(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を含む水溶液からタンパク質をろ過液として精製回収するろ過する膜において平均孔径が１０ｎｍ以上１μｍ以下、空孔率が６５％以上９０％以下で膜厚が３０μｍ以上で１ｍｍ以下の多層構造を持つ親水性多孔性平膜で、表裏面共に非円形状の孔で構成され膜表面と膜裏面との平均孔径比が１対３以上の膜の２枚以上を前段の膜の平均孔径が後段の膜の平均孔径以上となるように膜裏面に直接隣接する膜の膜表面を直接重ね合わせた多段積多層膜。
【請求項２】
請求項１において積層する平膜のすべてがミクロ相分離法で製膜された再生セルロース製平膜であることを特徴とする多段積多層膜。
【請求項３】
請求項１あるいは２において隣接する２枚の平膜の平均孔径の比が２以上で、８以下であり且つ隣接する膜については裏面と表面とが密着するように積層したことを特徴とする多段積多層膜。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質等を分離精製する際に微粒子除去のために使用する膜に関する。特に、溶液中で時間の経過により会合体を形成しやすいタンパク質や凝集体を形成しやすいコロイド粒子等の精製・分離を効率的に行える膜に関する。
【背景技術】
【０００２】  従来、微粒子状態で分散した固体状物質（力学的な力に対して流動せずに形状が維持される物質と定義）と液体の分離に使用される方法として中空糸膜や平膜を使用した膜濾過による分離方法が一般的に利用されている。膜濾過法は、固液分離に向いているが、使用する膜の種類、濾過の条件や方法、さらには濾過を行う溶液によっては、目詰まりを起こしやすく、回収される物質の膜透過率、回収率、除去される物質の除去率などに影響を与える。目詰まりは２種の機構によって進行する。すなわち、（１）血栓型目詰まりで、平均孔径より大きな固体粒子による（２）梗塞型目詰まりで平均孔径より小さな固体粒子あるいは溶解している分子による。【０００３】
そのなかにおいて、多段濾過方法は、血漿や血漿分画製剤、バイオ医薬などにおける溶液から有用タンパク質を回収し、さらにウイルスによる汚染の防止方法として有効な手段の一つである。つまり、溶液中からあらかじめ大きな粒子を取り除いたり、会合体を形成してしまっているタンパク質を単分散の状態にすることで次の濾過での目詰まりの原因を少なくし、ウイルス除去性能やタンパク質の透過率を高める効果がある（非特許文献１）。
【０００４】
例えば、濾過膜が中空糸膜の場合、特開平２−１６７２３２号（特許文献１）公報では、有用タンパク質をウイルスと分離する効率的な濾過方法として、前段の平均孔径の大きなプレフィルターで目詰まりを起こしやすい大きな粒子等を除去し、その液を後段のメインフィルターで濾過することによりメインフィルターの性能が生かされている。さらに、特開２０００−００５５６９号（特許文献２）公報では、直列多段濾過に使用する中空糸膜の性能を平均孔径・除去対象物質の除去率・回収対象物質の透過率を指定することにより、よりその効率を向上させている。
【０００５】  濾過膜が平膜の場合は、特開２００３−５１９００５号（特許文献３）公報で、クロスフロー濾過により物質を分離し、濾液および濃縮物中の目的物質を取得する装置により、多段濾過を行い、濾過効率と製品収率を向上させている。また、従来の同一モジュール内に複数の平膜を組み込むタイプの多段濾過法は、膜と膜の間に目の粗い素材を挟みこむ、サンドウィッチ型がある。膜間に目の粗い素材を挟み込まなければ多段濾過の効果が現れず、濾過速度の減少と目詰まりするまでの濾過量が減少する。【０００６】
