飾物中で培養してコロニーを形成させ；ついで
コロニーを単離し、それによって単離されたヒト歯髄幹細胞を作り出す
ことを含む方法によって作り出した単離された成人歯髄幹細胞であって、
ここに該成人歯髄幹細胞が請求項１に記載された成人歯髄幹細胞である、該単離された成人歯髄幹細胞。
【請求項７】
請求項１に記載の培養物をヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウムと混合することにより得られる細胞であって、哺乳動物に移植することによりヒト象牙質様構造を再生するための細胞。
【請求項８】
ヒト歯髄を３ｍｇ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼおよび４ｍｇ／ｍｌのディスパーゼを含む溶液中、３７℃にて１時間消化して、単一細胞懸濁液を形成させ；
単一細胞懸濁液を、２０％子ウシ胎児血清を補充したイーグル培地の修飾物中で培養してコロニーを形成させ；ついで
コロニーを単離し、それによって単離されたヒト歯髄幹細胞を作り出す
方法によって作り出した単離された成人歯髄幹細胞であって、
ここに該成人歯髄幹細胞が請求項１に記載された成人歯髄幹細胞である、該単離された成人歯髄幹細胞。
【請求項９】
単離された成人歯髄幹細胞を調製する方法であって、
（１）ヒト歯髄を３ｍｇ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼおよび４ｍｇ／ｍｌのディスパーゼを含む溶液中、３７℃にて１時間消化して、単一細胞懸濁液を形成させ；
（２）単一細胞懸濁液を、２０％子ウシ胎児血清を補充したイーグル培地の修飾物中で培養してコロニーを形成させ；ついで
（３）コロニーを単離し、それによって単離されたヒト歯髄幹細胞を作り出す
工程を含み、ここに該成人歯髄幹細胞が請求項１に記載された成人歯髄幹細胞である、該方法。
【請求項１０】
歯髄幹細胞とヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウムとを８ｍｇ／１０６細胞の割合で混合し、ついでそれを哺乳動物に６週間移植することによって得られる細胞であって、ヒト象牙質様構造を再生するための細胞であって、ここに該歯髄幹細胞が請求項１に記載された成人歯髄幹細胞である、該細胞。
【請求項１１】
ヒト象牙質様組織を再生することにおいて使用するための、鉱物供給源と混合した請求項１記載の培養物の細胞を含む組成物。
【請求項１２】
鉱物供給源がヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウムである請求項１１記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野
本発明は、ヒトにおける修復歯科学の分野に関する。詳細には、本発明は、象牙質／歯髄に分化し得る細胞の集団および象牙質／歯髄を再生する方法に関する。
【０００２】発明の背景
歯の形成の間には、上皮と歯乳頭細胞との間の相互作用が、間葉細胞の特定の集団の後に原生象牙質を形成する象牙芽細胞への分化を刺激することによって歯の形態形成を促進する。形態学的に、象牙芽細胞は、象牙質の外側端部に整列した偏心的な核および長い細胞突起を有する円柱状の一方向に並んだ細胞である（１）。歯の萌出後に、一般的な機械的腐食または破壊に応答し、かつ細菌によって引起こされる歯の分解を介して、象牙芽細胞によって第二象牙質が形成される（２）。この象牙芽細胞は、歯髄組織の何処かに存在する前駆体集団の増殖および分化から発生すると考えられている（３）。歯の発生および種々の分化した歯に関連する細胞型の膨大な知見にもかかわらず、出生後の生物におけるそれらの各々前駆細胞集団の特徴および性質に関してはほとんど知られていない。
【０００３】  出生後の生物における歯科修復は、歯髄組織と関連する未だ明確になっていない前駆集団によって維持されると考えられている分化した細胞、すなわち象牙芽細胞の活性を介して生じる（１）。現在までに、成人の歯髄組織からの歯牙発生前駆細胞の同定および単離はいまだ行われていない。ある条件下では、初期発生歯根組織および歯髄組織に由来する歯髄細胞の培養物が、イン・ビトロ（in vitro)で石灰化小節を形成する能力を有する象牙芽細胞様の外観を発生させ得ることが知られており（４）、この特性は通常、骨または骨髄細胞の培養物のものである（５、６）。多分化能骨髄ストローマ細胞（ＢＭＳＣ）およびその骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨髄支持性繊維ストローマ（myelosupportive fibrous-stroma）およびおそらくは筋肉および神経組織にさえも発達する能力についてはよく知られている（７−１２）。それらは、多様なストローマ細胞系統に分化するそれらの能力を維持しつつ、エクス・ビボ（ex vivo)におけるそれらの高い増殖能力によって特徴付けられる。
