(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるFGF1/FGF2キメラ蛋白質を有効成分として含む、細胞増殖促進用培地。
【請求項２】
前記細胞が、表皮細胞、繊維芽細胞、上皮細胞、骨髄細胞、又は幹細胞から選択された細胞である、請求項１に記載の細胞増殖促進用培地。
【請求項３】
前記細胞が、創傷障害又は放射線障害を受けた細胞である、請求項１又は２に記載の細胞増殖促進用培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸性繊維芽細胞成長因子（以下、FGF1という。）蛋白質の特定の一部領域を、塩基性繊維芽細胞成長因子（以下、FGF2という。）蛋白質の対応する領域に置換したキメラ蛋白質を有効成分とするFGF2代替用医薬組成物であって、特に創傷治癒促進、腸管の放射線障害の予防及び治療、骨髄の放射線障害の予防及び治療、並びに幹細胞増殖促進に有効な医薬組成物、並びに細胞増殖促進用培地、特に放射線障害を受けた細胞の障害修復用の又は幹細胞の増殖促進用の培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
FGF2は、FGF1と同様にFGFファミリーに属する繊維芽細胞成長因子であり、FGF1と同様、多くの細胞に増殖や遊走を引き起こす性質などFGF1と共通の性質を多く有しているが、FGF1がヘパリンの存在下で初めてその完全な生物活性を発揮し得るのに対し、FGF2はヘパリン非依存性である利点があるため、広くFGF2医薬組成物として用いられてきていた。
特に、創傷治癒のためのFGF2医薬組成物は、単に患部を消毒して細菌感染を防ぎ自然の皮膚再生機能を待つという、従来一般的に用いられていた「ポピドンヨード・白糖」とは全く異なり、積極的に皮膚細胞を増殖させることで治癒させるという画期的な創傷治癒促進用治療剤として、上市され臨床現場においても広く用いられており、既に一般名トラフェルミン、商品名フィブラストスプレーの名称で市販されている。FGF2医薬組成物は他にも、骨折治療剤（非特許文献５）、歯周病治療剤（非特許文献６）、骨髄の放射線障害防止剤（非特許文献７）、腸管の放射線障害防止剤（非特許文献８）、幹細胞の増殖剤（非特許文献９）などとして有効性が認められている。
【０００３】
ところで、我が国では皮膚細胞を増殖させることで治癒させるタイプの創傷治癒促進用治療剤としては、FGF2を用いた治療剤が一般的である。米国で最近上市されて用いられているFGF7増殖因子の場合は、その受容体結合特異性から、理論的に表皮の治療には有効であると考えられるが、真皮の細胞の増殖を促進することができないため、皮膚の治療に用いる際に、真皮にまで及ぶ潰瘍や床ずれなどの重篤な創傷治療には適さないと考えられるため、皮膚創傷への適応はなく、放射線化学療法における口腔内膜炎への適応が認められている。
一方、FGF2は、ヘパリン非依存性であって真皮の細胞の増殖を促進することができるため、重篤な場合を含め広く創傷治療一般に用いることができる。しかしながら、FGF2はその受容体結合特異性から、上皮細胞に対する反応性が極めて低いため、真皮の治療には有効であるが、表皮の細胞の増殖を直接促進することができなかった。すなわち、真皮の増殖再生を促す間に、表皮細胞の自己修復能を待ち、結果的に皮膚全体の再生を図るというものであったため、治癒にかかる時間が長くなる問題点がある。特に皮膚再生能が極端に落ちている高齢者の重篤な床ずれや糖尿病患者の皮膚潰瘍の治療などでは、なかなか治癒に至らない場合が多く、皮膚用治療薬としては、まだ満足のいくものではなかった。
またFGF2蛋白質は、生体内に存在する蛋白質分解酵素で分解されやすく、室温から体温程度の温度に相当する約20〜40℃の温度領域での活性が不安定なため、生体に投与した際に活性が速やかに失われるという問題点や、保存容器の壁面に吸着しやすく凝集体を形成しやすいため、溶液中から消滅しやすい点も、製剤化後の活性維持が難しく、医薬製剤としての改善も求められていた。
このような背景の下、FGF2の真皮細胞増殖活性及びヘパリン非依存性などFGF2活性としての利点は維持しつつ、表皮細胞などの上皮細胞にも増殖促進活性を有する皮膚の創傷治癒促進剤などとして用いることができ、かつ製剤化も容易で安定性の高いFGF2代替用の医薬組成物の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第2733207号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Imamura T, Friedman SA, Gamble S, Tokita Y, Opalenik SR, Thompson JA,Maciag T. Identification of the domain within fibroblast growth factor-1 responsiblefor heparin-dependence. Biochim Biophys Acta. 1995 Apr 28; 1266(2): 124-30.
【非特許文献２】T Imamura, T Tanahashi, A novel chimeric fibroblastgrowth factor for liver parenchymal cells Hepatology 1996 Volume 23, Issue 2 , Pages316-319
【非特許文献３】OrnitzDM, Xu J, Colvin JS, McEwen DG, MacArthur CA, Coulier F, Gao G, Goldfarb M. Receptorspecificity of the fibroblast growth factor family. J.Biol.Chem. 1996 Jun 21;271(25):15292-7.
【非特許文献４】V.P. Eswarakumar, I. Lax, J. Schlessinger (2005)Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & GrowthFactor Reviews 16, 139-149
【非特許文献５】Kawaguchi H, Nakamura K, Tabata Y, Ikada Y, AoyamaI, Anzai J, Nakamura T, Hiyama Y, Tamura M. Acceleration of Fracture Healing inNonhuman Primates by Fibroblast Growth Factor-2. J Clinical Endocrinol Metabolism86, 875-880, 2001
【非特許文献６】Murakami S, Takayama S, Kitamura M, ShimabukuroY, Yanagi K, Ikezawa K, Saho T, Nozaki T, Okada H. Recombinant human basic fibroblastgrowth factor (bFGF) stimulates periodontal regeneration in class II furcation defectscreated in beagle dogs. J Periodont Res. 38, 97-103, 2003
【非特許文献７】Ding I, Huang K, Wang X, Greig JR, Miller RW, Okunieff P.Radioprotection of hematopoietic tissue by fibroblast growth factors in fractionatedradiation experiments. Acta Oncol.1997;36(3):337-340.
【非特許文献８】Okunieff P, Mester M, Wang J, Maddox T, Gong X,Tang D, Coffee M, Ding I. In vivo radioprotective effects of angiogenic growth factorson the small bowel of C3H mice. Radiat Res. 150, 204-211, 1998.
【非特許文献９】GlaserT, PollardSM, SmithA, Bruestle O. Tripotentialdifferentiation of adherently expandable neural stem (NS) cells. PLoS ONE. 2007Mar 14;2(3):e298.
