(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルモネラエンテリティディス、サルモネラチフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプローラムからなる群から選択される１つまたはそれ以上のサルモネラ属菌に対して特異的死滅能を有することを特徴とし、受託番号KCCM11030Pによって寄託されている、分離されたバクテリオファージ。
【請求項２】
請求項１に記載のバクテリオファージを有効成分として含むサルモネラエンテリティディス、サルモネラチフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプローラムからなる群から選択される１つまたはそれ以上のサルモネラ属菌株によって誘発される感染性疾病の予防または治療用組成物。
【請求項３】
前記サルモネラエンテリティディスまたはサルモネラチフィムリウム感染性疾病はサルモネラ症及びサルモネラ菌食中毒であり、サルモネラガリナルム感染性疾病は家禽チフスであり、サルモネラプローラム感染性疾病は雛白痢である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
抗生剤として使用される、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１に記載のバクテリオファージを有効成分として含む家畜用飼料または飲用水。
【請求項６】
請求項１に記載のバクテリオファージを有効成分として含む消毒剤又は洗浄剤。
【請求項７】
請求項１に記載のバクテリオファージを必要とするヒトを除く動物に投与する段階を含む、サルモネラエンテリティディス、サルモネラチフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプローラムからなる群から選択される１つまたはそれ以上のサルモネラ菌株によって誘発された感染性疾病を予防または治療する方法。
【請求項８】
請求項２に記載の組成物を必要とするヒトを除く動物に投与する段階を含む、サルモネラエンテリティディス、サルモネラチフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプローラムからなる群から選択される１つ以上のサルモネラ菌株によって誘発される感染性疾病を予防または治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なバクテリオファージ(bacteriophage)に関する。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラ菌は、腸内菌科(family)の属(genus)であって、グラム陰性の条件嫌気性細菌で芽胞を形成しない桿菌として特徴され、大部分菌株は鞭毛による運動性を持つ。サルモネラ菌の平均ゲノムＧＣ含量は５０−５２％で、大腸菌(Escherichia coli)やシゲラ(Shigella)と類似する。サルモネラ属は人だけでなく、家畜に感染して疾病などを誘発する病原性の微生物である。サルモネラ菌種であるサルモネラエンテリカ(Salmonella enterica)は血清学的区分を介してガリナルム(gallinarum)、プローラム(pullorum)、チフィムリウム(typhimurium)、エンテリティディス(enteritidis)、チフィ(typhi)、コレレスイス(choleraesuis)、ダービー(derby)などを含む多様な血清型(serovar)を持つ(Bopp CA, Brenner FW, Wells JG, Strokebine NA. Escherichia, Shigella, Salmonella. In Murry PR, Baron EJ, et al., eds. Manual of Clinical Microbiology. 7th ed. Washington DC American Society for Microbiology 1999;467-74 ; Ryan KJ. Ray CG (editors) (2004). Sherris Medical Microbiology (4th ed). McGraw Hill. ISBN 0-8385-8529-9.)。これらのうち、サルモネラガリナルムとサルモネラプローラムは家禽−適応した病原体であり、サルモネラチフィは人−適応した病原体であり、サルモネラコレレスイスとサルモネラダービーは豚−適応した病原体であり、サルモネラエンテリティディスとサルモネラチフィムリウムは人らと家畜などに対する病原体である。各血清種は、それぞれの種内で疾病を誘発して農家と消費者に莫大な被害を与えたりする。
【０００３】
家禽でサルモネラ菌が誘発する疾病である家禽チフス(ＦＴ)は、サルモネラガリナルム(以下、"ＳＧ"という)が原因体である。家禽チフス(ＦＴ)は、鶏及び七面鳥のような家禽の敗血症疾病であり、急性または慢性の高い斃死率が進行され得る。最近にヨーロッパ、南米、アフリカ及び東南アジアなどでは家禽チフスの発生頻度が高いことで報告され、毎年その被害が増加されている。韓国では１９９２年以来でＦＴの発生を報告して来たし、茶色産卵鶏内ＦＴによって誘発された経済的損失が非常に深刻である(クォンヨングク。２０００年度鳥類疾病検索結果分析。国立獣医科学検疫院情報誌。２００１年３月；ギムエラン外、２００３年国内原種鷄及び種鶏の雛白痢(Pullorum disease)−家禽チフス感染実態、Korean J Vet Res(2006) 46(4): 347〜353)。
【０００４】
雛白痢もサルモネラ菌の菌株であるサルモネラプローラム(以下、"ＳＰ"という)によって誘発される。雛白痢は、一齢または季節にかかわらず発病するが、疾病に対して初生雛時期に最も感受性が高い。過去１世紀の間、１−２週齢またはその未満一齢の初生雛ひよこで深刻な疾病であった。１９８０年代以来、その発生が非常に減少した。しかし、１９９０年代中半以来再び増加する趨勢にある(クォン・ヨングック．２０００年度鳥類疾病検索結果分析．国立獣医科学検疫院情報誌．２００１年３月；ギム・エラン外、２００３年国内原種鷄及び種鶏の雛白痢(Pullorum disease)−家禽チフス感染実態、Korean J Vet Res(2006) 46(4): 347〜353)。
【０００５】
韓国では、１９９０年代以来家禽チフスと雛白痢の発生が増加している趨勢で農家に経済的損失を与えている。このために、２００４年から弱毒化されたＳＧ生菌ワクチンをブロイラー(broiler)に使用して家禽チフスに対して予防しようとした(キムエラン外、２００３年国内原種鶏及び種鶏の雛白痢−家禽チフス感染実態、Korean J Vet Res(2006) 46(4): 347〜353)。この効果に対する疑心と、産卵鶏において繼代伝染リスクで生菌ワクチンの使用が不許されている。残念ながら、家禽チフスと違って、雛白痢の場合には相変らず商業的に使用可能な予防策がない。したがって、家禽チフスと雛白痢を予防することができる新しい方法に対する模索が至急である。
【０００６】
一方、サルモネラエンテリティディス(以下、"ＳＥ"という)とサルモネラチフィムリウム(以下、"ＳＴ"という)は、ＳＧやＳＰと違って、宿主特異性ない人獣共通伝染菌である(Zoobises Report; United Kingdom 2003)。
【０００７】
ＳＥとＳＴは家禽、養豚、及び牛でサルモネラ症(salmonellosis)の原因になる。サルモネラ症は、家畜でサルモネラ菌によって急性または慢性の消化器伝染病に誘発され、発熱、腸炎及び敗血症を主症として示し、時々肺炎、関節炎、流産及び乳房炎も示す。サルモネラ症は全世界的に発生され、主に夏に最も頻繁に発病する(T.R. Callaway et al. Gastrointestinal microbial ecology and the safety of the food supply as related to Salmonella. J Anim Sci 2008.86:E163-E172)。牛の場合、典型的な症状として食慾不振、発熱、濃褐色下痢または粘血を含む。子牛の急性感染時、数日内に斃死され、姙娠中の感染は敗血症によって胎牛(fetal)が斃死されるので、早流産が発生し得る(www.livestock.co.kr)。養豚の場合、サルモネラ症は臨床的に３つの主要な症侯群として特徴される：急性敗血症型、急性腸炎型と慢性腸炎型。急性敗血症型は２〜４ヶ月齢の子豚で発生し、症状の開始２〜４日以内に大部分斃死される。急性腸炎型は肥育期の間に発生し、下痢と高熱、肺炎、及び神経徴候(nerves sign)を伴う。一部重症の場合、皮膚変色が起こる。慢性腸炎型の場合は持続的な下痢を伴う(www.livestock.co.kr)。
【０００８】
ＳＥ及びＳＴによって家禽、養豚、及び牛でサルモネラ症が発生すると、治療薬剤だけで完治させ難い。これはサルモネラ菌が多様な薬剤に強い耐性を有し、臨床症状を示す間に抗生剤が侵透できない細胞内に寄生するからである。現在まで抗生剤を含んでＳＥとＳＴによって発病されるサルモネラ症を治療するための効果的な方法がない(www.lhca.or.kr)。
