(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋可能なゼラチンと、前記架橋可能なゼラチンの架橋を誘導するトランスグルタミナーゼ、並びに、いずれの薬剤的に適合性の塩としてカルシウム、及び尿素を、酢酸緩衝液及びクエン酸緩衝液を組合せた溶液中に含有する組成物。
【請求項２】
前記カルシウム及び尿素を組み合わせて含有している場合に、前記カルシウム又は尿素をそれぞれ単独で含有している場合よりも、カルシウム及び尿素のそれぞれの含有量が少ないことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記酢酸及び／又はクエン酸が約０．５Ｍより少ないことを特徴とする請求項１〜２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４】
前記酢酸及び／又はクエン酸が少なくとも約０．０１Ｍである請求項３記載の組成物。
【請求項５】
イオン強度が、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍである請求項３又は４記載の組成物。
【請求項６】
前記トランスグルタミナーゼが、微生物性トランスグルタミナーゼを含有する請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
さらにカルシウム封鎖剤を含有する請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
いずれの薬剤的に適合性の塩としてカルシウム、及び尿素を含有し、且つ、ゼラチンと酢酸緩衝液とを含有する組成物及びトランスグルタミナーゼとクエン酸緩衝液とを含有する組成物とを組合せた組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、架橋可能なタンパク質および架橋可能なタンパク質の架橋を誘導する無毒性の物質を含んでなる、改良された架橋組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｉｎ  ｓｉｔｕにてゲルを形成できる生体材料は、様々な応用に対して有用である。多くの場合、ｉｎ  ｓｉｔｕゲル形成物質は、制御された薬物送達のための注射可能なマトリックス、または組織工学のための注射可能な足場として使用される（Ｇｕｔｏｗｓｋａ  Ａ，Ｊｅｏｎｇ  Ｂ，Ｊａｓｉｏｎｏｗｓｋｉ  Ｍ．Ａｎａｔ  Ｒｅｃ  ２００１，２６３，３４２−３４９．Ｓｉｌｖａ  ＥＡ，Ｍｏｏｎｅｙ  ＤＪ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２００７，５，５９０−８．Ｍａｈｏｎｅｙ  ＭＪ，Ａｎｓｅｔｈ  ＫＳ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ  ２００７，８１，２６９−７８）。ｉｎ  ｓｉｔｕゲル形成物質は、生理的環境における組織結合またはシール漏れのための接着剤（気体または液体のいずれか）としての機能もまた果たし得る。
【０００３】
軟組織の接着剤に対する興味は、創傷を閉鎖するための縫合に換わるもの、またはそれを補うものへの要求（Ｇｌｉｃｋｍａｎ  Ｍ，Ｇｈｅｉｓｓａｒｉ  Ａ，Ｍｏｎｅｙ  Ｓ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ，Ｂａｌｌａｒｄ  Ｊ．Ａｒｃｈ  Ｓｕｒｇ  ２００２，１３７，３２６−３１；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ３３２．Ｐｕｒｓｉｆｕｌｌ  ＮＦ，Ｍｏｒｅｙ  ＡＦ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｕｒｏｌ  ２００７，１７，３９６−４０１）、低侵襲性および美容整形外科への動向（Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；２ｎｄ  ｅｄ．；Ｑｕｉｎｎ，Ｊ．Ｖ．，Ｅｄ．；ＢＣ  Ｄｅｃｋｅｒ：Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ  Ｃａｎａｄａ，２００５．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｇｌｕｅ  ｉｎ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ；Ｓａｌｔｚ，Ｒ．；Ｔｏｒｉｕｍｉ，Ｄ．Ｍ．，Ｅｄｓ．；Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，：Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ  ２００４）、および緊急な止血の必要性（Ｐｕｓａｔｅｒｉ  ＡＥ，Ｈｏｌｃｏｍｂ  ＪＢ，Ｋｈｅｉｒａｂａｄｉ  ＢＳ，Ａｌａｍ  ＨＢ，Ｗａｄｅ  ＣＥ，Ｒｙａｎ  ＫＬ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｕｍａ−Ｉｎｊｕｒｙ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  ２００６，６０，６７４−６８２．Ａｃｈｅｓｏｎ  ＥＭ，Ｋｈｅｉｒａｂａｄｉ  ＢＳ，Ｄｅｇｕｚｍａｎ  Ｒ，Ｄｉｃｋ  ＥＪ，Ｈｏｌｃｏｍｂ  ＪＢ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｕｍａ−Ｉｎｊｕｒｙ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  ２００５，５９，８６５−８７４．Ｋｈｅｉｒａｂａｄｉ  ＢＳ，Ａｃｈｅｓｏｎ  ＥＭ，Ｄｅｇｕｚｍａｎ  Ｒ，Ｓｏｎｄｅｅｎ  ＪＬ，Ｒｙａｎ  ＫＬ，Ｄｅｌｇａｄｏ  Ａ，Ｄｉｃｋ  ＥＪ，Ｈｏｌｃｏｍｂ  ＪＢ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｕｍａ−Ｉｎｊｕｒｙ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  ２００５，５９，２５−３４）のために増大している。
【０００４】
ｉｎ  ｓｉｔｕゲル形成は様々なアプローチによって開始できる。ゲル形成への化学的なアプローチは、シアノアクリレートにおけるような接触、または光開始（ｐｈｏｔｏ−ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）のような外部刺激のいずれかによる重合の開始を含む。ゲル形成はまた、グルタルアルデヒドもしくはカルボジイミドのような低分子量の架橋剤（Ｏｔａｎｉ  Ｙ，Ｔａｂａｔａ  Ｙ，Ｉｋａｄａ  Ｙ．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ  １９９９，６７，９２２−６．Ｓｕｎｇ  ＨＷ，Ｈｕａｎｇ  ＤＭ，Ｃｈａｎｇ  ＷＨ，Ｈｕａｎｇ  ＲＮ，Ｈｓｕ  ＪＣ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９，４６，５２０−３０．Ｏｔａｎｉ，Ｙ．；Ｔａｂａｔａ，Ｙ．；Ｉｋａｄａ，Ｙ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９９８，１９，２１６７−７３．Ｌｉｍ，Ｄ．Ｗ．；Ｎｅｔｔｌｅｓ，Ｄ．Ｌ．；Ｓｅｔｔｏｎ，Ｌ．Ａ．；Ｃｈｉｌｋｏｔｉ，Ａ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００８，９，２２２−３０）またはポリマー上の活性置換基（Ｉｗａｔａ，Ｈ．；Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．；Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ，Ｋ．；Ｉｔｏｈ，Ｅ．；Ｉｋａｄａ，Ｙ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９９８，１９，１８６９−７６）のいずれかを用いて、予め形成されたポリマーを化学的に架橋することにより達成できる。
【０００５】
化学的なアプローチに加え、ゲル形成は自己集合性のペプチドを用いる物理的手段を通して達成できる（Ｅｌｌｉｓ−Ｂｅｈｎｋｅ  ＲＧ，Ｌｉａｎｇ  ＹＸ，Ｔａｙ  ＤＫ，Ｋａｕ  ＰＷ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＧＥ，Ｚｈａｎｇ  Ｓ，Ｗｕ  Ｗ，Ｓｏ  ＫＦ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００６，２，２０７−１５．Ｈａｉｎｅｓ−Ｂｕｔｔｅｒｉｃｋ  Ｌ，Ｒａｊａｇｏｐａｌ  Ｋ，Ｂｒａｎｃｏ  Ｍ，Ｓａｌｉｃｋ  Ｄ，Ｒｕｇｈａｎｉ  Ｒ，Ｐｉｌａｒｚ  Ｍ，Ｌａｍｍ  ＭＳ，Ｐｏｃｈａｎ  ＤＪ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＪＰ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００７，１０４，７７９１−６．Ｕｌｉｊｎ  ＲＶ，Ｓｍｉｔｈ  ＡＭ．Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｒｅｖ  ２００８，３７，６６４−７５）。
【０００６】
最後に、ゲル形成開始のための生物学的アプローチが、イガイ接着剤（ｍｕｓｓｅｌ  ｇｌｕｅ）のような海産の接着剤由来の架橋成分（Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  ＲＬ，Ｌｉｎｋ  ＲＰ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９０，８，５３−７）、またはフィブリン組織接着剤におけるような血液凝固（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＭＲ．Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  ２００１，１８２，１Ｓ−７Ｓ．Ｓｐｏｔｎｉｔｚ  ＷＤ．Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  ２００１，１８２，８Ｓ−１４Ｓ  Ｂｕｃｈｔａ  Ｃ，Ｈｅｄｒｉｃｈ  ＨＣ，Ｍａｃｈｅｒ  Ｍ，Ｈｏｃｋｅｒ  Ｐ，  Ｒｅｄｌ  Ｈ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００５，２６，６２３３−４１．２７−３０）に基づいて検討されてきた。
【０００７】
様々なバイオミメティックアプローチもまた、ｉｎ  ｓｉｔｕゲル形成のために考慮されてきた。これらのアプローチにおいて、ポリマー架橋およびゲル形成は、生物学において見出された架橋操作のうちの一つの後にモデル化される。おそらく最大の技術的興味を引き付けた生物学的モデルは、湿った条件下に設定されるイガイ接着剤（ｍｕｓｓｅｌ  ｇｌｕｅ）である（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ＨＧ，Ｒｏｂｅｒｔｏ  ＦＦ．Ｍａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（ＮＹ）２００７，９，６６１−８１．Ｄｅａｃｏｎ  ＭＰ，Ｄａｖｉｓ  ＳＳ，Ｗａｉｔｅ  ＪＨ，Ｈａｒｄｉｎｇ  ＳＥ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９８，３７，１４１０８−１２．）。イガイ接着剤（ｍｕｓｓｅｌ  ｇｌｕｅ）の架橋は、接着性タンパク質のフェノール性（すなわちドーパ）残基の反応性キノン残基への酵素的変換により開始され、この反応性キノン残基は続いてタンパク質間の架橋反応を起こし得る（Ｂｕｒｚｉｏ  ＬＡ，Ｗａｉｔｅ  ＪＨ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０００，３９，１１１４７−５３．ＭｃＤｏｗｅｌｌ  ＬＭ，Ｂｕｒｚｉｏ  ＬＡ，Ｗａｉｔｅ  ＪＨ，Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ＪＪ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９９，２７４，２０２９３−５）。技術的モデルとなった第二の生物学的架橋操作は、血液凝固の間に起こるトランスグルタミナーゼ触媒反応である（Ｅｈｒｂａｒ  Ｍ，Ｒｉｚｚｉ  ＳＣ，Ｈｌｕｓｈｃｈｕｋ  Ｒ，Ｄｊｏｎｏｖ  Ｖ，Ｚｉｓｃｈ  ＡＨ，Ｈｕｂｂｅｌｌ  ＪＡ，Ｗｅｂｅｒ  ＦＥ，Ｌｕｔｏｌｆ  ＭＰ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００７，２８，３８５６−６６）。ｉｎ  ｓｉｔｕゲル形成のためのバイオミメティックアプローチは、因子ＸＩＩＩａまたはその他の組織トランスグルタミナーゼの使用について検討してきた（Ｓｐｅｒｉｎｄｅ  Ｊ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  Ｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０００，３３，５４７６−５４８０．Ｓａｎｂｏｒｎ  ＴＪ，Ｍｅｓｓｅｒｓｍｉｔｈ  ＰＢ，Ｂａｒｒｏｎ  ＡＥ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００２，２３，２７０３−１０）。
【０００８】
特に興味がもたれる、ｉｎ  ｓｉｔｕゲル形成のためのバイオミメティックアプローチの一つは、カルシウム非依存性の微生物性トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）によるゼラチンの架橋である。ｍＴＧは因子ＸＩＩＩａに類似した架橋反応を触媒するが、微生物性酵素は活性のためにトロンビンまたはカルシウムのいずれも必要としない。ｍＴＧについての最初の研究は食品産業における応用を標的としていたが（Ｂａｂｉｎ  Ｈ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｅ．Ｆｏｏｄ  Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ  ２００１，１５，２７１−  ２７６．Ｍｏｔｏｋｉ  Ｍ，Ｓｅｇｕｒｏ  Ｋ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９８，９，２０４−２１０）、後の研究では医学応用への可能性を考慮した。以前のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究により、ｍＴＧがゼラチンを架橋して数分以内にゲルを形成できること、ゼラチン−ｍＴＧ接着剤は湿った、または濡れた組織を結合できること、および接着強度はフィブリンを基にしたシーラントに同等かまたはより強いことが示された（Ｃｈｅｎ  ＴＨ，Ｐａｙｎｅ  ＧＦ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００３，２４，２８３１−２８４１．ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ  ＭＫ，Ｐａｙｎｅ  ＧＦ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００４，５，１２７０−１２７９．Ｃｈｅｎ  Ｔ，Ｐａｙｎｅ  ＧＦ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ｂ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  ２００６，７７，４１６−２２．）。
【発明の概要】
【０００９】
背景技術は、限定はされないが外科的な応用、出血の制御、体液漏出のシーリング、創傷からの出血の制御を含む、止血または体液シーリングの目的に対するような広く様々な応用のために使用され得る非フィブリンタンパク質またはポリペプチドに基づく酵素的な架橋物質の一以上の性質を制御するための、一以上のさらなる賦形剤を特色とする改良された組成物について教示または示唆していない。
【００１０】
本発明は、架橋可能なタンパク質またはポリペプチド、および少なくとも幾つかの実施形態に従う一以上の架橋物質を含んでなる組成物を提供する。
【００１１】
本発明の幾つかの実施形態によれば、酢酸とクエン酸を組み合わせた緩衝液中において、フィブリンではないタンパク質またはポリペプチドであることを条件とする架橋可能なタンパク質またはポリペプチド、前記架橋可能なタンパク質の架橋を誘導する酵素を含んでなる組成物が提供される。任意に、前記架橋可能なタンパク質またはポリペプチドは酢酸ナトリウム緩衝液中にあり、このとき前記酵素はクエン酸ナトリウム緩衝液中にあり、前記架橋可能なタンパク質またはポリペプチド、および前記酵素は、組成物形成のためにそれぞれの緩衝液と共に混合される。好ましくは、前記架橋可能なタンパク質またはポリペプチドはゼラチンを含んでなる。さらに好ましくは、前記ゼラチンは少なくとも２５０ブルームである。
【００１２】
本発明の幾つかの実施形態によれば、いずれの薬剤的に適合性の塩としてカルシウムをさらに含んでなり、かつ任意に尿素をさらに含んでなる組成物が提供される。
【００１３】
好ましくは、カルシウムおよび尿素が組み合わされている場合には、前記カルシウムおよび前記尿素それぞれの量は、カルシウムおよび尿素のそれぞれが別々である場合よりも少ない。
【００１４】
さらに好ましくは、前記酢酸および／またはクエン酸は約０．５Ｍよりも少ない。
【００１５】
任意に、かつ最も好ましくは、前記酢酸および／またはクエン酸は少なくとも約０．０１Ｍである。
【００１６】
任意に、イオン強度は所望の架橋時間に従って約０．１Ｍないし約０．５Ｍから選択され、ここでイオン強度が増大すると架橋時間は比較的短くなる。
【００１７】
本明細書中に記載されるいずれの組成物について、任意に、かつ好ましくは、酵素は一以上のトランスグルタミナーゼまたはマルチ銅オキシダーゼを含んでなる。
【００１８】
さらに好ましくは、前記トランスグルタミナーゼは微生物性トランスグルタミナーゼを含んでなる。
【００１９】
本発明の幾つかの実施形態によれば、フィブリンではないタンパク質またはポリペプチドであることを条件とする架橋可能なタンパク質またはポリペプチド、前記架橋可能なタンパク質の架橋を誘導する酵素、金属イオン、および変性薬剤を含んでなる組成物が提供される。
【００２０】
任意に、架橋可能なタンパク質またはポリペプチドはゼラチンを含んでなる。好ましくは、前記ゼラチンは少なくとも２５０ブルームである。
【００２１】
さらに好ましくは、前記金属イオンはいずれの薬剤的に適合性の塩としてカルシウムを含んでなる。最も好ましくは、前記カルシウム塩は塩化カルシウムまたは水酸化カルシウムの一以上を含んでなる。任意に、かつ最も好ましくは、前記カルシウムは最高１Ｍの量である。
【００２２】
本明細書中に記載されるいずれの組成物について任意に、前記変性薬剤はカオトロープを含んでなる。好ましくは、前記カオトロープは尿素を含んでなる。さらに好ましくは、前記尿素は最高４Ｍの量である。最も好ましくは、カルシウムおよび尿素が組み合わされている場合には、前記カルシウムおよび前記尿素それぞれの量は少ない。
【００２３】
前記金属イオンがカルシウムを含んでなる場合、組成物は任意にカルシウム金属イオン封鎖剤をさらに含んでなる。
【００２４】
本発明の幾つかの実施形態によれば、フィブリンではないタンパク質またはポリペプチドであることを条件とする架橋可能なタンパク質またはポリペプチド、前記架橋可能なタンパク質の架橋を誘導するカルシウム非依存性の酵素、およびカルシウム金属イオン封鎖剤を含んでなる組成物が提供される。
【００２５】
任意に、前記カルシウム金属イオン封鎖剤はＥＤＴＡ、クエン酸塩、またはカルゴンの一以上を含んでなる。好ましくは、前記クエン酸塩または前記ＥＤＴＡは約０．０１Ｍないし約２Ｍの量である。さらに好ましくは、前記クエン酸塩または前記ＥＤＴＡは約０．０５Ｍないし約０．２Ｍの量である。最も好ましくは、前記クエン酸塩または前記ＥＤＴＡは約０．５Ｍないし約２Ｍの量である。
【００２６】
本発明の幾つかの実施形態によれば、フィブリンではないタンパク質またはポリペプチドであることを条件とする架橋可能なタンパク質またはポリペプチド、前記架橋可能なタンパク質の架橋を誘導する酵素、ならびにアルギン酸エステル、アラビアゴム、高粘度カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、キサンタンガム、グアーガム、およびＰＶＰからなる群より選択される粘度増強剤を含んでなる組成物が提供される。
【００２７】
本発明の幾つかの実施形態によれば、フィブリンではないタンパク質またはポリペプチドであることを条件とする架橋可能なタンパク質またはポリペプチド、前記架橋可能なタンパク質の架橋を誘導する酵素、およびコスモトロープを含んでなる組成物が提供される。
【００２８】
任意に、前記コスモトロープはプロリン、トレハロース、およびグルタミン酸塩からなる群より選択されるか、またはそれらのいずれの二以上の組み合わせである。また、該組成物は任意にカオトロープもさらなる特色とする。
【００２９】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ゼラチン、トランスグルタミナーゼ、および前記ゼラチンに共有結合できるＰＥＧ（ポリエチレングリコール）誘導体を含んでなる組成物が提供される。任意に、前記ＰＥＧ誘導体はいずれのアミノ化ＰＥＧ誘導体も含んでなる。好ましくは、前記アミノ化ＰＥＧ誘導体はＰＥＧアミンを含んでなる。
【００３０】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ゼラチン、トランスグルタミナーゼ、および前記ゼラチンに共有結合できるＰＶＡ（ポリビニルアルコール）誘導体を含んでなる組成物が提供される。任意に、前記ＰＶＡ誘導体はいずれのアミノ化ＰＶＡ誘導体も含んでなる。好ましくは、前記アミノ化ＰＶＡ誘導体はＰＶＡアミンを含んでなる。
【００３１】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ゼラチン、アミン基質架橋剤、およびカルバミル化阻害剤を含んでなる組成物が提供される。任意に、前記阻害剤はトランスグルタミナーゼを含んでなる。
【００３２】
好ましくは、前記カルバミル化阻害剤はアミンドナーを含んでなる。さらに好ましくは、前記アミンドナーはグリシンおよびヒスチジンからなる群より選択される。任意に、かつさらに好ましくは、前記アミンドナーは前記架橋剤による前記ゼラチンの架橋を阻害しない量である。また、任意に、かつさらに好ましくは、前記アミンドナーは前記架橋剤による前記ゼラチンの架橋が部分的に阻害される量でもある。上記の組成物はまた、任意に尿素をさらに含んでなってもよい。
【００３３】
本発明の幾つかの実施形態によれば、少なくとも部分的にサクシニル化されたゼラチン、非サクシニル化ゼラチン、およびアミン基質架橋剤を含んでなる組成物が提供される。
【００３４】
本発明の幾つかの実施形態によれば、少なくとも部分的にカルバミル化されたゼラチン、非カルバミル化ゼラチン、およびアミン基質架橋剤を含んでなる組成物が提供される。
【００３５】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ゼラチン、ジアミン、およびアミン基質架橋剤を含んでなる組成物が提供される。任意に、前記ジアミンはプトレシンを含んでなる。
【００３６】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ゼラチン、アミンドナー、およびアミン基質架橋剤を含んでなる組成物が提供される。
【００３７】
任意に、前記アミンドナーはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含んでなる。好ましくは、アミン基質架橋剤はトランスグルタミナーゼを含んでなる。
【００３８】
本発明の幾つかの実施形態によれば、発泡ゼラチンおよびトランスグルタミナーゼを含んでなる架橋組成物が提供される。任意に、前記トランスグルタミナーゼは凍結乾燥されている。
【００３９】
本発明の幾つかの実施形態によれば、フィブリンではないタンパク質またはポリペプチドであることを条件とする架橋可能なタンパク質またはポリペプチド、前記架橋可能なタンパク質の架橋を誘導するカルシウム非依存性の酵素、変性薬剤、および変性薬剤によるゾルゲル転移点を低下させる効果を逆転させて、前記変性薬剤の効果を逆転させる薬剤を含んでなる組成物が提供される。
【００４０】
任意に、前記変性薬剤は尿素を含んでなり、かつ前記変性薬剤の前記効果を逆転させる前記薬剤はウレアーゼを含んでなる。
【００４１】
任意に、本明細書中に記載されるいずれの組成物もソルビトールをさらに含んでなってよい。任意に、かつ好ましくは、前記ソルビトールは、架橋組成物の柔軟性を増大させるためおよび／または架橋速度を加速するために十分な量である。該組成物はまた、任意に酢酸塩をさらに含んでなってよい。
【００４２】
本発明の幾つかの実施形態によれば、本明細書中のいずれの組成物も任意に可塑剤をさらに含んでなってよい。任意に、前記可塑剤はアラビアゴム、グアーガム、ＰＶＡ、ＰＥＧ６０００、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、クエン酸アルキルエステル、グリセロールエステル、フタル酸アルキルエステル、セバシン酸アルキルエステル、ショ糖エステル、ソルビタンエステル、アセチル化モノグリセリド、グリセロール、脂肪酸エステル、グリコール、プロピレングリコール、ラウリン酸、ショ糖、グリセリルトリアセテート、ポロクサマー、フタル酸ジエチル、食用の脂肪または油のモノ−およびジ−グリセリド、フタル酸ジブチル、セバシン酸ジブチル、ポリソルベート、ポリエチレングリコール２００ないし１２，０００、Ｃａｒｂｏｗａｘポリエチレングリコール、および界面活性剤の濃度がＣＭＣ（臨界ミセル濃度）よりも高い前記界面活性剤からなる群より選択されるか；またはそれらの組み合わせである。好ましくは、前記界面活性剤は、ポリオキシエチレン−ソルビタン−脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体、ラウリル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポロクサマー、ポロキサミン、アルキルポリグルコシド、脂肪アルコール、脂肪酸塩、コカミドモノエタノールアミン、およびコカミドジエタノールアミンを含んでなる。
【００４３】
さらに好ましくは、前記界面活性剤の濃度は、前記架橋可能なタンパク質の約０．１％ないし約５％ｗ／ｗ乾燥重量の範囲である。任意に、かつ最も好ましくは、前記ポリオキシエチレン−ソルビタン−脂肪酸エステルはポリソルベート２０、２１、０、６０、６１、６５、８０、または８５の一以上を含んでなる。
【００４４】
本発明の幾つかの実施形態によれば、本明細書中のいずれの組成物も、任意に、アルギン酸エステル、アラビアゴム、高粘度カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、キサンタンガム、グアーガム、およびＰＶＰからなる群より選択される粘度増強剤をさらに含んでなってよい。
【００４５】
本発明の幾つかの実施形態によれば、本明細書中のいずれの組成物について任意に、前記酵素はトランスグルタミナーゼを含んでなり、該組成物はシスタミン、システイン、シアン酸塩、またはメラニンの一以上をさらに含んでなる。
【００４６】
本発明の幾つかの実施形態によれば、本明細書中のいずれの組成物も任意に、アンモニア捕捉剤、封鎖剤、もしくは結合剤、アンモニア代謝の刺激剤、または細胞内アンモニア取り込みの阻害剤をさらに含んでなってよい。任意に、前記アンモニア捕捉剤は二糖類ラクツロースを含んでなる。また、前記アンモニア結合剤は任意にサポニンも含んでなる。好ましくは、前記アンモニア捕捉剤は、フェニル酢酸ナトリウムおよび安息香酸ナトリウムを含んでなる溶液を、含んでなる。
【００４７】
また、好ましくは、前記アンモニア代謝の刺激剤はＬ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸塩、またはそれらの組み合わせも含んでなる。
【００４８】
また、好ましくは、前記細胞内アンモニア取り込みの阻害剤はＬ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸塩、またはそれらの組み合わせも含んでなる。
【００４９】
本発明の幾つかの実施形態によれば、本明細書中のいずれの組成物も任意に、コハク酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン（トリス）、３−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（トリシン）、２−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ジメチルアルシン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、および２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）からなる群より選択される緩衝液をさらに含んでなってよい。
【００５０】
本発明の幾つかの実施形態によれば、本明細書中のいずれの組成物も任意に約６ないし約７の範囲のｐＨを有してよく、このｐＨはまた、任意に約６でもある。
【００５１】
本発明の幾つかの実施形態によれば、本明細書中のいずれの組成物について、前記酵素は任意にトランスグルタミナーゼを含んでなってよい。任意に、前記トランスグルタミナーゼはカルシウム非依存性である。好ましくは、前記トランスグルタミナーゼは微生物性トランスグルタミナーゼである。さらに好ましくは、前記トランスグルタミナーゼのタンパク質濃度は組成物の約０．０００１％ないし約２％ｗ／ｗの量である。最も好ましくは、前記トランスグルタミナーゼは組成物の約０．０１％ないし約１．３５％ｗ／ｗの量である。また、最も好ましくは、前記トランスグルタミナーゼは組成物の約０．０５％ないし約０．５％ｗ／ｗの量でもある。
【００５２】
任意に、かつ最も好ましくは、前記トランスグルタミナーゼは組成物の約０．１％ないし約０．４％ｗ／ｗの量である。
【００５３】
任意に、前記トランスグルタミナーゼの濃度は、組成物全体の約１ないし約１８０酵素単位（Ｕ／ｍＬ）の範囲である。好ましくは、前記トランスグルタミナーゼの濃度は組成物全体の約４ないし約７０酵素単位（Ｕ／ｍＬ）の範囲である。さらに好ましくは、前記トランスグルタミナーゼの濃度は組成物全体の約１０ないし約５５酵素単位（Ｕ／ｍＬ）の範囲である。
【００５４】
本明細書中のいずれの組成物について、架橋物質：架橋可能なタンパク質溶液の比は任意に約１：１ないし約１：５ｖ／ｖである。
【００５５】
本発明の幾つかの実施形態によれば、本明細書中のいずれの組成物について、前記架橋可能なタンパク質またはポリペプチドはゼラチンを含んでなり、前記ゼラチンは動物源、組み換え源、またはそれらの組み合わせから産生される。任意に、前記動物源は魚類および哺乳類からなる群より選択される。好ましくは、前記哺乳類はブタおよび雌ウシからなる群より選択される。さらに好ましくは、前記ゼラチンはタイプＡ（酸処理されたもの）またはタイプＢ（アルカリ処理されたもの）である。最も好ましくは、前記ゼラチンは高分子量ゼラチンを含んでなる。任意に、かつ最も好ましくは、前記ゼラチンは少なくとも約２５０ブルームである。また、任意に、かつ最も好ましくは、前記ゼラチンは最初の抽出の間に産生される。
【００５６】
本発明の幾つかの実施形態によれば、本明細書中のいずれの組成物は任意に、架橋のための組成物を製造するための方法をさらに含んでなってよく、該方法は、フィブリンではないタンパク質またはポリペプチドであることを条件とする架橋可能なタンパク質またはポリペプチド、前記架橋可能なタンパク質またはポリペプチドの架橋のための酵素、および薬剤的に許容されるカルシウム塩の溶液を調製すること；および前記溶液にカルシウム金属イオン封鎖剤を加えることを含んでなる。
【００５７】
任意に、前記カルシウム金属イオン封鎖剤は、ポリリン酸塩およびカルボン酸塩、またはそれらの組み合わせの一以上を含んでなる。また、前記ポリリン酸塩は任意に、ピロリン酸塩、トリポリリン酸塩、高次ポリリン酸塩、およびヘキサメタリン酸塩からなる群より選択されるか、またはそれらの組み合わせである。好ましくはピロリン酸塩は、ピロリン酸四ナトリウム、ピロリン酸二水素二ナトリウム、ピロリン酸四カリウム、ピロリン酸二水素二カリウム、およびピロリン酸二ナトリウム二カリウムからなる群より選択されるか、またはそれらの組み合わせである。また、好ましくは前記トリポリリン酸塩は、トリポリリン酸五ナトリウム、およびトリポリリン酸五カリウムからなる群より選択されるか、またはそれらの組み合わせである。
【００５８】
また、好ましくは前記カルボン酸塩は、アルカリ金属クエン酸塩、アルカリ金属酢酸塩、アルカリ金属乳酸塩、アルカリ金属酒石酸塩、アルカリ金属リンゴ酸塩、エチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩、およびエチドロン酸からなる群より選択されるか、またはそれらの組み合わせである。さらに好ましくは、前記カルボン酸塩は、エチレンジアミン四酢酸およびクエン酸ナトリウムからなる群より選択されるか、またはそれらの組み合わせである。
【００５９】
任意に、かつさらに好ましくは、前記ヘキサメタリン酸塩はヘキサメタリン酸ナトリウムを含んでなる。
【００６０】
本発明の幾つかの実施形態によれば、架橋のための組成物を製造するための方法が提供され、該方法は、フィブリンではないタンパク質またはポリペプチドであることを条件とする架橋可能なタンパク質またはポリペプチド、前記架橋可能なタンパク質またはポリペプチドの架橋のための酵素、および変性剤の溶液を調製すること；および前記溶液に、変性薬剤によるゾルゲル転移点を低下させる効果を逆転させて、前記変性薬剤の効果を逆転させる薬剤を加えることを含んでなる。
【００６１】
任意に、前記変性薬剤は尿素を含んでなり、かつ前記変性薬剤の前記効果を逆転させる前記薬剤はウレアーゼを含んでなる。
【００６２】
本発明の幾つかの実施形態によれば、架橋のための組成物を製造するための方法が提供され、該方法は、フィブリンではないタンパク質またはポリペプチドであることを条件とする架橋可能なタンパク質またはポリペプチド、前記架橋可能なタンパク質またはポリペプチドの架橋のための酵素、およびカオトロープの溶液を調製すること；および前記溶液にコスモトロープを加えることを含んでなる。
【００６３】
任意に、ここで前記コスモトロープはプロリン、トレハロース、およびグルタミン酸塩からなる群より選択されるか、またはそれらのいずれの二以上の組み合わせである。
【００６４】
本発明の幾つかの実施形態によれば、架橋のための組成物を製造するための方法が提供され、該方法は、フィブリンではないタンパク質またはポリペプチドであることを条件とする架橋可能なタンパク質またはポリペプチド、および前記架橋可能なタンパク質またはポリペプチドの架橋のためのトランスグルタミナーゼの溶液を調製すること；および前記溶液に、シスタミン、システイン、シアン酸塩、またはメラニンの一以上を、前記トランスグルタミナーゼを少なくとも部分的に阻害するために加えることを含んでなる。
【００６５】
本発明の幾つかの実施形態によれば、特異的活性が、ミリグラムあたり＞２５酵素単位、＞９５％電気泳動的純度、グラムあたり＜５エンドトキシン単位、および＜１０ＣＦＵ／ｇである微生物性トランスグルタミナーゼ組成物が提供される。このようなトランスグルタミナーゼは、上記のいずれの請求項の架橋剤として任意に提供されてよい。
【００６６】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該組成物は、背景技術の少なくとも幾つかの不利な点を克服するために選択される、緩衝液および一以上のその他の賦形剤を特色とする。
【００６７】
任意に、かつ好ましくは、緩衝液は、酢酸緩衝液（例えば酢酸ナトリウム）、クエン酸緩衝液（例えばクエン酸ナトリウム）、コハク酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン（トリス）、３−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（トリシン）、２−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ジメチルアルシン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、および２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）からなる群より任意に、かつさらに好ましく選択される、非リン酸緩衝液である。
【００６８】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該組成物は局在型の薬物送達のためのビヒクルとして使用される。
【００６９】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該組成物は組織工学のための注射可能な足場である。
【００７０】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該組成物は止血組成物である。本発明の幾つかの実施形態によれば、該組成物は体液シーリング組成物である。
【００７１】
本発明の組成物は、好ましくは迅速な止血を提供し、これにより傷害または外科手術後の血液の損失を最小限にする。
【００７２】
本明細書中で用いられる「創傷」は、循環系からの血液の損失、またはその他のいずれの体液の、その生理的経路、例えばいずれの型の管からの損失をもたらす、患者のいずれの組織に対するいずれの損傷も指す。組織は、臓器もしくは血管のような内部組織、または皮膚のような外部組織であってよい。血液または体液の損失は、破裂した臓器からのような内部性、または裂傷からのような外部性であってよい。創傷は臓器のような軟組織、または骨のような硬組織にあってよい。損傷は、いずれの薬剤、または外傷性の傷害、感染、もしくは外科的介入を含む原因により引き起こされ得る。損傷は重篤であってよいか、または重篤でなくてよい。