【非特許文献１０】Forough R, Engleka K, Thompson JA, Jackson A, ImamuraT, Maciag T. Differential expression in Escherichia coli of the alpha and beta formsof heparin-binding acidic fibroblast growth factor-1: potential role of RNA secondarystructure. Biochim Biophys Acta. 1991 Nov 11;1090(3):293-8.    （なお、これら従来技術文献中の各記載は、本願明細書の記載として取り込むこととする。）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、FGF2が有している繊維芽細胞増殖活性、幹細胞増殖促進活性と共にヘパリン非依存性というFGF2の性質は保持しつつ、さらに上皮細胞の増殖促進活性を併せ持つFGF2代替医薬組成物、具体的には創傷治癒及び放射線障害の予防と治療に有効な医薬組成物並びに幹細胞増殖促進のための医薬組成物であって、温度安定性及び蛋白質分解酵素抵抗性の高い製剤を提供し、さらに温度安定性及び蛋白質分解酵素抵抗性の高いFGF1/FGF2キメラ蛋白質を有効成分とする細胞増殖促進用培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
表皮細胞などの上皮細胞にも増殖促進活性があるFGF蛋白質としては、FGF2の他にも受容体特性が広範に及ぶFGF1が知られている。FGF1は、真皮の細胞にも表皮の細胞にも作用して、それらの増殖を促進するが、外来性ヘパリンの添加なしには完全活性が得られない。創傷や腸管炎では出血性の状況になっており、ヘパリンによりアンチトロンビンIIIの活性が阻害されてしまうと血液凝固が抑制されて大きな問題となるため、外来性ヘパリンを必須とするFGF1は創傷や腸管炎用の治療剤には適さない。そのために、上述のように、従来は上皮細胞の増殖特性がないという欠点があっても皮膚創傷治療用にはFGF2を用いるしかなかったわけである。その上、FGF1は、蛋白質分解酵素による易分解性や、約20〜40℃の温度範囲での不安定性、容器壁への吸着性や凝集体の形成などの上記のFGF2の欠点は全て有し、しかもFGF2以上に顕著であったため、他の有効な医薬としての開発ターゲットとしての魅力に乏しいものであった。
ところで、本発明者らは、以前（１９９５年）に、FGF1蛋白質の特定の一部領域を、FGF2蛋白質の対応する領域に置換したキメラ蛋白質を多数作製し（非特許文献１）、その性質を調べていた。その過程で、FGF1蛋白質のアミノ酸配列の41〜83位の部分配列が、FGF2蛋白質のアミノ酸配列における対応する領域の部分配列に置換されたキメラ蛋白質（非特許文献１ではFGF-C(1211)、以下FGF-C1ともいう。）、及び同様に62〜83位の部分配列が、FGF2蛋白質由来の部分配列に置換されたキメラ蛋白質（非特許文献１ではFGF-C(1(1/2)11)、以下FGF-C2ともいう。）が、FGF1と同様の増殖活性を有していながら、ヘパリン非依存性に変化することを見出しており、FGF1アミノ酸配列の62〜83位の領域がFGF1のヘパリン依存性を決定する領域であることを考察した。なお、本発明において、62位、83位などというとき、FGF1の全長のcDNAに対応するアミノ酸配列のN末端を1位のアミノ酸として数えたFGF1アミノ酸配列上の位置を表す。
その後、これらキメラ蛋白質のFGF-C1（FGF-C(1211)）について、ヘパリンの非存在下での、FGF1と同様の強い肝臓細胞増殖促進活性及び神経突起伸展促進活性を確認し、肝臓細胞増殖用医薬組成物及び神経細胞増殖用医薬組成物について報告し、同時に特許出願している（非特許文献２、特許文献１）。
しかし、FGF-C1及びFGF-C2のいずれのキメラ蛋白質についても、蛋白質全長の２／３以上がFGF1由来のアミノ酸配列で構成されているため、その医薬組成物用途開発の方向性は、FGF1のヘパリン依存性決定領域をFGF2由来領域に置換することで、ヘパリン依存性が改善された点が着目され、あくまでFGF1代替用としての医薬組成物の域を出るものではなく、FGF2代替用の医薬組成物としての可能性は全く検討がなされていなかった。
【０００８】
今回、本発明者らは、FGF2医薬組成物の問題点を改善するという上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねる中で、既に作製した多数のキメラ蛋白質のアミノ酸配列を正確に確定し、かつそれぞれの受容体結合特異性を系統的に測定したところ、上記非特許文献１に開示されたFGF-C(1211)及びFGF-C(1(1/2)11)（以下、あわせて「FGF-C」ともいう。）のFGF1/FGF2キメラ蛋白質（以下、単にキメラ蛋白質ともいう。）がFGF2と同等の薬理活性を保持し、かつさらに優れた薬理活性を有する蛋白質であることを見いだし、これを有効成分とするFGF2代替医薬組成物、具体的には創傷治癒及び放射線障害の予防と治療に有効な医薬組成物並びに幹細胞増殖促進のための医薬組成物として本発明を完成するに至った。
本発明のFGF2代替医薬組成物の有効成分となるキメラ蛋白質は、それを構成するアミノ酸配列が、FGF1蛋白質のアミノ酸配列において、41〜83位の配列又はその少なくとも62〜78位の配列を含む部分配列が、FGF2蛋白質のアミノ酸配列における対応する位置の部分配列に置換されており、他の領域はFGF1のアミノ酸配列から構成されている。
そして本発明は、当該キメラ蛋白質の有する下記特徴を利用した、医薬組成物である。
（１）FGF受容体の全てのサブタイプを刺激する（FGF1と類似）。その結果、FGF2が刺激することができない上皮系細胞も刺激することができる。
（２）ヘパリンに依存せずに高活性を発揮できる（FGF2と類似）。
（３）容器の器壁などへの吸着性が低い。（FGF1とFGF2は高吸着性）
（４）室温〜体温（約20〜40℃）における活性の安定性が高い（FGF1とFGF2は低安定性）
（５）トリプシン分解に対する抵抗性が高い（FGF1とFGF2は易分解性）
【０００９】
本発明の医薬組成物の有効成分として含有させるキメラ蛋白質FGFCは、その２／３以上をFGF1由来蛋白質で構成されたFGF2とのキメラ蛋白質でありながら、FGF2と同様に、通常の細胞に対してはヘパリンの添加なしに細胞増殖活性を発揮できる上、FGF1と同様に、FGF2が刺激することのできないFGFR2bを含む全てのサブタイプのFGF受容体を活性化することができることが判明した。このため、これまでFGF2によって直接細胞増殖を効果的に促進することが出来なかったFGFR2b刺激を必要とする表皮角化細胞や小腸上皮細胞などの増殖を必要とする用途に対して有効な医薬組成物となりうる。また、ヘパリンの添加なしに完全活性を発揮させることが出来るため、これまでFGF1の適用が見送られていた、ヘパリン投与が悪影響を及ぼす用途に対して、有効な医薬組成物となりうる。この性質は、一例として、出血を伴う場所への適用、すなわち、創傷を受けた皮膚角化細胞への適用や、放射線による細胞障害を受けてびらんを伴っている小腸上皮粘膜細胞への適用に対して、最適な性質といえる。
また、キメラ蛋白質FGFCは、FGF1やFGF2に比べて蛋白質分解酵素に対する抵抗性が高い。このため、生体内で速やかに分解されて失活してしまうFGF1に比べて、投与時の有効濃度が長時間維持されることになり、投与時にはより低濃度でも同等の活性を発揮することが期待できる。
【００１０】
上皮細胞の増殖が問題となり期待される各種疾病の治療、例えば皮膚創傷受傷後の皮膚や皮下組織再生促進や皮膚の自然治癒機能低下時の創傷治癒改善などに有効である。このキメラ蛋白質はまた、放射線被ばくにより腸管や骨髄の細胞が障害を受けた場合、腸管上皮細胞や骨髄細胞の生存や増殖の促進作用を発揮するので、これら細胞の生存や増殖の機能が問題となったり期待されている各種疾患の治療、例えば癌の放射線治療の副作用としての腸管炎、原発事故などの被爆者に起こる腸管や骨髄の重篤な障害の予防や治療などに有効である。さらに、他にもFGF2医薬組成物の有効性が確認されている若しくは期待されている分野においては、FGF2の一部または全部を同等あるいはそれ以上に薬理効果の高い医薬組成物として代替しうる。例として、幹細胞増殖促進のための医薬組成物、骨折の治療、再生医療への応用、歯周病治療、慢性関節リウマチにおける膝関節痛、難治性皮膚潰瘍、強力な血管新生作用を利用することによって心筋梗塞などの冠動脈疾患や、間欠性跛行などの末梢循環障害治療、骨再生、神経再生など、失われた機能回復（再生医療）などが挙げられる。
