(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウム塩の存在下での微生物の発酵培養により培養液中に生産された乳酸カルシウムを精製する工程を含む乳酸の製造方法であって、該培養液のｐＨを６以上１１以下に調整し、該培養液をナノフィルターに通じて該培養液中の酢酸を透過液側に除去し、非透過液側から乳酸カルシウムを含んだ水溶液を回収する工程を含む、乳酸の製造方法。
【請求項２】
前記ナノフィルターの機能層がポリアミドを含む、請求項１に記載の乳酸の製造方法。
【請求項３】
前記ポリアミドが架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、化学式１で示される構成成分を含有することを特徴とする請求項２に記載の乳酸の製造方法。
【化１】
0005564783.tif 000009
（式中、Ｒは−Ｈまたは−ＣＨ３、ｎは０から３までの整数を表す。）
【請求項４】
前記培養液のｐＨの調整において、該培養液に水酸化カルシウムを添加することを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の発酵培養により培養液中に生産された乳酸を精製する工程を含む乳酸の製造方法に関する。詳しくは、微生物培養液をナノフィルターに通じることによって非透過液側から高純度の乳酸カルシウムを含んだ溶液を得る工程を含む、乳酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸は、食品用、医薬用などといった用途の他に、生分解性プラスチックのモノマー原料として工業的用途にまで広く適用され、需要が増加している。２−ヒドロキシプロピオン酸、即ち乳酸は、微生物による発酵により生産されることが知られており、微生物はグルコースに代表される炭水化物を含有する基質を乳酸に変換する。乳酸は、カルボニルα位の炭素に結合している水酸基の立体により、（Ｌ）−体および（Ｄ）−体の光学異性体に分類される。微生物発酵によれば、微生物を適宜選択することにより（Ｌ）−体または（Ｄ）−体の乳酸を選択的に、または（Ｌ）−体及び（Ｄ）−体の混合体（ラセミ体）の乳酸を生産することができる。
【０００３】
微生物発酵による乳酸の生産は、一般に、培養液中にアルカリ性物質を添加することで、微生物発酵に最適なｐＨに保持されながら行われる。微生物発酵により生産された酸性物質である乳酸の多くは、アルカリ性物質が添加されているために、培養液中で乳酸の多くは乳酸塩として存在している。この場合、フリーの乳酸は、発酵終了後、培養液に酸性物質を添加することで得られる。
【０００４】
具体的には、培養液中に添加するアルカリ性物質として水酸化カルシウムがしばしば用いられるが、この場合、微生物発酵により生産された乳酸は培養液中では乳酸カルシウムとして存在している。なお、乳酸カルシウムは、カルシウム吸収性が高いことから、良質なカルシウム供給源として食品用途に注目されている。
【０００５】
乳酸カルシウムを得る方法として、培養液を減圧濃縮して水を蒸発させる方法がある。しかしながら、微生物発酵液から取り出した乳酸カルシウムには、発酵過程で生産される乳酸以外の有機酸、例えば、酢酸等の不純物が含まれていることが多く、乳酸カルシウムの純度が低い上に、水を蒸発させるために加熱する必要があり、エネルギーコストが高いという問題点があった。
【０００６】
これまでに、乳酸カルシウム含有食品を製造する際に、乳酸カルシウムを濃縮するためにナノフィルター処理する技術が開示されているが（特許文献１参照）、本技術は、乳酸カルシウムが含まれる発酵液をナノフィルターで処理した透過液をｐＨ調整し、乳酸カルシウムを得ているが、透過液には乳酸以外に酢酸も含まれていることは当業者であれば容易に予測されることから、得られる乳酸カルシウムの純度は高いものとは言えない。
【特許文献１】特開２００１−２９９２８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上述したような課題、すなわち、微生物発酵により乳酸を生産する場合において、培養液中の乳酸以外の有機酸を除去するという課題を解決し、効率よく高純度の乳酸カルシウムを回収する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ｐＨ６〜１１に調整した微生物発酵培養液を、ナノフィルターに通じることにより、培養液中の乳酸カルシウムを含んだ水溶液を非透過液側から回収し、透過液側から乳酸以外の有機酸を高効率で除去することができることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、次の（１）〜（４）から構成される。
【０００９】
（１）カルシウム塩の存在下での微生物の発酵培養により培養液中に生産された乳酸カルシウムを精製する工程を含む乳酸の製造方法であって、該培養液のｐＨを６以上１１以下に調整し、該培養液をナノフィルターに通じて該培養液中の酢酸を透過液側に除去し、非透過液側から乳酸カルシウムを含んだ水溶液を回収する工程を含む、乳酸の製造方法。
【００１０】
（２）前記ナノフィルターの機能層がポリアミドを含む、（１）に記載の乳酸の製造方法。
【００１１】
（３）前記ポリアミドが架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、化学式１で示される構成成分を含有することを特徴とする（２）に記載の乳酸の製造方法。
【００１２】
【化１】
0005564783.tif 000002
【００１３】
