(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）活性炭、（２）無機吸着剤、（３）無機吸着剤と有機吸着剤、（４）無機吸着剤と活性炭、（５）無機吸着剤と有機吸着剤と活性炭、（６）有機吸着剤、及び（７）有機吸着剤と活性炭からなる群より選択される吸着剤に、ヒアルロン酸及び／又はその塩と不純物とを含むヒアルロン酸類溶液を接触させる工程を含み、
前記活性炭が湿潤化処理活性炭であり、
前記無機吸着剤が、活性白土、ＳｉＯ２・Ａｌ２Ｏ３、Ａｌ２Ｏ３・１０ＳｉＯ２・ｘＨ２Ｏ、Ａｌ２Ｏ３・ｘＨ２Ｏ、Ａｌ（ＯＨ）３・ＮａＨＣＯ３、６ＭｇＯ・Ａｌ２Ｏ３・ＣＯ２・Ｈ２Ｏ、ＭｇＯ、ＭｇＯ・Ａｌ２Ｏ３・２ＳｉＯ２、合成ゼオライト、天然ゼオライト、又はベントナイトからなり、
前記有機吸着剤が、セルロース誘導体系樹脂、ポリアミノ酸誘導体系樹脂、セファデクス誘導体系樹脂、キトサン誘導体系樹脂、オクチル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤、又はオクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤からなる、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法。
【請求項２】
（１）活性炭、（２）無機吸着剤、（３）無機吸着剤と有機吸着剤、（４）無機吸着剤と活性炭、（５）無機吸着剤と有機吸着剤と活性炭、（６）有機吸着剤、及び（７）有機吸着剤と活性炭からなる群より選択される吸着剤に、ヒアルロン酸及び／又はその塩と不純物とを含むヒアルロン酸類溶液を接触させ、それによりヒアルロン酸及び／又はその塩を精製する工程を含み、
前記活性炭が湿潤化処理活性炭であり、
前記無機吸着剤が、活性白土、ＳｉＯ２・Ａｌ２Ｏ３、Ａｌ２Ｏ３・１０ＳｉＯ２・ｘＨ２Ｏ、Ａｌ２Ｏ３・ｘＨ２Ｏ、Ａｌ（ＯＨ）３・ＮａＨＣＯ３、６ＭｇＯ・Ａｌ２Ｏ３・ＣＯ２・Ｈ２Ｏ、ＭｇＯ、ＭｇＯ・Ａｌ２Ｏ３・２ＳｉＯ２、合成ゼオライト、天然ゼオライト、又はベントナイトからなり、
前記有機吸着剤が、セルロース誘導体系樹脂、ポリアミノ酸誘導体系樹脂、セファデクス誘導体系樹脂、キトサン誘導体系樹脂、オクチル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤、又はオクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤からなる、ヒアルロン酸及び／又はその塩を製造するための方法。
【請求項３】
前記吸着剤が、（３）無機吸着剤と有機吸着剤、（４）無機吸着剤と活性炭、及び（５）無機吸着剤と有機吸着剤と活性炭からなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記活性炭の量が、ヒアルロン酸類溶液１００重量％に対し、５．０〜２０．０重量％であり、
前記無機吸着剤の量が、ヒアルロン酸類溶液１００重量％に対し、５．０〜２０．０重量％であり、
前記有機吸着剤の量が、ヒアルロン酸類溶液１００重量％に対し、５．０〜２０．０重量％であり、
前記ヒアルロン酸類溶液のｐＨが２〜５である、請求項１ないし３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
活性炭に、前記ヒアルロン酸類溶液を接触させる工程を含む、請求項１ないし４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記接触工程の前に、塩化ナトリウムを前記ヒアルロン酸類溶液に添加する工程を含む、請求項１ないし５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記不純物が、菌体、タンパク質、核酸、低分子化合物、又はエンドトキシンを含む、請求項１ないし６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記不純物が、タンパク質、又はエンドトキシンを含む、請求項１ないし７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