このような適用においてFGFCは、室温〜体温（約20〜40℃）の温度条件下での安定性が高く、しかも37℃下での蛋白質分解酵素耐性が高いので、高活性を実現できる。すなわち多様な生体障害における浸出液に含まれる蛋白質分解酵素による不活性化の影響を最小限にすることが出来る。
また、FGFCは、溶液を容器に保存した場合の濃度が低下しにくい、という優れた医薬製剤特性を有しているため、安定した高活性の医薬組成物が提供できる。
【００１１】
すなわち、本発明は以下を包含する。
〔１〕  酸性繊維芽細胞成長因子（FGF1）蛋白質の特定の一部領域を、塩基性繊維芽細胞成長因子（FGF2）蛋白質の対応する領域に置換したFGF1/FGF2キメラ蛋白質を有効成分とするFGF2代替用医薬組成物であって、
当該キメラ蛋白質を構成するアミノ酸配列が、FGF1蛋白質のアミノ酸配列において、41〜83位の配列又はその少なくとも62〜78位の配列を含む部分配列が、FGF2蛋白質のアミノ酸配列における対応する位置の部分配列に置換されており、他の領域はFGF1のアミノ酸配列から構成されていることを特徴とする、FGF2代替用医薬組成物。
〔２〕  前記キメラ蛋白質を構成するアミノ酸配列が、FGF1蛋白質のアミノ酸配列の41〜78位の部分配列が、FGF2蛋白質のアミノ酸配列における対応する位置の部分配列に置換されており、他の領域はFGF1のアミノ酸配列から構成されていることを特徴とする、前記〔１〕に記載のFGF2代替用医薬組成物。
〔３〕  前記キメラ蛋白質を構成するアミノ酸配列が、配列番号１〜４のいずれかで表されることを特徴とする前記〔１〕に記載のFGF2代替用医薬組成物。
〔４〕  前記キメラ蛋白質を構成するアミノ酸配列が、配列番号５〜８のいずれかで表されることを特徴とする、前記〔２〕に記載のFGF2代替用医薬組成物。
〔５〕  前記キメラ蛋白質が、配列番号５〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列をコードするDNAを用いて形質転換された大腸菌を培養し、その破砕物の可溶性画分から直接単離精製されたキメラ蛋白質の活性体であることを特徴とする、前記〔４〕に記載のFGF2代替用医薬組成物。
〔６〕  前記FGF2代替用医薬組成物が、FGF2蛋白質を有効成分とする医薬組成物よりも高い薬理作用を示す医薬組成物である、前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のFGF2代替用医薬組成物。
〔７〕  FGF2代替用医薬組成物が、創傷治癒促進のための医薬組成物である、前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のFGF2代替用医薬組成物。
〔８〕  前記創傷治癒促進が、上皮系の細胞増殖促進を伴うものである前記〔７〕に記載のFGF2代替用医薬組成物。
〔９〕  FGF2代替用医薬組成物が、腸管の放射線障害の予防及び／又は治療のための医薬組成物である、前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のFGF2代替用医薬組成物。
〔１０〕  FGF2代替用医薬組成物が、骨髄の放射線障害の予防及び／又は治療のための医薬組成物である、前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のFGF2代替用医薬組成物。
〔１１〕  FGF2代替用医薬組成物が、幹細胞増殖促進のための医薬組成物である、前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のFGF2代替用医薬組成物。
〔１２〕  配列番号５〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるＦＧＦ１／ＦＧＦ２キメラ蛋白質を有効成分として含む、細胞増殖促進用培地。
〔１３〕  前記細胞が、表皮細胞、繊維芽細胞、上皮細胞、骨髄細胞、又は幹細胞から選択された細胞である、前記〔１２〕に記載の細胞増殖促進用培地。
〔１４〕  前記細胞が、創傷障害又は放射線障害を受けた細胞である、前記〔１２〕又は〔１３〕に記載の細胞増殖促進用培地。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のキメラ蛋白質を有効成分とする医薬組成物を、FGF2を有効成分とする医薬組成物に代替して用いることで、FGF2が有効性を示す繊維芽細胞および幹細胞の増殖促進活性をヘパリンとの併用なしに発揮でき、かつ上皮細胞の増殖促進活性を併せ持つFGF2代替医薬組成物、たとえば、創傷治癒の促進剤、放射線による腸管上皮や骨髄を含む様々な臓器の受ける障害を予防したり治療したりする医薬組成物並びに幹細胞増殖促進のための医薬組成物を提供することができる。
また、当該FGF2代替医薬組成物は、従来のFGF2医薬組成物以上に、温度及び蛋白質分解酵素に対する安定性が高く、溶液を容器に保存した場合の濃度が低下しにくい、という製剤化しやすい点でも優れた特徴を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】細胞増殖促進活性により測定できるキメラ蛋白質の受容体特異性（ヘパリン存在下）
【図２】FGFR1c強制発現BaF3細胞に対する細胞増殖促進活性（ヘパリン存在下）
【図３】FGFR2b強制発現BaF3細胞に対する細胞増殖促進活性（ヘパリン存在下）
【図４】細胞増殖促進活性により測定できるキメラ蛋白質の受容体特異性（ヘパリン非存在下）
【図５】キメラ蛋白質のトリプシンによる分解に対する抵抗性（FGF1との比較）
【図６】キメラ蛋白質のトリプシンによる分解に対する抵抗性（FGF2との比較）
【図７】キメラ蛋白質のトリプシンによる分解に対する抵抗性（FGF1とFGF2との比較    ）
【図８】キメラ蛋白質のトリプシンによる分解に対する抵抗性（時間依存性）
【図９】キメラ蛋白質の37℃（体温）保存における活性安定性（FGF1との比較）
【図１０】キメラ蛋白質の37℃（体温）保存における活性安定性（FGF2との比較）
【図１１】キメラ蛋白質の容器保管時の溶液濃度安定性
【図１２】キメラ蛋白質の溶液中における構造安定性（25℃）
【図１３】キメラ蛋白質の溶液中における構造安定性（温度依存性）
【図１４】創傷治癒の重要なステップである表皮細胞に対するキメラ蛋白質の増殖促進活性（１）
【図１５】創傷治癒の重要なステップである表皮細胞に対するキメラ蛋白質の増殖促進活性（２）
【図１６】繊維芽細胞に対するキメラ蛋白質の増殖促進活性
【図１７】放射線による生体障害に対するキメラ蛋白質の予防と治癒促進活性
【図１８】大腸菌発現系を用いた可溶性キメラ蛋白質の効率的な大量生産
【図１９】キメラ蛋白質の創傷治癒促進活性
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の医薬組成物の有効成分として含有させるキメラ蛋白質のアミノ酸配列は、FGF1蛋白質のアミノ酸配列において、41〜83位の配列のうち少なくとも62〜78位の配列を含む部分配列が、FGF2蛋白質のアミノ酸配列における対応する位置の部分配列に置換されており、他の領域はFGF1のアミノ酸配列から構成されている。すなわちFGF1及びFGF2をコードするcDNAをカセットフォーマットで作成した後、cDNA上でキメラを作成し、それを大腸菌、酵母、動物細胞などの発現系を用いて発現させることにより得ることができる。
また、本発明のキメラ蛋白質は、典型的には、これら宿主細胞からの発現産物を精製して医薬製剤化するが、キメラcDNAを作成後、ヒトなど治療対象の動物に投与可能な発現ベクターなどを用いて遺伝子治療することができる。
【００１５】
上記のキメラ蛋白質の基本となるFGF1蛋白質およびFGF2蛋白質としては、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ等の哺乳動物のFGFのいずれでもよいが、免疫系による望ましくない反応を避ける意味から、治療対象となる動物と同種の起源のものが好ましい。
【００１６】
本発明の実施態様では、典型的な例としてヒトFGF1及びヒトFGF2のアミノ酸配列を用いて作製したキメラ蛋白質を用いたが、これらに限定されるものではない。
本発明のキメラ蛋白質を構成するアミノ酸配列は、基本的にはFGF1蛋白質のアミノ酸配列により構成されており、ヘパリン依存性に関与する部分のアミノ酸配列が、FGF2蛋白質の対応部分配列と置換されている。具体的には、FGF1アミノ酸配列の41〜83位の部分配列のうちの少なくとも62〜78位の配列を含む部分配列が、FGF2蛋白質のアミノ酸配列における対応する位置の部分配列に置換されていればよい。好ましくは、FGF1アミノ酸配列中の41〜78位の部分配列すべてが対応するFGF2アミノ酸配列（44〜81位に相当）に置換されたアミノ酸配列を有するものである。また、上記のキメラ蛋白質は、その機能を発揮する限りにおいて、そのアミノ酸配列の一部に、付加、欠失、置換、修飾があってもよい。
