(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高等植物のプラスチドにおいて少なくとも１の異種蛋白を発現するための組み換えＤＮＡ構築物であって、該少なくとも１の異種蛋白のコーディング領域に操作可能に結合するプロモーターエレメント、リーダー配列および下流ボックスエレメントを含む該コーディング領域の上流にあるキメラ５’調節領域を含み、該キメラ５’調節領域がＰｒｒｎプロモーターのみを用いて得られた発現と比べて該ＤＮＡ構築物によりコードされるｍＲＮＡ分子の翻訳効率を増大させるものであって、配列番号：１４の配列を有するＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０＋ＤＢ／Ｅｃである、組み換えＤＮＡ構築物。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡ構築物を含むベクター。
【請求項３】
該異種蛋白がエス・ヒドロスコピクス（S. hydroscopicus）によりコードされるｂａｒ遺伝子から発現されるものであり、該ｂａｒ遺伝子がｐＫＯ１２および配列番号：１８の配列を有するｐＪＥＫ３からなる群より選択されるプラスミドに挿入されているものである、請求項１記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４】
該異種蛋白が合成のｂａｒをコードする核酸から発現されるものであり、該合成ｂａｒ核酸が配列番号：１９および配列番号：２０からなる群より選択される配列を有するものである、請求項１記載のＤＮＡ構築物。
【請求項５】
該少なくとも１の異種蛋白が融合蛋白を含むものである、請求項１記載のＤＮＡ構築物。
【請求項６】
該融合蛋白が該５’調節領域に操作可能に結合する第１および第２のコーディング領域を有し、該融合蛋白の生成が該５’調節領域により調節され、該第１のコーディング領域が選択可能なマーカー遺伝子をコードしており、該第２のコーディング領域が、形質転換された植物細胞の可視化を容易ならしめる蛍光分子をコードしているものである、請求項５記載のＤＮＡ構築物。
【請求項７】
請求項６のＤＮＡ構築物を含むベクター。
【請求項８】
該融合蛋白が、緑色蛍光蛋白コーディング領域に作動可能に連結されたａａｄＡコーディング領域からなるものである、請求項６記載のＤＮＡ構築物。
【請求項９】
該ａａｄＡコーディング領域が、ＥＬＶＥＧＫＬＥＬＶＥＧＬＫＶＡおよびＥＬＡＶＥＧＫＬＥＶＡからなる群より選択される配列を有するペプチドリンカーをコードする核酸分子を介して該緑色蛍光蛋白コーディング領域に作動可能に連結されている、請求項８記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１０】
配列番号：２１〜２５からなる群より選択される配列を有する請求項９記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１１】
請求項１記載のＤＮＡ構築物を含む高等植物のプラスチドを形質転換するためのプラスミドであって、該プラスミドが配列番号：２７の配列を有するｐＭＳＫ４９または配列番号：２６の配列を有するｐＭＳＫ３５であり、目的とする少なくとも１の異種蛋白の発現のための少なくとも１の異種核酸を含んでいてもよい、プラスミド。
【請求項１２】
請求項１１記載のプラスミドを含有するトランスジェニック植物。
【請求項１３】
単子葉植物および双子葉植物からなる群より選択される請求項１２記載のトランスジェニック植物。
【請求項１４】
トランスプラストミック単子葉植物の製造方法であって、
ａ）単子葉植物から胚形成細胞を得て；
ｂ）少なくとも１の外来蛋白をコードしている異種ＤＮＡ分子が該細胞のプラスチド中に入る条件下で該細胞を該異種ＤＮＡ分子を伴う微粒子銃ボンバートメントにさらし、該少なくとも１の外来蛋白は選択可能なマーカーであり；
ｃ）選択剤を該細胞に適用して形質転換プラスチドから未形質転換プラスチドと形質転換プラスチドとを分別し、該細胞は該選択剤の存在下で生存し分裂する形質転換プラスチドを含むものであり；
ｄ）該生存細胞を選択培地に移して徒長枝再生および成長を促進し；次いで
ｅ）該徒長枝を根付かせて、そのことによりトランスプラストミック（transplastomic）単子葉植物を得る
ことを含み、該異種ＤＮＡ分子が、少なくとも１の異種蛋白のコーディング領域に作動可能に連結された、プロモーターエレメント、リーダー配列および下流ボックスエレメントを含む、配列番号：１４で示されるキメラ５’調節領域を含み、該キメラ５’調節領域が、該キメラ調節領域を欠如している構築物に比べてコードされるＲＮＡ分子の翻訳効率を増大させる、方法。
【請求項１５】
該選択剤がストレプトマイシンおよびパロモマイシンからなる群より選択されるものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
該単子葉植物が、トウモロコシ、キビ、サトウモロコシ、サトウキビ、コメ、小麦、大麦、オート麦、ライ麦、および芝からなる群より選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
該単子葉植物が、コメである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
工程ａ）の該胚形成細胞が、胚形成カルスであり、工程ｂ）が
ｉ）改変ＣＩＭ培地上でカルスの増殖を誘導し；
ｉｉ）該増殖カルスの、液体ＡＡ培地中での胚形成細胞懸濁液を得て；次いで
ｉｉｉ）該胚形成細胞を異種ＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡでコートした微粒子銃で砲撃する
ことによって実施され、工程ｃ）における該選択剤が選択液体ＡＡ培地であり、工程ｄ）における再生および成長を促進するための該選択培地が、選択ＲＲＭ再生培地であり、そして、工程ｅ）が選択ＭＳ塩培地中で実施される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の方法により製造されるトランスプラストミックコメ植物。
【請求項２０】
請求項１４記載の方法により形質転換された単子葉植物。
【請求項２１】
トウモロコシ、キビ、サトウモロコシ、サトウキビ、コメ、小麦、大麦、オート麦、ライ麦、および芝からなる群より選択される、請求項２０記載の単子葉植物。
【請求項２２】
トランスプラストミックコメ植物の製造方法であって、
ａ）コメ植物から胚形成カルスを得て；
ｂ）改変ＣＩＭ培地上でカルスの増殖を誘導し；
ｃ）該増殖カリスの、液体ＡＡ培地中での胚形成細胞懸濁液を得て；
ｄ）プラスミドＤＮＡで被覆された微小弾で該肺形成細胞を爆撃し；
ｅ）該爆撃された細胞を選択液体ＡＡ培地に移し；
ｆ）ＡＡ培地で生存している該細胞を、緑色徒長枝が出現するに十分な時間選択ＲＲＭ再生培地に移しておき；次いで
ｇ）選択ＭＳ塩培地中で該徒長枝を根付かせる
ことを含み、該プラスミドＤＮＡが、少なくとも１の異種蛋白のコーディング領域に作動可能に連結された、プロモーターエレメント、リーダー配列および下流ボックスエレメントを含む、配列番号：１４で示されるキメラ５’調節領域を含み、該キメラ５’調節領域が、該キメラ調節領域を欠如している構築物に比べてコードされるＲＮＡ分子の翻訳効率を増大させる、方法。
【請求項２３】
該プラスミドＤＮＡが、ｐＭＳＫ３５およびｐＭＳＫ４９からなる群から選択される、請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本出願は、米国特許法§１１９（ｅ）条の下、１９９８年８月３日に出願された米国仮出願第６０/０９５，１６３号、１９９８年１２月１５日に出願された第６０/１１２，２５７号、１９９８年８月３日に出願された第６０/０９５，１６７号、１９９９年４月２９日に出願された第６０/１３１，６１１号および、１９９９年６月１１日に出願された第６０/１３８，７６４号からの優先権を主張する。前記のそれぞれの全明細は、引用により本明細書中に組み込む。
米国特許法§２０２（ｃ）条に準じ、米国政府は、本明細書に開示する発明（これは一部、国際化学基金、認可Ｎｏ．ＭＣＢ-９６-３０７６３からの基金を用いてなされた）に関する一定の権利を有する。
【０００２】発明の分野
本発明は、遺伝子組換え植物および分子生物学の分野に関する。より詳細には本発明により、プラスチドゲノムをターゲットしているベクターであって、高等植物のプラスチドにおいて高レベルのタンパク質発現を促進している翻訳調節エレメントを含むベクターが提供される。単子葉植物と双子葉植物の両方とも、本明細書中に提供されるＤＮＡ構築物を用いてうまく形質転換される。
【０００３】発明の背景
本発明が属する分野の状態をより完全に記載するために、本出願中にいくらかの公開物を引用する。これらの公開物のそれぞれの明細を、引用により本明細書中に組み込む。
高等植物の葉緑体には、光合成機構の個々の成分が、全ての細胞タンパク質の比較的大きなフラクションとして蓄積されている。最良の例としては、葉の全タンパク質の６５％を組成する可能性がある、ＣＯ２固定に関与する酵素リブロース-１，５-ビスホスフェートカルボキシラーゼ-オキシゲナーゼ（ルビスコ）である（Ellis, R.J. 1979）。潜在的に達成することができる高いタンパク質レベルのために、葉緑体をタンパク質発現のための別のシステムとして探求することにかなり興味が持たれている。現在のところ、葉緑体中の導入遺伝子から発現されるタンパク質レベルは、高程度に発現される葉緑体遺伝子のレベルに劣る。葉に関してさらに報告されている高いレベルは次のようである。：１％のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(Carrer et al., 1993)；２．５％のβ-グルクロニダーゼ(Staub and Maliga, 1993)および３-５％のバシラス・ツリンギエンシス(Bacillus thringiensis)(Ｂｔ)クリスタルトキシン(McBride et al., 1995)。この収量を得るのに高くつくが、核にコードされる、プラスチド標的Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに基く別のシステムにより、タンパク質発現の高いレベルを提供することができる(McBride et al., 1994)。
【０００４】  細菌において、タンパク質合成の速度を制限する段階はたいてい、イニシエーターｔＲＮＡ(ホルミル-メチオニル-ｔＲＮＡｆ)およびｍＲＮＡの７０Ｓリボソームへの結合、イニシエーターコドンの認識、ｍＲＮＡのリーディングフレームの正確な調整(phasing)を含む翻訳の開始である。翻訳開始は開始ファクター(ＩＦ１、ＩＦ２、ＩＦ３)に依存し、ＧＴＰを必要とする。３０Ｓサブユニットは、１６ＳｒＲＮＡの３’とｍＲＮＡリボソーム結合部位または、翻訳開始コドンの約１０ヌクレオチド上流に位置するShine-Dalgarno(SD)配列(Voorma, 1996)の間のＲＮＡ-ＲＮＡ塩位対により開始コドンへと先導される。ＡＵＧ翻訳開始コドンの１５ヌクレオチド配列下流の「下流ボックス」(ＤＢ)と１６ＳｒＲＮＡ３’配列中の相補配列または、アンチ-下流ボックス(ＡＤＢ；ヌクレオチド位置１４６９−１４８３)の間のＲＮＡ-ＲＮＡ相互作用により、ｍＲＮＡの３０Ｓリボソームサブユニット上への付着も促進され得る。加えて特定のタンパク質-ＲＮＡ相互作用により翻訳の開始が促進される可能性もある(Voorma, 1996)。
【０００５】  細菌ＩＦ１、ＩＦ２およびＩＦ３開始ファクターおよびＳ１-様リボソームタンパク質の相同物を含む原核生物の翻訳機構の重要要素が、プラスチド中に同定されている(Stern et al., 1997)。ほとんどのプラスチドｍＲＮＡｓ(９２％)はリボソーム結合部位またはＳＤ配列：ＧＧＡＧＧまたは、その切断型トリ-またはテトラヌクレオチド変種を含む。この配列は、細菌のＳＤコンセンサス５’-ＵＡＡＧＧＡＧＧＵＧＡ-３’と類似している(Voorma, 1996)。目的の外来遺伝子の高等植物のプラスチド中での高レベルの発現が強く望まれる。本発明により、プラスチド形質転換ベクターにおける使用のための新規な遺伝子翻訳調節エレメントが提供される。そのようなベクターにこれらのエレメントを導入することにより、単子葉植物および双子葉植物の両方において高程度に発現される葉緑体遺伝子に関して観察されるタンパク質発現レベルに匹敵するタンパク質発現レベルが得られる。
【０００６】発明の概要
５’遺伝子調節領域は、独特なＤＮＡ配列情報（これにより、ＲＮＡポリメラーゼおよび翻訳を促進する翻訳調節エレメントによる認識が容易になる）を有するプロモーターを含む。これらの成分は両方とも、遺伝子の発現を駆動するのに共に作用する。
本発明に従い、翻訳調節エレメントを組み込むキメラ５’調節領域を構築した。これらのキメラ５’調節領域をプラスチド形質転換ベクターに組み込んだ後、標的植物細胞の形質転換が起こり、劇的に高められたレベルのタンパク質の発現が起こる。これらのキメラ５’調節領域は、幅広い範囲の植物組織において目的の外来遺伝子を発現させるのに利用するために用いることができる。そのようなプロモーターを含む、多細胞植物のプラスチドを安定に形質転換するためのＤＮＡ構築物および方法を提供することが本発明の目的である。
【０００７】  本発明の一態様において、高等植物のプラスチド中で少なくとも一つの異種構造タンパク質を発現するための組換えＤＮＡ構築物が提供される。該構築物は、少なくとも一つの該異種構造タンパク質のコーディング領域に操作可能な状態で結合するプロモーターエレメント、リーダー配列および下流ボックスエレメントを含む。該キメラ調節領域は、該ＤＮＡ構築物によりコードされるｍＲＮＡ分子の翻訳効率を高めるのに作用する。ＤＮＡ構築物から成るベクターも、本発明中に企図する。本発明の典型的なＤＮＡ構築物は、次のキメラ調節領域を含む。：ＰｒｎｎＬａｔｐＢ+ＤＢｗｔ、ＰｒｒｎＬａｔｐＢ-ＤＢ、ＰｒｒｎＬａｔｐＢ+ＤＢｍ、ＰｒｒｎＬｃｌｐＰ+ＤＢｗｔ、ＰｒｒｎｃｌｐＰ-ＤＢ、ＰｒｒｎＬｒｂｃＬ+ＤＢｗｔ、ＰｒｒｎＬｒｂｃＬ-ＤＢ、ＰｒｒｎＬｒｂｃＬ+ＤＢｍ、ＰｒｒｎＬｐｓｂＢ+ＤＢｗｔ、ＰｒｒｎＬｐｓｂＢ-ＤＢ、ＰｒｒｎＬｐｓｂＡ+ＤＢｗｔ、ＰｒｒｎＬｐｓｂＡ-ＤＢ、ＰｒｒｎＬｐｓｂＡ-ＤＢ(+ＧＣ)、ＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０+ＤＢ/Ｅｃ、ＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０+ＤＢ/ｐｔおよびＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０-ＤＢ。本発明の構築物中での使用に好ましい下流ボックス配列は、次の配列を有する。：
５’ＴＣＣＡＧＴＣＡＣＴＡＧＣＣＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧＣＡ’３および５’ＣＣＣＡＧＴＣＡＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＡＡ’３
【０００８】  本発明の５’調節セグメントは、高等植物のプラスチドにおいて、エス・ヒドロスコピカス(S.Hydroscopicus)からのバー遺伝子の発現を駆動するのに有効に用いられている。合成バー遺伝子も、本発明のＤＮＡ構築物を用いて形成および発現されている。微生物および真菌中でのタンパク質翻訳に好ましくないコーディング領域にレアコドンを組み込むことによりプラスチドにおいて導入遺伝子の封じ込めを最大限に活用するべく、これらの構築物は操作されている。
【０００９】  本発明のさらにもう一つの態様において、少なくとも一つの融合タンパク質を、本発明のＤＮＡ構築物を利用して製造する。典型的な融合タンパク質は、核融合タンパク質の生成が本明細書中に開示する５’調節領域により調節されるように、本明細書中に開示する５’調節領域に操作可能な状態で結合する第一および第二コーディング領域を有する。一態様において、該第一コーディング領域は選択可能なマーカー遺伝子をコードし、該第二コーディング領域は形質転換植物細胞の視覚化を容易にするための蛍光分子をコードする。そのような融合タンパク質をコードしているＤＮＡ構築物から成るベクターも本発明の範囲内にある。典型的な融合タンパク質は、緑色蛍光タンパク質コーディング領域に操作可能な状態で結合するａａｄＡコーディング領域から成る。これらの一部は、ＥＬＶＥＧＫＬＥＬＶＥＧＬＫＶＡおよびＥＬＡＶＥＧＫＬＥＶＡのようなペプチドリンカーにより結合することができる。
【００１０】  高等植物のプラスチドを形質転換するためのプラスミドも本発明に含まれる。典型的なプラスミドは、ｐＨＫ３０(Ｂ)、ｐＨＫ３１(Ｂ)、ｐＨＫ６０、ｐＨＫ３２(Ｂ)、ｐＨＫ３３(Ｂ)、ｐＨＫ３４(Ａ)、ｐＨＫ３５(Ａ)、ｐＨＫ６４(Ａ)、ｐＨＫ３６(Ａ)、ｐＨＫ３７(Ａ)、ｐＨＫ３８(Ａ)、ｐＨＫ３９(Ａ)、ｐＨＫ４０(Ａ)、ｐＨＫ４１(Ａ)、ｐＨＫ４２(Ａ)、ｐＨＫ４３(Ａ)、ｐＭＳＫ５６、ｐＭＳＫ５７、ｐＭＳＫ４８、ｐＭＳＫ４９、ｐＭＳＫ３５、ｐＭＳＫ５３およびｐＭＳＫ５４から成る群から選択される。
【００１１】  前記のプラスミドのセットを有する単子葉植物および双子葉植物両方の遺伝子組換え植物も、本発明の範囲内にあると企図する。
【００１２】
本発明のさらにもう一つの態様において、トランスプラストミック(transplastomic)単子葉植物を製造するための方法が提供される。一つの方法は、ａ)胚形成細胞を得ること；ｂ) 異種構造ＤＮＡが該細胞のプラスチドに入りこむ条件下で、該細胞を異種構造ＤＮＡ分子に暴露すること(該異種構造ＤＮＡ分子は少なくとも一つの外来タンパク質をコードし、少なくとも一つの該外来タンパク質は、選択可能なマーカーをコードする)；ｃ)非形質転換プラスチドの形質転換プラスチドからのソーティングを促進するために、該細胞に選択試薬を適用すること(該細胞は、該選択試薬の存在下で生存および分裂する形質転換プラスチドを含む)；ｄ)植物再生と苗条成長を促進するために、選択培地に該生存細胞を移すこと；および、ｅ)該苗条を根付かせ、それによりトランスプラストミックな単子葉植物を生み出すこと。異種構造ＤＮＡ分子は、微粒子銃ボンバードメント、アグロバクテリウム媒介形質転換、マイクロインジェクションおよびエレクトロポーレーションから成る群から選択される方法により植物細胞に導入することができる。前記方法の一態様において、フォトプラストは胚形成細胞から得、異種構造ＤＮＡ分子は、ポリエチレングリコールに暴露することにより該フォトプラストに送達する。本発明の方法の実施に適した選択試薬は、ストレプトマイシンおよびパロモマイシンである。本発明の方法を用いて形質転換することができる単子葉植物は、制限するものではないが、トウモロコシ、キビ、サトウモロコシ、サトウキビ、コメ、コムギ、オオムギ、エンバク、ライムギおよび芝草である。
【００１３】  好ましい態様において、トランスプラストミックな(transplastomic)コメ植物を生み出すための方法が提供される。この方法は次の段階を含む：ａ)胚形成カルスを得ること；ｂ)変更ＣＩＭ培地上でカルスの増殖を誘導すること；ｃ)該増殖カルスの、液体ＡＡ培地中での胚形成細胞懸濁液を得ること；ｄ)該胚形成細胞をプラスミドＤＮＡでコートした微粒子銃で砲撃すること；ｅ)該被砲撃細胞を選択液体ＡＡ培地に移すこと；ｆ)緑の苗条が現れるのに十分な期間、ＡＡ培地中で生存している該細胞を選択ＲＲＭ再生培地に移すこと；および、ｇ)該苗条を選択ＭＳ塩培地に根付かせること。
【００１４】  前記のような、コメを形質転換するのに適したプラスミドには、ｐＭＳＫ３５およびｐＭＳＫ５３、ｐＭＳＫ５４およびｐＭＳＫ４９が含まれる。そのように生み出されたトランスプラストミックなコメ植物も、本発明の範囲内にあると企図する。
本発明のさらなる最終的な態様において、形質転換植物に導入遺伝子を封じ込めるための方法も提供される。典型的な方法には次の段階が含まれる。：ａ)形質転換されるべき該植物におけるおよび、該植物に関連して見出される微生物におけるコドンの用いられ方を決定すること；および、ｂ)レア微生物コドンの導入により該導入遺伝子配列を遺伝子操作して、該植物関連微生物における該導入遺伝子の発現を排除すること。直前に記載した方法の典型的な態様において、導入遺伝子はバー遺伝子であり、該レアコドンはＡＧＡおよびＡＧＧから成る群から選択されるアルギニンをコードするコドンであり、導入遺伝子はＥ．ｃｏｌｉ中で発現されない。
【００１５】  次の定義により、本発明の主要事項の理解が容易になるであろう。
ヘテロプラストミック：植物細胞または組織に含まれる単一のプラスチドまたは一群のプラスチド中に、異なるプラスチドゲノムの混合群が存在することを言う。
ホモプラストミック：植物細胞または組織に含まれる一プラスチドまたは一群のプラスチドいずれかの中の、プラスチドゲノムの同質群を言う。ホモプラストミックなプラスチド、細胞または組織は、それらがプラスチドゲノムの１タイプのみを含むために遺伝子的に安定である。ゆえに、選択圧が解除された後もそれらはホモプラストミックなままであり、自家受精した子孫もまたホモプラストミックである。本発明の目的のために、機能的にホモプラストミックな(すなわち、野生型のＤＮＡまたは、配列変異を有する形質転換遺伝子の少数の群のみを含む)遺伝子のヘテロプラストミックな群を、本明細書中で「機能的にホモプラストミックである」または「実質的にホモプラストミックである」と言ってもよい。細胞または組織のこれらのタイプは、連続選択によりホモプラストミックな状態に容易に精製することができる。
【００１６】 プラストーム：プラスチドのゲノム
トランスプラストーム：形質転換されたプラスチドゲノム
プラスチドの形質転換：形質転換ＤＮＡのプラスチドゲノムへの安定な組み込み（形質転換プラスチドを含んでいる植物の種子後代に遺伝する）。
選択可能なマーカー遺伝子：「選択可能なマーカー遺伝子」は、発現に際し、プラスチドに選択的利点および表現形（これにより、うまく形質転換されたプラスチドまたは、該形質転換プラスチドを有する細胞または組織を同定することが可能となる）を与える遺伝子を言う。
【００１７】 形質転換ＤＮＡ：プラスチドに導入された場合、相同組換えによりプラスチドゲノムの部分となる相同ＤＮＡまたは、相同ＤＮＡに隣接する異種構造ＤＮＡを言う。
操作可能な状態で結合する：とは、両領域が遺伝子の発現および/またはタンパク質の翻訳を促進するべく機能するように構築物中に共に挿入された、２つの異なる領域または２つの異なる遺伝子に関する。
【００１８】  次の詳細な説明は、本発明のＤＮＡ構築物を作成および使用するために、および、本発明の方法を実施するために好ましい方法の例を提供する。特に記載していないいずれの分子クローニングおよび組換えＤＮＡ技術も、Sambrook et al., "DNA Cloning, A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, 1989に大まかに記載されている常套法により行う。
【００１９】発明の詳細な説明
プラスチド中の高レベル蛋白発現のためのＤＮＡカセットが本発明において提供される。高等植物プラスチドｍＲＮＡは、１６Ｓ ｒＲＮＡ ３−領域に対して相補的なＡＵＧの下流５０ヌクレオチドの範囲内の配列を含んでいる。これらの相補的な配列はE. coliのｍＲＮＡ中のＤＢ配列とほぼ同じ位置に存在する。図１Ａおよび２Ａ参照。興味深いことに、アンチ−下流−ボックス（ＡＤＢ）領域中のタバコプラスチドおよびE. coli １６Ｓ ｒＲＮＡ配列が有意に異なるので（図１Ｂ）、試験的に決定されたプラスチドＤＢ配列はE. coli DBコンセンサスとは有意に異なっている。プラスチドｒＲＮＡオペロンσ７０−型プロモーター（Ｐｒｒｎ−１１４；Svab and Maliga, 1993; Vera and Sugiura, 1995）ならびに未処理のＤＢ、変異ＤＢおよび合成ＤＢ配列を伴うプラスチドｍＲＮＡのリーダー配列からなる一連のキメラ５’調節領域を構築することによって、プラスチド中にＤＢ配列を含ませることによる蛋白発現改善の実行可能性を評価した。プラスチドｍＲＮＡリーダーはＳＤ配列の存在および位置に関して異なっている。キメラプロモーターからの翻訳効率を、プラスチド中の細菌ｎｅｏ遺伝子を発現させることにより調べた。ｎｅｏ（またはｋａｎ）遺伝子はネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）をコードしており、細菌およびプラスチドにおいてカナマイシン耐性を付与する（Carrer et al., 1993）。我々は、キメラなｎｅｏ転写物に由来するＮＰＴＩＩが全可溶性葉蛋白の０．２％ないし２３％の範囲で蓄積することを見出しており、そのことは、高レベルの蛋白発現に対するｍＲＮＡの５’領域における翻訳制御シグナルの重要性を示唆するものである。
【００２０】  核遺伝子のみから発現される組み換え蛋白を植物プラスチドにおいて生産することは非常に興味深いことである（Arntzen, 1997; Conrad and Fielder, 1998; Kusnadi et al., 1997）。本明細書に記載されるＰｒｒｎＬｒｂｃＬ＋ＤＢｗｔおよびＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０発現カセットから生じる蛋白レベルは、核遺伝子に関して報告された蛋白レベルを有意に超えるものであった。核遺伝子由来のＮＰＴＩＩの蓄積は、典型的には＜＜０．１％であり（Allen et al., 1996）、最高値は全可溶性蛋白の０．４％である（Houdt et al., 1997）。我々は、プラスチドｎｅｏ導入遺伝子からの１％のＮＰＴＩＩの蓄積を比較的初期に報告した（Carrer et al., 1993）。プラスチド導入遺伝子由来の蛋白蓄積に関する他の例は、２．５％のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）（Staub and Maliga, 1993）および３〜５％のBacillus thuringiensis（Ｂｔ）結晶性トキシン（McBride et al., 1995）である。この初期の報告と比較すると、我々は、ＮＰＴＩＩレベルの有意な増加を達成し、全可溶性蛋白の２３％までであった。
【００２１】  抗生物質不活性化酵素をAequorea victoria緑色蛍光蛋白と融合させることにより得られる蛋白ＦＬＡＲＥ−Ｓは、本発明のＰｒｒｎＬａｔｐＢ＋ＤＢｗｔおよびＰｒｒｎＬｒｂｃＬ＋ＤＢｗｔカセットから、全可溶性蛋白の８％および１８％にまで蓄積した。実施例８参照。本発明のカセットからの高レベルの蛋白蓄積は、キメラ遺伝子の翻訳制御領域（ＴＣＲ）を処理することに明らかに起因するといえる。これらの新規エレメントを種々の用途に用いて、農耕、工業または医薬的重要性を有する蛋白を発現させてもよい。
【００２２】  野外の作物における導入遺伝子の流出を制御する方法に対する強い需要がある。大部分の作物においてプラスチドは花粉によって伝達されないので（Maliga, 1993）、核ゲノムでなくプラスチドゲノムに導入遺伝子を入れることは本質的な導入遺伝子の封じ込めを引き起こす。技術が足りなかったので、作物におけるプラスチドの形質転換は広く用いられてはいなかった。選択マーカーの増強された発現は高い形質転換効率をもたらすはずである。本発明のキメラプロモーターは、プラスチド形質転換の範囲を農耕および工業的に重要な作物にまで拡張することを容易ならしめる。実際に、本明細書に記載したＰｒｒｎＬａｔｐＢ＋ＤＢｗｔカセットからの高レベル発現は、カナマイシン耐性トランスプラストミック（transplastomic）タバコ系の頻度を〜２５倍増加させた。より重要なことに、プラスチド形質転換後の高レベルのマーカー遺伝子発現はコメにおいて得られており、コメはプラスチド形質転換が成功した最初の穀物種である。結果を実施例８に示す。
