(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識粒子として蛍光粒子と吸光粒子とを有する試験片に、標的物質ＡおよびＢを含むことがある検体液を付与して前記蛍光粒子と吸光粒子とを流動させ、前記試験片の試験領域に捕捉された蛍光粒子および吸光粒子から発せられる蛍光および吸光をそれぞれ検出装置で一括して検出測定する多項目検出用イムノクロマトグラフィーであって、
前記検出装置は蛍光および吸光を検出する検出部とその制御を行う制御部とを有し、一方、
前記蛍光粒子および吸光粒子は、該蛍光粒子の蛍光の励起波長（λ１）と吸光粒子の吸収波長（λ２）とが同一の波長領域とされ、かつ、前記蛍光粒子が捕捉し検出する標的物質Ａと前記吸光粒子が捕捉し検出する標的物質Ｂとが異なるものとされており、
前記試験片において、前記蛍光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ１と前記吸光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ２とが異なる位置とされ、
前記検出装置の制御部は、そこから指令を発し、前記検出部を介して前記試験片を走査するに際し、前記試験領域ｎｔ１の反射光強度と試験領域ｎｔ２の反射光強度と試験領域ｎｔ１および試験領域ｎｔ２以外の非試験領域の反射光強度とを一括して検出測定するイムノクロマトグラフィー。
【請求項２】
前記検出装置が読取解析手段を有し、該読取解析手段が、前記蛍光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ１の反射光強度が非試験領域の反射光強度より大きいこと、他方、前記吸光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ２の反射光強度が前記非試験領域の反射光強度より小さいことから標的物質の検出を行う請求項１に記載のイムノクロマトグラフィー。
【請求項３】
前記蛍光粒子が蛍光シリカ粒子であり、前記吸光粒子が金コロイド粒子、着色シリカ粒子、または着色ラテックス粒子である請求項１または２に記載のイムノクロマトグラフィー。
【請求項４】
前記蛍光励起波長（λ１）および吸光吸収波長（λ２）が波長３００〜８００ｎｍの範囲にある請求項１〜３のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー。
【請求項５】
前記試験領域ｎｔ１と、前記試験領域ｎｔ２との間隔が１〜１０ｍｍの範囲である請求項１〜４のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー。
【請求項６】
前記蛍光励起波長に属するピーク及び／又は吸光吸収波長に属するピークの面積から標的物質の量を定量する請求項１〜５のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー。
【請求項７】
前記検出部に設けた１つの受光器により、前記蛍光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ１の反射光強度と、前記吸光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ２の反射光強度と、前記非試験領域の反射光強度とをともに検出する請求項１〜６のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー。
【請求項８】
標的物質Ａおよび標的物質Ｂが含有されることがある検体に対して、標的物質Ａの存在を前記試験領域ｎｔ１の反射光強度が前記非試験領域の反射光強度より大きいことから判定して、標的物質Ｂの存在を前記試験領域ｎｔ２の反射光強度が前記非試験領域の反射光強度より小さいことから判定し、両者の不存在を前記試験領域ｎｔ１の反射光強度、前記試験領域ｎｔ２の反射光強度、非試験領域の反射光強度が同程度の値であることから判定し、両者の存在を前記試験領域ｎｔ１の反射光強度が前記非試験領域の反射光強度より大きく、かつ前記試験領域ｎｔ２の反射光強度が前記非試験領域の反射光強度より小さいことから判定する請求項１〜７のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー。
【請求項９】
標識粒子として蛍光粒子と吸光粒子とを有する試験片を用い、標的物質ＡおよびＢを含むことがある検体液の付与により前記蛍光粒子と吸光粒子とを流動させ、前記試験片において蛍光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ１の反射光強度、吸光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ２の反射光強度、試験領域ｎｔ１および試験領域ｎｔ２以外の非試験領域の反射光強度を一括して検出測定する多項目検出用イムノクロマトグラフィーを行う検出装置であって、
前記検出装置は、蛍光および吸光を検出する検出部とその制御を行う制御部とを有し、
前記検出装置の制御部は、そこから指令を発し、前記検出部を介して前記試験片を走査するに際し、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）を満たす条件下で、前記試験領域ｎｔ１の反射光強度と、前記試験領域ｎｔ２の反射光強度と、前記非試験領域の反射光強度とを一括して検出測定する検出装置。
（ｉ）前記蛍光粒子の蛍光の励起波長と前記吸光粒子の吸収波長とが同一の波長領域である。
（ｉｉ）前記標的物質Ａと前記標的物質Ｂとが異なる。
（ｉｉｉ）前記試験領域ｎｔ１と前記試験領域ｎｔ２とが異なる位置にある。
【請求項１０】
さらに読取解析手段を有し、該読取解析手段が、標的物質Ａの存在を前記試験領域ｎｔ１の反射光強度が前記非試験領域の反射光強度より大きいことから判定して、標的物質Ｂの存在を前記試験領域ｎｔ２の反射光強度が前記非試験領域の反射光強度より小さいことから判定し、両者の不存在を前記試験領域ｎｔ１の反射光強度、前記試験領域ｎｔ２の反射光強度、非試験領域の反射光強度が同程度の値であることから判定し、両者の存在を前記試験領域ｎｔ１の反射光強度が前記非試験領域の反射光強度より大きく、かつ前記試験領域ｎｔ２の反射光強度が前記非試験領域の反射光強度より小さいことから判定する請求項９に記載の検出装置。
【請求項１１】
前記検出装置の検出部に組み込まれた受光器の受光感度が、前記吸光および蛍光を検出する波長領域に受光領域をもつ請求項９または１０に記載の検出装置。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィーに用いられる試薬であって、蛍光粒子と吸光粒子とを含んでなり、前記蛍光粒子には標的物質Ａを捕捉する結合性物質が導入されており、前記吸光粒子には標的物質Ａとは異なる標的物質Ｂを捕捉する結合性物質が導入されているイムノクロマトグラフィー用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノクロマトグラフィー、これに用いられる検出装置および試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
イムノクロマトグラフィーは、ナノ粒子を用いた診断手法である。この手法は操作が簡便で、判定までに要する時間が５〜３０分程度と比較的短時間であり、高価な装置を要しないことから優れた簡易診断手法として臨床の現場で多用されている。例えば、インフルエンザウィルスの感染の判定では、患者から採取した咽頭ぬぐい液や鼻腔ぬぐい液を検体として、その場で、短時間で判定が可能であり、感染の簡易判定手法として有力なツールとして普及している。【０００３】
イムノクロマトグラフィーでは一般的に金コロイドや着色ラテックス粒子等の着色粒子が標識粒子として用いられている。検体の状態や量、あるいは測定する内容によっては、こうした着色粒子を用いたイムノクロマトグラフィーでは、その感度が十分ではないことがある。場合によっては偽陰性・偽陽性と判定されてしまい、そうすると誤診等の原因ともなりかねない。これらの課題を解決するために、イムノクロマトグラフィーの高感度化に向けた試みが行われている。【０００４】
本出願人は、これまで、イムノクロマトグラフィーの高感度化の手法として、蛍光粒子を用いた蛍光イムノクロマトグラフィー、あるいはこれを吸光粒子と組み合わせたものを提案してきた（後記特許文献１〜３参照）。ここで提案されている技術によれば、試験領域から発せられる蛍光を目視でも検出することができるが、より高い精度や定量測定の便宜等を考慮して受光装置を用いて検出することもできる。この測定に適用できる高感度の検出装置として、本出願人は先に下記特許文献４の特有のレンズ系を利用する技術を提案した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００８／０１８５６６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００７／０９７３７７号パンフレット
【特許文献３】特開２０１０−１４６３１号公報
【特許文献４】特開２０１０−１９７２４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、本出願人はさらに蛍光粒子と吸光粒子とを組合せた試薬を利用し、それぞれ異なる標的物質を捕捉して検出する多項目検出用イムノクロマトグラフィーの技術開発を進めた（前記特許文献３は蛍光粒子と吸光粒子とを用いるものの、同じ標的物質を捕捉する単項目検出技術を開示する。）。これにより、例えば、診療現場において複数の疾患や感染項目等を一度に診断することができ、イムノクロマトグラフィーによる検査の効率を大幅に改善することができる。これまで、蛍光と吸光を組み合わせたこうした発想での技術開発はなされておらず、その検出方法や装置の検討に関しても未着手の状況であった。【０００７】
以上の状況に鑑み、本発明は、それぞれ異なる標的物質を捕捉する蛍光粒子と吸光粒子とを組み合わせて利用するイムノクロマトグラフィーにおいて、その蛍光と吸光とを一括して検出測定することができる検出方法および検出装置の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の上記の課題は下記の手段により解決された。
〔１〕標識粒子として蛍光粒子と吸光粒子とを有する試験片に、標的物質ＡおよびＢを含むことがある検体液を付与して前記蛍光粒子と吸光粒子とを流動させ、前記試験片の試験領域に捕捉された蛍光粒子および吸光粒子から発せられる蛍光および吸光をそれぞれ検出装置で一括して検出測定する多項目検出用イムノクロマトグラフィーであって、
前記検出装置は蛍光および吸光を検出する検出部とその制御を行う制御部とを有し、一方、
前記蛍光粒子および吸光粒子は、該蛍光粒子の蛍光の励起波長（λ１）と吸光粒子の吸収波長（λ２）とが同一の波長領域とされ、かつ、前記蛍光粒子が捕捉し検出する標的物質Ａと前記吸光粒子が捕捉し検出する標的物質Ｂとが異なるものとされており、