【００１７】
本発明のキメラ蛋白質FGFCとしては、非特許文献１に記載のキメラ蛋白質FGF-C(1211)及びFGF-C(1(1/2)11)が典型的な例として包含される。そこで、非特許文献１における公知キメラ化合物、FGF-C(1211)及びFGF-C(1(1/2)11)キメラ蛋白質がどのようなアミノ酸配列からなる蛋白質であるかを検討する。
非特許文献１においては、非特許文献１０に記載のカセット形式の合成方法が採用されており、Fig.1Aによると、上記FGF-C1及びFGF-C2の83位は、FGF2アミノ酸配列との置換であるから、本来の設計ではFGF2の対応位置でのLys（K）となるが、カセット方式での設計によれば、83位に当たる第2カセットと第3カセットの連結部分は制限酵素Nco1部位となり、Glu（E）の変異が導入される設計となる。また、同文献（第126頁左欄13行〜右欄7行）には、Fig.1BのFGF-C(1211)キメラ蛋白質を作製するための「Cassette  B（pTI2X,Fig.2）」を構成するオリゴヌクレオチド配列のセットが記載されており、そのオリゴヌクレオチド配列を用いてCassette  Bを作成し、これを非特許文献１０に記載の方法でFGF1遺伝子の相同的Cassette部分と交換した遺伝子の発現産物として得られるキメラ蛋白質の場合、上記83位のアミノ酸はFGF1の83位と同一アミノ酸のAsp（D）となる。同様に、FGF-C(1(1/2)11)キメラ蛋白質の場合も、Mun1-Nco1カセットを用いることが提案されているから、上記「Cassette  B」を用いるFGF-C(1211)キメラ蛋白質の場合と同様に83位アミノ酸としては、それぞれ、Lys（K）、Glu（E）及びAsp（D）の３種類のアミノ酸であるキメラ蛋白質の場合も包含されている。
つまり、非特許文献１においては、FGF-C(1211)及びFGF-C(1(1/2)11)として、83位アミノ酸が、Lys（K）、Glu（E）及びAsp（D）の３通りの場合のキメラ蛋白質が実質的に開示されていることになる。
ただし、同文献１においては、83位アミノ酸がLys（K）又はGlu（E）については提案がなされているだけで、実際に作製されたのは上記オリゴヌクレオチド配列を用いた発現産物としてのキメラ蛋白質であったため、83位がFGF1由来のAsp（D）である。同Fig.3及びFig.4においてヘパリン依存的DNA合成促進活性及びヘパリン結合強度を測定したものもAsp（D）である。なお、この83位アミノ酸がFGF1由来のAsp（D）である場合、その上流配列の79-82位のアミノ酸配列はFGF1もFGF2も共通している（同Fig.1A参照）ため、当該キメラ蛋白質は、FGF1の41〜78位のアミノ酸配列がFGF2由来のアミノ酸配列に置換されたキメラ蛋白質と表現することもできる。
また、これらキメラ蛋白質を作製する際に、FGF1cDNAの全長翻訳産物のN末端〜21位のアミノ酸は、動物組織からFGF1蛋白質抽出時に得られる短縮体アイソフォームと同様に、N末端の21アミノ酸を削除する方が発現量が高く取り扱いやすい。そして、N末側を大腸菌で生産する際の翻訳とメチオニンの翻訳後切断のためにMetAlaを付加するような改変も常套手段である。そしてこれらのN末端の違いによってFGF1としての活性に影響が無いことは、既に知られているので、本発明においてFGF-C(1211)、FGF-C(1(1/2)11)、又は単にFGFCというとき、N末端21アミノ酸を含む全長タイプ、削除した短縮体アイソフォーム及び当該短縮体N末端にMetAla（MA)を付加したトランケート体のいずれのタイプも包含される。ただし、大腸菌宿主での大量発現を意図する場合は、N末端を削除された短縮体又はそのN末端にMetAla（MA)を付加したトランケート体が、発現量が高く溶解性も高いために好ましい。特に83位がAsp(D)のタイプは、形質転換大腸菌を培養し、その菌体破砕物の可溶性画分から、簡単に活性体（封入体でなく正確にフォールディングされたもの）を単離精製できるので（実施例１１，図１８参照）、最も好ましい。
【００１８】
本発明の実施例１〜１２で用いたFGFCキメラ蛋白質は、非特許文献１でも実際に作製された配列番号６のアミノ酸配列からなる83位アミノ酸がAsp(D)のFGFC(MA/41-78/83D)である。実施例１３以降では、他の典型的なFGFCキメラ蛋白質である、83位アミノ酸がLys（K）又はGlu（E）のキメラ蛋白質も別途合成して、三者のFGF受容体刺激活性及び他の性質について比較した。いずれもヘパリン存在下でFGF1及びFGF2以上に各種FGF受容体刺激活性が高く、容器で保管する際の溶液濃度安定性、温度安定性、トリプシン分解抵抗性などの優れた性質を有することを観察したが、とりわけ83位アミノ酸がAsp（D)の場合（配列番号７：FGFC(MA/41-78/83D)が、そのいずれにおいても特に優れていた。また、83位のLys（K)はFGF2由来アミノ酸であり、Asp（D)はFGF1由来アミノ酸であるが、Glu（E)は外来アミノ酸であるため、医薬組成物として用いようとするときには、異物として認識される可能性があり不適切である。
なお、上述のように、83位アミノ酸がAsp（D）であるキメラ蛋白質（配列番号６，７）は、FGF1の41〜78位のアミノ酸配列がFGF2由来のアミノ酸配列に置換されたキメラ蛋白質ともいう。
【００１９】
以下、本発明のキメラ蛋白質の調製方法を具体的に述べる。
本発明のキメラ蛋白質としては、上述のように、（非特許文献１）において開示されたFGF-C（1211）の製造用オリゴヌクレオチドを用いて、（非特許文献１０）の手法を適用することができるが、下記の手法も適用できる。
(a)FGF1およびFGF2cDNA、あるいはこれらの人工的な一部改変物について、一方のFGFcDNAより適当な制限酵素を用いてDNA断片を切り出し、あるいはPCRなどの方法によって新規にDNA断片を作成した後、制限酵素末端を切り出し、他方のFGFcDNAの適当な部位にDNAリガーゼを用いて結合させればよい。この場合、読み取り枠を合わせるためにオリゴヌクレオチドを挿入させたり、同じ制限酵素部位を創製するために一部の塩基配列を改変してもよい。例えば、(b)一方のFGFcDNAより適当な制限酵素を用いてDNA断片を切り出し、これを他方のcDNAの相同部位を同じ制限酵素で切断した部位にDNAリガーゼを用いて結合させることができる。すなわち、アミノ酸相同性でFGF1とFGF2の配列を並べた場合に相当する領域をコードするDNA断片を入れ換えることになる。制限酵素として、１種あるいは２種以上の制限酵素が用いられる。PCRによる部位特異的変異処理についての基本的な操作は発明者らの既に発表した方法による［Imamura, T. et al.,Science 249, 1567-1570 (1990)］。
【００２０】
DNAを組み込むプラスミドとしては、宿主内で複製保持されるものであれば、いずれも使用することができるが、例えば大腸菌由来のpBR322、pUC18、及びこれらを基に構築されたpET-3cなどを挙げることができる。
プラスミドに組み込む方法としては、例えばT.Maniatisら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 239 (1982) に記載の方法などが挙げられる。
クローン化された遺伝子は、発現に適したベクター中のプロモーターの下流に連結して発現型ベクターを得ることができる。ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプラスミド(pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pET-3)、枯草菌由来のプラスミド(pUB110、pTP5、pC194)、酵母由来のプラスミド(pSH19、pSH15)由来のプラスミド、あるいはλファージなどのバクテリオファージやこの誘導体およびレトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、あるいは昆虫ウイルスなどが挙げられる。
【００２１】
本発明のFGFCの遺伝子はその5'末端に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3'末端には翻訳終始コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有してもよい。さらに該遺伝子を発現させるにはその上流にプロモーターを接続する。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
