(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケイガイの１００％メタノールエキスを有効成分として含む、創傷治癒促進剤として用いるためのアクアポリン３の発現亢進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アクアポリン３の発現調節剤（発現亢進剤及び発現抑制剤）、及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アクアポリン（aquaporin：以下ＡＱＰと略すことがある）は、アグレにより１９９２年に発見された膜６回貫通蛋白で、細胞内の水分量を調節する水チャネルとして機能する重要な蛋白である。アクアポリンは細菌から哺乳類に至るまで普遍的に存在しており、これまでに哺乳類で、ＡＱＰ０からＡＱＰ１２まで１３種類のアクアポリンが確認されている。
【０００３】
水チャネルの一種であるアクアポリン3(AQP3)は皮膚ケラチノサイトに多く存在し、水やグリセロールの輸送を促進することで皮膚の生理的保湿に重要である。また、本発明者らの研究によれば，AQP3の発現は皮膚炎症部位で著明に低下しており、これが種々の皮膚疾患に伴う乾燥症状の形成とも密接な関係にあることが示唆されている。さらに、AQP3はケラチノサイトの増殖・遊走能にも関わり、本チャネルが創傷時には治癒の促進に関与し、一方、皮膚癌では悪性化に関わっている。すなわち、AQP3の発現を促進する物質は、保湿効果および創傷治癒効果のある化粧品および医薬品として有用であり、またAQP3の発現を抑制する物質は抗腫瘍薬としての応用が期待できる。
【０００４】
アクアポリン３を増加させて保湿効果を示す材料としては、中央アジアの植物Ajuga turkestanicaが見出され（J Drugs Dermatol. 2007, 6 (6 Suppl): s20-4.)、米国のＤior社により既に化粧品として実用化されている。また、レチノイン酸がアクアポリン３の発現を促進する効果を示すことが報告されている（Cao et al., J cell Physiol, 215, 506, 2008）。しかし、化粧品又は医薬品として実用化の可能性があるアクアポリン３の発現調節剤は極めて少ない。
【０００５】
一方、ケイガイが保湿効果を示し、化粧品材料として用いることができることが報告されている（特開平６−９２８３８号公報、特開平９−２９３５号公報、特開平９−３０９３１号公報）。しかし、ケイガイが保湿効果を示す作用機序は不明である。また、ケイガイを含む複数の生薬の水溶性エキスが創傷治癒効果を示すことが、国際公開ＷＯ０３／０１５８０８号公報に記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J Drugs Dermatol. 2007, 6 (6 Suppl): s20-4.
【非特許文献２】Cao et al., J cell Physiol, 215, 506, 2008
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平６−９２８３８号公報
【特許文献２】特開平９−２９３５号公報
【特許文献３】特開平９−３０９３１号公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ０３／０１５８０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、アクアポリン３の機能異常に起因する病態の予防及び／又は治療のために有用なアクアポリン３の発現亢進剤及び発現抑制剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、in vitroの実験系によりAQP3発現調節薬を探索し、生薬ケイガイのメタノール抽出物が顕著なAQP3発現促進作用を示すこと、並びにショウキョウのメタノール抽出物がAQP3発現抑制作用を示すことを見出した。また、生薬ケイガイのメタノール抽出物が、AQP3発現促進に基づくと考えられる創傷治癒促進作用を示すことを確認した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明によれば、ケイガイエキスを有効成分として含む、アクアポリン３の発現亢進剤が提供される。