【００２３】  後で示す実施例は本発明の種々の具体例を説明するためのものである。実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
以下に示すプロトコルは本発明の実施を容易ならしめるためのものである。
【００２４】高等植物プラスチドにおける異種蛋白発現増加のためのキメラ５’カセットの調製
プラスチドｍＲＮＡ中の潜在的な下流ボックスの同定
下記遺伝子に関してｍＲＮＡ分子中の下流ボックスの存在または不存在を調べた：ｐｓｂＢ（Tanaka et al., 1987）およびｐｓｂＡ（Sugita and Sugiura, 1984）、光システムＩＩ遺伝子；リブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼの大サブユニットをコードするｒｂｃＬ（Shinozaki and Sugiura, 1982）；ＡＴＰａｓｅβサブユニットをコードするａｔｐＢ（Orozco et al., 1990）；およびＣｌｐ ＡＴＰ−依存性プラスチドプロテアーゼ蛋白分解サブユニットをコードするｃｌｐＰ（Hajdukiewicz et al., 1997）。興味深いことに、大部分またはすべてのＰｃｌｐＰ−５３プロモーターは転写開始部位の下流にあり、それゆえ、ＰｒｒｎＬｃｌｐＰ構築物は２個のプロモーター：Ｐｒｒｎ−１１４およびＰｃｌｐＰ−５３を含むと考えられる。これらの遺伝子の転写解部位は上で引用した文献に記載されている。プラスチドゲノム中の遺伝子のヌクレオチド位置に関してはShinozaki et al., 1986参照。
【００２５】  最初に、プラスチドＡＤＢは、１６Ｓ ｒＲＮＡ中のE. coli ＡＤＢとサイズおよび位置が類似していると考えられた。E. coli ＡＤＢはヌクレオチド１４６９および１４８３の間（１５ヌクレオチド）の保存された幹構造上に局在化しており、それはプラスチド１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド１４１６から１４３０までに対応している（Dams et al., 1988; Sprengart et al., 1996）。いずれの場合においてもＡＤＢは１６Ｓ ｒＲＮＡの端から２番目の幹に含まれているが、実際のＡＤＢ配列はプラスチドおよびE. coliにおいて異なっている（図１Ｂ）。プラスチド遺伝子ａｔｐＢ、ｃｌｐＰ、ｒｂｃＬ、ｐｅｔＡ、ｐｓａＡ、ｐｓｂＡ、ｐｓｂＢ、ｐｓｂＤおよびｐｓｂＥのＮ末端コーディング領域を、潜在的なＤＢ配列を求めて検索した。試験的に決定されたＤＢ領域上を中心とした２６ヌクレオチドの配列に関して相同性検索を行った（図１Ｂ）。検索により、別の解釈をされる不完全な短い鎖が明らかとなった。ｍＲＮＡ中のＤＢの位置が全く不定なので（Etchegaray and Inoue, 1999）、我々は図２Ａにおいて、ａｔｐＢおよびｒｂｃＬに関して４つの潜在的なＤＢ−ＡＤＢ相互作用を示す。下に示す２つのプラスチドｍＲＮＡを選択してプラスチドｍＲＮＡの翻訳におけるＤＢの役割を調べた：
１）ａｔｐＢ ｍＲＮＡはＳＤ配列を欠いている；２）ｒｂｃＬ ｍＲＮＡは原核コンセンサスにおいてＳＤ配列を含んでいる。さらに、ファージＴ７遺伝子１０（Ｔ７ｇ１０）リーダーを研究に加えた。このリーダーは十分に特徴づけられたE. coli ＤＢ配列を有する（図２Ｂ；Sprengart et al., 1996）。図２Ａに示された潜在的なＤＢ配列を有するさらなるプラスチドｍＲＮＡはｃｌｐＰ、ｐｓｂＢおよびｐｓｂＡである。
【００２６】翻訳に関するリーダー配列の効率を試験するための実験戦略
選択遺伝子の５’−ＵＴＲからの翻訳効率を比較するために、複数の隣接ヌクレオチド（−１１４、−１１３、−１１１；Sriraman et al., 1998）からの転写を開始させる強力なプラスチドｒＲＮＡオペロンσ７０−型プロモーター（Ｐｒｒｎ−１１４）（Svab and Maliga, 1993; Allison et al., 1996）の下流に５’−ＵＴＲをクローン化した。ＳａｃＩ−ＮｈｅＩまたはＳａｃＩ−ＮｃｏＩフラグメントとしてプロモーターフラグメントを構築した。慣用的な分子生物学的手法を用いるキメラプロモーターの構築を次のセクションにおいて詳細に説明する。
【００２７】  各選択５’−ＵＴＲにつき２個の構築物を調製した：１つは未処理下流ボックスあり（＋ＤＢ）、もう１つは未処理下流ボックスなし（−ＤＢ）であった。−ＤＢ構築物がＮｈｅＩ制限部位により提供される合成ＤＢを有することは、以下の議論から明らかであろう。カナマイシン耐性（ｎｅｏ）遺伝子のコーディング領域の上流にプロモーターをクローン化し、プロモーターはＮｈｅＩ−ＸｂａＩまたはＮｃｏＩ−ＸｂａＩフラグメント上で利用可能である。ｍＲＮＡの安定化のために、ｒｂｃＬ遺伝子３’−非翻訳領域をｎｅｏの下流にＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてクローン化した。それゆえ、キメラｎｅｏ遺伝子をｐＵＣ１１８またはｐＢＳＩＩＫＳ＋プラスミドからＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして切り出すことが可能である。これらの元になったプラスミドを表１に示す。
【表１】
0005414136.tif 000002
aSD+, 原核コンセンサス位置において標準偏差あり; SD-, 原核コンセンサス位置において標準偏差なし;
DB wt, 野生型; m, 変異体; s, 合成 DB としての NheI 部位である。
bEc or pt はE. coliまたはプラスチドDB配列に関する構築物についていう。
cpsbA(+GC) はｍＲＮＡ ５’末端において野生型ＡへのＧＣの付加を示す。
d源遺伝子 psbBにおいて 翻訳開始部位はＮｃｏＩ部位中にある; それゆえ、 +DB 構築物 pHK16 はこの NcoI 部位を NheI 部位の上流に有する。図９参照。
e翻訳開始コドンは NcoI 部位に含まれる; NheI 部位は kan コーディング領域のすぐ下流にある。図８参照。
【００２８】  ＰｒｒｎプロモーターフラグメントはプラスミドｐＰＲＶ１００Ａ中で利用可能である。成熟１６Ｓ ｒＲＮＡの５’末端の上流−１９７ヌクレオチドと−１１４ヌクレオチドとの間の配列を含むように該プロモーターを設計した。ヌクレオチド−１９７は、これらの研究および他の研究に使用されるＰｒｒｎプロモーター構築物の５’末端である（Svab and Maliga, 1993; −１は成熟１６Ｓ ｒＲＮＡの上流の最初のヌクレオチドである）。−１１４の位置のＧは３つの転写開始部位のうちの１つである。他の２つは隣接するＣ（−１１３）およびＡ（−１１１）ヌクレオチドである（Allison et al., 1996; Sriraman et al., 1998）。Ｐｒｒｎ転写が開始する位置のヌクレオチドを図３Ａ〜Ｄにおいて黒丸でマークした。大部分の構築物において、未処理プロモーターと同様に、このヌクレオチドはＧ（−１１４）である。２つの構築物においてはＧがＡに置換されており、リーダー配列の源であるｐｓｂＡプロモーター（ｐＨＫ２１、ｐＨＫ２２；下記参照）と同様である。
【００２９】ａｔｐＢからの５’リーダーの設計
ａｔｐＢ遺伝子に関して、少なくとも４つの一次転写物が含まれている複数のｍＲＮＡの５’末端がタバコ葉においてマッピングされ、４つのプロモーターからの転写ならびに翻訳開始コドンから９０ヌクレオチド上流のプロセッシングされた５’末端が示された（Orozco et al., 1990）。プロセッシングされたａｔｐＢの５’末端の末端ヌクレオチドはＧである。それゆえ、キメラ転写物のリーダー配列はプロセッシングされたａｔｐＢ ｍＲＮＡの５’末端の完全な複製物であろうと考えて、転写がＧから開始するようにキメラＰｒｒｎＬａｔｐＢプロモーターを設計した。ａｔｐＢコーディング領域からの４２個および６個のヌクレオチドがそれぞれ＋ＤＢｗｔおよび−ＤＢ構築物中に含まれている。４２個のヌクレオチドは図２Ａに示された４つの潜在的なＤＢ配列を含む。推定ｍＲＮＡ ５’二次構造に影響することなくＮｈｅＩ（ＴからＡ）およびＥｃｏＲＩ（ＧからＡ）制限部位を除去するようにリーダー配列中の２つの点突然変異を設計した。−ＤＢ構築物において、停止コドンの読み枠がずれているＮｈｅＩ制限部位（ＧＣＴＡＧＣ配列）の上流の未処理コーディング領域に由来する２つのコドン（６ヌクレオチド）が保持された（図３Ａ）。１１個のサイレント点突然変異がＰｒｒｎＬａｔｐＢ＋ＤＢｍ構築物のＤＢ領域に導入されて、塩基対数が最小化され、あるいは塩基対の性質が変化させられた（例えば、Ｇ−ＣからＧ−Ｕへ）（図２Ａ；図３Ａ）。
【００３０】ｃｌｐＰからの５’リーダーの設計
ｃｌｐＰ遺伝子の２つの主要な５’末端がタバコ葉においてマッピングされた（Hajdukiewicz et al., 1997）。近位の一次転写物の末端ヌクレオチドはＧである。それゆえ、キメラ転写物のリーダー配列はＰｃｌｐ−５３ ＮＥＰプロモーターから転写されたリーダーの完全な複製物であろうと考えて、Ｇにおいて転写が開始するようにキメラＰｒｒｎＬｃｌｐＰプロモーターを設計した。ｃｌｐＰコーディング領域からの４８個および６個のヌクレオチドがそれぞれ＋ＤＢｗｔおよび−ＤＢ構築物中に含まれている。図２Ａに示されるように、４８個のヌクレオチドは４つの潜在的なＤＢ配列を含む。−ＤＢ構築物において、停止コドンの読み枠がずれているＮｈｅＩ制限部位（ＧＣＴＡＧＣ配列）の上流の未処理コーディング領域由来の２つのコドン（６個のヌクレオチド）が保持された。
【００３１】ｒｂｃＬからの５’リーダーの設計
ｒｂｃＬ遺伝子に関して１の主要ｍＲＮＡ ５’末端および１のプロセッシングされたｍＲＮＡ ５’末端がタバコ葉においてマッピングされた（Shinozaki and Sugiura, 1982）。プロセッシングされた末端ヌクレオチドはＴである。末端のＴの下流にある１のヌクレオチドＧにおいて転写が開始するようにキメラＰｒｒｎＬｒｂｃＬプロモーターを設計した。ｒｂｃＬコーディング配列からの４２個および６個のヌクレオチドがそれぞれ＋ＤＢおよび−ＤＢ構築物中に含まれている。図２Ａに示すように４２個のヌクレオチドは４つの潜在的なＤＢ配列を含む。推定ｍＲＮＡ ５’二次構造に影響することなくＥｃｏＲＩ制限部位を除去するようにリーダー配列中の１の点突然変異（ＧからＡ）を設計した。−ＤＢ構築物において、停止コドンの読み枠がずれているＮｈｅＩ制限部位（ＧＣＴＡＧＣ配列）の上流の未処理コーディング領域由来の２つのコドン（６個のヌクレオチド）が保持された。２０個のサイレント点突然変異がＰｒｒｎＬｒｂｃＬ＋ＤＢｍ構築物のＤＢ領域中に導入されて、塩基対数が最小化され、あるいは塩基対の性質が変化させられた（例えば、Ｇ−ＣからＧ−Ｕへ）（図２Ｂ；図３Ｂ）。
【００３２】ｐｓｂＢからの５’リーダーの設計
ｐｓｂＢ遺伝子に関して１の主要ｍＲＮＡ ５’末端および１のプロセッシングされたｍＲＮＡ ５’末端がタバコ葉において実験的に同定された（Tanaka et al., 1987）。ＰｒｒｎプロモーターのＧ（−１１４）から転写が開始し、ｍＲＮＡの安定化に関与していると考えられる無傷の二次（幹）構造を含むようにリーダー配列を設計した。ｐｓｂＢコーディング領域からの４５個および３個のヌクレオチドが＋ＤＢおよび−ＤＢ構築物中に含まれている。図２Ａに示すように４５個のヌクレオチドは４つの潜在的なＤＢ配列を含む。本来的には、ｐｓｂＢリーダーを伴うｎｅｏコーディング領域を融合させるために使用されるＮｃｏＩ部位中にＡＴＧが含まれているので、ｐｓｂＢコーディング領域からのアミノ酸は−ＤＢ構築物中に付加されない。
【００３３】ｐｓｂＡからの５’リーダーの設計
ｐｓｂＡ遺伝子に関して１のｍＲＮＡ ５’末端がタバコ葉においてマッピングされた（Sugita and Sugiura, 1984）。一次転写物の末端ヌクレオチドはＡである。それゆえ、キメラ転写物のリーダー配列がｐｓｂＡプロモーターから転写されたリーダーの完全な複製物であろうと考えて、Ａにおいて転写が開始するようにキメラＰｒｒｎＬｐｓｂＡプロモーターを設計した。ｐｓｂＡコーディング領域からの２１個および３個のヌクレオチドがそれぞれ＋ＤＢおよび−ＤＢ構築物中に含まれる。図２Ａに示すように２１個のヌクレオチドは潜在的なＤＢ配列を含む。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）含むＮｃｏＩ部位を介してｎｅｏコーディング領域が当該キメラプロモーターに連結されたので、ｐｓｂＡコーディング領域由来のアミノ酸は−ＤＢ構築物中に付加されない。このことは、転写がＰｒｒｎ  Ｇ（−１１４）およびＣ（−１１３）から開始するように設計されているプラスミドＰＨＫ２３中の第２の−ＤＢプロモーターについても真実である（図３Ｃ）。
【００３４】  Ｔ７ファージ遺伝子１０リーダーの設計
Ｔ７ファージ遺伝子１０リーダー(６３ヌクレオチド)は、大腸菌における効率的な翻訳開始を促進することが示された(オリンズ(Olins)ら、1988年)。このリーダーは、大腸菌ｐＥＴ発現ベクター(スチュディール(Studier)ら、1990年；ノヴァジェン・インク(Novagen Inc.))中で用いられる。５'末端の末端ヌクレオチドはＧである。それゆえ、キメラＰｒｒｎＴ７ｇ１０Ｌプロモーターは、Ｇから転写を開始するように設計された。このことから、キメラ転写物のリーダー配列は、ＸｂａＩ部位を除去するために導入されたＴからＡへの変異を除いて、Ｔ７ファージ遺伝子１０ｍＲＮＡの複製物であると予想される。＋ＤＢ/Ｅｃ(大腸菌ＤＢ配列を有する)および−ＤＢ構築物には、それぞれＴ７ファージ遺伝子１０コード領域由来の２４および９ヌクレオチドが含まれる。プラスチドにおける大腸菌配列およびプラスチドＤＢ配列の効率を比較するために、第２の＋ＤＢプロモーターをタバコＤＢ配列を用いて構築した(ＰｒｒｎＴ７ｇ１０Ｌ＋ＤＢ/ｐｔ）。負のＴ７ｇ１０リーダーは、翻訳開始コドンの直ぐ下流にＮｈｅＩ部位を有する。このＮｈｅＩ部位は、＋ＤＢ構築物におけるＴからＡへの点突然変異により除去された(図３Ｄ)。
【００３５】  プラスチドゲノムに導入するために、キメラｎｅｏ遺伝子をプラスチド形質転換ベクターｐＰＲＶ１１１ＡまたはｐＰＲＶ１１１Ｂにクローニングした。米国特許第５，８７７，４０２号を参照されたい。その開示内容は、出典を示すことにより、本明細書の一部をなす。ｐＰＲＶ１１１ベクターは、タバコプラスチドゲノムの反転した反復領域への挿入を目的とし、選択可能なスペクチノマイシン(ａａｄＡ)耐性遺伝子を保持する。これらベクターの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ(Ｕ１２８１２、Ｕ１２８１３)に寄託されている。ベクターｐＰＲＶ１１１Ｂにおけるキメラｎｅｏ遺伝子がａａｄＡ遺伝子と直列しているのに対し、ベクターｐＰＲＶ１１１Ａにおけるキメラｎｅｏ遺伝子は互いに異なって配向している。キメラｎｅｏ遺伝子を有するプラスチド形質転換ベクターの一般的な概略を図４Ａおよび４Ｂに示す。
【００３６】  プラスチドｍＲＮＡリーダーを有するキメラＰｒｎｎプロモーターの構築
キメラＰｒｒｎプロモーター/リーダー断片は、本質的にルフェーヴル(Lefebvre)ら(1995年)に記載されているように、オーバーラップエクステンション(overlap extension)ＰＣＲ(ＳＯＥ-ＰＣＲ)により、ＳａｃＩ-ＮｈｅＩまたはＳａｃＩ-ＮｃｏＩ断片として構築した(下記表１)。Ｐｒｒｎ-プラスチドリーダーセグメントの構築は、図５に概略的に示されている。ＰＣＲ-１工程の目的は、１）Ｐｒｒｎプロモーター断片を増幅する一方、２）上流にＳａｃＩ部位に加え、特異的な下流リーダー配列との継ぎ目のない重複を加えることにある。この反応は、１）上記断片の５'末端にＳａｃＩ部位を加えるプライマー(オリゴヌクレオチド)；２）プラスミドｐＰＲＶ１００ＡのＰｒｒｎプロモーター配列を含有する適当な鋳型(ズーベンコ(Zoubenko)ら、1994年)；および３）増幅生成物の３'末端にリーダー配列との重複部分を加えるプライマーを含む。ＰＣＲ-２工程の目的は、１）プライマーとしてのＰＣＲ-１工程の生成物；２）特異的なリーダー配列を含有する適当なＤＮＡ鋳型；および３）増幅生成物の３'末端にＮｈｅＩ制限部位を含むプライマー(オリゴヌクレオチド)を用いて、ＤＢ配列を有するキメラプロモーターを生成することにある。ＰＣＲ-２の生成物は、ＤＢ配列を有するＳａｃＩ-ＮｈｅＩキメラＰｒｒｎプロモーター断片である。ＰＣＲ-３工程の目的は、適当なＮｈｅＩまたはＮｃｏＩ制限部位を導入しながら、ＤＢ配列を除去することにある。ＰＣＲ-３の生成物は、ＳａｃＩ-ＮｈｅＩまたはＳａｃＩ-ＮｃｏＩキメラＰｒｒｎプロモーター断片である。ここで、ＤＢ配列は、ＮｈｅＩ部位で置換されている。ＰＣＴ-４工程の目的は、野生型ＤＢを変異型ＤＢで置換することにある。ＰＣＲ-４の生成物は、ＳａｃＩ-ＮｈｅＩ Ｐｒｒｎプロモーター断片である。
【００３７】  キメラプロモーターの構築に用いられるプライマー(オリゴヌクレオチド)を表２に示す。これらキメラプロモーターは、図５に概略的に示すオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡ鋳型を用いて、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより得た。
【００３８】表２
キメラプロモーターの構築に用いられるオリゴヌクレオチド
#1:5'-CCCGAGCTCGCTCCCCCGCCGTCGTTC-3'
#2:5'-
CGAATTTAAAATAAATGTCCGCTTGCACGTCGATCGGTTAATTCTCCCAGAAATATAGCCATCC-3'
#3:5'-CCCGCTAGCCGTGGAAACCCCAGAACC-3'
#4:5'-CCCGCTAGCTCTCATAATAATAAAATAAATAAATATGTC-3'
#5;5'-TCACTTTGAGGTGGAAACGTAACTCCCAGAAATATAGCCATCC-3'
#6:5'-CCCGCTAGCTTCCTCTCCAGGACTTCG-3'
#7:5'-CCCGCTAGCAGGCATTAAATGAAAGAAAGAAC-3'
#8:5'-TAAGAATTTTCACAACAACAAGGTCTACTCGACTCCCAGAAATATAGCCATCC-3'
#9:5'-CCCGCTAGCTTTGAATCCAACACTTGCTTTAG-3'
#10:5'-CCCGCTAGCTGACATAAATCCCTCCCTAC-3'
#11:5'-CAAAGATAAATAGACACTACGTAACTTTATTGCATTGCTCCCAGAAATATAGCCATCC-3'
#12:5'-CCCGCTAGCATCATTCAATACAACGGTATGAACACG-3'
#13:5'-TTCTAGTGGGAAACCGTTGTGGTCTCCCTCCCAGAAATATAGCCATCC-3'
#14:5'-CCCGCTAGCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG-3'
#15:5'-CCCGCTAGCCTGTCCACCAGTCATGCTTGCCATA-3'
#16:5'-CCCGCTAGCCAAGGCAGGGCTAGTGATTGCCATATGTATATCTCCTTC-3'
#17:5'-TTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCAAGCATGACTGGTGG-3'
#18:5'-CTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGTGGGAAACCGTTGT-3'
#19:5'-CAAAATAGAAAATGGAAGGCTTTTTGCTCCCAGAAATATAGCCATCCC-3'
#20:5'-CAAAATAGAAAATGGAAGGCTTTTTTCCCAGAAATATAGCCATCCC-3'
#21:5'-GGGCCATGGTAAAATCTTGGTTTATTTAATC-3'
#22:5'-GGGGCTAGCTCTCTCTAAAATTGCAGT-3'
#23:5'-GAATAGCCTCTCCACCCA-3'
#24:5'-CCCGCTAGCCGTGGACACCCCACTTCCACTTGTTGTCGGGTTTATTCTCAT-3'
#25:5'-CCCGCTAGCTTTGAATCCTACTGAGGCTTTTGTTTCTGTTTGAGGACTCAT-3'
【００３９】  キメラＰｒｎｎプロモーター/ａｔｐＢリーダーセグメントの構築
プラスミドｐＨＫ１０中のＰｒｒｎＬａｔｐＢ＋ＤＢｗｔ(ＰＣＲ-２の生成物)
プラスミドｐＨＫ１１中のＰｒｒｎＬａｔｐＢ−ＤＢ(ＰＣＲ-３の生成物)
プラスミドｐＨＫ５０中のＰｒｒｎＬａｔｐＢ＋ＤＢｍ(ＰＣＲ-４の生成物)
ＰＣＲ-１：プライマーとしてのオリゴヌクレオチド＃１、＃２；鋳型としてのプラスミドｐＰＲＶ１００Ａ(ズーベンコ(Zoubenko)ら、1994年)ＤＮＡ。
ＰＣＲ-２：プライマーとしてのＰＣＲ-１工程の生成物、オリゴヌクレオチド＃３；鋳型としてのプラスミドｐＩＫ７９(下記参照)ＤＮＡ。
ＰＣＲ-３：プライマーとしてのオリゴヌクレオチド＃１、＃４；鋳型としてのＰＣＲ-２工程の生成物。
ＰＣＲ-４：プライマーとしてのオリゴヌクレオチド＃１、＃２４；鋳型としてのＰＣＲ-２工程の生成物。
プラスミドｐＩＫ７９は、これら遺伝子の互いに異なるプロモーターと共に、ｒｂｃＬ-ａｔｐＢ遺伝子間領域を含むヌクレオチド５５１４７〜６０４８４間にＰｖｕＩＩ/ＸｈｏＩタバコプラスチドＤＮＡ断片を保持するＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＢＳ＋ ファージミド誘導体である(シノザキ(Shinozaki)ら、1986年)。
【００４０】  キメラＰｒｎｎプロモーター/ｃｌｐＰリーダーセグメントの構築
プラスミドｐＨＫ１２中のＰｒｒｎＬｃｌｐＰ＋ＤＢｗｔ(ＰＣＲ-２の生成物)
プラスミドｐＨＫ１３中のＰｒｒｎＬｃｌｐＰ−ＤＢ(ＰＣＲ-３の生成物)
ＰＣＲ-１：プライマーとしてのオリゴヌクレオチド＃１、＃５；鋳型としてのプラスミドｐＰＲＶ１００Ａ(ズーベンコ(Zoubenko)ら、1994年)ＤＮＡ。
ＰＣＲ-２：プライマーとしてのＰＣＲ-１工程の生成物、オリゴ＃６；鋳型としてのタバコＳａｌ８ ｐｔＤＮＡ断片(シノザキ(Shinozaki)ら、1986年)。
ＰＣＲ-３：プライマーとしてのオリゴヌクレオチド＃１、＃７；鋳型としてのＰＣＲ-２工程の生成物。
【００４１】  キメラＰｒｎｎプロモーター/ｒｂｃＬリーダーセグメントの構築
プラスミドｐＨＫ１４中のＰｒｒｎＬｒｂｃＬ＋ＤＢｗｔ(ＰＣＲ-２の生成物)
プラスミドｐＨＫ１５中のＰｒｒｎＬｒｂｃＬ−ＤＢ(ＰＣＲ-３の生成物)
プラスミドｐＨＫ５４中のＰｒｒｎＬｒｂｃＬ＋ＤＢｍ(ＰＣＲ-４の生成物)
ＰＣＲ-１：プライマーとしてのオリゴヌクレオチド＃１、＃８；鋳型としてのプラスミドｐＰＲＶ１００Ａ(ズーベンコ(Zoubenko)ら、1994年)ＤＮＡ。
ＰＣＲ-２：プライマーとしてのＰＣＲ-１工程の生成物、オリゴヌクレオチド＃９；鋳型としてのプラスミドｐＩＫ７９ ＤＮＡ(上記ｐＨＫ１０の説明を参照)。
ＰＣＲ-３：プライマーとしてのオリゴヌクレオチド＃１、＃１０；鋳型としてのＰＣＲ-２工程の生成物。
ＰＣＲ-４：プライマーとしてのオリゴヌクレオチド＃１、＃２５；鋳型としてのＰＣＲ-２工程の生成物。
【００４２】  キメラＰｒｎｎプロモーター/ｐｓｂＢリーダーセグメントの構築
プラスミドｐＨＫ１６中のＰｒｒｎＬｐｓｂＢ＋ＤＢｗｔ(ＰＣＲ-２の生成物)
プラスミドｐＨＫ１７中のＰｒｒｎＬｐｓｂＢ−ＤＢ(ＳａｃＩ/ＮｃｏＩで消化した、ｐＨＫ１６由来のプロモーター)
ＰＣＲ-１：プライマーとしてのオリゴヌクレオチド＃１、＃１１；鋳型としてのプラスミドｐＰＲＶ１００Ａ(ズーベンコ(Zoubenko)ら、1994年)ＤＮＡ。
ＰＣＲ-２：プライマーとしてのＰＣＲ-１工程の生成物、オリゴ＃１２；鋳型としてのタバコＳａｌ８ ｐｔＤＮＡ断片(シノザキ(Shinozaki)ら、1986年)。
ＰＣＲ-３は、ｐｓｂＢ翻訳開始コドンがＮｃｏＩ部位に本来含まれているので必要なかった。それゆえ、−ＤＢ誘導体は、ＰＣＲ-２工程のＳａｃＩ/ＮｃｏＩ消化により得ることができた。
【００４３】  キメラＰｒｎｎプロモーター/ｐｓｂＡリーダーセグメントの構築
プラスミドｐＨＫ２１中のＰｒｒｎＬｐｓｂＡ＋ＤＢｗｔ(ＰＣＲ-２の生成物)
プラスミドｐＨＫ２２中のＰｒｒｎＬｐｓｂＡ−ＤＢ(ＰＣＲ-３の生成物)
ＰＣＲ-１：プライマーとしてのオリゴヌクレオチド＃１、＃２０；鋳型としてのプラスミドｐＰＲＶ１００Ａ(ズーベンコ(Zoubenko)ら、1994年)ＤＮＡ。
ＰＣＲ-２：プライマーとしてのＰＣＲ-１工程の生成物、オリゴ＃２２；鋳型としてのタバコＳａｌ３ ｐｔＤＮＡ断片(シノザキ(Shinozaki)ら、1986年)。
ＰＣＲ-３：プライマーとしてのオリゴヌクレオチド＃１、＃２１；鋳型としてのＰＣＲ-２工程の生成物。
プラスミドｐＨＫ２３中のＰｒｒｎＬｐｓｂＡ(ＧＣ)−ＤＢ(ＰＣＲ-２の生成物)
ＰＣＲ-１：プライマーとしてのオリゴヌクレオチド＃１、＃１９；鋳型としてのプラスミドｐＰＲＶ１００Ａ(ズーベンコ(Zoubenko)ら、1994年)ＤＮＡ。
ＰＣＲ-２：プライマーとしてのＰＣＲ-１工程の生成物、オリゴ＃２１；鋳型としてのタバコＳａｌ３ ｐｔＤＮＡ断片(シノザキ(Shinozaki)ら、1986年)。
【００４４】  上記のすべてにおいて、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＡＮポリメラーゼ(パーキン・エルマー(Perkin Elmer))またはＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ(ストラタジーン(Stratagene))を用いてＰＣＲ増幅を行い、徐々に低下するアニール温度を利用する「ステップダウン(stepdown)」ＰＣＲを実施した(ヘッカー(Hecker)およびルー(Roux)、1996年)。キメラＰｒｒｎ::ＬａｔｐＢプロモーターの正確な増幅条件を以下に示す。残りのキメラＰｒｒｎ-プラスチドリーダープロモーターの増幅条件は、ヘッカー(Hecker)およびルー(Roux)(1996年)に従って算出したが、アニール温度だけが異なる。プラスチドｍＲＮＡリーダーを有するキメラＰｒｒｎプロモーターを構築するためのＰＣＲ条件の説明を以下に与える。個々の工程の説明については、図５のスキームを参照。
【００４５】  ＰＣＲ-１プログラム：１００μｌあたり両方のプライマー５０ピコモル
１．１  変性            ９４℃で５分間
２．１  変性            ９４℃で１分間
２．２  アニール        ７２℃で０．５分間      ３サイクル
２．３  伸長            ７２℃で０．５分間
３．１  変性            ９４℃で１分間
３．２  アニール        ６９℃で０．５分間      ３サイクル
３．３  伸長            ７２℃で０．５分間
４．１  変性            ９４℃で１分間
４．２  アニール        ６６℃で０．５分間      ３サイクル
４．３  伸長            ７２℃で０．５分間
５．１  変性            ９４℃で１分間
５．２  アニール        ６３℃で０．５分間      ３サイクル
５．３  伸長            ７２℃で０．５分間
６．１  変性            ９４℃で１分間
６．２  アニール        ６０℃で０．５分間      ３サイクル
６．３  伸長            ７２℃で０．５分間
７．１  変性            ９４℃で１分間
７．２  アニール        ５７℃で０．５分間      ２０サイクル
７．３  伸長            ７２℃で０．５分間
８．１  伸長            ７２℃で１０分間
