(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０に記載のアミノ酸配列からなる、単離されたペプチド。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０に記載のアミノ酸配列において、以下の置換（ａ）および（ｂ）の一方または両方を有し、かつ、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する単離されたペプチド：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０に記載のアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている；ならびに
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０に記載のアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている。
【請求項３】
請求項１または２に記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
ＣＴＬを誘導するための組成物であって、請求項１または２に記載の１種もしくは複数種のペプチド、または請求項３記載の１種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項５】
ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導するための組成物であって、請求項１または２に記載の１種もしくは複数種のペプチド、または請求項３記載の１種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項６】
以下からなる群より選択される少なくとも１つの有効成分を含む、薬学的組成物：
（ａ）請求項１または２に記載の１種もしくは複数種のペプチド；
（ｂ）請求項１または２に記載のペプチドをコードする１種もしくは複数種のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項１または２に記載のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を自身の表面上に提示する１種もしくは複数種のＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）請求項１または２に記載のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を自身の表面上に提示する細胞を認識する１種もしくは複数種のＣＴＬ。
【請求項７】
がんの治療および予防のいずれかもしくは両方において、または対象におけるがんに対する免疫応答の誘導において使用するための、請求項６記載の薬学的組成物。
【請求項８】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために製剤化される、請求項６または７記載の薬学的組成物。
【請求項９】
ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）をインビトロで誘導するための方法であって、以下からなる群より選択される段階を含む、方法：
（ａ）ＡＰＣを請求項１または２に記載のペプチドとインビトロまたはエクスビボで接触させる段階、および
（ｂ）請求項１または２に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
【請求項１０】
ＣＴＬをインビトロで誘導するための方法であって、以下からなる群より選択される段階を含む、方法：
（ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１または２に記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣと共培養する段階；および
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１または２に記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階。
【請求項１１】
ＨＬＡ抗原と請求項１または２に記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する、単離されたＡＰＣ。
【請求項１２】
請求項９記載の方法によって誘導される、請求項１１記載のＡＰＣ。
【請求項１３】
ＨＬＡ抗原と請求項１または２に記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する細胞を認識する、単離されたＣＴＬ。
【請求項１４】
請求項１０記載の方法によって誘導される、請求項１３記載のＣＴＬ。
【請求項１５】
がんに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導するための組成物であって、請求項１または２に記載のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項１６】
請求項１または２に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１６記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１または２に記載のペプチド、または請求項３記載のポリヌクレオチドを含む診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物科学の分野、より具体的にはがん療法の分野に関する。特に本発明は、がんワクチンとして有効な新規ペプチド、ならびに腫瘍の治療および予防のいずれかまたは両方のための薬物に関する。
【０００２】
優先権
本出願は、２０１１年８月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／５２２，９９１号の恩典を主張し、その全内容は参照によって本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上に見出される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のエピトープペプチドを認識し、次いで腫瘍細胞を殺傷することが示されている。メラノーマ抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーが発見されて以来、他の多くのＴＡＡが、免疫学的アプローチによって発見されている（非特許文献１、Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2):177-80；非特許文献２、Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3):725-9）。これらのＴＡＡのうちのいくつかは、現在、免疫療法の標的として臨床開発の過程にある。
【０００４】
有望なＴＡＡは、がん細胞の増殖および生存に不可欠である。そのようなＴＡＡを免疫療法の標的として使用することによって、療法によって誘発される免疫選択の結果としてのＴＡＡの欠失、突然変異、または下方制御に起因し得るがん細胞の免疫回避の詳述されているリスクが最小限に抑えられ得る。したがって、強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し得る新規ＴＡＡの同定によって、進行中の様々な種類のがんに対するペプチドワクチン接種戦略のさらなる開発および臨床適用が保証される（非特許文献３、Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20):1442-55；非特許文献４、Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13):3134-42；非特許文献５、Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21):5554-9；非特許文献６、van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9)3308-14；非特許文献７、Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20):4465-8；非特許文献８、Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2):169-72；非特許文献９、Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3):439-66；非特許文献１０、Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3):387-94）。現在までに、これらの腫瘍関連抗原由来ペプチドを使用した臨床試験がいくつか報告されている。残念ながら、現在のがんワクチン治験の多くは低い客観的奏効率しか示していない（非特許文献１１、Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20):4169-80；非特許文献１２、Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188:33-42；非特許文献１３、Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9):909-15）。したがって、免疫療法標的としての新規ＴＡＡが当技術分野において依然として必要とされている。
【０００５】
ＭＰＨＯＳＰＨ１（Ｍ期リンタンパク質１（Ｍ−ｐｈａｓｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏtｅｉn  １）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６１９５およびＮＰ＿０５７２７９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５および１２６）は、Ｇ２／Ｍ遷移において特異的にリン酸化されたタンパク質の１つとして同定され、プラス方向指向キネシン関連タンパク質として明らかにされた（非特許文献１４、Abaza A et al., J Biol Chem 2003, 278:27844-52）。より詳細には、ＭＰＨＯＳＰＨ１は、細胞質分裂において重要な役割を担い、ＨｅＬａ細胞内で後期から終期の間に紡錘体の中間帯内に蓄積するプラス方向指向分子モーターであると報告されている（非特許文献１４、Abaza A et al., J Biol Chem 2003, 278:27844-5；非特許文献１５、Kamimoto T et al., J Biol Chem 2001, 276:37520-8）。２３，０４０個の遺伝子を含むゲノムワイドｃＤＮＡマイクロアレイを使用する遺伝子発現プロファイル解析の過程において、ＭＰＨＯＳＰＨ１は、膀胱癌において上方制御される新規分子として同定された（非特許文献１６、Kanehira M et al., Cancer Res. 2007 Apr 1;67(7):3276-85；特許文献１、ＷＯ２００６／０８５６８４）。さらに、ノザンブロット解析により、ＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子産物の発現は、精巣に限定され、正常な重要器官には見られないことが見出された。
【０００６】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有するＭＰＨＯＳＰＨ１由来のいくつかのペプチド断片が、以前に同定された（特許文献２、ＷＯ２００８／０４７４７３）。これらのペプチド断片は、同族ペプチド断片で刺激した細胞に対してＣＴＬを誘導する能力を実証した。しかしながら、以前の研究は、ペプチド断片が、ＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子およびＨＬＡ−Ａ２抗原を発現する腫瘍細胞を標的とするＣＴＬを誘導する能力を有するか否かを確認していなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０８５６８４
【特許文献２】ＷＯ２００８／０４７４７３
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2):177-80
【非特許文献２】Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3):725-9
【非特許文献３】Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20):1442-55
【非特許文献４】Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13):3134-42
【非特許文献５】Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21):5554-9
【非特許文献６】van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9):3308-14
【非特許文献７】Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20):4465-8
【非特許文献８】Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2):169-72
【非特許文献９】Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3):459-66
【非特許文献１０】Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3):387-94
【非特許文献１１】Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20):4169-80
【非特許文献１２】Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188:33-42
【非特許文献１３】Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9):909-15
【非特許文献１４】Abaza A et al., J Biol Chem 2003, 278:27844-5．
【非特許文献１５】Kamimoto T et al., J Biol Chem 2001, 276:37520-8
【非特許文献１６】Kanehira M et al., Cancer Res. 2007 Apr 1;67(7):3276-85.
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、免疫療法の適切な標的として役立ち得る新規ペプチドの発見に少なくとも一部基づいている。ＴＡＡは一般に免疫系によって「自己」として認識され、したがって多くの場合は免疫原性を有しないため、適切な標的の発見は極めて重要である。上記のとおり、ＭＰＨＯＳＰＨ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６１９５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）の遺伝子によってコードされるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）は、がんにおいて上方制御されると同定されており、このがんの例には、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸直腸癌、胃癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌および軟組織腫瘍が含まれるがこれらに限定されない。したがって、本発明は、がん／腫瘍免疫療法の候補標的としてのＭＰＨＯＳＰＨ１、より詳細には、適切な免疫療法標的として役立ち得る新規ＭＰＨＯＳＰＨ１エピトープペプチドを対象とする。
【００１０】
この目的のために、本発明は、ＭＰＨＯＳＰＨ１由来のペプチドのうち、ＭＰＨＯＳＰＨ１に特異的なＣＴＬを誘導する能力を保有する特異的エピトープペプチドの同定に少なくとも一部向けられている。以下により詳述するように、健常ドナーから得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＭＰＨＯＳＰＨ１由来のＨＬＡ−Ａ＊０２０１結合候補ペプチドを使用して刺激した。次いで、各候補ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２陽性標的細胞に対する特異的細胞傷害性を有するＣＴＬ株を樹立した。本明細書におけるこれらの結果は、これらのペプチドが、ＭＰＨＯＳＰＨ１を発現する細胞に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドであることを実証している。これらの結果は、ＭＰＨＯＳＰＨ１は免疫原性が強く、かつそのエピトープはがん／腫瘍免疫療法の有効な標的であることをさらに示している。
【００１１】
したがって、ＨＬＡ抗原と結合し、かつＣＴＬを誘導する単離されたペプチドであって、ＭＰＨＯＳＰＨ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）の免疫学的活性断片を含むペプチドを提供することは、本発明の１つの目的である。そのようなペプチドは、インビトロもしくはエクスビボにおいてＣＴＬを誘導するため、またはがんに対する免疫応答をインビボで誘導するために対象に直接投与するために使用することができ、このがんの例には、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌および軟組織腫瘍が含まれるがこれらに限定されない。
【００１２】
本発明のペプチドは、一般に、１５、１４、１３、１２、１１、または１０未満のアミノ酸長である。本発明の好ましいペプチドは、ノナペプチドまたはデカペプチドである。特に好ましいペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０の中より選択されるアミノ酸配列を有する。それらのペプチドがＨＬＡ−Ａ２抗原に結合し、かつＣＴＬを誘導することを実証したためである。
【００１３】
したがって、いくつかの態様において、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０の中より選択されるアミノ酸配列を有する１５、１４、１３、１２、１１、または１０未満のアミノ酸長のペプチドである。典型的な態様において、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０の中より選択されるアミノ酸配列を有するノナペプチドまたはデカペプチドである。さらに、本明細書において実証されるとおり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０のアミノ酸配列を有するペプチドは、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ２抗原を発現する腫瘍細胞を標的とするＣＴＬを誘導することが確認された。したがって、好ましい態様において、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０のアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００１４】
本発明のペプチドは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）とインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる場合、ＡＰＣ上のＨＬＡ−Ａ２抗原と結合し、ＨＬＡ−Ａ２抗原との複合体としてＡＰＣ上に提示される。あるいは、本発明のペプチドは、ＡＰＣによって吸収され、ＡＰＣ内でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０の中より選択されるアミノ酸配列から構成される断片にプロセシングされ、ＨＬＡ−Ａ２抗原との複合体としてＡＰＣ上に提示され得る。結果的に、そのようなペプチドに特異的なＣＴＬが誘導され、そのようなＣＴＬは本発明の要素とみなされる。
【００１５】
本発明はまた、改変ペプチドが元の未改変ペプチドと同等のＣＴＬ誘導能を保持する限り、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０の中より選択されるアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列を有する改変ペプチドを企図する。この目的のため、本発明は、１５、１４、１３、１２、１１、または１０未満のアミノ酸長の単離されたペプチドであって、ＣＴＬ誘導能を有し、かつ以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを提供する：
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４および６４からなる群より選択されるアミノ酸配列において１個、２個、または数個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列、ならびに
（ｉｉ）以下の特徴の一方または両方を有する、（ｉ）のアミノ酸配列：
（ａ）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのＮ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択される；ならびに
（ｂ）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのＣ末端アミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択される。
【００１６】
さらに、本発明はまた、１５、１４、１３、１２、または１１未満のアミノ酸長の単離されたペプチドであって、ＣＴＬ誘導能を有し、かつ以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを提供する：
（ｉ'）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３，７７，７９，９７，１０３および１２０からなる群より選択されるアミノ酸配列において１個、２個、または数個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列、ならびに
（ｉｉ'）以下の特徴の一方または両方を有する、（ｉ'）のアミノ酸配列：
（ａ）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのＮ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択される；ならびに
（ｂ）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのＣ末端アミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択される。
【００１７】
本明細書において実証されるとおり、そのようなペプチドは、ＡＰＣ上のＨＬＡ−Ａ２抗原と結合し、ＨＬＡ−Ａ２抗原との複合体としてＡＰＣ上に提示され得る。あるいは、そのようなペプチドは、それらのペプチドをＡＰＣと接触させる場合、ＡＰＣによって吸収され、ＡＰＣ内で（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉ'）、および（ｉｉ'）の中より選択されるアミノ酸配列から構成される断片にプロセシングされ、ＨＬＡ−Ａ２抗原との複合体としてＡＰＣ上に提示され得る。結果的に、そのようなペプチドに特異的なＣＴＬが誘導され、そのようなＣＴＬは本発明の要素とみなされる。
本発明はさらに、本発明のペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドを包含する。これらのポリヌクレオチドは、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導または調製するために使用することができる。上記の本発明のペプチドと同様に、そのようなＡＰＣは、がんに対する免疫応答を誘導するために対象に投与してよい。
【００１８】
対象に投与された場合、本発明のペプチドは、各ペプチドを標的とするＣＴＬを誘導するように、ＡＰＣの表面上に提示される。したがって、ＡＰＣおよびＣＴＬのいずれかまたは両方を誘導するために本発明によって提供される１種もしくは複数種のペプチドまたはポリヌクレオチドを含む剤または組成物を提供することは、本発明の１つの目的である。そのような剤または組成物は、がんの治療、がんの予防、およびがんの術後再発の予防の中より選択される１つまたはそれ以上の目的に使用することもできる。標的とされるがんの例には、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌および軟組織腫瘍が含まれるがこれらに限定されない。したがって、がんの治療およびがんの予防のいずれかまたは両方のための薬学的な剤または組成物であって、本発明の１種または複数種のペプチドまたはポリヌクレオチドを含むように製剤化されるそのような薬学的な剤または組成物を提供することは、本発明のさらに別の目的である。本発明の薬学的な剤または組成物は、有効成分として、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドの代わりにまたはそれに加えて、本発明のペプチドのいずれかを提示するＡＰＣまたはエキソソームを含み得る。
【００１９】
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドを、例えば、ＡＰＣを本発明のペプチドと接触させるか、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入することによって、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を表面上に提示するＡＰＣを誘導するために使用することができる。そのようなＡＰＣは、自身の表面上に標的ペプチドを提示する細胞を特異的に認識するＣＴＬを誘導する能力を有し、がん免疫療法において使用される。したがって、本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するための方法、ならびにそのような方法によって得られるＡＰＣを包含する。加えて、本発明はまた、ＡＰＣの誘導において使用される剤または組成物であって、本発明のいずれかのペプチドまたはポリヌクレオチドを含むそのような剤または組成物を包含する。
【００２０】
ＣＴＬを誘導するための方法を提供することは、本発明のさらなる目的であり、該方法は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソームと共培養する段階、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、もしくはＴＣＲサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチドを導入する段階であって、該ＴＣＲが、細胞表面上に提示された、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体に結合し得る段階、を含む。そのような方法によって得られるＣＴＬは、がんの治療およびがんの予防のいずれかまたは両方において使用され得る。がんの例には、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌および軟組織腫瘍が含まれるがこれらに限定されない。
【００２１】
表面上にＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示する単離されたＡＰＣを提供することは、本発明のさらに別の目的である。本発明はさらに、本発明のペプチドを標的とする単離されたＣＴＬを提供する。これらのＡＰＣおよびＣＴＬは、がん免疫療法との関連において利用される。
がんに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導するための方法であって、本発明のペプチド、そのようなペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのようなペプチドを提示するエキソソームまたはＡＰＣおよびそのようなペプチドを自身の表面上に提示する細胞を認識するＣＴＬの中より選択される少なくとも１つの成分を含む剤または組成物を投与する段階を含むそのような方法を提供することは、本発明のさらに別の目的である。
【００２２】
本発明の適用性は、ＭＰＨＯＳＰＨ１の過剰発現に関連するかまたはＭＰＨＯＳＰＨ１の過剰発現から生じる多数の疾患、例えばがんのいずれにも及び、このがんの例には膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌および軟組織腫瘍が含まれるがこれらに限定されない。
【００２３】
より具体的には、本発明は、以下を提供する：
［１］以下の（ａ）または（ｂ）の単離されたペプチド：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０からなる群より選択されるアミノ酸配列において１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されているアミノ酸配列を含むペプチドであって、かつ、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する、ペプチド、
［２］以下の特徴の一方または両方を有する、［１］に記載の単離されたペプチド：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０からなる群より選択されるアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択される；ならびに
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０からなる群より選択されるアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択される、
［３］ノナペプチドまたはデカペプチドである、［１］または［２］に記載の単離されたペプチド、
［４］［１］〜［３］のいずれか１つに記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、
［５］ＣＴＬを誘導するための組成物であって、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の１種もしくは複数種のペプチド、または［４］に記載の１種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、組成物、
［６］ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するための組成物であって、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の１種もしくは複数種のペプチド、または［４］に記載の１種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、組成物、
［７］（ａ）［１］〜［３］のいずれか１つに記載の１種または複数種のペプチド；
（ｂ）［１］〜［３］のいずれか１つに記載のペプチドをコードする１種または複数種のポリヌクレオチド；
（ｃ）［１］〜［３］のいずれか１つに記載のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を自身の表面上に提示する１種もしくは複数種のＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）［１］〜［３］のいずれか１つに記載のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を自身の表面上に提示する細胞を認識する１種もしくは複数種のＣＴＬ
からなる群より選択される少なくとも１つの有効成分を含む薬学的組成物、
［８］がんの治療および予防のいずれかもしくは両方において、または対象におけるがんに対する免疫応答の誘導において使用するための、［７］に記載の薬学的組成物、
［９］ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために製剤化される、［７］または［８］に記載の薬学的組成物、
［１０］ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導するための方法であって、以下からなる群より選択される段階を含む、方法：
（ａ）ＡＰＣを［１］〜［３］のいずれか１つに記載のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階、および
（ｂ）［１］〜［３］のいずれか１つに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階、
