(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列とハイブリッドを形成することができ、かつ標的配列とハイブリッドが形成されない場合にステム−ループ構造を形成することができる核酸であって、該核酸は、
(ａ) (ａ１)標的核酸配列に対して相補的な配列であって、前記（ａ１）の配列と（ａ１）の標的配列とのハイブリッドのΔＧが、Ｍｇ2+を有さない緩衝液でのハイブリダイズを含むハイブリダイゼーション条件下で、−１７〜−２５ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲に設計された前記（ａ１）の配列、
(ａ２)ステムを形成することができる２つの相補的な配列の対であって、前記（ａ２）の配列のハイブリッドのΔＧが、０よりも小さく、前記（ａ１）の配列と標的配列とのハイブリッドのΔＧよりも高く設計された前記（ａ２）の配列、
を含む核酸部と、
（ｂ）エフェクター及びインヒビターを含み、その際、核酸がステム−ループ構造を形成する場合に、該インヒビターはエフェクターを阻害し、かつ核酸がステム−ループ構造を形成しない場合に、該エフェクターは活性がある、
核酸。
【請求項２】
前記の核酸が、インサイチューハイブリダイゼーションのために好適である、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記のハイブリダイゼーションが、細胞内で実施される、請求項１又は２に記載の核酸。
【請求項４】
固相に共有的に連結される場合に、前記の核酸が、標的核酸配列とのハイブリダイゼーションのために好適であり、その際該標的核酸配列が、無細胞試料で提供される、請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
前記の（ａ１）の標的核酸配列が、微生物の核酸配列である、請求項１から４までのいずれか１項に記載の核酸。
【請求項６】
前記の（ａ１）の標的核酸配列が、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列である、請求項１から５までのいずれか１項に記載の核酸。
【請求項７】
前記の（ａ２）の２つの相補的な配列が、ステムを形成する、請求項１から６までのいずれか１項に記載の核酸。
【請求項８】
前記の（ａ１）の標的核酸配列に対して相補的な配列が、ループを形成する、請求項１から７までいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９】
前記の（ａ１）の標的核酸配列に対する相補的な配列、及び（ａ２）の２つの相補的な配列の少なくとも１つが、部分的に重複する、請求項１から８までのいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１０】
前記の（ａ２）の配列のハイブリッドのΔＧが、核酸と、ミスマッチ配列又は／及び標的配列とは異なる配列とのハイブリッドのΔＧよりも低い、請求項１から９までのいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１１】
前記のステム形成が、Ｍｇ2+の存在下で、実施される、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１２】
前記のステム形成が、Ｍｇ2+１〜２０ｍＭの存在下で、実施される、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１３】
前記のインヒビターが、核酸部の一方の末端に共有結合し、かつ前記のエフェクターが、核酸部の他方の末端に結合する、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１４】
前記のエフェクター又は／及びインヒビターが、リンカーによって核酸部に結合され、その際、リンカーは、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、アミノ酸、及びアミノ酸類似体から選択される構成単位を含む、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１５】
前記のインヒビター及びエフェクターが、ステムの部分を形成しない、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１６】
前記のエフェクターが、発光ラベルであり、かつ前記のインヒビターが、クエンチャーである、請求項１から１５までのいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１７】
前記の核酸部（ａ）が、リボヌクレオチド、リボヌクレオチド類似体、デオキシリボヌクレオチド又は／及びデオキシリボヌクレオチド類似体からなり、その際ヌクレオチド類似体が、ＰＮＡ構成単位とは異なる、請求項１から１６までのいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１８】
前記の（ａ２）の２つの相補的な配列の少なくとも１つが、少なくとも１つの不適合ヌクレオチドを含む、請求項１から１７までのいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１９】
前記の核酸部（ａ）が、表１の標識配列から選択される、請求項１から１８までのいずれか１項に記載の核酸。
【請求項２０】
請求項１から１９までのいずれか１項に記載の少なくとも２つの核酸を含む組合せ。
【請求項２１】
前記の（ａ２）の配列のハイブリッド、又は／及び前記の（ａ１）の配列と個々の核酸の標的配列とのハイブリッドのΔＧ値が、最大で４ｋｃａｌ／ｍｏｌだけ異なる、請求項２０に記載の組合せ。
【請求項２２】
前記の個々の核酸が、インサイチューハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするために要求されるハイブリダイゼーション条件下で均一に機能する、請求項２０または２１に記載の組合せ。
【請求項２３】
前記の個々の核酸が、無機固相に共有的に連結される場合に、ＤＮＡ又はＲＮＡをハイブリダイズするために要求されるハイブリダイゼーション条件下で均一に機能する、請求項２０から２２までのいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項２４】
