(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体試料中のsmall，dense LDLコレステロール定量方法であって、
(1)スフィンゴミエリナーゼの存在下でsmall，dense LDL以外のLDL中のコレステロールを消去する工程と、
(2)次いで、残存するsmall, dense LDL中のコレステロールを定量する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
工程(1)で用いるスフィンゴミエリナーゼの濃度が、0.1〜100U/mLであることを特徴とする請求項１に記載のsmall，dense LDLコレステロール定量方法。
【請求項３】
工程(2)において、少なくともsmall，dense LDLに作用する界面活性剤の存在下にコレステロール測定用酵素が添加されることを特徴とする、請求項１または２に記載のsmall，dense LDLコレステロール定量方法。
【請求項４】
工程(2)で用いられる少なくともsmall，dense LDLに作用する界面活性剤が全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤であることを特徴とする請求項３に記載のsmall，dense LDLコレステロール定量方法。
【請求項５】
工程(2)で用いられる少なくともsmall，dense LDLに作用する界面活性剤がポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体、またはHLBが11以上14未満であるポリオキシエチレン誘導体であることを特徴とする請求項３または４に記載のsmall，dense LDLコレステロール定量方法。
【請求項６】
工程(2)の前であって、工程(1)と同時に、または工程(1)の前もしくは後に、
(a)コレステロールエステラーゼの存在下で被検体試料中のLDL以外のリポ蛋白中コレステロールを消去する工程、
をさらに含むことを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載のsmall，dense LDLコレステロール定量方法。
【請求項７】
工程(a)で用いるコレステロールエステラーゼの濃度が0.01〜10Ｕ/mLであることを特徴とする請求項６に記載のsmall，dense LDLコレステロール定量方法。
【請求項８】
工程(a)において、さらにLDL以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤を添加する請求項６または７に記載のsmall，dense LDLコレステロール定量方法。
【請求項９】
工程(a)で用いる界面活性剤の濃度が0.05〜1.0％(w/v)であることを特徴とする請求項８に記載のsmall，dense LDLコレステロール定量方法。
【請求項１０】
工程(a)において、さらにコレステロールオキシダーゼおよびカタラーゼを添加する、請求項６から９のいずれか１項に記載のsmall，dense LDLコレステロール定量方法。
【請求項１１】
工程(a)において、さらにコレステロールオキシダーゼおよび４アミノアンチピリンを添加する、請求項６から９のいずれか１項に記載のsmall，dense LDLコレステロール定量方法。
【請求項１２】
工程(a)および工程(1)の反応が同一の溶液中で同時に行われることを特徴とする請求項６から１１のいずれか１項に記載のsmall，dense LDLコレステロール定量方法。
【請求項１３】
工程(a)で用いる界面活性剤が、ポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキルアミンからなる群から選択される非イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキル硫酸塩、アミドエーテル硫酸塩、アルキルタウリン酸塩およびリン酸エステル型からなる群から選択される陰イオン界面活性剤、アルキルメチルアンモニウム塩、第四級アンモニウム塩およびモノ直鎖アルキル型からなる群から選択される陽イオン界面活性剤、またはラウリルベタイン、ジメチルアルキルベタイン、イミダゾリン型及びアルキルジアミノエチルグリシンナトリウムからなる群から選択される両性界面活性剤であることを特徴とする請求項６から１２のいずれか１項に記載のsmall，dense LDLコレステロール定量方法。
【請求項１４】
少なくとも以下の２種類の試薬組成物を含む、small,dense LDLコレステロール定量用キット：
(i)  少なくともsmall，dense LDL以外のLDLに反応するスフィンゴミエリナーゼが含まれ、被検体中のsmall，dense LDL以外のLDL中のコレステロールを消去するための試薬組成物；
(ii)  small,dense LDLを測定するための、small,dense LDLのみに反応するポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体である界面活性剤、またはHLBが11以上14未満のポリオキシエチレン誘導体である界面活性剤、４アミノアンチピリンおよびペルオキシダーゼを含む試薬組成物。
【請求項１５】
さらに、(iii)  少なくともポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキルアミンからなる群から選択される非イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキル硫酸塩、アミドエーテル硫酸塩、アルキルタウリン酸塩およびリン酸エステル型からなる群から選択される陰イオン界面活性剤、アルキルメチルアンモニウム塩、第四級アンモニウム塩およびモノ直鎖アルキル型からなる群から選択される陽イオン界面活性剤、またはラウリルベタイン、ジメチルアルキルベタイン、イミダゾリン型及びアルキルジアミノエチルグリシンナトリウムからなる群から選択される両性界面活性剤が含まれ、LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するための試薬組成物を含み、少なくとも３つの試薬組成物を含む請求項１４記載のsmall,dense LDLコレステロール定量用キット。
【請求項１６】
(i)の試薬組成物にさらに、少なくともポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキルアミンからなる群から選択される非イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキル硫酸塩、アミドエーテル硫酸塩、アルキルタウリン酸塩およびリン酸エステル型からなる群から選択される陰イオン界面活性剤、アルキルメチルアンモニウム塩、第四級アンモニウム塩およびモノ直鎖アルキル型からなる群から選択される陽イオン界面活性剤、またはラウリルベタイン、ジメチルアルキルベタイン、イミダゾリン型及びアルキルジアミノエチルグリシンナトリウムからなる群から選択される両性界面活性剤が含まれ、(i)の試薬組成物により被検体中のsmall,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールが消去される、請求項１４記載のsmall,dense LDLコレステロール定量用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈硬化の診断に重要なsmall,dense LDL中のコレステロール測定方法および試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
コレステロールは細胞の主要な構成成分の１つだが、過剰なコレステロールは血管の内皮細胞下でマクロファージに取り込まれることにより泡沫細胞が形成され、動脈硬化の初期病変を呈することから臨床的に重要な成分である。低比重リポ蛋白（LDL）は血液中におけるコレステロール運搬の主役であり、動脈硬化性疾患の危険因子であるが、LDLの中でも特に粒子サイズが小さく平均的なLDLより高比重な、小粒子高比重LDL（small,dense LDL）は動脈硬化惹起性が通常のLDLより数倍高くなることが知られている。small,dense LDLの増加は動脈硬化性疾患の主要な危険因子の１つであり、分別測定することは臨床上極めて重要である。【０００３】
従来のsmall,dense LDL測定法は、超遠心法、電気泳動法、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法などがあるが、この方法は高価な設備を必要とし、測定に非常に時間を要するため簡便ではない。【０００４】
自動分析装置を用いてsmall,dense LDLを測定する方法としては、イオン強度の差により小粒子LDLを混濁または溶解させ吸光度の差により小粒子LDLを測定する方法（特許文献１を参照）がある。しかし、この方法では濁りによる吸光度差を測定しているため、small,dense LDL中のコレステロールを測定することが出来ず、また特異性や精度が不十分であった。【０００５】
また、small,dense LDL中のコレステロールや中性脂肪を、ポリアニオンと二価陽イオンからなる分離剤と自動分析装置対応の試薬の組み合わせて測定する方法（特許文献２を参照）が知られている。この方法では、超遠心法や電気泳動法に比べ簡便にsmall,dense LDL中の脂質成分が測定でき、特異性や精度に優れているが、検体を前処理しLDLをsmall,dense LDLとそれ以外のLDLに分離する操作が必要であった。
【特許文献１】特開2003-28882号公報