［１１］ＣＴＬを誘導するための方法であって、以下からなる群より選択される段階を含む、方法：
（ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と［１］〜［３］のいずれか１つに記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣと共培養する段階；
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と［１］〜［３］のいずれか１つに記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階；および
（ｃ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、またはＴＣＲサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチドを、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入する段階であって、該ＴＣＲが、細胞表面上に提示された、ＨＬＡ抗原と［１］〜［３］のいずれか１つに記載のペプチドとの複合体に結合し得る、段階、
［１２］ＨＬＡ抗原と［１］〜［３］のいずれか１つに記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する、単離されたＡＰＣ、
［１３］［１０］に記載の方法によって誘導される、［１２］に記載のＡＰＣ、
［１４］ＨＬＡ抗原と［１］〜［３］のいずれか１つに記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する細胞を認識する、単離されたＣＴＬ、
［１５］［１１］に記載の方法によって誘導される、［１４］に記載のＣＴＬ、
［１６］対象におけるがんの治療および予防のいずれかまたは両方の方法であって、対象に薬学的有効量の
（ａ）［１］〜［３］のいずれか１つに記載の１種もしくは複数種のペプチド；
（ｂ）［１］〜［３］のいずれか１つに記載のペプチドをコードする１種もしくは複数種のポリヌクレオチド；
（ｃ）［１］〜［３］のいずれか１つに記載のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を自身の表面上に提示する１種もしくは複数種のＡＰＣもしくはエキソソーム；または
（ｄ）［１］〜［３］のいずれか１つに記載のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を自身の表面上に提示する細胞を認識する１種もしくは複数種のＣＴＬ
を投与する段階を含む方法、
［１７］がんに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法であって、［１］〜［３］のいずれか１つに記載のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を該対象に投与する段階を含む、方法、
［１８］［１］〜［３］のいずれか１つに記載のペプチドに対する抗体またはその免疫学的活性断片、
［１９］［１］〜［３］のいずれか１つに記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、
［２０］［１９］に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞、ならびに
［２１］［１］〜［３］のいずれか１つに記載のペプチド、［４］に記載のポリヌクレオチドまたは［１８］に記載の抗体を含む診断キット。
【００２４】
本発明の目的および特徴は、添付の図面および実施例と併せて以下の詳細な説明を読むことによって、より十分に明らかになる。前述の発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様であり、本発明または本発明の他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。
特に、本発明をいくつかの特定の態様を参照して本明細書において説明するが、その説明は本発明を例示するものであり、本発明を限定するものとして構成されていないことが理解される。添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は様々な変更および適用に想到することができる。同様に、本発明のその他の目的、特徴、利益、および利点は、本概要および以下に記載する特定の態様から明らかになり、当業者には容易に明白になる。そのような目的、特徴、利益、および利点は、添付の実施例、データ、図面、およびそれらから引き出されるあらゆる妥当な推論と併せて上記から、単独で、または本明細書に組み入れられる参考文献を考慮して、明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
本発明の様々な局面および適用は、以下の図面の簡単な説明ならびに本発明の詳細な説明およびその好ましい態様を考慮することで、当業者に明白となるであろう。
【００２６】
【図１】図１はＭＰＨＯＳＰＨ１由来のペプチドで誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す一連の写真（ａ）〜（ｊ）から構成される。ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−８５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）で刺激したウェル番号＃７（ａ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−１２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）で刺激した＃５（ｂ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−８４６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）で刺激した＃５（ｃ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−４６０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）で刺激した＃２（ｄ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−７７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）で刺激した＃１（ｅ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−４０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）で刺激した＃１（ｆ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−９２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）で刺激した＃４（ｇ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−１４８４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）で刺激した＃５（ｈ）およびＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）で刺激した＃８（ｉ）におけるＣＴＬが、それぞれ対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。これらの画像のウェル上の四角は、対応するウェルからの細胞を、ＣＴＬ株を樹立するために増殖させたことを示す。対照的に、典型的な陰性データの例として、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−５７５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）で刺激したＣＴＬ（ｊ）からは特異的ＩＦＮ−γ産生が示されなかった。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【００２７】
【図２ａ−ｆ】図２ａ−ｆは、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−８５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）（ａ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−１２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）（ｂ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−８４６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）（ｃ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−４６０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）（ｄ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−７７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）（ｅ）、およびＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−４０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）（ｆ）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を実証する、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｆ）から構成される。ＣＴＬ株が産生したＩＦＮ−γの量は、ＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株が、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことを実証している。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。Ｒ／Ｓ比は、応答細胞（ＣＴＬ株）および刺激細胞の数の比を示す。
【００２８】
【図２ｇ−ｉ】図２ｇ−ｉは、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−９２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）（ｇ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−１４８４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）（ｈ）およびＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）（ｉ）で刺激したＣＴＬ株におけるＩＦＮ−γ産生を実証する、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す一連の折れ線グラフ（ｇ）〜（ｉ）から構成される。ＣＴＬ株が産生したＩＦＮ−γの量は、ＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株が、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことを実証している。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。Ｒ／Ｓ比は、応答細胞（ＣＴＬ株）および刺激細胞の数の比を示す。
【００２９】
【図３】図３は、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−８５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）（ａ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−８４６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）（ｂ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−４６０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）（ｃ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−７７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）（ｄ）およびＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）（ｅ）で刺激したＣＴＬ株からの限定希釈によって樹立されたＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ産生を示す折れ線グラフ（ａ）〜（ｅ）から構成される。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬクローンが、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことを実証している。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。Ｒ／Ｓ比は、応答細胞（ＣＴＬクローン）および刺激細胞の数の比を示す。
【００３０】
【図４】図４は腫瘍細胞株に対する特異的ＣＴＬ活性を示す折れ線グラフである。ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方を発現するＪ８２細胞、ＭＰＨＯＳＰＨ１を発現するがＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現しないＨＴ１３７６細胞ならびにＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現するがＭＰＨＯＳＰＨ１を発現しないＴ２細胞を、刺激細胞として使用した。ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）を用いて樹立したＣＴＬクローンは、Ｊ８２細胞に対して特異的ＣＴＬ活性を示した。一方、ＨＴ１３７６およびＴ２細胞に対して有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。Ｒ／Ｓ比は、応答細胞（ＣＴＬクローン）および刺激細胞の数の比を示す。
【００３１】
【図５】図５は腫瘍細胞株に対するＣＴＬの細胞傷害活性を示す折れ線グラフである。ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方を発現するＵＭＵＣ−３細胞、ＭＰＨＯＳＰＨ１を発現するがＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現しないＭＫＮ４５細胞ならびにＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現するがＭＰＨＯＳＰＨ１を発現しないＴ２を、標的細胞として使用した。ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）を用いて樹立したＣＴＬクローンは、ＵＭＵＣ−３細胞に対して強力な細胞傷害活性を示した。一方、ＭＫＮ４５およびＴ２細胞に対して有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。Ｅ／Ｔ比は、エフェクター細胞（ＣＴＬクローン）および標的細胞の数の比を示す。
【００３２】
【図６】図６はＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６を発現する標的細胞に対するＣＴＬの細胞傷害活性を示す折れ線グラフである。ＨＬＡ−Ａ＊０２０６または全長ＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）を用いて樹立されたＣＴＬ株は、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して特異的ＣＴＬ活性を示した（黒菱形）。一方、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６（三角）またはＭＰＨＯＳＰＨ１（丸）のいずれかを発現する標的細胞に対して、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等のいかなる方法および材料も使用することができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかしながら、本発明の材料および方法について記載する前に、これらの記載が単に例示にすぎず、限定を意図しないことが理解されるべきである。本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣例的な実験法および／または最適化に従って変動し得るため、本発明がこれらに限定されないことも理解されるべきである。さらに、本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではない。
【００３４】
本明細書において言及される各出版物、特許、または特許出願の開示は、その全体が参照により本明細書に明確に組み入れられる。しかしながら、本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によりそのような開示に先行する権利を与えられないと承認するものとしては解釈されるべきではない。
別段の定めのない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている用語と同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および例は、単に例示するためのものであり、限定することは意図しない。
【００３５】
Ｉ．定義：
本明細書で使用する「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、特に別段の指定のない限り「少なくとも１つ」を意味する。
物質（例えばペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等）に関して使用する「単離された」および「精製された」という用語は、物質がそうでなければ天然源中に含まれ得る少なくとも１種の物質を実質的に含まないことを示す。したがって、単離または精製されたペプチドは、細胞材料、例えば炭水化物、脂質、またはペプチドが由来する細胞もしくは組織源からの他の汚染タンパク質を実質的に含まないかまたは化学合成される場合に化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないペプチドを指す。「細胞材料を実質的に含まない」という用語には、ペプチドが、それが単離された細胞または組換え産生された細胞の細胞成分から分離されている、ペプチドの調製物が含まれる。したがって、細胞材料を実質的に含まないペプチドには、約３０％、２０％、１０％、または５％未満（乾燥重量ベースで）の異種タンパク質（本明細書において「混入タンパク質」とも称する）を有するポリペプチドの調製物が含まれる。ペプチドを組換え産生する場合、ペプチドは、好ましくは、培養培地も実質的に含まず、培養培地をペプチド調製物の容量の約２０％、１０％、または５％未満で有するペプチドの調製物を含む。ペプチドを化学合成によって生成する場合、ペプチドは、好ましくは、化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、ペプチドの合成に関与する化学物質前駆体または他の化学物質をペプチド調製物の容量の約３０％、２０％、１０％、５％未満（乾燥重量ベース）で有するペプチドの調製物を含む。特定のペプチド調製物が単離または精製されたペプチドを含むことは、例えば、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動よびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色等の後の単一バンドの出現によって示すことができる。好ましい態様において、本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離または精製される。
【００３６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が修飾された残基であるか、または、例えば対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに適用される。
本明細書で時として使用する「オリゴペプチド」という用語は、長さが２０残基またはそれ未満、典型的には１５残基またはそれ未満の本発明のペプチド、および典型的には約８〜約１１残基、しばしば約９または１０残基から構成される本発明のペプチドを指すのに使用される。後者はそれぞれ、本明細書において「ノナペプチド」および「デカペプチド」と称される。
【００３７】
本明細書で使用する「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸のいずれでもよい。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、および細胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、１つまたは複数の修飾されたＲ基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様の機能を有する化合物を指す。
【００３８】
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の推奨する、一般に公知の３文字表記または１文字表記で記載されてもよい。
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、本明細書において互換的に使用され、特に別段の指定のない限り、アミノ酸と同様に、一般に受け入れられている１文字コードで記載される。
【００３９】
「剤」および「組成物」という用語は本明細書で互換的に使用され、特定量の特定成分を含む生成物、ならびに特定量の特定成分の組み合わせから直接または間接的に生じる任意の生成物を指す。そのような用語は、修飾語「薬学的」に関して使用される場合（「薬学的剤」および「薬学的組成物」におけるものとして）、有効成分と担体を構成する任意の不活性成分とを含む生成物、ならびに任意の２つもしくはそれ以上の成分の組み合わせ、複合体形成、もしくは凝集から、または１つもしくは複数の成分の解離から、または１つもしくは複数の成分の他の種類の反応もしくは相互作用から直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図される。したがって、本発明との関連において、「薬学的剤」および「薬学的組成物」という用語は、本発明の分子または化合物と薬学的もしくは生理学的に許容される担体とを混合することによって作製される任意の組成物を指す。
【００４０】
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という語句は、薬学的または生理学的に許容される材料、組成物、物質、または媒体、例として限定されないが液体もしくは固体増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料を意味する。
本発明の薬学的な剤または組成物は、特にワクチンとして使用される。本発明との関連において、「ワクチン」（「免疫原性組成物」とも称される）という語句は、動物に接種した際に抗腫瘍免疫を誘導する機能を有する剤または組成物を指す。
【００４１】
本明細書における「有効成分」という用語は、生物学的活性または生理的活性のある、剤または組成物中の物質を指す。特に、薬学的な剤または組成物との関連において、「有効成分」という用語は、目的の薬理学的効果を示す物質を指す。例えば、がんの治療または予防に用いるための薬学的な剤または組成物の場合、剤または組成物中の有効成分は、がん細胞および／または組織に対して直接的または間接的に、少なくとも１つの生物学的作用または生理的作用をもたらし得る。好ましくは、そのような作用には、がん細胞増殖の低下または阻害、がん細胞および／または組織の損傷または殺傷などが含まれ得る。典型的には、有効成分の間接的効果は、がん細胞を認識または殺傷するＣＴＬの誘導である。製剤化される前には、「有効成分」は「バルク」、「原薬」、または「原体」と称することもできる。
【００４２】
別段の定めのない限り、「がん」という用語は、ＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子を過剰発現するがんを指し、このがんの例には、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌および軟組織腫瘍が含まれるがこれらに限定されない。
別段の定めのない限り、「細胞傷害性Ｔリンパ球」、「細胞傷害性Ｔ細胞」および「ＣＴＬ」という用語は本明細書において互換的に使用され、特に別段の指定のない限り、非自己細胞（例えば、腫瘍／がん細胞、ウイルス感染細胞）を認識し、そのような細胞の死滅を誘導し得るＴリンパ球のサブグループを指す。
【００４３】
別段の定めのない限り、本明細書で使用する「ＨＬＡ−Ａ２」という用語は、典型的には、その例には、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２０４、ＨＬＡ−Ａ＊０２０５、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６、ＨＬＡ−Ａ＊０２０７、ＨＬＡ−Ａ＊０２１０、ＨＬＡ−Ａ＊０２１１、ＨＬＡ−Ａ＊０２１３、ＨＬＡ−Ａ＊０２１６、ＨＬＡ−Ａ＊０２１８、ＨＬＡ−Ａ＊０２１９、ＨＬＡ−Ａ＊０２２８およびＨＬＡ−Ａ＊０２５０が含まれるが、これらに限定されないサブタイプを指す。
【００４４】
別段の定めのない限り、本明細書で使用する「キット」という用語は、試薬と他の材料との組み合わせに関して使用される。本明細書では、キットはマイクロアレイ、チップ、マーカー等を含み得ることが企図される。「キット」という用語は、試薬および／または材料の特定の組み合わせに限定されないことが意図される。
対象または患者との関連において、本明細書で使用される「対象の（または患者の）ＨＬＡ抗原はＨＬＡ−Ａ２である」という語句は、対象または患者がＭＨＣ（主要組織適合複合体）クラスＩ分子としてのＨＬＡ−Ａ２抗原遺伝子をホモ接合的またはヘテロ接合的に保有し、かつＨＬＡ−Ａ２抗原が対象または患者の細胞においてＨＬＡ抗原として発現されることを指す。
【００４５】
本発明の方法および組成物ががんの「治療」との関連において有用である限り、治療が臨床的利点、例えば対象おけるがんの大きさ、広がり、もしくは転移能の減少、がんの進行遅延、がんの臨床症状の緩和、生存時間の延長、術後再発の抑制等をもたらす場合に、治療は「有効である」とみなされる。治療を予防的に適用する場合、「有効な」とは、治療によって、がんの形成が遅延されるもしくは妨げられるか、またはがんの臨床症状が妨げられるもしくは緩和されることを意味する。有効性は、特定の腫瘍の種類を診断または治療するための任意の公知の方法と関連して決定される。
【００４６】
本発明の方法および組成物ががんの「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」との関連において有用である限り、そのような用語は本明細書において互換的に使用され、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の働きを指す。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベル」で行われ得る。第一次の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現を予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）することに加え、機能を回復させ、かつ疾患関連の合併症を減少させることによって、既存の疾患の悪影響を低下させることを目的とした働きを包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を緩和すること、例えば腫瘍の増殖および転移を減少させることを目的とした広範囲の予防的療法を含み得る。
【００４７】
本発明との関連において、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防は、例えば、以下のイベント、例えば、がん性細胞の増殖の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導、がんの発生の抑制、腫瘍退縮、転移の低減または阻害、がんの術後再発の抑制、ならびに生存時間の延長をもたらす任意の活性を含む。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を減少させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を緩和する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療および／または予防を構成し、１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の軽減もしくは安定した疾患を含む。
【００４８】
本発明との関連において、「抗体」という用語は、指定のタンパク質またはそのペプチドと特異的に反応する免疫グロブリンおよびその断片を指す。抗体には、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質または放射標識と融合させた抗体、および抗体断片が含まれ得る。さらに、本明細書において抗体は広義で使用され、具体的には完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全な抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を包含し、また所望の生物学的活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体」は、すべてのクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）を示す。
【００４９】
ＩＩ．ペプチド：
以下に詳述する本発明のペプチドは、「ＭＰＨＯＳＰＨ１ペプチド」または「ＭＰＨＯＳＰＨ１ポリペプチド」と称することができる。
ＭＰＨＯＳＰＨ１由来のペプチドがＣＴＬによって認識される抗原として機能することを実証するために、ＭＰＨＯＳＰＨ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）由来のペプチドを解析して、それらが、一般的に見られるＨＬＡアリルであるＨＬＡ−Ａ２によって拘束される抗原エピトープであるかどうかを判定した（Date Y et al., Tissue Antigens 47:93-101, 1996；Kondo A et al., J Immunol 155:4307-12,1995；Kubo RT et al., J Immunol 152:3913-24, 1994）。
ＭＰＨＯＳＰＨ１由来のＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−Ａ２に対するそれらの結合親和性に基づいて同定した。
【００５０】
さらに、これらのペプチドをパルスした（負荷した）樹状細胞（ＤＣ）によるＴ細胞のインビトロでの刺激後、以下の各ペプチドを用いてＤＣを刺激することによってＣＴＬの樹立に成功した：
ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ２−９−８５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、
ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ２−９−１２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、
ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ２−９−８４６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、
ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ２−１０−４６０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）、
ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ２−１０−７７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、
ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ２−１０−４０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）、
ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ２−１０−９２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）、
ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ２−１０−１４８４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）および
ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）。
【００５１】
樹立されたこれらのＣＴＬは、各ペプチドをパルスした標的細胞に対して強力な特異的ＣＴＬ活性を示した。これらの結果は、ＭＰＨＯＳＰＨ１がＣＴＬによって認識される抗原であること、および試験されたペプチドがＨＬＡ−Ａ２拘束性ＭＰＨＯＳＰＨ１エピトープペプチドであることを実証しており、したがって、これらのペプチドはＣＴＬによる細胞傷害性についての標的抗原として有効であり得る。さらに、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）は、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ２抗原の両方をＭＨＣクラスＩ分子として発現するがん細胞に対して強力な細胞傷害活性を有するＣＴＬを誘導した。この結果は、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ２−１０−２８２ペプチドがインビボで天然に生じて、ＨＬＡ−Ａ２抗原（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１またはＨＬＡ−Ａ＊０２０６）によってＭＰＨＯＳＰＨ１を発現するがん細胞上に提示されることを示唆している。これらの知見によれば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、またはその誘導体、突然変異体、変異体もしくは改変ペプチドは、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ２抗原を発現するがんを治療するための免疫療法との関連において有用である。本発明のある形態において、本明細書に開示するアミノ酸配列から構成されるペプチドは、がんの免疫療法に使用することができる。治療すべき癌の例には、例えば、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌および軟組織腫瘍が含まれるがこれらに限定されない。しかしながら、本発明のペプチドは、がんがＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ２抗原を発現する限り、いずれのがんにも適用することができる。
【００５２】
ＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子はがん細胞、例えば膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌および軟組織腫瘍において過剰発現されるが、多くの正常器官では発現されないため、それは免疫療法についての良好な標的である。したがって、本発明は、ＭＰＨＯＳＰＨ１からのＣＴＬ認識エピトープのノナペプチド（９個のアミノ酸残基から構成されるペプチド）およびデカペプチド（１０個のアミノ酸残基から構成されるペプチド）を提供する。あるいは、本発明は、ＨＬＡ抗原に結合し、かつ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導する単離されたペプチドであって、ＭＰＨＯＳＰＨ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）の免疫学的活性断片から構成される、ペプチドを提供する。より具体的には、いくつかの態様において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０の中より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。好ましい態様において、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０のアミノ酸配列を含むペプチドである。
【００５３】
一般に、例えばインターネット上で現在利用可能なソフトウェアプログラム、例えばParker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1):163-75およびNielsen M et al.(Protein Sci 2003;12:1007-17）に記載されているものを使用して、様々なペプチドとＨＬＡ抗原との間の結合親和性をインシリコで算出することができる。ＨＬＡ抗原との結合親和性は、例えば、Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1):163-75、Kuzushima K et al., Blood 2001,98(6):1872-81、Larsen MV et al.BMC Bioinformatics.2007 Oct 31;8:424、Buus S et al. Tissue Antigens.,62:378-84,2003、Nielsen M et al.,Protein Sci 2003;12:1007-17、およびNielsen M et al. PLoS ONE 2007:2:e796（これらは、例えばLafuente EM et al., Curresnt Pharmaceutical Design, 2009, 15, 3209-3220にまとめられている）に記載されているように測定することができる。結合親和性を測定するための方法は、例えばJournal of Immunological Methods（1995,185:181-190）およびProtein Science（2000,9:1838-1846）に記載されている。したがって、そのようなソフトウェアプログラムを利用して、ＨＬＡ抗原との高い結合親和性を有するＭＰＨＯＳＰＨ１由来の断片を選択することができる。したがって、本発明は、そのような公知のプログラムによってＨＬＡ抗原と結合することが決定されたＭＰＨＯＳＰＨ１由来の任意の断片から構成されるペプチドを包含する。さらに、そのようなペプチドは、全長のＭＰＨＯＳＰＨ１配列から構成されるペプチドを含み得る。
【００５４】
本発明のペプチド、特に本発明のノナペプチドおよびデカペプチドは、ペプチドがそのＣＴＬ誘導能を保持する限り、付加的なアミノ酸残基を隣接させることができる。具体的な付加的なアミノ酸残基は、それらが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を損なわない限り、任意の種類のアミノ酸から構成され得る。したがって、本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するペプチドであって、ＭＰＨＯＳＰＨ１由来のアミノ酸配列を含むペプチドを包含する。そのようなペプチドは、例えば、約４０アミノ酸未満であり、多くの場合は約２０アミノ酸未満であり、通常は約１５アミノ酸未満である。
【００５５】
一般に、あるペプチド中の１個、２個、数個またはそれ以上のアミノ酸の改変は該ペプチドの機能に影響を及ぼさず、または場合によっては元のペプチドの所望の機能を増強することさえあることが公知である。実際に、改変ペプチド（すなわち、元の参照配列に１個、２個または数個のアミノ酸残基を置換、挿入、欠失および／または付加することによって改変されたアミノ酸配列から構成されるペプチド）は、元のペプチドの生物学的活性を保持することが知られている（Mark et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1984,81:5662-6；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982,10:6487-500；Dalbadie-McFrland et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13）。したがって、本発明の一態様において、本発明のＣＴＬ誘導能を有するペプチドは、１個、２個または数個のアミノ酸が付加、欠失、挿入および／または置換されているＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドから構成されていてよい。別の態様において、本発明のペプチドは、改変ペプチドが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を保持する限り、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０の中より選択されるアミノ酸配列において１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されているアミノ酸配列を含むペプチドであり得る。好ましい態様において、本発明のペプチドは、改変ペプチドが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を保持する限り、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０のアミノ酸配列において１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されているアミノ酸配列を含むペプチドであり得る。
【００５６】
当業者は、単一のアミノ酸またはアミノ酸配列全体のわずかな割合を変更する、アミノ酸配列に対する個々の改変（すなわち、付加、挿入、欠失および／または置換）が、元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらす傾向があることを認識し；したがって、それは「保存的置換」または「保存的改変」と称され、この場合、タンパク質の変化は類似の機能を有するタンパク質をもたらす。機能的に類似しているアミノ酸を提示する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、ならびに以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖である：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。加えて、以下の８群はそれぞれ、相互に保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい）。
このような保存的改変ペプチドも、本発明のペプチドとみなされる。しかしながら、本発明のペプチドはこれらに限定されず、得られた改変ペプチドが元の未改変ペプチドのＣＴＬ誘導能を保持する限り、非保存的改変を含み得る。さらに、改変ペプチドは、ＭＰＨＯＳＰＨ１の多型変異体、種間相同体、またはアリル由来のＣＴＬ誘導可能なペプチドを排除すべきでない。
【００５７】
より高い結合親和性を達成するために、本発明のペプチドに対してアミノ酸残基を挿入、置換、欠失および／または付加してもよく、あるいは本発明のペプチドからアミノ酸残基を欠失させてよい。必要なＣＴＬ誘導能を保持するために、好ましくは少数の（例えば、１個、２個または数個の）またはわずかな割合のアミノ酸のみを改変（挿入、欠失、付加および／または置換）する。本明細書において、「数個」という用語は、５個またはそれ未満のアミノ酸、例えば４個または３個またはそれ未満を意味する。改変すべきアミノ酸の割合は、例えば、２０％もしくはそれ未満、好ましくは１５％もしくはそれ未満、より好ましくは１０％もしくはそれ未満、よりいっそう好ましくは１〜５％であり得る。
【００５８】
がん免疫療法との関連で使用された場合、本発明のペプチドは、ＨＬＡ抗原との複合体として、細胞またはエキソソームの表面上に提示され得る。したがって、ＣＴＬを誘導するだけでなく、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性も保有するペプチドを選択することが好ましい。この目的のために、ペプチドを、改善された結合親和性を有する改変ペプチドが得られるようにアミノ酸残基の置換、挿入、欠失および／または付加によって改変することができる。天然に提示されるペプチドに加えて、ＨＬＡ抗原への結合によって提示されるペプチドの配列の規則性は既知であることから（J Immunol 1994,152:3913;Immunogenetics 1995,41:178;J Immunol; 1994,155:4307）、そのような規則性に基づいた改変を本発明の免疫原性ペプチドに導入することができる。
【００５９】
例えば、高いＨＬＡ−Ａ２結合親和性を示すペプチドは、ロイシンまたはメチオニンで置換されたＮ末端から２番目のアミノ酸を有する傾向がある。同様に、Ｃ末端アミノ酸がバリンまたはロイシンで置換されたペプチドも好ましく使用することができる。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドであって、該ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されている、および／または該ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのアミノ酸配列のＣ末端がバリンもしくはロイシンで置換されているペプチドが、本発明によって企図される。別の態様において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０の中より選択されるアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されている、および／または該ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのアミノ酸配列のＣ末端がバリンもしくはロイシンで置換されているアミノ酸配列を有するペプチドを包含する。好ましい態様において、本発明のペプチドは、  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０のアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されている、および／または該ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのアミノ酸配列のＣ末端がバリンもしくはロイシンで置換されているアミノ酸配列を含み得る。
【００６０】
一態様において、本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するペプチドであって、以下の（１）〜（９）からなる群より選択される一般式を有するペプチドを提供する：
（１）ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ２−９−８５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）に対応
Ｆ  ［Ｘ１］  Ｌ  Ｔ  Ｉ  Ｅ  Ｎ  Ｅ  ［Ｘ２］、
（２）ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ２−９−１２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）に対応
Ｆ  ［Ｘ１］  Ｇ  Ｃ  Ｉ  Ｍ  Ｑ  Ｐ  ［Ｘ２］、
（３）ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ２−９−８４６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）に対応
Ｇ  ［Ｘ１］  Ｒ  Ａ  Ｆ  Ｌ  Ｌ  Ｔ  ［Ｘ２］、
（４）ＭＰＨＯＳＰＨ１−  Ａ２−１０−４６０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）に対応
Ｙ  ［Ｘ１］  Ａ  Ｙ  Ｄ  Ｅ  Ｔ  Ｌ  Ｎ  ［Ｘ２］、
（５）ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ２−１０−７７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）に対応
Ｋ  ［Ｘ１］  Ｉ  Ｃ  Ｎ  Ｅ  Ｔ  Ｖ  Ｅ  ［Ｘ２］
（６）ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ２−１０−４０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）に対応
Ｌ  ［Ｘ１］  Ｔ  Ｌ  Ｇ  Ｋ  Ｃ  Ｉ  Ｎ  ［Ｘ２］
（７）ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ２−１０−９２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）に対応
Ｋ  ［Ｘ１］  Ｓ  Ｎ  Ｅ  Ｉ  Ｅ  Ｔ  Ａ  ［Ｘ２］
（８）ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ２−１０−１４８４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）に対応
Ｑ  ［Ｘ１］  Ｖ  Ａ  Ａ  Ｌ  Ｅ  Ｉ  Ｑ  ［Ｘ２］、および
（９）ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）に対応
Ｙ  ［Ｘ１］  Ｙ  Ｄ  Ｌ  Ｆ  Ｖ  Ｐ  Ｖ  ［Ｘ２］。
【００６１】
一般式（１）〜（９）において、［Ｘ１］はロイシンまたはメチオニンであり、［Ｘ２］はバリンまたはロイシンである。本発明の特に好ましい態様において、一般式はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０に対応する（９）であり得る。本発明はさらに、上記定義の一般式（１）〜（９）によって表される単離されたペプチドであって、そのＮ末端およびＣ末端のいずれかまたは両方において１個、２個、または数個のアミノ酸が付加されているペプチドを提供する。代替的な態様において、本発明は、一般式（１）〜（９）によって表される単離されたペプチドであって、そのＮ末端およびＣ末端のいずれかまたは両方において１個、２個、または数個のアミノ酸残基が欠失されているペプチドを提供する。本発明はまた、一般式（１）〜（９）によって表される単離されたペプチドであって、該配列のいずれかにおいて１個、２個、または数個のアミノ酸が挿入または欠失されているペプチドを提供する。
【００６２】
末端のアミノ酸においてだけでなく、ペプチドの潜在的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）認識部位においても、置換を導入することができる。いくつかの研究は、例えばＣＡＰ１、ｐ５３（２６４−２７２）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）、またはｇｐ１００（２０９−２１７）など、アミノ酸置換を有するペプチドが元の機能と同等であるかまたはより優れた機能を有し得ることを実証している（Zaremba et al. Cancer Res.57,4570-4577,1997、T.K.Hoffmann et al.J Immunol.(2002)Feb 1;168(3):1338-47、S.O.Dionne et al.Cancer Immunol immunother.(2003)52:199-206、およびS.O.Dionne et al.Cancer Immunology,Immunotherapy(2004)53,307-314）。
本発明はまた、本発明のペプチドのＮ末端およびＣ末端のいずれかまたは両方に対する１個、２個、または数個のアミノ酸の付加を企図し、これらを付加することもできる。ＣＴＬ誘導能を保持するそのような改変ペプチドも、本発明に含まれる。
【００６３】
しかしながら、ペプチド配列が、異なる機能を有する内因性または外因性タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、有害な副作用、例えば自己免疫障害または特定の物質に対するアレルギー症状が誘発される可能性がある。したがって、ペプチドの配列が別のタンパク質のアミノ酸配列と一致する状況を回避するために、利用可能なデータベースを使用して相同性検索を行うことが望ましい場合がある。相同性検索から、対象ペプチドと同一であるかまたは１個もしくは２個のアミノ酸が異なるペプチドでさえも事実上存在しないことが明らかになった場合には、そのような副作用の危険を全く伴うことなしに、ＨＬＡ抗原とのその結合親和性を増加させるため、および／またはそのＣＴＬ誘導能を増加させるために、該対象ペプチドを改変することができる。
【００６４】
上記のようにＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドは、非常に効果的であると予測されるが、高い結合親和性の存在を指標として選択された候補ペプチドを、ＣＴＬ誘導能の存在についてさらに調べる。本明細書において「ＣＴＬ誘導能」という語句は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に提示された場合に、ＣＴＬを誘導するペプチドの能力を示す。さらに、「ＣＴＬ誘導能」は、ＣＴＬ活性化を誘導する、ＣＴＬ増殖を誘導する、ＣＴＬによる標的細胞の溶解を促進する、およびＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生を増加させる、ペプチドの能力を含む。
【００６５】
ＣＴＬ誘導能の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を保有するＡＰＣ（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ、および樹状細胞（ＤＣ））、またはより具体的にはヒト末梢血単核白血球由来のＤＣを誘導し、ＡＰＣを試験ペプチドで刺激した後、ＡＰＣをＣＤ８陽性細胞と混合してＣＴＬを誘導し、次いで、標的細胞に対してＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定することによって達成される。反応系として、ヒトＨＬＡ抗原を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug,61(8):764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice：dependence on MHC(HLA) class II restricted T(H) responseに記載されているもの）を使用することができる。あるいは、標的細胞を５１Ｃｒ等で放射標識することができ、標的細胞から放出された放射能からＣＴＬの細胞傷害活性を算出することができる。あるいは、固定化したペプチドを保有する細胞の存在下で、ＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定し、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を使用して培地上の阻止帯を可視化することによって、その活性を試験することができる。
【００６６】
上記のようにペプチドのＣＴＬ誘導能を試験した結果、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０によって示されるアミノ酸配列を有するそれらのペプチドの中より選択されるノナペプチドおよびデカペプチドが、ＣＴＬ誘導能およびＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を示すことが発見された。したがって、これらのペプチドは本発明の好ましい態様として例示される。
【００６７】
さらに、相同性解析の結果は、そのようなペプチドが、他のいかなる公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドとも有意な相同性を共有していないことを実証した。そのため、免疫療法に使用した場合に未知のまたは望ましくない免疫応答の可能性は低くなっている。したがって、この局面からもまた、これらのペプチドはがん患者においてＭＰＨＯＳＰＨ１に対する免疫を誘発するのに有用である。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドが、本発明によって包含される。
【００６８】
上記の改変に加えて、本発明のペプチドは、結果として生じる連結ペプチドが、元のペプチドのＣＴＬ誘導能を保持する限り、他のペプチドに連結させることができる。「他の」適切なペプチドの例には、本発明のペプチドまたは他のＴＡＡに由来するＣＴＬ誘導性ペプチドが含まれる。本発明のペプチドは、「他の」ペプチドにリンカーを介して直接または間接的に連結させることができる。ペプチド間のリンカーは当技術分野で周知であり、例えばＡＡＹ（P.M.Daftarian et al., J Trans Med 2007,5:26）、ＡＡＡ、ＮＫＲＫ（R.P.M.Sutmuller et al., J Immunol.2000,165:7308-7315）、またはＫ（S.Ota et al., Can Res.62,1471-1476、K.S.Kawamura et al., J Immunol.2002,168:5709-5715）である。
【００６９】
例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩを介する免疫応答を増加させるために、ＭＰＨＯＳＰＨ１ではない腫瘍関連抗原由来のペプチドを使用することもできる。がん細胞が２種以上の腫瘍関連遺伝子を発現することは、当技術分野において周知である。そのようなＴＡＡ由来のいくつかのＣＴＬ誘導可能なペプチドが単離されている（例えば、ＷＯ２００８／０４７４７３、ＷＯ２０１０／０４７０６２、ＷＯ２００８／１０２５５７、ＷＯ２００９／０２５１１６）。したがって、本発明のペプチドに連結された「他の」ペプチドの例には、ＭＨＰＯＳＰＨ１以外のＴＡＡ由来のＣＴＬ誘導可能なペプチドが含まれるがこれに限定されない。本発明において、「他の」ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドであるだけでなく、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドでもあり得る。当業者は、１種もしくは複数種のＭＰＨＯＳＰＨ１ペプチドおよび１種もしくは複数種のＭＰＨＯＳＰＨ１ではないペプチドを含むポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸を、従来の分子生物学の手順を使用して調製することができる。
【００７０】
上記の連結ペプチドを本明細書では「ポリトープ」と称し、これはすなわち、様々な配置（例えば、連鎖状、重複）で連結され得る、２つまたはそれ以上の潜在的な免疫原性または免疫応答刺激性ペプチドの群である。ポリトープ（またはポリトープをコードする核酸）を標準的な免疫化プロトコールに従って例えば動物に投与して、免疫応答の刺激、増強および／または誘発における該ポリトープの有効性を試験することができる。
【００７１】
ペプチドを直接的にまたは隣接配列の使用を介して連結して、ポリトープを形成することができ、ポリトープのワクチンとしての使用は当技術分野において周知である（例えば、Thomson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA 92(13):5845-5849,1995；Gilbert et al., Nature Biotechnol.15(12):1280-1284,1997；Thomsom et al., J Immunol.157(2):822-826,1996；Tarn et al., J Exp.Med.171(1):299-306,1990を参照されたい）。様々な数および組み合わせのエピトープを含むポリトープを調製することができ、ＣＴＬによる認識について、および免疫応答の増加における有効性について試験することができる。
【００７２】
本発明のペプチドは、それらがＣＴＬ誘導能を保持する限り、他の物質にさらに連結させることもできる。そのような「他の」物質の具体例には、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマー等が含まれるがこれらに限定されない。ペプチドは、修飾によって本明細書に記載するペプチドの生物学的活性が損なわれない限り、修飾、例えば糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化を含むことができる。このような種類の修飾は、付加的な機能（例えば、標的化機能および送達機能）を付与すること、またはポリペプチドを安定化するように行うことができる。
【００７３】
例えば、ポリペプチドのインビボ安定性を増加させるために、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸模倣体または非天然アミノ酸を導入することが当技術分野において公知であり、この概念を本発明のポリペプチドに対して採用することもできる。ポリペプチドの安定性は、いくつかの方法でアッセイすることができる。例えば、ペプチダーゼ、ならびに様々な生物学的媒質、例えばヒトの血漿および血清を使用して、安定性を試験することができる（例えば、Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11:291-302を参照されたい）。
本発明のペプチドがシステイン残基を含む場合、それらのペプチドはシステイン残基のＳＨ基間のジスルフィド結合を介して二量体を形成する傾向がある。したがって、本発明のペプチドの二量体も、本発明のペプチドに含まれる。
【００７４】
さらに、上述したように、１個、２個または数個のアミノ酸残基によって置換、欠失、挿入および／または付加されている改変ペプチドの中から、元のペプチドと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有するものをスクリーニングまたは選択することができる。したがって本発明はまた、元のものと比較して同一かまたはそれよりも高い活性を有する改変ペプチドをスクリーニングまたは選択する方法を提供する。例えば、本方法は、以下の段階を含み得る：
ａ：本発明のペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基を改変（すなわち、置換、欠失、挿入または付加）する段階、
ｂ：段階（ａ）において改変されたペプチドの活性を測定する段階、および
ｃ：元のペプチドと比較して同一かまたはそれよりも高い活性を有するペプチドを選択する段階。
本明細書において、活性には、ＭＨＣ結合活性およびＡＰＣまたはＣＴＬ誘導能が含まれ得る。好ましくは、ペプチドの活性はＣＴＬ誘導能である。
【００７５】
ＩＩＩ．ＭＰＨＯＳＰＨ１ペプチドの調製：
周知の技法を使用して、本発明のペプチドを調製することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術または化学合成によって、本発明のペプチドを合成的に調製することができる。本発明のペプチドは、個々に、または２つもしくはそれ以上のペプチドを含むより長いポリペプチドとして、合成することができる。ペプチドを単離する、すなわち、他の天然の宿主細胞タンパク質およびそれらの断片、または他のいかなる化学物質も実質的に含まないように精製または単離することができる。
【００７６】
本発明のペプチドは、そのような修飾によって元のペプチドの生物学的活性が損なわれない限り、修飾、例えば糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化を含み得る。他の例示的な修飾には、例えばペプチドの血清半減期を増加させるために使用することができる、Ｄ−アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の組み込みが含まれる。
【００７７】
選択されたアミノ酸配列に基づいた化学合成によって、本発明のペプチドを得ることができる。例えば、この合成に採用し得る従来のペプチド合成法には、以下のものが含まれる：
（ｉ）Peptide Synthesis, Interscience, New York,1966；
（ｉｉ）The Proteins,Vol.2,Academic Press, New York, 1976;
（ｉｉｉ）「ペプチド合成」（日本語），丸善,1975;
（ｉｖ）「ペプチド合成の基礎と実験」（日本語）丸善,1985;
（ｖ）医薬品の開発(第2版)（日本語），続第14巻(ペプチド合成),広川書店,1991;
（ｖｉ）ＷＯ９９／６７２８８；および
（ｖｉｉ）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol.2,"Solid Phase Peptide Synthesis",Academic Press,New York,1980,100-118.