前記の個々の核酸が、タンパク質に共有的に連結される場合に、ＤＮＡ又はＲＮＡをハイブリダイズするために要求されるハイブリダイゼーション条件下で均一に機能する、請求項２０から２３までのいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項２５】
ハイブリダイゼーション法であって、
（ａ）請求項１に記載の少なくとも１つの核酸を設計し、
（ｂ）前記少なくとも１つの核酸と生物学的試料（ヒトを除く）とを接触し、
（ｃ）核酸のステムが開く場合の条件下で、前記核酸と前記試料とをＭｇ2+を有さない緩衝液でのハイブリダイズを含むハイブリダイズをし、そして
（ｄ）Ｍｇ2+含有緩衝液での洗浄を含む、該試料とハイブリッドを形成しない前記の（ａ）の核酸分子におけるステム形成を可能にする条件をもたらすこと
を含むハイブリダイゼーション法。
【請求項２６】
インサイチューハイブリダイゼーションである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ハイブリダイゼーションが、細胞内で実施される、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記の試料が、検出されるべき微生物を含む、請求項２５から２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記の核酸の標的核酸配列が、微生物の核酸配列である、請求項２５から２８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記の標的核酸配列が、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列である、請求項２５から２９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１つの核酸が、固相に共有的に連結され、かつ前記の標的核酸が、無細胞試料で提供される、請求項２５から３０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
工程（ｄ）が、ｐＨ＞８で、又は／及び室温での洗浄を含む、請求項２５から３１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１から１９までのいずれか１項に記載の核酸、又は請求項２０から２４までのいずれか１項に記載の組合せを含むキット。
【請求項３４】
請求項１から１９までのいずれか１項に記載の核酸、又は請求項２０から２４までのいずれか１項に記載の組合せを含むチップ。
【請求項３５】
電子化学的チップである、請求項３４に記載のチップ。
【請求項３６】
請求項１から１９までのいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸、請求項２０から２４までのいずれか１項に記載の組合せ、請求項３３に記載のキット、又は／及び請求項３４または３５に記載のチップを、生物学的試料（ヒトを除く）内で、生物の存在又は不在を同定するために用いる使用。
【請求項３７】
ＩＳＨ又は／及びＦＩＳＨを含む、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
診断使用である、請求項３６又は３７に記載の使用。
【請求項３９】
少なくとも２つの核酸が、同一条件下で、同時に機能化する、請求項３６から３８までのいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション及びチップ技術のための核酸標識に関する。
【０００２】
背景／先行技術
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術の広範囲に及ぶ成功によって、微生物学研究は、常用の微生物学に対して分子生物学の応用のために待機している。このことは、分子生物学の固有の及び根本的な問題によって阻害されている。その精度のために、どのツール（プローブ）を選択するかを知る必要がある。その前提条件は、要求が、検出された生物に関して明記されるべきであることである。しかしながら、臨床試料において、２０００を超える臨床上適切な病原体が、感染の原因物質であることは公知ではない。合理的なアプローチは、
・病巣が、生物を生じる問題の９５％で生じなければならないこと
・どこで試料を取ったかが公知であり、かつ臨床データが存在している場合に、生物数が、２〜１６まで減少されうること
・殆どの臨床試料における９５パーセンタイルを覆う生物数が、約１００程度であること
の問題を解決する。
【０００３】
この基本原理は、ＤＮＡ−プローブを基礎とするアッセイを通常の基剤に対して操作することを経済的に可能にする。
【０００４】
微生物の群化、及び微生物の特異性又は範囲の存在／不在のための非常に急速な試験は、他の分野の微生物学的試験：血液銀行、医薬品産業、化粧品産業及び食品産業においても関連性がある。しばしば、同一生物は、規律及び反応条件を通して関連性があり、従って全てのプローブに関して標準化される必要がある。
【０００５】
蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による、又はチップ技術を使用するリボソームＲＮＡの検出は、酵素増幅工程を使用しないＤＮＡ−プローブの感受性及び特異性を利用する効率的な方法を表す。ＦＩＳＨは、標準測定装置、例えば落射蛍光顕微鏡で検出される十分に強いシグナルを生じる標的のインサイチュー検出に対する次の２つのアプローチに依存する：
１．同一分子が、ある特異的オリゴヌクレオチド又はヌクレオチド類似体プローブと、それぞれのある蛍光体とを結合するために十分な数で細胞内に存在する
２．多数の蛍光体、例えば標識されたコスミドを運搬する大きなプローブ。
【０００６】
微生物のそれぞれの環境における同定のためのＦＩＳＨ技術は、当業者によく知られている。病原体の検出のためのＦＩＳＨの適用は、ＦＩＳＨが、速度及び費用効率において優れる、臨床微生物学及び感染学に対して特に関係がある。
【０００７】
