(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式
0005468611.tif 000006
で表される化合物であって、
アイラントゥス・エクスケルサ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ  ｅｘｃｅｌｓａ）の根皮から単離され、抗癌性を有する化合物。
【請求項２】
細胞周期の進行を調節するカギとなる分子、すなわちｐ５３、ｐ２１、ｃ−Ｍｙｃ、サイクリンＤ１及びＣｄｋ４の発現に影響を及ぼす、請求項１に記載のアイラントゥス・エクスケルサ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ  ｅｘｃｅｌｓａ）の根皮から単離され、抗癌性を有する化合物。
【請求項３】
ＭＣＦ−７細胞において、他のシグナル分子の発現を調節する核の中へのｐ５３転移とともに微小管の集合および安定化を促進して微小管の動きを抑制し、その結果細胞増殖に必要な微小管ネットワークの破壊を示す、請求項１に記載のアイラントゥス・エクスケルサ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ  ｅｘｃｅｌｓａ）の根皮から単離され、抗癌性を有する化合物。
【請求項４】
固形腫瘍の治療において有効である、請求項１に記載のアイラントゥス・エクスケルサ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ  ｅｘｃｅｌｓａ）の根皮から単離され、抗癌性を有する化合物。
【請求項５】
固形腫瘍において、細胞密度、新生血管形成の減少を示し、壊死／アポトーシス細胞の増加を示す、請求項１に記載のアイラントゥス・エクスケルサ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ  ｅｘｃｅｌｓａ）の根皮から単離され、抗癌性を有する化合物。
【請求項６】
正常ヒト胚腎細胞ＨＥＫ２９３において、より少ない細胞毒性を示し、腫瘍体積の有意な縮小を示し、心臓、腎臓、肝臓、脾臓及び膵臓などの他の臓器に対してより少ない細胞毒性を示す、請求項１に記載のアイラントゥス・エクスケルサ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ  ｅｘｃｅｌｓａ）の根皮から単離され、抗癌性を有する化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アイラントゥス・エクスケルサ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ  ｅｘｃｅｌｓａ）から単離され、インビトロ及びインビボの両方において抗腫瘍活性を有する、新規なトリテルペノイドＡＥＣＨＩＬ−１に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の治療における技術の現状には化学療法が含まれる。これは、癌の治療において、種々の化合物を単独で又はそのような化合物を２種以上組み合わせて投与し、癌細胞の成長を阻害するか又は癌細胞を死滅させることを含む。太平洋イチイの木由来のパクリタキセル、ポドフィルムの木由来のエトポシド及びニチニチソウ由来のビンクリスチンのような化学修飾化合物が最も多く使用されているが、シスプラチン、マイトマイシン、ダウノルビシン、アドリアマイシン、インターフェロンのような他の化合物も使用されている。放射線療法は、遺伝物質を損傷させ、細胞のさらなる成長及び分裂を不可能にすることによって、腫瘍を縮小及び破壊させることを含む、別のタイプの療法である。
【０００３】
凍結療法は、異常な組織を破壊する液体窒素（又はアルゴンガス）を使用して超低温環境を創り出し、皮膚上の腫瘍などの外部の腫瘍を治療するために使用される。免疫療法は、癌の治療において、モノクローナル抗体で標識された毒素を利用するものである。
【０００４】
上記のすべての療法の最も重要な欠点は、これらが健常な細胞を傷害し、心臓、肺、神経、腎臓又は生殖器のような種々の臓器を損傷し、最終的には死に至らしめることである。他の副作用には、貧血、食欲低下、出血、疲労、インフルエンザ様症状、体液貯留、脱毛、不妊症、口腔及び咽喉の変化、悪心及び嘔吐、疼痛、性的変化、皮膚及び爪の変化、眼の変化、尿、腎臓及び膀胱の変化が含まれる。
【０００５】
植物は、癌の治療に使用されてきた長い歴史を有する。植物由来の化合物は、いくつかの臨床的に有用な抗癌剤の重要な源である。ビンブラスチン、ビンクリスチン、カンプトテシン誘導体、トポテカン及びイリノテカン、エピポドフィロトキシン由来のエトポシド並びにパクリタキセル（タキソール）を含む非常に多くの植物由来の化合物が癌化学療法に使用されているが、大部分が非腫瘍細胞に細胞毒性を示し、遺伝毒性、発癌性及び催奇形性の作用を誘導する可能性がある。それらの化学療法剤は標的とする悪性細胞を治療する際に高い有効性を示すにもかかわらず、これらの副作用によって、その使用が制限されている。したがって、癌の治療における有効且つ非毒性の両方である代替薬物の探索が、重要な研究方向である。
【０００６】
インド中南部に自生し、ニガキ科に属する木であるアイラントゥス・エクスケルサ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ  ｅｘｃｅｌｓａ  Ｒｏｘｂ）（天国の木）の根皮は、アーユルヴェーダ及び根拠に基づいた植物療法に広く使用されている。この科から派生した他の種は、その抗癌活性でよく知られている。Ａ．エクスケルサの化学成分は、トリテルペン及びアルカロイドを含む。本研究の目的は、アイラントゥス・エクスケルサの根皮から単離された新規なトリテルペノイド部分（ＡＥＣＨＬ−１）のインビトロ細胞毒性作用及びインビボ抗腫瘍作用を評価することである。
【０００７】
アイラントゥス・エクスケルサの木の根皮から得られたＡＥＣＨＬ−１は、有効投与量で、脱毛、心臓毒性、肝毒性、腎毒性のようなこれらの欠点のいくつかを克服することができた。腫瘍の治療に使用されている他の薬剤と比較して、ＡＥＣＨＬ−１は、コスト効率が良く、その源としての植物から容易に入手でき、抗癌剤の多くとは異なり正常細胞には非毒性である。
【０００８】
本発明の分子は、アイラントゥス・エクスケルサの木の根皮から単離され、種々の癌細胞において細胞毒性作用を有することが示された。分子（ＡＥＣＨＬ−１と称される）の抗腫瘍作用は非常に広範であった。この理由は、この分子が、明確な起源を有し異なるｐ５３状態の４種の腫瘍細胞系（Ｂ１６マウス黒色腫、ＰＣ３ヒト前立腺癌、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−２３１ヒト乳癌）の成長を阻害し、正常ヒト胚腎細胞ＨＥＫ２９３において、より少ない細胞毒性を示したためである。異なる起源の腫瘍、すなわちＣ５７中で成長したＢ１６Ｆ１０及びヌードマウス中で成長したＭＣＦ−７それぞれにおいて、ＡＥＣＨＬ−１は腫瘍体積の有意な縮小を示した。２種の臨床的に有用な薬剤であるシスプラチン及びパクリタキセルは、インビトロ及びインビボの両方の研究の標準試料として使用され、ＡＥＣＨＬ−１の作用は、パクリタキセル及びシスプラチンと同程度であることが分かった。
【０００９】
ＡＥＣＨＬ−１は、濃度依存的に細胞の生存／増殖を阻害した。それは、Ｇ２／Ｍ相の細胞周期を停止させることによるＰＣ３細胞増殖の阻害を示した。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞では、それはＳ−Ｇ２／Ｍ相の成長を停止させたが、Ｂ１６Ｆ１０細胞ではＧ０／Ｇ１相で成長停止を示した。ＭＣＦ−７細胞では、それはＳ−Ｇ２／Ｍ相の成長を停止させた。
【００１０】
アイラントゥス・エクスケルサから分子が単離され、特性決定されることは初めてのことであり、報告された性質について検討されたのも初めてのことである。したがって、本発明の知識に関する、国内及び国際レベルでの情報は、全く入手することができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の主な目的は、アイラントゥス・エクスケルサの根皮から単離され、抗癌性を有する、新規なトリテルペノイドＡＥＣＨＬ−１を開発することである。
【００１２】
他の目的は、インビトロ及びインビボにおける抗癌性を評価することである。
【００１３】
別の目的は、種々の形態の腫瘍の治療において注目すべき活性を示し、マウス黒色腫並びにヒト乳癌及び前立腺癌を含む異なる癌に特異性を有する、新規なトリテルペノイド分子を開発することである。
【００１４】
さらに別の目的は、抗癌活性を有する、新規なトリテルペノイド分子を開発すること及びいくつかのモデル系において死の作用機序を研究することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