【００７８】
あるいは、ペプチドを産生するための任意の公知の遺伝子工学的方法を採用して、本発明のペプチドを得ることもできる（例えば、Morrison J, J Bacteriology 1977,132:349-51；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology（eds.Wu et al.1983,101:347-62）。例えば、最初に、目的のペプチドを発現可能な形態で（例えば、プロモーター配列に相当する調節配列の下流に）コードするポリヌクレオチドを有する適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に形質転換する。そのようなベクターおよび宿主細胞も本発明によって提供される。次いで、該宿主細胞を培養して、関心対象のペプチドを産生させる。インビトロ翻訳系を採用して、ペプチドをインビトロで産生させることもできる。
【００７９】
ＩＶ．ポリヌクレオチド：
本発明は、上述の本発明のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドには、天然ＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０３１７０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５））由来のポリヌクレオチドまたはその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが含まれ得る。本明細書において「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、数多くの機能的に同一の核酸が任意の特定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、該コドンを、記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変異は当技術分野において「サイレント変異」と称され、保存的に改変された変異体の１種を表す。ペプチドをコードする本明細書に記載するあらゆる核酸配列は、該核酸のあらゆる可能なサイレント変異をも表す。核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一の分子を得ることができることを、当業者は容易に認識する。したがって、開示したペプチドをコードする各核酸配列は、それに関連するサイレント変異の非明示的な開示を表す。
【００８０】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの誘導体から構成され得る。当技術分野において周知のとおり、ＤＮＡ分子は塩基、例えば天然塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧから適切に構成され、ＲＮＡではＴがＵに置き換えられる。当業者は、非天然塩基もまたポリヌクレオチドに含まれることを認識する。
【００８１】
本発明のポリヌクレオチドは、介在するアミノ酸配列を伴って、または伴わずに、本発明の複数のペプチドをコードし得る。例えば、介在するアミノ酸配列は、ポリヌクレオチドまたは翻訳されたペプチドの切断部位（例えば、酵素認識配列）を提供し得る。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするコード配列に対するあらゆる付加的配列を含み得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドの発現に必要な調節配列を含む組換えポリヌクレオチドであってよく、またはマーカー遺伝子等を有する発現ベクター（プラスミド）であってよい。一般に、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを使用する従来の組換え技法によりポリヌクレオチドを操作することによって、そのような組換えポリヌクレオチドを調製することができる。
【００８２】
組換え技法および化学合成技法のいずれを使用しても、本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、本発明のペプチドのコード配列を有するポリヌクレオチドを適切なベクターに挿入することによって本発明のポリヌクレオチドを作製することができ、これはコンピテント細胞にトランスフェクトした場合に発現され得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドを、ＰＣＲ技法を使用して増幅し、または適切な宿主内で複製させることができる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York,1989を参照されたい）。あるいは、Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992,48:2223-311；Matthes et al., EMBO J 1984,3:801-5に記載されている固相技法を使用して、本発明のポリヌクレオチドを合成することができる。
【００８３】
Ｖ．エキソソーム：
本発明はさらに、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との間に形成された複合体を自身の表面上に提示する、エキソソームと称される細胞内小胞を提供する。エキソソームは、例えば公表特許公報  特表平１１−５１０５０７号およびＷＯ９９／０３４９９に詳述されている方法を使用することによって調製することができ、治療および／または予防の対象となる患者から得られたＡＰＣを使用して調製することができる。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様に、ワクチンとして接種することができる。
【００８４】
複合体中に含まれるＨＬＡ抗原の型は、治療および／または予防を必要とする対象のものと一致しなければならない。例えば日本人では、ＨＬＡ−Ａ２、特にＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６が適切であることが多い。日本人および白人の間で高発現するＨＬＡ−Ａ２型の使用は、有効な結果を得るのに好ましく、サブタイプ、例えばＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６が使用される。典型的には、クリニックにおいて、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型を予め調べることによって、この抗原に対して高レベルの結合親和性を有する、または抗原提示によるＣＴＬ誘導能を有するペプチドの適切な選択が可能となる。さらに、高い結合親和性およびＣＴＬ誘導能を示すペプチドを得るために、天然のＭＰＨＯＳＰＨ１部分ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、１個、２個、または数個のアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加を行うことができる。
【００８５】
本発明のエキソソームについてＨＬＡ−Ａ２型ＨＬＡ抗原を使用する場合、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０のいずれか１つのアミノ酸配列を有するペプチドが特に有用である。いくつかの態様において、本発明のエキソソームは、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２抗原との複合体を自身の表面上に提示するエキソソームである。そのような複合体中に含まれるＨＬＡ−Ａ２抗原の典型例には、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６が含まれるがこれらに限定されない。
【００８６】
ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）
本発明はまた、ＨＬＡ抗原および本発明のペプチドによって形成された複合体を自身の表面上に提示する単離されたＡＰＣを提供する。ＡＰＣは、治療および／または予防の対象となる患者に由来してよく、かつ単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と組み合わせて、ワクチンとして投与することができる。
【００８７】
ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、これには、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られている樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞が含まれる。ＤＣは、ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導作用を有する代表的なＡＰＣであるため、ＤＣは本発明のＡＰＣに適切である。
【００８８】
例えば、末梢血単球からＤＣを誘導し、次にそれらをインビトロ、エクスビボまたはインビボで本発明のペプチドと接触させる（で刺激する）ことによって、本発明のＡＰＣを得ることができる。本発明のペプチドを対象に投与する場合、本発明のペプチドを提示するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。したがって、本発明のＡＰＣは、本発明のペプチドを対象に投与した後、該対象からＡＰＣを回収することによって得ることができる。あるいは、本発明のＡＰＣは、対象から回収されたＡＰＣを本発明のペプチドと接触させることによって得ることができる。
【００８９】
対象においてがんに対する免疫応答を誘導するために、本発明のＡＰＣを単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と組み合わせて、対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は以下の段階を含み得る：
ａ：第１の対象からＡＰＣを回収する段階、
ｂ：段階ａのＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階、および
ｃ：段階ｂのＡＰＣを第２の対象に投与する段階。
【００９０】
第１の対象と第２の対象は同一の個体であってよく、または異なる個体であってよい。段階ｂによって得られるＡＰＣは、がんの治療および／または予防のためのワクチンとして投与することができ、このがんの例には、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌および軟組織腫瘍が含まれるがこれらに限定されない。
本発明はまた、ＡＰＣを誘導するための薬学的組成物を製造するための方法または工程であって、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体とともに混合または製剤化する段階を含む方法を提供する。
【００９１】
本発明の一局面によると、本発明のＡＰＣはＣＴＬ誘導能を有する。ＡＰＣとの関連において、語句「ＣＴＬ誘導能を有する」は、ペプチドと接触させていないＡＰＣにおけるものよりも高いＣＴＬ誘導能を示すことを指す。ＣＴＬ誘導能を有するそのようなＡＰＣは、上記の方法に加え、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをインビトロでＡＰＣに導入する段階を含む方法によって調製することができる。導入する遺伝子は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってよい。導入の方法の例には、特に限定されることなく、当技術分野において従来より実施されている様々な方法、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、またはリン酸カルシウム法が含まれ、それらを使用することができる。より具体的には、Cancer Res 1996,56:5672-7;J Immunol 1998,161:5607-13；J Exp Med 1996,184:465-72；公表特許公報第２０００−５０９２８１号に記載されているように、それを行うことができる。遺伝子をＡＰＣに導入することによって、該遺伝子は細胞内で転写、翻訳等を受け、次いで、得られたタンパク質はＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩによってプロセシングされて、提示経路を経て部分ペプチドが提示される。
いくつかの態様において、本発明のＡＰＣは、ＨＬＡ−Ａ２抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣである。そのような複合体中に含まれるＨＬＡ−Ａ２抗原の典型例には、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６が含まれるがこれらに限定されない。
【００９２】
ＶＩＩ．細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）：
本発明のペプチドのいずれかに対して誘導されたＣＴＬは、インビボでがん細胞を標的とする免疫応答を増強するため、ペプチドと同様にワクチンとして使用することができる。したがって本発明は、本発明の本ペプチドのいずれかによって特異的に誘導または活性化された、単離されたＣＴＬを提供する。
【００９３】
そのようなＣＴＬは、（１）本発明のペプチドを対象に投与し、（２）対象由来のＡＰＣ、およびＣＤ８陽性Ｔ細胞、もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させ（で刺激し）、（３）ＣＤ８陽性Ｔ細胞もしくは末梢血単核白血球を、ＨＬＡ抗原とペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソームとインビトロで接触させ、または（４）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、もしくはＴＣＲサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチドを導入することによって得ることができ、該ＴＣＲは、細胞表面上の、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２抗原との複合体と結合し得る。ＣＴＬの調製において使用すべきそのようなＡＰＣまたはエキソソームは、上記の方法によって調製することができる。（４）の方法の詳細は「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章において以下に記載する。
【００９４】
本発明のＣＴＬは、治療および／または予防の対象となる患者に由来してよく、かつ単独で投与すること、または効果を調節する目的で本発明のペプチド、ＡＰＣもしくはエキソソームを含む他の薬物と組み合わせて投与することができる。得られたＣＴＬは、本発明のペプチド、例えば誘導に使用した同一のペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。標的細胞は、ＭＰＨＯＳＰＨ１を内因的に発現する細胞、例えばがん細胞、またはＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子をトランスフェクトした細胞であってよく、かつ本発明のペプチドによる刺激に起因して該ペプチドを細胞表面上に提示する細胞も、活性化されたＣＴＬの攻撃の標的として役立ち得る。
【００９５】
いくつかの態様において、本発明のＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する細胞を認識する。ＣＴＬとの関連において、「細胞を認識する」という語句は、細胞表面上のＨＬＡ−Ａ２抗原と本発明のペプチドとの複合体にそのＴＣＲを介して結合し、その細胞に対して特異的な細胞傷害活性を示すことを指す。本明細書では、「特異的な細胞傷害活性」は、ＨＬＡ−Ａ２抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示する細胞に対して細胞傷害活性を示すが、他の細胞には示さないことを指す。そのような複合体中に含まれるＨＬＡ−Ａ２抗原の典型例には、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６が含まれるがこれらに限定されない。
【００９６】
ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）：
本発明はまた、ＴＣＲサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、またはＴＣＲサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチドを含み、該ＴＣＲが、細胞表面上の、ＨＬＡ−Ａ２抗原と本発明のペプチドとの複合体に結合し得る、組成物、およびそれを使用する方法を提供する。そのようなＴＣＲサブユニットは、ＭＰＨＯＳＰＨ１を発現する腫瘍細胞に対する特異性をＴ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を有する。当技術分野における公知の方法を使用することによって、本発明のペプチドで誘導されたＣＴＬのＴＣＲのα鎖およびβ鎖のそれぞれをコードするポリヌクレオチドを同定することができる（ＷＯ２００７／０３２２５５、およびMorgan et al., J Immunol.171.3288(2003)）。例えば、ＰＣＲ法を好ましく使用することができる。解析のためのＰＣＲプライマーは、例えば、５'側プライマーとしての５'−Ｒプライマー（５'−ｇｔｃｔａｃｃａｇｇｃａｔｔｃｇｃｔｔｃａｔ−３'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７）、および３'側プライマーとしての、ＴＣＲα鎖Ｃ領域に特異的な３−ＴＲａ−Ｃプライマー（５'−ｔｃａｇｃｔｇｇａｃｃａｃａｇｃｃｇｃａｇｃｇｔ−３'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８）、ＴＣＲβ鎖Ｃ１領域に特異的な３−ＴＲｂ−Ｃ１プライマー（５'−ｔｃａｇａａａｔｃｃｔｔｔｃｔｃｔｔｇａｃ−３'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９）、またはＴＣＲβ鎖Ｃ２領域に特異的な３−ＴＲβ−Ｃ２プライマー（５'−ｃｔａｇｃｃｔｃｔｇｇａａｔｃｃｔｔｔｃｔｃｔｔ−３'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０）であってよいが、これらに限定されない。ＴＣＲ誘導体は、本発明のペプチドを提示する標的細胞と高い結合力で結合することができ、かつ任意で、本発明のペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷をインビボおよびインビトロで媒介する。
【００９７】
ＴＣＲサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、またはＴＣＲサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチドを、適切なベクター、例えばレトロウイルスベクターに組み込むことができる。これらのベクターは、当技術分野において周知である。該ポリヌクレオチドまたはそれらを有用に含むベクターを、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８陽性Ｔ細胞）、例えば患者由来のＴ細胞に導入することができる。有利には、本発明は、患者自身のＴ細胞（または別の哺乳動物のＴ細胞）の迅速な改変によって、優れたがん細胞殺傷特性を有する改変Ｔ細胞を迅速かつ容易に作製することを可能にする容易に入手可能な組成物を提供する。
【００９８】
本発明のペプチドに対して特異的なＴＣＲは、ＴＣＲがＴ細胞の表面上に提示される場合に、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を特異的に認識し得るべきであり、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を提示する標的細胞に対する特異的活性をＴ細胞に付与し得る。そのようなＴＣＲサブユニットをコードするポリペプチドを導入することによって調製されたＣＴＬがそのような標的細胞を特異的に認識することができる必要な活性は、任意の公知の方法によって確認することができる。そのような方法の好ましい例には、例えば、ＨＬＡ分子および本発明のペプチドを使用するＨＬＡ多量体染色解析、ならびにＥＬＩＳＰＯＴアッセイが含まれる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行うことによって、上記方法によって調製されたＣＴＬが標的細胞を特異的に認識することができること、およびそのような認識によって生じたシグナルを細胞内に伝達することができることを確認することができる。さらに、上記方法によって調製されたＣＴＬが標的細胞に対する特異的細胞傷害活性を有することを公知の方法によって確認することもできる。そのような方法の例には、例えば、ＨＬＡ−Ａ２抗原およびＭＰＨＯＳＰＨ１の両方を発現する細胞を使用するＣｒ放出アッセイが含まれる。
【００９９】
一局面において、本発明は、ＴＣＲサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、またはＴＣＲサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチドによる形質導入によって調製されたＣＴＬであって、該ＴＣＲが、細胞表面上の、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドとＨＬＡ−Ａ２抗原との複合体に結合し得る、ＣＴＬ、を提供する。
【０１００】
形質導入されたＣＴＬは、インビボでがん細胞にホーミングすることができ、かつ周知のインビトロ培養法によって増殖させることができる（例えば、Kawakami et al., J Immunol.,142,3452-3461(1989)）。本発明のＣＴＬは、療法または保護を必要としている患者におけるがんの治療および予防のいずれかまたは両方に有用な免疫原性組成物を形成するために使用することができる（ＷＯ２００６／０３１２２１）。
【０１０１】
ＩＸ．薬学的組成物：
ＭＰＨＯＳＰＨ１の発現は、正常組織と比較して、その例に膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌および軟組織腫瘍が含まれるが必ずしもこれらに限定されないがんにおいて特異的に上昇するため、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを、がんの治療および予防のいずれかまたは両方に使用することができる。したがって、本発明は、がんの治療および予防のいずれかまたは両方のために製剤化される薬学的な剤または組成物であって、本発明の１種もしくは複数種のペプチドまたはポリヌクレオチドを有効成分として含むそのような剤または組成物を提供する。あるいは、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を提示する前述のエキソソームまたはＡＰＣのいずれかを、薬学的な剤または組成物のための有効成分として使用することができる。さらに、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を提示する細胞を認識し得る前述のＣＴＬを、本発明の薬学的な剤または組成物のための有効成分として使用することもできる。
【０１０２】
したがって、本発明は、以下の中より選択される少なくとも１つの有効成分を含む剤または組成物を提供する：
（ａ）本発明の１種または複数種のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする１種または複数種のポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明の１種または複数種のＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の１種または複数種のＣＴＬ。
【０１０３】
本発明の薬学的な剤または組成物は、ワクチンとして使用される。本発明との関連において、「ワクチン」（「免疫原性組成物」とも称される）という語句は、動物に接種した際に抗腫瘍免疫を改善、増強および／または誘導する機能を有する組成物を指す。換言すれば、本発明は、対象においてがんに対する免疫応答を誘導するための本発明の薬学的な剤または組成物を提供する。
【０１０４】
本発明の薬学的な剤または組成物は、対象におけるがんの治療および予防のいずれかまたは両方のために使用することができる。薬学的な剤または組成物を適用することができるそのような対象の例には、ヒト、ならびに他の哺乳動物、例としてマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒ、およびチンパンジー、特に商業的に重要な動物または家畜が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの態様において、本発明の薬学的な剤または組成物は、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために製剤化することができる。
【０１０５】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍、例としてその術後再発の治療および予防のいずれかまたは両方のために製剤化される薬学的な剤または組成物の製造における、以下の中より選択される有効成分の使用を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１０６】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍の治療および予防のいずれかまたは両方において使用される、以下の中より選択される有効成分を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１０７】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍の治療および予防のいずれかまたは両方のための薬学的な組成物または剤を製造するための方法または工程であって、薬学的にまたは生理学的に許容される担体を以下の中より選択される有効成分とともに製剤化する段階を含む方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明のＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１０８】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍の治療および予防のいずれかまたは両方のための薬学的な組成物または剤を製造するための方法または工程であって、以下の中より選択される有効成分と薬学的にまたは生理学的に許容される担体とを混合する段階を含む方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明のＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１０９】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍の治療および予防のいずれかまたは両方のための方法であって、以下の中より選択される少なくとも１つの有効成分を対象に投与する段階を含む方法を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明のＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１１０】
本発明によれば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドであり、したがって対象においてＨＬＡ−Ａ２およびＭＰＨＯＳＰＨ１を発現するがんに対する特異的免疫応答を誘導し得る候補として役立つことが見出された。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３または１２０のアミノ酸配列を有するこれらのペプチドのいずれかを含む本発明の薬学的な剤または組成物は、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために特に適している。これらのペプチドの特に好ましい例は、ＨＬＡ−Ａ２抗原およびＭＰＨＯＳＰＨ１を発現するがん細胞を標的とするＣＴＬを誘導する能力を有することが確認されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０のアミノ酸配列を有するペプチドである。したがって、好ましい態様において、本発明の薬学的な剤または組成物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０のアミノ酸配列を有するペプチドもしくはその改変型を含み、またはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。同じことが、これらのペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド（すなわち、本発明のポリヌクレオチド）を含む薬学的な剤または組成物にも当てはまる。
【０１１１】
本発明の薬学的な剤または組成物によって治療すべきがんには、ＭＰＨＯＳＰＨ１が発現される（例えば、過剰発現される）任意のがんが含まれ、このがんの例には、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌および軟組織腫瘍が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１２】
本発明の薬学的な剤または組成物は、前述の有効成分に加えて、例えばがん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有する他のペプチド、該他のペプチドをコードする他のポリヌクレオチド、該他のペプチドを提示する他の細胞等を含み得る。がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するそのような「他の」ペプチドの例には、がん特異的抗原（例えば、同定されたＴＡＡ）が含まれるが、これに限定されない。
【０１１３】
必要に応じて、本発明の薬学的な剤または組成物は、他の治療物質が、本発明の有効成分（すなわち、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、ＡＰＣ、ＣＴＬ）の抗腫瘍効果を阻害しない限り、追加の有効成分として該治療物質を任意に含み得る。例えば、製剤は、抗炎症剤、鎮痛剤、化学療法薬等を含み得る。医薬自体に他の治療物質を含めることに加えて、本発明の医薬を、１つまたは複数の他の薬理学的な剤または組成物と連続してまたは同時に投与することもできる。医薬および薬理学的な剤または組成物の量は、例えば、使用する薬理学的な剤または組成物の種類、治療する疾患、ならびに投与のスケジュールおよび経路に依存する。
当業者は、特に本明細書に言及された成分に加えて、本発明の薬学的な剤または組成物がさらに当該製剤化の型を考慮して当技術分野における従来の他の物質（例えば、増量剤、結合剤、希釈剤、添加剤等）を含み得ることを容易に認識する。
【０１１４】
本発明の一態様において、本発明の薬学的な剤または組成物を、治療すべき疾患、例えばがんの病態を治療するのに有用な材料を含む製品に、例えばキットとして包装することができる。該製品は、ラベルを有する本発明の薬学的な剤または組成物のいずれかの容器を含み得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。容器上のラベルには、剤または組成物が、疾患の１つまたは複数の状態の治療または予防のために使用されることが示されるべきである。ラベルはまた、投与等に関する指示も示し得る。
