(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレステロール値を低下させることを希望または必要とする個体におけるコレステロール値を低下させるための組成物であって、ルナシンに富んだ種子抽出物および大豆粉を含み、ルナシンに富んだ種子抽出物と大豆粉の重量比が、ルナシンに富んだ種子抽出物７０％対大豆粉３０％である、組成物。
【請求項２】
前記ルナシンに富んだ種子抽出物が、大豆から得られる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記個体がヒトである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物であって、該組成物が経口摂取により投与されることで特徴づけられる、組成物。
【請求項５】
組成物がカプセル剤、錠剤、散剤、半固形製剤、液体、ゲル、懸濁液またはエアゾールスプレーの形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物がキモトリプシン阻害剤もさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物であって、該組成物が毎日０．０５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇにて前記個体に投与されることで特徴づけられる、組成物。
【請求項８】
前記個体が、アテローム硬化症、動脈硬化症、心筋梗塞、心臓発作、糖尿病、冠動脈性心疾患、狭心症または不安定狭心症のリスクがある、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
心血管疾患に罹患するまたは前記疾患を発症するリスクがある個体において心血管疾患を治療または予防するための組成物であって、該組成物はルナシンに富んだ種子抽出物および大豆粉を含み、ルナシンに富んだ種子抽出物と大豆粉の重量比が、ルナシンに富んだ種子抽出物７０％対大豆粉３０％である、組成物。
【請求項１０】
前記ルナシンに富んだ種子抽出物が、大豆、小麦または大麦から得られる、請求項９に
記載の組成物。
【請求項１１】
前記個体がヒトである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項９に記載の組成物であって、該組成物が経口摂取により投与されることで特徴づけられる、組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、カプセル剤、錠剤、散剤、半固形製剤、液体、ゲル、懸濁液またはエアゾールスプレーの形態である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物がキモトリプシン阻害剤もさらに含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項９に記載の組成物であって、該組成物が毎日０．０５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇにて前記個体に投与されることで特徴づけられる、組成物。
【請求項１６】
前記個体が、アテローム硬化症、動脈硬化症、心筋梗塞、心臓発作、糖尿病、冠動脈性心疾患、狭心症または不安定狭心症のリスクがある、請求項９に記載の組成物。
【請求項１７】
個体の皮膚を治療するための組成物であって、該組成物はルナシンに富んだ種子抽出物および大豆粉を含み、ルナシンに富んだ種子抽出物と大豆粉の重量比が、ルナシンに富んだ種子抽出物７０％対大豆粉３０％である、組成物。
【請求項１８】
前記大豆粉がルナシン保護大豆粉を含む、請求項１、９および１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
個体のコレステロール値を低下させるまたは低減するための組成物であって、該組成物はルナシンに富んだ種子抽出物および大豆粉を含み、ルナシンに富んだ種子抽出物と大豆粉の重量比が、ルナシンに富んだ種子抽出物７０％対大豆粉３０％であり、該組成物が経口的に投与されることで特徴づけられる、組成物。
【請求項２０】
前記ルナシンに富んだ種子抽出物が、大豆、小麦または大麦から得られる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記個体がヒトである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組成物が、カプセル剤、錠剤、散剤、半固形製剤、液体、ゲル、懸濁液またはエアゾールスプレーの形態である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物がキモトリプシン阻害剤もさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２４】
前記個体が、アテローム硬化症、動脈硬化症、心筋梗塞、心臓発作、糖尿病、冠動脈性心疾患、狭心症または不安定狭心症のリスクがある、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１９に記載の組成物であって、該組成物が毎日０．０５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの量で投与されることで特徴づけられる、組成物。
【請求項２６】
コレステロール値を低減または維持するための組成物であって、該組成物はルナシンに富んだ種子抽出物および大豆粉を含み、ルナシンに富んだ種子抽出物と大豆粉の重量比が、ルナシンに富んだ種子抽出物７０％対大豆粉３０％である、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願）
本願は、２００６年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６０／９６６，５２９号（先の米国特許出願第１１／５３２，５２６号）に対する優先権を主張する。米国仮特許出願第６０／９６６，５２９号は、参考として本明細書中に援用される。本願はさらに、２００７年７月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／００７，９２５号（先の米国特許出願第１１／８７９，２４９号）に対する優先権を主張する。米国仮特許出願第６１／００７，９２５号は、参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
２００６年９月１６日に出願された米国特許出願第１１／５３２，５２８号は、その全体が、全ての目的のために、本明細書中に参考として援用される。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は一般的に、個体におけるコレステロール関連病態を治療するための組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、種々の健康に関連する利益を個体に提供するペプチドのクラス、および前記ペプチドを含む組成物に関する。より具体的には、本発明は、大豆ペプチドを含む新規組成物、前記組成物を使用して個体の総コレステロール値およびＬＤＬコレステロール値を低下させる方法、および前記ペプチドを含む組成物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）は、米国における大きな健康上の問題であり、死亡率が年間１００万人を超えている。危険因子には、喫煙および高血圧が含まれるが、血漿コレステロールの上昇がＣＨＤの主要な危険因子として関わっている。総コレステロールおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールの高値は、アテローム斑の形成に寄与し、最終的には血栓症または心筋梗塞に寄与する。それゆえ、コレステロール値の管理は、冠動脈性心疾患の発生率、死亡率および罹患率を減らすための予防および治療策において最も重要な部分を占める。
【０００５】
特定の大豆タンパク質の消費などの食事の要因が特定の個体でコレステロール値を管理し、ＣＨＤのリスクを低減するのに役立つという実質的な疫学的エビデンスがある。いくつかの疫学試験では、大豆食品の消費が、一部のアジア人集団における心血管疾患のリスク低減に関連することが明らかにされている（１）。より最近になって、中国人女性７５，０００名を対象とした3年間の大規模コホート研究では、大豆食品の摂取と冠動脈性心疾患（特に非致死性心筋梗塞）のリスク低減との用量反応関係が明らかにされている（２）。７３０名の調査ボランティアを含む３８の臨床試験を組み入れたメタアナリシスの結果からは、大豆タンパク質の摂取に関連して、血清コレステロール値が９．３％減少し、血清ＬＤＬコレステロール値が１２．９％減少し、血清トリグリセライド値が１０．５％減少したが、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）値の増加は無視できる程度であったことが明らかにされている（３）。大豆タンパク質が関わる実験の臨床結果により、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、飽和脂肪やコレステロールの低い日々の食事の一部としての大豆タンパク質２５ｇが心疾患のリスクを低減し得ると記載した食品ラベルの健康強調表示を承認することとなった。
【０００６】
コレステロール低下作用に寄与する可能性のある大豆の候補成分には、大豆タンパク質、ならびに非タンパク質成分のサポニンおよびイソフラボン（ゲニステインおよびダイドゼイン）が含まれる。残念なことに、一連の実験データでは、これらの成分のいずれがコレステロール低下作用をもたらすかが依然として不明であることが示されている。多くの場合、大豆イソフラボンが動物のコレステロール低減の原因であると仮定されている。実際、数多くの研究において、動物（４〜６）およびヒト（７、８）のコレステロール値を低減する大豆イソフラボンの役割に焦点が当てられている。興味深いことに、これらおよび他の研究では、大豆イソフラボンがいかなるコレステロール低下作用ももたらさないことが示されている。例えば、一研究において、大豆タンパク質の非存在下でイソフラボンに富んだ大豆抽出物をカニクイザルに与えた場合、いかなるコレステロール低下作用も生じなかった（９）。
【０００７】
いくつかの研究では、大豆タンパク質を単に動物の飼料に加えただけで、コレステロールの顕著な減少が観察された（１０）。また、イソフラボンに起因する現実性ある心保護作用機序に対する懸念（１１〜１３）により、ＣＨＤのリスクを低減するイソフラボンの役割に対する熱意が削がれている。また、トリテルペンまたはステロイド配糖体の構造的に異なる群であるサポニンも、コレステロール低下活性の原因となる可能性がある大豆成分として提唱されている（１４）。しかし、サポニンが大豆のコレステロール低下活性の原因となることを示す説得力ある動物またはヒト研究も、現実性のある作用機序も存在しない。同様のことが主要な大豆蓄積タンパクである７Ｓグロブリンにも当てはまり、これは、マウスのアテローム性動脈硬化を抑制することが認められているものの、コレステロール低下作用は示さなかった（１５）。
【０００８】
２００６年２月、米国心臓協会は、ＦＤＡが健康強調表示を承認してから発表された最近の臨床データを解析することによって、大豆タンパク質、イソフラボンおよび心臓血管の健康に関する科学的な勧告書を公表した（１６）。大豆イソフラボンに関する１９件の研究のうち、概してイソフラボンが低密度リポタンパク質コレステロール（「ＬＤＬコレステロール」）やその他の脂肪の危険因子に対して作用を示さないことを、米国心臓協会は発見した。勧告書では、１日のタンパク質摂取量の半分を超える「きわめて大量の大豆タンパク質」は、動物タンパク質混合物の１日のタンパク質と置き換えると、ＬＤＬコレステロールを数パーセントポイント低下させ得ると結論付けている。このエビデンスでは、原因となる栄養分として大豆イソフラボンよりもむしろ大豆タンパク質が支持されている。しかし、この時点で、大豆の別の成分が活性因子であり得るという可能性を除外することはできない。したがって、大豆タンパク質のどの成分がＣＨＤのリスクを低減する有益なコレステロール低下作用をもたらすかは依然として不明である。その結果、大豆タンパク質を使用してコレステロールを低下させる現在の方法は、目標とするものでもなければきわめて効果的なものでもない、種々の結果をもたらしている。
【０００９】
上記の臨床試験で報告され、ＦＤＡによって支持された大豆生成物の使用に関するさらなる欠点は、有益な結果を得るためには大量（２５ｍｇ／日）の大豆生成物が必要である点である。大豆生成物の所望の部分を十分量得やすくして、このような大豆生成物の調製および包装をより実現可能にする、より濃縮された組成物を得るのが望ましいと考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、個体の総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールを効果的に低減する組成物および関連方法の改善が必要とされている。本発明は、これらおよびその他の関連する利益を提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
個体におけるコレステロール値を低下させる方法であって、（ａ）（ｉ）コレステロール値を低下させることを希望または必要とする個体、ならびに（ｉｉ）配列番号２のペプチドおよび前記ペプチドの機能的に同等の変異体、断片または類似体からなる群から選択される化合物を含む組成物を提供することと、（ｂ）被験体に前記組成物を投与することとを含む、方法。
（項目２）
前記化合物が、大豆、小麦または大麦から得られる、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記化合物が、組換えＤＮＡ法を使用して前記化合物を産生、抽出および精製することによって得られる、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記化合物が合成ポリペプチドの産生によって得られる、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記個体がヒトである、項目１に記載の方法。
（項目６）
投与が前記組成物の経口摂取を含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
組成物がカプセル剤、錠剤、散剤、半固形製剤、液体、ゲル、懸濁液またはエアゾールスプレーの形態である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記組成物がキモトリプシン阻害剤もさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記化合物が、毎日０．０５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇにて前記個体に投与される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記個体が、アテローム硬化症、動脈硬化症、心筋梗塞、心臓発作、糖尿病、冠動脈性心疾患、狭心症または不安定狭心症のリスクがある、項目1に記載の方法。
（項目１１）
前記組成物が大豆粉もさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
心血管疾患を治療または予防する方法であって、（ｉ）心血管疾患に罹患するまたは前記疾患を発症するリスクがある個体、ならびに（ｉｉ）配列番号２のペプチドおよび前記ペプチドの機能的に同等の変異体、断片または類似体からなる群から選択される化合物を含む組成物を提供することと、（ｂ）被験体に前記組成物を投与することとを含む、方法。
（項目１３）
前記化合物が、大豆、小麦または大麦から得られる、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記化合物が、組換えＤＮＡ法を使用して前記化合物を産生、抽出および精製することによって得られる、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記化合物が合成ポリペプチドの産生によって得られる、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記個体がヒトである、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
投与が前記組成物の経口摂取を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１８）
組成物が、カプセル剤、錠剤、散剤、半固形製剤、液体、ゲル、懸濁液またはエアゾールスプレーの形態である、項目１２に記載の方法。
（項目１９）
前記組成物がキモトリプシン阻害剤もさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目２０）
前記化合物が、毎日０．０５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇにて前記個体に投与される、項目１２に記載の方法。
（項目２１）
前記個体が、アテローム硬化症、動脈硬化症、心筋梗塞、心臓発作、糖尿病、冠動脈性心疾患、狭心症または不安定狭心症のリスクがある、項目1２に記載の方法。
（項目２２）
前記組成物が大豆粉もさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目２３）
配列番号１の部分的に消化された生物学的に活性なペプチドを含む組成物。
（項目２４）
キモトリプシン阻害剤もさらに含む、項目２３に記載の組成物。
（項目２５）
大豆粉もさらに含む、項目２３に記載の組成物。
（項目２６）
個体の皮膚を治療する方法であって、ａ）ｉ）個体およびｉｉ）項目２３に記載の組成物を提供することと、ｂ）前記個体に項目２３に記載の組成物を局所投与することとを含む、方法。
（項目２７）
ルナシンに富んだ種子抽出物および大豆粉を含む組成物。
（項目２８）
ルナシンに富んだ種子抽出物と大豆粉の重量比が、ａ）ルナシンに富んだ種子抽出物９０％対大豆粉１０％から、ｂ）ルナシンに富んだ種子抽出物６０％対大豆粉４０％の間である、項目２７に記載の組成物。
（項目２９）
ルナシンに富んだ種子抽出物と大豆粉の重量比が、おおよそルナシンに富んだ種子抽出物７０％対大豆粉３０％である、項目２８に記載の組成物。
（項目３０）
前記大豆粉がルナシン保護大豆粉を含む、項目２７に記載の組成物。
（項目３１）
ルナシンが０．５重量％〜５重量％の組成物の濃度で存在する、項目２７に記載の組成物。
（項目３２）
ルナシンの生物活性を改善する方法であって、ａ）ルナシンを提供することと、ｂ）前記ルナシンを部分的に消化することとを含む、方法。
（項目３３）
大豆粉が、前記ルナシンが消化されている間に存在する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