アイラントゥス・エクスケルサの根皮から単離され、抗癌性を有し、種々の形態の腫瘍の治療において注目すべき活性を示し、特異性を有し、明確な起源を有し異なるｐ５３状態の４種の腫瘍細胞系（Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫、ＰＣ３ヒト前立腺癌、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌）の成長を阻害し、以下の特徴を有するＩＲ、ＮＭＲ及び質量スペクトル、すなわちＩＲ（ＫＢｒ）：３４２５、３４１９（ヒドロキシル基）、２９７２、２９６６、２９２３、２８７３（アルキルＣ−Ｈ伸縮）、１７３３（δラクトン）、１７１８（ビアセチル）、１６８０（アルケンとのＣ＝Ｏ共役）、１６５２（−Ｃ＝Ｃ伸縮）、１６００（芳香族）、１４９２、１４５４、１３９４（メチル伸縮）、１２２２（δラクトン）、１１８４、１１１０、１０５１、１０３１（アセタール）、１０１８ｎｍ（アルカン）
【化１】
0005468611.tif 000002
を有し、化学シフトは、δ目盛のｐｐｍで示されており、ｓは単一線、ｄは二重線、ｔは三重線であり、質量スペクトルは、以下の主要なピーク：二量体形成によるｍ／ｚ：１０６８を示し、実際の［Ｍ＋］は、５４３．８、４６３．３［Ｍ−Ｃ４Ｈ１Ｏ２］、４６１．４［Ｍ−Ｃ４Ｈ２Ｏ２］、４５９．４［Ｍ−Ｃ４Ｈ４Ｏ２］、３６１．２［Ｍ−Ｃ９Ｈ１１Ｏ４］であると考えられた、ＥＩ及びＥＳ質量スペクトルによって示されているように、分子式Ｃ２９Ｈ３６Ｏ１０を有する、融点２４８〜２５０℃の固体である、新規な化学部分トリテルペノイドＡＥＣＨＬ−１。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＨＰＬＣ（島津製作所  ＬＣ−２０ＡＴ）によって評価された、ＡＥＣＨＬ−１の純度を実証する図である。ＡＥＣＨＬ−１の調製物をＲＰ  Ｃ−１８  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラムに適用し、メタノール及び水の溶液を用いて溶出した。単一ピークは、調製物が９９％を超える純度であることを示していた。
【図２】ＡＥＣＨＬ−１の構造を、その質量フラグメントを用いて示す図である。
【図３．１−３．４（Ａ−Ｆ）】処理から１２、２４及び４８時間後に、腫瘍細胞の生存及び増殖百分率は、ＭＴＴ及び［３Ｈ］チミジン取り込みによって示されるように、すべての細胞系において、ＡＥＣＨＬ−１によって濃度及び時間依存的に有意に阻害された。
【図３．５Ａ】阻害率は濃度及び時間依存的に増加し、細胞系においてＡＥＣＨＬ−１での処理から４８時間後に、より高濃度で最大の効果が認められ、ＭＣＦ−７＞Ｂ１６Ｆ１０＞ＰＣ３＞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１＞ＨＥＫ２９３となった。
【図３．５Ｂ】意義深いことに、ＡＥＣＨＬ−１の１０μＭでの阻害作用は、４８時間処理されたＭＣＦ−７細胞におけるパクリタキセル又はシスプラチンの阻害作用よりも強く、このことはＡＥＣＨＬ−１が非常に強力であることを示唆している。
【図４】異なる細胞の異なる濃度での相対的な細胞成長の停止が、細胞のランダム視野の位相差画像において視覚的に明らかであることを説明する図である。
【図５】ＡＥＣＨＬ−１処理が細胞の微小管ネットワークに影響を及ぼすかどうかを試験した図である。ＭＣＦ−７細胞を、種々の濃度のパクリタキセル（１〜２０μＭ）及びＡＥＣＨＬ−１（２〜４０μＭ）で処理した。インキュベーションから２４時間後、核（蛍光緑色）の中へのｐ５３転移及び微小管ネットワーク（蛍光赤色）が、共焦点顕微鏡法によって視覚化された。ＡＥＣＨＬ−１処理は、核の中にｐ５３を転移させる結果となった。対照細胞中の微小管ネットワークは、正常な配置及び組織を示した。パクリタキセルでの処理は、結果として微小管を重合させ、細胞の微小管の密度を増加させ、核を取り囲む長く厚い微小管束を形成することになった。ＡＥＣＨＬ−１処理は、パクリタキセルが誘導した、微小管の肥厚及び密度増加などの微小管の変化の所見と類似の所見に帰着した。
【図６Ａ】シスプラチンは、５０μｇ又は１００μｇのＡＥＣＨＬ−１よりも極めて有意であることが分かったが、シスプラチン投与群では他の臓器に損傷を与えることを示す図である。
【図６Ｂ】シスプラチンは、５０μｇ又は１００μｇのＡＥＣＨＬ−１よりも極めて有意であることが分かったが、シスプラチン投与群では他の臓器に損傷を与えることを示す図である。
【図６Ｃ】ＭＣＦ−７細胞についてのＡＥＣＨＬ−１の細胞毒性用量は非常に低かったため、胸腺欠損ヌードマウスの腫瘍異種移植片に対して選択された用量は、５、１０及び２０μｇ／０．０５ｍｌであった。これらの用量のＡＥＣＨＬ−１では、腫瘍サイズは［５μｇでは３５．７２±０．０５％（ｐ＜０．００１）、１０μｇでは２８．５５±０．０６％（ｐ＜０．００１）、２０μｇでは４．１±０．２７％（ｐ＜０．０５）減少したのに対して、２０μｇパクリタキセルを投与したものは、［１４．１９±０．３２％（ｐ＜０．０５）］の減少を示し、これはＡＥＣＨＬ−１群に比べて少なかったことを実証する図である。
【図６Ｄ】ＭＣＦ−７細胞についてのＡＥＣＨＬ−１の細胞毒性用量は非常に低かったため、胸腺欠損ヌードマウスの腫瘍異種移植片に対して選択された用量は、５、１０及び２０μｇ／０．０５ｍｌであった。これらの用量のＡＥＣＨＬ−１では、腫瘍サイズは［５μｇでは３５．７２±０．０５％（ｐ＜０．００１）、１０μｇでは２８．５５±０．０６％（ｐ＜０．００１）、２０μｇでは４．１±０．２７％（ｐ＜０．０５）減少したのに対して、２０μｇパクリタキセルを投与したものは、［１４．１９±０．３２％（ｐ＜０．０５）］の減少を示し、これはＡＥＣＨＬ−１群に比べて少なかったことを実証する図である。
【図７Ａ】対照群において、並びに１００μｇＡＥＣＨＬ−１及びシスプラチンを投与されたマウスにおいて、体重（腫瘍を含む）の減少が認められた。これに対して、５０μｇＡＥＣＨＬ−１を投与されたマウスの場合には、体重は減少しなかったことを示す図である。
【図７Ｂ】５０及び１００μｇのＡＥＣＨＬ−１並びにシスプラチンの投与は、対照群と比較して、投与１２日後の腫瘍重量対体重比において有意な減少を示した（ｐ＜０．０１）。１００μｇＡＥＣＨＬ−１に比べて、５０μｇＡＥＣＨＬ−１の効果が大きかった。ＡＥＣＨＬ−１群及び対照群と比較して、シスプラチン投与群は比において有意な減少を示したことを示す図である。
【図８．１Ａ】血管が十分に発達していることが分かったことを示す図である。
【図８．１Ｂ】赤血球の存在によって示されるように、潅流した血管を示す図である。したがって、この領域の壊死は、血管新生が不足した結果ではないように思われた。
【図８．１Ｃ】１００μｇＡＥＣＨＬ−１での腫瘍の治療は、腫瘍領域の至る所に壊死性核の増加を示し、新生血管形成及び出血領域が消失しており、それ故に血管形成及び転移の見込みが減ったことを実証する図である。腫瘍細胞密度は、５０μｇＡＥＣＨＬ−１及び溶媒投与群のものと比較して低いことが分かった。
【図８．１Ｄ】シスプラチン投与群は、壊死性核の有意な増加を示し、腫瘍細胞密度が減少したことを示す図である。
【図８．１Ｅ】Ｃ５７マウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。Ｃ５７マウス由来の臓器の組織学的検査は以下のデータを示した。対照群由来の肝臓は、小葉の周辺に門脈トライアッドを有する中心静脈を示した。現れたクッパー細胞は正常であった。
【図８．１Ｆ】Ｃ５７マウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。Ｃ５７マウス由来の臓器の組織学的検査は以下のデータを示した。５０μｇＡＥＣＨＬ−１は、肝臓の正常な構造に影響を及ぼさなかった。
【図８．１Ｇ】Ｃ５７マウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。Ｃ５７マウス由来の臓器の組織学的検査は以下のデータを示した。１００μｇＡＥＣＨＬ−１は、肥大性細胞核を有する肝臓の正常な構造を保持している。
【図８．１Ｈ】Ｃ５７マウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。Ｃ５７マウス由来の臓器の組織学的検査は以下のデータを示した。シスプラチン投与群において、広範囲にわたる肝細胞の壊死が見られた。右側の矢印で示されている肝細胞は死滅している。このパターンは、種々の肝臓毒素で見ることができ、リンパ球浸潤を伴う肝細胞の巣状壊死が発生した。組織病理学的には、病変は、壊死に反応して炎症の程度を変化させることを伴う壊死を特徴とするティザー病のものに見える。急性肝臓病変は、主として好中球性の最小の炎症によって取り囲まれている壊死病巣からなる。
