(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖取り込み促進作用を有するジペプチドを有効成分として含有し、前記ジペプチドが、Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ、Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ、Ｌｙｓ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｉｌｅ、Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、およびＩｌｅ−Ｖａｌである、糖取り込み促進に用いられる組成物。
【請求項２】
組成物が、蛋白質を加水分解して得られるジペプチドを含有する蛋白質加水分解物である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
蛋白質の加水分解に用いる蛋白質加水分解酵素が、アスペルギルス属由来のプロテアーゼ又はバチルス属由来のプロテアーゼの１種以上である請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
蛋白質加水分解酵素が、アスペルギルス属由来のプロテアーゼ又はバチルス属由来のプロテアーゼの１種以上に、さらにトリプシンおよび／又はペプシンを組み合せたものである請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
蛋白質が、カゼイン、大豆蛋白質、小麦グルテン、乳ホエイ蛋白質、および牛肉からなる群から選択される少なくとも１種である請求項２ないし４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
ジペプチドが、筋肉細胞への糖取り込み促進作用を有し、筋肉における糖取り込み促進に用いられる請求項１ないし５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
糖尿病または血糖値上昇の予防または治療のための請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
グリコーゲン貯蔵促進のための請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
体力の増進、運動能力の増進、持久力の向上、または疲労回復のための請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組成物を含んでなる、糖尿病または血糖値上昇の予防または治療のための食品。
【請求項１１】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組成物を含んでなる、グリコーゲン貯蔵促進のための食品。
【請求項１２】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組成物を含んでなる、体力の増進、運動能力の増進、持久力の向上、または疲労回復のための食品。
【請求項１３】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組成物を含んでなる、糖尿病または血糖値上昇の予防または治療のための医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組成物を含んでなる、グリコーゲン貯蔵促進のための医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組成物を含んでなる、体力の増進、運動能力の増進、持久力の向上、または疲労回復のための医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組成物の製造方法であって、蛋白質を、蛋白質加水分解酵素を用いて加水分解してジペプチドを得る工程を含む組成物の製造方法。
【請求項１７】
蛋白質加水分解酵素が、アスペルギルス属由来のプロテアーゼ又はバチルス属由来のプロテアーゼの１種以上である請求項１６に記載の組成物の製造方法。
【請求項１８】
蛋白質加水分解酵素が、アスペルギルス属由来のプロテアーゼ又はバチルス属由来のプロテアーゼの１種以上に、さらにトリプシンおよび／又はペプシンを組み合せたものである請求項１７に記載の組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドを有効成分として含有する組成物に関する。また、本発明は、前記組成物を含有する食品又は医薬組成物に関する。さらに、本発明は、前記組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、インシュリンの作用不足に基づく高血糖状態の持続を特徴とする代謝疾患群の総称である。糖尿病は、インシュリン感受性低下とインシュリン分泌低下があらゆる程度で組み合わさることによって引き起こされ、糖、脂質、蛋白代謝に特徴的な異常が生じる。最近では、糖尿病は、生活習慣病の一つといわれ、適切な対応により改善が期待される疾患であるとされている。しかしながら、糖尿病が重度になると、神経障害、網膜症あるいは腎症など合併症が生じ、日常生活における動作を著しく低下させてしまうことがある。【０００３】
糖尿病はインシュリン依存型（ＩＤＤＭ）とインシュリン非依存型（ＮＩＤＤＭ）に大別される。インシュリン依存型は、ウィルスなどが原因とされる自己免疫機序によって膵臓β細胞が壊死、あるいは機能停止することにより、インシュリンを合成、分泌できないタイプである。またインシュリン非依存型は、加齢やストレスなどの不明確かつ多様な要因により生ずるインシュリン分泌不足や、インシュリン抵抗性に起因して、高血糖を示すタイプである。糖尿病患者の約９０％がインシュリン非依存型に含まれる。【０００４】
インシュリン非依存型の軽症、または中等度の患者における治療には、主に食事療法と運動療法が採用されている。例えば、食事のカロリー制限、運動による糖の代謝促進などによって血糖値の安定が図られている。糖尿病の予防、または悪化防止の観点から、食事療法のさらなる充実、すなわち、糖尿病を予防し、または悪化を防止することのできる食品が望まれている。【０００５】
