(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（１）：【化２０】
0005645186.tif 000022
〔式中、R11はCH2CH2CH2CH3を表し、R12は水素原子を表し、R13は一級アミンを有するアミン化合物由来の残基と、下記式 (Ia)-(Ig):
【化２１】
0005645186.tif 000023
から選択されるいずれかの化合物との結合体を表し、  m1は10〜500の整数を表し、m2は1〜5の整数を表す。〕で示されるアニオン性ポリマー。
【請求項２】
一級アミンを有するアミン化合物由来の残基が、下記一般式(11)：    -NH-(CH2)r-X11    (11) （式中、X11は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、rは0〜5の整数を表す。）  で示される基、又は下記一般式(12)：    -〔NH-(CH2)s1〕t1 -X12    (12) （式中、X12はX11と同義である。s1及びt1は、それぞれ独立し、かつ〔NH-(CH2)s1〕ユニット間で独立して、s1は1〜5の整数を表し、t1は2〜5の整数を表す。）  で示される基である、請求項１に記載のアニオン性ポリマー。
【請求項３】
一級アミンを有するアミン化合物由来の残基が、-NH-NH2又は-NH-(CH2)2-NH-(CH2)2-NH2 で示されるものである、請求項１に記載のアニオン性ポリマー。
【請求項４】
前記式（I）で示される化合物が、下記式（Ib）又は（Ic）で示される化合物である、請求項１に記載のアニオン性ポリマー。【化２２】
0005645186.tif 000024
0005645186.tif 000025

【請求項５】
核酸、カチオン性ポリマー及び請求項１〜４のいずれか１項に記載のアニオン性ポリマーを含むポリマー複合体。
【請求項６】
核酸がプラスミドDNA又はsiRNAである、請求項５に記載のポリマー複合体。
【請求項７】
カチオン性ポリマーが次式（２）：【化２３】
0005645186.tif 000026
〔式中、R21及びR22は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、R23は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表し、m3は10〜500の整数を表し、m4は1〜5の整数を表す。〕で示される化合物、次式（３）：
【化２４】
0005645186.tif 000027
〔式中、R31及びR32は、それぞれR21及びR22と同義であり、R33は、置換されていてもよい炭素数11〜27の飽和若しくは不飽和の直鎖状若しくは分枝状の脂肪族炭化水素基又はステロールオキシカルボニル基を表し、  m5及びm6はそれぞれ独立して0〜500の整数を表し（但し、m5及びm6の合計は10〜500の整数を表す。）、m7は1〜5の整数を表し、m8は1〜5の整数を表す。  「/」の表記は、その左右に示された(m5+ m6)個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕で示される化合物、 次式（４）：
【化２５】
0005645186.tif 000028
〔式中、R41及びR42は、それぞれR21及びR22と同義であり、  R43はR33と同義であり、  R44は、R23と同義であり、  m9及びm10はそれぞれm5及びm6と同義であり、m11及びm12はそれぞれm7及びm8と同義であり、  「/」の表記は、前記と同義である。〕で示される化合物、及び次式（５）：
【化２６】
0005645186.tif 000029
〔式中、R51及びR52は、それぞれR21及びR22と同義であり、  R53及びR54は、R23と同義であり、  L1は、NH、CO、下記一般式(13)：    -(CH2)p1-NH-    (13) （式中、p1は1〜6の整数を表す。）で示される基、又は下記一般式(14)：    -L2a-(CH2)q1-L3a-    (14) （式中、L2aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3aは、NH又はCOを表す。q1は1〜6の整数を表す。）で示される基を表し、  m13、m14及びm15はそれぞれ独立して0〜500の整数を表し（但し、m13、m14及びm15の合計は10〜500の整数を表す。）、m16及びm17はそれぞれm7及びm8と同義であり、nは0〜500の整数を表す。  「/」の表記は、その左右に示された(m13+m14+m15)個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕で示される化合物からなる群から選択されるいずれかの化合物である請求項６に記載のポリマー複合体。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載のポリマー複合体を含む、細胞内への核酸送達デバイス。
【請求項９】
請求項５〜７のいずれか１項に記載のポリマー複合体を含む、細胞内への核酸送達用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】  本発明は、標的細胞に核酸を送達することができる非ウイルス性合成ベクターとして、核酸を封入するポリマー複合体（ポリプレックス）に関する。特に、本発明は、核酸、カチオン性ポリマー及びアニオン性ポリマーを含み、アニオン性ポリマーがカチオン性ポリマーと核酸との複合体の表面を覆っている電荷変換型三元系ポリプレックスに関する。 
【背景技術】
【０００２】  非ウイルス性合成ベクター（リポプレックスおよびポリプレックス）を介した標的細胞へのDNAまたはRNAのデリバリーは、生物学的特性に固有の安全上の問題に直面しているウイルス性ベクターを用いたデリバリーに対する有望な代替方法として広く認識されている[1]。それにもかかわらず、非ウイルス性ベクターの場合でも、送達効率と安全上の問題（特に、化学毒性）とが両立しないことが大きな関心事である。トランスフェクション効率が高いベクターは、多くの場合高い毒性を示す一方で、毒性が低いベクターはトランスフェクション効率が低いことが多い。【０００３】  Behrらは、ポリエチレンイミン（PEI）について仮説を立てた「プロトン−スポンジ」効果によるエンドソーム脱出の概念を、遺伝子デリバリーの分野において導入した。それ以来、塩基度が調整された種々のポリカチオンが、ポリプレックスの構築のために開発されている。しかし、これらのポリカチオンの毒性によって、ポリプレックスは限定された用途でしか使用できない[2]。ポリカチオンの開発が限定的なものであることの主要な理由の一つは、おそらく、デリバリープロセスの異なる各段階において、ポリプレックスの異なる機能が必要とされ、対立する機能が必要とされることである。例えば、ポリプレックス中でアミン密度が高い部分は、エンドソーム膜障害を克服するために重要である。なぜならば、ポリプレックスのプロトン化電位は、エンドソーム緩衝及び膜不安定化の原因となるからである[3]。逆に、ポリプレックスが正に帯電する性質によって、負に帯電した血清成分と非特異的に相互作用を起こして毛細血管で血栓を形成する場合があり、原形質膜の構築が乱れて高い細胞毒性と過剰な免疫応答を誘導する危険性を有している[4]。【０００４】  これらの問題に対する周知の実際的な解決策として、ポリアニオン[5]またはポリエチレングリコール(PEG)[6]でポリプレックス表面を覆うことによる正電荷の遮蔽が挙げられる。しかし、主として細胞への取り込みが減少すること、そしてエンドソーム脱出の能力が損なわれることから、トランスフェクション効率が著しく低下することは避けられない。  したがって、トランスフェクションプロセスの間の特定部位における反遮蔽方法（deshielding method）の開発に対して、多くの労力が集中している[7]。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１−１】D. W. Pack, A. S. Hoffman, S. Pun, P.S. Stayton, Nat. Rev. Drug Discovery 2005, 4, 581-593
【非特許文献１−２】E. Mastrobattista, M. A. E. M. Aa, W. E. Hennink, D. J. A. Crommelin, Nat. Rev. Drug Discovery 2006, 5, 115-121.
【非特許文献２−１】O. Boussif, F. Lezoualc’h, M. A. Zanta, M. D. Mergny, D. Scherman, B. Demeneix, J. P. Behr, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995, 92, 7297-7301
【非特許文献２−２】M. Neu, D. Fischer, T. Kissel, J. Gene Med. 2005
【非特許文献３−１】M. X. Tang, C. T. Redemann, F. C. Szoka, Bioconjugate Chem. 1996, 7, 703-714
【非特許文献３−２】R. Wattiaux, N. Laurent, S. W-D. Coninck, M. Jadot, Adv,Drug Del. Rev. 2000, 41, 201-208.
【非特許文献４−１】A. C. Hunter, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58, 1523-1531
【非特許文献４−２】M. Ogris, S. Brunner, S. Schuler, R. Kircheis, E. Wagner, Gene Ther. 1999, 6, 595-605.
【非特許文献５】V.S. Trubetskoy, S. C. Wong, V. Subbotin, V. G. Budker, A. Loomis, J. E. Hagstrom, J. A. Wolff, Gene Ther. 2003, 10, 261-271.
【非特許文献６】M. Han, Y. Bae, N. Nishiyama, K. Miyata, M. Oba, K. Kataoka,J. Controlled Rel. 2007, 121, 38-48.
