(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥにおいて、
そのアミノアルキル基の含分が四級化されており、かつ以下の４つの構造式
【化１】
0005645668.tif 000005
〔上記の各式中、
ｍは、ブチルメタクリレート基の総数を表わし、
ｎは、アミノアルキル基の総数を表わし、
ｏは、メチルメタクリレート基の総数を表わし、かつ、
ｑは、四級化されたアミノアルキル基の総数を表わす〕
を有する
ことを特徴とする、
アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥ。
【請求項２】
請求項１記載のアミノアルキルメタクリレートコポリマーＥであって、
前記の四級化されているアミノアルキル基の含分が、アミノアルキル基の総数に対して１０％を上回るか、または２０％を上回る
ことを特徴とする、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のアミノアルキルメタクリレートコポリマーＥを製造するための方法であって、
前記の四級化を、メチルハロゲン化物またはジメチルスルフェートとの反応によって行う
ことを特徴とする、方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法であって、
前記のメチルハロゲン化物は、ヨウ化メチル、臭化メチル、および塩化メチルから成る群から選択されるか、または、ヨウ化メチルである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項５】
請求項３または４記載の方法であって、
メタノールを前記反応のための溶剤として使用する
ことを特徴とする、方法。
【請求項６】
請求項１または２に記載のアミノアルキルメタクリレートコポリマーＥの使用であって、医薬物質の透過率と、当該医薬物質の５．５超のｐＨ値での溶解度とを改善するための使用。
【請求項７】
前記のアミノアルキルメタクリレートコポリマーＥが前記の医薬物質と一緒に投与されることを特徴とする、請求項６記載の使用。
【請求項８】
１種以上の医薬物質と、請求項１または２に記載のアミノアルキルメタクリレートコポリマーＥとを含有する製薬学的調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学的に変性されたアミノアルキルメタクリレートコポリマーＥの添加に基づく、医薬物質の透過率および溶解性を改善するための戦略を表わし、この場合この化学的変性は、存在するアミノアルキル基の含分の四級化にある。
【０００２】
数多くの医薬物質の僅かな生物使用可能性（Bioverfuegbarkeit）は、医薬調製の際の大きな問題である。一定の適用経路に関連する生物使用可能性の重要性は、第１に作用物質の溶解性および透過率である。良好な透過率の際の劣悪な溶解性は、劣悪な透過率の際の良好な溶解性と同様に劣悪な生物使用可能性をまねく。溶解性および透過率の問題を克服するために、種々の戦略が追求されている。
【０００３】
腸内での前記物質の透過率は、例えば一定の助剤を使用することによって上昇させることができる。このような助剤は、例えばキトサンまたはカプリン酸ナトリウムである。この場合、前記物質は、なかんずく傍細胞輸送（parazellulaeren Transport）に影響を及ぼすと想定されている（Current Drug Delivery, 2005, 2, 9-22）。しかし、経細胞輸送（transzellulaeren Transport）に対してもプラスの影響を及ぼすことが考えられ得る。
【０００４】
アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥ（Pharmacopeia japonica; Europaeischen Arzneibuch中に"Basic butylated methacrylate copolymer"として項目に記載された）に対して、テトラサイクリンを同時に経口投与した場合には、そのＡＵＣ（"Area under the curve"=身体によって吸収される医薬の全体量に対する基準）は上昇していることを示すことができた（欧州特許出願公開第１３０２２０１号明細書Ａ１）。その上、オイドラギットＥ１００、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥの商業的に入手可能な形（Roehm GmbH）、は、粘液または胆汁酸に対するカチオン性作用物質の合成を減少させることができる（Takemura, Controlled Release Society 32nd Annual Meeting and Exposition; 欧州特許出願公開第１３０２２０１号明細書Ａ１; Macromol. Biosci., 2005, 5, 207 - 213）。更に、Ａｌａｓｉｎｏ他は、ドキソルビシンが負荷されたリポソームがオイドラギットＥ１００の存在下で不変のリポソームの大きさの際にオイドラギットＥ１００の不在下の場合よりも多量の作用物質を放出することを示すことができた（Macromol. Biosci., 2005, 5, 207 - 213）。これは、脂質膜上のオイドラギットＥ１００の透過率を変化させる作用を示唆する。オイドラギットＥ１００による機構が生物使用可能性を上昇させ得ることは、未だ研究により明らかにはなっていない。予想される機構は、胆汁酸の結合、粘液に対する医薬物質の結合の阻害およびオイドラギットＥ１００と細胞膜または密着帯との相互作用である。
【０００５】
図１は、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥ（オイドラギットＥ）の刊行物で普通の記載形式を示す。前記コポリマーの中、統計学的ターポリマーが重要であり、トリブロックコポリマーは重要ではなく、即ちｍ、ｎおよびｏの値は、変化しうることが明らかになる。
【０００６】
欧州特許出願公開第１３０２２０１号明細書Ａ１には、１つの酸と組み合わせてアミノアルキルメタクリレートコポリマーＥを使用することが記載されている。この化合物は、下記にオイドラギットＥとして詳細に規定されている。酸を添加することは、必要である。それというのも、前記化合物は、５．５よりも高いｐＨ値で劣悪に溶解するが、しかし、溶解しない状態では作用しないからである。
【０００７】
本発明の課題は、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥを、その溶解性が他の物質、例えば酸の添加なしに５．５を越えるｐＨ値で顕著に上昇されるように化学的に変性することであった。更に、本発明の課題は、このような化学的変性がアミノアルキルメタクリレートコポリマーＥの透過率を促進する作用を制限しないことであった。更に、このように変性されたアミノアルキルメタクリレートコポリマーＥは、毒性であってはならず、時間が掛からず、ならびに費用が掛からないように製造することができるはずである。
【０００８】
本発明の課題は、アミノアルキル基の含分が四級化されていることを特徴とする、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥによって満たされる。
【０００９】
特に、四級化されたアミノアルキル基の前記含分は、アミノアルキル基の全体数に関連して１０％を上廻り、特に２０％を上廻る。しかし、四級化率は、常に１００％未満である。
【００１０】
１つの好ましい実施態様において、前記のアミノアルキルメタクリレートコポリマーＥは、構造式：
【化１】
0005645668.tif 000002
〔式中、ｍは、ブチルメタクリレート基の全体数を表わし、ｎは、アミノアルキル基の全体数を表わし、ｏは、メチルメタクリレート基の全体数を表わし、およびｑは、四級化されたアミノアルキル基の全体数を表わす〕を有する。
【００１１】
本発明の課題は、同様に特徴付けられたアミノアルキルメタクリレートコポリマーＥの製造法によって満たされ、この場合前記の四級化は、メチルハロゲン化物またはジメチルスルフェートとの反応によって行なわれる。
【００１２】
１つの好ましい実施態様において、前記のメチルハロゲン化物は、ヨウ化メチル、臭化メチル、塩化メチルを含む群から選択され、好ましくは、ヨウ化メチルである。
【００１３】
特に、前記方法の場合、メタノールは、溶剤として使用される。