しかしながら、溶液中にタンパク質を含む液を濾過する場合、（１）タンパク質の膜内部での濃度上昇、（２）タンパク質の疎水的・電気的性質による膜への吸着作用や会合体の発生、などが原因となり目詰まりが起こりやすくなるが、特に会合体による膜の目詰まりにおいて、モジュールを組み合わせるタイプの多段濾過では、予め大きなプレフィルターで会合体をなくし、単分散な状態にしたとしても、次の濾過モジュールに行くまでに時間がかかり、よって再びタンパク質が会合体を形成しやすくなる。これにより、膜の平均孔径よりも大きくなった会合体は膜を通過し回収することが出来ないばかりか、目詰まりの積極的な原因ともなってしまう。さらには、後段で使用する膜の平均孔径が小さくなるにしたがってその傾向が大きくなる。
【０００７】
タンパク質の会合体形成の対策として、特開２００７−１６０１６号（特許文献４）公報では、タンパク質またはペプチドを含有する水溶液を中空糸を用いたクロスフロー濾過を行っているが、この際、タンパク質などを含む水溶液の性質をｐＨや塩などにより調製することで会合体の形成を防ぎ目的の低分子量のタンパク質と不要な高分子量のタンパク質の分画を行っているが、ｐＨの調節や塩の添加など液の調整が複雑である。また、これらの調整で会合体の形成を常に防ぐことが可能とはいえない。
【０００８】
本発明中での多孔性膜とは、フィールドエミッション型走査型電子顕微鏡によって膜中に孔の存在が認められる膜で平均孔径５ｎｍ以上、空孔率３０％以上の膜を意味する。
【０００９】
クロスフロー濾過とは、膜表面に沿って溶液を流しながら濾過する方式であり、平行濾過あるいはタンジェンシャル濾過ともいわれる。デッドエンド濾過とは溶液を閉鎖された１次側空間に圧入する方式である。
【００１０】
0005516835.tif 000002
こでろ過速度は１平方メートル当たりの純水のろ過速度でｍｌ／分の単位で測定され、膜厚はμｍ単位、粘度はセンチポイズ、膜間差圧はｍｍＨｇｔａｎｎｉ，空孔率は無次元単位である。この際の平均孔径の単位はｎｍとなる。
空孔率は字式により与えられる。
空孔率  ＝  （１  −  膜の密度／素材高分子の密度）
膜の密度は（膜の重量／膜の面積＊膜厚）で算出される。素材高分子の密度は空孔率０％時の膜の密度で、これはすでに文献で与えられている。
多層構造膜とは、膜の断面方向から電子顕微鏡で観察すると１０〜１０００ｎｍの厚さの層が認められ、膜ほ表面からの観察では網目状または粒子間のすきまが孔として、また粒子相互は（有）着した様子が観察される膜である。
このように網目状または粒子間の隙間が孔として観察される膜を非円形孔（文献上Ｕｐ孔となづけられている）を待つ膜と定義される。Ｕｐ孔を持つ膜の一般的な製法はミクロ相分離法での製膜であり非特許文献２および３に与えられる。表裏面共にＵｐ孔にするには流延用の高分子濃度を低くすれば良い。高分子濃度を５重量％程度に低くして溶媒蒸発法で製膜すると裏面に比較して蒸発面（表面）での平均孔径の小さな膜が得られる。高分子の例としてミクロ相分離法が適用できる高分子（例えば、セルロース誘導体やポリアクリロニトリルなど）が知られている。【００１１】
【非特許文献１】真鍋征一著『血液製剤のウイルス除去法』族医薬品の開発、２０巻、８５頁〜１０３頁、１９９２
【非特許文献２】真鍋征一著「ウイルス分離］高分子の物性（３）表面・海面と膜・輸送、高分子学会編、共立出版、４９３頁〜５２０頁、１９９５年
【非特許文献３】高分子論文集、３４件（Ｎｏ３）、ｐｐ２０５〜２１６（１９７７）。
【特許文献１】特開平−１６７２３２号
【特許文献２】特開２０００−００５５６９号
【特許文献３】特開２００３−５１９００５号