前記試験片において、前記蛍光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ１と前記吸光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ２とが異なる位置とされ、
前記検出装置の制御部は、そこから指令を発し、前記検出部を介して前記試験片を走査するに際し、前記試験領域ｎｔ１の反射光強度と試験領域ｎｔ２の反射光強度と試験領域ｎｔ１および試験領域ｎｔ２以外の非試験領域の反射光強度とを一括して検出測定するイムノクロマトグラフィー。
〔２〕前記検出装置が読取解析手段を有し、該読取解析手段が、前記蛍光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ１の反射光強度が非試験領域の反射光強度より大きいこと、他方、前記吸光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ２の反射光強度が前記非試験領域の反射光強度より小さいことから標的物質の検出を行う〔１〕に記載のイムノクロマトグラフィー。
〔３〕前記蛍光粒子が蛍光シリカ粒子であり、前記吸光粒子が金コロイド粒子、着色シリカ粒子、または着色ラテックス粒子である〔１〕または〔２〕に記載のイムノクロマトグラフィー。
〔４〕前記蛍光励起波長（λ１）および吸光吸収波長（λ２）が波長３００〜８００ｎｍの範囲にある〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載のイムノクロマトグラフィー。
〔５〕前記試験領域ｎｔ１と、前記試験領域ｎｔ２との間隔が１〜１０ｍｍの範囲である〔１〕〜〔４〕のいずれか１つに記載のイムノクロマトグラフィー。
〔６〕前記蛍光励起波長に属するピーク及び／又は吸光吸収波長に属するピークの面積から標的物質の量を定量する〔１〕〜〔５〕のいずれか１つに記載のイムノクロマトグラフィー。
〔７〕前記検出部に設けた１つの受光器により、前記蛍光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ１の反射光強度と、前記吸光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ２の反射光強度と、前記非試験領域の反射光強度とをともに検出する〔１〕〜〔６〕のいずれか１つに記載のイムノクロマトグラフィー。
〔８〕標的物質Ａおよび標的物質Ｂが含有されることがある検体に対して、標的物質Ａの存在を前記試験領域ｎｔ１の反射光強度が前記非試験領域の反射光強度より大きいことから判定して、標的物質Ｂの存在を前記試験領域ｎｔ２の反射光強度が前記非試験領域の反射光強度より小さいことから判定し、両者の不存在を前記試験領域ｎｔ１の反射光強度、前記試験領域ｎｔ２の反射光強度、非試験領域の反射光強度が同程度の値であることから判定し、両者の存在を前記試験領域ｎｔ１の反射光強度が前記非試験領域の反射光強度より大きく、かつ前記試験領域ｎｔ２の反射光強度が前記非試験領域の反射光強度より小さいことから判定する〔１〕〜〔７〕のいずれか１つに記載のイムノクロマトグラフィー。
〔９〕標識粒子として蛍光粒子と吸光粒子とを有する試験片を用い、標的物質ＡおよびＢを含むことがある検体液の付与により前記蛍光粒子と吸光粒子とを流動させ、前記試験片において蛍光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ１の反射光強度、吸光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ２の反射光強度、試験領域ｎｔ１および試験領域ｎｔ２以外の非試験領域の反射光強度を一括して検出測定する多項目検出用イムノクロマトグラフィーを行う検出装置であって、
前記検出装置は、蛍光および吸光を検出する検出部とその制御を行う制御部とを有し、
前記検出装置の制御部は、そこから指令を発し、前記検出部を介して前記試験片を走査するに際し、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）を満たす条件下で、前記試験領域ｎｔ１の反射光強度と、前記試験領域ｎｔ２の反射光強度と、前記非試験領域の反射光強度とを一括して検出測定する検出装置。
（ｉ）前記蛍光粒子の蛍光の励起波長と前記吸光粒子の吸収波長とが同一の波長領域である。
（ｉｉ）前記標的物質Ａと前記標的物質Ｂとが異なる。
（ｉｉｉ）前記試験領域ｎｔ１と前記試験領域ｎｔ２とが異なる位置にある。
〔１０〕さらに読取解析手段を有し、該読取解析手段が、標的物質Ａの存在を前記試験領域ｎｔ１の反射光強度が前記非試験領域の反射光強度より大きいことから判定して、標的物質Ｂの存在を前記試験領域ｎｔ２の反射光強度が前記非試験領域の反射光強度より小さいことから判定し、両者の不存在を前記試験領域ｎｔ１の反射光強度、前記試験領域ｎｔ２の反射光強度、非試験領域の反射光強度が同程度の値であることから判定し、両者の存在を前記試験領域ｎｔ１の反射光強度が前記非試験領域の反射光強度より大きく、かつ前記試験領域ｎｔ２の反射光強度が前記非試験領域の反射光強度より小さいことから判定する〔９〕に記載の検出装置。
〔１１〕前記検出装置の検出部に組み込まれた受光器の受光感度が、前記吸光および蛍光を検出する波長領域に受光領域をもつ〔９〕または〔１０〕に記載の検出装置。
〔１２〕〔１〕〜〔８〕のいずれか１つに記載のイムノクロマトグラフィーに用いられる試薬であって、蛍光粒子と吸光粒子とを含んでなり、前記蛍光粒子には標的物質Ａを捕捉する結合性物質が導入されており、前記吸光粒子には標的物質Ａとは異なる標的物質Ｂを捕捉する結合性物質が導入されているイムノクロマトグラフィー用試薬。
【０００９】
本明細書において「一括して」検出測定するとは、別の装置に切り替えることなく、単一の装置で複数の項目を検出ないし測定を行うことをいう。同時でなくともよいが、同時期（好ましくは３０秒以内、より好ましくは１０秒以内）に検出測定が行われることが好ましい。典型的には、検出部による一回の走査で検出および測定を行うことが可能であることを意味する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のイムノクロマトグラフィーおよびその検出装置によれば、それぞれ異なる標的物質を捕捉する蛍光粒子と吸光粒子とを組み合わせて利用するイムノクロマトグラフィーにおいて、その蛍光と吸光とを一括して検出測定することができる。また、前記一括した蛍光と吸光の検出測定により、複数の標的物質の検出等を効率的に行うことができ、診断および治療等のためのイムノクロマトグラフィー試験の効率を大幅に改善することができる。さらに、本発明の検出装置は、蛍光および吸光の検出を１つの検出部で一括して行うことができるため、イムノクロマトグラフィーにおける省スペース化およびデバイスコストの低減に資する。
また、本発明のイムノクロマトグラフィーにおいて、その試薬となる粒子（特に蛍光粒子）としてはシリカ粒子やラテックス粒子が挙げられるが、シリカはラテックス粒子に比べて光の透過性が高い材質であるため、光源が内部まで効率的に浸入および透過し、蛍光粒子の場合は、シリカ粒子に含まれる色素を効率的に励起することができ、吸光粒子の場合はシリカ粒子に含まれる色素が効率的に光源を吸収することができ、一層優れた効果を発揮する。
本発明の上記及び他の特徴及び利点は、下記の記載および添付の図面からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明に好適に用いられる長尺試験体を模式的に示す分解斜視図である。
【図２】本発明に好適に用いられるイムノクロマト試験片の説明図であり、（ａ）が平面図であり、（ｂ）が展開断面図である。
【図３】本発明の好ましい実施形態における試薬粒子の捕捉形態を示した説明図である。
【図４】本発明の好ましい実施形態に係るハイブリッド検出装置の例を模式的に示した斜視図である。
【図５】本発明のイムノクロマトグラフィーで検出された蛍光ピークおよび吸光ピークと試験片の試験領域との関係を模式的に示す説明図である。
【図６】Ａ型インフルエンザ核タンパク質の濃度とＩ１−Ｉｃの相関を示すグラフである。
【図７】Ｂ型インフルエンザ核タンパク質の濃度とＩｃ−Ｉ２の相関を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のイムノクロマトグラフィーは、特定の検出装置（以下、これを「ハイブリッド検出装置」ということがある。）を用いて蛍光と吸光とを一括して検出することを特徴とする。以下、この点について、好ましい実施形態中心に詳細に説明する。
【００１３】
［試験片］
まず、本発明の好ましい実施形態に係る試験片の基本的な構成から説明する。本実施形態のイムノクロマトグラフィー用試験片（テストストリップ）は、下記の部材が相互に毛細管現象が生じるように直列連結されている。
・試料添加用部材（サンプルパッド）８ａ
・蛍光シリカ粒子（蛍光標識体）２および金コロイド粒子（吸光標識体）３を含浸し乾燥して得られる部材（コンジュゲートパッド）８ｂ
・試験領域および参照領域を有するメンブレン（抗体固定化メンブレン）８ｃ
・吸収パッド８ｄ
本実施形態において試験片を構成する部材に特に制限はなく、メンブレンを有していれば、その他、上記で例示した部材の一部を省略する、あるいはそれ以外の部材を組み合わせて使用してもよい。たとえば、上述した部材以外にも、表面を覆う透明フィルムを適用したり、各部材の間に機能性のシートを付与したりしてもよい。逆に、検体液と標識試薬ナノ粒子の混合液を混合しサンプルパッドに滴下する方法では、コンジュゲートパッドは省略できる。
【００１４】
本実施形態においては、図１及び図２に示したように、上述した平面試験片１０が筐体上部６ａと筐体下部６ｂとで挟持内包され、長尺試験体１００をなしている。筐体上部６ａには、検出開口部６１と検体導入開口部６２とが設けられている。この検出開口部６１を介して、照射光を内部のメンブレン１０に送り、そこで発せられる反射光強度を検出・観測することができる。一方、検体導入開口部６２を介して検体液Ｓをメンブレン１０に供給し測定試験を行うことができる。なお、本明細書においては、蛍光粒子から発せられる蛍光、吸光粒子により吸収される吸光、及び試験領域以外の部分（非試験領域）における前記照射光に対する反射光を総称して「反射光」と呼ぶ。したがって、蛍光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ１からの蛍光の強度を「試験領域ｎｔ１の反射光強度（Ｉ１）」と呼び、吸光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ２での吸光の強度を「試験領域ｎｔ２の反射光強度（Ｉ２）」と呼び、前記非試験領域での反射光強度を「非試験領域の反射光強度（Ｉｃ）」と呼ぶ。
【００１５】