【００１４】
更に、本発明は、医薬物質の透過率および溶解性の改善のための上記に特徴付けられたアミノアルキルメタクリレートコポリマーＥの使用に関する。
【００１５】
１つの好ましい実施態様において、前記のコポリマーは、前記の医薬物質と一緒に投与される。
【００１６】
また、本発明の課題は、１つ以上の医薬物質および上記の特徴付けられたアミノアルキルメタクリレートコポリマーＥを含有する製薬学的調製物によって満たされる。
【００１７】
本発明者らは、意外なことに、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥの四級化された誘導体（２０％を上廻る四級化率）が低い透過率を有する物質の透過率を、単層のバリヤー機能を不可逆的に損なうことなしに、一時的に上昇させることができることを見出した。上昇速度は、少なくとも同様に高く、部分的には、四級化されていないアミノアルキルメタクリレートコポリマーＥで達成された上昇速度よりも明らかに高い。
【００１８】
部分的には、四級化されたアミノアルキルメタクリレートコポリマーＥのなお明らかに高い透過率を促進させる作用を用いた場合には、最初から考慮に入れることができなかった。それというのも、負荷された分子は、減少された脂質溶解性のために分子が負荷されていない構造類似物と比較して上皮および内皮を通しての僅かな透過係数を有することが公知であるからである。例示的に対の物質のスコポラミンおよびＮ−ブチルスコポラミンが挙げられる。最後に挙げたＮ−ブチルスコポラミンは、第四級アンモニウム化合物（永久陽イオン電荷を有する）であり、この化合物は、腸からの極く僅かな腸管の再吸収分を有し、血液脳障壁を通じての言うに値する通過を有しない。これは、不十分な脂質溶解性および前記分子と生体膜との相互作用に帰因する。
【００１９】
その上、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）は、四級化されたポリマーと一緒の細胞のインキュベーションの際に単層の透過率のための基準としてｐＨ７．４でも減少し、一方で、これは、元来のアミノアルキルメタクリレートコポリマーＥには当てはまらないことを示すことができた。この結果、四級化された誘導体のｐＨに依存しない溶解性および作用を推論することができる。それによって、本発明は、欧州特許出願公開第１３０２２０１号明細書Ａ１の教示とは異なり、酸の添加を必要としない。このことから、経口投与に対して１つの利点が明らかになる。それというのも、腸内でのｐＨは、領域に応じて５．５〜７．４であるからである。この性質は、生体内で僅かな透過率を有する医薬物質の透過率の改善、ひいては前記医薬物質の開発および医薬品としての前記医薬物質の使用を可能にする。
【００２０】
生物使用可能性促進剤（Bioverfuegbarkeitspromotoren）としての本発明による物質の使用は、殆んど全ての適用例に対して考えられ得る。溶液、懸濁液、乳濁液、装入物または別の適当な医薬剤形が重要である。更に、本発明は、経口、皮下、頬側、直腸、鼻孔または全ての別の適用例に使用されてよく、この場合再吸収バリヤーを克服することができ、医薬物質の局所的または全身的作用が可能になる。即ち、例えば眼科的目的のための使用、即ち眼への使用である。この場合、この物質は、角膜を通しての一定の医薬物質の漏出を改善することができる。
【００２１】
四級化された誘導体を製造するための本発明による方法は、（大規模でも）簡単に実施することができ、この場合には、時間が掛からず、ならびに費用が掛からないように実施することができる。
【００２２】
定義
本明細書中で使用されているような「透過率」（＝Durchlaessigkeit）の概念は、細胞膜、殊に上皮細胞膜を通じての物質、例えば医薬品の拡散である。「細胞透過率」または「上皮透過率」の概念は、同義語で使用することができる。
【００２３】
「四級化率」の概念は、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥの所定量中の窒素原子の全体数（アミノアルキル基）に対する第四級窒素原子（または第四級アミノアルキル基）の割合を示す。
【００２４】