個体のコレステロール値を低下させるまたは低減する方法であって、ａ）配列番号２のペプチドおよび配列番号２の機能的に同等の断片、変異体または類似体からなる群から選択されるペプチドを含有する生成物を提供することと、ｂ）前記生成物が組成物を消費する個体においてコレステロール値、総コレステロール値、ＬＤＬコレステロール値または脂質値を低減するまたは維持すると主張することとを含む、方法。
（項目３５）
前記ペプチドが、大豆、小麦または大麦から得られる、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記ぺプチドが、組換えＤＮＡ法を使用して前記化合物を産生、抽出および精製することによって得られる、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記ペプチドが合成ポリペプチドの産生によって得られる、項目３４に記載の方法。
（項目３８）
前記個体がヒトである、項目３４に記載の方法。
（項目３９）
前記生成物が、カプセル剤、錠剤、散剤、半固形製剤、液体、ゲル、懸濁液またはエアゾールスプレーの形態である、項目３４に記載の方法。
（項目４０）
前記生成物がキモトリプシン阻害剤もさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目４１）
前記個体が、アテローム硬化症、動脈硬化症、心筋梗塞、心臓発作、糖尿病、冠動脈性心疾患、狭心症または不安定狭心症のリスクがある、項目３４に記載の方法。
（項目４２）
前記組成物が大豆粉もさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目４３）
個体のコレステロール値を低下させる前記ペプチドの有効量が、毎日０．０５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇである、項目３４に記載の方法。
（項目４４）
コレステロール値を低減または維持する方法であって、前記低減または維持を必要とするヒトに生物学的に活性な量の配列番号２のペプチドを提供することを含む、方法。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および語句を以下に定義する。特に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語、表記および他の科学用語は、本発明が関係する当業者が通常理解する意味を有するものとして意図される。場合により、通常理解する意味を有する用語が、明確にするためおよび／またはすぐに参照するために本明細書で定義されるが、このような定義が本明細書に包含されることは、当該技術分野で通常理解されるものとの実質的な違いを表すと必ずしも解釈してはならない。本明細書に記載または参照される一般技術および手順は、通常、当業者により詳細に理解されており、従来の方法を使用して共通して採用されている。通常、市販のキットおよび試薬の使用に関わる手順は、特に明記されない限り、製造業者の定めるプロトコルおよび／またはパラメータに従って適宜実施される。
【００１２】
本明細書で使用する「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形は、特に明記されない限り、複数の言及を含む。例えば、「ａ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」は、１つ以上のプロテアーゼ酵素阻害剤を含む。
【００１３】
本明細書で使用する「μｇ」はマイクログラムの省略形であり、「μＭ」はマイクロモルの省略形である。
【００１４】
本明細書で使用する「生物活性」および「生理活性」は、化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ活性、または化合物、組成物もしくは他の混合物のｉｎ  ｖｉｖｏ投与時に生じる生理反応を指す。したがって、生物活性は、このような化合物、組成物および混合物の治療効果および薬学的活性を包含する。また、生物活性は、このような活性を試験または使用するために設計されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ系で観察および測定される場合もある。
【００１５】
本明細書で使用する「生物学的に活性な」という用語は、天然のルナシン分子の構造的、調節的および／または生化学的機能を有する分子を指す。
【００１６】
本明細書で使用する「組み合わせ」は、２つ以上の項目の間のいずれかの結び付きを指す。
【００１７】
本明細書で使用する「疾患に罹患する」という用語は、被験体（例えば、ヒト）が特定の疾患を経験していることを指す。本発明はいずれかの徴候もしくは症状、または疾患に限定されるものとして意図されず、したがって、本発明は、いずれかの範囲の疾患（例えば、無症状の発現から十分に発達した疾患まで）を経験している被験体であって、特定の疾患に関連する少なくともいくらかのしるし（例えば、徴候および症状）を呈する、被験体を包含するものとして意図される。
【００１８】
本明細書で使用する「疾患」、「障害」および「病態」という用語は、生存する動物またはその器官もしくは組織のいずれかの正常状態の障害であって、正常な機能の実行を中断または変更する障害に関連し、環境因子（例えば、栄養失調、工業災害または気候）、特定の病原体（例えば、蠕虫、細菌またはウイルス）、生体の固有の欠陥（例えば、種々の遺伝子異常）またはこれらおよび他の因子の組み合わせの反応となり得る、状態、徴候および／または症状を説明するために交換可能に使用される。
【００１９】
本明細書で使用する「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な組成物（例えば、ルナシンを含む）の量を指す。有効量は、１回以上の投与、塗布または投薬で投与することができ、特定の調合または投薬経路に限定されるものとして意図されない。
【００２０】
本明細書で使用する「投与」および「投与する」という用語は、薬物、プロドラッグもしくは他の薬剤、または治療的処置（例えば、本発明の組成物）を被験体（例えば、被験体またはｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏ細胞、組織および器官）に与える行為、および／またはいずれかの目的（好ましくは、本明細書に記載の目的）への組成物の使用を指示、指導もしくは助言する行為を指す。１つ以上の本発明の組成物の投与が指示、指導または助言される場合、このような指示は、組成物の使用が本明細書に記載の利益の１つ以上を提供し得るおよび／または提供することを使用者に指導および／または報告するものであり得る。
【００２１】
人体への例示的な投与経路は、目（眼内）、口（経口）、皮膚（局所または経皮）、鼻（経鼻）、肺（吸入）、口腔粘膜（口腔内）、耳、直腸、膣を介するもののほか、注射（例えば、静脈内、皮下、腫瘍内、腹腔内）によるものなどであってよい。
【００２２】
指示される投与は、例えば、口頭による指示（例えば、医師、医療従事者、営業部員もしくは組織、および／またはラジオもしくはテレビ媒体（すなわち、広告）からの口頭による指示を介したもの）、または書面による指示（例えば、医師もしくはその他の医療従事者（例えば、手書き）、営業部員もしくは組織（例えば、マーケティング小冊子、パンフレット、または他の指導ツール）、書面の媒体（例えば、インターネット、電子メールまたは他のコンピュータ関連媒体）、および／または組成物に関連する包装（例えば、組成物を含む包装上に存在するラベル）からの書面による指示を介したもの）を含み得る。本明細書で使用する「書面による」は、単語、図、記号および／または他の可視の記述子を介することを含む。このような指示は、本明細書で使用される実際の単語を利用する必要はなく、むしろ同一または類似の意味を伝える単語、図、記号などの使用が本発明の適用範囲内で企図される。
【００２３】
本明細書で使用する「同時投与」および「同時投与する」という用語は、被験体への少なくとも２つの薬剤（例えば、ルナシンと１つ以上の他の薬剤（例えば、プロテアーゼ酵素阻害剤）とを含む組成物）または療法の投与を指す。いくつかの実施形態において、２種以上の薬剤または療法の同時投与は同時に行われる。他の実施形態においては、第１の薬剤／療法が、第２の薬剤／療法の前に投与される。使用される種々の薬剤または療法の調合および／または投与経路は変動する場合があることを、当業者は理解する。同時投与に適切な用量は、当業者が容易に決定することができる。いくつかの実施形態において、薬剤または療法が同時投与される場合、それぞれの薬剤または療法は、これらの単独投与に適した用量よりも少ない用量で投与される。したがって、同時投与は、薬剤もしくは療法の同時投与によって有害（例えば、毒性）な可能性がある薬剤の必要量が低減される実施形態、および／または２種以上の薬剤の同時投与によって他の薬剤の同時投与による前記薬剤の内の１つの有益な作用に対する被験体の感作が惹起される実施形態において、特に望ましい。
【００２４】
本明細書で使用する「治療」という用語または文法上の相当語句は、疾患（例えば、心疾患）の症状の改善および／または反転を包含する。したがって、本発明のスクリーニング法で使用される場合に疾患に関連するいずれかのパラメータの改善を引き起こす組成物を、治療組成物として特定される場合がある。「治療」という用語は、治療的処置および予防または防止措置を指す。例えば、本発明の組成物および方法による治療から利益が得られる者には、すでに疾患および／または障害（例えば、コレステロール値の上昇）を有する者、ならびに（例えば、本発明の予防的処置を使用して）疾患および／または障害を予防する者が含まれる。
【００２５】
本明細書で使用する「疾患のリスクがある」という用語は、特定の疾患を経験する素因のある被験体（例えば、ヒト）を指す。この素因は、遺伝的（例えば、遺伝的障害などの疾患を経験する特定の遺伝的傾向）である場合もあれば、他の因子（例えば、年齢、体重、環境条件、環境に存在する有害化合物への曝露）による場合もある。したがって、本発明はいずれか特定のリスクに限定されるものとして意図されず、また本発明はいずれか特定の疾患に限定されるものとして意図されることもない。
【００２６】
本明細書で使用する「個体」、「宿主」、「被験体」および「罹患体」という用語は、研究、解析、検査、診断または治療されるヒトおよび非ヒト動物（例えば、霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、齧歯類、家禽、魚類、甲殻類があるがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されない、いずれかの動物を指す。本明細書で使用する「個体」、「宿主」、「被験体」および「罹患体」という用語は、特に明記されない限り、交換可能に使用される。
【００２７】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、抗原決定基に特異的に結合し、これらの産生を促進する抗原決定基と同一であるか構造的に関連するタンパク質に特異的に結合するいずれかの免疫グロブリンを指す。したがって、抗体は、これらの産生を促進する抗原を検出するためのアッセイで有用であり得る。モノクローナル抗体は、Ｂリンパ球（すなわち、Ｂ細胞）の単一クローンに由来し、一般的には構造および抗原特異性が均一である。ポリクローナル抗体は、抗体産生細胞の多くの異なるクローンから生じるため、それらの構造およびエピトープ特異性は異種であるものの、すべてが同じ抗原を認識する。また、「抗体」という用語は、いずれかの供給源（例えば、ヒト、齧歯類、非ヒト霊長類、ウサギ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ）から得られるいずれかの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ）を包含するものとして意図される。
【００２８】
本明細書で使用する「抗原」という用語は、抗体により認識することができるいずれかの物質に関して使用される。
【００２９】
本明細書で使用する「ウェスタンブロット」、「ウェスタン免疫ブロット」、「免疫ブロット」および「ウェスタン」という用語は、膜支持体上に固定されているタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの免疫学的分析を指す。最初に、タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動（すなわち、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）で分解するによってタンパク質を分離した後、タンパク質をゲルから固体支持体（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン膜）に移す。次に、固定したタンパク質を、対象となる抗原に対して反応性を有する抗体に曝露する。抗体（すなわち、一次抗体）の結合を、一次抗体に特異的に結合する二次抗体を使用することによって検出する。通常、二次抗体は、着色した反応生成物の産生によって抗原‐抗体複合体を視覚化させるか、発光酵素反応（例えば、ＥＣＬ試薬、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を触媒する酵素に結合する。
【００３０】
「化合物」という用語は、疾患、疾病、病気、または身体機能の障害を治療または予防するために使用することができる、いずれかの化学物質、医薬品、および薬物などを指す。化合物は、既知および潜在的な治療化合物を含む。化合物は、本明細書に記載のポリペプチドなどのポリペプチドを含む。
【００３１】
本明細書で使用する「毒性の」という用語は、毒物の投与前に同一の細胞または組織と比べた被験体、細胞または組織に対するいずれかの不利益または有害な作用を指す。
【００３２】
本明細書で使用する「医薬組成物」という用語は、活性薬剤（例えば、ルナシン）と、組成物をｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの診断または治療用途に特に適切にする担体（不活性または活性）との組み合わせを指す。
【００３３】
本明細書で使用する「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という用語は、被験体に投与した場合に、有害反応（例えば、毒性、アレルギー性、または免疫学的反応）を実質的に示さない組成物を指す。
【００３４】
本明細書で使用する「局所的に」という用語は、皮膚の表面、ならびに粘膜細胞および組織（例えば、歯槽、口腔、舌、咀嚼器官、または鼻粘膜、ならびに中空器官または体腔の内側を覆う他の組織および細胞）への本発明の組成物の塗布を指す。
【００３５】
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、乳濁液（例えば、油／水乳濁液または水／油乳濁液）、種々の型の湿潤剤、いずれかおよびすべての溶剤、分散媒、コーティング剤、ラウリル硫酸ナトリウム、等張および吸収遅延剤、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）を含むがこれらに限定されない、標準的な医薬担体のいずれかを指す。組成物はまた、安定剤および防腐剤も含み得る。担体の例としては、安定剤およびアジュバントがある（例えば、参考として本明細書で援用される、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９７５）を参照）。
【００３６】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド、前駆体またはＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）の配列を指す。ポリペプチドは、全長コード配列によって、または全長もしくは断片の所望の活性もしくは機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性）が保持される限り、コード配列のいずれかの部分によってコードされ得る。本用語はまた、遺伝子が全長ｍＲＮＡの長さに対応するように、いずれかの末端側〜約１ｋｂ以上離れた５’末端および３’末端上のコード領域に隣接して位置する構造遺伝子および配列のコード領域も包含する。コード領域の５’側に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’側または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語は、ｃＤＮＡおよび遺伝子のゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」、「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列で遮断されたコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子断片であり、イントロンはエンハンサーなどの調節エレメントを含み得る。イントロンは、核または一次転写産物から除去されるか、「スプライシングされる」ため、イントロンはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物中に存在しない。転写時にｍＲＮＡは、新生ポリペプチド中のアミノ酸の配列または順序を特定するように機能する。
【００３７】
本明細書で使用する「遺伝子発現」および「発現」という用語は、遺伝子の「転写」により（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼの酵素作用を介して）遺伝子中にコードされた遺伝情報をＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはｓｎＲＮＡ）に変換するプロセス、およびタンパク質コード遺伝子の場合は、ｍＲＮＡの「翻訳」により前記情報をタンパク質に変換するプロセスを指す。遺伝子発現は、前記プロセスの多くの段階で調節することができる。「上方調節」または「活性化」は、遺伝子発現産物（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質）の産生を増加させるおよび／または増強する調節を指すのに対して、「下方調節」または「抑制」は、産生を低減する調節を指す。上方調節または下方調節に関与する分子（例えば、転写因子）は、それぞれ「活性化因子」および「抑制因子」と呼ばれることが多い。
【００３８】
本明細書で使用する「プロモータ／調節配列」という用語は、プロモータ／調節配列に操作可能に結合する遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。場合により、この配列が中心的なプロモータとなる場合もあれば、この配列がエンハンサー配列および遺伝子産物の発現に必要とされる他の調節エレメントを含む場合もある。プロモータ／調節配列は、例えば、組織に特異的な様式で遺伝子産物を発現する配列であり得る。
【００３９】