８．２                  ３０℃で１分間
【００４６】  ＰＣＲ-２プログラムは、下記の変更点を有するが、上記のＰＣＲ-１プログラムと本質的に同じである：１）プライマー１００μｌは第１ＰＣＲ反応の生成物であり、オリゴヌクレオチドプライマー５０ピコモルを用いた；および２）ステップダウンＰＣＲにおけるアニール温度は６７℃〜５２℃である。したがって、下記のアニール温度を用いた：工程２．２、６７℃；工程３．２、６４℃；工程４．２、６１℃；工程５．２、５８℃；工程６．２、５５℃；工程７．２、５２℃。
【００４７】  ＰＣＲ-３およびＰＣＲ-４プログラムは、下記の変更点を有するが、上記のＰＣＲ-１プログラムと本質的に同じである：１）ステップダウンＰＣＲにおけるアニール温度は６９℃〜４４℃である。したがって、下記のアニール温度を用いた：工程２．２、６９℃；工程３．２、６４℃；工程４．２、５９℃；工程５．２、５４℃；工程６．２、４９℃；工程７．２、４４℃。最終的なＰＣＲ反応の収率が効率的なクローニングにしては低すぎる場合には、末端を生成するのに用いたプライマーを用いて最終的な生成物を増幅した。最終的なＰＣＲ生成物を適当な制限酵素(ＳａｃＩおよびＮｈｅＩまたはＳａｃＩおよびＮｃｏＩ)で消化し、プラスミドｐＨＫ２またはｐＨＫ３(下記参照)にクローニングした。
【００４８】  Ｔ７ファージ遺伝子１０ｍＲＮＡリーダーセグメントを有するキメラプロモーターの構築
キメラＰｒｒｎプロモーター/Ｔ７遺伝子１０リーダー(ＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０)断片は、ＳａｃＩ-ＮｈｅＩ断片として構築した(下記表１)。
【００４９】 プラスミドｐＨＫ１８中のＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０＋ＤＢ/Ｅｃプロモーター
適切なＤＮＡ鋳型がない場合、ＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０＋ＤＢ/Ｅｃは、図６に概略的に示すように、２つのＰＣＲ工程に改変ポリメラーゼ連鎖反応(ウチダ(Uchida)、1992年)を採用することにより構築した。ＰＣＲ-１ＡおよびＰＣＲ-１Ｂ工程は、２つの別々の反応(ＡおよびＢ)で２つの断片を生成する。ＰＣＲ-１Ａ工程の目的は、プラスミドｐＰＲＶ１００Ａ(ズーベンコ(Zoubenko)ら、1994年)をＤＮＡ鋳型として用いて、１）上流にＳａｃＩ部位(表２のオリゴヌクレオチド＃１)；および２）特異的な下流リーダー配列(表２のオリグヌクレオチド＃１３)との継ぎ目のない重複部分を加えながら、Ｐｒｒｎプロモーター断片を増幅することにある。ＰＣＲ-１Ｂ工程の目的は、表２の重複するオリゴヌクレオチド＃１５および＃１７を用いて、Ｔ７ｇ１０リーダー配列の一部を増幅することにある。ＮｈｅＩ部位はオリゴヌクレオチド＃１５に導入される。キメラＰｒｒｎプロモーターを構築するために、ＰＣＲ-１ＡおよびＰＣＲ-１Ｂ反応の両方を上記のようなステップダウンＰＣＲにより行った。
【００５０】  このキメラプロモーターを生成するＰＣＲ-２反応には、下記のものが含まれていた。
ａ）ＤＮＡ鋳型としてのＰＣＲ-１ＡおよびＰＣＲ-１Ｂ反応の生成物；
ｂ）ＰＣＲ-１ＡおよびＰＣＲ-１Ｂ反応の生成物と重複する断片を生成するオリゴヌクレオチド＃１８(０．５ピコモル；表２)；
ｃ）最終生成物を増幅するためのオリゴヌクレオチド＃１および＃１５(表２)、最終容量１００μｌ中に各々５０ピコモル。
【００５１】  キメラＰｒｒｎプロモーターについて上で説明したように、プロモーターをステップダウンＰＣＲにより増幅した；アニール温度は７２℃〜５７℃であった。
【００５２】 プラスミドｐＨＫ１９中のＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０＋ＤＢ／ｐｔプロモーター
図７に示すように、１回のＰＣＲ工程でプロモーターフラグメントを得た。反応は、ａ）ＤＮＡテンプレートとしてプラスミドｐＨＫ１８中でプロモーターＰｒｒｎＬＴ７ｇ＋ＤＢ／Ｅｃを生じるＰＣＲ−２反応の産物およびｂ）各々、１００μｌの最終容量のオリゴヌクレオチド＃１および＃１６（表２）、５０ピコモルを含んでいた。
プロモーターを、上記のキメラＰｒｒｎプロモーターの構築に関して記載したステップダウンＰＣＲによって増幅した。アニーリング温度は７２〜５２℃の間であった。
プラスミドｐＨＫ２０中のＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０−ＤＢプロモーター
図５のＰＣＲ−３工程と同様な１回のＰＣＲ工程でプロモーターフラグメントを得た。反応は、ａ）ＤＮＡテンプレートとしてプラスミドｐＨＫ１８中でプロモーターＰｒｒｎＬＴ７ｇ＋ＤＢ／Ｅｃを生じるＰＣＲ−２反応の産物およびｂ）各々、１００μｌの最終容量のオリゴヌクレオチド＃１および＃１４（表２）、５０ピコモルを含んでいた。
プロモーターを、上記のキメラＰｒｒｎプロモーターの構築について記載したステップダウンＰＣＲによって増幅した。アニーリング温度は７２〜５２℃の間であった。
最終ＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＮｈｅＩ制限酵素で消化し、プラスミドｐＨＫ３にクローンしてプラスミドｐＨＫ１８、ｐＨＫ１９、ｐＨＫ２０を得た。
【００５３】  キメラｎｅｏ遺伝子の構築
キメラプロモーターの構築は上記した。タンパク質の蓄積レベルに対する効果を決定するため、プロモーターをｎｅｏコード領域およびプラスチドｒｂｃＬ遺伝子の３’−ＵＴＲからなるカナマイシン耐性コード構築物の上流にクローンした。このような構築物は、ＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして同じＰｒｒｎ（Ｌ）ｒｂｃｌ（Ｓ）：：ｎｅｏ：：ＴｒｂｃＬ遺伝子を担持するプラスミドｐＨＫ２およびｐＨＫ３で入手できる。プラスミドｐＨＫ２はｐＵＣ１１８ベクター誘導体、ｐＨＫ３はｐＢＳＩＩＫＳ＋誘導体である。適した制限部位を有するプラスミド地図を図８に示す。プラスミドｐＨＫ２およびｐＨＫ３中のｎｅｏ遺伝子のＤＮＡ配列を図９に示す。プラスミドｐＨＫ２において、ｎｅｏ遺伝子はＳａｃＩ部位の上流にＥｃｏＲＩ部位を有することに注目（図８）。ＰｒｒｎおよびＴｒｂｃＬは、StaubおよびMaliga, 1994に記載されている。ｎｅｏ遺伝子はプラスミドｐＳＣ１（ChaudhuriおよびMaliga, 1996）から由来する。種々のプロモーター構築物を担持するｐＵＣ１１８およびｐＢＳＩＩＫＳ＋プラスミド誘導体を表１にリストしてある。
プロモーターフラグメントのＤＮＡ配列を決定するため、プラスミドを製造者の推奨に従ってＱＩＡＧＥＮプラスミド精製キットで精製した。ＤＮＡ配列決定を、Ｔ７ＤＮＡ配列決定キット（version 2.0 DNA, Amersham Cat. No. US70770）および、ｎｅｏコード配列と相補的な表２のプライマーＮｏ．＃２３を用いて行なった。これらのプロモーター配列を図３Ａ−Ｄに示す。
【００５４】  キメラｎｅｏ遺伝子のタバコプラスチド遺伝子への導入
タバコプラスチドゲノムへの外来遺伝子導入に適したベクターが入手できる。そのようなベクターは、プラスチドゲノムの繰り返し領域に挿入された選択可能なスペクチノマイシン耐性（ａａｄＡ）遺伝子およびターゲット挿入物を有するｐＰＲＶ１１１ＡおよびｐＰＲＶ１１１Ｂである（Zoubenko et al., 1994）。キメラｎｅｏ遺伝子をこれらのプラスチド形質転換ベクター（表１）の１つにクローンし、バイオリステイック（biolistic）法によりタバコプラスチドゲノムに導入した。形質転換した細胞植物を標準的なプロトコール（SvabおよびMaliga, 1993）に従って再生した。形質転換したプラスチドゲノムコピーの均一な集団をサザーン分析により確認した。
サザーン分析のため、ＣＴＡＢ法（Saghai-Maroof et al., 1984）により全細胞ＤＮＡを調製した。各形質転換植物の２枚の葉をホモジナイズし、２％ＣＴＡＢ（テトラデシル−トリメチル−アンモニウムブロマイド）、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１００ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む緩衝液中で６０℃にて３０分間インキュベートした。クロロホルム抽出後、ＤＮＡをイソプロピルアルコールで沈澱させ、水またはＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解した。適当な制限酵素で消化したＤＮＡを０．８％アガロースゲル上で電気泳動に付し、ＰｏｓｉＢｌｏｔトランスファー装置（Stratagene）を用いてナイロン膜に移した。ラピッドハイブリダイゼーション緩衝液およびプローブとしてプラスチドターゲット配列を用い、ランダムプライミングしてラベル（３２p、Boehringer Mannheim Cat No. 1004760）し、ブロットをプローブした。
【００５５】  表１にリストしたプラスミドの各々を用いてプラスチド形質転換を達成した。例外は、プラスミドｐＨＫ４１およびｐＨＫ４２であった。ｐｓｂＡリーダー誘導体を用いるＮＰＴＩＩ発現は、植物が生存できないほどに高かった。したがって、これらのリーダーは、より弱いプロモーターと融合した場合に使用するのに有利でありうる。
トランスプラストミック(transplastomic）ラインを、Ｎｔ（N. tabacum、種）、プラスミド名（例えば、ｐＨＫ３０）および個々のライン数および再生した植物を同定する文字で命名する。例えば、Ｎｔ−ｐＨＫ３０−１ＤおよびＮｔ−ｐＨＫ３０−１Ｃ植物は、両方とも、プラスミドｐＨＫ３０での形質転換で得られ、同じ形質転換事象から由来し、同じ培養から再生したものである。Ｎｔ−ｐＨＫ３０−２植物は、独立した形質転換事象から由来するものである。通常、構築物当り数個の形質転換ラインを得た。しかしながら、本明細書で示すデータは、１つだけ：        Ｎｔ−ｐＨＫ３０−１Ｄ、Ｎｔ−ｐＨＫ３１−１Ｃ、Ｎｔ−ｐＨＫ６０−５Ａ、Ｎｔ−ｐＨＫ３２−２Ｆ、ＮｔｐＨＫ３３−２Ａ、Ｎｔ−ｐＨＫ３４−９Ｃ、Ｎｔ−ｐＨＫ３５−４Ａ、Ｎｔ−ｐＨＫ６４−３Ａ、Ｎｔ−ｐＨＫ３６−１Ｃ、Ｎｔ−ｐＨＫ３７−２Ｄ、Ｎｔ−ｐＨＫ３８−２Ｅ、Ｎｔ−ｐＨＫ３９−３Ｂ、Ｎｔ−ｐＨＫ４０−１２ＢおよびＮｔ−ｐＨＫ４３−１Ｃのものである。
【００５６】  ＲＮＡブロット（ノーザン）分析によるｍＲＮＡ蓄積テスト
トランスプラストミックラインにおけるキメラｍＲＮＡの定常状態レベルを決定するためにＲＮＡゲルブロット分析を行なった。Stiekema et al (1988)に従って無菌培養で成長させた植物の葉および根から全葉ＤＮＡを調製した。ＲＮＡ（レーン当り４μｇ）を１％アガロースゲルで電気泳動に付し、ＰｏｓｉＢｌｏｔトランスファー装置（Stratagene）を用いてナイロン膜に移した。ラピッドハイブリダイゼーション緩衝液（Amersham）および３２Ｐラベルｎｅｏプローブ（Pharmacia, Ready-to-Go Random Priming Kit）を用いてブロットをプローブした。ｎｅｏプローブは、プラスミドｐＨＫ２からＮｈｅＩ／ＸｂａＩフラグメントを単離することにより得た。タバコ細胞質２５Ｓ  ｒＲＮＡプローブ用のテンプレートは、プライマー５’−ＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＡＡＴＣＡＡＣＴＡＧＣ−３’および５’−ＧＡＣＴＴＣＣＣＴＴＧＣＣＴＡＣＡＴＴＧ−３’を用いて全タバコ細胞ＤＮＡからＰＣＲ増幅されたフラグメントであった。ＲＮＡハイブリダイゼーションシグナルを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｉｍａｇｅｒを用いて定量し、２５Ｓ  ｒＲＮＡシグナルに対して標準化した。
【００５７】  タンパク質ゲルブロット（ウエスタン）分析によるＮＰＴＩＩ蓄積テスト
無菌培養で成長させたトランスジェニックタバコ植物の葉、根および種子から全可溶性タンパク質を抽出した。無菌培養で成長した葉の場合、約２００ｍｇの葉組織を、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  酢酸カリウム、５ｍＭ  酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトールおよび２ｍＭ  ＰＭＳＦを含む緩衝液１ｍｌ中でホモゲナイズした。ホモジネートを４℃にて２回遠心分離した不溶物を除去した。タンパク質濃度をバイオラドプロテインアッセイ試薬キットを用いて測定した。プラスチドゲノム中でｎｅｏを発現するトランスジェニックタバコ植物（Ｎｔ−ｐＴＮＨ３２−７０、Carrer et al., 1993）および野生型植物を、各々、陽性および陰性対照として用いた。タンパク質を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；１５％アクリルアミド、６Ｍ尿素）で分離し、セミドライ  トランスファー装置（Bio-Rad)を用い、ニトロセルロース膜に移した。非特異的結合部位をブロッキング後、膜を４０００倍希釈の、ＮＰＴＩＩに対するポリクローナルウサギ抗血清（5Prime→3Prime Inc.）と共にインキュベートした。２０００倍希釈したＨＲＰ−コンジュゲート二次抗体およびＥＣＬ化学ルミネッセンスを用い、Ｘ線フィルム上でイムノブロット検出をした。実験試料と、市販のＮＰＴＩＩ（5Prime→3Prime）の希釈系列との比較によりＮＰＩＩを定量した。
【００５８】      実施例１
ｒｂｃＬリーダーからのＤＢ配列増強タンパク質蓄積；ａｔｐＢ翻訳調節シグナルからのタンパク質の蓄積は高いがＤＢ独立性である。
ｎｅｏをレポーター遺伝子として使用してｍＲＮＡ翻訳におけるＤＢ配列の役割をテストした。ｎｅｏ遺伝子は細菌性酵素ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）（Beck et al., 1982）をコードする。テストしたｎｅｏ遺伝子は同じプロモーター（Ｐｒｒｎ）および転写ターミネーター（ＴｒｂｃＬ）を有し、ｍＲＮＡの５’−非翻訳領域およびコード領域Ｎ−末端を含む翻訳調節領域（ＴＣＲ）のみで異なる。ａｔｐＢおよびｒｂｃＬ  ＴＣＲで２つの構築物を調製した。１つの構築物は野生型ＴＣＲを含み、プロセスされた５’−非翻訳領域および４２ヌクレオチドのコード領域Ｎ−末端（ＰｒｒｎＬｒｂｃＬ＋ＤＢｗｔ、プラスミドｐＨＫ３０、図４Ｂ；ＰｒｒｎＬｒｂｃＬ＋ＤＢｗｔ、プラスミドｐＨＫ３４、図４Ａ）を含んでいた。第２の構築物はａｔｐＢおよびｒｂｃＬ  Ｎ−末端コード領域の４２−ヌクレオチドセグメントにおけるサイレント突然変異を含み、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡ塩基対のいずれかが除去または変更された（ＰｒｒｎＬａｔｐＢ＋ＤＢｍ、ｐＨＫ６４、図２Ａおよび図２Ｂ）。サイレント突然変異はアミノ酸配列に影響なしにｍＲＮＡ配列を変えた。例えば、図２Ａの下に示すように野生型ａｔｐＢ  ｍＲＮＡおよびＡＤＢ配列の間に１３の可能性ある塩基対を形成しうる。このＡＤＢ−ＤＢ相互反応については、１１個のサイレント突然変異が８個の塩基対事象に影響する。突然変異誘発後、１０個の塩基対事象について可能性があり、それらの多くは新規である。キメラｎｅｏ遺伝子を、バイオリスティックアプローチ（SvabおよびMeliga, 1993; Zoubenko et al., 1994）を用い、相同ターゲッティングによりタバコプラスチドゲノムに導入した。ＮＰＴＩＩおよびｎｅｏ  ｍＲＮＡレベルを、トランスプラストミック植物の葉で評価した。ＤＢ含有野生型およびＤＢ含有突然変異体植物のＮＰＴＩＩは全く同じタンパク質配列を有するので、植物中のタンパク質レベルはｍＲＮＡ翻訳の効率に直接反映する。ａｔｐＢ  ＴＣＲの場合、ＤＢの突然変異誘発はタンパク質の蓄積を、−７％の代わりに−４％減少させた（図１０および表３）。反対に、ｒｂｃＬ  ＤＢの突然変異誘発は劇的な効果を有し、ＮＰＴＩＩ蓄積を３５倍も減少させた。このように、ＤＢ−ＡＤＢ相互反応はプラスチドｒｂｃＬ  ｍＲＮＡの翻訳に非常に重要であるが、ａｔｐＢ  ｍＲＮＡの翻訳にはそんなに重要ではない。
【００５９】  我々はまた、ａｔｐＢおよびｒｂｃＬリーダーを用い、天然のＤＢなしで第３の構築物セットを調製した（ＰｒｒｎＬａｔｐＢ−ＤＢ、プラスミドｐＨＫ３１、図４Ｂ；ＰｒｒｎＬｒｂｃＬ−ＤＢ、プラスミドｐＨＫ３５、図４Ａ）。これらの構築物中のｎｅｏコード領域は、合成ＮｈｅＩ制限部位を介してＰｒｒｎプロモーターと直接結合している。ＮｈｅＩ制限部位（ＧＣＴＡＧＣ）は完全にＡＤＢ領域と相補性であり（図２Ｂ）、したがって、ＤＢ配列として機能するものと期待された。ＮｈｅＩ部位のＤＢの代替としての有用性は、ＤＢに依存性の高いｒｂｃＬリーダーからのＮＰＴＩＩ蓄積によって最も良く判断できる。突然変異体ＤＢ（０．３％）に対するＮｈｅＩ構築物からのＮＰＴＩＩの高いレベル（４．７％）は、ＮｈｅＩ部位を介するコード領域の結合が、外来ポリペプチドの発現に適したＤＢを提供することを示している（図１０、表３）。
【００６０】
【表２】
0005414136.tif 000003
【００６１】  考察
細菌においては、ＤＢの突然変異誘発または欠失は、個々のｍＲＮＡに応じて翻訳を２〜３４倍減少する（EtchegarayおよびInouye, 1999; Fzxen et al., 1991; Ito et al., 1996）。さらに、ＤＢへの依存は、ＳＤ配列が除去されると増加する（Sprengart et al., 1996; WuおよびJanssen, 1996）。我々の実験においては、ａｔｐＢまたはｒｂｃＬ５’ＵＴＰにおいて何らの変化もなく、ＡＵＧの下流の配列のみを変化させた。ａｔｐＢ  ＤＢ領域の突然変異誘発はタンパク質レベルを２倍減少させた。ａｔｐＢ  ｍＲＮＡはＡＵＧの上流に直接ＳＤを有していないが、多分、ＤＢに対する依存性を減少させる翻訳開始についての変化した機序を有していると推測される。あるいは、翻訳開始は、クラミドモナス（Chlamydomonas）のクロロプラストについて記載されている（Rochaix, 1996; Stern et al., 1997）アクチベータータンパク質によって促進されうる。ｒｂｃＬ翻訳に対するＤＢ突然変異誘発の結果はＮＰＴＩＩレベルの劇的な３５倍低下であった。したがって、効率的なｒｂｃＬ翻訳は、ＤＢ−ＡＤＢ相互反応に高度に依存する。原核生物および真核生物の双方における遺伝子は６１個のアミノ酸コドンの使用に片寄りを示し、固有のｍＲＮＡ集団の全コドンの片寄りに密接にマッチしたｔＲＮＡ集団を有する。コード領域におけるシノニムマイナーコドンの取り込みは翻訳を劇的に減少させ（Makrides, 1996）、ｍＲＮＡを不安定にする（Deana et al., 1998)。イー・コリ（E. coli）における発現の減少を引き起こすマイナーコドンのよく特徴付けされた例は、同じｔＲＮＡで認識される、１０００コドン当り２．６および１．６の頻度で存在するＡＧＡ／ＡＧＧアルギニンコドンである。したがって、我々は、野生型および突然変異誘発したａｔｐＢおよびｒｂｃＬ  ＤＢ領域におけるコドンの使用片寄りおよび１０００ヌクレオチド当りのトリプレットの頻度を比較した。我々は葉におけるＮＰＴＩＩ蓄積を検討したので、図１２に示す値は、高発現したｒｂｃＬ、ｐｓａＡ、ｐｓａＢ、ｐｓａＣ、ｐｓｂＡ、ｐｓｂＢ、ｐｓｂＣ、ｐｓｂＤ、ｐｓｂＥおよびｐｓｂＦ光合成遺伝子についてジェネティクスコンピューターグループ（GCG; Madison Wisconsin）コドン頻度プログラムを用いて計算した。コドンの使用片寄りおよびトリプレットの頻度は、ａｔｐＢおよびｒｂｃＬの両方において野生型および突然変異体ＤＢ領域で匹敵する。また、野生型および突然変異体ＤＢ構築物のｍＲＮＡは同様なレベルで蓄積される。したがって、Ｎｔ−ｐＨＫ６４ラインにおけるＰｒｒｎＬｒｂｃＬ＋ＤＢｍプロモーターからのＮＰＴＩＩ蓄積における劇的な変化は突然変異体ＤＢ領域における希少コドンの取り込みに貢献できない。
ここで、我々は、翻訳開始コドンの下流の配列がｍＲＮＡの翻訳に劇的に影響しうることを証明した。したがった、異種タンパク質のＤＢ領域におけるサイレント突然変異は、プラスチドｒＲＮＡの最後から２番目のステム構造でｍＲＮＡの相補性を増加させることによりクロロプラストの発現を著しく向上させうる。
【００６２】  異なるリーダーおよび同じ合成ＤＢを有するｎｅｏトランスジーンからのＮＰＴＩＩ蓄積に著しい差異がある（表３）。これは、５’ＵＴＲが翻訳効率の重要な決定因子であることを示している。多くのデータが、高等植物（HiroseおよびSugiura, 1996; StaubおよびMaliga, 1993）および単細胞藻類クラミドモナス（Mayfield et al., 1994; Nickelsen et al., 1999; Sakamoto et al., 1993; Zerges et al., 1997）における翻訳調節のターゲットとして５’ＵＴＲの重要性を支持するために利用できる。本明細書に示したデータは、プラスチドにおける翻訳効率は、ＡＵＧの上流および下流の両方の配列によって決定されることを示している。
【００６３】実施例２
ファージＴ７ｇ１０の翻訳調節配列についての研究はプラスチド中で効果的であるＤＢがＡＤＢに対して弱相補性であることを示す
実際のＡＤＢ配列はプラスチドおよびイー・コリで異なるため、我々はイー・コリＤＢを完全なプラスチドＤＢと置き換えること（１００％ＤＢ−ＡＤＢ相補性）でプラスチドでの翻訳が強化されると考えた（Sprengartら、１９９６；Etchegaray＆Inoyue、  １９９９）。我々は、ファージＴ７ｇ１０翻訳調節領域が十分に特徴付けられたイー・コリＤＢを有するため、研究に際してその領域を選択する。３つのＰｒｒｎプロモーター誘導体を構築した。カセットＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０＋ＤＢ／Ｅｃはイー・コリＤＢを含有する自然のＴ７ｇ１０ ＴＣＲと融合したＰｒｒｎからなる（プラスミドｐＨＫ３８；図２Ｂ、図４Ａ）。カセットＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０＋ＤＢ／ｐｔは、Ｐｒｒｎプロモーター、Ｔ７ｇ１０リーダーおよび完全なタバコＤＢからなる（ｐＨＫ３９；図２Ｂ、図４Ａ）。カセットＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０−ＤＢはＰｒｒｎプロモーターおよびＴ７ｇ１０リーダーを有するが、Ｔ７ｇ１０ＤＢ配列を欠いている（ｐＨＫ４０；図２Ｂ、図４Ａ）。これらの構築物中のｎｅｏコード領域は合成したＮｈｅＩ制限部位を介してＰｒｒｎプロモーターに直接結合する。３つの発現カセット中のｎｅｏ遺伝子を形質転換によりプラスチド中に導入し（SvabおよびMaliga、１９９３；Zoubenkoら、１９９４）およびトランスプラストミック（transplastomic）タバコの葉をＮＰＴＩＩ蓄積およびｍＲＮＡレベルについて試験した（図１０、１１；表３）。
【００６４】  意外にも、異種構造のＴ７ｇ１０ ＴＣＲから由来のＮＰＴＩＩレベル（Ｎｔ−ｐＨＫ３８；約１６％）は、ｒｂｃＬ ＴＣＲから得られるレベル（Ｎｔ−ｐＨＫ３４；約１１％）よりも高かった。我々は１００％の相補性を有するプラスチドＤＢを組み込むことがさらにＮＰＴレベルを強化すると考えた。そして、我々は完全なプラスチドＤＢを有する構築物（Ｎｔ−ｐＨＫ３９）で形質転換した植物が、イー・コリＴＣＲからのＮＰＴＩＩを発現する植物よりもＮＰＴＩＩを１００倍低いレベルで含有することを見出した（Ｎｔ−ｐＨＫ３８；図１０；表３）。このことは、イー・コリと異なり、１００％の相補性が翻訳効率を上昇させるよりもむしろ減少させることを示唆する。実際に、高度に発現されたプラスチド遺伝子は一つも完全なＤＢ配列を有しない（図２Ａ）。図１１に示されるＲＮＡゲルブロットは完全なＤＢを含むＮｔ−ｐＨＫ３９植物がｎｅｏｍＲＮＡを約３倍低く含有することを示す。したがって、これらの植物にてＮＰＴＩＩレベルを下げる原因が高速ｍＲＮＡターンオーバー速度にあることは明らかである。さらには、ＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０誘導体より発現されたＮＰＴＩＩは、Ｎ−末端にあるＤＢ−コード化アミノ酸で異なる。したがって、示唆的な蛋白ターンオーバー速度はＮＰＴＩＩ蓄積が異なる原因の一つであるかもしれない。合成したＮｈｅＩ含有のＤＢカセットを用いて、最高収率のＮＰＴＩＩ（２３％）を得た。
【００６５】考察
ｒｂｃ翻訳調節領域を利用するこの実施例により、翻訳開始コドンの下流にある配列が劇的にｍＲＮＡ翻訳に影響を及ぼしうることは明らかである。したがって、異種蛋白のＤＢ領域におけるサイレント変異が、そのｍＲＮＡとプラスチドｒＲＮＡの末端から２番目のステム構造との相補性を増加させることにより、葉緑体における発現を有意に改良する可能性がある。この知見は、完全に相補性があると翻訳が強化されるという（EtchegarayおよびInouye、１９９９；Strengartら、１９９６）プラスチドと、イー・コリの翻訳機構の違いを強調するものである。しかしながら、ＡＵＧに相対的な相補性の領域をシフトすること、または末端から２番目のステムとわずかに異なる領域を標的とすることで、完全に適合したＤＢを有するｍＲＮＡの極めて効果的な翻訳を促進しうる可能性がある。
Ｔ７ｇ１０構築物は１または２個の相対的に少ないＡＧＣセリンコドン（コドン１０００個当たり４.７個）を有し、その内の１つがＮｈｅＩ部位でコードされている。このコドンはＮｔ−ｐＨＫ３８およびＮｔ−ｐＨＫ４０植物にあり、それらは最高レベルのＮＰＴＩＩを含有する。ＡＧＣをＡＧＴセリンコドンと置き換えることでさらなる改良が期待される。
【００６６】実施例３
ｃｌｐＰ、ｐｓｂＢおよびｐｓｂＡ ＴＣＲは別個の発現特徴を有する
ＰｒｒｎＬｃｌｐＰプロモーター誘導体を有するトランスプラストミックタバコにてＮＰＴＩＩ蓄積を実験した。ＰｒｒｎＬｃｌｐＰ＋ＤＢｗｔ（Ｎｔ−ｐＨＫ３２−２Ｆ）およびＰｒｒｎＬｃｌｐＰ−ＤＢ（Ｎｔ−ｐＨＫ３３−２Ａ）植物はその葉に１.２％および０.２％ＮＰＴＩＩを蓄積する（図１０；表３）。我々はｃｌｐＰ５’−ＵＴＲの発現過剰が葉の色が淡緑色で成長の遅い変異表現型を惹起することを見出した。この表現型は成長した植物では標準となっている。我々はこの変異体表現型の第１の原因がＣｌｐＰ蛋白、ｃｌｐＰ遺伝子産物の欠失にあると仮定する。この変異体表現型は他の５’ＵＴＲで形質転換された植物にはない。したがって、我々はこの変異体表現型がｃｌｐＰ−特異的核因子との競合に起因しうると考える。ｃｌｐＰ遺伝子は２つのイントロンを有する。予備的なＲＮＡゲルブロット分析は、成熟したモノシストロニック（monocistronic）ｃｌｐＰ ｍＲＮＡが低レベルであり（野生型の約３０％）、淡緑色の葉中にイントロンＩ−含有のｃｌｐＰプレｍＲＮＡが蓄積することを明らかにする。表現型の標準化は翻訳可能なモノシストロニックｃｌｐＰ ｍＲＮＡのレベルが野生型レベルまで上昇することと同時に起こる。したがって、ｃｌｐＰ５’ＵＴＲの発現過剰はｃｌｐＰプレｍＲＮＡのスプライシングを干渉する可能性がある。
【００６７】  さらに、ＰｒｒｎＬｐｓｂＢプロモーター誘導体を有するトランスプラストミックタバコにおいて、ＮＰＴＩＩ蓄積を研究した。Ｐｒｒｎ ｐｓｂＢ＋ＤＢｗｔ（Ｎｔ−ｐＨＫ３６−１Ｃ）およびＰｒｒｎＬｐｓｂＢ−ＤＢ（Ｎｔ−ｐＨＫ３７−２Ｄ）植物はその葉に２.２％および２.４％のＮＰＴＩＩを蓄積する（図１０；表３）。すなわち、ｐｓｂＢ ＴＣＲの場合に合成したＤＢ配列は、自然にあるＤＢ配列を効果的に置換する。反対に、それは翻訳開始の別の機構に依存している可能性がある。