「医薬物質」の概念は、ヒトまたは動物の身体に対する使用、またはヒトまたは動物の身体中への使用に特定される物質からの物質および調剤を示し、
疾病、持病、身体の損傷または病的な苦痛を治癒、緩和、予防または識別することができ、
病原体、寄生虫または体外物質を阻止、排除または無害化することができ、
身体の性質、状態または機能、または精神的状態認識することができるか、または影響を及ぼすことができ、および
ヒトまたは動物の身体から製造された作用物質または体液を交換することができる。
【００２５】
「生物使用可能性（Bioverfuegbarkeit）」の概念は、全身的循環路中（特に：血液循環路中）で不変のまま使用される、物質の割合のための薬理学的測定の影響力を示す。この薬理学的測定の影響力は、如何に急速に物質（医薬物質）のどの位の規模で再吸収され、かつ作用場所に使用されるのかを示す。
【００２６】
「オイドラギットＥ１００」（Roehm GmbH）は、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥの商業的に入手可能な形である（他の選択可能な表記：ポリ（ブチルメタクリレート、（２−ジメチルアミノエチル）メチルアクリレート、メチルメタクリレート）および「基本ブチル化メタクリレートコポリマー」）。「オイドラギットＥ  ＰＯ」（同様にRoehm GmbH）は、オイドラギットＥ１００の粉末形である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥ（オイドラギットＥ）の構造式を示す。
【図２】オイドラギットＥ  ＰＯ（Roehm GmbH）のモノマー組成を測定するためのオイドラギットＥ  ＰＯの1Ｈ  ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ、ＭｅＯＨd4）を示す。信号の対応配置は、符号ａ〜ｊによって表示される。
【図３】ヨウ化メチルでのオイドラギットＥ  ＰＯ（Roehm GmbH）の四級化の反応式を示す。
【図４】０％、２２％、４２％および６５％の四級化率を有するオイドラギットＥ  ＰＯ（Roehm GmbH）の1Ｈ  ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ、ＭｅＯＨd4）を示し；第三級窒素に結合されたメチル基およびメチレン基のプロトンの信号は、灰色で記載されている。
【図５】1Ｈ  ＮＭＲ分光分析法によって測定された、６５％の末端四級化の際の時間に対する四級化率をプロットした図を示す。
【図６】１時間のインキュベーション後にｐＨ６．５で３つの測定値から標準偏差の記載と共にトリパンブルーを排除するＣａｃｏ−２−細胞の対照に対する百分率での割合を有するグラフを示す。
【図７】オイドラギットＥ  ＰＯおよびその四級化誘導体の存在下でｐＨ６．５で１時間のインキュベーション後にマンニトールのための４つの測定値からの標準偏差を有するＰapp（見掛け透過率）をプロットした図を示す。
【図８】等モル量のポリマーで１時間インキュベートした後のマンニトール透過率の可逆性を記録したグラフを示す。Ｐappは、６０分間の間隔で測定された。
【図９】ポリマーの存在下で１時間のインキュベーション後およびポリマー化合物なしで先端でｐＨ６．５および基底外側でｐＨ７．４で６時間のインキュベーション後の０．２１μＭの濃度でオイドラギットＥ  ＰＯおよびその四級化誘導体の添加の時点で先端でｐＨ６．５および基底外側でｐＨ７．４でのＴＥＥＲ値の百分率でのＴＥＥＲ値の経過を示す。
【図１０】ポリマーの存在下で１時間のインキュベーション後およびポリマー化合物なしで６時間のインキュベーション後の０．２１μＭの濃度でオイドラギットＥ  ＰＯおよびその四級化誘導体の添加の時点で先端および基底外側でｐＨ７．４でのＴＥＥＲ値の百分率でのＴＥＥＲ値の経過を示す。
【図１１】０．２μＭの濃度でオイドラギットＥ  ＰＯおよびその四級化誘導体の存在下で先端でｐＨ６．５および基底外側でｐＨ７．４で２時間のインキュベーション後の塩化トロスピウムのための３〜５つの測定値からの標準偏差を有するＰappをプロットした図を示す。