【００７３】
「ＴＧ」はいずれの型のトランスグルタミナーゼも指し；「ｍＴＧ」は、文脈によって微生物性トランスグルタミナーゼおよび／またはいずれの型のトランスグルタミナーゼもまた指してよい（以下の特定の実験的実施例では、この語は微生物性トランスグルタミナーゼを指す）。トランスグルタミナーゼは、血液由来の因子ＸＩＩＩ以外の、植物、組み換え動物、または微生物由来のトランスグルタミナーゼを任意に含んでなるが；トランスグルタミナーゼの実際の産生過程は、当該技術分野において公知であるいずれの型の組み換え方法を任意に含んでなってよい。
【００７４】
外科的な創傷閉鎖は現在、組織を引き合わせることによって治癒を促進する縫合およびステープルにより達成される。しかしながら非常にしばしば、これらは体液漏出を阻止するために必要である十分なシールを形成しない。従って、ステープルおよび縫合のラインに沿って頻繁に起こる漏出を含む外科手術後の漏出を阻止するためのデバイス及び方法に対する、大きな、まだ対処されていない医学的必要性がある。このようなデバイス及び方法は、末梢血管再構築、硬膜再構築、胸部、心血管、肺、神経、および胃腸の外科手術における止血またはその他の体液の静止を達成するために、縫合およびステープルの補助として必要とされる。現在市販されている最も高圧の止血デバイスは、仮に接着性であったとしても名ばかりである。このようなデバイスの好例は、ＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）ＡＣＳ（商標）（Ｚ−Ｍｅｄｉｃａ、ウォーリントン、コネチカット州）およびＨｅｍＣｏｎ（商標）バンデージ（ＨｅｍＣｏｎ、ポートランド、オレゴン州）であり、この二つの止血デバイスは現在米軍のメンバーに供給されている。ＨｅｍＣｏｎバンデージを作り上げるキトサンネットワークは血液で満たされ、活発な体液の流れに直面するか、または創傷からの中程度の血液の流れに直面してから１〜２時間後には急速に機能しなくなる（Ｂ．Ｓ  Ｋｈｅｉｒａｂａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｊ．Ｔｒａｕｍａ．５９：２５−３５；Ａ．Ｅ．Ｐｕｓａｔｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｊ．Ｔｒａｕｍａ．６０：６７４−６８２）。ＱｕｉｋＣｌｏｔミネラルは、有効であるために危険な量の熱を発生させなければならない（Ａ．Ｅ．Ｐｕｓａｔｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｊ．Ｔｒａｕｍａ．６０：６７４−６８２）。
【００７５】
出血の制御における使用が提案されてきた、多糖を基にしたその他の止血デバイスはＲＤＨ（商標）（アセチルグルコサミン）、ＴｒａｕｍａＤＥＸ（商標）（ＭＰＨ）、およびＣｈｉｔｏｓｋｉｎ（商標）（Ｃｈｉｔｏｓａｎ  ＆  Ｇｅｌａｔｉｎ）である。しかしながら、これらのバンデージのどの型についても、著しい血液の流れに直面したときの不具合を常に回避できることは示されていない。最近導入されたその他の止血デバイスは、Ｃｅｌｏｘ（商標）（キトサン結晶）およびＷｏｕｎｄＳｔａｔ（商標）（ＴｒａｕｍａＣｕｒｅ  Ｉｎｃ．メリーランド州）（スメクタイトミネラルおよび超吸収性ポリマーの顆粒混合物）を含む。しかしながらこれらの製品は両方とも迅速に膨張して創傷部位を満たすことから、特定の型の創傷における血液凝固の促進のみに適当であり、かつ周囲血管の血流を減少させるかまたはなくしてしまう危険性を示す。
【００７６】
上に述べた全ての製品は、創傷部位からの体液漏出を制御する自然の凝固カスケードに依存する。このように、それらの能力は著しく限定される。一般的な創傷部位のシーリング、特に血液以外の体液を漏出する傷害部位に関してはこれらの製品の範囲を越えている。
【００７７】
ｍＴＧによるゼラチンの架橋から組織の接着剤を形成しようとする以前の試み（すなわちＭｃＤｅｒｍｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２００４およびＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００６）に関しては、室温での操作でゼラチン溶液に起こる熱可逆性のゲル化のため、これらの試みの商業応用は限定されてきた。過去には、ゼラチン溶液のゲル化転移点を低下させるため、接着剤における尿素の使用が提案されてきたが（Ｏｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）、尿素は酵素活性を著しく破壊できる強力な変性剤として確立されていることから（Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ  Ｃｈｅｍ  ２３６（４），１９６１）、これをゼラチン−ｍＴＧシーラントと共に使用することは以前には考慮されていなかった。さらに、尿素の存在下でのｍＴＧ活性を特異的に探求した研究では、非常に低い濃度の尿素（＜０．５Ｍ）はｍＴＧの作用を大幅に阻害し（Ｎｏｍｕｒａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６５（４），２００１：ｐ．９８２−９８５）、かつ高濃度（８Ｍ）の尿素はｍＴＧを完全に不活性化すること（Ｙｏｋｏｙａｍａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐ  ＆  Ｐｕｒｉｆ  ２６，２００２：ｐ．３２９−３３５  ２００２）が見出された。
【００７８】
驚くべきことに、本明細書中で完全に説明されているかのように参照としてここに取り込まれる、本発明者らによって２００７年１２月１７日に提出されたＰＣＴ国際公開第２００８／０７６４０７号に記載されるように、本発明者らはある状況下では尿素が実際にゼラチンおよびｍＴＧと共に首尾良く使用できるかもしれないことを見出した。さらに驚くべきことには、以下に広く詳細が記載されるように、本発明者らは架橋されたゼラチン／ｍＴＧ組成物における尿素の使用および包含の可能性を拡大した。
【００７９】
本明細書中で用いられる「約」との語は、示される値のプラスまたはマイナスおおよそ１０パーセントを意味する。
【００８０】
本発明の様々な実施形態のその他の特色および利点は、以下の詳細な記述および請求項から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
本発明は、例としてのみ、添付の図面への参照によって本明細書に記載される。ここで、図面への詳細な特異的参照によって示される事項は例として、かつ本発明の好ましい実施形態の説明的な考察の目的のためのみであることが強調され、かつ最も有用であると信じられるものを提供し、かつ本発明の原理および概念的態様についての記述を容易に理解するために提示される。この点において、本発明の構造的な詳細を、本発明の基本的理解に必要なよりもさらに詳細に示すための試みはなされず、図面と共に解釈される記述により、本発明の幾つかの型をどのように実践で具体化し得るかが当業者に明らかとなる。
【００８２】
図面中：
【図１】ｍＴＧのｐＨ安定性を示した図である。
【図２】ｍＴＧの０．５Ｍ酢酸ナトリウム（Ｎａ−Ａｃ）および０．５Ｍクエン酸ナトリウム中での経時的な粘度の変化を示した図である。
【図３Ａ】本発明の幾つかの実施形態に従った、実例となる異なった処方について、３ｘ１０６ｃＰ（完全に形成されたゲルの３０％）および９ｘ１０６ｃＰ（完全に形成されたゲルの９０％）の粘度に至るまでの時間を示した図である。
【図３Ｂ】本発明の幾つかの実施形態に従った、実例となる異なった処方について、３ｘ１０６ｃＰ（完全に形成されたゲルの３０％）および９ｘ１０６ｃＰ（完全に形成されたゲルの９０％）の粘度に至るまでの時間を示した図である。
【図３Ｃ】本発明の幾つかの実施形態に従った、実例となる異なった処方について、３ｘ１０６ｃＰ（完全に形成されたゲルの３０％）および９ｘ１０６ｃＰ（完全に形成されたゲルの９０％）の粘度に至るまでの時間を示した図である。
【図３Ｄ】本発明の幾つかの実施形態に従った、実例となる異なった処方について、３ｘ１０６ｃＰ（完全に形成されたゲルの３０％）および９ｘ１０６ｃＰ（完全に形成されたゲルの９０％）の粘度に至るまでの時間を示した図である。
【図３Ｅ】本発明の幾つかの実施形態に従った、実例となる異なった処方について、３ｘ１０６ｃＰ（完全に形成されたゲルの３０％）および９ｘ１０６ｃＰ（完全に形成されたゲルの９０％）の粘度に至るまでの時間を示した図である。
【図３Ｆ】本発明の幾つかの実施形態に従った、実例となる異なった処方について、３ｘ１０６ｃＰ（完全に形成されたゲルの３０％）および９ｘ１０６ｃＰ（完全に形成されたゲルの９０％）の粘度に至るまでの時間を示した図である。
【図４】精製されたｍＴＧ材料のゲル電気泳動の結果を示した図である（レーン２〜８）。
【図５】異なった可塑剤溶液の、コントロールに比較した相対架橋率を示した図である。
【図６】本発明の幾つかの実施形態に従った、実例となる幾つかのゼラチン溶液：コントロール、ＡおよびＢの結果を示した図である。
【図７Ａ】本発明の幾つかの実施形態に従った、実例となる様々なゼラチン溶液をカルバミル化の阻害剤として作用する様々なグリシンおよびヒスチジン添加剤と共に架橋し、異なったインキュベーション時間後に粘度計によって試験した結果を要約した図である。
【図７Ｂ】本発明の幾つかの実施形態に従った、実例となる様々なゼラチン溶液をカルバミル化の阻害剤として作用する様々なグリシンおよびヒスチジン添加剤と共に架橋し、異なったインキュベーション時間後に粘度計によって試験した結果を要約した図である。
【図７Ｃ】本発明の幾つかの実施形態に従った、実例となる様々なゼラチン溶液をカルバミル化の阻害剤として作用する様々なグリシンおよびヒスチジン添加剤と共に架橋し、異なったインキュベーション時間後に粘度計によって試験した結果を要約した図である。
【図８】本発明の幾つかの実施形態に従ったコントロール溶液をシアン酸塩添加剤と共に、またはシアン酸塩添加剤なしに架橋し、高温での異なったインキュベーション時間後に粘度計によって試験した結果を要約した図である。
【図９】バースト圧力システムと、付随する組織マニホールドを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
本発明は、架橋可能なタンパク質またはポリペプチドの溶液、および架橋可能なタンパク質の架橋を誘導する一以上の無毒性の物質の溶液を含んでなる、改良された組成物に関するものである。
【００８４】
幾つかの実施形態によれば、架橋可能なタンパク質またはポリペプチドの溶液、および架橋可能なタンパク質の架橋を誘導する一以上の無毒性の物質の溶液は非リン酸緩衝液溶媒中にて調製される。
【００８５】
任意に、かつ好ましくは、架橋可能なタンパク質は本明細書中に記載されるように、ゼラチン、およびゼラチン変異体または変異体タンパク質のいずれも含む。任意に、かつ好ましくは、無毒性の物質はトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）を含んでなり、このトランスグルタミナーゼは、例えば任意にカルシウム非依存性の微生物性トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）であってよい、カルシウム依存性または非依存性であるいずれの型のトランスグルタミナーゼを任意に含んでなってよい。どのようにも限定しようとするものではないが、本発明の少なくとも幾つかの実施形態の改良された特性のうち、本発明の組成物は、背景技術の組成物に比較して増大したタンパク質架橋の比率を提供する。さらに、ｍＴＧの架橋反応は、血液凝固系の因子ＸＩＩＩａにより触媒されるものを超える著しい改善を示す。因子ＸＩＩＩａとは異なり、微生物性酵素は活性のためにトロンビンまたはカルシウムのいずれも必要としない。
【００８６】
従って本発明は少なくとも幾つかの実施形態により、様々な軟組織への応用のための、ゼラチン−ｍＴＧ接着剤組成物の改良された応用を提供する。さらに本発明は幾つかの実施形態によって組成物を調製するための方法を提供し、該方法は、架橋可能なタンパク質またはポリペプチドの溶液を提供すること；一以上の架橋物質の溶液を提供すること；および架橋可能なタンパク質またはポリペプチドの溶液を架橋物質の溶液と混合することを含んでなる。
【００８７】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該組成物は止血バンデージとしての使用に好ましく適応されたバンデージにより提供される。本明細書中に記載される組成物は、限定はされないが組織接着剤（特にバイオミメティック組織接着剤）、組織培養の足場、組織シーラント、止血組成物、薬物送達プラットフォーム、外科手術の補助物などを含む一以上の使用、同様に、限定はされないが、例えば食品における使用のための酵素の精製のような、食用製品、化粧品などを含むその他の非医学的な使用をさらに有してよい。
【００８８】
本発明の様々な実施形態は、以下、明確さのためにのみ提供される区分見出しの下に、どのように限定しようとするいずれの意図もなく、広く詳細が記載される。
【００８９】
架橋可能なタンパク質
本発明の好ましい実施形態によれば、架橋可能なタンパク質はゼラチンを含んでなる。
【００９０】
ゼラチンは、当該技術分野において公知のタンパク質を含んでなるいずれの型のゼラチンも任意に含んでなってよく、限定はされないが、好ましくは動物組織および／または限定はされないが動物の皮膚、結合組織（限定はされないが靭帯、軟骨などを含む）、枝角または角など、および／または骨、および／または魚の鱗および／または骨、またはその他の成分を含む動物組織から得られたコラーゲンの部分的な加水分解により得られたゼラチン；および／または細菌、酵母、動物、昆虫、もしくは植物系、またはいずれの型の細胞培養を用いて産生された組み換えゼラチンを含む。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態によれば、動物由来のゼラチンは、好ましくは哺乳類由来のゼラチンを含んでなり、さらに好ましくはブタの皮膚、ブタおよびウシの骨、もしくは分割したウシの皮、またはその他のいずれのブタまたはウシの源の一以上を含んでなる。さらに好ましくは、このようなゼラチンは、アナフィラキシーの頻度が低いという理由からブタのゼラチンを含んでなる。動物由来のゼラチンは、任意にタイプＡ（酸処理されたもの）またはタイプＢ（アルカリ処理されたもの）であってよいが、タイプＡが好ましい（しかしながらタイプＢゼラチンを使用する実施例が以下に示される）。
【００９２】
好ましくは、動物由来のゼラチンは、一般に低温（この正確な温度範囲は必ずしも限定されないが、５０〜６０℃）で行われる最初の抽出の間に得られるゼラチンを含んでなる。この様式で産生されるゼラチンは２５０〜３００ブルームの範囲にあると予想され、少なくとも約９５〜１００ｋＤａの高分子量を有する。好ましくは、２７５〜３００ブルームのゼラチンが使用される。
【００９３】
限定はされないが、このようなゼラチンの製造元の例はＰＢ  Ｇｅｌａｔｉｎｓ（Ｔｅｓｓｅｎｄｅｒｌｏ  Ｇｒｏｕｐ  ベルギー）である。
【００９４】
本発明の幾つかの実施形態によれば、動物由来のゼラチンは任意に魚類由来のゼラチンを含んでなる。いずれの型の魚類も任意に使用されてよく、好ましくはコイ、タラ、またはカワカマスのような冷水魚の品種、またはマグロである。このゼラチンのｐＨ（１０％溶液中での測定）は、好ましくは４〜６の範囲である。
【００９５】
冷水魚のゼラチンは１０℃の水中で溶液となることから、全ての冷水魚ゼラチンは０ブルームであると考えられる。本発明のために、高分子量の冷水魚ゼラチンは任意に、かつ好ましく用いられ、さらに好ましくは少なくとも約９５〜１００ｋＤａの分子量を含む。これは２５０〜３００ブルームの動物ゼラチンの分子量に等しい。冷水魚ゼラチンはそのプロリンおよびヒドロキシプロリンの濃度が低めである結果、動物ゼラチンよりもかなり低い温度で熱可逆性のゲル化を起こす。１０００アミノ酸残基あたり、動物ゼラチンは１３５〜１４５のプロリンおよび９０〜１００のヒドロキシプロリンを有するのに比較して、冷水魚ゼラチンは１００〜１３０のプロリンおよび５０〜７５のヒドロキシプロリン残基を有する（Ｈａｕｇ  ＩＪ，Ｄｒａｇｅｔ  ＫＩ，Ｓｍｉｄｓｒoｄ  Ｏ．（２００４）．Ｆｏｏｄ  Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ．１８：２０３−２１３）。
【００９６】
限定はされないが、このようなゼラチンの製造元の例はＮｏｒｌａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（クランブリー  ニュージャージー州）である。
【００９７】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ゼラチン−ｍＴＧ組成物のゼラチン溶液成分を形成するために低エンドトキシンゼラチンが用いられる。このようなゼラチンはＧｅｌｉｔａ（商標）（エーベルバッハ  独国）のような供給業者から市販されている。低エンドトキシンゼラチンは、グラムあたりのエンドトキシン単位（ＥＵ）が１０００よりも少ないゼラチンとして定義される。さらに好ましくは、エンドトキシンが５００ＥＵ／グラムよりも少ないゼラチンが用いられる。
【００９８】
脊椎または脳のいずれかと接触し得る物質のような非常に感受性の高い応用には、エンドトキシンが１００ＥＵ／グラムよりも少ないゼラチンが好ましく、５０ＥＵ／グラムよりも少ないゼラチンがさらに好ましい。エンドトキシンが１０ＥＵ／グラムよりも少ないゼラチンは非常に高価であるが、敏感な応用である本発明の少なくとも幾つかの実施形態の一部としてもまた使用され得る。
【００９９】
本発明の幾つかの実施形態によれば、タイプＩ、タイプＩＩ、またはその他のいずれの型の加水分解されたかまたはされていないコラーゲンは、架橋されるタンパク質材料としてゼラチンに置き換わる。様々な型のコラーゲンが、熱に安定なｍＴＧ−架橋ゲルを形成する能力を示している（Ｏ’Ｈａｌｌｏｒａｎ  ＤＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．２００６  Ｊｕｎ；１２（６）：１４６７−７４．Ｇａｒｃｉａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ａ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ  ｃｒｏｓｓ−  ｌｉｎｋｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ．Ｊ  Ｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｍａｔｅｒ  Ｍｅｄ．２００７  Ｏｃｔ；１８（１０）：１９９１−２００１．Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｊｕｎ  ７．Ｎｏｍｕｒａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｈａｒｋ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｗｉｔｈ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｕｒｅａ．Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１  Ａｐｒ；６５（４）：９８２−５）。
【０１００】
本発明の幾つかの実施形態によれば、組み換えヒトゼラチンが用いられる。このようなゼラチンはＦｉｂｒｏｇｅｎ（商標）（サンフランシスコ、カリフォルニア州）のような供給業者から市販されている。組み換えゼラチンは、好ましくは少なくとも約９０％の純度であり、さらに好ましくは少なくとも約９５％の純度である。幾つかの組み換えゼラチンは１０℃でゲル化しないことから０ブルームであるとみなされる。本発明の幾つかの実施形態のために、さらに好ましくは少なくとも約９５〜１００ｋＤａの分子量を含む、高分子量組み換えゼラチンが好ましく用いられる。
【０１０１】
上に述べたように、架橋可能なタンパク質は好ましくはゼラチンを含んでなるが、さらに、またはあるいは、その他の型のタンパク質もまた含んでなってよい。本発明の幾つかの実施形態によれば、タンパク質はトランスグルタミナーゼの基質でもあり、好ましくは適切なトランスグルタミナーゼ特異的ポリペプチドおよびポリマー配列を特色とする。限定はされないが、これらのタンパク質は、物質がトランスグルタミナーゼによって架橋される能力を増大するトランスグルタミナーゼ特異的な基質によってさらに好ましく修飾される生物接着剤またはポリマーを形成するための特性を独立して有する合成ポリマー配列を含む。これらの物質の型それぞれについて、限定されない例を以下に記載する。
【０１０２】
好ましくは約２０ないし約４０℃の転移点を有する、架橋のための適切なトランスグルタミナーゼ標的をもつ合成ポリペプチドおよびポリマー配列が開発された。好ましい物理的特性は組織結合能および線維形成能を含むが、これらに限定されない。ゲル化型ゼラチン（上記）と同じように、これらのポリペプチドは、転移点を低下させる一以上の物質もまた特色とする組成物中に任意に用いられてよい。
【０１０３】
限定はされないが、これらのペプチドの例はＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃにより提出された米国特許第５，４２８，０１４号および第５，９３９，３８５号に記載され、両方とも本明細書中で完全に説明されているかのように参照としてここに取り込まれる。両方の特許には生体適合性、生体接着性の、トランスグルタミナーゼにより架橋可能なポリペプチドについて記載され、ここでトランスグルタミナーゼは、タンパク質に結合したグルタミニル基のγ−カルボキサミド基とＬｙｓ基のε−アミノ基との間のアシル転移反応を触媒することが知られており、これによりε−（γ−グルタミル）リジンイソペプチド結合が形成される。
【０１０４】
例えば、式Ｓ１−Ｙ−Ｓ２の部分を含んでなる１３〜１２０アミノ酸残基を有するポリペプチドについて記載され、式中、Ｓ１はＴｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎを表し；Ｙは１〜７アミノ酸のスペーサーペプチドを表すかまたは存在せず；かつＳ２はＸａａ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌを表す。任意に、スペーサーペプチドＹはＧｌｎ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、またはＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを表す。また任意に、Ｓ２のアミノ酸１であるＸａａは、ＡｌａまたはＳｅｒを表す。任意に、スペーサーペプチドはＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙを含んでなる。任意に、かつ好ましくは、ＹおよびＳ２の少なくとも一はＧｌｎ残基を持たない。任意に、ポリペプチドのカルボキシル末端アミノ酸残基はＰｒｏまたはＧｌｙである。限定はされないが、ポリペプチドの特異的な例は以下の：Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ、Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ、Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ、またはＬｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙを含む。この特許には、これらのペプチドに関連する、高分子量、生体適合性、生体接着性の、トランスグルタミナーゼにより架橋可能なコポリマーおよびホモポリマーについてもまた記載される。
【０１０５】
米国特許第５，９３９，３８５号には、生体適合性、生体接着性の、トランスグルタミナーゼにより架橋可能なポリペプチドについて記載される。これらのポリペプチドは、好ましくは式Ｓ１−Ｙ−Ｓ２の部分を含んでなる約９〜１２０アミノ酸残基を有し、式中、Ｓ１はＩｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ、およびＧｌｙ−Ｇｌｎからなる群より選択され；ＹはＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＧｌｙまたはＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙを表し；かつＳ２はＡｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ、Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ、およびＡｌａ−Ｌｙｓからなる群より選択され、ここで前記ポリペプチドはアミノ末端およびカルボキシ末端を有し、かつトランスグルタミナーゼにより架橋可能である。好ましいポリペプチドはＧｌｙ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎである。アミノ末端およびカルボキシ末端のいずれか、または両方にエラストマーポリペプチドが隣接するポリペプチドもまた好ましい。さらにエラストマーポリペプチドが提供され、ここでエラストマーポリペプチドはペンタペプチドまたはテトラペプチドであり、特に隣接するエラストマーポリペプチドがＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、またはそれらのいずれの一部、好ましくは隣接ポリペプチドのアミノ末端がＶａｌ、および隣接ポリペプチドのカルボキシ末端がＧｌｙである隣接ポリペプチドである。この特許には、これらのペプチドに関連する、高分子量、生体適合性、生体接着性の、トランスグルタミナーゼにより架橋可能なコポリマーおよびホモポリマーについてもまた記載される。
【０１０６】
架橋物質
任意に、かつ好ましくは、無毒性の架橋物質はトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）を含んでなり、このトランスグルタミナーゼは、例えば任意に微生物性トランスグルタミナーゼであってよい、カルシウム依存性または非依存性であるいずれの型のトランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）を任意に含んでなってよい。
【０１０７】
本発明の幾つかの実施形態によれば、１０％以上のｍＴＧを含む、新たに入手可能な市販のトランスグルタミナーゼ製品が用いられてよい。限定はされないが、この種の新たに入手可能な市販のトランスグルタミナーゼ製品の例は、味の素株式会社（川崎市、日本）およびＹｉｍｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（中国）により生産されるものを含む。限定はされないが、この会社からのこのような製品の例はＡｃｔｉｖａ  ＴＧ−成分：ｍＴＧ（１０％）およびマルトデキストリン（９０％）；活性：８１０〜１，３５０Ｕ／ｇのＡｃｔｉｖａである。限定はされないが、Ｙｉｍｉｎｇからのこのような製品の例は、１０％ｍＴＧおよび９０％マルトデキストリンを含む一製品、および１０％ｍＴＧおよび９０％ラクトースを含む一製品を含み、また活性は８１０〜１，３５０Ｕ／ｇの製品である。限定はされないが、Ｙｉｍｉｎｇからのこのような製品のその他の例は、３０％ｍＴＧおよび７０％マルトデキストリン（ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒａｎ）を含む一製品、および３０％ｍＴＧおよび７０％ラクトースを含む一製品を含み、両方とも活性は２，４３０〜４，０５０Ｕ／ｇの製品である。
【０１０８】
上に述べたように、架橋物質は好ましくはトランスグルタミナーゼを含んでなるが、加えて、本発明の幾つかの実施形態によるその他の型の架橋物質もまた含んでなってよい。
【０１０９】
限定はされないが、このような架橋剤の例は、Ｎ，Ｎ−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、ＥＤＣを伴うＮ−ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）のようなカルボジイミド、またはポリ（Ｌ−グルタミン酸）（ＰＬＧＡ）およびポリアクリル酸と共に用いるカルボジイミドを含む。別の実施形態によれば、このような架橋剤はチロシナーゼまたはキトサンを伴うチロシナーゼを含んでよい。別の実施形態によれば、架橋（重合）は紫外線またはγ線により光開始される。別の実施形態によれば、架橋剤はアルキレン、クエン酸（炭酸）、またはナノ−ヒドロキシアパタイト（ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔａｉｔｅ）（ｎ−ＨＡ）＋ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）を含んでよい。
【０１１０】
別の実施形態によれば、架橋剤は植物由来ポリフェノール、例えばコーヒー酸（３，４−ジヒドロキシ桂皮酸）のような水酸化桂皮酸、クロロゲン酸（好ましくはキナ酸エステル）、カフタル酸（好ましくは酒石酸エステル）、およびフラボノイド（すなわちケルセチンおよびルチンとして）である。別の実施形態によれば、さらなる架橋剤は酸化型の単糖または二糖、オキソラクトース、または糖鎖に基づくジアルデヒド（ガラクトヘキソジアルドース）（ＧＡＬＡ）である。別の実施形態によれば、ゲニピンもしくはその他のイリドイドグリコシド誘導体、またはセコイリドイド類、好ましくはオレウロペイン（ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ）が架橋剤を構成する。別の実施形態によれば、架橋剤はチオール反応性ポリ（エチレングリコール）である。別の実施形態によれば、架橋剤はデキストラン、酸化型デキストラン、デキストランジアルデヒドである。別の実施形態によれば、架橋剤はラッカーゼまたはビリルビンオキシダーゼのようなマルチ銅オキシダーゼである。
【０１１１】
実例となる組成物
上記の架橋基質および架橋物質は、本発明に従う様々な組成物を形成するため、一以上のさらなる物質と任意に組み合わせてよい。幾つかの実施形態によれば、接着物質は任意に、かつ好ましく、（ｉ）ゼラチン；（ｉｉ）トランスグルタミナーゼを含んでなる。さらに好ましくは、ゼラチンおよびトランスグルタミナーゼは、シーリング、止血剤として有用であるために十分な量において提供される。
【０１１２】
加えて、止血製品には一以上の補助剤もまた含まれてよく、これらは例えば増殖因子のような薬物、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、およびその他の化合物である。限定はされないが、このような補助剤の実例は、テトラサイクリンおよびシプロフロキサシン、アモキシシリン、およびメトロニダゾールのような抗生物質；活性化プロテインＣ、ヘパリン、プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）、プロスタグランジン、ロイコトリエン、抗トランスグルタミナーゼＩＩＩ、ＡＤＰアーゼ、およびプラスミノーゲン活性化因子のような抗凝固剤；デキサメタゾンのようなステロイド、炎症を抑制するためのプロスタサイクリン、プロスタグランジン、ロイコトリエンおよび／またはキニンの阻害薬；カルシウムチャネル遮断薬、血管拡張薬および血管収縮薬のような心血管系薬剤；化学誘引物質；ブピバカインのような局所麻酔薬；および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、タキソールおよび／またはタキソテールのような抗増殖／抗腫瘍薬剤；ガンシクロビル、ジドブジン、アマンタジン、ビダラビン、リバビリン、トリフルリジン、アシクロビル、ジデオキシウリジンのような抗ウィルス薬、およびウィルス成分または遺伝子産物に対する抗体；アルファ−またはベータ−またはガンマ−インターフェロン、アルファ−またはベータ−腫瘍壊死因子のようなサイトカイン、およびインターロイキン；コロニー刺激因子；エリスロポエチン；ジフルカン、ケトコナゾール、およびニスタチンのような抗真菌薬；ペンタミジンのような抗寄生虫薬；アルファ−１−アンチトリプシンおよびアルファ−１−アンチキモトリプシンのような抗炎症薬；ブピバカインのような麻酔薬；鎮痛薬；消毒剤；およびホルモンを含む。限定はされないが、その他の実例となる補助剤はビタミンおよびその他の栄養補助剤；糖タンパク質；フィブロネクチン；ペプチドおよびタンパク質；炭水化物（単純および／または複合の両方）；プロテオグリカン；抗アンジオゲニン；抗原；脂質またはリポソーム；およびオリゴヌクレオチド（センスおよび／またはアンチセンスＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を含む。
【０１１３】
緩衝液の選択
２００７年１２月１７日に提出されたＰＣＴ国際公開第２００８／０７６４０７号には、架橋可能なタンパク質としてゼラチン、および無毒性の架橋物質として微生物性トランスグルタミナーゼを含んでなる組成物が開示され、ここではゼラチンおよびｍＴＧの両方を溶解するための好ましい溶媒としてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が用いられる。しかしながら、ＰＢＳは、ｍＴＧにより促進されるゼラチンの架橋の速度を低下させることが見出された。一つの仮説に限定しようとするものではないが、緩衝液中のリン酸分子がｍＴＧ酵素の架橋活性を減少させることが示唆される。従って、ゼラチンおよびｍＴＧ溶液両方の緩衝液としての使用には、リン酸を含まない緩衝液がさらに効果的であると判定された。
【０１１４】
限定はされないが、本発明における使用に適した非リン酸緩衝液の例は、酢酸緩衝液（例えば酢酸ナトリウム）、クエン酸緩衝液（例えばクエン酸ナトリウム）、コハク酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン（トリス）、３−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（トリシン）、２−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ジメチルアルシン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、および２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）を含む。
【０１１５】
任意に、かつ好ましくは、一以上のカルボキシル基を含んでなる緩衝液が用いられる。さらに好ましくは、緩衝液は酢酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムを含んでなる。さらに好ましくは、タンパク質またはポリペプチドのための緩衝液として酢酸ナトリウムが用いられ、架橋物質のための緩衝液としてクエン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウムが用いられる。
【０１１６】
任意に、かつ好ましくは、緩衝溶液は約０．０１ないし約０．６Ｍの範囲の濃度である。さらに好ましくは、タンパク質またはポリペプチドのための緩衝溶液は約０．０５ないし約０．１５Ｍの範囲の濃度であり、最も好ましくは約０．１Ｍの濃度である。さらに好ましくは、架橋物質のための緩衝溶液は約０．１ないし約０．５Ｍの範囲の濃度である。以下の限定されない実例に関して、これらの濃度の利点が記載される。
【０１１７】
一つの仮説に限定しようとするものではないが、以下の限定されない実例に関して記載されるように、酢酸ナトリウム緩衝液はｍＴＧにより触媒されるタンパク質の架橋を促進すると信じられている。
【０１１８】
一つの仮説に限定しようとするものではないが、酢酸ナトリウム緩衝液は、タンパク質／ポリペプチド溶液へ架橋剤と共に加えた場合、架橋組成物の力学的および生体適合的な特性を改善すると信じられている。この効果については、以下にさらに詳しく記載される。
【０１１９】
驚くべきことに、単一の組成物中でタンパク質／ポリペプチド溶液による酢酸ナトリウム緩衝液と架橋剤溶液によるクエン酸ナトリウム緩衝液を共に使用することにより、いずれの反応の不適切な阻害、またはいずれの不適切なさらなる反応の発生なしに、それぞれの型の緩衝液を使用する利点（すなわち架橋の促進および力学的特性の改善）が同時に達成され得ることが見出された。このアプローチの実行の成功は、以下の限定されない実例に関して記載される。
【０１２０】
緩衝液のｐＨ
２００７年１２月１７日に提出されたＰＣＴ国際公開第２００８／０７６４０７号には、好ましい実施形態に従い、溶液中のゼラチンの溶解度を増大させるため、通常のゼラチンの一般的な等イオンｐＨ値の範囲外である約１．５ないし約５．０、または約７．０ないし約９．０の範囲の値に調整される緩衝液のｐＨについてさらに開示される。ＰＣＴ出願の教示によれば、製品のｐＨが等イオンｐＨから遠いほど、ゼラチンの溶解度は良くなり得る。以下に広く詳細が記載されるように、トランスグルタミナーゼについては、ｐＨ６．０あたりの範囲にあるｐＨ値が最も効果的であることが見出された。
【０１２１】
しかしながら、生存している生命体内で使用する組成物のための許容される実践に従うと、ゼラチンは、等イオンゼラチン溶液のｐＨ範囲を包含する範囲であるｐＨ５．５〜９．０に緩衝された水性溶媒中で溶解されなければならない。
【０１２２】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ゼラチン溶液のｐＨは任意に、かつ好ましく、ｍＴＧがその酵素活性の８０％より多くを保持するｐＨレベルの範囲内に入るように調整される。現在知られているｍＴＧの種に関しては、この範囲は約５ないし約８である（Ａｃｔｉｖａ（登録商標）一般情報、Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  ＬＬＣ）。