（式中、Ｒは−Ｈまたは−ＣＨ３、ｎは０から３までの整数を表す。）。
【００１５】
（４）前記培養液のｐＨの調整において、該培養液に水酸化カルシウムを添加することを特徴とする、（１）から（３）のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る乳酸の製造方法は、発酵培養液中に含まれる乳酸以外の有機酸である酢酸を簡単な操作により効果的に除去することができる。従って、高純度の乳酸カルシウムを含んだ水溶液を得ることが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１８】
本発明の乳酸の製造方法は、カルシウム塩の存在下で微生物の発酵培養により培養液中に生産された乳酸カルシウムを精製する工程を含む方法であって、該培養液のｐＨを６以上１１以下に調整し、該培養液をナノフィルターに通じて該培養液中の乳酸以外の有機酸を透過液側に除去し、非透過液側から乳酸カルシウムを含んだ水溶液を回収するものである。
【００１９】
本発明の乳酸の製造方法で用いるナノフィルターとは、ナノ濾過膜（ナノフィルトレーション膜、ＮＦ膜）とも呼ばれるものであり、「一価のイオンは透過し、二価のイオンを阻止する膜」と一般に定義される膜である。数ナノメートル程度の微小空隙を有していると考えられる膜で、主として、水中の微小粒子や分子、イオン、塩類等を阻止するために用いられる。
【００２０】
ナノフィルターの素材には、酢酸セルロース系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマーなどの高分子素材を使用することができるが、前記１種類の素材で構成される膜に限定されず、複数の膜素材を含む膜であってもよい。またその膜構造は、膜の少なくとも片面に緻密層を持ち、緻密層から膜内部あるいはもう片方の面に向けて徐々に大きな孔径の微細孔を有する非対称膜や、非対称膜の緻密層の上に別の素材で形成された非常に薄い機能層を有する複合膜のどちらでもよい。複合膜としては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報に記載のように、ポリスルホンを膜素材とする支持膜にポリアミドの機能層からなるナノフィルターを構成させた複合膜を用いることができる。
【００２１】
これらの中でも高耐圧性と高透水性、高溶質除去性能を兼ね備え、優れたポテンシャルを有する、ポリアミドを機能層とした複合膜が好ましい。操作圧力に対する耐久性と、高い透水性、阻止性能を維持できるためには、ポリアミドを機能層とし、それを多孔質膜や不織布からなる支持体で保持する構造のものが適している。また、ポリアミド半透膜としては、多官能アミンと多官能酸ハロゲン化物との重縮合反応により得られる架橋ポリアミドの機能層を支持体に有してなる複合半透膜が適している。
【００２２】
ポリアミドを機能層とするナノフィルターにおいて、ポリアミドを構成する単量体の好ましいカルボン酸成分としては、例えば、トリメシン酸、ベンゾフェノンテトラカルボン酸、トリメリット酸、ピロメット酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ナフタレンジカルボン酸、ジフェニルカルボン酸、ピリジンカルボン酸などの芳香族カルボン酸が挙げられるが、製膜溶媒に対する溶解性を考慮すると、トリメシン酸、イソフタル酸、テレフタル酸、およびこれらの混合物がより好ましい。
【００２３】
前記ポリアミドを構成する単量体の好ましいアミン成分としては、ｍ−フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン、ベンジジン、メチレンビスジアニリン、４，４’−ジアミノビフェニルエーテル、ジアニシジン、３，３’，４−トリアミノビフェニルエーテル、３，３’，４，４’−テトラアミノビフェニルエーテル、３，３’−ジオキシベンジジン、１，８−ナフタレンジアミン、ｍ（ｐ）−モノメチルフェニレンジアミン、３，３’−モノメチルアミノ−４，４’−ジアミノビフェニルエーテル、４，Ｎ，Ｎ’−（４−アミノベンゾイル）−ｐ（ｍ）−フェニレンジアミン−２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾイミダゾール）、２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾオキサゾール）、２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾチアゾール）等の芳香環を有する一級ジアミン、ピペラジン、ピペリジンまたはこれらの誘導体等の二級ジアミンが挙げられ、中でもピペラジンまたはピペリジンを単量体として含む架橋ポリアミドを機能層とするナノフィルターは耐圧性、耐久性の他に、耐熱性、耐薬品性を有していることから好ましく用いられる。より好ましくは前記架橋ピペラジンポリアミドまたは架橋ピペリジンポリアミドを主成分とし、かつ、前記化学式１で示される構成成分を含有するポリアミドであり、さらに好ましくは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、前記化学式１で示される構成成分を含有するポリアミドである。また、前記化学式１中、ｎ＝３のものが好ましく用いられる。架橋ピペリジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式１で示される構成成分を含有するポリアミドとしては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報に記載のものが挙げられる。
