(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）凍結した、又はあらかじめ凍結したヒト胎盤から単離され、微粉砕又は粉砕された羊膜材料の粉末又はこの粉末から抽出された抽出物であって、インター−α−トリプシン阻害剤（ＩαＩ）の重鎖と共有結合することによって架橋され、１０6Ｄａより大きな分子量を有する高分子ヒアルロン酸（ＨＡ）、腫瘍壊死因子活性化遺伝子６（ＴＳＧ−６）、ペントラキシン（ＰＴＸ−３）、および、トロンボスポンジン（ＴＳＰ−１）を含む羊膜組成物と、
ｂ）担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤および賦形剤からなる群から選ばれた化学成分
を含む、創傷治癒に使用するための医薬組成物。
【請求項２】
ＩαＩの重鎖と共有結合することによって架橋された高分子ＨＡ、ＴＳＧ−６、ＰＴＸ−３、および、ＴＳＰ−１の全てが、凍結した、又はあらかじめ凍結したヒト胎盤を得、該胎盤を解凍し、その解凍した胎盤からヒト羊膜材料を単離し、そして、該ヒト羊膜材料を適切なバッファーの中でホモジナイズすることにより、調製されることを特徴とする請求項１記載の創傷治癒に使用するための医薬組成物。
【請求項３】
調製手順がさらに
ｉ）ホモジネートを凍結乾燥すること、又は、
ii）ホモジネートを遠心分離し、その遠心分離したホモジネートから上清を分離すること、
のいずれかを含むことを特徴とする請求項２記載の創傷治癒に使用するための医薬組成物。
【請求項４】
調製手順がさらに該上清を凍結乾燥して粉末にすることを含むことを特徴とする請求項３記載の創傷治癒に使用するための医薬組成物。
【請求項５】
調製手順がさらにヒト羊膜材料を凍結し、該凍結ヒト羊膜材料を粉砕することを含むことを特徴とする請求項１、２のいずれか一項に記載の創傷治癒に使用するための医薬組成物。
【請求項６】
羊膜材料は、ヒト胎盤から抽出された、ヒト羊膜、ヒト羊膜ゼリー、ヒト羊膜間質、またはこれらの組み合わせであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の創傷治癒に使用するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は２００５年９月２７日出願された米国仮出願第６０／７２０，７６０号の利益を主張するものであり、同仮出願の全内容は参照によって本明細書に組み入れられるものとする。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する記載
本発明は、国立衛生研究所から与えられたグラントＮｏ．ＲＯ１  ＥＹ０６８１９に基づく米国政府の支援によってなされたもので、米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は一般的に生物学と医薬分野に関する。特に本発明は、羊膜調製物から見いだすことができる化合物の組み合わせを使用する、細胞生理学的及び病理学的プロセッシングを調節する組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
胎盤は妊娠期間中における胎児の周りを囲む一時的な臓器である。胎盤によって気体や栄養素が輸送され、また他の代謝や内分泌機能がもたらされる。胎盤は数種類の組織により構成される。臍帯は胎盤と胎児をつなげ、これによって酸素が胎児に運ばれる。臍帯には、二本の動脈と一本の静脈がある。ワルトンゼリーという特殊なゼリー状の結合組織物質が臍帯の周りを囲み、胎動及び胎児生育期におけるダメージから胎児を保護する。胎盤の外側の「シェル」は「絨毛膜」として知られている。胎盤のほとんどは、絨毛膜絨毛樹の伸長部である絨毛膜絨毛により構成される。このような構造によって胎児の栄養交換が行われる。羊膜（ＡＭ）は無血管膜嚢であり、羊水で満たされている。この膜が、羊膜腔中の胎児を囲んでいる一番内側に存在する膜である。この組織は上皮層及び下側に隣接する無血管の間質層からなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本明細書は、精製組成物及び羊膜調製物（すなわち、羊膜、羊膜間質及び羊膜ゼリーを含む羊膜材料より調製される組成物）を開示する。ある態様では、精製組成物の少なくとも一成分が羊膜調製物から得られる。また本明細書は、精製組成物の少なくとも一成分がヒト胎盤と絨毛膜から得られる精製組成物を開示する。また本明細書は、上記精製組成物及び調製物のいずれかを調製する方法を開示する。また本明細書は、上記精製組成物及び調製物のいずれかを保管及び保存する方法を開示する。また本明細書は、上記精製組成物及び調製物のいずれかを使用する方法を開示し、例えば、保存方法、細胞培養方法、組織培養方法、治療方法、予防方法、美容方法が挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一つの態様は、
・架橋した高分子ヒアルロン酸（ＨＡ）；
・腫瘍壊死因子活性化遺伝子６（ＴＳＧ−６）；
・ペントラキシン（ＰＴＸ−３）；
・トロンボスポンジン（ＴＳＰ−１）を含む、精製組成物である。
【０００７】
さらなる実施態様では、該精製組成物の構成成分のうち少なくとも一部が、ヒト羊膜、ヒト羊膜ゼリー、ヒト羊膜間質、又はこれらの組み合わせから選択されるヒト羊膜材料から調製される。別の又はさらなる実施態様では、該精製組成物がさらにＳｍａｄ７を含む。該精製組成物のさらなる又は別の実施態様では、ＨＡの架橋がインター−α−トリプシン阻害剤の重鎖への共有結合を含む。該精製組成物のさらなる又は別の実施態様では、ＨＡに対するタンパク質の比が約１００未満である。
【０００８】
該精製組成物のさらなる又は別の実施態様では、該精製組成物の調製方法が
・凍結した、又はあらかじめ凍結したヒト胎盤を得るステップ；
・該胎盤を解凍し、その解凍した胎盤からヒト羊膜材料を単離するステップ；
・該ヒト羊膜材料を適当なバッファーの中でホモジナイズするステップ、を含む。
【０００９】
さらなる又は別の実施態様では、該調製方法がさらに
・該ヒト羊膜材料を凍結するステップ；
・該凍結羊膜材料を粉砕するステップ、を含む。
【００１０】
さらなる又は別の実施態様では、該調製方法がさらに
・該ホモジネートを凍結乾燥するステップ；又は
・該ホモジネートを遠心分離し、その遠心分離したホモジネートから上清を分離するステップ、を含む。
【００１１】
さらなる又は別の実施態様では、該調製方法がさらに
・該上清を凍結乾燥して粉末にするステップ、を含む。
【００１２】
さらなる又は別の実施態様では、該精製組成物が、薬学的に許容される非固体製剤用、又は徐放性固体製剤用担体をさらに含む。
【００１３】
本明細書に記載される他の態様は、有効量の瘢痕形成抑制組成物を、瘢痕形成の抑制を必要としている被験者に提供するステップを含む被験者における瘢痕形成を抑制する方法であって、該瘢痕形成抑制組成物が、ヒト羊膜、ヒト羊膜ゼリー、ヒト羊膜間質、又は羊膜から抽出されたこれらの組み合わせから選択されるヒト羊膜材料から調製される少なくとも一成分を含む方法である。
【００１４】
該方法のさらなる又は別の実施態様では、少なくとも一成分が該ヒト羊膜材料から抽出されたものである。該方法のさらなる又は別の実施態様では、該ヒト羊膜材料が該ヒト羊膜間質である。
【００１５】
該方法のさらなる又は別の実施態様では、該抽出方法が
・凍結した、又はあらかじめ凍結したヒト胎盤を得るステップ；
・該胎盤を解凍し、その解凍した胎盤からヒト羊膜材料を単離するステップ；
・該ヒト羊膜材料を適当なバッファーの中でホモジナイズするステップ；
・必要に応じて、該ホモジネートを凍結乾燥して粉末にするステップ；
・該ホモジネート又は該粉末を薬学的に許容される非固体製剤用、又は徐放性固体製剤用担体と混合するステップ、を含む。
【００１６】
さらなる又は別の実施態様では、該調製方法において、該ホモジネートを凍結乾燥するステップを
・該ホモジネートを遠心分離し、その遠心分離したホモジネートから上清を分離し、必要に応じてその上清を凍結乾燥して粉末にするステップに置き換える。
【００１７】
他の態様は、有効量の瘢痕逆行組成物を、瘢痕を有する被験者に提供するステップを含む被験者における瘢痕形成を逆行させる方法であって、該瘢痕逆行組成物が、ヒト羊膜、ヒト羊膜ゼリー、ヒト羊膜間質、又は羊膜から抽出されたこれらの組み合わせから選択されるヒト羊膜材料から調製される少なくとも一成分を含む方法である。この方法における他の又はさらなる実施態様では、少なくとも一成分が該ヒト羊膜材料から抽出されたものである。この方法における他の又はさらなる実施態様では、該ヒト羊膜材料が該ヒト羊膜間質である。
【００１８】
この方法における他の又はさらなる実施態様では、該抽出方法が
・凍結した、又はあらかじめ凍結したヒト胎盤を得るステップ；
・該胎盤を解凍し、その解凍した胎盤からヒト羊膜材料を単離するステップ；
・該ヒト羊膜材料を適当なバッファーの中でホモジナイズするステップ；
・必要に応じて、該ホモジネートを凍結乾燥して粉末にするステップ；
・該ホモジネート又は該粉末を薬学的に許容される非固体製剤用、又は徐放性固体製剤用担体と混合するステップ、を含む。
【００１９】
他の又はさらなる実施態様では、該調製方法において、該ホモジネートを凍結乾燥するステップを
・該ホモジネートを遠心分離し、その遠心分離したホモジネートから上清を分離し、必要に応じてその上清を凍結乾燥して粉末にするステップに置き換える。
【００２０】
本明細書に記載される他の態様は、有効量の血管新生抑制組成物を、血管新生の抑制を必要としている被験者に提供するステップを含む被験者における血管新生を抑制する方法であって、該血管新生抑制組成物が、ヒト羊膜、ヒト羊膜ゼリー、ヒト羊膜間質、又は羊膜から抽出されたこれらの組み合わせから選択されるヒト羊膜材料から調製される少なくとも一成分を含む方法である。
【００２１】
この方法における他の又はさらなる実施態様では、少なくとも一成分が該ヒト羊膜材料から抽出されたものである。この方法における他の又はさらなる実施態様では、該ヒト羊膜材料が該ヒト羊膜間質である。
【００２２】
この方法における他の又はさらなる実施態様では、該組成物が、
・架橋した高分子ヒアルロン酸（ＨＡ）；
・腫瘍壊死因子活性化遺伝子６（ＴＳＧ−６）；
・ペントラキシン（ＰＴＸ−３）；
・トロンボスポンジン（ＴＳＰ−１）を含む。
【００２３】
この方法における他の又はさらなる実施態様では、該抽出方法が
・凍結した、又はあらかじめ凍結したヒト胎盤を得るステップ；
・該胎盤を解凍し、その解凍した胎盤からヒト羊膜材料を単離するステップ；
・該ヒト羊膜材料を適当なバッファーの中でホモジナイズするステップ；
・必要に応じて、該ホモジネートを凍結乾燥して粉末にするステップ；
・該ホモジネート又は該粉末を薬学的に許容される非固体製剤用、又は徐放性固体製剤用担体と混合するステップ、を含む。
【００２４】
この方法における他の又はさらなる実施態様では、該調製方法において、該ホモジネートを凍結乾燥するステップを
・該ホモジネートを遠心分離し、その遠心分離したホモジネートから上清を分離し、必要に応じてその上清を凍結乾燥して粉末にするステップに置き換える。
【００２５】
この方法における他の又はさらなる実施態様では、血管新生の抑制を必要としている該被験者が癌患者である。この方法における他の又はさらなる実施態様では、血管新生の抑制を必要としている該被験者が加齢黄斑変性症患者である。
【００２６】
この方法における他の又はさらなる実施態様では、該血管新生抑制組成物が、非固体製剤又は徐放性固体製剤として提供される。
【００２７】
この方法における他の又はさらなる実施態様では、該血管新生抑制組成物が以下の性質を有する：
・血管形成に関与する内皮細胞のアポトーシスを引き起こす；
・血管形成に関与する内皮細胞の遊走を抑制する；
・血管形成に関与する内皮細胞の管腔形成を抑制する。
【００２８】
有効量の炎症抑制組成物を、炎症の抑制又は予防を必要としている被験者に提供するステップを含む被験者における炎症を抑制又は予防する方法であって、該炎症抑制組成物が、ヒト羊膜、ヒト羊膜ゼリー、ヒト羊膜間質、又は羊膜から抽出されたこれらの組み合わせから選択されるヒト羊膜材料から調製される少なくとも一成分を含む方法。
【００２９】
この方法における他の又はさらなる実施態様では、少なくとも一成分が該ヒト羊膜材料から抽出されたものである。この方法における他の又はさらなる実施態様では、該ヒト羊膜材料が該ヒト羊膜間質である。
【００３０】
この方法における他の又はさらなる実施態様では、該組成物が、
・架橋した高分子ヒアルロン酸（ＨＡ）；
・腫瘍壊死因子活性化遺伝子６（ＴＳＧ−６）；
・ペントラキシン（ＰＴＸ−３）；
・トロンボスポンジン（ＴＳＰ−１）を含む。
【００３１】
この方法における他の又はさらなる実施態様では、該抽出方法が
・凍結した、又はあらかじめ凍結したヒト胎盤を得るステップ；
・該胎盤を解凍し、その解凍した胎盤からヒト羊膜材料を単離するステップ；
・該ヒト羊膜材料を適当なバッファーの中でホモジナイズするステップ；
・必要に応じて、該ホモジネートを凍結乾燥して粉末にするステップ；
・該ホモジネート又は該粉末を薬学的に許容される非固体製剤用、又は徐放性固体製剤用担体と混合するステップ、を含む。
【００３２】
この方法における他の又はさらなる実施態様では、該調製方法において、該ホモジネートを凍結乾燥するステップを
・該ホモジネートを遠心分離し、その遠心分離したホモジネートから上清を分離し、必要に応じてその上清を凍結乾燥して粉末にするステップに置き換える。
【００３３】
この方法における他の又はさらなる実施態様では、該ヒトが関節炎を患っている。この方法における他の又はさらなる実施態様では、該ヒトが少なくとも片方の目に炎症を患っている。この方法における他の又はさらなる実施態様では、該炎症抑制組成物が、非固体製剤又は徐放性固体製剤として提供される。
【００３４】
この方法における他の又はさらなる実施態様では、該炎症抑制組成物が少なくとも以下の二つの性質を有する：
・炎症部位におけるマクロファージのアポトーシスを引き起こす；
・炎症部位におけるプロスタグランジンＥ１に対するプロスタグランジンＤ２の比を増加させる；
・炎症部位におけるＴＧＦ−β１活性を抑制する；又は
・炎症部位におけるインターフェロン−γシグナル伝達を阻害する。
【００３５】
各種ＡＭ調製物が、哺乳動物細胞と無処理の哺乳動物組織において、多くの生理学的に有意な効果を発現する。そのような効果としては、ＴＧＦ−βシグナル伝達の抑制、マクロファージのアポトーシスの増加、血管内皮細胞の増殖の減少、遊走の減少とアポトーシスの増加、保存やディスパーゼ処理により引き起こされる、角膜と角膜縁の上皮細胞及び角膜実質細胞のアポトーシスからの保護、組織における炎症の抑制が挙げられる。無処理ＡＭ片の他に、本明細書に記載される他の調製物としては、ＡＭ間質片、加工された（例えば、粉砕、微粉砕）ＡＭやＡＭ間質、及び無処理ＡＭ及びＡＭ間質の様々な抽出物が挙げられる。ＡＭ抽出物は液状でも凍結乾燥による粉末状でもよい。
【００３６】
また、該組成物としては、ＡＭ抽出物と一種以上の追加の基質成分（ＥＣＭ）のような増粘剤を混合して作ることができる、粘性を高めた、又はゲル状のＡＭ抽出物が挙げられる。数多くのＥＣＭ成分が知られており、例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸（ＨＡ）及びフィブリンが挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本明細書に記載のものに類似のあるいは同等の調製物、材料及び方法は、本発明の実施又は試験に際して使用することができるが、適切な調製物、方法及び材料をここに記載する。本明細書に記載されているすべての出版物の全内容は参照によって本明細書に組み入れられるものとする。争いが生じた場合には、定義を含む本明細書を基準とする。また、以下に示す具体的な実施の形態は、単なる説明のためのものにすぎず、発明を制限するためのものではない。
【００３８】
定義
処方、組成物又は成分に関する本明細書において使用される用語「許容される」は、治療される被験者の全般的健康に対して、持続的有害な影響を及ぼさないことを意味する。
【００３９】
「抗酸化剤」としては、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、トコフェロールが挙げられる。ある態様では、必要に応じて、抗酸化剤が化学安定性を高める。
【００４０】
「結合剤」は粘着性を与えるものであり、例えば、アルギン酸及びその塩；カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース（例えば、メトセル（登録商標））、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、クルセル（登録商標））、エチルセルロース（例えば、エトセル（登録商標））及び微結晶性セルロース（例えば、アビセル（Ａｖｉｃｅｌ、登録商標））などのセルロース誘導体；微結晶性デキストロース；アミロース；ケイ酸アルミニウムマグネシウム；多糖酸；ベントナイト；ゼラチン；ポリビニルピロリドン／ビニル酢酸共重合体；クロスポビドン；ポビドン；デンプン；アルファ化デンプン；トラガント；デキストリン；スクロース（例えば、Ｄｉｐａｃ（登録商標））、グルコース、デキストロース、モラセス、マンニトール、ソルビトール、キシリトール（例えば、キシリタブ（Ｘｙｌｉｔａｂ、登録商標））及びラクトースなどの糖類；アカシア、トラガント、ガティゴム、イサポール皮の粘液、ポリビニルピロリドン（例えば、ポリビドン（登録商標）、ＣＬ，Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）、ＣＬ，Ｐｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）、ＸＬ−１０）、カラマツ（ｌａｒｃｈ  ａｒａｂｏｇａｌａｃｔａｎ）、ビ−ゴム（Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標）などの天然又は合成ゴム；ポリエチレングリコール、ワックス類、アルギン酸ナトリウム、などが挙げられる。
【００４１】
本明細書において使用される用語「担体」とは、化合物の細胞内又は組織内への取り込みを促進する比較的無毒性の化合物質又は化学剤のことをいう。
【００４２】
「担体物質」には、一般的に医薬品に使用されるあらゆる賦形剤が含まれ、本明細書に開示される化合物との適合性及び目的の剤形の放出プロファイル特性に基づいて選ぶべきである。一般的な担体物質としては、例えば、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、潤滑剤、湿潤剤、希釈剤などが挙げられる。「医薬的に適合できる担体物質」としては、これに限定されないが、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル、カゼイン酸ナトリウム、大豆レシチン、タウロコール酸、ホスファチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、セルロース、セルロース複合体、糖類、ステアロイル乳酸ナトリウム、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファ化デンプンなどが挙げられる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  １９９９）参照。
【００４３】
本明細書において使用される用語「同時投与」などは、選択した複数の治療剤を一人の患者に投与することを含み、複数の治療剤を同じ又は異なる投与経路によって、あるいは同時に又は異なる時間に投与する治療レジメンを含む。
【００４４】
本明細書において使用される用語「遅延放出」とは、放出が、ある一般的に予測可能な場所であって、遅延放出の変化がなかったならば達成したであろう場所よりも遠位である場所において達成できるような配送のことをいう。
【００４５】
「分散剤」及び／又は「粘度調節剤」は、液状媒体又は粒状化方法もしくはブレンド方法によって薬剤の拡散と均一性をコントロールする物質を含む。ある態様では、これらの薬剤は基質をコーティング又は浸食する有効性も促進する。一般的な拡散促進剤／分散剤としては、例えば、親水性ポリマー、電解質、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０又は８０、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ；プラスドン（登録商標）が市販品として知られている）、及び、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、ＨＰＣ、ＨＰＣ−ＳＬ及びＨＰＣ−Ｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば、ＨＰＭＣ  Ｋ１００、ＨＰＭＣ  Ｋ４Ｍ、ＨＰＭＣ  Ｋ１５Ｍ及びＨＰＭＣ  Ｋ１００Ｍ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート（ＨＰＭＣＡＳ）、非結晶セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ビニルピロリドン／ビニル酢酸共重合体（Ｓ６３０）、エチレンオキシド付加４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノールポリマー、ホルムアルデヒド（チロキサポールとしても知られる）、ポロキサマー（例えば、プルロニックＦ６８（登録商標）、Ｆ８８（登録商標）及びＦ１０８（登録商標）があり、これらはエチレンオキサイドとプロピレンオキサイドとのブロックコポリマー）などの炭水化物型分散剤；ポロキサミン（例えば、テトロニック９０８（登録商標）、ポロキサミン９０８（登録商標）としても知られている。これはプロピレンオキサイド及びエチレンオキサイドをエチレンジアミン（ＢＡＳＦ社、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ニュージャージー州）に順次的に付加することによって得られる四官能性ブロックコポリマーである）、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、又はポリビニルピロリドンＫ３０、ポリビニルピロリドン／ビニル酢酸共重合体（Ｓ−６３０）、ポリエチレングリコール、（例えば、このポリエチレングリコールは、分子量が約３００〜約６０００でもよく、約３３５０〜約４０００でもよく、あるいは約７０００〜約５４００でもよい）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリソルベート−８０、アルギン酸ナトリウム、ゴム（例えば、トラガカントゴム、アカシアゴム、グアーゴム、キサンタン（キサンタンゴムを含む）など）、糖類、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）、ポリソルベート−８０、アルギン酸ナトリウム、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポビドン、カルボマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アルギン酸塩、キトサン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。セルロースやトリエチルセルロースなどの可塑剤も分散剤として使用できる。分散剤は、特にリポソーム型分散液に有用であり、また自己乳化型分散液としては、ジミリストイル���スファチジルコリン、卵由来天然ホスファチジルコリン、卵由来天然ホスファチジルグリセロール、コレステロール、イソプロピルミリステートが挙げられる。
【００４６】
用語「希釈剤」とは、目的の化合物を、配送に先だって希釈するために使用される化学物質のことをいう。また、希釈剤はより安定した環境を提供することができるので、化合物を安定化するために使用することもできる。当技術分野では、緩衝化した溶液（これはｐＨコントロール又は維持も提供することができる）に溶解した塩が希釈剤として利用され、これに限定されないが、リン酸緩衝食塩水が挙げられる。ある態様では、圧縮を容易にするために、又はカプセル充填において均一にブレンドするのに十分な容量を付与するために、希釈剤を用いて化合物の容量を増加させる。このような化合物としは、例えば、ラクトース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、アビセル（Ａｖｉｃｅｌ、登録商標）などの微結晶性セルロース、第二リン酸カルシウム、第二リン酸カルシウム二水和物、リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム；無水ラクトース、噴霧乾燥ラクトース；アルファ化デンプン、Ｄｉ−ｐａｃ（（登録商標）、Ａｍｓｔａｒ）などの圧縮性糖、マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート、スクロース型希釈剤、粉砂糖、第一硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物、乳酸カルシウム三水和物、デキストレート（ｄｅｘｔｒａｔｅ）、固形加水分解シリアル、アミロース、粉末セルロース、炭酸カルシウム、グリシン、カオリン、マンニトール、塩化ナトリウム、イノシトール、ベントナイトなどが挙げられる。
【００４７】
「腸溶コーティング」とは、胃中では実質的に元の状態のままであり、小腸又は結腸の中で薬剤が溶解し放出される物質のことをいう。一般的には、腸溶コーティングは低いｐＨ環境である胃中での放出を抑制し、それより高いｐＨ、一般的にはｐＨ６〜７ではイオン化し、その結果、小腸又は結腸中において十分に溶解し、そこで活性薬剤を放出するポリマー物質からなる。
【００４８】
「充填剤」としては、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、微結晶性セルロース、粉末セルロース、デキストロース、デキストレート、デキストラン、デンプン、アルファ化デンプン、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコールなどの化合物が挙げられる。
【００４９】
本明細書において使用される用語「有効量」又は「治療的有効量」とは、治療される疾患又は異常の一つ以上の症状をある程度軽減する、投与される薬剤又は化合物の十分な量のことをいう。その効果は、疾患の徴候、症状又は原因の軽減及び／又は緩和、あるいは生物学的システムにおける他の所望の変更でもよい。例えば、治療のために使用する「有効量」とは、過度の副作用を引き起こすことなく疾患の症状について臨床的意義のある減少をもたらすのに必要な、本明細書に開示される化合物を含む組成物の量のことをいう。任意の個々の場合における適切な「有効量」は、用量漸増試験などの技術を用いて決定することができる。用語「治療的有効量」には、例えば予防的有効量が含まれる。本明細書に開示される化合物の「有効量」は、過度の副作用を引き起こすことなく所望の薬理学的効果又は治療的改善を達成するのに有効な量である。なお、当然のことながら「有効量」又は「治療的有効量」は、被験者の該組成物の代謝におけるばらつき、年齢、体重、全身状態、治療される症状、治療される症状の重症度、及び処方医師の判断により被験者ごとに異なりうる。
【００５０】
本明細書において使用される用語「増強する」又は「増強」とは、所望の効果の作用強度又は作用時間を増加させる、もしくは引き伸ばすことを意味する。従って、治療剤の効果の増強についての、用語「増強」とは、他の治療剤のシステムに対する効果の作用強度又は作用時間を増加させる、もしくは引き伸ばす能力のことをいう。本明細書において使用される「増強有効量」とは、目的とするシステムにおける他の治療剤の効果を増強するための適切な量のことをいう。
【００５１】
用語「キット」及び「製造品」は同義語として用いられる。
【００５２】
本明細書において使用される用語「調節する」とは、目的物の活性を変えるように、直接的又は間接的に目的物と相互に作用することを意味する。例えば、例示のためだけであるが、目的物の活性を増強すること、目的物の活性を阻害すること、目的物の活性を制限すること、目的物の活性を延長することが挙げられる。
【００５３】
本明細書において使用される用語「調節物質」とは、分子の活性を変える化合物のことをいう。例えば、調節物質は、分子のある活性の大きさを、この調節物質がない場合の活性の大きさと比べて、増加させたり減少させたりすることができる。ある態様では、調節物質は分子の一つ以上の活性の大きさを減少させる阻害物質である。ある態様では、阻害物質が分子の一つ以上の活性を完全に阻止する。ある態様では、調節物質は分子の少なくとも一つの活性の大きさを増加させる活性化物質である。ある態様では、調節物質が存在することにより、その調節物質が存在しない場合には生じなかった活性が生じる。
【００５４】
用語「非水溶性希釈剤」とは、一般的に医薬品の処方において使用される化合物を意味し、例えば、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、デンプン、変性デンプン及び微結晶性セルロース、マイクロセルロース（例えば、約０．４５ｇ／ｃｍ3の密度を有するものあり、例えば、アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）、粉末セルロースが挙げられる）、タルクが挙げられる。
【００５５】
本明細書において使用される「薬学的に許容される」という用語によって、該化合物の生物学的活性又は性質を抑制しない、かつ比較的無毒性、すなわち望ましくない生物学的作用を引き起こさない、又はその物質が含まれている組成物の成分と悪影響を及ぼすように相互作用することなく、その物質を個人に投与することができる担体又は希釈剤のような物質のことをいう。
【００５６】
本明細書において使用される用語「医薬的組み合わせ」とは、一つを超える有効成分を混合又は組み合わせることにより製造される製品のことを意味し、複数の有効成分の固定の組み合わせと非固定の組み合わせの両方を含む。用語「固定の組み合わせ」とは、複数の有効成分、例えば本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物、及び併用剤を、単一の実体あるいは製剤として両者を同時に患者に投与することを意味する。用語「非固定の組み合わせ」とは、複数の有効成分、例えば本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物、及び併用剤を別々の実体として同時に、一斉に、あるいは順次的に、特定の時間間隔限度を設けずに、患者に投与することを意味し、このような投与により患者の体内における二つの化合物の有効濃度が提供される。また、後者の投与は、カクテル治療（例えば、三つ以上の有効成分の投与）にも適用される。
【００５７】
「可塑剤」とは、マイクロカプセル封入物質又はフィルムコートを柔らかくして壊れににくくするために使用される化合物のことをいう。適切な可塑剤としては、例えば、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３３５０及びＰＥＧ８００などのポリエチレングリコール、ステアリン酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロース、トリアセチンが挙げられる。ある態様では、可塑剤は分散剤や湿潤剤としても機能することができる。
【００５８】
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」とは、完全長のポリペプチド、又はポリペプチドのフラグメント又はセグメントのことを意味し、また完全長のポリペプチドのうち少なくとも約８個のアミノ酸残基、一般的には少なくとも１０個のアミノ酸残基、より一般的には少なくとも２０個のアミノ酸残基、頻繁には少なくとも３０個のアミノ酸残基、より頻繁には少なくとも５０個のアミノ酸残基あるいはそれ以上のアミノ酸残基からなる配列を包含する。
【００５９】
「可溶化剤」としては、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ドキュセートナトリウム、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ｎ−ブタノール、イソプロピルアルコール、コレステロール、胆汁酸塩、ポリエチレングリコール２００〜６００、グリコフロール、トランスクトール、プロピレングリコール、ジメチルイソソルバイドなどの化合物が挙げられる。
【００６０】
「安定化剤」としては、抗酸化剤、緩衝剤、酸、防腐剤などの化合物が挙げられる。
【００６１】
生物学的物質、羊膜の文脈、及び／又はタンパク質の文脈において使用される「実質的に純粋な」又は「精製した」とは、一般的に、混入している他のタンパク質、核酸、起源生物由来の他の生物学的物質からその物質を単離することを意味する。純度又は「単離」は、常法により測定することができ、通常は少なくとも約１０％純粋であり、より通常には少なくとも約２０％純粋であり、一般的には少なくとも約３０％純粋であり、より一般的には少なくとも約４０％純粋であり；さらに別の態様では、少なくとも約５０％純粋であり、より頻繁には少なくとも約６０％純粋であり；さらに別の態様では、少なくとも約９５％純粋である。
【００６２】
「懸濁剤」としては、ポリビニルピロリドン（例えば、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、ポリビニルピロリドンＫ３０など）、ビニルピロリドン／ビニル酢酸共重合体（Ｓ６３０）、ポリエチレングリコール、（例えば、このポリエチレングリコールは、分子量が約３００〜約６０００でもよく、約３３５０〜約４０００でもよく、あるいは約７０００〜約５４００でもよい）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースアセテートステアレート、ポリソルベート−８０、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ゴム（例えば、トラガカントゴム、アカシアゴム、グアーゴム、キサンタン（キサンタンゴムを含む）など）、糖類、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなど）、ポリソルベート−８０、アルギン酸ナトリウム、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポビドンなどの化合物を挙げることができる。
【００６３】
「界面活性剤」としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ドキュセートナトリウム、Ｔｗｅｅｎ６０又は８０、トリアセチン、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート、ポロクサマー、胆汁酸塩、モノステアリン酸グリセリン、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドとの共重合体（例えば、プルロニック（登録商標、ＢＡＳＦ））などの化合物が挙げられる。その他の界面活性剤としては、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリド及び植物油（例えば、ポリオキシエチレン（６０）硬化ヒマシ油）；ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びアルキルフェニルエーテル（例えば、オクトキシノール１０、オクトキシノール４０）が挙げられる。ある態様では、物理的安定性を増強するために、あるいは他の目的で界面活性剤を含むことができる。
【００６４】
本明細書において使用される用語「被験者」とは、動物、好ましくはヒトを含む哺乳動物を意味する。患者及び被験者という用語は、同じ意味で使うことができる。
【００６５】
本明細書において使用される用語「治療する」、「治療すること」又は「治療」には、疾患又は異常の症状の緩和、寛解又は回復、随伴症状の予防、潜在的な代謝性原因による症状の寛解又は予防、疾患又は異常の抑制（例えば、疾患又は異常の発症の阻止、疾患又は異常の緩和、疾患又は異常の軽減の惹起、疾患又は異常により引き起こされる異常の緩和、あるいは疾患又は異常の症状の予防的及び／又は治療的阻止）が含まれる。
【００６６】
「湿潤剤」としては、オレイン酸、モノステアリン酸グリセリン、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ドキュセートナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ドキュセートナトリウム、トリアセチン、Ｔｗｅｅｎ８０、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、アンモニウム塩などの化合物が挙げられる。