【非特許文献７−１】E. R. Gillies, A. P. Goodwin, J. M. Frechet, Bioconjugate Chem. 2004, 15, 1254-1263
【非特許文献７−２】M. Kramer, J. F. Stumbe, H. Turk, S. Krause, A. Komp, L.Delineau, S. Prokhorova, H. Krautz, R. Haag, Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 4252-4246.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  そこで、本発明者らは、ポリプレックス構造に電荷変換型部分を組み込むことによって高トランスフェクション活性と低毒性との両方の特性を発揮するポリプレックスの設計に対する新規アプローチを検討した。マレイン酸アミド誘導体であるcis-アコニチン酸アミドおよびシトラコン酸アミドは、中性のpHにおいて負電荷を有しているが、弱酸性のpH 5.5で速やかに分解され、正に帯電したアミンが露出する[8]。従って、本発明者らが正に帯電したポリプレックスの表面を分解性アミドから誘導されたポリマーで覆うことにより三元系ポリプレックス（pDNA/ポリカチオン/分解性側鎖を有するポリアニオン）を形成する場合、その三元系ポリマーは細胞の外側では中性〜負に帯電した性質を維持する。その一方で、エンドソームの酸性環境では、電荷変換型成分が正に帯電するように変化して、膜の破壊によるポリプレックスのエンドソーム脱出を促進することが予測される。このスキームは、図１において説明される。【０００７】  本発明は、細胞外ではマイナス電荷を帯び、エンドソームに入るとプラス電荷に電荷変換を行うポリマーを提供することを目的とする。また本発明は、前記ポリマーを含む複合体（ポリプレックス）であって、遺伝子導入効率と安全性との間に存在する問題（ジレンマ）を克服し、低毒性かつ高い遺伝子導入効率を達成し得る三元系ポリプレックスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った。その結果、ポリカチオンをシトラコン酸無水物又はcis-アコニチン酸無水物と反応させたポリマーは、中性条件下ではマイナス電荷を帯びているのに対し、酸性条件下ではカチオンに荷電が変換され、低毒性かつ高い遺伝子導入効率を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】  すなわち、本発明は次式（１）で示されるアニオン性ポリマーである。【化１】
0005645186.tif 000002
【００１０】〔式中、R11及びR12は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、  R13は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基と、下記式（I）：【化２】
0005645186.tif 000003
【００１１】（式中、Ra及びRbは、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、複素環基、複素環アルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基若しくはアリールオキシ基を表す。また、RaとRbとが結合し、それぞれが結合している炭素原子と共に芳香環又はシクロアルキル環を形成していてもよい。Ra及びRbがそれぞれ結合している炭素原子間の結合は、単結合又は二重結合である。）  で示される化合物又はその誘導体との結合体を表し、  m1は10〜500の整数を表し、m2は1〜5の整数を表す。〕【００１２】  本発明のアニオン性ポリマーにおいて、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基としては、例えば下記一般式(11)：    -NH-(CH2)r-X11    (11) （式中、X11は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、rは0〜5の整数を表す。）で示される基、又は下記一般式(12)：    -〔NH-(CH2)s1〕t1 -X12    (12) （式中、X12はX11と同義である。s1及びt1は、それぞれ独立し、かつ〔NH-(CH2)s1〕ユニット間で独立して、s1は1〜5の整数を表し、t1は2〜5の整数を表す。）で示される基が挙げられ、-NH-NH2 又は -NH-(CH2)2-NH-(CH2)2-NH2 で示されるものが好ましい。【００１３】  また、本発明のアニオン性ポリマーにおいて、前記式（I）で示される化合物としては、例えば下記式（Ia）〜（Ig）で示される化合物のうちの少なくとも１種が挙げられる。【化３】
0005645186.tif 000004
また、本発明は、核酸、カチオン性ポリマー及び前記アニオン性ポリマーを含むポリマー複合体を提供する。  本発明のポリマー複合体において、核酸としては、例えばプラスミドDNA又はsiRNAが挙げられる。
【００１４】  また、カチオン性ポリマーとしては、次式（２）：【化４】
0005645186.tif 000005
〔式中、R21及びR22は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、R23は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表し、m3は10〜500の整数を表し、m4は1〜5の整数を表す。〕で示される化合物、
【００１５】  次式（３）：【化５】
0005645186.tif 000006
〔式中、R31及びR32は、それぞれR21及びR22と同義であり、  R33は、置換されていてもよい炭素数11〜27の飽和若しくは不飽和の直鎖状若しくは分枝状の脂肪族炭化水素基又はステロールオキシカルボニル基を表し、  m5及びm6はそれぞれ独立して0〜500の整数を表し（但し、m5及びm6の合計は10〜500の整数を表す。）、m7は1〜5の整数を表し、m8は1〜5の整数を表す。  「/」の表記は、その左右に示された(m5+ m6)個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕で示される化合物、
【００１６】   次式（４）：【化６】
0005645186.tif 000007
〔式中、R41及びR42は、それぞれR21及びR22と同義であり、  R43はR33と同義であり、  R44は、R23と同義であり、  m9及びm10はそれぞれm5及びm6と同義であり、m11及びm12はそれぞれm7及びm8と同義であり、  「/」の表記は、前記と同義である。〕で示される化合物、及び
【００１７】  次式（５）：【化７】
0005645186.tif 000008
〔式中、R51及びR52は、それぞれR21及びR22と同義であり、  R53及びR54は、R23と同義であり、  L1は、NH、CO、下記一般式(13)：    -(CH2)p1-NH-    (13) （式中、p1は1〜6の整数を表す。）で示される基、又は下記一般式(14)：    -L2a-(CH2)q1-L3a-    (14) （式中、L2aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3aは、NH又はCOを表す。q1は1〜6の整数を表す。）で示される基を表し、  m13、m14及びm15はそれぞれ独立して0〜500の整数を表し（但し、m13、m14及びm15の合計は10〜500の整数を表す。）、m16及びm17はそれぞれm7及びm8と同義である。nは0〜500の整数を表す。  「/」の表記は、その左右に示された(m13+m14+m15)個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕  で示される化合物からなる群から選択されるいずれかの化合物が挙げられる。
【００１８】  さらに、本発明は、前記ポリマー複合体を含む細胞内への核酸送達デバイス又は細胞内への核酸送達用キットを提供する。  本発明のポリマー複合体（ポリプレックス）の好ましい態様において、アニオン性ポリマーは、カチオン性ポリマーと核酸との複合体の表面を覆っており、アニオン性ポリマーは中性pHにおいて負電荷を有し、弱酸性のpHにおいて正電荷を有するように変化することができるものである。  上記アニオン性ポリマーの特定の例としては、図 2A(c)に示されるポリマー(詳細には、“pAsp(DET-Aco)”)を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１９】 本発明により、中性条件下ではマイナス電荷を帯びているが酸性条件下ではカチオンに荷電が変換する電荷変換型三元系ポリプレックスが提供される。  遺伝子ベクターの研究分野において、HUVECのような毒性に敏感な初代細胞に遺伝子導入することは非常に困難である。本発明のポリプレックスは、このような種類の細胞に対してDNAやsiRNAなどの核酸を、毒性を惹起することなく高効率でデリバリーすることが可能である。また医学的な観点では、核酸デリバリーの主な障害は効率が低いこと、毒性が高いこと、及び血中で不安定なことが挙げられる。本発明の電荷変換三元系ポリプレックスは、細胞外ではマイナス電荷を帯びているため非常に低毒性であり、in vivoにおける遺伝子ベクターとして極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】エンドソーム破壊機能を有する電荷変換型三元系ポリプレックスの概要図である。
【図２】本発明において使用されるポリマーの構造式及び電荷変換を示す図である。(A) ポリカチオンの構造:(a) pAsp(DET)、(b) pAsp(EDA-Suc) (非電荷変換型ポリアニオン)および(c) pAsp(DET-Aco) (電荷変換型ポリアニオン)。(B)三元系ポリプレックス（DNA/pAsp(DET)/pAsp(DET-Aco)）の電荷変換。(C)三元系ポリプレックスの流体力学的直径の変化。白丸(○)はpH 5.5における結果を表し、黒丸(●)はpH 7.4における結果を表す。
【００２１】
【図３】ポリプレックスの機能を解析した結果を示す図である。(A) BSA溶液中のポリプレックスの安定性。(B) 種々のベクターのトランスフェクション活性。 (C) 種々のベクターでトランスフェクトされたHUVEC の相対的生存率。 (D) Cy 5-ラベル DNAの赤色蛍光とLysoTracker Greenの緑色蛍光との共局在の比率。各エラーバーは、標準誤差を意味する。ExGen 500 (黒色バー); pAsp(DET) ポリプレックス (● および濃灰色バー);  pAsp(EDA-Suc) 三元系ポリプレックス (▼ および灰色バー); pAsp(DET-Aco) 三元系ポリプレックス (○ および白色バー)。
【図４】HUVECの共焦点顕微鏡による観察結果を示す図である。(A)、(B)  pAsp(DET) ポリプレックスでトランスフェクトされたHUVECのCLSM像。(C)、(D)  pAsp(DET-Aco) 三元系ポリプレックスでトランスフェクトされたHUVECのCLSM像(E)、(F)  pAsp(EDA-Suc) 三元系ポリプレックスでトランスフェクトされたHUVECのCLSM像。(A)、(C)および(E)は、トランスフェクション後3時間の像であり、(B)、(D)および(F)はトランスフェクション後24時間の像である。Cy5 (赤色) -ラベルのプラスミドDNAを使用した。細胞核をHoechst 33342 (青色)で染色し、後期エンドソームおよびリソソームをLysoTracker Green (緑色)で染色した。各スケールバーは20 μmである。
【００２２】
【図５】各ポリプレックスのサイズ分布を示す図である。DNA/pAsp(DET)ポリプレックス(N/P比率= 4) (A)、pAsp(DET)/pAsp(DET-Aco)複合体(pAsp(DET-Aco)/pAsp(DET) = 2) (B)、および(DNA/pAsp(DET)/pAsp(DET-Aco)三元系ポリプレックス(N/P比率= 4; pAsp(DET-Aco)/pAsp(DET) = 2)のサイズ分布。
【図６】ポリプレックスのゲル遅延アッセイの結果を示す図である。レーン1  pDNAのみ; レーン2  pDNA/pAsp(DET)ポリプレックス（N/P比率 4）; レーン3  pDNA/pAsp(DET)/pAsp(DET-Aco) (N/P = 4, pAsp(DET-Aco)/pAsp(DET) = 2); レーン4  pDNA/pAsp(DET)/pAsp(DET-Aco) (N/P = 6, pAsp(DET-Aco)/pAsp(DET) = 2); レーン5  pDNA/pAsp(DET)/pAsp(DET-Aco) (N/P = 8, pAsp(DET-Aco)/pAsp(DET) = 2)。