ｐｓｂＡリーダーを含むＰｒｒｎプロモーター構築物を記載に従って獲得した。しかし、我々はそのうちの一つ、ＰｒｒｎＬｐｓｂＡ−ＤＢ（＋ＧＣ）だけをＮｔ−ｐＨＫ４３−１Ｃ系統のタバコプラスチド中に導入することができた。Ｎｔ−ｐＨＫ４３−１Ｃ植物はＮＰＴＩＩを比較的低いレベルで蓄積する（０.６％；図１０、表３）。＋ＤＢ構築物の導入が成功しないのは、植物にとって毒性である、ＮＰＴＩＩの劇的に増加した発現レベルによるものと考えられる。
【００６８】考察
ＰｒｒｎＬｃｌｐＰ＋ＤＢｗｔ（Ｎｔ−ｐＨＫ３２−２Ｆ）プロモーターから得られたＮＰＴＩＩのレベルは比較的低く、可溶性蛋白全体のわずか１.２％にすぎない。しかし、実施例４に示されるように、ｎｅｏ遺伝子がこのプロモーターから発現されると、トランスプラストミッククローンの回収が比較的効率的であるため、選択可能なマーカー遺伝子の発現を操作するにはこのプロモーターが望ましい。ｎｅｏをＰｒｒｎＬｃｌｐＰ＋ＤＢｗｔから発現させることが、組織培養中に変異体表現型を生じさせるものではない。かくして、マーカー遺伝子がその後に取り除かれる限り、マーカー遺伝子の発現を操作することが適当である。ｃｌｐＰイントロンのプロセッシングに必要な核コード化因子についての競合作用が観察される発現の減少をもたらすことは明らかである。このイントロンは単子葉植物のコメ（Hiratsukaら、１９８９）およびトウモロコシ（Maierら、１９９５）にはない。したがって、ＰｒｒｎＬｃｌｐＰ＋ＤＢｗｔプロモーターを用いて単子葉植物の形質転換に供することができる。さらには、ｃｌｐＰイントロンのプロセッシングに必要なトランス因子のレベルは、双子葉植物とは異なるレベルで発現されるようである。したがって、我々はｃｌｐＰ ＴＣＲの発現が他の双子葉類にて望ましくない結果をもたらさないであろうと考える。さらに、プラスチド中にてｃｌｐＰ ＴＣＲを発現する表現型の結果が、タバコ系統、N.tabacum cvの特性である可能性もある。ここでは、他のタバコ系統に存在しない、Petit Havanaを利用する。これはｃｌｐP遺伝子ＴＣＲを単子葉および双子葉類の両方における望ましい発現手段とするであろう。
【００６９】  両方のｐｓｂＢリーダー誘導体はＮＰＴＩＩを比較可能なレベルで蓄積する（各々、２．２％および２．４％；表３）。この５’制限領域は、蛋白の蓄積が約２％の範囲で必要とされる場合に、最も一般的に使用されるｒｂｃＬリーダーの代用となるものである。
過去には、ｐｓｂＡプロモーターおよびリーダー構築物が、葉で比較的高いレベルの発現を産生した（２．５％ＧＵＳ；StaubおよびMaliga、１９９３）。これらの構築物はｐｓｂＡ ＤＢ因子を含有しなかった。本発明は、ＤＢ配列が果たす調節役割を解明する一方で、高レベルの蛋白発現を得るのに適当なキメラプロモーターの生成を記載する。Ｐｒｒｎはプラスチド中にある最も強力な既知プロモーターであり、そのため、高レベルのＮＰＴＩＩ翻訳を提供する。これらの高レベルのＮＰＴＩＩは植物にとって毒性であるとすることができ、したがって最高の予想レベルのＮＰＴＩＩを有するトランスプラストミック系統を得ることは困難である。別の方法はｐｓｂＡリーダーを比較的弱いプロモーターに作動可能に連結させることを含む。この方法は比較的低レベルのｍＲＮＡから比較的高レベルの蛋白蓄積を得るのに適するカセットを生成することができる。
【００７０】実施例４
ＮＰＴＩＩの根および種子中での蓄積
転写後調節がプラスチド遺伝子発現の重要な機構である（Rochaix、１９９６；Stemら、１９９７）。したがって、我々は、ｍＲＮＡ翻訳のレベルで遺伝子発現が調節されるため、ＮＰＴＩＩ蓄積が組織特異的であると考える。かくして、ＮＰＴＩＩ蓄積を根および種子で試験した。
根でのＮＰＴＩＩ蓄積の試験をトランスプラストミック系統の部分集合を用いて行った（表４）。蛋白を抽出するための根を、通気を促進するために振盪機でインキュベートした滅菌培養基中の液体ＭＳ塩培地（３％シュークロース）にて増殖させた植物より採集した。葉のプロトコルと同様に蛋白を根から抽出し、ＮＰＴＩＩ蓄積について試験した（図１３Ａ）。最高レベルの、すなわち、０．７５％のＮＰＴＩＩがｃｌｐＰ ＴＣＲ（ＰｒｒｎＬｃｌｐＰ＋ＤＢｗｔ構築物；ｐＨＫ３２）からのＮＰＴＩＩを発現する植物の根で見出された。次に高い値、０．３％が、Ｔ７ｇ１０ ＴＣＲ（ＰｒｎｎＬＴ７ｇ１０＋ＤＢ／Ｅｃプロモーター）からのＮＰＴＩＩを発現するプラスミドｐＨＫ３８で形質転換した植物の根で見出された。ｐＨＫ３０−およびｐＨＫ３４−形質転換植物中のａｔｐＢおよびｒｂｃＬ ＴＣＲからの組換え蛋白を発現する根では、ＮＰＴＩＩのレベルは略同じであり、約０．１％であった。
【００７１】  根のプラスチドは葉にあるものよりも小さいため、我々は根でのＮＰＴＩＩ蓄積が葉における蓄積よりも低レベルであると考えた。この事象は、Ｎｔ−ｐＨＫ３２植物の場合を除き、試験したすべての根に対して言えることであった。興味のあることに、ｃｌｐＰ ＴＣＲからのＮＰＴＩＩは、葉（約１％、表３）の場合とほとんど同じレベルで根（０．７５％、表４）でも蓄積した。このことが根での高レベルのｎｅｏｍＲＮＡに寄与している可能性がある（図１３Ｂ）。ｃｌｐＰリーダーは最小ＰｃｌｐＰ−５３プロモーター（Sriramanら、１９９８ａ；ＮＡＲ２６：４８７４）を有しているため、我々は比較的高いｍＲＮＡレベルはＰｃｌｐＰ−５３が根で活性化することによるものと推測する。高レベルの発現が得られるため、ｃｌｐＰリーダーを根における蛋白発現のための所望のＴＣＲとする。
【００７２】  Ｔ７ｇ１０リーダー（ｐＨＫ３８）が根で最も効果的であり、すなわち、ｍＲＮＡに対するＮＰＴＩＩの蓄積が最も大きかった（表４）。Ｎｔ−ｐＨＫ３８植物のｎｅｏ ｍＲＮＡは、Ｎｔ−ｐＨＫ３２植物の場合よりも７倍以上と少ないが、ＮＰＴＩＩレベルはｃｌｐＰ ＴＣＲ（ｐＨＫ３２）を含むプラスチド中とほとんど同じくらい高かった（０．７５％であるのに対して略０．３０％）。葉のＴ７ｇ１０ ＴＣＲ（ｐＨＫ３８、ｐＨＫ４０；表３）および根のＴ７ｇ１０ ＴＣＲ（ｐＨＫ３８；表４）からの高レベルのＮＰＴＩＩ蓄積は、プラスチドにおける蛋白発現用のファージＴ７ｇ１０翻訳制御領域の汎用的有用性を示している。
【００７３】  さらに、トランスジェニック植物から収穫した種子にて蛋白蓄積を実験した（図１４）。蛋白レベルはｐＨＫ３２（ｃｌｐＰ ＴＣＲ）で形質転換した植物で０．０５％であり、プラスミドｐＨＫ３０（ａｔｐＢ ＴＣＲ）で形質転換した植物では約０．０１％であった。選択したＴＣＲに応じて種々の蛋白蓄積を示す、ｒｂｃＬ ＴＣＲ構築物（プラスミドｐＨＫ３４）にｎｅｏを導入した植物においては、ＮＰＴＩＩはまったく検出されなかった。
【００７４】
【表３】
0005414136.tif 000004
【００７５】実施例５
高レベルのＮＰＴＩＩ発現はカナマイシン耐性について選択することでトランスプラストミック系統の有効な回収を容易にする
高等植物のプラスチドゲノムは、葉の１細胞当たり１９００ないし５００００コピーにて存在する、１２０ｋｂないし１６０ｋｂの二本鎖ＤＮＡである（Bendich、１９８７）。遺伝学的に安定したトランスプラストミック系統を得るには、プラスチドゲノムコピー（ｐｔＤＮＡ）をすべて植物中で均等に変化させなければならない。同種の組み合わせにより、常に異種ＤＮＡの組込みが生じるため、プラスチド形質転換ベクターは特異的位置での挿入を標的とするようにプラスチドゲノムのセグメントを含有する。次に有用な選択することのできない遺伝子を選択可能なマーカー遺伝子とのクローンに付し、ついでそれを選択可能なマーカー遺伝子に連結させることでプラスチド遺伝子中に導入する（Maliga、１９９３）。弾道弾（biolistic）法（Svabら、１９９０；SvabおよびMaliga、１９９３）またはＰＥＧ処理（Goldsら、１９９３；o'Neilら、１９９３）により形質転換性ＤＮＡをプラスチド中に導入する。野生型ゲノムコピーの排除が選択的培地上で細胞分裂を繰り返す間に起こる。形質転換の成功は、ほとんどない最初に形質転換されたゲノムコピーの選択的増幅に成功するかに依存している。したがって、形質転換されたゲノムコピーを選択的に増幅するのに用いられる抗生物質の選択および植物細胞を抗生物質の作用から保護する機構は、ホモプラスミック植物を形成を成功させると考えられる、臨界的な媒介変数である。
【００７６】  トランスプラストミック系統を選択するために最も一般的に使用される抗生物質はスペクチノマイシン、プラスチドリボソームでの蛋白合成の阻害剤である。最初、プラスチド１６Ｓ ｒＲＮＡでの変異（Svabら、１９９０）をベースとする耐性について選択することにより、タバコのプラスチド形質転換を行った。選択は効果的でなく、５０個の爆撃試料当たり約１個のトランスプラストミッククローンを得た。これはおそらく、変異をベースとする１６Ｓ ｒＲＮＡが劣性であるためである。トランスプラストミック系統の回収は、キメラａａｄＡ遺伝子中でコードされるアミノグリコシド３”アデニルトランスフェラーゼによる不活性化をベースとするスペクチノマイシン耐性の、優性マーカーについて選択することにより約１００倍改良される（SvabおよびMaliga、１９９３）。タバコに加えて、スペクチノマイシン耐性（ａａｄＡ）について選択することでアラビドプシス（Arabidopsis）およびポテトにおけるトランスプラストミック系統を回収することができる。植物中のａａｄＡ遺伝子は、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンの両方に対する耐性を付与する。ａａｄＡ遺伝子で爆撃した後、ストレプトマイシン耐性について選択した物を用いて、スペクチノマイシンに対して耐性である種類、コメにてプラスチドを形質転換した。実施例８を参照のこと。
【００７７】  別のマーカー遺伝子でプラスチドを操作するには、選択的マーカーとしてのカナマイシン耐性を試験する必要がある。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするキメラｎｅｏ（ｋａｎ）遺伝子がトランスプラストミックタバコ系統を回収するのに適当であった。しかしながら、トランスプラストミックタバコ系統の回収は効率が比較的悪く、約２５個の爆撃を加えた葉試料においてわずか１個のトランスプラストミック系統が形成されただけであった。さらには、どのプラスチド形質転換事象についても、約２５ないし５０個のカナマイシン耐性系統が得られ、プラスチドｎｅｏ構築物の核ゲノムへの組込みはカナマイシン耐性をもたらした（Carrierら、１９９３）。我々は、タバコ葉緑体をａｔｐＢおよびｃｌｐＰ翻訳調節領域を含むプロモーターから発現された新規なｎｅｏ遺伝子を用いて形質転換した場合に、トランスプラストミッククローンの回収効率が有意に改良されることをここに報告する。核形質転換事象の数は本発明のカセットを用いて減少する。これらの改良により、新規なｎｅｏ遺伝子はプラスチドゲノムを操作するための実践的な手段となる。
【００７８】  考察
実施例１−４に記載のキメラｎｅｏ遺伝子は、それらがトランスプラストミック系統を直接選択することに適当であることは知られていなかったので、連鎖したスペクチノマイシン耐性（ａａｄＡ）遺伝子に対する選択によってプラスチド中に導入した。次いで、表３に挙げたトランスプラストミック系統を５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有する培地上で増殖できるそれらの能力によって、カナマイシンに対する耐性について試験した。試験に使用したＲＭＯＰ培地は、カナマイシン不在下で緑色カルスの形成およびシュート再生を誘導する。該実施例に用いられた組織培養法は、参考文献Carrerら、1993およびCarrerおよびMaliga, 1995に記載されている。
【００７９】  選択的カナマイシン培地上で、ほんの僅かな白色カルスが野生型葉切片から形成する。表３においてｐＨＫプラスミドで形質転換した植物の葉切片からの緑色カルスおよびシュートの形成は、ＮＰＴＩＩの蓄積がカナマイシン耐性を与えることを示す。発明者らは、プラスミドｐＨＫ３０およびｐＨＫ３２での衝撃後に、カナマイシン耐性によって、トランスプラストミッククローンを直接選択できるかを試験することを記載する。結果を表５にまとめる。
【００８０】  プラスミドｐＨＫ３０を用いて２５個のタバコ葉に衝撃を加えることにより、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有する培地上で４５個のカナマイシン耐性系統を得た。トランスプラストミックｎｅｏ系統は、非常に高いレベル、５００ｍｇ／Ｌのカナマイシンに耐性であることが予測される（Carrerら、1993）。さらに、プラスミドｐＨＫ３０において、ｎｅｏ遺伝子は物理的にスペクチノマイシン耐性（ａａｄＡ）遺伝子に連結されている。スペクチノマイシン耐性は、カナマイシン耐性のように明らかにされている。すなわち、選択培地（５００ｍｇ／Ｌ）ＲＭＯＰ培地上で、感受性の葉切片は白色カルスを形成し、シュートを形成しないが、耐性の葉切片は緑色カルスおよびシュートを形成する。したがって、発明者らは、全てのトランスプラストミック系統が５００ｍｇ／Ｌのカナマイシンおよび５００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンの両方に対して耐性であると想定した（CarrerおよびMaliga, 1995）。該試験を適用したとき、発明者らは、４５個の系統のうち２２個がこれらの基準を満たすことを見出した。ＥｃｏＲＩ制限酵素でのプラスチドＤＮＡの消化およびプラスチド標的領域でのプロービングは、野生型において３．１ｋｂフラグメントならびにトランスプラストミック系統において４．２ｋｂおよび１．２ｋｂフラグメントを検出する（図１５Ａ）。カナマイシン−スペクチノマイシン耐性系統のうち７個のＤＮＡゲルブロット分析は、プラスチドゲノム中への両方のトランスジーンの組込みを確定した（図１５Ｂ）。したがって、発明者らは、全２２個のカナマイシン−スペクチノマイシン系統がトランスプラストミックであると考える（表５）。
【００８１】  プラスミドｐＨＫ３２を用いて３０個のタバコ葉に衝撃を加えることにより、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有する培地上で２８個のカナマイシン耐性系統を得た。発明者らは、５００ｍｇ／Ｌのカナマイシンおよび５００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含有する培地上でこれらを試験することによって、１１個の２重耐性系統を同定した。試験された全６個は、ＤＮＡゲルブロット分析によってトランスプラストミックであったので、発明者らは、全１１個がトランスプラストミックであると確信する（表５）。
【００８２】
【表４】
0005414136.tif 000005
【００８３】  考察
挿入のためにプラスチドゲノムの同じ領域を標的とし、同様のサイズの標的配列および同じＤＮＡデリバリー方法を用いる場合に、プラスチド形質転換効率を比較すべきである。したがって、カナマイシン耐性の選択によって得られた、以前のキメラｎｅｏ遺伝子でのより低い形質転換効率は、おそらく、選択によるトランスプラストミッククローンの回収不足のためであった。発明者らは、ＰｒｒｎＬａｔｐＢ＋ＤＢｗｔおよびＰｒｒｎＬｃｌｐＰ＋ＤＢｗｔプロモーターから発現されるｎｅｏ遺伝子での形質転換がａａｄＡ遺伝子での形質転換と同じくらい効率がよいことを見出した。これは、有意な技術的進歩であり、再生可能な組織が非緑色プラスチドを含有する作物においてプラスチド形質転換を容易にするであろう。最も重要な標的は、穀物の非緑色プラスチドである。カナマイシン選択は、双子葉植物において、キメラｎｅｏ遺伝子での形質転換後にトランスジェニック系統を得るために幅広く使用されている。しかしながら、カナマイシンは、穀物の組織培養のような単子葉植物において、望ましくない選択物質である。しかしながら、ＮＰＴＩＩもまた、パロモマイシンを不活性化し、それは、穀物において極端に高い効率で核遺伝子形質転換体を回収するために使用されうる。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９９／０５２９６を参照のこと。
【００８４】  実施例６
タバコプラスチドにおける細菌性ｂａｒ遺伝子発現は、除草剤ホスフィノスリシン（phosphinothricin）に対する耐性を与える
非選択的除草剤のバイアラホス（Bialaphos）は、２つのＬ−アラニン残基およびホスフィノスリシン（ＰＰＴ）として知られる１つのグルタミン酸の類似体よりなるトリペプチドである。ＰＰＴは、植物および細菌の両方においてグルタミンシンセターゼの阻害剤であるが、無傷トリペプチドは、イン・ビトロでわずかな阻害効果を有するか、または阻害効果を有さない。バイアラホスは、細胞内ペプチダーゼがアラニン残基を除去し、活性ＰＰＴを放出するので、細菌および植物に毒性である。バイアラホスは、ストレプトミセス・ヒグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）によって生産される。細菌は、ｂａｒ遺伝子産物であるホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）によって、ホスフィノスリシン毒から保護される。該酵素は、ホスフィノスリシンまたはデメチルホスフィノスリシンをアセチル化する（Thompsonら、1987）。ＰＰＴ耐性穀物は、ストレプトミセス・ヒグロスコピカスｂａｒ遺伝子を植物核内で発現させることによって得られた。除草剤耐性系統は、タバコ、ジャガイモ、Brassica napusおよびBrassica oleraceaにおけるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）媒介性ＤＮＡデリバリー後の培養体において、ＰＰＴ耐性の直接的選択によって得られた（De Blockら、1987, 1989）。キメラｂａｒ遺伝子のバイオリスティックＤＮＡデリバリーは、ＰＰＴ耐性トウモロコシ（Spencerら、1990）、コメ（Caoら、1992）およびアラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）（Sawaskakiら、1994）を得るために用いられた。ＰＰＴ耐性がプラスチドにおけるストレプトミセス・ヒグロスコピカス由来のｂａｒの発現に基づくトランスプラストミックタバコ植物の構築は、本実施例に記載される。ｂａｒ遺伝子を発現するために用いられたベクターは、上記の実施例に示されるような例示的な５’調節領域を含有する。下記の物質および方法は、本発明の該態様の実施を容易にする。
【００８５】  プラスチドｂａｒ遺伝子の構築
ＮｃｏＩ／ＸｂａＩ ｂａｒ遺伝子フラグメントは、プライマー：
P1, 5'-AAACCATGGCACCACAAACAGAGAGCCCAGAACGACGCCC-3';
P2, 5'-AAAATCTAGATCATCAGATCTCGGTGACG-3'
と共にプラスミドｐＤＭ３０２（Caoら、1992）を用いるＰＣＲ増幅によって生じた。
【００８６】  ＰＣＲフラグメントの末端は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでの処理によって平滑末端化された。次いで、該フラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋（Stratagene, LA Jolla, CA）のＥｃｏＲＶ部位に連結して、プラスミドｐＪＥＫ３を作成した。ｐＪＥＫ３プラスミドＤＮＡの配列分析は、発明者らがｐＤＭ３０２のＰＣＲ増幅によって作成しようとしたＸｂａＩ部位が存在しないことを示した。図１９を参照のこと。ｂａｒ遺伝子は、ベクター配列によって追随される２個の翻訳終止コドンを有する。ｐＪＥＫ３の最後の２０ｂｐは：
CCCGTCACCGAGATCTGATGAtcgaattcctgcagcccgggggatccactagttctaga
である。ｂａｒ配列は大文字であり（終止コドンに下線を付す）、ベクター配列は小文字である（ＸｂａＩ部位に下線を付す）。ＸｂａＩ部位がベクター中、目的のＸｂａＩ部位から４０ｂｐに存在するので、この誤りを修正する必要はなかった。プラススミドｐＪＥＫ３由来のＮｃｏＩ−ＸｂａＩフラグメントをＮｃｏＩ−ＸｂａＩ消化したｐＧＳ１０４プラスミド（SerinoおよびMaliga, 1997）中に連結して、プラスミドｐＪＥＫ６を作成した。プラスミドｐＧＳ１０４は、ｐＰＲＶ１１１Ｂプラスチド形質転換ベクターにおけるＰｒｒｎＴｒｂｃＬ発現カセットをに有する。プラスミドｐＪＥＫ６のプラスチド標的領域の地図を図１６Ａ示す。
【００８７】  プラスチド形質転換および植物再生
タバコ（Nicotiana tabacum cv. Petit Havana）植物をＭＳ塩（MurashigeおよびSkoog, 1962）およびシュークロース（３０ｇ／Ｌ）を含有する寒天固形培地上で生育させた。衝撃を加えるために、葉を軸から離れた方を上にしてＲＭＯＰ培地上に置いた。ＲＭＯＰ培地は、ＭＳ塩、Ｎ６−ベンジルアデニン（１ｍｇ／Ｌ）、１−ナフタレン酢酸（０．１ｍｇ／Ｌ）、チミン（１ｍｇ／Ｌ）、イノシトール（１００ｍｇ／Ｌ）、寒天（６ｇ／Ｌ）、ｐＨ５．８およびシュークロース（３０ｇ／Ｌ）よりなる。ＤＮＡは、DuPont PDS1000He バイオリスティックガンを用いて、１μｍタングステン粒子の表面で、クロロプラスト中に導入した（Maliga 1995）。スペクチノマイシン耐性クローンは、５００μｇ／ｍＬスペクチノマイシン二塩酸塩を含有するＲＭＯＰ培地上で選択した。耐性シュートが同じ選択培地上で再生し、ＭＳ寒天培地上で根付いた（SvabおよびMaliga, 1993）。独立して形質転換した系統は、形質転換プラスミド（ｐＪＥＫ６）およびシリアルナンバー、例えば、ｐＪＥＫ６−２、ｐＪＥＫ６−５によって示された。同じ形質転換系統から再生した植物は、例えば、ｐＪＥＫ６−２Ａ、ｐＪＥＫ６−２Ｂのように文字によって区別される。
【００８８】  サザンブロット分析
全細胞ＤＮＡは、野生型およびトランスジェニックスペクチノマイシン耐性植物からＣＴＡＢを用いて単離された（Saghai-Maroofら、1984）。ＤＮＡは、ＳｍａＩおよびＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、０．７％アガロースゲル上で分離し、加圧ブロッターによってＨｙｂｏｎｄ−Ｎナイロン膜（Amersham, Arlington Heights, IL）上にブロットした。膜は、ｄＣＴＰ ＤＮＡ標識ビーズキット（Pharmacia Inc, Piscataway, NJ）を用いて（α−３２Ｐ）ｄＣＴＰで標識したＡｐａＩ／ＢａｍＨＩフラグメントと一晩ハイブリダイズさせた。膜を０．１Ｘ ＳＳＰＥ、０．２Ｘ ＳＤＳを用いて５５℃で３０分間洗浄した。フィルムを室温で３０分間、膜に曝露した。
【００８９】  ＰＡＴアッセイ
ＰＡＴアッセイは、Spencerら（1990）によって記載されたように行った。野生型タバコ（ｗｔ）、トランスジェニックＮｔ−ｐＤＭ３０７−１０タバコ（プラスミドｐＤＭ３０７中の核ｂａｒ遺伝子で形質転換された系統；Caoら、1992）、およびプラスチドｂａｒ遺伝子形質転換体由来の葉組織（１００ｍｇ）を１容量の抽出バッファー（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ ＮａＣｌ）中に均質化した。マイクロヒュージ（microfuge）中で１０分間スピン後に上清を収集した。タンパク質（２５ｍｇ）を１ｍｇ／ｍｌ ＰＰＴおよび１４Ｃ標識化アセチルＣｏＡに加えた。反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、全反応物をＴＬＣプレート上にスポットした。プロパノールおよびＮＨ４ＯＨの３：２混合物中で上昇クロマトグラフィーを行った。室温で一晩、フィルムをＴＬＣプレートに曝露した。
【００９０】  除草剤塗布
野生型およびトランスジェニック植物に５ｍｌの２％リバティー（Liberty）溶液（AgrEvo, Wilmington, DE）をエーロゾル噴霧器を用いて噴霧した。
【００９１】  結果および考察
まず、ｂａｒコーディング領域をプラスチド発現カセット中にクローニングすることによって、細菌性ｂａｒ遺伝子をプラスチド遺伝子に変換した。該カセットは、操作したプラスチドｒＲＮＡオペロンプロモーター（Ｐｒｒｎ）ならびにｍＲＮＡの安定化のためのプラスチドｒｂｃＬ遺伝子のＴｒｂｃＬおよび３’ＵＴＲよりなる。次いで、プラスチドｂａｒ遺伝子をプラスチド形質転換ベクター中にクローン化して、プラスミドｐＪＥＫ６を得、微細なタングステン粒子の表面でプラスチド中に導入した。ｂａｒ遺伝子は、図１６Ａに示されるように、プラスチド標的配列による２つの相同組換え事象によって、プラスチドゲノム中に組み込まれた。スペクチノマイシン含有培地上での連鎖したａａｄＡ（スペクチノマイシン耐性）遺伝子の選択は、結局、一様に形質転換したプラスチドゲノム集団を有した細胞を生じ、次いで、それは植物に再生した。
【００９２】  ｂａｒおよびａａｄＡの組込みは、ＤＮＡゲルブロット分析によって証明された。野生型およびトランスプラストミック植物の全細胞ＤＮＡをＳｍａＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素で消化し、N. tabacumの２．９ｋｂ ＡｐａＩ−ＢａｍＨＩプラスチド標的フラグメントでプローブした（図１６Ｂ）。トランスジェニック植物に予測された２つのフラグメント、３．３ｋｂおよび１．９ｋｂは、図１６Ｂに示される各トランスプラストミック試料に存在した。２．９ｋｂ野生型フラグメントの不在は、これらの植物が再生している間、野生型プラスチドゲノムコピーが選択培地上で弱められたことを示した。
【００９３】  プラスチドｂａｒ遺伝子が発現されたかどうかを決定するために、葉抽出物をホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）活性についてアッセイした。ＰＰＴのアセチル−ＰＰＴへの変換は、試験したトランスプラストミック系統の各々においてＰＡＴ活性を示した。図１７のデータは、トランスプラストミック系統Ｎｔ−ｐＪＥＫ６−２Ｄ、Ｎｔ−ｐＪＥＫ６−５ＡおよびＮｔ−ｐＪＥＫ６−１３Ｂについて示す。興味深いことに、ＰＡＴ活性は、Ｎｔ−ｐＤＭ３０７−１０植物の核においてカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターから発現されたｂａｒ遺伝子と比較して、ｂａｒがプラスチド中で発現されるとき有意に高かった（＞＞１０倍）。
【００９４】  ＰＡＴ発現は、組織培養および温室においてＰＰＴに対する耐性を与える。野生型葉切片を組織培養で生育させる場合、１０ｍｇ／Ｌ ＰＰＴは完全にカルス増殖を阻害する。この同じＰＰＴ濃度は、プラスミドｐＤＭ３０７中の核ｂａｒ構築物で衝撃を加えた後の核形質転換体の選択に適当である。ｂａｒをプラスチド中で発現している植物の葉切片は、培養培地中１００ｍｇ／Ｌ ＰＰＴまでの存在下で耐性を示す。発明者らは、市販のＰＰＴ処方であるリバティーを２％の推奨されるフィールド投与量で野生型およびトランスプラストミック植物に噴霧している温室において、ＰＰＴ耐性を試験した。図１８Ａに示されるように、処理の１３日後に、野生型植物は死滅したが、トランスジェニック植物は生き残った。それから、噴霧された植物は開花し、種をつけた。図１８Ｂは、ＰＰＴ耐性の母性遺伝を示す。プラスチド花粉伝達の欠如は、トランスジェニック花粉で受粉させた子孫において除草剤耐性の欠如をもたらす。細菌性ｂａｒ遺伝子は、高いＧ＋Ｃ含量（６８．３％；Genbank受託番号Ｘ１７２２０）を有するが、プラスチド遺伝子は比較的高いＡ＋Ｔ含量を有する；例えば、高発現ｐｓｂＡおよびｒｂｃＬ遺伝子のＧ＋Ｃ含量は各々、４２．７％および４３．７％である（Genbank受託番号Ｚ０００４４）。Ｇ＋Ｃ含量における相違は、また、コドン使用頻度の偏りにおいて反映される。興味深いことに、本明細書に示されるデータは、ストレプトミセス・ヒグロスコピカス由来のｂａｒの発現がフィールドレベルの非選択的除草剤ＰＰＴに対する耐性を与えるのに十分に高いことを示す。さらに、トランスプラストミック系統において得られたＰＡＴ酵素レベルは、核形質転換体において得られたレベルより有意に高い。したがって、発現レベルのさらなる改善は、実施例７に示すように、プラスチドのためにコドン使用頻度を最適化することによって得られうる。