【特許文献２】国際公開第WO2004/053500号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、検体の前処理操作をすることなしに、迅速かつ簡便な特異性に優れた分析を可能にする、自動分析装置対応のsmall,dense LDLの分別測定方法及び測定用試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは鋭意研究の結果、新規なsmall,dense LDLの測定法を完成させた。すなわち、種々のリポ蛋白を含有する被検体試料中のコレステロールをコレステロールエステラーゼならびにコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼにて測定する際、特定の基質に特異的に反応するホスフォリパーゼを用いることにより、small,dense LDLに対する酵素の反応速度に対しsmall，dense LDL以外のLDLに対する酵素の反応速度が増加し、カタラーゼや４アミノアンチピリンにより、small,dense LDL以外のLDL中コレステロールを消去し反応系外に導くことができた。この後にコレステロール測定用酵素を用いた酵素反応を行わせることにより、LDLの中でもsmall，dense LDLのコレステロールを測定することができた。さらにHDLやVLDL等のLDL以外のリポ蛋白に反応する特定の界面活性剤をsmall,dense LDL以外のLDLを反応系外に導く反応の前または後に加えると、該特定の界面活性剤とLDL以外のHDLやVLDL等のリポ蛋白が反応し、カタラーゼや４アミノアンチピリンにより、HDLやVLDL中のコレステロールを消去し反応系外に導くことができた。このsmall,dense LDL以外のLDLを消去する反応と、HDLやVLDL等のリポ蛋白を特定の界面活性剤と反応させHDLやVLDL中のコレステロールを消去させる反応を併せて行うことにより、small,dense LDL以外のリポ蛋白を消去させ反応系外に導くことができた。そして残ったsmall,dense LDLをコレステロール測定用酵素と反応させることによりsmall,dense LDL中のコレステロールのみを分別測定することに成功した。また、さらに界面活性剤の種類や酵素濃度を特定することにより、上記small,dense LDL以外のリポ蛋白を消去し反応系外に導く反応とHDLやVLDL中のコレステロールを消去し反応系外に導く反応を同一溶液中にて同時に行わせることに成功し、本発明を完成させるに至った。【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。【０００９】
[１]  被検体試料中のsmall，dense LDLコレステロール定量方法であって、
(1)ホスフォリパーゼの存在下でsmall，dense LDL以外のLDL中のコレステロールを消去する工程と、
(2)次いで、small, dense LDL中のコレステロールを定量する工程、
を含むことを特徴とする方法。【００１０】
[２]  工程(1)で用いるホスフォリパーゼがリポ蛋白中に存在するリン脂質中の少なくともスフィンゴミエリン、および／またはホスファチジルイノシトールに対する反応性が高いことを特徴とする、[１]のsmall，dense LDLコレステロール定量方法。【００１１】
[３]  工程(1)で用いるホスフォリパーゼの濃度が、0.1〜100U/mLであることを特徴とする[１]または[２]のsmall，dense LDLコレステロール定量方法。【００１２】
[４]  工程(2)において、少なくともsmall，dense LDLに作用する界面活性剤の存在下にコレステロール測定用酵素が添加されることを特徴とする、[１]から[３]のいずれかのsmall，dense LDLコレステロール定量方法。【００１３】
[５]  工程(2)で用いられる少なくともsmall，dense LDLに作用する界面活性剤が全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤であることを特徴とする[４]のsmall，dense LDLコレステロール定量方法。【００１４】
[６]  工程(2)で用いられる少なくともsmall，dense LDLに作用する界面活性剤がポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体、またはHLBが11以上14未満であるポリオキシエチレン誘導体であることを特徴とする[４]または[５]のsmall，dense LDLコレステロール定量方法。【００１５】
[７]  工程(2)の前であって、工程(1)と同時に、または工程(1)の前もしくは後に、
(a) コレステロールエステラーゼの存在下で被検体試料中のLDL以外のリポ蛋白中コレステロールを消去する工程、
をさらに含むことを特徴とする[１]から[６]のいずれかのsmall，dense LDLコレステロール定量方法。【００１６】
[８]  工程(a)で用いるコレステロールエステラーゼの濃度が0.01〜10Ｕ/mLであることを特徴とする[７]のsmall，dense LDLコレステロール定量方法。【００１７】
[９]  工程(a)において、さらにLDL以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤を添加する[７]または[８]のsmall，dense LDLコレステロール定量方法。【００１８】
[１０]  工程(a)で用いる界面活性剤の濃度が0.05〜1.0％であることを特徴とする[９]のsmall，dense LDLコレステロール定量方法。【００１９】
[１１]  工程(a)において、さらにコレステロールオキシダーゼおよびカタラーゼを添加する、[７]から[１０]のいずれかのsmall，dense LDLコレステロール定量方法。【００２０】
[１２]  工程(a)において、さらに４アミノアンチピリンを添加する、[７]から[１０]のいずれかのsmall，dense LDLコレステロール定量方法。【００２１】
[１３]  工程(a)および工程(1)の反応が同一の溶液中で同時に行われることを特徴とする[７]から[１２]のいずれかのsmall，dense LDLコレステロール定量方法。【００２２】
[１４]  工程(a)で用いる界面活性剤が、ポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキルアミンからなる群から選択される非イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキル硫酸塩、アミドエーテル硫酸塩、アルキルタウリン酸塩およびリン酸エステル型からなる群から選択される陰イオン界面活性剤、アルキルメチルアンモニウム塩、第四級アンモニウム塩およびモノ直鎖アルキル型からなる群から選択される陽イオン界面活性剤、またはラウリルベタイン、ジメチルアルキルベタイン、イミダゾリン型及びアルキルジアミノエチルグリシンナトリウムからなる群から選択される両性界面活性剤であることを特徴とする[７]から[１３]のいずれかのsmall，dense LDLコレステロール定量方法。【００２３】
[１５]  少なくとも以下の２種類の試薬組成物を含む、small,dense LDLコレステロール定量用キット：
(i)  少なくともsmall，dense LDL以外のLDLに反応するホスフォリパーゼが含まれ、被検体中のsmall，dense LDL以外のLDL中のコレステロールを消去するための試薬組成物；
(ii)  small,dense LDLを測定するための、small,dense LDLのみに反応するポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体である界面活性剤、またはHLBが11以上14未満のポリオキシエチレン誘導体である界面活性剤、４アミノアンチピリンおよびペルオキシダーゼを含む試薬組成物。【００２４】
[１６]  さらに、(iii)  少なくともポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキルアミンからなる群から選択される非イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキル硫酸塩、アミドエーテル硫酸塩、アルキルタウリン酸塩およびリン酸エステル型からなる群から選択される陰イオン界面活性剤、アルキルメチルアンモニウム塩、第四級アンモニウム塩およびモノ直鎖アルキル型からなる群から選択される陽イオン界面活性剤、またはラウリルベタイン、ジメチルアルキルベタイン、イミダゾリン型及びアルキルジアミノエチルグリシンナトリウムからなる群から選択される両性界面活性剤が含まれ、LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するための試薬組成物を含み、少なくとも３つの試薬組成物を含む[１５]のsmall,dense LDLコレステロール定量用キット。【００２５】
[１７]  (i)の試薬組成物にさらに、少なくともポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキルアミンからなる群から選択される非イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキル硫酸塩、アミドエーテル硫酸塩、アルキルタウリン酸塩およびリン酸エステル型からなる群から選択される陰イオン界面活性剤、アルキルメチルアンモニウム塩、第四級アンモニウム塩およびモノ直鎖アルキル型からなる群から選択される陽イオン界面活性剤、またはラウリルベタイン、ジメチルアルキルベタイン、イミダゾリン型及びアルキルジアミノエチルグリシンナトリウムからなる群から選択される両性界面活性剤が含まれ、(i)の試薬組成物により被検体中のsmall,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールが消去される、[１５]のsmall,dense LDLコレステロール定量用キット。【００２６】