チップ技術でのｒＲＮＡの検出は、標的を増幅する必要性も軽減する。総ｒＲＮＡは、試料から抽出され、かつチップ上に置かれる。特異的なプローブは、小さい表面積に濃縮され、かつそれぞれのｒＲＮＡ分子を引きつけて、特異的な存在／不在シグナルを提供する。かかるチップを製造するために、経済的に生存可能なそれらは、出来るだけ少ない操作で繰り返し使用されることを要求する。さらに、プローブの特徴の標準化は、再現性のある結果の発生のために最重要である。
【０００８】
常用の環境プローブにおいて受け入れられるためには、ある病気状態のための全てのプローブが、同一条件下で、ある容器（チップ、マイクロ流体装置、又はマイクロ滴定プレート）中で、又は容器上で同時に操作させることが出来る方法で設計されなければならない。プローブの設計において、及びプローブを経済的に生存可能にするために、あるプローブが、種々の病気状態に関連するものであってよいことを、考慮に入れなければならない。従って、１セットのプローブだけでなく全てのプローブが、同一のハイブリダイゼーション条件下で操作しなければならない。操作プローブの配列及び長さは、それに応じて試験されなければならない。
【０００９】
操作プローブの選択及び定義は、単純な配列比較及び理論的Ｔm値の決定によって実施されることができない。適用されたアルゴリズムによって、幅広い設定の値は、標準化ハイブリダイゼーション条件に適切なプローブ配列の選択に対する誘導を全く提供しないことで得られる。
【００１０】
プローブの質を左右するアルゴリズム及び因子の選択は、当業者に広く議論されている（１〜７）。他の誘導は、リボソームの３次元構造における配列と実際の位置との比較を要求されてよい。合理化に対する試みにおいて、Ｂｅｈｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ（８）のプローブの設計は、ハイブリダイゼーション部位と３Åの助力によって影響を受けやすい実際のリボソームの３次元モデルとの相互関係を調査した。彼らの発見は、インサイチューでの操作において使用されるＳＤＳが、圧倒的な変性作用を有することを示したが、２次元構造を予測したアルゴリズムによって取り込まれない。
【００１１】
ＦＩＳＨとチップ技術との双方における他の問題は、その方法が、追加の運搬工程を要求する未結合プローブ、試薬及び時間を除去する厳しい洗浄工程を必要としることである。ハイブリダイゼーションの成功は、洗浄工程に適用された技術及び精度に大いに依存してよい。しかしながら、常用の適用は、最小の工程及び操作時間を必要とし、最も重要なことには、個々の技術と無関係であるべきである。
【００１２】
工程の減少に対するある解決法は、オリゴヌクレオチド又はヌクレオチド類似体のヘアピン形成（分子標識）における蛍光共鳴エネルギー伝達（"ＦＲＥＴ"）の適用であってよい。標識の開発に対するいくつかのアプローチは、当業者に公知であり、かつ彼らの解釈に対する一般化された記載が、自由に入手できる（１３）。標識は、増幅酵素によって生じた鋳型の数の増加に対する溶液中でアニールする場合に、リアルタイムＰＣＲにおいて広く使用されている（１５）。わずかな試みのみが、膜上の細菌の検出／同定のための標識を生じさせている（１４）。ある成功した標識は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブで、細胞全体においてＥ．ｃｏｌｉを検出するために構築された。関連するＤＮＡ−プローブは、適切な性能を提供することに失敗した（１６）。他のＰＮＡ−標識の製造は、設計推奨において定められたようなオリゴヌクレオチドを基礎としたＰＮＡの乏しい溶解性によって制限される（１７）。
【００１３】
特許ＣＡ ２１７６２６６号／ＥＰ ０７４５６９０号は、リアルタイムＰＣＲのための万能ステムの構成に対する誘導を提供する（９）。驚くべきことに、前記の推奨は、インサイチューで微生物を同定するために設計されたプローブと合される場合に、作業標識を提供しない。リアルタイムＰＣＲは、ＩＳＨ（インサイチューハイブリダイゼーション）とチップとの双方が、固定された標的を要求する場合に、溶液中で実施される。それらの熱力学的な詳細は、インサイチューハイブリダイゼーション及びＦＲＥＴ要求と矛盾がない。従って、一般に作業ステムは、固定された標的での適用のために予測されることが出来なかった。従って、同一のＩＳＨ条件下で作業する複数個の標識を達成するために、個々のオリゴヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を適合する特異的標識のために経験的に研究する必要があった。
【００１４】
ＩＳＨ−標識の断片において、前記のステムが、大きいタンパク質／ＲＮＡ複合体、例えばリボソームでからませたＲＮＡに対するハイブリダイズの精密な均衡を妨げないことに注意すべきである。結合部位の利用性は、当業者に広く論じられており、かつ（１）において要約されている。
【００１５】
標識プローブの設計における他の制限は、ＩＳＨの製造中に細胞壁で生じる孔のサイズによって提供される。種々のプローブへの同一のステムの付加は、明瞭に個々の標識を生じる。複数のプローブは、既にヘアピンループを形成し、かつステムの付加は、"標識"形成を生じない。加えて、相補的な対を形成するための単純な付加基剤は、該ヘアピンが、ハイブリッド形成よりも熱力学的に好ましい範囲までＴmを増大してよい。特定のステムは、Ｔmを、ハイブリッドのＴmで、又はハイブリッドのＴm未満で維持している間に、配列を標識形成体にすることを考案されるべきである。標識（１３）の設計に関する教示は、１つの塩基対によるステムの長さの増加が、Ｔmを５℃だけ増加し、かつ該ステムのＴmが、配列のハイブリダイズのＴmと比較して１０℃高くあるべきである事を示す。
【００１６】
特定のｒＲＮＡ配列に基づく、単一の微生物、例えばバクテリアでのＦＩＳＨは、リボソームにおけるｒＲＮＡの立体障害のために困難であってよい。言い換えれば、ヘアピンを形成する標識は、埋没ｒＲＮＡ標的配列に対する乏しいアニールであってよい。
【００１７】
従って、本発明の目的は、前記の欠点を、少なくとも部分的に克服する分子標識を提供することである。本発明において提供される解決法、及びそれらの好ましい実施態様は、請求項において記載されている。
【００１８】