【００２２】
また、形質転換する宿主が大腸菌である場合には、trpプロモーター、lacプロモーター、rec
Aプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーターなどが、宿主が枯草菌である場合には、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーターなど、宿主が酵母である場合には、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。また、宿主が動物細胞である場合には、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーターが挙げられる。
【００２３】
このようにして構築されたキメラ蛋白質をコードする塩基配列を有する組み換えDNAを含むベクターを用いて、該ベクターを保持する形質転換体を製造する。
【００２４】
宿主としては、大腸菌［例えばBL21, BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE］、枯草菌 (例えばBacillus subtilis DB105)、酵母 (例えばPichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae)、動物細胞（例えばCOS cell, CHO cell, BHK cell, NIH3T3 cell, BALB/c3T3 cell, HUVE cell, LEII cell)、昆虫細胞などが挙げられる。
【００２５】
上記の形質転換は、それぞれの宿主について一般的に行われている方法で行う。または一般的でなくとも適用可能な方法ならばよい。例としては、宿主が大腸菌ならばカルシウム法その他の方法により作成したコンピータント細胞に組み換えDNAを含むベクターを温度ショック法あるいはエレクトロポレーション法により導入する。宿主が酵母であればリチウム法その他の方法により作成したコンピータント細胞に組み換えDNAを含むベクターを温度ショック法あるいはエレクトロポレーション法により導入する。宿主が動物細胞であれば、増殖期等の細胞に組み換えDNAを含むベクターをリン酸カルシウム法、リポフェクション法あるいはエレクトロポレーション法により導入する。
【００２６】
このようにして得られたキメラ蛋白質をコードする塩基配列を有する組み換えDNAを含むベクターを保持する形質転換体が得られる。該形質転換体を培地に培養することにより、キメラ蛋白質を産生させる。
形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては、それぞれの宿主について一般的に用いられているものを用いる。または一般的でなくとも適用可能な培地ならば良い。例としては、宿主が大腸菌ならばLB培地などを用いる。宿主が酵母であればYPD培地などを用いる。宿主が動物細胞であれば、Dulbecco's MEMに動物血清を加えたものなどを用いる。培養は、それぞれの宿主について一般的に用いられている条件で行う。また一般的でなくとも適用可能な条件ならばよい。例としては、宿主が大腸菌ならば約30〜37℃で、約3〜24時間行い、必要により通気や攪拌を加えることができる。宿主が酵母であれば約25〜37℃で、約12時間〜２週間行い、必要により通気や攪拌を加えることができる。宿主が動物細胞であれば約32〜37℃で、5% CO2、100%湿度の条件で約24時間〜２週間行い、必要により気相の条件を変えたり攪拌を加えることができる。
【００２７】
上記培養物からキメラ蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、ホモジェナイザー、フレンチプレス、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解によって菌体あるいは細胞を破壊することにより菌体外に目的の蛋白質を溶出させ、可溶性の画分からキメラ蛋白質を得る。また目的のキメラ蛋白質が不溶性画分に含まれる場合は菌体あるいは細胞を破壊後、遠心分離により不溶性画分を回収し、塩酸グアニジンなどを含む緩衝液などによって可溶性にして回収する方法も用いうる。このほか塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤を含む緩衝液によって直接菌体あるいは細胞を破壊し、菌体外に目的のキメラ蛋白質を溶出させる方法もある。
上記上澄み液からキメラ蛋白質を精製するには、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析、溶媒沈殿、透析、限外濾過、ゲル濾過、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などが使用されうる。さらに、多くのFGFキメラ蛋白質については、ヘパリンセファロースを担体としたアフィニティークロマトグラフィー法が適用できる。
【００２８】
このようにして得られた標品は通常は、4℃以下で冷蔵保存するが、キメラ蛋白質の活性が損なわれない限りにおいて-20℃以下で冷凍することもできる。また標品は、透析、凍結乾燥を行い、乾燥粉末とすることもできる。
【００２９】
上記のようにして得られたキメラ蛋白質を有効成分とするFGF2代替医薬組成物は、FGF2医薬組成物が従来用いられている、もしくは検討されている医薬組成物のすべてに対して、同等またはそれ以上の薬理効果を有する医薬組成物として使用できる。たとえば、創傷治癒の促進剤、放射線による腸管上皮や骨髄を含む様々な臓器の受ける障害を予防したり治療したりする医薬組成物並びに幹細胞増殖促進のための医薬組成物があげられる。
そして、特に上皮細胞の増殖が問題となったり期待されている各種疾病の治療、例えば皮膚創傷受傷後の皮膚や皮下組織再生促進や皮膚の自然治癒機能低下時の創傷治癒改善などに有効である。このキメラ蛋白質はまた、放射線被ばくにより腸管や骨髄の細胞が障害を受けた場合の障害改善にも有効である。このキメラ蛋白質は腸管上皮細胞や骨髄細胞の生存や増殖の促進作用を発揮するので、これら細胞の生存や増殖の機能が問題となったり期待されている各種疾患の治療、例えば癌の放射線治療の副作用としての腸管炎、原発事故などの被爆者に起こる腸管や骨髄の重篤な障害の予防や治療などに有効である。
【００３０】
さらに、本発明のキメラ蛋白質を有効成分とするFGF2代替医薬組成物は、キメラ蛋白質自身の特性として、FGF1と比較した場合に、室温（25℃）の温度条件下での安定性が高く、しかも体温（37℃）条件下での蛋白質分解酵素に対する耐性が高いことから、多様な生体障害における浸出液に含まれる蛋白質分解酵素による不活性化の影響を最小限にすることができる。また、容器で保管する際の溶液濃度が低下しにくい、という優れた医薬製剤特性を有しているため、安定した高活性の医薬組成物が提供できる。
【００３１】
本発明のキメラ蛋白質を有効成分とするFGF2代替医薬組成物は、医薬的に許容できる溶剤、賦形剤、担体、補助剤などを使用し、製剤製造の常法に従って液剤、注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤、坐剤、腸溶剤およびカプセル剤などの医薬組成物とする。医薬組成物中、有効成分であるキメラ蛋白質の含有量は、0.000001〜1.0重量％程度とすればよい。該医薬組成物は、肝臓細胞増殖剤、神経細胞分化生存促進剤として例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ等の哺乳動物に対して非経口的にまたは経口的に安全に投与することができる。本医薬組成物の投与量は、剤形、投与ルート、症状等により適宜変更しうるが、例えばヒトを含む哺乳動物に投与する場合、当該キメラ蛋白質を１日当たり、0.01〜10mg／体重1kg程度の範囲が例示される。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。なお、実施例中及び図中で、単に「FGFC」というときは、本発明の典型的なキメラ蛋白質の、83位がAsp（D)のトランケート体である「FGFC(MA/41-78/83D)」を指す。
〔実施例１〕細胞増殖促進活性により測定できるキメラ蛋白質の受容体特異性（ヘパリン存在下）
（１−１）  FGFCの受容体特異性をFGF1とFGF2の受容体特異性と比較した。内在性のFGF受容体を持たず、内在性のヘパラン硫酸も持たない細胞株BaF3細胞を親株とし、これに、FGF受容体の代表的7サブタイプ（FGFR1c、FGFR1b、FGFR2c、FGFR2b、FGFR3c、FGFR3b、FGFR4）をそれぞれ強制発現させた細胞株を作製した。これら細胞は、強制発現させたFGF受容体を刺激すると、増殖反応を起こすので、増えた細胞数を測定することで、受容体刺激活性を測定することができる。尚、細胞数は、細胞数に比例するミトコンドリア酵素の活性を比色定量することで測定した。