[１８]  ホスフォリパーゼがリポ蛋白中に存在するリン脂質中の少なくともスフィンゴミエリン、および／またはホスファチジルイノシトールに対する反応性が高いホスフォリパーゼである、[１５]から[１７]のいずれかのsmall,dense LDLコレステロール定量用キット。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の特定の界面活性剤、ホスフォリパーゼを含む試薬をリポ蛋白質を含む被検体試料に添加することにより、リポ蛋白中のsmall,dense LDLをフィルターや遠心分離を用いた分離操作をすることなく、直接、選択的に測定することができる。【００２８】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2007-264908号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程が最初の工程である３つの工程を含み、ホスフォリパーゼとしてホスフォリパーゼＡ２を用いる本発明の方法とsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法の相関を示す図である。
【図２】LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程が最初の工程である３つの工程を含み、ホスフォリパーゼとしてホスフォリパーゼＣを用いる本発明の方法とsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法の相関を示す図である。
【図３】LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程が最初の工程である３つの工程を含み、ホスフォリパーゼとしてホスフォリパーゼＤを用いる本発明の方法とsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法の相関を示す図である。
【図４】LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程が最初の工程である３つの工程を含み、ホスフォリパーゼとしてリゾホスフォリパーゼを用いる本発明の方法とsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法の相関を示す図である。
【図５】３つの工程を含み、ホスフォリパーゼとしてGlycerophospholipidに特異的なホスフォリパーゼを用いる本発明の方法とsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法の相関を示す図である。
【図６】LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程が最初の工程である３つの工程を含み、ホスフォリパーゼとしてスフィンゴミエリナーゼを用いる本発明の方法とsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法の相関を示す図である。
【図７】LDLのうちsmall, dense LDL以外のLDL（L LDL)中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程が最初の工程である３つの工程を含み、ホスフォリパーゼとしてスフィンゴミエリナーゼを用いる本発明の方法とsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法の相関を示す図である。
【図８】２つの工程を含み、ホスフォリパーゼとしてスフィンゴミエリナーゼを用い、界面活性剤としてエマルゲンB-66およびエマルゲンA-90を用いる本発明の方法とsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法の相関を示す図である。
【図９】３つの工程を含み、ホスフォリパーゼとしてスフィンゴミエリナーゼを用い、界面活性剤としてエマルゲンB-66を用いる本発明の方法とsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法の相関を示す図である。
【図１０】２つの工程を含み、ホスフォリパーゼとしてスフィンゴミエリナーゼを用い、界面活性剤としてエマルゲンA-90を用いる本発明の方法とsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法の相関を示す図である。
【図１１】２つの工程を含み、ホスフォリパーゼとしてスフィンゴミエリナーゼを用い、界面活性剤を用いない本発明の方法とsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法の相関を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、本発明について詳細に説明する。【００３１】
リポ蛋白は大きくVLDL、LDLおよびHDLの分画に分けられ、LDLはさらにsmall,dense LDLとそれ以外の亜分画に分けられる。small,dense LDLを小粒子LDL 、SLDL(small LDL)、dense LDL、sd LDLと呼ぶこともあり、またそれ以外のLDLをL LDL(large LDL)、Light LDLと呼ぶこともある。これらの分画および亜分画は、粒子サイズまたは比重により区別できる。その粒子サイズの直径は、報告者により異なるがVLDLが30nm〜80nm（30nm〜75nm）で、LDLが22nm〜28nm(19nm〜30nm)、HDLが直径７〜10nmである。比重は、VLDLが1.006以下、LDLが1.019〜1.063、HDLが1.063〜1.21である。LDL粒子直径はグラジエントゲル電気泳動（GGE）(JAMA, 260, p.1917-21, 1988)、NMR（HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2ndEdition、 Nader Rifai他編、p.609-623、AACC PRESS：TheFats of Life Summer 2002、LVDD 15 YEAR ANNIVERSARY ISSUE、Volume AVI No.3、p.15-16）により測定でき、比重は超遠心分離による分析(Atherosclerosis, 106, p.241-253, 1994: Atherosclerosis, 83, p.59, 1990)に基づいて決定できる。【００３２】
本発明の方法で測定しようとするsmall,dense LDLは、一般的にはLDL画分のうち直径が約22.0〜約25.5nmの亜分画、比重1.040〜1.063の亜分画を指す。LDLを大きさにより亜分画に分けているのは、LDLのうち粒子径が小さいものが動脈硬化惹起性が高く、LDLの中でもより悪性度が高いので、LDLの中でも小さいものを分別測定する必要があったからである。LDL内で直径分布や比重分布は連続しており、比重がどの程度以上のものが特に悪性度が高いというように明確に区別できるものではない。従って、上記の比重1.040〜1.063という値もsmall,dense LDLの特性として確立したものではなく、広く用いられており確立した値といえるLDLの比重範囲1.019〜1.063を中央点で分けたものである。例えば、別の報告では1.044〜1.060に分画される（Atherosclerosis:106 241-253 1994）。small,dense LDLの比重をどの範囲にするかは、報告者により若干の違いがあるが、いずれもその範囲で分別した場合のsmall,dense LDLの存在が臨床的な悪性度と関連している。【００３３】
本発明において、small,dense LDLという場合、LDLのうち比重が大きいものであって、臨床的に動脈硬化惹起性がそれ以外のLDLよりも大きいもの、好ましくはLDLの比重範囲のうち中央点より上の比重範囲に属するもの、さらに好ましくは比重1.044〜1.063の範囲に属するLDLをいう。また、LDL以外のリポ蛋白という場合、VLDL、HDLを指し、さらにカイロミクロン、IDL(intemediatedensity lipoprotein)、VHDL(very high density lipoprotein)を含めることもある。
【００３４】
本発明の方法は、LDLのうちsmall, dense LDL以外のLDL（L LDL)中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程、LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程およびsmall, dense LDLを測定する工程を含む。【００３５】
上記LDLのうちsmall, dense LDL以外のLDL（L LDL)中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程、LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程では、それぞれsmall, dense LDL以外のLDL（L LDL)中のコレステロールやLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する代わりに、それらを反応系外に導くための好適な技術を用いることもできる。具体的には、HDLやVLDL、L LDLなどに含まれるコレステロールがsmall,dense LDLコレステロールの定量に影響を及ぼさないように、HDL、VLDL、L LDLなどに含まれるコレステロールを凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりする等の公知の技術を用いて、反応系外に導くことが可能である。【００３６】
