(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１〜４個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ好中球刺激活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列の断片であって、配列番号１のアミノ酸配列において１個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなり、かつ好中球刺激活性を有するポリペプチド；および
（ｄ）前記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなり、そして１以上の修飾アミノ酸を含有するポリペプチド、ここで該修飾アミノ酸は、ポリペプチドのＮ末端のホルミル化、アセチル化、若しくはメチル化、および／または、Ｃ末端のエステル化若しくはアミド化、である；
からなる群より選択されるポリペプチド。
【請求項２】
以下：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列において１〜４個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ好中球刺激活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列の断片であって、配列番号３のアミノ酸配列において１個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなり、かつ好中球刺激活性を有するポリペプチド；および
（ｄ）前記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなり、そして１以上の修飾アミノ酸を含有するポリペプチド、ここで該修飾アミノ酸は、ポリペプチドのＮ末端のホルミル化、アセチル化、若しくはメチル化、および／または、Ｃ末端のエステル化若しくはアミド化、である；
からなる群より選択されるポリペプチド。
【請求項３】
以下：
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１〜４個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ好中球刺激活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列の断片であって、配列番号４のアミノ酸配列において１個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなり、かつ好中球刺激活性を有するポリペプチド；および
（ｄ）前記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなり、そして１以上の修飾アミノ酸を含有するポリペプチド、ここで該修飾アミノ酸は、ポリペプチドのＮ末端のホルミル化、アセチル化、若しくはメチル化、および／または、Ｃ末端のエステル化若しくはアミド化、である；
からなる群より選択されるポリペプチド。
【請求項４】
以下：
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列において１〜４個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ好中球刺激活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列の断片であって、配列番号５のアミノ酸配列において１個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなり、かつ好中球刺激活性を有するポリペプチド；および
（ｄ）前記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなり、そして１以上の修飾アミノ酸を含有するポリペプチド、ここで該修飾アミノ酸は、ポリペプチドのＮ末端のホルミル化、アセチル化、若しくはメチル化、および／または、Ｃ末端のエステル化若しくはアミド化、である；
からなる群より選択されるポリペプチド。
【請求項５】
（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドが、好中球の活性化を促進せずに好中球の遊走を促進する活性又は好中球の遊走を促進せずに好中球の活性化を促進する活性を有するものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
好中球刺激活性に影響を与える物質をスクリーニングする方法であって以下の工程：
（ｌ）物質と請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドとを、好中球と共存させる工程；
（ｍ）該物質が、該ポリペプチドの好中球刺激活性を促進するか又は阻害するかを確認する工程
を含む、前記方法。 
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、好中球刺激（遊走、活性化）活性を有するポリペプチドに関する。本発明のポリペプチド及びその受容体、並びにそれらに対する抗体は、好中球刺激に関する疾患又は状態の治療、診断等に利用することができる。
背景技術
炎症現象は、様々な因子が影響しあう複合反応であるが、炎症反応の主役は白血球である。白血球は、血液中から炎症刺激の加わった部位に、細静脈部を介して動員される。急性炎症では、まず、好中球の滲潤が起こり、続いてマクロファージ、リンパ球の滲潤が起こる。炎症の種類によっては、好酸球、好塩基球の滲潤が起こる。これらの白血球の滲潤は炎症の種類によって異なることまた、滲潤の時間的経過も異なることから、それぞれの白血球に対応するメカニズムが考えられている。
好中球の滲潤もまた、複合現象である。好中球は通常は血流の中心部を流れているが、刺激が加わり、微小循環の拡大と血流速度の低下が起こると、流体力学的な作用により血管の辺縁を流れるようになり、内皮細胞と接触するようになるという説がある。そして、初期には、好中球は内皮細胞表面を転がったり、ゆっくり散歩するように動いたりするが、その後、好中球は内皮細胞に強固に拘着（接着）するようになる。拘着した好中球は、内皮細胞間の接着部分に向かって偽足を出し、内皮細胞もまた好中球を包み込むようになり、好中球は内皮細胞下腔へと伸び出し、更に外膜細胞の間を通り抜けて組織内へ滲潤する。そして、炎症刺激異物の存在する局所において、活性酸素の産生による殺菌、分解酵素の分泌、サイトカイン類の放出、及び貧食作用を示すことで、その機能を発揮する。
好中球の滲潤が起こるのは、ウイルスや細菌のような異物が侵入した場合に限られない。例えば、心筋梗塞や臓器移植の後に臓器への血流が再開したとき、好中球の滲潤を伴う臓器障害が起こることがある。このような症状は、虚血後再灌流障害と呼ばれる。
好中球は、炎症部位から産生される走化性因子に反応し、その因子の濃度勾配を認識しながら炎症部位へ移動すると考えられている。現在までに好中球の局所への遊走を誘引する因子（走化性因子）として知られているものには、ケモカインと呼ばれる一連のタンパク質性因子、補体因子Ｃ３ａ及びＣ５ａ、アラキドン酸代謝系因子のロイコトリエンＢ４、血小板活性化因子、並びに細菌タンパク質のモデルペプチドであるホルミルメチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＦ）を含むホルミルペプチドがある（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，２５７−２８１，１９８４、及びＡｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，６７５−７０５，１９９７）。しかし、これらの物質が炎症発生の段階でどのように関与しているかは、はっきりしていない。
ケモカインは、好中球、単球又はＴリンパ球等を局所部位へ遊走させる働きを有するタンパク質性の内因性物質の総称である。ケモカインは、一次構造により、（１）Ｎ末端から１番目及び２番目においてシステイン残基が隣り合っているＣＣファミリー、（２）１個のアミノ酸で隔てられているＣＸＣファミリー、（３）３個のアミノ酸で隔てられているＣＸ３Ｃファミリー、及び（４）１個のシステイン残基を有するＣファミリーの４つに分類されている。これらのうち、好中球にはＣＸＣファミリーのみが作用すると考えられており、このファミリーに属するものとして、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、及び好中球活性化タンパク質−２（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２）等が知られている（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，６７５−７０５，１９９７）。
一方、炎症部位においては、活性化された好中球により放出される活性酸素や分解酵素等により細胞障害が生じていることが知られている。このような障害が生じている組織内においては、ＩＬ−８を含む種々のケモカインの濃度上昇が認められていることから、ＩＬ−８等は好中球の活性化による組織破壊にも関与しているといわれるが、細胞障害が発生する段階においてＩＬ−８が関与しているとは考えにくい。
発明の開示
ケモカインは正常組織に常に存在しているのではなく、組織に何らかの刺激が加わったときに合成され、分泌されてその機能を発揮すると考えられる。通常、遺伝子が転写、翻訳され、タンパク質が発現されるのには数時間〜約半日ぐらいかかるといわれる。これに対し、実際の炎症反応はさらに早く惹起されることも多い。従って、好中球を誘引して活性化することのできる因子を正常な細胞が予め用意している可能性がある。そしてそのような因子の解明は、炎症の発生を初期段階で抑える方法を確立することにもつながり、リウマチ、急性腎炎、及び劇症肝炎を含む炎症性疾患を含む種々の組織炎症や、虚血後再灌流障害の診断、並びに治療のための薬剤開発にとって極めて有用である。
本発明者らは、正常な細胞が予め用意しているであろう好中球刺激（遊走、活性化）に関係する因子を見出すべく、種々の検討を行った。そして健康なブタ心臓を材料とした抽出物から好中球刺激活性を有する新規ポリペプチド（配列番号１）を単離し、またそのポリペプチドと同様の活性を有すると予想される種々の新規ポリペプチド（配列番号３，４及び５）を見出した。さらに本発明者らは、上記新規ポリペプチドが、新規な受容体を介するか又は直接Ｇタンパク質を活性化する可能性があることを見出した。さらに本発明者らは、上記新規ポリペプチドが、新規な特性、すなわちある濃度では好中球遊走活性を発揮するが、濃度の上昇とともに遊走活性が脱感作され、しかも好中球を活性化（分解酵素、各種サイトカイン及び過酸化物質の産生、並びに貧食）するという特性を有する可能性があることをも見出した。そして本願発明を完成した。
発明の詳細な説明
好中球刺激活性を有するポリペプチド