また、食事後の血糖値の急な上昇とその継続（食後過血糖）が長年にわたって続くと、いずれは耐糖能異常に繋がり、糖尿病が悪化する恐れがある。糖尿病の悪化に伴って血管障害が促進され、神経症、腎症、網膜症、さらには心筋梗塞、脳卒中などの合併症の発症に繋がる危険性を有している。食後過血糖の抑制は、インシュリン非依存型糖尿病の治療に効果があるとされ、糖吸収抑制薬としてα−グルコシダーゼ阻害薬、インシュリン分泌促進薬としてスルホニルウレア剤などの医療用医薬品が利用されている。このような状況において、医薬品分野においても、糖尿病を予防し、または悪化を防止することのできる医薬品が望まれている。【０００６】
血糖値の上昇を抑制することのできる生体物質として、インシュリンがある。インシュリンは、例えば、肝臓における糖代謝を促進し、筋肉細胞や脂肪細胞における糖取り込みの亢進を引き起こすことによって血糖値を降下させる、生体内での唯一のホルモンである。筋肉や脂肪細胞に取り込まれた糖は、グリコーゲンへと代謝され組織内に貯蔵される。筋肉や脂肪細胞でのインシュリンの作用機序の一つとして、細胞内プールに存在する糖輸送担体タイプ４（ＧＬＵＴ４）の細胞膜上へのトランスロケート（動員）が挙げられる。インシュリンによる筋肉や脂肪細胞における糖取り込み促進に関わるシグナル伝達機構は、現在までのところ、以下のように考えられている。【０００７】
つまり、インシュリンは細胞膜上のインシュリン受容体（インシュリンレセプター：ＩＲ）に結合後、ＩＲの細胞内部分に存在するチロシンキナーゼを活性化し、インシュリン受容体基質（インシュリンレセプターサブストレイト：ＩＲＳｓ）ファミリーをチロシンリン酸化する。チロシンリン酸化されたＩＲＳｓがホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）を活性化させ、その後何らかのシグナル伝達が行われて、細胞内に潜在するＧＬＵＴ４が細胞膜上へトランスロケートされる（例えば、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４１，２４８−２５７，１９９９参照）。このインシュリンも、糖尿病を予防し、または悪化を防止するために、医薬品として用いられている。【０００８】
以上のように、糖代謝の異常は生活習慣病の多くの疾患と関連があることからも、生活習慣病の予防または悪化防止を目的とした食品や医薬品が必要とされている。【０００９】
また、スポーツの分野では、体力、とりわけ、持久力、抗疲労力、疲労回復力などが重要となる。そして、運動による筋肉の疲労は、エネルギー生産の源となる組織中のグリコーゲンが消費され、一定限界に達したときに起こる。すなわち、組織中のグリコーゲンが枯渇すると、筋肉が運動できない状態に陥る。また、組織中のグリコーゲン貯蔵量と持久力との間には、正の相関が報告されている（例えば、Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．，７１，１４０−１５０，１９６７参照）。このようなことから、持久力、抗疲労力、疲労回復力などを高めるためには、組織中のグリコーゲン貯蔵量を高めることが重要である。【００１０】
こうしたなかで、最近の研究成果として、例えば、微生物由来の低分子物質や天然植物抽出物からの細胞への糖取り込み促進作用を有する物質の発見が報告されている（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，９７４−９７７，１９９９参照）。また、例えば、乳ホエイ蛋白質とその加水分解物がグリコーゲン貯蔵効果を有することが報告されている（例えば、特開２００５−２８９８６１号公報参照）。さらに、乳蛋白質加水分解物が糖尿病治療に効果を奏する血糖降下作用を有すること（例えば、特開平０４−１４９１３９号公報参照）、乳ホエイ蛋白質加水分解物が血糖調節作用を有すること（例えば、特表２００６−５１０３６７号公報参照）がすでに報告されている。
【発明の開示】
【００１１】
こうした現状に鑑み、本発明者らは、糖尿病または血糖値上昇の予防または治療、グリコーゲン貯蔵促進、または、体力の増進、運動能力の増進、持久力の向上もしくは疲労回復のいずれか少なくとも１つに効果を有する組成物を提供することを本発明の目的とした。また、本発明者らは、少なくとも１つの前記効果を有する食品または医薬組成物を提供することを本発明の目的とした。さらに、本発明者らは、少なくとも１つの前記効果を有する組成物の製造方法を提供することを本発明の目的とした。
【００１２】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ペプチドを有効成分として含有し、血糖値を低下させ、グリコーゲンの貯蔵を促進することのできる組成物を見出し、本発明を完成させるに到った。
すなわち、本発明の一つの態様によれば、糖取り込み促進作用を有するペプチドを有効成分として含有し、糖取り込み促進に用いられる組成物が提供される。「糖取り込み促進作用を有するペプチド」としては、ロイシンおよび／またはイソロイシンを有するジペプチドが好ましい。
また、本発明の他の一つの態様によれば、ロイシンおよび／またはイソロイシンを有するジペプチドを有効成分として含有する組成物が提供される。
本発明において、「組成物」には、「ペプチドそのもの（単一のペプチド、もしくは複数のペプチドの混合物）」、「蛋白質加水分解物」、または「蛋白質加水分解物を膜処理、溶媒分画などにより精製して得た混合物」などが包含される。
【００１３】
また、上記いずれの態様においても、「ロイシンおよび／またはイソロイシンを有するジペプチド」として、Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ、Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ、Ｌｙｓ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｉｌｅ、Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、およびＩｌｅ−Ｖａｌよりなる群から選択される少なくとも１種以上のジペプチドを好適に使用し得る。
【００１４】