精製後の前記ヒアルロン酸及び／又はその塩の平均分子量が３５０万〜７００万Ｄａである、請求項１ないし８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒアルロン酸類溶液中のヒアルロン酸及び／又はその塩の濃度が１〜１０ｇ／Ｌである、請求項１ないし９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程がクリーン環境下で行われる、請求項１ないし１０の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸類の精製方法及び製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、化粧品の保湿剤の他、眼科、整形外科、皮膚科等で医薬品として用いられている。ヒアルロン酸は、動物組織、例えば、鶏の鶏冠、牛の眼の硝子体等からの抽出物により製造することができるが、夾雑物としてコンドロイチン硫酸等が混入したり、組織内に含まれるヒアルロニダーゼ等によって低分子量化されやすいため、ヒアルロン酸生産能を有する微生物を培養し、培養液からヒアルロン酸を製造すること（発酵法）も行なわれている（非特許文献１及び特許文献１）。【０００３】
抽出法や発酵法によって製造されるヒアルロン酸には、タンパク質や発熱性物質等が不純物として存在するため、これらを分離除去して高純度の製品を得る方法が検討されている。特に製造の初期段階での不純物の除去は、以降の精製工程の負荷の軽減を可能とし、医薬品としても使用可能な高純度な製品を得る方法としての開発が期待されている。その例として、例えば、発酵液にアルコール等の有機溶剤を加えることによりヒアルロン酸を析出し不純物と分離する精製法や、アニオン交換樹脂を用いて、発酵液から発熱性物質やタンパク質等を除去するヒアルロン酸の精製法が開示されている（特許文献２）。【０００４】
【非特許文献１】Journal of General Microbiology, 85, 372-375, 1976
【特許文献１】特公平４−１２９６０号公報
【特許文献２】特開昭６３−１２２９３号公報
【発明の概要】
【０００５】
しかしながら、工業的規模で注射液等の医薬品として使用できる高純度のヒアルロン酸類を得るには（１）初期段階での不純物の除去が十分に為されていないために、後工程への負荷が大きい（２）操作が煩雑な上に、ヒアルロン酸類の回収率が低い等のさらに改善の望まれる点が存在していた。
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、簡便かつ高収率で高純度のヒアルロン酸類を工業的規模で精製するための方法を提供することを目的とする。また、その精製方法に用いられる吸着剤を提供することも目的とする。
【０００７】
本発明者らは、上記目的を解決するために、ヒアルロン酸類含有液から不純物を効率よく分離除去し、高純度のヒアルロン酸類を簡便にかつ効率よく精製する方法について種々検討した結果、ヒアルロン酸類溶液を活性炭と接触させることにより、不純物を効率よく吸着除去できることを見いだし本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明によれば、（１）活性炭、（２）無機吸着剤、（３）無機吸着剤と有機吸着剤、（４）無機吸着剤と活性炭、（５）無機吸着剤と有機吸着剤と活性炭、（６）有機吸着剤、及び（７）有機吸着剤と活性炭からなる群より選択される吸着剤に、ヒアルロン酸及び／又はその塩と不純物とを含むヒアルロン酸類溶液を接触させる工程を含む、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法が提供される。この精製方法によると、不純物を効率よく吸着除去することができる。
【０００９】
また、本発明によれば、（１）活性炭、（４）無機吸着剤と活性炭、（５）無機吸着剤と有機吸着剤と活性炭、及び（７）有機吸着剤と活性炭からなる群より選択される吸着剤に、ヒアルロン酸及び／又はその塩と不純物とを含むヒアルロン酸類溶液を接触させる工程を含む、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法が提供される。この精製方法によると、不純物を効率よく吸着除去することができる。
【００１０】
また、本発明によれば、（１）活性炭、（２）無機吸着剤、（３）無機吸着剤と有機吸着剤、（４）無機吸着剤と活性炭、（５）無機吸着剤と有機吸着剤と活性炭、（６）有機吸着剤、及び（７）有機吸着剤と活性炭からなる群より選択される吸着剤に、ヒアルロン酸及び／又はその塩と不純物とを含むヒアルロン酸類溶液を接触させ、それによりヒアルロン酸及び／又はその塩を精製する工程を含む、ヒアルロン酸及び／又はその塩を製造するための方法が提供される。この製造方法によると、不純物を効率よく吸着除去することにより、純度の高いヒアルロン酸を効率的に製造することができる。
【００１１】
また、本発明によれば、（１）活性炭、（４）無機吸着剤と活性炭、（５）無機吸着剤と有機吸着剤と活性炭、及び（７）有機吸着剤と活性炭からなる群より選択される吸着剤に、ヒアルロン酸及び／又はその塩と不純物とを含むヒアルロン酸類溶液を接触させ、それによりヒアルロン酸及び／又はその塩を精製する工程を含む、ヒアルロン酸及び／又はその塩を製造するための方法が提供される。この製造方法によると、不純物を効率よく吸着除去することにより、純度の高いヒアルロン酸を効率的に製造することができる。
