(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボソーム結合部位の５’側にｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位を設け、該ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位の５’側にリボソーム結合部位と相補的な塩基配列を設けたｍＲＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のｍＲＮＡと、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位に相補的に結合するｓｍａｌｌ  ＲＮＡとを混合することによるｍＲＮＡの翻訳制御方法。
【請求項３】
請求項１に記載のｍＲＮＡを含んでなる、翻訳発現制御システム。
【請求項４】
開始コドンの３’側にｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位を設け、該ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位の３’側に蛋白質をコードする塩基配列を設けたｍＲＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のｍＲＮＡと、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位に相補的に結合するｓｍａｌｌ  ＲＮＡとを混合することによるｍＲＮＡの翻訳制御方法。
【請求項６】
請求項４に記載のｍＲＮＡを含んでなる、翻訳発現制御システム。
【請求項７】
請求項１に記載のｍＲＮＡと、請求項４に記載のｍＲＮＡとを含む翻訳発現制御システムであって、請求項１に記載のｍＲＮＡのｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位と、請求項４に記載のｍＲＮＡのｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位とが、同一の塩基配列である、翻訳発現制御システム。
【請求項８】
リボソーム結合部位の５’側にｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位を設け、該ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位の５’側にリボソーム結合部位と相補的な塩基配列を設け、該リボソーム結合部位と相補的な塩基配列の５’側に、前記ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位と同一の塩基配列を設け、開始コドンの３’側に、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの少なくとも連続した６塩基と同一の配列を設け、該ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの少なくとも連続した６塩基と同一の配列の３’側に、蛋白質をコードする塩基配列を設けたｍＲＮＡ。
【請求項９】
請求項１に記載のｍＲＮＡを用いて、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの発現量を検知する工程と、
目的蛋白質の翻訳を活性化する工程と
を含む、人工情報変換方法。
【請求項１０】
請求項４に記載のｍＲＮＡを用いて、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの発現量を検知する工程と、
目的蛋白質の翻訳を抑制する工程と
を含む、人工情報変換方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のｍＲＮＡを用いて、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの発現量を検知する工程と、
請求項４に記載のｍＲＮＡを用いて、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの発現量を検知する工程と、
請求項１に記載のｍＲＮＡがコードする目的蛋白質の翻訳を活性化する工程と、
請求項４に記載のｍＲＮＡがコードする目的蛋白質の翻訳を抑制する工程と
を含む、人工情報変換方法であって、
請求項１に記載のｍＲＮＡのｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位と、請求項４に記載のｍＲＮＡのｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位とが、同一の塩基配列である、人工情報変換方法。
【請求項１２】
請求項１に記載のｍＲＮＡを内包したリポソーム。
【請求項１３】
請求項４に記載のｍＲＮＡを内包したリポソーム。
【請求項１４】
ｍＲＮＡ又はＤＮＡと、無細胞翻訳系とを内包してなるリポソーム。
【請求項１５】
油性液体中に、１種以上のリン脂質と、ｍＲＮＡ又はＤＮＡと、無細胞翻訳系と、水性溶液とを混合し、前記ｍＲＮＡ又はＤＮＡと前記無細胞翻訳系とが前記リン脂質小胞に内包されたＷＯエマルジョンを形成する工程と、
水相に外膜脂質を溶解した油性液体を加え、油水の分離界面に前記脂質が並んだ分子膜を形成させる工程と、
前記ＷＯエマルジョンを前記分離界面における油相側に加え、前記ＷＯエマルジョンを前記分離界面における水相側に移行させて前記ＷＯエマルジョンの外側に前記外膜脂質を付加してリポソームを形成する工程と
を含む、ｍＲＮＡ又はＤＮＡと無細胞翻訳系とを内包したリポソームの製造方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載のリポソームを形成する工程の後に、前記リポソームを顕微鏡で観察する工程を含むリポソーム内での蛋白質翻訳反応をリアルタイムでモニタリングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞または人工細胞モデルにおける翻訳制御システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＲＮＡ構造生物学の発展により、生体内の複雑なＲＮＡ分子は物理的に分割可能な機能単位であるＲＮＡモジュールの集積により構成されていることが明らかとなってきた。天然に存在する複数のＲＮＡモジュールを組み合わせる方法により人工的な機能性ＲＮＡ分子が構築され、さらにｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ法を用いることで、人工リボザイムの創製に成功するなどモジュラーエンジニアリングの有効性が既に提示されている。【０００３】
一方、天然においては、ｍＲＮＡ上にアミノ酸や核酸などの代謝産物結合ＲＮＡモジュールを持ち、代謝産物濃度に依存して遺伝子の発現制御を行うリボスイッチが存在する。具体的には、アデニンリボスイッチ、グリシンリボスイッチ、ＳＡＭリボスイッチなどのリボスイッチが知られており、リボスイッチは、リガンドの結合によるｍＲＮＡの構造変化に伴うＳＤ配列・開始コドンとリボソーム相互作用の制御、又はターミネーター構造の制御を行うことが解明されてきた。【０００４】
また、近年マイクロＲＮＡなどのｓｍａｌｌ  ＲＮＡ分子が、細胞の発生、分化、癌化などにおいて重要な役割を果たすことがわかってきた。これらｓｍａｌｌ  ＲＮＡ分子の発現は、細胞の状態や細胞内での局在に応じてダイナミックに変化する。したがって、これらｓｍａｌｌ  ＲＮＡ分子の発現を検知し、その発現量に応じて細胞を検出する技術や、その発現量に応じて、細胞運命を制御する技術の開発が期待されている。【０００５】
従来、標的核酸にハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成する標的核酸を検出するための、ＨＩＶ  ＤＮＡを基質とした核酸プローブを用いたバイオセンサーが知られている（特許文献１を参照）。この技術はバイオセンサーの開発に主眼をおくもので、任意の入力因子（例えば、ｍｉＲＮＡ）を任意の出力に変換する（例えば、ＧＦＰ）人工情報変換システムの構築に主眼をおくものではない。さらに、この技術においては、基質として使用されるのはＤＮＡであって、ｍｉＲＮＡなどのＲＮＡ基質に対する応答性の効果が未知であった。【０００６】
また、人工ＲＮＡを用いて大腸菌内部での翻訳反応を制御する技術が知られている（非特許文献１を参照）。しかし、この技術は、あらかじめ細胞内部で構築したシステムであるため、翻訳制御に他因子が関与している可能性を否定できない。また、基質ＲＮＡと人工ＲＮＡの至適濃度を厳密に調整できない。【０００７】
無細胞翻訳系と共にＤＮＡ、ｍＲＮＡを静置水和法で作成したリポソームに内包する技術が知られている（非特許文献２、３を参照）。しかし、静置水和法で作成したリポソームでは、実際に翻訳反応を進行させたリポソームは全体の１０％程度であり、全てのリポソーム内部で翻訳反応を進行させることが難しかった。【０００８】
一方最近、マイクロメータスケールの細胞サイズの液滴であるエマルジョンから作成したリポソーム内部での無細胞翻訳系の発現が報告された（非特許文献４を参照）。しかしこの方法では、リポソームを遠心操作により回収するという作業を要するため、同時に複数種のリポソーム内での翻訳をリアルタイムでモニタリングすることが困難である。また従来技術では、細胞抽出物による翻訳系を用いているため、未知の因子の影響を排除できなかった。【０００９】
さらに、リポソーム内で翻訳の制御をした例はない。
【特許文献１】特開２００５−３４１８６５号公報
【非特許文献１】Ｉｓａａｃｓ  ＦＪ  ｅｔ  ａｌ；  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２２（７）：８４１−７，２００４
【非特許文献２】Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ；，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ５７６（３）：３８７−９０，  ２００４
【非特許文献３】Ｎｏｍｕｒａ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ；  Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．，  ４（１１）：１１７２−５，  ２００３  Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｃｅｌｌ−ｓｉｚｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ
【非特許文献４】Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｎｏｉｒｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ；  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．，  １０１（５１）：１７６６９−７４，  ２００４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、所望の分子に応答し、かつ所望の遺伝子の翻訳を活性化できるｍＲＮＡを構築し、任意の入力情報を目的蛋白質の出力に変換する人工情報変換システムを構築し、細胞内または無細胞翻訳系を用いて人工細胞モデル内で翻訳制御システムを構築することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものである。すなわち、本発明は、一実施の形態によれば、リボソーム結合部位の５’側にｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位を設け、該ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位の５’側にリボソーム結合部位と相補的な塩基配列を設けたｍＲＮＡである。このｍＲＮＡは、ＯＮスイッチｍＲＮＡともいう。【００１２】
本発明は、また別の実施形態によれば、上記ｍＲＮＡと、上記ｍＲＮＡのｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位に相補的に結合するｓｍａｌｌ  ＲＮＡとを混合することによるｍＲＮＡの翻訳制御方法である。【００１３】
本発明は、また別の実施形態によれば、上記ｍＲＮＡを含んでなる、翻訳発現制御システムである。【００１４】
本発明は、また別の実施形態によれば、ｍＲＮＡであって、開始コドンの３’側にｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位を設け、該ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位の３’側に蛋白質をコードする塩基配列を設けたｍＲＮＡである。このｍＲＮＡは、ＯＦＦスイッチｍＲＮＡともいう。
別の実施形態によれば、かかるｍＲＮＡと、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位に相補的に結合するｓｍａｌｌ  ＲＮＡとを混合することによるｍＲＮＡの翻訳制御方法、及びかかるｍＲＮＡを含んでなる、翻訳発現制御システムである。【００１５】
本発明は、さらに別の実施形態によれば、上記ＯＮスイッチｍＲＮＡと、上記ＯＦＦスイッチｍＲＮＡとを含む翻訳発現制御システムであって、ＯＮスイッチｍＲＮＡのｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位と、ＯＦＦスイッチｍＲＮＡのｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位とが、同一の塩基配列である、翻訳発現制御システムである。【００１６】
本発明は、さらに別の実施形態によれば、リボソーム結合部位の５’側にｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位を設け、該ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位の５’側にリボソーム結合部位と相補的な塩基配列を設け、該リボソーム結合部位と相補的な塩基配列の５’側に、前記ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位と同一の塩基配列を設け、開始コドンの３’側に、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの少なくとも連続した６塩基と同一の配列を設け、該ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの少なくとも連続した６塩基と同一の配列の３’側に、蛋白質をコードする塩基配列を設けたｍＲＮＡである。このｍＲＮＡは、ダブルＯＮスイッチｍＲＮＡともいう。【００１７】
本発明は、また別の実施形態によれば、上記ＯＮスイッチｍＲＮＡを用いて、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの発現量を検知する工程と、目的蛋白質の翻訳を活性化する工程とを含む、人工情報変換方法である。さらに本発明はまた別の実施形態によれば、上記ＯＦＦスイッチｍＲＮＡを用いて、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの発現量を検知する工程と、目的蛋白質の翻訳を抑制する工程とを含む人工情報変換方法である。さらには、人工情報変換方法は、同一のｓｍａｌｌ  ＲＮＡに特異的に反応する上記ＯＮスイッチｍＲＮＡと、上記ＯＦＦスイッチｍＲＮＡとの組み合わせを用いて、ＯＮスイッチｍＲＮＡがコードする蛋白質の翻訳を活性化すると同時に、ＯＦＦスイッチｍＲＮＡがコードする蛋白質の翻訳を抑制する工程を含む。【００１８】
本発明は別の実施形態によれば、上記ｍＲＮＡを内包したリポソームである。【００１９】
本発明は、また別の実施形態によれば、ｍＲＮＡ又はＤＮＡと、無細胞翻訳系とを内包してなるリポソームである。【００２０】
上記リポソームは、油性液体中に、１種以上のリン脂質と、ｍＲＮＡ又はＤＮＡと、無細胞翻訳系と、水性溶液とを混合し、前記ｍＲＮＡ又はＤＮＡと前記無細胞翻訳系とが前記リン脂質小胞に内包されたＷＯエマルジョンを形成する工程と、水相に外膜脂質を溶解した油性液体を加え、油水の分離界面に前記脂質が並んだ分子膜を形成させる工程と、前記ＷＯエマルジョンを前記分離界面における油相側に加え、前記ＷＯエマルジョンを前記分離界面における水相側に移行させて前記ＷＯエマルションの外側に前記外膜脂質を付加してリポソームを形成する工程とを含む製造方法によって得ることができる。【００２１】
本発明は、また別の実施形態によれば、上記リポソームを形成する工程の後に、前記リポソームを顕微鏡で観察する工程を含むリポソーム内での蛋白質翻訳反応をリアルタイムでモニタリングする方法である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の効果として、本発明にかかるｍＲＮＡによれば、低分子ＲＮＡの存在に応答して、所望の遺伝子の翻訳制御を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】スイッチオフ状態にある第一の実施形態によるｍＲＮＡを示す図。
【図２】スイッチオン状態にある第一の実施形態によるｍＲＮＡを示す図。
【図３】図３Ａは、ｍｉＲＮＡ１６４であり、図３Ｂは、５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡの二次構造を示す模式図である。
【図４】５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰのアッセイを示すグラフである。
【図５】５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  ｍｏｎｏｍｅｒのアッセイを示すグラフである。
【図６】５’ｍｉＲ１７１  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰのアッセイを示すグラフである。
【図７】５’ｍｉＲ１７０  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰのアッセイを示すグラフである。
【図８】ＰＤＭＳチャンバーにおける、リポソームの形成を示す模式図である。
【図９】リポソームの形成を模式的に示す図である。
【図１０】ＤＮＡを内包しないリポソームを１時間静置した。図１０Ａは、リポソーム内部の蛍光を現す（蛍光なし）写真であり、図１０Ｂは、リポソームが安定に存在することを示す位相差顕微鏡写真である。
