(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞中で導入遺伝子を発現させる調節配列に作動可能に連結された少なくとも１つの抗原をコードする導入遺伝子が安定的に組み込まれているサルアデノウイルスゲノムを含み、
抗原がトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）又はその少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含み、
サルアデノウイルスゲノムが、チンパンジーアデノウイルス分離株６３（ＡｄＣｈ６３）のゲノムである、組換え複製欠損サルアデノウイルスベクター。
【請求項２】
抗原が、ＭＥ．ＴＲＡＰを含む、又はＭＥ．ＴＲＡＰからなる、請求項１に記載のサルアデノウイルスベクター。
【請求項３】
導入遺伝子を発現させる調節配列がＣＭＶプロモーターを含む、請求項１又は２に記載のサルアデノウイルスベクター。
【請求項４】
調節配列が、ＨＣＭＶ  ＩＥ１遺伝子のプロモーターと、イントロンＡを含むＨＣＭＶ  ＩＥ１遺伝子の５’非翻訳領域のフラグメントとを含む、請求項３に記載のサルアデノウイルスベクター。
【請求項５】
感染性ウイルス粒子にパッケージングされたサルアデノウイルスゲノムを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のサルアデノウイルスベクター。
【請求項６】
１つ又は複数の薬学的に許容可能な媒体、担体、希釈剤、又はアジュバントと混合した請求項１〜５のいずれか一項に記載のサルアデノウイルスベクターを含む免疫原性組成物。
【請求項７】
１つ又は複数の薬学的に許容可能な媒体、担体、希釈剤、又はアジュバントと混合した請求項１〜５のいずれか一項に記載のサルアデノウイルスベクターを含むワクチン組成物。
【請求項８】
ｉ）組換え複製欠損サルアデノウイルスベクターを含む初回刺激組成物であって、サルアデノウイルスベクターが、哺乳動物細胞において導入遺伝子を発現させる調節配列に作動可能に連結された少なくとも１つの抗原をコードする導入遺伝子が安定的に組み込まれているサルアデノウイルスゲノムを含み、抗原がトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）又はその少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含み、かつサルアデノウイルスゲノムが、チンパンジーアデノウイルス分離株６３（ＡｄＣｈ６３）のゲノムである、初回刺激組成物と、
ｉｉ）非アデノウイルスベクターを含む追加免疫組成物であって、非アデノウイルスベクターがトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）又はその少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む抗原もコードする追加免疫組成物と
を含む製品の組合せ又はキット。
【請求項９】
初回刺激組成物と追加免疫組成物が両方ともトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）又はその少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む同一の抗原をコードする、請求項８に記載の製品の組合せ又はキット。
【請求項１０】
初回刺激組成物と追加免疫組成物が両方ともＭＥ．ＴＲＡＰをコードする、請求項８又は９に記載の製品の組合せ又はキット。
【請求項１１】
ワクチンとして使用するための組換え複製欠損サルアデノウイルスベクターであって、  サルアデノウイルスベクターが、哺乳動物細胞において導入遺伝子を発現させる調節配列に作動可能に連結された少なくとも１つの抗原をコードする導入遺伝子が安定的に組み込まれているサルアデノウイルスゲノムを含み、抗原がトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）又はその少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含み、かつサルアデノウイルスゲノムが、チンパンジーアデノウイルス分離株６３（ＡｄＣｈ６３）のゲノムである、ワクチンとして使用するための組換え複製欠損サルアデノウイルスベクター。
【請求項１２】
ヒト対象においてトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）に対する免疫応答を誘発するのに使用するための薬物の製造における、組換え複製欠損サルアデノウイルスベクターの使用であって、
サルアデノウイルスベクターが、哺乳動物細胞において導入遺伝子を発現させる調節配列に作動可能に連結された少なくとも１つの抗原をコードする導入遺伝子が安定的に組み込まれているサルアデノウイルスゲノムを含み、抗原がトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）又はその少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含み、かつサルアデノウイルスゲノムが、チンパンジーアデノウイルス分離株６３（ＡｄＣｈ６３）のゲノムである、使用。
【請求項１３】
抗マラリアワクチンとして使用するための薬物の製造における、組換え複製欠損サルアデノウイルスベクターの使用であって、
サルアデノウイルスベクターが、哺乳動物細胞において導入遺伝子を発現させる調節配列に作動可能に連結された少なくとも１つの抗原をコードする導入遺伝子が安定的に組み込まれているサルアデノウイルスゲノムを含み、抗原がトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）又はその少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含み、かつサルアデノウイルスゲノムが、チンパンジーアデノウイルス分離株６３（ＡｄＣｈ６３）のゲノムである、使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、マラリア寄生虫の生活環の前赤内期に対する免疫を誘発することができる組換えアデノウイルスベクターに関する。特に、本発明は、トロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）を含む抗原をコードする組換えサルアデノウイルスベクターを、またその前記ベクターを含む免疫原性組成物（たとえば、ワクチン）、及びそのような組成物を使用する方法も提供する。
【０００２】
［発明の背景］
マラリアは、依然として世界の主要な健康問題である。少なくとも３０億人、世界人口のほぼ半数が、マラリア流行地域で生活をしていると推定されており、３億から５億の臨床例と約１５０万の死亡が毎年報告されている［１］。効果的なワクチンを開発すれば、この疾患の問題を軽減することを助ける重要な業績となると考えられる。前赤内ワクチン接種法は、マラリア生活環のこの期に対する免疫がスポロゾイトとそれに続く肝内シゾントの両方に向けられる臨床試験においてある程度の有効性を示してきた［２］。細胞免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＩＦＮγ産生が肝臓期マラリアに対する保護において主要な役割を果たす前赤内免疫では重要であることがすでに明らかにされている［３］。
【０００３】
トロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）は、保護的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することがすでに明らかにされているスポロゾイト上で発現される抗原である［４］。ＴＲＡＰは、ＭＥ．ＴＲＡＰとして知られるいくつかのマラリア抗原由来の追加のＢ細胞、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含有するマルチエピトープストリングとの融合タンパク質としてワクチン臨床試験において広く試験されている［５、６］。
【０００４】
ＭＥ．ＴＲＡＰ抗原をコードするプラスミドＤＮＡに基づくワクチンベクター又は改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）は、本分野で試験されてきており（Ｍｏｏｒｔｈｙら、（２００４）ＰＬｏＳ、Ｍｅｄ  １（２）：ｅ３３）、初回刺激−追加免疫レジメ（ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ  ｒｅｇｉｍｅ）で使用されると、高頻度のエフェクターＴ細胞を誘導することが明らかにされている。
【０００５】
それにもかかわらず、ヒト対象における熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の自然感染を防ぎ、ほかにも、特にＣＤ８＋型のより強力なＴ細胞応答を誘導することができる改良された抗マラリアワクチンの必要性は残っている。ＤＮＡと、ＭＶＡ及び鶏痘などのポックスウイルスベクターの両方でのインサートとしてのＭＥ．ＴＲＡＰの臨床試験では、応答は主に、おそらくＣＤ８＋Ｔ細胞応答ほど保護的ではないＣＤ４＋型であった。
【０００６】
ヒト血清型５のアデノウイルスベクターは、マラリアのプラスモディウムヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）マウスモデルにおいてすでに使用されており、単回投与後に顕著な免疫原性及び著しい保護作用を示していた［７］。しかし、この血清型のヒトにおける使用を妨げている１つの主要限界は、広範なＡｄＨ５の存在であり、頻繁な小児期感染は抗体陽転をもたらす。ＡｄＨ５に対する既存の免疫という問題を回避するために、人間集団内で循環しないサル起源のアデノウイルス血清型の使用への関心が高まってきており、いくつかの研究では、ＳＡＲＳ［８］及びＨＩＶ［９、１０］のマウスモデルと非ヒト霊長類モデルの両方においてＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発するこれらのベクターの能力が実証されている。
【０００７】
［発明の概要］
本発明者らは、ＭＥ．ＴＲＡＰ抗原をコードするサルアデノウイルスベクター（特に、チンパンジーアデノウイルス分離株ＡｄＣｈ６３由来のアデノウイルスベクター）が、長期間にわたって、ＴＲＡＰに対する顕著なＣＤ８＋Ｔ細胞応答も高力価抗体応答も誘発することができることを、現在明らかにした。さらに、同じ導入遺伝子をコードするＭＶＡベクターのそれに続く投与により免疫原性を追加免疫することができ、起こりえるヒト免疫原性の優れた予測因子として使用される種であるアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）において強い免疫原性が観察される。免疫原性は、第１相ヒト臨床研究においても実証されている。マウス誘発モデルにおいてＭＥ．ＴＲＡＰをコードするＡｄＣｈ６３ベクターを使用して研究された予防効果は、他のアデノウイルスベクターの場合よりも意外に大きかった。このマウスモデルの有効性は、本分野において、ヒトに対して有用な予測的指標であると広く見られている。
【０００８】
第１の態様では、本発明は、トロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）又はその少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む抗原をコードする組換え複製欠損サルアデノウイルスベクターを提供する。
【０００９】
一実施形態では、サルアデノウイルスベクターは、哺乳動物細胞中で導入遺伝子を発現させる調節配列に作動可能に連結された少なくとも１つの抗原をコードする導入遺伝子が安定的に組み込まれているサルアデノウイルスゲノムを含み、抗原はトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）又はその少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む。
【００１０】
一実施形態では、前記サルアデノウイルスゲノムは、チンパンジーアデノウイルスベクターのゲノムである。
【００１１】
特定の非限定的な実施形態では、前記サルアデノウイルスゲノムは、チンパンジーアデノウイルス分離株６３（ＡｄＣｈ６３）のゲノムでもよい。ＡｄＣ９としても知られているベクターＡｄＣ６８、又はＡｄＣｈ３ベクター、又はＡｄＣ６若しくはＡｄＣ７ベクターも使用してよいが、ＡｄＣｈ６３ベクターが好ましい。したがって、本発明は、特にトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）又はその少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む抗原をコードする組換え複製欠損ＡｄＣｈ６３ベクターに関する。
【００１２】
本発明のすべての実施形態では、サルアデノウイルスベクターによってコードされている抗原は、ＭＥ．ＴＲＡＰを含むものでも、ＭＥ．ＴＲＡＰからなるものでもよい。
【００１３】
特定の非限定的な実施形態では、本発明は、ＭＥ．ＴＲＡＰをコードする組換え複製欠損サルアデノウイルスベクター（特にＡｄＣＨ６３ベクター）であって、ＭＥ．ＴＲＡＰの発現が、ヒトＣＭＶ  ＩＥ１遺伝子のプロモーターと、イントロンＡを含むヒトＣＭＶ  ＩＥ１遺伝子の５’非翻訳領域のフラグメントとを含む調節配列（本明細書では「長い」ＨＣＭＶプロモーターとも呼ばれる）により推進される、組換え複製欠損サルアデノウイルスベクター（特にＡｄＣｈ６３ベクター）を提供する。