【０００９】
家畜でのように、ＳＥ及びＳＴは家畜及びその製品を介して人に感染を誘発し、サルモネラ菌食中毒を起こすことができる。感染した、不十分に調理された家畜製品(例えば、肉類製品、家禽類製品、卵及びその副産物)を摂取した時に人体に感染する。人にサルモネラ菌食中毒は普通、頭痛と発熱、ひどい腹痛、下痢、悪心、及び嘔吐の即刻な発病を伴う。症状はたびたび感染してから６−７２時間内に現れ、４−７日間またはそれ以上持続するかもしれない(NSW+HEALTH．2008.01.14.)。
【００１０】
ＣＤＣ(疾病管理センター、米国)統計によると、２００５年から２００８年の間に発生された人の食中毒の１６％をサルモネラ菌のせいとして見て、その中でもＳＥとＳＴがそれぞれ２０％と１８％の原因である。１９７３年から１９８４年の間の人のサルモネラ菌食中毒に対して、伝染の食品媒介体として作用した場合が鶏は５％、牛肉は１９％、豚肉は７％、酪農製品が６％、及び七面鳥が９％であったと報告した事がある。１９７４〜１９８４年屠鷄処理段階の間ブロイラーで微生物学的汚染調査は、サルモネラ菌の３５％以上またはそれ以上の発生率を示した。１９８３年には鶏の５０．６％、七面鳥の６８．８％、ガチョウの６０％、豚肉の１１．６％、牛肉の１．５％においてサルモネラ菌が分離された。さらに、２００７年の統計によると、生家禽肉５．５％と生豚肉１．１％においてサルモネラ菌が発見されたと報告された。特に、ＳＥは大部分汚染された卵や汚染された家禽肉から由来し、ＳＴは汚染された豚肉、家禽肉、及び牛肉から由来されると明らかにされた(www.cdc.gov) (Centers for Disease Control and Prevention (CDC))。一例として、１９８８年以来米国、カナダ、及びヨーロッパではＳＥによる食中毒事例が急激に増加して来たことが見られるが、疫学的な追跡結果、卵や卵を含む食品が原因であることを立証した(Agre-Food Safety Information Service(AGROS)．国内外食中毒発生及び管理動向．２００８.０２)。また、２００２年ＦＡＯとＷＨＯが行ったリスク評価では、卵と家禽肉を通して伝播されたサルモネラ症の人発病率が観察された家禽類のサルモネラ有病率と密接な関係を現われると明らかにした。すなわち、家禽類のサルモネラ有病率が減少すると、人のサルモネラ症発病率も減少するという意味である(Salmonella control at the source; World Health Organization. International Food Safety Authorities Network (INFOSAN) Information Note No. 03/2007)。最近ではピーナッツ、ほうれん草、トマト、ピスタチオ、胡椒、及び最も最近ではクッキー生地のように多様な材料からサルモネラ菌の発生によって飲食物安全に対する心配が提起されている(Jane Black and Ed O'Keefe. Overhaul of Food Safety Rules in the Works. Washington Post Staff Writers Wednesday,July 8,2009)。
【００１１】
これらの理由のため、ドイツではサルモネラ菌による感染を報告しなければならない(ドイツ感染疾患予防法、Infektionsschutzgesetzに６項、７項に基づく)。１９９０年から２００５年まで約２０万件から約５万件に公式的記録の数は減少された。ドイツで毎５人のうち、１人程度がサルモネラ菌保菌者として推定されている。米国では毎年サルモネラ菌感染がおおよそ約４万件程度報告されている(en.wikipedia.org/wiki/Salmonella#cite_note-2)。
【００１２】
したがって、家畜及び人にサルモネラ症を起こすことができるＳＥとＳＴの統制方法に対する模索が至急である。ＵＳＤＡとＦＤＡの共同努力は、米国国内で１００万件が超える食物−由来感染を誘発する原因であるサルモネラ症を予防するための多様の効果的な措置などを開発したものである。中でもＦＤＡによって提起された最終法案が卵で汚染を減少するためのものである。ＦＤＡは現在、卵の製造社などが致命的なサルモネラ菌に対する定期的な試験を卵生産、保存及び運送の間に要求するでしょう。その結果、毎年汚染された卵によって誘発される７万９０００件及び死亡３０件の推定値を防止することができるでしょう(Jane Black and Ed O'Keefe. Overhaul of Food Safety Rules in the Works. Washington Post Staff Writers Wednesday,July 8,2009)。デンマークで、生産分野内サルモネラ菌管理費用対比サルモネラ症の総公衆衛生費用と比較した費用効果分析結果から、サルモネラ菌を管理することによって、２００１年度の一年に最小１４１０万ＵＳドル推定値を節約することができたという提案があった(Salmonella control at the source. World Health Organization. International Food Safety Authorities Network(INFOSAN) Information Note No. 03/2007)。
【００１３】
一方、バクテリオファージは細菌のみに感染及び破壊する細菌特異的ウイルスであって、宿主細菌内のみで自家増殖が可能である。バクテリオファージはタンパク質外被が取り囲まれている単一あるいは二重鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ形態の遺伝物質からなる。バクテリオファージは３つの基本形構造に分類される：２０面体(20-sided)の頭に尾がある形態；２０面体の頭に尾がない形態；及びフィラメント形。最も豊富な形態である２０面体の頭に尾がある形態のバクテリオファージは、その尾の特性に応じて：それぞれ収縮性尾のマイオウイルス科(Myoviridae)、長くて非収縮性尾のシホウイルス科(Siphoviridae)、及び短くて非収縮性尾のポドウイルス科(Podoviridae)でさらに分類され得る。２０面体の頭に尾のないバクテリオファージは、その頭の形態、頭の構成成分及び外皮の有無に基づいて分類される。ＤＮＡをその遺伝物質として持つフィラメント形態のバクテリオファージは、そのサイズ、形状、外被及びフィラメント構成成分に基づいて分類される(H.W.Ackermann. Frequency of morphological phage descriptions in the year 2000; Arch Virol (2001) 146:843-857; Elizabeth Kutter et al. Bacteriophages biology and application; CRC press)。
【００１４】
感染させる時、バクテリオファージは、細菌にくっついて自分の遺伝物質を細胞内に注入する。バクテリオファージは、後に溶菌性(lytic)または溶原性(lysogenic)の２つの生活週期のうち、１つを帯びるようになる。溶菌性バクテリオファージの場合、細胞の機構などを占めてファージ構造物などを作る。その後、新しいファージ粒子などを放出させることによって細胞を破壊するとか溶解する。溶原性バクテリオファージの場合、自分の核酸を宿主細胞の染色体に組み込ませて細胞を破壊せず一つの単位(unit)として共に複製される。一定の条件下で、溶原性バクテリオファージが溶菌性に従うように誘導され得る(Elizabeth Kutter et al. Bacteriophages biology and application. CRC Press)。
【００１５】
バクテリオファージの発見の以後、これを感染疾病治療剤として用いるための研究が進行された。しかし、広範囲な範囲を有する抗生剤が主に使用されながら、宿主特異性(specific target spectrum)を有するバクテリオファージは不要なもののように見えた。しかし、抗生剤の誤用または濫用で抗生剤耐性及び食品内の抗生剤残留の有害な影響に対する憂慮が加わっている(Cislo, M et al. Bacteriophage treatment of suppurative skin infections. Arch Immunol.Ther.Exp. 1987.2:175-183; Kim sung-hun et al., Bacteriophage; New Alternative Antibiotics. Biological research information center (BRIC))。特に、成長促進のために家畜用飼料に添加する抗微生物成長促進剤(ＡＧＰ)が抗生剤耐性誘発の原因であることが明らかになったことに応じて抗微生物成長促進剤(ＡＧＰ)の使用を禁止する政策などが最近立案されている。ヨーロッパ連合は、２００６年からすべての抗微生物成長促進剤(ＡＧＰ)の使用が禁止された。韓国は２００９年から一部ＡＧＰの使用禁止が施行されており、今後にすべてのＡＧＰの使用の全面禁止が予想されている。