本発明は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ好中球刺激活性を有するポリペプチド；又は（ｃ）前記（ａ）若しくは前記（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列と生物学的に同等であるアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。本発明はまた、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ好中球刺激活性を有するポリペプチド；又は（ｃ）前記（ａ）若しくは前記（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列と生物学的に同等であるアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。本発明はまた、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ好中球刺激活性を有するポリペプチド；又は（ｃ）前記（ａ）若しくは前記（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列と生物学的に同等であるアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。そして、本発明はまた、（ａ）配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ好中球刺激活性を有するポリペプチド；又は（ｃ）前記（ａ）若しくは前記（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列と生物学的に同等であるアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。
配列番号１のポリペプチドは、アミノ酸２３残基からなるポリペプチドであり、システイン残基を含んでいない。このポリペプチドは、ウシ心臓シトクロムＣオキシダーゼ  サブユニットＶＩＩＩのＣ末端２３残基（配列番号２）と８２％相同である（２３残基中、１９残基が一致）。さらに、ヒトシトクロムＣオキシダーゼ  サブユニットＶＩＩＩのＣ末端２１残基（配列番号３）とは５７％相同である（２１残基中、１２残基が一致）。
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本明細書では、配列番号１のポリペプチドをＣＯＳＰ−１ということもある。
配列番号４のポリペプチドは、ブタシトクロム  ｂ（１−１５）と同一の、以下のアミノ酸１５残基からなる配列のポリペプチドである。本明細書では、このペプチドをｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）ということもある。これはヒトシトクロム  ｂ（１−１５）（配列番号５）と６７％相同である（１５残基中、１０残基が一致）。
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配列中、ｆＭｅｔはホルミルメチオニル残基を表す。
本明細書でいう「好中球」は、ヒトを含む動物の好中球の他、好中球様細胞を含む。好中球様細胞の具体例としては、ジブチリックサイクリックＡＭＰ処理により分化したＨＬ６０細胞を挙げることができる。また、「好中球刺激活性」は、ヒトを含む動物の好中球又は好中球様細胞の、遊走（「走化」ということもある）及び／又は活性化を促進する活性をいう。遊走は組織への滲潤、局所への移動を含む。活性化は活性酸素の産生及び分解酵素（例えば、β−ＨＡ）の分泌、各種サイトカイン及び過酸化物質の産生、並びに貧食を含む。このような好中球刺激活性は、好中球走化活性、活性酸素放出、β−ＨＡ分泌量、及び／又は細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇を測定することにより検定することができる。また、本明細書で、あるポリペプチドが「好中球刺激活性を有する」というときは、好中球刺激活性のうち、好中球の遊走を促進する活性と好中球の活性化を促進する活性とのいずれか一方のみを有している場合と、双方を有している場合とを含む。
また、本明細書で、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列」というときの個数は、そのアミノ酸配列からなるポリペプチドが好中球刺激活性を有する限り特に限定されず、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、又は天然に生じうる程度の数のアミノ酸が置換等されていることを意味する。１〜９個又は１〜４個程度であれば、そのような活性を消失しないであろう。また、本明細書で、「配列番号ｘのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列」というとき、このアミノ酸配列は、配列番号ｘのアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列を含む。ここで、相同性は、少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上である。ここでは「相同」を、比較される配列間において、各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味で用いている。このとき、ギャップの存在及びアミノ酸の性質が考慮される。相同性の計算には、市販のソフトを用いることができる。
また、本明細書で、あるポリペプチドのアミノ酸配列と「生物学的に同等であるアミノ酸配列」というときは、該ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有し、そして含まれるアミノ酸が修飾されているが、該ポリペプチドと同様の機能・作用（例えば、好中球刺激活性）を有するようなアミノ酸配列をいう。修飾はポリペプチドのＮ末端（アミノ基）、Ｃ末端（カルボキシル基）、及びそれ以外のアミノ酸側鎖において起こりうる。例えば、Ｎ末端のホルミル化、アセチル化、メチル化、Ｃ末端のエステル化、アミド化又はその他の修飾を含む。Ｎ末端のホルミル化は特に好ましい。
本発明のポリペプチドは、動物組織材料から調製することができる。調製操作は、動物組織材料からポリペプチド成分を精製するのための通常の手段（例えば、アフィニティークロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲルろ過、ＨＰＬＣ）を用いて行うことができる。例えば、ブタ心臓ホモジネートからペプチド性物質を粗抽出し、これを分画し、好中球刺激活性を有する画分を得ることができる。また、本発明のポリペプチドは化学的に合成することができる。合成は、ポリペプチド合成のための通常の手段を用いて行うことができる。このような合成手段としては、Ｂｏｃ法、Ｆｍｏｃ法等がある。さらに、本発明のポリペプチドは、遺伝子工学的な手法を用いても製造することができる。
新規受容体及び／又はＧタンパク質に結合することができるポリペプチド
本発明のポリペプチドは、本発明者らの検討により、（１）好中球様に分化するのに伴って発現する受容体を介して、好中球刺激活性を発揮することができると考えられる点（実施例６参照）、（２）刺激による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇は細胞内Ｃａ２＋ストアからのＣａ２＋の遊離と細胞外からの流入により起こりうると考えられる点（実施例７参照）、そして（３）ＰＴＸ感受性Ｇタンパク質と共役する受容体の活性化を介して好中球活性化を引き起こすと考えられる点（実施例８参照）では、ｆＭＬＰと作用機序が類似していることが分かった。しかしながら、本発明のポリペプチドのうち、配列番号１のものは、［３Ｈ］ｆＭＬＰとｆＭＬＰ受容体の特異的な結合を阻害しない点では、ｆＭＬＰとは異なる受容体を介するか、又は直接Ｇタンパク質を活性化することで、情報を細胞内に伝達していると考えられる（実施例９及び１０参照）。従って本発明は、ｆＭＬＰを介するのとは異なる活性化経路を開示する。このような経路に関わる受容体及びＧタンパク質は、他の受容体及びＧタンパク質を得るために当業者に用いられている通常の方法に従って取得することができる。
さらに、本発明は：  （ｄ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｅ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記（ｄ）のポリペプチド結合性の受容体又はＧタンパク質に結合することができるポリペプチド；又は（ｆ）前記（ｄ）若しくは前記（ｅ）のポリペプチドのアミノ酸配列と生物学的に同等であるアミノ酸配列からなるポリペプチド：  （ｄ）配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記（ｄ）のポリペプチド結合性の受容体又はＧタンパク質に結合することができるポリペプチド；又は（ｆ）前記（ｄ）若しくは前記（ｅ）のポリペプチドのアミノ酸配列と生物学的に同等であるアミノ酸配列からなるポリペプチド：  （ｄ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記（ｄ）のポリペプチド結合性の受容体又はＧタンパク質に結合することができるポリペプチド；又は（ｆ）前記（ｄ）若しくは前記（ｅ）のポリペプチドのアミノ酸配列と生物学的に同等であるアミノ酸配列からなるポリペプチド：  及び（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記（ｄ）のポリペプチド結合性の受容体又はＧタンパク質に結合することができるポリペプチド；又は（ｆ）前記（ｄ）若しくは前記（ｅ）のポリペプチドのアミノ酸配列と生物学的に同等であるアミノ酸配列からなるポリペプチドをも提供する。
本明細書で、あるポリペプチドの受容体又はあるＧタンパク質に「結合することができる」というときは、特別な場合を除き、該ポリペプチドに対する受容体（例えば、上述した新規な受容体）と単に結合することができる（「親和性がある」ともいう。）ことをいい、結合の結果その受容体の構造変化をもたらし、続いて種々の生理作用を示すことができる場合と、結合して他の物質が受容体と結合するのを阻害することができる場合（それ自身は、受容体を介した生理作用を示さないことが多い）とを含む。あるペプチドが、本発明に関わる受容体又はＧタンパク質に結合することができるか否かは、ある物質が他の受容体及びＧタンパク質との結合性を測定する場合に当業者に用いられている通常の方法に従って取得することができる。
炎症発症性ペプチド
本発明のポリペプチドは、本発明者らの検討により、好中球刺激活性（遊走及び活性化）のうち、ある場合には（例えば、ある濃度において）遊走活性のみを発揮し得、他の場合には（例えば、先の濃度より高い濃度において）活性化能力のみを発揮しうる可能性があることが見出された（実施例１２）。また本発明のポリペプチドは生体内において、炎症部位より拡散し、好中球を誘引し（この段階では、好中球を活性化しない。）、好中球が炎症部位に接近することによって好中球に対する本発明のペプチドの濃度が上昇すると、好中球遊走を停止させ、炎症部位付近で好中球活性化している可能性が見出された（同実施例参照）。