【００９５】  プラスチドゲノムにおけるｂａｒの取込みの利点は、ほとんどの穀物において花粉伝達の欠如のため、除草剤耐性を封じることである。さらに、遺伝的分離の欠如は、除草剤耐性の付加的な育種系統への導入のための戻し交配を簡単にするであろう。
【００９６】実施例７
合成ｂａｒ遺伝子は封じ込めを改良しプラスチドにおける発現を増強する
細菌ｂａｒ遺伝子を、実施例６において上記したように、プラスミドｐＪＥＫ６での形質転換によってタバコプラスチドゲノムに導入した。プラスミドｐＪＥＫ６において、ｂａｒはＰｒｒｎ（Ｌ）ｒｂｃＬ（Ｓ）プロモーターおよびＴｒｂｃＬ転写ターミネーターからなるカセット中で発現される。このプラスミドは、組織培養培地中でＰＰＴの存在下で成長させた植物にＰＰＴ耐性を付与したが、形質転換系統についての直接選択は可能ではなかった。ホモプラストーム葉におけるＰＡＴレベルは高かったが、プラスチド形質転換の初期の間に少数のｐＪＥＫ６  ｂａｒコピーによって産生されたＰＡＴの量は細胞全体を保護するためにはおそらく不十分であった。
【００９７】  プラスチドにおけるｂａｒ発現を改良するために、合成遺伝子を作製した。平均的なタバコ光合成プラスチド遺伝子のコドン使用頻度を模倣するようにコドン使用頻度を改変した。コドン使用頻度を変更して、高等植物プラスチド遺伝子に特徴的な低いＧＣ含量とする。クローニングを補助するために、必要に応じて制限酵素認識配列を除去および付加した。細菌におけるコドン使用頻度は、相対的なｔＲＮＡ量を反映する。稀なｔＲＮＡのコドンの頻繁な使用は、翻訳効率を有意に低下させ得る。本発明者らは、プラスチドと細菌とで差別化されたコドン使用頻度が細菌における合成遺伝子の発現を低下させるかまたは防止し、それによって微生物への水平遺伝子伝達の危険性を低減すると期待した。本発明者らはまた、本発明者らの新規プロモーターカセットにおけるｂａｒ発現の改善がＰＰＴ含有培地でのプラスチド形質転換体の直接選択を可能にすると期待した。
【００９８】実施例７の材料および方法
光合成（ｒｂｃＬ、ｐｓａＡ、ｐｓａＢ、ｐｓａＣ、ｐｓｂＡ、ｐｓｂＢ、ｐｓｂＣ、ｐｓｂＤ、ｐｓｂＥ、ｐｓｂＦ）プラスチド遺伝子のコドンの比較をＧＣＧ（Genetics Computer Group, Madison, WI）を使用して編纂した。次いで、ＤＮＡ変異を細菌ｂａｒ遺伝子に導入して、そのコドン使用頻度をプラスチド遺伝子により類似するようにし、一方、クローニングの妨げとなる可能性のあるいくつかの制限酵素部位を除去した。図２８を参照のこと。合成ｂａｒ遺伝子（ｓ−ｂａｒ）を、ＰＣＲを使用する２８個のオリゴヌクレオチド（４４ｎｔプライマー１個、３０ｎｔプライマー１個、４０ｎｔプライマー２６個）からのｓ−ｂａｒ遺伝子全体の１工程アセンブリによって得た（Stemmer et al., 1995）。プライマーの上方および下方鎖は互いに２０ヌクレオチド重複している。ＰＣＲ増幅を介して、ＮｃｏＩおよびＮｈｅＩ部位を５’末端に付加し、ＸｂａＩ部位を３’末端に付加した。完全なｓ−ｂａｒ遺伝子を得るために、少量のアセンブリＰＣＲ産物をプライマー１Ａおよび１４Ｂを使用して増幅した。以下に列挙するプライマーにおいて、不変のヌクレオチドは大文字であり、変化したヌクレオチドは小文字である。
【００９９】プライマー１Ａ    ccATGgctAGCCCAGAAaGAaGaCCGGCCGAtATtaGaCG
プライマー１Ｂ    GCATaTCaGCtTCtGTaGCACGtCtaATaTCGGCCGGtCt
プライマー２Ａ    TGCtACaGAaGCtGAtATGCCaGCaGTtTGtACaATCGTt
プライマー２Ｂ    CTTGTtTCtATaTAaTGGTTaACGATtGTaCAaACtGCtG
プライマー３Ａ    AACCAtTAtATaGAaACAAGtACaGTaAACTTtaGaACtG
プライマー３Ｂ    tTCtTGaGGTTCtTGaGGtTCaGTtCtaAAGTTtACtGTa
プライマー４Ａ    AaCCtCAaGAACCtCAaGAaTGGACtGAtGAtCTaGTCCG
プライマー４Ｂ    AaGGATAGCGCTCtCGtAGACGGACtAGaTCaTCaGTCCA
プライマー５Ａ    TCTaCGaGAGCGCTATCCtTGGCTtGTaGCaGAaGTtGAC
プライマー５Ｂ    GCGATaCCaGCtACtTCaCCGTCaACtTCtGCtACaAGCC
プライマー６Ａ    GGtGAaGTaGCtGGtATCGCaTAtGCGGGCCCtTGGAAGG
プライマー６Ｂ    CCAaTCaTAtGCaTTtCtTGCCTTCCAaGGGCCCGCaTAt
プライマー７Ａ    CAaGaAAtGCaTAtGAtTGGACaGCtGAaTCaACtGTtTA
プライマー７Ｂ    GtTGaTGaCGtGGtGAaACGTAaACaGTtGAtTCaGCtGT
プライマー８Ａ    CGTtTCaCCaCGtCAtCAaCGtACaGGACTtGGtTCtACt
プライマー８Ｂ    TTCAGtAGaTGtGTaTAtAGaGTaGAaCCaAGtCCtGTaC
プライマー９Ａ    CTaTAtACaCAtCTaCTGAAaTCttTGGAGGCACAaGGtT
プライマー９Ｂ      aACAGCtACaACaCTCTTaAAaCCtTGTGCCTCCAaaGAt
プライマー１０Ａ    TtAAGAGtGTtGTaGCTGTtATaGGatTGCCtAAtGAtCC
プライマー１０Ｂ    CtTCaTGCATGCGtACaCtTGGaTCaTTaGGCAatCCtAT
プライマー１１Ａ    aAGtGTaCGCATGCAtGAaGCtCTaGGATATGCtCCaaGa
プライマー１１Ｂ    CCtGCaGCCCtCAaCATaCCtCttGGaGCATATCCtAGaG
プライマー１２Ａ    GGtATGtTGaGGGCtGCaGGtTTCAAaCAtGGaAACTGGC
プライマー１２Ｂ    tTGCCAaAAACCtACaTCATGCCAGTTtCCaTGtTTGAAa
プライマー１３Ａ    ATGAtGTaGGTTTtTGGCAaCTtGAtTTCAGtCTaCCaGT
プライマー１３Ｂ    GtAGaACtGGACGaGGaGGTACtGGtAGaCTGAAaTCaAG
プライマー１４Ａ    ACCtCCtCGTCCaGTtCTaCCaGTtACtGAGATCTGATGA
プライマー１４Ｂ    tctagaTCATCAGATCTCaGTaACtG
【０１００】  次いで、増幅したｓ−ｂａｒコード領域をｐＢＳＩＩＫＳ＋プラスミド（Stratagene, La Jolla, CA）中にクローン化し、配列決定した（図２０Ａ）。ｓ−ｂａｒ遺伝子をキメラＰｒｒｎＬａｔｐＢ＋ＤＢｗｔ、ＰｒｒｎＬｒｂｃＬ＋ＤＢｗｔおよびＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０＋ＤＢ／Ｅｃプロモーターを有するカセット中にクローン化した。表６は、本実施例の実施に使用したプラスミドを記載する。
【０１０１】
【表５】
0005414136.tif 000006
【０１０２】  細菌ｂａｒ遺伝子の３’末端に適切なクローニング部位を提供するために、ｓ−ｂａｒのＥａｇＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントを細菌ｂａｒコード領域の同種のフラグメントに置換した。この細菌ｂａｒ遺伝子はプラスミドｐＫＯ１２中に組込まれている（図２１）。プラスミドｐＫＯ１２において、細菌ｂａｒコード領域の最初の２２個のヌクレオチドはｓ−ｂａｒ由来のヌクレオチドによって置換されている。
【０１０３】結果
上記実施例に示すように、ｐＪＥＫ６中の操作した細菌ｂａｒ遺伝子はイー・コリおよび植物の両方において発現される。本発明者らは、コドンの改変がプラスチドおよびイー・コリにおけるｓ−ｂａｒ遺伝子の発現に影響を及ぼすかどうかを試験しようとした。イー・コリにおいて、ＰＡＴ活性を測定することによってｓ−ｂａｒ発現を測定した。抽出物をそれぞれＰｒｒｎＬａｔｐＢ＋ＤＢｗｔおよびＰｒｒｎＬｒｂｃＬ＋ＤＢｗｔプロモーターからｓ−ｂａｒを発現するプラスミドｐＫＯ３およびｐＫＯ８を保有する細菌から調製した。放射能アッセイによっては活性は検出されなかったが、細菌ｂａｒ遺伝子を有するプラスミドｐＪＥＫ６およびｐＫＯ１２で形質転換した細菌由来の抽出物は強いシグナルを生じた（図２２Ａ）。プラスミドｐＫＯ１２において、細菌ｂａｒコード領域の最初の２２個のヌクレオチドは、ｓ−ｂａｒ由来のヌクレオチドに置換されている。それゆえ、イー・コリにおけるｓ−ｂａｒからの発現の欠如は、最初の２２個のヌクレオチド内の変化には起因しない。
【０１０４】  ｓ−ｂａｒをまた、ベクターｐＫＯ３での形質転換によってプラスチドに導入した。抽出物をそれぞれｓ−ｂａｒおよびｂａｒ遺伝子を有するｐＫＯ３およびｐＪＥＫ６で形質転換したタバコ植物から調製した。両方の型の植物由来の抽出物は有意なＰＡＴ活性を含んでいた（図２２Ｂ）。それゆえ、合成ｂａｒはプラスチド中では発現されるが、イー・コリ中では発現されない。
【０１０５】  ｂａｒ遺伝子のコドン使用頻度の変更によってこの遺伝子のイー・コリにおける発現がなくなった。これはおそらくｓ−ｂａｒコード領域における稀なＡＧＡおよびＡＧＧアルギニンコドンの導入に起因する。ＡＧＡおよびＡＧＧについての１０００ヌクレオチドあたりのトリプレット頻度はイー・コリにおいて最低であり、このことはこれらのコドンの翻訳に必要とされるｔＲＮＡの量の少なさを反映している。マイナーなアルギニンｔＲＮＡＡｒｇ（ＡＧＧ／ＡＧＡ）はいくつかの哺乳動物遺伝子の細菌発現における限定要因であることが示されている。ｔＲＮＡＡｒｇ（ＡＧＧ／ＡＧＡ）をコードするＡｒｇＵ（ｄｎａＹ）遺伝子の同時発現の結果、標的タンパク質が高レベルに産生された（Makrides 1996）。細菌ｂａｒ遺伝子は１４個のアルギニンンコドンを有しており、そのいずれもが稀なＡＧＡ／ＡＧＧコドンではない。ｓ−ｂａｒ遺伝子はそのうち５個を有しており、そのうち３個が最初の２５個のコドン内に位置している。それゆえ、イー・コリにおけるｓ−ｂａｒ発現の欠如は、ｓ−ｂａｒコード領域における稀なＡＧＡおよびＡＧＧアルギニンンコドンの導入によって説明されると思われる。
【０１０６】  イー・コリに対しては毒性であるが、それが毒性ではないプラスチドにおいてその発現が所望されるタンパク質が存在する。これらのタンパク質のイー・コリにおける操作は問題となる。なぜなら、一般に使用されるＰＥＰプラスチドプロモーターはイー・コリ中で活性であり、従って遺伝子は転写されｍＲＮＡは翻訳されるからである。マイナーなコドンをコード領域に組み込むと、イー・コリにおけるこれらのタンパク質の翻訳が防止される。これに関して特に有用なのは、アルギニンコドンのＡＧＡ／ＡＧＧへの変換である。Ｎ末端領域にアルギニンが存在しない場合は、複数のＡＧＡ／ＡＧＧコドンを含むＮ末端融合体を設計して、ｍＲＮＡの翻訳を防止してもよい。
【０１０７】  耕地条件下の植物は、土壌中、葉の上および植物中に生息する微生物と会合する。プラスチドからのこれらの微生物への遺伝子の流出は示されていない。しかし、標的微生物においては稀であるが、プラスチドにおいては効率的に翻訳されるコドンをプラスチド遺伝子に組込むことは、さらなる安全性の尺度となる。選択マーカー遺伝子および目的の遺伝子中へのＡＧＡ／ＡＧＧコドンの組み込みは、植物から微生物（ＡＧＡ／ＡＧＧコドンを効率的に翻訳する能力を欠く）への遺伝子の伝達を防止する。特定の植物−微生物会合の場合、コドン使用頻度優先性の違いに基いて、プラスチドにおいては発現されるが微生物においては発現されない遺伝子を設計することができる。
【０１０８】  ｓ−ｂａｒ構築物でのボンバードメント後にトランスプラストームクローンを直接選択する試みはこれまでのところ失敗している。図２０Ａにおけるｓ−ｂａｒコード領域はプラスチド遺伝子に特徴的な割合で高頻度のコドンおよび稀なコドンを含んでいる。重要な段階における特定の関連で相対的に稀なコドンがプラスチド形質転換事象の回収を妨害する可能性がある。ｔＲＮＡ利用性に依存するｍＲＮＡの組織特異的翻訳の例が知られている（Zhou et al., 1999）。それゆえ、本発明者らは、高頻度のコドンのみを含む第２の合成ｂａｒ遺伝子、ｓ２−ｂａｒを設計した（図２０Ｂ）。ｓ２−ｂａｒでのプラスチド形質転換は、ＰＰＴ耐性によるプラスチド形質転換事象の直接選択を可能にする。
【０１０９】実施例８
タバコおよびコメにおけるトランスプラストームクローンの容易な同定のための蛍光性抗生物質耐性マーカー
高等植物におけるプラスチド形質転換は漸進的過程を通して達成され、その間、３００〜１０，０００個のプラスチドゲノムコピーの全てが一様に変化させられる。プラスチドゲノム中に組み込まれた抗生物質耐性遺伝子は、この過程の間のトランスプラストームの維持を容易にする。細胞におけるプラスチドゲノムコピーの高い数を仮定すれば、形質転換は不可避的にキメラ組織を生じ、ここでトランスプラストーム細胞を同定し植物に再生させる必要がある。キメラ組織において、抗生物質耐性は細胞自律性ではない：トランスプラストーム区域および野生型区域の両方はトランスジェニック細胞による表現型マスキングによって緑色である。スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに対する耐性を付与する蛍光性抗生物質耐性酵素であるＦＬＡＲＥ−Ｓ（これは、アミノグリコシド３’’−アデニリルトランスフェラーゼ［ＡＡＤ］をＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と翻訳融合することによって得られた）をコードする新規遺伝子を本実施例において提供する。ＦＬＡＲＥ−Ｓはキメラ組織におけるトランスプラストーム区域と野生型区域との区別を容易にし、それによって遺伝的に安定なトランスプラストーム系統を得るために必要とされる時間および努力を有意に軽減する。プラスチド形質転換事象について選択するためのＦＬＡＲＥ−Ｓの有用性は、ＦＬＡＲＥ−Ｓプラスチドベクターでの形質転換ならびにそれぞれスペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに対する耐性についての選択の後、タバコおよびコメ植物におけるトランスプラストームプラスチドおよび野生型プラスチドの分離を追跡することによって示された。
【０１１０】  プラスチド形質転換ベクターは、相同プラスチド標的化配列によって隣接される選択マーカー遺伝子およびパッセンジャー遺伝子（単数または複数）を含み（Zoubenko et al., 1994）、バイオリスティックＤＮＡ送達（Svab et al., 1990; Svab and Maliga, 1993）またはＰＥＧ処理（Golds et al., 1993; Koop et al., 1996; o'Neill et al., 1993）によってプラスチド中に導入される。選択マーカー遺伝子はスペクチノマイシン、ストレプトマイシンまたはカナマイシンに対する耐性をコードしてもよい。薬剤に対する耐性はプラスチドにおけるキメラａａｄＡ（Svab and Maliga, 1993）およびｎｅｏ（ｋａｎ）（Carrer et al., 1993）遺伝子の発現によって付与される。これらの薬剤は植物再生培地でのクロロフィル蓄積およびシュート形成を阻害する。トランスプラストーム系統は、白くなった野生型葉区画上で緑色シュートを形成する能力によって同定される。遺伝的に安定なトランスプラストーム系統の取得は、選択培地での細胞の培養を包含し、その間、細胞は少なくとも１６〜１７回分裂する（Moll et al., 1990）。この時間の間に、野生型および形質転換プラスチドおよびプラスチドゲノムコピーは徐々に選別される。ゲノムおよびオルガネラ選別の期間の延長は、野生型およびトランスジェニック細胞の区域からなるキメラ植物を生じる（Maliga, 1993）。キメラ組織において、ａａｄＡまたはｎｅｏによって付与される抗生物質耐性は細胞自律性ではない：トランスプラストーム区域および野生型区域の両方はトランスジェニック組織による表現型マスキングによって緑色である。キメラ性は、選択培地での植物再生の第２のサイクルを必要とする。可視マーカーがない場合、これは抗生物質選択およびＰＣＲまたはサザンプロービングによるトランスプラストーム植物の同定を含む非効率的な過程である。形質転換区域の可視的同定の実施可能性は、ホモプラストームクローンを得るために必要とされる努力を大いに軽減する。
【０１１１】  Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は可視マーカーであり、長く致死的な組織化学染色手順を必要としないで、生存細胞における蛍光性遺伝子産物の直接的な画像化を可能にする。その発色団は酸素の存在下で自触的に形成され、青色またはＵＶ光を吸収すると緑色蛍光を発する（Prasher et al., 1992; Chalfie et al., 1994; Heim et al., 1994）（参考文献Prasher, 1995; Cubitt et al., 1995; Misteli and Spector, 1997に概説される）。植物核における発現のために、潜在的イントロンを除去し、輝度を増強しＧＦＰの溶解性を改良するように変異を導入することによって、ｇｆｐ遺伝子は改変された（Pang et al., 1996; Reichel et al., 1996; Rouwendal et al., 1997; Haseloff et al., 1997; Davis and Vierstra, 1998）。ＧＦＰは、核遺伝子からの核、細胞質およびプラスチドへのタンパク質標的化をモニターするために（Sheen et al., 1995; Chiu et al., 1996; Kshler et al., 1997）、そして植物におけるウイルスの移動を追跡するために（Baulcombe et al., 1995; Epel et al., 1996）使用された。ＧＦＰはまた、プラスチドにおける一過性遺伝子発現を検出するために使用されている（Hibberd et al., 1998）。
【０１１２】  プラスチドゲノムにおけるｇｆｐ遺伝子の直接組み込みによるＧＦＰの発現を本明細書に記載する。本発明のプラスチド形質転換ベクター中の可視マーカー、ＧＦＰタンパク質の組み込みは、自発的抗生物質耐性変異体とプラスチド形質転換体との区別を容易にする（Svab et al., 1990）。さらに、キメラ組織中のトランスプラストーム区域を可視的に同定することができ、このことは、遺伝的に安定なトランスプラストーム系統を得るために必要とされる時間および努力を有意に軽減する。本明細書に記載のＧＦＰマーカーの有用性は、酵素アミノグリコシド３’’−アデニリルトランスフェラーゼ［ＡＡＤ］（植物にスペクチノマイシンおよびストレプトマイシン耐性を付与する）とのその融合によってさらに増強される。二機能性タンパク質ＦＬＡＲＥ−Ｓ（蛍光性抗生物質耐性酵素、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシン（fluorescent antibiotic resistance enzyme, spectinomycin and streptomycin））をコードするマーカー遺伝子の使用は、２つの遺伝子の物理的分離を防止し、操作を単純化する。さらに、蛍光性抗生物質耐性遺伝子は、プラスチド形質転換が容易に同定可能な組織培養表現型に関連しない穀物作物へのプラスチド形質転換の拡張を可能にする。
【０１１３】  以下のプロトコルを本実施例の実施を容易にするために提供する。
【０１１４】  タバコプラスチドベクターの構築。ａａｄＡ１６ｇｆｐ遺伝子は、ＦＬＡＲＥ１６−Ｓ融合タンパクをコードしており、ｐＢＳＫＳＩＩ＋誘導体であるプラスミドｐＭＳＫ５１からＸｈｅＩ−ＸｂａＩフラグメントとして切出すことができる（ジーンバンク受託番号はまだ付与されていない）。該融合タンパクは、ａａｄＡ（プラスミドｐＭＳＫ３８における）の下流にｇｆｐ（プラスミドｐＣＤ３−３２６Ｆ由来）をクローニングし、得られたプラスミドをＢｓｔＸＩ（ａａｄＡコード領域の３'末端で）およびＮｃｏＩ（ｇｆｐ翻訳開始コドンを包含する）で消化し、ＢｓｔＸＩ−ＮｃｏＩ適合アダプターにより２つのコード領域を連結することにより得られた。該アダプターは、オリゴヌクレオチド5'-GTGGGCAAAGAACTTGTTGAAGGAAAATTGGAGCTAGTAGAAGGTCTTAAAGTCGC-3'および5'-CATGGCGACTTTAAGACCTTCTACTAGCTCCAATTTTCCTTCAACAAGTTCTTTGCCCACTACC-3'をアニーリングすることにより得られた。該アダプターは、ＡＡＤおよびＧＦＰと１６アミノ酸残基（ELVEGKLELVEGLKVA）のペプチドとを連結する。
【０１１５】  プラスミドｐＭＳＫ３８（ｐＢＳＩＩＫＳ＋誘導体）における遺伝子工学処理したａａｄＡ遺伝子（Chinault et al., 1986）は、５’末端にＮｃｏＩおよびＮｈｅＩ部位を有しており、３’末端にＢｓｔＸＩおよびＸｂａＩ部位を有している。ＮｃｏＩ部位は、翻訳開始コドンを包含しており；ＮｈｅＩおよびＢｓｔＸＩ部位は、各々、コード領域の５’末端および３’末端の近くにあり；ＸｂａＩ部位は、終止コドンの下流にある。変異は、オリゴヌクレオチド5'-GGCCATGGGGGCTAGCGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATCG-3'および5'-CGAATTCTAGACATTATTTGCCCACTACCTTGGTGATCTC-3'を用いてＰＣＲにより導入された。
【０１１６】  プラスミドＣＤ３−３２６Ｆにおけるｇｆｐ遺伝子は、プラスミドｐｓｍＧＦＰの誘導体であり、オハイオ州コロンブスのアラビドプシス・バイオロジカル・リソース・センター（Arabidopsis Biological Resource Center）からオーダーナンバーＣＤ３−３２６の下に入手したＧＦＰ（Davis and Vierstra, 1998）の可溶性修飾バージョン（受託番号Ｕ７０４９５）をコードしている。プラスミドＣＤ３−３２６Ｆにおけるｇｆｐ遺伝子は、ＰｐｓｂＡ／ＴｐｓｂＡ発現カセットにおいて発現される。プラスミドＣＤ３−３２６Ｆにおけるｇｆｐ遺伝子は、以下の工程により得られた。ＣＤ３−３２６由来のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩフラグメントをｐＢＳＫＳ＋ベクターにクローン化してプラスミドＣＤ３−３２６Ａを得た。コード領域の下流にあるＳａｃＩ部位を、平滑末端化およびリンカーライゲーションによりＸｂａＩ部位に転換した（5'-GCTCTAGAGC；プラスミドＣＤ３−３２６Ｂ）。ＮｃｏＩ部位を、翻訳開始コドンを包含するように作成し、同時に、内部ＮｃｏＩ部位を、プライマー5'-CCGGATCCAAGGAGATATAACACCATGGCTAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC-3'および5'-GTGTTGGCCAAGGAACAGGTAGTTTTCC-3'を用いてコード領域Ｎ末端をＰＣＲ増幅することにより除去した。ＰＣＲ増幅フラグメントをＢａｍＨＩおよびＭｓｃＩ制限酵素で消化し、得られたフラグメントを用いてプラスミドＣＤ３−３２６ＢにおいてＢａｍＨＩ−ＭｓｃＩフラグメントを置換し、プラスミドＣＤ３−３２６Ｃを得た。プラスミドＣＤ３−３２６ＣからＮｃｏＩ−ＸｂａＩフラグメントとしてｇｆｐコード領域を切出し、ｐｓｂＡカセットにクローン化してプラスミドＣＤ３−３２６Ｄを得た。ＰｐｓｂＡおよびＴｐｓｂＡは、プラスミドｐＪＳ２５（Staub and Maliga, 1993）由来のｐｓｂＡ遺伝子プロモーターおよび３’未翻訳領域である。ＴｐｓｂＡは、修飾ＢｓｐＨＩ部位の下流にＨｉｎｄＩＩＩリンカーを挿入することによりトランケートされた（Peter Hajdukiewcz, 未公開）。ＰｐｓｂＡ：：ｇｆｐ：：ＴｐｓｂＡ遺伝子をＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして切出し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＰＲＶ１１１Ａにクローン化してプラスミドＣＤ３−３２６Ｆを得た。
【０１１７】  プラスミドｐＭＳＫ５１由来のａａｄＡ１６ｇｆｐコード領域を２つの発現カセットに導入した。プラスミドｐＭＳＫ５３において、ａａｄＡ１６ｇｆｐコード領域は、ＰｒｒｎＬｒｂｃＬ＋ＤＢｗｔ／ＴｐｓｂＡカセットにおいて発現され、ＦＬＡＲＥ１６−Ｓ２タンパク（経口抗生物質耐性酵素（fluorescent antibiotic resistance enzyme）、スペクチノマイシン（spectinomycin））をコードしている。ＰｒｒｎＬｒｂｃＬ＋ＤＢｗｔは、上記実施例に記載されており、プラスミドｐＨＫ１４由来のものである。該構築物は、ｒｒｎオペロンプロモーター、ｒｂｃＬ遺伝子リーダーおよび下流ボックス配列からなるキメラプロモーターを含有する。ＴｐｓｂＡは、ｐｓｂＡ遺伝子３’未翻訳領域であり、キメラｍＲＮＡを安定化するように機能する。プラスミドｐＭＳＫ５４において、ａａｄＡ１６ｇｆｐコード領域は、ＰｒｒｎＫａｔｐＢ＋ＤＢｗｔ／ＴｐｓｂＡカセットにおいて発現され、ＦＬＡＲＥ１６−Ｓ１タンパクをコードしている。ＰｒｒｎＬａｔｐＢ＋ＤＢｗｔは、プラスミドｐＨＫ１０由来であり、ｒｒｎオペロンプロモーター、ａｔｐＢリーダーおよび下流ボックス配列からなるキメラプロモーターである。実施例１〜４を参照のこと。
【０１１８】  キメラａｄｄＡ１６ｇｆｐ遺伝子をタバコプラスチド形質転換ベクターｐＰＲＶ１１１Ｂ（Zoubenko et al., 1994）に導入した。ａａｄＡ遺伝子は、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩ制限酵素を用いてプラスミドｐＰＲＶ１１１Ｂから切出し、プラスミドｐＭＳＫ５３およびｐＭＳＫ５４由来のＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩフラグメントと置換してプラスミドｐＭＳＫ５７（ａａｄＡ１６ｇｆｐ−Ｓ２）およびｐＭＳＫ５６（ａａｄＡ１６ｇｆｐ−Ｓ１）を得た。
【０１１９】  コメプラスチドベクターの構築。プラスミドｐＭＳＫ４９は、ｔｒｎＶ／ｒｐｓ１２／７遺伝子間領域において選択マーカーとしてａａｄＡ１１ｇｆｐ−Ｓ３遺伝子を担持しているコメ特異的プラスチド形質転換ベクターである（ジーンバンク受託番号はまだ付与されていない）。プラスミドｐＭＳＫ４９は、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩ制限部位を平滑末端化した後にｐＢＳＫＳＩＩ＋（ストラータジーン（Stratagene））ベクターにクローン化されたコメＳｍａＩ−ＳｎａＢＩプラスチドフラグメント（ゲノムにおけるヌクレオチド１２２４８８および１２５８７８での制限部位（Hiratsuka et al., 1989））を担持している。コメプラスチドＤＮＡフラグメントに存在するＸｂａＩ部位（ゲノムにおけるヌクレオチド１２５０３２位（Hiratsuka et al., 1989））を、充填および再ライゲーションにより除去した。選択マーカーをクローン化する前に、前駆プラスミドをＢｇｌＩＩ制限酵素で消化し、２つの近位ＢｇｌＩＩ部位（１２４３６７位および１２４４９１位）の間で１１９ヌクレオチドの欠失が生じる。次いで、ａａｄＡ１１ｇｆｐ−Ｓ３遺伝子を平滑末端ＢｇｌＩＩ部位にてクローン化した。