【００１６】
これらの抗生剤使用に対する増加する疑問が、抗生剤の代案としてバクテリオファージに対する関心の復活を引き起こした。Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ菌を統制するためのバクテリオファージ７つが米国登録特許第６，４８５，９０２号に記述された(Use of bacteriophage for control of Escherichia coli O157，２００２年度に登録される)。多様な種の微生物を統制するバクテリオファージの２種に対して米国登録特許第６，９４２，８５８号に記述された(Ｎｙｍｏｘ社から２００５年度に)。多くの産業界においてバクテリオファージを用いる多様な製品を開発するために活発に努力中である。ＥＢＩ  Ｆｏｏｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社(ヨーロッパ)は、米国ＦＤＡの承認を受けた最初のバクテリオファージを用いた製品である、リステリア菌(Listeria monocytogenes)によって誘発される食中毒を防止する食品添加剤製品であるＬｉｓｔｅｘ−Ｐ１００を開発した。リステリア菌統制食品添加型ファージ−ベース製品であるＬＭＰ−１０２も開発してＧＲＡＳ(Generally Regarded As Safe)の認証を受けた。２００７年には、ＯｍｎｉＬｙｔｉｃｓ社で屠畜過程中にＥ．ｃｏｌｉＯ１５７が牛肉で汚染されることを防ぐためのファージ−ベース洗浄液製品が開発され、米国農務省の食品安全検査局(ＦＳＩＳ)から承認された。ヨーロッパで、Clostridium sporogenes phage NCIMB 30008とClostridium tyrobutiricum phage NCIMB 30008とはそれぞれ２００３年と２００５年に飼料内のクロストリジウム(Clostridium)菌の汚染に対する飼料保存剤として登録された。このような研究は、家畜製品内の人獣共通伝染菌に対してバクテリオファージが抗生剤として使用され、持続的に研究が進行中であることを示している。
【００１７】
しかし、大部分のファージ生物防除(biocontrol)研究が大腸菌、リステリア菌、及びクロストリジウム菌を統制するのに力を注いでいる。サルモネラ菌も人獣共通伝染菌であって、この伝染菌による被害が減っていない。前述のように、ＳＥとＳＴは多薬剤耐性が存在するため、現在、韓国では伝染病予防法施行令(大統領令第１６９６１号)、伝染病予防法施行規則(保健福祉部令第１７９号)、及び国立保健院職制(大統領令第１７１６４号)によって全国的な抗菌耐性監視を実施している。したがって、サルモネラ菌を統制できるバクテリオファージの開発が必要である。
【発明の開示】
【技術的課題】
【００１８】
本発明によれば、家禽病原体サルモネラに感染する、自然界から分離したバクテリオファージに対する集中的で徹底的な研究を本発明者らが行って、広範囲な抗生剤の誤用または濫用によって発生された問題、例えば、薬物または多薬剤耐性バクテリア、薬物残余物などを解決するための目的で、サルモネラエンテリティディス(ＳＥ)、サルモネラチフィムリウム(ＳＴ)、サルモネラガリナルム(ＳＧ)及びサルモネラプローラム(ＳＰ)に対して特異的死滅能を持ち、有益菌には影響を与えない分離されたバクテリオファージの一部を結果的に見付けることができ、さらにこれらの形態学的、生化学的及び遺伝学的特性を確認したところ、耐酸性と耐熱性及び耐乾性が優れたことを示し、したがって、前記バクテリオファージをサルモネラエンテリティディスまたはサルモネラチフィムリウム誘発された疾病である、例えば、家畜サルモネラ症及びサルモネラ菌食中毒、及びサルモネラガリナルムまたはサルモネラプローラム誘発された疾病である、特に家禽チフス及び雛白痢の予防または治療用組成物の有効成分として用いることができる。また、本発明に応じるバクテリオファージは、家畜用飼料添加剤、家畜用飲用水、畜舎消毒剤(sanitizer)及び肉加工用洗浄剤を含むサルモネラ菌統制用の多様な製品に適用され得る。
【技術的解決方法】
【００１９】
本発明の一つの目的は、サルモネラエンテリティディス、サルモネラチフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプローラムからなる群から選択される１つまたはそれ以上のサルモネラ属菌に対して特異的死滅能を持つ新規なバクテリオファージを提供することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、前記バクテリオファージを有効成分として含むサルモネラエンテリティディス、サルモネラチフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプローラムからなる群から選択される１つまたはそれ以上のサルモネラ属菌によって誘発された感染性疾病の予防または治療用組成物を提供することである。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、家畜用飼料添加剤及び家畜用飲用水を提供することである。
【００２２】
本発明のまださらなる目的は、前記バクテリオファージを有効成分として含む洗浄剤及び消毒剤を提供することである。
【００２３】
本発明のまだ別の目的は、前記バクテリオファージを有効成分として含む組成物を用いてサルモネラエンテリティスまたはサルモネラチフィムリウムによって誘発されるサルモネラ症またはサルモネラ菌食中毒を予防または治療する方法を提供することである。また、本発明は、サルモネラガリナルムまたはサルモネラプローラムによって誘発される家禽チフス及び雛白痢を予防または治療する方法を提供することである。
【有利な効果】
【００２４】
本発明の新規なバクテリオファージは、サルモネラエンテリティディス、サルモネラチフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプローラムからなる群から選択される１つまたはそれ以上のサルモネラ菌株に対して特異的死滅能を持ち、さらに優れた耐酸性及び耐熱性並びに耐乾性を示す。このような理由で、本発明の前記新規なバクテリオファージは、サルモネラエンテリティディス、サルモネラチフィムリウム、サルモネラガリナルムまたはサルモネラプローラムによって誘発されるサルモネラ症、サルモネラ菌食中毒、家禽チフス及び雛白痢を含む感染性疾病の予防または治療用途として用いることができるだけでなく、サルモネラエンテリティディス、サルモネラチフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプローラムの統制用途として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ΦＣＪ７の電子顕微鏡の写真であり、ΦＣＪ７が２０面体の頭(isometric capsid)と長くて非収縮性の尾(long non-contractile tail)として特徴されるシホウイルス科(Siphoviridae)形態型群に属することを示す；
【図２】図２は、ΦＣＪ７のサルモネラ菌に対する溶菌斑形成有無写真である：Ａ：ＳＥ；Ｂ：ＳＴ；Ｃ：ＳＧ；Ｄ：ＳＰ；Ｅ：ＳＡ；Ｆ：ＳＢ；Ｇ：ＳＣ；Ｈ：ＳＤ。ＳＥ、ＳＴ、ＳＧ及びＳＰでは溶菌斑を形成するが、ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ及びＳＤでは溶菌斑を形成しない。
【図３】図３は、分離されたバクテリオファージΦＣＪ７のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果であり、バクテリオファージのタンパク質パターンを示したものであって、３８ｋＤａ、６３ｋＤａ、５２ｋＤａ及び１２ｋＤａの主要タンパク質を観察した(Invitrogen社のSee-blue plus 2 prestained-standardをマーカーとして使用した)；
【図４】図４は、分離されたバクテリオファージΦＣＪ７のＰＦＧＥの結果であり、ΦＣＪ７の全体ゲノムのサイズは、約３９．２ｋｂｐから４４．１ｋｂｐまでの間であることを示し、Bio-rad社の５ｋｂｐＤＮＡ size standardをサイズマーカーとして使用した；
【図５】図５は、ΦＣＪ７のゲノムＤＮＡの各プライマーセットを用いたＰＣＲの結果を示したものである：Ａ：配列番号５と６のプライマーセット；Ｂ：配列番号７と８のプライマーセット；Ｃ：配列番号９と１０のプライマーセット；及びＤ：配列番号１１と１２のプライマーセット。すべてのＰＣＲ産出物は５００ｂｐ〜３ｋｂｐの長さであった；
【図６】図６は、バクテリオファージΦＣＪ７の耐酸性実験の結果であって、ｐＨ２．１、２．５、３．０、３．５、４．０、５．５、６．４、６．９、７．４、８．０、９．０、９．８及び１１．０での生存バクテリオファージの数を示す。対照群と比較して、ｐＨ３．０まではバクテリオファージΦＣＪ７の活性を失わないが、ｐＨ２．５またはそれ以下ではその活性を完全に失う；