【０１２３】
ｍＴＧにより促進されるゼラチンの架橋はＮＨ３を産物として放出し、これが架橋過程の間に局所的な環境のｐＨを上昇させることから、高いｍＴＧ活性を示すｐＨ範囲の低い部分が好ましい。一つの仮説に限定しようとするものではないが、最初の溶液ｐＨが、高いｍＴＧ活性を示すｐＨ範囲の低い部分である場合、タンパク質架橋の間に起こるＮＨ３の放出は、局所的なｐＨを高いｍＴＧ活性を示すｐＨ範囲を超えて直ちに上昇させず、ｍＴＧは高い活性レベルで持続的に機能し得る。従って、好ましくは、ゼラチン溶液成分のｐＨは約５ないし約８、さらに好ましくは約６ないし約７の範囲のｐＨに調整される。最も好ましくは、ゼラチン溶液成分のｐＨは、未精製のトランスグルタミナーゼの活性に至的なｐＨである、約６のｐＨに調整される。
【０１２４】
ｐＨは、ｐＨ調整剤、またはその他のいずれの公知の方法を用いて調整できる。限定しようとするものではないが、例えばこのような方法の一つは、緩衝塩の溶解した溶液を、溶液ｐＨが望まれるｐＨレベルに達するまで氷酢酸により滴定することを含む。ｐＨ調整後、溶液を容積測定用の瓶に移し、望まれる緩衝溶液量および対応する緩衝濃度に達するまで再蒸留水を加える。
【０１２５】
カルシウムおよび尿素の添加
２００７年１２月１７日に提出されたＰＣＴ国際公開第２００８／０７６４０７号には、ゼラチン溶液への塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の添加が、ゼラチンの転移点を実質的に低下させることについて開示される。２Ｍ塩化カルシウム緩衝液中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液は、操作される室温において液体にとどまるのに十分な、２２℃未満の転移点を有する。しかしながら、ｍＴＧにより促進されるゼラチンの架橋は、このような高ＣａＣｌ２環境で大きく阻害され、ゲラチンゲルの硬化に必要とされる時間を大きく延長させる。さらに、このような環境でｍＴＧ架橋からもたらされた架橋ゼラチン産物は、低ＣａＣｌ２環境でのｍＴＧ架橋からもたらされた架橋ゼラチン産物よりも力学的特性は劣っている。
【０１２６】
驚くべきことに本発明者らは、塩化カルシウムと尿素が、ゼラチン溶液の転移点の低下における相乗的な効果を有することを見出した。塩化カルシウムと尿素の両方が適切な濃度で緩衝溶液中に取り込まれ、この緩衝溶液中にゼラチン（２５％、タイプＡ、３００ブルーム、ブタ）が溶解されるとき、ゼラチン溶液の転移点を操作される室温（１８〜２２℃）未満に低下させることができる。この相乗的な溶液に必要とされる尿素および塩化カルシウムそれぞれの濃度は、ゼラチン溶液の転移点を低下させるためにこれらの物質のうち一つのみが用いられた場合に必要とされる濃度よりもかなり低い。例えば、ゼラチンを２ＭのＣａＣｌ２溶液に溶解させる代わりに、ゼラチンを２Ｍの尿素を含む１ＭのＣａＣｌ２溶液、または３Ｍの尿素を含む０．５ＭのＣａＣｌ２溶液に溶解させることにより、同等な転移点の低下を達成することができる。この効果の実験的な実施例は、以下の限定されない実例に関して記載される。
【０１２７】
ＣａＣｌ２が存在しない場合、ゼラチン溶液の転移点を同等に低下させるためには４〜４．５Ｍの尿素溶液が必要とされる。多くの場合、この転移点を低下させるための相乗的な溶液が用いられると、ｍＴＧによる架橋からもたらされる架橋ゼラチンゲルの力学的特性（凝集強度、接着強度、および弾性）は改善される。
【０１２８】
本発明の別の実施形態によれば、ＣａＣｌ２の代替物として、またはＣａＣｌ２に加えて、異なったカルシウム化合物が用いられる。その他のカルシウム化合物の例は、水酸化カルシウムおよび炭酸カルシウムである。次にｍＴＧを用いて架橋されるゼラチン溶液の転移点を低下させるための水酸化カルシウムの使用は、以下の限定されない実例に関して記載される。
【０１２９】
別の実施形態によれば、カルシウム化合物の代替物として、またはカルシウム化合物に加えて、異なった二価の陽イオンを取り込む化合物が用いられる。限定はされないが、適切な二価化合物の例は塩化マグネシウムである。
【０１３０】
トランスグルタミナーゼ濃度
溶液の転移点を低下させるためのゼラチン溶液への塩化カルシウムおよび／または尿素の添加は、上記の低濃度であっても、ｍＴＧにより促進される架橋における阻害効果を有し、これによって、止血、組織シーリング、組織接着、およびその他の創傷処置応用に望まれる熱非可逆的なゼラチンゲル化の硬化は遅くなる。尿素またはＣａＣｌ２の添加によりもたらされる、ｍＴＧにより促進されるタンパク質架橋時間の延長は、上記の医学応用のためのタンパク質ｍＴＧ架橋の有用性を減少させ得る。
【０１３１】
本発明者らは、ｍＴＧ架橋反応を開始させるためにタンパク質溶液と混合されるｍＴＧ溶液中のｍＴＧ濃度を増大させることにより、ｍＴＧにより促進されるタンパク質架橋の反応速度率を増加できることを見出した。本発明の幾つかの実施形態による、溶液中のｍＴＧ濃度を増大させるための材料および方法は、市販の濃縮ｍＴＧ混合物の使用、増量剤からのｍＴＧ溶液の精製、および濾過技術を用いるｍＴＧ溶液の濃縮を含む。これらの方法および材料の使用を通し、ｍＴＧ溶液中のｍＴＧのタンパク質濃度を約２％ｗ／ｗの濃度まで増大することができる（１０重量％であるｍＴＧ製品、例えばＡＣＴＩＶＡ  ＴＧの２０％ｗ／ｗ溶液）。
【０１３２】
幾つかの実施形態によれば、ゼラチン溶液の転移点を低下させるため、尿素および／またはＣａＣｌ２をゼラチン溶液緩衝液に加えるとき、対応するｍＴＧ溶液の好ましいタンパク質濃度はｍＴＧ溶液総量の約０．１％ないし約２％ｗ／ｗの範囲内である。さらに好ましくは、ｍＴＧ溶液の濃度は、ｍＴＧ溶液総量の約０．２５％ないし約１％ｗ／ｗの範囲内である。最も好ましくは、ｍＴＧ溶液の濃度は、ｍＴＧ溶液総量の約０．４％ないし約０．８％ｗ／ｗの範囲内である。
【０１３３】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ｍＴＧ溶液はゼラチン溶液と共に、１：０．５ないし１：８、ｍＴＧ溶液：ゼラチン溶液の範囲の容積比において十分に混合される。好ましくは、容積比は１：１ないし１：４、ｍＴＧ溶液：ゼラチン溶液の範囲；さらに好ましくは、容積比は１：１ないし１：２、ｍＴＧ溶液：ゼラチン溶液の範囲である。
【０１３４】
これらの容積測定比およびｍＴＧ濃度をまとめて本発明の実施形態が記載され、ここで組成物全体中のｍＴＧのタンパク質濃度は、約０．０１％ないし約１．３５％ｗ／ｗの範囲内、好ましくは約０．０５％ないし約０．５％ｗ／ｗの範囲内、さらに好ましくは約０．１％ないし約０．４％ｗ／ｗの範囲内である。
【０１３５】
本発明の幾つかの実施形態によれば、組成物全体中の酵素活性は、グラムあたり約１ないし約１８０酵素単位（ＥＵ）の範囲内、好ましくは約４ないし約７０ＥＵ／ｇの範囲内、さらに好ましくは約１０ないし約５５ＥＵ／ｇの範囲内である。
【０１３６】
カルシウム金属イオン封鎖剤
上で考察したように、ＣａＣｌ２は架橋可能なタンパク質またはポリペプチドを含んでなる溶液の転移点の低下において非常に有用であるが、これが架橋ゼラチン溶液中に存在すると有害な効果がある。このように、医学的および外科的シーラントならびに止血応用における使用のための組成物の開発では、一旦架橋が起こった後にＣａＣｌ２の効果を中和する方法が非常に有用となるであろう。
【０１３７】
本発明の幾つかの実施形態によれば、止血または体液シーリング組成物はカルシウム結合剤を含んでなる。溶液が架橋物質を含んでなり、かつＣａＣｌ２を含む架橋可能なタンパク質の溶液中に少なくとも一のカルシウム結合剤が混合される場合、カルシウム結合剤はカルシウム分子に付着して、止血または体液シーリング組成物におけるその負の効果を減少させる。本発明の文脈内での「カルシウム結合剤」との語は、「カルシウム金属イオン封鎖剤」、「カルシウムキレート剤」、「カルシウムキレーター」、「カルシウム錯化剤」との語に同義である。
【０１３８】
さらに驚くべきことに、本発明の発明者らにより、ゼラチンのような架橋可能なタンパク質の溶液へのカルシウム結合剤の添加が、溶液中のカルシウムの中和の他にさらなる効果を有することが見出された。このような薬剤をゼラチン溶液に添加した際、ゼラチン溶液は物理的な熱可逆的ゲル化を起こす。このゲル化過程の速度は、ゼラチン溶液に加えた溶液中のカルシウム結合剤の濃度に依存する。好ましくは、ｍＴＧ溶液中のカルシウム結合剤の濃度は約０．１ないし約０．５Ｍの範囲内である。さらに好ましくは、濃度範囲は約０．２５ないし約０．５Ｍである。０．５Ｍを超える濃度では、特定のカルシウム結合剤により促進される熱可逆的ゲル化が十分迅速に起こる可能性があり、このためｍＴＧにより促進される架橋が大幅に妨げられる。
【０１３９】
ゼラチン溶液へのカルシウム結合剤を含む溶液の添加により誘発される熱可逆的ゲル化は、周囲温度では熱可逆的ゲルを形成しないゼラチン溶液を用いたとしても起こる。これらの型のゼラチン溶液は、ゼラチン溶液の転移点を、室温での操作において液体にとどめるために十分に低い１８〜２２℃未満に低下させる量の尿素および／またはＣａＣｌ２を含む、上記のものを含む。
【０１４０】
ゼラチン溶液へのカルシウム結合剤の添加により形成される熱可逆的ゼラチンゲルは、ゼラチンゲルをそのゾル−ゲル転移点未満の温度に至らせる際に形成される熱可逆的ゲルとは明確に異なる。温度の低下により誘発されるゲル化過程は、ゼラチン溶液が低い熱伝導率を有し、かつゼラチン溶液全体の温度がそのゾル−ゲル転移点未満の温度に降下するまで非常に長い時間を要することから、一般には漸進的過程である。ゼラチン溶液から形成されたゲルは透明かつ堅固である。カルシウム結合剤により誘発されるゲル化過程は、十分な量の薬剤が添加された場合、ほとんとすぐに起こり得る。形成されたゲルは不透明な白色であり、かつ非常に伸縮性がある。さらに、カルシウム結合剤によるゲル化から得られたゲルは、そのおおよそのゾル−ゲル転移点であり、３００ブルームゼラチンから得られたゲルのゾル−ゲル転移点よりも著しく高い、４０℃を超える温度においてのみ溶液に戻る。
【０１４１】
一つの仮説に限定しようとするものではないが、クエン酸塩、ＥＤＴＡ、およびカルゴンのような特定のカルシウム金属イオン封鎖剤の添加により誘発される熱可逆的な物理的ゲル化の機構は、これらの薬剤が陰性に荷電したポリアニオンであり、タイプＡゼラチンがｐＨ６．０の溶液中で陽性に荷電することを意味する７〜９の等電点を有することから（以下の参照実施例に示すように）、イオン性の架橋に由来する可能性がある。陰性に荷電したゼラチン溶液中に添加された、陰性に荷電したポリアニオンは、イオン性の架橋を起こし得る。
【０１４２】
本発明の別の任意の実施形態によれば、組成物にイオン性の架橋を導入するため、単一または複数のカルシウム金属イオン封鎖剤に加えて、またはそれらの代替として、カルシウム金属イオン封鎖剤以外の陰性に荷電したポリアニオンが用いられる。
【０１４３】
ゼラチンまたは関連する架橋可能なタンパク質の溶液への、カルシウム結合剤の添加を通して誘発できる熱可逆的ゲル化は、医学および外科的応用のためのｍＴＧにより促進される架橋タンパク質ゲル組成物の改良に大きな利点を有する。このことは特に、室温での操作において液体にとどまるために十分に低い１８〜２２℃未満のゾル−ゲル転移点を持つゼラチン溶液、例えば必要な量の尿素および／またはＣａＣｌ２を含むものから作られた架橋ゲルに関して真である。転移点を低下させる添加剤を含むゼラチン溶液から作られた架橋ゲルの弾性および凝集性は、このゲルが、次に通常ゼラチン溶液中に起こってゼラチンゲルを弾性および凝集性にする物理的、熱可逆的なゲル化を欠いていることから、減少している。弾性および凝集性の減少は、これらのゲルが組織シーラント、止血、または創傷閉鎖への応用に使用される際、ゲルが一旦創傷部位の上に置かれると、亀裂、および液体によるゲルの突破を許すことなしに血液またはその他の体液の流れに抵抗することが困難になるため、これらのゲルを著しく害する。しかしながら、架橋促進のためゼラチン溶液と混合されたｍＴＧ溶液にカルシウム結合剤が添加される場合、ゼラチン溶液は次に、ｍＴＧにより促進される架橋を起こすのと同時に物理的、熱可逆的なゲル化もまた起こし得る。本発明のこの実施形態に有用なカルシウム結合剤の濃度は、任意に、かつ好ましくは、ｍＴＧにより促進される架橋が起こるために必要な時間内に、それ自体では熱可逆的ゲル化をもたらし得ない量である。非常に多量のカルシウム結合剤が添加された場合、その後熱可逆的ゲル化が直ちに起こり、ｍＴＧにより促進される架橋は全く起こらないであろう。
【０１４４】
カルシウム結合剤により誘発される熱可逆的ゲル化は、カルシウムまたはカルシウムを含む分子が溶液の一部として含まれるゼラチン溶液、および、カルシウムまたはカルシウムを含む分子が含まれないゼラチン溶液の両方に起こる。いずれのカルシウムも含まないゼラチン溶液では、カルシウム結合剤の添加は、熱可逆的ゲル化効果の誘発のみにおいて有用である。単一または大きめの分子のいずれかであるカルシウムを含むゼラチン溶液では、カルシウム結合剤は、カルシウムの有害な効果の減少、および熱可逆的ゲル化効果の誘発の両方に有用である。架橋タンパク質／ポリペプチド組成物におけるカルシウムの有害な効果は、劣った力学的特性、特に脆弱性の増大および凝集強度の減少を含み得る。加えて、カルシウムがその毒性閾値を超える高濃度で存在する場合、有害な組織反応をもたらし得る。
【０１４５】
限定はされないが、本発明の文脈内で有用なカルシウム結合剤の例は、ポリリン酸塩、例えばピロリン酸塩（ピロリン酸四ナトリウム、ピロリン酸二水素二ナトリウム、ピロリン酸四カリウム、ピロリン酸二水素二カリウム、およびピロリン酸二ナトリウム二カリウムを含む）、トリポリリン酸塩（トリポリリン酸五ナトリウム、およびトリポリリン酸五カリウムを含む）、高次ポリリン酸塩、例えば四リン酸ナトリウムおよびカリウム、および「ガラス状リン酸塩（ｇｌａｓｓｙ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）」または「ポリピロリン酸塩」としても知られるヘキサメタリン酸塩、ならびにカルボン酸塩（例えば、アルカリ金属クエン酸塩、アルカリ金属酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、およびリンゴ酸塩、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のアルカリ金属塩、およびエチドロン酸）を含む。
【０１４６】
適切なカルシウム結合剤の好ましい例は、ＥＤＴＡおよびクエン酸ナトリウムを含む。
【０１４７】
ｍＴＧ溶液にＥＤＴＡまたはクエン酸ナトリウムを様々な濃度で加えた、ｍＴＧにより促進されるゼラチン溶液の架橋について述べる実験的実施例は、以下の限定されない実例に関して記載される。
【０１４８】
本発明の文脈内で有用なポリリン酸塩の好ましい例は、カルゴン（商標）の商業名で市販されているヘキサメタリン酸ナトリウム（ＳＨＭＰ）の粉末である。カルゴンは水中で周囲のカルシウムイオンと共に複合体を形成する。カルゴンは、本発明の一部として使用した場合、カルシウムを含むゼラチン溶液中に導入した際に、その他のカルシウム結合剤と同様の効果を有した。カルシウムを含まないゼラチン溶液中に導入した際に、カルゴンはその他のカルシウム結合剤のように同様の熱可逆的ゲル化過程を誘発したが、ｍＴＧにより促進されるゼラチンゲルの架橋時間の減少というさらなる利点もまた有した。カルゴンを含んで作られたゲルは、その他のカルシウム結合剤を含んで作られたゲルよりもさらに接着性であることもまた観察された。
【０１４９】
尿素金属イオン封鎖剤および尿素加水分解剤
上で考察したように、尿素がゼラチン溶液へ、その転移点を有意に低下させるように添加されてよい。このことは、室内環境で操作するゼラチン−ｍＴＧ組成物の使用の単純化における大きな利点である。しかしながら、高濃度の尿素存在下で形成された架橋ゼラチンゲルは、それが高い浸透圧を持ち、体内の天然組織に移植した際に周囲組織から水分を引き出すことから、特定の応用のためには理想的でない。
【０１５０】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ゼラチン溶液中の尿素の効果は、例えば尿素錯化剤または尿素金属イオン封鎖剤を必要に応じて活性化剤と共に、ゼラチン−ｍＴＧ組成物を形成するためにゼラチン溶液に混合されるｍＴＧ溶液中に含ませることによって中和される。加えて、尿素の加水分解を触媒する薬剤を、同様の効果によりｍＴＧ溶液中に含ませることができる。ｍＴＧ溶液がゼラチン溶液中に混合されたとき、尿素金属イオン封鎖剤または尿素加水分解剤は、ゼラチン溶液中で速やかに尿素と反応し、ゼラチン−ｍＴＧ組成物におけるその潜在的に望ましくない効果を中和、または減少させる。尿素金属イオン封鎖剤または尿素加水分解剤は任意に、ゼラチン−ｍＴＧ組成物の力学的特性における正の効果を持ち得り、組成物の接着強度、凝集強度、および／または弾性を増大し得る（閉じたリストを提供しようとするものではなく、また一つの仮説に限定しようとするものでもない）。
【０１５１】
限定はされないが、尿素の加水分解を触媒するための有用な薬剤の例は、尿素の二酸化炭素およびアンモニアへの加水分解を触媒する市販の酵素であるウレアーゼである。ウレアーゼは、多くの細菌、酵母の幾つかの種、および高等植物の幾つかに発生する。実例となる二つの源は、ここから結晶化され、十分に研究されたタチナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）およびバチルス・パスツーリ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉｉ）である。
【０１５２】
ウレアーゼは、好ましくは約０．１Ｍから、ゼラチン−ｍＴＧ組成物を形成するためにｍＴＧ溶液が添加され得る対応するゼラチン溶液中の尿素のモル濃度の約２倍の範囲の濃度において、最大は溶液中のウレアーゼの飽和点まで、ｍＴＧ溶液中に含まれる。例えば、ゼラチン緩衝液に１Ｍの尿素が含まれる場合、ウレアーゼの最大の好ましい濃度は２Ｍである。この好ましい濃度は、本明細書中に記載されるゼラチン−ｍＴＧ組成物において好ましい、１：２、ｍＴＧ溶液：ゼラチン溶液の比に関し、全ての尿素分子に対してウレアーゼ一分子が見込まれる。
【０１５３】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ウレアーゼはｍＴＧ溶液中にウレアーゼ安定剤と共に含まれる。限定はされないが、このような安定剤の例は、ｍＴＧ緩衝溶液中、約１Ｍないし約３Ｍの濃度のＥＤＴＡ、またはおおよそ５０％ｖ／ｖの濃度のグリセロールである。さらなる例は、米国特許第４，１８８，４６５号に記載されるように、グルタチオンおよびクエン酸塩を含む。
【０１５４】
限定はされないが、尿素−錯化剤の例は、低分子量アルコールおよびケトンのような活性化剤の存在下に尿素と錯体を形成するパラフィンである。このような過程は、米国特許第２，７１９，１４５号に記載される。
【０１５５】
可塑剤
本発明の幾つかの実施形態は、組成物の架橋可能なタンパク質成分よりも、架橋物質の溶液へのソルビトールの添加を含んでなる。
【０１５６】
驚くべきことに、以下に広く詳細が記載されるように、ｍＴＧ溶液に含まれるソルビトールは、ゼラチン架橋の開始前に、ゼラチン溶液と予想外に結合できることが見出された。ソルビトールは、ゼラチン溶液と混合する前にｍＴＧ溶液に添加された場合、ゼラチン−ｍＴＧ組成物の柔軟性および弾性を増大させる。このような増大した柔軟性および弾性は、組成物の特定の応用または使用の改善された特性を任意に表し得る。さらに、ソルビトールはｍＴＧの担体分子として作用することができ、これを酸化から保護してｍＴＧ溶液の有効期間を延長させる。
【０１５７】
ｍＴＧ溶液中に含まれてはいるが、添加するソルビトールの好ましい濃度は、特定のｍＴＧ溶液に対応するゼラチン溶液中のゼラチンの量を参照して好ましく決定される。対応するゼラチン溶液中のゼラチンの量の重量比として表現される、可塑剤の好ましい濃度は、１：１ないし３：１の範囲である。この範囲内で溶液に添加される可塑剤の量は、ゼラチン溶液の架橋時間において有意な効果を持たない。
【０１５８】
上で考察したように、ｍＴＧにより促進された架橋ゼラチン組成物の特性は、ｍＴＧ溶液に使用した緩衝液に依存して変更できる。例えば、クエン酸ナトリウム緩衝液が用いられる場合、ソルビトールを含むゼラチン−ｍＴＧ組成物は非常に柔軟である。酢酸ナトリウム緩衝液が用いられる場合、丈夫なゼラチンゲルを形成するために必要とされる架橋時間は大きく短縮される。クエン酸ナトリウムおよび酢酸ナトリウム緩衝溶液の両方により、ゼラチン−ｍＴＧ組成物は、ソルビトールの存在下ではソルビトールの非存在下よりもはるかに弾性および柔軟性を持つ。
【０１５９】
クエン酸ナトリウム緩衝液により作られたｍＴＧ溶液へのソルビトールの添加は、以下の限定されない実例に関して記載される。この実験的実施例の実験データは、ソルビトールが、クエン酸ナトリウム緩衝液中でｍＴＧにより作られたゲルの柔軟性をさらに増大することを確認する。
【０１６０】
以下に広く詳細が記載されるように、ソルビトールがｍＴＧ溶液に含まれる場合のｍＴＧにより促進されるゼラチンゲルの架橋は、ｍＴＧ溶液に酢酸ナトリウムが緩衝液として用いられるとき、クエン酸ナトリウムを緩衝液として用いて作られたゲルに比較して、さらに速い速度である。
【０１６１】
限定はされないが、本発明の文脈内で使用されてよい可塑剤のさらなる例は、クエン酸アルキルエステル、グリセロール、グリセロールエステル、フタル酸アルキルエステル、セバシン酸アルキルエステル、ショ糖エステル、ソルビタンエステル、アセチル化モノグリセリド、グリセロール、脂肪酸エステル、グリコール、プロピレングリコール、ラウリン酸、ショ糖、グリセリルトリアセテート、ポロクサマー、フタル酸ジエチル、食用の脂肪または油のモノ−およびジ−グリセリド、フタル酸ジブチル、セバシン酸ジブチル、ポリソルベート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２００ないし２０，０００、Ｃａｒｂｏｗａｘポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アラビアゴム、グアーガム、キサンタンガム、プラスドン（登録商標）（ポリビニルピロリドン）、マンニトール、およびそれらの混合物を含む。
【０１６２】
アラビアゴム、グアーガム、ＰＶＡ、ＰＥＧ６０００、およびプラスドンは、ｍＴＧ架橋ゼラチン組成物の柔軟性を増大させることが示された。好ましくは、本発明の可塑剤はソルビトール、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、またはアラビアゴムのうち一以上を含んでなるが、本明細書中に記載されるように、その他の有用な可塑剤もまた本発明の実施形態内に包含される。
【０１６３】
コスモトロープおよび／またはオスモライト
コスモトロープは、水溶液中のタンパク質周囲の溶媒和層における水分子の配列を増加させる物質であり、結果として：
・水溶液中での高分子およびタンパク質を安定化させる
・疎水性効果、分子間相互作用、およびタンパク質の凝集を増大させる。
【０１６４】
生体分子におけるコスモトロープの効果は、通常、尿素および塩化グアニジウム（ＧｕＣｌ）のようなカオトロープのそれとは反対である。カオトロープは水の構造を破壊し、結果として、タンパク質−タンパク質相互作用を犠牲にして水とタンパク質の間に新しい水素結合が形成され：
・凝集物の可溶化
・タンパク質の内部疎水領域を溶液へ暴露することによる球状タンパク質のアンフォールディング
がもたらされる。
【０１６５】
上記のように、尿素およびＧｕＣｌのようなカオトロープは、タンパク質／ポリペプチド鎖間の水素結合ネットワークを不安定化することによって、特定のタンパク質／ポリペプチド溶液の物理的ゲル化を破壊するために用いることができる。従って、これらのカオトロープは、これらの溶液のゾルからゲルへの転移温度を低下させる。
【０１６６】
しかしながらある状況においては、タンパク質／ポリペプチド溶液の物理的ゲル化の破壊は、架橋タンパク質組成物の力学的特性に有害な作用を持ち得る。例えば、物理的ゲル化はこのような組成物の弾性を増大させるために作用し得る。物理的ゲル化の破壊は、次にこれらの組成物の弾性を減少させ、特定の応用には望ましくない可能性のあるそれらの脆弱性を増大させる。
【０１６７】
架橋物質溶液にコスモトロープを取り込ませることにより、物理的ゲル化は、架橋物質により仲介されるゲル化と組み合わせて、好ましくはそれと同時に起こるように刺激でき、これによって物理的ゲル化の有益な力学的特性効果が維持される。
【０１６８】
本発明の幾つかの実施形態によれば、タンパク質／ポリペプチド溶液のゾル−ゲル転移点は低下し、一以上のコスモトロープが架橋物質または架橋物質溶液中に取り込まれる。
【０１６９】
好ましい実施形態によれば、タンパク質／ポリペプチド溶液中に、物理的ゲル化を起こすために十分な濃度のコスモトロープが添加される。
【０１７０】
限定はされないが、コスモトロープの濃度の範囲は、組み合わされた架橋タンパク質組成物の０．５〜１Ｍである。
【０１７１】
幾つかの実施形態によれば、コスモトロープはイオン性コスモトロープである。
【０１７２】
好ましい実施形態によれば、コスモトロープは非イオン性コスモトロープである。
【０１７３】
限定はされないが、非イオン性コスモトロープの例はプロリンおよびトレハロースである。
【０１７４】
限定はされないが、イオン性コスモトロープの例はトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）およびグルタミン酸塩（グルタミン酸）である。
【０１７５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのタンパク質の安定性におけるコスモトロープの安定化効果および尿素の中和作用は、そのオスモライトとしてのｉｎ  ｖｉｖｏでの機能に関連し得る。これらｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの機能の間のよい相関関係は、プロリンについて示されている（Ｆｉｓｈｅｒ  ＭＴ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  １０３，２００６：ｐ．１３２６５−６）。
【０１７６】
好ましい実施形態によれば、本発明における使用のためのコスモトロープはオスモライトである。
【０１７７】
限定はされないが、オスモライトの例はグルタミン酸塩またはプロリンである。
【０１７８】
架橋阻害剤
タンパク質／ポリペプチド溶液中の架橋密度が増大するに従い、架橋組成物の剛性も増大する。従って、架橋タンパク質組成物から柔軟性または弾性の増大が望まれる場合には、組成物中の架橋密度を制限することが有用となり得る。これを達成するための一様式は、組成物中に架橋阻害剤を導入することにより、タンパク質溶液中の架橋物質により触媒される架橋の量を減少させることである。
【０１７９】
本発明の実施形態によれば、架橋組成物の架橋レベルを低下させるように、タンパク質溶液または架橋剤溶液のいずれかに架橋阻害剤が添加される。
【０１８０】
本発明の好ましい実施形態によれば、架橋物質は酵素であり、阻害剤は酵素的阻害剤である。
【０１８１】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、架橋物質はトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）であり、阻害剤はトランスグルタミナーゼ阻害剤である。
【０１８２】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、架橋物質は微生物性トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）であり、阻害剤はｍＴＧ阻害剤である。
【０１８３】
限定はされないが、ｍＴＧ阻害剤の例は、シスタミン、ｍＴＧと共にジスルフィド橋を形成できる有機ジスルフィド、システイン、反応性Ｓ−Ｈ側鎖（チオール基）を有する疎水性アミノ酸、メラニン、変性剤、チオール基またはジスルフィド結合を有するその他の化合物、リジン、およびｍＴＧ基質を含む＜５ｋＤＡのサイズの化合物を含む。
【０１８４】
シスタミン、システイン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、およびメルカプトエタノールに存在するようなチオール側鎖は、それらがｍＴＧチオール基と反応することによりｍＴＧの活性位置を遮断できることから、阻害剤として役立つ。
【０１８５】
メラニンは競合的なｍＴＧ阻害剤としての機能を持つことが以前に記載されている（Ｉｋｕｒａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６（６），２００２，ｐ．１４１２−１４１４）。
【０１８６】
本発明の好ましい実施形態によれば、架橋活性の５０％未満までの阻害に十分な量の阻害剤が含まれる。さらに好ましい実施形態によれば、架橋活性の３０％未満までの阻害に十分な量が含まれる。
【０１８７】
本発明の別の実施形態によれば、阻害剤は架橋がすでに開始された後、組成物中に放出される。
【０１８８】
架橋可能なタンパク質／ポリペプチドのＰＥＧまたはＰＶＡコポリマー
幾つかの実施形態によれば、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）またはポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても知られるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、組成物の一以上の特性を改善するため、例えば（限定はされないが）組成物の柔軟性を増大させるため、またはタンパク質−架橋組成物に対する身体の免疫反応から遮蔽するために、タンパク質／ポリペプチドまたは架橋剤溶液にコポリマーとして添加される。ＰＥＧは３００Ｄａないし１０ＭＤａの広い範囲の分子量にわたって入手可能であり、分子量に依存して液体または低融点の固体であり得る。
【０１８９】
重合過程に使用する開始剤に依存して、異なった形の化学的に修飾されたＰＥＧもまた入手可能であり、それらの最も一般的なものは単官能基のメチルエーテルＰＥＧ（メトキシポリ（エチレングリコール））である。ＰＥＧはまた、異なった形状としても入手可能である。分岐ＰＥＧは、中央の中心基から生じる３ないし１０ＰＥＧ鎖を有する。星型ＰＥＧは、中央の中心基から生じる１０〜１００ＰＥＧ鎖を有する。櫛型ＰＥＧは、通常ポリマー骨格に接合する複数のＰＥＧ鎖を有する。これらのＰＥＧの型は全て、本発明において有用であるとみなされるべきである。
【０１９０】
ＰＥＧは、タンパク質−架橋剤組成物のタンパク質または架橋剤成分のいずれかに添加できる。ＰＥＧは、乾燥重量比２０：１ないし１：１、タンパク質：ＰＥＧにおいて優先的に添加される。ＰＥＧは、タンパク質もしくは架橋剤の修飾および／またはＰＥＧ分子の修飾を通して、タンパク質成分または架橋剤成分に添加できる。このような修飾の一例は、ＰＥＧ化として知られる過程であり、ＰＥＧ化はＰＥＧ構造を別のより大きな分子へ共有結合させる働きである。この過程は、タンパク質または架橋剤分子のいずれかにおいて行うことができる。
【０１９１】
ゼラチンＰＥＧ化の実施形態は、その多数の利点の中でも、限定しようとするものではないがＰＥＧがタンパク質鎖の一部であるという利点を持ち、それ故に、限定はされないが電荷および親水性、同様にそのかさばりによる立体効果を含むタンパク質表面特性の変化を誘導する。結果として、共有結合性に付着したＰＥＧは、タンパク質鎖間の分子間相互作用、順に物理的ゲル化および架橋剤に依存する架橋、同様にこれらの方法により調製されたゲルの力学的特性において著明な効果を持ち得る。
【０１９２】
ＰＥＧ化に用いられるＰＥＧ分子は、通常、それらが標的タンパク質上の官能基と自発的に反応するという意味において活性化されている。限定はされないが、ＰＥＧ化の例は、ＰＥＧのＮＨＳエステル誘導体を用いている。これらの活性化ＰＥＧ分子はタンパク質上の一級アミンと反応し、Ｎ−ヒドロキシ−サクシニミド（ＮＨＳ）を放出してアミド結合を形成する。
【０１９３】
タンパク質を修飾できるその他の方法は、リジンの内部鎖（ｉｎｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎｓ）およびタンパク質鎖のアミノ末端に見出される一級アミンを反応させることによる。修飾は、アルキル化、サクシニル化、カルバミル化、またはその他のいずれのタンパク質修飾の方法によってよい。
【０１９４】
好ましい実施形態によれば、架橋可能なタンパク質／ポリペプチドは最初に活性化ＰＥＧと反応してＰＥＧ化タンパク質を作る。ＰＥＧ化タンパク質は、限定はされないが透析、限外濾過、およびゲル濾過クロマトグラフィーのような方法により、過剰の未反応ＰＥＧおよびその他の反応産物から精製される。ＰＥＧ化タンパク質は、次に架橋剤と反応して架橋ゲルを形成できる。
【０１９５】
ＰＥＧはまた、アミン基を標的とする架橋剤に対する基質としての、ＰＥＧアミンの使用を通しても任意に添加できる。架橋剤はＰＥＧ分子を、その末端アミン基を通してタンパク質分子上の架橋剤基質へ架橋し、従ってこれはタンパク質上の天然アミン基と競合する。
【０１９６】
ＰＥＧアミンは、アミン官能基に結合したＰＥＧを含んでなる。これらのＰＥＧの形状の全ての型は市販されている。アミン官能ＰＥＧ製品の入手源は、ＮＯＦ（日本）、  Ｎａｎｏｃｓ（ニューヨーク、ニューヨーク州）、およびＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ロックフォード、イリノイ州）を含む。
【０１９７】
ＰＥＧ取り込みの全てのアプローチにおいては、架橋のために利用できる天然基質の数が減少することにより、架橋の減少がもたらされる。これは架橋ゲルの力学的特性に影響し得る、例えば任意に、それを硬さの少ないさらに柔軟なものにできる。加えて、かつ一つの仮説に限定しようとするものではないが、ＰＥＧ分子自体が可塑剤として作用し得り、得られるゲルの柔軟性にさらに貢献し得る。
【０１９８】
好ましい実施形態によれば、ＰＥＧアミンは活性リジンアミノ酸を含んでなる。
【０１９９】
本発明の別の実施形態によれば、タンパク質−架橋剤組成物の柔軟性または接着性を増大させるため、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が、コポリマーとしてゼラチンまたはｍＴＧ溶液に添加される。ＰＶＡは、高い引張強度および柔軟性を持つ水溶性の合成ポリマーである。体内のような高湿度環境では、ＰＶＡは水を吸収し得る。可塑剤として作用する水は、次にＰＶＡの引張強度を減少させるが、その伸長は増大させる。
【０２００】
幾つかの実施形態によれば、コポリマーはＰＶＡ−アミンを含んでなる。アミンを標的とする架橋剤が溶液に添加される際、タンパク質およびＰＶＡ−アミンの両方は基質として作用し得り、同程度の架橋タンパク質ポリマーよりも優れた柔軟性を持つタンパク質−ＰＶＡコポリマーが形成され得る。
【０２０１】
限定はされないが、ポリ（ビニルアルコール）のアミン官能誘導体を産生するために使用できる過程の例は、米国特許第６，１０７，４０１号に記載される。
【０２０２】
限定はされないが、ＰＶＡのアミンコポリマーを産生するために使用できる過程の別の例は、米国特許第４，９３１，５０１号に記載され、ここではポリ（ビニルアルコール）をアミノ−アルデヒドジアルキルアセタールと反応させる。
【０２０３】
異なった程度のアミン置換を持つＰＶＡを産生するための、カルボニルジイミダゾール活性化ジアミンを用いた二段階過程によるアミン修飾ポリ（ビニルアルコール）の合成過程もまた、別の限定されない例として以前に記載されている（Ｗｉｔｔｍａｎ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ａｎ  Ａｍｉｎｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１６  （６），１３９０−１３９８，２００５）。
【０２０４】
界面活性剤
本発明の幾つかの実施形態によれば、一以上の生体適合性の界面活性剤が、例えば溶液の表面張力を減少させるために、架橋可能なタンパク質またはポリペプチドの溶液に添加される。
【０２０５】
界面活性剤は液体の表面張力を低下させる湿潤剤であり、拡散を容易にして、二つの液体間の界面張力を低下させる。低い表面張力により、架橋可能なペプチド溶液はアプリケーターを容易に通過し、架橋物質溶液と容易に混合されることから、その取り扱いは容易になる。界面活性剤はまた、溶液の粘度も低下させられる。加えて、ゼラチン溶液の表面張力の低下は、ゼラチン溶液が単独またはｍＴＧ溶液と共に凍結乾燥される際に、乾燥ゼラチンの上層の膜形成を防止できることから有用性は大きい。このような膜は、凍結乾燥ゼラチンの均一な溶液への再構成を阻害する。
【０２０６】
限定はされないが、本発明の文脈内で有用な生体適合性界面活性剤の例は、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ（商標）２０）、ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル（Ｂｒｉｊ（商標）３５）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体（プルロニック（商標）Ｆ−６８）、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウレス硫酸ナトリウムまたはラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、ポロクサマーまたはポロキサミン、アルキルポリグルコシド、脂肪アルコール、脂肪酸塩、コカミドモノエタノールアミン、およびコカミドジエタノールアミンである。
【０２０７】
界面活性剤は、可塑剤としてもまた用いられてよい。例えばＴｗｅｅｎ８０は、幾つかの親水性ポリマーのガラス転移点（Ｔｇ）を低下させることが示されている。ポリマー内に、より小さな分子であるＴｗｅｅｎ８０が存在することにより、ポリマー鎖間の凝集性相互作用が希薄になり弱められると考えられている。このことは、ポリマーマトリックス内の自由になる体積を増大させることにより、摩擦およびもつれを減少させた（Ｇｈｅｂｒｅｍｅｓｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ３２８：１１９−１２９）。