【００６７】
本明細書において記載されるすべての出版物や特許出願は、それぞれ個々の出版物又は特許出願が引用により組込まれていることを特異的且つ個々に示されているかのように、引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【００６８】
本発明の新規の特徴は、特に添付の特許請求の範囲において説明される。本発明の特徴及び効果は、以下に記載の、本発明の原理を利用する実施の形態を説明する詳細な記述及び添付図面を参照することによりさらに理解されるであろう。
【００６９】
組成物
本明細書に記載されているのは、哺乳動物細胞及び無処理の哺乳動物組織において、多くの生理学的に有意な効果を発現する精製組成物である。該精製組成物は、少なくとも以下の４つの構成成分を含む。
・架橋した高分子ヒアルロン酸（ＨＡ）；
・腫瘍壊死因子活性化遺伝子６（ＴＳＧ−６）；
・ペントラキシン（ＰＴＸ−３）；
・トロンボスポンジン（ＴＳＰ−１）
【００７０】
これらの４つの構成成分を有する精製組成物には、さらに追加の構成成分を含むことができ、例えばＳｍａｄ７が挙げられる。
【００７１】
本明細書に記載の該精製組成物における任意の又はすべての構成成分は、（本明細書に記載されているような）ヒト羊膜ゼリー調製物と抽出物、（本明細書に記載されているような）ヒト羊膜調製物と抽出物、（本明細書に記載されているような）ヒト羊膜間質調製物と抽出物を含むヒト羊膜材料から調製することができる。
【００７２】
まとめると、これらの４つの構成成分（Ｓｍａｄ７の有無にかかわらず）は、ＴＧＦ−βプロモーター活性を抑制することができる。例えば、マクロファージのアポトーシスの増加；ヒト血管内皮細胞の増殖の減少、遊走の減少、アポトーシスの増加；ヒト線維芽細胞の生存率の減少、炎症の抑制；保存や傷害にさらされる上皮細胞のアポトーシスの抑制が挙げられる。
【００７３】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は天然の糖であり、滑膜・関節液、眼の硝子体液、軟骨、血管、細胞外基質、皮膚及び臍帯中に含まれている。ＨＡの架橋は、タンパク質のような他の分子と共有結合することにより達成することができる。例えば、ＨＡは、インター−α−トリプシン阻害剤の重鎖に共有結合することができる。本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物中のＨＡに対するタンパク質の割合は、約２００：１未満、約１００：１未満、約５０：１未満、あるいは約１０：１未満でありうる。
【００７４】
ＴＳＧ−６は、細胞外基質再構築、細胞増殖、白血球遊走に関与するヒアルロン酸結合タンパク質である。ＴＳＧ−６は、セリンプロテアーゼ阻害剤、インター−α−阻害剤と共に複合体を形成することができる。ＰＴＸ−３（ペントラキシン）は５量体の円盤状構造を持ち、血漿中に存在するＣａ2+依存性リガンド結合タンパク質である。ＴＳＰ−１（トロンボスポンジンＩ）は、強力な血管新生阻害活性を有しかつ他の生物学的活性を有するホモ三量体の糖タンパク質である。ＴＳＰ−１は、各種細胞により細胞外基質に分泌される。
【００７５】
これらの構成成分は、任意の適切なソースから得ることができる。例えば、その構成成分のうち少なくとも一つは、ヒトの組織、例えば羊膜、羊膜ゼリー、羊膜間質、又はこれらの組み合わせなどから得ることができる。その構成成分のうち少なくとも一つは、市販品から得ることができる。それらの構成成分のうち少なくとも一つは、形質転換体から単離することができる。そのタンパク質の配列は、ヒトのタンパク質の配列と少なくとも９０％、９３％、９５％、９７％、９９％又は９９．５％の類似性を有する。この構成成分は、精製、実質的に精製、又は部分的に精製されていてもよく、あるいは未精製抽出物中に存在していてもよい。また、この４つの構成成分は、それぞれ羊膜組織中に存在するので、哺乳動物の羊膜組織から調製してもよい。
【００７６】
他の態様では、タンパク質Ｓｍａｄ７も該組成物に含まれている。Ｓｍａｄ７は、任意の適切なソース、例えば、羊膜、市販品、形質転換体からの単離物質から得ることができる。このＳｍａｄ７タンパク質は、精製、実質的に精製、又は部分的に精製されていてもよく、あるいは、未精製抽出物中に存在していてもよい。
【００７７】
羊膜由来ＡＭ調製物
ある態様では、ＨＡ、ＴＳＧ−６、ＰＴＸ−３、ＴＳＰ−１、必要ならばＳｍａｄ７、の構成成分のうち少なくとも一つは羊膜の調製物から得ることができる。あるいは、ＨＡ、ＴＳＧ−６、ＰＴＸ−３、ＴＳＰ−１、必要ならばＳｍａｄ７、の組み合わせを含む、未精製の羊膜調製物を調製することができる。各種ＡＭ調製物の典型的な調製方法は本明細書に記載されている。
【００７８】
ヒト胎盤材料は、例えば、Ｂｉｏ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｃ．（マイアミ、フロリダ州）及びＢａｐｔｉｓｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（マイアミ、フロリダ州）（ＩＲＢ承認を受けて）のようなソースから得ることができる。組織は一般的に生の状態か凍結の状態で得られる。組織は、余分な保存緩衝液、血液、あるいは混入物質を除去するために洗浄する。余分な液体は、例えば、短時間の遠心分離ステップ、あるいは他の方法により除去する。組織は、次のホモジナイズ処理を容易にするために、例えば、液体窒素や他の冷却方法により凍結してもよい。ＡＭ組織のソースはヒトとすることができる。しかし、他のソースのＡＭ組織、例えば、ウシ又はブタのＡＭ組織なども使用することができる。
【００７９】
該組成物を調製するためにＡＭを使用することができる。ＡＭ調製物は、無処理のＡＭ、ＡＭ間質基質、ＨＡ、ＡＭゼリーから精製又は抽出した成分又は一部、インター−α−トリプシン阻害剤（ＨＡ−ＩＴＩ）を含んでもよい。必要ならば、ＡＭ調製物のある成分をステップ中任意の時間にその調製物から単離してもよい。例えば、特定のタンパク質あるいはＡＭタンパク質のセットを多く含む抽出物を該調製物から単離してもよい。組織のホモジナイズ処理後、大きい粒子を分離して除いてもよいし、調製物中に残したままにしてもよい。この調製物は必要ならば乾燥してもよい。典型的な調製方法は実施例１に記載される。
【００８０】
該組成物はＡＭゼリーからも得ることができる。ＡＭゼリーは生のＡＭ組織から得ることができ、また凍結ステップ前又は後に得ることもできる。ＡＭゼリーは凍結することができ、本明細書に記載されているように、ＡＭ調製物の調製手順に従って凍結粉砕することもできる。このゼリーは遠心分離してもよいし、凍結乾燥してもよい。
【００８１】
他の態様では、実質的に間質層から製造した組成物を調製する。この組成物を調製するために、間質層を、生、凍結、解凍、あるいは他の方法で処理されたＡＭ膜から分離する。間質は、例えば、酵素的方法、機械的方法、あるいは他の方法によって取り出すことができる。間質層材料は、生の状態か凍結状態でありうる。間質材料は、本明細書に記載されているようなＡＭ調製物の調製手順に従って粉砕又は凍結粉砕することができる。必要ならば、間質基質材料は遠心分離してもよいし、凍結乾燥してもよい。
【００８２】
組織は粉砕ステップの前に凍結してもよい。凍結ステップは任意の適切な冷却方法を用いて行うことができる。例えば、液体窒素を用いて組織を瞬間凍結することができる。あるいは、その材料をイソプロパノール／ドライアイス浴に入れることもできるし、他の冷却材を用いて瞬間凍結することもできる。市販の迅速凍結方法を用いることができる。さらに、その材料を冷凍庫に入れ、瞬間凍結ではなく、よりゆっくりと保存温度と平衡になるようにすることもできる。組織は任意の所望の温度で保存することができる。例えば、−２０℃又は−８０℃又は他の温度を保存温度として使用できる。
【００８３】
凍結する前に組織を粉砕するよりも、凍結したまま組織を微粉砕することが、組織の調製方法における一つの選択肢である。あるいは、生の組織、一部解凍した組織、又は解凍した組織を用いて粉砕ステップをすることができる。次に組織（生、凍結、又は解凍の状態）は、適切な用具、例えば外科用メスなどを用いて、所望の大きさの小片にスライスし、次いで、バイオパルベライザー（ＢｉｏＰｕｌｖｅｒｉｚｅｒ）（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，オクラホマ州）又は他の適切な装置を用いて微粒子になるように粉砕し、次いで、ホモジナイザー、例えばＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅａｒｏｒ（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｒｅｍｅｌ，ウィスコンシン州）などを用いて適切な溶液の中でホモジナイズする。代表的な溶液としては、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ＤＭＥＭ、ＮａＣｌ溶液及び水が挙げられるが、これに限定されない。溶液のｐＨは必要に応じて調整する。ある態様では、ｐＨ範囲は約５．５又は６．０〜約８．５である。ある態様では、凍結組織をｐＨが約６．３、約６．６又は約７．０〜約７．４、約７．６又は約７．８である溶液の中で粉砕する。
【００８４】
任意の適切な緩衝液又は液体を用いて製剤を調製することができる。実施例２では、調製物中の全タンパク質含有量及びＨＡに対して、各種抽出緩衝液（高塩濃度、低塩濃度、ＰＢＳなど）の使用について試験を行っている（表Ｘ）。実施例２では、いくつかの抽出方法を用いて、特定のタンパク質、ＴＳＧ−６（図１４）、ＰＴＸ−３（図１８）、ＴＳＰ−１（図１９）、Ｓｍａｄ７（図２０）の濃度について、さらに試験を行っている。
【００８５】
その後、ホモジネートを任意の適切な速度、温度、又は他のパラメータにて混合することができる。混合は、例えば、約１℃又は３℃〜約６℃、１０℃、１５℃又は２０℃の温度範囲で行うことができる。ある態様では、混合を約４℃で行う。ホモジネートの混合は、例えば、約１分未満、１０分、又は２０分〜約１、２、３時間、あるいはそれ以上行うことができる。
【００８６】
その後必要ならば、ホモジネートは遠心分離をして、任意の残存する大きい粒子を取り除くことができる。遠心分離は、必要に応じて、適切な時間、温度、タンパク質濃度、緩衝液、速度範囲を用いて行うことができる。遠心分離は、例えば、約１，０００、５，０００又は１０，０００ｘｇ〜約２０，０００ｘｇの範囲で行うことができる。ある態様では、遠心分離を約１５，０００ｘｇにて行う。遠心分離は、１分未満、５分、１０分、又は２０分〜約４０分、６０分、１．５時間、あるいはそれ以上の持続時間にて行うことができる。その後、上清を回収し、アリコットに分割して−８０℃で保管することができる。必要ならば、全タンパク質は、例えばＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，イリノイ州）などの任意の適切な市販のタンパク質分析キットを用いて定量することができる。実施例２、表Ｘ、図１３は、低速又は高速遠心分離後のＡＭ調製物の分析について記述する。
【００８７】
生化学的特徴づけと精製のために、上記の溶液には、プロテアーゼ阻害剤を添加することができる。プロテアーゼ阻害剤の典型的な配合物を以下に示す：１μｇ／ｍｌのアプロチニン、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、１μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ。しかし、一般的には、調製物を生細胞や生組織に添加する場合は、プロテアーゼ阻害剤は調製物に添加しない。
【００８８】
特定の成分又はタンパク質の存在を確認するために、製剤を試験することができる。例えば、これに限定されないが、ＨＡ、ＴＳＧ−６、ＰＴＸ−３、ＴＳＰ−１、Ｓｍａｄ７などの分子の存在について、製剤を試験することができる。また、調製ステップ中の任意の時点で病原体が存在しないことを確認するために、製剤を試験することもできる。
【００８９】
ＡＭ調製物は液体、懸濁液、凍結乾燥粉末（例えば、粉砕又は微粉砕状態）又は他の形状でありうる。例えば抗生物質や抗真菌剤のような抗菌剤を添加してもよい。組成物を安定化及び／又は保存するために、その組成物に他の物質を添加してもよい。該組成物は包装し、使用前に、例えば室温で保管してもよく、あるいは、例えば−２０℃や−８０℃で保管してもよい。
【００９０】
ある態様では、調製物は乾燥粉末製剤として存在する。乾燥粉末製剤は、より小さい容量で保管することができ、また、時間経過による分解から製剤を守るための同程度の低温度保管条件は必要でない。乾燥粉末製剤は、保管し、使用前に再構成すればよい。乾燥粉末製剤は、例えば、本明細書に記載されているような凍結粉砕ＡＭ組織を調製し、次いで組成物中の少なくとも水分を除去することにより調製することができる。過剰水は、任意の適切な方法により調製物から除去することができる。典型的な水の除去方法としては、市販の凍結乾燥機やフリーズドライヤーを用いた凍結乾燥の利用が挙げられる。適切な装置としては、例えば、Ｖｉｒｔｉｓ，Ｇａｒｄｉｎｅｒ，ニューヨーク州；ＦＴＳシステム，Ｓｔｏｎｅ  Ｒｉｄｇｅ，ニューヨーク州；Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ（Ｓａｖａｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ニューヨーク州）が挙げられる。除去される水分量は、約５％、１０％、２０％又は３０％〜約６０、７０、８０、９０、９５又は９９％、あるいはそれ以上である。ある態様では、実質的にすべての過剰水を除去する。その後、凍結乾燥した粉末を保管する。保管温度は、約−１９６℃未満、−８０℃、−５０℃又は−２０℃〜約２３℃を超える温度、と様々である。必要ならば、粉末を保管する前に特徴付けてもよい（重量、タンパク質含有量など）。
【００９１】
凍結乾燥した粉末は、使用前に適切な溶液又は緩衝液を用いて再構成することができる。典型的な溶液としては、これに限定されないが、ＰＢＳ、ＤＭＥＭとＢＳＳが挙げられる。溶液のｐＨは、必要に応じて調整することができる。ＡＭの濃度は、必要に応じて変えることができる。ある手順では、より濃縮した調製物が有用であり、一方他の手順では、ＡＭ濃度が低い溶液が有用である。さらに追加の化合物を該組成物に添加することができる。再構成した製剤に添加することができる典型的な化合物としては、これに限定されないが、ｐＨ調整剤、緩衝液、コラーゲン、ＨＡ、抗生物質、界面活性剤、安定化剤、タンパク質などが挙げられる。また、この凍結乾燥したＡＭ粉末は、所望の濃度になるように、調製されたクリーム、軟膏又はローションに添加することができる。
【００９２】
要求に応じて、該組成物にさらに追加の化合物を添加することができる。ある態様では、水溶性又は粉末化ＡＭ調製物をコラーゲン、フィブリン又はＨＡのようなＥＣＭ成分と混合することができる。
【００９３】
コラーゲンは体内で見つかる主要な構造タンパク質である。コラーゲンは組織を支え、組織と骨をつなげ、かつ人体の構造を提供する。人体が治癒プロセッシング中の場合は、コラーゲンが、細胞構造を構築する手助けをする役割を果たす。ヒアルロン酸は、天然の糖であり、滑膜・関節液、眼の硝子体液、軟骨、血管、細胞外基質、皮膚及び臍帯中に含まれている。フィブリンは血液凝固に関係するタンパク質である。
【００９４】
水溶性ＡＭ調製物は、コラーゲン、フィブリン又はＨＡと混合することができる。同様に、凍結乾燥したＡＭ調製物も、コラーゲン、フィブリン又はＨＡと混合することができる。コラーゲン、フィブリン、ＨＡは、コラーゲン又はＨＡと混合したＡＭ調製物が、ＴＧＦ−βプロモーター活性を抑制する効果を発現することが示されたので、適切な配送ビヒクルになりうる。ＡＭ調製物は、本明細書に記載の実験において、コラーゲンゲル及びＨＡゲルと混合したが、任意の可溶型（例えば、液体）のコラーゲンとＨＡ、又は他のＥＣＭ成分（例えば、フィブリン）を使用することもできる。コラーゲン、フィブリン又はＨＡは、任意の適切な起源生物から入手することができる。コラーゲン、フィブリン又はＨＡが添加される場合、ＡＭに対するこれらの化合物の比は、要求に応じて変えることができる。例えば、コラーゲン（又はフィブリンもしくはＨＡ）に対するＡＭの比は、約０．００１未満：１、０．０１:１、０．０５:１、又は０．１:１〜約１：１、１．５：１、２：１、５：１、１０：１、１００：１又は１０００：１、あるいはそれ以上を用いることができる。
【００９５】
コラーゲンゲルは、実施例１に記載されているように、例えば、原液（４ｍｇ／ｍｌ）を０．１Ｎの酢酸を用いて希釈し、それを適切な容積比の２０ｘＤＭＥＭ又は適切な緩衝液、及び１ＮのＮＡＯＨと混合することにより調製することができる。調製物中のコラーゲンは、約２ｍｇ／ｍｌ未満〜約４ｍｇ／ｍｌを超える範囲で存在することができる。
【００９６】
高分子ＨＡの各種希釈物は、例えば、市販のＨＡ（ヒーロン（Ｈｅａｌｏｎ、登録商標）（１０ｍｇＨＡ／ｍｌ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｌａｊｏｌｌａ、カリフォルニア州））をＤＭＥＭ又は適切な緩衝液を用いて希釈することにより調製することができる。凍結乾燥した粉末及び水溶型ＡＭ調製物は、ＰＢＳ、ＤＭＥＭのような溶液又は他の溶液を用いて目的のコラーゲン濃度に希釈することができる。調製物中のＨＡは、例えば、約２μｇ／ｍｌ未満〜約１２９μｇ／ｍｌを超える範囲で存在することができる。
【００９７】
以下の手順は、本明細書において記述されかつ使用される羊膜調製物と精製組成物を調製するための説明的な方法を示す。
【００９８】
保存ヒトＡＭの調製：
ヒト胎盤は、選択的帝王切開分娩の際に採取した（Ｈｅｉｌｉｇｅｎｈａｕｓら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．４２：１９６９−１９７４、２００１、Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｔｓｅｎｇ、Ａｍ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１２３：３０３−３１２、１９９７、Ｐｒａｂｈａｓａｗａｔら、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  １０４：９７４−９８５、１９９７、Ｔｓｅｎｇら、Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１６：４３１−４４１、１９９８）。ＡＭは、ニトロセルロース紙（ハイボンド−Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）の上に、上皮表面を上にして平らにして乗せた。ＡＭサンプルは、使用するまでＤＭＥＭ／グリセロール（１：２（ｖ／ｖ））の中で−８０℃で保管した。
【００９９】
羊膜抽出物の調製
生のヒト胎盤及び凍結ヒト胎盤はＢｉｏ−Ｔｉｓｓｕｅ、Ｂｉｏ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｃ．（マイアミ、フロリダ州）から入手した。全ヒトＡＭ抽出物（ＡＭＥ）の全調製手順は、次の細胞培養ベースの実験で使用できるように無菌的に行った。ＡＭは、バイオパルベライザー（ＢｉｏＰｕｌｖｅｒｉｚｅｒ）（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，オクラホマ州）の容器に入るように、小片にスライスし、液体窒素で凍結させ、微粉末になるよう粉砕し、秤量した。プロテアーゼ阻害剤（プロテアーゼ阻害剤カクテル、Ｐ８３４０、Ｓｉｇｍａ及び１ｍＭのＰＭＳＦを含む）と、ホスファターゼ阻害剤（５０ｍＭのフッ化ナトリウム及び０．２ｍＭのバナジン酸ナトリウム）とを含む１ｘＰＢＳの冷緩衝液（ｐＨ７．４）を得られた粉末に１：１（ｍｌ／ｇ）の割合で添加した。混合物は氷上に保持し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅａｒｏｒ（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｒｅｍｅｌ，ウィスコンシン州）を用いて、５回、各１分間ずつ（各回が終わるたびに２分間冷却する）ホモジナイズした。これら水溶性抽出物は「全」ＡＭ抽出物（ＡＭＥ）と命名した。
【０１００】
全ＡＭ抽出物は、二つの５０ｍｌ容の円錐形遠心チューブに分注した。一つは、高速（ＨＳ、４８，０００ｘｇ）で遠心分離し、もう一つは、低速（ＬＳ、１５，０００ｘｇ）で４℃にて遠心分離した。ＨＳ及びＬＳの上清のアリコットを無菌の１．５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに移し、それぞれＡＭ／ＨＳ及びＡＭ／ＬＳと命名した。所望のＡＭ／ＨＳサンプルは、凍結乾燥前に−２０℃にて１時間凍結させた。次にそのサンプルは蓋に穴があいているＦｒｅｅＺｏｎｅ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、カンザスシティ、ミズーリ州）のチャンバーに入れた。サンプルは−５０℃、０．８５ｍＢａｒの真空度にて５時間凍結乾燥した。使用前にサンプルは、同じ容量の無菌蒸留水を用いて再構成した。ＡＭ間質に付着した物質から簡単にこすり落としたＡＭゼリーから抽出物を調製する際にも、同じ方法を用いた。
【０１０１】
全可溶性ヒト羊膜と羊膜ゼリー抽出物の調製
凍結ヒト胎盤材料は、Ｂｉｏ−Ｔｉｓｓｕｅ、Ｂｉｏ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｃ．（マイアミ、フロリダ州）から入手した。全ヒトＡＭ抽出物（ＡＭＥ）の全調製手順は、次の細胞培養ベースの実験で使用できるように無菌的に行った。ＡＭは、バイオパルベライザー（ＢｉｏＰｕｌｖｅｒｉｚｅｒ）（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，オクラホマ州）の容器に入るように、小片にスライスし、液体窒素で凍結させ、微粉末になるよう粉砕し、秤量した。プロテアーゼ阻害剤（プロテアーゼ阻害剤カクテル、Ｐ８３４０、Ｓｉｇｍａ、及び１ｍＭのＰＭＳＦを含む）及びホスファターゼ阻害剤（５０ｍＭのフッ化ナトリウム及び０．２ｍＭのバナジン酸ナトリウム）を含む１ｘＰＢＳの冷緩衝液（ｐＨ７．４）を得られた粉末に１：１（ｍｌ／ｇ）の割合で添加した。混合物は氷上に保持し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅａｒｏｒ（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｒｅｍｅｌ，ウィスコンシン州）を用いて、５回、各１分間ずつ（各回が終わるたびに２分間冷却する）ホモジナイズした。これら水溶性抽出物は「全」ＡＭ抽出物（ＡＭＥ）と命名した。
【０１０２】
全水溶性抽出物は４℃にて１時間混合し、次に４℃で３０分間、二つの異なる遠心分離速度（すなわち、１５０００ｘｇと４８０００ｘｇ）によって分画した。得られた上清は、それぞれＬ及びＨと命名した。それぞれの上清はアリコットに分け、−８０℃で保管した。この方法は、ＡＭ間質に付着した物質から簡単にこすり落としたＡＭゼリーから抽出物を調製する際にも用いた。
【０１０３】
異なる緩衝液及び分画方法による全可溶性ヒト羊膜と羊膜ゼリー抽出物
異なる抽出緩衝液を用いた調製物の試験において、上記より調製した粉末を秤量し、バッファーＡ（等張性低塩濃度）（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）と湿重量（ｇ）のＡＭと緩衝液（ｍｌ）の比が１：１となるように混合し、４℃にて１時間撹拌した。４８０００ｘｇにて遠心分離し、次に得られたペレットをバッファーＢ（高塩濃度）（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を用い、４℃にて１時間撹拌することにより、抽出した。再び４８０００ｘｇにて遠心分離し、得られたペレットをバッファーＣ（４Ｍの塩酸グアニジン）（１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．８）、４Ｍの塩酸グアニジン、４ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を用い、４℃にて２４時間撹拌することにより、最終的に抽出した。上記３種の緩衝液には、全て以下のプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を添加した：１μｇ／ｍｌのアプロチニン、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、１μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、５０μＭのフッ化ナトリウム、０．２μＭのバナジン酸ナトリウム。得られた上清はそれぞれ抽出物Ａ、Ｂ、Ｃと命名し、０．５ｍＭのＰＭＳＦを含む透析バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５ＭのＮａＣｌ）に対して、４℃にて６時間、二回透析バッファーを交換して（それぞれ５００ｘ（透析バッファー：サンプル（体積比））を用いて）透析した。透析後、各サンプルの容量を計測し、透析バッファーと同じ容量となるように調整した。簡単にこすり落とすことができた、ＡＭ間質に付着した物質であるＡＭゼリーから抽出物を調製する際にも、同じ方法を用いた。
【０１０４】
ＰＢＳを用いる全可溶性ヒト羊膜抽出物の調製
全可溶性ヒトＡＭ抽出物（Ｔ）の全調製手順は、次の細胞培養ベースの実験で使用できるように無菌的に行った。凍結ヒト胎盤は、Ｂｉｏ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｃ．（マイアミ、フロリダ州）から入手し、そこからＡＭを回収した。ＡＭは、バイオパルベライザー（ＢｉｏＰｕｌｖｅｒｉｚｅｒ）（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，オクラホマ州）の容器に入るように、小片にスライスし、液体窒素で凍結させ、次いで微粉末になるよう粉砕した。得られた粉末は秤量し、プロテアーゼ阻害剤（プロテアーゼ阻害剤カクテル、Ｐ８３４０、Ｓｉｇｍａ、１ｍＭのＰＭＳＦを含む）及びホスファターゼ阻害剤（５０ｍＭのフッ化ナトリウムと０．２ｍＭのバナジン酸ナトリウム）を含む冷ＰＢＳ緩衝液（１０ｘＰＢＳ（ｃａｔ＃７００１１−０４４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）から蒸留水を加えて１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）に調製した）と１：１（ｍｌ／ｇ）の割合で混合した。混合物は氷上に保持し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅａｒｏｒ（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｒｅｍｅｌ，ウィスコンシン州）を用いて、５回、各１分間ずつ（各回が終わるたびに２分間冷却する）ホモジナイズした。この水溶性抽出物は「全」（Ｔ）と命名した。全水溶性抽出物は４℃にて１時間混合し、次に４℃で３０分間４８０００ｘｇにて遠心分離した。得られた上清はアリコットに分け、−８０℃で保管した。
【０１０５】
水溶性ＡＭ間質抽出物の調製
無菌的方法により、Ｂｉｏ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｃ．（マイアミ、フロリダ州）から入手した凍結ヒトＡＭは、もとの保存培地を除去するために、ＨＢＳＳを用いて２〜３回簡単に洗浄した。ＡＭ間質はスパチュラでこすり落とし、液体窒素の気相中で凍結させ、バイオパルベライザー（ＢｉｏＰｕｌｖｅｒｉｚｅｒ）（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，オクラホマ州）で微粒子になるように粉砕し、その後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅａｒｏｒ（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｒｅｍｅｌ，ウィスコンシン州）を用いて、氷上にて１分間ホモジナイズした。得られたホモジネートは、１時間回転することにより混合し、その後１４，０００ｘｇにて３０分間４℃で遠心分離した。得られたＰＢＳ中の上清を回収し、アリコットに分け、−８０℃で保管した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイにより測定した。この水溶性タンパク質抽出物は羊膜間質抽出物（ＡＳＥ）と命名し、本明細書に記載の実験に使用した。
【０１０６】
ＡＭ間質抽出物の調製
タンパク質抽出物の全調製手順は無菌的に行った。Ｂｉｏ−Ｔｉｓｓｕｅ（マイアミ、フロリダ州）から入手した凍結ヒトＡＭは、保存培地を除去するために、ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を用いて２〜３回簡単に洗浄した。ＡＭ間質抽出物を調製するために、ＡＭ間質は、ＡＭの間質側からスパチュラでこすり落とした。Ｂａｐｔｉｓｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（マイアミ、フロリダ州）から入手したヒト胎盤と絨毛膜は、血液を除去するために、ＨＢＳＳを用いて３回リンスした。水溶性タンパク質抽出物を調製するために、全ＡＭ、こすり落としたＡＭ間質、間質を除去したＡＭ、胎盤と絨毛膜は、それぞれ液体窒素の気相中で凍結させ、次いで、それぞれをバイオパルベライザー（ＢｉｏＰｕｌｖｅｒｉｚｅｒ）（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，オクラホマ州）で微粒子になるように粉砕し、その後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅａｒｏｒ（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｒｅｍｅｌ，ウィスコンシン州）を用いて、氷上にて１分間ホモジナイズした。得られた各ホモジネートは、１時間かけて混合し、その後１４，０００ｘｇにて３０分間４０℃で遠心分離した。得られた各上清（ＰＢＳ中）を回収し、アリコット（０．５ｍｌ）に分け、−８０℃で保管した。ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）を用いて、それぞれの抽出物中の全タンパク質を定量した。
【０１０７】
水溶性型及び凍結乾燥粉末状のヒトＡＭ抽出物の調製
ヒトＡＭ抽出物の典型的な調製手順においては、全手順は無菌的に行われる。特に断りのない限り、手順ステップ中においてＡＭ抽出物は室温で取り扱うことができる。まず、生の又は凍結状態のヒトＡＭを、好ましくはＢｉｏ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｃ．（マイアミ、フロリダ州）から入手する。凍結ＡＭは、保存培地を除去するために、ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を用いて２〜３回簡単に洗浄する。生のヒト胎盤又は絨毛膜は、血液を除去するために、ＨＢＳＳを用いて３回リンスする。
【０１０８】
水溶性型ＡＭ抽出物を調製するために、ＡＭ（例えば、ＡＭ間質、間質を除去したＡＭ、胎盤、絨毛膜）を無菌の５０ｍｌ容の遠心チューブに移し、４℃で５分間５０００ｘｇにて遠心分離し、余分な液体を除去する。得られたＡＭを秤量し、１００ｍｍ又は１５０ｍｍの無菌のペトリ皿に移し、その後のホモジナイズ処理を容易にするために、液体窒素容器の気相中で２０分間凍結させる。次に、凍結ＡＭは、使い捨てメスを用いて小片にスライスするか、バイオパルベライザー（ＢｉｏＰｕｌｖｅｒｉｚｅｒ）（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，オクラホマ州）又は他の適切な装置を用いて微粒子に粉砕し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅａｒｏｒ（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｒｅｍｅｌ，ウィスコンシン州）又は他の適切な装置を用いて、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又はＤＭＥＭ（フェノールレッド不含）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）中で、中性ｐＨにてホモジナイズする。生化学的特徴づけ及び精製のために、上記の溶液には、以下に記載のプロテアーゼ阻害剤を添加することができる：１μｇ／ｍｌのアプロチニン、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、１μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ。しかし、抽出物を細胞培養液に直接添加する場合は、プロテアーゼ阻害剤を抽出物に添加しない。得られたホモジネートは、４℃で３０分間混合し、その後１５，０００ｘｇにて３０分間遠心分離する。上清（すなわちＡＭ抽出物）を回収し、アリコット（０．５ｍｌ）に分け、−８０℃で保管する。ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）を用いて、それぞれのＡＭ抽出物中の全タンパク質を定量する。
【０１０９】
凍結乾燥粉末状のＡＭ抽出物を調製するために、凍結ＡＭをバイオパルベライザー（ＢｉｏＰｕｌｖｅｒｉｚｅｒ）（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，オクラホマ州）又は他の適切な装置を用いて微粒子に粉砕し、さらに、本明細書に記載されているようにホモジナイズする。約０．５ｍｌのアリコットをスピードバック（ＳｐｅｅｄＶａｃ）（Ｓａｖａｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ニューヨーク州）を用いて、４℃にて４時間凍結乾燥し、重量を２８０ｍｇから３２ｍｇ（約８９％減少）に減少させる。得られた凍結乾燥粉末を秤量し、−８０℃で保管する。使用前には、この凍結乾燥粉末を適切な緩衝液で再構成することができる。
【０１１０】
ＡＭ間質抽出物を調製するために、ＡＭ間質を無処理の全ＡＭの間質表面から、基底膜と羊膜上皮に傷をつけずにこすり落とし、それを凍結し、その凍結したＡＭ間質を、本明細書に記載されているように、バイオパルベライザーを用いて粉砕する。間質は、ＰＢＳ（例えば、１．４ｍｇ／ｍｌ）を用いて、中性ｐＨにて４℃で３０分間抽出し、その後１５，０００ｘｇにて３０分間遠心分離する。その上清を回収し、アリコット（０．５ｍｌ）に分け、−８０℃で保管する。ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）を用いて、ＡＭ間質抽出物中の全タンパク質を定量する。
【０１１１】
通常の分子生物学的手法に関わる方法は、本明細書に記載される。このような手法は、一般に当技術分野で周知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄ．，  ｖｏｌ．１−３，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００３（定期的に更新される）などの方法論に詳細に記載されている。動物細胞を培養する各種手法は、当技術分野で周知であり、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｒ．Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ，２０００，及びＡｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｉａｌ），Ｍ．Ｃｌｙｎｏｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９８に記載されている。タンパク質の分析及び精製に関する方法もまた、当技術分野で周知であり、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｉａｎ  Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００４に記載されている。
【０１１２】
医薬組成物