【図７】図７は、バクテリオファージΦＣＪ７の耐熱性実験結果であり、３７、４５、５３、６０、７０及び８０℃で０、１０、３０、６０及び１２０分毎の生存バクテリオファージの数を示す。バクテリオファージΦＣＪ７は、７０℃で２時間まではその活性を維持し、８０℃で１０分さらされる時はその活性を少し失ったし、それ以上の時間にさらされる後にはその活性を完全に失った；
【図８】図８は、ｓｐｅｅｄ−ｄｒｙｅｒ(Ｌａｂ  Ｐｌａｎｔ社)を用いたバクテリオファージΦＣＪ７の耐乾性実験の結果であり、乾燥前タイター(titer)と比較して、乾燥条件下でタイター変化を測定したものであって、活性が１００％維持されることが分かった；
【図９】図９は、投与前、投与後１、３、７、１０及び１４日に対するラットの体重グラフである。対照群と比較して、バクテリオファージΦＣＪ７と体重で有意な差は観察されなかった(■；雄の対照群、□；ΦＣＪ７を投与した雄の試験群、●；雌の対照群、○；ΦＣＪ７を投与した雌の試験群)。；及び
【図１０】図１０は、ΦＣＪ７の消毒能を示すグラフである。ΦＣＪ７は軽水、有機物希釈液、及び軽水＋牛乳２０％の条件でいずれも効果があることを示した。特に、ΦＣＪ７処理２．５時間後、効果が最も良いこととして示された。比較実験のために、陽性対照群として現在商業的に使用可能な製品であるハラソル(Harasol)(柳韓洋行、韓国)の場合、軽水の条件では非常に効果が良いが、有機物希釈液の条件では効果がなかったし、軽水＋牛乳２０％の条件でも効果が非常に減少することが分かった
【化１】
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【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
一つの側面から、本発明はサルモネラエンテリティディス、サルモネラチフィムリウム、サルモネラガリナルムまたはサルモネラプローラムに特異的死滅能を持つ新規な分離されたバクテリオファージに関する。
【００２７】
本発明のバクテリオファージは、形態学的構造上、２０面体の頭と長くて非収縮性の尾からなる形態型Ｂ１シホウイルス科に属し、全体のゲノムサイズが３８〜４５ｋｂｐであり、３７〜４０ｋＤａ、６２〜６５ｋＤａ、５１〜５４ｋＤａ及び１０〜１３ｋＤａサイズ範囲の主要構造タンパク質で特徴される。
【００２８】
好ましい態様において、本発明のバクテリオファージは、サルモネラエンテリティディス、サルモネラチフィムリウム、サルモネラガリナルムまたはサルモネラプローラムのみを選択的に感染させる種特異性を持つ。
【００２９】
好ましい態様において、本発明のバクテリオファージは、全体のゲノムサイズが約３８〜４５ｋｂｐであり、好ましくは約３９．２〜４４．１ｋｂｐである。さらに、バクテリオファージは、配列番号１〜４からなる群から選択される１つまたはそれ以上の核酸分子をゲノムの一部として含むことができる。好ましくは、バクテリオファージは、配列番号１〜４からなる核酸分子をゲノムの一部として含む。
【００３０】
本発明のバクテリオファージのゲノムを鋳型として用いて配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０及び配列番号１１と１２の中から選択されるプライマーセットの存在下でＰＣＲを行った場合、ＰＣＲ産出物は、それぞれ５００ｂｐ〜３ｋｂｐの長さである。好ましくは、前記言及したプライマーセットそれぞれの存在下でＰＣＲを行った場合、それぞれのＰＣＲ産出物は、５００ｂｐ〜３ｋｂｐの長さである。
【００３１】
本発明において用語"核酸分子"は、ＤＮＡ(ｇＤＮＡとｃＤＮＡ)及びＲＮＡ分子を含む意味である。核酸分子の構成単位を作るのに共に組み合わせられる、用語"ヌクレオチド"は、自然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形された類似体を含む。
【００３２】
本発明のバクテリオファージは、３７〜４０ｋＤａ、６２〜６５ｋＤａ、５１〜５４ｋＤａ及び１０〜１３ｋＤａサイズ範囲の主要構造タンパク質を持ち、好ましくは、約３８ｋＤａ、６３ｋＤａ、５２ｋＤａ及び１２ｋＤａそれぞれのサイズに相応する。
【００３３】
さらに、本発明のバクテリオファージは、耐酸性、耐熱性及び耐乾性である生化学的特徴を示す。
【００３４】
より具体的に、本発明のバクテリオファージは、酸と熱に優れた耐性を示し、これはｐＨ３．０〜ｐＨ１１．０の広いｐＨ範囲及び、３７℃〜７０℃の広い熱範囲にかけて生存することができる。また、その耐乾性に関して、バクテリオファージは、１２０℃／７０℃の高温乾燥した条件下でも生存を維持することができる。このような優れた耐酸性、耐熱性及び耐乾性は、本発明のバクテリオファージを家畜疾病及び家畜−由来された人疾病の予防及び治療用組成物並びに製品として適用することにおいて、広い温度及びｐＨ範囲の利用が可能になる。
【００３５】
屠鷄場(chicken slaughterhouse)の下水から試料を分離してＳＧ、ＳＰ、ＳＴ及びＳＥに対する特異的死滅能を持ち、前記のような特徴を有する本発明のバクテリオファージを同定し、これをΦＣＪ７と命名し、２００９年８月１４日韓国微生物保存センター(Korean Culture Center of Microorganisms、ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１)に受託番号第ＫＣＣＭ１１０３０Ｐ号で寄託した。
【００３６】
本発明の一実施例によれば、屠鷄場から下水試料を採取し、これを用いて宿主細胞であるＳＥを溶菌するバクテリオファージを分離した。これらがまたＳＧ、ＳＰ及びＳＴを溶菌させることができることを確認した(図２及び表１)。バクテリオファージ(ΦＣＪ７)を電子顕微鏡下で形態学的に観察した結果、形態型Ｂ１のシホウイルス科に属することを確認した(図１)。
【００３７】
タンパク質パターン分析で測定した結果、本発明のバクテリオファージΦＣＪ７は、約３８ｋＤａ、６３ｋＤａ、５２ｋＤａ及び１２ｋＤａの構造タンパク質を持つこととして示された(図３)。
【００３８】
さらに、ゲノム分析は、ΦＣＪ７が約４４．１〜３９．１ｋｂｐの全体のゲノムサイズを持ち(図４)、配列番号１〜４の核酸分子を全体ゲノムの一部として含むことを示した(実施例６)。また、本発明のバクテリオファージの他の種間の遺伝的類似性を比較して測定した結果、現在まで知られているバクテリオファージと非常に低い遺伝的相補性を示すことによって、本発明のバクテリオファージは新規なバクテリオファージであることを確認した(表２)。より具体的に、ΦＣＪ７に対して設計された、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０及び配列番号１１と１２のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った時、得られたＰＣＲ産出物は５００ｂｐ〜３ｋｂｐサイズであった(図５)。
【００３９】
また、ΦＣＪ７をＳＥ、ＳＴ、ＳＧ及びＳＰに感染させた結果から生じた、溶菌斑(ソフトアガーでファージによって細胞が溶菌されて形成される透明な地域)のサイズと濁度などが同一であることを確認した(図２)。
【００４０】
ΦＣＪ７を広範囲なｐＨ、温度及び乾燥下で安定性を調査した。前記バクテリオファージはｐＨ３．０〜１１．０の範囲(図６)及び３７℃〜７０℃の温度範囲にかけて生存する(図７)だけでなく、高温乾燥(１２０℃／７０℃)後でも安定に生存を維持することを確認した(図８)。
【００４１】
また、ΦＣＪ７の宿主細胞範囲に野生分離株ＳＥ、ＳＴ、ＳＧ及びＳＰがまた属することを確認することができた(表３)。
【００４２】
ΦＣＪ７を経口投与した結果、ラットで体重変化なしに維持されたし(図９)、死亡個体数、一般症状(表４)、及び臓器異常(表５)が観察されなかった。
【００４３】
また、家畜農場においてバクテリオファージΦＣＪ７を使用する時、洗浄能実験の結果、陽性対照群として通常の洗浄剤と比較した時、サルモネラ菌を効率的に統制し(表７)、多様な条件下でサルモネラ菌株に対する優れて一貫した死滅能があることを確認した(表７)。
【００４４】
これらのデータは、本発明のバクテリオファージΦＣＪ７がサルモネラ菌を統制することができる多様な製品への適用が容易であるということを意味するものである。
【００４５】
また別の側面から、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含むサルモネラエンテリティディス、サルモネラチフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプローラムからなる群から選択される１つまたは２つ以上のサルモネラ菌に誘発された感染性疾病の予防または治療用組成物に関する。
【００４６】
好ましい一態様において、前記組成物は、抗生剤を含むことができる。
【００４７】
本発明のバクテリオファージは、サルモネラエンテリティディス、サルモネラチフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプローラムに対して特異的死滅能を持つので、前記菌などによって誘発される疾病に対して予防するとかまたは治療するための目的に用いられる。好ましくは、感染性疾病の例は、サルモネラエンテリティディスまたはサルモネラチフィムリウムによるサルモネラ症及びサルモネラ菌食中毒、サルモネラガリナルムによる家禽チフス、及びサルモネラプローラムによる雛白痢を含むことができるが、これに制限されるのではない。