好ましくは、ケイガイエキスがケイガイの有機溶媒エキスである。
好ましくは、有機溶媒が低級アルコールである。
好ましくは、有機溶媒がメタノールである。
【００１１】
好ましくは、本発明のアクアポリン３の発現亢進剤は、皮膚の保湿剤として用いる。
好ましくは、本発明のアクアポリン３の発現亢進剤は、化粧品として用いる。
好ましくは、本発明のアクアポリン３の発現亢進剤は、ケラチノサイトの遊走促進剤として用いる。
好ましくは、本発明のアクアポリン３の発現亢進剤は、創傷治癒促進剤として用いる。
【００１２】
本発明によればさらに、ショウキョウエキスを有効成分として含む、アクアポリン３の発現抑制剤が提供される。
好ましくは、ショウキョウエキスがショウキョウの有機溶媒エキスである。
好ましくは、有機溶媒が低級アルコールである。
好ましくは、有機溶媒がメタノールである。
【００１３】
本発明によればさらに、ケイガイエキスをインビトロ又はインビボで投与することを含むアクアポリン３の発現を亢進する方法が提供される。
本発明によればさらに、ショウキョウエキスをインビトロ又はインビボで投与することを含むアクアポリン３の発現を抑制する方法が提供される。
【００１４】
本発明によればさらに、アクアポリン３の発現亢進剤の製造のためのケイガイエキスの使用が提供される。
本発明によればさらに、アクアポリン３の発現抑制剤の製造のためのショウキョウエキスの使用が提供される。
【発明の効果】
【００１５】
ケラチノサイトに多く存在するアクアポリン3は、皮膚の保湿作用と創傷治癒促進作用の両方の作用をもつことが知られている。本発明では、ケイガイエキスがアクアポリン3発現促進作用を示すとともに、ケラチノサイトの遊走促進作用を示すことから創傷治癒促進作用を示すことが実証された。本発明によるケイガイエキスを有効成分として含むアクアポリン３の発現亢進剤は、皮膚の保湿剤又は創傷治癒促進剤として有用であり、具体的には創傷治癒の促進を目的とした外傷治療薬としての医薬品、肌荒れ又は皮膚乾燥を改善する化粧品、さらには健康食品として利用可能である。さらに本発明では、ショウキョウエキスがアクアポリン3発現抑制作用を示すことが実証された。本発明によるショウキョウエキスを有効成分として含むアクアポリン３の発現抑制剤は、例えば、抗腫瘍剤として応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ケラチノサイトのアクアポリン３ｍＲＮＡ発現に対する各種生薬エキスの作用を示す。
【図２】図２は、ケラチノサイトのアクアポリン３タンパク質発現に対する各種生薬エキスの作用を示す。
【図３】図３は、ケラチノサイトの遊走能に対するケイガイの作用を示す。
【図４】図４は、皮膚炎症部位でのアクアポリン３ｍＲＮＡ発現の低下を示す。
【図５】図５は、ケイガイメタノールエキスより調製した各分画のアクアポリン３ｍＲＮＡ発現に対する作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、（１）ケイガイエキスを有効成分として含む、アクアポリン３の発現亢進剤、並びに（２）ショウキョウエキスを有効成分として含む、アクアポリン３の発現抑制剤に関する。
【００１８】
ケイガイエキスは、アクアポリン３の発現亢進作用を有するため、アクアポリン３の機能異常に起因する病態の予防及び／又は治療のための医薬の有効成分として有用である。アクアポリン３の機能異常とは、健常な組織内の細胞のアクアポリン３の状態とは異なる病態下の組織内細胞でのアクアポリン３の状態をいい、アクアポリン３の機能減退、細胞におけるアクアポリン３の数の減少などを含む。ケイガイエキスを有効成分として含む本発明のアクアポリン３の発現亢進剤は、具体的には、皮膚の保湿剤として用いたり、創傷治癒促進剤として用いることができるが、これらの用途のみに限定されず、アクアポリン３を発現する組織や器官の疾病の予防や治療を目的とする化粧品及び医薬組成物として、ヒト又は動物に投与することができる。
【００１９】
ショウキョウエキスは、アクアポリン３の発現抑制作用を有するため、アクアポリン３の機能異常に起因する病態の予防及び／又は治療のための医薬の有効成分として有用である。アクアポリン３の機能異常とは、健常な組織内の細胞のアクアポリン３の状態とは異なる病態下の組織内細胞でのアクアポリン３の状態をいい、アクアポリン３の機能増大、細胞におけるアクアポリン３の数の増加などを含む。ショウキョウエキスを有効成分として含む本発明のアクアポリン３の発現亢進剤は、具体的には、抗腫瘍剤として用いることができるが、これらの用途のみに限定されず、アクアポリン３を発現する組織や器官の疾病の予防や治療を目的とする化粧品及び医薬組成物として、ヒト又は動物に投与することができる。