【０００４】  象牙質／歯髄組織を再生するためまたは修復目的でヒトの歯を作り出すための先行技術は提供されていないため、機能的な歯に分化し得る組織を作り出す手段を見出すことの要望がおおいにある。本実験においては、成人歯髄からの細胞のクロノジェニック（clonogenic；コロニー形成能を有する）で、迅速に増殖性の集団を単離した。ついで、この歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）を、骨芽細胞の知られている前駆体であるヒト骨髄ストローマ細胞（ＢＭＳＣ）と比較した。それらはイン・ビトロ（in vitro)では同様の免疫表現型を共有するが、機能実験では、ＤＰＳＣが散発性であるが密に石灰化した小節しか生成せずに脂肪細胞を形成しないのに対して、ＢＭＳＣは脂質を載せた脂肪細胞の集団で接着細胞層全体を日常的に石灰化することが示された。ＤＰＳＣを免疫無防備マウスに移植すると、それは歯髄様間質組織を取囲む、ヒト象牙芽細胞様細胞と並んだ象牙質様構造を生成した。それに対して、ＢＭＳＣは、活性造血を有する繊維性脈管系組織（fibrous vascular tissue）および脂肪細胞を取囲む、骨細胞および表面に並んだ骨芽細胞を含む層状骨を形成した。本実験は、象牙質／歯髄複合体を形成する能力を有する出生後ヒト歯髄幹細胞を最初に単離した実験である。
【０００５】  本発明は、象牙質／歯髄組織に分化し得る成人歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）ならびに象牙質／歯髄を再生する方法およびヒト歯を作り出す方法を提供することによって当該技術分野における以前の限界および短所を克服する。
【０００６】発明の概要
本発明は、単離した成人歯髄幹細胞の培養物を提供する。
また、本発明は、ａ）単離した成人歯髄幹細胞の培養物からの細胞とヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウムとを接触させ、ついでｂ）工程ａ）からの細胞を哺乳動物に移植することを含むヒト象牙質／歯髄組織を再生する方法も提供する。
【０００７】図１Ａ−１Ｅ。イン・ビトロにおけるコロニー形成効率および細胞増殖性。１４日後の代表的な高（Ａ）および低（Ｂ）密度コロニー。形態は繊維芽細胞様細胞の典型である（Ｃ）。種々の平板密度における歯髄組織および骨髄からのコロニー形成細胞の発生率は、骨髄よりも歯髄により多くのクロノジェニック細胞が存在することを示している（Ｄ）。ＢｒｄＵ陽性細胞の数は、ＤＰＳＣおよびＢＭＳＣについて計数した細胞の合計数のパーセントとして表した（Ｅ）。統計学的有意性（＊）は、スチュデントｔ検定（ｐ＞０．０５）を用いて判定した。
【０００８】図２Ａ−２Ｌ。培養したＤＰＳＣの免疫表現型。免疫ペルオキシダーゼ反応性に基づく実験は、ＤＰＳＣの第一継代培養物に対して行った。代表的な染色パターンを：インテグリンβ１、（Ａ）；ＣＤ４４、（Ｂ）；Ｉ型コラーゲン、（Ｃ）；ＩＩＩ型コラーゲン、（Ｄ）；ＦＧＦ−２、（Ｅ）；オステオネクチン、（Ｆ）；オステオカルシン、（Ｇ）；ＭＵＣ−１８、（Ｈ）；α−平滑筋アクチン、（Ｉ）；オステオポンチン、（Ｊ）；ＶＣＡＭ−１、（Ｋ）について示す。内因性のアルカリホスファターゼ活性を（Ｌ）に示す。
【０００９】図３Ａ−３Ｄ。イン・ビトロにおける発生能力。培養したＤＰＳＣ（ＡおよびＢ）ならびにＢＭＳＣ（ＣおよびＤ）の接着層を、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸およびデキサメタゾンとともに無機リン酸で誘導した６週間後のカルシウム蓄積の尺度としてアリザリンレッド染色で示す（ＡおよびＣ）。無機リン酸を含まない以外は同一の培地における６週間後では、ＢＭＳＣ（Ｄ）では脂質蓄積が記録されたが、ＤＰＳＣ（Ｂ）では記録されなかった。
【００１０】図４Ａ−４Ｆ。イン・ビボにおける発生能力。断面図は、移植６週間後のヘマトキシリンおよびエオシンで染色したＤＰＳＣ移植片（Ａ、Ｃ、Ｄ）およびＢＭＳＣ移植片（Ｂ、Ｅ、Ｆ）の標本である。ＤＰＳＣ移植片においては、ＨＡ／ＴＣＰ担体表面（ｃ）が象牙質様マトリックス（ｄ）と並んでおり、血管（ｂｖ）および象牙芽細胞様細胞（ｏｄ）の界面層で歯髄様組織を取囲んでいる（Ａ）。象牙質マトリックス（ｄ）の拡大写真では、象牙芽細胞様層（ｏｄ）および象牙芽細胞突起（矢印）を強調している（Ｃ）。偏光下では、形成している表面に対するコラーゲン繊維の垂直の整列（破線）が示された（Ｄ）。ＢＭＳＣ移植片においては、層状骨（ｂ）がＨＡ／ＴＣＰ表面（ｃ）上に形成され、蓄積した脂肪細胞（ａ）で脈管系、造血骨髄器官（ｈｐ）を取囲んでいる（Ｂ）。拡大写真では、新しい骨が石灰化したマトリクス内に埋め込まれた骨細胞（ｏｃ）および骨表面に並んだ骨芽細胞（ｏｂ）を含むことが示されている（Ｅ）。偏光下では、コラーゲンフィブリルが形成している表面と平行に沈澱していることが示されている（破線）（Ｆ）。
【００１１】図５Ａ−５Ｂ。ヒト特異的ａｌｕ  ＤＮＡ配列に対するイン・サイチュ・ハイブリダイゼーション。歯髄組織中（大きな矢印）、および象牙質マトリックス（ｄ）に近接する象牙芽細胞様層中（小さい矢印）のＡｌｕ陽性細胞は、６週のＤＰＳＣ移植片において簡単に認められる（Ａ）。新たな骨マトリックス中に包まれた骨細胞（小さな矢印）および骨（ｂ）の表面に並んだ骨芽細胞（大きな矢印）は、ＢＭＳＣ移植片においてａｌｕプローブと陽性反応性を示している（Ｂ）。骨髄様器官中の造血要素（ｈｐ）はａｌｕプローブと反応性を示していない。