【０１２０】  プラスミドｐＭＳＫ４９におけるａａｄＡ遺伝子は、プラスミドｐＭＳＫ３８（上記）におけるａａｄＡ遺伝子を修飾してプラスミドｐＭＳＫ３９を得ることことにより得られた。該修飾は、ａａｄＡ遺伝子産物をそのＮ末端でヒトｃ−Ｍｙｃタンパクのエピトープ（アミノ酸４１０−４１９；EQKLISEEDL（Kolodziej and Young, 1991））と翻訳的に融合させることを含む。ＮｃｏＩ−ＮｈｅＩで消化したｐＭＳＫ３８プラスミドに適当な突出部を有する相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによりアダプターをライゲートすることにより遺伝子工学処理を行った。該オリゴヌクレオチドは、5'-CATGGGGGCTAGCGAACAAAAACTCATTTCTGAAGAAGACTTGC-3'および5'-CTAGGCAAGTCTTCTTCAGAAATGAGTTTTTGTTCGCTAGCCCC-3'であった。
【０１２１】  ＦＬＡＲＥ１１−ＳをコードするａａｄＡ１１ｇｆｐ遺伝子は、ＡＡＤおよびＧＦＰと１１量体ペプチドELAVEGKLEVAとを連結することにより得られた。同ポリクローニング部位においてａａｄＡおよびｇｆｐをクローン化するために、ｇｆｐ（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント；プラスミドＣＤ３−３２６Ｆ由来）をプラスミドｐＭＳＫ３９におけるａａｄＡの下流にクローン化してプラスミドｐＭＳＫ４１を得た。２つの遺伝子を一緒にＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして切出し、プラスミドｐＭＳＫ４５にクローン化してカナマイシン耐性遺伝子を置換してプラスミドｐＭＳＫ４８を得た。プラスミドｐＭＳＫ４５は、ＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０＋ＤＢ／Ｅｃプロモーターを担持するプラスミドｐＭＳＫ３５の誘導体である。該プロモーターは、プラスチドｒＲＮＡオペロンプロモーターおよびＴ７ファージ遺伝子１０リーダーのリーダー配列からなる。プラスミドｐＭＳＫ４８において、ａａｄＡは、ＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０＋ＤＢ／Ｅｃプロモーターから発現される。次いで、ａａｄＡおよびｇｆｐ遺伝子を、ＡＡＤおよびＧＦＰと１１量体ペプチドとを連結するＢｓｔＸＩ−ＮｃｏＩアダプターと翻訳的に融合させた。該アダプターは、オリゴヌクレオチド5'-GTGGGCAAAGAACTTGCAGTTGAAGGAAAATTGGAGGTCGC-3'および5'-CATGGCGACCTCCAATTTTCCTTCAACTGCAAGTTCTTTGCCCACTACC-3'をアニーリングすることにより得られ、ＢｓｔＸＩ／ＮｃｏＩで消化したｐＭＳＫ４８プラスミドＤＮＡにライゲートしてプラスミドｐＭＳＫ４９を得た。プラスミドｐＭＳＫ４９は、プラスミドｐＭＳＫ３５に存在するコメプラスチド標的配列を有する。
【０１２２】  タバコプラスチド形質転換。Ｄｕｐｏｎｔ  ＰＤＳ１０００Ｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｇｕｎ（１１００ｐｓｉ）を用いて、４〜６週齢の植物由来のタバコの葉にＤＮＡ被覆タングステン粒子で衝撃を与えた。トランスプラストムクローンを、５００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン・二塩酸塩を含有するＲＭＯＰ培地（Avab and Maliga, 1993）上で漂白した葉の切片に再生している緑色の新芽と同定した。スペクチノマイシン耐性の新芽にＵＶ光を照射した（Ｍｏｄｅｌ Ｂ １００ＡＰ、アメリカ合衆国カリフォルニア州アップランドのユーブィ・プロダクツ（UV Products））。緑色に発光している新芽を無スペクチノマイシンＭＳ培地（Murashige and Skoog, 1962）（３％スクロース）に移し、蛍光性領域（トランスプラストム）および非蛍光性領域（野生型）を形成した。蛍光性領域を切出し、選択的（５００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン）新芽再生（ＲＭＯＰ）培地に移した。再生した新芽をサザン分析法により均一な形質転換について試験した。
【０１２３】  コメプラスチド形質転換。成熟したコメ（Oryza sativa） cv. Ｔａｉｐｅｉ３０９の種子からのカルスの形成は、ＭＳ塩およびビタミン（２ｍｇ／Ｌのグリシン、０．５ｍｇ／Ｌのニコチン酸、０．５ｍｇ／Ｌのピリドキシンおよび０．１ｍｇ／Ｌのチアミン）、２ｍｇ／Ｌの２，４Ｄ、１ｍｇ／Ｌのカイネチンおよび３００ｍｇ／Ｌのカゼイン酵素加水分解産物ＩＩＩ型（Ｓｉｇｍａ Ｃ−１０２６）およびスクロース（３０ｇ／Ｌ）を含有する修飾ＣＩＭ培地（Tompson et al., 1986）上で行った。ＡＡ培地（Muller and Grafe, 1978）上で増殖している胚形成カルスからの胚形成懸濁液を得た。バイオリスティックプロセスによるプラスチド形成のために、コメ胚形成細胞を非選択修飾ＣＩＭ培地（Tompson et al., 1986）上の濾紙の上に置いた。衝撃を与えられた細胞を４８時間インキュベートし、選択液体ＡＡ培地（Muller and Grafe, 1978）に移し（１〜２週間）次いで、ＭＳ塩およびビタミン、１００ｍｇ／Ｌのｍｙｏ−イノシトール、４ｍｇ／ＬのＢＡＰ、０．５ｍｇ／ＬのＩＡＡ、０．５ｍｇ／ＬのＮＡＡ、３０ｎｇ／Ｌのスクロースおよび４９ｇ／Ｌのマルトースおよび１００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン硫酸塩を含有する固体修飾ＲＲＭ再生培地（Zhang and Wu, 1988）に移し、２〜３週間のうちに緑色の新芽が出てきた。この新芽を、３０ｇ／Ｌのスクロースおよび１００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン硫酸塩を含有する選択ＭＳ塩培地（Murashige and Skoog, 1962）上で根付かせた。ＰＣＲ分析および共焦顕微鏡用の葉の試料を選択培地上の植物から採取した。
【０１２４】  境界フラグメントのＰＣＲ増幅。Mettler（Mettler, 1987）に従って、全細胞ＤＮＡを抽出した。製造者の推奨に従って、Ｖｅｎｔバッファー中のＡｍｐｌｉＴａｑ（ストラータジーン）およびＶｅｎｔ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs））ＤＮＡポリメラーゼの９：１混合物を用いてＰＣＲ分析を行った。左境界フラグメントは、プライマーＯ３（5'-ATGGATGAACTATACAAATAAG-3'）およびＯ４（5'-GCTCCTATAGTGTGACG-3'）を用いて増幅した。右境界フラグメントは、プライマーＯ５（5'-ACTACCTCTGATAGTTGAGTCG-3'）およびＯ６（5'-AGAGGTTAATCGTACTCTGG-3'）を用いて増幅した。ＦＬＡＲＥ−Ｓ遺伝子のａｄｄＡ部分は、プライマーＯ１（5'-GGCTCCGCAGTGGATGGCGGCCTG-3'）およびＯ２（5'-GGGCTGATACTGGGCCGGCAGG-3'）を用いて増幅した。プライマーの位置は、図５Ａに示している。ＦＬＡＲＥ−Ｓを発現しているトランスプラストムタバコおよびコメ植物において同一のプライマーを用いることができることに注意すること。
【０１２５】  蛍光によるＦＬＡＲＥ−Ｓの検出。葉におけるＦＬＡＲＥ−Ｓ発現切片を、ＧＦＰ検出用ＣＣＤカメラシステムを装着したＯｌｙｍｐｕｓ ＳＺＸ立体顕微鏡により可視化した。ＧＦＰの細胞下位置を、レーザー走査共焦顕微鏡（Ｓａｒａｓｔｒｏ ２０００ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｉｍａｇｅ Ｓｙｓｔｅｍ、カリフォルニア州サニーヴェイルのモレキュラー・ダイナミクス（Molecular Dynamics））により証明した。このシステムは、４８８ｎｍおよび５６８ｎｍのラインを有するアルゴン混合ガスレーザーおよびディテクターチャネルを包含していた。該チャネルは、フルオレセインおよびローダミン画像用に調節される。ＧＦＰ蛍光は、ＦＩＴＣチャネル（４８８−５１４ｎｍ）にて検出された。クロロフィル蛍光は、ＴＲＩＴＣチャネル（５６０−５８０ｎｍ）にて検出された。ＧＦＰおよびクロロフィル蛍光により得られた画像を、顕微鏡に付属したコンピュータースクリーンにて調べ、Ａｄｏｂｅ ＰｈｏｔｏＳｈｏｐソフトウェアを用いて処理した。
【０１２６】  イムノブロット分析。無菌培養中の植物から回収した葉（０．５ｇ）を液体窒素中で凍結させ、乳鉢中で乳棒を用いて微粉に粉砕した。タンパク抽出のために、該粉末を、バッファー［５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸カリウム、５ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオトレイトールおよび２ｍＭ ＰＭＳＦ］１ｍｌを含有する遠心管に移し、フリッキングにより混合した。４℃で５分間、１１，６００ｇで遠心分離することにより、不溶性物質を除去した。上清中のタンパク濃度を、Ｂｉｏｒａｄタンパクアッセイ試薬キットを用いて測定した。１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Laemmli, 1970）にてタンパク（レーン当たり２０μｌ）を分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したタンパクを、セミドライエレクトロブロッティング装置（ビオ−ラド（Bio-Rad））を用いてＰｒｏｔｒａｎニトロセルロース膜（シュライヒャー・アンド・シュール（Schleicher and Schuell））に移動させた。該膜を、１〜２００倍に希釈したＬｉｖｉｎｇ Ｃｏｌｏｒｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（クローンテック（Clontech））と一緒にインキュベートした。ＦＬＡＲＥ−Ｓを、Ｘ線フィルム上でのＥＣＬケミルミネツセンスイムノブロット検出を用いて可視化した。ブロット上のＦＬＡＲＥ−Ｓを、市販の精製野生型ＧＦＰ（クローンテック）の連続希釈液と比較して定量化した。
【０１２７】  結果および考察
選択マーカーとしてのＦＬＡＲＥ−Ｓを有するタバコプラスチドベクター。
２つのＦＬＡＲＥ−Ｓ融合タンパクをイー・コリ（E. coli）中で試験した。１つは、ＡＡＤおよびＧＦＰを１１量体（ELAVEGKLEVA）リンカーにより連結し、もう１つは、１６量体（ELVEGKLELVEGLKVA）リンカーにより連結した。タバコにおける形質転換のために、ａａｄＡ１６ｇｆｐコード領域（１６量体リンカー）を、プラスチドにおける高レベルのタンパク蓄積を媒介することが知られている２つのカセットにて発現させた。共に、リボソームＲＮＡオペロンの発現を駆動する最強の公知プラスチドプロモーター（ｐｒｒｎ）、およびキメラｍＲＮＡの安定化のために高度に発現したｐｓｂＡ遺伝子の３’−ＵＴＲ（ＴｐｓｂＡ）を利用する。ＰｒｒｎＬａｔｐＢ＋ｗｔＤＢ（プラスミドｐＭＳＫ５６）およびＰｒｒｎＬｒｂｃＬ＋ＤＢｗｔ（プラスミドｐＭＳＫ５７）プロモーターは、各々、ａｔｐＢまたはｒｂｃＬ遺伝子リーダー配列、コード領域Ｎ末端、および下流ボックス（ＤＢ）配列を利用する。キメラ遺伝子におけるＤＢ配列の封入により、２つの遺伝子によりコードされるタンパクは、わずかに異なっており、ＦＬＡＲＥ１６−Ｓ（各々、ＦＬＡＲＥ１６−Ｓ１およびＦＬＡＲＥ１６−Ｓ２）と翻訳的に融合したＡＴＰ−ａｓｅβサブユニットの１４アミノ酸（ａｔｐＢ遺伝子産物）またはリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ｒｂｃＬ遺伝子産物）を有する。蛍光スペクチノマイシン耐性遺伝子を有するプラスチド形質転換ベクターを得るために、キメラ遺伝子を、プラスチドベクターｐＰＲＶ１１１ＢにおけるｔｒｎＶ／ｒｐｓ１２／７プラスチド遺伝子間領域にクローン化した。プラスミドｐＭＳＫ５６およびｐＭＳＫ５７（図２３）は、各々、マーカーとしてＦＬＡＲＥ１６−Ｓ１およびＦＬＡＲＥ１６−Ｓ２を発現する。
【０１２８】  トランスプラストミックタバコクローンの蛍光による同定
形質転換は、遺伝子銃によりpMSK56およびpMSK57プラスミドDNAを葉緑体中に導入して行った。遺伝子銃で撃った葉を選択（500mg/Lのスペクチノマイシン）シュート再生培地上へ置いた。野生型葉はこの培地上で脱色され、白色のカルスを生成する。形質転換されたプラスチドを有する細胞からは、緑色のシュートが再生される。選択培地上の葉を、ハンドヘルドのＵＶランプを用いて定期的にFLARE-Sの蛍光を観察した。
【０１２９】  pMSK56を撃ちこんだ葉から生じた若いシュート（サイズ3〜5 mm）においては蛍光は検出されなかった。しかし、このちいさなシュートを非選択性植物維持培地上へ移した時に、葉内に光る領域の形成が認められた。これに対して、プラスミドpMSK57を撃ちこんだ培養物においては、初期段階において小さな蛍光シュートが得られた。これらの蛍光シュートおよび非蛍光シュートの一部は、非選択性植物維持培地上で光る領域を有する植物体へと成長した。従って、FLARE16-S2はプラスチド形質転換の早期検出に有用である。選択培地上の若いシュート内のFLARE16-S2蛍光は比較的高レベルのFLARE16-S2によるものである。FLARE16-S2がFLARE16-S1と比べてより高レベルに発現されることはまた、FLARE16-S2を発現する斑入りの葉の、FLARE16-S1と比べてより輝度の高い領域によっても示される。
【０１３０】  個々のシュートにおいて光る領域のサイズはまちまちであった。様々な葉の層においてFLARE-Sは明かに発現した。スペクトマイシン耐性による古典的選択によっては、トランスプラストミックおよび野生型の各領域の相違は視覚化されない。均一に形質転換されたプラスチドゲノムを有する植物を再生することが、FLARE-Sを発現する蛍光部分により促進された。即ち、該蛍光部分はUVライトで容易に同定することができ、これを切り出し、スペクチノマイシン含有（500mg/L）培地にて第2の植物再生サイクルに供すればよい。
【０１３１】  高レベルのFLARE-Sが蓄積された場合、FLARE-Sが植物に対して毒性であるか否かに興味が持たれる。我々は毒性は低い形質転換効率として現れてくると予測した。３０のタバコの葉にプラスミドpMSK56およびpMSK57を撃ち込み、それぞれ７１および８１個のスペクチノマイシン耐性クローンを得た。これらのクローンのうち、それぞれお６６および７７のラインが蛍光によってトランスプラストミックであることが示された。かかるクローンのあるサブセットにおけるプラスチド形質転換を共焦点レーザースキャンニング顕微鏡（各７クローン；下記参照）により、およびサザン分析(各４クローン）により確認した。FLARE-S発現遺伝子によるプラスチド形質転換の発生頻度は、先に報告されている同じ挿入部位におけるキメラaadA遺伝子によるもの（SvabとMaliga、1993）より少し高かった（１回の撃ちこみにつき〜１であったのに対して〜２）。従って、高レベルのFLARE-Sの蓄積は有害ではないと推測される。毒性の欠如については、温室内の植物が明らかに正常なフェノタイプを示すことからも支持される（示さず）。
【０１３２】  共焦点顕微鏡による、タバコ植物内のFLARE-Sの局在の観察
フェノタイプのマスキングによって、キメラ葉内のトランスプラストミックおよび野生型領域は選択培地上では両方共に緑色である。しかしながら、我々は葉のキメラな部分において、同じ細胞内においてあるプラスチドがFLARE-Sを発現している一方で別のプラスチドが発現していないということを見出した(図２４）。FLARE-Sおよび葉緑素の蛍光をそれぞれ、フルオレセインおよびローダミンチャンネルにより検出した。次いで二つの画像を重ね合わせ、FLARE-Sのフルオレセインが葉緑体から誘導されたものであることを確認した。
【０１３３】  花弁のクロモプラストおよび根の細胞中の非緑色プラスチドを含む非緑色プラスチドについてもFLARE-Sの発現を検討した(図２４ｂ、ｆ）。トランスゲノムについてホモプラストミックである植物を用いてこの検討を行った。非緑色組織においては葉緑素によってオルガネラがプラスチドであるということの確認ができないことから、ホモプラストミック状態は重要であった。FLARE-Sの発現は葉緑体内でも非緑色プラスチド内でも容易に検出できたことから、プラスチドｒRNAオペロンプロモーターは明らかに全てのプラスチド型において活性である。
【０１３４】  タバコの葉内へのFLARE-Sの蓄積
FLARE-Sのホモプラストミック葉への蓄積について、FRARE16-S（520アミノ酸残基）のGFPタンパク質(239アミノ酸)を認識する市販のGFP抗体を用いて調べた。全可溶性葉タンパク質中、FLARE16-S1(532アミノ酸）は〜８％であったが、FLARE16-S2(532アミノ酸）では〜18％であった(図２５）。FLARE16-S濃度の測定には、GFPの一連の希釈物を参考に用い、より大きなサイズであるFLARE16-S1およびFLARE16-S2へと補整するために各値を2.6増加させた。
【０１３５】  FLARE-Sの発現による、コメ中のプラスチド形質転換の追跡
コメの植物再生は非緑色胚形成細胞から生じる。非緑色タバコプラスチド内へのFLARE-S発現に端を発し、我々は胚形成性コメ組織培養細胞の非緑色プラスチドの形質転換を試みた。プラスチド形質転換はFLARE11-S3を発現しているコメに特異的なベクターを用い、aadA11GFP-S3遺伝子のtrnV/rps12/7遺伝子間領域への挿入を標的として行った。コメベクター内への挿入部位の決定およびプラスチド標的配列のサイズは、図２３に示したタバコベクターと同様にした。
【０１３６】  コメにおけるプラスチド形質転換は、コメ胚形成細胞懸濁培養物に対してプラスミドpMSK49DNAで被覆した金粒子を撃ちこんで行った。コメ細胞はほとんどの穀物と同様、本来スペクチノマイシン耐性である(Fromm et al., 1987)。FLARE-Sはしかしながら、ストレプトマイシン耐性も同様に賦与する(Svab and Maliga, 1993)。従って、トランスプラストミックなラインの選択は、ストレプトマイシン選択培地(100mg/L)を用いて行った。この濃度のストレプトマイシンはコメの胚形成細胞の増殖を阻害する。遺伝子銃で撃った後のコメの細胞を、液体胚形成性AA培地内で最初に選択し、次いで固形植物再生培地上で耐性細胞が緑色のシュートを再生したことによって選択した（２５の撃ちこみプレート中、１２）。これらのシュートは根付き、植物体へと成長した。これらの植物体の葉から単離したDNAのボーダーフラグメントのPCR増幅により、aadA11GFP-S3遺伝子がプラスチドゲノム中に組み込まれていることを確認した(図２６）。左及び右のボーダーフラグメントは、核ゲノム内に遺伝子が組み込まれていない場合には、増幅されない。というのは、該対のプライマーのひとつ（０４または０６）がプラスチド標的領域の外側となるからである。
【０１３７】  ２つのPCR陽性植物の葉内のFLARE11-S3発現を、共焦点レーザースキャンニング顕微鏡で試験した。コメにおいてもタバコと同様、FLARE-Sマーカーによりトランスプラストミックおよび野生型プラスチドが判別された(図２７）。コメにおいては葉緑体のほんのちいさなフラクションのみがFLARE-Sを発現した。図２７において矢印で示した個々の細胞には、野生型およびトランスジェニック葉緑体が混在していたが、かかる細胞内においてFLARE-Sはプラスチドゲノムにのみ発現し得る。核ゲノム内プラスチドーターゲティング輸送ペプチド下流へのaadA11GFP-S3の組み込みにより、細胞内の各葉緑体へ均一なFLARE-Sの発現が導かれる。
【０１３８】  本発明の選択的マーカー遺伝子の配列を図２８−３４に示した。図３５は本実施例に開示した選択的マーカー遺伝子を説明する表である。
【０１３９】  トランスプラストミック領域の視覚による直接同定には、高レベルのFLARE-Sがプラスチド内で発現することが必要である。アラビドプシスにおける高レベルのGFP発現は毒性であり、植物の調節機能が妨害される。野生型（不溶性）GFPの毒性はGFPの核および細胞質内への蓄積に連動して生じるが、この毒性は小胞体中へこれらを排除することによって、除くことができる(Haseloff et al. 1997)。GFPの凝集体はまた、大腸菌細胞に対して細胞毒性である(Crameri et al., 1996)。蛍光強度を上げ、細胞毒性を避けるため、可溶性のコドン改変GFPが得られている(Davis and Vierstra, 1998)。我々は明らかな細胞毒性のないFLARE-Sの変異体、融合タンパク質を創り出すため、このDavisとVierstraの報告する可溶性改変GFPの遺伝子（Davis and Vierstra, 1998)を用いた。プラスチド形質転換頻度は、いくらか影響があったとすれば、下降するよりむしろ上昇した。タバコにおいては、通常遺伝子銃で撃たれた試料の葉１枚につき１のトランスプラストミッククローンを得る（Svab and Maliga, 1993)が、FLARE-S遺伝子では平均すると、試料１枚あたり２個のクローンを回収することができた。高蛍光組織からの植物体の再生は、容易に得ることができ、再生された植物体は野生型と識別不能なフェノタイプを有している。
【０１４０】  コメにおけるプラスチド形質転換には、非緑色プラスチド内において選択マーカーを発現させることが必要である。ｒRNAオペロンは２つのプロモーターを有している。このうち一つは真正細菌型（PEP）の、もう一つはファージ型（NEP）のプラスチドＲＮＡポリメラーゼに対するものである。FLARE-S発現を支配するプロモーターは、真正細菌型プラスチドRNAポリメラーゼのみにより認識される。以前、真正細菌型プロモーターは葉緑体内でのみ活性があると考えられていた（Maliga, 1998)。FLARE-Sが根および花弁内へ蓄積したということから、PEPが非緑色プラスチド内でも活性であることが示される。
【０１４１】  高等植物細胞は多数（300から50000）のプラスチドゲノムのコピーを含有しており（Bendich, 1987）、これらのうちのほんの少しが最初に形質転換されることから、プラスチド形質転換操作により、キメラ植物が生じることは避けられない。FLARE-Sのプラスチド内への高レベルの発現により、トランスプラストミック領域を視覚により同定することが、該部位が例えキメラ組織に存在していたとしても、可能となる。GFPおよびAADは１個のプラスチド形質転換ベクター内の２つの別個の遺伝子から発現させることができた。しかしながら、２機能性タンパク質をコード化するマーカー遺伝子による形質転換によって、２つの遺伝子の分離が防がれ、操作が単純になる。蛍光選択マーカーは、プラスチド形質転換がルーチンで行われている種であるタバコにおいて、遺伝子的に安定なプラスチド形質転換を得るために要される仕事量を顕著に減らすものとなる。穀物改良へプラスチド形質転換を応用することのネックとなっているのは、技術の欠如である。タバコにおいて、形質転換されたプラスチドを有するキメラクローンは、シュートの再生によって容易に同定することができる(Svab et al., 1990)。アラビドプシスにおいて、形質転換されたプラスチドを含むクローンは緑色化によって同定される(Sikdar et al., 1998)。我々は本願において、タバコやアラビドプシスで利用されているごとき視覚による同定の可能な組織培養フェノタイプを示さないコメの胚形成細胞において、FLARE-Sがトランスプラストームの選択に適したマーカーであることを示した。本明細書に示したデータ−は外来DNAをコメプラスチドゲノム内へ安定に組み込んだ最初の例である。これらのコメ植物はヘテロプラストミックである。均一に形質転換されたコメ植物を、ストレプトマイシン培地上での選択および胚形成細胞のFLARE-S発現を指標としたスクリーニングにより得ることができる。即ち、FLARE-Sマーカー系により、プラスチド形質転換を禾穀類へ応用することが可能となる。
【０１４２】  新規キメラプロモーターの有用性
σ７０−型プラスチドリボソームRNAオペロンプロモーターであるPrrnは、既知のもののなかで最も強いプラスチドプロモーターであり、全ての組織タイプにおいて発現する。このプロモーターのプラスチド内における最終的な生成物はRNAでありタンパク質ではない。従って、Prrnからのタンパク質の蓄積を促進するための一連のキメラプロモーターを、ネオマイシントランスフェラーゼ（NPTII)酵素の発現を参考タンパク質として用いて、構築した。
【０１４３】  １）発現カセットは各固有の組織特異的発現プロファイルを有している。本明細書に開示する発現カセットの一部は比較的高いレベルのタンパク質発現を、葉、根及び種子を含むすべての組織において促進する。他のカセットは異なる発現プロファイルを有している：例えば葉においては中程度のタンパク質蓄積を促進し、根においては比較的高レベルのタンパク質蓄積を促進する。あるタンパク質が全可溶性タンパク質の10％から50％のレベルで蓄積することを、高レベルのタンパク質発現とする。低レベルのタンパク質発現は、全可溶性細胞タンパク質の0.1％以下の範囲である場合とする。
【０１４４】  ２）選択マーカー遺伝子の効率は、遺伝子産物が形質転換の初期段階において蓄積する速度によって決まる。最初は細胞あたりほんのわずかのコピーしか存在しないが、このほんのわずかのコピーからの高レベルの発現が、早くからの毒性物質に対する耐性を賦与し、形質転換されたラインの効率的な回収を促進する。発現カセットは、抗生物質ストレプトマイシン、スペクチノマイシンおよびハイグロマイシン、および除草剤フォスフィノトリシンおよびグリフォスフェートに対する耐性を有する遺伝子の発現を制御するのに有用である。この態様において、選択的マーカー遺伝子の発現を妨げない限り、N−末端へのアミノ酸を付加することは許容される。NPT11はそういう酵素である。NPT11のような場合に、Ｎ−末端融合およびそれによるmRNA「下流ボックス」配列は、タンパク質レベルをさらに少なくとも２から4倍に増加させる。NheI部位に依存し、ソース遺伝子のコーディング領域への１のアミノ酸付加（Ｎ−末端）を含む−ＤＢ構築物が、必須ではないが便利である。タンパク質の不活性化により翻訳融合が可能でない場合には、本願に概略したように継ぎ目の無いインフレーム構築物をPCR法により作成してもよい。
【０１４５】  ３）キメラプロモーターを応用することが非常に有用である第２の重要な分野は、製薬、工業または農業目的のためのタンパク質発現である。例としては、これらに限定されないが、ワクチン、ヒトヘモグロビンのごときヘルスケア製品、工業用または家庭用酵素の製造などが挙げられる。
【０１４６】  参考文献
Allen, G.C., Hall, G.J., Michalowski, S., Newman, W., Spiker, S., Weissinger, A.K. and Thompson, W.F. (1996) High-level transgene expression in plant cells: effects of a strong scaffold attachment region from tobacco. Plant Cell, 8, 899-913.