【図７】pH 5.5におけるpAsp(DET)ポリプレックス(●)およびpAsp(EDA-Suc) (○)三元系ポリプレックスのゼータ電位の変化を示す図である。
【図８】ルシフェラーゼおよびVenus (YFP)トランスフェクションアッセイによるトランスフェクション効率と毒性の比較を示す図である。(A) ルシフェラーゼ活性(RLU/μgタンパク質)による相対的なトランスフェクション効率、(B) MTTアッセイによる相対的な細胞生存率、および(C) Venus (+) 細胞カウントの計算による相対的なVenus (YFP)発現。黒色バー; ExGen 500 (Fermentas, Canada)網掛けバー; Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA)  濃灰色バー; pAsp(DET) ポリプレックス白色バー pAsp(DET-Aco) 三元系ポリプレックス  )。各エラーバーは、標準偏差を意味する。
【００２３】
【図９】種々のトランスフェクション試薬によるHUVECに対するVenus (YFP) トランスフェクション結果を示す図である。(A) ExGen 500、(B) Lipofectamine 2000、(C) pAsp(DET) ポリプレックス、および (D) pAsp(DET-Aco) 三元系ポリプレックス。
【図１０】P[Lys(TFA)]ホモポリマーのゲル浸透クロマトグラフィーによる分析結果を示す図である。
【図１１】pDNA/PLL polyplexおよび三元系polyplexの物理化学的評価（粒径およびゼータ電位測定）を行った結果を示す図である。
【図１２】本発明の三元系polyplexを用いたときの遺伝子発現活性を試験した結果を示す図である。
【００２４】
【図１３】本発明の三元系ポリプレックスの細胞内取り込みについて、フローサイトメーターによる分析を行った結果を示す図である。
【図１４】共焦点レーザー顕微鏡観察結果を示す図である。
【図１５】エンドソーム内にトラップされたポリプレックスを定量的に評価した結果を示す図である。
【図１６】siRNAを搭載した三元系ポリプレックスによるルシフェラーゼ遺伝子のノックダウン効果とsiRNA導入に伴う細胞毒性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】  以下、本発明を詳細に説明する。但し、以下の説明は、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。以下の実施の態様は、本発明の趣旨から逸脱することなく、種々の変更および改変をなすことができることが理解される。  なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる米国仮出願61/126,077号（出願日：2008年4月30日）の明細書に記載の内容を包含する。  また、本明細書において列挙される全ての文書および刊行物は、あらゆる目的のために、本明細書においてその全体が参考として組み込まれる。  本発明は、核酸、カチオン性ポリマーおよびアニオン性ポリマーを含むポリマー複合体（ポリプレックス）であって、アニオン性ポリマーは中性pHにおいて負電荷を有し、弱酸性のpHにおいて正電荷を有するように変化することができるポリマー複合体である。また、本発明は、上記ポリマー複合体を構成するアニオン性ポリマーも提供する。
【００２６】１．アニオン性ポリマー 本発明のアニオン性ポリマーは、次式（１）で示されるものであり、電荷変換型ポリマーとして使用される。【化８】
0005645186.tif 000009
〔式中、R11及びR12は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、  R13は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基と、下記式（I）：
【化９】
0005645186.tif 000010
（式中、Ra及びRbは、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、複素環基、複素環アルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基若しくはアリールオキシ基を表す。また、RaとRbとが結合し、それぞれが結合している炭素原子と共に芳香環又はシクロアルキル環を形成していてもよい。Ra及びRbがそれぞれ結合している炭素原子間の結合は、単結合又は二重結合である。）  で示される化合物又はその誘導体との結合体を表し、m1は10〜500の整数を表し、m2は1〜5の整数を表す。〕
【００２７】  本発明のアニオン性ポリマーにおいて、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基としては、例えば下記一般式(11) 又は下記一般式(12) で示される基が挙げられる。    -NH-(CH2)r-X11    (11) （式中、X11は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、rは0〜5の整数を表す。）  -〔NH-(CH2)s1〕t1 -X12    (12) （式中、X12はX11と同義である。s1及びt1は、それぞれ独立し、かつ〔NH-(CH2)s1〕ユニット間で独立して、s1は1〜5の整数を表し、t1は2〜5の整数を表す。）
【００２８】  本発明において、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基は、-NH-NH2又は-NH-(CH2)2-NH-(CH2)2-NH2 で示されるものが好ましい。  本発明において、前記式（I）で示される化合物としては、例えば下記式（Ia）〜（Ig）で示される化合物のうちの少なくとも１種が挙げられる。【化１０】
0005645186.tif 000011

【００２９】  本発明のポリプレックス（polyplex）に含まれるアニオン性ポリマーの例としては、pAsp(DET-Aco)が好ましく挙げられるが、当該pAsp(DET-Aco)の構造は、カチオン性ポリマーであるpAsp(DET)（すなわち、アスパラギン酸骨格にエチレンジアンミンユニットが結合したアミノ酸のポリマー）の側鎖末端のアミノ基にN’-cis-aconityl基が結合することにより、アニオン性側鎖を有するポリマーとなったものである。pAsp(DET-Aco)は、疎水性基（例えばPLL）の一級アミノ基に式Iで示される化合物（例えばcis-aconityl anhydride）を反応させることによって合成することができる。
【００３０】  一級アミンを有するアミン化合物由来の残基と、式（I）で示される化合物又はその誘導体との結合は、例えば、前記式（I）で示される化合物と、アミン化合物のアミノ基とが結合（共有結合）して、下記式（I’）に示されるような構造をとることでなされる。ここで、誘導体とは、上記一般式（Ｉ）を基本骨格として当該化合物から派生する任意の化合物を指す。例えばIcの化合物のCOOHを例えばアルキル基でしたもの、IbやIeに示す化合物のメチル基を他のアルキル基で置換したもの、芳香環又はシクロアルキル環を少なくとも1個のハロゲン原子で置換したものなどが挙げられる。
【００３１】  式（I)において、置換基には、炭化水素基は、飽和又は不飽和の非環式であっても飽和又は不飽和の環式であってもよい。炭化水素基が非環式の場合には、直鎖状でも分岐状でもよい。炭化水素基には、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル基、Ｃ４〜Ｃ２０シクロアルキル基、Ｃ６〜Ｃ１８アリール基、Ｃ６〜Ｃ２０アラルキル基、Ｃ１〜Ｃ２０アルコキシ基、Ｃ６〜Ｃ１８アリールオキシ基などが含まれる。 【化１１】
0005645186.tif 000012
【００３２】  当該結合に関しては、例えば、前記式（I）で示される化合物が前記式（Ib）及び（Ic）で示される化合物である場合、当該結合後の上記式（I’）に示される構造としては、以下の通りとなる。【化１２】
0005645186.tif 000013
0005645186.tif 000014
【００３３】２．カチオン性ポリマー  本発明の複合体の構成成分である特定のカチオン性高分子は、少なくとも一部にポリカチオン部分を有するカチオン性高分子である。  本発明において、カチオン性ポリマー（ポリカチオン）としては、上記pAsp(DET)（上記pAsp(DET-Aco)の基本骨格となるpAsp(DET)も含む）には限定はされず、カチオン性基を側鎖に有するポリペプチドとして公知のものが全て含まれ、これらは、当業者の技術常識により、pAsp(DET)の場合と同様に本発明の実施に利用することができる。ここで言うカチオン性基とは、水素イオンが配位して既にカチオンとなっている基に限らず、水素イオンが配位すればカチオンとなる基も含む意味である。カチオン性基を側鎖に有するポリペプチドとは、塩基性側鎖を有する公知のアミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン等）がペプチド結合してなるもののほか、各種アミノ酸がペプチド結合し、その側鎖がカチオン性基を有するように置換されたものも含まれる。
【００３４】（１）モノポリマー  カチオン性ポリマー（モノポリマー）としては、例えば次式（２）〜（４）に示される化合物を挙げることができる。【化１３】
0005645186.tif 000015
〔式中、R21及びR22は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、R23は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表し、m3は10〜500の整数を表し、m4は1〜5の整数を表す。〕で示される化合物、
【００３５】次式（３）：【化１４】
0005645186.tif 000016
〔式中、R31及びR32は、それぞれR21及びR22と同義であり、  R33は、置換されていてもよい炭素数11〜27の飽和若しくは不飽和の直鎖状若しくは分枝状の脂肪族炭化水素基又はステロールオキシカルボニル基を表し、  m5及びm6はそれぞれ独立して0〜500の整数を表し（但し、m5及びm6の合計は10〜500の整数を表す。）、m7は1〜5の整数を表し、m8は1〜5の整数を表す。  「/」の表記は、その左右に示された(m5+ m6)個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕で示される化合物、
【００３６】 次式（４）：【化１５】
0005645186.tif 000017
〔式中、R41及びR42は、それぞれR21及びR22と同義であり、  R43はR33と同義であり、  R44は、R23と同義であり、  m9及びm10はそれぞれm5及びm6と同義であり、m11及びm12はそれぞれm7及びm8と同義であり、  「/」の表記は、前記と同義である。〕で示される化合物が挙げられる。
【００３７】  一般式(2)中、カチオン性基を含む部分となるR2は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表す。-R23基としては、例えば、下記一般式(22)又は下記一般式(23)で示される基が挙げられ、中でも下記一般式(23)で示される基が好ましい。    -NH-(CH2)r-X21    (22)〔式(22)中、X21は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、rは0〜5の整数を表す。〕    -〔NH-(CH2)s2〕t2 -X22    (23)〔式(23)中、X22は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表す。s2及びt2は、それぞれ独立し、かつ〔NH-(CH2)s2〕ユニット間で独立して、s2は1〜5（好ましくは2）の整数を表し、t2は2〜5（好ましくは2）の整数を表す。〕
【００３８】  一般式(22)及び(23)中、末端の-X21基及び-X22基（アミン化合物残基）としては、例えば、-NH2、-NH-CH3、-N(CH3)2、及び下記式(i)〜(viii)に示される基等が好ましく挙げられ、中でも-NH2が特に好ましい。なお、下記式(vi)中、Yとしては、例えば、水素原子、アルキル基（炭素数１〜６）、及びアミノアルキル基（炭素数１〜６）等が挙げられる。【化１６】
0005645186.tif 000018
一般式(2)中、-R23基としては、具体的には「-NH-NH2」又は「-NH-(CH2)2-NH-(CH2)2-NH2」が特に好ましく、中でもエチレンジアミンユニットを含む後者がより好ましい。  一般式(2)中、m3は、限定はされないが、100〜500、好ましくは30〜150（より好ましくは60〜100）の整数を表し、m4は、限定はされないが、好ましくは1〜5（より好ましくは1〜2）の整数を表す。