【００４８】
本発明において用語"サルモネラ症"は、サルモネラ菌感染による発熱、頭痛、下痢、及び嘔吐のような症状を言う。すなわち、サルモネラ症は、サルモネラ菌属の細菌による感染を総称し、２つの代表的な症状：腸チフスのような敗血症型；及び食中毒、腸炎、急性菌血症のような急性胃腸炎型を伴う。
【００４９】
本発明において用語"予防"とは、組成物の投与を通して疾病を抑制させるとか発病を遅延させるすべての行為を含むことを意味する。本発明において用語"治療"とは、組成物の投与を通して患者の症状が好転するとか有利に変更されるすべての行為を含むことを意味する。
【００５０】
本発明の前記組成物は、５×１０２〜５×１０１２ｐｆｕ／ｍｌ量のΦＣＪ７を含み、好ましくは１×１０６〜１×１０１０ｐｆｕ／ｍｌ量のΦＣＪ７を含む。
【００５１】
本発明の前記組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、担体とともに製剤化されて食品、医薬品及び飼料添加剤として提供され得る。
【００５２】
本発明において用語"薬学的に許容可能な担体"とは、生物体に著しい刺激を誘発せず、投与された有効成分の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤を言う。液状剤形に製剤化される組成物において、薬剤学的に許容される担体としては、滅菌及び生体適合性に適合しなければならない。例えば、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝生理食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、及びエタノールを含む。これらは単独または任意のその組み合わせで使用され得る。必要によって、抗酸化剤、緩衝額、静菌剤などのような別の通常の添加剤を組成物に添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に混合して、本発明の組成物を水溶液、懸濁液及び乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。
【００５３】
本発明の予防または治療用組成物は、疾患部位に塗布または噴霧を介して局所的に用いることができる。
【００５４】
これとは異なり、本発明の組成物は、経口または非経口経路を通して投与することもできる。非経口経路の場合、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または局部で投与可能である。
【００５５】
本発明の前記組成物の適合した塗布、噴霧または投与用量は、製剤化方法、投与方式、対象になる動物または患者の年齢、体重、性別、症状及び食餌、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応敏感度のような多様な要因を含むことに依存して変わる。熟練された当業者が患者に薬学的組成物を投与する時、正しい医学的判断の範囲内で医師や獣医師によって適合した総１日容量を容易に決定できるということは自明なことである。
【００５６】
本発明の組成物の経口投与用剤形としては、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ、水溶性または乳性懸濁液、粉末または顆粒、エマルジョン、ハードまたはソフトカプセル、シロップまたはエリキシル剤の形態であり得る。錠剤及びカプセルのような経口投与用剤形は、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンのような結合剤、リン酸二カルシウムのような賦形剤、トウモロコシ澱粉またはサツマイモ澱粉のような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマル酸ナトリウムまたはポリエチレングリコールワックスのような潤滑油を含むことができる。カプセル剤形の場合、脂肪油のような液体担体をさらに使用することができる。
【００５７】
本発明の組成物の非経口投与用剤形としては、皮下、静脈または筋肉内経路を介した注射用、坐剤用または呼吸器を経て吸入が可能にさせるエアゾール剤のようなスプレー用に製剤化することができる。注射用剤形は、本発明の組成物を水で安定剤または緩衝剤と共に溶解または懸濁させ、前記溶液または懸濁液をアンプルまたはバイアルの単位形態で積載して製剤化することができる。エアゾール剤のようなスプレー用は、水分散された濃縮物または湿潤粉末が分散するように推進剤などが添加剤とともに配合され得る。
【００５８】
本発明において用語"抗生剤"は、動物に投与されて細菌を死滅させるとかその成長を阻害することができる物質または化合物をいい、防腐剤、殺菌剤、抗菌剤を含むことを意味する。前記動物は人を含む哺乳動物である。本発明のバクテリオファージは、既存の抗生剤に比べてサルモネラ菌に対する特異性が非常に高いので、有益菌に影響せず、特定病源菌だけ死滅させることができる。さらに、本発明のバクテリオファージは薬物耐性を誘導しなくて、製品寿命が長い新規な抗生剤として提供され得る。
【００５９】
さらに別の側面から、本発明は前記バクテリオファージを有効成分として含む家畜用飼料または飲用水に関する。
【００６０】
水産業及び畜産業で飼料添加用抗生剤の使用は、感染予防を意味する。しかし、現在使用可能な飼料添加用抗生剤の大部分は、耐性菌株の発生を誘導することができ、家畜用製品に残留して人に伝染しやすいという問題がある。このような残留抗生剤の摂取は、人病原体の抗生剤耐性を誘発して、結果的に疾病の拡散を招くこともできる。さらに、家畜用飼料に一般的に混合して食べさせる飼料添加用抗生剤の種類が多く、これは多薬剤耐性菌の発生を誘発することができる。したがって、自然親和的なら前記問題を解決するのに十分な飼料添加剤用抗生物質として本発明の前記バクテリオファージを用いることができるのである。
【００６１】
本発明に応じる家畜用飼料は、バクテリオファージを直接添加するとか飼料添加剤形態で別に製造して家畜用飼料に混合させて製造することができる。本発明の家畜用飼料内のバクテリオファージは、液状または乾燥状態であることができ、好ましくは乾燥した粉末として存在する。この点から、本発明のバクテリオファージは、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥または凍結乾燥で乾燥され得るが、本発明にこれらの乾燥工程が制限されるのではない。本発明のバクテリオファージは、粉末として家畜用飼料の総重量に基づいて、０．０５〜１０重量％の量、好ましくは０．１〜２重量％の量で添加され得る。前記家畜用飼料は、本発明のバクテリオファージだけでなく、その保存性を高めることができる通常の他の添加剤などを含むことができる。
【００６２】
本発明の飼料添加剤には、非病原性の別の微生物が添加され得る。添加され得る微生物としては、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素及び糖転化酵素を生産できるバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)、牛の胃のような嫌気的条件で生理的活性及び分解能があるラクトバチルス菌株 (Lactobacillus sp.)、家畜の体重を増加させて牛乳の産乳量を増やし、飼料の消化及び吸収率を高める効果を示すアスペルギルスオリゼー(Aspergillus oryzae)を含む糸状菌(J Animal Sci 43:910-926,1976)及びサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のような酵母(JAnimSci56:735-739,1983)からなる群から選択され得る。
【００６３】
本発明によるΦＣＪ７を含む家畜用飼料には、植物性−ベース飼料としては穀物類、ナッツ類、食品副産物類、海藻類、纎維質類、製薬副産物類、油脂類、澱粉類、ミール(meal)類、及び穀物副産物類、動物性−ベース飼料としてはタンパク質類、無機物類、油脂類、単細胞タンパク質類、動物性プランクトン類、食品廃棄物類を含むことができ、これに限定されたのではない。
【００６４】
本発明によるΦＣＪ７を含む飼料添加剤には、品質低下を防止するために添加する結合剤、乳化剤及び保存剤などがあり、効用増大のために添加するアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、生菌剤、香味剤、非タンパク窒素、珪酸塩剤、緩衝剤、着色剤、抽出剤、及びオリゴ糖などがあり、これに限定されたのではない。
【００６５】
本発明のバクテリオファージを含む飲用水を供給する時、家畜は持続的にその家畜の腸内サルモネラ菌の数字を減少させ得る。その結果として、サルモネラ菌清浄家畜生産ができる。
【００６６】