【発明の実施の形態】
【００１２】
〔用語の説明〕
本明細書における「ヒアルロン酸類」には、遊離のヒアルロン酸、及び、本発明の目的を損なわない範囲で使用可能な任意のヒアルロン酸塩（これに限定されるものではないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、リチウム塩などの金属塩や、塩酸塩、リン酸塩、クエン酸塩などの酸付加物など）や水和物、それらの混合物が含まれる。ここで、ヒアルロン酸とは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸とが結合した２糖単位がくりかえし連鎖してなる高分子量の多糖類をいい、各種塩は主にグルクロン酸部分が塩の形となったものをいう。ヒアルロン酸は、折り畳み可能な鎖部分と、Ｄ−グルクロン酸部分のカルボキシル基の負電荷の相互作用によって、空間に展開しやすく、これにより大量の水と結合してゲルを形成することができる。また、低濃度であっても、分子間力が強いため、比較的高い粘性を有する。このような作用から、例えば、関節の湿潤作用、皮膚の柔軟作用などを有し、生理的にもそれらの役割を担っている。
【００１３】
ヒアルロン酸類の中でも、分子量約２００万Ｄａのヒアルロン酸ナトリウムは、分子量約８０万Ｄａのものに比べて医薬品として、変形性膝関節症、肩関節周囲炎、慢性関節リウマチ等の治療に優れた効果を発揮することが知られている（薬理と治療、Ｖｏｌ．２２、Ｎｏ．９、２８９（１９９４）；薬理と治療、Ｖｏｌ．２２、Ｎｏ．９、３１９（１９９４））。また、その他に、外科手術後の癒着防止用として、さらに皮膚科領域、眼科領域においても医薬品としての効果が知られており、一部は臨床的に一般に使用されている。医薬品として用いる場合には、平均分子量が１００万以上のヒアルロン酸類を用いることが望ましい。さらに、入手や取り扱いの容易さを勘案すると、平均分子量１００万〜５００万Ｄａのヒアルロン酸類が医薬品としては望ましく、平均分子量１５０万〜４００万Ｄａのヒアルロン酸類が特に望ましい。また、このような高分子量のヒアルロン酸類は、化粧品用途として使用した際にも、その高い保湿力から優れた効果を発揮する。
【００１４】
医薬品として、ヒアルロン酸類を溶解する注射用溶解液としては、注射用水、生理食塩水等に、酸、アルカリ、リン酸塩のような緩衝剤を含むｐＨ調整剤等を加えた一般に用いられる注射用溶解液（例えば、各国薬局方で認められているもの）を適宜使用することができる。
【００１５】
これらのヒアルロン酸類は、動物組織から抽出する抽出法により製造したものでも、ヒアルロン酸生産微生物菌株を用いて発酵させて得る発酵法で製造したものでもよい。しかしながら、動物組織から抽出したものには、他のムコ多糖などの不純物が比較的多く、分子量も小さいため、発酵法で得られるものを用いることが望ましい。本発明に適した発酵法の一例では、例えばストレプトコッカス属の微生物を使用して既知の方法でヒアルロン酸類を得ることができる。
【００１６】
発酵法により得られた発酵液を本発明の方法等に用いる場合には、既知の方法、例えば、遠心分離や濾過処理等で除菌した液を使用することが望ましい。場合によっては、透析処理、限外濾過等による低分子化合物の除去、精密濾過処理による水不溶微粒子の除去等の操作を行ってもよく、アルコール等の水溶性有機溶媒を添加してヒアルロン酸を析出精製したものを使用してもよい。また、アルミナ等で処理したものを用いてもよい。
【００１７】
本明細書における「ストレプトコッカス」には、ヒアルロン酸を生産することのできるストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の任意の細菌・その変異株が含まれる。特に、特許文献２に記載されたストレプトコッカス・エキＦＭ−１００（微工研菌寄第９０２７号）、特開平２−２３４６８９号公報に記載されたストレプトコッカス・エキＦＭ−３００（微工研菌寄第２３１９号）のような高収率で安定にヒアルロン酸を生産する変異株を用いることが望ましい。ヒアルロン酸の生産に適したストレプトコッカス属の細菌の例としては、他に、これに限定されるものではないが、例えば、ストレプトコッカス・エキ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・エキシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）及びこれらの変異株などが挙げられる。
【００１８】