【００３９】  脂肪族炭化水素残基が飽和である場合は、炭素数１１〜２７のアルキル基に等価であり、上記アルキル基に加えてペンタコシル基、ヘキサコシル基、へプタコシル基等が例示される。不飽和の脂肪族炭化水素残基は、該アルキル基の鎖中の炭素−炭素単結合の１〜５個が炭素−炭素二重結合となっている基に該当する。このような残基（Ｒ）を有するアシル基（ＲＣＯ−）の例としては、限定されるものでないが、ラウリン酸（またはドデカン酸）、ミリスチン酸（またはテトラデカン酸）、パルミチン酸（またはヘキサデカン酸）、パルミトオレイン酸（または９−ヘキサデセン酸）、ステアリン酸（またはオクタデカン酸）、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エレオステアリン酸（または９，１１，１３−オクタデカトリエン酸）、アラキジン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸等を挙げることができる。
【００４０】  本発明において、ステロールとは、シクロペンタノンヒドロフェナントレン環（Ｃ１７Ｈ２８）をベースとする天然、半合成または合成の化合物、さらにはそれらの誘導体を意味し、例えば、天然のステロールとしては、限定されるものではないが、コレステロール、コレスタノール、ジヒドロコレステロール、コール酸、カンペステロール、シストステロール等が挙げられ、その半合成または合成の化合物としては、これら天然物の例えば、合成前駆体（必要により、存在する場合には、一定の官能基、ヒドロキシ基の一部もしくは全部が当該技術分野で既知のヒドロキシ保護基により保護されているか、またはカルボキシル基がカルボキシル保護により保護されている化合物を包含する）であることができる。また、ステロール誘導体とは、本発明の目的に悪影響を及ぼさない範囲内で、シクロペンタノンヒドロフェナントレン環にＣ１−１２アルキル基、ハロゲン原子、例えば、塩素、臭素、フッ素、が導入されていてもよく、該環系は飽和、部分不飽和、であることができること等を意味する。ステロール誘導体の残基は、好ましくは、コレステロール、コレスタノール、ジヒドロキシコレステロールの３位ヒドロキシ基の水素原子が除去された基である。さらに好ましくは、コレステロール３位ヒドロキシ基の水素原子が除去された基である。ステロールオキシカルボニル基のステロールとしては、コレステロール、コレスタノール、ジヒドロコレステロール、コール酸、カンペステロール、シストステロール等の動植物油起源のものが挙げられる。
【００４１】  上記カチオン性ポリマーは以下のようにして製造することができる。  上記式（２）〜（４）で表されるポリ（アミノ酸）は、例えば、公知のアスパラギン酸エステル由来のＮ−カルボン酸無水物の重合により製造したポリアミノ酸エステルを、R23、R33及びR44の基のポリアミン残基に対応するポリアミンを用いてアミノリシスを行うことによりポリ（アミノ酸）の側鎖にポリアミン残基を導入し、こうして導入したポリアミン部分のアミノ基と、上記脂肪族炭化水素残基を有するアシル基に対応するカルボン酸のカルボキシル基を必要により活性化した後、上記アミノ基に対して活性化カルボン酸の適量を反応させることにより、製造することができる。
【００４２】（２）ブロックコポリマー  本発明において、カチオン性高分子は、上記の通りポリカチオン部分のみからなるポリマー（ホモポリマー）であってもよいが、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）部分及びポリカチオン部分を有するブロックコポリマー又はグラフトポリマーであってよく、限定はされず、本発明の複合体の用途等によって適宜好ましい態様を選択することができる。
【００４３】  PEG及びポリカチオンとしては、その構造（例えば重合度等）は限定されず、任意の構造のものを選択できるが、なかでもポリカチオンとしては、カチオン性基を側鎖に有するポリペプチドであることが好ましい。  本発明のポリプレックスは、核酸とブロックコポリマー中の一部（ポリカチオン部分）とが相互作用してイオンコンプレックスとなるコア部分を形成し、当該ブロックコポリマー中の他の部分（PEG部分を含む部分）がコア部分の周囲にシェル部分を形成した状態の、コア-シェル型のミセル状複合体ということができる。ブロックコポリマーとしては、下記一般式(1)で示されるものが挙げられる。
【００４４】  次式（５）：【化１７】
0005645186.tif 000019
〔式中、R51及びR52は、それぞれR21及びR22と同義であり、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表す。  R53及びR54は、R23と同義であり、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表す。  L1は、NH、CO、下記一般式(13)：    -(CH2)p1-NH-    (13) （式中、p1は1〜6の整数を表す。）で示される基、又は下記一般式(14)：    -L2a-(CH2)q1-L3a-    (14) （式中、L2aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3aは、NH又はCOを表す。q1は1〜6の整数を表す。）で示される基を表し、  m13、m14及びm15はそれぞれ独立して0〜500の整数を表し（但し、m13、m14及びm15の合計は10〜500の整数を表す。）、m16は1〜5の整数を表し、m17は1〜5の整数を表し、nは0〜500の整数を表す。  「/」の表記は、その左右に示された(m13+m14+m15)個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
【００４５】  ここで、上記一般式(5)のカチオン性高分子中、-R53基及び／又は-R54基は一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表し、前記一般式（２）の項で説明したものと同様に適用することができる。例えば、上記一般式(22) 又は上記一般式(23) で示される基が挙げられ、一般式(23)  で示される基が好ましい。
【００４６】  ここで、一般式(5)の構造式中、繰り返し単位数（重合度）がnのブロック部分がPEG部分であり、繰り返し単位数がm13の部分とm14の部分とm15の部分とを合わせたブロック部分（一般式(5)中、[   ] 内に示された部分）がポリカチオン部分である。また、ポリカチオン部分の構造中式中の「/」の表記は、その左右に示された各モノマー単位の配列順序が任意であることを意味する。例えば、Ａ、Ｂ及びＣというモノマー単位から構成されるブロック部分が、[-(Ａ)a-/-(Ｂ)b-/-(Ｃ)c-]と表記されている場合は、ａ個のＡとｂ個のＢとｃ個のＣとからなる合計(ａ+ｂ＋ｃ)個の各モノマー単位が、ランダムにどのような並び順で連結していてもよいことを意味する（但し、すべてのＡ、Ｂ及びＣは直鎖状に連結している。）。
【００４７】  上記炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、n-ヘキシル基、デシル基及びウンデシル基等が挙げられる。  また上記アルキル基の置換基としては、例えば、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、炭素数２〜７のアシルアミド基、シロキシ基、シリルアミノ基、及びトリアルキルシロキシ基（各アルキルシロキシ基は、それぞれ独立に、炭素数１〜６である）等が挙げられる。  上記置換基がアセタール化ホルミル基である場合、酸性の温和な条件下で加水分解することにより、他の置換基であるホルミル基（アルデヒド基；-CHO）に転化することができる。
【００４８】  一般式(5)中、リンカー部分となるL1は、NH、CO、下記一般式(4)：    -(CH2)p1-NH-    (4)  〔式(4)中、p1は1〜6（好ましくは2〜3）の整数を表す。〕で示される基、又は下記一般式(5)：    -L2a-(CH2)q1-L3a-    (5)  〔式(5)中、L2aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3aは、NH又はCOを表す。q1は1〜6（好ましくは2〜3）の整数を表す。〕で示される基を表す。
【００４９】  一般式(5)中、nは、PEG部分の繰り返し単位の数（重合度）を表し、具体的には、0〜500（好ましくは100〜400、より好ましくは200〜300）の整数を表す。  また、ポリカチオン部分を構成する各モノマー単位の重合度であるm13、m14及びm15については、それぞれ互いに独立して、0〜500（好ましくは0〜100、より好ましくは10〜100、さらに好ましくは20〜100、さらにより好ましくは30〜100）の整数を表す（但し、m13、m14及びm15の合計（m13+m14+m15）は、10〜500（好ましくは10〜300、より好ましくは20〜200、さらに好ましくは30〜150、さらに好ましくは40〜120、さらにより好ましくは50〜100、特に好ましくは60〜70）である。）。
【００５０】  一般式(5)で示されるカチオン性高分子の分子量（Mw）は、限定はされないが、23,000〜45,000であることが好ましく、より好ましくは28,000〜34,000である。また、個々のブロック部分については、PEG部分の分子量（Mw）は、8,000〜15,000であることが好ましく、より好ましくは10,000〜12,000であり、ポリカチオン部分の分子量（Mw）は、全体で15,000〜30,000であることが好ましく、より好ましくは18,000〜22,000である。  一般式(5)で示されるカチオン性高分子の製造方法は、限定はされないが、例えば、R51とPEG鎖のブロック部分とを含むセグメント（PEGセグメント）を予め合成しておき、このPEGセグメントの片末端（R51と反対の末端）に、所定のモノマーを順に重合し、その後必要に応じて側鎖をカチオン性基を含むように置換又は変換する方法、あるいは、上記PEGセグメントと、カチオン性基を含む側鎖を有するブロック部分とを予め合成しておき、これらを互いに連結する方法などが挙げられる。当該製法における各種反応の方法及び条件は、常法を考慮し適宜選択又は設定することができる。
【００５１】  上記PEGセグメントは、例えば、WO 96/32434号公報、WO 96/33233号公報及びWO 97/06202号公報等に記載のブロックコポリマーのPEGセグメント部分の製法を用いて調製することができる。PEGセグメントのうち-R51基と反対側の末端は、一般式(5)において「-L1」となる部分であり、-NH2、-COOH、下記一般式(6)：    -(CH2)p2-NH2    (6)  〔式(6)中、p2は1〜5（好ましくは2〜3）の整数を表す。〕で示される基、又は一般式(7)：    -L2b-(CH2)q2-L3b    (7)  〔式(7)中、L2bは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3bは、NH2又はCOOHを表す。q2は1〜6（好ましくは2〜3）の整数を表す。〕で示される基であることが好ましい。
【００５２】  一般式(5)で示されるカチオン性高分子の具体的な製造方法としては、例えば、末端にアミノ基を有するPEGセグメント誘導体を用いて、そのアミノ末端に、β-ベンジル-L-アスパルテート（BLA）及びNε-Z-L-リシン等の保護アミノ酸のN-カルボン酸無水物（NCA）を重合させてブロックコポリマーを合成し、その後、各ブロック部分の側鎖が前述したカチオン性基を有する側鎖となるように、ジエチレントリアミン（DET）等で置換又は変換する方法が挙げられる。（例えばWO 2007/99660号公報、N. Kanayama et al., ChemMedChem 1 (4) 439-444 (2006)等を参照）。
【００５３】３．核酸  本発明の複合体において、コア部分の構成成分として内包する核酸は、１つの態様ではプラスミドDNA又はsiRNA（small interfering RNA）である。siRNAは、RNA干渉（RNAi：RNA interference）利用して目的の遺伝子の発現を抑制し得るものであればよく、例えば、目的遺伝子としては、癌（腫瘍）遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、細胞周期関連遺伝子、増殖シグナル遺伝子等が好ましく挙げられる。また、siRNAの塩基長は、通常、30塩基未満（好ましくは19〜21塩基）であればよく、限定はされない。
【００５４】  但し、本発明においては、内包する核酸はプラスミドDNA及びsiRNAのみには限定されず、必要に応じて、他の核酸、例えばアンチセンスオリゴDNA、デコイ核酸（二重鎖DNA）、各種RNA、各種抑制遺伝子（癌抑制遺伝子等）、並びに化学修飾核酸及び非天然型核酸類縁体（例えばPNA（ペプチド核酸））を内包することもできる。  siRNA等の核酸分子はポリアニオンとなるため、前記ブロックコポリマーのポリカチオン部分の側鎖と、静電的相互作用により結合（会合）することができる。