ＡＭ調製物は、例えば、液剤、滴剤、懸濁剤、ペースト剤、スプレー剤、軟膏剤、油剤、乳剤、エアロゾル剤、被覆包帯、パッチ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、などの組成物を製造するために、配送ビヒクルと組み合わせることにより、非固体製剤として、投与目的で処方することができる。使用する剤形は、特定の適用に応じて決定される。ゲル剤は、導入部での有効成分の保持をより向上させ、有効成分のクリアランス前において有効成分の効果をより長く発現させるので、組成物を投与するのに有用である。あるいは、ＡＭ調製物は、徐放性固体製剤（経口製剤を含む）として処方することができる。典型的な薬学的に許容される担体又はビヒクル及び希釈剤の記載は、製剤と同様、本明細書中に提供され、また、当技術分野及びＵＳＰ／ＮＦにおける標準書である、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ中にも見つけることができる。
【０１１３】
医薬組成物は、１種以上の生理学的に許容される担体（有効成分を薬学的に使用しうる調製剤に加工するのを容易にする賦形剤及び補助剤を含む）を用いて、通常の方法により処方することができる。適切な処方は選択する投与経路に応じて決定される。当技術分野において適切でかつ理解されているように、任意の公知の手法、担体及び賦形剤を使用することができる。本明細書に記載の医薬組成物の概要は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ  ｅｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；１９９９）中に見つけることができ、その全内容は参照によって本明細書に組み入れられる。
【０１１４】
ある態様では、該組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体を含む。さらに、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物を他の有効成分と混合し、例えば併用療法などの目的で、医薬組成物として投与することができる。ある態様では、該医薬組成物は、他の薬剤又は医薬的作用物質、担体、アジュバント、例えば防腐剤、安定化剤、湿潤剤又は乳化剤、溶液促進剤、浸透圧を調節するために塩、及び／又は緩衝液を含んでもよい。さらに、該医薬組成物は他の治療上役に立つ物質を含んでもよい。
【０１１５】
本明細書において使用される医薬組成物とは、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物と、例えば、担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、及び／又は賦形剤などの他の化学的構成成分との混合物のことをいう。医薬組成物は、該化合物の生物への投与を容易にする。本明細書に記載の治療方法又は使用方法を実行するに当たって、治療的有効量の本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物を、治療が必要な疾患、障害又は異常を有する哺乳動物に、医薬組成物の形態で投与する。ある態様では、その哺乳動物はヒトである。治療的有効量は、疾患の重症度、被験者の年齢と相対的健康状態、使用する該化合物の力価、他の要因に応じて幅広く変わりうる。該化合物は、単独で又は他の１種以上の治療剤と組み合わせて構成成分の混合物として使用することができる。
【０１１６】
局所製剤
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物の製剤は、局所投与に適したものを含む。該製剤は単位剤形として便宜的に提供され、薬学分野でよく知られている任意の方法で調製することができる。単回剤形を製造するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、治療される被験者、特に剤形に応じて決定する。
【０１１７】
懸濁液は、懸濁剤（例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタ水酸化物、ベントナイト、寒天、トラガカント及びこれらの混合物など）を含むことができる。
【０１１８】
本明細書に記載の典型的な組成物は、多種多様な物理的形状を含む。例えば、これに限定されないが、溶液、ローション、クリーム、オイル、ゲル、スティック、スプレー、軟膏、バーム、シャンプー及びペーストが挙げられる。一般にこのような担体システムは、溶液、エマルション、ゲル、固体、エアロゾルとすることができる。該組成物は局所的に皮膚に適用することができ、また、例えば、当技術分野で周知のマイクロニードル、パッチ、包帯、又はガーゼパッドなどの経皮配送装置の形状で適用することもできる。
【０１１９】
このような軟膏、ペースト、クリーム、ゲルは、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物の他に、例えば、動物及び植物脂、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、酸化亜鉛、又はこれらの混合物などの賦形剤を含むことができる。
【０１２０】
粉末及びスプレーは、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物の他に、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、ポリアミド粉末、又はこれらの混合物などの賦形剤を含むことができる。スプレーは、さらに、通常使用される塩化フッ化炭化水素などの噴霧剤及びブタンやプロパンなどの揮発性不飽和炭化水素を含むこともできる。
【０１２１】
溶媒は一般に適切な局所的組成物の調製に使用される。このような溶媒は水性又は有機性のいずれでもよい。溶媒は、治療する動物に対し刺激を与えずに有効成分を分散又は溶解する能力を有する必要がある。水は全ての水性溶媒の基礎を作る。一方、適切な有機溶媒としては、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセロール、１，２，４−ブタントリオール、ソルビトールエステル、１，２，６−ヘキサントリオール、エタノール、イソプロパノール、ブタンジオール、これらの混合物が挙げられる。溶媒は、全体の組成物中に０．１％〜９９％、好ましくは２．０％〜７５％の範囲の量を含ませることができる。ある態様では、該組成物は、皮膚軟化薬含有組成物の形態で製造される。多種多様な適切な皮膚軟化薬が知られており、本明細書において使用することができる。
【０１２２】
ある態様では、該組成物は、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物を約０．０１％〜１０％の範囲で含むローション剤として処方される。他の態様では、該組成物はクリーム剤として、溶液担体システムの形態で処方される。好ましくは、クリーム組成物は、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物を約０．１％〜１５％、好ましくは１％〜５％の範囲で含む。ローション剤とクリーム剤は、エマルション及び溶液として処方することができる。該組成物は、当業界で入手できるスプレー剤とは異なる形態である、液体に懸濁したリポソームの形態を含む、液体の形態で投与することもできる。
【０１２３】
他の態様では、該有効成分は軟膏剤として処方される。適切な軟膏剤は、動物又は植物油又は半固形炭化水素（油性）の単純な基剤を含む。適切な軟膏剤はさらに、エマルションを形成するために水を吸収する吸収性軟膏基剤を含んでもよい。軟膏担体は同様に、水溶性である。軟膏剤は１％〜９９％の皮膚軟化剤と約０．１％〜９９％の増粘剤を含んでもよい。
【０１２４】
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物の該組成物中の割合は、約０．０１重量％〜約１００重量％、より好ましくは、約０．１重量％〜約９９．９重量％、特に約１．０重量％〜約９９．０重量％の範囲内で変動しうる。
【０１２５】
「担体」又は「ビヒクル」とは、好ましくは、局所投与に適した担体物質のことをいい、無毒性であり、該組成物の他の構成成分と悪影響を及ぼすように相互作用しない当技術分野で周知の物質、例えば、液体、ゲル溶媒、液体希釈剤、可溶化剤などが挙げられる。本明細書で使用される適切な担体としては、例えば、水、シリコーン、液状の糖類、ワックス、油、ワセリン、及び各種他の物質が上げられる。
【０１２６】
ある態様では、担体又はビヒクルとして、１種以上の溶媒、油、界面活性剤、湿潤剤、増粘剤、抗酸化剤、キレート剤、緩衝液、防腐剤が挙げられる。
【０１２７】
溶媒としては、例えば、ヘキサノール、シクロヘキサノール、ベンジルアルコール、１，２−ブタンジオール、グリセロール及びアミルアルコールなどのＣ2−Ｃ10アルコール；ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、エチルベンゼンなどのＣ5−Ｃ10炭化水素；ヘプチルアルデヒド、シクロヘキサノン、ベンジルアルデヒドなどのＣ4−Ｃ10アルデヒド、ケトン；アミルアセテート及びベンジルプロピオネートなどのＣ4−Ｃ10エステル；ユーカリ油、ヘンルーダ油、クミン油、リモネン、チモール、１−ピネンなどのエーテル油；１−クロロヘキサン、１−ブロモヘキサン、クロロシクロヘキサンなどの２〜８個の炭素原子を有するハロゲン化炭化水素が挙げられる。
【０１２８】
油としては、例えば、オリーブオイルや硬化油などの油脂；蜜ろう及びラノリンなどのワックス；流動パラフィンノセレシンやスクアランなどの炭化水素；ステアリン酸やオレイン酸などの脂肪酸；セチルアルコール、ステアリルアルコール、ラノリンアルコール、ヘキサデカノールなどのアルコール；イソプロピルミリステート、イソプロピルパルミテート、ブチルステアレートなどのエステルが挙げられる。
【０１２９】
界面活性剤としては、例えば、ステアリン酸ナトリウム、硫酸セチルナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテルホスフェート、Ｎ−アシルグルタミン酸ナトリウムなどのアニオン性界面活性剤；塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム及び塩化ステアリルトリメチルアンモニウムなどのカチオン性界面活性剤；アルキルアミノエチルグリシン塩酸塩溶液及びレシチンなどの両性界面活性剤；モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸ソルビタン、ショ糖脂肪酸エステル、モノステアリン酸プロピレングリコール、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、モノステアリン酸ポリエチレングリコール、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリオキシエチレンココナッツ脂肪酸モノエタノールアミド、ポリオキシプロピレングリコール（例えば、「プルロニック」という登録商標のもと市販されている物質）、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１３０】
吸湿剤としては、例えば、グリセリン、１,３−ブチレングリコール、プロピレングリコールが挙げられる。増粘剤としては、例えば、キサンタンゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウムが挙げられる。抗酸化剤としては、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、クエン酸、エトキシキンが挙げられる。キレート剤としては、例えば、エデト酸二ナトリウム及びエタンヒドロキシ二リン酸が挙げられる。緩衝剤としては、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂、リン酸水素二ナトリウムが挙げられる。防腐剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ジヒドロ酢酸、サリチル酸、安息香酸が挙げられる。
【０１３１】
ある態様では、担体／ビヒクルは、皮膚閉塞の制御ができる上記の物質から構成され、それによって、皮膚への刺激は最小であるが、生物学的に活性な成分の皮膚への浸透の最適な増強をもたらす。ある態様では、担体／ビヒクルは、連続相に分散した有効成分の粒子相を維持するのに役立つ分散剤を含むことができる。他の態様では、ラウリン酸アルコール、プロピレングリコールモノラウリン酸、乳酸ミリスチル、乳酸ラウリルなどの非イオン性賦形剤などにより、分散が促進される。
生物学的に活性な成分の真皮表面への配送率は、真皮配送増強剤によって向上させることができる。適切な真皮配送増強剤としては、例えば、ジメチルスルホキシドやジメチルアセトアミドなどのプロトン受容溶媒が挙げられる。他の適切な真皮配送増強剤としては、例えば、２−ピロリジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリジン、テルペン、界面活性剤、チオグリコール酸カルシウムが挙げられる。
【０１３２】
適切な真皮浸透増強剤としては、パラアミノ安息香酸の１〜５個の炭素脂肪酸エステル、イソプロピルパルミチン酸、イソプロピルミリスチン酸、エタノール、イソブチルアルコール、イソブチルアルコール、ステアリルアルコール、グリセロール、２−ピロリドン、尿素、プロピレングリコール、オレイン酸、パルミチン酸、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、２−ピロリドン、１−メチル−２−ピロリドン、５−メチル−２−ピロリドン、１，５−ジメチル−２−ピロリドン、１−エチル−２−ピロリドン、２−ピロリドンー５−カルボキシル酸、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルアミド、尿素、エチル酢酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、オレイン酸、イミダゾリン、ブチルウレア、ピロリドンカルボン酸エステルが挙げられる。
【０１３３】
着色剤、リリース剤、コーティング剤、甘味料、矯味矯臭剤及び香料、防腐剤、抗酸化剤同様に、湿潤剤、乳化剤、界面活性剤、潤滑剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなど）もまた、該組成物に含まれていてもよい。
【０１３４】
薬学的に許容される抗酸化剤としては、例えば、（１）水溶性抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、メタ硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど）；（２）油溶性抗酸化剤（例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど）；（３）金属キレート剤（例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など）が挙げられる。
【０１３５】
適切な局所投与用組成物としては、局所的に投与される治療剤に通常使用される全ての組成物（例えば、クリーム剤、ゼリー剤、包帯剤、シャンプー剤、チンキ剤、ペースト剤、軟膏剤、膏薬、粉剤、液剤、半液剤、など）等が挙げられる。該組成物の適用は、エアロゾルによって行うことができ、例えば、窒素、二酸化炭素、フレオンなどの噴霧剤を用いて行うことができ、また、例えば、ポンプ、スプレー、滴剤、ローション、又はスワブを用いて適用することができる増粘した組成物などの半固体など、噴霧剤を用いることなく行うこともできる。特に、膏薬、クリーム剤、ペースト剤、ゼリー剤、軟膏剤などの組成物や半固体組成物が都合よく使用される。
【０１３６】
眼科用製剤
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、眼への局所配送のあらゆる形態を含む、様々な方法で投与することができる。さらに、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、経口投与や静脈投与などの全身投与も可能である。本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、眼への局所投与することができ、溶液、懸濁液、ゲル又は軟膏などの様々な局所投与可能な眼科用組成物に処方することができる。従って、「眼への投与」は、これに限定されないが、眼内注射、網膜下注射、硝子体内注射、眼窩周囲投与、結膜下注射、眼球後注射、前房内注射（前眼房又は硝子体眼房への投与を含む）、テノン嚢下注射又は埋め込み、眼科用溶液、眼科用懸濁液、眼軟膏剤、眼内埋め込み、及び眼内挿入、眼内液剤、イオントフォレシスの使用、手術用洗浄液への混和、及び湿布（ほんの一例として、脳弓への飽和させた綿球の挿入）を包含する。
【０１３７】
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物からなる組成物は、例えば、薬剤が溶液中、懸濁液中、又はその両方に存在する液体の形態をとることができる。一般的に、該組成物が溶液又は懸濁液として投与されるときには、第一の割り当て分の薬剤が溶液中に存在し、第二の割り当て分の薬剤が、液体マトリックス中の懸濁液に粒子の形態で存在する。ある態様では、液体組成物にはゲル製剤が含まれる。他の態様では、液体組成物が水溶性である。あるいは、該組成物が軟膏剤の形態でありうる。
【０１３８】
有用な組成物は、水性溶液、懸濁液、又は溶液／懸濁液であってもよく、これは、点眼剤の形態で存在することができる。所望の投与量は、周知の数の液滴により眼に投与することができる。例えば、一滴の容量が２５μｌである場合、１〜６滴の投与により、２５〜１５０μｌの組成物が配送される。水性組成物は、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物を、一般的に約０．０１％〜約５０％、より一般的に約０．１％〜約２０％、さらにより一般的に約０．２％〜約１０％、最も一般的に約０．５％〜約５％（ｗ／ｖ）含む。
【０１３９】
一般的に、水性組成物は、眼科的に許容されるｐＨとモル浸透圧濃度を有する。製剤、組成物又は構成成分に関する「眼科的に許容される」とは、治療する眼、又はその機能、あるいは治療される被験者の健康状態に持続的な有害な影響を及ぼさないことを意味する。一時的な影響、例えば、軽い刺激や「突き刺すような」感覚などは薬剤の眼科用局所投与には一般的であり、問題となっている、「眼科的に許容される」製剤、組成物又は構成成分に整合性が取れている。
【０１４０】
有用な水性懸濁液もまた、１種以上のポリマーを懸濁剤として含むことができる。有用なポリマーとしては、例えば、セルロース系ポリマー（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）などの水溶性ポリマー、及び例えば、架橋型カルボキシル基含有ポリマーなどの水不溶性ポリマーが挙げられる。また有用な組成物は、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボマー（アクリル酸ポリマー）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリアクリルアミド、ポリカルボフィル、アクリル酸／ブチルアクリレートコポリマー、アルギン酸ナトリウム及びデキストランから選択される眼科的に許容される粘膜付着性ポリマーを含むこともできる。
【０１４１】
また、有用な組成物は、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物の構成成分の溶解度を助けるために、眼科的に許容される可溶化剤を含むことができる。用語「可溶化剤」には、一般に、薬剤のミセル溶液や真の溶液を形成させる媒介物が含まれる。ある眼科的に許容される非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０は可溶化剤として有用である。眼科的に許容されるグリコール、ポリグリコール（例えば、ポリエチレングリコール４００やグリコールエーテル）も同様に有用でありうる。
【０１４２】
また、有用な組成物は、１種以上の眼科的に許容されるｐＨ調整剤又は緩衝剤を含み、例えば、酸（例えば、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸及び塩酸など）；塩基（例えば、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、トリス−ヒドロキシメチルアミノメタンなど）；緩衝液（例えば、クエン酸塩／デキストロース、炭酸水素ナトリウム、塩化アンモニウム）が挙げられる。このような、酸、塩基、緩衝液は、該組成物のｐＨを眼科的に許容される範囲内に維持するのに必要な量で含まれる。
【０１４３】
また、有用な組成物は、１種以上の眼科的に許容される塩を、組成物の重量モル浸透圧濃度を眼科的に許容される範囲内にするのに必要な量で含むことができる。このような塩としては、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン又はアンモニウムカチオン及び塩素アニオン、クエン酸アニオン、アスコルビン酸アニオン、ホウ酸アニオン、リン酸アニオン、炭酸水素アニオン、硫酸アニオン、チオ硫酸アニオン、又は亜硫酸水素アニオンを有する塩が挙げられ、適切な塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、硫酸アンモニウムが挙げられる。
【０１４４】
また、他の有用な組成物は、微生物の活性を阻害するために、１種以上の眼科的に許容される防腐剤を含むことができる。適切な防腐剤としては、例えば、メルフェン（ｍｅｒｆｅｎ）やチオマーサル（ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌ）などの銀を含有する物質；安定化した二酸化塩素；塩化ベンザルコニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウムなどの四級アンモニウム化合物が挙げられる。
【０１４５】
さらに他の有用な組成物は、物理的安定性を増強させるため、あるいは他の目的で、１種以上の眼科的に許容される界面活性剤を含むことができる。適切な非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリドや植物油（例えば、ポリオキシエチレン（６０）硬化ヒマシ油）；ポリオキシエチレンアルキルエーテルやアルキルフェニルエーテル（例えばオクトキシノール１０、オクトキシノール４０）が挙げられる。
【０１４６】
さらに他の有用な組成物は、必要ならば、化学的安定性を増強させるために、１種以上の眼科的に許容される抗酸化剤を含むことができる。適切な抗酸化剤としては、ほんの一例として、アスコルビン酸及びメタ重亜硫酸ナトリウムが挙げられる。
【０１４７】
水性懸濁性組成物は、再び密閉できない単回投与用の容器に充填することができる。あるいは、再び密閉できる複数回投与用の容器を用いることもでき、この場合、一般的に該組成物は防腐剤を含んでいる。
【０１４８】
眼科用組成物は、眼と眼瞼の間、又は結膜嚢の中に挿入することができる、固形品の形状をとることもでき、その挿入された場所で本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物が放出される。放出は、該固形品が一般的に密接に接触する角膜表面を覆っている涙液に対して、あるいは角膜に対し直接行われる。このような方法による、眼内埋め込みに適した固形品は、一般に主にポリマーから構成され、生分解性であっても生分解性でなくてもよい。
【０１４９】
注射剤
筋肉内注射、皮下注射又は静脈内注射に適した製剤としては、生理学的に許容される無菌の水性又は非水性溶液剤、分散剤、懸濁剤又はエマルションが挙げられ、また無菌の注射可能溶液剤又は分散剤に再構成するための無菌粉末剤が挙げられる。適切な水性及び非水性の担体、希釈剤、溶媒又はビヒクルとしては、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、クレモホールなど）、それらの適切な混合物、植物油（例えば、オリーブ油など）、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを利用することにより、分散液の場合は必要な粒子サイズを維持することにより、及び界面活性剤を使用することにより維持することができる。皮下注射に適した製剤は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤などの添加剤を含むことができる。微生物の増殖の防止は、様々な抗菌剤や抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸など）により確保することができる。また、糖類、塩化ナトリウムなどの等張化剤を含んでいることが好ましい。注射可能な製剤形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンなどの吸収遅延剤を用いることにより、達成することができる。
【０１５０】
静脈内注射剤については、例えば、ハンクス液、リンガー液、生理食塩緩衝液、又は他の適切な溶液などの生理学的に適合性のある緩衝液を用いて、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物を水性溶液に製剤化することができる。経粘膜投与の場合、該製剤には透過すべきバリアに対して適した浸透剤を使用する。このような浸透剤は当技術分野において一般的に周知である。他の非経口注射剤については、適切な製剤は、好ましくは生理学的に適合性のある緩衝液又は賦形剤を用いて、水性又は非水性溶液を含むことができる。このような賦形剤は当技術分野において一般的に周知である。
【０１５１】
非経口注射剤は、急速投与注射又は連続注入に関与してもよい。注射用製剤は単位剤形（例えば、アンプル）で存在してもよく、あるいは複数回投与容器（防腐剤を添加する）の形態で存在してもよい。本明細書に記載の医薬組成物は、油性又は水性ビヒクルを用いた無菌懸濁液、溶液又はエマルションとして非経口注射に適した形態をとることができ、また、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤などの製剤化剤を含むこともできる。非経口投与用製剤としては、水溶性形態の有効成分の水性溶液が挙げられる。さらに、有効成分の懸濁液が、適切な油性注射懸濁剤として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、ゴマ油や合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチル、トリグリセリド、リポソームなど）などの油脂類が挙げられる。水性注射懸濁剤は、その懸濁剤の粘性を高める物質を含むことができる。この物質としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランが挙げられる。必要ならば、該懸濁剤は、適切な安定化剤又は化合物の溶解性を高める媒介物を含んでもよく、これにより高度に濃縮された溶液の調製が可能となる。あるいは、有効成分が粉末の形態でもよく、使用前に適切なビヒクル、例えば無菌のパイロジェンフリー水を用いて再構成する。
【０１５２】
経皮製剤
本明細書に記載の経皮製剤は、当技術分野に記載されている各種装置を用いて投与することができる。例えば、このような装置としては、これに限定されないが、米国特許第３，５９８，１２２号、第３，５９８，１２３号、第３，７１０，７９５号、第３，７３１，６８３号、第３，７４２，９５１号、第３，８１４，０９７号、第３，９２１，６３６号、第３，９７２，９９５号、第３，９９３，０７２号、第３，９９３，０７３号、第３，９９６，９３４号、第４，０３１，８９４号、第４，０６０，０８４号、第４，０６９，３０７号、第４，０７７，４０７号、第４，２０１，２１１号、第４，２３０，１０５号、第４，２９２，２９９号、第４，２９２，３０３号、第５，３３６，１６８号、第５，６６５，３７８号、第５，８３７，２８０号、第５，８６９，０９０号、第６，９２３，９８３号、第６，９２９，８０１号、第６，９４６，１４４号に記載されているものが挙げられ、その全内容はそれぞれ参照によって本明細書に明確に組み入れられる。
【０１５３】
本明細書に記載の経皮的剤形は、当技術分野で常用の薬学的に許容される、ある賦形剤を含むことができる。ある態様では、本明細書に記載の経皮製剤は少なくとも以下の３つの構成成分を含む：（１）本明細書に記載の製剤；（２）浸透増強剤；（３）水性アジュバント。さらに、経皮製剤は、追加の成分、例えば、これに限定されないが、ゲル化剤、クリーム、軟膏の基剤などを含むことができる。ある態様では、経皮製剤は、吸収を向上させ、経皮製剤が皮膚から除去されるのを防ぐために織布又は非織布の裏当て材を含むことができる。他の態様では、本明細書に記載の経皮製剤は、皮膚への拡散を促進するために、飽和又は過飽和状態を維持することができる。
【０１５４】
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物の経皮投与に適した製剤は、経皮配送装置や経皮配送パッチを利用してもよく、また親油性エマルション又は緩衝化水性溶液であってもよく、ポリマー又は粘着剤に溶解及び／又は分散させることができる。このようなパッチは、連続的、拍動的、あるいは応需的に製剤を配送するように構成されていてもよい。さらに、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物の経皮配送は、イオントフォレーシスパッチなどによって達成することができる。さらに経皮パッチは、該組成物の制御された配送を実施することができる。吸収速度は、速度制御膜を使用することによって、あるいは化合物をポリマーマトリックス又はゲルに閉じ込めることによって遅くすることができる。反対に、吸収増強剤を用いて吸収を向上させることができる。吸収増強剤又は担体は、皮膚透過を援助するために、薬学的に許容される吸収性溶媒を含むことができる。例えば、経皮装置は、裏当て材、化合物（必要ならば担体を加えて）を含むリザーバー、必要ならば、制御された既定の速度で長期にわたって化合物を被験者の皮膚に配送するための速度制御バリアからなる包帯の形状、及び装置を皮膚に固定する手段からなる包帯の形状をしている。
【０１５５】
固体経口剤形
本明細書に記載の固体剤形の製剤は、適合性担体、結合剤、充填剤、懸濁剤、矯味矯臭剤、甘味剤、崩壊剤、分散剤、界面活性剤、潤滑剤、着色剤、希釈剤、可溶化剤、保湿剤、可塑剤、安定化剤、浸透増強剤、湿潤剤、消泡剤、抗酸化剤、防腐剤、あるいはこれらの１種以上の組み合わせなどの、薬学的に許容される添加剤を１種以上含むことができる。さらに別の態様では、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０００）に記載されているような、標準のコーティング手順が使用される。
【０１５６】
圧縮錠剤は、本明細書に記載の製剤のバルクブレンドを圧縮することにより調製される固体剤形である。種々の態様においては、口腔内で溶解するように設計された圧縮錠剤は１種以上の矯味矯臭剤を含む。他の態様では、該圧縮錠剤は最終圧縮錠剤の周りを囲むフィルムを含む。ある態様では、フィルムコーティングにより、該組成物の製剤からの遅延放出を提供することができる。他の態様では、フィルムコーティングは、患者の薬剤服用順守（例えば、オパドライ（Ｏｐａｄｒｙ）（登録商標）コーティング、又は糖衣）に役立つ。オパドライ（Ｏｐａｄｒｙ）（登録商標）などのフィルムコーティングの量は、一般的に錠剤の重量に対し、約１％〜約３％の範囲である。他の態様では、圧縮錠剤は、１種以上の賦形剤を含む。
【０１５７】
カプセル剤は、例えば、本明細書に記載の組成物の製剤のバルクブレンドをカプセル内に充填することにより調製することができる。ある態様では、製剤（非水性懸濁剤や溶液剤）をソフトゼラチンカプセルに充填する。他の態様では、製剤を標準のゼラチンカプセル又は非ゼラチンカプセル（例えば、ＨＰＭＣからなるカプセル）に充填する。他の態様では、製剤をスプリンクルカプセル（カプセルを丸ごと飲み込んでもよいし、食事前にカプセルを開け、その中身を食物に振りかけてもよい）に充填する。ある態様では、治療用量を複数（例えば、２つ、３つ又は４つ）のカプセルに分ける。ある態様では、製剤の全投与量をカプセルの形態で配送する。
【０１５８】
種々の態様においては、粒子状組成物と１種以上の賦形剤を乾式混合し、圧縮して、経口投与後、約３０分未満、約３５分未満、約４０分未満、約４５分未満、約５０分未満、約５５分未満、又は約６０分未満で実質的に崩壊し、それによって製剤が消化液の中に放出される医薬組成物を提供するのに十分な硬度を有する錠剤のような塊になるようにする。
【０１５９】
別の態様では、剤形は、マイクロカプセル封入製剤を含むことができる。ある態様では、１種以上の他の適合性物質がマイクロカプセル封入材に含まれる。そのような物質としては、例えば、これに限定されないが、ｐＨ調整剤、分解促進剤、消泡剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、及び担体物質（例えば、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、潤滑剤、湿潤剤、希釈剤）が挙げられる。
【０１６０】
さらに、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物を含む固体剤形の製剤は、該組成物の徐放が提供されるように処方することができる。徐放とは、長時間にわたる所望のプロファイルに従って、組成物が含まれている剤形から組成物が放出されることをいう。徐放プロファイルとしては、例えば、持続放出、延長放出、拍動放出、遅延放出プロファイルが挙げられる。即時放出性組成物とは異なり、徐放性組成物は、既定のプロファイルに従って長期にわたり薬剤を被験者に配送することを可能にする。このような放出速度は、長期にわたり薬学的に有効な濃度で薬剤を提供することができるので、通常の迅速放出剤形の比べて、副作用を最小に抑えながら、より長い期間にわたって薬理反応を提供する。このような長期間にわたる反応は、対応する短時間作用型即時放出性調製物では達成できない多くの固有の利点を提供する。
【０１６１】
ある態様では、本明細書に記載の固体剤形は、腸溶性遅延放出性経口剤形として、すなわち、消化管の小腸で放出するように、腸溶コーティングを利用する本明細書に記載の医薬組成物の経口剤形として処方することができる。腸溶性剤形は、顆粒状、粉末状、ペレット状、ビーズ状、又は粒子状の有効成分及び／又は他の組成物の構成成分（これらはそれぞれコーティングされている、又はコーティングされていない）を含む圧縮、成形、又は押出成形された錠剤／型（コーティングされている、又はコーティングされていない）である。また、腸溶性経口剤形は、ペレット状、ビーズ状、又は顆粒状の固体担体又は組成物（これらはそれぞれコーティングされている、又はコーティングされていない）を含むカプセル（コーティングされた、又はコーティングされていない）でもよい。
【０１６２】
他の態様では、本明細書に記載の製剤は、拍動剤形を用いて配送される。拍動剤形は、制御されたラグタイムの後、既定の時点にて、あるいは特定の部位にて一つ以上の即時放出パルスを提供することができる。拍動剤形は、当技術分野で周知の各種拍動製剤を用いて投与することができる。そのような製剤としては、例えば、これに限定されないが、米国特許第５，０１１，６９２号、第５，０１７，３８１号、第５，２２９，１３５号、第５，８４０，３２９号に記載されているものが挙げられ、これらはそれぞれ参照によって本明細書に明確に組み入れられる。本製剤での使用に適した他の拍動剤形としては、例えば、これに限定されないが、米国特許第４，８７１，５４９号、第５，２６０，０６８号、第５，２６０，０６９号、第５，５０８，０４０号、第５，５６７，４４１号、第５，８３７，２８４号に記載されているものが挙げられ、これらは全て参照によって本明細書に明確に組み入れられる。
【０１６３】