LDLのうちsmall, dense LDL以外のLDL（L LDL)中のコレステロールを反応系外に導く工程においては、同工程のsmall, dense LDL以外のLDL（L LDL)中のコレステロールが反応系外に導かれる反応とは別の反応が起こることが考えられる。その別の反応が本発明の目的であるsmall, dense LDLの分別測定に影響を与えないのであれば、本発明の方法においてその別の反応は許容できる。別の反応としては、例えば、LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールが反応系外に導かれる反応があるが、これは通常、small, dense LDLの分別測定に影響を与えないため許容できる。【００３７】
本発明の方法は通常、自動分析装置内で行われる。【００３８】
本発明の方法のsmall，dense LDL以外のLDL（Large LDL；L LDL）中のコレステロールを消去し、反応系外に導くための工程においては、ホスフォリパーゼを用いる。ホスフォリパーゼとL LDLとの反応速度は、small,dense LDLとの反応速度よりも大きいので、ホスフォリパーゼはLDL中のL LDLを基質とした場合の酵素反応速度を選択的に上昇させる。ホスフォリパーゼとはリン脂質に反応する酵素の総称であり、ホスフォリパーゼＡ２、ホスフォリパーゼＣ、ホスフォリパーゼＤ等が存在するが、本発明ではいずれのホスフォリパーゼも用いることができる。さらに本発明では、リン脂質の中でもスフィンゴミエリンに対する反応性（スフィンゴミエリナーゼ活性）の高いホスフォリパーゼ（スフィンゴミエリナーゼ）、ホスファチジルイノシトールに対する反応性の高いホスフォリパーゼ等を好適に用いることができる。上記スフィンゴミエリンに対する反応性（スフィンゴミエリナーゼ活性）の高いホスフォリパーゼ、ホスファチジルイノシトールに対する反応性の高いホスフォリパーゼ等は、その他のリン脂質であるホスファチジルコリン等に対する活性を有していてもよい。上記ホスフォリパーゼの試薬中濃度は0.1〜100U/mLが好ましく、0.2〜20U/mLがより好ましい。反応時の反応液中の濃度は、0.05〜100U/mLが好ましく、0.1〜20U/mLがより好ましい。また、スフィンゴミエリナーゼ活性の高いホスフォリパーゼおよび／またはホスファチジルイノシトールに対する反応性の高いホスフォリパーゼに加えて、ホスフォリパーゼＡ２、ホスフォリパーゼＤ、リゾホスフォリパーゼ等の他のホスフォリパーゼを併せて用いることができる。上記ホスフォリパーゼとしては、スフィンゴミエリンに対する特異性の高いホスフォリパーゼ、ホスファチジルイノシトールに対する特異性の高いホスフォリパーゼが好適に用いることができる。ホスフォリパーゼは細菌や酵母、またはヒト胎盤由来のものを用いることが好ましい。ホスフォリパーゼの好ましい具体例としては、PLA2、PLC、PLD、LYPL、PLDP、SPC、PI-PLC（旭化成社製）、Sphingomyelinase from bacillus cereus、Sphingomyelinase from staphylococcus aureus、phospholipase C,Phosphatidylinositol-specific from bacillus cereus （SIGMA社製）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００３９】
L LDL中のコレステロールを消去する工程には、界面活性剤を用いても用いなくてもよい。好適な界面活性剤を用いれば、L LDL中のコレステロールの消去を促進することができる。界面活性剤を用いる場合は、下記のLDL以外のVLDL、HDLなどのリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程で用いる界面活性剤と同じものを好適に用いることができる。また、それとは異なる好適な界面活性剤を添加しても良い。【００４０】
LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程が、L LDL中のコレステロールを消去する工程に先立って実施される場合は、LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程での各成分がL LDL中のコレステロールを消去する工程にそのまま持ち越されるため、LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するために用いた界面活性剤をL LDL中のコレステロールを消去する工程でも使用することができる。【００４１】
上記のL LDL中のコレステロールを消去する工程においては、ホスフォリパーゼの存在下でコレステロールエステラーゼがL LDLに作用し、生じたコレステロールを、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ等のコレステロールと反応する酵素の存在下で反応させ消去することにより、L LDL中コレステロールを反応系外へ導く。L LDL中のコレステロールを消去する工程に界面活性剤を用いる場合は、ホスフォリパーゼの存在下でコレステロールエステラーゼおよび界面活性剤がL LDLに作用し、生じたコレステロールを、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ等のコレステロールと反応する酵素の存在下で反応させ消去することにより、L LDL中コレステロールを反応系外へ導く。ここで、「界面活性剤が作用（反応）する」とは、界面活性剤がリポ蛋白に結合して変性、分解等させ、リポ蛋白中のコレステロールが遊離することをいう。例えば「LDL以外のリポ蛋白に作用（反応）する界面活性剤」という場合、界面活性剤がLDLに全く作用しないことは要求されず、主にLDL以外のリポ蛋白に作用すればよい。例えば、small,dense LDL以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤は、small,dense LDLへの作用がsmall,dense LDL以外のリポ蛋白よりも小さい。「消去」とは、被検体試料中の物質を分解し、その分解物が次の工程において検出されないようにすることを意味する。すなわち、「L LDLのリポ蛋白中のコレステロールを消去する」とは、被検体試料中のL LDLを分解し、その分解産物であるL LDL中のコレステロールがその後の工程で検出されないようにすることをいう。消去するための方法としては、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼを作用させ発生した過酸化水素を、カタラーゼを用いて水と酸素に分解する方法、およびペルオキシダーゼを用いて水素供与体と過酸化水素を反応させ無色キノンに転化する方法を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。【００４２】
本発明において、「反応系外に導く」とは、HDLやVLDL、L LDLなどに含まれるコレステロールがsmall,dense LDLコレステロールの定量に影響を及ぼさないように、HDL、VLDL、L LDLなどに含まれるコレステロールを消去、凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりする等のことを言う。【００４３】
本発明では上記ホスフォリパーゼの存在下でL LDL中のコレステロールを消去する工程に加えて、LDL以外のVLDL、HDLなどのリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程を併せて行なうことができる。LDL以外のVLDL、HDLなどのリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程は、L LDL中のコレステロールを消去する工程の前であってもよいし、後であってもよいし、あるいは同時であってもよい。【００４４】
LDL以外のVLDL、HDLなどのリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程ではLDL以外のVLDL、HDL等のリポ蛋白に作用するがLDLとは反応しない界面活性剤の存在下でVLDL、HDL中コレステロールを消去する。LDL以外のVLDL、HDL等に作用反応する界面活性剤として、HLB値が13以上15以下のポリオキシエチレン誘導体が挙げられる。界面活性剤の試薬中濃度は0.3〜5％(w/v)が好ましく、0.5〜3％(w/v)がより好ましい。反応時の反応液中の濃度は、0.15〜5％が好ましく、0.25〜3％(w/v)がより好ましい。誘導体の例としては高級アルコール縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪酸アミド縮合物、高級アルキルアミン縮合物、高級アルキルメルカプタン縮合物、アルキルフェノール縮合物を挙げることができる。HLB13以上15以下のポリオキシエチレン誘導体の好ましい具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等でHLB値が13以上15以下の化合物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。上記界面活性剤の具体例として、エマルゲンB-66（ポリオキシエチレン誘導体）、エマルゲンA-90（ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル）等が挙げられる。【００４５】