【図８．１Ｉ】Ｃ５７マウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。Ｃ５７マウス由来の臓器の組織学的検査は以下のデータを示した。対照群由来の心臓は、個々の細胞を示す、中心に位置する顕著な核を有する平行線維を示した。
【図８．１Ｊ】Ｃ５７マウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。Ｃ５７マウス由来の臓器の組織学的検査は以下のデータを示した。５０μｇＡＥＣＨＬ−１の投与は、心筋線維の壊死を全く示さなかった。
【図８．１Ｋ】Ｃ５７マウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。Ｃ５７マウス由来の臓器の組織学的検査は以下のデータを示した。１００μｇＡＥＣＨＬ−１の投与は、収縮帯と核の欠乏とを有する広範囲にわたる心筋線維の壊死を示した。凝固壊死の特徴である、筋線維の小片化及び破損が発生している。
【図８．１Ｌ】Ｃ５７マウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。Ｃ５７マウス由来の臓器の組織学的検査は以下のデータを示した。シスプラチン投与マウスは、心筋線維の壊死が軽度のリンパ球浸潤を伴って発生することを示した。ここで再び、凝固壊死の特徴である、筋線維の小片化及び破損。
【図８．１Ｍ】Ｃ５７マウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。Ｃ５７マウス由来の臓器の組織学的検査は以下のデータを示した。対照において、マウスの腎臓は、境界が十分にはっきりした皮質及び髄質並びに十分に形成された糸球体を有する無傷の被膜を示した。
【図８．１Ｎ】Ｃ５７マウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。Ｃ５７マウス由来の臓器の組織学的検査は以下のデータを示した。５０μｇＡＥＣＨＬ−１の投与は、出血領域を有する軽度の尿細管空胞変性及び尿細管膨張を示し、下方部分に正常な糸球体が現れている。
【図８．１Ｏ】Ｃ５７マウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。Ｃ５７マウス由来の臓器の組織学的検査は以下のデータを示した。１００μｇＡＥＣＨＬ−１の投与は、出血状態を有する尿細管空胞変性及び尿細管膨張を示し、尿細管は散在性慢性炎症細胞浸潤を伴って膨張した。
【図８．１Ｐ】Ｃ５７マウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。Ｃ５７マウス由来の臓器の組織学的検査は以下のデータを示した。シスプラチン投与マウスにおいて、リンパ球は管内及び管周囲に散在していた。糸球体は細胞過形成であり、毛細血管のループは顕著な特徴が見られなかったが、これは増殖性糸球体腎炎のタイプである。多くの好中球が尿細管及び間質に見られ、すなわち腎盂腎炎であった。
【図８．１Ｑ】Ｃ５７マウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。Ｃ５７マウス由来の臓器の組織学的検査は以下のデータを示した。膵臓組織学について、細胞の構造に有意な変化は全く発生しなかった。
【図８．１Ｒ】Ｃ５７マウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。Ｃ５７マウス由来の臓器の組織学的検査は以下のデータを示した。膵臓組織学について、細胞の構造に有意な変化は全く発生しなかった。
【図８．１Ｓ】Ｃ５７マウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。Ｃ５７マウス由来の臓器の組織学的検査は以下のデータを示した。膵臓組織学について、細胞の構造に有意な変化は全く発生しなかった。
【図８．１Ｔ】Ｃ５７マウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。Ｃ５７マウス由来の臓器の組織学的検査は以下のデータを示した。膵臓組織学について、細胞の構造に有意な変化は全く発生しなかった。
【図８．１Ｕ】Ｃ５７マウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。Ｃ５７マウス由来の臓器の組織学的検査は以下のデータを示した。対照マウス由来の代表的な脾臓切片は、（＊）−細動脈周囲のリンパ鞘；（Θ）−濾胞；（Ψ）−辺縁帯によって示される白髄の異なる区画を示した。対照は、正常な脾臓構造を示した。白髄の過形成、特に濾胞；及び辺縁帯の過形成に留意されたい。組織学は、辺縁帯における顆粒球数の増加を示した。
【図８．１Ｖ】Ｃ５７マウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。Ｃ５７マウス由来の臓器の組織学的検査は以下のデータを示した。対照マウス由来の代表的な脾臓切片は、（＊）−細動脈周囲のリンパ鞘；（Θ）−濾胞；（Ψ）−辺縁帯によって示される白髄の異なる区画を示した。５０μｇＡＥＣＨＬ−１は、正常な脾臓構造を示した。白髄の過形成、特に濾胞；及び辺縁帯の過形成に留意されたい。組織学は、辺縁帯における顆粒球数の増加を示した。
【図８．１Ｗ】Ｃ５７マウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。Ｃ５７マウス由来の臓器の組織学的検査は以下のデータを示した。対照マウス由来の代表的な脾臓切片は、（＊）−細動脈周囲のリンパ鞘；（Θ）−濾胞；（Ψ）−辺縁帯によって示される白髄の異なる区画を示した。対照及び５０μｇＡＥＣＨＬ−１は、正常な脾臓構造を示した。白髄の過形成、特に濾胞；及び辺縁帯の過形成に留意されたい。組織学は、辺縁帯における顆粒球数の増加を示した。
【図８．１Ｘ】Ｃ５７マウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。Ｃ５７マウス由来の臓器の組織学的検査は以下のデータを示した。対照マウス由来の代表的な脾臓切片は、（＊）−細動脈周囲のリンパ鞘；（Θ）−濾胞；（Ψ）−辺縁帯によって示される白髄の異なる区画を示した。対照及び５０μｇＡＥＣＨＬ−１は、正常な脾臓構造を示した。白髄の過形成、特に濾胞；及び辺縁帯の過形成に留意されたい。組織学は、辺縁帯における顆粒球数の増加を示した。
【図８．２Ａ】ヌードマウスにおける腫瘍組織の組織学的検査を示す図である。ヌードマウスにおける腫瘍の組織学的検査は、Ｃ５７マウスのものと類似していた。対照マウス由来の腫瘍は、切片の至る所に、高度に密集した細胞で取り囲まれた明白な新生血管形成を示し、壊死細胞は存在しなかった。
【図８．２Ｂ】ヌードマウスにおける腫瘍組織の組織学的検査を示す図である。ヌードマウスにおける腫瘍の組織学的検査は、Ｃ５７マウスのものと類似していた。パクリタキセルの投与は、腫瘍細胞密度を減らし、切片内に多くの空きスペース及び壊死領域を発生させた。パクリタキセルは、血管及び出血領域の発生を伴う腫瘍血管新生に影響を及ぼさなかった。
【図８．２Ｃ】ヌードマウスにおける腫瘍組織の組織学的検査を示す図である。ヌードマウスにおける腫瘍の組織学的検査は、Ｃ５７マウスのものと類似していた。５μｇ用量のＡＥＣＨＬ−１は、腫瘍細胞密度の減少を示し、腫瘍領域の至る所に多くの空きスペースを示した。それはまた、新生血管形成の欠乏を示し、出血領域も存在しなかった。
【図８．２Ｄ】ヌードマウスにおける腫瘍組織の組織学的検査を示す図である。ヌードマウスにおける腫瘍の組織学的検査は、Ｃ５７マウスのものと類似していた。１０μｇのＡＥＣＨＬ−１は、類似の作用を示したが、血管新生を減少させることができず、出血領域が発生した。赤血球の存在によって示されるように、血管は潅流しているように思われたので、本発明者らは、この領域の血管の機能性を直接評価しなかった。したがって、この領域の壊死は、血管新生が不足した結果ではないように思われた。
【図８．２Ｅ】ヌードマウスにおける腫瘍組織の組織学的検査を示す図である。ヌードマウスにおける腫瘍の組織学的検査は、Ｃ５７マウスのものと類似していた。２０μｇのＡＥＣＨＬ−１は、類似の作用を示したが、血管新生を減少させることができず、出血領域が発生した。赤血球の存在によって示されるように、血管は潅流しているように思われたので、本発明者らは、この領域の血管の機能性を直接評価しなかった。したがって、この領域の壊死は、血管新生が不足した結果ではないように思われた。
【図８．２Ｆ】ヌードマウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。