【図１１】ｅＧＦＰをコードするＤＮＡを内包し、１時間後にリポソーム内部でのｅＧＦＰの発現を確認した。図１１（Ａ）は、リポソーム内部の蛍光を現す写真であり、図１１Ｂは、リポソームが存在することを示す位相差顕微鏡写真である。
【図１２】図１２は、３種類のＦｅｅｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、０．５ｍＭ  ｅｇｇＰＣ溶液、及び２種類のＬｉｐｏｓｏｍｅ  ｉｎｓｉｄｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いてリポソームを形成させた後、３７℃で６０分間、インキュベート後の顕微鏡写真である。
【図１３】図１３は、ｅＧＦＰをコードするＤＮＡと無細胞翻訳系をリポソームに内包させた時の作動時（０ｍｉｎ）と、それから１５分毎に、１５分（１５ｍｉｎ）、３０分（３０ｍｉｎ）、４５分（４５ｍｉｎ）、６０分（６０ｍｉｎ）、および１３５分（１３５ｍｉｎ）後のリポソームの蛍光を示す顕微鏡写真である。
【図１４】図１４Ａは、ＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチの作動時（０ｍｉｎ）、図１４Ｂは、作動６０分後（６０ｍｉｎ）のリポソームの蛍光を示す顕微鏡写真である。
【図１５】図１５は、スイッチオン状態にある第三の実施形態によるｍＲＮＡを示す図である。
【図１６】図１６は、スイッチオフ状態にある第三の実施形態によるｍＲＮＡを示す図である。
【図１７】図１７Ａは、第四の実施形態によるスイッチオフ状態にあるＯＮスイッチｍＲＮＡを示し、図１７Ｂは、第四の実施形態によるスイッチオン状態にあるＯＦＦスイッチｍＲＮＡを示し、図１７Ｃは、図１７ＡのｍＲＮＡと、図１７ＢのｍＲＮＡとの両方に特異的に結合するｓｍａｌｌ  ＲＮＡを示す。
【図１８】図１８Ａは、図１７ＡのＯＮスイッチｍＲＮＡに、図１７Ｃのｓｍａｌｌ  ＲＮＡを添加した状態を示す。図１８Ｂは、図１７ＢのＯＦＦスイッチｍＲＮＡに、図１７Ｃのｓｍａｌｌ  ＲＮＡを添加した状態を示す。
【図１９】図１９は、第五の実施形態によるスイッチオフ状態にあるダブルＯＮスイッチｍＲＮＡを示す。
【図２０】図２０は、第五の実施形態によるスイッチオン状態にあるダブルＯＮスイッチｍＲＮＡを示す。
【図２１】図２１は、５’ｍｉＲ１６４応答ＥＧＦＰスイッチのアッセイを示すグラフである。
【図２２】図２２は、５’ｍｉＲ１５６応答ＥＧＦＰスイッチのアッセイを示すグラフである。
【図２３】図２３は、５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒスイッチのアッセイを示すグラフである。
【図２４】図２４は、５’ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒスイッチのアッセイを示すグラフである。
【図２５】図２５は、５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒと、５’ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰのアッセイを示すグラフである。
【図２６】図２６は、ｍｉＲ１５６、ａｎｔｉ  ｍｉＲ１５６、及びｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＦＦスイッチを示す図である。
【図２７】図２７は、ｍｉＲ１６４、ａｎｔｉ  ｍｉＲ１６４、及びｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＦＦスイッチを示す図である。
【図２８】図２８は、ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＦＦスイッチのアッセイを示すグラフである。
【図２９】図２９は、ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＦＦスイッチのアッセイを示すグラフである。
【図３０】図３０は、ｍｉＲ１５６、ａｎｔｉ  ｍｉＲ１５６、及びｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＦＦスイッチを示す図である。
【図３１】図３１は、ｍｉＲ１６４、ａｎｔｉ  ｍｉＲ１６４、及びｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＦＦスイッチを示す図である。
【図３２】図３２は、ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＦＦスイッチのアッセイを示すグラフである。
【図３３】図３３は、ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＦＦスイッチのアッセイを示すグラフである。
【図３４】図３４は、ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＦＦスイッチとｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＮスイッチのアッセイを示すグラフである。
【図３５】図３５は、５’ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＮスイッチ、及びｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＦＦスイッチに、各濃度のｍｉＲ１５６、ｍｉＲ１６４を加えたアッセイを示すグラフである。
【図３６】図３６は、５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＮスイッチ、及びｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＦＦスイッチに、各濃度のｍｉＲ１６４、ｍｉＲ１５６を加えたアッセイを示すグラフである。
【図３７】図３７は、ｍｉＲＮＡ１５９ａ、ＲＣｍｉＲＮＡ１５９ａ、及びダブルＯＮスイッチｍＲＮＡであるｍｉＲＮＡ１５９ａ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＮスイッチの二次構造を示す図である。
【図３８】図３８は、ｍｉＲＮＡ１６３、ＲＣｍｉＲＮＡ１６３、及びダブルＯＮスイッチｍＲＮＡであるｍｉＲＮＡ１６３  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＮスイッチの二次構造を示す図である。
【図３９】図３９は、ｍｉＲＮＡ１５９ａ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＮスイッチのアッセイを示すグラフである。
【図４０】図４０は、ｍｉＲＮＡ１６３  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＮスイッチのアッセイを示すグラフである。
【符号の説明】
【００２４】
１    ｍＲＮＡ
２    リボソーム結合部位
３    ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位
４    オープンリーディングフレーム
４ａ  開始コドンＡＵＧ
４ｂ  発現させる蛋白質の遺伝子をコードする塩基配列
５    リボソーム結合部位と相補的な塩基配列
６    ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ
７    リボソーム
８    ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位の一部に相補的に結合する配列
１０  ＰＤＭＳチャンバー
１１  ＥｇｇＰＣ
１２  ＥｇｇＰＣ
１３  Ｆｅｅｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ
１４  エマルジョン
１５  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｉｎｓｉｄｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ
１６  リポソーム
２０  リボソーム結合部位
３０  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡに相補的な配列
４０  Ｄｓｒｅｄをコードする塩基配列
４１  オープンリーディングフレーム
４１ａ  開始コドンＡＵＧ
４１ｂ  ＥＧＦＰをコードする塩基配列４１ｂ
５０  リボソーム結合部位に相補的な配列
６０  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下に、本発明を、実施形態を挙げて詳細に説明する。しかし、以下の説明は本発明を限定するものではない。【００２６】
本発明の第一の実施形態によるｍＲＮＡは、リボソーム結合部位の５’側にｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位を設け、該ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位の５’側にリボソーム結合部位と相補的な配列を設けたことを特徴とする。図１に示すｍＲＮＡ１は、リボソーム結合部位２と、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３と、オープンリーディングフレーム４と、リボソーム結合部位と相補的な配列５とから構成される。【００２７】
［ｍＲＮＡ］
本実施形態によるｍＲＮＡ１は、リボソーム結合部位２を有し、翻訳機能を有する任意のｍＲＮＡであってよく、オープンリーディングフレーム４の配列は特定の配列には限定されない。また、ｍＲＮＡ１の転写効率を高めるために、５’末端にステム・ループ構造（図示せず）を有するｍＲＮＡであってもよい。５’末端のステム・ループ構造の例としては、通常知られている構造が挙げられるがこれには限定されない。当業者であれば、常法にしたがって、転写効率を高めるための任意のステム・ループ構造を５’末端に導入することができる。【００２８】
オープンリーディングフレーム４の配列は、所望の蛋白質を発現することができる遺伝子を有するものであってよく、特定の配列に限定されるものではないが、開始コドンを有するものである。例えば、翻訳機能が作用しているかどうかを確認する目的では、蛍光蛋白質をコードする遺伝子を有するオープンリーディングフレーム４を備えるｍＲＮＡを用いることができる。蛍光蛋白質としては、ｅＧＦＰ、ＧＦＰｕｖ、Ｄｓｒｅｄなどが挙げられ、これらの配列は一般に知られている。【００２９】
そのほかに、オープンリーディングフレーム４の配列は、特定の医薬物質として働く蛋白質をコードするものであってもよい。具体的には、アポトーシス誘導蛋白質ＢｉｍやＢａｘ、アポトーシス促進型ＢＨ３ペプチド及びその改変体などが挙げられるが、これらには限定されない。【００３０】
［ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位］
ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３は、特定のｓｍａｌｌ  ＲＮＡに相補的な配列を有する。ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ（低分子ＲＮＡ）は、１０塩基〜８０塩基の塩基長を有し、ＲＮＡまたは蛋白質と相互作用することで、細胞機能を制御する性質を有するＲＮＡの総称である。本実施形態において、任意の配列、任意の塩基長のｓｍａｌｌ  ＲＮＡを用いることができる。ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ自体が約３７℃付近の温度で、ステム構造を形成しないことが好ましい。【００３１】
ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの一例としては、ｍｉＲＮＡが挙げられる。ｍｉＲＮＡは、マイクロＲＮＡの略称である。ｍｉＲＮＡは、蛋白質をコードしない小さなＲＮＡ分子であり、発生・分化・増殖など様々な生命現象に関わっていると考えられている。具体的なｍｉＲＮＡの配列は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、ヒト、マウスなどの生物において約数百種類が特定されており、それらの配列はｍｉＲｂａｓｅなどのデータベースにより既知である。【００３２】
より具体的には、本実施形態においては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のｍｉＲＮＡである、ｍｉＲ１６４、ｍｉＲ１７０、ｍｉＲ１７１を用いることができるが、これらには限定されない。【００３３】
本実施形態におけるｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３は、特定のｓｍａｌｌ  ＲＮＡに相補的な配列とすることができる。または、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの全ての塩基配列に対して相補的でなくとも、少なくとも１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上の塩基に対して相補的であればよい。また、この相補的な配列のうち、１〜３の変異があってもよい場合もある。これは、特には、相補的な配列を形成する部位がＧＣリッチである場合に強固な水素結合を形成することができる場合が挙げられる。【００３４】
ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３は、リボソーム結合部位２の５’側に設けられる。本実施形態において、ｍＲＮＡ１のリボソーム結合部位２の５’側とは、リボソーム結合部位２から１塩基以上１５塩基以下離れた個所をいう。好ましくは、リボソーム結合部位２から１塩基以上１０塩基以下離れた個所であり、さらに好ましくは、１塩基以上５塩基以下離れた個所である。この範囲は、目的となる基質ｓｍａｌｌ  ＲＮＡに応答した翻訳反応の活性化を達成できる範囲で決定することができる。なお、図１中では、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３とリボソーム結合部位２との間が線で記載されているが、これはｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３とリボソーム結合部位２とが必ずしも隣接している必要はなく、本実施形態において、ｓｍａｌｌＲＮＡ結合部位３とリボソーム結合部位２との間に存在してもよい塩基配列は、特定の塩基配列に限定されるものではない。【００３５】
［リボソーム結合部位と相補的な配列］
ｍＲＮＡ１におけるｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３の５’側には、リボソーム結合部位と相補的な配列５を設ける。リボソーム結合部位と相補的な配列５は、同一のｍＲＮＡ１上にあるリボソーム結合部位２と相補的に結合して、ステム構造を形成させるためのものである。したがって、リボソーム結合部位と相補的な配列５は、具体的には、５’側から、ＵＣＵＣＣＵとすることができる。なお、リボソーム結合部位は、ＡＧＧＡＧＡに限らず、ＡＧリッチな配列であることが知られているので、リボソーム結合部位に相補的な配列であれば、これに限定されない。なお、リボソーム結合部位と相補的な配列５は、さらに、リボソーム結合部位２の３’側に隣接する約１〜１０塩基および／または５’側に隣接する約１〜１０塩基に対しても相補的な配列としてもよい。【００３６】
リボソーム結合部位と相補的な配列５は、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３の５’側に隣接して設けてもよく、１〜１０塩基、好ましくは１〜５塩基を介して設けてもよい。なお、図１中では、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３とリボソーム結合部位と相補的な配列５との間が線で記載されているが、これはｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３とリボソーム結合部位と相補的な配列５とが必ずしも隣接している必要はなく、本実施形態において、smallＲＮＡ結合部位３とリボソーム結合部位と相補的な配列５との間あいだに存在してもよい塩基配列は、特定の塩基配列に限定されるものではない。【００３７】
［ＲＮＡスイッチとしての作用］
上記のような特徴を有するｍＲＮＡ１は、人工ＲＮＡスイッチとして作用することができる。すなわち、特定のｓｍａｌｌ  ＲＮＡの存在に応答して、翻訳が始まるように作用することができる。かかる作用を、図面を用いて説明する。本実施形態によるｍＲＮＡ１は、２５〜４２℃、好ましくは約３３〜４１℃、ｐＨが約６．０〜８．５、好ましくはｐＨが約６．５〜８．０のＨｅｐｅｓ緩衝液中で、特定のｓｍａｌｌ  ＲＮＡの非存在下では、図１に示す構造（スイッチオフ状態）をとっている。すなわち、リボソーム結合部位２は、その５’側にあるリボソーム結合部位と相補的な配列５と相補鎖を形成して、ステム構造を形成している。そのため、リボソームが存在しても、リボソームはリボソーム結合部位２に結合することができない。したがって、ｍＲＮＡ１による翻訳は行われない。そして、このとき、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３は、図示するように、ループ構造を形成している。【００３８】
次に、ｍＲＮＡが、２５〜４２℃、好ましくは３３〜４１℃付近、ｐＨが約６．０〜８．５、好ましくは約６．５〜８．０のＨｅｐｅｓ緩衝液中で、上記図１に示す構造をとっている状態で、ｍＲＮＡに対して０．２５〜２０倍（モル）のｓｍａｌｌ  ＲＮＡ６を添加する。このｓｍａｌｌ  ＲＮＡ６は、上記ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３に相補的な配列を有するものである。ｍｉＲＮＡ６の存在する状態を図２に示す。図２中では、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ６が、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３に相補的に結合し、この結合により、リボソーム結合部位２におけるステム構造が崩れて、リボソーム結合部位２は、リボソーム７により結合可能な状態となる。そして、リボソーム７が存在する場合には、ｍＲＮＡ１の翻訳が開始され（スイッチオン）、特定の蛋白質がつくられる。【００３９】
さらに、ｍＲＮＡの量に対して、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの添加量を変化させることで、添加量依存的な翻訳制御が可能になる。また、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡのアンチセンスを加えれば、再び翻訳をＯＦＦにすることができる。【００４０】