本実施形態においては、前記試験片１０の中央においてメンブレン８ｃに、２つの試験領域（第１試験領域ｎｔ１および第２試験領域ｎｔ２）が設けられている。この第１試験領域ｎｔ１には、標的物質（被検物質）１Ａを捕捉する生体分子４が配置され固定化されている。つまり、第１試験領域では、蛍光粒子を含む標識体２を捕捉するようにされている。一方、第２試験領域には標的物質（被検物質）１Ｂを捕捉する生体分子５が配置され、ここで吸光標識体３を捕捉するようにされている。これにより、２つの標的物質、つまり標的物質Ａ（１Ａ）と標的物質Ｂ（１Ｂ）との区別検出が可能となる。すなわち、検体液ｓを付与した際に、そこに含まれる標的物質１（標的物質Ａ（１Ａ）と標的物質Ｂ（１Ｂ））とが蛍光標識体２および吸光標識体３とともにフロー方向Ｌに向かってメンブレン内を流動する。そして、標的物質Ａ（１Ａ）を捕捉した蛍光標識体２は第１試験領域ｎｔ１で捕捉され、その存在がそこで判別可能な状態となる。さらに、フロー方向Ｌに向かって流動した標的物質Ｂ（１Ｂ）は吸光標識体３に捕捉されており、これが第２試験領域ｎｔ２で捕捉されることによりその存在が検出される状態となる。
【００１６】
前記の捕捉形態をまとめると、本実施形態においては、標的物質Ａおよび標的物質Ｂが含有された検体試料に対して、蛍光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ１の反射光強度（Ｉ１）が試験領域ｎｔ１および試験領域ｎｔ２以外の非試験領域ｎｃ（図２参照）の反射光強度（Ｉｃ）より大きい（Ｉ１＞Ｉｃ）ことより判定する。また、標的物質Ｂの存在を吸光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ２の反射光強度（Ｉ２）が非試験領域ｎｃの反射光強度（Ｉｃ）より小さい（Ｉ２＜Ｉｃ）ことより判定する。両者の不存在は、蛍光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ１の反射光強度（Ｉ１）、吸光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ２の反射光強度（Ｉ２）、非試験領域の反射光強度（Ｉｃ）が同程度の値であることより判定する。両者の存在は、蛍光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ１の反射光強度（Ｉ１）が非試験領域の反射光強度（Ｉ２）より大きく、かつ吸光粒子が捕捉される試験領域ｎｔ２の反射光強度（Ｉ２）が非試験領域の反射光強度（Ｉｃ）より小さいことにより判定することができる。これにより、２つの標的物質を含むことがある試料の検出測定を一回の走査で行うことができる。なお、前記反射光の強度が同程度であるとは、必要により非試験領域の反射光強度（Ｉｃ）（ａ．ｕ．）を基礎にして、Ｉｃの±１０％以内のものを「同程度」といい、より厳密には±５％以内のものを言う。なお、反射光強度は本来測定装置や条件によって変わるが、上記のように相対値（比率）で評価することにより一般化できる。厳密に測定条件を定義するときには、特に断らない限り、後記実施例で測定した条件によるものとする。
【００１７】
図２（ａ）及び（ｂ）を参照して、本実施形態のイムノクロマトグラフィー用テストストリップについてさらに説明するが、本発明はこれらの説明によって制限されるものではない。なお、図２では、バッキングシート８ｅを省略せずに示している。図２（ａ）は、本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ（試験片）１０の好ましい実施形態の平面図を示し、図２（ｂ）は、図２（ａ）で示したイムノクロマトグラフィー用テストストリップの展開縦断面図を示す図である。本実施形態のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ１０は、上述のように、サンプルパッド８ａ、コンジュゲートパッド８ｂ、メンブレン８ｃ、吸収パッド８ｄを具備してなる。さらに、上記各構成部材は、粘着剤付きバッキングシート８ｅにより裏打ちされている。
【００１８】
図１および２においては、第１試験領域ｎｔ１、第２試験領域ｎｔ２、参照領域ｎｒをこの順序で配置した例を示している。また、本実施形態において非試験領域ｎｃは、メンブレン８ｃの表面で第１試験領域ｎｔ１、第２試験領域ｎｔ２、及び参照領域ｎｒ以外の部分として定義される。しかしながら、本発明はこれに限定されるものではなく、例えば試験領域の順序を逆にしてもよく、あるいは参照領域の配置箇所を別の部分にしてもよい。また、参照領域ｎｒを設けない構成としてもよい。
【００１９】
第１試験領域ｎｔ１と第２試験領域ｎｔ２との間隔ｄ（図２）は特に限定されないが、蛍光と吸光との重複による光強度の相殺を避ける観点から、２ｍｍ〜８ｍｍであることが好ましく、３ｍｍ〜５ｍｍであることがより好ましい。
【００２０】
［標的物質］
本発明において、検出、定量の対象としての標的物質１は、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、化学物質等が挙げられる。本発明において、標的物質１を含有する試料としては特に制限はないが、尿、血液などの液体試料が挙げられる。ここで本発明の重要な特徴の１つを示すと、この標的物質が蛍光検出されるもの（標的物質１Ａ）と吸光検出されるもの（標的物質１Ｂ）とで異なることである。この点で、同じ標的物質を蛍光と吸光の両方で検出する前記特許文献３の技術とは、その発明の基本的な着想が異なる。
本発明のイムノクロマトグラフィーにおいては、標的物質Ａと標的物質Ｂの異なる２つ以上の標的物質の検出を行うことができる。ただし、標的物質ＡやＢの不存在（陰性）の確認目的で検査を行うこともできる。したがって、検体液には、標的物質ＡおよびＢが含まれていても、標的物質ＡまたはＢのみが含まれていても、標的物質ＡおよびＢのいずれも含まれていなくてもよい。
【００２１】
［サンプルパッド］
サンプルパッド８ａは標的物質を含むサンプルを滴下する構成部材である。その材料や寸法等は特に限定されず、この種の製品に適用される一般的なものを利用することができる。
【００２２】
［コンジュゲートパッド］
コンジュゲートパッド８ｂは蛍光シリカ粒子等の蛍光標識体２および金コロイド粒子等の吸光標識体３が含浸された構成部材である。そして、サンプルパッド８ａから毛細管現象により移動してきた試料に含まれる標的物質が抗原抗体反応等の特異的分子認識反応で、前記蛍光シリカ粒子（標識体）によって捕捉され、標識される部分である。コンジュゲートパッド８ｂにおける単位面積（ｃｍ２）当たりの蛍光標識体の含有量は特に制限はないが１μｇ〜１００μｇが好ましい。吸光標識体も同様であり１μｇ〜１００μｇが好ましい。含浸方法としては、標識体の分散液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥する方法等が挙げられる。
【００２３】
［メンブレン］
抗体を固定化するメンブレン８ｃにおける抗体固定化部に、標的物質の有無を判定、すなわち陽性陰性を判定するためのテストライン（第１試験領域ｎｔ１および第２試験領域ｎｔ２）を設ける。このテストラインｎｔ１、ｎｔ２では、標的物質捕捉用抗体（試験用捕捉性物質）４および５がそれぞれ固定化されている。さらに、メンブレン８ｃには、蛍光シリカ粒子を捕捉するための抗体（参照用捕捉性物質）７が固定化されたコントロールライン（参照領域）ｎｒが含まれる。この、試験領域ｎｔ１、ｎｔ２では、例えば上述したような組合せにより、固定化抗体（試験用捕捉性物質）−標的物質−標識体からなるサンドイッチ型免疫複合体形成反応が行われる（図３参照）。前記メンブレンにおける判定部（試験領域、参照領域）の形状としては局所的に固定化抗体が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられるが、ライン状であることが好ましく、幅０．５〜１．５ｍｍのライン状であることがより好ましい。
【００２４】
上記サンドイッチ型免疫複合体形成反応を通じ、標識された標的物質が捕捉され、標識の程度により標的物質の有無（陽性陰性）を判定することができる。このとき、前記試験領域に蛍光シリカ粒子等の蛍光標識体および金コロイド粒子等の吸光標識体が濃縮され、その近傍が蛍光発光ないし吸光着色し検出器を用いて検出、及び判定とすることができる。
【００２５】
ここで本発明のイムノクロマトグラフィーにおける、標的物質、捕捉性物質、粒子の種類等の組合せの代表例を表１に挙げておく。本発明がこの例によって限定して解釈されるものではない。表中の（  ）内の番号は図面中の符号と対応する（特に図３を参照）。
【表１】
0005579343.tif 000002
本発明においては、このように複数の標的物質を同一波長領域の蛍光および吸光で検知可能な試薬成分の組合せとしたため、単一の検出部（受光器）でも高い感度で標的物質の有無や量を検出することができる。その結果、装置の構造や測定操作等を簡素化できることがその利点である。
【００２６】
抗体固定化メンブレンにおける判定部は、前記コンジュゲートパッドとの連結端及び前記吸収パッドとの連結端からある程度離れた位置（例えば、前記メンブレンの中程など）に設けておくことが好ましい。これにより、前記サンドイッチ型免疫複合体形成反応を充分に完了させることができる。あるいは、液体試料中の着色又は蛍光物質等の標識による測定への影響や標的物質と結合していない標識体による測定への影響を回避するために、好ましい。
【００２７】
前記抗体固定化部（試験領域）ｎｔ１、ｎｔ２における抗体固定化量は特に制限されないが、形状がライン状の場合、単位長さ（ｃｍ）当たりの０．５μｇ〜５μｇが好ましい。固定化方法としては、抗体溶液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。前述の抗体固定化後に、非特異的吸着による測定への影響を防止するために前記抗体固定化メンブレン全体をいわゆるブロッキング処理を施しておくことが好ましい。例えば、アルブミン、カゼイン、ポリビニルアルコール等のブロッキング剤を含有する緩衝液中に適当な時間浸漬した後乾燥する方法等が挙げられる。市販の前記ブロッキング剤としては、例えば、スキムミルク（ＤＩＦＣＯ社製）、４％ブロックエース（明治乳業社製）などが挙げられる。
【００２８】
メンブレン８ｃには、上述のように、さらに参照領域ｎｒが設けられている。そこには試験領域に捕捉されなかった標識体が捕捉される。これにより、試験領域での蛍光と対比して、標的物質の有無や量を同定することができる。この機能を果たすために、参照用捕捉性物質７には、試験用結合性物質２ｂ、または３ｂと結合性を有するものが選定される。また、参照領域は２つ設けてもよく、その場合、一方の参照用捕捉性物質には、試験用結合性物質２ｂと結合性を有するものが選定され、他方の参照用捕捉性物質には、試験用結合性物質３ｂと結合性を有するものが選定される。
【００２９】
［吸収パッド］