【００１２】図６Ａ−６Ｃ。ＤＰＳＣ移植片におけるヒト特異的象牙質シアロホスホタンパク質（Dentin Sialophosphoprotein）（ＤＳＰＰ）、オステオカルシン（ＯＣ）、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）のｍＲＮＡの発現。ＤＳＰＰ、ＢＳＰ、ＯＣおよびＧＡＰＤＨについての転写物を、６週齢のＤＳＰＣ移植片から単離した全ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲによって検出した（Ａ）。ＤＳＰＰ陽性細胞は、イン・サイチュ・ハイブリダイゼーションによって歯髄組織、および象牙質マトリックス（ｄ）に近接する象牙芽細胞層（矢印）にも見出された。プローブの特異性は、ヒト歯髄（ｐ）組織の象牙芽細胞層（矢印）におけるハイブリダイゼーションによって確認した（Ｃ）。ＤＳＰＰ特異的プローブの反応性は、ヒトの骨、骨髄および筋肉組織において検出されなかった。
【００１３】図７Ａ−７Ｄ。ヒトＤＳＰＰの免疫組織化学染色。骨および関連する骨髄要素は、ＢＭＳＣ移植片におけるＤＳＰＰ抗体染色に対して陰性であった（Ａ）。新たに形成した象牙質はＤＰＳＣ移植片中のＤＳＰＰ抗体染色に対して陽性であった（矢印、Ｂ）。ヒト歯髄中の通常のヒト象牙質および象牙芽細胞はＤＳＰＰに対して陽性であった（各々、ＣおよびＤ）。
【００１４】図８Ａ−８Ｂ。ＤＳＰＣ移植片における象牙質形成。８週齢ヒトＤＰＳＣ移植片における象牙質（矢印）のトリクローム（青色）染色（Ａ）。通常の歯の横方向の切片は、イン・サイチュの象牙質のトリクローム染色（矢印）を示している（Ｂ）。
【００１５】発明の詳細な説明
原文明細書中で用いる“ａ”、“ａｎ”または”ｔｈｅ”は１以上のものを意味し得る。例えば、“ａ”cellは１以上の細胞を意味し得る。さらに、“ｔｈｅ”cellも１以上の細胞を意味し得る。
【００１６】  本発明は、単離した成人歯髄幹細胞の培養物を提供する。成人歯髄幹細胞はいずれのヒト永久歯からも単離し得る。別法として、本発明の歯髄幹細胞は少なくとも約１８歳のヒト対象からも単離し得る。本明細書中で用いる“単離した”とは、本発明の細胞と一緒に天然に見出される夾雑物または他の細胞型を十分に含まない本発明の細胞を意味する。さらに、本発明の単離した細胞は、試料中に重要な細胞しか存在しないような濃度で存在する。“単離した”とは調製物が技術的に純粋（均一）である必要はないが、臨床的または研究用に使用し得る形態で細胞を提供するために十分に純粋である。
【００１７】  “幹”細胞とは、多分化能のある、クロノジェニックな、非常に増殖性が高く、かつ、組織を再生できる細胞である。したがって、幹細胞は、その微小環境中の他の細胞に影響を及ぼして特定のセルラインに分化させるか、または自身を特定の機能を有するもう１の細胞型に分化させ得るかのいずれかの能力を有する。したがって、本発明の成人歯髄幹細胞は、成人からの歯の歯髄組織から得た細胞である。本発明の幹細胞は、より成熟した機能性の細胞、例えば象牙芽細胞に分化し得る。象牙芽細胞は、血管結合組織歯髄を含みおよび覆い、かつ、完全に形成された歯の外側エナメル層によって覆われた組織である象牙質を作り出す、哺乳動物の口腔中に見出される細胞である。本発明の歯髄幹細胞は、イン・ビボ（in vivo)およびイン・ビトロ（in vitro)で象牙質／歯髄組織構造を作り出すことができる。この構造を図１に例示する。
【００１８】  本発明は脂肪細胞分化性（adipogenic）でない幹細胞を提供する。したがって、本発明のＤＰＳＣは脂肪細胞に分化しない。さらに、本発明の幹細胞は骨シアロタンパク質を産生しない。したがって、本発明の幹細胞は、脂肪細胞に分化することができ、骨シアロタンパク質を産生する細胞である骨髄幹細胞ではない。しかしながら、本発明の幹細胞は、各々、象牙質シアロホスホタンパク質（ＤＳＰＰ）として知られている象牙芽細胞特異的遺伝子によってコードされた象牙芽細胞特異的象牙質シアロタンパク質および象牙質ホスホタンパク質は産生する。
【００１９】  本発明は、ａ）単離した成人ＤＰＳＣの培養物からの細胞と鉱物供給源とを接触させ、ついでｂ）工程ａ）からの細胞を哺乳動物に移植することを含む、ヒト象牙質／歯髄組織を再生する方法を提供する。本発明の方法の幹細胞は、鉱物供給源、例えばヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウムと混合する。ついで、この細胞／鉱物組成物は、当業者に知られている方法によって哺乳動物に移植し得る。幹細胞／鉱物組成物は、免疫無防備哺乳動物、例えばマウスに移植することができ、そこで、移植した組織は、ヒトに移植するために採取し得るヒト象牙質／歯髄組織を作り出すことができる。該哺乳動物はマウス、ヒツジ、ウシ、またはヒトを含む移植実験に使用されかつ当業者に知られているいずれの哺乳動物ともし得る。さらに、幹細胞／鉱物組成物のヒト受容者は、他のヒト歯科患者にさらに移植するために象牙質／歯髄組織を採取し得る中間宿主ともなり得る。別法として、幹細胞／鉱物組成物のヒト受容者は、移植した組織の供与者および受容者の両方ならびに受容者のみとなり得る。