本発明の組成物を含有させることにより、糖尿病または血糖値上昇の予防または治療、グリコーゲン貯蔵促進、または、体力の増進、運動能力の増進、持久力の向上もしくは疲労回復のいずれか少なくとも１つに効果を有する食品または医薬組成物が提供される。
さらに、本発明によれば、ペプチドを有効成分として含有する組成物の製造方法が提供される。
本願の開示は、２００６年４月２１日に出願された特願２００６−１１７４３９号に記載の主題と関連しており、それらの開示内容は引用によりここに援用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の組成物の一態様としては、糖取り込み促進作用を有するペプチドを有効成分として含有し、糖取り込み促進に用いられる組成物がある。糖取り込み促進作用を有するペプチドは、ロイシンおよび／またはイソロイシンを有するジペプチドであることが好ましい。特に、Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ、Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ、Ｌｙｓ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｉｌｅ、Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、またはＩｌｅ−Ｖａｌを好適に使用し得る。【００１６】
また、本発明の組成物の他の態様としては、ロイシンおよび／またはイソロイシンを有するジペプチドを有効成分として含有する組成物がある。この態様の組成物は、例えば、生理活性組成物、栄養組成物、または機能性組成物として用いられる。また、この態様の組成物を、糖取り込み促進のために用いることも可能である。ロイシンおよび／またはイソロイシンを有するジペプチドとして、特に、Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ、Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ、Ｌｙｓ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｉｌｅ、Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、またはＩｌｅ−Ｖａｌを好適に使用し得る。【００１７】
上記いずれの態様においても、有効成分であるペプチドは、糖尿病または血糖値上昇の予防または治療効果（本明細書では、血糖値上昇の予防効果と血糖値低下効果とは、特に断らない限り同意語として使用するものとする。）、グリコーゲン貯蔵促進効果、または、体力の増進、運動能力の増進、持久力の向上もしくは疲労回復効果を有する。本発明におけるペプチドは、インシュリンに類似した生理活性物質であると考えられ、また、その作用メカニズムはインシュリンと同様のメカニズムであると推測される。従来、医薬品として用いられるインシュリンは、分子量が３，５００以上のペプチドであるため、経口投与では体内に吸収することができなかった。しかしながら、本発明におけるペプチド、特にロイシンおよび／またはイソロイシンを有するジペプチドは、経口投与により細胞への糖取り込み促進作用を示し得るペプチドであり、これにより血糖値の上昇を抑制することができる。また、これらのペプチドは、人体に対して有害な作用を示すこともない。【００１８】
糖取り込み促進作用を有するペプチドは、筋肉細胞、肝細胞などの細胞、特に筋肉細胞における糖取り込み作用を促進することができる。筋肉細胞においては、インシュリンがインシュリンレセプターに結合することに起因して、インシュリンレセプターシグナルの下流に存在するホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−３−ｋｉｎａｓｅ；ＰＩ３Ｋ）が活性化され、その後いくつかのシグナル伝達を経て、糖輸送担体タイプ４（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ４；ＧＬＵＴ４）が細胞表面にトランスロケートされる。そして、通常、糖は、細胞表面に存在するＧＬＵＴ４を介して細胞内に取り込まれる。この経路は、ＧＬＵＴ４阻害剤またはＰＩ３Ｋ阻害剤によって阻害される。【００１９】
本発明の組成物についても、後述する実施例において示すとおり、ペプチドによる糖取り込み促進効果は、ＧＬＵＴ４阻害剤またはＰＩ３Ｋ阻害剤によって抑えられる。このことから、ペプチドによって促進される糖取り込み作用が、インシュリンによる作用と同様のＧＬＵＴ４を介する作用であり、また、インシュリンによる作用と同様のＰＩ３Ｋを介する作用であると推測される。ＧＬＵＴ４阻害剤としては、例えばサイトカラシンＢが知られており、ＰＩ３Ｋ阻害剤としては、例えばＬＹ２９４００２（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ，３３３，４７１−４９０，１９９８）が知られている。【００２０】
本発明のペプチドを含有する組成物は、血糖値を低下させることができる。血糖値を低下させることにより、糖尿病や血糖値上昇の予防または治療が可能となる。【００２１】
また、本発明の組成物は、グリコーゲンを組織中に貯蔵させる作用を有する。そのため、運動パフォーマンスを向上させることができ、スポーツの現場においても有効性が十分に期待できる。さらに、本発明の組成物によれば、運動時の持久力、抗疲労力、疲労回復力、体力、運動能力、スタミナ、エネルギー補給力などを高めることができる。【００２２】
本発明におけるペプチドは、アミノ酸から合成することも可能であるが、好ましくは、蛋白質を加水分解することにより得ることができる。したがって、本発明の組成物の一例として、蛋白質を加水分解して得られたペプチドを含有する蛋白質加水分解物を挙げることができる。【００２３】
加水分解は、蛋白質加水分解酵素による加水分解が好ましい。原料としては、動物性蛋白質および植物性蛋白質を用いることが可能であり、例えば、牛肉、豚肉、鶏肉、卵、大豆、牛乳、ピーナッツ、とうもろこし、小麦などが挙げられる。本発明においては、カゼイン、大豆蛋白質、小麦グルテン、乳ホエイ蛋白質、および牛肉を用いることが好ましく、特に、乳ホエイ蛋白質を用いることが好ましい。乳ホエイ蛋白質としては、例えば、チーズまたはカゼインの製造工程で得られるチーズホエイまたはカゼインホエイを限外ろ過、ナノフィルトレーションなどのろ過方法によりろ過して得られる混合物、単離精製されたβ−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、ラクトフェリンなどを用いることができる。【００２４】