吸収パッド８ｄは、毛細管現象でメンブレンを移動してきた標的物質１Ａ，１Ｂ及び標識体２，３の混合物を吸引し、系内に一定の流れを生じさせるための構成部材である。
【００３０】
これら各構成部材の材料としては特に制限は無く、イムノクロマトグラフィー用テストストリップに用いられる部材が使用できる。サンプルパッドおよびコンジュゲートパッドとしてはＧｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のガラスファイバーのパッドが好ましい。メンブレンとしてはＨｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ１２０メンブレン（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のニトロセルロースメンブレンが好ましい。吸収パッドとしてはＣｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のセルロースメンブレンが好ましい。前記粘着剤付きバッキングシートとしては、ＡＲ９０２０（商品名、Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）等が挙げられる。
【００３１】
［技術用語の意味］
本明細書で用いる技術用語の意味を確認すると、標的物質１（１Ａ，１Ｂ）（図１中の符号を併せて示すが、これにより限定して解釈されるものではない。）はラテラルフロー法による検出対象となる物質であり、検体中の被検物質と同義である。結合性物質２ｂ，３ｂはそれぞれ前記標的物質及び捕捉性物質に対する結合能を有する物質であり、好ましくは生体分子である。結合性物質２ｂ，３ｂが導入された標識粒子２ａ，３ａを標識体２と呼ぶ。ただし、広義には、標識粒子という用語を標識体を含む意味で用いることがある。一方、試験領域でメンブレンに固定され、標的物質１（１Ａ，１Ｂ）を介して標識体２，３を捕捉するものが試験用捕捉性物質４，５である。他方、参照領域でメンブレンに固定されたものが参照用捕捉性物質７であり、これに標識体２，３が標的物質１（１Ａ，１Ｂ）を介さずに捕捉される。
【００３２】
［蛍光標識体］
蛍光標識体２としては、蛍光シリカ粒子や蛍光ラテックス粒子、半導体ナノ粒子などの合わせて用いることができる。本発明においては、特に蛍光シリカ粒子を用いることが好ましい。
シリカの屈折率は、後記のとおり１．４０〜１．４６程度であり、他方はラテックス粒子の屈折率は１．６程度である。このため、シリカは光の透過性がラテックスに比べて高い材質であり、光源が内部まで効率的に浸入および透過し、蛍光粒子の場合は、シリカ粒子に含まれる色素を効率的に励起することができ、吸光粒子の場合はシリカ粒子に含まれる色素が効率的に光源を吸収することができ、一層優れた効果を発揮する。  
【００３３】
蛍光シリカ粒子の調製方法に特に制限はなく、任意のいかなる調製方法によって得られたシリカ粒子であってもよい。例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５９，１５０−１５７（１９９３）に記載のゾル−ゲル法が挙げられる。
本発明において、国際公開２００７／０７４７２２Ａ１公報に記載された蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子の調製方法に準じて得られた、機能性化合物を含有するシリカ粒子を用いることが特に好ましい。前記機能性化合物の具体例としては、蛍光色素化合物、吸光化合物、磁性化合物、放射線標識化合物、ｐＨ感受性色素化合物等が挙げられる。
【００３４】
具体的には、前記機能性化合物を含有するシリカ粒子は、前記機能性化合物とシランカップリング剤とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合若しくは吸着させて得られた生成物に１種又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。これによりオルガノシロキサン成分とシロキサン成分とがシロキサン結合してなるシリカ粒子が得られる。
前記機能性化合物を含有するシリカ粒子の好ましい調製方法の態様としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する又は付加した前記機能性化合物と、それら活性基と対応して反応する置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。
【００３５】
前記シランカップリング剤としてγ−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、シラン化合物としてテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）を用いた場合を下記に例示する。
【００３６】
【化１】
0005579343.tif 000003
【００３７】
前記活性基を有する又は付加した前記機能性化合物の具体例として、５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン−ＮＨＳエステル（商品名、ｅｍｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ社製）、下記式でそれぞれ表されるＤＹ５５０−ＮＨＳエステル又はＤＹ６３０−ＮＨＳエステル（いずれも商品名、Ｄｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ社製）等のＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物を挙げることができる。
【００３８】
【化２】
0005579343.tif 000004
【００３９】
前記置換基を有するシランカップリング剤の具体例として、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシラン、Ｎ−２（アミノエチル）３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤を挙げることができる。中でも、ＡＰＳが好ましい。
【００４０】
前記縮重合させる前記シラン化合物としては特に制限はないが、ＴＥＯＳ、γ−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、γ−メルカプトプロピルトリエトキシシラン、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、３−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、３−イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、及び３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシランを挙げることができる。中でも、前記シリカ粒子内部のシロキサン成分を形成する観点からはＴＥＯＳが好ましく、前記シリカ粒子内部のオルガノシロキサン成分を形成する観点からはＭＰＳ又はＡＰＳが好ましい。
【００４１】
上述のように調製すると、球状、もしくは、球状に近いシリカ粒子が製造できる。球状に近いシリカ粒子とは、具体的には長軸と短軸の比が２以下の形状である。
所望の平均粒径のシリカ粒子を得るためには、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎたり小さすぎる粒子を除去するか、または適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清または沈殿のみを回収することで可能である。
【００４２】
前記シリカ粒子の表面に吸着又は結合させる生体分子としては、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、タンパク質又はペプチドが挙げられる。ここで、リガンドとはタンパク質と特異的に結合する物質をいい、例えば、酵素に結合する基質、補酵素、調節因子、あるいはホルモン、神経伝達物質などをいい、低分子量の分子やイオンばかりでなく、高分子量の物質も含む。
【００４３】
蛍光シリカ粒子の平均粒径が１ｎｍ〜１μｍであることが好ましく、２０ｎｍ〜５００ｎｍであることがより好ましく、２００ｎｍ〜４００ｎｍであることが特に好ましい。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した１００個の標識試薬シリカ粒子の合計の投影面積から標識試薬シリカ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択した標識試薬シリカ粒子の個数（１００個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
なお、前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子を含む概念の後述する「動的光散乱法による粒度」とは異なり、一次粒子のみからなる粒子の平均粒径である。
ラテックス粒子は密度が１ｇ／ｃｍ３であり、密度が小さいことから、粒径を小さくすると遠心分離で分離が不可能となり、標識粒子として使用できなくなることがある。これに対し、シリカは相対的に密度が大きいため（例えば約２ｇ／ｃｍ３）、粒径を小さくしても遠心分離で分離がしやすく、好適に標識粒子として使用することができる。したがって、本発明の検出において、シリカ粒子を用いるとラテックス粒子より小さな粒径の粒子を使用できることから、使用する粒子の粒径の選択の幅を広く取ることができ、メンブレン内の移動特性を最適にするより小径の粒子を選択することが可能になる。このような点から、本発明においてはシリカ粒子を用いることが好ましい。
また、下記のように低屈折率であることも、周囲の水の影響による光の散乱を起こさず、シリカ粒子を用いる利点となる。特に、本願発明においては、後記実施例で示すように、１０ｎｇ／ｍｌというごく微量の検体の検出に係る精度向上も見据えており、その観点からもシリカ粒子を用いた標識試薬とすることが好ましい。
＜屈折率＞    ５８９ｎｍ  ２３℃
ポリスチレンビーズ    １．５９
シリカ粒子            １．４０−１．４６
水                    １．３３
（理科年表  国立天文台編）
反射光強度  Ｒ＝（ｎ０−ｎｉ）２
ｎ０  水の屈折率
ｎｉ  粒子の屈折率
Ｒ（ポリスチレンビーズ）＝７．９３×１０−３
Ｒ（シリカ粒子）＝６．５７×１０−４〜２．１７×１０−３
【００４４】
本明細書において、前記「動的光散乱法による粒度」とは、動的光散乱法により測定され、前記の平均粒径とは異なり、一次粒子だけでなく、一次粒子が凝集してなる二次粒子をも含めた概念であり、前記複合粒子の分散安定性を評価する指標となる。