本明細書で使用する「細胞培養物」という用語は、いずれかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物を指す。本用語の範囲内に含まれるものとしては、連続継代細胞系（例えば、不死化表現型の細胞系）、初代細胞培養物、形質転換細胞系、有限細胞系（例えば、非形質転換細胞）、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持されるその他いずれかの細胞集団がある。
【００４０】
本明細書で使用する「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工的環境、および人工的環境内で行われるプロセスまたは反応を指す。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境は、試験管および細胞培養物から構成され得るが、これらに限定されない。「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、自然環境（例えば、動物または細胞）、および自然環境内で行われるプロセスまたは反応を指す。
【００４１】
本明細書で使用する「アミノ酸」は、以下の表１に列挙する標準の名称を有する天然アミノ酸のいずれかを指す。また、本用語は既知の合成アミノ酸も指す。特に記載がない限り、本開示に列挙されるすべてのアミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への順序で列挙される。本明細書で使用するいずれかの保護基、アミノ酸および他の化合物の省略形は、特に記載がない限り、これらの一般的な用法、承認された省略形、またはＩＵＰＡＣ‐ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅと一致する（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１：１７２６（１９７２）を参照）。本明細書で使用するアミノ酸残基は、下表に記載するその正式名称、それに対応する３文字コード、またはそれに対応する１文字コードによって表される。
【００４２】
【表１Ａ】
0005500989.tif 000002
【００４３】
【表１Ｂ】
0005500989.tif 000003
本明細書で使用する「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語はすべて、共有結合形の「ペプチド結合」により連結したアミノ酸の一次配列を指す。一般的にペプチドは、数個のアミノ酸、典型的には２〜５０個のアミノ酸から構成される。「ペプチド」という用語は、ペプチドおよびタンパク質を包含し、この場合の「タンパク質」という用語は、典型的には大きなポリペプチドを指し、「ペプチド」という用語は、典型的には短いポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は合成であるのに対し、他の実施形態において、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は組換えまたは天然である。「合成」ペプチドは、人工的手段によりｉｎ  ｖｉｔｒｏにて産生される（すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏにて産生されなかった）ペプチドである。さらに「ペプチド」という用語は、修飾アミノ酸（天然または非天然を問わない）もさらに含むが、このような修飾には、リン酸化、グリコシル化、ペグ化、脂質化およびメチル化が含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
「単離ペプチド」とは、細胞内で天然に共存する成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、他のタンパク質およびペプチド、炭水化物および脂質）から実質的に分離しているペプチドである。
【００４５】
ポリペプチドに適用される「実質的な同一性」という用語は、２つのペプチド配列が、欠失ギャップ量を使用して例えばＧＡＰプログラムまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより最適に整列させた場合に、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％以上の配列同一性（例えば、９９％の配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。
【００４６】
「機能的に同等の」という語句は、ポリペプチドの変異体、類似体または断片がルナシンポリペプチドと共通する所望の生物活性を保持することを意味する。本発明の少なくとも１つの実施形態において、ルナシンと共通する所望の生物活性とは、コレステロール、ＬＤＬコレステロール、総コレステロールまたは脂質の産生または既存の値の制御、安定化または低減に関連する生物活性である。好ましくは、一定量の類似体、変異体または断片は、前記類似体、変異体または断片が由来する天然のルナシンの当量と少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０、６０、８０、９０、９５または９９％同程度有効である。類似体、変異体または断片の相対的有効性の判定は、本発明の１つ以上のアッセイ法で所定量の類似体、変異体または断片を利用し、次いでヒストンＨ３のアセチル化を阻害するか、ＨＭＧ  Ｃｏ‐Ａ還元酵素、Ｓｐ１もしくはＬＤＬ受容体の発現を生じさせる試料の能力を測定する試験において天然のルナシンと類似体、変異体または断片の能力とを比較することによって容易に実施することができる。
【００４７】
ポリペプチドに関して本明細書で使用する「類似体」という用語は、本発明のポリペプチドの誘導体であるポリペプチドを意味し、この場合の誘導体は、前記ポリペプチドが以下で特定するルナシンポリペプチドと実質的に同一の機能を保持するように行われる、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失および／または置換を含む。
【００４８】
「断片」という用語は、完全長ルナシンポリペプチドの構成要素であり、完全長ルナシンポリペプチドと共通する定性的な生物活性を有するポリペプチド分子を指す。断片は、完全長ルナシンポリペプチドに由来する場合もあれば、あるいはその他いくつかの手段（例えば、化学合成）によって合成される場合もある。「断片」においては、長さが少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個、および最も好ましくは少なくとも３０、４０または５０個のアミノ酸からなり、かつ前記アミノ酸が断片となるタンパク質と機能的に同等であるタンパク質の断片を包含することが意図される。
【００４９】
本明細書で使用する「変異体」という用語は、ルナシンをコードする核酸から産生されるが、改変されたアミノ酸配列を有するように異なって加工されている点で野生型ルナシンと異なるポリペプチドを指す。例えば、変異体は、野生型ルナシンを産生するものの代替となる一次ＲＮＡ転写産物のスプライシングパターンによって産生され得る。
【００５０】
類似体および変異体は、元のタンパク質のアミノ酸配列と好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも８５、９０、９５、９８、９９または９９．９％同一のアミノ酸配列を生じるように１つ以上のアミノ酸の付加、欠失または置換によって類似体および変異体が誘導されるタンパク質と異なるアミノ酸配列を有するタンパク質を包含するものとして意図される。類似体または変異体は、特に多型変異体および種間類似体を含む。本発明の類似体および変異体はさらに、置換アミノ酸が類似の構造または化学特性を有する「保存的」変化も有し得る。保存的アミノ酸置換の一種は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり、脂肪族‐ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニンおよびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好適な保存的アミノ酸置換基は、バリン‐ロイシン‐イソロイシン、フェニルアラニン‐チロシン、リジン‐アルギニン、アラニン‐バリン、およびアスパラギン‐グルタミンである。より稀には、変異体が「非保存的」変化（例えば、グリシンのトリプトファンによる置換）も含み得る。また、類似の軽微な変異には、アミノ酸の欠失または挿入（すなわち、付加）、またはそれらの両方が含まれ得る。生物活性を損うことなくどのアミノ酸残基をいくつ置換、挿入または欠失させ得るかを判定する手引きは、当該技術分野で周知のコンピュータプログラム（例えば、ＤＮＡＳｔａｒソフトウェア）を使用して見出すことができる。変異体は、以下の実施例に記載のような機能的アッセイで検査することができる。
【００５１】
本明細書で使用する「保存的アミノ酸置換」という用語は、ポリペプチド鎖（タンパク質の一次配列）内における１つのアミノ酸と類似の特性を有する別のアミノ酸との置換または交換を指す。例えば、類似に帯電したアミノ酸のアスパラギン酸（Ａｓｐ）の、荷電したアミノ酸のグルタミン酸（Ｇｌｕ）による置換は、保存的アミノ酸置換であると考えられる。
【００５２】
本明細書で使用する「ルナシン」は、（配列番号１）に記載される天然の、合成または組換えにより得られる大豆ルナシンポリペプチドを指す。ルナシンペプチドのさらなる説明および種々の機能的に同等の断片および類似体の評価については、すべての目的において全体が参考として本明細書で援用される、米国特許第６１０７２８７号、米国特許第６５４４９５６号、２００２年１１月２２日出願の米国特許出願第２００３／０２２９０３８号、米国特許第６３９１８４８号、２００２年９月２３日出願の米国特許出願第１０／２５２２５６号、および２００２年１１月２２日出願の米国特許出願第１０／３０２６３３号に記載されている。これらの開示は、ルナシンの機能的に同等で、生物学的に活性な断片、変異体および類似体を特定する際に、当業者の手引きとなるであろう。
【００５３】
本明細書で使用する「ルナシンに富んだ」とは、生物学的に活性なレベルの天然ルナシンまたはルナシンの天然類似体を、すなわち、ルナシンまたは類似体の供給源として使用される物質中にルナシンが含まれる濃度よりも高い濃度で含有する組成物を指す。本明細書で使用する「ルナシンに富んだ種子抽出物」とは、生物学的に活性なレベルの天然ルナシンまたはルナシンの天然類似体を、すなわち、供給源の種子中にルナシンが天然に含まれる濃度の少なくとも２倍の濃度で含有する組成物を指す。本発明の組成物のいずれか特定の供給源に本発明を限定するものではないが、ルナシンに富んだ組成物は、市販されるものかどうかにかかわらず、大豆、小麦、大麦、大豆分離物、大豆濃縮物、または他の大豆由来生成物から得ることができる。
【００５４】
本明細書で使用する「ルナシン保護大豆粉」とは、大豆粉と、ルナシンまたはその類似体、変異体もしくは断片を完全な消化から保護するのに十分な量のプロテアーゼ阻害剤とを含む大豆粉組成物であって、本組成物を摂取した個体に有害反応を生じ得るレベルの栄養分吸収阻止要素を有さない大豆粉組成物を指す。
【００５５】
本明細書で使用する「消化された」とは、ポリペプチドをその成分のアミノ酸に分解する消化物質によりポリペプチドを処理することを指す。使用できる消化物質の例は、当該技術分野で周知であり、パンクレアチン、ならびにトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、プロテイナーゼＫ、サーモリシン、トロンビン、Ａｒｇ‐Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ‐Ｎエンドペプチダーゼ、Ａｓｐ‐Ｎエンドペプチダーゼ＋Ｎ末端Ｇｌｕ、ＢＮＰＳ‐Ｓｋａｔｏｌｅ、ＣＮＢｒ、クロストリパイン、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、ヨードソ安息香酸、ＬｙｓＣ、ＬｙｓＮ、ＮＴＣＢ（２‐ニトロ‐５‐チオシアノ安息香酸）およびブドウ球菌ペプチダーゼなどの他のプロテアーゼを含むが、これらに限定されない。
【００５６】
ポリペプチドに関して本明細書で使用する「部分的に消化された生物学的に活性な」とは、ポリペプチドの生物活性を増強する条件下で消化物質によりポリペプチドを処理することを指す。
【００５７】
「併用療法」という語句は、本発明の組成物を、障害を治療または予防する適応がある別の医薬品とともに、これらの治療薬の相互作用により有益な作用を提供することを意図した特定の治療法の一部として投与することを包含する。
【００５８】
本明細書では、本発明で利用される種々の成分を含む成分の商品名が参照されている。本明細書の発明者は、特定の商品名の物質によって限定されることを意図していない。商品名によって参照される物質と等価の物質（例えば、異なる名前または参照番号の異なる供給源から得られる物質）が、本明細書の説明で代用および利用され得る。
【００５９】
本明細書の組成物は、本明細書に記載される要素のいずれかを含み得るか、これらから本質的に構成され得るか、またはこれらから構成され得る。
【００６０】
本発明の実施においては、特に記載がない限り、当該技術分野の技術範囲内に含まれる分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、免疫学およびタンパク質動態の従来技法が利用されるであろう。このような技法は、以下の文献に詳細に説明されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ  Ｄ．G．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３‐８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９）、およびＭａｓｓ  ｉｓｏｔｏｐｏｍｅｒ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｔ  ｅｉｇｈｔ  ｙｅａｒｓ：ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ，ａｎａｌｙｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｎｅｅｓｅ（Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７６（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．３９）Ｅ１１４６‐Ｅ１１６２，１９９９）（これらはすべて全体が参考として本明細書で援用される）。さらに、市販のアッセイキットおよび試薬を使用する手順は、特に明記されない限り、典型的には製造業者規定のプロトコルに従って使用される。
【００６１】
本開示は、個体における総コレステロール値およびＬＤＬコレステロール値を低下させるために大豆関連ペプチドを使用する生成物および関連方法に関する。
【００６２】
一実施形態において、本発明は、個体におけるコレステロール値を低下させる方法であって、コレステロール値を低下させることを希望または必要とする個体、ならびに配列番号２のペプチドおよび前記ペプチドの機能的に同等の変異体、断片または類似体からなる群から選択される化合物を含む組成物を提供することと、前記被験体に前記組成物を投与することとを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、化合物は、大豆、小麦もしくは大麦から、または組換えＤＮＡ法を使用して前記化合物を産生、抽出および精製することにより、または合成ポリペプチドの産生により得られる。特定の実施形態において、個体はヒトである。特定の実施形態において、投与は組成物の経口摂取を含み、特定の実施形態において、組成物は、カプセル剤、錠剤、散剤、半固形製剤、液体、ゲル、懸濁液またはエアゾールスプレーの形態である。特定の実施形態において、組成物は、大豆粉もさらに含む。特定の実施形態において、大豆粉は、ルナシン保護大豆粉である。特定の好適な実施形態において、組成物は、キモトリプシン阻害剤もさらに含む。特定の実施形態において、化合物は、毎日０．０５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇにて前記個体に投与される。特定の実施形態において、個体は、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、心筋梗塞、心臓発作、糖尿病、冠動脈性心疾患、狭心症または不安定狭心症のリスクを有する。
【００６３】
別の実施形態において、本発明は、心血管疾患を治療または予防する方法であって、心血管疾患に罹患するまたは前記疾患を発症するリスクがある個体、ならびに配列番号２のペプチドおよび前記ペプチドの機能的に同等の変異体、断片または類似体からなる群から選択される化合物を含む組成物を提供することと、前記被験体に前記組成物を投与することとを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、化合物は、大豆、小麦もしくは大麦から、または組換えＤＮＡ法を使用して前記化合物を産生、抽出および精製することにより、または合成ポリペプチドの産生により得られるか、あるいは前記個体はヒトである。特定の実施形態において、投与は組成物の経口摂取を含み、特定の実施形態において、組成物は、カプセル剤、錠剤、散剤、半固形製剤、液体、ゲル、懸濁液またはエアゾールスプレーの形態である。特定の実施形態において、組成物は、大豆粉もさらに含む。特定の好適な実施形態において、組成物は、キモトリプシン阻害剤もさらに含む。特定の実施形態において、化合物は、毎日０．０５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇにて前記個体に投与される。特定の実施形態において、個体は、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、心筋梗塞、心臓発作、糖尿病、冠動脈性心疾患、狭心症または不安定狭心症のリスクを有する。
【００６４】
別の実施形態において、本発明は、配列番号１の部分的に消化された生物学的に活性なペプチドを含む組成物を提供する。特定の実施形態において、組成物はまた、キモトリプシン阻害剤も含む。特定の実施形態において、組成物は、大豆粉もさらに含む。
【００６５】
別の実施形態において、本発明は、個体の皮膚を治療する方法であって、ａ）ｉ）個体およびｉｉ）請求項２３に記載の組成物を提供することと、ｂ）請求項２３に記載の組成物を個体に局所投与することとを含む、方法を提供する。
【００６６】
別の実施形態において、本発明は、ルナシンに富んだ種子抽出物および大豆粉を含む組成物を提供する。特定の実施形態において、ルナシンに富んだ種子抽出物と大豆粉の重量比は、ａ）ルナシンに富んだ種子抽出物９０％対大豆粉１０％から、ｂ）ルナシンに富んだ種子抽出物６０％対大豆粉４０％、好ましくはルナシンに富んだ種子抽出物７０％対大豆粉３０％の間である。特定の実施形態において、大豆粉は、キモトリプシン阻害剤を含む。特定の実施形態において、ルナシンは、０．５重量％〜５重量％の組成物の濃度で組成物中に存在する。
【００６７】