本発明の目的は、標的核酸配列とハイブリッドを形成することができ、かつ標的配列とハイブリッドが形成されない場合にステム−ループ構造を形成することができる核酸であって、該核酸は、
(ａ) (ａ１)標的核酸配列に対して相補的な配列、
(ａ２)ステムを形成することができる２つの相補的な配列の対
を含む核酸部と、
（ｂ）エフェクター及びインヒビターを含み、その際、核酸がステム−ループ構造を形成する場合に、該インヒビターはエフェクターを阻害し、かつ核酸がステム−ループ構造を形成しない場合に、該エフェクターは活性がある核酸である。
【００１９】
標的核酸配列とハイブリッドを形成することができ、かつ該標的配列とハイブリッドが形成されない場合にステム−ループを形成することができる本発明の核酸は、本明細書において"標識"、"分子標識"、"ヘアピン"、又は"ヘアピンループ"とも言い、その際"開放"型（ステムが形成されない）及び"閉鎖"型（標識がステムを形成する）が含まれる。該開放型は、標的配列とハイブリッドを形成しない標識、及び標的配列とハイブリッドを形成する標識を含む。
【００２０】
特に、２つの相補的配列（ａ２）は、配列（ａ１）と隣接している、すなわち第一の配列（ａ２）が、配列（ａ１）の３’末端で付与され、かつ第二の配列（ａ２）が、配列（ａ１）の５’末端で付与される。
【００２１】
前記の（ａ１）と標的配列とのハイブリッドは、本明細書において"同系（ｃｏｇｎａｔｅ）配列とのハイブリッド"又は"同系ハイブリッド"とも言われる。
【００２２】
本発明において、前記エフェクターは、ステムを形成することができる２つの相補的配列の１つで付与されてよいが、一方で前記インヒビターは、他方の２つの相補的配列で付与されてよく、そのため実質的に該インヒビターは、ステムが形成される場合にエフェクター活性を阻害し、かつ該エフェクターは、ヘアピンが開いている場合に活性がある。有利には、該エフェクターは、それぞれ標識の５’末端もしくは３’末端で、又はそれぞれ５’末端もしくは３’末端に対して１、２、３、４、もしくは５ヌクレオチド離れている位置で、付与される。該インヒビターは、有利には、前記エフェクターによって覆われていない他方の末端で、すなわちそれぞれ３’末端もしくは５’末端で、又はそれぞれ３’末端もしくは５’末端に対して１、２、３、４、もしくは５ヌクレオチド離れている位置で、付与される。
【００２３】
従って、本明細書において記載されているヘアピンループの設計は、本質的に当業者によく知られている標識とは異なる。
【００２４】
本発明の標識と標的配列とのハイブリダイゼーションは、ループが開かれる条件下で、実施してよい。ハイブリダイズする場合にステムを形成しない標識は、標的ｒＲＮＡ配列に対してアニールすることができ、例えば、従って成功したハイブリダイゼーションを得ることができる。
【００２５】
この目的は、例えば、実質的に同系ハイブリッド（すなわち標識と標的配列とのハイブリッド）のＴmと同等である、又は同系ハイブリッドのＴmよりも低い標識のＴm（すなわちステムのＴm）によって達成される。従って、該標的配列とのハイブリダイゼーションは、ステムが開かれる場合に、例えばハイブリダイゼーションが、実質的にＭｇ2+を有さない条件下で実施される場合に、実施される。
【００２６】
同系ハイブリッド、及び標識のステムの"実質的に同等のＴm"は、５℃未満、有利には３℃未満、より有利には２℃未満、より有利には１℃未満、より有利には０．５℃未満、さらにより有利には０．２℃未満、最も有利には０．１℃未満で異なる融解温度に関する。
【００２７】
標識の一部を形成する双方の、インヒビターによるエフェクターの阻害を達成するために、標的配列とハイブリダイズしないそれら標識分子において、ステム形成が、ハイブリダイゼーション反応後に生じてよい。これは、例えば、ΔＧ＜０を有する標識によって達成されてよく、そしてヘアピンが同時に形成する。さらに、ステム形成は、本明細書において記載されているＭｇ2+含有緩衝液での洗浄によって導入されてよい。
【００２８】
特に、ヘアピンループは、標準化ハイブリダイゼーション条件下で（例えば実質的にＭｇ2+がない条件下で）、前記の標識ステムが開き、その結果可能な立体制限が、ハイブリダイゼーション過程を阻害しない方法で、構築される。例えば、立体制限は、標的配列がｒＲＮＡ配列である場合に存在してよい。エフェクターが蛍光体である場合に、該蛍光体は、リボソームタンパク質の極めて近くで消滅されない。
【００２９】
ハイブリダイゼーション後のステム形成の誘導のための好適な条件は、例えばＭｇ2+約１〜約２０ｍＭ、よりいっそう詳述すればＭｇ2+約５〜約１５ｍＭ、さらに詳述すればＭｇ2+約８〜約１２ｍＭ、最も詳述すればＭｇ2+約１０ｍＭを含有する、Ｍｇ2+含有緩衝液を含む。該緩衝液は、ｐＨ＞８であってよい。
【００３０】
さらに、前記の標識は、それら全体で機能し、かつ最近接及び積層効果がそれらの熱力学的性質において重大な影響を有するような、ステム及びループ中へ切り裂かれることはできない。本発明の好ましい標識は、表１において要約される。明らかに、好ましいステム配列が、ΔＧ、Ｔm、ＧＣ含有率又は同一種に対して選択された配列の長さとは無関係であることが示されている。
【００３１】
本発明において、標準化条件に好適な標識の個々の構成のための熱力学的な詳述は、以下を示す：標識の形成のためのギブスエネルギー（ΔＧ）は、以下の方法で設計されるべきである
・該標識は、ハイブリッド条件下で、同系標的配列の不在下で自発的に形成する（ΔＧ＜０）。
・同系ハイブリッドのΔＧは、標識のΔＧと比べて極めて低い（すなわちより消極的である）。
・標識のそれぞれのΔＧは、ミスマッチの又は同系ではない配列よりも低い。
・標識の形成のためのＴmは、標識のＴmが、実質的にハイブリッドのＴmよりも低い、又はハイブリッドのＴmである方法で設計されるべきである。
【００３２】
同系ハイブリッドのΔＧが、ハイブリダイゼーション条件下で、約−１７〜約−２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、有利には約−１８〜約−２４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、より有利には約−１９〜約−２３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、最も有利には約−２０〜約−２２ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲であることが好ましい。
【００３３】
ハイブリダイゼーション条件下で、同系ハイブリッドのΔＧが、５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、有利には３ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、より有利には２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、及び最も有利には１ｋｃａｌ／ｍｏｌであることも好ましい。
【００３４】
場合により、同系配列は、１つのアームのみが、標識形成を達成するために補われる必要がある場合に、自発的にヘアピンループを形成してよい。しかしながら、標的配列がｒＲＮＡ配列であった場合に、これは、エフェクター、例えば発光体を潜在的にリボソームの消失タンパク質の近傍で与える。好ましい配置において、そのステムは伸長する。本明細書において記載されている熱力学的な詳述との一致のために、伸長ステムでさえも、方法は、規格内でＴmとΔＧとの双方を保持することを考案した。本発明によって、これは、少なくとも１つの不適合のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の導入によって達成されうる。本発明において、少なくとも１つの不適合ヌクレオチドの導入は、追加のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の導入によって高められてよく、その結果２つの完全な配列が、異なる長さを有し、かつステムが、"分枝鎖状"（例えば配列表番号：１における位置３６を参照）になり、又は／かつ不適合のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体による適合ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の置き換えによって達せされてよい（例えば配列表番号：７における位置５を参照）。従って、本発明において、"ステムの形成が可能な完全配列"は、少なくとも１つの不適合ヌクレオチド、有利には１，２，３，４又は５つの不適合ヌクレオチドも含んでよい。
【００３５】
表２から分かるように、本明細書に記載されている配列は、ＰＮＡ−オリゴヌクレオチドの構成における前記の制限によって、ＰＮＡ−標識として考案されることはなかった。前記の主な制限は、オリゴヌクレオチドの長さにおいて、十分に特異的な、及びハイブリダイズされない場合にループのリフォールディングを確実にするために十分な長さのステムを有することを要求した。従って、微生物のインサイチュー同定を確実にするために十分な親和性及び速さでハイブリダイズすることができるＤＮＡ−標識を考案する必要がある。
【００３６】
本発明の標識は、ＰＮＡ標識ではない。標識の主鎖は、有利には、核酸主鎖である。該標識は、核酸部において、又は／及びリンカーが存在する場合にリンカーにおいて、核酸類似体、例えばデオキシリボヌクレオチド類似体又はリボヌクレオチド類似体を含んでよい。この類似体は、有利には、糖成分、塩基又は／及びリン酸塩群において改質されたヌクレオチド類似体である。該ヌクレオチド類似体は、有利には、ＰＮＡ構成単位ではない。
【００３７】
臨床上の試料における前記の９５パーセンタイルに続いて、病原体は、病気関連群中に分類されうる。それら生物に対してプローブは、特に全てのプローブが１つのチップ上で使用される場合に、前記の条件下で同時に作業するべきである。そのチップの適用は、同系の及びステムの特徴の双方の厳格な標準化を要求する。１つ以上のプローブ、すなわち少なくとも２つのプローブの組合せが使用される場合に、全てのプローブが、いくつかのスライド／チップ上で同時に作業するために設計されるべきである。
【００３８】
本発明の他の目的は、少なくとも２、有利には少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、又は少なくとも５０の標識を含む組合せである。その組合せは、表１の全ての標識に制限されないが、有利には最大で１００、最大で８０、最大で７０、最大で６０、最大で５０、最大で４０、最大で３０、又は最大で２０を含んでよい。
【００３９】
本発明の組合せにおいて、該標識は、同一又は異なる標的配列を有してよい。個々の標識の標的配列が、異なることが好ましい。
【００４０】
本発明の標識の組合せにおいて、（ａ２）の配列のハイブリッド、又は／及び標的配列との（ａ１）の配列のハイブリッドの個々の標識のΔＧ差は、同系配列に関して、最大で約４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、有利には最大で３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、より有利には最大で２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、及び最も有利には最大で約１ｋｃａｌ／ｍｏｌであってよい。
【００４１】
組合せにおいて、それぞれの同系配列に関するそれぞれの標識のＴm値は、最大で約３℃だけ、有利には最大で約２℃、より有利には最大で約１℃異なってよい。
【００４２】
本発明の組合せにおいて、個々の核酸は、均一に機能することが好ましい。"均一に機能すること"は、成功したハイブリダイゼーションが、本発明の種々の核酸プローブで、同一のハイブリダイゼーション条件下で、例えば標準化ハイブリダイゼーション条件下で達成されるうることを意味する。言い換えれば、均一な機能する本発明の核酸は、ハイブリダイゼーション条件の個々の最適化を要求しない。
【００４３】
病気状態に依存して、ある病原体は、最も頻繁に、原因物質であり、かつ従って診断群に従われうる。ある病原体の付加又は除外は、９５パーセンタイルに達するための地域疫学に依存して要求されてよい。表１の好ましいリストは、欧州及び殆どの北米国の要求を網羅する。
【００４４】