動的光散乱法による粒度の測定装置としては、ゼータサイザーナノ（商品名；マルバーン社製）が挙げられる。この手法は、微粒子などの光散乱体による光散乱強度の時間変動を測定し、その自己相関関数から光散乱体のブラウン運動速度を計算し、その結果から光散乱体の粒度分布を導出するというものである。
【００４５】
本発明の粒子は粒状物質として単分散であることが好ましく、粒度分布の変動係数いわゆるＣＶ値は特に制限はないが、１０％以下が好ましく、８％以下がより好ましい。
【００４６】
［吸光標識体］
吸光標識体３は、蛍光標識体２のときと同様に、標的物質、参照用捕捉性物質に対して良好な結合性を有する生体分子等（結合性物質）３ａで吸光微粒子３ａが表面修飾されていることが好ましい。吸光微粒子の表面修飾の実施形態は前記蛍光微粒子と同様である。
吸光微粒子の種類や形状は特に限定されない。吸光微粒子の平均粒径、構成材料等の好ましいものは前記蛍光微粒子と同様である。標識物質としては、微粒子の構成材料が吸光性のものであれば特に用いなくてもよい。標識物質（吸光物質）を適用する場合には、多環顔料やアゾ顔料などの有機顔料、カーボンブラックやウルトラマリン青などの無機顔料を用いることができる。例えば、前記シリカ粒子やラテックス粒子に前記吸光物質を内包させてもよい。また、吸光微粒子には下記の半導体微粒子等を用いることも好ましい。
【００４７】
・半導体粒子等
前記半導体粒子の材質は特に制限されないが、ＺｎＯ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＯ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＴｉＯ２、ＷＯ３、ＰｂＳ、又はＰｂＳｅが好ましく例示される。例えば、特許第３８９７２８５号公報等に記載の半導体ナノ粒子を用いることができる。前記半導体ナノ粒子は、チオール化合物の−ＳＨ基が半導体ナノ粒子の表面のＳ、Ｏ、Ｓｅ、Ｔｅ、Ｐ、Ａｓ、Ｎ等の原子と置換することにより表面修飾することができる。金粒子、前記金属ナノ粒子としては、特開２００３−２６６３８明細書等に記載の金コロイド粒子及び金属コロイド粒子を用いることができる。前記金属コロイド粒子の具体例としては、白金、銅、酸化鉄等の金属コロイド粒子が挙げられる。前記無機結晶としては、酸化鉄（ＩＩＩ）（Ｆｅ２Ｏ３）、酸化銀（Ｉ）（Ａｇ２Ｏ）、酸化スズ（ＩＶ）（ＳｎＯ２）、酸化チタン（ＩＶ）（ＴｉＯ２）、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）等が挙げられる。例えば、特開２００５−７６０６４公報に記載の無機結晶を用いることができる。
金コロイドは、一般に、表面プラズモン効果が大きく、また、可視光の波長を効率的に吸収するため、視認性が良い。また、吸収ピークの波長が緑レーザの波長とほぼ一致することから、緑レーザで励起できる蛍光粒子（たとえばローダミン６Ｇを含有するシリカ粒子）と組み合わせることで、蛍光の検出感度が高くかつ吸光による検出感度も高い、蛍光・吸光一括検出測定装置を構築できる。
【００４８】
・吸光係数
吸光微粒子は、可視光を吸収し着色して視認できるものであることが好ましい。そのモル吸光係数εが５×１０６Ｍ−１ｃｍ−１以上である粒子であることが好ましく、モル吸光係数εが５×１０７Ｍ−１ｃｍ−１〜１×１０１０Ｍ−１ｃｍ−１であることがより好ましい。
【００４９】
ここで、モル吸光係数εは下記ランベルト−ベールの式から算出することができる。
Ａ＝Ｌｏｇ１０（Ｉ０／Ｉ）＝εｂｐ＝ａｓｂｐ’
［Ａ：吸光度、Ｉ：透過光の強度、Ｉ０：入射光の強度、ε：モル吸光係数（Ｍ−１ｃｍ−１）、ｂ：光路長（ｃｍ）、ｐ：標識粒子（着色粒子及び蛍光微粒子の混合分散液を含む。）の濃度（Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））、ａｓ：比吸光度、ｐ’：標識粒子（着色粒子及び蛍光微粒子の混合分散液を含む。）の濃度（ｇ／ｌ）］
【００５０】
上記濃度ｐ’（ｇ／ｌ）は、一定量（例えば１ｍｌ）の標識粒子分散液から標識粒子のみを回収し、乾燥させて得られた質量を決定して得られた値である。一方、上記濃度ｐ（ｍｏｌ／ｌ）は、標識粒子の大きさをＴＥＭ写真から求め、一粒子の体積を決定し、粒子の密度（例えばシリカ粒子の場合は２．３ｇ／ｃｍ３）から一粒子の質量を決定し、一定量（例えば１ｍｌ）の標識粒子分散液から標識粒子のみを回収し、乾燥させて得られた標識粒子の質量からモル数を決定して得られた値である。本発明において、「標識粒子のモル吸光係数ε」とは、標識粒子分散液について吸光度を測定し、前記ランベルト−ベールの式に適用することにより得られた、前記分散液中における標識粒子のモル吸光係数εをいう。標識粒子の吸光度、吸光スペクトル及びεは、任意の吸光光度計ないしはプレートリーダーを用いて、水分散液、エタノール分散液、Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド分散液等の分散液として測定できる。
【００５１】
［蛍光及び吸光の波長］
本発明の好ましい実施形態においては、前記蛍光粒子２ａ（蛍光標識体２）および吸光粒子３ａ（吸光標識体３）は、その蛍光励起波長（典型的にはピークトップ）〔λ１〕と吸収波長（典型的には吸光ピークトップ）〔λ２〕とが同一の波長領域となるようにされている。ここで同一の波長領域とは本発明の所望の効果、つまり１つの検出部（受光器）により蛍光と吸光とを検出し、逆ピークとして読み取ることができれば特に限定はされない。ただし、イムノクロマトグラフィーの製造工程において標識粒子が目視で確認できること、すなわち呈色することが好ましいことから、蛍光の励起波長および吸光の吸収波長（λ１、λ２）は、３００ｎｍ〜８００ｎｍであることが好ましい。さらに、蛍光色素および着色色素の入手性等を考慮すると、上記蛍光及び吸光の検出波長領域（λ１、λ２）は、３５０〜７００ｎｍであることが好ましく、４００ｎｍ〜６５０ｎｍであることがより好ましい。汎用されている検出器（光センサー）の受光感度特性を考慮すると５００ｎｍ〜６５０ｎｍであることが特に好ましい。なおここで言うピークとはピークトップないしその近傍全般を指し、狭義にはピークトップ（頂点）を意味するものとする。なお、上記波長領域の蛍光は目視では概ね緑色に見え、吸光（着色）は概ね赤色に見える。上記蛍光励起波長〔λ１〕と吸収波長〔λ２〕の差〔Δλ〕は特に限定されないが、その差〔Δλ＝λ１−λ２〕は、好適な一括検出の観点から、６０ｎｍ以下であることが好ましく、３０ｎｍ以下であることがより好ましく、１０ｎｍ以下であることが特に好ましい。下限は特にないが、０．５ｎｍ以上であることが実際的である。なお、本発明において光の波長は特に断らない限り、後記実施例で測定した条件（装置、測定温度等）によるものとする。たとえば、蛍光色素、吸光色素ともにローダミン６Ｇを用いた場合には、蛍光励起波長〔λ１〕と吸収波長〔λ２〕の差は、２３ｎｍであり、蛍光色素として、ＡＴＴＯ５３２を、吸光色素として、ＴＡＭＲＡを用いた場合には、７ｎｍになり、上記関係を満足する。
【００５２】
［検出方法］
本発明のイムノクロマトグラフィーにおいては、前記試験片を用い、そこから発せられる蛍光および吸光（着色）をそれぞれハイブリッド検出装置で一括して検出測定する。図４は前記検出装置の好ましい実施形態を模式的に示した斜視図である。本検出装置２００は、検出ユニット本体２１とパーソナルコンピュータ（制御部）２５とが配線２３で接続された形態を有している。前記検出ユニット本体２１には、検出部２０（図５参照）が内臓されている。この検出部２０は、サンプル導入部２１ａからサンプルガイド２１ｂに沿って導入される長尺試験体１００のサンプル開口部６１に対応する位置で移動し、そこから露出する試験片１０の表面を走査するようにされている。これにより、試験片１０の試験領域（ｎｔ１、ｎｔ２）および参照領域ｎｒにおける蛍光ないし吸光、あるいは各領域の反射光強度（Ｉ１、Ｉ２、Ｉｃ）を検出測定することができる。
【００５３】
前記検出器２０は、受光器２７、受光レンズ２８、光照射器２９で構成されている。図５の上図は、この検出部２０を、試験領域（ｎｔ１、ｎｔ２）に沿って、初期位置（ｉ）から終期位置（ｆ）に至るまで走査したときの状態を模式的に示している。さらに、図５の下図は、そのときに検出される蛍光ピークと吸光ピークとの例を示している。同図に示したとおり、第１試験領域ｎｔ１では上に凸の蛍光ピークが検出され、第２試験領域ｎｔ２では下に凸の吸光ピークが検出されている。本実施例においては参照ラインｎｒで蛍光ピークが検出されている。両ピークは、試験領域が離間していることにより重なりなく検出され、光強度が相殺されないようにされている。このように、１つの検出部（受光器）により、蛍光と吸光との両者を一度に測定できることが本発明の利点である。
【００５４】
本実施形態において、前記ハイブリッド検出装置の制御部２５は、そこから指令を発し、前記検出部を介して前記試験片を走査し、前記蛍光ピークと吸光ピークとを一括して検出測定する。ただし、このような実施形態に限らず、制御部は任意の構成としてよく、例えば、検出ユニット本体２１の内部に組み込んでもよい。本実施形態においては、前記パーソナルコンピュータ（検出部）２５が読取解析手段を兼ねており、該読取解析手段が前記蛍光ピークを上もしくは下に凸のピークとして認識、前記吸光ピークを前記蛍光ピークとは上下逆に凸のピークとして認識し、それぞれの標的物質Ａ１，Ｂ１の検出を行い、その結果を表示部２５ａに表示できるようにしている。ただし、先に述べたとおり、この検出・解析においては、光のピークの解析のみによるものでなく、広く、反射光強度（Ｉ１、Ｉ２、Ｉｃ）から、標的物質の存在、不存在、又はその定量を行うことができる。
【００５５】
本実施形態においては、前記ハイブリッド検出装置２００を、前記蛍光ピーク及び／又は吸光ピークの面積から標的物質の量を定量する定量測定装置として用いることが好ましい。このような定量を行うときには、あらかじめピーク面積の検量線を求めておき、それに照合することで、被検物質の量を同定することが好ましい。概略的な量を知りたいとき、あるいは蛍光ピークで検出される被検物質と吸光ピークで検出される被検物質との相対関係を把握したいときなどは、検量線を用いずにピークから求められる積分強度で定量測定を行ってもよい。
本発明によれば、１つの試験片で複数の被検物質（標的物質）の測定ができるため、試験片間のばらつきや試料の作成上の誤差ないし誤操作（サンプルのすり替わり等）などを好適に防ぐことができ好ましい。また、シンプルな構成の検出装置とすることで、試験場所の移動や分散配置も可能となる。このような利点は、大量のサンプルを試験し測定することが求められる公共医療での利用において特に顕著となる。
【００５６】
上記のとおり、本発明のイムノクロマトグラフィーによる標的物質の検出方法においては、毛細管現象等を利用して移動する標識体を利用して、判定部で前記粒子を集積させ、判定を行う検出が好ましく、例えばイムノクロマトグラフィーやマイクロ流路チップ等を利用して行うことが好ましい。このとき、シリカ粒子はラテラルフロー用標識体として好適に用いることができる。さらに、本発明において、ラテラルフロータイプのイムノクロマトグラフィーを利用して標的物質を検出することが好ましい。