【００２０】  さらに、本発明は、ａ）単離した成人ＤＰＳＣの培養物からの細胞と鉱物供給源とを接触させ、ついでｂ）工程ａ）からの細胞を哺乳動物に移植することを含むヒト象牙質／歯髄組織を作り出す方法を提供する。本発明の幹細胞は、鉱物供給源、例えばヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウムと混合し得る。
【００２１】  当業者であれば、幹細胞／鉱物組成物を、皮下組織および口腔組織を含む哺乳動物の種々の部位に移植し得る。当業者であれば幹細胞／鉱物組成物を歯槽に移植し、それによって、ヒト患者に象牙質／歯髄組織を作り出し得ることは予想される。
【００２２】  さらに、移植した幹細胞／鉱物組成物は、エナメル質を作り出す細胞であるエナメル芽細胞と一緒に移植するかまたはそれとイン・ビトロで接触させて、エナメル質によって覆われた象牙質／歯髄組織を含む完全に形成された機能性の歯を作り出すことができる。同様にして、歯の硬エナメル層を模倣する生体適合性材料から作成した人工歯冠を作成し、それを鋳型として使用し得る。移植した幹細胞／鉱物組成物は人工歯冠の腔に直接的に移植し得、そこで細胞はイン・ビボで象牙質／歯髄組織に分化し得、それによって機能性の歯を形成し得る。
【００２３】  以下の実施例は、本明細書で特許請求する組成物および方法をいかにして製造および評価するかを完全な開示および記載でもって当業者に提供するために記載するものであって、本発明の純粋な例示を意図するものであって本発明者がその発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。数（例えば、量、温度ほか）に関する正確さを完全にする努力はしているが、ある程度の誤差およびふれも考慮すべきである。本発明を以下の実施例により詳細に説明するが、その膨大な修飾および変形が当業者に明らかであろうため、説明目的のみを意図している。
【００２４】
実施例
対象および細胞培養
NIH Office of Human Subjects Researchによって設定された認可ガイドラインで、Dental Clinic of the National Institute of Dental & Craniofacial Researchにおいて成人（１９-２９歳）から通常のヒトの埋伏した第三大臼歯を収集した。歯表面を清掃し、消毒した歯科用裂溝状バーを用いてセメント質−エナメル質接合部のまわりに切断して、髄質を暴露させた。歯冠および歯根から歯髄組織を静かに分離し、ついで、３ｍｇ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼ（Worthington Biochem, Freehold, NJ）および４ｍｇ／ｍｌのディスパーゼ（Boehringer Mannheim, GMBH, Germany）の溶液中、３７℃にて１時間消化した。７０μｍ濾過器（strainer）（Falcon, BD Labware, Franklin Lakes, NJ）に細胞を通すことによって単一細胞懸濁液を得た。正常な成人ボランティア（２０−３５歳）の骨髄吸引物から処理した骨髄細胞は、Poietic Technologies, Gaithersburg, Marylandから購入し、ついで増殖培地で洗浄した。歯髄および骨髄の単一細胞懸濁液（０.０１ないし１×１０５／ウェル）を、２０％子ウシ胎児血清（Equitech-Bio Inc, Kerrville, TX）、１００μＭのＬ−アスコルビン酸  ２−リン酸（WAKO, Tokyo, Japan）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Biofluids Inc, Rockville, MD）を補充したイーグル培地（GIBCO BRL, Grand Island, NY）の修飾物を含む６−ウェルプレート（Costar, Cambridge, MA）に播き、ついで、５％のＣＯ２中、３７℃にてインキュベートした。コロニー形成効率を評価するために、１４日目に培養物を４％のホルマリンで固定し、ついで０.１％のトルイジンブルーで染色した。＞５０細胞の塊をコロニーとしてスコアした。イン・ビトロの石灰化骨マトリックス沈澱物を誘導する条件は以前に報告されている（６）。ＤＰＳＣおよびＢＭＳＣの準融合培養物（第一継代）の増殖率は、Zymed Laboratories BrdU染色キット（Vector Laboratories, Burlingame, CA）を用いて、２４時間のブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取込みによって評価した。
【００２５】免疫組織化学