本明細書における「平均分子量」について、特記しない限り、ヒアルロン酸類の平均分子量を示す際は、粘度平均分子量のことをいう。粘度平均分子量は、当業者が通常行う方法により求めることができる。好ましくは、各国の薬局方等で一般的に用いられている測定方法により求めることができ、より好ましくは、日本薬局方で用いられている測定方法により求めることができる。一例としては、例えば、これに限定されるものではないが、その平均分子量は、極限粘度［η］を用いて、次式により求めることができる。
【式１】
【００１９】
0005603926.tif 000002
【００２０】
本明細書における「活性炭」とは、市販され、一般に用いられている、分離・除去・精製用の多孔質の炭素のことをいい、石炭又は木材等の原料の由来や、薬晶賦活又は水蒸気賦活等の製法に限定されるものではなく、さらに、粉末活性炭、粒状活性炭等の形状や、乾式、湿式などの性状に限定されるものでもない。本発明の方法等においては、これに限定されるものではないが、木材由来の活性炭を用いることが望ましい。また、同様に、水蒸気賦活により製造されたもの（湿式活性炭）を用いることが望ましい。さらに、煮沸等の前処理がされたもの（湿潤化処理活性炭）であることが望ましい。また、同様に、粉末活性炭を用いることが望ましい。
【００２１】
活性炭の具体例としては、これに限定されるものではないが、例えば、ツルミコールＧＬ−３０Ｓ、ツルミコールＨＣ−３０Ｓ［以上粒状・（株）ツルミコール製］、白鷺ＷＨ５Ｃ８／３２、白鷺ＬＨ２Ｃ２０／４８、白鷺ＷＨ２Ｃ８／３２ＳＳ［以上、粒状・武田薬品工業（株）製］、白鷺Ａ、白鷺Ｐ、精製白鷺、特性白鷺、カルボラフィン［以上、粉状・武田薬品工業（株）製］、北越ＳＤ、北越ＧＳＡ［以上、粉状・北越炭素工業（株）製］、シルバーＡ、花Ｆ、雪Ａ［以上、粉状・大三工業（株）製］などが挙げられる。
【００２２】
本明細書における「無機吸着剤」とは、例えば、Ａｌ２Ｏ３、ＳｉＯ２、ＭｇＯ、ＣａＯ、Ａｌ（ＯＨ）３などの無機化合物からなる吸着剤であり、その配合比や、製法、水和物の有無等に限定されるものではない。ただし、本明細書における「無機吸着剤」には、活性炭は含まれないものとする。
【００２３】
無機吸着剤の具体例としては、これに限定されるものではないが、モンモロリナイトの酸処理物からなる活性白土、例えば、ニッカナイトＧＨＣ−３６、ニッカナイトＧ−３６、ニッカゲルＭ−３０；ＳｉＯ２・Ａｌ２Ｏ３からなる吸着剤、例えば、ニッカゲルＳ−６、ニッカゲルＳ−６５［以上、日本活性白土（株）製］；Ａｌ２Ｏ３・１０ＳｉＯ２・ｘＨ２Ｏからなる吸着剤、例えば、トミックスＡＤ−７００ＮＳ；Ａｌ２Ｏ３・ｘＨ２Ｏからなる吸着剤、例えば、トミックスＡＤ−２００ＮＳ；Ａｌ（ＯＨ）３・ＮａＨＣＯ３からなる吸着剤、例えば、トミックスＡＤ−４００ＮＳ；６ＭｇＯ・Ａｌ２Ｏ３・ＣＯ２・Ｈ２Ｏからなる吸着剤、例えば、トミックスＡＤ−５００ＮＳ；ＭｇＯ・３ＳｉＯ２・ｘＨ２Ｏからなる吸着剤、例えば、トミックスＡＤ−６００ＮＳ；ＭｇＯからなる吸着剤、例えば、トミックスＡＤ−１００Ｇ、トミックスＡＤ−１００ＧＧ；ＭｇＯ・Ａｌ２Ｏ３・２ＳｉＯ２からなる吸着剤、例えば、トミックスＡＤ−３００ＮＳＳ、トミックスＡＤ−８００顆粒、Ｑ−Ｆｉａｅ２０００、Ｑ−Ｆｉａｅ３０００［以上、富田製薬（株）製］；合成ゼオライトＡ−４、合成ゼオライトＦ−９［以上、東洋曹達工業（株）製］；天然ゼオライト［日本活性白土（株）製］；ベントナイト［和光純薬工業（株）製］などが挙げられる。
【００２４】
本明細書における「有機吸着剤」とは、有機化合物からなる吸着剤をいい、その構造に限定されるものではない。
【００２５】
有機吸着剤の具体例としては、これに限定されるものではないが、セルロース誘導体系樹脂からなる吸着剤、例えば、ＤＥＡＥ−セルロース、ＴＥＡＥ−セルロース、ＥＣＴＥＯＬＡ−セルロース［以上、Ｓｅｒｖａ  Ｆｉｎｅｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  Ｇｍｂ  Ｈ＆Ｃｏ製］；ポリアミノ酸誘導体系樹脂からなる吸着剤、例えば、ＰＭＬＧ、ＰＭＬＧ−ＥＤ、ＰＭＬＧ−ＰＤ、ＰＭＬＧ−ＢＤ；セファデクス誘導体系樹脂からなる吸着剤、例えば、ＤＥＡＥ−セファデクス、ＱＡＥ−セファデクス［以上、ファルマシア（株）製］；キトサン誘導体系樹脂からなる吸着剤、例えば、クリムーバ［以上、粟田工業（株）製］；逆相クロマトグラフィー用充填剤としてオクチル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤、例えば、ＹＭＣ・ＧＥＬ  Ｃｏ−３００−Ｓ５；オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤、例えば、ＹＭＣ・ＧＥＬ  ＯＤＳ−ＡＱ６０−Ｓ５０、ＤＳ−ＡＭ−１２０−Ｓ５０、ＹＭＣ・ＧＥＬ  ＯＤＳ−Ａ１２０−Ｓ３０／５０、ＹＭＣ・ＧＥＬ  ＯＤＳ−ＡＱ６０−Ｓ５０、ＹＭＣ・ＧＥＬ  ＯＤＳ−ＡＤ１２０−Ｓ５０［以上、ＹＭＣ製］；オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤、例えば、ＯＤＰ−４００［以上、旭化成（株）製］、ＯＰ−４ＰＷ［以上、東ソー（株）製］などが挙げられる。