L LDL中のコレステロールを消去する工程において、small，dense LDLには反応せず、L LDLのみに反応する界面活性剤を使用する場合は、界面活性剤として、HLB値が13以上15以下のポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンアルキルアミンからなる群から選択される非イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキル硫酸塩、アミドエーテル硫酸塩、アルキルタウリン酸塩およびリン酸エステル型からなる群から選択される陰イオン界面活性剤、アルキルメチルアンモニウム塩、第四級アンモニウム塩およびモノ直鎖アルキル型からなる群から選択される陽イオン界面活性剤、またはラウリルベタイン、ジメチルアルキルベタイン、イミダゾリン型及びアルキルジアミノエチルグリシンナトリウムからなる群から選択される両性界面活性剤を添加してもよい。具体例として、非イオン界面活性剤としてはエマルゲンB-66、エマルゲンA-90、エマルゲン120、エマルゲン920（以上花王社製）、ノニオンHS-220、ノニオンHS-215、ノニオンK-230、ノニオンNS-220、ノニオンNS-230、ナイミーンF-215、ナイミーンL-207、アデカトールLB-1520（以上旭電化社製）、陰イオン界面活性剤としてエマール20CM、エマール20T、エマールE27C、レベノールWX（以上花王社製）、サンアミドCF-3、サンアミドCF-10、ダイヤポンK、ダイヤポンF、ダイヤポンK-SF、パーソフトEF、パーソフトEFT、パーソフトEL、パーソフトEP、パーソフトEK、パーソフトSL、ポリスターOMP、アデカコールPS-440E、トラックスK-40（以上ADEKA社製）、陽イオン界面活性剤としてコータミン24P（花王社製）、アデカミンMAC-30（ADEKA社製）、両性界面活性剤としてアンヒトール24B（花王社製）、ニッサンアノンLG、ニッサンアノンBDF-R、ニッサンアノンBF、ニッサンアノンBL、ニッサンアノンBL-SF、ニッサンアノンGLM-R-LV等があげられる。上記界面活性剤の試薬中濃度は、0.01〜1.0％(w/v)程度が好ましく、さらに好ましくは0.10〜0.50％(w/v)程度である。反応時の反応液中の濃度は、0.005〜1.0％(w/v)程度が好ましく0.05〜0.50％(w/v)程度がより好ましい。【００４６】
上記界面活性剤の存在下でコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼを作用させコレステロールから過酸化水素を発生させ、発生した過酸化水素は消去する。過酸化水素を消去する方法としては、カタラーゼを作用させて水と酸素に分解する方法、及びペルオキシダーゼを用いてフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物と過酸化水素を反応させて無色キノンに転化する方法を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。反応液中のコレステロールエステラーゼ濃度は0.010〜10U/mL程度が好ましい。また、コレステロールオキシダーゼは細菌や酵母由来のものを用いることができ、反応液中のコレステロールオキシダーゼの濃度は0.1〜0.7U/mL程度が好ましい。さらに、カタラーゼの反応液中の濃度は40〜500U/mL程度が好ましい。また、過酸化水素を無色キノンへ転化する場合の反応液中のペルオキシダーゼの濃度は0.4〜1.0U/mLが好ましく、反応液中のフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物の濃度としては0.4〜0.8mmol/Lが好ましい。【００４７】
上記のコレステロールオキシダーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノール系又はアニリン系水素供与体化合物等の消去に関する成分はL LDLを消去する工程、LDL以外のHDL、VLDL等を消去する工程のいずれかの工程に入っていれば良く、両方の工程に入っていてもよい。【００４８】
L LDL中のコレステロールを消去する工程の試薬量とLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程の試薬量は各成分の濃度範囲を考慮して決定すればよい。例えば、LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程に用いる試薬中の界面活性剤濃度を3g/Lとする。さらに、L LDL中のコレステロールを消去する工程の界面活性剤を未添加とする。この場合、試薬比をLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程に用いる試薬：L LDL中のコレステロールを消去する工程に用いる試薬を1：1の液量比とすると、被検体の量が少ない場合、該工程中の界面活性剤濃度は約1.5g/Lとなる。このように、反応時に必要な試薬濃度を考慮し、試薬の組成や添加試薬量を決定することができる。【００４９】
L LDL中のコレステロールを消去する工程において、small，dense LDLには反応せず、L LDLのみに反応する界面活性剤を使用する場合は、界面活性剤として、HLB値が13以上15以下のポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンアルキルアミンからなる群から選択される非イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキル硫酸塩、アミドエーテル硫酸塩、アルキルタウリン酸塩およびリン酸エステル型からなる群から選択される陰イオン界面活性剤、アルキルメチルアンモニウム塩、第四級アンモニウム塩およびモノ直鎖アルキル型からなる群から選択される陽イオン界面活性剤、またはラウリルベタイン、ジメチルアルキルベタイン、イミダゾリン型及びアルキルジアミノエチルグリシンナトリウムからなる群から選択される両性界面活性剤を添加してもよい。具体例として、非イオン界面活性剤としてはエマルゲンB-66、エマルゲンA-90、エマルゲン120、エマルゲン920（以上花王社製）、ノニオンHS-220、ノニオンHS-215、ノニオンK-230、ノニオンNS-220、ノニオンNS-230、ナイミーンF-215、ナイミーンL-207、アデカトールLB-1520（以上旭電化社製）、陰イオン界面活性剤としてエマール20CM、エマール20T、エマールE27C、レベノールWX（以上花王社製）、サンアミドCF-3、サンアミドCF-10、ダイヤポンK、ダイヤポンF、ダイヤポンK-SF、パーソフトEF、パーソフトEFT、パーソフトEL、パーソフトEP、パーソフトEK、パーソフトSL、ポリスターOMP（NOF Corporation)、アデカコールPS-440E、トラックスK-40（以上ADEKA社製）、陽イオン界面活性剤としてコータミン24P（花王社製）、アデカミン4 MAC-30（ADEKA社製）、両性界面活性剤としてアンヒトール24B（花王社製）、ニッサンアノンLG、ニッサンアノンBDF-R、ニッサンアノンBF、ニッサンアノンBL、ニッサンアノンBL-SF、ニッサンアノンGLM-R-LV等があげられる。上記界面活性剤の試薬中濃度は、0.01〜1.0％(w/v)程度が好ましく、さらに好ましくは0.10〜0.50％(w/v)程度である。反応時の反応液中の濃度は、0.005〜1.0％(w/v)程度が好ましく0.05〜0.50％(w/v)程度がより好ましい。
【００５０】
また、上記界面活性剤の存在下でのコレステロールエステラーゼの濃度を調整することにより、コレステロールエステラーゼと反応するリポ蛋白の種類を変えることができ、small,dense LDL以外のリポ蛋白の選択的消去が可能になる。反応時のコレステロールエステラーゼの濃度が上昇するにつれ、最初にLDLの中でもL LDLの酵素との反応性が上昇し反応系外へと導かれる。しかし、濃度がそれほど高くない範囲では、small,dense LDLの酵素との反応性は上昇しない。さらにコレステロールエステラーゼの濃度が上昇するとsmall,dense LDLの酵素との反応性が上昇する。このように、L LDLと酵素との反応性が高く、small,dense LDLの酵素との反応性が低い濃度範囲でコレステロールエステラーゼを添加すると選択的にsmall,dense LDLを測定することができる。従って、コレステロールエステラーゼの濃度を特定の範囲内に調整することにより、より選択的にsmall,dense LDLを測定することができる。コレステロールエステラーゼのL LDL中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程およびLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程の反応液中の濃度として0.1 U/mL〜3.0 U/mLが好ましく、0.3 U/mL〜2.5U/mLがさらに好ましく、0.6 U/mL〜2.0 U/mLが特に好ましい。本発明におけるコレステロールエステラーゼとしてはコレステロールエステルを加水分解する酵素であれば特に限定されず、動物または微生物由来のコレステロールエステラーゼを用いることができる。【００５１】
コレステロールデヒドロゲナーゼとしてはコレステロールを酸化して酸化型補酵素を還元する能力を有する酵素であれば特に限定されず、動物または微生物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼを用いることができる。コレステロールデヒドロゲナーゼの反応液中の濃度は0.01〜200U/mLが好ましく、0.1〜100U/mLが特に好ましい。【００５２】