別の実施形態において、本発明は、ルナシンの生物活性を改善する方法であって、ａ）ルナシンを提供することと、ｂ）前記ルナシンを部分的に消化することとを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、大豆粉は、ルナシンが消化されている間に存在する。
【００６８】
別の実施形態において、本発明は、個体のコレステロール値を低下させるまたは低減する方法であって、配列番号２のペプチドおよび配列番号２の機能的に同等の断片、変異体または類似体からなる群から選択されるペプチドを含有する生成物を提供することと、前記生成物が組成物を消費する個体においてコレステロール値、総コレステロール値、ＬＤＬコレステロール値または脂質値を低減するまたは維持すると主張することとを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、ペプチドは、大豆、小麦もしくは大麦から、または組換えＤＮＡ法を使用して前記化合物を産生、抽出および精製することにより、または合成ポリペプチドの産生により得られる。特定の実施形態において、個体はヒトである。特定の実施形態において、投与は組成物の経口摂取を含み、特定の実施形態において、組成物は、カプセル剤、錠剤、散剤、半固形製剤、液体、ゲル、懸濁液またはエアゾールスプレーの形態である。特定の実施形態において、組成物は、大豆粉もさらに含む。特定の好適な実施形態において、組成物は、キモトリプシン阻害剤もさらに含む。特定の実施形態において、組成物は、毎日２５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇにて前記個体に投与される。特定の実施形態において、個体は、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、心筋梗塞、心臓発作、糖尿病、冠動脈性心疾患、狭心症または不安定狭心症のリスクを有する。
【００６９】
別の実施形態において、本発明は、コレステロール値を低減または維持する方法であって、前記低減または維持を必要とするヒトに生物学的に活性な量の配列番号２のペプチドを提供することを含む、方法を提供する。
【００７０】
本発明の一例示的実施形態においては、生成物を消費する個体におけるコレステロール値を低下させるルナシンペプチドの有効量を含有する生成物が提供される。
【００７１】
本発明の別の例示的実施形態においては、ルナシンペプチドまたはルナシンペプチド誘導体の有効量、および組成物を消費する個体のコレステロール値を低下させるためにともに作用する１つ以上の酵素阻害剤を含有する組成物が提供される。
【００７２】
本発明のさらに別の例示的実施形態においては、個体のコレステロール値を低下または低減する方法が提供される。本方法は、個体にルナシンペプチドの有効量を含有する生成物を提供することと、本生成物が組成物を消費する個体においてコレステロール値、総コレステロール値、ＬＤＬコレステロール値または脂質値を低下させる、低減するまたは維持すると主張することとを含む。
【００７３】
本発明の少なくとも一実施形態の一態様において、個体のコレステロール値を低下させるルナシンペプチドおよび／またはルナシン誘導体ペプチドの有効量は、１日２５ｍｇ〜１００ｍｇであるが、但し、大豆タンパク質が平均０．１％のルナシンを含有し、少なくとも1日２５ｇｍの大豆タンパク質がヒトのＬＤＬコレステロールを低減することが臨床的に証明されていることを前提とする。
【００７４】
本発明の少なくとも１つの実施形態の別の態様において、個体において低下させるコレステロール値は、ＬＤＬコレステロール値および総コレステロール値である。
【００７５】
本発明の少なくとも１つの実施形態のさらに別の態様において、ルナシンペプチドは、ルナシンペプチドまたはルナシンペプチド誘導体を含む。
【００７６】
本発明の少なくとも１つの実施形態のさらに別の態様において、ルナシンペプチドは、大豆から得られる。
【００７７】
本発明の少なくとも１つの実施形態のさらに別の態様において、ルナシンペプチドは、大豆および他の種子植物から得られる。
【００７８】
本発明の少なくとも１つの実施形態のさらに別の態様において、ルナシンペプチドまたはルナシンペプチド誘導体は、組換えＤＮＡ法を使用してルナシンペプチドまたはルナシンペプチド誘導体を産生、抽出および精製することにより得られる。
【００７９】
本発明の少なくとも１つの実施形態のさらに別の態様において、ルナシンペプチドまたはルナシンペプチド誘導体は、合成塩基配列決定法により得られる。
【００８０】
本発明の少なくとも１つの実施形態のさらに別の態様において、１つ以上の酵素阻害剤は、１つ以上のトリプシン阻害剤を含む。
【００８１】
本発明の少なくとも１つの実施形態のさらに別の態様において、以下の実施例に記載のアッセイは、ルナシン分離物、濃縮物、抽出物、類似体、断片および変異体をスクリーニングして、本発明の方法でこれらを使用する前に所望の活性を確認するために使用することができる。本発明は、大豆分離物、濃縮物および抽出物、ならびにルナシンの変異体、断片および類似体をスクリーニングして、本発明の組成物および方法で使用するのに好適な活性を有するものを特定するために活性を測定する方法を包含し、これにより、本明細書に記載のものと類似の実験が、ルナシンの代わりにルナシン類似体、断片または変異体を使用して実施され、それによって本発明で使用するルナシンの類似体、変異体および断片の活性レベルをスクリーニングする簡便な方法が当業者に教示される。
【００８２】
本開示の上述の特徴および目的は、同じ参照番号が同じ要素を示す添付の図面と併せて記載された以下の説明を参照することにより、より明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】Ｇｍ２Ｓ  １  ｃＤＮＡ（配列番号２）によってコードされた２Ｓアルブミンタンパク質を示す。矢印は、小サブユニット（ルナシン）（配列番号２）および大サブユニット（メチオニンに富んだタンパク質）を生じるエンド型タンパク質分解部位を示す。両サブユニットの重要な領域を示す。
【図２】ステロール調節因子結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）を活性化するために無コレステロール培地（ＣＦＭ）で２４時間インキュベートする前に、ルナシンで２４時間処理したＨｅｐＧ２細胞（ＣＦＭ＋ＬＳ（２４））または処理していないＨｅｐＧ２細胞（ＣＦＭ）におけるＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素の相対的な発現レベルを示す、ウェスタンブロット解析の写真（上図）と、デンシトメータ値を示す表（下図）である。インキュベーション後、総タンパク質を抽出し、１０μｇのタンパク質を１０％トリス‐グリシンゲル上に充填して、ニトロセルロース膜上に電気ブロットし、ＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素およびアクチンに対して産生される一次抗体で免疫染色した（タンパク質の等しい充填を示すため）。スポットデンシトメータ値は、３件別々の実験データの平均および標準偏差を表す。
【図３】ＳＲＥＢＰを活性化するために無コレステロール培地（ＣＦＭ）で２４時間インキュベートする前に、ルナシンで２４時間処理したＨｅｐＧ２細胞（ＣＦＭ＋ＬＳ（２４））または処理していないＨｅｐＧ２細胞（ＣＦＭ）におけるＬＤＬ受容体の相対的な発現レベルを示す、ウェスタンブロット解析の写真（上図）と、デンシトメータ値を示す表（下図）である。インキュベーション後、総タンパク質を抽出し、１０μｇのタンパク質を１０％トリス‐グリシンゲル上に充填して、ニトロセルロース膜上に電気ブロットし、ＬＤＬ受容体およびアクチンに対して産生される一次抗体で免疫染色した（タンパク質の等しい充填を示すため）。スポットデンシトメータ値は、３件別々の実験データの平均および標準偏差を表す。
【図４】培養培地を、新しい培養培地（Ｍｅｄｉａ）、ルナシン含有培地（Ｍｅｄｉａ＋ＬＳ）、またはルナシン含有の無コレステロール培地（ＣＦＭ＋ＬＳ）もしくはルナシン非含有の無コレステロール培地（ＣＦＭ）と交換する前に、培養培地で集密から２４時間培養したＨｅｐＧ２細胞におけるＳｐ１の相対的な発現レベルを示す、ウェスタンブロット解析の写真（上図）と、デンシトメータ値を示す表（下図）である。次いで試料を記載の通り２４時間または４８時間インキュベートした。インキュベーション後、総タンパク質を抽出し、１０μｇのタンパク質を１０％トリス‐グリシンゲル上に充填して、ニトロセルロース膜上に電気ブロットし、Ｓｐ１およびアクチンに対して産生される一次抗体で免疫染色した（タンパク質の等しい充填を示すため）。スポットデンシトメータ値は、１件の実験データを表す。
【図５】市販される５種類の大豆タンパク質供給源（Ａ〜Ｅ）から抽出した２０μｇサイズの大豆タンパク質試料、ならびに０．２５μｇ、０．５μｇおよび１．０μｇの合成ルナシン試料を示す、Ｃｏｏｍａｓｉｅブルーで染色したＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルのデジタル画像（Ｉ）とウェスタンブロット解析の写真（ＩＩ）である。各５ｋＤａのルナシンバンドを矢印で示す。
【図６】０．５μｇ、１．０μｇおよび１．５μｇの合成ルナシンの試料と比較した、ルナシンに富んだ種子抽出物（特に、調合したルナシンに富んだ大豆濃縮物（ＬｅＳＣ）、大豆粉（ＳＦ）、および大豆粉を補充したＬｅＳＣ（ＬｅＳＣ＋ＳＦ）（ＬｅＳＣおよびＬｅＳＣ＋ＳＦの調合および開発については、以下の実施例４を参照））のタンパク含有量および（特に興味深い点として）ルナシン含有量のウェスタンブロット解析の写真である。
【図７】大豆タンパク質の種々の抽出物、濃縮物および分離物の生物活性に対するパンクレアチンによる消化の作用を示す、ウェスタンブロット解析の写真である。ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）アッセイを使用して、生物活性を判定した。各列は以下を表す：ＬｅＳＣ（Ａ）、ＬｅＳＣ＋ＳＦ（Ｂ）、消化ＬｅＳＣ＋ＳＦ（Ｃ）、消化ＬｅＳＣ（Ｄ）、消化大豆タンパク質分離物（Ｅ）、および消化大豆濃縮物（Ｆ）。ニワトリ赤血球に由来するコアヒストンを、ＨＡＴアッセイの陰性対照列およびテンプレート（Ｔｅｍｐ‐）ヒストンとして使用した。陽性対照列は、最大のヒストンアセチル化を生じたＨＡＴアッセイの未処理（Ｕｎｔｒｔ）テンプレートコアヒストンが該当する。弱いシグナルは、試料がヒストンＨ３のアセチル化を防止したことから、生理活性を有することを示す。強いシグナルは、試料が不活性であったため、ヒストンＨ３のアセチル化のレベルに影響を及ぼさなかったことを示す。
【図８】大豆粉の存在下または非存在下におけるルナシンに富んだ大豆濃縮物の生物活性に対するパンクレアチンによる消化の作用を示す、ウェスタンブロット解析の写真である。ＨＡＴ生理活性アッセイは、ＰＣＡＦ触媒ＨＡＴ反応のテンプレート／陰性対照（ｔｅｍｐ（‐））としてＨｅＬａ細胞に由来する酸抽出コアヒストンを使用して実施した。陽性対照としては、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）で処理したＨｅＬａ細胞に由来するコアヒストンを使用した。ＰＣＡＦによるヒストンＨ３アセチル化に対する合成ルナシン（＋ｓｙｎＬ）の阻害作用を使用して、ＬｅＳＣ（Ａ）、消化ＬｅＳＣ（Ａ  Ｄｉｇ）、ＬｅＳＣ＋ＳＦ（Ｂ）、および消化ＬｅＳＣ＋ＳＦ（Ｂ  Ｄｉｇ）の作用を比較した。記号の下の数値は、ＨｅＬａコアヒストンテンプレート（ｔｅｍｐ（‐））の免疫シグナルを使用して正規化したデンシトメータの相対的測定値を示す。低い数値は生物活性を示す。
【図９】トリプシンおよび／またはキモトリプシン阻害剤の存在下および非存在下におけるルナシンに富んだ大豆濃縮物に対するパンクレアチンによる消化の作用を示す、ウェスタンブロット解析の写真である。トリプシン阻害剤を含むルナシンに富んだ大豆濃縮物（ＬｅＳＣ＋Ｔｒｙ）、およびトリプシン＋キモトリプシン阻害剤を含むＬｅＳＣ（ＬｅＳＣ＋Ｔｒｙ＋Ｃｈｙ）の試料を、パンクレアチンで消化し、ルナシン抗体で免疫染色した。合成ルナシン（０．８μｇ、０．４μｇ、０．２μｇ）および不消化ＬｅＳＣを対照として含めた。
【図１０】ＰＣＡＦ触媒ＨＡＴ反応のテンプレートとしてニワトリ赤血球細胞に由来するコアヒストンを使用して実施したＨＡＴ生理活性アッセイ（図６）の結果を示す、ウェスタンブロット解析の写真である。未処理の陰性対照（‐ｓｙｎＬ）における最大のヒストンアセチル化と比較した、ＰＣＡＦによるヒストンＨ３アセチル化に対する合成ルナシン（＋ｓｙｎＬ）の阻害作用を対照として使用し、ルナシンに富んだ大豆濃縮物（ＬｅＳＣ）（Ａ）、トリプシンおよびキモトリプシン阻害剤を含むＬｅＳＣ（Ｂ）、トリプシン阻害剤を含むＬｅＳＣ（Ｃ）に対する消化の作用を比較した。また、未消化ＬｅＳＣ（Ｄ）および未消化ＬｅＳＣ＋大豆粉（Ｅ）も含めた。記号の下の数値は、未消化ＬｅＳＣ（Ｄ）の免疫シグナルを使用して正規化したデンシトメータの相対的測定値を示す。低い数値は、試料の生物活性が認められることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
本発明は一般的に、個体におけるコレステロール関連病態を治療するための組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、種々の健康に関連する利益を個体に提供するペプチドのクラス、および前記ペプチドを含む組成物に関する。より具体的には、本発明は、大豆ペプチドを含む新規組成物、前記組成物を使用して個体の総コレステロール値およびＬＤＬコレステロール値を低下させる方法、および前記ペプチドを含む組成物を製造する方法に関する。
ルナシン
ルナシンは、新規のクロマチン結合特性および遺伝子発現に対する後成的作用を有する大豆（ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）中に最近発見された生理活性成分である（１７、１８）。ルナシンは、子葉特異的２Ｓアルブミンの小サブユニットペプチドである。図１には、２Ｓアルブミンタンパク質（配列番号１）および小ルナシンサブユニット（配列番号２）が示されている。ルナシン大豆ペプチドは、耐熱性で、水溶性であり、選択された大豆タンパク質製剤中に多量に含まれ、重要なガイダンスが、ルナシンを分離または濃縮するための大豆および大豆生成物の供給源の選択に関する文献に提供されている（１９）。
【００８５】
本明細書において、ルナシンは、コレステロール低下作用を有する大豆の活性成分として特定されている。とりわけコレステロールを低減するための組成物、ならびにルナシンを製造および使用する方法についても記載されている。
【００８６】
この発見により、これまでコレステロール低減への大豆生成物の使用を困難にしてきたいくつかの問題が解決される。これまではコレステロール低減のための大豆の活性成分が特定されていなかったため、大豆生成物で選択することができなかった。そのため、これまでは、毎日大量の大豆を摂取する必要があったが、それでもコレステロールのわずかな減少しか認められなかった。現在は、高濃度のルナシンを含む大豆組成物が提供され、これにより、より少ない用量で治療の有効性を向上させ、より一貫した治療結果を得ることが可能となっている。
【００８７】
さらに、個体に大量の大豆を提供することに伴う加工および包装上の問題が対処され、現在では種々の調合物が入手できるようになっている。
【００８８】
ルナシンは、ＲＧＤ細胞接着モチーフを介して哺乳類の上皮細胞に入り、脱アセチル化ヒストンと優先的に結合し、ヒストンＨ３およびＨ４のアセチル化を阻害する能力を有することが、研究により明らかにされている（２０）。また、細胞形質転換、ホルモンに対する反応、ならびに食事および環境作用は、ＤＮＡのメチル化‐脱メチル化およびヒストンのアセチル化‐脱アセチル化の可逆的プロセスによって調整される遺伝子発現の後成的変化に関与するというエビデンスが得られ始めている（２１、２２）。
【００８９】
ルナシンは、ヒストンアセチラーゼ阻害剤として特定された最初の天然物質であるが、ヒストンアセチラーゼ酵素に直接影響は及ぼさない。ルナシンは、ヒストンＨ３およびＨ４のＮ末端尾部の特定の脱アセチル化されたリジン残基に結合し、これらをヒストンアセチル化の基質として利用できなくさせることによって、Ｈ３およびＨ４のアセチル化を阻害する（２０）。作用機序が解明されたことで、ルナシンは、重要な生物学的プロセスにおける後成学およびクロマチン修飾の新しい役割を解明する調査研究にとって重要な分子となっている。
【００９０】
カリフォルニア大学デービス校で行われた前立腺発癌に対するルナシンの作用に関する研究により、ヒストンＨ４の修飾および化学発癌抑制遺伝子の上方調節に対するルナシンの作用が明らかとなった（２３）。しかし、生物系における脱アセチル化Ｈ３  Ｎ末端尾部に結合するルナシンの特異的作用、およびＨ３ヒストンアセチル化の阻害については、現在のところ確認されていない。
【００９１】
血液中の大部分の循環コレステロールは、体内で合成されるため、ＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素（コレステロール生合成のための律速酵素）によって触媒されるコレステロールの体内産生、および肝臓細胞膜中のＬＤＬ受容体量は、ＬＤＬコレステロール値を調整する上で重要な因子である（３３）。
【００９２】
脱アセチル化ヒストンＨ３に結合するルナシンの特異的生体作用、およびアセチル化の阻害を判定するために、ステロール調節因子結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）によるコレステロール生合成において関与する遺伝子の誘導を、生体モデルとして使用した。この生体モデルを選択した理由は、ステロール枯渇によりＳＲＥＢＰが活性化されると、ＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素（コレステロール生合成のための律速酵素）およびＬＤＬ受容体遺伝子のプロモータ／調節配列に最も近いクロマチンにおいて、ヒストンアセチラーゼ酵素Ｐ３００／ＣＢＰ結合因子（ＰＣＡＦ）により、ヒストンＨ３のアセチル化が増大するものの、ヒストンＨ４のアセチルは増大しないためである（２４）。さらに、ＳＲＥＢＰが活性化されると、ＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素遺伝子のプロモータ／調節配列への共調節因子サイクリックアデノシン一リン酸応答要素結合（ＣＲＥＢ）の補充、およびＬＤＬ受容体遺伝子のプロモータ／調節配列へのＳｐ１の補充も増大する（２４）。
【００９３】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）アッセイ（以下の実施例８に記載）に関する本発明者等の研究により、ルナシンは、ヒストンアセチラーゼ酵素（ＰＣＡＦ）によるヒストンＨ３のアセチル化を顕著に阻害することが明らかにされている。ＨｅｐＧ２肝細胞を使用した細胞培養物実験により、合成ルナシンは、スタチン型コレステロール低下薬の作用と同様に、無コレステロール培地中でＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素の発現を顕著に低減し、ＬＤＬ受容体遺伝子の発現を増大させ得ることが明らかにされている（以下の実施例１）。また、本発明者等の研究では、無コレステロール培地中で、ＬＤＬ受容体発現の増大がＳｐ１発現の増大と一致することも明らかにされている（以下の実施例２）。