【００１４】
第２の態様では、本発明は、１つ又は複数の薬学的に許容可能な媒体、担体、希釈剤、又はアジュバントと混合した本発明の第１の態様に従ったサルアデノウイルスベクターを含む免疫原性組成物を提供する。
【００１５】
関連する態様では、本発明は、１つ又は複数の薬学的に許容可能な媒体、担体、希釈剤、又はアジュバントと混合した本発明の第１の態様に従ったサルアデノウイルスベクターを含むワクチン組成物を提供する。
【００１６】
特定の非限定的な実施形態では、本発明は、ＭＥ．ＴＲＡＰをコードする組換え複製欠損サルアデノウイルスベクター（特にＡｄＣＨ６３ベクター）であって、ＭＥ．ＴＲＡＰの発現が、「長い」ＨＣＭＶプロモーターにより推進される、組換え複製欠損サルアデノウイルスベクター（特にＡｄＣｈ６３ベクター）を含む免疫原性組成物又はワクチン組成物を提供する。特定の非限定的な実施形態では、前記免疫原性又はワクチン組成物は、１０ｍＭヒスチジン、７．５％ショ糖、３５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％ＰＳ８０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％エタノール、ｐＨ６．６に処方されたヒト対象への皮内投与に適している前記アデノウイルスベクターを含む。
【００１７】
第３の態様では、本発明は、ヒト対象においてトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）に対する免疫応答を誘発する方法であって、対象に（本発明の第１の態様に従った）ＴＲＡＰをコードする組換えサルアデノウイルスベクターを含む免疫原性組成物又はワクチン組成物を、前記対象においてＴＲＡＰに対する免疫応答を誘発するのに十分な量で投与するステップを含む方法を提供する。
【００１８】
一実施形態では、免疫原性又はワクチン組成物は単回用量免疫感作（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）として投与する。
【００１９】
第４の態様では、本発明は、ヒト対象においてトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）に対する免疫応答を誘発する方法であって、
ｉ）（本発明の第１の態様に従った）ＴＲＡＰをコードする組換えサルアデノウイルスベクターを含む初回刺激用量の免疫原性組成物又はワクチン組成物を対象に投与するステップと、
ｉｉ）トロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）を含む抗原をコードする非アデノウイルスベクターを含む追加免疫用量の免疫原性又はワクチン組成物を同一対象に投与するステップであって、初回刺激用量の少なくとも２週間後に追加免疫用量を投与するステップと
を含む方法を提供する。
【００２０】
一実施形態では、追加免疫用量の８週間後に追加免疫用量を投与してもよい。
【００２１】
１つ又は複数の追加の追加免疫用量を、その対象において誘発される免疫応答を最適化するために必要であれば同一対象に投与してもよい。
【００２２】
一実施形態では、ステップｉｉ）において投与される非アデノウイルスベクターは、組換えポックスウイルスベクター、たとえば、改変されたワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）である。
【００２３】
第５の態様では、本発明は、
ｉ）ＴＲＡＰ、又はその少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む抗原をコードするサルアデノウイルスベクターを含む初回刺激組成物と、
ｉｉ）非アデノウイルスベクターを含む追加免疫組成物であって、非アデノウイルスベクターがトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）又はその少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む抗原もコードする追加免疫組成物と
を含む製品の組合せ又はキットを提供する。
【００２４】
初回刺激組成物は、好ましくは、哺乳動物細胞において導入遺伝子を発現させる調節配列に作動可能に連結された少なくとも１つの抗原をコードする導入遺伝子が安定的に組み込まれているサルアデノウイルスゲノムを含むサルアデノウイルスベクターであって、前記抗原がトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）又はその少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む、サルアデノウイルスベクターを含む。
【００２５】
一実施形態では、初回刺激組成物と追加免疫組成物が両方ともトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）又はその少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む同一の抗原をコードしていてもよい。
【００２６】
特定の非限定的な実施形態では、初回刺激組成物と追加免疫組成物が両方ともＭＥ．ＴＲＡＰをコードしていてもよい。
【００２７】
追加の態様では、本発明は、ワクチンとして使用するための、ＴＲＡＰを含む抗原をコードする組換え複製欠損サルアデノウイルスベクター、特に、哺乳動物細胞において導入遺伝子を発現させる調節配列に作動可能に連結された少なくとも１つの抗原をコードする導入遺伝子が安定的に組み込まれているサルアデノウイルスゲノムを含み、抗原がトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）又はその少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むサルアデノウイルスベクターを提供する。
【００２８】
本発明は、ヒト対象においてトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）に対する免疫応答を誘発するのに使用するための薬物の製造における、ＴＲＡＰを含む抗原をコードする組換え複製欠損サルアデノウイルスベクター、特に、哺乳動物細胞において導入遺伝子を発現させる調節配列に作動可能に連結された少なくとも１つの抗原をコードする導入遺伝子が安定的に組み込まれているサルアデノウイルスゲノムを含み、抗原がトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）又はその少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むサルアデノウイルスベクターの使用も提供する。
【００２９】
本発明は、抗マラリアワクチンとして使用するための薬物の製造における、ＴＲＡＰを含む抗原をコードする組換え複製欠損サルアデノウイルスベクター、特に、哺乳動物細胞において導入遺伝子を発現させる調節配列に作動可能に連結された少なくとも１つの抗原をコードする導入遺伝子が安定的に組み込まれているサルアデノウイルスゲノムを含み、抗原がトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）又はその少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むサルアデノウイルスベクターの使用をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１ａ】抗原ＭＥ．ＴＲＡＰをコードするチンパンジーアデノウイルスベクターＡｄＣｈ６３に基づく本発明に従った例示的なアデノウイルスベクターの構築を図式的に示す図である。図１ａは、プラスミドｐＳＧ２  ＭＥ−ＴＲＡＰを示している。
【図１ｂ】抗原ＭＥ．ＴＲＡＰをコードするチンパンジーアデノウイルスベクターＡｄＣｈ６３に基づく本発明に従った例示的なアデノウイルスベクターの構築を図式的に示す図である。図１ｂは、ＡｆｅＩ及びＳａｌＩを使用した消化によりｐＳＧ２  ＭＥ−ＴＲＡＰから切り出した４．７ｋｂフラグメントを示している。このフラグメントは、ＨＣＭＶプロモーター、イントロンＡ、ＭＥＴＲＡＰ及びＢＧＨポリＡ配列を含有している。
【図１ｃ】抗原ＭＥ．ＴＲＡＰをコードするチンパンジーアデノウイルスベクターＡｄＣｈ６３に基づく本発明に従った例示的なアデノウイルスベクターの構築を図式的に示す図である。図１ｃは、ＨＣＭＶ及びＢＧＨｐＡの制御下でＣ型肝炎ウイルスの非構造的領域（ＮＳ）を担っているプレＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔアクセプターベクターを示している。
【図１ｄ】抗原ＭＥ．ＴＲＡＰをコードするチンパンジーアデノウイルスベクターＡｄＣｈ６３に基づく本発明に従った例示的なアデノウイルスベクターの構築を図式的に示す図である。図１ｄは、ＭＥ−ＴＲＡＰ抗原を含有するプレプラスミドｐＣｈＡｄ６３を示している。
【図２】単回初回刺激後のＡｄＣｈ６３ＭＥ．ＴＲＡＰの免疫原性を示す図である。生後６〜８週間ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＭＥ．ＴＲＡＰをコードする１×１０１０ｖｐのサルアデノウイルスベクターＡｄＣｈ６３及びＡｄＣ９で免疫感作した。免疫原性は、免疫感作の７、１２、及び６０日後にＥＬＩＳｐｏｔにより血液中で分析した。
【図３ａ】寄生虫誘発に対するＭＥ．ＴＲＡＰをコードするサルアデノウイルスベクターＡｄＣｈ６３及びＡｄＣ９の無菌保護及び有効性を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、アデノウイルス（１×１０１０ｖｐ）ベクターで免疫感作し、次にプラスモディウムベルゲイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ）の１０００スポロゾイトの静脈投与によって１４日後（ｎ＝６）及び６０日後（ｎ＝６）に誘発した。
【図３ｂ】寄生虫誘発に対するＭＥ．ＴＲＡＰをコードするサルアデノウイルスベクターＡｄＣｈ６３及びＡｄＣ９の無菌保護及び有効性を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、アデノウイルス（１×１０１０ｖｐ）ベクターで免疫感作し、次にプラスモディウムベルゲイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ）の１０００スポロゾイトの静脈投与によって１４日後（ｎ＝６）及び６０日後（ｎ＝６）に誘発した。
【図４ａ】アデノウイルス−ＭＶＡ初回刺激−追加免疫レジメによる免疫原性を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＭＥ．ＴＲＡＰをコードする（５×１０９ｖｐの）サルアデノウイルスベクターＡｄＣｈ６３及びＡｄＣ９をワクチン接種した。マウスはすべて８週間後にＭＶＡ  ＭＥ．ＴＲＡＰ（１×１０７ｐｆｕ）で再度免疫感作し、Ｔ細胞応答を１４日後にフローサイトメトリーにより（ａ）、追加免疫後の６３日目と１８２日目にはＥＬＩＳｐｏｔにより（ｂ）評価した。ＩｇＧ抗体の誘導もＭＶＡでの追加免疫の２８日後にＥＬＩＳＡにより定量した（ｃ）。
【図４ｂ】アデノウイルス−ＭＶＡ初回刺激−追加免疫レジメによる免疫原性を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＭＥ．ＴＲＡＰをコードする（５×１０９ｖｐの）サルアデノウイルスベクターＡｄＣｈ６３及びＡｄＣ９をワクチン接種した。マウスはすべて８週間後にＭＶＡ  ＭＥ．ＴＲＡＰ（１×１０７ｐｆｕ）で再度免疫感作し、Ｔ細胞応答を１４日後にフローサイトメトリーにより（ａ）、追加免疫後の６３日目と１８２日目にはＥＬＩＳｐｏｔにより（ｂ）評価した。ＩｇＧ抗体の誘導もＭＶＡでの追加免疫の２８日後にＥＬＩＳＡにより定量した（ｃ）。
【図４ｃ】アデノウイルス−ＭＶＡ初回刺激−追加免疫レジメによる免疫原性を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＭＥ．ＴＲＡＰをコードする（５×１０９ｖｐの）サルアデノウイルスベクターＡｄＣｈ６３及びＡｄＣ９をワクチン接種した。マウスはすべて８週間後にＭＶＡ  ＭＥ．ＴＲＡＰ（１×１０７ｐｆｕ）で再度免疫感作し、Ｔ細胞応答を１４日後にフローサイトメトリーにより（ａ）、追加免疫後の６３日目と１８２日目にはＥＬＩＳｐｏｔにより（ｂ）評価した。ＩｇＧ抗体の誘導もＭＶＡでの追加免疫の２８日後にＥＬＩＳＡにより定量した（ｃ）。
【図５ａ】寄生虫誘発に対するアデノウイルス−ＭＶＡ初回刺激−追加免疫レジメの無菌保護及び有効性を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、最初に、アデノウイルス（５×１０９ｖｐ）ベクターで免疫感作し、続いて８週間後にＭＥ．ＴＲＡＰをコードするＭＶＡ（１×１０７ｐｆｕ）で追加免疫した。マウスは、プラスモディウムベルゲイの１０００スポロゾイトの静脈投与によって１４日後（ａ）、６３日後（ｂ）及び１８２日後（ｃ）に誘発した。
【図５ｂ】寄生虫誘発に対するアデノウイルス−ＭＶＡ初回刺激−追加免疫レジメの無菌保護及び有効性を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、最初に、アデノウイルス（５×１０９ｖｐ）ベクターで免疫感作し、続いて８週間後にＭＥ．ＴＲＡＰをコードするＭＶＡ（１×１０７ｐｆｕ）で追加免疫した。マウスは、プラスモディウムベルゲイの１０００スポロゾイトの静脈投与によって１４日後（ａ）、６３日後（ｂ）及び１８２日後（ｃ）に誘発した。