上記作用に鑑みれば、第一の実施形態によるｍＲＮＡを用いて、ｍＲＮＡの翻訳制御方法をも提供することができ、かかる方法は、ｍＲＮＡと、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位に相補的に結合するｓｍａｌｌ  ＲＮＡとを混合することによる。また、上記ｍＲＮＡと、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位に相補的に結合するｓｍａｌｌ  ＲＮＡとを混合することによるｍＲＮＡの翻訳制御方法を提供することもできる。さらに、上記ｍＲＮＡを含んでなる、翻訳発現制御システムとすることもできる。この場合、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡをも含むシステムとすることが好ましい。さらには、上記ｍＲＮＡを用いて、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの発現量を検知する工程と、目的蛋白質の翻訳を活性化する工程とを含む、人工情報変換方法とすることもできる。人工情報変換方法においては、第一の実施形態によるｍＲＮＡの特性により、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡが発現する系においては、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの存在量、すなわち発現量に応じて、目的蛋白質の翻訳が活性化され、蛋白質が発現される。このように、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡによる「入力」を、蛋白質による「出力」に情報変換することができる。【００４１】
第一の実施形態によるｍＲＮＡは、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの存在、及びその存在量に応答して遺伝子の翻訳を行うことができる。また、生体細胞内で、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの発現量が生体反応に応じて変化することが知られているが、本実施形態によるｍＲＮＡを用いることにより、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの発現量の変化を検出できるという利点を有する。【００４２】
次に、本発明は、第二の実施形態によれば、ｍＲＮＡ又はＤＮＡと、無細胞翻訳系とを内包したリポソームである。また、ｍＲＮＡ又はＤＮＡと、無細胞翻訳系とを内包したリポソームの製造方法であって、油性液体中に、１種以上のリン脂質と、ｍＲＮＡ及び／又はＤＮＡと、蛋白質類を含む無細胞翻訳系と、水性溶液とを混合し、前記無細胞翻訳系が前記リン脂質小胞に内包されたＷＯエマルジョンを形成する工程と、水相に外膜脂質を溶解した油性液体を加え、油水の分離界面に前記脂質が並んだ分子膜を形成させる工程と、前記ＷＯエマルジョンを前記分離界面における油相側に加え、前記ＷＯエマルジョンを前記分離界面における水相側に自発的に移行させて前記ＷＯエマルションの外側に前記外膜脂質を付加してリポソームを形成する工程とを含む。【００４３】
リポソームに内包させるｍＲＮＡ又はＤＮＡは、任意のオープンリーディングフレームをもつｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡの配列をコードするＤＮＡであってよい。したがって、上記第一実施形態によるｍＲＮＡであってもよい。リポソーム内で、任意の蛋白質を発現させるものであればよい。また、二種以上の蛋白質を発現させることが好ましい場合には、二種以上の別のＤＮＡや、ｍＲＮＡとＤＮＡとの組み合わせを用いることもできる。【００４４】
リポソームに内包させる無細胞翻訳系とは、細胞外で、上記ｍＲＮＡ又はＤＮＡを発現させることができる組成物であって、リボソーム、複数種類の蛋白質因子、アミノ酸および緩衝液などから構成される。一例として、酵素類、大腸菌リボソーム、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（２０種類）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ｂｕｆｆｅｒ類（最終濃度で、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ，ｐＨ７．６，１００ｍＭ  Ｋ−Ｇｌｕ、２ｍＭ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、１３ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．３ｍＭ  ｅａｃｈ  ２０アミノ酸、５６ＯＤ／ｍｌ  ｔＲＮＡｍｉｘ、１０ｍｇ／ｍｌ  １０−ｆｏｒｍｙｌ−５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、２ｍＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＧＴＰ、１ｍＭ  ＵＴＰ、１ｍＭ  ＣＴＰ、２０ｍＭ  ＣＰ）を挙げることができるが、これらには限定されない。無細胞翻訳系に含まれる具体的な構成要素は、Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ．  ａｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６  （２００５）  ２９９−３０４に詳細に記載されており、当業者であれば、かかる文献に基づいて無細胞翻訳系を構成することができる。特に、精製された蛋白質から構成される無細胞翻訳系が好ましい。精製された蛋白質から構成される無細胞翻訳系では、ＲＮａｓｅが少なく、ＲＮＡの分解等が少ないことや、構成要素が明確であるため、本実施形態による、人工細胞システムを構成しうるリポソームにおいて好適に用いられる。【００４５】
上記ｍＲＮＡを内包したリポソームは、引用することにより本明細書の一部をなすものとするＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１７５１７の記載およびＬａｎｇｍｕｉｒ  ２００６，  ２２，９８２４−９８２８の記載に基づいて製造することができる。【００４６】
具体的には、油性液体中に、ｅｇｇＰＣ（卵由来のホスファチジルコリン）または、ホスファチジルセリン及びその誘導体、並びにホスファチジルエタノールアミン及びその誘導体から選択される脂質と、ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡの配列をコードするＤＮＡと、ｍｉＲＮＡと、蛋白質類を含む無細胞翻訳系と、水性溶液とを混合し、ＷＯエマルジョンを形成する。次に、水相に、ｅｇｇＰＣまたは、ホスファチジルセリン及びその誘導体、並びにホスファチジルエタノールアミン及びその誘導体から選択される外膜脂質を溶解した油性液体を加え、油水の分離界面に外膜脂質が並んだ分子膜を形成させる。【００４７】
ここで、内膜リン脂質の油性液体中の濃度が、０．５ｍＭ〜０．７５ｍＭであるように配合することが好ましい。内膜リン脂質として２種以上を用いる場合は、それらの合計濃度を上記範囲とすることが好ましい。また、油性液体と水性液体との配合比率を、体積比で（水性液体／油性液体）＝１／１０００〜１／１０となるようにすることが好ましい。【００４８】
油性液体は、内膜リン脂質を安定に分散させるものであれば特に制限されることはなく、例えば、鉱物油（ミネラルオイル）を用いることができる。水性液体は特に制限されないが、上記ｍＲＮＡを含有させ、所望の反応を生じさせるために必要な特性を有する液体、例とすることができる。【００４９】
リポソーム中を適切な状態、具体的には、収縮や破裂を起こさない状態で保つための浸透圧の条件は、リポソームの外圧を、内圧よりも少し小さい状態に保つことが好ましい。【００５０】
このように、リポソーム内に、ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡの配列をコードするＤＮＡと、ｍｉＲＮＡと、蛋白質類を含む無細胞翻訳系とを内包させることで、リポソーム内で翻訳制御または人工情報変換を行うことができ、人工細胞システムを構築することが可能になる。また、同様に、リポソーム内に、ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡの配列をコードするＤＮＡと、蛋白質類を含む無細胞翻訳系とを内包させることで、リポソーム内で翻訳反応を構築することが可能になる。【００５１】
上記方法により得られた、無細胞翻訳系を含むリポソームは、上記工程を経て形成されたときに、油と水の界面にリポソームが集合する傾向がある。このため、顕微鏡上で、焦点の合った多くのリポソームが同時に検出できる。かかる点を利用して、本実施形態の変形形態によれば、リポソーム内での蛋白質翻訳反応をリアルタイムでモニタリングする方法であって、リポソームを形成する工程の後に、前記リポソームを顕微鏡で観察する工程を含む。かかるモニタリング方法によれば、リポソーム内での翻訳スイッチのオンオフをリアルタイムでモニタリングすることができるという利点がある。【００５２】
このように、本発明の第二の実施形態によれば、全てのリポソームに翻訳反応系を内包できるという利点がある。また、リポソームが油と水の界面にとどまるため、顕微鏡上で複数リポソームの焦点の定まった像を取得できる。従って、複数リポソーム内部での翻訳反応をリアルタイムでモニタリングすることも可能になる。【００５３】
人工ＲＮＡスイッチによる翻訳制御システムの構築及びそれらのリポソームへの導入法を示す。本手法は特定のＲＮＡに応答して構造変化を起こし、遺伝子の翻訳反応を制御する人工ＲＮＡスイッチシステムの構築とこの人工ＲＮＡスイッチをリポソームへと導入し、リポソーム内で翻訳反応の制御を行う技術である。以下具体的実験例を挙げる。人工ＲＮＡスイッチシステムの構築の概略は、入力基質（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡなど）が、ｍＲＮＡ上流に挿入した「基質ＲＮＡ認識ＲＮＡモチーフ」に結合し、基質とＲＮＡモチーフの結合がｍＲＮＡ翻訳開始領域の構造変化を誘導し、リボソームとｍＲＮＡの結合により、目的蛋白質（ＧＦＰなど）翻訳の制御が可能になる、というものである。【００５４】
次に、本発明は、第三の実施形態によれば、ｍＲＮＡであって、開始コドンの３’側にｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位を設けたものである。本実施形態によるｍＲＮＡは、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡに応答して、翻訳をＯＮからＯＦＦへと制御するＯＦＦスイッチ型のｍＲＮＡとして機能させることができる。【００５５】
図１５に、本実施形態に係るｍＲＮＡの模式図を示す。図１５に示すｍＲＮＡでは、開始コドンＡＵＧ（４ａ）の３’側に、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３が隣接している。ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３の３’側には、発現させる蛋白質の遺伝子をコードする塩基配列４ｂが隣接している。すなわち、このｍＲＮＡにおいて、オープンリーディングフレームは、５’側から順に、開始コドンＡＵＧ（４ａ）、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３、発現させる蛋白質の遺伝子をコードする塩基配列４ｂで構成される。【００５６】
本実施形態において、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡは、第一実施形態において説明した任意のｓｍａｌｌ  ＲＮＡであってよい。以下の説明においては、ｍｉＲＮＡをｓｍａｌｌ  ＲＮＡとして用いる場合について説明する。ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３は、ｍｉＲＮＡに相補的な配列である。目的のｍｉＲＮＡに相補的に結合する限り、相補的な配列のうち、１〜３の変異があってもよい場合もある。これは、特には、相補的な配列を形成する部位がＧＣリッチである場合に強固な水素結合を形成することができる場合が挙げられる。本実施形態において、図示したｍＲＮＡにおいては、開始コドンＡＵＧ（４ａ）の３’側に、別の塩基を介することがなく、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３が隣接している。しかし、開始コドンＡＵＧ（４ａ）とｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３との間には、別の塩基が存在することもできる。具体的には、３塩基、６塩基、９塩基程度の比較的短い、３の倍数の塩基が存在することもできる。３の倍数の塩基とするのは、翻訳の読み枠をずらさないためである。【００５７】
発現させる蛋白質の遺伝子をコードする塩基配列４ｂは、任意の蛋白質の遺伝子をコードする塩基配列であってよい。例えば、マーカーとして機能する蛍光蛋白質、具体的には、ＤｓＲｅｄやＥＧＦＰが挙げられるが、これらには限定されない。図示したｍＲＮＡにおいては、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３の３’側に、別の塩基を介することがなく、蛋白質の遺伝子をコードする塩基配列４ｂが隣接している。しかし、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３の塩基数が３の倍数ではない場合には、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３と蛋白質の遺伝子をコードする塩基配列４ｂとの間に、１つまたは２つの塩基を挿入する。これは、蛋白質の読み枠がずれないようにするためである。また、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３の塩基数が３の倍数であっても、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３と、蛋白質の遺伝子をコードする塩基配列４ｂとの間には、別の塩基が存在することもできる。具体的には、３塩基、６塩基、９塩基程度の比較的短い、３の倍数の塩基が存在することもできる。【００５８】
図１５に示すｍＲＮＡにおいては、開始コドンＡＵＧの５’側に、リボソーム結合部位を明記していないが、リボソーム結合部位は存在していてもよく、真核細胞生物のｍＲＮＡの場合には存在しなくてもよい。【００５９】
本発明の第三実施形態による上記構成を有するｍＲＮＡは、特定のｓｍａｌｌ  ＲＮＡの存在下で、ＯＦＦスイッチ型のｍＲＮＡとして機能する。このようなｍＲＮＡの機能について以下に説明する。
特定のｓｍａｌｌ  ＲＮＡ、すなわち、第三実施形態によるｍＲＮＡに特異的に結合するｍｉＲＮＡ６の非存在下において、２５〜４２℃、ｐＨ６〜８．５の条件下で、上記ｍＲＮＡは、翻訳されて、Ｎ末端に、ｍｉＲＮＡがコードするアミノ酸が付着している所望の蛋白質を生ずる。ここへ、ｍｉＲＮＡ６を添加すると、ｍｉＲＮＡ６は、その特異的に結合する配列（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３）を持つように設計された上記ｍＲＮＡと、相補二重鎖を形成して、特異的に結合する。このときの分子の模式図を図１６に示す。その結果、リボソームによるｍＲＮＡの翻訳が阻害され、蛋白質の発現が抑制されることになる。【００６０】
このように、本実施形態によるｍＲＮＡと、これに特異的に結合するｓｍａｌｌ  ＲＮＡとを用いることにより、蛋白質の翻訳のＯＮからＯＦＦへの制御が可能になる。よって、第三実施形態の変形形態として、上記構成を有するｍＲＮＡと、これに特異的に結合するｓｍａｌｌ  ＲＮＡとを含む翻訳発現制御システム、または、ｍＲＮＡと、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位に相補的に結合するｓｍａｌｌ  ＲＮＡとを混合することによるｍＲＮＡの翻訳制御方法が挙げられる。
この実施形態の応用形態としては、Ｐｕｒｅシステム内での翻訳制御を達成することができ、人工シグナル細胞のツールとして有用である。
さらに、人工情報変換方法においては、第三の実施形態によるｍＲＮＡの特性により、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡが発現する系においては、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの存在量、すなわち発現量に応じて、目的蛋白質の翻訳が抑制され、蛋白質が発現されなくなる。このように、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡによる「入力」を、蛋白質による「出力」に情報変換することができる。【００６１】
次に、本発明の、第四の実施形態について説明する。本発明の第四の実施形態は、人工翻訳システムに関する。具体的には、第一の実施形態に記載のＯＮスイッチｍＲＮＡと、第三実施形態に記載のＯＦＦスイッチｍＲＮＡと、これらの両方に特異的に結合するｓｍａｌｌ  ＲＮＡとを含む、人工翻訳システムに関する。【００６２】
本実施形態に係る人工翻訳システムを構成する、ＯＮスイッチｍＲＮＡの模式図を図１７（Ａ）に、ＯＦＦスイッチｍＲＮＡの模式図を図１７（Ｂ）に、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの模式図を図１７（Ｃ）に示す。本実施形態においては、ＯＮスイッチｍＲＮＡが発現する蛋白質がＤｓｒｅｄ、ＯＦＦスイッチｍＲＮＡが発現する蛋白質がＥＧＦＰである場合について例示するが、発現する蛋白質の組み合わせは、例示であって、本発明を限定するものではない。【００６３】
本実施形態のＯＮスイッチｍＲＮＡは、図示するように、リボソーム結合部位２０の３’側に隣接してＤｓｒｅｄをコードする塩基配列４０を備え、リボソーム結合部位の５’側に、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡに相補的な配列３０を備える。さらに、その５’側には、リボソーム結合部位に相補的な配列５０を備える。そして、このＯＮスイッチｍＲＮＡはｓｍａｌｌ  ＲＮＡ６０の非存在下では、図１７（Ａ）に示すように、ステム−ループ構造を形成している。そしてこのとき、リボソーム結合部位２０が遮蔽されている。このため、この状態のＯＮスイッチｍＲＮＡは、翻訳可能な条件下においても、翻訳が進行せず、Ｄｓｒｅｄが産生されない。【００６４】