【００２６】
本明細書における「不純物」とは、ヒアルロン酸類、水その他の溶媒成分、無機塩以外の物質、特に、最終製品としてのヒアルロン酸類を用いる際に不利益を与え得る物質（発熱性物質など）のことをいう。主な不純物源としては、ヒアルロン酸類の生産段階での組織、微生物又は培養液（培地）由来のもの、あるいは、その後の精製段階等で混入したものが挙げられる。本明細書における不純物の例としては、これに限られるものではないが、組織又は菌体、タンパク質、核酸、多糖類、低分子化合物、あるいはエンドトキシンなどが挙げられる。不純物としての組織又は菌体には、これに限られるものではないが、それぞれ、抽出法で用いた抽出原料としての組織由来の組織片などや、発酵法で用いた微生物の菌体あるいは菌体片などが含まれる。不純物としてのタンパク質には、これに限られるものではないが、上記組織、菌由来のタンパク質や、生産後の工程で混入したタンパク質などが含まれる。不純物としてのエンドトキシンには、これに限られるものではないが、上記菌由来のリポ多糖類などが含まれる。
【００２７】
本明細書における「低分子化合物」とは、ヒアルロン酸類と比較して、分子量の比較的小さな化合物のことをいい、例えば、これに限られるものではないが、分子量２０００Ｄａ以下、あるいは、分子量１０００Ｄａ、あるいは分子量５００Ｄａ以下の化合物のことをいう。このような低分子化合物には、各種アミノ酸、有機酸（例えば、乳酸）、糖（例えば、グルコース）などが含まれる。
【００２８】
本明細書における「クリーン環境」とは、空調管理することで、環境由来の菌やエンドトキシンなどの不純物が製品にコンタミする可能性の極めて低い環境、特に医薬（菌、エンドトキシンフリー）相当製品の製造環境のことをいう。
クリーン環境の一例として、例えば、対象物質が以下のように規制された環境が挙げられる。
【００２９】
【表１】
0005603926.tif 000003
【００３０】
本明細書における「除去」には、対象の物質を完全に除き去ることに加え、部分的に除き去る（その物質の量を減少させる）ことも含まれる。本明細書における「精製」には、任意の又は特定の不純物を除去することが含まれる。
【００３１】
本明細書におけるそれぞれの数値範囲については、「〜」で示された上限値及び下限値をそれぞれ含むものとする。例えば、「Ａ〜Ｂ」なる記載は、Ａ以上でありＢ以下であることを意味する。また、「を含有する」には、「から実質的になる」および「からなる」が含まれるものとする。
【００３２】
〔実施の形態〕
本発明は、これに限られるものではないが、例えば、以下の実施態様に関する。
【００３３】
実施態様１：
（１）活性炭、（２）無機吸着剤、（３）無機吸着剤と有機吸着剤、（４）無機吸着剤と活性炭、（５）無機吸着剤と有機吸着剤と活性炭、（６）有機吸着剤、及び（７）有機吸着剤と活性炭からなる群より選択される吸着剤に、ヒアルロン酸及び／又はその塩と不純物とを含むヒアルロン酸類溶液を接触させる工程を含む、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法。
【００３４】
実施態様２：
（１）活性炭、（２）無機吸着剤、（３）無機吸着剤と有機吸着剤、（４）無機吸着剤と活性炭、（５）無機吸着剤と有機吸着剤と活性炭、（６）有機吸着剤、及び（７）有機吸着剤と活性炭からなる群より選択される吸着剤に、ヒアルロン酸及び／又はその塩と不純物とを含むヒアルロン酸類溶液を接触させ、それによりヒアルロン酸及び／又はその塩を精製する工程を含む、ヒアルロン酸及び／又はその塩を製造するための方法。
【００３５】
実施態様３：
上記ヒアルロン酸類溶液のｐＨが２〜５である、実施態様１または２に記載の方法。
【００３６】
実施態様４：
活性炭に、上記ヒアルロン酸類溶液を接触させる工程を含む、実施態様１ないし３の何れか一項に記載の方法。
【００３７】
実施態様５：
上記活性炭が湿潤化処理活性炭である、実施態様１ないし４の何れか一つに記載の方法。
【００３８】
実施態様６：
上記接触工程の前に、塩化ナトリウムを上記ヒアルロン酸類溶液に添加する工程を含む、実施態様１ないし５の何れか一つに記載の方法。
【００３９】
実施態様７：
上記不純物が、菌体、タンパク質、核酸、低分子化合物、又はエンドトキシンを含む、実施態様１ないし６の何れか一つに記載の方法。
【００４０】
実施態様８：
上記不純物が、タンパク質、又はエンドトキシンを含む、実施態様１ないし７の何れか一つに記載の方法。
【００４１】
実施態様９：