徐放システムの多くの他のタイプは当業者にはよく知られており、本明細書に記載の製剤での使用に適している。このような配送システムとしては、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなどのポリマー系システム；ステロール（例えば、コレステロール、コレステロールエステル、脂肪酸など）などの脂質又はモノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドなどの中性脂肪である多孔質基材の非ポリマー系システム；ヒドロゲル放出システム；シラスティックシステム;ペプチド系システム；ワックスコーティング、生体内分解性剤形、圧縮錠剤（通常の結合剤を使用）などが挙げられる。例えば、Ｌｉｂｅｒｍａｎら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  ２  Ｅｄ．，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．２０９−２１４（１９９０）；Ｓｉｎｇｈら、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｐｐ．７５１−７５３（２００２）；米国特許第４，３２７，７２５号、第４，６２４，８４８号、第４，９６８，５０９号、第５，４６１，１４０号、第５，４５６，９２３号、第５，５１６，５２７号、第５，６２２，７２１号、第５，６８６，１０５号、第５，７００，４１０号、第５，９７７，１７５号、第６，４６５，０１４号、第６，９３２，９８３号参照。これらはそれぞれ参照によって本明細書に明確に組み入れられる。
【０１６４】
ある態様では、本明細書に記載の粒子状の組成物、及び被験者に投与するための少なくとも１種の分散剤又は懸濁剤を含む製剤が提供される。該製剤は、懸濁するための粉末及び／又は顆粒であってもよく、水と混合することにより実質的に均一な懸濁液が得られる。
【０１６５】
本明細書に記載の水性懸濁剤及び分散剤は、Ｔｈｅ  ＵＳＰ  Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（２００５年版、９０５章）に規定されているように、少なくとも4時間、均質な状態を維持することができる。均質性は、全組成物の均質性を決定するのにふさわしいサンプリング方法によって決定するべきである。ある態様では、水性懸濁剤を１分未満物理的に撹拌することにより均質な懸濁剤に再懸濁することができる。別の態様では、水性懸濁剤を４５秒未満物理的に撹拌することにより均質な懸濁剤に再懸濁することができる。さらに別の態様では、水性懸濁剤を３０秒未満物理的に撹拌することにより均質な懸濁剤に再懸濁することができる。さらに別の態様では、均質な水性懸濁剤を維持するために撹拌する必要はない。
【０１６６】
本明細書に記載の水性懸濁剤又は分散剤に適した粘度増強剤としては、これに限定されないが、メチルセルロース、キサンタンゴム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プラスドン（登録商標）Ｓ−６３０、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギン酸塩、アカシア、キトサン、それらの組み合わせが挙げられる。その粘度増強剤の濃度は、選択した粘度増強剤と目的の粘度に応じて決定する。
【０１６７】
上記に掲載された添加剤の他に、液体製剤は、当技術分野で通常使われている不活性希釈剤を含むことができ、例えば水や他の溶媒、可溶化剤、乳化剤などが挙げられる。乳化剤としては、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、ラウリル硫酸ナトリウム、ドキュセートナトリウム、コレステロール、コレステロールエステル、タウロコール酸、ホスファチジルコリン、油類（例えば、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油など）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタン脂肪酸エステル、又はこれらの混合物などが挙げられる。
【０１６８】
任意の添加剤は、当技術分野の異なる実行者によってしばしば異なって分類される、あるいは、いくつかの異なる作用における任意の作用について通常使用されるので、本明細書に記載の水性分散剤又は懸濁剤に用いられる上記掲載の添加剤との間に重複があることを理解されたい。従って、上記掲載の添加剤は、本明細書に記載の製剤に含まれる添加剤の種類の単なる例としてとらえるべきであり、これに限定されない。このような添加剤の量は、所望の特定の性質に応じて、当業者によって容易に決定することができる。
【０１６９】
鼻腔内用製剤
鼻腔内用製剤は当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第４，４７６，１１６号、第５，１１６，８１７号、第６，３９１，４５２号に記載されており、これらはそれぞれ参照によって本明細書に明確に組み入れられる。製剤はこれらの文献や当技術分野で周知の他の技術に従って調製することができ、ベンジルアルコール又は他の適切な防腐剤、フッ化炭素、及び／又は当技術分野で周知の他の可溶化剤又は分散剤を利用して、生理食塩水溶液として調製される。例えば、Ａｎｃｅｌ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄ．（１９９５）参照。これらの組成物と製剤は、適切な無毒性の薬学的に許容される成分を用いて調製することができる。これらの成分は、鼻腔用剤形の調製に関わる当業者にはよく知られており、それらのうちいくつかは、当技術分野における標準的な参考文献である、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ，２１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００５中に見つけることができる。適切な担体の選択は、目的の鼻腔用剤形（例えば、溶液剤、懸濁剤、軟膏剤、又はゲル剤）の正確な性質によって大きく左右される。鼻腔用剤形は有効成分に加えて大量の水を一般的に含む。少量の他の成分（例えば、ｐＨ調整剤、乳化剤、分散剤、防腐剤、界面活性剤、ゲル化剤、又は緩衝化剤、他の安定化剤や可溶化剤など）が含まれてもよい。
【０１７０】
吸入による投与の場合、本明細書に記載の組成物は、エアロゾル、霧、又は粉末の形態でありうる。本明細書に記載の医薬組成物は、エアロゾルスプレー製剤の形態で、加圧パック又はネブライザーから都合よく配送される。この際、適切な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適切なガスなど）が用いられる。加圧エアロゾルの場合は、投与単位は、計量された量を配送するバルブを設けることにより決定してもよい。吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）又は吸入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）に使われるゼラチン（ほんの一例）などのカプセル剤やカートリッジ剤は、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物、及びラクトース又はデンプンなどの適切な粉末との粉末ミックスを含むように処方してもよい。
【０１７１】
その他の製剤
また、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、通常の座薬基剤（例えば、ココアバターや他のグリセリドなど）、合成ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン、ＰＥＧなど）などを含む直腸用組成物（例えば、浣腸、直腸ゲル、直腸フォーム、直腸エアロゾル、座薬、ゼリー状座薬、又は停留浣腸など）に処方してもよい。座薬形状の該組成物の場合、低融点ワックス、例えば、これに限定されないが、脂肪酸グリセリドの混合物（任意でココアバターと組み合わせて）が最初に融解する。
【０１７２】
投与方法及び治療レジメン
組成物は、任意の適切な手法により投与することができる。一般的には、該組成物は、目的の場所（例えば、眼表面、皮膚）に直接投与する。製剤の眼表面への投与は、当技術分野に周知である。ＡＭ調製物を皮膚に配送したい場合は、局所投与を利用することができる。注射可能な組成物も想定される。投与は非経口的（例えば、皮下投与）でもよい。他の配送方法としては、例えば、リポソーム配送、該組成物を含浸させた装置からの拡散、マイクロエマルションによる経皮配送（いずれも美容用及び医薬用の適用）が当技術分野に周知である。
【０１７３】
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物を含む組成物は、予防的及び／又は治療的処置のために投与することができる。治療的適用の場合は、治療に十分な量又はその疾患又は異常の症状を少なくとも一部停止する量の該組成物をすでに疾患又は異常を患っている患者に投与する。この用途における有効な量は、疾患又は異常の重症度及び経過、以前の治療、患者の健康状態、体重、薬剤反応、治療を実施している医師の判断によって決まる。通常の実験方法（用量漸増臨床試験が挙げられるが、これに限定されない）による治療的有効量の決定において当業者の間で熟慮される。
【０１７４】
予防的適用の場合は、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物を含む組成物を、特定の疾患、障害又は異常にかかりやすい、又はその危険にさらされる患者に投与する。この組成物の量は「予防的有効量又は用量」と定義する。この用途においても、正確な量は、患者の健康状態、体重などによって決まる。通常の実験方法（例えば、用量漸増臨床試験）によるこのような予防的有効量の決定において当業者の間で熟慮される。患者に用いる場合、この用途における有効な量は、疾患、障害又は異常の重症度と経過、以前の治療、患者の健康状態、薬剤反応、治療を実施している医師の判断によって決まる。
【０１７５】
患者の症状が改善しない場合は、医師の判断のもと、患者の疾患又は異常の症状の寛解、そうでなければ抑制や制限を目的として、該化合物の投与を慢性的、すなわち長期間（患者の生涯を含む）投与してもよい。
【０１７６】
患者の状態が改善しない場合は、医師の判断のもと、該化合物の投与を連続的に行ってもよい；あるいは、投与する医薬品の用量を一時的に減らすか、ある期間一時的に中止（すなわち「休薬期間」）してもよい。休薬期間の長さは２日から１年まで様々である（ほんの一例として、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１５日、２０日、２８日、３５日、５０日、７０日、１００日、１２０日、１５０日、１８０日、２００日、２５０日、２８０日、３００日、３２０日、３５０日、又は３６５日が挙げられる）。休薬期間中の用量減量は、１０％〜１００％でありうる（ほんの一例として、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％が挙げられる）。
【０１７７】
一旦、患者の症状の改善が見られた場合、必要ならば、維持量を投与する。その後、用量又は投与の頻度、あるいはその両方が、症状の相関的要素として、改善された疾患、障害、又は異常の状態が保持されるレベルまで減少させることができる。しかし患者は、症状が再発した際には、長期ベースで間欠治療を要求することができる。
【０１７８】
任意の薬剤の量は、例えば、特定の化合物、疾患又は異常とその重症度、治療が必要な被験者又は宿主の固有の性質（例えば、体重）などの要因に応じて変わる。しかし、それでもなお、そのケースをとりまく特定の環境（例えば、投与する特定の薬剤、投与経路、治療される症状、治療される被験者又は宿主）に従って、当技術分野に周知の方法によって規定どおりに決定することができる。しかし一般には、成人を治療するために使用される用量は、典型的には、一日あたり０．０２〜５０００ｍｇ、好ましくは一日あたり１〜１５００ｍｇの範囲である。望ましい用量は、単回投与量、又は、同時（あるいは単時間内）に投与される、又は適切な間隔をあけて、例えば、一日に２回、３回、４回あるいはそれ以上の部分用量が投与される、分割投与量として便宜的に表してもよい。
【０１７９】
本明細書に記載の医薬組成物は、正確な用量の単回投与に適した単位剤形でありうる。単位剤形にて、該製剤は、適切な量の１種以上の化合物を含む単位用量に分けられる。単位用量は、個別量の製剤を含むパッケージの形態でありうる。例えば、これに限定されないが、パッケ−ジ化した錠剤、カプセル剤、その他バイアル又はアンプルに入った粉剤が挙げられる。水性懸濁性組成物は、再び密閉できない単回投与用の容器に充填することができる。あるいは、再び密閉できる複数回投与用の容器を用いることもでき、この場合、一般的に該組成物は防腐剤を含んでいる。ほんの一例として、非経口注射用製剤は、単位剤形（例えば、アンプルが挙げられるが、これに限定されない）で存在してもよく、あるいは複数回投与容器（防腐剤を添加する）に入った形態でよい。
【０１８０】
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物に適した一日あたりの投与量は、体重１ｋｇあたり約０．０１〜２．５ｍｇである。ヒトを含む（これに限定されない）大型哺乳動物における一日あたりの表示投与量は、約０．５ｍｇ〜約１００ｍｇの範囲であり、便宜的に一日あたり４回まで（これに限定されない）数回に分割して、あるいは徐放性形態で投与する。適切な経口投与用単位剤形は、約１〜５０ｍｇの有効成分を含む。上記範囲はほんの提示に過ぎず、個々の治療レジメンに関する変数の数は多く、これらの推奨値からのかなりの数の逸脱はよくあることである。このような投与量は、多くの変数（使用する化合物の活性、治療される疾患又は異常、投与形態、個々の被験者の要件、治療される疾患又は異常の重症度及び医師の判断が挙げられるがこれに限定されない）に応じて変わる。
【０１８１】
上記治療レジメンの毒性及び治療効果は、細胞培養や実験動物における標準的な薬学的手法（ＬＤ50（母集団の５０％が死に至る用量）及びＥＤ50（母集団の５０％に治療効果があった用量）が挙げられるが、これに限定されない）によって決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ50とＥＤ50との間の比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイと動物実験から得られるデータは、ヒトに使用される投与量の範囲を考案するのに使用することができる。このような化合物の投与量は、好ましくは、毒性が最小で、ＥＤ50を含む濃度を丸で取り囲んだ範囲内にあるのが好ましい。投与量は、用いる剤形や使用する投与経路に応じて上記の範囲内で変動しうる。
【０１８２】
併用療法
本明細書に記載の組成物及び方法は、治療される症状に対する特別な有用性のために選択される他の周知の治療剤と併用することもできる。一般に、本明細書に記載の組成物は、併用療法を使用する実施の形態において、他の薬剤を同じ医薬組成物として投与する必要はなく、物理的、化学的性質の違いにより、異なる経路で投与しなければならないかもしれない。投与の形態や投与の推奨度（可能ならば同一医薬組成物中で）の決定は、十分ベテラン医師の知識の範囲内である。初回投与は、当技術分野に周知の確立されたプロトコルに従って行うことができる。次に、確認された効果に基づいて、用量、投与形態、投与回数について、ベテラン医師によって変更することができる。
【０１８３】
使用する化合物の特別の選択は、担当の医師の診断、患者の状態の医師による判断、適切な治療プロトコルによって決まる。疾患、障害又は異常の性質、患者の状態、使用する化合物の実際の選択に応じて該化合物を同時に（例えば、同時に、原則的に同時に、あるいは同じ治療プロトコル内で）、あるいは順次的に投与することができる。投与の順番の決定や治療プロトコル中における各治療剤の投与の反復回数は、治療する疾患と患者の状態の評価後において十分ベテラン医師の知識の範囲内である。
【０１８４】
医薬品を併用治療に使用する場合、治療的有効量が変わりうることは、当業者に周知である。併用療法レジメンに使用する医薬品と他の薬剤の治療的有効量を実験的に決定する方法は、文献に記載されている。例えば、メトロノーム投与（すなわち、中毒性副作用を最小にするために、低用量をより頻繁に提供する投与法）の使用については、文献に広範囲にわたって記述されている。併用療法は、患者の臨床管理の手助けをするために、様々な時間に開始と停止を行う断続的な治療もさらに含む。
【０１８５】
本明細書に記載の併用療法については、併用投与化合物の用量は、もちろん使用する併用医薬品の種類、使用する特定の医薬品、治療する疾患又は異常などに応じて変わる。さらに、一つ以上の生理活性物質と併用投与する場合は、本明細書に提供される化合物は、この生理活性物質と同時に、あるいは順次的に投与してもよい。順次的に投与する場合は、担当の医師が、生理活性物質と併用して投与するタンパク質の適切な順番を決定する。
【０１８６】
いずれの場合も、複数の治療剤を任意の順番で、あるいは同時に投与することができる。同時に投与する場合、複数の治療剤は、単一の形態、一体化した形態、あるいは複数の形態で（ほんの一例として、単一丸剤として、又は別個の二つの丸剤として）提供することができる。治療剤の一つあるいは両方を複数回投与してもよい。同時投与でない場合、複数回投与間のタイミングは、０週間以上〜４週間未満の範囲で変動しうる。さらに併用方法、組成物、処方は、二つの薬剤のみの使用に限定されない;複数の治療方法の併用も想定される。
【０１８７】
当然のことながら、軽減を目的とした症状を治療、予防、又は寛解するための投与レジメンは、様々な要因に従って変更することができる。これらの要因としては、被験者が患っている障害、及び被験者の年齢、体重、性別、食事、病状が挙げられる。したがって、実際に使用される投与レジメンは大きく異なる可能性があるので、本明細書に記載の投与レジメンから逸脱する可能性がある。
【０１８８】
本明細書に開示される併用療法を構成する製剤は、一体にした剤形、又は実質的に同時に投与することを意図した別個の複数の剤形でありうる。また、併用療法を構成する複数の製剤は、２段階投与を要求するレジメンにより投与されるいずれか一方の治療化合物を用いて順次的に投与してもよい。この２段階投与レジメンは、複数の活性剤の順次的投与又は別個の複数の活性剤の間隔を開けた投与を要求しうる。複数の投与ステップ間の時間間隔は、２〜３分から数時間までの範囲にわたってもよく、それぞれの製剤の性質（例えば、力価、溶解性、生物学的利用能、血漿中濃度半減期、製剤の薬物動態プロファイルなど）に応じて変動しうる。最適用量間隔は、目的の分子濃度の日内変動によっても決定することができる。
【０１８９】
さらに、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、付加的又は相乗的利点を患者にもたらす手順と併用してもよい。ほんの一例として、本明細書に開示される化合物の医薬組成物及び／又は他の治療剤との併用剤を、個人がある疾患又は異常に相関していることが知られている変異遺伝子の保持者であるかどうかを決定するための遺伝子検査と組み合わせる本明細書に記載の方法から、患者が治療的及び／又は予防的利点を見出すことが期待される。
【０１９０】
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物、及び併用療法は、疾患又は異常の発症前、発症中、あるいは発症後に投与することができる。化合物を含む該組成物を投与するタイミングは異なりうる。従って、例えば、該化合物は予防剤として使用することができ、疾患又は異常の発症を防ぐために、異常又は疾患を発症する性質を有する被験者に連続的に投与することができる。該化合物と組成物は、症状の発現中あるいは発現後可及的速やかに被験者に投与することができる。該化合物の投与は、症状が発現してから最初の４８時間以内、好ましくは症状が発現してから最初の４８時間以内、より好ましくは症状が発現してから最初の６時間以内、最も好ましくは症状が発現してから最初の３時間以内に開始することができる。初回投与は、実施可能な任意の方法（例えば、静脈注射、ボーラス注射、５分〜５時間にわたる点滴、丸剤、カプセル剤、経皮パッチ、口腔配送など、あるいはこれらの組み合わせなど）で行うことができる。化合物は、疾患又は異常の発症が確認又は疑われた後可及的速やかに、疾患の治療に必要な期間（例えば、約１ヶ月〜約３ヶ月など）投与することが好ましい。治療期間は被験者ごとに異なりうる。治療期間は周知の基準を用いて決定することができる。例えば、該化合物又は該化合物を含む製剤は、少なくとも２週間、好ましくは約１ヶ月〜約５年間、より好ましくは約１ヶ月〜約３年間投与することができる。
【０１９１】
キット／製造品
本明細書に記載の治療への適用に用いるために、キットと製造品もまた本明細書に記載される。このようなキットは、担体、パッケージ、又は一つ以上の容器（例えば、バイアル、チューブなどであり、それぞれの容器は本明細書に記載の方法に使用される個々の要素の一つを収容する）を受け入れるように区分されている容器を含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、テストチューブが挙げられる。その容器はガラスやプラスチックなどの様々な材料から製造することができる。
【０１９２】
本明細書に記載の製造品は包装材料を含む。医薬品を包装するのに使用される包装材料は当業者に周知である。例えば、米国特許第５，３２３，９０７号、第５，０５２，５５８号、第５，０３３，２５２号参照。医薬用包装材料としては、例えば、これに限定されないが、ブリスター包装、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、ボトル、選択された製剤、目的の形態の投与と治療に適した任意の包装材料が挙げられる。本明細書に提供される化合物と組成物の多種多様な製剤は、任意の疾患、障害又は異常のための様々な治療を目的とする。
【０１９３】
例えば、該容器は、１種以上の本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物を、必要ならば、組成物として、あるいは本明細書に開示されている他の薬剤と組み合わせて含むことができる。該容器は、必要ならば、無菌のアクセスポート（例えば、該容器は、皮下用注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内用溶液バッグ又はバイアルでありうる）を有する。このようなキットは、必要ならば、識別する表示又はラベルを付した化合物、又は本明細書に記載の方法にその化合物を使用することに関連する説明書を含む。
【０１９４】
キットは、典型的に一つ以上の補足的な容器を含んでもよく、それらはそれぞれ、一つ以上の各種構成要素（例えば、試薬、必要ならば、濃縮された形態で、及び／又は装置）を有することが、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物の商業的観点やユーザー観点から望ましい。このような構成要素の非限定的例としては、これに限定されないが、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、担体、包装、容器、バイアル、及び／又はチューブ、内容物を記載したラベル、及び／又は使用説明書、及び使用説明書の添付文書が挙げられる。一組の説明書も典型的に含まれる。
【０１９５】
ラベルが容器上に存在してもよいし、付随してもよい。ラベルを形成する文字、数字、又は他の符号が、容器自身に付着、鋳造又は食刻されている場合は、ラベルが容器上に存在しうる。ラベルが容器内又は容器を支える役目もする担体内に存在する場合は、ラベルは容器に付随しうる（例えば、添付文書として）。ラベルは、内容物を特定の治療への適用に使用することを示すために使用することができる。ラベルはまた、本明細書に記載の方法などにおける内容物の使用方法を示すこともできる。
【０１９６】
ある態様では、医薬組成物は、本明細書に提供される化合物を含む一つ以上の単位剤形を含むことができるパック又はディスペンサ装置中に存在してもよい。該パックは、例えば、金属フォイル又はプラスチックフォイル（例えばブリスターパックなど）を含む。該パック又はディスペンサ装置には、投与のための説明書が付随する。また、該パック又はディスペンサには、医薬品の製造、使用又は販売を管理している政府機関によって規定される形状の容器に関する通知が付随しうる。この通知は、ヒト又は動物に投与するための医薬品の形状がその政府機関により承認されたことを反映する。このような通知は、例えば、処方箋のために、米国食品医薬品局により承認されたラベル、又は承認された製品添付文書である。また、適合性医薬担体に調剤された本明細書に提供される化合物を含む組成物は調製され、適切な容器に入れられ、かつ適応された症状の治療のためにラベリングを施すことができる。
【０１９７】
治療方法
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は研究適用や臨床適用を含む多くの用途を有する。本明細書に記載の結果に基づいて、生理機能の所望の調節を達成するために、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物を組織又は細胞に適用することができる。また、所望の効果（本明細書に記載されているような）を達成するために、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物を細胞培養液又は組織培養液に添加することもできる。
【０１９８】
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、ＴＧＦプロモーター活性を抑制する。
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物の抗瘢痕作用、抗炎症作用、抗血管新生作用は、本明細書に示されるＴＧＦ−β１プロモーター活性の抑制により実証される。凍結羊膜の胎児部分は、生の羊膜よりも著しく高い抗瘢痕作用を有する。凍結羊膜の胎盤部分も、生の羊膜よりも著しく高い抗瘢痕作用を有する（実施例１）。従って、凍結ＡＭの胎盤部分又は胎児部分は、ＴＧＦ−βに対し、生の羊膜よりも強い抑制作用を示した。凍結ＡＭから得られた全ＡＭ抽出物によるこの抑制作用は、０．４〜１２５μｇ／ｍｌの範囲にわたって用量依存的であった。さらに、このような抑制作用は、高分子ＨＡのみでは代用できず（ＡＭ抽出物の１００倍相当量を超えた量）、ヒアルロニダーゼによる消化後にはこの抑制作用は失われた。このことにより、この抑制作用はＨＡ−ＩαＩとの複合体によって媒介されることが示唆された。低速又は高速での遠心分離はこの抑制作用に著しい影響は及ぼさなかった。しかし、次の凍結乾燥及び再構成により、より強い抑制作用が生じた。さらに、ＡＭの全体的な抑制作用はＡＭゼリーよりも高かった。
【０１９９】
ＴＧＦ−βは、サイトカインのプロトタイプであり、組織の炎症、さらには創傷治癒と瘢痕形成に関わっている。Ｂｏｒｄｅｒ，ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９０：１−７（１９９２）；Ｇｒａｎｄｅ，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２１４：２７−４０（１９９７）；Ｊｅｓｔｅｒ，ら、Ｐｒｏｇ．Ｒｅｔｉｎ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．，１８（３）：３１１−３５６（１９９９）；Ｍａｒｅｋ，ら、Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｍｏｎｉｔ．，８（７）：ＲＡ１４５−１５１（２００２）参照。哺乳動物細胞は、３種の異なるＴＧＦ−βファミリー：ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３を発現する。ＴＧＦ−βは、線維芽細胞を含む多くの種類の細胞において、α−ＳＭＡ、インテグリンα５β１、ＥＤＡドメインを含有するフィブロネクチン（Ｆｎ）の発現を上方制御することにより筋線維芽細胞の分化を促進する最も強力なサイトカインである。Ｔｓｅｎｇ，ら、Ｏｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｊ．，２（３）：１７７−１８７（２００４）；Ｒｏｎｎｏｖ−Ｊｅｓｓｅｎ，ら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６８：６９６−７０７（１９９３）；Ｖｅｒｂｅｅｋ，ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１４４：３７２−８２（１９９４）；Ｈａｌｅｓ，ら、Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．，１３：８８５−９０（１９９４）；Ｊｅｓｔｅｒ，ら、Ｃｏｒｎｅａ，１５：５０５−１６（１９９６）；Ｓｅｒｉｎｉ，ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４２：８７３−８１（１９９８）；Ｇｒａｎｄｅ，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２１４（１）：２７−４０（１９９７）；Ｊｅｓｔｅｒ，ら、Ｐｒｏｇ．Ｒｅｔｉｎ．Ｅｙｅ．Ｒｅｓ．，１８：３１１−５６（１９９９）参照。ＴＧＦ−βはまた、コラーゲン及びプロテオグリカンのような基質成分の発現を上方制御し、プロテアーゼ及び基質メタロプロテアーゼを下方制御し、またこれらの阻害物質の発現を上方制御する。まとめると、これらの作用は、細胞基質の相互作用と粘着性、さらに瘢痕組織の沈着と形成の増加をもたらす。Ｔｓｅｎｇ，ら、Ｏｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｊ．，２（３）：１７７−１８７（２００４）；Ｇｒａｎｄｅ，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２１４（１）：２７−４０（１９９７）；Ｊｅｓｔｅｒ，ら、Ｐｒｏｇ．Ｒｅｔｉｎ．Ｅｙｅ．Ｒｅｓ．，１８：３１１−５６（１９９９）；Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．，７：３６３−７４（１９９６）参照。
【０２００】
ＴＧＦ−βファミリーは、細胞膜上に存在するＴＧＦ−β受容体ファミリー（ＴＧＦ−βＲファミリー）と結合することにより、その作用を発現する。ヒトの細胞には、３種のＴＧＦ−βＲファミリー、すなわち、ＴＧＦ−βＲタイプＩ（ＴＧＦ−βＲＩ）、ＴＧＦ−βＲタイプＩＩ（ＴＧＦ−βＲＩＩ）、ＴＧＦ−βＲタイプＩＩＩ（ＴＧＦ−βＲＩＩＩ）がある。リガンドとして機能するＴＧＦ−βファミリーは、ＴＧＦ−βＲＩとＴＧＦ−βＲＩＩによって形成されたセリン／スレオニンキナーゼ受容体複合体に結合する。このような結合は、セリン／スレオニンキナーゼ受容体ではないＴＧＦ−βＲＩＩＩによって促進される。Ｔｓｅｎｇ，ら、Ｏｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｊ．，２（３）：１７７−１８７（２００４）；Ｍａｓｓａｇｕｅ，ら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．，１４：６２７−４４（２０００）参照。ＴＧＦ−βＲＩＩとの結合は、ＴＧＦ−βＲＩを活性化し、これは、本明細書に記載されている遺伝子を含む多くのターゲット遺伝子の転写を調節するＳｍａｄとして知られているエフェクタータンパク質ファミリーの直接的リン酸化に関与する。Ｔｓｅｎｇ，ら、Ｏｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｊ．，２（３）：１７７−１８７（２００４）；Ｍａｓｓａｇｕｅ，ら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１４：６２７−４４（２０００）；Ｄｅｒｙｎｃｋ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１３３３：Ｆ１０５−Ｆ１５０（１９９７）参照。
【０２０１】
ＴＧＦ−βの抑制は、ＴＧＦ−βに対する抗体、及びデコリンのようなＴＧＦ−βにより介在されるシグナル伝達を仲介する薬剤を中和することにより達成することができる。Ｓｈａｈｉ，ら、Ｌａｎｃｅｔ，３３９：２１３−２１４（１９９２）；Ｐｅｔｒｏｌｌ，ら、Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．，１７３９：７３６−７４７（１９９８）；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，ら、Ｎａｔｕｒｅ，３４６（６２８１）：２８１−２８４（１９９０）；Ｌｏｇａｎ，ら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１５９：５０４−５１０（１９９９）参照。多くの文献では、ＴＧＦ−βの活性化を調節、その受容体への結合、又はそのシグナル伝達のレベルにおいて達成されたＴＧＦ−βの抑制が示されている。羊膜は、転写レベルにおける抑制、すなわちＴＧＦ−β遺伝子の転写を中断させることによりそのような抑制を達成することができることが示されている。特に、羊膜は、ヒトの角膜と角膜縁の線維芽細胞及びヒトの結膜と翼状片線維芽細胞においてＴＧＦ−βのシグナル伝達を抑制することが示されている。Ｔｓｅｎｇ，ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１７９：３２５−３３５（１９９９）；Ｌｅｅ，ら、Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．，２０（４）：３２５−３３４（２０００）参照。
【０２０２】
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物の適用は、ＴＧＦ−βの産生又は活性を減少させるために使用することができる。数種類のＡＭ組成物、例えば、ＡＭＥ（全ヒトＡＭ抽出物）、遠心分離後のＡＭＥ上清、ＡＭゼリー、ＡＭ間質などを、実施例１に詳述したようにして調製した。ＴＧＦ−βの活性に対する種々の緩衝液（例えば、ＰＢＳ、低塩濃度緩衝液、高塩濃度緩衝液及び塩酸グアニジンなど）の影響を検討した。さらに、ＴＧＦ−βの活性に対する種々の凍結粉砕方法の影響を検討した。
【０２０３】
ＴＧＦ−β活性の抑制は、ヒアルロニダーゼの消化後には失われた。これにより、この抑制作用はＨＡ関連複合体によって媒介されていることが実証された（図３）。この抑制作用は、ＨＡを添加しても回復しなかった。遠心分離ステップは、ＡＭＥ及びＡＭゼリー抽出物のいずれにおいても、ＴＧＦ−β活性の抑制に変化をもたらさなかった（図５）。凍結乾燥は、ＡＭＥとゼリー抽出物のいずれにおいても、ＴＧＦ−β活性の抑制を増強した（図６）。図８、図９は、コラーゲンとＨＡが、それらがＡＭＥに添加された場合、ＴＧＦ−β活性の抑制を増強することができることを実証している。従って、ＡＭベースの組成物へのコラーゲンとＨＡの添加は、ＴＧＦ−βが関与する様々な疾患の治療に有用でありうる。
【０２０４】
本明細書に示されるように、ＴＧＦ−βは、ここで開示されている組成物によって下方制御される。従って、本明細書に記載の組成物は、ＴＧＦ−βの下方制御に関連する疾患（例えば、血管新生、創傷治癒及び組織炎症など）の治療に使用することができる。
【０２０５】
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、アポトーシスを抑制することができる。
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、組織におけるアポトーシスの予防、減少又は治療に用いることができる。ある態様では、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、損傷した組織におけるアポトーシスを減少又は予防することができる。この抗アポトーシス作用は、該組成物が、移植前に保管されている臓器の寿命を延ばすために使用できることを実証する。また該組成物は、外科手術中とその後における損傷を治療する又は予防するためにも使用することもできる。実施例３は、眼に損傷を負ったマウスモデルを用いてＡＭ抽出物の抗アポトーシス作用を実証している。マウスの眼を採取し、酵素処理あるいは機械的損傷により損傷を与え、ＡＭ抽出物を投与し、核に対するアポトーシス性損傷を測定するアッセイを用いて、細胞の損傷に対する作用を判定した。ＡＭ抽出物を用いたインキュベーションにより、アポトーシスのレベルが下がることが分かった。
【０２０６】
ＡＭ調製物により発現される抗アポトーシス作用により、ＡＭ調製物と組成物は、移植の前に組織（例えば、角膜）を保存するのに有用であることが期待される。保管されている組織へのＡＭ調製物の添加は、保管プロセッシングによる細胞損傷を減らすのに有用である。例えば、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、移植又は外科手術の前に保管されている組織に生じる分解の量を減らすために使用することができる。本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、場合によってはコラーゲン及び／又はＨＡを用いて、保存培地に添加することができる。保管された組織（例えば、眼、臓器、皮膚など）は、ＡＭ組成物が添加された場合に起こる、細胞のアポトーシスの減少によって恩恵を受けることができる。