従って、本発明は：  （ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ好中球の活性化を促進せずに好中球の遊走を促進する活性又は好中球の遊走を促進せずに好中球の活性化を促進する活性を有するポリペプチド；又は（ｃ）前記（ａ）若しくは前記（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列と生物学的に同等であるアミノ酸配列からなるポリペプチド：  （ａ）配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ好中球の活性化を促進せずに好中球の遊走を促進する活性又は好中球の遊走を促進せずに好中球の活性化を促進する活性を有するポリペプチド；又は（ｃ）前記（ａ）若しくは前記（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列と生物学的に同等であるアミノ酸配列からなるポリペプチド：  （ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ好中球の活性化を促進せずに好中球の遊走を促進する活性又は好中球の遊走を促進せずに好中球の活性化を促進する活性を有するポリペプチド；又は（ｃ）前記（ａ）若しくは前記（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列と生物学的に同等であるアミノ酸配列からなるポリペプチド：及び  （ａ）配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ好中球の活性化を促進せずに好中球の遊走を促進する活性又は好中球の遊走を促進せずに好中球の活性化を促進する活性を有するポリペプチド；又は（ｃ）前記（ａ）若しくは前記（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列と生物学的に同等であるアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。
治療方法、キット、スクリーニング方法等
本発明のポリペプチドは、好中球刺激活性を有するから、好中球の減少、機能低下に関連する疾患又は状態（例えば、好中球減少症）の診断・治療に有用である。また、心筋梗塞、及び臓器移植に起因するものを含む虚血後再灌流障害、Ｉ型糖尿病、並びにリウマチ、急性腎炎、及び劇症肝炎を含む炎症性疾患を含む、好中球の活性化に関連する疾患又は状態の診断又は治療方法の解明に有用である。さらに、本発明のポリペプチドは、好中球刺激活性の測定、好中球に関連する疾患又は状態の臨床検査又は治療に有用な物質のスクリーニング方法、好中球に関連する疾患又は状態の臨床検査又は治療に有用な物質の製造方法、並びに本発明のポリペプチドの好中球刺激活性に影響を与えるか否かを確認するためのキット、又は好中球に関連する疾患若しくは状態の臨床検査若しくは治療のためのキット、に用いることができる。
具体的には、本発明のポリペプチド又は該ポリペプチドの抗体等の、好中球に関連する疾患又は状態の臨床検査又は治療に有用な物質を用いて、上記の虚血後再灌流障害、Ｉ型糖尿病並びにリウマチ、急性腎炎及び劇症肝炎を含む炎症性疾患等の、早期発見、予防、治療等に用いることができる可能性がある。
また、本発明のポリペプチドに対する中和抗体等の、本発明のポリペプチドの活性を抑制する物質を用いて好中球の滲潤を抑制することにより、上記の虚血後再灌流障害、Ｉ型糖尿病並びにリウマチ、急性腎炎及び劇症肝炎を含む炎症性疾患等の治療にも用いることができる可能性がある。
さらに本発明のポリペプチドを過剰に投与し、好中球の炎症部位への移行を妨げることにより、上記の虚血後再灌流障害、Ｉ型糖尿病並びにリウマチ、急性腎炎及び劇症肝炎を含む炎症性疾患等における炎症を抑制することができる可能性もある。
本発明は、（ｌ）物質と本発明のポリペプチドとを組み合わせて用いる工程；及び（ｍ）該物質が本発明のポリペプチドの好中球刺激活性に影響を与えるか否かを確認する工程を含む、好中球に関連する疾患又は状態の臨床検査又は治療に有用な物質のスクリーニング方法：  （ｌ）物質と請求項１〜９の何れか１項に記載のポリペプチドとを組み合わせて用いる工程；（ｍ）該物質が該ポリペプチドの好中球刺激活性に影響を与えるか否かを確認する工程；及び（ｎ）該物質を合成するを含む、好中球に関連する疾患又は状態の臨床検査又は治療に有用な物質の製造方法：  並びに（ｓ）本発明のポリペプチド及び／又は以下で述べる抗体；及び（ｔ）本発明のポリペプチド及び／又は以下の抗体を包含する容器を含む、本発明のポリペプチドの好中球刺激活性に影響を与えるか否かを確認するためのキット、又はそのようなものを含む好中球に関連する疾患若しくは状態の臨床検査若しくは治療のためのキットを提供する。ここで、「物質と本発明のポリペプチドとを組み合わせて用いる」とは、例えば、物質と本発明のポリペプチドとを接触させること、及び物質と本発明のペプチドとを競合的に用いることを含む。「ポリペプチドの好中球刺激活性に影響を与える」とは、そのポリペプチドと結合することにより又は競合すること等により、その好中球刺激活性を促進すること又は阻害することを含む。
本発明のポリペプチド等の、好中球に関連する疾患又は状態の臨床検査又は治療に有用な物質の好中球刺激活性は、好中球（好中球様細胞を含む）を用いて評価することができる。例えば、好中球様に分化したＨＬ６０細胞、又はヒト白血球細胞の懸濁液にポリペプチドを加えて細胞を刺激し、細胞又は上清中の好中球が活性化されたときに産生される物質（活性化指標物質、例えばβ−ＨＡ）を測定することにより、評価することができる。刺激する際に、ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ  Ｂ及びＤＮａｓｅを添加し、上清中のβ−ＨＡ活性を測定するのが簡便である。同時に、細胞障害の指標となる物質（例えば、乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＬＤＨ）活性）を測定することは、ポリペプチドが細胞に障害を与えるか否かを判断することができ、また、活性化指標物質の分泌機序（例えば、エキソサイトーシス）を予想することができ、有用である。また、未分化又は好中球様に分化したＨＬ６０細胞を用いて、遊走活性を測定することによっても、本発明のポリペプチドを評価することができる。遊走活性の測定方法もまた、当業者にはよく知られている。ポリペプチドが好中球遊走活性を示せば、本発明の範囲に含まれうるが、本発明のポリペプチドとしては、好中球に対しては遊走活性を示すが、未分化の細胞においては遊走活性を示さないものが好ましい。例えば、未分化ＨＬ６０細胞においては遊走活性を示さないが、分化ＨＬ６０細胞においては遊走活性を示すものが好ましい。
抗体
さらに、本発明は、上述の一群のポリペプチドに対する抗体を提供する。このような抗体は、好中球の活性化に関連する疾患又は状態の診断・治療に有用である。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれも有用であるが、モノクローナル抗体がより好ましい。モノクローナル抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥのいずれかのイムノグロブリンクラスに属するモノクローナル抗体をも包含し、好適にはＩｇＧ及びＩｇＭイムノグロブリンクラスモノクローナル抗体である。抗体の製造には当業者にはよく知られた手段を用いることができる。例えば、モノクローナル抗体を製造するには、本発明のポリペプチドをキャリアータンパク質に結合させ、必要に応じアジュバンドとともに腹腔内に注射して、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ等の哺乳動物、好ましくはマウスを免疫感作する。必要に応じて感作を繰り返す。適当な抗体力価が得られるときに上記の哺乳動物の脾臓、リンパ節、骨髄又は扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞を取り出して、ミエローマ細胞、好ましくは上記の哺乳動物と同種のミエローマ細胞と融合させる。そして、選択培地を用いることにより、脾臓細胞同士のハイブリッド細胞、ミエローマ細胞同士のハイブリッド細胞、及び未融合細胞を除去する。得られたハイブリドーマを本発明のポリペプチドに対する反応性を指標にスクリーニングして、ポリペプチドに対する所望の抗体を産生する細胞を得る。得られたハイブリドーマから、マウス腹水法、又は適当な培地と培養器を用いた培養法により、所望の抗体を得ることができる。また、本発明の抗体と同様の作用を示すものとして、本発明のポリペプチドを修飾したポリペプチドを挙げることができる。
本発明のポリペプチド又は抗体を治療のために投与する際は、投与経路は意図した効果を発揮することができ、かつ安全に投与することができれば特に制限されない。また、意図した効果を発揮することができ、かつ安全に投与することができれば剤形は特に制限されず、投与経路等に応じたものとすることができる。製剤の際には薬剤的に許容できる防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤等の種々の担体を加えることができる。このような種々の製剤は、当業者にはよく知られた工程により製造することができる。投与量も、投与の目的、患者の性別、体重、年齢、剤形、症状、投与経路、投与回数、投与経過等に応じて適宜決定することができる。
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを抗原として当業者によく知られたＥＬＩＳＡ法等により、本発明のポリペプチドとの抗原抗体反応の面から評価することができる。また、上述の好中球刺激に関する評価系を利用して、好中球刺激活性の抑制効果の面から評価することができる。
以下、本発明を実施例により説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
実施例
実施例１〜３は、ポリペプチドの製造に関する。実施例４及び５は、ポリペプチドの好中球刺激活性に関連する。実施例６〜１０は、ポリペプチドの好中球活性化機序に関する。実施例１１は抗体の製造に関する。
実施例１（動物組織材料からのＣＯＳＰ−１の精製）
（１）粗抽出物の調製
健康なブタ心臓を材料として、ＣＯＳＰ−１を調製した。即ち、ブタ心臓（２．２ｋｇ、６匹分）を屠殺後直ちに摘出し、氷冷した生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ溶液）を用いて速やかに脱血し、洗浄し、氷冷した。続いて、心臓表層の脂肪組織や血管を氷冷下で出来るだけ切除し、厚さ５ｍｍ程度に薄く細片化し、次に、内因性プロテアーゼによる分解を最小限に抑えるため、細片化した組織を１６ｌのイオン交換水中で１００℃、１０分間熱処理した。これを室温にまで冷却し、ワーニングブレンダーを用いて１Ｍ酢酸−２０ｍＭ塩酸中で１０分間ホモジナイズした。このホモジネートに２０ｍＭ塩酸を含む１Ｍ酢酸を加え、全量を１０Ｌとし、これを１８時間、４℃で攪拌しながら抽出し、粗抽出溶液を得た。この抽出溶液を氷冷下で２０，０００ｇ、１０分間遠心し、得られた上清を２．５Ｌまで濃縮した。この濃縮溶液に、氷冷したアセトンを最終濃度が６０％になるように加え、２０時間、４℃で攪拌し、再び遠心分離（２０，０００ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）を行ない変性タンパク質などを沈殿除去し、エバポレーターでアセトンを除いた。続いてジエチルエーテルによる脱脂洗浄を２〜３回行なった。その後、抽出液が１Ｌになるまで濃縮し、さらに遠心して（２０，０００ｇ、３０ｍｉｎ、４℃）不溶物を除いた後、上清を減圧濃縮、凍結乾燥して粗抽出物を得た。