【００２０】
本発明で用いるケイガイエキスは、シソ科のオドリコソウ亜科に属するケイガイ（Schizonepeta tenuifolia Briquet（var.japonica Kitagawa））（花穂又は全草など）から抽出される成分である。
本発明で用いるショウキョウエキスは、ショウガ科（Zingiberaceae）のショウガ（Zingiber officinale Roscoe）の根茎から抽出される成分である。
【００２１】
抽出の方法は特に限定されないが、好ましい方法としては、まず上記植物原料を適度に切断又は粉砕したものを適当な溶媒を用いて室温から加温下で抽出する方法が挙げられる。抽出に用いる溶媒としては、有機溶媒が好ましく、例えば、低級アルコール（メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等）、多価アルコール（グリセリン、プロピレングリコール等）、低級アルキルエステル（酢酸エチル等）、ケトン(アセトン、メチルエチルケトン等)、炭化水素（ベンゼン、ヘキサン等）、エーテル類（ジエチルエーテル等）などを挙げることができる。上記の溶媒は単独で用いてもよいし、２種類以上の溶媒を混合して用いてもよい。上記の中でも、低級アルコールが好ましく、メタノールが特に好ましい。
【００２２】
なお、国際公開ＷＯ０３／０１５８０８号公報では、生薬は水溶性エキスとして調製することが記載されているが、本発明で見い出されたケイガイのアクアポリン３発現促進作用はメタノール抽出物であり、しかも、そのなかでも比較的疎水性の高い100％メタノール溶出分画に認められている。従って、本発明によるアクアポリン３の発現亢進は、国際公開ＷＯ０３／０１５８０８号公報とは別の成分に由来する効果であると考えられる。
【００２３】
抽出条件としては、原料に対して抽出溶媒を約２〜１００倍量、好ましくは３〜３０倍量加え、室温又は加温して数時間から数日間、必要に応じて攪拌しながら抽出することが好ましい。抽出後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、必要に応じて、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を行ってもよい。
【００２４】
本発明のアクアポリン３の発現亢進剤及びアクアポリン３の発現亢進剤は、ケイガイエキス又はショウキョウエキスをそのまま用いてもよいし、当該エキスを製剤化したものでもよい。ケイガイエキス又はショウキョウエキスは、薬学的に許容し得る担体又は任意の助剤を用いて、常法に従い、注射剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、及び錠剤等等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味・矯臭剤等を用いることができる。
【００２５】
ケイガイエキス又はショウキョウエキスは、化粧品、飲食品等に配合して使用してもよいし、外用薬として使用することもできる。
【００２６】
ケイガイエキス又はショウキョウエキスを化粧品に配合する場合、その配合量は適宜調整することができるが、一般的には約０．０００１〜１０質量％であり、好ましくは約０．００１〜１質量％である。
【００２７】
ケイガイエキス又はショウキョウエキスは、外用薬として例えば、乳液状、クリーム状もしくはジェル状の軟膏、又は貼付剤として患部に供することができる。該外用薬では、ケイガイエキス又はショウキョウエキス以外に、油性原料、界面活性剤、無機充填剤、増粘剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、防腐剤、栄養剤、色剤、香料、美白剤、血行促進剤、局所刺激剤、抗炎症剤、収斂剤、清涼剤、肌荒れ防止剤、制汗剤、ビタミン類、ホルモン類、又は抗ヒスタミン剤等の各種薬剤を用途に応じて適宜配合することができる。
【００２８】