【図５ｃ】寄生虫誘発に対するアデノウイルス−ＭＶＡ初回刺激−追加免疫レジメの無菌保護及び有効性を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、最初に、アデノウイルス（５×１０９ｖｐ）ベクターで免疫感作し、続いて８週間後にＭＥ．ＴＲＡＰをコードするＭＶＡ（１×１０７ｐｆｕ）で追加免疫した。マウスは、プラスモディウムベルゲイの１０００スポロゾイトの静脈投与によって１４日後（ａ）、６３日後（ｂ）及び１８２日後（ｃ）に誘発した。
【図６ａ】アカゲザルにおけるＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰ−初回刺激、ＭＶＡ  ＭＥ．ＴＲＡＰ−追加免疫レジメの免疫原性を示す図である。マカクは、ＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰ（５×１０１０ｖｐ）で筋肉及び皮内で免疫感作し、８週間後にＭＶＡ  ＭＥ．ＴＲＡＰ（２×１０８ｐｆｕ）で追加免疫した。免疫感作後血液中でｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴを実施しａ）Ａｄ−初回刺激及びＭＶＡ−追加免疫による免疫応答の動態は血液中で全体的なＭＥ．ＴＲＡＰ応答を示している。ｂ）ペプチドプールに対するＩＦＮγ応答は、初回刺激の４週間後及び追加免疫の１週間後にＭＥ．ＴＲＡＰの全配列に及んでいる（ｃ）。
【図６ｂ】アカゲザルにおけるＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰ−初回刺激、ＭＶＡ  ＭＥ．ＴＲＡＰ−追加免疫レジメの免疫原性を示す図である。マカクは、ＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰ（５×１０１０ｖｐ）で筋肉及び皮内で免疫感作し、８週間後にＭＶＡ  ＭＥ．ＴＲＡＰ（２×１０８ｐｆｕ）で追加免疫した。免疫感作後血液中でｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴを実施しａ）Ａｄ−初回刺激及びＭＶＡ−追加免疫による免疫応答の動態は血液中で全体的なＭＥ．ＴＲＡＰ応答を示している。ｂ）ペプチドプールに対するＩＦＮγ応答は、初回刺激の４週間後及び追加免疫の１週間後にＭＥ．ＴＲＡＰの全配列に及んでいる（ｃ）。
【図６ｃ】アカゲザルにおけるＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰ−初回刺激、ＭＶＡ  ＭＥ．ＴＲＡＰ−追加免疫レジメの免疫原性を示す図である。マカクは、ＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰ（５×１０１０ｖｐ）で筋肉及び皮内で免疫感作し、８週間後にＭＶＡ  ＭＥ．ＴＲＡＰ（２×１０８ｐｆｕ）で追加免疫した。免疫感作後血液中でｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴを実施しａ）Ａｄ−初回刺激及びＭＶＡ−追加免疫による免疫応答の動態は血液中で全体的なＭＥ．ＴＲＡＰ応答を示している。ｂ）ペプチドプールに対するＩＦＮγ応答は、初回刺激の４週間後及び追加免疫の１週間後にＭＥ．ＴＲＡＰの全配列に及んでいる（ｃ）。
【図７】アカゲザルで試験された２つの異なるＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰ−初回刺激、ＭＶＡ  ＭＥ．ＴＲＡＰ−追加免疫レジメを図式的に示す図である。時間（Ｔ）は週単位で示す。各場合で、初回刺激ワクチンはＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰ（５×１０１０ｖｐが筋肉内又は皮内に投与された）であり、８週間後の追加免疫はＭＶＡ  ＭＥ．ＴＲＡＰ（２×１０８ｐｆｕが皮内に投与された）を使用した。
【図８ａ】アカゲザルにおけるＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰ−初回刺激、ＭＶＡ  ＭＥ．ＴＲＡＰ−追加免疫レジメの免疫原性を示す図であり、ＴＲＡＰ  Ｔ細胞応答と抗体価を比較している。パネル（ａ）は、添付例に記載されたワクチン接種研究の時間経過にわたるＴＲＡＰペプチドプール上でのＩＦＮγ  ＥＬＩｓｐｏｔを使用して判定されたＴＲＡＰ  Ｔ細胞応答を示している（Ｔ＝週単位時間）。グループ１の対象は８週目と２４週目に追加免疫用量のＭＶＡ  ＭＥ．ＴＲＡＰを受け、一方、グループ２は８、１６、及び２４週目に追加免疫用量のＭＶＡ  ＭＥ．ＴＲＡＰを受けた。ＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰでの単回免疫感作は、１００万ＰＢＭＣ当たり約１０００ＳＦＵの強いＴ細胞応答を生じた。
【図８ｂ】アカゲザルにおけるＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰ−初回刺激、ＭＶＡ  ＭＥ．ＴＲＡＰ−追加免疫レジメの免疫原性を示す図であり、ＴＲＡＰ  Ｔ細胞応答と抗体価を比較している。パネル（ｂ）は、７名の個人のＴＲＡＰタンパク質に対して測定された抗体価の時間経過を示しており、強い抗体価がＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰでのワクチン接種により誘導され、ＭＶＡ  ＭＥ．ＴＲＡＰで追加免疫されたことを実証している。
【図９】ワクチンインサートに重複している１５アミノ酸長ペプチドプール（Ｔ９／９６  ＴＲＡＰ１５アミノ酸長）に対する、及び２０アミノ酸長ペプチドが重複している同一配列（Ｔ９／９６  ＴＲＡＰ２０アミノ酸長）に対するＩＦＮγ  ＥＬＩｓｐｏｔにより評価される、ヒト対象の第Ｉ相臨床試験ＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰのＴ細胞免疫原性の時間経過を示す図である。熱帯熱マラリア原虫の異種株を表す２０アミノ酸長ペプチド（３Ｄ７  ＴＲＡＰ２０アミノ酸長）に対する応答、及びＭＥポリエピトープストリングにおける短いストリングの主に九量体マラリアペプチドエピトープに対する応答も示されている（Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９７年、１１月：１５、１２８０〜８４頁）（ＭＥ）。
【００３１】
［発明の詳細な説明］
以下の段落では、本発明の種々の態様がさらに詳細に説明されている。本発明の一態様に関連して好ましいとして記載されるいかなる特徴も、別段に記載されない限り、本発明の他の態様に関連しても好ましい。
【００３２】
本発明者らは、前赤内マラリア（スポロゾイト）抗原トロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）を含む異種抗原を発現するサルアデノウイルスベクターを構築し、そのようなベクターが２つの異なる動物モデルにおいて強いＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することができることを観察した。ＴＲＡＰ抗原を発現するサルアデノウイルスベクターを使用して誘発されるＴ細胞応答のレベルは、特に霊長類モデルで試験される場合は、意外に高く、サルアデノウイルスベクターとＴＲＡＰ抗原の組合せが、この前赤内マラリア抗原に対する免疫を誘発するのに特に強力であることを示している。
【００３３】
したがって、本発明の主要な態様は、ＴＲＡＰ又はその少なくとも１つのエピトープ（好ましくはＴＲＡＰの少なくとも１つのＴ細胞エピトープ）を含む抗原をコードする組換え複製欠損サルアデノウイルスベクターを提供することである。組換え複製欠損サルアデノウイルスベクターは、典型的には、哺乳動物細胞において導入遺伝子を発現させる調節配列に作動可能に連結された少なくとも１つの抗原をコードする導入遺伝子が安定的に組み込まれたサルアデノウイルスゲノムであって、前記抗原がトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）又はその少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む、サルアデノウイルスゲノムを含むことになる。
【００３４】
アデノウイルスベクター、及び具体的にはサルアデノウイルスベクターは当技術分野では公知である。いくつかの複製欠損組換えサルアデノウイルスが国際公開第２００５／０７１０９３号パンフレットに記載されており、その内容は参照によりその全体を本明細書に組み込まれているものとする。
【００３５】
本発明のサルアデノウイルスベクターは、典型的には、哺乳動物細胞においてＴＲＡＰ抗原を発現させることができる調節配列に作動可能に連結されたＴＲＡＰ抗原をコードする核酸配列を含む導入遺伝子発現カセットの安定的挿入により改変されるサルアデノウイルスゲノムを含む。
【００３６】
本発明の組換えサルアデノウイルスベクターは、典型的には、前記ベクターが、ウイルス複製に不可欠な遺伝子産物をコードする遺伝子の機能的欠損、又は完全な除去のために、複製が不可能にされていることを意味する「複製欠損」である。一例として、本発明のベクターは、Ｅ１遺伝子のすべて又は一部、並びに任意選択でＥ３領域及び／又はＥ４領域も除去することにより複製欠損にしてもよい。サルアデノウイルスの天然Ｅ４領域を、ヒトアデノウイルスのＥ４領域、たとえば、Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６で置き換えてもよい。「複製欠損」サルアデノウイルスベクターの一般的特徴は、たとえば、国際公開第２００５／０７１０９３号パンフレットから、当技術分野では公知であり、前記特許文献の内容は参照により本明細書に組み込まれているものとする。
【００３７】
特定の、しかし非限定的な一実施形態では、本発明の組換えアデノウイルスベクターは、チンパンジーアデノウイルス分離株ＡｄＣｈ６３のゲノムに基づいていてもよい。この特定のウイルス血清型は、（たとえば、国際公開第２００５／０７１０９３号パンフレットから）当技術分野では公知であるが、プラスモディウム種の前赤内ＴＲＡＰ抗原のためのワクチン担体として記載されたことは以前は一度もなかった。本発明者らは、ＴＲＡＰ抗原を発現するＡｄＣｈ６３ベクター骨格の組合せが壮観なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導し、強いＴＲＡＰ特異的抗体（ＩｇＧ）応答を誘発する追加の利点を有することを観察している。
【００３８】
本発明のベクターは、完全長ＴＲＡＰ抗原を発現してもよく、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むそのフラグメントを発現してもよい。典型的には、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むフラグメントは、少なくとも９アミノ酸長であり、完全長のＴＲＡＰ又はＭＥ．ＴＲＡＰまでのいかなる長さでもよい。たとえば、前記フラグメントは、９〜２００、又は９〜１００、又は９〜５０アミノ酸長の範囲にあってもよい。ＴＲＡＰ配列内のＴ細胞エピトープの位置はすでに文献に記載されており、当業者には公知であろう。ＴＲＡＰのＴ細胞エピトープの例は以下の出版物に記載されている：Ａｉｄｏｏ  Ｍ、Ｌａｌｖａｎｉ  Ａ、Ａｌｌｓｏｐｐ  ＣＥ、Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ  Ｍ、Ｍｅｉｓｎｅｒ  ＳＪ、Ｋｒａｕｓａ  Ｐ、Ｂｒｏｗｎｉｎｇ  Ｍ、Ｍｏｒｒｉｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ、Ｇｏｔｃｈ  Ｆ、Ｆｉｄｏｃｋ  ＤＡら、Ｌａｎｃｅｔ．１９９５年；３４５：１００３〜７頁；Ｆｌａｎａｇａｎ  ＫＬ、Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ  Ｍ、Ａｋｉｎｗｕｎｍｉ  Ｐ、Ｌｅｅ  ＥＡ、Ｒｅｅｃｅ  ＷＨ、Ｒｏｂｓｏｎ  ＫＪ、Ｈｉｌｌ  ＡＶ、Ｐｉｎｄｅｒ  Ｍ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９年、６月；２９：１９４３〜５４頁；及びＦｌａｎａｇａｎ  ＫＬ、Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ  Ｍ、Ｏｄｈｉａｍｂｏ  Ｋ、Ｓｈｅｕ  Ｅ、Ｍｗａｎｇｉ  Ｔ、Ｇｅｌｄｅｒ  Ｃ、Ｈａｒｔ  Ｋ、Ｋｏｒｔｏｋ  Ｍ、Ｌｏｗｅ  Ｂ、Ｒｏｂｓｏｎ  ＫＪ、Ｍａｒｓｈ  Ｋ、Ｈｉｌｌ  ＡＶ、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ．２００６年３月；７４（３）：３６７〜７５頁、これら文書の内容は、ＴＲＡＰの既知Ｔ細胞エピトープを説明する目的で、参照によりその全体を本明細書に明示的に組み込まれているものとする。
【００３９】
ＴＲＡＰ抗原は、任意のプラスモディウム種由来でもよいが、典型的には、熱帯熱マラリア原虫の系統由来のＴＲＡＰ抗原であろう。ＴＲＡＰ抗原配列は、任意の熱帯熱マラリア原虫系統由来でもよいが、特定の（非限定的な）実施形態では、ＴＲＡＰ抗原は熱帯熱マラリア原虫系統Ｔ９／９６由来である。熱帯熱マラリア原虫の異なった系統のＴＲＡＰ抗原は高度なアミノ酸配列同一性（典型的には、全長ＴＲＡＰ配列にわたり９０％超）を示す。したがって、熱帯熱マラリア原虫系統Ｔ９／９６のＴＲＡＰ抗原と９０％超、９５％超、又は９９％超のアミノ酸配列同一性を共有するいかなるＴＲＡＰアミノ酸配列も使用することが企図されている。