乾固した粗抽出物を１Ｍ酢酸約３００ｍｌに溶解した後、ＳＰ−Ｓｈｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５（７×３７．５ｃｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーによって、１Ｍ酢酸で溶出されるＡ画分、２Ｍピリジンで溶出されるＰ画分、２Ｍピリジン−酢酸（ｐＨ５．０）で溶出されるＰＡ画分に分離した。これらをそれぞれ濃縮して凍結乾燥した。このうちＰＡ画分を０．１Ｍ酢酸８０ｍｌに溶解し、Ｓｈｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（４×１４６ｃｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより分離した。この際、移動相には０．１Ｍ酢酸を用い、流速０．４ｍｌ／ｍｉｎで溶出、フラクションコレクターにより１０ｍｌずつ分取した。各画分について分化ＨＬ６０細胞からのβ−ＨＡ分泌活性を、実施例４に記載の方法に従って測定した。その結果、３つの異なる活性画分、ＰＡＧ１（溶出量６５０〜７５０ｍｌ）、ＰＡＧ２（溶出量７５０〜１１００ｍｌ）、ＰＡＧ３（溶出量１４５０〜１７００ｍｌ）を得た。これらの操作を６回繰り返し、合計１３．２ｋｇのブタ心臓より抽出を行なった。
（２）精製
上記で得られたＰＡＧ１面分を調製用ＯＤＳカラム（２０×２５０ｍｍ、山村化学（株））を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製した。０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）存在下、アセトニトリルの直線的濃度勾配をかけて流速５ｍｌ／ｍｉｎで溶出を行い、２３０ｎｍの吸収を検出した。１画分当り１５ｍｌずつ分取し、それぞれの画分の分化ＨＬ６０細胞からのβ−ＨＡの分泌活性を測定した。結果、アセトニトリルの濃度が３３〜３９％で溶出される画分、及び４０〜４６％で溶出される画分に活性が認められたので、これらをそれぞれＰＡＧ１−Ａ、ＰＡＧ１−Ｂとした。
続いて、得られたＰＡＧ１−Ｂ画分を陽イオン交換カラムＴＳＫ−ＣＭ２ＳＷ（４．６×２５０ｍｍ  東ソー）を用た高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製した。１０％アセトニトリル存在下、ｐＨ６．６に調製したギ酸アンモニウム緩衝液の直線的濃度勾配をかけて流速１ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、２８０ｎｍの吸収を検出した。１画分当り１ｍｌずつ分取し、それぞれの画分の分化ＨＬ６０細胞からのβ−ＨＡの分泌活性を測定した。その結果、ギ酸アンモニウムの濃度が８８〜１０９ｍＭで溶出される画分（ＰＡＧ１−ＢＩ）、２５４〜２７１ｍＭで溶出される画分（ＰＡＧ１−ＢＩＩ）に活性が認められた。
さらにＰＡＧ１−ＢＩＩ画分を、分析用Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、２１８ＴＰ５４Ｖｙｄａｃ社）を用いたＲＰ−ＨＰＬＣによりさらに精製した。溶出は０．１％ＴＦＡ存在下でアセトニトリルの濃度勾配をかけ流速１ｍｌ／ｍｉｎで行い、２１４ｎｍの吸収で検出し、１画分当たり１ｍｌずつ分取し、コンセントレターで濃縮、減圧乾固した後、各画分を２００μｌの超純水に溶解してβ−ＨＡ分泌活性を測定した。その結果、アセトニトリルの濃度が３３％で溶出される１２番目の画分（ＰＡＧ１−ＢＩＩ（Ｆ１２））に７１％／ｃｏｎｔｒｏｌの分泌活性が認められた。続いてさらに、この活性画分を分析用Ｃ２／Ｃ１８カラム（２．１×１００ｍｍμＲＰＣ  Ｃ２／Ｃ１８  ＳＣ２．１／１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いた微量ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析及び精製した（流速１００μｌ／ｍｉｎ）。ＰＡＧ１−ＢＩＩ（Ｆ１２）には夾雑物が含まれていたため、ピーク分取を行い（ＰＡＧ１−ＢＩＩ（Ｆ１２）ｐｅａｋ）、これを濃縮し、減圧乾固した後、１００μｌに溶解して活性を測定した。結果、アセトニトリルの濃度が４０％で溶出される単一のピークに８４％／ｃｏｎｔｒｏｌの分泌活性が認められた。
（３）サーモリシン処理による確認
ＰＡＧ１−ＢＩＩ（Ｆ１２）ｐｅａｋ画分について、含まれる活性成分がタンパク質又はポリペプチドであるかどうか確認するため、タンパク質分解酵素であるサーモリシンによる酵素消化がこれら物質の活性に与える影響を検討した。即ち、得られた画分と０．１Ｍピリジン−塩酸（ｐＨ６．５）に溶解したサーモリシン（１ｍｇ／ｍｌ）とを混合し（サンプル：サーモリシン溶液  １：１）、４５℃で、２４時間反応させた。つぎに酵素反応を停止させるために、混合液を１００℃、５分間処理した。そして得られた溶液のβ−ＨＡ分泌活性を測定した。
その結果、サーモリシン消化によりこの画分の活性が完全に消失した（処理前１２．８％／ｃｏｎｔｒｏｌ、処理後０．４％／ｃｏｎｔｒｏｌ）。従って、この画分のβ−ＨＡ分泌活性成分は、タンパク質又はポリペプチドであることが示された。
（４）構造解析
ａ．アミノ酸配列等の解析
ＰＡＧ１−ＢＩＩ（Ｆ１２）ｐｅａｋ画分に含まれる物質について、ｆａｓｔ  ａｔｏｍ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＦＡＢＭＳ）（ＪＥＯＬ  ＪＭＳ−ＨＸ／ＨＸ１０Ａ日本電子）による分子量の測定を行なった。その結果、ＰＡＧ１−ＢＩＩ（Ｆ１２）ｐｅａｋ画分に含まれる物質は、分子量が２５６８．２であることが示された。さらに、質量分析におけるスペクトルから、画分に含まれる物質はいずれもシステイン残基を含まないことが示唆された。
さらに、ＰＡＧ１−ＢＩＩ（Ｆ１２）ｐｅａｋ画分について酸加水分解を行い、アミノ酸組成を解析した。結果を下表に示す。
0005500749.tif 000004
次いで、アミノ酸一次配列解析装置（ＰＰＳＱ−１０、島津製作所）を用い、エドマン法によるアミノ酸配列の解析を行なった。結果を以下に示す。
0005500749.tif 000005
このようにＰＡＧ１−ＢＩＩ（Ｆ１２）ｐｅａｋ画分に含まれる物質は、２３残基のポリペプチドであり、システイン残基を含んでいなかった。
ｂ．Ｃ末端解析
エドマン法によるアミノ酸配列解析ではＣ末端がカルボキシル基であるか、修飾を受けているかを決定することは不可能である。そこで、ポリペプチドのＣ末端構造を明らかにするために、ＦＡＢＭＳを用いて解析した。その結果、Ｃ末端がカルボキシル基であるときの理論分子量とＦＡＢＭＳによって求められた分子量とが一致したことから、Ｃ末端がカルボキシル基であることが示された。
ｃ．ホモロジー検索
得られたポリペプチドが新規なものであるかどうか情報を得るために、データベースＧｅｎｏｍｅ  Ｎｅｔ  ＷＷＷ（Ｌｏｃａｔｉｏｎ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／）を用い、既知物質とのホモロジー検索を行なった。その結果、このポリペプチドは、ウシ心臓シトクロムＣオキシダーゼ  サブユニットＶＩＩＩのＣ末端２３残基と８２％相同であり（２３残基中、１９残基が一致）、このポリペプチドがブタ心臓シトクロムＣオキシダーゼ  サブユニットＶＩＩＩ関連ペプチドであることが予想された。そこで、このポリペプチドをｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１（ＣＯＳＰ−１）と命名した。ウシ心臓シトクロムＣオキシダーゼ  サブユニットＶＩＩＩのＣ末端２３残基を以下に示す。
0005500749.tif 000006
またＣＯＳＰ−１は、ヒトシトクロムＣオキシダーゼ  サブユニットＶＩＩＩのＣ末端部と５７％相同であった（２１残基中、１２残基が一致）。この配列を以下に示す。
0005500749.tif 000007
実施例２（動物組織材料からのｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）の精製）
（１）精製
実施例１で得られたＰＡＧ１を、まず調製用ＯＤＳカラム（２０×２５０ｍｍ、山村化学（株））を用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、得られた各画分についてコンセントレターで濃縮、減圧乾固した後、超純水に溶解して分泌活性を測定した。このとき０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）存在下、アセトニトリルの直線的濃度勾配をかけて流速５ｍｌ／ｍｉｎで溶出を行い、２３０ｎｍの吸収を検出し、１画分当り１５ｍｌずつ分取した。その結果、最も活性の高い画分がアセトニトリル濃度として約２７〜３１％で溶出されたので、これをＰＡＧ１−１とした。次にこのＰＡＧ１−Ｉ画分をＴＳＫ−ＣＭ２ＳＷカラム（４．６×２５０ｍｍ、東ソー）を用いた陽イオン交換ＨＰＬＣにより精製して活性を測定した。このとき、１０％アセトニトリル存在下、ｐＨ６．６に調製したギ酸アンモニウム緩衝液の直線的濃度勾配をかけて流速１ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、２８０ｎｍの吸収を検出し、１画分当り１ｍｌずつ分取した。その結果、ギ酸アンモニウムの濃度が１５６〜１６５ｍＭで溶出される画分（ＰＡＧ１−Ｉ−ａ）、２１４〜２２８ｍＭで溶出される画分（ＰＡＧ１−Ｉ−ｂ）、及び２３４〜２４１ｍＭで溶出される画分（ＰＡＧ１−Ｉ−ｃ）にそれぞれ分泌活性が認められた。
これらの中で、ＰＡＧ１−Ｉ−ｃ画分を、分析用Ｃ４カラム（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ４、１．０×１５０ｍｍ、野村化学）を用いた微量ＲＰ−ＨＰＬＣにより０．１％ＴＦＡ存在下でアセトニトリルの濃度勾配をかけて流速５０μｌ／ｍｉｎで溶出し、精製して活性を測定したところ、アセトニトリルの濃度が２４％で溶出される画分（ＰＡＧ１−Ｉ−ｃ１）、２６％で溶出される画分（ＰＡＧ１−Ｉ−ｃ２）、２７％で溶出される面分（ＰＡＧ１−Ｉ−ｃ３）に活性が認められた。そして、最も高い活性が認められたＰＡＧ１−Ｉ−ｃ２についてさらに分析用Ｃ１８カラム（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ１８、１．０×２５０ｍｍ、野村化学）を用いた微量ＲＰ−ＨＰＬＣにより０．１％ＴＦＡ存在下でアセトニトリルの濃度勾配をかけて流速５０μｌ／ｍｉｎで溶出し、精製を行なったところ、アセトニトリルの濃度が２６％で溶出されるピークに活性が認められた。この活性画分の純度を検定するとともに、さらに精製するため、再度同じ分析用Ｃ１８カラムを用いて溶出を行なった結果、活性と一致する単一の溶出ピークを得ることができた。
（２）構造解析
画分に含まれる物質の構造を知るため、ＴＯＦ−ＭＳ（Ｖｏｙｇｅｒ  Ｅｌｉｔｅ、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ社）による分子量の測定を行なった。その結果、ＰＡＧ１−Ｉ−ｃ２画分に含まれる物質の分子量は、１８０６．４７であることが示された。またＦＡＢ−ＭＳを用いた質量分析を行なったところ、１８０５．１であることが示された。
この活性化物質の構造情報を得るためＦＡＢを用いたタンデム質量分析ＦＡＢ−ＭＳ／ＭＳ分析を行なった結果、以下に示す配列情報が得られた。ただし括弧内は残基量（残基の分子量）を表す。