蛋白質加水分解における酵素、酸、またはアルカリ処理の条件（例えば、基質の濃度、酵素量、処理温度、ｐＨ、あるいは時間など）は、適宜設定することできる。蛋白質の加水分解に使用する酵素としては、食品衛生上無害なものであることが好ましく、例えば、バシラス属またはアスペルギルス属に属する微生物由来のプロテアーゼ、パパイヤ由来のパパイン、パイナップル由来のブロメラインなどの植物由来のプロテアーゼ、パンクレアチン、トリプシンなどの動物由来のプロテアーゼが挙げられ、これらを単一であるいは組み合わせて使用することができる。【００２５】
例えば、Ｉｌｅ−Ｌｅｕを得る場合には、バシラス属由来のプロテアーゼおよびアスペルギルス属由来のプロテアーゼを組み合わせて加水分解を行うことが好ましく、Ｉｌｅ−Ｔｒｐを得る場合には、トリプシンで反応後、アスペルギルス属由来のプロテアーゼで反応させることが好ましい。また、Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｌｙｓ−Ｉｌｅ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｉｌｅ、Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ、およびＩｌｅ−Ｖａｌを得る場合には、アスペルギルス属由来のプロテアーゼを用いることが好ましく、Ａｌａ−ＬｅｕおよびＡｓｐ−Ｌｅｕを得る場合には、トリプシンで反応後、バシラス属由来のプロテアーゼで反応させることが好ましく、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、およびＬｅｕ−Ｖａｌを得る場合には、ペプシンで反応後、アスペルギルス属由来のプロテアーゼで反応させることが好ましい。【００２６】
蛋白質加水分解酵素による加水分解の場合、例えば、処理温度は、３５〜５５℃が好ましく、処理時間は、３〜９時間が好ましく、また、酵素の使用量は、蛋白質１００ｇに対し０．５〜１０ｇが好ましい。【００２７】
蛋白質加水分解物から、吸着剤処理法、膜分離法、溶媒分画法、通常用いられている樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー操作等の精製法により、高純度の糖取り込み促進作用を有するペプチドを単離・精製することができる。【００２８】
単離・精製をする前に、蛋白質加水分解物からペプチドを抽出してもよい。ペプチドの抽出に用いる溶剤としては、水、エタノール、メタノール、アセトンまたはこれらの混合溶剤を用いることが好ましい。溶剤として、例えば、９０体積％エタノール水溶液を用いることができる。【００２９】
抽出の際の蛋白質加水分解物と溶剤の比率は、特に限定されるものではないが、蛋白質加水分解物（乾燥）１に対して溶剤２から１，０００重量倍、特に抽出操作、効率の観点から、５から１００重量倍が望ましい。また、抽出温度は、「室温」から「常圧下での溶剤の沸点」の範囲が便利である。抽出時間は抽出温度によって異なるが、数時間から２日間の範囲とすることが好ましい。このような操作を行うことにより、精製されたペプチドを溶媒抽出物として得ることができる。したがって、本発明の組成物の一例として、精製されたペプチドを含有する溶媒抽出物を挙げることができる。溶媒抽出物は、好ましくは、凍結乾燥された状態で用いられる。【００３０】
蛋白質加水分解物あるいはその溶媒抽出物を、吸着モードのクロマトグラフィーに付して分画するには、例えば、次の方法がある。まず、凍結乾燥された蛋白質加水分解物またはその溶媒抽出物を少量の水、メタノール、エタノール等の溶媒あるいはこれらの混合溶媒に溶解する。次いで、得られた溶液をカラムに流してペプチドを吸着剤に吸着させる。その後、カラムを水で十分に洗浄し、メタノール、エタノール、アセトン等の親水性溶媒あるいはこれらの混合溶媒でペプチドを溶出させればよい。吸着モードのカラムクロマトグラフィーに換え、他の分離モードのクロマトグラフィーを用いることもできる。さらに二つ以上の吸着モードおよび／または他の分離モードのカラムクロマトグラフィーを組み合わせることにより、より高純度に単離・精製されたペプチドを得ることができる。吸着剤充填カラムとしては、例えば、セファデックスＬＨ−２０（スウェーデン、ファルマシア製）、ダイアイオンＨＰ２０（三菱化成工業製）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ（野村化学製）、ＯＤＳ−Ａ（ＹＭＣ製）、ＯＤＳ−ＡＱ（ＹＭＣ製）、ＭＣＩ−ＧＥＬ（三菱化成工業製）、ＭＣＩ−ＣＨＰ２０（三菱化成工業製）、セパビーズＨＰ１ＭＧ（三菱化成工業製）、トヨパールＨＷ４０Ｆ（東ソー製）が挙げられる。【００３１】
このように単離・精製されたペプチドも、本発明の組成物として用いることができる。また、ペプチドの混合物である、単離・精製前の蛋白質加水分解物または溶媒抽出物をそのまま、あるいは凍結乾燥させた後に本発明の組成物として用いることも可能である。本発明の組成物は、場合により、そのまま摂取することができる。【００３２】
本発明の組成物は、有効成分であるペプチドの他に、公知の物質を含んでもよい。例えば、本発明の組成物は、原料として用いることのできる種々の蛋白質を加水分解することにより生じるその他のペプチドや、加水分解に用いられた触媒を含んでもよい。また、細胞への糖取り込み量を増すために、各種の糖を含んでもよい。【００３３】
上述のようにして得られる本発明の組成物は、一般の食品（飲料を含む）に配合することができる。本発明の組成物が配合された食品は、糖尿病または血糖値上昇の予防または治療用の食品として使用される。同様に、組織中へのグリコーゲン貯蔵を促進し、運動パフォーマンスを向上させる食品として使用することができる。さらに、同様に、体力の増進、運動能力の増進、持久力の向上、または疲労回復のための食品として使用することができる。【００３４】