追加の側面によれば、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む洗浄剤または消毒剤に関する。
【００６７】
前記バクテリオファージを有効成分として含む消毒剤は、例えば、食中毒に対する食品衛生に非常に有用である。具体的に、消毒剤をサルモネラ菌汚染防止の製剤または食品添加物としてのみ用いることだけでなく、サルモネラ菌清浄家畜生産にも使用することができる。サルモネラ菌除去のために消毒剤を生活下水処理場及び家禽畜舍、家畜屠殺場、家畜斃死地域、調理場所と設備、及び任意の家禽活動領域に撒布され得る。
【００６８】
さらに、前記バクテリオファージを有効成分として含む洗浄剤は、既に、または潜在的にサルモネラ菌で汚染可能な皮膚、羽毛などのような生きている家畜の身体部位に使用され得る。
【００６９】
まだ別の側面から、本発明は、サルモネラエンテリティディス、サルモネラチフィムリウム、サルモネラガリナルムまたはサルモネラプローラムに対して特異的死滅能を持つバクテリオファージを必要とする動物に投与する段階を含むサルモネラエンテリティディス、サルモネラチフィムリウム、サルモネラガリナルムまたはサルモネラプローラム誘発された感染性疾病を予防または治療する方法に関する。
【００７０】
さらにもう一つの側面から、本発明は、サルモネラエンテリティディス、サルモネラチフィムリウム、サルモネラガリナルムまたはサルモネラプローラム誘発された疾病の予防または治療用組成物を必要とする動物に投与する段階を含むサルモネラエンテリティディス、サルモネラチフィムリウム、サルモネラガリナルムまたはサルモネラプローラム誘発された感染性疾病を予防または治療する方法に関する。
【００７１】
本発明の前記組成物は、薬学的製剤の形態で動物に投与され得るとか、家畜用飼料または飲用水に混合して動物によって摂取されることができ、好ましくは家畜用飼料混合物としてあり得る。本発明で、前記動物は牛、豚、鶏、家禽類、及び人を含むが、これに制限されるのではない。
【００７２】
目的組職に逹することができる限り、どのような経路、経口または非経口で本発明の組成物が投与され得る。具体的に、本発明の組成物は、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻腔内、及び吸入経路を介して投与され得る。
【００７３】
本発明に応じる疾病の治療方法は、本発明の組成物を薬学的有効量で投与することを含む。総１日容量は、正しい医学的判断の範囲内で医師や獣医師によって決定され得るということは熟練した当業者に自明なことである。与えられた患者に対する治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、患者の年齢、体重、健康状態、性別及び食餌、投与時間と投与経路、組成物の分泌率、治療期間、具体的な組成物とともに使用されるとか使用されない薬物などを含む医薬分野で公知の多様な因子に応じて変化することができる。
【００７４】
以下、実施例を介して本発明をより詳細に説明しようとする。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるのではない。
【発明の実施のための形態】
【００７５】
実施例１：サルモネラ菌バクテリオファージの分離
１−１．バクテリオファージスクリーニング及び単一バクテリオファージ分離
屠鷄場及び辺い下水終末処理場からの試料５０ｍｌのそれぞれを遠心分離管に移して４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄液を０．４５μｍフィルターを用いてろ過した。サルモネラエンテリティディス(以下、"ＳＥ"という)振盪培養液(ＯＤ６００＝２)１５０μｌと１０×Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地(以下、"ＬＢ培地"という、トリップトン１０ｇ；酵母抽出物５ｇ；ＮａＣｌ１０ｇ；最終体積が１Ｌになるように)２ｍｌに試料ろ過液１８ｍｌを混合した。この混合液を３７℃で１８時間培養した後、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上澄液を０．２μｍフィルターを用いてろ過した。別に、０．７％アガー(ｗ／ｖ)３ｍｌ及びＳＥ振盪培養液(ＯＤ６００＝２)１５０μｌを混合してＬＢプレートに注いで固めた。そのプレートの上に試料培養ろ過液１０μｌを塗抹し、引き継いで３７℃で１８時間培養した(０．７％アガーは"トップアガー"として使用しったし、トップアガーでバクテリオファージ溶菌のタイター測定(titration)を行うことをソフトアガーオーバーレイ(soft agar overlay)方法であると定義する)。
【００７６】
ファージ溶菌が生じた試料培養ろ過液を希釈してＳＥ振盪培養液(ＯＤ６００＝２)１５０μｌを混合した後、ソフトアガーオーバーレイ試験を行って単一溶菌斑を得た。１つの溶菌斑は、同一のバクテリオファージからなったとみるので、単一バクテリオファージを分離するために、１つの溶菌斑を取って４００μｌＳＭ溶液(ＮａＣｌ、５．８ｇ；ＭｇＳＯ４７Ｈ２０．２ｇ；１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ(ｐＨ７．５)、５０ｍｌ；Ｈ２Ｏ、最終体積が１Ｌになるように)に溶解し、４時間室温に放置した。分離されたバクテリオファージを大量確保するために単一バクテリオファージ溶液の上澄液１００μｌを取った後、０．７％アガー１２ｍｌとＳＥ振盪培養液５００μｌを混合して、ＬＢプレート(１５０ｍｍ直径)でソフトアガーオーバーレイ試験を実施した。完全に溶菌が生じたプレートに１５ｍｌＳＭ溶液を注いだ後、前記プレートを４時間室温で静かに振盪してトップアガーからバクテリオファージを溶出させた。溶出されたバクテリオファージを含むＳＭ溶液を回収した後、最終体積の１％に相応する量のクロロホルムを添加して１０分間よく混合した。その後、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ここで得られた上澄液を０．２μｍフィルターでろ過し、使用時まで冷蔵保管した。
【００７７】
１−２．バクテリオファージの大量バッチ
選別されたバクテリオファージをＳＥを用いて大量培養した。ＳＥを振盪培養した。１．５×１０１０ｃｆｕ(colony forming unit)になるように分株くて４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、この沈殿物(pellet)を４ｍｌのＳＭ溶液に再懸濁させた。前記再懸濁物にバクテリオファージを７．５×１０７ｐｆｕ(plaque forming unit)で接種し、０．００５のＭＯＩ(multiplicity of infection)に作った後、引き継いで３７℃で２０分間培養した。この溶液を１５０ｍｌＬＢ培地が入っているフラスコに接種した後、５時間３７℃で培養した。最終体積の１％に相応する量のクロロホルムを添加して培養液を２０分間振盪した。ＤＮａｓｅＩとＲＮａｓｅＡをそれぞれ最終濃度１μｇ／ｍｌになるように添加した。前記溶液を３０分間３７℃で放置させた。最終濃度がそれぞれ１Ｍと１０％(ｗ／ｖ)になるようにＮａＣｌとＰＥＧ(polyethylene glycol)を入れた後、４℃で３時間さらに放置させた。前記溶液を４℃で１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離後、上澄液を除去した。５ｍｌのＳＭ溶液で沈殿物を再懸濁させた後、２０分間室温に放置させ、４ｍｌのクロロホルムでよく混合した。４℃で４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上澄液を０．２μｍフィルターでろ過し、グリセロール密度勾配法(密度：４０％、５％グリセロール)を用いた超遠心分離(３５、０００ｒｐｍ、４℃、１時間)を介してΦＣＪ７を精製した。精製したΦＣＪ７は３００μｌのＳＭ溶液に再懸濁し、引き継いでタイターを測定した。前記ΦＣＪ７は２００９年８月１４日韓国微生物保存センター(ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１)に受託番号第ＫＣＣＭ１１０３０Ｐ号として寄託した。
【００７８】
実施例２：ΦＣＪ７のサルモネラ菌感染可否の調査
選別されたバクテリオファージがＳＥの外に他の種のサルモネラ菌に対して溶菌活性を持つのか確認するために他の種のサルモネラ菌に交差感染を試みた。その結果、ΦＣＪ７は、ＳＣ(Salmonella choleraesuis)、ＳＤ(Salmonella derby)、ＳＡ(Salmonella arizonae)及びＳＢ(Salmonella bongori)には感染しなかったが、ＳＥ(Salmonella Enteritidis)、ＳＴ(Salmonella Typhimurium)、ＳＧ(Salmonella Gallinarum)及びＳＰ(Salmonella Pullorum)に感染した(実施例１１参照)。その結果を下記表１及び図２に示した。
【００７９】
【表１】
0005613767.tif 000003
【００８０】
実施例３：バクテリオファージΦＣＪ７の形態