Ｎ末端側：（２６０）−（２２７）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ／Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−：Ｃ末端側
また活性画分についてＡｒｇ残基のＣ末端側を切断する酵素であるＡｒｇ−Ｃによる処理を行なった。即ち、濃縮乾燥させた精製物質に４ｐｍｏｌのＡｒｇ−Ｃを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液２０μｌを加え、３７℃で１６時間インキュベートして処理し、これをＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ１８カラム（１．０×２５０ｍｍ、野村化学）を用いた微量ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。この際、０．１％ＴＦＡ存在下でアセトニトリルの濃度勾配をかけて流速５０μｌ／ｍｉｎで溶出し、２１４ｎｍの吸収ピークを示す４つの画分を、溶出順にＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄとし、それぞれについてアミノ酸一次構造解析を行なった。結果を下表に示す。
0005500749.tif 000008
Ｃの配列についてホモロジー検索を行なった結果、ミトコンドリアタンパク質であるブタシトクロム  ｂ（６−１５）の配列と同一であった。さらにＦＡＢ−ＭＳ／ＭＳにより得られた活性画分のＮ末端側からの残基量、２６０と２２７がブタシトクロム  ｂ（１−４）のｆＭｅｔ−Ｔｈｒ及びＡｓｎ−Ｉｌｅの残基量と一致した。
このようにＡｒｇ−Ｃにより得られた部分ポリペプチドの配列及びＦＡＢ−ＭＳ／ＭＳ分析による構造情報より、この活性画分に含まれる物質は、ブタシトクロム  ｂ（１−１５）と同一であり、以下の配列であることが予測された。
0005500749.tif 000009
また、検索の結果得られた配列（ｆＣｙｔ  ｂ（１−１５））より算出される分子量は１８２４．１９であり、ＦＡＢ−ＭＳによる質量分析の結果得られた分子量１８０５．１とは同一ではなかったが、ＦＡＢ−ＭＳ／ＭＳ分析より、活性画分に含まれる物質のＣ末端部分が修飾されている可能性が示唆された。
さらに、決定されたブタシトクロム  ｂ（１−１５）の配列は、ヒトシトクロム  ｂ（１−１５）と６７％相同であった（１５残基中、１０残基が一致）。その配列を以下に示す。
0005500749.tif 000010
実施例３（ＣＯＳＰ−１及びｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）（ブタ及びヒト）の合成）
ポリペプチドの合成はＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法により、Ｂｏｃ法又はＦｍｏｃ法で簡易型ガラス反応容器中で行なった。
（１）材料
Ｎα−ｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ（Ｂｏｃ）−Ｌ−Ａｌａ−ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ（ＰＡＭ）樹脂及びｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｏｘｙ（ＨＭＰ）樹脂は渡辺化学工業（株）から、Ｎ，Ｎ’−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＤＣＣ）、１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ（ＨＯＢｔ）、Ｂｏｃ−アミノ酸及び９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ（Ｆｍｏｃ）−アミノ酸は（株）ペプチド研究所から購入したものを使用した。その他の一般試薬は和光純薬（株）より入手したものを使用した。
（２）Ｂｏｃ法による合成
Ｂｏｃ法によるポリペプチド合成において、固相担体にはＰＡＭ樹脂を、アミノ酸α−アミノ基の保護にはＢｏｃ基を用いた。Ｂｏｃ−アミノ酸の側鎖保護基として、Ａｓｐにはｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ基、Ｓｅｒ及びＴｙｒにはＢｅｎｚｙｌ基、Ｈｉｓには２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ（Ｄｎｐ）基、ＡｒｇにはＴｏｓｙｌ基を用いた。
最初にＢｏｃ−Ｘ−ＰＡＭ樹脂（Ｘは合成したいポリペプチドのＣ末端アミノ酸）を５０％ＴＦＡで処理し、Ｎ末端のＢｏｃ基を切断し、続いてＢｏｃ−Ｘの導入量に対し２．５当量のＢｏｃ−アミノ酸をＤＣＣ−ＨＯＢｔ法で縮合させた。数時間後、Ｋａｉｓａｒのニンヒドリンテストによって反応が完了しているかどうかを確認し、反応が充分でない場合は再度縮合反応を行なった。このようにＢｏｃ基の切断と保護アミノ酸の縮合反応を繰り返してＣ末端より順次ポリペプチド鎖を延長し、保護ポリペプチド樹脂を得た。ただし、Ｔｒｐのインドール環を保護するために、Ｔｒｐ残基導入後のＢｏｃ基の切断には２％エタンジチオールを含む５０％ＴＦＡを使用した。
得られた保護ポリペプチド樹脂の脱保護及び樹脂からの脱離は、無水フッ化水素処理により行なった。即ち、保護ポリペプチド樹脂１ｇあたりアニソール（０．５ｍｌ）、チオアニソール、エタンジチオール、硫化メチル（各１ｍｌ）存在下、１０ｍｌの無水フッ化水素で氷冷下１時間処理してポリペプチドを樹脂から脱離し、同時に保護基を除去した。反応後直ちにＨＦを真空下で除去し、ポリペプチド及び樹脂混合物をジエチルエーテルで洗浄した後、６０％アセトニトリルによりポリペプチドを抽出し、減圧濃縮後凍結乾燥して粗ポリペプチドを得た。ただし、保護ポリペプチド樹脂にＨｉｓが含まれている場合は、Ｄｎｐ基をチオフェノール（２０ｍｍｏｌ／ｍｍｏｌ  Ｄｎｐ基）で１時間反応させて除去した後、Ｎ末端のＢｏｃ基を切断、無水フッ化水素処理を行った。
（３）Ｆｍｏｃ法による合成
Ｆｍｏｃ法によるポリペプチド合成においては、固相担体にＨＭＰ樹脂を、α−アミノ基の保護にはＦｍｏｃ基を用いた。側鎖の保護には、Ａｓｎ、Ｈｉｓにｔｒｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ（Ｔｒｔ）基、Ｓｅｒ、Ｔｙｒにｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ（ｔ−Ｂｕ）基、Ａｒｇに４−ｍｅｔｈｏｘｙ−２，３，６−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ（Ｍｔｒ）基、Ｌｙｓにはｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｌｂｏｎｙｌ（Ｂｏｃ）基を用いた。
まずＨＭＰ樹脂をｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ（ＤＣＭ）中で膨潤させた後、これと２当量のＤＣＣ、０．２当量のｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ（ＤＭＡＰ）、２当量のＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）をＮ，Ｎ’−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ（ＤＭＦ）中において１時間反応させＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＨＭＰ樹脂を得た。ＨＭＰ樹脂へのアミノ酸の導入量は、ピペリジン：ＤＭＦ（３：７）の処理により生成されるＮ−（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅの量を、３０１ｎｍにおける吸光度を測定することにより定量した。ポリペプチド鎖の伸長は、Ｆｍｏｃ−アミノ酸−樹脂を２０％ピペリジン−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｒｉｄｏｎｅ（ＮＭＰ）中で約３０分処理してＦｍｏｃ基を除去した後、導入されたＣ末端アミノ酸に対して５当量のＦｍｏｃ−アミノ酸、ＨＯＢｔ、ＤＣＣ、及び１当量のＮ，Ｎ’，Ｎ”−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（ＤＩＥＡ）を加えて、３０分〜数時間縮合する操作を繰り返すことで行なった。Ｆｍｏｃ基の脱離及び縮合反応の進行は、微量の樹脂を反応容器より取り出してニンヒドリンテストを行なって確認した。
Ｎ末端へのｆｏｒｍｙｌ基の導入は、まずポリペプチド鎖の伸長を終えたポリペプチド樹脂のＦｍｏｃ基を除去し、このポリペプチド樹脂とそれぞれ２０当量のギ酸、ＤＣＣ、ＨＯＢｔとをＤＭＦ中で反応させることにより行った。反応の終了は、ニンヒドリンテストにより確認した。得られた保護ポリペプチド樹脂の脱保護及び樹脂からの脱離は、スカベンジャーとしてフェノール、チオアニソールを含むＴＦＡ溶液（ＴＦＡ：フェノール：チオアニソール：水＝８２．５：５：５：５）で３時間処理することにより行なった。反応終了後に反応混合液を濃縮除去し、１Ｍ酢酸を用いてポリペプチドの抽出を行ない、樹脂をろ別した。その後ジエチルエーテルによる洗浄を３回行ないスカベンジャーを除去し、減圧濃縮した後、凍結乾燥することで粗ポリペプチドを得た。
（４）合成したポリペプチドの精製
合成ポリペプチドの精製は、ＴＳＫ  ｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（２０×２５０ｍｍ、東ソー）カラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣによって行った。０．１％ＴＦＡ存在下でアセトニトリルの直線的濃度勾配をかけて流速５ｍｌ／ｍｉｎで溶出を行い、２１４ｎｍの吸収を指標に主なピークを分取し、これを凍結乾燥することで精製ポリペプチドを得た。精製ポリペプチドの純度は、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＯＤＳ（４．５×２５０ｍｍ）カラムを使用した分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより確認した。即ち、ポリペプチドの精製と同様に、０．１％ＴＦＡ存在下でアセトニトリルの直線的濃度勾配をかけて流速１ｍｌ／ｍｉｎで溶出を行い、２１４ｎｍの吸収で確認した。また、精製したポリペプチドを２％フェノール、２％チオグリコール酸を含む６Ｎ塩酸中で１１０℃、２４時間加水分解し、加水分解物をアミノ酸分析計によって分析し、ポリペプチドのアミノ酸組成及び含有量を確認した。
実施例４（β−ＨＡ分泌活性）
合成したＣＯＳＰ−１、ｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）及びＣｙｔ  ｂ（１−１５）（ブタ及びヒト）のβ−ＨＡ分泌活性について検討した。
（１）材料