いっぽう、本実施形態のＯＦＦスイッチｍＲＮＡは、図１７（Ｂ）示すように、開始コドンＡＵＧ（４１ａ）の３’側に隣接して、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ６０に相補的な配列３０を備える。ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ６０に相補的な配列３０の３’側には、ＥＧＦＰをコードする塩基配列４１ｂを備える。また、開始コドンＡＵＧ（４１ａ）の５’側には、リボソーム結合部位が存在する場合もあり（図示せず）、存在しない場合もある。このようなＯＦＦスイッチｍＲＮＡは、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ６０の非存在下、翻訳可能な条件下において、翻訳が進行し、蛋白質ＥＧＦＰが産生される。【００６５】
図１７（Ｃ）示すｓｍａｌｌ  ＲＮＡ６０は、ＯＮスイッチｍＲＮＡ、ＯＦＦスイッチｍＲＮＡの双方において、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ６０に相補的な配列３０に、特異的に結合して相補鎖を形成することが可能な配列からなる。【００６６】
次に、上記ＯＮスイッチｍＲＮＡ、ＯＦＦスイッチｍＲＮＡ、及びｓｍａｌｌ  ＲＮＡ６０が共存する場合のそれぞれの分子の状態を図１８に模式的に示す。図１８（Ａ）に示すＯＮスイッチｍＲＮＡは、図１７（Ａ）でループを形成していた配列３０に、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ６０が特異的に結合して相補鎖を形成している。その結果、ステム−ループ構造が崩壊して、リボソーム結合部位２０には、リボソームが結合可能な状態になっている。いっぽう、図１８（Ｂ）に示すＯＦＦスイッチｍＲＮＡでは、開始コドンの直下にある配列３０に、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ６０が特異的に結合して相補鎖を形成している。その結果、図１８（Ｂ）に示すＯＦＦスイッチｍＲＮＡでは、翻訳が進行できない状態になっている。【００６７】
図１８（Ａ）に示すこのような状態においては、ＯＮスイッチｍＲＮＡには、リボソームが結合可能であり、翻訳が可能な状態である。よって、リボソームが存在して、そのほかの条件が整えば、オープンリーディングフレーム４０中の遺伝子が発現され、Ｄｓｒｅｄが産生される。いっぽう、ＯＦＦスイッチｍＲＮＡでは、開始コドンの直下で、二本鎖が形成されているため、ｍＲＮＡの翻訳が不可能である。その結果、配列４１ｂがコードするＥＧＦＰの生産はされないことになる。【００６８】
このように、第四実施の形態によれば、同一のｓｍａｌｌ  ＲＮＡの存在に応答して、別の挙動をする二つのｍＲＮＡをスイッチとして用いることができる。
この実施形態の応用形態としては、Ｐｕｒｅシステム内での翻訳制御を達成することができ、人工シグナル細胞のツールとして有用である。
さらに、人工情報変換方法においては、第四の実施形態によるＯＮスイッチｍＲＮＡ及びＯＦＦスイッチｍＲＮＡの特性により、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡが発現する系においては、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの存在量、すなわち発現量に応じて、ＯＮスイッチｍＲＮＡがコードする目的蛋白質の翻訳が活性化され、蛋白質が発現される。同時に、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの存在量、すなわち発現量に応じて、ＯＦＦスイッチｍＲＮＡがコードする別の目的蛋白質の翻訳が抑制され、蛋白質が発現されなくなる。このように、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡによる「入力」を、二つの異なる蛋白質による別々の「出力」に情報変換することができる。【００６９】
次に、本発明の、第五の実施形態について説明する。第五の実施形態は、ｍＲＮＡであって、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの添加に対し、ＯＮスイッチとして機能するｍＲＮＡである。本実施形態によるｍＲＮＡを、ダブルＯＮスイッチｍＲＮＡという。【００７０】
図１９に、本実施形態に係るｍＲＮＡの二次構造を模式的に示す。本実施形態に係るｍＲＮＡは、５’側から順に、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３、リボソーム結合部位に相補的な配列５、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３、リボソーム結合部位２、オープンリーディングフレーム４を備える。オープンリーディングフレーム４は、５’側から順に、開始コドンＡＵＧ４ａ、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３の一部に相補的に結合する配列８、発現させる蛋白質の遺伝子をコードする塩基配列４ｂを備える。
ここで、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３は、特定のｓｍａｌｌ  ＲＮＡと逆相補鎖を形成する塩基配列とすることができる。目的のｓｍａｌｌ  ＲＮＡに相補的に結合する限り、相補的な配列のうち、１〜３の変異があってもよい場合もある。また、二つのｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３は、同一の配列であることが好ましい。【００７１】
ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３の一部に相補的に結合する配列８は、特定のｓｍａｌｌＲＮＡの少なくとも連続した６塩基と同一の配列を有する。連続した塩基数は、好ましくは、６塩基以上であって、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの塩基数以下の３の倍数である。具体的には、６塩基、９塩基、１２塩基、１５塩基、１８塩基程度とすることが好ましいが、これらには限定されない。このような構成とする理由は、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡと相補鎖を形成するとともに、発現させる蛋白質の読み枠がずれないようにするためである。なお、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３の一部に相補的に結合する配列８が、特定のｓｍａｌｌＲＮＡと同一の配列と、それ以外の配列とから構成される場合にも、配列８の塩基数は３の倍数である。【００７２】
図１９に示すｍＲＮＡは、特定のｓｍａｌｌ  ＲＮＡの非存在下で、図示するように、ステム−ループ構造を形成している。このとき、ステムの部分では、リボソーム結合部位に相補的な配列５とリボソーム結合部位２とが形成する第一の相補鎖部分と、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３と、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３の一部に相補的に結合する配列８とが形成する第二の相補鎖部分とが存在する。そして、リボソーム結合部位２は、相補鎖の形成により、遮蔽されている。そのため、リボソームが存在しても、リボソームはリボソーム結合部位２に結合することができない。よって、この状態のダブルＯＮスイッチｍＲＮＡは、翻訳可能な条件下においても、翻訳が進行せず、配列４ｂがコードする蛋白質が産生されることがない。
第五実施形態にかかるｍＲＮＡにおいて、第一の相補鎖部分と、第二の相補鎖部分とが存在する利点は、二つの相補鎖の作用により、特定のｓｍａｌｌ  ＲＮＡの非存在下で、安定なＯＦＦ状態を形成でき、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの存在下で、効率よくＯＮ状態を形成できる点である。
次に、図２０に、上記ｍＲＮＡと、特定のｓｍａｌｌ  ＲＮＡ６とを共存させた場合の、ｍＲＮＡの二次構造を模式的に示す。ここでは、特定のｓｍａｌｌ  ＲＮＡ６が、ｍＲＮＡ上の二つのｓｍａｌｌ  ＲＮＡ結合部位３の両方に特異的に結合して、相補鎖を形成している。その結果、ステム−ループ構造が崩壊して、リボソーム結合部位２の遮蔽が外れている。よって、リボソームが存在して、そのほかの条件が整えば、翻訳が進行し、塩基配列４ｂがコードする蛋白質が生産されることとなる。【００７３】
このように、第五実施の形態によれば、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡの結合部位の配列により、ｍＲＮＡ構造が安定なＯＦＦ状態とＯＮ状態を形成できない場合、第一の相補鎖部分と、第二の相補鎖部分の協調的作用により、効率のよいＯＦＦからＯＮへのスイッチを作成できるという利点が存在する。
【実施例１】
【００７４】
［Ｏｒｉｇｉｎａｌ  ＥＧＦＰ及びＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチの作製］
Ｏｒｉｇｉｎａｌ  ＥＧＦＰ並びにＲＮＡ応答人工ＲＮＡ（ＥＧＦＰ）は、ｐＥＧＦＰ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）より、２回または３回のＰＣＲを行い作製した。（ＥＧＦＰ  配列番号１）またここに出てくるプライマーはすべて北海道システムサイエンスにより合成されたものである。【００７５】
［Ｏｒｉｇｉｎａｌ  ＥＧＦＰの作成］
ｐＥＧＦＰをテンプレート、プライマーとしてＥＧＦＰ  ｆｗｄ（配列番号２）、ＥＧＦＰ  ｒｅｖ（配列番号３）を用いて１ｓｔ  ＰＣＲを行った。５０μＬ反応液には、ｐＥＧＦＰ  ２５ｎｇ  各１０μＭ  ＤＮＡプライマー  １．５μＬ、２  ｍＭ  ｄＮＴＰｓを５μＬ、１０×ＫＯＤ−ＰＬＵＳ−ｂｕｆｆｅｒ  ｖｅｒ．２  ５μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ２μＬ  ＫＯＤ−ＰＬＵＳ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １μＬが混合してあり、初めに９４℃  ２分インキュベートした後、９４℃  １５秒、５０℃  ３０秒、６８℃  １分を２０サイクルで行った。以下すべて同じＰＣＲ条件で行っているのでテンプレートとプライマーだけ今後は示す。【００７６】
反応後、フェノール処理、エタノール沈殿を行い、非変性色素（３０％グリセリン、０．０７５％キシレンシアノール、０．０７５％ブロモフェノールブルー、６９．８５％超純水）に溶解し、低融点アガロースＳＥＡ  ＰＬＡＱＵＥ  ＧＴＧ  ＡＧＡＲＯＳＥ（ＦＭＣ）で分離、目的のバンドを切り出した。切り出したアガロース断片にＴＥ  ２００μＬ加え６５℃  ３０ｍｉｎインキュベートした後フェノール処理を３回、ジエチルエーテル処理、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡを精製した。（ＥＧＦＰ  １ｓｔ  ＰＣＲ、配列番号４）。次にＥＧＦＰ  １ｓｔ  ＰＣＲをテンプレート、プライマーとしてＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５）ＥＧＦＰ  ｒｅｖを用いて２ｎｄ  ＰＣＲを上記と同じの方法で行った。反応後、上記と同じ方法で分離、精製を行い、超純水に溶解してＤＵ６４０  ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲ（ＢＥＣＫＭＡＮ製）を用いて濃度測定を行った。これがＯｒｉｇｉｎａｌ  ＥＧＦＰ  ｔｅｍｐｌａｔｅ（配列番号６）である。Ｏｒｉｇｉｎａｌ  ＥＧＦＰ  ｔｅｍｐｌａｔｅを鋳型としてＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ製）を用いて転写反応を行った。ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔを用いた転写反応は以下の通りである。超純水に溶解した鋳型ＤＮＡ  １μｇ、Ｔ７  １０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ、Ｔ７  ＡＴＰ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （７５ｍＭ）  ２μＬ（ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰに関しても同様）、Ｔ７  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  ２μＬを混合し，超純水で全２０μＬにした反応液を３７℃で４時間から一晩反応させた。反応後は、ＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ  １μＬ加え、３７℃で１５分インキュベートし、鋳型ＤＮＡを分解させた。転写反応によって得られたＯｒｉｇｉｎａｌ  ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ（配列番号７）をＲｎｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。Ｒｎｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ  Ｋｉｔを用いた精製は以下の通りである。【００７７】
転写反応液に、超純水８０μＬを加え１００μＬとし、さらにＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ  ３５０μＬを添加して十分に混和した。２５０μＬのエタノールを添加し、ピペッティングにより完全に混和した。２ｍＬコレクションチューブにセットしたＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎに上記サンプルをアプライし微量高速冷却遠心機ＭＸ−１００（ＴＯＭＹ製）を用いて、１０，０００ｒｐｍ、１５秒間遠心し、フロースルーは捨てた。スピンカラムを新しい２ｍｌコレクションチューブ上に移し、スピンカラム上に５００μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＲＰＥをピペットで添加した。１０，０００ｒｐｍで１５秒間遠心しフロースルーは捨てた。ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎに５００μＬの８０％エタノールを添加、１０，０００ｒｐｍで２分間遠心しフロースルーは捨てた。ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎを新しい２ｍｌコレクションチューブに移し、スピンカラムのキャップを開け、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心、フロースルーは捨てた。スピンカラムを新しい１．５ｍｌコレクションチューブに移し、シリカゲルメンブレンの真ん中に２０μＬの超純水を加え、１４，０００  ｒｐｍで５分間遠心して溶出した。この溶出液をＤＵ６４０  ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲを用いて濃度測定を行った。【００７８】
［ＲＮＡ応答人工ＲＮＡ（５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ）の作成］
ＥＧＦＰ  １ｓｔ  ＰＣＲをテンプレート、プライマーとして、５’ＵＴＲ−ｍｉＲＮＡ１６４  ｆｗｄ（配列番号８）とＥＧＦＰ  ｒｅｖを用いて２ｎｄ  ＰＣＲを上記と同じの方法で行った。反応後、上記と同じ方法で分離、精製を行ったものが５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ２ｎｄ  ＰＣＲ（配列番号９）である。次に５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ２ｎｄ  ＰＣＲをテンプレート、プライマーとしてＴ７−ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｕｎｉ（配列番号１０）とＥＧＦＰ  ｒｅｖを用いて３ｒｄ  ＰＣＲを上記と同じの方法で行った。反応後、上記と同じ方法で分離、精製を行い、超純水に溶解してＤＵ６４０  ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯ  ＭＥＴＥＲを用いて濃度測定を行った。これが５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ｔｅｍｐｌａｔｅ（配列番号１１）である。５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ｔｅｍｐｌａｔｅを鋳型として、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）を用いて上記と同じ方法で転写反応を行った。転写反応によって得られた５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ  （配列番号１２）を上記と同じ方法でＲｎｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔを用いて精製、濃度測定を行った。図３Ｂは、５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡの二次構造を示す模式図であり、図３Ａは、ｍｉＲＮＡ１６４を示す図である。【００７９】
［ＲＮＡ応答人工ＲＮＡ（５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ）の作成］