【００５７】
前記テストストリップの作製法としては、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの並び順に、各部材間で毛管現象を生じさせ易くするために、それら各部材の両端を隣接する部材と１〜５ｍｍ程度重ね合わせて（好ましくはバッキングシート上に）貼付することで作製することができる。
【００５８】
前記イムノクロマトグラフィー用蛍光・吸光検出システムとしては、少なくとも（１）サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン及び吸収パッドからなるテストストリップ、並びに（２）励起光源からなることが好ましい。
前記蛍光検出システムにおいて、前記シリカ粒子（標識体）が発する蛍光を好適に検出する観点から、前記励起光源（光照射器）が、波長５００ｎｍ〜５５０ｎｍの励起光を発することが好ましい。前記励起光源としては、水銀ランプ、ハロゲンランプ及びキセノンランプが挙げられる。特にレーザダイオードまたは発光ダイオードから照射した励起光を用いることが好ましい。
また、前記蛍光検出システムは、前記励起光源から特定の波長の光のみを透過するためのフィルタを備えていることがより好ましく、さらに、蛍光を的確に検出する観点から、前記励起光を除去し蛍光のみを透過するフィルタを備えていることがさらに好ましい。
【００５９】
前記受光器は、前記蛍光を受光し吸光（着色）を検知する光電子倍増管、ＣＣＤ検出器、ＣＭＯＳ検出器であることが特に好ましく、これにより目視では確認できない強度ないしは波長の蛍光も検出でき、さらにはその蛍光強度を測定できることから標的物質の定量もでき、高感度検出及び定量が可能となる。受光器の受光感度における特性としては、高感度の製品の入手性の観点から、波長４００〜７００ｎｍに高感度の受光領域（受光ピーク）があるものを適用することが好ましく、波長５００〜６００ｎｍに高感度の受光領域（受光ピーク）があるものを適用することがより好ましい。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【００６１】
調製例１（蛍光シリカナノ粒子の調製）
５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ・スクシンイミジルエステル（商品名、ｅｍｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ社製）２．９ｍｇを１ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ここに１．３μＬのＡＰＳを加え、室温（２５℃）で１時間反応を行った。
得られた反応液６００μＬと、エタノール１４０ｍＬ、ＴＥＯＳ６．５ｍＬ、蒸留水３５ｍＬ及び２８質量％アンモニア水１５．５ｍＬを混合し、室温で２４時間反応を行った。
反応液を１５０００×Ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカ粒子に蒸留水を４ｍＬ加え、粒子を分散させ、再度１５０００×Ｇの重力加速度で２０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、シリカナノ粒子分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去し、平均粒径２２７ｎｍのシリカナノ粒子１．６５ｇを得た。収率約９４％。【００６２】
調製例２（蛍光シリカ粒子と抗体の複合粒子の調製）
調製例１で用いた、濃度５ｍｇ／ｍｌのローダミン６Ｇ含有蛍光シリカ粒子（平均粒径１９７ｎｍ）の分散液１００μＬ（分散媒：蒸留水）に、蒸留水７７５μＬ、濃度１０ｍｇ／ｍＬのアルギン酸ナトリウム水溶液（重量平均分子量７００００）１００μＬ及び２８重量％のアンモニア水溶液を２５μＬ加え、室温（２４℃）で１時間緩やかに混合した。得られたコロイドを１２，０００×Ｇの重力加速度で３０分遠心分離し、上清を除去した。ここに蒸留水を８７５μＬ加え、粒子を再分散させた。続いて、１０ｍｇ／ｍＬのアルギン酸ナトリウム水溶液を１００μＬ加え撹拌子でよく撹拌したあと、２８重量％のアンモニア水溶液を２５μＬ加え、１時間緩やかに混合した。このコロイドを１２，０００×Ｇの重力加速度で３０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水を１ｍＬ加え粒子を分散させた。同様にして更に２回遠心分離と蒸留水への分散を繰り返して粒子を洗浄し、蒸留水２００μＬに分散させ、ローダミン６Ｇ含有シリカ粒子／アルギン酸の複合粒子のコロイドを得た（収量２．５ｍｇ／ｍＬ×２００μＬ）。【００６３】
前記ローダミン６Ｇ含有蛍光シリカ粒子／アルギン酸の複合粒子のコロイドに、０．５Ｍの２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄバッファー（ｐＨ６．０）を１００μＬ、蒸留水３９５μＬ、５０ｍｇ／ｍＬのＮＨＳ（Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）水溶液２３０μＬ、及び１９．２ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）水溶液７５μＬを順に加えて１０分間混合した。【００６４】
コロイドを１２，０００×Ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。ここに５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）を４００μＬ加え、粒子を分散させ、さらにヤギ由来の抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ，ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｇｏａｔ−Ｐｏｌｙ，ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）１００μＬ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を加え、室温で３０分間緩やかに混合し、抗ｈＣＧ抗体を前記シリカナノ粒子に共有結合させた。【００６５】
続いて、コロイドを１２，０００×Ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。ここに５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）を１ｍＬ加え、粒子を分散させ、１２，０００×Ｇの重力加速度で１０分遠心分離後、上清を除去した。ここに５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）を１ｍＬ加え、粒子を分散させ、１２，０００×Ｇの重力加速度で１０分遠心分離後、上清を除去した。ここに５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）を１ｍＬ加え、粒子を分散させ、シリカ粒子と抗Ａ型インフルエンザ各タンパク質抗体の複合粒子コロイド０．５ｍｇ／ｍｌを１ｍＬ得た。【００６６】
調製例３（金コロイドと抗体の複合粒子の調製）
金コロイド（粒径４０ｎｍ）０．５ｍＬに、５０μｇ／ｍＬの抗Ｂ型インフルエンザ核タンパク質抗体（Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ，Ｍｏｍｏｃｌｏｎａｌ（Ｃｌｏｎｅ  ９Ｄ６），タカラバイオ社製）を１００μＬ加え、１０分間室温で静置した。続いて、１重量％の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１００μＬ加え、更に１０分間室温で静置した。その後、８，０００×Ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去し、１重量％の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１００μＬ加え粒子を分散させた。【００６７】
作製例（検出装置）
光源と光学フィルタと光電子倍増管（ＰＭＴ）からなる検出ユニットを有し、該検出ユニットが、モーターによって一定速度で直線移動する機構を備え、ＰＭＴの受光強度を５０μ秒ごとに記録する記録機構を備えた検出装置を作製した。なお、検出ユニットは、光源が５３２ｎｍのレーザダイオードであり、レーザダイオードをサンプルに照射し、反射光を５５０ｎｍ以上の波長の光のみを透過する光学フィルタを透過させた後に光電子増倍管（ＰＭＴ）（浜松ホトニクス社製、ヘッドオン型光電子倍増管（商品名））で受光する機構を有する。なお、本実施例において反射光の検出はすべて室温（２５℃）で行った。【００６８】
実施例１（イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製）
調製例１、２で得られた蛍光シリカ粒子と抗体の複合粒子のコロイド２４０μＬと調製例３で得られた金コロイド粒子と抗体の複合粒子１００μＬと５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）４６０μＬを混合した。得られた混合液８００μＬをＧｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（ＧＦＣＰ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）（８×１５０ｍｍ）に均等に塗布した。デシケーター内で室温下、一夜減圧乾燥し、調製例で得られた複合粒子を含有してなるコンジュゲートパッドを作製した。【００６９】
次に、抗体固定化メンブレンを以下の方法で作製した。
メンブレン（丈２５ｍｍ、商品名：Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ１２０  メンブレン、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）の端から約９ｍｍの位置に、幅約１ｍｍのＡ型インフルエンザ用テストラインとして、マウス由来の抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＩｎＡ２４５，ＨｙＴｅｓｔ社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。
続いて、幅約１ｍｍのＢ型インフルエンザ用テストラインとして、マウス由来の抗Ｂ型インフルエンザ核タンパク質抗体（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。なお、Ａ型インフルエンザ用テストラインとＢ型インフルエンザ用テストラインとの間隔ｄは３ｍｍとした。【００７０】