ヒト骨髄性白血病細胞由来株のＨＬ６０細胞は理化学研究所から購入したものを使用した。ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ、ＦＣＳ）はＢｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、ＲＰＭＩ−１６４０培地はＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社、ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ、ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｆｒｅｅ）（ＢＳＡ）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社、Ｎ６、２’−Ｏ−ｄｉｂｕｔｙｒｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ３’：５’−ｃｙｃｌｉｃｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｄｂ−ｃＡＭＰ）、ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ  Ｂ、ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ（ＤＮａｓｅ  Ｉ）、ｆＭＬＰ、及びｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅはＳＩＧＭＡ社、β−ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＮＡＤ）は東京化成工業、硫酸ストレプトマイシン、結晶ペニシリンＧは明治製菓（株）から購入したものを使用した。
（２）方法
ａ．ＨＬ６０細胞の培養、及び好中球様細胞への分化誘導
培養には、熱非働化したＦＣＳ（最終濃度１０％）、ストレプトマイシン（同１００ｍｇ／ｌ）、ペニシリンＧ（同１０万単位／ｌ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ含むＲＰＭＩ−１６４０培養液（ｐＨ７．４）を用いた。細胞培養は細胞密度が２×１０５〜１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにしてプラスチック製の培養フラスコ（８０ｃｍ２、２６０ｍｌ、Ｎｕｎｃ社）の中、３７℃、ＣＯ２濃度５％、湿度１００％の条件下、静置して行った。
ＨＬ６０細胞の好中球様細胞への分化は、フラスコ内の細胞密度が１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの時点でｄｂ−ｃＡＭＰを分化誘導剤として最終濃度が０．５ｍＭとなるように添加し、３日間静置して行なった。
ｂ．ヒト白血球の調製
ヒト末梢血（５００単位のヘパリンナトリウムを含む）３０ｍｌを５ｍｌのリンホセパールＩが入った遠心管４本に分けて重層し、室温下遠心分離（４００ｇ、３０ｍｉｎ）した。このとき血漿とリンホセパールＩの界面に白濁した層として存在する単球及びリンパ球を注意深く吸い取り、これを単球−リンパ球混合細胞とした。次に沈殿した好中球を含む赤血球細胞層をリン酸平衡生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ；１３９ｍＭ  ＮａＣｌ、８．１８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）により洗浄した後に、８５％のＰｅｒｃｏｌｌ−Ｈｅｐｅｓ平衡Ｈａｎｋ’ｓ緩衝溶液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１３６．９ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．４４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．４９ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．３４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、４．２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ７．４）の上に重層して遠心（８００ｇ、１０ｍｉｎ）することにより赤血球細胞を沈殿させた。そして好中球を含むＰｅｒｃｏｌｌ層を注意深く吸い取り、生理食塩水により洗浄した後、０．２％ＮａＣｌ水溶液に置換し約３０秒後に同量の１．６％ＮａＣｌ水溶液を加える操作を２回行なうことにより、含まれる赤血球を溶血させて好中球を得た。
得られた単球−リンパ球混合細胞及び好中球の純度は、フローサイトメーターを用いた解析により検定した。即ち、ヒト末梢血由来の細胞画分の浮遊液に、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅを終濃度１００ｎｇ／ｍｌになるように加えて死細胞を染色し、フローサイトメーターを用いてこの細胞浮遊液のｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ染色陰性細胞（生細胞）のみに関してｆｏｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙおよびｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙをｌｉｎｅａｒ  ｓｃａｌｅにて測定した。測定結果はＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてｆｏｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（Ｘ軸）とｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（Ｙ軸）のドットプロットとして表示した。その結果、単球及びリンパ球の混合細胞は純度８４％であり、また好中球は純度８３％であった。
ｃ．細胞の刺激
分化ＨＬ６０細胞及びヒト白血球細胞を、まず氷冷した０．１％ＢＳＡを含むＨｅｐｅｓ緩衝Ｈａｎｋ’ｓ平衡塩溶液（Ｈｅｐｅｓ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｈａｎｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＢＨＳ；１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１３６．９ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．４４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．４９ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．３４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、５．５ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ、４．２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。そして、細胞密度が５．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調製し、この細胞懸濁液に、ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ  Ｂ及びＤＮａｓｅ  Ｉをそれぞれ終濃度５μｇ／ｍｌになるように添加した。この後、細胞懸濁液を氷冷したチューブに９０μｌずつ移し（５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅ）、３７℃で１０分間インキュベートし、それぞれのチューブに１０μｌのポリペプチド（又は抽出物）溶液のいずれかを加えて、さらに３７℃で１０分間細胞を刺激した。この後すぐに２００μｌの氷冷した反応停止溶液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１２３ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）を細胞懸濁液に加え、刺激を停止した。この後、４℃で６０秒間遠心分離することにより細胞を沈殿させ、この上清中のβ−ＨＡ活性、及び乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＬＤＨ）活性の測定を行なった。
ｄ．β−ＨＡ酵素活性測定
反応上清中に分泌されたβ−ＨＡの量は、ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅを基質とした酵素反応により生成されるｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌの吸収を４１５ｎｍで測定することにより求めた。即ち、上述の反応上清９０μｌを９６ｗｅｌｌのＩｍｍｕｎｏ  ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ社）に移し取り、６０μｌの基質溶液（１０ｍＭ  ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ／４０ｍＭ  ｃｉｔｒａｔｅ、７０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ４．５）を加えることによって酵素反応を開始させた。これを３７℃で１時間反応させた後、１００μｌの反応停止液（４００ｍＭ  ｇｌｙｃｉｎｅ、ｐＨ１０．７）を加えて反応を停止させ、４１５ｎｍの吸収を測定した。コントロールとして、終濃度０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００によって処理したときの細胞上清中のβ−ＨＡの量、及び終濃度１０μＭのｆＭＬＰの刺激により分泌されたβ−ＨＡ量の測定を常に行なった。
反応溶液中に分泌されたβ−ＨＡ酵素活性は、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により細胞を破壊した時に放出されるβ−ＨＡの酵素活性を細胞内の全酵素活性とし、これに対する百分率（％／ｔｏｔａｌ）で示すか、又は１０μＭのｆＭＬＰによる刺激で放出されたβ−ＨＡの酵素活性を最大分泌活性とし、これに対する百分率（％／ｃｏｎｔｒｏｌ）で表した。
ｅ．ＬＤＨ酵素活性測定
反応液中に分泌されたＬＤＨの量は、ｌａｃｔａｔｅの脱水素反応の伴うＮＡＤの還元反応によって生じるＮＡＤＨの吸収（３４０ｎｍ）を測定することによって求めた。即ち、１００μｌの反応上清に４００μｌの基質−緩衝液（１２５ｍＭ  ２−ａｍｉｎｏ−２−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ、１２５ｍＭ  ｌｉｔｈｉｕｍ  ｌａｃｔａｔｅ、６．２５ｍＭ  ＮＡＤ、ｐＨ９．５）を加えることによって反応を開始させた。これを３７℃で１時間反応させた後、氷水中で急冷して反応を停止させ、３４０ｎｍの吸収を測定した。
反応溶液中に分泌されたＬＤＨの酵素活性は、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により細胞を破壊したときに放出されるＬＤＨの酵素活性を細胞内の全酵素活性とし、これに対する百分率（％／ｔｏｔａｌ）で表した。
（２）結果及び考察
ａ．分化ＨＬ６０細胞に対するβ−ＨＡ分泌活性