【特許文献４】特開２００７−１６０１６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明では、濾過による膜分離で粒子による目詰まりが起こりにくく、膜の平均孔径以下の大きさのタンパク質を高透過率で得る為の多段積多層膜を提供することを目的とする。特に会合が起こりやすい物質（例、グロブリン）を高効率で微粒子を除去しつつ高い回収率で精製することができる濾過用の膜を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記従来技術の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、多層構造を持つ多孔性の平膜複数枚を、前段の膜の平均孔径が後段の膜の平均孔径以上となるように直接重ね合わせた多段多積層膜を用いることで、単独濾過以上のタンパク質透過率を実現でき、これらにより時間的、コスト的な問題を解消できることを見出した。また、積層する平膜を検討した結果、膜の平均孔径が５ｎｍ以上２μｍ以下、空孔率が６５％以上９０％以下、膜厚が２０μｍ以上１ｍｍ以下の平膜による多段積多層膜であり、さらに積層する平膜が吸着機構による孔の目詰まりを防止するために親水性高分子である再生セルロース製の上記多段積多層膜であることによって、本発明を完成するに至った。たとえば、平膜を多数積み重ねる際、空孔率が低く、また円筒状孔（例えば、ニュークレオポア膜）を重ねた場合には、濾過速度は圧力勾配から算出される値より１／２以下になる。
【００１４】
即ち本発明の多段積多層膜は、（１）膜の上に直接膜がくるように多孔性平膜を積層するため、積層する平膜の間には特別なスリットや空間を設ける必要がなく、（２）濾過効率を高めるために前段の平均孔径が後に続く後段の平均孔径よりも大きくなるように積層するという点である。これにより、タンパク質を含む液の特別な液調製をすることなく、さらには使用するモジュールは１つでよく、膜間の空間を維持するための支持体や緩衝材の必要もない、多段濾過を行える多段積多層膜である。
【００１５】
多孔性膜の製法として湿式または乾式法での製膜方法が採用できる。この方法では製膜過程でミクロ相分離が通常発生する。ミクロ相分離を膜厚方向に逐次発生させることで多層構造膜を作製できる。多層構造膜では微粒子の除去性が優れ、かつタンパク透過性も与えられる。
【００１６】
多段に積層する多孔性平膜は濾過の効果を得るため、膜厚は薄いほうが濾過速度などに有効だがピンホールや扱いやすさ、機械的強度の面から３０μｍ以上１ｍｍ以下であることが必要である。さらに、タンパク質の高透過率を実現するために空孔率６５％以上９０％以下であることが必要である。多孔性平膜の膜平面内で定義される平均孔径において、膜表面と膜裏面との平均孔径比が、１対３以上にすることにより多段に積層する効果は高まる。
【００１７】
多段に積層する平膜は、２枚以上複数枚を重ねるが、その枚数と組み合わせは積層する平膜の性能や濾過の目標、条件、溶液の種類などにより総合的に判断すればよい。多段に積層する平膜においては、隣接する膜においては、前段の膜裏面に対して後段の膜表面が直接重なるように重ねることが重要である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、多層構造をもつ多孔性膜を多段に積層した平膜であることで、有用タンパク質が透過するのに必要な空間と、会合体が再生しないための短時間の濾過とを確保することができ高透過率を達成できる。膜同士が密着するため、前段の膜から次段の膜へのタンパク質を含む溶液の通過時間がほとんど同時であり、タンパク質が再び会合体を形成するのを防ぐことができる。このため、微粒子除去性能を持つ層の部分を透過する溶液中ではほとんど単分散な状態のタンパク質を含む溶液となり、会合体による目詰まりが起こりにくくなる。