【図１２】５０μｇ／ｍｌの濃度でオイドラギットＥ  ＰＯの四級化誘導体の存在下で先端でｐＨ６．５および基底外側でｐＨ７．４でタリノロール（Talinolol）のための３つの測定値からの標準偏差を有するＰappをプロットした図を示す。
【実施例】
【００２８】
１．オイドラギットＥ  ＰＯの四級化
オイドラギットＥ  ＰＯ（Roehm GmbH）のモノマー組成を1Ｈ  ＮＭＲ分光分析法により測定した（図２／第１表）。このために使用される重水素化された溶剤ＭｅＯＨd4をＤｅｕｔｅｒｏ  ＧｍｂＨから購入した。
【００２９】
【表１】
0005645668.tif 000003
第１表  ポリマーオイドラギットＥ  ＰＯのモノマー組成。ＢＭＡ＝ブチルメタクリレート、ＤＭＡＥＭＡ＝（２−ジメチルアミノエチル）メタクリレート、ＭＭＡ＝メチルメタクリレート
【００３０】
定義された四級化されたオイドラギットＥ  ＰＯを、オイドラギットＥ  ＰＯの第三級アミン基をヨウ化メチル（ＭｅＩ）で二分子求核置換することによって製出した。典型的な四級化反応（図３）のために、オイドラギットＥ  ＰＯを一口フラスコ中でメタノール（MeOH）中に溶解し（０．１ｇ／ｍl；Acros Organics）、この場合この中には、出発化合物ならびに相応する四級化生成物が良好に溶解している。所望の四級化率に必要とされる量のＭｅＩ（Acros Organics）を計量し、攪拌されている溶液に添加した。メチル化の場合、オイドラギット（登録商標）Ｅ  ＰＯのモノマー組成物の製造業者の記載に関連するならば、前記の所望の四級化率に対して理論的に必要とされるであろうよりも約１０％少ないＭｅＩを使用した（第１表）。一緒のＢＭＡおよびＭＭＡに対するＤＭＡＥＭＡの実際の物質量比は、１０％より低いので、ＭｅＩ量の低減は、必要である。１〜２時間後、前記ポリマーを、２０倍の容量を有する強力に攪拌されている−７８℃のジエチルエーテルへと緩徐に滴加することによって、析出させた。
【００３１】
達成された四級化率を1Ｈ  ＮＭＲにより測定するために、試料を取り出し、高真空中で乾燥させた。窒素の四級化または正電荷の導入は、結合された基に対して電子密度の減少を生じる。1Ｈ  ＮＭＲスペクトル中で、この脱保護（Entschirmung）は、明らかに低磁界側への移動（Tieffeldverschiebung）を示す。従って、第三級窒素に結合した基の信号の縮小化により四級化は、定めることができる。出発化合物の同じモノマー組成を絶えず取る場合には、図４に示された全てのスペクトルにおいて、ＢＭＡのブチル基に対するメチレン基の信号の積分は、１．６６ｐｐｍで参照として２に設定された。引続き、第三級窒素に結合されたメチル基のプロトンの信号により、全てのスペクトル中で正確に同一の区間（Ｉメチル）に亘って積分された。出発化合物において、この積分の値は、９．４４である。従って、窒素原子の全体数に対する第四級窒素原子の割合、即ち次式：
【数１】
0005645668.tif 000004
による四級化率ＤＱnが判明する。
【００３２】
６５％の四級化率を有するオイドラギットＥ  ＰＯに関する1Ｈ  ＮＭＲ：
1Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＭｅＯＨd4）δ＝４．５２（広幅，ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）3+），４．１２（広幅，ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2），３．９１（広幅，ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3），３．６４（広幅，ＣＯＯＣＨ3），３．４２（広幅，ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）3+），２．６８（広幅，ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2），２．３５（広幅，ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2），２．２１〜１．７５（広幅，ＣＨ2  基準），１．６５（広幅，ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3），１．４６（広幅，ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3），１．３０（広幅，ＣＨ3），１．２３〜０．６９（広幅，ＣＨ3，ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3）。