【００５５】４．三元系ポリプレックス  本発明の複合体は、核酸とポリカチオンとでポリプレックスを形成させ、そこに電荷変換型ポリマーである前記アニオン性ポリマー（例えばpAsp(DET-Aco)）を添加することにより得ることができる高分子化合物の複合体であり、三元系ポリプレックス（ポリイオンコンプレックス：PIC)とも呼ばれる。  本発明の三元系ポリプレックスは、核酸とポリカチオン部分とが静電的相互作用をしてコア部分を形成し、その外側をアニオン性ポリマー（例えばpAsp(DET-Aco)）が覆う形態となっている。
【００５６】  本発明の三元系ポリプレックスは、例えば、核酸とカチオン性高分子とを任意のバッファー（例えばTrisバッファー等）中で混合してポリプレックスを形成させた後に、pAsp(DET-Aco)を添加することにより容易に調製することができる。  本発明のPICの大きさは、限定はされないが、例えば、動的光散乱測定法（DLS）による粒径が5〜200 nmであることが好ましく、より好ましくは10〜150nmである。
【００５７】  また、本発明の三元系ポリプレックスは、例えば、前記カチオン性高分子としてブロックコポリマー中のポリカチオン部分と核酸とが静電的相互作用により結合したものが挙げられる。具体的には、前記カチオン性高分子がさらにポリエチレングリコール部分を含む高分子であって、核酸と前記カチオン性高分子中のポリカチオン部分とがコア部分を形成し、前記カチオン性高分子中のポリエチレングリコール部分が前記コア部分の周囲にシェル部分を形成したものが挙げられる。
【００５８】  本発明の三元系ポリプレックスは、核酸（例えば、プラスミドDNAやsiRNA）とブロックコポリマーとを任意のバッファー（例えばTrisバッファー等）中で混合することにより容易に調製することができるが、ブロックコポリマーと核酸との静電結合の前に、ブロックコポリマーのみがジスルフィド結合をして凝集等しないよう、十分な還元条件下で行うことが好ましい。還元条件は、例えばDTT（Dithiothreitol）等を添加することにより調整することができる。
【００５９】  ブロックコポリマーと核酸との混合比は、限定はされないが、例えば、ブロックコポリマー中のカチオン性基（例えばアミノ基）の総数（N）と、核酸中のリン酸基の総数（P）との比（N/P比）が、0.5〜100であることが好ましく、より好ましくは0.5〜10、さらに好ましくは1〜10、さらにより好ましくは1〜4、特に好ましくは1〜2である。ブロックコポリマーが一般式(5)のコポリマーである場合のN/P比も、上記と同様に0.5〜10であることが好ましく、より好ましくは0.5〜4、さらに好ましくは1〜2である。この場合のNは、ポリカチオン部分の側鎖に含まれる１級アミンと２級アミンの合計数である。
【００６０】  N/P比が上記範囲のときは、遊離のポリマーが存在せず、in vivoでの高い発現効率が得られる等の点で好ましい。なお、上記カチオン性基（N）は、内包する核酸中のリン酸基と静電的に相互作用してイオン結合を形成することができる基を意味する。  本発明の三元系ポリプレックスの大きさは、限定はされないが、例えば、動的光散乱測定法（DLS）による粒径が30〜150nmであることが好ましく、より好ましくは50〜100nmである。
【００６１】  本発明の三元系ポリプレックスは、中性環境下（pH7.0〜7.4、好ましくはpH7.4）のバッファー中ではマイナス電荷を帯びているが、酸性環境下（pH5.0〜6.8、好ましくはpH5.5）のバッファー中ではプラス電荷に電荷が変換する。細胞外のpHは7.4であり、三元系ポリプレックスは血清蛋白質存在下でも安定である。しかしながら、一旦細胞に取り込まれてエンドソーム内に局在すると、pHは5.5まで低下して、式（I)で示される化合物（好ましくはcis-アコニチン酸アミドまたはシトラコン酸アミド）は分解され、エンドソーム膜を脆弱化させる機能を有するポリカチオン（pAsp(DET)等）がポリプレックス表面に露出する。このような作用により、電荷変換型三元系ポリプレックスは、例えばHUVEC（ヒト臍帯静脈内皮細胞）等の非常に敏感な細胞に対しても低毒性かつ高い遺伝子導入効率を示す。
【００６２】５．核酸送達デバイス  本発明においては、上述した三元系ポリプレックス（単に「ポリプレックス」ということもある）を含む核酸送達デバイスが提供される。本発明の送達デバイスは、標的細胞内へ安定したまま送達することが困難であった核酸を、容易に安定化状態にすることができる。また、細胞内外のpHの変化を利用し、ポリプレックスのコア部分に内包した所望の核酸を、in vitroおよびin vivoのいずれにおいても、標的細胞内に効率的に導入する手段として使用することができる。
【００６３】  例えば、所望のプラスミドまたはsiRNAを内包したポリプレックスを含む溶液を被験動物に投与して、体内の標的細胞に取り込ませる。その後、細胞内に取り込まれたポリプレックスがエンドソームから細胞質に移行する。細胞質内のpHの変化に応答して、当該結合が開裂し、その結果、内包されている核酸と細胞内に存在するポリアニオンとの置換が促進され、ポリプレックスが解離することにより、所望の核酸を細胞質内に放出することができる。
【００６４】  本発明の送達デバイスは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ等の各種動物に適用することができ、限定はされない。被験動物への投与方法は、通常、点滴静注などの非経口用法が採用され、投与量、投与回数及び投与期間などの各条件は、被験動物の種類及び状態に合わせて適宜設定することができる。  本発明の送達デバイスは、各種疾患の原因となる細胞に所望の核酸を導入する治療（遺伝子治療）に用いることができる。よって本発明は、前記ポリプレックスを含む各種疾患の治療用の医薬組成物、当該医薬組成物を有効成分として含む各種疾患用の遺伝子治療剤、及び、前述したPICを用いる各種疾患の治療方法（特に遺伝子治療方法）を提供することもできる。
【００６５】  投与の方法及び条件は前記と同様である。また、各種疾患としては、例えば、癌（例えば、肺癌、膵臓癌、脳腫瘍、肝癌、乳癌、大腸癌、神経芽細胞腫 及び膀胱癌等）、循環器疾患、運動器疾患、及び中枢系疾患等が挙げられる。  上記医薬組成物については、薬剤製造上一般に用いられる賦形剤、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤及び等張化剤等を適宜選択して使用し、常法により調製することができる。また、医薬組成物の形態は、通常、静脈内注射剤（点滴を含む）が採用され、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態等で提供される。
【００６６】６．核酸送達用キット  本発明の核酸送達用キットは、前記アニオン性ポリマー又は本発明のポリマー複合体を含むことを特徴とするものである。当該キットは、例えば癌細胞等の各種標的細胞に対してsiRNAを導入する、RNAiを利用した遺伝子治療に好ましく用いることができる。  本発明のキットにおいて、ポリマーの保存状態は、限定はされず、その安定性（保存性）及び使用容易性等を考慮して溶液状又は粉末状等の状態を選択できる。
【００６７】  本発明のキットは、前記アニオン性ポリマー及びポリマー複合体以外に他の構成要素を含んでいてもよい。他の構成要素としては、例えば、細胞内に導入する核酸、溶解用又は希釈用等の各種バッファー、溶解用バッファー、各種タンパク質、及び使用説明書（使用マニュアル）等を挙げることができ、使用目的と使用するポリマーの種類に応じて、適宜選択することができる。  本発明のキットは、標的細胞内に導入する所望の核酸（例えばプラスミドDNA又はsiRNA）をコア部分としたポリイオンコンプレックス（PIC）を調製するために使用され、調製したPICは、標的細胞への核酸送達デバイスとして有効に用いることができる。
【００６８】  以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本実施例はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００６９】材料と方法1. 材料  N,N-ジメチルホルムアミド(DMF) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd, Japan)、ジクロロメタン(DCM) (Wako, Japan)、n-ブチルアミン、エチレンジアミン(1,2-ジアミノエタン)、ジエチレントリアミン(ビス(2-アミノエチル)アミン) (Tokyo Chemical Industry Co. Ltd, Japan)を購入して、使用前に再蒸留した。酢酸および塩酸を購入して、さらに精製することなく使用した(Wako, Japan)。1-メチル-2-ピロリジノン(NMP)、cis-アコニチン酸無水物、無水コハク酸、ウシ血清アルブミンをSigma (St. Louis, MO)から購入した。β-ベンジル-L-アスパラテート-N-カルボキシ-無水物(BLA-NCA)を、Nippon OilおよびFats Co., Ltd.(Tokyo, Japan)から得た。【００７０】2. 合成  2-1. PBLA (ポリ(β-ベンジル-L-アスパラテート))の合成 (2)  n-ブチルアミンの末端アミノ基によって開始されるBLA-NCAの開環重合によってPBLAを調製した。n-ブチルアミン(0.0417 mmol)を5 mLのDMF/DCM (1:10)に溶解した。8 mLのDMF/DCM (1:10)中のBLA-NCA (4.60 mmol)溶液をn-ブチルアミンの溶液に添加し、反応混合物をアルゴン雰囲気下35°Cで48時間撹拌した。得られるポリマーをジエチルエーテル(150 mL)に沈殿させた。粗沈殿物をジエチルエーテルで２回洗浄し、白色粉末として最終生成物を得た。1H NMR測定から、BLA単位の重合度(DP)は、 102であると計算された。JEOL EX 300分光計を使用して300MHzにおいて全てのNMRスペクトルを記録した。テトラメチルシランからダウンフィールドへの化学シフトをppmでレポートした。1H NMR (CDCl3): δ0.87 (3H, CH3CH2CH2CH2NH), δ1.27 (3H, CH3CH2CH2CH2NH), δ2.69, 3.12(206H, COCHCH2COOCH2Ph, CH3CH2CH2CH2NH), δ4.28 (102H, COCHNH), δ5.07(204H, COOCH2Ph), δ7.27(510H, COOCH2Ph), δ8.88(102H, COCHNH).【００７１】2-2. pAsp(EDA) (ポリ[(2-アミノエチル)アスパルトアミド]) (3)およびpAsp(DET)(ポリ(2-[(2-アミノエチル)アミノ]エチルアスパルトアミド)) (4)の合成  PBLA (0.802 mmolのベンジルエステル)をNMP (10 mL)に溶解した。ジエチレントリアミン(DET) (40.1 mmol)を溶液に添加して、反応混合物を0°Cで1時間撹拌した。得られた溶液を10% 酢酸水溶液(30 mL)に滴下した。中和溶液を0.01M 塩酸溶液(× 3)および蒸留水(× 3)に対して4°Cで透析した。凍結乾燥の後に、白色粉末のpAsp(DET)を塩酸塩として得た。1H NMRにおいてベンジルピークは確認されなかった。pAsp(EDA)の合成は、DETの代わりにエチレンジアミン(EDA)を使用することを除いて、同様に行った。【００７２】1H NMR (D2O): δ0,87 (3H, CH3CH2CH2CH2NH), δ1.27 (4H, CH3CH2CH2CH2NH), δ2.63 (408H, COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2, COCH2CHCONHCH2CH2NHCH2CH2NH2, COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2), δ2.76(204H, COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2), δ2.94 (204H, COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2), δ3.20-3.50 (308H, CH3CH2CH2CH2NH, COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2)【００７３】2-3. pAsp(EDA-Suc) (ポリ[(N’-スクシニル-2-アミノエチル)アスパルトアミド]) (5)およびpAsp(DET-Aco)(ポリ(2-[([N’-cis-アコニチル]-2-アミノエチル)アミノ]エチルアスパルトアミド)) (6)の合成  pAsp(DET) (0.055 mmolの一級アミン)を0.5 M NaHCO3 緩衝液 (pH 9.0, 50 mL)に溶解した。Cis-アコチニン酸無水物(2.76 mmol ) (Aco)を溶液に添加し、0°Cで3時間撹拌した。反応混合物をAmicon Ultra (MWCO=10,000; Millipore (Billerica, MA))を用いて精製した(×3 蒸留水使用)。凍結乾燥の後に、最終生成物を白色粉末として得た。1H NMRから計算したところ、変換収率は99%を超えた。pAsp(EDA-Suc)の合成は、AcoおよびpAsp(DET)の代わりにコハク酸無水物(Suc)およびpAsp(EDA)を用いることを除いて、同様に行った。【００７４】PEG-pAsp(DET-cisAco) (D2O)の1H NMR: δ0.87 (3H, CH3CH2CH2CH2NH), δ01.27 (4H, CH3CH2CH2CH2NH), δ1.78 (204H, COCHC(COONa)CH2COONa), δ2.67, δ2.76,δ2.94, δ3.20 (920H, CH3CH2CH2CH2NH, COCHCH2CONHCH2CH2NHCH2CH2NH2), δ5.43-5.71 (102H, COCHC(COONa)CH2COONa).【化１８】