【０２０８】
本発明の好ましい実施形態によれば、一以上の界面活性剤が、架橋組成物の弾性を改善するため、特に時間が経つと硬化することから、可塑剤として用いられる。
【０２０９】
別の任意の実施形態によれば、一以上の界面活性剤が、本発明に関連するものとして上に列挙された可塑剤のうちの別の可塑剤と組み合わせられる。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ（Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ３９（２００６）８４０−６）は、架橋されていない乾燥ゼラチン膜の弾性の増大における、可塑剤（グリセロール）と界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０、Ｓｐａｎ８０、レシチン）の間の相乗的効果について示した。
【０２１０】
界面活性剤はゼラチン溶液に、溶液中のゼラチンの乾燥重量の重量比０．１〜５％で優先的に添加される。あるいは、界面活性剤はゼラチン溶液に、溶液中の特定の界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）におおよそ等しい濃度で添加される。各界面活性剤のＣＭＣは異なり、かつ界面活性剤を溶解させる溶液のイオン濃度に依存する。
【０２１１】
組織基質の中和
本発明の幾つかの実施形態によれば、止血または体液シーリング組成物は、該組成物によりシールされ、付着され、またはその他の処置をされる組織基質上の表面物質の接着阻害効果を中和する、基質特異的結合剤をさらに含んでなる。例えばこれらの薬剤は、抗接着効果を持つ基質表面物質を結合、溶解、および／または分散することができる。
【０２１２】
好ましい実施形態によれば、本発明の組成物は、消化管（ＧＩＴ）または頬粘膜にあるような粘膜への接着を標的とする。
【０２１３】
腸のようなＧＩＴ内の組織はしばしば、持続的に産生される粘液で覆われる粘膜性である。粘液はそれ自体が常に補充されることから、ＧＩＴ組織への接着を成功させるには、粘膜層下の組織自体に特異的に接着する組成物が必要とされる。
【０２１４】
ＧＩＴの標的部位に特異的に接着させる一方法は、ＧＩＴの細胞表面に可逆的に結合できる粘膜接着剤を用いることによる。これらの粘膜接着剤は、分子が粘液自体よりも粘膜細胞表面へ強力かつ迅速に直接結合する、受容体−リガンド様の相互作用に基づくことから、大きな特異性によって機能する。
【０２１５】
限定はされないが、これらの独特な必要性を有する化合物の種類の例はレクチンである。レクチンはタンパク質または糖タンパク質であり、炭水化物へ特異的かつ可逆的に結合する一般的能力を共有する。これらは可溶型または細胞付着型のいずれかとして存在し、炭水化物選択的および認識部分を有する。腸上皮細胞は、膜アンカー複合糖質で構成される細胞表面を有する。これらの表面はレクチンの標的となり得ることから、腸送達の概念が可能となる（Ｓｈａｈ  ＫＵ，Ｒｏｃｃａ  ＪＧ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｔｅｃｈ．，２００４，４（５），１）。
【０２１６】
限定はされないが、粘膜接着性レクチンの例はトマトレクチン（ＴＬ）である。ＴＬのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合については広く研究され、小腸上皮へ選択的に結合することが示された（Ｌｅｈｒ  Ｃ，Ｂｏｕｗｓｔｒａ  ＪＡ，Ｋｏｋ  Ｗ，Ｎｏａｃｈ  ＡＢ，ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ＡＧ，Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ  ＨＥ．Ｐｈａｒｍａ  Ｒｅｓ．，１９９２，９（４），５４７−５３）。
【０２１７】
レクチンは、膜アンカー複合糖質を含む全ての粘膜組織表面への接着を改善するために有用である。限定はされないが、このような組織表面の例は、頬粘膜および腸壁である。
【０２１８】
限定はされないが、頬の粘膜接着を改善する化合物の例は、ポリ（アスパラギン酸）（ＰＡＡ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）モノエチルエーテルモノメタクリレートのコポリマー（ＰＡＡ−ｃｏ−ＰＥＧ）（ＰＥＧＭＭ）である（Ｓｈｏｊａｅｉ  ＡＭ，Ｌｉ  Ｘ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９７，４７，１５１−６１．２７）。好ましくは、ＰＥＧＭＭは、最も好ましい熱力学特性および最高の粘膜接着力を持つ１６モル％ＰＥＧＭＭである。
【０２１９】
本発明の幾つかの実施形態によれば、粘膜接着剤は市販の粘膜接着性ヒドロゲルである。限定はされないが、本明細書中に記載される新規組成物の基質特異的接着を改善するための使用に適したヒドロゲルの例は、商標名Ｃｏｒｐｌｅｘ（登録商標）（Ｃｏｒｉｕｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メンロパーク、カリフォルニア州）で市販されている。これらの接着性ヒドロゲルは、膜形成親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン（ＰＶＰ））と、その鎖末端に相補的な反応性水酸基を有する短鎖可塑剤（必然ではないが、典型的にはＰＥＧ）との非共有結合性（水素結合）架橋により調製される。
【０２２０】
限定はされないが、粘膜接着性化合物の別の例は一以上のチオール基を持つポリマーを含む。このようなポリマーでは、スルフヒドリル基の導入により粘膜接着性ポリマーの接着特性が増大する（Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ  Ａ，Ｓｃｈｗａｒｃｈ  Ｖ，Ｓｔｅｉｎｉｎｇｅｒ  Ｓ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１９９９，１６，６，８７６−８１．３２）。改善された接着は、ブタ小腸粘膜について示された。チオール化ポリマー（チオマー）もまた、強力な頬接着特性を示した（Ｌａｎｇｏｔｈ  Ｎ，Ｋａｌｂｅ  Ｊ，Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ  Ａ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，２００３，２５２，１４１−４８）。
【０２２１】
限定はされないが、頬接着剤の別の例はハケア由来の天然粘膜接着性ゴムである（Ａｌｕｒ  ＨＨ，Ｐａｔｈｅｒ  ＳＩ，Ｍｉｔｒａ  ＡＫ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＴＰ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１９９９，８８（１），１−１０）。
【０２２２】
酵素の精製および濃縮
本発明の幾つかの実施形態によれば、トランスグルタミナーゼ溶液には、全て閉じたリストに限定しようとするものではないが、１）トランスグルタミナーゼ混合物からの発酵残渣の除去；２）トランスグルタミナーゼ溶液中の活性トランスグルタミナーゼ量の濃縮；３）担体タンパク質または炭水化物からのトランスグルタミナーゼ溶液のさらなる精製；４）トランスグルタミナーゼ溶液のエンドトキシンレベルの低下；および／または５）トランスグルタミナーゼ溶液からの全ての微生物の除去、溶液の効果的な安定化、の一以上を実施するため、一段階または多段階の精製を行う。
【０２２３】
本発明は少なくとも幾つかの実施形態において、止血または体液シーリング組成物の調製方法をさらに提供し、該方法は、架橋可能なタンパク質またはポリペプチドの溶液を提供すること；架橋物質の溶液を提供すること；および架橋可能なタンパク質またはポリペプチドの溶液を架橋物質の溶液と混合することを含んでなる。
【０２２４】
幾つかの実施形態によれば、架橋物質の溶液は、架橋可能なタンパク質またはポリペプチドの溶液との混合の前に濾過される。
【０２２５】
本発明の好ましい実施形態によれば、濾過過程は、より微細な濾過工程を迅速に遮断し得る発酵残渣の大きな塊を除去するため、浄化としても知られる粗濾過を最初に使用する。限定はされないが、このような粗濾過の例は、約０．４５μｍ孔径による濾過および約０．６５μｍ孔径による濾過である。
【０２２６】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、架橋物質の溶液は、例えば物質のバイオバーデンをグラムあたり１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）未満に低下させ、医学的使用に適したものにするため、任意に、かつ好ましく孔径０．２２μｍ未満のフィルターを通す。好ましくは、バイオバーデンは実際には除外されて、約１０−２未満、さらに好ましくは１０−３未満の無菌性保証水準（ＳＡＬ）が達成され、ここでＳＡＬとは滅菌過程の後に一単位が無菌ではない確立を表す、微生物学で用いられる語である。
【０２２７】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、担体の炭水化物およびタンパク質を除去して架橋物質溶液を精製するためのみではなく、溶液を濃縮するために、接線流またはホローファイバー限外濾過技術のいずれかが用いられる。本発明による使用のための好ましい孔径は、架橋組成物成分のサイズよりも小さな孔径である。
【０２２８】
好ましい実施形態によれば、架橋物質はｍＴＧであり、孔径は１０〜５０ｋＤａの範囲である。さらに好ましい実施形態によれば、架橋物質はｍＴＧであり、孔径は１０〜３０ｋＤａの範囲である。
【０２２９】
別の実施形態によれば、架橋物質を周囲の物質から選択的に分離するため、一以上のサイズ排除クロマトグラフィー工程が用いられる。
【０２３０】
別の実施形態によれば、架橋物質を周囲の物質から選択的に分離するため、一以上の疎水性または親水性相互作用クロマトグラフィー工程が用いられる。
【０２３１】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、架橋物質はタンパク質であり、架橋タンパク質を優先的に結合させることによってそれを周囲の物質から精製するため、一以上のイオン交換クロマトグラフィー工程が用いられる。
【０２３２】
さらに好ましい実施形態によれば、架橋タンパク質はｍＴＧであり、ｍＴＧを精製するために一以上の陽イオン交換クロマトグラフィー工程が用いられる。
【０２３３】
好ましい実施形態によれば、陽イオン交換樹脂はセファロース樹脂である。
【０２３４】
別の好ましい実施形態によれば、精製によって架橋物質のエンドトキシンレベルはグラムあたり＜５エンドトキシン単位（ＥＵ）に減少する。
【０２３５】
別の好ましい実施形態によれば、架橋物質はｍＴＧであり、精製によって特異的活性がミリグラムあたり２０酵素単位を超え、好ましくはミリグラムあたり２５単位を超えるｍＴＧ組成物がもたらされる。
【０２３６】
別の好ましい実施形態によれば、架橋物質はｍＴＧであり、精製によって少なくとも９５％の電気泳動的な純度、好ましくは少なくとも９８％がもたらされる。
【０２３７】
限定はされないが、本明細書中に記載されるｍＴＧ精製過程の例によれば、ミリグラムあたりの特異的活性＞２５酵素単位、＞９５％電気泳動的純度、グラムあたり＜５エンドトキシン単位、および＜１０ＣＦＵ／ｇのｍＴＧ組成物を産生するため、食物グレードのｍＴＧ産物が精製される。
【０２３８】
上記のように、ｍＴＧ濃度はまた、本発明の組成物の幾つかの実施形態に対する好ましいパラメーターでもある。上記の精製過程はさらに濃縮されたｍＴＧ材料もまた、もたらし得る。濃縮されていないｍＴＧ溶液よりもさらに迅速なゼラチンの架橋に加え、濃縮ｍＴＧ溶液は、濃縮されていないコントロールに比べてさらに弾性であり、さらに接着性であり、かつ、さらに透明である。
【０２３９】
酵素溶液の粘度の増大
本発明の別の実施形態によれば、架橋剤とゼラチン溶液との間の粘度の相違を少なくするために、無毒性架橋剤溶液の粘度が増大される。溶液中の粘度の相違が少なくなることにより、二つの溶液は迅速かつ均一に混合できる。
【０２４０】
本発明の好ましい実施形態によれば、架橋剤溶液の粘度は５０ないし５０００ｃＰに増大される。
【０２４１】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、架橋剤溶液の粘度は１５０ないし２５００ｃＰに増大される。
【０２４２】
限定はされないが本実施形態の例によれば、粘度を増大させるために、アミン官能性をもたない高分子量分子が架橋剤溶液に添加される。限定はされないが、このような分子の例は可溶性デンプン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【０２４３】
本発明の好ましい実施形態によれば、溶液の粘度を増大させるため、架橋剤溶液に一以上の粘度増強剤が、架橋反応を５０％を超えて阻害することなく、好ましくは反応を３０％を超えて阻害することなく、さらに好ましくは反応を阻害することなく添加される。限定はされないが、適切な粘度増強剤の例はアルギン酸エステル、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、キサンタンガム、グアーガム、およびプラスドンを含む。
【０２４４】
架橋可能なタンパク質／ポリペプチドにおけるカルバミル化の阻害
本特許において先に述べたように、本発明の幾つかの実施形態によれば、タンパク質溶液のゾル−ゲル転移点を低下させるために尿素が用いられる。尿素の使用により起こり得る一つの不都合は、それがシアン酸へ解離することである。シアン酸イオンはタンパク質上の一級アミンと反応してカルバミル化誘導体を生じる。これはカルバミル化として知られる過程において、架橋可能なタンパク質上のアミン基を脱官能基化する。本発明の好ましい実施形態によれば、架橋可能なタンパク質の一架橋基質は一以上のアミン基を含んでなる。これらの基が脱官能基化された場合、架橋のために利用できる基質の数が減少し、かつ架橋率も減少する。尿素は温度依存性の比率で時間と共にシアン酸塩に分解することから、溶液中に尿素が存在する時間、同様に溶液の温度はカルバミル化率に影響を与える。
【０２４５】
カルバミル化は、この過程がアミン官能基タンパク質およびポリペプチドに有害作用を持つとして以前に記載されているように、本発明に記載される実施形態に対して潜在的に問題があるのは驚くべきことではない。米国特許第４，６０５，５１３号には、１，２−エチレンジアミンまたは１，２−エチレンジアミンに構造的に関連する化合物を用いてポリペプチドのカルバミル化を阻害する方法について記載される。米国特許第７，４５９，４２５Ｂ２号には、カルバミル化阻害剤の添加により、尿素またはシアン酸塩を含む溶液中のポリペプチドのカルバミル化を阻害する過程について記載される。
【０２４６】
背景技術に記載されるカルバミル化阻害過程では、標的分子のカルバミル化の原因となるシアン酸イオンを結合する競合的なアミン基基質の使用に依存する。これらの背景技術による過程は、架橋可能なタンパク質の架橋可能な基質がアミン基を含むことから、本発明の好ましい実施形態に関しては問題を起こし得る。従って競合的なアミン基基質の添加は、標的である架橋可能なタンパク質の架橋を競合的に阻害できる。この例として、米国特許第７，４５９，４２５Ｂ２号に好ましいカルバミル化阻害剤として開示されたヒドロキシルアミンは、尿素と共にインキュベートされたタンパク質溶液の架橋時間を延長させることが本発明者らにより見出された。
【０２４７】
架橋物質は、限定はされないがアリールアジド、カルボジイミド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、ＮＨＳ−エステル、ビニル−スルホン、ジイソシアネート、ならびに例えばグルタルアルデヒドおよびホルムアルデヒドのようなアルデヒドを含む、一級アミンと反応する官能基を有する化学的実体を任意に含んでなってよい。
【０２４８】
架橋物質はまた、任意に（代わりに、または加えて）、酵素架橋剤をアミン基基質と共に含んでなってもよい。好ましくは、酵素架橋剤は基質としてリジンのイプシロンアミノ基を用いる。限定はされないが、このような酵素の例は微生物性トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）および組織トランスグルタミナーゼである。
【０２４９】
背景技術に記載される化合物は、それらの化合物がトランスグルタミナーゼの好ましい基質である一級アミンを含むことから、トランスグルタミナーゼに依存する架橋を阻害し得ることが予想され得る。驚くべきことに背景技術の教示とは対照的に、タンパク質／ポリペプチド溶液中のカルバミル化は、競合的なカルバミル化阻害剤の添加を通して、タンパク質／ポリペプチドのアミン基依存性の架橋に不利な影響を及ぼすことなく阻害できることが本発明者らにより発見された。
【０２５０】
本発明の実施形態によれば、カルバミル化阻害剤は、架橋可能なタンパク質／ポリペプチド組成物中に含まれる。
【０２５１】
限定はされないが、カルバミル化阻害剤についての記述は、標的となるタンパク質／ポリペプチドよりもさらに好ましいカルバミル化の基質となることのできるいずれの分子である。
【０２５２】
限定はされないが、阻害剤の例はその構造に一級アミンを有する分子である。
【０２５３】
好ましい実施形態によれば、カルバミル化阻害剤はポリペプチドの架橋能を阻害しないか、またはその架橋能をカルバミル化反応の阻害よりも大きな程度には阻害しない。
【０２５４】
別の好ましい実施形態によれば、カルバミル化阻害剤は架橋剤の活性を阻害しないか、またはその活性をカルバミル化反応の阻害よりも大きな程度には阻害しない。
【０２５５】
好ましい実施形態によれば、カルバミル化阻害剤はアミノ酸またはアミノ酸塩を含んでなる。
【０２５６】
さらに好ましい実施形態によれば、カルバミル化阻害剤はグリシンまたはヒスチジンの一以上である。さらに好ましい実施形態によれば、カルバミル化阻害剤はグリシンである。
【０２５７】
任意に、かつ好ましくは、組成物中のグリシン濃度は約０．０５Ｍないし約１．５Ｍである。さらに好ましくは、グリシンは約０．１Ｍないし約０．９Ｍの濃度で使用される。
【０２５８】
驚くべきことに、グリシンはアミン基を含んでいるにもかかわらず、トランスグルタミナーゼの架橋活性またはｍＴＧ依存性のゼラチン架橋の動態を阻害しなかったことが本発明者らにより見出された。
【０２５９】
グリシンは、その他のアミン基を含む物質に比較して、尿素を含むゼラチン溶液中のカルバミル化を優先的に、かつ用量依存性に阻害することが示された。ヒスチジンもまた、カルバミル化阻害のために任意に使用できる。
【０２６０】
シアン酸ナトリウムもまた阻害効果をもたらし、尿素の分解がｍＴＧ架橋の阻害の原因であることが確認される。
【０２６１】
架橋可能なタンパク質におけるアミン基の修飾
本発明の別の実施形態によれば、架橋可能なタンパク質／ポリペプチドは架橋物質の基質であるアミン基を含み、かつ架橋可能なタンパク質／ポリペプチド上の一級アミン基は修飾される。
【０２６２】
ゼラチンにおける関連するアミン基は、リジン側鎖上のイプシロンアミン、およびゼラチン鎖のアミノ末端の遊離アミンである。
【０２６３】
架橋可能なタンパク質／ポリペプチド上のアミン基の修飾は、架橋に利用できる架橋可能な基質の数を減少させ得り、その結果、組成物の弾性の維持または組成物の表面電荷もしくは疎水性のような化学的特性の変更によって、架橋タンパク質組成物の力学的特性を改善する。
【０２６４】
本発明の実施形態によれば、一級アミンの修飾は、限定はされないがアルキル化、アミド化、カルバミル化、またはサクシニル化を含む一以上の方法により任意に行われてよい。
【０２６５】
別の実施形態によれば、ゼラチン上の一級アミン基は、タンパク質を無水酢酸、グルタル酸無水物、およびシトラコン酸無水物と反応させることにより任意に修飾できる。
【０２６６】
別の実施形態によれば、一級アミン基は、サクシニミジルエステルの誘導体と反応させることによってもまた任意に修飾できる。加えて、一級アミン基はＰＥＧ化により修飾され得る。好ましい実施形態によれば、タンパク質／ポリペプチドはサクシニル化される。
【０２６７】
サクシニル化は、無水コハク酸が、リジンのε−アミノ基、および／または、タンパク質／ポリペプチドのアミノ−Ｎ−末端α−アミノ基と反応する過程である。
【０２６８】
【数１】
0005450612.tif 000002
【０２６９】
好ましい実施形態によれば、架橋物質はトランスグルタミナーゼであり、架橋可能なタンパク質上の一級アミン基は修飾される。
【０２７０】
カゼイン中のリジンのサクシニル化は、例えばタンパク質をトランスグルタミナーゼの非基質にすることが示された（Ｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ５０（４），１９８６：ｐ．８５１−８５５）。
【０２７１】
サクシニル化の好ましい実施形態によれば、サクシニル化反応を開始するため、タンパク質／ポリペプチドへ任意に、かつ好ましく無水コハク酸が添加される。望まれるレベルのサクシニル化が達成されたとき、サクシニル化タンパク質は、限定はされないが透析、限外濾過、もしくはゲル濾過クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせを含む方法により、過剰の未反応無水コハク酸およびその他の反応産物から好ましく分離または精製される。過剰の未反応無水コハク酸は、それをさらなる反応から機能的に除去するために、任意に一以上の添加剤と化学的に反応させる。
【０２７２】
別の実施形態によれば、修飾タンパク質は非修飾タンパク質と、非修飾タンパク質の重量あたり１：１０〜１０：１の範囲の修飾タンパク質の重量の比において、任意に、かつ好ましく混合される。
【０２７３】
修飾タンパク質は、架橋物質の添加前に非修飾タンパク質と任意に混合されてよいか、または架橋物質が添加されたときのみに非修飾タンパク質と混合されるように、架橋物質に任意に添加されてよい。
【０２７４】
別の実施形態によれば、架橋物質溶液の粘度を増大させるため、通常は架橋物質の基質となり得るタンパク質が好ましく修飾され、かつ用いられる。
【０２７５】
別の実施形態によれば、架橋物質はトランスグルタミナーゼであり、タンパク質は、そのリジン基の大多数を非官能基基質として、限定はされないがエチレンジアミン、ジアミノヘキサン、プトレシン、カダベリン、スペルミン、スペルミジン、およびジェファミン（ｊｅｆｆａｍｉｎｅ）を含むジアミンリンカーの存在下でｍＴＧにより架橋できるグルタミン基を残すように、好ましく修飾される。
【０２７６】
好ましい実施形態によれば、タンパク質はゼラチンである。
【０２７７】
ゼラチンのサクシニル化の完了により、ゼラチンは最早ｍＴＧにより架橋されない。
【０２７８】
また以下に述べるように、サクシニル化されたゼラチンは、限定はされないが例えば架橋ゼラチン組成物の力学的特性を改善するために、任意に非修飾ゼラチンと混合して用いられてよい。
【０２７９】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、組成物中のタンパク質／ポリペプチドは、カルバミル化を通して任意に、かつ好ましく修飾される。
【０２８０】
タンパク質のカルバミル化は、イソシアン酸がペプチドのアミノ基と反応してカルバミル化ペプチドを形成する過程である。
【０２８１】
【数２】
0005450612.tif 000003
【０２８２】
タンパク質またはペプチドのアミン基が架橋過程の基質として用いられる際、アミン基の修飾のためにカルバミル化が任意に用いられてよい。
【０２８３】
限定されない実施形態によれば、カルバミル化反応を開始するため、タンパク質／ポリペプチドへ任意に、かつ好ましくシアン酸塩が添加される。望まれるレベルのカルバミル化が達成されたとき、カルバミル化タンパク質は、限定はされないが透析、限外濾過、もしくはゲル濾過クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせを含む一以上の方法により、過剰の未反応シアン酸塩およびその他の反応産物から任意に分離または精製される。過剰の未反応シアン酸塩は、それをさらなる反応から機能的に除去するために、任意に一以上の添加剤と化学的に反応させる。
【０２８４】
限定されない実施形態によれば、カルバミル化反応を起こすため、シアン酸塩が架橋反応の開始前かまたは架橋反応の間にタンパク質／ポリペプチドへ直接好ましく添加される。
【０２８５】
限定はされないが、この目的のために用いてよいシアン酸塩の例は、シアン酸ナトリウム、シアン酸アンモニウム、およびシアン酸カリウムを含む。
【０２８６】
別の実施形態によれば、タンパク質溶液は尿素を好ましく含み、カルバミル化は尿素のシアン酸アンモニウムへの分解に従って開始される。
【０２８７】
シアン酸塩を、タンパク質−架橋剤組成物の総量へｇタンパク質あたり０．００１〜０．１ｍＭの範囲の濃度で添加することにより、部分的なカルバミル化が好ましく達成される。好ましくは、部分的なカルバミル化を達成するために、シアン酸塩はｇタンパク質あたり０．０１〜０．０５ｍＭの範囲の濃度で添加される。
【０２８８】
ｇタンパク質あたり０．０５ｍＭを超える濃度、かつ好ましくは０．１ｍＭを超える濃度が、タンパク質のアミン基の全カルバミル化を起こすため、任意に用いられてよい。
【０２８９】
タンパク質分子鎖間の架橋ブリッジ（ジアミン分子）
本発明のさらなる実施形態によれば、トランスグルタミナーゼが特異的活性を持つためのジアミンが、タンパク質架橋間の架橋ブリッジを作ることによってゼラチン−ｍＴＧ組成物の特定の特性を改善するものとして架橋タンパク質組成物中に取り込まれるように、タンパク質または架橋剤組成物へ添加される。限定はされないが（かつ閉じたリストを提供しようとするものではなく）、架橋ブリッジの利点の例は、増大した弾性、改変された生体吸収（ｂｉｏａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）時間、または改変された凝集強度を含む。
【０２９０】
上記のようにこの実施形態は、例えば架橋可能なタンパク質が架橋剤物質の基質であるアミン基を含む場合に、任意に有用であり得る。
【０２９１】
幾つかの場合には、ジアミンは架橋動態を阻害するためにもまた使用できる。架橋剤がリジン側鎖上のイプシロンアミン基を標的とする場合、ジアミンは架橋剤の標的基質と競合して架橋反応を遅くすることができる。
【０２９２】
限定はされないが、使用できるジアミンの例は、プトレシン、カダベリン、ヘキサンジアミン、スペルミジン、およびスペルミンであってよい。加えて、ジェファミン（ｊｅｆｆａｍｉｎｅ）ＥＤＲ−１４８（Ｈｕｎｔｓｍａｎ）のようなポリエーテルアミン型のジアミンが用いられてよい。同様に、リジンおよびポリリジン、または二以上のリジン残基を含むペプチドが用いられてよい。
【０２９３】
修飾アミン基の項で述べたように本発明の別の実施形態によれば、トランスグルタミナーゼが架橋剤であり、一以上のジアミンが、アミン基が修飾されたタンパク質溶液へ任意に添加されてよい。このような場合、修飾タンパク質またはその中の幾つかのペプチドは、それ自体で架橋可能ではあり得ない。ジアミンは次に、トランスグルタミナーゼによる架橋が起こるための一級アミンを提供する。このアプローチの多数の利点の中でも、ジアミンは天然のリジンと競合して架橋反応を減速させることはないであろう。むしろ、これらは標的タンパク質のグルタミン基質を、ジアミンブリッジを通して互いにつなぎ得る。一つの仮説に限定しようとするものではないが、この過程により、架橋組成物の柔軟性を改善するための、より長くさらに柔軟なブリッジを持つゲルがもたらされる。
【０２９４】
幾つかのジアミンが、架橋タンパク質組成物のプロテアーゼによる生分解の比率を改変するために用いられてよい。例えばリジンおよびヘキサンジアミンは、プロテアーゼによる生分解の比率を減少または促進する能力を示している（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００４，２５（１５）：ｐ．２９９７−３００４）。
【０２９５】
好ましい実施形態によれば、架橋ブリッジは架橋可能なタンパク質／ポリペプチドのリジン側鎖間にジアミンを通して形成される。
【０２９６】
限定はされないが、この状況で使用できるジアミンの例は、アジピンジアミドおよびグルタルジアミドである。
【０２９７】
ジアミン化合物であるプトレシンの、ゼラチン架橋反応の動態における効果が、以下の実例となる限定されない例に関して記載される。プトレシンは架橋反応を用量依存性に減速させたことから、トランスグルタミナーゼの基質として働き、かつゼラチンと共に架橋されることが示唆される。これは弾性もまた増大させた。
【０２９８】
架橋タンパク質またはポリペプチドのＵＨＴ滅菌法
本発明の幾つかの実施形態によれば超高温滅菌法（ＵＨＴ）処理が、ゼラチン溶液のようなタンパク質またはポリペプチド溶液を滅菌するため、その医学的応用における使用のための調製において用いられる。ＵＨＴは液体の形である物質を１２０〜１４０℃の範囲の温度まで約３〜１８０秒の短い間熱することによる滅菌法である。高温が処理時間を短縮させ、これにより物質特性が損なわれることが少なくなる。ＵＨＴシステムにおける正確な温度制御は、物質中の不可欠なバイオバーデンの減少を確実にする。
【０２９９】
タンパク質溶液の首尾良い、反復可能な熱滅菌法には、溶液の総量が特定の温度に達し、その温度が設定された長さの時間保持されることが要求される（容認できる時間／温度の組み合わせは、ＧＭＰ標準の下に定義される）。これは「保持時間」と定義される。
【０３００】
オートクレーブ内では、少なくとも保持時間の間に物質の全ての部分が要求される温度（一般には約１２１℃）に達したことを確実にするには、物質は典型的にはオートクレーブ内に３０〜４０分間保持される。
【０３０１】
ＵＨＴにおいては、この過程はさらに良く制御されるために急速であり得る。物質については全てを一度に熱するよりも、むしろ少量の物質をいずれの所定時間熱する連続的フロー過程が行われる。
【０３０２】
本発明の幾つかの実施形態によれば、伝統的なＵＨＴは、本明細書中に記載される新規組成物のタンパク質溶液成分の、部分的または全体的な滅菌に用いられる。伝統的なＵＨＴでは、物質のいずれの特定の一定分量のための加熱過程も数秒を要し、次にこの物質はその温度にて保持時間の間保持される。
【０３０３】
本発明の別の実施形態によれば、タンパク質溶液にはＵＨＴシステムに入る前に脱気過程が施される。
【０３０４】
本発明の好ましい実施形態によれば、ＵＨＴシステムにおける物質の過熱は物質の間接加熱、例えば水または蒸気を通した加熱により達成される。
【０３０５】
本発明の別の実施形態によれば、ＵＨＴシステムにおける物質の過熱は物質の直接加熱、例えば熱した蒸気の注入により達成される。
【０３０６】
本発明の好ましい実施形態によれば、ＵＨＴ処理が直接的な蒸気注入加熱により行われる場合、処理されるタンパク質またはポリペプチド溶液は最初に、最終の医学的に有用なタンパク質／ポリペプチド架橋剤組成物に必要とされる濃度よりも高い濃度で調製される。
【０３０７】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、処理されるタンパク質／ポリペプチド溶液の最初の濃度は、この溶液に要求される最終濃度よりも約５％（ｗ／ｖ）高い。
【０３０８】
本発明の幾つかの実施形態によれば、それぞれの一定分量に対する加熱過程が保持時間前に１秒未満、好ましくは０．５秒未満、さらに好ましくはおおよそ２／１０秒を要するマイクロ波ＵＨＴが用いられる。この短い加熱時間は、それを確実に行うことによって物質の全ての部分が熱波の均一なフィールドを一定の流速で通過することを可能にする。これはよく制御された非常に正確な過程である。
【０３０９】
本発明における使用のためのゼラチン溶液の首尾良い滅菌法には、加熱過程がゼラチン分子のいかなる加水分解ももたらさないことが要求される。タンパク質溶液、例えばゼラチン溶液をオートクレーブすることにより、部分的な加水分解および架橋活性の著しい減少がもたらされることが知られている。さらに、尿素のような物質を含むゼラチン溶液をオートクレーブすることで、ゼラチン材料のほとんど全ての架橋活性を失うこととなる。換言すれば、首尾良いオートクレーブ法のために必要とされる加熱時間の延長は、ゼラチン溶液材料に特定の望ましくない効果をもたらす。
【０３１０】
タンパク質処理のためには、必要とされる加熱時間がオートクレーブ法で必要とされる時間よりもはるかに短いことから、ＵＨＴはオートクレーブ法より何倍も繊細である。ＵＨＴはゼラチン溶液中のゼラチン分子の著しい部分的加水分解をもたらさない。
【０３１１】
ＵＨＴ処理の間のタンパク質またはポリペプチド溶液の直接加熱は、伝統的なＵＨＴにおけるさらに迅速な加熱の形である。しかしながら、直接加熱には蒸気を材料へ直接注入することが必要とされる。通常は、材料が一旦滅菌された後に蒸気は真空下で除去される。しかしながら、これはゼラチン溶液のような高粘度のタンパク質溶液においては不可能である。従って、直接の蒸気注入加熱が用いられる場合、滅菌された材料の何パーセンテージまでが注入蒸気により希釈されたかを評価するため、ＵＨＴシステムの較正が必要である。一般にこのパーセンテージはおおよそ５％である。一旦正確な希釈パーセンテージが決定されると、蒸気の注入による希釈を許容する必要のあった最初の溶液をさらに濃縮することができる。
【０３１２】
約２０〜３０秒を要するために直接加熱よりもわずかに遅い間接加熱は、処理される材料の内容に全く影響を与えないことから、直接加熱よりも単純である。
【０３１３】
均一マイクロ波フィールドＵＨＴは非常に新しい技術であるが、タンパク質溶液による使用のためによく制御された繊細な滅菌法でもある。マイクロ波ＵＨＴは、均一マイクロ波技術に依存した比較的新しい技術である。この技術は、材料の一定分量を非常に特異的な温度へと均一に加熱することを可能にする。材料の総量がその特異的な温度へと加熱される。その温度よりも熱くなる材料、およびその温度に加熱されない材料は皆無である。ＵＨＴの全過程はこの均一な加熱法の信頼性および一貫性に依存する。標準的なマイクロ波は熱波の均一なフィールドを作り出すことはできない。結果として、加熱は常にある温度に対して不均一である。材料全体が十分に加熱されることを確実にし得る滅菌過程においては、材料のある部分が過剰に加熱され、使用には不適切となり得る。
【０３１４】
マイクロ波ＵＨＴは、処理される材料の濃度のいかなる変更も必要とすることなく、直接蒸気注入による迅速な加熱を達成することによって全過程の時間を最小化する。
【０３１５】
ＵＨＴ処理に先立つ溶液の脱気は、ＵＨＴ処理が進行中である材料中の気泡が過程の進路を超えてバーストし得ることから、非常に好都合である。これは過程を混乱させ、熱滅菌過程の不均一な結果をもたらし得る。
【０３１６】
タンパク質またはポリペプチド溶液のＵＨＴ処理は、２Ｌ／分未満の流速による連続的なフロー処理として定義される、小規模な熱処理のために設計されたシステムを用いて優先的に行われる。ＵＨＴ処理は、１．２Ｌ／分未満の流速によりさらに優先的に実行される。この規模の流速は、小規模で伝統的、またはＭｉｃｒｏｔｈｅｒｍｉｃｓ（ローリー、ノースカロライナ州）により市販されているような均一なマイクロ波ＵＨＴシステムを用いて、任意に、かつ好ましく達成される。低い流速により、さらに正確で効果的なＵＨＴ過程が可能になる。
【０３１７】
アミンドナー
一級アミン基が架橋剤物質の基質である本発明の幾つかの実施形態によれば、架橋タンパク質組成物の架橋反応動態または力学特性を改変するため、ゼラチン溶液にアミンドナーが添加される。
【０３１８】
ポリアミンは、一級アミノ基を二以上有する有機化合物である。その化学的性質のため、ポリアミンはその他の分子と共に水素、イオン、または共有結合を形成できる。動物においては、多数のタンパク質に対するポリアミンの後翻訳共有結合が、これらの反応がトランスグルタミナーゼにより触媒され、ペプチドに結合した二または一のグルタミン残基それぞれと共に架橋複合体を形成することを示す、沢山の証拠と共に示されてきた（Ｓｅｒａｆｉｎｉｅ−Ｆｒａｃａｓｓｉｎｉ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９８８）８７，７５７−７６１．Ｏｈｔａｋｅ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２００７；８１，７：ｐ．５７７−５８４）。
【０３１９】
限定はされないが、適切なポリアミンの例はポリリジン、キトサン、またはポリエチレンイミンを含む。
【０３２０】
別の適切なポリアミンは、ＢＡＳＦ（独国）により生産される市販のアミン反応性ＰＶＡ物質であるポリビニルアミンである。ポリビニルアミン分子の鎖長および電荷密度は、ポリビニルアミンを取り込むコポリマーの異なった特性を得るために変動し得る。
【０３２１】
幾つかの実施形態によれば、ポリアミンは、タンパク質と架橋剤物質との混合に先立って任意にタンパク質組成物中に含まれる。
【０３２２】
幾つかの実施形態によれば、ポリアミンは、タンパク質と架橋剤物質との混合に先立って任意に架橋剤組成物中に含まれる。
【０３２３】
一実施形態によれば、複数の陽性電荷を持ち、かつ生細胞への接着を仲介するために用いられる、リジンのポリマーであるポリリジンが含まれる。生細胞との相互作用は、ほとんどの哺乳類細胞の細胞膜上に見出される陰性に荷電したシアル酸炭水化物を通して仲介される。限定はされないが、この目的に関連し得るポリアミンの別の例はポリエチレンイミンである。
【０３２４】
幾つかの実施形態によれば、ポリアミンは架橋が開始された後に任意に添加される。通常、タイプＡのゼラチン中にはリジンよりもグルタミンが多く、ゼラチンの各１０００アミノ酸残基あたり、それぞれ３０残基対４８残基である。組成物中にポリアミンが含まれることにより、平衡が一級アミンの過剰へと傾き得る。一級アミンは組織への付着のためのアンカー点として働き得る。
【０３２５】
本発明の組成物へのポリアミンの添加は、組成物中の反応部位の数を増加させることにより、組成物の凝集強度、同様にその接着性を増大させ得る。
【０３２６】