さらに本発明の他の観点は、場合により要求されたハイブリダイゼーション試薬と共に、列挙された生物を検出するために要求される少なくとも２つの表１の標識を含有してよい、キット又はチップである。有利には、前記のチップ又はキットは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、又は少なくとも５０の標識を含有する。該キット又はチップは、最大で表１の標識の全てを、有利には最大で１００、最大で８０、最大で７０、最大で６０、最大で５０、最大で４０、最大で３０、又は最大で２０を含んでよい。
【００４５】
列挙された生物の検出、計数及び同定のための分類及び得られるキットのリストは、表１において従う。
【００４６】
前記標識は、チューブ、マイクロタイタープレート、濾過マイクロタイターウェル、スライド及びチップ中で実施されるために設計されたアッセイに適用されうる。その検出は、蛍光、時間分解蛍光で、多数の蛍光体で、及び電気化学酵素を使用して行われうる。
【００４７】
ＦＩＳＨのための好ましい実施態様において、そのアッセイは、いくつかの試料を保持及び分離するために設計されたガラススライド上で実施される。
【００４８】
本発明の他の目的は、ハイブリダイゼーション法であって、
（ａ）少なくとも１つのあらゆる本発明の核酸、又は本発明の核酸の組合せと、生物学的試料との接触し、
（ｂ）核酸のステムが開く場合の条件下で、核酸又は（ａ）の核酸の組合せと該試料とのハイブリダイズ、例えば実質的にＭｇ2+を有さない緩衝液でハイブリダイズし、そして
（ｃ）該試料でハイブリッドを形成しない（ａ）の核酸分子におけるステム形成を可能にする条件、例えばマグネシウム含有緩衝液で、例えばｐＨ＞８で又は／及び室温で洗浄することをもたらすこと
を含むハイブリダイゼーション法である。
【００４９】
該試料は、標識によって検出されるための核酸を含む疑いのある生物学的起源、例えば診断又は食品試料のあらゆる試料であってよい。該試料は、微生物、例えばバクテリア、酵母及び糸状菌、特に、グラム陽性菌又は／及びグラム陰性菌を含む試料であってよい。
【００５０】
本発明のハイブリダイゼーション法において使用されるのは、本明細書において記載されているキット又はチップでもありうる。
【００５１】
"実質的にＭｇ2+を有さない"とは、Ｍｇ2+濃度１ｍＭ未満、有利には０．１ｍＭ未満、より有利には０．０５ｍＭ未満、最も有利には０．０１ｍＭ未満に関する。
【００５２】
工程（ｃ）における緩衝液は、Ｍｇ2+約１〜約２０ｍＭ、より有利にはＭｇ2+約５〜約１５ｍＭ、さらに有利にはＭｇ2+約８〜約１２ｍＭ、最も有利にはＭｇ2+約１０ｍＭを含んでよい。
【００５３】
前記で示されている、実質的にＭｇ2+を有さない溶液及びＭｇ2+含有溶液の適用を含むあらゆる好適なハイブリダイゼーションプロトコルが適用されてよい。例えば、次のプロトコルが使用されてよい：診断試料のアリコートを、スライド上で定義された領域に適用する。有利には、１０μｌの定義された量を適用し、そして乾燥する。
１．該試料を、スライドに熱固定する。
２．グラム陽性生物が、十分に公表された明細書に従って、リゾチーム／リゾスタフィン消化を受ける。好ましい一実施態様において、該消化を、７分間、４６℃で、加湿チャンバー中で操作する。
３．そして、孔を、例えば、数分間１００％メタノール又はエタノールのスライドを浸漬することによって形成する。好ましい一実施態様において、メタノール又はエタノールを氷冷し、かつその浸漬時間は、グラム陰性菌に関して７分、グラム陽性菌に関して３分間である。
４．そして該スライドを、例えば５５℃で、スライド加温装置上で乾燥する。
５．その標識を、（実質液にＭｇ2+を有さなくてよい）ハイブリダイゼーション緩衝液中で溶解し、そしてスライドのそれぞれの領域にスライド加温装置上で適用する。
６．そして該スライドを、ハイブリダイゼーション緩衝液で加湿したハイブリダイゼーションチャンバー中へ置く。好ましい一実施態様において、該スライドを、疎水性カバーガラスで覆い、そして覆われたスライド加温装置上に４６℃で１２分間置く。
７．そして該スライドを、例えばｐＨ＞８で又は／及び室温で、マグネシウム含有緩衝液で洗浄する。その緩衝液は、主に、Ｍｇ2+約１〜約２０ｍＭ、より有利にはＭｇ2+約５〜約１５ｍＭ、さらにより有利にはＭｇ2+約８〜約１２ｍＭ、最も有利にはＭｇ2+１０ｍＭを含む。
８．そして該スライドを乾燥し、そして固定液で固定してよく、さらに例えば４００×、６００×、又は１０００×の合計倍率で、落射蛍光顕微鏡下で読み取ることができる。
【００５４】
万一、他の容器が、ハイブリダイゼーションのために使用される場合に、その検出は、当業者によく知られている、フローサイトメトリー又は自動蛍光読み取り機を介してよい。
【００５５】
さらに、本発明の他の実施態様は、本発明の標識のチップ適用に関する。チップ適用のために、該標識は、キャリヤー表面に共有的に結合させられる必要がある。この機能のために、設計された標識の３’末端の塩基が、ビオチン化、又はタンパク質及び核酸化学の当業者によく知られている方法を使用して、ヘテロ−二官能性試薬によって酵素に結合されてよい。さらに、ビオチン化標識は、化学源を有さないで得られうるストレプトアビジン被覆チップに付加されてよい（１９）。この適用において、それぞれのビオチン化ヘアピンループは、あるチップの多数の別個の領域、例えば少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、もしくは少なくとも５００の領域、又は最大５００、最大４００、もしくは最大３００の領域に結合させられうる。総ＲＮＡは、市販のキット（２０）を使用して試料から抽出されることができ、かつハイブリダイゼーション条件下でチップに適用されうる。ハイブリダイゼーション後に、該チップは、例えばｐＨ＞８で、マグネシウム含有緩衝液で簡単に洗浄されうる。領域上の蛍光は、特異的な標的配列、例えば試料中のそれぞれの生物の存在を示す特異的なＲＮＡの存在を示す。
【００５６】
大量の常用の適用に対してハイブリダイゼーションアッセイを開始するためには、１つの再使用可能なチップ上で、大量の試料を分析することが必要である。該チップの設計は、大量生成、十分な質の調整、及び長期の保存性を可能にうる。
【００５７】