0005645186.tif 000020
スキーム:   pAsp(DET) (4)、pAsp(EDA-Suc) (5)およびpAsp(DET-Aco) (6)の合成スキーム  (a) BLA-NCA, DMF/DCM; (b) DET (またはEDA), NMP; (c) cis-アコニチン酸無水物(またはコハク酸無水物), pH 9.0 緩衝液
【００７５】3. プラスミドDNAの調製  CAGプロモーターとルシフェラーゼをコードするプラスミドは、RIKEN Bioresource Center (Japan)によって提供された(H. Niwa et al. Gene, 1991, 108, 193-199)。また、SEYFP-F46L (Venus)のフラグメント（これは、黄色蛍光タンパク質の変異体であり、F46Lの変異を含む(T. Nagai et al. Nat. Biotechnol., 2002, 20, 87-90)）はRIKENによって提供され、このフラグメントをpCAccベクターに挿入した(pCAcc+Venus)。コンピテントなDH5 E. coli 中でこのプラスミドを増幅させ、HiSpeed Plasmid MaxiKit (QIAGEN Science Co., Inc., Germany)を用いて精製した。プラスミド濃度は、260 nmの吸光度によって決定した。  【００７６】4. 三元系ポリプレックスの形成  種々のN/P比率(4~8)でpAsp(DET) (1 mg/mL)とプラスミドDNA (50 μg/mL)とを単純に混合することによって、正のポリプレックスを得た。ここでN/P比率は、pAsp(DET)中のアミン単位のpDNAのリン酸単位に対する過剰なモル比率として規定される。RTで15分間インキュベートした後、正のポリプレックスにpAsp(DET-Aco) (またはpAsp(EDA-Suc))溶液(1 mg/mL)を添加した。pAsp(DET)とpAsp(DET-Aco) (またはpAsp(EDA-Suc))との間のモル比率は、1〜4の間で変動させた。RTで15分以上インキュベーションした後、三元系ポリプレックスを得た。【００７７】5. ポリプレックスのDLS測定(図 5および 6を参照のこと)  各ポリプレックスを水性緩衝液(pH 5.5 酢酸緩衝液 (10 mM)またはpH 7.4 Tris-HCl緩衝液(10 mM))中に希釈した。プラスミドDNAの最終濃度は33 μg/mLであった。各サンプルを37°Cでインキュベートした後、Zetasizer Nano-ZS (green badge, ZEN3500, Malvern, Ltd. Malvern, U. K.)を使用して633nmのHe-Neイオンレーザーを用いて動的光散乱(DLS)測定を行った。  DNA/pAsp(DET) 正のポリプレックス(N/P比率= 6) およびDNA/pAsp(DET)/pAsp(DET-Aco)三元系ポリプレックス(N/P ratio = 6)のpH 7.4でのDLS分布を図 5.に示す。【００７８】6. ゼータ電位測定(図 7を参照のこと)  正のポリプレックスおよび三元系ポリプレックスのゼータ電位を、Zetasizer Nano-ZS (green badge, ZEN3500, Malvern, Ltd. Malvern, U. K.)を使用して633 nm のHe-Neイオンレーザーを用いて、レーザードップラー電気泳動から決定した（検出角度173°、温度37°C）。各複合体を水性緩衝液(pH 5.5 酢酸緩衝液(10 mM)またはpH 7.4 Tris-HCl緩衝液(10 mM))中に希釈した。プラスミドDNAの最終濃度は、33 μg/mLであった。各サンプルを37°Cでインキュベートした。得られた電気泳動の移動度から、各複合体のゼータ電位をSmoluchowski方程式: ζ = 4πηυ/e （式中、ηは溶媒の粘度であり、υは電気泳動移動度であり、そしてeは溶媒の誘電率である）によって計算した。【００７９】7. インビトロトランスフェクション  ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)をコラーゲンでコーティングした24ウェル培養プレートにまき、インスリン、hEGF、GA-1000、hFGF-BおよびFBS (5%)を含む400 μLのEBMTM-2中で一晩インキュベートした。40 μLの各サンプル溶液を培地に添加した(1 μg プラスミドDNA/ウェル)。24時間インキュベートした後、培地をサンプルを含まない新しい培地と交換し、その後さらに24時間インキュベートした。400 μLのDulbeccco’s PBSで細胞を洗浄し、100 μLのセルカルチャーPromega溶解緩衝液によって溶解した。溶解物のルシフェラーゼ活性は、Mithras LB 940 (Berthold Technologies)を用いて光ルミッセンス強度から評価した。Micro BCATM タンパク質アッセイ試薬キット(Pierce)によって決定した溶解物中のタンパク質の量により、得られたル��フェラーゼを正規化した。Venus (YFP)発現の観察は、Biozeero BZ-8000 (Keyence)を用いて450-490 nm (発光フィルター: 510-560 nm)の励起波長において行った。【００８０】8. 細胞生存アッセイ(図 8 および 9を参照のこと)  細胞毒性アッセイのために、HUVECをサンプルと共に24時間インキュベートし、MTTアッセイ(Cell Counting Kit-9, Dojindo, Kumamoto, Japan)によって生存率を評価した。製造業者によって提供されたプロトコルに従って、450 nmにおいて吸光度を読み取ることによって各ウェルを測定した。同時にTris-HCl 緩衝液(10 mM, pH 7.4)のみと共にインキュベートしたコントロール細胞に対する相対値(%)として結果を表した。 【００８１】9. アルブミン溶液中の複合体の安定性  ウシ血清アルブミン(BSA)溶液（Tris-HCl 緩衝液中(10 mM, pH 7.4)）によって各サンプルを希釈した。最終プラスミド濃度は33 μg/mLであり、最終BSA濃度は2 mg/mLであった。37°Cでインキュベートした後、上記に説明したとおりにDLSによって複合体のサイズを測定した。【００８２】10. 共焦点レーザー顕微鏡(CLSM)観察 (図 4を参照のこと)  ラベルIT核酸ラベリングキット(Mirus, Madison, WI)を用いてCy5でpDNAをラベルした。HUVEC (30,000細胞)を35 mm ガラスベースディッシュ(Iwaki, Japan)にまき、インスリン、hEGF、GA-1000、hFGF-BおよびFBS (5%)を含む1mLのEBMTM-2中で一晩インキュベートした。培地を新しい培地と交換した後、3 μg Cy 5-ラベルpDNAを含むポリプレックスまたは三元系複合体の溶液120 μL(N/P =6; pAsp(DET-Aco) (またはpAsp(EDA-Suc)/pAsp(DET)モル比率= 2)をガラスディシュに塗布した。インキュベートの後、培地を除去して細胞をPBSで二回洗浄した。細胞内分布をCLSMで観察し、その後、酸性の後期エンドソームおよびリソソームをLysoTracker Green (Molecular Probes, Eugene, OR)で染色し、核をHoechst 33342 (Dojindo Laboratories, Japan)で染色した。LSM 510 (Carl Zeiss, Germany)を使用して（63×対物レンズ(C-Apochromat, Carl Zeiss, Germany)使用）、LysoTraker、Cy 5、およびHoechst 33342について、それぞれ488 nm (Arレーザー)、633 nm (He-Neレーザー)および710 nm (Mai Taiレーザー)の励起波長で、CLSM観察を行った。【００８３】結果プラスミドDNAとポリカチオンとの間のポリプレックスを調製した。ポリカチオンとして、本発明者らは、ポリ{N-[N’-(2-アミノエチル)-2-アミノエチル]アスパルトアミド} (pAsp(DET)) (図 2Aを参照のこと)を選択した。これは、本発明者らのグループによって、従来のポリカチオン（PEIを含む）と比較して細胞毒性の低い、エンドソームを破壊し膜を不安定化する部分であることが証明されている[9]。ポリカチオンの量が過剰であるので(N/P比率= 4~8)、ポリプレックスは、およそ+40 mVのゼータ電位の正の表面電荷を示した。次いで、ポリプレックスに、１〜４モル等価の電荷変換型ポリマーであるポリ(N-{N’-[(N’’-cis-アコニチル)-2-アミノエチル]-2-アミノエチル}アスパルトアミド) (pAsp(DET-Aco)) (図 2Aを参照のこと)を添加して三元系ポリプレックスを形成した。【００８４】  pAsp(DET-Aco)は、cis-アコニチン酸アミドの分解の後にエンドソームのpHにおいてエンドソームを効率的に破壊することもできるpAsp(DET)aに変化することに注意されたい。各三元系ポリプレックスは、種々の電荷比率において、単峰型のサイズ分布を示し、過剰なpAsp(DET-Aco)の存在下でさえも、動的光散乱(DLS)測定で約130 nmの平均直径を有した。DNAを含まないpAsp(DET-Aco)とpAsp(DET)との間の二元ポリプレックスが形成した可能性もあるが、DNAを含有する三元系ポリプレックスが形成したことをゲル電気泳動アッセイによって確認した(材料と方法,および 図 5と 6を参照のこと)。【００８５】  三元系ポリプレックスの電荷変換の挙動は、図 2Bに示されるゼータ電位の変化からモニタリングした。三元系ポリプレックスは、pH7.4においておよそ-40 mVのゼータ電位を維持した。しかし、pH 5.5でのゼータ電位は、負から正に段階的に変化し、cis-アコニチン酸アミド部分の分解に起因する電荷変換が実証された。pH 5.5で2時間インキュベートした後、ゼータ電位は0 mVに達した。ネガティブコントロールとして、本発明者らは、類似の構造を有する非電荷変換型ポリカチオンであるポリ[(N’-スクシニル-2-アミノエチル)アスパルトアミド] (pAsp(EDA-Suc)). (図 2Aを参照のこと)を使用した。pAsp(DET)およびpAsp(EDA-Suc)からの三元系ポリプレックスは、pH 5.5とpH 7.4でおよそ-40 mVのゼータ電位を維持し、電荷変換の兆候はみられなかった (材料と方法、および 図 7を参照のこと)。【００８６】 この電荷変換もまた、三元系ポリプレックスの劇的なサイズ変化を誘導した。図 2Cに示されるように、三元系ポリプレックスは、pH 7.4においておよそ130 nmの直径を維持したが、1時間後 pH 5.5において、サイズが急に増加した。2時間後、直径が1 μmを超える大きな凝集物が形成された。この凝集が起こる理由は、おそらく、ゼータ電位の測定のデータに示されるとおり、1時間後の部分的な電荷の中和と2時間後の完全な中和（pH 5.5）に起因する反発力の低下によるものである。【００８７】  インビボでの適用の可能性に関して、血清タンパク質の溶液中でのポリプレックスの安定性に焦点が当てられなければならない。ウシ血清アルブミン(BSA)の溶液において、三元系ポリプレックスは、もとの直径を維持する一方で、pAsp(DET)の正のポリプレックスは、1時間インキュベーションの後でも直径が急に増加した（図 3Aを参照のこと）。三元系ポリプレックスの安定性の改善は、おそらく、アニオン性三元系ポリプレックスとBSAとの間の反発力に起因するものであり、将来の全身適用のためのメリットとなり得る。【００８８】  ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を用いてトランスフェクションを行った。HUVECをトランスフェクトするのは非常に困難であり、毒性に対する感受性も非常に高いので、限られたトランスフェクション試薬しか利用できない[10]。【００８９】  ルシフェラーゼpDNAを用いて得られたトランスフェクションのデータを図 3Bに要約した。