【００４０】
ＴＲＡＰ抗原（又はそのＴ細胞エピトープフラグメント）は、単独で発現させてもよく、追加のポリペプチド配列と組み合わせて、たとえば、融合タンパク質として発現させてもよい。これらの追加のポリペプチド配列は、Ｂ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ、特に、ＴＲＡＰ以外の熱帯熱マラリア原虫抗原由来のＢ細胞又はＴ細胞エピトープを含んでいてもよい。特に有利な組合せは、ＭＥ．ＴＲＡＰと表示される構築物で、これは、他の前赤内熱帯熱マラリア抗原由来のＢ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープのマルチエピトープストリングに融合している完全長ＴＲＡＰ抗原を含む（５、６）。文献に記載されているＭＥ．ＴＲＡＰ抗原（及び配列番号２に示されている）は、熱帯熱マラリア原虫系統Ｔ９／９６から採取した完全長ＴＲＡＰ配列を含有する。しかし、このＭＥ．ＴＲＡＰ構築物のＴＲＡＰ部分は、熱帯熱マラリアの他の系統から採取したＴＲＡＰ配列で置き換えてもよいことは認識されるであろう。当業者であれば、ＴＲＡＰ配列（及び／又はＭＥ配列）は、Ｔ細胞（又はＢ細胞）免疫原性を実質的に変えることなく、１つ又は複数のアミノ酸置換、挿入又は欠失により改変してもよいことも認識されるであろう。
【００４１】
特定の非限定的な一実施形態では、ＭＥ．ＴＲＡＰ抗原は、配列番号２として示されているアミノ酸配列を含んでもよく、配列番号２として示されているアミノ酸配列からなるものでもよい。他の適切なＴＲＡＰ抗原配列は、Ｒｏｂｓｏｎ  ＫＪら、Ｎａｔｕｒｅ．１９８８年；３３５：７９〜８２頁、に記載されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれているものとする。ＭＥエピトープストリングは、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＳＣら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７年；１５（１２）：１２８０〜４頁、に記載されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれているものとする。
【００４２】
ＴＲＡＰ抗原を発現させる調節配列は、転写開始配列、プロモーター配列又はエンハンサー配列、及びその組合せを含んでいてもよい。プロモーター配列は、典型的には、（アデノウイルス及び発現された抗原の両方に関して）異種プロモーターであり、真核生物ＲＮＡポリメラーゼ（たとえば、ＲＮＡ  ｐｏｌＩＩ）により認識されるどのようなプロモーターでもよい。
【００４３】
好ましいプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期（ＩＥ１）プロモーターであり、Ｃｈａｐｍａｎら、ＮＡＲ、１９：３９７９〜３９８６頁により記載されており、この文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれているものとする。このプロモーターは、イントロンＡ配列を含むＩＥ１遺伝子の５’非翻訳領域のフラグメントを含む「長い」形で使用してもよく、イントロンＡ配列を欠く「短い」形で使用してもよい。「長い」ＣＭＶプロモーターが一般に好まれ、典型的には、エキソンＢを排除することになる。しかし、本発明が、ＴＲＡＰ抗原を発現させるのに「長い」ＨＣＭＶプロモーターの使用に限定されるものではないことは理解されるべきである。その発現レベルが、「長い」ＨＣＭＶプロモーターを使用して実現される発現レベルと実質的に等価であるプロモーターを含む、抗原を適切なレベルで発現させる他の異種プロモーターを使用してもよい。適切なプロモーターには、たとえば、マウスＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＳＶ４０初期／後期プロモーター及びβアクチンプロモーターが挙げられる。
【００４４】
（ＴＲＡＰを含む抗原をコードする）導入遺伝子発現カセットは、典型的には、異種転写終結配列も含む。いかなる適切なＲＮＡｐｏｌＩＩ終結配列も、たとえば、ＢＧＨポリＡ配列も使用してもよい。「長い」ＨＣＭＶプロモーターとＢＧＨポリＡ配列の組合せは特に有利であり、ＡｄＣｈ６３ベクター骨格とともに使用するのに好ましい。
【００４５】
（ＴＲＡＰを含む抗原をコードする）導入遺伝子発現カセットは、典型的には、サルアデノウイルスゲノムのＥ１欠失領域に挿入される。しかし、１）導入遺伝子発現カセットが、アデノウイルスゲノムへの挿入に続いてＴＲＡＰを含む抗原を発現させることができるという意味で、導入遺伝子発現カセットが機能的である、並びに２）導入遺伝子の挿入が、適切な宿主細胞株においてアデノウイルスベクターの複製及び／又は感染性ウイルス粒子へのアデノウイルスベクターのパッケージングを妨げないのであれば、挿入部位の正確な位置及びベクター内での導入遺伝子発現カセットの方向は決定的ではないことは理解されるべきである。
【００４６】
本発明のサルアデノウイルスベクターは、典型的には、ＴＲＡＰ抗原をコードする組換えアデノウイルスゲノムを含む感染性ウイルス粒子として供給され、使用される。複製欠損アデノウイルスは、ウイルス複製及びトランスでのパッケージングに不可欠な欠損遺伝子産物を提供する細胞株を使用して、組織培養で増殖させ、高力価の感染性ウイルス粒子を産生することができる。アデノウイルス骨格（ゲノム）配列は、標準組換えＤＮＡ技術を使用するクローニング及び操作を促進するために、細菌プラスミドベクターにクローン化してもよい。そのようなプラスミドは、対応するアデノウイルスベクターの「分子クローン」を表しており、組換えアデノウイルスゲノム全体を含有している。プラスミドベクターを制限酵素で消化して細菌配列を除去し逆位末端配列を暴露することに続いて、こうして得られる核酸を使用して、ウイルスゲノム配列から欠失した不可欠な遺伝子機能（たとえば、Ｅ１遺伝子産物）を提供する適切な宿主細胞株をトランスフェクトしてもよく、これにより純粋な組換えウイルス粒子が作製される。適切な例は、細胞株ＨＥＫ２９３であり、これはＥ１欠損アデノウイルスの増殖を支援する。別の適切な細胞株は、ＰｅｒＣ６と呼ばれる細胞株である。
【００４７】
本発明は主に、免疫原性組成物、たとえば、ワクチンで投与することができる組換えサルアデノウイルス粒子に関するが、プラスミドベクターの形で安定的に組み込まれたＴＲＡＰ（又はＭＥ．ＴＲＡＰ）発現カセットとともにサルアデノウイルス骨格を含む対応するプラスミドベクターも本発明の一部を形成することは理解されるべきである。そのようなプラスミドベクターは、ＴＲＡＰ（又はＭＥ．ＴＲＡＰ）抗原をコードする組換えアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルス粒子の高力価ストックの作製に有用である。
【００４８】
免疫原性組成物
本発明は、本発明の第１の態様に従ったサルアデノウイルスベクターを含む免疫原性組成物も提供する。そのような組成物は、典型的には、１つ又は複数の薬学的に許容可能な媒体、希釈剤、担体又はアジュバントと混合した感染性アデノウイルス粒子の形でサルアデノウイルスベクターを含む。
【００４９】
一実施形態では、組成物は、ヒト投与に適しており、少なくともＴＲＡＰ抗原に対する（ＣＤ８＋、多くの場合細胞障害性、Ｔ細胞によるなどの）保護的免疫応答を誘発するために使用することができるワクチン組成物でもよい。
【００５０】
本発明の第１の態様に関連して記載されるサルアデノウイルスベクターの好ましい特徴は、本発明の組成物にも当てはまる。
【００５１】
本発明の組成物は、典型的には、適切な液体担体、たとえば、１０ｍＭヒスチジン、７．５％ショ糖、３５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％ＰＳ８０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％エタノール、ｐＨ６．６、エンドトキシンフリーＰＢＳ又は他のあらゆる適切な担体などの水性担体中にアデノウイルス粒子を含む液体剤形として処方されることになる。好ましい剤形は、筋肉内又は皮内投与用に処方されるが、経口、静脈内、粘膜、経皮等などの他の投与経路は除外されてはいない。ヒト投与を目的とする免疫原性又はワクチン組成物は、典型的には、１〜３×１０１１ｖｐ／ｍＬの範囲の力価でウイルス粒子を含有する。
【００５２】
免疫応答を誘発する方法
本発明のサルアデノウイルスベクターを含む組成物は、コードされたＴＲＡＰ抗原に対する免疫応答を誘発するためにヒト対象に投与してもよい。発明者らは、本発明に従ったベクター（及び、特にＭＥ．ＴＲＡＰ抗原をコードするＡｄＣｈ６３又はＡｄＣ９ベクター）が動物モデルにおいて強いＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することができることを明らかにした。特に、マウス誘発モデルにおいてＭＥ．ＴＲＡＰをコードするＡｄＣｈ６３ベクターを使用して明らかにされた予防効果は、他のアデノウイルスベクターを使用するよりもまったく意外にも大きい。このモデルにおける効果は、当技術分野では、ヒトに対して有用で予測的指標であると広く見なされており、したがって、ＭＥ．ＴＲＡＰをコードするＡｄＣｈ６３を含むワクチンは、マラリアに対して人を保護するのに有用となる。実際、発明者らは、ＭＥ．ＴＲＡＰをコードするＡｄＣｈ６３を含む実例ワクチンがヒトにおいて免疫原性であることをすでに実証している。
【００５３】
したがって、本発明は、本発明に従った組成物（及び、特に、ＭＥ．ＴＲＡＰ抗原をコードするＡｄＣｈ６３ベクターを含む組成物）を、単回免疫感作において、又はより広い投薬レジメン、たとえば、初回刺激−追加免疫レジメの一部としてのいずれかで、ヒト対象に投与することを提供する。
【００５４】
本発明のサルアデノウイルスベクターを使用した免疫感作を受けるヒト対象は、マラリアに対して免疫感作することが望ましいどんなヒト対象でもよい。
【００５５】
単回免疫感作レジメでは、対象は典型的には、１×１０８〜５×１０１０ウイルス粒子の範囲の投与量を受けることになる。この投与量は、一般に皮内に投与されることになるが、別の投与量及び投与経路を含む他の治療レジメは除外されるべきではない。
【００５６】
初回刺激−追加免疫レジメは、典型的には、最初の時点でＴＲＡＰ（及び、特にＭＥ．ＴＲＡＰ）を含む抗原を発現する初回刺激用量の組換えサルアデノウイルスを投与し、それに続いて第２の時点でＴＲＡＰ（又はＭＥ．ＴＲＡＰ）を含む抗原をコードする追加免疫用量の非アデノウイルスベクターを投与することを含む。第１と第２の時点は、少なくとも２週間、典型的にはほぼ８週間隔てられる。
【００５７】
追加免疫用量を投与するのに使用する非アデノウイルスベクターは、ＴＲＡＰ（又はＭＥ．ＴＲＡＰ）を含む抗原をコードする非アデノウイルスベクターならどれでもよい。適切な例には、ウイルスベクター、特に組換えポックスウイルスベクター（たとえば、ＭＶＡ）、及びプラスミドＤＮＡベクターが挙げられる。
【００５８】
好ましい（が、非限定的な）組合せは、初回刺激用量にＭＥ．ＴＲＡＰ抗原をコードする組換えＡｄＣｈ６３と、追加免疫用量にＭＥ．ＴＲＡＰをコードするＭＶＡを利用する（たとえば、１×１０７〜１×１０８ｐｆｕの範囲の用量で）。好ましい（が、やはり非限定的な）レジメでは、両用量は皮内に投与され、初回刺激と追加免疫用量は８週間の期間隔てられる。
【００５９】
本明細書に記載されるワクチン及びワクチン接種レジメにより誘導されるＴ細胞は、マラリア予防に有用でも、マラリア治療に有用でもよい。しかし、前記Ｔ細胞は、他の適用も有する。前記Ｔ細胞を使用して、マラリア感染を診断するためのＴ細胞の使用におけるような、マラリア診断において使用する試薬を作製してもよい。又は、使用されるＴ細胞は、マラリア免疫療法のためのＴ細胞移行プロトコルにおいて価値があるものでもよい。さらに、個人がワクチン接種後に十分な免疫応答を生じる能力は、特異的免疫又は遺伝子欠損を排除するための免疫能の尺度として使用してもよい。
【００６０】
本発明は、以下の非限定的な実験の例を参照すればさらに理解されるであろう。
【００６１】
実施例１
ＡｄＣｈ６３ＭＥ．ＴＲＡＰベクターの作製
ＡｄＣｈ６３  ＭＥ−ＴＲＡＰは、マラリアを予防するためのワクチン接種のために使用されることになるＭＥ−ＴＲＡＰを発現する複製欠損サルアデノウイルスベクターである。
【００６２】
ＡｄＣｈ６３  ＭＥ−ＴＲＡＰは、完全前赤内期抗原であるトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）に融合している熱帯熱マラリア原虫前赤内期抗原由来の一連の既知細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを発現する遺伝子の配列を含有するサルアデノウイルス、チンパンジーアデノウイルス血清型６３からなる。
【００６３】
ＭＥ−ＴＲＡＰの「複数のエピトープ」部分を構成する個々のＣＴＬエピトープは、種々の潜在的に保護的な標的抗原を表し、ワクチン接種を受けた集団の大多数におけるワクチンに対する免疫応答を保証するために含まれる。ＴＲＡＰは豊富な前赤内期抗原である。照射スポロゾイトで免疫感作されマラリアに対して保護されているヒトボランティアは、ＴＲＡＰに対するＴ細胞応答を発現し、ＴＲＡＰはマラリアワクチンに含むための有力な候補になっている。
【００６４】
ワクチンインサートのヌクレオチド配列は配列番号１として示されている。
【００６５】