96 wellマイクロタイタープレートに、ウェルあたり1×104個のBaF3細胞を、10% FBS、RPMI1640培地に懸濁して播種した。さらにヘパリンを5μg/mlとなるように添加した。FGF試料を様々な濃度で添加し、44時間培養後、TetraColorOne試薬を加えてさらに4時間培養を行い、450nmにおける吸光度を測定した。結果を図１に示す。各点は３重の試料の平均＋/−標準偏差（S.D.）を表す。
FGFCはヘパリン存在下で、FGF1と同様に、全てのFGF受容体サブタイプ（FGFR1c、FGFR1b、FGFR2c、FGFR2b、FGFR3c、FGFR3b、FGFR4）を刺激できる活性を持つこと、その強さは、FGF1と同等もしくはやや強いことが示された。一方、FGF2は、特に上皮系細胞の増殖促進に重要である受容体FGFR2bに対する活性が非常に弱く、FGF1の1000分の1程度であることが示された。（図１）
すなわち、図１からみて、FGFCはFGF1と同等またはそれ以上に、FGF2が刺激することのできないFGFR2bを含む全てのサブタイプのFGF受容体を活性化することができることであり、このことは、これまでFGF2によって直接細胞増殖を効果的に促進することが出来なかったFGFR2b刺激を必要とする表皮角化細胞や小腸上皮細胞などの増殖を必要とする用途に対して有効な医薬組成物となりうることを示すものである。
【００３３】
（１−２）  上記（１−１）と同様の条件下で、FGFC(MA/41-83/83K)、FGFC(MA/41-83/83E)、FGFC(MA/41-78/83D)、FGFC(M/41-78/83D)とFGF1について、FGFR1c強制発現BaF3細胞に対する細胞増殖促進活性を外来ヘパリン存在下で調べた。（図２）
図２によれば、FGFC(MA/41-83/83K)、FGFC(MA/41-83/83E)、FGFC(MA/41-78/83D)、FGFC(M/41-78/83D)は外来ヘパリン存在下で、FGF1と同等もしくはやや強く、受容体FGFR1cを刺激できる活性を持つことが示された。
【００３４】
（１−３）  上記（１−１）と同様の条件下で、FGFC(MA/41-83/83E)、FGFC(M/41-78/83D)、FGF1とFGF2について、上皮系細胞の増殖促進に重要である受容体FGFR2bを強制発現させたBaF3細胞に対する細胞増殖促進活性を外来ヘパリン存在下で調べた。（図３）
図３によれば、FGFC(MA/41-83/83E)とFGFC(M/41-78/83D)は外来ヘパリン存在下で、FGF1と同様の強さでもしくはやや強く、受容体FGFR2bを刺激できる活性を持つことが示された。一方、FGF2は、受容体FGFR2bに対する活性が非常に弱く、FGF1の数十分の１程度であることが示された。
【００３５】
〔実施例２〕細胞増殖促進活性により測定できるキメラ蛋白質の受容体特異性（ヘパリン非存在下）
FGFC、FGF1とFGF2について、受容体特異性を調べた。実施例（１−１）とほぼ同じ条件で実験を行った。ただし、この実験ではヘパリンは添加しなかった。各点は３重の試料の平均＋/−標準偏差（S.D.）を表す。
FGFCはヘパリン非存在下であっても、ほとんど全てのFGF受容体サブタイプ（FGFR1c、FGFR1b、FGFR2c、FGFR2b、FGFR3c、FGFR4）に対しこれらを刺激できる活性を持つことが示された。また、FGF2には、調べたどの受容体サブタイプ（FGFR1c、FGFR2b）についても活性はほとんど無い。（図４）
図４のデータを図１とスケールをあわせて各受容体に対して比較してみると、FGF1が、ヘパリンを添加しないと受容体刺激活性が大きく失われるのに対して、FGFCはR3b受容体以外は高い活性を保っている。特に、FGF2にはヘパリン非存在、存在にかかわらず備わっていないR2b受容体刺激活性が、FGFCがヘパリン非存在下でも極めて高い点は注目に値する。すなわち、R2b受容体は上皮細胞に多く存在することから、FGF2には上皮細胞増殖活性が無いのに対して、FGFCには上皮細胞増殖活性が存在することを示すものである。
なお、FGF1は、ヘパリン非存在下であっても、たとえば1mg/kg以上という高濃度で投与することで受容体刺激活性が残る場合があるが、このような高濃度で生体内に投与することはポリペプチド製剤を高濃度で投与した際に起こる免疫系刺激の問題、及び腎臓機能への悪影響などのため現実的ではない。
【００３６】
〔実施例３〕キメラ蛋白質のトリプシンによる分解に対する抵抗性（濃度依存性）
（３−１）  FGFCとFGF1について、トリプシンによる分解に対する抵抗性を調べた。それぞれ500ngのFGFを含む30μlのPBS溶液中に、トリプシンを様々な最終濃度になるよう添加し、37℃で1時間インキュベートして、蛋白質分解を許容した。その後、試料をSDSポリアクリルアミドを用いて電気泳動で分離した。泳動後のゲルを、蛋白質をその量に比例して染色するCBB染色液で処理し、光学スキャンすることにより、分解されていない残存FGF蛋白質の量を定量した。（図５）
図５からみて、FGFCでは0.01%トリプシンによる処理でも80%程度残存していたのに対し、FGF1では完全に分解されてしまった。また0.001%トリプシンによる処理ではFGFCは90％程度残存していたのに対し、FGF1では30％程度しか残存していなかった。このことは、FGFCが多様な生体障害における浸出液に含まれる蛋白質分解酵素による不活性化の影響を最小限にすることができることを示すものである。
【００３７】
（３−２）  FGFCとFGF2について、（３−１）と同様の条件下でトリプシンによる分解に対する抵抗性を調べた。それぞれ500ngのFGFを含む30μlのPBS溶液中に、トリプシンを様々な最終濃度になるよう添加し、37℃で１時間インキュベートして、蛋白質分解を許容した。その後、試料をSDSポリアクリルアミドを用いて電気泳動で分離した。泳動後のゲルを、蛋白質をその量に比例して染色するCBB染色液で処理し。光学スキャンすることにより、分解されていない残存FGF蛋白質の量を定量した。（図６）
図６によると、FGFCでは0.01%トリプシンによる処理でも70%程度残存していたのに対し、FGF2では35%程度しか残存しなかった。このことは、FGFCが多様な生体障害における浸出液に含まれる蛋白質分解酵素による不活性化の影響を最小限にすることができることを示すものである。
【００３８】
（３−３）  FGFC、FGF1とFGF2について、（３−１）と同様の条件下での実験の中で、トリプシンによる分解に対する抵抗性を比較した。それぞれ500ngのFGFを含む30μlのPBS溶液中に、トリプシンを様々な最終濃度になるよう添加し、37℃で１時間インキュベートして、蛋白質分解を許容した。その後、試料をSDSポリアクリルアミドを用いて電気泳動で分離した。泳動後のゲルを、蛋白質をその量に比例して染色するCBB染色液で処理し、光学スキャンすることにより、分解されていない残存FGF蛋白質の量を定量した。（図７）
図７によると、FGFCでは0.01%トリプシンによる処理でも30%程度の分解であったのに対し、FGF1では完全に、FGF2では60%以上が分解されてしまった。このことは、FGFCが体液等に含まれる蛋白質分解酵素による不活性化の影響を最小限にすることができることを示し、FGF1やFGF2と比較して体内半減期が長いことを示唆するものである。
【００３９】
〔実施例４〕キメラ蛋白質のトリプシンによる分解に対する抵抗性（時間依存性）
実施例３と同様の条件下で、FGFC(MA/41-83/83K)、FGFC(MA/41-83/83E)、FGFC(MA/41-78/83D)、FGFC(M/41-78/83D)、FGF1とFGF2について、トリプシンによる分解に対する抵抗性を時間依存性の観点から調べた。それぞれ500ngのFGFを含む30μlのPBS溶液中に、トリプシンを最終濃度0.015%となるよう添加し、37℃で様々な時間インキュベートして、蛋白質分解を許容した。その後、試料をSDSポリアクリルアミドを用いて電気泳動で分離した。泳動後のゲルを、蛋白質をその量に比例して染色するCBB染色液で処理し。光学スキャンすることにより、分解されていない残存FGF蛋白質の量を定量した。（図８）