【０１１５】
本発明の薬学的な剤または組成物を含むキットは、上記の容器に加えて、任意で、薬学的に許容される希釈剤を収容した第２の容器をさらに含み得る。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および使用説明を記載した添付文書を含む、商業上の観点および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
必要に応じて、有効成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置にて、本発明の薬学的な剤または組成物を包装することができる。該パックは、例えば、ブリスターパックのように金属ホイルまたはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する説明書が添付され得る。
【０１１６】
（１）有効成分としてペプチドを含む薬学的組成物：
本発明のペプチドは、薬学的な剤または組成物として直接投与してよく、または必要であれば、従来の製剤化法によって製剤化してよい。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬物に通常使用される担体、賦形剤等が特に制限なく必要に応じて含まれ得る。そのような担体の例には、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液等が含まれるがこれらに限定されない。さらに、薬学的な物質、剤または組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤等を含み得る。本発明の薬学的な剤または組成物は、抗がん目的に使用することができる。
【０１１７】
インビボでＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチドを、本発明のペプチドの２つまたはそれ以上を含む組み合わせとして調製することができる。ペプチドはカクテルであってよく、または標準的な技法を使用して互いに結合させてよい。例えば、ペプチドは化学的に連結させ、または１個もしくは数個のアミノ酸をリンカーとして有し得る単一の融合ポリペプチド配列として発現させることができる（例えば、リジンリンカー：K.S.Kawamura et al.J.Immunol.2992,168:5709-5715）。組み合わせにおけるペプチドは、同一であってよく、または異なっていてよい。本発明のペプチドを投与することによって、ペプチドはＨＬＡ抗原によってＡＰＣ上に高密度で提示され、次いで、提示されたペプチドとＨＬＡ抗原との間に形成された複合体に対して特異的に反応するＣＴＬが誘導される。あるいは、ＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を対象から取り出し、次いで本発明のペプチドによって刺激して、本発明のペプチドのいずれかを自身の細胞表面上に提示するＡＰＣを得ることができる。これらのＡＰＣを対象に再投与して対象においてＣＴＬを誘導することができ、結果として、腫瘍関連内皮に対する攻撃性を増加させることができる。
【０１１８】
有効成分として本発明のいずれかのペプチドを含む本発明の薬学的な剤または組成物は、細胞性免疫が効率的に樹立されるようにアジュバントも含み得る。あるいは、本発明の薬学的な剤または組成物は、他の有効成分とともに投与してよく、または顆粒内へ製剤化することによって投与してよい。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質とともに（または連続して）投与した場合に、該タンパク質に対する免疫応答を増強する任意の化合物、物質または組成物を指す。適用することができるアジュバントには、文献（Clin Microbiol Rec 1994,7:277-89）に記載されているものが含まれる。例示的なアジュバントには、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、ＩＳＣＯＭａｔｒｉｘ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣｐＧ、Ｏ／Ｗエマルション等が含まれるが、これらに限定されない。
さらに、リポソーム製剤、直径数マイクロメートルのビーズにペプチドが結合している顆粒製剤、およびペプチドに脂質が結合している製剤を好都合に使用してもよい。
【０１１９】
本発明の別の態様において、本発明のペプチドはまた、薬学的に許容される塩の形態で投与してもよい。塩の好ましい例には、アルカリ金属との塩、金属との塩、有機塩基との塩、アミンとの塩、有機酸（酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸等）との塩、および無機酸（塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等）との塩が含まれる。本明細書で使用する「薬学的に許容される塩」という語句は、その化合物の生物学的有効性および特性を保持し、無機または有機の酸または塩基との反応によって得られる塩を指す。
【０１２０】
いくつかの態様において、本発明の薬学的な剤または組成物は、ＣＴＬをプライミングする成分を含む。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬをプライミングし得る物質として同定されている。例えば、パルミチン酸残基をリジン残基のεアミノ基およびαアミノ基に付着させ、次いで本発明のペプチドに連結させることができる。次いで、脂質付加したペプチドを、ミセルもしくは粒子の状態で直接投与するか、リポソーム中に取り込ませて投与するか、またはアジュバント中に乳化させて投与することができる。ＣＴＬ応答の脂質による刺激の別の例として、適切なペプチドに共有結合している場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポタンパク質、例えばトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニル−セリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）を使用してＣＴＬをプライミングすることができる（例えば、Deres et al., Nature 1989,342:561-4を参照されたい）。
【０１２１】
適当な投与方法の例には、経口、皮内、皮下、筋肉内、骨内、腹膜、および静脈内注射等、ならびに全身投与または標的部位の近傍への局所投与（すなわち、直接注射）が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。投与は、単回投与によって行うことができ、または複数回投与によってブーストすることができる。本発明のペプチドの用量は、治療すべき疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に応じて適宜調整することができ、これは通常０．００１ｍｇ〜１，０００ｍｇ、例えば０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切かつ最適な投与量を容易に決定することができる。
【０１２２】
（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的組成物：
本発明の薬学的な剤または組成物はまた、本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチドを含み得る。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞に導入された場合に、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現することを意味する。具体的な態様において、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、該ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するように備えることができる（相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばThomas KR & Capecchi MR,Cell 1987,51:503-12を参照されたい。例えば、Wolff et al., Science 1990,247:1465-8；米国特許第５，５８０，８５９号；第５，５８９，４６６号；第５，８０４，５６６号；第５，７３９，１１８号；第５，７３６，５２４号；第５，６７９，６４７号；およびＷＯ９８／０４７２０）も参照されたい。ＤＮＡに基づく送達技術の例には、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が含まれる（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
【０１２３】
ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって、本発明のペプチドを発現させることもできる。発現ベクターの例には、弱毒化ウイルス宿主、例えばワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスが含まれる。このアプローチは、例えば、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとして、ワクシニアウイルスの使用を伴う。宿主に導入すると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって免疫応答を誘発する。免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Stover et al.,Nature 1991,351:456-60に記載されている。治療的な投与または免疫化に有用である多種多様な他のベクター、例えばアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が明らかである。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000,6:66-71；Shedlock et al.,J Leukoc Biol 2000,68:793-806；Hipp et al.,In Vivo 2000,14:571-85を参照されたい。
【０１２４】
ポリヌクレオチドの患者内への送達は、直接的であってよく、この場合にはポリヌクレオチドを保有するベクターに患者を直接曝露し、または間接的であってよく、この場合にはまずインビトロで細胞を関心対象のポリヌクレオチドで形質転換し、次いで該細胞を患者内に移植する。これら２つのアプローチはそれぞれ、インビボおよびエクスビボの遺伝子療法として公知である。
【０１２５】
遺伝子療法の方法の一般的な総説に関しては、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993,12:488-505；Wu and Wu, Biotherapy 1991,3:87-95；Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993,33:573-96；Mulligan, Science 1993,260:926-32；Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993,62:191-217；Trends in Biotechnology 1993,11(5):155-215を参照されたい。本発明に適用可能な組換えＤＮＡ技術の分野において一般に公知の方法は、Ausubel et al.によってCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wile & Sons, NY, 1993；およびKriegerによって  Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY,1990に記載されている。
【０１２６】
ペプチドの投与と同様に、ポリヌクレオチドの投与は、経口、皮内、皮下、静脈内、筋肉内、骨内、および／または腹膜注射等によって、ならびに全身投与または標的部位の近傍への局所投与を介して行うことができ、これらが使用される。投与は、単回投与によって行うことができ、または複数回投与によってブーストすることができる。適切な担体中のポリヌクレオチドの用量、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞中のポリヌクレオチドの用量は、治療すべき疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に応じて適宜調整することができ、これらは通常０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日に１度〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適宜選択することができる。
【０１２７】
Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣおよびＣＴＬを使用する方法：
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドを使用して、ＡＰＣおよびＣＴＬを調製または誘導することができる。本発明のエキソソームおよびＡＰＣを使用して、ＣＴＬを誘導することもできる。ペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソームおよびＡＰＣは、ＣＴＬ誘導能を任意の他の化合物が阻害しない限り、この追加の化合物と組み合わせて使用することができる。したがって、前述の本発明の薬学的な剤または組成物のいずれかを使用してＣＴＬを誘導することができる。それに加えて、該ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものを使用して、以下に説明するように、ＡＰＣを誘導することもできる。
【０１２８】
（１）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法：
本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを使用して、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導する方法を提供する。
本発明の方法は、ＡＰＣを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階を含む。例えば、ＡＰＣを本発明のペプチドとエクスビボで接触させる段階を含む方法は、以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階；および
ｂ：段階ａのＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階。
【０１２９】
ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られているＤＣ、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞を含む。ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導能を有することから、好ましくはＤＣを使用することができる。本発明のペプチドのいずれか１つを単独で、もしくは本発明の他のペプチドまたはＭＰＨＯＳＰＨ１以外のＴＡＡ由来のＣＴＬ誘導可能なペプチドと組み合わせて使用することができる。
【０１３０】
一方、本発明のペプチドを対象に投与する場合、ＡＰＣは、インビボでペプチドと接触させ、結果的に、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣが対象の体内で誘導される。したがって、本発明の方法は、本発明のペプチドを対象に投与して対象の体内でＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導することを含む。同様に、本発明のポリヌクレオチドを対象に発現可能な形態で投与する場合、本発明のペプチドがインビボで発現してＡＰＣと接触し、結果的に、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣが対象の体内で誘導される。したがって、本発明の方法は、本発明のポリヌクレオチドを対象に投与して対象の体内でＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導することも含む。「発現可能な形態」という語句は、「ＩＸ．薬学的組成物、（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的組成物」の章に上記されている。
【０１３１】
さらに、本発明の方法は、本発明のポリヌクレオチドをＡＰＣに導入してＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導することを含み得る。例えば、該方法は以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階；および
ｂ：本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
段階ｂは、「ＶＩ．抗原提示細胞」の章に上述したように行うことができる。
【０１３２】
あるいは本発明は、ＭＰＨＯＳＰＨ１に対するＣＴＬ活性を特異的に誘導する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製するための方法であって、以下の段階のうちの１つを含み得る方法を提供する：
（ａ）ＡＰＣを、本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
あるいは、本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するための方法であって、以下の中より選択される段階を含む方法を提供する：
（ａ）ＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階；
（ｂ）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
【０１３３】
本発明の方法は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで実施することができる。好ましくは、本発明の方法は、インビトロまたはエクスビボで実施することができる。ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣの誘導に使用されるＡＰＣは、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ２抗原を発現するＡＰＣであってよい。そのようなＡＰＣは、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から当技術分野において周知の方法によって調製することができる。本発明の方法によって誘導したＡＰＣは、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原（ＨＬＡ−Ａ２抗原）との複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣであってよい。対象においてがんに対する免疫応答を誘導するために本発明の方法によって誘導したＡＰＣを対象に投与する場合、対象は、好ましくは、ＡＰＣが由来する同一の対象である。しかしながら、対象は、対象がＡＰＣドナーと同一のＨＬＡ型を有する限り、ＡＰＣドナーと異なる対象でよい。
別の態様において、本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣの誘導に使用される剤または組成物を提供し、そのような剤または組成物は、本発明の１種または複数種のペプチドまたはポリヌクレオチドを含む。
【０１３４】
別の態様において、本発明は、ＡＰＣを誘導するために製剤化される剤または組成物の製造における、本発明のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
あるいは本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣの誘導に使用される本発明のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリペプチドをさらに提供する。
【０１３５】
（２）ＣＴＬを誘導する方法：
本発明はまた、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソームまたはＡＰＣを使用してＣＴＬを誘導するための方法を提供する。
本発明はまた、ＴＣＲサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、またはＴＣＲサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチドを使用してＣＴＬを誘導するための方法であって、該ＴＣＲが、細胞表面上に提示された、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識（と結合）し得る、方法、を提供する。好ましくは、ＣＴＬを誘導するための方法は、以下の中より選択される少なくとも１つの段階を含み得る：
ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する抗原提示細胞および／またはエキソソームと接触させる段階；ならびに
ｂ）ＴＣＲサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、またはＴＣＲサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチドを、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入する段階であって、該ＴＣＲが、細胞表面上に提示された、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識（と結合）し得る、段階。
【０１３６】
本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣ、またはエキソソームを対象に投与する場合、該対象の体内でＣＴＬが誘導され、ＭＰＨＯＳＰＨ１を発現するがん細胞を標的とする免疫応答の強度が増強される。したがって本発明の方法は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣまたはエキソソームを対象に投与する段階を含み得る。
【０１３７】
あるいはＣＴＬは、それらをエクスビボまたはインビトロで使用することによって誘導することもでき、ＣＴＬを誘導した後、活性化ＣＴＬを対象に戻してよい。例えば、方法は以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階；
ｂ：段階ａのＡＰＣをペプチドと接触させる段階、および
ｃ：段階ｂのＡＰＣをＣＤ８陽性Ｔ細胞と共培養する段階。
【０１３８】
上記の段階ｃにおいてＣＤ８陽性Ｔ細胞と共培養すべきＡＰＣは、「ＶＩ．抗原提示細胞」の章に上述したように、本発明のポリヌクレオチドをＡＰＣに導入することによって調製することもできるが、本発明はこれに限定されず、したがってＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に効果的に提示する任意のＡＰＣを包含する。
【０１３９】
上述のＡＰＣの代わりに、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームを任意で利用することができる。すなわち、本発明は、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームを共培養する段階を含み得る。そのようなエキソソームは、「Ｖ．エキソソーム」の章に上述した方法によって調製することができる。
ＣＴＬの誘導に使用されるＡＰＣまたはエキソソームは、好ましくは、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２抗原との複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソームであり得る。
【０１４０】
さらに、ＴＣＲサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、またはＴＣＲサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチドを、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入することによって、ＣＴＬを誘導することができ、該ＴＣＲは、細胞表面上に提示された、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体に結合し得る。そのような形質導入は、「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章に上述したように行うことができる。
【０１４１】
本発明の方法は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで実施することができる。好ましくは、本発明の方法は、インビトロまたはエクスビボで実施することができる。ＣＴＬの誘導に使用するＣＤ８陽性Ｔ細胞は、対象から得たＰＢＭＣから当技術分野において周知の方法によって調製することができる。好ましい態様において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のためのドナーは、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象であってよい。本発明の方法によって誘導したＣＴＬは、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を自身の表面上に提示する細胞を認識し得るＣＴＬであってよい。対象においてがんに対する免疫応答を誘導するために本発明の方法によって誘導したＣＴＬを対象に投与する場合、対象は、好ましくは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が由来する同一の対象である。しかしながら、対象は、対象がＣＤ８陽性Ｔ細胞ドナーと同一のＨＬＡ型を有する限り、ＣＤ８陽性Ｔ細胞ドナーと異なる対象でよい。
【０１４２】
加えて、本発明は、ＣＴＬを誘導するための薬学的な剤または組成物を製造するための方法または工程であって、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体とともに混合または製剤化する段階を含む方法または工程を提供する。
別の態様において、本発明は、ＣＴＬを誘導するための剤または組成物であって、本発明の１種もしくは複数種のペプチド、１種もしくは複数種のポリヌクレオチド、または１種もしくは複数種のＡＰＣもしくはエキソソームを含む剤または組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、ＣＴＬの誘導のために製剤化される剤または組成物の製造における、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、またはＡＰＣもしくはエキソソームの使用を提供する。
あるいは本発明は、ＣＴＬの誘導に使用される本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、またはＡＰＣもしくはエキソソームをさらに提供する。
【０１４３】
（３）免疫応答を誘導する方法：
さらに本発明は、ＭＰＨＯＳＰＨ１に関連する疾患に対して免疫応答を誘導するための方法を提供する。企図される疾患にはがんが含まれ、このがんの例には、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌および軟組織腫瘍が含まれるがこれらに限定されない。
【０１４４】
本発明の方法は、本発明のペプチドのいずれかまたはそれらをコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む剤または組成物を対象に投与する段階を含み得る。本発明の方法はまた、本発明のペプチドのいずれかを提示するエキソソームまたはＡＰＣの投与を企図する。詳細については、「ＩＸ．薬学的組成物」の項、特に本発明の薬学的な剤および組成物のワクチンとしての使用について記載している部分を参照されたい。加えて、免疫応答を誘導するために本発明の方法に用いることができるエキソソームおよびＡＰＣは、上記「Ｖ．エキソソーム」、「ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）」、ならびに「Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣおよびＣＴＬを使用する方法」の（１）および（２）の項において詳述している。
好ましい形態において、本発明の方法によって治療される対象は、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象であり得る。
【０１４５】
本発明はまた、免疫応答を誘導する薬学的な剤または組成物を製造するための方法または工程であって、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを薬学的に許容される担体とともに混合または製剤化する段階を含み得る方法を提供する。
あるいは、本発明の方法は、以下を含む本発明のワクチンまたは薬学的組成物を投与する段階を含み得る：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸（ポリヌクレオチド）；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソーム；または
（ｄ）本発明のＣＴＬ。
【０１４６】
本発明との関連において、ＭＰＨＯＳＰＨ１を発現するがんをこれらの有効成分で治療することができる。そのようながんの例には、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌および軟組織腫瘍が含まれるがこれらに限定されない。したがって、有効成分を含むワクチンまたは薬学的組成物を投与する前に、治療すべき細胞または組織中のＭＰＨＯＳＰＨ１の発現レベルが同一器官の正常細胞と比較して増強されているかどうかを確認することが好ましい。したがって一態様において、本発明は、ＭＰＨＯＳＰＨ１を発現するがんを治療するための方法であって、以下の段階を含み得る方法を提供する：
ｉ）治療すべきがんを有する対象から得られたがん細胞または組織中のＭＰＨＯＳＰＨ１の発現レベルを決定する段階；
ｉｉ）ＭＰＨＯＳＰＨ１の発現レベルを正常対照と比較する段階；および
ｉｉｉ）上記の段階（ａ）〜（ｄ）の中より選択される少なくとも１つの成分を、正常対照と比較してＭＰＨＯＳＰＨ１を過剰発現するがんを有する対象に投与する段階。
【０１４７】
あるいは本発明はまた、ＭＰＨＯＳＰＨ１を過剰発現するがんを有する対象への投与において使用される、上記の（ａ）〜（ｄ）の中より選択される少なくとも１つの成分を含むワクチンまたは薬学的組成物を提供する。換言すれば、本発明はさらに、本発明のＭＰＨＯＳＰＨ１ポリペプチドで治療すべき対象を同定するための方法であって、対象由来の細胞または組織中のＭＰＨＯＳＰＨ１の発現レベルを決定する段階を含み、該レベルが、該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇していることによって、該対象が本発明のＭＰＨＯＳＰＨ１ポリペプチドで治療され得るがんを有し得ることが示されるそのような方法を提供する。本発明のがんを治療すべき対象を同定する方法を、以下、より詳細に説明する。