【図８．２Ｇ】ヌードマウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。パクリタキセルは、リンパ球浸潤の徴候を伴う心筋線維の壊死を示した。２０μｇ用量のパクリタキセルは、心筋の小片化及び破損を伴い、広範囲にわたる心筋線維の壊死を示した。
【図８．２Ｈ】ヌードマウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。５μｇＡＥＣＨＬ−１の投与は、正常な心筋に全く変化を示さなかった。
【図８．２Ｉ】ヌードマウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。１０μｇのＡＥＣＨＬ−１は、リンパ球浸潤の徴候を伴う心筋線維の壊死を示した。
【図８．２Ｊ】ヌードマウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。２０μｇのＡＥＣＨＬ−１は、リンパ球浸潤の徴候を伴う心筋線維の壊死を示した。
【図８．２Ｋ】ヌードマウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。
【図８．２Ｌ】ヌードマウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。パクリタキセル投与群は、出血領域を有する尿細管空胞変性膨張の徴候を示した。
【図８．２Ｍ】ヌードマウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。ＡＥＣＨＬ−１投与群由来の腎臓構造に有意な変化は全く認められなかった。
【図８．２Ｎ】ヌードマウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。ＡＥＣＨＬ−１投与群由来の腎臓構造に有意な変化は全く認められなかった。
【図８．２Ｏ】ヌードマウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。ＡＥＣＨＬ−１投与群由来の腎臓構造に有意な変化は全く認められなかった。
【図８．２Ｐ】ヌードマウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。
【図８．２Ｑ】ヌードマウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。パクリタキセル投与群由来の肝臓は、門脈トライアッドを有する中心静脈を示した。肝臓の正常な構造に全く変化を示さなかった。
【図８．２Ｒ】ヌードマウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。ＡＥＣＨＬ−１投与群由来の肝臓は、門脈トライアッドを有する中心静脈を示した。肝臓の正常な構造に全く変化を示さなかった。
【図８．２Ｓ】ヌードマウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。ＡＥＣＨＬ−１投与群由来の肝臓は、門脈トライアッドを有する中心静脈を示した。肝臓の正常な構造に全く変化を示さなかった。
【図８．２Ｔ】ヌードマウスにおける臓器の組織病理学的検査を示す図である。ＡＥＣＨＬ−１投与群由来の肝臓は、門脈トライアッドを有する中心静脈を示した。肝臓の正常な構造に全く変化を示さなかった。
【図９】ＡＥＣＨＬ−１はチェックポイントタンパク質ｐ５３（腫瘍抑制タンパク質）、細胞停止タンパク質ｐ２１の発現の上方調節及びｃ−Ｍｙｃの下方調節を誘導した。ｐ５３タンパク質は、対照と比較して、シスプラチン同様、５０μｇ及び１００μｇＡＥＣＨＬ−１の両方で発現の増加を示したことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
インビボ研究の用量は、本検討において行われたインビトロ実験に基づいて定められた。このインビトロ実験では、Ｃ５７マウス及び胸腺欠損ヌードマウスの両方を対象に選択された投与量で、２１日以内に死亡は全く認められなかった。Ｃ５７マウスを対象に１２日間のＡＥＣＨＬ−１の腫瘍内注射（５０及び１００μｇの用量レベルで）及び胸腺欠損ヌードマウスを対象に１０日間のＡＥＣＨＬ−１の腫瘍内注射（５、１０及び２０μｇの用量レベルで）は、対照と比較して腫瘍体積を有意に減少させた。結果は低濃度でより有意であった。Ｃ５７マウス及び胸腺欠損ヌードマウスにおける腫瘍の顕微鏡検査は、対照動物において、細胞密度の増加及び新生血管形成を示し、血管形成の疑徴を示す出血領域の存在を伴ったのに対して、ＡＥＣＨＬ−１投与群は、細胞密度、新生血管形成の減少を示し、壊死／アポトーシス細胞が増加した。
【００１８】
本発明者らは、ＡＥＣＨＬ−１の抗腫瘍作用は、従来の化学療法薬であるパクリタキセル及びシスプラチンと同程度であることを見出した。シスプラチンと比較して、ＡＥＣＨＬ−１は、腎臓及び心臓の損傷の点からみて、より少ない毒性を示した。
【００１９】
ＡＥＣＨＬ−１は、細胞周期の進行を調節するカギとなる分子、すなわちｐ５３、ｐ２１、ｃ−Ｍｙｃ、サイクリンＤ１及びＣｄｋ４の発現に影響を及ぼす。ＡＥＣＨＬ−１を投与されたＣ５７マウスから単離された腫瘍細胞のウェスタンブロット分析は、ｐ５３、ｐ２１値の上方調節及びサイクリンＤ１、ＣＤＫ４の下方調節並びに腫瘍発生分子ｃ−Ｍｙｃ発現を示した。このことは、サイクリンＤ１及びＣＤＫ４発現の下方調節及びｐ５３の上方調節が、サイクリンＤ１／Ｃｄｋ４シグナル経路を介して又は腫瘍成長を助ける腫瘍発生分子ｃ−Ｍｙｃの下方調節の故に、ＡＥＣＨＬ−１によって誘導された成長阻害に寄与することを示唆している。
【００２０】
ＡＥＣＨＬ−１を投与後のＭＣＦ−７細胞は、癌細胞成長の阻害を助ける他のシグナル分子の発現を調節する核の中へのｐ５３転移とともにチューブリンの重合を示した。
【００２１】
したがって、ＡＥＣＨＬ−１は、固形腫瘍の治療において、有効な新規化学部分であることが分かった。その作用は乳癌において、より明白であった。
【００２２】
方法
アイラントゥス根皮のクロロホルム抽出物からＡＥＣＨＬ−１の抽出及び単離
アイラントゥス・エクスケルサの粉末根皮のクロロホルム抽出物（１．５ｇ）を、シリカゲル上でカラムクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム：メタノール混合物で溶出した。各５０ｍｌの溶出液を回収し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分析した。粘着性の暗褐色物質からなるクロロホルムの最初の少数の溶出液は廃棄したが、（９８：２ｖ／ｖ）で溶出した、濃緑色蛍光からなる画分は、メタノールを増量してさらに溶出し、蛍光の画分を完全に除去した。さらに極性を増加させて（クロロホルム：メタノール９０：１０ｖ／ｖ）溶出することによって、溶出液を濃縮後、淡白髪色の固体物質を得た。この物質は、ＴＬＣにかけた時に３つのスポットを示し、これらをメタノール中で再結晶を繰り返すことによって精製した。精製後、それは２５４ｎｍにおいて単一の青色帯を示し、クロロホルム：メタノール（９：１ｖ／ｖ）中で展開後、アニスアルデヒド硫酸試薬で処理したところ、ピンク色になる。その化合物をＡＥＣＨＬ−１と称した（収量１８０ｍｇ）。ＡＥＣＨＬ−１は、ＵＶ、ＩＲ、ＮＭＲ及び質量分光分析によって特性決定された。
【００２３】
抗体及び試薬
ウサギポリクローナル抗ｐ２１抗体及び抗ｐｐ５３抗体をＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から購入し、マウスモノクローナル抗ＣＤＫ４抗体及び抗サイクリンＤ１抗体をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入した。マウスモノクローナル抗ｐ５３抗体及びｃ−Ｍｙｃ抗体をＡｂｃａｍ（ＵＳＡ）から購入した。マウスモノクローナル抗アクチンをＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）から購入し、マウスモノクローナル抗チューブリン、シスプラチン及びパクリタキセルをＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。［３Ｈ］チミジンをＢｏａｒｄ  ｏｆ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｕｍｂａｉ、Ｉｎｄｉａ）から購入した。他の化学薬品はすべて、分析グレードのものであった。
【００２４】
細胞培養