【００９４】
本発明をいずれか特定の作用機序または作用様式に限定することを意図するものではないが、ルナシンは、ＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素の発現の活性化に必要となるヒストンアセチラーゼ酵素（ＰＣＡＦ）によるヒストンＨ３のアセチル化を低減し、ＬＤＬ受容体の発現を増大させるという分子作用機序が、記載の実験に基づき提案されている。それゆえ、ルナシンは、１）コレステロール低下スタチン薬によって酵素活性が低減されるＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素の遺伝子発現を阻害することと、２）血中ＬＤＬコレステロールのクリアランスを増加させるＬＤＬ受容体発現を増大させることとによって、総コレステロール値およびＬＤＬコレステロール値を低減することができる。
【００９５】
さらに、実施例に示す通り、ルナシンの生物活性は、大豆タンパク質の消費とＬＤＬコレステロール値および心血管疾患リスクの低下とを結びつける大規模な疫学および臨床データによってもさらに裏付けられている（３）。大豆タンパク質においてルナシンがコレステロール低下特性をもたらす主成分として特定されたことで、心臓の健康への利益を最大限高めるように大豆タンパクの成分を最適に活用することが容易になる。
【００９６】
以前に発表されたデータでは、異なる大豆の種類、大豆タンパク質濃縮物および大豆タンパク質分離物におけるルナシンの含有量が、調製により互いに著しく異なることが実証されている（１９）。本発明をいずれか特定の作用様式または機序に限定することを意図するものではないが、本データから、ルナシンは、大豆タンパク質のコレステロール低下特性を解明する現実性ある分子作用機序を有する大豆に由来した唯一の生理活性剤であることが見受けられる（実施例１および２に後述）。また、本データは、米国心臓協会の学術報告書に引用される広範な臨床結果を解明する上でも役立つ（１６）。現在、ルナシンは、種々の大豆タンパク質製剤中に種々の量で存在することが知られているため（１９）、大豆タンパク質分離物を使用した以前の研究、さらには高濃度の大豆タンパク質を試験した研究においても認められた、コレステロール低下作用に関する予測不可能な結果、および用量依存作用の欠如は、ルナシン量の変動もしくは消化中にルナシンを保護するキモトリプシン阻害剤の不在のいずれか、またはこれら２つの因子の組み合わせに起因する可能性があると見受けられる。
【００９７】
ルナシンが個体におけるコレステロールを低減し、ＬＤＬコレステロール低下の原因となる大豆成分であるという本発明者等の驚くべき所見は、５０％の大豆粉と５０％の大豆タンパク質濃縮物を混合させた場合に、臨床試験で最高のＬＤＬコレステロール低減率（低減率２０〜３０％）が報告されたことを示す実験により、さらに裏付けられている（２６、２７）。市販される種々の供給源においてルナシンの濃度および生物活性は変化するものの、ルナシンの種々の供給源の中では大豆タンパク質濃縮物が、生理活性ルナシンの収率が高いことが、いくつかの実験で明らかにされている（実施例４および参考文献（１９）を参照）。本発明の好適な実施形態において、大豆タンパク質濃縮物は、本発明の組成物および方法で使用されるルナシンの供給源である。
【００９８】
例えば、上述の臨床試験で使用されたもののように大豆タンパク質混合物中に大豆粉が含まれると、摂取時に消化および分解からルナシンを保護することが本書で明らかにされている（実施例５を参照）。また、大豆粉と混合したルナシンに富んだ種子抽出物の部分消化も、ルナシンの生理活性を増大させることが明らかにされている（実施例６）。
【００９９】
以下では、大豆粉が、消化作用による生物活性の低減からルナシン含有組成物の生物活性を保護することが明らかにされている。また、トリプシン阻害剤、および具体的には大豆粉で見られるキモトリプシン阻害剤（３４）が、消化の有害作用からルナシン含有組成物の生物活性を保護することも、本発明者等は発見した。本発明をいずれかの作用機序または作用様式に限定することを意図するものではないが、上述の臨床研究では、大豆粉中に内因性キモトリプシン阻害剤を含めたことで、ルナシンが消化から保護され、ルナシンペプチドは本研究に参加した個体の肝臓および血液における生物学的利用能が高くなり、これによって最高のＬＤＬコレステロール低減率が得られたと考えられる。
【０１００】
大豆タンパク質のコレステロール低下作用は、個体の血漿ＬＤＬコレステロール値を顕著に低下させるために必要となる、ルナシンの適切な吸着および肝臓への送達を最適にする調合物を開発することによって、さらに増大させることができる。本発明の好適な実施形態は、大豆粉もしくはキモトリプシンまたはこれら２つの組み合わせとともにルナシンを含む組成物、このような組成物を使用および製造する方法を包含する。
【０１０１】
ルナシンは、無子葉特異的２Ｓアルブミンの小サブユニットペプチドである。図１には、２Ｓアルブミンタンパク質（配列番号１）および小ルナシンサブユニット（配列番号２）が示されている。哺乳動物細胞内のルナシン遺伝子の構成的発現により、動原体の形成が妨げられ、有糸分裂が破壊されることにより、細胞死がもたらされることが明らかにされている（１８）。哺乳類の細胞培養物に外部からルナシンペプチドが加えられると、ルナシンペプチドは、化学発癌物質および腫瘍遺伝子によって誘発される、正常細胞から癌性病巣への変換を抑制する。その化学発癌抑制の作用機序を解明するために、本発明者等は、ルナシンが（ａ）ＲＧＤ細胞接着モチーフを介して内在化され、（ｂ）前中期のテロメア中において低アセチル化クロマチンと共局在化し、（ｃ）他のクロマチン結合タンパク質で見られる構造保存性ヘリカルモチーフの存在下で促進される、脱アセチル化ヒストンＨ４に優先的に結合し、（ｄ）ヒストンＨ３およびＨ４のアセチル化を阻害し、（ｅ）Ｅ１Ａトランスフェクト細胞のアポトーシスを誘発することを明らかにした（２０）。これらの結果に基づき、ルナシンが核内に入り、脱アセチル化ヒストンと結合し、それらのアセチル化を防止し、Ｒｂ腫瘍抑圧遺伝子およびｈラス腫瘍遺伝子によって制御されるもののような遺伝子発現を阻害する、新規の化学発癌抑制機序が提案されている。
【０１０２】
マイクロアレイ実験では、ルナシンを使用しても負の遺伝子変化がわずかまたは全く生じないことが実証されている。ルナシン治療に伴う遺伝子変化を判定するために、合成ルナシンで治療した非腫瘍形成性（ＲＷＰＥ‐１）および腫瘍形成性（ＲＷＰＥ‐２）前立腺細胞の遺伝子発現プロフィールを、マイクロアレイ解析を使用して評価した。結果では、調査した１４，５００個の遺伝子の内で１２３個の遺伝子が、２μＭのルナシンに２４時間曝露した細胞で、２倍を超える発現量の変化が見られたことが示されている（２３）。これらの遺伝子の内で１２１個の遺伝子がＲＷＰＥ‐１細胞で上方調節され、ＲＷＰＥ‐２細胞で上方調節された遺伝子はわずか２個であった。２μＭのルナシンで処理した非腫瘍形成性または腫瘍形成性上皮細胞で下方調節された遺伝子は認められなかった。ＲＷＰＥ‐１細胞で上方調節された遺伝子には、腫瘍抑制、プロアポトーシス、有糸分裂チェックポイント、および細胞分裂の制御などの癌形成の予防に関与する遺伝子が含まれる（２３）。
【０１０３】
また、本発明者等の実験のマイクロアレイの結果により、ルナシンは、変換から正常細胞を保護する遺伝子の転写活性化因子として作用し得ることも示唆されている。これらの所見は、脱アセチル化ヒストンＨ４のアセチル化を阻害することによって、ルナシンが正常細胞から腫瘍への変換を予防することを示唆する、以前の機序モデルとは対照的な所見である（２０）。これらのヒストンのアセチル化を阻害することにより、Ｒｂ（網膜芽細胞腫タンパク質）などの腫瘍抑制因子の非存在下または失活下でさえも、腫瘍遺伝子の染色質凝縮および転写サイレンシングが生じることが考えられる。しかし、最近の研究において、国立衛生研究所より入手し、Ｅ１Ａ腫瘍遺伝子をトランスフェクトしたルナシン処理マウス繊維芽細胞３Ｔ３細胞（ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞）（２４時間前処理）は、Ｅ１Ａのトランスフェクションの８日後にｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐｉタンパク質値の５倍の増加を示した（２８）。タンパク質ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐｉは、細胞周期進行の主要な制御点であるサイクリン依存性キナーゼの強力な全身性阻害剤である（２９）。マイクロアレイの結果では、２４時間以内にｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐｉの上方調節が示されなかったが、ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐの転写活性化因子（３０）である遺伝子ＳＰ３は、２４時間後にルナシンにより上方調節され、このことが、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞におけるｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐｉの発現の後の増加の説明となっている。
【０１０４】
さらに、マイクロアレイの結果は、ルナシンで前処理したＣ３Ｈ／Ｔ１０１／２細胞を化学発癌物質のジメチルベンゾアントラセン（ＤＭＢＡ）およびＭＣＡに曝露した場合に認められる病巣形成の７０％の低減の説明にも役立つ（２０）。わずか１２５ｎＭのルナシンにこれら細胞を１回２４時間曝露するだけで、６週間継続した化学発癌アッセイにおいて病巣形成を抑制するのに十分であった（２０）。ルナシンによるＣ３Ｈ／Ｔ１０１／２細胞の２４時間の前処理によって、ＤＭＢＡおよびＭＣＡにより誘発される変換から細胞を保護する化学発癌抑制遺伝子の発現が上方調節されると考えられる。
【０１０５】
正常な前立腺細胞においてルナシンにより上方調節された１２１個の遺伝子に関するバイオインフォマティクス解析では、２５％を超える遺伝子が、ＣｐＧアイランドから（１０ヌクレオソーム離れて）０〜２，０００ｂｐまでに位置することが明らかにされているが、これは、ゲノムにおける遺伝子のランダム分布の観点からだけも大きな意義がある。腫瘍形成性前立腺細胞系（ＲＷＰＥ‐２）におけるこれらの化学発癌抑制遺伝子のルナシンによる上方調節が見られないことは、発癌に特徴的なＣｐＧアイランドのシトシンメチル化およびクロマチン低アセチル化の増大に起因する可能性がある。
スクリーニングアッセイ
本発明はさらに、本発明の方法において有用な生物学的に活性な物質について、ルナシンまたはルナシンの類似体、断片もしくは変異体の潜在的な供給源をスクリーニングするために使用できるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイも提供する。本発明の一実施形態においては、ＨｅＬａ細胞およびニワトリ赤血球細胞の酸抽出タンパク質から精製されたコアヒストン、ならびに組換えヒストンＨ３（Ｕｐｓｔａｔｅ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅより市販）を、ルナシンの存在下または非存在下でＰＣＡＦヒストンアセチラーゼ酵素を使用したヒストンアセチラーゼ（ＨＡＴ）反応のテンプレートとして使用する。本発明の好適な実施形態においては、ルナシンまたはルナシンの類似体、断片もしくは変異体の潜在的供給源を以下の通りスクリーニングする。まず、コアヒストンテンプレートおよびルナシン試料（１０：１  ｗ／ｗ）を、氷中で５分間および２５℃にて１０分間インキュベートした後、溶液を１×ＨＡＴ反応混合物、１μＭアセチルＣｏＡおよび５μＬのＰＣＡＦ（Ｕｐｓｔａｔｅ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの推奨濃度に基づく）に加える。混合物を、２５０ｒｐｍで１時間振盪させながら、３０℃にてインキュベートする。β‐メルカプトエタノールを含有するＬａｅｍｍｌｉ停止緩衝液（１：１  ｖ／ｖ）を加え、５分間煮沸し、氷中で１５分間急冷することによって、反応を停止させる。ＰＣＡＦ  ＨＡＴ反応の生成物を１６％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ上で泳動し、ニトロセルロース膜上にブロットし、ジアセチル化ヒストンＨ３（Ａｃ‐Ｌｙｓ１３＋Ａｃ‐Ｌｙｓ１４  Ｈ３）および／またはＡｃ‐Ｌｙｓ１４ヒストンＨ３に対して産生される一次抗体の後、ＨＲＰ結合二次抗体で免疫染色する。抗体複合体の化学発光シグナルを、標準の化学発光試薬を使用して視覚化し、コダックＢｉｏＭＡＸフィルムに曝露し、現像して、デジタルスキャナおよびＳｉｌｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（米国ユタ州オレム）製のＵＮ‐ＳＣＡＮ‐ＩＴソフトウェアプログラムを使用してスポットデンシトメータで測定することができる。
【０１０６】
このｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＨＡＴアッセイは、時間と費用を要する細胞培養物および／または動物実験に頼ることなく、種々の供給源から誘導されるルナシン（実施例５および６を参照）の生物活性を判定するために使用することができる。ＳＲＥＢＰ転写活性化因子によるＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素遺伝子の発現の活性化には、ヒストンＨ３のアセチル化が必要であり（２４）、ヒストンＨ３のアセチル化を阻害するルナシンの能力によって、ＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素の発現が低減され、その結果、肝臓におけるコレステロールの生合成が低減される。
ルナシンの供給源
天然のルナシンは、大豆の種子中、ならびに市販の大豆タンパク質供給源（１９）、および大麦（３５）や小麦（３６）などの他の種子供給源に由来するその類似体から多量に見つけることができる。種子発生のＤＮＡ核内倍加ステージにおけるルナシンの生物学的役割により（１８）、ルナシンおよびその類似体は、同様に他の種子産生植物（被子植物）の内乳および子葉でも発見されることが予想される。
【０１０７】
本発明のポリペプチドは、当該技術分野で周知のいくつかの方法で得ることができる。例えば、本発明の適用範囲を本発明のペプチドを得るいずれか特定の方法に限定することを意図するものではないが、ルナシンならびにその類似体、変異体および断片は、従来のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ｆ‐Ｍｏｃまたはｔ‐Ｂｏｃ化学を含むがこれに限定されない、市販の自動化手順を使用して化学的に合成することができる。ポリペプチドの精製法も当該技術分野で周知であり、これらの方法には、陽イオンおよび陰イオン交換クロマトグラフィ、免疫アフィニティクロマトグラフィ、およびサイズ排除クロマトグラフィが含まれるが、これらに限定されない。目的によっては、組換え系でポリペプチドを産生するのが好ましい。
【０１０８】
タンパク質の断片は、いくつかの方法で（例えば、組換え手段、タンパク質分解、または化学合成によって）産生することができる。ポリペプチドの内部または末端断片は、ポリペプチドをコードする核酸の片側の末端（末端断片の場合）または両側の末端（内部断片の場合）から１つ以上のヌクレオチドを取り出すことによって生成することができる。突然変異ＤＮＡの発現によって、ポリペプチドの断片が産生される。したがって「末端から取り出す」エンドヌクレアーゼによる消化により、断片の配列をコードするＤＮＡを生成することができる。また、タンパク質の断片をコードするＤＮＡも、ランダム剪断、制限消化、または上述の方法の組み合わせによって生成することができる。
【０１０９】
また、断片も、従来のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ｆ‐Ｍｏｃまたはｔ‐Ｂｏｃ化学などの当該技術分野で既知の技法を使用して化学的に合成することができる。例えば、本発明のペプチドは、断片の重複のない所望の長さの断片に任意に分割することもできれば、所望の長さの重複した断片に分割することもできる。
【０１１０】
タンパク質のアミノ酸配列変異体は、タンパク質またはタンパク質の特定のドメインもしくは領域をコードするＤＮＡのランダム突然変異誘発により調製することができる。有用な方法には、ＰＣＲ突然変異誘発および飽和突然変異誘発が含まれる。また、ランダムなアミノ酸配列変異体のライブラリも、一組の縮重オリゴヌクレオチド配列の合成により生成することができる（変異体ライブラリのタンパク質のスクリーニング法については、本明細書の別記する）。
【０１１１】
ルナシンペプチド類似体、断片および変異体のスクリーニング：ルナシンペプチドならびにその類似体、断片および変異体の存在および量は、ルナシンペプチドの生理活性カルボキシル末端に対して産生されるルナシン抗体でウェスタンブロットを免疫染色することにより判定することができる（実施例３を参照）。ルナシンペプチドならびにその類似体、断片および変異体の生理活性は、実施例４および実施例８に記載のようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＨＡＴアッセイを実施することにより判定および定量分析することができる。
ルナシンの天然供給源
ルナシンは、自然界に存在し、大豆の種子、ならびに市販の大豆タンパク質供給源（１９）、および大麦（３５）や小麦（３６）などの他の種子の供給源に由来するその類似体から得られる。ルナシンを得るいずれかの方法に限定することを意図するものではないが、ルナシンは、以下の大豆供給源から抽出することができる：フレークまたは粉末形態の大豆粉、大豆タンパク質濃縮物、および大豆分離物（実施例３を参照）。
【０１１２】
大豆フレークは、通常、大豆を脱皮、脱脂および粉砕することによって産生され、典型的には無水ベースで約６５％（重量）未満の大豆タンパク質を含有する。また、大豆フレークは、可溶性炭水化物、不溶性炭水化物（例えば、大豆繊維）、および大豆に固有の脂肪も含有する。大豆フレークは、例えばヘキサンで抽出することによって脱脂することができる。大豆粉、粗挽き大豆、および挽き割り大豆は、ハンマーミルまたはエアジェットミルなどの粉砕器および製粉器で大豆フレークを所望の粒径まで粉砕することにより、大豆フレークから製造される。粉砕した物質は、典型的には、乾熱で熱処理するか湿熱で蒸らし、挽いたフレークを「トースト」して、大豆に含まれる栄養分吸収阻止要素（Ｂｏｗｍａｎ‐ＢｉｒｋおよびＫｕｎｉｔｚトリプシン阻害剤、ならびに他のプロテアーゼ阻害剤を含む）を不活化する。
【０１１３】