【００２４】
ナノフィルターは一般にスパイラル型の膜エレメントとして使用されるが、本発明で用いるナノフィルターも、スパイラル型の膜エレメントとして使用されることが好ましく採用できる。好ましいナノフィルターの具体例としては、例えば、架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式（１）で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノフィルターモジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００、ＳＵ−６１０も使用することができる。また、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノフィルターのＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００、ＮＦ−４００、あるいはポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノフィルターのＮＦ９９、ＮＦ９７，ＮＦ９９ＨＦ、酢酸セルロース系のナノフィルターであるＧＥ  Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社製ナノフィルターのＧＥｓｅｐａなどが挙げられる。
【００２５】
本発明の乳酸の製造方法における、「ナノフィルターに通じる」とは、微生物の発酵培養により生産された乳酸を含む培養液を、ナノフィルターに通じて濾過し、非透過液側に乳酸カルシウムを含んだ水溶液を濾別回収し、透過液側に酢酸を濾液として透過させることを意味する。
【００２６】
乳酸水溶液のナノフィルター透過性の評価方法としては、乳酸透過率を算出して評価する方法が挙げられるが、この方法に限定されるものではない。乳酸透過率は、高速液体クロマトグラフィーに代表される分析により、原水（培養液）中に含まれる乳酸濃度（原水乳酸濃度）および透過水（乳酸溶液）中に含まれる乳酸濃度（透過水乳酸濃度）を測定することで、式１によって算出することができる。
【００２７】
乳酸透過率（％）＝（透過水乳酸濃度／原水乳酸濃度）×１００・・・（式１）。
式１と同様に、酢酸透過率を式２によって算出することができる。
【００２８】
酢酸透過率（％）＝（透過水酢酸濃度／原水酢酸濃度）×１００・・・（式２）。
【００２９】
膜単位面積、単位圧力当たりの透過流量（膜透過流束）の評価方法としては、透過水量および透過水量を採水した時間および膜面積を測定することで、式３によって算出することができる。
【００３０】
膜透過流束（ｍ３／（ｍ２・日））＝透過水量／（膜面積×採水時間）・・・（式３）。
【００３１】
本発明の乳酸の製造方法において、微生物培養液のナノフィルターによる濾過は、圧力をかけて行ってもよい。その濾過圧は、０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下の範囲で好ましく用いられるが、０．１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるため、０．５ＭＰａ以上７ＭＰａ以下で用いれば、膜透過流束が高いことから、乳酸溶液を効率的に透過させることができ、膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことからより好ましく、１ＭＰａ以上６ＭＰａ以下で用いることが特に好ましい。
【００３２】
本発明の乳酸の製造方法で用いるナノフィルターの膜分離性能としては、温度２５℃、ｐＨ６．５に調整した塩化ナトリウム水溶液（５００ｍｇ／Ｌ）を０．７５ＭＰａの濾過圧で評価したとき塩除去率が４５％以上のものが好ましく用いられる。ここでいう塩除去率は前記塩化ナトリウム水溶液の透過水塩濃度を測定することにより、式４によって算出することができる。
【００３３】
塩除去率＝１００×｛１−（透過水中の塩濃度／供給水中の塩濃度）｝・・・（式４）。
【００３４】
また、ナノフィルターの膜の透過性能としては、塩化ナトリウム（５００ｍｇ／Ｌ）で０．３ＭＰａの濾過圧において、膜透過流束（ｍ３／（ｍ２・日））が０．５以上のものが好ましく用いられる。
【００３５】
また、硫酸マグネシウム透過率が、操作圧力０．５ＭＰａ、原水温度２５℃、原水濃度１０００ｐｐｍにおいて、１．５％以下であるものが好ましく用いられる。上記条件におけるナノフィルターの硫酸マグネシウム透過率が１．５％を上回る場合、乳酸カルシウムを含んだ水溶液の一部がナノフィルターを透過し、非透過側からの回収率が低減する場合がある。より好ましくはナノフィルターの硫酸マグネシウム透過率が１．０％以下のものが用いられる。硫酸マグネシウム透過率は、イオンクロマトグラフィーに代表される分析により、原水中に含まれる硫酸マグネシウム濃度（原水硫酸マグネシウム濃度）および透過液中に含まれる硫酸マグネシウム濃度（透過液硫酸マグネシウム濃度）を測定し、式５によって算出することができる。
【００３６】
硫酸マグネシウム透過率（％）＝（透過液硫酸マグネシウム濃度）／（原水硫酸マグネシウム濃度）×１００・・・（式５）。
【００３７】
本発明の乳酸の製造方法において、ナノフィルターに通じる培養液のｐＨは６以上１１以下であることを特徴とする。ナノフィルターは、溶液中にイオン化（解離）している物質の方が、イオン化していない（非解離）物質に比べて阻止しやすい特性から、培養液のｐＨを６以上とすることで、培養液中で乳酸が解離してイオンとして存在している割合（解離乳酸／非解離乳酸）の方が、酢酸が解離してイオンとして存在している割合（解離酢酸／非解離酢酸）より多くなり、非透過液側から効率的に乳酸カルシウムを含んだ水溶液を回収することができ、透過液側から乳酸以外の有機酸を効率的に分離することができる。さらに、培養液のｐＨが１１を越えると、ナノフィルターの耐久性に悪影響を及ぼすため、好ましくない。