一元ポリプレックスおよび三元系ポリプレックスの両方においてDNAとpAsp(DET)との間のN/P比率は6であり、この比率において、これらのポリプレックスは最も高いトランスフェクション効率を示した。2モル等量のpAsp(DET-Aco)およびpAsp(EDA-Suc)を添加することによって三元系ポリプレックスを形成した。コントロールのpAsp(EDA-Suc)の三元系ポリプレックスは、pAsp(DET)の一元ポリプレックスと同様のトランスフェクション効率を示したが、pAsp(DET-Aco)の電荷変換型三元系ポリプレックスは、ExGen 500（市販のトランスフェクション試薬の直鎖状PEI）のトランスフェクション効率の１０倍を越えるトランスフェクション効率を示し、pAsp(DET)ポリプレックスよりも２倍高いトランスフェクション効率を示した。【００９０】  三元系複合体の負の表面電荷は細胞の取り込みおよびエンドソーム脱出のために有用なものではないにもかかわらず、図 3Aに示されるとおり血清タンパク質の存在下で複合体の安定性を増し、毒性を低減させることが可能であり、それゆえ、非電荷変換型三元系ポリプレックス（DNA/pAsp(DET)/pAsp(DET-Suc)）は同様のトランスフェクション効率を示すことが可能であった。安定性および低毒性に基づいて電荷変換型エンドソーム破壊部分を三元系ポリプレックスに導入すると(DNA/pAsp(DET)/pAsp(DET-Aco))、トランスフェクション効率はさらに上昇した。【００９１】  黄色蛍光タンパク質(YFP) pDNAを使用したトランスフェクションの結果を、以下に記載の「材料と方法」において要約し（図 8 および 9を参照のこと）、これらも三元系ポリプレックスシステムの適切なトランスフェクション効率を示した。【００９２】  MTTアッセイによって測定された細胞毒性を図 3Cに記載した。N/P 比率が6および8であるとき（これは、最適なトランスフェクション比率である）、ExGen 500は生存率が10 %を下回る非常に高い毒性を示し、pAsp(DET)ポリプレックスもまた50 %まで生存率が低下した。生存率が低下したことについての主な原因の一つは、おそらく、ポリプレックスの正の表面電荷が膜毒性を誘導したことである[11]。しかしながら、細胞の外側で負に帯電した表面を有している三元系ポリプレックスは、両方のN/P比率ともほとんど細胞毒性を示さなかった。【００９３】  電荷変換型三元系ポリプレックスのエンドソーム脱出の増強を確認するために、Cy5ラベルのpDNAを使用して共焦点レーザー顕微鏡(CLSM)によって、ポリプレックスの細胞内分布を調査した(図 4を参照のこと)。ポリプレックスが酸性の細胞小器官から放出されると、黄色の蛍光は赤色へと変化する。正に帯電したpAsp(DET)ポリプレックスは、3時間後でさえ顕著なエンドソーム脱出を示し、24時間後には80 %超のDNAの脱出が示された。3時間後に、両方の三元系ポリプレックスは、低エンドソーム脱出を示した。しかしながら、pAsp(DET-Aco)からの電荷変換型三元系ポリプレックスは、24時間後に正のpAsp(DET)ポリプレックスにより類似のエンドソーム脱出を示した。一方で、pAsp(EDA-Suc)からの非電荷変換型ポリプレックスの大部分（40%超）は、依然としてエンドソーム中にあった。【００９４】  CLSM像の定量的な分析を図 3Dに要約する。電荷変換型ポリプレックスは、3時間までは非電荷変換型ポリプレックスと類似した挙動を示したが、7時間後には共局在化の程度が低く、最終的には24時間後の正のpAsp(DET)ポリプレックスと類似した比率であった。エンドソーム酸性化とその後必要とされる電荷変換を考慮すると、CLSMデータは合理的であり、ルシフェラーゼのトランスフェクションデータとも一致する。【００９５】  要約すると、本発明者らは、細胞外部のpHにおいて負電荷を帯び、エンドソームのpHにおいて正に変化してエンドソームを破壊する三元系ポリプレックスを開発した。最終的には、本発明者らは、かなり高いトランスフェクション活性と、感受性の高い初代細胞（HUVEC）に対する低い毒性に到達した。この三元系ポリプレックスシステムのトランスフェクション効率は、適切なリガンドのコンジュゲーション（例えば、インテグリンレセプターへの結合を通じて内在化を活性化するためのRGDペプチド）によってより高���ることができる[12]。エンドソーム破壊部分を有する本発明者らの電荷変換型三元系ポリプレックスの概念は、感受性の高い種々の初代細胞に容易に適用することができ、この概念の効率的で化学毒性のないトランスフェクションは、生物医学の分野で最も重要かつ急を要する問題の一つである。また、負に帯電した血清タンパク質の存在下における三元系ポリプレックスの安定性は、インビボの遺伝子ベクターの開発のためにも有用である。 
【実施例２】
【００９６】実験方法（１）Poly(L-lysine) (PLL)ホモポリマーの合成  三方コックを備えたナス型フラスコを真空乾燥させ、アルゴン(Ar)雰囲気下でLys(TFA)-NCA (1.01 g, 3.77 mmol)を加え、次いでDMSO (8 mL)を加えて溶解させた。開始剤としてn-ブチルアミン(5.4 mg, 73.8 mmol)をモノマー溶液に加え、35℃の恒温槽中で４８時間ほど攪拌した。反応終了後、激しく攪拌した過剰量のジエチルエーテル中に重合溶液をゆっくりと滴下していき、ポリマーを沈殿させた。約１時間攪拌を続け、ポリマーがほぼ全てが沈殿した後に、上澄み溶液をデカンテーションにて除去した。沈殿したポリマーは、室温にて減圧乾燥させた。1H NMRによる分析から、連鎖長（リジンの重合度(DP)）は５２であった。【００９７】  50 mg のP[lys(TFA)] (DP：52)をMeOH 5 mlに溶解した後、1N NaOH 0.5 mlを加え35℃、6時間撹拌した。反応終了後、透析膜（スペクトラム社製、MW CutOff：6000〜8000）を用いて弱酸性のHCl溶液に対して3回、純粋に対して3回透析を行い、凍結乾燥をしてポリマーを回収した。【化１９】
0005645186.tif 000021
【００９８】（２）PAsp(DET(x)) (x= aco and suc)の合成  PAsp(DET(x)) (x= aco and suc）は、実施例１と同様にして合成した。カチオン性ポリマーPAsp(DET)の連鎖長（アスパラギン酸ユニット数）は133のものを用いた。【００９９】（３）pDNA/PLL polyplexの作成方法および三元系polyplexの作成方法  (i) pDNA/PLL カチオン性polyplex  HEPESバッファー(10mM, pH 7.4) に溶解させたpDNA（CAG-Luc）とPLL（DP= 52）をN/P=2になるように混合し、４℃にて一晩静置してpDNA/PLLポリプレックス（2/3 OD）を調整した。  (ii) 三元系polyplex 上述のカチオン性ポリプレックスpDNA/PLL溶液に対し、PAsp(DET(aco))またはPAsp(EDA(suc))を所定量添加して４℃にて3時間静置させた後、三元系ポリプレックスを調整した。【０１００】（４）三元系polyplexの粒径およびゼータ電位測定  三元系polyplexの粒径およびゼータ電位測定は、実施例１と同様に行った。【０１０１】（５）トランスフェクション（Huh-7およびHUVEC）  24穴well dish に1well あたり2万個の細胞をまき、24時間培養後、31μlのポリプレックス（pDNA濃度：2/3OD）を添加した。24時間細胞とポリプレックスを接触させ、培地(DMEM)の交換を行った後さらに24時間培養を行った。遺伝子発現活性は、Luciferase Assay法にて評価した。  培養細胞としては、ヒト肝癌細胞(Huh-7)と正常ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を用いた。【０１０２】（６）フローサイトメーターによる取り込み量の評価  ６穴well dish に1well あたり4万個の細胞（Huh-7）をまき、24時間培養後、蛍光色素であるCy5にてラベル化されたpDNAを用いて調整したポリプレックス（pDNA濃度：2/3 OD）を60μl添加した。24時間細胞後にポリプレックスを接触させ、2〜3回PBSで洗浄した後、トリプシン処理を行った。測定はBD Biosciences社のBD LSR IIアナライザーを用いた。【０１０３】（７）共焦点レーザー顕微鏡観察  35 mmシャーレに、細胞（Huh-7）を5万個/wellまき、24時間培養後、蛍光色素であるCy5にてラベル化されたpDNAを用いて調製したポリプレックス（pDNA濃度：2/3OD）を90μl添加した。24時間細胞を行い、次いでポリプレックスを接触させた後、5 μM Lysto Tracker（20 μL）とHoechst（10 μL）を用いて核およびエンドソームを染色した。測定を行う直前に、3回PBS 洗浄を行い、2 mlの培地を加え観察を行った。共焦点レーザー顕微鏡はカールツァイス社製のLSM-510を用いた。【０１０４】実験結果（１）Poly(L-lysine) (PLL)ホモポリマーの合成  1H NMRによる分析から、脱保護前のポリマーP[Lys(TFA)]の連鎖長（リジンの重合度(DP)）は５２であった。またゲル浸透クロマトグラフィー（GPC：Gel Permeation Chromatography)による分析の結果、オリゴマーなどを含まず、単分散性の高いポリマーであった（図10）。  脱保護後のポリマーサンプルに対しも、同様に1H NMRおよびGPCによる分析を行った。  その結果、P[Lys(TFA)]側鎖の保護基TFAの除去を確認し、さらに水系GPCによる分析からは主鎖の加水分解などは認められなかった。ポリマーの回収率は77％であった。【０１０５】（２）PAsp[DET(aco)]およびPAsp[EDA(suc)]の合成  PAsp[DET(aco)]およびPAsp[EDA(suc)]は、実施例１と同様にして合成した。【０１０６】（３）pDNA/PLL polyplexおよび三元系polyplexの物理化学的評価（粒径およびゼータ電位測定）  カチオン性のポリプレックスpDNA/PLLに対して、PAsp[DET(aco)]またはPAsp[EDA(suc)]を添加して三元系ポリプレックスの形成を試みた。ゼータ電位測定からは、PAsp(DET(x))をpDNAに対して等倍, ２倍, ３倍, ４倍, ５倍モルと順に添加することにより、負の表面電荷を示唆する結果が得られた（図11）。さらに、光散乱測定からはPAsp(DET(x))の添加量に関わらず、約110~130 nmの粒径を有するポリプレックスの形成が認められた。これらの結果から、２次凝集などを伴わずに、安定した粒径を有するアニオン性の三元系polyplexが形成されたと考えられる。【０１０７】（５）トランスフェクション（Huh-7およびHUVEC）  PAsp(EDA(suc))を添加した三元系polyplexにおいては、遺伝子発現活性は何も加えていないカチオン性pDNA/PLLと同等もしくはそれ以下であった。一方、PAsp[DET(aco)]を添加した三元系polyplexの遺伝子発現活性は、pDNA/PLL と比較してHuh-7に対しては約２０倍、HUVECでは約１０倍の活性上昇が認められた（図12）。PAsp[DET(aco)]はpHに応答してポリマーの電荷が反転するCharge-Conversion機能を有しているため、この特性が発現活性上昇に寄与したと思われる。【０１０８】（６）フローサイトメーターによる取り込み量の評価  カチオン性ポリプレックスであるpDNA/PLLのみ、そしてこれにPAsp[DET(aco)]またはPAsp[EDA(suc)]を添加して得られた２つの三元系ポリプレックスに対する細胞内取り込み評価を行った。フローサイトメーターによる分析の結果、どのポリプレックスにおいてもほぼ同様の取り込み量であった（図13）。  PAsp[DET(aco)]添加系においては、若干の取り込み量増加が見られたが、この増加量では、２０倍もの遺伝子発現活性上昇を説明できない。つまりポリプレックスの細胞内動態挙動の違いが遺伝子発現活性上昇に反映しているものと予想される。【０１０９】（７）共焦点レーザー顕微鏡観察  カチオン性ポリプレックスであるpDNA/PLLのみ、そしてこれにPAsp[DET(aco)]またはPAsp[EDA(suc)]を添加して得られた２つの三元系ポリプレックスに対する細胞内動態観察を共焦点レーザー顕微鏡を用いて行った。カチオン性ポリプレックスpDNA/PLLおよびPAsp[EDA(suc)]を添加した三元系ポリプレックスにおいては、黄色の領域が多く観察されている（図14）。これはポリプレックスがエンドソーム内にトラップされた状態を反映している。一方で、PAsp[DET(aco)] を添加した三元系ポリプレックスにおいては、赤い領域が多く分布している。これはポリプレックスがエンドソームから脱出し、細胞質中に移行した状態を強く示唆している（図14）。【０１１０】  またさらに、これらの共焦点レーザー顕微鏡画像を元に、エンドソーム内にトラップされたポリプレックスを定量的に評価した。カチオン性ポリプレックスpDNA/PLLおよびPAsp[EDA(suc)]を添加した三元系ポリプレックスにおいては、７０％以上がトラップされたままであった（図15）。PLLホモポリマーおよびその誘導体を用いたポリプレックスは、エンドソームから脱出できる性質が非常に乏しい。また、PAsp[EDA(suc)]は、酸性pH応答して電荷を反転させる機能を持ち合わせていないため、三元系ポリプレックス化した場合においても細胞内動態の改善、つまりエンドソームからの脱出効率を向上させることはできなかった。一方、PAsp[DET(aco)] を添加した三元系ポリプレックスにおいては、トラップされたままのポリプレックスは約４０％程度であった（図15）。つまり、ポリプレックスがエンドドームから効率よく脱出していることを示しており、この挙動が遺伝子発現活性の大きな上昇に寄与したと考��られる。 