続いて、幅約１ｍｍのコントロールラインとして、ヤギ由来の抗マウスＩｇＧ抗体（ＡＫＰ  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）シュガー・フリー）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、５０℃で３０分乾燥させた。なお、Ｂ型インフルエンザ用テストラインとコントロールラインとの間隔は３ｍｍとした。
サンプルパッド（Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（ＧＦＣＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、前記コンジュゲートパッド、前記抗体固定化メンブレン、及び吸収パッド（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐａｄ（ＣＦＳＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）をバッキングシート（商品名ＡＲ９０２０，Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）上でこの順に組み立てた。なお、メンブレンはＡ型インフルエンザ用テストラインがコンジュゲートパッド側、コントロールラインが吸収パッド側になる向きで構成した。【００７１】
インフルエンザ核タンパク質の迅速判定
表２に示す組成で、Ａ型インフルエンザ核タンパク質とＢ型インフルエンザ核タンパク質の混合液を調製した。続いて同混合液をテストストリップのサンプルパッド部分に１００μＬ滴下した。１５分後、作製例の検出器による測定、およびＡ型インフルエンザ用テストラインの蛍光リーダーによる判定、Ｂ型インフルエンザ用テストラインの目視による判定を行った。ここで蛍光リーダーとは、波長５３２ｎｍのレーザダイオードと光学フィルターからなる装置であり、メンブレンのライン領域に前記レーザダイオードを照射し、光学フィルムを介してラインを観察することによって、蛍光粒子の発する蛍光のみを観察する装置である。【００７２】
測定結果の一例として、Ｎｏ１６のメンブレンを測定したときの蛍光プロファイルを図５に示す。図中位置９ｍｍ付近の上に凸のピークは、Ａ型インフルエンザ用テストラインに結合した蛍光シリカ粒子によるピークである。位置１２ｍｍ付近の下に凸のピークは、Ｂ型インフルエンザ用テストラインに結合した金頃ロイドによるピークである。位置１５ｍｍ付近の上に凸のピークは、コントロールラインに結合した蛍光シリカ粒子によるピークである。【００７３】
測定および判定の結果を表２に示す。表中ラインｎｔ１は、Ａ型インフルエンザ用テストライン、ラインｎｔ２は、Ｂ型インフルエンザ用テストラインを示す。判定器の値のベースライン値は、メンブレンの位置１０．５ｍｍの蛍光強度の値である。ラインｎｔ１の値は、Ａ型インフルエンザ用テストラインの蛍光強度のピーク値（Ｉ１）である。ラインｎｔ２の値は、Ｂ型インフルエンザ用テストラインの蛍光強度のピーク値（Ｉ２）である。また、ラインの判定は、ラインｎｔ１は蛍光リーダーを用いた判定であり、ラインｎｔ２は目視の判定である。「＋」はラインが見えたことを意味し、「−」はラインが見えなかったことを意味する。なお蛍光リーダーとは光源として５３２ｎｍのレーザダイオードを照射し、反射光を、５４０ｎｍ以上の波長の光のみを透過する光学フィルタを通して目視で観察する装置である。
Ａ型インフルエンザ核タンパク質の濃度とＩ１−Ｉｃの相関、およびＢ型インフルエンザ核タンパク質濃度とＩｃ−Ｉ２の相関を図６および図７にそれぞれに示す。【００７４】
この結果から、Ａ型インフルエンザ用テストラインについて、Ａ型インフルエンザ核タンパク質を１０ｎｇ／ｍＬ以上含むサンプルでは、ラインのピークの蛍光強度とベースライン（図５中の補助線Ｉｃ参照）の蛍光強度の差（Ｉ１−Ｉｃ）は、Ａ型インフルエンザ核タンパク質を含まないサンプルの値に比べて優位に大きい値である。具体的にはＡ型インフルエンザ核タンパク質を１００ｎｇ／ｍＬ以上含むサンプルでは、ラインのピークの蛍光強度とベースラインの蛍光強度の差（Ｉ１−Ｉｃ）は、ベースラインの蛍光強度Ｉｃの３０％以上の値であるのに対し、Ａ型インフルエンザ核タンパク質を含まないサンプルでは、５％以下の値である。また、蛍光リーダーでの判定では、検出限界が２０ｎｇ／ｍＬであったことから、本検出手法は高感度であることが分かる。【００７５】
同様に、Ｂ型インフルエンザ用テストラインについて、Ｂ型インフルエンザ核タンパク質を２００ｎｇ／ｍＬ以上含むサンプルでは、ベースラインの蛍光強度とラインのピークの蛍光強度の差（Ｉｃ−Ｉ２）は、Ｂ型インフルエンザ核タンパク質を含まないサンプルの値に比べて優位に大きい値である。具体的にはＢ型インフルエンザ核タンパク質を２００ｎｇ／ｍＬ以上含むサンプルでは、ベースラインの蛍光強度とラインのピークの蛍光強度の差（Ｉｃ−Ｉ２）は、ベースラインの蛍光強度Ｉｃの１５％以上の値であるのに対し、Ｂ型インフルエンザ核タンパク質を含まないサンプルでは、４％以下の値である。また、目視の判定では、検出限界が５００ｎｇ／ｍＬであったことから、本検出手法の方が高感度である。
以上より、本検出手法は、１回の測定で同時に２項目の検出が可能であり、かつ蛍光リーダーや目視の判定より高感度であるといえる。【００７６】
【表２】
0005579343.tif 000005
Ａ型：Ａ型インフルエンザ核タンパク質
Ｂ型：Ｂ型インフルエンザ核タンパク質
ラインの判定：ラインｎｔ１は蛍光リーダによる判定。ラインｎｔ２は目視による判定。【００７７】
（実施例２）標的物質の定量
実施例１の表２に示した結果をもとに、Ａ型インフルエンザ核タンパク質とＢ型インフルエンザ核タンパク質との検量線を作成した。これに基づき、２種類の被験体Ａ，Ｂ（体液）を採取し、その一括検出を前記の装置を用いて行った。その結果は、被験体Ａでは、Ｉ１−Ｉｃが０．２１６、Ｉｃ−Ｉ２については０．００２であった。被験体Ｂでは、Ｉ１−Ｉｃが０．００５、Ｉｃ−Ｉ２については０．０４４であった。この結果から、当該試験体ＡのＡ型インフルエンザ核タンパク質は２７ｎｇ／ｍｌであり、当該試験体ＢのＢ型インフルエンザ核タンパク質は２４６ｎｇ／ｍｌと同定された。別の方法（ＥＬＩＳＡ法）を用いて上記被検体の成分を同定したところ、上記の結果と良く一致した。この結果から、本発明によれば、高い精度の定量検出が可能であることが分かる。
さらに、上記の検量線をピーク強度差ではなくピーク面積に替えて作成し、定量測定を行った。その結果、さらに定量検出の精度が高まることが分かった。【００７８】
調製例４（吸光シリカナノ粒子の調製）
５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ・スクシンイミジルエステル（商品名、ｅｍｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ社製）２．９ｍｇを１ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ここに１．３μＬのＡＰＳを加え、室温（２５℃）で１時間反応を行った。
続いて、ヘプタン４ｍｌにＡＯＴ（エーロゾルＯＴ）２８０ｍｇを加えた。ここに、蒸留水４０μｌ、２８％アンモニア水４０μｌを加え、良く撹拌し、逆ミセルを調製した。
上記の逆ミセル液に、５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ／シランカップリング剤複合体溶液２００μｌ、ＴＥＯＳ（オルトけい酸テトラエチル）１００μｌを加え、室温で良く混合し、２４時間反応を行った。
反応液にアセトンを４ｍｌ加え良く混合した後、２２０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカ粒子にエタノールを１ｍｌ加え分散させ、再度２２０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返した。続いて、沈殿したシリカ粒子に蒸留水を１ｍｌ加え分散させ、２２０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、吸光シリカ粒子分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去した。
これによって、５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ含有吸光シリカ粒子（平均粒径２３８ｎｍ）を２０．２ｍｇ得た。収率７４％。
（５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ含有吸光シリカ粒子の吸光スペクトル並びに吸光最大波長におけるモル吸光係数εの測定）
吸光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）及び光路長１ｃｍのセルを用いて、５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ含有吸光シリカ粒子の水分散液の吸光スペクトルと吸光最大波長（５４６ｎｍ）におけるモル吸光係数εを測定した。５３２ｎｍにおけるεは１．１×１０１０Ｍ−１ｃｍ−１であった。【００７９】
調製例５（シリカ粒子と抗体の複合粒子の調製）
調製例２と同様の方法で調製例６の５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ含有吸光シリカ粒子と抗B型インフルエンザ各タンパク質抗体の複合粒子コロイド０．５ｍｇ／ｍｌを１ｍＬ得た。【００８０】
（実施例３）
実施例１と同様の方法で、インフルエンザ核タンパク質の迅速判定試験を実施した。測定および判定の結果を表３に示す。【００８１】
【表３】
0005579343.tif 000006
【００８２】
この結果から、Ａ型インフルエンザ用テストラインについて、Ａ型インフルエンザ核タンパク質を１０ｎｇ／ｍＬ以上含むサンプルでは、ラインのピークの蛍光強度とベースラインの蛍光強度の差（Ｉ１−Ｉｃ）は、Ａ型インフルエンザ核タンパク質を含まないサンプルの値に比べて優位に大きい値である。また、蛍光リーダーでの判定では、検出限界が２０ｎｇ／ｍＬであったことから、本検出手法は高感度であることが分かる。【００８３】
同様に、Ｂ型インフルエンザ用テストラインについて、Ｂ型インフルエンザ核タンパク質を２００ｎｇ／ｍＬ以上含むサンプルでは、ベースラインの蛍光強度とラインのピークの蛍光強度の差（Ｉｃ−Ｉ２）は、Ｂ型インフルエンザ核タンパク質を含まないサンプルの値に比べて優位に大きい値である。また、目視の判定では、検出限界が５００ｎｇ／ｍＬであったことから、本検出手法の方が高感度である。
以上より、本検出手法は、１回の測定で同時に２項目の検出が可能であり、かつ蛍光リーダーや目視の判定より高感度であるといえる。【００８４】