加えて、ポリアミンはゼラチン鎖間に柔軟な架橋ブリッジを形成し得ることによって、架橋ゲルの柔軟性を増大させる。
【０３２７】
また、ポリアミンは組織フィブロネクチンを結合することが示されてきた（上記の参考文献を参照のこと）。従って、タンパク質−架橋剤組成物に取り込まれたポリアミンは、組成物を天然組織へ結合させる仲介物質としてもまた作用し得る。
【０３２８】
本発明の好ましい実施形態によれば、タンパク質組成物中にはポリエチレンイミン（好ましくは分岐ポリエチレンイミン）が任意に含まれる。
【０３２９】
分岐ポリエチレンイミンは、一級アミン基、二級アミン基、および三級アミン基を持つ高度に分岐したポリマーである。
【０３３０】
実施例２９には、限定はされないが例えばｍＴＧ−架橋ゼラチン組成物の弾性を増大させるためのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の使用
について記載される。
【０３３１】
アンモニアスカベンジング剤、金属イオン封鎖剤、および結合剤
アンモニアは毒性が強い。通常、血中アンモニア濃度は＜５０μｍｏｌ／Ｌであり、わずかに１００μｍｏｌ／Ｌへの上昇が意識障害を引き起こし得る。２００μｍｏｌ／Ｌの血中アンモニア濃度は昏睡および痙攣に関連する。
【０３３２】
アンモニウムは、アミノ酸およびアミンの脱アミノ化の結果として、身体のほとんどの細胞において産生される。アンモニウムの閾値濃度を超えるアンモニウムの毒性は、グルタミン酸脱水素酵素の酵素作用による。この酵素は、グルタミン酸塩からアンモニウムおよびケトグルタル酸への酸化的脱アミノ化を触媒する；この反応は容易に可逆であり、反応の方向（グルタミン酸塩の脱アミノ化またはグルタミン酸塩形成へ向かう）は様々な基質の相対的濃度に依存する。アンモニウム濃度の上昇に従い、反応はケトグルタル酸からグルタミン酸塩形成の方向へ進行する。血中アンモニウムが上昇すると、グルタミン酸塩およびグルタミンの形成によってそれを解毒する能力を超えるため、アンモニア中毒が起こる。
【０３３３】
アンモニア分子は、フィブリン、ゼラチン、およびその他のタンパク質上のトランスグルタミナーゼによって促進される架橋反応により放出される。従って、局所的な生理環境において大量のｍＴＧ架橋を生じさせることは、極端な状況においては有毒な濃度のアンモニア放出をもたらし得る。
【０３３４】
移植可能および／または外科的な状況のような、生理的な状況におけるゼラチン−ｍＴＧ組成物使用の実施形態によれば、局所的なアンモニアの濃度は、ゼラチン−ｍＴＧ組成物中へのアンモニアスカベンジャー剤、アンモニア結合剤、またはその他のアンモニア中和剤の取り込みにより、潜在的に危険な閾値未満に好ましく減少される。このような薬剤は、ゼラチン−ｍＴＧ組成物を形成するために混合される、ゼラチン成分またはｍＴＧ成分のいずれかに含まれてよい。
【０３３５】
限定はされないが、このような薬剤の例は二糖類ラクツロースである。ラクツロースは腸内酵素により加水分解されない合成二糖類である。ラクツロースは腸の内容物を酸性化することによって細菌性アンモニアの産生を阻害する。これは大腸内フローラの増殖を促進する。増殖するバイオマスはアミノ酸由来のアンモニアおよび窒素を用いて細菌性タンパク質を合成し、これは次にタンパク質のＮＨ３への分解を阻害する。ラクツロースは細菌性尿素の分解を阻害することによってアンモニアを減少させ、かつ大腸での通過時間を短くすることにより、アンモニア産生のための時間を短縮してアンモニア除去を促進する（Ｄｅｇｌｉｎ  ＪＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｃｔｕｌｏｓｅ．Ｉｎ  Ｄａｖｉｓ’ｓ  ｄｒｕｇ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｎｕｒｓｅｓ（９ｔｈ  ｅｄ．，２００３）（ｐｐ．５８９−５９０）．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｆ．Ａ．Ｄａｖｉｓ）。ラクツロースは、供給業者の中でも特に、Ｓｏｌｖａｙ  ＳＡ（ブリュッセル）から市販されている。
【０３３６】
本発明の別の実施形態は、アンモニア中毒の治療において、強力な陽イオン交換樹脂であるＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）ＩＲ−１２０（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フィラデルフィア、ペンシルベニア州）の四つの型の混合物を任意に、かつ好ましく特色とする。この樹脂混合物は、総量７５０ｍＥｑで体外循環システムにおいて用いられる際、実験用イヌにおける高アンモニア血症の是正に有効であること、およびいずれの有害作用も伴わないことが見出された（Ｊｕｇｇｉ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ−Ｖｉｖｏ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｒｅｓｉｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  Ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｏｒｐｏｒｅａｌ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ．ＡＮＺ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  １９６８；３８（２）：ｐ  １９４−２０１）。
【０３３７】
本発明の別の実施形態は、サポニン、特にユッカサポニン、またはＹｕｃｃａ  ｓｃｈｉｄｉｇｅｒａ植物の糖画分誘導体を任意に、かつ好ましく特色とし、これらは両方ともアンモニア結合能を示してきた（Ｈｕｓｓａｉｎ  Ｉ，Ｉｓｍａｉｌ  ＡＭ，Ｃｈｅｅｋｅ  ＰＲ．Ａｎｉｍａｌ  Ｆｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６；６２（２），ｐ．１２１−１２９）。
【０３３８】
本発明の別の実施形態は、アンモニアスカベンジャーとしてフェニル酢酸ナトリウムおよび安息香酸ナトリウム溶液を任意に、かつ好ましく特色とする。このような溶液は、限定はされないが、例としてＡＭＭＯＮＵＬ（登録商標）（Ｍｅｄｉｃｉｓ、スコッツデール、アリゾナ州）の商標名で市販されており、これは１０％フェニル酢酸ナトリウム、１０％安息香酸ナトリウムの溶液から成る。
【０３３９】
本発明の別の実施形態によれば、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）またはＬ−グルタミン酸塩（Ｌ−Ｇｌｕ）が、タンパク質−架橋剤組成物、好ましくは組成物のタンパク質成分に添加される。Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ｇｌｕは、細胞内のアンモニアから尿素への代謝を刺激し、また細胞からのアンモニア放出の取り込みおよび促進も阻害する（Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｅ，Ｈａｇｅｎ  ＳＪ．Ａｍ  Ｊ  ｏｆ  Ｐｈｙｓ．ＧＩ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓ，２００２；４６（６），ｐ．Ｇ１２６４−Ｇ１２７５．）。一つの仮説に限定しようとするものではないが、アンモニアを放出するｉｎ  ｓｉｔｕでの架橋過程において、Ｌ−Ｇｌｎおよび／またはＬ−Ｇｌｕは、環境の遊離アンモニアの量を減少させることによって細胞に吸収される量を減少させ、かつアンモニアを代謝する細胞の自然な能力を促進する、放出されたアンモニアの中和における有用性を持つ。ｍＴＧ−架橋ゼラチン組成物をラットに皮下移植してから最初の１４日間にわたる、それに対する組織反応は、以下の実例となる限定されない例に関して記載されるように、ｍＴＧ架橋反応によって放出されたアンモニアを捕捉するためのグルタミン酸塩の包含によって著しく改善された。
【０３４０】
着色料
本発明の別の実施形態によれば、応用上、組成物の可視性を改善するために、タンパク質または架橋剤溶液のいずれかに生体適合性の着色料が添加される。
【０３４１】
さらなる止血剤
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記の組成物のいずれもが、凝固因子、凝固イニシエーター、血小板活性化因子、血管収縮薬、および線溶阻害剤からなる群より選択され得るさらなる止血剤を、さらに含んでなってよい。限定はされないが、これらの例はエピネフリン、アドレノクロム、コラーゲン、トロンビン、フィブリン、フィブリノーゲン、酸化セルロース、およびキトサンを含む。
【０３４２】
凍結乾燥製品の構成
本発明の実施形態によれば、架橋可能なタンパク質またはポリペプチドが無毒性の架橋剤と十分に混合されて均一な溶液が形成され、架橋過程の完了を防ぐために該溶液の温度が直ちに下げられる、乾燥または凍結組成物が形成される。混合された組成物は、次に凍結、または凍結および乾燥されて、新規で均一な組成物が形成される。
【０３４３】
この型の組成物は、ｉｎ  ｓｉｔｕでの凝集ゲルの組成にかかる時間の正確な制御を可能にすることから、大きな有用性を持つ。実施例中に示す粘度計グラフに見られるように、架橋が起こるためにかかる時間は非常に正確に定義することができる。ｍＴＧのような幾つかの架橋剤の活性は温度依存性であることから、組成物の温度が架橋剤の活性温度未満に低下した場合、架橋過程は事実上停止され得る。ｍＴＧの場合、おおよそ２０℃未満の温度で架橋活性は本質的に停止する。
【０３４４】
本発明の好ましい実施形態によれば、反応は組成物がその最終的な力学強度の３０％に達する前に停止される。
【０３４５】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、反応は組成物がその最終的な力学強度の１５％に達する前に停止される。
【０３４６】
本発明のさらになお好ましい実施形態によれば、反応は組成物がその最終的な力学強度の５％に達する前に停止される。
【０３４７】
この実施形態の目的のための最終的な力学強度は、組成物の架橋可能な物質の全てが自由に流動しないために十分な程度架橋される点として定義される。粘度計試験では、この点はおおまかには１０ＭｃＰで起こる。
【０３４８】
本発明の実施形態によれば、乾燥架橋剤物質が架橋可能なタンパク質またはポリペプチドの凍結乾燥組成物を通して完全に分散された乾燥組成物が形成される。
【０３４９】
好ましい実施形態によれば、タンパク質はゼラチンであり、架橋されないゼラチンの発泡体はこのような多孔性の発泡体全体への架橋剤の分散に先立って凍結乾燥される。
【０３５０】
別の好ましい実施形態によれば、架橋剤が発泡体へ溶解されないように、ゼラチン発泡体に乾燥架橋剤物質が添加される（すなわち、凍結乾燥に先立つ架橋活性がみられない）。
【０３５１】
驚くべきことには、安定剤または架橋剤のいずれも添加することなく発泡体ゼラチンの凍結乾燥が可能になるように、十分に安定であったゼラチン溶液から再構成可能な発泡体が任意に形成され得ることが見出された。
【０３５２】
このような発泡体を形成するための、本発明の好ましい、実例となる実施形態によれば、ゼラチン溶液はそれが液体の形である温度において調製かつ保持される。ゼラチン溶液は次にそれがゾル−ゲル転移点未満の温度に冷却される間、延長された、好ましくは連続的な泡沫化過程に供される。
【０３５３】
ゼラチン溶液の濃度は、好ましくは０．５％〜２０％ｗ／ｗ、さらに好ましくは５〜１０％ｗ／ｗの範囲である。
【０３５４】
ゼラチン溶液の最初の温度は３０℃〜７０℃、好ましくは３０℃〜５０℃、さらに好ましくは３５℃〜４０℃である。泡沫化過程の間の環境温度は０℃〜２５℃、好ましくは１５℃〜２５℃、さらに好ましくは２０℃〜２３℃である。限定はされないが、泡沫化過程の例は撹拌、混合、混和、および気体の注入を含む。
【０３５５】
好ましくは、泡沫化過程は撹拌または混合を含む。
【０３５６】
泡沫化過程では、一以上の泡沫化技術が任意に用いられてよい。あるいは、一つの泡沫化技術が異なる条件下で複数回、例えば低レベルの発泡体産生のための穏やかな撹拌と、それに続くゼラチン発泡体中に最大の通気を達成するための活発な撹拌が任意に用いられてよい。
【０３５７】
任意の実施形態によれば、泡沫化の完了により、ゼラチン発泡体は、泡沫化過程の完了時のゼラチン発泡体の温度よりも低い温度に冷却された容器へ好ましく移される。
【０３５８】
別の実施形態によれば、泡沫化過程の完了後直ちに、ゼラチン発泡体は任意に、かつ好ましく、迅速に冷却される。限定はされないが、迅速な冷却の例は、泡沫化過程の直後にゼラチン発泡体を液体窒素に暴露することである。
【０３５９】
好ましい実施形態によれば、乾燥ゼラチン発泡体は約１２％未満の水分を含む。さらに好ましい実施形態によれば、乾燥ゼラチン発泡体は約８％未満の水分を含む。
【０３６０】
別の実施形態によれば、ゼラチン発泡体は任意に、発泡体が部分的に崩壊して発泡体の下部にゼラチン発泡体のより密な層が形成されるように、泡沫化完了直後（約５分以内まで）に冷却またはその他の方法によってさらに安定化されない。
【０３６１】
上記の実施形態によれば、より密な層は約５０％未満、好ましくは約３５％未満、さらに好ましくは約２０％未満である凍結乾燥ゼラチン組成物の濃さを任意に含んでなる。
【０３６２】
ここで用いられる密度とは、凍結乾燥組成物の容積あたりのゼラチン重量の増大を指す。このような増大は任意に５％程度であってよいが、好ましくは約１０％よりも大きく、さらに好ましくは約２０％よりも大きい。
【０３６３】
一つの仮説または閉じたリストに限定しようとするものではないが、このようなゼラチン発泡体の濃い層は、乾燥組成物の上部の再構成特性に影響を与えることなく凍結乾燥ゼラチン組成物に力学強度を与えると信じられている。
【実施例】
【０３６４】
ここで以下の実施例が上の記述と共に参照され、本発明の幾つかの実施形態を限定されない様式において例証する。
【実施例１】
【０３６５】
酢酸緩衝液およびクエン酸緩衝液を用いた架橋時間の比較
材料
実験には以下の材料を用いた：３００ブルーム、タイプＡブタゼラチン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、ゼラチンＭｅｄｅｘ−３００ブルーム７０メッシュ、医薬用ゼラチン［Ｍｅｄｅｘ、英国バッチ］、９８％尿素［Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ランチェスター］、塩化カルシウム９７％乾燥粉末［Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ランチェスター］、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１）、０．５Ｍ無水クエン酸ナトリウム９９％［Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ランチェスター］、Ｄ−ソルビトール９７％［Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州］、１０％微生物性トランスグルタミナーゼ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％（１０％酵素、９０％マルトデキストリン）［味の素、日本］。
【０３６６】
方法
２Ｍカルシウム溶液の原液、４．５Ｍおよび５Ｍ尿素、０．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液ｐＨ６．０、０．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液ｐＨ６．０、２Ｍクエン酸ナトリウム溶液ｐＨ６．０、および２．３６Ｍクエン酸溶液を調製した。
【０３６７】
２Ｍ尿素、１Ｍカルシウム、０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含む２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（溶液Ａ）を調製した。以下の異なる溶液：
溶液１−０．５Ｍ酢酸ナトリウム
溶液２−０．５Ｍクエン酸ナトリウム
にｍＴＧを溶解することにより、７．５％（ｗ／ｗ）微生物性トランスグルタミナーゼ（１０％ｗ／ｗ  ｍＴＧ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ）溶液を調製した。
【０３６８】
粘度計試験
各粘度測定試験のため、５０ｍＬビーカー内で、２５ｍＬのゼラチン溶液を１２．５ｍＬのｍＴＧ溶液と混合した。次に、混合されたゼラチン−ｍＴＧ溶液の粘度をゲル化が起こるに従って追跡した。特定の速度およびこの試験に用いた特定のスピンドルにより、粘度計で記録可能な最大粘度の３０％および９０％を達成するために各試験群が必要とする時間を記録することによって、異なる試験群を比較した。
【０３６９】
この実験では、ＤＶ  ＩＩ＋  ＰＲＯ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ミドルボロ、マサチューセッツ州）をＴ−Ｅ  ９５「ｔ−ｂａｒ」スピンドルと共に用いた。粘度計試験の経過中、スピンドルの垂直運動を維持するためにヘリパス粘度計スタンドを用いた。ヘリパスは１ｃｍパスに沿って運動した。粘度計の読み取りは、粘度計およびＨｙｐｅｒＴｅｒｍｉｎａｌソフトウェアを用いた一秒当たり一読み取りの率で出力した。粘度測定試験のためのスピンドルの回転速度は０．５ｒｐｍであった。Ｔ−Ｅ  ９５スピンドルを用いたこの速度での記録可能な最高粘度は１０ｘ１０６ｃＰであり、これは３０％の点が３ｘ１０６ｃＰに等しく、９０％の点が９ｘ１０６ｃＰに等しかったことを意味する。
【０３７０】
全範囲の粘度計試験のため、ビーカーを３７℃の水浴中に浸した。試験群間の一貫性を確実にするため、試験の間を通してビーカー内の平均温度もまた記録した。
【０３７１】
結果
図２及び表１は、０．５Ｍ酢酸ナトリウム（溶液１）および０．５Ｍクエン酸ナトリウム（溶液２）中の７．５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％と反応した、１Ｍカルシウム２Ｍ尿素（溶液Ａ）中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチンの粘度変化を示す。
【０３７２】
【表１】
0005450612.tif 000004
【０３７３】
この実験の結果により、０．５Ｍ酢酸ナトリウム中のｍＴＧの使用は、０．５Ｍクエン酸ナトリウム中のｍＴＧに比較して著しく短い架橋時間を導くことが示された。
【実施例２】
【０３７４】
架橋時間における異なった緩衝液および緩衝液イオン濃度の効果
材料
実験には以下の材料を用いた：３００ブルーム、タイプＡ医薬用ブタゼラチン（７０メッシュ）［Ｉｔａｌ  Ｇｅｌａｔｉｎｅ、サンタヴィクトリアダルバ、イタリア］、尿素−最小値９９．５％［Ｓｉｇｍａ、セントルイス］、塩化カルシウム９７％乾燥粉末［Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ランチェスター］、無水クエン酸ナトリウム９９％［Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ランチェスター］、無水クエン酸［Ｆｒｕｔａｒｏｍ、イスラエル］、酢酸ナトリウム三水和物［Ｓｉｇｍａ、セントルイス］、氷酢酸分析グレード［Ｆｒｕｔａｒｏｍ、イスラエル］、および１０％微生物性トランスグルタミナーゼ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％（１０％酵素、９０％マルトデキストリン）［味の素、日本］。
【０３７５】
方法
以下の原液を調製した：２Ｍカルシウム溶液、４Ｍおよび４．５Ｍ尿素溶液、０．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液、２Ｍクエン酸ナトリウム溶液、および２．３６Ｍクエン酸溶液。
【０３７６】
２Ｍ尿素および１ＭＣａＣｌ２中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（溶液Ａ）を調製した。７．５％（ｗ／ｗ）微生物性トランスグルタミナーゼを調製し、以下の六溶液に溶解した：
溶液１−０．１Ｍ酢酸ナトリウム
溶液２−０．２５Ｍ酢酸ナトリウム
溶液３−０．５Ｍ酢酸ナトリウム
溶液４−０．２５Ｍクエン酸ナトリウム
溶液５−０．５Ｍクエン酸ナトリウム
溶液６−０．６Ｍクエン酸ナトリウム
【０３７７】
架橋（ＸＬ）時間を決定するため、２ｍＬのゼラチン溶液を１ｍＬの各型のｍＴＧ溶液と混合した。各型のｍＴＧ溶液のために、１２ウェル培養プレートの別々のウェル内で三つの別々のサンプルを調製した。均一な溶液を形成するために溶液を完全に混合し、次に混合した溶液が密着したゼラチン状の塊を形成する時間により、架橋時間を決定した。
【０３７８】
結果
表２に示すように、ｍＴＧ緩衝液中のより低いイオン濃度（０．５Ｍの代わりに０．１Ｍ）は、酢酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム緩衝液の両方でより速い架橋をもたらすことが見出された。
【０３７９】
【表２】
0005450612.tif 000005
0005450612.tif 000006
【０３８０】
表２の結果はイオン強度と架橋時間の間の直接の相関を示し、ここでｍＴＧ緩衝溶液中のより低いイオン強度はより迅速な架橋をもたらした。酢酸ナトリウム緩衝液中のｍＴＧ溶液はクエン酸ナトリウム緩衝液中のものよりもより迅速に架橋を行い、かつさらに均一なゲルを形成した。クエン酸ナトリウム緩衝液による酵素溶液はより遅く架橋を行い、おそらくクエン酸ナトリウムが原因の物理的なゼラチンのゲル化の結果として、不均一なゲルを形成した。しかしながら、クエン酸ナトリウム中のｍＴＧにより形成されたゲルは、酢酸ナトリウムによるゲルに比較してかなり柔軟かつ凝集性である。
【実施例３】
【０３８１】
架橋時間におけるゼラチン緩衝溶液のイオン強度の効果
材料
実験には以下の材料を用いた：３００ブルーム、タイプＡブタゼラチン［Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州］、酢酸ナトリウム−０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、酢酸ナトリウム−０．２５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、酢酸ナトリウム−０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）［Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ］、および１０％微生物性トランスグルタミナーゼ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％（１０％酵素、９０％マルトデキストリン）［味の素、日本］。
【０３８２】
方法
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン（溶液Ａ）、０．２５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン（溶液Ｂ）、０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン（溶液Ｃ）、０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ緩衝液中の７．５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ（溶液１）および０．２５Ｍ  Ｎａ−Ａｃ緩衝液中の７．５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ（溶液２）を調製した。
【０３８３】
結果
ゼラチン緩衝液のイオン濃度を０．２５〜０．５Ｍに上昇させることにより、架橋時間は短縮されることが見出された。しかしながら、ゼラチン緩衝液とｍＴＧ緩衝液の両方についてイオン濃度が高い場合、ゲルは形成されなかった。さらに、イオン濃度の高い緩衝液中のゼラチン溶液によって形成された架橋ゲルは、低いイオン濃度で形成されたゲルよりも熱安定性の低いことが見出された。
【０３８４】
表３、４および５に例証するように、イオン強度の増大するゼラチン溶液と０．１ＭのｍＴＧ溶液は、反応時間の改善により架橋時間を短縮した。Ｎａ−Ａｃが０．２５Ｍおよび０．５Ｍの形成ゲルには、０．１Ｍの形成ゲルに比較して顕著な違いは見られなかった。
【０３８５】
イオン強度の増大したｍＴＧ溶液とイオン強度の増大したゼラチン溶液により、ゲル形成反応時間がより長く、力学的に弱い架橋ゲルが供給された。
【０３８６】
【表３】
0005450612.tif 000007
【０３８７】
【表４】
0005450612.tif 000008
【０３８８】
【表５】
0005450612.tif 000009
【実施例４】
【０３８９】
転移点における塩化カルシウムおよび尿素の効果
材料
実験には以下の材料を用いた：３００ブルーム、タイプＡブタゼラチン［Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州］、９８％尿素［Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ランチェスター］、塩化カルシウム９７％［Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ランチェスター］、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳ−ダルベッコリン酸緩衝食塩水［Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル］、微生物性トランスグルタミナーゼＡＣＴＩＶＡ−ＷＭ、マルトデキストリン中の１％酵素粉末［味の素、日本］、１０％微生物性トランスグルタミナーゼ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％（１０％酵素、９０％マルトデキストリン）［味の素、日本］。
【０３９０】
方法
５Ｍカルシウム溶液、５Ｍ尿素溶液の原液を調製した。尿素およびカルシウム原液を希釈することにより、２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液、尿素およびカルシウム溶液を調製した。
【０３９１】
コントロールＡ−ゼラチンをＰＢＳに溶解した。
コントロールカルシウムＡ−ゼラチンを２Ｍカルシウムに溶解した。
コントロールカルシウムＢ−ゼラチンを１Ｍカルシウムに溶解した。
溶液Ｃ−ゼラチンを１Ｍカルシウムおよび２Ｍ尿素を含むＰＢＳ溶液に溶解した。
溶液Ｄ−ゼラチンを１Ｍカルシウムおよび３Ｍ尿素を含むＰＢＳ溶液に溶解した。
溶液Ｅ−ゼラチンを０．５Ｍカルシウムおよび２Ｍ尿素を含むＰＢＳ溶液に溶解した。
溶液Ｆ−ゼラチンを０．５Ｍカルシウムおよび３Ｍ尿素を含むＰＢＳ溶液に溶解した。
【０３９２】
結果
表６に示すように、尿素およびカルシウムは、２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液の転移点の低下において相乗的な効果を持つことが示された。２Ｍ尿素と組み合わせた１Ｍ塩化カルシウムを含む２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液は、室温にて低い粘性を有する。０．５Ｍ塩化カルシウムおよび３Ｍ尿素を含む２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液は、室温において粘性である。尿素を含むゼラチンゲルの架橋により、弱いゲルが供給された。尿素の濃度が高いほど、形成されたゲルは弱かった。ゼラチン溶液中のカルシウムの存在により、架橋ゲルの強度は増大した。
【０３９３】
【表６】
0005450612.tif 000010
【実施例５】
【０３９４】
ゼラチンおよびｍＴＧ溶液の各組み合わせのために用いられる架橋剤の適切な量を決定するために行われる最適化実験
材料
実験には以下の材料を用いた：Ｇｅｌｉｔａ３００ブルーム、タイプＡブタゼラチン（Ｍｅｄｅｘ、英国）、尿素９９．５％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、塩化カルシウム（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ランチェスター）、酢酸ナトリウム三水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、酢酸１００％（Ｒｉｄｅｌ−Ｄｅ  Ｈａｅｎ）、ＡＣＴＩＶＡ  ＴＧ（１０％タンパク質、９０％マルトデキストリン）微生物性トランスグルタミナーゼ（味の素、日本）、クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、クエン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、Ｄ−ソルビトール、９７％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）。
【０３９５】
原液の調製
０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ  ｐＨ６．０中の２Ｍカルシウム溶液を調製した。溶液をＷｈａｔｍａｎ濾紙１番を用いて濾過した。
【０３９６】
０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ  ｐＨ６．０中の４Ｍおよび５Ｍ尿素溶液を調製した。溶液を２２μｍセルロースアセテート膜による２５０ｍＬ濾過システムを用いて濾過し、冷蔵保管した。
【０３９７】
０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ溶液ｐＨ６．０を調製し、これを２２μｍセルロースアセテート膜による２５０ｍＬ濾過システムを用いて濾過し、冷蔵保管した。
【０３９８】
２Ｍクエン酸ナトリウム溶液を調製した。
【０３９９】
２．３６Ｍクエン酸溶液を調製した。
【０４００】
ゼラチン溶液の調製
２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液を異なる添加剤中で以下のように調製した：溶液Ａ−２Ｍ尿素、１Ｍ  ＣａＣｌ２、０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ  ｐＨ６．０中、溶液Ｂ−４．５Ｍ尿素、０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ  ｐＨ６．０中。
【０４０１】
ゼラチン粉末を完全に溶解するため、溶液を５０℃に熱して勢いよく攪拌した。次に溶液を２４℃のインキュベーターに渡し、使用まで一晩（ＯＮ）保管した。
【０４０２】
微生物性トランスグルタミナーゼ溶液の調製：
ｍＴＧ（ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％）を異なる濃度で、異なる溶液に溶解することにより、微生物性トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）溶液を調製した。溶液は使用直前に調製した。ｍＴＧを完全に溶解するため、プラスチックロッドを用いて溶液を勢いよく攪拌する必要があった。溶液は以下のように調製した：
溶液１−０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ中の７．５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％
溶液２−０．１Ｍ  Ｎａ−Ａ中の５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％
溶液３−０．１Ｍ  Ｎａ−Ａ中の６％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％
溶液４−０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ中の７％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％
溶液５−０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃによる３：１ソルビトール（乾燥ゼラチン重量に対する乾燥ソルビトール重量の比）中の５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％
溶液６−０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃによる３：１ソルビトール中の６．２５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％
溶液７−０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃによる３：１ソルビトール中の７．５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％
溶液８−０．１Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の１０％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％
溶液９−０．１Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の１２．５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％
溶液１０−０．１Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の２．５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％
溶液１１−０．１Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％
溶液１２−０．１Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の７．５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％
溶液１３−０．１Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の３％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％
溶液１４−０．５Ｍ  Ｎａ−クエン酸による３：１ソルビトール（ゼラチンに対するソルビトールの比）中の５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％
溶液１５−０．５Ｍ  Ｎａ−クエン酸による３：１ソルビトール（ゼラチンに対するソルビトールの比）中の６．２５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％
【０４０３】
粘度計試験
粘度計による実験は上記の手順に従って行った。
【０４０４】
結果
溶液は粘度計を通して試験し、各ｍＴＧ−ゼラチン溶液に至的な酵素濃度を決定した。各溶液について、実験を通しての平均温度、トルクの３０％までの時間、およびトルクの９０％までの時間を試験した。
【０４０５】
図３に、上記の異なる製剤について、粘度３ｘ１０６ｃＰ（完全に形成されたゲルの３０％）および９ｘ１０６ｃＰ（完全に形成されたゲルの９０％）までの時間を示す。
【０４０６】
図３Ａに、０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ中の４．５Ｍ尿素を含む上記の２５％ゼラチン溶液について、粘度に至るまでの時間を示す。全てについてそれぞれ、最初の二つのバーはｍＴＧ濃度５％についてのトルクの３０％および９０％までの時間に関し；、次の二つのバーはｍＴＧ濃度６％についてのトルクの３０％および９０％までの時間に関し；最後の二つのバーはｍＴＧ濃度７％についてのトルクの３０％および９０％までの時間に関する。示されるように、トルクの３０％および９０％両方までの時間はｍＴＧ濃度の増大に従って短縮し、ｍＴＧ量の増加は架橋の迅速性を増大することが示された。
【０４０７】
図３Ｂに、０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ中の４．５Ｍ尿素、およびソルビトール：ゼラチンの比が３：１で存在するソルビトールを含む上記の２５％ゼラチン溶液について、粘度に至るまでの時間を示す。最初の二つのバーはそれぞれｍＴＧ濃度６．３％についてのトルクの３０％および９０％までの時間に関し、最後の二つのバーはそれぞれｍＴＧ濃度７．５％についてのトルクの３０％および９０％までの時間に関する。再び、トルクの３０％および９０％両方までの時間はｍＴＧ濃度の増大に従って短縮した。
【０４０８】
図３Ｃに、０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ中の２Ｍ尿素および１Ｍカルシウム、７．５％の単一濃度であるｍＴＧを含む上記の２５％ゼラチン溶液について、粘度に至るまでの時間を示す。左のバーはトルクの３０％までの時間を示し、右のバーはトルクの９０％までの時間を示す。これらの条件下で、効果的な架橋もまた見出された。
【０４０９】
図３Ｄに、０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ中の２Ｍ尿素および１Ｍカルシウム、ならびにソルビトール：ゼラチンの比が３：１で存在するソルビトールを含む上記の２５％ゼラチン溶液について、粘度に至るまでの時間を示す。最初の二つのバーはそれぞれｍＴＧ濃度５％についてのトルクの３０％および９０％までの時間に関し、次の二つのバーはそれぞれｍＴＧ濃度６．３％についてのトルクの３０％および９０％までの時間に関し、最後の二つのバーはそれぞれｍＴＧ濃度７．５％についてのトルクの３０％および９０％までの時間に関する。図３Ｃに比較して、ソルビトールは、トルクへの時間が著しく短縮したように明らかに架橋のより大きな迅速性をもたらしたが、少なくとも幾らかはなおｍＴＧ濃度に依存する。