本発明の食品は、筋肉細胞への糖取り込み促進作用、グリコーゲンの貯蔵促進作用を有するため、日常摂取する食品、サプリメントとして摂取する健康食品または機能性食品として提供することができる。そして、本発明の食品は、血糖値の上昇抑制用、糖尿病の予防または治療用、体力の増進もしくは低下の予防、運動能力の増進、持久力の向上、疲労回復を希望する消費者に適した食品、または、それらの症状が気になる消費者に適した食品である。このようなことから本発明の食品を、特定保健用食品、病者用食品として提供することができる。さらに、本発明の食品は、ヒト以外の哺乳動物を対象として使用される場合には、飼料として用いることができる。【００３５】
本発明の食品の形態は特に限定されるものではない。本発明の食品の具体例としては、飲料、粉末飲料、濃厚飲料、タブレット、焼き菓子、スープ、ハンバーグ、粉末状食品、カプセル状食品、ゼリー、カレー、パン、ソーセージ、ヨーグルト、チーズ、チョコレート、ガム、ジャム、アイスクリームなどが挙げられる。【００３６】
糖取り込み促進作用を有するペプチドは水溶性であることが好ましい。また、ロイシンおよび／またはイソロイシンを有するジペプチドは、水溶性である。水溶性のペプチドは、広く一般の食品に添加することが可能である。例えば、水溶性ペプチドを合計０．００１重量％以上配合したお茶を毎日約１Ｌ飲用することにより、１日当たり１０ｍｇのペプチドの摂取が可能となる。血糖値上昇を抑制するためには、用いるペプチドの活性に応じて食品に配合し、ペプチドの摂取量を純品換算で０．１〜１０，０００ｍｇ／日の範囲で適宜増減させることが好ましい。【００３７】
本発明の組成物を、血糖値上昇抑制剤、糖尿病予防・治療剤等の医薬組成物として用いることもできる。また、グリコーゲン貯蔵促進により治療、予防、または改善し得る疾患または症状のためのグリコーゲン貯蔵促進剤として用いることができる。さらに、体力の増進剤、運動能力の増進剤、持久力の向上剤、または疲労回復剤等の医薬品組成物として用いることができる。【００３８】
これらの医薬品組成物の主な投与形態は、経口剤である。経口剤に使用することができる担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、希釈剤、添加剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。具体的には、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバター等を挙げることができる。経口剤の用途等に応じてこれら担体をそれぞれ単独で、または組み合わせて使用することができる。【００３９】
本発明の医薬組成物を、血糖値上昇抑制剤、糖尿病予防・治療剤、グリコーゲン貯蔵促進剤等の経口剤として用いる場合の投与量は、患者の年齢、症状等により適宜変更すればよい。一般には、投与量が、ペプチド純品換算で０．１〜１０，０００ｍｇ／日の範囲となるように用いることが好ましい。【００４０】
本発明の食品または医薬組成物において配合が可能な他の成分としては、例えば、炭水化物、蛋白質、アミノ酸、ミネラル類および／またはビタミン類等が挙げられる。ここで、炭水化物としては、澱粉、コーンスターチ等の多糖類、デキストリン、スクロース、グルコース、フルクトース等のその他の糖類等が挙げられる。また、ここで、蛋白質としては、動物性蛋白質であっても、植物性蛋白質であっても、またはそれらの混合物であってもよく、例えば、乳蛋白質、大豆蛋白質、卵蛋白質等が挙げられる。また、アミノ酸としては、必須アミノ酸であるロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、リジン、スレオニン、メチオニン、ヒスチジンや、非必須アミノ酸であるグルタミン、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、アルギニン、シスチン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、オルニチン、タウリン等が挙げられる。また、ミネラル類としては、特に限定するものではないが、カルシウム、マグネシウム、鉄等が挙げられる。また、ナトリウムまたはカリウム、あるいはその他の栄養的必須元素である亜鉛、銅、クロム、セレン、マンガン、モリブデン等が挙げられる。また、ビタミン類としては、特に限定するものではないが、栄養的に必須であるビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ，ビタミンＥ，ナイアシン、パントテン酸、葉酸、コエンザイムＱ１０等が挙げられる。【００４１】
本発明において、有効成分であるペプチドは、血糖上昇抑制作用、またはグリコーゲン貯蔵増進作用を示す活性物質として、十分な有効性を有する。本発明の組成物は、糖尿病または血糖値上昇の予防または治療、グリコーゲン貯蔵促進、または、体力の増進、運動能力の増進、持久力の向上もしくは疲労回復の効果を有する。また、本発明の組成物を含有させることにより、糖尿病または血糖値上昇の予防または治療、グリコーゲン貯蔵促進、または、体力の増進、運動能力の増進、持久力の向上もしくは疲労回復に優れた効果を奏する食品または医薬組成物を提供することができる。
【実施例】
【００４２】
次に、有効成分であるペプチドの製造例、および各種生物試験例、製剤実施例等を挙げて、本発明を更に詳しく説明する。なお、本発明はこれらの実施例等になんら制約されるものではないことはいうまでもない。なお、実施例中、特に断りのない限り、「％」は「重量％」を、「部」は「重量部」を意味する。【００４３】
製造例１
カゼイン、大豆蛋白質、小麦グルテン、乳ホエイ蛋白質、および牛肉それぞれ５０ｇを水１Ｌに溶解させた。それぞれの溶液のｐＨを７．０に調整後、５０℃に加熱し、保温した。バシラス属由来のプロテアーゼ（プロテアーゼＭアマノ、アマノエンザイム社）５００ｍｇとアスペルギルス属由来のプロテアーゼ（プロテアーゼＮアマノ、アマノエンザイム社）５００ｍｇを溶液に加え、８時間インキュベートし、その後１０分間加熱することによりプロテアーゼを失活させた。【００４４】