L LDL中のコレステロールを消去する工程および/またはLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程の反応液中には、各種リポ蛋白に対する作用を調整するために、任意的にリポ蛋白分解酵素を加えることもできる。リポ蛋白分解酵素としては、リポプロテインリパーゼを用いることができる。リポプロテインリパーゼはリポタンパク質を分解する能力を有する酵素であれば特に限定されず動物または微生物由来のリポプロテインリパーゼを用いることができる。リポプロテインリパーゼの反応液中の濃度は0.01〜10U/mLが好ましく、0.01〜5U/mLがさらに好ましく、0.01〜1U/mLが特に好ましい。【００５３】
本発明のL LDL中のコレステロールを消去する工程とLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程は同一の試薬中にて同時に行わせることができる。この場合、反応液中のコレステロールエステラーゼの濃度は0.5〜2.0U/mLが好ましい。界面活性剤はL LDL中のコレステロールを消去する工程および／またはLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程で用いられる界面活性剤をそのまま使用することができ、反応液中の界面活性剤濃度は0.05〜0.3％(w/v)が好ましい。また、反応液中のホスフォリパーゼの濃度は0.1〜30U/mLが好ましい。【００５４】
本発明では上記L LDL中のコレステロールを消去する工程とLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程のいずれにおいても反応せずに残存したsmall,dense LDL中のコレステロールをその後の工程で定量する。この定量工程では従来から用いられているLDLの定量方法を用いることができる。例えば、LDL凝集剤を添加して形成されたLDL特異的凝集物の含有量を比濁測定によって定量する方法、LDL特異的な抗体による抗原抗体反応を用いる方法、酵素を用い分解生成物を定量する方法等がある。これらのうち、酵素を用い分解生成物を定量する方法が好ましい。該方法においては、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ等のコレステロール測定用酵素を加えてsmall,dense LDLのコレステロールを遊離・分解し、その反応生成物を定量する。この定量工程の際、small,dense LDL中のコレステロールを定量するために、少なくともsmall,dense LDLに作用する界面活性剤を用いればよい。少なくともsmall,dense LDLに作用する界面活性剤とはsmall,dense LDLのみに作用する界面活性剤でもよいし、small,dense LDL以外に他のリポ蛋白にも作用する界面活性剤、全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤であってもよい。【００５５】
small,dense LDLのみに作用する界面活性剤としてはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体を好適に用いることができる。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体として、例えばプルロニック17R-4、プルロニックL-64、プルロニックPE3100、プルロニックP-85、プルロニックF-88、プルロニックP-103、プルロニックF-127等のプルロニック（登録商標）系界面活性剤（BASF社、ADEKA社）などが挙げられる。【００５６】
全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤としては、市販の総コレステロール測定用試薬等に用いられている界面活性剤であればどれでも使用することができ、好ましい例としてHLBが11以上14未満、好ましくは12以上14未満であるポリオキシエチレン誘導体をあげることができる。具体的には、例えばポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（エマルゲン909（花王社製））、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（エマルゲン707（花王社製）、エマルゲン709（花王社製））が挙げられる。【００５７】
small,dense LDLを定量する工程で用いられる界面活性剤の反応液中の濃度は、好ましくは0.01〜10％（w/v）程度であり、さらに好ましくは0.1〜5%（w/v）程度である。【００５８】
small,dense LDLの定量工程においてコレステロールに反応するコレステロール測定用酵素としてコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼを用いる場合、酵素反応により過酸化水素が生成する。発生した過酸化水素からペルオキシダーゼの存在下で水素供与体と水素受容体とのカップリング反応により色素（有色キノン）が形成され、該色素を波長400〜700nmで測定することによりsmall,dense LDL中のコレステロールを定量することができる。【００５９】
定量工程で用いる水素供与体としてはアニリン誘導体が好ましく、アニリン誘導体としてはN−エチル−N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−3−メチルアニリン（TOOS）、N−エチル−N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−3，5−ジメチルアニリン（MAOS）、N−エチル−N−（3−スルホプロピル）−3−メチルアニリン（TOPS）、N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−3，5−ジメトキシアニリン（HDAOS）、N−（3−スルホプロピル）アニリン（HALPS）、N−（3−スルホプロピル）−3−メトキシ−5−アニリン（HMMPS）等があげられる。水素供与体の使用濃度は反応液中の最終濃度で0.1〜1.5mmol/Lが好ましい。【００６０】
水素受容体としては4−アミノアンチピリンやメチルベンゾチアゾロンヒドラゾン等を用いることができる。【００６１】
コレステロール測定用酵素としてコレステロールエステラーゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼを用いる場合、酵素反応によりNAD（P）からNAD（P）Hが発生する。発生したNAD（P）Hは330〜400nmでの吸光度を測定することによりsmall,dense LDL中のコレステロールを定量することができる。【００６２】
本発明の方法のL LDL中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程およびLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程において、イオン強度調整剤として1価の陽イオンおよび／または2価の陽イオンまたはそれらの塩を用いることができる。イオン強度調整剤を添加することにより、small,dense LDLとL LDLを差別化しやすくなる。具体的には塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、塩化リチウム、塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、硫酸リチウム、硫酸アンモニウム、酢酸マグネシウム等を用いることができる。イオン強度調整剤の反応時の濃度は0〜100mmol／Lが好ましい。【００６３】
さらに本発明ではsmall，dense LDLとL LDLに対するホスフォリパーゼの触媒活性を調整するためにL LDL中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程およびLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程においてポリアニオンを添加することもできる。添加するポリアニオンとしてはヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン硫酸などを好適に用いることができる。試薬中のポリアニオンの濃度はヘパリンの場合10〜250U/mL、リンタングステン酸の場合0.02〜1.25%(w/v)、デキストラン硫酸の場合0.02〜1.25%(w/v)が好ましい。反応液中の濃度は、それぞれ5〜250U/mL、0.01〜1.25%(w/v)、0.01〜1.25%(w/v)が好ましい。【００６４】
本発明の各工程における、反応温度は2℃〜45℃で行うことが好ましく、25℃〜40℃で行うことがさらに好ましい。【００６５】
反応時間は各工程とも1〜10分間で行うことが好ましく、3〜7分で行うことがさらに好ましい。【００６６】
本発明の被検体試料としては、血清、血漿を使用することができるが、これらに限定されるものではない。【００６７】
本発明で用いる自動分析装置として、例えば、TBA-120FR・200FR(東芝)、JCA-BM1250・1650・2250（日本電子）、HITACHI7180・7170（日立）、AU2700（OLYMPUS）等が挙げられる。【００６８】