【０４１０】
図３Ｅに、ゼラチン溶液が０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中にあり、かつｍＴＧが０．５Ｍクエン酸緩衝液中にある、４．５Ｍ尿素を含む上記の２５％ゼラチン溶液について、粘度に至るまでの時間を示す。最初の二つのバーはそれぞれｍＴＧ濃度７．５％についてのトルクの３０％および９０％までの時間に関し、次の二つのバーはそれぞれｍＴＧ濃度５％についてのトルクの３０％および９０％までの時間に関し、最後の二つのバーはそれぞれｍＴＧ濃度２．５％についてのトルクの３０％および９０％までの時間に関する。カルシウムを含まない尿素の増大は、トルクへの時間が著しく短縮したように、なお架橋のより大きな迅速性をもたらしたが、少なくとも幾らかはなおｍＴＧ濃度に依存する。
【０４１１】
図３Ｆに、０．５Ｍクエン酸ナトリウムを含む０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ中の４．５Ｍ尿素を含み、ゼラチンに対して３：１の比のソルビトールを添加した上記の２５％ゼラチン溶液について、粘度に至るまでの時間を示す。二つのバーはそれぞれｍＴＧ濃度５％についてのトルクの３０％および９０％までの時間に関する。３０％または９０％にかかわらず、トルクへの時間から、ソルビトールは架橋率を減少させるようである。
【実施例６】
【０４１２】
タンパク質溶液の転移点における水酸化カルシウムの効果
この実施例は、ゼラチン溶液のゾル−ゲル転移点における水酸化カルシウムの効果について示す。水酸化カルシウムはこの転移点を低下させることが示された。
【０４１３】
材料
実験には以下の材料を用いた：３００ブルーム、タイプＡブタゼラチン（Ｇｅｌｉｔａ、スーシティー）、水酸化カルシウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、尿素９８％（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ランチェスター）、酢酸ナトリウム三水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、酢酸（Ｆｒｕｔａｒｏｎ、イスラエル）。
【０４１４】
方法
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、４Ｍ尿素、および２Ｍ水酸化カルシウムの原液を調製した。
【０４１５】
以下の溶液を調製した：
コントロール−０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液
溶液Ａ−２Ｍ  ＣａＯＨ中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン
溶液Ｂ−２Ｍ尿素  １Ｍ  ＣａＯＨ中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液
溶液Ｃ−０．５Ｍ  ＣａＯＨ中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液
【０４１６】
全ての溶液は、均一な溶液の形成を確実にするために撹拌を続ける間、５０℃に熱した。溶液が均一になった後、全ての溶液を２２℃の環境に移した。２時間後、物理的状態（液体またはゲル）を評価するために手で溶液に触れた。
【０４１７】
結果
溶液ＡおよびＢは２２℃で液体であったがコントロール溶液および溶液Ｃはゲルであったことから、水酸化カルシウムはゼラチン溶液のゾル−ゲル転移点を低下し得り、かつこの効果は用量依存性であることが示された。
【実施例７】
【０４１８】
ゼラチン溶液のｍＴＧ架橋におけるカルシウム金属イオン封鎖剤の効果
ＥＤＴＡまたはクエン酸ナトリウムがｍＴＧ溶液に添加されたｍＴＧによって促進されるゼラチン溶液の架橋の効果を以下の実施例に記載する。
【０４１９】
材料
実験には以下の材料を用いた：３００ブルーム、タイプＡブタゼラチン［Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州］、９８％尿素［Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ランチェスター］、塩化カルシウム９７％［Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ランチェスター］、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳ−ダルベッコリン酸緩衝食塩水［Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル］、エチレンジアミン四酢酸、無水クエン酸ナトリウム９９％［Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ランチェスター］、無水クエン酸［Ｆｒｕｔａｒｏｍ、イスラエル］、微生物性トランスグルタミナーゼＡＣＴＩＶＡ−ＷＭ、マルトデキストリン中の１％酵素粉末［味の素、日本］、１０％微生物性トランスグルタミナーゼ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％（１０％酵素、９０％マルトデキストリン）［味の素、日本］。
【０４２０】
方法
５Ｍカルシウム溶液、５Ｍ尿素溶液、および２Ｍ  ＥＤＴＡの原液を調製した。尿素およびカルシウム原液を希釈することにより、２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液、尿素およびカルシウム溶液を調製した。
【０４２１】
コントロールＡ−ゼラチンをＰＢＳに溶解した。
コントロールカルシウムＡ−ゼラチンを２Ｍカルシウムに溶解した。
コントロールカルシウムＢ−ゼラチンを１Ｍカルシウムに溶解した。
溶液Ｃ−ゼラチンを１Ｍカルシウムおよび２Ｍ尿素を含むＰＢＳ溶液に溶解した。
溶液Ｄ−ゼラチンを１Ｍカルシウムおよび３Ｍ尿素を含むＰＢＳ溶液に溶解した。
溶液Ｅ−ゼラチンを０．５Ｍカルシウムおよび２Ｍ尿素を含むＰＢＳ溶液に溶解した。
溶液Ｆ−ゼラチンを０．５Ｍカルシウムおよび３Ｍ尿素を含むＰＢＳ溶液に溶解した。
溶液Ｇ−ゼラチンを４Ｍ尿素を含むＰＢＳ溶液に溶解した。
【０４２２】
０．２％ｗ／ｗ  ｍＴＧ溶液（ＡＣＴＩＶＡ−ＷＭの２０％ｗ／ｗ溶液：１％ｍＴＧ、９９％マルトデキストリン）を以下のように調製した：
ｍＴＧコントロール−ｍＴＧをＰＢＳ中に溶解した。
溶液１−ｍＴＧをＰＢＳ中の２Ｍ  ＥＤＴＡ溶液に溶解した（注記：ｍＴＧをＥＤＴＡ中に溶解する間、わずかに白色の不透明な溶液が形成された。ｍＴＧは、後に溶液中に溶解した凝集塊を形成した）。
溶液２−ｍＴＧをＰＢＳ中の１．５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液に溶解した。
溶液３−ｍＴＧをＰＢＳ中の０．７５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液に溶解した。
溶液４−ｍＴＧを２Ｍクエン酸ナトリウムを含む溶液中に溶解した。
溶液５−ｍＴＧを１Ｍクエン酸ナトリウムを含む溶液中に溶解した。
溶液６−ｍＴＧを０．５Ｍクエン酸ナトリウムを含む溶液中に溶解した。
１％ｗ／ｗの濃縮ｍＴＧ溶液（ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧの１０％ｗ／ｗ溶液：１０％ｍＴＧ、９０％マルトデキストリン）溶液を調製した：
コントロール−ＰＢＳに溶解した濃縮ｍＴＧ。
溶液７−０．５Ｍクエン酸ナトリウム溶液に溶解した濃縮ｍＴＧ。
【０４２３】
結果
以下の表７および８に、ｍＴＧにより架橋（ＣＬ）されたゼラチンゲルについての実験結果を要約する。表７にはＥＤＴＡを含むｍＴＧにより架橋されたゼラチンゲルについて記載され、表８にはクエン酸ナトリウムを含むｍＴＧにより架橋されたゼラチンゲルについて記載される。ゼラチン溶液におけるクエン酸ナトリウムの効果を表９に要約する。
【０４２４】
【表７】
0005450612.tif 000011
0005450612.tif 000012
【０４２５】
【表８】
0005450612.tif 000013
【０４２６】
【表９】
0005450612.tif 000014
【０４２７】
上の表に示されるように、ＥＤＴＡはゼラチン溶液を物理的に架橋する。高濃度のＥＤＴＡ（０．７５〜２Ｍ）は、ゼラチン溶液を直ちに架橋した。ＥＤＴＡにより架橋されたゼラチンゲルは接着性ではなかった。ＥＤＴＡはゼラチンと混合されたときに非常に強く柔軟なゲルを形成した。ＥＤＴＡの濃度が高いほど、形成されたゲルは強くなった。中程度のＥＤＴＡ濃度（０．５〜０．７５Ｍ）においては、不均一な架橋が起こった。これはおそらく試薬の不十分な混和によるものである。低めのＥＤＴＡ濃度（０．５Ｍ未満）においてゼラチン溶液の架橋は見られず、ゼラチンはわずかに粘性となった。ＥＤＴＡを含むｍＴＧ溶液によるゼラチン溶液の架橋によって、接着性の、強く柔軟なゲルが作られた。
【０４２８】
クエン酸ナトリウムは２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液を物理的に架橋した。形成されたゲルは３７℃で安定であった。クエン酸ナトリウムは、接着性ではない、高度に柔軟で強いゲルを形成した。１Ｍおよび２Ｍのクエン酸ナトリウム溶液は、添加剤を含むかまたは含まない２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液を直ちに架橋した。０．５ないし０．７５Ｍの範囲の濃度におけるクエン酸ナトリウム溶液は、ゼラチンを添加剤なしで直ちに架橋した。しかしながら、尿素を含むゼラチン溶液は粘性になっただけであった。本明細書中に提示される実験によれば、０．１ないし０．５Ｍの範囲の濃度におけるクエン酸ナトリウム溶液の使用によって物理的ゲル化はもたらされなかった。これらの濃度よりも上では、クエン酸ナトリウムの濃度が高いほど、形成されたゲルは強くなった。この結果により、ｍＴＧの存在下または非存在下で、ゼラチン溶液に対する架橋剤としてのクエン酸ナトリウムの使用が示唆された。形成されたゲルの３７℃での安定性により、これらのゲルは、外科的なシーリングのような応用に対する体腔内でのｉｎ  ｓｉｔｕ架橋のために使用できることが示唆される。クエン酸ナトリウムはゼラチンによって接着性のゲルを形成しないと考えられることから、クエン酸ナトリウムとｍＴＧの組み合わせは好ましいか、または考慮され得る。０．５Ｍのクエン酸ナトリウムを含むｍＴＧ溶液によって架橋されたゼラチン溶液により、高度に柔軟で、強い接着性のゲルが形成された。
【実施例８】
【０４２９】
ゼラチン溶液のｍＴＧによる架橋におけるカルゴンの効果
本明細書中で用いられる「カルゴン」との語は、例えばヘキサメタリン酸ナトリウムのような非晶質のポリリン酸ナトリウムを指す。
【０４３０】
材料
以下の材料を用いた：３００ブルーム、タイプＡブタゼラチン［Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州］、９８％尿素［Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ランチェスター］、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１）は前述の通りに調製した、０．５Ｍ無水クエン酸ナトリウム９９％［Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ランチェスター］、塩化カルシウム９７％乾燥粉末［Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ランチェスター］、カルゴン［Ｇｌｏｂａｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ＩＮＣ］、１０％微生物性トランスグルタミナーゼ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％（１０％酵素、９０％マルトデキストリン）［味の素、日本］。
【０４３１】
酢酸ナトリウム中の４Ｍ尿素原液、および塩化カルシウム溶液の４Ｍ原液を調製した。
【０４３２】
方法
以下のコントロールおよび実験的溶液を調製した：
ゼラチン溶液Ａ、４Ｍ尿素を含む２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン
ゼラチン溶液Ｂ、２ＭＣａＣｌ２を含む２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン
ゼラチン溶液Ｃ、２Ｍ尿素１ＭＣａＣｌ２を含む２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン
ゼラチン溶液Ｄ、２Ｍ尿素２ＭＣａＣｌ２を含む２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン
ｍＴＧ溶液１、０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ緩衝液中の０．５％ｍＴＧ−５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％
ｍＴＧ溶液２、１０％ｗｔカルゴンを含む、０．５％ｍＴＧ−５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％
ｍＴＧ溶液３、５％ｗｔカルゴンを含む、０．５％ｍＴＧ−５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％
ｍＴＧ溶液４、５％ｗｔカルゴンを含む、１．０％ｍＴＧ−１０％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％
ｍＴＧ溶液５、５％ｗｔカルゴンを含む、２．０％ｍＴＧ−２０％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％
ｍＴＧ溶液６、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中の５％ｗｔカルゴンを含む、１．０％ｍＴＧ−１０％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％
ｍＴＧ溶液７、０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中の５％ｗｔカルゴンを含む、１．０％ｍＴＧ−１０％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％。
【０４３３】
異なるゼラチン溶液と異なるｍＴＧ溶液との混合により形成されたゲルのゲル特性は、２ｍＬのゼラチン溶液と１ｍＬのｍＴＧ溶液とを十分に混合することによって主観的に試験された。次にゼラチンの塊全体が密着した固体ゲルの形成時間としてゲル化時間を評価することにより、ゲル化時間を追跡した。
【０４３４】
結果
カルゴン使用についての最初の試験により、カルシウムを含まないコントロール溶液の架橋時間が軽度に短縮されることが証明された。しかしながら、力学的特性の改善は認められなかった。カルゴンは非常に接着性で弾力のあるゲルの形成をもたらしたが、カルシウム添加剤を含む溶液の架橋時間を著しく延長させることもまた証明された。さらに、５％ｗｔカルゴン溶液が同等の１０％ｗｔカルゴン溶液よりも良いゲルを迅速に産生するように、カルゴンは低めの濃度でより良く作用するようである。
【０４３５】
【表１０】
0005450612.tif 000015
0005450612.tif 000016
【０４３６】
さらなる試験によれば、カルゴンにより非常に接着性で弾力のあるゲルが作られたが、カルシウム添加剤を含む溶液における架橋時間もまた有意に延長した。カルゴンにより形成されたゲルの力学的特性（接着性、弾性、強度）は長時間（４５＋分）保持され、時間の進行と共に改善された。０．１Ｍ酢酸ナトリウムまたは０．５Ｍクエン酸ナトリウム中の、５％ｗｔカルゴンを含む１０％ｗ／ｗ  ｍＴＧ溶液の使用は、２Ｍ尿素、１Ｍ  Ｃａ中の２５％ｗ／ｗゼラチンに対し、２Ｍ尿素、２Ｍ  Ｃａ中の２５％ｗ／ｗゼラチンに比較して短い架橋時間（より速い反応）をもたらした。２Ｍ尿素、２Ｍ  Ｃａ中の２５％ｗ／ｗゼラチンは、０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ中のｍＴＧ溶液により、０．５Ｍ  Ｎａ−クエン酸中のｍＴＧ溶液と比較してより速く架橋ゲルを形成した。
【０４３７】
【表１１】
0005450612.tif 000017
0005450612.tif 000018
0005450612.tif 000019
【実施例９】
【０４３８】
尿素によるゾル−ゲル転移点を低下させる効果を逆転させるためのウレアーゼの使用
材料
実験には以下の材料を用いた：Ｇｅｌｉｔａ２７５ブルーム、タイプＡブタゼラチン（Ｇｅｌｉｔａ、スーシティー）、９８％尿素（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ランチェスター）、酢酸ナトリウム三水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、酢酸１００％（Ｒｉｄｅｌ−Ｄｅ  Ｈａｅｎ）、ウレアーゼタイプＩＩＩ：タチナタマメ由来（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）。
【０４３９】
方法
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、および４．５Ｍ尿素溶液の原液を調製した。
【０４４０】
０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％ｗ／ｗゼラチン溶液（溶液Ａ）および４．５Ｍ尿素、０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含む２５％ｗ／ｗゼラチン溶液（溶液Ｂ）を調製した。
【０４４１】
溶液が均一になった後、溶液Ｂの半分を０．１２５ｇのウレアーゼ（５０００単位）を加えた別のビーカーに移し（溶液Ｃ）、持続的に攪拌した。次に溶液Ａ、Ｂ、およびＣを２２℃の環境に移した。
【０４４２】
結果
２２℃において６０分後、溶液Ｂは粘性の液体のままであったが、溶液ＣおよびＡはゲルの形態に戻ったことが見出された。
【０４４３】
これらの結果からウレアーゼは、ゼラチン溶液への尿素添加によるゾル−ゲル転移点を低下させる効果を逆転させることが示された。
【実施例１０】
【０４４４】
架橋ゲルの柔軟性におけるソルビトールの効果；ｍＴＧ架橋反応の促進におけるソルビトールの効果
材料
以下の材料を用いた：ゼラチン−３００ブルーム、タイプＡブタゼラチン［Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州］、９８％尿素［Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ランチェスター］、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１）、塩化カルシウム９７％［Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ランチェスター］、無水クエン酸ナトリウム９９％［Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ランチェスター］、無水クエン酸［Ｆｒｕｔａｒｏｍ、イスラエル］、１０％微生物性トランスグルタミナーゼ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％（１０％酵素、９０％マルトデキストリン）［味の素、日本］。
【０４４５】
方法
以下の溶液を調製した：Ｎａ−Ａｃ中の４Ｍ尿素溶液、４Ｍカルシウム溶液、２Ｍクエン酸ナトリウム溶液を調製した、０．５Ｍクエン酸ナトリウム溶液を調製した。
ゼラチン溶液Ａ−４Ｍ尿素を含む２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン。
ゼラチン溶液Ｂ−２Ｍ尿素および１Ｍ  Ｃａを含む２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン
ｍＴＧ溶液１−１：１（ｗ／ｗ）（ゼラチン溶液中の乾燥ゼラチン重量に関して）ソルビトールおよび０．５Ｍ  Ｎａ−クエン酸を含む０．５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ溶液（５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ溶液）
ｍＴＧ溶液２−２：１（ｗ／ｗ）（ゼラチン溶液中の乾燥ゼラチン重量に関して）ソルビトールおよび０．５Ｍ  Ｎａ−クエン酸を含む０．５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ溶液（５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ溶液）
ｍＴＧ溶液３−３：１（ｗ／ｗ）（ゼラチン溶液中の乾燥ゼラチン重量に関して）ソルビトールおよび０．５Ｍ  Ｎａ−クエン酸を含む０．５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ溶液（５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ溶液）。
【０４４６】
結果
この実験的実施例の実験データにより、ソルビトールは、クエン酸ナトリウム緩衝液中のｍＴＧによって調製されたゲルの柔軟性をさらに増強させることが確認された。
【０４４７】
表１２〜１４に例証されるように、ｍＴＧ溶液中のソルビトールおよびクエン酸ナトリウムの使用により、４Ｍ尿素中の２５％ｗ／ｗゼラチンならびに２Ｍ尿素および１Ｍ  ＣａＣｌ２中の２５％ｗ／ｗゼラチンの両方についてかなり柔軟なゲルが産生されることが証明された。従って、ソルビトールは柔軟性特性の増強、同様にｍＴＧ活性の維持に役立ち得る。ソルビトール濃度の増大はより速い架橋反応を導くこともまた見出された。
【０４４８】
【表１２】
0005450612.tif 000020
【０４４９】
【表１３】
0005450612.tif 000021
【０４５０】
【表１４】
0005450612.tif 000022
【実施例１１】
【０４５１】
可塑剤としてのアラビアゴム、グアーガム、ＰＶＡ、ＰＥＧ６０００、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）
アラビアゴム、グアーガム、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００、およびＰＶＰは、それらが溶解される溶液中のスペーサーとして作用し得る可塑剤である。この実施例により、これらの可塑剤が、架橋タンパク質溶液の柔軟性を改善するために、タンパク質溶液の架橋に用いられる架橋剤溶液中に添加されてよいことが示される。
【０４５２】
材料
実験には以下の材料を用いた：Ｇｅｌｉｔａ２７５ブルーム、タイプＡブタゼラチン（Ｇｅｌｉｔａ、スーシティー）、尿素９９．５％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、酢酸ナトリウム三水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、酢酸１００％（Ｒｉｄｅｌ−Ｄｅ  Ｈａｅｎ）、ＡＣＴＩＶＡ  ＴＧ（１０％タンパク質、９０％マルトデキストリン、味の素、日本）、クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、クエン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、塩化ナトリウム（Ｆｒｕｔａｒｏｍ、イスラエル）、アラビアゴム（Ｓｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、ＰＶＡ（Ｍｅｒｃｋ；ダルムシュタット、ドイツ）、ＰＥＧ６０００（Ｆｌｕｋａ；セントルイス、ミズーリ州）、グアーガム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；セントルイス、ミズーリ州）、プラスドン  Ｋ−９０の形態であるＰＶＰ（ＩＳＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．；テキサスシティー、テキサス州）。
【０４５３】
以下の原液を調製した：０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ溶液  ｐＨ６．０、０．４Ｍ  Ｎａ−クエン酸溶液  ｐＨ６．０、０．１  Ｎａ−Ａｃ溶液中の４．５Ｍ尿素、０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ  ｐＨ６．０中の２Ｍ  ＣａＣ１２原液、ＷＦＩ中の４０％ｗ／ｖアラビアゴム溶液、ＷＦＩ中の５％ｗ／ｖグアーガム溶液、ＷＦＩ中の２０％ｗ／ｗ  ＰＶＰ溶液、ＷＦＩ中の５％ｗ／ｖ  ＰＶＡ溶液、ＷＦＩ中の５％ｗ／ｖグアーガム溶液、ＷＦＩ中の１０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ６０００。
【０４５４】
３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  ＣａＣｌ２、および０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃの緩衝液中に、１２．５％ｗ／ｗ（溶液Ａ）および２５％ｗ／ｗ（溶液Ｂ）のゼラチン溶液を調製した。
【０４５５】
０．４Ｍ  Ｎａ−クエン酸中にＡｃｔｉｖａ  ＴＧ（１０％ｍＴＧ、９０％マルトデキストリン）を溶解することにより、０．３７５％ｗ／ｗ（溶液１）および０．５％ｗ／ｗ（溶液２）のｍＴＧ粉末溶液を調製した。
【０４５６】
方法
０．３７５％ｍＴＧ溶液（溶液１）の一定分量を、各可塑剤の原液と共に容積測定比１：１にて混合した。必要とされる可塑剤の濃度が原液の半分よりも少ない場合、可塑剤をｍＴＧ溶液との混合前に希釈した。ｍＴＧ−可塑剤溶液のそれぞれの型について、１０ｍＬの溶液を２０ｍＬのゼラチン溶液Ａと十分に混合し、１００ｍＬのビーカー内に注いだ。
【０４５７】
１００ｍＬのビーカー内で３０ｍＬの材料により形成されたゼラチン−ｍＴＧ−可塑剤プラグを、溶液の混合から１０分以内にビーカーから除いた。次に各プラグを生理食塩水中で２４時間、室温にて保管した。
【０４５８】
２４時間の保管時間に続き、各プラグは盲検試験者の手によって触れられ、プラグの柔軟性が１−３（＋、＋＋、または＋＋＋）のスケールにおいて判断された。各プラグの型に対し、柔軟性の標識が記録された。
【０４５９】
結果
以下の表に示すように、コントロールゲル（可塑剤なし）をベースラインの柔軟性（＋）として標識し、その他の可塑剤群はゲルの柔軟性の顕著な増大を示す標識を与えられた。
【０４６０】
【表１５】
0005450612.tif 000023
【実施例１２】
【０４６１】
ゲル化時間におけるｍＴＧ溶液の濃度による効果
材料および方法
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中に１０％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ粉末を溶解することにより、ｍＴＧ溶液を調製した。用いたｍＴＧは、９９％マルトデキストリンおよび１％タンパク質を含んでなるＡＣＴＩＶＡ  ＷＭ（味の素、日本）である。各ｍＴＧ溶液の量は、担体物質および緩衝剤を除くための５０ｋＤａ限外濾過カートリッジを用いて、示される率へ濃縮された。
【０４６２】
別に、ｐＨ６．０の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中に２０％（ｗ／ｗ）タイプＡ、３００ブルームゼラチンを含むゼラチン溶液を調製した。
【０４６３】
ｍＴＧ溶液を濃縮した後、各ｍＴＧ溶液の一定分量をゼラチン溶液の一定分量に、容積測定比１：２、ｍＴＧ溶液：ゼラチン溶液にて加えた。次にこの混合物を十分に混合した。混合した組成物をチューブ内で３０秒ごとに反転し、組成物が流動しなくなった時間をゲル化時間として定義した。
【０４６４】
結果
表１６に、ゲル化時間におけるｍＴＧ溶液の濃度による効果について示す。
【０４６５】
【表１６】
0005450612.tif 000024
【実施例１３】
【０４６６】
微生物性トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）の精製過程
この実施例は微生物性トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）の精製過程に関し、この精製過程では、限定されない例として、ミリグラムあたり＞２５酵素単位、＞９５％電気泳動的純度、グラムあたり＜５エンドトキシン単位、および＜１０ＣＦＵ／ｇの特異的活性を持つｍＴＧ組成物を産生するための食物グレードであるｍＴＧ製品が精製される。
【０４６７】
食物グレードのｍＴＧ産物（Ａｃｔｉｖａ（商標）ＴＧ；味の素、日本）を未加工の出発物質として使用した。このｍＴＧ製品の最初の特性を表１７に示す：
【０４６８】
【表１７】
0005450612.tif 000025
【０４６９】
この食物グレード製品は以下に示す精製過程のスキームにより処理された：
【０４７０】
【表１８】
0005450612.tif 000026
【０４７１】
得られた精製ｍＴＧ溶液について、以下の表１９Ａに示す：
【０４７２】
【表１９Ａ】
0005450612.tif 000027
【０４７３】
図４に、精製した材料のゲル電気泳動の結果を示す（レーン２〜８）。各レーンには、表１９Ｂに示すように、１〜２０μｇの範囲の異なった量の精製ｍＴＧを負荷した：
【０４７４】
【表１９Ｂ】
0005450612.tif 000028
【０４７５】
レーン１に分子量標準を、既知の分子量と共に示す。精製ｍＴＧは約３８ｋｄの主要バンドにより表される。デンシトメトリーの直線性は６μｇを超える負荷量では計算されなかったことから、６マイクログラムのタンパク質のバンド（レーン５）をデンシトメトリー分析に使用した。結果を以下の表２０に示す。
【０４７６】
【表２０】
0005450612.tif 000029
【０４７７】
上の表２０の結果は、主要バンドの濃さがサンプル中の総タンパク質の〜９５．９％を含むことを示す。この精製過程により、食物グレードのｍＴＧは医学上の使用にさらに適したｍＴＧ組成物へと精製可能であることが示される。
【実施例１４】
【０４７８】
架橋剤物質溶液の粘性増大のための、アルギン酸エステル、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、キサンタンガム、グアーガム、ＰＶＰの使用
アルギン酸エステル、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、キサンタンガム、グアーガム、およびＰＶＰは、それらが溶解された溶液の粘性を増大させる公知の増粘剤（ｖｉｓｃｏｆｉｅｒｓ）である。この例によってこれらの増粘剤（ｖｉｓｃｏｆｉｅｒｓ）が、架橋タンパク質溶液に対して用いられる架橋剤溶液に、タンパク質のゲル化をもたらす架橋率を５０％を超えて阻害することなく添加できることが示された。さらに驚くべきことには、これらの増粘剤（ｖｉｓｃｏｆｉｅｒｓ）の幾つかはゲル化速度を促進する。
【０４７９】
材料
実験には以下の材料を用いた：Ｇｅｌｉｔａ２７５ブルーム、タイプＡブタゼラチン（Ｇｅｌｉｔａ、スーシティー）、尿素９９．５％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、酢酸ナトリウム三水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、酢酸１００％（Ｒｉｄｅｌ−Ｄｅ  Ｈａｅｎ）、ＡＣＴＩＶＡ  ＴＧ（１０％タンパク質、９０％マルトデキストリン、味の素、日本）、クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、クエン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、塩化ナトリウム（Ｆｒｕｔａｒｏｍ、イスラエル）、アルギン酸エステル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；セントルイス、ミズーリ州）、アラビアゴム（Ｓｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、カルボキシメチルセルロース（高および中粘度、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；セントルイス、ミズーリ州）、キサンタンガム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、グアーガム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；セントルイス、ミズーリ州）、プラスドン  Ｋ−９０（ＩＳＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．；テキサスシティー、テキサス州）。
【０４８０】
以下の原液を調製した：０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ溶液  ｐＨ６．０、０．４Ｍ  Ｎａ−クエン酸溶液  ｐＨ６．０、０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ溶液中の４．５Ｍ尿素、０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ  ｐＨ６．０中の２Ｍ  ＣａＣ１２原液、注射用水（ＷＦＩ）中の５％ｗ／ｖアルギン酸エステル溶液、ＷＦＩ中の４０％ｗ／ｖアラビアゴム溶液、ＷＦＩ中の４．２％ｗ／ｖ中粘度ＣＭＣ溶液、ＷＦＩ中の２．５％ｗ／ｖ高粘度ＣＭＣ溶液、ＷＦＩ中の１．８％ｗ／ｖキサンタンガム溶液、ＷＦＩ中の５％ｗ／ｖグアーガム溶液、ＷＦＩ中の２０％ｗ／ｗ  プラスドン溶液。
【０４８１】
３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  ＣａＣｌ２、および０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃの緩衝液中に、１２．５％ｗ／ｗ（溶液Ａ）および２５％ｗ／ｗ（溶液Ｂ）のゼラチン溶液を調製した。
【０４８２】
０．４Ｍ  Ｎａ−クエン酸中にＡｃｔｉｖａ  ＴＧを溶解することにより、３．７５％ｗ／ｗ（溶液１）および５％ｗ／ｗ（溶液２）のｍＴＧ粉末溶液を調製した。
【０４８３】
方法
３．７５％ｍＴＧ溶液（溶液１）の一定分量を、各増粘剤（ｖｉｓｃｏｆｉｅｒ）の原液と共に容積測定比１：１にて混合した。必要とされる増粘剤（ｖｉｓｃｏｆｉｅｒ）の濃度が原液の半分よりも少ない場合、増粘剤（ｖｉｓｃｏｆｉｅｒ）をｍＴＧ溶液との混合前に希釈した。手動での撹拌により、各ｍＴＧ−増粘剤（ｖｉｓｃｏｆｉｅｒ）溶液の粘度を定性的に評価した。
【０４８４】
ｍＴＧ−増粘剤（ｖｉｓｃｏｆｉｅｒ）溶液のそれぞれの型について、１０ｍＬの溶液を２０ｍＬのゼラチン溶液Ａと十分に混合し、１００ｍＬのビーカー内に注いだ。次に、混合した溶液の粘度の増大を、ＤＶ−ＩＩ＋  Ｐｒｏ  Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ；ミドルボロ、マサチューセッツ州）を用い、０．５ＲＰＭの速度でらせん状のパスに沿って運動するｔ−ｂａｒスピンドルを用いて追跡した。この実験は、ｍＴＧ−増粘剤（ｖｉｓｃｏｆｉｅｒ）溶液のそれぞれの型について３回反復した。
【０４８５】
架橋率は、ゼラチン−ｍＴＧ−増粘剤（ｖｉｓｃｏｆｉｅｒ）溶液が、９ｘ１０６ｃＰの粘度を達成するまでに費やした時間の長さにより定義した。架橋の阻害のパーセンテージを決定するため、次に各ゼラチン−ｍＴＧ−増粘剤（ｖｉｓｃｏｆｉｅｒ）組成物の平均架橋率を、増粘剤（ｖｉｓｃｏｆｉｅｒ）を含まないコントロールのゼラチン−ｍＴＧ−組成物の平均と比較した。
【０４８６】
結果
プラスドン、キサンタンガム、ＣＭＣ、アラビアゴム、およびアルギン酸エステルを含むｍＴＧ溶液の粘度は、増粘剤（ｖｉｓｃｏｆｉｅｒ）を添加しないｍＴＧ溶液よりも顕著に粘性であることが観察された。
【０４８７】
図５で、異なる増粘剤（ｖｉｓｃｏｆｉｅｒ）によるゼラチン−ｍＴＧ溶液の相対的架橋率を見ることができ、これは異なる可塑剤のコントロールに比較した相対架橋率を表す。架橋は粘度測定を用いて定量的に測定した。カラムの表題中のパーセンテージ値は、ゲル中の可塑剤の濃度を指す。
【０４８８】
いずれの増粘剤（ｖｉｓｃｏｆｉｅｒ）も、反応を３０％を超えて阻害しなかった。プラスドン、キサンタンガム、および高粘度ＣＭＣは架橋率を促進した。
【実施例１５】
【０４８９】
ｍＴＧ架橋ゼラチン組成物に対する組織反応の、グルタミン酸塩による改善
材料
実験には以下の材料を用いた：Ｇｅｌｉｔａ２７５ブルーム、タイプＡブタゼラチン（Ｇｅｌｉｔａ、スーシティー）、尿素９９．５％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、酢酸ナトリウム三水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、酢酸１００％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、クエン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、Ｌ−グルタミン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、微生物性トランスグルタミナーゼ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ（１０％酵素、９０％マルトデキストリン）（味の素、日本）、８匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット。