得られた溶液を凍結乾燥により粉末状にした。粉末を０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液に１０００倍（体積比）に希釈し、下記の条件によりＬＣ／ＭＳを用い、Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ、Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ、Ｌｙｓ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｉｌｅ、Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、およびＩｌｅ−Ｖａｌの含量を定量した。【００４５】
１ｇ蛋白質あたりの各ペプチドの生成量（ｍｇ）を表１に示す。カゼイン、大豆蛋白質、小麦グルテン、乳ホエイ蛋白質、および牛肉から、表１に示すペプチドが得られた。【００４６】
分析条件
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＨＧ−３（１５ｍｍ×２ｍｍ）
移動相：Ａ液：０．０５％  ＴＦＡ水溶液
Ｂ液：０．０５％  ＴＦＡアセトニトリル溶液
移動相の通液開始から０ｍｉｎに３体積％Ｂ液、４０ｍｉｎ後に２０体積％Ｂ液（いずれもＡ液およびＢ液の合計に対する割合）となるように、グラジエントをかけた。
カラム温度：３５℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＭＳ条件
Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＡＰＩ−ＥＳ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ＳＩＭ  ｉｏｎ：ｍ／ｚ  ２４５
Ｄｒｙｉｎｇ  ｇａｓ：１０Ｌ／ｍｉｎ  ａｔ  ３５０℃
Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ：２５ｐｓｉｇ
Ｆｒａｇｍｅｎｔｏｒ：３０Ｖ
ＥＭ  ｇａｉｎ：１【００４７】
【表１】
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【００４８】
製造例２
乳ホエイ蛋白質５０ｇを水１Ｌに溶解させた。１）バシラス属由来のプロテアーゼ（プロテアーゼＭアマノ、アマノエンザイム社）５００ｍｇ、２）アスペルギルス属由来のプロテアーゼ（プロテアーゼＮアマノ、アマノエンザイム社）５００ｍｇ、３）トリプシン（ノボ社）５００ｍｇ、４）ペプシン（和光純薬）５００ｍｇ、５）フレーバザイム（ノボ社）５００ｍｇ、６）アスペルギルス属由来のプロテアーゼ（ウマミザイム、アマノエンザイム社）５００ｍｇ、７）アスペルギルス属由来のプロテアーゼ（プロテアーゼＡアマノ、アマノエンザイム社）５００ｍｇ、および８）アスペルギルス属由来のプロテアーゼ（プロテアーゼＰアマノ、アマノエンザイム社）５００ｍｇをそれぞれ単独で、または組み合わせて溶液に加え、乳ホエイ蛋白質を加水分解した（表２）。プロテアーゼを加熱失活後、得られた溶液を凍結乾燥により粉末にした。粉末を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液に１０００倍（体積比）に希釈し、上記の条件によりＬＣ／ＭＳを用い、Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ、Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ、Ｌｙｓ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｉｌｅ、Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、およびＩｌｅ−Ｖａｌを定量した。【００４９】
結果を表２に示す。１）バシラス属由来のプロテアーゼおよび２）アスペルギルス属由来のプロテアーゼを組み合わせて反応させた場合に、最もＩｌｅ−Ｌｅｕを高含量に含む蛋白質加水分解物が得られた。また、３）トリプシンで反応後、２）アスペルギルス属由来のプロテアーゼで反応させた場合に、最もＩｌｅ−Ｔｒｐを高含量に含む蛋白質加水分解物が得られた。【００５０】
また、Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｌｙｓ−Ｉｌｅ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｉｌｅ、Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ、およびＩｌｅ−Ｖａｌは、６）アスペルギルス属由来のプロテアーゼで反応させた場合に、Ａｌａ−ＬｅｕおよびＡｓｐ−Ｌｅｕは、３）トリプシンで反応後、１）バシラス属由来のプロテアーゼで反応させた場合に、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、およびＬｅｕ−Ｖａｌは、４）ペプシンで反応後、２）アスペルギルス属由来のプロテアーゼで反応させた場合に、最もそれらのペプチドを高含量に含む蛋白質加水分解物が得られた。【００５１】
【表２】
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【００５２】
製造例３
乳ホエイ蛋白質５０ｇを水１Ｌに溶解させた。溶液のｐＨを７．０に調整後、５０℃に加熱し、保温した。バシラス属由来のプロテアーゼ（プロテアーゼＭアマノ、アマノエンザイム社）５００ｍｇとアスペルギルス属由来のプロテアーゼ（プロテアーゼＮアマノ、アマノエンザイム社）５００ｍｇを溶液に加え、８時間インキュベートし、次いで１０分間加熱することによりプロテアーゼを失活させた。その後、凍結乾燥により粉末状にした乳ホエイ蛋白質加水分解物１０ｇから、０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％エタノール（エタノール水溶液全体に対するのエタノールの体積％）１Ｌを用いて、Ｉｌｅ−ＬｅｕおよびＩｌｅ−Ｔｒｐを抽出した。抽出液を、濃縮エバポレータで濃縮後、凍結乾燥により粉末化した。得られた粉末を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液に１０００倍（体積比）に希釈し、上記の条件によりＬＣ／ＭＳを用い、Ｉｌｅ−ＬｅｕおよびＩｌｅ−Ｔｒｐを定量した。【００５３】
結果を表３に示す。９０％エタノールでの抽出物に、最もＩｌｅ−ＬｅｕおよびＩｌｅ−Ｔｒｐが多く含まれていた。【００５４】