精製されたΦＣＪ７を０．０１％ゼラチン溶液で希釈した後、２．５％グルタルアルデヒド(glutaraldehyde)溶液で固定した。この試料を炭素被覆マイカプレート(carbon-coated mica plate、ｃａ．２．５×２．５ｍｍ)に滴下して１０分間適応させた後、滅菌蒸溜水で洗浄した。カーボンフィルムを銅グリッドに挟んで４％酢酸ウラニルで３０〜６０秒間染色し、乾燥を行った。ＪＥＭ−１０１１透過電子顕微鏡(８０ｋＶ、倍率×１２０、０００〜×２００、０００)で検査し、図１に示すように、精製されたΦＣＪ７は、形態学上に２０面体の頭と長くて非収縮性の尾からなった、形態型Ｂ１のシホウイルス科に属することが分かった。
【００８１】
実施例４：ΦＣＪ７のタンパク質パターン分析
１０１２ｐｆｕ／ｍｌタイターの精製されたΦＣＪ７溶液１５μｌと５×ＳＤＳ試料溶液３μｌを混合した後、５分間加熱した。ΦＣＪ７の全体タンパク質を４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ(Invitrogen社)ゲルにおいて展開した。そして、ゲルをクマシーブル(coomassie blue)で１時間室温で染色した。主要なバンドは、図３に示すように、約３８ｋＤａ、６３ｋＤａ、５２ｋＤａ及び１２ｋＤａで観察された。
【００８２】
実施例５：ΦＣＪ７の全体ゲノムＤＮＡサイズ
超遠心分離を用いてΦＣＪ７のゲノムＤＮＡを抽出した。この点と係わって、精製されたΦＣＪ７培養液にＥＤＴＡ(ethylenediaminetetraacetic acid(ｐＨ８．０))、プロテイナーゼＫ、及びＳＤＳ(sodium dodecyl sulfate)をそれぞれ最終濃度が２０ｍＭ、５０μｇ／ｍｌ、及び０．５％(ｗ／ｖ)になるように添加した後、引き継いで５０℃で１時間培養した。同一量のフェノール(ｐＨ８．０)を添加した後、よく混合した。室温で１２、０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄液を同一量のＰＣＩ(phenol:chloroform:isoamylalhocol＝２５：２４：１)とよく混合した。室温で１２、０００ｒｐｍで１０分間再び遠心分離して生成された上澄液に１／１０体積の３Ｍの酢酸ナトリウムと２倍量の冷たい９５％エタノールを添加した後、−２０℃で１時間放置させた。その後、０℃で１０分間１２、０００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄液を完全に除去した後、ＤＮＡ沈殿物を５０μｌのＴＥ(Tris-EDTA(ｐＨ８．０))に溶解させた。抽出したＤＮＡを１０倍希釈し、ＯＤ２６０で吸光度を測定して濃度を測定した。１μｇ全体ゲノムＤＮＡを１％ＰＦＧＥ(pulse-field gel electrophoresis)アガローズゲルにローディングした後、ＢＩＯＲＡＤ  ＰＦＧＥシステム７番プログラム(size range 25-100kbp; switch time ramp 0.4-2.0 seconds、 linear shape; forward voltage 180V; reverse voltage 120V)を用いて室温で２０時間展開した。ΦＣＪ７のゲノムＤＮＡは図４に示すように、約３９．２ｋｂｐから４４．１ｋｂｐまでの長さだった。
【００８３】
実施例６：ΦＣＪ７の遺伝的分析
精製されたΦＣＪ７の遺伝的分析のために、ΦＣＪ７のゲノムＤＮＡ５μｇをＳｔｕＩとＮｒｕＩ、ＡｆｅＩとＨｉｎＣＩＩ、及びＳｎａＢＩとＰｖｕＩＩ制限酵素で同時に処理(double digestion)した。ベクターｐＣＬ１９２０(Ｐｒｏｍｅｇａ社)をＳｍａＩで切った後、ＣＩＰ(calf intestinal alkaline phosphatase)処理した。Ｔ−ｂｌｕｎｔベクター(Ｓｏｌｇｅｎｔ社)も使用した。切片されたゲノムＤＮＡとベクターの量が３：１になるように合わせて混合した後、１６℃で２時間ライゲーションした。得られた組換えベクターをＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αに形質転換させ、青白選別法のためにそれぞれスペクチノマイシン(spectinomycin)またはカナマイシン及びＸ−ｇａｌ(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)を含むＬＢプレートに付けた。選別されたコロニーをそれぞれの抗生剤が含まれた培養培地で１６時間振盪培養した。そして、プラスミド精製キット(Ｐｒｏｍｅｇａ社)を用いてプラスミドを抽出した。
【００８４】
前記プラスミドなどをＦＴＲ１３５とＦＴＲ１３６(配列番号１３と１４)、及びＭ１３forwardとＭ１３reverse(配列番号１５と１６)プライマーセットを用いてＰＣＲでクローニング可否を確認したし、挿入断片が１ｋｂまたはそれ以上になるサイズのものだけ選択した。前記プライマーセットを用いて塩基配列を分析した。このように得た塩基配列をそれぞれ配列番号１〜４で示し、それぞれは５００ｂｐ〜３ｋｂｐの長さであり、これをＮＣＢＩ  ｂｌａｓｔｘプログラムを用いて配列類似性を分析し、その結果を下記表２に示した。
【００８５】
【表２】
0005613767.tif 000004
【００８６】
実施例７：ΦＣＪ７特異的プライマー配列製作
ΦＣＪ７を同定するために、ΦＣＪ７特異的なプライマーを配列番号１〜４に基づいて製作した。配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０及び配列番号１１と１２をそれぞれプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。０．１μｇのバクテリオファージゲノムＤＮＡと０．５ｐｍｏｌｅのプライマーそれぞれをｐｒｅ−ｍｉｘ(Ｂｉｏｎｅｅｒ社)に添加し、最終体積が２０μｌになるように合わせた。３０サイクルの変性；９４℃３０秒、アニーリング；６０℃３０秒、重合；７２℃１分３０秒でＰＣＲを行った。配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０及び配列番号１１と１２のプライマーセットで全部約５００ｂｐ〜３ｋｂｐ長さのＰＣＲ産物を得た。その結果を図５に示した。
【００８７】
実施例８：バクテリオファージのｐＨ安定性
ΦＣＪ７が鶏の胃腸内低いｐＨ環境で生存できるかどうかを確認するために、広いｐＨ範囲(ｐＨ２．１、２．５、３．０、３．５、４．０、５．５、６．４、６．９、７．４、８．２、９．０、９．８及び１１．０)で安定性を試した。多様なｐＨ溶液(酢酸ナトリウム溶液(ｐＨ４．０、ｐＨ５．５、及びｐＨ６．４)、クエン酸ナトリウム溶液(ｐＨ２．５、ｐＨ３．０及びｐＨ３．５)、リン酸ナトリウム溶液(ｐＨ６．９及びｐＨ７．４)、及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液(ｐＨ８．２、ｐＨ９．０、ｐＨ１０．０及びｐＨ１１．０)を０．２Ｍ濃度を持つように製造した。それぞれのｐＨ溶液１８０μｌとバクテリオファージ溶液(１．０×１０１１ｐｆｕ／ｍｌ)２０μｌを混合して各ｐＨ溶液の濃度が１Ｍになるようにした後、引き継いで２時間室温で培養した。この反応液を段階的に(serially)希釈し、ソフトアガーオーバーレイ方法を用いて各段階の希釈液１０μｌを３７℃で１８時間培養してファージ溶菌のタイターを測定した。０時間のΦＣＪ７のタイターと比較してｐＨに応じるタイター変化測定を介してバクテリオファージのｐＨに対する安定性を確認した。その結果、バクテリオファージはｐＨ３．０まではその活性を失わないで安定性を維持することが分かった。しかし、ｐＨ２．５またはそれ以下のｐＨではその活性を失った。その結果を図６に示した。
【００８８】
実施例９：バクテリオファージの熱安定性
飼料添加剤として用いるために、バクテリオファージの剤形工程で発生する熱に対する安定性試験を行った。この点と係わって、１．０×１０１１ｐｆｕ／ｍｌタイターのΦＣＪ７の溶液２００μｌを３７℃、４５℃、５３℃、６０℃、７０℃または８０℃で０分、１０分、３０分、６０分及び１２０分間培養した。この溶液を段階的に希釈し、ソフトアガーオーバーレイ方法を用いて各段階の希釈液１０μｌを３７℃で１８時間培養してファージ溶菌のタイターを測定した。０時間及び３７℃でのタイターと比較して温度及び露出時間によるタイター変化測定を介してバクテリオファージの熱に対する安定性を確認した。その結果、バクテリオファージは７０℃で２時間までではその活性を失わなかったし、８０℃で１０分露出された時はその活性が少し失ったが、８０℃で１０分以上露出された場合には活性を完全に失ってしまうことを確認することができた。その結果を図７に示した。
【００８９】
実施例１０：バクテリオファージの乾燥耐性
飼料添加剤として用いるために、バクテリオファージの剤形工程で発生する乾燥条件に対する耐性を試した。熱安定性試験から得た結果に基づいて、噴霧乾燥機(Ｌａｂ  Ｐｌａｎｔ社)を用いて乾燥試験を行った。
【００９０】