ケイガイエキス又はショウキョウエキスの投与量及び投与回数は特に限定されず、予防及び／又は治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢、疾患の重篤度などの条件に応じて、適宜選択することができる。一般的には、成人一日あたりの投与量は有効成分であるケイガイエキス又はショウキョウエキスの重量として０．１〜1000 mg程度である。
【００２９】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
製造例１：ケイガイ及びショウキョウのメタノールエキスの製造
乾燥ケイガイ１ｇまたは乾燥ショウキョウにメタノール10ｍｌを加え、加熱（７０℃）もしくは室温で２時間抽出、不溶物を濾別して、減圧下濃縮、乾固させた。実験には、この抽出物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で再溶解して、１００ｍｇ／ｍｌの濃度に調製したものを用いた。
【００３１】
実施例１：ケラチノサイトのアクアポリン３ｍＲＮＡ発現に対する各種生薬エキスの作用
ケラチノサイト株ＤＪＭ−１細胞の培養液にカンゾウ、ケイガイ、ソウジュツ、タクシャ、トウキ及びショウキョウのメタノールエキス（０．１ｍｇ／ｍｌ）を加え、２４時間培養後に細胞の総ＲＮＡをTRIZOL試薬（Invitrogen社）を用いて抽出した。アクアポリン３ｍＲＮＡ量はReal time-ＰＣＲ法により測定し、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量を基に標準化した。Real time-ＰＣＲは、まず、抽出した総ＲＮＡを出発物質とし、PrimeScript Reverse Transcriptase (Takara社) を用いて逆転写反応させＤＮＡ化した。これを鋳型とし、SYBR Premix Ex Taq (Takara社) と以下に示すプライマーを用いて、(95℃ for 3 min) x 1 cycle, (95℃ for 15 sec, 60℃ for 1 min) x 40 cyclesで増幅反応させた。ｍＲＮＡ量はＰＣＲの増幅産物が一定量検出される最初のサイクル数(threshold cycle：Ct値)より求め、ＧＡＰＤＨのCt値と比較することで定量化した。
【００３２】
AQP3-Foward：5'-TGCCTGGGGACCCTCATC-3'（配列番号１）
AQP3-Reverse：5'-GATCATATCCAAGTGTCC-3'（配列番号２）
GAPDH- Forward：5'-ACCATCTTCCAGGAGCGAGA-3'（配列番号３）
GAPDH- Reverse：5'-CAGTCTTCTGGGTGGCAGTG-3'（配列番号４）
【００３３】
アクアポリン３ｍＲＮＡ量の測定結果を図１に示す。図１において、アクアポリン３ｍＲＮＡ量は、溶媒投与群のアクアポリン３ｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ比を１として標記した。Means±ＳＤ、ｎ＝３，＊：ｐ＜０．０５（対照に対して、Dunnett two-tailed test）
【００３４】
図１の結果から分かるように、ケイガイ、ソウジュツ及びトウキで有意な発現亢進が認められ、ショウキョウで有意な発現抑制が認められた。
【００３５】
実施例２：ケラチノサイトのアクアポリン３タンパク質発現に対する各種生薬エキスの作用
ケラチノサイト株ＤＪＭ−１細胞の培養液にカンゾウ、ケイガイ、ソウジュツ、タクシャ、トウキ及びショウキョウのメタノールエキス（０．１ｍｇ／ｍｌ）を加え、２４時間培養後に細胞をRIPA buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholate, 1% protease inhibitor cocktail; pH 7.5)で可溶化し、遠心（14,000 xg、4℃、10分）した上清を試料とした。試料を12％ポリアクリルアミドゲルで分離した後、PVDF膜に転写した。転写したPVDF膜は5％スキムミルクでブロッキングし、一次抗体(抗アクアポリン3抗体、Chemicon社または抗βアクチン抗体、Sigma社、4℃、8時間)および二次抗体反応 (抗ウサギ抗体、Jackson labs社、室温, １時間) と反応させた。その後、ECL advance Western blotting analysis system (GE Healthcare Life Science社) を用いて免疫複合体を化学発光させ、バイオイメージアナライザー（LAS-1000、Fuji Film社）で検出した。