【表３】
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【００５５】
実施例１
錠剤
常法に従い、下記の成分を所定量採取し、均一に混合し、圧縮成型して、直径７ｍｍ、１錠１５０ｍｇの錠剤を得た。
イソロイシルロイシン（糖取り込み促進ジペプチド）    ３０部
グルタミン    ５部
バリン    ５部
ロイシン    ７部
イソロイシン    ３部
トウモロコシデンプン    １９部
結晶セルロース    ３０部
ステアリン酸マグネシウム    １部【００５６】
実施例２
食品
下記の成分を所定量採取し、均一化して、本発明による食品を製造した。
製造例１で作成した糖取り込み促進ペプチド含有蛋白質分解物（粉末）    ９０部
グルタミン    ２部
ピロリン酸第２鉄    １部
トウモロコシデンプン    ７部【００５７】
実施例３
錠菓
実施例２による食品を用い、以下の配合にて、常法に従って錠菓を製造した。
グラニュー糖    ５２部
濃縮果汁    ５部
クエン酸    ６部
香料    ２部
乳化剤    ３部
実施例２の食品    ３２部【００５８】
生物試験例１：筋肉細胞における糖取り込み速度に与える影響
ウィスター系雄性ラット（体重１２０ｇ）（１６匹）をペントバルビタール麻酔下、滑車上筋を傷つけないように注意深く摘出した。滑車上筋を、０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、８ｍＭ  グルコース、および３２ｍＭ  マンニトール含有ＫＲＨ（１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ：ｐＨ７．４、以下同様）緩衝液中で、５％ＣＯ２、９５％Ｏ２下、３５℃で１時間インキュベートした。その後、滑車上筋を取り出し、０．１％ＢＳＡ、４０ｍＭ  マンニトール、および１ｍＭ  Ｉｌｅ−Ｌｅｕ（国産化学（株））、１ｍＭ  Ｉｌｅ−Ｔｒｐ（国産化学（株））、または１ｍＭロイシン当量の製造例１で作成した乳ホエイ蛋白質加水分解物を含むＫＲＨ緩衝液中で、５％ＣＯ２、９５％Ｏ２下、３０℃で３０分間インキュベートした（各群８検体）。次いで、滑車上筋を取り出し、０．１％ＢＳＡ、３２ｍＭ  マンニトール、８ｍＭ  ２−デオキシグルコース含有ＫＲＨ緩衝液中で、５％ＣＯ２、９５％Ｏ２下、３０℃で正確に２０分間インキュベートした。正確に２０分間インキュベートした後、直ちに滑車上筋を液体窒素で凍結させた。その後、凍結した滑車上筋を、０．３Ｍ  過塩素酸水溶液でホモジナイズし、懸濁液を中和後、２−デオキシグルコース−６−リン酸の量を、酵素法を用いて定量し、糖取り込み速度を測定した。【００５９】
糖取り込み速度（平均値±標準誤差）を表４に示す。Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ、および蛋白質加水分解物の全てに、筋肉細胞への糖取り込み作用があった。【００６０】
【表４】
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【００６１】
生物試験例２：筋肉細胞における糖取り込み速度効果に対するＰＩ３Ｋインヒビター、ＧＬＵＴ４インヒビターの影響
ウィスター系雄性ラット（体重１２０ｇ）（各群８匹）をペントバルビタール麻酔下、滑車上筋を傷つけないように注意深く摘出した。滑車上筋を、０．１％ＢＳＡ、８ｍＭ  グルコース、および３２ｍＭ  マンニトール含有ＫＲＨ緩衝液中で、５％ＣＯ２、９５％Ｏ２下、３５℃で１時間インキュベートした。その後、滑車上筋を取り出し、０．１％ＢＳＡ、４０ｍＭ  マンニトール、および１ｍＭ  Ｉｌｅ−Ｌｅｕ（国産化学（株））、１ｍＭ  Ｉｌｅ−Ｌｅｕ＋１０μＭ  ＬＹ２９４００２（シグマ社）、または１ｍＭ  Ｉｌｅ−Ｌｅｕ＋７０μＭ  サイトカラシンＢ（シグマ社）を含むＫＲＨ緩衝液中で、５％ＣＯ２、９５％Ｏ２下、３０℃で３０分間インキュベートした。次いで、滑車上筋を取り出し、０．１％ＢＳＡ、３２ｍＭ  マンニトール、８ｍＭ  ２−デオキシグルコース含有ＫＲＨ緩衝液中、５％ＣＯ２、９５％Ｏ２下、３０℃で正確に２０分間インキュベートした。正確に２０分間インキュベートした後、直ちに滑車上筋を液体窒素で凍結させた。その後、凍結した滑車上筋を、０．３Ｍ  過塩素酸水溶液でホモジナイズし、懸濁液を中和後、２−デオキシグルコース−６−リン酸の量を、酵素法を用いて定量し、糖取り込み速度を測定した。【００６２】
糖取り込み速度（平均値±標準誤差）を表５に示す。ＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２、ＧＬＵＴ４阻害剤であるサイトカラシンＢを加えることにより、Ｉｌｅ−Ｌｅｕによる糖取り込み作用が阻害された。このことはＩｌｅ−Ｌｅｕが、ＰＩ３Ｋを介して、ＧＬＵＴ４を細胞膜上にトランスロケーションし、ＧＬＵＴ４を介して筋肉細胞における糖取り込み作用を促進していることを示している。【００６３】
【表５】
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【００６４】
生物試験例３：経口糖負荷試験
ウィスター系雄性ラット約３６０ｇ（各群６匹）を用いた。１８時間絶食させたラットに、３０％グルコース水溶液を２．０ｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）になるように投与した。さらに、試験物質群として、製造例１で作成した乳ホエイ蛋白質加水分解物またはＩｌｅ−Ｌｅｕを０．１ｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）となる量、３０％グルコース水溶液に加えて投与した。３０、６０、９０、１２０、１８０分後にラットの尾静脈血から採血を行い、ダイヤセンサー（アークレイ社）を用い血糖値を測定した。【００６５】
血糖値の変化量（平均値±標準誤差）を表６に示す。糖液を単独で投与した場合に比べ、蛋白質加水分解物またはＩｌｅ−Ｌｅｕを加えることにより、有意に血糖の上昇を抑制できた。【００６６】
【表６】
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【００６７】
生物試験例４：２型糖尿病モデルマウスを用いた糖尿病発症予防効果確認試験