【０１４８】
目的とするＭＰＨＯＳＰＨ１の転写産物または翻訳産物を含む限り、対象由来の任意の細胞または組織をＭＰＨＯＳＰＨ１発現の測定に使用することができる。適切な試料の例には、身体組織、ならびに体液、例えば血液、痰および尿が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、対象由来の細胞または組織試料は、細胞集団、例として上皮細胞、より好ましくはがん性上皮細胞またはがんの疑いがある組織に由来する上皮細胞を含む。さらに、必要に応じて、得られた身体組織および体液から細胞を精製し、次いでこれを対象由来試料として使用してもよい。
本発明の方法によって治療すべき対象は、好ましくは哺乳動物である。具体的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４９】
本発明によれば、対象から得られた細胞または組織中のＭＰＨＯＳＰＨ１の発現レベルを決定することができる。発現レベルは、当技術分野で公知の方法を使用して、転写（核酸）産物レベルで決定することができる。例えば、ＭＰＨＯＳＰＨ１のｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノザンハイブリダイゼーション）によってプローブを使用して定量することができる。検出は、チップ、アレイ等において実施することができる。アレイの使用は、ＭＰＨＯＳＰＨ１の発現レベルを検出するのに好ましい場合がある。当業者は、ＭＰＨＯＳＰＨ１の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ＭＰＨＯＳＰＨ１のｃＤＮＡをプローブとして使用することができる。必要に応じて、プローブを、適切な標識、例えば色素、蛍光物質および同位体で標識してもよく、該遺伝子の発現レベルを、ハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
【０１５０】
さらに、増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によってプライマーを使用して、ＭＰＨＯＳＰＨ１（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）の転写産物を定量してよい。そのようなプライマーは、該遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製することができる。
具体的には、本発明の方法に使用されるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、ＭＰＨＯＳＰＨ１のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で使用する「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、その他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択する。Ｔｍとは、平衡状態で、標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が占有される。典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度がナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０Ｍであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、不安定化物質、例えばホルムアミドの添加によって達成してよい。
【０１５１】
本発明のプローブまたはプライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、典型的には、ストリンジェントな条件下で、少なくとも約２０００、１０００、５００、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、または２５の連続する、ＭＰＨＯＳＰＨ１を含む核酸のセンス鎖ヌクレオチド配列、またはＭＰＨＯＳＰＨ１を含む核酸のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列、またはそれらの配列の天然の変異体とハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。特に、例えば、好ましい態様において、５〜５０の長さを有するオリゴヌクレオチドを、検出すべき遺伝子を増幅するためのプライマーとして使用することができる。より好ましくは、ＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、特定のサイズ、一般には１５〜３０ｂ長のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーによって検出することができる。サイズは少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチドの範囲であってよく、プローブおよびプライマーのサイズは５〜１０ヌクレオチド、１０〜１５ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチドおよび２５〜３０ヌクレオチドの範囲であってよい。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの長さは、１５〜２５から選択することができる。そのようなオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを使用することによって遺伝子を検出するためのアッセイ手順、装置、または試薬は、周知である（例えばオリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはＰＣＲ）。これらのアッセイにおいて、プローブまたはプライマーはタグまたはリンカー配列も含み得る。さらに、プローブまたはプライマーは、検出可能な標識または捕捉される親和性リガンドで修飾することができる。あるいは、ハイブリダイゼーションに基づく検出手順において、数百（例えば、約１００〜２００）塩基から数千（例えば、約１０００〜２０００）塩基長を有するポリヌクレオチドも、プローブに使用することができる（例えば、ノザンブロッティングアッセイまたはｃＤＮＡマイクロアレイ解析）。
【０１５２】
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出することができる。例えば、ＭＰＨＯＳＰＨ１タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）またはその免疫学的断片の量を測定することができる。翻訳産物としてタンパク質の量を測定するための方法には、タンパク質を特異的に認識する抗体を使用する免疫測定法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片または改変抗体がＭＰＨＯＳＰＨ１タンパク質への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に使用することができる。本発明のペプチドに対するそのような抗体およびその断片も本発明によって提供される。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。
【０１５３】
ＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出する別の方法として、ＭＰＨＯＳＰＨ１タンパク質に対する抗体を使用する免疫組織化学的解析によって、染色の強度を測定してよい。すなわちこの測定では、強度の染色によって、該タンパク質の存在／レベルの増加が示され、それと同時にＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子の高発現レベルが示される。
標的遺伝子、例えばＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子のがん細胞における発現レベルは、そのレベルが、標的遺伝子の対照レベル（例えば、正常細胞中のレベル）から例えば１０％、２５％、もしくは５０％増加するか；または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上まで増加する場合に、増加していると判定され得る。
【０１５４】
対照レベルは、疾患状態（がん性または非がん性）が判明している対象から予め採取し保存しておいた試料を使用して、がん細胞と同時に決定することができる。加えて、治療すべきがんを有する器官の非がん性領域から得られた正常細胞を、正常対照として使用してもよい。あるいは、対照レベルは、疾患状態が判明している対象に由来する試料中のＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子の予め決定された発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計的方法によって決定してよい。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースに由来し得る。さらに、本発明の一局面によれば、生物学的試料中のＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定された複数の対照レベルと比較することができる。対象由来の生物学的試料の組織型と類似の組織型に由来する参照試料から決定された対照レベルを使用することが好ましい。さらに、疾患状態が判明している集団におけるＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子の発現レベルの基準値を使用することが好ましい。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値＋／−２Ｓ．Ｄ．または平均値＋／−３Ｓ．Ｄ．の範囲を、基準値として使用することができる。
【０１５５】
本発明との関連において、がん性でないと判明している生物学的試料から決定された対照レベルは「正常対照レベル」と称される。一方、対照レベルががん性生物学的試料から決定される場合には、これは「がん性対照レベル」と称される。試料の発現レベルと対照レベルとの差を、その発現レベルが細胞のがん性状態または非がん性状態に応じて異ならないことが判明している対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。
ＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇しているか、またはがん性対照レベルと類似している／同等である場合、該対象は治療すべきがんを有すると診断され得る。
【０１５６】
本発明はまた、（ｉ）対象が治療すべきがんを有する疑いがあるかどうかを診断する方法、および／または（ｉｉ）がん治療のための対象を選択する方法であって、以下の段階を含み得る方法を提供する：
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から得られた細胞または組織中のＭＰＨＯＳＰＨ１の発現レベルを決定する段階；
ｂ）ＭＰＨＯＳＰＨ１の発現レベルを正常対照レベルと比較する段階；
ｃ）ＭＰＨＯＳＰＨ１の発現レベルが正常対照レベルと比較して増加している場合に、該対象を治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階。
【０１５７】
あるいは、そのような方法は以下の段階を含み得る：
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から得られた細胞または組織中のＭＰＨＯＳＰＨ１の発現レベルを決定する段階；
ｂ）ＭＰＨＯＳＰＨ１の発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階；
ｃ）ＭＰＨＯＳＰＨ１の発現レベルががん性対照レベルと類似しているか、または同等である場合に、該対象を治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階。
【０１５８】
本発明はまた、本発明のＭＰＨＯＳＰＨ１ポリペプチドで治療され得るがんに罹患しているか、または該がんに罹患している疑いがあるか、または該がんを発症するリスクのある対象を診断または判定するための診断キットであって、がん免疫療法の有効性または適用性を評価および／またはモニターするのにも使用され得るキットを提供する。好ましくは、がんには、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌および軟組織腫瘍が含まれるがこれらに限定されない。より詳細には、キットは、好ましくは、対象由来細胞中のＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子の発現を検出するための少なくとも１つの試薬を含み得、その試薬は以下の群より選択され得る：
（ａ）ＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＭＰＨＯＳＰＨ１タンパク質またはその免疫学的断片を検出するための試薬；および
（ｃ）ＭＰＨＯＳＰＨ１タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
【０１５９】
ＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子のｍＲＮＡを検出するのに適した試薬の例には、ＭＰＨＯＳＰＨ１  ｍＲＮＡに特異的に結合するか、またはＭＰＨＯＳＰＨ１  ｍＲＮＡを同定する核酸、例えばＭＰＨＯＳＰＨ１  ｍＲＮＡの一部に対する相補的配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれ得る。このような種類のオリゴヌクレオチドは、ＭＰＨＯＳＰＨ１  ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブによって例示される。このような種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製することができる。必要に応じて、ＭＰＨＯＳＰＨ１  ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体基質上に固定化することができる。さらに、ＭＰＨＯＳＰＨ１  ｍＲＮＡを検出するための２つ以上の試薬をキット中に含めることもできる。
【０１６０】
一方、ＭＰＨＯＳＰＨ１タンパク質をまたはその免疫学的断片を検出するのに適した試薬の例には、ＭＰＨＯＳＰＨ１タンパク質に対する抗体またはその免疫学的断片が含まれ得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片または改変抗体がＭＰＨＯＳＰＨ１タンパク質またはその免疫学的断片への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を試薬として使用することができる。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。さらに、直接連結技法または間接標識技法によって、抗体をシグナル発生分子で標識することができる。標識、および抗体を標識し、標的に対する抗体の結合を検出する方法は当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明に使用することができる。さらに、ＭＰＨＯＳＰＨ１タンパク質を検出するための２つ以上の試薬をキット中に含めることもできる。
【０１６１】
キットは、前述の試薬のうちの２つ以上を含み得る。キットはさらに、ＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子に対するプローブまたはＭＰＨＯＳＰＨ１ペプチドに対する抗体を結合させるための固体基質および試薬、細胞を培養するための培地および容器、陽性および陰性対照試薬、ならびにＭＰＨＯＳＰＨ１ペプチドに対する抗体を検出するための二次抗体を含み得る。例えば、がんを有さない対象、またはがんに罹患している対象から得られた組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットは、緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および使用説明を記載した添付文書（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業上の観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。これらの試薬等は、ラベルを貼った容器中に保持され得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれ得る。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。
【０１６２】
本発明の一態様において、試薬がＭＰＨＯＳＰＨ１  ｍＲＮＡに対するプローブである場合には、該試薬を多孔性ストリップなどの固体基質上に固定化して、少なくとも１つの検出部位を形成させることができる。多孔性ストリップの測定または検出領域は、それぞれが核酸（プローブ）を含む複数の部位を含み得る。検査ストリップはまた、陰性および／または陽性対照用の部位を含み得る。あるいは、対照部位は、検査ストリップとは別のストリップ上に位置し得る。任意で、異なる検出部位は異なる量の固定化核酸を含み得る、すなわち、第１検出部位ではより多い量の固定化核酸を、および以降の部位ではより少ない量の固定化核酸を含み得る。試験試料を添加すると、検出可能なシグナルを呈する部位の数によって、試料中に存在するＭＰＨＯＳＰＨ１  ｍＲＮＡの量の定量的指標が提供される。検出部位は、適切に検出可能な任意の形状で構成することができ、典型的には、検査ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。
【０１６３】
本発明のキットは、陽性対照試料またはＭＰＨＯＳＰＨ１標準試料をさらに含み得る。本発明の陽性対照試料は、ＭＰＨＯＳＰＨ１陽性試料を回収し、次にそれらのＭＰＨＯＳＰＨ１レベルをアッセイすることによって調製することができる。あるいは、精製ＭＰＨＯＳＰＨ１タンパク質またはポリヌクレオチドを、ＭＰＨＯＳＰＨ１を発現しない細胞に添加して、陽性試料またはＭＰＨＯＳＰＨ１標準試料を形成してよい。本発明との関連において、精製ＭＰＨＯＳＰＨ１は組換えタンパク質であってよい。陽性対照試料のＭＰＨＯＳＰＨ１レベルは、例えばカットオフ値よりも高い。
【０１６４】
一態様において、本発明はさらに、本発明の抗体またはその断片によって特異的に認識されるタンパク質またはその部分タンパク質を含む診断キットを提供する。
【０１６５】
本発明のタンパク質の部分ペプチドの例には、本発明のタンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも８個、好ましくは１５個、およびより好ましくは２０個の連続したアミノ酸から構成されるポリペプチドが含まれる。本発明のタンパク質またはペプチド（ポリペプチド）を使用して試料（例えば、血液、組織）中の抗体を検出することによって、がんを診断することができる。本発明のタンパク質およびペプチドを調製するための方法は、上記のとおりである。
【０１６６】
抗ＭＰＨＯＳＰＨ１抗体の量と、上記のような対応する対照試料中の抗ＭＰＨＯＳＰＨ１抗体の量との差を測定することによって、本発明のがんを診断するための方法を行うことができる。対象の細胞または組織が該遺伝子の発現産物（ＭＰＨＯＳＰＨ１）に対する抗体を含み、この抗ＭＰＨＯＳＰＨ１抗体の量が正常対照中の抗ＭＰＨＯＳＰＨ１抗体の量と比較してカットオフ値のレベルよりも高いと判定される場合に、該対象ががんに罹患していることが疑われる。
【０１６７】
別の態様において、本発明の診断キットは、本発明のペプチドおよびそれに結合しているＨＬＡ分子を含み得る。抗原性ペプチドおよびＨＬＡ分子を使用して抗原特異的ＣＴＬを検出するための方法は、既に確立されている（例えば、Altman JD et al., Science.1996,274(5284):94-6）。したがって、腫瘍抗原特異的ＣＴＬを検出するための検出法に、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を適用することができ、それによってがんの再発および／または転移のより早期の発見が可能になる。さらに、本発明のペプチドを有効成分として含む医薬を適用できる対象を選択するために、または医薬の治療効果を評価するために、これを使用することができる。
【０１６８】
詳細には、公知の方法に従って（例えば、Altman JD et al., Science.1996,274(5284):94-6を参照されたい）、放射標識ＨＬＡ分子と本発明のペプチドとの四量体などのオリゴマー複合体を調製することができる。この複合体を使用して、例えば、がんに罹患している疑いのある対象に由来する末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的ＣＴＬを定量することによって、診断を行うことができる。
【０１６９】
本発明はさらに、本明細書に記載されるペプチドエピトープを使用することによって、対象の免疫学的応答を評価するための方法および診断用の剤を提供する。本発明の一態様において、本明細書に記載するようなＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドを、対象の免疫応答を評価または予測するための試薬として使用することができる。評価される免疫応答は、免疫原を免疫担当細胞とインビトロまたはインビボで接触させることによって誘導され得る。ある態様においては、ペプチドエピトープを認識して結合する抗原特異的ＣＴＬの産生をもたらし得る任意の物質または組成物を、試薬として用いてよい。ペプチド試薬を免疫原として使用しなくてもよい。そのような解析に用いられるアッセイ系には、四量体、細胞内リンホカイン染色、およびインターフェロン放出アッセイ、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイなどの比較的最近の技術開発が含まれる。好ましい態様において、免疫学的応答を評価するための免疫担当細胞は、末梢血、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から選択し得る。そのような免疫担当細胞を回収または単離するための方法は当技術分野において周知である。代替的な好ましい態様において、ペプチド試薬と接触させるべき免疫担当細胞には、抗原提示細胞、例えば樹状細胞が含まれる。
【０１７０】
例えば、本発明のペプチドを四量体染色アッセイにおいて使用して、腫瘍細胞抗原または免疫原への曝露後の抗原特異的ＣＴＬの存在について末梢血単核細胞を評価することができる。ＨＬＡ四量体複合体を使用して、抗原特異的ＣＴＬを直接可視化し（例えば、Ogg et al., Science 279:2103-2106, 1998；およびAltman et al, Science 174:94-96,1996を参照されたい）、末梢血単核細胞の試料中の抗原特異的ＣＴＬ集団の頻度を測定することができる。本発明のペプチドを使用する四量体試薬は、以下に記載するように作製することができる。
【０１７１】
ＨＬＡ分子に結合するペプチドは、対応するＨＬＡ重鎖およびβ２−ミクログロブリンの存在下で再び折り畳まれて、３分子複合体を生成する。この複合体において、該重鎖のカルボキシ末端を前もってタンパク質中に作製した部位でビオチン化する。次にストレプトアビジンを該複合体に添加して、３分子複合体およびストレプトアビジンから構成される四量体を形成する。蛍光標識ストレプトアビジンの手法によって、この四量体を使用して、抗原特異的細胞を染色することができる。次いで、この細胞を例えばフローサイトメトリーによって同定することができる。そのような解析を、診断または予後診断目的に使用することができる。この手順によって同定された細胞を治療目的に使用することもできる。
【０１７２】
本発明はまた、本発明のペプチドを含む、免疫リコール応答を評価するための試薬を提供する（例えば、Bertoni et al,J.Clin.Invest.100:503-513,1997、およびPenna et al., J Ezp.Med.174:1565-1570,1991を参照されたい）。例えば、治療すべきがんを有する個体から得られた患者ＰＢＭＣ試料を、特異的ペプチドを使用して抗原特異的ＣＴＬの存在について解析することができる。ＰＢＭＣを培養し、該細胞を本発明のペプチドで刺激することによって、単核細胞を含む血液試料を評価することができる。適切な培養期間後、増殖した細胞集団を例えばＣＴＬ活性について解析することができる。
【０１７３】
本発明のペプチドは、ワクチンの有効性を評価するための試薬として使用することもできる。免疫原をワクチン接種した患者から得られたＰＢＭＣを、例えば上記の方法のいずれかを使用して解析することができる。患者のＨＬＡ型を決定し、該患者に存在するアリル特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬を解析のために選択する。ワクチンの免疫原性は、ＰＢＭＣ試料中のエピトープ特異的ＣＴＬの存在によって示され得る。本発明のペプチドは、当技術分野で周知の技法を使用して抗体を作製するために使用することもでき（例えば、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Willey/Greene, NY；およびAntibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring  Harbor Lagoratory Press, 1989を参照されたい）、この抗体は、がんを診断、検出、またはモニターするための試薬として使用され得る。そのような抗体は、ＨＬＡ分子との関連でペプチドを認識する抗体、すなわちペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗体を含み得る。
【０１７４】
本発明のペプチドおよび組成物はさらなる用途をいくつか有し、そのうちの一部を本明細書に記載する。例えば、本発明は、ＭＰＨＯＳＰＨ１免疫原性ポリペプチドの量を特徴とする障害を診断または検出する方法を提供する。これらの方法は、生物学的試料中でのＭＰＨＯＳＰＨ１ペプチド、またはＭＰＨＯＳＰＨ１ペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との複合体の量を測定することを含む。ペプチドまたはペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との複合体の発現は、該ペプチドまたは該複合体の結合パートナーを用いてアッセイすることによって、測定または検出することができる。好ましい態様において、ペプチドまたは複合体の結合パートナーは、該ペプチドを認識してこれに特異的に結合する抗体であってよい。生物学的試料、例えば腫瘍生検中のＭＰＨＯＳＰＨ１の発現は、ＭＰＨＯＳＰＨ１プライマーを使用する標準的なＰＣＲ増幅プロトコールによって試験することもできる。腫瘍発現の例は本明細書に提示してあり、ＭＰＨＯＳＰＨ１増幅のための例示的な条件およびプライマーのさらなる開示は、内容が参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ２００３／２７３２２に見出すことができる。
【０１７５】
好ましくは診断法は、対象から単離された生物学的試料をＭＰＨＯＳＰＨ１ペプチドに特異的な物質と接触させて、該生物学的試料中のＭＰＨＯＳＰＨ１ペプチドの存在を検出する段階を含む。本明細書で使用する「接触させる」とは、剤と生物学的試料中に存在するＭＰＨＯＳＰＨ１ペプチドとの間の特異的相互作用が可能となるように、生物学的試料を、例えば濃度、温度、時間、イオン強度の適切な条件下で、剤に十分に近接させて配置することを意味する。一般に、剤と生物学的試料を接触させるための条件は、生物学的試料中の分子と生物学的試料中のその同族物（例えば、タンパク質とその受容体同族物、抗体とそのタンパク質抗原同族物、核酸とその相補的配列同族物）との間の特異的相互作用を促進するための、当業者に公知の条件である。分子とその同族物との間の特異的相互作用を促進するための最適な条件は、内容が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｌｏｗらに対して発行された米国特許第５，１０８，９２１号に記載されている。
【０１７６】
本発明の診断法は、インビボおよびインビトロの一方または両方で行うことができる。したがって、生物学的試料は、本発明においてインビボまたはインビトロに位置し得る。例えば、生物学的試料はインビボの組織であってよく、かつＭＰＨＯＳＰＨ１免疫原性ポリペプチドに特異的な剤を使用して、組織中のそのような分子の存在を検出することができる。あるいは、生物学的試料をインビトロで採取または単離することができる（例えば、血液試料、腫瘍生検、組織抽出物）。特に好ましい態様において、生物学的試料は細胞を含む試料であってよく、より好ましくは、診断または治療する対象から採取された腫瘍細胞を含む試料であってよい。
【０１７７】
あるいは、フルオレセイン標識ＨＬＡ多量体複合体で染色することによって、抗原特異的Ｔ細胞の直接的な定量を可能にする方法によって、診断を行うこともできる（例えば、Altman,J.D.et al., 1996,Science 274:94;Altman,J.D.et al.,1993, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10330）。細胞内リンホカイン染色、およびインターフェロン−γ放出アッセイ、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイもまた提供されている。多量体染色、細胞内リンホカイン染色、およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイはすべて、より慣例的なアッセイより少なくとも１０倍感度が高いようである（Murali-Krishna, K. et al., 1998, Immunity 8:177；Lalvani,A. et al., 1997, J.Exp.Med.186:859;Dunbar,P.R.et al., 1998,Curr.Biol.8:413）。五量体（例えば、ＵＳ２００４−２０９２９５Ａ）、デキストラマー（ｄｅｘｔｒａｍｅｒ）（例えば、ＷＯ０２／０７２６３１）、およびストレプタマー（ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒ）（例えば、Nature medicine 6.631-637(2002)）を使用することもできる。
【０１７８】
したがって、いくつかの態様において、本発明は、本発明のＭＰＨＯＳＰＨ１ペプチドの少なくとも１つを投与された対象の免疫学的応答を診断または評価するための方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：
（ａ）免疫原を、該免疫原に対して特異的なＣＴＬの誘導に適した条件下で免疫担当細胞と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）で誘導されたＣＴＬの誘導レベルを検出または決定する段階；および
（ｃ）対象の免疫学的応答をＣＴＬ誘導レベルと相関させる段階。
【０１７９】