【実施例３】
【０１１１】 実験方法（１）Ｎ−スクシイミジルオクタデカノエートの合成  Ｎ−スクシンイミジルオクタデカノエートの合成は、公知方法［N．M．Howarth，W．E．Lindsell，E．Murray，P．N．Preson，Tetrahedron  61（2005）8875-8887．］に従って行った。ステアリン酸（1.87g，6.56mmol）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（0.76g，6.56mmol）を80mLのジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸（WSC）（1.25g，6.56mmol）と48時間反応させた。その後、水で洗浄し、ＤＣＭで２回抽出、MgSO2で乾燥することによって白色の粉末を得た（収量1.4g，収率56％）。ステアリン酸のカルボキシル基の転換率は、１H-NMRによって算出したところ96％であった。【０１１２】（２）ステアロイル基導入poly（L-Lysine）の合成  poly（L-Lysine）（分子量20,000）とDIPEAをメタノールに溶解し、少量のジクロロメタンに溶解したＮ−スクシンイミジルオクタデカノエートと４℃で24時間反応させた。反応後、ジエチルエテール中で再沈し、濾過したサンプルをメタノール／水（１：１  ｖ／ｖ）に溶解した後、４℃で0.01M HCl水溶液に対して３回、蒸留水に対して１回透析を行った。その後、凍結乾燥によって回収することによって、側鎖にステアロイル基が15％、28％および45％導入されたpoly（L-Lysine）（PLL-ST）を合成した。【０１１３】（３）siRNAを搭載した三元系ポリプレックスの調製と遺伝子ノックダウン効率の評価及びMTTアッセイ  siRNA/PLL-STポリプレックスは、HEPESバッファー(10mM, pH 7.4) に溶解させたsiRNAとPLL-STをsiRNAのリン酸残基とリシン残基の比が1.4になるように混合し、その後、PAsp(DET(aco))を異なる混合比で混合して４℃にて3時間静置させることにより、三元系ポリプレックスを調製した。【０１１４】  siRNA阻害アッセイにおいては、40,000個／wellでHuh-7細胞を播種し、Lipofectamine 2000でGL3ルシフェラーゼとRellinaルシフェラーゼを発現するプラスミドを遺伝子導入し、GL3ルシフェラーゼに対するsiRNAを搭載した三元系ポリプレックス（siRNA濃度：100nM）を加えて48時間培養した。siRNAによるGL3ルシフェラーゼの発現阻害効果は、GL3およびRellinaに対する基質を添加した後のルシフェラーゼ発光量の比（GL3／Rellina）を算出することにより評価した。【０１１５】  一方、MTTアッセイにおいては、10,000個／wellでHuh-7細胞を播種し、GL3ルシフェラーゼに対するsiRNAを搭載した三元系ポリプレックス（siRNA濃度：100nM）を加えて48時間培養した。その後、細胞生存率をMTTアッセイにより評価した。【０１１６】 実験結果（１）siRNAを搭載した三元系ポリプレックスの遺伝子ノックダウン効率の評価  siRNAを搭載した三元系ポリプレックスの遺伝子ノックダウン効率は、ステアロイル基の導入効率の増加に伴って増強され、PAsp(DET(aco))を添加した場合は、混合比が0.7および1.4の時は遺伝子ノックダウン効率が増強されるが、混合比が2.8および5.6の時は遺伝子ノックダウン効率が低下することが確認された（図１６（A））。PAsp(DET(aco))の混合比が0.7および1.4の時は、PAsp(DET)が露出されることによって、ポリプレックスのエンドソーム脱出が促進され、混合比が2.8および5.6の時は、ポリプレックスの表面がアニオン性になることによってその細胞内取り込み量が減少するものと考えられ、その結果として図１６（A）の結果が得られたものと考えられる。【０１１７】（２）siRNAを搭載した三元系ポリプレックスの細胞毒性の評価  siRNAを搭載した三元系ポリプレックスの細胞毒性は、PLL-STのステアロイル基導入率が28％および45％であってPAsp(DET(aco))の混合比が0.7および1.4の三元系ポリプレックスにおいて、増加が認められたが、PLL-STのステアロイル基導入率が１５％の三元系ポリプレックスおよびPLL-STのステアロイル基導入率が28％および45％であってPAsp(DET(aco))の混合比が2.8および5.6の三元系ポリプレックスにおいては、減少することが明らかになった（図１６（B））。これらの結果は、PLLのステアロイル基の過度の導入はその細胞毒性を増加させうるが、PAsp(DET(aco))の添加によって細胞毒性を低減することができることを示している。【０１１８】  すなわち、PAsp(DET(aco))を添加し、三元系ポリプレックスを調製することによって、内核を構成するポリカチオンのsiRNA導入活性を維持しつつ、その細胞毒性を低減させることができるものと考えられる。【０１１９】参考文献[1]  a) D. W. Pack, A. S. Hoffman, S. Pun, P.S. Stayton, Nat. Rev. Drug Discovery 2005, 4, 581-593; b) E. Mastrobattista, M. A. E. M. Aa, W. E. Hennink, D. J. A. Crommelin, Nat. Rev. Drug Discovery 2006, 5, 115-121.[2]  a) O. Boussif, F. Lezoualc’h, M. A. Zanta, M. D. Mergny, D. Scherman, B. Demeneix, J. P. Behr, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995, 92, 7297-7301; b) M. Neu, D. Fischer, T. Kissel, J. Gene Med. 2005, 7, 992-1009.[3]  a) M. X. Tang, C. T. Redemann, F. C. Szoka, Bioconjugate Chem. 1996, 7, 703-714; b) R. Wattiaux, N. Laurent, S. W-D. Coninck, M. Jadot, Adv, Drug Del. Rev. 2000, 41, 201-208.[4]  a) A. C. Hunter, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58, 1523-1531; b) M. Ogris, S. Brunner, S. Schuler, R. Kircheis, E. Wagner, Gene Ther. 1999, 6, 595-605.[5]  V.S. Trubetskoy, S. C. Wong, V. Subbotin, V. G. Budker, A. Loomis, J. E. Hagstrom, J. A. Wolff, Gene Ther. 2003, 10, 261-271.[6]  M. Han, Y. Bae, N. Nishiyama, K. Miyata, M. Oba, K. Kataoka, J. Controlled Rel. 2007, 121, 38-48.【０１２０】[7]  a) E. R. Gillies, A. P. Goodwin, J. M. Frechet, Bioconjugate Chem. 2004, 15, 1254-1263; b) M. Kramer, J. F. Stumbe, H. Turk, S. Krause, A. Komp, L. Delineau, S. Prokhorova, H. Krautz, R. Haag, Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 4252-4246.[8]  a) Y. Lee, S. Fukushima, Y. Bae, S. Hiki, T. Ishii, K. Kataoka, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 5362-5363; b) D. B. Rozema, D. L. Lewis, D. H. Wakefield, S. C. Wong, J. J. Klein, P. L. Roesch, S. L. Bertin, T. W. Reppen, Q. Chu, A. V. Blokhin, J. E. Hagstrom, J. A. Wolff, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2007, 104, 12982-12987.[9]  a) N. Kanayama, S. Fukushima, N. Nishiyama, K. Itaka, W-D. Jang, K. Miyata, Y. Yamasaki, U-I. Chung, K. Kataoka, Chem. Med. Chem. 2006, 1, 439-444; b) K. Masago, K. Itaka, N. Nishiyama, U. Chung, U., K. Kataoka, Biomaterials 2007, 28, 5169-5175.[10]  a) V. Zaric, D. Weltin, P. Erbacher, J.S. Remy, J. P. Behr, D. Stephan, J. Gene Med. 2004, 6, 176-184; b) J. J. Green, G. T. Zugates, N. C. Tedford, Y. H. Huang, L. G. Griffith, D. A. Lauffenburger, J. A. Sawicki, R. Langer, D. G. Anderson, Adv. Mater. 2007, 19, 2836-2842.[11]  a) D. Fischer, Y. Li, B. Ahlemeyer, J. Krieglstein, T. Kissel, Biomaterials 2003, 24, 1121-1131; b) S. M. Moghimi, P. Symonds, J. C. Murray, A. C. Hunter, G. Debska, A. Szewczyk, Mol. Ther. 2005, 11, 990-995.[12]  a) K. Temming, R. M. Schiffelers, G. Molema, R.J. Kok, Drug Resist Updat. 2005, 8, 381-402; b) M. Oba, S. Fukushima, N. Kanayama, K. Aoyagi, N. Nishiyama, H. Koyama, K. Kataoka, Bioconjugate Chem. 2007, 18, 1415-1423.
【産業上の利用可能性】
【０１２１】  本発明により、電荷変換型三元系ポリプレックスが提供される。本発明のポリプレックスは、核酸を、毒性を惹起することなく高効率で細胞にデリバリーすることが可能であり、遺伝子治療等に極めて有用である。
【図２】
0005645186.tif 000030
【図７】
0005645186.tif 000031
【図１０】
0005645186.tif 000032
【図１１】
0005645186.tif 000033
【図１２】
0005645186.tif 000034
【図１３】
0005645186.tif 000035
【図１５】
0005645186.tif 000036
【図１】
0005645186.tif 000037
【図３】
0005645186.tif 000038
【図４】
0005645186.tif 000039
【図５】
0005645186.tif 000040
【図６】
0005645186.tif 000041
【図８】
0005645186.tif 000042
【図９】
0005645186.tif 000043
【図１４】
0005645186.tif 000044
【図１６】
0005645186.tif 000045