【００３３】
反応経過を追求するために、６５％の四級化率に関連して試料を反応混合物から取り出した。全ての揮発性成分を反応混合物から高真空中で分離することによって、反応をそれぞれ停止させた。図５は、第２次の動力学により進行するＳN２反応（＝求核性二分子置換）に対して予想することができる典型的な飽和曲線を示す。達成しようと努力される四級化率は、既に１時間後に達成されており、この場合この１時間で反応は、定量的に進行する。
【００３４】
オイドラギットＥ  ＰＯをヨウ化メチルで四級化した後、ヨウ化物は、正電荷を有するアンモニウム基に対する対イオンを有する。細胞試験の際にポリマーそれ自体によって惹起されない効果をできるだけ排除しうるために、ヨウ化物を生化学的に懸念されない塩化物とイオン交換することを実施した。イオン交換樹脂（Dowex Monosphere 550A, OH-負荷した；Sigma Aldrich）を水中に懸濁させ、約３ｃｍの直径を有する約３０ｃｍの長さのカラム中に充填した。流出する水のｐＨ値は、８〜９であった。次に、半分に濃縮された酢酸で、ｐＨ値が酸になるまで洗浄し、引続き流出する水が中性になるまで水で洗浄した。引続き、Ｈ2Ｏ中の四級化された化合物３００ｍｇを前記カラム上に添加し、水３００ｍｌで洗浄した。１ｍｌを取出し、濃縮された硝酸銀溶液（Acros Organics）を添加した。沈殿物を観察することができた場合には、前記溶液を繰返しカラム上に添加し、Ｈ2Ｏ  １００ｍｌで後洗浄した。ｐＨ値をＨＣｌで１に調節し、酢酸および水を遠心分離し（abrotieren）、ポリマーを６０℃で真空乾燥箱中で数日間乾燥させた。最終製品は、無色の固体であった（収率：９５％を上廻る）。
【００３５】
２．Ｃａｃｏ−２−細胞モデル中での四級化されたオイドラギットＥ  ＰＯ誘導体の試験
Ａ．方法
細胞の培養
Ｃａｃｏ−２−細胞を１ｃｍ2当たり１０００００個の細胞の密度で２４個の孔を有するポリカーボネート−トランスウェル（Polycarbonat-Transwells）（直径：０．３３ｃｍ2）中に培養した。前記細胞を、ペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌ、可欠アミノ酸１％およびＦＢＳ１０％が添加されたＤＭＥＭ中でＣＯ2５％および空気湿度９０％で生育させた。試験を培養後２０〜２２日間実施した。
【００３６】
細胞培養の維持のために、細胞を７５ｃｍ2の細胞培養瓶中に貯蔵し、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（０．２５％／０．０２％）で双方の流れが８０〜９０％合流した際にトリプシン化し、それぞれの二日目に中性媒体を供給した。次に、前記細胞を上記の記載と同様にトリプシン化し、試験のためにトランスウェル（Transwells）中で培養した。細胞を剥離するためのトリプシンでの処理は、継代培養（Passagieren）とも呼称される。この意味で試験には、単に継代４４〜５８の細胞を使用した。
【００３７】
トリパンブルー排除アッセイ
最初にＭＥＳ／ＨＢＳＳ  １０ｍＭ（ｐＨ６．５）中のトリパンブルー０．０４％の溶液を製造した。Ｃａｃｏ−２−細胞をトリプシン化し、遠心分離し、ＭＥＳ／ＨＢＳＳ  １０ｍＭ（ｐＨ６．５）中に再懸濁させた。次に、前記細胞を１時間、１．５ｍｌのエッペンドルフ型容器（Eppendorf-Gefaessen）中でポリマー０．２１μＭを有するＭＥＳ／ＨＢＳＳ  １０ｍＭ（ｐＨ６．５）中で室温で回転歯車（Drehrad）上でインキュベートした。引続き、細胞懸濁液５０μｌをトリパンブルー溶液の５０μｌと混合し、この混合物２０μｌを血球計上に添加し、光学顕微鏡の下で細胞数を数えた。この試験の場合、無傷の細胞は、染料のトリパンブルーを排除し、損傷した／死亡した細胞は、青色に着色されていることを示す。