プラスミドｐＣｈＡｄ６３  ＭＥ−ＴＲＡＰを、ＡｄＣｈ６３  ＭＥ−ＴＲＡＰ作製のための出発原料として使用した。このプラスミドを作製するために、ＭＥ−ＴＲＡＰ発現カセットを、相同組換えを介して直鎖化されたプレアデノアクセプターベクターにクローン化した。このプラスミドの構築は、図１に図式的に示されている。
【００６６】
プラスミドｐＳＧ２  ＭＥ−ＴＲＡＰ（図１ａ）は、ＡｆｅＩとＳａｌＩで切断して、ＨＣＭＶプロモーター、ＭＥＴＲＡＰ及びＢＧＨポリＡ配列を含有する４．７Ｋｂフラグメントを切り出した。
【００６７】
ＨＣＭＶプロモーター、イントロンＡ及びＢＧＨポリＡ配列も含有するこうして得られたＭＥ−ＴＲＡＰ４．７Ｋｂフラグメント（図１ｂ）は、ＨＣＭＶとＢＧＨｐＡの制御下でＣ型肝炎ウイルスの非構造領域（ＮＳ）を担うｐｒｅＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔアクセプターベクターに組み換えられた（図１ｃ）。ｐＣｈＡｄ６３ベクターは、ｐＣｈＡｄ６３ウイルス骨格の異なる領域に以下の改変物を担っているプラスミドベクターにクローン化された野生型チンパンジーアデノウイルス６３ゲノム由来である：
１）ウイルスゲノムのＥ１領域（ｂｐ４５５〜ｂｐ３４２１）の欠失
２）Ｅ３領域ｂｐ２７２０７〜ｂｐ３１７８８の欠失
３）Ｅ４領域ｂｐ３３８３４〜ｂｐ３６２１６の欠失
４）Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６  ｂｐ３３３１９〜ｂｐ３４２００の挿入
【００６８】
アクセプターベクター、ＣｈＡｄ６３（ｃ）ＮＳｍｕｔは、ＨｐａＩとＳｎａｂＩでの切断により直鎖化された。ＭＥ−ＴＲＡＰカセットは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で相同組換えによりプレアデノベクターにクローン化された。ＢＪ  ５１８３細胞は、約３０ｎｇの直鎖化アクセプターベクター（△ＨｐａＩ、△ＳｎａｂＩ）と約１００ｎｇの消化されたｐＳＧ２  ＭＥ−ＴＲＡＰ（△ＡｆｅＩ、△ＳａｌＩ）で同時形質転換した。組換えは４．７ｋｂフラグメントとプレアデノＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔアクセプターベクターの間で起こり、４．７ｋｂフラグメント（ＨＣＭＶプロモーター、ＭＥ−ＴＲＡＰ遺伝子及びＢＧＨポリＡ配列を含有する）が、ＨＣＭＶプロモーターとＢＧＨポリＡ配列間に存在する相同性を利用してアデノウイルスベクターに挿入された。陽性クローンは、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩを使用した制限消化分析により同定された。
【００６９】
図１ｄは、ＭＥ−ＴＲＡＰ抗原を含有する新規のＣｈＡｄ６３ベクターの地図である。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ部位が示されている。プラスミドＤＮＡの同一性の確認は、制限酵素分析及び塩基配列決定により得られた。予想されたＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ制限酵素プロファイルは、ＭＥ−ＴＲＡＰ含有フラグメントについてアガロースゲル電気泳動上で観察された。塩基配列分析は、異なるオリゴで実施され、ＭＥ−ＴＲＡＰインサートの配列が正しいことが確認された。
一次ウイルスストック（ＰＶＳ）の製造
ＨＥＫ２９３細胞の調製
↓
プラスミドＤＮＡの直鎖化
↓トランスフェクション
アデノウイルス感染を開始する
↓
アデノウイルスを回収する
【００７０】
ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞株は、剪断されたヒトアデノウイルス５型ＤＮＡにより形質転換された一次ヒト胎児由来腎臓の永久株である。前記細胞はヒトアデノウイルスに特に感受性であり、Ｅ１Ａ欠失複製欠損アデノウイルスの増殖を支援することになる。ＨＥＫ２９３細胞は、Ｂｉｏ  Ｒｅｌｉａｎｃｅ社、Ｔｏｄｄ  Ｃａｍｐｕｓ、Ｗｅｓｔ  ｏｆ  Ｓｃｏｔｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ、グラスゴーＧ２０  ＯＸＡから入手した。
【００７１】
ＨＥＫ２９３細胞株は、接着細胞として培養した。前記細胞は、無菌状態で、グルタミン及び１０％認定ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ中で抗生物質なしで増殖させた。
【００７２】
ＰＶＳを作製するために、対数期ＨＥＫ２９３細胞は、化学的に定義されたカチオン性リポソームトランスフェクション試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用して、５μｇのＰｍｅＩ直鎖化プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした（播種の１８時間後）。
【００７３】
制限酵素ＰｍｅＩ及び特異的緩衝液はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）社から購入した。この緩衝液中のＢＳＡは米国起源と定義されていた。４ユニットのＰｍｅＩ（１０，０００Ｕ／ｍＬ）を使用して、１μｇのＤＮＡを直鎖化した。減菌水を希釈用に使用した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）無添加のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）をトランスフェクション段階のために使用した（ＦＢＳの存在はトランスフェクション効率を低下させる）。トランスフェクトされた細胞は、最大細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察された１０日目に回収された。ウイルスは３回の凍結融解により細胞から回収し、１０％無菌グリセロール中細胞上清で貯蔵し、最終容量を４．１ｍＬとした。ＰＶＳのバイアルはスナップ凍結し、−８０℃で保存した。このストックには６か月の再試験日付を付けた。
【００７４】
プレ作業ベクターストックの製造
ＨＥＫ２９３細胞の単一バイアルを解凍し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ＋グルタミンに広げ、５継代後、２Ｃｅｌｌｂｉｎｄローラーの平らに分散した接着細胞を作製した。感染の日に、１ローラー中の細胞は組換えトリプシンを使用して懸濁し、数を数えた。細胞密度は１．０６×１０５細胞／ｃｍ２であった。第２ローラー中の細胞は、１１３ｍＬの接種菌液中０．６４ｐｆｕ／細胞の感染効率（ＭＯＩ）で一次ウイルスストックを感染させた。ストックウイルスの必要量（１．２５ｍＬ）は、湿った氷上で解凍し、細胞培地（ＤＭＥＭ＋グルタミン及び２％ＦＢＳ）で１１５ｍＬまで希釈した。
ローラー瓶は一度手作業で回転させ、次に、３７℃に設定されたインキュベーター内の０．１ｒｐｍで回転するローラーバンク上に４８時間置いた。ローラー瓶はＣＰＥの存在を毎日調べた。典型的ＣＰＥは細胞の円形化を伴う。対照細胞培養物はＣＰＥの不在について調べる。
【００７５】
ウイルス感染ローラー瓶は、１回のウイルス複製後及び全ＣＰＥの出現とともに回収した（４８時間）。ウイルス感染細胞は培地中に穏やかに再懸濁されて、細胞懸濁液を形成し、次に２０℃、２０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離によりペレット化した。上清は取り除き、細胞ペレットは８．０ｍＬの細胞溶解緩衝液（ＣＢＦ精製水で調製した１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ、ｐＨ７．９）に再懸濁した。次に、細胞ペレットは５０ｍＬポリプロピレン管に移した。細胞ペレットは、３回の凍結融解にかけた（ＩＰＡ／乾燥ＣＯ２浴槽中で凍結させ、次に３７℃水槽中で解凍した）。細胞ライセートは、４℃で３０分間、３０００ｒｐｍで追加の遠心分離により清澄させた。上清（細胞ライセート）は、少量のアリコートを−８０℃でスナップ凍結した。感染力価（３．３４×１０８ｐｆｕ／ｍＬ）の細胞ライセートから試料を採取した。感染及び非感染細胞上清の試料（両方とも１００ｍＬ）はバイオバーデンについて分析した（両方ともネガティブ）。
【００７６】
作業ベクターストック（ＷＶＳ）１及び２の製造
プレ作業ベクターストック（ｐｒｅＷＶＳ）を使用して、作業ベクターストック１（ＷＶＳ１）を製造し、ＷＳＶ１を使用してＷＶＳ２を製造した。両方とも、Ｃｅｌｌｂｉｎｄローラー瓶中に平らに接着しているＨＥＫ２９３細胞中での１回のウイルス複製を含んでいた。ＷＶＳ２の大きさは、バッチ製造ロットが全ＷＶＳ２の１０％以下を使用するように計算されている。ＷＶＳ１では、細胞密度１．２９×１０５／ｃｍ２での１４ローラーのＨＥＫ２９３細胞をウイルス増殖のために使用し、ＷＶＳ２では、細胞密度１．５４×１０５／ｃｍ２での２９ローラーを使用した。ＷＶＳ１とＷＶＳ２の両方の製造仕様書は同じであった。ウイルス接種菌液（それぞれプレＷＶＳ又はＷＶＳ１）は、ＤＭＥＭ＋グルタミン及び２％ＦＢＳで、ＷＶＳ１では１１３ｍＬ／ローラーまで、ＷＶＳ２では２時間で２０ｍＬ／ローラーまで、次に最終的に１１３ｍＬ／ローラーまで希釈された。最終ＭＯＩは、それぞれＷＶＳ１で１．０１、ＷＶＳ２で８．６ｐｆｕ／細胞であった。瓶は１回手作業で回転させ、次に、それぞれ４８時間と７１時間、３７℃で０．１ｒｐｍのローラーバンク上に置いた。ローラー瓶は、ＣＰＥの存在を毎日調べた。非感染ＨＥＫ２９３細胞を含有するネガティブコントロールローラーを、比較と細胞数カウント手順の両方のために含めた。
【００７７】
ＷＶＳ１は、感染４８時間後に回収され、ＷＶＳ２は感染７１時間後に回収された。ウイルス感染細胞は、細胞上清中に穏やかに再懸濁されて、細胞懸濁液を形成し、次に、遠心分離管にデカントされて、２０℃で１５分間、２０００ｒｐｍでの遠心分離によりペレット化された。細胞上清は取り除かれ、各細胞ペレットは、ローラー当たり８．０ｍＬの細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ、ｐＨ７．９）中に再懸濁した。次に、細胞ペレット懸濁液は、ポリプロピレン管に貯蔵した。前記管は３回の凍結融解を受けた（ＩＰＡ／乾燥ＣＯ２浴槽内で凍結され、次に３７℃水槽で解凍された）。こうして得られた細胞ライセートは、４℃で３０分間、３０００ｒｐｍでの追加の遠心分離により清澄させた。ウイルス（ＷＳＶ１又はＷＳＶ２）を含有する上清（細胞ライセート）を貯蔵し、試料採取し、アリコートにし、−８０℃でスナップ凍結した。ストックごとの最終容量の１１２ｍＬと２３６ｍＬを調製した。
【００７８】
ＡｄＣｈ６３  ＭＥ−ＴＲＡＰのバルク回収臨床ロットの製造
ＷＶＳ２を使用して、ＡｄＣｈ６３  ＭＥ−ＴＲＡＰの３バルク回収ロットを製造した。各ロットはＷＶＳ２からの単回ウイルス複製からなる。手法は上記のＷＶＳ２の製造に類似しており、２０ｍＬ／ローラーで２時間の開始接種、続いて最大最終容量の１１３ｍＬ／ローラーであったが、細胞溶解中の第１回凍結／融解サイクル後ベンゾナーゼを添加した。ウイルス接種菌液（ＷＶＳ２）は、上記の通り、２％ＦＢＳとグルタミンを含有するＤＭＥＭで希釈し、ＭＯＩの２〜３ｐｆｕ／細胞で２０ｍＬのＨＥＫ２９３ローラー瓶中に添加された。瓶は１回手作業で回転させ、次に、合計７１時間３７℃のインキュベーター中の０．１ｒｐｍで回転するローラーバンク上に置いた。ローラー瓶をＣＰＥの存在について毎日調べ、ウイルス感染ローラー瓶は全体ＣＰＥの出現後に回収した。ウイルス感染細胞は培地に穏やかに再懸濁され、細胞懸濁液を形成した。細胞懸濁液と上清の２．５ｍＬ試料を各ローラーから取り出し貯蔵した。これには、「プレバルク回収プールロット１、２又は３」とラベルを貼った。これらの「バルク回収」試料は最終貯蔵のために採取して、外来性ウイルスのインプロセス外部試験用、及び逆転写酵素用のバルク回収試料を作製した。次に、残りの懸濁液は２０℃で３０分間、２０００ｒｐｍでの遠心分離によりペレット化した。上清は取り除き、各細胞ペレットは８．０ｍＬの細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ、ｐＨ７．９）中に再懸濁した。次に、細胞ペレット懸濁液は貯蔵（プール）し、ポリプロピレン管に分注した。前記管は１回の凍結融解を受けた（ＩＰＡ／乾燥ＣＯ２浴槽内で凍結され、次に３７℃水槽で解凍された）。最小凍結時間は３０分であった。次に、ベンゾナーゼを添加して、精製に先立って、残留宿主細胞ＤＮＡを分解した（８ｍＬ細胞ライセート当たり１５００ユニット）。細胞ライセートは、全速に設定したジャイロロッカー上、２０℃±２℃で２５〜３５分間ベンゾナーゼとともにインキュベートし、その後、上記のように追加の２回の凍結融解を行った。細胞ライセートは、４℃で３０分、３０００ｒｐｍで追加の遠心分離により清澄した。細胞ライセート上清は、無菌ピペットを使用して取り除き、容量を測定して、貯蔵し、アリコートにし、−８０℃でスナップ凍結した。
【００７９】
精製された回収ロットを調製するための下流処理
ＢＨＬ解凍（５４〜１２８ｍＬ）
↓
ＣｓＣｌ段階勾配（１又は２回／ロット）
↓
ＣｓＣｌ平衡勾配（１回／ロット）
↓
処方（緩衝液交換）
↓
希釈及びアグリゲート濾過（０．４５μ）
↓
単回精製ロットとしてスナップ凍結
【００８０】