本発明の測定方法を実施するに当たり、用いる試薬を複数の試薬組成物に分けてもよい。本発明においては、試薬としてはL LDLやLDL以外のVLDL、HDLなどのリポ蛋白と反応する界面活性剤、コレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼ等のコレステロール測定用酵素、界面活性剤、過酸化水素を分解するカタラーゼ、過酸化水素からカップリング反応により色素を形成させるためのペルオキシダーゼ、水素供与体、緩衝液等が用いられる。これらの試薬の各試薬組成物への振り分けは、試薬の安定性等を考慮して適宜分配される。用いる試薬組成物の数は、本発明の方法の工程の数に対応させればよい。例えば、L LDL中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程、LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程およびsmall, dense LDLを測定する工程の３つの工程がある場合、それぞれの工程を行うための３種類の試薬組成物を調製する。また、L LDL中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程とLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程を同時に行う場合、この工程を行うための試薬組成物とsmall, dense LDLを測定する工程を行うための試薬組成物の２種類の試薬組成物を調製する。【００６９】
LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程、L LDL中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程およびsmall,dense LDLを測定する工程の３つの工程がある場合、それぞれの工程に対して、試薬組成物Ａ（LDL以外リポ蛋白中のコレステロール消去用試薬組成物）、試薬組成物Ｂ（L LDL中のコレステロール消去用試薬組成物）および試薬組成物Ｃ（small,dense LDL測定用試薬組成物）を用いる。LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程に用いる試薬組成物Ａには、少なくともポリオキシエチレン誘導体等のLDL以外のVLDL、HDLなどのリポ蛋白に作用する界面活性剤が含まれる。L LDL中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程に用いる試薬組成物Ｂには、少なくともL LDLに反応するホスフォリパーゼが含まれる。組成物Ａまたは組成物Ｂのうち最初に行う工程に添加する試薬組成物には、さらに、コレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼ等のコレステロールを分解する酵素、アニリン誘導体等の水素供与体、過酸化水素を消去するカタラーゼ等を含ませればよい。例えば、LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程を最初に行い、次いでL LDL中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程を行う場合、試薬組成物Ａは少なくともポリオキシエチレン誘導体等のLDL以外のVLDL、HDLなどのリポ蛋白に作用する界面活性剤を含み、さらにコレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼ等のコレステロールを分解する酵素、アニリン誘導体等の水素供与体、過酸化水素を消去するカタラーゼ等を含む。試薬組成物Ｂは、少なくともL LDLに反応するホスフォリパーゼを含み、必要に応じて界面活性剤を添加してもよい。一方、L LDL中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程を最初に行い、次いでLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程を行う場合、試薬組成物Ｂは、少なくともL LDLに反応するホスフォリパーゼを含み、さらにコレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼ等のコレステロールを分解する酵素、アニリン誘導体等の水素供与体、過酸化水素を消去するカタラーゼ等を含む。試薬組成物Ａは、少なくともポリオキシエチレン誘導体等のLDL以外のVLDL、HDLなどのリポ蛋白に作用する界面活性剤を含む。small,dense LDLを測定する工程に用いる試薬組成物Ｃには、small,dense LDLのみに反応する界面活性剤もしくは全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤、４アミノアンチピリン等の水素受容体、ペルオキシダーゼ等を含ませることができる。この際、試薬組成物Ａ及び試薬組成物Ｂには、必要に応じて、１価の陽イオン、２価の陽イオンもしくはそれらの塩、またはポリアニオンを添加してもよい。また、試薬組成物Ａ及び試薬組成物Ｂには、血清アルブミンが含まれていてもよい。各試薬組成物のpHは、中性付近、例えばpH6〜pH8、好ましくはpH6.5〜7.5であり、緩衝液を添加してpHを調整すればよい。【００７０】
本発明の方法をLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程、L LDL中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程およびsmall,dense LDLを測定する工程の３つの工程をこの順番で行う場合、被検体試料に試薬組成物Ａを添加し反応させ、次いで試薬組成物Ｂを添加し反応させ、その後試薬組成物Ｃを添加し反応させ、吸光度を測定することにより行えばよい。【００７１】
被検体試料の量、各試薬組成物の量は限定されず、各試薬組成物中の試薬の濃度等を考慮して適宜決定できるが、例えば、被検体試料１〜10μL、試薬組成物ＡからＣをそれぞれ25〜200μL用いればよい。【００７２】
本発明の方法を、L LDL中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程、LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程およびsmall,dense LDLを測定する工程の３つの工程をこの順番で行う場合、最初に被検体試料に試薬組成物Ｂを添加し反応させ、次いで試薬組成物Ａを添加し反応させ、その後試薬組成物Ｃを添加し反応させ、吸光度を測定すればよい。【００７３】
本発明の方法では、L LDL中のコレステロールとLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールが、small,dense LDLを測定する工程に先行して反応系外に導かれることにより、small,dense LDLを測定することができる。L LDL中のコレステロールとLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを反応系外に導く方法は前述の通り、消去のほかに、凝集させたり、阻害したりする等の公知の技術を用いることができる。また、small,dense LDLを測定する工程に２以上の工程を先行させる場合には、small,dense LDLを測定する工程の直前の工程でL LDL中のコレステロールとLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを反応系外に導く反応が完了すればよい。従って、ある１つの工程ではL LDL中のコレステロールにホスフォリオパーゼを作用させる事のみを行い、その産物の消去は後工程で行うことや、ある１つの工程ではLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを分解することのみを行い、その産物の消去は後工程で行うこと等も可能である。各工程の産物は同一工程にて消去することも可能である。【００７４】
LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程とL LDL中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程を合わせて一つの工程とし、その工程の後にsmall,dense LDLを測定する工程を行う２工程による反応の場合、最初の工程では、上記の試薬組成物Ａと試薬組成物Ｂが含む試薬を含む試薬組成物ＡＢと試薬組成物Ｃを用いればよい。すなわち、試薬組成物ＡＢは、少なくともポリオキシエチレン誘導体等のLDL以外のVLDL、HDLなどのリポ蛋白に作用する界面活性剤およびL LDLに反応するホスフォリパーゼを含む。この場合、被検体試料に試薬組成物ＡＢを添加し、L LDLやLDL以外のVLDL、HDLなどのリポ蛋白を界面活性剤に作用させ、酵素と反応させ、次いで試薬組成物Ｃを添加してsmall,dense LDLを界面活性剤に作用させ酵素と反応させ、small,dense LDL中のコレステロールを測定すればよい。
【実施例】
【００７５】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００７６】
実施例１
LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程、L LDL中のコレステロールを消去する工程およびsmall，dense LDLコレステロールを測定する工程をこの順序で行いsmall,dense LDLを測定した。【００７７】
LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程に用いる試薬組成物Ａ、L LDL中のコレステロールを消去する工程に用いる試薬組成物Ｂ、small，dense LDLコレステロールを測定する工程に用いる試薬組成物Ｃを以下のように調製した。【００７８】
0005450080.tif 000002