【００３８】
本発明の乳酸の製造方法において、ナノフィルターの透過液側から分離される乳酸以外の有機酸は、発酵培養の副生物由来または発酵原料由来の有機酸であるが、本発明においては酢酸が好ましく分離されうる。
【００３９】
本発明の乳酸の製造方法において、培養液のｐＨを調整するための手段としては、塩基性カルシウムが好ましく用いられ、例えば、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、酸化カルシウム、酢酸カルシウムの固体、または水溶液を添加することが好ましく、水酸化カルシウムがより好ましい。水溶液を添加する場合、塩基性カルシウムの濃度は限定されるものではなく、飽和溶解度を越えた、スラリー状のものを添加してもよい。
【００４０】
ナノフィルターによる分離で用いる微生物培養液中の乳酸カルシウム溶液中の乳酸の濃度は、特に限定されないが、高濃度であれば、濃縮する時間を短縮することができることからコスト削減に好適であり、例えば１０ｇ／Ｌ以上１００ｇ／Ｌ以下が好ましい。
【００４１】
上記の通りナノフィルターで非透過側から回収される乳酸カルシウムを含む溶液に酸性物質を添加することで、高純度のフリーの乳酸が得られる。添加する酸性物質としては、硫酸、塩酸、硝酸などが挙げられる。
【００４２】
以下、本発明の乳酸の製造方法に供される、微生物の発酵培養による乳酸生産について説明する。
【００４３】
微生物の発酵培養による乳酸生産に使用する発酵原料としては、培養する微生物の生育を促し、目的とする発酵生産物である乳酸を良好に生産させうるものであればよく、炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が良い。炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトース、ラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、グリセリンなども使用される。窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を適宜添加することができる。本発明に使用する微生物が生育のために特定の栄養素（例えば、アミノ酸など）を必要とする場合には、その栄養物をそれ自体もしくはそれを含有する天然物として添加する。また、消泡剤も必要に応じて使用してもよい。本発明において、培養液とは、発酵原料に微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言う。培養液に追加する発酵原料の組成は、目的とする乳酸の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。
【００４４】
本発明では、微生物の培養は、通常ｐＨ４−８、温度２０−４０℃の範囲で行われる。培養液のｐＨはアルカリ性物質、具体的には塩基性のカルシウム塩によって上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。塩基性カルシウム塩としては、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、酸化カルシウム、酢酸カルシウムなどが好ましく用いられ、水酸化カルシウムがより好ましく用いられる。
【００４５】
微生物の培養において、酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。
【００４６】
微生物の培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って微生物濃度を高くした後に、連続培養（引き抜き）を開始しても良いし、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。適当な時期から原料培養液の供給及び培養物の引き抜きを行うことが可能である。原料培養液供給と培養物の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、原料培養液の供給と培養物の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。原料培養液には上記に示したような菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、培養液の環境が微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが効率よい生産性を得るのに好ましく、一例として、乾燥重量として５ｇ／Ｌ以上に維持することで良好な生産効率が得られる。
【００４７】
発酵生産能力のあるフレッシュな菌体を増殖させつつ行う連続培養操作は、通常、単一の発酵槽で行うのが、培養管理上好ましい。しかしながら、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続培養法であれば、発酵槽の数は問わない。発酵槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵槽を用いることもあり得る。この場合、複数の発酵槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても発酵生産物の高生産性は得られる。