アデノウイルス粒子は、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）中で特徴的な密度を有しており、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｏｐｔｉｍａ超遠心分離機での密度勾配超遠心分離により、大多数の汚染ウイルス性及び宿主細胞タンパク質並びにＤＮＡからのその精製が可能になる。パッケージされたＤＮＡを欠くウイルス粒子（空のカプシド）は、密度が低くなっているので完全なビリオンから分離することができる。典型的には、段階勾配超遠心分離に続いて、下のほうのバンドの「感染性」ウイルス粒子が見られ、その上のバンドが空のカプシドを含有している。第１段階勾配からの回収物は、２０時間の平衡ＣｓＣｌ密度勾配超遠心分離によりさらに精製される。精製ロットの大きさは、遠心管及びローター（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４０）が保持することができると考えられるバルク回収物の容積により制約を受けた。バルク回収ロットアリコートの大きさは、その容積がこのプロセスへの移行に適しているように選ばれており、適切な容積のバルク回収物は各精製ロットの開始時に解凍された。１と２の予備的段階勾配遠心分離試行の間からのウイルス回収物は、第２の平衡遠心分離段階の出発原料として使用した。したがって、バルク回収ロットの精製は、一連の繰り返し衛生処理において実施された。全体では、開始少ロット（毒性及び安定性研究のため）並びに１０精製ロットは、３バルク回収ロットから調製された。
【００８１】
不連続ＣｓＣｌ超遠心分離
段階勾配は、３つの異なった密度のＣｓＣｌを使用して、１４ｍＬ超透明遠心管（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）において、手作業で調製した。塩化セシウム溶液は、ＣＢＦ精製水中１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９において調製した。最初に、２ｍＬの１．２５ｇ／Ｌ  ＣｓＣｌ溶液が各管に添加され、２ｍＬの１．３５ｇ／Ｌ  ＣｓＣｌを下層にした。最後に、最大密度のＣｓＣｌ（０．５ｍＬの１．５０ＣｓＣｌ）の溶液が下層にした。段階勾配は、使用１時間以内に冷却溶液を使用して調製した。
【００８２】
バルク回収ロット細胞ライセートの個々の試料は冷水（４〜１０℃）中で解凍した。ほぼ８．５ｍＬの細胞ライセートは、ＣｓＣｌ勾配上に手作業で層状化された。管は即座に（１時間未満）１８０，０００ｇで３時間遠心分離された。細胞残渣の上方領域、空のカプシド物質の拡散バンド及び感染性ウイルスの下方鮮明バンドが、遠心分離中に分離した。下方バンドは、１ｍＬ注射器に取り付けられた１６Ｇ水平針で各管の側面を突き刺すことにより回収された。平均で、管当たり０．６ｍＬのウイルスが収集され、貯蔵され、必要であれば、４〜１０℃で保存された。最大保持時間は４時間であった。
【００８３】
平衡ＣｓＣｌ超遠心分離
同一遠心管を使用して、平衡超遠心分離を実施した。これらの管は最初６ｍＬのＣｓＣｌ密度１．３５で満たされ、第１超遠心分離段階から回収された１．０〜１．５ｍＬのウイルスプールで重層した。追加の緩衝液は、注射用蒸留水で調製されたリン酸緩衝生理食塩水であった。ウイルスは１０℃で２０時間、１５０，０００ｇで遠心分離された。これにより、拡散薄淡上方バンドと無傷のウイルス粒子の下方鮮明バンドが生じた。鮮明バンドのいずれの側の２つの薄淡バンドも可視化することもできると考えられる。感染性ウイルス粒子の主な鮮明バンドは、以前と同じ１６Ｇ水平針と注射器いずれかを使用して回収した。管当たり０．５と１．０ｍＬの間のウイルスが回収され、緩衝液交換による最終処方前の最大２時間、保冷容器内４〜１０℃で保存された。
【００８４】
最終緩衝液への処方
ウイルスのＣｓＣｌ精製プールは、殺生物剤として０．１５％Ｋａｔｈｏｎを含有する水中で８．３ｍＬのＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５（ＧＥヘルスケア社のアマシャムバイオサイエンス事業部）を含有する使い捨てポリプロピレンがすでに注入されたＰＤ−１０カラムを使用したＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５上でのクロマトグラフ脱塩を介して最終処方緩衝液（Ａ４３８）に緩衝液交換された。衛生化に先立って、カラム溶出液からＫａｔｈｏｎの９９．５％超を取り除く６カラム容積の水洗浄の条件が確立された。
【００８５】
洗浄後、次にカラムは、０．５Ｍ水酸化ナトリウムで最小２０分間衛生化され、５カラム容積のリン酸緩衝生理食塩水を使用して、水酸化ナトリウムを中和した。カラムは最終的に処方緩衝液中に洗浄された：（３カラム容積）処方緩衝液（Ａ４３８）：１０ｍＭ  ヒスチジン、３５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（Ｖ／Ｖ）エタノール、７．５％ショ糖、０．１％ＰＳ８０、ｐＨ６．６は注射用蒸留水を使用して調製された。皮下塩化セシウム注射のため、ラットＬＤ５０に相当するよう調整された重量より低い最終製品最大患者用量６ｌｏｇ超中の最終ＣｓＣｌ濃度を生じる、ウイルス試料（１．５ｍＬ未満）及び収集容積（２．２５ｍＬ未満）のための条件が確立された。一連のカラム（５以下）を使用して、特定の容量を適用させ収集することができるように、各精製ロットを緩衝液交換した。ウイルスピークは各カラムから単一画分として収集され、その画分は貯蔵されて、濃縮された精製ロットを作製した。ＱＣウイルス粒子決定から、ロットは氷冷したＡ４３８で、２〜３×１０１１ｖｐ／ｍＬ間まで希釈され、０．４５ミクロンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｅｘ  ＨＶ  ３３ｍｍ直径ＰＶＤＦディスクフィルター）で濾過して、大きなウイルス凝集体を取り除いた。各精製ロットは、イソプロピルアルコール／ドライアイス中でスナップ凍結させ、−８０℃で保存した。最大保持時間は処方後１時間であった。
【００８６】
最終剤形は、０．６ｍＬのガラスバイアルで提示される。ＡｄＣｈ６３  ＭＥ−ＴＲＡＰの各バイアルは、１０ｍＭ  ヒスチジン、７．５％ショ糖、３５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％ＰＳ８０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％エタノール、ｐＨ６．６に処方された１．３×１０１１ｖｐ／ｍＬを含有する。（この力価は、２６０ｎｍでの吸光度により決定された）。使用されるＡｄＣｈ６３  ＭＥ−ＴＲＡＰの用量は、典型的には、皮内投与による１×１０８ｖｐと５×１０１０ｖｐの間である。投与される量は、任意の最新の濃度に従って変化してもよい。
【００８７】
実施例２−ＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰベクターの試験
材料と方法
マウスの免疫感作
生後６〜８週のメスＢＡＬＢ／ｃマウスは、ジョンラドクリフホスピタル、オックスフォードのバイオメディカルサービスユニットから購入し、全動物は英国内務省Ａｎｉｍａｌｓ  Ａｃｔ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｌｉｃｅｎｓｅの条件に従って保証されている。免疫感作は皮内で実施され、この経路は、他の経路、たとえば、皮下、筋肉内と比べると、より良好な免疫原性を誘発することがすでに明らかにされている［１１］。アデノウイルスは、単回初回刺激を含む実験では、１×１０１０ウイルス粒子（ｖ．ｐ．）の用量で、初回刺激−追加免疫プロトコルではより低い用量の５×１０９ｖｐで投与された。ＭＶＡは、Ｔ細胞応答を追加免疫するために１×１０７ｐｆｕの用量で使用された。ベクターはすべて、免疫感作に先立ってエンドトキシンフリーＰＢＳ中に再懸濁された。
【００８８】
マカクにおける免疫感作及びＴ細胞応答の分析
アカゲザルは、用量５×１０１０ｖ．ｐ．のＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰの三角筋への筋肉内注射（マカク識別番号：００３３、１０２９、２０１３及び４０７３）並びに皮内投与（識別番号：００４３、２００９、及び６０１５）の２つの異なる経路により免疫感作された。マカクはすべて、８週間後に、用量２×１０８ｐｆｕのＭＶＡ  ＭＥ．ＴＲＡＰでの皮内免疫感作により追加免疫を与えられた。
【００８９】
ｅｘ  ｖｉｖｏＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔは、ＭＥ．ＴＲＡＰの全領域に及ぶ４ペプチドプールでＴ細胞を刺激することにより実施された。ＴＲＡＰに対する全応答は、個々のプールに応答を加え、ＤＭＳＯのみを含有する非刺激試料の背景値を減算することにより計算された。
【００９０】
ウイルスベクター
本実験において使用したすべてのウイルスベクター、すなわちＡｄＣｈ６３、ＡｄＣ９及びＭＶＡは、すでに記載されている導入遺伝子ＭＥ．ＴＲＡＰ［５、１２］を発現する。本明細書の別の場所に記載しているように、インサートＭＥ．ＴＲＡＰは、７８９アミノ酸のタンパク質をコードする２３９８ｂｐのハイブリッド導入遺伝子である。ＭＥストリングは、いくつかの他のＢ及びＴ細胞エピトープの間にＢＡＬＢ／ｃ  Ｈ−２ＫｄエピトープＰｂ９を含有する［１３］。サルアデノウイルスベクターＡｄＣ９（ＳＡｄＶ）は、上記の通りに構築し増殖させた［１４］。
【００９１】
ＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰのための製造及びベクター作製は、実施例１に記載の通りに実施した。ＡｄＣｈ６３は、このプロトコルを使用して良好な力価で首尾よく作製されており、類似のプロトコルを使用して、代わりのサルアデノウイルスベクター骨格に基づいたＭＥ．ＴＲＡＰベクターを作製してもよい。
【００９２】
ｅｘ  ｖｉｖｏＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ
ＡＣＫ処理脾細胞又はＰＢＭＣは、最終濃度１μｇ／ｍｌの免疫優性Ｈ−２Ｋｄ制限エピトープＰｂ９（ＳＹＩＰＳＡＥＫＩ）とともにＩＰＶＨ膜プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）上で１８〜２０時間培養した。ＥＬＩＳＰＯＴは、以前記載された通りに実施した［１５］。
【００９３】
ＥＬＩＳＡ
ＴＲＡＰ領域に対するＩｇＧ抗体は、以前記載された通りにＥＬＩＳＡにより分析した［１６］。この実験では、血清は、アデノウイルス−ＭＶＡ初回刺激−追加免疫レジメでの免疫感作の４週間後に、少なくとも３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスのグループから得た。
【００９４】
寄生虫誘発
プラスモディウムベルゲイ（ＡＮＫＡ株クローン２３４）スポロゾイト（ｓｐｚ）は、メスハマダラカステフェンス（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ）蚊の唾液腺から単離した。寄生虫は、ＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁され、各マウスは静脈経路を介して合計１，０００ｓｐｚを受けた。血液試料は５日〜２０日にかけて毎日採取され；スメアはギムザで染色され、赤血球内でのシゾントの存在についてスクリーニングされた。生存は、血液中での寄生虫の完全な不在として定義された。
【００９５】
統計的分析
フローサイトメトリー試料の統計的有意性は、一元配置又は二元配置ＡＮＯＶＡのいずれか及びボンフェローニポストテストで分析された。統計的検査はすべて、ウィンドウズ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４．０３版、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ．を使用して実施された。
【００９６】
結果
マウスにおけるＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰの単回初回刺激による免疫原性
単回免疫感作すると、アデノウイルスベクターは強い長期のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することができた。図２は、両方ともＭＥ．ＴＲＡＰ導入遺伝子をコードするＡｄＣｈ６３とＡｄＣ９間の比較を示している。導入遺伝子のＭＥストリングに免疫優性Ｈ−２Ｋｄ制限エピトープＰｂ９（ＳＹＩＰＳＡＥＫＩ）が存在するために、我々はウイルスベクターにより誘発される免疫応答の効力を評価することができた。我々の研究室での結果によれば、ＡｄＣ９は、もっとも免疫原性なベクターの１つであり、ヒト血清型ＡｄＨ５よりも優れているＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することができることが明らかになった。図２には、ＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰは６０日の期間にわたりＡｄＣ９に類似の応答を誘導することが示されている。ＡｄＣｈ６３  ＣＤ８応答は初期のワクチン接種７日後にはＡｄＣ９よりも有意に高く、その後に有意差は見られなかった。どんなウイルスベクターワクチンもその重要な目標は、強い記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する可能性であり、それに関しては、ＡｄＣ９とＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰの両ベクターは、６０日の長期間後でも類似の免疫原性を示した。
【００９７】
マウスにおけるプラスモディウムベルゲイでの誘発に対する保護