調製例６（蛍光シリカナノ粒子の調製）
ＡＴＴＯ５３２−ＮＨＳエステル（商品名、ＡＴＴＯ−ＴＥＣ  ＧｍｂＨ社製）３．５ｍｇを１ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ここに１．３μＬのＡＰＳを加え、室温（２５℃）で１時間反応を行った。
得られた反応液６００μＬと、エタノール１４０ｍＬ、ＴＥＯＳ６．５ｍＬ、蒸留水３５ｍＬ及び２８質量％アンモニア水１５．５ｍＬを混合し、室温で２４時間反応を行った。
反応液を１５０００×Ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカ粒子に蒸留水を４ｍＬ加え、粒子を分散させ、再度１５０００×Ｇの重力加速度で２０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、シリカナノ粒子分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去し、平均粒径２３８ｎｍのシリカナノ粒子１．４７ｇを得た。収率約８３％。【００８５】
調製例７（シリカ粒子と抗体の複合粒子の調製）
調製例２と同様の方法でＡＴＴＯ５３２含有蛍光シリカ粒子と抗ノロウィルスＧＩモノクローナル抗体（自社製）の複合粒子コロイド０．５ｍｇ／ｍｌを１ｍＬ得た。【００８６】
調製例８（吸光シリカナノ粒子の調製）
５−（ａｎｄ−６）−Ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ，  Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｅｓｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）３．３ｍｇを１ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ここに１．４μｌのＡＰＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン）を加え、室温（２３℃）で１時間反応を行い、ＴＡＭＲＡ／シランカップリング剤複合体溶液を得た。
続いて、ヘプタン４ｍｌにＡＯＴ（エーロゾルＯＴ）２８０ｍｇを加えた。ここに、蒸留水４０μｌ、２８％アンモニア水４０μｌを加え、良く撹拌し、逆ミセルを調製した。
上記の逆ミセル液に、ＴＡＭＲＡ／シランカップリング剤複合体溶液２００μｌ、ＴＥＯＳ（オルトけい酸テトラエチル）１００μｌを加え、室温で良く混合し、２４時間反応を行った。
反応液にアセトンを４ｍｌ加え良く混合した後、２２０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカ粒子にエタノールを１ｍｌ加え分散させ、再度２２０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返した。続いて、沈殿したシリカ粒子に蒸留水を１ｍｌ加え分散させ、２２０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、吸光シリカ粒子分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去した。
これによって、ＴＡＭＲＡ含有吸光シリカ粒子（平均粒径２１１ｎｍ）を１８．０ｍｇ得た。収率６６％。【００８７】
（ＴＡＭＲＡ含有コロイドシリカ粒子の吸光スペクトル並びに吸光最大波長におけるモル吸光係数εの測定）
吸光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）及び光路長１ｃｍのセルを用いて、ＴＡＭＲＡ含有コロイドシリカ粒子の水分散液の吸光スペクトルと吸光最大波長（５４６ｎｍ）におけるモル吸光係数εを測定した。６６０ｎｍにおけるεは１．６×１０１０Ｍ−１ｃｍ−１であった。【００８８】
調製例９（シリカ粒子と抗体の複合粒子の調製）
調製例２と同様の方法でＴＡＭＲＡ含有吸光シリカ粒子と抗ノロウィルスＧＩＩモノクローナル抗体（自社製）の複合粒子コロイド０．５ｍｇ／ｍｌを１ｍＬ得た。【００８９】
（実施例４）
調製例７で得られた蛍光シリカ粒子と抗体の複合粒子のコロイド２４０μＬと調製例９で得られた吸光シリカ粒子と抗体の複合粒子１００μＬと５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）４６０μＬを混合した。得られた混合液８００μＬをＧｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（ＧＦＣＰ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）（８×１５０ｍｍ）に均等に塗布した。デシケーター内で室温下、一夜減圧乾燥し、調製例で得られた複合粒子を含有してなるコンジュゲートパッドを作製した。
次に、抗体固定化メンブレンを以下の方法で作製した。
メンブレン（丈２５ｍｍ、商品名：Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ１８０  メンブレン、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）の端から約９ｍｍの位置に、幅約１ｍｍのノロウィルスＧＩ用テストラインとして、マウス由来の抗ノロウィルスＧＩ抗体（自社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。
続いて、幅約１ｍｍのノロウィルスＧＩＩ用テストラインとして、マウス由来の抗ノロウィルスＧＩＩ抗体（自社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。なお、ノロウィルスＧＩ用テストラインとノロウィルスＧＩＩ用テストラインとの間隔ｄは３ｍｍとした。
続いて、幅約１ｍｍのコントロールラインとして、ヤギ由来の抗マウスＩｇＧ抗体（ＡＫＰ  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）シュガー・フリー）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、５０℃で３０分乾燥させた。なお、ノロウィルスＧＩＩ用テストラインとコントロールラインとの間隔は３ｍｍとした。
サンプルパッド（Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（ＧＦＣＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、前記コンジュゲートパッド、前記抗体固定化メンブレン、及び吸収パッド（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐａｄ（ＣＦＳＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）をバッキングシート（商品名ＡＲ９０２０，Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）上でこの順に組み立てた。なお、メンブレンはノロウィルスＧＩ用テストラインがコンジュゲートパッド側、コントロールラインが吸収パッド側になる向きで構成した。【００９０】
ノロウィルス抗原の迅速判定
表４に示す組成で、ノロウィルスＧＩ抗原（ＶＬＰ  ＧＩ／１）とノロウィルスＧＩ抗原（ＶＬＰ  ＧＩＩ／４）の混合液を調製した。続いて同混合液をテストストリップのサンプルパッド部分に１００μＬ滴下した。１５分後、作製例の検出器による測定、およびノロウィルスＧＩ用テストラインの蛍光リーダーによる判定、ノロウィルスＧＩＩ用テストラインの目視による判定を行った。【００９１】
【表４】
0005579343.tif 000007
【００９２】
この結果から、ノロウィルスＧＩ用テストラインについて、ＶＬＰ  ＧＩ／１を０．１ｎｇ／ｍＬ以上含むサンプルでは、ラインのピークの蛍光強度とベースラインの蛍光強度の差（Ｉ１−Ｉｃ）は、ＶＬＰ  ＧＩ／１を含まないサンプルの値に比べて優位に大きい値である。また、蛍光リーダーでの判定では、検出限界が０．２ｎｇ／ｍＬであったことから、本検出手法は高感度であることが分かる。
同様に、ノロウィルスＧＩＩ用テストラインについて、ＶＬＰ  ＧＩＩ／４を１ｎｇ／ｍＬ以上含むサンプルでは、ベースラインの蛍光強度とラインのピークの蛍光強度の差（Ｉｃ−Ｉ２）は、ＶＬＰ  ＧＩＩ／４を含まないサンプルの値に比べて優位に大きい値である。また、目視の判定では、検出限界が２．５ｎｇ／ｍＬであったことから、本検出手法の方が高感度である。
以上より、本検出手法は、１回の測定で同時に２項目の検出が可能であり、かつ蛍光リーダーや目視の判定より高感度であるといえる。【００９３】
本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。
本願は、２０１２年１１月２８日に日本国で特許出願された特願２０１２−２６０２２７に基づく優先権を主張するものであり、これらはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。
【符号の説明】
【００９４】
１  標的物質（被検物質）
１Ａ  第１標的物質
１Ｂ  第２標的物質
２  蛍光標識体
２ａ  蛍光微粒子
２ｂ  結合性物質
３  吸光標識体
３ａ  吸光微粒子
３ｂ  結合性物質
４、５  試験用捕捉性物質
６  筐体
６１  検出開口部
６２  検体導入開口部
６ａ  筐体上部
６ｂ  筐体下部
８ａ  サンプルパッド
８ｂ  コンジュゲートパッド
８ｃ  メンブレン
８ｄ  吸収パッド
８ｅ  バッキングシート
７  参照用捕捉性物質
１０  試験片（テストストリップ）
１００  長尺試験体
ｎｔ１  第１試験領域（テストライン）
ｎｔ２  第２試験領域（テストライン）
ｎｒ    参照領域（リファレンスライン）
Ｌ  ラテラルフロー方向
Ｓ  検体液【００９５】
２０  検出部
２１  検出ユニット本体
２１ａ  サンプル導入部
２１ｂ  サンプルガイド
２３  配線
２５  パーソナルコンピュータ（制御部）
２７  受光器
２８  受光レンズ
２９  光照射器
【要約】
蛍光および吸光をそれぞれ検出装置で一括して検出測定する多項目検出用イムノクロマトグラフィーであって、蛍光粒子および吸光粒子は、蛍光粒子の蛍光の励起波長と吸光粒子の吸収波長とが同一の波長領域とされ、試験領域の反射光強度と試験領域の反射光強度と試験領域および試験領域以外の非試験領域の反射光強度とを一括して検出測定するイムノクロマトグラフィー。
【選択図】図１【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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