ＨＥＫ２９３（ヒト胚腎細胞系）、Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌、ＭＣＦ−７ヒト乳癌及びＰＣ３ヒト前立腺癌細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得られた。ＰＣ３細胞を、ハムＦ１２培地（Ｓｉｇｍａ）中で培養し、ＨＥＫ２９３、ＭＣＦ−７及びＢ１６Ｆ１０細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｓｉｇｍａ）中で培養し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び２ｍｍｏｌ／Ｌグルタミンが補充されたリーボビッツＬ−１５中で、５％ＣＯ２及び９５％空気の加湿雰囲気中、３７℃にて培養し、またＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＣＯ２を含まない通常の加湿雰囲気中、３７℃にて培養した。
【００２５】
細胞生存率アッセイ
ＡＥＣＨＬ−１がＨＥＫ２９３、Ｂ１６Ｆ１０、ＰＣ３、ＭＣＦ７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に及ぼす細胞毒性作用を、以前の研究において記載されているＭＴＴアッセイによって測定した。細胞を、９６−ウェル平底マイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）に、各ウェル５×１０３細胞の密度で分注した。２４時間後、それらを、１００μｌ培地中、種々の濃度のＡＥＣＨＬ−１（０〜１５０μＭ）、シスプラチン（０〜１００μＭ）又はパクリタキセル（０〜５０μＭ）で１２、２４及び４８時間処理した。ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］溶液（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌ）を、実験終了時に各ウェルに加え、最終濃度を０．５ｍｇ／ｍｌにし、培養液をさらに４時間インキュベートした。得られたホルマザン結晶をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１００μｌに溶かし、吸光度をマイクロプレートリーダーで５７０ｎｍにて測定した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｐｅｃｔｒａ  ＭＡＸ２５０）。細胞毒性作用を、以下のように算出される相対阻害百分率として表した。
相対阻害（％）＝［（Ａ５７０対照−Ａ５７０ＡＥＣＨＬ−１）／Ａ５７０対照］×１００
【００２６】
細胞増殖アッセイ
５×１０３細胞（Ｂ１６Ｆ１０、ＰＣ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ−７細胞）を含む完全培地のアリコートを９６ウェル組織培養プレートに分注した。翌日に、培地を、種々の濃度のＡＥＣＨＬ−１（０〜１５０μＭ）、シスプラチン（０〜１００μＭ）又はパクリタキセル（０〜５０μＭ）を含む新鮮な培地１００μｌに交換した。６時間のインキュベーション後、１μＣｉ［３Ｈ］チミジンを各ウェルに加えた。処理から２４及び４８時間後、９６ウェル自動回収装置を用いて、ガラスろ紙上に細胞を回収し、取り込まれた［３Ｈ］チミジンの量をβ−カウンターで決定した（Ｃａｎｂｅｒｒａ  ｐａｃｋａｒｄ）。
【００２７】
細胞周期分析
ＭＣＦ−７、Ｂ１６Ｆ１０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＰＣ３細胞の細胞周期分析を、フローサイトメトリーによって行った。細胞を６ウェルプレート（３×１０５細胞／ウェル）で培養し、種々の濃度のＡＥＣＨＬ−１（０〜１００μＭ）及びパクリタキセル（０〜５０μＭ）で２４時間処理した。トリプシン（０．０５％）、０．０２％ＥＤＴＡ、０．０５％グルコースを用いて細胞を回収し、単細胞懸濁液を調製した。細胞を洗浄し、遠心分離（１０００×ｇで２分間）によってペレットにし、ボルテックスしながら７０％エタノールに固定し、４℃で１時間保存した。固定した細胞を遠心分離によってペレットにし、エタノールを除去し、ＰＢＳで洗浄した。５０μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム、０．１ｇ／Ｌ  ＲＮａｓｅ及び１％ＢＳＡを含むＰＢＳに細胞を再懸濁し、暗所で３７℃にて３０分間インキュベートし、４８８ｎｍのアルゴンレーザーを備えたフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ−ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）で分析した。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアを使用してデータを解析し、細胞周期の異なる相にある細胞集団百分率を決定した。
【００２８】
免疫細胞化学
免疫細胞化学は、これまでに記載されているように行った。ＡＥＣＨＬ−１又はパクリタキセルでの処理から２４時間後、細胞をＰＢＳ中３．７％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、次いで０．１％トリトン−Ｘ１００で５分間透過処理し、次いで２％ＢＳＡ及び５％ヤギ血清で３０分間ブロックした。細胞を１次抗ｐ５３抗体（１：１００；Ａｂｃａｍ）及び抗α−チューブリン抗体（１：１００００；Ｓｉｇｍａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）とともに、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、細胞をＣＹ２コンジュゲート２次抗体（１：２００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＡｌｅｘａコンジュゲート２次抗体（１：１００００；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）とともに４５分間インキュベートし、ＤＡＰＩで核を染色した。共焦点顕微鏡下で画像を得た。
【００２９】
インビボにおける同種移植片及び異種移植片の腫瘍モデル
同種移植片モデル用に、雄Ｃ５７Ｂ１／６マウス（６〜８週齢）をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅから得、異種移植片モデル用に、雌胸腺欠損ヌードマウスであるＮＩＨ、ｎｕ／ｎｕ（Ｓｗｉｓｓ）をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（Ｐｕｎｅ、Ｉｎｄｉａ）から得た。雄Ｃ５７Ｂ１／６マウスについては、標準的な齧歯類の固形飼料及び水を自由に与え、１２時間点灯／１２時間消灯のサイクルでの標準的な飼育状態を保ったが、雌胸腺欠損ヌードマウスについては、特定の無菌条件下で飼育し、インビボ腫瘍形成性試験に使用した。すべての手順は、Ｃｅｎｔｒａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの特定の規定に準じて行われた。使用動物は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって準備された「実験動物の世話と使用のためのガイド（ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｉｍａｌｓ）（ＮＩＨ出版８５−２３，１９８５年改訂）」の方針に従って世話された。同種移植片モデルでは、馴化から１週間後、トリパンブルー色素排除試験を使用して行った９５％を超える生存率を有する、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞（５×１０６／０．１ｍｌ）の単細胞のみの懸濁液を、Ｃ５７Ｂ１／６マウスの脇腹に皮下注射した。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍は、腫瘍細胞接種後約７日で触知可能となった。異種移植片モデルでは、腫瘍形成性実験をこれまでに記載されているように行った。手短に、ＭＣＦ−７（２×１０７／０．１ｍｌ）の単細胞のみの懸濁液を、雌胸腺欠損ヌードマウスの脇腹に皮下注射した。各マウスには、接種前２週目に１７−β−エストラジオール０．７２ｍｇペレットを皮下移植した。隔日毎に腫瘍の存在について動物を評価し、腫瘍の測定を移植後１０日目に始め、腫瘍が動物の体重のおよそ８〜１０％に達するまで隔週に続けた。ノギス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ、Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｋａｎａｇａｗａ、Ｊａｐａｎ）を使用して、腫瘍の長さ（Ｌ）及び幅（Ｗ）を測定し、式Ｌ×Ｗ２／２を使用して、腫瘍体積を算出した。２週間後、Ｃ５７Ｂ１／６マウス（ｎ＝６）を４群に分けた。腫瘍内注射を以下のように、すなわち対照（０．５％ＤＭＳＯ中０．０５ｍｌＰＢＳ）、ＡＥＣＨＬ−１（５０μｇ／０．０５ｍｌ）、ＡＥＣＨＬ−１（１００μｇ／０．０５ｍｌ）及びシスプラチン（１００μｇ／０．０５ｍｌ）を１２日間行った。雌胸腺欠損ヌードマウス（ｎ＝３）を５群に分け、腫瘍内注射を以下のように、すなわち対照（２％ＤＭＳＯ中０．０５ｍｌＰＢＳ）、ＡＥＣＨＬ−１（５μｇ／０．０５ｍｌ）、ＡＥＣＨＬ−１（１０μｇ／０．０５ｍｌ）、ＡＥＣＨＬ−１（２０μｇ／０．０５ｍｌ）及びパクリタキセル（２０μｇ／０．０５ｍｌ）を１０日間行った。試験中、腫瘍体積を規則的な間隔で測定した。試験終了時、動物をエーテル麻酔下で屠殺し、腫瘍及び腎臓、心臓、肝臓、脾臓及び膵臓のような他の臓器を解剖した。光学顕微鏡による組織学的分析用に、腫瘍及び他の臓器の半分を１０％緩衝ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋した。サイクリンＤ１、ＣＤＫ４、ｐ５３、ｐｐ５３、ｐ２１及びｃ−Ｍｙｃの値を、Ｃ５７Ｂ１／６マウス��腫瘍ホモジネート中、ウェスタンブロットによって分析した。