精製後の上記ヒアルロン酸及び／又はその塩の平均分子量が３５０万〜７００万Ｄａである、実施態様１ないし８の何れか一つに記載の方法。
【００４２】
実施態様１０：
上記ヒアルロン酸類溶液中のヒアルロン酸及び／又はその塩の濃度が１〜１０ｇ／Ｌである、実施態様１ないし９の何れか一つに記載の方法。
【００４３】
実施態様１１：
上記工程がクリーン環境下で行われる、実施態様１ないし１０の何れか一つに記載の方法。  
【００４４】
以下、本発明の態様について説明する。
【００４５】
本発明の第一の態様（例えば、実施態様１）は、（１）活性炭、（２）無機吸着剤、（３）無機吸着剤と有機吸着剤、（４）無機吸着剤と活性炭、（５）無機吸着剤と有機吸着剤と活性炭、（６）有機吸着剤、及び（７）有機吸着剤と活性炭からなる群より選択される吸着剤に、ヒアルロン酸及び／又はその塩と不純物とを含むヒアルロン酸類溶液を接触させる工程を含む、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法である。この精製方法では、特定の吸着剤を用いることにより、不純物を効率よく吸着・除去することができる。
【００４６】
上記第一の態様において、用いられる吸着剤は、好ましくは、（１）活性炭、（４）無機吸着剤と活性炭、（５）無機吸着剤と有機吸着剤と活性炭、及び（７）有機吸着剤と活性炭からなる群より選択され、より好ましくは、（１）活性炭である。
【００４７】
本発明の第二の態様（例えば、実施態様２）は、（１）活性炭、（２）無機吸着剤、（３）無機吸着剤と有機吸着剤、（４）無機吸着剤と活性炭、（５）無機吸着剤と有機吸着剤と活性炭、（６）有機吸着剤、及び（７）有機吸着剤と活性炭からなる群より選択される吸着剤に、ヒアルロン酸及び／又はその塩と不純物とを含むヒアルロン酸類溶液を接触させ、それによりヒアルロン酸及び／又はその塩を精製する工程を含む、ヒアルロン酸及び／又はその塩を製造するための方法である。この製造方法では、特定の吸着剤を用いて、不純物を効率よく吸着・除去することにより、純度の高いヒアルロン酸を効率的に製造することができる。
【００４８】
上記第二の態様において、用いられる吸着剤は、好ましくは、（１）活性炭、（４）無機吸着剤と活性炭、（５）無機吸着剤と有機吸着剤と活性炭、及び（７）有機吸着剤と活性炭からなる群より選択され、より好ましくは、（１）活性炭である。
【００４９】
上記態様の方法において、複数の吸着剤をヒアルロン酸類溶液と接触させる際には、同時に接触させても、別々に接触させてもよい。また、複数の吸着剤を混合させた混合吸着剤を用いてもよい。
【００５０】
上記態様の方法においては、吸着剤とヒアルロン酸類溶液とを接触させた後、吸着剤を分離してもよく、その場合、例えば、濾過または遠心分離等により、濾液を回収することができる。分離の効率や作業の煩雑さ等の点から、分離手段としては、濾過を行うことが望ましい。
【００５１】
分離の手段として濾過を行う場合、吸着剤およびそれに吸着された不純物を分離できる限り、濾過方法や濾材に限定されるものではないが、例えば、膜、フィルター、カラム、ろ紙等を用いて、常圧下で（自然濾過）あるいは加圧して行われる。濾材の材質は、これに限定されるものではないが、例えば、ポリプロピレン製等の各種不織布、セラミックス、セルロース（ろ紙）等が挙げられる。また、珪藻土などの濾過補助剤を用いることもできるが、不純物（特に金属／重金属）の混入防止の観点からは、濾過補助剤を用いない方がより望ましい。濾材の孔径についても、吸着剤およびそれに吸着した不純物を分離できれば、限定されるものではないが、例えば、０．２〜５０μｍの孔径のものを用いることができる。
【００５２】
上記態様の方法等で用いられる無機吸着剤の量は、これに限定されるものではないが、ヒアルロン酸類溶液１００重量％に対し、０．５〜２０．０重量％であることが望ましく、５．０〜２０．０重量％であることがさらに望ましい。これらの範囲内では、より高い精製（吸着）作用が期待できる。
【００５３】
上記態様の方法等で用いられる有機吸着剤の量は、これに限定されるものではないが、ヒアルロン酸類溶液１００重量％に対し、０．５〜２０．０重量％であることが望ましく、５．０〜２０．０重量％であることがさらに望ましい。これらの範囲内では、より高い精製（吸着）作用が期待できる。
【００５４】
上記態様の方法で用いられる活性炭の量は、これに限定されるものではないが、ヒアルロン酸類溶液１００重量％に対し、０．５〜２０．０重量％であることが望ましく、５．０〜２０．０重量％であることがさらに望ましい。これらの範囲内では、より高い精製（吸着）作用が期待できる。
【００５５】