【００３６】
ウエスタンブロットによるアクアポリン３タンパク質発現の測定結果を図２に示す。図２の結果から分かるように、ケイガイを処理した細胞のみにアクアポリン３量の増加が認められ、ソウジュツ及びショウキョウでアクアポリン３量が減少した。
【００３７】
実施例３：ケラチノサイトの遊走能に対するケイガイの作用
ケラチノサイト株ＤＪＭ−１細胞のコンフルエントカルチャーの培養液にケイガイ又はショウキョウのメタノールエキス（０．１ｍｇ／ｍｌ）を加え、２４時間培養後に培養皿底部の細胞を２００μｌピペットチップの先端で１度だけ直線的に掻き取った。その後、培養液に１％ＦＢＳを加え、さらに２４時間培養して顕微鏡下に細胞の写真を撮影し、剥ぎ取られた細胞の間隔の幅を測定した。
【００３８】
測定の結果を図３に示す。図３の上は、コントロール、ケイガイ処理した細胞及びショウキョウを処理した細胞の２４時間後の細胞間隙の写真を示す。図３の下のグラフは、本実験の結果をMeans±ＳＤ（ｎ＝５）として標記した。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１（対照に対して、Student's T-test）
図３に示す通り、ケイガイ存在下に培養した細胞では有意に間隙の幅が狭くなり、ケラチノサイトの遊走が促進された。一方、ショウキョウでは間隙の幅が有意に広くなり、遊走が抑制された。
【００３９】
実施例４：皮膚炎症部位でのアクアポリン３ｍＲＮＡ発現の低下
皮膚炎を自然発症したＮＣＮｇａマウスより炎症部位および正常部位の皮膚を各３箇所ずつ摘出し、これらの試料のアクアポリン３ｍＲＮＡ量を半定量的ＰＣＲ法により調べた。皮膚組織からの総ＲＮＡの抽出にはTRIZOL試薬（Invitrogen社）を用いた。抽出した各RNA試料はRNA PCR Kit Ver. 2（Takara社）を用いて逆転写および増幅し、アクアポリン３および内部標準としてＨＰＲＴのｍＲＮＡを検出した。逆転写には本キットに含まれるoligo-dTプライマーを用い、４２℃、６０分間反応させ、ＤＮＡ化した。アクアポリン3のＰＣＲ反応には上記の配列番号１から４に記載のプライマーを用い、ＨＰＲＴには下記に示すプライマーを用いた。増幅されたＤＮＡ断片は１．５％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により検出した。
【００４０】
HPRT-Forward：5'-GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG-3'（配列番号５）
HPRT-Reverse：5'-GATTCAACTTGCGCTCATCTTAGGC-3'（配列番号６）
【００４１】
結果を図４に示す。いずれの炎症部位でも、正常皮膚に比べアクアポリン３ｍＲＮＡ量は減少していたが、ケラチノサイトのマーカーであるＨＰＲＴｍＲＮＡ量には著名な影響はなかった。
【００４２】
実施例５：ケイガイメタノールエキスより調製した各分画のアクアポリン３ｍＲＮＡ発現に対する作用
ケイガイのメタノールエキスを疎水クロマトDiaion HP-20Pカラムに吸着させ、その後、アセトン、１００％メタノール、５０％メタノールおよび水を用いて疎水性の高い物質より溶出して粗分画を調製した。各分画を上記の濃度でケラチノサイト細胞株ＤＪＭ−１の培養液に添加し、２４時間後にＲＮＡを抽出し、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法でアクアポリン３ｍＲＮＡ量を評価した。なお、各分画の濃度は回収率を基に算出したケイガイメタノールエキス０．１ｍｇ／ｍｌ中の濃度に設定した。本実験の半定量的ＲＴ−ＰＣＲは上記実施例４の方法に準じた。
【００４３】
結果を図５に示す。アクアポリン３発現亢進作用は主に１００％メタノール分画（一部アセトン分画）に現れ、比較的疎水性の物質の関与が示唆された。
【図１】
0005564735.tif 000002
【図２】
0005564735.tif 000003
【図３】
0005564735.tif 000004
【図４】
0005564735.tif 000005
【図５】
0005564735.tif 000006
【配列表】
0005564735000001.app