【００３０】
ウェスタンブロット分析
免疫ブロット分析に先立ち、−８０℃で保存された腫瘍部分を解凍し、洗浄し、細切してミンチにし、溶解緩衝液（１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０％グリセロール、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤カクテル、Ｒｏｃｈｅ）中で、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ均質化装置を用いてホモジネートした。溶解物を４℃で３０分間インキュベートし、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロ遠心機で１４０００ｒ．ｐ．ｍ．にて１５分間遠心分離した。タンパク質を可溶化させた形態で単離した。タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキット）によって測定し、−８０℃で保存した。免疫ブロット法については、腫瘍溶解物由来の全タンパク質のうちの６０μｇを使用した。タンパク質を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で分割し、イモビロン−Ｐニトロセルロース膜に移し、ＴＢＳＴ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中５％（ｗｔ／ｖ）脱脂粉乳（Ｓｉｇｍａ）で室温にて３時間ブロックし、次いで１次抗体ｐ５３、ｐｐ５３、ｐ２１、サイクリンＤ１、ＣＤＫ４及びｃ−ＭｙｃとともにＴＢＳＴ中で３時間及びアクチンとともに１時間、室温でインキュベートした。膜をＨＲＰコンジュゲート２次抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともに、１：１００００希釈で、室温にて１時間、さらにインキュベートした。各抗体インキュベーション後、膜をＴＢＳＴ緩衝液で３回、入念に洗浄した。タンパク質のバンドの視覚化は、エンハンサー型化学発光基質反応物（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、製造業者の使用説明書に従って、Ｘ−ＯＭＡＴ  ＡＲ５フィルム（Ｋｏｄａｋ）を使用して行った。
【００３１】
統計分析
腫瘍体積について報告されたデータを、平均±ＳＥＭとして表した。統計的差異をＡＮＯＶＡによって決定し、適用された事後試験はＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ多重比較試験であった。腫瘍の体重に対する比については、適用された事後試験はＤｕｎｎｅｔｔ多重比較試験であった。
【００３２】
結果
ＡＥＣＨＬ−１のＨＰＬＣ分析
試料：ＡＥＣＨＬ−１
移動相：メタノール：水（９０：１０）
流速：１ｍｌ／分
ＵＶｍａｘ：２３５ｎｍ
濃度：１００ｐｐｍ
カラム：ＲＰ  Ｃ−１８  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラム
保持時間（ＲＴ）：４．７３４分
【００３３】
ＡＥＣＨＬ−１の特性決定
ＡＥＣＨＬ−１を特性決定したところ、以下の特徴を有するＩＲ、ＮＭＲ及び質量スペクトルを示した。
ＩＲ（ＫＢｒ）：３４２５、３４１９（ヒドロキシル基）、２９７２、２９６６、２９２３、２８７３（アルキルＣ−Ｈ伸縮）、１７３３（δラクトン）、１７１８（ビアセチル）、１６８０（アルケンとのＣ＝Ｏ共役）、１６５２（−Ｃ＝Ｃ伸縮）、１６００（芳香族）、１４９２、１４５４、１３９４（メチル伸縮）、１２２２（δラクトン）、１１８４、１１１０、１０５１、１０３１（アセタール）、１０１８ｎｍ（アルカン）。
【化２】
0005468611.tif 000003
化学シフトは、δ目盛のｐｐｍで示されており、ｓは単一線、ｄは二重線、ｔは三重線である。
【００３４】
質量スペクトルは、以下の主要なピーク：二量体形成によるｍ／ｚ：１０６８を示した。実際の［Ｍ＋］は、５４３．８、４６３．３［Ｍ−Ｃ４Ｈ１Ｏ２］、４６１．４［Ｍ−Ｃ４Ｈ２Ｏ２］、４５９．４［Ｍ−Ｃ４Ｈ４Ｏ２］、３６１．２［Ｍ−Ｃ９Ｈ１１Ｏ４］であると考えられた。ＡＥＣＨＬ−１は、ＥＩ及びＥＳ質量スペクトルによって示されているように、分子式Ｃ２９Ｈ３６Ｏ１０を有する、融点２４８〜２５０℃の固体である。ＩＲスペクトルは、ヒドロキシル（単数又は複数）（３４２５ｎｍ、３４１９ｎｍ）、δラクトン（１７３３ｎｍ）及び芳香族部分（１６００ｎｍ）の存在を示した。ＵＶスペクトルは、２３５ｎｍで特徴のある吸収極大を示し、このことはヒドロキシル及びケトンのような助色団基の存在を示していた。ＡＥＣＨＬ−１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、芳香族プロトンδ６．８９及びＣ−１５のエステル官能基の特徴であるδ５．３０の単一線の存在を明らかにした。Ｈ−２２は、δ４．０５の単一線及びδ３．６５の二重線としてのＡＢ系として現れ、Ｈ−１２は、δ３．９５の三重線として現れた。芳香環上のメチル基Ｈ−１９は、δ２．３の単一線として現れた。６個のプロトンに対するδ１．２３５の二重線は、Ｈ−５’に割り当てられた。Ｈ−４’は、δ０．９５の三重線として現れた。メチル基Ｈ−１８は、δ２．１６の単一線として現れた（図２）。
【化３】
0005468611.tif 000004
図２．質量フラグメントを用いたＡＥＣＨＬ−１の構造
【００３５】
ＡＥＣＨＬ−１がインビトロでの腫瘍細胞の増殖に及ぼす影響。
最初の実験では、本発明者らは、異なる濃度のＡＥＣＨＬ−１が腫瘍細胞Ｂ１６Ｆ１０、ＰＣ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ−７の生存及び増殖百分率に及ぼす影響を調べた。図３．１〜３．４（Ａ〜Ｆ）に示されているように、処理から１２、２４及び４８時間後に、腫瘍細胞の生存及び増殖百分率は、ＭＴＴ及び［３Ｈ］チミジン取り込みによって示されるように、すべての細胞系において、ＡＥＣＨＬ−１によって濃度及び時間依存的に有意に阻害された。阻害率は濃度及び時間依存的に増加し、細胞系においてＡＥＣＨＬ−１での処理から４８時間後に、より高濃度で最大の効果が認められ、ＭＣＦ−７＞Ｂ１６Ｆ１０＞ＰＣ３＞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１＞ＨＥＫ２９３となった（図３．５Ａ）。意義深いことに、ＡＥＣＨＬ−１の１０μＭでの阻害作用は、４８時間処理されたＭＣＦ−７細胞におけるパクリタキセル又はシスプラチンの阻害作用よりも強く（図３．５Ｂ）、このことはＡＥＣＨＬ−１が非常に強力であることを示唆している。
図４．異なる細胞の異なる濃度での相対的な細胞成長の停止が、細胞のランダム視野の位相差画像において視覚的に明らかである。
【００３６】
表１．ＡＥＣＨＬ−１がフローサイトメーターによる細胞周期分布に及ぼす影響
ａ）Ｂ１６Ｆ１０細胞：Ｂ１６Ｆ１０細胞の場合には、対照細胞は、細胞周期のＧ０／Ｇ１相、Ｓ相及びＧ２／Ｍ相を反映したＤＮＡ含量の典型的なパターンを示す。溶媒処理細胞は、対照と比較した場合、それぞれＧ０／Ｇ１の僅かな減少、すなわち対照の５５．６４％に対して５２．１８％を示し、Ｇ２／Ｍ相細胞計数の増加、すなわち対照の細胞計数２２．９８％に対して２６．５９％を示した以外は、細胞分布パターンに有意な変化を全く示さなかった。ＡＥＣＨＬ−１での処理は、Ｇ０／Ｇ１細胞計数の顕著な増加、すなわち溶媒対照の５２．１８％に対して、（１０、２０、４０、１００μＭ）の濃度でそれぞれ５６．５５、５７．６７、７２．０８％を示した。それはまた、Ｓ相の細胞計数の減少、すなわち溶媒対照の２１．３９％に対して、（１０、２０、４０μＭの濃度で）それぞれ２０．４６、１８．４０、１１．４３を示した。Ｇ２／Ｍ相の細胞計数も減少する、すなわち溶媒処理の２６．５９％に対して、それぞれ２３．０２〜１４．７３％であることも分かった。ＡＥＣＨＬ−１の１０〜２０μＭの濃度範囲については、アポトーシス細胞又は壊死細胞は全く認められなかった。しかし、高濃度すなわち１００μＭでは、細胞成長はアポトーシスによって阻害されている、すなわち溶媒対照の０．２４％に対して、それぞれ７．８２％であることが分かった。１００μＭでは、細胞分布はそれぞれ、Ｇ０／Ｇ１相６４．０４％、Ｓ相１５．４１％及びＧ２／Ｍ相１３．２３％のようになることが分かった。ＡＥＣＨＬ−１は、低濃度でＧ０／Ｇ１相停止及び高濃度で顕著なアポトーシスを伴うＧ０／Ｇ１相停止を示した。