本発明の関連において、免疫原は、好ましくは、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０の中より選択されるＭＰＨＯＳＰＨ１ペプチド、ならびに（ｂ）そのようなアミノ酸配列が１個、２個またはそれ以上のアミノ酸置換によって改変されたそのようなアミノ酸配列を有するペプチド、のうち少なくとも１つを含む。一方、免疫原特異的ＣＴＬの誘導に適した条件は当技術分野において周知である。例えば、免疫担当細胞を、免疫原特異的ＣＴＬを誘導するために免疫原の存在下でインビトロで培養してもよい。免疫原特異的ＣＴＬを誘導する目的で、任意の刺激因子を細胞培養物に添加してもよい。例えば、ＩＬ−２は、ＣＴＬ誘導のための好ましい刺激因子である。
【０１８０】
いくつかの態様において、ペプチドがん療法によって治療される対象の免疫学的応答をモニターまたは評価する段階は、治療前、治療中、および／または治療後に行うことができる。一般に、がん療法プロトコール中、免疫原性ペプチドは、治療される対象に繰り返し投与される。例えば、免疫原性ペプチドを３〜１０週間にわたって毎週投与してもよい。したがって、対象の免疫学的応答は、がん療法プロトコール中に評価またはモニターされ得る。あるいは、がん療法に対する免疫学的応答を評価またはモニターする段階が、療法プロトコールの完了時であってもよい。
【０１８１】
本発明によれば、免疫原特異的ＣＴＬの誘導が対照と比較して強化されていることによって、評価または診断される対象が、投与された免疫原に対して免疫学的に応答したことが示される。免疫学的応答を評価するのに適した対照には、例えば、免疫担当細胞をペプチドと接触させていない場合の、またはいかなるＭＰＨＯＳＰＨ１ペプチドとも異なるアミノ酸配列（例えば、ランダムなアミノ酸配列）を有する対照ペプチドと接触させている場合の、ＣＴＬ誘導レベルが含まれ得る。１つの好ましい態様においては、対象に投与された各免疫原間で免疫学的応答を比較することによって、対象の免疫学的応答を配列特異的な様式で評価する。特に、いくつかの種類のＭＰＨＯＳＰＨ１ペプチドについての混合物を対象に投与する場合であっても、免疫学的応答はペプチドに依存して異なる可能性がある。その場合には、各ペプチド間で免疫学的応答を比較することによって、対象がより強い応答を示すペプチドを同定することができる。
【０１８２】
ＸＩ．抗体：
本発明はさらに、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は本発明のペプチドに特異的に結合し、他のペプチドには結合しない（または弱く結合する）。あるいは、抗体は本発明のペプチドおよびその相同体に結合し得る。本発明のペプチドに対する抗体は、がんの診断および予後診断のアッセイ、ならびに画像化方法論において使用され得る。同様に、そのような抗体は、ＭＰＨＯＳＰＨ１ががん患者において同じく発現または過剰発現する限り、他のがんの治療、診断、および／または予後診断において使用され得る。さらに、細胞内で発現する抗体（例えば、一本鎖抗体）は、ＭＰＨＯＳＰＨ１の発現が関与するがんの治療において治療的に使用され得、このがんの例には、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌および軟組織腫瘍が含まれるがこれらに限定されない。
【０１８３】
本発明はまた、ＭＰＨＯＳＰＨ１タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）またはその断片、例としてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０の中より選択されるアミノ酸配列から構成されるポリペプチドを検出および／または定量するための様々な免疫学的アッセイを提供する。そのようなアッセイは、必要に応じて、ＭＰＨＯＳＰＨ１タンパク質またはその断片を認識してそれと結合し得る１種または複数種の抗ＭＰＨＯＳＰＨ１抗体を含み得る。本発明との関連において、ＭＰＨＯＳＰＨ１ポリペプチドに結合する抗ＭＰＨＯＳＰＨ１抗体は、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０の中より選択されるアミノ酸配列から構成されるポリペプチドを認識するが、他のペプチドは除外する。抗体の結合特異性は、阻害試験によって確認することができる。すなわち、解析すべき抗体と全長ＭＰＨＯＳＰＨ１ポリペプチドとの間の結合が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０の中より選択されるアミノ酸配列を有する任意の断片ポリペプチドの存在下で阻害される場合、この抗体が該断片に特異的に結合することが示される。本発明との関連において、そのような免疫学的アッセイは、様々な種類の放射免疫測定法、免疫クロマトグラフ技法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光測定法（ＥＬＩＦＡ）等を含むがこれらに限定されない、当技術分野で周知の様々な免疫学的アッセイ形式の範囲内で行われる。
【０１８４】
本発明の免疫学的であるが非抗体性の関連アッセイには、Ｔ細胞免疫原性アッセイ（阻害性または刺激性）およびＭＨＣ結合アッセイもまた含まれ得る。加えて、ＭＰＨＯＳＰＨ１を発現するがんを検出し得る免疫学的画像化法も、本発明によって提供され、これには、本発明の標識抗体を使用する放射性シンチグラフィー画像化法が含まれるが、これに限定されない。そのようなアッセイは、ＭＰＨＯＳＰＨ１を発現するがんの検出、モニタリング、および予後診断において臨床的に使用され得、このがんの例には、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌および軟組織腫瘍が含まれるがこれらに限定されない。
【０１８５】
本発明はまた、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの任意の形態で使用することができ、これには、ウサギなどの動物を本発明のペプチドで免疫することによって得られる抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝子組換えによって作製されたヒト化抗体が含まれる。
【０１８６】
抗体を得るための抗原として使用される本発明のペプチドは、任意の動物種に由来し得るが、好ましくは哺乳動物、例えばヒト、マウス、またはラット、より好ましくはヒトに由来する。ヒト由来のペプチドは、本明細書に開示するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から得ることができる。
【０１８７】
本発明によれば、完全なタンパク質およびタンパク質の部分ペプチドが免疫抗原として役立ち得る。適切な部分ペプチドの例には、例えば、本発明のペプチドのアミノ（Ｎ）末端断片またはカルボキシ（Ｃ）末端断片が含まれる。
本明細書では、抗体を、ＭＰＨＯＳＰＨ１ペプチドの全長または断片のいずれかと反応するタンパク質と定義する。好ましい態様において、本発明の抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１４、６４、７３、７７、７９、９７、１０３および１２０の中より選択されるアミノ酸配列を有するＭＰＨＯＳＰＨ１の断片ペプチドを認識する。オリゴペプチドを合成する方法は、当技術分野において周知である。合成後、免疫原として使用する前にペプチドを任意に精製してもよい。本発明において、免疫原性を増強するために、オリゴペプチド（例えば、９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒ）を担体と結合または連結させてもよい。担体として、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が周知である。ＫＬＨとペプチドを結合する方法も、当技術分野において周知である。
【０１８８】
あるいは、本発明のペプチドまたはその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクターに挿入することができ、次いでこれを使用して本明細書に記載のように宿主細胞を形質転換する。所望のペプチドまたはその断片を、任意の標準的な方法によって宿主細胞の外部または内部から回収することができ、後にこれを抗原として使用することができる。あるいは、ペプチドを発現する細胞全体もしくはそれらの溶解物、または化学合成したペプチドを抗原として使用してもよい。
【０１８９】
任意の哺乳動物を抗原で免疫することができるが、細胞融合に用いられる親細胞との適合性を考慮に入れることが好ましい。一般に、齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、または霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅ）科の動物を使用することができる。齧歯目科の動物には、例えばマウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目科の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長目科の動物には、例えば狭鼻下目（Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）（旧世界ザル）のサル、例えばカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーが含まれる。
【０１９０】
動物を抗原で免疫する方法は、当技術分野で公知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物を免疫するための標準的な方法である。より具体的には、抗原を適量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水等で希釈し、懸濁させる。必要に応じて、抗原懸濁液を、フロイント完全アジュバントなどの適量の標準的アジュバントと混合し、乳化し、次いで哺乳動物に投与することができる。その後、適量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を、４〜２１日ごとに数回投与することが好ましい。免疫化には、適切な担体を使用してもよい。上記のように免疫した後、血清を、所望の抗体の量の増加に関して標準的方法で調べることができる。
【０１９１】
本発明のペプチドに対するポリクローナル抗体は、血清中の所望の抗体の増加に関して調べた免疫後の哺乳動物から血液を回収し、任意の従来法によって血液から血清を分離することによって、調製することができる。ポリクローナル抗体はポリクローナル抗体を含む血清を含んでよく、およびポリクローナル抗体を含む画分を該血清から単離してよい。免疫グロブリンＧまたはＭは、本発明のペプチドのみを認識する画分から、例えば、本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いた上で、この画分をプロテインＡまたはプロテインＧカラムを使用してさらに精製して、調製することができる。
【０１９２】
本発明との関連において使用されるモノクローナル抗体を調製するには、抗原で免疫した哺乳動物から免疫細胞を回収し、上記のように血清中の所望の抗体のレベル増加について確かめ、細胞融合に供する。細胞融合に使用する免疫細胞は、好ましくは脾臓から得ることができる。上記の免疫細胞と融合させる別の好ましい親細胞には、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、およびより好ましくは薬物による融合細胞の選択のための特性を獲得した骨髄腫細胞が含まれる。
公知の方法、例えば、Milstein et al.（Galfre and Milstein, MethodsEnzymol 73:3-46(1981)）の方法に従って、上記の免疫細胞と骨髄腫細胞とを融合させることができる。
【０１９３】
細胞融合によって結果として得られたハイブリドーマは、それらをＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地）などの標準的な選択培地中で培養することによって選択することができる。細胞培養は典型的に、ＨＡＴ培地中で、所望のハイブリドーマを除く他のすべての細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な期間である数日間から数週間にわたって継続する。次いで、標準的な限界希釈を行い、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよびクローニングすることができる。
【０１９４】
ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物を抗原で免疫する上記の方法に加えて、ヒトリンパ球、例えばＥＢウイルスに感染したリンパ球を、ペプチド、ペプチドを発現している細胞またはそれらの溶解物でインビトロにおいて免疫することもできる。次いで、免疫後のリンパ球を、無限に分裂可能なヒト由来骨髄腫細胞、例えばＵ２６６と融合させて、該ペプチドに結合し得る所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる（特開昭６３−１７６８８号）。
【０１９５】
次いで、得られたハイブリドーマをマウスの腹腔内に移植し、腹水を抽出することができる。得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡもしくはプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、または本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムによって精製することができる。本発明の抗体は、本発明のペプチドの精製および検出のためだけでなく、本発明のペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補としても使用することができる。
【０１９６】
あるいは、免疫したリンパ球などの、抗体を産生する免疫細胞を癌遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体の調製に使用することもできる。
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子操作技法を使用して組換えによって調製することもできる（例えば、MacMillan Publishers LTD(1990)によって英国で刊行された、Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodiesを参照されたい）。例えば、抗体をコードするＤＮＡを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターに挿入した上で、宿主細胞に導入して、組換え抗体を調製することができる。本発明はまた、上記のようにして調製された組換え抗体を提供する。
【０１９７】
本発明の抗体は、本発明のペプチドの１種または複数種に結合する限り、抗体の断片または修飾抗体であってよい。例えば、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはＨ鎖およびＬ鎖由来のＦｖ断片が適切なリンカーによって連結されている一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であってよい（Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-83(1988)）。より具体的には、抗体断片は、抗体を酵素、例えばパパインまたはペプシンで処理することによって作製することができる。あるいは、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞内で発現させることができる（例えば、Co et al., J Immunol 152:2968-76(1994)；Better and Horwitz, Methods Enzymol 178:476-96(1989)；Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178:497-515(1989)；Lamoyi, Methods Enzymol 121:652-63(1986)；Rousseaux et al., Methods Enzymol 121:663-9(1986)；Bird and Walker, Trends Biotechnol 9:132-7(1991)を参照されたい）。
【０１９８】
抗体は、様々な分子、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との結合によって修飾することができる。本発明は、そのような修飾抗体を提供する。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。これらの修飾法は、当技術分野で慣例的である。
【０１９９】
あるいは、本発明の抗体は、非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト抗体に由来する定常領域との間のキメラ抗体として、または非ヒト抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域とを含むヒト化抗体として得ることもできる。そのような抗体は、公知の技術に従って調製することができる。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行うことができる（例えば、Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536(1988)を参照されたい）。したがって、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全には満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されたキメラ抗体である。
【０２００】
ヒトのフレームワーク領域および定常領域に加えて、ヒト可変領域をも含む完全なヒト抗体を使用することもできる。そのような抗体は、当技術分野で公知の様々な技法を使用して作製することができる。例えば、インビトロの方法には、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用が含まれる（例えば、Hoogenboom & Winter, J.Mol.Biol.227:381(1991)）。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたトランスジェニック動物、例えばマウスに導入することによって、ヒト抗体を作製することもできる。このアプローチは、例えば米国特許第６，１５０，５８４号、第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号に記載されている。
【０２０１】
上記のようにして得られた抗体は、均質になるまで精製してもよい。例えば、一般的なタンパク質に対して用いられる分離法および精製法に従って、抗体の分離および精製を行うことができる。例えば、これらに限定されないが、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動の使用を適切に選択しかつ組み合わせることによって、抗体を分離および単離することができる（Antibodies:A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)）。プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムをアフィニティーカラムとして使用することができる。用いられるべき例示的なプロテインＡカラムには、例えば、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳおよびＳｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。
【０２０２】
適切なクロマトグラフィー技法の例には、アフィニティークロマトグラフィー以外に、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が含まれる（Strategies for Protein Purification  and  Characterization:A  Laboratory  Course  Maual.Ed  Daniel  R.Marshak  et  al.,  Cold  Spring  Harbor Laboratory Press (1996)）。クロマトグラフィー手順は、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣおよびＦＰＬＣによって行うことができる。
【０２０３】
例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、および／または免疫蛍光法を使用して、本発明の抗体の抗原結合活性を測定することができる。ＥＬＩＳＡの場合、本発明の抗体をプレート上に固定化し、本発明のペプチドを該プレートに添加し、次いで所望の抗体を含む試料、例えば抗体産生細胞の培養上清または精製抗体を添加する。次いで、一次抗体を認識し、酵素、例えばアルカリホスファターゼで標識された二次抗体を添加し、プレートをインキュベートする。続いて洗浄後に、酵素基質、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を該プレートに添加し、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を評価する。抗体の結合活性を評価するために、ペプチド断片、例えばＣ末端またはＮ末端断片を抗原として使用してもよい。本発明の抗体の活性を評価するために、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用してもよい。
【０２０４】
本発明の抗体を本発明のペプチドを含むと想定される試料に対して曝露し、該抗体と該ペプチドとによって形成される免疫複合体を検出または測定することによって、上記の方法によって本発明のペプチドの検出または測定が可能になる。
本発明のペプチドを検出または測定する方法はペプチドを特異的に検出または測定することができるため、この方法は、該ペプチドを使用する種々の実験において使用され得る。
【０２０５】
ＸＩＩ．ベクターおよび宿主細胞：
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするベクターおよび本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターは、宿主細胞中における本発明のポリヌクレオチド担体、特にＤＮＡとして、本発明のペプチドを発現させるため、または遺伝子療法用に本発明のポリヌクレオチドを投与するために有用である。
【０２０６】
大腸菌を宿主細胞として選択し、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１またはＸＬ１Ｂｌｕｅ）内で増幅して大量に作製する場合、ベクターは、大腸菌内での増幅に適した「複製起点」と、選択された形質転換大腸菌の選択に適したマーカー遺伝子（例えば、薬物、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコールまたは同様のものによって選択される薬物耐性遺伝子）とを有する必要がある。例えば、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ等を使用することができる。加えて、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴおよびｐＴ７も上記のベクターと同様に、ｃＤＮＡのサブクローニングおよび抽出に使用することができる。ベクターを本発明のタンパク質の産生に使用する場合には、発現ベクターが使用され得る。例えば、大腸菌内で発現させる発現ベクターは、大腸菌内で増幅するために上記の特徴を有する必要がある。大腸菌、例えばＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１またはＸＬ１  Ｂｌｕｅを宿主細胞として使用する場合、ベクターは、大腸菌内で所望の遺伝子を効率的に発現し得るプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ward et al., Nature 341:544-6(1989)；FASEB J 6:2422-7(1992)）、ａｒａＢプロモーター（Better et al., Science 240:1041-3(1988)）、Ｔ７プロモーター等を有する必要がある。この点に関して、例えば、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓシステム」（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＥＧＦＰ、およびｐＥＴ（この場合、宿主は好ましくはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＬ２１である）を上記のベクターの代わりに使用することができる。さらにベクターは、ペプチド分泌のためのシグナル配列を含んでもよい。ペプチドを大腸菌のペリプラズムに分泌させる例示的なシグナル配列は、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei et al., J Bacteriol 169;4379(1987)）である。ベクターを標的宿主細胞に導入する手段には、例えば塩化カルシウム法およびエレクトロポレーション法が含まれる。
【０２０７】
大腸菌に加えて、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Nucleic Acids Res 18(17):5322(1990)）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば、「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣバキュロウイルス発現系」（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えば、ｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩｐｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）発現キット」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）を、本発明のポリペプチドの産生に使用することができる。
【０２０８】
ベクターをＣＨＯ、ＣＯＳ、またはＮＩＨ３Ｔ３細胞などの動物細胞内で発現させるためには、ベクターはこのような細胞における発現に必要なプロモーター、例えば、ＳＶ４０プロモーター（Mulligan et al., Nature 277:108(1979)）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18:5322(1990)）、ＣＭＶプロモーター等、および好ましくは形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、薬物（例えば、ネオマイシン、Ｇ４１８）によって選択される薬物耐性遺伝子）を保有する必要がある。これらの特徴を有する公知のベクターの例には、例えばｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶおよびｐＯＰ１３が含まれる。
【０２０９】
以下、実施例を参照して本発明をより詳細に記載する。しかしながら、以下の材料、方法および実施例は、本発明のある形態の作製および使用において当業者を支援するために役立ち得る一方、本発明の局面を説明するためのものにすぎず、したがって本発明の範囲を決して限定することを意図しない。当業者は容易に認識するため、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができる。
【実施例】
【０２１０】
材料および方法
細胞株
Ｔ２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性Ｂリンパ芽球様細胞株、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性Ｂリンパ芽球様細胞株、ＨＴ１３７６、Ｊ８２、ＣＯＳ７およびＵＭ−ＵＣ３は、ＡＴＣＣから購入した。ＭＫＮ−４５はＪＣＲＢから購入した。
【０２１１】
ＭＰＨＯＳＰＨ１由来ペプチドの候補選択
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に結合するＭＰＨＯＳＰＨ１由来の９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒペプチドを、結合予測ソフトウェア「ＢＩＭＡＳ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｍａｓ．ｃｉｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ）（Parker et al., J Immunol 1994, 152(1):163-75、Kuzushima et al., Blood 2001, 98(6):1872-81）を使用して予測した。これらのペプチドは、Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，Ｔｅｘａｓ）によって、標準的な固相合成法によって合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。該ペプチドの純度（＞９０％）および同一性を、それぞれ分析用ＨＰＬＣおよび質量分析によって決定した。ペプチドをジメチルスルホキシドに２０ｍｇ／ｍｌで溶解し、−８０℃で保存した。
【０２１２】
インビトロでのＣＴＬ誘導