それらの明細書を満たすために、本発明に他の実施態様において、本発明の標識は、特異的な反応を触媒作用することによってシグナルを発する酵素に共有的に結合される。特に、該酵素は、電子化学的シグナルを発してよい。好適な酵素は、制限されることなく、チロシナーゼ、ペルオキシダーゼ、亜硫酸オキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グアニンオキシダーゼを含む。好適な一実施態様において、該酵素は、好熱性生物又は超好熱性生物の遺伝子配列から組換え的に誘導されて、その安定性をハイブリダイゼーション条件及び高温下で提供する（２１）。該酵素は、標識分子の一方の末端で、標識と結合されてよい。該分子の他方の末端で、インヒビターが結合されてよく、酵素活性を阻害することができる。前記のヘアピンループに対して同系配列が存在しない場合に、該インヒビターは、酵素を阻害し、かつシグナルは発せられない。同系配列の存在においては、前記ループが、酵素からよく除去されたインヒビターで変性されないままであり、かつ該酵素は、当業者によく記述されている装置によって検出されうる電子化学的シグナルを発する。リンカーは、酵素又は／及びインヒビターの結合のために、例えばインヒビターの結合のために使用されてよい。
【００５８】
他の好ましい一実施態様において、グルコースオキシダーゼは、前記のヘアピンループの一方の末端に結合され、かつグルコースオキシダーゼインヒビター、例えばアデニンヌクレオチド又はアデニンヌクレオチド類似体は、該ヘアピンループの他方の末端に結合される。アデニンヌクレオチドは、グルコースオキシダーゼの公知のインヒビターである（２２、２３）。リンカーは、グルコースオキシダーゼ又は／及びグルコースオキシダーゼインヒビターの結合のために、例えばグルコースオキシダーゼインヒビターの結合のために使用されてよい。前記のヘアピンループに対して同系配列が存在しない場合に、該インヒビター、特にアデニンヌクレオチドは、酵素を阻害し、かつシグナルは発せられない。同系配列の存在においては、前記ループが、酵素から十分に除去されたインヒビターで変性されないままであり、かつ該酵素は、当業者によく記述されている装置によって検出されうる電子化学的シグナルを発する。
【００５９】
かかるアッセイを実施するために、それぞれ検出装置（チップ）上で規定された位置に適用されてよい、同一の特徴を有する多数の配列（表１）が開発される。総ＲＮＡは、抽出方法及びすぐに利用できる市販のキットを使用して試料から抽出され（２０）、かつハイブリダイゼーション条件下でチップ上へ設置される。ハイブリダイゼーション後に、該チップを、基質緩衝液で、４６℃で洗浄し、そしてそのシグナルを読み取る。そのサイクルの終わりで、全てのハイブリダイズされたＲＮＡを、ハイブリダイゼーション緩衝液で高温で洗浄する。有利には、洗浄温度は、それぞれのＴmより１０℃高く選択される。好ましい一実施態様において、前記のチップを、６０℃でハイブリダイゼーション緩衝液で洗浄する。そしてその温度は、４６℃まで降下して、次の分析サイクルのために平衡にしてよい。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の標識配列を示す図。
【図２】ＰＮＡ標識が、本発明において安定ではないことを示す図。
【図３】表１における様な同一条件下で作業し、かつ非常に類似した物理化学的条件を有する標識プローブのリストを示す図。
【００６１】
説明
表１は、本発明の標識配列を記載している。略語：Ｒ＆Ｇ：赤又は／及び緑の蛍光染料が、標識、例えばＣｙ３又はＦＩＴＣ又はそれらの誘導体に結合されてよい。
【００６２】
表２は、ＰＮＡ標識が、本発明において安定ではないことを記載している。計算は、ＰＮＡ標識である標識を仮定して、表１の配列で実施した。ＤＮＡ標識と対照的に、全ての次の５つの判定基準が、満たされている：ＧＣ含有率＜６０％、＜３塩基自己相補性、連続して４プリン、最大１８の長さ、逆配列の回分構造又は繰り返し又はヘアピン。表２における"あり"（"なし"）は、判定基準が満たされる（満たされていない）事を示す。"最終"の蘭は、ＰＮＡ標識が、本発明において安定である（"あり"）又は安定でない（"なし"）場合に示す。最終における"なし"は、５つの判定基準の１つが満たされていないことをしめす。"あり"は、全ての判定基準が満たされていることを示す。表２の全ての配列は、"なし"であると判定される。従って、表１の配列は、ＰＮＡ標識において安定ではない。
【００６３】
引用文献
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【００６４】
0005645407.tif 000003
【００６５】
0005645407.tif 000004
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
0005645407.tif 000009
【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図１−２０】
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【図１−２１】
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【図１−２２】
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【図１−２３】
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【図１−２４】
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【図１−２５】
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【図１−２６】
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【図１−２７】
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【図１−２８】
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【図１−２９】
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【図１−３０】
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【図１−３１】
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【図１−３２】
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【図１−３３】
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【図１−３４】
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【図１−３５】
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【図１−３６】
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【図１−３７】
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【図１−３８】
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【図１−３９】
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【図１−４０】
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【図１−４１】
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【図１−４２】
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【図１−４３】
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【図１−４４】
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【図１−４５】
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【図１−４６】
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【図１−４７】
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【図１−４８】
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【図１−４９】
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【図１−５０】
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【図１−５１】
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【図１−５２】
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【図１−５３】
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【図１−５４】
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【図１−５５】
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【図１−５６】
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【図１−５７】
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【図１−５８】
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【図１−５９】
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【図１−６０】
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【図１−６１】
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【図１−６２】
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【図１−６３】
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【図１−６４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図２−１０】
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【図２−１１】
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【図２−１２】
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【図２−１３】
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【図２−１４】
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【図２−１５】
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【図２−１６】
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【図２−１７】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図３−９】
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【図３−１０】
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【配列表】
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