Allison LA, Simon LD, Maliga P (1996) Deletion of rpoB reveals a second distinct transcription system in plastids of higher plants. EMBO J 15: 2802-2809
Arntzen, C.J. (1997) High-tech herbal medicine: plant-based vaccines [news]. Nature Biotechnology, 15, 221-222.
Baulcombe, D. C. Chapman, S. and Cruz, S. S. 1995. Jellyfish green fluorescent protein as a reporter for virus infections. Plant J. 7: 1045-1053.
Beck, E., Ludwig, G., Auerswald, E.A., Reiss, B. and Schaller, H. (1982) Nucleotide sequence and exact localization of the neomycin phosphotransferase gene from transposon Tn5. Gene, 19, 327-336.
Bendich, A. J. 1987. Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome? Bio-essays  6: 279-282.
Bonham-Smith, P.C. and Bourque, D.P. (1989) Translation of chloroplast-encoded mRNA: potential initiation and termination signals. Nucleic Acids Res. 17, 2057-2080.
Cao, J., Duan, X., McElroy, D., and Wu, R. (1992) Regeneration of herbicide resistant transgenic rice plants following microprojectile-mediated transformation of suspension culture cells. Plant Cell Report 11:586-591.
Carrer, H. and Maliga, P. (1995) Targeted insertion of foreign genes into the tobacco plastid genome without physical linkage to the selectable marker gene. Biotechnology, 13, 791-794.
Carrer, H., Hockenberry, T.N., Svab, Z. and Maliga, P. (1993) Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco. Mol. Gen. Genet., 241, 49-56.
Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W. and Prasher, D. C. 1994. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263: 802-805.
Chaudhuri, S. and Maliga, P. (1996) Sequences directing C to U editing of the plastid psbL mRNA are located within a 22 nucleotide segment spanning the editing site. EMBO J., 15, 5958-5964.
Chinault, A.C., Blakesley, V.A., Roessler, E., Willis, D.G., Smith, C.A., Cook, R.G., and Fenwick, R.G. 1986. Characterization of transferable plasmids for Shigella flexneri 2a that confer resistance trimethoprim, Streptomycin and sulfonamides. Plasmid 15: 119-131.
Chiu, W-L., Niwa, Y., Zeng, W., Hirano, T., Kobayashi, H. and Sheen, J. 1996. Engineered gfp as a vital reporter in plants. Curr. Biol. 6: 325-330.
Conrad, U. and Fiedler, U. (1998) Compartment-specific accumulation of recombinant immunoglobulins in plant cells: an essential tool for antibody production and immunomodulation of physiological functions and pathogen activity. Plant Mol. Biol., 38, 101-109.
Corriveau, J.L., and Coleman, A.W. (1988) Rapid screening method to detect potential biparental inheritance of plastid DNA and the results for over 200 angiosperm species. Amer. J. Bot. 75:1443-1458.
Crameri, A., Whitehorn, E. A., Tate, E. and Stemmer, W. P. C. 1996. Improved green fluorescent protein by molecular evolution by DNA shuffling. Nature Biotech. 14: 315-319.
Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A. and Tsien, R. Y. 1995. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci. 20: 448-455.
Dams, E., Hendriks, L., Van de Peer, Y., Neefs, J.M., Smits, G., Vandenbempt, I. and De Wachter, R. (1988) Compilation of small ribosomal subunit RNA sequences. Nucleic Acids Res., 16 Suppl, r87-173.
Daniell, H., Datta, R., Varma, S., Gray, S., and Lee, S.B. (1998) Containement of herbicide resistance through genetic engineering of the chloroplast genome. Nat. Biotech. 16:345-348.
Davis, S.J., and Vierstra, R.D. 1998. Soluble, highly fluorescent variants of green fluorescent protein (GFP) for use in higher plants. Plant Mol. Biol. 36: 521-528.
De Block, M., Botterman, J., Vandewiele, M., Dockx, J., Thoen, C., Gossele, V., Rao, Movva, N., Thompson, C., Van Montagu, M., and Leemans, J. (1987). Engineering herbicide resistance in plants by expression of a detoxifying enzyme. EMBO J. 6:2513-2518.
De Block, M., De Brouwer, D., Tenning, P. (1989). Transformation of Brassica napus and Brassica oleracea using Agrobacterium tumefaciens and the expression of the bar and neo genes in the transgenic plants. Plant Physiol . 91:694-701.
Deana, A., Ehrlich, R. and Reiss, C. (1998) Silent mutations in the Escherichia coli ompA leader peptide region strongly affect transcription and translation in vivo. Nucleic Acids Res., 26, 4778-4782.
Ellis, R.J. (1979) The most abundant protein in the world. Trends Biochem. Sci., 4, 241-244.
Epel, B.L., Padgett, H.S., Heinlein, M., and Beachy, R. 1996. Plant virus movement protein dynamics probed with GFP-protein fusion. Gene 173: 75-79.
Etchegaray, J.P. and Inouye, M. (1999) Translational enhancement by an element downstream of the initiation codon in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 274, 10079-10085.
Faxin, m., Plumbridge, J. and Isaksson, L.A. (1991) Codon choice and potential complementarity between mRNA downstream of the initiation codon and bases 1471-1480 in 16S ribosomal RNA affects expression of glnS. Nucleic Acids Res., 19, 5247-5251.
Fromm, H., Edelman, M., Aviv, D. and Galun, E. 1987. The molecular basis ofrRNA-dependent spectinomycin resistance in Nicotiana chloroplasts. EMBO J. 11: 3233-3237.
Gallo-Meagher, M., and Irvine, J.E. (1996) Herbicide resistant transgenic sugarcane plants containing the bar gene. Crop Sci. 36:1367-1374.
Golds, T., Maliga, P., and Koop, H.U. 1993. Stable plastid transformation in PEG-treated protoplasts of Nicotiana tabaccum. Biotechnology 11:95-97.
Gray, A.J., and Raybould, A.F. (1988) Reducing transgene escape routes. Nature 392:653-654.
Hajdukiewicz, P., Allison, L.A., Maliga, P. (1997) The two plastid RNA polymerases encoded by the nuclear and plastid compartments transcribe distinct groups of genes in tobacco plastids. EMBO J. 16, 4041-4048.
Haseloff, J., Siemering, K. R., Prasher, D. C., and Hodge, S. 1997. Removal of a cryptic intron and subcellular localization of green fluorescent protein are required to mark transgenic Arabidopsis plants brightly. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 94: 2122-2127.
Hecker, K.H. and Roux, K.H. (1996) High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. Biotechniques, 20, 478-485.
Heim, R., Prasher, D. C. and Tsien, R. Y. 1994. Wavelength mutations and posttranslational autooxidation of green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 12501-12504.
Hibberd, J.M., Linley, P.J., Khan, M.S., and Gray, J.C. 1998. Transient expression of green fluorescent protein in various plastid types following micro-projectile bombardment. Plant J. 16: 627-632.
Hiratsuka, J., Shimada, H., Whittier, R., Ishibashi, T., Sakamoto, M., Mori, M., Kondo, C., Honji, Y., Sun, C-R., Meng, B-Y., Li, U-Q., Kanno, A., Nishizawa, Y., Hirai, A., Shinozaki, K., and Sugiura, M. 1989. The complete sequence of the rice (Oryza sativa) chloroplast genome: Intermole cular recombination between distict tRNA genes accounts for a major plastid DNA inversion during the evolution of the cereals. Mol. Gen. Genet. 217: 185-194.
Hirose, T. and Sugiura, M. (1996) Cis-acting elements and trans-acting factors for accurate translation of chloroplast psbA mRNAs: development of an in vitro translation system from tobacco chloroplasts. EMBO J., 15, 1687-1695.
Houdt, H.V., Ingelbrecht, I., Montagu, M.V. and Depicker, A. (1997) Post-transcriptional silencing of a neomycin phosphotransferase II transgene correlates with the accumulation of unproductive RNAs and with increased cytosine methylation of 3' flanking positions. Plant J., 12, 379-392. Ito, K., Kawakami, K. and Nakamura, Y. (1993) Multiple control of Escherichia coli lysyl-tRNA synthetase expression involves a transcriptional repressor and a translational enhancer element. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 302-306.
Kane, J.F. (1995) Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli. Current Opinion In Biotechnology, 6, 494-500.
Khan, M.S. and Maliga, P. (1999) Fluorescent antibiotic resistance marker to track plastid transformation in higher plants. Nature Biotechnology, in press.
Kling, J. (1996) Could transgenic supercrops one day breed superweeds? Science 274:180-181.
Kvhler, R.H., Cao, J., Zipfel, W.R., Webb, W.W., and Hanson, M.R. 1997. Exchange of protein molecules through connections between higher plant plastids. Science 276: 2039-2042.
Kolodziej, P. A., and Young, R. A. 1991. Epitope tagging and protein surveillance. Methods Enzymol. 194: 508-519.
Koop, H.U., Steinm|ller, K., Wagner, H., Rvssler, C., Eibl, C., and Sacher, L. 1996. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via PEG-mediated protoplast transformation. Planta 199: 193-101.
Kusnadi, A., Nikolov, Z. and Howard, J. (1997) Production of recombinant proteins in transgenic plants: practical considerations. Biotechnology and Bioengineering, 56, 473-484.
Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature  227: 680-685.
Lefebvre, B., Formstecher, P. and Lefebvre, P. (1995) Improvement of the gene splicing overlap method (SOE) method. BioTechniques 19: 186-187
Maier, R.M., Neckermann, K., Igloi, G.L. and Kvssel, H. (1995) Complete sequence of the maize chloroplast genome: gene content, hotspots of dive rgence and fine tuning of genetic information by transcript editing. J. Mol. Biol., 251, 614-628.
Makrides, S.C. (1996) Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiological Reviews, 60, 512-538.
Maliga P (1995). Biolistic transformation of tobacco cells with nuclear drug resistance genes. In Maliga P, Klessig D, Cashmore A, Gruissem W, Varner J (eds), Methods in Plant Molecular Biology-A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 37-52.
Maliga, P. (1993) Towards plastid transformation in flowering plants. Trends in Biotechnology 11:101-107.
Maliga, P. 1998. Two plastid RNA polymerases of higher plants: an evolving story. Trends Plant Sci. 3: 4-6.
Mayfield, S.P., Cohen, A., Danon, A. and Yohn, C.B. (1994) Translation of the psbA mRNA of Chlamydomonas reinhardtii requires a structured RNA element contained within the 5' untranslated region. J. Cell Biol., 127, 1537-1545.
McBride, K.E., Scaaf, D.J., Daley, M. and Stalker, D. (1994) Controlled expression of plastid transgenes in plants based on a nuclear-encoded and plastid-targeted T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305.
McBride, K.E., Svab, Z., Schaaf, D.J., Hogan, P.S., Stalker, D.M. and Maliga, P. (1995) Amplification of a chimeric Bacillus gene in chloroplasts leads to an extraordinary level of an insecticidal protein in tobacco. Biotechnology (N Y), 13, 362-365.
Medgyesy, P., Pay, A., and Marton, L. (1986) Transmission of paternal chloroplasts in Nicotiana. Mol. Gen. Genet. 204:195-198.
Mettler, I.J. 1987. A simple and rapid method for minipreparation of DNA from tissue-cultured plant cells. Plant Mol. Biol. Rep. 5: 346-349.
Mikkelsen, T.R., Andersen, B., and Jorgensen, R.B. (1996). The risk of crop transgene spread. Nature 380:31.
Misteli, T., and Spector, D.L. 1997. Applications of the green fluorescent protein in cell biology and biotechnology. Nature Biotech. 15: 961-964.
Mitta, M., Fang, L. and Inouye, M. (1997) Deletion analysis of cspA of Escherichia coli: requirement of the AT-rich UP element for cspA transcription and the downstream box in the coding region for its cold shock induction. Mol Microbiol, 26, 321-335.
Moll, B., Posby, L., and Maliga, P. 1990. Streptomycin and lincomycin resistance are selective plastid markers in cultured Nicotiana cells. Mol. Gen. Genet. 221: 245-250.
Muller, A. J., and Grafe, R. 1978. Isolation and characterization of cell lines of Nicotiana tobacum lacking nitrate reductase. Mol. Gen. Genet. 161: 67-76.
Murashige, T. and Skoog, F. (1962) A revised medium for the growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum, 15, 473-497. Nickelsen, J., Fleischmann, M., Boudreau, E., Rahire, M. and Rochaix, J.D. (1999) Identification of cis-acting RNA leader elements required for chloroplast psbD gene expression in Chlamydomonas. The Plant Cell, 11, 957-970.
Olins, P.O., Devine, C.S., Rangwala, S.H., Kavka, K.S. (1988) The T7 phage gene 10 leader RNA, a ribosome-binding site that dramatically enhances the expression of foreign genes in Escherichia coli. Gene 73: 227-235. O'Neill, C., Horvath, G.V., Horvath, E., Dix, P.J., and Medgyesy, P. 1993. Chloroplast transformation in plants: polyethylene glycol (PEG) treatment of protoplasts is an alternative to biolistic delivery system. Plant J. 3: 729-738.
Orozco,E.M., Chen,L.J. and Eilers,R.J. (1990) The divergently transcribed rbcL and atpB genes of tobacco plastid DNA are separated by nineteen base pairs. Curr. Genet., 17, 65-71.
Pang, S-Z., DeBoer, D.L., Wan, Y., Ye, G., Layton, J.G., Neher, M.K., Armstrong, C.L., Fry, J.E., Hinchee, M.A.W., and Fromm, M.E. 1996. An improved green fluorescent protein gene as avital marker in plants. Plant Physiol. 112: 893-900.
Prasher, D. C. 1995. Using GFP to see the light. Trends Genet. 11: 320-323.
Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Predergast, F. G. and Cormier, M. J. 1992. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene 111: 229-233.
Reichel, C., Mathur, J., Eckes, P., Langenkemper, K., Koncz, C., Schell, J., Reiss, B., and Maas, C. 1996. Enhanced green fluorescence by the expression of an Aequorea victoria green fluorescent protein mutant in mono- and dicotyledonous plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5888-5893.
Rochaix, J.D. (1996) Post-transcriptional regulation of chloroplast gene expression in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Mol. Biol., 32, 327-341.Rouwendal., G.J.A., Mendes, O., Wolbert, E.J.H., and de Boer, A.D., 1997. Enhanced expression in tobacco of the gene encoding green fluorescent protein by modification of its codon usage. Plant Mol. Biol. 33: 989-999
Saghai-Maroof, M.A., Soliman, K.M., Jorgensen, R.A., and Allard, R.W. (1984) Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 8014-8018.
Sakamoto, W., Kindle, K.L. and Stern, D.B. (1993) In vivo analysis of Chlamydomonas chloroplast petD gene expression using stable transformation of beta-glucuronidase translational fusions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 497-501.
Sawasaki, T., Seki, M., Anzai, H., Irifune, K., and Morikawa, H. (1994). Stable transformation of Arabidopsis with the bar gene using particle bombardment. Transgenic Res. 3:279-286.
Serino, G., and Maliga, P. (1997) A negative selection scheme based on the expression of cytosine deaminase in plastids. Plant J . 12:697-701.
Sheen, J., Hwang, S., Niwa, Y., Kobayashi, H., and Galbraith, D.W. 1995. Green fluorescent protein as a new vital marker in plant cells. Plant J. 8: 777-784.
Shimada, H., and Sugiura, M. (1991) Fine structural features of the chloroplast genome: comparison of the sequenced chloroplast genomes. Nucleic Acids Res. 19:983-995.
Shinozaki, K. and Sugiura, M. (1982) The nucleotide sequence of the tobacco chloroplast gene for the large subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase. Gene 20: 91-102.
Shinozaki, K., Deno, H., Wakasugi, T. and Sugiura, M. (1986a) Tobacco chloroplast gene coding for subunit I of proton-translocating ATPase: comparison with the wheat subunit I and E. coli subunit b. Curr. Genet., 10, 421-423.
Shinozaki, K., Ohme, M., Tanaka, M., Wakasugi, T., Hayashida, N., Matsabayashi, T., Zaita, N., Chungwongse, J., Obokata, J., Yamaguchi-Shinozaki, K., Deno, H., Kamogashira, T., Yamada, K., Kasuda, J., Takaiwa, F., Kato, A., Todoh, N., Shimada, H. and Sugiura, M. (1986b) The complete sequence of the tobacco chloroplast genome: its gene organization and expression, EMBO J., 5, 2043-2049.
Sikdar, S.R., Serino, G., Chaudhuri, S., and Maliga, P. 1998. Plastid transformation in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Rep. 18: 20-24.
Spencer, T.M., Gordon-Kamm, W.J., Daines, R.J., Start, W.G., and Lemaux, P.G. (1990). Bialaphos selection of stable transformants from maize cell culture. Theor. Appl. Genet. 79:625-631.
Sprengart, M.L., Fuchs, E. and Porter, A.G. (1996) The downstream box: an efficient and independent translation initiation signal in Escherichia coli. EMBO J., 15, 665-674.
Sriraman, P., Silhavy, D. and Maliga, P. (1998a) The phage-type PclpP-53 plastid promoter comprises sequences downstream of the transcription initiation site. Nucleic Acids Res., 26, 4874-4879.
Sriraman, P., Silhavy, D. and Maliga, P. (1998b) Transcription from heterologous rRNA operon promoters in chloroplasts reveals requirement for specific activating factors. Plant Physiol., 117, 1495-1499.
Sriraman, P., Silhavy, D., Maliga, P. (1998b) Transcription from heterologous ribosomal RNA operon promoters in chloroplasts reveals requirement for specific activating factors. Plant Physiol. 117: 1495-1499.
Staub, J., Maliga, P. (1993) Accumulation of D1 polypeptide in tobacco plastids is regulated via the untranslated region of the psbA mRNA. EMBO J. 12:601-606
Staub, J.M. and Maliga, P. (1994) Translation of psbA mRNA is regulated by light via the 5'-untranslated region in tobacco plastids. Plant J., 6, 547-553.
Stemmer, W.P., Crameri, A., Ha, K.D., Brennan, T.M. and Heyneker, H.L. (1995) Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene, 164, 49-53.
Stern, D.B., Higgs, D.C. And Yang, J. (1997) Transcription and translation in chloroplasts. Trends Plant Sci. 2, 308-315.
Stiekema WJ, Heidekamp F, Dirkse WG, van Beckum J, deHaan P, ten Bosch C, Louwerse JD (1988) Molecular cloning and analysis of four potato tuber mRNAs. Plant Mol Biol 11: 255-269
Strauch, E., Wohlleben, , W., and P|hler, A. (1988) Cloning of phosphinothricin acetyltransferase gene from Streptomyces viridochromogenes T|4494 and its expression in Streptomyces lividans and Escherichia coli.. Gene 63:65-74.
Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J. and Dubendorff, J.W. (1990) Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185: 60-89.
Sugita, M. and Sugiura, M. (1984) Nucleotide sequence and transcription of the gene for the 32,000 dalton thylakoid membrane protein from Nicotiana tabacum. Mol. Gen. Genet. 195: 308-313.
Svab, Z., Hajdukiewicz, P., and Maliga, P. 1990. Stable transformation of plastids in higher plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530. Svab, Z., and Maliga, P. (1993). High-frequency plastid transformation in tobacco by selection for a chimeric aadA gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917.
Tachibana. K., Watanabe. T., Sekizawa, T., and Takematsu, T. (1986) Action mechanism of bialaphos II Accumulation of ammonia in plants treated with bialaphos. J. Pest. Sci. 11:33-37.
Tanaka, M., Obokata, J., Chunwongse, J., Shinozaki, K., Sugiura, M. (1987) Rapid splicing and stepwise processing of a transcript from the psbB operon in tobacco chloroplasts: Determination of the intron sites in petB and petD. Mol. Gen. Genet. 209: 427-431.
Thompson, C.J., Movva, N.R,, Tizard, R., Crameri, R., Davies, J.E., Lauwereys, M., Botterman, J. (1987) Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus. EMBO J. 6:2519-2523.
Timmons, A.M., Charters, Y.M., Crawford, J.W., Burn, D., Scott, S.E., Subbels, S.J., Wilson, N.J., Robertson, A., O'Brian, E.T., Squire, G.R., and Wilkinson, M.J. (1996) Risks from transgenic crops. Nature 380:487.
Tompson, J.A., Abdullah, R., and Cocking, E.C. 1986. Protoplast cultureof rice using media solidified with agarose. Plant Science 47: 123-133.
Uchida, K (1992) Recombination and amplification of multiple portions of genomic DNA by a modified polymerase chain reaction. Anal. Biochem. 202: 159-161.