【００４８】
本発明で使用される微生物については特に制限はないが、例えば、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、乳酸菌、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌などが挙げられる。動物細胞、昆虫細胞等の培養細胞も、本発明で使用される微生物に含まれる。前記微生物の中でも、酵母、乳酸菌および大腸菌のいずれかから選択されることが好ましい。使用する微生物は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５０】
（乳酸生産能力を持つ酵母株の作製）
参考例１  乳酸生産能力を持つ酵母株の作製
乳酸生産能力を持つ酵母株を下記のように造成した。具体的には、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することでＬ−乳酸生産能力を持つ酵母株を造成した。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）には、Ｌａ−Ｔａｑ（宝酒造社製）、あるいはKOD-Plus-polymerase（東洋紡社製）を用い、付属の取扱説明に従って行った。
【００５１】
ヒト乳ガン株化細胞（ＭＣＦ−７）を培養回収後、TRIZOL Reagent（Invitrogen社製）を用いてtotal ＲＮＡを抽出し、得られたtotal ＲＮＡを鋳型としてSuperScript Choice System（Invitrogen社製）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った。これらの操作の詳細は、それぞれ付属のプロトコールに従った。得られたｃＤＮＡを続くＰＣＲの増幅鋳型とした。
【００５２】
上記操作で得られたｃＤＮＡを増幅鋳型とし、配列番号１および配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたKOD-Plus-polymeraseによるＰＣＲによりＬ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングを行った。各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をT4 Polynucleotide Kinase（TAKARA社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素HincIIで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（TAKARA社製）を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌DH５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより各種Ｌ−ｌｄｈ遺伝子（アクセッションナンバー；ＡＹ００９１０８、配列番号３）がサブクローニングされたプラスミドを得た。得られたＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に挿入した。このようにしてヒト由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子発現プラスミドｐＬ−ｌｄｈ５（Ｌ−ｌｄｈ遺伝子）を得た。
【００５３】
ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ５を増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより１．３ｋｂのヒト由来ＬＤＨ遺伝子、及びサッカロミセス・セレビセ由来のＴＤＨ３遺伝子のターミネーター配列含むＤＮＡ断片を増幅した。また、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型として、配列番号６および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより１．２ｋｂのサッカロミセス・セレビセ由来のＴＲＰ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。それぞれのＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲ法によって得られた産物を１．５％アガロースゲル電気泳動して、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子及びＴＲＰ１遺伝子が連結された２．５ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調製した。この２．５ｋｂのＤＮＡ断片で出芽酵母ＮＢＲＣ１０５０５株を常法に従いトリプトファン非要求性に形質転換した。
【００５４】