単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を抗原提示細胞として使用して、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）上に提示されたペプチドに対して応答する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導した。他所に記載されているように、ＤＣをインビトロで作製した（Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15,63(14):4112-8）。具体的には、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ  ｐｌｕｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）溶液によって健常なボランティア（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性）から単離した末梢血単核細胞を、プラスチック製の組織培養ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）へ付着させることによって分離し、それらを単球画分として濃縮した。２％の加熱非働化した自己血清（ＡＳ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、１０００Ｕ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）および１０００Ｕ／ｍｌのインターロイキン（ＩＬ）−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）の存在下で、単球が濃縮された集団を培養した。７日間の培養後、サイトカインで誘導したＤＣに、ＡＩＭ−Ｖ培地中で３７℃で３時間、３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で２０μｇ／ｍｌの各合成ペプチドをパルスした。作製された細胞は、自身の細胞表面上に、ＤＣ関連分子、例えばＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡクラスＩＩを発現しているようであった（データは示さず）。次いで、ペプチドパルスしたこれらのＤＣをＸ線照射（２０Ｇｙ）によって不活化し、ＣＤ８  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ）を用いた陽性選択によって得られた自己ＣＤ８＋Ｔ細胞と１：２０の比率で混合した。これらの培養物を４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に準備し、各ウェルは、０．５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／２％ＡＳ培地中に、１．５×１０４個のペプチドパルスしたＤＣ、３×１０５個のＣＤ８＋Ｔ細胞および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を含んだ。３日後、これらの培養物に、ＩＬ−２（ＣＨＩＲＯＮ）を最終濃度２０ＩＵ／ｍｌまで添加した。７日目および１４日目に、ペプチドパルスした自己ＤＣでＴ細胞をさらに刺激した。ＤＣは上記と同じ方法によって毎回調製した。２１日目に、３回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたＴ２細胞に対してＣＴＬを試験した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1):94-9；Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8):1052-7；Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24):8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5):411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8):498-506）。
【０２１３】
ＣＴＬ増殖手順
Ｒｉｄｄｅｌｌら（Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16):1038-44；Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2):216-23）によって記載されている方法と類似の方法を使用して、ＣＴＬを培養下で増殖させた。４０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、マイトマイシンＣによって不活化した２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株とともに、合計５×１０４個のＣＴＬを２５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地中に懸濁した。培養開始１日後に、１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を該培養物に添加した。５、８、および１１日目に、３０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新たなＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地を、該培養物に供給した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1):94-9；Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8):1052-7；Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24):8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5):411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8):498-506）。
【０２１４】
ＣＴＬクローンの樹立
９６丸底マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）においてＣＴＬ０．３個、１個、および３個／ウェルとなるように、希釈を行った。ＣＴＬを、１×１０４個細胞／ウェルの２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株、３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、および１２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２とともに、合計１５０μｌ／ウェルの５％ＡＳ含有ＡＩＭ−Ｖ培地中で培養した。１０日後、５０μｌ／ウェルのＩＬ−２を、ＩＬ−２の最終濃度が１２５Ｕ／ｍｌに到達するように該培地に添加した。１４日目にＣＴＬ活性を試験し、上記と同じ方法を使用してＣＴＬクローンを増殖させた（Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24):8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5):411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8):498-506）。
【０２１５】
特異的ＣＴＬ活性
特異的ＣＴＬ活性を調べるために、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイおよびＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。ペプチドパルスしたＴ２（１×１０４個／ウェル）を刺激細胞として調製した。４８ウェルプレート中の培養細胞、ＣＴＬ株およびＣＴＬクローンを応答細胞として使用した。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＦＮ−γＥＬＩＳＡアッセイは、製造業者の手順に従って行った。
【０２１６】
ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を内因的に発現する標的細胞株を認識するＣＴＬ能力
ＣＴＬクローンを、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を内因的に発現する標的細胞を認識するその能力について調べた。樹立したＣＴＬクローンを、標的細胞株（５×１０４個／ウェル）とともに二晩培養した。インキュベート後、培養培地中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡによって測定した。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡは、製造業者の手順のもと行った。
【０２１７】
細胞傷害活性
ＣＴＬクローンを、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を内因的に発現する腫瘍細胞を殺傷するその能力について調べた。標的細胞（腫瘍細胞株）を１００μ−ＣｉのＮａ２５１ＣｒＯ４（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）でＣＯ２インキュベーター内で１時間標識した。ペプチドパルスした標的細胞は、細胞を２０μｇ／ｍｌのペプチドとともに標識前に１６時間インキュベートすることによって調製した。５１Ｃｒで標識した標的細胞をリンスし、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート中で２００μｌの最終容量でＣＴＬクローンと混合した。プレートを遠心分離（８００ｒｐｍで４分）して細胞間接触を増加させ、ＣＯ２インキュベーター内に配置した。４時間のインキュベート後、５０μｌの上清を各ウェルから回収し、放射能をガンマカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で測定した。特異的細胞傷害性の割合は、以下の式によって特異的５１Ｃｒ放出の割合を算出することによって決定した：｛（試験試料放出のｃｐｍ−自然放出のｃｐｍ）／（最大放出のｃｐｍ−自然放出のｃｐｍ）｝×１００。自然放出は、標的細胞を単独で、エフェクター細胞の非存在下でインキュベートすることによって決定した。最大放出は、標的を１Ｎ  ＨＣｌとインキュベートすることによって得た。すべての測定は二重で行った。
【０２１８】
標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ０２０６のいずれかまたは両方を強制的に発現する細胞の樹立
標的遺伝子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０６のオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅産物を発現ベクターにクローニングした。製造業者の手順に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６ヌル細胞株であるＣＯＳ７に該プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、トランスフェクトした細胞をベルセン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて回収し、ＣＴＬ活性アッセイのための刺激細胞（５×１０４個細胞／ウェル）として使用した。
【０２１９】
ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６を内因的に発現する標的細胞株を認識するＣＴＬ能力
ＣＴＬクローンを、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６を内因的に発現する標的細胞を認識するその能力について調べた。樹立したＣＴＬ株およびクローンを、標的細胞株（５×１０４個／ウェル）とともに二晩培養した。インキュベート後、培養培地中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡによって測定した。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡは、製造業者の手順のもと行った。
【０２２０】
結果
がんにおけるＭＰＨＯＳＰＨ１発現の増強
ｃＤＮＡマイクロアレイを使用して様々ながんから得られた包括的な遺伝子発現プロファイルデータによって、ＭＰＨＯＳＰＨ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６１９５；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２５）発現が、対応する正常組織と比較してがん組織内で特異的に上昇していることが明らかになった。ＭＰＨＯＳＰＨ１発現は、３１例の膀胱癌のうち３０例、３６例の乳癌のうち８例、１８例の子宮頸癌のうち１８例、１７例の胆管細胞癌のうち５例、３１例のＣＭＬのうち２５例、１１例の結腸直腸癌のうち６例、１４例の胃癌のうち６例、５例のＮＳＣＬＣのうち５例、７例のリンパ腫のうち７例、１０例の骨肉腫のうち６例、２２例の前立腺癌のうち７例、１８例の腎癌のうち１０例、および２１例の軟組織腫瘍のうち１５例において、確かに上昇していた（表１）。
【０２２１】
【表１】
0005564730.tif 000002
【０２２２】
ＭＰＨＯＳＰＨ１由来のＨＬＡ−Ａ０２結合ペプチドの予測
表２ａおよび２ｂは、ＨＬＡ−Ａ０２に結合するＭＰＨＯＳＰＨ１の９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒペプチドを、結合親和性の高い順に示す。エピトープペプチドを決定するために、ＨＬＡ−Ａ０２結合能を有する可能性がある合計４７種のペプチドを選択して調べた。
【０２２３】
【表２ａ】
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【０２２４】
【表２ｂ】
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【０２２５】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のＭＰＨＯＳＰＨ１由来の予測ペプチドによるＣＴＬの誘導
ＭＰＨＯＳＰＨ１由来のペプチドに対するＣＴＬを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ペプチド特異的なＣＴＬ活性を検出した（図１）。ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−８５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）で刺激したウェル番号＃７（ａ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−１２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）で刺激した＃５（ｂ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−８４６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）で刺激した＃５（ｃ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−４６０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）で刺激した＃２（ｄ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−７７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）で刺激した＃１（ｅ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−４０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）で刺激した＃１（ｆ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−９２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）で刺激した＃４（ｇ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−１４８４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）で刺激した＃５（ｈ）およびＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）で刺激した＃８（ｉ）が、対照ウェルと比較して強力なＩＦＮ−γ産生を実証した。一方、表２ａおよびｂに示される他のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１との結合活性を有する可能性があるにもかかわらず、それらのペプチドでの刺激では、特異的なＣＴＬ活性は検出されなかった。典型的な陰性データの例として、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−５７５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）で刺激したＣＴＬ（ｊ）からは特異的ＩＦＮ−γ産生は観察されなかった。以上を総合すると、これらの結果は、ＭＰＨＯＳＰＨ１由来の１０種の選択ペプチドが強力なＣＴＬを誘導し得ることを示唆している。
【０２２６】
ＭＰＨＯＳＰＨ１由来ペプチドに対するＣＴＬ株およびクローンの樹立
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてペプチド特異的なＣＴＬ活性を示した、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−８５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）で刺激したウェル番号＃７（ａ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−１２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）で刺激した＃５（ｂ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−８４６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）で刺激した＃５（ｃ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−４６０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）で刺激した＃２（ｄ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−７７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）で刺激した＃１（ｅ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−４０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）で刺激した＃１（ｆ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−９２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）で刺激した＃４（ｇ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−１４８４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）で刺激した＃５（ｈ）およびＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）で刺激した＃８（ｉ）における細胞を増殖させ、ＣＴＬ株を樹立した（図２）。これらのＣＴＬ株のＣＴＬ活性をＩＦＮ−γＥＬＩＳＡによって測定した。ＣＴＬ株は、ペプチドをパルスしなかったＴ２細胞と比較して、対応するペプチドをパルスしたＴ２細胞に対して強力なＩＦＮ−γ産生を実証した。さらに、「材料および方法」に記載したとおりに、ＣＴＬ株から限界希釈によってＣＴＬクローンを樹立し、対応するペプチドをパルスしたＴ２細胞に対するＣＴＬクローンからのＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γＥＬＩＳＡによって測定した。ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−８５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）（ａ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−８４６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）（ｂ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−４６０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）（ｃ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−７７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）（ｄ）およびＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）（ｅ）で刺激したＣＴＬクローンから強力なＩＦＮ−γ産生が観察された（図３）。
【０２２７】
ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
樹立したＣＴＬクローンを、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を発現する標的細胞を認識する能力について調べた。ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）を用いて刺激したＣＴＬクローンは、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方を発現するＪ８２細胞に対して強力なＣＴＬ活性を示した。一方、ＭＰＨＯＳＰＨ１を発現するがＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現しないＨＴ１３７６細胞およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現するがＭＰＨＯＳＰＨ１を発現しないＴ２細胞に対して有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった（図４）。したがって、このデータによって、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）ペプチドが内因的にプロセシングされ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子とともに標的細胞上に発現され、ＣＴＬによって認識されることが明確に実証された。
【０２２８】
ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現する腫瘍細胞株に対する細胞傷害活性
樹立したＣＴＬクローンを、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現する腫瘍細胞株を認識し、殺傷するその能力について調べた。ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）を用いて刺激したＣＴＬクローンは、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方を発現するＵＭＵＣ−３細胞に対して強力な細胞傷害活性を示した。一方、ＭＰＨＯＳＰＨ１を発現するがＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現しないＭＫＮ４５細胞およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現するがＭＰＨＯＳＰＨ１を発現しないＴ２細胞に対して、両方のＣＴＬクローンについて有意な細胞傷害活性は検出されなかった（図５）。これらの結果は、ＭＰＨＯＳＰＨ１由来のＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）ペプチドがＭＰＨＯＳＰＨ１発現腫瘍を有する患者のためのがんワクチンに適用可能であり得ることを示している。
【０２２９】
ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６を発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）ペプチドに対して産生された樹立ＣＴＬ株を、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子を発現する標的細胞を認識する能力について調べた。全長ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６遺伝子の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６遺伝子を発現する標的細胞についての特異的モデル）を刺激細胞として調製し、全長ＭＰＨＯＳＰＨ１またはＨＬＡ−Ａ＊０２０６のいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として使用した。図６において、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）を用いて刺激したＣＴＬクローンは、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６の両方を発現するＣＯＳ７細胞に対して強力なＣＴＬ活性を示した。一方、対照に対して有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。したがって、このデータによって、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）ペプチドが内因的にプロセシングされ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子とともに標的細胞上に発現され、ＣＴＬによって認識されることが明確に実証された。
【０２３０】
抗原ペプチドの相同性解析
ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−８５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−１２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−８４６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−４６０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−７７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−４０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−９２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−１４８４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）およびＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）を用いて刺激したＣＴＬは、有意かつ特異的なＣＴＬ活性を示した。この結果は、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−８５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−１２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−８４６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−４６０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−７７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−４０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−９２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−１４８４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）およびＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）の配列が、ヒト免疫系を感作することが知られている他の分子に由来するペプチドと相同的であるという事実に起因する可能性がある。この可能性を排除するために、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いて、クエリーとしてのこれらのペプチド配列に対して相同性解析を行ったが、有意な相同性を有する配列は認められなかった。相同性解析の結果は、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−８５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−１２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−９−８４６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−４６０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−７７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−４０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−９２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−１４８４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）およびＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ０２−１０−２８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）の配列が固有のものであること、したがって本発明者らの知る限りでは、この分子が、ある非関連分子に対して意図しない免疫学的応答を引き起こす可能性はほとんどないことを示している。
【０２３１】
結論として、本明細書で同定された、ＭＰＨＯＳＰＨ１に由来する新規ＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープペプチドが、がん免疫療法の分野において利用され得る。
【産業上の利用可能性】
【０２３２】
本発明は、新規ＴＡＡ、特に、強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し、したがって幅広いがんの種類に対する適用性を有し得る、ＭＰＨＯＳＰＨ１由来の新規ＴＡＡを提供する。そのようなＴＡＡは、ＭＰＨＯＳＰＨ１関連疾患、例えば、がん、より詳細には、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌および軟組織腫瘍に対するペプチドワクチンとして使用され得る。
【０２３３】
本明細書において、本発明をその特定の態様に関して詳細に説明しているが、前述の説明は本質的に例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を説明することを意図していることが理解されるべきである。慣例的な実験を通して、当業者は、その境界および限界が添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および改変がその中でなされ得ることを容易に認識する。
【図１】
0005564730.tif 000007
【図２ａ−ｆ】
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【図２ｇ−ｉ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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