Varshavsky, A. (1996) The N-end rule: Functions, mysteries, uses. Proc. Natl. Acad. Sci USA 93, 121423-12149.
Vera, A., and Sugiura M (1995). Chloroplast rRNA transcription from structurally different tandem promoters: an additional novel-type promoter. Curr. Genet. 27, 280-284.
Voorma, H.O. (1996) Control of translation in prokaryotes. In: Translational Control, Hershey, J.W.B., Methews, M.B. and Sonenberg, N., eds. pp. 759-777, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY
Wehrmann, A., Vliet, V.A., Opsomer, C., Bottermanm J., and Schulz, A. (1996) The bar and pat gene products make them equally applicable for plant engineers. Nat. Biotechnol. 14:1274-1278.
Wohlleben, W., Arnold, W., Broer, I., Hillemann, D., Strauch, E. and P|hler, A. (1988) Nucleotide sequence of the phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomyces T|949 and its expression in Nicotiana tabacum. Gene 70:25-37.
Wu, C.J. and Janssen, G.R. (1996) Translation of vph mRNA in Streptomyces lividans and Escherichia coli after removal of the 5' untranslated leader. Mol Microbiol, 22, 339-355.
Zerges, W., Girard-Bascou, J. and Rochaix, J.D. (1997) Translation of the chloroplast psbC mRNA is controlled by interactions between its 5' leader and the nuclear loci TBC1 and TBC3 in Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Biol., 17, 3440-3448.
Zhang, W., and Wu, R. 1988. Efficient regeneration of transgenic plants from rice protoplasts and correctly regulated expression of the foreign gene in the plants. Theor. Appl. Gene. 76: 835-840.
Zhou, J., Liu, W.J., Peng, S.W., Sun, X.Y. and Frazer, I. (1999) Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability. Journal Of Virology, 73, 4972-4982.
Zoubenko, O. V., Allison, L. A., Svab, Z. and Maliga, P. 1994. Efficient targeting of foreign genes into the tobacco plastid genome. Nuceic Acids Res. 22: 3819-3824.
【０１４７】  上記において本発明の特定の好ましい具体例を記載し、具体的に例示しているが、本発明はそのような具体例に限定されるものではない。上記した特許請求の範囲に記載の発明の範囲および精神を逸脱することなく、種々の修飾を本発明に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  プラスチドｍＲＮＡおよび小（１６Ｓ）リボゾームＲＮＡは、ＡＵＧの下流に、プラスチドにおける翻訳開始期のｍＲＮＡと１６Ｓ  ｒＲＮＡとの間の相互作用に関係する相補配列を含有する。提示したモデルはイー・コリにおけるデータに基く（Sprengartら、１９９６年）；１６ｓ  ｒＲＮＡの配列については、リファレンスを参照。ＳＤ，シャイン−ダルガノ配列；ＡＳＤ，抗ＳＤ領域；ＤＢ，下流ボックス；ＡＤＢ，抗ＤＢ領域。ワトソン−クリック（直線）およびＧ−Ｕ（閉じた円）の対には印をつけている。
【図１Ｂ】  プラスチド（ｐｔ；本願）中およびイー・コリ（Ｅｃ；Sprengartら、１９９６年）中の１６Ｓ  ｒＲＮＡの抗−下流−ボックス領域（ＡＤＢ配列、下線部）。イー・コリＡＤＢボックスは、タバコ１６Ｓ  ｒＲＮＡの１４１６〜１４３０ヌクレオチド（Damsら、１９８８年；Shinozakiらの１０４１７３〜１０４１８７ヌクレオチド間の配列）に対応する１６Ｓ  ｒＲＮＡの１４６９〜１４８３ヌクレオチド間の配列を含有する（Sprengartら、１９９６年）。
【図２Ａ】  プラスチドＡＤＢと、ａｔｐＢ、ｃｌｐＰ、ｒｂｃＬ、ｐｓｂＢおよびｐｓｂＡ  ｍＲＮＡ（下線）との間の塩基対形成。多様な代替ＤＢ−ＡＤＢ相互作用を示す。変化してｍＲＮＡ−ｒＲＮＡ相互作用を減少また変化させたヌクレオチドを小文字で示す。丸括弧内は、２６ｎｔ  ＡＤＢ領域と形成される可能性のあるヌクレオチド対の数である。太字は、変異によって影響を受ける対形成の数である。
【図２Ｂ】  Ｐｒｒｎ  Ｔ７  ファージ遺伝子  １０リーダー誘導体とイー・コリおよびプラスチドのＡＤＢ配列との相補性。変化してｍＲＮＡ−ｒＲＮＡ相互作用を減少また変化させるヌクレオチドを小文字で示す。丸括弧内は、２６ｎｔ  ＡＤＢ領域と形成される可能性のあるヌクレオチド対の数である。
【図３Ａ】  ａｔｐＢおよびｃｌｐＰ翻訳調節領域を有するキメラＰｒｒｎプラスチドプロモーター断片のＤＮＡ配列。丸括弧内は、プロモーター断片源であるプラスミドの名称である。Ｐｒｒｎプロモーター配列には、下線を付してある；タバコプラスチドにおいて転写が開始するヌクレオチドには、黒丸の印を付してある；翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は太字である。ＳＤには波線を付してある；５’および３’制限部位ならびに点突然変異は小文字である。
【図３Ｂ】  ｒｂｃＬおよびｐｓｂＢ翻訳調節領域を有するキメラＰｒｒｎプラスチドプロモーター断片のＤＮＡ配列。詳細は図３Ａの記載を参照。
【図３Ｃ】  ｐｓｂＡ翻訳調節領域を有するキメラＰｒｒｎプラスチドプロモーター断片のＤＮＡ配列。詳細は図３Ａの記載を参照。
【図３Ｄ】  Ｔ７ファージ遺伝子１０（ＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０＋ＤＢ／Ｅｃ）プラスチド（ＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０＋ＤＢ／ｐｔ）および合成ＤＢ（ＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０−ＤＢ）を有するキメラＰｒｒｎプラスチドプロモーター断片のＤＮＡ配列。詳細は図３Ａの記載を参照。
【図４Ａ】  キメラｎｅｏ遺伝子を有するプラスミド形質転換ベクターｐＰＲＶ１１１Ａ。プラスミド連続番号、例えばｐＨＫ３４、はｐＰＲＶ１１１Ａプラスミド形質転換ベクター誘導体を表わす；近接する、丸括弧内のプラスミド番号（例、ｐＨＫ１４）は、ｐＵＣ１１８またはｐＢＳＩＩＫＳ＋ベクターにおけるキメラｎｅｏ遺伝子の源を示す。矢印は、選択マーカー遺伝子（ａａｄＡ）およびキメラｎｅｏ遺伝子の方向を示す。太い下線はプラスチド標的配列である。キメラｎｅｏ遺伝子の構成部分は；Ｐｒｒｎ、ｒＲＮＡオペロンプロモーター断片；Ｌ，リーダー配列；ＤＢ，下流ボックスである；合成ＤＢとして働くＮｈｅＩ部位に太線で印を付してある；ｎｅｏ、ネオマイシン  ホスホトランスフェラーゼコード領域；ＴｒＢｃＬ，ｒｂｃＬ  ３’−非翻訳領域。１６ＳｒＤＮＡ、ｔｒｎＶ、ｒｐｓ１２／７はプラスチド遺伝子である（Shinozakiら、１９８６年）。制限部位は、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｈＩ、ＳｔｕＩ、ＳａｃＩ、ＮｈｅＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩについて印を付してある。角括弧内の制限酵素部位は、構築中削除された。プラスミドｐＨＫ３６におけるｎｅｏ翻訳開始はＮｃｏＩ部位に含まれる（印は付さず）。プラスミドｐＰＲＶ１１１Ａ−ＤＢ誘導体（ｐＨＫ３５、ｐＨＫ３７、ｐＨＫ４０、ｐＨＫ４２、ｐＨＫ４３）におけるＮｈｅＩおよびＮｃｏＩの存在および相対オーダーにはアスタリスクを付している。プロ−モーター配列は、図３Ｂ、ＣおよびＤに示す。
【図４Ｂ】  キメラｎｅｏ遺伝子を有するプラスチド形質転換ベクターｐＰＲＶ１１１Ｂ。図４Ａの記載を参照。プロモーター配列は図３Ａに示す。
【図５】  重複伸張ＰＣＲによるＰｒｒｎプロモーター−プラスチド  リーダー断片の構築。
【図６】  プラスミドｐＨＫ１８中のＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０＋ＤＢ／Ｅｃプロモーター（ＳａｃＩ−ＮｈｅＩ断片）のＰＣＲによる構築。
【図７】  プラスミドｐＨＫ１９中のＰｒｒｎＬＴ７ｇ１０＋ＤＢ／ｐｔプロモーター（ＳａｃＩ−ＮｈｅＩ断片）のＰＣＲによる構築。
【図８】  Ｐｒｒｎ（Ｌ）ｒｂｃＬ（Ｓ）：：ｎｅｏ：：ＴｒｂｃＬ遺伝子を有するプラスミドｐＨＫ２およびｐＨＫ３の制限地図。制限酵素開裂部位は、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｃＩ、ＸｂａＩについて印を付している。
【図９】  プラスミドｐＨＫ３中のＰｒｒｎ（Ｌ）ｒｂｃＬ（Ｓ）：：ｎｅｏ：：ＴｒｂｃＬ遺伝子のＤＮＡ配列。プラスミドｐＨＫ２は、ＳａｃＩ部位の上流にＥｃｏＲＩ部位があることを除いて同一のｎｅｏ遺伝子を担持する。
【図１０】  タンパク質ゲルブロット分析により検出された、タバコ葉中のＮＰＴＩＩの蓄積。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに付した全可溶性葉タンパク質（μｇ）の量をレーンの上に示す。植物形質転換に用いたプラスミドを示す；付した、レーン当たりのたんぱく質のμｇを下に記す。ＮＰＴＩＩ標準およびＮｔ−ｐＴＮＨ３２抽出物を陽性対照として流した；野生型非形質転換植物（ｗｔ）由来の抽出物を陰性対照として用いた。
【図１１】  トランスプラストミック（transplastomic）葉におけるｎｅｏ  ｍＲＮＡのレベル。ブロットは、ｎｅｏ（上部）およびローディング（loading）対照としての細胞質２５Ｓ  ｒＲＮＡ（下部）について探索した。ベクターｐＰＲＶ１１１Ａ（図４Ａ）中の単シストロンｎｅｏ  ｍＲＮＡの位置、ベクターｐＰＲＶ１１１Ｂ中の単シストロンｎｅｏおよび二シストロンｎｅｏ−ａａｄＡ転写産物ならびにｐＴＮＨ３２形質転換植物中の単シストロンｎｅｏおよび二シストロンｒｂｃＬ−ｎｅｏ転写産物（Carrerら、１９９３年）に、印を付している。レーンは、遺伝子導入植物連続番号で示す。レーン当たり、４μｇの全細胞ＲＮＡを流した。
【図１２】  突然変異誘発ａｔｐＢおよびｒｂｃＬ  ＤＢ領域における、特定のアミノ酸をコードするコドンの画分および１０００コドン当たりのトリプレット頻度。変化したヌクレオチドは小文字で示す。
【図１３Ａ】  タンパク質ゲルブロット分析により検出された、タバコ根中のＮＰＴＩＩの蓄積。レーンは、植物形質転換に用いたプラスミドで示す；レーン当たりに付したタンパク質のμｇを下に記す。ＮＰＴＩＩ標準を陽性対照として流した；野生型非形質転換植物（ｗｔ）由来の抽出物を陰性対照として用いた。
【図１３Ｂ】  タバコ根におけるｎｅｏ  ｍＲＮＡの定常レベル。ｎｅｏプローブは、ベクターｐＰＲＶ１１１Ａで形質転換した植物において単シストロンｍＲＮＡを検出し、ベクターｐＰＲＶ１１１Ｂで形質転換した植物において単シストロンｎｅｏおよび二シストロンｎｅｏ−ａａｄＡ転写物を検出している。レーンは、遺伝子導入植物連続番号で示す。レーン当たり、４μｇの全細胞ＲＮＡを荷した。
【図１４】  タバコ種子におけるＮＰＴＩＩ蓄積を検出するためのタンパク質ゲルブロット分析。レーンは、植物形質転換に用いたプラスミドで示す；レーン当たりに荷したタンパク質のμｇを下に記す。ＮＰＴＩＩ標準を陽性対照として流した；野生型非形質転換植物（ｗｔ）由来の抽出物を陰性対照として用いた。
【図１５Ａ】  プラスミド標的配列（下線）を介する２つの相同組換現象にるプラスチドゲノムへのキメラｎｅｏおよびａａｄＡ遺伝子の組込みを示す図である。プラスミドｐＨＫ３０およびｐＨＫ３２がプラスチド形質転換ベクターｐＰＲＶ１１１Ｂ誘導体（Zoubenkoら、１９９４年）であることの図は上に示す。水平な矢印は遺伝子の方向を示している。キメラｎｅｏ遺伝子の転写については、図４Ｂを参照。１６ＳｒＤＮＡ、ｔｒｎＶ、ｒｐｓ１２／７はプラスチド遺伝子（Shinozakiら、１９８６年）である。制限部位は、ＥｃｏＲＩ（Ｅ）、ＳａｃＩ（Ｓ）、ＮｈｅＩ（Ｎ）、ＸｂａＩ（Ｈ）、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）、ＢａｍＨＩ（Ｂａ）およびＢｇｌＩＩについて印をつけてある。丸括弧内の制限部位は、構築中に削除された。中央に、挿入に関して標的とされた野生型プラスチドＤＮＡ領域（Ｗｔ−ｐｔＤＮＡ）を示す。プラスミドとｐｔＤＮＡとをつなぐ線は、ベクタープラスチド−標的領域の末端での相同組換えの部位を示す。形質転換プラスチドゲノムセグメント（Ｔ−ｐｔＤＮＡ）地図を下部に示す。
【図１５Ｂ】  ＤＮＡゲルブロット分析により、プラスチドゲノムへのｎｅｏおよびａａｄＡ遺伝子の組込みを確認している。上部のブロットは、プラスチド標的配列を用いて探索した（図１５Ａのプローブ１）。トランスプラストミックなラインにおいては４．２ｋｂおよび１．４ｋｂの断片が表れ、野生型においては３．１ｋｂの断片が表れている（図１５Ａ参照）。１．４ｋｂ−シグナルはほとんどのクローンにおいて弱い（week）。下部のブロットは、ｎｅｏ配列について探索したものであり、トランスプラストミックなラインにおいてのみである。
【図１６Ａ】  タバコプラスチドゲノムへのｂａｒ遺伝子の組込みを示す図。プラスミドｐＪＥＫ６におけるプラスチド標的領域の地図は上部に示す。野生型プラスチドゲノム（ｗｔ−ｐｔＤＮＡ）の標的領域を中央に示す。トランスプラストーム（transplastome）（ｔ−ｐｔＤＮＡ）組み込まれた導入遺伝子を下部に示す。地図の位置は；ｂａｒ遺伝子；ａａｄＡ、選択可能なスペクチノマイシン耐性遺伝子；１６ＳｒＤＮＡおよびｒｐｓ１２／７、プラスチド遺伝子（Shinozakiら、１９８６年）について示している。矢印は転写の方向を示している。プローブ（２．５ｋｂ）の地図の位置は太線で示している；ＳｍａＩおよびＢｇｌＩＩ消化によって生じた野生型（２．９ｋｂ）および遺伝子導入（３．３ｋｂ、１．９ｋｂ）断片は、細線によって示されている。
【図１６Ｂ】  ＤＮＡゲルブロットにより、タバコプラスチドゲノムへのｂａｒ遺伝子の組込みを確認している。データは、トランスプラストミックなラインＮｔ−ｐＪＥＫ６−２Ａ〜Ｅ、Ｎｔ−ｐＪＥＫ５−２Ａ〜Ｅ、Ｎｔ−ｐＪＥＫ６−１３ＡおよびＥならびに野生型親系統について示されている。ＳｍａＩ−ＢｇｌＩＩ消化全細胞ＤＮＡを、図１６Ａにおいて太線で印を付した２．５ｋｂ  ＡｐａＩ−ＢａｍＨＩプラスチド標的配列で探索した。
【図１７】  ＰＡＴアッセイにより、タバコプラスチドにおけるｂａｒ発現を確認している。ＰＡＴ活性は、放射標識１４Ｃ−アセチル−ＣｏＡを用いた、ＰＰＴのアセチルーＰＰＴへの変換によって測定した。データは、トランスプラストミック系統Ｎｔ−ｐＪＥＫ６−２Ｄ、Ｎｔ−ｐＪＥＫ６−５ＡおよびＮｔ−ｐＪＥＫ６−１３Ｂ、各形質転換Ｎｔ−ｐＤＭ３０７−１０および野生型（ｗｔ）について示されている。
【図１８Ａ】  トランスプラストミックなタバコ植物は除草剤耐性である。リバティ（Liberty）スプレー（５ｍｌ、２％溶液）１３日後の野生型およびｐＪＥＫ６形質転換植物。
【図１８Ｂ】  種子子孫におけるＰＰＴ耐性の母系遺伝。０、１０および５０ｍｇ／Ｌ  ＰＰＴにおいて出芽したＮｔ−ｐＪＥＬＫ６−５Ａ植物との相反交配由来の種子。ｗｔ×ｐＪＥＫ６−５Ａ，花粉親として用いたトランスプラストミック；ｐＪＥＫ６−５Ａ×ｗｔ，トランスプラストミック系統雌性親。耐性苗はＰＰＴ培地上で緑色であり、感受性苗は脱色している。
【図１９】  プラスミドｐＪＥＫ３およびｐＪＥＫ６における、操作された細菌ｂａｒコード領域ＤＮＡ配列ならびにコードされるアミノ酸配列。ｒｂｃＬ  ５  Ｎ末アミノ酸をコードするヌクレオチドは小文字である。構築中に３’末端に付加されたヌクレオチドもまた小文字である。ＮｃｏＩ、ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩクローニング部位には印を付してある。
【図２０Ａ】  合成ｂａｒ遺伝子ＤＮＡ配列およびコードされるアミノ酸配列である。ＡＧＡ／ＡＧＧコドンによってコードされるアルギニンは太字で表わしている。もとのヌクレオチドは大文字で、変化した塩基は小文字で表わしている。クローニングに用いた制限部位には印を付している。
【図２０Ｂ】  合成ｓ２−ｂａｒ遺伝子ＤＮＡ配列およびコードされるアミノ酸配列である。ＡＧＡ／ＡＧＧコドンによってコードされるアルギニンは太字で表わしている。もとのヌクレオチドは大文字で、変化した塩基は小文字で表わしている。クローニングに用いた制限部位には印を付している。
【図２１】  合成および細菌ｂａｒ遺伝子である。ｂａｒコード領域はＰｒｒｎ／ＴｒｂｃＬカセットにおいて発現する。Ｐｒｒｎプロモーターは、翻訳調節領域に関して異なる。
【図２２Ａ】  イー・コリにおいて、ＰＡＴはｓ−ｂａｒコード領域からではなくｂａｒコード領域から発現する。ＰＡＴ活性は、放射標識１４Ｃ−アセチル−ＣｏＡを用いた、ＰＰＴのアセチルーＰＰＴへの変換によって測定した。。データは、ｂａｒ遺伝子を担持するプラスミドｐＪＥＫ６およびｐＫＯ１２、およびｓ−ｂａｒを担持するｐＫＯ８について示してある。
【図２２Ｂ】  タバコプラスチドにおけるｂａｒおよびｓ−ｂａｒ発現を確認するＰＡＴアッセイである。ＰＡＴ活性は、放射標識１４Ｃ−アセチル−ＣｏＡを用いた、ＰＰＴのアセチルーＰＰＴへの変換によって測定した。データは、各々ｂａｒおよびｓ−ｂａｒを担持するトランスプラストミックなラインＮｔ−ｐＪＥＫ６−１３ＢおよびＮｔ−ｐＫＯ３−２４ａについて示されている。
【図２３Ａ】  プラスチド逆位繰返領域を標的とする、選択マーカーとしてＦＬＡＲＥ１６−Ｓを有するプラスチド形質転換ベクター。ａａｄＡ−ｇｆｐ連結部でのＤＮＡおよびタンパク質配列である。ａａｄＡおよびｇｆｐ由来のヌクレオチドを大文字で、アダプター配列およびＢｓｔＸＩ制限部位を作成するために用いた点突然変異を小文字で表わしている。
【図２３Ｂ】  プラスチド逆位繰返領域を標的とする、選択マーカーとしてＦＬＡＲＥ１６−Ｓを有するプラスチド形質転換ベクターの物理地図。示されているのは；ａａｄＡ１６ｐｔ−ｇｆｐコード領域およびその構成部分（ａａｄＡおよびｇｆｐコード領域）のプロモーター（Ｐ）および３’ＵＴＲ；ｒｒｎ１６およびｒｐｓ１２／７プラスチド遺伝子；制限エンドヌクレアーゼ部位  ＨｉｎｄＩＩＩ（除去されている）、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＮｃｏＩ、ＢｓｔＸＩ、ＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩ  である。プラスミドｐＭＳＫ５６においてａａｄＡ１６ｐｔ−ｇｆｐをＰｒｒｎ：ＬａｔｐＢＤＢプロモーターから発現し、ＦＬＡＲＥ１６−Ｓ１をコードする。プラスミドｐＭＳＫ５７においてａａｄＡ１６ｐｔ−ｇｆｐをＰｒｒｎ：ＬｒｂｃＬＤＢプロモーターから発現し、ＦＬＡＲＥ１６−Ｓ２をコードする。
【図２４】  ヘテロプラストミック（heteroplastomic）組織における、レーザー走査型共焦顕微鏡法によるタバコプラスチドへのＦＬＡＲＥ１６−Ｓの局在の測定（localization）。像を処理し、ＦＲＡＬＥ１６−Ｓ（緑）およびクロロフィル蛍光（赤）を検出し、ならびに併合した視野に検出した。セクションは、ＦＲＡＬＥ１６−Ｓ１（ａ，ｂ）およびＦＲＡＬＥ１６−Ｓ２（３ｃ〜ｆ）を発現する植物に由来するものを示している。なお、野生型、ならびに形質転換された葉中のプラスチド（３ａ、ｃ、ｄ）、花弁の有色体（３ｂ）、糸状突起（３ｅ）および非緑色根プラスチド（ｆ）である。白矢印はトランスプラストミック細胞小器官を示す。棒線は２５μｍを表わす。
【図２５】  葉緑体におけるＦＲＡＬＥ１６−Ｓ蓄積の免疫ブロット分析。荷したタンパク質の量（μｇ）をレーンの上に示す。ＦＲＡＬＥ１６−Ｓ１（Ｎｔ−ｐＭＳＫ５６植物）およびＦＲＡＬＥ１６−Ｓ２（Ｎｔ−ｐＭＳＫ５７植物）の定量は、精製ＧＦＰの逐次希釈との比較に基く。野生型植物（Ｎｔ）由来の抽出物を陰性対照として用いた。
【図２６Ａ】  境界断片の増幅によりプラスチドゲノムへのＦＬＡＲＥ−Ｓ遺伝子の組込みを確認する。コメ（ｐＭＳＫ４９）およびタバコ（ｐＭＳＫ５７）ベクターのプラスチド標的領域の地図、ベクター（Ｏｓ−ｗｔおよびＮｔ−ｗｔ）によって標的とされるコメおよびタバコプラスチドゲノム、およびＦＲＡＬＥ遺伝子組込み後の同領域。野生型プラスチドゲノムにおいてプラスチド標的領域の末端を同源の配列に連結する。野生型プラスチドゲノムにおいてのみ、プラスチド遺伝子１６ＳｒＤＮＡ、ｔｒｎＶおよびｒｐｓ１２／７を示してある。ＰＣＲプライマー（Ｏ１〜Ｏ６）およびそれらによって生じたＰＣＲ断片もまた示してある。
【図２６Ｂ】  境界断片の増幅によりプラスチドゲノムへのＦＬＡＲＥ−Ｓ遺伝子の組込みを確認する。ＰＣＲ増幅した左および右境界断片を用いたゲル、ならびにａａｄＡ断片を用いたゲル。結果は、コメ（Ｏｓ−ｐＭＳＫ４９−１およびＯｓ−ｐＭＳＫ４９−２）およびタバコ（Ｎｔ−ｐＭＳＫ５７）トランスプラストミック系統および野生型（Ｏｓ−ｗｔ）コメについて示されている。分子量マーカーはＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化λＤＮＡである。
【図２７】  レーザー走査型共焦顕微鏡法による、Ｏｓ−ｐＭＳＫ４９−５系統におけるコメ葉緑体へのＦＬＡＲＥ１１−Ｓ３の局在の測定。像を処理し、ＦＲＡＬＥ１１−Ｓ（緑）およびクロロフィル蛍光（赤）を検出し、ならびに併合した視野に検出した。矢印は細胞内のプラスチドの混合集団を示す。棒線は２５μｍを表わす。
【図２８】  ＦＬＡＲＥ１６−Ｓの配列を示す。
【図２９】  ＦＬＡＲＥ１６−Ｓ１の配列を示す。
【図３０】  ＦＬＡＲＥ１６−Ｓ２の配列を示す。
【図３１】  ＦＬＡＲＥ１１−Ｓの配列を示す。
【図３２】  ＦＬＡＲＥ１１−Ｓ３の配列を示す。
【図３３Ａ】  ｐＭＳＫ３５の配列を示す。
【図３３Ｂ】  ｐＭＳＫ３５の配列を示す。
【図３４Ａ】  ｐＭＳＫ４９の配列を示す。
【図３４Ｂ】  ｐＭＳＫ４９の配列を示す。
【図３５】  本発明のＦＬＡＲＥ構築物を記載する表。
【図１Ａ】
0005414136.tif 000007
【図１Ｂ】
0005414136.tif 000008
【図２Ａ】
0005414136.tif 000009
【図２Ｂ】
0005414136.tif 000010
【図３Ａ】
0005414136.tif 000011
【図３Ｂ】
0005414136.tif 000012
【図３Ｃ】
0005414136.tif 000013
【図３Ｄ】
0005414136.tif 000014
【図４Ａ】
0005414136.tif 000015
【図４Ｂ】
0005414136.tif 000016
【図５】
0005414136.tif 000017
【図６】
0005414136.tif 000018
【図７】
0005414136.tif 000019
【図８】
0005414136.tif 000020
【図９】
0005414136.tif 000021
【図１０】
0005414136.tif 000022
【図１１】
0005414136.tif 000023
【図１２】
0005414136.tif 000024
【図１３Ａ】
0005414136.tif 000025
【図１３Ｂ】
0005414136.tif 000026
【図１４】
0005414136.tif 000027
【図１５Ａ】
0005414136.tif 000028
【図１５Ｂ】
0005414136.tif 000029
【図１６Ａ】
0005414136.tif 000030
【図１６Ｂ】
0005414136.tif 000031
【図１７】
0005414136.tif 000032
【図１８Ａ】
0005414136.tif 000033
【図１８Ｂ】
0005414136.tif 000034
【図１９】
0005414136.tif 000035
【図２０Ａ】
0005414136.tif 000036
【図２０Ｂ】
0005414136.tif 000037
【図２１】
0005414136.tif 000038
【図２２Ａ】
0005414136.tif 000039
【図２２Ｂ】
0005414136.tif 000040
【図２３Ａ】
0005414136.tif 000041
【図２３Ｂ】
0005414136.tif 000042
【図２４】
0005414136.tif 000043
【図２５】
0005414136.tif 000044
【図２６Ａ】
0005414136.tif 000045
【図２６Ｂ】
0005414136.tif 000046
【図２７】
0005414136.tif 000047
【図２８】
0005414136.tif 000048
【図２９】
0005414136.tif 000049
【図３０】
0005414136.tif 000050
【図３１】
0005414136.tif 000051
【図３２】
0005414136.tif 000052
【図３３Ａ】
0005414136.tif 000053
【図３３Ｂ】
0005414136.tif 000054
【図３４Ａ】
0005414136.tif 000055
【図３４Ｂ】
0005414136.tif 000056
【図３５】
0005414136.tif 000057