得られた形質転換細胞がヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結されている細胞であることの確認は、下記のように行った。まず、形質転換細胞のゲノムＤＮＡを常法に従って調製し、これを増幅鋳型とした配列番号８および配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより０．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。また、形質転換細胞が乳酸生産能力を持つかどうかは、ＳＣ培地（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＹＥＡＳＴ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ２０００  ＥＤＩＴＩＯＮ、  ＣＳＨＬ  ＰＲＥＳＳ）で形質転換細胞を培養した培養上澄に乳酸が含まれていることを下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することで確認した。
【００５５】
カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）、移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）、反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）、検出方法：電気伝導度、温度：４５℃。
【００５６】
また、Ｌ−乳酸の光学純度測定は以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
【００５７】
カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー社製）、移動相 ：１ｍＭ 硫酸銅水溶液、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出方法 ：ＵＶ２５４ｎｍ、温度 ：３０℃。
【００５８】
また、Ｌ−乳酸の光学純度は式４で計算される。ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。
【００５９】
光学純度（％）＝１００×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）‥‥‥（式６）。
【００６０】
ＨＰＬＣ分析の結果、４ｇ／ＬのＬ−乳酸が検出され、Ｄ−乳酸は検出限界以下であった。以上の検討により、この形質転換体がＬ−乳酸生産能力を持つことを確認した。得られた形質転換細胞を酵母ＳＷ−１株として、続く実施例に用いた。
【００６１】
参考例２  バッチ発酵によるＬ−乳酸の製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的なバッチ発酵を行い、その乳酸生産性を評価した。表１に示す乳酸発酵培地を用い、バッチ発酵試験を行った。該培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、生産物である乳酸の濃度の評価には、参考例１に示したＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーＣ（和光純薬）を用いた。参考例２の運転条件を以下に示す。
【００６２】
反応槽容量（乳酸発酵培地量）：２（Ｌ）、  温度調整：３０（℃）、反応槽通気量：０．２（Ｌ／ｍｉｎ）、反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）、ｐＨ調整：１Ｎ  水酸化カルシウムによりｐＨ５に調整。
【００６３】
まず、ＳＷ−１株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。温度調整、ｐＨ調整を行い、発酵培養を行った。この時の菌体増殖量は、６００ｎｍでの吸光度で１５であった。回分発酵の結果を表２に示す。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
【表２】
0005564783.tif 000004
【００６６】
参考例３  ナノフィルターの無機塩（硫酸マグネシウム）阻止率評価
超純水１０Ｌに硫酸マグネシウム（和光純薬工業株式会社製）１０ｇ添加して２５℃１時間攪拌し、１０００ｐｐｍ硫酸マグネシウム水溶液を調製した。次いで、図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に上記で調整した硫酸マグネシウム水溶液１０Ｌを注入した。図２の符号７に示される９０φナノフィルターとして、架橋ピペラジンポリアミド系ナノフィルター“ＵＴＣ６０”（ナノフィルター１；東レ株式会社製）、架橋ピペラジンポリアミド系ナノフィルター“ＮＦ−４００”（ナノフィルター２；フィルムテック製）、ポリアミド系ナノフィルター“ＮＦ９９”（ナノフィルター３；アルファラバル製）、酢酸セルロース系ナノフィルター“ＧＥｓｅｐａ”（ナノフィルター４；ＧＥ  Ｏｓｍｏｎｉｃｓ製）をそれぞれステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにセットし、原水温度を２５℃、高圧ポンプ３の圧力を０．５ＭＰａに調整し、透過液５を回収した。原水槽１、透過液５に含まれる、硫酸マグネシウムの濃度をイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）により以下の条件で分析し、硫酸マグネシウムの透過率を計算した。
【００６７】
陰イオン；カラム（ＡＳ４Ａ−ＳＣ（ＤＩＯＮＥＸ製））、溶離液（１．８ｍＭ炭酸ナトリウム／１．７ｍＭ炭酸水素ナトリウム）、温度（３５℃）。
【００６８】
陽イオン；カラム（ＣＳ１２Ａ（ＤＩＯＮＥＸ製））、溶離液（２０ｍＭメタンスルホン酸）、温度（３５℃）。
【００６９】
結果を表３に示す。
【００７０】
【表３】