図８によると、0.015％トリプシンによる60分間処理で、FGFC(MA/41-78/83D)、FGFC(M/41-78/83D)では60〜70％程度残存していたのに対し、FGFC(MA/41-83/83K)、FGFC(MA/41-83/83E)、FGF1では完全に分解し、FGF2は30％程度しか残存しなかった。0.015％トリプシンによる5分間処理で、FGF1では20％程度しか残存しなかったのに対し、FGFC(MA/41-78/83D)、FGFC(M/41-78/83D)では90％以上残存していた。このことは、FGFC(MA/41-78/83D)、FGFC(M/41-78/83D)が多様な生体障害における浸出液に含まれる蛋白質分解酵素による不活性化の影響を最小限にすることができることを示し、FGF1やFGF2と比較して体内半減期が長いことを示唆するものである。
【００４０】
〔実施例５〕キメラ蛋白質の体温条件下（37℃）保存における活性安定性
（５−１）  FGFCとFGF1について、37℃での保存における安定性を調べた。蛋白質の吸着によるロスを低減するために10％BSAを含むRPMI1640培地50μlに、5μgのFGFを溶解し、エッペンドルフチューブ中において、37℃で様々な時間、保管した。その後、これを原液として様々な希釈液を調製し、FGFR1c/BaF3細胞に対する生物活性を測定した。測定方法は実施例１と同様に行った。（図９）
図９における横軸の濃度は、当初の濃度として表してある。この結果、FGFCとFGF1は当初ほぼ同じ強さの活性を発揮するが、FGF1が、体温程度の温度条件下（37℃）では、1時間程度でも活性が失われはじめ、6時間もたつとほとんど活性が残らないのに対して、FGFCの場合は、1時間〜6時間ではほとんど影響が無いことが示された。
【００４１】
（５−２）  FGFCとFGF2について、37℃での保存における活性安定性を調べた。実験は上記（５−１）と同様に行った。（図１０）この結果、FGFCとFGF2は当初ほぼ同じ強さの活性を発揮するが、FGF2が、体温程度の温度条件下（37℃）では、24時間後に残存活性が30分の1程度にまで低下するのに対して、FGFCの場合は、24時間後ではほとんど影響が無く、FGF2に対して１０倍以上の活性があることが示された。
したがって、（５−１）及び（５−２）の結果から、FGF1やFGF2と比較して高い安定性が得られる点はもちろんのこと、冷蔵保存が必要な従来のFGF2医薬組成物に代替して使用する場合に、室温〜体温という温度条件においても安定性が高いことを示すものであるから、医薬製剤としてみても、きわめてメリットが高い。
【００４２】
〔実施例６〕キメラ蛋白質の容器保管時の溶液濃度安定性
FGFCとFGF1それぞれの含有溶液について、37℃保存における保存容器への吸着などにより失われる程度を調べるため、容器保管時の溶液濃度安定性を調べた。それぞれ5μgのFGFを含む50μlのPBS溶液を、ELISA用96 wellマイクロタイタープレートの各ウェルに入れ、37℃に保温して様々な時間インキュベートして、蛋白質の容器への吸着を許容した。その後、ウェル内の試料溶液を全量回収し、SDSポリアクリルアミドを用いて電気泳動で分離した。泳動後のゲルを、蛋白質をその量に比例して染色するCBB染色液で処理し、光学スキャンすることにより、吸着されずに溶液中に残存しているFGF蛋白質の量を定量した。（図１１）
一般に、時間の経過と共に溶液中のFGF1又はFGF2の濃度が暫減していく理由としては、FGF1及びFGF2がポリプロピレン（通常の試料容器材料）やポリスチレン（通常の培養容器材料）への吸着性が高いことや、溶液中で凝集体を形成して不溶化し沈殿してしまうことなどが考えられる。図１１に示す実験の結果は、FGF1では、24時間で半分近くまで濃度が落ちてしまうのに対し、FGFCの場合は、48時間でも半分以上の濃度を保っており、108時間たっても一部濃度は残存していることが示されている。このことは、FGFCの場合は医薬品製剤の保存時の濃度低下が少ないことであるから、製剤化の際のメリットが高い。
【００４３】
〔実施例７〕キメラ蛋白質の溶液中（室温下）における構造安定性
（７−１）  FGFCとFGF1それぞれの含有溶液について、実施例６と同様の条件下で室温（25℃）における構造安定性を調べた。0.7Mグアニジウム塩酸、25ｍMリン酸緩衝液、pH7.3の溶液中で最終濃度2μMに調製したFGF1及びFGFCを、石英キュベットに入れ、温度を25℃に保ったまま、280nmの紫外光で励起し、発生する自家蛍光を調べた。（図１２）この測定をすると、FGFの場合、蛋白質が変性して３次元構造が壊れた時に、353nm付近でトリプトファン残基による特徴的な自家蛍光強度が高まることが既に知られている。
図１２によれば、FGF1が、室温（25℃）では、353nm付近に強い蛍光を示し、正しいフォールディングが一部分壊れた構造を取っていることが示される。一方、FGFCにはこの蛍光はほとんど認められないことから、ほとんどの分子が正しいフォールディングをしていることが示される。したがって、FGF1と比較してFGFCは室温において高い構造安定性を有することが分かる。室温条件において安定性が高いことを示すものであるから、医薬製剤としてみても、きわめてメリットが大きい。
【００４４】
（７−２）  FGFCとFGF1それぞれの含有溶液について、（７−１）と同一条件下で、溶液の温度を変化させた場合の構造安定性を調べた。0.7Mグアニジウム塩酸、25ｍMリン酸緩衝液、pH7.3の溶液中で最終濃度2μMに調製したFGFCとFGF1を、石英キュベットに入れ、温度を10℃から50℃に変化させつつ、280nmの紫外光で励起し、発生する353nmの自家蛍光を調べた。そして、10℃においてのフォールディングが正しいと見なし、温度を上昇させた結果増加する353nmの自家蛍光の極大値を、全てのフォールディングが壊れたものと見なして、フォールディングが壊れた割合(fraction unfolded)を表示した。（図１３）その結果、FGF1は、35℃付近で約50%の分子のフォールディングが壊れた状態になるのに対し、FGFCの壊れた割合は35℃付近では約10%であった。また、FGF1は、40℃付近で約80%の分子のフォールディングが壊れた状態になるのに対し、FGFCの壊れた割合は40℃付近では約30%に過ぎなかった。これらのことより、FGFCはFGF1よりも、分子の正しいフォールディングが壊れにくいこと、すなわち、溶液中において高い構造安定性を有することが分かる。このことから、FGFCは医薬製剤としてみても、きわめてメリットが大きい。
【００４５】
〔実施例８〕創傷治癒の重要なステップである表皮細胞に対するキメラ蛋白質の増殖促進活性（ヘパリン非添加）
（８−１）  創傷治癒の重要なステップとして表皮細胞の増殖があるが、これを直接促進できるものとして上市されているFGF医薬は現在までない。本実施例では、表皮角化細胞MK2細胞の増殖を促進する活性を測定し、FGFCと、FGF1及びFGF2とを比較した。
MK2細胞は、組織培養用マルチウェルプレート（48well）に1×104細胞/0.5ml/wellの割合で播種した。細胞を10％ウシ胎児血清、EGF、を添加した低カルシウムDMEM培地で、5％CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した後、0.1%FBSを添加した低カルシウムDMEM培地(0.25ml/well)に交換した。24時間後、培養液にキメラ蛋白質または他の試料を様々な濃度で添加した。その後細胞を46時間培養してから、培養液にTetraColorOne試薬を添加し、さらに4時間培養を行った。培養終了後の培養液の450nmにおける吸光度を測定し、細胞数にほぼ比例するミトコンドリア酵素の活性を測定した。これをもって細胞数の指標とした。図中に示される各点は、２重の試料の平均を表す。（図１４）
図１４によると、1ng/mlの濃度において、FGFCでは強く細胞増殖を促進したのに対し、FGF1とFGF2では、半分以下の増殖促進が得られたのみであった。また、それぞれが最も高い活性を示す濃度において、FGFCはFGF1よりも強くより多くの細胞数にまで細胞増殖を促進することが示された。FGF2はFGF1よりもさらに低い活性しか示さなかった。これらのことから、FGFCは、表皮細胞に多いFGFR2b刺激活性のないFGF2のみならず、FGF1と比較しても高い促進活性を示しており、このことは優れた創傷治癒用医薬組成物として有用であることを示すものである。
【００４６】
（８−２）  本実施例では、上記実施例（８−１）と同様にして、表皮角化細胞MK2細胞の増殖を促進する活性を測定し、FGFC(MA/41-78/83D)、FGFC(M/41-78/83D)、FGF1、及びFGF2を比較した（図１５）。その結果、FGFC(MA/41-78/83D)、FGFC(M/41-78/83D)とも、強く細胞増殖を促進したのに対し、FGF1とFGF2の増殖促進活性は弱く、特にFGF2の活性が顕著に低いことが確認された。このことは、FGFC(MA/41-78/83D)、FGFC(M/41-78/83D)が、優れた創傷治癒用医薬組成物として有用であることを示すものである。