本研究の結果によりはじめて、アデノウイルスベクターでの単回ワクチン接種が、プラスモディウムベルゲイスポロゾイトでの誘発によるマラリアに対する高レベルの無菌保護を誘発することができることが明らかになった。初期実験では、ＡｄＨ５、ＡｄＣ７及びＡｄＣ９などのベクターが、１回のみのワクチン接種（１×１０１０ｖ．ｐの用量で）後に高い割合のマウスを保護することができることが明らかになった。図３は、ワクチン投与と誘発間の、免疫感作後すぐの１４日目（ａ）と６０日の長期間後（ｂ）のＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰとＡｄＣ９の保護レベルの比較を示している。当期間にわたる両ベクターによる類似の免疫原性にもかかわらず（図２）、ＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰにより誘発される保護レベルは、両時点でＡｄＣ９よりも優れていた。特に重要なのは、ワクチン接種後の１４日目の誘発では、ＡｄＣｈ６３が１５日間感染に対してすべてのマウスを保護しており、実験の最後で６匹のうち１匹のマウスのみが感染したことを我々は見出した。ＡｄＣ９が短期間（図３ａ）と長期間（図３ｂ）で示した保護レベルはもっと低かった。
【００９８】
初回刺激−追加免疫レジメ
ＡｄＨ５での初回刺激とそれに続く同一導入遺伝子をコードするＭＶＡでの追加免疫（Ａ−Ｍレジメ）は、ベクターの単回投与と又はＤＮＡ若しくはＦＰ９とそれに続くＭＶＡなどの他のベクターでの初回刺激−追加免疫レジメと比較すると免疫原性を増加させることが報告されている［１１］。したがって、我々は、サルアデノウイルスベクターとそれに続く８週間後のポックスウイルスベクターＭＶＡを組み合わせた初回刺激−追加免疫レジメを使用したアプローチを試験した。図４は、ＡｄＣｈ６３−ＭＶＡとＡｄＣ９−ＭＶＡレジメにより誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞応答（図４ａ、ｂ）と抗体応答（図４ｃ）間の比較を示している。免疫感作後すぐに（図４ａ）、ＡｄＣｈ６３は高レベルのＣＤ８応答を示し、ＡｄＣ９応答はもっと強力であったが、統計学的差異は見られなかった。長期間の応答の分析により、単回初回刺激に対する初回刺激−追加免疫レジメの大きな優位が明らかにされた。図４ｂに示されるように、ＣＤ８応答は追加免疫後６０日目でも依然として高く（２５，０００ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣ超）、単回ワクチン接種による同一時点でのレベル（１０，０００ＳＦＣ／１００万ＰＢＭＣ未満、図２）と依然対照的であった。ＭＶＡ追加免疫の６か月後、免疫原性レベルは依然としてまだ１０，０００ｓｐｏｔ／１００万ＰＢＭＣ超であり、試験した２つのサルアデノウイルスベクター間には有意差は見られなかった。
【００９９】
このシステムでは、保護効率は細胞免疫応答を利用しているが、アデノウイルスベクターは強い導入遺伝子特異的抗体応答を誘導するという追加の利点を提供する［１７］。細胞免疫応答に加えて抗体が提供する特別な保護のために、アデノウイルスベクターがヒトにおいてワクチン目的で使用される場合にはこの特徴は潜在的に重要になる。液性応答は、Ａ−Ｍ初回刺激−追加免疫レジメにより誘発されるＩｇＧを定量することにより評価された。図４ｃに示すように、抗体応答は試験された両レジメで高く、ＡｄＣｈ６３−ＭＶＡ組合せを使用すると、ＡｄＣ９と比べてＩｇＧレベルは有意に高かった。
【０１００】
免疫原性レベルは初回刺激−追加免疫レジメにより改善されたために、無菌保護のレベルは逐次ワクチン接種という同一戦略を使用して分析された（図５）。両レジメにおいて追加免疫後の短い間隔及び長い間隔で顕著なレベルが見られた。しかし、ＡｄＣｈ６３−ＭＶＡレジメは、試験したすべての時点でＡｄＣ９−ＭＶＡより優れていた。興味深いことに、ＡｄＣｈ６３−ＭＶＡレジメは短期間では動物の１００％において無菌保護を誘発した。その保護は時間とともに減少したが、保護は依然高く、際立っているのは、追加免疫ワクチン接種の６か月後でも両レジメが顕著なレベルの保護を誘導したことであった（図５ｃ）。
【０１０１】
アカゲザルにおける免疫原性
多くの先行技術例では、ベクターワクチンの有効性は、マウスにおける応答と比べた場合、非ヒト霊長類又はヒトにおいて試験したときには減少することが観察される。したがって、マウスにおける上記のレジメに類似する初回刺激−追加免疫レジメがアカゲザルにおいて試験された。
【０１０２】
実施例１に従って調製されたＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰワクチンの５×１０１０ｖｐの用量で７匹のアカゲザルが免疫感作された。前記ワクチンは皮内又は筋肉内のいずれかで投与されたが、経路間で免疫原性の差異は観察されなかったので、総合データが示されている。ＡｄＣｈ６３  ＭＥ−ＴＲＡＰでの免疫感作後の種々の時間に、ＭＥ−ＴＲＡＰをコードする異種ウイルスベクターであるＭＶＡでの追加免疫感作が行われた（図７参照）。データでは、ＡｄＣｈ６３  ＭＥ−ＴＲＡＰが、ヒトにおけるワクチン免疫原性を有用に予測すると広く見なされている種であるマカクザルにおいて高度に免疫原性であったことが示されている（図８）。単回免疫感作後、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて１００万ＰＢＭＣあたり約１０００ＳＦＵの平均のＴ細胞応答が観察され、このワクチンインサートではヒトにおける保護に依然関連していたレベルであった（Ｗｅｂｓｔｅｒら、ＰＮＡＳ  ２００５年、１０２：４８３６〜４１頁）。強い抗体価もワクチン接種により誘導された。ＭＶＡでの異種追加免疫感作は、Ｔ細胞も抗体応答もはるかに高いレベルにまで追加免疫することができた。選択された時点からのＴ細胞の表現型の限られた分析では、ＣＤ８とＣＤ４  Ｔ細胞の両方がワクチン接種レジメにより誘導され、これらの細胞が、インターフェロンγ、ＴＮＦ及びＩＬ２を発現する多機能細胞である可能性があることが明らかになった。
【０１０３】
図６ａに示すように、ＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰでの初回刺激は、ワクチン接種後４週間目に最大になる強固なＴ細胞応答を誘発した。興味深いことに、１匹（４０７３）を除くすべてのマカクが体重３〜４ｋｇ間である若年であり、もっと年長で体重のある動物番号４０７３（１０ｋｇ超）は初回刺激すると並はずれて良好な免疫応答を示した。重要なことに、Ｔ細胞応答は、その後に続くＭＶＡ  ＭＥ．ＴＲＡＰでのワクチン接種により追加免疫することができ、初回刺激のピーク対追加免疫後のピークを比較すると、いくつかの場合には最大５倍の差異が見られた。免疫応答と完全なＭＥ．ＴＲＡＰ領域に及ぶペプチドプールを比較した後の追加の観察が行われた。Ｔ細胞応答は、ＡｄＣｈ６３初回刺激後プールＴ２に主に集中していた（図６ｂ）。しかし、ＭＶＡ追加免疫は、ＭＥ．ＴＲＡＰに対する免疫応答の幅を増加させるという追加の利点を与え、この場合、主な焦点はＴ２だけではなく完全なＭＥ．ＴＲＡＰ配列にも向かっていた（図６ｃ）。重要なことに、マカクにおいて誘導されるこれらの強いＴ細胞応答は、おそらく、これまでマラリア抗原に対して誘導されたもっとも強い応答であり、今まで企てられたあらゆる臨床試験によりＭＥ．ＴＲＡＰに対して誘導されたＴ細胞応答よりもはるかに高い。ＴＲＡＰに対して誘導されたＴ細胞応答の大きさは、ヒト臨床試験において測定される保護の量と相関性があったために（Ｗｅｂｓｔｅｒら、ＰＮＡＳ；Ｄｕｎａｃｈｉｅら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、このワクチンレジメは、ヒトにおいて今まで試験されたどのＭＥ．ＴＲＡＰワクチンよりも効果的であるはずだと我々は予測している。
【０１０４】
ヒトにおけるＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰの使用
サルアデノウイルスベクターＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰは、ＡｄＣｈ６３  ＭＥ．ＴＲＡＰの単回免疫感作、及び以前のアデノウイルス、それに続く８週間後のＭＶＡ追加免疫を含む初回刺激−追加免疫レジメによるヒトにおける安全性及び免疫原性を試験する第一相ヒト臨床試験において評価済みである。
【０１０５】
採用されたボランティア全員が健常な成人男性であった。今回はじめてチンパンジーアデノウイルスベクターがヒトにおいて評価されたので、ワクチン接種を受けるヒトの最初のグループは、非常に低用量のワクチン、１０８ｖｐを受けた。これは、マカクに投与された５×１０１０ｖｐ用量とは対照的であってもよく、ヒトアデノウイルスベクターの以前のワクチン試験において典型的な用量である１〜１０×１０１０ｖｐが使用された。この低用量の１０８ｖｐでは、最初の８名のボランティアにおける局所的安全性も全身的安全性も良好であった。これらの個人のうち４名は、用量２×１０８ｐｆｕのＭＥ−ＴＲＡＰをコードするＭＶＡでの追加免疫感作を受けた。これらの４名のボランティアのＴ細胞免疫原性の時間経過を、図９に平均応答として示している。ワクチンインサートに重複する１５アミノ酸長ペプチドプール：Ｔ９／９６ＴＲＡＰ１５アミノ酸長に対する、及びまた２０アミノ酸長ペプチドが重複する同一配列：Ｔ９／９６ＴＲＡＰ２０アミノ酸長に対する免疫原性は、ｅｘ  ｖｉｖｏ  γインターフェロンＥＬＩＳＰＯＴにより測定された。熱帯熱マラリア原虫の異種系統を表す２０アミノ酸長ペプチド：３Ｄ７  ＴＲＡＰ  ２０アミノ酸長に対する応答も示されている。最後に、ＭＥ−ポリエピトープストリング中の主に九量体マラリアペプチドエピトープの短いストリングに対する応答（Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７年、１１月；１５：１２８０〜４頁）が示されている：ＭＥ。
【０１０６】
これらの結果は、使用された非常に低い投与量でも、ＴＲＡＰに対する検出可能なＴ細胞応答が、ヒトにおけるＡｄＣｈ６３  ＭＥ−ＴＲＡＰでの単回免疫感作後の４週間目に観察されることを示している。さらに、これらの応答はＭＶＡワクチンにより強く追加免疫することができ、ヒトにおいて記憶Ｔ細胞がアデノウイルスベクターにより初回刺激されていることを示している。
【０１０７】
本明細書に引用されている特許、特許出願、及び公開されている参考文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。本発明は特に、好ましい実施形態への言及とともに明らかにされ説明されているが、特許請求の範囲により包含されている本発明の範囲から逸脱することなく形式及び詳細な点に種々の変更を加えることができることは当業者により理解されるであろう。
【０１０８】
ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ
１  Ｓｎｏｗ，Ｒ．Ｗ．，Ｇｕｅｒｒａ，Ｃ．Ａ．，Ｎｏｏｒ，Ａ．Ｍ．，Ｍｙｉｎｔ，Ｈ．Ｙ．  ａｎｄ  Ｈａｙ，Ｓ．Ｉ．，Ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｐｉｓｏｄｅｓ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｍａｌａｒｉａ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００５．  ４３４：２１４−２１７．
２  Ｈｉｌｌ，Ａ．Ｖ．，Ｐｒｅ−ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｔｏｗａｒｄｓ  ｇｒｅａｔｅｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｒｎｕｎｏｌ  ２００６．  ６：２１−３２．
３  Ｔｓｕｊｉ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｚａｖａｌａ，Ｆ．，Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｉｖｅｒ  ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ  ２００３．  １９：８８−９３．
４  Ｋｈｕｓｍｉｔｈ，Ｓ．，Ｃｈａｒｏｅｎｖｉｔ，Ｙ．，Ｋｕｍａｒ，Ｓ．，Ｓｅｄｅｇａｈ，Ｍ．，Ｂｅａｕｄｏｉｎ，Ｒ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａ  ｂｙ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２  ｐｌｕｓ  ＣＳ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１．  ２５２：７１５−７１８．
５  Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｃ．，Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ，Ｍ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｓ．Ｊ．，Ａｌｌｓｏｐｐ，Ｃ．Ｅ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｒ．，Ｌａｙｔｏｎ，Ｇ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｈｉｌｌ，Ａ．Ｖ．，Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍａｌａｒｉａ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９７．  １５：１２８０−１２８４．