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【００７１】
実施例１〜３
（ナノフィルターモジュールで分離する培養液の準備）
参考例１、２で乳酸発酵した培養液（２L）をｐＨが７．５（実施例１）、ｐＨが９．０（実施例２）、ｐＨが１０．０（実施例３）になるまで水酸化カルシウム（和光純薬製）を添加した。
【００７２】
（ナノフィルターモジュールによる分離実験）
次いで、図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に上記で得られた培養液２Ｌを注入した。４インチナノフィルターモジュール２（架橋ピペラジンポリアミド系ナノフィルターモジュールＳＵ−６１０、東レ株式会社製）を専用ベッセルにセットし、高圧ポンプ３の圧力を２ＭＰａに調整して運転し、それぞれのｐＨにおける非透過液４、透過液５を回収した。非透過液４、透過液５に含まれる、乳酸、酢酸濃度を、高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製）により分析した。結果を表４に示す。
【００７３】
【表４】
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【００７４】
表４に示すように、７．５、９．０、１０．０のすべてのｐＨにおいて、酢酸が透過液側に高効率で除去され、高純度の乳酸カルシウムを含んだ水溶液を非透過液側から高効率で回収できたことがわかった。
【００７５】
また、上記実施例１から実施例３において、ナノフィルターモジュールを新しい膜に取り換えることなく、一つの膜を用いて実施したが、上記の濾過圧において、酢酸が高効率で除去された。
【００７６】
実施例４〜１５
（９０φナノフィルターで分離する培養液の準備）
参考例１、２で乳酸発酵した培養液（２Ｌ）をｐＨが７．５、９．０、１０．０になるまで水酸化カルシウム（和光純薬製）を添加した。
【００７７】
（ナノ濾過膜による分離実験）
次いで、図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に上記実施例で得られた濾液２Ｌを注入した。図２の符号７の９０φナノフィルターとして、前記ナノフィルター１〜４をステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにそれぞれセットし、高圧ポンプ３の圧力を２ＭＰａに調整して運転し、それぞれのｐＨにおける非透過液４、透過液５を回収した。非透過液４、透過液５に含まれる、乳酸、酢酸濃度を、高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製）により分析した。結果を表５に示す。
【００７８】
【表５】
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【００７９】
表５に示すように、すべてのｐＨにおいて、酢酸が透過液側から高効率で除去され、高純度の乳酸カルシウムを含んだ水溶液を非透過液側から高効率で回収できたことがわかった。また、上記実施例４〜１５において、ナノフィルターを新しい膜に取り換えることなく、上記の濾過圧において、酢酸が高効率で除去された。
【００８０】
比較例１
（ナノフィルターモジュールで分離する培養液の準備）
参考例１、２で乳酸発酵した培養液（２Ｌ）を（ｐＨ５．０）を使用した。
【００８１】
（ナノフィルターモジュールによる分離実験）
次いで、図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に上記で得られた培養液２Ｌを注入した。ナノフィルターモジュール２（ピペラジンポリアミド半透膜ＳＵ−６１０、東レ社製）を専用ベッセルにセットし、高圧ポンプ３の圧力を２ＭＰａに調整して運転し、ｐＨ４．５における非透過液４、透過液５を回収した。非透過液４、透過液５に含まれる、乳酸、酢酸濃度を、高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製）により分析した。結果を表６に示す。
【００８２】
【表６】
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【００８３】
表６に示すように、ｐＨ５．０においては、酢酸は透過液側に高効率で除去されるが、乳酸も透過液側に含まれているために乳酸カルシウムの回収率が低く、効率的に分離されていないことがわかった。
【００８４】
以上の実施例及び比較例の結果から、ｐＨ６〜１１に調整した微生物発酵培養液を、ナノフィルターに通じることにより、培養液中の乳酸カルシウムを含んだ水溶液を非透過液側から回収し、透過液側から酢酸を高効率で除去することができることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明で用いたナノフィルター膜分離装置の一つの実施の形態を示す概要図である。
【図２】本発明で用いたナノフィルター膜分離装置のナノフィルターが装着されたセル断面図の一つの実施の形態を示す概要図である。
【符号の説明】
【００８６】
１  原水槽
２  ナノフィルターモジュール
３  高圧ポンプ
４  非透過液の流れ
５  透過液の流れ
６  高圧ポンプにより送液された培養液の流れ
７  ９０φナノフィルター
８  支持板
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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