【００３７】
ｂ）ＰＣ３細胞：ＰＣ３細胞の場合には、対照細胞は、細胞周期のＧ０／Ｇ１相、Ｓ相及びＧ２／Ｍ相を反映したＤＮＡ含量の典型的なパターンを示した。溶媒処理は、周期における細胞の分布に有意な変化を全く示さなかった。
【００３８】
ＡＥＣＨＬ−１（１０〜１００μＭ）での処理は、Ｇ０／Ｇ１の細胞計数の減少、すなわち溶媒処理細胞のもの（５２．４９％）に対して、それぞれ５０．７４％〜４２．９２％を示した。ＡＥＣＨＬ−１の１００μＭ処理で、Ｓ−Ｇ２／Ｍ相が４５．４１％から５３．６２％まで細胞計数の増加を示し、Ｇ０／Ｇ１相で細胞計数が減少したことから、細胞成長はＳ−Ｇ２／Ｍ相で停止されることが分かった。ＡＥＣＨＬ−１は、ＰＣ３細胞の成長をＳ−Ｇ２／Ｍ相で停止させる。ＡＥＣＨＬ−１はまた、ＰＣ３細胞のアポトーシス細胞死を示した。
【００３９】
ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞：ＭＤＡ−２３１細胞の場合には、対照細胞は、細胞周期のＧ０／Ｇ１相、Ｓ相及びＧ２／Ｍ相を反映したＤＮＡ含量の典型的なパターンを示した。溶媒処理細胞は、対照と比較した場合、細胞分布パターンに有意な変化を全く示さなかった。
【００４０】
ＡＥＣＨＬ−１（１０、２０、４０、１００μＭ）での処理は、Ｇ０／Ｇ１の細胞計数の減少、すなわち溶媒対照４９．１６％と比較して、それぞれ４３．０３、３３．１８、２６．６６及び２２．８２％を示した。ＡＥＣＨＬ−１の濃度が増加するにつれて、Ｓ相の細胞計数は増加する、すなわち溶媒処理２５．７３％に対して、それぞれ２４．０６、２８．６３、２８．１２、３０．９９％であることが分かった。ＡＥＣＨＬ−１処理でさえ、Ｇ２／Ｍ相の細胞計数を増加させた、すなわち溶媒処理の２４．１０％と比較して、それぞれ３２．２１、３８．０１、４５．１４、４６．１７％であった。したがって、細胞はＳ−Ｇ２／Ｍ相で蓄積するようになる。ＡＥＣＨＬ−１は、Ｓ−Ｇ２／Ｍ相でＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞成長の停止を示した。
【００４１】
ｄ）ＭＣＦ−７細胞：ＭＣＦ−７細胞において、１０、２０、４０及び１００μＭの濃度でのＡＥＣＨＬ−１は、対照が５３．６７％であるのに対して、Ｇ０／Ｇ１相の細胞はそれぞれ３５．０４、２７．８５、２９．６８及び３６．２６％を示した。したがって、細胞成長はＧ０／Ｇ１相で減少することが分かった。同時にＳ−Ｇ２／Ｍ相の細胞計数は、ＡＥＣＨＬ−１の１００μＭの濃度で、それぞれ４５．１３から６９．４％まで増加した。したがって、ＡＥＣＨＬ−１は、Ｓ−Ｇ２／Ｍ相で成長を停止させる。
【００４２】
ＡＥＣＨＬ−１が細胞のｐ５３転移及び微小管に及ぼす影響。
腫瘍抑制遺伝子ｐ５３は、ヒト癌形成を妨げる重大な役割を果たす。それは、核の中に転移し、細胞周期調節タンパク質を上方調節することによって転写因子として働き、細胞周期の停止及び／又はプログラムされた細胞死（アポトーシス）を誘導する（１１）。したがって、ＡＥＣＨＬ−１の影響を、ｐ５３の転移に関して研究した。また、パクリタキセルは、インビトロにおいて強いチューブリン安定化活性を示すため（１２）、本発明者らは、ＡＥＣＨＬ−１処理が細胞の微小管ネットワークに影響を及ぼすかどうかを試験した。ＭＣＦ−７細胞を、種々の濃度のパクリタキセル（１〜２０μＭ）及びＡＥＣＨＬ−１（２〜４０μＭ）で処理した。インキュベーションから２４時間後、核（蛍光緑色）の中へのｐ５３転移及び微小管ネットワーク（蛍光赤色）が、共焦点顕微鏡法によって視覚化された。ＡＥＣＨＬ−１処理は、核の中にｐ５３を転移させる結果となった。対照細胞中の微小管ネットワークは、正常な配置及び組織を示した（図５）。パクリタキセルでの処理は、結果として微小管を重合させ、細胞の微小管の密度を増加させ、核を取り囲む長く厚い微小管束を形成することになった。ＡＥＣＨＬ−１処理は、パクリタキセルが誘導した、微小管の肥厚及び密度増加などの微小管の変化の所見と類似の所見に帰着した。
【００４３】
ＡＥＣＨＬ−１が同種移植片及び異種移植片における原発腫瘍体積に及ぼす影響。
次に、本発明者らは、Ｃ５７Ｂ１／６マウスで成長しているＢ１６Ｆ１０細胞の原発腫瘍同種移植片及び胸腺欠損ヌードマウスで成長しているＭＣＦ−７細胞の原発腫瘍異種移植片それぞれの成長にＡＥＣＨＬ−１が及ぼす影響を調べた。予備研究では、本発明者らは、Ｃ５７マウスにおけるＡＥＣＨＬ−１の最大耐量は、５００μｇ／マウスの単回投与であることが分かり、１か月間観察し、毒性の明白な徴候は全く見られなかった。これをもとに、本発明者らは、この最大耐量の１０〜２０％である用量又は腹腔内投与にて５０及び１００μｇ／ｋｇ／日又はインビトロで最大細胞死を誘導する用量を選択した。２週間後に病気の明白な徴候は全くなく、ＡＥＣＨＬ−１投与群及び対照群の両群間に体重差は全くなかった（データは示さず）ため、この投与計画はマウスに悪影響を及ぼさないように思われた。１８日目に、対照群において腫瘍体積の有意な増加が認められた（ｐ＜０．００１）。５０及び１００μｇのＡＥＣＨＬ−１を、生着した腫瘍同種移植片を有するこれらのマウスに投与したところ、腫瘍サイズは［５０μｇＡＥＣＨＬ−１では４４．３０３±５．２０％（ｐ＜０．００１）及び１００μｇＡＥＣＨＬ−１では５１．０１４±１．２７％（ｐ＜０．００１））減少したのに対して、１００μｇシスプラチンを投与したものは、［９３．１３±０．５３９％（ｐ＜０．００１）］の減少を示した。ＡＥＣＨＬ−１（５０μｇ）対ＡＥＣＨＬ−１（１００μｇ）では、有意差はないことが分かった（ｐ＞０．０５）。
【００４４】
２４日目に、対照、ＡＥＣＨＬ−１（５０μｇ）及びＡＥＣＨＬ−１（１００μｇ）における腫瘍体積が増加している（ｐ＜０．００１）ことが分かったが、シスプラチン投与群の体積は減少している（ｐ＜０．００１）ことが分かった。
【００４５】
シスプラチンは、５０μｇ又は１００μｇのＡＥＣＨＬ−１に比べて極めて有意であることが分かったが、シスプラチン投与群における他の臓器への損傷は、ＡＥＣＨＬ−１投与群に比べて大きかった（図６Ａ及び６Ｂ）。
【００４６】
ＭＣＦ−７細胞についてのＡＥＣＨＬ−１の細胞毒性用量は非常に低かったため、胸腺欠損ヌードマウスの腫瘍異種移植片に対して選択された用量は、５、１０及び２０μｇ／０．０５ｍｌであった。これらの用量のＡＥＣＨＬ−１では、腫瘍サイズは［５μｇでは３５．７２±０．０５％（ｐ＜０．００１）、１０μｇでは２８．５５±０．０６％（ｐ＜０．００１）、２０μｇでは４．１±０．２７％（ｐ＜０．０５）減少したのに対して、２０μｇパクリタキセルを投与したものは、［１４．１９±０．３２％（ｐ＜０．０５）］の減少を示し、これはＡＥＣＨＬ−１群に比べて少なかった（図６Ｃ及び６Ｄ）。
【００４７】
これらの結果は、ＡＥＣＨＬ−１の抗腫瘍作用が、試験された従来の化学療法薬と同程度か又はそれよりもさらに優れていることを実証した。このように、両濃度でのＡＥＣＨＬ−１は、対照群と比較した場合、腫瘍細胞の成長を妨げ、腫瘍体積を減少させた。
【００４８】
ＡＥＣＨＬ−１が、体重及び腫瘍重量／体重比に及ぼす影響
対照群において、並びに１００μｇＡＥＣＨＬ−１及びシスプラチンを投与されたマウスにおいて、体重（腫瘍を含む）の減少が認められた。これに対して、５０μｇＡＥＣＨＬ−１を投与されたマウスの場合には、体重は減少しなかった（図７Ａ）。
【００４９】
５０及び１００μｇのＡＥＣＨＬ−１並びにシスプラチンの投与は、対照群と比較して、投与１２日後の腫瘍重量対体重比において有意な減少を示した（ｐ＜０．０１）。１００μｇＡＥＣＨＬ−１に比べて、５０μｇＡＥＣＨＬ−１の効果が大きかった。ＡＥＣＨＬ−１群及び対照群と比較して、シスプラチン投与群は比において有意な減少を示した（図７Ｂ）。
【００５０】
Ｃ５７マウスにおける腫瘍組織の組織学的検査
血管形成が誘導される場合、転移性腫瘍細胞が急速に成長する。したがって、血管形成の阻害が腫瘍成長、増殖及び２次転移を妨げる。血管形成の阻害及び腫瘍の浸潤、運動及び増殖並びに血管の内皮細胞の成長の抑制は、癌の予防に本質的に必要である。