結果を下表及び図１に示す。
0005500749.tif 000011
0005500749.tif 000012
ＣＯＳＰ−１及びｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）は濃度依存的に分化ＨＬ６０細胞からのβ−ＨＡ分泌を刺激した（ＥＣ５０：ＣＯＳＰ−１  ２．６７×１０−７Ｍ、ｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）３．８０×１０−８Ｍ）。またＣｙｔ  ｂ（１−１５）は、ｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）の約１／１０００以下ではあるが、活性を持つことが示された。しかしながらこれらのポリペプチド刺激時において細胞からのＬＤＨの漏出がみられなかった。従って、ＣＯＳＰ−１、ｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）及びＣｙｔ  ｂ（１−１５）は分化ＨＬ６０細胞からのエキソサイト−シスを引き起こすことによりβ−ＨＡの分泌を促進することが示された。
また、ＣＯＳＰ−１及びｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）のヒト相同ペプチド、ヒトＣＯＳＰ−１及びヒトｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）は、ＣＯＳＰ−１及びｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）と同様に分化ＨＬ６０細胞においてβ−ＨＡの分泌活性を持つことが示された。
ｂ．ヒト好中球に対するβ−ＨＡ分泌活性
結果を下表に示す。
0005500749.tif 000013
ヒトから単離した好中球細胞からのβ−ＨＡ分泌は、無刺激時１７．９％であるのに対し、１０μＭ  ｆＭＬＰ刺激時には６８．３％、１０μＭ  ＣＯＳＰ−１刺激時には４０．５％、１０μＭ  ｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）刺激時には５８．３％であり、分泌刺激が認められた。また単球及びリンパ球の混合細胞においては、無刺激時１６．３±６．０％であるのに対し、１０μＭ  ｆＭＬＰ刺激時は２１．８±５．３％、１０μＭ  ｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）刺激時は２０．０±７．８％と、わずかではあるがβ−ＨＡ分泌活性が認められた。しかしながら、好中球細胞及び混合細胞どちらにおいても、ＬＤＨの漏出は認められなかった。従って、これらポリペプチドはヒト好中球に障害を与えることなくエキソサイト−シスを引き起こすことによりβ−ＨＡの分泌を促進することが示された。
実施例５（遊走活性）
ｆＭＬＰやインターロイキン８などの好中球活性化因子は、好中球からのβ−ＨＡをはじめとした各種分解酵素分泌活性のほかに遊走活性を持つことが知られている。そこでＣＯＳＰ−１及びｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）の、未分化又は好中球様に分化したＨＬ６０細胞に対する遊走活性を検討した。
（１）方法
各ポリペプチドの遊走活性は、ケモタキセル（クラボウ）を用いて以下に示すようにして測定した。即ち、分化又は未分化ＨＬ６０細胞を氷冷したＨＢＨＳで３回洗浄した後、細胞密度が４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を３７℃で１０分間インキュベートした後、ケモタキセルに５００μｌずつ移し（２×１０６ｃｅｌｌｓ／セル）、これを各ｗｅｌｌに１ｍｌのポリペプチドを含むあらかじめ３７℃に暖めたＨＢＨＳを入れたプレートにのせ、３７℃で１時間インキュベートした。この後ケモタキセルをプレートから取り除き、各ｗｅｌｌに遊走した細胞数をカウントした。
遊走活性は、無刺激の場合に遊走する細胞数に対する刺激した場合に遊走する細胞数の比（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｉｎｄｅｘ）で表した。
（２）結果及び考察
結果を図２に示す。
未分化の細胞においてこれらポリペプチドは遊走活性を示さなかったが、分化ＨＬ６０細胞において濃度依存的に誘引活性を示した。
実施例６（ＨＬ６０細胞の分泌作用に及ぼす分化の影響）
ＨＬ６０細胞をｄｂ−ｃＡＭＰ処理すると好中球様に分化するのに伴い細胞表面にｆＭＬＰ受容体が発現されるが、その発現量は時間依存的に増加することが知られている。そこで、ＨＬ６０細胞が分化するに伴いＣＯＳＰ−１によるβ−ＨＡ分泌がどのように変化するのかを検討した。
（１）方法
細胞培養方法は、実施例４に記載された方法に従った。但し、最終濃度１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培養液を使用し、ＨＬ６０細胞の好中球様細胞への分化は、ｄｂ−ｃＡＭＰ（最終濃度０，５ｍＭ）を添加した時点でのフラスコ内の細胞密度が０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調製して行った。そして、ＨＬ６０細胞が、未分化、細胞分化後２４時間、４８時間、７２時間における、ＣＯＳＰ−１及びｆＭＬＰよるβ−ＨＡ分泌活性を測定した。
（２）結果及び考察
結果を下表及び図３に示す。
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ＣＯＳＰ−１及びｆＭＬＰは未分化細胞においては分泌を引き起こさなかったが、分化後はそれぞれの時間において濃度依存的に分泌を惹起し、また分化が進むほど最大分泌量が上昇し、かつその感受性が増大した。加えて、ＣＯＳＰ−１及びｆＭＬＰはＨＬ６０細胞からのＬＤＨの漏出を起こさなかった。従って、ＣＯＳＰ−１はｆＭＬＰと同様にＨＬ６０細胞の分化に伴って発現する受容体を介してβ−ＨＡ分泌を惹起している可能性が示された。
実施例７（細胞内Ｃａ２＋濃度に及ぼす影響）
つづいてＣＯＳＰ−１による刺激が、ＨＬ６０細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）にどのような影響を与えるのかを検討し、既に報告されているｆＭＬＰによる刺激の場合と比較した。
（１）方法
分化、又は未分化ＨＬ６０細胞をＨｅｐｅｓ−Ｎａ液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１１ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ、０．２％  ＢＳＡ、ｐＨ７．４）によって２回洗浄した後、Ｃａ２＋感受性蛍光試薬であるｆｕｒａ−２／ＡＭを細胞懸濁液に加え（４ｍｌ、最終濃度４μＭ）、室温、遮光下で６０分間、緩やかに振とうしてｆｕｒａ−２をＨＬ６０細胞に取り込ませた。続いてこの細胞をＨｅｐｅｓ−Ｎａ液で２回洗浄し、最終的な細胞密度が１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにし、この細胞懸濁液１ｍｌを反応キュベットに入れ、３０℃で撹拌しながら種々のサンプルで刺激した。このとき、励起波長３４０ｎｍと３８０ｎｍにおける５００ｎｍの蛍光強度比（Ｆ）を蛍光光度計（ＣＡＦ−１００、日本分光社製）で測定し、［Ｃａ２＋］ｉを次式に従って計算した。
［Ｃａ２＋］ｉ（ｎＭ）＝Ｋ×｛（Ｆ−Ｆｍｉｎ）／（Ｆｍａｘ−Ｆ）｝×Ａ／Ｂ
式中の符号の意味は以下の通り：
Ｆｍａｘ；０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で全細胞を可溶化した後の励起波長３４０ｎｍと３８０ｎｍにおける５００ｎｍの蛍光強度比、
Ｆｍｉｎ；４ｍＭ  ＥＧＴＡで全カルシウムをキレートしたときの励起波長３４０ｎｍと３８０ｎｍにおける５００ｎｍの蛍光強度比、
Ａ；ＥＧＴＡでキレートしたときの励起波長３８０ｎｍにおける５００ｎｍの蛍光強度、
Ｂ；Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で全細胞を可溶化したときの励起波長３８０ｎｍにおける５００ｍｎの蛍光強度、
Ｋ；２２４（ｎＭ）（ｆｕｒａ−２の解離定数）。
（２）結果及び考察
結果を図４に示す。ＣＯＳＰ−１及びｆＭＬＰは分化ＨＬ６０細胞（＋）において細胞内Ｃａ２＋濃度上昇を惹起したが、未分化ＨＬ６０細胞（−）では起こさなかった。また、既に報告されているようにＡＴＰは分化、未分化を問わずＨＬ６０細胞において細胞内Ｃａ２＋濃度上昇を惹起した。
さらに図５に示すように、ＣＯＳＰ−１及びｆＭＬＰの刺激による細胞内Ｃａ２＋濃度上昇は、細胞外Ｃａ２＋の有無に関係なく起こるが、細胞外Ｃａ２＋存在下（＋）に比べ非存在下（−）ではその上昇量が低下した。したがって、ＣＯＳＰ−１及びｆＭＬＰの刺激による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇は細胞内Ｃａ２＋ストアからのＣａ２＋の遊離と細胞外からの流入により起こることが示唆された。
実施例８（百日咳毒素ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ（ＰＴＸ）処理による影響）
分化ＨＬ６０細胞に発現しているｆＭＬＰ受容体は、ＰＴＸ処理により不活性化されるＧタンパク質（ＰＴＸ感受性Ｇタンパク質）を活性化させることで細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇や分解酵素の分泌などを起こすことが知られている。そこで、ＣＯＳＰ−１の刺激により引き起こされる分化ＨＬ６０細胞における細胞内Ｃａ２＋濃度上昇やβ−ＨＡ分泌がＰＴＸ処理によりどのように変化するのかを検討した。
（１）方法
ＰＴＸ処理は、β−ＨＡ分泌活性の測定、及び細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を行う１６時間前に、分化ＨＬ６０細胞を２等分し、ＰＴＸ処理する細胞には終濃度が５０ｎｇ／ｍｌになるようにＰＴＸを添加した。ＰＴＸ処理しない細胞にはそれと同量の超純水を添加した。ＰＴＸ処理には、ＰＴＸ（５０μｇ）（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｉｎｃ．から購入したものを使用）を超純水１ｍｌに溶解し、２〜３℃で保存したものを使用した。
（２）結果及び考察
結果を図６及び図７に示す。ＰＴＸ処理により、ＣＯＳＰ−１及びｆＭＬＰによる細胞内Ｃａ２＋濃度上昇やβ−ＨＡ分泌はほぼ完全に阻害された。従って、ＣＯＳＰ−１による細胞内Ｃａ２＋濃度上昇やβ−ＨＡ分泌は、ＰＴＸ感受性Ｇタンパク質と共役する受容体の活性化を介して引き起こされている可能性が示された。
実施例９（ＣＯＳＰ−１のｆＭＬＰ受容体に対する結合親和性）
ＣＯＳＰ−１による、細胞内Ｃａ２＋濃度上昇及びβ−ＨＡ分泌について検討した結果、これらは非常によく似た刺激機構で分化ＨＬ６０細胞を活性化していることが示された（実施例６〜８参照）。そこで、まだ同定されていないＣＯＳＰ−１受容体の実体を解明するため、まずｆＭＬＰの特異的阻害剤として報告されているＢｏｃ−ＭＬＦがＣＯＳＰ−１によるβ−ＨＡ分泌に対してどのような影響を与えるかについて検討した。その結果、ＣＯＳＰ−１による分化ＨＬ６０細胞からのβ−ＨＡ分泌はＢｏｃ−ＭＬＦにより有意に抑制されることが示された（データーは示さず）。