【００３８】
マンニトールに対する輸送再生（"transport recovery輸送回復"）アッセイ
このアッセイを、２４個の孔を有するポリカーボネート−トランスウェル中で実施した。細胞を１時間、ポリマーの溶液（０．２１μＭ）、マンニトール０．１ｍＭおよび14Ｃマンニトール１μＣｉ／ｍｌと一緒に先端でＭＥＳ／ＨＢＳＳ  ２５ｍＭ（ｐＨ６．５）中で、および基底外側でＨＥＰＥＳ／ＨＢＳＳ  ２５ｍＭ（ｐＨ７．４）中でインキュベートした。先端および基底外側での溶液を１時間後に注意深く除去し、先端側でマンニトール０．１ｍＭおよび14Ｃマンニトール１μＣｉ／ｍｌを有するＭＥＳ／ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ２５ｍＭ（ｐＨ６．５）によって、および基底外側でＨＥＰＥＳ／ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ２５ｍＭ（ｐＨ７．４）によって置換した。ポリカーボネート装入物を毎時間緩衝液で充填された新規の２４個の孔を有するポリカーボネート−トランスウェル板中に移行させた。基底外側での媒体の試料をシンチレーションカウントのために使用した。初期のマンニトール濃度を測定するために、先端での媒体の試料を試験の開始時および先端での媒体の交換後に取り出し、シンチレーションカウントに使用した。
【００３９】
トロスピウムのための輸送アッセイ
トロスピウム輸送をＨＰＬＣにより分析した。先端の細胞側を、前記ポリマーを０．２１μＭの濃度で含有しかつトロスピウム２ｍＭを含有する、ＭＥＳ／ＨＢＳＳ  １０ｍＭ（ｐＨ６．５）からなる輸送緩衝液でインキュベートし、基底外側の細胞側を、ＨＥＰＥＳ／ＨＢＳＳ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）中でインキュベートした。先端の側から試験の開始時に試料１００μｌを取出し、新しい緩衝液１００μｌによって置換した。ＨＰＬＣ毎に試料を測定するために、試料を−１８℃で貯蔵した。
【００４０】
タリノロールのための輸送アッセイ
タリノロールを１μＣi／ｍｌの濃度で使用した。先端の側を、ＭＥＳ／ＨＢＳＳ  １０ｍＭ（ｐＨ６．５）中のポリマー溶液（０．２１μＭ）でインキュベートし、基底外側の側を、ＨＥＰＥＳ／ＨＢＳＳ１０ｍＭ（ｐＨ７．４）中でインキュベートした。開始時に試料２０μｌを先端の側から取出し、供与体室を新しい溶液２０μｌで再び充填した。３０分、６０分、９０分および１２０分の後、基底外側の室から試料５００μｌを取出し、それぞれ新しい試料５００μｌによって置換した。
【００４１】
シンチレーションカウント
試料を、ミニバイアルスＡ小管（Mini Vials A-Roehrchen）（Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe, Deutschland）中で液体シンチレーションカウンター（LC 6000, Beckman Coulter, Unterschleissheimm, Deutschland）を用いて徹底的な混合後にシンチレーション溶液Rotiszint 22 ４ｍｌ（Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe, Deutschland）で分析した。計数時間は、全ての試料および試験に対して５分間に調節された。
【００４２】
ＨＰＬＣ
測定を、Ｊａｓｃｏ  ＰＵ−９８０ポンプとＪａｓｃｏ  ＡＳ−９５０試料捕集器（自動サンプラー）とＪａｓｃｏ  ＵＶ−９７５  ＵＶ／ＶＩＳ検出器（Jasco Deutschland GmbH, Gross-Umstadt, Deutschland）とからなるＪａｓｃｏ  ＨＰＬＣシステムを用いて内部標準としてのアメジニウムメチルスルフェート（Ameziniummetilsulfat）を使用しながら実施した。
【００４３】
クロマトグラフィー条件：
カラム：ＬｉＣｈｒｏＣａｒｔ  １２５×４ｍｍ、ＲＰ−８、Ｓｕｐｅｒｓｐｈｅｒ  ６０（Merck Darmstadt, Deutschland）、