【０２０７】
一旦、ドナーの組織が回収されると、一般的にその組織は移植まで保存培地に保管される。該組成物は、細胞のアポトーシスを予防するために、その保存培地に添加することができる。例えば、該組成物は、角膜縁上皮幹細胞を保存するための保存培地に添加することができる。同様に、ＡＭ調製物含有組成物は、細胞（例えば、角膜実質細胞）のアポトーシスを予防するために、細胞培養液又は消化培地に添加することができる。本明細書に記載の実験により、ディスパーゼ消化（外科的傷害及び病的傷害（それぞれ、例えば、ＰＲＫにおけるエキシマアブレーションや再発性角膜びらんなど）を模倣する処理）中のＡＭ調製物のインキュベーションにより、上皮細胞と角膜実質細胞の両方のアポトーシスを著しく減少させることが示されたので、該組成物はまた、角膜実質細胞のアポトーシスを減少させ、その結果角膜混濁を減少させることを試みるために、機械的擦過又はエキシマレーザーフォトアブレーションを受けた眼に投与することができる。他の例としては、ＡＭ調製物含有製剤は、角膜実質細胞のアポトーシスを減少させるために、手術の状態において、又は再発性角膜びらんや基底膜が溶解している円錐角膜などの疾患にも使用することができる。
【０２０８】
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、瘢痕形成を予防又は逆行させることができ、また創傷治癒の手助けをするのに用いることができる。
成人や他の哺乳脊椎動物において、皮膚のような組織の創傷治癒は、胎児性組織や胚性組織の治癒の際に起こると思われる再生プロセッシングとは異なり、一般的に修復プロセッシングである。創傷修復プロセッシングの結果は、内因的パラメータ（例えば、組織酸素化）と外因的パラメータ（例えば、創傷ドレッシング）の両方を含む多くの異なる要素の影響を受ける。しかし、創傷し損傷した組織の治癒と修復の全プロセッシング（必要な細胞間の伝達を含む）は、成人や他の哺乳動物において、創傷環境内に開放され、とりわけ血管新生、白血球走化性、線維芽細胞の増殖、遊走、さらにはコラーゲンや他の細胞外基質分子の創傷部位における沈着を引き起こすと思われる多くの特定の可溶性増殖因子により協調して制御されていることを示す多くの証拠がある。確認され、単離されているこのような増殖因子は、一般的に特殊な可溶性タンパク質やポリペプチドであり、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、など）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子ＩとＩＩ（ＩＧＦＩ及びＩＧＦＩＩ）、酸性と塩基性線維芽細胞増殖因子（酸性ＦＧＦと塩基性ＦＧＦ）が挙げられる。
【０２０９】
筋線維芽細胞は、表現型の上では、平滑筋細胞と線維芽細胞の間の中間体である。筋線維芽細胞は、形態形成、腫瘍形成、炎症、創傷の治癒、ほとんどの臓器や組織における線維症において重要な役割を果たしている。通常の創傷治癒中において、ＴＧＦ−β１のような増殖因子の影響と任意の組織内で発生した機械的ストレスの影響を受けて、線維芽細胞が創傷部に移動し、筋線維芽細胞に分化する。通常は、筋線維芽細胞は、回復期におけるアポトーシスによって徐々に消失する。しかし、ある病的状態の下では、筋線維芽細胞は生き残り、細胞外基質を再構築し続け、その結果、瘢痕を形成する。従って、筋線維芽細胞の分化を制御する能力が、創傷治癒の間の各種組織における瘢痕形成を防ぐのに有用である。本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、瘢痕形成の予防と逆行の両方を可能にし、従って、瘢痕形成が起こりうる全ての疾患の治療に有用である。
【０２１０】
ある態様では、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、瘢痕組織の形成を抑制又は予防することができる。この効果は実施例４において実証されている。ＡＭＳＣを、プラスチック上、コラーゲン上、又はＡＭ組織表面物質上で培養した。プラスチック上で培養したＡＭＳＣは、インビトロで筋線維芽細胞に迅速に分化した。しかし、これらの分化した筋線維芽細胞は、ＡＭ間質基質上で継代培養すると、ＡＭＳＣに逆行させることができた（図２３）。筋線維芽細胞分化の逆行はまた、羊膜間質抽出物を分化した筋線維芽細胞に添加することによっても達成することができる（図２５）。さらに、ＡＭ間質抽出物はまた、ＡＭＳＣの筋線維芽細胞への分化を防ぐことも分かった（図２６）。
【０２１１】
従って、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、任意の方法により引き起こされる瘢痕形成を防ぐため、又は逆行させるために用いることができる。該組成物は、しわ、皮膚線条、手術による瘢痕、外傷瘢痕、火傷や機械的損傷による瘢痕などを治療するために投与することができる。
【０２１２】
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、創傷による瘢痕形成を治療する又は予防するために使用することができる。創傷は、組織構造の正常な連続性を破壊する物理的方法（例えば、機械的、化学的、あるいはウイルス、細菌、真菌、他の病原菌など）、又は熱的方法によって引き起こされる内部及び外部の身体の損傷又は傷害である。創傷は、事故、手術、病原性生物、又は外科的処置によって引き起こされる。
【０２１３】
さらに、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、線維芽細胞の遊走を抑制することができる。実施例５及び図２７〜２９に示すように、ＡＭＥは、線維芽細胞の遊走を抑制することが分かった。ＡＭＥの生物学的活性を調べるために、ヒトの角膜縁の外植片（ＨＬＥ）をＳＨＥＭ又はＡＭＥを添加したＳＨＥＭで培養した。ＡＭＥ（２５μｇ／ｍｌ）は、角膜縁の外植片からの上皮性増殖の開始を遅らせた。ＡＭＥは、外植した線維芽細胞の間質からの遊走を抑制し、その結果、線維芽細胞が非常に少ない増殖上皮層をもたらした。さらに、ＡＭＥを含むＳＨＥＭにおいて形成された該上皮層は平滑な縁部を有していた。この現象は、ＨＬＥを１０μＭのＳＢ２０３５８０（ＭＡＰＫ  ｐ３８阻害剤）を含んだＳＨＥＭで培養したときの現象に似ていた。増殖後の残留している外植片の組織切片により、ＡＭＥが存在しなければ、間質基質の溶解が明らかに増加することが分かった。従って、ＡＭＥは、間質基質の溶解を防ぐことにより、線維芽細胞の遊走を阻害することができると思われる。これらの発見により、ＡＭＥは、ヒト角膜幹細胞の増殖を促進し、炎症、瘢痕、血管新生に対抗する方向に、創傷治癒を変更する新規の製品を開発するために使用することができることを示唆する。
【０２１４】
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、治癒を向上させ、組織に対する機械的損傷から組織の損傷の量を減らすために手術中又は手術後に使用することができる。本明細書に記載の組成物及び方法の適用用途は広範囲に及び、これに限定されないが、全てのタイプの手術（例えば、形成外科手術、脊髄手術、又は帝王切開手術など）；疾患（例えば、癌、うっ血性心不全及び腎臓病など）；火傷、にきび、あるいは他の損傷による異常を包含する。本明細書に記載の方法は、再生手術又は形成外科手術において、医師により使用することができる。本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、短期及び長期の治療効果を達成するために、体表上又は組織上に局所的にも適用することができる。
【０２１５】
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、眼疾患による損傷を治療する又は予防するために使用することができる。本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物を投与することにより治療が可能である眼疾患の種類としては、例えば、これに限定されないが、ドライアイ、角膜損傷、角膜腫瘍、シェーグレン症候群、コンタクトレンズによる損傷、真菌感染症、ウイルス感染症、細菌感染症、機械的損傷、手術による損傷、火傷による損傷、結膜の炎症、眼球類天疱瘡、スティーブンス・ジョンソン症候群、化学的損傷、などが挙げられる。
【０２１６】
また、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は表皮疾患を治療するためにも使用することができる。本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物を投与することにより治療が可能である表皮層疾患の種類としては、例えば、これに限定されないが、真菌病、ウイルス病、細菌病、発疹、湿疹、乾癬、魚鱗癬、表皮溶解性角化症などが挙げられる。
【０２１７】
血管新生関連疾患の治療と予防
本明細書に記載されるように、凍結保存したＡＭの無血管間質から調製された可溶性タンパク質抽出物を使用し、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物の抗血管新生作用が実証された。ＡＭ間質抽出物（ＡＳＥ）は、増殖を抑制し、アポトーシスを引き起こし、遊走を減少させ、管腔形成を阻害することにより、培養したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対して強力な抗血管新生作用を有することが分かった。実施例８は、羊膜間質抽出物（ＡＳＥ）が抗血管新生特性を有することを実証している。ＡＳＥは、ＨＵＶＥＣの細胞増殖を抑制することが分かった（図３４）。また、ＡＳＥはＨＵＶＥＣ細胞のアポトーシスを引き起こすことも分かった（図３５）。ＡＳＥによるＶＥＧＦ誘発細胞遊走を抑制する作用が、トランスウェルアッセイを用いて実証された（図３７）。また、ＡＳＥはＨＵＶＥＣ細胞の管腔形成を阻害することも分かった（図３８）。
【０２１８】
まとめると、これらの結果により、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、血管新生関連疾患の治療に有用であることが実証される。治療することが可能な血管新生関連疾患としては、例えば、これに限定されないが、腫瘍増殖、癌や眼科的異常（例えば、角膜移植拒絶反応、眼血管新生、網膜血管新生（損傷又は感染に伴う血管新生を含む）、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、網膜虚血、硝子体出血など）が挙げられる。
【０２１９】
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物を用いることにより治療が可能である癌の種類としては、例えば、これに限定されないが、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、膀胱癌、骨癌、脳幹グリオーマ、脳腫瘍、乳癌、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、上皮性悪性腫瘍、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣細胞腫、食道癌、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、眼球内黒色腫、眼癌、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍（頭蓋外）、胚細胞腫瘍（性腺外）、胚細胞腫瘍（卵巣）、妊娠性トロホブラスト腫瘍、グリオーマ、有毛細胞白血病、頭頚部癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視経路グリオーマ、眼球内黒色腫、島細胞癌（膵島）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、喉頭癌、白血病（急性リンパ性）、白血病（急性骨髄性）、白血病（慢性リンパ性）、白血病（慢性骨髄性）、口唇／口腔癌、肝臓癌、肺癌（非小細胞）、肺癌（小細胞）、リンパ腫（皮膚Ｔ細胞）、リンパ腫（非ホジキン）、骨肉腫/骨の悪性線維性組織球腫、髄芽細胞腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性障害、骨髄性白血病、骨髄球性白血病、骨髄増殖性疾患、鼻腔／副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、松果体芽細胞腫及びテント上未分化神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫（カポジ）、肉腫（子宮）、セザリー症候群、皮膚癌（非黒色腫）、皮膚癌（黒色腫）、皮膚癌（メルケル細胞）、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、絨毛性腫瘍、妊娠性、尿道癌、子宮癌、子宮内膜、子宮肉腫、膣癌、視経路及び視床下部膠腫、外陰部癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、などが挙げられる。
【０２２０】
炎症の治療
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、炎症を抑えるために使用することができる。ＡＭは、抗炎症能力を与える／媒介する多くの要素（例えば、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属する因子、プロテアーゼ阻害剤、ＩＬ−１受容体拮抗剤（ＩＬ−１ＲＡ）など）を含む。ＩＬ−１０は、炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−８など）を抑制及び対抗することが知られている。Ｆｏｕｔｕｎａｔｏ，ら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．，１７５：１０５７−６５（１９９６）；Ｆｏｕｔｕｎａｔｏ，ら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．，１７７：８０３−９（１９９７）；Ｆｏｕｔｕｎａｔｏ，ら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．，１７９：７９４−９（１９９８）参照。アクチビンとインヒビン（ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する因子）は、ＡＭによって産生される。各種用量のアクチビンは、異なる結果をもたらす。アクチビンが低用量の場合、ＩＬ−６、ＩＬ−８、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の産生が促進され、高用量の場合、産生は阻害される。Ｐｅｔｒａｇｌｉａ，ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，７７：５４２−８（１９９３）；Ｒｉｌｅｙ、ら、Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．１５：５７８−８３（２０００）；Ｋｅｅｌａｎ，ら、Ｐｌａｃｅｎｔａ，３１：３８−４３（２０００）参照。ＡＭは、また、α１抗トリプシンのような、抗炎症作用を発現するプロテアーゼ阻害剤を含む。Ｎａ，ら、Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  Ｒｅｓ．，１３：４５９−６６（１９９９）参照。ＩＬ−１ＲＡは、ＩＬ−１も阻害剤であり、従って、ＩＬ−１が介在している炎症を抑制する。Ｒｏｍｅｒｏ，ら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．，１７１：９１２−２１（１９９４）参照。本発明者らは、ＡＭがＩＬ−１の発現と産生を下方制御し、ＩＬ−１ＲＡを上方制御することを実証した。Ｔｓｅｎｇ，ら、Ｏｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｊ．，２（３）：１７７−１８７（２００４）参照。
【０２２１】
活性化されたマクロファージは、宿主の炎症反応の開始、維持、消散における重要な役割を果たす。ウイルス、細菌、寄生虫を殺す、及びスカベンジャー細胞として働く他に、マクロファージは過剰なフリーラジカル、溶菌酵素、炎症性サイトカインを産生することにより宿主に対し有害な影響も及ぼし、全体としては、組織損傷を悪化させ多くの急性及び慢性炎症に関連する全身症状の原因となる。
【０２２２】
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、実施例６及び図３０〜３３に示すように炎症作用をもたらすマクロファージを抑制することができる。ＩＦＮγを活性化した場合と活性化しない場合について抗炎症作用を試験するために、モデルとして、マウスマクロファージ細胞株であるＲａｗ２６４．７を使用した。凍結保存した羊膜（ＡＭ）は、特にＩＦＮγの刺激を受けて、Ｒａｗ２６４．７細胞によるＮＯの産生を抑制した。さらに、細胞をＡＭ上で培養したときに、プラスチック上で培養したときと比べて、ＰＧＤ２の産生がＰＧＥ２の産生よりも、より大きい恩恵を受けた。抗炎症作用の指標であるＰＧＤ２とＰＧＥ２との比は、ＡＭ上で細胞を培養したときに、プラスチック上で培養したときと比べて、著しく高かった。
【０２２３】
細胞をＡＭ上で培養したときに、プラスチック上で培養したときと比べて、Ｒａｗ２６４．７におけるＴＧＦ−β１のプロモーター活性の抑制が著しく高かったように、上記抗炎症作用は、ＴＧＦ−βシグナル伝達の抑制と相関していた。さらに、１２５μｇ／ｍｌのＡＭＥの添加が、Ｒａｗ２６４．７細胞の細胞死を引き起こした。まとめると、これらの結果は、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物がマクロファージを抑制することができ、その結果、抗炎症作用がもたらされることを実証する。
【０２２４】
従って、本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、組織の炎症に関連する疾患を治療するために使用することができる。炎症性疾患は典型的に以下の兆候の一つ以上によって特徴付けられる：疼痛（ｄｏｌｏｒ：有害物質の発生と神経の刺激による）；発熱（ｃａｌｏｒ：血管拡張による）；発赤（ｒｕｂｏｒ：血管拡張と血流量増大による）；腫脹（ｔｕｍｏｒ：過剰の体液の流入又は制限された体液の流出による）；機能障害（ｆｕｎｃｔｉｏ  ｌａｅｓａ：これは一部でも全部でもよく、また一時的でも永久的でもよい）。炎症は、多くの病態を成し、例えば、これに限定されないが、以下の一つ以上の病態である炎症が上げられる：急性、癒着性、萎縮性、カタル性、慢性、硬化性（ｃｉｒｒｈｏｔｉｃ）、びまん性、播種性、滲出性、フィブリン性、線維化性、限局性、肉芽腫性、過形成性、肥大性、間質性、転移性、壊死性、閉塞性、実質性、形成性、増殖性（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）、繁殖性（ｐｒｏｌｉｆｅｒｏｕｓ）、偽膜性、化膿性（ｐｕｒｕｌｅｎｔ）、硬化性（ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ）、血清形成性（ｓｅｒｏｐｌａｓｔｉｃ）、漿液性、単純性、特異性、亜急性、化膿性（ｓｕｐｐｕｒａｔｉｖｅ）、毒性、外傷性、潰瘍性、など。
【０２２５】
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物を投与することにより治療が可能である炎症性疾患としては、例えば、これに限定されないが、関節炎（関節リウマチ、脊椎関節症、痛風関節炎、変性関節疾患（すなわち、変形性関節症）、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、未分化脊椎炎、ベーチェット病、溶血性自己免疫性貧血、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、穀粉症、急性肩痛、乾癬性関節炎、若年性関節炎を含む）、喘息、アテローム性動脈硬化、骨粗鬆症、気管支炎、腱炎、滑液包炎、皮膚炎疾患（すなわち、乾癬、湿疹、火傷、皮膚炎）、遺尿症、好酸球性疾患、消化管疾患（炎症性腸疾患、消化性潰瘍、限局性腸炎、憩室炎、消化管出血、クローン病、胃炎、下痢症、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎を含む）、胃食道逆流症、好酸球性食道炎、胃不全麻痺（例えば、糖尿病性胃不全麻痺など）；食物不耐性、食物アレルギー、その他の機能性腸疾患（例えば、非潰瘍性消化不良、非心臓性胸痛など）等が挙げられる。
【０２２６】
本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物は、また、例えば、以下の疾患に関連する炎症を治療するために使用することができる：血管性疾患、片頭痛、緊張型頭痛、結節性動脈周囲炎、甲状腺炎、再生不良性貧血、ホジキン病、水腫性硬化症（ｓｃｉｅｒｏｄｏｍａ）、リューマチ熱、タイプI糖尿病、重症筋無力症、サルコイドーシス、ネフローゼ症候群、ベーチェット病、多発性筋炎、歯肉炎、過敏症、結膜炎、多発性硬化症及び虚血（例えば、心筋虚血）。該化合物は、脳障害（例えば、パーキンソン病やアルツハイマー症）に関連する神経炎症や頭蓋放射線障害に関連する慢性炎症を治療するのに有用である。該化合物は、急性炎症性疾患（例えば、感染症が原因で起こる疾患など）や慢性炎症性疾患（例えば、喘息、関節炎、炎症性腸疾患が原因で起こる疾患など）を治療するのに有用である。また、該化合物は外傷性筋痛症や非炎症性筋痛症を治療するのに有用である。
【０２２７】
本明細書に記載の組成物及び方法は、以下に示す実施例を用いてより詳細に説明される。これらの実施例は説明のために提供されるものであり、本発明をなんら制限するものではない。
【実施例】
【０２２８】
実施例１：各種羊膜調製物の抑制作用
ヒアルロニダーゼによる消化
凍結ＡＭから調製した水溶性ＡＭ抽出物（ＡＭＥ）を、上記のプロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤を添加した反応緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．１ＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％のＢＳＡ）の中で、１０ユニット／ｍｌのヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ１１３６）を加えて、あるいは加えずに、２時間３７℃で混合した。陽性対照として、ヒト臍帯から精製した高分子ＨＡ（ｃａｔ＃Ｈ１８７６、Ｓｉｇｍａ）を用いた。
【０２２９】
細胞培養とＴＧＦ−β１プロモーター抑制
１００ｍｍのプラスチック製皿上でＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で培養したヒト角膜線維芽細胞が８０％コンフルエント（約１．０ｘ１０6個）に達した時点で、細胞を２回、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳで洗浄した。アデノウイルス−ＴＧＦ−β１プロモーター−ルシフェラーゼ（ＭＯＩ＝３７．５）とａｄｅｎｏ−ＣＭＶ−β−ｇａｌ（ＭＯＩ＝３０）を、１０ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ及び細胞が入った培養プレートに加え、３７℃で４時間培養し、その後、４ｍｌのあらかじめ温めておいたトリプシン／ＥＤＴＡを用いて５分間トリプシン処理をした。８ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳを用いてトリプシン／ＥＤＴＡの活性を中和させた後、細胞を１５ｍｌチューブに回収し、１，５００ｒｐｍ（約６００ｘｇ）で５分間遠心分離した。培地をデカントし、その後、細胞を１５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳに再懸濁し、細胞生存率をトリパンブルー染色により測定した。３ｘ１０4個の生細胞をプラスチック製２４ウェルに、又はＡＭインサートの間質表面上に播種した。全部で４ウェルと４つのインサートを準備した。次に、細胞を３７℃で４８時間、ＣＯ2インキュベーターの中で培養した。
【０２３０】
増殖培地を各ウェルから注意深く取り除き、その後、付着した細胞を取り除かないように注意して、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳで少なくとも２回リンスした。ウェル中のＰＢＳをできるだけ除去した後、細胞を覆うように１００μｌの１ｘ溶解バッファーを加えた。その後、細胞を機械的にこすり落とし、氷上に置かれたマイクロ遠心チューブに移した。１０〜１５秒間ボルテックスを行い、その後室温にて１２，０００ｘｇで１５秒間遠心分離して細胞溶解物を回収した。細胞溶解物と称された上清は、ルシフェラーゼ活性についてアッセイする前に−８０℃で保管した。
【０２３１】
各種ＡＭ抽出物によるＴＧＦ−β１プロモーター活性の抑制
図１において、プラスチック対照（ＰＬ）と比較して、凍結した羊膜の胎盤部分と胎児部分（それぞれ、ＦＲＯ／Ｐ及びＦＲＯ／Ｆ）は、両方とも、有意なＴＧＦ−β１プロモーター活性の抑制を示した（それぞれ、Ｐ＜０．０１）。生の胎盤については、羊膜の胎盤部分（ＦＲＥ／Ｐ）も、有意なＴＧＦ−β１プロモーター活性の抑制を示した（Ｐ＜０．０５）。しかし、生の羊膜の胎児部分（ＦＲＥ／Ｆ）は、なんら抑制作用を示さなかった（Ｐ＝０．５）．これらの結果は、生の羊膜の胎児部分は、凍結した同等物と同等の抗創傷作用を有さないことを示した。凍結した羊膜としては、胎盤部分（ＦＲＯ／Ｐ）による抑制作用は、胎児部分による抑制作用と有意差があるとはいえなかった（Ｐ＝０．３）。生の羊膜については、胎児部分（ＦＲＥ／Ｆ）による抑制作用は、胎盤部分（ＦＲＥ／Ｐ）と有意差があるとはいえなかった（Ｐ＝０．１）。胎盤部分については、凍結した羊膜（ＦＲＯ／Ｐ）による抑制作用は、生の羊膜（ＦＲＥ／Ｐ）よりも有意に優れていた（Ｐ＜０．０５）。しかし、胎児部分においては、凍結した羊膜（ＦＲＯ／Ｆ）による抑制作用は、生の羊膜（ＦＲＥ／Ｆ）による抑制作用と有意差があるとはいえなかった（Ｐ＝０．１）。
【０２３２】
ＴＧＦ−β１プロモーター活性の抑制は用量依存的であり、ヒアルロニダーゼによる消化後失われた。
凍結ＡＭから調製された全水溶性ＡＭ抽出物によるＴＧＦ−β１プロモーター活性の抑制は、０．０４〜１２５μｇ／ｍｌの間において、用量反応曲線に従った（図２）。ＴＧＦ−β１とＴＧＦ−βＲＩＩのプロモーター活性により示されるように、凍結ＡＭから調製された２５μｇ／ｍｌの全水溶性ＡＭ抽出物の抑制作用は、ヒアルロニダーゼを用いて前処理すると失われた。これにより、この抑制作用は、ＨＡ関連複合体により媒介されていることが示された（図３）。なお、２５μｇ／ｍｌのＡＭ抽出物は、０．７８μｇ／ｍｌ未満のＨＡを含んでいた。
【０２３３】
ヒアルロニダーゼにより失われた抑制作用はＨＡを添加しても回復することができない。
１００μｇ／ｍｌの高分子ＨＡ単独では、弱い抑制活性を示したが、その大きさは、２５μｇ／ｍｌのＡＭ抽出物よりも著しく低かった。まとめると、これらのデータは、ＡＭ抽出物の抑制作用は、ＨＡ結合複合体、すなわち、ＨＡ−ＩαＩ複合体により媒介されていることを示唆する。
【０２３４】
遠心分離後由来の可溶性ＡＭＥとゼリー抽出物は、ＴＧＦ−β１プロモーター活性に対する抑制作用を変えない。
プロモーター活性
ＰＢＳ対照と比較して、ＨＡ、ＡＭ（全、低速、高速）、ゼリー（全、低速、高速）は、β−ガラクトシダーゼ活性により正規化すると、ＴＧＦ−β１プロモーターの活性化の抑制を示した。Ｐ値により、対照グループ間において、ばらつきによる統計的な有意性が無いことが示された（データ示さず）。全ＡＭＥと二つの条件により遠心分離された可溶性ＡＭＥとを比較した結果より、有意差がないことが示された。しかし、遠心分離処理されていないＡＭＥは、低又は高可溶性ＡＭＥと比較すると、低い抑制を示した。同様に、ゼリー／Ｔは、ゼリー／ＨＳと比較して、低いＴＧＦ−β抑制活性を示した（図５）。
【０２３５】
凍結乾燥により、ＡＭＥとゼリー抽出物の抑制作用が増強された。
ヒト角膜線維芽細胞は、対照であるＨＡのみ、及び低濃度のＡＭＥ又はゼリー抽出物中では、細胞形態になんら変化を示さなかった（データ示さず）。しかし、高濃度のＡＭＥとＬ／ＡＭＥで処理した後は、早くも播種後１８時間には、細胞は著しく変化し、細くかつ小さくなった（図６）。さらに、細胞密度も減少した。上記変化は、ＡＭＥとゼリー抽出物それぞれにおいて、凍結乾燥ＡＭＥ又はＬ／ＡＭＥの場合、凍結乾燥しなかった同等物と比べ、より劇的だった（図６）。
【０２３６】
ＴＧＦ−βプロモーターが、ＡＭＥ処理中に抑制されるかどうか調べるために、ルシフェラーゼアッセイを行った。トランスフェクション対照として、β−ガラクトシダーゼアッセイを用いた。その結果、ＡＭＥ−１２５、Ｌ−ＡＭＥ−２５、Ｌ−ＡＭＥ−１２５、Ｌ−ゼリー−１２５は、ＴＧＦ−β１プロモーター活性の阻害において有意差を示した。阻害率は、それぞれ、８６％（Ｐ＜０．０１）、５５％（Ｐ＜０．１）、９５％（Ｐ＜０．０１）、４６％（Ｐ＜０．１）だった（図７）。このデータにより、凍結乾燥状態である、高濃度（１２５μｇ／ｍｌ）のＡＭＥ又はゼリーが、凍結乾燥状態でないＡＭＥよりも有効であることが示唆された。最も低い濃度の市販のＨＡ（４μｇ／ｍｌ）は、ＡＭＥ／１２５中のＨＡ濃度（３．８μｇ／ｍｌ）に近いが、ＡＭＥ／１２５の抑制の有効性は、ＨＡよりもはるかに強力である（データ示さず）。しかも、ＡＭＥの全体の形態は、ゼリー形態よりも、よりよいＴＧＦ−β抑制を示した。
【０２３７】
コラーゲンゲル又はＨＡと混合したＡＭ抽出物によるＴＧＦ−β１プロモーター活性の抑制
次に、天然タイプ１コラーゲンゲルと水溶性ＡＭ抽出物の混合物を調製した。この混合物を調製するために、最初に、ラットの尾腱（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州）から調製した４ｍｇ／ｍｌのコラーゲンのストック溶液を０．１Ｎ酢酸を用いて希釈し、１／２０容量の２０ｘＤＭＥＭ及び１ＮのＮａＯＨと混合することにより、コラーゲンゲルを調製した。３７℃でインキュベーションすることにより、コラーゲンゲルが形成された。次に、水溶性ＡＭ抽出物（本明細書に記載されているように調製された）を、ＤＭＥＭ中に２５μｇ／ｍｌの濃度になるように希釈し、その後上記コラーゲンゲルと混合した。タイプ１コラーゲンゲルと混合したＡＭ抽出物の抑制作用は、ＢＳＡのみを添加した対照と比較して、ＡＭ抽出物（ＡＭＥ）のみを使用した場合の抑制作用と同様だった（図８、Ｐ＜０．０１）。コラーゲンゲルのみ（Ｃｏｌ）も、プラスチックの対照と比べると、同様の抑制活性を示した（図８、Ｐ＜０．０１）。ＡＭＥをコラーゲンゲルに添加すると（Ｃｏｌ＋ＡＭＥ）、より抑制された（図８、Ｐ＜０．０１）。水溶性ＡＭ抽出物（ＡＭＥ）をＨＡゲルと混合すると、ＴＧＦ−β１のプロモーター活性に対する抑制作用は、ＡＭＥのみにより発現される抑制作用と同じように（図９）、ＨＡのみ（対照として、ＢＳＡと混合した）と比較して、より保存された（図５、Ｐ＜０．０１）。従って、ＡＭ抽出組成物、又はこれのコラーゲンとの併用は、眼組織におけるＴＧＦ−β活性を抑制するのに有用である。
【０２３８】
実施例２：羊膜の構成成分の特徴づけ
材料と方法
各抽出物中のタンパク質の濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）により定量した。各抽出物中のヒアルロン酸（ＨＡ）の濃度は、ＨＡの段階希釈により作成されたメーカーにより提供された検量線を用いて、ＥＬＩＳＡに基づくヒアルロン酸（ＨＡ）定量テストキット（Ｃｏｒｇｅｎｉｘ，Ｗｅｓｔｍｉｎｓｔｅｒ、コロラド州）を用いてアッセイした。
【０２３９】
ヒアルロニダーゼ消化によるＨＡの分子量範囲の分析
各種抽出物のＨＡの分子量範囲を、Ｌｅｅ及びＣｏｗｍａｎにより記述される方法（Ｌｅｅ，Ｈ．Ｇ．及びＣｏｗｍａｎ，Ｍ．Ｋ．Ａｎ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，２１９，２７８−２８７）に従って、アガロースゲル電気泳動により分析した。サンプルを、０．５％アガロースゲル電気泳動にアプライし、次に０．００５％のステインズオール（Ｓｔａｉｎｓ−Ａｌｌ）（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃２３０９６−０）を用いて５０％のエタノール中で染色した。ゲルの染色は、室温にて光保護カバーで覆い、一晩行った（３〜４時間のこれより短い時間での染色も許容される結果をもたらす）。そのゲルを水に移し、約６時間室内用照明器具に暴露することにより、脱染すると、ＨＡは、青いバンドとして可視化された。分子量スタンダードは、分子量０．９〜５．７ｘ１０6の範囲にわたるラムダＤＮＡ−ＢｓｔＥＩＩ消化制限フラグメント（ｃａｔ＃Ｄ９７９３、Ｓｉｇｍａ）を含んでいた。ＨＡの確実性は、陽性対照としてヒト臍帯から精製した高分子ＨＡ（ｃａｔ＃Ｈ１８７６、Ｓｉｇｍａ）を用い、反応緩衝液（上記プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤を加えた、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％のＢＳＡ）の中で、１０ユニット／ｍｌのヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ１１３６）を加えて、又は加えずに抽出物を２時間３７℃でインキュベーションすることにより、さらに実証した。
【０２４０】
ウェスタンブロット分析
上記抽出物を４〜１５％変性アクリルアミドゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース膜に移した。その後、ウサギ抗ヒトインター−α−トリプシン阻害剤（ウサギポリクローナル抗体（ｃａｔ＃Ａ０３０１、ＤＡＫＯ、１：１０００））、ウサギ抗ヒトＴＳＧ−６ポリクローナル抗体（Ｄｒ．Ｔｏｎｙ  Ｄａｙ氏により提供された、１：１０００希釈）、ラットモノクローナル抗−ＰＴＸ３抗体（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＡＬＶ−８０４−４６４，１μｇ／ｍｌ）、Ｃａｌｉｂｉｏｃｈｅｍから入手した抗トロンボスポンジン１抗体（ｃａｔ＃ＢＡ２４）、ヤギ抗ヒトＳｍａｄ７抗体（ＡＦ２０２９、１：１０００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてイムノブッロトを実施した。免疫反応性タンパクバンドは、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｉｎｇ  ＴＭＣ化学発光試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により検出した。
【０２４１】
結果
実験により、水溶性ＡＭ抽出物が９０℃で１０分間前処理された場合、観察されたＴＧＦ−β１プロモーター活性に対する抑制作用が消滅したことが示された。これにより、関係する成分は、立体構造が重要なタンパク質を含んでいる可能性が高いことが示唆された。
【０２４２】
ＡＭ抽出物中のＨＡ及びタンパク質の定量
以下の表にまとめた結果は、全てのＡＭとゼリー抽出物が、ＨＡとタンパク質の両方を含んでいることを示した。一般に、全抽出物中におけるタンパク質とＨＡとの重量比は、ＡＭを遠心分離した後の上清（例えば、ＰＢＳにおけるＬとＨ、かつバッファーＡにおけるＡ）よりも高い。これにより、ほとんどのタンパク質含有物質は、遠心分離により除去されることが示唆された。しかし、この傾向はＡＭゼリーには認められなかった。これにより、ＡＭ抽出物は、ゼリーよりも多くのタンパク質を含んでいることが示唆された（ＰＢＳにおけるＴ及びＡ／Ｂ／ＣにおけるＴ参照）。また、タンパク質とＨＡとの比は、ＡＭとＡＭゼリーの両方において、抽出物Ａから抽出物Ｂ及びＣへと増加した。このことは、ＨＡはほとんどが可溶性形態で含まれ、反対に、タンパク質は非水溶性成分中に含まれていることを支持する。さらに、ＨＡは、Ａ／Ｂ／Ｃにおいて、遠心分離後、ＡＭゼリーから大部分が除去された。
【０２４３】
【表１】
0005505760.tif 000002
【０２４４】
異なるＡＭ抽出物中のＨＡは、１，０００，０００Ｄａよりも大きい分子量を有する。