この結果からＣＯＳＰ−１がｆＭＬＰ受容体に結合する可能性が考えられたため、ＣＯＳＰ−１のｆＭＬＰ受容体に対する結合親和性を検討した。
（１）方法
ＣＯＳＰ−１のｆＭＬＰ受容体に対する結合親和性の検討は、分化ＨＬ６０細胞を用いて行った。即ち、分化ＨＬ６０細胞をＨＢＨＳで２回洗浄した後、３．１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように細胞を懸濁し、これをチューブに移し（２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／８０μｌ）、２２℃で、１０分間インキュベートした。次いで、各濃度に調製したＣＯＳＰ−１、又はｆＭＬＰ（１０μｌ）を加え、２２℃で、５分間インキュベートした。この後、さらに１０μｌの［３Ｈ］ｆＭＬＰ（最終濃度５０ｎＭ）を加え、２２℃で６０分間反応させた後、直ちに氷冷したＰＢＳ−ＢＳＡ（１０ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  ＢＳＡ）を５００μｌ加えて反応を停止させた。そして、この細胞懸濁液をｇｌａｓｓ−ｆｉｂｅｒ  ｆｉｌｔｅｒ（Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｃ）に通し、氷冷したＰＢＳ−ＢＳＡ（２ｍｌ）でフィルターを３回洗浄して細胞に結合していない［３Ｈ］ｆＭＬＰを除去した。このｇｌａｓｓ−ｆｉｂｅｒ  ｈｉｌｔｅｒを乾燥させて、ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ溶液の中に加え、放射活性を測定した。
ｆＭＬＰ受容体に対する受容体結合実験の測定値は、非標識リガンド非存在下で特異的な結合をしている［３Ｈ］ｆＭＬＰの放射活性を最大結合量とし、これに対する百分率（％／ｔｏｔａｌ）で示した。
（２）結果及び考察
結果を図８に示す。ｆＭＬＰは［３Ｈ］ｆＭＬＰとｆＭＬＰ受容体の特異的な結合を濃度依存的に阻害したが、ＣＯＳＰ−１は終濃度１０μＭにおいてもこれを阻害しなかった。従って、分化ＨＬ６０細胞においてＣＯＳＰ−１は、ｆＭＬＰ受容体とは異なる受容体を経てその情報を細胞内に伝達していることが示唆された。
実施例１０（ペプチドによるＧタンパク質の活性化）
ＣＯＳＰ−１がｆＭＬＰ受容体以外の経路で情報を伝達していることが示されたので、ＣＯＳＰ−１の刺激が、細胞膜表面に存在する受容体を経たものか、又は直接Ｇタンパク質を活性化するためのものなのかを検討するため、精製したＧタンパク質を活性化するか否かを検討した。
（１）方法
好中球に存在し、ｆＭＬＰの情報伝達に関わっていると考えられるＧタンパク質（Ｇｉ）をウサギ肝臓より抽出、精製した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１６２３７−１６２４３，１９９２）。このＧｉをリン脂質膜に再構成し、これをｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）あるいはＣＯＳＰ−１により刺激し、ＧＴＰアーゼ活性を測定した。
（２）結果及び考察
ＣＯＳＰ−１は、３μＭにおいてＧｉのＧＴＰアーゼ活性を約６倍刺激したが、ｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）は１００μＭにおいても刺激活性を持たなかった。
以上の結果より、ＣＯＳＰ−１は直接Ｇタンパク質を刺激することで好中球を活性化する可能性があることが示唆された。
実施例１１（モノクローナル抗体の調製）
精製したＣＯＳＰ−１の１０〜１００μｇをキャリアータンパク質と結合させた後、アジュバンド中に乳化し、マウス腹腔内に注射し、マウスを免疫する。１０〜１２日後、さらにその後週１〜２回、追加注射する。さらに、食塩水に精製ＣＯＳＰ−１を溶解し、静脈注射して、３〜４後にマウスの脾臓細胞を採取する。採取した細胞と、マウスミエローマ細胞ＮＳ１とを融合し、ＨＡＴ培地を用いて所望を脾臓細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマを選択する。そして、ＣＯＳＰ−１に対する反応性を指標に、所望の抗体を高濃度に産生するハイブリドーマをスクリーニングする。
得られたハイブリドーマを、プラスチック製の培養フラスコ（８０ｃｍ２、２６０ｍｌ、Ｎｕｎｃ社）の中、極東Ｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬）に添加剤ＲＤ−１（極東製薬）を加えたものを培地として、３７℃、ＣＯ２濃度５％、湿度１００％の条件下、３〜１０日間、静置培養する。培養上清を限外ろ過膜を用いて濃縮し、定法により精製して、所望のモノクローナル抗体を得ることができる。
実施例１２（ＣＯＳＰ−１及びｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）ヒトホモローグの、ヒト由来好中球様細胞に対する効果）
ブタ由来ＣＯＳＰ−１及びｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）は濃度依存的に分化ＨＬ６０細胞からのβ−ＨＡ分泌及び分化ＨＬ６０細胞の誘引活性を示した（実施例４及び５参照）。ＨＬ６０細胞はヒト由来の好中球由来細胞であるため、ＣＯＳＰ−１及びｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）ヒトホモローグの、分化ＨＬ６０細胞に対するβ−ＨＡ分泌及び分化ＨＬ６０細胞の遊走活性について精査した。また、比較のために微生物由来タンパク質のモデルペプチドであるｆＭＬＰによる作用も同様にして比較・検討した。
（１）方法
ＣＯＳＰ−１及びｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）ヒトホモローグによるβ−ＨＡ分泌活性及び遊走活性の測定は、それぞれ実施例４及び５に記載した方法に従って行った。そして、β−ＨＡ分泌活性は、最大反応を示す１０μＭ  ｆＭＬＰ刺激時の分泌量に対する百分率で、また遊走活性は、無刺激の場合に遊走する細胞数に対する刺激した場合に遊走する細胞数の比（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓｉｓ  ｉｎｄｅｘ）で表した。
（２）結果及び考察
結果を図９に示す。
ヒトＣＯＳＰ−１（ｈＣＯＳＰ−１）及びヒトｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）（ｈｆＣｙｔ  ｂ（１−１５））の両者とも、分化ＨＬ６０細胞からのβ−ＨＡ分泌及び分化ＨＬ６０細胞遊走活性を示した。しかし、この作用は未分化ＨＬ６０細胞では認められなかった（結果は示さず）。
また、ヒトホモローグによる刺激においては、特徴的な作用が認められた。即ち、ｆＭＬＰ、ｈＣＯＳＰ−１及びｈｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）すべての場合においてβ−ＨＡ分泌活性を示す濃度より低い濃度で遊走活性が認められたが、ｆＭＬＰにおいては分化ＨＬ６０細胞からのβ−ＨＡ分泌活性が認められる濃度において遊走活性も認められたのに対し、ｈＣＯＳＰ−１及びｈｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）の刺激においては、β−ＨＡ分泌を惹起するよりも低い濃度においてのみ、遊走活性が認められ、β−ＨＡ分泌活性が認められる濃度においては遊走活性は脱感作された。
以上の結果より、生体内においてｈＣＯＳＰ−１及びｈｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）は炎症部位より拡散し、まず好中球を誘引し（この段階では、好中球の活性化（貧食や過酸化物質の産生など）は起こさない。）、好中球が炎症部位に接近することによってこれらのペプチドの濃度が上昇すると、好中球は遊走を停止し、その場所で活性化されて貧食、過酸化物質の産生などの作用を発揮することで、炎症部位に存在する死細胞や障害細胞などの有害物質の除去作用を示すものと考えられる。
このように、本出願は、ｈＣＯＳＰ−１及びｈｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）などが関与する、以下に記載する新しい炎症発症機構をも提起する。この機構を図１０に示す。
組織障害が起きる（細胞がダメージを受ける）と、ミトコンドリアの膨張によってタンパク質が漏出する。漏出したミトコンドリアタンパク質は断片化され、ｈＣＯＳＰ−１及びｈｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）のようなペプチドを生じる。これらのペプチドは拡散し、好中球を傷害部位に誘引する。好中球は傷害部位に近接すると運動を停止する。同時に好中球はこれらのペプチドによって活性化され、各種分解酵素の分泌、各種サイトカインや活性酸素の産生、貧食などの作用を示すことにより傷害部位に存在する有害な死細胞及び障害細胞、並びにそれらの産物の処理にあたる、というものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】  図１は、ポリペプチドの分化ＨＬ６０細胞に対するβ−ＨＡ分泌活性についての実験結果である（実施例４）。データは８つの異なる実験の平均値±Ｓ．Ｅ．を表す。□はｆＭＬＰ、○はＣｙｔ  ｂ（１−１５）、◇はｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）を表す。
図２は、ポリペプチドの好中球様に分化したＨＬ６０細胞に対する遊走活性についての実験結果である（実施例５）。○はｆＭＬＰ、●はＣＯＳＰ−１、□はｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）を表す。
図３は、ポリペプチドのＨＬ６０細胞の分泌作用に及ぼす分化の影響についての実験結果である（実施例６）。●は未分化、▽は分化２４時間、▼は分化４８時間、□は分化７２時間の値を表す。
図４は、ポリペプチドの細胞内Ｃａ２＋濃度に及ぼす効果及びそれに対する分化の影響についての実験結果である（実施例７）。
図５は、ポリペプチドの細胞内Ｃａ２＋濃度に及ぼす細胞外カルシウム存在の影響についての実験結果である（実施例７）。
図６は、ＰＴＸ処理によるポリペプチドのβ−ＨＡ分泌に与える影響についての実験結果である（実施例８）。●及び■は、５０ｎｇ／ｍｌのＰＴＸで、○及び□は超純水で前処理したときの値を表す。
図７は、ＰＴＸ処理によるポリペプチドの細胞内Ｃａ２＋濃度上昇に与える影響についての実験結果である（実施例８）。
図８は、ＣＯＳＰ−１のｆＭＬＰ受容体に対する結合親和性ついての実験結果である（実施例９）。○はｆＭＬＰ、●はＣＯＳＰ−１を表す。
図９は、ｆＭＬＰ、ヒトＣＯＳＰ−１及びヒトｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）の、好中球様細胞へ分化したＨＬ６０細胞のβ−ＨＡ分泌及び遊走活性に対する効果についての実験結果である（実施例１２）。●はｆＭＬＰ、▲はヒトｆＣｙｔ  ｂ（１−１５）、■はヒトＣＯＳＰ−１を表す。
図１０は、本願によって提起される炎症機構を図示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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