さらに、活性炭は、水性液中での加熱処理などの前処理を施した湿潤化処理活性炭であることが望ましい。湿潤化処理を施すことで、活性炭の不純物吸着量が高くなり、分散性が上昇するため、不純物を効率よく吸着・除去できることに加え、精製時におけるヒアルロン酸類の分子量の低下を低減させることも可能であり、特に、高分子量（例えば、精製後（例えば、吸着処理に続く濾過後）の平均分子量が３５０万〜７００万Ｄａ）のヒアルロン酸類の精製において、優れた効果を発揮する。
【００５６】
さらに、活性炭の原料としては、特に生体に適用する際に問題となり得る不純物等の観点からは、木材由来が望ましく、その形状は、分散性や吸着効率の観点からは、粉末状が望ましい。
【００５７】
また、活性炭を、無機吸着剤と有機吸着剤の何れかあるいは双方と混合して、混合吸着剤として用いる場合、これに限定されるものではないが、活性炭の量は上記態様に適する範囲内であることが望ましく、混合吸着剤の総量は、ヒアルロン酸類溶液１００重量％に対し、２０．０重量％を越えないことが望ましく、０．５〜２０．０重量％であることがさらに望ましく、５．０〜２０．０重量％であることが最も望ましい。これらの範囲内では、より高い精製（吸着）作用が期待できる。
【００５８】
また、その後に必要となる分離・精製工程等を考慮すると、追加の精製工程を必要とする成分の混入を避けることが望ましい。すなわち、新たな不純物の混入を避けるための、本発明の他の態様は、上記第一の態様において、吸着剤として活性炭を用い、活性炭に、上記ヒアルロン酸類溶液を接触させる工程を含む精製方法または対応する製造方法、さらには、上記ヒアルロン酸類溶液を、活性炭と同時に無機吸着剤又は有機吸着剤と接触させる工程を含まない精製方法または対応する製造方法である。活性炭単独でも十分な吸着・分離効果を奏することが可能であるため、新たな不純物の混入を避けることを重視する場合には、吸着剤として活性炭単独で処理することが望ましい。もちろん、この場合も、活性炭による吸着処理とは別に、他の精製処理等の工程を行うことはできる。
【００５９】
上記の活性炭、無機吸着剤、有機吸着剤、あるいは混合吸着剤を、精製対象のヒアルロン酸溶液と接触させる際には、これらの吸着剤を一回懸濁し、そのまま保持してもよいが、持続して懸濁・攪拌することが望ましい。攪拌を行う場合は、これに限定されるものではないが、１０分間〜２時間の攪拌が望ましく、２０分間〜１時間の攪拌がさらに望ましい。
【００６０】
上記態様の方法では、従来は処理が困難であった比較的高濃度（例えば、１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌ）のヒアルロン酸類溶液についても、効率的に処理することができる。ヒアルロン酸類濃度は、ヒアルロン酸類溶液の溶液粘度の高さに起因する取り扱いの困難さ及びヒアルロン酸類の溶解度の観点からは、これに限定されるものではないが、０．１〜２０ｇ／Ｌが望ましく、０．５〜１５ｇ／Ｌがさらに望ましく、１〜１０ｇ／Ｌが最も望ましい。
【００６１】
また、上記態様の方法において、ヒアルロン酸類溶液の粘度を下げる目的で、ヒアルロン酸類溶液に塩化ナトリウム等の塩類を共存させることもできる。この場合、精製効果が損なわれないように、高濃度の塩の共存は避けることが望ましい。このような塩の共存の具体例としては、０．１〜５重量％の塩化ナトリウムをヒアルロン酸類溶液に添加することが挙げられる。
【００６２】
上記態様の方法を用いる際のヒアルロン酸類溶液の温度は、これに限定されるものではないが、０〜８０℃であることが望ましい。温度が８０℃以下であれば、処理中のヒアルロン酸類の分解及び分子量の低下を、強く抑えることができる。
【００６３】
本発明の他の態様は、ヒアルロン酸類溶液のｐＨが２〜５である上記態様の方法である。この精製方法または製造方法では、特定のｐＨ条件下で吸着剤、特に活性炭を用いることにより、ヒアルロン酸類の低分子量化は低く抑えながらも、不純物を効率よく吸着・除去することができる。ｐＨの調整については、適するｐＨ範囲にあるヒアルロン酸類溶液を用いても、酸・塩基を用いてそのｐＨに調整するｐＨ範囲に調整しても、あるいは、吸着・濾過の作業工程において、作業溶液を特定のｐＨに調整してもよい。
【００６４】
さらに、上記態様の方法によると、特定のｐＨ条件下で吸着剤、特に活性炭を用いることで、ヒアルロン酸類の消失は低く抑えながらも、不純物として、一般的に活性炭により除去可能とされる高分子化合物（例えば、菌体、タンパク質、核酸、エンドトキシン）のみならず、低分子化合物（例えば、アミノ酸、糖、有機酸）までも効率的に分離・除去することが可能であった。また、上記態様の方法は、特定のｐＨ条件下で吸着剤、特に活性炭を用いることで、生菌、タンパク質、アミノ酸、及び／又はエンドトキシンの除去に優れた効果を発揮し、特に、タンパク質及び／又はエンドトキシンの除去においてはさらに優れた効果を奏する。
【００６５】