６  Ｍｏｏｒｔｈｙ，Ｖ．Ｓ．，ＭｃＣｏｎｋｅｙ，Ｓ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．，Ｇｏｔｈａｒｄ，Ｐ．，Ａｒｕｌａｎａｎｔｈａｍ，Ｎ．，Ｄｅｇａｎｏ，Ｐ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．，Ｈａｎｎａｎ，Ｃ．，Ｒｏｙ，Ｍ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｃ．，Ｐｅｔｏ，Ｔ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｈｉｌｌ，Ａ．Ｖ．，Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｉｖｅｒ−ｓｔａｇｅ  Ｐ．  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｍａｌａｒｉａ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｅ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００３．  ２１：１９９５−２００２．
７  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｅ．Ｇ．，Ｚａｖａｌａ，Ｆ．，Ｅｉｃｈｉｎｇｅｒ，Ｄ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｔｓｕｊｉ，Ｍ．，Ｓｉｎｇｌｅ  ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ  ｄｏｓｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９７．  １５８：１２６８−１２７４．
８  Ｚｈｉ，Ｙ．，Ｆｉｇｕｅｒｅｄｏ，Ｊ．，Ｋｏｂｉｎｇｅｒ，Ｇ．Ｐ．，Ｈａｇａｎ，Ｈ．，Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｇａｏ，Ｇ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｓｅｖｅｒｅ  Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  Ｎｏｎｈｕｍａｎ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｈｕｍａｎ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００６．
９  Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｊ．Ｃ．，Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．，Ｒｅｙｅｓ−Ｓａｎｄｏｖａｌ，Ａ．，Ｐａｖｌａｋｉｓ，Ｇ．Ｎ．，Ｘｉａｎｇ，Ｚ．Ｑ．，Ｗｌａｚｌｏ，Ａ．Ｐ．，Ｇｉｌｅｓ−Ｄａｖｉｓ，Ｗ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．，Ａ  ｓｉｍｉａｎ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｏ  ＨＩＶ−１  ｇａｇ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３．  １７０：１４１６−１４２２．
１０  Ｒｅｙｅｓ−Ｓａｎｄｏｖａｌ，Ａ．，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｊ．Ｃ．，Ｇｒａｎｔ，Ｒ．，Ｒｏｙ，Ｓ．，Ｘｉａｎｇ，Ｚ．Ｑ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．，Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ｕｐｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｓｉｍｉａｎ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００４．  ７８：７３９２−７３９９．
１１  Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｃ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．，Ｈａｎｎａｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｈｕ，Ｊ．Ｔ．，Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ，Ｍ．，Ｓｉｎｄｅｎ，Ｒ．  ａｎｄ  Ｈｉｌｌ，Ａ．Ｖ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍａｌａｒｉａ  ｍｏｄｅｌ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｍｅｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００２．  ２０：１０３９−１０４５．
１２  ＭｃＣｏｎｋｅｙ，Ｓ．Ｊ．，Ｒｅｅｃｅ，Ｗ．Ｈ．，Ｍｏｏｒｔｈｙ，Ｖ．Ｓ．，Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｄ．，Ｄｕｎａｃｈｉｅ，Ｓ．，Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｇ．，Ｖｕｏｌａ，Ｊ．Ｍ．，Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｔ．Ｊ．，Ｇｏｔｈａｒｄ，Ｐ．，Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｋ．，Ｈａｎｎａｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｅｖｅｒａｅｒｅ，Ｓ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｋ．，Ｋｅｓｔｅｒ，Ｋ．Ｅ．，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｊ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．，Ｈｅｐｐｎｅｒ，Ｄ．Ｇ．，Ｐａｔｈａｎ，Ａ．，Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｋ．，Ａｒｕｌａｎａｎｔｈａｍ，Ｎ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｔ．，Ｒｏｙ，Ｍ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｌ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．，Ｐｅｔｏ，Ｔ．，Ｓｉｎｄｅｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｈｉｌｌ，Ａ．Ｖ．，  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｂｏｏｓｔｅｄ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００３．  ９：７２９−７３５．
１３  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｃ．，Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｔ．Ｊ．，Ｈａｎｋｅ，Ｔ．，Ｒｏｂｓｏｎ，Ｋ．Ｊ．，Ｈａｎｎａｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｍ．，Ｓｉｎｄｅｎ，Ｒ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｈｉｌｌ，Ａ．Ｖ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｍａｌａｒｉａ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９８．  ４：３９７−４０２．
１４  Ｒｏｙ，Ｓ．，Ｇａｏ，Ｇ．，Ｌｕ，Ｙ．，Ｚｈｏｕ，Ｘ．，Ｌｏｃｋ，Ｍ．，Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｒ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００４．  １５：５１９−５３０．
１５  Ｍｏｏｒｅ，Ａ．Ｃ．，Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ，Ａ．，Ｄｒａｐｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｋ．Ｒ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｈｉｌｌ，Ａ．Ｖ．，Ａｎｔｉ−ＣＤ２５  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ：  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｄｕｒａｂｌｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５．  １７５：７２６４−７２７３．
１６  Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｄ．Ｐ．，Ｄｕｎａｃｈｉｅ，Ｓ．，Ｖｕｏｌａ，Ｊ．Ｍ．，Ｂｅｒｔｈｏｕｄ，Ｔ．，Ｋｅａｔｉｎｇ，Ｓ．，Ｌａｉｄｌａｗ，Ｓ．Ｍ．，ＭｃＣｏｎｋｅｙ，Ｓ．Ｊ．，Ｐｏｕｌｔｏｎ，Ｉ．，Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｌ．，Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｒ．Ｆ．，Ｂｅｊｏｎ，Ｐ．，Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｇ．，Ｓｉｎｄｅｎ，Ｒ．，Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｈｉｌｌ，Ａ．Ｖ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ  ＦＰ９  ａｎｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００５．  １０２：４８３６−４８４１．
１７  Ｘｉａｎｇ，Ｚ．，Ｇａｏ，Ｇ．；Ｒｅｙｅｓ−Ｓａｎｄｏｖａｌ，Ａ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．，Ｎｏｖｅｌ，  ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ６８−ｂａｓｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００２．  ７６：２６６７−２６７５．
１８  Ｓａｃｒｅ，Ｋ．，Ｃａｒｃｅｌａｉｎ，Ｇ．，Ｃａｓｓｏｕｘ，Ｎ．，Ｆｉｌｌｅｔ，Ａ．Ｍ．，Ｃｏｓｔａｇｌｉｏｌａ，Ｄ．，Ｖｉｔｔｅｃｏｑ，Ｄ．，Ｓａｌｍｏｎ，Ｄ．，Ａｍｏｕｒａ，Ｚ．，Ｋａｔｌａｍａ，Ｃ．  ａｎｄ  Ａｕｔｒａｎ，Ｂ．，Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ，  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｕｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００５．  ２０１：１９９９−２０１０．
【図１ａ】
0005505937.tif 000002
【図１ｂ】
0005505937.tif 000003
【図１ｃ】
0005505937.tif 000004
【図１ｄ】
0005505937.tif 000005
【図２】
0005505937.tif 000006
【図３ａ】
0005505937.tif 000007
【図３ｂ】
0005505937.tif 000008
【図４ａ】
0005505937.tif 000009
【図４ｂ】
0005505937.tif 000010
【図４ｃ】
0005505937.tif 000011
【図５ａ】
0005505937.tif 000012
【図５ｂ】
0005505937.tif 000013
【図５ｃ】
0005505937.tif 000014
【図６ａ】
0005505937.tif 000015
【図６ｂ】
0005505937.tif 000016
【図６ｃ】
0005505937.tif 000017
【図７】
0005505937.tif 000018
【図８ａ】
0005505937.tif 000019
【図８ｂ】
0005505937.tif 000020
【図９】
0005505937.tif 000021
【配列表】
0005505937000001.app