ＲＮＡ応答人工ＲＮＡ（Ｄｓｒｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ）は、ｐＤｓｒｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）より、３回ＰＣＲを行い作製した（Ｄｓｒｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ  配列番号１３）。ｐＤｓｒｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒをテンプレート、プライマーとして、Ｄｓｒｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ  ｆｗｄ（配列番号１４）と、Ｄｓｒｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ  ｒｅｖ（配列番号１５）を用いて１ｓｔ  ＰＣＲを上記と同じの方法で行った。反応後、上記と同じ方法で分離、精製を行ったものがＤｓｒｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ  １ｓｔ  ＰＣＲ（配列番号１６）である。次にＤｓｒｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ  １ｓｔ  ＰＣＲをテンプレート、プライマーとして、５’ＵＴＲ−ｍｉＲＮＡ１６４  ｆｗｄと、Ｄｓｒｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ  ｒｅｖを用いて２ｎｄ  ＰＣＲを上記と同じの方法で行った。反応後、上記と同じ方法で分離、精製を行ったものが５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ  ２ｎｄ  ＰＣＲ（配列番号１７）である。さらに、５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ  ２ｎｄ  ＰＣＲをテンプレート、プライマーとして、Ｔ７−ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｕｎｉとＤｓｒｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ  ｒｅｖを用いて３ｒｄ  ＰＣＲを上記と同じの方法で行った。反応後、上記と同じ方法で分離、精製を行い、超純水に溶解してＤＵ６４０  ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯ  ＭＥＴＥＲを用いて濃度測定を行った。これが５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  （配列番号１８）である。５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ  ｔｅｍｐｌａｔｅを鋳型としてＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）を用いて上記と同じ方法で転写反応を行った。転写反応によって得られた５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ  ｍＲＮＡ  （配列番号１９）を上記と同じ方法でＲｎｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔを用いて精製、濃度測定を行った。【００８０】
［ＲＮＡ応答人工ＲＮＡ（５’ｍｉＲ１７０  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ）の作成］
ＥＧＦＰ  １ｓｔ  ＰＣＲをテンプレート、プライマーとして、５’ＵＴＲ−ｍｉＲＮＡ１７０  ｆｗｄ（配列番号２０）とＥＧＦＰ  ｒｅｖを用いて２ｎｄ  ＰＣＲを上記と同じの方法で行った。反応後、上記と同じ方法で分離、精製を行ったものが５’ｍｉＲ１７０  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ２ｎｄ  ＰＣＲ（配列番号２１）である。次に、５’ｍｉＲ１７０  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ２ｎｄ  ＰＣＲをテンプレート、プライマーとして  Ｔ７−ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｕｎｉとＥＧＦＰ  ｒｅｖを用いて３ｒｄ  ＰＣＲを上記と同じの方法で行った。反応後、上記と同じ方法で分離、精製を行い、超純水に溶解してＤＵ６４０  ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲを用いて濃度測定を行った。これが５’ｍｉＲ１７０  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ｔｅｍｐｌａｔｅ（配列番号２２）である。５’ｍｉＲ１７０  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ｔｅｍｐｌａｔｅを鋳型としてＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）を用いて上記と同じ方法で転写反応を行った。転写反応によって得られた５’ｍｉＲ１７０  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ  （配列番号２３）を上記と同じ方法でＲｎｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔを用いて精製、濃度測定を行った。【００８１】
［ＲＮＡ応答人工ＲＮＡ（５’ｍｉＲ１７１  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ）の作成］
ＥＧＦＰ  １ｓｔ  ＰＣＲをテンプレート、プライマーとして、５’ＵＴＲ−ｍｉＲＮＡ１７１  ｆｗｄ（配列番号２４）とＥＧＦＰ  ｒｅｖを用いて２ｎｄ  ＰＣＲを上記と同じの方法で行った。反応後、上記と同じ方法で分離、精製を行ったものが５’ｍｉＲ１７１  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ２ｎｄ  ＰＣＲ（配列番号２５）である。次に、５’ｍｉＲ１７１  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ２ｎｄ  ＰＣＲをテンプレート、プライマーとして、Ｔ７−ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｕｎｉとＥＧＦＰ  ｒｅｖを用いて３ｒｄ  ＰＣＲを上記と同じの方法で行った。反応後、上記と同じ方法で分離、精製を行い、超純水に溶解してＤＵ６４０  ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲを用いて濃度測定を行った。これが、５’ｍｉＲ１７１  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  （配列番号２６）である。５’ｍｉＲ１７１  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ｔｅｍｐｌａｔｅを鋳型として、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）を用いて上記と同じ方法で転写反応を行った。転写反応によって得られた５’ｍｉＲ１７１  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ（配列番号２７）を上記と同じ方法でＲｎｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔを用いて精製、濃度測定を行った。
【実施例２】
【００８２】
［ＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチの無細胞発現系を用いた翻訳制御アッセイ。］
ＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチの翻訳制御を確認するために無細胞発現システムである、Ｐｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍを用いた。Ｐｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ、はＳｏｌｕｔｉｏｎＡとＳｏｌｕｔｉｏｎＢで構成される。今後単にＳｏｌｕｔｉｏｎＡ，Ｂと表記する。ＳｏｌｕｔｉｏｎＡの組成は１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ-ＫＯＨ (ｐＨ７．６)、２００ｍＭ  Ｌ-Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ Ｍｏｎｏｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓａｌｔ、４ｍＭ ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、２６ｍＭ Ｍｇ(ＯＡｃ)2、２ｍＭ ＤＴＴ、１１２ＯＤ/ｍｌ ｔＲＮＡ ｍｉｘ、２０μｇ/ｍｌ １０-ｆｏｒｍｙｌ-５,６,７,８-ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ、４ｍＭ ＡＴＰ、４ｍＭ ＧＴＰ、２ｍＭ ＣＴＰ、２ｍＭ ＵＴＰ、４０ｍＭ ｃｒｅａｔｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．６ｍＭ ２０ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓであり、ＳｏｌｕｔｉｏｎＢは主に転写翻訳に必要な蛋白質である、Ｔ７ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＩＦ１、ＩＦ２、ＩＦ３、ＥＦ-Ｇ、ＥＦ-Ｔｕ、ＥＦ-Ｔｓ、ＲＦ１、ＲＦ２、ＲＦ３、ＲＲＦなどで構成されている。以下に各ＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチのアッセイ法と結果を示す。【００８３】
［５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰのアッセイ］
５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ２０μＭ  １μＬ，超純水  １μＬ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ  ５μＬ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ  ２μＬを混合したものを５本用意し、合成したｍｉＲＮＡ１６４（北海道システムサイエンス  配列番号２９）４０μＭ，２０μＭ，１０μＭ，５μＭ，０μＭを、１μＬずつ、それぞれ別個の溶液に加え、全量を１０μＬとし、３７℃で７５分間で反応させた。反応後、超純水で２００μＬにし、ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００（ＴＥＣＡＮ製）を用いて、励起波長４８５ｎｍ、吸収波長５３５ｎｍで測定した（図４）。【００８４】
ネガティブコントロールとして、５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ２０μＭ  １μＬ，超純水  １μＬ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ  ５μＬ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ  ２μＬを混合したものを５本用意し、合成したｍｉＲＮＡ１６３（北海道システムサイエンス  配列番号  ２８）４０μＭ，２０μＭ，１０μＭ，５μＭ，０μＭを、１μＬずつ、それぞれ別個の溶液に加え、全量を１０μＬとし、３７℃で７５分間で反応させた。反応後、超純水で２００  μＬにし、ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いて、励起波長４８５ｎｍ、吸収波長５３５ｎｍで測定した（図４）。このアッセイによりこのＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチ（５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ）が、ｍｉＲＮＡ１６４に特異的に反応し、翻訳制御が起きていることが確認された。【００８５】
［５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒのアッセイ］
５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ  １０μＭ  １μＬ，超純水  １μＬ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ  ５μＬ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ  ２μＬを混合したものを４本用意し、ｍｉＲＮＡ１６４  ４０μＭ，２０μＭ，１０μＭ，０μＭを１μＬを、それぞれ別個の溶液に加え、全量を１０μＬとし、３７℃で７５分間で反応させた。反応後、超純水で２００μＬにし、ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００（ＴＥＣＡＮ製）を用いて、励起波長５３５ｎｍ、吸収波長５９５ｎｍで測定した（図５）。このアッセイにより、これらのＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチ（５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ，５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ）はオープンリーディングフレームの配列に依存しないことが分かった。【００８６】
［５’ｍｉＲ１７１  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰのアッセイ］
５’ｍｉＲ１７１  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ２μＭ  １μＬ，超純水  １μＬ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ  ５μＬ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ  ２μＬを混合したものを３本用意し、合成したｍｉＲＮＡ１７１（北海道システムサイエンス  配列番号３１）４０μＭ，  １０μＭ，０μＭを、１μＬずつ、それぞれ別個の溶液に加え、全量を１０μＬとし、３７℃で７５分間反応させた。反応後、超純水で２００μＬにし、ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００（ＴＥＣＡＮ製）を用いて、励起波長４８５ｎｍ、吸収波長５３５ｎｍで測定した（図６）。コントロールとして、５’ｍｉＲ１７１  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ２μＭ  １μＬ，超純水  １μＬ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ  ５μＬ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ  ２μＬを混合したものを６本用意し、合成したｍｉＲＮＡ１７０（北海道システムサイエンス  配列番号３０）又はｍｉＲＮＡ１６３又はｍｉＲＮＡ１６４  ４０μＭ，１０μＭを、１μＬずつ、それぞれ別個の溶液に加え、全量を１０μＬとし、３７℃  ７５分間で反応させた。反応後、超純水で２００μＬにし、ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いて、励起波長４８５ｎｍ、吸収波長５３５ｎｍで測定した。（図６）このアッセイによりこのＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチ（５’ｍｉＲ１７１  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ）がｍｉＲＮＡ１７１に特異的に反応し、２塩基しか違わないｍｉＲＮＡ１７０とも翻訳効率に差が出ることが確認された。【００８７】
［５’ｍｉＲ１７０  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰのアッセイ］
５’ｍｉＲ１７０  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ２μＭ  １μＬ，超純水  １μＬ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ  ５μＬ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ  ２μＬを混合したものを３本用意し、ｍｉＲＮＡ１７０  １０μＭ，５μＭ，０μＭを、１μＬずつ、それぞれ別個の溶液に加え、全量を１０μＬとし、３７℃  ７５分間で反応させた。反応後、超純水で２００μＬにし、ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００（ＴＥＣＡＮ製）を用いて、励起波長４８５ｎｍ、吸収波長５３５ｎｍで測定した（図７）。コントロールとして５’ｍｉＲ１７０  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ２μＭ  １μＬ，超純水  １μＬ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ  ５μＬ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ  ２μＬを混合したものを３本用意し、合成したｍｉＲＮＡ１７１  １０μＭ，５μＭ，０μＭを、１μＬずつ、それぞれ別個の溶液に加え、全量を１０μＬとし、３７℃  ７５分間で反応させた。反応後、超純水で２００μＬにし、ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００（ＴＥＣＡＮ製）を用いて、励起波長４８５ｎｍ、吸収波長５３５ｎｍで測定した（図７）。このアッセイにより、このＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチ（５’ｍｉＲ１７０  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ）がｍｉＲＮＡ１７０に特異的に反応し、２塩基しか違わないｍｉＲＮＡ１７１とも翻訳効率に差が出ることが確認された。
【実施例３】
【００８８】
［遺伝子と無細胞発現系を内包するリポソームの調整及び発現の確認］
［遺伝子と無細胞発現系を内包するリポソームの調整法］