１０週令の２型糖尿病マウスモデル動物雄性ＫＫ−Ａｙマウス（日本クレア（株））を、水および食餌を自由摂取させ３週間飼育した（各群８匹）。食餌として、２５％カゼイン食（ＡＩＮ９３Ｇに従った）、または２５％カゼイン食に製造例１で作成した乳ホエイ蛋白質加水分解物を３％となる量添加した餌をそれぞれ摂取させた。飼育開始前と飼育３週間後にマウスの尾静脈より採血をし、血糖値を測定した。【００６８】
血糖値（平均値±標準誤差）を表７に示す。カゼイン食を摂取したマウスは、血糖値が上昇し、糖尿病が悪化した。これに対し、乳ホエイ蛋白質加水分解物を添加したカゼイン食を摂取したマウスは、有意に血糖値の上昇が抑制された。【００６９】
【表７】
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【００７０】
生物試験例５：グリコーゲン貯蔵効果確認試験
ウィスター系雄性ラット（各群８匹）を、水および食餌を自由摂取させ１週間飼育した。その際、１〜６日目には、ラットに１日あたり６時間の水泳トレーニングの負荷を掛けた。解剖前日（７日目）は１８ｇの制限食を与えた。次いで、ラットに、体重あたり２％重量の錘をつけ、４時間水泳運動させるグリコーゲン枯渇運動をさせた。その後、コントロールとして２５％カゼイン食（ＡＩＮ９３Ｇに従った）、あるいは２５％カゼイン食に含まれるカゼインを製造例１で作成した乳ホエイ蛋白質加水分解物に置き換えた餌を摂取させた。摂取開始から１２時間後にエーテル麻酔下でラットを解剖し、肝臓および筋肉を摘出した。直ちに、摘出した臓器を用いてグリコーゲン量を分析した。【００７１】
グリコーゲン量（平均値±標準誤差）を表８に示す。乳ホエイ蛋白質加水分解物は、グリコーゲン貯蔵促進作用を有していた。【００７２】
【表８】
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【００７３】
生物試験例６：筋肉細胞における糖取り込み速度に与える影響
ラット筋芽細胞Ｌ６を、５％ＣＯ２条件下、タイプ１コラーゲンコートシャーレを用い、１０％牛血清添加イーグル培地（αＭＥＭ）で培養した。常法に従い、トリプシン処理により回収した細胞を、タイプ１コラーゲンコート４８穴プレートに５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように撒き、３日間培養してコンフルエントにした。培地を除いた後、２％牛血清添加イーグル培地（αＭＥＭ）を各ｗｅｌｌ毎に５００μＬ添加して５日間培養し、細胞を分化誘導させた。各ｗｅｌｌを、５００μＬ  ＫＲＨ緩衝液（１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ：ｐＨ７．４）で細胞がはがれないように注意深く洗浄した。次いで、各ｗｅｌｌに、Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ、Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ、Ｌｙｓ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｉｌｅ、Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、またはＩｌｅ−Ｖａｌ（国産化学（株））をそれぞれ１ｍＭ含むＫＲＨ緩衝液を５００μＬ加え、３時間反応させた。その後、ＫＲＨ緩衝液を取り除き、８ｍＭ  ２−デオキシグルコース含有ＫＲＨ緩衝液を１００μＬ加え、正確に１０分間反応させた。１００μＬ  ０．１Ｎ  ＮａＯＨで反応を停止し、等量の０．１Ｎ  ＨＣｌで中和した後、２−デオキシグルコース−６−リン酸量を、酵素法を用いて定量することによって、糖取り込み速度を測定した。【００７４】
糖取り込み速度（平均値±標準誤差）を表９に示す。Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ、Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ、Ｌｙｓ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｉｌｅ、Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、およびＩｌｅ−Ｖａｌは、筋肉細胞への糖取り込み作用を有していた。
【表９】
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【００７５】
生物試験例７：マウスを用いた持久運動能力向上効果確認試験
雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス約２０ｇ（日本クレア（株））を水及び食餌を自由摂取させ３週間飼育した（各群８匹）。飼育１週目は１５メートル／分、１５分間、傾斜なしの条件下のトレッドミル運動負荷から始め、徐々にスピードと運動時間を２２メートル／分、３０分間、傾斜なしまで上げることによりトレッドミル運動に慣れさせた。２週目から飼育終了時まではスピード２２メートル／分、３０分間、傾斜なしの条件下で運動負荷を実施した。運動負荷は１週間あたり５日間実施した。食餌は２５％カゼイン食（ＡＩＮ９３Ｇに従った）、および２５％カゼイン食に含まれるカゼインを製造例１で作成した乳ホエイ蛋白質加水分解物に置き換えた餌をそれぞれ摂取させた。飼育３週間後に、運動パフォーマンステストを実施した。トレッドミルを用い、スピード３０メートル／分、傾斜なしの条件下で運動負荷を実施し、マウスが疲労困憊に到るまでの時間を計測した。【００７６】
持久運動時間（平均値±標準誤差）を表１０に示す。カゼイン食を摂取したマウスに比べ、蛋白質加水分解物を摂取したマウスは、持久運動時間が約１．７倍に増加した。
【表１０】
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【００７７】
本発明の組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける糖取り込み促進作用と同時に、上記生物試験例で示すとおり、ｉｎ  ｖｉｖｏでのウィスターラットまたはマウス試験においても、血糖上昇抑制効果、グリコーゲン貯蔵効果、持久運動能力向上効果を有していた。