第一代ＤＰＳＣおよびＢＭＳＣを８−チャンバースライド（２×１０４細胞／ウェル）（NUNC Inc, Naperville, IL）に継代培養した。その細胞を４％のホルマリン中で固定し、ついでZymed広域スペクトル・免疫ペルオキシダーゼキット（Vector Laboratories）を用いて、飽和レベルの一次抗体および対応する対照抗体と反応させた。
【００２６】  用いた抗体は：マウス(IgG)対照 (Caltag, Burlingame, CA)．ウサギ(Ig)対照、TUK4(抗-CD14)、QBEND 10(抗-CD34)、2B11/PD7(抗-CD45)、M318(抗-MyoD)、1A4(抗-α平滑筋アクチン)、2F11(抗-ニューロフィラメント)、(Dako, Carpinteria, CA);H9H11(抗-CD44)、6G10(抗-VCAM-1)(Dr. P. J. Simmons, HCCR, Adelaide, South Australia);CC9(抗-MUC-18)(Dr. S. Gronthos NIDCR/NIH, MD);MAB1343(抗−COLIII)、MAB1959(抗-β1)(Chemicon, Temecula, CA);LF67(抗-COL I)、LF32(抗-OC)、BON-1(抗-ON)、LF100(抗-BSP)、LF123(抗-OP)(Dr. L. Fisher, NIDCR/NIH, MD);MAB 1104(抗-COL II)(RDI, Flanders, NJ);E-8(抗-PPARγ)、147(抗-FGF-2)、(Santa Cruz, Santa Cruz, CA)であった。ウサギ血清(1/500)、モノクローナル上清(1/4)および精製抗体 (10 μg/ml)の作業希釈物を用いた。
【００２７】免疫組織化学
第二代ＤＰＳＣおよびＢＭＳＣ培養物をＰＢＳ中で洗浄し、ついで４％のホルマリンを用いて固定した。アルカリホスファターゼ活性をSigma in vitro アルカリホスファターゼ基質キット（８５Ｌ-２）を用いて評価した。カルシウム沈澱は２％のアリザリンレッドＳ（ｐＨ４．２）で処理することによって検出した。
【００２８】移植
ほぼ５.０×１０６のＤＰＳＣおよびＢＭＳＣ（第三継代）を４０ｍｇのヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウム（ＨＡ／ＴＣＰ）セラミック粉末（Zimmer Inc, Warsaw, IN）と混合し、ついで以前に記載されているごとく（９）、１０週齢の免疫無防備ベージュマウス（NIH-bg-nu-xid、Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN）の背面に皮下移植した。これらの手法は、認可された小動物プロトコールの規定（NIDCR#97-024）に準じて行った。移植片を移植６週間後に回収し、４％のホルマリンで固定し、緩衝化した１０％のＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）で脱灰させ、ついでパラフィンに包埋した。切片（５ｍ）を脱パラフィンし、Ｈ＆Ｅで染色した。
【００２９】ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡは、ＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０（TEL-TEST Inc. Friendswood, TX）を用いて、６週齢のＤＰＳＣ移植片のコラゲナーゼ／ディスパーゼ消化細胞懸濁液から調製した。第一鎖ｃＤＮＡ合成は、オリゴ−ｄＴプライマーを用いて第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（GIBCO BRL, Life Technologies）を用いて行った。第一鎖ｃＤＮＡ（２μｌ）を１×ＰＣＲ反応緩衝液：１.５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．２単位のAmpliTaq DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer Inc, Norwalk, CT）ならびに１０ピコモルの各ヒト特異的プライマーセット：ＢＳＰ（センス（配列番号：１）
【００３０】
【化１】
0005645338.tif 000002
【００３１】Ｓ(アンチセンス（配列番号：２）
【００３２】
【化２】
0005645338.tif 000003
【００３３】ＯＣ（センス（配列番号：３）
【００３４】
【化３】
0005645338.tif 000004
【００３５】アンチセンス（配列番号：４）
【００３６】
【化４】
0005645338.tif 000005
【００３７】ＤＳＰＰ（センス（配列番号：５）
【００３８】
【化５】
0005645338.tif 000006
【００３９】アンチセンス、５'−（配列番号：６）
【００４０】
【化６】
0005645338.tif 000007
【００４１】ＧＡＰＤＨ（センス（配列番号；７）
【００４２】