Ｌ−α−Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ（Ｅｇｇ，Ｃｈｉｃｋｅｎ）（Ａｖａｎｔｉ製）を、メタノール：クロロホルム＝１：２溶液に溶解し、１０ｍＭ  ｅｇｇＰＣ有機溶液とした。ダーラム管（マルエム製）に１０ｍＭ  ｅｇｇＰＣ溶液  ２５〜３７．５μＬを入れて窒素ガス（太陽日酸製）を吹き付けてメタノール：クロロホルム溶液を蒸発させ、脂質フィルムを形成した。脂質フィルムを形成したダーラム管をアルミホイルに包み、デシケーターに入れてダイアフラム型ドライ真空ポンプＤＡ−４０Ｓ（ＵＬＶＡＣ製）を用いて１０分間真空に引いた。その後ミネラルオイル（ナカライ製）５００μＬを加え、パラフィルムで封をして、超音波洗浄器  ＵＳ−１ＫＳ（ＳＮＤ製）を用いて５０℃  ６０分ソニケーションを行った。ソニケーション後ただちにＶｏｒｔｅｘで２０秒間振動させた。このようにして調整したものが０．５〜０．７５ｍＭ  ｅｇｇＰＣ溶液である。顕微鏡で観察する為のチャンバーとしてＰＤＭＳを用いた。図８に、チャンバーを模式的に示す。図８中、カバーガラスにセットしたＰＤＭＳチャンバー１０の穴にＦｅｅｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ１３（詳細は後述する）を１０μＬ入れた。その上に上記のように調整したｅｇｇＰＣ溶液１２を１０μＬ静かにアプライし、１時間静置した。ｅｇｇＰＣ溶液１１  ５０μＬに、２．５μＬのＬｉｐｏｓｏｍｅ  ｉｎｓｉｄｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ１５（詳細は後述する）を加え、ピペッティングによりＷ／Ｏエマルジョンを形成させ、エマルジョン１４を上記の静置したＦｅｅｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ−ｅｇｇＰＣ溶液の上にアプライし、リポソーム１６を形成させた（図９）。３７℃に設定したＴｈｅｒｍｏ  Ｐｌａｔｅ  （ＴＯＫＡＩ  ＨＩＴ）をセットした共焦点レーザースキャン顕微鏡  ＬＳＭ５１０（ＺＥＩＳＳ）上にＰＤＭＳチャンバーを移し観察した。【００８９】
［Ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎとＬｉｐｏｓｏｍｅ  ｉｎｓｉｄｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎの条件検討］
Ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎと、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｉｎｓｉｄｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎとの浸透圧の差によってリポソームの形成能とリポソーム内での翻訳効率がどのように変化するかをＦｅｅｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ３種類、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｉｎｓｉｄｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ２種類の組み合わせ、計６種類で比較、検討した。Ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎの３種類として
（Ａ）ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ  ９．６μＬ＋Ｐｕｒｅ  ｍｉｘ（ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ  ５μＬ＋ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ  ２μＬ＋超純水３μＬを混ぜたもの）  ０．４μＬ
（Ｂ）ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ  ５μＬ＋超純水５μＬ
（Ｃ）ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ  ５μＬ＋超純水４．６μＬ＋Ｐｕｒｅ  ｍｉｘ０．４μＬを作成した。【００９０】
各Ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎのＢｕｆｆｅｒ濃度は次のようになる。
（Ａ）９８ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ-ＫＯＨ  (ｐＨ７．６)、１９６ｍＭ  Ｌ-Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  Ｍｏｎｏｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｓａｌｔ、３．９２ｍＭ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、２５．４８ｍＭ  Ｍｇ(ＯＡｃ)２、１．９６ｍＭ  ＤＴＴ
（Ｂ）５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ-ＫＯＨ  (ｐＨ７．６)、１００ｍＭ  Ｌ-Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  Ｍｏｎｏｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｓａｌｔ、２ｍＭ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、１３ｍＭ  Ｍｇ(ＯＡｃ)２、１ｍＭ  ＤＴＴ
（Ｃ）５２ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ-ＫＯＨ  (ｐＨ７．６)、１０４ｍＭ  Ｌ-Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  Ｍｏｎｏｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｓａｌｔ、２．０８ｍＭ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、１３．５２ｍＭ  Ｍｇ(ＯＡｃ)２、１．０４ｍＭ  ＤＴＴ【００９１】
Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｉｎｓｉｄｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎの２種類には
１．Ｐｕｒｅ（Ｏｒｉｇｉｎａｌ  ＥＧＦＰ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ  ２μｇ／μＬ  １μＬ＋超純水  ２μＬ＋  ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ  ５μＬ＋ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ  ２μＬ）  １００％
２．Ｐｕｒｅ（Ｏｒｉｇｉｎａｌ  ＥＧＦＰ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ  ２μｇ／μＬ  １μＬ＋超純水  ２μＬ＋  ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ  ５μＬ＋ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ  ２μＬ）    ５０％＋ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ  ２倍希釈  ５０％  （超純水  ５μＬ＋  ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ  ５μＬ）  ５０％
を作成した。【００９２】
Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｉｎｓｉｄｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎのＢｕｆｆｅｒ濃度は次のようになる。
１．  ５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ  （ｐＨ７．６）、１００ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  Ｍｏｎｏｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｓａｌｔ、２ｍＭ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、１３ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、１ｍＭ  ＤＴＴ
２．  ５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ  （ｐＨ７．６）、１００ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  Ｍｏｎｏｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｓａｌｔ、２ｍＭ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、１３ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、１ｍＭ  ＤＴＴ【００９３】
まず、リポソーム形成能の比較を行うため、あらかじめＬｉｐｏｓｏｍｅ  ｉｎｓｉｄｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ２種類をリポソーム形成前に３７℃でインキュベートしてＥＧＦＰを発現させ、その後でリポソームを調整した。Ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎは上記の３種類、０．５ｍＭ  ｅｇｇＰＣ溶液で行った。この結果Ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎの浸透圧が高い（Ａ）より（Ｂ）、（Ｃ）ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ  ５μＬ＋超純水４．６μＬ＋Ｐｕｒｅ  ｍｉｘ０．４μＬを作成の方が、数が多く大きいリポソームを形成できることが確認できた。【００９４】
次にＦｅｅｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａ）、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｉｎｓｉｄｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ２の条件で、ｅＧＦＰをＣｏｄｅするＤＮＡを内包し、１ｈ後にリポソーム内部でのｅＧＦＰの発現を確認した。図１１（Ａ）は、リポソーム内部の蛍光を現す写真であり、図１１（Ｂ）は、リポソーム１６が存在することを示す明視野顕微鏡像である。ＤＮＡを含まないリポソームも１ｈ後に安定に存在した（図１０（Ｂ））が、蛍光は発しなかった（図１０（Ａ））。なお、図１０（Ｂ）、図１１（Ｂ）においては、リポソームの輪郭を明確にするために、輪郭線を書き足している。【００９５】
次にリポソームの中での翻訳効率の差を確認するために、上記のＦｅｅｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ３種類、０．５ｍＭ  ｅｇｇＰＣ溶液、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｉｎｓｉｄｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ２種類を用いてリポソームを形成させた後、３７℃でインキュベートした。６０分後の顕微鏡写真を、図１２に示す。この結果Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｉｎｓｉｄｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ２種類ではＰｕｒｅ  １００％の方が、蛍光強度が大きく、Ｆｅｅｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ３種類では（Ａ）が他の（Ｂ）、（Ｃ）より蛍光強度が大きかった。ただし数や大きさは上記の結果と同じく（Ａ）より（Ｂ）、（Ｃ）の方が、数が多く大きいリポソームを形成していた。【００９６】
これらの結果を考慮して、Ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎには、（Ｃ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ  ５μＬ＋超純水４．６μＬ＋Ｐｕｒｅ  ｍｉｘ０．４μＬを用い、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｉｎｓｉｄｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎには１．Ｐｕｒｅ  １００％を用いることに決定した。【００９７】
［リポソーム内でのＯｒｉｇｉｎａｌ  ＥＧＦＰ  ｔｅｍｐｌａｔｅの発現をＴｉｍｅ  ｌａｐｓｅで確認］
ＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチの効率や持続時間などを分析するのに必要な遺伝子発現のＴｉｍｅ  ｌａｐｓｅがリポソーム内で可能かを確認するために、まずＯｒｉｇｉｎａｌ  ＥＧＦＰで確認した。Ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎには、（Ｃ）ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ  ５μＬ＋超純水４．６μＬ＋Ｐｕｒｅ  ｍｉｘ０．４μＬを用い、ｅｇｇＰＣ溶液の濃度は０．７５ｍＭ、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｉｎｓｉｄｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎには、１．Ｐｕｒｅ  １００％を用いた。結果を、図１３に示す。０ｍｉｎでは観察されなかったリポソーム内の蛍光が、１５分毎に明るく、明確に観察されるようになり、１３５ｍｉｎでは、はっきり見えることがわかる。この結果から、リポソーム内での発現のＴｉｍｅ  ｌａｐｓｅが可能であることが確認できた。
【実施例４】
【００９８】
［ＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチのリポソーム内での翻訳制御の確認］
［５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰのリポソーム内での翻訳制御のＴｉｍｅ  ｌａｐｓｅ］
ＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチである５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰの翻訳制御がリポソーム内で可能であることをＴｉｍｅ  ｌａｐｓｅをとり確認した。Ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎには、（Ｃ）ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ  ５μＬ＋超純水４．６μＬ＋Ｐｕｒｅ  ｍｉｘ０．４μＬを用い、ｅｇｇＰＣ溶液の濃度は０．７５ｍＭ、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｉｎｓｉｄｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎには（５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ３０μＭ  １μＬ＋ｍｉＲＮＡ１６４  ６０μＭ  １μＬ＋超純水  １μＬ＋  ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ  ５μＬ＋ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ  ２μＬ）を用いた。結果を、図１４に示す。図中、０ｍｉｎでは、リポソーム内で蛍光が観察されないのに対し、６０ｍｉｎでは、明らかな蛍光が観察できた。これは、ｍｉＲＮＡの存在により、遺伝子の翻訳がＯＮになり、蛍光蛋白質が作られたことを意味する。この結果よりリポソーム内でのＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチの翻訳制御が可能であることが確認できた。
【実施例５】
【００９９】
ＯＮスイッチ型のＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチを作製し、その翻訳制御アッセイを行った。【０１００】
［ＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチの作製］
５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ、５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒは、実施例１と同様の方法で作製した。これらの各々に相補的に結合するｍｉＲＮＡであるｍｉＲ１６４は、北海道システムサイエンス社から購入した。【０１０１】
５’ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ（配列番号３２）は、実施例１と同様の方法で作製した。