よって、目詰まりによる圧力上昇を抑えられ、タンパク質の高透過率を実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明で使用する平膜は親水性素材であり、湿式または乾式のミクロ相分離法で作製される。例えば、銅安法再生セルロース平膜は親水性素材として最適であるが膜厚を１００μｍ以上に、また、平均孔径を１００ｎｍ以上にするのが難しい。製法は特公昭６２−０４４０１８号に与えられている。再生セルロース製の平膜の製法として多孔性アセテート膜を０．１規定の水酸化ナトリウム水溶液でケン化処理することによって得られる。この方法では、蒸発面の膜面（表面）での平均孔径が小さく、裏面の平均孔径は表面のそれの３倍以上となる。この方法により０．０１μｍ〜数μｍの平均孔径を持つ多孔性多層性膜が得られ、膜厚は２０μｍ〜数ｍｍまで可能である。このようにして得られた多孔性再生セルロース平膜を濾過器の支持体の上に複数枚、原液側から濾液側に向かって膜の平均孔径がだんだんに小さくなるように積層し、隣接する膜については裏面と表面とが密着するように重ねる。
【００２０】
分離・精製を行う方法は、濾過でも拡散でもよく、濾過では、デッドエンド方式やクロスフロー方式などが利用できる。拡散では、定常孔拡散方式であることが望ましい。定常孔拡散法は、特開２００５−３４９２６８号公報に与えられている。
【実施例１】
【００２１】  ミクロ相分離法によってアセテート膜を作製し、これを０．１規定水酸化ナトリウム水溶液に１２時間浸漬し、得られた平膜をアセトンにより脱水乾燥した。このようにして得られた平均孔径１００ｎｍ、空孔率８５％、膜厚１００μｍ、膜表面平均孔径５０ｎｍ、膜裏面平均孔径４５０ｎｍと平均孔径２０ｎｍ、空孔率８５％、膜厚１００μｍ、膜表面の平均孔径１５ｎｍ、膜裏面平均孔径８０ｎｍの再生セルロース多孔性膜を４７ｍｍ径（有効膜面積１２．５ｃｍ２）の濾過器（アドバンテック東洋（株）製）内に、平均孔径２０ｎｍの平膜の裏面上に直接平均孔径１００ｎｍの平膜の表面を重ねてセットした。濾過に共するタンパク質溶液として、１．０ｗｔ％ウシγグロブリン溶液を使用し、該フィルターを用いて、デッドエンド方式で定速濾過を行った。濾過条件は、濾過速度０．０９ｍｌ／ｍｉｎで定速濾過し、濾過圧が１ｋｇｆ／ｃｍ２を超えた時点を終了とした。結果、濾過時間１２０分、濾過回収液量３．７２ｍｌ、ウシγグロブリンの膜透過率は９７．４％であった。
【実施例２】
【００２２】
実施例１と同様にセットした濾過器を平膜が地面と垂直になるよう置き、実施例１と同様のタンパク質溶液及び濾過条件下で定速濾過を行った。結果、濾過時間３００分（圧力は１ｋｇｆ／ｃｍ２にまで達していなかった）、濾過回収液量２２．５３ｍｌ、ウシγグロブリンの膜透過率は９７．３％であった。
【００２３】
（比較例１）平均孔径１００ｎｍの平膜で濾過して１．０ｗｔ％ウシγグロブリン溶液を作製し、その４５分後に平均孔径２０ｎｍの平膜で実施例１と同様の条件下で定速濾過を行った。結果、濾過時間１００分、濾過回収液量４．３１ｍｌ、ウシγグロブリンの膜透過率は１．５％であった。  
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明は、タンパク質などの生理活性を持つ物質の分離、精製に利用できる。また、コロイド系を取り扱う工業においてコロイド粒子を含めて特定の微粒子を精製、分離する多層構造を持つ多段積多層膜として工業的プロセスに組み込むことができる。特に単位膜面積当たりの処理液量が大きいので、バイオ医薬品製造工程のみでなく、バイオリアクターと連結させて機能性食品の製造工程にも利用できる。