さらに、上記態様の方法によると、吸着処理を特定のｐＨ範囲で行うことで、精製時におけるヒアルロン酸類の分子量の低下を低減させることができ、特に、高分子量（例えば、精製後（例えば、吸着処理に続く濾過後）の平均分子量が３５０万〜７００万Ｄａ）のヒアルロン酸類の精製において、優れた効果を発揮する。
【００６６】
本発明の他の態様は、ヒアルロン酸類溶液のｐＨが４〜５である上記態様の方法である。この精製方法または製造方法では、吸着剤または活性炭と菌体との吸着がさらに良好となるため、精製の精度が上昇すると共に、比較的大きな孔径（例えば、菌のサイズ（約１μｍ）より大きな孔径など）の濾材を用いて濾過する場合でも、菌体を濾過し切る（菌漏れを防ぐ）ことができ、通液も容易となる。
【００６７】
また、本発明の更なる態様では、上記態様において、ヒアルロン酸類がストレプトコッカス・エキＦＭ−１００（微工研条寄第９０２７号）あるいはストレプトコッカス・エキＦＭ−３００（微工研条寄第２３１９号）により生産される。これらの微生物により生産されたヒアルロン酸類を精製対象として用いることで、より不純物が少なく、高分子量のヒアルロン酸類精製物を得ることができ、特に医薬として用いる際には優れた効果を発揮する。
【００６８】
上記態様の精製方法を用いることで、ヒアルロン酸類の分離・精製工程の負荷を軽減することができるため、上記態様に関する精製方法は、ヒアルロン酸類製造の工業的なプロセスの比較的初期段階で用いることが特に有効的である。
【００６９】
さらに、上記態様の精製方法を、クリーン環境下で行うことにより、従来は困難であった、医薬品に要求される高品質のヒアルロン酸類の工業的規模での効率的な精製が可能となる。このような精製方法は、医薬品用のヒアルロン酸類の生産において、極めて高い産業的有用性を有する。
【００７０】
なお、上記実施態様、上記態様により説明される精製方法等は、本発明を限定するものではなく、例示することを意図して開示されているものである。本発明の技術的範囲は、特許請求の範囲の記載により定められるものであり、当業者は、特許請求の範囲に記載された発明の技術的範囲において種々の設計的変更が可能である。
【００７１】
例えば、上記精製方法は、更なる他の工程を含むか、あるいは、上記精製方法に引き続いて更なる他の工程・方法が実施され、ヒアルロン酸類等を製造する方法であってもよい。そのような工程・方法としては、例えば、ヒアルロン酸生産微生物菌株を培養する工程、ヒアルロン酸産生微生物菌株培養液から培養濾液を製造する工程、精製対象液を遠心分離する工程、対象液を中和する工程、精製対象液を精密濾過する工程、対象液を透析処理する工程、精製対象液に芳香族系吸着樹脂を加えて攪拌及び限外濾過する工程、対象液をクロマトグラフィーで精製する工程、活性炭を対象液から分離する工程、活性炭を対象液から除去する工程、有機溶媒を加えてヒアルロン酸類を沈殿させる工程、ヒアルロン酸類を結晶化する工程、ヒアルロン酸類を乾燥させる工程などが挙げられる。
【実施例】
【００７２】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００７３】
ストレプトコッカス・エキＦＭ−１００（微工研菌寄第９０２７号）を用いて培養した発酵液１５０ｍｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ＰＨ４．０）を３００ｍｌのガラスビーカーに採取し、表１又は２に示す条件で吸着剤処理を行い、マグネチックスターラーを用い４００ｒｐｍで３０分間懸濁攪拌処理した。その処理液を濾紙を用いて加圧濾過し、濾液１５０ｍｌに塩化ナトリウム４．５ｇ（３．０重量％）を添加後、エタノール６００ｍｌでヒアルロン酸ナトリウムを析出させた。この析出ヒアルロン酸ナトリウムを、エタノール３００ｍｌで洗浄した後、４０℃で真空乾燥させてヒアルロン酸ナトリウム０．５ｇを得た。【００７４】
このようにして得られたヒアルロン酸ナトリウムを、表４に示す評価項目、評価基準を用いて評価した。精製条件及び評価結果を表２及び３に示す。【００７５】
なお、吸着処理時の溶液のｐＨが１の際には、精製対象であるヒアルロン酸を含む培養液がゲル化し、精製工程（吸着処理等）を行うことができなかった。【００７６】
【表２】
0005603926.tif 000004
【００７７】
【表３】
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【００７８】
【表４】
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* ET：エンドトキシン【００７９】
以上の実験から、本発明に係る精製方法を用いることで、ヒアルロン酸類溶液から、不純物を効果的に吸着除去し、精製できることが確認された。【００８０】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。