本発明の一実施形態において、トースティングは、プロテアーゼ阻害剤の活性を破壊する条件下では実施されない。本発明の好適な実施形態において、トースティングは、キモトリプシン阻害剤の活性を破壊するのに十分な時間または熱で実施されない。物質中の大豆タンパク質の変性を防止し、大豆物質への水の添加および大豆物質からの水の除去に伴う費用を避けるために、多量な水の存在下で粉砕フレークを加熱処理することは避けられる。粉砕・加熱処理して得られた物質は、物質の平均粒径に応じて大豆粉、粗挽き大豆、または挽き割り大豆となる。大豆粉は、一般的に約１５０．ｍｕ．ｍ未満の粒径を有し、粗挽き大豆は、一般的に約１５０〜約１，０００．ｍｕ．ｍの粒径を有し、挽き割り大豆は、一般的に約１，０００．ｍｕ．ｍを超える粒径を有する。
【０１１４】
大豆タンパク質濃縮物は、典型的には無水ベースで約６５（重量）％〜約９０（重量）％未満の大豆タンパク質を含有し、主要な非タンパク質成分は繊維である。大豆タンパク質濃縮物は、典型的には、脱脂大豆フレークを水性アルコール溶液または酸性水溶液のいずれかで洗浄して、タンパク質および繊維から可溶性炭水化物を取り除くことにより、脱脂大豆フレークから形成される。
【０１１５】
より高度に精製された大豆タンパク質物質である大豆タンパク質分離物（単離大豆タンパク質とも呼ばれる）は、無水ベースで少なくとも約９０（重量）％の大豆タンパク質を含有し、可溶性炭水化物または繊維をほとんど含まないように加工される。単離大豆タンパク質は、典型的には、大豆タンパク質および水溶性炭水化物をアルカリ性水性抽出物で脱脂大豆フレークまたは大豆粉から抽出することにより形成される。水性抽出物は、可溶性タンパク質および可溶性炭水化物とともに、抽出物に溶解しない物質（主に、繊維）から分離される。次いで、抽出物は、典型的には酸で処理して抽出物のｐＨをタンパク質の等電点に調整し、抽出物からタンパク質を沈殿させる。沈殿したタンパク質は、可溶性炭水化物を保持する抽出物から分離され、任意のｐＨ調整ステップを行った後に乾燥させられる。
ルナシンおよびルナシンに富んだ組成物の供給源の抽出
ルナシンおよびルナシンに富んだ組成物は、大豆に含まれる天然プロテアーゼ阻害剤とともに、大豆タンパク質の低分子量アルブミン画分から得ることができる（３７、３８）。また、大豆プロテアーゼ阻害剤の抽出手順を使用して、ルナシンを抽出し、ルナシンに富んだ組成物を得ることもできる。
【０１１６】
大豆プロテアーゼ阻害剤の抽出方法には、当該技術分野で既知のものがある。例えば、以下すべての全体が参考として本明細書で援用される、米国特許第７２３５２６９号（Ｋｏｎｗｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ）、米国特許第４７９３９９６号、第５２１７７１７号、第５５０５９４６号（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．）、２００３年４月３日出願の米国特許出願第２００３／００６４１２１号（Ｋｏｎｗｉｎｓｋｉ、ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第７２３５２６９号（Ｓｉｎｇｅ）を参照されたい。但し、これまでの大豆プロテアーゼ阻害剤の抽出方法は、ルナシンの収率を最適に調節することに焦点が置かれていない。本発明の組成物の生物活性は、抽出を実施する前にルナシン濃縮のためのルナシン抽出に関して出発物質の供給源を事前にスクリーニングすることにより、改善することができる。本発明の好適な方法では、本発明の方法に使用する前に、ルナシンの潜在的供給源がスクリーニングされ、ルナシン濃縮が測定される。
【０１１７】
ルナシンに富んだ組成物を得る方法の以下のさらなる例は、本発明をいずれか特定のルナシン抽出方法に限定するものとして意図されるものではない。脱脂大豆粉は、６０％エタノールで抽出し、冷アセトンで沈殿させた後、多段階カラムクロマトグラフィにかけることができる。プロテアーゼ阻害剤は、（他のタンパク質とともに）６０％エタノールに溶解する。次いで、プロテアーゼ阻害剤を冷アセトンで沈殿させ、遠心沈殿させ、水に再溶解し、さらなる精製用の粗抽出液を作成する（３７）。本手順の変形は、ＣＭセルロースおよびＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィでのさらなる精製のための出発原料として使用された大豆エキスを単離するために、Ｏｄａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（３８）によって使用された。本手順では、室温にて脱脂大豆粉を６０％エタノール（４：１）で抽出した後、２倍容量の冷アセトンを加え、沈殿物を水に再溶解し、蒸留水で透析し、ｐＨを４．０に調整した後、さらに５ｍＭのＮａＡｃｅｔａｔｅ、ｐＨ４．０で透析する。
【０１１８】
ルナシンの富んだ組成物を得る別の方法には、大豆タンパク質の低分子量画分を抽出することによる方法がある（３９、４０）。本手順では、高塩濃度の緩衝溶媒（０．１ＭのＮａＰｈｏｓｐｈａｔｅ緩衝液、ｐＨ７．５、０．５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦ、５ｍＭのＤＴＴ）を使用して、大豆粉から総タンパク質を抽出する。蒸留水に対して透析することによって、溶液中に大豆アルブミンが残る。なぜなら、大豆アルブミンは水溶性であり、不水溶性のグロブリンが沈殿するためである。アルブミン溶液を凍結乾燥させ、最小容量に再溶解して、多量のルナシンペプチドを含有するであろうアルブミン濃縮物を得る。
【０１１９】
低分子量アルブミンおよびプロテアーゼ阻害剤に富んだ大豆抽出物のさらなるルナシン精製は、陰イオン交換または分子排除クロマトグラフィおよび免疫アフィニティクロマトグラフィによって達成することができる。陰イオン交換樹脂の例には、ＤＥＡＥセファデックス、ＱＡＥセファデックス、ＤＥＡＥセファロース、ＱＡＥセファロース、ＤＥＡＥセファセル、ＤＥＡＥセルロース、およびＱＡＥセルロースがある。分子排除樹脂の例には、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ‐２５（ペプチド１〜５ｋＤａを分離）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ‐５０（タンパク質１．５〜３０ｋＤａを分離）がある。免疫アフィニティカラムは、ルナシン抗体を使用して大豆タンパク質画分からルナシンペプチドを捕捉することにより調製することができる。
【０１２０】
以下の実施例３および４では、以下のようにしてルナシンに富んだ種子抽出物を得た。本明細書に記載の別の実験で生物学的に活性なルナシンを含有することが判明した大豆タンパク質濃縮物を、０．１×ＰＢＳを用いた一段階緩衝液抽出で出発物質として使用し、次いで遠心分離によって上澄みを分離した。約２倍容量のアセトンを上澄みに加えて、フィルタバッグを用いた遠心分離によって沈殿物を分離した後、真空乾燥させて、ルナシンに富んだ種子抽出物を得た。本発明の特定の実施形態において、本手順の変形例では、アセトン沈殿の代わりに、緩衝液抽出後に上澄みを７５℃まで真空加熱することによって原体積の最高１０分の１まで濃縮した後、凍結乾燥させて粉末形態のルナシンに富んだ種子抽出物を得る。
投与
組成物は、経口投与、局所投与、経皮投与または体内への直接注射を含めたいくつかの異なる経路を使用して投与することができる。本発明の実施において使用する組成物の投与は、全身投与（すなわち、上述の経路のいずれかを介した被験体全体への投与）であってもよければ、局所投与（すなわち、上述の経路のいずれかを介した被験体の特定の疾患または病態がある特定の部位への投与）であってもよい。
【０１２１】
また、本発明の方法、キットおよび組成物は、高いコレステロール値または脂質値に関連または由来する障害を治療または予防する適応がある別の組成物または治療（例えば、前記障害に関連する症状および合併症を治療、防止または最小化するために通常投与される、スタチン（例えば、ロバスタチン）、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、抗不整脈剤、抗コレステロール血症剤、利尿剤、ドーパミン受容体作動薬、ドーパミン受容体拮抗薬、または血管拡張剤）との「併用療法」で使用することができる。これらの薬物には使用に伴う特定の欠点があるが、それらのいくつかは、本発明の組成物と併せて投与した場合に治療効果を達成するのに必要な用量を低減することにより改善することができる。
投薬
本発明の一例示的実施形態においては、生成物を消費する個体におけるコレステロール値を低下させるルナシンペプチドの有効量を含有する生成物が提供される。但し、ルナシンの有効量は、本組成物を消費する個体の大きさ、体重、健康および所望の目標により少なくとも一部が変動することを理解しなければならない。したがって、少なくとも１つの実施形態において、個体に提供するルナシンの有効量は、毎日２５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇであると考えられる。
【０１２２】
本発明の組成物は、関連のある個々の被験体における特定の必要性に応じて、種々の用量で投与し、本発明の教示に基づき有効な治療濃度を提供することができる。選択された組成物の活性、被験体の生理特性、被験体の疾患または病態の程度または性質、および投与方法などの因子によって、選択された組成物の有効量を構成する要素が決まる。一般的に初回量は、特定の被験体の治療に最適な用量を決定するために変更される。適切な用量は、ヒトまたは個体の大きさ、体重、健康、年齢および性別、罹患体の所望の目的、組成物が投与される病態の重症度、治療に対する反応、本組成物と相互作用する（本組成物を強化または阻害する）可能性がある、罹患体に投与されている他の薬物の種類および量、ならびに肝臓および腎臓の機能などの他の薬物動態学的考慮事項などの因子のいずれかまたはすべてを考慮することにより選択することができる。これらの考慮事項は、当該技術分野で周知であり、標準的な教材に記載されている。
【０１２３】
本発明のいずれかの実施形態の治療有効量は、当該技術分野の通常の技能を有する薬理学者および臨床医に既知の方法を使用して決定される。例えば、有効量は、治療中の罹患体がコレステロール値、総コレステロール値、ＬＤＬコレステロール値または脂質値の低下を示す時まで、本発明の組成物量を増加させながら投与することにより、主観的に決定することができる。組成物、コレステロールおよび脂質の血中値は、定期的な生物学的および化学的アッセイを使用して測定することができ、これらの血中値は、投与経路に適合させることができる。その後、最も所望のレベルのコレステロール低減をもたらす血中値および投与経路を使用して、治療のための医薬組成物の「有効量」を確立することができる。
【０１２４】
投与経路と並行して組成物を滴定するこの同一の方法を使用して、本明細書に記載のいずれかおよびすべての障害を治療するための本発明の組成物の治療有効量を確認することができる。さらに、以下に記載のような動物モデルを使用して、特定の疾患または病態に適切な用量を決定することができる。典型的には、最初にｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ試験から得られた用量作用関係によって、被験体への投与に適切な用量に関する有用なガイダンスが得られる。
【０１２５】
コレステロール値、ＬＤＬコレステロール値もしくは脂質値の低減もしくは制御、またはコレステロールもしくはＬＤＬコレステロールの合成に関する本発明の一実施形態において、本発明の方法および組成物は、約５ｎｇ〜約１，０００ｇ、約１００ｎｇ〜約６００ｍｇ、約１ｍｇ〜約５００ｍｇまたは約２０ｍｇ〜約４００ｍｇのルナシンまたはルナシンの機能的に同等の変異体、類似体もしくは断片を含む組成物の用量を包含する。実例として、本発明の組成物の用量単位は、典型的には、例えば、本発明の組成物の約５ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、５００ｎｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、８０ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、５ｇ、１０ｇ、２０ｇ、３０ｇまたは４０ｇを含有し得るが、これらに限定されない。本発明の特定の好適な実施形態において、本発明の組成物は、約２．５〜１００ｍｇ、好ましくは５〜５０ｍｇ、より好ましくは約２５ｍｇのルナシンまたはルナシンの断片、変異体および類似体を含有する。
【０１２６】
ルナシンまたはその断片、変異体および類似体の例示的な用量は、本発明の教示に従って、平均体重が６０ｋｇのヒトおよび他の個体の場合に０．０００１ｍｇ〜２００ｍｇ、好ましくは２．５ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは２５ｍｇ〜５０ｍｇの範囲となるが、代替の用量も本発明の適用範囲内に含まれるものとして企図される。局所投与のための組成物および方法に関する本発明の特定の好適な実施形態において、ルナシンまたはその断片、変異体および類似体は、２５μｇ／ｍＬ〜２５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは５０μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１００μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは約２５０μｇ／ｍＬのレベルで存在する。経口投与のための組成物および方法に関する本発明の特定の好適な実施形態において、ルナシンまたはその断片、変異体および類似体は、０．０１ｍｇ／体重ｋｇ〜１００ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは０．０５ｍｇ／体重ｋｇ〜５０ｍｇ／体重ｋｇ、より好ましくは０．５ｍｇ／体重ｋｇ〜２．５ｍｇ／体重ｋｇ、およびさらにより好ましくは０．２ｍｇ／体重ｋｇ〜１．５ｍｇ／体重ｋｇのレベルで個体に提供される。
【０１２７】
用量は、１日当たり１回〜約４回の用量で、または治療効果を誘引するためには１日当たり多数回の用量で投与することができる。剤形は、所定の投与量を達成するために使用される所望の投与頻度、ならびに送達経路に合わせて選択することができる。
【０１２８】
治療効果を誘引するのに必要な治療薬の量は、例えば、血清への薬剤の吸収速度、薬剤の生物学的利用能、ならびにＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素および／またはＬＤＬ受容体の発現または作用を調整する効力を基にして、ならびに総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールの低減を監視することにより、実験的に決定することができる。これらのパラメータの決定は、当該技術分野の適用範囲内に十分含まれる。
調合物
また、本発明は、本発明の組成物を含有する調合物にも関する。本発明の生成物および組成物は単独で使用することもできれば、あるいは食品、散剤、バー、カプセル剤、シェイク、およびその他の個体が消費する周知の生成物中で使用することもできる。
【０１２９】
好適な一実施形態において、本発明の組成物は、食事に適した賦形剤、希釈剤、担体、または食品と一緒にされる。本発明の好適な実施形態において、調合物は、丸剤、錠剤、カプセル剤、散剤、フードバーの形態または類似の剤形である。
【０１３０】
調合物は、液体または固体の調合物（飲料、滅菌注射液、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、散剤、ドロップ、懸濁液またはシロップ剤、軟膏、ローション剤、クリームペースト、ゲルを含む）である、本発明の特定の組成物を補充した栄養補給剤、製剤、ビタミン剤、食品添加物または食品など、広範な種類のものであり得る。
【０１３１】
調合物は、都合のよい用量形態に包装され、他の活性成分も含み、ならびに／または従来の賦形剤、薬学的に許容される担体および希釈剤を含有し得る。また、薬草療法および治療に本発明の組成物を含めることも、本発明の好適な部分である。
【０１３２】
医薬および化粧品の両用途において本発明の組成物を局所塗布するのに好適な調合物は、局所塗布に適した賦形剤を使用する。局所調合物は、典型的にはゲル、軟膏、散剤または液体であるが、所望の表面において規定量の活性成分を放出する制御型調合物も望ましい。調合物は、表皮を介した活性部分の浸透性を高める物質を含有し得る。このような浸透剤には、例えば、ＤＭＳＯ、種々の胆汁酸塩、無毒性界面活性剤などが含まれる。化粧品／医薬組成物の標準的な成分は、当該技術分野で周知であり、医薬品の局所塗布用の調合物については、参考として本明細書で援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．に記載されている。化粧品の調合物は多種多様であり、実務家に周知である。
【０１３３】
本発明の好適な一実施形態においては、厳密に化粧品の目的であるか、医薬／化粧品の目的であるかにかかわらず、活性成分の局所使用のための組成物が企図される。
【０１３４】
本発明のいくつかの実施形態は、以下の疾患または病態（コレステロール値、総コレステロール値、ＬＤＬコレステロール値または脂質値の上昇、癌性腫瘍、アテローム硬化症、高血圧、肥満、糖尿病および腎臓疾患を含むがこれらに限定されない高脂血症に関連するいずれかの疾患）の１つ以上を治療する方法であって、これらの疾患または病態の１つに罹患する罹患体を、本発明の方法に従って、生物学的に活性なレベルのルナシンまたはその機能的に同等の断片、変異体もしくは類似体を含む組成物で治療することを含む、方法を包含する。本発明の別の実施形態は、特定のコレステロール値、総コレステロール値、ＬＤＬコレステロール値または脂質値を維持することを望む個体を、本発明の方法に従って、生物学的に活性なレベルのルナシンまたはその機能的に同等の断片、変異体もしくは類似体で治療することを含む方法を包含する。
【０１３５】
本発明の物質の主な用途はヒトを対象としたものであるが、治療が家畜もしくは農用動物または実験動物で望まれる場合もあり得る。実際に、本発明の一態様として、本発明の組成物の安全性および有効性を確認するための実験動物の使用がある。したがって、コレステロール値を低減または制御する個々の製剤の能力を確認し、個々の製剤が毒性でないことを保証するために、ヒトでの使用が意図される生成物をラット、マウスまたはウサギなどの実験動物に適用することができる。直前に記載の通り、品質管理の状況下における本発明の物質の使用も、本発明の一部である。
ルナシンの生物活性を維持するまたは向上させる方法
本発明の別の例示的実施形態においては、ルナシンペプチドまたはルナシンペプチド誘導体の有効量を含有する組成物、および組成物を消費する個体のコレステロール値を一緒に低下させる１つ以上のプロテアーゼ酵素阻害剤を含む組成物が提供される。
【０１３６】
プロテアーゼ酵素阻害剤は、ルナシンを消化から保護することで、適切な目標領域への吸収および送達を促進する作用を持つ。適切なプロテアーゼ酵素阻害剤の例には、パンクレアチン、トリプシンおよびキモトリプシンの阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。但し、本発明の適用範囲には、ルナシンならびにルナシンの断片、類似体および変異体と、個体におけるルナシンの吸収または送達を促進することが知られるか、そのような促進が考えられるその他いずれかの組成物または生成物との使用が含まれることを理解しなければならない。