１．０×１０１１ｐｆｕ／ｍｌタイターのΦＣＪ７の溶液５０ｍｌに安定化剤として作用するデキストリンと砂糖をそれぞれ４０％(ｗ／ｖ)と２％(ｗ／ｖ)の量で添加した。得られた溶液を入口温度及び出口温度をそれぞれ１２０℃及び７０℃に維持して噴霧乾燥機内部に噴射させた。その後、得られた粉末０．３ｇを２ｍｌのＳＭ溶液に再懸濁させた後、タイター値を測定した。乾燥後、乾燥前のタイターと比較した時、バクテリオファージは活性が全然減少しないことが分かった。その結果を図８に示した。
【００９１】
実施例１１：バクテリオファージの野生分離株に対する感染の範囲
ΦＣＪ７が本発明で使用されたＳＥ(ＳＧＳＣ  ＳＥ２２８２)、ＳＴ(ＡＴＣＣ  ＳＴ１４０２８)、ＳＧ(ＳＧＳＣ  ＳＧ２２９３)、及びＳＰ(ＳＧＳＣ  ＳＰ２２９５)菌株の他にさらに、韓国ソウル大学校獣医科大学鳥類疾病学室、国立獣医科学検疫院及び疾病管理本部から入手した韓国の野生分離株サルモネラエンテリティディス(３６株)、サルモネラチフィムリウム(２２株)、サルモネラガリナルム(５６株)、サルモネラプローラム(１９株)、サルモネラコレレスイス(２株)、サルモネラダービー(４株)及びサルモネラアリゾナ(１株)とサルモネラボンゴール(１株)に対して溶菌活性があるかどうかを試した。各菌株の振盪培養液(ＯＤ６００＝２)１５０μｌを混合し、ソフトアガーオーバーレイ方法を用いてΦＣＪ７の溶液(１０１０ｐｆｕ／ｍｌ)１０μｌを３７℃で１８時間培養して溶菌斑形成有無を観察した。ＳＥ、ＳＴ、ＳＧ及びＳＰのすべてに対してバクテリオファージΦＣＪ７が９４％の溶菌活性を示すことを確認することができた。その結果を下記表３に要約した。
【００９２】
【表３】
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【００９３】
実施例１２：バクテリオファージの毒性試験
サルモネラ症、サルモネラ菌食中毒、家禽チフス及び雛白痢予防用バクテリオファージで安全使用のために、生体内(in vivo)毒性試験を行った。毒性試験は単回経口投与で行なわれた。この試験は、ラットに単回のΦＣＪ７を経口投与し、おおよそのΦＣＪ７の致死濃度を確認するために急性毒性を調査した。このために、特定病原体不在(ＳＰＦ)ラット(ＳＤ)７週齢雄と雌のそれぞれ１０匹をΦＣＪ７投与前２４時間絶食させた。投与当日、経口投与用ゾンデ(sonde)を用いて１×１０１２ｐｆｕ／ｍｌタイターのΦＣＪ７を雄と雌のそれぞれ５匹に１０ｍｌ／ｋｇ量で経口投与する一方、対照群として５匹には２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌと２ｍＭＭｇＣｌ２混合溶液を経口投与する。経口投与した後４時間後にラットに飼料を提供した。投与当日には投与後３０分に観察を始めて４時間まで毎時間観察した。その時から、１４日間は１日１回一般症状を調査した。死亡個体は発生しなかった。ΦＣＪ７による毒性症状と目立っている臨床症状も発生しなかった。その結果は、下記表４と表５に要約した。投与前、投与後１、３、７、１０及び１４日に体重を測定して記録した。有意性のある体重変化の差は観察されず、ΦＣＪ７が食欲を減少させるとか体重を変化させるのに十分な毒性反応を誘発しないことが分かった。この結果は、図９に示した。剖検して肉眼ですべての臓器を検査した結果、目立っている異常は観察されなかった。したがって、新規なバクテリオファージΦＣＪ７は、毒性がないことを確認することができた。
【００９４】
【表４】
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【表５】
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ａ：異常が検出されない
【００９５】
実施例１３：バクテリオファージの効能
サルモネラ菌−誘発された疾病に対する予防及び治療使用のためのΦＣＪ７の効能を評価するために、サルモネラ菌感染に対して厳格な条件で飼育されている種鶏２万匹の養鶏農場でバクテリオファージのサルモネラ菌統制の可能性を試した。
【００９６】
ΦＣＪ７を１０６ｐｆｕｌ濃度で含む飲用水を総２５日供給した。１次で１７日間供給した。その後、２次で再びΦＣＪ７を含む飲用水を８日間供給する前にΦＣＪ７がない飲用水を１０日間供給した。ΦＣＪ７供給前後でねわら、ほこりを介するサルモネラ菌環境モニタリングと雛、羽毛、卵殻を介した発生サンプルサルモネラ菌環境モニタリングを行った。ΦＣＪ７を供給する以前に孵化場羽毛及び雛でサルモネラ菌が検出されたし、これはサルモネラ菌を厳格に統制するといっても実際に大きい農場ではサルモネラ菌の統制が易しくないということが分かった。対照的に、ΦＣＪ７を供給した後には持続的にサルモネラ菌が環境及び発生サンプルで検出されなかった。したがって、飲用水の形態でΦＣＪ７の供給時にサルモネラ菌排出抑制及びサルモネラ菌統制効能を示すことが分かった。その結果を下記表６に要約して示した。
【００９７】
【表６】
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【００９８】
実施例１４：バクテリオファージの消毒効能
サルモネラ菌に対する洗浄剤としてのバクテリオファージの効能を評価した。軽水、有機物、及び牛乳の条件下でハラソル(畜舎、築堤及び飲用水消毒剤、次亜塩素酸ナトリウム４．６％、柳韓洋行)を対照群として使用して比較した。
【００９９】
１０９ｐｆｕ／ｍｌタイターを持つΦＣＪ７、ハラソル(次亜塩素酸ナトリウム４．６％)、そして、ＳＥ菌株を準備した。Ｏ．Ｄ．＝０．５になるように培養した後、ＳＥを軽水で５倍希釈し、Ｏ．Ｄ．が０．１になるようにした。それぞれ５０ｍｌの軽水、有機物希釈液、または軽水＋牛乳２０％希釈液を含む２５０ｍｌフラスコを２つ準備した。一つのフラスコに１０７ｐｆｕ量のバクテリオファージを添加する一方、他の一つにハラソル１／２４０希釈液を添加した。それぞれのフラスコにＯ．Ｄ．＝０．１である菌株培養液を２ｍｌずつ添加した後、引き継いで３７℃で２００ｒｐｍの条件で培養しながら０．５時間、２．５時間、６時間、及び１０時間目にサンプリングした。この試料を段階的に希釈してＬＢプレートに塗抹した。その後、死滅能を確認するために３７℃で１８時間培養して細胞を数えた。軽水の使用時、既存の消毒剤の場合、条件に応じて抗菌力偏差が非常に大きく示された。対照的に、バクテリオファージの場合、多様な条件でも抗菌力が均一に示された。この結果は図１０に示した。
【０１００】
実施例１５：バクテリオファージの洗浄効能
肉加工洗浄剤として使用するために、バクテリオファージのサルモネラ菌統制能力を評価するために、既存の洗浄剤(４〜６％の次亜塩素酸ナトリウム)と比較する試験を行った。この点と係わって、ストアで鶏の胸肉塊５０ｇを購買した。ＳＥ振盪培養液(Ｏ．Ｄ．＝２)を１０８ｃｆｕ／ｍｌ濃度に調節した後、鶏胸肉塊当り２００μｌを均一に塗布して室温で１２分間乾燥させた。バクテリオファージΦＣＪ７は１０９ｐｆｕ／ｌ、１０１０ｐｆｕ／ｌ、及び１０１１ｐｆｕ／ｌ濃度で入れたし、洗浄剤塩素は、噴霧器内５０ｐｐｍ濃度で合わせてそれぞれの噴霧器に５０ｐｐｍずつ入れた。１回／秒の速度で１０秒間噴霧した。処理された鶏の胸肉塊はそれぞれの衛生パックに入れ、そして、３０ｍｌのＳＭ溶液を添加した。  そのパックを半円を描きながら振盪した。得られたＷＣＲ(whole carcass rinse)を段階的に希釈し、その希釈液をＬＢ培地に塗抹した後、引き継いでＳＥ数を確認するために３７℃で１８時間培養した。それらでそれぞれ処理した直後、洗浄剤にはまだサルモネラ菌が残っていることを確認した。しかし、バクテリオファージΦＣＪ７は非常に効果が良いことを確認することができた。さらに、時間の経過によって、前記化学物に比べて前記バクテリオファージは持続的に洗浄能を示した。この結果は、下記表７に要約して示した。
【０１０１】
【表７】
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【産業上利用の可能性】
【０１０２】
本発明の新規なバクテリオファージは、サルモネラエンテリティディス(ＳＥ)、サルモネラチフィムリウム(ＳＴ)、サルモネラガリナルム(ＳＧ)及びサルモネラプローラム(ＳＰ)からなる群から選択される１つまたはそれ以上のサルモネラ属菌に対して特異的死滅能を持ち、有益菌は死滅させず、さらに優れた耐酸性、耐熱性及び耐乾性を示すので、今まで記載されたように、サルモネラエンテリティディス、サルモネラチフィムリウム、サルモネラガリナルムまたはサルモネラプローラムによって誘発されるサルモネラ症、サルモネラ菌食中毒、家禽チフス、及び雛白痢を含む感染性疾病を予防及び治療する目的で治療剤、家畜用飼料または家畜用飲用水、洗浄剤及び消毒剤などに有効成分として広く利用され得る。
【０１０３】
例示的な説明の目的のために、本発明の好ましい態様を記述したが、付随の特許請求の範囲に記述された本発明の範囲と精神から逸脱せず、熟練された当業者が多様な変形、添加及び置換が可能であるということは自明である。
【化２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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