【００４７】
〔実施例９〕キメラ蛋白質の繊維芽細胞に対する増殖促進活性（ヘパリン非添加）
本実験では、繊維芽細胞に対する細胞増殖刺激活性を測定し、FGFC(MA/41-78/83D)、FGFC(M/41-83/83E)、FGF1、及びFGF2を比較した。繊維芽細胞は内在的にヘパラン硫酸糖鎖を合成する能力を有する。また、生体内では、FGFの標的細胞となりうる細胞である。したがって、この実験では、ヘパリンを添加せずに測定した活性により、生体に投与したFGFの繊維芽細胞に対する細胞増殖刺激活性を推定評価することができると考えられる。各点は２重の試料の平均を表す（図１６）。
図１６に示される結果からみて、FGFC(MA/41-78/83D)、FGFC(M/41-83/83E)は、繊維芽細胞に対して、外来ヘパリンに依存せず、強い増殖促進活性を有することがわかった。その活性は、FGF2と比較して、同等かやや高いことが示された。これに対し、FGF1は、ヘパリン非添加の条件では活性が低いことが示された。これは、FGF1が、構造の安定化のために、外来ヘパリンを必要としていることを示唆している。このことは、FGFC(MA/41-78/83D)、FGFC(M/41-83/83E)が、優れた創傷治癒用医薬組成物として有用であることを示すものである。
【００４８】
〔実施例１０〕放射線による生体障害に対するキメラ蛋白質の予防と治癒促進活性
本実施例では、放射線による生体障害に対するキメラ蛋白質の予防と治癒促進活性を測定する目的で、マウスの全身放射線被ばくにより引き起こされる小腸上皮細胞の障害とその治癒に対するFGFCの効果を調べた。
マウスを用いた実験はすべて人道的配慮を行い、事前に承認された実験動物計画に基づいて実施された。10μgのFGFCは生理食塩水に5μg/mlヘパリンを含む緩衝液で希釈し，最終量を0.5mlとして、放射線照射の24時間前にC3Hマウスの腹腔に投与した。マウスは、137Csの線源から発生するガンマ線を全身に10グレイ照射され、線量率は約0.57Gy/minであった。その3.5日後に生存したマウスを安楽死させ、組織標本を採取し、10%フォルムアルデヒドによって固定し、パラフィンに包埋し、組織学的検討用に処理した。空腸を１０部位に分けてそれぞれから切片を作製し，顕微鏡観察によって、クリプト構造のスコア付けを行った。クリプトは１０以上の細胞を含んでいるものを生存と判断した、各群３匹のマウスからクリプトを数え、その平均数を放射線非照射群のマウスと比較した（図１７）。
その結果、FGFCを投与したマウス群では生理食塩水を投与した群に比べて有意に高いクリプトの生存率が観察された。これらの結果は、FGFCはクリプトの放射線障害の予防治療に対して優れた効果を有することを示すものである。なお、この実験系では、クリプトの放射線障害の予防治療効果を有することが知られているFGF1の活性を同時に測定してFGFCの活性と比較したが、FGFCはFGF1よりも強い活性を示すことが示された。
【００４９】
〔実施例１１〕大腸菌発現系を用いた可溶性キメラ蛋白質の効率的な大量生産
FGFC(MA/41-83/83K)、FGFC(MA/41-83/83E)、FGFC(MA/41-78/83D)、FGFC(M/41-78/83D)を、それぞれインサートとして有するpET-3c発現ベクターを用いて形質変換した大腸菌BL21(DE3)pLysS株を、常法に基づいて同スケールで培養し、蛋白質を発現させ、その後菌体を破壊し、遠心し、可溶性画分に得られた蛋白質をSDSポリアクリルアミドゲルに同規模の培養液由来の蛋白質をロードし、電気泳動（SDS-PAGE）で分析した。結果を図１８に示す。それぞれ、レーン１は、未精製の菌体由来可溶性総蛋白質、レーン４は、菌体由来可溶性総蛋白質のうち、ヘパリンアフィニティークロマトカラムに結合した後に高濃度食塩によって溶出されたFGF蛋白質を示す。レーン２は、それぞれ上記カラムの素通り画分、レーン３は、洗浄画分を示す。電気泳動後、ゲルは常法に従ってクーマシーブルー（CBB）で蛋白質を染色した。矢印はFGFCの位置を示す。
FGFC(MA/41-78/83D)、FGFC(M/41-78/83D)のいずれも、FGFC(MA/41-83/83K)、FGFC(MA/41-83/83E)に比べて大量の可溶性蛋白質が生産される事が示されている。FGF１及びFGF2では一般に、ヘパリンへの結合性を有する分子は、活性型の分子フォールディングを持っていると考えられている。従ってこの結果から、FGFC(MA/41-78/83D)とFGFC(M/41-78/83D)は、その活性型としての生産量も高いことが示唆される。また、この結果で、FGFC(MA/41-83/83K)の可溶性蛋白質と比べてもFGFC(MA/41-78/83D)、FGFC(M/41-78/83D)の可溶性蛋白質生産量が大量であることがわかる。このことから、FGFC(MA/41-83/83E)の、83位のアミノ酸(E)をFGF2本来のアミノ酸（K）に変更しただけのFGFC(MA/41-83/83K)では、生産量増加とはならないことが示される。
【００５０】
〔実施例１２〕創傷治癒促進活性（マウス皮膚の全層欠損創治癒に対する影響）
本実施例では、マウス皮膚の全層欠損創治癒に対するFGFC及びFGF2の効果を調べた。マウス皮膚の全層欠損創の作製とFGFの効果評価を以下のように行った。糖尿病モデルマウスdb/dbを麻酔し、背部に、外科的手技により約3cm2の面積を有する円形の全層皮膚欠損創を作った。そこにFGFC、またはFGF2を10μg含む生理食塩水100μlを滴下投与した。対照群には生理食塩水を滴下投与した。そして清潔なケージでマウスを飼育した。経時的に傷口の大きさを測定し、その面積を算定した。このようにして得られる創面積の経時的減少を比較することにより、FGFの創傷治癒促進活性を評価した。その結果、FGFC及びFGF2のいずれを投与したマウスでも、生理食塩水を投与したマウスに比べ迅速に創面積が減少することが示された（図１９）。そして、FGFCの創傷治癒促進効果はFGF2とほぼ同等であり、特に最初の5日間ではFGF2よりも若干効果が高いことが観察された。すなわち、FGFCは、FGF2と同等もしくはそれ以上の創傷の治癒を強く促進する活性を持つことが示された。
【００５１】
〔実施例１３〕幹細胞増殖活性
本実施例では、幹細胞として神経幹細胞を用いて、神経幹細胞に対するFGFC、FGF1、またはFGF2の効果を調べる。新鮮な中枢神経組織を酵素処理して得られる神経幹細胞を含む懸濁液を、ウシ胎児血清（FBS）を含まない、上皮成長因子（EGF）とFGFC、FGF1、またはFGF2、場合によってはさらに白血病抑制因子（LIF）を含む無血清培地で細胞を浮遊培養する。すると、球状の細胞塊(ニューロスフィア)として神経幹細胞が増殖してくる。ニューロスフィアの細胞をほぐして継代培養することが可能である。このようにして得られる神経幹細胞の数を測定することにより、FGFCが優れた幹細胞増殖活性を有していることが示される。
この後、ニューロスフィアの構成細胞を、コーティングを施した培養皿に接着させ、増殖因子を除いて、ウシ胎児血清等の各種分化誘導因子を加えることにより、神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトなどの細胞に分化を誘導することができることから、ニューロスフィアの構成細胞として神経幹細胞の増殖をFGFCが促進することを証明することができる。
FGFCが増殖促進できる幹細胞としては、神経幹細胞に限定されず、間葉系幹細胞、胎生幹細胞、誘導多能性幹細胞（iPS細胞）など、多くの幹細胞に利用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明の医薬組成物は、FGF2を有効成分とする医薬組成物の代替用であり、かつより製剤化しやすい医薬組成物、例えば創傷治癒の促進剤、放射線による腸管上皮や骨髄を含む様々な臓器の受ける障害の予防及び治療用医薬組成物並びに幹細胞増殖促進用医薬組成物として用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図７】
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【図８】
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【図１８】
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【配列表】
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