【化７】
0005645338.tif 000008
【００４３】アンチセンス（配列番号：８）
【００４４】
【化８】
0005645338.tif 000009
【００４５】の５０μｌ  ＰＣＲ反応物中に希釈した。その反応物をPCR Express Hybaidサーマルサイクラー(Hybaid, Franklin, MA)中、１サイクルについて９４℃にて２分間、その後３５サイクルについて９４℃／（４５秒）、５６℃／（４５秒）、７２℃／（６０秒）、最後に７２℃にて１０分間延長してインキュベートした。増幅後に、１０μｌの各反応物を１.５％アガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色によって視覚化した。
【００４６】イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション
ヒト特異的ａｌｕ反復配列に対するジゴキシゲニン−標識プローブを、以前に記載されているごとく（１３）、ａｌｕに対するプライマーを用いるＰＣＲによって調製した。同様にして、ヒトＤＳＰＰのｍＲＮＡに特異的なジゴキシゲニン−標識プローブも、前記したのと同一のＰＣＲ条件下でＤＳＰＰプライマーを用いて調製した。両プローブの特異性はＤＮＡ配列決定によって確認した。非染色切片を脱パラフィンし、ｍＲＮＡ locator-Hyb Kit（カタログ番号1800；Ambion, Inc., Austin, TX）を用いてジゴキシゲニン−標識ａｌｕプローブ（９）またはＤＳＰＰプローブのいずれかとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後に、組織切片中のａｌｕおよびＤＳＰＰの両方のｍＲＮＡの存在を、抗−ジゴキシゲニン・アルカリホスファターゼコンジュゲート・Ｆａｂフラグメント（Boehringer Mannheim）との免疫反応性によって検出した。
【００４７】ＤＰＳＣのクロノジェニツク集団の単離
骨前駆細胞（osteoprogenitor）は、プラスチック基層に接着するその能力および適当な刺激によって増殖を開始する能力によって、骨髄の吸引物から単離し得る（１３−１５）。各コロニーは単一の前駆細胞（コロニー形成単位−繊維芽細胞、ＣＦＵ-Ｆ）から発生し、細胞形態および増殖能力において幅広い変化を示す（１３−１８）。本明細書において、歯髄組織におけるクロノジェニック細胞集団の存在（図１ＡおよびＢ）を最初に立証している。各コロニー内の細胞は、ヒト骨髄ＣＦＵ−Ｆの子孫に類似する典型的な繊維芽細胞様の形態（１９）によって特徴付けられた（図１Ｃ）。歯髄組織由来のコロニー形成細胞の頻度（平板した１０４細胞当り２２ないし７０コロニーの範囲）は、同様の平板密度（平板した０.１ないし２．５×１０４細胞）上での骨髄ＣＦＵ−Ｆ（２.４ないし３.１コロニー／平板した１０４細胞）の発生率と比較して有意に高かった（図１Ｄ）。さらに、ＤＰＳＣ培養物中の増殖する細胞の数も、ＢｒｄＵ取込み方法を用いてＢＭＳＣ培養物（４６％ＢｒｄＵ陽性細胞±１.９６  ＳＥＭ、ｎ＝３）と比較した場合に有意に高かった（平均７２％ＢｒｄＵ陽性細胞±３.４８  ＳＥＭ、ｎ＝３）（ｔ−検定  ｐ＜０．０５）（図１Ｅ）。
【００４８】イン・ビトロでのＤＰＳＣの免疫表現型の特徴付け
ＤＰＳＣおよびＢＭＳＣクロノジェニック集団の子孫を特徴付けるために、異なる表現型と関連する公知の抗原に特異的な大きな一連の抗体を用いて免疫組織化学実験を行った。両方の細胞集団について典型的な免疫反応特性を表１に示す。ＤＰＳＣおよびＢＭＳＣの第一代培養物は、造血系マーカーＣＤ１４（単球／マクロファージ）、ＣＤ４５（一般的白血球抗原）、ＣＤ３４（造血幹細胞／前駆細胞／内皮細胞）、ならびにＭｙｏＤ（平滑筋）、ニューロフィラメント（神経）、ＩＩ型コラーゲン（軟骨）およびＰＰＡＲγ（脂肪）のごとき他のマーカーと反応しなかった。一般的に、ＤＰＳＣおよびＢＭＳＣは、内皮細胞（ＶＣＡＭ−１およびＭＵＣ−１８）、平滑筋（α−平滑筋アクチン）、骨（アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、オステオネクチン、オステオポンチン、オステオカルシン）および繊維芽細胞（ＩＩＩ型コラーゲン、ＦＧＦ−２）と関連する種々のマーカーについて同様の発現パターンを示す。骨マトリックスタンパク質である骨シアロタンパク質はＤＰＳＣ培養物中に存在しないが、ＢＭＳＣ培養物中には低レベルで存在した。ＤＰＳＣについての代表的な免疫反応性パターンを図２に示す。多くのマーカーは均一に発現されていないが、細胞のサブセット中に見出され、ＤＳＰＣ集団は、ＢＭＳＣ集団について示されたのと同様に異種であることを示している。
【００４９】イン・ビトロにおけるＤＰＳＣの分化能
Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸、グルココルチコイド、デキサメタゾン、および無機リン酸塩の存在下で増殖させたＤＰＳＣの長期培養（５ないし６週間）により、高レベルのカルシウムを含むアリジリンレッド陽性の凝集した小節を形成する能力を実証した（図３Ａ）。沈澱物は、単一石灰化ゾーンとして接着層全体にわたってばらばらに散乱していた。それに対して、ＢＭＳＣ培養物は、誘導の３ないし４週間後に接着層全体にわたって石灰化した沈澱物の広いシートを生成した（図３Ｃ）。デキサメタゾンを用いた刺激の６週間後に第一代ＤＰＳＣ培養物における脂肪生成の事実は存在せず（図３Ｃ）、一方、脂質を含有する脂肪細胞のクラスターがＢＭＳＣの第一代培養物においては２週間ほども早期に検出された（図３Ｄ）。
【００５０】  エクス・ビボ(ex vivo)で拡大させたＤＰＳＣは、イン・ビボで象牙質／歯髄構造を生成し得る。適当な組織構造の完全な発生能および形成がイン・ビトロで十分に認識できない場合があるため、ＤＰＳＣはヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウム（ＨＡ／ＴＣＰ）粉末と結合して免疫無防備マウスに移植した。移植６週間後に、ＤＰＳＣはＨＡ／ＴＣＰ粒子の表面に並ぶ象牙質様構造を生成し、それは偏光下で観察した場合に象牙芽細胞様層に垂直に沈澱した非常に規則正しいコラーゲンマトリックスからなるものであった（図４Ａ、Ｃ、Ｄ）。免疫学的実験により、該マトリックスはＩ型コラーゲンから主としてなることが示された。象牙芽細胞様細胞は細胞質突起を象牙質マトリックスに伸長させ、それは血管が侵入した歯髄様間質組織と境界面を接している。歯髄および象牙芽細胞様細胞は、そのヒトａｌｕ特異的プローブに対する反応性に基づいて、供与者起源のものであることが判明した（図５Ａ）。さらに、ＤＰＳＣ移植片は、ＲＴ−ＰＣＲおよびイン・サイチュ・ハイブリダイゼーションによって、骨シアロタンパク質、オステオカルシンおよび象牙質シアロホスホタンパク質（ＤＳＰＰ）を含む象牙質マトリックス成分のヒト特異的な転写物を発現した（図６）。対応するＢＭＳＣ転写物は、異なる層の骨をＨＡ／ＴＣＰの表面に形成し、そこでは、コラーゲン繊維は骨形成表面上の骨芽細胞に対して平行に配列していた（図４Ｂ、Ｅ、Ｆ）。骨マトリックス内に埋没する骨細胞、および骨芽細胞も供与者起源のものであることが判明した（図５Ｂ）。新たに形成した骨は間質組織を取囲み、これは活性な造血および脂肪細胞蓄積の広範な領域で、髄質様器官に似ているシヌソイド網目構造によって侵入されていた。興味深いことには、ＤＰＳＣ移植片は、移植４ヶ月後でも、造血細胞を支持できず、または脂肪細胞形成を開始できなかった。
【００５１】ヒトＤＳＰＰに対する免疫組織化学染色
ＤＰＳＣおよびＢＭＳＣの移植は前記と同様にして行った。移植片は移植８週間後に回収し、４％の新たに調製したパラホルムアルデヒドを用いて２４時間固定化し、１０％のＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を用いて７日間脱灰した。ついで、その移植片を７０％のエタノールに移し、パラフィンブロック中に包埋した。ＤＳＰＰ抗体はDr. Larry Fisher（NIDCR／NIH）から寄贈いただいた。脱パラフィンし、脱水し、内因性ペルオキシダーゼを除去した後に、切片をＤＳＰＰ一次抗体と一緒に室温にて１時間インキュベートした。ついで、第二抗体および酵素コンジュゲートのインキュベーションに、指示書に従ってHistostain SPキットを用いた（Zymed Laboratories Inc. South San Francisco, CA, U.S.A.）。ヒトの歯髄および脱灰した象牙質組織を陽性対照として用いた。この手法により、ＤＰＳＣ移植片中の新たに形成した象牙質が象牙質特異的ＤＳＰＰ抗体に対して陽性であることが示された（図７）。このことは、イン・ビボにおいてヒトＤＰＳＣが象牙芽細胞に分化してヒト象牙質を再生することのさらなる証拠である。
【００５２】ＤＰＳＣ移植片における象牙質形成のトリクローム染色
ＤＰＳＣおよびＢＭＳＣの移植は、前記と同様にして行った。８週齢のヒトＤＰＳＣ移植片を４％の新たに調製したパラホルムアルデヒドで２４時間固定し、７０％のエタノールに移し、プラスティック包埋した。Trichrome染色（GOMORI）キット（Sigma, #HT10516）を製造業者のプロトコールに従って染色に用いた。通常の歯のプラスチック包埋切片を陽性対照として用いた。この染色により、ＤＰＳＣが普通のヒト象牙質と同様の無機物化したコラーゲン構造を含む象牙質を再生することが示された（図８）。
【００５３】  本明細書に示すデータは、クロノジェニックで、非常に増殖性が高く、かつ組織を再生することができる（それを幹細胞として有効に定義する特性である）細胞を出生後の歯髄が含むことを最初に実証するものである。筋肉、神経組織および象牙質関連組織は出生後の生活間には改造しないが、それらはすべて傷害に応答して分化する能力を有する幹細胞を含有する。ヒトＤＰＳＣの免疫無防備マウスへの移植により、さらにこれらの幹細胞を特徴付けするための新たなモデルが提供された。さらに、これらの移植片中に形成された象牙質および歯髄様組織の量は、生物の生涯の間にイン・サイチュで生成されるであろう量を遥かに超える。したがって、単一の歯からの多数のＤＰＳＣの今回の単離により、多くの歯の歯科学的修復が可能となる。さらに、エクス・ビボで拡大させたＤＰＳＣと結合した適当な形態および組成を有する担体の使用を介して、生存能力のある（viable）歯科インプラントの作製が提供される。