【０４９０】
二種のゼラチン溶液を調製した：
１）４．５Ｍ尿素、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（溶液Ａ）。
２）１．２ｇ／ゼラチン溶液１００ｍＬの濃度にてＬ−グルタミン酸塩が添加された上の溶液（溶液Ｂ）。
【０４９１】
０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の７．５％（ｗ／ｗ）Ａｃｔｉｖａ  ＴＧ溶液（ｍＴＧ溶液）もまた調製した。
【０４９２】
方法
各移植の前に、一ゼラチン溶液をｍＴＧ溶液と共に容積測定比２：１にて混合した。次に、混合したゼラチン−ｍＴＧ組成物の０．１ｍＬを、ＳＤラットにおける４か所の別々の皮下部位へ直ちに移植した。これは、４匹のラットはゼラチン溶液Ａにより、かつ４匹のラットはゼラチン溶液Ｂ（グルタミン酸塩）によって、８匹のラットにおいて反復された。
【０４９３】
１４日後、ラットを屠殺した。移植部位からの病変部を除去し、組織病理学的評価を行った。
【０４９４】
それぞれに予定された剖検時間の間に全ての動物から全ての組織を回収し、試験研究室への発送前に少なくとも４８時間の固定時間の間、１０％中性緩衝ホルマリン（約４％ホルムアルデヒド溶液）中で固定した。
【０４９５】
研究プロトコルにリストされる組織について、スライドの準備とそれに続く組織病理学的試験を行った。組織は切り取られ、パラフィン中に包埋され、おおよそ５ミクロンの厚さの切片が作られ、ヘマトキシリン＆エオジン（Ｈ＆Ｅ）により染色された。
【０４９６】
１４日後に屠殺された各群の一般的評価およびスコア化は個別に行った。全スコア値は相対的であり、慢性および急性炎症スコアの両方を含む。
【０４９７】
結果
移植１４日後に屠殺されたラットの各材料についての組織病理学的スコア化（値は４匹の動物の平均）。結果を表２１および２２に示す。
【０４９８】
【表２１】
0005450612.tif 000030
【０４９９】
【表２２】
0005450612.tif 000031
【０５００】
これらの結果により、移植された架橋ゼラチン組成物へのグルタミン酸塩の添加は、それ以外は同等な条件下で、低いレベルの炎症反応をもたらしたことが示される。
【実施例１６】
【０５０１】
カオトロープにより低下したゾル−ゲル転移点を持つゼラチン溶液の物理的ゲル化の回復におけるプロリンおよびトレハロースの効果
材料
実験には以下の材料を用いた：Ｇｅｌｉｔａ２７５ブルーム、タイプＡブタゼラチン（Ｇｅｌｉｔａ、スーシティー）、尿素９９．５％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、酢酸ナトリウム三水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、酢酸１００％（Ｒｉｄｅｌ−Ｄｅ  Ｈａｅｎ）、プロリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、トレハロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）。
【０５０２】
方法
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、緩衝液ｐＨ６．０、４．５Ｍ尿素、２Ｍ  ＣａＣｌ２の原液を調製した。
【０５０３】
３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（コントロール溶液）、１Ｍプロリン、３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（溶液Ａ）、１．５Ｍプロリン、３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（溶液Ｂ）；０．５Ｍプロリン、０．４Ｍトレハロース、３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（溶液Ｃ）；１．５Ｍプロリン、０．４Ｍトレハロース、３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（溶液Ｄ）；を調製した。均一な溶液を得るため、すべての溶液を持続的に攪拌しながら５０℃に熱した。
【０５０４】
溶液を得た後、すべての溶液を２５℃に設定した恒温槽へ移した。６０分後、溶液に触れることによって各溶液の物理的状態を調べた。次に溶液を２２℃に移し、さらに６０分後、再び物理的状態を調べた。
【０５０５】
結果
２５℃において、コントロール溶液は予想通り軽度に粘性のある液体にとどまった。溶液Ａは高度に粘性であった。６０分後、溶液Ｂ、ＣおよびＤは完全にゲル化した。
【０５０６】
２２℃においてさらに６０分後、溶液Ａは同様に固体ゲルを形成した。
【０５０７】
コントロールゼラチン溶液は、２２℃または２５℃においてゲルを形成しなかった。
【０５０８】
これらの観察は、コントロール溶液との比較において、プロリンの添加がより高いゼラチン溶液の転移点を導くことを示す。この結果はまた、０．５Ｍプロリンと０．４Ｍトレハロースは２５℃でゲル化を起こしたが１Ｍプロリン単独では起こさなかったことから、プロリン単独と比較して、プロリンとトレハロースを共に組み合わせた際、これらの間に相乗効果があることも示す。
【実施例１７】
【０５０９】
ｍＴＧ架橋ゼラチンゲルの弾性増大に対する、プロリンおよびグルタミン酸塩（コスモトロープ）の効果
材料
実験には以下の材料を用いた：Ｇｅｌｉｔａ２７５ブルーム、タイプＡブタゼラチン（Ｇｅｌｉｔａ、スーシティー）、尿素９９．５％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、酢酸ナトリウム三水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、酢酸１００％（Ｒｉｄｅｌ−Ｄｅ  Ｈａｅｎ）、クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、クエン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、Ｌ−プロリン９９％（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、Ｌ−グルタミン酸（グルタミン酸塩）、非動物源（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、１０％微生物性トランスグルタミナーゼ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％（１０％酵素、９０％マルトデキストリン）（味の素、日本）。
【０５１０】
方法
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、０．２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、４．５Ｍ尿素、２Ｍ  ＣａＣｌ２の原液を調製した。
【０５１１】
３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（溶液Ａ）、０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の０．２５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ（ｍＴＧコントロール）、０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の、０．０４ｇ／ｍｌグルタミン酸塩を含む０．２５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ（ｍＴＧ１）、および０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の、０．２５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ  ２．５Ｍプロリン（ｍＴＧ２）を調製した。
【０５１２】
上記の各ゼラチン溶液の一定分量とｍＴＧ溶液の一定分量を混合することにより形成された架橋ゲルについて、次に引張試験を行った。
【０５１３】
各試験に対し、６ｍｌのゼラチン溶液を３ｍｌのｍＴＧ溶液と混合した。得られた混合液をドッグボーンの形をした型へ、各型内に２ｍＬアプライした。これらの型内に形成されたゲルの効果的な試験断面の範囲は１２ｍｍｘ１．７ｍｍである。ゲルを含んだ型は３７℃にて１０分間インキュベートした。インキュベート後、型に生理食塩水をかけて、形成ゲルを型から抜き出した。
【０５１４】
各ゲルを試験するため、ドッグボーン形のゲルのいずれかの端のタブを、Ｍｏｄｅｌ  ３３４３  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｓｔｒｏｎ（商標）；ノーウッド、マサチューセッツ州）内に固定した。次に上のタブを上向きに０．５ｍｍ／ｓの速度で引っ張ることにより、ゲルドッグボーンに引張力が発生した。サンプルの張力は破壊が見られるまで続いた。結果を分析し、弾性係数、ピーク応力、および破断に至る伸びを含む材料特性を算出するため、Ｂｌｕｅｈｉｌｌ  ２  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｎｓｔｒｏｎ（商標）；ノーウッド、マサチューセッツ州）を用いた。
【０５１５】
結果
表２３に示すように、材料試験の結果により、プロリンおよびグルタミン酸塩の両方がｍＴＧ架橋ゼラチン組成物の弾性を増大させるために使用できることが示された。
【０５１６】
【表２３】
0005450612.tif 000032
【実施例１８】
【０５１７】
架橋タンパク質組成物の弾性の増大における、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ  ２０およびＴｗｅｅｎ  ８０の効果
この実施例は、そのＣＭＣ（臨界ミセル濃度）を超えて使用した際の、界面活性剤の効果に関する。限定はされないが、例として「Ｔｗｅｅｎ」ファミリーの二つのメンバーが挙げられる。Ｔｗｅｅｎ（商標）親水性界面活性剤（ポリソルベート）は、ＰＥＧソルビタンエステル（ポリオキシエチレン−ソルビタン−脂肪酸エステル）、例えばＴｗｅｅｎ（商標）の商標名で知られ、かつ市販されている型のモノ−およびトリ−ラウリル、パルミチル、ステアリル、およびオレイルエステルのファミリーである（Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｈ．Ｐ．，“Ｌｅｘｉｋｏｎ  ｄｅｒ  Ｈｉｌｆｓｓｔｏｆｆｅ  ｆｕｒ  Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，Ｋｏｓｍｅｔｉｃ  ｕｎｄ  Ａｎｇｒｅｎｚｅｎｄｅ  Ｇｅｂｉｅｔｅ”，Ｅｄｉｔｉｏ  Ｃａｎｔｏｒ．Ｄ−７９６０  Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９，ｐａｇｅｓ  １３００−１３０４）。Ｔｗｅｅｎ（商標）２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）は、１６．７のＨＬＢを持つ。その他の型のＴｗｅｅｎ（商標）界面活性剤もまた、本発明の少なくとも幾つかの実施形態の組成物に対して有用であろう。
【０５１８】
Ｔｗｅｅｎ（商標）界面活性剤は水に可溶性であるが油には可溶性ではない。この界面活性剤のファミリーの化学構造は、エステル結合によってソルビタンに結合する、一般には約５ないし２０のエチレングリコール単位である、１、２または３の短いＰＥＧ鎖を特色とする。これらの界面活性剤は様々な会社（Ｃｒｏｄａ、ＩＣＩ、Ｓａｎｄｏｚ、Ｍａｚｅｒ、Ａｔｌａｓ）によって生産され、Ｔｗｅｅｎ（商標）：Ｓｏｒｌａｔｅ（商標）、Ｍｏｎｉｔａｎ（商標）、Ｃｒｉｌｌｅｔ（商標）他の様々な商標名の下に登場し得る。ポリソルベート２０、２１、０、６０、６１、６５、８０および８５である、このファミリーのメンバーは、本発明のこの実施形態に好ましい。
【０５１９】
材料
実験には以下の材料を用いた：Ｇｅｌｉｔａ２７５ブルーム、タイプＡブタゼラチン（Ｇｅｌｉｔａ、スーシティー）、尿素９９．５％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、酢酸ナトリウム三水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、酢酸１００％（Ｒｉｄｅｌ−Ｄｅ  Ｈａｅｎ）、クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、クエン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、１０％微生物性トランスグルタミナーゼ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％（１０％酵素、９０％マルトデキストリン）（味の素、日本）。
【０５２０】
方法
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、０．２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、４．５Ｍ尿素、２Ｍ  ＣａＣｌ２の原液を調製した。
【０５２１】
３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（溶液Ａ）、３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の、０．１％または１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（それぞれ溶液Ｂ、Ｃ）、３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の、０．１％または１％Ｔｗｅｅｎ  ８０を含む２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（それぞれ溶液Ｄ、Ｅ）、および０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の、０．２５％（ｗ／ｗ）食物グレードｍＴＧ溶液（溶液１）を調製した。
【０５２２】
上記の各ゼラチン溶液の一定分量とｍＴＧ溶液の一定分量を混合することにより形成された架橋ゲルについて、次に引張試験を行った。
【０５２３】
各試験に対し、６ｍｌのゼラチン溶液を３ｍｌのｍＴＧ溶液と混合した。得られた混合液をドッグボーンの形をした型へ、各型内に２ｍＬアプライした。これらの型内に形成されたゲルの効果的な試験断面の範囲は１２ｍｍｘ１．７ｍｍである。ゲルを含んだ型は３７℃にて１０分間インキュベートした。インキュベート後、型に生理食塩水をかけて、形成ゲルを型から抜き出した。
【０５２４】
各ゲルを試験するため、ドッグボーン形のゲルのいずれかの端のタブを、Ｍｏｄｅｌ  ３３４３  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｓｔｒｏｎ（商標）；ノーウッド、マサチューセッツ州）内に固定した。次に上のタブを上向きに０．５ｍｍ／ｓの速度で引っ張ることにより、ゲルドッグボーンに引張力が発生した。サンプルの張力は破壊が見られるまで続いた。結果を分析し、弾性係数、ピーク応力、および破断に至る伸びを含む材料特性を算出するため、Ｂｌｕｅｈｉｌｌ  ２  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｎｓｔｒｏｎ（商標）；ノーウッド、マサチューセッツ州）を用いた。
【０５２５】
結果
表２４に示すように、材料試験の結果により、Ｔｗｅｅｎ２０およびＴｗｅｅｎ８０の両方が架橋ゼラチンゲルの弾性（破断に至る伸び）を増大させるために有用であること、およびこの効果は濃度依存性であることが示された。
【０５２６】
【表２４】
0005450612.tif 000033
【実施例１９】
【０５２７】
シスタミン、システイン、およびメラニンのｍＴＧ阻害剤としての使用
材料
実験には以下の材料を用いた：Ｇｅｌｉｔａ２７５ブルーム、タイプＡブタゼラチン（Ｇｅｌｉｔａ、スーシティー）、尿素９９．５％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、酢酸ナトリウム三水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、酢酸１００％（Ｒｉｄｅｌ−Ｄｅ  Ｈａｅｎ）、クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、クエン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、シスタミン二塩酸塩９８％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、Ｌ−システイン９７％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、メラニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、１０％微生物性トランスグルタミナーゼ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％（１０％酵素、９０％マルトデキストリン）（味の素、日本）。
【０５２８】
方法
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、０．２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、４．５Ｍ尿素、２Ｍ  ＣａＣＬ２の原液を調製した。
【０５２９】
３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（コントロール溶液）、３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン０．１％ｗ／ｖシスタミン溶液（溶液Ａ）、３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン１０％ｗ／ｖシステイン溶液（溶液Ｂ）、０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の０．７５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ（溶液１）、０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の０．２５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ（溶液２）、２ｍｇ／ｍｌメラニンを含む０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の０．２５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ（溶液３）、１０ｍｇ／ｍｌメラニンを含む０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の０．２５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ（溶液４）を調製した。
【０５３０】
シスタミンおよびシステインを含むゼラチン溶液（Ａ、Ｂ）を、溶液１を用いて粘度計により試験した。
【０５３１】
メラニンを含むｍＴＧ溶液（３、４）を、コントロール溶液を用いて定性的に試験した。
【０５３２】
粘度計試験
各粘度測定試験のため、５０ｍＬビーカー内で、２０ｍＬのゼラチン溶液を１０ｍＬのｍＴＧ溶液と混合した。次に、混合されたゼラチン−ｍＴＧ溶液の粘度をゲル化が起こるに従って追跡した。特定の速度およびこの試験に用いた特定のスピンドルにより、粘度計で記録可能な最大粘度の３０％および９０％を達成するために各試験群が必要とする時間を記録することによって、異なる試験群を比較した。
【０５３３】
この実験では、ＤＶ  ＩＩ＋  ＰＲＯ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ミドルボロ、マサチューセッツ州）をＴ−Ｅ  ９５「ｔ−ｂａｒ」スピンドルと共に用いた。粘度計試験の経過中、スピンドルの垂直運動を維持するためにヘリパス粘度計スタンドを用いた。ヘリパスは１ｃｍパスに沿って運動した。粘度計の読み取りは、粘度計およびＨｙｐｅｒＴｅｒｍｉｎａｌソフトウェアを用いた一秒当たり一読み取りの率で出力した。粘度測定試験のためのスピンドルの回転速度は０．５ｒｐｍであった。Ｔ−Ｅ  ９５スピンドルを用いたこの速度での記録可能な最高粘度は１０ｘ１０６ｃＰであり、これは３０％の点が３ｘ１０６ｃＰに等しく、９０％の点が９ｘ１０６ｃＰに等しかったことを意味する。
【０５３４】
全範囲の粘度計試験のため、ビーカーを３７℃の水浴中に浸した。試験群間の一貫性を確実にするため、試験の間を通してビーカー内の平均温度もまた記録した。
【０５３５】
定性架橋試験
ゼラチンおよびｍＴＧ溶液を２：１の比で混合し、次に３７℃のインキュベーターに移し、明らかなゲル化が検出された時に架橋時間を定義した。
【０５３６】
結果
シスタミンおよびシステイン阻害結果
図６に、ゼラチン溶液コントロール、ＡおよびＢの結果を示す。示されるように、ゼラチン溶液へのシスタミンの添加はマトリックスの架橋時間を約４０％延長した。システインの添加は平均架橋時間の約２８％の延長をもたらした。これらの結果は、ゼラチン溶液へのシスタミンまたはシステインの添加によるｍＴＧの阻害を示す。
【０５３７】
試験時に、シスタミンまたはシステインを含む溶液からの架橋ゲルは、シスタミンまたはシステイン添加剤を含まない同等の架橋ゲルよりもさらに柔軟に見えた。
【０５３８】
メラニンの結果：
表２５に、メラニンの効果に関する架橋時間の結果を示す。ｍＴＧをメラニンと共に使用した際、架橋時間は著しく延長した。メラニン濃度の増大に伴い、架橋時間も延長した。この知見は、メラニン添加によるｍＴＧの阻害を示す。
【０５３９】
【表２５】
0005450612.tif 000034
【実施例２０】
【０５４０】
ゼラチン架橋反応の動態および架橋ゼラチン組成物の弾性におけるＰＥＧ−アミンの効果
材料
実験には以下の材料を用いた：Ｇｅｌｉｔａ２７５ブルーム、タイプＡブタゼラチン（Ｇｅｌｉｔａ、スーシティー）、尿素９９．５％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、酢酸ナトリウム三水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、酢酸１００％（Ｒｉｄｅｌ−Ｄｅ  Ｈａｅｎ）、クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、クエン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、ＰＥＧ−アミン分子量５０００（日油（Ｎｏｆ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、日本）、ＰＥＧ６０００（Ｆｌｕｋａ、スイス）、微生物性トランスグルタミナーゼ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ（１０％酵素、９０％マルトデキストリン）（味の素、日本）。
【０５４１】
方法
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、０．２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、４．５Ｍ尿素、２Ｍ  ＣａＣＬ２の原液を調製した。
【０５４２】
３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  ＣａＣｌ２、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（コントロール溶液）、５％ｗ／ｖ  ＰＥＧ−アミンを含む３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  ＣａＣｌ２、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（溶液Ａ）、１０％ＰＥＧ−アミンを含む３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  ＣａＣｌ２、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（溶液Ｂ）、２０％ＰＥＧ−アミンを含む３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  ＣａＣｌ２、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（溶液Ｃ）、２０％ＰＥＧ６０００を含む３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  ＣａＣｌ２、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（溶液Ｄ）を調製した。
【０５４３】
溶液を定性的および弾性試験により試験した。
【０５４４】
定性的架橋試験
ガラスチューブ内で、ゼラチン溶液Ａ、ＢおよびＣそれぞれを、ｍＴＧ溶液と共に２：１の容積測定比にて混合し、次に３７℃の振盪インキュベーターへ移した。液体溶液の流動が停止したとみられる時間をゲル化時間として定義した。
【０５４５】
弾性試験
ｍＴＧ溶液により架橋したコントロール溶液および溶液Ｂを、時間による弾性の変化について試験した。
【０５４６】
各弾性試験に対し、６ｍＬのゼラチン溶液を３ｍｌのｍＴＧ溶液と混合した。得られた混合液をドッグボーン型へ、各型内に２ｍＬアプライした。型を３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、型に生理食塩水をかけて、ゼラチン−ｍＴＧ組成物を型から抜き出した。
【０５４７】
次に試料を生理食塩水中で３７℃にてインキュベートするか、または直ちに試験した。型から取り外したゼラチン−ｍＴＧ組成物の厚さを、カリパスを用いて測定した。
【０５４８】
各ゲルを試験するため、ドッグボーン形のゲルのいずれかの端のタブを、Ｍｏｄｅｌ  ３３４３  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｓｔｒｏｎ（商標）；ノーウッド、マサチューセッツ州）内に固定した。次に上のタブを上向きに０．５ｍｍ／ｓの速度で引っ張ることにより、ゲルドッグボーンに引張力が発生した。サンプルの張力は破壊が見られるまで続いた。結果を分析し、弾性係数、ピーク応力、および破断に至る伸びを含む材料特性を算出するため、Ｂｌｕｅｈｉｌｌ  ２  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｎｓｔｒｏｎ（商標）；ノーウッド、マサチューセッツ州）を用いた。
【０５４９】
結果
定性的架橋試験
表２７に定性的架橋試験の結果を表し、ＰＥＧ−アミンの量の増大によりゲル化時間は短縮することが示される。
【０５５０】
【表２７】
0005450612.tif 000035
【０５５１】
弾性試験
表２８に弾性試験の結果の平均を表し、これらは３７℃における生理食塩水中での２時間インキュベーションの結果である。この結果はＰＥＧ−アミンがゲル化組成物の弾性を増大し得ることを示す。
【０５５２】
【表２８】
0005450612.tif 000036
【０５５３】
全体的にこれらの結果は、ＰＥＧ−アミンの含有がゼラチン溶液のｍＴＧ架橋の動態に影響し得ること；およびＰＥＧ−アミンの含有が架橋ゼラチン組成物の弾性を増大させ得ることを示す。限定はされないが、ゼラチンに共有結合できる適切なＰＥＧ誘導体の別の例はＰＶＡ−アミンであり、これもまた本発明のこの実施形態により包含される。
【実施例２１】
【０５５４】
カルバミル化の阻害
この実施例により、グリシンは、尿素を含むゼラチン溶液のカルバミル化を、その後のｍＴＧ架橋を阻害することなく用量依存性に阻害することが示される。カルバミル化の阻害のため、ヒスチジンも同様に使用できる。
【０５５５】
材料
実験には以下の材料を用いた：Ｇｅｌｉｔａ２７５ブルーム、タイプＡブタゼラチン（Ｇｅｌｉｔａ、スーシティー）、尿素９９．５％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、酢酸ナトリウム三水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、酢酸１００％（Ｒｉｄｅｌ−Ｄｅ  Ｈａｅｎ）、クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、クエン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、グリシン、非動物源（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、１０％微生物性トランスグルタミナーゼ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％（１０％酵素、９０％マルトデキストリン）（味の素、日本）。
【０５５６】
方法
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、０．２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、４．５Ｍ尿素、２Ｍ  ＣａＣＬ２の原液を調製した。
【０５５７】
３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（コントロール溶液）、３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン０．１Ｍヒスチジン溶液（溶液Ａ）、３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン０．１Ｍグリシン溶液（溶液Ｂ）、３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン０．４Ｍグリシン溶液（溶液Ｃ）、３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン０．５Ｍグリシン溶液（溶液Ｄ）、３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン０．７Ｍグリシン溶液（溶液Ｅ）、３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン０．９Ｍグリシン溶液（溶液Ｆ）、３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン１Ｍグリシン溶液（溶液Ｇ）、０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の０．２５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ（溶液１）、０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の０．７５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ（溶液２）を調製した。
【０５５８】
結果
図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃに、カルバミル化の阻害剤として作用する様々なグリシンおよびヒスチジン添加剤を用いたゼラチン溶液の結果を要約する。これらは高温（５０℃）における異なったインキュベーション時間の後に架橋され、粘度計によって試験された。全ての図は、全体の架橋時間の３０％および９０％両方の値を表す。
【０５５９】
図７Ａは、グリシンまたはヒスチジン添加剤（各０．１Ｍ）を含むおよび含まないゼラチン溶液の、５０℃における１日のインキュベーションの後の標準化された架橋時間値を表す。値は、４℃にて１日保管された添加剤を含まないコントロール溶液に基づいて標準化されたことから、１００％の値は、ゼラチンコントロール溶液が架橋時間を達成するために必要な時間として定義される。図７Ａは、ゼラチンコントロール、溶液Ａおよび溶液Ｂの、５０℃における１日のインキュベーションの後の標準化された架橋時間を示す。円錐は３０％のトルクに至るまでの時間を示し、円柱は９０％のトルクに至るまでの時間を示す。データは一対で示され、最初の二つはコントロール溶液単独に関し、２番目は溶液Ａに関し、３番目の一対は溶液Ｂに関する。
【０５６０】
図７Ａからの結果は、１日のインキュベーションの後、０．１Ｍヒスチジンを含むゼラチン溶液（Ａ）および５０℃でインキュベートされた添加剤を含まないゼラチン溶液（コントロール）の両方が、４℃で保管されたコントロールに比較した粘度レベルに達するまで３８％〜４０％長く要したことを示す。しかしながら、０．１Ｍグリシン（Ｂ）の使用は反応阻害のレベルを低下させ、架橋反応の遅延は１４〜１７％に限られた。
【０５６１】
図７Ｂは、グリシンまたはヒスチジン添加剤を含むおよび含まないゼラチン溶液の、５０℃における２日のインキュベーションの後の標準化された架橋時間値を表す。円錐は３０％のトルクに至るまでの時間を示し、円柱は９０％のトルクに至るまでの時間を示す。データは一対で示され、最初の二つは溶液Ｂ単独に関し、２番目は溶液Ｃに関し、３番目の一対は溶液Ｆに関し、４番目の一対は溶液Ｆに関する。値は、これもまた５０℃にて２日間インキュベートした添加剤を含まないゼラチンコントロール溶液に基づいて標準化されたことから、１００％の架橋時間は、インキュベートされたコントロール溶液が架橋時間を達成するために必要な時間である。
【０５６２】
図７Ｂからの結果は、最高のグリシン濃度である０．９Ｍを有するゼラチン溶液（溶液Ｆ）が最も良い架橋時間を導いたことを示す。反応はコントロール溶液よりも約２２％速く、一方で０．１Ｍのグリシン濃度（溶液Ｂ）は、コントロールよりも反応時間がわずかに５〜６％速い反応を導いた。０．１Ｍヒスチジンを含むゼラチン溶液（溶液Ａ）の使用は０．９Ｍグリシンを含むゼラチン溶液（Ｆ）と同様の架橋時間を導き、この反応時間はコントロール溶液よりも１８％速かった。
【０５６３】
図７Ｃは、グリシンを含むゼラチン溶液の、５０℃における２週間のインキュベーション後の架橋時間値、およびゼラチンコントロール溶液の架橋時間値を表す。円錐は３０％のトルクに至るまでの時間を示し、円柱は９０％のトルクに至るまでの時間を示す。データは一対で示され、最初の二つはコントロール溶液単独に関し、２番目は溶液Ｄに関し、３番目の一対は溶液Ｅに関し、４番目の一対は溶液Ｆに関し、５番目の一対は溶液Ｇに関する。
【０５６４】
図７Ｃからの結果は、０．９Ｍグリシンを含むゼラチン溶液（溶液Ｆ）の架橋時間が１Ｍグリシンを含むゼラチン溶液（溶液Ｇ）により達成された架橋時間よりも５０％低かったことから、最高のグリシン濃度を有するゼラチン溶液の使用は必ずしも最良の結果を導かないことを示す。また、０．７Ｍグリシン（Ｅ）が０．９Ｍグリシンを含むゼラチン溶液よりも約５０％高い架橋時間を達成したことから、０．９Ｍグリシンは至適濃度であるとみられる。結果はまた、２３分を超える時間の後に添加剤を含まないゼラチン溶液による架橋が見られなかったことから、溶液の劣化の徴候も示した。
【０５６５】
全体的にこれらの結果は、グリシンおよびヒスチジンの両方がゼラチンのカルバミル化反応を阻害し得ることを示す。しかしながら、特定の濃度および物質の選択は溶液中のシアン酸塩産生の状態に依存する。
【実施例２２】
【０５６６】
尿素を含まないゼラチン溶液の部分的架橋へのシアン酸塩添加
この実施例により、シアン酸ナトリウムの存在が阻害効果をもたらすことが示され、尿素の分解がｍＴＧ架橋の阻害の原因であることが確認される。
【０５６７】
材料
実験には以下の材料を用いた：Ｇｅｌｉｔａ２７５ブルーム、タイプＡブタゼラチン（Ｇｅｌｉｔａ、スーシティー）、酢酸ナトリウム三水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、酢酸１００％（Ｒｉｄｅｌ−Ｄｅ  Ｈａｅｎ）、クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、クエン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、シアン酸ナトリウム９６％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、１０％微生物性トランスグルタミナーゼ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％（１０％酵素、９０％マルトデキストリン）（味の素、日本）。
【０５６８】
方法
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０および０．２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０の原液を調製した。
【０５６９】
０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（コントロール溶液）、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン＋０．１Ｍシアン酸ナトリウム（溶液Ａ）、および０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の０．２５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ（溶液１）を調製した。
【０５７０】
粘度計試験
実施例１９に記載したように、粘度計試験を行った。
【０５７１】
結果