高分子量（＞１０6Ｄａ）のＨＡは、全抽出物中や抽出物Ａ中に存在していた（図１０）。しかし、より大きい分子量のＨＡが抽出物Ｂ中に存在しており、また、抽出物Ｃ中には、ＨＡがさらに大きい分子量を持つ細いバンド中に含まれていた（図１０）。全てのＨＡ含有成分は、ヒアルロニダーゼ消化後消滅した。これにより、これらの抽出物は実際にＨＡを含んでいたことが確認された。陽性対照であるＳｉｇｍａから入手したＨＡ（ｃａｔ＃Ｈ１１３６）と比較して、同じような高分子量（＞１０6Ｄａ）のＨＡが、低速と高速遠心分離後に得られた上清の両方にも含まれていた（図１１）。また、これらのＨＡ含有バンドは、ヒアルロニダーゼ消化後消滅した。ＡＭゼリーについても、同様の結果が得られた（図示せず）。
【０２４５】
インター−α−トリプシン阻害剤（ＩαＩ）は各種ＡＭ抽出物中に存在し、その重鎖（ＨＣ）はＨＡに共有結合する。
図１２は、ヒアルロニダーゼによる消化前には、遊離重鎖が異なる複合体中に存在し、少量の軽鎖（ＵＴＩ又はビクニン）も存在していることを示した。しかし、全ての抽出物中、すなわち、全抽出物と抽出物Ａ、Ｂ、Ｃ中において、ＨＡとＩαＩの重鎖間で共有結合した複合体が存在し、その後者は、ヒアルロニダーゼによる消化後のみ遊離した。同じ結果が、異なる２種の速さの遠心分離処理により得られた抽出物Ｈ及びＬにおいても得られた（図１３）。
【０２４６】
腫瘍壊死因子活性化遺伝子６（ＴＳＧ−６）もＡＭ抽出物中に存在する。
図１４は、ＴＳＧ−６（約３８ｋＤａ）が、全抽出物、抽出物Ａ、抽出物Ｃ中に存在していることを示した。抽出物Ａには、精製ＴＳＧ−６（約３５ｋＤ）のバンドに近い約３８ｋＤａの移動バンドが存在した。他の約４５ｋＤａと５５ｋＤａのバンドの正体は分からなかった。全ＡＭ抽出物（遠心分離処理なし）である、「Ｔ」は、抽出物Ａ（遠心分離処理後）に含まれていた二本のバンド（両方とも３５ｋＤより大きい）及びそれよりさらに大きい一本のバンド（５５ｋＤ）を示したが、その低いほうのバンド（４５ｋＤ）は、抽出物Ｃにも含まれていた。これらの全てのバンドは、サンプルをヒアルロニダーゼ（図１４）又はＦ−グリコシダーゼ（図１５）により処理をしても、著しく変化しなかった。しかし、コンドロイチン硫酸ＡＢＣリアーゼを用いた消化により、ＭＡＢ２１０４抗体（図１７）ではなく、ＲＡＨ−１抗体（図１６）を用いることにより、よりはっきりと分かる３８ｋＤバンドをもたらした。
【０２４７】
ペントラキシン（ＰＴＸ−３）は、もっぱら水溶性ＡＭ抽出物中に存在し、ＨＡと複合体を形成する。
図１８は、ＰＴＸ−３もＡＭ抽出物中に存在することができ、水溶性抽出物Ａ中でのみ、ＨＡと複合体を形成することを示した。
【０２４８】
トロンボスポンジン（ＴＳＰ−１）は、各種ＡＭ抽出物中に存在する。
図１９は、全てのＡＭ抽出物は、ＴＳＰ−１の高分子量のバンドを有し、一方、全抽出物（Ｔ）と抽出物Ｃもまた、３５〜１２０ｋＤａ間にいくつかのバンドも有することを示した。ヒアルロニダーゼによる消化によっても、いくつかのバンドが若干強くなったり弱くなったりした以外は、反応パターンは変わらなかった。
【０２４９】
Ｓｍａｄ７は、水溶性ＡＭ抽出物中にほとんどが存在する。
Ｓｍａｄ７は、ＡＭのＰＢＳ抽出物中及び尿素抽出物中の両方に含まれていた（図２０）。
【０２５０】
実施例３：水溶性ＡＭ抽出物は、保管により、又は機械的及び酵素的方法により引き起こされる傷害により誘発される角膜上皮細胞（基底細胞及び角膜実質細胞）の細胞死を阻止する。
結果
ＡＭ抽出物が、損傷した組織におけるアポトーシスを阻止することができることを実証するために、マウスモデルを用いて以下の実験を実施した。全部で２２匹のマウスの眼球を摘出し、そのうちの２つを、前処理対照として凍結切片を得るために、直ちにＯＣＴに包埋した。残りの２０眼球は、３つのサブグループに分けた。すなわち、１）機械的掻爬（ｎ＝８）；２）消化処理（酵素的）（ｎ＝６）；３）無処理の対照（ｎ＝６）。各グループにおいて、同じ数の眼球を、処理に先だって、規定の添加剤（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を添加した角膜実質細胞無血清培地（ＫＳＦＭ）中において、１２５μｇ／ｍｌのＡＭ抽出物が存在する（＋）又は存在しない（−）条件下にて４℃で２４時間、プレインキュベートした。ＫＳＦＭ＋／−ＡＭ抽出物（本明細書に記載のように調製）中にてインキュベート開始後最初の２４時間の終わりに、サブグループ１の８個の眼球を、手術用刃を用いて機械的に掻爬し、これをさらに二つのグループに分けた（それぞれ、ｎ＝４）。その後、ＫＳＦＭ＋／−ＡＭ抽出物にて３７℃でインキュベートした。サブグループ２の６個の眼球に対し、１０ｍｇ／ｍｌのディスパーゼＩＩを用いて、ＫＳＦＭ＋／−ＡＭ抽出物中において、１８時間４℃で酵素消化をした（それぞれ、ｎ＝３）。各グループからの１個の眼球をＯＣＴに包埋し、凍結切片を得た。各グループの残りの２個の眼球は、分析前に、さらに２４時間、ＫＳＦＭ＋／−ＡＭ抽出物中において、インキュベートした。無処理の対照（ｎ＝６）については、３個の眼球をそれぞれ、ＫＳＦＭ＋／−ＡＭ抽出物中において、３７℃で連続的に２日間インキュベートした。１個の眼球は、最初の一日の最後に取り出し、２個の眼球は、２日の最後に取り出した。
【０２５１】
これらの眼球から得られた凍結切片は、ＴＵＮＥＬ染色を施した。簡単に説明すると、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州）から入手されるＤｅａｄＥｎｄ（登録商標）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ＴＵＮＥＬ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、メーカーの使用説明書に従って、末端デオキシヌクレオチド転移酵素媒介ＦＩＴＣ結合ｄＵＴＰニック末端ＤＮＡ標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイを実施した。切片は、４％ホルムアルデヒド中で２０分間室温にて固定し、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて透過処理した。その後、サンプルは、切れ目の入った３’−ヒドロキシルＤＮＡ末端を修復するために、外因性ＴｄＴとフルオレセイン結合ｄＵＴＰを用いて、６０分間３７℃でインキュベートした。陽性対照として、細胞をＤＮａｓｅＩで処理し、また、陰性対照は、ｒＴｄＴ酵素を含まないバッファーを用いてインキュベートした。アポトーシス核は緑の蛍光により標識され、また核は赤の蛍光としてＤＡＰＩで対比染色された。
【０２５２】
水溶性の形態のＡＭ抽出物を、水溶性ＡＭ抽出物を調製する方法に従って調製した。ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，イリノイ州）を使用して、ＡＭ抽出物中の全タンパク質を定量した。
【０２５３】
正常なマウスの眼球は、ＫＳＦＭ中でインキュベートする前に、未損傷の対照における角膜上皮の表層中においてのみ、最少量のアポトーシスを示し、間質の角膜実質細胞におけるアポトーシスは認められなかった。しかし、ＫＳＦＭ中にて２４時間、４℃のインキュベーションを行った後、表層間質の角膜実質細胞におけるアポトーシスのゆるやかな増加がみられた。このような、角膜実質細胞のアポトーシスの増加は、ＡＭ抽出物により抑制された。
【０２５４】
また、ＡＭ抽出物は、細胞に機械的損傷を与えた後のアポトーシスを減少させることが示された。機械的掻爬後、マウスの眼球は、角膜実質細胞のアポトーシスの顕著な増加を示した。しかし、機械的掻爬後、ＡＭ抽出物を加えてインキュベートすると、角膜実質細胞のアポトーシスが減少した。
【０２５５】
また、マウスの眼球を酵素的に処理し、細胞に損傷を与えた。ＫＳＦＭ中にて４℃で１８時間ディスパーゼ消化により、角膜実質細胞だけでなく、上皮細胞においても顕著な量のアポトーシスがもたらされた。上皮細胞のアポトーシスは、表層上皮細胞だけでなく、基底上皮細胞において見られることが分かった。上皮細胞と角膜実質細胞のアポトーシスの度合いは、機械的掻爬後に見られたアポトーシスよりも非常に大きかった。ディスパーゼ消化中のＡＭ抽出物のインキュベーションは、上皮細胞と角膜実質細胞の両者のアポトーシスを著しく削減させた。これは、ディスパーゼ処理は、基底膜を対象としうる外科的傷害（例えば、ＰＲＫにおけるエキシマアブレーション）や病的傷害（例えば、再発性角膜びらん）を模倣しているので、大きな意味を持つ。この実験の結果は、損傷した細胞を有する組織へのＡＭ抽出物の適用が、細胞の損傷を減少させるあるいは予防するために使用することができることを実証する。
【０２５６】
実施例４：羊膜間質抽出物は、筋線維芽細胞を脱分化する。
材料
ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、０．２５％のトリプシン／０．５３ｍＭのＥＤＴＡ、ライブアンドデッド細胞生存率アッセイ試薬（Ｌｉｖｅ  ａｎｄ  Ｄｅａｄ  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｒｅａｇｅｎｔ）、ＦＩＴＣ結合ファロイジンはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州）から購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加剤、ホルムアルデヒド、プロテアーゼ阻害剤カクテル、マウス抗デスミン抗体、ＦＩＴＣ結合抗マウス、ヤギ、ラットＩｇＧ、ヨウ化プロピジウム、ヘキスト−３３３４２色素はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州）から入手した。トランスウェルインサートは、コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ニューヨーク州）から入手した。タイプＩコラーゲンは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，マサチューセッツ州）から入手した。ＢＣＡ（登録商標）タンパク質アッセイキットは、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，イリノイ州）から入手した。ディスパーゼＩＩとコラゲーゼはＲｏｃｈｅ（Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，ドイツ）から入手した。マウス抗αＳＭＡとＫｉ６７抗体はＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，カリフォルニア州）から入手した。ウサギ抗ビメンチン抗体はＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，マサチューセッツ州）から入手した。マウス抗ＥＤＡフィブロネクチン抗体はＣｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，カリフォルニア州）から入手した。ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧは、ＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，カリフォルニア州）から入手した。退色防止封入液はＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、カリフォルニア州）から入手した。凍結保存ヒトＡＭはＢｉｏ−Ｔｉｓｓｕｅ（マイアミ，フロリダ州）から入手した。
【０２５７】
細胞培養
ヒトの組織は、ヘルシンキ宣言に従って取り扱った。生のヒト胎盤は、Ｂａｐｔｉｓｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（マイアミ，フロリダ州）から、ＩＲＢ承認プロトコルに基づいて、インフォームドコンセントを得てから帝王切開後入手した。ゲンタマイシンとアンホテリシンＢを含むＰＢＳにより２回リンスを行った後、ＡＭを絨毛膜から機械的にはがし取り、小片（約３０ｍｍの直径）にカットした。その後、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中の１０ｍｇ／ｍｌのディスパーゼＩＩを用いて消化処理を３７℃にて２０分間行った。その後、解剖顕微鏡下で羊膜上皮を外科的ピーリングにより取り除き、残りの間質を、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中の２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼにより、３７℃にて１４時間さらに消化した。８００ｘｇで５分間の遠心分離により細胞を回収し、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭに再懸濁し、加湿環境下、空中５％のＣＯ2で３７℃にて培養した。培地は２日おきに交換した。酵素消化前のＡＭも、凍結切片作成のために、ＯＣＴに包埋した。ヒト強角膜組織は、Ｆｌｏｒｉｄａ  Ｌｉｏｎｓ  Ｅｙｅ  Ｂａｎｋ（マイアミ，フロリダ州）から入手した。そこから、角膜線維芽細胞（ＨＣＦ）を採取し、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭで培養した。継代２代目（Ｐ１）の細胞を全ての実験に使用した。
【０２５８】
水溶性ＡＭ間質抽出物及びＡＭインサートの調製
無菌的方法を用い、凍結保存されたヒトＡＭを、保存培地を除去するために、ＨＢＳＳを用いて２〜３回簡単に洗浄した。ＡＭ間質はスパチュラでこすり落とし、液体窒素の気相中で凍結させ、バイオパルベライザー（ＢｉｏＰｕｌｖｅｒｉｚｅｒ）（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，オクラホマ州）で微粒子になるように粉砕し、その後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅａｒｏｒ（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｒｅｍｅｌ，ウィスコンシン州）を用いて、氷上にて１分間ホモジナイズした。得られたホモジネートは、１時間回転することにより混合し、その後１４，０００ｘｇにて３０分間４℃で遠心分離した。得られたＰＢＳ中の上清を回収し、アリコットに分け、−８０℃で保管した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイを用いて定量した。この水溶性タンパク質抽出物は羊膜間質抽出物（ＡＳＥ）と命名した。ＡＭインサートの調製については、ＡＭを使用する直前に解凍し、ＨＢＳＳで３回洗浄し、約２．５ｘ２．５ｃｍの大きさの小片にカットし、間質基質が上を向くようにして、カルチャーインサート上に固定した。
【０２５９】
免疫染色
ＡＭのクリオスタット切片（４μｍ）を、アセトン中で１０分間−２０℃にて固定し、培養したＡＭＳＣとＡＭＳＣを含んだＡＭ全マウントを、４％パラホルムアルデヒド中で３０分間４℃にて固定した。切片又は培養細胞は、ＰＢＳで３回、各５分間ずつリンスし、その後０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回、各５分間ずつリンスし、非特異的染色をブロックするために、２％ＢＳＡでプレインキュベーションした。切片又は細胞は、抗αＳＭＡ（１：２００）抗体、抗デスミン（１：２００）抗体及び抗ビメンチン（１：２００）抗体を加えて、１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回１５分間洗浄を行い、その後、切片又は細胞は、ＦＩＴＣ又はテキサスレッド結合二次抗体を加えて、４５分間インキュベートした。Ｆ−アクチンで標識するために、細胞は、さらに２００ユニット／ｍｌの濃度のＦＩＴＣ結合ファロイジンで１５分間染色した。さらにＰＢＳで３回、各１５分間ずつ洗浄を行い、その後、核をＰＩ（１：２０００）で１分間、又はヘキスト−３３３４２で１５分間染色し、次いで、蛍光顕微鏡で分析した。Ｋｉ６７の免疫組織化学染色のために、内在性のペルオキシダーゼ活性を、０．６％の過酸化水素で１０分間処理することによりブロックした。非特異的染色は、１％の通常のヤギ血清で３０分間処理することによりブロックした。次に、細胞を抗Ｋｉ６７抗体（１：５０）を加えて１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回、各１５分間ずつ洗浄を行い、その後、細胞は、ビオチン化したウサギ抗マウスＩｇＧ（１：１００）を加えて３０分間インキュベートした。次に、ＡＢＣ試薬を加えて３０分間インキュベートした。反応生成物は、ＤＡＢで５分間処理して発色させ、光学顕微鏡下で調査した。
【０２６０】
ウェスタンブロット分析
プラスチック、コラーゲン、又はＡＭ表面から、培養したＡＭＳＣ又は筋線維芽細胞を回収し、冷ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のノニデットＰ−４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）で抽出した。溶解物から抽出した同じ量のタンパク質を４％〜１５％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で分離し、その後、ニトロセルロース膜に電気泳動的に移した。５％の脱脂乳で１時間ブロッキングを行った後、ブロットを、αＳＭＡとＥＤ−Ａフィブロネクチンに対する一次抗体を加えてインキュベートした。添加対照として、αアクチンを使用した。特定の結合は、抗マウス又は抗ウサギ西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体により検出し、化学発光法により増強して可視化した。
【０２６１】
統計的分析
上記の実験は、全て３回（各回につき３通り以上）繰り返した。群平均は、適切なバージョンのスチューデント不対ｔ検定を用いて比較した。試験結果は、ｐ＜０．０５の両側ｐ値を統計的に有意とみなして記載した。要約データは、平均±Ｓ．Ｄ．として記載する。
【０２６２】
結果
ＡＭＳＣの生体内での表現型
羊膜上皮細胞をディスパーゼＩＩにより除去した後、ＡＭ中のＡＭＳＣは、ｉｎ  ｓｉｔｕで観察することができた。位相差顕微鏡により、それらは樹状形態を示し、薄化ステップにより細胞間接触を維持していた（図２１Ａ）。細胞生存率、樹状形態、細胞間接触は、ライブアンドデッド（Ｌｉｖｅ  ａｎｄ  Ｄｅａｄ）アッセイを用いて染色することにより、より良好に可視化された（図２１Ｂ）。ＡＭの横断面の免疫染色により、ＡＭＳＣがαＳＭＡ（図２１Ｃ）とデスミン（図２１Ｄ）を発現しないことが示された。一方、陽性対照としての臍帯間葉系細胞は、αＳＭＡとデスミンの両方に対し、強い染色を示した（それぞれ、図２１Ｃ、２１Ｄの挿入図参照）。しかし、すべてのＡＭＳＣはビメンチンを発現した（図２１Ｅ）。これらのデータは、ひとまとめにすると、ＡＭＳＣは、生体内で繊維芽細胞の表現型を有していることを示した。
【０２６３】
生体内のＡＭＳＣの筋繊維芽細胞への迅速分化
ＡＭＳＣのインビトロの分化を調べるために、コラゲナーゼにより単離したＡＭＳＣをプラスチック皿上に播種し、１０％のＦＢＳを含んだＤＭＥＭで、２００個／ｍｍ2の密度で培養した。４〜５日以内に、細胞は典型的な繊維芽細胞の細胞形状をとり（図２２Ａ）、かつαＳＭＡ陰性のままであった（図２２Ｅ）。しかし、ある細胞は、１週間の培養の終わりには、細胞の大きさが増加し始め、形状が変化し始め（図２２Ｂ）、かつαＳＭＡを発現し始めた（図２２Ｆ）。別のプラスチック皿で同じ培地を用いて継代培養した後、大部分の細胞は、１週間の継代１代目の終わりには、典型的な筋繊維芽細胞の細胞形状を発現し（図２２Ｃ）、最終的には全ての細胞が、１週間の継代２代目の終わりには筋繊維芽細胞の形状に変化し、顕著な微小線維を有した（図２２Ｄ）。従って、αＳＭＡ陽性筋繊維芽細胞は、１週間の初代培養における７１．９±３．７％から、継代１代目の培養には９３．９±４．１％、継代２代目の培養には９８．５±１．７％へと劇的に増加した（図２２Ｉ）。にもかかわらず、デスミンの発現は、継代２代目の培養でもいまだ陰性だった（データ示さず）。ウェスタンブロット分析は、生体内のＡＭＳＣは、ＥＤ−Ａフィブロネクチンを弱く発現していたが、αＳＭＡは発現していなかったことを示した。しかし、αＳＭＡとＥＤ−Ａフィブロネクチンの発現は初代培養の終わりには劇的に増加し、継代２代目においても維持されていた（図２２Ｊ）。これらの結果は、ＡＭＳＣがこの血清含有培地を用いたプラスチック上で迅速に筋繊維芽細胞に分化したことを示した。
【０２６４】
ＡＭＳＣから分化した筋繊維芽細胞は、ＡＭ間質基質上で継代培養すると逆行させることができた。
我々の過去の研究において、我々は、初代培養からＡＭの間質基質上でヒト又はマウスの角膜実質細胞を培養すると、ＡＭがヒト又はマウスの角膜実質細胞の筋繊維芽細胞への分化を阻害しうることを示した。ＡＭ間質基質が分化した筋繊維芽細胞の表現型も強力に調節するかどうかさらに調べるために、継代２代目におけるＡＭＳＣから分化した筋繊維芽細胞をＡＭの間質基質上で継代培養し、対照としてコラーゲンＩで被覆した皿上で継代培養したものと比較した。１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養を開始してから７日間後、コラーゲンＩ上のＡＭＳＣは、いまだに筋繊維芽細胞の形状を維持していた（図２３Ａ）。これに対し、ＡＭ間質基質上に播種した細胞は、円形、紡錘形、細長い形、樹状形が混ざっている形状を呈していた（図２３Ｂ）。ライブアンドデッド（Ｌｉｖｅ  ａｎｄ  Ｄｅａｄ）アッセイにより、コラーゲンＩ（図２３Ｃ）とＡＭ基質（図２３Ｄ）上の細胞は、両者ともに１００％の生存率を維持していることが確認されたが、細胞形状は著しく異なっていることが分かった。ファロイジンに対する免疫染色により、コラーゲンＩ上に播種された筋繊維芽細胞においては、鮮明なストレスファイバー（図２３Ｅ）が示され、これはまた強いαＳＭＡ発現も含んでいた（図２３Ｇ）。これに対し、ＡＭ間質基質上に播種した細胞においては、ファロイジン染色は弱くかつまばらで（図２３Ｆ）、αＳＭＡ染色はぼんやりしていた（図２３Ｈ）。ウェスタンブロット分析により、ＡＭＳＣ由来の筋繊維芽細胞は、タイプＩコラーゲン上に播種された場合、連続して多量のＥＤ−ＡフィブロネクチンとαＳＭＡを発現することが確認された（図２３Ｉ）。これに対し、ＡＭ間質基質上に播種された場合、ＥＤ−Ａフィブロネクチンの発現は減少し、αＳＭＡの発現は検出できなくなった（図２３Ｉ）。これらの結果をまとめると、ＡＭＳＣから分化した筋繊維芽細胞は、ＡＭ間質基質上で継代培養した場合、いまだに繊維芽細胞の表現型に逆行しうることが示された。
【０２６５】
羊膜間質抽出物はＡＭＳＣの筋繊維芽細胞への分化を抑制し、分化した筋繊維芽細胞を逆行させる。
ＡＭ間質基質による上記の逆行活性が水溶性ＡＭ間質抽出物中で保持されるかどうかさらに調べるために、初代ＡＭＳＣ（Ｐ０）を、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で、１００μｇ／ｍｌのＡＳＥを加えて、あるいは加えずにプラスチック上で培養した。その結果、ＡＭＳＣは、ＡＳＥの有無に関わらず培養を開始してから４日後において、紡錘状の繊維芽細胞の形状を維持していることが分かった（それぞれ、図２４Ａ、２４Ｂ）。しかし、その時、ＡＳＥを添加しなかった場合、αＳＭＡを既に発現しており（図２４Ｅ）、一方、ＡＳＥを添加した場合、αＳＭＡの発現をしないままだった（図２４Ｆ）。培養を１０日間に延長した場合、図２に示すように、ＡＭＳＣは拡張した形状を示し、活発にファロイジン陽性ストレスファイバーを発現し（図２４Ｃ）、αＳＭＡの陽性発現を含んでいた（図２４Ｇ）。印象的だったのは、ＡＳＥが存在する場合、ＡＭＳＣは小核と共に凝集して、様々な大きさの球を形成した（図２４Ｄ）。球になったこれらの細胞は、ライブアンドデッド（Ｌｉｖｅ  ａｎｄ  Ｄｅａｄ）アッセイにより、生存可能な状態を維持していた（データ示さず）。いくつかの球は、プラスチック皿から離れるが、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭに切り替えると、新しいプラスチック皿に再び付着することができ、新たに筋繊維芽細胞の増殖を開始した（データ示さず）。ファロイジン染色により、ストレスファイバーは全く発現せず（図２４Ｄ）、一方、球におけるαＳＭＡの発現は弱いことが分かった（図２４Ｈ）。これらの結果により、ＡＳＥは実際にＡＭＳＣの筋繊維芽細胞への分化を妨げることができることが示された。
【０２６６】
ＡＭ間質基質による上記の逆行活性がＡＳＥ中で保持されるかどうか調べるために、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭを含むプラスチック上の継代２代目のＡＭＳＣ培養液に、１００μｇ／ｍｌのＡＳＥを１週間加えた。前に述べたように（図２２）、この時までに、ほとんど全ての細胞が扁平上皮形態と顕著なストレスファイバーを有し、かつ強力にαＳＭＡの発現を示す筋繊維芽細胞に変化していた。ＡＳＥを添加することにより、細胞は、αＳＭＡの発現が著しく減少した（図２５Ｂ）、細長い、あるいは紡錘状の形状（図２５Ａ）に逆行した。ウェステンブロット分析により、ＡＳＥの添加後、ＥＤＡフィブロネクチンとαＳＭＡの発現の減少がさらに確認された（図２５Ｃ）。これらの結果により、ＡＭ間質は、前もって添加した場合、ＡＭＳＣの筋繊維芽細胞への分化を抑制することができ、後になって添加した場合、分化した筋繊維芽細胞を繊維芽細胞に逆行させることができる可溶性因子を含むことが示された。
【０２６７】
筋繊維芽細胞の逆行は、細胞増殖に関連していなかった。
上記ＡＳＥによるＡＭＳＣの筋繊維芽細胞から繊維芽細胞への表現型の逆行が、細胞の増殖に伴って起こるかどうかさらに調べるために、我々は、図２において記述したようにほとんど全ての細胞が筋繊維芽細胞に変化した継代３代目の培養液において、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭから無血清のＤＭＥＭ／ＩＴＳに培地を切り替えた。６日間の観察プロセッシングにおいて、対照倍地中の細胞は、細胞質中に顕著なストレスファイバーを有する同じ筋繊維芽細胞形態を維持していた（図２６Ａ及び２６Ｄ）。しかし、ＡＳＥを加えた実験培地中の細胞は、徐々にその形状を、０日目（図２４Ｅ）の大きくかつ扁平な形状から、２日目と４日目（それぞれ、図２６Ｆ及び２６Ｇ）には紡錘状かつ細長い形状に変化させ、６日目（図２６Ｈ）において、最終的には、いくつかの細胞は縮んで小さくなった。ＡＳＥの添加により引き起こされたこのような劇的な形態の変化に伴って、αＳＭＡを発現するストレスファイバーも失われた（図２６Ｉ〜２６Ｌ）。Ｋｉ６７染色により、Ｐ３の培養液のＤＭＥＭ／ＩＴＳ中の筋繊維芽細胞は、ＡＳＥの添加の有無に関わらず、細胞増殖を全く発現しなかったことが確認された（それぞれ、図２６Ｍ、２６Ｎ）。対照として、Ｐ１培養液中のＡＭＳＣは、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中のプラスチック上で培養した場合、時々Ｋｉ６７陽性核を示した（図２６Ｏ）。一方、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中のプラスチック上で培養したヒトの角膜繊維芽細胞の多くは、Ｋｉ６７陽性核を示した（図２６Ｐ）。これらの結果は、ＡＳＥは、細胞増殖に影響を及ぼすことなく、ＡＭＳＣの筋繊維芽細胞への分化を妨げるだけでなく、ＡＭＳＣから分化した筋繊維芽細胞を繊維芽細胞に逆行させるという概念を強く支持した。
【０２６８】
形態及びＳｍａｄシグナル伝達の相違、及びＡＭ間質基質によるＴＧＦ−βプロモーター活性の抑制
コラゲナーゼにより新たに単離したマウス間質細胞は、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中のプラスチック上で培養すると繊維芽細胞の形態を発現したが、同じ培地を用いてＡＭ間質基質上で培養すると、樹状形態を発現した。免疫染色により、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１による暴露後でさえ、ＩＴＳを含むＤＭＥＭ中のＡＭ上で培養した樹状形態の角膜実質細胞におけるＳｍａｄ４による核排除が示された。これに対し、細胞の増加率は、プラスチック上で培養した場合の１３％から、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１を添加後３時間及び５日間経過すると、それぞれ６７％及び８５％に増加した。これらの結果は、ＡＭ間質基質は、角膜実質細胞の表現型を維持するのに役立つＳｍａｄ媒介Ｔ−ＴＧＦ−βシグナル伝達を抑制することを示唆する。
【０２６９】
プラスチック上、及び無処理の凍結保存したＡＭ（凍結保存された無処理のＡＭの調製について本明細書に記載されているように調製した）上で培養したマウス角膜繊維芽細胞を、ＣＭＶ−βガラクトシダーゼを加えたＴＧＦ−β２プロモータールシフェラーゼ、又はＣＭＶ−βガラクトシダーゼを加えたＴＧＦ−βＲＩＩプロモータールシフェラーゼを用いて４８時間同時形質移入した。細胞抽出物は、ルシフェラーゼとβガラクトシダーゼの両方の活性についてアッセイした。ＴＧＦ−β２とＴＧＦ−βＲＩＩのプロモーター活性の相対ルシフェラーゼ単位は、ＡＭ上で培養した細胞において抑制された。
【０２７０】
実施例５：ＡＭ抽出物は、ヒトの角膜縁の外植片からの繊維芽細胞の遊走を抑制する
材料及び方法
ＰＢＳによる全可溶性ヒトの羊膜抽出物の調製
全可溶性ヒトＡＭ抽出物（Ｔ）の調製に関する全手順は、次の細胞培養ベースの実験で使用できるように無菌的に行った。凍結ヒト胎盤は、Ｂｉｏ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｃ．（マイアミ、フロリダ州）から入手し、そこからＡＭを回収した。ＡＭは、バイオパルベライザー（ＢｉｏＰｕｌｖｅｒｉｚｅｒ）（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，オクラホマ州）の容器に入るように、小片にスライスし、液体窒素で凍結させ、次いで微粉末になるよう粉砕した。得られた粉末は秤量し、プロテアーゼ阻害剤（プロテアーゼ阻害剤カクテル、Ｐ８３４０、Ｓｉｇｍａ、１ｍＭのＰＭＳＦを含む）とホスファターゼ阻害剤（５０ｍＭのフッ化ナトリウムと０．２ｍＭのバナジン酸ナトリウム）を含む冷ＰＢＳ緩衝液（１０ｘＰＢＳ（ｃａｔ＃７００１１−０４４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）から蒸留水を加えて１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）に調製した）と１：１（ｍｌ／ｇ）の割合で混合した。混合物は氷上に保持し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅａｒｏｒ（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｒｅｍｅｌ，ウィスコンシン州）を用いて、５回、各１分間ずつ（各回が終わるたびに２分間冷却する）ホモジナイズした。この水溶性抽出物は「全」（Ｔ）と命名した。全水溶性抽出物は４℃にて１時間混合し、次に４℃で３０分間４８０００ｘｇにて遠心分離した。得られた上清はアリコットに分け、−８０℃で保管した。
【０２７１】
ヒトの角膜縁の外植片の培養
ヒトの組織は、ヘルシンキ宣言の原則に従って取り扱った。角膜縁は、ドナーの角膜（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｙｅ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｆｌｏｒｉｄａ，Ｏｒｌａｎｄｏ，フロリダ州）又は移植後のドナーの角膜（Ｆｌｏｒｉｄａ  Ｌｉｏｎｓ  Ｅｙｅ  Ｂａｎｋ，マイアミ，フロリダ州）のいずれかから入手した。余分な強膜、虹彩、角膜内皮、結膜、テノン嚢は取り除いた。残りの角膜縁は、ＨＥＰＥＳ緩衝タイプのＤＭＥＭと、５％のＦＢＳ、０．５％ＤＭＳＯ、２ｎｇ／ｍｌのマウスＥＧＦ、５μｇ／ｍｌのインスリン、５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌのセレニウム、０．５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０ｎＭのコレラ毒、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１．２５μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢを含むＨａｍ  Ｆ１２培地と、の同容量混合物からなるＳＨＥＭ培地で３回簡単にリンスした。それぞれの角膜縁は、等しく二等分に分割し、各半分にされたものは、さらに６つの外植片に等しく分割し、すなわち、一つの角膜縁につき１２の外植片を作成した。年齢、性別、人種によるバラツキを排除するために、同一のドナーの角膜において相当する場所からの外植片を対照グループと実験グループとしてそれぞれ選択した。外植片は、上皮サイドを上に向けて、各６つのウェルの中央に配置し、ＳＨＥＭ又は２５μｇ／ｍｌの上記全ＡＭ抽出物を含むＳＨＥＭにより培養した。培養液は３７℃で９５％の湿度及び５％のＣＯ2の下で維持し、培地は一日おきに交換した。外植片の増殖は、倒立位相差顕微鏡（ニコン、日本）を用いて１４日間毎日モニターした。増殖した面積は、アドービフォトショップ（Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ）５．５により一日おきにデジタル化し、ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪ  １．３０ｖ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、メリーランド州）により分析した。
【０２７２】
ＭＴＴアッセイ
ＭＴＴアッセイ（細胞増殖キットＩ、ｃａｔ＃１１４６５００７００１、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州）は、代謝的に活性な細胞により黄色のテトラゾリウム塩であるＭＴＴが切断され紫色のホルマザン結晶へと変化する原理に基づく比色分析アッセイである。ＳＨＥＭ（対照グループ）又は２５μｇ／ｍｌのＡＭＥを含むＳＨＥＭ（ＡＭＥグループ）により１４日間培養したヒトの角膜縁の外植片から増殖した細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ消化によりばらばらにして回収し、ＳＨＥＭ培地に再懸濁した。細胞数は血球計数器によりカウントし、９６ウェルあたり２０００個の細胞を１００μｌの培地を用いて播種した。各グループはさらに３つのサブグループ（対照（添加剤なし）、ＰＢＳ（２μｌのＰＢＳを細胞播種後直ちに添加）、ＡＭＥ（２μｌの１２５０μｇ／ｍｌのＡＭＥ（ＡＭＥの最終濃度を２５μｇ／ｍｌにした）を細胞播種後直ちに添加））に分けた。各サブグループは、合計１６のウェル（繰り返しによって）からなる。細胞は、３７℃で９５％の湿度、５％のＣＯ2の下、一日おきに培地交換をしながら、１０日間培養した。ＭＴＴアッセイを実施する際には、１０μｌのＭＴＴ標識試薬（最終濃度：０．５ｍｇ／ｍｌ）を各９６ウェルに加えた。９６ウェルプレートは、同じ培養条件下で４時間インキュベートした。その後、１００μｌの可溶化溶液を各ウェルに加え、次いでプレートをさらに２０時間、同じ条件下でインキュベートした。サンプルの分光吸光度はマイクロプレートリーダー（Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）、Ｍｅｒｉｄｅｎ，コネチカット州）を用いて、５５０ｎｍの波長にて測定し、６５０ｎｍの参照波長における吸光度も測定し、両測定値の差を求めた。
【０２７３】
ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色
１４日間の培養後、外植片をウェルから取り出し、ＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）に包埋し、液体窒素中で短時間で凍結させ、−８０℃で保管した。組織は、スノウコート（ｓｎｏｗｃｏａｔ）Ｘ−Ｔｒａ（登録商標）マイクロスライド（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，イリノイ州）上で、ミクロトームプラス（Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ  Ｐｌｕｓ，Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄｕｒｈａｍ，ノースカロライナ州）を用いて、６μｍにて切片化した。その後、該切片は、１０％ホルマリン中で１０分間固定し、ハリス・ヘマトキシリンで５分間染色し、次いで１％エオジンＹで１分間２５℃にて染色した。組織は、一連の７０％、９５％、１００％アルコールでそれぞれ５分間ずつ脱水し、最後にキシレン（ＳＵＢ−Ｘ（登録商標）、Ｘｙｌｅｎｅ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ）で処理し、カバースリップを載せた。このスライドを倒立顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ，ＴＥ２０００−Ｕ，ニコン）の下で観察した。