血清試料2μLに試薬組成物Ａ75μLを加え、37℃で5分間反応させた後に、試薬組成物Ｂ75μLを加え5分間反応させ、その後試薬組成物Ｃ50μLを加え5分間反応させ 主波長600nm、副波長700nmでの吸光度を測定した。【００７９】
比較対象法として、デンカ生研社製のsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いてsmall,dense LDLコレステロール濃度を比較した。その結果を図１に示す。【００８０】
図１に示すように、本実施例の方法はsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法と良好な相関性を示した。【００８１】
実施例２
実施例１で用いた試薬組成物Ｂ中、ホスフォリパーゼをホスフォリパーゼＣ［PLC］とした試薬組成物を調製した。【００８２】
0005450080.tif 000003
実施例１と同様の手順で測定を行い、sd LDL-C「生研」によって得られる値と比較した。その結果を図２に示す。【００８３】
図２に示すように、本実施例の方法はsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法と良好な相関性を示した。【００８４】
実施例３
実施例１で用いた試薬組成物Ｂ中、ホスフォリパーゼをホスフォリパーゼＤ［PLD］とした試薬組成物を調製した。【００８５】
0005450080.tif 000004
実施例１と同様の手順で測定を行い、sd LDL-C「生研」によって得られる値と比較した。その結果を図３に示す。【００８６】
図３に示すように、本実施例の方法はsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法と良好な相関性を示した。【００８７】
実施例４
実施例１で用いた試薬組成物Ｂ中、ホスフォリパーゼをリゾホスフォリパーゼ［LYPL］とした試薬組成物を調製した。【００８８】
0005450080.tif 000005
実施例１と同様の手順で測定を行い、sd LDL-C「生研」によって得られる値と比較した。その結果を図４に示す。【００８９】
図４に示すように、本実施例の方法はsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法と良好な相関性を示した。【００９０】
実施例５
実施例１で用いた試薬組成物Ｂ、中ホスフォリパーゼをGlycerophospholipidに特異的なホスフォリパーゼ［PLDP］とした試薬組成物を調製した。【００９１】
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実施例１と同様の手順で測定を行い、sd LDL-C「生研」によって得られる値と比較した。その結果を図５に示す。【００９２】
図５に示すように、本実施例の方法はsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法と良好な相関性を示した。【００９３】
実施例６
実施例１で用いた試薬組成物Ｂ中、ホスフォリパーゼをスフィンゴミエリナーゼ［SPC］とした試薬組成物を調製した。【００９４】
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実施例１と同様の手順で測定を行い、sd LDL-C「生研」によって得られる値と比較した。その結果を図６に示す。【００９５】
図６に示すように、本実施例の方法はsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法と良好な相関性を示した。【００９６】
実施例７
L LDL中のコレステロールを消去する工程、LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程およびsmall，dense LDLコレステロールを測定する工程をこの順序で行いsmall,dense LDLを測定した。【００９７】
L LDL中のコレステロールを消去する工程に用いる試薬組成物Ｂ、LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程に用いる試薬組成物Ａ、small，dense LDLコレステロールを測定する工程に用いる試薬組成物Ｃを以下のように調製した。【００９８】
0005450080.tif 000008
血清試料2μLに試薬組成物Ｂ75μLを加え、37℃で5分間反応させた後に、試薬組成物Ａ75μLを加え5分間反応させ、その後試薬組成物Ｃ50μLを加え5分間反応させ 主波長600nm、副波長700nmでの吸光度を測定した。【００９９】
比較対象法として、デンカ生研社製のsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いてsmall,dense LDLコレステロール濃度を比較した。その結果を図７に示す。【０１００】
図７に示すように、本実施例の方法はsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法と良好な相関性を示した。【０１０１】
実施例８
本実施例においては、L LDL中のコレステロールを消去する工程およびLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程（つまりsmall，dense LDL以外中のコレステロールを消去する工程）を同時に行った。L LDLを消去する工程およびLDL以外のリポ蛋白を消去する工程（つまりsmall，dense LDL以外を消去する工程）に用いる試薬組成物ＡＢ、ならびにsmall，dense LDLコレステロールを測定する工程に用いる試薬組成物Ｃを以下のように調製した。【０１０２】
0005450080.tif 000009
血清試料2μLに試薬組成物ＡＢ150μLを加え、37℃で5分間反応させた後に、試薬組成物Ｃ50μLを加え5分間反応させ主波長600nm、副波長700nmでの吸光度を測定した。【０１０３】
比較対象法として、デンカ生研社製のsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いてsmall,dense LDLコレステロール濃度を比較した。その結果を図８に示す。【０１０４】
図８に示すように、本実施例の方法はsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法と良好な相関性を示した。【０１０５】
実施例９
実施例６で用いた試薬組成物Ａ中、界面活性剤をエマルゲンB-66の１種類とした試薬組成物を調製した。【０１０６】
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実施例１と同様の手順で測定を行い、sd LDL-C「生研」によって得られる値と比較した。その結果を図９に示す。【０１０７】
図９に示すように、本実施例の方法はsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法と良好な相関性を示した。【０１０８】
実施例１０
試薬組成物ＡＢ中、界面活性剤をエマルゲンA-90の１種類とした試薬組成物を調製した。【０１０９】
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血清試料2μLに試薬組成物ＡＢ150μLを加え、37℃で5分間反応させた後に、試薬組成物Ｃ50μLを加え5分間反応させ主波長600nm、副波長700nmでの吸光度を測定した。【０１１０】
比較対象法として、超遠心法を用いた。その結果を図１０に示す。【０１１１】
図１０に示すように、本実施例の方法はsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法と良好な相関性を示した。【０１１２】
実施例１１
試薬組成物ＡＢ中に界面活性剤を用いない試薬組成物を調製した。【０１１３】
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血清試料2μLに試薬組成物ＡＢ150μLを加え、37℃で5分間反応させた後に、試薬組成物Ｃ50μLを加え5分間反応させ主波長600nm、副波長700nmでの吸光度を測定した。【０１１４】
比較対象法として、超遠心法を用いた。その結果を図１１に示す。【０１１５】
図１１に示すように、本実施例の方法はsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法と良好な相関性を示した。【０１１６】
実施例１２
実施例１で用いた試薬組成物Ａに種々の界面活性剤を加えた試薬を調製した。加えた界面活性剤は、ノニオンHS215、エマルゲン920、ノニオンNS220、ノニオンHS220、ノニオンNS230、パーソフトEPのいずれかであり、ノニオンHS215、エマルゲン920またはノニオンNS220は、0.03％(w/v)を添加し、ノニオンHS220、ノニオンNS230またはパーソフトEPは、0.06％(w/v)を添加した。【０１１７】
0005450080.tif 000013
実施例１と同様の手順で測定を行い、sd LDL-C「生研」によって得られる値と比較した。その結果を表１に示す。【０１１８】
表１に示すように、試薬組成物Ａに界面活性剤としてエマルゲンB-66とノニオンHS215、エマルゲン920、ノニオンNS220、ノニオンHS220、ノニオンNS230、パーソフトEPを併用して用いた方法はsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法と良好な相関性を示した。
【表１】
0005450080.tif 000014
【０１１９】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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