図８に、高温（５０℃）における異なったインキュベーション時間後に架橋され、粘度計により試験された、シアン酸塩添加剤を含むおよび含まないコントロール溶液の結果を要約する。円錐は３０％のトルクに至るまでの時間を示し、円柱は９０％のトルクに至るまでの時間（すなわち架橋時間）を示す。データは一対で示され、最初の二つはコントロール溶液に関し、２番目は溶液Ａに関する。架橋時間の値は、４℃にて１日保管された添加剤を含まないコントロール溶液に基づいて標準化された。従って１００％の値は、この溶液の架橋時間を達成するために必要な時間である。
【０５７２】
結果により、５０℃にてインキュベーションを行ったコントロール溶液はわずかに延長した架橋時間を示したが（約１０％）、０．１Ｍシアン酸塩も含む溶液（溶液Ａ）はその架橋時間を７６％を超えるまで著しく延長したことが示される。この知見により、直接の添加または尿素の分解のいずれかによるシアン酸陰イオンの添加はゼラチン溶液の架橋時間を著しく悪化させ、かつ著しい阻害効果を持つことが示される。
【実施例２３】
【０５７３】
ゼラチン溶液はゼラチンが最早ｍＴＧ架橋の基質ではなくなるほど完全にサクシニル化され得る
材料
実験には以下の材料を用いた：Ｇｅｌｉｔａ２７５ブルーム、タイプＡブタゼラチン（Ｇｅｌｉｔａ、スーシティー）、無水コハク酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、水酸化ナトリウム（Ｒｉｄｅｌ−Ｄｅ  Ｈａｅｎ）、炭酸水素ナトリウム（Ｆｒｕｔａｒｕｍ、イスラエル）、クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、１０％微生物性トランスグルタミナーゼ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％（１０％酵素、９０％マルトデキストリン）（味の素、日本）。
【０５７４】
方法
０．１Ｍ炭酸水素緩衝液ｐＨ８．０、４Ｍ水酸化ナトリウム、および０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸の原液を調製した。
【０５７５】
０．１Ｍ炭酸水素緩衝液中の１％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液を調製した（溶液Ａ）。溶液を持続的に撹拌しながら３７℃の温度に熱した。また、０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の０．７５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ（ｍＴＧ溶液）も調製した。
【０５７６】
均一な定常状態に達した後、溶液中に無水コハク酸を粉末の形で加えた。溶液のｐＨを常にモニターし、４Ｍ水酸化ナトリウムの添加によってｐＨ＝８に維持した。ｐＨのさらなる変化が見られなくなった時点で溶液を透析バッグに入れ、蒸留水中に２４時間浸した。
【０５７７】
得られた溶液を、３０ｋＤａ膜カットオフによる限外濾過過程を用いて濃縮した。この過程の間に吸気圧は１．５ｂａｒを超えなかった。
【０５７８】
溶液の濃度は２８０ｎｍにおける溶液の吸光度を用いて決定した（溶液Ａ）。対応する非サクシニル化ゼラチンの溶液（溶液Ｂ）を、溶液Ａと同じ濃度にて調製した。
【０５７９】
２．５ｍｌのｍＴＧ溶液を５ｍｌの溶液ＡおよびＢそれぞれと共に混合し、４０℃に設置した。
【０５８０】
結果
定性的架橋試験
溶液のインキュベーションの間、溶液Ｂは１分後に架橋したが、溶液Ａは２時間後においても架橋しないことが観察された。従って、ゼラチンのサクシニル化は明らかに架橋を遮断した。
【実施例２４】
【０５８１】
サクシニル化ゼラチンは非修飾ゼラチンと共に、架橋ゼラチン組成物の力学的特性を改善する様式において混合できる
材料
実験には以下の材料を用いた：Ｇｅｌｉｔａ２７５ブルーム、タイプＡブタゼラチン（Ｇｅｌｉｔａ、スーシティー）、尿素９９．５％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、酢酸ナトリウム三水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、酢酸１００％（Ｒｉｄｅｌ−Ｄｅ  Ｈａｅｎ）、クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、クエン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、１０％微生物性トランスグルタミナーゼ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％（１０％酵素、９０％マルトデキストリン）（味の素、日本）、以前に記載したように調製されたサクシニル化ゼラチン。
【０５８２】
方法
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、０．２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、４．５Ｍ尿素、２Ｍ  ＣａＣＬ２の原液を調製した。
【０５８３】
サクシニル化ゼラチン溶液、および３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液を含む２１％（ｗ／ｖ）ゼラチン溶液（溶液Ａ）、蒸留水、および３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液を含む２１％（ｗ／ｖ）ゼラチン溶液（溶液Ｂ）、０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の０．７５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ（溶液１）を調製した。
【０５８４】
溶液Ａおよび溶液ＢのｍＴＧ架橋時間を粘度計により試験した。各粘度測定試験のため、５０ｍＬビーカー内で、２０ｍＬのゼラチン溶液を１０ｍＬのｍＴＧ溶液と混合した。次に、混合されたゼラチン−ｍＴＧ溶液の粘度をゲル化が起こるに従って追跡した。特定の速度およびこの試験に用いた特定のスピンドルにより、粘度計で記録可能な最大粘度の９０％を達成するために各試験群が必要とする時間を記録することによって、異なる試験群を比較した。
【０５８５】
この実験では、ＤＶ  ＩＩ＋  ＰＲＯ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ミドルボロ、マサチューセッツ州）をＴ−Ｅ  ９５「ｔ−ｂａｒ」スピンドルと共に用いた。粘度計試験の経過中、スピンドルの垂直運動を維持するためにヘリパス粘度計スタンドを用いた。ヘリパスは１ｃｍパスに沿って運動した。粘度計の読み取りは、粘度計およびＨｙｐｅｒＴｅｒｍｉｎａｌソフトウェアを用いた一秒当たり一読み取りの率で出力した。粘度測定試験のためのスピンドルの回転速度は０．５ｒｐｍであった。Ｔ−Ｅ  ９５スピンドルを用いたこの速度での記録可能な最高粘度は１０ｘ１０６ｃＰであり、これは３０％の点が３ｘ１０６ｃＰに等しく、９０％の点が９ｘ１０６ｃＰに等しかったことを意味する。
【０５８６】
全範囲の粘度計試験のため、ビーカーを３７℃の水浴中に浸した。試験群間の一貫性を確実にするため、試験の間を通してビーカー内の平均温度もまた記録した。
【０５８７】
粘度測定試験が完了すると、得られた架橋ゼラチンプラグをビーカーから取り出し、生理食塩水浴内に浸した。２４時間後に溶液Ａおよび溶液Ｂゼラチンプラグの両方を生理食塩水浴から取り出し、比較的な柔軟性を判定するために手で触れた。
【０５８８】
結果
表２９に架橋時間の結果を示し、サクシニル化および非サクシニル化の混合は、架橋のためにより長い時間を必要とすることが示される。
【０５８９】
【表２９】
0005450612.tif 000037
【０５９０】
溶液Ａから形成された三つの（３）ゼラチンプラグの全ては、溶液Ｂから形成された三つの（３）ゼラチンプラグの全てよりも明らかに、さらに柔軟であったことから、ゼラチン溶液へのサクシニル化ゼラチンの含有は、ｍＴＧによる架橋後のその溶液の脆弱性を減少させることが示される。
【実施例２５】
【０５９１】
ゼラチンのアミン基基質を遮断するためのカルバミル化の使用
この実施例には、架橋ゼラチン組成物の柔軟性および弾性を改善するためのカルバミル化の使用について記載される。
【０５９２】
材料
実験には以下の材料を用いた：Ｇｅｌｉｔａ２７５ブルーム、タイプＡブタゼラチン（Ｇｅｌｉｔａ、スーシティー）、尿素９９．５％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、酢酸ナトリウム三水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、酢酸１００％（Ｒｉｄｅｌ−Ｄｅ  Ｈａｅｎ）、クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、クエン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、シアン酸ナトリウム９６％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、１０％微生物性トランスグルタミナーゼ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％（１０％酵素、９０％マルトデキストリン）（味の素、日本）。
【０５９３】
方法
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、０．２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、４．５Ｍ尿素、２Ｍ  ＣａＣＬ２、０．３Ｍシアン酸ナトリウムの原液を調製した。
【０５９４】
３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（溶液Ａ）、および０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の０．７５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ（溶液１）を調製した。
【０５９５】
粘度計試験
実施例１９に記載したように、粘度計試験を行った。
【０５９６】
ゼラチンと酵素との混合に先立ち、シアン酸ナトリウムを以下のように溶液Ａまたは１のいずれかに添加した：
【０５９７】
１００〜２００μｌの０．３Ｍシアン酸ナトリウムを１０ｍｌの溶液１へ添加。混合物を数回反転し、次に２０ｍｌの溶液Ａに加え、粘度計試験を行った。
【０５９８】
５０〜１５０μｌの０．３Ｍシアン酸ナトリウムを２０ｍｌの溶液Ａへ添加。混合物を数回反転し、次に１０ｍｌの溶液１に加え、粘度計試験を行った。
【０５９９】
結果
表３０に粘度計試験の結果を示す。リジン鎖のアミノ側鎖の部分的遮断からもたらされる架橋時間の延長に加え、定性的な観察により、シアン酸基で処理した架橋ゲルはさらに柔軟で弾力があり、かつ接着性の架橋ゲルを導くことが示される。
【０６００】
【表３０】
0005450612.tif 000038
【実施例２６】
【０６０１】
ゼラチン架橋反応の動態におけるジアミン化合物、プトレシンの効果
この実施例により、プトレシンが架橋反応を用量依存性に遅延させたことが示され、これはトランスグルタミナーゼの基質として働き、かつゼラチンと共に架橋されることが示唆された。さらに、得られた架橋ゼラチンはより弾力があった。
【０６０２】
材料
実験には以下の材料を用いた：Ｇｅｌｉｔａ２７５ブルーム、タイプＡブタゼラチン（Ｇｅｌｉｔａ、スーシティー）、尿素９９．５％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、酢酸ナトリウム三水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、酢酸１００％（Ｒｉｄｅｌ−Ｄｅ  Ｈａｅｎ）、クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、クエン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、プトレシン二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、１０％微生物性トランスグルタミナーゼ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％（１０％酵素、９０％マルトデキストリン）（味の素、日本）。
【０６０３】
方法
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、０．２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、４．５Ｍ尿素、２Ｍ  ＣａＣＬ２の原液を調製した。
【０６０４】
３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  ＣａＣｌ２、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン（コントロール溶液）、３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  ＣａＣｌ２、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の、プトレシンを１−１のモル比で含む２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン（溶液Ａ）、３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  ＣａＣｌ２、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の、プトレシンを１−１／２のモル比で含む２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン（溶液Ｂ）、３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  ＣａＣｌ２、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中のプトレシンを１−１／４のモル比で含む２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン（溶液Ｃ）、０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の１．２５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ（溶液１）、０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の０．７５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ（溶液２）、０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の０．５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ（溶液３）、および０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の０．２５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ（溶液４）を調製した。
【０６０５】
溶液を定性的および弾性試験により試験した。
【０６０６】
定性的架橋試験
溶液Ａ、ＢおよびＣを、溶液１および２と共に２：１の比にて混合し、次に３７℃のインキュベーターへ移して、明らかなゲル化が認められた際に架橋時間を定義した。
【０６０７】
弾性試験
ｍＴＧ３およびｍＴＧ４それぞれを用い、コントロール溶液および溶液Ｂを、時間による弾性の変化について試験した。
【０６０８】
各弾性試験に対し、６ｍｌのゼラチン溶液を３ｍｌのｍＴＧ溶液と混合した。得られた混合液をドッグボーン型へ、各形態内に２ｍｌアプライした。型は３７℃で１０分間インキュベートされる。インキュベート後、型に生理食塩水をかけ、型から抜き出す。
【０６０９】
試料を生理食塩水中でＲＴにてインキュベートするか、または直ちに試験する。形態の厚さを測定し、試料を装置のクランプの間に配置する。
【０６１０】
結果
定性的架橋試験
表３１に定性的架橋試験の結果を表し、プトレシン濃度の増大は架橋時間の延長をもたらすことが示される。
【０６１１】
【表３１】
0005450612.tif 000039
【０６１２】
弾性試験
表３２に弾性試験の結果の平均を表し、これらは室温における生理食塩水中での２時間インキュベーションの結果である。
【０６１３】
【表３２】
0005450612.tif 000040
【実施例２７】
【０６１４】
ｍＴＧ架橋ゼラチン組成物の弾性を増大させるためのアミンドナー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の使用
材料
実験には以下の材料を用いた：Ｇｅｌｉｔａ２７５ブルーム、タイプＡブタゼラチン（Ｇｅｌｉｔａ、スーシティー）、尿素９９．５％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、酢酸ナトリウム三水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、酢酸１００％（Ｒｉｄｅｌ−Ｄｅ  Ｈａｅｎ）、クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、クエン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）分子量７５０，０００（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、１０％微生物性トランスグルタミナーゼ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％（１０％酵素、９０％マルトデキストリン）（味の素、日本）。
【０６１５】
方法
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、０．２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、４．５Ｍ尿素、２Ｍ  ＣａＣＬ２の原液を調製した。
【０６１６】
３．８Ｍ尿素、０．１５Ｍ  Ｃａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（溶液Ａ）、０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の０．７５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ（溶液１）、０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の１０％ｖ／ｖ  ＰＥＩを含む０．７５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ（溶液２）、０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の０．２５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ（溶液３）、および０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の１０％ｖ／ｖ  ＰＥＩを含む０．２５％（ｗ／ｗ）ｍＴＧ（溶液４）を調製した。
【０６１７】
粘度計試験
実施例１９に記載したように、粘度計試験を行った。
【０６１８】
Ｉｎｓｔｒｏｎによる力学的試験
材料を特徴付けるための力学的特性を、Ｉｎｓｔｒｏｎ装置により試験した。
【０６１９】
各弾性試験に対し、６ｍｌのゼラチン溶液を３ｍｌのｍＴＧ溶液と混合した。得られた混合液をドッグボーン型へ、各形態内に２ｍｌアプライした。型を３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、型に生理食塩水をかけ、型から抜き出した。
【０６２０】
試料を生理食塩水中で室温（ＲＴ）にてインキュベートするか、または直ちに試験した。形態の厚さを測定し、試料を装置のクランプの間に配置した。
【０６２１】
各試料について、係数、破断時の引張応力、および破断時の引張伸び（伸長の程度）を算出した。
【０６２２】
結果
表３２に、ＰＥＩを含むかまたは含まないｍＴＧ溶液により架橋された溶液Ａの結果を要約する。架橋ゲルの架橋時間および力学的特性を達成するため、粘度計およびＩｎｓｔｒｏｎ試験の両方を実行した。Ｉｎｓｔｒｏｎ試験は２時間のインキュベーション後に実行した。
【０６２３】
結果により、ＰＥＩを含むｍＴＧ（溶液２）による溶液Ａの架橋時間は、ＰＥＩを含まないｍＴＧ溶液（溶液１）の使用に比較してわずかに７％〜１４％延長することが示される。
【０６２４】
表３３に示すように、ＰＥＩを含むの力学的特性は、Ａおよび溶液３とＡおよび溶液４との間の比較に見られるようにかなり改善され、ＰＥＩを含まない架橋ゲルに比較すると、ＰＥＩに基づく架橋ゲルの係数は１０％低く、６０％を超えて大きな伸長を達成した。
【０６２５】
【表３３】
0005450612.tif 000041
【実施例２８】
【０６２６】
発泡ゼラチン中への未加工ｍＴＧ粉末の分散
この実施例は、適切なゼラチン発泡体の形成、および反応が直ちに検出されないような、乾燥ｍＴＧの発泡体中への拡散について記載する。乾燥組成物が再構成される一回に限り、架橋活性が見られる。
【０６２７】
材料
実験には以下の材料を用いた：Ｇｅｌｉｔａ２７５ブルーム、タイプＡブタゼラチン（Ｇｅｌｉｔａ、スーシティー）、ＷＦＩ（注射用水（Ｗａｔｅｒ  Ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）；Ｃｕｒｅ、イスラエル）、１０％微生物性トランスグルタミナーゼ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％（１０％酵素、９０％マルトデキストリン）（味の素、日本）。
【０６２８】
方法
ＷＦＩ水中の５％ｗ／ｗゼラチン溶液を発泡のために選択した（この濃度は良好なゼラチン構造を達成することが証明されており、一方で溶媒は共融点が比較的高くなるようにＷＦＩを選択した）。環境温度が２１℃〜２２℃であったとき、ゼラチン溶液は発泡前に３６〜３７摂氏温度に維持した。３６℃〜３７℃におけるゼラチン溶液を機械装置に負荷し、発泡させた。発泡手順が完了した後、１５ｇの発泡体を各アルミニウムトレイに負荷し、次に０．２５ｇの未加工ｍＴＧ粉末（９０％マルトデキストリンを含む）を篩を用いて発泡層の上へ分散した。次に、全てのトレイにおいて１％ｗ／ｗよりも少ないｍＴＧを取り込んだ総量３０ｇの発泡体が得られるように、各トレイにさらなる１５ｇの発泡体を負荷してｍＴＧ層を覆った。未加工のｍＴＧ粉末はその低い溶解度のため、その基質と直ちに反応しないことが以前に示されていることから、トレイに負荷する間に架橋反応は見られなかった（硬化は検出されなかった）。全てのトレイを移動させ、凍結乾燥棚に置いた。全てのトレイがＦＤ内部に置かれた後に限り、試験プログラムを開始させた。全てのトレイは同じ最終温度環境（−４０摂氏温度）において保管された。凍結乾燥プログラムの全体時間は３６〜４０時間であった。
【０６２９】
再構成試験：
凍結乾燥パッドをトレイから取り出し、再構成過程を観察するため水中に浸した。
【０６３０】
これらの試験により、発泡体マトリックス内の大部分が溶解しなかったことが明らかになった。それらの部分においてｍＴＧ粉末の典型的な灰色が観察されることと共に、これらの知見は、発泡体マトリックスの一部に架橋反応が起こっており、そのために２０分後においても溶解しなかったことを示している。
【実施例２９】
【０６３１】
組み換えゼラチンのｍＴＧによる架橋
材料
厚さ約２ｃｍの凍結乾燥塊である、１００ｋＤａ組み換えゼラチン（ｒゼラチン）。ＡＣＴＩＶＡ  ＴＧ微生物性トランスグルタミナーゼ粉末（１０％タンパク質、９０％マルトデキストリン；味の素、日本）。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４。
【０６３２】
方法
ＰＢＳを室温（２３〜２５℃）に置いた。ｒゼラチンを手動で撹拌して均一な溶液にすることにより、２５％ｗ／ｗ  ｒゼラチンＰＢＳ溶液を調製する。溶液を一旦完全に混合した後、空気を除くために短く遠心する。
【０６３３】
ｍＴＧを手動で撹拌して均一な溶液にすることにより、７．５％ｗ／ｗ  ＡＣＴＩＶＡ  ＴＧ  ＰＢＳ溶液を調製する（ｍＴＧ溶液）。
【０６３４】
２ｍＬのｒゼラチン溶液および１ｍＬのｍＴＧ溶液を、ピペットを用いてプラスチックの秤量皿へ分注する。分注後直ちにピペットチップを用いて溶液を完全に混合する。ゲル化時間を定性的に評価するため、３０秒ごとにピペットチップを用いて混合した溶液に触れる。一旦ゲル化が観察されると、サンプルを手でプレートから除き、サンプルの弾性を手で引き伸ばすことによって示す。
【０６３５】
上記のサンプル調製手順を繰り返し、サンプルを５０℃の水浴中のビーカー内に１０分間配置する。次にサンプルを、それがゲル相を維持しているか、または液相に戻っているかを決定するため（すなわち熱可逆性を評価するため）主観的に評価する。
【０６３６】
予想された結果
この過程の後でゲル化が観察され、ｒゼラチンが微生物性トランスグルタミナーゼによる架橋の基質として作用することが予想されることは、予想されている。
【実施例３０】
【０６３７】
タイプＢゼラチンのｍＴＧによる架橋
これまでにｍＴＧをタイプＢゼラチンの架橋に使用する試みがなされてきた。しかしながらタイプＢゼラチンの物理的ゲル化は記録されてきたが、タイプＢゼラチンのｍＴＧ架橋における試みは成功していない（Ｃｒｅｓｃｅｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２００２，３：ｐ．１３８４−１３９１）。驚くべきことに本明細書中の実施形態によれば、ゼラチンを酢酸緩衝液に溶解し、ｍＴＧをクエン酸緩衝液に溶解すると、タイプＢゼラチンのｍＴＧによる架橋が丈夫なゲルの形成をもたらすことが見出された。
【０６３８】
材料
２２５ブルーム、タイプＢウシゼラチン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、酢酸ナトリウム三水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、酢酸１００％（Ｒｉｄｅｌ−Ｄｅ  Ｈａｅｎ）、クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、クエン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス）、ＡＣＴＩＶＡ  ＴＧ微生物性トランスグルタミナーゼ粉末（１０％タンパク質、９０％マルトデキストリン；味の素、日本）。
【０６３９】
方法
以下の溶液を調製した：５０℃においてｐＨ６．０である０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液、０．２Ｍ  Ｎａ−クエン酸中の７．５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ溶液（ｍＴＧ溶液）。
【０６４０】
ゼラチン溶液の一部を室温（２２〜２３℃）にてインキュベートし、温度の５０℃からの低下を追跡した。温度の低下に従ってゲル化溶液を定期的に攪拌することにより、液体溶液から物理的ゲルまでの転移点を決定した。スターラーの使用によりゼラチン溶液がそれ以上動かせなくなった温度を物理的ゲル化点として決定した。
【０６４１】
５０℃のゼラチン溶液の２ｍＬの一定分量を、別々にプラスチックチューブ内の１ｍＬまたは２ｍＬのｍＴＧ溶液と共に混合した。これらのチューブを３７℃のインキュベーター内に配置した。酵素的架橋ゲルが形成されているか否かを決定するため、チューブを３０秒ごとに取り出して反転した。チューブの反転によりゼラチン−ｍＴＧ混合物がそれ以上流動しなくなった時間をゲル化時間として定義した。
【０６４２】
結果
ゼラチン溶液の物理的ゾル−ゲル転移点は３０℃において発生した。両方のゼラチン−ｍＴＧ組成物において、２分以内にゲル化が観察された。
【０６４３】
これらの結果により、タイプＢゼラチンは、約３０℃未満で熱可逆性物理的ゲル、およびより高い温度でｍＴＧにより架橋される化学的ゲルの両方を形成し得ることが示される。
【実施例３１】
【０６４４】
破裂圧力接着試験
材料
この実験に使用した材料は、タイプＡ、３００ブルーム、７０メッシュブタ医薬用ゼラチン（Ｍｅｄｅｘ、英国、バッチ＃８００６７）、９８％尿素、乾燥粉末（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ランチェスター：ロット＃１０１１０５８６）、９７％ＣａＣｌ２、乾燥粉末（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ランチェスター：ロット＃１０１１０５６１）、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１）、０．５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、Ｄ−ソルビトール、９７％（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州：バッチ＃１３４４７７６）、１０％微生物性トランスグルタミナーゼ−ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ１０％（１０％酵素、９０％マルトデキストリン）［味の素、日本］である。
【０６４５】
方法
ゼラチン溶液の調製：
１．コントロール−０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液。
２．０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン、４．５Ｍ尿素。
３．０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン、２Ｍ尿素、１Ｍ  Ｃａ。
【０６４６】
ゼラチン粉末を完全に溶解するため、溶液を４０℃に熱して勢いよく攪拌した。次に溶液を２４℃のインキュベーター内で実験に先立ち一晩保持した。
【０６４７】
微生物性トランスグルタミナーゼ溶液の調製：
酢酸ナトリウム溶液：
ａ．ソルビトール：ゼラチン、３：１ｗ／ｗの比でソルビトールを加えた、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％。
ｂ．ソルビトール：ゼラチン、３：１ｗ／ｗの比でソルビトールを加えた、０．２５Ｍ酢酸ナトリウム中の５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％。
ｃ．ソルビトール：ゼラチン、３：１ｗ／ｗの比でソルビトールを加えた、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の７．５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％。
ｄ．０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の７％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％。
ｅ．ソルビトール：ゼラチン、３：１ｗ／ｗの比でソルビトールを加えた、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中の７．５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％。
クエン酸ナトリウム溶液：
ｆ．０．１Ｍクエン酸ナトリウム中の２．５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％。
ｇ．０．１Ｍクエン酸ナトリウム中の３％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％。
ｈ．０．１Ｍクエン酸ナトリウム中の１０％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％。
ｉ．ソルビトール：ゼラチン、３：１ｗ／ｗの比でソルビトールを加えた、０．５Ｍクエン酸ナトリウム中の５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％。
ｊ．ソルビトール：ゼラチン、３：１ｗ／ｗの比でソルビトールを加えた、０．５Ｍクエン酸ナトリウム中の１０％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％。
ｋ．ソルビトール：ゼラチン、０．６：１ｗ／ｗの比でソルビトールを加えた、０．５Ｍクエン酸ナトリウム中の５％（ｗ／ｗ）ＡＣＴＩＶＡ−ＴＧ  １０％。
酵素溶液は使用前にｗｈａｔｍａｎ濾紙の１番を用いて濾過した。
【０６４８】
破裂圧力試験：
ＡＳＴＮプロトコルの指示Ｆ２３９２−０４の改変型に従って破裂圧力試験を実行した。
【０６４９】
異なった接着性組成物の接着性を比較するため、破裂圧力接着試験を実行した。各破裂圧力接着試験に対し、コラーゲンソーセージケーシング（Ｎｉｔｔａ  Ｃａｓｉｎｇｓ、ニュージャージー州）を基質として用いた。各ケーシング試料に直径２ｍｍの穴を開け、各試料を試料保持マニホールド内へ固定した。次に、組織マニホールドに熱した（３７℃）生理的液体（生理食塩水溶液）を満たした。一旦マニホールドが満たされると、実験用架橋組成物を調製して試料穴の上部に入れ、組成物によって穴を完全に覆った。
【０６５０】
実験用組成物は、２５ｍＬビーカー内で、４ｍＬの架橋可能なタンパク質溶液と２ｍＬの無毒性架橋剤を混合することによって調製された。４ｍＬの混合溶液を５ｍＬシリンジ内へ引き入れた。小ビーカー内でゼラチンとｍＴＧ溶液を混合した後、４ｍｌの形成ゲルをシリンジ内へ移した。次に、３ｍＬの組成物を入れて試料穴を覆った。４分後（混合時から）に破裂圧力システムを起動し、接着性組成物が破壊されて液体がバーストするまで、穴の下へ圧力を指示レベルまで高くしていった。
【０６５１】
再現性を達成するため、各製剤は、他に言及しない限り少なくとも４回試験した。
【０６５２】
破裂圧力システムおよび付随する組織マニホールドの概略図を図９に示す。
【０６５３】
結果
以下の表に、様々なゼラチン−ｍＴＧの組み合わせによる破裂圧力試験の結果を要約する。測定された最初の大気圧は７５５ｍｍＨｇであった。従って全ての事例において、基質に接着するゼラチン−ｍＴＧ組成物による正味圧力は記録された圧力値（結果の表に注記される）から７５５ｍｍＨｇを差し引いたものに等しかった。例えば記録値８５５ｍｍＨｇは、破裂圧力システム内で試験された組成物の接着強度が１００ｍｍＨｇであったことを示す。
【０６５４】
コントロール−０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ溶液中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン
【０６５５】
【表３４】
0005450612.tif 000042
【０６５６】
０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ溶液中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン、４．５Ｍ尿素
【０６５７】
【表３５】
0005450612.tif 000043
0005450612.tif 000044
0005450612.tif 000045
【０６５８】
０．１Ｍ  Ｎａ−Ａｃ溶液中の２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン、２Ｍ尿素、１Ｍ  Ｃａ
【０６５９】
【表３６】
0005450612.tif 000046
【０６６０】
本発明中のその他の実施形態により、同様の破裂圧力結果が得られた。
【０６６１】
明確さのため、別々の実施形態の文脈内に記載される本発明の特定の特色は、単一の実施形態において組み合わされて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔さのため、単一の実施形態の文脈内に記載される本発明の様々な特色は、別々に、またはいずれの適切な下位の組み合わせにおいて提供されてもよい。
【０６６２】
本発明はその特定の実施形態と協同して記載されるが、多数の代替物、改変および変動が当業者に明らかとなるであろうことは明白である。従って、添付の請求項の精神および広い範囲内にある、このような全ての代替物、改変および変動を包含することが意図される。本明細書中で言及される全ての出版物、特許および特許出願は、各々の出版物、特許および特許出願が特異的かつ個別に、参照によりここに取り込まれることが示されていたかのように同等の範囲まで、それらの全体が参照により本明細書中に取り込まれる。加えて、この出願のいずれの参考文献の引用または識別も、このような参考文献が本発明に対する先行技術として入手可能であることの承認として解釈されてはならない。
【図１】
0005450612.tif 000047
【図２】
0005450612.tif 000048
【図３Ａ】
0005450612.tif 000049
【図３Ｂ】
0005450612.tif 000050
【図３Ｃ】
0005450612.tif 000051
【図３Ｄ】
0005450612.tif 000052
【図３Ｅ】
0005450612.tif 000053
【図３Ｆ】
0005450612.tif 000054
【図４】
0005450612.tif 000055
【図５】
0005450612.tif 000056
【図６】
0005450612.tif 000057
【図７Ａ】
0005450612.tif 000058
【図７Ｂ】
0005450612.tif 000059
【図７Ｃ】
0005450612.tif 000060
【図８】
0005450612.tif 000061
【図９】
0005450612.tif 000062