【００５４】  本願全体を通して種々の種々の刊行物を参照する。これらの刊行物は、関係する技術の状態をより完全に説明するために、本発明がその全体の開示を出典明示して本明細書の一部とみなす。
【００５５】  本発明の趣旨から逸脱することなく、種々の修飾および変易を本発明に成し得ることは当業者に明らかであろう。本発明の他の態様は、明細書の考察および本明細書に開示した本発明の実施から当業者に明らかであろう。本明細書および実施例は単なる例示のみとみなし、本発明の真正な範囲および意図は以下の請求の範囲によって示されることを意図する。
【００５６】参考文献
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【００５７】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ−Ｃ】  イン・ビトロにおけるコロニー形成効率および細胞増殖性。１４日後の代表的な高（Ａ）および低（Ｂ）密度コロニー。形態は繊維芽細胞様細胞の典型である（Ｃ）。
【図１Ｄ】  種々の平板密度における歯髄組織および骨髄からのコロニー形成細胞の発生率を示すグラフ。
【図１Ｅ】  ＤＰＳＣおよびＢＭＳＣについて計数した細胞の合計数のパーセントとして表したＢｒｄＵ陽性細胞の数を示すグラフ。
【図２Ａ−Ｆ】  培養したＤＰＳＣの免疫表現型を示す図。
【図２Ｇ−Ｌ】  培養したＤＰＳＣの免疫表現型を示す図。
【図３Ａ−Ｄ】  イン・ビトロにおける発生能力を示す図。
【図４Ａ−Ｂ】  イン・ビボにおける発生能力を示す図。
【図４Ｃ−Ｆ】  イン・ビボにおける発生能力を示す図。
【図５Ａ−Ｂ】  ヒト特異的ａｌｕ  ＤＮＡ配列に対するイン・サイチュ・ハイブリダイゼーションを示す図。
【図６Ａ−Ｃ】  ＤＰＳＣ移植片におけるヒト特異的象牙質シアロホスホタンパク質（Dentin Sialophosphoprotein）（ＤＳＰＰ）、オステオカルシン（ＯＣ）、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）のｍＲＮＡの発現を示す図。
【図７Ａ−Ｂ】  ヒトＤＳＰＰの免疫組織化学染色を示す図。
【図７Ｃ−Ｄ】  ヒトＤＳＰＰの免疫組織化学染色を示す図。
【図８Ａ−Ｂ】  ＤＳＰＣ移植片における象牙質形成を示す図。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
0005645338.tif 000014
【図１Ｅ】
0005645338.tif 000015
【図２Ａ】
0005645338.tif 000016
【図２Ｂ】
0005645338.tif 000017
【図２Ｃ】
0005645338.tif 000018
【図２Ｄ】
0005645338.tif 000019
【図２Ｅ】
0005645338.tif 000020
【図２Ｆ】
0005645338.tif 000021
【図２Ｇ】
0005645338.tif 000022
【図２Ｈ】
0005645338.tif 000023
【図２Ｉ】
0005645338.tif 000024
【図２Ｊ】
0005645338.tif 000025
【図２Ｋ】
0005645338.tif 000026
【図２Ｌ】
0005645338.tif 000027
【図３Ａ】
0005645338.tif 000028
【図３Ｂ】
0005645338.tif 000029
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
0005645338.tif 000031
【図４Ａ】
0005645338.tif 000032
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
0005645338.tif 000035
【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
0005645338.tif 000038
【図５Ｂ】
0005645338.tif 000039
【図６Ａ】
0005645338.tif 000040
【図６Ｂ】
0005645338.tif 000041
【図６Ｃ】
0005645338.tif 000042
【図７Ａ】
0005645338.tif 000043
【図７Ｂ】
0005645338.tif 000044
【図７Ｃ】
0005645338.tif 000045
【図７Ｄ】
0005645338.tif 000046
【図８Ａ】
0005645338.tif 000047
【図８Ｂ】
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【配列表】
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