【００５１】
腫瘍組織の組織学的検査によって、腫瘍細胞密度、位置、数及び血管構造について評価し、血管形成に関連する可能性のある変化：毛細血管の血管完全性を決定するための出血領域の存在；並びに腫瘍生存率を検討するための核濃縮性／壊死性の細胞領域の存在、サイズ及び位置を評価した。
【００５２】
溶媒投与群由来の腫瘍は、新生血管形成の増加を示しており、血管形成の疑徴を示す細胞密度の増加及び出血領域の存在を伴い、転移の恐れが増大した。血管は十分に発達していることが分かった（図８．１Ａ）。５０μｇＡＥＣＨＬ−１での腫瘍の治療は、腫瘍血管新生に大きな影響を示さず、出血領域の出現は少なかった。腫瘍細胞密度は減少していることが分かり、腫瘍の中心に核濃縮性／壊死性細胞が出現していた。赤血球の存在によって示されるように、血管は潅流しているように思われたので、本発明者らは、この領域の血管の機能性を直接評価しなかった。したがって、この領域の壊死は、血管新生が不足した結果ではないように思われた（図８．１Ｂ）。
【００５３】
１００μｇＡＥＣＨＬ−１での腫瘍の治療は、腫瘍領域の至る所に壊死性核の増加を示し、新生血管形成及び出血領域が消失しており、それ故に血管形成及び転移の見込みが低減した。腫瘍細胞密度は、５０μｇＡＥＣＨＬ−１及び溶媒投与群のものと比較して低いことが分かった（図８．１Ｃ）。
【００５４】
シスプラチン投与群は、壊死性核の有意な増加を示し、腫瘍細胞密度が減少した（図８．１Ｄ）。腫瘍体積も減少していることが分かった。新生血管形成及び出血領域の徴候は全くなかった。対照及び５０μｇＡＥＣＨＬ−１と比較して、細胞の多くが死滅していることが分かった。
【００５５】
したがって、ＡＥＣＨＬ−１は、新生血管形成を阻害することによって血管形成の進行を妨げ、ひいては転移のリスクを減少させる。
【００５６】
Ｃ５７マウスにおける臓器の組織病理学的検査
Ｃ５７マウス由来の臓器の組織学的検査は以下のデータを示した。対照群由来の肝臓は、小葉の周辺に門脈トライアッドを有する中心静脈を示した。現れたクッパー細胞は正常であった（図８．１Ｅ）。５０μｇＡＥＣＨＬ−１は、肝臓の正常な構造に影響を及ぼさなかった（図８．１Ｆ）。また、１００μｇＡＥＣＨＬ−１は、肥大性細胞核を有する肝臓の正常な構造を保持している（図８．１Ｇ）。シスプラチン投与群において、広範囲にわたる肝細胞の壊死が見られた。右側の矢印で示されている肝細胞は死滅している。このパターンは、種々の肝臓毒素で見ることができ、リンパ球浸潤を伴う肝細胞の巣状壊死が発生した。組織病理学的には、病変は、壊死に反応して炎症の程度を変化させることを伴う壊死を特徴とするティザー病のものに見える。急性肝臓病変は、主として好中球性の最小の炎症によって取り囲まれている壊死病巣からなる（図８．１Ｈ）。
【００５７】
対照群由来の心臓は、個々の細胞を示す、中心に位置する顕著な核を有する平行線維を示した（図８．１Ｉ）。５０μｇＡＥＣＨＬ−１の投与は、心筋線維の壊死を全く示さなかった（図８．１Ｊ）。１００μｇＡＥＣＨＬ−１の投与は、収縮帯と核の欠乏とを有する広範囲にわたる心筋線維の壊死を示した。凝固壊死の特徴である、筋線維の小片化及び破損が発生している（図８．１Ｋ）。シスプラチン投与マウスは、心筋線維の壊死が軽度のリンパ球浸潤を伴って発生することを示した。ここで再び、凝固壊死の特徴である、筋線維の小片化及び破損（図８．１Ｌ）。
【００５８】
対照において、マウスの腎臓は、境界が十分にはっきりした皮質及び髄質並びに十分に形成された糸球体を有する無傷の被膜を示した（図８．１Ｍ）。５０μｇＡＥＣＨＬ−１の投与は、出血領域を有する軽度の尿細管空胞変性及び尿細管膨張を示し、下方部分に正常な糸球体が現れている（図８．１Ｎ）。１００μｇＡＥＣＨＬ−１の投与は、出血状態を有する尿細管空胞変性及び尿細管膨張を示し、尿細管は散在性慢性炎症細胞浸潤を伴って膨張した（図８．１Ｏ）。シスプラチン投与マウスにおいて、リンパ球は管内及び管周囲に散在していた。糸球体は細胞過形成であり、毛細血管のループは顕著な特徴が見られなかったが、これは増殖性糸球体腎炎のタイプである。多くの好中球が尿細管及び間質に見られ、すなわち腎盂腎炎であった（図８．１Ｐ）。
【００５９】
膵臓組織学について、細胞の構造に有意な変化は発生しなかった（図８．１Ｑ〜Ｔ）。
【００６０】
対照マウス由来の代表的な脾臓切片は、（＊）−細動脈周囲のリンパ鞘；（Θ）−濾胞；（Ψ）−辺縁帯によって示される白髄の異なる区画を示した。対照及び５０μｇＡＥＣＨＬ−１は、正常な脾臓構造を示した。白髄の過形成、特に濾胞；及び辺縁帯の過形成に留意されたい。組織学は、辺縁帯における顆粒球数の増加を示した（図８．１Ｕ〜Ｘ）。
【００６１】
ヌードマウスにおける腫瘍組織の組織学的検査
ヌードマウスにおける腫瘍の組織学的検査は、Ｃ５７マウスのものと類似していた。対照マウス由来の腫瘍は、切片の至る所に、高度に密集した細胞で取り囲まれた明白な新生血管形成を示し、壊死細胞は存在しなかった（図８．２Ａ）。パクリタキセルの投与は、腫瘍細胞密度を減らし、切片内に多くの空きスペース及び壊死領域を発生させた。パクリタキセルは、血管及び出血領域の発生を伴う腫瘍血管新生に影響を及ぼさなかった（図８．２Ｂ）。５μｇ用量のＡＥＣＨＬ−１は、腫瘍細胞密度の減少を示し、腫瘍領域の至る所に多くの空きスペースを示した。それはまた、新生血管形成の欠乏を示し、出血領域も存在しなかった（図８．２Ｃ）。１０及び２０μｇのＡＥＣＨＬ−１は、類似の作用を示したが、血管新生を減少させることができず、出血領域が発生した。赤血球の存在によって示されるように、血管は潅流しているように思われたので、本発明者らは、この領域の血管の機能性を直接評価しなかった。したがって、この領域の壊死は、血管新生が不足した結果ではないように思われた（図８．２Ｄ及びＥ）。
【００６２】
ヌードマウスにおける臓器の組織病理学的検査
５μｇＡＥＣＨＬ−１の投与は、正常な心筋に全く変化を示さなかったが、パクリタキセル、１０及び２０μｇのＡＥＣＨＬ−１は、リンパ球浸潤の徴候を伴う心筋線維の壊死を示した。２０μｇ用量のパクリタキセルは、心筋の小片化及び破損を伴い、広範囲にわたる心筋線維の壊死を示した（図８．２Ｆ〜Ｊ）。
【００６３】
ＡＥＣＨＬ−１投与群由来の腎臓構造に有意な変化は認められなかったが、パクリタキセル投与群は、出血領域を有する尿細管空胞変性膨張の徴候を示した（図８．２Ｋ〜Ｏ）。
【００６４】
パクリタキセル投与群及びＡＥＣＨＬ−１投与群由来の肝臓は、門脈トライアッドを有する中心静脈を示した。ＡＥＣＨＬ−１及びパクリタキセルの両群は、肝臓の正常な構造に全く変化を示さなかった（図８．２Ｐ〜Ｔ）。
【００６５】
タンパク質発現に伴う腫瘍細胞成長停止
ＡＥＣＨＬ−１は、すべての細胞タイプにおいて成長停止を示したため、本発明者らは、次に、細胞周期を制御する分子について試験した。ウェスタンブロットの結果、ＡＥＣＨＬ−１はサイクリンＤ１及びＣＤＫ４の発現を減少させることが判明した。チェックポイントタンパク質ｐ５３（腫瘍抑制タンパク質）、細胞停止タンパク質ｐ２１の発現の上方調節及びｃ−Ｍｙｃ（腫瘍発生分子）の下方調節を誘導した。ｐ５３タンパク質は、対照と比較して、シスプラチン同様、５０μｇ及び１００μｇＡＥＣＨＬ−１の両方で発現の増加を示した（図９）。しかし、５０μｇＡＥＣＨＬ−１での発現と比較して、１００μｇにおける発現は少なかった。ｐ５３（ｐｐ５３）タンパク質のリン酸化は、ＡＥＣＨＬ−１の５０μｇ濃度で増加し、その上、１００μｇ濃度で減少した。これに対して、シスプラチンは、全く変化を示さなかった。ＡＥＣＨＬ−１の５０μｇ濃度で、ｐ２１の発現が減少し、その上、１００μｇ濃度で増加した。シスプラチンは、ｐ２１発現の増加を示した。このことは、サイクリンＤ１及びＣＤＫ４発現の下方調節及びｐ５３の上方調節が、サイクリンＤ１／Ｃｄｋ４シグナル経路を介して又は腫瘍成長を助ける腫瘍発生分子ｃ−Ｍｙｃの下方調節の故に、ＡＥＣＨＬ−１によって誘導された成長阻害に寄与することを示唆している。
【００６６】
表１  ＡＥＣＨＬ−１処理細胞の細胞周期分析
【表１】
0005468611.tif 000005
【図１】
0005468611.tif 000007
【図２】
0005468611.tif 000008
【図３】
0005468611.tif 000009
【図４】
0005468611.tif 000010
【図５】
0005468611.tif 000011
【図６】
0005468611.tif 000012
【図７】
0005468611.tif 000013
【図８】
0005468611.tif 000014
【図９】
0005468611.tif 000015
【図１０】
0005468611.tif 000016
【図１１】
0005468611.tif 000017
【図１２】
0005468611.tif 000018