【０１３７】
本発明のさらに別の例示的実施形態においては、個体のコレステロール値を低下させるまたは低減する方法が提供される。本方法は、個体にルナシンペプチドの有効量を含有する生成物を提供することと、本生成物が組成物を消費する個体においてコレステロール値、総コレステロール値、ＬＤＬコレステロール値または脂質値を低下させる、低減するまたは維持すると主張することとを含む。但し、本発明は、本生成物が組成物を消費する個体においてコレステロール値、総コレステロール値、ＬＤＬコレステロール値または脂質値を低下させる、低減するまたは維持すると、種々の方法（示唆、または書面、口頭もしくは電子的手段を介した明示を含むがこれらに限定されない）で主張することを含むことを理解しなければならない。
【０１３８】
本発明の少なくとも１つの実施形態の一態様において、ルナシンペプチドは大豆から得られる。本発明の少なくとも１つの実施形態の別の態様において、ルナシンペプチドは、他の種子植物、または大豆と他の種子植物との組み合わせから得られる。十分な量のルナシンを含有する種子植物は、当該技術分野で周知である。
【０１３９】
本発明の少なくとも１つの実施形態のさらに別の態様において、ルナシンペプチドまたはルナシンペプチド誘導体は、組換えＤＮＡ法を使用してルナシンペプチドもしくはルナシンペプチド誘導体を産生、抽出および精製するか、またはその他の方法で単離ルナシンペプチドを得ることにより得られる。本発明の少なくとも１つの実施形態のさらに別の態様において、ルナシンペプチドまたはルナシンペプチド誘導体は、合成ポリペプチドの産生により得られる。これらのルナシンを得る方法は、当該技術分野で周知である。
ルナシンの部分消化
本発明の驚くべき発見としては、ルナシンの部分消化によって、ルナシンの生物活性は低減または破壊されるのではなく、むしろ実際にはルナシンの生物活性が増強または増大されるという発見がある（以下の図８および実施例６を参照）。したがって、本発明の好適な実施形態は、部分的に消化された生物学的に活性なルナシンペプチドを包含する。
【０１４０】
大豆粉と混合したルナシンに富んだ大豆タンパク質（ＬｅＳＣ＋ＳＦ）のパンクレアチン消化酵素による部分消化によって、ルナシンペプチドの生理活性が増大する（図８）。これは、局所塗布のためのルナシンに富んだ種子抽出物の調製において実際に適用される。
【０１４１】
合成ルナシンは、送達系としてエタノールを使用して局所的に塗布されると、マウスにおける皮膚腫瘍の形成を低減することが明らかにされている（２０）。部分的に消化された生物学的に活性なルナシンを、適切な賦形剤を加えた局所調合物で使用することにより、皮膚腫瘍および癌の形成、光線性角化症、酒さ、染み、そばかす、ならびに細胞分裂および細胞増殖の異常に伴うその他の皮膚疾患を低減することなど、塗布におけるルナシンの有効性を増大させることが可能である。また、この調合物をルナシンの局所送達に使用することで、コレステロール値を低減し、ならびにアテローム硬化症、高血圧、肥満および糖尿病などがあるがこれらに限定されないその他のコレステロール関連疾患を治療することもできる。
【０１４２】
大豆粉が含まれると、消化時にルナシンの生物活性が保護されることが明らかにされている（実施例５を参照）。本発明をいずれか特定の作用機序または作用様式に限定することを意図するものではないが、消化時に大豆粉が含まれることで、ルナシンは完全な消化から保護されるものの、ルナシンの生物活性を増大させる部分消化は行われることが考えられる。
【０１４３】
本発明の一実施形態は、部分的に消化されたルナシンペプチド、その断片、変異体または類似体である。本発明の好適な実施形態は、大豆粉と組み合わせた、部分的に消化されたルナシンペプチド、その断片、変異体または類似体である。本発明の別の好適な実施形態は、局所塗布に適した調合物中における、部分的に消化されたルナシンペプチド、その断片、変異体または類似体である。本発明の別の好適な実施形態は、皮膚障害を治療する方法であって、このような治療を必要とする罹患体に部分的に消化されたルナシンペプチド、その類似体、変異体または断片を局所塗布することを含む、方法である。
【０１４４】
前述の考察、実施形態および例は単に特定の好適な実施形態の詳細な説明を示すだけのものであることを理解しなければならない。また、本発明の趣旨および適用範囲から逸脱することなく、種々の変更および同等物が可能であることが、当業者には明らかになるであろう。
【０１４５】
以下の非限定的な実施例は、本発明をより詳細に例示するために提供するものである。これらの実施例は、本発明の適用範囲を限定するものとして意図されるものではなく、またこれらの実施例をそのように解釈してもならない。これらの反応スキームおよび本発明に基づく組成物の構造を参照すれば、当業者にはその他の手順および適応形態が明らかになるであろう。このような手順は、本発明の適用範囲に含まれると見なされる。特に記載がない限り、量は重量部または重量パーセントの単位をとる。引用した特許および刊行物はすべて、参考として本明細書で援用される。
【実施例】
【０１４６】
以下の実施例は、本発明の特定の好適な実施形態および態様を示し、さらに例証するために提供するものであり、本発明の適用範囲を限定するものとして解釈されるものではない。
（実施例１）
ルナシンがＬＤＬコレステロール値および総コレステロール値を低下させることを実証する実験：スタチン薬による血清コレステロールの低下は、ＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素（コレステロール合成の体内代謝経路における律速酵素）を競合的に阻害することによって達成させる。また、スタチンは、内因性コレステロール合成を低減することによって、肝細胞によるＬＤＬ受容体の発現の上方調節を生じ、これによって血流からの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のクリアランスを増加させる（２５）。１９８５年、Ｍｉｃｈａｅｌ  ＢｒｏｗｎおよびＪｏｓｅｐｈ  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎは、ＬＤＬの低下機序を解明した業績に対してノーベル医学生理学賞を受賞した。
【０１４７】
ＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素およびＬＤＬ受容体の転写調節は、Ｓｔｅｒｏｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ‐Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＥＢＰ）‐１および‐２によって制御される。このタンパク質は、還元酵素およびＬＤＬ受容体遺伝子の５’末端に位置するステロール調節エレメント（ＳＲＥ）と結合する。ＳＲＥＢＰが不活性であると、ＥＲまたは核膜に結合する。コレステロール値が低下すると、ＳＲＥＢＰがタンパク質分解により膜から放出され、核に移動する。ここでＳＲＥＢＰはＳＲＥに結合し、ＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素およびＬＤＬ受容体の転写を上方調節する（２４、２５）。
【０１４８】
ＨｅｐＧ２肝細胞の細胞培養物では、培養培地中のコレステロールを除去することによって、ＳＲＥＢＰを活性化させ、ＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素およびＬＤＬ受容体の発現を増大させることができる。これは、細胞を無血清培地に２４時間曝露することによって達成することができる（３１、３２）。
【０１４９】
以下の関連する実験は、ＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素発現およびＬＤＬ受容体発現に対するルナシンの作用を評価するために実施した。
【０１５０】
第１の実験では、ＨｅｐＧ２細胞（１×１０６）を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で１０μＭ合成ルナシンを用いるか、または用いずに２４時間処理した後、培養培地を無コレステロール培地と交換して、ＳＲＥＢＰを活性化させた。２４時間後、総タンパク質を抽出し、１０μｇのタンパク質を１０％トリス‐グリシンゲル上に充填して、ニトロセルロース膜上に電気ブロットし、ＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素およびアクチンに対して産生される一次抗体で免疫染色した（タンパク質の等しい充填を示すため）。スポットデンシトメータ値は、デジタルスキャンおよびＵｎ‐Ｓｃａｎ  Ｉｔソフトウェアにより得て、３件別々の実験データの平均および標準偏差を表す。結果を図２に示す。
【０１５１】
第２の実験では、ＨｅｐＧ２細胞（１×１０６）を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で１０μＭ合成ルナシンを用いるか、または用いずに２４時間処理した後、培養培地を無コレステロール培地と交換して、ＳＲＥＢＰを活性化させた。２４時間後、総タンパク質を抽出し、１０μｇのタンパク質を１０％トリス‐グリシンゲル上に充填して、ニトロセルロース膜上に電気ブロットし、ＬＤＬ受容体およびアクチンに対して産生される一次抗体で免疫染色した（タンパク質の等しい充填を示すため）。スポットデンシトメータ値は、デジタルスキャンおよびＵｎ‐Ｓｃａｎ  Ｉｔソフトウェアにより得て、３件別々の実験データの平均および標準偏差を表す。結果を図３に示す。
【０１５２】
図２および図３は、ＨｅｐＧ２細胞を無コレステロール培地で２４時間培養した時のＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素（９８％増加）およびＬＤＬ受容体（３４％増加）の上方調節を示す。但し、ルナシンを無コレステロール培地に加えると、ＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素の発現は５０％を超えて低下するのに対し（図２）、ＬＤＬ受容体の発現は６０％を超えて増加している（図３）。
【０１５３】
このルナシンの作用は、ＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素活性を阻害することによって内因性コレステロール合成を低減し、ＬＤＬ受容体発現の増大をもたらすスタチン薬と類似している。但し、本発明がいずれかの明確な作用機序または作用様式に限定されることを意図するものではないが、ルナシンの作用様式は、酵素活性を阻害するのではなく、むしろ転写段階でＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素の発現を阻害すると考えられる点で、スタチン薬と異なると考えられる。スタチン薬のように、ルナシンは、ＬＤＬ‐受容体遺伝子の発現を上方調節する。さらにまた、本発明がいずれかの明確な作用機序または作用様式に限定されることを意図するものではないが、これら２つのＳＲＥＢＰ制御遺伝子に対するルナシンの対照的な作用は、２件別々のコレステロール制御プロモータ／調節配列への共調節転写因子の選択的補充によって説明することができる。
（実施例２）
Ｓｐ１活性化補助因子の発現に対するルナシンの作用
ＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素とは異なり、ステロール枯渇によるＬＤＬ受容体のＳＲＥＢＰ活性化では、ＬＤＬ受容体遺伝子のプロモータ／調節配列におけるＳＲＥＢＰに隣接した部位へのＳｐ１活性化補助因子の補充を増大させる必要がある（２５）。図３に示す通り、無コレステロール培地中のルナシン（ＬＳ）によるＬＤＬ受容体の上方調節は、Ｓｐ１活性化補助因子の利用能およびＬＤＬ受容体プロモータ／調節配列へのＳｐ１活性化補助因子の補充の増大によると思われる。この仮説を検証するために、以下の通り、Ｓｐ１抗体を使用したウェスタン解析により、ルナシン処理培養培地および無コレステロール培地においてＳｐ１値を判定した。ＨｅｐＧ２細胞（１×１０６）を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で集密から２４時間培養した後、培養培地を新しい培養培地または無コレステロール培地（ＳＲＥＢＰを活性化するために）と交換し、１０μＭの合成ルナシンを用いるか、または用いずに処理した。２４時間後、各処理から総タンパク質を抽出し、１０μｇのタンパク質を１０％トリス‐グリシンゲル上に充填して、ニトロセルロース膜上に電気ブロットし、Ｓｐ１およびアクチンに対して産生される一次抗体で免疫染色した（タンパク質の等しい充填を示すため）。スポットデンシトメータ値は、デジタルスキャンおよびＵｎ‐Ｓｃａｎ  Ｉｔソフトウェアにより得て、１つの実験のデータを表す。結果を図４に示す。
【０１５４】
図４は、対照およびルナシン処理培養培地のＳｐ１値に有意差がなかったことを示している。しかし、Ｓｐ１値は、培養培地に比べて無コレステロール培地中で２３％増加した。無コレステロール培地中でルナシンを添加することにより、Ｓｐ１値がさらに約６０％増加した。これはルナシン処理した無コレステロール培地におけるＬＤＬ受容体値の増加を密接に反映している。
【０１５５】
これらの実験のデータは、ステロール枯渇培地中のルナシンによるＬＤＬ受容体発現の増大がＳｐ１転写性活性化補助因子の利用能の増大に起因し得ることを示している。また、ルナシンによるＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素発現の阻害は、細胞内のコレステロール値を低下させ、これによりＳＲＥＢＰを活性化した状態に維持し、結果としてＬＤＬ受容体の発現を上方調節する。したがって、これらのデータは、ルナシンがＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素（コレステロール合成の体内代謝経路における律速酵素）の発現を阻害すると同時に、ＬＤＬ受容体の発現を増大させ、結果として血流からの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のクリアランスを増大させて、個体の総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールを低下させることを示している。
【０１５６】
個体の大部分の循環コレステロールは体内で合成され、ヒトの食事における腸からの２００〜３００ｍｇ／日の摂取量と比べて、平均で１，０００ｍｇ／日合成される。したがって、肝細胞膜内のＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素およびＬＤＬ受容体の量によって触媒されるコレステロールの体内産生は、個体のコレステロール値の調整における単独の最も重要な因子である。したがって、これらの実験は、ルナシンの有効量によって個体のＬＤＬコレステロール値および総コレステロール値が低減されることを示している。
（実施例３）
ルナシンは市販の大豆タンパク質供給源から抽出可能：ルナシンは、大豆タンパク質（１９）、ならびに大麦（４）および小麦（５）などの他の種子供給源に由来するその類似体の市販の供給源から多量に発見されている。ルナシンに富んだ種子抽出物を得るために使用可能な出発原材料に好適な供給源を特定するために、ルナシンの存在について市販の大豆タンパク質生成物をいくつかスクリーニングした。
【０１５７】
使用した手順は、以下の通りであった。異なる市販の供給源（Ｓｅｌａｅ、米国ミズーリ州セントルイス）から得られた大豆タンパク質試料（Ａ〜Ｅ）約５００ｍｇを、室温にて１時間振盪することによりリン酸緩衝食塩水溶液（ｐＨ７．２）５０ｍＬに溶解した。試料を２，５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、水性画分を分離して、別々のチューブに入れた。タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定し、総タンパク質約２０μｇを２つのＢｉｏ‐Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニア州ハーキュリーズ）１６％トリス‐トリシンゲルに充填した。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルの１つ（Ｉ）をＣｏｏｍａｓｉｅブルーで染色し、デジタル画像処理を行う前に脱染色した。５ｋＤａのルナシンバンドを矢印で示す。その他の１つ（ＩＩ）を、ニトロセルロース膜上に電気ブロットし、アフィニティ精製したルナシンポリクローナル抗体（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、米国カリフォルニア州ラモーナ）、次いでＨＲＰ結合ロバ抗ウサギ二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）とともにインキュベートした。ルナシン免疫シグナル（矢印で指示）を、Ａｍｅｒｓｈａｍ製のＥＣＬウェスタンブロットキットを使用して検出する。
【０１５８】
結果を図５に記載する。写真から、ルナシン濃度が供給源の間で大幅に異なることは明らかである。このアッセイは、本発明の組成物および方法の使用における天然ルナシンの供給源を特定する上で有用なツールである。最も多くのルナシンを含有した大豆濃縮物（図５の試料Ａ）を、ルナシンに富んだ種子抽出物（以下の実施例およびこれらが参照される図では「ルナシンに富んだ大豆濃縮物」または「ＬｅＳＣ」と呼ぶ）を産生するための緩衝液抽出手順において出発物質として使用した。
（実施例４）
調合したルナシンに富んだ大豆濃縮物（ＬｅＳＣ）および大豆粉（ＳＦ）を補充したＬｅＳＣは多量のルナシンを含有：この実験では、ルナシンに富んだ大豆濃縮物（ＬｅＳＣ）および大豆粉を補充したＬｅＳＣ中のルナシン量を評価した。留意されたい点は、本発明の特定の実施形態において、ルナシンに富んだ種子抽出物が大豆濃縮物よりむしろ大豆分離物または他の大豆生成物から得られる点である。
【０１５９】
ルナシンに富んだ大豆濃縮物は、最初に、実施例３に記載の通り、ルナシンポリクローナル抗体に使用したウェスタンブロット解析によって、多量のルナシンを含有する市販の大豆タンパク質製剤を特定することによって産生した。次いで、最も多くルナシンを含有することが特定された大豆タンパク質濃縮物を一段階緩衝抽出手順（０．１×ＰＢＳ  ｐＨ７．２）において出発物質として使用し、遠心分離によって上澄みを分離した。２倍容量のアセトンを上澄みに加えて、フィルタバッグを用いた遠心分離によって沈殿物を分離した後、真空乾燥させて、ルナシンに富んだ大豆濃縮物を得た。
【０１６０】
望ましくない過剰な消化に対するルナシンの抵抗性を高める取り組みによって、ルナシンンの生物学的利用能が向上し、摂取時の生理活性が保持され、その結果、本発明の少なくとも１つの好適な実施形態、すなわち、ルナシンに富んだ種子抽出物および大豆粉を含む組成物が発見された。
【０１６１】