【０２７４】
結果
ＡＭ抽出物はヒトの角膜縁の外植片からの上皮の遊走を遅くし、その結果、増殖物中の上皮細胞は減少したが、多くの前駆細胞が含まれていた。
以下に示す表は、ＡＭ抽出物を添加した培地において、角膜縁の外植片からの上皮の増殖の開始が遅れ、その結果、上皮の増殖物中にはより少ない細胞が含まれていたことを示す。
【０２７５】
【表２】
0005505760.tif 000003
【０２７６】
ＡＭ抽出物はヒトの角膜縁の外植片からの繊維芽細胞の遊走を抑制し、その結果、増殖物中の繊維芽細胞は減少した。
図２７Ａにおいて、ＳＨＥＭ（対照）とＳＨＥＭ／ＡＭＥ（ＡＭＥ）の両方で培養したヒトの角膜縁の外植片からの増殖物は、同様の上皮層を形成した。しかし、繊維芽細胞様細胞は、対照中にのみいくつか見られたが、ＡＭＥ培養液中には見られなかった。これは、ＡＭＥは繊維芽細胞の遊走を抑制するかもしれないことを示す。図２７Ｂにおいて、１４日間の培養後、ヒトの角膜縁の外植片を培養ウェルから取り出し、包埋し、切片化し、Ｈ＆Ｅで染色した。対照中よりも、ＡＭＥ中に非常に多くの間質細胞が存在していた。これは、おそらくＡＭＥが繊維芽細胞の遊走を抑制したことにより起こったと考えられる。
【０２７７】
ＡＭＥによる繊維芽細胞増殖の抑制
ＳＨＥＭ（対照）とＳＨＥＭ／ＡＭＥ（ＡＭＥ）の両方で１４日間培養したヒトの角膜縁の外植片からの増殖物を別々に回収し、ＭＴＴアッセイで記述したように、９６個の各ウェルに、１ウェルあたり２０００個の細胞となるように播種した。対照からの細胞は、カラム１〜３（１：対照；２：ＰＢＳ；３：ＡＭＥ；ここでは１つのプレートにつきｎ＝８と示したが、同様の結果を有する複製としてはｎ＝１６）に播種し、ＡＭＥからの細胞は、カラム４〜６（１：対照；２：ＰＢＳ；３：ＡＭＥ）に播種した。１０日間の培養後、細胞はＭＴＴアッセイに使用した。繊維芽細胞の増殖について、サブグループ間（対照、ＰＢＳとＡＭＥ）において有意な差はなかったが、ＳＨＥＭとＳＨＥＭ／ＡＭＥにおける増殖物に由来する細胞間には、繊維芽細胞の増殖について、統計的に有意な差があった（図２８Ａ）。繊維芽細胞は上皮細胞よりも非常に早く増殖するので、ＭＴＴ試薬を加えると、繊維芽細胞を含むウェルも非常に早くピンク色になった。対照とＡＭＥにおける繊維芽細胞の増殖の統計的分析は、ＡＭＥが繊維芽細胞の増殖を著しく抑制することを示した（ｐ＝０．０１）（図２８Ｂ）。
【０２７８】
ＳＨＥＭ／ＡＭＥ中で培養した上皮細胞の増殖物からのクローン増殖はＳＨＥＭのみで培養した場合よりも多かった。
ヒトの角膜縁の外植片をＳＨＥＭ（対照）のみかＳＨＥＭ／ＡＭＥ（１００μｇ／ｍｌ）中で培養した。１０日間の培養後、増殖した上皮細胞をトリプシン／ＥＤＴＡを用いて回収し、再度細胞数をカウントした。上皮細胞の増殖は、ＡＭＥによって著しく抑制された。すなわち、ＳＨＥＭ中で培養した３つの外植片からの細胞の合計は、９ｘ１０5だったが、ＳＨＥＭ／ＡＭＥ中で培養した３つの外植片からの細胞の合計は、２．３ｘ１０5であり、対照／ＡＭＥの比は３．９である。これらの細胞を、５００個又は１０００個ずつ、６０ｍｍの皿（約１８又は３６個／ｃｍ2）における、ＳＨＥＭ培地中でＭＭＣ前処理（４μｇ／ｍｌで３７℃にて２時間）をしたスイス３Ｔ３フィーダーレイヤー上に播種した。播種してから４〜５日後、上皮クローンが形成し始めた。ＳＨＥＭ／ＡＭＥを用いて前もって培養した細胞由来のクローンは、ＳＨＥＭのみを用いて前もって培養した細胞由来のクローンよりも数が多くかつサイズも大きかった（ｐ＜０．０５）。クローンは、１０日目まで増殖させ、その後クリスタルバイオレット色素で染色し、クローンの数と大きさが分かるようにした。
【０２７９】
ＡＭＥは増殖物のＭＡＰＫｐ３８を阻害した。
ＳＨＥＭ（対照）とＳＨＥＭ／ＡＭＥ（ＡＭＥ）の両方で１４日間培養したヒトの角膜縁の外植片からの増殖物は、同様の上皮層を形成した。しかし、上皮層の縁部が異なっていた：対照の上皮層の縁部はざらざらで、一方、ＡＭＥの上皮層の縁部は滑らかだった（図２９、対照：左のパネル；ＡＭＥ：右のパネル）。この現象は、ＭＡＰＫｐ３８阻害剤（ＳＨＥＭ中の１０μＭのＳＢ２０３５８０）による、ヒトの角膜縁の外植片の増殖に対する影響に似ていた（データ示さず）。これは、ＡＭＥは、ＭＡＰＫｐ３８を阻害しうる成分を含んでいるという別の証拠を提供した。
【０２８０】
実施例６：羊膜調製物は、マクロファージの機能を抑制する
材料と方法
細胞培養とＩＦＮγ刺激
マウスマクロファージ細胞株であるＲａｗ２６４．７細胞は、ＡＴＣＣから入手し、１０％のウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１．２５μｇ／ｍｌのフンギゾンを添加した、フェノールレッドを含まない、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて、１００ｍｍの培養皿中で培養した。細胞が７０％〜８０％コンフルエントに達したら、培地を除去し、トリプシン／ＥＤＴＡを用い１０分間２５℃で処理した。消化後、細胞はまだ皿にしっかり付着していたので、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を除去した。次に、インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ：１０００ｍｌ中に５ｍｇのインスリン、５ｍｇのヒトトランスフェリン、５μｇの亜セレン酸ナトリウムを含む。Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州）を含む５ｍｌのＤＭＥＭを皿に加え、細胞をピペッティングにより回収した。５００ｘｇで５分間遠心分離した後、培地を除去し、細胞ペレットをＤＭＥＭ／ＩＴＳ培地に再懸濁した。次に、細胞数をカウントし、細胞密度を０．５ｘ１０6／ｍｌに調整した。
【０２８１】
細胞を播種するために、０．５ｍｌ（０．２５ｘ１０6）の細胞懸濁液を２４個の各ウェルに加えた。細胞を付着させるために一時間後、５μｌのＩＦＮ−γ（２ｘ１０4Ｕ）を、ＩＦＮ−γの最終濃度が２００Ｕ／ｍｌになるように、各ウェルに加えた。４８時間後、ＮＯアッセイとＰＧＤ2／ＰＧＥ2アッセイのために、細胞培養液を回収した。細胞は、ライブアンドデッド（Ｌｉｖｅ  ＆  Ｄｅａｄ）アッセイのために使用した、あるいは、ウェスタンブロットのために回収した。
【０２８２】
ライブアンドデッド（Ｌｉｖｅ  ＆  Ｄｅａｄ）アッセイ
培地を除去し、２００μｌの混合ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン州）を各ウェルに加えた。細胞と一緒に１５分間室温にてインキュベートし、その後細胞を蛍光顕微鏡の下で観察した。生細胞は、細胞質中において強く均一な緑の蛍光を生成し、死細胞は核中において明るい赤の蛍光を生成する。
【０２８３】
ＮＯアッセイ
培養の終わりに、各ウェルの細胞培養液をそれぞれ回収し、１２，０００ｘｇで、１０分間４℃にて遠心分離した。澄んだ培地を新しいチューブに移し、直接アッセイに供するか、そうでない場合は、後で行われるアッセイの前には−８０℃で保管した。ＮＯ生成を、Ｇｒｉｅｓｓ試薬を用い、メーカーのプロトコルに従って、それの安定した分解物である亜硝酸塩を測定することにより評価した。簡単に説明すると、５０μｌの澄んだ培地を１００μｌのＧｒｉｅｓｓ試薬（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ａｕｒｏｒａ，オハイオ州）と混合し、１５分後、Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）のユニバーサルマイクロプレートアナライザー（Ｐａｃｋａｒｄ、Ｍｅｒｉｄｅｎ，コネチカット州）を用いて、５５０ｎｍで吸光度を測定した。亜硝酸塩の量は、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ2；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州）の検量線により算出した。
【０２８４】
プロスタグランジンＤ2（ＰＧＤ2）とプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ２）アッセイ
細胞培地の上清を、ＩＦＮ−γ刺激をして、又はしないで、４８時間後回収した。ＰＧＤ２とＰＧＥ２の濃度は、ＥＩＡキット（それぞれ、ｃａｔ＃５１２０２１及び５１４０１０、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ミシガン州）を用いて、供給者の使用説明書に従ってアッセイを実施して測定した。
【０２８５】
ＴＧＦ−β１プロモーターアッセイ
ＴＧＦ−β１プロモーター活性アッセイは、ヒトのＴＧＦ−β１プロモーター（−１３６２〜＋１１）−ルシフェラーゼ、ＴＧＦ−β２プロモーター（−１７２９〜＋６３，Ｎｏｍａら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，４：２４７−２５５，１９９１）、ＴＧＦ−β３プロモーター（−１３８７〜＋１１０）を含むプラスミドを使用する。ＴＧＦ−β２プロモーターとＴＧＦ−β３プロモーターの両者は、ｐＧＬ３ベーシックのＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩに挿入した。ヒトＴＧＦ−βＲＩＩプロモーター（−１８８３〜＋５０，Ｂａｅら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７０：２９４６０−２９４６８，１９９５）は、ヒトの角膜繊維芽細胞のゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用し、ＰＣＲにより増幅した。その際、フォワードプライマーとしては、５’−ＧＴＡＣＧＧＴＡＣＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＴＴＡＴＧＧＴＴＣ−３’を使用し、リバースプライマーとしては、５’−ＧＴＡＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＣＴＣＡＧＣＧＣ−３’を使用した。増幅したＴＧＦ−βＲＩＩプロモーターフラグメントは、次にＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ゲル精製（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，カリフォルニア州）を行い、ｐＧＬ３ベーシックの同じサイトに挿入した。複製欠損アデノウイルスは、既刊の方法（Ｃｈｅｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１２９７−１３０５，２００１；Ｈｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：２５０９−２５１４，１９９８）に従って、ミシガン大学のコア研究室（Ｃｏｒｅ  Ｌａｂ）により、各プロモーター構築物につき作成された。
【０２８６】
２ｘ１００ｍｍのプラスチック皿において、ヒトの角膜繊維芽細胞（継代１〜４）をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で培養した。細胞が８０％コンフルエント（約８ｘ１０5個／皿）に達した時点で、培地を除去し、細胞を２回、それぞれの培地で洗浄した。ＴＧＦ−βｌ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、又はＴＧＦ−βＲＩＩプロモーター（それぞれ、ルシフェラーゼに結合している）を含む複製欠損アデノウイルス（それぞれ、感染効率（ＭＯＩ）は１００）及び対照として、ＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼを含むアデノウイルス（ＭＯＩ：３０）を含む新しい培地を細胞と一緒に４時間インキュベートした。その後、アデノウイルスを含む培地を除去し、細胞を、あらかじめ温めておいたトリプシン／ＥＤＴＡを用いて５分間室温でトリプシン処理した。細胞を１５ｍｌの無菌チューブに回収し、１０００ｒｐｍ（約６００ｘｇ）にて５分間遠心分離した。培地を慎重に取り除き、その後、細胞を１回、それぞれの培地で洗浄した。細胞ペレットを所望の密度になるように培地に再懸濁した。異なる量の（例えば、２５μｇ／ｍｌ）の水溶性ＡＭ抽出物（水溶性ＡＭ抽出物の調製について本明細書に記載されているように調製した）、あるいは他の試薬を加えて又は加えないで、総量１００μｌの細胞懸濁液（５０００個の細胞）を９６ウェルプレートの各ウェルに移した。
【０２８７】
細胞は、さらに４４時間（アデノウイルス形質導入については、トータルで４８時間）培養した。その後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで１回リンスした。それぞれの９６ウェルからの細胞は、５０μｌの細胞培養溶解試薬（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州）中で溶解した。細胞溶解物は１５秒間ボルテックスにかけ、その後、４℃で２分間１２，０００ｘｇにて遠心分離することにより、上清を得た。その上清をクリーンチューブに移した。２０μｌの上清をルシフェラーゼアッセイかβ−ガラクトシダーゼアッセイに使用した。ルシフェラーゼアッセイについては、１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州）を各ウェルに分注し、２０μｌの細胞溶解物をそこに加え、３回のピペッティングにより混合した。ルシフェラーゼ分析装置（Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標），Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，マサチューセッツ州）にプログラムを与え、１０秒間の測定を実施した。高感度のβ−ガラクトシダーゼアッセイ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，カリフォルニア州）については、２０μｌの細胞溶解物を１３０μｌのクロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ）基質を各ウェルに加えて混合し、３０分間〜２時間、３７℃でサンプルが赤く変化するまでインキュベートした。反応を止め、各サンプルの吸光度を５７０ｎｍで測定した。各サンプルのβ−ガラクトシダーゼの活性を算出し、相対ルシフェラーゼ活性として該ルシフェラーゼ活性を正規化するのに使用した。
【０２８８】
結果
ＡＭはマクロファージＲａｗ２６４．７細胞によるＮＯ産生を減少させた。
Ｒａｗ２６４．７細胞を、ＤＭＥＭ／ＩＴＳの入った２４個の各ウェルに２．５ｘ１０5個ずつ播種した（各グループについてｎ＝３）。細胞を２００ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γを用いて、又は用いないで刺激した後、方法の項目で記述したＮＯアッセイに供するために、培養液を回収した。ＩＦＮ−γ刺激が無い場合、マクロファージは、プラスチック上で培養しても無処理羊膜（ｉＡＭ）の間質表面上で培養しても検出可能なＮＯをほとんど産生しなかった（図３０）。ＩＦＮ−γ刺激後、マクロファージは、いずれの培地においても、ＮＯを非常に多く産生したが、マクロファージをｉＡＭの間質表面上で培養したときの方が、プラスチック上で培養したときと比べて、ＮＯは著しく少なかった（ｐ＝０．０４８）（図３０）。
【０２８９】
ＡＭはＰＧＥ2産生を下方制御するが、ＰＧＤ2合成には好都合であった。
ＩＦＮ−γ刺激が無い場合、Ｒａｗ２６４．７細胞は、プラスチック上で培養したときは、ＰＧＤ2をほとんど産生しなかったが、ｉＡＭ上で培養したときには非常に多く産生した。これは、おそらく、ＡＭ上皮細胞から放出されたＰＧＤ2のせいだと思われた（図３１Ａ）。ＩＦＮ−γ刺激がある場合、プラスチック上及びｉＡＭ上の両方において培養されたＲａｗ２６４．７細胞中のＰＧＤ２の産生は増加した（図３１Ａ）。ＩＦＮ−γ刺激が無い場合、Ｒａｗ２６４．７細胞は、プラスチック上で培養したときは、ＰＧＥ2をほとんど産生しなかったが、ｉＡＭ上で培養したときには非常に多く産生した。これは、おそらく、ＡＭ上皮細胞から放出されたＰＧＥ2のせいだと思われた（図３１Ｂ）。ＩＦＮ−γ刺激がある場合、プラスチック上で培養されたＲａｗ２６４．７細胞中のＰＧＥ2の産生は劇的に増加したが、ｉＡＭ上におけるＰＧＥ2の産生はほとんど変化しなかった（図３１Ｂ）。抗炎症作用の指標としてのＰＧＤ2／ＰＧＥ2の比は、ＩＦＮ−γ刺激の有無に関わらず、Ｒａｗ２６４．７細胞をｉＡＭ上で培養したときに非常に高かった（図３１Ｃ）。
【０２９０】
ＡＭはマクロファージにおけるＴＧＦ−β１プロモーターの活性化を抑制した。
ＩＦＮ−γ刺激が無い場合、Ｒａｗ２６４．７細胞におけるＴＧＦ−β１プロモーターの活性は、プラスチック上よりもｉＡＭ上の方が抑制されたが、統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．４）（図３２）。ＩＦＮ−γ刺激がある場合、Ｒａｗ２６４．７細胞におけるＴＧＦ−β１プロモーターの活性は、プラスチック上とｉＡＭ上の両方において減少した。しかし、ＴＧＦ−β１プロモーターの活性の抑制は、プラスチック上で培養した場合と比べて、非常に高くかつ統計的に有意だった（ｐ＜０．０１）（図３２）。
【０２９１】
ＡＭＥはマクロファージ細胞死を誘起した。
Ｒａｗ２６４．７細胞を、１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭの入った２４個の各ウェルに２ｘ１０5個ずつ播種した。１時間後、１２５μｇ／ｍｌのＡＭＥ（ＰＢＳ中）を培養液に加え、一方、対照には、同容量のＰＢＳを加えた。２４時間の培養後、Ｒａｗ２６４．７細胞は、対照の場合ではよく付着していたが、ＡＭＥを加えた場合は、多くの細胞が浮遊し、死んでいるように見えた（図３３）。
【０２９２】
マクロファージのアポトーシスを測定するインビトロアッセイ
インビトロにおけるマクロファージのアポトーシスアッセイを用い、どの程度ＡＭが抗炎症作用を発現するかを、ＩＦＮ−γにより活性化されたマウスマクロファージ細胞株（Ｒａｗ２６４．７細胞）のアポトーシスを促進することに基づいて測定した。細胞死検出ＥＬＩＳＡＰＬＵＳキットは、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  （Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）から入手した。１０4個の細胞と同等の細胞溶解物及び培養後の条件培地を、メーカーの使用説明書に従って、細胞死検出ＥＬＩＳＡＰＬＵＳアッセイに供した。このＥＬＩＳＡは、マウスモノクローナル抗ヒストンと抗ＤＮＡ抗体を用いるアポトーシス性細胞死により産生された細胞質内ヒストン関連ＤＮＡフラグメント（モノ及びオリゴヌクレオソーム）のインビトロでの定性的及かつ定量的測定のための測光的酵素免疫測定法である。陽性及び陰性対照はキットに含まれており、メーカーより提供される。吸光度は、Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）のユニバーサルマイクロプレートアナライザーを用いて、４０５ｎｍで測定した。マクロファージは凍結保存した無処理のＡＭの間質サイド上で培養した。凍結保存された無処理のＡＭは、ヒトの胎盤を採取し、その胎盤からＡＭを回収し、ニトロセルロース紙（ハイボンド−Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）の上に、上皮表面を上にして平らにして乗せることにより調製し、使用するまで、ＤＭＥＭ／グリセロール（１：２（ｖ／ｖ））の中で、−８０℃で保管したものである。ＡＭ間質基質上でマクロファージを培養するためには、マクロファージを、無処理の凍結保存したＡＭの間質サイド上に播種した。
【０２９３】
その結果、ＤＭＥＭ＋ＩＴＳを用いたプラスチックでの培養４８時間後に少量のアポトーシスが検出され、マクロファージがＩＦＮ−γにより活性化されるとアポトーシスは減少することを示した。凍結保存された無処理のＡＭ上で培養したマクロファージも、いくらかアポトーシスを発現したが、ＡＭとプラスチック間には有意差は無かった。これに対し、ＩＦＮ−γにより活性化されたマクロファージは、ＡＭ上で培養すると、アポトーシスの著しい増加を示した。このアッセイの結果は、本明細書に記載のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイ染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州）、ヘキスト−３３３４２核染色及びＤｅａｄＥｎｄ（登録商標）蛍光分析末端デオキシヌクレオチド転移酵素媒介ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ−ニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）法（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州）により得られた結果と相関していた。
【０２９４】
プラスチック（ＰＬ）上で培養されたマクロファージは均一に分配し、かつほとんどが楕円形であるが、２００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ（ＰＬ／ＩＦＮ−γ）で活性化された後の細胞は、大きくなって紡錘状になった。これに対し、ＡＭ間質基質上で培養したマクロファージは、凝集して塊になり、かつ円形を留めていた。そして、ＩＦＮ−γで活性化されると（ＡＭ／ＩＦＮ−γ）、細胞は縮み、変質して残骸になった。ＡＭによって引き起こされたこれらの劇的な形態の変化は、４８時間において、ＩＦＮ−γによる活性化の有無に関わらず、細胞死検出ＥＬＩＳＡにより測定されたマクロファージのアポトーシスの顕著な促進と相関していた（図１、ＰＬ対ＡＭ：ｐ＞０．０５；ＰＬ対ＰＬ／ＩＦＮ−γ、及びＡＭ対ＡＭ／ＩＦＮ−γ：ｐ＜０．０５；ＰＬ／ＩＦＮ−）対ＡＭ／ＩＦＮ−γ：ｐ＜０．０１）。この結果は、ＡＭ間質上で培養したマクロファージは、ＩＦＮ−γで活性化された後、細胞死を示唆する形態に変化したことを示した。
【０２９５】
ＡＭでの培養における上記の形態の変化が、実際に細胞死を表すのか明らかにするために、平行実験中の細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイに供した。ＩＦＮ−γによる有無に関わらずプラスチック上で培養した細胞、及びＩＦＮ−γによる活性化無しでＡＭ上において培養した細胞は、４８時間において、大部分が生存していた（すなわち、緑色の蛍光を発していた）。これに対し、ＩＦＮ−γによる活性化後、ＡＭ上で培養した多くの細胞は死んだ（すなわち、赤色の蛍光を発していた）。
【０２９６】
上記細胞死がアポトーシスによって媒介されているかどうか明らかにするために、平行実験中の細胞をヘキスト−３３３４２染色に供した。強くヘキスト染色された断片化核は、ＩＦＮ−γ無しのＡＭ及びプラスチック対照と比較して、ＡＭ／ＩＦＮ−γ中により多く見られた。ヘキスト−３３３４２陽性アポトーシス核の割合は、１２．４±２．７％（ＰＬ），１６．５±３．１％（ＰＬ／ＩＦＮ−γ），１４．７±１．１％（ＡＭ），６３．８±７．９％（ＡＭ／ＩＦＮ−γ）だった。ＰＬとＰＬ／ＩＦＮ−γの間、及びＰＬとＡＭの間（全て、ｐ＞０．０５）には、統計的差は無かった。一方、ＡＭとＡＭ／ＩＦＮ−γの間、及びＰＬ／ＩＦＮ−γとＡＭ／ＩＦＮ−γの間（全て、ｐ＜０．００１）には、統計的差があった。さらに、ヘキスト−３３３４２染色は、ＩＦＮ−γにより活性化した場合、プラスチック上での培養液中に多核巨細胞が存在することを明らかにした。これに対し、ＡＭ／ＩＦＮ−γの培養液中には、このような巨細胞は存在していなかった。
【０２９７】
そのような断片化核が実際にＤＮＡ断片化により引き起こされたかどうか実証するために、平行実験中の細胞をＴＵＮＥＬアッセイ染色に供した。ＴＵＮＥＬ陽性断片化核は、ＰＬ，ＰＬ／ＩＦＮ−γ，及びＩＦＮ−γ無しのＡＭ培養液中において散発的だったが、ＡＭ／ＩＦＮ−γ培養液中において顕著に増加した。この結果は、ヘキスト−３３３４２染色による結果と一致した。
【０２９８】
ＡＭは、ＮＦ−κＢとＡｋｔにより媒介される生存経路を遮断することにより、ＩＦＮ−γにより活性化されたインビトロにおけるマクロファージのアポトーシスを誘起した。
内因的に発生した、又は外因的に適用されたＮＯは、マクロファージにおけるアポトーシス性細胞死を誘発することが報告されている。ＮＯが、上記のＡＭ間質基質上で培養したマクロファージのアポトーシスの原因であるかどうか明らかにするために、異なる培養時間（２４時間〜７２時間）の終わりに採取した条件培地中の亜硝酸塩の濃度を測定した。また、ＴＮＦ−α産生についても検出した。結果は、ＰＬ，又はＩＦＮ−γ活性化無しのＡＭで培養したマクロファージは、低レベルのＮＯとＴＮＦ−αを産生していたことを示した。また、ＮＯ産生において、培養時間に関わらず、プラスチックとＡＭとの間で差は無かった（全て、ｐ＞０．０５）。一方、ＴＮＦ−αの濃度は、全てのタイムポイントにおいて、プラスチック上よりもＡＭ上の方が高かった（全て、ｐ＜０．０５）。しかし、ＩＦＮγにより活性化されると、プラスチック上で培養されたマクロファージは、２４時間〜７２時間にわたり、増加したレベルのＮＯとＴＮＦ−αを連続的に産生した。これに対し、ＡＭ上で培養したマクロファージは、２４時間〜４８時間にわたり、ＮＯとＴＮＦ−αの産生が増加したが、４８時間〜７２時間の間は、それらのレベルの増加は見られなかった（ｐ＞０．０５）。これは、４８時間後にＮＯとＴＮＦ−αの産生が終わったことを示す。ＡＭ上でのＮＯ濃度はプラスチック上のＮＯ濃度よりも２４時間及び４８時間において高かった（ｐ＜０．０１）。一方、ＡＭ上でのＴＮＦ−αの濃度は、たった２４時間においても高かった（ｐ＜０．０１）。培地においてＡＭのみで４８時間インキュベートした対照は、ＩＦＮ−γの有無に関わらず、上清中に検出可能なレベルのＮＯとＴＮＦ−αをなんら見出せなかった。これは、ＡＭ自身がＮＯとＴＮＦ−αを産生しなかったことを示す。まとめると、これらのデータもまた、ＡＭはＩＦＮ−γと相乗的に働いて、より多くのＮＯを産生し、ＡＭ自身は、マクロファージによるＴＮＦ−αの産生を弱く誘発することを示した。ＩＦＮ−γにより促進される亜硝酸塩レベルは、細胞をＡＭ上で培養した場合に、プラスチック上で培養した場合と比べて、４８時間の時点でより顕著であった（ｐ＜０．０１）。この所見は、アポトーシスの所見とよく相関していた。
【０２９９】
高レベルのＮＯとアポトーシスが原因として働くように相関しているかどうか明らかにするために、ＮＯの産生を、ＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン酢酸塩（Ｌ−ＮＭＭＡ）又はＬ−Ｎ６−（１−イミノエチル）リジン塩酸塩（Ｌ−ＮＩＬ）（両者ともにＮＯ合成酵素の阻害物質である）を加えて、ブロックした。その結果、５００μＭのＬ−ＮＭＭＡ又はＬ−ＮＩＬは、ＡＭ上で培養した細胞に対し、すなわち、Ｌ−ＮＭＭＡについては、４６．２±４．３μＭ〜１９．８±４．９μＭ、及びＬ−ＮＩＬについては１４．０±９．８μＭ（両者ともにｐ＜０．０１）のベースラインから判断して、ＩＦＮ−γにより誘起される亜硝酸塩レベルを著しく減少させた（５０％超減）ことが示された。しかし、ヘキスト３３３４２染色により測定されたマクロファージのアポトーシスの程度は、それほど著しく減少しなかった。これらの結果をまとめると、ＩＦＮ−γの活性化を受けたＡＭ上におけるマクロファージのアポトーシスは、ＮＯの過剰産生により媒介されないことが分かった。
【０３００】
ＡＭ上におけるマクロファージのアポトーシスのメカニズムをさらに調べるために、二つの主要な細胞生存シグナル伝達経路：ＮＦ−κＢシグナル伝達経路とＡｋｔ−ＦＫＨＲシグナル伝達経路を調査した。これらの経路は、アポトーシスのための定量ＥＬＩＳＡが明らかでない場合は、ＩＦＮ−γを加えて、あるいは加えずにプラスチック上又はＡＭ上で２４時間培養したマクロファージからの全ＩＫＫ−α、ＩＫＫ−β、ＮＦ−κＢのｐ６５（ＲｅＩＡ）サブユニット、Ａｋｔ、ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、ホスホ−ＦＫＨＲ（Ｔｈｒ２４）／ＦＫＨＲＬ１（Ｔｈｒ３２）の発現を測定することにより調査した。ウェスタンブロット分析は、ＩＦＮ−γによる活性化がある場合のプラスチック上で培養したマクロファージにおいて、ＮＦ−κＢのｐ６５（ＲｅＩＡ）サブユニットと全Ａｋｔが若干上方制御されていたことを示した。ＩＦＮ−γによる活性化がある場合のＡＭ上で培養したマクロファージにおいて、ＩＫＫ−α、ＩＫＫ−β、全Ａｋｔ、ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）は下方制御されただけだった。一方、ＩＦＮ−γによる活性化がない場合のＡＭ上で培養したマクロファージにおいて、ＮＦ−κＢのｐ６５（ＲｅＩＡ）サブユニットとホスホ−ＦＫＨＲ（Ｔｈｒ２４）／ＦＫＨＲＬ１（Ｔｈｒ３２）は下方制御され、さらにＩＦＮ−γによる活性化がある場合にも下方制御された。これらの結果は、この二つのシグナル伝達経路は、二つともＡＭ上で培養されたマクロファージのアポトーシスに関連していることを示した。
【０３０１】
実施例７：二つの異なるＡＭ抽出物を配送するためのビヒクルとしてのコラーゲン又はＨＡの使用における相対的な作用強度の比較
可溶性及び凍結乾燥形態のＡＭ抽出物（それぞれ、可溶性及び凍結乾燥形態のＡＭ抽出物の調製について本明細書に記載されている方法に従って調製した）の最適濃度を決定するために、及び適切な濃度の各形態のＡＭ抽出物を含む二つの異なるビヒクル間におけるＴＧＦ−βプロモーター活性の抑制と、マクロファージのアポトーシスの促進についての相対的な作用強度を比較するために、タイプＩコラーゲンゲル又はＨＡを用いた段階希釈により、これら二つの形態のＡＭ抽出物を比較し、また、それらのタンパク質濃度を適宜にモニターする。タイプＩコラーゲンゲルについては、タンパク質濃度は０．０５ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌまで異なる。ＨＡゲルにおいては、タンパク質濃度は０．０５ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌまで異なる。この二つの形態のＡＭ抽出物を含むこれらの段階希釈溶液又はゲルは、ヒトの角膜繊維芽細胞を播種する前にプラスチック皿にプレコートするか、あるいは細胞は既にプラスチック皿に播種し、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭに直接加える。抗瘢痕作用は、ＴＧＦ−βｌ、β２、β３及びＲＩＩのプロモーター活性をアッセイし、そのプロモーター活性を陽性対照（ＡＭ抽出物（ビヒクル無し）を加えずにプラスチック上に細胞を播種）又は陰性対照（任意の形態のＡＭ抽出物（ビヒクル無し）を加えたプラスチック上に細胞を播種）と比較することにより、測定する。陽性対照（１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭの入ったプラスチック上に播種した細胞）は、高いプロモーター活性を示した。これに対し、陰性対照（１０％ＦＢＳを加え、さらに２５μｇ／ｍｌのＡＭ抽出も加えたＤＭＥＭの入ったプラスチック上に播種した細胞）は、プロモーター活性の少なくとも５０％の削減を示した。これらの対照値に基づき、コラーゲンゲル又はＨＡに混入させた、異なる濃度のＡＭ抽出物を用いた実験グループについて、測定することができる。
【０３０２】
コラーゲン又はＨＡ中における二つの形態のＡＭ抽出物の最も有効な濃度が一旦決定されると、その結果について、１０ｐｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１を加えたＩＴＳを含む血清不含ＤＭＥＭを用いた実験を繰り返すことにより実証を行う。抗瘢痕作用は、さらにＳｍａｄ２、３、４、及び筋繊維芽細胞のマーカーであるα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の免疫細胞局在性によるＳｍａｄ媒介シグナル伝達の抑制と相関させる（Ｇａｂｂｉａｎｉ  Ｇ．，Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２００：５００−５０３，２００３；Ｊｅｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｏｌｌ，Ｐｒｏｇ  Ｒｅｔｉｎ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１８：３１１−３５６，１９９９）。別の陽性対照は、１０μｇ／ｍｌの中和抗体を３種全てのＴＧＦ−βのアイソフォームに加えることにより、実施される。抗炎症作用は、ＩＴＳを含むＤＭＥＭに溶解した２００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γによる活性化をした場合としない場合のマウスのマクロファージにおいて、細胞死検出ＥＬＩＳＡＰＬＵＳキット（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を用いてアポトーシスの程度を測定し、得られたデータを、細胞形態、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州）、ヘキスト−３３３４２核染色、最近報告された（Ｌｉら、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．２００５，Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ＴＵＮＥＬアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州）により得られたデータと相関させることにより、同様に試験される。
【０３０３】
実施例８：羊膜間質抽出物は抗血管新生特性を有する。
材料と方法
材料
ＨＵＶＥＣ及び内皮細胞増殖培地は、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ドイツ）から入手した。細胞増殖キットＩ（ＭＴＴ）は、Ｒｏｃｈｅ（Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，ドイツ）から入手した。ＢＣＡ（登録商標）タンパク質アッセイキットは、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，イリノイ州）から入手した。ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｈａｍ  Ｆ／１２培地、ＨＥＰＥＳバッファー、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、０．２５％のトリプシン／０．５３ｍＭのＥＤＴＡ、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイ試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州）から購入した。ヨウ化プロピジウム、ヘキスト−３３３４２色素、ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、インスリン、ヒドロコルチゾン、ホルムアルデヒド、クリスタルバイオレット、ＦＩＴＣ結合抗マウス、ヤギ、ラットＩｇＧはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州）から入手した。トランスウェルインサートはコーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ニューヨーク州）から入手した。マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，マサチューセッツ州）から入手した。