具体的には、人工ＲＮＡスイッチの鋳型ＤＮＡはすべてグラディエントマスターサイクラー（エッペンドルフ社）を用いて、２回または３回のＰＣＲを行い作製した。ＰＣＲはすべてＫＯＤ−ＰＬＵＳ−（ＴＯＹＯＢＯ）を用い次のプロトコルで行った。ＰＣＲ反応液５０μＬには、鋳型ＤＮＡ  ２５ｎｇ  各１０μＭ  ＤＮＡプライマー  １．５μＬ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓを５μＬ、１０×ＫＯＤ−ＰＬＵＳ−ｂｕｆｆｅｒ  ｖｅｒ．２  ５μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ２μＬ  ＫＯＤ−ＰＬＵＳ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １μＬが混合してあり、初めに９４℃  ２分インキュベートした後、９４℃  １５秒、５０℃  ３０秒、６８℃  １分を２０サイクルで行った。反応後、フェノール処理、エタノール沈殿を行い、非変性色素（３０％グリセリン、０．０７５％キシレンシアノール、０．０７５％ブロモフェノールブルー、６９．８５％超純水）に溶解し、低融点アガロースＳＥＡ  ＰＬＡＱＵＥ  ＧＴＧ  ＡＧＡＲＯＳＥ  （ＦＭＣ）で分離、目的のバンドを切り出した。切り出したアガロース断片にＴＥ  ２００μＬ加え、６５℃  ３０分インキュベートした後フェノール処理を３回、ジエチルエーテル処理、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡを精製した。超純水に溶解してＤＵ６４０  ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲ  （ＢＥＣＫＭＡＮ）を用いて濃度測定を行った。
これらの方法で作製した鋳型ＤＮＡを用いてＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて転写反応を行った。ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔを用いた転写反応は以下の通りである。超純水に溶解した鋳型ＤＮＡ  １μｇ、Ｔ７  １０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ、Ｔ７  ＡＴＰ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（７５ｍＭ）  ２μＬ（ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰに関しても同様）、Ｔ７  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  ２μＬを混合し，超純水で全２０μＬにした反応液を３７℃で４時間から一晩反応させた。反応後は、ＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ  １μＬ加え、３７℃で１５分インキュベートし、鋳型ＤＮＡを分解させた。転写反応によって得られた各ｍＲＮＡをＲｎｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。【０１０２】
各ＲＮＡを作製するのに用いた鋳型、プライマーの名前を示す。ｍｉＲＮＡ  ＥＧＦＰ  ＯＮスイッチ製造スキームにおいて、１ｓｔ  ＰＣＲでは、Ｏｒｉｇｉｎａｌ  ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ（配列番号７）を  鋳型ＤＮＡとして用いた。２ｎｄ  ＰＣＲでは、鋳型ＤＮＡとして、１ｓｔ  ＰＣＲ後のＥＧＦＰ  ＤＮＡを用い、プライマー  ５’ＵＴＲ−ｍｉＲＮＡ１５６  ｆｗｄ（5’GGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTATCTCCTGTGCTCACTCTCTTCTGTCAAGAAGGAGATATACCAATG-3’  配列番号３３）、ＥＧＦＰ  ｒｅｖ（配列番号３）を用いた。３ｒｄ  ＰＣＲでは、鋳型ＤＮＡとして、２ｎｄ  ＰＣＲ後のｍｉＲＮＡ１５６応答ＥＧＦＰ  ＤＮＡを用い、プライマーとしては、Ｔ７−ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｕｎｉ（配列番号１０）、ＥＧＦＰ  ｒｅｖ（配列番号３）を用いた。【０１０３】
５’ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ（配列番号３４）も、上記と同様の方法で作製した。
このｍｉＲＮＡ応答Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＮスイッチ製造スキームにおいては、１ｓｔ  ＰＣＲでは、鋳型ＤＮＡとして、ｐＤｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  （ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（配列番号１３）を用い、プライマーとして、Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ｆｗｄ（配列番号１４）、Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ｒｅｖ（配列番号１５）を用いた。２ｎｄ  ＰＣＲ  では、鋳型ＤＮＡとして、１ｓｔ  ＰＣＲ後のＤｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＤＮＡを用い、プライマーとして、５’ＵＴＲ−ｍｉＲＮＡ１５６  ｆｗｄ（配列番号３４）、Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ｒｅｖ（配列番号１５）を用いた。３ｒｄ  ＰＣＲでは、鋳型ＤＮＡとして、２ｎｄ  ＰＣＲ後のｍｉＲＮＡ１５６応答Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＤＮＡを用い、プライマーとしては、Ｔ７−ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｕｎｉ（配列番号１０）、Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ｒｅｖ（配列番号１５）を用いた。
また、５’ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ、５’ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒの各々に相補的に結合するｍｉＲＮＡであるｍｉＲ１５６（5’-UGACAGAAGAGAGUGAGCAC-3’  配列番号３５）は、北海道システムサイエンス社から購入した。【０１０４】
［ＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチの無細胞発現系を用いた翻訳制御アッセイ］
上記で作製した各ＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチ  ２０００ｎＭに対し、各ＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチに相補的に結合する各ｍｉＲＮＡを加え、ＰＵＲＥ  ＳＹＳＴＥＭでＥＧＦＰ、Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒタンパク質の発現を行い、その蛍光量を各フィルターにより確認した。ｍｉＲＮＡを加えていないときの各タンパク質の蛍光量を１とし、各ｍｉＲＮＡの濃度変化と蛍光量の変化の比をプロットした。【０１０５】
図２１は、５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰスイッチに対し各濃度のｍｉＲ１６４、ｍｉＲ１５６、ｍｉＲ１６３を加え、蛍光量の変化の比をプロットしたグラフであり、図２２は、５’ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰスイッチに対し各濃度のｍｉＲ１５６、ｍｉＲ１６４を加え、蛍光量の変化の比をプロットしたグラフである。図２３は、５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒスイッチに対し各濃度のｍｉＲ１６４、ｍｉＲ１５６を加え、蛍光量の変化の比をプロットしたグラフであり、図２４は、５’ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒスイッチに対し各濃度のｍｉＲ１５６、ｍｉＲ１６４を加え、蛍光量の変化の比をプロットしたグラフである。これらの結果から、各々のスイッチは、配列、長さの類似したｍｉＲＮＡの中から、目的のｍｉＲＮＡのみを特異的に認識し、翻訳を活性化できことがわかる。さらに、翻訳する遺伝子の種類は特定の配列に依存せず、任意の遺伝子の翻訳活性化を制御できることがわかった。
【実施例６】
【０１０６】
［異なる二つのＯＮスイッチＲＮＡ］
異なるｍｉＲＮＡに応答して遺伝子の発現がＯＮになるＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチを二つ作製し、それを組み合わせることにより最も単純な人工翻訳システムを構築した。
ＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチとしては、上記実施例５で作製した、５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒと、５’ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰを用いた。各ＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチに相補的に結合するｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ１６４（配列番号２９）、ｍｉＲ１５６（配列番号３９）を用いた。【０１０７】
二つのＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチ各２０００  ｎＭの混合溶液に対し、各ｍｉＲＮＡを４０００  ｎＭ加えた。次に、ＰＵＲＥ  ＳＹＳＴＥＭでＥＧＦＰ、Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒタンパク質の発現を行い、その蛍光量を各フィルターにより確認した。ｍｉＲＮＡを加えていないときの各タンパク質の蛍光量を１とし、各ｍｉＲＮＡを加えたときの蛍光量の変化の比をプロットした。結果を、図２５に示す。グラフから、ｍｉＲＮＡ１５６を加えればＥＧＦＰの蛍光である緑色が、ｍｉＲＮＡ１６４を加えればＤｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒの蛍光である赤色が見え、選択的に緑色や赤色に光らせることができており、人工翻訳システムの構築に成功していることが分かった。
【実施例７】
【０１０８】
［ＯＦＦスイッチＥＧＦＰ］
［設計］
ｍｉＲＮＡに応答してＥＧＦＰの発現がＯＦＦになるＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチを作製した。図２６、２７に設計したＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチ、これに特異的に結合するｍｉＲＮＡ、および当該ｍｉＲＮＡの逆相補鎖を示す。また、各ＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチの下方には、ｍｉＲＮＡの逆相補鎖を、開始コドンの３’側であって、ＥＧＦＰ遺伝子の５’側に挿入して発現させたときに、ＥＧＦＰのＮ末端に付加するアミノ酸を示す。図２６に示すＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチ、は、ｍｉＲＮＡ１５６（配列番号３５）の非存在下ではＥＧＦＰを発現し、ｍｉＲＮＡ１５６に応答して、ＥＧＦＰの発現が抑制されることを意図するものである。このｍＲＮＡを、ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＦＦスイッチ（配列番号３６）とする。ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＦＦスイッチには、ｍｉＲＮＡ１５６の逆相補鎖（5’-GUGCUCACUCUCUUCUGUCA-3’  配列番号３７）の配列が含まれている。
図２７に示すＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチは、ｍｉＲＮＡ１６４（配列番号２９）の非存在下ではＥＧＦＰを発現し、ｍｉＲＮＡ１６４に応答して、ＥＧＦＰの発現が抑制されることを意図するものである。このｍＲＮＡを、ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＦＦスイッチ（配列番号３８）とする。ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＦＦスイッチには、ｍｉＲＮＡ１６４の逆相補鎖（5’-UGCACGUGCCCUGCUUCUCCA-3’  配列番号３９）の配列が含まれている。【０１０９】
［製造］
人工ＲＮＡスイッチの鋳型ＤＮＡはすべてグラディエントマスターサイクラー（エッペンドルフ社）を用いて、２回または３回のＰＣＲを行い作製した。ＰＣＲはすべてＫＯＤ−ＰＬＵＳ−（ＴＯＹＯＢＯ）を用い次のプロトコルで行った。ＰＣＲ反応液５０μＬには、鋳型ＤＮＡ  ２５ｎｇ  各１０μＭ  ＤＮＡプライマー  １．５μＬ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓを５μＬ、１０×ＫＯＤ−ＰＬＵＳ−ｂｕｆｆｅｒ  ｖｅｒ．２  ５μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ２μＬ  ＫＯＤ−ＰＬＵＳ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １μＬが混合してあり、初めに９４℃  ２分インキュベートした後、９４℃  １５秒、５０℃  ３０秒、６８℃  １分を２０サイクルで行った。反応後、フェノール処理、エタノール沈殿を行い、非変性色素（３０％グリセリン、０．０７５％キシレンシアノール、０．０７５％ブロモフェノールブルー、６９．８５％超純水）に溶解し、低融点アガロースＳＥＡ  ＰＬＡＱＵＥ  ＧＴＧ  ＡＧＡＲＯＳＥ（ＦＭＣ）で分離、目的のバンドを切り出した。切り出したアガロース断片にＴＥ  ２００μＬ加え、６５℃で３０分インキュベートした後フェノール処理を３回、ジエチルエーテル処理、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡを精製した。超純水に溶解してＤＵ６４０  ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲ（ＢＥＣＫＭＡＮ）を用いて濃度測定を行った。
これらの方法で作製した鋳型ＤＮＡを用いてＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて転写反応を行った。ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔを用いた転写反応は以下の通りである。超純水に溶解した鋳型ＤＮＡ  １μｇ、Ｔ７  １０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ、Ｔ７  ＡＴＰ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（７５ｍＭ）  ２μＬ（ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰに関しても同様）、Ｔ７  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  ２μＬを混合し，超純水で全２０μＬにした反応液を３７℃で４時間から一晩反応させた。反応後は、ＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ  １μＬ加え、３７℃で１５分インキュベートし、鋳型ＤＮＡを分解させた。転写反応によって得られた各ｍＲＮＡをＲｎｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
上記ｍｉＲＮＡ応答ＥＧＦＰ  ＯＦＦ  スイッチの作製において、１ｓｔ  ＰＣＲでは、鋳型ＤＮＡとして、ｐＥＧＦＰ  （ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（配列番号１）を用い、プライマーとしては、ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＯＦＦ  ｆｗｄ（5’AAGGAGATATACCAATGGTGCTCACTCTCTTCTGTCAGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3  配列番号４０）または、ｍｉＲ１６４ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＯＦＦ  ｆｗｄ（5’AAGGAGATATACCAATGTGCACGTGCCCTGCTTCTCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’  配列番号４１）、及びＥＧＦＰ  ｒｅｖ（配列番号３）を用いた。２ｎｄ  ＰＣＲでは、鋳型ＤＮＡとして、１ｓｔ  ＰＣＲ後のＥＧＦＰ  ＤＮＡを用い、プライマーとして、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５）、ＥＧＦＰ  ｒｅｖ（配列番号３）を用いた。ｍｉＲＮＡおよび各プライマーは、北海道システムサイエンス社から購入した。【０１１０】
［評価］
ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＦＦスイッチ、ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＦＦスイッチに対し、各濃度のｍｉＲＮＡ１５６、ｍｉＲＮＡ  １６４を加えた。これらについて、ＰＵＲＥ  ＳＹＳＴＥＭでＥＧＦＰタンパク質の発現を行い、その蛍光量を確認した。ｍｉＲＮＡを加えていないときの蛍光量を１とし、各ｍｉＲＮＡの濃度変化と蛍光比率の変化をプロットした。結果を図に示す。【０１１１】
図２８は、ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＦＦスイッチ  ２００ｎＭに対し、各濃度のｍｉＲＮＡ１５６、ｍｉＲＮＡ１６４を加え、蛍光量の変化の比をプロットしたグラフであり、図２９は、ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＦＦスイッチ  １００ｎＭに対し、各濃度のｍｉＲＮＡ１５６、ｍｉＲＮＡ１６４を加え、蛍光量の変化の比をプロットしたグラフである。どちらも特異的に翻訳の抑制が起きていることがわかる。また、この結果から、開始コドンの直下にｍｉＲＮＡの逆相補鎖を挿入した場合でも、ＥＧＦＰのＮ末端に７つのアミノ酸が付加した蛋白質が発現しても、ＥＧＦＰの発現効率が低下することがないことを発見した。これは、ＥＧＦＰ  ＯＦＦスイッチの設計が、予想以上に成功したことを示す大きな成果である。【０１１２】
［ＯＦＦスイッチＤｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ］
［設計］
ｍｉＲＮＡに応答してＤｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒの発現がＯＦＦになるＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチを作製した。図３０、３１に設計したＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチ、これに特異的に結合するｍｉＲＮＡ、および当該ｍｉＲＮＡの逆相補鎖を示す。また、各ＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチの下方には、ｍｉＲＮＡの逆相補鎖を、開始コドンの３’側であって、Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ遺伝子の５’側に挿入して発現させたときに、Ｄｓｒｅｄ  ＭｏｎｏｍｅｒのＮ末端に付加するアミノ酸を示す。図３０に示すＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチは、ｍｉＲＮＡ１５６の非存在下ではＤｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒを発現し、ｍｉＲＮＡ１５６に応答して、Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒの発現が抑制されることを意図するものである。これを、ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＦＦスイッチＲＮＡ（配列番号４２）という。図３１に示すＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチは、ｍｉＲＮＡ１６４の非存在下ではＤｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒを発現し、ｍｉＲＮＡ１６４に応答して、Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒの発現が抑制されることを意図するものである。これを、ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＦＦスイッチＲＮＡ（配列番号４３）という。【０１１３】
［製造］
ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＦＦスイッチ及びｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＦＦスイッチは、上記ＯＦＦスイッチＥＧＦＰと同様にして製造した。
１ｓｔ  ＰＣＲにおいては、鋳型ＤＮＡとして、ｐＤｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（配列番号１３）を用い、プライマーとして、ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＯＦＦ  ｆｗｄ（配列番号４０）または、ｍｉＲ１６４ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＯＦＦ  ｆｗｄ（配列番号４１）、Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ｒｅｖ（配列番号１６）を用いた。２ｎｄ  ＰＣＲにおいては、鋳型ＤＮＡとして、１ｓｔ  ＰＣＲ後のＤｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＤＮＡを用い、プライマーとしては、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５）、Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ｒｅｖ（配列番号１６）を用いた。【０１１４】
［評価］
ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＦＦスイッチ２００ｎＭ、ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＦＦスイッチ２００ｎＭに対し、各濃度のｍｉＲＮＡ１５６、ｍｉＲＮＡ  １６４を加えた。これらについて、ＰＵＲＥ  ＳＹＳＴＥＭでＥＧＦＰタンパク質の発現を行い、その蛍光量を確認した。ｍｉＲＮＡを加えていないときの蛍光量を１とし、各ｍｉＲＮＡの濃度変化と蛍光比率の変化をプロットした。結果を図に示す。【０１１５】
図３２は、ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＦＦスイッチ２００ｎＭに対し、各濃度のｍｉＲＮＡ１５６、ｍｉＲＮＡ１６４を加え、蛍光量の変化の比をプロットしたグラフである。図３３は、ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＦＦスイッチ２００ｎＭに対し、各濃度のｍｉＲＮＡ１５６、ｍｉＲＮＡ１６４を加え、蛍光量の変化の比をプロットしたグラフである。どちらも特異的に翻訳の抑制が起きていることがわかる。また、この場合も、ＥＧＦＰと同様、開始コドンの直下に挿入したｍｉＲＮＡの逆相補鎖が、Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒの発現効率に与える影響は少なく、効率のよいＯＦＦスイッチの設計に成功した。
【実施例８】
【０１１６】
［同一のｓｍａｌｌ  ＲＮＡに応答する異なるスイッチによる人工翻訳システム］
［ＧｒｅｅｎからＲｅｄ］
同一のｓｍａｌｌ  ＲＮＡに応答する異なるスイッチによる人工翻訳システムの評価を行った。ｍｉＲ１６４に応答してＥＧＦＰの発現がＯＮからＯＦＦになる、ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＦＦスイッチ（図２７）は実施例７に従って作成した。ｍｉＲ１６４に応答してＤｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒの発現がＯＦＦからＯＮになるｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＮスイッチ（配列番号１９）は、実施例１に従って作製した。【０１１７】
ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＦＦスイッチ  １００ｎＭとｍｉＲ１６４応答Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＮスイッチ  ２０００ｎＭの混合溶液に各濃度のｍｉＲ１５６、ｍｉＲ１６４を加え、ＰＵＲＥ  ＳＹＳＴＥＭでＥＧＦＰ、Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒタンパク質の発現を行い、その蛍光量を各フィルターにより確認した。ｍｉＲＮＡを加えていないときの各タンパク質の蛍光量を１とし、各ｍｉＲＮＡの濃度変化と蛍光量の変化の比をプロットした。結果を図３４に示す。図３４のグラフ中、左側の目盛は、ｍｉＲ１５６ＥＧＦＰ、ｍｉＲ１５６ＤｓＲｅｄ、ｍｉＲ１６４ＤｓＲｅｄに関し、右の目盛は、ｍｉＲ１６４ＥＧＦＰに関する。なお、ｍｉＲ１５６ＥＧＦＰとは、ｍｉＲ１５６を加えたときのＥＧＦＰの蛍光比率を表し、ｍｉＲ１５６ＤｓＲｅｄとは、ｍｉＲ１５６を加えたときのＤｓＲｅｄの蛍光比率を表し、ｍｉＲ１６４ＥＧＦＰとはｍｉＲ１６４を加えたときのＥＧＦＰの蛍光比率を表し、ｍｉＲ１６４ＤｓＲｅｄとはｍｉＲ１６４を加えたときのＤｓＲｅｄの蛍光比率を表す。ｍｉＲ１６４特異的に緑色から赤色への変化が確認でき、人工翻訳システムの構築に成功していることが分かる。また、ｍｉＲＮＡ１５６で蛍光変化しないことがコントロールとなっている。【０１１８】
［ＲｅｄからＧｒｅｅｎ］
同一のｓｍａｌｌ  ＲＮＡに応答する異なるスイッチによる、別の人工翻訳システムの評価を行った。
ｍｉＲ１５６に応答してＥＧＦＰの発現がＯＦＦからＯＮになる、５’ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＮスイッチは、実施例５に従って作製した。いっぽう、ｍｉＲ１５６に応答してＤｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒの発現がＯＮからＯＦＦになる、ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＦＦスイッチ（図３０）は、実施例７に従って作製した。【０１１９】
ＰＵＲＥ  ＳＹＳＴＥＭで、５’ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＮスイッチ  ２０００ｎＭ、ｍｉＲ１５６  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＦＦスイッチ５００ｎＭの混合溶液に、各濃度のｍｉＲ１５６、あるいはｍｉＲ１６４を加えて、ＥＧＦＰ、Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒタンパク質の発現を行い、その蛍光量を各フィルターにより確認した。ｍｉＲＮＡを加えていないときの各タンパク質の蛍光量を１とし、各ｍｉＲＮＡの濃度変化と蛍光量の変化の比をプロットした。結果を、図３５に示す。図３５のグラフ中、左側の目盛は、ｍｉＲ１５６ＥＧＦＰ、ｍｉＲ１６４ＥＧＦＰ、及びｍｉＲ１６４Ｄｓｒｅｄに関し、右側の目盛は、ｍｉＲ１５６Ｄｓｒｅｄに関する。ｍｉＲ１５６特異的に赤色から緑色への変化が確認でき、人工翻訳システムの構築に成功していることが分かる。また、ｍｉＲＮＡ１６４で蛍光変化しないことがコントロールとなっている。【０１２０】
ｍｉＲ１６４に応答してＥＧＦＰの発現がＯＦＦからＯＮになる、５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＮスイッチは、実施例１に従って作製した。いっぽう、ｍｉＲ１６４に応答してＤｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒの発現がＯＮからＯＦＦになる、ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＦＦスイッチ（図３１）は、実施例７に従って作製した。【０１２１】
ＰＵＲＥ  ＳＹＳＴＥＭで、５’ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＮスイッチ  ２０００ｎＭ、ｍｉＲ１６４  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ＯＦＦスイッチ５００ｎＭの混合溶液に、各濃度のｍｉＲ１５６、あるいはｍｉＲ１６４を加え、ＥＧＦＰ、Ｄｓｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒタンパク質の発現を行い、その蛍光量を各フィルターにより確認した。ｍｉＲＮＡを加えていないときの各タンパク質の蛍光量を１とし、各ｍｉＲＮＡの濃度変化と蛍光量の変化の比をプロットした。結果を、図３６に示す。図３６のグラフ中、左側の目盛は、ｍｉＲ１５６  ＥＧＦＰ、ｍｉＲ１６４  ＥＧＦＰ、ｍｉＲ１５６  Ｄｓｒｅｄに関し、右側の目盛は、ｍｉＲ１６４  Ｄｓｒｅｄに関する。ｍｉＲ１６４特異的に赤色から緑色への変化が確認でき、人工翻訳システムの構築に成功していることが分かる。ｍｉＲＮＡ１５６で蛍光変化しないことがコントロールとなっている。
【実施例９】
【０１２２】
［ダブルＯＮスイッチ］
［ＲＮＡ応答人工ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ１５９ａ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＮスイッチ）の作成］
実施例１と同様の方法で、ＲＮＡ応答人工ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ１５９ａ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＮスイッチ）を作成した。図３７に、ｍｉＲＮＡ１５９ａ（5’-UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA-3’  配列番号４４）と、その相補鎖（5’-UAGAGCUCCCUUCAAUCCAAA-3’  配列番号４５）、およびｍｉＲＮＡ１５９ａに特異的に反応するダブルＯＮスイッチｍＲＮＡ（配列番号４６）の二次構造を示す。【０１２３】
［ＲＮＡ応答人工ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ１６３  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＮスイッチ）の作成］
実施例１と同様の方法で、ＲＮＡ応答人工ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ１６３  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＮスイッチ）を作成した。図３８にｍｉＲＮＡ１６３（配列番号２８）と、その相補鎖（5’-AUCGAAGUUCCAAGUCCUCUUCAA-3’  配列番号４７）、およびｍｉＲＮＡ１６３に特異的に反応するダブルＯＮスイッチｍＲＮＡ（配列番号４８）の二次構造を示す。【０１２４】
［ＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチの無細胞発現系を用いた翻訳制御アッセイ。］
上記二種のＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチの翻訳制御を確認するために無細胞発現システムである、Ｐｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍを用いた。Ｐｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍに関しては、実施例２で説明したとおりである。【０１２５】
［ｍｉＲＮＡ１５９ａ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＮスイッチのアッセイ］
ｍｉＲＮＡ１５９ａ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ２０μＭ  １μＬ，超純水  １μＬ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ  ５μＬ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ  ２μＬを混合したものを５本用意し、合成したｍｉＲＮＡ１５９ａ（配列番号４４）４０μＭ，２０μＭ，１０μＭ，５μＭ，０μＭを、１μＬずつ、それぞれ別個の溶液に加え、全量を１０μＬとし、３７℃で７５分間で反応させた。反応後、超純水で２００μＬにし、ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００（ＴＥＣＡＮ製）を用いて、励起波長４８５ｎｍ、吸収波長５３５ｎｍで測定した（図３９）。ネガティブコントロールとして、ｍｉＲＮＡ１５９ａ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ２０μＭ  １μＬ，超純水  １μＬ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ  ５μＬ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ  ２μＬを混合したものを５本用意し、合成したｍｉＲＮＡ１６３（北海道システムサイエンス  配列番号２８）４０μＭ，２０μＭ，１０μＭ，５μＭ，０μＭを、１μＬずつ、それぞれ別個の溶液に加え、全量を１０μＬとし、３７℃で７５分間で反応させた。反応後、超純水で２００μＬにし、ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いて、励起波長４８５ｎｍ、吸収波長５３５ｎｍで測定した（図３９）。このアッセイによりこのＲＮＡ応答人工ＲＮＡスイッチ（ｍｉＲＮＡ１５９ａ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ）が、ｍｉＲＮＡ１５９ａに特異的に反応し、ＯＦＦからＯＮへの翻訳制御が起きていることが確認された。【０１２６】
［ｍｉＲＮＡ１６３  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＮスイッチのアッセイ］
上記ｍｉＲＮＡ１５９ａ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰと同様にして、ｍｉＲＮＡ１６３  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＮスイッチ（配列番号４８）のアッセイを行った。ネガティブコントロールとしては、ｍｉＲＮＡ１６３  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＮスイッチに、ｍｉＲＮＡ１５９ａを添加したものを用いた。なお、ｍｉＲＮＡ１６３ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰスイッチ濃度は１μＭとした。測定結果を図４０に示す。このアッセイにより、ｍｉＲＮＡ１６３  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＥＧＦＰ  ＯＮスイッチが、ｍｉＲＮＡ１６３に特異的に反応し、ＯＦＦからＯＮへの翻訳制御が起きていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明の活用例として、任意のＲＮＡの発現に応答して、下流のシグナル蛋白質（蛍光、発光蛋白質など）の発現を制御できるバイオセンサー、人工遺伝子回路として機能できる。この人工ＲＮＡを細胞内に導入することで、細胞を破壊することなく特定のＲＮＡ（ｍｉＲＮＡなど）を発現する細胞を検出するシステムや細胞運命を制御する技術へと展開できる。
また人工ＲＮＡをリポソームに無細胞翻訳系と共に内包することにより、リポソーム内で遺伝子ネットワークの構築が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【配列表】
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