本発明の少なくとも１つの実施形態において、天然のルナシンを含む本発明の組成物は、使用する大豆濃縮物の量によって制御することができる総タンパク質およびルナシンの含有量を変更し、使用する大豆粉の量によって制御することができる消化からのルナシン保護量を変更することによって、本発明の特定の方法における使用に対して最適に調整することができる。
【０１６２】
食品をベースとした品目では、生成物中のプロテアーゼ阻害剤の量を制限することが望ましい場合もある。例えば、参考として本明細書で援用される、２００７年４月２６日出願の米国特許出願第２００７００９２６３３号では、いくつかの大豆生成物の標準的な加工の一部に、Ｂｏｗｍａｎ‐ＢｉｒｋおよびＫｕｎｔｚ阻害剤などの栄養分吸収阻止要素を不活性化する熱処理が含まれることが教示されている。したがって、本発明の好適な実施形態において、ルナシンおよび大豆粉を含む組成物は、経口用途に望ましくないレベルの栄養分吸収阻止要素を有するには十分でないが、消化中のルナシンの生物活性を保護するには十分であるレベルのプロテアーゼ阻害剤を有するように、本明細書に記載のまたは当業者に既知の調製法によって最適に調整される。
【０１６３】
大豆濃縮物および大豆粉の５０：５０の混合に関する臨床試験では、ＬＤＬコレステロールの２０〜３０％の低減がもたらされた（２６、２７）。これらの臨床試験は、ルナシンがＬＤＬコレステロールを低減する際の大豆濃縮物の活性要素であることを認識せずに実施したため、混合物中に存在するルナシンの値は制御されなかった。本発明は、ルナシンの濃度を最大にし、したがってコレステロールに関連する用途における治療の組成物の活性を最大にするために、本発明の出発物質および最終生成物中のルナシン濃度を測定する改善された方法を教示している。本発明の少なくとも１つの好適な実施形態において、大豆粉とルナシンに富んだ種子抽出物との比率は、１０：９０〜５０：５０、より好ましくは２０：８０〜４０：６０、より好ましくは約３０：７０（大豆粉：大豆濃縮物）である。本発明の好適な実施形態において、大豆粉とルナシンに富んだ種子抽出物との比率は、ルナシンの生物学的に活性な濃度、および大豆粉による消化からの十分な保護を提供する比率である。
【０１６４】
以下のいくつかの実験では、大豆粉（ＳＦ）を出発大豆濃縮物に加えた（３０：７０  ｗ／ｗの混合）後、０．１×ＰＢＳ  ｐＨ７．２を用いた緩衝液抽出およびアセトン沈殿を実施し、ルナシンに富んだ大豆濃縮物と大豆粉の混合物（ＬｅＳＣ＋ＳＦ）を得た。
【０１６５】
この実験で使用したウェスタンブロット解析手順は、以下の通りであった。ＬｅＳＣ、ＳＦおよびＬｅＳＣ＋ＳＦの総タンパク質約２０μｇを、１６％トリス‐トリシンゲルに電気泳動し、ニトロセルロース膜上へ電気ブロットした。ブロットをルナシンのポリクローナル抗体、次いでＨＲＰ結合抗ウサギ二次抗体とともにインキュベートした後、ルナシン免疫シグナルをＥＣＬキットで検出した。図６に示す通り、ＬｅＳＣおよびＬｅＳＣ＋ＳＦは、多量のルナシンを含有した。
（実施例５）
大豆粉と合わせたルナシンに富んだ種子抽出物は、消化酵素で消化された時でも生理活性を保持
ＬｅＳＣ（Ａ）、ＬｅＳＣ＋ＳＦ（Ｂ）、消化ＬｅＳＣ＋ＳＦ（Ｃ）、消化ＬｅＳＣ（Ｄ）、消化大豆タンパク質分離物（Ｅ）および消化大豆濃縮物（Ｆ）の生物活性を、Ｈ３ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）アッセイを使用して測定した（実施例８を参照）。ＬｅＳＣ、ＬｅＳＣ＋ＳＦ、大豆タンパク質分離物および大豆濃縮物の総タンパク質約１００ｍｇを、１：１（ｗ／ｗ）でパンクレアチン（Ｓｉｇｍａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ミズーリ州セントルイス）を混合し、４０℃にて３０分間インキュベートすることによって消化させた。ＨＡＴアッセイが作用していることを確認するために、合成ルナシン（＋ｓｙｎＬ）による処理を含めた。合成ルナシンは、ＨＡＴアッセイのテンプレートとしてニワトリ赤血球（Ｕｐｓｔａｔｅ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州ビルリカ）から単離したコアヒストンを使用して、ヒストンアセチラーゼ酵素（ＰＣＡＦ）によるヒストンＨ３のアセチル化を低減させた。試料タンパク質約１０μｇを、コアヒストン１μｇとともにインキュベートした後、ＰＣＡＦ酵素およびアセチルＣｏＡ基質とのＨＡＴ反応にかけた。反応生成物を、１６％トリス‐トリシンゲル上で泳動し、ニトロセルロース膜上へ電気ブロットした。ブロットを、（ヒストン１４およびヒストン１０でジアセチル化された）アセチル化Ｈ３に対して産生される一次抗体およびＨＲＰ結合抗ウサギ二次抗体とともにインキュベートした後、ＥＣＬキットを使用してシグナルを検出した。弱いシグナルは、ルナシンペプチドがヒストンＨ３のアセチル化を防止したことから、生理活性を有することを示した。強いシグナルは、ルナシンペプチドが消化され、不活性になったため、ヒストンＨ３のアセチル化のレベルに影響を及ぼさなかったことを示した。結果を図７に示す。
【０１６６】
未処理の対照に比べて、合成ルナシンの存在下でＨ３アセチル化の顕著な低下が認められた。ＬｅＳＣ（図７のＡ）およびＬｅＳＣ＋ＳＦ（図７のＢ）は、ＰＣＡＦによるＨ３のアセチル化を顕著に低減することができ、このことは両方の大豆タンパク質抽出物に含まれるルナシンが生物学的に活性であることを示した。パンクレアチンによるＬｅＳＣ＋ＳＦ（図７のＣ）の消化は、生物活性を低減させたものの、ＬｅＳＣが単独で消化される場合ほどではなかった（図７のＤ）。ＬｅＳＣのように、多量のルナシンを含有する大豆タンパク質分離物および大豆濃縮物は、パンクレアチンによる消化の後、ルナシンの生物活性を示さなかった（図７のＥおよびＦ）。これらの結果は、調合したＬｅＳＣ＋ＳＦがパンクレアチンによる消化からある程度ルナシンを保護し、ルナシンに生物活性を保持させることを示している。
（実施例６）
調合したＬｅＳＣ＋ＳＦの部分消化によりルナシンの生物活性が増大：消化および未消化のＬｅＳＣおよびＬｅＳＣ＋ＳＦの生物活性を判定するための確証実験を、異なるコアヒストンテンプレートを使用して実施した。今回、本発明者等は、ＨｅＬａ腫瘍細胞から抽出されたコアヒストンを使用した。ニワトリ赤血球細胞とは異なり、酪酸ナトリウム処理したＨｅＬａ細胞に由来するコアヒストンは市販されており（Ｕｐｓｔａｔｅ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）、ヒストンアセチル化の陽性対照として使用することができる。未処置のＨｅＬａ細胞から単離されたコアヒストンを、陰性対照（低レベルのヒストンアセチル化）およびＨＡＴアッセイのテンプレートとして使用した。
【０１６７】
ＰＣＡＦ触媒ＨＡＴ反応のテンプレート（ｔｅｍｐ（‐）対照）としてＨｅＬａ細胞に由来する酸抽出コアヒストン（Ｕｐｓｔａｔｅ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＨＡＴ生理活性アッセイを実施した。陽性対照としては、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）で処理したＨｅＬａ細胞に由来するコアヒストンを使用した。これはＮａＢがヒストンアセチル化を増大させることが知られているヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるためである。ＰＣＡＦによるヒストンＨ３のアセチル化に対する合成ルナシン（＋ｓｙｎＬ）の阻害作用を使用して、ルナシンに富んだ大豆濃縮物（Ａ）、消化ＬｅＳＣ（Ａ  Ｄｉｇ）、ＬｅＳＣ＋ＳＦ（Ｂ）、および消化ＬｅＳＣ＋ＳＦ（Ｂ  Ｄｉｇ）の作用を比較した。１：０．５（ｗ／ｗ）でパンクレアチンを加え、３８℃にて１５分間インキュベートすることにより、ＬｅＳＣおよびＬｅＳＣ＋ＳＦを部分的に消化した。記号の下の数値は、テンプレート（ｔｅｍｐ）の免疫シグナルを使用して正規化したデンシトメータの相対的測定値を示す。低い数値は、ルナシンの生物活性が認められることを示している。
【０１６８】
結果を図８に示す。合成ルナシンの存在下では、Ｈ３アセチル化の顕著な低減が認められた。未消化ＬｅＳＣ（Ａ）およびＬｅＳＣ＋ＳＦ（Ｂ）は、Ｈ３アセチル化レベルの低減を示し、このことは、これらの大豆抽出物に含まれる天然ルナシンが生物学的に活性であったことを示している。ＬｅＳＣ（Ａ  Ｄｉｇ）の部分消化は、生物活性の低減をもたらした。
【０１６９】
驚くべきことに、ＬｅＳＣ＋ＳＦの部分消化は、生物活性の低減よりもむしろ増加をもたらした。本発明がいずれかの明確な機序に限定されることを意図するものではないが、ルナシンは高分子量タンパク質複合体に共有結合し、大豆粉の保護により、部分消化は、単にこれらの結合を分解し、生理活性ルナシンを溶液中に放出するだけで、これを破壊することはないと考えられる。本発明の好適な実施形態において、ルナシンは、使用前に部分消化させる。本発明の別の好適な実施形態において、ルナシンが部分的に消化される時には、大豆粉が存在する。
【０１７０】
ＬｅＳＣ＋ＳＦを、１：０．５（ｗ／ｗ）の比率で新たに調製されたパンクレアチン溶液（蒸留水１０μｇ／ｍＬ）と混合することによって、部分的に消化させた。混合物を、３８℃にて１５分間インキュベートした後、プロテアーゼおよび消化酵素を５分間沸騰させ、次に氷中で急冷することによって不活性化させた。これらの消化条件下でＬｅＳＣ大豆抽出物中のルナシンを消化および不活性化したが（図８のＡ  Ｄｉｇ列）、ＬｅＳＣ＋ＳＦのルナシンの方がより生物学的に活性であった（図８のＢ  Ｄｉｇ列）。但し、ＬｅＳＣ＋ＳＦの部分消化の条件は、ルナシン含有量に関して消化生成物（図６）を分析し、ＨＡＴアッセイを使用して生物活性（図８）を分析することによって、実験的に決定する必要がある。
【０１７１】
パンクレアチンおよびプロテアーゼ酵素の供給源、プロテアーゼ酵素の古さ、またはインキュベーション条件の変動は、消化条件のばらつきをもたらす可能性がある。例えば、部分消化に調製から１カ月後のパンクレアチンを使用すると、上記の同様のインキュベーション条件下で、ルナシンの活性の劣化および低減が生じる。したがって、本発明の好適な実施形態においては、プロテアーゼ酵素の濃度およびインキュベーション時間の許容範囲が、処理した組成物の生物活性を評価するために上記で使用したＨＡＴアッセイなどのアッセイを使用して決定される。本発明の好適な実施形態において、新しいパンクレアチン酵素は、３８℃にて１０分間インキュベートされる。ルナシン抽出物１μｇにつき０．５μｇのパンクレアチンを使用する。
（実施例７）
キモトリプシン阻害剤（Ｃｈｙ）はルナシンの生理活性を保護：大豆に含まれるどのプロテアーゼ阻害剤がルナシンを消化から保護するのかを判定するために、大豆トリプシン阻害因子およびトリプシン＋キモトリプシン阻害剤をＳｉｇｍａから入手し、１：１  ｗ／ｗの比率でＬｅＳＣと混合した。混合物をパンクレアチンで消化し、消化生成物をルナシン抗体で免疫染色した。
【０１７２】
実験の詳細は以下の通りである。ＬｅＳＣ＋大豆トリプシン阻害剤（１：１  ｗ／ｗ）（Ｓｉｇｍａ）ならびにＬｅＳＣ＋トリプシンおよびキモトリプシン阻害剤（１：１  ｗ／ｗ）（Ｓｉｇｍａ）を、３８℃にて１５分間インキュベートすることにより、パンクレアチン（１：１  ｗ／ｗ）で消化した。消化生成物およびＬｅＳＣを、ルナシン一次抗体および標準対照の合成ルナシンを使用して、ウェスタンブロット解析（図９）により分析した。
【０１７３】
ＨＡＴ生物活性アッセイは、ＰＣＡＦ触媒ＨＡＴ反応のテンプレートとしてニワトリ赤血球細胞に由来するコアヒストン（Ｕｐｓｔａｔｅ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して実施した（図１０）。未処理の陰性対照（‐ｓｙｎＬ）と比較したＰＣＡＦによるヒストンＨ３アセチル化に対する合成ルナシン（＋ｓｙｎＬ）の阻害作用を使用して、消化ＬｅＳＣ（Ａ）、消化ＬｅＳＣ＋ｔｒｙ＋ｃｈｙ（Ｂ）、消化ＬｅＳＣ＋ｔｒｙ（Ｃ）、未消化ＬｅＳＣ（Ｄ）および消化ＬｅＳＣ＋ＳＦ（Ｅ）の作用を比較した。記号の下の数値は、未消化ＬｅＳＣ（Ｄ）の免疫シグナルを使用して正規化したデンシトメータの相対的測定値を示す。低い数値は、ルナシンの生物活性が認められることを示している。
【０１７４】
図９および図１０の結果は、ＬｅＳＣ＋トリプシン＋キモトリプシン阻害剤試料においての方が、ＬｅＳＣ＋トリプシン阻害剤試料においてもよりも、ルナシンが消化からより良好に保護されたことを示している。同様に、ルナシンの生物活性を判定するＨＡＴアッセイでは、ＬｅＳＣ＋トリプシン＋キモトリプシン阻害剤の消化の方が、ＬｅＳＣ＋トリプシン阻害剤の消化よりも顕著な生理活性を示した（図１０）。パンクレアチンによるＬｅＳＣの消化は、生物活性の低減をもたらした。これらの結果は、ルナシンに富んだ種子抽出物とともにキモトリプシン阻害剤を含めることは、ルナシンの生物活性の保護に役立つだけでなく、ルナシンの過剰な消化からの保護にも役立つことを示している。
（実施例８）
ルナシンの生物活性を判定するためのスクリーニングアッセイ
ニワトリ赤血球細胞から精製したコアヒストンを、ＰＣＡＦヒストンアセチラーゼ酵素を使用したヒストンアセチラーゼ（ＨＡＴ）反応のテンプレートとして、約２〜１０μＭのルナシンの存在下または非存在下で使用した。コアヒストンテンプレートおよびルナシンに富んだ大豆濃縮物（ＬｅＳＣおよびＬｅＳＣ＋ＳＦ）を混合し（１０：１  ｗ／ｗ）、氷中で５分間および２５℃にて１０分間インキュベートした後、混合物を１×ＨＡＴ反応混合物、１μＭアセチルＣｏＡ、および５μＬのＰＣＡＦ（Ｕｐｓｔａｔｅ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの推奨濃度に基づく）に加えた。反応混合物を、２５０ｒｐｍで１時間振盪させながら、３０℃にてインキュベートした。β‐メルカプトエタノールを含むＬａｅｍｍｌｉ停止緩衝液（１：１  ｖ／ｖ）を加え、５分間煮沸した後、氷中で１５分間急冷することにより、反応を停止させた。ＰＣＡＦ  ＨＡＴ反応の生成物を１６％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ上で泳動し、ニトロセルロース膜上にブロットし、ジアセチル化ヒストンＨ３（Ａｃ‐Ｌｙｓ１３＋Ａｃ‐Ｌｙｓ１４  Ｈ３）に対して産生される一次抗体の後、ＨＲＰ結合抗ウサギ二次抗体で免疫染色した。抗体複合体の化学発光シグナルを、標準の化学発光試薬を使用して視覚化し、コダックＢｉｏＭＡＸフィルムに曝露し、現像して、デジタルスキャナおよびＳｉｌｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（米国ユタ州オレム）製のＵＮ‐ＳＣＡＮ‐ＩＴソフトウェアプログラムを使用してスポットデンシトメータで測定した。図７のＡ列およびＢ列は、未処理の対照に比べて、ＬｅＳＣおよびＬｅＳＣ＋ＳＦで処理した反応混合物ではＨ３アセチル化が低減されていることを示しており、このことは、このスクリーニング法で、ルナシンに富んだ種子抽出物、およびルナシンまたはルナシンの断片、類似体もしくは変異体を含む他の組成物の生物活性を判定できることを示している。同じ図７では、ＬｅＳＣの消化（Ｄ列）によって生物活性は消失するものの、ＬｅＳＣ＋ＳＦの消化（Ｃ列）では生物活性が消失せず、単に生物活性の部分低下が示されるだけであることも確認されている。
（実施例９）
先に記載した組成物のｉｎ  ｖｉｖｏ活性、ならびにキットの治療への利用および治療法は、以下の手順のいずれかにより任意に決定することができる。
【０１７５】
雄イヌ（ビーグル、約９〜約１４キログラム、１〜４歳）に、５．５％のラードおよび１％のコレステロールを補充した標準のドックフードを与える。絶食させたイヌからベースラインの血液試料を採取した後、血漿コレステロールの基準値を得る試験を開始する。次に、イヌを、同様の血漿コレステロール値を有する５匹の動物からなる群に無作為化する。本明細書に記載の治療法に従って、給餌の直前に７日間動物に投薬した。血漿コレステロール測定のため、最終投薬の２４時間後に血液試料を得る。市販のキットを使用したコレステロール酸化酵素法の変形例によって、血漿コレステロール値を測定する。
【０１７６】
任意の代替手順では、ハムスターを６匹の群に分けて、０．５％のコレステロールを含有する管理されたコレステロール食餌を７日間与える。食事性コレステロールの曝露を判定するため、食餌の消費量を監視する。本明細書に記載の治療法に従って、食餌の開始から動物に１日１回投薬する。投薬は経口の強制飼養によって行う。瀕死または体調不良の動物はすべて安楽死させる。７日後に、ケタミンを筋肉内（ＩＭ）注射することによって動物を麻酔し、断頭によって屠殺する。血漿の脂質分析のため、ＥＤＴＡを含有する真空チューブに血液を集め、組織の脂質分析のために肝臓を切除する。脂質分析は、発表されている手順（例えば、Ｓｃｈｎｉｔｚｅｒ‐Ｐｏｌｏｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９９Ａ，４（１９９１），ｐｐ．６６５‐６７０）に従って実施し、データを脂質対対照の低減率として記録する。
【０１７７】
上記の詳細、例およびデータは、本発明の組成物の製造および使用の完全な説明を提供するものである。生成物、組成物および関連する方法は、現在のところ最も実用的で好適な実施形態であると考えられる事項に関連して説明されているものの、本開示を開示された実施形態に限定する必要のないことは理解されるものとする。請求の趣旨および範囲内に含まれる種々の変形および類似の構成を網羅することが意図されており、これらの範囲には、このような変形および類似の構造をすべて包含するように最も広い解釈を適用しなければならない。本開示は、以下の請求項のいずれかおよびすべての実施形態を含む。上で考察または引用したすべての特許、学術論文およびその他の文献は、参考として本明細書で援用される。本明細書で考察もしくは引用した、または以下に列挙するすべての特許、学術論文およびその他の文献も、参考として本明細書で援用される。
【０１７８】
（参考文献）
上で援用された数値参照は、以下の発表された文献および抄録の一覧に対応する。以下に列挙する刊行物はすべて、個々の刊行物がそれぞれ、全体が参考として援用されるものとして具体的かつ個別に記載される場合と同程度に、全体が参考として本明細書で援用される。
【０１７９】
【化１】
0005500989.tif 000004
【０１８０】
【化２】
0005500989.tif 000005
【０１８１】
【化３】
0005500989.tif 000006
【０１８２】
【化４】
0005500989.tif 000007
【図１】
0005500989.tif 000008
【図２】
0005500989.tif 000009
【図３】
0005500989.tif 000010
【図４】
0005500989.tif 000011
【図５】
0005500989.tif 000012
【図６】
0005500989.tif 000013
【図７】
0005500989.tif 000014
【図８】
0005500989.tif 000015
【図９】
0005500989.tif 000016
【図１０】
0005500989.tif 000017
【配列表】
0005500989000001.app