【０３０４】
細胞培養
２％のウシ胎児血清、０．１ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、１μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、１ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を加えた内皮細胞増殖因子でＨＵＶＥＣを培養した。ヒトの角強膜組織をＦｌｏｒｉｄａ  Ｌｉｏｎｓ  Ｅｙｅ  Ｂａｎｋ（マイアミ，フロリダ州）から入手し、そこから角膜繊維芽細胞（ＨＣＦ）を回収し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで培養した。継代２代目の細胞を実験に使用した。ＳＶ４０−不死化ウサギ角膜上皮細胞（ＲＣＥ）（Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ  Ｒｅｉｎａｃｈ（ニューヨーク州立大学カレッジ・オブ・オプトメトリー（Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｏｐｔｏｍｅｔｒｙ）生物科学科、ニューヨーク州）により提供された）は、１０％のＦＢＳ、５ｎｇ／ｍＬのインスリン及び５ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いて増殖させた。
【０３０５】
水溶性ＡＭ間質抽出物の調製
無菌的方法を用い、Ｂｉｏ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｃ．（マイアミ、フロリダ州）から入手した凍結されたヒトＡＭを、もとの保存培地を除去するために、ＨＢＳＳを用いて２〜３回簡単に洗浄した。ＡＭ間質はスパチュラでこすり落とし、液体窒素の気相中で凍結させ、バイオパルベライザー（ＢｉｏＰｕｌｖｅｒｉｚｅｒ）（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，オクラホマ州）で微粒子になるように粉砕し、その後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅａｒｏｒ（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｒｅｍｅｌ，ウィスコンシン州）を用いて、氷上にて１分間ホモジナイズした。得られたホモジネートは、１時間回転することにより混合し、その後１４，０００ｘｇにて３０分間４℃で遠心分離した。得られたＰＢＳ中の上清を回収し、アリコットに分け、−８０℃で保管した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイにより測定した。この水溶性タンパク質抽出物は羊膜間質抽出物（ＡＳＥ）と命名し、本明細書に記載の実験に使用した。
【０３０６】
細胞増殖アッセイ
細胞は、上記のそれぞれの増殖培地が入った９６ウェルプレート（ｎ＝６）に、１つのウェル（ＡＳＥの濃度が増加するようにした）につき２，０００個の細胞密度となるように播種し、４８時間培養した。細胞の増殖は、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）ベースの細胞増殖アッセイ法により、メーカーにより推奨されているプロトコルに従って測定した。
【０３０７】
アポトーシスアッセイ
ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイとヘキスト−３３３４２染色を用い、アポトーシス細胞を検出した。簡単に説明すると、４８時間の培養後、各増殖培地をそれぞれ培養液から取り除き、２００μｌの混合ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイ試薬を加え、１５分間室温にてインキュベートした。生細胞は、細胞質の緑の蛍光染色により識別され、一方死細胞は、核中において赤の蛍光に染色される。アポトーシスを評価する手段として核の形態を特徴付けるために、ヘキスト−３３３４２色素がそれぞれの増殖培地に、最終濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように加えられ、３７℃で１５分間インキュベートされる。ヘキスト−３３３４２は、生細胞の核を染色し、増加した蛍光と核の断片化又は凝結によりアポトーシス細胞を同定する。
【０３０８】
遊走アッセイ
ＡＳＥによるＶＥＧＦ誘導走化性に対する抑制作用を、トランスウェルアッセイを用い、ＨＵＶＥＣについて試験した。完全増殖培地を用いて、ＨＵＶＥＣを３６時間増殖させた。細胞のトリプシン処理と洗浄を行い、その後細胞を、０．５％のＦＢＳを加えた不完全増殖培地に再懸濁し、２００μｌ中に６０，０００個の細胞となるようにトランスウェルインサート（直径：８ｍｍ）（８μｍのポアサイズを有するポリカーボネート膜により分離されている）の内側に播種した。この際、２００μｇ／ｍｌのＡＳＥを加えたものと加えないものを準備した。１％のＦＢＳと１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを加えた８００μｌ容量の増殖培地を、走化性因子（ｃｈｅｍｏｔａｃｔａｎｔ）としてトランスウェルインサートの外側の２４ウェルプレートに直接加えた。０．５％のＦＢＳを加えた増殖培地を、陰性対照として２４ウェルプレートに直接加えた。３７℃で５％ＣＯ2と９５％湿度にて４．５時間インキュベートした後、遊走しなかった細胞は吸引した。一方、膜はＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに溶解した４％ホルムアルデヒド中で固定し、クリスタルバイオレットで染色した。その後、顕微鏡の下で観察を行った。膜の別の面に遊走した細胞の数を数えた。
【０３０９】
内皮管腔形成アッセイ
３２０μｌのマトリゲルを２４ウェルプレートの各ウェルに加え、３７℃で３０分間重合させた。内皮細胞の培養液（１０％ＦＢＳを含む）に懸濁したＨＵＶＥＣ（５０，０００個／ウェル）を、異なる濃度のＡＳＥが存在するマトリゲルに播種した。対照細胞は、同じ濃度のＢＳＡを含むマトリゲルを用いて培養した。細胞は２４時間３７℃で培養し、顕微鏡の下で撮影を行った（ニコン、日本）。各ウェルに対し１０ランダム、４０ｘフィールド撮影を行い、管の数をカウントし、平均値を算出し、比較した。
【０３１０】
統計的分析
上記の実験は、全て３回（各回につき３通り以上）繰り返した。群平均は、適切なバージョンのスチューデント不対t検定を用いて比較した。試験結果は、ｐ＜０．０５の両側ｐ値を統計的に有意とみなして記載した。要約データは、平均±Ｓ．Ｄ．として記載する。
【０３１１】
結果
ＡＳＥはＨＵＶＥＣ細胞の増殖を優先的に阻害した。
我々は、初めに培地に加えられたＡＳＥが細胞の増殖を抑制するかどうか試験した。ＡＳＥの添加のない対照と比較すると、ＨＵＶＥＣの増殖は、５０〜２００μｇ／ｍｌのＡＳＥにより著しく抑制された（図３４Ａ、ｐ＜０．００１）。しかし、ＲＣＥとＨＣＦの増殖は、２００μｇ／ｍｌの濃度のみのＡＳＥにより著しく抑制された（図３４Ｂ、３４Ｃ、それぞれ、ｐ＜０．０１）。この結果は、ＡＳＥがＨＵＶＥＣ細胞の増殖を優先的に阻害することを示した。
【０３１２】
ＡＳＥはＨＵＶＥＣ細胞のアポトーシスを誘発した。
位相差画像は、２００μｇ／ｍｌのＡＳＥにより４８時間処理された場合、ＨＵＶＥＣが紡錘形状から縮んで、小さく丸い形状になり、細胞密度が著しく減少することを示した。これに対し、ＨＣＦ細胞とＲＣＥ細胞の細胞形態と密度は、２００μｇ／ｍｌのＡＳＥにより４８時間処理されても、変化しなかった（データ示さず）。２００μｇ／ｍｌのＡＳＥによるこのようなＨＵＶＥＣ細胞における変化は、細胞死に付随して起こるか明らかにするために、２００μｇ／ｍｌのＡＳＥを加えて４８時間インキュベートした後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイとヘキスト−３３３４２染色を実施した。その結果、ＨＵＶＥＣ細胞は、ＡＳＥを添加しない対照では生存していたが（図３５Ａａ）、ＡＳＥ処理後では、顕著な細胞死を示した（図３５Ａｄ）。これに対し、ＨＣＦ細胞とＲＣＥ細胞はともに、ＡＳＥ処理の有る（それぞれ、図３５Ａｅ、３５Ａｆ）無し（それぞれ、図３５Ａｂ、３５Ａｃ）に関わらず、注目に値する細胞死は何も観察されなかった。ヘキスト−３３３４２染色は、ＡＳＥで処理されたＨＵＶＥＣは、６１．６±７．７％の凝結と断片化核を有した（図３５Ｂｄ）ことを示し、この値は、ＡＳＥ処理をしない対照の値：３．１±１．８％よりも著しく高かった（図３５Ｂａ、２Ｃも参照、ｐ＜０．００１）。これに対し、ＨＣＦ、ＲＣＥともに、ＡＳＥ処理の有る（それぞれ、図３５Ｂｅ、３５Ｂｆ）無し（それぞれ、図３５Ｂｂ、３５Ｂｃ）に関わらず、明白なアポトーシスは見られなかった（図３６も参照、それぞれ、ｐ＝０．８４、０．３０）。これらの結果は、ＡＳＥがアポトーシスを引き起こしてＨＵＶＥＣの増殖を抑制することを示した。
【０３１３】
ＡＳＥは、ＶＥＧＦの刺激の有無に関わらず、ＨＵＶＥＣ細胞の遊走を阻害した。
我々は、次にＡＳＥが、ＶＥＧＦにより刺激されたＨＵＶＥＣの遊走を抑制することができるかどうか試験した。走化性因子としてのＶＥＧＦ無しの対照において、いくつかの細胞は、４．５時間の試験期間中にポリカーボネート膜のポアを通って遊走した（図３７Ａ）。走化性因子としてのＶＥＧＦで処理した場合、細胞遊走は劇的に増加した（図３７Ｂ、ｐ＜０．００１）。しかし、ＨＵＶＥＣを２００μｇ／ｍｌのＡＳＥで処理した場合、ＶＥＧＦを用いた陽性対照（ｐ＜０．００１）又はＶＥＧＦを用いない陰性対照（ｐ＜０．０１）と比較すると、ＶＥＧＦの影響を受けた細胞遊走の規模は著しく阻害された（図３７Ｃ）。これらの結果は、ＡＳＥはＶＥＧＦのケモカイン機能の抑制をするだけでなく、ＨＵＶＥＣが本質的に有している遊走の抑制もすることを示した。
【０３１４】
ＡＳＥはＨＵＶＥＣ細胞による管腔形成を阻害した。
ＡＳＥの抗血管新生作用をさらに調べるために、我々は、インビトロ管腔形成アッセイを実施した。基底膜タンパク質の固体ゲルであるＨＵＶＥＣをマトリゲル上に播種すると、ＨＵＶＥＣは、迅速に整列し、２４時間後、中空管様構造物を形成する（図３８Ａ）。これに対し、ＡＳＥをその培養液に加えると、１００μｇ／ｍｌ（図３８Ｂ）と２００μｇ／ｍｌ（図３８Ｃ）のいずれの濃度においても、ＨＵＶＥＣによる管腔形成は、著しく抑制された（両方ともに、ｐ＜０．００１）。ＡＳＥのこれらの二つの用量間の差は、統計的に有意ではなかった（図３８Ｄ）。まとめると、これらの結果は、ＡＳＥは、血管新生プロセッシング中の管腔形成を抑制することにより、抗血管新生作用も発現することを示した。
【０３１５】
実施例９：ＡＭ抽出物を含むスキンローション組成物
スキンローションは、以下の方法によって調製される。０．２５ｇのヒドロキシ安息香酸メチルと７．５ｇのグリセリンを７５ｍｌの水に１５０°Ｆで溶解する。０．７ｇのソルビタンモノラウレート、０．７ｇのポリソルベート２０と１．０ｇのセトステアリルアルコールを１５０°Ｆで融解し、上記溶液に混ぜ合わせる。この混合物を混ぜながら冷ます。この混合物の温度が約９０°Ｆより下がったら、混合しながら４ｍｌの本明細書に記載のＡＭ調製物と精製組成物を加える。微量の香料も混ぜながら加える。出来上がったローションを１０ｍｌのアリコットに包装し、室温で保管する。
【０３１６】
実施例１０：局所用ＡＭ間質基質ゲル組成物と皮膚炎症の治療
局所用医薬ゲル組成物を調製するために、１００ｍｇの凍結粉砕及び凍結乾燥したＡＭ間質基質材料を１．７５ｇのヒドロキシプロピルセルロース、１０ｍｌのプロピレングリコール、１０ｍｌのイソプロピルミリスチン酸及び１００ｍｌの精製アルコールＵＳＰと混合する。次に、得られたゲル混合物を、局所投与に適した容器、例えばチューブに入れる。このゲルを、炎症を起こした皮膚に一日２回適用する。この方法を用いることにより、皮膚の炎症が減少する。
【０３１７】
実施例１１：点眼液組成物と眼疾患の治療
眼科用点眼液は、１００ｍｇの粉砕及び凍結乾燥したＡＭ抽出物を０．９ｇの塩化ナトリウムと１００ｍｌの精製水中で混合し、０．２ミクロンのフィルターを用いてろ過することにより調製される。次に、得られた等張液を、眼科的投与に適した眼科用配送ユニット、例えば、点眼液用容器に入れる。一日４回この組成物を２滴、火傷により損傷した眼に適用する。この方法を用いることにより、眼は正常で健康な状態に戻る。
【０３１８】
実施例１２：眼軟膏剤組成物とそれを用いた眼疾患の治療
無菌の眼軟膏剤組成物は、９０ｇの白色ワセリン、１０ｇの液体ワセリンと０．５ｇの凍結乾燥したＡＭ粉末を混ぜ合わせることにより調製される。この混合物を低温殺菌し、個別のチューブ容器に２．０ｇずつ包装する。
【０３１９】
この組成物を用いて眼疾患を治療するために、約０．１ｇのアリコットを、下瞼の内側の端に、チューブから直接かつやさしく適用する。この軟膏剤を一日４回適用する。患者の進捗状況を、眼科医は１週間おきにモニターする。この方法を用いることにより、眼疾患は改善する。
【０３２０】
実施例１３：ＡＭ調製物を用いたヒトの眼疾患の治療
眼に火傷による損傷を有する個人を特定する。ＤＭＥＭ中に１％のＡＭと０．５％のコラーゲンを含む調製物を調製する。上記の個人にこの組成物を２滴一日に４回処置する。この方法を用いることにより、眼の損傷は、何も処置されなかった火傷により損傷した眼と比較して改善する。
【０３２１】
実施例１４：ＡＭ調製物を用いたヒトの皮膚疾患の治療
乾癬を有する個人を特定する。１ｍｇ／ｍｌの精製したＳｍａｄ７（市販品由来）を添加した再構成されたＡＭを５％含む調製物を用いて、この特定した個人を治療する。この処方をローション組成物に溶解する。治療は一日に２回投与する。この方法を用いることにより、乾癬は軽減し、消滅する。
【０３２２】
実施例１５：ＡＭ抽出物を含む直腸ゲル組成物
直腸ゲル組成物は、１００ｍｇの市販のＨＡとＴＳＧ−６（精製した）を５ｍｌの無菌ＡＭ抽出物（実施例１に記載した凍結したＡＭ膜材料から調製した）を混合することにより調製した。この混合物に、２．５ｇのメチルセルロース（１５００ｍＰａ）、１００ｍｇのメチルパラベン、５ｇのグリセリン、９５ｍｌの精製水を加えた。次に、得られたゲル混合物を、直腸投与に適した直腸配送ユニット、例えばシリンジに入れる。
【０３２３】
実施例１６：皮膚炎症を治療するためのキット
皮膚炎症を治療するためのＯＴＣ用キットを調製する。このキットは、ペースト剤形のＡＭ抽出物の入った１ｍｌの容器、アプリケーター、使用説明書を含むパッケージから構成される。
【０３２４】
実施例１７：徐放性固体製剤及び関節炎を和らげるためのその使用
徐放性固体製剤は、１００ｍｇの凍結乾燥及び凍結粉砕したＡＭ間質基質と８００ｍｇのメチルセルロースを混合し、次いでカルボキシメチルセルロース膜に入れてマイクロカプセル化することにより調製される。得られたマイクロカプセル化物質は、約１５ｍｇをボーラスとして、関節炎患者の炎症を起こした膝関節の皮下に埋め込む。埋め込みステップは一週間に一回繰り返す。この方法を用いることにより、膝の炎症は減少する。
【０３２５】
実施例１８：非経口組成物
筋肉内投与のための非経口組成物は、各１０ｍｇずつの：ＨＡ、ＴＳＧ−６、ＰＴＸ−３及びＴＳＰ−１（それぞれ、市販品から入手）と１００ｍｇの本明細書に記載されている化合物の水溶性の塩を混合し、それをＤＭＳＯに溶解し、次いで１０ｍｌの０．９％無菌生理食塩水と混合することにより調製される。この混合物を注射による投与に適した剤形ユニットに入れる。
【０３２６】
実施例１９：ＡＭ非経口調製物の直接注射によるヒトの腫瘍の治療
幅約２ｃｍの皮下腫瘍を有する患者を特定する。１０ｇの液状ＡＭ抽出物と１０％のＰＥＧ３００水溶液を２時間４℃で混合する。この混合物を０．２０μｍフィルターでろ過し、無菌ガラスバイアル（ゴムストッパーで栓がしてあり、アルミニウムキャップで密閉してあった）に分注した。このバイアルは、使用前に４℃で２週間まで保管される。上記の患者の治療は、この溶液の０．５０ｍｌを腫瘍の場所に経皮的に、投与容量を腫瘤の４つの別個の領域に分けて（約１２５μｌを各４つの場所に）直接注射することにより行われる。この組成物を４８時間ごとに投与する。腫瘍の大きさを毎週モニターする。この方法を用いることにより、腫瘍の大きさは減少する。
【０３２７】
好ましい実施の形態を本明細書に示し、説明してきたが、数多くの変形、変更及び代替が本発明から逸脱しない範囲で当業者によって案出されるであろう。当然のことながら、本明細書に記載された本発明の実施の形態のさまざまな変更が、本発明を実施するために用いられてよいことが理解されなければならない。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、及び特許請求の範囲内の方法及び構造及びそれらの等価物が特許請求の範囲によって保護されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０３２８】
【図１】Ａは、各種ＡＭ抽出物によるＴＧＦ−β１プロモーター活性の抑制を示す棒グラフを非限定的に例示したものである。ＰＬ：プラスチック対照；ＦＲＯ／Ｐ：凍結された羊膜、胎盤部分；ＦＲＯ／Ｆ：凍結された羊膜、胎児部分；ＦＲＥ／Ｐ：生の羊膜、胎盤部分；ＦＲＥ／Ｆ：生の羊膜、胎児部分。Ｂは、各種胎盤調製物のＰ値を比較する表を示したものである
【図２】ＴＧＦ−β１プロモーター活性の抑制の用量反応曲線を示す棒グラフを非限定的に例示したものである。ＲＬＵ：相対ルシフェラーゼ単位。
【図３】各種ＡＭ抽出物調製物によるＴＧＦ−β１プロモーター活性の抑制に対する影響を示す棒グラフを非限定的に例示したものである。
【図４】各種ＡＭ抽出物調製物によるＴＧＦ−βＲＩＩプロモーター活性の抑制に対する影響を示す棒グラフを非限定的に例示したものである。
【図５】遠心分離後に得られた可溶性ＡＭＥ及びゼリー抽出物のＴＧＦ−βプロモーター活性に対する抑制作用が変化しないことを示す棒グラフを非限定的に例示したものである。ＨＡ、ＡＭ（全（Ｔ）、低速（ＬＳ）、高速（ＨＳ））、及びゼリー（全（Ｔ）、低速（ＬＳ）、高速（ＨＳ））は、β−ガラクトシダーゼ活性により正規化したときのＰＢＳ対照と比較したＴＧＦ−β１プロモーターの活性化の抑制を示した。
【図６】各種化合物による処理後１８時間又は４８時間における細胞形態の変化を示す、ヒト角膜線維芽細胞の顕微鏡画像のセットを非限定的に例示したものである。ＰＢＳ：ＰＢＳ対照；ＨＡ：ヒアルロン酸；ＡＭＥ：羊膜抽出物；Ｌ／ＡＭＥ：凍結乾燥した羊膜抽出物；ＡＭＪ：羊膜ゼリー；Ｌ／ＡＭＪ：凍結乾燥した羊膜ゼリー。
【図７】凍結乾燥した（Ｌ）あるいは凍結乾燥しないＡＭＥ（２５又は１２５μｇ／ｍｌ）による、ＴＧＦ−β１活性の抑制に対する影響を示す棒グラフを非限定的に例示したものである。その活性は相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）で測定される。
【図８】コラーゲンゲル（Ｃｏｌ）、ＡＭ抽出物（ＡＭＥ）、あるいはコラーゲンゲルとＡＭ抽出物の混合物（Ｃｏｌ＋ＡＭＥ）の添加による、ＴＧＦ−βプロモーター活性の抑制に対する影響を示す棒グラフを非限定的に例示したものである。対照としてＢＳＡを使用した。
【図９】ＡＭＥ、ＨＡ，又はＨＡ＋ＡＭＥを用いた処理による、ＴＧＦ−β１活性の抑制に対する影響を比較する棒グラフを非限定的に例示したものである（ＢＳＡのみを用いた対照アッセイと比較した）。プロモーター活性は、相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）として表示する。
【図１０】各種ＡＭ抽出物における、ＡＭ抽出物中のヒアルロン酸の分子量範囲を、アガロースゲル電気泳動により分離して分析した非限定的な例を示す。バッファーＡ、Ｂ、Ｃにより抽出された羊膜は、ヒアルロニダーゼを加えて、又は加えずに処理し、０．５％アガロースゲルにより電気泳動的に分離した。
【図１１】各種ＡＭ抽出物における、ＡＭ抽出物中のヒアルロン酸の分子量範囲を、アガロースゲル電気泳動により分離して分析した非限定的な例を示す。ＰＢＳバッファーにより抽出された羊膜は、ヒアルロニダーゼ（１５０ｍＭのＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中、１０ユニット／ｍｌ）を加えて、又は加えずに２時間３７℃で処理し、その後０．５％アガロースゲルで泳動させた。ＨＡ：ヒアルロン酸陽性対照；Ｌ：低速遠心分離後のＡＭ抽出物；Ｈ：高速遠心分離後のＡＭ抽出物。
【図１２】インター−α−トリプシン阻害剤（ＩαＩ）がＡＭ抽出物中に存在することを実証するウェスタンブロット写真を非限定的に例示したものである。ビクニンのシグナルが非常に弱かったが（約３９ｋＤａ）、ＩαＩは、ＡＭ抽出物ＡとＣ中に存在した。ウェスタンブロットへの転写前に、抽出物を４〜１５％変性アクリルアミドゲル上で分離した。
【図１３】インター−α−トリプシン阻害剤（ＩαＩ）が、低速（ＬＳ）及び高速（ＨＳ）遠心分離後においても、ＡＭ抽出物中に存在することを実証するイムノブロットを非限定的に例示したものである。
【図１４】ヒアルロニダーゼ処理をした（＋）、又は処理をしない（−）ＴＳＧ−６（腫瘍壊死因子活性化遺伝子６）のイムノブロットを非限定的に例示したものである。サンプルは、遠心分離処理されていない全ＡＭ抽出物（Ｔ）、等張性低塩濃度緩衝液（バッファーＡ）；高塩濃度緩衝液（Ｂ）；又は４Ｍの塩酸グアニジン（Ｃ）（詳細は実施例２に記載）での抽出後のＡＭ抽出物を含んでいた。ＴＳＧ−６は、全抽出物、バッファーＡ抽出物、及びバッファーＣ抽出物中に存在していた。ヒアルロニダーゼの添加は、抽出物中のＴＳＧ−６の濃度を変化させなかったように思われた。
【図１５】ＡＭ中のＴＳＧ−６の脱グリコシル化におけるイムノブロット分析を非限定的に例示したものである。ＡＭ抽出物Ａ、Ｂ及びＣは、２０ユニット／ｍｌのペプチド：Ｎ−グリカナーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）を加えて（＋）、又は加えずに、３７℃で３時間処理した。ＡＭ中のＴＳＧ−６の脱グリコシル化は、次にウェスタンブロットで分析した。陽性対照として、ヒト角膜線維芽細胞（ＨＣＦ）の細胞溶解物を使用した。
【図１６】コンドロイチン硫酸ＡＢＣリアーゼを用いた消化による、ＡＭ中の潜在的なＴＳＧ−６複合体のイムノブロット分析を非限定的に例示したものである。ＡＭ抽出物Ａ、Ｂ及びＣは、１ユニット／ｍｌのＡＢＣリアーゼを加えずに（−）又は加えて（＋）３７℃で２時間処理した。次にＴＳＧ−６複合体の起こりうる崩壊を抗ＴＳＧ−６抗体、ＲＡＨ−１：１：１０００を用いてウェスタンブロットにより分析した。
【図１７】コンドロイチン硫酸ＡＢＣリアーゼを用いた消化による、ＡＭ中の潜在的なＴＳＧ−６複合体のイムノブロットを非限定的に例示したものである。これは、異なるＴＳＧ−６抗体を使用した以外は図１６に示された実験と同じ実験である。ここで、抗ＴＳＧ−６抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した（ｃａｔ＃ＭＡＢ２１０４）。
【図１８】Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手したラットモノクローナル抗ＰＴＸ３抗体を用いて、ペントラキシン（ＰＴＸ３）がＡＭ中に存在することを実証するイムノブロットを非限定的に例示したものである。ＨＣＦ：ヒトの角膜繊維芽細胞；Ｔ、Ａ、Ｂ、Ｃ：それぞれ、全ＡＭ抽出物、抽出物Ａ、抽出物Ｂ、抽出物Ｃ；ＨＡｓｅ：ヒアルロニダーゼ
【図１９】ＴＳＰ−１がＡＭ中に存在することを実証するイムノブロットを非限定的に例示したものである。単量体ＴＳＰ−１（１８０ｋＤａ）及び推定上の三量体ＴＳＰ−１（５４０ｋＤａ）が示される。陽性対照であるＴＳＰ−１は、ヒトの血小板（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａｔ＃６０５２２５）から精製し、１レーンあたり１００ｎｇの量をロードした。
【図２０】Ｓｍａｄ７がＡＭ中に存在することを実証するイムノブロットを非限定的に例示したものである。ＡＭは、ＰＢＳ又は尿素（２Ｍの尿素を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））で抽出した。２０μｇの全タンパク質を各抽出物についてロードした。Ｓｍａｄ７は、ヤギ抗ヒトＳｍａｄ７（ＡＦ２０２９，１：１０００，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出した。Ｓｍａｄ７は、約５１ｋＤａのバンドとして移動した。
【図２１】ＡＭ中における羊膜間質細胞（ＡＭＳＣ）の顕微鏡画像を非限定的に例示したものである。Ａ：ＡＭＳＣは、ｉｎ  ｓｉｔｕで樹状形態を示し、細胞間接触を維持していた。Ｂ：細胞生存率のためのライブアンドデッド（Ｌｉｖｅ  ａｎｄ  Ｄｅａｄ）アッセイによる染色。この方法により樹状形態及び細胞間接触がより可視化された。Ｃ：ＡＭＳＣはαＳＭＡを発現していなかった。Ｄ：ＡＭＳＣはデスミンを発現していなかった。これに対し、陽性対照としての臍帯間葉系細胞は、αＳＭＡとデスミンの両方に対し強い染色を示した（それぞれＣとＤの挿入図）。Ｅ：全てのＡＭＳＣがビメンチンを発現した。点線は、ＡＭ上皮層とＡＭ間質層との間の分離線を示す。核対比染色をＤＡＰＩ（Ｃ、Ｄ）及びＰＩ（Ｅ）のそれぞれによって実施した。バーは５０μｍを表す。
【図２２】ＡＭＳＣのインビトロでの筋繊維芽細胞の迅速な分化を非限定的に例示したものである。Ｐ０＝初代ＡＭＳＣ細胞；Ｐ１＝継代１代目；Ｐ２＝継代２代目。Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２は、それぞれ継代０代目、継代１代目及び継代２代目を示す。Ａ及びＥ：Ｐ０（４日）；Ｂ及びＦ：Ｐ０（７日）；Ｃ及びＧ：Ｐ１；Ｄ及びＨ：Ｐ２。Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈの細胞は、マウス抗αＳＭＡモノクローナル抗体により免疫染色された。Ａ：１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中のプラスチック上で培養したＡＭＳＣは、典型的な繊維芽細胞の細胞形状を呈した。バーは１００μｍを表す。  Ｉは、αＳＭＡ陽性筋繊維芽細胞が、１週間の初代培養における７１．９±３．７％から、継代１代目には９３．９±４．１％、継代２代目には９８．５±１．７％へと劇的に増加したことを実証する折れ線グラフを非限定的に例示したものである。  Ｊは、αＳＭＡとＥＤ−Ａフィブロネクチン（Ｆｎ）のタンパク質の発現の増加を実証するイムノブロット分析を非限定的に例示したものである。ＰＯ及びＰ２は、それぞれ継代０代目及び継代２代目を示す。Ｂ−アクチンを対照として使用する。
【図２３】Ａ〜Ｈは、ＡＭＳＣから分化した筋繊維芽細胞をＡＭ間質基質上で培養しなおすと、繊維芽細胞に逆行することを実証する顕微鏡画像を非限定的に例示したものである。Ｐ２のＡＭＳＣ由来の筋繊維芽細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中のタイプＩコラーゲン（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）又はＡＭ間質基質（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）上で７日間継代培養した。バーは１００μｍを表す。ライブアンドデッド（Ｌｉｖｅ  ａｎｄ  Ｄｅａｄ）アッセイにより、コラーゲン（Ｃ）及びＡＭ間質基質（Ｄ）上の細胞が１００％の生存率を維持していたが異なる細胞形状を呈しているが分かった。ファロイジン及びαＳＭＡによる二重染色により、コラーゲンで培養した筋繊維芽細胞には鮮明なストレスファイバー（Ｅ）と強いαＳＭＡ（Ｇ）が発現していることが分かった。これに対し、ＡＭ間質基質上で継代培養した細胞においては、ファロイジン染色は弱くかつまばらで（Ｆ）、αＳＭＡ染色はぼんやりしていた（Ｈ）。Ｉ：イムノブロット分析により、ＡＭ間質基質上に播種された場合、タイプＩコラーゲン上に播種された場合と比較して、ＥＤ−Ａフィブロネクチン（Ｆｎ）の発現は減少し、ＡＭＳＣのαＳＭＡの発現は検出できなかったことが示された。
【図２４】Ａ〜Ｈは、ＡＭ間質抽出物（ＡＳＥ）がＡＭＳＣの筋繊維芽細胞への分化を妨げることを実証する顕微鏡画像を非限定的に例示したものである。ファロイジン染色（上部パネル）及びαＳＭＡ染色（下部パネル）を実施した。Ａ及びＥ：ＡＳＥを添加しないで４日間培養した細胞；Ｂ及びＦ：ＡＳＥを添加して４日間培養した細胞；Ｃ及びＧ：ＡＳＥを添加しないで１０日間培養した細胞；Ｄ及びＨ：ＡＳＥを添加して１０日間培養した細胞。Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの細胞は、ＦＩＴＣ結合ファロイジンを用いて染色した。Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨの細胞は、マウス抗αＳＭＡモノクローナル抗体を用いて染色した。ＡＭＳＣは、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中のプラスチック上で４日間培養した後も、ＡＳＥの有る（Ｂ）無し（Ａ）に関わらず紡錘状の繊維芽細胞の形状を維持していた。しかしその時には、ＡＳＥを添加した場合には（Ｆ）細胞はαＳＭＡを発現していなかったが、ＡＳＥを添加しなかった場合には（Ｅ）細胞は既にαＳＭＡを発現し始めていた。培養を１０日間に延長した際には、ＡＳＥを添加しなかった場合、細胞は膨張し、顕著なストレスファイバーを発現し（Ｃ）、αＳＭＡを強く発現していた（Ｇ）。これに対し、ＡＳＥを添加した場合、ＡＭＳＣは凝集して様々な大きさの球状になった。これらの球は、ストレスファイバーを発現していなかったが（Ｄ）、弱いαＳＭＡ染色を発現していた（Ｈ）。バーは１００μｍを表す。
【図２５】ＡとＢは、羊膜間質抽出物（ＡＳＥ）が分化した筋繊維芽細胞を逆行させることを実証する顕微鏡画像を非限定的に例示したものである。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中のプラスチック上におけるＡＭＳＣから分化した筋繊維芽細胞の継代２代目を、ＡＳＥを添加して１週間培養した。Ａ：細胞は扁平上皮形状から細長い紡錘形状に逆行した。Ｂ：αＳＭＡ染色は著しく減少した。Ｃ：イムノブロット分析は、ＥＤ−Ａフィブロネクチン及びαＳＭＡレベルがＡＳＥを添加していない対照と比較して減少したことを示す。バーは１００μｍを表す。
【図２６】Ａ〜Ｌは、ＡＳＥによる筋繊維芽細胞の逆行は細胞増殖と関連していないことを実証する顕微鏡画像を非限定的に例示したものである。ＡＭＳＣ（継代２代目）ＡＳＥを添加しないで（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）又は添加して（Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、ＤＭＥＭ／ＩＴＳ中で、表示のように、０、２、４及び６日間培養した。αＳＭＡ発現ストレスファイバーは、ＡＳＥの添加後、０日目から６日目まで徐々に減少し（Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ）、形態の変化と相関していた（Ｅ〜Ｈ）。
【図２７】Ａ〜Ｄは、ＡＭ抽出物が、ヒトの角膜縁の外植片からの繊維芽細胞の遊走を抑制し、その結果増殖物中の繊維芽細胞を減少させることを実証する顕微鏡画像を非限定的に例示したものである。Ａ，Ｂ：ＳＨＥＭ（対照）及びＳＨＥＭ／ＡＭＥ（ＡＭＥ）の両者において培養したヒトの角膜縁の外植片からの増殖物。Ｃ，Ｄ：１４日間の培養後、ヒトの角膜縁の外植片を培養ウェルから取り出し、包埋し、切片化しヘマトキシリン・エオジン染色により染色した。
【図２８】Ａは、ＡＭＥによる繊維芽細胞の増殖の抑制を実証する４８ウェルアッセイプレートの写真を非限定的に例示したものである。ＳＨＥＭ（対照）又は２５μｇ／ｍｌのＡＭＥを含むＳＨＥＭ（ＡＭＥ）で１４日間増殖させた後のヒトの角膜縁の外植片からの増殖物を別々に回収し、９６個の各ウェルに１ウェルあたり２０００個の細胞となるように播種した。対照からの細胞は、カラム１〜３（１：対照；２：ＰＢＳ；３：ＡＭＥ）に播種し；ＡＭＥからの細胞は、カラム４〜６（１：対照；２：ＰＢＳ；３：ＡＭＥ）に播種した。１０日間の培養後、ＭＴＴアッセイを実施した。  Ｂは、ＡＭＥによる繊維芽細胞の増殖の相対的な抑制についての定量的及び統計的分析を示す棒グラフを非限定的に例示したものである。
【図２９】ＡとＢは、ＳＨＥＭ対照（図２９Ａ）及びＡＭＥを含むＳＨＥＭ（図２９Ｂ）の両者において１４日間培養したヒトの角膜縁の外植片からの増殖物の顕微鏡画像を非限定的に例示したものである。
【図３０】プラスチック上又は無処理羊膜上で培養した細胞における、ＩＦＮ−γ刺激がある場合と無い場合の相対的なＮＯ産生を示す棒グラフを非限定的に例示したものである。Ｒａｗ２６４．７細胞をＤＭＥＭ／ＩＴＳの入った２４個の各ウェルに２．５ｘ１０5個ずつ播種した（各グループについてｎ＝３）。細胞は２００μ／ｍｌのＩＦＮ−γを用いて、又は用いないで刺激し、培養液はＮＯアッセイに供するために回収した。Ｐｌ：プラスチック；ｉＡＭ：無処理羊膜。
【図３１】ＩＦＮ−γ刺激がある場合と無い場合のプラスチック上又はｉＡＭ上で培養したＲａｗ２６４．７細胞中のプロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）及びプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）のレベルを定量した棒グラフパネルを非限定的に例示したものである。Ａ：ＰＧＤ２の合成；Ｂ：ＰＧＥ２の合成；Ｃ：プラスチック上及びｉＡＭ上で培養したときのＲａｗ２６４．６におけるＰＧＤ２／ＰＧＥ２の比。
【図３２】ＩＦＮ−γ刺激がある場合と無い場合のプラスチック上又はｉＡＭ上で培養したＲａｗ２６４．７細胞におけるＴＧＦ−β１プロモーター活性を実証する棒グラフを非限定的に例示したものである。
【図３３】ＡＭＥにより誘起されたマクロファージの死を示す顕微鏡画像を非限定的に例示したものである。Ｒａｗ２６４．７細胞を１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭの入った２４個の各ウェルに２ｘ１０5個ずつ播種した。１時間後、１２５μｇ／ｍｌのＰＢＳ（対照、図３３Ａ）又は１２５μｇ／ｍｌのＡＭＥ（ＰＢＳ中）（ＡＭＥ、図３３Ｂ）を培養液に加えた。
【図３４】ＡＳＥがＨＵＶＥＣ細胞を優先的に阻害することを実証する棒グラフを非限定的に例示したものである。Ａ：ＨＵＶＥＣの生細胞の測定；Ｂ：ＨＣＦの生細胞の測定；Ｃ：ＲＣＥの生細胞の測定。
【図３５】ＨＵＶＥＣ細胞の顕微鏡画像を非限定的に例示したものである。結果は、ＨＵＶＥＣ細胞はＡＳＥを添加しない対照では生存していたが（図３５Ａａ）、ＡＳＥ処理後では、顕著な細胞死を示した（図３５Ａｄ）ことを示した。これに対し、ＨＣＦ及びＲＣＥ細胞はともに、ＡＳＥ処理の有る（それぞれ、図３５Ａｅ及び３５Ａｆ）無し（それぞれ、図３５Ａｂ及び３５Ａｃ）に関わらず、注目に値する細胞死は何も観察されなかった。ヘキスト−３３３４２染色は、ＡＳＥで処理されたＨＵＶＥＣは、６１．６±７．７％の凝結と断片化核を有した（図３５Ｂｄ）ことを示し、この値は、ＡＳＥ処理をしない対照の値：３．１±１．８％よりも著しく高かった（図３５Ｂａ、２Ｃも参照、ｐ＜０．００１）。これに対し、ＨＣＦ及びＲＣＥともに、ＡＳＥ処理の有る（それぞれ、図３５Ｂｅ及び３５Ｂｆ）無し（それぞれ、図３５Ｂｂ及び３５Ｂｃ）に関わらず、明白なアポトーシスは見られなかった。
【図３６】ＡＳＥの添加により、アポトーシスＨＵＶＥＣ細胞の数が増加することを実証する棒グラフを非限定的に例示したものである。
【図３７】ＶＥＧＦにより刺激されたＨＵＶＥＣの遊走がＡＳＥにより抑制される影響を非限定的に例示したものである。Ａ：対照（ＶＥＧＦもＡＳＥも添加しない）。Ｂ：ＶＥＧＦの添加により細胞の遊走が増加した。Ｃ：ＶＥＧＦと２００μｇ／ｍｌのＡＳＥの添加。ＡＳＥの添加により、ＶＥＧＦにより誘起された遊走が遅くなった。図３７Ｄは、図３７Ａ、３７Ｂ及び３７Ｃで起こった細胞遊走を定量化した棒グラフを示したものである。
【図３８】ＡＳＥの添加が管腔形成を抑制することを実証する顕微鏡画像パネル（Ａ〜Ｃ）及び棒グラフ（Ｄ）を非限定的に例示したものである。インビトロ管腔形成アッセイを実施するために、ＨＵＶＥＣ細胞をマトリゲル上に播種した。Ａ：対照培地における管腔様構造物の形成。Ｂ：培地への１００μｇ／ｍｌのＡＳＥの添加により、管腔形成が抑制された。Ｃ：培地への２００μｇ／ｍｌのＡＳＥの添加により、管腔形成が抑制された。Ｄ：Ａ、Ｂ及びＣからの単位領域に形成された管腔の数を定量化した棒グラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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