移動相：ＨＥＰＥＳ  ０．０１Ｍ、Ｋ2ＨＰＯ4×３Ｈ2Ｏ  ０．００３Ｍ、２回蒸留した水３００ｍｌ、アセトニトリル７００ｍｌ、８５％燐酸１．５ｍｌ、
温度：室温、
流速：１．２ｍｌ／分、
検出：ＵＶ吸収２１０ｎｍ、
注入容量：５０μｌ、
運転時間：７分間。
【００４４】
経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ＝transepithlial electrical resistance）の測定
ＴＥＥＲを所謂「チョップスティック（Chopstick）」電極（Millicell ERS, Millipore, Bedford, USA）で測定した。輸送再生試験のために、２４個の孔を有するポリカーボネート−トランスウェルを利用し、細胞を、最初に２０分間、先端でＭＥＳ／ＤＭＥＭ  ２５ｍＭ（ｐＨ６．５）で、および基底外側でＨＥＰＥＳ／ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ２５ｍＭ（ｐＨ７．４）でインキュベートした。その後、濃縮されたポリマー溶液をピペットで注入し（zupittetieren）、したがってインキュベーション媒体中でのポリマーの最終濃度は、０．２１μＭであった。次に、ＴＥＥＲを１時間に亘って追求し、その後に先端の側の媒体を新しい緩衝液（ＭＥＳ／ＤＭＥＭ（ｐＨ６．５）＋１０％ＦＢＳ２５ｍＭまたはＨＥＰＥＳ／ＤＭＥＭ（ｐＨ７．４）＋１０％ＦＢＳ２５ｍＭ）によって置換した。次に、ＴＥＥＲの再生を６時間に亘って追求した。
【００４５】
Ｐapp（見掛け透過率）の算出
Ｐapp値を次の式により算出した：Ｐapp＝（Ｖa／（Ａ＊ｔ））＊（［医薬］受容体／［医薬］出発、供与体Ｘ）、この場合Ｖaは、ｍｌでの受容体室内での先端での容量を表わし、Ａは、ｃｍ2での単層の面積を表わし、ｔは、秒での時間を表わし、［医薬］受容体は、ｔ秒後の基底外側の室内での累積医薬濃度を表わし、および［医薬］出発、供与体は、供与体室内での初期医薬濃度を表わす。
【００４６】
Ｂ．結果
項目１の記載により合成された化合物の中から、２２％、４２％および６５％の四級化率を有する３つの誘導体をＣａｃｏ−２−細胞モデル（J. Pharm Sei., 2000, 89, 63 - 75）中で試験した。
【００４７】
オイドラギットＥ  ＰＯの四級化された融合対の毒性を試験するために、最初にトリパンブルー排除試験を実施した。図６から判断することができるように、四級化された化合物は、オイドラギットＥ  ＰＯよりも僅かに高い毒性を有するにすぎない。その上、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）ならびにマンニトール輸送の上昇は、細胞を四級化された化合物と一緒にインキュベートした際に可逆的であった（図８および９）。これは、上皮が物質によって不可逆的な損傷を被らないし、ポリマー溶液の除去後にバリヤー機能が再生されることを示す。
【００４８】
ｐＨ７．４（先端および基底外側で）でオイドラギットＥ  ＰＯは、四級化された誘導体に対して等モル量の濃度でＴＥＥＲに関連して対照と比較可能な挙動を取り、一方で、四級化された化合物は、ＴＥＥＲの明らかな減少を惹起する（図１０）。もしかすると、オイドラギットＥ  ＰＯは、中性のｐＨでその劣悪な溶解性のために作用を有していないかもしれない。
【００４９】
マンニトール透過率の上昇と共に（図７）、ポリマーは、細胞培養のモデル中でトロスピウム（図１１）およびタリノロール（図１２）の透過率を上昇させた。マンニトール透過率およびトロスピウム透過率の場合には、四級化された誘導体の等モル量は、オイドラギットＥ  ＰＯと比較された。この場合、前記誘導体は、等モル量で記載された物質の透過率を部分的によりいっそう強く上昇させたが、しかし、全ての場合に、オイドラギットＥ  ＰＯと少なくともちょうど同じように強く上昇させることが判明した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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